02002D0657 — ES — 10.06.2021 — 003.001

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►B DECISIÓN DE LA COMISIÓN ►C1 de 14 de agosto de 2002 ◄ por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados [notificada con el número C(2002) 3044] (Texto pertinente a efectos del EEE) (2002/657/CE) (DO L 221 de 17.8.2002, p. 8)

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DECISIÓN DE LA COMISIÓN

►C1 de 14 de agosto de 2002 ◄

por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados

[notificada con el número C(2002) 3044]

(Texto pertinente a efectos del EEE)

(2002/657/CE)

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2. CRITERIOS DE FUNCIONAMIENTO Y OTROS REQUISITOS Y PROCEDIMIENTOS DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS

Los métodos o combinaciones de métodos analíticos diferentes de los descritos a continuación sólo pueden utilizarse con fines de criba o confirmación si se puede demostrar que cumplen los requisitos pertinentes establecidos en la presente Decisión.

2.1. REQUISITOS GENERALES

2.1.1. Manipulación de las muestras

Las muestras se recogerán, manipularán y procesarán de manera que se obtenga la máxima probabilidad de detectar la sustancia. En los procedimientos de manipulación de las muestras se evitará la posibilidad de contaminación accidental o de pérdida de analitos.

2.1.2. Funcionamiento de los ensayos

2.1.2.1. La recuperación

En el análisis de muestras se determinará la recuperación en cada lote de muestras si se utiliza un factor corrector de la recuperación fijo. Si la recuperación se encuentra dentro de los límites, puede emplearse el factor corrector fijo. En caso contrario, se aplicará el factor de recuperación de ese lote específico, a no ser que deba aplicarse el factor específico de recuperación del analito de la muestra, en cuyo caso se utilizará el procedimiento de adición de patrón (véase el punto 3.5) o de un patrón interno para la determinación cuantitativa de un analito en una muestra.

2.1.2.2. Especificidad

Un método deberá ser capaz de distinguir entre el analito y otras sustancia en las condiciones experimentales. Se hará una estimación de esa capacidad de distinción. Deberán aplicarse estrategias para superar cualquier interferencia previsible con las sustancias cuando se aplica la técnica de medición descrita, como la utilización de productos homólogos, análogos o metabólicos del residuo de interés. Es especialmente importante estudiar cualquier interferencia que pudiera resultar de los componentes de la matriz.

2.2. MÉTODOS DE CRIBA

De acuerdo con la Directiva 96/23/CE, para el cribado se utilizarán sólo técnicas analíticas respecto de las cuales pueda demostrarse de modo documental que están validadas y tienen un porcentaje de falsos conformes < 5 % (error β) al nivel de interés. Si se sospecha que un resultado no es conforme, se confirmará mediante un método de confirmación.

2.3. MÉTODOS DE CONFIRMACIÓN PARA RESIDUOS ORGÁNICOS Y CONTAMINANTES

Los métodos de confirmación para residuos orgánicos o contaminantes incluirán información sobre la estructura química del analito. En consecuencia, los métodos basados exclusivamente en análisis cromatográficos que prescinden de la detección espectrométrica no convienen por sí solos como métodos de confirmación. No obstante, si una técnica por sí sola carece de la especificidad necesaria, dicha especificidad se obtendrá por medio de procedimientos analíticos consistentes en combinaciones adecuadas de limpieza, separación cromatográfica y detección espectrométrica.

Los métodos o combinaciones de métodos siguientes se consideran adecuados para la identificación de residuos orgánicos o contaminantes en el caso de los grupos de sustancias indicados:







Cuadro 1 Métodos de confirmación adecuados para residuos orgánicos o contaminantes Técnica de medición Sustancias del anexo 1 de la Directiva 96/23/CE Limitaciones CL o CG con detección por espectrometría de masas Grupos A y B Sólo si sucede a una separación por cromatografía en línea y fuera de línea Sólo si se utilizan técnicas de barrido completo o técnicas que no registran los espectros de masa completos pero incluyen al menos 3 (grupo B) o 4 (grupo A) puntos de identificación CL o CG con detección espectrométrica de IR Grupos A y B Deben cumplirse requisitos específicos de absorción en la espectrometría de IR CL-DAD barrido completo Grupo B Deben cumplirse requisitos específicos de absorción en la espectrometría de UV CL-fluorescencia Grupo B Sólo se aplica a las moléculas que presentan fluorescencia natural y a las que la presentan después de transformación o derivatización 2-D TLC-UV/VIS por barrido completo Grupo B Se requieren la HPTLC bidimensional y la cocromatografía CG-Detección de la captación electrónica Grupo B Sólo si se utilizan dos columnas de polaridad diferente CL-inmunograma Grupo B Sólo si se utilizan al menos dos sistemas cromatográficos diferentes o un segundo método de detección independiente CL-UV/VIS (longitud de onda única) Grupo B Sólo si se utilizan al menos dos sistemas cromatográficos diferentes o un segundo método de detección independiente

2.3.1. Criterios y requisitos de funcionamiento comunes

Los métodos de confirmación proporcionarán información sobre la estructura química del analito. Si se obtiene la misma respuesta con más de un compuesto, el método no es capaz de distinguir esos compuestos. Los métodos basados exclusivamente en análisis cromatográficos sin recurrir al empleo de la detección espectrométrica no convienen por sí solos como métodos de confirmación.

Si se utilizan estos métodos, al comenzar el procedimiento de extracción se añadirá un patrón interno adecuado a la porción de ensayo. Se emplearán, según su disponibilidad, formas marcadas por isótopos estables del analito, especialmente adecuadas para la detección por espectrometría de masas, o compuestos relacionados estructuralmente con el analito.

Cuando no pueda utilizarse un patrón interno adecuado, la identificación del analito se confirmará mediante cocromatografía. En este caso, sólo se obtendrá un pico, en el cual la altura (o superficie) máxima será equivalente a la cantidad de analito añadida. En el caso de la cromatografía de gases (CG) o la cromatografía líquida (CL), la anchura del pico medida a la mitad de la altura máxima oscilará entre un 90 % y un 110 % de la anchura original, y los tiempos de retención serán idénticos, con una tolerancia del 5 %. Para los métodos de cromatografía en capa fina (TLC), se intensificará únicamente la mancha que supuestamente se debe al analito; no deberá aparecer ninguna mancha nueva ni se modificará el aspecto.

Los materiales de referencia o enriquecidos que contengan cantidades conocidas de analito, en el límite o a proximidad del límite permitido o de decisión (muestra de control no conforme), así como los materiales de control conformes y los blancos de reactivo, deberán utilizarse preferentemente durante todo el proceso simultáneamente con cada lote de muestras de ensayo analizado. El orden para inyectar las soluciones en el instrumento de análisis es el siguiente: blanco de reactivo, muestra de control conforme, muestra o muestras por confirmar, muestra de control conforme de nuevo y, por último, muestra de control no conforme. Se justificará toda variación de esta secuencia.

2.3.2. Criterios de funcionamiento adicionales y otros requisitos que deben cumplir los métodos cuantitativos de análisis

2.3.2.1. Veracidad de los métodos cuantitativos

En el caso de análisis repetidos de un material de referencia certificado, los intervalos de referencia de la desviación entre la fracción de la masa media determinada experimentalmente, con corrector de recuperación, y el valor auténtico estarán dentro de los siguientes límites:







Cuadro 2 Veracidad mínima de los métodos cuantitativos Fracción de masa Intervalo ≤ 1 μg/kg – 50 % a + 20 % > 1 μg/kg a 10 μg/kg – 30 % a + 10 % ≥ 10 μg/kg – 20 % a + 10 %

Cuando no se dispone de tales CRM, se acepta una valoración de la veracidad de las mediciones mediante recuperación de adiciones de cantidades conocidas de uno o varios analitos a una matriz en blanco. Los datos corregidos mediante la recuperación media sólo son aceptables si entran dentro de los intervalos expuestos en el cuadro 2.

2.3.2.2. Precisión de los métodos cuantitativos

El coeficiente de variación (CV) interlaboratorios para el análisis repetido de un material de referencia o enriquecido, en condiciones de reproducibilidad, no superará el nivel calculado mediante la ecuación de Horwitz, a saber:

donde C es la fracción de masa expresada como potencia (exponente) de 10 (por ejemplo, 1 mg/g = 10–3). El cuadro 3 recoge varios ejemplos.







Cuadro 3 Ejemplos de CV de reproducibilidad de los métodos cuantitativos en un intervalo de fracciones de masa de analito Fracción de masa CV de reproducibilidad (%) 1 μg/kg (*1) 10 μg/kg (*1) 100 μg/kg 23 1 000 μg/kg (1 mg/kg) 16 ( *1 ) Con fracciones de masa inferiores a 100 μg/kg, la aplicación de la ecuación de Horwitz conduce a valores inaceptablemente elevados. Por ello, los CV de las concentraciones inferiores a 100 μg/kg serán lo más bajos posible.

En análisis realizados en condiciones de repetibilidad, los CV intralaboratorio suelen arrojar valores situados entre la mitad y los dos tercios de los mencionados. En análisis realizados en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio, los CV intralaboratorio no serán superiores a los CV de reproducibilidad.

En el caso de sustancias para las que se ha establecido un límite permitido, el método alcanzará una reproducibilidad intralaboratorio no superior al CV de reproducibilidad correspondiente en una concentración de 0,5 × el límite permitido.

2.3.3. Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la espectrometría de masas

Los métodos de espectrometría de masas pueden servir de métodos de confirmación sólo después de una separación cromatográfica en línea y fuera de línea.

2.3.3.1. Separación cromatográfica

En todos los procesos de CG-MS, la separación por cromatografía de gases se realizará mediante columnas capilares. En todos los procesos de CL-MS, la separación cromatográfica se realizará mediante columnas adecuadas de CL. En cualquier caso, el tiempo de retención mínimo aceptable para el analito es el doble del tiempo de retención correspondiente al volumen vacío de la columna. El tiempo de retención (o el tiempo relativo de retención) del analito en la porción de ensayo corresponderá al del patrón de calibración, dentro de una banda especificada de tiempo de retención. Esta banda de tiempo de retención será acorde con el poder de resolución del sistema cromatográfico. La relación entre el tiempo de retención cromatográfica del analito y el del patrón interno, es decir, el tiempo relativo de retención del analito, corresponderá al de la solución de calibración, con un margen de tolerancia de ± 0,5 % para la CG y ± 2,5 % para la CL.

2.3.3.2. Detección por espectrometría de masas

La detección por espectrometría de masas se llevará a cabo mediante técnicas de MS, como el registro de espectros de masa completos (barridos completos) o el control de iones específicos (SIM), así como de técnicas de MS-MSn, como el control de la reacción seleccionada (SRM), u otras técnicas apropiadas de MS o MS-MSn, combinadas con los modos de ionización adecuados. En espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), la resolución será generalmente superior a 10 000 para todo el intervalo de masas, con una definición del valle del 10 %.

Barrido completo: Cuando la determinación con técnicas de espectrometría de masas se lleva a cabo registrando espectros completos, es obligatoria la presencia de todos los iones de diagnóstico medidos (el ion molecular, los aductos característicos del ion molecular, los iones fragmentados característicos y los iones isotópicos) con una intensidad relativa superior al 10 % en el espectro de referencia del patrón de calibración.

SIM: Cuando la determinación con técnicas de espectrometría de masas se lleva a cabo por fragmentografía, el ion molecular será preferiblemente uno de los iones de diagnóstico seleccionados (el ion molecular, los aductos característicos del ion molecular, los iones fragmentados característicos y todos sus iones isotópicos). Los iones de diagnóstico seleccionados no deberán proceder exclusivamente de la misma parte de la molécula. La relación señal-ruido para cada ion de diagnóstico será ≥ 3:1.

Barrido completo y SIM: Las intensidades relativas de los iones detectados, expresadas como porcentaje de la intensidad del ion más intenso o de la transición, corresponderá a las del patrón de calibración, bien de soluciones del patrón de calibración, bien de muestras enriquecidas, en concentraciones comparables, medidas en las mismas condiciones, con los siguientes márgenes de tolerancia indicados en el cuadro 4.







Cuadro 4 Tolerancias máximas permitidas de intensidades relativas de iones en diversas técnicas de espectrometría de masas Intensidad relativa (% del pico de base) EI-CG-MS (relativos) CI-CG-MS, CG-MSn CL-MS, CL-MSn (relativos) > 50 % ± 10 % ± 20 % > 20 % – 50 % ± 15 % ± 25 % > 10 % – 20 % ± 20 % ± 30 % ≤ 10 % ± 50 % ± 50 %

Interpretación de los datos del espectro de masas: Deben identificarse las intensidades relativas de los iones de diagnóstico, o de los pares de iones de precursor/producto, comparando sus espectros o integrando las señales de cada traza de masa. Cuando se procede a la corrección del fondo, se hará uniformemente en todo el lote (véase el apartado 4 del punto 2.3.1) y se indicará claramente.

Barrido completo: Si se registran espectros de barrido completo en una única espectrometría de masas, debe haber un mínimo de cuatro iones con una intensidad relativa ≥ 10 % del pico de base. Se incluirá el ion molecular si se encuentra en el espectro de referencia con una intensidad relativa ≥ 10 %. Deberá encontrarse un mínimo de cuatro iones dentro de los límites máximos de tolerancia permitidos para las intensidades relativas de los iones (cuadro 5). Puede recurrirse a la búsqueda bibliográfica asistida por ordenador. En este caso, la comparación de los datos del espectro de masas en las muestras de ensayo con la solución de calibración superará un factor crítico de correspondencia. Este factor se determinará para cada analito durante el proceso de validación, sobre la base de espectros para los que se cumplen los criterios que vamos a describir. Se controlará la variabilidad debida a la matriz de la muestra y el funcionamiento del detector.

SIM: Cuando se miden fracciones de la masa con técnicas distintas de las de barrido completo, ha de utilizarse un sistema de puntos de identificación para interpretar los datos. La confirmación de las sustancias clasificadas en el grupo A del anexo I de la Directiva 96/23/CE requiere un mínimo de 4 puntos de identificación. La confirmación de las sustancias clasificadas en el grupo B del anexo I de la Directiva 96/23/CE requiere un mínimo de 3 puntos de identificación. El siguiente cuadro presenta el número de puntos de identificación que puede obtener cada una de las técnicas básicas de espectrometría de masas. No obstante, para obtener los puntos de identificación que requiere la confirmación y el total de puntos de identificación que han de calcularse:

a) se medirá como mínimo un ratio de un ion;

b) todos los ratios de iones pertinentes medidos cumplirán los criterios descritos, y

c) se combinará un máximo de tres técnicas distintas para alcanzar el número mínimo de puntos de identificación.







Cuadro 5 Relación entre diversos tipos de fracciones de masa y puntos de identificación obtenidos Técnica de MS Puntos de identificación obtenidos por ion Espectrometría de masas de baja resolución (LR) 1,0 Ion precursor LR-MSn 1,0 Productos de transición LR-MSn 1,5 HRMS 2,0 Ion precursor HR- MSn 2,0 Productos de transición HR-MSn 2,5 Notas: (1) Cada ion se contará una sola vez. (2) La CG-MS mediante ionización por impacto de electrones se considera una técnica distinta de la CG-MS mediante ionización química. (3) Sólo podrán utilizarse distintos analitos para aumentar el número de puntos de identificación si en los derivados intervienen tipos distintos de reacción química. (4) Para las sustancias del grupo A del anexo I de la Directiva 96/23/CE, si se emplea una de las técnicas HPLC combinada con detección espectrofotométrica por red de diodos mediante barrido completo (DAD), HPLC combinada con detección por fluorescencia, HPLC combinada con un inmunograma, una TLC bidimensional combinada con detección espectrométrica; puede aportarse un máximo de un punto de identificación, siempre que se cumplan los criterios exigidos para dichas técnicas. (5) Los productos de transición abarcan productos de segunda y de tercera generación.







Cuadro 6 Ejemplos de número de puntos de identificación obtenidos mediante diversas técnicas y combinaciones de técnicas (n = un número entero) Técnica o técnicas Número de iones Puntos de identificación CG-MS (EI o CI) N n CG-MS (EI + CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4 CG-MS (EI o CI) 2 derivados 2 (derivado A) + 2 (derivado B) 4 CL-MS N n CG-MS-MS 1 ion precursor y 2 de segunda generación 4 CL-MS-MS 1 ion precursor y 2 de segunda generación 4 CG-MS-MS 2 iones precursores, cada uno con 1 de segunda generación 5 CL-MS-MS 2 iones precursores, cada uno con 1 de segunda generación 5 CL-MS-MS-MS 1 ion precursor, 1 de segunda generación y 2 de tercera generación 5,5 HRMS N 2 n CG-MS + LC-MS 2 + 2 4 CG-MS + HRMS 2 + 1 4

2.3.4. Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la cromatografía con detección por infrarrojos

Picos adecuados: se entiende por picos adecuados los máximos de absorción en el espectro de infrarrojos de un patrón de calibración que cumpla los requisitos siguientes:

2.3.4.1. Detección por infrarrojos

Máximo de absorción: se producirá en un intervalo de número de onda de 4 000 -500 cm–1.

Intensidad de absorción: no será inferior a

a) una absorbancia molar específica de 40 con respecto al valor de base del pico, o

b) una absorbancia relativa del 12,5 % de la absorbancia del pico más intenso en el intervalo 4 000 -500 cm–1

si ambas se miden con respecto a una absorbancia cero, y del 5 % de la absorbancia del pico más intenso en el intervalo 4 000 -500 cm–1 cuando ambas se miden con respecto al valor de base del pico.

Nota:

Aun cuando desde el punto de vista teórico puedan preferirse picos adecuados según a), en la práctica los picos según b) son más fáciles de determinar.

Se determinará el número de picos en el espectro de infrarrojos del analito cuyas frecuencias se correspondan con un pico adecuado en el espectro del patrón de calibración, con un margen de ± 1 cm–1.

2.3.4.2. Interpretación de los datos del espectro de infrarrojos

La absorción estará presente en todas las regiones del espectro del analito que correspondan a un pico adecuado en el espectro de referencia del patrón de calibración. Es necesario un mínimo de seis picos adecuados en el espectro de infrarrojos del patrón de calibración. Si el número de picos adecuados es inferior a seis (7), el espectro en cuestión no podrá utilizarse como espectro de referencia. La «puntuación», es decir, el porcentaje de picos adecuados observados en el espectro de infrarrojos del analito deberá ser al menos de 50. En caso de que no exista una correspondencia exacta para un pico adecuado, la región pertinente del espectro del analito habrá de ser compatible con la presencia de un pico concordante. El procedimiento se aplicará únicamente a los picos de absorción del espectro de la muestra cuya intensidad sea al menos tres veces superior al ruido entre un pico y otro.

2.3.5. Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la determinación de un analito mediante CL combinada con otras técnicas de detección

2.3.5.1. Separación cromatográfica

Si se dispone de material adecuado, se empleará un patrón interno. Se tratará de un patrón afín, con un tiempo de retención cercano al del analito. El analito deberá eluir en el tiempo de retención típico del patrón de calibración correspondiente, en las mismas condiciones experimentales. El tiempo mínimo aceptable de retención de un analito será el doble del tiempo de retención del volumen en vacío de la columna. La relación entre el tiempo de retención del analito y el del patrón interno, es decir, el tiempo relativo de retención del analito, corresponderá a la del patrón de calibración en la matriz apropiada, con un margen de ± 2,5 %.

2.3.5.2. Detección UV/VIS por barrido completo

Deben cumplirse los criterios de funcionamiento de los métodos de CL.

Los máximos de absorción en el espectro del analito presentarán las mismas longitudes de onda que los del patrón de calibración, dentro de un margen determinado por la resolución del sistema de detección. Para la detección por red de diodos, suele ser de ± 2 nm. El espectro del analito por encima de los 220 nm, para aquellas partes de ambos espectros con una absorbancia relativa ≥ 10 %, no deberán diferir visualmente del espectro del patrón de calibración. Este criterio se satisface, en primer lugar, cuando se presentan máximos iguales y, en segundo lugar, cuando en ninguno de los puntos observados la diferencia entre ambos espectros es superior a 10 % de la absorbancia del patrón de calibración. Si se recurre a la búsqueda en bibliotecas y concordancia asistidas por ordenador y a la concordancia, la comparación de los datos del espectro en las muestras de ensayo con los del patrón de calibración deberá superar un factor crítico de correspondencia. Este factor se determinará durante el proceso de validación para cada analito, sobre la base de espectros para los que se cumplen los criterios descritos anteriormente. Se controlará la variabilidad debida a la matriz de la muestra y el funcionamiento del detector.

2.3.5.3. Criterios de funcionamiento de la detección fluorimétrica

Deben cumplirse los criterios de funcionamiento de los métodos de CL.

Ello se aplica a las moléculas que presentan fluorescencia natural y a las que la presentan después de transformación o derivatización. La selección de las longitudes de onda de excitación y de emisión en combinación con las condiciones cromatográficas se harán de tal manera que se minimice la aparición de componentes de interferencia en extractos de muestras en blanco.

El máximo del pico más próximo en el cromatograma estará separado del pico del analito designado por al menos una anchura del pico, medida al 10 % de la altura máxima del pico del analito.

2.3.5.4. Criterios de funcionamiento para la identificación de un analito mediante CL-inmunograma

Por sí sola, la CL-inmunograma no es apropiada como método de confirmación.

Deben cumplirse los criterios aplicables a los métodos de CL.

Los parámetros de control de la calidad predefinidos, por ejemplo, la fijación inespecífica, la fijación relativa de las muestras de control o el valor de la absorbancia del blanco, deberán situarse dentro de los límites obtenidos durante la validación del análisis.

El inmunograma constará de al menos cinco fracciones.

Cada fracción será inferior a la mitad de la anchura del pico.

La fracción con el máximo contenido de analito debe ser la misma para la muestra problema, la muestra de control no conforme y el patrón.

2.3.5.5. Determinación de un analito mediante CL combinada con detección de UV/VIS (longitud de onda única)

Por sí sola, la CL con detección de UV/VIS (longitud de onda única) no es apropiada como método de confirmación.

El máximo del pico más próximo en el cromatograma estará separado del pico del analito designado por al menos una anchura del pico, medida al 10 % de la altura máxima del pico del analito.

2.3.6. Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la determinación de un analito mediante 2D TLC combinada con detección espectrométrica UV/VIS por barrido completo

Se requieren la HPTLC bidimensional y la cocromatografía.

Los valores RF del analito deben coincidir con los valores RF de los patrones, con un margen de ± 5 %.

El aspecto visual del analito no se distinguirá del aspecto visual del patrón.

En manchas del mismo color, el centro de la mancha más cercana estará separado del centro de la mancha del analito por una distancia de al menos la mitad de la suma de los diámetros de ambas manchas.

El aspecto visual del espectro del analito no se distinguirá del aspecto visual del patrón, como se explica en el caso de la detección UV/VIS por barrido completo.

Si se recurre a la búsqueda bibliográfica asistida por ordenador y a la concordancia, la comparación de los datos del espectro en las muestras de ensayo con los del patrón de calibración debe superar un factor crítico de correspondencia. Este factor se determinará durante el proceso de validación para cada analito, sobre la base de espectros para los que se cumplen los criterios descritos anteriormente. Se controlará la variabilidad debida a la matriz de la muestra y el funcionamiento del detector.

2.3.7. Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la determinación de un analito mediante CG combinada con detección de la captación electrónica (ECD)

Si se dispone de material adecuado, se empleará un patrón interno. De preferencia, se tratará de una sustancia afín, con un tiempo de retención cercano al del analito. El analito deberá eluir en el tiempo de retención típico del patrón de calibración correspondiente en las mismas condiciones experimentales. El tiempo mínimo aceptable de retención de un analito será el doble del tiempo de retención del volumen en vacío de la columna. La relación entre el tiempo de retención del analito y el del patrón interno, es decir, el tiempo relativo de retención del analito, corresponderá a la del patrón de calibración en la matriz apropiada, con un margen de ± 0,5 %. El máximo del pico más próximo en el cromatograma estará separado del pico del analito designado por al menos una anchura del pico, medida al 10 % de la altura máxima del pico del analito. Para obtener información adicional puede recurrirse a la cocromatografía.

2.4. MÉTODOS DE CONFIRMACIÓN DE LOS ELEMENTOS QUÍMICOS

Los análisis de confirmación de los elementos químicos se basarán en el concepto de identificación inequívoca y de cuantificación exacta y precisa a partir de las propiedades fisicoquímicas específicas del elemento químico en cuestión (por ejemplo, la longitud de onda característica del elemento de la radiación emitida o absorbida, o la masa atómica) al nivel de interés.

Los métodos o combinaciones de métodos siguientes se consideran convenientes para la identificación de elementos químicos:







Cuadro 7 Métodos adecuados de confirmación de los elementos químicos Técnica Parámetro medido Voltamperometría diferencial de impulsos de redisolución anódica Señal eléctrica Espectrometría de absorción atómica Llama Longitud de onda de absorción Generación de hidruros Longitud de onda de absorción Vapor frío Longitud de onda de absorción Atomización electrotérmica (cámara de grafito) Longitud de onda de absorción Espectrometría de emisión atómica Plasma acoplado inductivamente Longitud de onda de emisión Espectrometría de masas Plasma acoplado inductivamente Relación masa/carga

2.4.1. Criterios de funcionamiento comunes y otros requisitos de los métodos de confirmación

Los materiales de referencia o enriquecidos que contengan cantidades conocidas de analito, en el límite o a proximidad del límite máximo permitido o de decisión (muestra de control no conforme), así como los materiales de control conformes y los blancos de reactivo, deberán utilizarse preferentemente durante todo el proceso simultáneamente con cada lote de muestras de ensayo analizado. El orden recomendado para inyectar las soluciones en el instrumento de análisis es el siguiente: blanco de reactivo, muestra de control conforme, muestra por confirmar, muestra de control conforme y, por último, muestra de control no conforme. Se justificará toda variación de esta secuencia.

En general, la mayoría de las técnicas analíticas requieren la digestión completa de la matriz orgánica para obtener soluciones antes de proceder a la determinación del analito, lo cual puede realizarse mediante procedimientos de mineralización asistida por microondas, que minimizan el riesgo de pérdida o contaminación de los analitos. Se utilizarán tubos de teflón descontaminados de buena calidad. Si se recurre a otros métodos de digestión, húmeda o seca, se dispondrá de pruebas documentales que excluyan posibles fenómenos de pérdida o contaminación. En determinadas circunstancias puede optarse por procedimientos de separación (por ejemplo, la extracción), como alternativa a la digestión, para separar los analitos de los componentes de la matriz y/o concentrarlos, e introducirlos en el equipo de análisis.

En cuanto a la calibración, ya sea externa o basada en el método de adición de patrón, se tendrá cuidado de no superar el intervalo de trabajo establecido para el análisis. En el caso de una calibración externa, los patrones de calibración deben prepararse en una solución cuya composición sea lo más análoga posible a la de la muestra. Asimismo, se procederá a la corrección del fondo según exijan las circunstancias específicas del análisis.

2.4.2. Criterios de funcionamiento adicionales y otros requisitos que deben cumplir los métodos cuantitativos de análisis

2.4.2.1. Veracidad de los métodos cuantitativos

En el caso de análisis repetidos de los elementos de un material de referencia certificado, la desviación entre el contenido medio determinado experimentalmente y el valor auténtico no superará el límite de ± 10 %. Cuando no se dispone de tales CRM, se acepta una valoración de la veracidad de las mediciones mediante recuperación de adiciones de cantidades conocidas del elemento a las muestras desconocidas. Obsérvese que el elemento añadido no está químicamente ligado a la matriz real como lo está el analito, por lo que los resultados obtenidos por este procedimiento tienen menos validez que los obtenidos por CRM. Los datos de recuperación sólo son aceptables si entran en un margen de ± 10 % del valor perseguido.

2.4.2.2. Precisión de los métodos cuantitativos

En caso de análisis repetidos de una muestra en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio, el coeficiente de variación (CV) intralaboratorio de la media no superará los siguientes valores:







Cuadro 8 CV de los métodos cuantitativos en un intervalo de fracciones de masa del elemento Fracción de masa CV (%) ≥ 10 μg/kg a 100 μg/kg 20 > 100 μg/kg a 1 000 μg/kg 15 ≥ 1 000 μg/kg 10

2.4.3. Requisitos específicos de la voltamperometría diferencial de impulsos de redisolución anódica (DPASV)

Es de capital importancia la destrucción completa de la materia orgánica de las muestras antes de proceder a determinaciones por DPASV. En los voltamogramas no deberán verse señales anchas que resulten de la presencia de materia orgánica. En la DPASV, los constituyentes inorgánicos de la matriz pueden influir en la altura de los picos. Por ello, la cuantificación ha realizarse por el método de adiciones de patrón. Con este método se suministrarán muestras de voltamogramas típicos de una solución de muestra.

2.4.4. Requisitos específicos de la espectrometría de absorción atómica (AAS)

Esta técnica se emplea básicamente para estudiar un único elemento, lo que exige la optimación de los parámetros experimentales en función del elemento que deba cuantificarse. Siempre que sea posible, se verificarán los resultados cualitativa y cuantitativamente recurriendo a líneas de absorción alternativas (lo ideal es utilizar dos líneas diferentes). Los patrones de calibración se prepararán en una solución matriz cuya composición sea lo más análoga posible a la de la muestra que debe medirse (por ejemplo, concentración de ácidos o composición de los agentes modificantes). Para minimizar los valores en blanco, todos los reactivos serán de la mayor pureza disponible. Según el modo que se elija para vaporizar o atomizar la muestra, puede distinguirse entre varios tipos de AAS.

2.4.4.1. Criterios específicos de la AAS de llama

Se optimará el reglaje de los instrumentos para cada elemento. En particular, ha comprobarse la composición de los gases y el flujo. Para evitar las interferencias por la absorción del fondo, se utilizará un corrector de fuente de radiación continua. Si no se conocen las matrices, se comprobará si es preciso corregir el fondo.

2.4.4.2. Requisitos específicos de la AAS con cámara de grafito

En el laboratorio, la contaminación afecta frecuentemente a la exactitud cuando se trabaja con ultratrazas en la cámara de grafito. Por ello, deben utilizarse reactivos muy puros, agua desionizada y materiales de plástico inerte para la manipulación de la muestra y del patrón. Se optimará el reglaje de los instrumentos para cada elemento. En particular, han de comprobarse las condiciones de pretratamiento y atomización (temperatura y tiempo) y la modificación de la matriz.

Trabajar en condiciones isotermas de atomización [por ejemplo, tubo transversal de grafito calentado con plataforma L' vov integrada (8)] reduce la influencia de la matriz en la atomización del analito. En combinación con la modificación de la matriz y con la corrección Zeeman del fondo (9) puede procederse a la cuantificación mediante una curva de calibración basada en la medición de soluciones patrón acuosas.

2.4.5. Requisitos específicos de la espectrometría de absorción atómica por generación de hidruros

Los compuestos orgánicos que contienen elementos como arsénico, bismuto, germanio, plomo, antimonio, selenio, estaño y telurio pueden ser muy estables y exigir una descomposición oxidativa para obtener resultados correctos de contenido total del elemento. En consecuencia, se recomienda la digestión por microondas o la incineración de alta presión en condiciones fuertemente oxidantes. Se prestará la máxima atención a la conversión completa y reproducible de los elementos en sus hidruros correspondientes.

La formación de hidruro de arsénico en una solución de ácido clorhídrico con NaBH4 depende del estado de oxidación del arsénico (As III: formación rápida, As V: período de formación más largo). Para evitar una pérdida de sensibilidad en la determinación del As V con la técnica de inyección de flujo, causada por el breve tiempo de reacción de este sistema, después de la descomposición oxidativa As V debe reducirse a As III. Para ello, son adecuados el yoduro de potasio/ácido ascórbico o la cisteína. Se procederá de la misma manera con los blancos, las soluciones de calibración y las de muestra. La utilización de un sistema de lotes permite determinar ambas especies de arsénico sin que la exactitud se vea afectada. Dado el período de formación más largo del hidruro de As V, la calibración se realizará por integración del área del pico. Se optimará el reglaje de los instrumentos. En particular, el flujo de gas que transfiere el hidruro al atomizador es especialmente importante y ha de comprobarse.

2.4.6. Requisitos específicos de la espectrometría de absorción atómica por vapor frío

El vapor frío se usa sólo en el caso del mercurio. Dadas las pérdidas de mercurio elemental por volatilización y adsorción, ha de prestarse una atención especial durante todo el análisis. Debe tenerse el máximo cuidado en evitar la contaminación debida a los reactivos o al entorno.

Para obtener resultados correctos en el contenido total del mercurio, es preciso proceder a la descomposición oxidativa de los compuestos orgánicos que contienen mercurio. Para la descomposición deben utilizarse sistemas sellados con digestión asistida por microondas o incinerador de alta presión. Debe observarse un cuidado especial al limpiar el equipo que ha estado en contacto con el mercurio.

Conviene trabajar con la técnica de inyección de flujo. Para límites de decisión más bajos, se recomienda la adsorción de mercurio elemental en un adsorbente de oro/platino, seguida de desorción térmica. La humedad en torno al absorbente o la celda falsea la medición, por lo que debe evitarse.

2.4.7. Requisitos específicos de la espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente (ICP-AES)

La espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente (10) es un método que permite la medición simultánea de diversos elementos. Para emplear la ICP-AES, primero ha de procederse a la digestión de las muestras para descomponer las matrices orgánicas. Se utilizarán sistemas sellados con digestión asistida por microondas o incinerador de alta presión. La calibración de los instrumentos y la selección de la longitud de onda desempeñan un papel esencial para un análisis ICP-AES correcto. Para la calibración de los instrumentos, en el caso de curvas de calibración lineales, suele ser necesaria la medición de sólo cuatro concentraciones de las soluciones de calibración, ya que las curvas de calibración ICP-AES suelen ser lineales para cuatro a seis órdenes de magnitud de concentración. Generalmente, ha de procederse a la calibración del sistema ICP-AES con un patrón válido para múltiples elementos, que se preparará en una solución que contenga la misma concentración de ácidos que la solución de medición. Se comprobarán las concentraciones de elemento en la curva lineal.

La selección de longitudes de onda para la medición de la emisión de los analitos debe adecuarse a las concentraciones de los elementos que han de determinarse. Si la concentración del analito se encuentra fuera del intervalo de trabajo de una línea de emisión, se utilizará otra línea de emisión. Al principio, se elegirá la línea de emisión más sensible (sin interferencias) y, después, otra menos sensible. Si se trabaja en el límite de detección o cerca de él, lo mejor suele ser optar por la línea más sensible para el analito correspondiente. Las interferencias espectrales y de fondo originan las principales dificultades en ICP-AES. Pueden producirse interferencias el desplazamiento simple del fondo, como el desplazamiento oblicuo del fondo, la superposición espectral directa y el desplazamiento complejo del fondo. Cada una de estas interferencias tiene sus propias causas y remedios. Según las matrices se aplicarán correcciones de interferencias y se optimarán los parámetros operativos. Algunas interferencias pueden evitarse mediante dilución o adaptación de las matrices. En cada lote de muestras de análisis, tanto el material de referencia y enriquecido que contiene cantidades conocidas del analito como el material blanco se tratarán del mismo modo que las muestras de análisis. Para controlar posibles desviaciones, se comprobará el patrón después de unas 10 muestras. Todos los reactivos y el gas plasma será la mayor pureza disponible.

2.4.8. Requisitos específicos de la espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) (11)

La determinación de indicios de elementos de masa atómica media, como el cromo, el cobre y el níquel, puede sufrir fuertes interferencias de otros iones isobáricos y poliatómicos. Ello sólo puede evitarse si se dispone de un poder de resolución mínimo de 7 000 -8 000 . Entre las dificultades de las técnicas MS figuran la desviación instrumental, los efectos de matriz y la interferencia de iones moleculares (m/z < 80). Es precisa una estandarización interna múltiple que cubra el mismo ámbito de masa que los elementos por determinar para corregir la desviación instrumental y los efectos de matriz.

Debe descomponerse completamente la materia orgánica de las muestras antes de proceder a mediciones por ICP-MS. Como para la AAS, tras su digestión en sistemas sellados, los elementos volátiles, como el yodo, deben transferirse a un estado de oxidación estable. Las mayores interferencias proceden de combinaciones de iones moleculares de argón (gas plasma), hidrógeno, carbono, nitrógeno y oxígeno (ácidos empleados para la disolución, impurezas del gas plasma y gases atmosféricos incorporados) y la matriz de la muestra. Para evitar interferencias es preciso proceder a la digestión completa, las mediciones del fondo, la correcta elección de las masas analíticas que a veces se asocian con una menor abundancia (límite de detección más pobre) y la disolución de los ácidos empleados para la disolución, por ejemplo el ácido nítrico.

Para determinar los elementos deben excluirse las interferencias mediante la correcta elección de las masas analíticas específicas, lo que incluye la confirmación de las relaciones de isótopos. Se comprobará la respuesta instrumental para cada medición, teniendo en cuenta los factores de Fano, por medio de patrones internos.

3. VALIDACIÓN

La validación demostrará que el método analítico cumple los criterios relativos a las características de funcionamiento aplicables.

Controles con objetivos diferentes requieren distintas categorías de métodos. El cuadro siguiente determina qué características de funcionamiento han de comprobarse para cada tipo de método.







Cuadro 9 Clasificación de los métodos analíticos en función de las características de funcionamiento que deben determinarse Límite de detección CCβ Límite de decisión CCα Veracidad/la recuperación Precisión Selectividad/especificidad Aplicabilidad/robustez/estabilidad Métodos cualitativos S + – – – + + C + + – – + + Métodos cuantitativos S + – – + + + C + + + + + +

3.1. PROCEDIMIENTOS DE VALIDACIÓN

En este capítulo se ofrecen ejemplos o referencias de procedimientos de validación de los métodos analíticos. Pueden utilizarse otros enfoques para demostrar que el método analítico cumple los criterios de funcionamiento, a condición de que alcancen la misma cantidad y calidad de información.

La validación también puede realizarse a través de un estudio interlaboratorios, como se establecen en el Codex Alimentarius, las normas ISO o la IUPAC (12), o de acuerdo con métodos alternativos como estudios en un solo laboratorio, o la validación interna (13) (14). Esta parte se centra en los estudios en un solo laboratorio (o validación interna) a través de un enfoque modular. Este enfoque consiste en:

1) un conjunto de características comunes de funcionamiento, independiente del modelo de validación empleado, y

2) procedimientos más específicos que dependen del modelo, tal como se presenta en el cuadro 10 a continuación.







Cuadro 10 Parámetros de funcionamiento independientes y dependientes del modelo Validación Parámetros de funcionamiento independientes del modelo Parámetros de funcionamiento dependientes del modelo Características comunes de funcionamiento (3.1.1) Enfoque convencional de la validación (3.1.2) Enfoque de la validación interna (3.1.3) Especificidad La recuperación La recuperación Veracidad Repetibilidad Repetibilidad Robustez: cambios menores Reproducibilidad intralaboratorio Reproducibilidad intralaboratorio Estabilidad Reproducibilidad Reproducibilidad El límite de decisión (CCα) El límite de decisión (CCα) Capacidad de detección (CCβ) Capacidad de detección (CCβ) Curvas de calibración Curvas de calibración Robustez: cambios importantes Robustez

3.1.1. Características de funcionamiento independientes del modelo

Al margen del enfoque de validación que se adopte, deben determinarse las siguientes características de funcionamiento. Para minimizar la carga de trabajo, puede emplearse un planteamiento cuidadosamente diseñado y estadísticamente sólido para combinar experimentos realizados con el fin de determinar diferentes parámetros.

3.1.1.1. Especificidad

En los métodos analíticos es importante el poder de distinción entre el analito y sustancias afines (isómeros, metabolitos, productos de degradación, sustancias endógenas, constituyentes de la matriz, etc.). Son necesarios dos enfoques para comprobar si existen interferencias.

Por ello, se elegirán sustancias que potencialmente interfieran y se analizarán muestras en blanco pertinentes para detectar posibles interferencias y valorar sus efectos:

— seleccione una gama de compuestos químicamente relacionados (metabolitos, derivados, etc.) u otras sustancias que puedan encontrarse en las muestras con el compuesto de interés,

— analice un número apropiado de muestras en blanco representativas (n ≥ 20) y verifique posibles interferencias (señales, picos, indicios de iones) en la región de interés en la que cabe esperar la elución del analito,

— asimismo, se enriquecerán muestras en blanco representativas hasta una concentración adecuada con sustancias que pueden interferir con la identificación o la cuantificación del analito,

— después del análisis estudie si: — dicha presencia puede conducir a una falsa identificación, — la identificación del analito se ve dificultada por la presencia de una o más interferencias, o — la cuantificación sufre una influencia apreciable.

3.1.1.2. Veracidad

En este apartado se describe la determinación de la veracidad (un componente de la exactitud). La veracidad sólo puede establecerse mediante material de referencia certificado (CRM). Se utilizará CRM siempre que se pueda. El procedimiento se describe detalladamente en la norma ISO 5725-4 (5). Presentamos un ejemplo a continuación:

— analice 6 muestras idénticas del CRM siguiendo las instrucciones de ensayo del método,

— determine la concentración del analito en cada una de dichas muestras,

— calcule la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación (%) para estas concentraciones,

— calcule la veracidad dividiendo la concentración media detectada por el valor certificado (medido como concentración) y multiplíquelo por 100, para expresar el resultado en porcentaje:

Veracidad (%) = concentración media detectada (tras introducción del factor corrector de recuperación) × 100/valor certificado.

Si no se dispone de CRM, en lugar de la veracidad puede determinarse la recuperación, tal como se describe en el punto 4.1.2.1.

3.1.1.3. Aplicabilidad/robustez (cambios menores)

En estos estudios se utiliza la introducción deliberada por el laboratorio de variaciones menores razonables y la observación de sus consecuencias.

Deben realizarse estudios previos a la investigación seleccionando factores del pretratamiento, limpieza y análisis de la muestra que pueden influir en los resultados de la medición. Entre estos factores se cuentan el operador, la procedencia y la edad de los reactivos, disolventes, patrones y extractos de la muestra, la velocidad de calentamiento, la temperatura, el pH y muchos otros factores que pueden darse en el laboratorio. Conviene modificar dichos factores en un orden de magnitud acorde con las desviaciones habituales entre laboratorios.

— identifique posibles factores que pudieran influir en los resultados,

— varíe ligeramente cada factor,

— realice una prueba de robustez según el método de Youden (15)(16) (a este nivel pueden emplearse otros métodos homologados, pero el método de Youden reduce al mínimo el tiempo y el esfuerzo requeridos). El método de Youden es un diseño factorial fraccional. No permite detectar interacciones entre los diversos factores,

— si se observa que un factor influye significativamente en los resultados de la medición, proceda a otros experimentos para determinar los límites de aceptabilidad de dicho factor,

— los factores que influyen significativamente en los resultados deben quedar claramente identificados en el protocolo del método.

La idea de base no es estudiar una alteración a la vez, sino introducir diversas variaciones simultáneamente. Por ejemplo, imaginemos que A, B, C, D, E, F, G son los valores nominales de siete factores distintos que podrían influir en los resultados si sus valores nominales se cambian ligeramente. Demos a sus valores alternativos las minúsculas correspondientes a, b, c, d, e, f, g. Esto nos da 27 o 128 combinaciones diferentes.

Puede tomarse un subconjunto de ocho de dichas combinaciones, con una mezcla equilibrada de mayúsculas y de minúsculas (cuadro 11). Debe procederse a ocho determinaciones, utilizando una combinación de los factores elegidos (A-G). En el cuadro 11 se presentan los resultados de las determinaciones (S-Z).







Cuadro 11 Configuración del experimento para estudios de robustez (cambios menores) Valor del factor F Combinación de determinaciones 1 2 3 4 5 6 7 8 A/a A A A A a a a a B/b B B b b B B b b C/c C c C c C c C c D/d D D d d d d D D E/e E e E e e E e E F/f F f f F F f f F G/g G g g G g G G g Resultado observado R S T U V W X Y Z Para los cálculos, véanse los ejemplos de ensayos de robustez en el punto 3.3.

3.1.1.4. Estabilidad

Se ha observado que la insuficiente estabilidad del analito o de los constituyentes de la matriz en la muestra durante el almacenamiento o el análisis puede dar origen a desviaciones significativas del resultado del análisis. Además, debe comprobarse la estabilidad del patrón de calibración en la solución. Normalmente, la estabilidad del analito está debidamente caracterizada para diversas condiciones de almacenamiento. El control de las condiciones de almacenamiento debe formar parte del sistema habitual de acreditación del laboratorio. Si no se conoce este particular, a continuación se ofrecen ejemplos de cómo determinar la estabilidad.

Estabilidad del analito en la solución

— Prepare nuevas soluciones madre del analito y dilúyalas, siguiendo las instrucciones de ensayo, para obtener el número suficiente de alícuotas (por ejemplo, 40) de cada concentración seleccionada (en torno al límite de funcionamiento mínimo exigido en el caso de sustancias para las que no se ha establecido un límite permitido, o en torno al límite permitido para las demás sustancias). Prepare soluciones de los analitos empleados en el enriquecimiento y en la solución del análisis final, y de cualquier otra solución de interés (por ejemplo, patrones derivados).

— Mida el contenido de analito en la solución recién preparada, siguiendo las instrucciones de ensayo.

— Vierta los volúmenes adecuados en recipientes apropiados, etiquételos y almacénelos de acuerdo con el procedimiento descrito en el cuadro 12.



Cuadro 12 Procedimiento para la determinación de la estabilidad del analito en la solución – 20 °C + 4 °C + 20 °C A oscuras 10 alícuotas 10 alícuotas 10 alícuotas A la luz 10 alícuotas

— El tiempo de almacenamiento puede ser de 1, 2, 3 y 4 semanas o más si es necesario, es decir, hasta que se observen los primeros fenómenos de degradación durante la identificación o la cuantificación. Debe registrarse el tiempo máximo y las condiciones óptimas de almacenamiento.

— Debe calcularse la concentración del analito (o los analitos) en cada alícuota tomando como valor 100 % la solución del analito recién preparado en el momento del análisis. Ci = concentración en el momento i Cfresco = concentración de la solución recién preparada.

Estabilidad del analito (o los analitos) en la matriz

— Utilice muestras reales siempre que sea posible. Cuando no disponga de ellas, utilice matriz enriquecida con el analito.

— Si dispone de ellas, determine la concentración en el material mientras está aún fresco. Tome otras alícuotas del material después de 1, 2, 4 y 20 semanas, y determine las concentraciones. El tejido debe almacenarse como mínimo a - 20 °C, o menos si es necesario.

— Si no dispone de material real, tome material en blanco y homogenéicelo. Divida el material en 5 alícuotas. Enriquezca cada alícuota con el analito, preparado de preferencia en una pequeña cantidad de solución acuosa. Analice una alícuota inmediatamente. Almacene las alícuotas restantes como mínimo a - 20 °C, o menos si es necesario, y analícelas tras 1, 2, 4 y 20 semanas.

3.1.1.5. Curvas de calibración

Cuando se utilizan curvas de calibración para la cuantificación es preciso:

— emplear al menos cinco niveles (incluyendo el cero) en la construcción de la curva,

— describir el intervalo de trabajo de la curva,

— describir la fórmula matemática de la curva y la bondad del ajuste de los datos a la curva,

— describir los márgenes de aceptabilidad de los parámetros de la curva.

Si es necesaria una calibración en serie de una solución patrón, se indicarán ámbitos aceptables para los parámetros de la curva de calibración, que pueden variar de una serie a otra.

3.1.2. Procedimientos convencionales de validación

El cálculo de los parámetros por métodos convencionales exige la realización de diversos experimentos aislados. Debe determinarse cada característica de funcionamiento para cada cambio importante (véase el apartado sobre aplicabilidad/robustez). Con los métodos multianalitos pueden analizarse varios analitos simultáneamente, siempre que previamente se hayan descartado posibles interferencias de importancia. De modo similar pueden determinarse varias características de funcionamiento. Así pues, para minimizar la carga de trabajo es conveniente combinar los experimentos cuando sea posible (por ejemplo, la repetibilidad y la reproducibilidad intralaboratorio con la especificidad, el análisis de muestras en blanco para determinar el límite decisión y las pruebas de especificidad).

3.1.2.1. La recuperación

cuando no se dispone de CRM, debe determinarse la recuperación mediante experimentos con matriz en blanco enriquecida, por ejemplo mediante el procedimiento siguiente:

— seleccione 18 alícuotas de un material en blanco y enriquezca cada 6 de ellas con 1, 1,5 y 2 veces el límite de funcionamiento mínimo exigido o 0,5, 1 y 1,5 veces el límite permitido,

— analice las muestras y calcule la concentración en cada muestra,

— mediante la siguiente ecuación, calcule la recuperación para cada muestra,

— calcule la recuperación media y el CV de los 6 resultados a cada nivel,

— % de recuperación = 100 × contenido medido/nivel de enriquecimiento.

El método convencional de determinación de la recuperación es una variante del método de adición de patrón descrito en el punto 3.5, si:

— la muestra se considera en blanco, en vez de una muestra para analizar,

— se considera que el componente final ( 1 ) y la recuperación ( 2 ) son similares para ambas porciones de ensayo,

— las muestras de ensayo tienen la misma masa, y los extractos de las fracciones de ensayo el mismo volumen,

— la cantidad de patrón de calibración añadida a la segunda porción de ensayo (enriquecida) se expresa x ADD . (x ADD = ρ A .V A ),

— x 1 es el valor medido del blanco y x 2 el valor medido de la segunda porción de ensayo (enriquecida);

— entonces, el % de recuperación = 100 (x 2 - x 1 )/x ADD .

Si cualquiera de las condiciones mencionadas no se cumple (o se supone que no se cumple), se llevará a cabo el procedimiento completo de determinación de la recuperación por el método de la adición de patrón que se describe en el punto 3.5.

3.1.2.2. Repetibilidad

— Prepare un conjunto de muestras de matrices idénticas, enriquecidas con el analito para dar concentraciones equivalentes a 1, 1,5 y 2 veces el límite de funcionamiento mínimo exigido o 0,5, 1 y 1,5 veces el límite permitido.

— En cada nivel debe procederse al análisis con un mínimo de 6 muestras idénticas.

— Analice las muestras.

— Calcule la concentración detectada en cada muestra.

— Determine la concentración media, la desviación estándar y el coeficiente de variación (%) de las muestras enriquecidas.

— Repita estos pasos al menos otras dos veces.

— Calcule las concentraciones medias generales y los CV de las muestras enriquecidas.

3.1.2.3. Reproducibilidad intralaboratorio

— Prepare un conjunto de muestras de materiales de ensayo especificados (de matrices idénticas o diferentes), enriquecidas con el analito para dar concentraciones equivalentes a 1, 1,5 y 2 veces el límite de funcionamiento mínimo exigido o 0,5, 1 y 1,5 veces el límite permitido.

— En cada nivel debe procederse al análisis con un mínimo de 6 muestras idénticas.

— Repita estos pasos al menos otras dos veces con operadores diferentes y distintas condiciones ambientales (por ejemplo, diferentes lotes de reactivos, disolventes, temperaturas ambientales, instrumentos, etc.).

— Analice las muestras.

— Calcule la concentración detectada en cada muestra.

— Determine la concentración media, la desviación estándar y el coeficiente de variación (%) de las muestras enriquecidas.

3.1.2.4. Reproducibilidad

De acuerdo con la norma ISO 5725-2 (5), para verificar la reproducibilidad los laboratorios deben participar en estudios colaborativos.

3.1.2.5. Límite de decisión (CCα)

El límite de decisión debe establecerse según los requisitos de identificación, o de identificación más cuantificación, definidos en la parte 2, «Criterios de funcionamiento y otros requisitos y procedimientos de los métodos analíticos».

▼C2

En el caso de sustancias para las que se ha establecido un límite permitido, se puede establecer el CCα:

▼B

— bien mediante el procedimiento de curva de calibración, de conformidad con la norma ISO 11843 (17) (denominado valor crítico de la variable de estado neto). En este caso, se utilizará material blanco, enriquecido hasta el límite de funcionamiento mínimo exigido, y por encima del mismo, en incrementos equidistantes. Analice las muestras. Tras la identificación, delimite la señal frente a la concentración añadida. El límite de decisión es igual a la concentración correspondiente a la ordenada en el origen más 2,33 veces la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio de la ordenada en origen. Esto sólo se aplica a análisis cuantitativos (α = 1 %),

— bien analizando un mínimo de 20 materiales blancos por matriz, para poder calcular la relación señal-ruido en la banda en la que se espera encontrar el analito. Puede usarse como límite de decisión un valor triple al de la relación señal-ruido. Esto es aplicable a análisis cuantitativos y cualitativos.

En el caso de sustancias para las que no se ha establecido un límite permitido, se puede establecer el CCα:

— bien mediante el procedimiento de curva de calibración, de conformidad con la norma ISO 11843 (17) (denominado valor crítico de la variable de estado neto). En este caso, se utilizará material blanco, enriquecido en torno al límite permitido en incrementos equidistantes. Analice las muestras. Tras la identificación, delimite la señal frente a la concentración añadida. El límite de decisión (α = 5 %) equivale a la concentración correspondiente al límite permitido más 1,64 veces la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio,

— bien analizando un mínimo de 20 materiales blancos por matriz, enriquecidos con analito hasta el límite permitido. El límite de decisión (α = 5 %) es igual a la concentración en el límite permitido más 1,64 veces la desviación estándar correspondiente.

Véase también el artículo 5 y el punto 3.2.

3.1.2.6. La capacidad de detección (CCβ)

La capacidad de detección debe establecerse según los requisitos definidos de cribado, de identificación o de identificación más cuantificación (véase la parte 2).

En el caso de sustancias para las que no se ha establecido un límite permitido, se puede establecer el CCβ:

— bien mediante el procedimiento de curva de calibración, de conformidad con la norma ISO 11843 (17) (denominado valor mínimo detectable de la variable de estado neto). En este caso, se utilizará material blanco representativo, enriquecido hasta el límite de funcionamiento mínimo exigido, y por debajo del mismo, en incrementos equidistantes. Analice las muestras. Tras la identificación, delimite la señal frente a la concentración añadida. La capacidad de detección (β = 5 %) es igual a la concentración correspondiente al límite de decisión más 1,64 veces la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio del contenido medio medido en el límite decisión,

— bien analizando un mínimo de 20 materiales blancos por matriz, enriquecidos con analito en cantidades hasta el límite de decisión. Analice las muestras e identifique los analitos. La capacidad de detección (β = 5 %) es igual al valor del límite de decisión más 1,64 veces la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio del contenido medido,

— si no se dispone de resultados cuantitativos, la capacidad de detección puede determinarse investigando el material blanco enriquecido hasta el límite de decisión y por encima del mismo. En este caso, la capacidad de detección del método es igual al nivel de concentración, en el que sólo queda ≤ 5 % de resultados de falso conforme. Por ello, debe procederse a un mínimo de 20 análisis para al menos un nivel de concentración a fin de garantizar la fiabilidad de esta determinación.

En el caso de sustancias para las que se ha establecido un límite permitido, se puede establecer el CCβ:

— bien mediante el procedimiento de curva de calibración, de conformidad con la norma ISO 11843 (17) (denominado valor mínimo detectable de la variable de estado neto). En este caso, se utilizará material blanco representativo, enriquecido en torno al límite permitido en incrementos equidistantes. Analice las muestras e identifique los analitos. Calcule la desviación estándar del contenido medio en el límite de decisión. La capacidad de detección (ß = 5 %) es igual a la concentración correspondiente al valor del límite de decisión más 1,64 veces la desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio.

— bien analizando un mínimo de 20 materiales blancos por matriz, enriquecidos con analito hasta el límite de decisión. La capacidad de detección (β = 5 %) es igual al valor del límite de decisión más 1,64 veces la desviación estándar correspondiente.

Véase también el punto 3.2.

3.1.2.7. Robustez (cambios importantes)

El método de análisis debe probarse en diversas condiciones experimentales, por ejemplo ante diferentes especies, matrices o condiciones de muestreo. Los cambios introducidos deben ser importantes. La importancia de esos cambios puede evaluarse utilizando, por ejemplo, el enfoque Youden (15) (16). Para todo cambio importante debe determinarse cada característica de funcionamiento que haya tenido un efecto significativo en el funcionamiento del análisis.

3.1.3. Validación mediante métodos alternativos

Si se aplican procedimientos alternativos de validación, se indicará en el protocolo de validación el modelo y la estrategia, con sus respectivos requisitos previos, hipótesis y fórmulas, o, cuando menos, sus referencias. Se presenta a continuación un ejemplo de planteamiento alternativo. Si se aplica, por ejemplo, el modelo de validación interna, las características de funcionamiento se determinan de una manera que permita una validación para los cambios importantes en el mismo procedimiento de validación. Ello exige definir un plan experimental de validación

3.1.3.1. Plan experimental

Debe elaborarse un plan experimental, en función del número de especies y de factores diferentes que se pretenda estudiar. Por ello, en el primer paso de todo el proceso de validación se estudiarán las poblaciones de muestras que se analizarán en el futuro en el laboratorio para seleccionar las especies más importantes y aquellos factores que pueden influir en los resultados de las mediciones. Posteriormente, se elegirá el intervalo de concentración adaptado a la finalidad de acuerdo con el nivel de interés.

Ejemplo:

— Pueden estudiarse simultáneamente varios analitos mediante el método de análisis que se está validando.

— Se han identificado dos variantes del factor dominante (A y B). Los factores dominantes forman la base sobre la cual se combinan los niveles del factor. Entre estos factores dominantes pueden figurar la especie o la matriz. En el presente ejemplo, el factor dominante se varió en dos niveles, es decir, se consideraron dos especies distintas (A y B). De manera general, se pueden variar los factores dominantes en más de dos niveles, lo cual sólo aumenta el número de análisis que deben realizarse.

— Los factores seleccionados se variarán en dos niveles (que se indican como + o -).







Cuadro 13 Factores considerados importantes en el procedimiento de validación Sexo del animal (factor 1) Raza (factor 2) Condiciones de transporte (factor 3) Condiciones de almacenamiento (factor 4) Frescura de la muestra (factor 5) Condiciones de engorde (factor 6) Distintos operadores con diferentes grados de experiencia (factor 7)







Cuadro 14 Posible plan experimental para el ejemplo propuesto Especie Factor 1 Factor 2 Factor 3 Factor 4 Factor 5 Factor 6 Factor 7 Muestra no A + + + + – + – 1 A + + – – + – – 2 A + – + – – – + 3 A + – – + + + + 4 A – + + – + + + 5 A – + – + – – + 6 A – – + + + – – 7 A – – – – – + – 8 B + + + + + – + 9 B + + – – – + + 10 B + – + – + + – 11 B + – – + – – – 12 B – + + – – – – 13 B – + – + + + – 14 B – – + + – + + 15 B – – – – + – + 16

Como cada muestra (cada combinación de nivel de factores) tiene que enriquecerse con 4 concentraciones distintas en torno al nivel de interés, y como debe analizarse una muestra en blanco por nivel, se realizarán 5 × 16 = 80 análisis para todo el experimento de validación.

De los resultados de estos 80 resultados medidos es posible calcular (13) (14):

Recuperación

— la repetibilidad por nivel de concentración (s ir ),

— la reproducibilidad intralaboratorio por nivel de concentración (s iR ),

— el límite de decisión (CCα),

— la capacidad de detección (CCβ),

— la curva de potencias (índice de error β frente a concentración; véase el punto 3.1.3.2),

— la robustez frente a los cambios importantes; la robustez frente a los cambios menores puede determinarse de acuerdo con lo expuesto en el punto 3.1.1.3,

— 16 curvas de calibración dependientes de la muestra,

— 1 curva de calibración global,

— el intervalo de predicción de la curva de calibración global,

— las desviaciones inducidas por la matriz (S mat ),

— las desviaciones inducidas por el proceso de análisis (S run ),

— el efecto de cada factor en los resultados de la medición.

Estas características de funcionamiento permiten la evaluación global del funcionamiento del método, pues no sólo se estudia la influencia de cada factor, sino también las combinaciones pertinentes de estos factores. Con ayuda de esta configuración experimental puede decidirse si se excluye de la curva de calibración global alguno de los factores, por apartarse significativamente de las desviaciones estándar de los demás factores.

3.1.3.2. Curva de potencias

La curva de potencias da información sobre la capacidad de detección del método en el intervalo de concentración elegido. Hace referencia al error β en la aplicación del método estudiado. La curva de potencias permite calcular la capacidad de detección de cada categoría de métodos (cribado, confirmación) o tipo (cualitativo o cuantitativo) para un error β determinado (por ejemplo, 5 %).

Figura 1

Curva de potencias

En la figura 1 se presenta un ejemplo del establecimiento gráfico de la capacidad de detección (CCβ) de un método analítico. Este método concreto presenta un riesgo remanente del 5 % de llegar a una decisión de falso conforme en una concentración de 0,50 μg/kg. En una concentración de 0,55 μg/kg el riesgo de llegar a una decisión de falso conforme disminuye hasta el 1 %.

3.1.3.3. Reproducibilidad

La determinación de la reproducibilidad de un método mediante el concepto de estudio intralaboratorio (validación interna) exige la participación repetida en estudios de aptitud, de conformidad con las guías ISO 43-1 (3) y 43-2 (4). Los laboratorios pueden elegir sus propios métodos, siempre que se utilicen en condiciones de rutina. La desviación estándar del laboratorio puede utilizarse para evaluar la reproducibilidad del método.

3.2. REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LOS DIVERSOS LÍMITES ANALÍTICOS

Figura 2

Sustancias para las que no se ha establecido un límite permitido

Figura 3

Sustancias para las que se ha establecido un límite permitido

3.3. EJEMPLO DE CÁLCULO PARA ESTUDIAR LA ROBUSTEZ DEL MÉTODO ANTE CAMBIOS MENORES, SEGÚN EL MÉTODO DE YOUDEN (16)







Comparación de medias (A) AA = Σ(Ai)/4 AB = Σ(Bi)/4 AC = Σ(Ci)/4 AD = Σ(Di)/4 AE = Σ(Ei)/4 AF = Σ(Ei)/4 AG = Σ(Gi)/4 Aa = Σ(ai)/4 Ab = Σ(bi)/4 Ac = Σ(ci)/4 Ad = Σ(di)/4 Ae = Σ(ei)/4 Af = Σ(fi)/4 Ag = Σ(gi)/4 Compare las medias de las mayúsculas (AA a AG) con las medias de las minúsculas correspondientes (Aa a Ag). Si uno de los factores tiene un efecto, la diferencia será significativamente mayor que las diferencias de los otros factores. Un método robusto no debe verse afectado por los cambios que, con casi toda certeza, habrá entre laboratorios. Si no existe una diferencia destacada, la medición más realista del error aleatorio la dan las siete diferencias.







Diferencias (Di) Cuadrado de las diferencias (Di 2) Da = A – a = Σ(Ai) – Σ(ai) Db = B – b = Σ(Bi) – Σ(bi) Dc = C – c = Σ(Ci) – Σ(ci) Dd = D – d = Σ(Di) – Σ(di) De = E – e = Σ(Ei) – Σ(ei) Df = F – f = Σ(Fi) – Σ(fi) Dg = G – g = Σ(Gi) – Σ(gi) Da 2 = valor a Db 2 = valor b Dc 2 = valor c Dd 2 = valor d De 2 = valor e Df 2 = valor f Dg 2 = valor g

Desviación estándar de las diferencias Di (SDi):

Si el valor SDi obtenido es significativamente mayor que la desviación estándar del método hallada en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio expuestas (véase más arriba), puede deducirse que el conjunto de los factores influye en el resultado, aunque cada factor aislado no presente una influencia significativa, y que el método no es lo suficientemente robusto frente a las modificaciones escogidas.

3.4. EJEMPLOS DE CÁLCULO PARA EL PROCEDIMIENTO DE VALIDACIÓN INTERNA

Ejemplos y cálculos para el protocolo de validación interna descrito en el apartado «validación de acuerdo con modelos alternativos» (3.1.3) (13) (14).

3.5. EJEMPLOS DEL MÉTODO DE ADICIÓN DE PATRÓN

Una muestra de ensayo con un contenido de analito T se divide en dos porciones de ensayo 1 y 2 de masas respectivas m1 y m2. La porción de ensayo 2 se enriquece con un volumen VA de una solución de concentración ρA del analito. Tras las fases de extracción y de purificación del método se obtienen dos extractos de las fracciones de ensayo, de volúmenes respectivos V1 y V2. Se considera que la recuperación del analito es rc. Ambos extractos se analizan con un método de medición de sensibilidad b y dan una respuesta analítica de x1 y x2, respectivamente.

Suponiendo que rc y b sean iguales para el analito en la muestra natural y en la enriquecida, el contenido T puede calcularse de la manera siguiente:

Este método permite determinar la recuperación rc. A continuación, además del análisis que acabamos de describir, se enriquece parte del extracto de la porción de ensayo 1 (de volumen V3) con una cantidad conocida ρB.VB del analito y se analiza. La respuesta analítica es x3 y la recuperación es:

Puede calcularse también la sensibilidad b:

Se han descrito todas las condiciones de aplicación y los detalles (18).

▼M3 —————

▼M1









ANEXO II







Límites mínimos de funcionamiento exigidos Sustancia y/o metabolito Matrices MRPL Cloranfenicol Carne Huevos 0,3 μg/kg Leche Orina Productos de la acuicultura Miel Acetato de medroxiprogesterona Grasa de los riñones de cerdo 1 μg/kg Metabolitos de nitrofuranos: — furazolidona Carne de aves de corral 1 μg/kg para todos — furaltadona Productos de la acuicultura — nitrofurantoína — nitrofurazona ▼M2 Suma de verde de malaquita y verde de leucomalaquita Carne de productos de la acuicultura 2 μg/kg