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►B DIRECTIVA 98/57/CE DELCONSEJO
de 20 de julio de 1998
sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al
(DO L 235 de 21.8.1998, p. 1)
Rectificada por:
►C1Rectificación, DO L 218 de 18.8.1999, p. 30 (98/57)
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DIRECTIVA 98/57/CE DELCONSEJO
de 20 de julio de 1998
sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
EL CONSEJO DE LA UNIÓN EUROPEA,
VistoelTratadoconstitutivodelaComunidadEuropeay,enparticular,
su artículo 43,
Vista la propuesta de la Comisión(1),
Visto el dictamen del Parlamento Europeo(2),
Visto el dictamen del Comité Económico y Social(3),
Considerandoqueelorganismonocivo Ralstoniasolanacearum (Smith)
Yabuuchi et al. se denominaba anteriormente Pseudomonas solana-
cearum(Smith) Smith; que es probable que Ralstonia solanacearum
(Smith) Yabucchi etal.pase a ser la denominación generalmente acep-
tada de este organismo; que la presente Directiva debería tener encuenta esta novedad científica;
Considerando que la producción de patatas y tomates ocupa un lugar
importante en la agricultura de la Comunidad; que el rendimiento deestosproductossevecontinuamenteamenazadoporciertosorganismosnocivos;
Considerando que, con la protección de ambos cultivos contra esos
organismos, no sólo se mantendría la capacidad productiva sino queademás aumentaría la productividad agrícola;
ConsiderandoquelasmedidasdeprotecciónestablecidasporunEstado
miembro para impedir la introducción de organismos nocivos en suterritorio no pueden tener sino un efecto limitado si al mismo tiempotales organismos no se controlan metódicamente en toda la Comunidady si no se evita su propagación;
Considerandoqueunodelosorganismosnocivosqueatacanalapatata
yeltomatees Ralstoniasolanacearum (Smith)Yabuucchi etal.,agente
patógeno de la podredumbre parda de la patata y de la marchitezbacteriana de la planta de la patata y del tomate; que en algunas partesdelaComunidadsehandadobrotesdeenfermedadescausadasporesteagente patógeno y que todavía subsisten algunos focos de infecciónaislados;
Considerando que el cultivo de la patata y el tomate corre un grave
riesgo en toda la Comunidad si no se adoptan medidas eficaces enrelacióncondichoscultivosparalocalizareseorganismo,determinardequé foma se distribuye, prevenir su aparición y, en caso de que éstatenga lugar, impedir su propagación y controlarlo para su erradicación;
Considerandoque,paraalcanzareseobjetivo,esprecisotomarmedidas
concretas en la Comunidad; que, además, los Estados miembros debenpoder adoptar, en caso necesario, medidas complementarias o másexigentes siempre que con ellas no se obstaculice la circulación deambos productos dentro de la Comunidad, salvo en los casos previstosen la Directiva 77/93/CEE del Consejo, de 21 de diciembre de 1976,relativa a las medidas de protección contra la introducción en losEstados miembros de organismos nocivos para los vegetales oproductos vegetales(
4) que tales medidas deben ser notificadas a los
otros Estados miembros y a la Comisión;
(1) DO C124 de 21.4.1997, p. 12, y DO C108 de 7.4.1998, p. 85.
(2) DO C14 de 19.1.1998, p. 34.
(3) DO C206 de 7.7.1997, p. 57.
(4) DO L 26 de 31.1.1977, p. 20; Directiva cuya última modificación la
constituye la Directiva 98/2/CE de la Comisión (DO L 15 de 21.1.1998,p. 34).
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▼BConsiderando que las medidas deben tener en cuenta la necesidad de
efectuarcontrolesoficialessistemáticosquepermitanlocalizarelagentepatógeno; que tales controles deben incluir no sólo procedimientos deinspección sino también, en caso necesario, métodos de muestreo yanálisis, ya que en determinadas circunstancias ambientales es posiblequelasenfermedadessemantenganlatentesynoseapreciendurantelafase de crecimiento de la patata o durante el almacenamiento de lostubérculos de ésta; que la contaminación del cultivo en crecimiento noes el factor más importante sino el hecho de que el patógeno puedapropagarse por las aguas de superficie y ciertas solanáceas silvestresqueaparecenconfrecuenciaenloscultivosdepatatasytomates,conelconsiguiente riesgo de infección de los mismos si se utiliza para suriego agua contaminada; que el patógeno puede subsistir durante elinviernoenpatatasytomateras(decrecimientoespontáneo)yqueestasplantas pueden constituir una fuente de infección que se transmita deunatemporadaaotra;queelpatógenosepropagatambiénsilaspatatasentran en contacto con patatas infectadas o con equipos de plantación,cosechaymanipulaciónocontenedoresdetransporteyalmacenamientoquehayansidocontaminadospreviamenteporhaberestadoencontactocon patatas infectadas;
Considerando que la propagación del patógeno puede reducirse o
evitarsedesinfectandoesosmateriales;que,enelcasodelaspatatasdesiembra, cualquiera de esas fuentes de contaminación representa ungrave riesgo de propagación del patógeno; que tal riesgo lo planteatambién la infección latente de patatas de siembra y que esto puedeevitarse con el uso de patatas de siembra que se hayan producido en elmarco de un programa oficialmente aprobado que obligue a analizardichas patatas y a comprobar la inexistencia en ellas de la infección;
Considerandoqueelconocimientoactualdelabiologíayepidemiología
del organismo Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.en las
condiciones europeas es incompleto y puede preverse desde ahora lanecesidad de revisar dentro de varias temporadas las medidas aquíestablecidas; que también puede preverse la consecución de mejoras enlos procedimientos de análisis si se amplía la investigación, especial-mente sobre la sensibilidad y especificidad de dichos procedimientos,con el fin de seleccionar y normalizar aquellos métodos de análisis queaporten los mejores resultados;
Considerandoque,parafijarlospormenoresdeestasmedidasgenerales
así como de las más estrictas o complementarias que adopten losEstados miembros para impedir la introducción del agente patógeno ensu territorio, es deseable que aquéllos colaboren estrechamente con laComisión dentro del Comité fitosanitario permanente (denominado enlo sucessivo «el Comité»),
HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA:
Artículo 1
La presente Directiva regula las medidas que habrán de tomarse en los
Estadosmiembroscontraelorganismo Ralstoniasolanacearum (Smith)
Yabucchietal.,anteriormentedenominado Pseudomonassolanacearum
(Smith) Smith (denominado en lo sucesivo «el organismo») con el finde,enloquerespectaalasplantashuéspeddelorganismoindicadasenla sección I del anexo I (denominadas en lo sucesivo «el materialvegetal indicado»):
a) localizar el organismo y determinar su distribución;
b) impedir su aparición y propagación; y
c) en caso de que aparezca, evitar su propagación y controlarlo con
vistas a su erradicación.
Artículo 2
1. Los Estados miembros llevarán a cabo anualmente exámenes
oficiales sistemáticos para detectar la posible presencia del organismoenelmaterialvegetalindicadooriginariodesuterritorio.Conobjetodedeterminar otras posibles fuentes de contaminación existentes para el
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cultivo del material vegetal indicado, los Estados miembros llevarán acabounaevaluaciónderiesgoy,salvoquenosehayadetectadoriesgoalguno de propagación durante dicha evaluación, efectuarán en laszonasproductorasdedichomaterialexámenesoficialesorientadosespe-cíficamente a la detección del organismo en plantas distintas de esematerial, incluidas las solanáceas silvestres huésped, así como en lasaguas de superficie que se utilicen para regar o rociar tal material y enlosresiduoslíquidosvertidosporlasinstalacionesindustrialesdetrans-formación o de embalaje en las que se manipule el material indicado yque se utilicen para regar o rociar el material vegetal indicado. Laextensión de estos exámenes orientados se determinará en función delriesgo observado. Los Estados miembros podrán realizar tambiénexámenes oficiales destinados a la detección del organismo en otrosmateriales, como el medio de cultivo, el suelo y los residuos sólidosprocedentes de las instalaciones industriales de transformación o deembalaje.
2. Los exámenes oficiales previstos en el apartado 1 se efectuarán:
a) en el caso del material vegetal indicado, de acuerdo con las normas
establecidas en el punto 1 de la seccion II del anexo I; y,
b) enelcasodelasplantashuéspeddelorganismodistintasdelmaterial
vegetalindicadoyeneldelasaguas,incluidoslosresiduoslíquidos,aplicandométodosapropiadosy,cuandoproceda,tomandomuestrasysometiéndolasaanálisisdelaboratoriooficialesobajosupervisiónoficial;
c) cuando resulte apropiado, en el caso de otros materiales, utilizando
métodos adecuados.
Para la realización de esos exámenes, los pormenores de los procedi-
mientosdeinspecciónasícomoelnúmero,origenyclasificacióndelasmuestras y el calendario de su recogida serán decididos por los orga-nismos oficiales responsables contemplados en la Directiva 77/93/CEEbasándose en principios científicos y estadísticos sólidos y en labiología del organismo y teniendo en cuenta, según el Estado miembrodequesetrate,lossistemasconcretosqueseutilicenparalaproduccióndelmaterialvegetalindicadoy,ensucaso,deotrasplantashuéspeddelorganismo.
3. Losdetallesyresultadosdelosexámenesoficialesprevistosenel
apartado 1 serán notificados a los demás Estados miembros y a laComisióncadaaño,siguiendoatalefectolasdisposicionesdelpunto2de la sección II del anexo I. Estas notificaciones se presentarán a mástardar el 1 de junio salvo en el caso de las patatas utilizadas parasiembra en la propia explotación, que se presentarán a más tardar el 1de septiembre. Los detalles y resultados relativos a los cultivos sereferiránalaproduccióndelañoanterior.Elcontenidodeestasnotifica-ciones podrá presentarse al Comité.
4. Deberáaplicarseelprocedimientoestablecidoenelartículo16bis
de la Directiva 77/93/CEE en la adopción de:
— los métodos apropiados para los exámenes y análisis de laboratorio
previstos en la letra b) del párrafo primero del apartado 2.
5. El mismo procedimiento podrá aplicarse en la adopción de:
— losmétodosadecuadosparalosexámenesprevistosenlaletrac)del
párrafo primero del apartado 2;
— cualquier precisión de los procedimientos previstos en el párrafo
segundo del apartado 2 que sea necesaria para garantizar unosniveles de seguridad comparables entre los distintos Estados miem-bros.
Artículo 3
Los Estados miembros velarán por que los casos en que se sospeche o
se confirme la presencia del organismo en su territorio sean comuni-cados a sus propios organismos oficiales responsables.
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Artículo 4
1. En todos los casos de sospecha de brote, los organismos oficiales
responsables del Estado o Estados miembros afectados velarán por larealizacióndeanálisisdelaboratoriooficialesobajosupervisiónoficialen los que se aplique, para el material vegetal indicado, el métodopertinente establecido en el anexo II y en las condiciones determinadasen el punto 1 del anexo III o, en todos los demás casos, cualquier otrométodo aprobado oficialmente que permita confirmar o despejar lasospecha en cuestión. En caso de confirmación, serán de aplicación losrequisitos dispuestos en el punto 2 del anexo III.
2. Enesperadelaconfirmaciónodisipacióndelasospechaalaque
se refiere el apartado 1, en todos los casos en que:
i) se hayan observado síntomas de las enfermedades causadas por el
organismo y se hayan obtenido resultados positivos en la prueba opruebas de detección rápida que se contemplan en el punto 1 de lasección I y en el punto 1 de la sección II del anexo II; o
ii) se haya obtenido un resultado positivo en la prueba o pruebas de
deteccióncontempladasenelpunto2delasecciónIyenlasecciónIII del anexo II,
los organismos oficiales responsables de los Estados miembros, en loque respecta a la producción propia:
a) prohibirán la circulación de las plantas y tubérculos de todos los
cultivos, lotes o partidas de los que se hayan tomado las muestras,salvoquetalcirculacióntengalugarbajosucontrolysiemprequesehayacomprobadoquenoexisteningúnriesgoidentificabledepropa-gación del organismo;
b) tomaránlasmedidasnecesariasparadescubrirelorigendelpresunto
brote;
c) establecerán, en lo que respecta especialmente a la producción del
material vegetal indicado y al movimiento de lotes de patata desiembradistintosdelosmencionadosenlaletraa),producidosenellugardeproduccióndelquesehayanobtenidolasmuestrasmencio-nadas en la letra a), medidas preventivas complementarias que,basándose en el nivel de riesgo estimado, sean adecuadas paraprevenir toda propagación del organismo.
3. En los casos de sospecha de brote en que exista un riesgo de
contaminacióndelmaterialvegetalindicadoodelasaguasdesuperficieque procedan o se dirijan a otro u otros Estados miembros, el Estadomiembro en el que se haya observado el presunto brote informaráinmediatamenteaeseoesosEstadosmiembrosdelosdetallesdedichobrote y del nivel de riesgo identificado, y dichos Estados miembroscooperarán en consecuencia. Los Estados miembros a los que así seinforme aplicarán medidas preventivas acordes con lo dispuesto en laletra c) del apartad o 2 y tomarán cualquier otra medida que resulte
adecuada de conformidad con lo dispuesto en los apartados 1 y 2.
4. Seaplicaráelprocedimientoestablecidoenelartículo16bisdela
Directiva 77/93/CEE en la adopción de:
— las medidas contempladas en la letra c) del apartado 2.
Artículo 5
1. Si la presencia del organismo en una muestra tomada en cumpli-
mientodelapresenteDirectivafuereconfirmadaporanálisisdelabora-torio oficiales o bajo supervisión oficial en los que se utilice, para elmaterial vegetal indicado, el método establecido en el anexo II o, paratodoslosdemáscasos,cualquierotrométodooficialmenteaprobado,losorganismos oficiales responsables del Estado miembro interesado,basándose a tal efecto en principios científicos sólidos, en la biologíadelorganismoyenlossistemasconcretosdeproducción,comercializa-ción y transformación que se utilicen en dicho Estado para las plantashuésped del organismo, adoptarán las siguientes medidas:
a) en el caso del material vegetal indicado:
i) emprenderán una investigación para determinar el alcance y la
fuenteofuentesprimariasdelacontaminación,conarregloalasdisposiciones del anexo IV y efectuando nuevos análisis de
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conformidad con el apartado 1 del artículo 4 como mínimo en
todas las existencias de patata de siembra relacionadas clónica-mente;
ii) declararán contaminados el material vegetal indicado, la partida
o el lote de los que se haya tomado la muestra, así como lamaquinaria,vehículo,nave,almacénounidadesdeésteycuales-quieraotrosobjetos,incluidoelmaterialdeembalaje,quehayanestadoencontactoconelmaterialvegetalindicadoalqueperte-nezca la muestra tomada; asimismo, declararán contaminados,ensucaso,elcampoocampos,launidadounidadesdeproduc-cióndecultivosprotegidosyellugarolugaresdeproducciónenlos que se haya cosechado el material vegetal indicado y de losque proceda la muestra; además, en el caso de las muestrastomadas durante la fase de cultivo, declararán contaminados elcampo o campos, el lugar o lugares de producción y, si proce-diere,launidadounidadesdeproduccióndecultivosprotegidosde los que se haya tomado la muestra;
iii) determinarán, con arreglo a las disposiciones del punto 1 del
anexo V, el alcance de la contaminación que probablemente sehaya producido por contactos anteriores o posteriores a lacosecha, por nexos en la producción, riego o rociamiento o porrelaciones clonales con la contaminación declarada; y
iv) delimitarán una zona en función de tres factores: la declaración
de contaminación contemplada en el inciso ii) anterior, elalcance de la contaminación probable que se determine en elmarco del inciso iii) anterior y la posible propagación del orga-nismo, con arreglo a las disposiciones del inciso i) del punto 2del anexo V.
b) en el caso de los cultivos de plantas huésped distintas del material
mencionado en la letra a) en los que se haya identificado un riesgopara la producción del material vegetal indicado:
i) emprenderánunainvestigacióndeacuerdoconlodispuestoenel
inciso i) de la letra a);
ii) declararán contaminadas las plantas huésped del organismo de
las que se haya tomado la muestra; y
iii) con respecto a la producción del material vegetal indicado,
determinarán el alcance de la contaminación probable y delimi-tarán una zona de conformidad con los incisos iii) y iv) de laletra a), respectivamente.
c) en el caso de las aguas de superficie (incluidos los vertidos de
residuos líquidos procedentes de instalaciones industriales de trans-formación o envasado en las que se manipule el material vegetalindicado)yeneldelassolanáceassilvestreshuéspeddelorganismoasociadas en las que, por causa del riego, rociamiento o anegacióncon dichas aguas, se haya identificado un riesgo para la produccióndel material vegetal indicado:
i) emprenderán una investigación para determinar el alcance de la
contaminación, realizando en los momentos oportunos unexamen oficial de muestras de las aguas de superficie y, en sucaso, de las solanáceas silvestres huésped del organismo;
ii) procederán,enlamedidaqueseapertinenteysobrelabasedela
investigación mencionada en el inciso i), a declarar contami-nadas las aguas de superficie de las que se hayan tomado lamuestra o muestras; y,
iii) determinarán el alcance de la contaminación probable y delimi-
tarán una zona en función de la declaración de contaminacióncontempladaenelincisoii)anteriorydelaposiblepropagacióndel organismo, teniendo en cuenta las disposiciones del punto 1y del inciso ii) del punto 2 del anexo V.
2. Deconformidadconlasdisposicionesdelpunto3delanexoV,los
Estados miembros notificarán inmediatamente a los otros Estadosmiembros y a la Comisión cualquier caso de contaminación declaradaen virtud del inciso ii) de la letra a) y del inciso ii) de la letra c) delapartado 1, así como los datos relativos a la zona que se haya delimi-tadoconarregloalincisoiv)delaletraa)delapartado1y,ensucaso,al inciso iii) de la letra c) de ese mismo apartado. Los detalles de la
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notificación con arreglo al presente párrafo podrán ser presentados al
Comité.
Los Estados miembros presentarán al mismo tiempo a la Comisión la
notificacióncomplementariaprevistaenelapartado4delanexoV.Losdetalles de la notificación con arreglo al presente párrafo podrán serpresentados al Comité.
3. Como resultado de la notificación dispuesta en el apartad o2yd e
los datos en ella contenidos, los Estados miembros afectados empren-derán una investigación de acuerdo con el inciso i) de la letra a) delapartado 1 y, en su caso, con el inciso i) de la letra c) del mismoapartado, y tomarán las medidas complementarias que sean adecuadasde conformidad con los apartados 1 y 2.
Artículo 6
1. Los Estados miembros prohibirán la plantación del material
vegetalindicadoquesehayadeclaradocontaminadoenvirtuddelincisoii) de la letra a) del apartado 1 del artículo 5 y ordenarán que, bajo elcontrol y aprobación de sus organismos oficiales responsables, dichomaterial sea sometido a una de las disposiciones del punto 1 del anexoVI con el fin de que pueda establecerse que no existe ningún riesgoidentificable de propagación del organismo.
2. Los Estados miembros prohibirán la plantación del material
vegetal indicado que, en virtud del inciso iii) de la letra a) y del incisoiii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 5, se haya consideradoprobablemente contaminado, incluido el material vegetal indicadorespectodelquesehayadetectadolaexistenciadealgúnriesgo,produ-cidoenlugaresdeproducciónqueconarregloalincisoiii)delaletraa)del apartado 1 del artículo 5 se hayan considerado probablementecontaminados, y ordenarán que, bajo el control de sus organismosoficialesresponsables,dichomaterialsedestineaunusoadecuadooseelimine de acuerdo con el punto 2 del anexo VI a fin de que puedaestablecerse que no existe ningún riesgo identificable de propagacióndel organismo.
3. Los Estados miembros ordenarán que toda maquinaria, vehículo,
nave,almacénounidadesdeéstosycualesquieraotrosobjetos,incluidoelmaterialdeembalaje,quesehayandeclaradocontaminadosenvirtuddel inciso ii) de la letra a) y del inciso iii) de la letra c) del apartado 1del artículo 5 o que se hayan considerado probablemente contaminadosen virtud del inciso iii) de la letra a) del apartado 1 del mismo artículose destruyan o se descontaminen aplicando métodos apropiados deconformidad con el punto 3 del anexo VI. Tras su descontaminación,todos estos objetos dejarán de considerarse contaminados.
4. Sin perjuicio de las medidas que se ejecuten en virtud de los
apartados 1,2y3 ,l o s Estados miembros ordenarán que en la zona
delimitadaconarregloalosincisosiv)delaletraa)yiii)delaletrac)del apartado 1 del artículo 5 se apliquen una serie de medidas acordescon lo dispuesto en los puntos 4.1 y 4.2 del anexo VI. Cada año senotificarándetallesdeestasmedidasalosdemásEstadosmiembrosyalaComisión.LosdetallesdeestanotificaciónpodránserpresentadosalComité.
Artículo 7
1. Los Estados miembros dispondrán que las patatas de siembra
deberáncumplirlosrequisitosdelaDirectiva77/93/CEEyprocederenlínea directa de patatas que, habiéndose obtenido en el marco de unprograma oficialmente aprobado, hayan dado resultados negativos encuanto a la presencia del organismo en análisis oficiales u oficialmentesupervisados en los que se haya utilizado el método pertinente estable-cido en el anexo II.
Dichos análisis serán efectuados por un Estado miembro:
a) en los casos en que se haya confirmado la presencia del organismo
en su producción propia de patatas de siembra,
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i) analizandoelmaterialpropagadoanteriormente,incluidalaselec-
ción clonal inicial y analizando sistemáticamente los clones depatatas de siembra de base, o
ii) en los casos en que se haya demostrado que no hay relación
clonal,analizandotodoslosclonesdepatatasdesiembradebaseo el material propagado anteriormente, incluida la selecciónclonal inicial, y
b) en los demás casos, bien en cada una de las plantas de la selección
clonal inicial, bien en muestras representativas de las patatas desiembra de base o del material propagado anteriormente.
2. Deconformidadconelprocedimientoestablecidoenelartículo16
bisde la Directiva 77/93/CEE podrán adoptarse las siguientes disposi-
ciones:
— las normas de desarrollo de la letra a) del párrafo segundo del
apartado 1; y
— las disposiciones aplicables a las muestras representativas a las que
se refiere la letra b) del párrafo segundo del apartado 1.
Artículo 8
Los Estados miembros prohibirán la conservación y manipulación del
organismo.
Artículo 9
Sin perjuicio de las disposiciones de la Directiva 77/93/CEE, los
Estados miembros podrán autorizar excepciones a lo dispuesto en losartículos6y8d el apresente Directiva de conformidad con las normas
establecidas en la Directiva 95/44/CE para la realización de pruebas einvestigacionescientíficasodeestudiosenmateriadeseleccionesvarie-tales(
1).
Artículo 10
LosEstadosmiembrospodránadoptar,respectoasuproducciónpropia,
las medidas complementarias o más estrictas que sean necesarias paracombatir el organismo o impedir su propagación, siempre que talesmedidas se ajusten a las disposiciones de la Directiva 77/93/CEE.
LosdatosdeestasmedidasdeberánsernotificadosalosdemásEstados
miembrosyal aComisión. El contenido de esta notificación podrá ser
presentado al Comité.
Artículo 11
Las modificaciones que a la vista de la evolución de los conocimientos
científicosotécnicosseaprecisointroducirenlosanexosdelapresenteDirectivaseadoptarándeconformidadconelprocedimientoestablecidoen el artículo 16 bisde la Directiva 77/93/CEE. En el caso de los
métodos establecidos en el anexo II y de las medidas dispuestas en lospuntos 4.1 y 4.2 del anexo VI, la Comisión elaborará un informe en elque se analizarán tales métodos y medidas sobre la base de la expe-riencia adquirida, y este informe se presentará al Comité antes del 1 deenero de 2002.
Artículo 12
1. LosEstadosmiembrospondránenvigorlasdisposicioneslegales,
reglamentarias y administrativas necesarias para dar cumplimiento a loestablecidoenlapresenteDirectivaconefectosal21deagostode1999.Informarán de ello inmediatamente a la Comisión.
Cuando los Estados miembros adopten dichas medidas, éstas harán
referencia a la presente Directiva o irán acompañadas de dicha refe-
(1) DO L 184 de 3.8.1995, p. 34. Directiva cuya última modificación la
constituye la Directiva de la Comisión (DO L 204 de 31.7.1997, p. 43).
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renciaensupublicaciónoficial.LosEstadosmiembrosestableceránlasmodalidades de la mencionada referencia.
2. Los Estados miembros comunicarán de inmediato a la Comisión
las principales disposiciones de Derecho interno que adopten en elámbito regulado por la presente Directiva. La Comisión informará deello a los demás Estados miembros.
Artículo 13
La presente Directiva entrará en vigor el día de su publicación en el
Diario Oficial de las Comunidades Europeas .
Artículo 14
Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros.
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ANEXOI
SECCIÓN I
Listadeplantasquepuedenserhuéspedde Ralstonia solanacearum (Smith)
Yabuuchi et al. a las que se refiere el artículo 1
Plantas(incluidoslostubérculos),salvolassemillasverdaderas,
deSolanumtuberosumL.Patata
Plantas,salvolassemillasylosfrutos,deLycopersiconlycoper-
sicum(L.)KarstenexFarw.Tomate
SECCIÓN II
Exámenes
1. Losexámenesoficialescontempladosenlaletraa)delapartado2delartículo
2 se basarán en la biología del organismo, así como en los sistemas deproducción concretos que se utilicen en el Estado miembro de que se trate, eincluirán lo siguiente:
i) en el caso de las patatas:
— en los momentos oportunos, una inspección visual del cultivo en
crecimiento, y/o muestras de patatas de siembra y de otras patatasdurantelafasedecrecimientooalmacenadas;estasmuestrassesome-teránaunainspecciónvisualoficialobajosupervisiónoficial,paralocual se procederá a seccionar los tubérculos,
y
— en el caso de las patatas de siembra y, si procede, de otras patatas,
análisisdelaboratoriooficialesobajosupervisiónoficialenlosqueseutilice el método establecido en el anexo II;
ii) en el caso de los tomates:
— en los momentos oportunos, una inspección visual de, al menos, el
cultivo en crecimiento de plantas destinadas a la replantación parautilización profesional.
2. La notificación de los exámenes oficiales dispuesta en el apartado 3 del
artículo 2 incluirá los datos siguientes:
i) en el caso de los exámenes de patatas:
— lasuperficietotalestimada,enhectáreas,deloscultivosdepatatasde
siembra y de otras patatas,
— la clasificación por categorías (de siembra y de consumo) y, en su
caso, por regiones,
— lacantidaddemuestrastomadasparalosanálisisyelmomentodesu
recogida,
— el número de inspecciones visuales efectuadas en el campo,— el número de inspecciones visuales realizadas en tubérculos (y la
cantidad de muestras);
ii) en el caso de los exámenes de, al menos, el cultivo en crecimiento de
plantasdetomatedestinadasalareplantaciónparautilizaciónprofesional:
— la cantidad total estimada de plantas,
— el número de inspecciones visuales;
iii) enelcasodelosexámenesdeplantashuéspeddelorganismodistintasde
la patata y el tomate, incluidas las solanáceas silvestres huésped:
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— la especie,
— la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida,— la zona o río objeto del muestreo, según proceda,— el método de análisis;
iv) enelcasodelosexámenesdeaguasydelosvertidosderesiduoslíquidos
procedentes de las instalaciones industriales de transformación o deembalaje:
— la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida,
— la zona, río o ubicación de la instalación objeto del muestreo, según
corresponda,
— el método de análisis.
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ANEXOII
MÉTODO DE DIAGNÓSTICO, DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE
RASTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.
ÁMBITO DE APLICACIÓN DEL MÉTODO
El presente método describe los diversos procedimientos involucrados en:
i) el diagnóstico de la podredumbre parda en tubérculos de patata y de la
marchitez bacteriana en plantas de patata y de tomate;
ii) ladetecciónde Ralstoniasolanacearum enmuestrasdetubérculosdepatata;
iii)la identificación de Ralstonia solanacearum .
En los apéndices se facilitan detalles para la preparación de los materiales de
prueba, entre otros, medios nutritivos, tampones, soluciones y reactivos.
ÍNDICE
SECCIÓNI: Aplicacióndelmétodo… 9
1.Diagnósticodelapodredumbrepardaenlostubérculosdepatataydela
marchitezbacterianaenlasplantasdepatataydetomate…9
2.Deteccióneidentificaciónde Ralstoniasolanacearum enmuestrasde
tubérculosdepatata…11
SECCIÓNII: Diagnósticodelapodredumbrepardaenlostubérculosdepatatayde
lamarchitezbacterianaenlasplantasdepatataydetomate…13
1.Síntomas… 13
2.Pruebasdeselecciónrápida… 133.Procesodeaislamiento… 144.Pruebasconfirmación… 14
SECCIÓNIII: DeteccióneidentificacióndeRalstoniasolanacearumenmuestrasde
tubérculosdepatata…17
1.Preparacióndelamuestraparaelanálisis… 17
2.Pruebadeinmunofluorescencia(IF)… 183.Pruebadeinmunoabsorciónenzimática( EnzymeLinkedImmunoSorbent
AssayoELISA)…20
4.Pruebadepolimerizaciónencadena( PolymeraseChainReaction oPCR)
…20
5.Pruebasdesiembraenmedioselectivo… 22
6.Pruebasdebioensayo… 237.Pruebasdeenriquecimiento… 238.Pruebasdepatogenicidad… 23
Apéndice1: Mediosnutritivosparaelaislamientoyelcultivode Ralstoniasolana-
cearum…24
Apéndice2: Materialesparalapreparacióndelasmuestras… 25
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Apéndice3: MaterialesparalapruebaIF… 26
Apéndice4: DeterminacióndelniveldecontaminaciónenlapruebaIF… 27
Apéndice5: MaterialesparalapruebaELISA… 28
Apéndice6: MaterialesparalapruebaPCR… 29
Apéndice7: Materialesparalaspruebasdesiembraemmedioselectivoydeenriqueci-
miento…29
Referencias… 30
SECCIÓN I
APLICACIÓN DEL MÉTODO
1.Diagnóstico de la podredumbre parda en los tubérculos de patata y
la marchitez bacteriana en las plantas de patata y de tomate
Elprocedimientodeanálisisquesedestinaalostubérculosdepatataque
presentan síntomas típicos de la podredumbre pard a y a las plantas de
patata y de tomate que presentan síntomas típicos o que permiten lasospechademarchitezbacterianaincluyeunapruebadeselecciónrápida,elaislamientodelpatógenodeltejidovascularinfectadoenunmediodediagnóstico y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivocomoRalstonia solanacearum .
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Organigrama
Notas
(1) La descripción de los síntomas se presenta en el punto 1 de la sección II.
(2) Las pruebas de selección rápida facilitan un diagnóstico de presunción.
Son pruebas adecuadas:
— la prueba de la exudación del tejido vascular del tallo (punto 2 de la
sección II),
— la prueba de detección de gránulos de poli- β-hidroxibutirato (punto 2 de
la sección II),
— la prueba IF (punto 2 de la sección III),— la prueba ELISA (punto 3 de la sección III),— la prueba PCR (punto 4 de la sección III).
(
3) Aunque el aislamiento del patógeno de material vegetal con síntomas típicos
essencillomediantesiembradediluciones,elcultivopuedefallarenestadosavanzados de infección. Las bacterias saprofitas que crecen en el tejidoenfermopuedenenmascararoinhibirelpatógenoenelmediodeaislamiento.Si el aislamiento es negativo pero los síntomas de la enfermedad son lostípicos, deberá repetirse el aislamiento, preferentemente valiéndose de unasiembra en medio selectivo.
(
4) La identificación fiable de un cultivo puro de Ralstonia solanacearum se
consigueutilizandoalmenosunadelaspruebasqueseenumeranenelpunto4.1delasecciónII,encombinaciónconunapruebadepatogenicidad(punto4.3 de la sección II). La caracterización de la cepa es facultativa, aunque serecomienda cada vez que se presente un caso nuevo.
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2.Detección e identificación de Ralstonia solanacearum en muestras de
tubérculos de patata
El procedimiento se destina a la detección de infecciones latentes en
tubérculos de patata mediante una o, preferiblemente, varias pruebas deselección que, de ser positivas, se complementan con el aislamiento delpatógeno; en caso de aislamiento de colonias típicas, se procede acontinuación a la identificación de un cultivo puro como Ralstonia
solanacearum .
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Organigrama
Notas
(1) Tamaño de la muestra
El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos. Sin embargo, elprocedimiento puede adaptarse convenientemente para muestras con menosde 200 tubérculos.
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(2) Pruebas de selección
Es posible que una única prueba no sea lo suficientemente sensible o fiableparadetectar Ralstoniasolanacearum enunamuestra.Porelloserecomienda
realizarmásdeunapruebayquesebasenenprincipiosbiológicosdiferentes.
(
3) Prueba de inmunofluorescencia (IF)
La prueba IF es una prueba de selección plenamente reconocida, lo quesupone una ventaja frente a otras pruebas que aún no han sido puestas apunto o convalidadas completamente. La prueba se usa para otras muchasbacterias,porejemploClavibactermichiganensisssp.sepedonicus.Lospará-metros de lectura que se especifican en este método hacen que resulte unaprueba sensible (con límites de detección de 10
3-104células por ml de
precipitado de extracto de patata).Elfactorcríticoenquesebasalafiabilidaddelosresultadoseslacalidaddelantisuero. Sólo es aceptable un antisuero con un título elevado (2000, comomínimo, para el antisuero crudo) y todas las pruebas deben realizarse con eltítulo del antisuero o con una dilución por debajo de éste. Se prefiere elmétodo indirecto. El método directo puede aplicarse si la prueba tiene ungrado de sensibilidad y especificidad equivalente al del método indirecto.La prueba IF presenta la ventaja de la interpretación subjetiva de la morfo-logíadelatincióncelularydelaintensidaddelafluorescencia,quefacilitaninformación sobre la especificidad de la reacción. Son frecuentes las reac-ciones cruzadas producidas por bacterias serológicamente afines procedentesdel suelo o asociadas a tejidos de la patata con morfología celular deRalstonia solanacearum . Aunque la prueba IF puede utilizarse como única
prueba de selección, cuando se sospeche que se han producido reaccionescruzadas convendrá efectuar una prueba de selección alternativa basada enprincipiosbiológicosdiferentes.Entalescasoslasiembraenmedioselectivoes la prueba más adecuada.
(
4) Pruebas de siembra en medio selectivo
El medio SMSA modificado y el procedimiento que se especifican en estemétodo hacen que ésta sea una prueba sensible y selectiva para la deteccióndeRalstoniasolanacearum ,cuyosresultadospuedenconocersedetresaseis
días después de la preparación de la muestra. El agente patógeno se obtienedirectamente en cultivo y puede identificarse fácilmente. Para poder aprove-charplenamenteelpotencialdelaprueba,esnecesarioprepararconcuidadolas cuñas para evitar las bacterias secundarias asociadas al tubérculo de lapatata que compiten con Ralstonia solanacearum en el medio y pueden
afectareldesarrollodelagentepatógeno.Algunascepaspuedencrecerinsufi-cientemente,yaqueloscomponentesdelmediopuedenafectaralorganismobuscado. Asimismo, debe tenerse cuidado para diferenciar Ralstoniasolana-
cearumde otras bacterias que pueden desarrollarse en el medio. Aunque la
siembraenmedioselectivopuedeutilizarsecomoúnicapruebadeselección,cuando se obtengan resultados negativos y se sospeche que se ha producidouna inhibición de Ralstonia solanacearum debido a la presencia de otras
bacterias en el medio, será conveniente realizar una segunda prueba deselección. En tal caso, la prueba IF será la más apropiada.
(
5) Prueba ELISA
En general, la prueba ELISA es menos sensible que la prueba IF (límites dedetección: 10
4-105células por ml de precipitado de extracto de patata). Se
trata de una prueba barata y rápida, que, no obstante, en lo que a resultadosse refiere, está en general más expuesta a dar resultados falsos positivos(reacciones cruzadas) y falsos negativos (inhibición causada por moléculasfenólicas presentes en el extracto de patata). El antisuero debe poseer unaespecificidadmuyelevada.LapruebaELISAnopuedeutilizarsecomoúnicaprueba de selección.
(
6) Prueba PCR
Esta prueba posee el potencial necesario para una gran sensibilidad dedetección, pero puede ser inhibida fácilmente por componentes del extractode planta o tubérculo, con el consiguiente resultado falso negativo. Algunoscultivares de patata contienen más inhibidores que otros, que es necesarioeliminar.Lainhibiciónpuedereducirsemediantedilución,sibienconellosediluyen también las poblaciones de Ralstonia solanacearum . Debe tenerse
mucho cuidado en todas las fases de preparación de las muestras y de laprueba para evitar contaminaciones que darían lugar a resultados positivosfalsos.Tambiénpuedenderseresultadosfalsospositivosdebidoasecuencias
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homólogas de otros organismos. De ahí que la prueba PCR directa no pueda
utilizarse como única prueba de selección.
(7) Prueba de enriquecimiento
La incubación de muestras de extracto de patata en un caldo semiselectivo,como el caldo SMSA modificado, permite la multiplicación de Ralstonia
solanacearum y, lo que es más importante quizás, también diluye los inhibi-
dores potenciales de las pruebas ELISA o PCR. De este modo, Ralstonia
solanacearum puededetectarsemediantelaspruebasIF,ELISAyPCRenun
caldo de enriquecimiento. No recomendamos la realización de cultivosdirectos a partir de caldos enriquecidos, ya que estos métodos de enriqueci-mientonosehanensayadoyprobadoafondo.Siseincluyenaquíesporqueposeen un potencial considerable. No obstante, debido a la relativa falta deexperiencia que se tiene de ellos, no pueden utilizarse como métodos dedetección únicos.
(
8) Prueba de bioensayo
La prueba de bioensayo se usa para el aislamiento de Ralstonia solana-
cearuma partir de extracto de patatas mediante enriquecimiento selectivo de
la bacteria en una planta huésped, y puede realizarse en plantas de tomate oen berenjenas. Exige que las condiciones de incubación sean óptimas, segúnseespecificanenestemétodo.EsmuyprobablequelasbacteriasinhibidorasdeRalstonia solanacearum en medio SMSA no interfieran en esta prueba.
(
9) Pruebas confirmatorias
La identificación fiable de un cultivo puro de Ralstonia solanacearum se
efectúamediantealgunadelaspruebasqueseenumeranenelpunto4.1delasecciónII,encombinaciónconunapruebadepatogenicidad(punto4.3delasección II). Aunque la caracterización de la cepa es optativa, se recomiendaen cada caso nuevo.
SECCIÓN II
DIAGNÓSTICO DE LA PODREDUMBRE PARDA EN LOS TUBÉR-
CULOS DE PATATA DE LA MARCHITEZ BACTERIANA EN LAS
PLANTAS DE PATATA Y DE TOMATE
1.Síntomas
1.1. Síntomas en la patata
En la planta. La fase inicial de la infección se caracteriza por un
marchitamiento de las hojas en progresión ascendente hacia el extremosuperior de la planta, bajo el efecto de las temperaturas diurnas altas,con una recuperación durante la noche. El marchitamiento se hacerápidamente irreversible y ocasiona la muerte de la planta. El tejidovascular de los tallos de las plantas marchitadas cortados transversal-mente puede volverse pardo, y de la superficie del corte brota unexudado mucoso blanquecino o éste puede extraerse apretando el tallo.Si se coloca verticalmente un tallo cortado en agua, de los hacesvasculares salen hilos viscosos.
En el tubérculo. Los tubérculos de patata deben cortarse transversal-
mentecercadelapartebasal(estolón).Enlafaseinicialdelainfecciónse produce una decoloración entre amarillo vítreo y pardo claro de lalínea vascular, de la cual fluye espontáneamente un exudado mucosocrema pálido al cabo de varios minutos o cuando se hace una ligerapresión con los pulgares en la piel próxima a la superficie del corte.Posteriormente, la decoloración vascular adquiere un tono pardo másmarcadoylanecrosispuedeextendersealtejidoparenquimático.Enlasfases avanzadas, la infección progresa desde la parte basal y los ojos,pudiendo dar lugar a que se produzcan en la piel lesiones ligeramentehundidasdecolorpardorojizoporlasquefluyenbacterias,loquehaceque se adhieran partículas del suelo.
1.2 Síntomas en el tomate
En la planta. El primer síntoma visible es el aspecto fláccido de las
hojasmásjóvenes.Encondicionesmedioambientalesfavorablesparaelpatógeno (temperatura del suelo de unos 25 °C, humedad saturada) se
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produceepinastiayunmarchitamientodeunaparteodelatotalidadde
la planta en pocos días que desemboca en el colapso total de la misma.En condiciones menos favorables (temperatura del suelo por debajo de21°C) pueden surgir numerosas raíces adventicias del tallo. En
ocasiones se observa un cordón grasiento a lo largo del tallo quedemuestra la existencia de necrosis en el sistema vascular. Al cortartransversalmente el tallo, los tejidos vasculares del mismo, quepresentan una decoloración parda, exudan gotas de líquido bacterianoblanco o amarillento.
2.Pruebas de selección rápida
Las pruebas de selección rápida facilitan un diagnóstico de presunción.
Realícese una o más de las siguientes pruebas:
Prueba de la exudación del tallo
La presencia de Ralstoniasolanacearum en tallos de patata o de tomate
marchitos puede evaluarse utilizando la sencilla prueba de presunciónque se indica a continuación.
Cortareltallojustoporencimadelniveldelsuelo.Colocarlasuperficie
delcorteenunvasodeprecipitadosquecontengaagua.Pocodespués,delos haces vasculares saldrán espontáneamente hilos de flujo bacteriano.Este fenómeno no se producirá con ninguna otra bacteria que causeinfecciones vasculares en las plantas de patata o de tomate.
Prueba de la detección de gránulos de poli- β-hidroxibutirato (PHB)
Los gránulos de PHB de las células de Ralstonia solanacearum se
visualizan tiñendo con azul Nil o A o negro Sudán B.
Preparar un frotis del exudado o del tejido sospechoso en un portaob-
jetos, o un frotis de un cultivo de 48 horas en YPGA o SPA (apéndice1).Prepararfrotisdecontrolpositivodeunacepadebiova r2yraza3y,
si se considera útil, un frotis de un control negativo. Dejar secar. Pasarcon rapidez varias veces por la llama la cara inferior del portaobjetoshasta que el frotis quede fijado.
Prueba del azul Nilo
1. Bañar el frotis fijado con solución acuosa al 1% de azul Nilo A.
Incubar durante 10 minutos a 55 °C.
2. Escurrir la solución de tinción. Lavar suavemente al grifo durante
unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.
3. Bañar el frotis con ácido acético acuoso al 8%. Incubar durante 1
minuto a temperatura ambiente.
4. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Secar con un
pañuelo de papel.
5. Humedecer de nuevo con una gota de agua. Tapar con un cubreob-
jetos.
6. Examinar el frotis tintado con un microscopio epifluorescente a
450nm con gota de aceite de inmersión, a 1000 aumentos.
Observar si se produce la fluorescencia naranja brillante de los gránulos
dePHB.Observartambiénconlaluznormalparacerciorarsedequelosgránulos son intracelulares y de que la morfología celular es la típica deRalstonia solanacearum .
Prueba del negro Sudán
1. BañarelfrotisfijadoconunasolucióndenegroSudánBal0,3%en
etanol del 70%. Dejar en incubación durante 10 minutos a tempera-tura ambiente.
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2. Escurrir la solución de tinción. Lavar suavemente con agua del grifo
durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo depapel.
3. Sumergir brevemente el frotis en xilol. Secar con un pañuelo de
papel.
¡Cuidado! El xilol es un producto nocivo. Trabajar en campana de
humos.
4. Bañarelfrotisconsafraninaacuosaal0,5%(p/v)ydejardurante10
minutos a temperatura ambiente.
¡Cuidado! La safranina es un producto nocivo. Trabajar en campana
de humos.
5. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Secar con un
pañuelo de papel. Tapar con un cubreobjetos.
6. Examinar la tinción con un microscopio óptico con luz transmitida
con aceite de inmersión, a 1000 aumentos.
Los gránulos de PHB de las células de Ralstonia solanacearum se
tiñen de negro azulado, mientras que las paredes de las células lohacen de rosa.
Otras pruebas
Otras pruebas adecuadas para una selección rápida son la prueba IF
(punto2delasecciónIII),lapruebaELISA(punto3delasecciónIII)yla prueba PCR (punto 4 de la sección III).
3.Proceso de aislamiento
3.1. Coger exudado o secciones de tejido decolorado del anillo vascular del
tubérculo o de los haces vasculares del tallo de la planta de patata o detomate. Poner en suspensión en un volumen reducido de agua destiladaestéril o en tampón fosfato 50mM. Dejar reposar d e5a1 0minutos.
3.2. Preparar series de diluciones decimales de la suspensión, por ejemplo
1/10 y 1/100, o más si se considera necesario.
3.3. Añadir un volumen normalizado de la suspensión y de las diluciones a
un medio nutritivo general (NA, YPGA y SPA; apéndice 1) y/o a unmedio de tetrazolio de Kelman (apéndice 1) y/o a un medio selectivoSMSA (apéndice 7). Extender o hacer estrías con una técnica adecuadadediluciónenplacas.Siseconsideraútil,prepararunconjuntodeplacasdistintas con un cultivo de una suspensión celular diluida de una cepavirulentadeRalstoniasolanacearum debiovar2yraza3queseutilizará
como control positivo.
3.4. Dejar en incubación las placas tres días a 28 °C. La incubación puede
prolongarsehastaseisdíassielcrecimientoeslento,perolascoloniasenSMSA con frecuencia se vuelven atípicas y mueren.
En un medio nutritivo general, los aislados virulentos de Ralstonia
solanacearum desarrollan colonias de color blanco nacarado, planas,
irregulares y fluidas, que con frecuencia presentan los verticilos caracte-rísticos.
En el medio de tetrazolio de Kelman, las colonias típicas de aislados
virulentosde Ralstoniasolanacearum sondecolorcrema,planas,irregu-
lares, con anillos de color rojo sangre en el centro. Las colonias aviru-lentas deRalstonia solanacearum son butirosas y de color rojo fuerte.
En el medio SMSA, las colonias típicas de los aislados virulentos de
Ralstoniasolanacearum son de color blanco lechoso, planas, irregulares
y fluidas, y presentan centros de un marcado color rojo sangre.
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Las formas avirulentas de Ralstonia solanacearum desarrollan colonias
menos fluidas, cuyo color oscila entre completamente rosa y rojo en elmedio SMSA.
3.5. Purificarlascoloniasdemorfologíacaracterísticamediantesubcultivoen
un medio nutritivo general. Evitar los subcultivos continuos que puedendar lugar a una pérdida de virulencia.
4.Pruebas de confirmación
4.1. Identificación de Ralstonia solanacearum
Identificar los cultivos puros de Ralstoniasolanacearum mediante uno,
como mínimo, de los siguientes procedimientos.
Pruebas nutricionales y enzimáticas
Nota:Incluir los controles adecuados en cada prueba.
Lassiguientespropiedadesfenotípicasde Ralstoniasolanacearum están
universalmente presentes o ausentes:
Pigmentofluorescente −
InclusionesdePHB +PruebaO/F O+/F−Catalasa +OxidasadeKovacs +
Reduccióndenitratos +
Utilizacióndecitrato +
Crecimientoa40 °C −
CrecimientoenNaClal1% +
CrecimientoenNaClal2% −Dihidrolasadearginina −Licuacióndegelatina −Hidrólisisdelalmidón −Hidrólisisdelaesculina −Produccióndelevano −
Los medios y métodos se encuentran en Lelliott y Stead (1987).
Prueba IF
Prepararunasuspensiónde10
6célulaspormldelcultivoydelascepas
de control positivo. Preparar una serie de diluciones a del antisuero.Aplicar el procedimiento de IF (punto 2 de la sección III). El título IFdel cultivo debe ser equivalente al del control positivo.
Prueba ELISA
Preparar una suspensión de más de 10
6células por ml del cultivo y de
lascepasdecontrolpositivo.AplicarelprocedimientoELISA(punto3delasecciónIII).ElvalorELISAdelcultivodebeserequivalentealdelcontrol positivo.
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Biovar
1 2 3 4 5Prueba PCR
Prepararunasuspensiónde106célulaspormldelcultivoydelascepas
de control positivo. Aplicar el procedimiento PCR (punto 4 de lasección III). El producto de la PCR del cultivo debe tener el mismotamaño y bandas del análisis de la enzima de restricción (REA) que elcontrol positivo.
Hibridación fluorescente in situ (Fluorescent in situ
hybridisation o FISH)
Prepararunasuspensiónde10
6célulaspormldelcultivoydelascepas
de control positivo. Aplicar el procedimiento FISH (Van Beuningen etal., 1995) con el iniciador OLI-1 PCR (Seal et al., 1993). El cultivo
debe mostrar la misma reacción que el control positivo.
Perfiles de proteínas
Las proteínas de células enteras desnaturalizadas se separan mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (Stead, 1992a).
Perfiles de ácidos grasos ( Fatty acid profiling o FAP)
Mantenerelcultivoylacepadecontrolpositivoenagardetripticasade
soja durante 48 horas a 28 °Cy aplicar el procedimiento FAP (Janse,
1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). El perfil del cultivo debe ser idén-ticoaldelcontrolpositivo.Enlascondicionesespecificadas,losácidosgrasoscaracterísticosson14:03OH,16:02OH,16:12OHy18:12OH.
4.2.Caracterización de las cepas
Lacaracterizacióndelascepasesoptativa,peroserecomiendaencada
caso nuevo, utilizando al menos unas de las pruebas siguientes:
Determinación de los biovares
Ralstonia solanacearum se separa en biovares en función de la capa-
cidad de producir ácido de tres hexosas alcohólicas y tres azúcares(Hayward, 1964 y 1994).
Utilización de:
—maltosa
− + + − +
—lactosa − + + − +
—celobiosa − + + − +
—mannitol − − + + +
—sorbitol − − + + −
—dulcitol − − + + −
El biovar 2 se diferencia en subfenotipos mediante pruebas adicionales
(Hayward, 1994):
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Biovar2 Biovar2-A Biovar2-T
Raza(*)
1 2 3Utilizacióndetrehalosa − + +
Utilizacióndeinositol + − +
UtilizacióndeD-ribosa − − +
Actividadpectolítica baja baja alta
Determinación de las razas
La raza (Buddenhagen etal., 1962) puede determinarse con una prueba
de patogenidad en plantas de tomate o en berenjenas y en plantas detabaco, y mediante una reacción de hipersensibilidad (HR) en hojas detabaco (Lozano y Sequeira, 1970):
Reacciónen: —plantasde
tomate/beren-jenas
Marchita-
mientoSinreacción Marchita-
miento
—plantasdetabaco Marchita-
mientoSinreacción Sinreacción
—hojasdetabaco Necrosis
(48h)y
marchita-
miento(7-
8días)HR(12-24h) Clorosis(2-8
días)
(*) Laraza4(patógenaeneljengibreyenalgúnotrohuésped)ylaraza5(patógenasóloenellamorera)
no están incluidas.
La caracterización de la raza a través de pruebas de patogenicidad ohipersensibilidadenhojasdetabacopuedenosermuyfiable,peropodráser deducida a partir del biovar y del huésped natural de origen.
El cultivo puede caracterizarse aún más mediante lo siguiente:
Obtención de la huella dactilar genómica
La diferenciación molecular de las cepas en el complejo de Ralstonia
solanacearum puede realizarse del modo siguiente:
Análisis RFLP (Cook et al., 1989).PCR de secuencia repetitiva [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al.,
1995; Smith et al., 1995)].
4.3.Prueba de patogenicidad
Esta prueba se destina a confirmar el diagnóstico de Ralstonia solana-
cearumy comprobar la virulencia de los cultivos identificados como
Ralstonia solanacearum .
Preparar un inóculo de 10
6células por ml del cultivo y una cepa de
control positivo. Inocular de 5 a 10 plantas de tomate o berenjenas,preferentemente en la fase de la tercera hoja verdadera o posterior(punto6delasecciónIII).Dejarenincubaciónhastadossemanasentre2 2y2 8 °Ccon alta humedad relativa y riego diario. Observar si se
produce marchitamiento y/o epinastia, clorosis o enanismo.
Aislar las plantas sintomáticas de la forma siguiente:
— separar secciones del tallo 2cm por encina del punto de inocula-
ción,
— dilacerar y suspender en un pequeño volumen de agua estéril o en
tampón fosfato 50mM. Sembrar, dejar en incubación y buscarcolonias típicas de Ralstonia solanacearum .
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SECCIÓN III
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE RALSTONIA SOLANACEARUM
EN MUESTRAS DE TUBÉRCULOS DE PATATA
Nota:El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos. Sin embargo, el
procedimiento puede adaptarse convenientemente para muestras conmenos de 200 tubérculos.
1.Preparación de la muestra para el análisis
Observación: El extracto de patata obtenido con este procedimiento
puedeemplearsetambiénparaladetecciónde Clavibacter
michiganensis ssp. sepedonicus.
Opciones previas al análisis, en caso de considerarlas útiles:
i) incubar la muestra a 25-30 °Cdurante un período de hasta dos
semanas para favorecer la multiplicación de las poblaciones latentesdeRalstonia solanacearum ;
ii) lavar los tubérculos con agua corriente utilizando desinfectantes y
detergentes apropiados. Secar al aire los tubérculos.
1.1. Quitar la epidermis de la parte basal (ombligo) del tubérculo con un
bisturí o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que los tejidosvasculares queden a la vista. Extraer con cuidado una cuña cónicapequeña (de3a5m md e diámetro) de tejido vascular de la parte basal
de cada tubérculo. Extraer el mínimo volumen posible de tejido novascular. Procesar cada uno de los tubérculos de la muestra.
Observación: Elexamenvisualdelostubérculos(punto1delasección
II) puede efecturarse en esta fase. Retirar los tubérculosque presenten síntomas o estén muy podridos y anali-zarlos individualmente (sección II).
1.2. Colocar las cuñas en un recipiente cerrado. Es conveniente procesarlas
inmediatamente. De no ser posible, pueden almacenarse durante unperíodo de 24 horas como máximo o, si se mantienen a 4 °C, que no
supere las 72 horas.
1.3. Procesar las cuñas por uno de los métodos siguientes:
i) Colocar las cuñas en un recipiente adecuado.
Añadir solución tampón de maceración (apéndice 2) en cantidad
suficiente para que las cubra.
Desmenuzarlas en una trituradora Waring Blender o Ultra Thurrax
hasta lograr una homogeneización completa pero no excesiva.
Dejar el macerado en remojo de 15 a 30 minutos.
ii) Colocar las cuñas en un recipiente adecuado.
Añadir solución tampón de maceración en cantidad suficiente para
que las cubra.
Colocar el recipiente en un agitador rotatorio.Incubar a 50-100 rpm durante 4 horas a 20-22 °Co durante 16-24
horas a 4 °C.
iii) Colocarlascuñasdentrodeunabolsademaceracióndesechableque
sea resistente (por ejemplo, una bolsa Stomacher, de 105×150mm,estéril por radiación).
Machacar con cuidado las cuñas valiéndose de un instrumento
adecuado,como,porejemplo,unmartillo,hastalograrunahomoge-neización completa.
Añadir solución tampón de maceración en cantidad suficiente para
que cubra las cuñas.
Dejar asentar el macerado durante 15-30 minutos.
1.4. Extraerlasbacteriasdelascuñasprocesadasmedianteunodelosproce-
dimientos siguientes:
i) Decantar suavemente el macerado en un tubo de centrifugar y dejar
los residuos en el recipiente o la bolsa. Si el decantado presenta unaspecto turbio, centrifugar a 180g, como máximo, durante 10minutos, a una temperatura inferior a 10 °C.
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Centrifugar el decantado o el sobrenadante obtenido en la primera
centrifugación,a7000gdurante15minuto soa10000g durante10
minutos a una temperatura inferior a 10 °C.
Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
ii) Filtrar el macerado mediante un sistema de filtración cuyos poros
tengan un tamaño de 40-100µm.
Acelerar la filtración utilizando una bomba de vacío.Recoger el filtrado en un tubo de centrifugar.Lavar el filtro con un tampón de maceración.Centrifugar el filtrado a 7000g durante 15 minuto soa1 00 0 0g
durante 10 minutos a una temperatura inferior a 10 °C.
Descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
1.5. Resuspender el precipitado en 1ml de tampón de precipitado (apéndice
2).
Dividir en dos partes iguales y poner cada parte en un microvial.Utilizar un solo microvial para la prueba. Conservar el extracto sobrante
a4 °Cdurante el análisis.
Añadir glicerol estéril al 10-25% (v/v) al otro microvial. Homogeneizar
por agitación. Guardar a −18 °C(semanas)oa−7 0 °C(meses).
2.Prueba de inmunofluorescencia (IF)
Utilizar antisuero para Ralstoniasolanacearum , de preferencia para raza
3 y biovar 2. Determinar el título en una suspensión de 10
6células por
ml de la cepa homóloga de Ralstonia solanacearum con una dilución
apropiada del conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), segúnlas recomendaciones del fabricante. El antisuero crudo debería presentarun título IF de al menos 1:2000.
Utilizarportaobjetosdepocillosmúltiples,depreferenciacon10pocillos
de 6mm de diámetro como mínimo.
Incluir en cada portaobjetos un control de conjugado FITC. Deberá
repetirse la prueba con el control PBS incluido, si se observa algunacélula positiva en el control FITC.
Preparar en otro portaobjetos controles positivos con una suspensión de
10
6células por ml de una cepa de raza/biovar adecuados de Ralstonia
solanacearum . Incluir un portaobjetos en cada serie de pruebas.
2.1. Preparar los portaobjetos según uno de los procedimientos siguientes:
i) Para precipitados con una cantidad relativamente pequeña de
almidón:
Echar con una pipeta un volumen determinado (15µl es suficiente
para pocillos de 6mm de diámetro; aumentar el volumen si eldiámetro es mayor) del precipitado resuspendido en una fila depocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para unasegunda muestra, tal como se indica en la figura 1.
ii) Para otros precipitados:
Preparardilucionesdecimales,porejemplo1/10,1/100y1/1000,del
precipitado resuspendido en tampón de precipitado. Echar con unapipeta un volumen normalizado medido (15µl es suficiente parapocillosde6mmdediámetro;aumentarelvolumensieldiámetroesmayor)delprecipitadoresuspendidoydecadadiluciónenunafiladepocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para unasegunda muestra, tal como se indica en la figura 2.
2.2. Dejarsecarlasgotitas.Fijarlascélulasbacterianasalportaobjetoscalen-
tándolo, flameándolo o mediante etanol del 95%.
2.3. Procedimiento IF
i) Si el portaobjetos se ha preparado según el inciso i) de punto 2.1:
Prepararunconjuntodedilucionesa delantisueroeneltampónIF
(apéndice3): deltítulo(T/4), deltítulo(T/2),eltítulo(T)ydosveces el título (2T).
ii) Si el portaobjetos se ha preparado según el inciso ii) del punto 2.1:
Prepararladilucióndetrabajo(DT)delantisueroeneltampónIF.La
dilución de trabajo es la dilución del antisuero con especificidadóptima, y normalmente es a la mitad del título.
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 26
▼B
FITCT/4 T/2 T 2T = >Dilucionesa de
antisuero
FITCDiluciónnormalizadadeantisuero
Nada Nada 1/10 1/100 1/1000 = >Dilucióndecimal
delprecipitadoresuspendidoFigura 1
Preparacióndelportaobjetossegúnelincisoi)delospuntos2.1y
2.3
Dilución normalizada del precipitado resuspendido
(T = título)
Muestra1 •1 •2 •3 •4 •5
Duplicadodelamuestra1o
muestra2•6•7•8•9•10
Figura 2
Preparación del portaobjetos según del inciso ii) de los puntos 2.1 y 2.3
Muestra1 •1 •2 •3 •4 •5
Duplicadodelamuestra1o
muestra2•6•7•8•9•10
2.3.1. Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido.
Añadir a los pocillos correspondientes la dilución o diluciones de anti-
suero. Aplicar PBS en los pocillos FITC. El volumen del antisueroaplicado en los pocillos debe ser equivalente al volumen de extractoaplicado.
2.3.2. Tapar y dejar incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.2.3.3. Sacudir las gotitas de antisuero del portaobjectos y enjuagar cuidadosa-
mente los portaobjetos con tampón IF. Lavar durante 5 minutos contampón IF-Tween. Repetir la operación con tampón IF (apéndice 3).Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad.
2.3.4. Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido.
Cubrir los pocillos en cuestión y el pocillo FITC con la dilución del
conjugadoFITCutilizadoparadeterminareltítulo.Elvolumendeconju-gado aplicado en los pocillos debe ser idéntico al volumen de antisueroaplicado.
2.3.5. Taparydejarenincubacióndurante30minutosatemperaturaambiente.2.3.6. Sacudirlasgotitasdeconjugadodelportaobjetos.Enjuagarylavarcomo
antes (2.3.3). Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad.
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 27
▼B
2.3.7. Echar con una pipeta de 5 a 10µl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M
(apéndice3)ounvolumensimilarencadapocilloycolocaruncubreob-jetos.
2.4. Lectura de la prueba IF
Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros
adecuados para que se produzca la excitación del FITC, con aceite deinmersión y a 500-1000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de
dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro.
En primer lugar, comprobar el control positivo. Las células deben ser
fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas.
Nota:La prueba test debe repetirse si la tinción es aberrante.
Leer los portaobjetos. Observar primero la ausencia de células fluores-centes en los pocillos FITC. Si existieran indicaría una unión no especí-fica del conjugado, autofluorescencia o contaminación.
Nota:En este caso, repetir la prueba.
Comprobarsihaycélulasfluorescentesbrillantesconmorfologíacaracte-rística deRalstonia solanacearum en los pocillos problema. La inten-
sidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de controlpositivo a la misma dilución del antisuero. Deberán descartarse lascélulas que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia seaescasa,amenosquehayamuchascélulasdeestetipo(véaselainterpre-tación de los resultados de la prueba IF).
Interpretación de los resultados de la prueba IF
i) La prueba será negativa si en la muestra no se encuentran células
fluorescentes brillantes con morfología característica.
ii) Si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología
característica, determinar el número medio de células por campomicroscópicoycalcularelnúmerodecélulas(N)pormldeprecipi-tado resuspendido (apéndice 4).
Se considera que el límite de detección para la prueba IF está
alrededor de 10
3células por ml de precipitado resuspendido:
— en las muestras con N >103celulas por ml, la prueba IF se
considera positivo,
— enlas ►C1muestrasconN <103célulasporml, ◄laprueba
IF puede considerarse positivo.
iii) Si hay un gran número de células ( >105células por ml) incomple-
tamente teñidas o con fluorescencia débil en el título, deberá reali-zarse una segunda prueba:
— bien una prueba basada en un principio biológico distinto,
— bienrepetirlapruebaIF,yaseaconunsegundoantisueroocon
una dilución decimal del precipitado.
3.Prueba de inmunoabsorción enzimática ( Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay o ELISA)
(Basada en Robinson-Smith et al., 1995)
Utilizar antisuero para Ralstonia solanacearum , preferiblemente de la
raza 3 y biovar 2. Determinar el título en una suspensión de 10
6células
por ml de la cepa homóloga de Ralstonia solanacearum .
Se recomienda utilizar placas de microtitulación NUNCPolysorp.Incluir un control negativo de extracto de patata y un control de tampón
fosfato salino (PBS).
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Utilizar una suspensión de más de 106células por ml de una raza/biovar
deRalstonia solanacearum como control positivo. Procesarlo de la
mismamaneraquelamuestraomuestras,perobienseparadodeéstasenla placa de microtitulación.
3.1. Echarconunapipetade100a200µldelprecipitadoresuspendidoenun
microvial.
Calentar durante 4 minutos a 100 °C. Colocar el microvial en hielo.
3.2. Añadir un volumen igual de tampón de tapizado de carbonato de doble
concentración (apéndice 5). Homogeneizar por agitación.
3.3. Añadiralícuotasde100µlacadaunodedospocillos,comomínimo,de
la placa de microtitulación.
Dejar en incubación durante una hora a 37 °Co durante una noche a
4°C.
3.4. Quitar los extractos de los pocillos. Lavar éstos tres veces con PBS-
Tween (apéndice 5), dejando en ellos la última solución de lavadodurante al menos 5 minutos.
3.5. Prepararladiluciónadecuadadeantisuerode Ralstoniasolanacearum en
tampón de bloqueo (apéndice 5). Echar 100µl de dilución de antisueroen los pocillos.
Dejar en incubación durante una hora a 37 °C.
3.6. Quitar el antisuero de los pocillos. Lavar éstos como en el punto 3.4.3.7. Preparar la dilución adecuada de conjugado de fosfatasa alcalina en
tampón de bloqueo. Echar 100µl de dilución de conjugado en los poci-llos.
Dejar en incubación durante una hora a 37 °C.
3.8. Quitarelconjugadodelospocillos.Lavaréstoscomoenlospuntos3.4y
3.6.
3.9. Prepararlasolucióndesustratodefosfatasaalcalina(apéndice5).Echar
100µl en los pocillos. Dejar en incubación de 30 minutos a una hora enla oscuridad a temperatura ambiente.
3.10. Leer la absorbancia a 409nm.
Interpretación de la prueba ELISA
LapruebaELISAseránegativasiladensidadóptica(DO)delamuestra
es<2×DO del control negativo.
La prueba ELISA será positiva si la DO de la muestra es >2×DOdel
control negativo.
4.Prueba de polimerización en cadena (Polymerase Chain Reaction o
PCR)
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Componente Cantidad Concentraciónfinal(Basado en Seal et al., 1993)
Observación: Deberánutilizarsepuntasdepipetaajustadasconfiltroen
todas las fases de preparación de la muestra y siempreque haya que manejar PCR.Preparar una suspensión de10
6células por ml de una cepa de Ralstonia solana-
cearumde raza 3 y biovar 2 como control positivo.
Actuar del mismo modo que con la muestra o muestras.
4.1. Echar con una pipeta 100µl del precipitado resuspendido en un micro-
vial.
Otraalternativaesechar90µldelprecipitadoresuspendidoenunmicro-
vial que contenga 10µl de NaOH 0,5 M. Mezclar invirtiendo el vialrepetidamente.
4.2. Calentar durante 4 minutos a 100 °C. Colocar el microvial en hielo
inmediatamente.
4.3. Preparar por lo menos dos diluciones decimales, por ejemplo 1/10 y
1/100, o más si se considera útil, en agua destilada estéril o ultrapura(UPW).
4.4. Preparar la mezcla de reacción PCR (apéndice 6) en un vial estéril
añadiendo los componentes siguientes en el orden en que se citan:
Volumen de reacción de 50µl
Agua destilada estéril o ultra-
pura30,8µl-33,8µl
10×tampón PCR 5,0µl 1×
d-ATP 1,0µl 0,2mMd-CTP 1,0µl 0,2mMd-GTP 1,0µl 0,2mMd-TTP 1,0µl 0,2mMIniciador OLI-1 (20µM) 2,5µl 1µMIniciador Y-2 (20µM) 2,5µl 1µMPolimerasa Taq (5 U/µl)
0,2µl 1,0U
Volumentotal 45-48µl
Para más reacciones
Calcularlacantidaddecadacomponenteparaelnúmerodereaccionesnecesario.Mezclarloscomponentesyponer45-48µldelamezclaenvialesPCRestériles.Colocar los viales con la mezcla de la reacción PCR en hielo.
Para volúmenes de reacción de 25µl
Reducir los componentes proporcionalmente.
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▼B
4.5. Amplificación de la PCR
4.5.1. Optativo: centrifugar con impulsos los viales que contienen la muestra
hervida y el control positivo.
Añadir, en el orden indicado, 2-5µl de la muestra o muestras, el control
de agua y el control positivo a los viales que contienen la mezcla de lareacción PCR. Colocar los viales en el calentador del termociclador deADN.
4.5.2. Aplicar el siguiente programa:
1 ciclo de:i) 2 minutos a 96 °C:desnaturalización de la cadena molde;
50 ciclos de:
ii) 20 segundos a 94 °C:desnaturalización,
iii) 20 segundos a 68 °C:hibridación de iniciador,
iv) 30 segundos a 72 °C:extensión de la copia;1 ciclo de:
v) 10 minutos a 72 °C:nueva extensión;1 ciclo de:
vi) mantenimiento de la temperatura a 4 °C.
Observación: Estos parámetros son para un aparato Perkin Elmer 9600. Para
otros termocicladores tal vez se precise una capa de aceitemineral en los viales de la reacción PCR y/o modificar la dura-ción de las fases ii), iii) y iv) de amplificación.
4.5.3. Retirar los viales del termociclador. Analizar el producto de la PCR. Si
estaoperaciónnoserealizainmediatamente,almacenarlosvialesa4 °C
si se van a utilizar el mismo dí aoa- 1 8 °Csi el período de espera va a
ser mayor.
4.6. Análisis del producto de la PCR
Los fragmentos de la PCR se detectan mediante electroforesis en gel de
agarosa y tinción con bromuro de etidio.
4.6.1. Preparar un gel de agarosa apropiado llevando suavemente la agarosa a
ebullición en un tampón de tris-acetato para electroforesis (TAE).
4.6.2. Enfriar la agarosa fundida a 50-60 °C, verterla en el molde de la unidad
de electroforesis e insertar el peine. Dejar solidificar el gel.
4.6.3. Retirar el peine. Sumergir el gel en TAE de modo que quede cubierto
(2-3mm) con el tampón.
4.6.4. Poner gotitas de 3µl de tampón de carga en parafilm. Añadir 12µl del
producto de la PCR procedentes de las muestras, del control positivo odel control de agua, y mezclar aspirando suavemente en la punta de lapipeta antes de la carga. Los volúmenes dados pueden modificarse paraque se ajusten a la capacidad de los pocillos en el gel de agarosa.
4.6.5. Cargar con cuidado los pocillos del gel. Incluir un marcador ADN
apropiado al menos en un pocillo, para que sirva de referencia.
4.6.6. Conectarloscablesalgeneradordeelectricidadyalequipodeelectrofo-
resis. Dejar correr el gel a 5-8V/cm hasta que la parte delantera delindicador de seguimiento se halle a 1cm del final del gel.
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4.6.7. Cortar el suministro de electricidad. Desconectar los cables de la unidad
de electroforesis.
Retirar el gel con cuidado. Sumergirlo en una solución de bromuro de
etidio durante un período comprendido entre 30 y 45 minutos.
Observación: Debenllevarseguantesdesechablescadavezquesemani-
pule bromuro de etidio, ya que es un mutágeno muyfuerte.
4.6.8. Desteñir en agua destilada durante 10-15 minutos.
4.6.9. VisualizarelfragmentoolosfragmentosdeADNamplificadosmediante
transiluminaciónUV.ElproductodelaPCRde Ralstoniasolanacearum
conelconjuntodeiniciadoresOLI-1eY-2tieneunalongitudde288bp.Cotejar con el marcador de ADN y con el control positivo.
Observación: El control de agua debe ser negativo en cualquier caso.
De lo contrario, repetir la prueba.
4.6.10. Hacer una fotografía del gel, en caso de necesitarse una prueba perma-
nente.
4.6.11. Confirmar la autenticidad del fragmento amplificado mediante un
análisis de la enzima de restricción (REA).
4.7. Análisis de la enzima de restricción (REA)
4.7.1. Echar 8,5µl del producto de la PCR (4.5.3) en un microvial nuevo.
Añadir 1µl de tampón de enzima 10×y 0,5µl de enzima de restricciónAvaII.
4.7.2. Mezclar aspirando suavemente en la punta de la pipeta. Si quedan gotas
en las paredes del vial, dar un pulso en una microcentrífuga. Dejarincubar durante una hora a 37 °C.
4.7.3. Analizar el fragmento de la PCR digerido mediante electroforesis en gel
de agarosa, tal como se indica en el punto 4.6.
Interpretación de los resultados de la prueba PCR
La prueba PCR es negativa si no se detecta el fragmento 288 bp
característicoysisedetectaparalacepadecontrolpositivode Ralstonia
solanacearum .
LapruebaPCRespositivasisedetectaelfragmento288bpyelanálisis
REA del fragmento amplificado es idéntico al de la cepa de controlpositivo deRalstonia solanacearum .
5.Pruebas de siembra en medio selectivo
(Basadas en Elphinstone et al., 1996)
5.1. Realizarlapruebamedianteunatécnicadediluciónenplacasapropiada,
como, por ejemplo:
i) Preparar al menos dos diluciones decimales, por ejemplo 1/10 y
1/100, o más si se considera necesario, del sedimento resuspendidoentampóndeprecipitado.Echarconunapipetaunvolumennormali-zado medido (50-100µl) del sedimento resuspendido y de cada dilu-
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▼B
ciónenelmedioselectivoSMSAmodificado(apéndice7)yextender
con una varilla de vidrio por toda la superficie del medio.
Siseconsideraútil,realizartambiénunaestríadediluciónconunasa
cargada con 10 µl del sedimento resuspendido. Flamear el asa entrecada siembra.
ii) Poner un volumen estándar medido (50-100µl) del sedimento resus-
pendidoenelmedioselectivoSMSAmodificadoyextenderconunavarilla de vidrio por toda la superficie del medio. Pasar la varilla sinflamearla al menos por otras dos placas de SMSA modificado.
5.2. Añadir,mediantelamismatécnicadediluciónenplacas,unasuspensión
de10
6célulaspormldeunacepade Ralstoniasolanacearum deraza3y
biovar 2 como control positivo a un conjunto diferente de placas deSMSA modificado.
5.3. Dejarincubarlasplacasa28 °C.Iniciarsulecturaalcabodetresdías.Si
el resultado es negativo, esperar hasta seis días como máximo. Losaislados virulentos de Ralstonia solanacearum desarrollan colonias de
color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas, con unos centros decolor rojo sangre y que presentan rayas o espirales internas.
5.4. Purificarlascoloniasdemorfologíacaracterísticamediantesubcultivoen
un medio nutritivo general (apéndice 1).
5.5. Identificarloscultivospuros(punto4.1delasecciónII)yconfirmarlos
cultivos deRalstonia solanacearum mediante una prueba de patogeni-
cidad (punto 4.3 de la sección II).
Interpretación de los resultados de la siembra en medio selectivo
La siembra en medio selectivo es negativa si no se aíslan colonias
bacterianas al cabo de seis días ni se aíslan colonias características deRalstonia solanacearum , siempre que no haya sospechas de inhibición
producidaporcoloniasdeotrasbacteriasyqueenloscontrolespositivosse encuentren colonias características de Ralstonia solanacearum .
Lasiembraenmedioselectivoespositivasiseaíslancoloniascaracterís-
ticas deRalstonia solanacearum .
6.Pruebas de bioensayo
(Basadas en Janse, 1988)
6.1. Utilizarencadamuestra10plántulasdetomateodeberenjenasensibles,
en la fase de la tercera hoja verdadera. Las plantas no deben regarsedurante las 24 horas previas a la inoculación.
6.2. Distribuir entre las plantas 100µl de sedimento resuspendido, inoculán-
dolo en el tallo, entre los cotiledones, y en uno o varios puntos más.
6.3. Utilizando esta misma técnica, inocular 10 plántulas con una suspensión
de 10
6células por ml de una cepa virulenta de Ralstonia solanacearum
de raza 3 y biovar 2 como control positivo y con tampón de precipitadocomo control negativo. Separar las plantas inoculadas con el controlpositivo de las otras para evitar contaminaciones.
6.4. Dejarquelosplantonessigancreciendohasta4semanasa22-28 °Ccon
alta humedad relativa y riego diario. Comprobar si se aprecian síntomasde marchitamiento, epinastia, clorosis y/o crecimiento reducido.
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6.5. Aislardelasplantasinfectadas(secciónII).Identificarloscultivospuros
de morfología característica (punto 4.1 de la sección II) y confirmar loscultivos deRalstonia solanacearum mediante una prueba de patogeni-
cidad (punto 4.3 de la sección II).
6.6. Si se considera útil, comprobar si se ha producido infección en los lotes
que no presenten signos de ella. Separar del tallo de cada planta unasección de 1cm que esté 2cm por encima del punto de inoculación.Homogeneizar los tejidos en tampón de maceración. Llevar a cabo lasiembrapordiluciónenplacas(punto5.1delasecciónIII).Deobtenerseun resultado positivo, identificar los cultivos puros de morfología carac-terística (punto 4.1 de la sección II) y confirmar la presencia de cultivosdeRalstoniasolanacearum medianteunapruebadepatogenicidad(punto
4.3 de la sección II).
Interpretación de los resultados de la prueba del bioensayo
Lapruebadelbioensayoesnegativasilasplantasnoestáninfectadaspor
Ralstoniasolanacearum ,siemprequesedetecte Ralstoniasolanacearum
en los controles positivos.
La prueba del bioensayo es positiva si las plantas están infectadas por
Ralstonia solanacearum .
7.Pruebas de enriquecimento
(Basadas en Elphinstone et al., 1996)
7.1. Echar100µldesedimentoresuspendidoen3mldecaldoSMSAmodifi-
cado (apéndice 7).
7.2. Dejar incubar a 28 °Cdurante 48 horas y, en cualquier caso, durante un
máximode72horas,manteniendoeltapóndeltubosinapretarparaquehaya aireación.
7.3. Ajustar el tapón y mezclar. Hacer partes alícuotas para la prueba IF
(punto2delapresentesección),lapruebaELISA(punto3delapresentesección) y/o la prueba PCR (punto 4 de la presente sección).
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Apéndice 1
Mediosnutritivosparaelaislamientoyelcultivode Ralstonia solanacearum
Agar nutritivo (NA)
Agarnutriente(Difco) 23g
Aguadestilada 1l
Preparar volúmenes de 0,5litros del medio en matraces de un litro.
Disolver los ingredientes.Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 °C. Distribuir en placas.
Agar levadura peptona glucosa (YPGA)
Extractodelevadura(Difco) 5g
Bactopeptona(Difco) 5gD(+)glucosa(monohidrato) 10gBactoagar(Difco) 15gAguadestilada 1l
Preparar volúmenes de 0,5litros del medio en matraces de un litro.
Disolver los ingredientes.Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 °C. Distribuir en placas.
Agar de sacarosa y peptona (SPA)
Sacarosa 20g
Peptona 5gK
2HPO4 0,5g
MgSO4·7H2O 0,25g
Bactoagar(Difco) 15g
Aguadestilada 1l
Preparar volúmenes de 0,5litros del medio en matraces de un litro.
Disolver los ingredientes. Si es necesario, ajustar el pH a 7,2-7,4.Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 °C. Distribuir en placas.
Medio de tetrazolio de Kelman
Casaminoácidos(Difco) 1g
Bactopeptona(Difco) 10gDextrosa 5gBactoagar(Difco) 15gAguadestilada 1l
Preparar volúmenes de 0,5litros del medio en matraces de un litro.
Disolver los ingredientes.
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Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 °C.
Añadir una solución acuosa de cloruro de trifenil tetrazolio (Sigma), esterilizada
por filtración, para conseguir una concentración final de 50mg/l.
Distribuir en placas.
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Apéndice 2
Materiales para la preparación de muestras
Tampón de maceración: tampón fosfato 50 mM, pH 7,0
Este tampón se utiliza para macerar tejidos.
Na2HPO4 4,26g
KH2PO4 2,72g
Aguadestilada 1l
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
ParalarealizacióndelapruebaPCRdirecta,serecomiendaañadirpolivinilpirro-
lidona-40000MWT(PVP-40)al5%,parareducirlaincidenciadelainhibiciónde amplificación por moléculas aromáticas presentes en el extracto.
En el caso de utilizarse los procedimientos de homogeneización con Waring
Blender o con Ultra Turrax para la maceración de los tejidos de patata, serecomienda la utilización de un defloculante, un agente antiespumante o unantioxidante.
Coposdelubrol 0,5g/l
AntiespumanteDCsilicona 1,0ml/lTetrasodiopirofosfato 1,0g/l
Esterilizarseparadamenteenunautoclave.Añadirhastaobtenerlaconcentración
deseada.
Tampón del precipitado: tampón fosfato 10 mM, pH 7,2Este tampón se utiliza para la resuspensión y dilución de los precipitados de las
cuñas de patata.
Na
2HPO4·12H2O 2,7g
NaH2PO4·2H2O 0,4g
Aguadestilada 1l
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
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Apéndice 3
Materiales para la prueba IF
Tampón IF: tampón fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2
Este tampón se utiliza para la dilución de antisueros.
Na2HPO4·12H2O 2,7g
NaH2PO4·2H2O 0,4g
NaCl 8,0g
Aguadestilada 1l
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
IF-Puffer-TweenEste tampón se utiliza para lavar los portaobjetos. Añadir 0,1% de Tween 20 al
tampón IF.
Tampón fosfato glicerol 0,1 M, pH 7,6Estetampónseutilizacomofluidodemontajeenlospocillosdelosportaobjetos
de IF para aumentar la fluorescencia.
Na
2HPO4·12H2O 3,2g
NaH2PO4·2H2O 0,15g
Glicerol 50ml
Aguadestilada 100ml
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 38
▼B
Apéndice 4
Determinación del nivel de contaminación en la prueba IF
Superficie(S)delpocillodelportaobjetosmúltiple
=πD2
4
enqueD=diámetrodelpocillo. (1)
Superficie(s)delcampodelobjetivo
=πd2
4
enqued=diámetrodelcampo. (2)
Calculardbienpormedicióndirectabienconlasfórmulassiguientes:
s=πi2
G2K2×4
enque
i=coeficientedecampo(dependedeltipodelocularyvaríad e8a24),
K=coeficientedeltubo(1o1,25),
G=aumento(100×,40×,etc.)delobjetivo. (3)
De(2):
d=4s
π√(4)
De(3):
d=4×πi2
G2K2×4
π=i
GK√
Contarelnúmerodecélulasfluorescentestípicasporcampo( c).
Calcularelnúmerodecélulasfluorescentestípicasporpocillo( C):
C=cS
s
Calcularelnúmerodecélulasfluorescentestípicaspormldeprecipitado( N):
N=C×1000
y×F
enquey=volumendeprecipitadoenelpocillo,F=factordedilucióndelprecipitado.
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 39
▼B
Apéndice 5
Materiales para la prueba ELISA
Tampón carbonato fuerza doble para tapizado, pH 9,6
Na2CO3 6,36g
NaHCO3 11,72g
Aguadestilada 1l
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
Si el extracto contiene una alta proporción de moléculas aromáticas, puede
añadirse como antioxidante sulfito de sodio con una concentración final de0,2%.
Tampón fosfato salino (PBS) 10 ×, pH 7,4
NaCl 80g
KH
2PO4 2g
Na2HPO4·12H2O2 9 g
KCl 2g
Aguadestilada 1l
Disolver los ingredientes y comprobar el pH. Preparar las alícuotas necesarias.
Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
Tampón fosfato salino-Tween (PBS-T)
PBS10× 100ml
Soluciónal10%deTween20 5mlAguadestilada 895ml
Tampón de bloqueo (anticuerpos) (debe prepararse en el momento
de su utilización)
PBS10× 10ml
Polivinilpirrolidona-44000MWT(PVP-44) 2gSoluciónal10%deTween20 0,5gLecheenpolvo 0,5gAguadestilada hasta
completar
100ml
Solución de sustrato fosfatasa alcalina, pH 9,8
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 40
▼B
Dietanolamina 97ml
Aguadestilada 800ml
Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.
Completar hasta 1litro con agua destilada.Añadir 0,2g de MgCl
2.
Disolver dos pastillas de 5mg de sustrato fosfatasa (Sigma) por cada 15ml de
solución.
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 41
▼B
Apéndice 6
Materiales para la prueba PCR
Secuencia del oligonucleótido iniciador
IniciadorOLI-1 5 /prime1-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3 /prime1
IniciadorY-2 5 /prime1-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3 /prime1
Para los materiales véase Seal et al., 1993.
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 42
▼B
Apéndice 7
Materiales para las pruebas de siembra en medio selectivo y de enriqueci-
miento
Medio selectivo SMSA (Engelbrecht, 1994, modificado por
Elphinstone et al., 1996)
Mediobase
Casaminoácidos(Difco) 1gBactopeptona(Difco) 10gGlicerol 5mlAgar(Difco) 15gAguadestilada 1l
Preparar volúmenes de 0,5litros del medio en matraces de 1litro.
DisolverlosingredientesycomprobarelpH.Siesnecesario,ajustarelpHa6,5
antes de esterilizar. Ralstonia solanacearum no se desarrolla bien con un pH
>7,0.
Esterilizar en un autoclave a 121 °Cdurante 15 minutos.
Enfriar hasta 50 °C.
Añadir los siguientes ingredientes (todos de Sigma) para obtener las concentra-
ciones finales especificadas:
Violetacristal 5mg/l
PolimixinaBsulfato 100mg/l (aproximadamente
600000unidades)SigmaP-1004
Bacitracina(*) 25mg/l (aproximadamente1250
unidades)SigmaB-0125
Cloranfenicol 5mg/l SigmaC-3175
PenicilinaG 0,5mg/l (aproximadamente825
unidades)SigmaP-3032
Salesdetetrazolio 50mg/l
(*) Siseconsideranecesario,elaumentodelaconcentracióndebacitracinahasta300ppmpuedereducirlacontami-
nación por bacterias saprofitas sin reducir la recuperación de Ralstonia solanacearum .
Disolver los ingredientes en etanol del 70% para obtener las concentraciones
indicadas para el volumen de diluyente preparado. Algunos ingredientes, comoporejemplolapolimixin aByelcloranfenicol,exigenunligerocalentamientoy
agitación.
Caldo SMSA (Elphinstone et al., 1996)
PreparardeformaidénticaalmedioselectivoSMSA,perosuprimirelagarolas
sales de tetrazolio.
Distribuir en alícuotas de 3ml, en tubos desechables Universal de 30ml.
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 43
▼B
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1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 44
▼B
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1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 45
▼B
ANEXOIII
1. En todos los casos en que se sospeche la presencia del organismo y, habién-
dose obtenido un resultado positivo en pruebas de detección realizadas conarreglo al método correspondiente establecido en el anexo II para el materialvegetalindicad ooacualquierotrométodooficialmenteaprobado,paratodos
los demás casos, se espere a la conclusión de dicho método para confirmar odisipar la sospecha, deberán retenerse y conservarse convenientemente hastaese momento:
— siempre que sea posible, el lote, o la parte del mismo (del que se haya
tomado la muestra) en su embalaje original con etiqueta,
— siempre que sea posible, la parte restante de las muestras,— cualquier extracto que sobre y cualquier material adicional que se haya
preparado para la prueba o pruebas de detección (por ejemplo, las placasde inmunofluorescencia),
— toda la documentación pertinente.
2. En los casos en que finalmente se confirme la presencia del organismo,
deberán retenerse y conservarse convenientemente durante al menos el messiguiente al procedimiento de notificación dispuesto en el apartado 2 delartículo 5:
— el material mencionado en el punto 1, y
— una muestra del material de tomate o berenjena infectado que se haya
inoculado con el extracto de tubérculo o planta en su caso, y
— el cultivo aislado del organismo.
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▼B
ANEXOIV
Los elementos de la investigación que dispone el inciso i) de la letra a) del
apartado 1 del artículo 5 serán, cuando proceda, los siguientes:
i) los lugares de producción:
— en los que se estén cultivando o se hayan cultivado patatas que estén
relacionadasclónicamenteconaquellasenlasquesehayacomprobadolainfección por el organismo,
— enlosqueseesténcultivandoosehayancultivadotomatesqueprocedan
de las mismas fuentes que aquellos en los que se haya comprobado lainfección por el organismo,
— enlosqueseesténcultivandoosehayancultivadopatatasotomatesque
se hayan puesto bajo control oficial por sospecharse la presencia delorganismo,
— en los que se estén cultivando o se hayan cultivado patatas que estén
relacionadas clónicamente con las que hayan sido cultivadas en lugaresde producción de los que se sospeche la infección por el organismo,
— en los que se cultiven patatas o tomates y que estén localizados en las
proximidades de los lugares de producción infectados, incluidos aquellosen los que se compartan equipos e instalaciones de producción directa-mente o por intervención de un contratista común,
— en los que se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas de
superficiedecualquierfuenteenlaquesehayaconfirmadoodelaquesesospeche la infección por el organismo,
— en los que se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas de
superficie de una fuente explotada en común con lugares de producciónen los que se haya confirmado o de los que se sospeche la infección porel organismo,
— que estén o hayan sido anegados con aguas de superficie en las que se
haya confirmado o de las que se sospeche la infección por el organismo;y
ii) las aguas de superficie que se utilicen para el riego o rociamiento, o para la
anegación, de un campo o campos o de un lugar o lugares de producción enlos que se haya confirmado la infección por el organismo.
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▼B
ANEXOV
1. Aldeterminar,conarregloalincisoiii)delaletraa)yalincisoiii)delaletra
c) del apartado 1 del artículo 5, el alcance de la contaminación probable, seincluirán los elementos siguientes, cuando proceda:
— elmaterialvegetalindicadoobtenidoenunlugardeproducciónquehaya
sido declarado contaminado en virtud del inciso ii) de la letra a) delapartado 1 del artículo 5,
— el lugar o lugares de producción que tengan una relación de producción
con el material vegetal indicado que haya sido declarado contaminado envirtud del inciso ii) de la letra a) del apartado 1 del artículo 5, incluidosaquellos lugares que compartan equipos e instalaciones de produccióndirectamente o por intervención de un contratista común,
— el material vegetal indicado que se haya producido en el lugar o lugares
deproduccióncontempladosenelguiónanterioroqueestuvierapresenteen tales lugares durante el tiempo en que el material vegetal indicadodeclaradocontaminadoenvirtuddelincisoii)delaletraa)delapartado1del artículo 5, se hallara presente en los lugares de producción mencio-nados en el primer guión,
— los almacenes que hayan manipulado el material vegetal indicado proce-
dente de los lugares de producción a los que se refieren los guionesanteriores,
— cualquier maquinaria, vehículo, nave, almacén o unidades de éstos y
cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que puedanhaberestadoencontactoconelmaterialvegetalindicadodeclaradoconta-minadoenvirtuddelincisoii)delaletraa)delapartado1delartículo5,
— cualquier material vegetal indicado que haya sido almacenado o haya
estadoencontactoconcualquieradelasestructurasylosobjetosmencio-nados en el guión anterior antes de la limpieza y desinfección de éstos,
— como resultado de la investigación y de los análisis contemplados en el
inciso i) de la letra a) del apartado 1 del artículo 5: en el caso de laspatatas, aquellos tubérculos o plantas que tengan una relación clonalfraternaoparentalconelmaterialvegetalindicadodeclaradocontaminadoen virtud del inciso ii) de la letra a) del apartado 1 del artículo 5, y que,según los resultados de la investigación, tengan probabilidades de estarcontaminados;y,enelcasodelostomates,aquellasplantasqueprocedande las mismas fuentes que dicho material y con respecto a las cuales,aunque las pruebas de detección del organismo hayan sido negativos,parezca probable la contaminación a través de un vínculo clonal,
— el lugar o lugares de producción del material vegetal indicado a que se
refiere el guión anterior,
— el lugar o lugares de producción del material vegetal indicado en los que
se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas que hayan sidodeclaradascontaminadasenvirtuddelincisoii)delaletrac)delapartado1 del artículo 5,
— el material vegetal indicado producido en campos anegados con aguas de
superficie en las que se haya confirmado la infección por el organismo.
2. Para la determinación de la posible propagación a la que se refieren el inciso
iv) de la letra a) y el inciso iii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 5,deberán tenerse en cuenta los elementos siguientes:
i) enloscasoscontempladosenelincisoiv)delaletraa)delapartado1del
artículo 5:
— la proximidad de otros lugares de producción en los que se cultive el
material vegetal indicado,
— la producción y utilización comunes de existencias de patatas de
siembra,
— los lugares de producción en los que se utilicen aguas de superficie
paraelriegoorociamientodelmaterialvegetalindicadocuandoexistao haya existido el riesgo de escorrentía, o de anegamiento, de aguassuperficiales procedentes de un lugar o lugares de producción quehayansidodeclaradoscontaminadosenvirtuddelincisoii)delaletraa) del apartado 1 del artículo 5;
ii) en los casos en que se hayan declarado contaminadas aguas de superficie
en virtud del inciso ii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 5:
— el lugar o lugares productores del material vegetal indicado contiguos
a las aguas superficiales declaradas contaminadas, o que corran elriesgo de ser anegados por estas aguas,
— cualquierfuentederiegoseparadaquesecomuniquedealgunaforma
con las aguas superficiales declaradas contaminadas.
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▼B
3. La notificación a la que se refiere el párrafo primero del apartado 2 del
artículo 5 incluirá los datos siguientes:
— la fecha en la que se haya tenido noticia de la presunta presencia del
organismo en virtud del artícul o 4 y las fechas de la toma de muestras y
de la confirmación de la presencia de dicho organismo con arreglo alartículo 5, según los casos,
— unadescripcióndeloselementosdeladeclaracióndecontaminaciónyde
la delimitación de zonas.
4. La notificación a la que se refiere el párrafo primero del apartado 2 del
artículo 5 incluirá los datos siguientes:
— en el caso de cualquier partida o lote de patatas declarado contaminado,
los certificados prescritos en los artículo s7u8d el a Directiva 77/
93/CEE, el número de pasaporte o número de registro de los productoresde patata, de los almacenes colectivos y de los centros de distribución,según proceda,
— en el caso de cualquier partida o lote de tomateras declarado como
contaminado, los certificados prescritos en los artículo s7y8d el a
Directiva77/93/CEEyelnúmerodepasaportedeacuerdoconlalistaquese recoge en el punto 2.2 de la sección I de la parte A del anexo V de laDirectiva 77/93/CEE,
— en el caso de las existencias de patatas de siembra y, si fuere posible, en
todos los demás casos, el nombre y la categoría de la variedad,
— cualesquieraotrosdatosquerequieralaComisiónrelativosalbroteconfir-
mado.
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▼B
ANEXOVI
1. Con respecto al apartado 1 del artículo 6, se dispondrá lo siguiente:
— la incineración,
— la utilización como piensos, previo tratamiento térmico adecuado, de
forma que no haya riesgo alguno de supervivencia del organismo, o
— el enterramiento profundo en un vertedero donde no exista ningún
riesgodefiltraciónatierrasagrícolasnidecontactoconfuentesdeaguaque puedan utilizarse para riego de dichas tierras,
— latransformaciónindustrial,previaentregadirectaeinmediatadelmate-
rial a una planta de transformación con instalaciones que estén oficial-mente autorizadas para la eliminación de residuos y, se ajusten a lasdisposiciones del anexo VII de la presente Directiva, u
— otras medidas, siempre que se haya establecido que no existe ningún
riesgo identificable de propagación del organism o y a condición de que
tales medidas sean notificadas inmediatamente a la Comisión y a losdemás Estados miembros.
2. El uso adecuado o la eliminación del material vegetal indicado dispuestos
en el apartado 2 del artículo 6 deberán efectuarse bajo el control de losorganismos oficiales responsables del Estado o Estados miembros intere-sados, así como con la oportuna comunicación entre estos organismos paragarantizar en todo momento dicho control, y con la aprobación del orga-nismooficialdelEstadomiembrodondevayanaenvasarseotransformarselas patatas, en lo que se refiere a los vertederos citados en los guionesprimero y segundo, y consistirán en lo siguiente:
i) en el caso de los tubérculos de patata:
— el uso como patatas de consumo que se embalen en lugares con
instalaciones apropiadas para la eliminación de residuos, listas parala entrega y uso directos sin necesidad de nuevo embalaje, y que sedestinen a esa entrega y uso directos, o
— elusocomopatatasdeconsumoquesedestinenalatransformación
industrialyalaentregadirectaeinmediataaunaplantadetransfor-
maciónconinstalacionesapropiadasparalaeliminaciónderesiduos,o
— algún otro tipo de uso o eliminación, siempre que se establezca que
no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo,y previa aprobación de los citados organismos oficiales responsa-bles.DichasmedidassenotificaráninmediatamentealaComisiónya los demás Estados miembros;
ii) en el caso de las otras partes de las plantas, incluidos los detritos del
tallo y de las hojas:
— la destrucción, o
— algún otro tipo de uso o eliminación, siempre que se establezca que
noexisteningúnriesgoidentificabledepropagacióndelorganismoya condición de que ese uso o eliminación sean notificados a laComisión y a los demás Estados miembros.
3. Losmétodosadecuadosparaladescontaminacióndelosobjetosalosquese
refiereelapartado3delartículo6consistiránenunalimpiezay,ensucaso,una desinfección que permitan descartar todo riesgo identificable de propa-gacióndelorganismo;estasoperacionesseefectuaránbajolasupervisióndelos organismos oficiales responsables de los Estados miembros.
4. La serie de medidas mencionadas en el apartado 4 del artículo 6 que
deberánaplicarlosEstadosmiembrosdentrodelazonaozonasdelimitadasque se hayan establecido en virtud del inciso iv) de la letra a) y del incisoiii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 5 serán las siguientes:
4.1. En los casos en que en virtud del inciso ii) de la letra a) del apartado 1 del
artículo 5, se hayan declarado contaminados lugares de producción, lasmedidas consistirán en lo siguiente:
a) en los campos o unidades de producción de cultivos protegidos que se
hayan declarado contaminados en virtud de esa misma disposición:
i) — durante al menos los cuatro años de cultivo siguientes a la
declaración de la contaminación;
— se adoptarán medidas para eliminar las patatas y tomateras
espontáneas así como otras plantas huésped del organismo,incluidas las malas hierbas solanáceas;
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 50
▼B
— no se plantarán:
— patatas ni tubérculos de patata,
— tomateras y semillas de tomateras,— teniendo en cuenta la biología del organismo:
— otras plantas huésped,
— plantas de especies de Brassica para las que exista un
riesgo identificado de supervivencia o propagación delorganismo,
— otros cultivos para los que exista un riesgo identificado de
supervivencia o propagación del organismo;
— enlaprimeratemporadadecultivodepatatasotomatessiguiente
al período indicado en el guión anterior y, siempre que se hayacomprobado que durante al menos los dos años de vegetacióninmediatamente anteriores a la plantación, el campo estuvo libredepatatasytomaterasespontáneasydeotrasplantashuéspeddelorganismo, incluidas las malas hierbas solanáceas:
— en el caso de las patatas, se plantarán patatas de siembra
certificadas oficialmente para la producción de patatas deconsumo exclusivamente,
y
— se efectuará un examen oficial, acompañado de los análisis
oportunos, según se dispone en el apartado 1 del artículo 2;
— en la temporada de cultivo de patatas o tomates siguiente a la
indicada en el guión anterior y tras un ciclo de rotaciónadecuado, se procederá, en el caso de las patatas, a la plantaciónde patatas de siembra certificadas oficialmente para la produc-ción de patatas de siembra o de consumo y, en el caso de laspatatasytomates,alarealizacióndelexamenoficialquedisponeel apartado 1 del artículo 2; o
ii) duranteloscincoañosdecultivosiguientesaldeladeclaracióndela
contaminación:
— se adoptarán medidas para eliminar las patatas y tomateras
espontáneas así como otras plantas que puedan ser huésped delorganismo, incluidas las malas hierbas solanáceas, y
— durante los tres primeros años, se dejará y mantendrá el campo,
bien en barbecho completo, bien para el cultivo de cereales, conarreglo al riesgo que se haya determinado, bien como pastopermanente,consiegaintensayfrecuenteopastoreointensivo,obien como pastizal para la producción de semillas y, a continua-ción, en los dos años subsiguientes, se plantarán plantas que noseanhuéspeddelorganismoparalasquenoexistaningúnriesgoidentificado de supervivencia o propagación de éste;
— enlaprimeratemporadadecultivodepatatasotomatessiguiente
al período indicado en el guión anterior,
— enelcasodelaspatatas,seplantaránexclusivamentepatatas
de siembra certificadas oficialmente para la producción depatatas de siembra o de consumo,
y se efectuará el examen oficial, acompañado de los análisis opor-
tunos, que dispone el apartado 1 del artículo 2.
b) En otros campos, las medidas consistirán en lo siguiente:
— duranteelañodecultivosiguientealadeclaracióndelacontamina-
ción:
— no se plantarán patatas ni tubérculos de patata ni otras plantas
que puedan ser huésped del organismo, y se adoptarán medidaspara eliminar las patatas y tomateras espontáneas así como otrasplantas que puedan ser huésped del organismo, incluidas lasmalas hierbas solanáceas, o
— enelcasodelostuberculosdepatata,sepodránplantarexclusi-
vamente patatas de siembra certificadas oficialmente, para laproducción de patatas de consumo, con la condición de que losorganismos oficiales responsables hayan quedado plenamenteconvencidos de la eliminación de riesgos a través de plantasespóntaneas de patatas y tomateras y otros hospederos del orga-nismo, incluidas las malas hierbas solanáceas; durante la fase decrecimiento, se inspeccionarán los cultivos en los momentosoportunos,laspatatasespontáneassesometeránaanálisisparalaposibledeteccióndelorganismoy,alfinal,seinspeccionaránlostubérculos cosechados;
1998L0057 — ES — 21.08.1998 — 000.001 — 51
▼B
— enelprimerañodecultivosiguientealindicadoenelguiónanterior:
— en el caso de las patatas, se plantarán exclusivamente patatas de
siembra certificadas oficialmente para la producción de patatasde siembra o de consumo;
— durante al menos el segundo año de cultivo siguiente al indicado en
el primer guión:
— en el caso de las patatas, se plantarán para la producción de
patatas de siembra o de consumo exclusivamente patatas desiembra certificadas oficialmente o patatas de siembra que sehayancultivadobajocontroloficialapartirdepatatasdesiembracertificadas oficialmente;
— en cada uno de los años de cultivo indicados en los guiones ante-
riores, se adoptarán medidas para eliminar las patatas y tomaterasespontáneas así como otras plantas que puedan ser huésped delorganismo, incluidas las malas hierbas solanáceas; además, se efec-tuaráelexamenoficialquedisponeelapartado1delartículo2y,enloscasosenqueseplantenpatatasdesiembraparalaproduccióndeese mismo tipo de patatas, se someterán a análisis los tubérculos.
c) Inmediatamente después de haberse declarado la contaminación en
virtuddelincisoii)delaletraa)delapartado1delartículo5,yencadauno de los años de cultivo subsiguientes hasta, inclusive, la primeratemporada de cultivo permisible de patatas o tomates en el campo ocampos declarados contaminados que se contemplan en la letra a) ante-rior:
— toda la maquinaria e instalaciones de almacenamiento del lugar de
producción que se utilicen en la producción de patatas o tomates selimpiarán y, en su caso, desinfectarán utilizando métodos adecuadosde la forma que se dispone en el punto 3, y
— con el fin de impedir la propagación del organismo, se efectuarán
controles oficiales de los planes de riego y rociamiento y, en casonecesario, se prohibirán los mismos.
d) En el caso de las unidades de producción de cultivos protegidos que
hayansidodeclaradascontaminadasenvirtuddelincisoii)delaletraa)del apartado 1 del artículo 5, y en las que sea posible una sustitucióntotal de los medios de cultivo:
— no se plantarán patatas ni tubérculos de patata ni otras plantas que
puedanserhuéspeddelorganismo,incluidastomaterasysemillasdetomateras, a menos que, por una parte, dichas unidades se hayansometido a medidas oficialmente supervisadas que, teniendo porobjetolaeliminacióndelorganismoylaretiradadetodoelmaterialvegetalhuésped,incluyan,comomínimo,uncambiocompletodelosmediosdecultivoyunalimpiezay,ensucaso,unadesinfeccióndetales unidades y de todo el equipo y que, por otra parte, los orga-nismosoficialesresponsableshayandadosubsiguientementesuauto-rización para la producción de patatas o tomates, y
— además, la producción procederá, en el caso de la patata, de patatas
de siembra certificadas oficialmente o de minitubérculos o micro-plantas obtenidos de fuentes analizadas,
— asimismo, con objeto de impedir la propagación del organismo, se
efectuaráncontrolesoficialesdelosplanesderiegoyrociamientoy,en su caso, se prohibirán los mismos.
4.2. Dentrodelazonadelimitadaysinperjuiciodelasmedidasdispuestasenel
punto 4.1, los Estados miembros:
a) inmediatamente después de la declaración de contaminación y durante
un período de al menos tres años de cultivo:
aa) enloscasosenqueladelimitacióndelazonasehayaefectuadoen
virtud del inciso iv) de la letra a) del apartado 1 del artículo 5:
— garantizarán por que sus organismos oficiales responsables
supervisen las instalaciones que cultiven, almacenen o mani-pulen tubérculos de patata o tomates, así como aquellas otrasinstalacionesqueutilicenenelmarcodeuncontratomaquinariapara la producción de patatas o tomates,
— exigiránquelamaquinariaylosalmacenesdeesasinstalaciones
se limpien y, en su caso, desinfecten utilizando métodosadecuados de la forma que se dispone en el punto 3,
— requerirán que, para todos los cultivos de patata dentro de la
zona delimitada, se planten exclusivamente semillas certificadasosemillascultivadasbajocontroloficial,yseefectúeunanálisisdespués de cosechar los cultivos de patatas de siembra enlugaresdeproduccióndeterminadoscomoprobablementeconta-
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minados según el inciso iii) de la letra a) del apartado 1 del
artículo 5,
— dispondrán que en todas las instalaciones situadas en la zona se
manipulen separadamente las existencias cosechadas de patatasde siembra y las de patatas de consumo,
— efectuarán el examen oficial que dispone el apartado 1 del
artículo 2;
ab) en los casos en que, en virtud del inciso ii) de la letra c) del
apartado1delartículo5,sehayandeclaradocontaminadasaguasdesuperficie o en que, por disposición del punto 2 del anexo V, sehayanincluidodichasaguasentrelosfactoresdelaposiblepropaga-ción del organismo:
— realizarán un examen anual, en los momentos oportunos, con
unatomademuestrasdelasaguasdesuperficieydelasplantashuésped solanáceas pertinentes en las fuentes hídricas perti-nentes, así como análisis con arreglo a:
— en el caso del material vegetal indicado, el método corres-
pondiente establecido en el anexo II, o
— en otros casos, cualquier otro método oficialmente autori-
zado;
— conelfindeimpedirlapropagacióndelorganismo,establecerán
controlesoficialesdelosplanesderiegoyrociamientoasícomouna prohibición (revisable a la vista de los resultados delexamen anual arriba mencionado) del uso de las aguas decla-radas contaminadas para el riego y rociamiento del materialvegetal indicado y, en su caso, de otras plantas huésped;
— en los casos en que se hayan contaminado por vertidos de
residuos líquidos, establecerán controles oficiales de la elimina-cióndelosresiduosprocedentesdelasinstalacionesindustrialesdetransformaciónoenvasadoquemanipulenelmaterialvegetalindicado;
b) establecerán, cuando así proceda, un programa para la sustitución en un
plazo adecuado de todas las existencias de patatas de siembra.
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ANEXOVII
Las instalaciones de eliminación de residuos autorizadas oficialmente a las que
se refiere el cuarto guión del punto 1 del anexo VI deberán cumplir las disposi-cionesqueseindicanacontinuaciónconelfindeevitartodoriesgodepropaga-ción del organismo:
i) losresiduosprocedentesdelatransformacióndepatatasytomates(incluidas
las patatas y tomates rechazados y las peladuras), así como cualquier otroresiduo sólido que acompañe a las patatas y tomates, se eliminarán:
— mediante su enterramiento profundo en un vertedero donde no exista
ningún riesgo de filtración a tierras agrícolas ni de contacto con fuentesdeaguaquepuedanutilizarseparaelriegodedichastierras;losresiduosse conducirán directamente al vertedero en las condiciones necesariaspara evitar todo riesgo de pérdida de los mismos, o
— mediante su incineración;
ii) los residuos líquidos procedentes de la transformación que contengan
elementos sólidos en suspensión se filtrarán o se someterán a procesos desedimentaciónparalaseparacióndedichoselementos.Éstosseeliminarándela forma dispuesta en el inciso i).
Por su parte, los residuos líquidos se someterán a alguna de las medidas
siguientes:
— calentamiento a una temperatura mínima de 70 °Cdurante al menos
treinta minutos antes de la eliminación, o
— eliminación por otro sistema que, aprobado oficialmente y aplicado bajo
controloficial,descartetodoriesgodecontactodelosresiduoscontierrasagrícolas con fuentes de agua que puedan utilizarse para el riego detierras agrícolas. Las características de tal sistema serán notificadas a losdemás Estados miembro syal aComisión.