1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceitesdeorujodeolivaysobresus
métodosdeanálisis
(DOL248de5.9.1991,p.1)
Modificadopor:
DiarioOficial
nopágina fecha
►M1Reglamento (CEE) no3682/91 de la Comisión de 17 de diciembre de
1991L349 36 18.12.1991
►M2Reglamento(CEE)no1429/92delaComisiónde26demayode1992 L150 17 2.6.1992
►M3Reglamento(CEE)no1683/92delaComisiónde29dejuniode1992 L176 27 30.6.1992
►M4Reglamento(CEE)no1996/92delaComisiónde15dejuliode1992 L199 18 18.7.1992
►M5Reglamento (CEE) no3288/92 de la Comisión de 12 de noviembre de
1992L327 28 13.11.1992
►M6Reglamento(CEE)no183/93delaComisiónde29deenerode1993 L22 58 30.1.1993
►M7modificado por el Reglamento (CEE) no826/93 de la Comisión de 6
deabrilde1993L87 6 7.4.1993
►M8Reglamento(CEE)no620/93delaComisiónde17demarzode1993 L66 29 18.3.1993
►M9Reglamento(CE)no177/94delaComisiónde28deenerode1994 L24 33 29.1.1994
►M10Reglamento(CE)no2632/94delaComisiónde28deoctubrede1994 L280 43 29.10.1994
►M11Reglamento(CE)no656/95delaComisiónde28demarzode1995 L69 1 29.3.1995
►M12Reglamento(CE)no2527/95delaComisiónde27deoctubrede1995 L258 49 28.10.1995
►M13Reglamento(CE)no2472/97delaComisiónde11dediciembrede1997 L341 25 12.12.1997
►M14Reglamento(CE)no282/98delaComisiónde3defebrerode1998 L28 5 4.2.1998
►M15Reglamento(CE)no2248/98delaComisiónde19deoctubrede1998 L282 55 20.10.1998
►M16Reglamento(CE)no379/1999delaComisiónde19defebrerode1999 L46 15 20.2.1999
►M17Reglamento(CE)no455/2001delaComisiónde6demarzode2001 L65 9 7.3.2001
►M18Reglamento(CE)no2042/2001delaComisiónde18deoctubrede2001 L276 8 19.10.2001
►M19Reglamento(CE)no796/2002delaComisiónde6demayode2002 L128 8 15.5.2002
Rectificadopor:
►C1Rectificación,DOL347de28.11.1992,p.69(2568/91)
►C2Rectificación,DOL176de20.7.1993,p.30(183/93)
►C3Rectificación,DOL63de4.3.1998,p.34(2472/97)
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REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceites
deorujodeolivaysobresusmétodosdeanálisis
LACOMISIÓNDELASCOMUNIDADESEUROPEAS,
VistoelTratadoconstitutivodelaComunidadEconómicaEuropea,
VistoelReglamento no136/66/CEE delConsejo,de22deseptiembre
de1966,porelqueseestablecelaorganizacióncomúndemercadosenelsectordelasmateriasgrasas(
1),cuyaúltimamodificación laconsti-
tuye el Reglamento (CEE) no3577/90(2), y, en particular, su artículo
35bis,
ConsiderandoqueenelAnexodelReglamentono136/66/CEEseesta-
blecen las denominaciones y definiciones de los aceites de oliva y de
los aceites de orujo de oliva comercializados dentro de cada Estado
miembro, así como en los intercambios intracomunitarios y contercerospaíses;
Considerando que, para poder distinguir los diferentes tipos de aceite,
procede definir lascaracterísticas fisicoquímicas decada unodeellos,
asícomolascaracterísticasorganolépticasdelosaceitesvírgenes,afindegarantizarasílapurezaycalidaddeestosproductos,sinperjuiciodeotrasdisposicionesexistentesenlamateria;
Considerandoqueconviene determinar demanera uniformeentodala
Comunidadlapresenciadelascaracterísticasdelosdiferentestiposdeaceite; que, para ello, procede establecer los métodos comunitarios deanálisis químico y de valoración organoléptica; que conviene, sinembargo, permitir que durante un período transitorio se utilicen otros
métodosdeanálisisqueseanaplicadosenlosEstadosmiembros,esta-
bleciendo al mismo tiempo que en caso de presentarse resultadosdivergentesprevalezcanlosobtenidosatravésdelmétodocomún;
Considerandoqueladefinicióndelascaracterísticas fisicoquímicas de
los aceites de oliva y de sus métodos de análisis comporta la adapta-
ción de las notas complementarias del capítulo 15 de la nomenclaturacombinada;
Considerando que el método de valoración de las características orga-
nolépticas delosaceites vírgenesrequiere lacreacióndeunospaneles
de catadores seleccionados yespecialmente adiestrados; queconviene,porlotanto,preverelplazonecesario parainstaurarunaestructura deeste tipo; que, dadas las dificultades a las que se enfrentarán determi-nados Estados miembros para crear dichos paneles, procede autorizarqueserecurraapanelesexistentesenotrosEstadosmiembros;
Considerando que, para garantizar el correcto funcionamiento del
sistema de las exacciones reguladoras aplicables a la importación deorujodeoliva,esconvenientepreverunmétodoúnicoparaladetermi-nacióndelcontenidoenaceitedeestosproductos;
Considerando que, para no perjudicar el comercio, resulta oportuno
prever un período limitado para la salida al mercado del aceite quehaya sido envasado antes de la entrada en vigor del presente Regla-mento;
ConsiderandoqueprocedederogarelReglamento(CEE)n
o1058/77de
la Comisión(3), cuya última modificación la constituye el Reglamento
(CEE)no1858/88(4);
Considerando que el Comité de gestión de las materias grasas no ha
emitidodictamenalgunoenelplazoestablecidoporsupresidente,1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—2
(1)D Ono172de30.9.1966,p.3025/66.
(2)D OnoL353de17.12.1990,p.23.
(3)D OnoL128de24.5.1977,p.6.
(4)D OnoL166de1.7.1988,p.10.
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HAADOPTADOELPRESENTEREGLAMENTO:
Artículo 1
1. Se considerarán aceites de oliva vírgenes, a que se refieren las
letras a), b), y c) del punto 1 del Anexo del Reglamento no136/66/
CEE,losaceitescuyascaracterísticasseajustenalasindicadas,respec-
tivamente,enlospuntos1, 2y3delAnexoIdelpresenteReglamento.
2. Seconsideraráaceitedeolivavirgenlampante,aqueserefierela
letrad)delpunto1delAnexodelReglamentono136/66/CEE,elaceite
cuyascaracterísticasseajustenalasindicadasenelpunto4delAnexoIdelpresenteReglamento.
3. Seconsideraráaceitedeolivarefinado,aqueserefiereelpunto2
del Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas caracterís-
ticasseajustenalasindicadasenelpunto5delAnexoIdelpresenteReglamento.
4. Se considerará aceite de oliva, a que se refiere el punto 3 del
Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas características
seajustenalasindicadasenelpunto6delAnexoIdelpresenteRegla-mento.
5. Seconsiderará aceite deorujodeolivacrudo,aqueserefiere el
punto 4 del Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas
características seajustenalasindicadasenelpunto7delAnexoIdel
presenteReglamento.
6. Seconsiderará aceite deorujodeolivarefinado,aqueserefiere
el punto 5 del Anexo del Reglamento no136/66/CEE, el aceite cuyas
características seajustenalasindicadasenelpunto8delAnexoIdel
presenteReglamento.
7. Seconsideraráaceitedeorujodeoliva,aqueserefiereelpunto6
del Anexo del Reglamento no136/66/CEE, el aceite cuyas caracterís-
ticasseajustenalasindicadasenelpunto9delAnexoIdelpresenteReglamento.
8. No obstante, para las ►
M18campañas de comercialización
1998/99 a 2002/03 ◄, se considerarán igualmente aceites de oliva
virgenaefectosdelodispuestoenlasletraa),b),c)yd)delpunto1del anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, los aceites a granel o en
envases de un contenido neto igual o superior a 100 kg, totalmenteoriginariosdeMarruecos,cuyascaracterísticasseanconformes,respec-tivamente, a las indicadas en los puntos 1, 2, 3 y 4 del anexo I del
presente Reglamento, y, sin perjuicio de lo dispuesto en los apartados
1y2,cuyocontenidodeácidolinoléniconoseasuperioral1%.
Artículo 2
1. Las características de los aceites, previstas en el Anexo I, se
determinaránempleandolosmétodosdeanálisissiguientes:
— para determinar los ácidos grasos libres, expresados en porcentaje
deácidooleico,elmétodorecogidoenelAnexoII,
— para determinar el índice de peróxidos, el método recogido en el
AnexoIII,
— para determinar el contenido de ceras, el método recogido en el
anexoIV,
— paradeterminarelcontenidodeesteroles,elmétodorecogidoenel
AnexoV,
— para determinar el eritrodiol + uvaol, el método recogido en el
AnexoVI,
— para determinar los ácidos grasos saturados en la posición 2 del
triglicérido,elmétodorecogidoenelAnexoVII,
— paradeterminar elcontenidodetrilinoleína, elmétodorecogidoen
elAnexoVIII,1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—3
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— para el análisis espectrofotométrico, el método recogido en el
AnexoIX,
— para determinar la composición de ácidos grasos, el método reco-
gidoenlosAnexosX«A»yX«B»,
— paradeterminarlossolventeshalogenadosvolátiles,elmétodoreco-
gidoenelAnexoXI,
— paralavaloracióndelascaracterísticasorganolépticasdelosaceites
de oliva vírgenes, el método recogido en el Anexo XII, que seaplicarádeconformidadconelapartado2,
— para la prueba de la refinación, el método recogido en el Anexo
XIII,
— para determinar los estigmastadienos, el método recogido en el
AnexoXVII,
— para determinar la composición de los triglicéridos de ECN42, el
métodoquefiguraenelAnexoXVIII,
— para determinar el contenido de alcoholes alifáticos, el método
recogidoenelanexoXIX.
2. La comprobación de las características organolépticas de los
aceites deolivavírgenes porparte delasautoridades nacionales osus
representantes correrá acargodepaneles decatadores autorizados porlosEstadosmiembros.
Lascaracterísticasorganolépticasdelaceitedeolivamencionadoenel
apartado 1 se considerarán conformes a la categoría declarada si un
panel de catadores autorizado por el Estado miembro interesado
confirmadichaclasificación.
En caso de que el panel autorizado no confirme tal declaración en lo
que respecta a las características organolépticas de la categoría deaceite de oliva declarada, las autoridades nacionales o sus represen-
tantes ordenarán que se proceda, a petición del interesado, a dos
análisiscontradictoriosporotrospanelesautorizados;almenosunodeellosdeberáserrealizadoporunpaneldecataautorizadoporelEstadomiembro productor. Las características en cuestión se consideraránconformesalasdeclaradassiambosanálisiscontradictoriosconfirman
la clasificación declarada. En caso contrario, los gastos generados por
los análisis contradictorios, sin perjuicio de otras posibles sanciones,correránporcuentadelinteresado.
3. Enlotocantealacomprobaciónporlasautoridadesnacionaleso
sus representantes de las características de los aceites previstas en elapartado1,latomademuestrasseefectuarádeacuerdoconlasnormasinternacionales ENISO661yENISO5555relativasalapreparacióndelasmuestrasyalmuestreo.Ahorabien,noobstantelodispuestoenel punto 6.8 de la norma EN ISO 5555, respecto de los lotes
compuestos por esos aceites, presentados en envases inmediatos de
una capacidad igual o inferior a 100 litros, la toma de muestras serealizarádeacuerdoconelanexoI bisdelpresenteReglamento.
SinperjuiciodelodispuestoenlanormaENISO5555yenelcapítulo
6 de la norma EN ISO 661, las muestras deberán guardarse lo antesposibleenunlugarprotegidodelaluzydelaselevadas temperaturasyenviarseallaboratorioparalarealizacióndelosanálisisamástardar:
— el décimo día hábil siguiente al de la toma de la muestra, durante
losmesesdeoctubreamayo,y
— el quinto día hábil siguiente al de la toma la muestra, durante los
mesesdejunioaseptiembre.
4. Paralacomprobaciónprevistaenelapartado3,losanálisisaque
se refieren los anexos II, III, IX y XII, así como, en su caso, lossegundos análisis previstos por las legislaciones nacionales, se efec-tuarán antes de la fecha de caducidad mínima. En caso de que la1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—4
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tomadelamuestraseefectúemásdecuatromesesantesdelafechade
caducidad mínima, dichos análisis se realizarán como muy tarde elcuartomessiguientealdelatomadelamuestra.Noseaplicaráningún
plazoalosdemásanálisisprevistosporelcitadoReglamento.
Exceptosilatomademuestrassehaefectuadomenosdeunmesantes
delafechadecaducidadmínima,encasodequelosresultadosdelos
análisis no se ajusten a las características de la categoría de aceite deoliva odeorujodeoliva declarada, senotificará esteextremo alinte-resado como muy tarde un mes antes de que finalice el plazomencionadoenelpárrafoprimero.
5. Convistasaladeterminacióndelascaracterísticasdelosaceites
deolivaefectuadaconarregloalosmétodoscontempladosenelapar-
tado 1, los resultados de los análisis se compararán directamente con
loslímitesfijadosenelpresenteReglamento.
Artículo ►M193◄
Encasodequesecompruebequelascaracterísticas organolépticas de
un aceite son distintas de las correspondientes a su denominación, elEstado miembro interesado aplicará sanciones económicas administra-
tivas, cuyo importe se determinará en función de la gravedad de la
irregularidadcomprobada,sinperjuiciodeotrasposiblessanciones.
Paralaevaluacióndelasirregularidadessetendrásobretodoencuenta
la evolución natural de las características del aceite de oliva conser-vadoencondicionesnormales.
Al principio de cada semestre, los Estados miembros informarán a la
Comisióndelnúmeroylanaturalezadelasirregularidadesobservadas,asícomodelassancionesimpuestasduranteelsemestreanterior.
Artículo 4
1. Para la apreciación y el control de las características organolép-
ticas por parte de las autoridades nacionales o sus representantes, losEstadosmiembrospodránconstituirpanelesdecatadoresautorizados.
Las condiciones de autorización serán establecidas por los Estados
miembrosconlosobjetivossiguientes:
— cumplirlascondicionesdelpunto4delanexoXII,
— asegurarquelaformacióndeljefedelpaneldecatadoresseefectúa
enunestablecimientoyencondicionesreconocidosatalefectoporelEstadomiembro,
— someter la validez de la autorización a losresultados obtenidos en
elsistemadecontrolanualimplantadoporelEstadomiembro.
TodoslosEstadosmiembroscomunicaránalaComisiónlalistadelos
paneles de catadores autorizados, así como las demás medidas adop-tadasdeconformidadconelpresenteapartado.
2. En casodequeunEstado miembro tenga dificultades para crear
un panel de catadores en su territorio, podrá recurrir a un panel dedegustadoresautorizadodeotroEstadomiembro.
3. Cada Estado miembro elaborará la lista de los paneles de cata-
dores creados por organizaciones profesionales o interprofesionales enlas condiciones fijadas en el apartado 1 y velará por el cumplimientodeesascondiciones.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—5
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Artículo 6
1. El contenido en aceite de orujode aceituna ydemásresiduos de
laextraccióndelaceitedeoliva(códigosNC23069011y23069019)
sedeterminaráconarregloalmétodorecogidoenelAnexoXV.
2. Elcontenidodeaceite mencionadoenelapartado1seexpresará
comoporcentajedelextractosecoenpeso.
Artículo 7
Serán aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de
sustanciasextrañasdistintasdelasmencionadasenelAnexoXI.
Artículo 8
1. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión las medidas
adoptadasenaplicacióndelpresenteReglamento.
2. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión, al inicio de
cadasemestreunarecapitulacióndelosdatosanalíticosdelasdetermi-nacionesefectuadasduranteelsemestreprecedente.
Estos resultados serán examinados por el Comité de gestión de las
materiasgrasasconarregloalprocedimiento previstoenelartículo39
delReglamenton
o136/66/CEE.
Artículo 9
QuedaderogadoelReglamento(CEE)no1058/77.
Artículo 10
1. ElpresenteReglamentoentraráenvigoreltercerdíasiguienteal
desupublicaciónenel DiarioOficial delasComunidadesEuropeas .
Noobstante,elmétodoquefiguraenelAnexoXIIseaplicaráapartir
del►M11denoviembre de1992 ◄,exceptoenloqueserefiere a
lasoperacionesrelacionadasconlaintervención.
Dichométodonoseaplicará alosaceitesdeolivavírgenesenvasados
antesdel1denoviembrede1992.
ElpresenteReglamentonoseaplicaráalosaceitesdeolivaydeorujo
de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presenteReglamentoycomercializadoshastael31deoctubrede1992.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y
directamenteaplicableencadaEstadomiembro.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—6
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ANEXOS
Índice
AnexoI: Característicasdelosaceitesdeoliva…
AnexoIbis: Muestreodelotesdeaceitedeolivaoaceitedeorujodeoliva
presentadoenenvasesinmediatosde100litroscomomáximo
…
AnexoII: Determinacióndelgradodeacidez…
AnexoIII: Determinacióndelíndicedeperóxidos…
AnexoIV: ►M6Determinacióndelcontenidodecerasmediantecrama-
tografíadegasesconcolumnacapilar ◄…
AnexoV: Determinacióndelacomposiciónydelcontenidodeesteroles
mediantecromatografíadegasesconcolumnacapilar…
AnexoVI: Determinacióndeleritrodiolyuvaol…
AnexoVII: Determinacióndelosácidosgrasossaturadosenlaposición2
delostriglicéridosdeaceitesygrasas…
AnexoVIII: Determinacióndelporcentajedetrilinoleína…
AnexoIX: Pruebaespectrofométricaenelultravioleta…
AnexoX«A»: Análisisdelosésteresmetílicosdelosácidosgrasosmediante
cromatografíadegases…
AnexoX«B»: Preparacióndelosésteresmetílicosdelosácidosgrasos…AnexoXI: Determinacióndelcontenidoen ►
C1disolventes ◄haloge-
nadosvolátilesenelaceitedeoliva…
AnexoXII: Valoraciónorganolépticadelaceitedeolivavirgen…AnexoXIII: ►
M6Neutralización y decoloración del aceite de oliva en
laboratorio ◄…
AnexoXV: Contenidodeaceitedelosorujosdeaceituna…
AnexoXVI: Determinacióndelíndicedeyodo…
AnexoXVII: Método para la determinación de estigmastadienos en los
aceitesvegetales…
AnexoXVIII: Métodoparaladeterminacióndelacomposicióndelostrigli-
céridosdeECN42…
AnexoXIX: Método de determinación del contenido de alcoholes alifá-
ticos…1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—7
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ANEXOI
CARACTERÍSTICASDELOSACEITESDEOLIVA
CategoríaAcidez
(%)(*)Índicede
peróxidos
mEq02/
kg(*)Disolventes
halogenados
mg/kg(*)(1)Ceras
mg/kg(**)Ácidossatu-
radosen
posición2
delostrigli-
céridos
(%)Estigmasta-
dieno
mg/kg(2)Diferencia
entre
ECN42
(HPLC)y
ECN42
(cálculo
teórico)K232(*) K270(*)K270después
depasarpor
alúmina(3)Delta-K(*)Evaluación
organolép-
tica
Medianadel
defecto
(Md)(*)Evaluación
organolép-
tica
Medianadel
atributo
frutado
(Mf)(*)
1.Aceitedeolivavirgen
extra≤1,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,20 ≤0,10 ≤0,01 Md=0 Mf>0
2.Aceitedeolivavirgen ≤2,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf>0
3.Aceitedeolivavirgen
corriente≤3,3 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤6,0(4)—
4.Aceitedeolivavirgen
lampante>3,3 >20 >0,20 ≤300(5)≤1,3 ≤0,50 ≤0,3 ≤3,70 >0,25 ≤0,11 — Md>6 —
5. Aceite de oliva refi-
nado≤0,5 ≤5 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,40 ≤1,20 — ≤0,16 — —
6.Aceitedeoliva ≤1,5 ≤15 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,30 ≤1,00 — ≤0,13 — —
7. Aceite de orujo de
olivacrudo>0,5(**) — — >350(6)≤1,8 — ≤0 , 6 ——————
8. Aceite de orujo de
olivarefinado≤0,5 ≤5 ≤0,20 >350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,50 ≤2,50 — ≤0,25 — —
9. Aceite de orujo de
oliva≤1,5 ≤15 ≤0,20 >350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,30 ≤2,00 — ≤0,20 — —
(1) Límitemáximodeloscompuestostotaleshalogenadosdetectadosmediantecapturadeelectrones.
Ellímitemáximodecadaunodeloscomponentesdetectadosesde0,10mg/kg.
(2) Sumadeisómerosquepodríansepararse(ono)mediantecolumnacapilar.
(3) Paraconfirmarlapresenciadeaceiterefinado,cuandoelK270sobrepaseellímitedelacategoríacorrespondiente,deberáprocedersealadeterminacióndelK270despuésdetratamientoconalúmina.
(4) Silamedianadelatributofrutadoesiguala0,lamedianadeldefectodebeserinferioroiguala2,5.
(5) Los aceites con un contenido en ceras comprendido entre 300 mg/kg y 350 mg/kg se consideran aceite de oliva lampante si el contenido de alcoholes alifá ticos totales es inferior o igual a 350 mg/kg o si el porcentaje de
eritrodiolyuvaolesinferioroiguala3,5.
(6) Losaceitesconuncontenidoencerascomprendidoentre300mg/kgy350mg/kgseconsideranaceitedeorujodeolivacrudosielcontenidodealcoholesa lifáticostotalesessuperiora350mg/kgysielporcentajedeeritrodiol
yuvaolessuperiora3,5.▼M191991R2568—ES—22.05.2002—019.001—8
CategoríaContenidoenácidos
Sumasde
los
isómeros
trans-
oleicos
(%)Sumasde
los
isómeros
trans-
linoleicos
+trans-
linolé-
nicos
(%)Coles-
terol
(%)Brasicas-
terol
(%)Campes-
terol
(%)Estigmas-
terol
(%)Betasitos-
terol
(%)(1)Delta-7-
estigmas-
tenol
(%)Esteroles
totales
(mg/kg)Eritrodiol
yuvaol
(%)(**)Mirístico
(%)Linolé-
nico
(%)Araquí-
dico
(%)Eicose-
noico
(%)Behénico
(%)Lignocé-
rico
(%)
1. Aceite de oliva
virgenextra≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
2. Aceite de oliva
virgen≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
3. Aceite de oliva
virgencorriente≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
4. Aceite de oliva
virgenlampante≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1000≤4,5(2)
5. Aceite de oliva
refinado≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
6.Aceitedeoliva ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
7. Aceite de orujo
deolivacrudo≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2500 >4,5(3)
8. Aceite de orujo
deolivarefinado≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1800 >4,5
9. Aceite de orujo
deoliva≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1600 >4,5
(1) Sumade:delta-5,23-estigmastadienol+clerosterol+beta-sitosterol+sitostanol+delta-5-avenasterol+delta-5,24-estigmastadienol.
(2) Los aceites con un contenido en ceras comprendido entre 300 mg/kg y 350 mg/kg se consideran aceite de oliva lampante si el contenido de alcoholes alifá ticos totales es inferior o igual a 350 mg/kg o si el porcentaje de
eritrodiolyuvaolesinferioroiguala3,5.
(3) Losaceitesconuncontenidoencerascomprendidoentre300mg/kgy350mg/kgseconsideranaceitedeorujodeolivacrudosielcontenidodealcoholesa lifáticostotalesessuperiora350mg/kgysielprocentajedeeritrodiol
yuvaolessuperiora3,5.
Notas:
a) Losresultadosdelosanálisisdeberánexpresarseconelmismonúmerêodedecimalesqueelprevistoparacadacaracterística.
Laúltimacifraexpresadadeberáredondearsehaciaarribasilacifrasiguienteessuperiora4.
b) Paracambiardecategoríaunaceiteodeclararlonoconformeencuantoasupureza,bastaconqueunasoladelascaracterísticasnoseajustealoslími tesfijados.
c) Lascaracterísticasindicadasconasterisco(*),relativasalacalidaddelaceite,implicanlosiguiente:
— enelcasodelaceitedeolivavirgenlampante,loslímitescorrespondientes(exceptoeldeK232)puedennorespetarsesimultáneamente.
— enelcasodelosdemásaceitesdeolivavírgenes,elincumplimientodeunodeloslímitessupondráuncambiodecategoría,aunqueseguiránclasificad osdentrodeunadelascategoríasdelosaceitesdeolivavírgenes.
d) Lascaracterísticasindicadascondosasteriscos(**)implicanque,enelcasodetodoslosaceitesdeorujodeolivaseñalados,puedennorespetars esimultáneamenteloslímitescorrespondientes.▼M191991R2568—ES—22.05.2002—019.001—9
▼M17
ANEXOIbis
Muestreodelotesdeaceitedeolivaoaceitedeorujodeolivapresentadoen
envasesinmediatosde100litroscomomáximo
El presente método de muestreo se aplicará a los lotes de aceite de oliva o de
orujo de oliva de 125000 litros como máximo, presentados en envases inme-
diatosde100litroscomomáximo.
Cuandounlotecontengamásde125000litrossedividiráensublotesdecanti-
dadesaproximadamente igualesoinferioresa125000litros,acadaunodelos
cualesseaplicaráestemétodo.
1. Contenidodeunamuestraelemental
Cadamuestraelementalconsistiráenlosiguiente:
a) encasodequelosenvasesinmediatostenganunacapacidadigualosupe-
riora6litros,elaceitedeunenvaseinmediato,repartidoentrealmenos
seisrecipientesde1litro,deloscuales:
— unrecipienteparalosanálisismencionadosenlosanexosII,III,IXy
XII,
— otrorecipienteparalosdemásanálisis,y— losrecipientesrestantesparalosposiblessegundosanálisis;
b) encasodequelosenvasesinmediatostenganunacapacidadigualosupe-
riora2litroseinferiora6litros,elaceitedecuatroenvasesinmediatos,
deloscuales:
— un envase inmediato para los análisis mencionados en los anexos II,
III,IXyXII,
— unterciodeotroenvaseparalosdemásanálisis,y— elrestodelaceiteparalosposiblessegundosanálisis;
c) encasodequelosenvasesinmediatostenganunacapacidadigualosupe-
riora0,75litroseinferiora2litros,elaceitedeseisenvasesinmediatos,
deloscuales:
— un envase inmediato para los análisis mencionados en los anexos II,
III,IXyXII,
— otroenvaseparalosdemásanálisis,y
— elrestodelaceiteparalosposiblessegundosanálisis;
d) en caso de que los envases inmediatos tengan una capacidad inferior a
0,75litros,elaceite delnúmeromínimodeenvasescuyacapacidad total
supere4,5litros,conladistribuciónsiguiente:
— el aceite del número mínimo de envases cuya capacidad supere 0,75
litros se reservará para los análisis a que se refieren los anexos II,
III,IXyXII,
— lamismacantidadsereservaráparalosdemásanálisis,y
— elrestodelaceiteseconservaráparalosposiblessegundosanálisis.
2. Númerodemuestraselementales
Elnúmeromínimodemuestraselementales sedeterminará enfuncióndela
talladellote,conarregloalcuadrosiguiente:
Talladellote(enlitros)inferiora Númeromínimodemuestraselementales
7500 2
25000 3
75000 4
125000 5
Losenvases inmediatos de una misma muestra elemental deberán escogerse
deformacontiguaenellote.
En caso de duda, el Estado miembro aumentará el número de muestras
elementalesquedebantomarse.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—10
▼M17
3. Análisisyresultados
Siempre que sea posible, los aceites deberán mantenerse en los recipientes
originaleshastaelmomentodelosanálisis.
a) Cada muestra elemental se subdividirá en muestras de laboratorio con
arreglo al punto 2.5 de la norma EN ISO 5555, para someterlas a losanálisissiguientes:
— determinacióndeácidosgrasoslibres,comosecontemplaenelprimer
guióndelapartado1delartículo2,
— determinación del índice de peróxido, como se contempla en el
segundoguióndelapartado1delartículo2,
— análisis espectrofotométrico, como se contempla en el octavo guión
delapartado1delartículo2,
— composiciónenácidosgrasos,comosecontemplaenelnovenoguión
delapartado1delartículo2.
b) Encasodequelosresultadosdelosanálisismencionadosenlaletraa)de
almenosuna de lasmuestras elementales tomadas del mismolote no se
ajustenalascaracterísticasdelacategoríadeaceitedeclarada,elconjunto
dellotedequesetratesedeclararánoconforme.
En caso de que todos los resultados de los análisis mencionados en la
letraa)decadaunadelasmuestraselementales tomadasdelmismolote
seanhomogéneos,habidacuentadelascaracterísticas derepetibilidadde
los métodos de que se trate, y se ajusten a las características de la cate-
goríadeaceitedeclarada,unadelasmuestraselementalesdedicholotese
someteráalosdemásanálisis.
c) En caso de que uno de los resultados de los análisis mencionados en el
párrafosegundodelaletrab)noseajustealascaracterísticasdelacate-
goríadeaceitedeclarada,elconjuntodellotedequesetratesedeclarará
noconforme.
En caso de que todos los resultados de los análisis mencionados en el
párrafo segundo de la letra b) se ajusten a las características de la cate-
goría de aceite declarada, todo el lote de que se trate se declarará
conforme.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—11
▼B
ANEXOII
DETERMINACIÓNDELGRADODEACIDEZ
1. OBJETO
Determinar los ácidos libres en los aceites de oliva. El contenido en
ácidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada según el
métodoconvencional.
1.1.Principio
Disolución de la muestra en una mezcla de disolventes y valoración de
los ácidos grasos libres mediante una solución etanólica de hidróxido
potásico.
1.2.Reactivos
Todos los reactivos deben ser de calidad analítica reconocida y el agua
utilizadadebeseraguadestiladaodeunapurezaequivalente.
1.2.1. Mezcla de éter dietílico y etanol de 95 % (V/V), en proporción de
volumen1:1.
Nota:El éter dietílico es muy inflamable y puede formar peróxidos
explosivos.Debeutilizarsetomandoespecialesprecauciones.
Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilización con la
solucióndehidróxidopotásico(1.2.2)enpresenciade0,3mldelasolu-
cióndefenolftaleína(1.2.3)porcada100mldemezcla.
Nota:Si no es posible utilizar éter dietílico, puede sustituirse por una
mezcladedisolventesformadaporetanolytolueno.Sifueranece-
sario,eletanolpodríasustituirse,asuvez,por2-propanol.
1.2.2. Solución etanólica valorada de hidróxido potásico, = 0,1 M o, en caso
necesario,=0,5M.Nota1.
Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilización,
la concentración exacta de la solución etanólica de hidróxido potásico.
Debeutilizarseunasoluciónquehayasidopreparadaporlomenoscinco
días antes y decantada en un frasco de vidrio marrón cerrado con tapón
degoma.Lasolucióndebeserincoloraodecoloramarillopaja.
Nota:Se puede preparar una solución incolora y estable de hidróxido
potásico de la manera siguiente: Llevar a ebullición, y mantener
ésta a reflujo durante una hora, 1000 ml de etanol con 8 g dehidróxido potásico y 0,5 g de virutas de aluminio. Destilar inme-
diatamente. Disolver en el destilado la cantidad requerida de
hidróxido potásico. Dejar reposar durante varios días y decantar
el líquido claro sobrenadante, separándolo del precipitado de
carbonatopotásico.
La solución también puede prepararse de la manera siguiente sin
efectuar la destilación: añadir 4 ml de butilato de aluminio a
1000 ml de etanol y dejar reposar la mezcla durante algunos
días.Decantarellíquidosobrenadanteydisolverenéllacantidad
necesaria de hidróxido potásico. La solución está lista para ser
utilizada.
1.2.3. Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol de 95-96 % (V/V) o solu-
ción de 20 g/l de azul alcalino (en caso de aceites de oliva muy
coloreados)enetanolde95-96%(V/V).
1.3.Material
Materialhabitualdelaboratorio,yenparticular:
1.3.1. Balanzaanalítica
1.3.2. Matrazerlenmeyerde250mldecapacidad
1.3.3. Buretade10mldecapacidad,congraduaciónde0,05ml
1.4.Procedimento
1.4.1. Preparacióndelamuestraparalaprueba1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—12
▼B
La determinación se efectuará en una muestra filtrada. Si el contenido
globaldehumedadeimpurezasesinferioral1%,seutilizarálamuestra
talcual.
1.4.2. Muestraparalaprueba
Tomar la muestra, según el grado de acidez previsto, de acuerdo con el
cuadrosiguiente:
GradodeacidezprevistoPesodelamuestra
(eng)Precisióndelapesadade
lamuestra
(eng)
<1 20 0,05
1a4 10 0,02
4a15 2,5 0,01
15a75 0,5 0,001
>75 0,1 0,0002
Pesarlamuestraenelmatrazerlenmeyer(1.3.2)
1.4.3 Determinación
Disolverlamuestra(1.4.2)en50a150mldelamezcladeéterdietílico
yetanol(1.2.1),previamenteneutralizada.
Valorar,agitando,conlasolucióndehidróxidopotásicode0,1M(1.2.2)
(véase nota 2) hasta el viraje del indicador (la coloración rosa de la
fenolftaleínadebepermaneceralmenosdurante10segundos).
Nota1:La solución etanólica valorada de hidróxido potásico (1.2.2)
puede sustituirse por una solución acuosa de hidróxido potásico
o sódico siempre que el volumen de agua añadido no provoque
unaseparacióndelasfases.
Nota2:Sila cantidad necesaria delasolucióndehidróxidopotásico de
0,1Msuperalos10ml,debeutilizarseunasoluciónde0,5M.
Nota3:Si la solución se enturbia durante la valoración, añadir una
cantidad suficiente de la mezcla de disolventes (1.2.1) para que
lasoluciónseaclare.
1.5Expresióndelaacidezenporcentajedeácidooleico
Laacidez,expresadaenporcentajedeácidooleicoesiguala:
V/C2c/C2M
1000/C2100
P¼V/C2c/C2M
10/C2P
siendo:
V: volumen en ml de la solución valorada de hidróxido potásico utili-
zada.
c: concentraciónexacta,enmolesporlitro,delasolucióndehidróxido
potásicoutilizada.
M: peso molecular del ácido en que se expresa el resultado (ácido
oleico=282).
P: pesoengramosdelamuestrautilizada.
Se tomará como resultado la media aritmética ►M6de dos
determinaciones ◄.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—13
▼B
ANEXOIII
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEPERÓXIDOS
1. OBJETO
Lapresentenormadescribeunmétodoparaladeterminacióndelíndicede
peróxidosdelosaceitesygrasas.
2. ÁMBITODEAPLICACIÓN
Lapresentenormaesaplicablealosaceitesygrasasanimalesyvegetales.
3. DEFINICIÓN
El índice de peróxidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de
oxígenoactivoporkgdegrasa)deperóxidosenlamuestraqueocasionan
laoxidacióndelyoduropotásicoenlascondicionesdetrabajodescritas.
4. PRINCIPIO
La muestra problema, disuelta en ácido acético y cloroformo, se trata con
solucióndeyoduropotásico.Elyodoliberadosevaloraconsoluciónvalo-
radadetiosulfatosódico.
5. APARATOS
Todo el material utilizado estará exento de sustancias reductoras u
oxidantes.
Nota:Noengrasarlassuperficiesesmeriladas.
5.1. Navecilladevidriode3ml5.2. Matraces con cuello y tapón esmerilados, de 250ml de capacidad aproxi-
madamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco
(nitrógenoo,preferiblemente,dióxidodecarbono).
5.3. Buretade25o50ml,graduadaen0,1ml.
6. REACTIVOS
6.1. Cloroformoparaanálisis,exentodeoxígenoporborboteodeunacorriente
degasinertepuroyseco.
6.2. Ácidoacéticoglacialparaanálisis,exentodeoxígenoporborboteodeuna
corrientedegasinertepuroyseco.
6.3. Solución acuosa saturada de yoduro potásico, recién preparada, exenta de
yodoyyodatos.
6.4. Solución acuosa de tiosulfato sódico 0,01 N o 0,002 N valorada exacta-
mente;lavaloraciónseefectuaráinmediatamenteantesdeluso.
6.5. Solución de almidón, en solución acuosa de 10 g/l, recién preparada con
almidónsoluble.
7. MUESTRA
La muestra se tomará y almacenará al abrigo de la luz, y se mantendrá
refrigeradadentrodeenvasesdevidriototalmentellenosyherméticamente
cerradoscontaponesdevidrioesmeriladoodecorcho.
8. PROCEDIMIENTO
Elensayoserealizaráconluznaturaldifusaoconluzartificial. Pesarcon
precisiónde0,001genunanavecilladevidrio(5.1)o,ensudefecto,enun
matraz (5.2) una cantidad de muestra en función del índice de peróxidos
quesepresuponga,conarregloalcuadrosiguiente:1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—14
▼B
Índicedeperóxidosquesesupone
(meqdeO2/kg)Pesodelamuestraproblema
(eng)
de0a12 de5,0a2,0
de12a20 de2,0a1,2de20a30 de1,2a0,8de30a50 de0,8a0,5
de50a90 de0,5a0,3
Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la
muestraproblema.Añadir10mldecloroformo(6.1).Disolverrápidamente
la muestra problema mediante agitación. Añadir 15 ml de ácido acético
(6.2) y, a continuación, 1 ml de solución de yoduro potásico (6.3). Cerrar
rápidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscu-
ridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida
entre15y25ºC.
Añadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al
mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solución de tiosul-
fato sódico (6.4) (solución 0,002 N si se presuponen valores inferiores a
12ysolución0,01Nsisepresuponenvaloressuperioresa12),utilizando
lasolucióndealmidón(6.5)comoindicador.
Efectuardosdeterminacionespormuestra.
Realizar simultáneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo
en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solución de tiosulfato sódico 0,01 N
(6.4),sustituirlosreactivos.
9. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
El índice de peróxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxígeno
activoporkgdegrasasecalculamediantelafórmulasiguiente:
IP¼
V/C2N/C21000
P
siendo:
V: ml de solución valorada de tiosulfato sódico (6.4) empleados en el
ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo
enblanco.
N: normalidadexactadelasolucióndetiosulfatosódico(6.4)empleada.
P: peso,engramosdelamuestraproblema.
Elresultadoserálamediaartiméticadelasdosdeterminacionesefectuadas.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—15
▼M6
ANEXOIV
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE
CROMATOGRAFÍADEGASESCONCOLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de ceras en determinados aceites y grasas en las condi-
cionesdeensayo.
Puede utilizarse, en particular, para distinguir el aceite de oliva obte-
nidomedianteextracción(aceitedeorujodeoliva).
2. PRINCIPIO
Fraccionamiento de la grasa o aceite, a los que se habrá añadido un
patróninternoadecuado,mediantecromatografíaencolumnadegelde
sílice hidratado. Recuperación de la fracción eluida en las condiciones
de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicéridos) y, a
continuación,análisisdirectomediantecromatografíadegasescolumna
capilar.
3. APARATOS
3.1. MatrazErlenmeyerde25ml.
3.2. Columnadevidrioparacromatografíade15mmdediámetrointeriory
30-40cmdelongitud.
3.3. Cromatógrafo de gases adecuado con columna capilar, dotado de un
sistema de introducción directa en la columna, que incluya los
siguienteselementos:
3.3.1. Hornotermostáticoparalascolumnas,quepuedamantenerlatempera-
turadeseadaconunaoscilaciónmáximade1ºC.
3.3.2. Inyectorenfríoparaintroduccióndirectaenlacolumna.3.3.3. Detectordeionizacióndellamayconvertidor-amplificador.3.3.4. Registrador-integrador quepueda funcionar con elconvertidor-amplifi-
cador(3.3.3),conuntiempoderespuestainferioroigualaunsegundo
yvelocidaddelpapelvariable.
3.3.5. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de ►
C210-15 m ◄de
longitud y 0,25-0,32 mm de diámetro interior, con un recubrimiento
interno de SE-52 o SE-54 líquido, o equivalente, de un espesor que
oscileentre0,10y0,30 µm.
3.4. Microjeringa para inyección en columna, de 10 µl de capacidad,
provistadeunaagujacementada.
4. REACTIVOS
4.1. Geldesílice70-230mesh,artículo7754Merck.
Mantenerelgelenelhornodurantecuatrohorasaunatemperaturade
500ºC.Dejarenfriaryañadirun2%deagua.Agitarbienparahomo-
geneizar la mezcla. Mantener al abrigo de la luz durante al menos 12
horasantesdesuuso.
4.2. n-Hexano,decalidadparacromatografía.4.3. Éteretílico,decalidadparacromatografía.4.4. n-Heptano,decalidadparacromatografía.
4.5. Solución patrón de laurilaraquidato al 0,1 % (m/v) en hexano (patrón
interno).
4.6. Gasportador:hidrógenopuro,decalidadparacromatografíadegases.4.7. Gasesauxiliares:
— hidrógenopuro,decalidadparacromatografíadegases,
— airepuro,decalidadparacromatografíadegases.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—16
▼M6
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Separacióndelafraccióndelasceras
5.1.1. Preparacióndelacolumnacromatográfica.
Suspenderenn-hexanoanhidro15gdegeldesílicehidratadoal2%e
introducirenlacolumna.
Dejar sedimentar espontáneamente. Completar la sedimentación con
ayudadeunvibradoreléctrico,afindeobtenerunabandacromatográ-
ficamáshomogénea.Hacerpasar30mlden-hexanoparaeliminar las
posiblesimpurezas.
5.1.2. Cromatografíaencolumna.
Pesar con exactitud 500 mg de la muestra en un matraz de 25 ml;
añadir unacantidad de patrón interno apropiada, enfuncióndel conte-
nido de ceras que se presuma; por ejemplo, añadir 0,1 mg de
laurilaraquidatosisetratadeaceitedeolivay0,25-0,50mgsisetrata
deaceitedeorujodeoliva.
Transferir la muestra preparada a la columna cromatográfica, que se
habrá acondicionado como se indica en el punto 5.1.1 con ayuda de
dosporcionesde2mlden-hexano.
Dejarfluireldisolventehastaquesesitúea1mmporencimadelnivel
superiordel absorbente. Acontinuación, iniciar laelución cromatográ-
fica; recoger 140 ml de la mezcla de n-hexano y éter etílico en la
proporciónde99:1aunritmode15gotasaproximadamente cadadiez
segundos(2,1ml/minuto).
Secar la fracción resultante en un evaporador rotatorio hasta que se
haya eliminado casi todo el disolvente. Eliminar los últimos 2 o 3 ml
mediante una corriente débil de nitrógeno y añadir a continuación 10
mlden-heptano.
5.2. Análisisporcromatografíadegases
5.2.1. Operacionespreliminaresyacondicionamientodelacolumna.
5.2.1.1. Instalarlacolumnaenelcromatógrafodegases,conectandoelterminal
deentradaalsistemaencolumnayelterminaldesalidaaldetector.
Comprobar el funcionamiento general del cromatógrafo de gases
(funcionamiento de los circuitos de gas, eficacia del detector y del
registrador,etc.).
5.2.1.2. Silacolumnaseutilizaporvezprimera,esconvenienteacondicionarla.
Hacer pasar a través de la columna una corriente ligera de gas y, a
continuación, encender el cromatógrafo de gases. Calentar gradual-
mente hasta alcanzar una temperatura de ensayo (véase la nota).
Mantener esta temperatura durante al menos dos horas y, a continua-
ción, ajustar el aparato a las condiciones de ensayo (regulación del
flujo del gas, encendido de la llama, conexión con el registrador elec-
trónico, regulación de la temperatura del horno para la columna,
regulacióndeldetector,etc.).Registrarlaseñalconunasensibilidadal
menosdosvecessuperioralaexigidaparaefectuarelanálisis.Lalínea
de base deberá ser lineal, sin picos de ningún tipo, y no deberá
presentarderiva.
Unaderivarectilíneanegativaindicaquelasconexionesdelacolumna
nosoncorrectas;unaderivapositivaindicaquelacolumnanohasido
acondicionadaadecuadamente.
Nota:La temperatura de acondicionamiento debrá ser en todo
momentoalmenos20ºCinferioralatemperaturamáximaespe-
cificadaparaeleluyentequeseutilice.
5.2.2. Eleccióndelascondicionesdeensayo
5.2.2.1. Lascondicionesdeensayosongeneralmentelassiguientes:
— temperatura de la columna: se parte de una temperatura inicial de
80ºCqueseincrementaarazónde30ºC/minutohastalos120ºC,
y que, a continuación, se programa para que aumente 5 ºC/minuto
hastaalcanzarlos340ºC;
— temperaturadeldetector:350ºC;
— velocidadlinealdelgasportador:hidrógeno,20-35cm/segundo,
— sensibilidadinstrumental:4-16veceslaatenuaciónmínima,— sensibilidaddelregistrador:1-2mVdesdeelfondodelaescala,— velocidaddelpapel:30cm/hora,— cantidadinyectada:0,5-1 µldesolución.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—17
▼M6
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna ydel cromatógrafo degases (afin de obtener cromato-
gramas que reúnan las siguientes condiciones: el tiempo de retención
delpatróninternoC32debeserde25±2minutosyelpicomásrepre-
sentativo de las ceras debe estar comprendido entre el 60 y el 100 %
desdeelfondodelaescala).
5.2.2.2. Determinarlosparámetrosdeintegracióndelospicosdemaneraquese
obtengaunaevaluacióncorrectadelasáreasdelospicosconsiderados.
5.2.3. Realizacióndelanálisis5.2.3.1. Tomar 1 µldesolucióncon lamicrojeringa de10 µl;sacar elémbolo
hastaquelaagujaestévacía.Introducirlaagujaenelsistemadeinyec-
ción e inyectar rápidamente después de 1 o 2 segundos.Despuésde 5
segundosaproximadamente,extraerlentamentelaaguja.
5.2.3.2. Llevaracaboelregistrohastaquelascerassehayaneluidocompleta-
mente.
La línea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas
(5.2.1.2).
5.2.4. Identificacióndelospicos
Identificar los picos sobre la base de los tiempos de retención,
comparándolos con mezclas de ceras analizadas en las mismas condi-
cionesycuyostiemposderetenciónseanconocidos.
Lafigura1presentauncromatogramadelascerasdeunaceitedeoliva
virgen.
5.2.5. Análisiscuantitativo
5.2.5.1. Determinar con ayuda del integrador las áreas de los picos correspon-
dientesalpatróninternoyalosésteresalifáticosdeC40aC46.
5.2.5.2. Determinarelcontenidodecadaunodelosésteresenmg/kgdemateria
grasa,aplicandolasiguientefórmula:
éster(mg/kg)=A
x·ms·►M91000◄
As·m
siendo:
Ax= áreadelpicodecadaunodelosésteres;
As= áreadelpicodellaurilaraquidato;
ms= peso,enmiligramos,dellaurilaraquidatoañadido;
m = peso,engramos,delamuestratomadaparaladeterminación.
6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Expresarloscontenidosdelasdistintascerasylasumadeesosconte-
nidosenmg/kgdemateriagrasa.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—18
▼M6
APÉNDICE
Determinación delavelocidad linealdelgas
Inyectarde1a3 µldemetano(propano)enelcromatógrafodegases,después
dehaberloajustadoalascondicionesdeensayonormales.Medireltiempoque
tardaelgasenrecorrerlacolumna,desdeelmomentodesuinyecciónhastala
aparicióndelpico(tM).
Lavelocidadlinealencm/segundovienedadaporlafórmulaL/tM,siendoLla
longituddelacolumnaexpresadaencmytMeltiempomedidoensegundos.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—19
▼M61991R2568—ES—22.05.2002—019.001—20
▼B
ANEXOV
DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DEL CONTENIDO DE
ESTEROLES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON
COLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de esteroles en las materias grasas, expresado como
contenido de cada uno de los esteroles analizados y como contenido
totaldeesteroles.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadio α-coles-
tanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
potásico;acontinuación,extraccióndelinsaponificableconéteretílico.
Separación de la fracción de esteroles del insaponificable extraído
mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los esteroles
recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se
analizanmediantecromatografíadegasesconcolumnacapilar.
3. MATERIAL
3.1. Matrazde250ml,provistoderefrigerante dereflujoconjuntasesme-
riladas.
3.2. Embudosdeseparaciónde500ml.
3.3. Matracesde250ml.
3.4. Equipo completo de cromatografía en capa fina, utilizando placas de
vidriode20×20cm.
3.5. Lámparaultravioletadeunalongituddeondade366o254nm.
3.6. Microjeringade100µly500µl.
3.7. EmbudocilíndricofiltranteconfiltroporosoG3(porosidad15-40µm),
de2cmdediámetroy5cmdealtura,aproximadamente,conundispo-
sitivo adecuado para la filtración en vacío y una junta esmerilada
macho12/21.
3.8. Matrazcónicoparavacíode50ml,conjuntaesmeriladahembra12/21
acoplablealembudofiltrante(3.7).
3.9. Probetade10mldefondocónicocontapónhermético.
3.10. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna
capilar,provistodeunsistemadedivisióndeflujoformadopor:
3.10.1. Hornoparalacolumna,quepuedamantenerlatemperaturadeseadacon
precisiónde±1ºC.
3.10.2. Inyectorconelementovaporizadordevidriotratadoconpersilano.
3.10.3. Detectordeionizacióndellamayconvertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integrador quepueda funcionar con elconvertidor-amplifi-
cador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y
convelocidaddepapelvariable.
3.11. Columnacapilardevidrioosílicefundida,de20a30mdelongitudy
de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interno, recubierta interiormente de
líquidoSE-52,SE-54oequivalente,conunespesoruniformequeoscile
entre0,10y0,30µm.
3.12. Microjeringa de 10 µl para cromatografía de gases, con aguja endure-
cida.
4. REACTIVOS
4.1. Hidróxido potásico, solución etanólica 2N aproximadamente: disolver,
enfriando al mismo tiempo, 130 g de hidróxido potásico (valoración
mínima del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un
litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio oscuro
biencerradas.
4.2. Éteretílicodecalidadparaanálisis.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—21
▼B
4.3. Sulfatosódicoanhidrodecalidadparaanálisis.
4.4. Placasdevidriorecubiertas congeldesílice, sinindicador defluores-
cencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya
preparadasparaeluso).
4.5. Hidróxidopotásico,soluciónetanólica0,2N:disolver13gdehidróxido
potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con
etanol.
4.6. Bencenoparacromatografía.
4.7. Acetonaparacromatografía.(Véase5.2.2).
4.8. Hexanoparacromatografía.(Véase5.2.2).4.9. Éteretílicoparacromatografía.(Véase5.2.2).4.10. Cloroformodecalidadparaanálisis.
4.11. Solución patrón para cromatografía en capa fina: colesterol o fitoste-
roles,soluciónal ►
M62%◄encloroformo.
4.12. Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol. Para hacerla
ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2N
dehidróxidopotásico.
4.13. Piridinaanhidraparacromatografía.
4.14. Hexametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Soluciónproblema de trimetilsililéteres delosesteroles: preparar enel
momento del usoa partir de esteroles puroso de mezclas de esteroles
obtenidosdeaceitesqueloscontengan.
4.17. α-colestanol,disoluciónal0,2%(m/V)encloroformo(patróninterno).
4.18. Gasportador:hidrógenooheliodecalidadparacromatografíadegases.4.19. Gasesauxiliares:
— hidrógenodecalidadparacromatografíadegases,
— airedecalidadparacromatografíadegases.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparacióndelinsaponificable.5.1.1. Con la microjeringa de 500 µl introducir en el matraz de 250 ml un
volumen de disolución de α-colestanol al 0,2 % en cloroformo (4.17)
que contenga una cantidad de α-colestanol correspondiente al 10 %
aproximadamente del contenido de esteroles en la alícuota de la
muestraparaladeterminación.Porejemplo,para5gdemuestraañadir
500µldelasoluciónde α-colestanol al0,2%,sisetrata deaceite de
oliva,y1500µl,sisetrata ►
M6 ◄deaceitedeorujo
deoliva.
Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación,
pesarconprecisión,enelmismomatraz,5gdemuestrasecayfiltrada.
Enelcasodeaceites ►M6 ◄conunaltocontenidode
colesterolpuedeproducirseönpicocuyotiempoderetenciónseaidén-
ticoaldelcolestanol.Entalcasoelanálisisdelafraccióndeesteroles
deberealizarsedosveces:conpatróninternoysinél ►M6ohayque
utilizarbetulinolenlugardecolestanol ◄.
5.1.2. Añadir50mldesoluciónetanólicadehidróxidopotásico2N,adaptarel
refrigerante de reflujo y calentar en baño María con ligera ebullición,
agitandoenérgicaeininterrumpidamentehastaqueseproduzcalasapo-
nificación(lasoluciónsevuelvelímpida).Calentardurante20minutos
másy,acontinuación,añadir50mldeaguadestiladaporlapartesupe-
riordelrefrigerante; separarelrefrigerante yenfriarelmatraz a30ºC
aproximadamente.
5.1.3. Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de
separaciónde500ml,mediantevarioslavadosconuntotalaproximado
de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éter
etílico, agitar enérgicamente durante unos30 segundosy dejar reposar
hastalaseparacióndelasfases(nota1).
Separar la fase acuosa inferior pasándola a un segundo embudo de
separación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el
mismoprocedimiento,utilizandocadavezde60a70mldeéteretílico.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—22
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Nota1:Lasposiblesemulsionespodráneliminarseañadiendopequeñas
cantidadesdealcoholetílicoometílicoconunpulverizador.
5.1.4. Reunir las fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y
lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de
lavadopresentereacciónneutra.
Unavezeliminada elaguadelavado,secarconsulfatosódicoanhidro
y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml previa-
mente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeñas cantidades
deéteretílico.
5.1.5. Destilar eléterhastaquequedenunospocosml; acontinuación, secar
con un vacío ligero o en una corriente de nitrógeno, completando el
secado en una estufa a 100 ºC durante 15 minutos aproximadamente;
dejarenfriarenundesecadorypesar.
5.2. Separacióndelafraccióndeesteroles.
5.2.1. Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas
con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2N de hidróxido
potásico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana
durante dos horas y, por último, mantenerlas en una estufa regulada a
100 ºC durante una hora. Sacarlas de la estufa y conservarlas en un
desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas
sometidas a este tratamiento deberán utilizarse en un plazo de quince
díascomomáximo).
Nota2:Siseutilizanplacasbásicasdegeldesíliceparalaseparación
delafraccióndeesteroles,yanoesnecesariotratarelinsapo-
nificableconalúmina.Deestemodo,todosloscompuestosde
naturalezaácida(ácidosgrasosyotros)quedanretenidosenla
líneadeaplicación,ylabandadelosesterolesapareceperfec-
tamente diferenciada de la banda de los alcoholes alifáticos y
triterpénicos.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de
benceno-acetona95:5(v/v)hastaunaalturade1cmaproximadamente.
Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y éter etílico
65:35(v/v).Cerrarlacubetaconsucorrespondientetapaydejartrans-
currirmediahoracomomínimo, deformaquesealcance elequilibrio
líquido-vapor.Enlascarasinterioresdelacubetapuedencolocarsetiras
de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el
tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elución
másuniformeyregulardeloscomponentes.
Nota3:Paraquelascondicionesdeelución seanperfectamente repro-
ducibles, la mezcla de desarrollo deberá cambiarse en cada
prueba.
5.2.3. Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 %
aproximadamente y, con la microjeringa de 100 µl, depositar 0,3 ml
de dicha solución en una placa cromatográfica (5.2.1) a unos2 cm de
unodelosbordes,formandounalínealomásfinayuniformeposible.
Alaalturadelalínea deaplicación sedepositan,enunextremodela
placa, de2a3µldelasolucióndereferencia deesteroles (4.11)para
poderidentificarlabandadeesterolesunavezefectuadoeldesarrollo.
5.2.4. Introducirlaplacaenlacubetadedesarrollo,preparadacomoseindica
en el punto 5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura ambiente entre
15 y 20 ºC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca
laeluciónhastaqueelfrentedeldisolvente sesitúea1cmaproxima-
damente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y
evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la
placabajounacampanaunosminutos.
5.2.5. Pulverizarlaplacaligerayuniformementeconlasoluciónde2,7-diclo-
rofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede
identificarse la banda de los esteroles mediante comparación con la
mancha obtenida a partir de la solución de referencia; marcar con
lápiznegroloslímitesdelabandaalolargodelosmárgenesdefluo-
rescencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área
delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el
embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclarcuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo
elfiltradoenelmatrazcónico(3.8)acopladoalembudofiltrante.
Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando
cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo
matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—23
▼B
un volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al tubo de
ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suaveencorriente ligera denitrógeno,recoger
conalgunasgotasdeacetona,evaporardenuevohastasequedad,intro-
ducirenunaestufaa105ºCduranteunos10minutos,dejarenfriaren
eldesecadorypesar.
Elresiduoquequedaeneltubodeensayoestáformadoporlafracción
deesteroles.
5.3. Preparacióndelostrimetilsililéteres.
5.3.1. Agregaraltuboquecontienelafraccióndeesteroleselreactivodesila-
nización formado por una mezcla de piridina-hexametildisilazano-
trimetilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 4), a razón de 50 µl por mili-
gramodeesteroles,evitandotodaabsorcióndehumedad(nota5).
Nota4:Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además,
también existen otros reactivos de silanización, como el bis-
trimetilsililacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que se
diluyeenelmismovolumendepiridinaanhidra.
5.3.2. Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la completa
disolución de los esteroles. Dejar reposar un cuarto de hora, como
mínimo,atemperaturaambienteycentrifugardurantealgunosminutos;
lasoluciónlímpida queda lista para elanálisis mediante cromatografía
degases.
Nota5:La formación de una ligera opalescencia es normal y no
ocasiona ninguna interferencia. La formación de una flocula-
ciónblanca olaaparición deunacoloración rosasonindicios
de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este
casodeberárepetirselaprueba.
5.4. Cromatografíadegases.
5.4.1. Operacionespreliminares:acondicionamientodelacolumna.
5.4.1.1. Colocarlacolumnaenelcromatógrafouniendounodelosextremosde
lacolumnaalinyectoryelotroaldetector.
Efectuarloscontrolesgeneralesdelequipoparacromatografíadegases
(estanquidaddeloscricuitosdegases,eficaciadeldetector,eficaciadel
sistemadedivisióndeflujoydelsistemaderegistro,etc.).
5.4.1.2. Silacolumnaseutilizaporvezprimera,esconvenienteacondicionarla
previamente.Hacerpasarunligeroflujodegasatravésdelacolumna,
encenderelequipodecromatografíadegaseseiniciaruncalentamiento
gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 ºC superior a la
temperatura de trabajo (nota 6).Mantener dicha temperatura durante 2
horas como mínimo; a continuación, poner el equipo completo en
condiciones de funcionamiento (regulación del flujo de gases y de la
relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador
electrónico, regulación de la temperatura del horno del detector y del
inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos
veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de
base debe ser lineal, exento de picos de cualquier tipo y no debe
presentarderiva.
Unaderivarectilíneanegativaindicaquelasconexionesdelacolumna
nosontotalmenteestancas;unaderivapositivaindicaqueelacondicio-
namientodelacolumnaesinsuficiente.
Nota6:La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre,
comomínimo20ºCinferioralatemperaturamáximaprevista
paralafaseestacionariautilizada.
5.4.2. Eleccióndelascondicionesdetrabajo.
5.4.2.1. Lascondicionesdetrabajoexigidassonlassiguientes:
— temperaturadelacolumna:260ºC±5ºC,
—►C1temperaturadelinyector ◄:280ºC,
— temperaturadeldetector:290ºC,— velocidadlinealdelgasportador:helio20a35cm/s,hidrógeno30
a50cm/s,
— relaciónde«split»de1/50a1/100,
— sensibilidaddelinstrumento:de4a16veceslaatenuaciónmínima,
— sensibilidadderegistro:1a2mVf.e.— velocidaddelpapel:30a60cm/hora,— cantidaddesustanciainyectada:0,5a1µldesolucióndeTMSE.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—24
▼B
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
delacolumna ydelcromatógrafo, demodoqueseobtengancromato-
gramasquecumplanlossiguientesrequisitos:
— eltiempoderetencióndel β-sitosteroldebeserde20±5minutos,
— elpicodelcampesteroldebeser:paraelaceite deoliva(contenido
mediodel3%),15±5%delfondodeescala;paraelaceitedesoja
(contenidomediodel20%),80±10%delfondodeescala,
— sedebenseparar todoslosesteroles presentes;esnecesario quelos
picos no sólo se separen sino que se resuelvan completamente, es
decir, que el trazo del pico llegue a la línea de base antes de que
seinicieelpicosiguiente.Noobstante,podráadmitirseunaresolu-
ción incompleta si el pico a TRR 1,02 puede cuantificarse
utilizandolaperpendicular.
5.4.3. Realizacióndelanálisis.
5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 µl tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µl de
airey,acontinuación,entre0,5y1µldelasoluciónproblema;elevar
elémbolodelajeringademodoquelaagujaquedevacía.Introducirla
agujaatravésdelseptumy,despuésde 1o2segundos,inyectarrápida-
mente;transcurridosunos5segundos,extraerlaagujalentamente.
5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los
esterolespresentes.
La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones
exigidas(5.4.1.2).
5.4.4. Identificacióndelospicos.
Paralaidentificación delosdiferentes picosseutilizan lostiempos de
retención y la comparación con mezclas de TMSE de los esteroles
analizadasenlasmismascondiciones.
Laelucióndelosesterolesseefectúa enelordensiguiente:colesterol,
brasicasterol,24-metilencolesterol, campesterol,campestanol,estigmas-
terol, ∆-7-campesterol, ∆-5,23-estigmastadienol, clerosterol, β-
sitosterol, sitostanol, ∆-5-avenasterol, ∆-5,24-estigmastadienol, ∆-7-
estigmastenol, ∆-7-avenasterol.
En el cuadro Ifiguran lostiempos de retención correspondientes al β-
sitosterolparalascolumnasSE52ySE54.
Lasfiguras1y2ilustranloscromatogramastípicosdealgunosaceites.
5.4.5. Determinacióncuantitativa.5.4.5.1. Calcularlasáreasdelospicosdel α-colestanolydelosesterolesutili-
zando el integrador. No se tomarán en cuenta los picos de aquellos
componentesquenofigurenenelcuadroI.Elfactorderespuestapara
elα-colestanoldebeconsiderarsecomo1.
5.4.5.2. Calculardelmodosiguienteelcontenido decadaunodelosesteroles,
expresadoenmg/100gdemateriagrasa:
esterolx=A
x·ms·100
As·m
siendo:
Ax: áreadelpicodelesterolx ►M6 ◄,
As: áreadelpicodel α-colestanol,
ms: pesode α-colestanolañadido,enmiligramos,
m: pesodelamuestratomadoparaladeterminación,engramos.
6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
6.1. ►C1Seexpresa ◄elcontenidodecadaunodelosesterolesenmg/
100gdemateriagrasay,como«esterolestotales»,susuma.
6.2. Elporcentaje decadaunodelosesteroles simpleseslarazónentreel
áreadelpicocorrespondienteylasumadelasáreasdelospicosdelos
esteroles.
%delesterolX=Ax
ΣA×1001991R2568—ES—22.05.2002—019.001—25
▼B
siendo:
Ax: áreadelpicodex,
ΣA: sumadelasáreasdetodoslospicos.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—26
▼B
APÉNDICE
Determinación delavelocidad linealdelgas
Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condiciones normales,
de1a3µldemetano(opropano)ymedireltiempoquetardaelgasenrecorrer
lacolumna,desdeelmomentodelainyecciónhastaelmomentoenqueaparece
elpico(tM).
La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la
columnaencmytMeltiempo,expresadoensegundos.
CuadroI
Tiemposderetenciónrelativosdelosesteroles
Pi-
coIdentificaciónTiempoderetención
Columna
SE54Columna
SE52
1 colesterol ∆5-colesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 colestanol 5 α-colestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brasicasterol [24S]-24-metil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-metilencolesterol 24-metilen- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-metil- ∆5colesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-metil-colestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 estigmasterol [24S]-24-etil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆7-campesterol [24R]-24-metil- ∆7-colesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆ 5,23-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,23-colestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 clerosterol [24S]-24-etil- ∆ 5,25-colestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-etil- ∆5-colesten-3 β-ol 1 1
12 sitostanol 24-etil-colestan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆5-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆5-colesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆ 5,24-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆7-estigmastenol [24R,S]-24-etil- ∆ 7,24-colesten-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆7-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆7-3β-ol 1,16 1,161991R2568—ES—22.05.2002—019.001—27
▼B
Figura1
Cromatogramadelafraccióndeesterolesdeunaceite deolivabruto
1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—28
▼B
Figura2
Cromatogramadelafracción deesterolesdeunaceite deolivarefinado
1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—29
▼B
ANEXOVI
DETERMINACIÓNDELCONTENIDOENERITRODIOLYUVAOL
INTRODUCCIÓN
El eritrodiol, entendido corrientemente como conjunto de los dioles
eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, característico
de algunos tipos de materias grasas. Su concentración es mucho más
elevadaenlosaceitesdeolivaobtenidosmedianteextracciónqueenlos
obtenidosmediantepresiónoenelaceitedepepitadeuvay,porlotanto,
sudeterminación puede servirpara comprobar la existencia de aceite de
olivaobtenidomedianteextracción.
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para determinar el eritro-
diolenlasmateriasgrasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se saponifica con una solución etanólica de hidróxido
potásico;acontinuaciónseextraeelinsaponificable conéteretílicoyse
purificapasándoloporunacolumnadealúmina.
Elfraccionamiento delinsaponificable serealiza mediante cromatografía
encapafinaenplacadegeldesíliceyseaíslanlabandadelafracción
esterólicayladeleritrodiol.
Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la placa se transforman en
trimetilsililéteres yseguidamenteseanalizalamezclamediantecromato-
grafíadegases.
El resultado seexpresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto
deeritrodiol+esteroles.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. El mismo material que el indicado para el método del Anexo V (Deter-
minacióndelcontenidodeesteroles).
4. REACTIVOS
4.1. Los mismos reactivos que los indicados para el método del Anexo V
(Determinacióndelcontenidodeesteroles).
4.2. Soluciónpatróndeeritrodiolal0,5%encloroformo.
5. PROCEDIMIENTO5.1.Preparacióndelinsaponificable
Serealizatalcomoseindicaenelapartado5.1.2delmétododelAnexo
V
5.2.Separacióndeleritrodiolylosesteroles
5.2.1. Véaseelapartado5.2.1delmétododelAnexoV.
5.2.2. Véaseelapartado5.2.2delmétodomencionado.5.2.3. Prepararunasolucióndelinsaponificableal5%encloroformo.
Conunamicrojeringade0,1mldepositar0,3mldeestasoluciónenuna
placa cromatográfica aaproximadamente 1,5cmdelbordeinferiordela
placa,formandounabandalomásfinayuniformeposible.Depositaren
unextremodelaplaca,comoreferencia,algunosmicrolitrosdelassolu-
cionesdecolesterolyeritrodiol.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el apartado 5.2.1. La temperatura ambiente debe ser de unos 20 ºC.
Taparinmediatamente lacubetaydejarqueseproduzcalaeluciónhasta
que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximadamente del borde
superior de la placa. Sacar ésta de la cubeta de desarrollo y evaporar el
disolventeenunacorrientedeairecaliente.
5.2.5. Pulverizar la placa uniformemente con la solución alcohólica de 2 ′,7′-
diclorofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta pueden1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—30
▼B
identificarselasbandasdelosesterolesydeleritrodiolmediantecompa-
raciónconlasreferencias;delimitarlasbandasconunapuntaligeramente
porelexteriordelosmárgenesdefluorescencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en las áreas
delimitadas. Reunir el material obtenido en un matraz cónico de 50 ml;
añadir 15 ml de cloroformo caliente, agitar bien y filtrar en el embudo
de filtro poroso vertiendo el gel de sílice sobre el propio filtro. Lavar
tres veces con 10 ml de cloroformo caliente cada vez, recogiendo el
filtrado en un matraz esférico de 100 ml. Evaporar hasta obtener un
volumende4a5ml,transvasaraltubodecentrifugadodefondocónico
de10mlpreviamente tarado,evaporarhastasequedadmediante calenta-
mientosuaveencorrientedenitrógenoypesar.
5.3.Preparacióndelostrimetilsililéteres
Serealizatalcomoseindicaenelapartado5.3delmétododelAnexoV.
5.4.Cromatografíadegases
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4 del método citado. Las
condiciones operativas de la cromatografía de gases deben cumplir los
requisitos necesarios para analizar los esteroles y, además, permitir la
separacióndelosTMSEdeleritrodiolydeluvaol.
Una vez inyectada la muestra, dejar que se desarrolle el proceso hasta
que se produzca la elución de los esteroles presentes, el eritrodiol y el
uvaol; identificar los picos (el eritrodiol y el uvaol tienen tiempos de
retención relativos, respecto al β-sitosterol, de alrededor de 1,45 y 1,55,
respectivamente) y calcular sus áreas de la misma forma que para los
esteroles.
6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Eritrodiol,%=A1+A2
A1+A2+ΣAesteroles×100
siendo:
A1: áreadelpicodeleritrodiol,
A2: áreadelpicodeluvaol ►M6 ◄,
ΣAesteroles: sumadelasáreasdelosesterolespresentes.
Losresultadosdebenexpresarseconunacifradecimal.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—31
▼B
ANEXOVII
DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS SITUADOS EN LA
POSICIÓN2DELOSTRIGLICÉRIDOSDEACEITESYGRASAS
1. OBJETO
La presente norma describe un método para la determinación de la
composición porcentual de ácidos grasos que se encuentran esterificados
enlaposición2 ►C1(oposicióninterna) ◄delostriglicéridos.
2. CAMPODEAPLICACIÓN
Lapresentenormaesaplicablealosaceitesygrasascuyopuntodefusión
sesitúapordebajodelos45ºC,debidoalascaracterísticasespecialesde
laaccióndelalipasapancreática.
No es aplicable sin reservas a los aceites y grasas que contengan canti-
dades importantes de ácidos grasos con 12 átomos de carbono o menos
(aceitesdecocoydepalmiste,materiasgrasasbutíricas),deácidosgrasos
altamente insaturados (con más de cuatro enlaces dobles) que tengan 20
átomosdecarbonoomás(aceitesdepescadoydemamíferosmarinos)o
deácidosgrasosquetengangruposconfuncionesoxigenadas,ademásdel
grupoácido.
3. PRINCIPIO
Neutralización de los aceites y grasas si fuera necesario. Purificación
mediante tratamiento en columna de alúmina. Hidrólisis parcial de los
triglicéridos bajo la acción de la lipasa pancreática durante un tiempo
determinado. Separación de los monoglicéridos resultantes mediante
cromatografíaencapafinaymetanólisisdeestosmonoglicéridos.Análisis
delosésteresmetílicosmediantecromatografíagas-líquido.
4. EQUIPO
4.1. Matrazdefondoredondode100ml.4.2. Matrazdefondoredondode25mlconbocaesmerilada.4.3. Refrigerantedeairede1mdelongitud,adaptablealmatraz4.2.
4.4. Matrazerlenmeyerde250ml.
4.5. Vasodeprecipitadosde50ml.4.6. Embudodeseparaciónde500ml.4.7. Columnaparacromatografía,devidrio,condiámetrointeriorde13mmy
longitudde400mm,provistadeundiscodevidrioporosoydeunallave.
4.8. Tubodecentrífugade10mlcontapóndevidrioesmerilado.4.9. Buretade5mlgraduadaen0,05ml.4.10. Jeringahipodérmicade1mlprovistadeunaagujafina.4.11. Microjeringaquepuedadispensargotasde3-4µl.
4.12. Aplicadorparacromatografíaencapafina.
4.13. Placasdevidriode20×20cmparacromatografíaencapafina.4.14. Cubeta de desarrollo para cromatografía en capa fina, de vidrio, provista
deunatapadevidrioesmerilado,adecuadaparalasplacasde20×20cm.
4.15. Pulverizadorparacromatografíaencapafina.
4.16. Estufareguladaa103±2ºC.4.17. Termostatoregulableaunatemperaturacomprendidaentre30y45ºCcon
precisiónde0,5ºC.
4.18. Evaporadorrotatorio.
4.19. Vibrador eléctrico, con el que pueda agitarse vigorosamente el tubo de
centrífuga.
4.20. Lámparaultravioletaparaexaminarlasplacasdecapafina.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—32
▼B
Paraelcontroldelaactividad lipásica:
4.21. pH-metro.
4.22. Agitadorespiral.4.23. Buretade5ml.4.24. Cronómetro.
Paralaeventual preparacióndelalipasa:
4.25. Agitador de laboratorio, adecuado para dispersar y mezclar materiales
heterogéneos.
5. REACTIVOS
5.1. n-Hexanoo,ensudefecto,éterdepetróleo(puntodeebullición30-50ºC),
decalidadparacromatografía.
5.2. 2-Propanol,oetanol,95%(v/v)decalidadparaanálisis.
5.3. 2-Propanol,oetanol,soluciónacuosa1/1.5.4. Éterdietílico,exentodeperóxidos.5.5. Acetona.5.6. Ácidofórmico,almenosde98%(p/p).5.7. Solventededesarrollo:unamezcladen-hexano(5.1),éterdietílico(5.4)y
ácidofórmico(5.6)enlasproporciones70/30/1(v/v/v).
5.8. Alúmina activada para cromatografía, neutra, actividad l según Brock-
mann.
5.9. Geldesíliceconaglutinante,decalidadparacromatografíaencapafina.5.10. Lipasapancreáticadecalidadadecuada(véanselasnotas1y2).5.11. Hidróxidosódicoensoluciónacuosade120g/l.5.12. Ácidoclorhídrico,soluciónacuosa6N.5.13. Soluciónacuosade220g/ldeclorurodecalcio(CaCl
2).
5.14. Soluciónacuosade1g/ldecolatosódico(decalidadenzimática).
5.15. Solucióntampón:soluciónacuosadetris-hidroximetil-aminometano 1M,
ajustadaapH=8conácidoclorhídrico(5.12)(controlarconunpotenció-
metro).
5.16. Soluciónde10g/ldefenolftaleínaenetanolal95%(v/v).5.17. Solución de 2 g/l de 2 ′,7′-diclorofluoresceína en etanol al 95 % (v/v);
alcalinizar ligeramente añadiendo 1gotadesolucióndehidróxidosódico
1Npor100ml.
Paraelcontroldelaactividad lipásica:
5.18. Aceiteneutralizado.5.19. Soluciónacuosadehidróxidosódico0,1N.
5.20. Soluciónacuosade200g/ldecolatosódico(decalidadenzimática).
5.21. Soluciónacuosade100g/ldegomaarábiga.
6. PREPARACIÓNDELAMUESTRA
Silaacidezdelamuestra,determinadaconarregloalmétododelAnexo
IIesinferioral3%,seefectuarádirectamentelapurificaciónencolumna
dealúminacomosedescribeenelpunto6.2.
Silaacidezdelamuestra,determinadaconarregloalmétododelAnexo
II,essuperioral3%,seefectuaráunaneutralizaciónalcalinaenpresencia
de un solvente, como se describe en el punto 6.1, y a continuación e
realizarálapurificaciónencolumnadealúminadescritaenelpunto6.2.
6.1. Neutralizaciónalcalinaenpresenciadeunsolvente.
Introducir en el embudo de separación (4.6) aproximadamente 10 g de
aceitecrudoyañadir100mldehexano(5.1),50mlde2-propanol(5.2),
algunasgotasdesolucióndefenolftaleína(5.16)yelvolumendesolución
dehidróxidosódico(5.11)correspondientealaacidezlibredelaceitemás1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—33
▼B
un0,3%deexceso.Agitarenérgicamentedurante1minuto,añadir50ml
deaguadestilada,agitardenuevoydejarreposar.
Unavezquesehayaproducidolaseparación,separarlacapainferiorque
contiene los jabones. Separar, asimismo, todas las capas intermedias
(mucílago, materias insolubles). Lavar la solución de hexano delaceite
neutralizado con porciones sucesivas de 25-30 ml de la solución de 2-
propanol(5.3),hastaquedesaparezcaelcolorrosadelafenolftaleína.
Eliminar la mayor parte del hexano mediante destilación en vacío en el
evaporador rotatorio (4.18); desecar el aceite en vacío a 30-40 ºC
mediante una corriente de nitrógeno puro hasta la completa eliminación
delhexano.
6.2. Purificaciónconalúmina.
Preparar una suspensión de 15 g de alúmina activada (5.8) en 50 ml de
hexano (5.1) y verterla en la columna cromatográfica (4.7), removiendo
al mismo tiempo. Dejar que la alúmina se asiente uniformemente y
esperar a que el nivel del solvente descienda a 1-2 mm por encima del
absorbente. Verter cuidadosamente en la columna 5 g de aceite disueltos
en 25 ml de hexano (5.1); recoger todo el eluyente de la columna en un
matrazdefondoredondo(4.1).
7. PREPARACIÓNDELASPLACASCROMATOGRÁFICAS
Limpiar perfectamente las placas de vidrio (4.13) con etanol, éter de
petróleoyacetonaparaeliminarcualquierrastrodemateriagrasa.
Introducir en un matraz erlenmeyer (4.4) 30 g de polvo de sílice (5.9).
Añadir 60 ml de agua destilada. Tapar y agitar enérgicamente durante 1
minuto. Transferir inmediatamente al aplicador la mezcla semifluida
(4.12)yrecubrirlasplacaslimpiasconunacapade0,25mmdeespesor.
Secar lasplacas alaire durante 15minutosyacontinuación enlaestufa
(4.16)a103±2ºCdurante1hora.Antesdeluso,enfriarlasplacasenun
desecador a temperatura ambiente. En el comercio pueden adquirirse
placaspreparadas.
8. PROCEDIMIENTO
8.1. Hidrólisisconlipasapancreática.
Pesareneltubodecentrífuga(4.8)0,1gaproximadamentedelamuestra
preparada; si la muestra es aceite líquido, proceder como se indica a
continuación; si es una grasa sólida, disolverla en 0,2 ml de hexano
(5.1),aplicando,siesnecesario,unligerocalentamiento.
Añadir 20 mg de lipasa (5.10) y 2 ml de solución tampón (5.15). Agitar
bien,peroconcuidado,yañadiracontinuación 0,5mldelasoluciónde
colato sódico (5.14) y 0,2 ml de la solución de cloruro de calcio (5.13).
Cerrar el tubo con el tapón esmerilado, agitar cuidadosamente (evitando
humedecereltapón)eintroducireltuboinmediatamente eneltermostato
(4.17)a40±0,5ºCyagitarmanualmentedurante1minutoexacto.
Sacareltubodeltermostato yagitarenérgicamente conelvibradoreléc-
trico(4.19)durante2minutosexactos.
Enfriar de inmediato en agua corriente; añadir 1 ml de ácido clorhídrico
(5.12)y1mldeéterdietílico(5.4).Taparymezclarenérgicamenteconel
vibrador eléctrico. Dejar en reposo y extraer la capa orgánica con la
jeringa(4.10),trascentrifugarsifuesenecesario.
8.2. Separacióndelosmonoglicéridosporcromatografíaencapafina.
Conayudadelamicrojeringa (4.11)colocarelextractoa1,5cmaproxi-
madamente del borde inferior de la placa cromatográfica, depositándolo
demaneraqueformeunalínea fina,uniformeylomásestrecha posible.
Introducir la placa en una cubeta de desarrollo (4.14) bien saturada y
desarrollar con el solvente de desarrollo (5.7) a unos 20 ºC hasta 1 cm
aproximadamentedelbordesuperiordelaplaca.
Secar la placa al aire a la temperatura de la cubeta y pulverizarla con la
solución de 2 ′,7′-diclorofluoresceína (5.17). Identificar la banda de los
monoglicéridos(Rfaproximadamente0,035)conluzultravioleta(4.20).
8.3. Análisisdelosmonoglicéridosporcromatografíagas-líquido.
Raspar con una espátula la banda citada en el punto 8.2 (procurando no
raspar los componentes que permanezcan en la línea de base) y pasarla
al matraz de metilación (4.2). Tratar directamente la sílice recogida
como se indica en el Anexo X-B, de modo que los monoglicéridos se1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—34
▼B
transformen en ésteres metílicos, y, a continuación, examinar los ésteres
mediante cromatografía en fase gaseosa, como se describe en el Anexo
X-A.
9. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Calcular la composición de los ácidos grasos situados en la posición y
expresarelresultadoconunacifradecimal(nota3).
10. NOTAS
Nota1:Controldelaactividadlipásica
Prepararunaemulsiónoleosacomosigue:agitarenunmezclador
adecuadounamezclaconstituidapor165mldesolucióndegoma
arábiga (5.21), 15 g de hielo picado y 20 ml de aceite neutrali-
zado(5.18).
En un vaso de precipitados (4.5) introducir 10 ml de esta emul-
sión,0,3mldesolucióndecolatosódico(5.20)y20mldeagua
destilada.
Colocar el vaso en un termostato a 37 ºC ± 0,5 ºC (nota 4) e
introducirloselectrodosdelpH-metro(4.21)yunagitadorespiral
(4.22);después,añadirgotaagotaconunabureta(4.23)solución
dehidróxidosódico(5.19)hastaobtenerunpHde8,5.
Añadirunasuspensiónacuosadelalipasa(véaseacontinuación)
encantidadsuficiente.SemideelpHy,tanprontocomoalcance
el valor de 8,3, se pone en marcha un cronómetro y se va
añadiendo la disolución de hidróxido sódico (5.19) gota a gota,
con la velocidad necesaria para mantener constante el pH de
8,3; anotar cada minuto el volumen de solución alcalina consu-
mido.
Llevar los datos obtenidos a un sistema de ejes de coordenadas,
indicando en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros
de solución alcalina necesarios para mantener constante el pH.
Deberáobtenerseunagráficalineal.
Lasuspensióndelipasamencionadaesunasuspensiónenaguaal
1/1000 (p/p). Deberá emplearse en cada ensayo una cantidad
suficiente de esta suspensión, de modo que en 4 o 5 minutos se
consuma 1 ml de solución alcalina aproximadamente. Normal-
mentesenecesitande1a5mgdepolvo.
La unidad lipásica se define como la cantidad de enzima que
libera10µeqdeácidoporminuto.LaactividadAdelpolvoutili-
zado, medida en unidades lipásicas por mg, se calcula medianteestafórmula:
A¼V/C210
p
siendo:
V = volumen de solución de hidróxido sódico (5.19) consu-
midoporminuto(calculadoapartirdelagráfica),
p = peso,enmg,delamuestrasproblemadepolvo.
Nota2:Preparacióndelalipasa
En el comercio pueden encontrarse lipasas de actividad lipásica
satisfactoria. También esposible prepararlas en laboratorio dela
manera siguiente: tomar 5kg de páncreas fresco de cerdo, refri-
geradoa0ºC;eliminarlagrasasólidayeltejidoconjuntivoque
lorodean,ytriturarenunmolinodecuchillashastaobteneruna
pastafluida.Conunagitador(4.25)agitarlapastajuntocon2,5l
de acetona anhidra, durante 4-6 horas y después centrifugar.
Efectuartresextraccionesmásdelresiduoconelmismovolumen
deacetonaanhidra,dosextraccionesconunamezcladeacetonay
éteretílico1:1(V/V),ydosextraccionesconéteretílico,eneste
orden.
Desecar el residuo al vado durante 48 horas para obtener un
polvoestable,quedebealmacenarseenunrefrigerador.
Nota3:Es aconsejable en todos los casos determinar la composición de
losácidos grasostotales delamisma muestra,yaquelacompa-
raciónconladelosácidossituadosenlaposición2facilitará la
interpretacióndelascifrasobtenidas.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—35
▼B
Nota4:Portratarsedeunaceitelíquido,lahidrólisisseefectúaa37ºC.
No obstante, en el caso de la muestra problema se efectuará a
40 ºC a fin de que puedan examinarse las grasas con puntos de
fusióndehasta45ºC.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—36
▼B
ANEXOVIII
DETERMINACIÓNDELPORCENTAJEDETRILINOLEÍNA
1. OBJETO
Determinación ►C1delporcentaje detrilinoleína delosaceites vegetales
mediantecromatografíalíquidadealtaresolución ◄.
Lapresentenormadescribeunmétodoparaefectuarlaseparaciónydeter-
minación de la composición de los triglicéridos de los aceites vegetales
según su peso molecular y grado de insaturación ►C1expresado por ◄
sunúmeroequivalentedecarbonos(véaselanota1).
2. CAMPODEAPLICACIÓN
Lapresentenormaesaplicableatodoslosaceitesvegetalesquecontengan
triglicéridos de ácidos grasos de cadena larga. Este método es especial-
mente adecuado para detectar la presencia de pequeñas cantidades de
aceites semisecantes (ricos en ácido linoleico) en aceites vegetales cuyo
principal ácido graso insaturado sea el ácido oleico, como es el caso de
losaceitesdeoliva.
3. PRINCIPIO
Separación de los triglicéridos en función de su número equivalente de
carbonos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase
inversaeinterpretacióndeloscromatogramas.
4. APARATOS
4.1. Cromatógrafodelíquidosdealtaresoluciónconcontroltermostáticodela
temperaturadelacolumna.
4.2. Sistemadeinyecciónconunvolumende10µl.4.3. Detector:refractómetrodiferencial.Lasensibilidadentodalaescaladeberá
sercomomínimode10
−4unidadesdeíndicederefracción.
4.4. Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de
diámetro interior, rellena de partículas de sílice de 5 µm de diámetro con
un22-23%decarbonoenformadeoctadecilsilano(nota2).
4.5. Registradory/ointegrador.
5. REACTIVOS
Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de
elución deberán desgasificarse y podrán reciclarse varias veces sin que
elloafectealasseparaciones.
5.1. Cloroformo.5.2. Acetona.5.3. Acetonitrilo.5.4. Fase móvil: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarán para
obtenerlaseparacióndeseada;comenzarconunamezcla50:50).
5.5. Disolventedesolubilización:acetonaomezcladeacetona-cloroformo1:1.5.6. Triglicéridos dereferencia: puedenutilizarse bientriglicéridos comerciales
(tripalmitina, trioleína, etc.), en cuyo caso se reflejarán en un gráfico los
tiemposderetenciónfrentealnúmeroequivalentedecarbonos,alternativa-
menteuncromatogramadereferenciadelaceitedesoja(véanselasnotas3
y4ylasfiguras1y2).
6. PREPARACIÓNDELASMUESTRAS
Preparardelsiguientemodounasoluciónal5%delasmuestrasquevayan
a analizarse: pesar 0,5 ± 0,001 g de la muestra en un matraz aforado de
10mlyenrasarhasta10mlconeldisolventedesolubilización(5.5).
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Instalar el sistema cromatográfico. Bombear fase móvil (5.4) a razón de
1,5ml/mm para purgarelsistema completo. Esperar hastaque seobtenga1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—37
▼B
unalínea debaseestable. Inyectar 10µldelamuestrapreparada comose
indicaenelpunto6.
8. CÁLCULOYEXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Utilícese el método de normalización interna, es decir, considérese que la
suma de las áreas de los picos de los diferentes triglicéridos es igual a
100 %. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicérido mediante esta
fórmula:
%deltriglicérido=áreadelpico
sumadelasáreasdelospicos×100
Elresultadoseexpresaconundecimal.
Nota1:El orden de elución puede determinarse calculando el número
equivalentedecarbonos,queamenudovienedadoporlarelación
NEC=NC−2n,siendoNCelnúmerodecarbonosynelnúmero
de enlaces dobles; es posible calcularlo con una precisión mucho
mayor tomando en consideración el origen del enlace doble. Si
no,nlynlnsonelnúmerodeenlacesdoblesatribuiblealosácidos
oleico, linoleico y linolénico, respectivamente, el número equiva-
lentedecarbonospuedecalcularsemediantelarelaciónsiguiente:
NEC=NC−dono−dlnl−dlnnln
Loscoeficientesdo,dlydlnpuedencalcularsemediantelostriglicé-
ridosdereferencia.
En las condiciones que se especifican en el presente método, la
relaciónqueseobtengaserásimilaralasiguiente:
NEC=NC−[2,60no]−[2,35nl]−[2,17nln]
Nota2:Ejemplos: Lichrosorb(Merck)RP18Art50333;
Lichrosphere(Merck)100CH18Art50377osimilares.
Nota3:Algunos triglicéridos de referencia también permiten calcular la
resoluciónrespectoalatrioleínai:
α=TR′/TR′oleína
utilizandoeltiempoderetencióncorregidoTR ′=TR−TRdisol-
vente.
La representación gráfica del log αfrente a f (número de enlaces
dobles) permite determinar los valores de retención de todos los
triglicéridos de los ácidos grasos contenidos en los triglicéridos
dereferencia(véaselafigura2).
Nota4:Laeficaciadelacolumnadebepermitirsepararclaramenteelpico
de la LLL (trilinoleína) de los triglicéridos con tiempo de reten-
ciónpróximo.
Nota5:En el caso de los aceites vírgenes lampantes y de los aceites de
orujode oliva brutos,paraobtener una buena separación delpico
de la trilinoleína de los picos adyacentes o de posibles sustancias
interferentes, se debe purificar previamente el aceite según la
metodologíasiguiente:
Sellevaacabolaabsorciónde200 µldeaceite sindiluirenuna
columnita de sílice sólida para extracción de líquido (tipo SEP
PAKsilicacartridge-waterspart.no51900).
La elución de los triglicéridos se efectúa con 20 ml de hexano
anhidroparaHPLCenuntiempomáximode20segundos.
El producto eluido se seca en una corriente de nitrógeno y se
recoge con isopropanol o acetona (5 ml). Se inyectan entre 10 y
20µl en HPLC. Es necesario comprobar que la composición de
ácidosgrasosdelaceitesealamismaantesydespuésdelapurifi-
cación, dentro de los límites de error del método analítico
adoptado.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—38
▼M11
▼B
Figura1
Cromatogramadeunamuestradeaceite desoja
Nota:P: ácido palmítico; St: ácido esteárico; O: ácido oleico; L: ácido
linoleico;Ln:ácidolinolénico1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—39
▼B
Figura2
Representación gráficadellogalfafrenteaf(númerodeenlaces dobles)
Nota:La:ácidolaúrico;My:ácidomirístico;P:ácidopalmítico;St:ácido
esterárico;O:ácidooleico;L:ácidolinoleico;Ln:ácidolinolénico.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—40
▼B
ANEXOIX
PRUEBAESPECTROFOTOMÉTRICAENELULTRAVIOLETA
INTRODUCCIÓN
Lapruebaespectrofotométricaenelultravioletapuedeproporcionarindica-
ciones sobre la calidad de una materia grasa, suestado de conservación y
lasmodificacionesinducidasporlosprocesostecnológicos.
Lasabsorcionesenlaslongitudesdeondaindicadasenelmétodosedeben
a la presencia de sistemas diénicos y triénicos ►C1conjugados ◄. Los
valores de estas absorciones se expresan en extinción específica E1cm1%
(extinción de una solución de la materia grasa al 1 % en el disolvente
determinado, enunespesorde 1cm) queseexpresará convencionalmente
comoK,tambiéndenominadocoeficientedeextinción.
1. OBJETO
Elmétododescribeelprocedimientodeejecucióndelapruebaespectrofo-
tométricaenelultravioletadelasmateriasgrasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la
extinción de la solución a las longitudes de onda prescritas, respecto al
disolvente puro. A partir de los valores espectrofotométricos se calculan
lasextincionesespecíficas.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. Espectrofotómetroparamedidasdeextinciónenelultravioletaentre220y
360nm,conposibilidaddelecturaparacadaunidadnanométrica.
3.2. Cubetas de cuarzo, con tapadera, con paso óptico de 1 cm. Las cubetas,
llenasdeaguaodeotrodisolventeadecuado,nodebenpresentarentreellas
diferenciassuperioresa0,01unidadesdeextinción.
3.3. Matracesaforadosde25ml.
3.4. Columnadecromatografíade270mmdelongitudy35mmdediámetroen
lapartesuperior:de270mmdelongitudy10mmdediámetroenlaparte
inferior.
4. REACTIVOS
4.1. Isooctano (2,2,4-trimetilpentano) de calidad para espectrofotometría: debe
tener,respectoalaguadestilada,unatransmitanciadel60%comomínimo
a220nmydel95%comomínimoa250nm;o
— ciclohexano decalidad paraespectrofotometría: debe tener, respectoal
agua destilada, una transmitancia del 40 % como mínimo a 220 nm y
del95%comomínimoa250nm.
4.2. Alúmina básica para cromatografía en columna, preparada y controlada
comosedescribeenelapéndiceI.
4.3. n-Hexanoparacromatografía.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Lamuestradebeserperfectamentehomogéneayestarexentadeimpurezas
en suspensión. Los aceites líquidos a temperatura ambiente se filtran con
papel de filtro a una temperatura aproximada de 30 ºC, las grasas sólidas
se homogeneizan y se filtran a una temperatura superior en 10 ºC como
máximoasutemperaturadefusión.
5.2. Sepesanconprecisión0,25gaproximadamentedelamuestrapreparaday
se colocan en un matraz aforado de 25 ml, se completa con el disolvente
adecuado y se homogeneiza. La solución resultante debe estar perfecta-
mente clara. Si presenta opalescencia o turbidez, se filtrará rápidamente
conpapeldefiltro.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—41
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3. Se llena una cubeta con la solución obtenida y se miden las extinciones,
usando como referencia el disolvente empleado, a las longitudes de onda
comprendidas entre 232 y 276 nm. Los valores de extinción obtenidos
debenestarcomprendidosenelintervaloentre0,1y0,8;encasocontrario
es necesario repetir la medida utilizando soluciones más concentradas o
másdiluidassegúnelcaso.
5.4. Cuandosequieradeterminarlaextinciónespecíficadespuésdeltratamiento
conalúminaseprocederádelsiguientemodo:enlacolumnaparacromato-
grafía se introducen 30 g de alúmina básica en suspensión en hexano;
después de asentarse el absorbente se elimina el exceso de hexano, hasta
1cmaproximadamentesobreelnivelsuperiordelaalúmina.
Sedisuelven10gdemateria grasa,homogeneizada yfiltrada tal como se
describeenelpunto5.1,en100mldehexanoysevierteestasoluciónen
la columna. Se recoge el líquido eluido y se evapora totalmente el disol-
venteenvacíoaunatemperaturainferiora25ºC.
Con la materia grasa así obtenida se procede inmediatamente tal como se
indicaenelpunto5.2.
6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
6.1. Se expresan las extinciones específicas o coeficientes de extinción a las
diversaslongitudesdeonda,calculadascomosigue:
Kλ¼Eλ
c:e:
siendo:
Kλ= extinciónespecíficaalalongituddeondalambda,
Eλ= extinciónmedidaalalongituddeondalambda,
c = concentracióndeladisoluciónengpor100ml,
e = espesordelacubetaencm.
Losresultadosdebenexpresarsecondoscifrasdecimales.
6.2. La prueba espectrofotométrica del aceite de oliva según el método oficial
de los Reglamentos de la CEE requiere la determinación de la extinción
específica, en solución en isooctano, a las longitudes de onda de 232 y
270nm,yladeterminaciónde ∆Edefinidocomo:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
donde Kmes la extinción específica a la longitud de onda m, longitud de
ondademáximaabsorciónalrededorde270nm.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—42
▼B
APÉNDICEI
Preparacióndelaalúminaycontroldesuactividad
A.1.1. Preparación de la alúmina
En un recipiente quepueda cerrarse herméticamente se echa la alúmina
previamentedesecadaenhornoa380-400ºCdurantetreshoras,seañade
aguadestiladaenunaproporciónde5mlpor100gdealúmina,secierra
rápidamente el recipiente, se agita repetidas veces y se deja reposar
durante12horascomomínimoantesdeluso.
A.1.2. Control de la actividad de la alúmina
Se prepara una columna para cromatografía con 30 g de alúmina. Se
operatalcomosedescribeenelapartado5.4.Sehacepasaratravésde
lacolumnaunamezclaformadapor:
— 95 % de aceite de oliva virgen, con extinción específica a 268 nm
menorque0,18,
— 5 % de aceite de cacahuete tratado con tierras decolorantes en el
procesoderefinado,conunaextinciónespecíficaa268nmmayoro
igualque4.
Si, después del paso por la columna, la mezcla presenta una extinción
específica a 268 nm mayor que 0,11, la alúmina es aceptable; en otro
casosedebeaumentarelporcentajedehidratación.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—43
▼B
APÉNDICEII
Ajustedelespectrofotómetro
A.2. Elaparatodeberevisarseperiódicamente(porlomenoscadaseismeses)
tantoenloqueserefierealaconformidaddelalongituddeondacomoa
laexactituddelarespuesta.
A.2.1. Elcontroldelarespuestadelalongituddeondapuedehacersemediante
unalámparadevapordemercurioomediantefiltrosadecuados.
A.2.2. Para controlar la célula fotoeléctrica y el fotomultiplicador se procede
comosigue:sepesan0,2gdecromatopotásicodecalidadparaespectro-
fotometría, se disuelven, en un matraz aforado de 1000 ml, en una
solución de hidróxido potásico 0,05 N y se completa hasta el enrase.
De la solución obtenida se toman exactamente 25 ml, se transvasan a
unmatrazaforadode500mlysecompletahastaelenraseconlamisma
solucióndehidróxidopotásico.
Semidelaextincióna275nmdelasoluciónasíobtenida,utilizandola
solucióndehidróxidopotásicocomoreferencia.Laextinciónmedidaen
cubetade1cmdeberáserde0,200±0,005.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—44
▼B
ANEXOX«A»
ANÁLISISDELOSÉSTERESMETÍLICOSDELOSÁCIDOSGRASOS
MEDIANTECROMATOGRAFÍADEGASES
1. OBJETO
El presente ►C1método ◄proporciona orientaciones generales para
determinar, mediantecromatografía degasesconcolumnaderellenoo
capilar, la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de
ésteresmetílicosdeácidosgrasosobtenidosconarregloalAnexoXB.
Elmétodonoesaplicablealosácidosgrasospolimerizados.
2. REACTIVOS
2.1.Gasportador
Gas inerte (nitrógeno, helio, argón, hidrógeno, etc.), perfectamente
desecadoyquecontengamenosde10mg/kgdeoxígeno.
Nota1:El hidrógeno, que sólo se emplea como gas portador en las
columnas capilares, puede duplicar la velocidad del análisis,
peroespeligroso.Existendispositivosdeseguridad.
2.2. Gasesauxiliares
2.2.1. Hidrógeno(pureza ≥99,9%)exentodeimpurezasorgánicas.
2.2.2. Aireuoxígeno,exentodeimpurezasorgánicas.
2.3.Patróndereferencia
Una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos puros, o los ésteres
metílicos de una grasa de composición conocida y, preferentemente,
similaraladelamateriagrasaobjetodeanálisis.
Deberáevitarselaoxidacióndelosácidosgrasospoliinsaturados.
3. APARATOS
Las normas que figuran a continuación se refieren al equipo ordinario
para cromatografía de gases, utilizando columnas de relleno y/o capi-
lares y un detector de ionización de llama. Podrá utilizarse cualquier
aparatocuyaeficaciayresoluciónseajustenalodispuestoenelpunto
4.1.2.
3.1.Cromatógrafodegases
Elcromatógrafodegasesconstarádelossiguienteselementos:
3.1.1. Sistema de inyección
Utilizarunsistemadeinyección:
a) con columnas de relleno, con un espacio muerto lo más pequeño
posible (en este caso, el sistema de inyección podrá calentarse a
una temperatura que sea entre 20 y 50 ºC superior a la de la
columna);o
b) concolumnascapilares;enestecaso,elsistemadeinyecciónestará
especialmente diseñado para poder operar con esa clase de
columnas; podrá utilizarse un inyector con división de flujo o un
inyector«oncolumn».
Nota2:En ausencia de ácidos grasos con menos de 16 átomos de
carbono,podráutilizarseuninyectordeagujamóvil.
3.1.2. Horno
Elhornopodrácalentarlacolumnaa260ºCcomomínimoymantener
dichatemperaturaconunaoscilaciónmáximade1ºC,siseempleauna
columnaderelleno,yde0,1ºC,siseempleaunacolumnacapilar.Este
último requisito es especialmente importante si se utiliza una columna
desílicefundida.
Serecomiendaemplearentodosloscasosunsistemadecalentamiento
programado, sobre todo en el caso de ácidos grasos con menos de 16
átomosdecarbono.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—45
▼B
3.1.3. Columna de relleno
3.1.3.1. Columna de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(esdecir,vidriooaceroinoxidable)ydelasdimensionessiguientes:
a) Longitud: de 1 a 3 m. Con ácidos grasos de cadena larga (más de
C20) es conveniente utilizar una columna relativamente corta. Para
el análisis de ácidos con 4 o 6 átomos de carbono se recomienda
unacolumnade2m.
b) Diámetrointerior:de2a4mm.
Nota3:Si hay componentes poliinsaturados con más de tres enlaces
dobles,puedendescomponerseenunacolumnadeaceroinoxi-
dable.
Nota4:Puedeutilizarseunsistemacondoblecolumnaderelleno.
3.1.3.2. Relleno,queincluyalossiguienteselementos:
a)Soporte:tierra de diatomeas lavada con ácido y silanizada, u otro
soporte inerte adecuado, con un margen estrecho de tamaño de
grano (margen de 25 µm, entre 125 y 200 µm); el tamaño medio
degranoestaráenfuncióndeldiámetrointeriorydelalongitudde
lacolumna.
b)Faseestacionaria: líquidopolardetipopoliéster(porejemplo:poli-
succinato de dietilenglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato
de etilenglicol, etc.), cianosiliconas o cualquier otro líquido que
permita efectuar la separación cromatográfica exigida (véase el
punto 4). La fase estacionalia deberá constituir del 5 % (m/m) al
20 % (m/m) del relleno. Para algunas separaciones podrá utilizarse
unafasefijanopolar.
3.1.3.3. Acondicionamientodelacolumna
Estandolacolumnadesconectadadeldetector,siesposible,calentarel
hornogradualmentehasta185ºCyhacerpasaratravésdelacolumna
recién preparada una corriente de gas inerte a razón de 20-60 ml/min
durante 16 horas como mínimo a la temparatura citada y, a continua-
ción,alatemperaturade195ºCdurante2horasmás.
3.1.4. Columna capilar3.1.4.1. Tubo de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(generalmente, vidrio o sílice fundida). El diámetro interior estará
comprendido entre 0,2 y 0,8 mm. La superficie interior se someterá a
un tratamiento adecuado (por ejemplo, preparación de la superficie,
inactivación) antes de introducir el recubrimiento de fase fija. En la
mayoríadecasos,essuficienteunalongitudde ►
C125m◄.
3.1.4.2. Faseestacionaria detipopoliglicol [poli(etilenglicol) 20000],poliéster
(polisuccinato de butanodiol) o polisiloxano polar (cianosiliconas),generalmente. Son apropiadas las columnas de fase químicamente
ligada.
Nota5:Existe el riesgo de que los polisiloxanos polares dificulten la
identificaciónyseparacióndelácidolinolénicoydelosácidos
C
20.
Elespesordelafaseestarácomprendidoentre0,1y0,2µm.
3.1.4.3. Montajeyacondicionamientodelacolumna.
Observar las precauciones normales de montaje de columnas capilares
(esdecir,instalacióndelacolumnaenelhorno,elecciónymontajede
las juntas (estanqueidad), conexión de los extremos de la columna al
inyector y al detector (reducción de los espacios muertos). Colocar la
columna bajo un flujo de gas portador [por ejemplo, 0,3 bar (30 kPa)
paraunacolumnade ►C125m◄delongitudy0,3mmdediámetro
interior].
Acondicionar la columna programando el gradiente detemperatura del
hornoa3ºC/minapartirdelatemperaturaambientehastaalcanzaruna
temperatura10ºCinferiorallímite dedescomposicióndelafaseesta-
cionaria.Mantenerelhornoaesatemperaturadurante1horahastaque
seestabilicelalíneadebase.Restablecerlatemperaturade180ºCpara
trabajarencondicionesisotérmicas.
Nota6:En el comercio pueden obtenerse columnas adecuadas previa-
menteacondicionadas.
3.1.5. Detector que puede calentarse a una temperatura superior a la de la
columna.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—46
▼B
3.2.Jeringa
Tendráunacapacidadmáximade10µlyestarágraduadaen0,1µl.
3.3.Registrador
Siseemplealacurvadelregistradorparacalcularlacomposicióndela
mezcla analizada, se necesita un registrador electrónico de alta preci-
sióncompatible conlosaparatosutilizados.Elregistradordeberátener
lassiguientescaracterísticas:
a) tiempoderepuestainferiora1,5sy,preferiblemente,inferiora1s
(eltiempo derepuesta eseltiempo quetarda lapluma registradora
enpasarde0a90%despuésdelaintroduccióninstantáneadeuna
señaldel100%);
b) anchodelpapel:20cmcomomínimo;
c) velocidaddelpapel:ajustableavalorescomprendidosentre0,4cm/
miny2,5cm/min.
3.4.Integrador
La utilización de un integrador electrónico permite efectuar cálculos
rápidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibi-
lidad adecuada y la corrección de la desviación de la línea de base
debesersatisfactoria.
4. PROCEDIMIENTO
Lasoperacionesdescritasenlospuntos4.1a4.3sólosonválidassise
empleaundetectordeionizacióndellama.
Comoalternativa puede emplearse uncromatógrafo degasesconcata-
rómetro(cuyofuncionamientosebasaenelprincipiodeloscambiosde
conductividadtérmica).Enesecaso,lascondicionesdeensayodeberán
modificarsecomoseindicaenelpunto6.
4.1.Condicionesdeensayo
4.1.1. Determinacióndelascondicionesoperativasóptimas
4.1.1.1. Columnaderelleno
Al establecer las condiciones de ensayo deberán tenerse en cuenta las
variablessiguientes:
a) longitudydiámetrodelacolumna;
b) composiciónycantidaddelafaseestacionaria;
c) temperaturadelacolumna;
d) flujodelgasportador;
e) resoluciónexigida;
f) tamaño de la muestra problema, determinado de modo que el
conjuntodeldetectoryelelectrómetrodéunarespuestalineal;
g) duracióndelanálisis.
Como norma general, las cifras de las tablas 1 y 2 permitirán obtener
los resultados deseados, es decir, al menos 2000 platos teóricos por
metro de longitud de columna en el caso del estearato de metilo, y su
eluciónen15minutosaproximadamente.
Cuandoelaparatolopermita,latemperaturadelinyectordeberáserde
200ºCaproximadamenteyladeldetectordeberáserigualosuperiora
ladelacolumna.
Porlogeneral,larazónentrelavelocidaddeflujodelhidrógenosumi-
nistradoaldetectordeionización dellama yladelgasportadoroscila
entre 1:2 y 1:1, en función del diámetro de la columna. El flujo del
oxígenoesde5a10vecessuperioraldelhidrógeno.
Tabla1
Diámetrointeriordelacolumna
mmFlujodelgasportador
ml/min
21 5 a 2 5
32 0 a 4 0
44 0 a 6 01991R2568—ES—22.05.2002—019.001—47
▼B
Tabla2
Concentracióndelafasefija
%(m/m)Temperaturadelacolumna
ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Columnacapilar
Laspropiedadesdeeficacia ypermeabilidad delascolumnascapilares
implican que la separación de los constituyentes y la duración del
análisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la
columna. Por lo tanto, para optimizar las condiciones operativas será
necesario manipular este parámetro (o, lo que es más sencillo, la
presiónencabezadecolumna)segúnsedeseemejorarlasseparaciones
oefectuarunanálisisrápido.
4.1.2. Determinación del número de platos teóricos (eficacia) y de la resolu-
ción
(Véaselafigura1)Efectuarelanálisisdeunamezcladeestearatodemetiloydeoleatode
metilo(porejemplo,ésteresmetílicosdemantecadecacao)enpropor-
cionesaproximadamenteequivalentes.
Escoger la temperatura de la columna y el flujo del gas portador de
maneraqueelmáximodelpicodelestearatodemetiloseregistreapro-
ximadamente 15 minutos después del pico del disolvente. Utilizar una
cantidadsuficientedelamezcladeésteresmetílicos,demaneraqueel
picodelestearatodemetiloseeleveatrescuartosaproximadamentede
laescalacompleta.
Calcular el número «n» de platos teóricos (eficacia) mediante la
siguientefórmula:
n¼16
dr1
a1/C20/C21
2
ylaresolución«R»mediantelasiguientefórmula:
R¼2∆
a1þa2
siendo:
dr1= distanciaenmm,desdeeliniciodelcromatogramahastael
máximodelpicodelestearatodemetilo,
a1ya2= anchura,enmm,delospicosdelestearato demetiloydel
oleato de metilo, respectivamente, medida entre lospuntos
de intersección de las tangentes en los puntos de inflexión
delacurvaconlalíneadebase,
∆= distancia, en mm, entre los dos máximos de los picos del
estearatodemetiloydeloleatodemetilo,
yelíndicederesolución«lr»mediantelasiguientefórmula:
a
b
siendo:
a = alturadelpicomáspequeño,medidaapartirdelalíneadebase;
b = altura del punto más bajo del valle comprendido entre los dos
picosadyacentes,medidaapartirdelalíneadebase.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—48
▼M2
▼B
Figura1
Cromatogramaparadeterminarelnúmerodeplatosteóricos(eficacia)ylareso-
lución
Se establecerán unas condiciones de análisis que permitan obtener almenos2000platos teóricos pormetro de longitud decolumna para el
estearatodemetiloyunaresoluciónde1,25comomínimo.
4.2.Muestraproblema
Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 µl a 2 µl de la solución de ésteres
metílicos preparados con arreglo al Anexo X B e inyectarlos en la
columna.
Enelcasodeésteresnodisueltos,prepararunasoluciónde100mg/ml
aproximadamente en heptano de calidad para cromatografía e inyectar
de0,1µla1µldeestasolución.
Sisólosedeseandetectarloscomponentespresentesencantidadesmuy
pequeñas,sepodráaumentareltamañodelamuestra(hasta10veces).
4.3.Análisis
Comonormageneral,lascondicionesdeensayosonlasqueseespeci-
ficanenelpunto4.1.1.
Noobstante,cuandosedeterminanácidosconmenosde12átomosde
carbono es posible operar a menor temperatura de columna, mientras
que cuando se determinan ácidos grasos con más de 20 átomos de
carbono es posible operar a una temperatura mayor. Aveces se puede
utilizar en los dos casos anteriores un sistema de programación de
temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene ésteres metílicos de
ácidosgrasosconmenosde12átomosdecarbono,inyectarlamuestra
a 100 ºC (o a 50 — 60 ºC si hay ácido butírico) y elevar inmediata-
mentelatemperatura arazónde4—8ºC/min hastaalcanzar elnivel
deseado.Enalgunoscasosesposiblecombinarambosprocedimientos.
Traselcalentamientoprogramado,secontinúalaeluciónatemperatura
constantehastaquetodosloscomponentessehayeneluido.Sielinstru-
mentonopuedeefectuar uncalentamiento programado,seoperaados
temperaturasfijascomprendidasentre100y195ºC.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—49
▼B
Siesnecesario,serecomiendaqueseefectúeunanálisiscondosfases
fijas de diferente polaridad para comprobar la ausencia de picos
«ocultos»,porejemplo encasodepresencia simultánea deC18:3yC20:0oC18:3yC18:2conjugados.
4.4.Preparacióndelcromatogramaylasgráficasdereferencia
Analizar la mezcla patrón de referencia (2.3) aplicando las mismas
condiciones de ensayo que a la muestra y medir los tiempos o las
distancias de retención de los ácidos grasos que la componen. Repre-
sentar gráficamente en papel semilogarítmico, para cualquier grado de
insaturación, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retención en
funcióndelnúmerodeátomosdecarbono.Encondicionesisotérmicas,
lasgráficasdelosésteresdecadenalinealconelmismogradodeinsa-
turación deben formar líneas rectas. Dichas líneas rectas deben ser
aproximadamenteparalelas.
Deben evitarse las condiciones que propicien la existencia de «picos
ocultos»,esdecir,unaresolucióninsuficiente paraseparar doscompo-
nentes.
5. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
5.1.Análisiscualitativo
Identificarlospicosdelestearatodemetilodelamuestraapartirdelos
gráficoscitadosenelpunto4.4,siesnecesarioporinterpolación.
5.2.Análisiscuantitativo
5.2.1. Determinación de la composición
Salvo en casos excepcionales, utilizar el método de normalización
interna, es decir, partir del principio de que todos los componentes de
la muestra están representados en el cromatograma, de manera que eltotal delasáreas situadasdebajo decadopico representa el100%de
losconstituyentes(elucióntotal).
Si el equipo incluye un integrador, utilizar las cifras que éste propor-
cione. En caso contrario, determinar el área situada debajo de cada
picomultiplicandolaalturadelpicoporelanchoalamitaddelaaltura
y,cuandoseanecesario, tomar enconsideración lasatenuaciones utili-
zadasduranteelregistro.
5.2.2. Método de cálculo
5.2.2.1. Casogeneral
Calcular el contenido de un componente dado (i) (expresado como
porcentaje en masa de ésteres metílicos), mediante la determinación
del porcentaje que representa el área de su pico en relación con la
sumadelasáreasdetodoslospicos,aplicandolafórmulasiguiente:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: áreadelpicocorrespondientealcomponentei.
ΣA: sumadelasáreasdetodoslospicos.
Expresarelresultadoconunacifradecimal.
Nota7:En este caso general se considera que el resultado del cálculo
basado en las áreas relativas representa el porcentaje en peso.
Paraloscasosenquenoesválidaestaconsideración,véaseel
punto5.2.2.2.
5.2.2.2. Utilizacióndefactoresdecorrección
Enalgunoscasos,porejemploenpresenciadeácidosgrasosconmenos
de 8 átomos de carbono o de ácidos con grupos secundarios, si se
utilizan detectores de conductividad térmica o si es necesario alcanzar
mayor nivel de exactitud, deben aplicarse factores de corrección para
convertir los porcentajes de las áreas de los picos en porcentajes en
pesodeloscomponentes.
Determinar los factores de corrección con un cromatograma obtenido
delanálisisdeunamezcladereferenciadeésteresmetílicosdecompo-1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—50
▼B
sición conocida en condiciones de ensayo idénticas a las empleadas
paraelanálisisdelamuestra.
La fórmula que se aplicará a la muestra de referencia para obtener el
porcentajeenpesodelcomponenteieslasiguiente:
mi
Σm/C2100
siendo:
mi= pesodelcomponenteidelamuestradereferencia,
Σm = sumadelospesosdelosdiversoscomponentesdelamuestra
dereferencia.
Apartirdelcromatogramadelamuestradereferencia(4.4)calcularel
porcentaje(área/área)delcomponenteidelsiguientemodo:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: áreadelpicocorrespondientealcomponentei,
ΣA: sumadelasáreasdetodoslospicos.
Elfactordecorrecciónsecalculadelsiguientemodo:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Por lo general, los factores de corrección se expresan con relación a
KC16,demodoquelosfactoresrelativosseconviertenenlosiguiente:
K0
i¼Ki
KC16
En la muestra, el contenido de cada componente i, expresado como
porcentajeenpesodelosésteresmetílicos,eselsiguiente:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Expresarlosresultadosconunacifradecimal.
5.2.2.3. Utilizacióndepatróninterno
En algunos análisis (por ejemplo, cuando no se cuantifican todos los
ácidos grasos por estar presentes simultáneamente ácidos de 4 y 6
átomos de carbono y ácidos de 16 y 18 átomos de carbono, o cuando
es necesario determinar la cantidad absoluta de un ácido graso en la
muestra) es preciso utilizar un patrón interno. Se emplean con
frecuenciaácidosgrasosde5,15o17átomosdecarbono.Debedeter-
minarse,siesnecesario,elfactordecorreccióndelpatróninterno.
El porcentaje en peso del componente i, expresado como ésteres
metílicos,secalculamedianteestafórmula:
mp/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
p/C2Ap/C2100
siendo:
Ai: áreadelpicocorrespondientealcomponentei.
Ap: áreadelpicocorrespondientealpatróninterno.
K′i: factordecorreccióndelcomponentei(conrelaciónaKC16).
K′p: factordecorreccióndelpatróninterno(conrelaciónaKC16).
m: peso,enmg,delamuestra.
mp: peso,enmg,delpatróninterno.
Expresarlosresultadosconunacifradecimal.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—51
▼M2
6. CASO ESPECIAL DE DETERMINACIÓN DE LOS ISÓMEROS
TRANS
Es posible determinar el contenido de isómeros trans de los ácidos
grasos con un número de átomos de carbono comprendido entre 10 y
24porseparación delosésteresmetílicos, utilizando columnascroma-
tográficascapilaresconunapolaridadespecial.
6.1. Columna capilar de silicio de un diámetro interno comprendido entre
0,25mmy0,32mmyde50mdelongitud,recubiertadeunacapade
cianopropisilicona deunespesorcomprendidoentre0,1y0,3µm(tipo
SP2340,tipoSP2380,C.P.sil88,Silor10osimilar).
6.2. LosésteresmetílicossepreparansegúnelprocedimientoBdescritoen
el Anexo X «B». Las materias grasas con una acidez libre superior al
3 % deben neutralizarse previamente con arreglo al punto 6.1 del
AnexoVII.
6.3. Las condiciones generales de trabajo para la cromatografía en fase
gaseosasonlassiguientes:
— temperatura de la columna programada de 150º a 230 ºC (por
ejemplo, 165 ºC durante 15 minutos y a continuación un aumento
de5ºCporminutohastaalcanzar200ºC),
— temperaturadelinyector:250ºCsiseutilizaelsistemadeinyector
divisor o la temperatura inicial de la columna si se emplea el
sistema«oncolumn»,
— temperaturadeldetector:260ºC,— flujodelgasvector(helioehidrógeno):1,2ml/minuto.
La cantidad inyectada debe ser tal que, en las condiciones de sensibi-
lidad empleadas, la altura del pico correspondiente al éster metílico
delácidoaraquídicoseaigualosuperioral20%delfondodeescala.
6.4. La identificación de los diversos ésteres metílicos se efectúa compa-
rando los tiempos de retención con los de las mezclas de referencia
(talycomoseindicaenelpunto2.3).
Los ésteres de los ácidos grasos trans son eluidos antes que los
isómeros cis correspondientes. En la figura 2 se presenta un ejemplo
decromatograma.
Figura2
Cromatogramadegasestiporelativoaladeterminacióndelosisómerostransde
losácidosgrasosconcolumnacapilar
6.5. La eficacia de la columna determinada con arreglo al punto 4.1.2
deberá permitir una separación, conuníndice deresolución superior a
2,dedeterminadasparejascríticas,comolaformadaporelgrupodelos
ácidostransisoleicosyelpicodelácidooleico(transC18:1/cisC18:1).1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—52
▼M2
6.6. La proporción de los diversos ácidos grasos trans se calcula estable-
ciendo la relación entre la superficie del pico correspondiente y la
sumadelassuperficiesdetodoslospicospresentes.
Setomanenconsideraciónlosporcentajesdelosácidos:
— trans octadecenoicos (T 18:1), que en el Anexo I del presente
Reglamentofigurancomotaldeisómerostransoleicos,
— cis-trans y trans-cis octadecadienoicos [(CT/TC) 8:2], que en el
Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de isómeros
translinoleicos,
— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis octadecatrie-
noicos[(TCT+CCT+CTC+TCC)18:3],queenelAnexoIdel
presente Reglamento figuran como total de isómeros translinolé-
nicos.
Nota8:Teniendo en cuenta las características particulares de este
método,losresultadosdebendarsecondosdecimales.
►M27.◄CASOESPECIALDEUTILIZACIÓNDEUNCATARÓMETRO
(FUNCIONAMIENTO BASADO EN EL PRINCIPIO DE LOS
CAMBIOSDECONDUCTIVIDADTÉRMICA)
Para la determinación de la composición cualitativa y cuantitativa de
una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos también podrá utili-
zarse un cromatógrafo de gases provisto de un detector cuyo
funcionamientosebaseenelprincipiodeloscambiosdeconductividad
térmica (catarómetro). En esecaso, las condiciones establecidas en los
puntos3y4deberánmodificarsecomoseindicaenlatabla3.
Paraelanálisiscuantitativo,utilizarlosfactoresdecorreccióndefinidos
enelpunto5.2.2.2.
Tabla3
Variable Valor/condición
Columna Longitud:2a4m
Diámetrointerior:4mm
Soporte Tamañodegranoentre160y
200µm
Concentracióndelafaseestacio-
nariaDe15%a25%(m/m)
Gasportador Helioo,ensudefecto,hidrógeno,
conelmenorcontenidode
oxígenoposible
Gasesauxiliares Ninguno
Temperaturadelinyector De40a60ºCmásqueladela
columna
Temperaturadelacolumna De180a200ºC
Flujodelgasportador Normalmenteentre60y80ml/
min
Tamañodelamuestraproblema
inyectadaNormalmenteentre0,5y2µl
►M28.◄INFORMEDELANÁLISIS
En el informe del análisis seexpondrán losmétodos utilizados para la
preparación de los ésteres metílicos y para la realización del análisis
mediante cromatografía de gases, así como los resultados obtenidos.
Semencionarán,asimismo,cualesquiera procedimientosdetrabajoque
no se especifiquen en la presente norma internacional o que se consi-
deren facultativos, así como toda circunstancia que pueda haber
influidoenlosresultados.
El informe del análisis incluirá todos los datos necesarios para la
completaidentificacióndelamuestra.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—53
▼B
▼M19
ANEXOX«B»
PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS
GRASOS DEL ACEITE DE OLIVA Y DEL ACEITE DE ORUJO DE
OLIVA
Se recomiendan los dos métodos siguientes para la preparación de los ésteres
metílicos de losácidos grasos de los aceites de oliva y de losaceites de orujo
deoliva.
MétodoA: Transesterificación en frío con una solución metanólica de hidró-
xidopotásico.
MétodoB: Metilaciónencalienteconunasoluciónmetanólica demetilato de
sodio,seguidadeesterificaciónenmedioácido.
Seaplicaráunouotrométodosegúnelparámetroanalíticoquesevayaadeter-
minar y dependiendo de la categoría de aceite, tal como se indica a
continuación:
a) Determinacióndel ∆ECN42(diferenciaentreelcontenidorealyelcontenido
teóricoentriglicéridosconECN42):
— ElmétodoAseaplicaráalasmuestrasdeaceitesdetodaslascategorías
traspurificación delaceitepasándoloatravésdeunacolumnadegelde
sílice.
b) Determinacióndelacomposicióndeácidosgrasos
— El método A se aplicará directamente a las muestras de aceites de las
siguientescategorías:
— aceitesdeolivavírgenesconunaacidezlibreinferioral3,3%,
— aceitedeolivarefinado,— aceite de oliva (mezcla de aceites de oliva vírgenes y de aceite de
olivarefinado),
— aceitedeorujodeolivarefinado,— aceite de orujo de oliva (mezcla de aceites de oliva vírgenes y de
aceitedeorujodeolivarefinado).
— El método B se aplicará directamente a las muestras de aceites de las
siguientescategorías:
— aceitedeolivavirgenconunaacidezlibresuperioral3,3%,
— aceitedeorujodeolivacrudo.
c) Determinacióndelosisómeros transdelosácidosgrasos
— El método A se aplicará directamente a las muestras de aceites de las
siguientescategorías:
— aceitesdeolivavírgenesconunaacidezlibreinferioral3,3%,
— aceitedeolivarefinado,— aceite de oliva (mezcla de aceites de oliva vírgenes y de aceite de
olivarefinado),
— aceitedeorujodeolivarefinado,
— aceite de orujo de oliva (mezcla de aceites de oliva vírgenes y de
aceitedeorujodeolivarefinado).
— El método A se aplicará a las muestras de aceite de las categorías
siguientestraspurificacióndelaceitepasándoloatravésdeunacolumna
degeldesílice:
— aceitedeolivavirgenconunaacidezlibresuperioral3,3%,
— aceitedeorujodeolivacrudo.
PURIFICACIÓNDELASMUESTRASDEACEITE
Cuando proceda, las muestras se purificarán pasando el aceite a través de una
columna de gel de sílice, utilizando como disolvente de elución hexano/éter
dietílico(87:13,v/v)talcomosedescribeenelmétodoIUPAC2.507.
Como procedimiento alternativo puede recurrirse a la extracción en fase sólida
utilizandocartuchosdegeldesílice.Secolocauncartuchodegeldesílice(1g,
6ml)enunaparatodeeluciónenvacío,selavacon6mldehexanoysedeja
deaplicarelvacíoparaevitarquesesequelacolumna.Acontinuaciónseintro-
duceenlacolumnaunasolucióndeaceite(0,12gaproximadamente)en0,5ml
de hexano y se aplica el vacío para que la solución se introduzca en la sílice;
después se eluye con 10 ml de hexano/éter dietílico (87: 13 v/v) en vacío. Se
homogeneiza la totalidad de los eluidos y se divide en dos alícuotas similares.
Una alícuota se evapora hasta sequedad en un evaporador rotatorio a presión
reducida y a temperatura ambiente. El residuo se disuelve en 1 ml de heptano1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—54
▼M19
y la solución queda lista para el análisis de ácidos grasos porCG.La segunda
alícuotaseevaporayelresiduosedisuelveen1mldeacetonaparaelanálisis
delostriglicéridosmedianteHPLCsiesnecesario.
MÉTODOSPARALA PREPARACIÓNDE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE
LOSÁCIDOSGRASOS
1.Método A: Transesterificación en frío con una solución metanólica de
hidróxido potásico
1.1.Ámbitodeaplicación
Estemétodorápidoesaplicablealosaceitesdeolivayalosaceitesde
orujodeolivaconuncontenidoenácidosgrasoslibresinferioral3,3%.
Elhidróxidopotásiconoproducelaesterificación delosácidosgrasos
libres. Los ésteres etílicos de los ácidos grasos se transesterifican más
lentamentequelosglicéridosypuedequesólosemetilenparcialmente.
1.2.Principio
Losésteresmetílicosseformanportransesterificaciónconunasolución
metanólicadehidróxidopotásicocomofaseintermediaantesdequese
produzcalasaponificación(punto5delmétodoISO5509:2000,punto
5delmétodoIUPAC2.301).
1.3.Reactivos
Metanolconuncontenidoenaguaigualoinferioral0,5%(m/m).Heptanoparacromatografía.Hidróxido potásico, solución metanólica 2 N aproximadamente:
disolver11,2gdehidróxidopotásicoen100mldemetanol.
1.4.Material
Tubosderosca(5mldevolumen)contapónprovistodejuntadePTFEPipetasaforadasoautomáticasde2mly0,2ml.
1.5.Procedimiento
En un tubo de rosca de 5 ml pesar aproximadamente 0,1 g de la
muestra de aceite. Añadir 2 ml de heptano y agitar. Añadir 0,2 ml de
la solución metanólica 2 N de hidróxido potásico, poner el tapón
provisto de junta de PTFE, cerrar bien y agitar enérgicamente durante
30 segundos. Dejar reposar hasta que la parte superior de la solución
quede clara. Decantar la capa superior, que es la que contiene los
ésteres metílicos. La solución de heptano está lista para inyectarse en
el cromatógrafo. Es aconsejable mantener la solución en el frigorífico
hasta el momento de realizar el análisis cromatográfico. No se reco-
miendaguardarlasolucióndurantemásde12horas.
2.Método B: Metilación en caliente con una solución metanólica de
metilato de sodio, seguida de esterificación en medio ácido
2.1.Ámbitodeaplicación
Estemétodoesaplicable alosaceitesdeolivayalosaceitesdeorujo
deolivaconuncontenidoenácidosgrasoslibressuperioral3,3%.
2.2.Principio
Neutralización delosácidosgrasoslibresymetanólisis alcalina delos
glicéridos,seguidadeesterificacióndelosácidosgrasosenmedioácido
(punto4.2delmétodoIUPACn
o2.301).
2.3.Reactivos
— Heptanoparacromatografía,
— Metanolconuncontenidoenaguaigualoinferioral0,05%(m/m),— Metilatodesodio,soluciónmetanólica0,2N:disolver5gdesodio
en 1000 ml de metanol (puede prepararse a partir de soluciones
comerciales),
— Fenolftaleína,0,2%soluciónmetanólica,1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—55
▼M19
— Ácido sulfúrico, en solución metanólica 1 N: añadir 3 ml de ácido
sulfúricoal96%a100mldemetanol,
— Soluciónsaturadadeclorurosódicoenagua.
2.4.Material
— Matrazaforadode50ml,confondoplanoycuelloesmeriladolargo
yestrecho,
— Refrigerantedereflujo:refrigerantedeaire(de1mdelongitud)con
juntaesmerilada,
— Perlaspararegularlaebullición,
— Embudodecristal.
2.5.Procedimiento
Poner 0,25 g de la muestra de aceite en un matraz aforado de 50 ml,
concuelloesmerilado.Conayudadelembudo,añadir10mldelasolu-
ciónmetanólica demetilato desodio0,2Nylasperlaspararegularla
ebullición. Acoplar el refrigerante de reflujo, agitar y llevar a ebulli-
ción. La solución debería quedar límpida al cabo de unos 10 minutos.
La reacción está terminada prácticamente a los 15 minutos. Retirar elmatraz de la fuente de calor, esperar hasta que pare el reflujo, quitar
elrefrigeranteyañadirdosgotasdelasolucióndefenolftaleína.Añadir
unosmililitrosdeácidosulfúricoensoluciónmetanólica1Nhastaque
lasoluciónquedeincoloray,acontinuación,añadirunexcesode1ml.
Colocar el refrigerante y volver a llevar a ebullición durante unos 20
minutos. Retirar el matraz de la fuente de calor y enfriarlo en chorro
deagua.Quitarelrefrigerante,añadir20mldelasoluciónsaturadade
clorurosódicoyagitar.Añadir5mldeheptano,taparelmatrazyagitar
enérgicamentedurante15segundos.
Dejarreposarhastaquelasdosfasesseseparencompletamente.Añadir
de nuevo solución saturada de cloruro sódico hasta que la fase acuosa
alcancelaparteinferiordelcuellodelmatraz.Lacapasuperior,quese
encuentra en el cuello del matraz, es la que contiene los ésteres
metílicos. Esta solución está lista para inyectarse en el cromatógrafo
degases.
Precaución:LametilaciónconelmétodoBdeberealizarseencampana
extractora.
2.6.AlternativasalametilaciónsegúnelMétodoB
2.6.1.MétodoC
2.6.1.1. Principio
La materia grasa analizada se trata con solución metanólica de ácido
clorhídrico,enunaampollacerrada,a100ºC.
2.6.1.2. Material
— Ampolla de cristal grueso con una capacidad de unos 5 ml (altura
de40a45mm,diámetrode14a16mm).
— Pipetasaforadasde 1y2ml.
2.6.1.3. Reactivos
Solucióndeácidoclorhídricoen2%demetanol,preparadaapartirde
ácidoclorhídricogaseosoymetanolanhidro(nota1).
Hexanoparacromatografía.
Nota1:Puedenemplearse soluciones comerciales decloruro dehidró-
geno en metanol. En el laboratorio pueden prepararse
fácilmente pequeñas cantidades de ácido clorhídrico gaseoso
porsimpledesplazamientodelasolucióncomercial(p=1,18),
añadiendoalgunasgotasdeácidosulfúricoconcentrado.Comoel metanol muestra mucha avidez por el ácido clorhídrico, se
aconseja tomar las precauciones necesarias para la disolución
(porejemplo,introducirelgasatravésdeunpequeñoembudo
invertido cuyo borde roce la superficie del metanol). Pueden
prepararseconantelacióngrandescantidadesdesoluciónmeta-
nólica de ácido clorhídrico, ya que se conserva en perfectas
condiciones en la oscuridad dentro de frascos con tapones de
vidrio. Este reactivo puede asimismo prepararse disolviendo
clorurodeacetiloenmetanolanhidro.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—56
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2.6.1.4. Procedimiento
— Colocar en la ampolla de cristal 0,2 g de la materia grasa, previa-
mente desecada en sulfato de sodio y filtrada, y 2 ml de la
soluciónmetanólicadeácidoclorhídrico.Cerrarlaampolla.
— Sumergirlaampollaa100ºCdurante40minutos.— Enfriarlaampollaenchorrodeagua,abrirlayañadir2mldeagua
destiladay1mldehexano.
— Centrifugar y extraer la fase del hexano, que estará lista para ser
utilizada.
2.6.2.MétodoD
2.6.2.1. Principio
Lamateria grasaanalizada secalienta areflujoconmetanol, hexanoy
ácido sulfúrico. Los ésteres metílicos obtenidos se extraen con éter de
petróleo.
2.6.2.2. Material
— Tubo de ensayo de unos 20 ml de capacidad, con refrigerante de
reflujo de aire de aproximadamente 1 m de longitud, con junta
esmerilada.
— Pipetaaforadade5ml.
— Ampolladedecantaciónde50ml.— Probetasde10mly25ml.— Tubodeensayodefondocónicode15ml.
2.6.2.3. Reactivos
— Reactivo de metilación: metanol anhidro, hexano y ácido sulfúrico
concentrado(p=1,84)enlasiguienteproporción:75:25:1(v/v/v).
— Éterdepetróleo40-60ºC.— Sulfatosódicoanhidro.
2.6.2.4. Procedimiento
Introducir0,1gdeaceiteeneltubode20mlyañadir5mldelreactivo
demetilación.
AcoplarelrefrigerantedereflujoycalentaralbañoMaríaenebullición
durante30minutos(nota2).
Pasar cuantitativamente la mezcla a una ampolla de decantación de
50mlcon10mldeaguadestiladay10mldeéterdepetróleo.Agitar
enérgicamente y esperar a que se produzca la separación de las fases.
Separar la fase acuosa y lavar dos veces la capa etérea con 20 ml de
agua destilada. Añadir a la ampolla de decantación una pequeña
cantidad de sulfato sódico anhidro, agitar, dejar reposar unos minutos
yfiltrar,recogiendoelfiltradoenuntubodefondocónicode15ml.
Evaporar el disolvente al baño María haciendo pasar una corriente de
nitrógeno.
Nota2:Para controlar la ebullición, introducir una varita de vidrio en
eltuboylimitarlatemperaturadelbañoMaríaa90ºC.
3.Parámetros de precisión
LaevaluaciónestadísticadelaprecisióndelosmétodosAyBhasido
publicada por el Consejo Oleícola Internacional en su método COI/
T.20/Doc.n
o24.
RECOMENDACIONES PARA EL ANÁLISIS MEDIANTE CROMATO-
GRAFÍA DE GASES DE LOS ÉSTERES DE LOS ÁCIDOS GRASOS DEL
ACEITEDEOLIVAYDELACEITEDEORUJODEOLIVA
1.Procedimiento
El análisis mediante cromatografía de gases de soluciones de ésteres
grasosenhexanoserealizarásegúnlanormaISO5508,utilizandouna
columnacapilar(50mdelongitud×0,25o0,32mmdediámetrointe-
rior) impregnada con cianopropilsilicona, tal como se indica para la
determinación de los isómeros transde los ácidos grasos (COI/T.20/
Doc.no17).
Enlafigura1sepresentaelperfilcromatográficotípicodeunaceitede
orujodeolivaquecontieneésteresmetílicosyetílicosdeácidosgrasos
eisómerostransdeésteresmetílicos.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—57
▼M19
2.Cálculos
2.1. Paracalcularlacomposiciónenácidosgrasosyel ∆ECN42,sehande
tenerencuentalossiguientesácidosgrasos:
Mirístico(C14:0).
Palmítico (C16:0). Suma de las áreas de los picos correspondientes a
losésteresmetílicosyetílicos.
Palmitoleico(C16:1).Sumadelasáreasdelospicoscorrespondientesa
losisómeros ω9yω7deléstermetílico.
Heptadecanoico(C17:0).
Heptadecenoico(C17:1).
Esteárico(C18:0).Oleico (C18:1). Suma de las áreas de los picos correspondientes a los
isómeros ω9yω7deléstermetílico,delésteretílicoydelosisómeros
transdeléstermetílico.
Linoleico (C18:2). Suma de las áreas de los picos correspondientes a
losésteresmetílicosyetílicosyalosisómeros transdeléstermetílico.
Araquídico(C20:0).
Linolénico (C18:3). Suma de las áreas del éster metílico y de los
isómerostransdeléstermetílico.
Eicosenoico(C20:1).
Behénico(C22:0).
Lignocérico(C24:0).Elescualenonosetieneencuentaparacalculareláreatotal.
2.2. Para calcular el porcentaje de trans-C18:1 se utilizará el pico corres-
pondiente a los ésteres metílicos de este ácido graso. Para la suma
[trans-C18:2 +trans-C18:3], se sumarán todos los picos correspon-
dientes a los isómeros transde estos dos ácidos grasos. Para calcular
el área total se tendrán en cuenta todos los picos mencionados en 2.1
(véaseCOI/T.20/Doc.n
o17).
El cálculo del porcentaje de cada ácido graso se efectuará según la
siguientefórmula:%X=(ÁreaX×100)/(áreatotal)1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—58
▼M19
Figura1:Perfil cromatográfico deunaceite deorujode oliva,obtenido conel
método de metilación en frío. Los picos cromatográficos corresponden a los
ésteresmetílicos,exceptoaquellosenqueseindicaotracosa.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—59
▼B
ANEXOXI
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ►C1 DISOLVENTES ◄
HALOGENADOSVOLÁTILESENELACEITEDEOLIVA
1. PRINCIPIODELMÉTODO
Análisisporcromatografíaenfasegaseosasegúnlatécnicadelespaciode
cabeza(headspace).
2. EQUIPO
2.1. Cromatografíadegasescondetectordecapturadeelectrones(ECD).
2.2. Equipoparaespaciodecabeza (headspace).
2.3. Columnadecromatografíaenfasegaseosadevidriode2metrosdelargoy
2mmdediámetro,faseestacionaria.
OV101al10%impregnadoencromosorbW-AW-DMCS(tierradediato-
meascalcinadalavadaconácidoysilanizado(80—100Mesh).
2.4. Gas portador y gas auxiliar: nitrógeno para cromatografía de gases de
purezaadecuadaparaladetecciónporcapturadeelectrones.
2.5. Frascosde cristal de 10 a 15 ml provistosde septum de teflón y con una
cápsuladealuminioconunorificioparatomademuestrasconjeringa.
2.6. Pinzascapsuladoraparacerrarherméticamente.2.7. Jeringaparagasesde0,5y2ml.
3. REACTIVOS
►
C1Disolventes ◄halogenados con una pureza apropiada para su uso
encromatografíaenlafasegaseosa.
4. PROCEDIMIENTODEANÁLISIS
4.1. Pesar con exactitud unos 3 g de aceite en un frasco de cristal (no reutili-
zable), tapar el frasco de manera que quede cerrado herméticamente.
Introducir el frasco en un baño con termostato a 70 ºC durante 1 hora.
Extraer con precisión, por medio de una jeringa, un volumen de 0,2 a
0,5 ml del espacio de cabeza. Inyectarlo en la columna del cromatógrafo
degasesconlassiguientescondiciones:
temperaturainyector:150ºC
temperaturacolumna:70—80ºC
temperaturadetector:200—250ºC
Podránutilizarseotrastemperaturassiemprequelosresultadosseanequiva-
lentes.
Lainyecciónsepuederealizarconelequipoparaespaciodecabeza.
4.2. Soluciones de referencia. Preparar soluciones patrón utilizando aceite de
oliva refinado sin trazas de ►C1disolventes ◄con concentraciones en
hidrocarburos halogenados de 0,05 a 1 ppm(m g/kg) según el contenido
supuestodelamuestra.Paraprepararlasolucióndereferencia,siesnece-
sariodiluirpreviamenteelhidrocarburohalogenadopatrón,puedeutilizarse
pentano.
4.3. Cuantificación. Se efectúa por cálculo mediante la relación de áreas o
alturas del pico de la muestra y de la solución patrón cuya concentración
sea la más próxima a la de la muestra. Si la desviación es superior al
10 %, será necesario volver a hacer el análisis, comparándolo con una
nueva solución patrón de concentración tal que se ajuste a la desviación
relativaantesmencionada.Elcontenidoseestableceráefectuandolamedia
devariasinyecciones.
4.4. Expresióndelosresultados.Losresultadosseexpresaránenppm(mg/kg).
Ellímitededeteccióndelmétodoesde0,01mg/kg.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—60
▼M19
ANEXOXII
VALORACIÓN ORGANOLÉPTICA DE LOS ACEITES DE OLIVA
VÍRGENES
1. OBJETOYÁMBITODEAPLICACIÓN
El presente método tiene por finalidad establecer los criterios necesarios
para la valoración de las características organolépticas del aceite de oliva
virgensegúnsedefineenelpunto1delanexodelReglamentono136/66/
CEE,ydescribirlasnormasparasuclasificaciónenesesentido.
El método descrito sólo es aplicable a la clasificación de los aceites de
oliva vírgenes, en función de la existencia del atributo «frutado» y de la
intensidad de los defectos, determinados por un grupo de catadores selec-
cionadosyentrenados,constituidoenpaneldeconformidadconelpunto4.
2. ASPECTOSGENERALES
Paraelvocabulariogeneraldebase,lasaladedegustación,lametodología
generalylacopadecatadelosaceites,serecomiendaajustarsealaspres-
cripcionesdelConsejoOleícolaInternacional.
3. VOCABULARIOESPECÍFICO3.1.Atributospositivos
Frutado:conjuntodesensacionesolfativas,dependientesdelavariedadde
oliva y características del aceite procedente de frutos sanos y frescos,
verdesomaduros,percibidoporvíadirectaoretronasal.
Amargo: gusto característico del aceite obtenido a partir de las aceitunas
verdesoenenvero.
Picante: sensación táctil de picor, característica de los aceites producidos
eniniciodecampaña,principalmentedeaceitunastodavíaverdes.
3.2.Atributosnegativos
Atrojado: flavor característico del aceite obtenido a partir de aceitunas
amontonadasenavanzadogradodefermentaciónanaerobia.
Moho-humedad : flavor característico del aceite obtenido a partir de acei-
tunas en las que se han desarrollado abundantes hongos y levaduras por
haberpermanecidoalmacenadasconhumedaddurantevariosdías.
Borras:flavorcaracterísticodelaceitequehapermanecidoencontactocon
loslodosdedecantaciónentrujalesydepósitos.
Avinado-avinagrado : flavor característico de determinados aceites que
recuerda al vinoo el vinagre. Se debe fundamentalmente a un proceso de
fermentacióndelasaceitunasquedalugaralaformacióndeácidoacético,
acetatodeetiloyetanol.
Metálico:flavorquerecuerdaalosmetales,característicadelaceitequeha
permanecido mucho tiempo en contacto con superficies metálicas durante
losprocesosdemolienda,batido,prensadooalmacenamiento.
Rancio:flavordelosaceitesquehansufridounprocesodeoxidación.
Cocido o quemado : flavor característico de los aceites, originada por un
calentamientoexcesivoy/oprolongadodurantesuobtención,especialmente
durante el termobatido de la pasta, si éste se ha realizado en condiciones
térmicasinadecuadas.
Heno-madera:flavorcaracterístico dedeterminadosaceitesprocedentesde
aceitunassecas.
Basto:sensaciónbuco-táctildensaypastosaproducidaporalgunosaceites.
Lubricante:flavorquerecuerdaaldelgasóleo,lagrasaoelaceitemineral.
Alpechín:flavoradquiridoporelaceitecomoconsecuenciadeuncontacto
prolongadoconlasaguasdevegetación.
Salmuera: flavor del aceite obtenido a partir de aceitunas conservadas en
salmuera.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—61
▼M19
Esparto:flavorcaracterísticodelaceiteobtenidoapartirdeaceitunaspren-
sadasencapachosnuevosdeesparto.Puedeserdiferentesegúnsetratede
capachosfabricadosconespartoverdeoconespartoseco.
Tierra:flavordelaceiteobtenidoapartirdeaceitunasrecogidascontierra,
embarradasynolavadas.
Gusano: flavor del aceite obtenido a partir de aceitunas fuertemente
atacadasporlarvasdelamoscadelolivo( BactroceraOleae ).
Pepino:flavordelaceitecaracterísticodeunenvasadoherméticoexcesiva-
menteprolongado,especialmenteenrecipientesdehojalata,queseatribuye
alaformaciónde2-6nonadienal.
4. PANELDECATADORES
ElpaneldeberásernombradoporelEstadomiembroycomponersedeun
jefedepanelyunnúmerodecatadorescomprendidoentreochoydoce.No
obstante, el númerode catadores para lacampaña 2001/02 podráserinfe-
rioraocho.
El jefe del panel deberá haber recibido una sólida formación y ser un
avezadoexpertoenlosdiferentestiposdeaceitedeoliva.Seráresponsable
delpanel,desuorganizaciónyfuncionamientoydelapreparación,codifi-
cación y presentación de las muestras a los catadores, así como de la
compilacióndelosdatosysutratamientoestadístico.
El jefe del panel seleccionará a los catadores y supervisará su entrena-
miento y actuación profesional para garantizar que se mantienen en un
niveldeaptitudadecuado.
Los catadores de los controles organolépticos del aceite de oliva deberán
ser seleccionados y entrenados en función de su habilidad para distinguir
entremuestrassimilares,conformealoestablecido enlaguíadelConsejo
Oleícola Internacional para la selección, entrenamiento y control de los
catadorescualificadosdeaceitedeolivavirgen.
Los paneles deberán comprometerse a participar en las valoraciones orga-
nolépticas que se programen en el ámbito nacional, comunitario o
internacional para el control periódico y la armonización de los criterios
de percepción. Además, deberán presentar anualmente al Estado miembro
interesado toda la información que éste solicite sobre la composición del
paneleindicarleelnúmerodevaloracionesquehayanrealizadoencalidad
depanelautorizado.
5. PROCEDIMIENTODEVALORACIÓNORGANOLÉPTICAYCLASIFI-
CACIÓN
5.1.Utilizacióndelafichadecataporelcatador
En el apéndice A del presente método figura el modelo de ficha de cata
quedebenemplearloscatadores.
Cadaunodeloscatadoresintegrantesdelpaneldeberáolery,actoseguido,
degustar(1) el aceite sometido a valoración, contenido en la copa de cata,
con el fin de analizar las percepciones olfativas, gustativas, táctiles y
quinestésicas. Acontinuación, deberá consignarenlaficha decata quese
pondrá a su disposición la intensidad con la que percibe cada uno de los
atributosnegativosypositivos.
Encasodequesepercibanatributosnegativosnoindicadosenlafichade
cata, deberán consignar en el apartado «Otros», empleando los términos
que los describan con mayor precisión de entre los definidos en el punto
3.2delpresentemétodo.
5.2.Utilizacióndelosdatosporeljefedepanel
Eljefedepaneldeberárecogerlasfichasdecatacumplimentadasporcada
unodeloscatadores,controlarlasintensidadesatribuidas,y,sicomprueba
algunaanomalía,solicitaralcatadorquerevisesufichadecatay,encaso
necesario,querepitalaprueba.
Eljefedepanelpuedeintroducirlosdatosdecadacatadorenunprograma
informáticoconformealmétododecálculoestadísticodelamedianaindi-
cadoenelapéndiceB.Laintroduccióndedatosparacadamuestradeberá
realizarse mediante una matriz compuesta de diez columnas correspon-1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—62
(1) Podrá abstenerse de la degustación cuando aprecie algunos atributos negativos suma-
menteintensos,circunstanciaexcepcional quedeberáindicarenlafichadecata.
▼M19
dientesalosdiezatributossensorialesydenlíneascorrespondientesalos
nmiembrosdelpaneldecata.
Cuando al menos el 50 % del panel inscriba un atributo negativo en el
apartado«Otros»,eljefedepaneldeberáprocederalcálculodelamediana
deesteatributoyalaclasificacióncorrespondiente.
Enelcasodelosanálisisefectuadosapropósitodeloscontrolesdeconfor-
midad con las normas o de los análisis contradictorios, el jefe de panel
deberáordenarqueseprocedaalavaloraciónorganolépticadelaceitepor
triplicado,conalmenosundíadeintervaloentrecadaprueba;lamediana
delosatributossecalcularáapartirdelconjuntodedatosdelasfichasde
catadelastrespruebas.
5.3.Clasificacióndelosaceites
Elaceiteseclasificabajolasdenominacionesqueseindicanmásadelante,
en función de la mediana de los defectos y de la mediana del atributo
«frutado».Pormedianadelosdefectosseentiendelamedianadelatributo
negativopercibidoconmayorintensidad.Elvalordelcoeficientedevaria-
ciónsólidoparaeseatributonegativodebeserinferioroigualal20%.
a)Aceitedeolivavirgenextra :lamedianadelosdefectosesiguala0yla
delatributo«frutado»superiora0.
b)Aceitedeolivavirgen :lamedianadelosdefectosessuperiora0einfe-
rioraiguala2,5yladelatributo«frutado»superiora0.
c)Aceite de oliva virgen corriente :lamedianadelosdefectosessuperior
a2,5einferioroiguala6,0,obien,lamedianadelosdefectosesinfe-
rioroiguala2,5yladelatributo«frutado»iguala0.
d)Aceite de olivavirgen lampante :lamedianadelosdefectosessuperior
a6,0.
No obstante, a partir del 1 de noviembre de 2003, las categorías c) y d)
quedansustituidasporlasiguientecategoríaúnica:
c)Aceitedeolivalampante :lamedianadelosdefectosessuperiora2,5,o
bien,lamedianadelosdefectosesinferioroiguala2,5yladelatributo
«frutado»esiguala0.
5.4.Casosparticulares
Cuando la mediana de los atributos positivos distintos de «frutado» sea
superiora5,0,eljefedepanelconsignarátalextremoenelcertificado de
análisisdelaceite.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—63
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APÉNDICEA
1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—64
▼M19
APÉNDICEB
MÉTODODECÁLCULODELAMEDIANAYDELOSINTERVALOS
DECONFIANZA
Mediana
La mediana es la cifra real Xm caracterizada por el hecho de que la probabi-
lidad (P) de que los valores de la distribución (X) sean inferiores a esa cifra(Xm) es inferior o igual a 0,5, y de que, simultáneamente, la probabilidad (P)
dequelosvaloresdeladistribución(X)seaninferioresoigualesaXmessupe-
rioroiguala0,5.Otradefiniciónconsideralamedianacomoelpercentil50de
una distribución de cifras ordenadas de forma creciente. En otros términos, la
mediana representa el valor central de una serie ordenada de cifras impares, o
bienlamediadelosdosvalorescentralesdeunaserieordenadadecifraspares.
Desviacióntípicasólida
Paraobtenerunaestimaciónfiabledelavariabilidadqueseproduceentornoa
lamediana,esprecisoreferirsealaestimacióndeladesviacióntípicasólidade
Stuart yKendall.Lafórmula deladesviación típica asintótica depende deNe
IQR.Neselnúmerodeobservaciones eIQRelrangointercuartílico, esdecir,
laestimaciónsólidadelavariabilidaddelosdatosconsiderados(elrangointer-
cuartílico encierra exactamente el 50 % de los casos de una distribución
cualquiera de probabilidad). Para determinar el rango intercuartílico se calcula
ladimensióndeladesviaciónentrelospercentiles75y25.
IQR=percentil75-percentil25
El percentil es el valor Xpc caracterizado por el hecho de que la probabilidad
(P)dequelosvaloresdeladistribuciónseaninferioresaXpcesinferioroigual
aunacentésimadeterminada,ydeque,simultáneamente,laprobabilidad(P)de
quelosvalores deladistribución seaninferioresoiguales aXpcessuperioro
igual a dicha centésima. La centésima indica la fracción de distribución esco-
gida.Enelcasodelamediana,éstaesiguala50/100.
Enotraspalabras, elpercentil eselvalor dedistribuciónque correspondeaunáreadeterminada,trazadaapartirdelacurvadedistribuciónodedensidad.Por
ejemplo,elpercentil25representaelvalordedistribucióncorrespondienteaun
áreaiguala0,25o25/100.
Coeficientedevariaciónsólidoen%
ElCVResunacifrapura,esdecir,carentededimensión,queindicaelporcen-
tajedevariabilidaddelaseriedecifrasanalizadasenrelaciónconelvalorMe
de la mediana; por ese motivo, este coeficiente resulta muy útil a la hora de
comprobarlafiabilidaddelosmiembrosdelpaneldecata.
Intervalosdeconfianzaal95%sobrelamediana
Los intervalos de confianza (IC) al 95 % (valor del error de primera especie
iguala0,05,o5%)constituyenelintervalodentrodelquepodríavariarelvalor
de la mediana en la hipótesis de que fuera posible repetir la experiencia un
número infinito de veces. En la práctica, este intervalo indica el intervalo de1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—65
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variabilidad de la prueba en las condiciones fijadas, en la hipótesis de que el
ensayo pueda repetirse varias veces. Al igual que el CVR, el intervalo contri-
buyeaevaluarlafiabilidaddelaprueba.
I C. Superior = Me + (c.S)I. C. Inferior = Me - (c.S)Donde c, en el caso del
intervalodeconfianzaa0,95,esiguala1,96.
La clasificación se efectúa mediante la comparación de los valores de la
mediana con los intervalos de referencia establecidos en el punto 5.3 del
método. El programa informático permite visualizar la clasificación en un
cuadrodedatosestadísticosoenungráfico.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—66
▼B
ANEXOXIII
NEUTRALIZACIÓNYDECOLORACIÓNDELACEITEDEOLIVAEN
LABRATORIO
1. NEUTRALIZACIÓN Y DECOLORACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA
ENLABORATORIO
1.1.Neutralizacióndelaceite
1.1.1. Equipo
— vasode300mldeformaalta,
— centrífugacontubosde100ml,— vasode250ml,— matracesde100ml,— ampolladedecantaciónde1litro.
1.1.2. Reactivos
— soluciónacuosadehidróxidodesodioal12%,
— soluciónetanólicaal1%defenolftaleína,— hexanoparaanálisis,— alcoholisopropílicopuroparaanálisis.
1.1.3. Modo de operar
a)Aceites deacidezexpresadaenácidooleico inferioral30%
Introducirenunvasode300mldeformaalta,50gdeaceitebrutoy
calentar a 65 ºC al baño María. Agitar lentamente, y añadir una
cantidad de solución de hidróxido de sodio al 12 % que corresponda
alaacidezlibredelaceiteconunexcesodel5%.Continuaragitando
durantecincominutos,manteniendolatemperaturaa65ºC.
Trasladar el total a unos tubos de centrífuga de 100 ml, separar la
masa jabonosa por centrifugación. Verter el aceite decantado en un
vaso de 250 ml y lavar con 50-60 ml de agua destilada hirviendo
eliminando durante este proceso la capa acuosa con la ayuda de un
sifón.Repetir loslavados hasta eliminar completamente losrestos de
jabonresidual(desaparicióndelacoloraciónrosaenlafenolftaleína).
Centrifugar el aceite para eliminar las pequeñas cantidades de agua
residual.
b)Aceites deacidezexpresadaenácidooleico superioral30%
Introducir en una ampolla de decantación de un litro, 50 g de aceite
bruto, 200 ml de hexano, 100 ml de alcohol isopropílico y una
cantidad de solución de hidróxido de sodio al 12 % que corresponda
alaacidezlibredelaceite,conunexcesodel0,3%.Agitarenérgica-
menteduranteunminuto.Añadir100mldeaguadestilada, agitarde
nuevoydejarreposar.
Despuésdelaseparacióndelascapas,dejarsalirlacapainferiorque
contienelosjabones.Entreambascapas(aceitosaporencimayacuosa
pordebajo) se forma frecuentemente una capa intermedia constituida
por mucílagos y sustancias insolubles que deberá eliminarse igual-
mente
Proceder a continuación al lavado de la solución hexánica de aceite
neutroconporcionesde50-60mldeunasolucióndealcoholisopropí-
lico/agua destilada 1/1 (v/v) hasta la desaparición de la coloración
rosa en la fenolftaleína. Proceder a continuación a la eliminación
completadelhexanopordestilaciónenvacío(porejemplo,enelrota-
vapor).
1.2.Decoloracióndelaceiteneutro
1.2.1. Equipo
— matrazde250mlcon3bocasquepermitanlainserciónde:
a) un termómetro graduado en grados que permita hacer lecturas
hasta90ºC,1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—67
▼M6
▼B
▼B
b) unagitadormecánicoquegirea250-300vueltasporminutoequi-
padoparaelfuncionamientoenvacio,
c) unrácorhacialabombadevacío,
— bombadevacio,provistadeunmanómetro,capazdelograrpresiones
residualesde15-30milibares.
1.2.2. Modo de operar
Pesar en el matraz de 3 bocas cerca de 100 g del aceite neutralizado.
Insertar el termómetro y el agitador, volver a unir a la bomba de vacío
ycalentarhasta90ºCagitándolo.
Mantener dicha temperatura, siempre bajo agitación, hasta que el aceite
que deba analizarse esté completamente liberado de suhumedad (treinta
minutosaproximadamente).
Interrumpirentonceselvacíoyañadirle2a3gdetierraactivada.Resta-
blecer el vacío hasta obtener una presión residual de 15-30 milibares y,
siempre con una temperatura de 90 ºC, agitar durante 30 minutos a 250
vueltasporminutoaproximadamente.
Filtraracontinuaciónencalienteenunbañotermoestático(50-60ºC).1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—68
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▼B
ANEXOXV
1. CONTENIDOENACEITEDELOSORUJOSDEACEITUNA
1.1.Material
— aparato de extracción apropiado tipo ►C1soxhlet ◄, provisto de un
matrazde200a250ml,
— baño por calefacción eléctrica (baño de arena, baño de agua, etc.) o
placacalefactora,
— balanzaanalítica,— estufareguladaa80ºCcomomáximo,— estufadecalefaccióneléctricaprovistadeundispositivodetermorregu-
laciónreguladaa103ºC±2ºCyquepermitarealizarunainsuflación
deaireounapresiónreducida,
— trituradormecánicofácildelimpiaryquepermitaeltrituradodelorujo
sincalentamientoysindisminuciónsensibledesucontenidoenaguayenaceite,
— cartucho de extracción y algodón hidrófilo o papel filtro, exentos de
productosextraíblesporelhexano,
— desecador,— cribaconagujerosde1mmdediámetro,
— piedrapómezenpequeñosgranos,previamentesecada.
1.2.Reactivo
n-hexanotécnicocuyoresiduoenevaporacióncompletadeberáserinferior
a0,002gpara100ml.
2. MODODEOPERAR2.1.Preparacióndelamuestraparaensayo
Triturar la muestra para laboratorio, si fuera necesario, en el triturador
mecánico, previamente bienlimpio,parareducirlaapartículasquepuedan
atravesarcompletamentelacriba.
Utilizaraproximadamenteunavigésimapartedelamuestraparacompletar
la limpieza del triturador, tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo,
mezclarloconcuidadoyanalizarlosindemora.
2.2.Tomademuestra
Pesar inmediatamente después del triturado, alrededor de 10 g de la
muestraparaensayoconunaaproximaciónde0,01g.
2.3.Preparacióndelcartuchodeextracción
►
C1colocar la muestra en el cartucho y taparla con el tapón ◄de
algodón hidrófilo. En caso de haber utilizado papel de filtro, envolver la
muestramolidaendichopapel.
2.4.Presecado
Cuando el orujo esté muy húmedo (contenido en agua y en materias
volátiles superior al 10 %), efectuar un presecado colocando durante un
tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa
calentada a 80 ºC como máximo, para llevar el contenido en agua y en
materiasvolátilespordebajodel10%.
2.5.Preparacióndelmatraz
Pesar con aproximación de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de
piedrapómez,previamente secadoenlaestufaa103ºC±2ºCydespués
enfriadodurantealmenosunahoraeneldesecador.
2.6.Primeraextracción
Colocar en el aparato de extracción el cartucho (o el papel de filtro) que
contenga la muestra. Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano.
►C1Adaptar ◄elmatrazalaparatodeextracciónycolocarlotodosobre
la placa calefactora. Llevar la calefacción a tal estado que el caudal de
reflujo sea al menos de tres gotas por segundo (ebullición moderada, no
tumultuosa).1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—69
▼B
Despuésdecuatrohorasdeextracción,dejarenfriar.Quitarelcartuchodel
aparatodeextracciónycolocarloenunacorrientedeaireparaeliminar la
mayorpartedeldisolventequeloimpregna.
2.7.Segundaextracción
Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea
posible.Colocardenuevocuantitativamentelamezclaenelcartuchoyésta
enelaparatodeextracción.
Empezar de nuevo la extracción durante dos horas más, utilizando el
mismomatrazconteniendolaprimeraextracción.
Lasoluciónobtenida enelmatraz deextracción deberáserlímpida. Sino
fuere así, filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer
matraz yelpapel defiltroconhexano.Recoger elfiltrado yeldisolvente
en un segundo matraz previamente secado y tarado aproximadamente a
1mg.
2.8.Eliminacióndeldisolventeypesadadelextracto
Eliminarenelequipodeextracciónlamayorpartedeldisolvente.Eliminar
losúltimosrestosdeéstecalentandoelmatrazenlaestufaa103ºC±2ºC
durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminación, ya sea insuflando aire de
vezencuandoopreferiblementeungasinerte,oactuandobajounapresión
reducida.
Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora, y
pesarloconunaprecisiónde1mgaproximadamente.
Calentar denuevo10minutosenlasmismascondiciones, dejar enfriar en
eldesecadorypesar.
Ladiferenciaentrelosresultadosdeestasdospesadasdeberáserinferioro
igual a 10 mg, si no, calentar de nuevo durante períodos de diez minutos
seguidos de enfriamento y pesada, hasta que la diferencia de peso sea, a
losumo,de10mg.Seleccionarlaúltimapesadadelmatraz.
Efectuardosdeterminaciones.
3. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS3.1.Mododecálculoyfórmula
a) Elextractoexpresadoenpesodelproductotalcualseráiguala:
S=m
1×100
m0
donde: S eselporcentajeenpesodelextractodelproductotalcual,
m0eselpeso,engramos,delamuestra,
m1eselpeso,engramos,delextractoseco.
Tomar como resultado la media aritmética de las dos determinaciones,
silascondicionesderepetitividadsecumplen.
Expresarelresultadoconunsolodecimal.
b) El extracto se relacionará con la materia seca utilizando la siguiente
fórmula:
S×100
100−U=%grasasobreextractoseco
donde: S eselprocentajeenpesodeextractodelproductotalcualver
a),
U essucontenidoenaguayenmateriasvolátiles.
3.2.Repetitividad
La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones, efectuadas
simultáneamente o rápidamente la una a continuación de la otra mediante
elmismoanálisis,nodeberásersuperiora0,2gdeextractodehexanopor
cada100gdemuestra.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—70
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Encasocontrario,repetirsobreotrasdostomasdemuestra.Siestavezla
diferenciaesdenuevosuperiora0,2gtomarcomoresultadolamediaarit-
méticadelascuatrodeterminacionesefectuadas.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—71
▼B
ANEXOXVI
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEYODO
1. OBJETO
La presente norma internacional especifica un método para la determina-
cióndelíndicedeyododelasgrasasyaceitesanimalesyvegetales,enlo
sucesivodenominadosgrasas.
2. DEFINICIÓN
A los fines de la presente norma internacional, se aplicará la definición
siguiente:
2.1.Índice de yodo: el peso de yodo absorbido por la muestra en las condi-
cionesdetrabajoqueseespecificanenlapresentenormainternacional.
Elíndicedeyodoseexpresaengramosdeyodopor100grdemuestra.
3. PRINCIPIO
DisolucióndelamuestraproblemayadicióndereactivodeWijs.Unavez
transcurrido el tiempo que se especifica, adición de solución acuosa de
yoduro potásico y valoración del yodo liberado con solución de tiosulfato
sódico.
4. REACTIVOS
Todoslosreactivosserándecalidadanalíticareconocida.
4.1. Yoduropotásico,soluciónde100g/l,exentodeyodatosodeyodolibre.
4.2. Engrudodealmidón.
Mezclar 5 g de almidón soluble con 30 ml de agua, añadir esta mezcla a
1000mldeaguaenebullición,hervirdurante3minutosydejarenfriar.
4.3. Soluciónvolumétricapatróndetiosulfatosódico.
c(Na2S2O3.5H2O)=0,1mol/l, valorada comomáximo 7díasantes desu
uso.
4.4. Disolvente, preparado mezclando volúmenes iguales de ciclohexano y
ácidoacético.
4.5. ReactivodeWijs,quecontengamonoclorurodeyodoenácidoacético.Se
utilizaráreactivodeWijscomercializado.
Nota:Elreactivocontiene9gdeICl3+9gdeIenácidoacético.
5. MATERIAL
Materialordinariodelaboratorioy,enparticular,losiguiente:
5.1. Navecillas de vidrio, apropiadas para la muestra problema y que puedan
introducirseenlosmatraces(5.2).
5.2. Matraces erlenmeyer de 500 ml de capacidad con boca esmerilada,
provistosdesuscorrespondientestaponesdevidrioyperfectamentesecos.
6. PREPARACIÓNDELAMUESTRA ►C1PROBLEMA ◄.
►C1La muestra homogeneizada, se seca sobre sulfato sódico y se
filtra◄.
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Tamañodelamuestra
Elpesodelamuestravaríaenfuncióndelíndicedeyodoprevisto,comose
indicaenelcuadro1.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—72
▼B
Cuadro1
Índicedeyodoprevisto Pesodelamuestraproblema
menosde5 3,00g
5—20 1,00g
21—50 0,40g
51—100 0,20g
101—150 0,13g
151—200 0,10g
Pesar la muestra problema con precisión de 0,1 mg en una
►C1navecilla ◄devidrio5.1.
7.2. Determinación
Introducirlamuestraproblemaenunmatrazde500ml(5.2).Añadir20ml
deldisolvente(4.4)paradisolverlagrasa.Agregarexactamente 25mldel
reactivo de Wijs (4.5), tapar el matraz, agitar el contenido y colocar el
matraz al abrigo de la luz. No deberá utilizarse la boca para pipetear el
reactivodeWijs.
Preparardelmismomodounensayoenblancoconeldisolventeyelreac-
tivo,perosinlamuestraproblema.
Para las muestras con un índice de yodo inferior a 150, mantener los
matraces en la oscuridad durante 1 hora; para las muestras con un índice
deyodosuperiora150,asícomoenelcasodeproductospolimerizadoso
considerablementeoxidados,mantenerenlaoscuridaddurante2horas.
Unaveztranscurridoeltiempocorrespondiente,agregaracadaunodelos
matraces20mldesolucióndeyoduropotásico(4.1)y150mldeagua.
Valorarconladisoluciondetiosulfatosódico(4.3)hastaquehayadesapa-
recidocasitotalmenteelcoloramarilloproducidoporelyodo.Añadirunas
gotas de engrudo de almidón (4.2) y continuar la valoración hasta el
momentoprecisoenquedesaparezcaelcolorazuldespuésdeunaagitación
muyintensa.
Nota:Sepermiteladeterminaciónpotenciométricadelpuntofinal.
7.3. Númerodedeterminaciones
Efectuar2determinacionesdelamuestraproblema.
8. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Elíndicedeyodoseexpresadelsiguientemodo:
12;69c V1/C0V2 ðÞ
p
siendo:
c: valor numérico de la concentración exacta, expresada en moles por
litro, de la solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico (4.3)
utilizada;
V1: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
detiosulfatosódico(4.3)utilizadaparaelensayoenblanco;
V2: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
detiosulfatosódico(4.3)utilizadaparaladeterminación;
p: valor numérico del peso, expresado en gramos, de la muestra
problema(7.1).
Setomará como resultadolamedia aritmética delasdosdeterminaciones,
siempre que se cumpla el requisito establecido con respecto a la repetibi-
lidad.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—73
▼M11
ANEXOXVII
MÉTODOPARALADETERMINACIÓNDEESTIGMASTADIENOSEN
LOSACEITESVEGETALES
1. OBJETIVOS
Determinacióndeestigmastadienosenlosaceitesvegetalesquepresentan
bajas concentraciones de dichos hidrocarburos, particularmente en el
aceitedeolivavirgenyenelaceitedeorujodeolivasinrefinar.
2. APLICACIÓN
Se trata de una norma aplicable a cualquier aceite de origen vegetal,
teniendo encuentaqueúnicamente seobtendránmedidasfiables cuando
el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de
0,01a4,0mg/kg.Elmétodoresultaespecialmenteadecuadoparadetectar
la presencia de aceites vegetales refinados (aceites de oliva, orujo de
oliva, girasol, palma, etc.) en el aceite de oliva virgen, dado que los
aceitesrefinadoscontienenestigmastadienosylosaceitesvírgenesno.
3. FUNDAMENTO
Aislamiento de la materia insaponificable. Separación de la fracción de
hidrocarburos esteroideos mediante cromatografia en columna de gel de
síliceyanálisismediantecromatografíadegasesencolumnacapilar.
4. INSTRUMENTAL
4.1. Matracesde250mlaptosparacolocarlesunrefrigerantedereflujo.4.2. Embudosdedecantaciónconcapacidadpara500ml.4.3. Matracesdefondoredondode100ml.4.4. Rotavapor.4.5. Columna de vidrio para cromatografía (1,5-2,0 cm de diámetro interno
por50cmdelongitud)provistadeunallavedeteflónyconunatorunda
de lana de vidrio o un disco de vidrio unterizado en el fondo. Para
preparar la columna de gel de sílice se vierte hexano en la columna de
cromatografía hasta que alcance una altura de aproximadamente 5 cm,
llenándose a continuación con una papilla de gel de sílice en hexano
(15 g en 40 ml) mediante la ayuda de varias porciones de hexano. Se
deja sedimentar la mezcla en reposo, completándose la sedimentación
aplicando una ligera vibración. Añadir sulfato sódico anhidro hasta una
altura de aproximadamente 0,5 cm y finalmente eluir el exceso de
hexano.
4.6. Cromatógrafo de gases equipado con detector de ionización de llama,
inyectorcondivisióndeflujou«coldon-column»yhornoprogramable
conprecisiónde±1ºC.
4.7. Columna capilar de sílice fundida (0,25 o 0,32 mm de diámetro
interno × 25 mde longitud), recubierta con una película de 0,25 µmde
espesordelafase5%-fenilmetilsilicona.
Nota1.
Puedenutilizarseotrascolumnasconpolaridadessimilaresoinferiores.
4.8. Integrador-registrador con capacidad para modo de integración valle-
valle.
4.9. Microjeringade5-10 µlparacromatografíadegasesconagujafija.
4.10. Calentadordetipomantaoplacaeléctrica.
5. REACTIVOS
Salvo indicación en sentido contrario, únicamente se utilizarán reactivos
de calidad para análisis. Debe emplearse agua destilada o de pureza al
menosequivalente.
5.1. Hexano o una mezcla de alcanos con un intervalo de ebullición de 65-
70ºC,destiladosencolumnarectificadora.
Nota2.
Eldisolventedebedestilarseparaeliminarimpurezas.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—74
▼M11
5.2. Etanolde96v/v.
5.3. Sulfatosódicoanhidro.5.4. Soluciónalcohólicadehidróxidopotásicoal10%.Añadir10mldeagua
a 50 g de hidróxido potásico, agitar y diluir seguidamente la mezcla en
etanolhastaunvolumende500ml.
Nota3.
La potasa alcohólica toma color marrón con el tiempo. Debe prepararse
diariamenteysealmacenaráenbotellasdevidriooscurocerradashermé-
ticamente.
5.5. Geldesílice60paracolumnadecromatografia, de70-230mallas(refe-
rencia7734deMerckosimilar).
Nota4.
Porlo general, el gel de sílice puede utilizarse directamente a partir del
envasesinnecesidaddetratamiento.Sinembargo,algunoslotesdesílice
pueden presentar baja actividad produciendo separaciones cromatográ-
ficasinadecuadas.Cuandoelloocurradebetratarseelgeldesílicedela
siguientemanera:activarelgelcalentándoloa550ºCduranteunmínimo
decuatrohoras.Traselcalentamiento ponerelgeldesíliceaenfriaren
undesecadorytrasvasarloacontinuaciónaunmatrazconcierrehermé-
tico.Seañadeseguidamenteun2%deaguaagitandohastaquedejende
versegrumosyelpolvofluyalibremente.
Sialgúnlotedegeldesíliceoriginacromatogramasconpicosqueinter-
fieran,dichogelserásometidoaltratamientoanteriormentemencionado.
Puede considerarse como alternativa la utilización de gel de sílice 60
extrapuro(referencia7754deMerck).
5.6. Soluciónmadre(200ppm)decolesta-3,5-dieno(Sigma,99%depureza)
enhexano(10mgen50ml).
5.7. Soluciónpatróndecolesta-3,5-dienoenhexanoconunaconcentraciónde
20ppm,queseobtienediluyendolasoluciónanterior.
Nota5.
Sisemantienelatemperaturapordebajode4ºC,lassoluciones5.6y5.7
permaneceráninalteradasduranteunmínimode4meses.
5.8. Solución den-nonacosanoen hexanocon unaconcentración aproximada
de100ppm.
5.9. Gas portador para cromatografia: helio o hidrógeno de 99,9990 % de
pureza.
5.10. Gasesauxiliaresparaeldetectordeionizacióndellama:airepurificadoe
hidrógenode99,9990%depureza.
6. METODOLOGÍA
6.1.Preparacióndelamateriainsaponificable:
6.1.1. Pesar20±0,1gdeaceiteenunmatrazde250ml(4.1),añadir1mlde
soluciónpatróndecolesta-3,5-dieno(20 µg)y75mldepotasaalcohólica
al 10 %, colocar un refrigerante de reflujo y calentar a ebullición suave
durante30minutos.Retirardelafuentedecalorelmatrazconlamuestra
ydejarenfriarligeramente lasolución(elenfriamiento nodebesertotal
paraevitarladecantacióndelamuestra).Añadir100mldeaguaypasar
la solución a un embudo de decantación (4.2) con ayuda de 100 ml de
hexano.Agitarenérgicamentedurante30segundosydejardecantar.
Nota6.
Siseproduceemulsión,quenodesaparecerápidamente,añadirpequeñas
cantidadesdeetanol.
6.1.2. Pasar la fase acuosa inferior a un segundo embudo de decantación y
someterla nuevamente a extracción con 100 ml de hexano. Separar
nuevamentelafaseinferiorylavarlosextractosdehexano(mezclándolos
en otro embudo de decantación) con tres porciones de 100 ml cada una
deunamezcladeaguayetanol(1:1)hastaobtenerunpHneutro.
6.1.3. Pasar la solución de hexano a través de sulfato sódico anhidro (50 g),
lavarcon20mldehexanoyevaporara30ºCypresiónreducidaenun
rotavaporhastasequedad.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—75
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6.2.Separacióndelafraccióndehidrocarburosesteroideos:
6.2.1. Introducirelresiduoenlacolumnadefraccionamientoconayudadedos
porcionesde1mldehexano,distribuirlamuestraenlacolumnadejando
que el nivel de solución descienda hasta la parte superior del sulfato de
sodioycomenzarlaelucióncromatográfica conhexanoaunflujoapro-
ximadode1ml/min.Desecharlosprimeros25-30mldeeluidoyrecoger
lafracción siguiente de40ml.Después,pasar estafracción aunmatraz
defondoredondode100ml(4.3).
Nota7.
Laprimerafraccióncontieneloshidrocarburossaturados(cf.Figura1a)y
lasegundafracciónlosesteroideos.Alproseguirconlaeluciónseobtiene
escualenoyotroscompuestosrelacionados.Parapoderobtenerunabuena
separación entre los hidrocarburos saturados y los esteroideos, es nece-
sario optimizar los volúmenes de las fracciones. A tal efecto se debe
ajustar el volumen de la primera fracción de tal manera que cuando se
analice la segunda, los picos correspondientes a los hidrocarburos satu-
rados sean bajos (cf. Figura 1c); cuando estos no aparezcan pero la
intensidad del pico correspondiente al patrón sea reducida, debe dismi-
nuirse el volumen. De todas formas, puesto que no se produce
solapamiento de los picos durante la cromatografía de gases, no es
precisa una separación completa entre los componentes de la primera y
segundafraccionessiemprequelascondicionesdelaCGesténajustadas
como se indica en 6.3.1. Por lo general no es necesario optimizar el
volumendelasegundafracción,puestoqueexisteunabuenaseparación
con los componentes que eluyen posteriormente. Sin embargo, la
presenciadeunpicoimportantea1,5min,aproximadamente,pordebajo
deltiempoderetencióndelpatrónsedebealescualenoyrevelaunamala
separación.
6.2.2. Evaporar la segunda fracción en rotavapor a 30 ºC y presión reducida
hastasequedad.Disolverinmediatamente elresiduoen0,2mldehexano
ymantenerlasoluciónenelrefrigeradorhastaelmomentodesuanálisis.
Nota8.
Los residuos 6.1.3 y 6.2.2 no deben mantenerse en seco a temperatura
ambiente.Unavezobtenidos,esnecesarioañadirlesdisolventeyalmace-
narlosenunrefrigerador.
6.3.Cromatografíadegases
6.3.1. Condicionesdetrabajoparainyeccióncondivisióndeflujo.
— temperaturadelinyector:300ºC,
— temperaturadeldetector:320ºC.
— integrador-registrador:losparámetrosdeintegracióndebenserfijados
detalformaquelaevaluacióndelasáreasseacorrecta.Lamodalidad
deintegraciónvalle-valleeslamásrecomendable,
— sensibilidad:aproximadamente16veceslaatenuaciónmínima,
— cantidaddedisolucióninyectada:1 µl,
— programación de la temperatura del horno: temperatura inicial cons-
tante de 235 ºC durante 6 minutos, seguida de un aumento gradual
de2ºC/minhastaalcanzar285ºC,
— inyecciónconunadivisióndeflujode1:15,
— gasportador:helioohidrógenoa120kPadepresión.
Dichas condiciones pueden modificarse en función de las características
del cromatógrafo yde la columna con objeto de obtener cromatogramas
querespondanalossiguientesrequisitos:Picodelpatróninternosituado
conunaaproximaciónde5minutosentornoaltiempocitadoen6.3.2;el
pico del patrón interno alcanzará, como mínimo, un 80 % de la escala
total.
Elsistemadecromatografíadegasesdeberácomprobarseinyectandouna
mezcla de la solución madre de colestadieno (5.6) y de n-nonacosano(5.8). El pico del colesta-3,5-dieno deberá aparecer antes que el del n-
nonacosano (véase figura 1c); si esto no ocurre, pueden adoptarse dos
soluciones:reducirlatemperaturainicialdelhornoosustituirlacolumna
decromatografíadegasesporotradepolaridadinferior.
6.3.2. Identificacióndepicos
Elpicodelpatróninternoapareceauntiempoderetenciónde,aproxima-
damente, 19 minutos, y el del estigmasta-3,5-dieno lo hace a un tiempo
de retención relativo de aproximadamente 1,29 (véase figura 1b). El
estigmasta-3,5-dieno suele ir acompañado de pequeñas cantidades de un
isómero y, por lo general, ambos originan un solo pico cromatográfico.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—76
▼M11
Noobstante,silacolumnaesdemasiadopolar,otieneungranpoderde
resolución,elisómeropuedeaparecerenformadeunpequeñopicojusto
antesycercadelestigmasta-3,5-dieno(véasefigura2).Enestoscasos,es
preciso sumarlasáreas delosdospicos. Conel finde estar seguroque
losestigmastadienoseluyencomounsolopicoserecomiendainstituirla
columnaporotrademenorpolaridadodemayordiámetrointerior.
Nota9.
Para obtener una referencia de los estigmastadienos puede utilizarse el
análisis de cualquier aceite vegetal refinado empleando menor cantidad
demuestra(de1a2g).Losestigmastadienosdanlugaraunpicoimpor-
tantedefácilidentificación.
6.3.3. Análisiscuantitativo
Elcontenidodelosestigmastadienossedeterminaaplicandolafórmula
mg=kgdeestigmastadienos ¼As/C2Mc
Ac/C2Mo
enlacual: Ab= área del pico de estigmastadienos (si el pico se
halla dividido en dospicos, súmeseel área de los
dospicos.).
Ac= áreadelpicodelpatróninterno(colestadieno).
Mc= pesodepatrónañadido,enmicrogramos.
Mo= pesodeaceiteempleado,engramos.
Límitededetección:aproximadamente0,01mg/kg.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—77
▼M11
Figura1
Cromatogramasprocedentesdelanálisisdemuestrasdeaceitedeolivaen
columnacapilardesílicefundida(0,25mmdediámetrointerno×25m)
recubierta con una película de 0,25 µmde grosor de 5 %-fenilm etilsili-
cona.
a) Primerafracción(30ml)deunaceitevirgenmarcadoconelpatrón.
b) Segundafracción(40ml)deunaceitedeolivaquecontiene0,10mg/
kgdeestigmastadienos.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—78
▼M11
c) Segunda fracción (40 ml) que incluye una pequeña proporción de la
primera.
Figura2
Cromatograma procedente delanálisisdeunamuestra deaceite deoliva
refinadoenunacolumnaDB-5,enelqueseapreciaelisómerodelestig-
masta-3,5-dieno.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—79
▼M13
ANEXOXVIII
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE TRIGLICÉRIDOS CON
ECN42 (DIFERENCIA ENTRE EL CONTENIDO TEÓRICO Y LOS
DATOSOBTENIDOSPORHPLC)
1.Objeto
Determinacióndelacomposicióndetriglicéridos(TG)delosaceitesde
oliva, expresados en su número equivalente de carbonos (ECN) en
función de las diferencias existentes entre el contenido teórico, calcu-
lado a partir de la composición de ácidos grasos, y los resultados
analíticos obtenidos mediante cromatografía de líquidosde alta resolu-
ción(HPLC).
2.Campodeaplicación
Lapresentenormaesaplicablealosaceitesdeoliva.Elmétodopuede
utilizarse para detectar la presencia de pequeñas cantidades de aceites
de semillas (ricos en ácido linoleico) en todos los tipos de aceites de
oliva.
3.Principio
El contenido teórico de triglicéridos con ECN42 (calculado sobre la
basedeladeterminación delacomposición deácidosgrasosmediante
GLC)yelcontenidodetriglicéridosconECN42determinadomediante
HPLCsecorrespondendentrodeunoslímitesenelcasodelosaceites
puros.LasdiferenciassuperioresalosvaloresestablecidosenelRegla-
mento respecto a cada tipo de aceite indican que el aceite contiene
aceitesdesemillas.
4.Método
El método para calcular el contenido teórico de triglicéridos con
ECN42 ysudiferencia respecto a losdatos obtenidos mediante HPLC
consiste esencialmente en coordinar los datos analíticos obtenidos por
otros métodos. Pueden distinguirse tres fases: determinación de la
composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases en
columnacapilar, cálculodelacomposiciónteórica detriglicéridos con
ECN42, y determinación de los triglicéridos con ECN42 mediante
HPLC.
4.1.Aparatos
4.1.1. Matracesredondosde250y500ml.
4.1.2. Vasosdeprecipitadosde100ml.
4.1.3. Columnadecromatografía devidrio,de21mmdediámetro interior y
450 mm de longitud, con grifo y cono (hembra) normalizado en el
extremosuperior.
4.1.4. Embudosdedecantaciónde250ml,concono(macho)normalizadoen
el extremo inferior, para conexión con el extremo superior de la
columna.
4.1.5. Varilladevidriode600mmdelongitud.
4.1.6. Embudodevidriode80mmdediámetro.
4.1.7. Matracesaforadosde50ml.
4.1.8. Matracesaforadosde20ml.
4.1.9. Evaporadorderotación.
4.1.10. Cromatografía de líquidos de alta resolución, con control termostático
delatemperaturadelacolumna.
4.1.11. Sistemadeinyeccióndevolúmenesde10 µl.
4.1.12. Detector: refractómetro diferencial. La sensibilidad de toda la escala
deberásercomomínimode10−4unidadesdeíndicederefracción.
4.1.13. Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de
diámetro interior, rellena de partículas de sílice de 5 µmde diám etro
conun22-23%decarbonoenformadeoctadecilsilano(nota2).
4.1.14. Registradorointegrador.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—80
▼M13
4.2.Reactivos
Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de
elucióndeberándesgasificarse ypodránreciclarse variasvecessinque
elloafectealasseparaciones.
4.2.1. Éterdepetróleo,40-60ºC,gradocromatográfico.
4.2.2. Éteretílico,libredeperóxidos,reciéndestilado.
4.2.3. Disolventedeeluciónparalapurificacióndelaceiteporcromatográfica
encolumna:mezcladeéterdepetróleo/éteretílico87/13(v/v).
4.2.4. Gel de sílice, 70-230 mallas, tipo Merck 7734, con contenido de agua
normalizadoal5%(p/p).
4.2.5. Lanadevidrio.4.2.6. Acetona.4.2.7. Acetonitrilo.4.2.8. Disolvente de elución para HPLC: acetonitrilo + acetona (las propor-
ciones se ajustarán para obtener la separación deseada; comenzar con
unamezclade50:50).
4.2.9. Disolventedesolubilización:acetona.4.2.10. Triglicéridos de referencia: pueden utilizarse triglicéridos comerciales
(tripalmitina, trioleína, etc.), en cuyo caso se reflejarán en un gráfico
los tiempos de retención frente al número equivalente de carbonos, o
bien cromatogramas de referencia correspondientes a aceite de soja, a
una mezcla de aceite de soja y aceite de oliva 30:70 y a aceite puro
deoliva(véanselasnotas3y4ylasfiguras1,2,3y4).
4.3.Preparacióndelamuestra
Como pueden obtenerse falsos resultados positivos debido a la
presenciadediversassustanciasqueinterfieren,lamuestradebesome-
terse siempre a un proceso de purificación según el método IUPAC
2.507, relativo a la determinación de las sustancias polares en los
aceitesoxidados.
4.3.1. Preparación de la columna cromatográfica
Llenarlacolumna(4.1.3)conaproximadamente30mldedisolventede
elución (4.2.3); introducir un poco de lana de vidrio (4.2.5), empuján-
dolohastaelfondodelacolumnaconlavarilladevidrio(4.1.5).
Prepararenunvasodeprecipitadosde100mlunasuspensióncon25g
degeldesílice(4.2.4)en80mldelamezcladeelución(4.2.3)ytrans-
ferirlaalacolumnaconayudadeunembudodevidrio(4.1.6).
Pararealizar latransferencia total delgeldesílice alacolumna, lavar
el vaso de precipitados con la mezcla de elución y pasar también los
líquidosdelavadoalacolumna.
Abrir el grifo de la columna y dejar que salga el disolvente de ella
hasta que su nivel se sitúe aproximadamente 1 cm por encima del gel
desílice.
4.3.2. Cromatografía en columna
Pesar, con la precisión de 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g de aceite previamente
filtrado, homogeneizado y, en caso necesario, deshidratado, en un
matraz aforado de 50 ml (4.1.7). Disolver en 20 ml aproximadamente
de disolvente de elución (4.2.3). Si es necesario, calentar ligeramente
para facilitar la disolución. Enfriar a temperatura ambiente y enrasar
coneldisolventedeelución.
Introducir con una pipeta aforada 20 ml de solución en la columna
preparadacomoseindicaen4.3.1,abrirelgrifoyhacereluireldisol-
ventehastaelniveldelacapadegeldesílice.
Eluircon150mldedisolventedeelución(4.2.3),regulandoelflujode
disolvente a 2 ml porminuto aproximadamente (de modoque pasen a
travésdelacolumna150mlen60-70minutos).
Recogereleluidoenunmatrazredondode250ml(4.1.1)previamente
taradoypesadoexactamente.Eliminareldisolventeapresiónreducida
(Rotavapor) y pesar el residuo que se utilizará en la preparación de la
solución para el análisis por HPLC y en la preparación de los ésteres
metílicos.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—81
▼M13
Traspasarporlacolumna,deberecuperarsecomomínimoun90%de
la muestra en el caso de aceite de oliva de las categorías extravirgen,
virgenyrefinadoordinario,mientrasqueeneldelosaceiteslampantes
y de orujo los porcentajes de recuperación no pueden ser inferiores al
80%.
4.4.AnálisisporHPLC
4.4.1. Preparación de las muestras para el análisis cromatográfico
Preparar del siguiente modo una solución al 5 % de la muestra que
vaya a analizarse: pesar 0,5 ± 0,001 g de la muestra en un matraz
aforadode10mlyenrasarconeldisolventedesolubilización(4.2.9).
4.4.2. Procedimiento
Instalar el sistema cromatográfico. Bombear el disolvente de elución
(4.2.8) a un ritmo de 1,5 ml/mn para purgar todo el sistema. Esperar
hasta que se obtenga una línea de base estable. Inyectar 10 µld el a
muestrapreparadacomoseindicaenelpunto4.3.
4.4.3. Cálculo y expresión de los resultados
Utilizarelmétododenormalizacióninterna,esdecir,considerarquela
suma de las superficies de los picos correspondientes a los distintos
triglicéridos de ECN entre 42 y 52 es igual al 100 %. Calcular el
porcentajerelativodecadatriglicéridomediantelafórmulasiguiente:
%detriglicérido=superficiedelpico×100/sumadelasuperficiesde
lospicos.
Elresultadoseexpresacon,comomínimo,dosdecimales.Nota1:Elordendeeluciónpuededeterminarsemedianteelcálculodel
númeroequivalente decarbonos,queconfrecuencia vienedadoporla
fórmula ECN = CN−2n, siendo CN el número de carbonos y n el
número de enlaces dobles; puede calcularse con mayor precisión
teniendo en cuenta el origen del enlace doble. Si n
o,nlynlnson los
númerosde enlaces dobles delosácidos oleico, linoleico y linolénico,
respectivamente, el número equivalente de carbonos puede calcularse
mediantelafórmulasiguiente:
ECN=CN−dono−dlnl−dlnnln,
siendodo,dlydlncoeficientesquepuedencalcularsemediantelostrigli-
céridos de referencia. En las condiciones que se especifican en el
presentemétodolafórmulaobtenidaserásimilaralasiguiente:
ECN=CN−(2,60no)−(2,35nl)−(2,17nln)
Nota2:Ejemplos: Lichrosorb(Merck)RP18Art50333
Lichrosphere(Merck)100CH18Art50377oequi-
valente.
Nota 3:Con varios triglicéridos de referencia también es posible
calcularlaresoluciónconrespectoalatrioleína:
α=TR'/TRtrioleína
utilizandoeltiempoderetenciónreducidoTR'=TR−TRdisolvente.La representación gráfica del log αfrente a f (número de enlaces
dobles)permite determinar losvalores deretención detodoslostrigli-
céridosdelosácidosgrasoscontenidosenlostriglicéridosdereferencia
(véaselafigura2).
Nota 4:La resolución de la columna debe permitir separar claramente
elpicodelatrilinoleínadelospicosdelostriglicéridosconuntiempo
deretenciónpróximo.LaeluciónseprosiguehastaelpicodeECN52.
Nota 5:Para obtener un cromatograma que permita la medición
correcta de las superficies de todos los picos de interés en la presente
determinación, es necesario que el segundo pico correspondiente a
ECN50tengaunaalturaigualal50%delaescalacompletadelregis-
trador.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—82
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4.5.Cálculodelacomposicióndetriglicéridos(%moles)apartirdelos
datosdeGLCdeácidosgrasos(%superficie)
4.5.1. Determinación de la composición de ácidos grasos
Lacomposicióndeácidosgrasossedeterminaconarregloalmétodode
cromatografía de gases de la CEE que figura en el Anexo X A del
Reglamento(CEE)no2568/91,utilizandocolumnacapilar.Laprepara-
ción de los ésteres metílicos se realiza según el Anexo X B (solución
alcohólicademetilatosódico).
4.5.2. Ácidos grasos considerados para el cálculo
Los glicéridos se agrupan en función de su número equivalente de
carbonos (ECN), teniendo en cuenta las equivalencias que figuran a
continuación entre ECN y ácidos grasos. Sólo se han considerado los
ácidos grasos con 16 y 18 átomos de carbono, ya que son los únicos
importantesparaelaceitedeoliva.
Ácidograso(AG) AbreviaturaPesomole-
cular(PM)ECN
Ácidopalmítico P 256,4 16
Ácidopalmitoleico Po 254,4 14Ácidoesteárico S 284,5 18
Ácidooleico O 282,5 16
Ácidolinoleico L 280,4 14Ácidolinolénico Ln 278,4 12
4.5.3. Transformación del % superficie en moles para todos los
ácidosgrasos
molesP ¼
%sup :P
PMPmolesS ¼%sup :S
PMSmolesPo ¼%sup :Po
PMPo/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
molesO ¼
%sup :O
PMOmolesL ¼%sup :L
PMLmolesLn ¼%sup :Ln
PMLn
4.5.4. Normalización al 100 % de los ácidos grasos
%molesP 1 ;2;3 ðÞ ¼molesP /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)%molesS 1 ;2;3 ðÞ ¼
molesS /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
%molesPo 1 ;2;3 ðÞ ¼molesPo /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
%molesO 1 ;2;3 ðÞ ¼molesO /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
%molesL 1 ;2;3 ðÞ ¼molesL /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
%molesLn 1 ;2;3 ðÞ ¼molesLn /C3100
moles P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Elresultadoproporcionaelporcentajedecadaácidograsoen%moles
entodaslasposiciones(1,2y3)delosTG.
A continuación se calculan las sumas de los ácidos grasos saturados
(AGS)PySydelosácidosgrasosinsaturados(AGI)Po,O,LyLn:
%molesAGS=%molesP+%molesS/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)%molesAGI=100-%molesAGS.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—83
▼M13
4.5.5. Cálculo de la composición de los ácidos grasos en las posi-
ciones2y1-3delosTG
Losácidosgrasossedistribuyenentresgruposdelsiguientemodo:dos
idénticosparalasposiciones 1y3yunoparalaposición2,concoefi-
cientes diferentes para los ácidos saturados (P y S) y los insaturados
(Po,O,LyLn).
4.5.5.1. Ácidosgrasossaturadosenlaposición2[P(2)yS(2)]
%molesP(2)=%molesP(1,2,3)*0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)%molesS(2)=%molesS(1,2,3)*0,06
4.5.5.2. Ácidosgrasosinsaturadosenlaposición2[Po(2),O(2),L(2)yLn(2)]
%molesPo2 ðÞ ¼%molesPo1 ;2;3 ðÞ
%molesAGI/C3100 /C0%molesP2 ðÞ/C0%molesS2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)%molesO2 ðÞ ¼
%molesO1 ;2;3 ðÞ
%molesAGI/C3100 /C0%molesP2 ðÞ/C0%molesS2 ðÞ ½/C138
%molesL2 ðÞ ¼%molesL1 ;2;3 ðÞ
%molesAGI/C3100 /C0%molesP2 ðÞ/C0%molesS2 ðÞ ½/C138
%molesLn2 ðÞ ¼%molesLn1 ;2;3 ðÞ
%molesAGI/C3100 /C0%molesP2 ðÞ/C0%molesS2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3. Ácidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3),
L(1,3)yLn(1,3)]
%molesP1 ;3ðÞ ¼%molesP1 ;2;3 ðÞ /C0%molesP2 ðÞ
2þ%molesP1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)%molesS1 ;3ðÞ ¼
%molesS1 ;2;3 ðÞ /C0%molesS2 ðÞ
2þ%molesS1 ;2;3 ðÞ
%molesPo1 ;3ðÞ ¼%molesPo1 ;2;3 ðÞ /C0%molesPo2 ðÞ
2þ%molesPo1 ;2;3 ðÞ
%molesO1 ;3ðÞ ¼%molesO1 ;2;3 ðÞ /C0%molesO2 ðÞ
2þ%molesO1 ;2;3 ðÞ
%molesL1 ;3ðÞ ¼%molesL1 ;2;3 ðÞ /C0%molesL2 ðÞ
2þ%molesL1 ;2;3 ðÞ
%molesLn1 ;3ðÞ ¼%molesLn1 ;2;3 ðÞ /C0%molesLn 2 ðÞ
2þ%molesLn1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Cálculo de los triglicéridos
4.5.6.1. TGconunácidograso(AAA;enestecaso,LLL,PoPoPo)
%molesAAA ¼%molesA1 ;3ðÞ /C3%molesA2 ðÞ/C3%molesA1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TGcondosácidosgrasos(AAB;enestecaso,PoPoL,PoLL)
%molesAAB ¼%molesA1 ;3ðÞ /C3%molesA2 ðÞ/C3%molesB1 ;3ðÞ /C32
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
%molesABA ¼
%molesA1 ;3ðÞ /C3%molesB2 ðÞ/C3%molesA1 ;3ðÞ
100001991R2568—ES—22.05.2002—019.001—84
▼M13
4.5.6.3. TGcontresácidosgrasosdiferentes(ABC;enestecaso,OLLn,PLLn,
PoOLn,PPoLn)
%molesABC ¼%molesA1 ;3ðÞ /C3%molesB2 ðÞ/C3%molesC 1 ;3ðÞ /C32
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) %molesBCA ¼
%molesB1 ;3ðÞ /C3%molesC2 ðÞ/C3%molesA1 ;3ðÞ /C32
10000
%molesCAB ¼%molesC1 ;3ðÞ /C3%molesA2 ðÞ/C3%molesB 1 ;3ðÞ /C32
10000
4.5.6.4. TriglicéridosconECN42
Los triglicéridos siguientes con ECN42 se calculan según las ecua-
ciones7,8y9,porordenprevistodeelución enHPLC(normalmente
sólotrespicos).
LLL
PoLLeisómerodeposiciónLPoLOLLneisómerosdeposiciónOLnLyLnOL
PoPoLeisómerodeposiciónPoLPo
PoOLneisómerosdeposiciónOPoLnyOLnPoPLLneisómerosdeposiciónLLnPyLnPL
PoPoPo
SLnLneisómerodeposiciónLnSLnPPoLneisómerosdeposiciónPLnPoyPoPLn
LostriglicéridosconECN42seobtienenmediantelasumadelosnueve
triglicéridos,incluidossusisómerosdeposición.Elresultadoseexpresa
con,comomínimo,dosdecimales.
5.Evaluacióndelosresultados
Se comparan el contenido teórico calculado y el determinado por
HPLC. Si la diferencia entre los datos de HPLC y los datos teóricos
es superior al valor establecido para la categoría correspondiente de
aceiteenelReglamento,lamuestracontieneaceitedesemillas.
Nota:Losresultadosseexpresanconunacifradecimal.
6.Ejemplo(los números hacen referencia a las secciones del texto del
método)
4.5.1. Cálculo del porcentaje de moles de los ácidos grasos a
partirdelosdatosobtenidosmedianteGLC(%superficie)
Los datos siguientes de la composición de ácidos grasos se obtienen
medianteGLC:
AG
PMP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
%sup. 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Transformación del % superficie en moles para todos los
ácidosgrasos
molesP ¼10
256 ;4¼0;03900molesP Véasefórmula(1)
molesS ¼3
284 ;5¼0;01054molesS Véasefórmula(1)
molesPo ¼1
254 ;4¼0;00393molesPo Véasefórmula(1)1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—85
▼M13
molesO ¼75
282 ;5¼0;26549molesO Véasefórmula(1)
molesL ¼10
280 ;4¼0;03566molesL Véasefórmula(1)
molesLn ¼1
278 ;4¼0;003594molesLn Véasefórmula(1)
Total =0,35822molesTG
4.5.4. Normalización al 100 % de los ácidos grasos
%molesP1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900molesP /C3100
0;35822moles¼10;888% Véasefórmula(2)
%molesS1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054molesS /C3100
0;35822moles¼2;944% Véasefórmula(2)
%molesPo1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393molesPo /C3100
0;35822moles¼1;097% Véasefórmula(2)
%molesO1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549molesO /C3100
0;35822moles¼74;113% Véasefórmula(2)
%molesL1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566molesL /C3100
0;35822moles¼9;956% Véasefórmula(2)
%molesLn1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359molesLn /C3100
0;35822moles¼1;003% Véasefórmula(2)
Total%moles =100,0%
Sumadelosácidosgrasossaturadoseinsaturadosenlasposiciones1,2
y3delosTG:
%molesAGS=10,888%+2,944%=13,831% Véasefórmula(3)
%molesAGI=100,000%−13,831%=86,169% Véasefórmula(3)
4.5.5. Cálculo de la composición de ácidos grasos en las posi-
ciones2y1-3delosTG
4.5.5.1. Ácidosgrasossaturadosenlaposición2[P(2)yS(2)]
%molesP(2)=10,888%*0,06=0,653%moles Véasefórmula(4)
%molesS(2)=2,944%*0,06=0,177%moles Véasefórmula(4)
4.5.5.2. Ácidos grasos insaturados en la posiciones 1 y 3 [Po(1,3), O(1,3),
L(1,3)yLn(1,3)]
%molesPo2 ðÞ¼1;097%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼1;263%moles Véase
fórmula(5)
%molesO2 ðÞ ¼74;113%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295%moles Véase
fórmula(5)
%molesL2 ðÞ ¼9;956%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458%moles Véase
fórmula(5)
%molesLn2 ðÞ ¼1;003%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154%moles Véase
fórmula(5)
4.5.5.3. Ácidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3),
L(1,3)yLn(1,3)]
%molesP1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005%moles Véasefórmula(6)1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—86
▼M13
%molesS1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327%moles Véasefórmula(6)
%molesPo1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015%moles Véasefórmula(6)
%molesO1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522%moles Véasefórmula(6)
%molesL1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205%moles Véasefórmula(6)
%molesLn1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927%moles Véasefórmula(6)
4.5.6. Cálculo de triglicéridos
Apartir de la composición calculada de losácidos grasos en las posi-
cionessn-2ysn-1,3(véaseelsiguientecuadro):
AGen Posición1y3 Posición2
P 16,005% 0,653%
S 4,327% 0,177%
Po 1,015% 1,263%
O 68,522% 85,295%L 9,205% 11,458%Ln 0,927% 1,154%
Suma 100,0% 100,0%
Secalculanlostriglicéridossiguientes:
LLL
PoPoPoPoLLconunisómerodeposición
SLnLnconunisómerodeposición
PoPoLconunisómerodeposiciónPPoLncondosisómerosdeposiciónOLLncondosisómerosdeposición
PLLncondosisómerosdeposición
PoOLncondosisómerosdeposición
4.5.6.1. TGconunácidograso(LLL,PoPoPo) Véasefórmula(7)
%molesLLL ¼
9;205% /C311;458% /C39;205%
10000=0,09708molLLL
%molesPoPoPo ¼1;015% /C31;263% /C31;015%
10000=0,00013molPoPoPo
4.5.6.2. TGcondosácidosgrasos(PoLL,SLnLn,PoPoL) Véasefórmula(8)
%molesPoLL þLLPo ¼1;015% /C311;458% /C39;205% /C32
10000=0,02141
%molesLPoL ¼9;205% /C31;263% /C39;205%
10000=0,01070
0,03211molPoLL
%molesSLnLn þLnLnS ¼4;327% /C31;154% /C30;927% /C32
10000=0,000931991R2568—ES—22.05.2002—019.001—87
▼M13
%molesLnSLn ¼0;927% /C30;177% /C30;927%
10000 =0,00002
0,00095molSLnLn
%molesPoPoL þLPoPo ¼1;015% /C31;263% /C39;205% /C32
10000=0,00236
%molesPoLPo ¼1;015% /C311;458% /C31;015%
10000=0,00118
0,00354molPoPoL
4.5.6.3. TGcontresácidosgrasosdiferentes(PoPLn,OLLn,PLLn,PoOLn)
Véasefórmula(9)
%molesPPoLn ¼16;005% /C31;263% /C30;927% /C32
10000=0,00375
%molesLnPPo ¼0;927% /C30;653% /C31;015% /C32
10000=0,00012
%molesPoLnP ¼1;015% /C31;154% /C316;005% /C32
10000=0,00375
0,00762molPPoLn
%molesOLLn ¼68;522% /C311;458% /C30;927% /C32
10000=0,14577
%molesLnOL ¼0;927% /C385;295% /C39;205% /C32
10000=0,14577
%molesLLnO ¼9;205% /C31;154% /C368;522% /C32
10000=0,14577
0,43671molOLLn
%molesPLLn ¼16;005% /C311;458% /C30;927% /C32
10000=0,03400
%molesLnPL ¼0;927% /C30;653% /C39;205% /C32
10000=0,00111
%molesLLnP ¼9;205% /C31;154% /C316;005% /C32
10000=0,03400
0,06911molPLLn
%molesPoOLn ¼1;015% /C385;295% /C30;927% /C32
10000=0,01605
%molesLnPoO ¼0;927% /C31;263% /C368;522% /C32
10000=0,01605
%molesOLnPo ¼68;522% /C31;154% /C31;015% /C32
10000=0,01605
0,04815molPoOLn
ECN42=0,69540molTG1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—88
▼M14
Figura 1:Representación gráfica del log alfa frente a f (número de enlaces
dobles)
Nota:La: ácido laúrico; My: ácido mirístico; P: ácido palmítico; St:
ácido esterárico; O: ácido oleico; L: ácido linoleico; Ln: ácido
linolénico.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—89
▼M14
Figura2:aceite desoja
Figura3:aceite desoja/aceite deoliva30/70
1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—90
▼M14
Figura4:aceite deoliva
1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—91
▼M19
ANEXOXIX
DETERMINACIÓNDELCONTENIDODEALCOHOLESALIFÁTICOS
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA
CAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de alcoholes alifáticos en las materias grasas, expresado
como contenido de cada uno de los alcoholes alifáticos analizados y
comocontenidototal.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadido 1-eico-
sanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
potásico;acontinuación,extraccióndelinsaponificableconéteretílico.
Separación de la fracción alcohólica del insaponificable mediante
cromatografía en placa de gel de sílice básica; los alcoholes recupe-
rados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se
analizanmediantecromatografíadegasesconcolumnacapilar.
3. EQUIPO
3.1. Matrazde250ml,provistoderefrigerante dereflujoconjuntasesme-
riladas.
3.2. Embudosdedecantaciónde500ml.3.3. Matracesde250ml.
3.4. Equipocompletodecromatografíaencapafina(fasesólida),conplacas
devidriode20×20cm.
3.5. Lámparaultravioletadeunalongituddeondade366o254nm.
3.6. Microjeringasde100y500 µl.
3.7. EmbudocilíndricofiltranteconfiltroporosoG3(porosidad15-40 µm),
de2cmdediámetroy5cmdealtura,aproximadamente,conundispo-
sitivo adecuado para la filtración en vacío y una junta esmerilada
macho12/21.
3.8. Matrazcónicoparavacíode50ml,conjuntaesmeriladahembra12/21
acoplablealembudofiltrante(3.7).
3.9. Tubode10mldefondocónicocontapónhermético.
3.10. Cromatógrafo de gases que pueda funcionar con columna capilar,
provistodeunsistemadefraccionamiento,formadopor:
3.10.1. Hornotermostáticoparalacolumna,quepuedamantenerlatemperatura
deseadaconprecisiónaproximadade1ºC.
3.10.2. Inyector termorregulable con elemento vaporizador de vidrio persilani-
zado.
3.10.3. Detectordeionizacióndellamayconvertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integradorquepuedafuncionarconunconvertidor-amplifi-
cador, con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y con
velocidaddepapelvariable.
3.11. Columnacapilardevidrioosílicefundida,de20a30mdelongitudy
de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interior, recubierta interiormente de
líquidoSE-52,SE-54oequivalente,conunespesoruniformequeoscile
entre0,10y0,30 µm.
3.12. Microjeringa de 10 µl para cromatografia de gases, con aguja endure-
cida.
3.13. Balanzadeprecisiónconsensibilidadde1mgeindicaciónde0,1mg.
4. REACTIVOS
4.1. Hidróxido potásico en solución etanólica aproximadamente 2 N:
disolver,enfriandoalmismotiempo,130gdehidróxidopotásico(título
mínimo del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un
litroconetanol.Conservarlasoluciónenbotellasdevidrioopacobien
cerradas.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—92
▼M19
4.2. Éteretílicodecalidadparaanálisis.
4.3. Sulfatosódicoanhidrodecalidadparaanálisis.
4.4. Placasdevidriorecubiertas congeldesílice, sinindicador defluores-
cencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya
preparadasparaeluso).
4.5. Hidróxidopotásicoensoluciónetanólica0,2N:disolver13gdehidró-
xidopotásicoen20mldeaguadestiladaycompletarhastaunlitrocon
etanol.
4.6. Bencenoparacromatografía(5.2.2).4.7. Acetonaparacromatografía(5.2.2).
4.8. Hexanoparacromatografía(5.2.2).
4.9. Éteretílicoparacromatografía(5.2.2).4.10. Cloroformodecalidadparaanálisis.4.11. Solución de referencia para cromatografía en capa fina: colesterol o
fitosterol,soluciónal0,5%encloroformo.
4.12. Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol; para hacerla
ligeramente básicaseañadenalgunasgotasdesoluciónalcohólica 2N
dehidróxidopotásico.
4.13. Piridinaanhidraparacromatografía.4.14. Hexametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.
4.16. SoluciónpatróndetrimetilsililéteresdelosalcoholesalifáticosdeC
20a
C28; debe prepararse en el momento de utilización a partir de mezclas
dealcoholespuros.
4.17. 1-eicosanol,soluciónal0,1%(m/v)encloroformo(patróninterno).4.18. Gasportador:hidrógenooheliopuro,decalidadparacromatografíade
gases.
4.19. Gasauxiliar:nitrógenopuro,decalidadparacromatografíadegases.
5. PROCEDIMIENTO5.1.Preparacióndelinsaponificable
5.1.1. Con la microjeringa de 500 µl, introducir en el matraz de 250 ml un
volumendesolucionde1-eicosanolal0,1%encloroformo(4.17)que
contenga una cantidad de 1-eicosanol correspondiente al 10 % aproxi-
madamente del contenido de alcoholes alifáticos en la alícuota de la
muestraparaladeterminación.Porejemplo,para5gdemuestra,añadir
250µl de la solución de 1-eicosanol al 0,1 %, si se trata de aceite de
oliva,y1500 µlsisetratadeaceitedeorujodeoliva.
Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación,
pesarconprecisión,enelmismomatraz,5gdemuestrasecayfiltrada.
5.1.2. Añadir50mldesoluciónetanólicadehidróxidopotásico2N,poneren
funcionamiento el refrigerante de reflujo y calentar al baño María con
ligeraebullición,agitandoenérgicaeininterrumpidamente hastaquese
produzca la saponificación (la solución se vuelve límpida). Calentar
durante20minutosmásy,acontinuación,añadir50mldeaguadesti-
lada por la parte superior del refrigerante; separar éste y enfriar el
matraza30ºCaproximadamente.
5.1.3. Pasar cuantitativamente el contenido del matraz a una ampolla de
decantación de 500 ml, mediante varios lavados con un total de unos
50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éteretílico, agitar enérgicamente durante unos30 segundosy dejar reposar
hastalacompletaseparacióndelasfases(nota1).
Separar la fase acuosa inferior pasándola a una segunda ampolla de
decantación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el
mismoprocedimiento,utilizandocadavezde60a70mldeéteretílico.
Nota1:Las posibles emulsiones pueden eliminarse añadiendo una
pequeñacantidad dealcoholetílico ometílico conunpulveri-
zador.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—93
▼M19
5.1.4. Reunir las fracciones etéreas en una misma ampolla de decantación y
lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de
lavadopresentereacciónneutra.
Una vez eliminada el agua de lavado, desecar con sulfato sódico
anhidro y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml
previamentepesado,lavandolaampollayelfiltroconpequeñascanti-
dadesdeéteretílico.
5.1.5. Destilar eléter hasta quequede unapequeña cantidad; acontinuación,
secarenvacíoligerooencorrientedenitrógenoycompletarelsecado
enestufa a100ºCdurante 15minutosaproximadamente; dejar enfriar
enundesecadorypesar.
5.2.Separacióndelafracciónalcohólica
5.2.1. Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas
con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2 N de hidróxido
potásico (4.5) durante 10 segundos; dejarlas en reposo; secarlas bien
bajo campana de aspiración durante dos horas y, por último, ponerlas
enestufaa100ºCduranteunahora.
Sacarlas de la estufa y conservarlas en un desecador de cloruro de
calciohastaelmomentodeluso(lasplacassometidasaestetratamiento
debenutilizarseenelplazodequincedíascomomáximo).
Nota2:Siseutilizanplacasbásicasdegeldesíliceparalaseparación
delafracciónalcohólica,yanoesnecesariotratarelinsaponi-
ficableconalúmina.Deestamanera,seretienenenlalíneade
aplicación todos los componentes de naturaleza ácida (ácidos
grasosyotros).Asíseobtienelabandadealcoholesalifáticos
yterpénicosnetamenteseparadadelabandadeesteroles.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de
hexano-éter etílico 65:35 (v/v) hasta una altura de 1 cmaproxim ada-
mente(*).
Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y dejar transcurrir media
horacomomínimo,deformaquesealcanceelequilibriolíquido-vapor.
En lascaras interiores de lacubeta pueden colocarse tiras de papel de
filtroquesesumerjaneneleluyente:deestamaneraeltiempodedesa-
rrollosereducecasiuntercioyseobtieneunaeluciónmásuniformey
regulardeloscomponentes.
Nota3:A fin de que las condiciones de elución sean perfectamente
reproducibles,lamezcladebecambiarseparacadaprueba.
5.2.3. Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 %
aproximadamente y, con la microjeringa de 100 µl, depositar 0,3 ml
de dicha solucion en la placa cromatográfica (5.2.1) a unos 2 cm de
unodelosbordes,formandounalíneacontinualomásfinayuniforme
posible. A la altura de la línea de aplicación se depositan, en un
extremo de la placa, de 2 a 3 µl de la solucion de referencia de
alcoholes alifáticos (4.11) para poder identificar la banda de alcoholes
alifáticosenelrevelado.
5.2.4. Introducirlaplacaenlacubetadedesarrollo,preparadacomoseindica
en el punto 5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura de entre 15 y
20 ºC. Tapar inmediatamente la cubeta con su tapa y dejar que se
produzca la elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm
aproximadamentedelbordesuperiordelaplaca.
Sacarlaplacadelacubetayevaporareldisolventeenunacorrientede
aire caliente o bien dejando la placa bajo campana de aspiración un
brevemomento.
5.2.5. Pulverizarlaplacaligerayuniformementeconlasoluciónde2,7-diclo-
rofluoresceína. Identificar la banda de alcoholes alifáticos mediante
comparación con la mancha obtenida con la solución de referencia;
marcar con lápiz negro el conjunto de la banda de alcoholes alifáticos
ydelabandainmediatamente superiorcorrespondiente alosalcoholes
triterpénicos.
Nota4:La prescripción de recoger el conjunto de la banda de
alcoholes alifáticos y de la banda de alcoholes terpénicos
respondealhechodequeésta,enlascondicionesdelmétodo,
incluyecantidadessignificativasdealcoholesalifáticos.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—94
(*) En ciertos casos particulares, para obtener una buena separación de las bandas es
necesarioemplearcomoeluyentelamezclabenceno-acetona95/5(v/v).
▼M19
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área
delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el
embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclar
cuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo
elfiltradoenelmatrazcónico(3.8)acopladoalembudofiltrante.
Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando
cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo
matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener
unvolumenaproximadode4a5ml,transvasarlasoluciónresidualal
tubo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suaveencorriente ligera denitrógeno,recoger
conalgunasgotasdeacetona,evaporardenuevohastasequedad,intro-
ducir en estufa a 105 ºC durante unos 10 minutos, dejar enfriar en el
desecadorypesar.
Elresiduoquequedaeneltubodeensayoestáformadoporlafracción
alcohólica.
5.3.Preparacióndelostrimetilsililéteres
5.3.1. Agregar al tubo que contiene la fracción de alcoholes el reactivo de
silanizaciónformadoporunamezcladepiridina,hexametildisilazano y
trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 5), a razón de 50 µl por mili-
gramodealcoholesevitandotodaabsorcióndehumedad(nota6).
Nota5:Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además,
también existen otros reactivos de silanización, como la bis-
trimetilsililtrifluoroacetamida +1%detrimetilclorosilano,que
sediluyeenelmismovolumendepiridinaanhidra.
Nota6:Laeventual formación deunaligera opalescencia esnormaly
noocasionaningunainterferencia. Laformacióndeunaflocu-
laciónblancaolaaparicióndeunacoloraciónrosasonindicios
de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este
casodeberárepetirselaprueba.
5.3.2. Tapareltuboyagitarcuidadosamente(sininvertir)hastalatotaldiso-
lución de los alcoholes. Dejar reposar al menos un cuarto de hora a
temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos; la solu-
ción límpida queda lista para el análisis mediante cromatografía de
gases.
5.4.Cromatografíadegases
5.4.1. Operacionespreliminares:acondicionamientodelacolumna
5.4.1.1. Colocarlacolumnaenelcromatógrafodegases,uniendoelextremode
entrada al inyector conectado al sistema de fraccionamiento y el
extremo de salida al detector. Efectuar los controles generales del
equipo de cromatografía de gases (estanqueidad de los circuitos de
gases, eficacia del detector, eficacia del sistema de fraccionamiento y
delsistemaderegistro,etc.).
5.4.1.2. Silacolumnaseutilizaporvezprimera,esconvenienteacondicionarla
previamente.Hacerpasarunligeroflujodegasatravésdelacolumna,
encender después el equipo de cromatografía de gases e iniciar un
calentamientogradualhastaalcanzarunatemperaturasuperioralmenos
en20ºCalatemperaturadetrabajo(nota7).Mantenerdichatempera-
tura durante 2 horas como mínimo; a continuación, poner el equipo
completo en condiciones de funcionamiento [regulación del flujo de
gases y del fraccionamiento ( split), encendido de la llama, conexión
con el registrador electrónico, regulación de la temperatura del horno,
deldetectorydelinyector,etc.]yregistrarlaseñalconunasensibilidad
almenosdosvecessuperioralaprevistaparaelanálisis.Eltrazadode
lalíneadebasedebeserlineal,estarexentodepicosdecualquiertipo
ynodebepresentarderiva.Unaderivarectilíneanegativaindicaquelas
conexionesdelacolumnanosontotalmente estancas;unaderivaposi-
tivaindicaqueelacondicionamientodelacolumnaesinsuficiente.
Nota7:Latemperaturadeacondicionamientodebesersiempreinferior
en,comomínimo,20ºCalatemperaturamáximaprevistapara
lafaseestacionariautilizada.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—95
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5.4.2. Eleccióndelascondicionesdetrabajo
5.4.2.1. Lascondicionesdetrabajosugeridassonlassiguientes:
— temperaturadelacolumna:inicialmenteisotermadurante8minutos
a180ºC;acontinuación,programarunincrementode5ºC/minuto
hastaalcanzarlos260ºCymantenerdespués15minutosa260ºC,
— temperaturadelevaporador(inyector):280ºC,
— temperaturadeldetector:290ºC,— velocidadlinealdelgasportador:helio20a35cm/s,hidrógeno30
a50cm/s,
— relacióndefraccionamiento( split):de1/50a1/100,
— sensibilidaddelinstrumento:de4a16veceslaatenuaciónmínima,
— sensibilidadderegistro:1a2mVf.e.,
— velocidaddelpapel:30a60cm/hora,
— cantidaddesustanciainyectada:0,5a1 µldesolucióndeTMSE.
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
delacolumna ydelcromatógrafo, demodoqueseobtengancromato-
gramasquecumplanlossiguientesrequisitos:
— eltiempoderetencióndelalcoholC
26debeserde18±5minutos,
— elpicodelalcoholC22debeserel80±20%delaescaladefondo
enelcasodelaceitedeolivayel40±20%delaescaladefondo
enelcasodelaceitedesemillas.
5.4.2.2. Para comprobar los requisitos citados, efectuar varias inyecciones de
mezclas problema de TMSE de alcoholes y ajustar las condiciones de
trabajoparaobtenerlosmejoresresultados.
5.4.2.3. Losparámetrosdeintegracióndelospicosdebenestablecersedemodo
que se obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos
tomadosenconsideración.
5.4.3. Realizacióndelanálisis
5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 µl tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µld e
airey,acontinuación,entre0,5y1 µldelasoluciónproblema;elevar
elémbolodelajeringademodoquelaagujaquedevacía.Introducirla
agujaatravésdelamembranadelcomplejodeinyeccióny,despuésde
1 o 2 segundos, inyectar rápidamente; transcurridos unos 5 segundos,
extraerlaagujalentamente.
5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los
alcoholes presentes. La línea de base debe ajustarse en todo momento
alascondicionesexigidas(5.4.1.2).
5.4.4. Identificacióndelospicos
Paralaidentificación delosdiferentes picosseutilizan lostiempos de
retención y la comparación con la mezcla de TMSE de los alcoholes
alifáticos,analizadaenlasmismascondiciones.
La figura 1 muestra un cromatograma de la fracción alcohólica de un
aceitedeolivavirgen.
5.4.5. Determinacióncuantitativa
5.4.5.1. Calcularlasáreasdelospicosdel1-eicosanolydelosalcoholesalifá-
ticosC22,C24,C26yC28utilizandoelintegrador.
5.4.5.2. Calculardelmodosiguienteelcontenidodecadaunodelosalcoholes
alifáticos,expresadoenmiligramospor1000gramosdemateriagrasa:
donde:
Ax= áreadelpicodelalcoholx
As= áreadelpicodel1-eicosanol
ms= pesode1-eicosanolañadido,enmiligramos
m = pesodelamuestratomadaparaladeterminación,engramos.1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—96
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6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Seexpresaelcontenidodecadaunodelosalcoholesalifáticosenmili-
gramospor1000gramosdemateriagrasaysusumacomo«alcoholes
alifáticostotales.».1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—97
▼M19
APÉNDICE
Determinación delavelocidad linealdelgas
Inyectar en el cromatógrafo de gases, preparado para trabajar en condiciones
normales, de 1 a 3 µl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el
gasenrecorrerlacolumna,desdeelmomentodelainyecciónhastaelmomento
enqueapareceelpico(tM).
La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la
columnaencmytMeltiempo,expresadoensegundos.
Figura1—Cromatogramadelafracciónalcohólicadeunaceitevirgen
1 = Eicosanol
2 = Docosanol
3 = Tricosanol4 = Tetracosanol
5 = Pentacosanol
6 = Hexacosanol7 = Heptacosanol8 = Octacosanol1991R2568—ES—22.05.2002—019.001—98