1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B TERCERADIRECTIVADELACOMISIÓN
de27deabrilde1972
por la quesedeterminan métodosdeanálisiscomunitario parael control oficial delos alimentos
paraanimales
(72/199/CEE)
(DO L 123 de 29.5.1972, p. 6)
Modificada por:
Diario Oficial
nopágina fecha
►M1Directiva 81/680/CEE de la Comisión de 30 de julio de 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Directiva 84/4/CEE de la Comisión de 20 de diciembre de 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Directiva 93/28/CEE de la Comisión de 4 de junio de 1993 L 179 8 22.7.1993
►M4Directiva 98/54/CE de la Comisión de 16 de julio de 1998 L 208 49 24.7.1998
►M5Directiva 1999/79/CE de la Comisión de 27 de julio de 1999 L 209 23 7.8.1999
▼B
TERCERADIRECTIVADELACOMISIÓN
de27deabrilde1972
por la que se determinan métodos de análisis comunitario para el
controloficial delosalimentosparaanimales
(72/199/CEE)
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,
Vista la Directiva del Consejo, de 20 de julio de 1970, relativa a la
introducción de métodos de toma de muestras y de análisis comunita-
rios para el control oficial de los alimentos para animales (1)y ,e n
particular, su artículo 2,
Considerando que la Directiva antes mencionada prevé que los
controles oficiales de los alimentos para animales dirigidos a
comprobar si se respetan las condiciones establecidas en virtud de lasdisposiciones legales, reglamentarias o administrativas relativas a lacalidad y la composición de los alimentos para animales se efectuaránsegún métodos de toma de muestras y de análisis comunitarios;
Considerando que las Directivas n
o71/250/CEE y no71/393/CEE de la
Comisión, de 15 de junio de 1971 (2) y de 18 de noviembre de 1971 (3),
han establecido ya determinados métodos de análisis comunitarios; que,habida cuenta del grado de avance de los trabajos efectuados desde
entonces, es conveniente adoptar una tercera serie de medidas;
Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva se
ajustan al dictamen del Comité Permanente de la Alimentación Animal;
HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA:
Artículo 1
Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles
oficiales de los alimentos para animales, en lo que se refiere a suscontenidos en almidón, proteínas brutas, proteínas brutas solubilizablesmediante la pepsina y el ácido chlorhídrico, y en gosipol libre y total,
así como la actividad de la pepsina, se efectúen según los métodos
descritos en el Anexo I de la presente Directiva.
Artículo 2
Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles
oficiales de los alimentos para animales ►M4 ◄refe-
ridos al contenido de dichos alimentos en ►M4 ◄
tilosina y virginiamicina, se efectúen según los métodos descritos en
el Anexo II de la presente Directiva.
Artículo 3
Los Estados miembros aplicarán, a más tardar el 1 de julio de 1973, las
disposiciones legales, reglamentarias o administrativas necesarias paracumplir las disposiciones de la presente Directiva. Informarán de elloinmediatamente a la Comisión.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 2
(1)D O noL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)D O noL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(3)D O noL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Artículo 4
Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 3
▼B
ANEXOI
1.DETERMINACIÓNDELALMIDÓN
MÉTODO POLARIMÉTRICO
1.Objetivosycampodeaplicación
El método permite determinar el contenido en almidón y en productos de
degradación de alto peso molecular del almidón de la alimentación animal
con el objetivo de controlar el cumplimiento de la Directiva 86/174/CEE y
la Directiva 96/25/CE.
2.Principio
El método comprende una doble determinación. En la primera, la muestra se
trata en caliente mediante ácido clorhídrico diluido. Previa defecación y
filtración, se medirá mediante un polarímetro el poder rotatorio de la solu-
ción.
En la segunda, la muestra se extrae mediante el etanol al 40 %. Tras la acidi-
ficación del filtrado por el ácido clorhídrico, defecación y filtración, se mide
el poder rotatorio en las mismas condiciones que cuando la primera determi-
nación.
La diferencia entre ambas multiplicada por un factor común da como resul-
tado el contenido en almidón de la muestra.
3.Reactivos
3.1. Ácido clorhídrico al 25 % (p/p), d: 1,126.
3.2. Ácido clorhídrico al 1,128 % (p/v).
La concentración debe comprobarse mediante trituración con la ayuda
de una solución de hidróxido de sodio 0,1 N en presencia de rojo de
metilo al 0,1 % (p/v) en el etanol al 94 % (v/v). 10 ml = 30,94 ml
de NaOh 0,1 N.
3.3. Solución de Carrez I: Disolver en el agua 21,9 g de acetato de zinc
Zn CH 3COO ðÞ2:2H2O y 3 g de ácido acético glacial. Completar a
100 ml con agua.
3.4. Solución de Carrez II: Disolver en el agua 10,6 g de ferrocianuro de
potasio K 4Fe CNðÞ6/C2/C3
/C13H2O:Completar a 100 ml con agua.
3.5. Etanol al 40 % (v/v), d: 0,948 a 20 ºC.
4.Equipo
4.1. Erlenmeyer de 250 ml de esmerilado normalizado, con refrigerante de
reflujo.
4.2. Polarímetro o sacarímetro.
5.Métodooperatorio
5.1.Preparacióndelamuestra
Triturar la muestra de forma que pase en su totalidad a través de un
tamiz de malla redonda de 0,5 mm de diámetro.
5.2.Determinación delpoderrotatoriototal(PoS)(véaseelpunto7.1)
Pesar, con precisión de 1 mg, 2,5 g de la muestra triturada e introdu-
cirlos en un matraz aforado de 100 ml. Añadir 25 ml de ácido
clorhídrico (punto 3.2), agitar para obtener un buen reparto de la toma
de muestras y añadir de nuevo 25 ml de ácido clorhídrico (punto 3.2).
Sumergir el matraz en un baño de agua hirviendo y, durante los tres
primeros minutos siguientes, agitar enérgicamente y con regularidad
para evitar la formación de aglomerados. La cantidad de agua del baño
debe ser suficiente para permitir mantener el baño en ebullición cuando
el matraz esté sumergido en él. Éste no podrá ser retirado del baño a lo
largo de la agitación. Después de quince minutos exactamente, retirar el
matraz del baño, añadir a ello 30 ml de agua fría y refrigerar inmediata-
mente hasta 20 ºC.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 4
▼M5
▼M5
Añadir a continuación 5 ml de solución de Carrez II (punto 3.4) y agitar
de nuevo durante un minuto. Completar el volumen con agua, homoge-
neizar y filtrar: Si el filtrado no está perfectamente límpido (lo que es
poco frecuente), volver a comenzar el análisis empleando una cantidad
mayor de las soluciones de Carrez I y II, por ejemplo 10 ml.
Medir a continuación el poder rotatorio de la solución en un tubo de
200 mm mediante un polarímetro o un sacarímetro.
5.3.Determinación del poder rotatorio (P ′oS ′) de las sustancias solubles
enel etanolal40%
Pesar, con precisión de 1 mg, 5 g de la muestra, introducirlos en un
matraz aforado de 100 ml y añadir 8 ml aproximadamente de etanol
(punto 3.5) (véase el punto 7.2). Dejar el matraz en reposo durante 1
hora a temperatura ambiente; a lo largo de este lapso de tiempo,
proceder 6 veces a una agitación enérgica de forma que la toma de
muestra esté bien mezclada con el etanol. Llevar después el volumen
con el etanol (punto 3.5), homogeneizar y filtrar. Introducir mediante la
pipeta 50 ml del filtrado (= 2,5 g de la muestra) en un erlenmeyer de
250 ml, añadir 2,1 ml de ácido clorhídrico (punto 3.1) y agitar enérgica-
mente. Ajustar un refrigerante a reflujo al erlenmeyer y sumergirlo en
un baño de agua hirviendo. Después del baño, retirar el erlenmeyer del
baño, transvasar su contenido a un matraz aforado de 100 ml limpiando
con un poco de agua fría, y refrigerar hasta 20 ºC. Defecar a continua-
ción con ayuda de las soluciones de Carrez I (punto 3.3) y II (punto
3.4), completar al volumen con agua, homogeneizar, filtrar y medir el
poder rotatorio como se indica en los párrafos segundo y tercero del
punto 5.2.
6.Cálculodelosresultados
El contenido en almidón por ciento de la muestra se calcula de la manera
siguiente:
6.1.Mediciones efectuadas conpolarímetro
porcentaje de almid´ on¼2000 P - P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = poder rotatorio total en grados de arco
P′= poder rotatorio en grados de arco dado para las sustancias
solubles en el etanol al 40 %
α½/C13820º
D= Poder rotatorio específico del almidón puro. Los valores
convencionalmente admitidos para dicho factor son los
siguientes:
+ 185,9º: almidón de arroz
+ 185,4º: almidón de patata+ 184,6º: almidón de maíz
+ 182,7º: almidón de trigo
+ 181,5º: almidón de cebada
+ 181,3º: almidón de avena
+ 184,0º: otros tipos de almidón, así como mezclas de almi-
dones de los piensos completos compuestos.
6.2.Mediciones efectuadas mediante sacarímetro
porcentaje de almid´ on¼2000
α½/C13820º
D/C22N/C20;665 ðÞ /C2 S-S0ðÞ
100-26;6N/C2S-S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = poder rotatorio total en grados sacarimétricos
S′= poder rotatorio en grados sacarimétricos dado por las sustan-
cias solubles en el etanol al 40 %.
N = peso en g de sacarosa en 100 ml de agua dando bajo un
espesor de 200 mm un poder rotatorio de 100º sacarimétricos.
16,29 g para los sacarímetros franceses
26,00 g para los sacarímetros alemanes
20,00 g para los sacarímetros mixtos
α½/C13820º
D= poder rotatorio específico del almidón puro (véase el puno
6.1).1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 5
▼M5
6.3.Repetibilidad
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efec-
tuadas sobre una misma muestra no debe exceder del 0,4 en valor
absoluto para los contenidos en almidón inferiores al 40 % 1,1 % en
valor relativo para los contenidos en almidón iguales o superiores al
40 %.
7.Observaciones
7.1. Cuando la muestra contenga más del 6 % de los carbonatos, calculados
en carbonato de calcio, éstos deben ser destruidos mediante un trata-
miento con ayuda de una cantidad exactamente apropiada del ácido
sulfúrico diluido, antes de la determinación del poder rotatorio total.
7.2. En el caso de los productos de elevado contenido en lactosa, tales como
el polvo de suero láctico o de leche descremada, proceder como sigue
según la adición de los 80 ml de etanol (punto 3.5). Ajustar al matraz
un refrigerante de reflujo, sumergir el matraz durante treinta minutos
en un baño de agua a 50 ºC. Dejar a continuación refrigerar y seguir
con el análisis tal como se indica en el punto 5.3.
7.3. En el caso de que las siguientes materias primas estén presentes en una
cantidad importante en los alimentos para animales, ocasionarán interfe-
rencias al determinar el contenido de almidón mediante el método
polarimétrico y por lo tanto pueden obtenerse resultados incorrectos:
— productos derivados de la remolacha (azucarera) como la pulpa de
remolacha (azucarera), las melazas de remolacha (azucarera), lapulpa de remolacha (azucarera) melazada, las vinazas de remolacha
(azucarera), y el azúcar (de remolacha),
— pulpa de cítricos,
— semillas de lino, torta de presión de lino, harina de extracción de
lino,
— semillas de colza, torta de presión de colza, harina de extracción de
colza, cáscaras de colza,
— semillas de girasol, harina de extracción de semilla de girasol, harina
de extracción de girasol parcialmente decorticado,
— torta de presión de copra, harina de extracción de copra,
— pulpa de patata,
— levadura deshidratada,
— productos ricos en inulina [por ejemplo, plaquitas y harina de agua-
turma (pataca)],
— chicharrones.
2.DETERMINACIÓNDELAPROTEÍNABRUTA
1.Objetivoycampodeaplicación
Este método permite determinar el contenido en proteínas brutas de los
piensos a partir del contenido en nitrógeno, determinado según el método de
Kjeldahl.
2.Principio
La muestra se mineraliza con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador.
La solución ácida se alcaliniza mediante una solución de hidróxido de sodio.
El amoníaco es destilado y recogido en una cantidad medida de ácido sulfú-
rico, cuyo exceso es titulado por una solución valorada de hidróxido de
sodio.
3.Reactivos
3.1. Sulfato potástico3.2. Catalizador: óxido cúprico CuO o sulfato cúprico cristalizado pentalhi-
dratado CuSO
4.5H2O
3.3. Zinc granulado3.4. Ácido sulfúrico ρ
20= 1,84 g/ml
3.5. Ácido sulfúrico C(½ H2SO4) = 0,5 mol/l
3.6. Ácido sulfúrico C(½ H2SO4) = 0,1 mol/l1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 6
▼M3
▼M3
3.7. Indicador de rojo de metilo: disolver 300 mg de rojo de metilo en
100 ml de etanol, σ= 95-96 % (v/v)
3.8. Solución de hidróxido de sodio (puede utilizarse el grado técnico) β
= 40 g/100 ml (m/v: 40 %)
3.9. Solución de hidróxido de sodio c = 0,25 mol/l
3.10. Solución de hidróxido de sodio c = 0,1 mol/l
3.11. Piedra pómez en gránulos, lavada con ácido clorhídrico y calcinada
3.12. Acetanilida (punto de fusión = 114 ºC, N = 10,36 %)
3.13. Sacarosa (libre de compuestos nitrogenados)
4.Equipo
Aparatos adecuados para mineralizar, destilar y titular según el procedi-
miento de Kjeldahl
5.Métodooperatorio
5.1.Mineralización
Pesar 1 g de muestra con una precisión de 0,001 g y transferir dicha
cantidad al matraz del apartado mineralizador. Añadir 15 g de sulfato
de potasio (3.1), una cantidad apropiada de catalizador (3.2) (0,3 a 0,4 g
de óxido cúprico o 0,9 a 1,2 g de sulfato cúprico pentahidratado), 25 ml
de ácido sulfúrico (3.4) y algunos gránulos de piedra pómez (3.11).
Homogeneizar. Calentar el matraz primero con moderación y agitando
de vez en cuando, si es necesario, hasta la carbonización de la masa y
la desaparición de la espuma; después, más intensamente hasta la ebulli-
ción regular del líquido. El calentamiento es adecuado cuando el ácido
en ebullición se condensa en las paredes del matraz. Evitar el recalenta-
miento de las paredes y la adhesión sobre ellas de partículas orgánicas.
Cuando la solución se vuelva transparente de color verde claro,
mantener la ebullición durante otras dos horas. Después dejar enfriar.
5.2.Destilación
Añadir con precaución agua suficiente para disolver completamente los
sulfatos. Dejar enfriar y añadir a continuación algunos gránulos de zinc
(3.3).
Introducir en el matraz colector del apartado destilador 25 ml, medidos
con exactitud, de ácido sulfúrico (3.5 o 3.6) según el contenido supuesto
de nitrógeno y algunas gotas del indicador de rojo de metilo (3.7).
Conectar el matraz de mineralización al refrigerante del aparato desti-
lador y sumergir la extremidad del refrigerante en el líquido del matraz
colector a una profundidad mínima de 1 cm (véase la observación 8.3).
Introducir lentamente en el matraz de digestión 100 ml de solución de
hidróxido de sodio (3.8) si pérdida de amoníaco (8.1).
Calentar el matraz hasta la destilación completa del amoníaco.
5.3.Titulación
Titular el exceso de ácido sulfúrico del frasco colector mediante la solu-
ción de hidróxido de sodio (3.9 o 3.10), según la concentración del
ácido sulfúrico utilizado, hasta alcanzar el punto final.
5.4.Pruebaenblanco
Para confirmar que los reactivos están exentos de nitrógeno, efectuar
una prueba en blanco (mineralización, destilación y titulación) utili-
zando 1 g de sacarosa (3.13) en lugar de la muestra.
6.Cálculodelosresultados
El contenido en proteína bruta se calcula con arreglo a la siguiente fórmula:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
Donde:
Vo= volumen (ml) de NaOH (3.9 o 3.10) utilizado en la prueba en blanco1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 7
▼M3
V1= volumen (ml) de NaOH (3.9 o 3.10) utilizados en la titulación de la
muestra
c = concentración (mol/l) de hidróxido de sodio (3.9 o 3.10)m = masa (g) de la muestra
7.Comprobacióndelmétodo
7.1.Repetibilidad
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efec-
tuadas con una misma muestra no debe sobrepasar:
— 0,2 % en valor absoluto, para los contenidos en proteína bruta
inferiores al 20 %,
— 1,0 % en valor relativo sobre el valor más alto, para los conte-
nidos en proteína entre el 20 % y el 40 %,
— 0,4 % en valor absoluto, para los contenidos superiores al 40 %.
7.2.Exactitud
Efectuar el análisis (mineralización, destilación y titulación) en 1,5 a
2,0 g de acetanilida (3.12) en presencia de 1 g de sacarosa (3.13); 1 g
de acetanilida consume 14,80 ml de ácido sulfúrico (3.5). La recupera-
ción debe ser del 99 %, como mínimo.
8.Observaciones
8.1. El aparato puede ser manual, semiautomático o automático. Si el aparato
exige un trasvase entre mineralización y destilación, dicho trasvase debe
realizarse sin pérdida. Si el matraz del aparato de destilación no está
provisto de un embudo con llave, añadir la solución de hidróxido de
sodio inmediatamente antes de conectar el matraz al refrigerante,
dejando deslizar el líquido lentamente por las paredes.
8.2. Si el producto de la mineralización se solidifica, empezar de nuevo la
determinación utilizando una cantidad de ácido sulfúrico (3.4) mayor
que la especificada más arriba.
8.3. Para los productos con un contenido bajo de nitrógeno, el volumen de
ácido sulfúrico (3.6) que ha de introducirse en el frasco colector podrá
reducirse, si fuera necesario, a 10 o 15 ml y completarse con agua hasta
25 ml.
3.DETERMINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS BRUTAS SOLUBLES POR
LAPEPSINAYELÁCIDOCLORHÍDRICO
1.Objetivoycampodeaplicación
El método permite determinar la fracción de las proteínas brutas solubili-
zadas por la pepsina y el ácido clorhídrico en unas condiciones
determinadas. Es aplicable a todos los alimentos.
2.Principio
La muestra se someterá a un tratamiento de 48 h a 40 ºC por una solución
clorhídrica de pepsina. La suspensión se filtra y el contenido en nitrógeno del
filtrado se determina según el método descrito para la determinación de las
proteinas brutas.
3.Reactivos
3.1. Ácido clorhídrico, d: 1,125
3.2. Ácido clorhídrico 0,075 N.
3.3. Pepsina a 2,0 v/mg; dicha actividad se define y debe controlarse según
el método objeto de la parte 4 del presente Anexo.
3.4. Solución recien preparada de aproximadamente 0,02 % (p/v) de pepsina
en el ácido clorhídrico (3.2); actividad: 400 V/l.
3.5. Emulsión de antiespuma (silicona por ejemplo).3.6. Todos los reactivos indicados en el punto 3 del método de determina-
ción de las proteínas brutas.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 8
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4.Equipo
4.1. Baño de agua o estufa de incubación, regulada a 40 ºC ± 1 ºC.
4.2. Aparatos de mineralizar y de destilar según Kjeldahl.
5.Métodooperatorio
5.1.Puestaensolución (v. observaciones 7.2)
Pesar, con precisión de 1 mg, 2 g de la muestra. Introducir la toma de
muestra en un matraz aforado de 500 ml y añadir 450 ml de solución
clorhídrica de pepsina (3.4) previamente llevada a 40 ºC. Agitar de
forma que se evite la formación de aglomerados. Comprobar que el pH
de la suspensión sea inferior a 1,7. Llevar el matraz en el baño de agua
o la estufa de incubación (4.1) y mantenerlo allí durante 48 h. Agitar
después 8, 24 y 32 h. Después de 48 h, añadir 15 ml de ácido clorhí-
drico (3.1), refrigerar hasta 20 ºC, completar el volumen con agua y
filtrar.
5.2.Mineralización
Tomar 250 ml del filtrado e introducirlos en el matraz del aparato de
destilar (4.2). Añadir los reactivos necesarios para la mineralización
como se indica en el método de determinación de las proteínas brutas,
en la segunda frase del punto 5.1.
Homogeneizar y calentar hasta ebullición. Si hay formación de espuma,
añadir algunas gotas de emulsión de antiespuma (3.5). Mantener una
ebullición viva hasta evaporación casi completa del agua. Eliminar los
últimos resíduos de agua con precaución, reduciendo la intensidad del
calentamiento. Cuando aparezca límpida e incolora la solución (verde
claro en presencia de catalizador a base de cobre), continuar la ebulli-
ción durante 1 h más. Dejar refrigerar a continuación.
5.3.Destilaciónytitulación
Proceder como se indica en el método de determinación de las proteínas
brutas, puntos 5.2 y 5.3.
5.4.Pruebaenblanco
Efectuar una prueba en blanco aplicando el método operatorio en falta
de muestra para analizar.
6.Cálculodelosresultados
Deducir el volumen de ácido sulfúrico consumido por la prueba en blanco
del consumido por la toma de muestra. 1 ml de ácido sulfúrico 0,1 N corres-
ponde a 1,4 mg de nitrógeno.
Multiplicar la cantidad de nitrógeno por el factor 6,25. Expresar el resultado
en porcentaje de la muestra.
Repetibilidad
La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones paralelas efec-
tuadas sobre una misma muestra no debe exceder de:
— 0,4 en valor absoluto, para los contenidos inferiores al 20 %;
— 2,0 %, en valor relativo, para los contenidos comprendidos entre el 20 y
el 40 %;
— 0,8, en valor absoluto, para los contenidos superiores al 40 %.
7.Observaciones
7.1. Los valores obtenidos por el presente método no tienen relación directa
con la digestibilidad en vivo.
7.2. Los productos cuyo contenido en materias grasas exceda del 10 % deben
ser previamente desgrasados por extracción del éter de petróleo (éb. 40-
60 ºC).1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 9
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4.DETERMINACIÓNDELAACTIVIDADDELAPEPSINA
1.Objetivoyámbitodeaplicación
El método permite controlar la actividad de la pepsina empleada para la
determinación de las proteínas brutas solubilizadas por la pepsina y el ácido
clorhídrico.
2.Principio
La hemoglobina se trata en las condiciones definidas por la pepsina en medio
clorhídrico. La fracción no hidrolizada de las proteínas y se precipita por el
ácido tricloracético. Al filtrado se le añade hidróxido de sodio y reactivo
según Folin-Ciocalteu. La densidad ofítica de esta solución se mide a
750 mm y la cantidad de tirosina que corresponda se lee sobre una curva de
muestreo.
Definición: La unidad de pepsina se define como la cantidad de dicha encima
que libera por minuto, en las condiciones del método, una cantidad de agru-
paciones hidroxianil cuya coloración por el reactivo según Folin-Ciocalteu
tiene una densidad óptica correspondiente a la de un mol de tirosina, en las
mismas condiciones.
3.Reactivos
3.1. Ácido clorhídrico 0,2 N.3.2. Ácido clorhídrico 0,06 N.3.3. Ácido clorhídrico 0,025 N.
3.4. Solución al 5 % (p/v) de ácido tricloracético.
3.5. Solución de hidróxido de sodio.3.6. Reactivo según Folin-Ciocalteu. Introducir 100 g de tungstato de sodio
(Na
2WO4.2H2O), 25 g de molibdato de sodio (Na2MO4.2H2O) y
700 ml de agua en un matraz de fondo redondo de 2 l de esmerilado
normalizado. Añadir 50 ml de ácido fosfórico (d: 1,71) y 100 ml de
ácido clorhídrico concentrado (d: 1,19), ajustar al matraz un refrigerante
de reflujo, calentar hasta ebullición y mantener la solución en ebullición
suave durante 10 h. Dejar refrigerar, separar el refrigerante de reflujo,
añadir 175 g de sulfato de litio (Li2SO4.2 H2O), 50 ml de agua y 1 ml
de bromo. Hacer hervir durante 15 minutos para eliminar el exceso de
bromo.
Dejar refrigerar, transvasar la solución en un matraz aforado de 1 l,
completar el volumen con agua, homogeneizar y filtrar. No puede
subsistir coloración verduzca. Antes de su empleo, diluir 1 volumen del
reactivo por dos volúmenes de agua.
3.7. Solución de hemoglobina: Pesar una cantidad de hemoglobina, sustrato
proteíco según Anson (2 g aproximadamente) correspondiente a 354 mg
de nitrógeno (1) e introducirla en un matraz de 200 ml de esmerilado
normalizado. Añadir algunos ml de ácido clorhídrico (3.2), conectar el
matraz a la bomba de vacío y agitar hasta disolución completa de hemo-
globina. Cortar el vacío y añadir agitando constantemente el ácido
clorhídrico (3.2) para completar a 100 ml. Preparar inmediatamente
antesdesuempleo .
3.8. Solución patrón de tirosina: Disolver 181,2 mg de tirosina en el ácido
clorhídrico (3.1) y completar a 1 l con el mismo ácido (solución madre).Tomar 20,0 ml y diluir a 100 ml mediante ácido clorhidrico (3.1) 1 ml
de dicha solución contiene 0,2 µmoles de tirosina.
4.Equipo
4.1. Baño de agua, regulado a 25 ºC ± 0,1 ºC por el ultratermostato.4.2. Espectofotómetro.4.3. Cronómetro, precisión: 1 segundo.4.4. pH-metro.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 10
(1) Determinar el contenido en nitrógeno mediante un semi-microkjeldahl (contenido
teórico: 17,7 % de nitrógeno).
▼B
5.Métodooperatorio
5.1.Preparacióndelasolución (v. observaciones 7.1)
Disolver 150 mg de pepsina en 100 ml de ácido clorhídrico (3.2). Tomar
mediante la pipeta 2 ml de la solución, introducirlos en un matraz
aforado de 50 ml y completar al volumen mediante ácido clorhídrico
(3.3). El pH, controlado por el pH metro, debe ser de 1,6 ± 0,1.
Sumergir el matraz en el baño de agua.
5.2.Hidrólisis
Introducir mediante la pipeta en un tubo de ensayo 5,0 ml de solución
de hemoglobina (3.7), llevar a 25 ºC en el baño de agua (4.1), añadir
1,0 ml de la solución de pepsina obtenida en 5.1 y mezclar con ayuda
de una varilla de cristal, espesada en una extremidad, mediante aproxi-
madamente 10 movimientos de vaivén. Mantener el tubo de ensayo en
el baño de agua a 25 ºC durante 10 minutos exactamente, contados
desde el momento de la adición de la solución de pepsina (la duración
y la temperatura deben ser perfectamente respetadas). Añadir a conti-
nuación 10,0 ml de solución de ácido tricloracético (3.4), previamente
llevada a 25 ºC, homogeneizar y filtrar sobre un filtro seco.
5.3.Desarrollodelacoloraciónymedición deladensidadóptica
Tomar mediante la pipeta 5,0 ml del fitrado, introducirlos en un erlen-
meyer de 50 ml, añadir 10,0 ml de solución de hidrócido de sodio (3.5)
y, agitando constantemente, 3,0 ml de reactivo diluido de Folin-
Ciocalteu (3.6). Tras 5 a 10 minutos, determinar la densidad óptica de
la solución al espectofotómetro de 750 mm en las cubetas de 1 cm de
espesor, en comparación con el agua.
5.4.Pruebaenblanco
Para cada determinación, proceder a una prueba en blanco tal como se
indica a continuación.
Introducir mediante la pipeta en un tubo de ensayo 5,0 ml de solución
de hemoglobina (3.7), llevar a 25 ºC en el baño de agua (4.1), añadir
10,0 ml de solución de ácido tricloracético (3.4) previamente llevado a
25 ºC, homogeneizar y añadir a continuación 1,0 ml de la solución de
pepsina obtenida en 5.1. Mezclar con la ayuda de una varilla de cristal
y mantener el tubo de ensayo 10 minutos exactamente en el baño de
agua (4.1) a 25 ºC. Homogeneizar y filtrar sobre un filtro seco. Conti-
nuar el método operativo tal como se indica en 5.3.
5.5.Curvadecalibrado
Introducir en los erlenmeyers de 50 ml volúmenes de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 y
5,0 ml de solución patrón de tirosina (3.8), correspondientes respectiva-
mente a unas cantidades de tirosina de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 y 1,0 µmoles.
Completar la serie mediante un testigo exento de tirosina. Llevar los
volúmenes a 5,0 ml con la ayuda de ácido clorhídrico (3.1). Añadir
10,0 ml de solución de hidróxido de sodio (3.5) y, agitando constante-
mente, 3,0 ml del reactivo diluido de Folin-Ciocalteu (3.6). Medir la
densidad óptica tal como se indica en la última frase del punto 5.3.
Trazar la curva de calibrado llevando las densidades ópticas en relación
con las cantidades de tirosina.
6.Cálculodelosresultados
Leer sobre la curva de calibrado la cantidad de tirosina, en µmol, correspon-
diente a la densidad óptica de la solución coloreada, corregida de la prueba
en blanco.
La actividad de la pepsina, en µmol de tirosina, por mg y por minuto, a 25 ºC,
está dada por la fórmula.
Unidades por mg V =mgðÞ ¼0;32 a
p
en la que:
a — cantidad de tirosina, en µmol, leída sobre la curva de calibrado;
b — peso en mg de la cantidad de pepsina añadida en 5.2.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 11
▼B
7.Observaciones
7.1. La cantidad de pepsina que haya de ponerse en solución debe ser esco-
gida de forma que se pueda obtener, cuando la medida fotométrica final,
una densidad óptica de 0,35 ± 0,035.
7.2. Dos unidades por mg obtenidas por el presente método corresponden a:
3,64 unidades millonésimas Anson/mg (µmol de tirosina/mg) min a
35,5 ºC).
5.DETERMINACIÓNDELGOSSIPOLLIBREYTOTAL
1.Objetivoycampodeaplicación
El método permite determinar el gossipol libre, el gossipol total y las subs-
tancias químicamente presentes en las semillas, harinas y tortas de algodón
así como en los alimentos compuestos que los contengan. El límite inferior
de la determinación es de 20 ppm.
2.Principio
El gossipol se extrae en presencia de 3-amino-l-propanol, ya sea mediante
una mezcla de iso-propanol y de hexano para la determinación del gossipol
libre, y sea por la dimetilformamida para la determinación del gossipol total.
El gossipol se transforma mediante anilina en gossipol-dianilina, cuya
densidad óptica se mide a 440 nm.
3.Reactivos
3.1. Mezcla isopropanol-lexano: mezclar 60 partes en volumen de isopro-
panol p.a. con 40 partes en volumen de lexano normal.
3.2. Disolvente A: Situar en un matraz aforado de 1 l, 500 ml aproximada-
mente de la mezcla de isopropanollexano (3.1), 2 ml de 3-amino-l-
propanol, 8 ml de ácido acético glacial y 50 ml de agua. Completar al
volumen mediante la mezcla de isopropanol-lexano (3.1). Dicho reactivo
es estable durante una semana.
3.3. Disolvente B: Situar mediante la pipeta en un matraz aforado de 100 ml,
2 ml de 3-amino-l-propanol y 10 ml de ácido acético glacial. Refrigerar
a la temperatura ambiente y completar al volumen mediante la N, N-
dimetilformamida. Dicho reactivo es estable durante una semana.
3.4. Anilina p.a.: si la densidad óptica de la prueba en blanco excede de
0,022destilar la anilina sobre polvo de cinc eliminando las fracciones
primera y última del 10 % destilado. Este reactivo en frasco tapado de
cristal pardo y en el refrigerador, se conserva varios meses.
3.5. Solución patrón A de gossipol: Colocar en un matraz aforado de 250 ml,
27,9 mg de aceite de gossipol. Disolver y completar al volumen por el
disolvente A (3.2). Introducir mediante la pipeta 50 ml de dicha solu-
ción en un matraz aforado de 250 ml y completar al volumen por el
disolvente A. La concentración en gossipol de dicha solución es de
0,02 mg/ml. Dejar reposar durante 1 h a la temperatura ambiente, antes
de su empleo.
3.6. Solución patrón B de gossipol: Colocar en un matraz aforado de 50 ml,
27,9 mg de acetato de gossipol. Disolver y completar al volumen
mediante el disolvente B (3.3). La concentración en gossipol de dicha
solución es de 0,5 mg/ml.
Conservados al resguardo de la luz las soluciones patrón A y B de gossipol
se mantienen estables durante 24 h.
4.Equipo
4.1. Mezclador (balancín): alrededor de 35 revoluciones por minuto.
4.2. Espectofotómetro.
5.Métodooperatorio
5.1.Tomademuestras
La toma de muestras en relación con el supuesto contenido en gossipol
de la muestra. Es preferible operar sobre una pequeña toma de muestras
y sobre una parte alícuota del filtrado relativamente importante, de
forma que se obtenga una cantidad de gossipol suficiente para efectuar
una medición fotométrica precisa. Para la determinación del gossipol
libre en las semillas, las harinas y la torta de algosón, la toma de mues-1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 12
▼B
tras no debe exceder de 1 g; para los piensos completos compuestos
podrá alcanzar los 5 g. Una parte alícuota de 10 ml de filtrado es conve-
niente en la mayoría de los casos; deberá contener de 50 a 100 µg de
gossipol. Para la determinación del gossipol total, la toma de muestras
podrá variar de 0,5 a 5 g con el fin de que una parte alícuota de 2 ml
de filtrado contenga de 40 a 200 µg de gossipol.
El análisis debe efectuarse a una temperatura ambiente cercana a los
20ºC.
5.2.Determinación delgossipollibre
Introducir la toma de muestras en un matraz de cuello esmerilado de
250 ml, cuyo fondo esté recubierto de cristal pulverizado. Añadir con
la pipeta 50 ml de disolvente A (3.2), tapar el matraz y mezclar durante
1 h en el balancín. Filtrar en seco y recoger el filtrado en un pequeño
matraz de cuello esmerilado. A lo largo de la filtración, recubrir el
embudo con un cristal de reloj. Introducir con la pipeta respectivamente
en dos matraces aforados de 25 ml (A y B) unas partes alícuotas idén-
ticas de filtrado que contengan de 50 a 100 µg de gossipol. Completar si
fuera necesario, el volumen a 10 ml con la ayuda del disolvente A (3.2).
Completar seguidamente al volumen el contenido del matraz (A)
mediante la mezcla isopropanol-hexano (3.1). Dicha solución se
empleará como solución de referencia para la medición de la solución
de la muestra.
Introducir con la pipeta 10 ml del disolvente A (3.2) respectivamente en
otros dos matraces aforados de 5 ml (C y D). Completar al volumen el
contenido del matraz (C) mediante la mezcla isopropanol-hexano (3.1).
Dicha solución se empleará como solución de referencia para la medi-
ción de la solución de la prueba en blanco.
Añadir 2 ml de anilina (3.4) respectivamente en los matraces (D) y (B).
Calentar durante 30 minutos sobre un baño de agua hirviendo para desa-
rrollar la coloración. Refrigerar a la temperatura ambiente, completar al
volumen mediante la mezcla isopropanol-hexano (3.1), homogeneizar y
dejar reposar durante 1 h.
Determinar mediante el espectómetro a 440 nm, en las cubetas de cristal
de 1 cm, la densidad óptica de la solución de la prueba en blanco (D) en
comparación con la solución de referencia (C) y la densidad óptica de la
solución de la muestra (B) en comparación con la solución de referencia
(A).
Sustraer la densidad óptica de la solución de prueba en blanco de la
solución de la muestra (= densidad óptica corregida). Calcular a partir
de dicho valor el contenido en gossipol libre tal como se indica en 6.
5.3.Determinación delgossipoltotal
Introducir una toma de muestras que contenga de 1 a 5 mg de gossipol
en un matraz aforado de 50 ml y añadir 10 ml de disolvente B (3.3).
Preparar simultáneamente una prueba en blanco introduciendo 10 ml de
disolvente B (3.3), en otro matraz aforado de 50 ml. Calentar ambos
matraces durante 30 minutos sobre un baño de agua hirviendo. Refri-
gerar a la temperatura ambiente y completar el contenido de cada
matraz al volumen por la mezcla isopropanol-hexano (3.1). Homoge-
neizar y dejar reposar durante 10 a 15 minutos, filtrar a continuación y
recoger los filtrados en matraces de cuello esmerilado.
Llevar mediante la pipeta 2 ml del filtrado de la muestra respectiva-
mente a dos matraces aforados de 25 ml y 2 ml del filtrado de la
prueba en blanco respectivamente a otros dos matraces de 25 ml. Tomar
un matraz de cada serie y completar los contenidos respectivos a 25 ml
mediante la mezcla isopropanol-hexano (3.1). Estas soluciones se
emplearán como soluciones de referencia.
Añadir 2 ml de anilina (3.4) respectivamente en los otros dos matraces.
Calentar durante 30 minutos sobre baño de agua hirviendo para desarro-
llar la coloración. Refrigerar a la temperatura ambiente, completar a
25 ml mediante la mezcla de isopropanol-hexano (3.1), homogeneizar y
dejar reposar durante 1 h.
Determinar la densidad óptica tal como se indica en 5.2 para el gossipol
libre. Calcular a partir de dicho valor el contenido en gossipol total
como se indica en 6.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 13
▼B
6.Cálculodelosresultados
El cálculo de los resultados puede hacerse ya sea a partir de la densidad
óptica específica (6.1), ya sea refiriéndose a una curva de calibrado (6.2).
6.1.Apartirdeladensidadópticaespecífica
En las condiciones descritas, las densidades ópticas específicas son las
siguientes:
gossipol libre: E1%
1c m¼625
gossipol total: E1%
1c m¼600
El contenido en gossipol libre o total de la muestra está dado por la
siguiente fórmula:
gossipol % ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
en la que:
E = densidad óptica corregida, determinada como se indica en 5.2,
p= toma de muestras en g,
a — parte alícuota del filtrado en ml.
6.2.Apartirdeunacurvadecalibrado
6.2.1.Gossipollibre
Preparar 2 series de 5 matraces aforados de 25 ml. En cada serie,
introducir mediante la pipeta en los matraces unos volúmenes
respectivos de 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 y 10,0 ml de la solución
patrón A de gossipol (3.5). Completar cada serie mediante un
testigo constituído por un matraz aforado de 25 ml que contenga
únicamente 10 ml de disolvente A (3.2).
Completar a 25 ml el volumen de los matraces de la primera serie
(incluido el testigo) mediante la mezcla isopropanol-hexano (3.1)
(serie de referencia).
Añadir 2 ml de anilina (3.4) en cada matraz de la segunda serie
(incluyendo el testigo). Calentar durante 30 minutos sobre un
baño de agua hirviendo para desarrollar la coloración. Refrigerar
a la temperatura ambiente, completar al volumen mediante la
mezcla isopropanol-hexano (3.1), homogeneizar y dejar reposar
durante 1 h (serie patrón).
Determinar en las condiciones indicadas en 5.2 la densidad óptica
de las soluciones de la serie patrón en comparación con las solu-
ciones correspondientes de la serie de referencia. Trazar
gráficamente la curva de calibrado poniendo las densidades
ópticas en relación con las cantidades de gossipol (en µg).
6.2.2.Gossipoltotal
Preparar 6 matraces aforados de 50 ml. Introducir en el primer
matraz 10 ml de disolvente B (3.3) y en los otros, respectiva-
mente 2,0 — 4,0 — 6,0 — 8,0 y 10,0 ml de la solución etalón
B de gossipol (3.6). Completar el contenido de cada matraz de
10 ml con la ayuda del disolvente B (3.3). Calentar durante 30
minutos sobre un baño de agua hirviendo. Refrigerar a la tempe-
ratura ambiente, completar al volumen mediante la mezcla
isopropanol-hexano (3.1) y homogeneizar.
Introducir 2,0 ml de dichas soluciones respectivamente en dos
series de 6 matraces aforados de 25 ml. Completar a 25 ml el
contenido de los matraces de la primera serie mediante la mezcla
de isopropanol-hexano (3.1) (serie de referencia).
Añadir 2 ml de anilina (3.4) en cada matraz de la segunda serie.
Calentar durante 30 minutos sobre un baño de agua hirviendo.
Refrigerar a la temperatura ambiente, completar al volumen
mediante la mezcla isopropanol-hexano (3.1), homogeneizar y
dejar deposar durante 1 h (serie patrón).
Determinar en las condiciones indicadas en 5.2 la densidad óptica
de las soluciones de la serie patrón en comparación con las solu-1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 14
▼B
ciones correspondientes de la serie de referencia. Trazar gráfica-
mente la curva de calibrado poniendo las densidades ópticas en
relación con las cantidades de gossipol (en µg).
6.3.Repetibilidad
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efec-
tuadas sobre una misma muestra no debe exceder:
— del 15 %, en valor relativo, para los contenidos en gossipol infe-
riores a 500 ppm,
— de 75 ppm, en valor absoluto, para los contenidos comprendidos
entre 500 y 750 ppm,
— del 10 %, en valor relativo, para los contenidos superiores a
750 ppm.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 15
▼B
ANEXOII
4.DETERMINACIÓNDELATILOSINA
— por difusión sobre gelosa —
1.Objetoyámbitodeaplicación
El método permite determinar la tilosina en los alimentos, los concentrados y
las premezclas. El límite inferior de la determinación es de 2 ppm.
2.Principio
La muestra se trata mediante una solución tampón de fosfato de pH 8,
previamente llevada a 80 ºC, y se la someterá a continuación a la extracción
por metanol. Previa centrifugación, el extracto se diluye y su actividad anti-
biótica se determina por la medición de la difusión de la tilosina en un medio
gelosificado inseminado con Sarcina lutea. La difusión está indicada por la
formación de zonas de inhibición en presencia del microorganismo. El
diámetro de dichas zonas es directamente proporcional al logaritmo de la
concentración del antibiótico.
3.Microorganismo:SarcinaluteaATCCno9341
3.1.Mantenimiento delacepa
Inocular Sarcina lutea sobre gelosa inclinada en tubo constituída por
medio de cultivo (4.1), ajustado a pH 7,0. Incubar durante una noche a
35 ºC aproximadamente. Conservar el cultivo en refrigerador y repicar
todos los meses sobre glucosa inclinada.
3.2.Preparacióndelasuspensióndegérmenes
Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa inclinada (3.1) de reciente
preparación, por 2 a 3 ml de suelo fisiológico (4.4). Inseminar con dicha
suspensión un frasco de Roux que contenga 250 ml del medio de cultivo
(4.1), ajustado a pH 7,0. Incubar durante 24 h a 35 ºC, recoger los
gérmenes con ayuda de 25 ml de suero fisiológico (4.4). Homogeneizar
y diluir dicha suspensión para obtener una transformación luminosa del
75 % aproximadamente a 65 mm.
Conservar en refrigerador, dicha suspensión es utilizable durante una
semana.
Mediante unos ensayos preliminares sobre placas con el medio de base
de la determinación (4.1), determinar la cantidad de inóculo que permita
obtener para las diferentes concentraciones de tilosina empleada en la
zonas de inhibición tan extendidas como sea posible y que además estén
claras. La inoculación del medio de cultivo se hace a 48-50 ºC.
4.Mediosdecultivoyreactivos
4.1.Mediodebasedeladeterminación (1)
Glucosa 1 g
Peptona tripsica 10 g
Extracto de carne 1,5 g
Extracto de levadura 3 gGelosa, según la calidad 10 a 20 g
Agua destilada ad 1 000 ml
Ajustar en el momento del empleo a pH 7,0 para el mantenimiento de la
cepa y la preparación de la suspensión de gérmenes y a pH 2,0 para la
determinación.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 16
(1) Cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismo
resultados puede ser utilizado.▼M4
▼B
▼B
4.2.Tampónfosfato,pH8
Fosfato monopotásico KH2PO4p.a. 0,523 g
Fosfato bipotásico K2HPO4p.a. 16,730 g
Agua destilada ad 1 000 ml
4.3.Tampónfosfato,pH7
Fosfato monopotásico KH2PO4p.a. 5,5 g
Fosfato bipotásico K2HPO4p.a. 13,6 g
Agua destilada ad 1 000 ml
4.4. Suero fisiológico estéril
4.5. Metanol puro4.6. Metanol al 10 % (v/v)4.7. Mezcla tampón fosfato (4.2.)/metanol puro: 60/40 en volumen.4.8. Substancia de calibrado: tilosina conocida.
5.Solucionesdecalibrado
Secar la substancia de calibrado (4.8) durante 3 h a 60 ºC en una estufa de
vacío (5 mm de mercurio). Pasar 10 a 50 mg en un matraz aforado, disol-
verlos en 5 ml de metanol (4.5) y diluir la solución mediante el tampón
fosfato, pH 7 (4.3) para obtener una concentración en tilosina-base de
1 000 µg/ml.
A partir de dicha solución-madre, preparar diluyendo mediante la mezcla
(4.7) una solución de calibrado de trabajo S
8que contenga 2 µg de tilosina-
base por ml.
Preparar a continuación por diluciones sucesivas (1 + ) con ayuda de la
mezcla (4.7), las concentraciones siguientes:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extracción
Tomar para los concentrados una toma de muestras de 10 g; para las
premezclas y los alimentos una toma de muestras de 20 g. Añadir 60 ml de
tampón fosfato, pH 8 (4.2), previamente llevado a 80 ºC, y homogeneizar
durante 2 minutos (electrodoméstico, Ultra-turrax, etc.)
Dejar reposar durante diez minutos, añadir 40 ml de metanol (4.5) y homo-
geneizar durante 5 minutos. Centrifugar, tomar una parte alícuota de extracto
y diluir mediante la solución (4.7) para obtener una concentración supuesta
en tilosina de 2 µg/ml (= U8). Preparar a continuación las concentraciones
U4,U2yU1por diluciones sucesivas (1 + 1) con ayuda de la solución (4.7).
Para los contenidos inferiores a 10 ppm, evaporar el extracto en seco en un
evaporador rotativo a 35 ºC y recoger el residuo mediante metanol al 40 %
(4.6).
7.Modalidadesdeladeterminación
7.1.Inoculación delmediodecultivo
Inocular a 48-50 ºC el medio de base de la determinación (4.1), ajustado
a pH 8,0, por la suspensión de gérmenes (3.2).
7.2.Preparacióndelascajas
La difusión sobre gelosa se efectúa en unas cajas con las 4 concentra-
ciones de la solución de calibrado (S8,S4,S2,S1) y las 4
concentraciones del extracto (U8,U4,U2,U1). Cada caja deberá recibir
necesariamente las 4 concentraciones de calibrado o del extracto.
Con tal fin, escoger las dimensiones de las cajas de tal forma que se
puedan practicar en el medio gelosificado al menos 8 unidades de 10 a1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 17
▼B
13 mm de diámetro. Calcular la cantidad del medio de cultivo inoculado
(7.1) que habrá de emplearse de forma que se pueda obtener un recubri-
miento uniforme de 2 mm aproximadamente de espesor. Es preferible
emplear como cajas placas de vidrio planas previstas de un anillo de
aluminio o de material plástico perfectamente plano de 200 mm de
diámetro y 20 mm de altura.
Introducir mediante la pipeta en las cavidades unas cantidades exacta-
mente medidas de solución de antibiótico comprendidas entre 0,10 y
0,15 ml, según el diámetro.
Para cada muestra, hacer al menos 4 repeticiones de difusión con cada
concentración, de forma que cada determinación sea objeto de una
evaluación de 32 zonas de inhibición.
7.3.Incubación
Incubar las cajas durante una noche a 35-37 ºC.
8.Evaluación
Medir el diámetro de las zonas de inhibición, de preferencia, por proyección.
Inscribir las medidas sobre papel semilogarítmico, llevando el logaritmo de
las concentraciones en relación con los diámetros de zonas de inhibición.
Trazar las rectas de la solución de calibrado y del extracto. A falta de inter-
ferencias, las dos rectas deberán ser paralelas.
El logaritmo de la actividad relativa está calculado por la siguiente fórmula:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Actividad real = actividad supuesta × actividad relativa.
9.Repetibilidad
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectudas
sobre la misma muestra no debe sobrepasar el 10 %, en valor relativo.
5.DETERMINACIÓNDELAVIRGINIAMICINA
— por difusión en gelosa —
1.Objetoyámbitodeaplicación
El método permite determinar la virginiamicina en los alimentos y en las
premezclas. El límite inferior de la determinación es de 2 mg/kg (2 ppm) (1).
2.Principio
Se somete la muestra a una extracción mediante una solución metanólica de
Tween 80. El extracto se decanta o centrifuga, y se diluye después. Su acti-
vidad antibiótica se determina por medición de la difusión de la
virginiamicina en un medio de gelosa, sembrado con Micrococcus luteus .
La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición del micro-
organismo. El diámetro de dichas zonas se considera directamente
proporcional al logaritmo de la concentración de antibiótico para la gama de
concentraciones utilizades.
3.Microorganismos:«Micrococcusluteus»ATCC9341(NCTC8340,NCIB
8553)
3.1. Mantenimiento de la cepa
Sembrar el medio de cultivo (4.1), en tubos inclinados, con Micrococcus
luteus. Incubar durante venticuatro horas a 30 ºC, conservar en frigorí-
fico a unos 4 ºC y renovar la siembra cada quince días.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 18
(1) 1 mg de virginiamicina equivale a 1 000 unidades «UK».▼M2
▼M2
3.2.Preparacióndelasuspensiónbacteriana (a)
Recoger los gérmenes en un tubo de gelosa (3.1), de preparación
reciente, con ayuda de 2 a 3 ml de solución de cloruro sódico (4.3).
Sembrar con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo (4.1) en un
matraz de Roux e incubar durante dieciocho a veinte horas a 30 ºC.
Recoger los gérmenes en 25 ml. de solución de cloruro sódico (4.3) y
homogeneizar.
Diluir la suspensión a1/10con ayuda de la solución de cloruro sódico
(4.3). La transmisión luminosa de la suspensión, medida a 650 nm bajo
un espesor de 1 cm por comparación con la solución de cloruro sódico
(4.3), debe ser de alrededor del 75 %. Esta suspensión puede conser-
varse una semana a unos 4 ºC.
4.Mediosdecultivoyreactivos
4.1.Mediodemantenimiento delacepaydebasedeladeterminación (b)
Peptona de carne 6,0 g
Triptona 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Glucosa 1,0 g
Gelosa 10,0 a 20,0 g
Agua 1 000 ml
pH 6,5 (tras esterilización)
4.2.Tampónfosfato,pH6
Hidrogenofosfato de potasio K2HPO42,0 g
Dihidrogenofosfato de potasio, KH2PO48,0 g
Agua hasta 1 000 ml
4.3. Solución a 0,8 % (p/v) de cloruro sódico: disolver en agua 8 g de
cloruro sódico, diluir hasta 1 000 ml y esterilizar.
4.4. Matanol.
4.5. Mezcla de tampón fosfato (4.2) y de metanol (4.4): 80/20 (v/v).
4.6. Solución en metanol al 0,5 % (p/v) de Tween 80: disolver 5 g de Tween
80 en metanol (4.4) y diluir hasta 1000 ml con metanol.
4.7. Sustancia de referencia: virginiamicina de actividad conocida.
5.Solucionesdereferencia
Disolver una cantidad pesada exactamente de la sustancia de referencia (4.7)
en el metanol (4.4) y diluir con metanol (4.4) para obtener una solución
madre a 1 000 µg de virginiamicina/ml. Conservada en un matraz tapado a
4 ºC, esta solución es estable durante 5 días.
Preparar, a partir de esta solución y mediante diluciones sucesivas con la
ayuda de la mezcla (4.5), las soluciones siguientes:
S81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Preparación delextractoydelassoluciones
6.1.Extracción
6.1.1.Productoscuyocontenidoenviginiamicinanoexcedede100mg/
kg
Pesar una cantidad de muestra de 50,0 g. Añadir 200 ml de solu-
ción (4.6), agitar durante 30 minutos y dejar luego sedimentar o
centrifugar. Recoger 20 ml de la solución sobrenadante y1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 19
(a) Pueden utilizarse otros métodos, siempre que esté demostrado que producen suspen-
siones bacterianas análogas.
(b) Puede utilizarse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé
los mismos resultados.
▼M2
evaporar hasta 5 ml en un evaporador rotatorio a una temperatura
que no exceda de 40 ºC. Disolver el residuo con ayuda de la
mezcla (4.5) para obtener una concentración supuesta de virginia-
micina de 1 µg/ml (= U8).
6.1.2.Productoscuyocontenidoenvirginiamicinaessuperiora100mg/
kg
Pesar una cantidad de muestra que no exceda de 10,0 g y
contenga de 1 a 50 mg de virginiamicina. Añadir 100 ml de solu-
ción (4.6), agitar durante 30 minutos, y dejar sedimentar luego o
centrifugar. Disolver la solución sobrenadante con ayuda de la
mezcla (4.5) para obtener una concentración de virginiamicina
de 1 µg/ml (= U8).
6.2.Solucionesdelextracto
Preparar, a partir de la solución U8y por diluciones sucesivas (1 + 1)
con ayuda de la mezcla (4.5), las soluciones U4(concentración supuesta:
0,5 µg/ml, U2(concentración supuesta: 0,25 µg/ml) y U1(concentración
supuesta: 0,125 µg/ml).
7.Modalidadesdeladeterminación
7.1.Inoculación delmediodecultivo
Sembrar a unos 50 ºC el medio de base de la determinación (4.1) con la
suspensión bacteriana (3.2). Mediante ensayos preliminares sobre placas
con el medio (4.1), determinar la cantidad de suspensión bacteriana que
permite obtener para las differentes concentraciones de virginiamicina
zonas de inhibición lo más amplias posibles sind dejar de ser nítidas.
7.2.Preparacióndelascajas
La difusión en gelosa se efectúa en cajas con las cuatro concentraciones
de la solución de referencia (S8,S4,S2,S1) y las cuatro concentraciones
del extracto (U8,U4,U2,U1). Cada caja debe recibir necesariamente las
cuatro concentraciones de la referencia y del extracto. A tal fin, hay que
elegir la dimensión de las cajas de forma que se puedan excaver en el
medio de gelosa por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de
diámetro, cuyos centros no disten menos de 30 mm. Pueden emplearse
como cajas placas de vidrio planas, coronadas por un anillo de aluminio
o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura.
Introducir en las cajas una cantidad del medio (4.1), sembrado tal como
se indica en 7.1, que permita obtener una capa de unos 2 mm de grosor
(60 ml para una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, excavar
las cavidades y depositar en ellas volúmenes exactamente medidos de
las soluciones de la referencia y del extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad
según el diámetro). Repetir por lo menos cuatro veces cada concentra-
ción, de forma que cada determinación comprenda la valoración de 32
zonas de inhibición.
7.3.Incubación
Incubar las cajas durante dieciséis a dieciocho horas a 30 ºC I 2 ± ºC.
8.Valoración
Medir el diámetro de las zonas de inhibición con un error no superior a
0,1 mm. Para cada concentración, registrar las medidas medias en papel
semilogarítmico, trasladando el logaritmo de las concentraciones en relación
con los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas más ajustadas
para la solución de referencia y para el extracto, por ejemplo, mediante el
procedimiento siguiente:
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución de
refrencia (SL) con ayuda de la fórmula:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más alto de la solución de refe-
rencia (SH) con ayuda de la fórmula:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
101972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 20
▼M2
Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto para el
nivel más bajo (UL) y el nivel más alto (UH) sustituyendo S1,S2,S4yS8en
las fórmulas anteriores por U1,U2,U4yU8.
Consignar los valores SL y SH en la misma gráfica. Al unir los dos puntos,
se obtiene la recta más ajustada para la solución de referencia. Sie se sigue el
mismo método para UL y UH, se obtiene la recta más ajustada para el
extracto.
Si no hubiere ninguna interferencia, las rectas se consideran paralelas cuando
(SH — SL) y (UH — UL) no difieren en más de un 10 % de su media.
Si las rectas no son paralelas, pueden eliminarse U1yS1,oU8yS8. Los
valores SL, SH, UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se
calculan entonces con ayuda de la fórmulas siguientes:
(a′)S L ¼5s1þ2s2/C0s4
6ó5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H ¼5s4þ2s2/C0s1
6ó5s8þ2s4/C0s2
6
y de fórmulas análogas para UL y UH. La utilización de esta alternativa
obliga a respetar los mismos criterios de paralelismo.
En el boletín de análisis debe mencionarse la obtención de un resultado
procedente de tres niveles.
Cuando las rectas se consideren paralelas, hay que calcular el logaritmo de la
actividad relativa (log A) mediante una de las fórmulas siguientes, según el
número de niveles (4 o 3) utilizados para la valoración del paralelismo.
Para 4 niveles:
(c) log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Para 3 niveles:
(d) log A ¼u1/C0u2/C0u4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4/C0s4/C0u1/C0s1
o
(d′) log A ¼u2/C0u4/C0u8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8/C0s8/C0u2/C0s2
Actividad del extracto de la muestra = actividad de la referencia correspon-
diente × A:
(U8=S8×A )
Si la actividad relativa no se encuentra en la gama de valores comprendidos
entre 0,5 y 2,0, ha de repetirse la determinación procediendo a los ajustes
apropiados de las concentraciones del extracto o, en su caso, de las solu-
ciones de referencia. Cuando actividad no pueda encuadrarse en la gama de
los valores exigidos, el resultado se considerará aproximado y así se hará
constar en el boletín de análisis.
Cuando las rectas no se consideren paralelas, se repetirá la determinación. Si
tampoco ahora se lograre el paralelismo, la determinación se considerará
insatisfactoria.
Expresar el resultado en miligramos de virginiamicina por kilogramo de
alimento.
9.Reproducibilidad
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas en la
misma muestra por el mismo analista no debe exceder de:
2 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos de virginiamicina inferiores a
10 mg/kg,
20 por 100 del resultado más alto, para los contenidos de 10 a 25 mg/kg,5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos de 25 a 50 mg/kg,
10 por 100 del resultado más alto, para los contenidos superiores a 50 mg/kg.1972L0199 — ES — 27.08.1999 — 005.001 — 21