1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceitesdeorujodeolivaysobresus
métodosdeanálisis
(DO L 248 de 5.9.1991, p. 1)
Modificado por:
DiarioOficial
nopágina fecha
►M1Reglamento(CEE) no3682/91 de la Comisión de 17 de diciembre de
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Reglamento(CEE) no1429/92 de la Comisión de 26 de mayo de 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Reglamento(CEE) no1683/92 de la Comisión de 29 de junio de 1992 L 176 27 30.6.1992
Rectificadopo r:
►C1Rectificación, DO L 347 de 28.11.1992, p. 69 (2568/91)
▼B
REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceites
deorujodeolivaysobresusmétodosdeanálisis
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,
Vistoel Reglamentono136/66/CEE del Consejo, de 22 de septiembre
de 1966, por el que se establece la organización común de mercados enel sector de las materias grasas(
1), cuya última modificación la consti-
tuye el Reglamento(CEE) no3577/90(2), y, en particular, su artículo
35bis,
Considerando que en el Anexo del Reglamento no136/66/CEE se esta-
blecen las denominaciones y definiciones de los aceites de oliva y de
los aceites de orujo de oliva comercializados dentro de cada Estado
miembro, así como en los intercambios intracomunitarios y conterceros países;
Considerando que, para poder distinguir los diferentes tipos de aceite,
procede definir las características fisicoquímicas de cada uno de ellos,
así como las características organolépticas de los aceites vírgenes, a finde garantizar así la pureza y calidad de estos productos, sin perjuicio deotras disposiciones existentes en la materia;
Considerando que conviene determinar de manera uniforme en toda la
Comunidad la presencia de las características de los diferentes tipos deaceite; que, para ello, procede establecer los métodos comunitarios deanálisis químico y de valoración organoléptica; que conviene, sinembargo, permitir que durante un período transitorio se utilicen otros
métodos de análisis que sean aplicados en los Estados miembros, esta-
bleciendoal mismotiempoque en casode presentarse resultado sdivergentes prevalezcan los obtenidos a través del método común;
Considerando que la definición de las características fisicoquímicas de
los aceites de oliva y de sus métodos de análisis comporta la adapta-
ción de las notas complementarias del capítulo 15 de la nomenclaturacombinada;
Considerando que el método de valoración de las características orga-
nolépticas de los aceites vírgenes requiere la creación de unos paneles
de catadores seleccionados y especialmente adiestrados; que conviene,por lo tanto, prever el plazo necesario para instaurar una estructura deeste tipo; que, dadas las dificultades a las que se enfrentarán determi-nados Estados miembros para crear dichos paneles, procede autorizarque se recurra a paneles existentes en otros Estados miembros;
Considerando que, para garantizar el correcto funcionamiento del
sistema de las exacciones reguladoras aplicables a la importación deorujo de oliva, es conveniente prever un método único para la determi-nación del contenido en aceite de estos productos;
Considerando que, para no perjudicar el comercio, resulta oportuno
prever un período limitado para la salida al mercado del aceite quehaya sidoenvasadoantes de la entrada en vigo r del presente Regla-mento;
Considerando que procede derogar el Reglamento (CEE) n
o1058/77 de
la Comisión(3), cuya última modificación la constituye el Reglamento
(CEE) no1858/88(4);
Considerando que el Comité de gestión de las materias grasas no ha
emitidodictamen algunoen el plazoestablecidopo r su presidente,1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 2
(1)D O no172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.
(2)D O noL 353 de 17. 12. 1990, p. 23.
(3)D O noL 128 de 24. 5. 1977, p. 6.
(4)D O noL 166 de 1. 7. 1988, p. 10.
▼B
HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:
Artículo 1
1. Se considerarán aceites de oliva vírgenes, a que se refieren las
letras a), b), y c) del punto1 del Anexodel Reglamentono136/66/
CEE, los aceites cuyas características se ajusten a las indicadas, respec-tivamente, en los puntos 1, 2 y 3 del AnexoI del presente Reglamento .
2. Se considerará aceite de oliva virgen lampante, a que se refiere la
letra d) del punto1 del Anexodel Reglamenton
o136/66/CEE, el aceite
cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto4 del Anexo
I del presente Reglamento.
3. Se considerará aceite de oliva refinado, a que se refiere el punto 2
del Anexodel Reglamentono136/66/CEE, el aceite cuyas caracterís-
ticas se ajusten a las indicadas en el punto5 del AnexoI del presenteReglamento.
4. Se considerará aceite de oliva, a que se refiere el punto 3 del
Anexodel Reglamenton
o136/66/CEE, el aceite cuyas características
se ajusten a las indicadas en el punto6 del AnexoI del presente Regla-mento.
5. Se considerará aceite de orujo de oliva crudo, a que se refiere el
punto4 del Anexodel Reglamenton
o136/66/CEE, el aceite cuyas
características se ajusten a las indicadas en el punto7 del AnexoI del
presente Reglamento.
6. Se considerará aceite de orujo de oliva refinado, a que se refiere
el punto5 del Anexodel Reglamentono136/66/CEE, el aceite cuyas
características se ajusten a las indicadas en el punto8 del AnexoI delpresente Reglamento.
7. Se considerará aceite de orujo de oliva, a que se refiere el punto 6
del Anexodel Reglamenton
o136/66/CEE, el aceite cuyas caracterís-
ticas se ajusten a las indicadas en el punto9 del AnexoI del presenteReglamento.
Artículo 2
1. Las características de los aceites, previstas en el Anexo I, se
determinarán empleando los métodos de análisis siguientes:
— para determinar los ácidos grasos libres, expresados en porcentaje
de ácido oleico, el método recogido en el Anexo II,
— para determinar el índice de peróxidos, el método recogido en el
AnexoIII,
— para determinar los alcoholes alifáticos, el método recogido en el
AnexoIV,
— para determinar el contenido de esteroles, el método recogido en el
AnexoV,
— para determinar el eritrodiol + uvaol, el método recogido en el
AnexoVI,
— para determinar los ácidos grasos saturados en la posición 2 del
triglicérido, el método recogido en el Anexo VII,
— para determinar el contenido de trilinoleína, el método recogido en
el AnexoVIII,
— para el análisis espectrofotométrico, el método recogido en el
AnexoIX,
— para determinar la composición de ácidos grasos, el método reco-
gido en los Anexos X «A» y X «B»,
— para determinar los solventes halogenados volátiles, el método reco-
gidoen el AnexoXI,
— para la valoración de las características organolépticas de los aceites
de oliva vírgenes, el método recogido en el Anexo XII, que seaplicará de conformidad con el apartado 2,
— para la prueba de la refinación, el método recogido en el Anexo
XIII.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 3
▼B
2.►M3El analista expertoen análisis senso riales, asistidosi es
preciso por expertos ◄, llevará a cabola valo ración de las caracterís-
ticas organolépticas con arreglo al procedimiento descrito en la ficha
de degustación contemplada en el Anexo XII. En caso de que el
análisis determine características organolépticas distintas de las resul-tantes de la denominación del producto, el analista someterá lamuestra al examen de un panel de catadores, con arreglo a las disposi-ciones del Anexo XII.
El análisis contradictorio será realizado por el panel de catadores de
conformidad con las disposiciones citadas anteriormente.
Para la valoración de las características organolépticas con ocasión de
operaciones relacionadas con el régimen de intervención, el panel de
catadores procederá a aquella con arreglo a las disposiciones del Anexo
XII.
Artículo 3
Hasta el 31 de octubre de 1992, la introducción de los métodos de
análisis previstos en el artículo 2 no será óbice para que los Estadosmiembros empleen otros métodos comprobados y científicamente
válidos, siempre que con ello no se obstaculice la libre circulación de
los productos reconocidos conformes a la normativa en aplicación delos métodos comunitarios. Los Estados miembros interesados comuni-carán a la Comisión dichos otros métodos antes de utilizarlos.
En caso de que alguno de estos otros métodos dé un resultado diferente
del alcanzado por el método común, se considerará válido el resultadoobtenido en aplicación del método común.
Artículo 4
1. A fin de apreciar las características organolépticas, los Estados
miembros constituirán paneles de catadores seleccionados y entrenados
de acuerdo con las normas previstas en el método descrito en el Anexo
XII.
2. En casode que un Estadomiembrotenga dificultades para co ns-
tituir un panel en su territorio podrá recurrir a un panel que se halleestablecido en otro Estado miembro.
Artículo 5
Las notas complementarias números 2, 3 y 4 del capítulo15 de la
nomenclatura combinada se sustituirán por las que figuran en el AnexoXIV del presente Reglamento.
Artículo 6
1. El contenido en aceite de orujo de aceituna y demás residuos de
la extracción del aceite de oliva (códigos NC 2306 90 11 y 2306 9019)se determinará con arreglo al método recogido en el Anexo XV.
2. El contenido de aceite mencionado en el apartado 1 se expresará
como porcentaje del extracto seco en peso.
Artículo 7
Serán aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de
sustancias extrañas distintas de las mencionadas en el Anexo XI.
Artículo 8
1. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión las medidas
adoptadas en aplicación del presente Reglamento.
2. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión, al inicio de
cada semestre una recapitulación de los datos analíticos de las determi-naciones efectuadas durante el semestre precedente.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 4
▼B
Estos resultados serán examinados por el Comité de gestión de las
materias grasas con arreglo al procedimiento previsto en el artículo 39del Reglamenton
o136/66/CEE.
Artículo 9
Queda derogado el Reglamento (CEE) no1058/77.
Artículo 10
1. El presente Reglamentoentrará en vigo r el tercer día siguiente al
de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas .
No obstante, el método que figura en el Anexo XII se aplicará a partir
del►M11 de noviembre de 1992 ◄, exceptoen loque se refiere a
las operaciones relacionadas con la intervención.
El presente Reglamento no se aplicará a los aceites de oliva y de orujo
de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presenteReglamento y comercializados hasta el 31 de octubre de 1992.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y
directamente aplicable en cada Estadomiembro .1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 5
▼B
ANEXOS
Índice
Anexo I: Características de los aceites de oliva …
AnexoII: Determinación del gradode acidez …
AnexoIII: Determinación del índice de peróxido s …Anexo IV: Determinación del contenido de alcoholes alifáticos mediante
cromatografía de gases con columna capilar …
Anexo V: Determinación de la composición y del contenido de esteroles
mediante cromatografía de gases con columna capilar …
Anexo VI: Determinación del eritrodiol y uvaol …Anexo VII: Determinación de los ácidos grasos saturados en la posición 2
de los triglicéridos de aceites y grasas …
Anexo VIII: Determinación del porcentaje de trilinoleína …Anexo IX: Prueba espectrofométrica en el ultravioleta …
Anexo X «A»: Análisis de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante
cromatografía de gases …
Anexo X «B»: Preparación de los ésteres metílicos de los ácidos grasos …
AnexoXI: Determinación del co ntenidoen ►
C1disolventes ◄haloge-
nados volátiles en el aceite de oliva …
Anexo XII: Valoración organoléptica del aceite de oliva virgen …
AnexoXIII: Prueba de la refinación …Anexo XIV: Notas complementarias 2, 3 y 4 del capítulo 15 de la nomen-
clatura combinada …
Anexo XV: Contenido de aceite de los orujos de aceituna …
AnexoXVI: Determinación del índice de yo do…1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 6
ANEXO I
CARACTERÍSTICASDELOSACEITESDEOLIVA
CategoríaAcidez
%Índice de
peróxidos
meq/O2/kgSolventes
haloge-
nados mg/
kg (1)Alcoholes
alifáticos
mg/kgÁcidos
grasos
saturados
en posición
2d el os
triglicé-
ridos
%Eritrodiol
+ uvaol
%Trilino-
leina
%Colesterol
%Brassicas-
terol
%Campes-
terol
%Estigmas-
terol
%Betasitos-
terol
%(2)∆-Estig-
mastenol
%Esteroles
totales mg/
kg
1. Aceite de oliva
virgen extra M 1,0 M 20 M 0,200 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
2. Aceite de oliva
virgen M 2,0 M 20 M 0,200 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
3. Aceite de oliva
virgen corriente M 3,3 M 20 M 0,200 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
4. Aceite de oliva
virgen lampante > 3,3 > 20 > 0,200 M 400 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1 000
5. Aceite de oliva
refinadoM 0,5 M 10 M 0,200 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
6. Aceite de oliva M 1,5 M 15 M 0,200 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 0007. Aceite de orujo de
oliva crudo m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2 500
8. Aceite de orujo de
oliva refinado M 0,5 M 10 M 0,200 — M 2,0 m 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800
9. Aceite de orujo de
oliva M 1,5 M 15 M 0,200 — M 2,0 > 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800
M = máximo, m = mínimo
(1) Contenido total de compuestos detectados mediante captura de electrones. Para cada uno de los componentes el límite máximo es de 0,10 mg/kg.
(2)∆-S-23-Estigmastadienol + Clerosterol + Betasitosterol + Sitostanol + ∆-5-Avenasterol + ∆-5-24 Estigmastadienol.
Nota:Para descalificar un aceite bastará con que una sola de las características no se ajuste a los límites fijados.▼B1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 7
CategoríaContenido de ácidos
Total de
isómeros
transoleicos
%Total de
isómeros
translino-
leicos y
translinolé-
nicos
%K232K270K270despuès
de pasar por
alúmina +Delta K Panel test
Mirístico
%Linolénico
%Araquídico
%Icosanoico
%Behénico
%Lignocérico
%
1. Aceite de oliva
virgen extra M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,40 M 0,20 M 0,10 M 0,01 ≥6,5
2. Aceite de oliva
virgen M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥5,5
3. Aceite de oliva
virgen corriente M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥3,5
4. Aceite de oliva
virgen lampante M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,10 < 0,10 M 3,70 > 0,25 M 0,11 — < 3,5
5. Aceite de oliva refi-
nadoM 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —
6. Aceite de oliva M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —7. Aceite de orujo de
oliva crudo M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,10 —————
8. Aceite de orujo de
oliva refinado M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,40 < 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Aceite de orujo de
oliva M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,40 < 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —▼M21991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 8
▼B
ANEXO II
DETERMINACIÓNDELGRADODEACIDEZ
1. OBJETO
Determinar los ácidos libres en los aceites de oliva. El contenido en
ácidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada según el
método convencional.
1.1.Principio
Disolución de la muestra en una mezcla de disolventes y valoración de
los ácidos grasos libres mediante una solución etanólica de hidróxido
potásico.
1.2.Reactivos
Todos los reactivos deben ser de calidad analítica reconocida y el agua
utilizada debe ser agua destilada ode una pureza equivalente.
1.2.1. Mezcla de éter dietílico y etanol de 95 % (V/V), en proporción de
volumen 1:1.
Nota:El éter dietílico es muy inflamable y puede formar peróxidos
explosivos. Debe utilizarse tomando especiales precauciones.
Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilización con la
solución de hidróxido potásico (1.2.2) en presencia de 0,3 ml de la solu-
ción de fenolftaleína (1.2.3) por cada 100 ml de mezcla.
Nota:Si no es posible utilizar éter dietílico, puede sustituirse por una
mezcla de disolventes formada por etanol y tolueno. Si fuera nece-
sario, el etanol podría sustituirse, a su vez, por 2-propanol.
1.2.2. Solución etanólica valorada de hidróxido potásico, = 0,1 M o, en caso
necesario, = 0,5 M. Nota 1.
Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilización,
la concentración exacta de la solución etanólica de hidróxido potásico.
Debe utilizarse una solución que haya sido preparada por lo menos cinco
días antes y decantada en un frascode vidriomarrón cerradoco n tapón
de goma. La solución debe ser incolora o de color amarillo paja.
Nota:Se puede preparar una solución incolora y estable de hidróxido
potásico de la manera siguiente: Llevar a ebullición, y mantener
ésta a reflujo durante una hora, 1 000 ml de etanol con 8 g dehidróxido potásico y 0,5 g de virutas de aluminio. Destilar inme-
diatamente. Disolver en el destilado la cantidad requerida de
hidróxido potásico. Dejar reposar durante varios días y decantar
el líquido claro sobrenadante, separándolo del precipitado de
carbonato potásico.
La solución también puede prepararse de la manera siguiente sin
efectuar la destilación: añadir 4 ml de butilatode aluminioa
1 000 ml de etanol y dejar reposar la mezcla durante algunos
días. Decantar el líquido sobrenadante y disolver en él la cantidad
necesaria de hidróxido potásico. La solución está lista para ser
utilizada.
1.2.3. Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol de 95-96 % (V/V) o solu-
ción de 20 g/l de azul alcalino(en casode aceites de o liva muy
coloreados) en etanol de 95-96 % (V/V).
1.3.Material
Material habitual de laboratorio, y en particular:
1.3.1. Balanza analítica
1.3.2. Matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad
1.3.3. Bureta de 10 ml de capacidad, con graduación de 0,05 ml
1.4.Procedimento
1.4.1. Preparación de la muestra para la prueba1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 9
▼B
La determinación se efectuará en una muestra filtrada. Si el contenido
global de humedad e impurezas es inferior al 1 %, se utilizará la muestra
tal cual.
1.4.2. Muestra para la prueba
Tomar la muestra, según el grado de acidez previsto, de acuerdo con el
cuadrosiguiente:
Gradode acidez previstoPesode la muestra
(en g)Precisión de la pesada de
la muestra
(en g)
< 1 20 0,05
1 a 4 10 0,02
4 a 15 2,5 0,01
15 a 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Pesar la muestra en el matraz erlenmeyer (1.3.2)
1.4.3 Determinación
Disolver la muestra (1.4.2) en 50 a 150 ml de la mezcla de éter dietílico
y etanol (1.2.1), previamente neutralizada.
Valorar, agitando, con la solución de hidróxido potásico de 0,1 M (1.2.2)
(véase nota 2) hasta el viraje del indicador (la coloración rosa de la
fenolftaleína debe permanecer al menos durante 10 segundos).
Nota 1:La solución etanólica valorada de hidróxido potásico (1.2.2)
puede sustituirse por una solución acuosa de hidróxido potásico
o sódico siempre que el volumen de agua añadido no provoque
una separación de las fases.
Nota 2:Si la cantidad necesaria de la solución de hidróxido potásico de
0,1 M supera los 10 ml, debe utilizarse una solución de 0,5 M.
Nota 3:Si la solución se enturbia durante la valoración, añadir una
cantidad suficiente de la mezcla de disolventes (1.2.1) para que
la solución se aclare.
1.5Expresióndelaacidezenporcentajedeácidooleico
La acidez, expresada en porcentaje de ácido oleico es igual a:
V/C2c/C2M
1000/C2100
P¼V/C2c/C2M
10/C2P
siendo:
V: volumen en ml de la solución valorada de hidróxido potásico utili-
zada.
c: concentración exacta, en moles por litro, de la solución de hidróxido
potásico utilizada.
M: pesomo lecular del ácidoen que se expresa el resultado(ácido
oleico = 282).
P: pesoen gramo s de la muestra utilizada.
Se tomará como resultado la media aritmética de dos determinaciones.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 10
▼B
ANEXO III
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEPERÓXIDOS
1. OBJETO
La presente norma describe un método para la determinación del índice de
peróxidos de los aceites y grasas.
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
La presente norma es aplicable a los aceites y grasas animales y vegetales.
3. DEFINICIÓN
El índice de peróxidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de
oxígeno activo por kg de grasa) de peróxidos en la muestra que ocasionan
la oxidación del yoduro potásico en las condiciones de trabajo descritas.
4. PRINCIPIO
La muestra problema, disuelta en ácido acético y cloroformo, se trata con
solución de yoduro potásico. El yodo liberado se valora con solución valo-
rada de tiosulfato sódico.
5. APARATOS
Todo el material utilizado estará exento de sustancias reductoras u
oxidantes.
Nota:Noengrasar las superficies esmeriladas.
5.1. Navecilla de vidriode 3 ml5.2. Matraces con cuello y tapón esmerilados, de 250 ml de capacidad aproxi-
madamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco
(nitrógeno o, preferiblemente, dióxido de carbono).
5.3. Bureta de 25 o50 ml, graduada en 0,1 ml.
6. REACTIVOS
6.1. Cloroformo para análisis, exento de oxígeno por borboteo de una corriente
de gas inerte puroy seco .
6.2. Ácido acético glacial para análisis, exento de oxígeno por borboteo de una
corriente de gas inerte puro y seco.
6.3. Solución acuosa saturada de yoduro potásico, recién preparada, exenta de
yodo y yodatos.
6.4. Solución acuosa de tiosulfato sódico 0,01 N o 0,002 N valorada exacta-
mente; la valoración se efectuará inmediatamente antes del uso.
6.5. Solución de almidón, en solución acuosa de 10 g/l, recién preparada con
almidón soluble.
7. MUESTRA
La muestra se tomará y almacenará al abrigo de la luz, y se mantendrá
refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y herméticamente
cerrados con tapones de vidrio esmerilado o de corcho.
8. PROCEDIMIENTO
El ensayo se realizará con luz natural difusa o con luz artificial. Pesar con
precisión de 0,001 g en una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un
matraz (5.2) una cantidad de muestra en función del índice de peróxidos
que se presuponga, con arreglo al cuadro siguiente:1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 11
▼B
Índice de peróxidos que se supone
(meq de O2/kg)Pesode la muestra pro blema
(en g)
de 0 a 12 de 5,0 a 2,0
de 12 a 20 de 2,0 a 1,2de 20 a 30 de 1,2 a 0,8de 30 a 50 de 0,8 a 0,5
de 50 a 90 de 0,5 a 0,3
Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la
muestra problema. Añadir 10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rápidamente
la muestra problema mediante agitación. Añadir 15 ml de ácido acético
(6.2) y, a continuación, 1 ml de solución de yoduro potásico (6.3). Cerrar
rápidamente el matraz, agitar durante 1 minutoy mantenerloen la o scu-
ridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida
entre 15 y 25 ºC.
Añadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al
mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solución de tiosul-
fato sódico (6.4) (solución 0,002 N si se presuponen valores inferiores a
12 y solución 0,01 N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando
la solución de almidón (6.5) como indicador.
Efectuar dos determinaciones por muestra.
Realizar simultáneamente un ensayoen blanco . Si el resultadodel ensayo
en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solución de tiosulfato sódico 0,01 N
(6.4), sustituir los reactivos.
9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
El índice de peróxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxígeno
activopo r kg de grasa se calcula mediante la fórmula siguiente:
IP¼
V/C2N/C21000
P
siendo:
V: ml de solución valorada de tiosulfato sódico (6.4) empleados en el
ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo
en blanco.
N: normalidad exacta de la solución de tiosulfato sódico (6.4) empleada.
P: peso, en gramos de la muestra problema.
El resultado será la media artimética de las dos determinaciones efectuadas.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 12
▼B
ANEXO IV
DETERMINACIÓNDELCONTENIDODEALCOHOLESALIFÁTICOS
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA
CAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de alcoholes alifáticos en las materias grasas, expresado
como contenido de cada uno de los alcoholes alifáticos analizados y
como contenido total.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadido 1-eico-
sanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
potásico; a continuación, extracción del insaponificable con éter etílico.
Separación de la fracción de alcoholes del insaponificable extraído
mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los alcoholes
recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se
analizan mediante cromatografía de gases con columna capilar.
3. MATERIAL
3.1. Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo con juntas esme-
riladas.
3.2. Embudos de decantación de 500 ml.
3.3. Matraces de 250 ml.
3.4. Equipo completo de cromatografía en capa fina, utilizando placas de
vidriode 20 × 20 cm.
3.5. Lámpara ultravioleta de una longitud de onda de 366 o 254 nm.
3.6. Microjeringas de 100 µl y 500 µl.
3.7. Embudo cilíndrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 µm),
de 2 cm de diámetro y 5 cm de altura, aproximadamente, con un dispo-
sitivoadecuadopara la filtración en vacíoy una junta esmerilada
macho12/21.
3.8. Matraz cónicopara vacíode 50 ml, co n junta esmerilada hembra 12/21
acoplable al embudo filtrante (3.7).
3.9. Probeta de 10 ml de fondo cónico con tapón hermético.
3.10. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna
capilar, provisto de un sistema de división de flujo formado por:
3.10.1. Horno para la columna, que pueda mantener la temperatura deseada con
precisión de ± 1 ºC.
3.10.2. Inyector con elemento vaporizador de vidrio tratado con persilano.
3.10.3. Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplifi-
cador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y
con velocidad de papel variable.
3.11. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de 20 a 30 m de longitud y
de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interno, recubierta interiormente de
líquido SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile
entre 0,10 y 0,30 µm.
3.12. Microjeringa de 10 µl para cromatografía de gases, con aguja endure-
cida.
4. REACTIVOS
4.1. Hidróxido potásico en solución etanólica aproximadamente 2N:
disolver, enfriando al mismo tiempo, 130 g de hiróxido potásico (valo-
ración mínima del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta
un litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio oscuro
bien cerradas.
4.2. Éter etílicode calidad para análisis.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 13
▼B
4.3. Sulfatosódicoanhidrode calidad para análisis.
4.4. Placas de vidrio recubiertas con gel de sílice, sin indicador de fluores-
cencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya
preparadas para el uso).
4.5. Hidróxidopo tásicoen ►C1solución etanólica 0,2N ◄: disolver 13 g
de hidróxido potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un
litro con etanol.
4.6. Benceno para cromatografía.4.7. Acetona para cromatografía.4.8. Hexano para cromatografía.
4.9. Éter etílico para cromatografía.
4.10. Cloroformo de calidad para análisis.4.11. Solución patrón para cromatografía en capa fina: mezcla de alcoholes
de C
20aC28, disolución al 5 % en cloroformo.
4.12. Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol. Para hacerla
ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2N
de hidróxido potásico.
4.13. Piridina anhidra para cromatografía.
4.14. Hexametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Solución problema de trimetilsililéteres de los alcoholes alifáticos de
C
20aC28: preparar en el momento del uso a partir de mezclas de
alcoholes puros.
4.17. 1-eicosanol, disolución al 0,1 % (m/v) en cloroformo (patrón interno).4.18. Gas portador: hidrógeno o helio de calidad para cromatografía de gases.
4.19. Gases auxiliares:
— hidrógeno de calidad para cromatografía de gases,
— aire de calidad para cromatografía de gases.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparación del insaponificable.5.1.1. Con la microjeringa de 500 µl introducir en el matraz de 250 ml un
volumen de disolución de 1-eicosanol (se puede utilizar igualmente
►
C11-heneicosanol ◄) al 0,1 % en cloroformo (4.17) que contenga
una cantidad de 1-eicosanol correspondiente al 10 % aproximadamente
del contenido de alcoholes alifáticos en la alícuota de la muestra para la
determinación. Por ejemplo, para 5 g de muestra añadir 250 µl de la
solución de 1-eicosanol al 0,1 %, si se trata de aceite de oliva, y
1 500 µl, si se trata de aceite de orujo de oliva.
Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación,
pesar con precisión, en el mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada.
5.1.2. Añadir 50 ml de solución etanólica de hidróxido potásico 2N, adaptar el
refrigerante de reflujoy calentar al bañoMaría co n ligera ebullición,
agitando enérgica e ininterrumpidamente hasta que se produzca la sapo-
nificación (la solución se vuelve límpida). Calentar durante 20 minutos
más y, a continuación, añadir 50 ml de agua destilada por la parte supe-
rior del refrigerante; separar el refrigerante y enfriar el matraz a 30 ºC
aproximadamente.
5.1.3. Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de
separación de 500 ml, mediante varios lavados con un total de 50 ml
de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éter etílico,
agitar enérgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar hasta
la completa separación de las fases (nota 1).
Separar la fase acuosa inferior pasándola a un segundo embudo de
separación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el
mismo procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de éter etílico.
Nota 1:Las posibles emulsiones podrán eliminarse añadiendo pequeñas
cantidades de alcohol etílico o metílico con un pulverizador.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 14
▼B
5.1.4. Reunir las fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y
lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de
lavadopresente reacción neutra.
Una vez eliminada el agua de lavado, secar con sulfato sódico anhidro
y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml previa-
mente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeñas cantidades
de éter etílico.
5.1.5. Destilar el éter hasta que queden unos pocos ml; a continuación, secar
en un vacío ligero o en una corriente de nitrógeno, completando el
secado en una estufa a 100 ºC durante 15 minutos aproximadamente;
dejar enfriar en un desecador y pesar.
5.2. Separación de la fracción de alcoholes.
5.2.1. Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas
con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2N de hidróxido
potásico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana
durante dos horas y, por último, mantenerlas en una estufa regulada a
100 ºC durante una hora.
Sacarlas de la estufa y conservarlas en un desecador de cloruro de
calcio hasta el momento del uso (las placas sometidas a este tratamiento
deberán utilizarse en un plazo de quince días como máximo).
Nota 2:Si se utilizan placas básicas de gel de sílice para la separación
de la fracción de alcoholes, ya no es necesario tratar el insapo-
nificable con alúmina. De este modo, todos los compuestos de
naturaleza ácida (ácidos grasos y otros) quedan retenidos en la
línea de aplicación, y la banda de los esteroles aparece perfec-
tamente diferenciada de la banda de los alcoholes alifáticos y
terpénicos.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de
benceno y acetona 95:5 (V/V) hasta una altura de 1 cm aproximada-
mente. Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y éter
etílico 65:35 (V/V). Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y
dejar transcurrir media hora como mínimo, de forma que se alcance el
equilibrio líquido-vapor. En las caras interiores de la cubeta pueden
colocarse tiras de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente: de
esta manera el tiempode desarro llose reduce casi un tercioy se
obtiene una elución más uniforme y regular de los componentes.
Nota 3:Para que las condiciones de elución sean perfectamente repro-
ducibles, la mezcla de desarrollo deberá cambiarse en cada
prueba.
5.2.3. Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 %
aproximadamente y, con la microjeringa de 100 µl, depositar 0,3 ml
de dicha solución en una placa cromatográfica (5.2.1) a unos 2 cm de
uno de los bordes, formando una línea lo más fina y uniforme posible.
A la altura de la línea de aplicación se depositan, en un extremo de la
placa, de 2 a 3 µl de la solución de referencia de alcoholes (4.11) para
poder identificar la banda de alcoholes alifáticos una vez efectuado el
desarrollo.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el punto5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura de entre 15 y
20 ºC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la
elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximada-
mente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y
evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la
placa bajo una campana unos minutos.
5.2.5. Pulverizar la placa ligera y uniformemente con la solución de 2,7-diclo-
rofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede
identificarse la banda de los alcoholes alifáticos mediante comparación
con la mancha obtenida con la solución de referencia; marcar con lápiz
negro el conjunto de la banda de alcoholes alifáticos y de la banda
inmediatamente superior correspondiente a los alcoholes triterpénicos.
Nota 4:La prescripción de considerar junto con la banda de alcoholes
triterpénicos la de alcoholes alifáticos responde al hecho de
que la primera, en las condiciones del presente ensayo, incluye
cantidades significativas de alcoholes alifáticos.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área
delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el
embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclar
cuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo
el filtradoen el matraz cónico(3.8) aco pladoal embudofiltrante.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 15
▼B
Lavar el residuoen el embudotres veces co n éter etílico(empleando
cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo
matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener
una volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al tubo de
ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitrógeno, recoger
con algunas gotas de acetona, evaporar de nuevo hasta sequedad, intro-
ducir en una estufa a 105 ºC durante unos 10 minutos, dejar enfriar en
el desecador y pesar.
El residuo que queda en el tubo de ensayo está formado por la fracción
de alcoholes.
5.3. Preparación de los trimetilsililéteres.
5.3.1. Agregar al tubo que contiene la fracción de alcoholes el reactivo de
silanización formado por una mezcla de piridina, hexametildisilazano y
trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 5), a razón de 50 µl por mili-
gramo de alcoholes evitando toda absorción de humedad (nota 6).
Nota 5:Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además,
también existen otros reactivos de silanización, como el bis-
trimetilsililacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que se
diluye en el mismovo lumen de piridina anhidra.
5.3.2. Tapar el tubo, agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la total disolu-
ción de los alcoholes. Dejar reposar un cuarto de hora, como mínimo, a
temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos; la solu-
ción límpida queda lista para el análisis mediante cromatografía de
gases.
Nota 6:La formación de una ligera opalescencia es normal y no
ocasiona ninguna interferencia. La formación de una flocula-
ción blanca o la aparición de una coloración rosa son indicios
de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este
casodeberá repetirse la prueba.
5.4. Cromatografía de gases.
5.4.1. Operaciones preliminares: acondicionamiento de la columna.5.4.1.1. Colocar la columna en el cromatógrafo uniendo uno de los extremos de
la columna al inyector y el otro al detector.
Efectuar los controles generales del equipo para cromatografía de gases
(estanquidad de los circuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del
sistema de fraccionamiento y del sistema de registro, etc.).
5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla
previamente. Hacer pasar un ligeroflujode gas a través de la co lumna,
encender el equipo de cromatografía de gases e iniciar un calentamiento
gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 ºC superior a la
temperatura de trabajo(no ta 7). Mantener dicha temperatura durante 2
horas como mínimo; a continuación, poner el equipo completo en
condiciones de funcionamiento (regulación del flujo de gases y de la
relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador
electrónico, regulación de la temperatura del horno, del detector y del
inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos
veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de
base debe ser lineal, estar exentode pico s de cualquier tipoy nodebe
presentar deriva.
Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna
no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicio-
namientode la co lumna es insuficiente.
Nota 7:La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre,
como mínimo, 20 ºC inferior a la temperatura máxima prevista
para la fase estacionaria utilizada.
5.4.2. Elección de las condiciones de trabajo.
5.4.2.1. Las condiciones de trabajo exigidas son las siguientes:
— temperatura de la columna: inicialmente isoterma durante 8 minutos
a 180 ºC; a continuación, programar un incremento de 5 ºC/minuto
hasta alcanzar los 260 ºC; después, mantener durante 15 minutos a
260 ºC.
— temperatura del inyector: 280 ºC,
— temperatura del detector: 290 ºC,
— velocidad lineal del gas portador: helio 20 a 35 cm/s, hidrógeno 30
a 50 cm/s,1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 16
▼B
— relación de «split» de 1/50 a 1/100,
— sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima,
— sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e.,
— velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,— cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 µl de solución de TMSE.
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna y del cromatógrafo, de modo que se obtengan cromato-
gramas que cumplan los siguientes requisitos:
— el tiempo de retención del alcohol C
26debe ser de 18 ± 5 minutos,
— el pico del alcohol C22debe ser: para el aceite de oliva, 80 ± 20 %
del fondo de escala, y para el aceite de semillas, 40 ± 20 % del
fondo de escala.
5.4.2.2. Para comprobar los requisitos citados, efectuar varias inyecciones de
mezclas problema de TMSE de alcoholes y ajustar las condiciones de
trabajo para obtener los mejores resultados.
5.4.2.3. Los parámetros de integración de los picos deberán establecerse de
modo que se obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos
tomados en consideración.
5.4.3. Realización del análisis.5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 µl tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µl de
aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 µl de la solución problema; elevar
el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la
aguja a través del septum y, después de 1 o2 segundo s, inyectar rápida-
mente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente.
5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los
alcoholes presentes.
La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones
exigidas (5.4.1.2.).
5.4.4. Identificación de los picos.
Para la identificación de los diferentes picos se utilizan los tiempos de
retención y la comparación con mezclas de TMSE de los alcoholes
analizadas en las mismas condiciones.
La figura 1 muestra un cromatograma de la fracción alcohólica de un
aceite de oliva virgen.
5.4.5. Determinación cuantitativa.
5.4.5.1. Calcular las áreas de los picos del 1-eicosanol y de los alcoholes alifá-
ticos de C
22aC28utilizandoel integrado r.
5.4.5.2. Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los alcoholes,
expresadoen mg/100 g de materia grasa:
alcohol x =Ax·ms· 100
As·m
siendo:
Ax: área del pico del alcohol x.
As: área del pico del 1-eicosanol.
ms: peso de 1-eicosanol añadido, en miligramos.
m: peso de la muestra tomado para la determinación, en gramos.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Se expresa el contenido de cada uno de los alcoholes alifáticos en mg/
100 g de materia grasa y como «alcoholes alifáticos totales», su suma.
(C22+C24+C26+C28).1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 17
▼B
APÉNDICE
Determinación de la velocidad lineal del gas
Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condiciones normales,
de 1 a 3 µl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gas en recorrer
la columna, desde el momento de la inyección hasta que aparece el pico (tM).
La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la
columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.
Figura 1 — Cromatograma de la fracción alcohólica de un aceite de oliva
virgen
1 = Eicosanol
2 = Dicosanol
3 = Tricosanol4 = Tetracosanol
5 = Pentacosanol
6 = Hexacosanol7 = Heptacosanol8 = Octacosanol1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 18
▼B
ANEXO V
DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DEL CONTENIDO DE
ESTEROLES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON
COLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de esteroles en las materias grasas, expresado como
contenido de cada uno de los esteroles analizados y como contenido
total de esteroles.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadio α-coles-
tanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
potásico; a continuación, extracción del insaponificable con éter etílico.
Separación de la fracción de esteroles del insaponificable extraído
mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los esteroles
recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se
analizan mediante cromatografía de gases con columna capilar.
3. MATERIAL
3.1. Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo con juntas esme-
riladas.
3.2. Embudos de separación de 500 ml.
3.3. Matraces de 250 ml.
3.4. Equipo completo de cromatografía en capa fina, utilizando placas de
vidriode 20 × 20 cm.
3.5. Lámpara ultravioleta de una longitud de onda de 366 o 254 nm.
3.6. Microjeringa de 100 µl y 500 µl.
3.7. Embudo cilíndrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 µm),
de 2 cm de diámetro y 5 cm de altura, aproximadamente, con un dispo-
sitivoadecuadopara la filtración en vacíoy una junta esmerilada
macho12/21.
3.8. Matraz cónicopara vacíode 50 ml, co n junta esmerilada hembra 12/21
acoplable al embudo filtrante (3.7).
3.9. Probeta de 10 ml de fondo cónico con tapón hermético.
3.10. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna
capilar, provisto de un sistema de división de flujo formado por:
3.10.1. Horno para la columna, que pueda mantener la temperatura deseada con
precisión de ± 1 ºC.
3.10.2. Inyector con elemento vaporizador de vidrio tratado con persilano.
3.10.3. Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplifi-
cador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y
con velocidad de papel variable.
3.11. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de 20 a 30 m de longitud y
de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interno, recubierta interiormente de
líquido SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile
entre 0,10 y 0,30 µm.
3.12. Microjeringa de 10 µl para cromatografía de gases, con aguja endure-
cida.
4. REACTIVOS
4.1. Hidróxido potásico, solución etanólica 2N aproximadamente: disolver,
enfriando al mismo tiempo, 130 g de hidróxido potásico (valoración
mínima del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un
litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio oscuro
bien cerradas.
4.2. Éter etílicode calidad para análisis.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 19
▼B
4.3. Sulfatosódicoanhidrode calidad para análisis.
4.4. Placas de vidrio recubiertas con gel de sílice, sin indicador de fluores-
cencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya
preparadas para el uso).
4.5. Hidróxido potásico, solución etanólica 0,2N: disolver 13 g de hidróxido
potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con
etanol.
4.6. Benceno para cromatografía.4.7. Acetona para cromatografía. (Véase 5.2.2).4.8. Hexano para cromatografía. (Véase 5.2.2).4.9. Éter etílico para cromatografía. (Véase 5.2.2).4.10. Cloroformo de calidad para análisis.4.11. Solución patrón para cromatografía en capa fina: colesterol o fitoste-
roles, solución al 5 % en cloroformo.
4.12. Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol. Para hacerla
ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2N
de hidróxido potásico.
4.13. Piridina anhidra para cromatografía.4.14. Hexametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Solución problema de trimetilsililéteres de los esteroles: preparar en el
momento del uso a partir de esteroles puros o de mezclas de esteroles
obtenidos de aceites que los contengan.
4.17. α-colestanol, disolución al 0,2 % (m/V) en cloroformo (patrón interno).
4.18. Gas portador: hidrógeno o helio de calidad para cromatografía de gases.4.19. Gases auxiliares:
— hidrógeno de calidad para cromatografía de gases,
— aire de calidad para cromatografía de gases.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparación del insaponificable.5.1.1. Con la microjeringa de 500 µl introducir en el matraz de 250 ml un
volumen de disolución de α-colestanol al 0,2 % en cloroformo (4.17)
que contenga una cantidad de α-colestanol correspondiente al 10 %
aproximadamente del contenido de esteroles en la alícuota de la
muestra para la determinación. Por ejemplo, para 5 g de muestra añadir
500 µl de la solución de α-colestanol al 0,2 %, si se trata de aceite de
oliva, y 1500 µl, si se trata de aceite de semillas o de aceite de orujo de
oliva.
Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación,
pesar con precisión, en el mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada.
En el caso de aceites y grasas animales o vegetales con un alto conte-
nido de colesterol puede producirse ön pico cuyo tiempo de retención
sea idéntico al del colestanol. En tal caso el análisis de la fracción de
esteroles debe realizarse dos veces: con patrón interno y sin él.
5.1.2. Añadir 50 ml de solución etanólica de hidróxido potásico 2N, adaptar el
refrigerante de reflujoy calentar en bañoMaría co n ligera ebullición,
agitando enérgica e ininterrumpidamente hasta que se produzca la sapo-
nificación (la solución se vuelve límpida). Calentar durante 20 minutos
más y, a continuación, añadir 50 ml de agua destilada por la parte supe-
rior del refrigerante; separar el refrigerante y enfriar el matraz a 30 ºC
aproximadamente.
5.1.3. Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de
separación de 500 ml, mediante varios lavados con un total aproximado
de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éter
etílico, agitar enérgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar
hasta la separación de las fases (nota 1).
Separar la fase acuosa inferior pasándola a un segundo embudo de
separación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el
mismo procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de éter etílico.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 20
▼B
Nota 1:Las posibles emulsiones podrán eliminarse añadiendo pequeñas
cantidades de alcohol etílico o metílico con un pulverizador.
5.1.4. Reunir las fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y
lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de
lavadopresente reacción neutra.
Una vez eliminada el agua de lavado, secar con sulfato sódico anhidro
y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml previa-
mente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeñas cantidades
de éter etílico.
5.1.5. Destilar el éter hasta que queden unos pocos ml; a continuación, secar
con un vacío ligero o en una corriente de nitrógeno, completando el
secado en una estufa a 100 ºC durante 15 minutos aproximadamente;
dejar enfriar en un desecador y pesar.
5.2. Separación de la fracción de esteroles.
5.2.1. Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas
con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2N de hidróxido
potásico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana
durante dos horas y, por último, mantenerlas en una estufa regulada a
100 ºC durante una hora. Sacarlas de la estufa y conservarlas en un
desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas
sometidas a este tratamiento deberán utilizarse en un plazo de quince
días como máximo).
Nota 2:Si se utilizan placas básicas de gel de sílice para la separación
de la fracción de esteroles, ya no es necesario tratar el insapo-
nificable con alúmina. De este modo, todos los compuestos de
naturaleza ácida (ácidos grasos y otros) quedan retenidos en la
línea de aplicación, y la banda de los esteroles aparece perfec-
tamente diferenciada de la banda de los alcoholes alifáticos y
triterpénicos.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de
benceno-acetona 95:5 (v/v) hasta una altura de 1 cm aproximadamente.
Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y éter etílico
65:35 (v/v). Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y dejar trans-
currir media hora como mínimo, de forma que se alcance el equilibrio
líquido-vapor. En las caras interiores de la cubeta pueden colocarse tiras
de papel de filtroque se sumerjan en el eluyente: de esta manera el
tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elución
más uniforme y regular de los componentes.
Nota 3:Para que las condiciones de elución sean perfectamente repro-
ducibles, la mezcla de desarrollo deberá cambiarse en cada
prueba.
5.2.3. Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 %
aproximadamente y, con la microjeringa de 100 µl, depositar 0,3 ml
de dicha solución en una placa cromatográfica (5.2.1) a unos 2 cm de
uno de los bordes, formando una línea lo más fina y uniforme posible.
A la altura de la línea de aplicación se depositan, en un extremo de la
placa, de 2 a 3 µl de la solución de referencia de esteroles (4.11) para
poder identificar la banda de esteroles una vez efectuado el desarrollo.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el punto5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura ambiente entre
15 y 20 ºC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca
la elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproxima-
damente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y
evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la
placa bajo una campana unos minutos.
5.2.5. Pulverizar la placa ligera y uniformemente con la solución de 2,7-diclo-
rofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede
identificarse la banda de los esteroles mediante comparación con la
mancha obtenida a partir de la solución de referencia; marcar con
lápiz negro los límites de la banda a lo largo de los márgenes de fluo-
rescencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área
delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el
embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclarcuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo
el filtradoen el matraz cónico(3.8) aco pladoal embudofiltrante.
Lavar el residuoen el embudotres veces co n éter etílico(empleando
cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo
matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 21
▼B
un volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al tubo de
ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitrógeno, recoger
con algunas gotas de acetona, evaporar de nuevo hasta sequedad, intro-
ducir en una estufa a 105 ºC durante unos 10 minutos, dejar enfriar en
el desecador y pesar.
El residuo que queda en el tubo de ensayo está formado por la fracción
de esteroles.
5.3. Preparación de los trimetilsililéteres.
5.3.1. Agregar al tubo que contiene la fracción de esteroles el reactivo de sila-
nización formado por una mezcla de piridina-hexametildisilazano-
trimetilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 4), a razón de 50 µl por mili-
gramo de esteroles, evitando toda absorción de humedad (nota 5).
Nota 4:Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además,
también existen otros reactivos de silanización, como el bis-
trimetilsililacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que se
diluye en el mismovo lumen de piridina anhidra.
5.3.2. Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la completa
disolución de los esteroles. Dejar reposar un cuarto de hora, como
mínimo, a temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos;
la solución límpida queda lista para el análisis mediante cromatografía
de gases.
Nota 5:La formación de una ligera opalescencia es normal y no
ocasiona ninguna interferencia. La formación de una flocula-
ción blanca o la aparición de una coloración rosa son indicios
de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este
casodeberá repetirse la prueba.
5.4. Cromatografía de gases.
5.4.1. Operaciones preliminares: acondicionamiento de la columna.
5.4.1.1. Colocar la columna en el cromatógrafo uniendo uno de los extremos de
la columna al inyector y el otro al detector.
Efectuar los controles generales del equipo para cromatografía de gases
(estanquidad de los cricuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del
sistema de división de flujoy del sistema de registro , etc.).
5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla
previamente. Hacer pasar un ligeroflujode gas a través de la co lumna,
encender el equipo de cromatografía de gases e iniciar un calentamiento
gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 ºC superior a la
temperatura de trabajo(no ta 6). Mantener dicha temperatura durante 2
horas como mínimo; a continuación, poner el equipo completo en
condiciones de funcionamiento (regulación del flujo de gases y de la
relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador
electrónico, regulación de la temperatura del horno del detector y del
inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos
veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de
base debe ser lineal, exentode pico s de cualquier tipoy nodebe
presentar deriva.
Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna
no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicio-
namientode la co lumna es insuficiente.
Nota 6:La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre,
como mínimo 20 ºC inferior a la temperatura máxima prevista
para la fase estacionaria utilizada.
5.4.2. Elección de las condiciones de trabajo.
5.4.2.1. Las condiciones de trabajo exigidas son las siguientes:
— temperatura de la columna: 260 ºC ± 5 ºC,
—►C1temperatura del inyector ◄: 280 ºC,
— temperatura del detector: 290 ºC,— velocidad lineal del gas portador: helio 20 a 35 cm/s, hidrógeno 30
a 50 cm/s,
— relación de «split» de 1/50 a 1/100,
— sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima,
— sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e.— velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,— cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 µl de solución de TMSE.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 22
▼B
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna y del cromatógrafo, de modo que se obtengan cromato-
gramas que cumplan los siguientes requisitos:
— el tiempode retención del β-sitosterol debe ser de 20 ± 5 minutos,
— el pico del campesterol debe ser: para el aceite de oliva (contenido
medio del 3 %), 15 ± 5 % del fondo de escala; para el aceite de soja
(contenido medio del 20 %), 80 ± 10 % del fondo de escala,
— se deben separar todos los esteroles presentes; es necesario que los
pico s nosólose separen sinoque se resuelvan co mpletamente, es
decir, que el trazodel picollegue a la línea de base antes de que
se inicie el pico siguiente. No obstante, podrá admitirse una resolu-
ción incompleta si el pico a TRR 1,02 puede cuantificarse
utilizandola perpendicular.
5.4.3. Realización del análisis.
5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 µl tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µl de
aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 µl de la solución problema; elevar
el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la
aguja a través del septum y, después de 1 o2 segundo s, inyectar rápida-
mente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente.
5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los
esteroles presentes.
La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones
exigidas (5.4.1.2).
5.4.4. Identificación de los picos.
Para la identificación de los diferentes picos se utilizan los tiempos de
retención y la comparación con mezclas de TMSE de los esteroles
analizadas en las mismas condiciones.
La elución de los esteroles se efectúa en el orden siguiente: colesterol,
brasicasterol, 24-metilencolesterol, campesterol, campestanol, estigmas-
terol, ∆-7-campesterol, ∆-5,23-estigmastadienol, clerosterol, β-
sitosterol, sitostanol, ∆-5-avenasterol, ∆-5,24-estigmastadienol, ∆-7-
estigmastenol, ∆-7-avenasterol.
En el cuadro I figuran los tiempos de retención correspondientes al β-
sitosterol para las columnas SE 52 y SE 54.
Las figuras 1 y 2 ilustran los cromatogramas típicos de algunos aceites.
5.4.5. Determinación cuantitativa.5.4.5.1. Calcular las áreas de los picos del α-colestanol y de los esteroles utili-
zando el integrador. No se tomarán en cuenta los picos de aquellos
componentes que no figuren en el cuadro I. El factor de respuesta para
elα-colestanol debe considerarse como 1.
5.4.5.2. Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los esteroles,
expresadoen mg/100 g de materia grasa:
esterol x =A
x·ms· 100
As·m
siendo:
Ax: área del pico del esterol x, en milímetros cuadrados,
As: área del picodel α-colestanol,
ms: pesode α-colestanol añadido, en miligramos,
m: peso de la muestra tomado para la determinación, en gramos.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
6.1. ►C1Se expresa ◄el contenido de cada uno de los esteroles en mg/
100 g de materia grasa y, como «esteroles totales», su suma.
6.2. El porcentaje de cada uno de los esteroles simples es la razón entre el
área del pico correspondiente y la suma de las áreas de los picos de los
esteroles.
% del esterol X =Ax
ΣA× 1001991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 23
▼B
siendo:
Ax: área del picode x,
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 24
▼B
APÉNDICE
Determinación de la velocidad lineal del gas
Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condiciones normales,
de 1 a 3 µl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gas en recorrer
la columna, desde el momento de la inyección hasta el momento en que aparece
el pico(tM).
La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la
columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.
CuadroI
Tiempos de retención relativos de los esteroles
Pi-
coIdentificaciónTiempode retención
Columna
SE 54Columna
SE 52
1 colesterol ∆5-colesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 colestanol 5 α-colestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brasicasterol [24S]-24-metil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-metilencolesterol 24-metilen- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-metil- ∆5colesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-metil-colestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 estigmasterol [24S]-24-etil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆7-campesterol [24R]-24-metil- ∆7-colesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆ 5,23-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,23-colestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 clerosterol [24S]-24-etil- ∆ 5,25-colestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-etil- ∆5-colesten-3 β-ol 1 1
12 sitostanol 24-etil-colestan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆5-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆5-colesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆ 5,24-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆7-estigmastenol [24R,S]-24-etil- ∆ 7,24-colesten-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆7-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆7-3β-ol 1,16 1,161991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 25
▼B
Figura1
Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva bruto
1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 26
▼B
Figura2
Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva refinado
1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 27
▼B
ANEXO VI
DETERMINACIÓNDELCONTENIDOENERITRODIOLYUVAOL
INTRODUCCIÓN
El eritrodiol, entendido corrientemente como conjunto de los dioles
eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, característico
de algunos tipos de materias grasas. Su concentración es mucho más
elevada en los aceites de oliva obtenidos mediante extracción que en los
obtenidos mediante presión o en el aceite de pepita de uva y, por lo tanto,
su determinación puede servir para comprobar la existencia de aceite de
oliva obtenido mediante extracción.
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para determinar el eritro-
diol en las materias grasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se saponifica con una solución etanólica de hidróxido
potásico; a continuación se extrae el insaponificable con éter etílico y se
purifica pasándolo por una columna de alúmina.
El fraccionamiento del insaponificable se realiza mediante cromatografía
en capa fina en placa de gel de sílice y se aíslan la banda de la fracción
esterólica y la del eritrodiol.
Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la placa se transforman en
trimetilsililéteres y seguidamente se analiza la mezcla mediante cromato-
grafía de gases.
El resultado se expresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto
de eritrodiol + esteroles.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. El mismomaterial que el indicadopara el méto dodel AnexoV (Deter-
minación del contenido de esteroles).
4. REACTIVOS
4.1. Los mismos reactivos que los indicados para el método del Anexo V
(Determinación del contenido de esteroles).
4.2. Solución patrón de eritrodiol al 0,5 % en cloroformo.
5. PROCEDIMIENTO5.1.Preparacióndelinsaponificable
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.1.2 del método del Anexo
V
5.2.Separacióndeleritrodiolylosesteroles
5.2.1. Véase el apartado5.2.1 del méto dodel AnexoV.
5.2.2. Véase el apartado 5.2.2 del método mencionado.5.2.3. Preparar una solución del insaponificable al 5 % en cloroformo.
Con una microjeringa de 0,1 ml depositar 0,3 ml de esta solución en una
placa cromatográfica a aproximadamente 1,5 cm del borde inferior de la
placa, formando una banda lo más fina y uniforme posible. Depositar en
un extremo de la placa, como referencia, algunos microlitros de las solu-
ciones de colesterol y eritrodiol.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el apartado5.2.1. La temperatura ambiente debe ser de uno s 20 ºC.
Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la elución hasta
que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximadamente del borde
superior de la placa. Sacar ésta de la cubeta de desarrollo y evaporar el
disolvente en una corriente de aire caliente.
5.2.5. Pulverizar la placa uniformemente con la solución alcohólica de 2 ′,7′-
diclorofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta pueden1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 28
▼B
identificarse las bandas de los esteroles y del eritrodiol mediante compa-
ración con las referencias; delimitar las bandas con una punta ligeramente
por el exterior de los márgenes de fluorescencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en las áreas
delimitadas. Reunir el material obtenido en un matraz cónico de 50 ml;
añadir 15 ml de cloroformo caliente, agitar bien y filtrar en el embudo
de filtro poroso vertiendo el gel de sílice sobre el propio filtro. Lavar
tres veces con 10 ml de cloroformo caliente cada vez, recogiendo el
filtrado en un matraz esférico de 100 ml. Evaporar hasta obtener un
volumen de 4 a 5 ml, transvasar al tubo de centrifugado de fondo cónico
de 10 ml previamente tarado, evaporar hasta sequedad mediante calenta-
mientosuave en co rriente de nitrógenoy pesar.
5.3.Preparacióndelostrimetilsililéteres
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.3 del método del Anexo V.
5.4.Cromatografíadegases
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4 del método citado. Las
condiciones operativas de la cromatografía de gases deben cumplir los
requisitos necesarios para analizar los esteroles y, además, permitir la
separación de los TMSE del eritrodiol y del uvaol.
Una vez inyectada la muestra, dejar que se desarrolle el proceso hasta
que se produzca la elución de los esteroles presentes, el eritrodiol y el
uvaol; identificar los picos (el eritrodiol y el uvaol tienen tiempos de
retención relativos, respecto al β-sitosterol, de alrededor de 1,45 y 1,55,
respectivamente) y calcular sus áreas de la misma forma que para los
esteroles.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Eritrodiol, % =A1+A2
A1+A2+ΣAesteroles× 100
siendo:
A1: área del pico del eritrodiol,
A2: área del pico del uvaol, en milímetros cuadrados,
ΣAesteroles: suma de las áreas de los esteroles presentes.
Los resultados deben expresarse con una cifra decimal.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 29
▼B
ANEXO VII
DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS SITUADOS EN LA
POSICIÓN2DELOSTRIGLICÉRIDOSDEACEITESYGRASAS
1. OBJETO
La presente norma describe un método para la determinación de la
composición porcentual de ácidos grasos que se encuentran esterificados
en la posición 2 ►C1(opo sición interna) ◄de los triglicéridos.
2. CAMPO DE APLICACIÓN
La presente norma es aplicable a los aceites y grasas cuyo punto de fusión
se sitúa por debajo de los 45 ºC, debido a las características especiales de
la acción de la lipasa pancreática.
No es aplicable sin reservas a los aceites y grasas que contengan canti-
dades importantes de ácidos grasos con 12 átomos de carbono o menos
(aceites de coco y de palmiste, materias grasas butíricas), de ácidos grasos
altamente insaturados (con más de cuatro enlaces dobles) que tengan 20
átomos de carbono o más (aceites de pescado y de mamíferos marinos) o
de ácidos grasos que tengan grupos con funciones oxigenadas, además del
grupoácido .
3. PRINCIPIO
Neutralización de los aceites y grasas si fuera necesario. Purificación
mediante tratamiento en columna de alúmina. Hidrólisis parcial de los
triglicéridos bajo la acción de la lipasa pancreática durante un tiempo
determinado. Separación de los monoglicéridos resultantes mediante
cromatografía en capa fina y metanólisis de estos monoglicéridos. Análisis
de los ésteres metílicos mediante cromatografía gas-líquido.
4. EQUIPO
4.1. Matraz de fondo redondo de 100 ml.4.2. Matraz de fondo redondo de 25 ml con boca esmerilada.4.3. Refrigerante de aire de 1 m de longitud, adaptable al matraz 4.2.
4.4. Matraz erlenmeyer de 250 ml.
4.5. Vasode precipitado s de 50 ml.4.6. Embudode separación de 500 ml.4.7. Columna para cromatografía, de vidrio, con diámetro interior de 13 mm y
longitud de 400 mm, provista de un disco de vidrio poroso y de una llave.
4.8. Tubo de centrífuga de 10 ml con tapón de vidrio esmerilado.4.9. Bureta de 5 ml graduada en 0,05 ml.4.10. Jeringa hipodérmica de 1 ml provista de una aguja fina.4.11. Microjeringa que pueda dispensar gotas de 3-4 µl.
4.12. Aplicador para cromatografía en capa fina.
4.13. Placas de vidrio de 20 × 20 cm para cromatografía en capa fina.4.14. Cubeta de desarrollo para cromatografía en capa fina, de vidrio, provista
de una tapa de vidrioesmerilado , adecuada para las placas de 20 × 20 cm.
4.15. Pulverizador para cromatografía en capa fina.
4.16. Estufa regulada a 103 ± 2 ºC.4.17. Termostato regulable a una temperatura comprendida entre 30 y 45 ºC con
precisión de 0,5 ºC.
4.18. Evaporador rotatorio.
4.19. Vibrador eléctrico, con el que pueda agitarse vigorosamente el tubo de
centrífuga.
4.20. Lámpara ultravioleta para examinar las placas de capa fina.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 30
▼B
Para el control de la actividad lipásica:
4.21. pH-metro.
4.22. Agitador espiral.4.23. Bureta de 5 ml.4.24. Cronómetro.
Para la eventual preparación de la lipasa:
4.25. Agitador de laboratorio, adecuado para dispersar y mezclar materiales
heterogéneos.
5. REACTIVOS
5.1. n-Hexano o, en su defecto, éter de petróleo (punto de ebullición 30-50 ºC),
de calidad para cromatografía.
5.2. 2-Propanol, o etanol, 95 % (v/v) de calidad para análisis.
5.3. 2-Propanol, o etanol, solución acuosa 1/1.5.4. Éter dietílico, exento de peróxidos.5.5. Acetona.5.6. Ácido fórmico, al menos de 98 % (p/p).5.7. Solvente de desarrollo: una mezcla de n-hexano (5.1), éter dietílico (5.4) y
ácido fórmico (5.6) en las proporciones 70/30/1 (v/v/v).
5.8. Alúmina activada para cromatografía, neutra, actividad l según Brock-
mann.
5.9. Gel de sílice con aglutinante, de calidad para cromatografía en capa fina.5.10. Lipasa pancreática de calidad adecuada (véanse las notas 1 y 2).5.11. Hidróxido sódico en solución acuosa de 120 g/l.5.12. Ácido clorhídrico, solución acuosa 6 N.5.13. Solución acuosa de 220 g/l de cloruro de calcio (CaCl
2).
5.14. Solución acuosa de 1 g/l de colato sódico (de calidad enzimática).
5.15. Solución tampón: solución acuosa de tris-hidroximetil-aminometano 1 M,
ajustada a pH = 8 con ácido clorhídrico (5.12) (controlar con un potenció-
metro).
5.16. Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol al 95 % (v/v).5.17. Solución de 2 g/l de 2 ′,7′-diclorofluoresceína en etanol al 95 % (v/v);
alcalinizar ligeramente añadiendo 1 gota de solución de hidróxido sódico
1 N por 100 ml.
Para el control de la actividad lipásica:
5.18. Aceite neutralizado.5.19. Solución acuosa de hidróxido sódico 0,1 N.
5.20. Solución acuosa de 200 g/l de colato sódico (de calidad enzimática).
5.21. Solución acuosa de 100 g/l de goma arábiga.
6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al método del Anexo
II es inferior al 3 %, se efectuará directamente la purificación en columna
de alúmina como se describe en el punto 6.2.
Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al método del Anexo
II, es superior al 3 %, se efectuará una neutralización alcalina en presencia
de un solvente, como se describe en el punto 6.1, y a continuación e
realizará la purificación en columna de alúmina descrita en el punto 6.2.
6.1. Neutralización alcalina en presencia de un solvente.
Introducir en el embudo de separación (4.6) aproximadamente 10 g de
aceite crudo y añadir 100 ml de hexano (5.1), 50 ml de 2-propanol (5.2),
algunas gotas de solución de fenolftaleína (5.16) y el volumen de solución
de hidróxido sódico (5.11) correspondiente a la acidez libre del aceite más1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 31
▼B
un 0,3 % de exceso. Agitar enérgicamente durante 1 minuto, añadir 50 ml
de agua destilada, agitar de nuevoy dejar repo sar.
Una vez que se haya producido la separación, separar la capa inferior que
contiene los jabones. Separar, asimismo, todas las capas intermedias
(mucílago, materias insolubles). Lavar la solución de hexano delaceite
neutralizado con porciones sucesivas de 25-30 ml de la solución de 2-
propanol (5.3), hasta que desaparezca el color rosa de la fenolftaleína.
Eliminar la mayor parte del hexano mediante destilación en vacío en el
evaporador rotatorio (4.18); desecar el aceite en vacío a 30-40 ºC
mediante una corriente de nitrógeno puro hasta la completa eliminación
del hexano.
6.2. Purificación con alúmina.
Preparar una suspensión de 15 g de alúmina activada (5.8) en 50 ml de
hexano (5.1) y verterla en la columna cromatográfica (4.7), removiendo
al mismo tiempo. Dejar que la alúmina se asiente uniformemente y
esperar a que el nivel del solvente descienda a 1-2 mm por encima del
absorbente. Verter cuidadosamente en la columna 5 g de aceite disueltos
en 25 ml de hexano (5.1); recoger todo el eluyente de la columna en un
matraz de fondo redondo (4.1).
7. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS
Limpiar perfectamente las placas de vidrio (4.13) con etanol, éter de
petróleoy aceto na para eliminar cualquier rastrode materia grasa.
Introducir en un matraz erlenmeyer (4.4) 30 g de polvo de sílice (5.9).
Añadir 60 ml de agua destilada. Tapar y agitar enérgicamente durante 1
minuto. Transferir inmediatamente al aplicador la mezcla semifluida
(4.12) y recubrir las placas limpias con una capa de 0,25 mm de espesor.
Secar las placas al aire durante 15 minutos y a continuación en la estufa
(4.16) a 103 ± 2 ºC durante 1 hora. Antes del uso, enfriar las placas en un
desecador a temperatura ambiente. En el comercio pueden adquirirse
placas preparadas.
8. PROCEDIMIENTO
8.1. Hidrólisis con lipasa pancreática.
Pesar en el tubode centrífuga (4.8) 0,1 g apro ximadamente de la muestra
preparada; si la muestra es aceite líquido, proceder como se indica a
continuación; si es una grasa sólida, disolverla en 0,2 ml de hexano
(5.1), aplicando, si es necesario, un ligero calentamiento.
Añadir 20 mg de lipasa (5.10) y 2 ml de solución tampón (5.15). Agitar
bien, pero con cuidado, y añadir a continuación 0,5 ml de la solución de
colato sódico (5.14) y 0,2 ml de la solución de cloruro de calcio (5.13).
Cerrar el tubo con el tapón esmerilado, agitar cuidadosamente (evitando
humedecer el tapón) e introducir el tubo inmediatamente en el termostato
(4.17) a 40 ± 0,5 ºC y agitar manualmente durante 1 minutoexacto .
Sacar el tubo del termostato y agitar enérgicamente con el vibrador eléc-
trico (4.19) durante 2 minutos exactos.
Enfriar de inmediato en agua corriente; añadir 1 ml de ácido clorhídrico
(5.12) y 1 ml de éter dietílico(5.4). Tapar y mezclar enérgicamente co n el
vibrador eléctrico. Dejar en reposo y extraer la capa orgánica con la
jeringa (4.10), tras centrifugar si fuese necesario.
8.2. Separación de los monoglicéridos por cromatografía en capa fina.
Con ayuda de la microjeringa (4.11) colocar el extracto a 1,5 cm aproxi-
madamente del borde inferior de la placa cromatográfica, depositándolo
de manera que forme una línea fina, uniforme y lo más estrecha posible.
Introducir la placa en una cubeta de desarrollo (4.14) bien saturada y
desarrollar con el solvente de desarrollo (5.7) a unos 20 ºC hasta 1 cm
aproximadamente del borde superior de la placa.
Secar la placa al aire a la temperatura de la cubeta y pulverizarla con la
solución de 2 ′,7′-diclorofluoresceína (5.17). Identificar la banda de los
monoglicéridos (Rfaproximadamente 0,035) con luz ultravioleta (4.20).
8.3. Análisis de los monoglicéridos por cromatografía gas-líquido.
Raspar con una espátula la banda citada en el punto 8.2 (procurando no
raspar los componentes que permanezcan en la línea de base) y pasarla
al matraz de metilación (4.2). Tratar directamente la sílice recogida
como se indica en el Anexo X-B, de modo que los monoglicéridos se1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 32
▼B
transformen en ésteres metílicos, y, a continuación, examinar los ésteres
mediante cromatografía en fase gaseosa, como se describe en el Anexo
X-A.
9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Calcular la composición de los ácidos grasos situados en la posición y
expresar el resultado con una cifra decimal (nota 3).
10. NOTAS
Nota 1:Control de la actividad lipásica
Preparar una emulsión oleosa como sigue: agitar en un mezclador
adecuado una mezcla constituida por 165 ml de solución de goma
arábiga (5.21), 15 g de hielopicadoy 20 ml de aceite neutrali-
zado(5.18).
En un vaso de precipitados (4.5) introducir 10 ml de esta emul-
sión, 0,3 ml de solución de colato sódico (5.20) y 20 ml de agua
destilada.
Colocar el vaso en un termostato a 37 ºC ± 0,5 ºC (nota 4) e
introducir los electrodos del pH-metro (4.21) y un agitador espiral
(4.22); después, añadir gota a gota con una bureta (4.23) solución
de hidróxidosódico(5.19) hasta o btener un pH de 8,5.
Añadir una suspensión acuosa de la lipasa (véase a continuación)
en cantidad suficiente. Se mide el pH y, tan pronto como alcance
el valor de 8,3, se pone en marcha un cronómetro y se va
añadiendo la disolución de hidróxido sódico (5.19) gota a gota,
con la velocidad necesaria para mantener constante el pH de
8,3; anotar cada minuto el volumen de solución alcalina consu-
mido.
Llevar los datos obtenidos a un sistema de ejes de coordenadas,
indicando en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros
de solución alcalina necesarios para mantener constante el pH.
Deberá obtenerse una gráfica lineal.
La suspensión de lipasa mencionada es una suspensión en agua al
1/1 000 (p/p). Deberá emplearse en cada ensayouna cantidad
suficiente de esta suspensión, de modo que en 4 o 5 minutos se
consuma 1 ml de solución alcalina aproximadamente. Normal-
mente se necesitan de 1 a 5 mg de polvo.
La unidad lipásica se define como la cantidad de enzima que
libera 10 µeq de ácido por minuto. La actividad A del polvo utili-
zado, medida en unidades lipásicas por mg, se calcula medianteesta fórmula:
A¼V/C210
p
siendo:
V = volumen de solución de hidróxido sódico (5.19) consu-
midopo r minuto(calculadoa partir de la gráfica),
p = peso, en mg, de la muestras problema de polvo.
Nota 2:Preparación de la lipasa
En el comercio pueden encontrarse lipasas de actividad lipásica
satisfactoria. También es posible prepararlas en laboratorio de la
manera siguiente: tomar 5 kg de páncreas fresco de cerdo, refri-
geradoa 0 ºC; eliminar la grasa sólida y el tejidoco njuntivoque
lo rodean, y triturar en un molino de cuchillas hasta obtener una
pasta fluida. Con un agitador (4.25) agitarla pasta junto con 2,5 l
de acetona anhidra, durante 4-6 horas y después centrifugar.
Efectuar tres extracciones más del residuo con el mismo volumen
de acetona anhidra, dos extracciones con una mezcla de acetona y
éter etílico 1: 1 (V/V), y dos extracciones con éter etílico, en este
orden.
Desecar el residuo al vado durante 48 horas para obtener un
polvo estable, que debe almacenarse en un refrigerador.
Nota 3:Es aconsejable en todos los casos determinar la composición de
los ácidos grasos totales de la misma muestra, ya que la compa-
ración con la de los ácidos situados en la posición 2 facilitará la
interpretación de las cifras obtenidas.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 33
▼B
Nota 4:Por tratarse de un aceite líquido, la hidrólisis se efectúa a 37 ºC.
No obstante, en el caso de la muestra problema se efectuará a
40 ºC a fin de que puedan examinarse las grasas con puntos de
fusión de hasta 45 ºC.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 34
▼B
ANEXO VIII
DETERMINACIÓNDELPORCENTAJEDETRILINOLEÍNA
1. OBJETO
Determinación ►C1del porcentaje de trilinoleína de los aceites vegetales
mediante cromatografía líquida de alta resolución ◄.
La presente norma describe un método para efectuar la separación y deter-
minación de la composición de los triglicéridos de los aceites vegetales
según su pesomo lecular y gradode insaturación ►C1expresadopo r ◄
su número equivalente de carbonos (véase la nota 1).
2. CAMPO DE APLICACIÓN
La presente norma es aplicable a todos los aceites vegetales que contengan
triglicéridos de ácidos grasos de cadena larga. Este método es especial-
mente adecuadopara detectar la presencia de pequeñas cantidades de
aceites semisecantes (ricos en ácido linoleico) en aceites vegetales cuyo
principal ácido graso insaturado sea el ácido oleico, como es el caso de
los aceites de oliva.
3. PRINCIPIO
Separación de los triglicéridos en función de su número equivalente de
carbonos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase
inversa e interpretación de los cromatogramas.
4. APARATOS
4.1. Cromatógrafo de líquidos de alta resolución con control termostático de la
temperatura de la columna.
4.2. Sistema de inyección con un volumen de 10 µl.4.3. Detector: refractómetro diferencial. La sensibilidad en toda la escala deberá
ser como mínimo de 10
−4unidades de índice de refracción.
4.4. Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de
diámetrointerio r, rellena de partículas de sílice de 5 µm de diámetroco n
un 22-23 % de carbono en forma de octadecilsilano (nota 2).
4.5. Registrador y/o integrador.
5. REACTIVOS
Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de
elución deberán desgasificarse y podrán reciclarse varias veces sin que
elloafecte a las separacio nes.
5.1. Cloroformo.5.2. Acetona.5.3. Acetonitrilo.5.4. Fase móvil: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarán para
obtener la separación deseada; comenzar con una mezcla 50:50).
5.5. Disolvente de solubilización: acetona o mezcla de acetona-cloroformo 1:1.5.6. Triglicéridos de referencia: pueden utilizarse bien triglicéridos comerciales
(tripalmitina, trioleína, etc.), en cuyo caso se reflejarán en un gráfico los
tiempos de retención frente al número equivalente de carbonos, alternativa-
mente un cromatograma de referencia del aceite de soja (véanse las notas 3
y 4 y las figuras 1 y 2).
6. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Preparar del siguiente modo una solución al 5 % de las muestras que vayan
a analizarse: pesar 0,5 ± 0,001 g de la muestra en un matraz aforado de
10 ml y enrasar hasta 10 ml con el disolvente de solubilización (5.5).
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Instalar el sistema cromatográfico. Bombear fase móvil (5.4) a razón de
1,5 ml/mm para purgar el sistema completo. Esperar hasta que se obtenga1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 35
▼B
una línea de base estable. Inyectar 10 µl de la muestra preparada como se
indica en el punto6.
8. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Utilícese el método de normalización interna, es decir, considérese que la
suma de las áreas de los picos de los diferentes triglicéridos es igual a
100 %. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicérido mediante esta
fórmula:
% del triglicérido=área del pico
suma de las áreas de los picos× 100
El resultadose expresa co n un decimal.
Nota 1:El orden de elución puede determinarse calculando el número
equivalente de carbonos, que a menudo viene dado por la relación
NEC = NC − 2n, siendo NC el número de carbonos y n el número
de enlaces dobles; es posible calcularlo con una precisión mucho
mayor tomando en consideración el origen del enlace doble. Si
no,nlynlnson el número de enlaces dobles atribuible a los ácidos
oleico, linoleico y linolénico, respectivamente, el número equiva-
lente de carbonos puede calcularse mediante la relación siguiente:
NEC = NC − dono−dlnl−dlnnln
Los coeficientes do,dlydlnpueden calcularse mediante los triglicé-
ridos de referencia.
En las condiciones que se especifican en el presente método, la
relación que se obtenga será similar a la siguiente:
NEC = NC − [2,60 no] − [2,35 nl] − [2,17 nln]
Nota 2:Ejemplos: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333;
Lichrosphere (Merck) 100 CH 18 Art 50377 o similares.
Nota 3:Algunos triglicéridos de referencia también permiten calcular la
resolución respecto a la trioleínai:
α=T R′/TR′oleína
utilizandoel tiempode retención co rregidoTR ′= TR − TR disol-
vente.
La representación gráfica del log αfrente a f (númerode enlaces
dobles) permite determinar los valores de retención de todos los
triglicéridos de los ácidos grasos contenidos en los triglicéridos
de referencia (véase la figura 2).
Nota 4:La eficacia de la columna debe permitir separar claramente el pico
de la LLL (trilinoleína) de los triglicéridos con tiempo de reten-
ción próximo.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 36
▼B
Figura1
Cromatograma de una muestra de aceite de soja
Nota:P: ácido palmítico; St: ácido esteárico; O: ácido oleico; L: ácido
linoleico; Ln: ácido linolénico1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 37
▼B
Figura2
Representación gráfica del log alfa frente a f (número de enlaces dobles)
Nota:La: ácidolaúrico ; My: ácidomirístico ; P: ácidopalmítico ; St: ácido
esterárico; O: ácido oleico; L: ácido linoleico; Ln: ácido linolénico.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 38
▼B
ANEXO IX
PRUEBAESPECTROFOTOMÉTRICAENELULTRAVIOLETA
INTRODUCCIÓN
La prueba espectrofotométrica en el ultravioleta puede proporcionar indica-
ciones sobre la calidad de una materia grasa, su estado de conservación y
las modificaciones inducidas por los procesos tecnológicos.
Las absorciones en las longitudes de onda indicadas en el método se deben
a la presencia de sistemas diénicos y triénicos ►C1conjugados ◄.L os
valores de estas absorciones se expresan en extinción específica E1cm1%
(extinción de una solución de la materia grasa al 1 % en el disolvente
determinado, en un espesor de 1 cm) que se expresará convencionalmente
como K, también denominado coeficiente de extinción.
1. OBJETO
El método describe el procedimiento de ejecución de la prueba espectrofo-
tométrica en el ultravioleta de las materias grasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la
extinción de la solución a las longitudes de onda prescritas, respecto al
disolvente puro. A partir de los valores espectrofotométricos se calculan
las extinciones específicas.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Espectrofotómetro para medidas de extinción en el ultravioleta entre 220 y
360 nm, con posibilidad de lectura para cada unidad nanométrica.
3.2. Cubetas de cuarzo, con tapadera, con paso óptico de 1 cm. Las cubetas,
llenas de agua o de otro disolvente adecuado, no deben presentar entre ellas
diferencias superiores a 0,01 unidades de extinción.
3.3. Matraces aforados de 25 ml.3.4. Columna de cromatografía, de 540 mm de longitud y 35 mm de diámetro,
con tubo de reflujo de un diámetro aproximado de 10 mm.
4. REACTIVOS
4.1. Isooctano (2,2,4-trimetilpentano) de calidad para espectrofotometría: debe
tener, respectoal agua destilada, una transmitancia del 60 % co momínimo
a 220 nm y del 95 % como mínimo a 250 nm; o
— ciclohexano de calidad para espectrofotometría: debe tener, respecto al
agua destilada, una transmitancia del 40 % como mínimo a 220 nm y
del 95 % como mínimo a 250 nm; u
— otro disolvente adecuado, que permita obtener una disolución completa
de la materia grasa (por ejemplo, alcohol etílico para el aceite de
ricino).
4.2. Alúmina básica para cromatografía en columna, preparada y controlada
como se describe en el apéndice I.
4.3. n-Hexano para cromatografía.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. La muestra debe ser perfectamente homogénea y estar exenta de impurezas
en suspensión. Los aceites líquidos a temperatura ambiente se filtran con
papel de filtroa una temperatura apro ximada de 30 ºC, las grasas sólidas
se homogeneizan y se filtran a una temperatura superior en 10 ºC como
máximoa su temperatura de fusión.
5.2. Se pesan con precisión 0,25 g aproximadamente de la muestra preparada y
se colocan en un matraz aforado de 25 ml, se completa con el disolvente
adecuado y se homogeneiza. La solución resultante debe estar perfecta-
mente clara. Si presenta opalescencia o turbidez, se filtrará rápidamente
con papel de filtro.
5.3. Se llena una cubeta con la solución obtenida y se miden las extinciones,
usando como referencia el disolvente empleado, a las longitudes de onda
comprendidas entre 232 y 276 nm. Los valores de extinción obtenidos1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 39
▼B
deben estar comprendidos en el intervalo entre 0,1 y 0,8; en caso contrario
es necesario repetir la medida utilizando soluciones más concentradas o
más diluidas según el caso.
5.4. Cuandose quiera determinar la extinción específica después del tratamiento
con alúmina se procederá del siguiente modo: en la columna para cromato-
grafía se introducen 30 g de alúmina básica en suspensión en hexano;
después de asentarse el absorbente se elimina el exceso de hexano, hasta
1 cm aproximadamente sobre el nivel superior de la alúmina.
Se disuelven 10 g de materia grasa, homogeneizada y filtrada tal como se
describe en el punto5.1, en 100 ml de hexanoy se vierte esta so lución en
la columna. Se recoge el líquido eluido y se evapora totalmente el disol-
vente en vacíoa una temperatura inferio r a 25 ºC.
Con la materia grasa así obtenida se procede inmediatamente tal como se
indica en el punto5.2.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
6.1. Se expresan las extinciones específicas o coeficientes de extinción a las
diversas longitudes de onda, calculadas como sigue:
Kλ¼Eλ
c:e:
siendo:
Kλ= extinción específica a la longitud de onda lambda,
Eλ= extinción medida a la longitud de onda lambda,
c = concentración de la disolución en g por 100 ml,e = espesor de la cubeta en cm.
Los resultados deben expresarse con dos cifras decimales.
6.2. La prueba espectrofotométrica del aceite de oliva según el método oficial
de los Reglamentos de la CEE requiere la determinación de la extinción
específica, en solución en isooctano, a las longitudes de onda de 232 y
270 nm, y la determinación de ∆E definido como:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
donde Kmes la extinción específica a la longitud de onda m, longitud de
onda de máxima absorción alrededor de 270 nm.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 40
▼B
APÉNDICE I
Preparación de la alúmina y control de su actividad
A.1.1. Preparación de la alúmina
En un recipiente que pueda cerrarse herméticamente se echa la alúmina
previamente desecada en horno a 380-400 ºC durante tres horas, se añade
agua destilada en una proporción de 5 ml por 100 g de alúmina, se cierra
rápidamente el recipiente, se agita repetidas veces y se deja reposar
durante 12 horas como mínimo antes del uso.
A.1.2. Control de la actividad de la alúmina
Se prepara una columna para cromatografía con 30 g de alúmina. Se
opera tal como se describe en el apartado 5.4. Se hace pasar a través de
la columna una mezcla formada por:
— 95 % de aceite de oliva virgen, con extinción específica a 268 nm
menor que 0,18,
— 5 % de aceite de cacahuete tratado con tierras decolorantes en el
proceso de refinado, con una extinción específica a 268 nm mayor o
igual que 4.
Si, después del paso por la columna, la mezcla presenta una extinción
específica a 268 nm mayor que 0,11, la alúmina es aceptable; en otro
casose debe aumentar el po rcentaje de hidratación.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 41
▼B
APÉNDICE II
Ajuste del espectrofotómetro
A.2. El aparato debe revisarse periódicamente (por lo menos cada seis meses)
tanto en lo que se refiere a la conformidad de la longitud de onda como a
la exactitud de la respuesta.
A.2.1. El control de la respuesta de la longitud de onda puede hacerse mediante
una lámpara de vapor de mercurio o mediante filtros adecuados.
A.2.2. Para controlar la célula fotoeléctrica y el fotomultiplicador se procede
como sigue: se pesan 0,2 g de cromato potásico de calidad para espectro-
fotometría, se disuelven, en un matraz aforado de 1 000 ml, en una
solución de hidróxido potásico 0,05 N y se completa hasta el enrase.
De la solución obtenida se toman exactamente 25 ml, se transvasan a
un matraz aforado de 500 ml y se completa hasta el enrase con la misma
solución de hidróxido potásico.
Se mide la extinción a 275 nm de la solución así obtenida, utilizando la
solución de hidróxido potásico como referencia. La extinción medida en
cubeta de 1 cm deberá ser de 0,200 ± 0,005.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 42
▼B
ANEXO X «A»
ANÁLISISDELOSÉSTERESMETÍLICOSDELOSÁCIDOSGRASOS
MEDIANTECROMATOGRAFÍADEGASES
1. OBJETO
El presente ►C1método ◄proporciona orientaciones generales para
determinar, mediante cromatografía de gases con columna de relleno o
capilar, la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de
ésteres metílicos de ácidos grasos obtenidos con arreglo al Anexo X B.
El método no es aplicable a los ácidos grasos polimerizados.
2. REACTIVOS
2.1.Gasportador
Gas inerte (nitrógeno, helio, argón, hidrógeno, etc.), perfectamente
desecado y que contenga menos de 10 mg/kg de oxígeno.
Nota 1:El hidrógeno, que sólo se emplea como gas portador en las
columnas capilares, puede duplicar la velocidad del análisis,
pero es peligroso. Existen dispositivos de seguridad.
2.2. Gases auxiliares
2.2.1. Hidrógeno(pureza ≥99,9 %) exentode impurezas o rgánicas.
2.2.2. Aire u oxígeno, exento de impurezas orgánicas.
2.3.Patróndereferencia
Una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos puros, o los ésteres
metílicos de una grasa de composición conocida y, preferentemente,
similar a la de la materia grasa objeto de análisis.
Deberá evitarse la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.
3. APARATOS
Las normas que figuran a continuación se refieren al equipo ordinario
para cromatografía de gases, utilizando columnas de relleno y/o capi-
lares y un detector de ionización de llama. Podrá utilizarse cualquier
aparatocuya eficacia y reso lución se ajusten a lodispuestoen el punto
4.1.2.
3.1.Cromatógrafodegases
El cromatógrafo de gases constará de los siguientes elementos:
3.1.1. Sistema de inyección
Utilizar un sistema de inyección:
a) con columnas de relleno, con un espacio muerto lo más pequeño
posible (en este caso, el sistema de inyección podrá calentarse a
una temperatura que sea entre 20 y 50 ºC superior a la de la
columna); o
b) con columnas capilares; en este caso, el sistema de inyección estará
especialmente diseñado para poder operar con esa clase de
columnas; podrá utilizarse un inyector con división de flujo o un
inyector «on column».
Nota 2:En ausencia de ácidos grasos con menos de 16 átomos de
carbono, podrá utilizarse un inyector de aguja móvil.
3.1.2. Horno
El horno podrá calentar la columna a 260 ºC como mínimo y mantener
dicha temperatura con una oscilación máxima de 1 ºC, si se emplea una
columna de relleno, y de 0,1 ºC, si se emplea una columna capilar. Este
último requisito es especialmente importante si se utiliza una columna
de sílice fundida.
Se recomienda emplear en todos los casos un sistema de calentamiento
programado, sobre todo en el caso de ácidos grasos con menos de 16
átomos de carbono.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 43
▼B
3.1.3. Columna de relleno
3.1.3.1. Columna de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(es decir, vidrio o acero inoxidable) y de las dimensiones siguientes:
a) Longitud: de 1 a 3 m. Con ácidos grasos de cadena larga (más de
C20) es conveniente utilizar una columna relativamente corta. Para
el análisis de ácidos con 4 o 6 átomos de carbono se recomienda
una columna de 2 m.
b) Diámetrointerio r: de 2 a 4 mm.
Nota 3:Si hay componentes poliinsaturados con más de tres enlaces
dobles, pueden descomponerse en una columna de acero inoxi-
dable.
Nota 4:Puede utilizarse un sistema con doble columna de relleno.
3.1.3.2. Relleno, que incluya los siguientes elementos:
a)Soporte: tierra de diatomeas lavada con ácido y silanizada, u otro
soporte inerte adecuado, con un margen estrecho de tamaño de
grano(margen de 25 µm, entre 125 y 200 µm); el tamañomedio
de grano estará en función del diámetro interior y de la longitud de
la columna.
b)Fase estacionaria: líquido polar de tipo poliéster (por ejemplo: poli-
succinato de dietilenglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato
de etilenglicol, etc.), cianosiliconas o cualquier otro líquido que
permita efectuar la separación cromatográfica exigida (véase el
punto 4). La fase estacionalia deberá constituir del 5 % (m/m) al
20 % (m/m) del relleno. Para algunas separaciones podrá utilizarse
una fase fija nopo lar.
3.1.3.3. Acondicionamiento de la columna
Estando la columna desconectada del detector, si es posible, calentar el
horno gradualmente hasta 185 ºC y hacer pasar a través de la columna
recién preparada una corriente de gas inerte a razón de 20-60 ml/min
durante 16 horas como mínimo a la temparatura citada y, a continua-
ción, a la temperatura de 195 ºC durante 2 horas más.
3.1.4. Columna capilar3.1.4.1. Tubode un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(generalmente, vidrioosílice fundida). El diámetrointerio r estará
comprendido entre 0,2 y 0,8 mm. La superficie interior se someterá a
un tratamiento adecuado (por ejemplo, preparación de la superficie,
inactivación) antes de introducir el recubrimiento de fase fija. En la
mayoría de casos, es suficiente una longitud de ►
C125 m◄.
3.1.4.2. Fase estacionaria de tipo poliglicol [poli(etilenglicol) 20000], poliéster
(polisuccinato de butanodiol) o polisiloxano polar (cianosiliconas),generalmente. Son apropiadas las columnas de fase químicamente
ligada.
Nota 5:Existe el riesgo de que los polisiloxanos polares dificulten la
identificación y separación del ácido linolénico y de los ácidos
C
20.
El espesor de la fase estará comprendido entre 0,1 y 0,2 µm.
3.1.4.3. Montaje y acondicionamiento de la columna.
Observar las precauciones normales de montaje de columnas capilares
(es decir, instalación de la columna en el horno, elección y montaje de
las juntas (estanqueidad), conexión de los extremos de la columna al
inyector y al detector (reducción de los espacios muertos). Colocar la
columna bajo un flujo de gas portador [por ejemplo, 0,3 bar (30 kPa)
para una columna de ►C125 m◄de longitud y 0,3 mm de diámetro
interior].
Acondicionar la columna programando el gradiente de temperatura del
horno a 3 ºC/min a partir de la temperatura ambiente hasta alcanzar una
temperatura 10 ºC inferior al límite de descomposición de la fase esta-
cionaria. Mantener el horno a esa temperatura durante 1 hora hasta que
se estabilice la línea de base. Restablecer la temperatura de 180 ºC para
trabajar en condiciones isotérmicas.
Nota 6:En el comercio pueden obtenerse columnas adecuadas previa-
mente acondicionadas.
3.1.5. Detector que puede calentarse a una temperatura superior a la de la
columna.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 44
▼B
3.2.Jeringa
Tendrá una capacidad máxima de 10 µl y estará graduada en 0,1 µl.
3.3.Registrador
Si se emplea la curva del registrador para calcular la composición de la
mezcla analizada, se necesita un registrador electrónico de alta preci-
sión compatible con los aparatos utilizados. El registrador deberá tener
las siguientes características:
a) tiempo de repuesta inferior a 1,5 s y, preferiblemente, inferior a 1 s
(el tiempode repuesta es el tiempoque tarda la pluma registrado ra
en pasar de 0 a 90 % después de la introducción instantánea de una
señal del 100 %);
b) ancho del papel: 20 cm como mínimo;
c) velocidad del papel: ajustable a valores comprendidos entre 0,4 cm/
min y 2,5 cm/min.
3.4.Integrador
La utilización de un integrador electrónico permite efectuar cálculos
rápidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibi-
lidad adecuada y la corrección de la desviación de la línea de base
debe ser satisfactoria.
4. PROCEDIMIENTO
Las operaciones descritas en los puntos 4.1 a 4.3 sólo son válidas si se
emplea un detector de ionización de llama.
Como alternativa puede emplearse un cromatógrafo de gases con cata-
rómetro (cuyo funcionamiento se basa en el principio de los cambios de
conductividad térmica). En ese caso, las condiciones de ensayo deberán
modificarse como se indica en el punto 6.
4.1.Condicionesdeensayo
4.1.1. Determinación de las condiciones operativas óptimas
4.1.1.1. Columna de relleno
Al establecer las condiciones de ensayo deberán tenerse en cuenta las
variables siguientes:
a) longitud y diámetro de la columna;
b) composición y cantidad de la fase estacionaria;
c) temperatura de la columna;
d) flujo del gas portador;
e) resolución exigida;
f) tamaño de la muestra problema, determinado de modo que el
conjunto del detector y el electrómetro dé una respuesta lineal;
g) duración del análisis.
Como norma general, las cifras de las tablas 1 y 2 permitirán obtener
los resultados deseados, es decir, al menos 2 000 platos teóricos por
metro de longitud de columna en el caso del estearato de metilo, y su
elución en 15 minutos aproximadamente.
Cuandoel aparatolopermita, la temperatura del inyecto r deberá ser de
200 ºC aproximadamente y la del detector deberá ser igual o superior a
la de la columna.
Por lo general, la razón entre la velocidad de flujo del hidrógeno sumi-
nistrado al detector de ionización de llama y la del gas portador oscila
entre 1:2 y 1:1, en función del diámetrode la co lumna. El flujodel
oxígeno es de 5 a 10 veces superior al del hidrógeno.
Tabla 1
Diámetro interior de la columna
mmFlujo del gas portador
ml/min
21 5 a 2 5
32 0 a 4 0
44 0 a 6 01991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 45
▼B
Tabla 2
Concentración de la fase fija
% (m/m)Temperatura de la columna
ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Columna capilar
Las propiedades de eficacia y permeabilidad de las columnas capilares
implican que la separación de los constituyentes y la duración del
análisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la
columna. Por lo tanto, para optimizar las condiciones operativas será
necesario manipular este parámetro (o, lo que es más sencillo, la
presión en cabeza de columna) según se desee mejorar las separaciones
oefectuar un análisis rápido .
4.1.2. Determinación del número de platos teóricos (eficacia) y de la resolu-
ción
(Véase la figura 1)
Efectuar el análisis de una mezcla de estearatode metiloy de o leatode
metilo (por ejemplo, ésteres metílicos de manteca de cacao) en propor-
ciones aproximadamente equivalentes.
Escoger la temperatura de la columna y el flujo del gas portador de
manera que el máximodel picodel estearatode metilose registre apro -
ximadamente 15 minutos después del pico del disolvente. Utilizar una
cantidad suficiente de la mezcla de ésteres metílicos, de manera que el
pico del estearato de metilo se eleve a tres cuartos aproximadamente de
la escala completa.
Calcular el número «n» de platos teóricos (eficacia) mediante la
siguiente fórmula:
n¼16dr1
a1/C20/C21
2
y la resolución «R» mediante la siguiente fórmula:
R¼2∆
a1þa2
siendo:
dr1= distancia en mm, desde el inicio del cromatograma hasta el
máximodel picodel estearatode metilo ,
a1ya2= anchura, en mm, de los picos del estearato de metilo y del
oleato de metilo, respectivamente, medida entre los puntos
de intersección de las tangentes en los puntos de inflexión
de la curva con la línea de base,
∆ = distancia, en mm, entre los dos máximos de los picos del
estearato de metilo y del oleato de metilo,
y el índice de resolución «lr» mediante la siguiente fórmula:
a
b
siendo:
a = altura del picomás pequeño , medida a partir de la línea de base;
b = altura del punto más bajo del valle comprendido entre los dos
picos adyacentes, medida a partir de la línea de base.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 46
▼M2
▼B
Figura1
Cromatograma para determinar el número de platos teóricos (eficacia) y la reso-
lución
Se establecerán unas condiciones de análisis que permitan obtener almenos 2 000 platos teóricos por metro de longitud de columna para el
estearato de metilo y una resolución de 1,25 como mínimo.
4.2.Muestraproblema
Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 µl a 2 µl de la solución de ésteres
metílicos preparados con arreglo al Anexo X B e inyectarlos en la
columna.
En el caso de ésteres no disueltos, preparar una solución de 100 mg/ml
aproximadamente en heptano de calidad para cromatografía e inyectar
de 0,1 µl a 1 µl de esta solución.
Si sólo se desean detectar los componentes presentes en cantidades muy
pequeñas, se podrá aumentar el tamaño de la muestra (hasta 10 veces).
4.3.Análisis
Como norma general, las condiciones de ensayo son las que se especi-
fican en el punto4.1.1.
No obstante, cuando se determinan ácidos con menos de 12 átomos de
carbono es posible operar a menor temperatura de columna, mientras
que cuando se determinan ácidos grasos con más de 20 átomos de
carbono es posible operar a una temperatura mayor. A veces se puede
utilizar en los dos casos anteriores un sistema de programación de
temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene ésteres metílicos de
ácidos grasos con menos de 12 átomos de carbono, inyectar la muestra
a 100 ºC (oa 50 — 60 ºC si hay ácidobutírico ) y elevar inmediata-
mente la temperatura a razón de 4 — 8 ºC/min hasta alcanzar el nivel
deseado. En algunos casos es posible combinar ambos procedimientos.
Tras el calentamiento programado, se continúa la elución a temperatura
constante hasta que todos los componentes se hayen eluido. Si el instru-
mento no puede efectuar un calentamiento programado, se opera a dos
temperaturas fijas comprendidas entre 100 y 195 ºC.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 47
▼B
Si es necesario, se recomienda que se efectúe un análisis con dos fases
fijas de diferente polaridad para comprobar la ausencia de picos
«ocultos», por ejemplo en caso de presencia simultánea de C18:3yC20:0oC18:3yC18:2conjugados.
4.4.Preparacióndelcromatogramaylasgráficasdereferencia
Analizar la mezcla patrón de referencia (2.3) aplicandolas mismas
condiciones de ensayo que a la muestra y medir los tiempos o las
distancias de retención de los ácidos grasos que la componen. Repre-
sentar gráficamente en papel semilogarítmico, para cualquier grado de
insaturación, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retención en
función del número de átomos de carbono. En condiciones isotérmicas,
las gráficas de los ésteres de cadena lineal con el mismo grado de insa-
turación deben formar líneas rectas. Dichas líneas rectas deben ser
aproximadamente paralelas.
Deben evitarse las condiciones que propicien la existencia de «picos
ocultos», es decir, una resolución insuficiente para separar dos compo-
nentes.
5. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
5.1.Análisiscualitativo
Identificar los picos del estearato de metilo de la muestra a partir de los
gráficos citados en el punto 4.4, si es necesario por interpolación.
5.2.Análisiscuantitativo
5.2.1. Determinación de la composición
Salvo en casos excepcionales, utilizar el método de normalización
interna, es decir, partir del principio de que todos los componentes de
la muestra están representados en el cromatograma, de manera que eltotal de las áreas situadas debajo de cado pico representa el 100 % de
los constituyentes (elución total).
Si el equipo incluye un integrador, utilizar las cifras que éste propor-
cione. En caso contrario, determinar el área situada debajo de cada
picomultiplicandola altura del picopo r el anchoa la mitad de la altura
y, cuando sea necesario, tomar en consideración las atenuaciones utili-
zadas durante el registro.
5.2.2. Método de cálculo
5.2.2.1. Casogeneral
Calcular el contenido de un componente dado (i) (expresado como
porcentaje en masa de ésteres metílicos), mediante la determinación
del porcentaje que representa el área de su pico en relación con la
suma de las áreas de todos los picos, aplicando la fórmula siguiente:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i.
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.
Expresar el resultadoco n una cifra decimal.
Nota 7:En este casogeneral se co nsidera que el resultadodel cálculo
basado en las áreas relativas representa el porcentaje en peso.
Para los casos en que no es válida esta consideración, véase el
punto5.2.2.2.
5.2.2.2. Utilización de factores de corrección
En algunos casos, por ejemplo en presencia de ácidos grasos con menos
de 8 átomos de carbono o de ácidos con grupos secundarios, si se
utilizan detectores de conductividad térmica o si es necesario alcanzar
mayor nivel de exactitud, deben aplicarse factores de corrección para
convertir los porcentajes de las áreas de los picos en porcentajes en
peso de los componentes.
Determinar los factores de corrección con un cromatograma obtenido
del análisis de una mezcla de referencia de ésteres metílicos de compo-1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 48
▼B
sición conocida en condiciones de ensayo idénticas a las empleadas
para el análisis de la muestra.
La fórmula que se aplicará a la muestra de referencia para obtener el
porcentaje en peso del componente i es la siguiente:
mi
Σm/C2100
siendo:
mi= peso del componente i de la muestra de referencia,
Σm = suma de los pesos de los diversos componentes de la muestra
de referencia.
A partir del cromatograma de la muestra de referencia (4.4) calcular el
porcentaje (área/área) del componente i del siguiente modo:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i,
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.
El factor de corrección se calcula del siguiente modo:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Por lo general, los factores de corrección se expresan con relación a
KC16, de modo que los factores relativos se convierten en lo siguiente:
K0
i¼Ki
KC16
En la muestra, el contenido de cada componente i, expresado como
porcentaje en peso de los ésteres metílicos, es el siguiente:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Expresar los resultados con una cifra decimal.
5.2.2.3. Utilización de patrón interno
En algunos análisis (por ejemplo, cuando no se cuantifican todos los
ácidos grasos por estar presentes simultáneamente ácidos de 4 y 6
átomos de carbono y ácidos de 16 y 18 átomos de carbono, o cuando
es necesariodeterminar la cantidad abso luta de un ácidograsoen la
muestra) es preciso utilizar un patrón interno. Se emplean con
frecuencia ácidos grasos de 5, 15 o 17 átomos de carbono. Debe deter-
minarse, si es necesario, el factor de corrección del patrón interno.
El porcentaje en peso del componente i, expresado como ésteres
metílicos, se calcula mediante esta fórmula:
mp/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
p/C2Ap/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i.
Ap: área del pico correspondiente al patrón interno.
K′i: factor de corrección del componente i (con relación a KC16).
K′p: factor de corrección del patrón interno (con relación a KC16).
m: peso, en mg, de la muestra.
mp: peso, en mg, del patrón interno.
Expresar los resultados con una cifra decimal.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 49
▼M2
6. CASO ESPECIAL DE DETERMINACIÓN DE LOS ISÓMEROS
TRANS
Es posible determinar el contenido de isómeros trans de los ácidos
grasos con un número de átomos de carbono comprendido entre 10 y
24 por separación de los ésteres metílicos, utilizando columnas croma-
tográficas capilares con una polaridad especial.
6.1. Columna capilar de silicio de un diámetro interno comprendido entre
0,25 mm y 0,32 mm y de 50 m de longitud, recubierta de una capa de
cianopropisilicona de un espesor comprendido entre 0,1 y 0,3 µm (tipo
SP 2340, tipoSP 2380, C.P. sil 88, Silo r 10 osimilar).
6.2. Los ésteres metílicos se preparan según el procedimiento B descrito en
el Anexo X «B». Las materias grasas con una acidez libre superior al
3 % deben neutralizarse previamente con arreglo al punto 6.1 del
AnexoVII.
6.3. Las condiciones generales de trabajo para la cromatografía en fase
gaseosa son las siguientes:
— temperatura de la columna programada de 150º a 230 ºC (por
ejemplo, 165 ºC durante 15 minutos y a continuación un aumento
de 5 ºC por minuto hasta alcanzar 200 ºC),
— temperatura del inyector: 250 ºC si se utiliza el sistema de inyector
divisor o la temperatura inicial de la columna si se emplea el
sistema «on column»,
— temperatura del detector: 260 ºC,— flujo del gas vector (helio e hidrógeno): 1,2 ml/minuto.
La cantidad inyectada debe ser tal que, en las condiciones de sensibi-
lidad empleadas, la altura del pico correspondiente al éster metílico
del ácido araquídico sea igual o superior al 20 % del fondo de escala.
6.4. La identificación de los diversos ésteres metílicos se efectúa compa-
rando los tiempos de retención con los de las mezclas de referencia
(tal y como se indica en el punto 2.3).
Los ésteres de los ácidos grasos trans son eluidos antes que los
isómeros cis correspondientes. En la figura 2 se presenta un ejemplo
de cromatograma.
Figura2
Cromatograma de gases tipo relativo a la determinación de los isómeros trans de
los ácidos grasos con columna capilar
6.5. La eficacia de la columna determinada con arreglo al punto 4.1.2
deberá permitir una separación, con un índice de resolución superior a
2, de determinadas parejas críticas, como la formada por el grupo de los
ácidos transisoleicos y el pico del ácido oleico (trans C18:1/cis C18:1).1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 50
▼M2
6.6. La proporción de los diversos ácidos grasos trans se calcula estable-
ciendo la relación entre la superficie del pico correspondiente y la
suma de las superficies de todos los picos presentes.
Se toman en consideración los porcentajes de los ácidos:
— trans octadecenoicos (T 18:1), que en el Anexo I del presente
Reglamento figuran como tal de isómeros transoleicos,
— cis-trans y trans-cis octadecadienoicos [(CT/TC) 8:2], que en el
Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de isómeros
translinoleicos,
— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis octadecatrie-
noicos [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], que en el Anexo I del
presente Reglamento figuran como total de isómeros translinolé-
nicos.
Nota 8:Teniendoen cuenta las características particulares de este
método, los resultados deben darse con dos decimales.
►M27.◄CASO ESPECIAL DE UTILIZACIÓN DE UN CATARÓMETRO
(FUNCIONAMIENTO BASADO EN EL PRINCIPIO DE LOS
CAMBIOS DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA)
Para la determinación de la composición cualitativa y cuantitativa de
una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos también podrá utili-
zarse un cromatógrafo de gases provisto de un detector cuyo
funcionamiento se base en el principio de los cambios de conductividad
térmica (catarómetro). En ese caso, las condiciones establecidas en los
puntos3 y 4 deberán modificarse como se indica en la tabla 3.
Para el análisis cuantitativo, utilizar los factores de corrección definidos
en el punto5.2.2.2.
Tabla 3
Variable Valor/condición
Columna Longitud: 2 a 4 m
Diámetrointerio r: 4 mm
Soporte Tamaño de grano entre 160 y
200 µm
Concentración de la fase estacio-
nariaDe 15 % a 25 % (m/m)
Gas portador Helio o, en su defecto, hidrógeno,
con el menor contenido de
oxígeno posible
Gases auxiliares Ninguno
Temperatura del inyector De 40 a 60 ºC más que la de la
columna
Temperatura de la columna De 180 a 200 ºC
Flujo del gas portador Normalmente entre 60 y 80 ml/
min
Tamañode la muestra pro blema
inyectadaNormalmente entre 0,5 y 2 µl
►M28.◄INFORME DEL ANÁLISIS
En el informe del análisis se expondrán los métodos utilizados para la
preparación de los ésteres metílicos y para la realización del análisis
mediante cromatografía de gases, así como los resultados obtenidos.
Se mencionarán, asimismo, cualesquiera procedimientos de trabajo que
no se especifiquen en la presente norma internacional o que se consi-
deren facultativos, así como toda circunstancia que pueda haber
influido en los resultados.
El informe del análisis incluirá todos los datos necesarios para la
completa identificación de la muestra.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 51
▼B
▼B
ANEXO X «B»
PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS
GRASOSDECONFORMIDADCONLOSPUNTOSIYIIDELANEXO
VIDELREGLAMENTO(CEE)No72/77OSEGÚNELMÉTODOQUE
SEDESCRIBEACONTINUACIÓN
INTRODUCCIÓN
La elección del procedimiento a utilizar deberá hacerse en función de la
composición de los ácidos y de la acidez de la materia grasa que haya
que examinar y del análisis mediante cromatografía de gases que deba
efectuarse.
En particular:
— cuando se trate de materias grasas que contengan ácidos grasos inferior
aC12, sólo podrán utilizarse los procedimientos en tubo cerrado ►C1o
con sulfato dimetílico ◄,
— cuando se trate de materias grasas con una acidez superior al 3 %, sólo
podrán utilizarse los procedimientos con mezcla de metanol y ácido
clorhídrico o con sulfato dimetílico,
— en la determinación mediante cromatografía de gases de los isómeros
trans, sólo podrán utilizarse los procedimientos con metilato sódico o
con sulfato dimetílico,
— el procedimiento con mezcla de metanol, hexano y ácido sulfúrico
deberá utilizarse en la preparación de los ésteres metílicos de pequeñas
cantidades de materias grasas por separación mediante cromatografía en
capa fina.
Nose tendrá en cuenta el insapo nificable cuandonosupere el 3 %; en caso
contrario, los ésteres metílicos deberán prepararse a partir de los ácidos
grasos.
1. OBJETO
A continuación se describen cinco procedimientos para la preparación de
los ésteres metílicos de las materias grasas:
a) con metilato sódico;
b) con metilato sódico en tubo cerrado;
c) con mezcla de metanol y ácido clorhídrico en tubo cerrado;
d) con sulfato dimetílico;
e) con mezcla de metanol, hexano y ácido sulfúrico.
ProcedimientoA
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se calienta a reflujo con alcohol
metílico y metilato sódico. Los ésteres metílicos que se obtengan se extraen
con éter etílico.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Matraz redondo de 100 ml con refrigerante de reflujo, provisto en su extre-
midad superior de un tubo para cal sódica, con junta esmerilada.
3.2. Probetas de 50 ml.
3.3. Pipeta de 5 ml graduada en divisiones de 0,1 ml.
3.4. Embudos de separación de 250 ml.3.5. Matraz redondo de 200 ml.
4. REACTIVOS
4.1. Metanol anhidro.
4.2. Solución de metilato sódico en metanol al 1 % aproximadamente. Se
prepara disolviendo 0,34 g de sodio metal en 100 ml de metanol anhidro.
4.3. Éter etílico.4.4. Solución de cloruro sódico al 10 %.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 52
▼B
4.5. Éter de petróleo40 º—60 ºC.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el matraz de 100 ml 2 g de grasa previamente deshidratada en
sulfato sódico y filtrada. Añadir 35 ml de metanol, acoplar el refrigerante y
llevar a ebullición manteniéndola a reflujo durante algunos minutos.
5.2. Interrumpir el calentamiento, separar el refrigerante y añadir rápidamente
3,5 ml de la solución de metilato sódico; acoplar nuevamente el refrige-
rante y hervir a reflujo durante 3 horas como mínimo. La metilación se
habrá completado cuando toda la materia grasa se haya disuelto y la mezcla
de reacción esté perfectamente transparente a temperatura ambiente.
5.3. Enfriar y verter la mezcla de reacción en una ampolla de separación de
250 ml, añadir 35 o40 ml de éter etílico , 100 ml de agua y 5 o6 ml de
la solución de cloruro sódico al 10 %. Agitar y esperar a que se produzca la
separación de las capas; transferir la fase acuosa a una segunda ampolla de
separación y extraerla de nuevo con 25 ml de éter etílico.
Añadir a los extractos etéreos reunidos 50 ml de éter de petróleo
40 º—60 ºC, lo que provocará la separación del agua que debe eliminarse.
Lavar la fase etérea tres veces con 10 o 15 ml de agua cada vez, desecar
sobre sulfato sódico y pasar filtrando a través de papel a un matraz redondo
de 200 ml.
Concentrar la solución al baño María hasta unos 20 ml mientras se hace
pasar una corriente de nitrógeno puro.
ProcedimientoB
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis es tratada con metilato sódico en solu-
ción metanólica, en recipiente cerrado, a 85 º—90 ºC.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Tubode vidriode paredes gruesas, de uno s 5 ml (altura: 40—45 mm,
diámetro: 14—16 mm).
3.2. Pipeta de 1 ml graduada en divisiones de 0,1 ml.
4. REACTIVOS
4.1. Solución de metilato sódico en metanol al 1,5 % aproximadamente. Se
prepara disolviendo 0,50 g de sodio metal en 100 ml de metanol anhidro.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de vidrio 2 g de materia grasa previamente deshidra-
tada en sulfato sódico y filtrada. Añadir 0,3 g (unos 0,4 ml) de la solución
de metilatosódicoy cerrar el tuboa la llama.
5.2. Mantener el tubo durante dos horas al baño María a una temperatura entre
85 º y 90 ºC agitándolo de vez en cuando. La esterificación se habrá conse-
guidocuandose vuelva transparente el co ntenidodel frascotras la
sedimentación de la glicerina y de los residuos de los reactivos.
5.3. Enfriar a temperatura ambiente. Abrir el tubocuandose vayan a utilizar lo s
ésteres metílicos. Éstos no necesitan de ninguna otra manipulación antes de
ser analizados.
ProcedimientoC
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis es tratada con una mezcla de metanol y
ácido clorhídrico, en tubo cerrado, a 100 ºC.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Tubode vidriode paredes gruesas, de uno s 5 ml (altura: 40—45 mm,
diámetro: 14—16 mm).
3.2. Pipetas aforadas de 1 y 2 ml.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 53
▼B
4. REACTIVOS
4.1. Solución de ácido clorhídrico en metanol al 2 %. Se prepara con ácido
clorhídrico gaseoso y metanol anhidro (nota 1).
4.2. Hexano de calidad adecuada para cromatografía.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de vidrio 0,2 g de materia grasa, previamente deshi-
dratada en sulfatosódicoy filtrada, y 2 ml de la so lución de ácido
clorhídrico en metanol. Cerrar el tubo a la llama.
5.2. Mantener el tubodurante 40 minuto s al bañoMaría a 100 ºC.
5.3. Enfriar el tubo en agua corriente, abrirlo, añadir 2 ml de agua destilada y
1 ml de hexano. Centrifugar y extraer la fase del hexano que estará lista
para ser utilizada.
ProcedimientoD
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se saponifica con una solución en
alcohol metílico de hidróxido potásico, y después se trata con sulfato
dimetílico. Tras añadir ácido clorhídrico, los ésteres metílicos formados se
separan espontáneamente. Mediante el tratamiento posterior con alúmina,
se obtienen ésteres metílicos de elevada pureza.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Tubode ensayode vidriode paredes gruesas, de 20 ml apro ximadamente
de capacidad, con tapón esmerilado 10/19 y enganches de seguridad.
3.2. Refrigerante de reflujo de cinco ampollas con junta esmerilada 10/19.
3.3. Filtros de vidrio de fondo poroso, de graduación G 2 y diámetro de 20 mm.
3.4. Tubos de ensayo de vidrio de fondo cónico, de unos 10 ml de capacidad.
3.5. Jeringas de 1y5m l .
4. REACTIVOS
4.1. Solución al 10 % de hidróxido potásico en alcohol metílico de calidad
adecuada para cromatografía.
4.2. Solución al 0,05 % del indicador verde de bromocresol en alcohol metílico.
4.3. Sulfatodimetílico(d = 1,335 a 15 ºC).
4.4. Ácido clorhídrico concentrado (d = 1,19) diluido 1:1 con alcohol metílico
de calidad cromatográfica.
4.5. Óxido de aluminio normalizado según el método Brockmann para cromato-
grafía de adsorción.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de ensayo de 20 ml unos 2,2 ml de materia grasa
previamente deshidratada en sulfatosódicoy filtrada; añadir 5 ml de la
solución de hidróxido potásico y algunos granos de piedra pómez para
regular la ebullición. Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar agitando
sobre llama pequeña durante 5 minutos. Para que la saponificación sea
completa, la solución deberá volverse transparente. Por último, enfriar en
agua corriente y separar el refrigerante.
5.2. Añadir dos gotas del indicador y, lentamente, con la ayuda de una jeringa,
1 ml de sulfatodimetílico . Cerrar herméticamente el tubode ensayoy
agitar durante dos o tres minutos, introduciendo con frecuencia el fondo
del tubo en agua hirviendo: la reacción será completa cuando el indicador
pase del azul al amarillo. Al final, enfriar el tubo en agua corriente, abrirlo
y añadir 5 ml de la solución metanólica de ácido clorhídrico.
5.3. Tras agitar durante unos segundos, inclinar el tubo y darle ligeras sacudidas
que faciliten la aparición de los ésteres metílicos en forma de masa oleosa
(nota A).
Retirar los ésteres metílicos con una jeringa, introducirlos en un tubo de
fondo cónico, añadir un volumen de alúmina equivalente a un cuarto del
volumen de los ésteres metílicos, agitar y filtrar con papel de filtro.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 54
▼B
Nota A:En caso de que no se produzca espontáneamente la separación de
los ésteres metílicos, añadir al tubo 5 ml de agua y agitar.
ProcedimientoE
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se calienta a reflujo con metanol,
hexano y ácido sulfúrico. Los ésteres metílicos que se obtengan seextraerán con éter de petróleo.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Tubo de ensayo de unos 20 ml de capacidad, con refrigerante de reflujo de
aire, de 1 m aproximadamente de longitud, con junta esmerilada.
3.2. Pipeta aforada 5 ml.
3.3. Ampolla de separación de 50 ml.3.4. Probetas de 10 y 25 ml.
3.5. Tubode fo ndocónicode 15 ml.
4. REACTIVOS
4.1. Reactivo de metilación: metanol anhidro, hexano y ácido sulfúrico concen-
trado (d = 1,84) en la seguiente proporción: 75:25:1 (V/V/V).
4.2. Éter de petróleo40—60 ºC.4.3. Sulfatosódicoanhidro .
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de 20 ml el material recuperado de la placa y añadir
5 ml de reactivode metilación.
5.2. Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar al baño María en ebullición
durante 30 minutos (nota 2).
5.3. Transferir cuantitativamente la mezcla a una ampolla de separación de
50 ml con la ayuda de 10 ml de agua destilada y 10 ml de éter de petróleo.
Agitar enérgicamente y esperar a que se produzca la separación de las
fases, extraer la capa acuosa y lavar la capa etérea dos veces con 20 ml
de agua destilada. Añadir a la ampolla de separación una pequeña cantidad
de sulfato sódico anhidro, agitar, dejar reposar unos minutos y pasar
filtrandoa un tubode fo ndocónicode 15 ml.
Evaporar el disolvente al baño María haciendo pasar una corriente de nitró-
geno.
Nota 1:En el laboratorio pueden prepararse fácilmente pequeñas canti-
dades de ácido clorhídrico gaseoso por simple desplazamiento de
la solución comercial ( ρ= 1,18), añadiendoalgunas go tas de
ácidosulfúricoco ncentrado( ρ= 1,84). El gas liberadose deseca
fácilmente por borboteo a través de ácido sulfúrico concentrado.
Dado que el ácido clorhídrico es absorbido por el metanol con
mucha rapidez, se aconseja que se adopten las precauciones nece-
sarias al disolverlo (es decir, introducir el gas a través de un
embudo pequeño invertido cuyo borde roce la superficie del
líquido). Pueden prepararse con antelación cantidades grandes de
solución metanólica de ácido clorhídrico, ya que se conserva en
perfectas condiciones en la oscuridad dentro de botellas con
tapones de vidrio.
Nota 2:Para controlar la ebullición, introducir una varita de vidrio en el
tuboy limitar la temperatura del bañoMaría a 90 ºC.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 55
▼B
ANEXO XI
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ►C1 DISOLVENTES ◄
HALOGENADOSVOLÁTILESENELACEITEDEOLIVA
1. PRINCIPIO DEL MÉTODO
Análisis por cromatografía en fase gaseosa según la técnica del espacio de
cabeza(head space) .
2. EQUIPO
2.1. Cromatografía de gases con detector de captura de electrones (ECD).
2.2. Equipopara espaciode cabeza (head space) .
2.3. Columna de cromatografía en fase gaseosa de vidrio de 2 metros de largo y
2 mm de diámetro, fase estacionaria.
OV 101 al 10 % impregnado en cromosorb W-AW-DMCS (tierra de diato-
meas calcinada lavada con ácido y silanizado (80—100 Mesh).
2.4. Gas portador y gas auxiliar: nitrógeno para cromatografía de gases de
pureza adecuada para la detección por captura de electrones.
2.5. Frascos de cristal de 10 a 15 ml provistos de septum de teflón y con una
cápsula de aluminio con un orificio para toma de muestras con jeringa.
2.6. Pinzas capsuladora para cerrar herméticamente.2.7. Jeringa para gases de 0,5 y 2 ml.
3. REACTIVOS
►
C1Disolventes ◄halogenados con una pureza apropiada para su uso
en cromatografía en la fase gaseosa.
4. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
4.1. Pesar con exactitud unos 3 g de aceite en un frasco de cristal (no reutili-
zable), tapar el frascode manera que quede cerradoherméticamente.
Introducir el frasco en un baño con termostato a 70 ºC durante 1 hora.
Extraer con precisión, por medio de una jeringa, un volumen de 0,2 a
0,5 ml del espacio de cabeza. Inyectarlo en la columna del cromatógrafo
de gases con las siguientes condiciones:
temperatura inyector: 150 ºC
temperatura columna: 70—80 ºC
temperatura detector: 200—250 ºC
Podrán utilizarse otras temperaturas siempre que los resultados sean equiva-
lentes.
La inyección se puede realizar con el equipo para espacio de cabeza.
4.2. Soluciones de referencia. Preparar soluciones patrón utilizando aceite de
oliva refinado sin trazas de ►C1disolventes ◄con concentraciones en
hidrocarburos halogenados de 0,05 a 1 ppm (mg/kg) según el contenido
supuestode la muestra. Para preparar la so lución de referencia, si es nece-
sario diluir previamente el hidrocarburo halogenado patrón, puede utilizarse
pentano.
4.3. Cuantificación. Se efectúa por cálculo mediante la relación de áreas o
alturas del pico de la muestra y de la solución patrón cuya concentración
sea la más próxima a la de la muestra. Si la desviación es superior al
10 %, será necesario volver a hacer el análisis, comparándolo con una
nueva solución patrón de concentración tal que se ajuste a la desviación
relativa antes mencionada. El contenido se establecerá efectuando la media
de varias inyecciones.
4.4. Expresión de los resultados. Los resultados se expresarán en ppm (mg/kg).
El límite de detección del método es de 0,01 mg/kg.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 56
▼B
ANEXO XII
VALORACIÓNORGANOLÉPTICADELACEITEDEOLIVAVIRGEN
1. OBJETO
El presente método tiene por finalidad establecer los criterios necesarios
para valorar las características del flavor del aceite de oliva virgen y
desarrollar la sistemática necesaria.
2. CAMPO DE APLICACIÓN
El método que se describe sólo es aplicable a la valoración y clasifica-
ción organoléptica del aceite de oliva virgen utilizable para consumo
directo. Se limita a clasificar el aceite virgen en una escala numérica,
relacionada con la percepción de los estímulos de su flavor, según el
juicio de un grupo de catadores seleccionados constituidos en panel.
3. ANÁLISIS SENSORIAL: VOCABULARIO GENERAL BÁSICO
Véase el capítulo «Análisis sensorial: vocabulario general básico».
4. VOCABULARIO ESPECÍFICO DEL ACEITE DE OLIVA
4.1 Sensaciones agradables producidas por los atributos característicos de
calidad de los aceites de oliva vírgenes:
Frutado: flavor que recuerda el olor y el gusto del fruto sano, fresco y
recogido en el punto óptimo de su maduración.
Frutado maduro: flavor del aceite de oliva obtenido de frutos maduros,
generalmente de olor apagado y sabor dulce.
Frutado verde: flavor del aceite extraído de frutos aún verdes.
4.2. Sensaciones más o menos agradables en función de su intensidad, que no
deben considerarse defectos aunque influyen en la armonía del frutado.
Manzana: flavor del aceite de oliva que recuerda a dicho fruto.
Dulce:sabor agradable del aceite, que, sin ser precisamente azucarado,
no predominan en él los atributos amargo, astringente o picante.
Hierba:flavor característico de algunos aceites que recuerda a la hierba
recién cortada.
Hojas verdes (amargo): flavor del aceite obtenido de aceitunas excesiva-
mente verdes o que se han molido mezcladas con hojas y tallos.
Amargo: sabor característico del aceite obtenido de aceitunas verdes o en
envero. Puede ser más o menos agradable según su intensidad.
Aspero:sensación característica de algunos aceites que al ser degustados
producen una sensación buco-táctil de astringencia.
Picante: sensación gustativa de picor, característica de los aceites obte-
nidos a comienzos de la campaña, principalmente de aceitunas todavías
verdes. Se debe a la acción de las sustancias fenólicas sobre los termi-
nales del nervio trigémino que se extienden por toda la cavidad bucal.
Almendrado: este flavor puede darse en dos aspectos: el típico de la
almendra fresca oel pro piode la almendra seca y sana, que puede
confundirse con un rancio incipiente. Se aprecia como un regusto cuando
el aceite permanece en contacto con la lengua y el paladar; se asocia a
los aceites dulces y de olor apagado.
Apagado o plano: flavor del aceite de oliva cuyas características orga-
nolépticas son muy tenues debido a la pérdida de sus componentes
aromáticos.
Heno:flavor característico de algunos aceites que recuerda a la hierba
más omeno s seca.
4.3 Sensaciones siempre desagradables, incluso cuando apenas son percepti-
bles, que deben considerarse defectos organolépticos.
Esparto: flavor característico del aceite obtenido de aceitunas prensadas
en capachos nuevos de esparto. El flavor puede ser diferente si el
capacho está fabricado con esparto verde o si lo está con esparto seco.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 57
▼M3
▼M3
Tierra:flavor característico del aceite obtenido de aceitunas recogidas
con tierra, embarradas y no lavadas. Este flavor puede ir unido al de
moho o humedad en algunas ocasiones.
Viejo:flavor característico del aceite cuando permanece demasiado
tiempoen recipientes de almacenamiento . También puede darse en
aceites envasados durante un período prolongado.
Gusano:flavor característico del aceite obtenido de aceitunas fuertemente
atacadas por larvas de mosca del olivo (Dacus oleae) .
Metálico: flavor que recuerda a los metales. Es característico del aceite
que ha permanecido en contacto, durante tiempo prolongado, con
alimentos o superficies metálicas en condiciones indebidas, durante los
procesos de molienda, batido, prensado o almacenamiento.
Moho-humedad: flavor característico del aceite obtenido de frutos en los
que se han desarrollado abundantes hongos y levaduras a causa de haber
permanecido amontonados y con humedad varios días.
Rancio:flavor característico y común a todos los aceites y grasas que han
sufrido un proceso autoxidativo, a causa de su prolongado contacto con el
aire. Este flavor es desagradable e irreversible.
Atrojado: flavor característico del aceite obtenido de aceitunas amonto-
nadas que han sufridoun avanzadogradode fermentación.
Salmuera: flavor del aceite extraído de aceitunas conservadas en solu-
ciones salinas.
Orujo:flavor característico que recuerda al del orujo de aceituna.
Jabonoso: flavor con una sensación olfato-gustativa que recuerda a la del
jabón verde.
Alpechín: flavor característico adquirido por el aceite a causa de una mala
decantación y prolongado contacto con las aguas de vegetación.
Avinado-avinagrado: flavor característico de algunos aceites que
recuerdan al vinoovinagre. Es debidofundamentalmente a la fo rmación
de ácido acético, acetato de etiolo y etanol, en cantidades superiores o lo
normal en el aroma del aceite de oliva.
Pepino:flavor que se produce en el aceite sometido a un envasado
hermético y excesivamente prolongado, particularmente en hojalata, que
es atribuido a la formación de 2-6 nonadienal.
Cocido o quemado: flavor característico del aceite originado por un exce-
sivo o prolongado calentamiento durante su obtención, muy
particuarlmente durante el termo-batido de la pasta, si éste se realiza en
condiciones inadecuadas.
Borras:flavor característico del aceite recuperado de los lados decan-
tados en depósitos y trujales.
Capacho: flavor característico del aceite obtenido de aceitunas prensadas
en capachos sucios con residuos fermentados.
Grasa de máquina: olor del aceite de oliva obtenido en una almarzara de
cuya maquinaria no han sido adecuadamente eliminados residuos de
petróleo, de grasa o aceite mineral.
Basto:percepción característica de algunos aceites que, al ser degustados,
producen una sensación buco-táctil densa y pastosa.
5. COPA PARA DEGUSTACIÓN DE ACEITES
Véase el capítulo«Co pa para la degustación de aceites».
6. SALA DE CATA
Véase el capítulo«Guía para la instalación de una sala de cata».
7. UTENSILIOS
En cada cabina y a disposición del catador deben estar los utensilios
necesarios para que éste pueda ejercer adecuadamente su cometido. Estos
son:
— copas (normalizadas), conteniendo las muestras marcadas en clave
con un par de números dígitos tomados al azar, o con un par de1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 58
▼B
▼B
números y letras. Las marcas se deben hacer con un lápiz indeleble e
inodoro,
— vidrios de reloj con idénticas marcas, para cubrir las copas,— hoja de puntuación, véase figura 2, conteniendo las instrucciones para
su utilización,
— lápiz o bolígrafo,— bandejitas conteniendo rodajas de manzanas,— vasode agua a la temperatura ambiente.
8. METODOLOGÍA
En este apartado se establecen los conocimientos previos necesarios para
la realización del análisis sensorial de los aceites de oliva vírgenes y trata
de normalizar el comportamiento y la actuación de los catadores que han
de intervenir en las pruebas, los cuales han de tomar conciencia tanto de
las recomendaciones de tipo general como de las específicas para la cata
de los aceites de oliva.
8.1.Actuacióndelorganizadorojefedelpanel (ogrupode catado res)
El organizador del panel deberá ser una persona suficientemente formada,
conocedora y experta en los tipos de aceites que encontrará en su trabajo.
Es la figura clave del panel y el responsable de la organización y del
funcionamiento del mismo. Convocará con tiempo suficiente a los cata-
dores y les aclarará cualquier duda en cuanto a la realización de los
ensayos, aunque se abstendrá de sugerirles ningún tipo de opinión sobre
la muestra.
Será responsable del inventario de los utensilios, de su adecuada
limpieza, de la preparación y codificación de las muestras, así como de
su presentación a dos catadores según el diseño experimental adecuado;
de la recopilación de los datos y de su tratamiento estadístico, a fin de
obtener los mejores resultados con el menor esfuerzo.
El trabajo del jefe del panel requiere habilidad sensorial, meticulosidad en
la preparación de los ensayos, riguroso orden para su ejecución, así como
habilidad y paciencia para planificar y ejecutar las pruebas. Es misión del
jefe de panel estimular la moral de los componentes del grupo, fomen-
tando entre ellos el interés, curiosidad y espíritu competitivo. Debe
evitar que su opinión sea conocida e impedir que los criterios de posibles
líderes se impongan sobre los restantes catadores. También es de su
competencia el entrenamiento, selección y control sobre los mismos, a
fin de conocer si se mantienen con el adecuado nivel de aptitud.
8.2.Condicionesdelensayo
8.2.1. Tamañode la muestra
La cantidad de aceite contenido en cada copa debe ser de 15 ml.
8.2.2. Temperatura de la prueba
Las muestras de aceite a catar se mantendrán dentrode las co pas a 28 ºC
± 2 ºC. Esta temperatura se ha elegido por ser en la que se observan con
mayor facilidad diferencias organolépticas, dentro de la temperatura
normal, cuando los aceites se usan como condimento. Otro aspecto que
inclina a tomar este valor es que temperaturas más bajas o más altas
producen una escasa volatilización de los compuestos aromáticos o por
el contrario volátiles ya propios de aceites calentados.
8.2.3. Horario del ensayo
Para la cata de aceites, las horas de trabajo óptimas son las de la mañana.
Está demostrado que durante el día existen períodos de óptima percepción
para el gusto y el olfato.
Las comidas son precedidas de un período de incremento de la sensibi-
lidad olfato-gustativa, seguidas de un decrecimiento de la misma.
Sin embargo, este criterio no debe ser llevado al extremo, hasta el punto
de que el hambre pueda distraer a los catadores, haciendo descender en
ellos su capacidad de discriminación y, particularmente, sus criterios de
preferencia y aceptación.
9. CATADORES
Las personas que intervengan como catadores en los ensayos organolép-
ticos de aceites de oliva comestibles deberán ser entrenados y
seleccionados de acuerdo con su habilidad para distinguir entre muestras1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 59
▼B
similares, debiéndose tener en cuenta que la precisión se mejorará con el
entrenamiento (véase apartado correspondiente).
Para la prueba se exige un número de 8 a 12 catadores siendo conve-
niente disponer de algunos más en reserva, para cubrir posibles ausencias.
9.1.Normasgeneralesdecomportamientoparacandidatosycatadores
Las presentes recomendaciones se refieren al comportamiento de los
candidatos y catadores durante su trabajo.
Al recibir la comunicación del jefe del panel para intervenir en un ensayo
organoléptico, el catador deberá estar en condiciones de realizarlo a la
hora previamente señalada, ateniéndose a las siguientes normas:
9.1.1. Se abstendrá de fumar al menos 30 minutos antes de la hora fijada.
9.1.2. No utilizará ningún perfume, cosmético o jabón cuyo olor persista en el
momento del ensayo. Para el lavado de las manos utilizará un jabón no
perfumado o poco perfumado, procediendo a enjuagarse las manos y a
secárselas tantas veces como sean necesarias para eliminar cualquier olor.
9.1.3. No deberá haber tomado ningún alimento al menos una hora antes de
realizar la cata.
9.1.4. Si se encontrase en condiciones de inferioridad fisiológica, particular-
mente si tiene afectado el sentido del olfato o del gusto, o bajo algún
efecto psicológico que le impida concentrarse en su trabajo, deberá comu-
nicarlo al jefe del panel al objeto de que lo aparte del trabajo, o bien para
que tome las decisiones oportunas, teniendo en cuenta su posible desvia-
ción de los valores medios del resto del panel.
9.1.5. El catador, una vez cumplidas las normas precedentes, procederá a ocupar
su lugar en la cabina que le corresponda, con el mayor orden y silencio
posibles.
9.1.6. Una vez sentado, procederá a examinar si el material que necesita está en
orden y es el correcto, comprobando si la clave de la copa se corresponde
con la del vidrio de reloj que la cubre.
9.1.7. Leerá detenidamente las instrucciones contenidas en la hoja de puntua-
ción, no comenzando el examen de la muestra hasta estar totalmente
compenetrado con el trabajo que debe realizar. En caso de duda, debe
consultar privadamente las dificultades encontradas con el jefe del panel.
9.1.8. El catador procederá a tomar la copa, manteniéndola cubierta con su
vidrio de reloj, la inclinará ligeramente, y en esta posición le dará un
giro total a fin de mojar lo más posible la superficie interior. Hecha esta
operación, separará el vidrio de reloj y procederá a oler la muestra,
haciendo inspiraciones suaves, lentas e intensas, hasta formarse un
criterio sobre el aceite que debe juzgar. El período de olfacción no debe
soprepasar 30 segundos. Si en este período no se ha llegado a ninguna
conclusión, debe tomarse un pequeño descanso, antes de un nuevo
intento. Una vez realizado el ensayo olfativo, se procederá a enjuiciar el
flavor (sensación conjunta olfato-gustativa-táctil). Para ello se tomará un
pequeño sorbo de aceite, de unos 3 ml aproximadamente. Es muy impor-
tante distribuir el aceite por toda la cavidad bucal, desde la parte anterior
de la boca y la lengua, por los laterales y la parte posterior, hasta los
pilares del paladar; ya que, como se sabe, la percepción de los cuatro
sabores fundamentales, dulce, salado, ácido y amargo, se hace con
distinta intensidad según las zonas de la lengua y el paladar.
Debe insistirse en la necesidad de que el aceite se extienda en cantidad
suficiente y muy lentamente por la parte posterior de la lengua hacia los
pilares del paladar y la garganta, concentrando la atención en el orden de
aparición de los estímulos amargo y picante; si no se procede así, en
algunos aceites ambos estímulos pueden pasar inadvertidos o el amargo
quedar oculto por el picante.
Aspiraciones cortas y sucesivas, introduciendo aire por la boca, permiten,
además de extender la muestra ampliamente por la cavidad bucal, percibir
por vía retronasal los componentes volátiles aromáticos.
La sensación táctil debe tomarse, también, en consideración: así, la
fluidez, pastosidad y picor o escozor deben ser anotados cuando se
detecten y, si la prueba así loexige, cuantificar su intensidad.
9.1.9. La valorazión organoléptica de un aceite virgen debe hacerse evaluando
una sola muestra por sesión, para evitar el efecto de contraste que podría
producir la degustación inmediata de otras.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 60
▼B
Puesto que las catas sucesivas son afectadas por la fatiga, o pérdida de
sensibilidad, causadas por las precedentes, se impone utilizar un producto
capaz de eliminar de la boca los restos de aceite de la cata anterior.
Se recomienda el uso de un pequeño trozo de manzana, de unos 15 gr, el
cual, después de masticado, puede ser vertido al escupidor, procediendo
seguidamente a enjuagarse con un poco de agua a temperatura ambiente.
Entre la cata finalizada y la siguiente deben transcurrir al menos 15
minutos.
9.2.Preseleccióndecandidatos
Esta etapa deberá realizarla el organizador del panel mediante entrevistas
personales y tiene por objeto conocer la personalidad del candidato y las
características que le rodean. Las exigencias previas respecto a las condi-
ciones fisiológicas y psicológicas no son muy rigurosas, ya que, en
principio, cualquier persona normal puede desarrollar esta actividad. La
importancia de la edad, sexo, determinados hábitos (fumar) etc., se consi-
deran secundarios frente a otros aspectos, tales como: la salud, el interés
personal y disponer de tiempo para este trabajo.
Durante la entrevista, el organizador del ensayo debe explicar al candi-
datolas características de la función que va a realizar e info rmarle del
tiempo aproximado que le va a ocupar. A continuación ha de recabar
datos que le permitan valorar el grado de interés y motivación del candi-
dato, así como de su disponibilidad real de tiempo. La encuesta siguiente
deberá servirle como referencia.
(1)
Con esta información el organizador realizará la preselección, rechazando
a los candidatos con poco interés por este tipo de trabajo, poco tiempo
disponible, o incapaces para concretar sus ideas.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 61
(1) Describa el interés que puede tener la valoración organoléptica de cualquier alimento o
si le parece del aceite de oliva.
▼B
9.3.Determinacióndel«umbralmedio»delgrupopara«atributoscarac-
terísticos»
Se eligen cuidadosamente cuatro aceites, de tal forma que cada uno sea
considerado como representante típico de los atributos: atrojado, avinado,
rancio y amargo, con la mayor y más clara intensidad posible.
Tomando una parte alícuota de cada uno de ellos se preparan muestras, a
distintas concentraciones de razón 2, por sucesivas diluciones con el
soporte apropiado hasta que en las dos o tres diluciones últimas no sea
posible detectar diferencia con la copa que contiene sólo el soporte. Una
última pareja la formarán dos copas de soporte.
La serie se completará con copas de concentraciones superiores, hasta un
total de 8.
Preparar suficiente cantidad de muestras de las distintas concentraciones
para entregar series completas de cada atributo a cada uno de los candi-
datos.
Para estabelecer el «umbral medio» de los candidatos, para cada atributo
se presentará a éstos una copa conteniendo 15 ml de una cualquiera de
las concentraciones preparadas, junto con otra copa que contenga sólo
15 ml del «soporte». El candidato, después de realizar el ensayo, debe
indicar si son iguales o distintas.
El mismo ensayo se repite para las restantes concentraciones del atributo
estudiado.
Se anota el número de contestaciones correctas obtenidas para cada
concentración del conjunto de candidatos, y se refiere como porcentaje
del número de ensayos efectuados.
Se representa en orden creciente, en abscisas las concentraciones ensa-
yadas y en ordenadas el % de identificaciones correctas hechas para
cada concentración.
La figura 1 representa un ejemploprácticode loexpuestoanterio rmente.
El umbral de detección se define sobre abscisas extrapolando de la curva
el punto de la ordenada que corresponde a un 75 % de aciertos.
Esta concentración «umbral», que puede ser distinta para cada aceite de
partida, dependiendode la intensidad del atributoen dichoaceite, debe
ser similar para los distintos grupos de candidatos de distintos paneles;
no está unida a ninguna costumbre, hábito o preferencia tendenciosa,
consiguientemente es un punto de referencia común a cualquier grupo
humano normal y puede servir para homogeneizar los distintos paneles
sólo por su sensibilidad olfato-gustativa.
A partir de la concentración umbral del grupo obtenida se procederá
como sigue:
Prepárese una serie de concentraciones crecientes y decrecientes de forma
que esta «concentración umbral» corresponda al lugar 10 de esta escala.
Lógicamente las concentraciones 11 y 12 serán más diluidas y consi-
guientemente muy difíciles de detectar en ellas la presencia del aceite
con el atributo elegido.
A partir de la concentración C10, las restantes muestras pueden prepararse
mediante la fórmula:
C10×an, donde «a» es una constante correspondiente al factor de dilución
igual a 1,5 y «n» el exponente que variará desde 9 a − 2.
Por ejemplo: supuesto el umbral obtenido para el aceite rancio = 0,32;
será C10= 0,32, a partir de ella como a = 1,5 la serie de muestras tendría
las siguientes concentraciones.
Muestras 1 2 3456789 1 0 1 1 1 2
Concentración 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Si se repite todo lo anterior para los tres restantes atributos, partiendo de
los umbrales respectivos calculados también como antes se indicó, se
obtendrán así escalas que para todos los laboratorios tendrán intensidades
aromáticas similares para cada estímulo, aunque se haya partido de
aceites de oliva cuyos defectos son perceptibles con distinta intensidad.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 62
▼B
9.4.Seleccióndecatadoresporelmétodode«clasificacióndeintensidad»
La selección debe realizarse partiendo de un número de candidatos dos o
tres veces superior al necesario para formar el grupo, con objeto de poder
elegir a los más sensibles y de mayor capacidad discriminatoria. Siempre
es aconsejable realizar las pruebas con el mismo producto que se va a
analizar posteriormente. (Consiguientemente nosotros utilizaremos aceite
de oliva.)
Figura1
En la elección del método, junto a su eficacia no se puede olvidar que es
de interés que el procedimiento a seguir sea lo más económico posible en
cuantoa cantidad de aceite, númerode muestras a utilizar y tiempodedi-
cadoa la selección. La eficacia de un pro cedimientode selección se
caracteriza por la elección de los niveles óptimos de las tres variables
dependientes siguientes: a) «costo» determinado por el número de
ensayos, b) «proporción» de candidatos potencialmente aptos que por
azar pueden ser desafortunadamente rechazados en la criba y c) «propor-
ción» de candidatos no apropiados que por un azar favorable son
aceptados en la selección sin deber serlo.
El procedimiento de selección elegido: «prueba de clasificación de inten-
sidad»(The intensity rating test) descritoen las no rmas ASTM (American
Society for Testing and Materials) y STP(Special Technical Publication)
440 página 53, modificado en cuatro puntos:
1) reducción del númerode muestras en la serie;
2) ampliación de estímulos con objeto de aumentar el número de notas
olfato-gustativas sobre las que está basada la selección, a fin de
adecuarlas a los defectos más comunes perceptibles en el aceite de
oliva;
3) variación de la relación de concentración en la serie;
4) tratamiento estadístico de los resultados.
Material necesario
— botellas o matraces de 1500 ml,
— copas de vidrio oscuro,1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 63
▼B
— probetas de 10 ml, 15 ml, 1 000 ml y 1 500 ml.
Productos necesarios
— Parafina Merck (referencia 7.160, DAB 8, USP XX) o soporte
oleoso inodoro e insípido (aceite de oliva u otro similar reciénrefinado),
— aceites: atrojado, avinado, rancio y amargo.
9.4.1. Procedimiento operatorio
Una vez preparadas las concentraciones se empezará la selección
partiendo de 25 candidatos, de acuerdo con la metodología que se
explicará a continuación para cada estímulo:
1) Se preparan series de 12 copas, marcadas en clave (una serie por
candidato). En cada copa se vierten 15 ml de cada una de las distintas
concentraciones, preparadas de acuerdo con la fórmula C
10×an.
2) Una vez llenas las copas conviene que permanezcan en la sala de cata,
a 20—22 ºC, cubiertas con un vidrio de reloj al menos una hora antes
de comenzar los ensayos, a fin de homogeneizar su temperatura con la
ambiente.
3) Las 12 copas de una serie se colocan por el organizador del ensayo,
de mayor a menor concentración, en una fila.
A continuación se procede a invitar a cada candidato para que realice el
ensayo por separado, dándole las siguientes instrucciones:
9.4.2. Instrucciones para el candidato
Las 12 copas alineadas frente al candidato contienen diluciones de cada
uno de los estímulos atrojado, avinado, rancio y amargo según sea el
caso. Las copas se diferencian unas de otras en la intensidad del olor, la
de olor más intenso se encuentra en el extremo izquierdo, la intensidad de
olor de las restantes va disminuyendo gradualmente hacia la derecha. La
última copa de la derecha puede tener tan poco olor que podría no ser
detectable.
Procédase como sigue: familiarícese con los olores de las copas que
forman la serie. Para ello comience a oler por la de la derecha (no12) e
intente recordar la intensidad de los olores. Procure no fatigarse.
Cuando considere que se ha habituado a la escala de concentraciones de
olor presentada, salga de la habitación.
El organizador del ensayo procederá, mientras tanto, a entresacar una
copa de la serie que emparejará con la última de la derecha procediendo
a tapar el hueco aproximando entre sí las restantes. Vuelva entonces de
nuevo a la habitación para continuar el ensayo.
La prueba consiste en lo siguiente:
La copa separada debe ser restituida al lugar que le corresponde en la
serie. Para ello puede olerla y compararla con las restantes tantas veces
como se quiera, teniendo en cuenta que si la restituye correctamente al
lugar que le corresponde, debe oler más fuerte que su inmediata de la
derecha y más débil que la de la inzquierda. Esta prueba se repetirá con
otras tres copas.
Para facilitar el trabajoy la reco gida de la respuesta emitida, a cada
candidato se le entregará junto con las instrucciones anteriormente
descritas el siguiente estadillo.
9.4.3. Obtención de los resultados
Para facilitar la ordenación de datos de cada uno de los candidatos, el
organizador del panel los anotará de la forma siguiente:1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 64
▼B
9.4.4. Procedimiento estadístico de puntuación
En el caso concreto de la selección efectuada, las copas a reintegrar en su
lugar serán las mismas para todos y cada uno de los candidatos y de
acuerdo con los cálculos estadísticos realizados para este caso serán aque-
llas cuyo orden de serie se indica a continuación para cada atributo.
Atrojado (At) Avinado (Av) Rancio (Ra) Amargo (Am)
Copa noCopa noCopa noCopa no
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
El número ocupado por las copas en la serie no puede ser variado, puesto
que los cálculos estadísticos para este ensayo se han realizado de acuerdo
con la probabilidad de que las copas indicadas sean restituidas a su lugar
por azar.
Ahora bien, con objeto de dificultar, cualquier paso de información de un
candidato a otro el organizador del panel tendrá presente los siguientes
puntos:
1) Los candidatos no pueden comunicarse entre sí. Las claves serán dife-
rentes para cada candidato.
2) Los candidatos no pueden enterarse qué posición ocupan las copas que
se le han retirado.
3) Aunque todos los candidatos deben recibir las copas reseñadas ante-
riormente, el organizador debe variar el orden en que las entrega a
cada candidato.
A cada candidatose le asigna una puntuación en función de sus resul-
tados obtenidos; procediendo tal y como se pasa a describir a
continuación:
Sean ei
1,ei
2,…e12ilas 12 copas con las doce concentraciones correspon-
dientes de un atributo i (i = cualquiera de los cuatro atributos atrojado,
avinado, rancio y amargo) ordenadas de mayor a menor.
Sea ekiuna de las copas seleccionadas y sea K ′la posición que asigna el
candidato a dicha copa en la serie. Los valores de K y K ′son, por consi-
guiente, números enteros comprendidos entre el 1 y el 12 ambos inclusive
que corresponden a las posiciones real y asignada por el candidato,
respectivamente, de la copa seleccionada.
Sea T (máxima desviación admitida) un valor, fijado de antemano, en
nuestrocasoigual a 3 de tal fo rma que si (K ′− K) > T el candidatoes
rechazadoauto máticamente(1).
Si por el contrario (K ′−K )≤T, el candidato, en principio, no es recha-
zadoy puede co ntinuar la prueba, puestoque es capaz de situar el
estímulo problema en el lugar que le corresponde o cuando menos en
los lugares próximos inmediatos.
En este caso, la puntuación asignada a un candidato cuando valora un
estímulo (concentración) de un determinado atributo, por ejemplo, de la
serie atrojado (At), será igual al cuadrado de la diferencia entre el número
de orden que corresponde a la posición correcta que ocuparía en la serie
la copa portadora del estímulo y la posición a que el candidato la ha rein-
tegrado, es decir:
P(At)
h=( K′−K )21991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 65
(1) Es importante que el organizador insista sobre el candidato a fin de que el ensayo se
conduzca razonablemente sin que se produzca una pérdida de sensibilidad por
cansancio olfativo.
▼B
Puesto que esta operación será realizada por un mismo cadidato sobre
cuatro estímulos (concentraciones) de cada atributo, la puntación parcial
para dichoatributo(po r ejemploAt) sería:
ZAt=PAt
h+PAt
j+PAt
l+PAt
m
Para facilidad de comprensión se exponen los siguientes ejemplos:
Ejemplo1:
Supongamos que las respuestas del candidato A para los cuatro estímulos
que se han retiradode la serie del atributo(i) so n las siguientes:
Posición correcta de
la copa en la serie
(K)Posición en que fue
colocada (K ′)Separación de la posición
correcta
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 5 4−5=−1
10 6 10 − 6 = 4 (1)
2 4 2−4=−2
(1) Este candidato es rechazado, ya que ha obtenido en el ensayo un valor de T > 3.
Ejemplo2:
Supongamos que un candidato reordena las copas de un atributo como
sigue:
Posición correcta de
la copa en la serie
(K)Posición en que fue
colocada
(K′)Separación de la posición
correcta
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10 − 7 = 3
2 3 2−3=−1
Este candidatonoes rechazadoy la puntuación que o btiene para este atri-
butoes:
Zi=02+02+32+( −1 )2=1 0
La puntuación final del candidato que nos permitirá seleccionarlo o no
como catador en función de sus respuestas frente a los cuatro atributos
que hemos tomado para la selección sería:
PhAt+PjAt+PlAt+PmAt=ZAt
PhAv+PjAv+PlAv+PmAv=ZAv
PhRa+PjRa+PlRa+PmRa=ZRa
PhAm+PjAm+PlAm+PmAm=ZAm
Z final = ZAt+…+ZAm
siendo:
At: atrojado.
Av: avinado.
Ra: rancio.Am: amargo.
El problema es ahora determinar hasta qué valor de Z es posible consi-
derar que el candidato posee buenos niveles de percepción, memoria
olfativa y organización mental para dar la adecuada respuesta para los
cuatro estímulos considerados. Naturalmente Z es siempre un valor no
negativo, y Z = 0 significa que el candidato ha reconocido y cuantificado
correctamente todas las 16 intensidades presentadas (cuatro de cada atri-
buto). Valores de Z distintos de cero indican que el candidato ha
reconocido las zonas de las escalas donde se sitúan las intensidades selec-
cionadas, pero dentro de ellas no ha podido realizar una correcta situación1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 66
▼B
a su posición debido a que no posee una buena capacidad discriminatoria
asociada a la escala de intensidad que se le ha presentado para uno o
varios de los estímulos.
Así pues, habrá que determinar un valor crítico Z, tal que en el supuesto
de que el candidato realice todas sus asignaciones de posición en la
escala al azar dentro de las zonas que previamente ha reconocido, la
probabilidad de una puntación definitiva Z, inferior a Zc, sea una cantidad
suficientemente pequeña αque previamente se puede fijar. En otras pala-
bras, que la probabilidad de que con este procedimiento se seleccione un
catador para el panel que no posea suficiente capacidad discriminatoria
para las intensidades de estos estímulos que se han utilizado para la selec-
ción, sea inferior a α.
Fijado α,en nuestrocasoigual 0,05, la o btención de Zcdepende de la
distribución de probabilidad de la variable Z, que a su vez depende de
las distribuciones de probabilidad de las variables p (K ′).
Realizados los cálculos estadísticos correspondientes, el valor obtenido
para Zces igual a 34.
Una vez obtenida la puntuación Z de todos los candidatos, serán recha-
zados aquellos cuya puntuación sea superior a 34.
Por ejemplo, los candidatos A y B obtienen las siguientes puntuaciones:
AtributoCandidato A Candidato B
Atrojado ZAt=1 0 ZAt=1 2
AvinadoZAv=1 0 ZAv=1 1
RancioZRa=1 0 ZRa=1 5
AmargoZAm=4 ZAm=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Los valores de Z para ambos candidatos son para el A = 34 y para el B
= 38, luegoserá elegidoel candidatoA y rechazadoel B. Eliminandolo s
candidatos con puntuación superior a 34 los restantes se ordenarán por
sus valores de Z, eligiéndose por orden hasta completar el número de 12
que deseamos reunir.
9.5.Entrenamiento
El entrenamiento tiene como objetivos principales:
a) familiarizar al catador con las numerosas variantes olfato-gustativo-
táctiles que ofrecen los aceites de oliva vírgenes;
b) familiarizar a los catadores con la metodología sensorial específica;
c) incrementar la habilidad individual para reconocer, identificar y cuan-
tificar los atributos sensoriales;
d) mejorar la sensibilidad y la memoria frente a los distintos atributos
para conseguir juicios consistentes.
El período de entrenamiento suele consistir en una serie de sesiones
según las posibilidades del grupo y del estudio, en las que después de
analizar individualmente los aceites, los catadores discuten conjuntamente
con el director las dificultades encontradas y comentan las calificaciones
para aunar criterios y unificar opiniones.
El gradode entrenamientoco nseguidodespués de un determinado
número de sesiones se evalúa observando el incremento en el porcentaje
de juicios correctos si se utilizan pruebas discriminatorias o analizando
las variaciones de las calificaciones individuales medias del grupo,
cuandose trata de pruebas escalares.
La utilidad práctica de este período de entrenamiento ha sido amplia-
mente discutida, pero hoy se considera muy eficaz e incluso
imprescindible cuando se necesita disponer de datos sensoriales exactos
y precisos.
9.6.Comprobación
Los grupos de catadores muy entrenados suelen realizar catas periódicas
y continuadas con pruebas sensoriales que requieren un gran esfuerzo.
Sobre su opinión se basan, en muchas ocasiones, decisiones de gran1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 67
▼B
importancia tecnológica y comercial, y por ello, después de seleccionados
y entrenados, deben estar sometidos a comprobaciones que garanticen la
fiabilidad de los resultados.
Es evidente que sería necesario, una vez los paneles constituidos y some-
tidos a ensayos de rutina, proceder periódicamente a comprobar su
«performance» a intervalos adecuados.
10. PROCEDIMIENTO PARA LA EVALUACIÓN ORGANOLÉPTICA DE
ACEITES DE OLIVA VÍRGENES
Reunidas las condiciones y medios necesarios indicados en las normas
anteriormente citadas y seleccionado el grupo de catadores, cada uno de
ellos olerá y degustará(1) la copa que contiene la muestra de aceite some-
tida a examen analizando en ella las percepciones olfativas, gustativas,
táctiles y quinestéticas con ayuda de la hoja de la figura 2 donde anotará
su presencia y el valor de su intensidad. A continuación pasará a puntuar
la calidad del aceite.
10.1.Utilizacióndelahojadelafigura2 (descripción del flavor y puntua-
ción de calidad)
En la parte izquierda de esta hoja se incluyen algunas de las percepciones
sensoriales más características que suelen encontrarse con mayor
frecuencia en los aceites de oliva y que describen su flavor. En el caso
de que se perciban otros estímulos que no se correspondan con los califi-
cativos enumerados deberá anotarlos como «otros» empleando el
calificativo o calificativos que lo describa o describan con mayor
propiedad.
Los estímulos perceptibles deberán ser valorados proporcionalmente a su
intensidad indicando ésta con un signo (+) en el casillero correspondiente,
de acuerdoco n el criteriosiguiente:
1: casi imperceptible.
2: ligera.
3: media.
4: grande.5: extrema.
En la parte derecha de esta hoja, se establece una escala de 9 puntos (9
calidad excepcional, 1 pésima) que será utilizada por el catador para dar
una puntuación única, conjunta, de las características del aceite. Esta
puntuación debe ser consecuente con las virtudes, defectos encontrados
en el aceite, anotados ya en la parte de la izquierda.
La primera columna (defectos) de la tabla de puntuación comprende
cinco apartados, de esta forma la clasificación de los aceites se basará
fundamentalmente en la ausencia total o en la presencia de flavores
defectuosos así como en la mayor o menor gravedad o intensidad de
éstos; sin embargo, como la escala de valoración es de 9 puntos, deberán
considerarse algunos matices o aspectos que contribuyen de forma defini-
tiva a decidir la puntuación total de calidad, que se describen en la
segunda columna (características).
10.2.Puntuaciónfinal
El jefe del panel recogerá las puntuaciones dadas por cada uno de los
catadores, comprobará que los atributos y las intensidades con que los
ha percibido y marcado en la tabla de perfil se corresponden aceptable-
mente con la valoración asignada al aceite en la «hoja de puntuación».
En caso de existir una diferencia apreciable, solicitará al catador que
revise su hoja de puntuación.
Si fuese necesario, el catador repetirá el ensayo.
Por último, el jefe del panel tabulará las puntuaciones de todo el grupo y
calculará la media aritmética y el error típico (de la media).
Si el error típico es superior al error de método, hará repetir el ensayo a
todo el grupo.
El grupo repetirá los ensayos hasta obtener una evaluación por triplicado
de la muestra, únicamente en el casode análisis de revisión. La puntua-1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 68
(1) Podrá abstenerse cuando al olerla encuentre algún atributo extremada e intensamente
desagradable y anotará esta circunstancia excepcional en la hoja de puntuación.
▼B
ción final de la muestra será la media de las tres puntuaciones dadas, con
una cifra decimal.
Si el valor de intensidad media de amargo y/o picante es superior a 2,5,
al aceite se le dará la calificación correspondiente y se hará constar que
es especialmente amargoy/opicante.
Expresión de los resultados: el jefe del panel determinará, a partir de la
puntuación media, la categoría a la que corresponde la muestra, según los
valores establecidos en el Anexo I. ►M3A tal fin, el jefe aplicará, hasta
el 31 de octubre de 1993, un margen de tolerancia de + 0,5 si la puntua-
ción media es igual o superior a 5 puntos. Sólo indicará en el informe del
análisis la categoría a la que pertenezca la muestra. Cuando las pruebas
sean realizadas por el analista indicado en el párrafo primero del apartado
2 del artículo 2 del presente Reglamento, utilizará el mismo procedi-
mientode establecimientode las catego rías. ◄
Nota:Las muestras deberán conservarse cerradas y en frigorífico hasta su
análisis, devolviéndolas a éste hasta completar el triplicado.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 69
▼M3
Figura2
Aceitedeolivavirgen
ANÁLISISSENSORIAL:VOCABULARIOGENERALBÁSICO
1. OBJETO
La presente norma tiene por objeto agrupar los términos generales utili-
zados para el análisis sensorial y proporcionar su definición.
2. VOCABULARIO
2.1.Terminologíageneral
Análisis sensorial (sustantivo):
examen de los caracteres organolépticos de un producto mediante los
sentidos.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 70
▼B
▼B
Percepción (sustantivo):
toma de conciencia sensorial de objetos o acontecimientos exteriores.
Organoléptico (adjetivo) (carácter o propiedad):
califica toda propiedad de un producto susceptible de ser percibida por
los órganos de los sentidos.
Experto(sustantivo):
(en lo que concierne al examen de los caracteres organolépticos)
catador especializado en el análisis sensorial de un determinado producto
y que posee conocimientos básicos sobre la elaboración del mismo y las
preferencias del mercado.
Catador(sustantivo):
persona perspicaz, sensible, seleccionada y entrenada, que estima con los
órganos de sus sentidos los caracteres organolépticos de un alimento.
Grupo de catadores:
conjunto de sujetos o jueces los cuales han sido especialmente seleccio-
nados y entrenados y que se reúnen para efectuar bajo condiciones
controladas el análisis sensorial del producto.
Sensación (sustantivo):
fenómenosubjetivoresultante del estímulode un sistema senso rial. Este
fenómenoes subjetivamente discriminable y o bjetivamente definible a
través del órgano sensorial interesado, según la naturaleza o la cualidad
del estímulo, así como por su intensidad.
Sensibilidad (sustantivo):
capacidad de los órganos sensoriales que les permite percibir cualitativa y
cuantitativamente un estímulode po ca intensidad odiferencias pequeñas
entre estímulos.
Cata(sustantivo):
operación que consiste en percibir, analizar y juzgar los caracteres orga-
nolépticos, y más particularmente los olfato-gustativos, táctiles y
quinestéticos de un producto alimenticio.
Aceptación (sustantivo):
acto que consiste en admitir como favorable un producto por parte de un
individuoouna po blación.
Armonía (sustantivo):
cualidad de un producto que origina una sensación de conjunto agradable.
Dicha sensación es debida a la percepción de sus componentes, aportados
como estímulos olfativos, gustativos, táctiles y quinestéticos porque se
encuentran en relaciones de concentración adecuadas.
Aceptabilidad (sustantivo):
estado de un producto recibido favorablemente por un individuo o pobla-
ción en función de sus propiedades organolépticas.
Discriminación (sustantivo):
diferenciación cualitativa y/o cuantitativa entre dos o varios estímulos.
Compensación (sustantivo):
resultado de la interacción debida a un conjunto de estímulos de modo
que cada uno se percibe con menor intensidad que si actuara solo.
Aspecto(sustantivo):
conjunto de caracteres organolépticos percibidos por el órgano de la vista:
tamaño, forma, color, conformación, turbidez, limpieza, fluidez, espuma y
efervescencia.
Este términoes preferible al de apariencia.
Atributo(sustantivo):
propiedad carcterística perceptible.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 71
▼B
2.2.Terminologíarelativaalafisiología
Estímulo (sustantivo):
agente físico o químico que produce específicamente la respuesta de los
receptores sensoriales externos o internos.
Gusto:(Sentidodel gusto )uno de los sentidos cuyos receptores están localizados en la boca, parti-
cularmente sobre la lengua y que son activados por diferentes compuestos
en solución.
Gustativo (adjetivo):
califica la propiedad de un producto capaz de estimular el aparato gusta-
tivo despertando las sensaciones correspondientes a uno a varios de los
cuatros sabores elementales: dulce, salado, ácido y amargo.
Receptor (sustantivo):
estructura especializada de un órganosenso rial excitable, capaz de recibir
un estímulo y convertirlo en influjo nervioso.
Nota:Los receptores se clasifican según el tipo de energía asociada al
estímulo (luz, calor, sonido, etcétera).
Olfacción (sustantivo):
función del aparato olfativo con vistas a la percepción y discriminación
de las moléculas que acceden a él, en fase gaseosa desde un medio
externo, por vía nasal directa o indirecta.
Intensidad (sustantivo):
gradode energía de una cualidad medible según una escala cuantitativa
de valores superiores al umbral.
Adaptación (sustantivo):
modificación temporal de la sensibilidad para percibir estímulos senso-
riales como resultado de una contínua y repetida exposición a ese o
similar estímulo.
Inhibición (sustantivo):
falta de respuesta por parte de un órgano sensorial o de una parte del
mismo, a pesar de estar sometido a la acción de un estímulo adecuado
de intensidad superior al umbral.
Respuesta (sustantivo):
acción con que las células sensoriales corresponden a la de uno o varios
estímulos relativos a una modalidad sensorial definida.
Cuerpo(sustantivo):
sensación táctil percibida en la boca y que otorga un grado de densidad,
viscosidad, consistencia o compacidad a un producto.
Fragancia (sustantivo):
olor fresco, suave y delicioso.Oler(verbo):
(sentido activo aplicado al olfato)designa la acción de percibir un olor.
Objetivo (adjetivo):
a) califica a aquello que proporciona una representación real y compro-
bable del objeto, reduciendo al mínimo los factores humanos (por
ejemplo: preferencia, costumbre, afectividad);
b) califica a aquella técnica que, bien utilizando métodos sensoriales o
métodos instrumentales, permite reducir al mínimo los errores propios.
Nota:Se desaconseja emplear como sinónimo el término de instrumental.
Subjetivo (adjetivo):
califica a aquello que proporciona una percepción condicionada por
nuestro modo de pensar o sentir y no sólo por el estímulo.
Quinestesia:1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 72
▼B
conjunto de sensaciones resultante de una presión aplicable a la muestra
por un movimiento (por ejemplo, presión de los dedos en el caso de un
queso).
Umbral(sustantivo):
Umbral absoluto:
cantidad mínima de un estímulosenso rial, que da lugar:
— a la aparición de una sensación (umbral de aparición ode detección),
— o al reconocimiento de dicha sensación (umbral de identificación).
Umbral diferencial:
cantidad mínima de estímulosenso rial que da lugar a una diferencia
perceptible en la intensidad de la sensación.
Umbral final:
cantidad máxima de un estímuloa partir de la cual un aumentode inten-
sidad nose percibe.
Umbral preferencial:
valor cuantitativo mínimo de un estímulo o valor crítico supraliminar de
este estímulo al que corresponde la aparición de una respuesta de atrac-
ción o repulsa en relación con un estímulo neutro, por ejemplo, en la
elección entre una solución azucarada y el agua.
Nota:se debe distinguir entre umbral absoluto de preferencia y umbral
diferencial de preferencia.
Subliminar (adjetivo):
por debajo del umbral absoluto.Supraliminar (adjetivo):
por encima del umbral absoluto.
Fatiga sensorial:
caso particular de adaptación sensorial en el que se produce una disminu-
ción de la sensibilidad.
Compensación (sustantivo):
resultado de la interacción debida a un conjunto de estímulos de modo
que cada uno se percibe con menor intensidad que si actuara solo.
Sinérgico (adjetivo):
efecto o acción concertada de determinadas sustancias, de modo que la
intensidad de los caracteres organolépticos resultantes de la mezcla son
superiores a la suma de las intensidades que cada uno de ellos mostraba
por separado.
Efecto de contraste:
aumento de la respuesta a las diferencias entre los estímulos simultáneos
o consecutivos. Contrario del efecto de convergencia.
Efecto de convergencia:
disminución de la respuesta a las diferencias entre los estímulos simultá-
neos o consecutivos. Contrario del efecto de contraste.
2.3.Terminologíarelativaalaspropiedadesorganolépticas
Ácido(adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por soluciones acuosas diluidas
de la mayoría de los ácidos (por ejemplo, ácidos cítrico, láctico y
tartárico);
b) califica la propiedad de los cuerpos puros o mezclas que al ser degus-
tados producen este sabor.
El sustantivo correspondiente es acidez.
Agrio(adjetivo):
califica la sensación olfato-gustativa con predominio de ácidos general-
mente de origen fermentativo, y a los alimentos que producen esta
sensación. Algunos factores que contribuyen a dicha sensación están rela-1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 73
▼B
cionados con el proceso de fermentación, por ejemplo acética, de un
producto alimenticio.
Amargo(adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por soluciones acuosas diluidas
de diversas sustancias tales como quinina, cafeína y determinados
heterósidos;
b) califica la propiedad de aquellos cuerpos puros o sus mezclas que al
ser degustados producen este sabor.
El sustantivo correspondiente es amargor.
Salado(adjetivo):
a) sensación característica que se percibe a través del sentidodel gusto ,
cuyo ejemplo más típico es el producido por una solución de cloruro
sódico;
b) califica la propiedad de las sustancias o mezclas que producen este
sabor durante la degustación.
El sustantivo correspondiente es salinidad.
Dulce(adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por las soluciones acuosas de
diversas sustancias, por ejemplo, la sacarosa;
b) califica la propiedad de las sustancias puras o mezclas, que al ser
degustadas producen este sabor.
El sustantivo correspondiente es dulzor.
Astringente:
a) califica la sensación compleja producida en la boca por una solución
acuosa diluida de productos como algunos taninos (por ejemplo, los
taninos del caqui y de endrina);
b) califica la propiedad de los cuerpos puros o mezclas que producen
esta sensación.
El sustantivo correspondiente es astringencia.
Flavor(sustantivo):
se entiende por flavor el conjunto de percepciones de estímulos olfatogus-
tativos, táctiles y quinestéticos que permite a un sujeto identificar un
alimento y establecer un criterio, a distintos niveles, de agrado o desa-
grado.
Sabor(sustantivo):
a) sensaciones percibidas como consecuencia del estímulo de las papilas
gustativas por algunas sustancias solubles,
b) cualidad de la sensación particular producida por tales sustancias.
Sabor elemental (sustantivo):
Cada uno de los cuatro sabores reconocidos: dulce, salado, ácido, amargo.
Olor(sustantivo):
a) conjunto de sensaciones percibidas por el órgano olfativo cuando se
inspiran determinadas sustancias volátiles;
b) cualidad de la sensación particular producida por cada una de las
sustancias anteriores.
Aroma(sustantivo):
a) sensaciones agradables percibidas por el órgano olfativo por vía indi-
recta cuandose realiza la degustación de un alimento ;
b) en perfumería y en lenguaje noespecializadose aplica también a las
mismas sensaciones apreciadas por vía nasal directa.
Regusto(sustantivo):
Conjunto de sensaciones percibidas después de haber desaparecido el
estímulode la bo ca, distintas a las percibidas previamente.
Es sinónimode dejo .1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 74
▼B
Aromático (adjetivo):
a) califica la propiedad de los cuerpos puros o mezclas que, al ser degus-
tados, producen las sensaciones calificadas como aroma;
b) califica a aquellos productos que, examinados por vía nasal directa,
producen sensaciones de fragancia y frescor.
Textura(sustantivo):
características del estado sólido o reológico de un producto, cuyo
conjunto es capaz de estimular los receptores mecánicos, durante la
degustación, particularmente de los situados en la región bucal.
Nota:Este término se refiere únicamente a las propiedades objetivas y no
a las sensaciones producidas y que se designan por términos gene-
rales, tales como consistencia, fibrosidad, untuosidad, etc.
Paladear:
acción de conseguir que un alimento situado en la boca entre en contacto
con todas las zonas sensibles de la misma, con objeto de percibir las
sensaciones bucales que produce.
Nota:Este vocabulario puede ampliarse consultando las Normas ISO
5492/I, II, III, IV, V y otras existentes, tales como el elaborado
por J.L. Magnen «Les cahiers techniques du Centre national de
coordination des etudes et recherches sur la nutrition et l'alimenta-
tion», etc.
COPAPARALADEGUSTACIÓNDEACEITES
1. OBJETO
La presente norma tiene por objeto describir las características de la copa,
destinada al análisis organoléptico de los aceites comestibles (olor, sabor,
flavor).
Describe, además, el dispositivo de calentamiento adaptado, necesario
para la obtención y el mantenimiento de la temperatura adecuada para
este análisis.
2. DESCRIPCIÓN
El esquema diseñadode la figura 1 pretende o ptimizar las características
deseables en un utensiliode esta naturaleza, y que pueden co ncretarse en
los puntos siguientes:
a) máxima estabilidad, dificultandosu inclinación y derramamientodel
aceite contenido;
b) fondo fácilmente adaptable a los huecos del bloque de calefacción que
permite el calentamiento homogéneo de la base de la copa;
c) estrechamiento de la boca que favorece la concentración de olores y
facilita su identificación;
d) de vidrio oscuro que no permita al catador percibir el color del aceite,
impidiéndole cualquier prejuicio y la posible creación de sesgos o
tendencias que puedan afectar a la objetividad de la determinación.
2.1.Dimensiones
El esquema de la copa va representado en la figura 1, teniendo las dimen-
siones siguientes:
— capacidad total ….............................. 130 ml ± 10 ml,
— altura total ….................................. 60 mm ± 1 mm,— diámetrode la bo ca …......................... 50 mm ± 1 mm,— diámetrode la parte más ancha ….............. 70 mm ± 1 mm,— diámetrode la base …......................... 35 mm ± 1 mm,— espesor de vidrio en las paredes laterales ….... 1,5 mm ± 0,2 mm,— espesor de vidrio en el fondo …................ 5 mm ± 1 mm.
Cada copa irá acompañada de un vidrio de reloj cuyo diámetro será de
unos 10 mm superior al de su boca. Este vidrio servirá de tapa para evitar
la pérdida de aroma y la entrada de polvo.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 75
▼B
2.2.Característicasdefabricación
La copa deberá estar fabricada con vidrio resistente; de color oscuro que
impida apreciar la coloración de su contenido, exento de rayas o
burbujas.
El borde deberá ser regular, liso y rebordeado.La pieza deberá estar recocida, permitiéndole resistir las variaciones de
temperatura que ha de sufrir en los ensayos.
2.3.Normasparalautilización
La limpieza de las copas deberá realizarse utilizando jabón o detergente
no perfumados, enjuagándose a continuación repetidas veces hasta
eliminar totalmente el agente de limpieza. Se enjuaga finalmente con
agua destilada, se deja escurrir y se seca en una estufa de desecación.
No deben utilizarse ácidos concentrados ni mezcla crómica.Las copas deben mantenerse en la estufa hasta su utilización, o conser-
varse en un armario protegiéndolas de toda contaminación de olores
extraños.
Antes de cada utilización, deberá olerse cada copa, con el fin de
comprobar la ausencia de cualquier olor extraño. Al preparar el ensayo
se tendrá mucho cuidado de anotar la clave de cada copa y el aceite que
le corresponde. Esta correspondencia clave/aceite sólo será conocida por
el organizador del ensayo.
3. DISPOSITIVO DE CALENTAMIENTO DE LAS MUESTRAS
El examen organoléptico de las muestras deberá efectuarse a una tempe-
ratura determinada que, para los aceites comestibles, debe ser de 28 ± 2 ºC.
Para conseguir esto, deberá instalarse en el interior de cada cabina, al
alcance del catador, un dispositivo de calefacción como el representado
en la figura 2. Consiste en un bloque de aluminio sumergido en un baño
de agua regulado termostáticamente, con el objeto de obtener una tempe-
ratura uniforme. Este bloque lleva una serie de oquedades a las que se
adaptan los fondos de las copas. La diferencia de temperatura entre el
dispositivo de calentamiento y el aceite de las copas colocadas en las
oquedades de los distintos bloques no debe ser superior a ± 2 ºC.
Figura1—Copadedegustación
Dimensiones (en mm)1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 76
▼B
Figura 2 — Dispositivo de calentamiento de las muestras (Dimen-
sionesenmilímetros)
GUÍAPARALAINSTALACIÓNDEUNASALADECATA
1. INTRODUCCIÓN
La sala de cata tiene por objeto proporcionar al grupo de catadores que
intervienen en los ensayos sensoriales un ambiente adecuado, cómodo y
normalizado que facilite el trabajo y tienda a mejorar la repetitividad y
reproducibilidad de los resultados.
2. OBJETO
La presente norma tiene por objeto precisar las condiciones básicas a que
debe atenerse la instalación de una sala de cata.
3. ESPECIFICACIONES GENERALES DE LA INSTALACIÓN
Un local, cualquiera que sea su superficie, deberá responder a las especi-
ficaciones siguientes:
El local deberá ser agradable y estar convenientemente iluminado, pero
conservando un carácter neutro. Con este fin, se recomienda un color1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 77
▼B
relajante, lisoy claroen las paredes para que se cree una atmósfera de
distensión(1).
El local será de fácil limpieza y estará aislado de cualquier fuente de
ruido; por tanto, preferentemente insonorizado. Estará igualmente aislado
de olores extraños por lo que, a ser posible, estará provisto de un dispo-
sitivo eficaz de ventilación. Si las oscilaciones de la temperatura
ambiental lo aconsejan, la sala de cata deberá dotarse de aire acondicio-
nadoque mantenga el ambiente próximoa 20-22 ºC.
3.1.Dimensiones
Las dimensiones del local dependen frecuentemente de las disponibili-
dades de los laboratorios o de las empresas. En general, deberá ser lo
suficientemente espacioso para permitir la instalación de unas diez
cabinas y también de una zona para la preparación de las muestras.
Sin embargo, es evidente que cuanto mayor sea el espacio dedicado a las
instalaciones, mejor será, ya que así se podrán prever dependencias
anexas para, por ejemplo, limpieza del material, colocación de prepara-
ciones culinarias y reuniones de «paneles abiertos».
3.2.Iluminación
La iluminación general, ya provenga de la luz solar o de lámparas (por
ejemplo, lámparas de tubo tipo «luz de día») será uniforme, regulable y
con luz difusa.
3.3.Temperaturayestadohigrométrico
El local se mantendrá continuamente en condiciones térmicas e higromé-
tricas agradables. Salvocircunstancias especiales, se reco mienda una
temperatura de 20-22 ºC y un estadohigro métricode 60 a 70 % de
humedad relativa.
4. DESCRIPCIÓN DE LAS CABINAS
4.1.Característicasgenerales
Las cabinas se situarán en el local una al lado de otra, serán idénticas
entre sí y estarán separadas unas de otras por mamparas lo suficiente-
mente altas y anchas para aislar a los catadores entre sí, una vez
sentados. Se pueden construir de cualquier material apropiado y de fácil
limpieza y conservación (por ejemplo: madera, contra-chapado vitrifi-
cado, paneles laminados, etcétera). Si se utilizan pinturas, éstas deberán,
después de secas, ser totalmente inodoras.
Los asientos previstos en cada cabina serán cómodos y de altura regu-
lable.
También hay que prever que en cada una de ellas el alumbradosea indi-
vidual, regulable en dirección e intensidad.
Es muy recomendable que las cabinas estén provistas de un pulsador
conectado a un dispositivo luminoso exterior que permita al catador
comunicar a la persona que lo atiende desde el exterior, sin distraer a
los demás, que ha terminado el ensayo, desea nuevas muestras, carece
de algún utensilio, ha observado alguna irregularidad, o desea alguna
información, etc.
4.2.Dimensiones
Las cabinas serán suficientemente amplias y confortables.En general, se mantendrán las siguientes dimensiones:
— ancho:
0,75 m (sin pila en la mesa),0,85 m (con pila en la mesa);
— fondo:
0,50 m (la mesa),0,20 m excesode la mampara;
— altura de las mamparas:1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 78
(1) El color de la habitación y su iluminación pueden influir en los resultados del análisis
sensorial.
▼B
0,60 m mínimoa partir de la mesa;
— altura de la mesa:
0,75 metros.
4.3.Disposición
La superficie de la mesa será de fácil limpieza.Una parte de esta superficie debe reservarse para una pila dotada de agua
corriente potable. Sin embargo, si esto no es factible, se reservará este
espacio para la colocación de una cubeta, escupidera o similar.
Cuandose deban mantener las muestras, mientras se realiza la prueba a
temperatura constante superior o inferior al ambiente, conviene disponer
de un equipoadecuadopara tal fin (bañoMaría, placa calefacto ra, etc.).
También se puede instalar una repisa, a una altura aproximada del suelo
de 1,10 metros, para colocar en ella diferentes accesorios (vasos, material
menudo, etc.).
Si la disposición de las cabinas en la sala lo permite, es conveniente
instalar un dispositivo para facilitar la presentación de las muestras. Este
puede ser en forma de corredera (figura 1), de torno vertical (figura 2)
indicado para vasos o copas (recipientes altos), o de torno horizontal
cuando los recipientes en que se sirven las muestras tienen poca altura
(figura 3). Sencillamente, que posea hueco suficiente para el paso de las
bandejas y copas que contengan las muestras a examinar.
5. LOCALES COMPLEMENTARIOS
Si se dispone de espacio suficiente, conviene contar con locales separados
para preparación de muestras (cocina experimental si se prevén ensayos
culinarios u otros), estanterías para la colocación de vasos o utensilios y
salas de reunión para las discusiones previas o posteriores a los ensayos.
En estos casos dichos locales se mantendrán limpios y en ningún caso
podrán molestar el trabajo de los jueces, en la sala de cata, con sus
olores, ruidos, o con la conversación de los reunidos.
Véase en la figura 4 un ejemplo de sala de cata e instalaciones comple-
mentarias.
Nota:Las condiciones descritas son las ideales; pero si no fuese posible
disponer de una instalación semejante reservada únicamente para
el análisis sensorial, los ensayos podrían realizarse en un local
que reúna las condiciones mínimas descritas (luz, temperatura,
ruido, olores), instalando cabinas móviles a partir de elementos
plegables de tal forma que permitan, como mínimo aislar entre sí
a los catadores.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 79
▼B
DISPOSICIÓN DE LA CABINA
Figura1
1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 80
▼B
TORNO DE PRESENTACIÓN DE LAS MUESTRAS
Figura2
1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 81
▼B
TRAMPILLA DE PRESENTACIÓN DE LAS MUESTRAS
Figura3
1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 82
▼B
LABORATORIO DE ANÁLISIS SENSORIAL
Figura4— Ejemplo de sala de cata
1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 83
▼B
ANEXO XIII
PRUEBADEREFINACIÓN
1. NEUTRALIZACIÓN Y DECOLORACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA
EN LABORATORIO
1.1.Neutralizacióndelaceite
1.1.1. Equipo
— vasode 300 ml de fo rma alta,
— centrífuga con tubos de 100 ml,
— vasode 250 ml,
— matraces de 100 ml,
— ampolla de decantación de 1 litro.
1.1.2. Reactivos
— solución acuosa de hidróxido de sodio al 12 %,
— solución etanólica al 1 % de fenolftaleína,
— hexanopara análisis,
— alcohol isopropílico puro para análisis.
1.1.3. Modo de operar
a)Aceites de acidez expresada en ácido oleico inferior al 30%
Introducir en un vaso de 300 ml de forma alta, 50 g de aceite bruto y
calentar a 65 ºC al bañoMaría. Agitar lentamente, y añadir una
cantidad de solución de hidróxido de sodio al 12 % que corresponda
a la acidez libre del aceite con un exceso del 5 %. Continuar agitando
durante cincominuto s, manteniendola temperatura a 65 ºC.
Trasladar el total a unos tubos de centrífuga de 100 ml, separar la
masa jabonosa por centrifugación. Verter el aceite decantado en un
vasode 250 ml y lavar co n 50-60 ml de agua destilada hirviendo
eliminando durante este proceso la capa acuosa con la ayuda de un
sifón. Repetir los lavados hasta eliminar completamente los restos de
jabon residual (desaparición de la coloración rosa en la fenolftaleína).
Centrifugar el aceite para eliminar las pequeñas cantidades de agua
residual.
b)Aceites de acidez expresada en ácido oleico superior al 30%
Introducir en una ampolla de decantación de un litro, 50 g de aceite
bruto, 200 ml de hexano, 100 ml de alcohol isopropílico y una
cantidad de solución de hidróxido de sodio al 12 % que corresponda
a la acidez libre del aceite, con un exceso del 0,3 %. Agitar enérgica-
mente durante un minuto. Añadir 100 ml de agua destilada, agitar de
nuevoy dejar repo sar.
Después de la separación de las capas, dejar salir la capa inferior que
contiene los jabones. Entre ambas capas (aceitosa por encima y acuosa
por debajo) se forma frecuentemente una capa intermedia constituida
por mucílagos y sustancias insolubles que deberá eliminarse igual-
mente
Proceder a continuación al lavado de la solución hexánica de aceite
neutro con porciones de 50-60 ml de una solución de alcohol isopropí-
lico/agua destilada 1/1 (v/v) hasta la desaparición de la coloración
rosa en la fenolftaleína. Proceder a continuación a la eliminación
completa del hexano por destilación en vacío (por ejemplo, en el rota-
vapor).
1.2.Decoloracióndelaceiteneutro
1.2.1. Equipo
— matraz de 250 ml con 3 bocas que permitan la inserción de:
a) un termómetrograduadoen grado s que permita hacer lecturas
hasta 90 ºC,
b) un agitador mecánico que gire a 250-300 vueltas por minuto equi-
pado para el funcionamiento en vacio,
c) un rácor hacia la bomba de vacío,1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 84
▼B
— bomba de vacio, provista de un manómetro, capaz de lograr presiones
residuales de 15-30 milibares.
1.2.2. Modo de operar
Pesar en el matraz de 3 bocas cerca de 100 g del aceite neutralizado.
Insertar el termómetro y el agitador, volver a unir a la bomba de vacíoy calentar hasta 90 ºC agitándolo.
Mantener dicha temperatura, siempre bajoagitación, hasta que el aceite
que deba analizarse esté completamente liberado de su humedad (treinta
minutos aproximadamente).
Interrumpir entonces el vacío y añadirle 2 a 3 g de tierra activada. Resta-
blecer el vacíohasta o btener una presión residual de 15-30 milibares y,
siempre con una temperatura de 90 ºC, agitar durante 30 minutos a 250
vueltas por minuto aproximadamente.
Filtrar a continuación en caliente en un baño termoestático (50-60 ºC).1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 85
▼B
ANEXO XIV
NOTAS COMPLEMENTARIAS 2, 3 Y 4 DEL CAPÍTULO 15 DE LA
NOMENCLATURACOMBINADA
1.«Nota 2A: Sólo se considerará “aceite de oliva”, para la aplicación de los
códigos NC 1509 y 1510, el aceite que proceda exclusivamente
del tratamiento de aceitunas, con exclusión del aceite de oliva
reesterificado y de cualquier mezcla de aceite de oliva con aceites
de otra naturaleza.
La presencia de aceite de oliva reesterificado o de aceites de otra
naturaleza se comprobará con los métodos recogidos en los
Anexos V, VII, IX, X y XII. En el cuadro siguiente figuran las
características analíticas del contenido de esteroles y ácidos
grasos común a todos los aceites de oliva pertenecientes a los
códigos NC 1509 y 1510.
Cuadro I: contenido de ácidos en % Cuadro II: Contenido de esteroles en %
Ácido mirístico M 0,1 Colesterol M 0,5
Ácido linolénico M 0,9 Brasicasterol M 0,2
Ácidoaraquídico M 0,7 Campestero l M 4,0Ácido eicosánico M 0,5 Estigmasterol < Campesterol
Ácidobehénico M 0,3 β-sitosterol (
1) m 93,0
Ácidoligno cérico M 0,5 ∆-7-estigmasterol M 0,5
m = mínimo.
M = máximo.
(1)∆-5,23-Estigmasterol + Colesterol + β-sitosterol + Sitostanol + ∆-5-Avenasterol + ∆-5-24-Estig-
mastadienol.
Nota 2B: Se considerarán “aceites de oliva vírgenes” los obtenidos a partir
del fruto del olivo únicamente por procedimientos mecánicos u
otros procedimientos físicos, en condiciones, sobre todo térmicas,
que noimpliquen la alteración del aceite, y que nohayan sufrido
tratamientoalgunodistintodel lavado , la decantación, el centrifu-
gado y el filtrado, con exclusión de los aceites obtenidos mediante
disolventes (código NC 1510) que se definen a continuación en los
puntos I y II.
I. Se considerará “aceite de oliva virgen lampante”, para la apli-
cación del códigoNC 15091010, cualquiera que sea su acidez,
el aceite que presente las siguientes características:
a) un contenido de alcoholes alifáticos de 400 mg/kg como
máximo;
b) un contenido de eritrodiol y uvaol del 4,5 % como máximo;
c) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de
los triglicéridos del 1,3 % como máximo;
d) ouna de las características siguientes:
— d1) un índice de peróxidos superior a 20 meq 02/kg;
— d2) un contenido total de solventes halogenados volátiles
superior a 0,2 mg/kg y/o que alguno de ellos sea
superior a 0,1 mg/kg;
— d3) un coeficiente de extinción K270superior a 0,25 y,
después de tratar el aceite con alúmina activada, no
superior a 0,11. Algunos aceites con un contenido de
ácidos grasos libres, expresado en ácido oleico, supe-
rior a 3,3 g por cada 100, pueden tener, después de
pasar sobre la alúmina activada, de acuerdo con el
método recogido en el Anexo XV, un coeficiente de
extinción K270superior a 0,11. En tal caso, después
de neutralizarlos y decolorarlos en el laboratorio,
deberán presentar las siguientes características:
— un coeficiente de extinción K270inferior o igual a
1,20,1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 86
▼B
— una variación ( ∆K) del coeficiente de extinción
en un entorno de 270 nanómetros superior a
0,01 e inferior o igual a 0,16;
siendo:
∆K=Km− 0,5 (Km−4+Km+4)
Km= coeficiente de extinción con la longitud de
onda del vértice máximo de la curva de absor-
ción en un entorno de 270 nm,
Km−4yKm+4= coeficientes de extincíon con
longitudes de onda inferiores y superiores en
4 nm a la de Km.
— d4) características organolépticas con defectos que
puedan percibirse con una intensidad superior a la
aceptable medida con una puntuación inferior a 3,5
en la cata.
II. Se considerará “aceite de oliva virgen”, para la aplicación del
códigoNC 15091090, el aceite de o liva que presente las
siguientes características:
a) una acidez máxima, expresada en ácido oleico, de 3,3 g por
cada 100;
b) un índice de peróxidos de 20 meq 02/kg como máximo;
c) un contenido de alcoholes alifáticos de 300 mg/kg como
máximo;
d) un contenido total de solventes halogenados volátiles que no
exceda de 0,2 mg/kg, y siempre que noexceda de 0,1 mg/kg
en cada unode ello s;
e) un coeficiente de extinción K270de 0,250 como máximo y,
después de tratar el aceite con alúmina activada, de 0,10
como máximo(1);
f) una variación del coeficiente de extinción ( ∆K) en la zona
de 270 nanómetros de 0,010 como máximo;
g) características organolépticas con defectos que puedan perci-
birse con una intensidad inferior a la aceptable medida con
una puntuación superior a 3,5 en la cata;
h) un contenido de eritrodiol y uvaol del 4,5 % como máximo;
i) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de
los triglicéridos del 1,3 % como máximo.
Nota 2C: Se incluirá en el código NC 1509 1090 el aceite de oliva obtenido
por tratamiento de los aceites de los códigos NC 1509 1010 o
1509 1090, incluso con adición de aceite de oliva virgen, que
presente las siguientes características:
a) una acidez máxima, expresada en ácido oleico, de 3,3 g por
cada 100;
b) un contenido de alcoholes alifáticos de 350 mg/kg como
máximo;
c) un coeficiente de extinción K270superior a 0,25 pero no a 1,20
y, después de pasar la muestra de aceite sobre la alúmina acti-
vada, superior a 0,10;
d) una variación del coeficiente de extinción ( ∆K) en la zona de
270 nanómetros superior a 0,01 pero no a 0,16;
e) un contenido de eritrodiol y uvaol del 4,5 % como máximo;
f) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de los
triglicéridos del 1,5 % como máximo.
Nota 2D: Se considerarán “aceites crudos” del código NC 1510 0010 los
aceites, principalmente los aceites de orujo, que presenten las
siguientes características:
a) una acidez, expresada en ácido oleico, superior a 2 gr por cada
100;
b) un contenido de eritrodiol y uvaol superior al 12 %;
c) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 del
triglicérido del 1,8 % como máximo.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 87
(1) Cuandoel K270sea superior a 0,25 se procederá a una nueva determinación utilizando
el tratamientoco n alúmina; el K270nodeberá so brepasar 0,10.
▼B
Nota 2E: Se considerarán aceites del código NC 15100090 los aceites obte-
nidos por tratamiento de los aceites del código NC 15100010,
incluso con adición de aceites de oliva vírgenes, que no posean
las características de los aceites que figuran en los puntos I y II y
siempre que presenten un contenido de ácidos grasos saturados en
la posición 2 de los triglicéridos del 2 % como máximo.».
2.«Nota 3: Se excluirán de los códigos NC 15220031 y 15220039:
a) los residuos procedentes del tratamiento de grasas que
contengan aceite cuyo índice de yodo, determinado por el
método que figura en el Anexo XVI, sea inferior a 70 o superior
a 100;
b) los residuos procedentes del tratamiento de grasas que
contengan aceite cuyo índice de yodo esté comprendido entre
70 y 100, pero en los que la superficie del pico correspondiente
al volumen de retención de beta-sitosterol, determinada de
acuerdo con las disposiciones del Anexo V del Reglamento
mencionado en la nota complementaria 4 siguiente, represente
menos del 93 % de la superficie total de los picos de los este-
roles.».
3.«Nota 4: Los métodos de análisis para determinar las características de los
productos contemplados anteriormente son los previstos en los
Anexos del Reglamento (CEE) no2568/91.».1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 88
▼B
ANEXO XV
1. CONTENIDO EN ACEITE DE LOS ORUJOS DE ACEITUNA
1.1.Material
— aparatode extracción apro piadotipo ►C1soxhlet ◄, provisto de un
matraz de 200 a 250 ml,
— bañopo r calefacción eléctrica (bañode arena, bañode agua, etc.) o
placa calefactora,
— balanza analítica,— estufa regulada a 80 ºC como máximo,— estufa de calefacción eléctrica provista de un dispositivo de termorregu-
lación regulada a 103 ºC ± 2 ºC y que permita realizar una insuflación
de aire ouna presión reducida,
— triturador mecánico fácil de limpiar y que permita el triturado del orujo
sin calentamientoy sin disminución sensible de su co ntenidoen agua yen aceite,
— cartucho de extracción y algodón hidrófilo o papel filtro, exentos de
productos extraíbles por el hexano,
— desecador,— criba con agujeros de 1 mm de diámetro,
— piedra pómez en pequeños granos, previamente secada.
1.2.Reactivo
n-hexano técnico cuyo residuo en evaporación completa deberá ser inferior
a 0,002 g para 100 ml.
2. MODO DE OPERAR2.1.Preparacióndelamuestraparaensayo
Triturar la muestra para laboratorio, si fuera necesario, en el triturador
mecánico, previamente bien limpio, para reducirla a partículas que puedan
atravesar completamente la criba.
Utilizar aproximadamente una vigésima parte de la muestra para completar
la limpieza del triturador, tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo,
mezclarloco n cuidadoy analizarlosin demo ra.
2.2.Tomademuestra
Pesar inmediatamente después del triturado, alrededor de 10 g de la
muestra para ensayo con una aproximación de 0,01 g.
2.3.Preparacióndelcartuchodeextracción
►
C1colocar la muestra en el cartucho y taparla con el tapón ◄de
algodón hidrófilo. En caso de haber utilizado papel de filtro, envolver la
muestra molida en dicho papel.
2.4.Presecado
Cuando el orujo esté muy húmedo (contenido en agua y en materias
volátiles superior al 10 %), efectuar un presecado colocando durante un
tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa
calentada a 80 ºC como máximo, para llevar el contenido en agua y en
materias volátiles por debajo del 10 %.
2.5.Preparacióndelmatraz
Pesar con aproximación de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de
piedra pómez, previamente secadoen la estufa a 103 ºC ± 2 ºC y después
enfriado durante al menos una hora en el desecador.
2.6.Primeraextracción
Colocar en el aparato de extracción el cartucho (o el papel de filtro) que
contenga la muestra. Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano.
►C1Adaptar ◄el matraz al aparato de extracción y colocarlo todo sobre
la placa calefactora. Llevar la calefacción a tal estado que el caudal de
reflujo sea al menos de tres gotas por segundo (ebullición moderada, no
tumultuosa).1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 89
▼B
Después de cuatroho ras de extracción, dejar enfriar. Quitar el cartuchodel
aparato de extracción y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la
mayor parte del disolvente que lo impregna.
2.7.Segundaextracción
Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea
posible. Colocar de nuevo cuantitativamente la mezcla en el cartucho y ésta
en el aparatode extracción.
Empezar de nuevo la extracción durante dos horas más, utilizando el
mismomatraz co nteniendola primera extracción.
La solución obtenida en el matraz de extracción deberá ser límpida. Si no
fuere así, filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer
matraz y el papel de filtro con hexano. Recoger el filtrado y el disolvente
en un segundomatraz previamente secadoy taradoapro ximadamente a
1 mg.
2.8.Eliminacióndeldisolventeypesadadelextracto
Eliminar en el equipo de extracción la mayor parte del disolvente. Eliminar
los últimos restos de éste calentando el matraz en la estufa a 103 ºC ± 2 ºC
durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminación, ya sea insuflando aire de
vez en cuandoopreferiblemente un gas inerte, oactuandobajouna presión
reducida.
Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora, y
pesarlo con una precisión de 1 mg aproximadamente.
Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas condiciones, dejar enfriar en
el desecador y pesar.
La diferencia entre los resultados de estas dos pesadas deberá ser inferior o
igual a 10 mg, si no, calentar de nuevo durante períodos de diez minutos
seguidos de enfriamento y pesada, hasta que la diferencia de peso sea, a
lo sumo, de 10 mg. Seleccionar la última pesada del matraz.
Efectuar dos determinaciones.
3. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
3.1.Mododecálculoyfórmula
a) El extractoexpresadoen pesodel pro ductotal cual será igual a:
S=m1×100
m0
donde: S es el porcentaje en peso del extracto del producto tal cual,
m0es el peso, en gramos, de la muestra,
m1es el peso, en gramos, del extracto seco.
Tomar como resultado la media aritmética de las dos determinaciones,
si las condiciones de repetitividad se cumplen.
Expresar el resultado con un solo decimal.
b) El extracto se relacionará con la materia seca utilizando la siguiente
fórmula:
S×100
100 − U= % grasa sobre extracto seco
donde: S es el procentaje en peso de extracto del producto tal cual ver
a),
U es su contenido en agua y en materias volátiles.
3.2.Repetitividad
La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones, efectuadas
simultáneamente o rápidamente la una a continuación de la otra mediante
el mismo análisis, no deberá ser superior a 0,2 g de extracto de hexano por
cada 100 g de muestra.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 90
▼B
En caso contrario, repetir sobre otras dos tomas de muestra. Si esta vez la
diferencia es de nuevo superior a 0,2 g tomar como resultado la media arit-
mética de las cuatrodeterminacio nes efectuadas.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 91
▼B
ANEXO XVI
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEYODO
1. OBJETO
La presente norma internacional especifica un método para la determina-
ción del índice de yodo de las grasas y aceites animales y vegetales, en lo
sucesivo denominados grasas.
2. DEFINICIÓN
A los fines de la presente norma internacional, se aplicará la definición
siguiente:
2.1.Índice de yodo: el peso de yodo absorbido por la muestra en las condi-
ciones de trabajo que se especifican en la presente norma internacional.
El índice de yodo se expresa en gramos de yodo por 100 gr de muestra.
3. PRINCIPIO
Disolución de la muestra problema y adición de reactivo de Wijs. Una vez
transcurrido el tiempo que se especifica, adición de solución acuosa de
yoduro potásico y valoración del yodo liberado con solución de tiosulfato
sódico.
4. REACTIVOS
Todos los reactivos serán de calidad analítica reconocida.
4.1. Yoduro potásico, solución de 100 g/l, exento de yodatos o de yodo libre.
4.2. Engrudode almidón.
Mezclar 5 g de almidón soluble con 30 ml de agua, añadir esta mezcla a
1 000 ml de agua en ebullición, hervir durante 3 minutos y dejar enfriar.
4.3. Solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico.
c (Na2S2O3.5 H2O) = 0,1 mol/l, valorada como máximo 7 días antes de su
uso.
4.4. Disolvente, preparado mezclando volúmenes iguales de ciclohexano y
ácidoacético .
4.5. Reactivo de Wijs, que contenga monocloruro de yodo en ácido acético. Se
utilizará reactivo de Wijs comercializado.
Nota:El reactivoco ntiene 9 g de ICl3+ 9 g de I en ácidoacético .
5. MATERIAL
Material ordinario de laboratorio y, en particular, lo siguiente:
5.1. Navecillas de vidrio, apropiadas para la muestra problema y que puedan
introducirse en los matraces (5.2).
5.2. Matraces erlenmeyer de 500 ml de capacidad con boca esmerilada,
provistos de sus correspondientes tapones de vidrio y perfectamente secos.
6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ►C1PROBLEMA ◄.
►C1La muestra homogeneizada, se seca sobre sulfato sódico y se
filtra◄.
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Tamañode la muestra
El peso de la muestra varía en función del índice de yodo previsto, como se
indica en el cuadro1.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 92
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Cuadro 1
Índice de yodo previsto Peso de la muestra problema
menos de 5 3,00 g
5—20 1,00 g
21—50 0,40 g
51—100 0,20 g
101—150 0,13 g
151—200 0,10 g
Pesar la muestra problema con precisión de 0,1 mg en una
►C1navecilla ◄de vidrio5.1.
7.2. Determinación
Introducir la muestra problema en un matraz de 500 ml (5.2). Añadir 20 ml
del disolvente (4.4) para disolver la grasa. Agregar exactamente 25 ml del
reactivo de Wijs (4.5), tapar el matraz, agitar el contenido y colocar el
matraz al abrigode la luz. Nodeberá utilizarse la bo ca para pipetear el
reactivode Wijs.
Preparar del mismo modo un ensayo en blanco con el disolvente y el reac-
tivo, pero sin la muestra problema.
Para las muestras con un índice de yodo inferior a 150, mantener los
matraces en la oscuridad durante 1 hora; para las muestras con un índice
de yodo superior a 150, así como en el caso de productos polimerizados o
considerablemente oxidados, mantener en la oscuridad durante 2 horas.
Una vez transcurrido el tiempo correspondiente, agregar a cada uno de los
matraces 20 ml de solución de yoduro potásico (4.1) y 150 ml de agua.
Valorar con la disolucion de tiosulfato sódico (4.3) hasta que haya desapa-
recido casi totalmente el color amarillo producido por el yodo. Añadir unas
gotas de engrudo de almidón (4.2) y continuar la valoración hasta el
momento preciso en que desaparezca el color azul después de una agitación
muy intensa.
Nota:Se permite la determinación potenciométrica del punto final.
7.3. Númerode determinacio nes
Efectuar 2 determinaciones de la muestra problema.
8. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
El índice de yodo se expresa del siguiente modo:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
p
siendo:
c: valor numérico de la concentración exacta, expresada en moles por
litro, de la solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico (4.3)
utilizada;
V1: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para el ensayo en blanco;
V2: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para la determinación;
p: valor numérico del peso, expresado en gramos, de la muestra
problema (7.1).
Se tomará como resultado la media aritmética de las dos determinaciones,
siempre que se cumpla el requisitoestablecidoco n respectoa la repetibi-
lidad.1991R2568 — ES — 03.07.1992 — 003.001 — 93