1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B CUARTADIRECTIVADELACOMISIÓN
de5dediciembre de1972
porlaquesedeterminanmétodosdeanálisiscomunitariosparaelcontroloficialdelosalimentos
paraanimales
(73/46/CEE)
(DOL83de30.3.1973,p.21)
Modificadapor:
DiarioOficial
nopágina fecha
►M1Directiva81/680/CEEdelaComisiónde30dejuliode1981 L246 32 29.8.1981
►M2Directiva92/89/CEEdelaComisiónde3denoviembrede1992 L344 35 26.11.1992
►M3Directiva98/54/CEdelaComisiónde16dejuliode1998 L208 49 24.7.1998
▼B
CUARTADIRECTIVADELACOMISIÓN
de5dediciembre de1972
por la que sedeterminanmétodos de análisis comunitarios para el
controloficial delosalimentosparaanimales
(73/46/CEE)
LACOMISIÓNDELASCOMUNIDADESEUROPEAS,
VistoelTratadoconstitutivodelaComunidadEconómicaEuropea,
Vista la Directiva del Consejo, de 20 de julio de 1970, relativa a la
introducción de métodos de toma de muestras y de análisis comunita-riosparaelcontroloficialdelosalimentosparaaninales(
1),modificada
porlaDirectiva72/275/CEEde20dejuliode1972(2),y,enparticular,
suartículo2,
ConsiderandoquelaDirectiva antesmencionada préqueloscontroles
oficiales de los alimentos para animales dirigidos a comprobar si se
respetan las condiciones establecidas en virtud de las disposicioneslegales, reglamentarias o administrativas referentes a la calidad y al acomposición de los mencionados alimentos se efectúen según losmétodosdetomademuestrasydeanálisiscomunitarios;
ConsiderandoquelasDirectivasn
o71/250/CEE,no71/393/CEEyno72/
199/CEEdelaComisión,de15dejuniode1971(3),18denoviembre
de 1971(4) y 27 de abril de 1972(5), respectivamente, han establecido
ya determinados métodos de análisis comunitariós; que, habida cuentadel grado de avance de los trabajos efectuados desde entonces, esconvenienteestablecerunacuartaseriedemétodos;
Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva se
ajustanaldictamendelComitépermanentedelaalimentaciónanimal;
HAADOPTADOLAPRESENTEDIRECTIVA:
Artículo 1
Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles
oficiales de los alimentos para animales, en lo que se refiere a los
contenidos en humedad de las grasas y aceites animales y vegetales,
así como a los contenidos en magnesio y en celulosa bruta de losalimentos,seefectuarán segúnlosmétodosdescritosenelAnexoIdelapresenteDirectiva.
Artículo 2
Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles
oficiales de los alimentos para animales, en lo que se refiere a sus
contenidos en retinol (vitamina A), ►M3 ◄se efec-
tuarán según los métodos descritos en el Anexo II de la presenteDirectiva.
Artículo 3
Los Estados miembros aplicarán a más tardar el 1 de enero de 1974,
las disposiciones legales, reglamentarias o administrativas necesarias1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—2
(1)D OnoL170de3.8.1970,p.2.
(2)D OnoL171de29.7.1972,p.39.
(3)D OnoL155de12.7.1971,p.13.
(4)D OnoL279de20.12.1971,p.7.
(5)D OnoL123de29.5.1972,p.6.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
para cumplir las disposiciones de la presente Directiva. Informarán de
elloinmediatamente alaComisión.
Artículo 4
LosdestinatariosdelapresenteDirectivaseránlosEstadosmiembros,1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—3
▼B
ANEXO I
1.DETERMINACIÓNDELAHUMEDADENLASGRASASYACEITES
ANIMALESYVEGETALES
1.Objetivoycampodeaplicación
Elmétodopermite determinar elcontenido enhumedad(aguayotrasmate-
riasvolátiles)delasgrasasyaceitesanimalesyvegetales.
2.Principio
La muestra se somete a desecación a 103 ºC hasta que cese la disminución
delamasa.Lapartedemasasedeterminapropesada.
3.Equipo
3.1. Recipiente de fondo plano, de material resistente a la corrosión,
diámetro:8a9cmaltura:3cmaproximadamente
3.2. Termómetrodemercurio,debulbareforzada,ycámaradedilataciónen
laextremidadsuperior,graduadode80ºCaproximadamentea110ºCal
menos,longitud:10cmaproximadamente
3.3. Bañodearenaoplacacaloríferaeléctrica3.4. Desecador,conteniendoundeshidratanteeficaz3.5. Balanzaanalítica
4.Métodooperatorio
Pesar,conprecisiónde1mg,20gaproximadamentedelamuestrahomoge-
neizadaenelrecipiente(3.1)secoytarado,conteniendoeltermómetro(3.2).
Calentarsobreelbañodearenaolaplacacalorífera(3.3),agitandoconstan-
tementeconlaayudadeuntermómetro,deformaquelatemperaturaalcance
90ºCen7minutosaproximadamente.
Reducir la intensidad del calentamiento siguiendo la frecuencia con la que
ascienden las burbujas desde el fondo del recipiente. La temparatura no
debeexederde105ºC.Continuaragitando,rozandoelfondodelrecipiente,
hastaqueceselaformacióndeburbujas.
Paragarantizarlacompletaeliminacióndelahumedad,repetirvariasvecese
calentamiento a 103 ºC ± 2 ºC, refrigerando a 93 ºC entre los sucesivoscalentamientos. Dejar refrigerar a continuación en el desecador (3.4) hasta
latemperaturaambienteypesar.Repetirestaoperaciónhastaquelapérdida
demasaentredospesadassucesivasnoexcedaenmásde2mg.
N.B.Un aumento de la masa de la muestra después de un calentamiento
repetido indica una oxidación de la grasa. En este caso, calcular el
resultado a partir de la pesada efectuada inmediatamente antes del
comienzodelaumentodemasa.
5.Cálculodelosresultados
Elcontenidoenporcentajedelamuestravienedadoporlafórmula:
M
1/C0M2 ðÞ /C1100
Mo
enlaque:
Mo= masa,engramos,delatomademuestra,
M1= masa, en gramos,del recipiente con su contenido, antes de calenta-
miento,
M2= masa,engramos,delrecipienteconsucontenido,despuésdelcalen-
tamiento.
Losresultadosinferioresa0.05%debenreferirseporlamención«menosdel
0,05%».
RepetibilidadLadiferenciaentrelosresultadosdedosdeterminacionesparalelasefectuadas
sobreunamismamuestranodebeexcederdel0,05%envalorabsoluto.1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—4
▼B
2.DETERMINACIÓNDELMAGNESIO
—porespectrofotometríadeabsorciónatómica—
1.Objetivoyámbitodeaplicación
El método permite determinar el magnesio en la alimentación animal. Está
especialmente indicado para determinar los contenidos en magnesio infe-
rioresal5%.
2.Principio
Lamuestraseincinerayseponeensoluciónenelácidoclorhídricodiluido.
Si no contiene sustancias orgánicas, se pone directamente en solución en el
ácidoclorhídrico.Lasoluciónesdiluidayelcontenidoenmagnesiosedeter-
mina por espectrofotometría de absorción atómica a 285,2 nm, por
comparaciónconlassolucionesdecalibrado.
3.Reactivos
3.1. Acidoclorhídricop.a.,d:1,16
3.2. Acidoclorhídricop.a.,d:1,193.3. Magnesio, en cinta o hilo, o sulfato de magnesio MgSO
4.7 H2O p.a.
secadoenvacíoalatemperaturaambiente.
3.4. Solucióndesaldeestroncio(cloruroonitrato)al2,5porciento(p/v)de
estroncio(=76,08gdeSrCl2.6H2Op.a./1o60,38gdeSr(NO3)2p.a./
1)
3.5. Solucióndecalibradodemagnesio:pesar,conprecisiónde1mg,1gde
magnesio(3.3),separandopreviamenteyconcuidadodesupelículade
ócido, o una cantidad correspondiente de sulfato de magnesio (3.3),
introducirlo en un matriz aforado de 1000 ml, añadir 80 ml de ácido
clorhídrico (3.1),dejardisolverycompletar a1000mlconagua,1ml
dedichasolucióncontiene1000mgdemagnesio
4.Equipo
4.1. Crusolesdeincineracióndeplatino,cuarzooporcelana4.2. Hornodebarroeléctrico,contermostato
4.3. Espectrofotómetrodeabsorciónatómica
5.Métodooperatorio
5.1.Puesta en solución
5.1.1.Alimentos constituidos exclusivamente por sustancias minerales
Pesarconprecisiónde1mg,5gdelamuestraeintroducirlosen
unmatraz aforadode500mlcon250a300mldeagua.Añadir
40mldeácidoclorhídrico(3.1),llevaraebulliciónymantenerel
líquido en ebullición lenta durante 30 minutos. Dejar refrigerar,
completar el volumen mediante agua, homogeneizar y filtrar en
un vaso seco a través de un filtro de pliegue seco. Rechazar los
30primerosmldelfiltrado.
En presencia de silicio, tratar 5 g de la muestras mediante una
cantidad suficiente (15 a 30 ml) de ácido clorhídrico (3.2) y
evaporar en seco sobre un baño de agua. Continuar tal como se
indicaen5.1.2,apartirdelatercerafrase.
5.1.2.Alimentos constituidos esencialmente por sustancias minerales
Pesar,conprecisiónde1mg,5mgdelamuestraenuncrisolde
incineración e incinerar a 550 ºC en el horno de barro hasta la
obtención de cenizas exentas de partículas carbónicas. Para
eliminar el silicio, añadir a las cenizas una cantidad suficiente
(15a30ml)deácidoclorhídrico (3.2)yevaporarensecosobre
un baño de agua. Secar a continuación durante una hora en la
estufa a 105 ºC. Volver a tomar el residuo mediante 10 ml de
ácidoclorhídrico (3.1)ytransferir conlaayudadeaguacaliente
a un matraz aforado de 500 ml. Llevar a ebullición, dejar refri-
gerar y completar el volumen mediante agua. Homogeneizar y
filtrar en un vaso seco a través de un filtro de pliegues seco.
Rechazarlos30primerosmldelfiltrado.1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—5
▼B
5.1.3.Alimentos formados esencialmente por sustancias orgánicas
Pesar, con precisión de 1 mg, 5 g de la muestra en un crisol de
incineracióneincinerarenunhornodebarro,hastalaobtención
de cenizas exentas de partículas carbonosas. Recoger las cenizas
mediante5mldeácidoclorhídrico(3.2),evaporarensecosobre
un baño de agua y secar a continuación durante una hora en la
estufa a 105 ºC, para insolubilizar el silicio. Recoger el residuo
mediante 5 ml de ácido clorhídrico (3.1), transvasar con ayuda
deaguacalienteenunmatrazaforadode250ml,llevaraebulli-
ción, dejar refrigerar y completar el volumen mediante agua.
Homogeneizar y filtrar en un vaso seco a través de un filtro de
plieguesseco.Rechazarlos30primerosmilímetrosdelfiltrado.
5.2.Medición de la absorción atómica
Preparar, diluyendo la solución de calibrado (3.5) mediante agua, al
menos 5 soluciones de referencia de concentraciones crecientes, esco-
gidas en función de la zona de medida óptima del espectrofotómetro.
Añadir a cada solución 10 ml de solución de sal de estroncio (3.4) y
completaracontinuaciónalvolumende100mlmedianteagua.
Diluirmedianteaguaunapartatealícuotadelfiltradoobtenidoen5.1.1,
5.1.2 o 5.1.3 de forma que se obtenga una concentración en magnesio
comprendida en los límites de concentración de las soluciones de refe-
rencia.Laconcentraciónenácidoclorhídricodedichasoluciónnodebe
excederde0,4N.Añadir10mldesolucióndesaldeestroncio(3.4)y
completaracontinuaciónalvolumena100mlmedianteagua.
Medir la absorción de la solución que haya de determinarse y de las
solucionesdereferenciamediantelalongituddeondade285,2nm.
6.Cálculosdelosresultados
Calcularlacantidaddemagnesiodelamuestraapartirdelassolucionesde
referencia.Expresarelresultadoenporcentajedelamuestra.
RepetibilidadLadiferenciaentrelosresultadosdedosdeterminacionesparalelasefectuadas
sobrelamismamuestranodebeexcederdel5porcientoenvalorrelativo.
3.DETERMINACIÓNDELAFIBRABRUTA
1.Objetoycampodeaplicación
Este método permite determinar en los piensos las substancias orgánicas
libres de grasas e insolubles en medio ácido y alcalino, convencionalmente
denominadasfibrabruta.
2.Principio
La muestra, en sucaso desengrasada, se trata sucesivamente con soluciones
en ebullición de ácido sulfúrico e hidróxido de potasio, de concentraciones
determinadas. Se separa el residuo por filtración mediante filtro de vidrio
sinterizado,selava,seseca,sepesaysecalcinaaunatemperaturacompren-
dida entre 475 y 500 ºC. La pérdida de peso debida a la calcinación
correspondealafibrabrutadelamuestradeensayo.
3.Reactivos
3.1. Ácidosulfúrico,c=0,13mol/l.3.2. Agenteantiespumante(porejemplo,n-octanol).3.3. Coadyuvante defiltración Celite 545oequivalente, calentado a500ºC
durantecuatrohoras(véase8.6).
3.4.Acetona.
3.5. Éterdepetróleoligero—intervalodeebullición40-60ºC.
3.6. Ácidoclorhídrico,c=0,5mol/l.3.7. Solucióndehidróxidodepotasio,c=0,23mol/l.1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—6
▼M2
▼M2
4.Aparatos
4.1. Aparatosdecalentamiento paraladigestiónconácidosulfúricoosolu-
ción de hidróxido de potasio, equipado con un soporte para el crisol
filtrante (4.2) y con un tubo de salida provisto de un grifo para hacer
el vacío y evacuar el líquido y, en su caso, con aire comprimido para
aplicar contrapresión. Cada día, antes de su utilización, calentarlo
previamenteconaguahirviendodurantecincominutos.
4.2. Crisol filtrante de vidrio, de 50 ml, con una placa filtrante de vidrio
sinterizadofundido,deporosidadcomprendidaentre40y90µm.Antes
deutilizarloporprimeravez,calentara500ºCdurantealgunosminutos
yenfriar(8.6).
4.3. Columna resistente a la ebullición, de 270 ml como mínimo, con
condensadordereflujo.
4.4. Estufadesecadocontermostato.
4.5. Hornodemufla,contermostato.4.6. Aparato de extracción en frío, compuesto por un soporte para el crisol
filtrante (4.2) y un tubo de descarga provisto de un grifo para hacer
vacíoyevacuarellíquido.
4.7. Juntasdeconexiónparaunirelaparatodecalentamiento(4.1),elcrisol
(4.2)ylacolumna(4.3)yconectarelextractordefrío(4.6)yelcrisol.
5.Procedimiento
Pesar 1 g de muestra con una aproximación de 1 mg, en su caso previa
preparación (véase 8.1, 8.2 y 8.3), y ponerlo en un crisol (4.2) y añadir un
gramodecoadyuvantedefiltración(3.3).
Acoplarelaparato decalentamiento (4.1)yelcrisol filtrante (4.2),yunir a
continuación lacolumna (4.3)yelcrisol.Ponerenelvaso150mldeácido
sulfúrico (3.1) calentado previamente hasta el punto de ebullición y añadir
algunas gotas de antiespumante (3.2) en caso necesario. Llevar el líquido a
ebulliciónen5±2minutosydejarhervirenérgicamentedurante30minutos
exactos.
Abrirelgrifodeltubodedescarga(4.1)yfiltraralvacíoelácidosulfúricoa
través del crisol filtrante. Lavar tres veces al vacío el residuo del crisol
filtrante utilizando 30 ml de agua hirviendo cada vez. Después de cada
lavado,secarelresiduodelfiltrodeaspiración.
Cerrarelgrifodesalidayañadiralacolumna150mldesolucióndehidró-
xido de potasio (3.7) hirviendo. Añadir unas gotas de antiespumante (3.2).
Llevarellíquidoaebulliciónen5±2minutosydejarhervirenérgicamente
durante30minutosexactos.Filtrarelresiduoylavartalcomosehaindicado
paraeltratamientoconácidosulfúrico.
Después del último lavado, secar el residuo por aspiración, desconectar el
crisol ysucontenido yconectarlo alextractor defrío(4.6).Aplicar vacío y
lavartresveceselresiduo,enelcrisolutilizando25mldeacetonacadavez,
secándoloporaspiracióndespuésdecadalavado.
Secar el crisol filtrante a 130 ºC en la estufa hasta alcanzar un peso cons-
tante. Despuésdecada secado, enfriar eneldesecador ypesarrápidamente.
Colocaracontinuaciónelcrisolenelhornodemuflaycalcinarelcontenido
aunatemperaturacomprendidaentre475y500ºCdurante30minutoscomo
mínimo.
Después de cada calcinación, enfriar, primero en el horno y después en el
desecador,antesdepesar.
Realizarunapruebaenblancosinlamuestra.Lapérdidadepesodebidaala
calcinaciónnodebeexcederde4mg.
6.Cálculodelosresultados
El contenido de fibra bruta en porcentaje de la muestra se expresa por la
fórmula:
b/C0c ðÞ /C2100
a
a = masadelamuestraeng,
b = pérdidademasaporcalcinación delresiduodelamuestradespuésde
secara130ºC,1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—7
▼M2
c = pérdida de masa por calcinación del residuo de la prueba en blanco
despuésdesecara130ºC.
7.Repetibilidad
La diferencia entre dos determinaciones paralelas llevadas a cabo en la
mismamuestranodebenexceder:
— 0,3envalorabsolutoparacontenidosdefibrabrutainferioresal10%,
— el 3 % relativo al resultado más alto, para contenidos de fibra bruta
igualesosuperioresal10%.
8.Observaciones
8.1. Los piensos con un contenido de grasa bruta superior al 10 % deben
desengrasarse con éter de petróleo (3.5) antes de efectuar su análisis.
Conectar elcrisolfiltrante (4.2),conlamuestra previamente pesada,al
extractordefrío(4.6)ylavartresvecesalvacíoutilizando30mldeéter
depetróleo (3.5)cadavez.Secarlamuestraporaspiración, conectarel
crisolconsucontenidoalaparatodecalentamiento(4.1)ycontinuarcon
arregloalpunto5.
8.2. Lospiensosquecontengangrasasquenopuedanextraersedirectamente
conéterdepetróleo(3.5)debendesengrasarseconarregloalpunto8.1y
someterse aunnuevodesengrasado despuésdehaber sidotratados con
ácidoenebullición.
Después del tratamiento con ácido en ebullición y del lavado, unir el
crisolysucontenidoalextractordefrío(4.6),lavartresvecesutilizando
30mldeacetonacadavezylavaracontinuaciónotrastresvecesutili-
zando30mldeéterdepetróleocadavez.Secarelfiltroporaspiración
ycontinuarelanálisisconarregloalpunto5,comenzandoconeltrata-
mientoconhidróxidodepotasio.
8.3. Si los piensos contienen más de un 5 % de carbonatos, expresados en
carbonato de calcio, conectar el crisol (4.2), con la muestra pesada, al
aparato de calentamiento (4.1). Lavar la muestra tres veces con 30 ml
de ácido clorhídrico (3.6). Después de cada adición, dejar reposar la
muestraduranteunminutoaproximadamenteantesdefiltrar.Lavaruna
vezcon30mldeaguayseguiracontinuaciónconarregloalpunto5.
8.4. Si se utiliza una batería de aparatos (varios crisoles unidos al mismo
aparato de calentamiento), no deben realizarse dos determinaciones de
lamismamuestraenlamismaserie.
8.5. Si,despuésdelaebullición,resultadifícilfiltrarlassolucionesácidasy
alcalinas,introducirairecomprimidoporeltubodedescargadelaparato
decalentamientoyseguirfiltrandoacontinuación.
8.6. Con objeto de alargar la duración de los crisoles filtrantes de vidrio,
conviene que la temperatura de calcinación no supere los 500 ºC.
Asimismo, deben evitarse los cambios térmicos bruscos en los ciclos
decalentamientoyenfriamiento.1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—8
▼B
ANEXO II
1.DETERMINACIÓNDELRETINOL(VITAMINAA)
1.Objetivoycampodeaplicatión
El método permite determinar el retinol (vitamina A) en los alimentos, los
concentrados y los premezclas. El límite inferior de la determinación es de
10000 UI/kg para los alimentos altamente pigmentados y de 4000 UI/kg
para el resto de los productos(1). Los productos se clasificarán aquí en dos
grupos,segúnsucontenidosupuestoenretinol:
Grupo A:contenidoinferioresa200000UI/kg,
Grupo B:contenidosigualesosuperioresa200000UI/kg.
2.Principio
La muestra se hidroliza en caliente mediante una solución de hidróxido de
potasioenmedioetanólicoyenpresenciadeunantioxidanteoenatmósfera
de nitrógeno. La mezcla se somete a la extracción por 1,2-dicloretano. El
extracto seevaporaensecoyserecogeporeléterdepetróleo.Lasolución
secromatografíasobrecolumnadeóxidodealuminio(paralosproductosdel
grupoB,lacromatografíasóloserequiereendeterminadoscasos).Elretinolse determina mediante espectrofotometría a 610 nm tras el desarrollo de un
complejo coloreado según la reacción de Carr-Price, en el caso de los
productosdelgrupoA;porespectrofotometría enl'UVa325nmenelcaso
delosproductosdelgrupoB.
3.Reactivos
a)empleados para el análisis de los productos de los grupos A y B
3.1. Etanolal96%(v/v)3.2. Soluciónal10%(p/v)deascorbatodesodiop.a.,o3.3. Azote,purificado3.4. Soluciónal50%(p/v)dehidróxidodepotasiop.a.3.5. Solucióndehidróxidodepotasio1N
3.6. Solucióndehidróxidodepotasio0,5N
3.7. 1,2-dicloretanop.a.3.8. Eterdepetróleo,puro,ebullición30-50ºC.Sifueranecesario,puri-
ficar como se indica. Agitar 1000 ml de éter de petróleo con
porciones de 20 ml ácido sulfúrico concentrado hasta que el ácido
se mantenga incoloro. Eliminar el ácido y lavar el éter sucesiva-
mente con500mldeagua,dosveces con250mldeunasolución
al 10 % de hidróxido de sodio y tres veces 500 ml de agua.
Eliminar la capa acuosa, secar el éter durante 1 hora sobre carbón
activoysulfatodesodiodealuminio,filtrarydestilar.
3.9. Oxido de aluminio, estandarizado según Brockmann: calcinar
durante8ha750ºC,refrigerarendesecadoryconservarenfrasco
decristalmarrón,detapónesmerilado.Antesdelempleoencroma-
togrfía,humedecercomoseindica:introducirenunfrascodecristal
marrón10gdeóxidodealuminioy0,7mldeagua,taparherméti-
camente, volver a calentar durante 5 minutos en un baño de agua
hirviendo siempre con energía. Dejar refrigerar agitándolo.
Comprobarlaactividaddelóxidodealuminioasípreparadosome-
tiendo al análisis según 5.3y 5.4 una cantidad conocida de retinol
decalibradopatrónmuestra(3.17)
3.10. Oxidodealuminiobásico,gradodeactividadI3.11. Eter dietílico, puro. Eliminar los peróxidos y los restos de agua
mediantecromatografíasobrecolumnadeóxidodealuminiobásico
(3.10)(25gdeóxidodealuminiopara250mldeéterdietílico)
3.12. Solucionesdeéterdepetróleo(3.8)al4,8,12,16y20%(v/v)de
éterdietílico(3.11)
3.13. Solucióndesulfurodesodio0,5molesenlaglicerinaal70%(v/v)
preparadaapartirdelsulfurodesodiop.a.1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—9
(1) 1UI=0,3µgderetinol.
▼B
b)utilizados exclusivamente para el análisis de los productos del grupo A
3.14. Bencenop.a.,cristalizable3.15. Cloroformop.a.Eliminareletanol,elfosgenoylosrestosdeagua
mediantecromatografíasobrecolumnadeóxidodealuminiobásico
(3.10) (50 g de óxido de aluminio para 200 ml de cloroformo)
conviene cromatografiar una segunda vez los 50 primeros ml del
eluido)
3.16 ReactivosegúnCarr-Price.Agitar25gaproximadamente detriclo-
ruro de antimonio p.a. (conservado en desecador) con 100 ml de
cloroformo(3.15)hastalasaturacióndelasolución.Unpasodébil
de tricloruro no estorba. Añadir 2 ml de anhídrido acético p.a.
Consevarenelfrigoríficoenunfrascodecristalmarróncontapón
esmerilado.Períododeconservación:variassemanas
3.17. Retinoldemuestrapatrón,controladoporespectrofotometría
c)utilizados exclusivamente para el análisis de los productos del grupo B
3.18. Isopropanol,paracromatografía
4.Equipo
4.1. Bañodeagua
4.2. Aparato rotativo de evaporación en vacío, con matraces redondos de
diferentescapacidades
4.3. Tubos para cromatografía, de cristal (longitud: 300 mm, diámetro inte-
rior:13mmaproximadamente)
4.4. Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de espesor (de cuarzo para
medicionesenl'UV)
4.5. LámparaUV,365nm
5.Métodooperatorio
N.B.Lasmanipulacionesnodebenhacersebajolaluzdirecta,sifueranece-
sarioenunaparatodecristalmarrón
5.1.Toma de muestras
Efectuar una toma de muestras de la muestra finamente dividida,
proporcionalalcontenidosupuestoenvitaminaA,osea:
0,1a1,0gparalasconcentraciones(contenidossuperioresa20000UI/
kg),
3,0 a 5,0 g para las premezclas (contenidos comprendidos entre 400 y
20000UI/g,
10a20sgparalasmezclasminerales,
30gparalosproductosdelgrupoA.
Introducirinmediatamente latomademuestrasenunmatrazde500ml
detapónesmerilado.
5.2.Hidrólisis y extracción (
1)
Añadirsucesivamentealatomademuestras40mldeetanol(3.1.),2ml
desolucióndeascorbatodesodio(3.2)(2),10mldesolucióndehidró-
xidodepotasio(3.4.)y2mldesolucióndesulfurodesodio(3.13).
Calentar durante 30 minutos a 70-80 ºC bajo refrigerante de reflujo y
dejarrefrigerar acontinuación bajocorriente deagua.Añadir50mlde
etanol (3.1) y 100 ml (tomados con la pipeta) de 1,2-dicloretano (3.7).
Agitar enérgicamente y de cantar el líquido sobrenadante en una
ampolla de decantación. Añadir en la ampolla 150 ml de solución de
hidróxido de potasio (3.5), agitar durante 10 segundos y dejar reposar
hasta la separación de las fases. Recoger la fase de dicloretánica (fase
inferior) en una ampolla de decantación, añadir 40 ml de solución de
hidróxido de potasio (3.6), agitar durante 10 segundos y dejar reposar
hasta la separación de las fases. Recoger la fase dicloretánica en una
ampolla dedecantación ylavar 6a8vecesconayuda deporciones de1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—10
(1) Paralosalimentosdelantanciaylosproductosquetienentendenciaaaglomerarseoa
hincharse,duplicar la cantidad de reactivos indicados en 5.2 primer y segundo párrafo.
(2) La adición de ascorbato de sodio no es necesaria cuando la hidrólisis se efectúe en
atmósferadenitrógeno.
▼B
40 ml de agua, hasta la ausencia de álcali (prueba de fenoltaleina).
Recoger lafase dicloretánica yeliminar losúltimos restosde aguacon
ayudadebandasdepapelfiltro.
Evaporar en seco una parte alícuota de la solución, en vacío y sobre
bañodeaguaalatemperaturade40ºC.Recogerrápidamenteelresiduo
con5mldeéterdepetróleo(3.8).
Para los productos del grupo A ,cromatografiarcomoseindicaen5.3.1.
Para los productos del grupo B , transvesar la solución a un matraz
aforado de 50 ml, completar al volumen con éter de petróleo (3.8)
homogeneizarymedirladensidadópticacomoseindicaen5.4.2.
5.3.Cromatografía
5.3.1.Productos del grupo A
Llenar un tubo para cromatografía (4.3.), hasta una, altura de
200mm,deóxidodealuminio(3.9)previamenteimpregnadode
éter de petróleo (3.8). Introducir en el tubo la solución en 5.2 y
añadirinmediatamente20mldeéterdepetróleo(3.8).Eluirsuce-
sivamente por porcionesde 10 ml de las soluciones de éter de
petróleo al 4, 8, 12, 16 y 20 por ciento de éter dietílico (3.12),
en vacio parcial o bajo presión, la velocidad de salida habrá de
serde2a3gotasporsegundo.
Elcarotenoseeluiráenprimerlugar(1).Elretinolseeluyegene-
ralmente por la solución de éter de petróleo al 20 por ciento de
éter dietílico (3.12). La elusión se controla bajo luz UV (breve
irradiación de la columna por una lámpara de mercurio). La
banda fluorescente del retinol se separa netamente de las bandas
amarillas de xantófila que la siguen. Recoger la fracción del
eluidoquecontieneelretinolenunerlenmeyer.
5.3.2.Productos del grupo B
La cromatografía sólo debe efectuarse cuando las mediciones de
la densidad óptica obtenidas en 5.4.2no sean conformes con las
disposicionesindicadasen5.4.2.
Si se hiciese patente la cromatografía, introducir en la columna
cromatográfica una parte alícuota de la solución en el éter de
petróleo obtenido en 5.2, con un contenido de aproximadamente
500UIderetinol,ycromatografiarcomoseindicaen5.3.1.
5.4.Medición de la densidad óptica
5.4.1.Productos del grupo A
Evaporar en seco, en vacío, el eluado que contiene el retinol,
obtenido en 5.3.1. Recoger el residuo con 2 ml de benceno
(3.14).Tomar0,3mldedichasoluciónyañadir3mldelreactivo
segúnCarr-Price(3.16).Sedesarrollaunacoloraciónazul.Medir
la densidad óptica mediante el espectrómetro a 610 nm, 30
segundos exactamente después del principio de reacción. Deter-
minar el contenido en retinol, refiriéndose a una curva de
calibradoobtenidaapartirdesolucionesbencénicasdeconcentra-
ciones crecientes en retinol de patrón tratados con el reactivosegún Carr-Price [de 2 a 16 UI de vitamina A de patrón (3.17)
con0,3mldebenceno(3.14)+3mldereactivosegúnCarr-Price
(3.16)]. La curva de calibrado debe controlarse regularmente y
durante breves intervalos de tiempo con la ayuda de la muestra
ydeunasoluciónreciénpreparadadelreactivosegúnCarr-Price.
5.4.2.Productos del grupo B
Tomarlapartealícuotadelasolucióneneléterdepetróleoobte-
nidoen 5.2,con uncontenido aproximado de 200UIde retinol.
Evaporar en seco, en vacío, y recoger el residuo con 25 ml de
isopropanol(3.18).Medirladensidadópticaconelespectrofotó-
metro a 325, 310 y 334 nm. El máximo de absorción se sitúa a
325 nm. El contenido en retino A de la solución se calcula tal
comosigue:
E
325.18,30=UIderetinol1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—11
(1) El contenido de caroteno puede determinarse por la medida de la densidad óptica a
450nm;E1%
1cm¼2600 :
▼B
Sinembargo,lasrelacionesdelasdensidadesópticas
E310:E325yE334:E325
debenserde6:7=0,857.
Cuando una de dichas relaciones se separe sensiblemente de
dicho valor (<0,830 u > 0,880), la medición de las densidades
ópticasdebeprecederseporunacromatografía,segúnelprocedi-
miento indicado en 5.3.2. Si la medición de las densidades
ópticas efectuada tras la cromatografía indica que las relaciones
antesmencionadasseseparantodavíadeformasensibledelvalor
0,857(<0,830ó>0,880),ladeterminacióndebeefectuarsesegún
elprocedimientoindicadoparalosproductosdelgrupoA.
6.Cálculodelosresultados
Calcularelcontenidoenretinoldelamuestrateniendoencuentoelpesode
la toma muestras y de las diluciones efectuadas a lo largo del análisis.
ExpresarelresultadoenUIderetinolporkg.
Repetibilidad
Ladiferenciaentrelosresultadosdedosdeterminacionesparalelasefectuadas
sobrelamismamuestranodebeexceder:
— del 20 %, en valor relativo, para los contenidos en retinol inferiores a
75000UI/kg,
— de 15000 UI para los contenidos comprendidos entre 75000 y
150000UI/kg,
— del 10 %, en valor relativo, para los contenidos comprendidos entre
150000y250000UI/kg,
— de 25000 UI para los contenidos comprendidos entre 250000 y
500000UI/kg,
— del 5 %, en valor relativo, para loscontenidos superiores a 500000 UI/
kg.1973L0046—ES—13.08.1998—003.001—12
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