1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B SÉPTIMADIRECTIVADELACOMISIÓN
de1demarzode1976
sobredeterminacióndemétodosdeanálisiscomunitariosparaelcontroloficialdelaalimentación
animal
(76/372/CEE)
(DO L 102 de 15.4.1976, p. 8)
Modificada por:
Diario Oficial
nopágina fecha
►M1Directiva 81/680/CEE de la Comisión de 30 de julio de 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Directiva 92/95/CEE de la Comisión de 9 de noviembre de 1992 L 327 54 13.11.1992
►M3Directiva 94/14/CE de la Comisión de 29 de marzo de 1994 L 94 30 13.4.1994
▼B
SÉPTIMADIRECTIVADELACOMISIÓN
de1demarzode1976
sobre determinación demétodosdeanálisiscomunitarios parael
controloficialdelaalimentaciónanimal
(76/372/CEE)
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,Vista la Directiva del Consejo, de 20 de julio de 1970, referente a la
introducción de modos de tomas de muestras y de métodos de análisis
comunitariospara el control oficial de la alimentación animal(
1), modi-
ficada en último lugar por el Acta de adhesión(2) y, en particular, su
artículo 2,
Considerando que la Directiva arriba contemplada prevé que los
controlesoficialesde la alimentación animal dirigidosa comprobarque se respetan las condiciones prescritas en virtud de las disposicioneslegales, reglamentarias y administrativas referentes a la calidad y a la
composición de la alimentación animal, se llevan a cabo según los
modos de tomas de muestras y los métodos de análisis comunitarios,
Considerando que las Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/
CEE, 73/46/CEE, 74/203/CEE y 75/84/CEE de la Comisión, de 15 dejunio de 1971(
3), 18 de noviembre de 1971(4), 27 de abril de 1972(5),
5 de diciembre de 1972(6), 25 de marzo de 1974(7) y 20 de diciembre
de 1974(8), establecieron ya un determinado número de métodos de
análisis comunitarios; que habida cuenta del avanzado estado de lostrabajos llevados a cabo desde entonces, conviene adoptar una séptimaserie de métodos,
Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva
concuerdan con el dictamen del Comité permanente de la alimentaciónanimal.
HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA:
Artículo 1
Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles
oficialesde alimentación animal, en lo referente a s u contenido en afla-
toxina B1se llevarán a cabo según los métodos descritos en el Anexo
de la presente Directiva.
Artículo 2
LosEs tadosmiembrosaplicarán, a mástardar, el 1 de octubre de 1976,
las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas necesarias
para cumplir la presente Directiva e informarán de ello inmediatamente
a la Comisión.
Artículo 3
Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 2
(1)D O noL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)D O noL 73 de 27. 3. 1972, p. 14.
(3)D O noL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(4)D O noL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.
(5)D O noL 123 de 29. 5. 1972, p. 6.
(6)D O noL 83 de 30. 3. 1973, p. 21.
(7)D O noL 108 de 22. 4. 1974, p. 7.
(8)D O noL 32 de 5. 2. 1975, p. 26.▼M1
▼B
▼B
ANEXO
DOSIFICACIÓNDELAAFLATOXINAB1
A. MÉTODO POR CROMATOGRAFÍA MONODIMENSIONAL EN CAPA
FINA
1.Objetoycampodeaplicación
El método permite determinar el contenido en aflatoxina de las
materias primas y piensos simples. Este método no puede ser utili-
zado en presencia de pulpas de cítricos. El límite inferior de
determinación es0,01 mg/kg (10 ppb).
En presencia de sustancias interferentes que dificulten las determi-
naciones, se volverá a iniciar el análisis según el método B (por
cromatografía de líquidosde alta res olución).
2.Principio
La muestra se somete a la extracción mediante cloroformo. Se filtra
el extracto y se toma del mismo una parte alicuota que es purifi-
cada mediante cromatografía en columna de gel de sílice. El
eluido se evapora y el residuo se vuelve a tomar mediante un
volumen determinado de cloroformo o de una mezcla de benceno
y acetonitrilo. Una parte alicuota de dicha solución se somete a la
cromatografía en capa fina. La cantidad de aflatoxina B1se deter-
mina bajo irradiación ultravioleta del cromatograma bien sea
visualmente, o a través de fluordensitometría, mediante compara-
ción con cantidadesconocidasde aflatoxina B1-tipo. La identidad
de la aflatoxina B1extraida del alimento debe confirmarse mediante
losprocedimientosindicados .
3.Reactivos
NB:Todos los reactivos deben ser de calidad «para el análisis» en
la medida en que no se ha dado ninguna otra indicación.
3.1. Acetona.
3.2. Cloroformo, estabilizado por del 0,5 al 1,0 por ciento de etanol de
96º (v/v).
3.3. n-Hexano.
3.4. Metanol.
3.5. Eter dietílico anhídrido, exento de peróxidos.
3.6. Mezcla de benceno y de acetonitrilo: 98/2 (v/v).
3.7. Mezcla de cloroformo (3.2) y de metanol (3.4): 97/3 (v/v).
3.8. Gel de sílice, para cromatografía en columna, granulometría: de
0,05 a 0,20 mm.
3.9. Algodón hidrófilo, previamente desengrasado mediante cloroformo,
o lana de vidrio.
3.10. Sulfato de sodio, anhidro, granulado.
3.11. Gasinerte, por ejemplo: ázoe.
3.12. Acido clorhídrico 1 N.
3.13. Acidó sulfúrico al 50 por ciento (v/v).
3.14. Tierra de diatomeas(Hiflos upercel) lavada con ácido.
3.15. Gel de sílice G-HR o equivalente, para cromatografía en capa fina.
3.16. Solución tipo de 0,1 µgr. aproximadamente de aflatoxina B1por
milímetro en el cloroformo (3.2) o en la mezcla de benceno/aceto-
nitrilo (3.6), preparada y controlada como se indica en el punto 7.
3.17. Solución tipo cualitativa de 0,1 µgr. aproximadamente de aflatoxina
B1yB2por ml en el cloroformo (3.2) o en la mezcla benceno/
acetonitrilo (3.6). Estas concentraciones se dan a título indicativo1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 3
▼M2
▼B
▼B
y deben ajustarse con objeto de obtener la misma intensidad de
fluorescencia para las dos aflatoxinas.
3.18. Disolventes de revelado:
3.18.1. Cloroformo (3.2)/acetona (3.1): 9/1 (v/v), cubeta no saturada;
3.18.2. Eter dietílico (3.5)/metanol (3.4)/agua: 96/3/1 (v/v/v), cubeta no
saturada;
3.18.3. Eter dietílico (3.5)/metanol (3.4)/agua: 94/4,5/1,5 (v/v/v), cubeta
saturada;
3.18.4. Cloroformo (3.2)/metanol (3.4): 94/6 (v/v), cubeta saturada;
3.18.5 Cloroformo (3.2)/metanol (3.4): 97/3 (v/v), cubeta saturada.
4.Equipo
4.1. Triturador-mezclador.
4.2. Aparato para agitar o agitador magnético.
4.3. Filtrosplegados , Schleicher y Schüll no588 o equivalente,
diámetro: 24 cm.
4.4. Tubospara cromatografía, de cris tal (diámetro interior: 22 mm,
longitud 300 mm), con grifo de teflón y depósito de 250 ml.
4.5. Aparato rotativo de evaporación en vacío, con matraz de 500 ml.
4.6. Frascos cónicos de 500 ml, con tapón esmerilado.
4.7. Equipo para cromatografía en capa fina.
4.8. Placasde vidrio para cromatografía en capa fina, 200 × 200 mm,
preparadas de la siguiente manera (con las cantidades indicadas se
pueden recubrir cinco placas): introducir 30 grs. de gel de sílice G-
HR (3.15) en un frasco cónico, añadir 60 ml de agua, tapar y agitardurante un minuto. Extender la suspensión en las placas con objeto
de obtener una capa uniforme de 0,25 mm de espesor. Dejar secar
al aire y conservar después en un desecador provisto de gel de
sílice. En el momento de su utilización, activar las placas mante-
niéndolasdurante una hora en la es tufa a 110 nº C.
Las placas ya listas para su utilización son prácticas en la medida
en que dan resultados parecidos a los de las placas preparadas
según se ha indicado más arriba.
4.9. Lámpara ultravioleta de ondaslargas(360 nm). La intens idad de
irradiación debe permitir distinguir, incluso con claridad, una
mancha de 1,0 ngr. de aflatoxina B1 en una placa para cromato-
grafía en capa fina, a una distancia de 10 cm de la lámpara.
4.10. Tubosde 10 ml, graduados , con taponesde polietileno.
4.11. Espectrofotómetro ultravioleta.
4.12. Fluordensitómetro (eventualmente).
5.Mododeoperar
5.1. Preparación de la muestra (ver las observaciones del punto 1 de la
parte C)
Triturar la muestra de manera que pase completamentte a través de
un tamiz de mallasdel mm (conforme a la recomendación ISO R
565).
5.2. Extracción
Introducir 50,0 g de la muestra molida y homogeneizada en un
frasco cónico de 500 ml (4.6). Añadir 25 g de tierra de diatomeas
(3.14), 25 ml de agua y 250 ml de cloroformo (3.2). Tapar el
frasco, sacudir o agitar durante 30 minutos con ayuda del aparato
(4.2) y filtrar mediante el filtro plegado (4.3). Eliminar los10
primerosml del res ultado de la filtración y recoger a continuación
50 ml.
5.3. Purificación en columna
Proveer la extremidad inferior de un tubo para cromatografía (4.4)
de un tapón de algodón o de lana de vidrio (3.9), llenar losdos
terciosdel tubo de cloroformo (3.2) y añadir 5 g de s ulfato de
sodio (3.10).1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 4
▼B
Comprobar que la superificie superior de la capa de sulfato de
sodio está plana; añadir a continuación, en pequeñas porciones,
10 g de gel de sílice (3.8). Remover con precaución después de
cada adición con el fin de eliminar lasburbujasde aire. Dejar que
se pose durante 15 minutos y añadir seguidamente, con precaución,
15 g de sulfato de sodio (3.10). Dejar descender el líquido hasta la
proximidad inmediata de la superficie superior de la capa de sulfato
de sodio.
Mezclar los50 ml de extracto recogidosen 5.2 con 100 ml de n-
hexano (3.3) y transvasar cuantitativamente la mezcla en la
columna. Dejar descender el líquido hasta la superficie superior de
la capa de sulfato de sodio. Eliminar el líquido derramado. Añadir
a continuación 100 ml de éter dietílico (3.5) y dejar descender de
nuevo el líquido hasta la superficie superior de la capa de sulfato
de sodio. Durante estas operaciones, procurar que el líquido derra-
mado sea de 8 a 12 ml por minuto y que la columna no se vacíe.
Eliminar los líquidos derramados. Eluir después mediante 150 ml
de la mezcla cloroformo/metanol (3.7) y recoger la totalidad del
eluido.
Evaporar éste casi hasta vaciarlo, bajo una corriente de gas inerte
(3.11) y a una temperatura que no supere los 50 nºC, mediante el
aparato rotativo de evaporación en vacío (4.5). Introducir cuantitati-
vamente el residuo por medio de cloroformo (3.2) o de la mezcla
benceno/-acetonitrilo (3.6) en un tubo de 10 ml (4.10). Concentrar
la solución bajo una corriente de gas inerte (3.11) y llevar después
el volumen a 2,0 ml por medio de cloroformo (3.2) o de la mezcla
benceno/acetonitrilo (3.6).
5.4. Cromatografía en capa fina
Depositar puntualmente en una placa para cromatografía en capa
fina (4.8), a 2 cm del borde inferior y a intervalosde 2 cm, los
volúmenesde la s olución tipo y del extracto indicadosa continua-
ción:
— 10, 15, 20, 30 y 40 µl de la solución tipo de aflatoxina B1(3.16);
— 10 µl del extracto obtenido en 5.3 y, en superposición en el
mismo punto, 20 µl de la solución tipo (3.16);
— 10 y 20 µl del extracto obtenido en 5.3.
Revelar el cromatograma fuera del alcance de la luz, con ayuda de
uno de los disolventes de revelado (3.18). La elección del disol-
vente debe determinarse previamente depositando en la placa 25 µl
de la solución tipo cualitativa (3.17) y asegurándose de que,
durante el revelado, lasaflatoxinasB1yB2están completamente
separadas.
Dejar evaporar losdis olventesfuera del alcance de la luz e irradiar
a continuación mediante luz ultravioleta, colocando la placa a 10 cm
de la lámpara (4.9). Lasmanchasde aflatoxina B1dan una fluores-
cencia azul.
5.5. Determinaciones cuantitativas
Proceder a las determinaciones bien sea visualmente, o mediante
fluordensitometría según se indica en lo sucesivo:
5.5.1. Medidasvis uales
Determinar la cantidad de aflatoxina B1del extracto comparando la
intensidad de fluorescencia de las manchas del extracto con la de
las manchas de la solución tipo. Interpolar si es necesario. La fluo-
rescencia obtenida por superposición del extracto a la solución tipo
deber ser más fuerte que la de los 10 µl de extracto y únicamente
debe dar lugar a la percepción de una sóla mancha. Si la intensidad
de fluorescencia dada por los 10 µl de extracto es más fuerte que la
de los40 µl de s olución tipo, diluir el extracto 10 o 100 veces
mediante cloroformo (3.2) o mediante la mezcla de benceno/aceto-
nitrilo (3.6) antesde s ometerlo a una nueva cromatografía en capa
fina.
5.5.2. Medidaspor fluordens itometría
Medir la intensidad de fluorescencia de las manchas de aflatoxina
B1en el fluordensitómetro (4.12) utilizando una longitud de onda
de excitación de 365 nm y una longitud de onda de emisión de
443 nm. Determinar la cantidad de aflatoxina B1de losdepós itos
del extracto y de la solución tipo.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 5
▼B
5.6. Confirmación de la identidad de aflatoxina B1
Confirmar la identidad de la aflatoxina B1del extracto mediante los
siguientes procedimientos:
5.6.1. Tratamiento por ácido sulfúrico.
Pulverizar ácido sulfúrico (3.13) sobre el cromatograma obtenido
en 5.4. La fluorescencia de las manchas de aflatoxina B1debe virar
del azul al amarillo bajo irradiación ultavioleta.
5.6.2. Cromatografía bidimensional que implique la formación
de aflatoxina B1— semiacetal (aflatoxina B2a)
NB:Las operaciones descritas en lo sucesivo deben llevarse a cabo
siguiendo el esquema que aparece en la figura 3.
5.6.2.1. Aplicación de lass oluciones
Trazar en una placa (4.8) dosrectasparalelasa dosladoscontiguos
(distantes 6 cm de esos lados), destinadas a delimitar el desplaza-
miento de los frentes de disolventes. Depositar en una placa, con
ayuda de pipetas capilares o de microjeringas, las soluciones indi-
cadas en lo sucesivo:
—en el punto A: un volumen de extracto purificado de la muestra
obtenida en 5.3, que contenga 2,5 nanogramosaproximada-
mente de aflatoxina B1;
—en los puntos B y C: 25 µl de la solución tipo (3.16).
5.6.2.2. Revelado
Revelar el cromatograma en la dirección I con ayuda del disolvente
de revelado (3.18.1) [capa de 1 cm en una cubeta no saturada],
fuera del alcance de la luz, hasta que el frente de disolvente alcancela línea de delimitación. Retirar la placa de la cubeta y dejar secar
durante cinco minutosfuera del alcance de la luz y a la temperatura
ambiente. Pulverizar a continuación ácido clorhídrico (3.12) en una
banda de 2,5 cm de altura que abarque lospuntosA y B (indicada
con trazos rayados en la figura 3), hasta su oscurecimiento, prote-
giendo el resto de la placa mediante una hoja de vidrio. Dejar
reaccionar durante diez minutos en la obscuridad y secar con ayuda
de una corriente de aire a la temperatura ambiente.
Revelar a continuación el cromatograma en la dirección II con
ayuda del disolvente de revelado (3.18.1) [capa de 1 cm en una
cubeta no saturada], fuera del alcance de la luz, hasta que el frente
del disolvente alcance la línea de delimitación. Retirar la placa de
la cubeta y dejar secar a la temperatura ambiente.
5.6.2.3. Interpretación del cromatograma
Examinar el cromatograma con luz ultravioleta (4.9) y comprobar
las observaciones indicadas en lo sucesivo:
a) Aparición de una mancha fluorescente azul de aflatoxina B
1procedente de la solución tipo depositada en C (desplazamiento
en la dirección I).
b) Aparición de una mancha fluorescente azul de aflatoxina B1(que no ha reaccionado con el ácido clorhídrico) y de una
mancha fluorescente azul más intensa de aflatoxina B1—
semiacetal, procedente de la solución tipo depositada en B
(desplazamiento en la dirección II).
c) Aparición de manchass imilaresa lasindicadasen la letra b),
procedentes del extracto de la muestra depositado en A. El
emplazamiento de estas manchas está definido por la distancia
de desplazamiento de la aflatoxina B1a partir del punto A en
la dirección I (la misma distancia que la recorrida por la solu-
ción tipo depositada en C) seguida de las distancias de
desplazamiento recorridas en la dirección II por la aflatoxina
B1(que no ha reaccionado con el ácido clorhídrico) y por la
aflatoxina B1— semiacetal (las mismas distancias que las reco-
rridas por la solución tipo depositada en B). Las intensidades de
fluorescencia de las manchas de semiacetal procedentes del
extracto y de la solución tipo deberían corresponderse.
6.Cálculoderesultados
6.1. A partir de medidas visuales
El contenido en microgramosde aflatoxina B1por kilogramo de
muestra (ppb) viene dado por la fórmula1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 6
▼B
S/C1Y/C1V
W/C1X
en la cual:
X e Y son respectivamente los volúmenes en microlitros de solu-
ción tipo de aflatoxina B1(3.16) y del extracto, que tienen una
intensidad de fluorescencia semejante;
S = concentración en microgramosde aflatoxina B1por ml de la
solución tipo (3.16);
V = volumen final del extracto en microlitros, habida cuenta de
laseventualesdiluciones ;
W = peso en gramos de la toma de prueba correspondiente al
volumen de extracto sometido a la purificación en columna.
6.2. A partir de medidas fluordensitométricas
El contenido en microgramosde aflatoxina B1por kilogramo de
muestra (ppb) viene dado por la fórmula
S/C1V
W/C1Y
en la cual:
Y = volumen en microlitrosdel extracto depos itado en la placa
(10 o 20 µl);
S = cantidad en nanogramosde aflatoxina B1del depósito del
extracto (habida cuenta del volumen Y), deducida de las
determinaciones;
V = volumen final del extracto en microlitros, habida cuenta de
laseventualesdiluciones ;
W = peso en gramos de la toma de prueba, correspondiente al
volumen de extracto sometido a la purificación en columna.
7.Preparaciónycontroldelasolucióntipo(3.16)
7.1. Determinación de la concentración en aflatoxina B1
Preparar una solución tipo de aflatoxina B1en el cloroformo (3.2) o
en la mezcla benceno/-acetonitrilo (3.6) cuya concentración esde 8
a 10 µgrs por milílitro. Determinar el espectro de absorción entre
330 y 370 nm con ayuda de un espectrofotómetro (4.11).
Elevar la densidad óptica (A) a 363 nm en el caso de la solución
clorofórmica y a 348 nm en el caso de la solución en la mezcla
benceno/acetonitrilo.
Calcular la concentración de microgramosde aflatoxina B1por
milílitro de solución a partir de las siguientes fórmulas:
312/C1A/C11000
20600para la solución clorofórmica;
312/C1A/C11000
19800para la solución en la mezcla benceno/acetonitrilo.
Fuera del alcance de la luz, efectuar lasdilucionesconvenientes
para obtener una solución tipo de trabajo cuya concentración en
aflatoxina B1esde 0,1 µg aproximadamente por milílitro. Cons er-
vada en el refrigerador, dicha solución permanece estable durante
dos semanas.
7.2. Control de la pureza cromatográfica
Depositar en una placa (4.8) 5 µl de la solución tipo en 8-10 µg de
aflatoxina B1por milílitro (ver 7.1). Revelar el cromatograma según
se ha indicado en 5.4. Con la luz ultravioleta, la fluorescencia sólo
debe dar lugar a la percepción de una sola mancha y no debe perci-
birse ninguna fluorescencia en la zona del depósito de origen.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 7
▼B
8.Repetibilidad
La diferencia entre losres ultadosde lasdosdeterminacionespara-
lelas efectuadas en la misma muestra por el mismo analista no
debería superar:
— el 25 por ciento del resultado más elevado para los contenidos
en aflatoxina B1de 10 a 20 µg/kg,
— 5 µg, en valor absoluto, para los contenidos de 20 a 50 µg/kg,
— el 10 por ciento del resultado más elevado para los contenidos
superiores a 50 µg/kg.
9.Reproductibilidad
Ver lasobs ervacionesdel punto 2 de la parte C.
B. DETERMINACIÓN DE LA AFLATOXINA B1MEDIANTE CROMATO-
GRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN
1.Objetoyámbitodeaplicación
La presente propuesta describe un método para la determinación de
la aflatoxina B1en los piensos, incluidos los que contienen pulpa de
cítricos. El límite inferior de determinación es de 0,001 mg/kg.
2.Principio
El método se basa en la separación mediante cromatografía de
líquidos de alta resolución con detección por fluorescencia. La
extracción de la muestra se realiza con cloroformo. Se filtra el
extracto y una parte alícuota de éste se purifica en un cartucho de
Florisil y, a continuación, en un cartucho C18. La separación y
determinación finaless e realizan mediante cromatografía de
líquidos de alta resolución (HPLC) utilizando una columna de fase
inversa C18, seguida de una reacción post-columna con solución
acuosa de yodo y detección por fluorescencia.
Nota:Las micotoxinas son extremadamente tóxicas. Las manipula-
ciones deben llevarse a cabo en campana extractora de humos.
Deben tomarse precauciones especiales cuando las toxinas están
en forma sólida, ya que debido a su naturaleza electrostática
tienden a dispersarse en las áreas de trabajo.
3.Reactivos
3.1. Cloroformo estabilizado con 0,5 a 1,0 % de etanol, en masa. Ver
observación 10.2.
3.2. Metanol, grado HPLC para preparación de 3.6.3.3. Acetona.
3.4. Acetonitrilo, grado HPLC.
3.5. Disolventes de elución: preparar un día antes de su utilización o
eliminar mediante ultrasonidos el aire que contengan.
3.5.1. Mezcla de acetona (3.3) y agua, 98 + 2 (v + v).
3.5.2. Mezcla de agua y metanol (3.2), 80 + 20 (v + v).3.5.3. Mezcla de agua y acetona (3.3), 85 + 15 (v + v).3.6. Fase móvil para la HPLC.
Mezcla de agua, metanol (3.2) y acetonitrilo (3.4), 130 + 70 + 40
(v + v + v).
Nota:Puede ser necesario ajustar la composición de los disolventes
de la fase móvil, de acuerdo con las características de la columna
HPLC utilizada.
3.7. Solución acuosa saturada de yodo. Añadir 2 g de yodo a 400 ml de
agua. Mezclar durante 90 minutoscomo mínimo y filtrar a través
de un filtro de membrana (4.15). Proteger de la luz la solución
saturada, a fin de evitar la fotodegradación.
3.8. Celite 545 lavada con ácido, o equivalente.
3.9. Cartucho de Florisil (Waters SEP-PAK) o equivalente.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 8
▼M2
▼M2
3.10. Cartucho C18(WatersSEP-PAK) o equivalente.
3.11. Gasinerte, por ejemplo nitrógeno.
3.12. Solución patrón de aflatoxina B1en cloroformo con una concentra-
ción de 10 µg/ml. Comprobar la concentración de la solución del
siguiente modo: Determinar el espectro de absorción de la solución
citada entre 330 y 370 nm por medio del espectrofotómetro (4.23).
Medir la absorbancia (A) en el máximo cercano a 363 nm. Calcular
la concentration de aflatoxina B1en microgramospor mililitro de
solución, empleando la fórmula siguiente:
Concentraci´ on èmg =ml ðÞ ¼312/C2A/C21000
22300¼13;991/C2A
3.12.1. Solución madre de aflatoxina B1en cloroformo.
Transferir cuantitativamente 2,5 ml de la solución patrón de aflato-
xina B1(3.12) a un matraz aforado de 50 ml y enrasar con
cloroformo. Almacenar esta solución en un lugar fresco (4º C) al
abrigo de la luz, adecuadamente tapada y envuelta en una hoja de
aluminio.
3.13. Solucionesde aflatoxina B1para calibración de HPLC.
Nota:para la preparación de estas soluciones deberá utilizarse
material de vidrio lavado con ácido (véase el punto 4. Aparatos).
3.13.1. Solución para calibración de 4 ng/ml.
Dejar reposar (algunas horas) la solución madre (3.12.1). Contenida
en el matraz aforado envuelto en la hoja de aluminio, hasta que
alcance la temperatura ambiente. Transferir 400 µl de la solución
madre (200 ng aflatoxina B1) a un matraz aforado de 50 ml y
evaporar la solución hasta sequedad en corriente de gas inerte
(3.11). Disolver el residuo obtenido en 20 ml aproximadamente de
mezcla de agua y acetona (3.5.3), enrasar con mezcla de agua y
acetona (3.5.3) y mezclar completamente.
3.13.2. Solución para calibración de 3 ng/ml.
Transferir cuantitativamente 7,5 ml de la solución para calibración
(3.13.1) a un matraz aforado de 10 ml con la mezcla de agua y
acetona (3.5.3) y mezclar completamente.
3.13.3. Solución para calibración de 2 ng/ml.
Transferir cuantitativamente 25 ml de la solución para calibración
(3.13.1) a un matraz aforado de 50 ml, enrasar con la mezcla de
agua y acetona (3.5.3) y mezclar completamente.
Esta solución se denomina también «Patrón de referencia» y se usa,
en particular, para efectuar inyeccionesrepetidasdurante el proce-
dimiento de HPLC.
3.13.4. Solución para calibración de 1 ng/ml.
Transferir cuantitativamente 2,5 ml de solución para calibración
(3.13.1.) a un matraz aforado de 10 ml, enrasar con la mezcla de
agua y acetona (3.5.3) y mezclar completamente.
3.14. Una mezcla de aflatoxinasB1,B2,G1yG2en concentracionesapro-
ximadasde 1; 0,5; 1 y 0,5 µg/ml, res pectivamente, en 1 ml de
cloroformo.
3.14.1. Solución de comprobación cromatográfica.
Transferir la mezcla (3.14) a un tubo de ensayo con tapón de vidrio
o a un frasco con tapón de rosca. Transferir 40 µl de esta solución a
un tubo de ensayo con tapón de vidrio — lavado con ácido —
(4.2.2.). Evaporar el cloroformo en una corriente de gasinerte
(3.11.) y disolver de nuevo en 10 ml de la mezcla de agua y
acetona (3.5.3.).
3.15. Reactivospara la prueba de confirmación (6).3.15.1. Solución acuosa saturada de cloruro de sodio.3.15.2. Sulfato de sodio anhidro, granular.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 9
▼M2
4.Aparatos
Atención: El uso de material de vidrio que no se haya lavado con
ácido, para las soluciones acuosas de aflatoxina, puede originar
pérdidas de aflatoxinas. Deberán tomarse precauciones especiales
con el material de vidrio nuevo o desechables, por ejemplo los
frascos para muestreador automático y las pipetas Pasteur. Por lo
tanto, el material de vidrio que vaya a estar en contacto con las
soluciones acuosas de aflatoxinas deberá sumergirse durante varias
horasen un ácido diluido (por ejemplo, ácido s ulfúrico, C = 2 mol/
l) y, a continuación, lavarse a fondo con agua destilada para
suprimir todo resto de ácido (por ejemplo, 3 enjuagues, seguidos
de una comprobación con papel pH). En concreto, este tratamiento
deberá aplicars e a losmatracesredondos(4.4), a losmatraces
aforados, probetas, a los frascos o tubos utilizados para soluciones
para calibración y extractosfinales(en particular, losfras cospara
muestreador automático) y a las pipetas Pasteur si se utilizan para
transferir soluciones para calibración o extractos.
4.1. Triturador/mezclador.
4.2. Tamiz de malla de 1,0 mm (ISO R 565).4.3. Agitador mecánico.4.4. Evaporador rotatorio a vacío provisto de un matraz redondo de
150 ml a 250 ml.
4.5. Cromatógrafo de líquidosde alta res olución, con bucle de inyec-
ción que permita inyectar 250 µl. Ver instrucciones del fabricante
para el llenado parcial o total del bucle.
4.6. Columna analítica para HPLC: relleno C
18de 3 o 5 µm.
4.7. Bomba libre de pulsos que suministre el reactivo yodado para la
reacción postcolumna, por ejemplo, bomba para HPLC o concebida
para reacción postcolumna.
4.8. Conexión en T Valco de volumen muerto nulo, de acero inoxidable
(1/16″×0,75 mm).
4.9. Serpentín de reacción, de teflón o de acero inoxidable. Lasdimen-
siones comprendidas entre 3 000 × 0,5 mm y 5 000 × 0,5 mm
resultan apropiadas en combinación con columnas HPLC de 5 o
3 µm.
4.10. Baño de agua termostatizado a 60 ºC, con una variación de tempe-
ratura de menosde 0,1 ºC.
4.11. Detector de fluorescencia que proporcione longitudes de onda de
excitación de 365 nm aproximadamente y de emisión de 435 nm
aproximadamente. (Para losaparatosde filtro: longitud de onda de
emisión < 400 nm.) Deberá ser posible efectuar la detección de
0,05 ng de B1, como mínimo. Se recomienda aplicar cierta contra-
presión (por ejemplo, un constrictor o una espiral de teflón o acero
inoxidable conectada al orificio de salida del detector) a fin de
suprimir las burbujas de aire en la célula de flujo.
4.12. Registrador de banda de papel.
4.13. Integrador electrónico (facultativo).4.14. Filtro de pliegues24 cm. Macherey-Nagel 617 1/4 o equivalente.4.15. Filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm, Millipore
HAWP 04700 o equivalente.
4.16. Erlenmeyer de 500 ml con tapón de vidrio.4.17. Columna de vidrio (con un diámetro interior de 1 cm aproximada-
mente y una longitud de 30 cm aproximadamente) provista de una
punta Luer.
4.18. Llave Luer de nailon resistente al cloroformo (por ejemplo, Bio-rad
7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 o equivalente).
4.19. Jeringa de 10 ml resistente a productos químicos, con llave Luer.4.20. Jeringa de 250 µl adecuada para la inyección en HPLC (ver 4.5).
4.21. Microjeringa de 100 µl para la preparación de soluciones de cali-
bración (comprobar, mediante pesada, que su precisión es del 2 %).
4.22. Tuboscalibradosde 10,0 ml con tapón de vidrio.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 10
▼M2
4.23. Espectrofotómetro adecuado para realizar medidas en la región
U.V. del espectro.
4.24. Equipo para efectuar la prueba de confirmación (6).
4.24.1. Embudo de decantación de 100 ml (con llave de teflón), lavado con
ácido.
4.24.2. Fuente de calor a 40-50 ºC.
5.Procedimiento
5.1. Preparación de la muestra
Triturar la muestra de manera que pueda pasar a través del tamiz
(4.2).
5.2. Porción de ensayo.
Pesar en el erlenmeyer (4.16.) 50,0 g de la muestra problema
preparada.
5.3. Extracción
Añadir a la porción de ensayo 25 g de Celite (3.8.) 250 ml de
cloroformo (3.1.) y 25 ml de agua. Tapar el matraz y agitar durante
30 minutosen el agitador mecánico (4.3.). Filtrar a travésde filtro
de pliegues(4.14.). Recoger 50 ml de filtrado. Si fuera neces ario,
tomar una alícuota del filtrado y diluir a 50 ml con cloroformo de
forma que la concentración de aflatoxina B1no sea mayor de 4 ng/
ml.
5.4. Purificación (el procedimiento debe seguirse sin interrupciones
significativas)
Deberán tomarse las siguientes precauciones:
— proteger convenientemente de la luz natural el laboratorio de
análisis. Para ello se pueden utilizar:
1) hojasque abs orban losrayosUV para cubrir lasventanasy
una luz tamizada (evítese la luz solar directa);
2) cortinaso pers ianasen combinación con luz artificial
(pueden utilizarse tubos fluorescentes).
— proteger de la luz todo lo posible las soluciones que contengan
aflatoxina (conservar en la oscuridad y utilizar hojas de
aluminio).
5.4.1. Purificación con SEP-PAK de florisil.
5.4.1.1. Preparación del conjunto columna-cartucho
Acoplar una llave (4.18.) a la rama máscorta de un cartucho de
Florisil (3.9.) (véase la figura 1). Lavar el cartucho y eliminar el
aire tomando con una jeringa (4.19.) 10 ml de cloroformo (3.1) y
haciendo pasar rápidamente 8 ml de cloroformo por la llave a
travésdel cartucho. Unir la rama máslarga del cartucho a la
columna de vidrio (4.17.) e introducir en la columna a travésdel
cartucho los 2 ml de cloroformo restantes. Cerrar la llave y sacar
la jeringa.
5.4.1.2. Purificación
Introducir en el conjunto columna-cartucho el filtrado recogido con
arreglo al punto 5.3. y dejar escurrir por gravedad. Lavar con 5 ml
de cloroformo (3.1.) y, a continuación, con 20 ml de metanol (3.2.).
Desechar los eluatos. Durante estas operaciones, evitar que el
conjunto columna-cartucho se quede seco. Eluir la aflatoxina B1con 40 ml de la mezcla acetona/agua (3.5.1.) y recoger la totalidaddel eluato en el matraz redondo (150 ml) del evaporador rotatorio
(4.4.). Concentrar el eluato en el evaporador rotatorio a una tempe-
ratura de 40-50 ºC hasta que cese la destilación de la acetona.
(Nota:en ese momento quedan en el matraz 0,5 ml de líquido
aproximadamente. Se ha demostrado experimentalmente que el
continuar la evaporación no tiene consecuencias nocivas y que
cuando quedan 0,5 ml de líquido la cantidad de acetona presente
no es significativa. La presencia de residuos de acetona podría
provocar pérdidasde la aflatoxina B
1en el cartucho C18.) Añadir
1 ml de metanol (4.2.), agitar el matraz para disolver la aflatoxina
B1adherida a sus paredes, añadir 4 ml de H2O y mezclar. Desco-
nectar y desechar el cartucho. Lavar con agua la columna de
vidrio y conservarla para efectuar la purificación C18.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 11
▼M2
5.4.2. Purificación con SEP-PAK C18.
5.4.2.1. Preparación del conjunto columna-cartucho
Acoplar una llave (4.18.) a la rama máscorta de un cartucho C18(3.10.) (véase la figura 1). Purgar el cartucho y extraer el aire
haciendo pasar rápidamente con una jeringa (4.19.) 10 ml de
metanol (3.2.) por la llave a travésdel cartucho. (Lasburbujasde
aire del cartucho son visibles en forma de manchas de luz sobre un
fondo grisáceo.) Tomar 10 ml de agua y hacer pasar 8 ml a través
del cartucho (evítese introducir aire cuando se pase del metanol al
agua). Unir la rama máslarga del cartucho a una columna de vidrio
e introducir en la columna a travésdel cartucho los2 ml de agua
restantes. Cerrar la llave y sacar la jeringa.
5.4.2.2. Purificación
Transferir cuantitativamente a la columna (4.17.) el extracto reco-
gido en el punto 5.4.1.2., lavando dosvecesel matraz con 5 ml de
la mezcla de agua y metanol (3.5.2.), y dejar escurrir por gravedad.
Durante estas operaciones, evitar que el conjunto columna-cartucho
se quede seco. (Si se forman burbujas de aire en el estrechamiento
próximo al cartucho, detener el flujo y golpear la parte superior de
la columna de vidrio para eliminar lasburbujas . Reanudar de inme-
diato lasoperaciones .) Eluir con 25 ml de la mezcla de agua y
metanol (3.5.2). Desechar los eluatos. Eluir la aflatoxina B1con
50 ml de la mezcla de agua y acetona (3.5.3.) y recoger la totalidad
del eluato en un matraz aforado de 50 ml. Enrasar con agua hasta
50 ml y mezclar: la solución de ensayo obtenida se utiliza para la
cromatografía (5.5.)
Atención: normalmente no esneces ario filtrar el extracto final
antes de efectuar la HPLC. Cuando sea necesario filtrar,
deberán evitarse los filtros de celulosa, dado que pueden
dar lugar a pérdidasde aflatoxina B1. Pueden utilizarse
filtrosde teflón.
5.5. Cromatografía de líquidos de alta resolución
(Véase la figura 2 para el montaje del equipo). Dejar transcurrir el
tiempo suficiente para que los instrumentos se calienten y estabi-
licen antesdel us o.
Nota 1:
Los caudales que se citan para la fase móvil de HPLC y el reactivo
postcolumna son meramente indicativos. Puede ser necesario
realizar un ajuste en función de las características de la columna
de HPLC.
Nota 2:
La respuesta del detector para la aflatoxina B1depende de la
temperatura, por lo que debe efectuarse la compensación por la
deriva (véase la Figura 3). La invección de una cantidad fija del
patrón de referencia de la aflatoxina B1(3.13.3.) a intervalosregu-
lares(por ejemplo, cada tresenyecciones ) permite corregir,
utilizando la respuesta media, los valores de los picos de la aflato-
xina B1entre estos patrones de referencia, siempre y cuando la
diferencia entre las respuestas de patrones de referencia consecu-
tivoss ea muy pequeña (< 10 %). Por lo tanto, lasinyecciones
deberán efectuarse sin interrupciones. Si es necesaria una interrup-
ción, la última inyección antesde la interrupción y la primera
después de ésta deberán ser inyecciones del patrón de referencia
(3.13.3.). Dado que la curva de calibración eslineal y pas a por el
origen, lascantidadesde aflatoxina B1presentes en los extractos de
la muestra se determinan directamente por referencia a los patrones
adyacentes.
5.5.1. Ajuste de la bomba HPLC.
Ajustar la bomba HPLC (4.5.) de manera que se obtenga un caudal
de 0,5 o 0,3 ml/min para una columna HPLC de 5 µm o 3 µm
(4.6.), respectivamente utilizando la fase móvil (3.5.).
5.5.2. Ajuste de la bomba para la reacción postcolumna.
Ajustar la bomba (4.7.) de manera que se obtenga un caudal de 0,2-
0,4 ml/min de solución acuosa saturada de yodo (3.7.). Información
a título indicativo: se recomiendan caudales de 0,4 o 0,2 ml/min,
aproximadamente, en asociación con caudales de 0,5 y 0,3 ml/min
de la fase móvil, respectivamente.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 12
▼M2
5.5.3. Detector de fluorescencia.
Establecer el detector (4.11.) a una longitud de onda de excitación
de 365 nm y de emisión de 435 nm (aparato de filtro: > 400 nm).
Ajustar el atenuador del detector de manera que el 80 % aproxima-
damente del recorrido máximo de la plumilla registradora
corresponda a 1 ng de aflatoxina B1.
5.5.4. Inyector.
Para todas las soluciones inyectar cantidades de 250 µl siguiendo
lasins truccionesdel fabricante del aparato.
5.5.5. Comprobación de la separación cromatográfica.
Inyectar la solución cromatográfica (3.14.1.). Los valles deberán ser
inferiores al 5 % de la suma de las alturas de los picos adyacentes.
5.5.6. Comprobación de la estabilidad del sistema.
Antes de llevar a cabo cada una de las series de análisis, efectuar
inyecciones repetidas del patrón de referencia (3.13.3.) hasta que se
estabilicen las áreas de los picos (Nota: lospicosproducidospor la
aflatoxina B1entre inyecciones consecutivas deberán presentar dife-
renciasinferioresal 6 %). Proceder inmediatamente a efectuar la
comprobación de la linearidad (5.5.7).
5.5.7. Comprobación de la linearidad.
Inyectar lass olucionesde aflatoxina B1para calibración (3.13.1. y
3.13.4.). Utilizar el patrón de referencia (3.13.3.) a intervalosde 3
inyecciones, a fin de corregir la deriva en las respuestas (Nota: las
respuestas de los picos del patrón de referencia deberán presentar
diferenciasinferioresal 10 % en 90 minutos ). Corregir la deriva
aplicando la fórmula que se indica en el punto 7. La gráfica de cali-
bración deberá ser lineal y pasar por el origen, dentro de los límites
de 2 vecesel valor del error típico de la es timación de Y. Los
valoreshalladosdeberán diferir en menosdel 3 % de losvalores
nominales. Si se cumplen estas condiciones, continuar las opera-
cionesinmediatamente. En cas o contrario, identificar y corregir las
causas del problema antes de continuar.
5.5.8. Inyección de extractosde mues tra.
Inyectar losextractosde mues tra purificados(5.4.2.2.). Repetir la
inyección del patrón de referencia (3.13.3.) después de dos inyec-
ciones de extracto de muestra de acuerdo a la siguiente secuencia:
patrón de referencia, extracto, extracto, patrón de referencia,
extracto, extracto, patrón de referencia, etc.
6.Pruebadeconfirmación
6.1. Tratamiento ulterior del extracto (5.4.2.2.)
Añadir 5 ml de la solución de cloruro de sodio (3.15.1.) al extracto
final obtenido como se describe en el punto 5.4.2.2.. Extraer 3
vecescon 2 ml de cloroformo durante 1 minuto, utilizando el
embudo de decantación (4.24.1.). Verter losextractoscombinados
de cloroformo en un tubo de ensayo de 10 ml a través de 1 g apro-
ximadamente de sulfato de sodio (3.15.2.). [Se puede utilizar un
embudo pequeño (4 cm de diámetro) colocando en el estrecha-
miento un algodón recubierto de 1 g de sulfato de sodio
aproximadamente.]
Lavar la capa de sulfato de sodio con unos ml de cloroformo y
recoger los lavados en el mismo tubo de ensayo. Evaporar en dicho
tubo el extracto de cloroformo hasta sequedad utilizando la fuente
de calor (4.24.2.) y disolverlo de nuevo en 1 ml de cloroformo.
6.2. Preparación de los derivados y cromatografía en capa fina
Véase la Directiva 76/372/CEE del Consejo, Anexo, método A,
punto 5.6.2.
7.Cálculodelosresultados
Calcular el contenido de aflatoxina B1(µg/kg) de la muestra
mediante la fórmula siguiente:1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 13
▼M2
contenido de aflatoxina B 1en èmg =kg¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc
siendo:
m = cantidad, en ng, de aflatoxina B1representada por el
pico B1de la muestra, calculada del siguiente
modo:
m¼P muestraðÞ
Pst1ðÞ þ Pst2ðÞ/C22rstðÞ
P(muestra) = área del pico de la aflatoxina B1de la muestra
B(st1) = área del pico de la aflatoxina B1del patrón de refe-
rencia anterior (3.13.3.)
P(st2) = área del pico de la aflatoxina B1del patrón de refe-
rencia siguiente (3.13.3.)
r(st) = cantidad inyectada de patrón de referencia (3.13.3.)
expresada en ng
Vm= volumen del extracto de muestra inyectado, en ml
Vext= volumen final del extracto de muestra, en ml (5.3.)
M = masa de la muestra en gV
f= volumen del filtrado transferido al cartucho de
Florisil (5.4.1.2.), en ml
Vc= volumen de cloroformo utilizado para la extracción
de la muestra, en ml
Si se aplica el procedimiento expuesto, la fórmula se reduce a:
contenido de aflatoxina B1en µg/kg = 20 × m.
7.1. El cálculo de los resultados también puede efectuarse midiendo la
altura de lospicos .
8.Repetibilidad:
véase el punto 10.1. (observaciones).
9.Reproducibilidad:
véase el punto 10.1.
10.Observaciones
10.1. Precisión
En el Cuadro 1 figuran losres ultadosde la repetibilidad y reprodu-
cibilidad obtenidosen un ens ayo colaborativo(1) sobre piensos
compuestos realizado a escala internacional. El término repetibi-
lidad (r) utilizado aquí se define como la mayor diferencia no
significativa, con una probabilidad del 95 %, entre dos lecturas de
una misma muestra efectuadas en el mismo laboratorio y en condi-
ciones similares. El término reproducibilidad (R) se define de
manera análoga y se refiere a la comparación entre los resultados
obtenidosen doslaboratoriosdiferentes . Con arreglo a la norma
ISO 3534-1977, 2.35(2) y a la Decisión 89/610/CEE de la Comi-
sión(3), tanto r como R también figuran en el Cuadro 1 en forma
de coeficientesde variación.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 14
(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and
Contaminants8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977.
(3)D O noL 351 de 2. 12. 1989, p. 39.
▼M2
Cuadro 1
Repetibilidad(r)yreproducibilidad(R)expresadasendiferen-
ciasyencoeficientesdevariación
(15 laboratorios)
Nivel r R CVr(*) CVR
(µg/kg) (%) (%)
8 & 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = Coeficiente de variación.
10.2. Estabilidad del cloroformo (3.1)
Las características de adsorción del cartucho de florisil pueden
verse modificadas si se utiliza un estabilizador diferente del etanol.
Esto debe ser verificado con arreglo al punto 10.3. cuando no se
disponga del cloroformo descrito.
10.3. Exactitud
La aplicación correcta del método deberá comprobarse efectuando
medicionesrepetidascon materialesde referencia certificados . Si
no se dispone de estos materiales, la validez del método deberá
comprobarse mediante experimentos de recuperación en muestras
en blanco. La diferencia entre la media y el valor real no deberá
rebasar los límites de −20 % a 10 % del valor real.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 15
▼M2
Figura 1: Conjunto columna-cartucho
Figura 2: Diagrama de los flujos del sistema de cromatografía de
líquidos con reacción con yodo en postcolumna1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 16
▼M2
Figura 3: Compensación de la deriva de la respuesta de la aflato-
xina B1mediante inyección del patrón de referencia a intervalos
regulares (3.13.3)
C. OBSERVACIONES REFERENTES A LOS MÉTODOS A Y B
1.Desengrasado
Las muestras que contengan más del 5 % de materias grasas deben desengra-
sarse con éter de petróleo (punto de ebullición 40-60 ºC) tras la preparación
indicada en 5.1. En estos casos, los resultados del análisis se expresarán en
peso de la muestra no desengrasada.
2.ReproducibilidaddelosresultadosdelmétodoA
La reproducibilidad de los resultados, es decir, la variación entre los resul-
tados obtenidos por dos o más laboratorios con la misma muestra, se ha
calculado en:
± 50 % del valor medio de losres ultadospara losvaloresmediosde aflato-
xina B1de 10 a 20 µg/kg,
± 10 µg/kg del valor medio para losvaloresmediosentre 20 y 50 µg/kg,± 20 % del valor medio para losvaloresmedioss uperioresa 50 µg/kg.1976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 17
▼M3
▼B
ANEXO
Figura 1
Figura 21976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 18
▼B
Figura 31976L0372 — ES — 03.05.1994 — 003.001 — 19