2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B DECISIÓNDELACOMISIÓN
►C1 de14deagostode2002 ◄
porlaqueseaplicalaDirectiva96/23/CEdelConsejoencuantoalfuncionamientodelosmétodos
analíticosylainterpretacióndelosresultados
[notificada con el número C(2002) 3044]
(TextopertinenteaefectosdelEEE)
(2002/657/CE)
(DOL221de17.8.2002,p.8)
Rectificadapor:
►C1Rectificación,DOL239de6.9.2002,p.66(2002/657/CE)
▼B
DECISIÓNDELACOMISIÓN
►C1 de14deagostode2002 ◄
porlaqueseaplicalaDirectiva96/23/CEdelConsejoencuantoal
funcionamientodelosmétodosanalíticosylainterpretacióndelos
resultados
[notificada con el número C(2002) 3044]
(TextopertinenteaefectosdelEEE)
(2002/657/CE)
LACOMISIÓNDELASCOMUNIDADESEUROPEAS,
VistoelTratadoconstitutivodelaComunidadEuropea,
VistalaDirectiva96/23/CEdelConsejo,de29deabrilde1996,rela-
tiva a las medidas de control aplicables respecto de determinadas
sustancias y susresiduos en los animales vivos y susproductos y por
laquesederoganlasDirectivas85/358/CEEy86/469/CEEylasDeci-siones 89/187/CEE y 91/664/CEE(
1), y, en particular, el segundo
párrafodelapartado1desuartículo15,
Considerandolosiguiente:
(1)La presencia de residuos en productos de origen animal es una
cuestiónqueafectaalasaludpública.
(2)En la Decisión 98/179/CE de la Comisión, de 23 de febrero de1998,por la que se fijan normas específicas relativas a la tomademuestras oficiales para el control de determinadas sustancias
ysusresiduosenlosanimalesvivosysusproductos(
2),seesta-
blece que el análisis de las muestras será efectuadoexclusivamente porloslaboratorios autorizadosporlaautoridadcompetenteparaelcontroloficialderesiduos.
(3)Esnecesariogarantizarlacalidadycomparabilidaddelosresul-tados analíticos de los laboratorios autorizados para el controloficialderesiduos.Paraellodebenutilizarsesistemasdeasegu-ramientodelacalidady,específicamente, métodosvalidadosde
acuerdo con procedimientos y criterios de funcionamiento
comunes, y garantizarse la trazabilidad con arreglo a normascomunesonormasconsensuadas.
(4)De acuerdo con la Directiva 93/99/CEE del Consejo, de 29 deoctubre de 1993, sobre medidas adicionales relativas al controloficial de los productos alimenticios y la Decisión 98/179/CE(
3), a partir de enero de 2002, los laboratorios de control
oficiales deben estar autorizados con arreglo a la norma ISO
17025 (1). De conformidad con la Decisión 98/179/CE, se
exigirá a los laboratorios autorizados su participación en unprogramaexterno,internacionalmente reconocido,deevaluacióny acreditación del control de calidad. Dichos laboratoriosdeberán asimismo demostrar su competencia participando demaneraregularysatisfactoriaenprogramasadecuadosdeensayo
de aptitud reconocidos u organizados por laboratorios de refe-
rencianacionalesocomunitarios.
(5)De acuerdo con la Directiva 96/23/CE, una red de laboratorioscomunitariosdereferencia, laboratoriosnacionalesdereferenciaylaboratoriosnacionalesdecontrolfacilitalastareasdecoordi-nación.
(6)Los avances realizados en química analítica desde la adopciónde la Directiva 96/23/CE han dejado obsoleto el concepto demétodosderutinaymétodosdereferenciaylohanreemplazadoporunplanteamientoenelqueseestablecencriteriosdefuncio-2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—2
(1) DOL125de23.5.1996,p.10.
(2) DOL65de5.3.1998,p.31.
(3) DOL290de24.11.1993,p.14.
▼B
namiento y procedimientos de validación de los métodos de
cribadoyconfirmación.
(7)Es necesario acordar criterios comunes de interpretación de losresultadosdeloslaboratoriosoficialesdecontrolparagarantizar
unaaplicaciónarmonizadadelaDirectiva96/23/CE.
(8)Deben establecerse progresivamente límites mínimos de funcio-
namiento exigidos (MRPL) de los métodos analíticos aplicablesa sustancias para las que no se ha establecido un límite permi-tido y, en particular, a sustancias cuya utilización no ha sidoautorizada ni prohibida específicamente en la Comunidad, conobjeto de garantizar una aplicación armonizada de la Directiva
96/23/CE.
(9)LaDecisión90/515/CEEdelaComisión,de26deseptiembrede
1990,porlaqueseestablecenlosmétodosdereferenciaparalainvestigaciónderesiduosdemetalespesadosydearsénico(
1),la
Decisión 93/256/CEE de la Comisión, de 14 de abril de 1993,porlaqueseestablecenlosmétodosquedeberánutilizarseparala detección de residuos de sustancias de efecto hormonal y de
sustancias de efecto tireostático(
2), y la Decisión 93/257/CEE
delaComisión,de15deabrilde1993,porlaqueseestablecenlosmétodosdereferenciaylalistadelaboratoriosnacionalesdereferencia para la detección de residuos(
3), cuya última modifi-
cación la constituye la Decisión 98/536/CE(4), revisadas
anteriormente para tener en cuenta los avances de los conoci-
mientos científicos y técnicos, se consideran obsoletas encuanto a su ámbito de aplicación y sus disposiciones y, enconsecuencia,debenserderogadasporlapresenteDecisión.
(10)Debe fijarse un período transitorio que permita adaptar losmétodosdeanálisisdelasmuestrasoficialesalasdisposicionesdelapresenteDecisión.
(11)Las medidas previstas en la presente Decisión se ajustan aldictamen del Comité permanente de la cadena alimentaria y de
sanidadanimal.
HAADOPTADOLAPRESENTEDECISIÓN:
Artículo 1
Contenidoyámbitodeaplicación
La presente Decisión establece normas relativas a los métodos analí-
ticos de muestras oficiales tomadas de conformidad con la segunda
frase del apartado 1 del artículo 15 de la Directiva 96/23/CE y fija
criterios comunes de interpretación de los resultados analíticos dedichasmuestrasporpartedeloslaboratoriosoficialesdecontrol.
La presente Decisión no será aplicable a determinadas sustancias
sujetasanormasmásespecíficasdelalegislacióncomunitaria.
Artículo 2
Definiciones
A efectos de la presente Decisión, se aplicarán las definiciones de la
Directiva96/23/CEydelanexodelapresenteDecisión.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—3
(1) DOL286de18.10.1990,p.33.
(2) DOL118de14.5.1993,p.64.
(3) DOL118de14.5.1993,p.75.
(4) DOL251de11.9.1998,p.39.
▼B
Artículo 3
Métodosanalíticos
LosEstadosmiembrosgarantizaránquelasmuestrasoficialestomadas
deacuerdoconlaDirectiva96/23/CEseanalizansegúnmétodosque:
a) estándocumentadosenlasinstruccionesdeensayo,preferiblemente
deacuerdoconlanormaISO78-2(6);
b) cumplen las disposiciones del punto 2 del anexo de la presente
Decisión;
c) han sido validados de acuerdo con los procedimientos descritos en
elpunto3delanexo;
d) cumplen los límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL)
queseestablecerándeacuerdoconelartículo4.
Artículo 4
Límitesmínimosdefuncionamientoexigidos
La presente Decisión se revisará para establecer progresivamente los
límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL) de los métodosanalíticos aplicables a sustancias para las que no se ha establecido un
límitepermitido.
Artículo 5
Controldecalidad
Los Estados miembros asegurarán la calidad de los resultados de los
análisis de las muestras tomadas de acuerdo con la Directiva 96/23/CE, en particular comprobando los ensayos y/o las calibraciones deacuerdoconelpunto9delcapítulo5delanormaISO17025(1).
Artículo 6
Interpretacióndelosresultados
1. El resultado de un análisis se considerará no conforme si se
superaellímitededecisióndelmétododeconfirmaciónparaelanalito.
2. Si se ha establecido un límite permitido para una sustancia, el
límite de decisión es la concentración por encima de la cual puededecidirseconunacertezaestadísticade1- αquesehasuperadoefec-
tivamenteellímitepermitido.
3. Sinosehaestablecidounlímitepermitidoparaunasustancia,el
límite de decisión es la concentración más baja a partir de la cual unmétodo puede detectar la presencia del analito en cuestión con una
certezaestadísticade1- α.
4. ParalassustanciasdelgrupoAdelanexoIdelaDirectiva96/23/
CE,elerror αseráequivalente oinferiora1%.Paratodaslasdemás
sustancias,elerror αseráequivalenteoinferiora5%.
Artículo 7
Derogación
Quedan derogadas las Decisiones 90/515/CEE, 93/256/CEE y 93/257/
CEE.
Artículo 8
Disposicionestransitorias
Los métodos de análisis de muestras oficiales de sustancias del grupo
AdelanexoIdelaDirectiva96/23/CEquecumplenloscriteriosesta-
blecidos en las Decisiones 90/515/CEE, 93/256/CEE y 93/257/CEEpodránseguirutilizándosehastatranscurridosdosañosdesdelaentradaenvigordelapresenteDecisión.Losmétodosaplicadosactualmentealas sustancias del grupo B del anexo I de la Directiva 96/23/CE2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—4
▼B
deberáncumplirlasdisposicionesdelapresenteDecisiónamástardar
cincoañosdespuésdelafechadeaplicacióndelamisma.
Artículo 9
Fechadeaplicación
LapresenteDecisiónseaplicaráapartirdel1deseptiembrede2002.
Artículo 10
Destinatarios
LosdestinatariosdelapresenteDecisiónseránlosEstadosmiembros.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—5
▼B
ANEXO
CRITERIOS DE FUNCIONAMIENTO Y OTROS REQUISITOS Y
PROCEDIMIENTOSDELOSMÉTODOSANALÍTICOS
1.DEFINICIONES
1.1. «Exactitud»: gradode concordancia entre el resultado del ensayoy un
valordereferencia aceptado(2).Seobtienedeterminando laveracidad
ylaprecisión.
1.2. «Error alfa ( α)»: probabilidad de que la muestra analizada sea real-
mente conforme, aunque se haya obtenido una medición no conforme
(«decisióndefalsonoconforme»).
1.3. «Analito»: sustancia que debe ser detectada, identificada y/o cuantifi-
cadaylosderivadosdelamismaqueseformenduranteelanálisis.
1.4. «Error beta ( β)»: probabilidad de que la muestra analizada sea real-
mente no conforme, aunque se haya obtenido una medición conforme
(«decisióndefalsoconforme»).
1.5. «Sesgo»:diferenciaentreelresultadodelensayoesperadoyunvalorde
referenciaaceptado(2).
1.6. «Patrón de calibración»: mecanismo de medición que representa la
cantidadtotaldesustanciadeinterésdemodoquesuvalorestévincu-
ladoaunabasedereferencia.
1.7. «Materialcertificadodereferencia(CRM)»:materialalquesehaasig-
nadouncontenidodeanalitoespecificado.
1.8. «Cocromatografía»: procedimiento en el que se divide el extracto en
dos partes antes de la cromatografía. Una parte se cromatografía tal
cual. La otra se mezcla con el analito patrón que debe medirse y se
cromatografía también. Lacantidad deanalito patrón añadido debe ser
similar a la cantidad de analito estimada en el extracto. Este método
está diseñado para mejorar la identificación deun analito pormétodos
cromatográficos, especialmente cuando no puede utilizarse un patrón
internoadecuado.
1.9. «Estudio colaborativo»: análisis de una misma muestra con un mismo
método para determinar las características de funcionamiento del
método. El estudio cubre el error aleatorio de medición y el sesgo de
laboratorio.
1.10. «Método de confirmación»: método que proporciona información total
o complementaria que permite identificar y, en su caso, cuantificar de
manerainequívocalasustanciaalniveldeinterés.
1.11. «Límite de decisión (CC α)»: límite en el cual y a partir del cual se
puedeconcluirconunaprobabilidad deerror αqueunamuestranoes
conforme.
1.12. «Capacidaddedetección(CC β)»:contenidomínimodelasustanciaque
puede ser detectado, identificado o cuantificado en una muestra, con
una probabilidad de error β.En el caso de sustancias para las que no
se ha establecido un límite permitido, la capacidad de detección es la
concentración mínima en la que un método puede detectar muestrasrealmente contaminadas con una certeza estadística de 1 - β.En el
caso de sustancias para las que se ha establecido un límite permitido,
la capacidad de detección es la concentración en la que un método
puede detectar límites de concentración permitidos con una certeza
estadísticade1- β.
1.13. «Material de muestra enriquecido»: muestra enriquecida con una
cantidadconocidadelanalitoquedebedetectarse.
1.14. «Estudio interlaboratorios (comparación)»: organización, realización y
evaluación de ensayos de una misma muestra por doso más laborato-
rios según condiciones predefinidas para determinar el funcionamiento
de los ensayos. En función del objetivo del estudio puede catalogarse
deestudiocolaborativoodeestudiodeaptitud.
1.15. «Patróninterno(IS)»:sustancianocontenidaenlamuestra,depropie-
dades físicoquímicas lo más próximas posible a las del analito que ha
deidentificarse,queseañadeacadamuestraypatróndecalibración.
1.16. «Muestradelaboratorio»:muestraquesepreparayseenvíaaunlabo-
ratorioparaunainspecciónounensayo.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—6
▼B
1.17. «Niveldeinterés»:concentración deunasustanciaounanalitoenuna
muestra que es significativa para determinar su conformidad con la
legislación.
1.18. «Límite mínimo de funcionamiento exigido (MRPL)»: contenido
mínimo deunanalito enunamuestraquedebeserdetectado yconfir-
mado.Sirveparaarmonizarelfuncionamientoanalíticodelosmétodos
aplicables a las sustancias para las que no se ha establecido un límite
permitido.
1.19. «Característica de funcionamiento»: calidad funcional que puede atri-
buirse a un método analítico. Puede tratarse, por ejemplo, de la
especificidad, la exactitud, la veracidad, la precisión, la repetibilidad,
la reproducibilidad, la recuperación, la capacidad de detección y la
robustez.
1.20. «Criterios de funcionamiento»: exigencias de una característica de
funcionamiento en función de las cuales se puede determinar que un
método analítico es adecuado para la finalidad perseguida y ofrece
resultadosfiables.
1.21. «Límite permitido»: límite máximo de residuo, nivel máximo u otra
toleranciamáximadesustanciasestablecidosenotroámbitodelalegis-
lacióncomunitaria.
1.22. «Precisión»: grado de concordancia entre resultados de ensayos inde-
pendientes obtenidos en condiciones estipuladas (predeterminadas). La
precisiónsueleexpresarsecomoimprecisiónycalcularsecomodesvia-
ción estándar de los resultados de los ensayos. Cuanto mayor es la
desviaciónestándarmenoreslaprecisión(2).
1.23. «Estudio de aptitud»: procedimiento por el que varios laboratorios
analizan unamismamuestraconsuspropiosmétodos,siemprequelos
utilicenencondicionesderutina.Elestudiodeberealizarsedeacuerdo
conlasGuíasISO43-1(3)y43-2(4)ypuedeutilizarseparaevaluarla
reproducibilidaddelosmétodos.
1.24. «Método cualitativo»: método analítico que identifica una sustancia
basándoseensuspropiedadesquímicas,biológicasofísicas.
1.25. «Métodocuantitativo»:métodoanalíticoquedeterminalacantidadola
fracción de la masa de una sustancia de forma que pueda expresarse
comovalornuméricodeunidadesapropiadas.
1.26. «Determinación del blanco de reactivo»: procedimiento analítico
completo aplicado sin la porción de ensayo o utilizando una cantidad
equivalentededisolventeadecuadoenlugardelaporcióndeensayo.
1.27. «Recuperación»: porcentaje de la concentración real de una sustancia
recuperadoduranteelprocedimientoanalítico.Estefactorsedetermina
durantelavalidaciónsinosedisponedematerialdereferenciacertifi-
cado.
1.28. «Material de referencia»: material del que se haya confirmado una o
varias propiedades, por medio de un método validado, de manera que
pueda utilizarse para calibrar un aparato o comprobar un método de
medición.
1.29. «Repetibilidad»:precisiónencondicionesderepetibilidad(2).1.30. «Condiciones de repetibilidad»: condiciones en las que un mismo
operador obtiene resultados de ensayos independientes con el mismo
métodoeidénticasmuestrasdeanálisis,enelmismolaboratorioycon
elmismoequipo(2).
1.31. «Reproducibilidad»: precisión en condiciones de reproducibilidad (2)
(4).
1.32. «Condiciones de reproducibilidad»: condiciones en las que operadores
diferentesobtienen resultadosdeensayosindependientes conelmismo
métodoeidénticasmuestrasdeensayo,enlaboratoriosdiferentesycon
equiposdiferentes(2)(4).
1.33. «Robustez»:susceptibilidaddeunmétodoanalíticoaloscambiosdelas
condicionesexperimentales,quepuedenexpresarseenformadelistade
losmaterialesdelamuestra,losanalitos,lascondicionesdealmacena-
mientoolascondicionesambientalesodepreparacióndelamuestraen
lasque puede aplicarse elmétodo tal cual ocon determinadas modifi-
caciones menores. Deberá indicarse cualquier variación de las
condiciones experimentales susceptibles de fluctuación en la práctica
(por ejemplo, estabilidad de los reactivos, composición de la muestra,
pHotemperatura)quepuedanafectaralosresultadosanalíticos.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—7
▼B
1.34. «Determinación del blanco de la muestra»: procedimiento analítico
completo aplicado a una porción de ensayo de una muestra que no
contieneelanalito.
1.35. «Métodosdecribado»:métodosutilizadosparadetectarlapresenciade
una sustancia, o tipo de sustancias, al nivel de interés. Estos métodos
permitentratarunelevadonúmerodemuestrasyseutilizanparacribar
grandes cantidades de muestras en busca de posibles resultados no
conformes. Están diseñados específicamente para evitar resultados de
falsoconforme.
1.36. «Estudiointralaboratorio (validacióninterna)»:estudioanalítico porun
solo laboratorio que utiliza el mismo método para proceder a análisis,
separados por largos intervalos de tiempo justificados, de idénticos o
diferentesmaterialesdeensayoencondicionesdistintas.
1.37. «Especificidad»: capacidad de un método de distinguir entre el analito
queseestámidiendoyotrassustancias.Estacaracterísticaesantetodo
una función de la técnica de medición descrita, pero puede variar en
funcióndeltipodecompuestoodelamatriz.
1.38. «Adicióndepatrón»:procedimiento enelquelamuestradeensayose
divide en dos (o más) porciones de ensayo. Una de las porciones se
analizatalcualyenlaotra(olasotras)seañadencantidadesconocidas
del analito patrón antes de proceder al análisis. La cantidad de analito
patrón añadida debe ser entre dos y cinco veces superior al contenido
estimado de analito en la muestra. Este procedimiento está diseñado
para determinar el contenido de un analito en una muestra, teniendo
encuentalarecuperacióndelprocedimientoanalítico.
1.39. «Analito patrón»: analito de contenido y pureza conocidos y certifi-
cadosqueseutilizacomoreferenciaenelensayo.
1.40. «Sustancia»:materiadeconstituciónquímicaparticularoconfirmaday
susmetabolitos.
1.41. «Porción de ensayo»: cantidad de material extraído de la muestra de
ensayoenlaqueserealizaelanálisisolaobservación.
1.42. «Muestra de ensayo»: muestra preparada a partir de una muestra de
laboratorioydelaquesetomaránporcionesdeensayo.
1.43. «Veracidad»: grado de concordancia existente entre el valor medio
obtenidodeunagranseriederesultadosyunvalordereferenciaacep-
tado.Laveracidadseexpresanormalmentecomosesgo(2).
1.44. LasunidadessonlasdescritasenlaguíaISO31(20)ylaDirectiva71/
354/CE(19).
1.45. «Validación»:confirmaciónmedianteexamenypuestaadisposiciónde
pruebas efectivas de que se cumplen los requisitos particulares de un
usoespecíficoprevisto(1).
1.46. «Reproducibilidad intralaboratorio»: precisión obtenida en un mismo
laboratorio y en condiciones estipuladas (predeterminadas) —relativas,
por ejemplo, al método, los materiales de ensayo, los operadores y el
entorno—separadosporlargosintervalosdetiempojustificados.
2.CRITERIOS DE FUNCIONAMIENTO Y OTROS REQUISITOS Y
PROCEDIMIENTOSDELOSMÉTODOSANALÍTICOS
Losmétodosocombinacionesdemétodosanalíticosdiferentesdelosdescritosa
continuación sólo pueden utilizarse con fines de criba o confirmación si se
puede demostrar que cumplen los requisitos pertinentes establecidos en la
presenteDecisión.
2.1. REQUISITOSGENERALES
2.1.1.Manipulacióndelasmuestras
Lasmuestrasserecogerán,manipularányprocesarándemaneraquese
obtengalamáximaprobabilidaddedetectarlasustancia.Enlosproce-
dimientosdemanipulación delasmuestrasseevitará laposibilidadde
contaminaciónaccidentalodepérdidadeanalitos.
2.1.2.Funcionamientodelosensayos
2.1.2.1.La recuperación
En el análisis de muestras se determinará la recuperación en cada lote
demuestrassiseutilizaunfactorcorrectordelarecuperaciónfijo.Sila
recuperación se encuentra dentro de los límites, puede emplearse el
factorcorrectorfijo.Encasocontrario,seaplicará elfactorderecupe-2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—8
▼B
ración de ese lote específico, a no ser que deba aplicarse el factor
específico de recuperación del analito de la muestra, en cuyo caso se
utilizará el procedimiento de adición de patrón (véase el punto 3.5) o
de un patrón interno para la determinación cuantitativa de un analito
enunamuestra.
2.1.2.2.Especificidad
Un método deberá ser capaz de distinguir entre el analito y otras
sustanciaenlascondicionesexperimentales.Seharáunaestimaciónde
esa capacidad de distinción. Deberán aplicarse estrategias para superar
cualquierinterferencia previsibleconlassustanciascuandoseaplicala
técnica de medición descrita, como la utilización de productos homó-
logos,análogosometabólicos del residuodeinterés. Esespecialmenteimportante estudiar cualquier interferencia que pudiera resultar de los
componentesdelamatriz.
2.2. MÉTODOSDECRIBA
DeacuerdoconlaDirectiva96/23/CE,paraelcribadoseutilizaránsólotécnicas
analíticas respecto de las cuales pueda demostrarse de modo documental que
están validadas y tienen un porcentaje de falsos conformes < 5 % (error β)al
niveldeinterés.Sisesospechaqueunresultadonoesconforme,seconfirmará
medianteunmétododeconfirmación.
2.3. MÉTODOS DE CONFIRMACIÓN PARA RESIDUOS ORGÁNICOS Y
CONTAMINANTES
Losmétodosdeconfirmaciónpararesiduosorgánicosocontaminantesincluirán
información sobre la estructura química del analito. En consecuencia, los
métodosbasadosexclusivamente enanálisiscromatográficosqueprescindende
ladetecciónespectrométricanoconvienenporsísoloscomométodosdeconfir-mación. No obstante, si una técnica por sí sola carece de la especificidad
necesaria, dicha especificidad se obtendrá por medio de procedimientos analí-
ticos consistentes en combinaciones adecuadas de limpieza, separación
cromatográficaydetecciónespectrométrica.
Los métodos o combinaciones de métodos siguientes se consideran adecuados
para la identificación de residuos orgánicos o contaminantes en el caso de los
gruposdesustanciasindicados:
Cuadro1
Métodosdeconfirmaciónadecuadospararesiduosorgánicosocontaminantes
TécnicademediciónSustanciasdelanexo1
delaDirectiva96/23/CELimitaciones
CL o CG con detección
por espectrometría de
masasGruposAyB Sólo si sucede a una separación por cromato-
grafíaenlíneayfueradelínea
Sólo si se utilizan técnicas de barrido
completo o técnicas que no registran los
espectros de masa completos pero incluyen al
menos 3 (grupo B) o 4 (grupo A) puntos de
identificación
CL o CG con detección
espectrométricadeIRGruposAyB Deben cumplirse requisitos específicos de
absorciónenlaespectrometríadeIR
CL-DADbarridocompleto GrupoB Deben cumplirse requisitos específicos de
absorciónenlaespectrometríadeUV
CL-fluorescencia GrupoB Sólo se aplica a las moléculas que presentan
fluorescencia natural y a las que la presentan
despuésdetransformaciónoderivatización
2-D TLC-UV/VIS por
barridocompletoGrupoB Se requieren la HPTLC bidimensional y la
cocromatografía
CG-Detección de la capta-
ciónelectrónicaGrupoB Sólo si se utilizan dos columnas de polaridad
diferente
CL-inmunograma GrupoB Sólo si se utilizan al menos dos sistemas
cromatográficos diferentes o un segundo
métododedetecciónindependiente
CL-UV/VIS (longitud de
ondaúnica)GrupoB Sólo si se utilizan al menos dos sistemas
cromatográficos diferentes o un segundo
métododedetecciónindependiente2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—9
▼B
2.3.1.Criteriosyrequisitosdefuncionamientocomunes
Los métodos de confirmación proporcionarán información sobre la
estructura química del analito. Si se obtiene la misma respuesta con
más de un compuesto, el método no es capaz de distinguir esos
compuestos. Los métodos basados exclusivamente en análisis croma-
tográficos sin recurrir al empleo de la detección espectrométrica no
convienenporsísoloscomométodosdeconfirmación.
Si se utilizan estos métodos, al comenzar el procedimiento de extrac-
ciónseañadirá unpatróninterno adecuado alaporcióndeensayo. Se
emplearán, según su disponibilidad, formas marcadas por isótopos
estables del analito, especialmente adecuadas para la detección por
espectrometría de masas, o compuestos relacionados estructuralmente
conelanalito.
Cuando no pueda utilizarse un patrón interno adecuado, la identifica-
cióndelanalitoseconfirmarámediante cocromatografía. Enestecaso,
sóloseobtendráunpico,enelcuallaaltura(osuperficie)máximaserá
equivalentealacantidaddeanalitoañadida.Enelcasodelacromato-
grafía de gases (CG) o la cromatografía líquida (CL), la anchura del
pico medida a la mitad de la altura máxima oscilará entre un 90 % y
un110%delaanchuraoriginal,ylostiemposderetenciónseránidén-
ticos,conunatoleranciadel5%.Paralosmétodosdecromatografíaen
capa fina (TLC), se intensificará únicamente la mancha que supuesta-
mentesedebealanalito;nodeberáaparecerningunamanchanuevanisemodificaráelaspecto.
Los materiales de referencia o enriquecidos que contengan cantidades
conocidas de analito, en el límite o a proximidad del límite permitido
odedecisión(muestradecontrolnoconforme),asícomolosmateriales
decontrolconformesylosblancosdereactivo,deberánutilizarseprefe-
rentemente durante todo el proceso simultáneamente con cada lote de
muestrasdeensayoanalizado. Elordenparainyectarlassolucionesen
elinstrumentodeanálisiseselsiguiente:blancodereactivo,muestrade
controlconforme,muestraomuestrasporconfirmar,muestradecontrol
conforme de nuevoy,porúltimo, muestra de control no conforme. Se
justificarátodavariacióndeestasecuencia.
2.3.2.Criterios de funcionamiento adicionales y otros requisitos que
debencumplirlosmétodoscuantitativosdeanálisis
2.3.2.1.Veracidad de los métodos cuantitativos
Enelcasodeanálisisrepetidosdeunmaterialdereferenciacertificado,
losintervalosdereferenciadeladesviaciónentrelafraccióndelamasa
mediadeterminadaexperimentalmente,concorrectorderecuperación,y
elvalorauténticoestarándentrodelossiguienteslímites:
Cuadro2
Veracidadmínimadelosmétodoscuantitativos
Fraccióndemasa Intervalo
≤1µg/kg –50%a+20%
>1 µg/kga10 µg/kg –30%a+10%
≥10µg/kg –20%a+10%
Cuando no se dispone de tales CRM, se acepta una valoración de la
veracidad de las mediciones mediante recuperación de adiciones de
cantidades conocidas de uno o varios analitos a una matriz en blanco.
Los datos corregidos mediante la recuperación media sólo son acep-
tablessientrandentrodelosintervalosexpuestosenelcuadro2.
2.3.2.2.Precisión de los métodos cuantitativos
Elcoeficiente devariación(CV)interlaboratorios paraelanálisisrepe-
tido de un material de referencia o enriquecido, en condiciones de
reproducibilidad, no superará el nivel calculado mediante la ecuación
deHorwitz,asaber:
CV=2(1-0,5logC)
donde C es la fracción de masa expresada como potencia (exponente)
de10(porejemplo,1mg/g=10–3).Elcuadro3recogevariosejemplos.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—10
▼B
Cuadro3
Ejemplos de CV de reproducibilidad de los métodos cuantitativos en un intervalo de
fraccionesdemasadeanalito
Fraccióndemasa CVdereproducibilidad(%)
1µg/kg (*)
10µg/kg (*)
100 µg/kg 23
1000 µg/kg(1mg/kg) 16
(*) Con fracciones de masa inferiores a 100 µg/kg, la aplicación de la ecuación de Horwitz conduce a
valores inaceptablemente elevados. Por ello, los CV de las concentraciones inferiores a 100 µg/kg
seránlomásbajosposible.
Enanálisisrealizadosencondicionesderepetibilidad,losCVintralabo-
ratoriosuelenarrojarvaloressituadosentrelamitadylosdosterciosde
losmencionados.Enanálisisrealizadosencondicionesdereproducibi-
lidadintralaboratorio, losCVintralaboratorio noseránsuperioresalos
CVdereproducibilidad.
Enelcasodesustanciasparalasquesehaestablecidounlímitepermi-
tido, el método alcanzará una reproducibilidad intralaboratorio no
superior al CV de reproducibilidad correspondiente en una concentra-
ciónde0,5×ellímitepermitido.
2.3.3.Criteriosdefuncionamientoyotrosrequisitosdelaespectrometría
demasas
Losmétodos de espectrometría de masas pueden servirde métodos de
confirmaciónsólodespuésdeunaseparacióncromatográficaenlíneay
fueradelínea.
2.3.3.1.Separación cromatográfica
En todos los procesos de CG-MS, la separación por cromatografía de
gases se realizará mediante columnas capilares. En todos los procesos
de CL-MS, la separación cromatográfica se realizará mediante
columnas adecuadas de CL. En cualquier caso, el tiempo de retención
mínimo aceptable para el analito es el doble del tiempo de retención
correspondiente al volumen vacío de la columna. El tiempo de reten-
ción (o el tiempo relativo de retención) del analito en la porción de
ensayocorresponderáaldelpatróndecalibración,dentrodeunabanda
especificadadetiempoderetención.Estabandadetiempoderetención
será acorde con el poder de resolución del sistema cromatográfico. La
relaciónentreeltiempoderetencióncromatográficadelanalitoyeldel
patrón interno, es decir, el tiempo relativo de retención del analito,
corresponderáaldelasolucióndecalibración, conunmargendetole-
ranciade±0,5%paralaCGy±2,5%paralaCL.
2.3.3.2.Detección por espectrometría de masas
La detección por espectrometría de masas se llevará a cabo mediante
técnicas de MS, como el registro de espectros de masa completos
(barridoscompletos) oelcontrol deionesespecíficos (SIM),asícomo
de técnicas de MS-MSn, como el control de la reacción seleccionada
(SRM),uotrastécnicasapropiadasdeMSoMS-MSn,combinadascon
losmodosdeionizaciónadecuados.Enespectrometríademasasdealta
resolución (HRMS),la resolución será generalmente superior a 10000
paratodoelintervalodemasas,conunadefinicióndelvalledel10%.
Barrido completo: Cuando la determinación con técnicas de espec-
trometría de masasselleva acabo registrando espectros completos, es
obligatoria la presencia de todos los iones de diagnóstico medidos (el
ion molecular, los aductos característicos del ion molecular, los iones
fragmentados característicos y losionesisotópicos) con una intensidad
relativasuperioral10%enelespectrodereferenciadelpatróndecali-
bración.
SIM: Cuando la determinación con técnicas de espectrometría de
masassellevaacaboporfragmentografía,elionmolecularseráprefe-
riblemente uno de los iones de diagnóstico seleccionados (el ion
molecular,losaductoscaracterísticosdelionmolecular,losionesfrag-
mentados característicos y todos sus iones isotópicos). Los iones de
diagnóstico seleccionados no deberán proceder exclusivamente de la
misma parte de la molécula. La relación señal-ruido para cada ion de
diagnósticoserá ≥3:1.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—11
▼B
Barrido completo y SIM: Las intensidades relativas de los iones
detectados, expresadas como porcentaje de la intensidad del ion más
intensoodelatransición,corresponderáalasdelpatróndecalibración,
biendesolucionesdelpatróndecalibración,biendemuestrasenrique-
cidas, en concentraciones comparables, medidas en las mismas
condiciones, con los siguientes márgenes de tolerancia indicados en el
cuadro4.
Cuadro4
Tolerancias máximas permitidas de intensidades relativas de iones en diversas técnicas
deespectrometríademasas
Intensidadrelativa
(%delpicodebase)EI-CG-MS
(relativos)CI-CG-MS,CG-MSn
CL-MS,CL-MSn
(relativos)
>50% ±10% ±20%
>20%–50% ±15% ±25%
>10%–20% ±20% ±30%≤10% ±50% ±50%
Interpretación de los datos del espectro de masas: Deben
identificarselasintensidadesrelativasdelosionesdediagnóstico,ode
los pares de iones de precursor/producto, comparando sus espectros o
integrando las señales de cada traza de masa. Cuando se procede a la
corrección del fondo, se hará uniformemente en todo el lote (véase el
apartado4delpunto2.3.1)yseindicaráclaramente.
Barrido completo:Si se registran espectros de barrido completo en
una única espectrometría de masas, debe haber un mínimo de cuatro
ionesconunaintensidadrelativa ≥10%delpicodebase.Seincluirá
el ion molecular si se encuentra en el espectro de referencia con una
intensidad relativa ≥10 %. Deberá encontrarse un mínimo de cuatro
iones dentro de los límites máximos de tolerancia permitidos para las
intensidades relativas de los iones (cuadro 5). Puede recurrirse a la
búsqueda bibliográfica asistida porordenador. En este caso,la compa-
racióndelosdatosdelespectrodemasasenlasmuestrasdeensayocon
lasolucióndecalibraciónsuperaráunfactorcríticodecorrespondencia.
Estefactorsedeterminaráparacadaanalitoduranteelprocesodevali-
dación,sobrelabasedeespectrosparalosquesecumplenloscriterios
quevamosadescribir. Secontrolará lavariabilidad debida alamatriz
delamuestrayelfuncionamientodeldetector.
SIM:Cuandosemidenfraccionesdelamasacontécnicasdistintasde
lasdebarridocompleto,hadeutilizarseunsistemadepuntosdeiden-
tificación para interpretar los datos. La confirmación de las sustancias
clasificadas en el grupo A del anexo I de la Directiva 96/23/CE
requiere un mínimo de 4puntos de identificación. La confirmación de
lassustanciasclasificadasenelgrupoBdelanexoIdelaDirectiva96/
23/CE requiere un mínimo de 3 puntos de identificación. El siguiente
cuadro presenta el número de puntos de identificación que puede
obtener cada una de las técnicas básicas de espectrometría de masas.
No obstante, para obtener los puntos de identificación que requiere la
confirmación y el total de puntos de identificación que han de calcu-
larse:
a) semedirácomomínimounratiodeunion;
b) todoslosratiosdeionespertinentesmedidoscumpliránloscriterios
descritos,y
c) se combinará un máximo de tres técnicas distintas para alcanzar el
númeromínimodepuntosdeidentificación.
Cuadro5
Relaciónentrediversostiposdefraccionesdemasaypuntosdeidentificaciónobtenidos
TécnicadeMS Puntosdeidentificaciónobtenidosporion
Espectrometría de masas de baja resolución
(LR)1,0
IonprecursorLR-MSn1,0
ProductosdetransiciónLR-MSn1,5
HRMS 2,02002D0657—ES—17.08.2002—000.001—12
▼B
TécnicadeMS Puntosdeidentificaciónobtenidosporion
IonprecursorHR-MSn2,0
ProductosdetransiciónHR-MSn2,5
Notas:
(1) Cadaionsecontaráunasolavez.
(2) LaCG-MSmedianteionizaciónporimpactodeelectronesseconsideraunatécnicadistintadelaCG-
MSmedianteionizaciónquímica.
(3) Sólopodránutilizarsedistintosanalitosparaaumentarelnúmerodepuntosdeidentificaciónsienlos
derivadosintervienentiposdistintosdereacciónquímica.
(4) ParalassustanciasdelgrupoAdelanexoIdelaDirectiva96/23/CE,siseempleaunadelastécnicas
HPLC combinada con detección espectrofotométrica por red de diodos mediante barrido completo(DAD), HPLC combinada con detección por fluorescencia, HPLC combinada con un inmunograma,
unaTLCbidimensionalcombinada condetecciónespectrométrica;puedeaportarse unmáximodeun
puntodeidentificación,siemprequesecumplanloscriteriosexigidosparadichastécnicas.
(5) Losproductosdetransiciónabarcanproductosdesegundaydetercerageneración.
Cuadro6
Ejemplosdenúmerodepuntosdeidentificaciónobtenidosmediantediversastécnicasy
combinacionesdetécnicas(n=unnúmeroentero)
Técnicaotécnicas Númerodeiones Puntosdeidentificación
CG-MS(EIoCI) N n
CG-MS(EI+CI) 2(EI)+2(CI) 4
CG-MS (EI o CI) 2 deri-
vados2 (derivado A) + 2 (deri-
vadoB)4
CL-MS N n
CG-MS-MS 1 ion precursor y 2 de
segundageneración4
CL-MS-MS 1 ion precursor y 2 de
segundageneración4
CG-MS-MS 2 iones precursores, cada
uno con 1 de segunda
generación5
CL-MS-MS 2 iones precursores, cada
uno con 1 de segunda
generación5
CL-MS-MS-MS 1 ion precursor, 1 de
segunda generación y 2 de
tercerageneración5,5
HRMS N 2n
CG-MS+LC-MS 2+2 4
CG-MS+HRMS 2+1 4
2.3.4.Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la cromatografía
condetecciónporinfrarrojos
Picos adecuados: se entiende por picos adecuados los máximos de
absorciónenelespectrodeinfrarrojosdeunpatróndecalibración que
cumplalosrequisitossiguientes:
2.3.4.1.Detección por infrarrojos
Máximo de absorción: se producirá en un intervalo de número de
ondade4000-500cm–1.
Intensidad de absorción:noseráinferiora
a) unaabsorbanciamolarespecíficade40conrespectoalvalordebase
delpico,o
b) unaabsorbanciarelativa del12,5%delaabsorbanciadelpicomás
intensoenelintervalo4000-500cm–1
siambassemidenconrespectoaunaabsorbanciacero,ydel5%delaabsorbanciadelpicomásintensoenelintervalo4000-500cm
–1cuando
ambassemidenconrespectoalvalordebasedelpico.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—13
▼B
Nota: Aun cuando desde el punto de vista teórico puedan preferirse
picos adecuados según a), en la práctica los picos según b) son más
fácilesdedeterminar.
Se determinará el número de picos en el espectro de infrarrojos del
analito cuyas frecuencias se correspondan con un pico adecuado en el
espectrodelpatróndecalibración,conunmargende±1cm–1.
2.3.4.2.Interpretación de los datos del espectro de infrarrojos
La absorción estará presente en todas las regiones del espectro del
analito que correspondan a un pico adecuado en el espectro de refe-
renciadelpatróndecalibración. Esnecesariounmínimodeseispicos
adecuadosenelespectrodeinfrarrojosdelpatróndecalibración. Siel
númerodepicosadecuadosesinferioraseis(7),elespectroencuestión
no podrá utilizarse como espectro de referencia. La «puntuación», es
decir, el porcentaje de picos adecuados observados en el espectro de
infrarrojos del analito deberá ser al menos de 50. En caso de que no
exista una correspondencia exacta para un pico adecuado, la región
pertinente del espectro del analito habrá de ser compatible con la
presencia de un pico concordante. El procedimiento se aplicará única-
mente a los picos de absorción del espectro de la muestra cuya
intensidad sea al menos tres veces superior al ruido entre un pico y
otro.
2.3.5.Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la determinación
deunanalitomedianteCLcombinadaconotrastécnicasdedetec-
ción
2.3.5.1.Separación cromatográfica
Sise dispone de material adecuado, se empleará un patrón interno. Se
tratará de un patrón afín, con un tiempo de retención cercano al del
analito. El analito deberá eluir en el tiempo de retención típico del
patróndecalibracióncorrespondiente,enlasmismascondicionesexpe-
rimentales.Eltiempomínimoaceptablederetencióndeunanalitoserá
eldoble deltiempo deretención delvolumen envacío delacolumna.
La relación entre el tiempo de retención del analito y el del patrón
interno, es decir, el tiempo relativo de retención del analito, corres-
ponderá a la del patrón de calibración en la matriz apropiada, con un
margende±2,5%.
2.3.5.2.Detección UV/VIS por barrido completo
DebencumplirseloscriteriosdefuncionamientodelosmétodosdeCL.
Los máximos de absorción en el espectro del analito presentarán las
mismas longitudes de onda que los del patrón de calibración, dentro
de un margen determinado por la resolución del sistema de detección.
Para la detección por red de diodos, suele ser de ± 2 nm. El espectro
del analito por encima de los 220 nm, para aquellas partes de ambosespectros con una absorbancia relativa ≥10 %, no deberán diferir
visualmentedelespectrodelpatróndecalibración.Estecriteriosesatis-
face, en primer lugar, cuando se presentan máximos iguales y, en
segundo lugar, cuando en ninguno de los puntos observados la dife-
rencia entre ambosespectros essuperiora10%de laabsorbancia del
patrón de calibración. Si se recurre a la búsqueda en bibliotecas y
concordancia asistidas por ordenador y a la concordancia, la compara-
ción de los datos del espectro en las muestras de ensayo con los del
patrón de calibración deberá superar un factor crítico de correspon-
dencia. Este factor se determinará durante el proceso de validación
para cada analito, sobre la base de espectros para los que se cumplen
los criterios descritos anteriormente. Se controlará la variabilidad
debidaalamatrizdelamuestrayelfuncionamientodeldetector.
2.3.5.3.Criterios de funcionamiento de la detección fluorimétrica
DebencumplirseloscriteriosdefuncionamientodelosmétodosdeCL.
Ello se aplica a las moléculas que presentan fluorescencia natural y a
las que la presentan después de transformación o derivatización. La
selección de las longitudes de onda de excitación y de emisión en
combinación con las condiciones cromatográficas se harán de tal
manera que se minimice la aparición de componentes de interferencia
enextractosdemuestrasenblanco.
El máximo del pico más próximo en el cromatograma estará separado
del pico del analito designado por al menos una anchura del pico,
medidaal10%delaalturamáximadelpicodelanalito.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—14
▼B
2.3.5.4.Criterios de funcionamiento para la identificación de un analito
mediante CL-inmunograma
Por sí sola, la CL-inmunograma no es apropiada como método de
confirmación.
DebencumplirseloscriteriosaplicablesalosmétodosdeCL.Los parámetros de control de la calidad predefinidos, por ejemplo, la
fijacióninespecífica,lafijaciónrelativadelasmuestrasdecontroloel
valor de la absorbancia del blanco, deberán situarse dentro de los
límitesobtenidosdurantelavalidacióndelanálisis.
Elinmunogramaconstarádealmenoscincofracciones.Cadafracciónseráinferioralamitaddelaanchuradelpico.Lafracciónconelmáximocontenidodeanalitodebeserlamismapara
lamuestraproblema,lamuestradecontrolnoconformeyelpatrón.
2.3.5.5.Determinación de un analito mediante CL combinada con detección de
UV/VIS (longitud de onda única)
Porsísola,laCLcondeteccióndeUV/VIS(longituddeondaúnica)no
esapropiadacomométododeconfirmación.
El máximo del pico más próximo en el cromatograma estará separado
del pico del analito designado por al menos una anchura del pico,
medidaal10%delaalturamáximadelpicodelanalito.
2.3.6.Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la determinación
deunanalitomediante2DTLCcombinadacondetecciónespectro-
métricaUV/VISporbarridocompleto
SerequierenlaHPTLCbidimensionalylacocromatografía.Los valores RF del analito deben coincidir con los valores RF de los
patrones,conunmargende±5%.
El aspecto visual del analito no se distinguirá del aspecto visual del
patrón.
En manchas del mismo color, el centro de la mancha más cercana
estará separado del centro de la mancha del analito por una distancia
dealmenoslamitaddelasumadelosdiámetrosdeambasmanchas.
El aspecto visual del espectro del analito no se distinguirá del aspecto
visual del patrón, como se explica en el caso de la detección UV/VIS
porbarridocompleto.
Si se recurre a la búsqueda bibliográfica asistida por ordenador y a la
concordancia,lacomparacióndelosdatosdelespectroenlasmuestras
de ensayo con los del patrón de calibración debe superar un factor
crítico de correspondencia. Este factor se determinará durante el
proceso de validación para cada analito, sobre la base de espectros
para los que se cumplen los criterios descritos anteriormente. Se
controlará lavariabilidad debidaalamatriz delamuestrayelfuncio-
namientodeldetector.
2.3.7.Criterios de funcionamiento y otros requisitos de la determinación
de un analito mediante CG combinada con detección de la capta-
ciónelectrónica(ECD)
Sisedisponedematerial adecuado,seempleará unpatróninterno.De
preferencia,setratarádeunasustanciaafín,conuntiempoderetención
cercanoaldelanalito.Elanalitodeberáeluireneltiempoderetención
típico del patrón de calibración correspondiente en las mismas condi-
cionesexperimentales. Eltiempomínimoaceptable deretención deun
analitoseráeldobledeltiempoderetencióndelvolumenenvacíodela
columna. La relación entre el tiempo de retención del analito y el del
patrón interno, es decir, el tiempo relativo de retención del analito,
corresponderá a la del patrón de calibración en la matriz apropiada,
con un margen de ± 0,5 %. El máximo del pico más próximo en el
cromatograma estará separado del pico del analito designado por al
menos una anchura del pico, medida al 10 % de la altura máxima del
pico del analito. Para obtener información adicional puede recurrirse a
lacocromatografía.
2.4. MÉTODOSDECONFIRMACIÓNDELOSELEMENTOSQUÍMICOS
Los análisis de confirmación de los elementos químicos se basarán en el
concepto de identificación inequívoca y de cuantificación exacta y precisa a
partir de las propiedades fisicoquímicas específicas del elemento químico en2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—15
▼B
cuestión (por ejemplo, la longitud de onda característica del elemento de la
radiaciónemitidaoabsorbida,olamasaatómica)alniveldeinterés.
Losmétodosocombinacionesdemétodossiguientesseconsideranconvenientes
paralaidentificacióndeelementosquímicos:
Cuadro7
Métodosadecuadosdeconfirmacióndeloselementosquímicos
Técnica Parámetromedido
Voltamperometría diferencial de impulsos de
redisoluciónanódicaSeñaleléctrica
Espectrometríadeabsorciónatómica
Llama Longituddeondadeabsorción
Generacióndehidruros Longituddeondadeabsorción
Vaporfrío Longituddeondadeabsorción
Atomización electrotérmica (cámara de
grafito)Longituddeondadeabsorción
Espectrometríadeemisiónatómica
Plasmaacopladoinductivamente Longituddeondadeemisión
Espectrometríademasas
Plasmaacopladoinductivamente Relaciónmasa/carga
2.4.1.Criterios de funcionamiento comunes y otros requisitos de los
métodosdeconfirmación
Los materiales de referencia o enriquecidos que contengan cantidades
conocidas de analito, en el límite o a proximidad del límite máximo
permitido o de decisión (muestra de control no conforme), así como
losmateriales decontrol conformes ylosblancosde reactivo, deberán
utilizarsepreferentementedurantetodoelprocesosimultáneamentecon
cadalotedemuestrasdeensayoanalizado.Elordenrecomendadopara
inyectar las soluciones en el instrumento de análisis es el siguiente:
blanco de reactivo, muestra de control conforme, muestra por
confirmar, muestra de control conforme y, por último, muestra de
controlnoconforme.Sejustificarátodavariacióndeestasecuencia.
En general, la mayoría de las técnicas analíticas requieren la digestión
completa de la matriz orgánica para obtener soluciones antes de
proceder a la determinación del analito, lo cual puede realizarse
mediante procedimientos de mineralización asistida por microondas,
que minimizan el riesgo de pérdida o contaminación de los analitos.
Se utilizarán tubos de teflón descontaminados de buena calidad. Si se
recurre a otros métodos de digestión, húmeda o seca, se dispondrá de
pruebas documentales que excluyan posibles fenómenos de pérdida o
contaminación. En determinadas circunstancias puede optarse por
procedimientos deseparación (porejemplo, laextracción), como alter-
nativaaladigestión,parasepararlosanalitosdeloscomponentesdela
matrizy/oconcentrarlos,eintroducirlosenelequipodeanálisis.
En cuanto a la calibración, ya sea externa o basada en el método de
adición de patrón, se tendrá cuidado de no superar el intervalo de
trabajo establecido para el análisis. En el caso de una calibración
externa, los patrones de calibración deben prepararse en una solución
cuya composición sea lo más análoga posible a la de la muestra.
Asimismo, se procederá a la corrección del fondo según exijan las
circunstanciasespecíficasdelanálisis.
2.4.2.Criterios de funcionamiento adicionales y otros requisitos que
debencumplirlosmétodoscuantitativosdeanálisis
2.4.2.1.Veracidad de los métodos cuantitativos
Enelcasodeanálisisrepetidosdeloselementosdeunmaterialderefe-
rencia certificado, la desviación entre el contenido medio determinado
experimentalmenteyelvalorauténticonosuperaráellímitede±10%.
Cuando no se dispone de tales CRM, se acepta una valoración de la
veracidad de las mediciones mediante recuperación de adiciones de
cantidadesconocidasdelelementoalasmuestrasdesconocidas.Obsér-
vesequeelelemento añadidonoestáquímicamente ligadoalamatriz
realcomoloestáelanalito,porloquelosresultadosobtenidosporeste2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—16
▼B
procedimiento tienen menos validez que los obtenidos por CRM. Los
datos de recuperación sólo son aceptables si entran en un margen de
±10%delvalorperseguido.
2.4.2.2.Precisión de los métodos cuantitativos
En caso de análisis repetidos de una muestra en condiciones de repro-
ducibilidad intralaboratorio, el coeficiente de variación (CV)
intralaboratoriodelamedianosuperarálossiguientesvalores:
Cuadro8
CVdelosmétodoscuantitativosenunintervalodefraccionesdemasadelelemento
Fraccióndemasa CV(%)
≥10µg/kga100 µg/kg 20
>100 µg/kga1000 µg/kg 15
≥1000 µg/kg 10
2.4.3.Requisitos específicos de la voltamperometría diferencial de
impulsosderedisoluciónanódica(DPASV)
Es de capital importancia la destrucción completa de la materia
orgánica de las muestras antes de proceder a determinaciones por
DPASV. En los voltamogramas no deberán verse señales anchas que
resultendelapresenciademateriaorgánica.EnlaDPASV,losconsti-
tuyentes inorgánicos de la matriz pueden influir en la altura de los
picos. Por ello, la cuantificación ha realizarse por el método de
adiciones de patrón. Con este método se suministrarán muestras de
voltamogramastípicosdeunasolucióndemuestra.
2.4.4.Requisitos específicos de la espectrometría de absorción atómica
(AAS)
Estatécnicaseempleabásicamenteparaestudiarunúnicoelemento,lo
que exige la optimación de los parámetros experimentales en función
delelementoquedebacuantificarse.Siemprequeseaposible,severifi-
caránlosresultadoscualitativaycuantitativamente recurriendoalíneas
deabsorciónalternativas(loidealesutilizardoslíneasdiferentes).Los
patrones de calibración se prepararán en una solución matriz cuya
composición sea lo más análoga posible a la de la muestra que debe
medirse (por ejemplo, concentración de ácidos o composición de los
agentes modificantes). Para minimizar los valores en blanco, todos los
reactivos serán de la mayor pureza disponible. Según el modo que se
elija para vaporizar o atomizar la muestra, puede distinguirse entre
variostiposdeAAS.
2.4.4.1.Criterios específicos de la AAS de llama
Seoptimaráelreglajedelosinstrumentosparacadaelemento.Enparti-
cular, ha comprobarse la composición de los gases y el flujo. Para
evitar las interferencias por la absorción del fondo, se utilizará un
corrector de fuente de radiación continua. Si no se conocen las
matrices,secomprobarásiesprecisocorregirelfondo.
2.4.4.2.Requisitos específicos de la AAS con cámara de grafito
Enellaboratorio,lacontaminaciónafectafrecuentementealaexactitud
cuando se trabaja con ultratrazas en la cámara de grafito. Por ello,
debenutilizarsereactivosmuypuros,aguadesionizada ymateriales de
plástico inerte para la manipulación de la muestra y del patrón. Se
optimará el reglaje de los instrumentos para cada elemento. En parti-
cular, han de comprobarse las condiciones de pretratamiento y
atomización(temperaturaytiempo)ylamodificacióndelamatriz.
Trabajar en condiciones isotermas de atomización [por ejemplo, tubo
transversal de grafito calentado con plataforma L' vov integrada (8)]
reduce la influencia de la matriz en la atomización del analito. En
combinación con la modificación de la matriz y con la corrección
Zeeman del fondo (9) puede procederse a la cuantificación mediante
una curva de calibración basada en la medición de soluciones patrón
acuosas.
2.4.5.Requisitos específicos de la espectrometría de absorción atómica
porgeneracióndehidruros
Los compuestos orgánicos que contienen elementos como arsénico,
bismuto, germanio, plomo, antimonio, selenio, estaño y telurio pueden2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—17
▼B
ser muy estables y exigir una descomposición oxidativa para obtener
resultados correctos de contenido total del elemento. En consecuencia,
se recomienda la digestión por microondas o la incineración de alta
presión en condiciones fuertemente oxidantes. Se prestará la máxima
atención a la conversión completa y reproducible de los elementos en
sushidruroscorrespondientes.
La formación de hidruro de arsénico en una solución de ácido clorhí-
drico con NaBH4depende del estado de oxidación del arsénico (As
III: formación rápida, As V: período de formación más largo). Para
evitarunapérdidadesensibilidadenladeterminación delAsVconla
técnica deinyeccióndeflujo,causadaporelbrevetiempodereacción
de este sistema, después de la descomposición oxidativa As V debe
reducirseaAsIII.Paraello,sonadecuadoselyodurodepotasio/ácido
ascórbico o la cisteína. Se procederá de la misma manera con los
blancos, las soluciones de calibración y las de muestra. La utilización
de un sistema de lotes permite determinar ambas especies de arsénico
sin que la exactitud se vea afectada. Dado el período de formación
más largo del hidruro de AsV, la calibración se realizará porintegra-
ción del área del pico. Se optimará el reglaje de los instrumentos. En
particular, el flujo de gas que transfiere el hidruro al atomizador es
especialmenteimportanteyhadecomprobarse.
2.4.6.Requisitos específicos de la espectrometría de absorción atómica
porvaporfrío
Elvaporfríoseusasóloenelcasodelmercurio.Dadaslaspérdidasde
mercurio elemental por volatilización y adsorción, ha de prestarse una
atención especial durante todo el análisis. Debe tenerse el máximo
cuidadoenevitarlacontaminacióndebidaalosreactivosoalentorno.
Paraobtenerresultadoscorrectosenelcontenidototaldelmercurio,es
preciso proceder a la descomposición oxidativa de los compuestos
orgánicosque contienen mercurio. Para ladescomposición deben utili-
zarse sistemas sellados con digestión asistida por microondas o
incinerador de alta presión. Debe observarse un cuidado especial al
limpiarelequipoquehaestadoencontactoconelmercurio.
Convienetrabajar conlatécnica deinyección deflujo.Paralímitesde
decisión más bajos, se recomienda la adsorción de mercurio elemental
en un adsorbente de oro/platino, seguida de desorción térmica. La
humedad en torno al absorbente o la celda falsea la medición, por lo
quedebeevitarse.
2.4.7.Requisitosespecíficos de la espectrometría de emisión atómica con
plasmaacopladoinductivamente(ICP-AES)
La espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductiva-
mente (10) es un método que permite la medición simultánea de
diversos elementos. Para emplear la ICP-AES, primero ha de proce-
derse a la digestión de las muestras para descomponer las matrices
orgánicas. Se utilizarán sistemas sellados con digestión asistida por
microondas o incinerador de alta presión. La calibración de losinstru-
mentos y la selección de la longitud de onda desempeñan un papel
esencial para un análisis ICP-AES correcto. Para la calibración de los
instrumentos, en el caso de curvas de calibración lineales, suele ser
necesaria lamedición desólocuatro concentraciones delassoluciones
de calibración, ya que las curvas de calibración ICP-AES suelen ser
linealesparacuatroaseisórdenesdemagnituddeconcentración.Gene-
ralmente,hadeprocedersealacalibracióndelsistemaICP-AESconun
patrón válido para múltiples elementos, que se preparará en una solu-
ción que contenga la misma concentración de ácidos que la solución
de medición. Se comprobarán las concentraciones de elemento en la
curvalineal.
La selección de longitudes de onda para la medición de la emisión de
losanalitosdebeadecuarsealasconcentraciones deloselementosque
handedeterminarse.Silaconcentración delanalitoseencuentrafuera
delintervalo detrabajo deunalínea deemisión, seutilizará otra línea
de emisión. Al principio, se elegirá la línea de emisión más sensible
(sininterferencias) y,después, otra menos sensible. Si se trabaja en ellímite de detección ocerca deél, lomejor suele seroptar porla línea
más sensible para el analito correspondiente. Las interferencias espec-
trales y de fondo originan las principales dificultades en ICP-AES.
Pueden producirse interferencias el desplazamiento simple del fondo,
como el desplazamiento oblicuo del fondo, la superposición espectral
directa y el desplazamiento complejo del fondo. Cada una de estas
interferencias tiene sus propias causas y remedios. Según las matrices
se aplicarán correcciones de interferencias y se optimarán los paráme-
tros operativos. Algunas interferencias pueden evitarse mediante2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—18
▼B
dilución o adaptación de las matrices. En cada lote de muestras de
análisis, tanto el material de referencia y enriquecido que contiene
cantidades conocidas del analito como el material blanco se tratarán
del mismo modo que las muestras de análisis. Para controlar posibles
desviaciones, se comprobará el patrón después de unas 10 muestras.
Todoslosreactivosyelgasplasmaserálamayorpurezadisponible.
2.4.8.Requisitosespecíficos de la espectrometría de emisión atómica con
plasmaacopladoinductivamente(ICP-MS)(11)
La determinación de indicios de elementos de masa atómica media,
comoelcromo,elcobreyelníquel,puedesufrirfuertesinterferencias
deotrosionesisobáricosypoliatómicos.Ellosólopuedeevitarsesise
dispone de un poder de resolución mínimo de 7000-8000. Entre las
dificultades de las técnicas MS figuran la desviación instrumental, los
efectos de matriz y la interferencia de iones moleculares (m/z < 80).
Es precisa una estandarización interna múltiple que cubra el mismo
ámbito de masa que los elementos por determinar para corregir la
desviacióninstrumentalylosefectosdematriz.
Debe descomponerse completamente la materia orgánica de las mues-
tras antes de proceder a mediciones por ICP-MS. Como para la AAS,
trassudigestiónensistemas sellados,loselementos volátiles, comoel
yodo,debentransferirseaunestadodeoxidaciónestable.Lasmayores
interferencias proceden de combinaciones de iones moleculares de
argón (gas plasma), hidrógeno, carbono, nitrógeno y oxígeno (ácidos
empleadosparaladisolución,impurezasdelgasplasmaygasesatmos-
féricos incorporados) y la matriz de la muestra. Para evitar
interferencias es preciso proceder a la digestión completa, las medi-
ciones del fondo, la correcta elección de las masas analíticas que a
veces se asocian con una menor abundancia (límite de detección más
pobre) y la disolución de losácidos empleados para la disolución, por
ejemploelácidonítrico.
Para determinar los elementos deben excluirse las interferencias
mediante la correcta elección de las masas analíticas específicas, lo
que incluye la confirmación de las relaciones de isótopos. Se
comprobará la respuesta instrumental para cada medición, teniendo en
cuentalosfactoresdeFano,pormediodepatronesinternos.
3.VALIDACIÓN
Lavalidacióndemostraráqueelmétodoanalíticocumpleloscriteriosrelativosa
lascaracterísticasdefuncionamientoaplicables.
Controlesconobjetivosdiferentesrequierendistintascategoríasdemétodos.El
cuadro siguiente determina qué características de funcionamiento han de
comprobarseparacadatipodemétodo.
Cuadro9
Clasificación de los métodos analíticos en función de las características de funcionamiento que
debendeterminarse
Límitede
detección
CCβLímitede
decisión
CCαVeracidad/
larecupe-
raciónPrecisiónSelecti-
vidad/espe-
cificidadAplicabi-
lidad/
robustez/
estabilidad
Métodos
cualitativosS+–––++
C++––++
Métodos
cuantita-
tivosS+––+++
C++++++
S=métodosdecriba;C=métodosdeconfirmación;+=determinaciónobligatoria.
3.1. PROCEDIMIENTOSDEVALIDACIÓN
Enestecapítuloseofrecenejemplosoreferenciasdeprocedimientosdevalida-
cióndelosmétodosanalíticos. Puedenutilizarseotrosenfoquesparademostrar
queelmétodoanalítico cumpleloscriteriosdefuncionamiento, acondiciónde
quealcancenlamismacantidadycalidaddeinformación.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—19
▼B
Lavalidacióntambiénpuederealizarse atravésdeunestudiointerlaboratorios,
comoseestablecenenelCodex Alimentarius,lasnormasISOolaIUPAC(12),
odeacuerdo conmétodosalternativos como estudiosenunsololaboratorio, o
la validación interna (13) (14). Esta parte se centra en los estudios en un solo
laboratorio(ovalidacióninterna)atravésdeunenfoquemodular.Esteenfoque
consisteen:
1) unconjuntodecaracterísticascomunesdefuncionamiento,independientedel
modelodevalidaciónempleado,y
2) procedimientos más específicos que dependen del modelo, tal como se
presentaenelcuadro10acontinuación.
Cuadro10
Parámetrosdefuncionamientoindependientesydependientesdelmodelo
Validación
Parámetrosdefuncionamiento
independientesdelmodeloParámetrosdefuncionamientodependientesdelmodelo
Características comunes de
funcionamiento(3.1.1)Enfoque convencional de la
validación(3.1.2)Enfoquedelavalidacióninterna
(3.1.3)
Especificidad Larecuperación Larecuperación
Veracidad Repetibilidad Repetibilidad
Robustez:cambiosmenores Reproducibilidad intralabora-
torioReproducibilidad intralabora-
torio
Estabilidad Reproducibilidad Reproducibilidad
Ellímitededecisión(CC α)Ellímitededecisión(CC α)
Capacidad de detección
(CC β)Capacidaddedetección(CC β)
Curvasdecalibración Curvasdecalibración
Robustez: cambios impor-
tantesRobustez
3.1.1.Característicasdefuncionamientoindependientesdelmodelo
Almargendelenfoquedevalidaciónqueseadopte,debendeterminarse
las siguientes características de funcionamiento. Para minimizar la
carga de trabajo, puede emplearse un planteamiento cuidadosamente
diseñado y estadísticamente sólido para combinar experimentos reali-
zadosconelfindedeterminardiferentesparámetros.
3.1.1.1.Especificidad
Enlosmétodosanalíticos esimportante elpoderdedistinciónentreel
analito y sustancias afines (isómeros, metabolitos, productos de degra-
dación, sustancias endógenas, constituyentes de la matriz, etc.). Son
necesariosdosenfoquesparacomprobarsiexisteninterferencias.
Por ello, se elegirán sustancias que potencialmente interfieran y se
analizaránmuestrasenblancopertinentesparadetectarposiblesinterfe-
renciasyvalorarsusefectos:
— seleccione una gama de compuestos químicamente relacionados
(metabolitos, derivados, etc.) u otras sustancias que puedan encon-trarseenlasmuestrasconelcompuestodeinterés,
— analice unnúmeroapropiadodemuestrasenblancorepresentativas
(n≥20)yverifiqueposiblesinterferencias(señales,picos,indicios
de iones) en la región de interés en la que cabe esperar la elución
delanalito,
— asimismo, seenriquecerán muestrasenblancorepresentativas hasta
una concentración adecuada con sustancias que pueden interferir
conlaidentificaciónolacuantificacióndelanalito,
— despuésdelanálisisestudiesi:
— dichapresenciapuedeconduciraunafalsaidentificación,
— laidentificacióndelanalitosevedificultadaporlapresenciade
unaomásinterferencias,o
— lacuantificaciónsufreunainfluenciaapreciable.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—20
▼B
3.1.1.2.Veracidad
En este apartado se describe la determinación de la veracidad (un
componente de la exactitud). La veracidad sólo puede establecerse
mediante material de referencia certificado (CRM). Se utilizará CRM
siempre que se pueda. El procedimiento se describe detalladamente en
lanormaISO5725-4(5).Presentamosunejemploacontinuación:
— analice6muestrasidénticasdelCRMsiguiendolasinstruccionesde
ensayodelmétodo,
— determinelaconcentracióndelanalitoencadaunadedichasmues-
tras,
— calculelamedia,ladesviaciónestándaryelcoeficientedevariación
(%)paraestasconcentraciones,
— calcule la veracidad dividiendo la concentración media detectada
por el valor certificado (medido como concentración) y multiplí-
quelopor100,paraexpresarelresultadoenporcentaje:
Veracidad (%) = concentración media detectada (tras introducción del
factorcorrectorderecuperación)×100/valorcertificado.
SinosedisponedeCRM,enlugardelaveracidadpuededeterminarse
larecuperación,talcomosedescribeenelpunto4.1.2.1.
3.1.1.3.Aplicabilidad/robustez (cambios menores)
Enestosestudiosseutilizalaintroduccióndeliberadaporellaboratorio
de variaciones menores razonables y la observación de susconsecuen-
cias.
Deben realizarse estudios previos a la investigación seleccionando
factores del pretratamiento, limpieza y análisis de la muestra quepuedeninfluirenlosresultadosdelamedición.Entreestosfactoresse
cuentan el operador, la procedencia y la edad de los reactivos, disol-
ventes, patrones y extractos de la muestra, la velocidad de
calentamiento, la temperatura, el pH y muchos otros factores que
pueden darse en el laboratorio. Conviene modificar dichos factores en
un orden de magnitud acorde con las desviaciones habituales entre
laboratorios.
— identifiqueposiblesfactoresquepudieraninfluirenlosresultados,
— varíeligeramentecadafactor,
— realiceunapruebaderobustezsegúnelmétododeYouden(15)(16)
(aestenivelpuedenemplearseotrosmétodoshomologados,peroel
métododeYoudenreducealmínimoeltiempoyelesfuerzoreque-
ridos). El método de Youden es un diseño factorial fraccional. No
permitedetectarinteraccionesentrelosdiversosfactores,
— si se observa que un factor influye significativamente en los resul-
tadosdelamedición,procedaaotrosexperimentosparadeterminar
loslímitesdeaceptabilidaddedichofactor,
— losfactoresqueinfluyensignificativamente enlosresultadosdeben
quedarclaramenteidentificadosenelprotocolodelmétodo.
La idea de base no es estudiar una alteración a la vez, sino introducir
diversasvariacionessimultáneamente.Porejemplo,imaginemosqueA,
B, C, D, E, F, G son los valores nominales de siete factores distintos
que podrían influir en los resultados si sus valores nominales se
cambian ligeramente. Demos a sus valores alternativos las minúsculas
correspondientesa,b,c,d,e,f,g.Estonosda2
7o128combinaciones
diferentes.
Puede tomarse un subconjunto de ocho de dichas combinaciones, con
una mezcla equilibrada de mayúsculas y de minúsculas (cuadro 11).
Debe procederse a ocho determinaciones, utilizando una combinación
delosfactoreselegidos (A-G).Enelcuadro11sepresentanlosresul-
tadosdelasdeterminaciones(S-Z).
Cuadro11
Configuracióndelexperimentoparaestudiosderobustez(cambiosmenores)
Valordel
factorFCombinacióndedeterminaciones
12345678
A / a AAAAaaaa
B / b BBbbBBbb
C / c CcCcCcCc2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—21
▼B
Valordel
factorFCombinacióndedeterminaciones
12345678
D / d DDddddDD
E/e E e E e e E e E
F / f FffFFffF
G/g G g g G g G G g
Resultado
observadoRSTUVWXYZ
Paraloscálculos,véanselosejemplosdeensayosderobustezenelpunto3.3.
3.1.1.4.Estabilidad
Se ha observado que la insuficiente estabilidad del analito o de los
constituyentes delamatriz enlamuestra durante el almacenamiento o
el análisis puede dar origen a desviaciones significativas del resultado
del análisis. Además, debe comprobarse la estabilidad del patrón de
calibración enlasolución.Normalmente, laestabilidad delanalitoestá
debidamente caracterizada para diversas condiciones de almacena-
miento. El control de las condiciones de almacenamiento debe formar
parte del sistema habitual de acreditación del laboratorio. Si no se
conoce este particular, a continuación se ofrecen ejemplos de cómo
determinarlaestabilidad.
Estabilidaddelanalitoenlasolución— Prepare nuevas soluciones madre del analito y dilúyalas, siguiendo
las instrucciones de ensayo, para obtener el número suficiente de
alícuotas (porejemplo, 40)de cada concentración seleccionada (en
torno al límite de funcionamiento mínimo exigido en el caso de
sustancias para las que no se ha establecido un límite permitido, o
en torno al límite permitido para las demás sustancias). Prepare
soluciones delosanalitos empleados enel enriquecimiento y enla
solución del análisis final, y de cualquier otra solución de interés
(porejemplo,patronesderivados).
— Mida el contenido de analito en la solución recién preparada,
siguiendolasinstruccionesdeensayo.
— Vierta los volúmenes adecuados en recipientes apropiados, etiqué-
telosyalmacénelosdeacuerdoconelprocedimiento descritoenel
cuadro12.
Cuadro12
Procedimientoparaladeterminacióndelaestabilidaddelanalitoenlasolución
–20ºC +4ºC +20ºC
Aoscuras 10alícuotas 10alícuotas 10alícuotas
Alaluz 10alícuotas
— El tiempo de almacenamiento puede ser de 1, 2, 3 y 4 semanas o
más si es necesario, es decir, hasta que se observen los primeros
fenómenosdedegradación durantelaidentificación olacuantifica-
ción.Deberegistrarseeltiempomáximoylascondicionesóptimas
dealmacenamiento.
— Debecalcularselaconcentracióndelanalito(olosanalitos)encada
alícuota tomando como valor 100 % la solución del analito recién
preparadoenelmomentodelanálisis.
Restodelanalito(%)=Ci×100/Cfresco
Ci= concentraciónenelmomentoi
Cfresco= concentracióndelasoluciónreciénpreparada.
Estabilidaddelanalito(olosanalitos)enlamatriz— Utilice muestras reales siempre que sea posible. Cuando no
dispongadeellas,utilicematrizenriquecidaconelanalito.
— Sidisponedeellas,determinelaconcentraciónenelmaterialmien-
trasestáaúnfresco.Tomeotrasalícuotasdelmaterialdespuésde1,2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—22
▼B
2,4y20semanas,ydetermine lasconcentraciones. Eltejido debe
almacenarsecomomínimoa-20ºC,omenossiesnecesario.
— Sinodisponedematerial real,tomematerial enblancoyhomoge-
néicelo.Dividaelmaterial en5alícuotas.Enriquezcacadaalícuota
conelanalito,preparadodepreferenciaenunapequeñacantidadde
solución acuosa. Analice una alícuota inmediatamente. Almacene
lasalícuotasrestantescomomínimoa-20ºC,omenossiesnece-
sario,yanalícelastras1,2,4y20semanas.
3.1.1.5.Curvas de calibración
Cuando se utilizan curvas de calibración para la cuantificación es
preciso:
— emplearalmenoscinconiveles(incluyendoelcero)enlaconstruc-
cióndelacurva,
— describirelintervalodetrabajodelacurva,— describir la fórmula matemática de la curva y la bondad del ajuste
delosdatosalacurva,
— describir los márgenes de aceptabilidad de los parámetros de la
curva.
Siesnecesariaunacalibraciónenseriedeunasoluciónpatrón,seindi-
caránámbitosaceptablesparalosparámetrosdelacurvadecalibración,
quepuedenvariardeunaserieaotra.
3.1.2.Procedimientosconvencionalesdevalidación
Elcálculodelosparámetrospormétodosconvencionalesexigelareali-
zación de diversos experimentos aislados. Debe determinarse cada
característica de funcionamiento para cada cambio importante (véase
elapartadosobreaplicabilidad/robustez).Conlosmétodosmultianalitos
puedenanalizarsevariosanalitossimultáneamente, siemprequeprevia-
mente se hayan descartado posibles interferencias de importancia. De
modo similar pueden determinarse varias características de funciona-miento. Así pues, para minimizar la carga de trabajo es conveniente
combinarlosexperimentoscuandoseaposible(porejemplo,larepetibi-
lidad y la reproducibilidad intralaboratorio con la especificidad, el
análisis demuestras enblanco para determinar ellímite decisión ylas
pruebasdeespecificidad).
3.1.2.1.La recuperación
cuando no se dispone de CRM, debe determinarse la recuperación
mediante experimentos con matriz en blanco enriquecida, por ejemplo
medianteelprocedimientosiguiente:
— seleccione 18alícuotasdeunmaterial enblancoyenriquezcacada
6deellascon1,1,5y2vecesellímitedefuncionamientomínimo
exigidoo0,5,1y1,5vecesellímitepermitido,
— analicelasmuestrasycalculelaconcentraciónencadamuestra,— mediante la siguiente ecuación, calcule la recuperación para cada
muestra,
— calcule la recuperación media y el CV de los 6 resultados a cada
nivel,
— % de recuperación = 100 × contenido medido/nivel de enriqueci-
miento.
El método convencional de determinación de la recuperación es una
variantedelmétododeadicióndepatróndescritoenelpunto3.5,si:
— la muestra se considera en blanco, en vez de una muestra para
analizar,
— se considera que el componente final(
1) y la recuperación(2) son
similaresparaambasporcionesdeensayo,
— lasmuestrasdeensayotienenlamismamasa,ylosextractosdelas
fraccionesdeensayoelmismovolumen,
— lacantidaddepatróndecalibraciónañadidaalasegundaporciónde
ensayo(enriquecida)seexpresaxADD.(xADD=ρA.VA),
—x1eselvalormedidodelblancoyx2elvalormedidodelasegunda
porcióndeensayo(enriquecida);2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—23
(1) Componente final: fracción de la masa del analito contenida en la muestra y presente
enelextractofinal.
(2) Recuperación (aquí): fracción de la masa del analito añadida a la muestra que está
presente enel extracto final.Enel restodel documento se suponequeel componentefinal y la recuperación son iguales, por lo que sólo se utilizará el término «recupera-
ción».
▼B
— entonces,el%derecuperación=100(x2-x1)/xADD.
Si cualquiera de las condiciones mencionadas no se cumple (o se
suponequenosecumple),sellevaráacaboelprocedimientocompleto
de determinación de la recuperación por el método de la adición de
patrónquesedescribeenelpunto3.5.
3.1.2.2.Repetibilidad
— Prepareunconjuntodemuestrasdematricesidénticas,enriquecidas
con el analito para dar concentraciones equivalentes a 1, 1,5 y 2
veces el límite de funcionamiento mínimo exigido o 0,5, 1 y 1,5
vecesellímitepermitido.
— En cada nivel debe procederse al análisis con un mínimo de 6
muestrasidénticas.
— Analicelasmuestras.
— Calculelaconcentracióndetectadaencadamuestra.
— Determinelaconcentraciónmedia,ladesviaciónestándaryelcoefi-
cientedevariación(%)delasmuestrasenriquecidas.
— Repitaestospasosalmenosotrasdosveces.
— CalculelasconcentracionesmediasgeneralesylosCVdelasmues-
trasenriquecidas.
3.1.2.3.Reproducibilidad intralaboratorio
— Prepare un conjunto de muestras de materiales de ensayo especifi-
cados (de matrices idénticas o diferentes), enriquecidas con el
analito para dar concentraciones equivalentes a 1, 1,5 y 2 veces el
límite de funcionamiento mínimo exigido o 0,5, 1 y 1,5 veces el
límitepermitido.
— En cada nivel debe procederse al análisis con un mínimo de 6
muestrasidénticas.
— Repita estos pasos al menos otras dos veces con operadores dife-
rentes y distintas condiciones ambientales (por ejemplo, diferentes
lotes de reactivos, disolventes, temperaturas ambientales, instru-
mentos,etc.).
— Analicelasmuestras.
— Calculelaconcentracióndetectadaencadamuestra.— Determinelaconcentraciónmedia,ladesviaciónestándaryelcoefi-
cientedevariación(%)delasmuestrasenriquecidas.
3.1.2.4.Reproducibilidad
DeacuerdoconlanormaISO5725-2(5),paraverificarlareproducibi-
lidadloslaboratoriosdebenparticiparenestudioscolaborativos.
3.1.2.5.Límite de decisión (CC α)
Ellímitededecisióndebeestablecersesegúnlosrequisitosdeidentifi-
cación, o de identificación más cuantificación, definidos en la parte 2,
«Criteriosdefuncionamientoyotrosrequisitosyprocedimientosdelos
métodosanalíticos».
En el caso de sustancias para las que no se ha establecido un límite
permitido,sepuedeestablecerelCC α:
— bienmedianteelprocedimiento decurvadecalibración, deconfor-
midadconlanormaISO11843(17)(denominadovalorcríticodela
variable de estado neto). Eneste caso, seutilizará material blanco,
enriquecido hasta el límite de funcionamiento mínimo exigido, y
por encima del mismo, en incrementos equidistantes. Analice las
muestras.Traslaidentificación,delimitelaseñalfrentealaconcen-
tración añadida. El límite de decisión es igual a la concentración
correspondiente a la ordenada en el origen más 2,33 veces la
desviación estándar de la reproducibilidad intralaboratorio de la
ordenada en origen. Esto sólo se aplica a análisis cuantitativos
(α=1%),
— bien analizando un mínimo de 20 materiales blancos por matriz,
parapodercalcularlarelaciónseñal-ruidoenlabandaenlaquese
esperaencontrarelanalito.Puedeusarsecomolímitededecisiónun
valortriplealdelarelaciónseñal-ruido.Estoesaplicableaanálisis
cuantitativosycualitativos.
En el caso de sustancias para las que no se ha establecido un límite
permitido,sepuedeestablecerelCC α:
— bienmedianteelprocedimiento decurvadecalibración, deconfor-
midadconlanormaISO11843(17)(denominadovalorcríticodela
variable de estado neto). Eneste caso, seutilizará material blanco,2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—24
▼B
enriquecido en torno al límite permitido en incrementos equidis-
tantes. Analice las muestras. Tras la identificación, delimite la
señal frente a la concentración añadida. El límite de decisión
(α= 5 %) equivale a la concentración correspondiente al límite
permitido más 1,64 veces la desviación estándar de la reproducibi-
lidadintralaboratorio,
— bien analizando un mínimo de 20 materiales blancos por matriz,
enriquecidosconanalitohastaellímitepermitido.Ellímitededeci-
sión ( α= 5 %) es igual a la concentración en el límite permitido
más1,64vecesladesviaciónestándarcorrespondiente.
Véasetambiénelartículo5yelpunto3.2.
3.1.2.6.La capacidad de detección (CC β)
La capacidad de detección debe establecerse según los requisitos defi-
nidos de cribado, de identificación o de identificación más
cuantificación(véaselaparte2).
En el caso de sustancias para las que no se ha establecido un límite
permitido,sepuedeestablecerelCC β:
— bienmedianteelprocedimiento decurvadecalibración, deconfor-
midad con la norma ISO 11843 (17) (denominado valor mínimo
detectable de la variable de estado neto). En este caso, se utilizarámaterial blanco representativo, enriquecido hasta el límite de
funcionamiento mínimoexigido,ypordebajodelmismo,enincre-
mentos equidistantes. Analice las muestras. Tras la identificación,
delimite la señal frente a la concentración añadida. La capacidad
dedetección( β=5%)esigualalaconcentración correspondiente
al límite de decisión más 1,64 veces la desviación estándar de la
reproducibilidad intralaboratorio del contenido medio medido en el
límitedecisión,
— bien analizando un mínimo de 20 materiales blancos por matriz,
enriquecidos con analito en cantidades hasta el límite de decisión.
Analice las muestras e identifique los analitos. La capacidad de
detección ( β= 5 %) es igual al valor del límite de decisión más
1,64vecesladesviaciónestándardelareproducibilidadintralabora-
toriodelcontenidomedido,
— si nosedisponede resultadoscuantitativos, la capacidad dedetec-
ciónpuededeterminarseinvestigandoelmaterialblancoenriquecido
hastaellímitededecisiónyporencimadelmismo.Enestecaso,la
capacidad de detección del método es igual al nivel de concentra-
ción, en el que sólo queda ≤5 % de resultados de falso
conforme. Por ello, debe procederse a un mínimo de 20 análisis
paraalmenosunniveldeconcentraciónafindegarantizarlafiabi-
lidaddeestadeterminación.
Enelcasodesustanciasparalasquesehaestablecidounlímitepermi-
tido,sepuedeestablecerelCC β:
— bienmedianteelprocedimiento decurvadecalibración, deconfor-
midad con la norma ISO 11843 (17) (denominado valor mínimo
detectable de la variable de estado neto). En este caso, se utilizará
materialblancorepresentativo,enriquecidoentornoallímitepermi-
tidoenincrementosequidistantes.Analicelasmuestraseidentifique
losanalitos.Calculeladesviación estándardelcontenidomedio en
ellímitededecisión.Lacapacidaddedetección(ß=5%)esigual
a la concentración correspondiente al valor del límite de decisión
más1,64vecesladesviaciónestándardelareproducibilidadintrala-boratorio.
— bien analizando un mínimo de 20 materiales blancos por matriz,
enriquecidos con analito hasta el límite de decisión. La capacidad
dedetección( β=5%)esigualalvalordellímitededecisiónmás
1,64vecesladesviaciónestándarcorrespondiente.
Véasetambiénelpunto3.2.
3.1.2.7.Robustez (cambios importantes)
Elmétododeanálisisdebeprobarseendiversascondicionesexperimen-
tales, por ejemplo ante diferentes especies, matrices o condiciones de
muestreo. Los cambios introducidos deben ser importantes. La impor-
tancia de esos cambios puede evaluarse utilizando, por ejemplo, el
enfoqueYouden(15)(16).Paratodocambioimportante debedetermi-
narse cada característica de funcionamiento que haya tenido un efecto
significativoenelfuncionamientodelanálisis.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—25
▼B
3.1.3.Validaciónmediantemétodosalternativos
Si se aplican procedimientos alternativos de validación, se indicará en
elprotocolodevalidaciónelmodeloylaestrategia,consusrespectivos
requisitos previos, hipótesis y fórmulas, o, cuando menos, sus referen-
cias. Se presenta a continuación un ejemplo de planteamiento
alternativo. Si se aplica, porejemplo, el modelo de validación interna,
lascaracterísticas defuncionamiento sedeterminandeunamaneraque
permita una validación para los cambios importantes en el mismo
procedimiento de validación. Ello exige definir un plan experimental
devalidación
3.1.3.1.Plan experimental
Debeelaborarseunplanexperimental, enfuncióndelnúmerodeespe-
cies y de factores diferentes que se pretenda estudiar. Por ello, en el
primer paso de todo el proceso de validación se estudiarán las pobla-
ciones de muestras que se analizarán en el futuro en el laboratorio
para seleccionar las especies más importantes y aquellos factores que
pueden influir en los resultados de las mediciones. Posteriormente, se
elegiráelintervalodeconcentraciónadaptadoalafinalidaddeacuerdo
conelniveldeinterés.
Ejemplo:
— Pueden estudiarse simultáneamente varios analitos mediante el
métododeanálisisqueseestávalidando.
— Sehanidentificadodosvariantesdelfactordominante(AyB).Los
factores dominantes forman la base sobre la cual se combinan los
niveles del factor. Entre estos factores dominantes pueden figurar
la especie o la matriz. En el presente ejemplo, el factor dominante
se varió en dos niveles, es decir, se consideraron dos especies
distintas(AyB).Demanerageneral,sepuedenvariarlosfactores
dominantesenmásdedosniveles,locualsóloaumentaelnúmero
deanálisisquedebenrealizarse.
— Los factores seleccionados se variarán en dos niveles (que se
indicancomo+o-).
Cuadro13
Factoresconsideradosimportantesenelprocedimientodevalidación
Sexodelanimal (factor1)
Raza (factor2)
Condicionesdetransporte (factor3)
Condicionesdealmacenamiento (factor4)Frescuradelamuestra (factor5)
Condicionesdeengorde (factor6)
Distintosoperadorescondiferentesgradosdeexperiencia (factor7)
Cuadro14
Posibleplanexperimentalparaelejemplopropuesto
Especie Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 Factor7Muestra
no
A ++++–+–1
A+ + – – + – – 2
A +–+–––+3
A +––++++4
A– + + – + + + 5A –+–+––+6
A ––+++––7
A –––––+–8
B +++++–+92002D0657—ES—17.08.2002—000.001—26
▼B
Especie Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Factor5 Factor6 Factor7Muestra
no
B+ + – – – + + 1 0
B +–+–++–1 1
B+ – – + – – – 1 2
B –++––––1 3
B –+–+++–1 4B– – + + – + + 1 5
B ––––+–+1 6
Comocada muestra (cada combinación de nivel de factores) tiene que
enriquecersecon4concentracionesdistintasentornoalniveldeinterés,
ycomo debe analizarse unamuestra enblanco pornivel,serealizarán
5×16=80análisisparatodoelexperimentodevalidación.
De los resultados de estos 80 resultados medidos es posible calcular
(13)(14):
Recuperación
— larepetibilidadporniveldeconcentración(s
ir),
— lareproducibilidadintralaboratorioporniveldeconcentración(siR),
— ellímitededecisión(CC α),
— lacapacidaddedetección(CC β),
— la curva de potencias (índice de error βfrente a concentración;
véaseelpunto3.1.3.2),
— larobustezfrentealoscambiosimportantes;larobustezfrentealos
cambiosmenorespuededeterminarsedeacuerdoconloexpuestoen
elpunto3.1.1.3,
— 16curvasdecalibracióndependientesdelamuestra,— 1curvadecalibraciónglobal,
— elintervalodeprediccióndelacurvadecalibraciónglobal,
— lasdesviacionesinducidasporlamatriz(S
mat),
— lasdesviacionesinducidasporelprocesodeanálisis(Srun),
— elefectodecadafactorenlosresultadosdelamedición.
Estas características de funcionamiento permiten la evaluación global
del funcionamiento del método, pues no sólo se estudia la influencia
de cada factor, sino también las combinaciones pertinentes de estos
factores.Conayudadeestaconfiguraciónexperimentalpuededecidirse
si se excluye de la curva de calibración global alguno de los factores,
por apartarse significativamente de las desviaciones estándar de los
demásfactores.
3.1.3.2.Curva de potencias
La curva de potencias da información sobrela capacidad de detección
delmétodoenelintervalodeconcentraciónelegido.Hacereferenciaal
error βen la aplicación del método estudiado. La curva de potencias
permite calcular la capacidad de detección de cada categoría de
métodos(cribado,confirmación)otipo(cualitativoocuantitativo)para
unerror βdeterminado(porejemplo,5%).2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—27
▼B
Figura1
Curvadepotencias
Enlafigura1sepresentaunejemplodelestablecimiento gráficodela
capacidad de detección (CC β)de un método analítico. Este método
concretopresentaunriesgoremanentedel5%dellegaraunadecisión
defalsoconformeenunaconcentraciónde0,50 µg/kg.Enunaconcen-
tración de 0,55 µg/kg el riesgo de llegar a una decisión de falso
conformedisminuyehastael1%.
3.1.3.3.Reproducibilidad
La determinación de la reproducibilidad de un método mediante el
concepto deestudiointralaboratorio (validación interna) exige la parti-
cipación repetida en estudios de aptitud, de conformidad con las guías
ISO 43-1 (3) y 43-2 (4). Los laboratorios pueden elegir sus propios
métodos, siempre que se utilicen en condiciones de rutina. La desvia-
ción estándar del laboratorio puede utilizarse para evaluar la
reproducibilidaddelmétodo.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—28
▼B
3.2. REPRESENTACIÓNGRÁFICADELOSDIVERSOSLÍMITESANALÍTICOS
Figura2
Sustanciasparalasquenosehaestablecidounlímitepermitido
2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—29
▼B
Figura3
Sustanciasparalasquesehaestablecidounlímitepermitido
2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—30
▼B
3.3. EJEMPLO DE CÁLCULO PARA ESTUDIAR LA ROBUSTEZ DEL
MÉTODO ANTE CAMBIOS MENORES, SEGÚN EL MÉTODO DE
YOUDEN(16)
Comparacióndemedias(A)
AA=Σ(Ai)/4
AB=Σ(Bi)/4
AC=Σ(Ci)/4
AD=Σ(Di)/4
AE=Σ(Ei)/4
AF=Σ(Ei)/4
AG=Σ(Gi)/4
Aa=Σ(ai)/4
Ab=Σ(bi)/4
Ac=Σ(ci)/4
Ad=Σ(di)/4
Ae=Σ(ei)/4
Af=Σ(fi)/4
Ag=Σ(gi)/4Comparelasmediasdelasmayúsculas(AAaAG)conlasmediasdelasminús-
culascorrespondientes(AaaAg).Siunodelosfactorestieneunefecto,ladife-
renciaserásignificativamentemayorquelasdiferenciasdelosotrosfactores.
Unmétodo robustonodebeverseafectado porloscambios que,concasitoda
certeza,habráentrelaboratorios.
Si no existe una diferencia destacada, la medición más realista del error alea-
torioladanlassietediferencias.
Diferencias(Di) Cuadradodelasdiferencias(Di2)
Da=A–a= Σ(Ai)–Σ(ai)
Db=B–b= Σ(Bi)–Σ(bi)
Dc=C–c= Σ(Ci)–Σ(ci)
Dd=D–d= Σ(Di)–Σ(di)
De=E–e= Σ(Ei)–Σ(ei)
Df=F–f= Σ(Fi)–Σ(fi)
Dg=G–g= Σ(Gi)–Σ(gi)Da2= valora
Db2= valorb
Dc2= valorc
Dd2= valord
De2= valore
Df2= valorf
Dg2= valorg
Desviación estándar de las diferencias Di(SDi):
SielvalorSDiobtenidoessignificativamente mayorqueladesviación estándar
delmétodohalladaencondicionesdereproducibilidadintralaboratorioexpuestas
(véasemásarriba),puedededucirsequeelconjuntodelosfactoresinfluyeenel
resultado,aunquecadafactoraisladonopresenteunainfluenciasignificativa,yqueelmétodonoeslosuficientementerobustofrentealasmodificacionesesco-
gidas.
3.4. EJEMPLOS DE CÁLCULO PARA EL PROCEDIMIENTO DE VALI-
DACIÓNINTERNA
Ejemplosycálculosparaelprotocolodevalidacióninternadescritoenelapar-
tado«validacióndeacuerdoconmodelosalternativos»(3.1.3)(13)(14).
3.5. EJEMPLOSDELMÉTODODEADICIÓNDEPATRÓN
Una muestra de ensayo con un contenido de analito T se divide en dos
porcionesdeensayo1y2demasasrespectivasm
1ym2.Laporcióndeensayo
2 se enriquece con un volumen VAde una solución de concentración ρAdel
analito. Tras las fases de extracción y de purificación del método se obtienen
dos extractos de las fracciones de ensayo, de volúmenes respectivos V1yV2.
Seconsideraquelarecuperacióndelanalitoesrc.Ambosextractosseanalizan
conunmétododemedicióndesensibilidadbydanunarespuestaanalíticadex1yx2,respectivamente.
Suponiendoquercybseanigualesparaelanalitoenlamuestranaturalyenla
enriquecida,elcontenidoTpuedecalcularsedelamanerasiguiente:
T=x1.V1.ρA.VA/(x2.V2.m1-x1.V1.m2)
Estemétodopermitedeterminarlarecuperaciónrc.Acontinuación,ademásdel
análisisqueacabamosdedescribir,seenriquecepartedelextractodelaporción2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—31
▼B
deensayo1(devolumenV3)conunacantidadconocida ρB.VBdelanalitoyse
analiza.Larespuestaanalíticaesx3ylarecuperaciónes:
rc=x2.V1.V2.ρB.VB/[x3.V1.V3(T.m2+ρA.VA)-x2.V2.T.m1(V3-VB)]
Puedecalcularsetambiénlasensibilidadb:b=x
1.V1/rc.T.m1
Sehandescritotodaslascondicionesdeaplicaciónylosdetalles(18).
4.ABREVIATURASEMPLEADAS
AAS Espectrometríadeabsorciónatómica
AES EspectrometríadeemisiónatómicaAOAC-I Asociacióndequímicosanalíticosoficiales(AOACInternational)
B Fracciónligada(inmunoanálisis)
CI IonizaciónquímicaCRM Materialdereferenciacertificado
CV Coeficientedevariación
2D Bidimensional
DAD Detecciónporreddediodos
DPASV VoltamperometríadiferencialdeimpulsosderedisoluciónanódicaECD Deteccióndelacaptaciónelectrónica
EI Ionizaciónporimpactoelectrónico
CG CromatografíadegasesHPLC Cromatografíalíquidadealtaresolución
HPTLC Cromatografíaencapafinadealtorendimiento
HRMS (Espectrometríademasas)dealtaresoluciónICP-AES Espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductiva-
mente
ICP-MS Espectrometríademasasconplasmaacopladoinductivamente
IR Infrarrojo
ISO OrganizaciónInternacionaldeNormalizaciónCL Cromatografíalíquida
LR(MS) (Espectrometríademasas)debajaresolución
MRPL Límitedefuncionamientomínimoexigido
MS Espectrometríademasas
m/z Relaciónmasa/cargaRF Migraciónrelativaalfrentededisolvente(TLC)
RSDL Desviacionesestándarrelativasdellaboratorio
SIM ControldeionesespecíficosTLC cromatografíaencapafina
UV Luzultravioleta
VIS Luzvisible.
5.REFERENCIAS
(1) ISO17025:1999Generalrequirementforthecompetenceofcalibration
andtestinglaboratories.
(2) ISO 3534-1: 1993 Statistical Methods for quality control — Vol. 1
vocabularyandsymbols.
(3) ISO Guide 43-1:1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons — Part 1: Development and operation of proficiency testing
schemes.
(4) ISO Guide 43-2:1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons — Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by
laboratoryaccreditationbodies.
(5) ISO 5725:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results — Part 1:General principles and definitions; ISO
5725-2Part2:Basicmethodforthedetermination ofrepeatability and
reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—32
▼B
methods for the determination of the trueness of a standard measure-
mentmethod.
(6) ISO78-2:1999Chemistry—Layoutsforstandards—Part2:Methods
ofchemicalanalysis.
(7) W.GdeRuigandJ.MWeseman«Anewapproachtoconfirmationby
infraredspectrometry»J.Chemometrics4(1990)61-77.
(8) Véase, por ejemplo, May, T. W., Brumbaugh, W. G., 1982, Matrix
modifier and L'vov platform for elimination of matrix interferences in
theanalysisoffishtissuesforleadbygraphite furnace atomic absorp-
tionspectrometry:AnalyticalChemistry54(7):1032-1037(90353).
(9) Applications ofZeeman Graphite FurnaceAtomic AbsorptionSpectro-
metry in the Chemical Laboratory and in Toxicology, C. Minoia, S.
Caroli(Eds.),PergamonPress(Oxford),1992,pp.xxvi+675.
(10) Inductively Coupled Plasmas in Analytical Atomic Spectrometry, A.
Montaser, D. W. Golighty (Eds.), VCH Publishers, Inc. (New York),
1992.
(11) Plasma Source MassSpectrometry Developments and Applications, G.
Holland, S. D. Tanner (Eds.), The Royal Society of Chemistry, 1997,
pp.329.
(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of
method-performancestudies,Pure&AppliedChem,67,331.
(13) Jülicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection
methods in trace analysis by means of a statistically based in-house
validationconcept.Analyst,120,173.
(14) Gowik, P., Jülicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for
non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high perfor-
mance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method
description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr.,
716,221.
(15) OAC-I Peer Verified Methods, Policies and Procedures, 1993, AOAC
International, 2200 Wilson Blvd., Suite 400, Arlington, Virginia
22201-3301,USA.
(16) W.J.Youden;Steiner,E.H.;«StatisticalManualoftheAOAC–Associa-
tionofOfficialAnalyticalChemists»,AOAC-I,WashingtonDC:1975,
p.35ff.
(17) ISO11843: 1997 Capability of detection — Part 1: Terms and defini-
tions, Part 2: Methodology in the linear calibration case Part 2:
Methodologyinthelinearcalibrationcase.
(18) R.W. Stephany & L.A. van Ginkel: «Yield or recovery: a world of
difference». Proceedings 8th Euro Food Chem, Vienna, Austria
September 18-20 (1995) Federation of European Chemical Societies,
Event206.ISBN3-900554-17X,pp.2-9.
(19) Directive71/354/EECof18October1971ontheapproximationofthe
laws of the Member States relating to units of measurement Official
JournalL243,29/10/1971,p.29.
(20) ISO31-0:1992Quantitiesandunits—Part0:Generalprinciples.2002D0657—ES—17.08.2002—000.001—33