2012R0640 — ES — 23.07.2012 — 000.001

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que modifica, con vistas a su adaptación al progreso técnico, el Reglamento (CE) no 440/2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) no 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH)

Rectificado por:

▼B

REGLAMENTO (UE) No 640/2012 DE LA COMISIÓN

de 6 de julio de 2012

que modifica, con vistas a su adaptación al progreso técnico, el Reglamento (CE) no 440/2008, por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) no 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH)

(Texto pertinente a efectos del EEE)

El Reglamento (CE) no 440/2008 de la Comisión ( 2 ) incluye los métodos de ensayo para la determinación de las propiedades fisicoquímicas, toxicológicas y ecotoxicológicas de las sustancias, que deben aplicarse a efectos del Reglamento (CE) no 1907/2006.

Visto el Reglamento (CE) no 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Preparados Químicos, se modifica la Directiva 1999/45/CE y se derogan el Reglamento (CEE) no 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) no 1488/94 de la Comisión así como la Directiva 76/769/CEE del Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la Comisión ( 1 ), y, en particular, su artículo 13, apartado 3,

Artículo 1

El anexo del Reglamento (CE) no 440/2008 queda modificado con arreglo al anexo del presente Reglamento.

Artículo 2

El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de la Unión Europea.

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.

ANEXO

El anexo del Reglamento (CE) no 440/2008 queda modificado como sigue:

Sustancias de referencia : Sustancias seleccionadas para utilizarse en el proceso de validación, cuyas respuestas en el sistema de ensayo de referencia in vitro o in vivo o en la especie de interés ya se conocen. Estas sustancias deben ser representativas de las clases de sustancias con las que esté previsto utilizar el método de ensayo, y deben representar toda la gama de respuestas que puede esperarse de las sustancias con las que pueda utilizarse, desde fuertes hasta débiles e incluso negativas. Es posible que se necesiten distintos conjuntos de sustancias de referencia para las diferentes fases del proceso de validación y para los distintos métodos de ensayo y usos de los ensayos (14).

Abreviaturas: AOO = Acetona: aceite de oliva (4:1, v/v); no CAS = número del Chemical Abstracts Service; DMF = N,N-dimetilformamida; DMSO = dimetilsulfóxido; DNCB = 2,4-dinitroclorobenceno; CE3 = concentración estimada que se considera necesaria para producir un índice de estimulación de 3; cobayas = resultado del ensayo con cobayas (es decir, el B. 6 o TG 406 de la OCDE) (13); AHC = aldehído hexilcinámico; Líq. = líquido; LLNA = resultado del ensayo con ganglios linfáticos locales de múrido (es decir, el B. 42 o TG 429 de la OCDE) (1); MEK = metil-etil-cetona; NA = no aplicable por ser el índice de estimulación < 3; NC = no calculado al haberse obtenido los datos de un solo estudio; Sól. = sólido; Veh. = vehículo del ensayo.

(7) Disponible comercialmente como Kathon CG (no CAS 55965-84-9), que es una mezcla 3:1 de CMI y MI. Las concentraciones relativas de cada componente varían del 1,1 % al 1,25 % (CMI) y del 0,3 % al 0,45 % (MI). Los componentes inactivos son sales de magnesio (del 21,5 % al 24 %) y nitrato de cobre (del 0,15 % al 0,17 %), y el resto de la formulación consiste en agua, entre el 74 % y el 77 %. Puede adquirirse fácilmente Kathon CG a través de Sigma-Aldrich y Rohm and Haas (actualmente, Dow Chemical Corporation).

(1) Se supone que no es sensibilizante en seres humanos, ya que no se han encontrado resultados clínicos de la prueba del parche, no está incluido en el juego de alérgenos de la prueba del parche y tampoco se han encontrado informes de casos de sensibilización en seres humanos.

Si no se cumple alguno de estos criterios, no pueden utilizarse estas normas de comportamiento para la validación del método similar o modificado.

(37) OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]

(35) OCDE (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Paris, France. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.

(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256.

(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.

(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.

(25) OCDE (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Disponible en la dirección: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.

(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Disponible en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

(17) Comité Científico Consultivo del CEVMA (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), Comisión Europea, Dirección General Centro Común de Investigación, Instituto de Sanidad y Protección de los Consumidores, Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos, april 2007. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]

(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185.

(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284.

(14) OCDE (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, París. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(13) OCDE (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257.

(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286.

(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273.

(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59.

(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.

(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.

(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.

(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79.

(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13-31.

(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169.

(1) OCDE (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

29. La reducción del número de grupos de dosis es la única diferencia entre los protocolos del LLNA y del rLLNA, por lo que este rLLNA no proporciona información sobre la relación dosis-respuesta. En consecuencia, no debe utilizarse el rLLNA cuando se necesite obtener información sobre dicha relación. Como en el LLNA de dosis múltiples, la máxima concentración de la sustancia problema evaluada en el rLLNA debe ser la concentración máxima que no induzca en el ratón toxicidad sistémica manifiesta ni excesiva irritación cutánea local (véase el punto 18).

19. El vehículo no debe interferir con el resultado del ensayo ni sesgarlo, y debe seleccionarse con el propósito de maximizar la solubilidad para conseguir la mayor concentración posible y de obtener a la vez una solución o suspensión que sea adecuada para la aplicación de la sustancia problema. Los vehículos recomendados son acetona: aceite de oliva (4:1, v/v), N,N-dimetilformamida, metil-etil-cetona, propilenglicol y dimetilsulfóxido (19), pero se pueden utilizar otros si se aporta una justificación científica suficiente. En determinadas situaciones, puede ser necesario utilizar un disolvente relevante desde el punto de vista clínico o la formulación comercial en que se vende la sustancia analizada, como control adicional. Se tendrá especial cuidado en velar por que las sustancias problema hidrófilas se incorporen a un sistema de vehículo que humedezca la piel y no se escurra inmediatamente, mediante la incorporación de los solubilizadores adecuados (por ejemplo, Pluronic® L92 al 1 %). Por tanto, se evitarán los vehículos totalmente acuosos.

11. Se utilizan sustancias de control positivo (CP) para demostrar que el ensayo funciona apropiadamente, respondiendo con la sensibilidad adecuada y reproducible cuando se aplica una sustancia problema sensibilizante de la que se ha caracterizado bien la magnitud de la respuesta. Se recomienda la inclusión de un CP en paralelo porque demuestra la competencia del laboratorio para efectuar con éxito cada ensayo y permite la evaluación de la reproducibilidad y comparabilidad intra e interlaboratorios. Por otra parte, ciertas autoridades normativas requieren la utilización de un CP en cada estudio, por lo que se aconseja a los usuarios que consulten con las autoridades competentes antes de efectuar el LLNA. En consecuencia, se recomienda el uso sistemático de un CP en paralelo para evitar la necesidad, que podría surgir del uso de un CP periódico, de tener que efectuar ensayos adicionales con animales para cumplir los requisitos (véase el punto 12). El CP debe dar una respuesta positiva en el LLNA con un nivel de exposición calculado para producir un aumento del índice de estimulación > 3 con respecto al grupo de control negativo (CN). La dosis del CP debe ser tal que no provoque un exceso de irritación cutánea ni toxicidad sistémica, y que la inducción sea reproducible pero no excesiva (por ejemplo, un índice de estimulación > 20 sería excesivo). Los controles positivos preferidos son aldehído hexilcinámico (no del Chemical Abstracts Service [CAS] 101-86-0) al 25 % en acetona: aceite de oliva (4:1, v/v) y mercaptobenzotiazol (no CAS 149-30-4) al 5 % en N,N-dimetilformamida (véase el apéndice 1, cuadro 1). Puede haber circunstancias en que sea posible utilizar otros controles positivos, mediante una justificación adecuada y siempre que se cumplan los criterios antes mencionados.

9. Se eligen los animales al azar, se marcan para su identificación individual (pero no en las orejas) y se mantienen en sus jaulas al menos cinco días hasta el inicio de la administración de la sustancia, para que se aclimaten a las condiciones del laboratorio. Antes de iniciar el tratamiento, todos los animales serán examinados para comprobar que no presentan lesiones cutáneas observables.

7. El ratón es la especie elegida para este ensayo. Se utilizan hembras adultas jóvenes de las cepas CBA/Ca o CBA/J, nulíparas y que no estén preñadas. Al comienzo del estudio los animales deben tener una edad de 8 a 12 semanas; la variación del peso de los animales debe ser mínima, sin superar el 20 % del peso medio. También se podrán utilizar otras cepas y machos, si se aportan datos suficientes para demostrar que no existen diferencias significativas específicas de la cepa o del sexo en la respuesta del LLNA.

5. El LLNA es un método in vivo, por lo que no elimina el uso de animales para la evaluación de la sensibilización alérgica por contacto. No obstante, puede reducir el número de animales necesarios para este fin. Además supone un refinamiento sustancial (menos dolor y molestias) de la forma de utilizar animales en los ensayos de sensibilización alérgica por contacto. El LLNA se basa en la consideración de fenómenos inmunológicos desencadenados por sustancias químicas durante la fase de inducción de la sensibilización. Al contrario que los ensayos que utilizan cobayas (es decir, los del capítulo B.6, TG 406 de la OCDE) (13), el LLNA no necesita que se provoquen reacciones cutáneas de hipersensibilidad. Tampoco exige el uso de coadyuvantes, como ocurre en el ensayo de maximización con cobayas (13). Por consiguiente, el LLNA reduce el dolor y las molestias para los animales. A pesar de las ventajas que supone con respecto al ensayo del capítulo B.6 y a la TG 406 de la OCDE, ha de reconocerse que hay ciertas limitaciones que pueden obligar a utilizar el capítulo B.6 o la TG 406 de la OCDE (13) (por ejemplo, los resultados falsos negativos que se producen en el LLNA con determinados metales, los falsos positivos con algunos irritantes cutáneos (como algunos productos químicos del tipo de los agentes tensioactivos) (19) (20), o la solubilidad de la sustancia problema). Además, las sustancias o clases químicas que contienen grupos funcionales de los que se haya visto que actúan como posibles factores de confusión (21) pueden hacer necesario el uso de ensayos con cobayas (es decir, el B.6 o la TG 406 de la OCDE) (13). Por otra parte, según la limitada base de datos de la validación, que se refiere principalmente a formulaciones de plaguicidas, el LLNA tiene mayor probabilidad que el ensayo con cobayas de dar un resultado positivo con estos tipos de sustancias problema (22). Sin embargo, cuando se somete a ensayo una formulación, podría considerarse la inclusión de sustancias similares con resultados conocidos como sustancias de evaluación comparativa para demostrar que el LLNA funciona correctamente (véase el punto 16). Dejando aparte estas limitaciones detectadas, el LLNA debería ser aplicable para el ensayo de cualquier sustancia, salvo que haya propiedades asociadas a esta que puedan interferir con la exactitud del LLNA.

4. El LLNA constituye un método alternativo para identificar productos químicos que pueden ser sensibilizantes cutáneos. Esto no implica necesariamente que deba utilizarse en todos los casos el LLNA en lugar de los ensayos con cobayas (es decir, el B.6, TG 406 de la OCDE) (13), sino que, como su valor es equivalente, el LLNA puede emplearse como alternativa en la que, generalmente, los resultados positivos y negativos ya no necesitan una confirmación posterior. Antes de efectuar el estudio, el laboratorio de ensayo debe considerar toda la información disponible sobre la sustancia problema. Tal información ha de incluir la identidad y la estructura química de esta sustancia, sus propiedades fisicoquímicas, los resultados de cualquier otro ensayo de toxicidad in vitro o in vivo efectuado con ella, y los datos toxicológicos disponibles sobre sustancias relacionadas estructuralmente. Es necesario sopesar esta información a fin de determinar si el LLNA es apropiado para cada sustancia problema (dada la incompatibilidad de ciertos tipos de productos químicos con el LLNA; véase el punto 5) y de ayudar en la selección de las dosis.

2. El LLNA estudia la fase de inducción de la sensibilización cutánea y proporciona datos cuantitativos adecuados para la evaluación de la relación dosis-respuesta. Ha de señalarse que los sensibilizantes suaves o moderados que se recomiendan como productos químicos adecuados para el control positivo (CP) en métodos de ensayo con cobayas (es decir, el B.6, TG 406 de la OCDE) (13), son también apropiados para utilizarse en el LLNA (6) (8) (15). En este ME se describe también la opción de un LLNA reducido (rLLNA), que podría suponer una reducción de hasta el 40 % del número de animales utilizados (16) (17) (18). El rLLNA puede utilizarse cuando sea necesario a efectos normativos confirmar una predicción negativa de potencial de sensibilización cutánea, siempre que se respeten todas las demás especificaciones del protocolo del LLNA, como se describe en el presente ME. La predicción de un resultado negativo debe efectuarse sobre la base de toda la información disponible según se describe en el punto 4. Antes de aplicar el rLLNA, debe aportarse una justificación clara y científicamente motivada de su uso. Si, contra lo esperado, se obtiene un resultado positivo o dudoso en el rLLNA, puede ser necesario efectuar más ensayos para interpretar o aclarar la observación. El rLLNA no debe utilizarse para identificar el peligro de sustancias problema que sean sensibilizantes cutáneos cuando se necesite información sobre la relación dosis-respuesta, tal como la subcategorización a efectos del Reglamento (CE) no 1272/2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y del Sistema Globalmente Armonizado de las Naciones Unidas de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos.

1. Las directrices de ensayo de productos químicos de la OCDE (TG, por su nombre en inglés) y los métodos de ensayo de la UE basados en ellas se revisan periódicamente en función de los avances científicos, los cambios en las necesidades normativas y las consideraciones de bienestar de los animales. Ya se ha adoptado el método de ensayo (ME) original para la determinación de la sensibilización cutánea con ratones, la prueba con ganglios linfáticos locales (LLNA, de su nombre en inglés, que corresponde a la TG 429 de la OCDE, capítulo B.42 del presente anexo) (1). Se han publicado los datos de la validación del LLNA, así como una revisión de los trabajos asociados (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). El LLNA actualizado se basa en la evaluación de la experiencia y de los datos científicos (12). Este es el segundo ME que se diseña para evaluar el potencial de sensibilización cutánea de los productos químicos (sustancias y mezclas) en animales. El otro ME (es decir, el correspondiente a la TG 406 de la OCDE, capítulo B.6 del presente anexo) utiliza ensayos con cobayas, en concreto el ensayo de maximización en cobaya y el ensayo de Buehler (13). El LLNA resulta más ventajoso que el método B.6 y la TG 406 de la OCDE (13) en cuanto al bienestar de los animales. El presente ME LLNA actualizado incluye un conjunto de normas de comportamiento (NC) (apéndice 1) que puede utilizarse para evaluar la situación de la validación de métodos de ensayo nuevos o modificados que sean similares, desde el punto de vista funcional y mecánico, al LLNA, de acuerdo con los principios del documento de orientación no 34 de la OCDE (14).

14. No hay que descartar que, incluso después de repetir el ensayo, no se obtenga el número mínimo de tres tandas válidas requerido para cada sustancia estudiada en relación con cada sustancia de referencia en cada uno de los laboratorios participantes, lo que dejaría incompleto el cuadro de datos. En tales casos, deben cumplirse los siguientes tres criterios conjuntamente para poder considerar aceptables los conjuntos de datos:

13. Es posible que uno o varios de los ensayos correspondientes a una o más sustancias problema no cumplan los criterios de aceptación del ensayo en cuanto a las sustancias problema y de control, o no sean aceptables por otros motivos. Para completar los datos que falten respecto a cada sustancia problema se puede efectuar un máximo de dos ensayos adicionales (repeticiones del ensayo). Más precisamente, como en caso de repetición del ensayo también hay que ensayar en paralelo el CP y el CN, puede realizarse un máximo de dos tandas adicionales para cada sustancia problema.

12. La exactitud (sensibilidad, especificidad y exactitud general) del método propuesto similar o modificado debe ser comparable a la del MVR o mejor que esta, teniendo en cuenta la información adicional relativa a la pertinencia en la especie de interés (cuadro 2). La sensibilidad debe ser igual o superior (≥) al 80 % (2) (8) (23). Sin embargo, se aplica otra restricción específica a la sensibilidad del método in vitro propuesto, ya que solamente dos sustancias de la categoría 2 in vivo, el 1-decanol y el disulfuro de di-n-propilo, pueden ser clasificados erróneamente como “sin categoría” por más de un laboratorio participante. La especificidad debe ser igual o superior (≥) al 70 % (2) (8) (23). No hay ninguna otra restricción respecto a la especificidad del método in vitro propuesto, es decir, cualquier laboratorio participante puede clasificar erróneamente cualquier sustancia “sin categoría”in vivo siempre que la especificidad final del método de ensayo se mantenga dentro del rango aceptable. La exactitud general debe ser igual o superior (≥) al 75 % (2) (8) (23). Aunque la sensibilidad del MVR calculada con las veinte sustancias de referencia recogidas en el cuadro 1 sea igual al 90 %, el valor mínimo definido de sensibilidad que se exige para que un método similar o modificado se considere válido está fijado en el 80 %, ya que se sabe que tanto el 1-decanol (sustancia dudosa) como el disulfuro de di-n-propilo (falso negativo en el MVR) no son irritantes para los seres humanos (31) (32) (33), aunque estén identificados como irritantes en la prueba con conejos. Como los modelos de EhR están basados en células de origen humano, es posible que clasifiquen estas sustancias como no irritantes (“sin categoría” según el SGA de la ONU o el CLP de la UE).

(1) La elección de las sustancias se basa en los criterios siguientes: i) las sustancias se encuentran en el comercio, ii) son representativas de toda la gama de puntuaciones de la prueba de irritación de Draize (desde no irritantes hasta muy irritantes), iii) tienen una estructura química bien definida; iv) son representativas de los grupos funcionales químicos utilizados en el proceso de validación, y v) no están asociadas con un perfil extremadamente tóxico (por ejemplo, carcinogénesis o toxicidad para el sistema reproductor) ni con unos costes de eliminación prohibitivos.

7. Las sustancias de referencia se utilizan para determinar si la fiabilidad y la exactitud de un método propuesto similar o modificado, del que se haya demostrado que presenta una similitud al MVR suficiente desde el punto de vista estructural y funcional, o que represente una modificación poco importante de uno de los tres métodos validados, son comparables a las del MVR o mejores que estas (2) (8) (16) (23). Entre las veinte sustancias de referencia recomendadas que figuran en el cuadro 1 se encuentran sustancias representativas de diferentes clases químicas (es decir, categorías químicas basadas en grupos funcionales) y de toda la gama de puntuaciones de la prueba de irritación de Draize (desde no irritantes hasta muy irritantes). Las sustancias incluidas en esta lista comprenden diez sustancias de la categoría 2 del SGA de la ONU o del CLP de la UE, y otras diez sustancias sin categoría, de las que tres son sustancias de la categoría optativa 3 del SGA de la ONU. Según el presente método de ensayo, la categoría optativa 3 no se considera categoría (“sin categoría”). Las sustancias recogidas en el cuadro 1 se han elegido entre las sustancias utilizadas en la fase de optimización tras la prevalidación y en el estudio de validación del MVR, teniendo en cuenta los grupos funcionales químicos y el estado físico (14) (18). Estas sustancias de referencia representan el número mínimo de sustancias que deben utilizarse para evaluar la exactitud y la fiabilidad de un método propuesto similar o modificado, pero no deben utilizarse para el desarrollo de nuevos métodos. En situaciones en que no se disponga de alguna sustancia de la lista, se podrán utilizar otras sustancias para las que se disponga de datos de referencia in vivo adecuados, en principio del grupo de sustancias utilizadas en la fase de optimización tras la prevalidación o en el estudio de validación del MVR. Si así se desea, esta lista mínima de sustancias de referencia puede complementarse con sustancias adicionales representativas de otras clases químicas y para las que se disponga de datos de referencia in vivo adecuados, con el fin de evaluar mejor la exactitud del método propuesto.

3. Los métodos similares o modificados respecto a cualquiera de los tres métodos validados [EpiSkinTM (método validado de referencia– MVR), EpiDermTM SIT (EPI-200) y SkinEthicTM RHE] propuestos para utilizarse con arreglo al presente ME deben evaluarse a fin de determinar su fiabilidad y exactitud, utilizando sustancias representativas de toda la gama de puntuaciones de la prueba de irritación de Draize. Los métodos similares o modificados propuestos, cuando se evalúan con las veinte sustancias de referencia recomendadas de las normas de comportamiento (cuadro 1), deben presentar unos valores de fiabilidad y exactitud comparables a los del MVR o mejores que estos (cuadro 2) (2) (16). Los valores de fiabilidad y exactitud que deben alcanzarse se presentan en los puntos 8 a 12 del presente apéndice. Se incluyen sustancias no clasificadas (“sin categoría” según el SGA de la ONU o el CLP de la UE) y clasificadas (categoría 2 del SGA de la ONU o del CLP de la UE) (1), que representan diferentes clases químicas, de forma que la fiabilidad y la exactitud (sensibilidad, especificidad y exactitud general) del método propuesto puedan compararse con las del MVR. Antes de utilizar un método para ensayar nuevas sustancias problema, debe determinarse su fiabilidad, así como su capacidad para detectar correctamente las sustancias irritantes de la categoría 2 del SGA de la ONU o del CLP de la UE, y, en función del marco normativo para el que se obtienen los datos, también su capacidad para detectar correctamente las sustancias “sin categoría” según el SGA de la ONU o el CLP de la UE.

Sustancias de referencia : Sustancias seleccionadas para utilizarse en el proceso de validación, cuyas respuestas en el sistema de ensayo de referencia in vitro o in vivo o en la especie de interés ya se conocen. Estas sustancias deben ser representativas de las clases de sustancias con las que esté previsto utilizar el método de ensayo, y deben representar toda la gama de respuestas que puede esperarse de las sustancias con las que pueda utilizarse, desde fuertes hasta débiles e incluso negativas. Es posible que se necesiten distintos conjuntos de sustancias de referencia para las diferentes fases del proceso de validación y para los distintos métodos de ensayo y usos de los ensayos (9).

(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, 109-116.

(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animalin vivo data, ALTEX, 14, 359-365.

(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1-4.

(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp. 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.

(28) SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irritation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(27) EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(26) EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min-42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63.

(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, 231-243.

(23) OCDE (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No. 137, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]

(22) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2008), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(21) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(20) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2007), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy-Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358.

(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619.

(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.

(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.

(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349.

(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests – An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.

(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114.

(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770.

(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.

(9) OCDE (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(8) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2009), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (EHR)? Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(7) OCDE (2006), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(6) OCDE (2004), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(5) OCDE (2004), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(4) OCDE (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(3) Reglamento (CE) no 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) no 1907/2006. DO L 353 de 31.12.2008, p. 1.

(2) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2009), Statement on the “Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

— en función del marco normativo en el que se utilicen los resultados del presente ME, la sustancia problema podrá considerarse no irritante para la piel de acuerdo con la categoría “sin categoría” del SGA de la ONU o del CLP de la UE, si la viabilidad del tejido después de la exposición y la incubación tras el tratamiento es superior (>) al 50 %.

28. Los valores de DO obtenidos con cada sustancia problema pueden utilizarse para calcular el porcentaje de viabilidad respecto al CN, que se fija en el 100 %. Es necesario definir claramente y documentar, así como demostrar que son adecuados, el valor de corte del porcentaje de viabilidad celular que permite distinguir las sustancias problema irritantes de las no clasificadas, y el procedimiento o procedimientos estadísticos utilizados para evaluar los resultados e identificar las sustancias irritantes. A continuación se indican los valores de corte para la predicción del efecto irritante:

27. En cada método en que se utilicen lotes válidos de modelos de EhR (véase el punto 21), los tejidos tratados con el CN deben presentar una DO que refleje la calidad de los tejidos que hayan pasado por las fases de transporte y recepción y por todos los procesos del protocolo. Los valores de DO del control no deben ser inferiores a los límites históricamente establecidos. Análogamente, los tejidos tratados con el CP, es decir, DSS en solución acuosa al 5 %, deben reflejar su capacidad de responder a una sustancia irritante en las condiciones del ME (26) (27) (28). Deben definirse unas medidas asociadas y adecuadas de la variabilidad entre las réplicas del tejido [por ejemplo, si se utilizan desviaciones típicas (DT), deben estar dentro del intervalo de tolerancia del 95 % unilateral calculado a partir de los datos históricos; en el caso del MVR, la DT es < 18 %].

25. El ensayo del MTT es un método cuantitativo validado que debe utilizarse para medir la viabilidad celular según el presente ME. Es compatible con el uso de un modelo de tejido tridimensional. La muestra de tejido se coloca en una solución de MTT de la concentración adecuada (por ejemplo, de 0,3 a 1 mg/mL) durante 3 horas. A continuación, utilizando un disolvente (por ejemplo, isopropanol, isopropanol ácido), se extrae del tejido el precipitado que se produce de formazano azul y se mide la concentración de este determinando la DO a 570 nm, con un paso de banda máximo de ± 30 nm.

17. El ensayo utilizado para determinar la magnitud de la viabilidad es el del MTT (25). Los usuarios del modelo de EhR deben asegurarse de que cada lote utilizado de este modelo cumple los criterios definidos en relación con el control negativo (CN). La densidad óptica (DO) del disolvente de extracción solo debe ser suficientemente reducida, es decir, DO < 0,1. El diseñador o proveedor del modelo de EhR establece un rango de aceptabilidad (con un límite inferior y un límite superior) de los valores de DO de los controles negativos (en las condiciones del método de ensayo de irritación cutánea), y en el cuadro 2 se indican los rangos de aceptabilidad de los tres métodos validados. Hay que demostrar documentalmente que los tejidos tratados con el CN son estables en cultivo (proporcionan unas mediciones similares de la viabilidad) durante todo el tiempo de exposición del ensayo.

(2) Puntuación in vivo de acuerdo con el ME B.4 y la TG 404 de la OCDE (4).

13. Antes de proceder al uso sistemático de cualquiera de los tres métodos validados que se adhieren al presente ME, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica, utilizando las diez sustancias de referencia que se recogen en el cuadro 1. En caso de métodos similares desarrollados con arreglo al presente ME o de modificaciones de cualquiera de los tres métodos validados, antes de utilizar el método para ensayos normativos es necesario cumplir los requisitos de las normas de comportamiento descritos en el apéndice 2 del presente ME.

12. La viabilidad celular de los modelos de EhR se determina por la transformación enzimática del colorante vital MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, azul de tiazolilo; número CAS 298-93-1] en una sal azul de formazano que se mide cuantitativamente tras su extracción de los tejidos (25). Las sustancias irritantes se identifican por su capacidad de reducir la viabilidad celular por debajo de unos umbrales definidos (es decir, ≤ 50 %, en el caso los de irritantes de la categoría 2 del SGA de la ONU o del CLP de la UE). En función del marco normativo en que se utilicen los resultados de este ME, los productos químicos que producen viabilidades celulares por encima del nivel umbral definido, pueden considerarse no irritantes (es decir, > 50 %, “sin categoría”).

10. La sustancia problema se aplica tópicamente a un modelo de EhR tridimensional, formado por queratinocitos epidérmicos no transformados, obtenidos de seres humanos, que se han cultivado para formar un modelo de la epidermis humana bien diferenciado en varias capas. Consiste en las capas organizadas basal, espinosa y granulosa, y en un estrato córneo con varias capas intercelulares laminares de lípidos, que representan las principales clases de lípidos, análogas a las que se encuentran in vivo.

8. El presente ME se refiere al componente de irritación cutánea in vitro de la estrategia de ensayos secuenciales del ME B.4 (TG 404 de la OCDE) sobre corrosión o irritación cutánea (4). Aunque el presente ME no aporta información adecuada sobre la corrosión cutánea, ha de observarse que el ME B.40 bis (TG 431 de la OCDE) sobre corrosión cutánea se basa en el mismo sistema de ensayo con EhR, si bien utilizando un protocolo distinto (capítulo B.40 bis). El presente ME se basa en modelos de EhR que utilizan queratinocitos humanos, los cuales, por lo tanto, representan in vitro el órgano diana de la especie de interés. Además, cubre directamente la fase inicial de la cascada inflamatoria o mecanismo de acción (el daño celular y el daño tisular que provocan traumatismo localizado) que sucede durante la irritación in vivo. Durante la validación del presente ME se ha sometido a ensayo una amplia variedad de productos químicos, y la base de datos empíricos del estudio de validación contaba con 58 sustancias en total (16) (18) (23). El ME es aplicable a sólidos, líquidos, semisólidos y ceras. Los líquidos pueden ser acuosos o no acuosos; los sólidos pueden ser solubles o insolubles en agua. Cuando sea posible, deberán triturarse los sólidos para transformarlos en polvo fino antes de su aplicación; no es necesario realizar ningún otro tratamiento previo de la muestra. Aún no se ha efectuado ningún estudio de validación con gases y aerosoles (24). Aunque no hay que descartar que estos tipos de sustancias puedan estudiarse utilizando la tecnología de EhR, el ME actual no permite ensayar gases ni aerosoles. Ha de señalarse asimismo que los productos químicos muy coloreados pueden interferir con la medición de la viabilidad celular, lo que haría necesario utilizar controles adaptados para corregir esta interferencia (véanse los puntos 24 a 26).

7. Una limitación del ME, puesta de manifiesto en el estudio de validación (16), es que no permite la clasificación de los productos químicos en la categoría 3 optativa del SGA de la ONU (irritantes suaves) (1). Cuando se utilice como ensayo de sustitución parcial, es posible que se exija la realización de ensayos de seguimiento in vivo, para caracterizar plenamente el potencial de irritación cutánea (4 y capítulo B.4 del presente anexo). Se reconoce que el uso de piel humana está sujeto a condiciones y consideraciones éticas tanto nacionales como internacionales.

5. Antes de poder utilizar con fines normativos un método con EhR in vitro distinto del MVR, del EpiDermTM SIT (EPI-200) y del SkinEthicTM RhE, es necesario determinar su fiabilidad, pertinencia (exactitud) y limitaciones respecto al objetivo perseguido, a fin de garantizar que puede considerarse similar al MVR, de acuerdo con los requisitos de las NC establecidas en el presente ME (apéndice 2). Por otra parte, se recomienda consultar el documento explicativo de base de la OCDE sobre los ensayos de irritación cutánea in vitro antes de desarrollar y validar un método de EhR in vitro similar o modificado y de presentarlo para su adopción reglamentaria (23).

4. Hay tres métodos validados que se adhieren al presente ME. Se han completado los estudios de prevalidación, optimización y validación de un método in vitro (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), que utiliza un modelo de EhR, disponible comercialmente como EpiSkinTM (designado como método validado de referencia – MVR). Los otros dos métodos de irritación cutánea in vitro con EhR, disponibles comercialmente, han mostrado resultados similares a los del MVR según una validación basada en NC (21); se trata de los métodos EpiDermTM SIT (EPI-200) y SkinEthicTM RHE (22).

3. El presente ME se refiere al efecto sobre la salud humana denominado irritación cutánea. Se basa en la epidermis humana reconstruida (EhR), que, en su diseño general (utilización de queratinocitos epidérmicos no transformados, obtenidos de seres humanos, como origen de las células, y de un tejido y una arquitectura celular representativos), imita bien las propiedades bioquímicas y fisiológicas de las capas superiores de la piel humana, es decir, la epidermis. Este ME incluye también un conjunto de normas de comportamiento (NC) (apéndice 2) para la evaluación de métodos similares y modificados, basados en la EhR, y desarrollados por el CEVMA de la Comisión Europea (8), de acuerdo con los principios del documento de orientación no 34 de la OCDE (9).

2. La evaluación de la irritación cutánea, generalmente, ha implicado el uso de animales de laboratorio (véase la TG 404 de la OCDE, capítulo B.4 del presente anexo) (4). Respondiendo a la preocupación por el bienestar de los animales, el ME B.4 se revisó en 2004 para tener en cuenta la determinación de la corrosión o irritación cutánea aplicando una estrategia de ensayos secuenciales, utilizando métodos de ensayo validados in vitro o ex vivo, lo que evita infligir daños y sufrimiento a los animales. ►C1 Se han adoptado como TG 430, 431 y 435 de la OCDE ◄ tres métodos de ensayo in vitro validados (5) (6) (7), y dos de ellos como capítulos B.40 y B.40 bis del presente anexo, para su uso en la parte correspondiente a la corrosión de la estrategia de evaluación secuencial del capítulo B.4 o de la TG 404 de la OCDE (4).

1. La irritación cutánea se refiere a la producción de una lesión reversible de la piel como consecuencia de la aplicación de una sustancia problema durante un período de hasta 4 horas [según la definición del Sistema Globalmente Armonizado (SGA) de las Naciones Unidas de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos y del Reglamento (CE) no 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (1) (3)]. El presente método de ensayo (ME) proporciona un procedimiento in vitro que puede utilizarse para identificar el peligro de productos químicos irritantes (sustancias y mezclas) de acuerdo con la categoría 2 del SGA de la ONU y del sistema de clasificación, etiquetado y envasado (CLP, de su nombre en inglés) de la UE (1) (2) (3). En la UE y en otras regiones que no han adoptado la categoría 3 optativa del SGA de la ONU (irritantes suaves), el presente ME puede utilizarse también para identificar productos químicos no clasificados, es decir, los “sin categoría” del SGA de la ONU y del CLP de la UE (1) (3). El presente ME puede emplearse para determinar la capacidad de irritación cutánea de los productos químicos, como un ensayo independiente de sustitución del ensayo de irritación cutánea in vivo, dentro de una estrategia de evaluación secuencial (punto 4 y capítulo B.4 del presente anexo).

3) Se añaden los siguientes capítulos:

«B.49. ENSAYO DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULAS DE MAMÍFERO IN VITRO

INTRODUCCIÓN

1. El ensayo de micronúcleos in vitro (MNvit) es un ensayo de genotoxicidad para la detección de micronúcleos (MN) en el citoplasma de células en interfase. Los micronúcleos pueden proceder de fragmentos cromosómicos acéntricos (es decir, que carecen de centrómero) o de cromosomas completos que no pueden migrar a los polos durante la anafase de la división celular. El ensayo detecta la actividad de productos químicos clastogénicos y aneugénicos (sustancias y mezclas) (1) (2) en células que han sufrido la división celular durante la exposición a la sustancia problema o después de la misma. El presente método de ensayo (ME) permite el uso de protocolos con y sin citocalasina B (citoB), que es un inhibidor de la polimerización de la actina. La adición de citoB antes de la mitosis diana permite la identificación y el análisis selectivo de la frecuencia de micronúcleos en las células que han completado una sola mitosis porque dichas células son binucleadas (3) (4). Este ME permite también el uso de protocolos sin bloqueo de la citocinesis, siempre que haya pruebas de que la población celular analizada ha experimentado la mitosis.

2. Además de utilizar el ensayo de MNvit para identificar productos químicos (sustancias y mezclas) que inducen micronúcleos, el uso del bloqueo de la citocinesis, del etiquetado inmunoquímico de cinetocoros, o de la hibridación con sondas centroméricas o teloméricas [hibridación fluorescente in situ (FISH)] puede aportar también información sobre los mecanismos del daño cromosómico y de la formación de micronúcleos (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Los procedimientos de etiquetado e hibridación pueden utilizarse cuando hay un aumento en la formación de micronúcleos y el investigador desea determinar si el aumento es consecuencia de sucesos clastogénicos o aneugénicos.

3. Los micronúcleos representan un daño que se ha transmitido a las células hijas, mientras que las aberraciones cromosómicas registradas en las células en metafase pueden no transmitirse. Debido a que los micronúcleos de las células en interfase pueden evaluarse de forma relativamente objetiva, el personal de laboratorio solamente tiene que determinar si las células han sufrido o no la división y cuántas células contienen un micronúcleo. Como resultado, las preparaciones pueden evaluarse de forma relativamente rápida y el análisis puede automatizarse. Esto hace que sea factible evaluar miles en lugar de cientos de células por tratamiento, lo que aumenta el poder del ensayo. Finalmente, como los micronúcleos pueden derivarse de cromosomas retardados, existe la posibilidad de detectar agentes inductores de aneuploidía que son difíciles de estudiar en ensayos convencionales de aberraciones cromosómicas como, por ejemplo, la TG 473 de la OCDE (capítulo B.10 del presente anexo) (17). Sin embargo, el ensayo de MNvit no permite diferenciar las sustancias que inducen poliploidía de las que inducen efectos clastogénicos sin recurrir a técnicas especiales como la FISH mencionada en el punto 2.

4. El ensayo de MNvit es un método in vitro que utiliza normalmente células cultivadas de roedor o humanas. Proporciona una base general para investigar el potencial de causar daño cromosómicoin vitro porque permite detectar tanto anéugenos como clastógenos.

5. El ensayo de MNvit es sólido y efectivo con una diversidad de tipos celulares, y tanto en presencia como en ausencia de citoB. Hay muchos datos que apoyan la validez del ensayo de MNvit con diversas líneas celulares de roedor (CHO, V79, CHL/IU y L5178Y) y con linfocitos humanos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Aquí se incluyen, en particular, los estudios internacionales de validación coordinados por la Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) y los informes del International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Los datos disponibles también se han vuelto a evaluar en un estudio de validación retrospectiva con ponderación de los datos, por parte del Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (CEVMA) de la Comisión Europea, y el método de ensayo ha sido avalado en cuanto a su validez científica por el Comité científico consultivo del CEVMA (ESAC) (32) (33) (34). Se ha descrito el uso de la línea celular linfoblastoide humana TK6 (35), de células HepG2 (36) (37) y de células primarias de embrión de hámster sirio (38), aunque no se han utilizado en los estudios de validación.

DEFINICIONES

6. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

CONSIDERACIONES INICIALES

7. Los ensayos realizados in vitro suelen exigir la utilización de una fuente exógena de activación metabólica, salvo que las células sean competentes metabólicamente respecto a las sustancias que se ensayan. El sistema exógeno de activación metabólica no reproduce completamente las condiciones in vivo. Debe procurarse también evitar las circunstancias que puedan conducir a resultados falsos positivos que no reflejen la mutagenicidad intrínseca y que puedan deberse a factores tales como cambios en el pH o en la osmolalidad, o a altos niveles de citotoxicidad (39) (40) (41). Si la sustancia problema provoca un cambio en el pH del medio en el momento de su incorporación, hay que ajustar el pH, preferentemente amortiguando la solución madre de forma que todos los volúmenes en todas las concentraciones de ensayo, y respecto a todos los controles, se mantengan iguales.

8. Para analizar la inducción de la formación de micronúcleos, es fundamental que haya habido mitosis en los cultivos tanto tratados como sin tratar. La fase que proporciona más información para evaluar la formación de micronúcleos es la de las células que han completado una sola mitosis durante el tratamiento con la sustancia problema, o después de este tratamiento.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

9. Los cultivos celulares de origen humano o de mamífero se exponen a la sustancia problema tanto con una fuente exógena de activación metabólica como sin ella, salvo que se utilicen células con una capacidad adecuada de metabolización. En todos los ensayos se incluyen un control positivo (CP) y un control del disolvente o vehículo (CV) en paralelo.

10. Durante la exposición a la sustancia problema, o después de la misma, las células se cultivan durante un tiempo suficiente para que el daño cromosómico o del huso acromático provoquen la formación de micronúcleos en las células en interfase. Para la inducción de aneuploidía, es necesario normalmente que la sustancia problema esté presente durante la mitosis. Las células en interfase se recogen, se tiñen y se analizan para detectar la presencia de micronúcleos. Lo ideal es que los micronúcleos se evalúen solamente en las células que hayan completado la mitosis durante la exposición a la sustancia problema o durante el período tras la exposición, en su caso. En los cultivos que se hayan tratado con un bloqueante de la citocinesis, esto se consigue evaluando únicamente las células binucleadas. En ausencia de bloqueante de la citocinesis es importante demostrar la probabilidad de que las células analizadas hayan experimentado la división celular durante la exposición a la sustancia problema o después de dicha exposición. En relación con todos los protocolos, es importante demostrar que ha habido proliferación celular en los cultivos tanto tratados como de control, y el grado de citotoxicidad o citostasis inducido por la sustancia problema debe estimarse en los cultivos (o en cultivos paralelos) que se examinan para evaluar la presencia de micronúcleos en ellos.

DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO

Preparativos

11. Pueden utilizarse cultivos primarios de linfocitos de sangre periférica humana (5) (19) (42) (43) y una serie de líneas celulares de roedor, tales como CHO, V79, CHL/IU, y L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). El uso de otros tipos y líneas celulares debe justificarse por la demostración de su comportamiento en el ensayo, como se describe en la sección de criterios de aceptabilidad. Como la frecuencia espontánea de la formación de micronúcleos influye en la sensibilidad del ensayo, se recomienda la utilización de tipos celulares con una frecuencia espontánea de micronúcleos que sea baja y estable.

12. Los linfocitos de sangre periférica humana deben obtenerse de individuos no fumadores, sanos, jóvenes (de entre 18 y 35 años de edad, aproximadamente), que no hayan estado expuestos recientemente a radiaciones ni a sustancias genotóxicas conocidas. Si se combinan las células procedentes de más de un donante, debe especificarse el número de donantes. La frecuencia de micronúcleos aumenta con la edad y esta tendencia es más pronunciada en las mujeres que en los varones (44), lo que debe tenerse en cuenta al efectuar la selección de las células de los donantes para su combinación.

Medios y condiciones de cultivo

13. Para el mantenimiento de los cultivos deben utilizarse medios de cultivo y condiciones de incubación (recipientes de cultivo, concentración de CO2, temperatura y humedad) adecuados. Las cepas y líneas celulares establecidas deben examinarse sistemáticamente para comprobar la estabilidad del número modal de cromosomas y la ausencia de contaminación por micoplasmas, y deben dejar de utilizarse si se contaminan o si hay un cambio en el número modal de cromosomas. Debe conocerse la duración del ciclo celular normal en las condiciones de cultivo aplicadas en el laboratorio de ensayo. Si se utiliza el método de bloqueo de la citocinesis, la concentración del inhibidor de la citocinesis debe optimizarse para el tipo de células específico que se utilice y debe demostrarse que proporciona un buen rendimiento de células binucleadas para la evaluación.

Preparación de los cultivos

14. Cepas y líneas celulares establecidas: las células se propagan a partir de cultivos madre, se siembran en medio de cultivo a una densidad tal que los cultivos no lleguen a confluir en monocapas, y los cultivos en suspensión no alcancen una densidad excesiva antes del momento de la recogida, y se incuban a 37 °C.

15. Linfocitos: se cultiva sangre completa tratada con un anticoagulante (por ejemplo, heparina), o bien linfocitos aislados, en presencia de un mitógeno [por ejemplo, fitohemaglutinina (PHA)] antes de la exposición a la sustancia problema y a la citoB.

Activación metabólica

16. Se debe recurrir a sistemas de metabolización exógenos cuando se utilizan células con una capacidad metabólica endógena inadecuada. El sistema más comúnmente empleado es una fracción postmitocondrial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene a partir del hígado de roedores tratados con inductores enzimáticos como el aroclor 1254 (45) (46) o una combinación de fenobarbital y β-naftoflavona (46) (47) (48) (49). Esta última combinación no infringe el Convenio de Estocolmo sobre contaminantes orgánicos persistentes (50) ni el Reglamento (CE) no 850/2004, sobre contaminantes orgánicos persistentes (66), y se ha visto que es tan efectiva como el aroclor 1254 para inducir las oxidasas de función mixta (46) (47) (48) (49). La fracción S9 se utiliza normalmente a concentraciones que varían entre el 1 y el 10 % (v/v) en el medio de ensayo final. La elección de un sistema de activación metabólica puede depender de la clase de sustancia que se estudia y, en algunos casos, puede ser adecuado utilizar más de una concentración de S9.

17. Las líneas celulares genéticamente modificadas que expresan enzimas de activación, humanas o de roedores, pueden suprimir la necesidad de utilizar un sistema de activación metabólica exógeno, y pueden utilizarse como células de ensayo. En estos casos, la elección de las líneas celulares utilizadas debe justificarse científicamente, por ejemplo, por la pertinencia de las oxidasas de función mixta para el metabolismo de la sustancia problema (51), y por su capacidad de respuesta a clastógenos y anéugenos conocidos (véase la sección sobre criterios de aceptabilidad). Debe reconocerse que la sustancia estudiada puede no ser metabolizada por la oxidasa u oxidasas de función mixta expresadas; en este caso, los resultados negativos no indicarían que la sustancia problema no puede inducir micronúcleos.

Preparación de la sustancia problema

18. Las sustancias sólidas deben disolverse en disolventes o vehículos adecuados y, si es conveniente, diluirse antes de tratar las células. Las sustancias líquidas pueden añadirse directamente al sistema de ensayo o diluirse antes del tratamiento. Las sustancias gaseosas o volátiles deben ensayarse aplicando modificaciones adecuadas a los protocolos normales, tales como el tratamiento en recipientes sellados (52) (53). Han de emplearse soluciones de la sustancia problema recién preparadas, salvo que los datos relativos a la estabilidad demuestren que es posible su conservación.

Condiciones del ensayo

Disolvente o vehículo

19. El disolvente o vehículo no debe reaccionar con la sustancia problema ni ser incompatible con la supervivencia de las células ni con el mantenimiento de la actividad de la fracción S9 a la concentración utilizada. Para utilizar algún disolvente o vehículo distinto de los bien establecidos (por ejemplo, agua, medio de cultivo celular, dimetilsulfóxido), debe disponerse de datos justificativos que indiquen su compatibilidad con la sustancia problema y su ausencia de toxicidad genética. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso.

Utilización de citoB como bloqueante de la citocinesis

20. Una de las consideraciones más importantes en la realización del ensayo de MNvit es la de velar por que las células que se examinen hayan completado la mitosis durante el tratamiento o en el período de incubación tras el mismo, en su caso. La citoB es el agente más ampliamente utilizado para bloquear la citocinesis, ya que inhibe el ensamblaje de la actina, con lo que impide la separación de las células hijas tras la mitosis, y así se forman células binucleadas (5) (54) (55). Así pues, el recuento de micronúcleos puede limitarse a las células que han experimentado la mitosis durante el tratamiento o después de este. El efecto de la sustancia problema sobre la cinética de la proliferación celular puede medirse simultáneamente. La citoB debe utilizarse como bloqueante de la citocinesis cuando se utilizan linfocitos humanos, ya que la duración de los ciclos celulares es variable dentro de los cultivos y entre los donantes, y debido a que no todos los linfocitos responden a la PHA. Al examinar líneas celulares, se han utilizado otros métodos para determinar si las células que se evalúan han experimentado la división; estos métodos se consideran más abajo (véase el punto 26).

21. El laboratorio debe determinar la concentración adecuada de citoB para cada tipo de células con el fin de conseguir la frecuencia óptima de células binucleadas en los cultivos de control del disolvente o vehículo. La concentración adecuada de citoB está generalmente entre 3 y 6 μg/ml.

Medición de la proliferación celular y de la citotoxicidad, y selección de las concentraciones de exposición

22. Cuando se determina la concentración máxima de sustancia problema que se va a estudiar, debe evitarse llegar a concentraciones que puedan producir respuestas positivas falsas, tales como las provocadas por una citotoxicidad excesiva, precipitación en el medio de cultivo, y cambios fuertes del pH o de la osmolalidad (39) (40) (41).

23. Se mide la proliferación celular para asegurarse de que las células tratadas han efectuado una mitosis durante el ensayo y de que los tratamientos se efectúan a los niveles adecuados de citotoxicidad (véase el punto 29). La citotoxicidad debe determinarse con y sin activación metabólica en las células que requieren activación metabólica, utilizando el aumento relativo del recuento de células (ARRC) o la duplicación relativa de la población (DRP) (véanse las fórmulas en el apéndice 2), salvo que se emplee la citoB. Cuando se emplea esta sustancia, es posible determinar la citotoxicidad utilizando el índice de replicación (IR) (véase la fórmula en el apéndice 2).

24. El tratamiento de los cultivos con citoB, junto con la medición de las frecuencias relativas de células mononucleadas, binucleadas y multinucleadas en el cultivo, constituye un método exacto de cuantificación del efecto sobre la proliferación celular y de la actividad citotóxica o citostática de un tratamiento (5), y garantiza que solamente se evalúan las células que se han dividido durante el tratamiento o después de este.

25. En los estudios con citoB, la citostasis o la citotoxicidad pueden cuantificarse mediante el índice de proliferación con bloqueo de la citocinesis (IPBC) (5) (26) (56), o pueden derivarse del IR de, al menos, 500 células por cultivo (véanse las fórmulas en el apéndice 2). Cuando se utiliza la citoB para evaluar la proliferación celular, hay que determinar el IPBC o el IR basándose en un mínimo de 500 células por cultivo. Estas mediciones, entre otras, pueden utilizarse para estimar la citotoxicidad comparando los valores obtenidos con los cultivos tratados y con los controles. La evaluación de otros indicadores de citotoxicidad (por ejemplo, confluencia, número de células, apoptosis, necrosis, recuento de las células en metafase) puede aportar información útil.

26. En los estudios sin citoB, es necesario demostrar que las células evaluadas en el cultivo se han dividido durante el tratamiento con la sustancia problema o tras este tratamiento; en caso contrario, pueden obtenerse respuestas negativas falsas. Entre los métodos que se han utilizado para garantizar que las células objeto de evaluación se han dividido figuran los siguientes: la incorporación y posterior detección de bromodesoxiuridina (BrdU) para identificar las células que se han replicado (57), la formación de clones cuando se tratan células de líneas celulares permanentes y se evalúan in situ en el portaobjetos de un microscopio [índice de proliferación (IP)] (25) (26) (27) (28), o la medición de la duplicación relativa de la población (DRP) o del aumento relativo del recuento de células (ARRC) u otros métodos comprobados (16) (56) (58) (59) (véanse las fórmulas en el apéndice 2). La evaluación de otros indicadores de citotoxicidad o de la citostasis (por ejemplo, confluencia, número de células, apoptosis, necrosis, recuento de las células en metafase) puede aportar información útil.

27. Deben evaluarse al menos tres concentraciones de ensayo analizables. Con este fin, puede ser necesario realizar el experimento utilizando un número mayor de concentraciones próximas entre sí y analizar la formación de micronúcleos en las concentraciones que aporten el rango apropiado de citotoxicidades. Otra estrategia posible consiste en efectuar un ensayo preliminar de citotoxicidad a fin de estrechar el rango para el ensayo definitivo.

28. El objetivo es que la concentración máxima provoque una citotoxicidad del 55 ± 5 %. Unos niveles más elevados podrían inducir daño cromosómico como efecto secundario de la citotoxicidad (60). Cuando se produce citotoxicidad, las concentraciones de ensayo seleccionadas deben cubrir un rango que vaya desde la que provoca una citotoxicidad del 55 ± 5 % hasta la que no provoca citotoxicidad o solo débilmente.

29. Si no se observa citotoxicidad ni precipitado, la concentración de ensayo máxima debe corresponder a la más baja del grupo siguiente: 0,01 M, 5 mg/mL o 5 μl/mL. Las concentraciones seleccionadas para el análisis no deben estar separadas, en general, por un factor de más de 10. En el caso de sustancias problema que muestran una curva de concentración-respuesta de gran pendiente, puede ser necesario reducir más la separación entre las concentraciones de la sustancia problema, de forma que se evalúen cultivos en los rangos de toxicidad moderada y baja.

30. En caso de que la solubilidad constituya un factor limitante, la concentración máxima, si no está limitada por la citotoxicidad, debe ser la concentración más baja a la que un precipitado mínimo es visible en los cultivos, siempre que esto no interfiera con el recuento. La valoración de la precipitación debe realizarse con métodos como la microscopia óptica, anotando el precipitado que persiste, o el que aparece durante el cultivo (hacia el final del tratamiento).

Controles

31. En todos los experimentos deben incluirse controles positivos (CP) y del disolvente o vehículo en paralelo, con y sin activación metabólica.

32. Los CP son necesarios para demostrar la capacidad de las células utilizadas y del protocolo de ensayo para identificar clastógenos y anéugenos, ►C1 y confirmar la actividad metabólica de la preparación de S9. ◄ Los CP deben emplear inductores conocidos de la formación de micronúcleos a concentraciones a las que se prevea que se van a obtener aumentos pequeños, pero reproducibles, sobre la frecuencia espontánea, y demostrar la sensibilidad del sistema de ensayo. Las concentraciones de los CP deben ser tales que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados.

33. Debe utilizarse un clastógeno que requiera activación metabólica (por ejemplo, ciclofosfamida, benzo[a]pireno) para demostrar tanto la competencia metabólica como la capacidad del sistema de ensayo para detectar clastógenos. Si está justificado, pueden utilizarse otros CP. Debido a que algunos CP que necesitan activación metabólica pueden ser activos sin activación metabólica exógena en ciertas condiciones de tratamiento o en ciertas líneas celulares, la necesidad de activación metabólica y la actividad de la preparación de S9 deben probarse en la línea celular seleccionada y a las concentraciones seleccionadas.

34. Por el momento, no se conoce ningún anéugeno que necesite activación metabólica para su actividad genotóxica (16). Como ejemplos de CP aceptados actualmente para la actividad aneugénica pueden citarse la colchicina y la vimblastina. Pueden utilizarse otras sustancias si inducen micronúcleos solamente, o principalmente, a través de su actividad aneugénica. Para evitar tener que recurrir a dos CP (para la clastogenicidad y para la aneugenicidad) sin activación metabólica, el control de aneugenicidad puede servir como CP sin S9, y el control de clastogenicidad puede utilizarse para comprobar la idoneidad del sistema de activación metabólica utilizado. En células que no requieren S9 deben utilizarse CP tanto para la clastogenicidad como para la aneugenicidad. En el apéndice 3 se recogen los CP sugeridos.

35. Puede considerarse la utilización de un CP en función de las clases químicas, si se dispone de sustancias adecuadas. Todos los CP utilizados deben ser adecuados para el tipo de células y para las condiciones de activación.

36. Deben incluirse controles del disolvente o vehículo para cada tiempo de recogida. Se realizarán asimismo controles negativos (CN) sin tratar (sin disolvente ni vehículo), salvo que exista información publicada o datos de los controles históricos del laboratorio que demuestre que, a las concentraciones utilizadas, el disolvente elegido no provoca efectos genotóxicos ni otro tipo de efectos nocivos.

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Pauta de tratamiento

37. Para maximizar la probabilidad de detectar un anéugeno o un clastógeno que actúe en una fase específica del ciclo celular, es importante que se trate con la sustancia problema un número suficiente de células en todas las fases de su ciclo celular. Por tanto, es posible que la pauta de tratamiento de líneas celulares y de cultivos celulares primarios difiera en algunos aspectos de la aplicada a los linfocitos, que requieren estimulación mitogénica para empezar su ciclo celular; este tema se trata en los puntos 41 a 43 (16).

38. Una serie de consideraciones teóricas, junto con datos publicados (18), indica que la mayoría de los anéugenos y clastógenos se detectan con un corto período de tratamiento, de entre 3 y 6 horas en presencia y ausencia de S9, seguido de la eliminación de la sustancia problema y de un período de crecimiento de entre 1,5 y 2,0 ciclos celulares (6). Las células se recogen a un tiempo equivalente a unas 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular normal (es decir, sin tratamiento), bien tras el inicio o bien al final del tratamiento (véase el cuadro 1). Los tiempos de la toma de muestras o los de recuperación pueden ampliarse si se sabe o se sospecha que la sustancia problema afecta a la duración del ciclo celular (por ejemplo, cuando se someten a ensayo análogos de nucleósidos).

39. Debido a la posible citotoxicidad de las preparaciones de S9 para las células de mamífero cultivadas, se aplica un tratamiento con exposición prolongada de 1,5-2,0 ciclos celulares normales solamente en ausencia de S9. En el tratamiento prolongado, se ofrecen opciones que permiten el tratamiento de las células con la sustancia problema en ausencia y en presencia de citoB. Estas opciones se refieren a situaciones en que puede haber preocupación respecto a posibles interacciones entre la sustancia problema y la citoB.

40. Las pautas sugeridas de tratamiento de las células se presentan en el cuadro 1. Estas pautas generales de tratamiento pueden modificarse en función de la estabilidad o reactividad de la sustancia problema o de las características particulares de crecimiento de las células utilizadas. Todos los tratamientos deben iniciarse y terminarse mientras las células están en la fase de crecimiento exponencial. Estas pautas se presentan con más detalle en los puntos 41 a 47 siguientes.



Cuadro 1 Tratamiento de las células y tiempos de recogida para el ensayo de MNvit Linfocitos, células primarias y líneas celulares tratadas con citoB + S9 Tratar durante 3-6 horas en presencia de S9; retirar la fracción S9 y el medio de tratamiento; añadir medio fresco y citoB; recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos celulares normales. – S9 Exposición corta Tratar durante 3-6 horas; retirar el medio de tratamiento; añadir medio fresco y citoB; recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos celulares normales. – S9 Exposición prolongada Opción A: Tratar durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales en presencia de citoB; recoger al final del período de exposición. Opción B: Tratar durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales; retirar la sustancia problema; añadir medio fresco y citoB; recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos celulares normales. Líneas celulares tratadas sin citoB (Igual que las pautas de tratamiento indicadas más arriba, salvo que no se añade citoB)

Linfocitos, células primarias y líneas celulares tratadas con citoB

41. En el caso de los linfocitos, el enfoque más eficiente es iniciar la exposición a la sustancia problema a las 44-48 horas de la estimulación con PHA, cuando la sincronización del ciclo habrá desaparecido (5). En el ensayo inicial, se tratan las células durante 3 a 6 horas con la sustancia problema en ausencia y en presencia de S9. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco que contiene citoB, y las células se recogen cuando ha pasado un tiempo equivalente a 1,5-2,0 ciclos celulares normales.

42. Si ambos ensayos iniciales de tratamiento corto (3-6 horas) son negativos o dudosos, se aplica un tratamiento posterior con exposición prolongada sin S9. Se dispone de dos opciones de tratamiento, que son igualmente aceptables. Sin embargo, podría ser más adecuado seguir la opción A en caso de linfocitos estimulados en que el crecimiento exponencial podría declinar a las 96 horas de la estimulación. Asimismo, los cultivos de células no deben haber alcanzado la confluencia en el momento del muestreo final en la opción B. — Opción A: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales, y se recogen al final del período de tratamiento. — Opción B: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco, y las células se recogen cuando han pasado otros 1,5-2,0 ciclos celulares normales.

43. Las células primarias y las líneas celulares deben tratarse de forma similar a los linfocitos, salvo que no es necesario estimularlas con PHA durante 44-48 horas. Las células distintas de los linfocitos deben exponerse de forma tal que, al final del estudio, las células estén aún en fase de crecimiento logarítmico.

Líneas celulares tratadas sin citoB

44. Las células deben tratarse durante 3-6 horas en presencia y en ausencia de S9. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco, y las células se recogen al cabo de un tiempo equivalente a 1,5-2,0 ciclos celulares normales.

45. Si ambos ensayos iniciales de tratamiento corto (3-6 horas) son negativos o dudosos, se aplica un tratamiento posterior con exposición prolongada (sin S9). Se dispone de dos opciones de tratamiento, que son igualmente aceptables. — Opción A: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales, y se recogen al final del período de tratamiento. — Opción B: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5-2,0 ciclos celulares normales. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco, y las células se recogen cuando han pasado otros 1,5-2,0 ciclos celulares normales.

46. En las monocapas, es posible que haya células mitóticas (identificables por su forma redondeada y por despegarse de la superficie) al final del tratamiento de 3-6 horas. Como las células mitóticas se despegan con facilidad, pueden perderse cuando se retira el medio que contiene la sustancia problema. Debe procurarse recogerlas cuando se lavan los cultivos, y devolverlas a estos, para evitar la pérdida de células en mitosis, y que podrían presentar micronúcleos, en el momento de la recogida final.

Número de cultivos

47. Los cultivos deben hacerse por duplicado con cada concentración de la sustancia problema y en el caso de los cultivos del vehículo o disolvente y del CN. Si se puede demostrar, sobre la base de datos históricos del laboratorio, que la diferencia entre los cultivos duplicados es mínima, cabe la posibilidad de que resulte aceptable un cultivo único. Si se utilizan cultivos únicos, se recomienda que se analice un número mayor de concentraciones.

Recogida de las células y preparación de los portaobjetos

48. Cada cultivo se recoge y se manipula por separado. La preparación de las células puede implicar un tratamiento hipotónico, pero esta fase no es necesaria si se consigue de otra manera una extensión adecuada de las células. Pueden usarse distintas técnicas para la preparación de los portaobjetos, siempre que lleven a la obtención de preparaciones celulares de buena calidad para su evaluación. Debe conservarse el citoplasma celular para poder detectar los micronúcleos y también (si se aplica el método de bloqueo de la citocinesis) identificar de forma fiable las células binucleadas.

49. Las preparaciones pueden teñirse siguiendo varios métodos, tales como la tinción de Giemsa o la aplicación de colorantes fluorescentes específicos del ADN (59). Si se emplea un colorante específico del ADN [por ejemplo, naranja de acridina (61) o Hoechst 33258 más pironina-Y (62)] pueden evitarse algunos de los artefactos que aparecen cuando se utiliza un colorante que no es específico del ADN. Si resulta interesante obtener información sobre los mecanismos implicados en su formación, para identificar el contenido (cromosoma o fragmento cromosómico) de los micronúcleos pueden utilizarse anticuerpos anti-cinetocoro, la técnica FISH con sondas pancentroméricas de ADN o el etiquetado in situ del cebado con cebadores pancentroméricos específicos, junto con una tinción de contraste adecuada del ADN (15) (16). Pueden utilizarse otros métodos para diferenciar entre clastógenos y anéugenos, siempre que se haya comprobado que son eficaces.

Análisis

50. Antes de analizarlos al microscopio, se asigna un código independiente a todos los portaobjetos, incluidos los del disolvente o vehículo y los de los controles. Otra posibilidad es analizar las muestras codificadas utilizando un sistema automático de análisis de imágenes o citometría de flujo que esté validado.

51. En los cultivos tratados con citoB, deben analizarse las frecuencias de los micronúcleos en al menos 2 000 células binucleadas por cada concentración (al menos 1 000 células binucleadas por cultivo y dos cultivos por concentración). Si se utilizan cultivos únicos, deben evaluarse al menos 2 000 células binucleadas por concentración de cada cultivo. Si para la evaluación a cada concentración se dispone de un número sustancialmente inferior a 1 000 de células binucleadas por cultivo, o a 2 000 si se utiliza un cultivo único, y si no se detecta un aumento significativo de micronúcleos, debe repetirse el ensayo utilizando más células, o a concentraciones menos tóxicas, según sea más conveniente. Ha de procurarse no tener en cuenta para la evaluación las células binucleadas con formas irregulares o en las que los dos núcleos difieran mucho por su tamaño; tampoco deben confundirse las células binucleadas con células multinucleadas mal extendidas. Las células que contengan más de dos núcleos principales no deben tenerse en cuenta para el análisis de micronúcleos, ya que la frecuencia espontánea de micronúcleos puede ser más elevada en estas células (63) (64). Puede aceptarse incluir en la evaluación las células mononucleadas si se demuestra que la sustancia problema interfiere con la actividad de la citoB.

52. En las líneas celulares sometidas a ensayo sin tratamiento con citoB, debe evaluarse la presencia de micronúcleos en al menos 2 000 células por concentración (al menos 1 000 células por cultivo y dos cultivos por concentración). Cuando se utilice un cultivo único por concentración, se evaluarán al menos 2 000 células de cada cultivo.

53. Cuando se utiliza la citoB, para evaluar la proliferación celular hay que determinar el IPBC o el IR (véase el apéndice 2) basándose en un mínimo de 500 células por cultivo. Cuando se hacen los tratamientos en ausencia de citoB, es fundamental aportar pruebas de que las células que se están considerando han proliferado, como se indica en los puntos 24 a 27.

Criterios de aceptabilidad

54. Los laboratorios que se propongan utilizar el ensayo de MNvit descrito en el presente ME deben demostrar su capacidad de detectar de forma fiable y exacta las sustancias de actividad aneugénica y clastogénica conocida, con y sin activación metabólica, así como las que se sabe que son negativas, utilizando las sustancias de referencia del apéndice 3. Para demostrar su capacidad de aplicar el presente ME correctamente, el laboratorio debe aportar pruebas de que las células que se evalúan para la formación de micronúcleos han completado una sola división nuclear si el ensayo se lleva a cabo sin utilizar citoB.

55. Se recomienda utilizar las sustancias del apéndice 3·como sustancias de referencia. Pueden incluirse otras sustancias en lugar de las de la lista, o además de ellas, si se conoce su actividad y si inducen la formación de micronúcleos por los mismos mecanismos de acción, y si se demuestra que son pertinentes para las sustancias que se van a ensayar con el procedimiento de MNvit. La justificación podría incluir un estudio de validación en que se haya utilizado una amplia variedad de sustancias o que se haya centrado en un espectro más reducido basado en la clase química de la sustancia problema o en el mecanismo del daño que se estudie.

56. El control del disolvente o vehículo y los cultivos sin tratar deben mostrar de forma reproducible unas frecuencias bajas y consistentes de micronúcleos (normalmente, 5-25 micronúcleos/1 000 células para los tipos de células señalados en el punto 11). Es posible que otros tipos de células tengan diferentes rangos de respuestas, las cuales deben determinarse cuando se validen para su utilización en el ensayo de MNvit. Deben utilizarse los datos del CN, del disolvente y del CP para establecer los rangos de los controles históricos. Estos valores deben utilizarse en la toma de decisiones sobre la idoneidad de los CN o CP en paralelo para un experimento.

57. Si se proponen para el ensayo cambios en el protocolo que sean de poca importancia (por ejemplo, uso de técnicas de recuento automáticas en vez de manuales, uso de un nuevo tipo de células), será necesario demostrar la efectividad del cambio antes de que se pueda considerar que es aceptable la utilización del protocolo modificado. La demostración de la efectividad incluye la demostración de que pueden detectarse los principales mecanismos de rotura cromosómica y ganancia o pérdida de cromosomas, y de que pueden obtenerse resultados positivos y negativos apropiados para la clase de cada sustancia, o para la amplia gama de sustancias, que se van a ensayar.

DATOS E INFORME

Tratamiento de los resultados

58. Si se utiliza la técnica de bloqueo de la citocinesis, para la evaluación de la inducción de micronúcleos se emplearán solo las frecuencias de las células binucleadas con micronúcleos (independientemente del número de micronúcleos por célula). El tener en cuenta para la evaluación cuántas células tienen uno, dos o más micronúcleos puede aportar información útil, pero no es obligatorio.

59. También deben medirse en paralelo la citotoxicidad o la citostasis para todos los cultivos tratados y los de control del disolvente o vehículo (58). Los valores del IPBC y del IR deben calcularse para todos los cultivos tratados y de control, como medidas de retraso del ciclo celular cuando se utiliza el método de bloqueo de la citocinesis. En ausencia de citoB, debe utilizarse la DRP o el ARRC o el IP (véase el apéndice 2).

60. Deben proporcionarse datos de cada cultivo. Además, se resumirán todos los datos en forma de cuadro.

61. Las sustancias que inducen micronúcleos en el ensayo de MNvit pueden deber esta propiedad a su capacidad de inducir rotura cromosómica, pérdida de cromosomas, o una combinación de ambas. Para determinar si el mecanismo de inducción de micronúcleos se debe a actividad clastogénica y/o aneugénica, pueden realizarse análisis más detallados utilizando anticuerpos anti-cinetocoro, sondas in situ específicas del centrómero, u otros métodos.

Evaluación e interpretación de los resultados

62. No se requiere ninguna verificación mediante ensayos adicionales en caso de una respuesta positiva o negativa clara. Los resultados dudosos pueden aclararse mediante el análisis de otras 1 000 células procedentes de todos los cultivos, para mantener el carácter ciego del ensayo. Si con este enfoque no se resuelve el resultado, deben efectuarse más ensayos. En los siguientes experimentos se considerará la posibilidad de modificar los parámetros del estudio en una gama de condiciones ampliada o restringida, según proceda. Entre los parámetros del estudio que podrían modificarse figuran el espaciado entre las concentraciones del ensayo, los períodos de tratamiento y de recogida de las células, o las condiciones de activación metabólica.

63. Son varios los criterios para determinar un resultado positivo, tales como un aumento relacionado con la concentración o un aumento estadísticamente significativo del número de células que presentan micronúcleos. Debe considerarse en primer lugar la importancia biológica de los resultados. Para la evaluación de la significación biológica de la respuesta puede servir de orientación considerar si los valores observados se encuentran dentro o fuera del rango del control histórico. Pueden emplearse métodos estadísticos adecuados como apoyo para evaluar los resultados del ensayo (65). Sin embargo, los resultados de las pruebas estadísticas deben evaluarse respecto a la relación dosis-respuesta. También deben tenerse en cuenta la reproducibilidad y los datos históricos.

64. Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán claramente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos no permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia problema. Estas respuestas dudosas o cuestionables pueden darse con independencia del número de veces que se repita el experimento.

65. Un resultado positivo en el ensayo de MNvit indica que la sustancia problema induce roturas cromosómicas o pérdida de cromosomas en células de mamífero cultivadas. Un resultado negativo indica que, en las condiciones en que se realiza el ensayo, la sustancia problema no induce roturas cromosómicas ni pérdida o ganancia de cromosomas en las células de mamífero cultivadas.

Informe del ensayo

66. El informe del ensayo debe incluir como mínimo la siguiente información, si es importante para la realización del estudio: Sustancia problema: — datos de identificación y número de registro del Chemical Abstracts Service y número CE, — naturaleza física y pureza, — propiedades físico-químicas importantes para la realización del estudio, — reactividad de la sustancia problema con el disolvente o vehículo o con el medio de cultivo de las células. Disolvente o vehículo: — justificación de la elección del disolvente o vehículo, — solubilidad y estabilidad de la sustancia problema en el disolvente o vehículo. Células: — tipo y procedencia de las células utilizadas, — idoneidad del tipo de células utilizado, — ausencia de micoplasmas, si procede, — información sobre la duración del ciclo celular, tiempo de duplicación o índice de proliferación, — en caso de que se utilicen linfocitos, indicación del sexo, edad, y número de los donantes de sangre, si procede, — en caso de que se utilicen linfocitos, si lo que se expone a la sustancia es la sangre completa o son los linfocitos aislados, — número de pases, si procede, — métodos de mantenimiento de los cultivos celulares, si procede, — número modal de cromosomas, — duración del ciclo celular normal (control negativo). Condiciones del ensayo: — identidad de la sustancia de bloqueo de la citocinesis (por ejemplo, citoB), si se utiliza, y su concentración, junto con la duración de la exposición de las células, — justificación de la selección de las concentraciones y del número de cultivos, incluidos los datos de citotoxicidad y los límites de solubilidad, si se dispone de ellos, — composición del medio, concentración de CO2, si procede, — concentraciones de la sustancia problema, — concentración (y volumen) del vehículo y de la sustancia problema añadidos, — temperatura y duración de la incubación, — duración del tratamiento, — momento de la recogida tras el tratamiento, — densidad celular en el momento de la siembra, si procede, — tipo y composición del sistema de activación metabólica, incluidos los criterios de aceptabilidad, — sustancias de control positivo y controles negativos, — métodos de preparación de los portaobjetos y técnica de tinción utilizados, — criterios para la identificación de micronúcleos, — números de células analizadas, — métodos de determinación de la citotoxicidad, — cualquier información adicional relativa a la citotoxicidad, — criterios empleados para considerar si los resultados de los estudios son positivos, negativos o dudosos, — métodos utilizados de análisis estadístico, — métodos, como la utilización de anticuerpos anti-cinetocoro, para caracterizar si los micronúcleos contienen cromosomas completos o fragmentos, en su caso. Resultados: — parámetro utilizado para medir la citotoxicidad como, por ejemplo, IPBC o IR en caso de aplicación de bloqueo de la citocinesis, o ARRC, DRP o IP cuando no se aplica este bloqueo; otras observaciones pertinentes como, por ejemplo, confluencia celular, apoptosis, necrosis, recuento de metafases, frecuencia de células binucleadas, — signos de precipitación, — datos sobre el pH y la osmolalidad del medio de tratamiento, si se han determinado, — definición de células aceptables para el análisis, — distribución de las células mono, bi y multinucleadas si se utiliza un método de bloqueo de la citocinesis, — número de células con micronúcleos, indicado por separado para cada cultivo tratado y de control, precisándose si corresponden a células binucleadas o mononucleadas, en su caso, — relación concentración-respuesta, cuando sea posible, — datos del control negativo (disolvente o vehículo) y de la sustancia de control positivo (concentraciones y disolventes) en paralelo, — datos históricos del control negativo (disolvente o vehículo) y de las sustancias utilizadas como control positivo, con los rangos, las medias y la desviación típica e intervalo de confianza (por ejemplo, 95 %), — análisis estadístico; valores p, si se dispone de ellos. Discusión de los resultados Conclusiones

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