1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B SÉPTIMADIRECTIVADELACOMISIÓN
de1demarzode1976
sobredeterminacióndemétodosdeanálisiscomunitariosparaelcontroloficialdelaalimentación
animal
(76/372/CEE)
(DOL102de15.4.1976,p.8)
Modificadapor:
DiarioOficial
nopágina fecha
►M1Directiva81/680/CEEdelaComisiónde30dejuliode1981 L246 32 29.8.1981
▼B
SÉPTIMADIRECTIVADELACOMISIÓN
de1demarzode1976
sobre determinación demétodosdeanálisiscomunitarios parael
controloficialdelaalimentaciónanimal
(76/372/CEE)
LACOMISIÓNDELASCOMUNIDADESEUROPEAS,
VistoelTratadoconstitutivodelaComunidadEconómicaEuropea,Vista la Directiva del Consejo, de 20 de julio de 1970, referente a la
introduccióndemodosdetomasdemuestrasydemétodosdeanálisis
comunitariosparaelcontroloficialdelaalimentaciónanimal(
1),modi-
ficada en último lugar por el Acta de adhesión(2) y, en particular, su
artículo2,
Considerando que la Directiva arriba contemplada prevé que los
controles oficiales de la alimentación animal dirigidos a comprobarqueserespetanlascondicionesprescritasenvirtuddelasdisposicioneslegales, reglamentarias y administrativas referentes a la calidad y a la
composición de la alimentación animal, se llevan a cabo según los
modosdetomasdemuestrasylosmétodosdeanálisiscomunitarios,
Considerando que las Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/
CEE, 73/46/CEE, 74/203/CEE y75/84/CEE de laComisión, de15dejuniode1971(
3),18denoviembrede1971(4),27deabrilde1972(5),
5dediciembrede1972(6),25demarzode1974(7)y20dediciembre
de 1974(8), establecieron ya un determinado número de métodos de
análisis comunitarios; que habida cuenta del avanzado estado de lostrabajosllevadosacabodesdeentonces,convieneadoptarunaséptimaseriedemétodos,
Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva
concuerdanconeldictamendelComitépermanentedelaalimentaciónanimal.
HAADOPTADOLAPRESENTEDIRECTIVA:
Artículo 1
Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles
oficialesdealimentaciónanimal,enloreferenteasucontenidoenafla-
toxina B1sellevarán a cabo según losmétodos descritos en el Anexo
delapresenteDirectiva.
Artículo 2
LosEstadosmiembrosaplicarán,amástardar,el1deoctubrede1976,
las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas necesarias
paracumplirlapresenteDirectivaeinformarándeelloinmediatamente
alaComisión.
Artículo 3
LosdestinatariosdelapresenteDirectivaseránlosEstadosmiembros.1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—2
(1)D OnoL170de3.8.1970,p.2.
(2)D OnoL73de27.3.1972,p.14.
(3)D OnoL155de12.7.1971,p.13.
(4)D OnoL279de20.12.1971,p.7.
(5)D OnoL123de29.5.1972,p.6.
(6)D OnoL83de30.3.1973,p.21.
(7)D OnoL108de22.4.1974,p.7.
(8)D OnoL32de5.2.1975,p.26.▼M1
▼B
▼B
ANEXO
DOSIFICACIÓNDELAAFLATOXINAB1
A. MÉTODO POR CROMATOGRAFÍA MONODIMENSIONAL EN CAPA
FINA
1.Objetoyámbitodeaplicación
Elmétodopermitedeterminar elcontenidodeaflatoxina B1delos
alimentos siguientes: tortas de cacahuetes, de copra, de lino, de
soja,desésamodebabasúydegérmenesdemaíz,cerealesyderi-
vados, harina de guisantes, pulpa y fécula de patatas. El límite
inferiordeladosificaciónesdeO,01mg/kg(10ppb).
Enpresenciadesustanciasinterferentesqueobstaculicenlasdeter-
minaciones, conviene recomenzar el análisis según el método B
(porcromatografíabidimensionalencapafina).
2.Principio
Lamuestrasesometealaextracciónmediantecloroformo.Sefiltra
el extracto y se toma del mismo una parte alicuota que es purifi-
cada mediante cromatografía en columna de gel de sílice. El
eluido se evapora y el residuo se vuelve a tomar mediante un
volumen determinado de cloroformo o de una mezcla de benceno
yacetonitrilo. Unapartealicuota dedichasoluciónsesomete ala
cromatografía en capa fina. La cantidad de aflatoxina B1se deter-
mina bajo irradiación ultravioleta del cromatograma bien sea
visualmente, o a través de fluordensitometría, mediante compara-
ción con cantidades conocidas deaflatoxina B1-tipo. La identidad
delaaflatoxinaB1extraidadelalimentodebeconfirmarsemediante
losprocedimientosindicados.
3.Reactivos
NB:Todoslosreactivosdebenserdecalidad«paraelanálisis»en
lamedidaenquenosehadadoningunaotraindicación.
3.1. Acetona.
3.2. Cloroformo,estabilizadopordel0,5al1,0porcientodeetanolde
96º(v/v).
3.3. n-Hexano.
3.4. Metanol.
3.5. Eterdietílicoanhídrido,exentodeperóxidos.
3.6. Mezcladebencenoydeacetonitrilo:98/2(v/v).
3.7. Mezcladecloroformo(3.2)ydemetanol(3.4):97/3(v/v).
3.8. Gel de sílice, para cromatografía en columna, granulometría: de
0,05a0,20mm.
3.9. Algodónhidrófilo,previamentedesengrasadomediantecloroformo,
olanadevidrio.
3.10. Sulfatodesodio,anhidro,granulado.
3.11. Gasinerte,porejemplo:ázoe.
3.12. Acidoclorhídrico1N.
3.13. Acidósulfúricoal50porciento(v/v).
3.14. Tierradediatomeas(Hiflosupercel)lavadaconácido.
3.15. GeldesíliceG-HRoequivalente,paracromatografíaencapafina.
3.16. Solución tipo de 0,1 µgr. aproximadamente de aflatoxina B1por
milímetroenelcloroformo(3.2)oenlamezcladebenceno/aceto-
nitrilo(3.6),preparadaycontroladacomoseindicaenelpunto7.
3.17. Solucióntipocualitativade0,1µgr.aproximadamentedeaflatoxina
B1yB2por ml en el cloroformo (3.2) o en la mezcla benceno/
acetonitrilo (3.6). Estas concentraciones se dan a título indicativo
y deben ajustarse con objeto de obtener la misma intensidad de
fluorescenciaparalasdosaflatoxinas.1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—3
▼B
3.18. Disolventesderevelado:
3.18.1. Cloroformo(3.2)/acetona(3.1):9/1(v/v),cubetanosaturada;
3.18.2. Eter dietílico (3.5)/metanol (3.4)/agua: 96/3/1 (v/v/v), cubeta no
saturada;
3.18.3. Eter dietílico (3.5)/metanol (3.4)/agua: 94/4,5/1,5 (v/v/v), cubeta
saturada;
3.18.4. Cloroformo(3.2)/metanol(3.4):94/6(v/v),cubetasaturada;3.18.5 Cloroformo(3.2)/metanol(3.4):97/3(v/v),cubetasaturada.
4.Equipo
4.1. Triturador-mezclador.4.2. Aparatoparaagitaroagitadormagnético.
4.3. Filtros plegados, Schleicher y Schüll n
o588 o equivalente,
diámetro:24cm.
4.4. Tubos para cromatografía, de cristal (diámetro interior: 22 mm,
longitud300mm),congrifodeteflónydepósitode250ml.
4.5. Aparatorotativodeevaporaciónenvacío,conmatrazde500ml.
4.6. Frascoscónicosde500ml,contapónesmerilado.
4.7. Equipoparacromatografíaencapafina.
4.8. Placas de vidrio para cromatografía en capa fina, 200 × 200 mm,
preparadasdelasiguiente manera(conlascantidades indicadas se
puedenrecubrircincoplacas):introducir30grs.degeldesíliceG-
HR(3.15)enunfrascocónico,añadir60mldeagua,taparyagitar
duranteunminuto.Extenderlasuspensiónenlasplacasconobjeto
deobtenerunacapauniformede0,25mmdeespesor.Dejarsecar
al aire y conservar después en un desecador provisto de gel de
sílice. En el momento de su utilización, activar las placas mante-
niéndolasduranteunahoraenlaestufaa110nºC.
Las placas ya listas para su utilización son prácticas en la medida
en que dan resultados parecidos a los de las placas preparadas
segúnsehaindicadomásarriba.
4.9. Lámpara ultravioleta de ondas largas (360 nm). La intensidad de
irradiación debe permitir distinguir, incluso con claridad, una
mancha de 1,0 ngr. de aflatoxina B1 en una placa para cromato-
grafíaencapafina,aunadistanciade10cmdelalámpara.
4.10. Tubosde10ml,graduados,contaponesdepolietileno.
4.11. Espectrofotómetroultravioleta.
4.12. Fluordensitómetro(eventualmente).
5.Mododeoperar
5.1. Preparación de la muestra (ver las observaciones del punto 1 de la
parte C)
Triturarlamuestrademaneraquepasecompletamentteatravésde
un tamiz de mallas del mm (conforme a la recomendación ISO R
565).
5.2. Extracción
Introducir 50,0 g de la muestra molida y homogeneizada en un
frascocónico de500ml(4.6).Añadir25gdetierra dediatomeas
(3.14), 25 ml de agua y 250 ml de cloroformo (3.2). Tapar el
frasco, sacudir o agitar durante 30 minutos con ayuda del aparato
(4.2) y filtrar mediante el filtro plegado (4.3). Eliminar los 10
primerosmldelresultadodelafiltración yrecogeracontinuación
50ml.
5.3. Purificación en columna
Proveerlaextremidad inferiordeuntuboparacromatografía (4.4)
de un tapón de algodón o de lana de vidrio (3.9), llenar los dos
tercios del tubo de cloroformo (3.2) y añadir 5 g de sulfato de
sodio(3.10).
Comprobar que la superificie superior de la capa de sulfato de
sodio está plana; añadir a continuación, en pequeñas porciones,1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—4
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10 g de gel de sílice (3.8). Remover con precaución después de
cadaadiciónconelfindeeliminar lasburbujasdeaire.Dejarque
seposedurante15minutosyañadirseguidamente,conprecaución,
15gdesulfatodesodio(3.10).Dejardescenderellíquidohastala
proximidadinmediatadelasuperficiesuperiordelacapadesulfato
desodio.
Mezclar los 50 ml de extracto recogidos en 5.2 con 100 ml de n-
hexano (3.3) y transvasar cuantitativamente la mezcla en la
columna.Dejardescenderellíquidohastalasuperficiesuperiorde
lacapadesulfatodesodio.Eliminarellíquidoderramado.Añadir
a continuación 100 ml de éter dietílico (3.5) y dejar descender de
nuevo el líquido hasta la superficie superior de la capa de sulfato
desodio.Duranteestasoperaciones,procurarqueellíquidoderra-
mado sea de8a12 mlporminuto yque la columna no sevacíe.
Eliminar los líquidos derramados. Eluir después mediante 150 ml
de la mezcla cloroformo/metanol (3.7) y recoger la totalidad del
eluido.
Evaporar éste casi hasta vaciarlo, bajo una corriente de gas inerte
(3.11) y a una temperatura que no supere los 50 nºC, mediante el
aparatorotativodeevaporaciónenvacío(4.5).Introducircuantitati-
vamente el residuo por medio de cloroformo (3.2) o de la mezcla
benceno/-acetonitrilo (3.6)enuntubode10ml(4.10).Concentrar
lasoluciónbajounacorrientedegasinerte(3.11)yllevardespués
elvolumena2,0mlpormediodecloroformo(3.2)odelamezclabenceno/acetonitrilo (3.6).
5.4. Cromatografía en capa fina
Depositar puntualmente en una placa para cromatografía en capa
fina (4.8), a 2 cmdel borde inferior y a intervalos de 2 cm , los
volúmenesdelasolucióntipoydelextractoindicadosacontinua-
ción:
— 10, 15, 20, 30 y 40 µl de la solución tipo de aflatoxina B
1(3.16);
— 10 µl del extracto obtenido en 5.3 y, en superposición en el
mismopunto,20µldelasolucióntipo(3.16);
— 10y20µldelextractoobtenidoen5.3.
Revelarelcromatogramafueradelalcancedelaluz,conayudade
uno de los disolventes de revelado (3.18). La elección del disol-
ventedebedeterminarsepreviamentedepositandoenlaplaca25µl
de la solución tipo cualitativa (3.17) y asegurándose de que,
durante el revelado, las aflatoxinas B1yB2están completamente
separadas.
Dejarevaporarlosdisolventesfueradelalcancedelaluzeirradiar
acontinuaciónmedianteluzultravioleta,colocandolaplacaa10cm
delalámpara(4.9).LasmanchasdeaflatoxinaB1danunafluores-
cenciaazul.
5.5. Determinaciones cuantitativas
Proceder a las determinaciones bien sea visualmente, o mediante
fluordensitometríasegúnseindicaenlosucesivo:
5.5.1. Medidas visuales
DeterminarlacantidaddeaflatoxinaB1delextractocomparandola
intensidad de fluorescencia de las manchas del extracto con la de
lasmanchasdelasolucióntipo.Interpolarsiesnecesario.Lafluo-
rescenciaobtenidaporsuperposicióndelextractoalasolucióntipo
deber ser más fuerte que lade los10 µlde extracto yúnicamente
debedarlugaralapercepcióndeunasólamancha.Silaintensidad
defluorescenciadadaporlos10µldeextractoesmásfuertequela
de los 40 µl de solución tipo, diluir el extracto 10 o 100 veces
mediantecloroformo(3.2)omediantelamezcladebenceno/aceto-
nitrilo(3.6)antesdesometerloaunanuevacromatografía encapa
fina.
5.5.2. Medidas por fluordensitometría
Medir la intensidad de fluorescencia de las manchas de aflatoxina
B1en el fluordensitómetro (4.12) utilizando una longitud de onda
de excitación de 365 nmy una longitud de onda de em isión de
443 nm. Determinar la cantidad de aflatoxina B1de los depósitos
delextractoydelasolucióntipo.1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—5
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5.6. Confirmación de la identidad de aflatoxina B1
ConfirmarlaidentidaddelaaflatoxinaB1delextractomediantelos
siguientesprocedimientos:
5.6.1. Tratamiento por ácido sulfúrico.
Pulverizar ácido sulfúrico (3.13) sobre el cromatograma obtenido
en5.4.LafluorescenciadelasmanchasdeaflatoxinaB1debevirar
delazulalamarillobajoirradiaciónultavioleta.
5.6.2. Cromatografía bidimensional que implique la formación
deaflatoxinaB1—semiacetal(aflatoxinaB2a)
NB:Lasoperacionesdescritasenlosucesivodebenllevarseacabo
siguiendoelesquemaqueapareceenlafigura3.
5.6.2.1. Aplicacióndelassoluciones
Trazarenunaplaca(4.8)dosrectasparalelasadosladoscontiguos
(distantes 6 cmde esos lados), destinadas a delim itar el desplaza-
miento de los frentes de disolventes. Depositar en una placa, con
ayuda de pipetas capilares o de microjeringas, las soluciones indi-
cadasenlosucesivo:
—en el punto A: unvolumendeextractopurificadodelamuestra
obtenida en 5.3, que contenga 2,5 nanogramos aproximada-
mentedeaflatoxinaB1;
—en los puntos B y C: 25µldelasolucióntipo(3.16).
5.6.2.2. Revelado
RevelarelcromatogramaenladirecciónIconayudadeldisolvente
de revelado (3.18.1) [capa de 1 cmen una cubeta no saturada],
fueradelalcancedelaluz,hastaqueelfrentededisolventealcancelalíneadedelimitación. Retirarlaplacadelacubetaydejarsecar
durantecincominutosfueradelalcancedelaluzyalatemperatura
ambiente.Pulverizaracontinuaciónácidoclorhídrico(3.12)enuna
bandade2,5cmdealturaqueabarquelospuntosAyB(indicada
con trazos rayados en la figura 3),hasta suoscurecimiento, prote-
giendo el resto de la placa mediante una hoja de vidrio. Dejar
reaccionardurantediezminutosenlaobscuridadysecarconayuda
deunacorrientedeairealatemperaturaambiente.
Revelar a continuación el cromatograma en la dirección II con
ayuda del disolvente de revelado (3.18.1) [capa de 1 cmen una
cubetanosaturada],fueradelalcancedelaluz,hastaqueelfrente
del disolvente alcance la línea de delimitación. Retirar la placa de
lacubetaydejarsecaralatemperaturaambiente.
5.6.2.3. Interpretacióndelcromatograma
Examinar el cromatograma con luz ultravioleta (4.9) y comprobar
lasobservacionesindicadasenlosucesivo:
a) Aparición de una mancha fluorescente azul de aflatoxina B
1procedentedelasolucióntipodepositadaenC(desplazamiento
enladirecciónI).
b) Aparición de una mancha fluorescente azul de aflatoxina B1(que no ha reaccionado con el ácido clorhídrico) y de una
mancha fluorescente azul más intensa de aflatoxina B1—
semiacetal, procedente de la solución tipo depositada en B
(desplazamientoenladirecciónII).
c) Aparición de manchas similares a las indicadas en la letra b),
procedentes del extracto de la muestra depositado en A. El
emplazamiento de estas manchas está definido por la distancia
de desplazamiento de la aflatoxina B1a partir del punto A en
la dirección I (la misma distancia que la recorrida por la solu-
ción tipo depositada en C) seguida de las distancias de
desplazamiento recorridas en la dirección II por la aflatoxina
B1(que no ha reaccionado con el ácido clorhídrico) y por la
aflatoxinaB1—semiacetal(lasmismasdistanciasquelasreco-
rridasporlasolucióntipodepositadaenB).Lasintensidadesde
fluorescencia de las manchas de semiacetal procedentes del
extractoydelasolucióntipodeberíancorresponderse.
6.Cálculoderesultados
6.1. A partir de medidas visuales
El contenido en microgramos de aflatoxina B1por kilogramo de
muestra(ppb)vienedadoporlafórmula1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—6
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S/C1Y/C1V
W /C1X
enlacual:
X e Y son respectivamente los volúmenes en microlitros de solu-
ción tipo de aflatoxina B1(3.16) y del extracto, que tienen una
intensidaddefluorescenciasemejante;
S = concentraciónenmicrogramosdeaflatoxinaB1pormldela
solucióntipo(3.16);
V = volumen final del extracto enmicrolitros, habida cuenta de
laseventualesdiluciones;
W = peso en gramos de la toma de prueba correspondiente al
volumendeextractosometidoalapurificaciónencolumna.
6.2. A partir de medidas fluordensitométricas
El contenido en microgramos de aflatoxina B1por kilogramo de
muestra(ppb)vienedadoporlafórmula
S/C1V
W /C1Y
enlacual:
Y = volumen en microlitros del extracto depositado en la placa
(10o20µl);
S = cantidad en nanogramos de aflatoxina B1del depósito del
extracto (habida cuenta del volumen Y), deducida de las
determinaciones;
V = volumen final del extracto enmicrolitros, habida cuenta de
laseventualesdiluciones;
W = peso en gramos de la toma de prueba, correspondiente al
volumendeextractosometidoalapurificaciónencolumna.
7.Preparaciónycontroldelasolucióntipo(3.16)
7.1. Determinación de la concentración en aflatoxina B1
PrepararunasolucióntipodeaflatoxinaB1enelcloroformo(3.2)o
enlamezclabenceno/-acetonitrilo(3.6)cuyaconcentraciónesde8
a 10 µgrs por milílitro. Determinar el espectro de absorción entre
330y370nmconayudadeunespectrofotómetro(4.11).
Elevar la densidad óptica (A) a 363 nmen el caso de la solución
clorofórmica y a 348 nm en el caso de la solución en la mezcla
benceno/acetonitrilo.
Calcular la concentración de microgramos de aflatoxina B1por
milílitrodesoluciónapartirdelassiguientesfórmulas:
312 /C1A/C11000
20600paralasoluciónclorofórmica;
312 /C1A/C11000
19800paralasoluciónenlamezclabenceno/acetonitrilo.
Fuera del alcance de la luz, efectuar las diluciones convenientes
para obtener una solución tipo de trabajo cuya concentración en
aflatoxina B1es de 0,1 µg aproximadamente pormilílitro. Conser-
vada en el refrigerador, dicha solución permanece estable durante
dossemanas.
7.2. Control de la pureza cromatográfica
Depositarenunaplaca(4.8)5µldelasolucióntipoen8-10µgde
aflatoxinaB1pormilílitro(ver7.1).Revelarelcromatogramasegún
sehaindicadoen5.4.Conlaluzultravioleta,lafluorescenciasólo
debedarlugaralapercepcióndeunasolamanchaynodebeperci-
birseningunafluorescenciaenlazonadeldepósitodeorigen.1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—7
▼B
8.Repetibilidad
Ladiferencia entrelosresultadosdelasdosdeterminaciones para-
lelas efectuadas en la misma muestra por el mismo analista no
deberíasuperar:
— el25 porciento del resultado más elevado para loscontenidos
enaflatoxinaB1de10a20µg/kg,
— 5µg,envalorabsoluto,paraloscontenidosde20a50µg/kg,
— el10 porciento del resultado más elevado para loscontenidos
superioresa50µg/kg.
9.Reproductibilidad
Verlasobservacionesdelpunto2delaparteC.
B. MÉTODOPORCROMATOGRAFÍABIDIMENSIONALENCAPAFINA
1.Objetoyámbitodeaplicación
El método permite determinar el contenido en aflatoxina B1de la
alimentación animal que no entra dentro del ámbito de aplicación
del método A.Ellímite inferior dela dosificación es de0,01mg/
kg (10 ppb). El método no se aplica a alimentos que contengan
pulpasdeagrios.
2.Principio
Lamuestrasesometealaextracciónmediantecloroformo.Sefiltra
el extracto y se toma del mismo una parte alicuota que es purifi-
cada mediante cromatografía en columna de gel de sílice. El
eluidoevaporayelresiduosevuelveatomarmedianteunvolumen
determinadodecloroformoodeunamezcladebencenoyacetoni-
trilo. Una parte alicuota de dicha solución se somete a la
cromatografía bidimensional en capa fina. La cantidad de aflato-
xina B1se determina bajo irradiación ultravioleta del
cromatograma, bien sea visualmente, o a través de fluordensito-
metría, mediante comparación con cantidades conocidas de
aflatoxina B1extraida del alimento debe confirmarse mediante el
procedimientoindicado.
3.Reactivos
NB:Todoslosreactivosdebenserdecalidad«paraelanálisis»en
lamedidaenquenosehadadoningunaotraindicación.
3.1. Acetona.
3.2. Cloroformo,estabilizadopordel0,5al1,0porcientodeetanolde
96º(v/v).
3.3. n-Hexano.
3.4. Metanol.3.5. Eterdietílicoanhídrido,exentodeperóxidos.
3.6. Mezcladebencenoydeacetonitrilo:98/2(v/v).
3.7. Mezcladecloroformo(3.2)ydemetanol(3.4):97/3(v/v).3.8. Gel de sílice, para cromatografía en columna, granulometría: de
0,05a0,20mm.
3.9. Algodónhidrófilo,previamenteextraídomedianteelcloroformo,o
lanadevidrio.
3.10. Sulfatodesodio,anhídrido,granulado.3.11. Gasinerte,porejemplo:ázoe.
3.12. Acidoclorhídrico1N.
3.13. Tierradediatomeas(Hiflosupercel)lavadaconácido.3.14. GeldesíliceG-HRoequivalente,paracromatografíaencapafina.3.15. Disolventesderevelado.
3.15.1. Eter dietílico (3.5)/metanol (3.4)/agua: 94/4,5/1,5 (v/v/v), cubeta
saturada.
3.15.2. Cloroformo(3.2)/acetona(3.1):9/1(v/v)cubetanosaturada.1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—8
▼B
3.16. Solución tipo de 0,1 µgr. approximadamente de aflotoxina B1por
milímetro en el cloroformo (3.2) o en la mezcla benceno/acetoni-
trilo(3.6),preparadaycontroladacomoseindicaenelpunto7del
métodoA.
4.Equipo
Verpunto4delmétodoA.
5.Mododeoperar
5.1. Preparación de la muestra
ver puntos 5.1, 5.2 y 5.3 del
métodoA./C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C1505.2. Extracción
5.3. Purificación en columna
5.4. Cromatografiá bidimensional en capa fina.
5.4.1. Aplicación de las soluciones (seguirelesquemaqueaparece
enlafigura1)
Trazarenunaplaca(4.8)dosrectasparalelasadosladoscontiguos
(a5y6cmdedistanciarespectivamentedeestoslados),destinadas
a delimitar el desplazamiento de los frentes de disolventes. Depo-
sitarenlaplacaconayudadepipetascapilaresodemicrojeringas
lassolucionesindicadasenlosucesivo:
—en el punto A,20µldelextractopurificadodelamuestra,obte-
nidoen5.3,
—en el punto B,20µldelasolucióntipo(3.16),
—en el punto C,10µldelasolucióntipo(3.16),
—en el punto D,20µldelasolucióntipo(3.16),
—en el punto E,40µldelasolucióntipo(3.16).
Secar con ayuda de una ligera corriente de aire o con gas inerte
(3.11). Las manchas obtenidas deben tener un diámetro de alre-
dedorde5mm.
5.4.2. Revelado (seguirelesquemaqueapareceenlafigura1).
RevelarelcromatogramaenladirecciónIconayudadeldisolvente
de revelado (3.15.1) [capa de 1 cmen una cubeta saturada], fuera
del alcance de la luz, hasta que el frente del disolvente alcance la
líneadedelimitación.Retirarlaplacadelacubetaydejarsecar,al
menos durante quince minutos, fuera del alcance de la luz y a
temperaturaambiente.
Revelar a continuación el cromatograma en la dirección II con
ayuda del disolvente de revelado (3.15.2) [capa de 1 cmen una
cubetanosaturada],fueradelalcancedelaluz,hastaqueelfrente
del disolvente alcance la línea de delimitación. Reitrar la placa de
lacubetaydejarsecar,fueradelalcancedelaluzyatemperatura
ambiente.
5.4.3. Interpretación del cromatograma (seguir el esquema que
apareceenlafigura2)
Irradiar el cromatograma mediante luz ultravioleta colocando la
placa a10 cm de lalámpara (4.9).Localizar el emplazamiento de
las manchas de fluorescencia azul B, C, D y E de aflatoxina B
1procedentesdelasolucióntipoytrazardosrectasimaginariasquepasen por estas manchas y perpendiculares a las direcciones de
revelado.ElpuntodeintersecciónPdeestasrectaseselemplaza-
miento en donde debería encontrarse la mancha de aflatoxina B
1procedente del extracto de la muestra depositado en A (figura 1).No obstante, el emplazamiento en donde debería encontrarse la
mancha de aflatoxina B
1procedente del extracto de la muestra
depositadoenA(figura 1).Noobstante,elemplazamiento realde
esta mancha puede encontrarse en un punto Qsituado en la inter-
seccióndedosrectasimaginariasqueformenentresíunángulode
aproximadamente 100 grados y que pase respectivamente por las
manchas B y C. Determinar la cantidad de aflatoxina B1del
extractodelamuestrasegúnseindicaen5.5.
5.4.4. Cromatografía complementaria
Trazar en una nueva placa (4.8) dos rectas paralelas a dos lados
contiguos,segúnseindicaenelesquemadelafigura1,ydepositar
en el punto A (ver figura 1) 20 µl del extracto purificado de la1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—9
▼B
muestra obtenida en 5.3 y, en superposición, 20 µl de la solución
tipo (3.16). Revelar según se indica en 5.4.2. Irradiar el cromato-
gramamedianteluzultravioleta(4.9)ycomprobarque:
— lasmanchasdeaflatoxina B1delextracto ydelasolucióntipo
sesuperponen,
— la fluorescencia de esta mancha es más intensa que la de la
mancha de aflatoxina B1revelada en el punto Qde la primera
placa.
— la fluorescencia de esta mancha es más intensa que la de la
mancha de aflatoxina B1revelada en el punto Qde la primera
placa.
5.5. Determinaciones cuantitativas
Proceder a las determinaciones, bien sea visualmente o mediante
fluordensitometría,segúnseindicaenlosucesivo:
5.5.1. Medidas visuales
DeterminarlacantidaddeaflatoxinaB1delextractocomparandola
intensidaddefluorescenciadelamanchadelextractoconladelas
manchasC,DyEdelasolucióntipo.Interpolarsiesnecesario.Si
la intensidad de la fluorescencia dada por los 20 µl del extractoes
másfuertequeladelos40µldesolucióntipo,diluirelextracto10
o 100 vecez mediante cloroformo (3.2) o mediante la mezcla de
benceno/acetonitrilo(3.6)antesdesometerloaunanuevacromato-
grafíaencapafina.
5.5.2. Medidas por fluordensitometría
Medir la intensidad de fluorescencia de las manchas de aflatoxina
B1conelfluordensitómetro(4.12)utilizandounalongituddeonda
deexcitaciónde365nmyunalongituddeemisiónde443nm.
Determinar la cantidad de aflatoxina B1del depósito del extracto
comparando la intensidad de fluorescencia de la mancha del
extractoconladelasmanchasC,DyEdelacolucióntipo.
5.6. Confirmación de la identidad de la aflatoxina B1
Verpunto5.6delmétodoA.
6.Cálculodelosresultados
Verpunto6delmétodoA.
7.Repetibilidad
VerpuntoBdelmétodoA.
8.Reproductibilidad
Verlasobservacionesdelpunto2delaparteC.
C. OBSERVACIONESREFERENTESALOSMÉTODOSAYB
1.Desengrasado
Las muestras que contengan más del 5 por ciento de materias grasas deben
desengrasarse mediante éter de petróleo (éb. 40-60º C) tras la preparación
indicada en5.1.Endichoscasos,losresultadosdelanálisisdebenatribuirse
alpesodelamuestranodesengrasada.
2.Reproductibilidaddelosresultados
La reproductibilidad de los resultados, es decir la variación entre los resul-
tados obtenidos por dos o más laboratorios sobre la misma muestra, se ha
calculadoen:
±50porcientodelvalormediodelosresultadosparalosvaloresmediosen
aflatoxinaB1de10a20µg/kg,
±10µg/kgapartirdelvalormedioparalosvaloresmediosde20a50µg/kg,±20porcientodelvalormedioparalosvaloresmediossuperioresa50µg/
kg.1976L0372—ES—19.08.1981—001.001—10
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ANEXO
Figura 1
Figura 21976L0372—ES—19.08.1981—001.001—11
▼B
Figura 31976L0372—ES—19.08.1981—001.001—12