2009R0152 — ES — 12.02.2013 — 002.001

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►B REGLAMENTO (CE) no152/2009 DE LA COMISIÓN de 27 de enero de 2009. por el que se establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los piensos (Texto pertinente a efectos del EEE) (DO L 054, 26.2.2009, p.1)

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▼B

REGLAMENTO (CE) no152/2009 DE LA COMISIÓN

de 27 de enero de 2009.

por el que se establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los piensos

(Texto pertinente a efectos del EEE)







LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS, Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea, Visto el Reglamento (CE) no 882/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 29 de abril de 2004, sobre los controles oficiales efectuados para garantizar la verificación del cumplimiento de la legislación en materia de piensos y alimentos y la normativa sobre salud animal y bienestar de los animales ( 1 ), y, en particular, su artículo 11, apartado 4, letras a), b) y c), Considerando lo siguiente: (1) Los actos que se citan a continuación se adoptaron para implementar la Directiva 70/373/CEE y siguen estando en vigor según el artículo 62, apartado 2, del Reglamento (CE) no 882/2004: — Primera Directiva 71/250/CEE de la Comisión, de 15 de junio de 1971, por la que se determinan métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales ( 2 ), — Segunda Directiva 71/393/CEE de la Comisión, de 18 de noviembre de 1971, por la que se establecen métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales ( 3 ), — Tercera Directiva 72/199/CEE de la Comisión, de 27 de abril de 1972, por la que se determinan métodos de análisis comunitario para el control oficial de los alimentos para animales ( 4 ), — Cuarta Directiva 73/46/CEE de la Comisión, de 5 de diciembre de 1972, por la que se determinan métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales ( 5 ), — Primera Directiva 76/371/CEE de la Comisión, de 1 de marzo de 1976, sobre determinación de modos comunitarios de toma de muestras para el control oficial de la alimentación animal ( 6 ), — Séptima Directiva 76/372/CEE de la Comisión, de 1 de marzo de 1976, sobre determinación de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de la alimentación animal ( 7 ), — Octava Directiva 78/633/CEE de la Comisión, de 15 de junio de 1978, por la que se fijan los métodos de análisis comunitario para el control oficial de los alimentos para animales ( 8 ), — Novena Directiva 81/715/CEE de la Comisión, de 31 de julio de 1981, por la que se establecen métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales ( 9 ), — Décima Directiva 84/425/CEE de la Comisión, de 25 de julio de 1984, por la que se fijan métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales ( 10 ), — Directiva 86/174/CEE de la Comisión, de 9 de abril de 1986, por la que se fija el método de cálculo del valor energético de los piensos compuestos destinados a las aves de corral ( 11 ), — Undécima Directiva 93/70/CEE de la Comisión, de 28 de julio de 1993, por la que se fijan métodos de análisis comunitario para el control oficial de los alimentos para animales ( 12 ), — Duodécima Directiva 93/117/CE de la Comisión, de 17 de diciembre de 1993, por la que se fijan métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales ( 13 ), — Directiva 98/64/CE de la Comisión, de 3 de septiembre de 1998, por la que se fijan métodos de análisis comunitarios para determinar la existencia de aminoácidos, de grasa bruta y de olaquindox en los alimentos para animales y se modifica la Directiva 71/393/CEE ( 14 ), — Directiva 1999/27/CE de la Comisión, de 20 de abril de 1999, por la que se fijan métodos de análisis comunitarios para la determinación de amprolio, diclazurilo y carbadox en los alimentos para animales y se modifican las Directivas 71/250/CEE, 73/46/CEE y se deroga la Directiva 74/203/CEE ( 15 ), — Directiva 1999/76/CE de la Comisión, de 23 de julio de 1999, por la que se fijan métodos de análisis comunitarios para la determinación de lasalocid sódico en los alimentos para animales ( 16 ), — Directiva 2000/45/CE de la Comisión, de 6 de julio de 2000, por la que se fijan métodos de análisis comunitarios para la determinación de vitamina A, vitamina E y triptófano en los piensos ( 17 ), — Directiva 2002/70/CE de la Comisión, de 26 de julio de 2002, por la que se establecen los requisitos para la determinación de los niveles de dioxinas y de PCB similares a las dioxinas en los piensos ( 18 ), — Directiva 2003/126/CE de la Comisión, de 23 de diciembre de 2003, relativa a los métodos de análisis para determinar los componentes de origen animal a los efectos del control oficial de los piensos ( 19 ). (2) Dado que la Directiva 70/373/CEE fue sustituida por el Reglamento (CE) no 882/2004, conviene reemplazar los actos de desarrollo de dicha Directiva por un único reglamento. Al mismo tiempo, es conveniente adaptar los métodos a los nuevos conocimientos científicos y tecnológicos. Los métodos que han dejado de ser válidos para el fin al que están destinados deben suprimirse. Aunque está previsto actualizar a su debido tiempo las disposiciones relativas al muestreo, a fin de tener en cuenta los últimos avances en las formas de producción, almacenamiento, transporte y comercialización de los piensos, conviene mantener por el momento las disposiciones existentes a este respecto. (3) Deben, pues, derogarse las Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE y 2003/126/CE. (4) Las medidas previstas en el presente Reglamento se ajustan al dictamen del Comité permanente de la cadena alimentaria y de sanidad animal. Considerando lo siguiente: HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:







Artículo 1

El muestreo para el control oficial de los piensos en lo que se refiere a la determinación de los componentes, los aditivos y las sustancias indeseables, con excepción de los residuos de plaguicidas y los microorganismos, se llevará a cabo de acuerdo con los métodos expuestos en el anexo I.

Artículo 2

La preparación de las muestras para el análisis y la expresión de los resultados se efectuarán conforme a los métodos expuestos en el anexo II.

Artículo 3

Los análisis para el control oficial de los piensos se realizarán aplicando los métodos expuestos en el anexo III (Métodos de análisis para el control de la composición de los materiales para piensos y los piensos compuestos), el anexo IV (Métodos de análisis para el control del nivel de aditivos autorizados en los piensos), el anexo V (Métodos de análisis para el control de sustancias indeseables en los piensos) y el anexo VI (Métodos de análisis para la determinación de componentes de origen animal con fines de control oficial de los piensos).

Artículo 4

El valor energético de los piensos compuestos para aves de corral se calculará conforme al anexo VII.

Artículo 5

Los métodos de análisis expuestos en el anexo VIII, utilizados para controlar la presencia ilícita de aditivos que ya no están autorizados en los piensos, se emplearán con fines de confirmación.

Artículo 6

Quedan derogadas las Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE y 2003/126/CE.

Las referencias a las Directivas derogadas se entenderán hechas al presente Reglamento y se leerán con arreglo a la tabla de correspondencias que figura en el anexo IX.

Artículo 7

El presente Reglamento entrará en vigor el vigésimo día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de la Unión Europea.

Será aplicable a partir del 26 de agosto de 2009

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.









ANEXO I

MÉTODOS DE MUESTREO

1. OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN

Las muestras destinadas al control oficial de los piensos se tomarán siguiendo los métodos que se describen a continuación. Las muestras así obtenidas se considerarán representativas de las porciones objeto de muestreo.

2. PERSONAL ENCARGADO DEL MUESTREO

La toma de muestras correrá a cargo de personas autorizadas al efecto por los Estados miembros.

3. DEFINICIONES

Lote objeto de muestreo: una cantidad de producto que constituye una unidad y tiene características presuntamente uniformes.

Muestra elemental: cantidad tomada en un punto del lote objeto de muestreo.

Muestra global: suma de las muestras elementales tomadas del mismo lote objeto de muestreo.

Muestra reducida: parte representativa de la muestra global, obtenida por reducción de esta.

Muestra final: parte de la muestra reducida o de la muestra global homogeneizada.

4. INSTRUMENTAL

4.1. El instrumental de muestreo debe estar hecho de materiales que no puedan contaminar los productos de los se hayan de tomar muestras. Este instrumental puede ser aprobado oficialmente por los Estados miembros.

4.2. Instrumental recomendado para el muestreo de piensos sólidos

4.2.1. Muestreo manual

4.2.1.1. Pala de fondo plano y bordes verticales

4.2.1.2. Sonda con hendidura larga o compartimentos. Las dimensiones de la sonda deben ajustarse a las características del lote objeto de muestreo (profundidad del recipiente, dimensiones del saco, etc.) y al tamaño de las partículas del pienso.

4.2.2. Muestreo mecánico

Podrán utilizarse aparatos mecánicos homologados para el muestreo de piensos en movimiento.

4.2.3. Divisor

Para tomar muestras elementales y preparar muestras reducidas y muestras finales podrán utilizarse aparatos diseñados para dividir la muestra en partes aproximadamente iguales.

5. REQUISITOS CUANTITATIVOS







5.A. En relación con el control de sustancias o productos repartidos de manera uniforme en el pienso 5.A.1. Lote objeto de muestreo El lote objeto de muestreo debe tener un tamaño que permita tomar muestras de todas las partes que lo compongan. 5.A.2. Muestras elementales 5.A.2.1. Piensos a granel Número mínimo de muestras elementales 5.A.2.1.1. Lotes objeto de muestreo que no superen las 2,5 toneladas Siete 5.A.2.1.2. Lotes objeto de muestreo que superen las 2,5 toneladas √ Veinte veces el número de toneladas que constituyen el lote objeto de muestreo (1), hasta un máximo de 40 muestras elementales 5.A.2.2. Piensos envasados Número mínimo de envases de los que deben tomarse muestras (2) 5.A.2.2.1. Envases con un contenido superior a 1 kg 5.A.2.2.1.1. Lotes objeto de muestreo compuestos de uno a cuatro envases Todos los envases 5.A.2.2.1.2. Lotes objeto de muestreo compuestos de cinco a 16 envases Cuatro 5.A.2.2.1.3. Lotes objeto de muestreo compuestos de más de 16 envases √ Número de envases que componen el lote objeto de muestreo (1), hasta un máximo de 20 envases 5.A.2.2.2. Envases de no más de 1 kg Cuatro 5.A.2.3. Piensos líquidos o semilíquidos Número mínimo de recipientes de los que deben tomarse muestras (2) 5.A.2.3.1. Recipientes de más de 1 l 5.A.2.3.1.1. Lotes objeto de muestreo compuestos de uno a cuatro recipientes Todos los recipientes 5.A.2.3.1.2. Lotes objeto de muestreo compuestos de cinco a 16 recipientes Cuatro 5.A.2.3.1.3. Lotes objeto de muestreo compuestos de más de 16 recipientes √ Número de recipientes que componen el lote objeto de muestreo (1), hasta un máximo de 20 recipientes 5.A.2.3.2. Recipientes de no más de 1 l Cuatro 5.A.2.4. Piensos en bloques y piedras para lamer de sales minerales Número mínimo de bloques o piedras para lamer de los que deben tomarse muestras (2): un bloque o una piedra para lamer por lote objeto de muestreo compuesto de 25 unidades, hasta un máximo de cuatro bloques o piedras. 5.A.3. Muestra global Se requiere una sola muestra global por cada lote objeto de muestreo. La cantidad total de las muestras elementales que constituyen la muestra global no será inferior a las cantidades siguientes: 5.A.3.1. Piensos a granel 4 kg 5.A.3.2. Piensos envasados 5.A.3.2.1. Envases de más de 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. Envases de no más de 1 kg Peso del contenido de cuatro envases originales 5.A.3.3. Piensos líquidos o semilíquidos: 5.A.3.3.1. Recipientes de más de 1 l 4 l 5.A.3.3.2. Recipientes de no más de 1 l Volumen del contenido de cuatro envases originales 5.A.3.4. Piensos en bloques o piedras para lamer 5.A.3.4.1. De un peso superior a 1 kg cada uno 4 kg 5.A.3.4.2. De un peso no superior a 1 kg cada uno El peso de cuatro bloques o piedras para lamer 5.A.4. Muestras finales La muestra global da lugar, una vez reducida si es necesario, a las muestras finales. Se requiere el análisis de, por lo menos, una muestra final. La cantidad de muestra final destinada al análisis no será inferior a lo que se indica a continuación: Piensos sólidos 500 g Piensos líquidos o semilíquidos 500 ml 5.B. En relación con el control de sustancias o productos indeseables que pueden estar repartidos de manera no uniforme en el pienso, como son las aflatoxinas, el cornezuelo del centeno, el ricino y las crotalarias en los materiales para piensos (3) 5.B.1. Lote objeto de muestreo: véase 5.A.1. 5.B.2. Muestras elementales 5.B.2.1. Piensos a granel: véase 5.A.2.1. 5.B.2.2. Piensos envasados Número mínimo de envases de los que deben tomarse muestras 5.B.2.2.1. Lotes objeto de muestreo compuestos de uno a cuatro envases Todos los envases 5.B.2.2.2. Lotes objeto de muestreo compuestos de cinco a 16 envases Cuatro 5.B.2.2.3. Lotes objeto de muestreo compuestos de más de 16 envases √ Número de envases que componen el lote objeto de muestreo (1), hasta un máximo de 40 envases 5.B.3. Muestras globales El número de muestras globales variará en función del tamaño del lote objeto de muestreo. A continuación se indica el número mínimo de muestras globales por cada lote objeto de muestreo. El peso total de las muestras elementales que componen cada muestra global no será inferior a 4 kg. 5.B.3.1. Piensos a granel Peso del lote objeto de muestreo en toneladas Número mínimo de muestras globales por cada lote objeto de muestreo hasta 1 1 más de 1 y hasta 10 2 más de 10 y hasta 40 3 más de 40 4 5.B.3.2. Piensos envasados Tamaño del lote objeto de muestreo en número de envases Número mínimo de muestras globales por cada lote objeto de muestreo 1 a 16 1 17 a 200 2 201 a 800 3 más de 800 4 5.B.4. Muestras finales Cada muestra global da lugar, una vez reducida, a las muestras finales. Se requiere el análisis de por lo menos una muestra final por cada muestra global. El peso de la muestra final destinada al análisis no puede ser inferior a 500 g. (1) Cuando la cifra obtenida sea un quebrado, deberá redondearse al siguiente número entero. (2) En el caso de envases o recipientes cuyo contenido no exceda de 1 kg o 1 l, y en el de los bloques o piedras para lamer que no pesen más de 1 kg cada uno, la muestra elemental estará formada por el contenido de un envase o recipiente original, o por un bloque o una piedra para lamer. (3) Los métodos presentados en 5.A se emplean para el control de las aflatoxinas, el cornezuelo del centeno, el ricino y las crotalarias en piensos completos y complementarios.

6. INSTRUCCIONES PARA LA TOMA, LA PREPARACIÓN Y EL ENVASADO DE LAS MUESTRAS

6.1. Generalidades

Las muestras deben tomarse y prepararse lo más rápidamente posible, tomando las precauciones necesarias para evitar que el producto se altere o contamine. Los instrumentos, así como las superficies y los recipientes destinados a recibir las muestras, deben estar limpios y secos.

6.2. Muestras elementales

6.2.A. En relación con el control de sustancias o productos repartidos de manera uniforme en el pienso

Las muestras elementales deben tomarse al azar en todo el lote objeto de muestreo y tener aproximadamente el mismo tamaño.

6.2.A.1. Piensos a granel

El lote objeto de muestreo deberá dividirse simbólicamente en varias partes aproximadamente iguales. Deberá seleccionarse al azar un número de partes que se corresponda con el número de muestras elementales requeridas en el punto 5.A.2, y de cada una de esas partes deberá tomarse al menos una muestra.

En su caso, el muestreo puede realizarse mientras el lote objeto de muestreo está en movimiento (carga o descarga).

6.2.A.2. Piensos envasados

Una vez seleccionado el número requerido de envases para muestreo según se indica en el punto 5.A.2, deberá tomarse parte del contenido de cada envase con una sonda o una pala. Si es necesario, las muestras se tomarán después de haber vaciado por separado los envases. Los grumos se desharán, si es necesario, apartándolos y devolviéndolos a la muestra, en cada muestra global por separado.

6.2.A.3. Piensos líquidos o semilíquidos homogéneos u homogeneizables

Una vez seleccionado el número requerido de recipientes para muestreo según se indica en el punto 5.A.2, deberá homogeneizarse el contenido, si es necesario, y tomarse una cantidad de cada recipiente.

Las muestras elementales pueden tomarse mientras se vacía el contenido.

6.2.A.4. Piensos líquidos o semilíquidos no homogeneizables

Una vez seleccionado el número requerido de recipientes para muestreo según se indica en el punto 5.A.2, se tomarán muestras en diferentes niveles.

También pueden tomarse muestras mientras se vacía el contenido, pero, en ese caso, deberán desecharse las primeras fracciones.

En cualquier caso, el volumen total recogido no debe ser inferior a 10 l.

6.2.A.5. Piensos en bloques y piedras para lamer de sales minerales

Una vez seleccionado el número requerido de bloques o piedras para muestreo según se indica en el punto 5.A.2, se tomará una parte de cada bloque o piedra para lamer.

6.2.B. En relación con el control de sustancias o productos indeseables que pueden estar repartidos de manera no uniforme en el pienso, como son las aflatoxinas, el cornezuelo del centeno, el ricino y las crotalarias en los materiales para piensos

El lote objeto de muestreo deberá dividirse simbólicamente en un número de partes aproximadamente iguales correspondiente al número de muestras globales que se establece en el punto 5.B.3. Si este número es mayor de uno, el número total de muestras elementales establecido en el punto 5.B.2 se distribuirá de manera aproximadamente igual en las diferentes partes. A continuación se tomarán muestras de aproximadamente el mismo tamaño ( 20 ), de manera que la cantidad total en las muestras de cada parte no sea inferior al mínimo de 4 kg requerido para cada muestra global. No se unirán muestras elementales tomadas de partes diferentes.

6.3. Preparación de muestras globales

6.3.A. En relación con el control de sustancias o productos repartidos de manera uniforme en el pienso

Las muestras elementales se mezclarán para formar una sola muestra global.

6.3.B. En relación con el control de sustancias o productos indeseables que pueden estar repartidos de manera no uniforme en el pienso, como son las aflatoxinas, el cornezuelo del centeno, el ricino y las crotalarias en los materiales para piensos

Se mezclarán las muestras elementales de cada parte del lote objeto de muestreo y se constituirán el número de muestras globales que se establece en el punto 5.B.3, teniendo cuidado de anotar el origen de cada muestra global.

6.4. Preparación de muestras finales

El material de cada muestra global deberá mezclarse cuidadosamente para obtener una mezcla homogénea ( 21 ). Si fuera necesario, la muestra global deberá reducirse hasta un mínimo de 2 kg o 2 l (muestra reducida), bien con ayuda de un divisor mecánico o automático, bien con el método de cuarteo.

Deberán prepararse a continuación, como mínimo, tres muestras finales que tengan aproximadamente la misma cantidad y se ajusten a las exigencias cuantitativas del punto 5.A.4 o 5.B.4. Cada muestra deberá introducirse en un recipiente apropiado. Deberán tomarse todas las precauciones necesarias para evitar cualquier alteración en la composición de la muestra o cualquier contaminación o adulteración que pudiera sobrevenir durante el transporte o el almacenamiento.

6.5. Envasado de muestras finales

Los recipientes o los envases deberán precintarse y etiquetarse (la etiqueta debe estar totalmente incorporada en el precinto) de manera que sea imposible abrirlos sin deteriorar el precinto.

7. ACTA DE MUESTREO

De cada muestreo deberá levantarse un acta que permita identificar sin ambigüedad el lote objeto de muestreo.

8. DESTINO DE LA MUESTRAS

De cada muestra global deberá enviarse cuanto antes al laboratorio de análisis autorizado, como mínimo, una muestra final, con la información necesaria para el analista.









ANEXO II

DISPOSICIONES GENERALES SOBRE MÉTODOS DE ANÁLISIS PARA PIENSOS

A. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS

1. Objeto

Los procedimientos descritos a continuación se refieren a la preparación para el análisis de muestras finales enviadas a los laboratorios de control tras ser tomadas conforme a lo dispuesto en el anexo I.

Estas muestras deben prepararse de manera que las cantidades pesadas según disponen los métodos de análisis sean homogéneas y representativas de las muestras finales.

2. Precauciones que deben tomarse

El procedimiento que debe seguirse para preparar las muestras depende de los métodos de análisis empleados. Por tanto, es muy importante que dicho procedimiento se adecúe al método de análisis aplicado.

Todas las operaciones necesarias deben realizarse de modo que se eviten en lo posible la contaminación de la muestra y los cambios en su composición.

La molienda, la mezcla y el tamizado deberán efectuarse lo más rápidamente posible, a fin de minimizar la exposición de la muestra al aire y a la luz. No se emplearán molinos ni moledoras que puedan calentar perceptiblemente la muestra.

Para los piensos especialmente sensibles al calor se recomienda la molienda manual. Deberá cuidarse también de que el propio instrumental no sea fuente de contaminación de los oligoelementos.

Si la muestra no puede prepararse sin que su contenido de humedad sufra cambios significativos, debe determinarse dicho contenido antes y después de prepararla, de acuerdo con el método establecido en la parte A del anexo III.

3. Procedimiento

Dividir la muestra en las submuestras adecuadas para ser analizadas y servir de referencia, empleando técnicas divisorias apropiadas como la formación de montones alternativos con pala o la subdivisión con divisores mecánicos estacionarios o rotatorios. No se recomienda la técnica de conos y cuarteo, pues las submuestras resultantes pueden presentar un elevado error de división. Guardar la muestra de referencia en un recipiente adecuado, limpio y seco, con tapa hermética, y preparar las submuestras para el análisis de al menos 100 g, según se indica más adelante.

3.1. Piensos que pueden molerse tal como se presentan

Salvo que se especifique lo contrario en los métodos de análisis, tamizar la muestra completa por un tamiz con una luz de malla de 1 mm (conforme a la Recomendación ISO R565) tras molerla, si es necesario. No moler en exceso.

Mezclar la muestra tamizada y recogerla en un recipiente limpio y seco adecuado, provisto de tapón hermético. Volver a mezclar inmediatamente antes de pesar la cantidad para análisis.

3.2. Piensos que pueden molerse tras secarse

Salvo que se especifique lo contrario en los métodos de análisis, secar la muestra hasta que su contenido de humedad disminuya a un nivel del 8 % al 12 %, de acuerdo con el procedimiento preliminar de secado descrito en el punto 4.3 del método de determinación de la humedad mencionado en la parte A del anexo III. Proceder a continuación como se indica en el punto 3.1.

3.3. Piensos líquidos o semilíquidos

Colocar la muestra en un recipiente limpio y seco adecuado, provisto de tapón hermético. Mezclar bien inmediatamente antes de pesar la cantidad para análisis.

3.4. Otros piensos

Las muestras que no puedan prepararse conforme a uno de los procedimientos anteriores deberán someterse a cualquier otro procedimiento que garantice que las cantidades pesadas para el análisis son homogéneas y representativas de las muestras finales.

4. Almacenamiento de las muestras

Las muestras deben almacenarse a una temperatura que no altere su composición. Las destinadas al análisis de vitaminas o sustancias especialmente fotosensibles deberán guardarse en recipientes de vidrio marrón.

B. DISPOSICIONES RELATIVAS A LOS REACTIVOS Y EL INSTRUMENTAL EMPLEADOS EN LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS

1. Salvo que se especifique lo contrario en el método de análisis, todos los reactivos deben ser analíticamente puros (a.p.). Si se analizan oligoelementos, debe comprobarse la pureza de los reactivos por medio de un ensayo en blanco. Dependiendo de los resultados que se obtengan, quizá sea necesaria una mayor purificación de los reactivos.

2. Siempre que en los métodos de análisis se mencionen operaciones que impliquen preparación de soluciones, dilución, enjuague o lavado sin indicar la naturaleza del disolvente o el diluyente, debe utilizarse agua. Por regla general, el agua deberá desmineralizarse o destilarse. En casos particulares, indicados en los métodos de análisis, debe someterse a procedimientos especiales de purificación.

3. Habida cuenta del equipamiento que se encuentra normalmente en los laboratorios de control, en los métodos de análisis solo se hace referencia a los instrumentos y aparatos especiales o que requieren un uso específico. Deben estar limpios, sobre todo cuando hayan de determinarse cantidades muy pequeñas de sustancias.

C. APLICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

1. Procedimiento de extracción

Varios métodos establecen un procedimiento de extracción específico. Como regla general, puede aplicarse un procedimiento de extracción distinto al mencionado en el método si se ha demostrado que su eficacia de extracción es equivalente para la matriz analizada.

2. Procedimiento de limpieza (cleanup)

Varios métodos establecen un procedimiento de limpieza específico. Como regla general, puede aplicarse un procedimiento de limpieza distinto al mencionado en el método si se ha demostrado que sus resultados analíticos son equivalentes para la matriz analizada.

3. Comunicación del método de análisis empleado

En general se establece un único método de análisis para determinar cada una de las sustancias del pienso. Si se ofrecen varios métodos, en el informe de análisis debe indicarse el método particular empleado por el laboratorio de control.

4. Número de determinaciones

El resultado indicado en el informe de análisis deberá ser el valor medio obtenido de, como mínimo, dos determinaciones, efectuadas en porciones de la muestra distintas y de repetibilidad satisfactoria.

Sin embargo, en el caso de análisis de sustancias indeseables, si el resultado de la primera determinación es significativamente (> 50 %) inferior a la especificación que ha de controlarse, no serán necesarias más determinaciones, a condición de que se apliquen los procedimientos de calidad adecuados.

Si se controla el contenido declarado de una sustancia o un ingrediente y el resultado de la primera determinación confirma dicho contenido, es decir, que el resultado analítico entra en el intervalo de variación aceptable del contenido declarado, no será necesaria una segunda determinación, siempre que se apliquen los procedimientos de calidad apropiados.

En algunos casos, este intervalo de variación aceptable está definido en la legislación, por ejemplo en la Directiva 79/373/CEE de la Comisión ( 22 ).

5. Comunicación de los resultados analíticos

El resultado analítico se expresará según establezca el método de análisis, con el número adecuado de cifras significativas, y se corregirá, si es necesario, con respecto al contenido de humedad de la muestra final antes de la preparación.

6. Incertidumbre de medida y tasa de recuperación en caso de análisis de sustancias indeseables

Por lo que se refiere a las sustancias indeseables según se definen en la Directiva 2002/32/CE, en especial las dioxinas y los PCB similares a las dioxinas, se considerará que un producto destinado a la alimentación animal no cumple los requisitos relativos al contenido máximo establecido si se estima que el resultado analítico excede del contenido máximo, teniendo en cuenta la incertidumbre de medida expandida y la corrección en función de la recuperación. Para evaluar el cumplimiento se emplea la concentración analizada, una vez corregida en función de la recuperación y tras deducirse la incertidumbre de medida expandida. Este procedimiento solo es aplicable en los casos en que el método de análisis permite estimar la incertidumbre de medida expandida y la corrección en función de la recuperación (no es posible, por ejemplo, en caso de análisis microscópico).

El resultado analítico se comunicará como sigue (en la medida en que el método de análisis utilizado permita estimar la incertidumbre de medida y la tasa de recuperación):

a) corregido en función de la recuperación, indicando el nivel de la misma; dicha corrección no será necesaria si la tasa de recuperación es del 90 % al 110 %;

b) como «x +/- U», donde x es el resultado analítico y U la incertidumbre de medida expandida, utilizando un factor de cobertura de 2, que da un nivel de confianza del 95 % aproximadamente.

Sin embargo, si el resultado del análisis fuera notablemente inferior (> 50 %) a la especificación que ha de controlarse, podría comunicarse sin corrección en función de la recuperación, y la tasa de recuperación y la incertidumbre de medida podrían omitirse, a condición de que se aplicaran los procedimientos de calidad apropiados y de que el análisis sirviera exclusivamente para comprobar el cumplimiento de las disposiciones legales.









ANEXO III

MÉTODOS DE ANÁLISIS PARA EL CONTROL DE LA COMPOSICIÓN DE LOS MATERIALES PARA PIENSOS Y LOS PIENSOS COMPUESTOS

A. DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD

1. Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite determinar el contenido de humedad de los piensos. Si el pienso contiene sustancias volátiles, como ácidos orgánicos, debe tenerse presente que, junto con el contenido de humedad, también se determina una cantidad importante de esas sustancias.

No incluye el análisis de productos lácteos como materiales para piensos, el análisis de sustancias minerales y mezclas compuestas predominantemente de sustancias minerales, el análisis de grasas y aceites animales y vegetales, ni el análisis de semillas y frutos oleaginosos.

2. Principio

La muestra se deseca en las condiciones especificadas, que varían en función de la naturaleza del pienso. La pérdida de peso se determina por pesada. Cuando se trata de piensos sólidos con un elevado contenido de humedad, es necesario efectuar un secado preliminar.

3. Instrumental

3.1. Trituradora de material que no absorba la humedad, fácil de limpiar, que permita un triturado rápido y uniforme sin provocar un calentamiento sensible, evite al máximo el contacto con el aire exterior y cumpla los requisitos indicados en los puntos 4.1.1 y 4.1.2 (por ejemplo, microtrituradoras de martillos o de enfriamiento por agua, molinos de conos plegables, trituradoras de movimiento lento o de discos dentados).

3.2. Balanza analítica, con una exactitud de 1 mg

3.3. Recipientes secos de metal no corrosible o de vidrio, con tapas que garanticen un cierre hermético; la superficie de trabajo debe permitir que la muestra de ensayo se esparza a razón de 0,3 g/cm2 aproximadamente.

3.4. Estufa isotérmica de calentamiento eléctrico (± 2 oC), adecuadamente ventilada, que permita una rápida regulación de la temperatura ( 23 ).

3.5. Estufa de vacío regulable de calentamiento eléctrico, provista de una bomba de aceite y un mecanismo para introducir, o bien aire desecado caliente, o bien un agente desecante (por ejemplo, óxido de calcio)

3.6. Desecador con una placa gruesa perforada de metal o porcelana, que contenga un agente desecante eficaz.

4. Procedimiento

Nota : Las operaciones que se describen en esta sección deben realizarse inmediatamente después de abrir los paquetes de muestras. Los análisis deben efectuarse, como mínimo, por duplicado.

4.1. Preparación

4.1.1. Piensos distintos de los contemplados en los puntos 4.1.2 y 4.1.3.

Tomar, como mínimo, 50 g de la muestra. Si es necesario, triturar o dividir de manera que no se produzca variación alguna en el contenido de humedad (véase el punto 6).

4.1.2. Cereales y grañones

Tomar, como mínimo, 50 g de la muestra. Moler en partículas de las que al menos el 50 % pasen por un tamiz con una luz de malla de 0,5 mm y no dejen más de un 10 % de desecho en un tamiz con una luz de malla redonda de 1 mm.

4.1.3. Piensos líquidos o en forma de pasta, piensos compuestos predominantemente de aceites y grasas

Tomar unos 25 g de la muestra, pesar con una precisión de 10 mg, añadir una cantidad apropiada de arena anhidra pesada con una precisión de 10 mg y mezclar hasta obtener un producto homogéneo.

4.2. Desecación

4.2.1. Piensos distintos de los contemplados en los puntos 4.2.2 y 4.2.3.

Tarar un recipiente (3.3) con su tapa, con una precisión de 1 mg. En el recipiente tarado, pesar, con una precisión de 1 mg, unos 5 g de la muestra y esparcirla uniformemente. Colocar el recipiente, sin su tapa, en la estufa precalentada a 103 oC. Para impedir que la estufa se enfríe en exceso, introducir el recipiente lo más rápidamente posible. Dejar secar durante cuatro horas, contadas a partir del momento en que la estufa haya alcanzado de nuevo una temperatura de 103 oC. Volver a colocar la tapa sobre el recipiente, retirarlo de la estufa, dejarlo enfriar durante 30 a 45 minutos en el desecador (3.6) y pesar con una precisión de 1 mg.

En el caso de piensos compuestos predominantemente de aceites y grasas, secar en la estufa durante otros 30 minutos a 130 oC. La diferencia entre las dos pesadas no debe superar el 0,1 % de humedad.

4.2.2. Cereales, harina, grañones y sémola

Tarar un recipiente (3.3) con su tapa, con una precisión de 0,5 mg. En el recipiente tarado, pesar, con una precisión de 1 mg, unos 5 g de la muestra triturada y esparcirla uniformemente. Colocar el recipiente, sin su tapa, en la estufa precalentada a 130 oC. Para impedir que la estufa se enfríe en exceso, introducir el recipiente lo más rápidamente posible. Dejar secar durante dos horas, contadas a partir del momento en que la estufa haya alcanzado de nuevo una temperatura de 130 oC. Volver a colocar la tapa sobre el recipiente, retirarlo de la estufa, dejarlo enfriar durante 30 a 45 minutos en el desecador (3.6) y pesar con una precisión de 1 mg.

4.2.3. Piensos compuestos con más de un 4 % de sacarosa o lactosa: materiales para piensos como algarrobas, productos cerealísticos hidrolizados, semillas de malta, lonchas de remolacha desecadas, pescado y azúcares solubles; piensos compuestos con más de un 25 % de sales minerales que contengan agua de cristalización. Tarar un recipiente (3.3) con su tapa, con una precisión de 0,5 mg. En el recipiente tarado, pesar, con una precisión de 1 mg, unos 5 g de la muestra y esparcirla uniformemente. Colocar el recipiente, sin su tapa, en la estufa de vacío (3.5) precalentada a una temperatura comprendida entre 80 oC y 85 oC. Para impedir que la estufa se enfríe en exceso, introducir el recipiente lo más rápidamente posible. Elevar la presión a 100 Torr y dejar secar durante cuatro horas a esa presión, bien en una corriente de aire seco caliente, bien mediante un agente desecante (unos 300 g para 20 muestras). En este último caso, desconectar la bomba de vacío cuando se haya alcanzado la presión prescrita. Calcular el tiempo de secado a partir del momento en que la estufa haya alcanzado de nuevo una temperatura de 80 oC a 85 oC. A continuación, restablecer con precaución la presión atmosférica en la estufa. Abrirla, tapar inmediatamente el recipiente, retirarlo de la estufa, dejarlo enfriar durante 30 a 45 minutos en el desecador (3.6) y pesar con una precisión de 1 mg. Proceder a una desecación complementaria de 30 minutos en la estufa de vacío a una temperatura de 80 oC a 85 oC y volver a pesar. La diferencia entre las dos pesadas no debe superar el 0,1 % de humedad.

4.3. Predesecación

4.3.1. Piensos distintos de los contemplados en el punto 4.3.2.

Los piensos sólidos con un contenido de humedad elevado que dificulte su trituración deben someterse a una predesecación, del siguiente modo:

Pesar, con una precisión de 10 mg, unos 50 g de la muestra no triturada (los piensos comprimidos o aglomerados pueden dividirse someramente, si es necesario) en un recipiente apropiado (por ejemplo, una placa de aluminio de 20 × 12 cm con un borde de 0,5 cm). Dejar secar en una estufa a una temperatura de 60 oC a 70 oC, hasta que el contenido de humedad se haya reducido a un valor comprendido entre el 8 % y el 12 %. Retirar de la estufa, dejar enfriar al descubierto en el laboratorio durante una hora y pesar con una precisión de 10 mg. Triturar inmediatamente después como se indica en el punto 4.1.1 y efectuar la desecación como se indica en el punto 4.2.1 o 4.2.3, según la naturaleza del pienso.

4.3.2. Cereales

Los granos con un índice de humedad superior al 17 % deben someterse a una desecación preliminar del siguiente modo:

Pesar, con una precisión de 10 mg, unos 50 g de grano sin moler en un recipiente apropiado (por ejemplo, una placa de aluminio de 20 × 12 cm con un borde de 0,5 cm). Dejar secar en una estufa durante cinco a siete minutos a una temperatura de 130 oC. Retirar de la estufa, dejar enfriar al descubierto en el laboratorio durante dos horas y pesar con una precisión de 10 mg. Moler inmediatamente después como se indica en el punto 4.1.2 y efectuar la desecación como se indica en el punto 4.2.2.

5. Cálculo de los resultados

El contenido de humedad (X), en porcentaje de la muestra, se calcula con las fórmulas siguientes:

5.1. Desecación sin predesecación

donde:

m = peso inicial, en gramos, de la muestra de ensayo;

m0 = peso, en gramos, de la muestra de ensayo seca.

5.2. Desecación con predesecación

donde:

m = peso inicial, en gramos, de la muestra de ensayo;

m1 = peso, en gramos, de la muestra de ensayo tras la predesecación;

m2 = peso, en gramos, de la muestra de ensayo una vez triturada o molida;

m0 = peso, en gramos, de la muestra de ensayo seca.

5.3. Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no excederá del 0,2 % del valor absoluto de humedad.

6. Observación

Cuando resulte necesario efectuar una trituración y se considere que esta modifica el contenido de humedad del producto, los resultados del análisis de los componentes del pienso deben corregirse atendiendo al contenido de humedad de la muestra en su estado inicial.

B. DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD EN GRASAS Y ACEITES ANIMALES Y VEGETALES

1. Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite determinar el contenido de agua y sustancias volátiles de las grasas y los aceites animales y vegetales.

2. Principio

Se deseca la muestra a 103 oC con un peso constante (la pérdida de peso entre dos pesadas sucesivas debe ser inferior o igual a 1 mg). La pérdida de peso se determina mediante pesada.

3. Instrumental

3.1. Plato de fondo plano de material resistente a la corrosión, de 8 cm a 9 cm de diámetro y de aproximadamente 3 cm de alto

3.2. Termómetro de bulbo reforzado con tubo capilar en el extremo superior, graduado entre aproximadamente 80 oC y, como mínimo, 110 oC, de unos 10 cm de longitud

3.3. Baño de arena o placa calefactora eléctrica

3.4. Desecador con un agente desecante eficaz

3.5. Balanza analítica

4. Procedimiento

Pesar, con una precisión de 1 mg, unos 20 g de la muestra homogeneizada en el plato tarado seco (3.1) que contiene el termómetro (3.2). Calentar en el baño de arena o la placa calefactora (3.3), removiendo continuamente con el termómetro, de manera que la temperatura alcance 90 oC en unos siete minutos.

Reducir el calor, observando con qué frecuencia salen burbujas del fondo del plato. La temperatura no debe sobrepasar los 105 oC. Seguir removiendo, raspando el fondo del plato, hasta que dejen de formarse burbujas.

Para eliminar completamente la humedad, calentar varias veces a 103 oC ± 2 oC, enfriando a 93 oC entre los sucesivos calentamientos. A continuación, dejar enfriar a temperatura ambiente en el desecador (3.4) y pesar. Repetir esta operación hasta que la pérdida de peso entre dos pesadas sucesivas deje de sobrepasar los 2 mg.

Nota : El incremento del peso de la muestra tras varios calentamientos es indicio de una oxidación de la grasa, en cuyo caso debe calcularse el resultado a partir de la pesada efectuada inmediatamente antes de que empezara a producirse ese incremento.

5. Cálculo de los resultados

El contenido de humedad (X), como porcentaje de la muestra, viene dado por la fórmula siguiente:

donde:

m = peso, en gramos, de la muestra de ensayo;

m1 = peso, en gramos, del plato con su contenido, antes del calentamiento;

m2 = peso, en gramos, del plato con su contenido, tras el calentamiento.

Los resultados inferiores al 0,05 % deben registrarse como «inferior al 0,05 %».

Repetibilidad

La diferencia de humedad entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no debe exceder del 0,05 %, en valor absoluto.

C. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE PROTEÍNA BRUTA

1. Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite determinar el contenido de proteína bruta del pienso sobre la base del contenido de nitrógeno, determinado por el método Kjeldahl.

2. Principio

La muestra se digiere con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador. La solución ácida se alcaliniza son una solución de hidróxido de sodio. El amoniaco se destila y se recoge en una cantidad medida de ácido sulfúrico, cuyo exceso se titula con una solución patrón de hidróxido de sodio.

Alternativamente, el amoniaco desprendido se destila en un exceso de solución de ácido bórico, tras lo cual se efectúa la titulación con una solución de ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.

3. Reactivos

3.1. Sulfato de potasio

3.2. Catalizador: óxido de cobre (II), CuO, o sulfato de cobre (II) pentahidratado, CuSO4 5H2 O

3.3. Cinc granulado

3.4. Acido sulfúrico, ρ20 = 1,84 g/ml

3.5. Ácido sulfúrico, solución volumétrica patrón, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6. Ácido sulfúrico, solución volumétrica patrón, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7. Ácido sulfúrico, solución volumétrica patrón, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8. Indicador de rojo de metilo; disolver 300 mg de rojo de metilo en 100 ml de etanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9. Solución de hidróxido de sodio (puede utilizarse la calidad técnica), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %)

3.10. Hidróxido de sodio, solución volumétrica patrón, c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11. Hidróxido de sodio, solución volumétrica patrón, c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12. Piedra pómez granulada, lavada en ácido clorhídrico y calcinada

3.13. Acetanilida (punto de fusión = 114 oC, contenido de N = 10,36 %)

3.14. Sacarosa (exenta de nitrógeno)

3.15. Ácido bórico (H3BO3)

3.16. Solución de indicador de rojo de metilo: disolver 100 mg de rojo de metilo en 100 ml de etanol o metanol.

3.17. Solución de verde de bromocresol: disolver 100 mg de verde de bromocresol en 100 ml de etanol o metanol.

3.18. Solución de ácido bórico (10 g/l a 40 g/l, en función del instrumental empleado) Si se aplica la detección colorimétrica del punto final, debe añadirse rojo de metilo y verde de bromocresol a las soluciones de ácido bórico. Si se prepara 1 l de solución de ácido bórico, antes de ajustar el volumen deberán añadirse 7 ml de solución de indicador de rojo de metilo (3.16) y 10 ml de solución de verde de bromocresol (3.17). Dependiendo del agua utilizada, el pH de la solución de ácido bórico podría variar de un lote a otro. A menudo es necesario un ajuste con un pequeño volumen de álcali para obtener un blanco positivo. Nota : Añadiendo de 3 ml a 4 ml aproximadamente de NaOH (3.11) a 1 l de solución de ácido bórico de 10 g/l se suelen conseguir buenos ajustes. Guardar la solución a temperatura ambiente, al abrigo de la luz y de fuentes de vapores amoniacales.

3.19 Ácido clorhídrico, solución volumétrica patrón, c(HCl) = 0,10 mol/l Nota : Pueden emplearse otras concentraciones de soluciones volumétricas (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 y 3.19), si en los cálculos se hacen las correcciones correspondientes. Las concentraciones deberán expresarse siempre con cuatro decimales.

4. Instrumental

El adecuado para efectuar la digestión, la destilación y la titulación conforme al procedimiento Kjeldahl.

5. Procedimiento

5.1. Digestión

Pesar, con una precisión de 0,001 g, 1 g de la muestra, y pasar esta al matraz del aparato de digestión. Añadir 15 g de sulfato de potasio (3.1.), una cantidad apropiada de catalizador (3.2) (de 0,3 g a 0,4 g de óxido de cobre [II] o de 0,9 g a 1,2 g de sulfato de cobre [II] pentahidratado), 25 ml de ácido sulfúrico (3.4) y, si es necesario, unos pocos gránulos de piedra pómez (3.12), y mezclar.

Calentar el matraz, moderadamente al principio, agitándolo en círculos de vez en cuando, si es necesario, hasta que la masa se haya carbonizado y la espuma haya desaparecido; a continuación, calentar más intensamente hasta que el líquido hierva de manera constante. El calentamiento es el adecuado si el ácido en ebullición se condensa en la pared del matraz. Evitar que los lados se sobrecalienten y que se adhieran a ellos partículas orgánicas.

Cuando la solución se aclare y adopte un color verde claro, seguir hirviendo durante otras dos horas, y dejar enfriar a continuación.

5.2. Destilación

Añadir con cuidado suficiente agua para que los sulfatos se disuelvan por completo. Dejar enfriar y, a continuación, si es necesario, añadir unos pocos gránulos de cinc (3.3). Proceder conforme al punto 5.2.1 o 5.2.2.

5.2.1. Destilación en ácido sulfúrico

Verter en el matraz receptor del aparato de destilación exactamente 25 ml de ácido sulfúrico (3.5) o (3.7), en función del supuesto contenido de nitrógeno. Añadir unas pocas gotas del indicador de rojo de metilo (3.8).

Conectar el matraz de digestión al refrigerante del aparato de destilación y sumergir el extremo del refrigerante, como mínimo, 1 cm en el líquido contenido en el matraz receptor (véase la observación del punto 8.3). Verter lentamente 100 ml de solución de hidróxido de sodio (3.9) en el matraz de digestión sin pérdida de amoniaco (véase la observación del punto 8.1). Calentar el matraz hasta que el amoniaco se haya destilado.

5.2.2. Destilación en ácido bórico

Si la titulación del contenido de amoniaco del destilado se efectúa manualmente, se aplica el procedimiento mencionado a continuación. Si la unidad de destilación está completamente automatizada e incluye la titulación del contenido de amoniaco del destilado, seguir las instrucciones de empleo del fabricante.

Colocar un matraz receptor que contenga de 25 ml a 30 ml de la solución de ácido bórico (3.18) bajo la salida del refrigerante, de manera que el tubo de descarga quede bajo la superficie del exceso de solución de ácido bórico. Ajustar la unidad de destilación para que dispense 50 ml de solución de hidróxido de sodio (3.9). Poner en funcionamiento la unidad de destilación siguiendo las instrucciones del fabricante y destilar el amoniaco desprendido por la adición de la solución de hidróxido de sodio. Recoger el destilado en la solución receptora de ácido bórico. La cantidad de destilado (tiempo de destilación de vapor) depende de la cantidad de nitrógeno que contiene la muestra. Seguir las instrucciones del fabricante.

Nota : En una unidad de destilación semiautomática, la adición de exceso de hidróxido de sodio y la destilación de vapor se realizan de forma automática.

5.3. Titulación

Proceder conforme al punto 5.3.1 o 5.3.2.

5.3.1. Ácido sulfúrico

Titular el exceso de ácido sulfúrico en el matraz receptor con solución de hidróxido de sodio (3.10 o 3.11), dependiendo de la concentración del ácido sulfúrico empleado, hasta alcanzar el punto final.

5.3.2. Ácido bórico

Titular, empleando una bureta, el contenido del matraz receptor con la solución volumétrica patrón de ácido clorhídrico (3.19) o con la solución volumétrica patrón de ácido sulfúrico (3.6), y leer la cantidad de titulante utilizado.

Si se aplica la detección colorimétrica del punto final, este se alcanza cuando aparece el primer rastro de coloración rosa en el contenido. Leer la bureta con una precisión de 0,05 ml. Una placa agitadora magnética iluminada o un detector fotométrico pueden ayudar a visualizar el punto final.

También puede hacerse automáticamente utilizando un destilador de vapor con titulación automática.

Utilizar el destilador o el destilador/titulador siguiendo las correspondientes instrucciones del fabricante.

Nota : Si se utiliza un sistema de titulación automática, la titulación empieza inmediatamente después de que comience la destilación, y se emplea la solución de ácido bórico al 1 % (3.18). Si se utiliza una unidad de destilación completamente automática, la titulación automática del amoniaco puede también llevarse a cabo con detección del punto final mediante un sistema de pH potenciométrico. En este caso se emplea un titulador automático con pehachímetro. El pehachímetro deberá calibrarse adecuadamente en el intervalo de pH 4 a pH 7, siguiendo los procedimientos normales de laboratorio para la calibración del pH. El punto final del pH de la titulación se alcanza con un pH 4,6, que es el punto álgido de la curva de titulación (punto de inflexión).

5.4. Ensayo en blanco

Para confirmar que los reactivos no tienen nitrógeno, efectuar un ensayo en blanco (digestión, destilación y titulación) con un 1 g de sacarosa (3.14) en lugar de la muestra.

6. Cálculo de los resultados

Los cálculos se realizan conforme al punto 6.1 o 6.2.

6.1. Cálculo para la titulación según el punto 5.3.1

El contenido de proteína bruta, expresado en porcentaje en peso, se calcula según la fórmula siguiente:

donde:

V0 = es el volumen (ml) de NaOH (3.10 o 3.11) empleado en el ensayo en blanco;

V1 = es el volumen (ml) de NaOH (3.10 o 3.11) empleado en la titulación de la muestra;

c = es la concentración (mol/l) de hidróxido de sodio (3.10 o 3.11);

m = es el peso (g) de la muestra.

6.2 Cálculo para la titulación según el punto 5.3.2

6.2.1. Titulación con ácido clorhídrico

El contenido de proteína bruta, expresado en porcentaje en peso, se calcula según la fórmula siguiente:

donde:

m = es el peso (g) de la porción de ensayo;

c = es la concentración (mol/l) de solución volumétrica patrón de ácido clorhídrico (3.19);

V0 = es el volumen (en mililitros) de ácido clorhídrico empleado en el ensayo en blanco;

V1 = es el volumen (en mililitros) de ácido clorhídrico empleado para la porción de ensayo.

6.2.2. Titulación con ácido sulfúrico

El contenido de proteína bruta, expresado en porcentaje en peso, se calcula según la fórmula siguiente:

donde:

m = es el peso (g) de la porción de ensayo;

c = es la concentración (mol/l) de solución volumétrica patrón de ácido sulfúrico (3.6);

V0 = es el volumen (en mililitros) de ácido sulfúrico (3.6) empleado para el ensayo en blanco;

V1 = es el volumen (en mililitros) de ácido sulfúrico (3.6) empleado para la porción de ensayo.

7. Verificación del método

7.1. Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no debe exceder del:

— 0,2 % en valor absoluto, en el caso de contenidos de proteína bruta inferiores al 20 %,

— 1,0 % del valor superior, en el caso de contenidos de proteína bruta del 20 % a 40 %,

— 0,4 % en valor absoluto, en el caso de contenidos de proteína bruta superiores al 40 %.

7.2. Exactitud

Efectuar el análisis (digestión, destilación y titulación) con 1,5 g a 2,0 g de acetanilida (3.13) en presencia de 1 g de sacarosa (3.14); 1 g de acetanilida consume 14,80 ml de ácido sulfúrico (3.5). La recuperación debe ser de al menos el 99 %.

8. Observaciones

8.1. El instrumental puede ser de tipo manual, semiautomático o automático. Si requiere un transvase entre la digestión y la destilación, este debe tener lugar sin pérdidas. Si el matraz del aparato de destilación no va provisto de un embudo de decantación, añadir el hidróxido de sodio inmediatamente antes de conectarlo al refrigerante, vertiendo el líquido de forma que caiga lentamente por la pared del matraz.

8.2. Si el producto de la digestión se solidifica, recomenzar la determinación con una cantidad de ácido sulfúrico (3.4) mayor que la especificada anteriormente.

8.3. En el caso de productos con un bajo contenido de nitrógeno, el volumen de ácido sulfúrico (3.7) que se pone en el matraz receptor puede reducirse, si es necesario, a 10 ml o 15 ml, enrasando a continuación con agua hasta los 25 ml.

8.4. Aunque para los análisis ordinarios pueden emplearse métodos de determinación de la proteína bruta alternativos, el método Kjeldahl descrito en esta parte C es el método de referencia. La equivalencia de los resultados obtenidos con el método alternativo (por ejemplo, DUMAS) respecto de los obtenidos con el método de referencia debe demostrarse para cada una de las matrices. Puesto que los resultados obtenidos con un método alternativo, aun habiéndose verificado la equivalencia, pueden desviarse ligeramente de los obtenidos con el método de referencia, es necesario mencionar en el informe analítico el método de análisis empleado para la determinación de la proteína bruta.

D. DETERMINACIÓN DE LA UREA

1. Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite determinar el nivel de urea en los piensos.

2. Principio

La muestra se suspende en agua con un agente clarificante. A continuación se filtra la suspensión. El contenido de urea del filtrado se determina tras añadir 4-dimetilaminobenzaldehído (4-DMAB) midiendo la densidad óptica a una longitud de onda de 420 nm.

3. Reactivos

3.1. Solución de 4-dimetilaminobenzaldehído: disolver 1,6 g de 4-DMAB en 100 ml de etanol al 96 % y añadir 10 ml de ácido clorhídrico (ρ201,19 g/ml). Este reactivo se conserva como máximo dos semanas.

3.2. Solución de Carrez I: disolver en agua 21,9 g de acetato de cinc, Zn(CH3COO)2 · 2H2O, y 3 g de ácido acético glacial. Enrasar con agua a 100 ml.

3.3. Solución de Carrez II: disolver en agua 10,6 g de ferrocianuro de potasio, K4Fe(CN)6 · 3H2O. Enrasar con agua a 100 ml.

3.4. Carbón activo que no absorba urea (debe comprobarse).

3.5. Solución de urea al 0,1 % (p/v)

4. Instrumental

4.1. Mezclador (tambor): de 35 a 40 revoluciones por minuto aproximadamente

4.2. Tubos de ensayo: 160 × 16 mm con tapones esmerilados

4.3. Espectrofotómetro

5. Procedimiento

5.1. Análisis de la muestra

Pesar, con una precisión de 1 mg, 2 g de la muestra e introducirlos con 1 g de carbón activo (3.4) en un matraz aforado de 500 ml. Añadir 400 ml de agua y 5 ml de solución de Carrez I (3.2), mezclar durante aproximadamente 30 segundos y añadir 5 ml de solución de Carrez II (3.3). Mezclar durante 30 minutos en el tambor. Enrasar con agua, agitar y filtrar.

Retirar 5 ml de los filtrados incoloros transparentes, colocarlos en tubos de ensayo con tapones esmerilados, añadir 5 ml de solución de 4-DMAB (3.1) y mezclar. Colocar los tubos en una baño maría a 20 oC (+/- 4 oC). Transcurridos 15 minutos, medir la densidad óptica de la solución de muestra con el espectrofotómetro a 420 nm. Comparar con la solución de ensayo en blanco de los reactivos.

5.2. Curva de calibración

Retirar de la solución de urea (3.5) unos volúmenes de 1, 2, 4, 5 y 10 ml, verterlos en matraces aforados de 100 ml y enrasar con agua. Retirar 5 ml de cada solución, añadir a cada una de ellas 5 ml de solución de 4-DMAB (3.1), homogeneizar y medir la densidad óptica, como se ha mostrado anteriormente, comparándola con una solución de control que contenga 5 ml de 4-DMAB y 5 ml de agua sin urea. Trazar la curva de calibración.

6. Cálculo de los resultados

Determinar la cantidad de urea de la muestra empleando la curva de calibración.

Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.

7. Observaciones

7.1. Si el contenido de urea excede del 3 %, reducir la muestra a 1 g o diluir la solución inicial de manera que en 500 ml no haya más de 50 mg de urea.

7.2. Si los contenidos de urea son bajos, incrementar la muestra, siempre que el filtrado siga siendo transparente e incoloro.

7.3. Si la muestra contiene compuestos nitrogenados simples, como aminoácidos, la densidad óptica deberá medirse a 435 nm.

E. DETERMINACIÓN DE LAS BASES NITROGENADAS VOLÁTILES

I. POR MICRODIFUSIÓN

1. Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite determinar el contenido de bases nitrogenadas volátiles de los piensos, expresadas en amoniaco.

2. Principio

La muestra se extrae con agua y la solución se clarifica y se filtra. Las bases nitrogenadas volátiles se desplazan por microdifusión con una solución de carbonato de potasio, se recogen en una solución de ácido bórico y se titulan con ácido sulfúrico.

3. Reactivos

3.1. Ácido tricloroacético, solución al 20 % (p/v)

3.2. Indicador: disolver 33 mg de verde de bromocresol y 65 mg de rojo de metilo en 100 ml de etanol al 95-96 % (v/v).

3.3. Solución de ácido bórico: en un matraz aforado de 1 l, disolver 10 g de ácido bórico en 200 ml de etanol al 95-96 % (v/v) y 700 ml de agua. Añadir 10 ml de indicador (3.2). Mezclar y, si es necesario, ajustar la coloración de la solución al rojo claro añadiendo una solución de hidróxido de sodio. Con 1 ml de esta solución se fijarán, como máximo, 300 μg de NH3.

3.4. Solución saturada de carbonato de potasio: disolver 100 g de carbonato de potasio en 100 ml de agua en ebullición. Dejar enfriar y filtrar.

3.5. Acido sulfúrico de 0,01 mol/l

4. Instrumental

4.1. Mezclador (tambor): de 35 a 40 revoluciones por minuto aproximadamente

4.2. Células de Conway de vidrio o de plástico (véase el diagrama)

4.3. Microburetas graduadas a 1/100 ml

5. Procedimiento

Pesar, con una precisión de 1 mg, 10 g de la muestra e introducirlos con 100 ml de agua en un matraz aforado de 200 ml. Mezclar o remover en el tambor durante 30 minutos. Añadir 50 ml de solución de ácido tricloracético (3.1), enrasar con agua, agitar enérgicamente y filtrar por un filtro de pliegues.

Empleando una pipeta, verter 1 ml de solución de ácido bórico (3.3) en la parte central de la célula de Conway y 1 ml del filtrado de la muestra en la corona de la célula. Cubrir parcialmente con la tapa engrasada. Dejar caer rápidamente en la corona 1 ml de solución saturada de carbonato de potasio (3.4) y cerrar la tapa de manera que la célula quede herméticamente cerrada. Girar con precaución la célula haciéndola rotar en un plano horizontal, de forma que se mezclen los dos reactivos. Dejar incubar, bien durante al menos cuatro horas a temperatura ambiente, bien durante una hora a 40 oC.

Con ayuda de una microbureta (4.3), titular las bases volátiles en la solución de ácido bórico con ácido sulfúrico (3.5).

Efectuar un ensayo en blanco siguiendo el mismo procedimiento, pero sin la muestra que debe analizarse.

6. Cálculo de los resultados

1 ml de una solución de 0,01 mol/l de H2SO4 corresponde a 0,34 mg de amoniaco.

Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.

Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no excederá del:

— 10 % en valor relativo, en el caso de contenidos de amoniaco inferiores al 1,0 %,

— 0,1 % en valor absoluto, en el caso de contenidos de amoniaco iguales o superiores al 1,0 %.

7. Observación

Si el contenido de amoniaco de la muestra es superior al 0,6 %, diluir el filtrado inicial.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. POR DESTILACIÓN

1. Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite determinar el contenido de bases nitrogenadas volátiles, expresadas en amoniaco, de la harina de pescado que no contenga prácticamente urea. Únicamente es aplicable para contenidos de amoniaco inferiores al 0,25 %.

2. Principio

La muestra se extrae con agua y la solución se clarifica y se filtra. Las bases nitrogenadas volátiles se desplazan en el punto de ebullición añadiendo óxido de magnesio y se recogen en una cantidad determinada de ácido sulfúrico, cuyo exceso se titula por retroceso con una solución de hidróxido de sodio.

3. Reactivos

3.1. Ácido tricloroacético, solución al 20 % (p/v)

3.2. Óxido de magnesio

3.3. Emulsión antiespumante (por ejemplo, silicona)

3.4. Acido sulfúrico de 0,05 mol/l

3.5. Solución de hidróxido de sodio de 0,1 mol/l

3.6. Solución de rojo de metilo al 0,3 % en etanol al 95 %-96 % (v/v)

4. Instrumental

4.1. Mezclador (tambor): de 35 a 40 revoluciones por minuto aproximadamente

4.2. Aparato de destilación de tipo Kjeldahl

5. Procedimiento

Pesar, con una precisión de 1 mg, 10 g de la muestra e introducirlos con 100 ml de agua en un matraz aforado de 200 ml. Mezclar o remover en el tambor durante 30 minutos. Añadir 50 ml de solución de ácido tricloracético (3.1), enrasar con agua, agitar enérgicamente y filtrar por un filtro de pliegues.

Tomar una cantidad de filtrado limpio que sea adecuada para el contenido supuesto de bases nitrogenadas volátiles (en general, basta con 100 ml). Diluir hasta 200 ml y añadir 2 g de óxido de magnesio (3.2) y unas pocas gotas de emulsión antiespumante (3.3). La solución debe ser alcalina en el papel de tornasol; si no lo es, añadir un poco de óxido de magnesio (3.2). Proceder conforme a los puntos 5.2 y 5.3 del método de análisis para la determinación del contenido de proteína bruta (parte C del presente anexo).

Efectuar un ensayo en blanco siguiendo el mismo procedimiento, pero sin la muestra que debe analizarse.

6. Cálculo de los resultados

1 ml de solución de 0,05 mol/l de H2SO4 corresponde a 1,7 mg de amoniaco.

Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.

Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no excederá del 10 % de amoniaco, en valor relativo.

F. DETERMINACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS (EXCEPTO TRIPTÓFANO)

1. Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite determinar la presencia en los piensos de aminoácidos libres (sintéticos y naturales) y totales (unidos en péptidos y libres), utilizando un analizador de aminoácidos. Es aplicable a los siguientes aminoácidos: cistina y cisteína, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina y valina.

El método no distingue entre las sales de los aminoácidos, y tampoco permite diferenciar entre sus formas D y L. No es válido para determinar el triptófano ni los análogos hidroxilados de los aminoácidos.

2. Principio

2.1. Aminoácidos libres

Los aminoácidos libres se extraen con ácido clorhídrico diluido. Las macromoléculas nitrogenadas extraídas a la vez se precipitan con ácido sulfosalicílico y se eliminan por filtración. El pH de la solución filtrada se ajusta a 2,20. Los aminoácidos se separan por cromatografía de intercambio iónico y se determinan por reacción con ninhidrina mediante detección fotométrica a 570 nm.

2.2. Aminoácidos totales

El procedimiento elegido depende de los aminoácidos estudiados. La cistina, la cisteína y la metionina deben oxidarse a ácido cisteico y metionina sulfona, respectivamente, antes de la hidrólisis. La tirosina debe determinarse en hidrolizados de muestras no oxidadas. Todos los demás aminoácidos citados en el punto 1 pueden determinarse tanto en muestras oxidadas como no oxidadas.

La oxidación se realiza a 0 oC con una mezcla de ácido perfórmico y fenol. El exceso de reactivo oxidante se descompone con disulfito de sodio. La muestra oxidada o no oxidada se hidroliza con ácido clorhídrico (3.20) durante 23 horas. El pH del hidrolizado se ajusta a 2,20. Los aminoácidos se separan por cromatografía de intercambio iónico y se determinan por reacción con ninhidrina mediante detección fotométrica a 570 nm (440 nm en el caso de la prolina).

3. Reactivos

Debe utilizarse agua bidestilada o agua de calidad equivalente (conductividad < 10 μS).

3.1. Peróxido de hidrógeno, p (p/p) = 30 %

3.2. Ácido fórmico, p (p/p) = 98-100 %

3.3. Fenol

3.4. Disulfito de sodio

3.5. Hidróxido de sodio

3.6. Ácido 5-sulfosalicílico dihidratado

3.7. Ácido clorhídrico, con una densidad aproximada de 1,18 g/ml

3.8. Citrato trisódico dihidratado

3.9. 2,2′-Tiodietanol (tiodiglicol)

3.10. Cloruro de sodio

3.11. Ninhidrina

3.12. Éter de petróleo, con un intervalo de ebullición de 40-60 oC

3.13. Norleucina, u otro compuesto adecuado para ser utilizado como patrón interno

3.14. Gas nitrógeno (< 10 ppm de oxígeno)

3.15. 1-Octanol

3.16. Aminoácidos

3.16.1. Sustancias patrón enumeradas en el punto 1. Compuestos puros sin agua de cristalización. Desecar en vacío sobre P2O5 o H2SO4 durante una semana antes de su utilización.

3.16.2. Ácido cisteico

3.16.3. Metionina sulfona

3.17. Solución de hidróxido de sodio, c = 7,5 mol/l: Disolver 300 g de NaOH (3.5) en agua y enrasar a 1 l.

3.18. Solución de hidróxido de sodio, c = 1 mol/l: Disolver 40 g de NaOH (3.5) en agua y enrasar a 1 l.

3.19. Solución de ácido fórmico y fenol: Mezclar 889 g de ácido fórmico (3.2) con 111 g de agua y añadir 4,73 g de fenol (3.3).

3.20. Mezcla de hidrólisis, c = 6 mol de HCl/l, con 1 g de fenol/l: Añadir 1 g de fenol (3.3) a 492 ml de HCl (3.7) y enrasar a 1 l con agua.

3.21. Mezcla de extracción, c = 0,1 mol de HCl/l, con un 2 % de tiodiglicol: tomar 8,2 ml de HCl (3.7), diluir con unos 900 ml de agua, añadir 20 ml de tiodiglicol (3.9) y enrasar a 1 l con agua (no mezclar 3.7 y 3.9 directamente).

3.22. Ácido 5-sulfosalicílico, ß = 6 %: Disolver 60 g de ácido 5-sulfosalicílico (3.6) en agua y enrasar a 1 l con agua.

3.23. Mezcla de oxidación (ácido perfórmico y fenol): Mezclar 0,5 ml de peróxido de hidrógeno (3.1) con 4,5 ml de solución de ácido fórmico y fenol (3.19) en un pequeño vaso de precipitado. Incubar a 20-30 oC durante una hora a fin de que se forme ácido perfórmico y, a continuación, enfriar sobre baño de hielo y agua (15 minutos) antes de añadir a la muestra. Precaución: evitar el contacto con la piel y llevar vestimenta de protección.

3.24. Solución reguladora de citrato, c = 0,2 mol de Na+/l, pH = 2,20: Disolver 19,61 g de citrato de sodio (3.8), 5 ml de tiodiglicol (3.9), 1 g de fenol (3.3) y 16,50 ml de HCl (3.7) en unos 800 ml de agua. Ajustar el pH a 2,20. Enrasar a 1 l con agua.

3.25. Soluciones reguladoras de elución, preparadas según las condiciones del analizador utilizado (4.9)

3.26. Reactivo de ninhidrina, preparado según las condiciones del analizador utilizado (4.9)

3.27. Soluciones patrón de aminoácidos. Estas soluciones deberán conservarse a una temperatura inferior a 5 oC.

3.27.1. Solución patrón madre de aminoácidos (3.16.1) c = 2,5 μmol/ml de cada uno en ácido clorhídrico Disponibles en los comercios

3.27.2. Solución patrón madre de ácido cisteico y metionina sulfona, c = 1,25 μmol/ml Disolver 0,2115 g de ácido cisteico (3.16.2) y 0,2265 g de metionina sulfona (3.16.3) en solución reguladora de citrato (3.24) en un matraz aforado de 1 l y enrasar con solución reguladora de citrato. Conservar a menos de 5 oC durante un período máximo de 12 meses. Esta solución no se utiliza si la solución patrón madre (3.27.1) contiene ácido cisteico y metionina sulfona.

3.27.3. Solución patrón madre del patrón interno, por ejemplo, norleucina, c = 20 μmol/ml Disolver 0,6560 g de norleucina (3.13) en solución reguladora de citrato (3.24) en un matraz aforado y enrasar a 250 ml con solución reguladora de citrato. Conservar a menos de 5 oC durante un período máximo de seis meses.

3.27.4. Solución de calibración de los aminoácidos patrón para utilizar con los hidrolizados, c = 5 nmol/50 μl de ácido cisteico y metionina sulfona y c = 10 nmol/50 μl de los demás aminoácidos. Disolver 2,2 g de cloruro de sodio (3.10) en un vaso de precipitado de 100 ml con 30 ml de solución reguladora de citrato (3.24). Añadir 4,00 ml de solución patrón madre de aminoácidos (3.27.1), 4,00 ml de solución patrón madre de ácido cisteico y metionina sulfona (3.27.2) y 0,50 ml de solución patrón madre de patrón interno (3.27.3), si se utiliza. Ajustar el pH a 2,20 con hidróxido de sodio (3.18). Transvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 50 ml, enrasar con solución reguladora de citrato (3.24) y mezclar. Conservar a menos de 5 oC durante un período máximo de tres meses. Véanse también las observaciones del punto 9.1.

3.27.5. Solución de calibración de los aminoácidos patrón para utilizar con los hidrolizados preparados según el punto 5.3.3.1 y con los extractos (5.2). La solución de calibración se prepara con arreglo al punto 3.27.4, pero sin cloruro de sodio. Conservar a menos de 5 oC durante un período máximo de tres meses.

4. Instrumental

4.1. Matraz de fondo redondo de 100 ml o 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo

4.2. Frasco de vidrio borosilicato de 100 ml con tapón de rosca provisto de junta de goma/teflón (por ejemplo Duran, Schott), para uso en estufa

4.3. Estufa con ventilación forzada y con un regulador de la temperatura de exactitud superior a ± 2 oC

4.4. Pehachímetro (lectura con tres decimales)

4.5. Filtro de membrana (0,22 μm)

4.6. Centrífuga

4.7. Evaporador rotativo de vacío

4.8. Agitador mecánico o magnético

4.9. Analizador de aminoácidos o equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR) con columna de intercambio iónico, dispositivo para ninhidrina, derivatización postcolumna y detector fotométrico La columna se llena con resinas de poliestireno sulfonadas capaces de separar unos aminoácidos de otros y los aminoácidos de otros materiales que reaccionan con la ninhidrina. El flujo en las conducciones de solución reguladora y de ninhidrina se regula mediante bombas con una estabilidad de flujo de ±0,5 % en el período que abarca tanto la fase de calibración del patrón como el análisis de la muestra. Con algunos analizadores de aminoácidos pueden utilizarse procedimientos de hidrólisis en los que el hidrolizado presenta una concentración de sodio de c = 0,8 mol/l y contiene todo el ácido fórmico residual de la fase de oxidación. Otros no proporcionan una separación satisfactoria de determinados aminoácidos si el hidrolizado contiene ácido fórmico en exceso o elevadas concentraciones de ión sodio. En este caso, el volumen de ácido se reduce por evaporación hasta aproximadamente 5 ml después de la hidrólisis y antes de ajustar el pH. La evaporación deberá realizarse en vacío a 40 oC como máximo.

5. Procedimiento

5.1. Preparación de la muestra

La muestra se muele hasta que pase por un tamiz de 0,5 mm. Las muestras con humedad elevada deben secarse al aire a una temperatura no superior a 50 oC, o bien liofilizarse antes de la molienda. Las muestras con un elevado contenido de grasa deberán someterse a extracción con éter de petróleo (3.12) antes de la molienda.

5.2. Determinación de los aminoácidos libres en piensos y premezclas

Pesar en un Erlenmeyer, con una precisión de 0,2 mg, una cantidad adecuada (1-5 g) de la muestra preparada (5.1), y añadir 100,0 ml de mezcla de extracción (3.21). Agitar la mezcla durante 60 minutos utilizando un agitador mecánico o magnético (4.8). Dejar que sedimente y pipetear 10,0 ml de la solución sobrenadante a un vaso de precipitado de 100 ml.

Añadir removiendo 5,0 ml de solución de ácido sulfosalicílico (3.22) y seguir removiendo con ayuda de un agitador magnético durante cinco minutos. Filtrar o centrifugar el sobrenadante para eliminar el posible precipitado. Verter 10,0 ml de la solución resultante en un vaso de precipitado de 100 ml y ajustar el pH a 2,20 con solución de hidróxido de sodio (3.18), transvasar a un matraz aforado de volumen adecuado con solución reguladora de citrato (3.24) y enrasar con esta misma solución reguladora.

Si se utiliza un patrón interno, añadir 1,00 ml de patrón interno (3.27.3) por cada 100 ml de solución final y enrasar con la solución reguladora (3.24).

Pasar a la fase de cromatografía según el punto 5.4.

Si los extractos no se examinan el mismo día, deben conservarse a menos de 5 oC.

5.3. Determinación de los aminoácidos totales

5.3.1. Oxidación

Pesar, con una precisión de 0,2 mg, entre 0,1 g y 1 g de la muestra preparada (5.1), en:

— un matraz de fondo redondo de 100 ml (4.1) para hidrólisis abierta (5.3.2.3), o

— un matraz de fondo redondo de 250 ml (4.1), si se requiere una baja concentración de sodio (5.3.3.1), o

— un frasco de 100 ml con tapón de rosca (4.2) para hidrólisis cerrada (5.3.2.4).

La porción de muestra pesada debe tener un contenido de nitrógeno de unos 10 mg y un contenido de humedad no superior a 100 mg.

Colocar el matraz o el frasco en un baño de hielo y agua y enfriarlo a 0 oC, añadir 5 ml de mezcla de oxidación (3.23) y mezclar con una espátula de vidrio de punta curvada. Cerrar el matraz o el frasco, con la espátula dentro, por medio de una película impermeable al aire, colocar el baño de hielo y agua con el recipiente cerrado en un frigorífico a 0 oC y dejar durante 16 horas. Transcurridas esas 16 horas, sacar del frigorífico y descomponer el exceso de reactivo de oxidación añadiendo 0,84 g de disulfito de sodio (3.4).

Pasar al punto 5.3.2.1.

5.3.2. Hidrólisis

5.3.2.1. Hidrólisis de muestras oxidadas

Añadir 25 ml de mezcla de hidrólisis (3.20) a la muestra oxidada preparada según el punto 5.3.1, procurando arrastrar cualquier residuo de muestra que hubiera quedado adherido a las paredes del recipiente y a la espátula.

Según el procedimiento de hidrólisis utilizado, proceder según el punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hidrólisis de muestras no oxidadas

Pesar en un matraz de fondo redondo de 100 ml o 250 ml (4.1), o en un frasco de 100 ml con tapón de rosca (4.2), con una precisión de 0,2 mg, entre 0,1 g y 1 g de la muestra preparada (5.1). La porción de muestra pesada debe tener un contenido de nitrógeno de unos 10 mg. Añadir cuidadosamente 25 ml de mezcla de hidrólisis (3.20) y mezclar con la muestra. Proceder según el punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

5.3.2.3. Hidrólisis abierta

Añadir 3 perlas de vidrio a la mezcla del matraz (preparada según el punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2) y hervir con borboteo continuo y reflujo durante 23 horas. Al terminar la hidrólisis, lavar el refrigerante con 5 ml de solución reguladora de citrato (3.24). Desconectar el matraz y enfriarlo en un baño de hielo.

Proceder según el punto 5.3.3.

5.3.2.4. Hidrólisis cerrada

Colocar el frasco con la mezcla preparada según el punto 5.3.2.1 o 5.3.2.2 en una estufa (4.3) a 110 oC. Durante la primera hora, para prevenir la formación de presión (debido a la producción de sustancias gaseosas) y evitar el peligro de explosión, poner el tapón de rosca encima del recipiente, pero sin cerrarlo. Al cabo de una hora, cerrar el recipiente con el tapón y dejarlo en la estufa (4.3) durante 23 horas. Una vez terminada la hidrólisis, sacar el frasco de la estufa, desenroscar cuidadosamente el tapón y colocar el frasco en un baño de hielo y agua. Dejar enfriar.

En función del método de ajuste del pH (5.3.3), transvasar cuantitativamente el contenido del frasco a un vaso de precipitado de 250 ml o a un matraz de fondo redondo de 250 ml, utilizando solución reguladora de citrato (3.24).

Proceder según el punto 5.3.3.

5.3.3. Ajuste del pH

En función de la tolerancia al sodio del analizador de aminoácidos (4.9), proceder según el punto 5.3.3.1 o 5.3.3.2 para ajustar el pH.

5.3.3.1. En el caso de sistemas cromatográficos (4.9) que requieran una baja concentración de sodio

Es recomendable utilizar una solución patrón madre de patrón interno (3.27.3) si se utilizan analizadores de aminoácidos que requieran una baja concentración de sodio (cuando haya que reducir el volumen de ácido).

En este caso, añadir al hidrolizado 2,00 ml de la solución patrón madre (3.27.3) interna antes de la evaporación.

Añadir 2 gotas de 1-octanol (3.15) al hidrolizado obtenido según el punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4.

Por medio de un evaporador rotativo (4.7), reducir el volumen a 5-10 ml en vacío a 40 oC. Si el volumen se reduce accidentalmente a menos de 5 ml, debe desecharse el hidrolizado y recomenzarse el análisis.

Ajustar el pH a 2,20 con solución de hidróxido de sodio (3.18) y pasar al punto 5.3.4.

5.3.3.2. Para los demás analizadores de aminoácidos (4.9)

Tomar los hidrolizados obtenidos de acuerdo con el punto 5.3.2.3 o 5.3.2.4 y neutralizarlos parcialmente añadiendo, mientras se remueve, 17 ml de solución de hidróxido de sodio (3.17), cuidando de que la temperatura se mantenga por debajo de 40 oC.

Ajustar el pH a 2,20 a temperatura ambiente con solución de hidróxido de sodio (3.17) y, finalmente, con solución de hidróxido de sodio (3.18). Pasar al punto 5.3.4.

5.3.4. Solución de muestra para cromatografía

Transvasar cuantitativamente el hidrolizado de pH ajustado (5.3.3.1 o 5.3.3.2) con solución reguladora de citrato (3.24) a un matraz aforado de 200 ml y enrasar con solución reguladora (3.24).

Si aún no se ha utilizado un patrón interno, añadir 2,00 ml de patrón interno (3.27.3) y enrasar con solución reguladora de citrato (3.24). Mezclar perfectamente.

Pasar a la fase de cromatografía (5.4).

Si las soluciones de muestra no se van a examinar el mismo día, deben conservarse a menos de 5 oC.

5.4. Cromatografía

Antes de realizar la cromatografía, llevar el extracto (5.2) o el hidrolizado (5.3.4) a temperatura ambiente. Agitar la mezcla y filtrar una cantidad adecuada a través de un filtro de membrana de 0,22 μm (4.5). Se obtiene una solución clara que se somete a cromatografía de intercambio iónico, utilizando un analizador de aminoácidos (4.9).

La inyección puede realizarse de forma manual o automática. Es importante que siempre se añada a la columna la misma cantidad de solución ± 0,5 % para el análisis de patrones y muestras, excepto cuando se utilice un patrón interno, y que las relaciones sodio/aminoácidos de las soluciones patrón y de muestra sean lo más parecidas posible.

En general, la frecuencia de las calibraciones depende de la estabilidad del reactivo de ninhidrina y del sistema analítico. El patrón o la muestra se diluyen con solución reguladora de citrato (3.24) para conseguir un área de pico del patrón equivalente al 30-200 % del área de pico de los aminoácidos de la muestra.

La cromatografía de aminoácidos variará ligeramente según el tipo de analizador empleado y la resina utilizada. El sistema elegido debe ser capaz de separar unos aminoácidos de otros y los aminoácidos de otros materiales que reaccionan con la ninhidrina. En el intervalo de funcionamiento, el sistema cromatográfico debe proporcionar una respuesta lineal a los cambios en las cantidades de aminoácidos que se añadan a la columna.

Durante la fase de cromatografía, cuando se analice una solución equimolar (de los aminoácidos determinados), se aplicarán las relaciones altura de valle/altura de pico que se mencionan más adelante. Esta solución equimolar debe contener al menos el 30 % de la carga máxima de cada aminoácido que puede medirse con exactitud con el sistema de análisis de aminoácidos (4.9).

Para separar la treonina de la serina, la relación altura de valle/altura de pico del más bajo de los dos aminoácidos que se solapan en el cromatograma no debe pasar de 2/10 (si solo se determinan cistina, cisteína, metionina, treonina y lisina, una separación insuficiente entre picos adyacentes afectará negativamente a la determinación). Respecto a los demás aminoácidos, la separación debe ser mejor que 1/10.

El sistema debe garantizar que la lisina se separe de los «artefactos de lisina» y de la ornitina.

6. Cálculo de los resultados

Las áreas de los picos de la muestra y el patrón se miden para cada aminoácido y la cantidad correspondiente (X) se calcula en gramos de aminoácidos por kilogramo de muestra.

Si se utiliza un patrón interno, debe multiplicarse por:

A = área de pico, hidrolizado o extracto

B = área de pico, solución patrón de calibración

C = área de pico, patrón interno en el hidrolizado o el extracto

D = área de pico, patrón interno, solución patrón de calibración

M = peso molecular del aminoácido que se está determinando

c = concentración del patrón en μmol/ml

m = peso de la muestra (g) (corregido para obtener el peso original si se ha desecado o desengrasado)

V = mililitros de hidrolizado total (5.3.4) o mililitros de volumen de dilución total calculado del extracto (6.1).

Tanto la cistina como la cisteína se determinan como ácido cisteico en hidrolizados de la muestra oxidada, pero se calculan como cistina (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) utilizando un M de 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).

La metionina se determina como metionina sulfona en hidrolizados de muestra oxidada, pero se calcula como metionina utilizando el M de la metionina: 149,21 g/mol.

La metionina libre añadida se determina tras extracción como metionina, utilizando para el cálculo el mismo M.

6.1. El volumen total de dilución de los extractos (F) para la determinación de los aminoácidos libres (5.2) se calcula como sigue: V = volumen del extracto final

7. Evaluación del método

El método se puso a prueba en un estudio intercomparativo realizado a nivel internacional en 1990 con cuatro piensos diferentes (pienso mezclado para cerdos, pienso compuesto para pollos de engorde, concentrado de proteínas y premezcla). Los resultados, tras descartar los valores atípicos, de la media y de la desviación típica se indican en los cuadros que figuran en el presente punto:







Medias en g/kg Material de referencia Aminoácido Treonina Cistina y cisteína Metionina Lisina Pienso mezclado para cerdos 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Pienso compuesto para pollos de engorde 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Concentrado de proteínas 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premezcla 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = número de laboratorios participantes

7.1. Repetibilidad

La repetibilidad del citado estudio intercomparativo, expresada como «desviación típica intralaboratorio», se indica en los cuadros siguientes:







Desviación típica intralaboratorio (Sr) en g/kg Material de referencia Aminoácido Treonina Cistina y cisteína Metionina Lisina Pienso mezclado para cerdos 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Pienso compuesto para pollos de engorde 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Concentrado de proteínas 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premezcla 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = número de laboratorios participantes







Coeficiente de variación (%) de la desviación típica intralaboratorio (Sr) Material de referencia Aminoácido Treonina Cistina y cisteína Metionina Lisina Pienso mezclado para cerdos 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Pienso compuesto para pollos de engorde 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Concentrado de proteínas 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premezcla 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = número de laboratorios participantes

7.2 Reproducibilidad

En el cuadro siguiente se indican los resultados de la desviación típica interlaboratorios obtenida en el citado estudio intercomparativo:







Desviación típica interlaboratorios (SR) en g/kg Material de referencia Aminoácido Treonina Cistina y cisteína Metionina Lisina Pienso mezclado para cerdos 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Pienso compuesto para pollos de engorde 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Concentrado de proteínas 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premezcla 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = número de laboratorios participantes







Coeficiente de variación (%) de la desviación típica interlaboratorios (SR) Material de referencia Aminoácido Treonina Cistina y cisteína Metionina Lisina Pienso mezclado para cerdos 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Pienso compuesto para pollos de engorde 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Concentrado de proteínas 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premezcla 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = número de laboratorios participantes

8. Uso de materiales de referencia

La correcta aplicación del método se verificará haciendo mediciones reiteradas de materiales de referencia certificados, cuando estén disponibles. Se recomienda la calibración con solución de calibración de aminoácidos certificada.

9. Observaciones

9.1. Debido a las diferencias entre los analizadores de aminoácidos, las concentraciones finales de las soluciones de calibración de los aminoácidos patrón (véanse los puntos 3.27.4 y 3.27.5) y del hidrolizado (véase el punto 5.3.4) deberán entenderse como orientativas. El intervalo de respuesta lineal del aparato debe comprobarse con todos los aminoácidos. La solución patrón se diluye con una solución reguladora de citrato para obtener áreas de pico en el centro del intervalo.

9.2. Si se usa un equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución para analizar los hidrolizados, deben optimizarse las condiciones experimentales siguiendo las recomendaciones del fabricante.

9.3. Si se aplica este método a piensos que contengan más de un 1 % de cloruro (concentrados, piensos minerales, piensos complementarios), es posible que se subestimen los valores de metionina, por lo que debe aplicarse un tratamiento especial.

G. DETERMINACIÓN DEL TRIPTÓFANO

1. Objeto y ámbito de aplicación

Este método permite determinar el triptófano total y libre en los piensos. No distingue entre formas L y D.

2. Principio

Para la determinación del triptófano total, la muestra se hidroliza en condiciones alcalinas con solución saturada de hidróxido de bario y se calienta a 110 oC durante veinte horas. Tras la hidrólisis se añade patrón interno.

Para la determinación del triptófano libre, la muestra se somete a extracción en condiciones de acidez suave en presencia de patrón interno.

El triptófano y el patrón interno presentes en el hidrolizado o en el extracto se determinan mediante CLAR con detección por fluorescencia.

3. Reactivos

3.1. Debe utilizarse agua bidestilada o agua de calidad equivalente (conductividad < 10 μS/cm).

3.2. Sustancia patrón: triptófano (pureza/contenido ≥ 99 %), desecado al vacío sobre pentóxido de fósforo

3.3. Patrón interno: α-metiltriptófano (pureza/contenido ≥ 99 %), desecado al vacío sobre pentóxido de fósforo

3.4. Hidróxido de bario octahidratado (deberá procurarse no exponer excesivamente el Ba(OH)2 · 8 H2O al aire a fin de evitar la formación de BaCO3, que podría interferir en la determinación) (véase la observación del punto 9.3)

3.5. Hidróxido de sodio

3.6. Ácido ortofosfórico, p (p/p) = 85 %

3.7. Ácido clorhídrico, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8. Metanol, equivalente al de calidad CLAR

3.9. Éter de petróleo, con un intervalo de ebullición de 40-60 oC

3.10. Solución de hidróxido de sodio, c = 1 mol/l: Disolver 40,0 g de NaOH (3.5) en agua y enrasar a 1 l con agua (3.1).

3.11. Ácido clorhídrico, c = 6 mol/l: Tomar 492 ml de HCl (3.7) y enrasar a 1 l con agua.

3.12. Ácido clorhídrico, c = 1 mol/l: Tomar 82 ml de HCl (3.7) y enrasar a 1 l con agua.

3.13. Ácido clorhídrico, c = 0,1 mol/l: Tomar 8,2 ml de HCl (3.7) y enrasar a 1 l con agua.

3.14. Ácido ortofosfórico, c = 0,5 mol/l: Tomar 34 ml de ácido ortofosfórico (3.6) y enrasar a 1 l con agua (3.1).

3.15. Solución concentrada de triptófano (3.2), c = 2,50 μmol/ml: En un matraz aforado de 500 ml, disolver 0,2553 g de triptófano (3.2) en ácido clorhídrico (3.13) y enrasar con ácido clorhídrico (3.13). Conservar a - 18 oC durante cuatro semanas como máximo.

3.16. Solución concentrada de patrón interno, c = 2,50 μmol/ml: En un matraz aforado de 500 ml, disolver 0,2728 g de α-metiltriptófano (3.3) en ácido clorhídrico (3.13) y enrasar con ácido clorhídrico (3.13). Conservar a - 18 oC durante cuatro semanas como máximo.

3.17. Solución patrón de calibración de triptófano y patrón interno: Tomar 2,00 ml de solución concentrada de triptófano (3.15) y 2,00 ml de solución concentrada de patrón interno (α-metiltriptófano) (3.16). Diluir con agua (3.1) y metanol (3.8) hasta conseguir aproximadamente el mismo volumen y la misma concentración de metanol (10-30 %) que en el hidrolizado acabado. Esta solución debe prepararse poco antes de utilizarse. Proteger de la luz solar directa mientras se prepara.

3.18. Ácido acético

3.19. 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol

3.20. Etanolamina p (p/p) > 98 %

3.21. Solución de 1 g de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (3.19) en 100 ml de metanol (3.8)

3.22. Fase móvil para la CLAR: 3,00 g de ácido acético (3.18) + 900 ml de agua (3.1) + 50,0 ml de solución (3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (3.19) en metanol (3.8) (1 g/100 ml). Ajustar el pH a 5,00 con etanolamina (3.20). Enrasar a 1 000 ml con agua (3.1).

4. Instrumental

4.1. Equipo de CLAR con detector por espectrofluorometría

4.2. Columna cromatográfica de líquidos, de 125 mm x 4 mm, C18, relleno de 3 μm, o equivalente

4.3. pH-metro

4.4. Matraz de polipropileno, de 125 ml de capacidad, cuello ancho y tapón de rosca

4.5. Filtro de membrana de 0,45 μm

4.6. Autoclave, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar

4.7. Agitador mecánico o magnético

4.8. Agitador vortex

5. Procedimiento

5.1. Preparación de las muestras

La muestra se muele hasta que pase por un tamiz de 0,5 mm. Las muestras con humedad elevada deben secarse al aire a una temperatura no superior a 50 oC, o bien liofilizarse antes de la molienda. Las muestras con un elevado contenido de grasa deberán someterse a extracción con éter de petróleo (3.9) antes de la molienda.

5.2. Determinación del triptófano libre (extracto)

Pesar en un Erlenmeyer, con una precisión de 1 mg, una cantidad adecuada (1-5 g) de la muestra preparada (5.1). Añadir 100,0 ml de ácido clorhídrico (3.13) y 5,00 ml de solución concentrada de patrón interno (3.16). Agitar o mezclar durante 60 minutos utilizando un agitador mecánico o magnético (4.7). Dejar sedimentar y pipetear 10,0 ml de la solución sobrenadante a un vaso de precipitado. Añadir 5 ml de ácido ortofosfórico (3.14). Ajustar el pH a 3 utilizando hidróxido de sodio (3.10). Añadir suficiente metanol (3.8) para obtener en el volumen final una concentración de metanol del 10 % al 30 %. Transvasar a un matraz aforado de capacidad adecuada y diluir con agua hasta conseguir el volumen necesario para la cromatografía (aproximadamente el mismo volumen que la solución patrón de calibración [3.17]).

Filtrar unos pocos mililitros de la solución por un filtro de membrana de 0,45 μm (4.5) antes de inyectarla en la columna de CLAR. Pasar a la fase de cromatografía según el punto 5.4.

Proteger la solución patrón y los extractos de la luz solar directa. Si no es posible analizar los extractos el mismo día, pueden conservarse a 5 oC durante tres días como máximo.

5.3. Determinación del triptófano total (hidrolizado)

Pesar en el matraz de polipropileno (4.4), con una precisión de 0,2 mg, entre 0,1 g y 1 g de la muestra preparada (5.1). La porción de muestra pesada deberá tener un contenido de nitrógeno de unos 10 mg. Añadir 8,4 g de hidróxido de bario octahidratado (3.4) y 10 ml de agua. Mezclar con un agitador vortex (4.8) o un agitador magnético (4.7). Dejar dentro de la mezcla el imán recubierto de teflón. Lavar las paredes del recipiente con 4 ml de agua. Poner el tapón de rosca y cerrar el matraz sin apretar. Pasar al autoclave (4.6) con agua hirviendo y dejar al vapor durante 30 a 60 minutos. Cerrar el autoclave y dejar a 110 (± 2) oC durante 20 horas.

Antes de abrir el autoclave, reducir la temperatura hasta justo por debajo de 100 oC. Para evitar la cristalización del Ba(OH)2 · 8 H2O, añadir a la mezcla caliente 30 ml de agua que esté a temperatura ambiente. Agitar o remover suavemente. Añadir 2,00 ml de solución concentrada de patrón interno (α-metiltriptófano) (3.16). Enfriar el recipiente en baño de agua y hielo durante 15 minutos.

A continuación, añadir 5 ml de ácido ortofosfórico (3.14). Mantener el recipiente en el baño frío y neutralizar con HCl (3.11), al tiempo que se remueve; ajustar el pH a 3,0 con HCl (3.12). Añadir suficiente metanol para obtener en el volumen final una concentración de metanol del 10 % al 30 %. Pasar a un matraz aforado de capacidad adecuada y diluir con agua hasta conseguir el volumen definido necesario para la cromatografía (por ejemplo, 100 ml). La adición de metanol no deberá producir precipitación.

Filtrar unos pocos mililitros de la solución por un filtro de membrana de 0,45 μm (4.5) antes de inyectarla en la columna de CLAR. Pasar a la fase de cromatografía según el punto 5.4.

Proteger la solución patrón y los hidrolizados de la luz solar directa. Si no es posible analizar los hidrolizados el mismo día, pueden conservarse a 5 oC durante tres días, como máximo.

5.4. Determinación mediante CLAR

Las siguientes condiciones de elución isocrática tienen carácter orientativo; pueden aplicarse otras, siempre que ofrezcan resultados equivalentes (véanse también las observaciones de los puntos 9.1 y 9.2).







Columna cromatográfica de líquidos: 125 mm x 4 mm, C18, relleno de 3 μm, o equivalente Temperatura de la columna: Temperatura ambiente Fase móvil (3.22): 3,00 g de ácido acético (3.18) + 900 ml de agua (3.1) +50,0 ml de solución (3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (3.19) en metanol (3.8) (1 g/100 ml). Ajustar el pH a 5,00 con etanolamina (3.20). Enrasar a 1 000 ml con agua (3.1). Caudal: 1 ml/min. Tiempo total del ciclo: Aproximadamente 34 minutos Longitud de onda de detección: Excitación: 280 nm, emisión: 356 nm. Volumen de inyección: 20 μl

6. Cálculo de los resultados

Se calcula la cantidad de triptófano (X) en gramos por cada 100 g de muestra.

A = área de pico del patrón interno, solución patrón de calibración (3.17)

B = área de pico del triptófano, extracto (5.2) o hidrolizado (5.3)

V1 = volumen en mililitros (2 ml) de la solución concentrada de triptófano (3.15) añadida a la solución de calibración (3.17)

c = concentración en μmol/ml (= 2,50) de la solución concentrada de triptófano (3.15) añadida a la solución de calibración (3.17)

V2 = volumen en mililitros de la solución concentrada de patrón interno (3.16) añadida al extracto (5.2) (= 5,00 ml) o al hidrolizado (5.3) (= 2,00 ml)

C = área de pico del patrón interno, extracto (5.2) o hidrolizado (5.3)

D = área de pico del triptófano, solución patrón de calibración (3.17)

V3 = volumen en mililitros (= 2,00 ml) de la solución concentrada de patrón interno (3.16) añadida a la solución patrón de calibración (3.17)

m = peso de la muestra en gramos (corregido al peso original si se ha desecado o desengrasado)

M = peso molecular del triptófano (= 204,23 g/mol)

7. Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra no debe rebasar el 10 % del resultado más elevado.

8. Resultados de un estudio colaborativo

Se organizó un estudio colaborativo de la Comunidad Europea (cuarta comparación interlaboratorios), en el cual hasta 12 laboratorios analizaron tres muestras para certificar el método de hidrólisis. Con cada muestra se repitieron varios análisis (5). Los resultados se recogen en el cuadro siguiente:







Muestra 1 Pienso para cerdos Muestra 2 Pienso para cerdos con complemento de L-triptófano Muestra 3 Pienso concentrado para cerdos L 12 12 12 n 50 55 50 Media [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = número de laboratorios que presentaron resultados

n = número de resultados individuales aceptados tras eliminar los valores atípicos (identificados mediante las pruebas de Cochran y Dixon)

sr = desviación típica de la repetibilidad

SR = desviación típica de la reproducibilidad

r = repetibilidad

R = reproducibilidad

CVr = coeficiente de variación de la repetibilidad, en tanto por ciento

CVR = coeficiente de variación de la reproducibilidad, en tanto por ciento

En otro estudio colaborativo de la Comunidad Europea (tercera comparación interlaboratorios), hasta trece laboratorios analizaron dos muestras para certificar el método de extracción del triptófano libre. Con cada muestra se repitieron varios análisis (5). Los resultados se recogen en el cuadro siguiente:







Muestra 4 Mezcla de trigo y soja Muestra 5 Mezcla de trigo y soja (= muestra 4) con triptófano añadido (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Media [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = número de laboratorios que presentaron resultados

n = número de resultados individuales aceptados tras eliminar los valores atípicos (identificados mediante las pruebas de Cochran y Dixon)

sr = desviación típica de la repetibilidad

SR = desviación típica de la reproducibilidad

r = repetibilidad

R = reproducibilidad

CVr = coeficiente de variación de la repetibilidad, en tanto por ciento

CVR = coeficiente de variación de la reproducibilidad, en tanto por ciento

En otro estudio intercomparativo de la Comunidad Europea, hasta siete laboratorios analizaron cuatro muestras para certificar el método de hidrólisis de triptófano. A continuación figuran los resultados del estudio. Con cada muestra se repitieron varios análisis (5).







Muestra 1 Pienso mezclado para cerdos (CRM 117) Muestra 2 Harina de pescado con poca grasa (CRM 118) Muestra 3 Sémola de soja (CRM 119) Muestra 4 Leche desnatada en polvo (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Media [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = número de laboratorios que presentaron resultados

n = número de resultados individuales aceptados tras eliminar los valores atípicos (identificados mediante las pruebas de Cochran y Dixon)

sr = desviación típica de la repetibilidad

SR = desviación típica de la reproducibilidad

r = repetibilidad

R = reproducibilidad

CVr = coeficiente de variación de la repetibilidad, en tanto por ciento

CVR = coeficiente de variación de la reproducibilidad, en tanto por ciento

9. Observaciones

9.1. Las siguientes condiciones cromatográficas pueden ofrecer una mejor separación entre el triptófano y el α-metiltriptófano. Elución isocrática, seguida de lavado de la columna de gradiente:



Columna cromatográfica de líquidos: 125 mm x 4 mm, C18, relleno de 5 μm, o equivalente Temperatura de la columna: 32 oC Fase móvil: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V + V) B: Metanol Programa de gradientes: 0 min. 100 % A 0 % B 15 min. 100 % A 0 % B 17 min. 60 % A 40 % B 19 min. 60 % A 40 % B 21 min. 100 % A 0 % B 33 min. 100 % A 0 % B Caudal: 1,2 ml/min. Tiempo total del ciclo: aproximadamente 33 minutos

9.2. La cromatografía variará en función del tipo de CLAR y del material de relleno de la columna. El sistema elegido debe proporcionar una separación en la línea base entre el triptófano y el patrón interno. Asimismo, es importante que los productos de degradación se separen bien del triptófano y del patrón interno. Deberán pasarse hidrolizados sin patrón interno para comprobar las impurezas de la línea base bajo el patrón interno. También es importante que el ciclo dure lo suficiente para que se eluyan todo