1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B OCTAVADIRECTIVADELACOMISIÓN
de15dejuniode1978
porlaquesefijanlosmétodosdeanálisiscomunitarioparaelcontroloficialdelosalimentospara
animales
(78/633/CEE)
(DO L 206 de 29.7.1978, p. 43)
Modificada por:
Diario Oficial
nopágina fecha
►M1Directiva 81/680/CEE de la Comisión de 30 de julio de 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
OCTAVADIRECTIVADELACOMISIÓN
de15dejuniode1978
por la que se fijan los métodos de análisis comunitario para el
controloficial delosalimentosparaanimales
(78/633/CEE)
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,
Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo, de 20 de julio de 1970,
referente a la introducción de modos de toma de muestras y demétodos de análisis comunitarios para el control oficial de losalimentos para animales (
1), modificado en último lugarporel Acta de
adhesión, y en particular su artículo 2,
Considerando que la Directiva anteriormente contemplada prevé que
los controles oficiales de los alimentos para animales dirigidos a
comprobar que las condiciones prescritas en virtud de las disposicioneslegales, reglamentarias o administrativas referentes a la calidad y a lacomposición de los animales se respetan y se realizan según modos detoma de muestras y de métodos de análisis comunitarios;
Considerando que las Directivas de la Comisión 71/250/CEE, de 15 de
junio de 1971 (
2), 71/393/CEE de 18 de noviembre de 1971 (3), 72/199/
CEE de 27 de abril de 1972 (4), 73/46/CEE de 5 de diciembre de
1972 (5), 74/203/CEE de 25 de marzo de 1974(6), 75/84/CEE de 20 de
diciembre de 1974 (7) y 76/372/CEE de 1 de marzo de 1976 (8) han
fijado ya un determinado número de métodos de análisis comunitarios;que, teniendo en cuenta el grado de desarrollo de los trabajos reali-zados desde entonces, procede establecer una octava serie de métodos;
Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva
concuerdan con el dictamen del Comité permanente de alimentación
animal,
HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA:
Artículo 1
1. Los Estados miembros prescribirán que los análisis para los
controles oficiales de los alimentos para animales, en lo referente a sucontenido en bacitracina-cinc, flavofosfolipol, hierro, cobre, manganeso
y cinc, se realizarán según los métodos descritos en el anexo de la
presente Directiva.
Artículo 2
Los Estados miembros aplicarán, el 1 de enero de 1979, las disposi-
ciones legales, reglamentarias y administrativas necesarias para
cumplir las disposiciones de la presente Directiva e informarán de elloinmediatamente a la Comisión.1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1)D O noL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)D O noL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(3)D O noL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.
(4)D O noL 123 de 29. 5. 1972, p. 6.
(5)D O noL 83 de 30. 3. 1973, p. 21.
(6)D O noL 108 de 22. 4. 1974, p. 7.
(7)D O noL 32 de 5. 2. 1975, p. 26.
(8)D O noL 102 de 15. 4. 1976, p. 8.▼M1
▼B
▼B
Artículo 3
Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros.1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 3
▼B
ANEXO
1.DOSIFICACIÓN DE LA BACITRACINA-CINC POR DIFUSIÓN EN
GELOSA
1. OBJETO Y DOMINIO DE APLICACIÓN
El método permitirá dosificar la bacitracina-cinc en los alimentos, los
concentrados y las premezclas. El límite inferior de dosificación será
de 5 mg/kg (5 ppm) (*). El método no será valedero en presencia de
sustancias perturbadoras, en particular de fuertes cantidades de cobre o
de ácido ascórbico.
2. PRINCIPIO
Se someterá la muestra a una extracción a pH 2 por una mezcla de
metanol/agua/ácido clorhídrico. Se llevará el extracto a pH 6,5, concen-
trado si fuere necesario, y diluido. Se determinará su actividad
antibiótica pormedida de la difusión de la bacitr acina-cinc en un medio
de gelosa, sembrado con « Micrococcus luteus » (sinónimo: «M. flavus») .
Se revelará la difusión por la formación de zonas de inhibición del
microorganismo. Se considerará el diámetro de dichas zonas como
directamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibió-
tico para la gama de las concentraciones utilizadas.
3. MICROORGANISMO: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
3.1.Mantenimientodelextractobase
Sembrar el medio de cultivo (4.1), en tubos inclinados, con «Micro-
coccus luteus». Incubar 24 h a 30-37 ºC, conservar en refrigerador a
4 ºC aproximadamente y renovar la siembra cada dos semanas.
3.2.Preparacióndelasuspensiónbacteriana (a)
Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa (3.1), de preparación
reciente, mediante 2 a 3 ml de solución de cloruro de sodio (4.3).
Sembrar en superficie con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo
(4.1) en un frasco de Roux e incubar de 18 a 20 h a 30-37 ºC. Recoger
los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro de sodio (4.3) y homoge-
neizar. Diluir la suspensión a 1/10 mediante la solución de cloruro de
sodio (4.3). La transmisión luminosa de la suspensión, medida a
650 nm bajo un espesorde 1 cm en compar ación con la solución de
cloruro de sodio (4.3), deberá ser de 75 % aproximadamente.
4. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
4.1.Mediodemantenimientodelextracto base (b)
Peptona de carne 6,0 g
Triptona 4,0 gExtracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Glucosa 1,0 gGelosa 15,0 g
Agua 1 000 ml
pH 6,5-6,6 (después de esterilizar)
4.2.Mediodebasedeladosificación (
b)
Triptona 10,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 gGlucosa 1,0 g
Gelosa 20,0 g
Tween 80 1 mlAgua 1 000 ml
pH 6,5 (después de esterilizado)
4.3. Solución a 0,8 % (p/v) de cloruro de sodio: disolver en agua 8 g de
cloruro sodio p.a.; diluir a 1 000 ml y esterilizar.1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 4
(*) 1 mg de bacitracina-cinc (calidad para alimentos de los animales) equivale a 42
unidades internacionales (UI).
(a) Se podrán utilizar otros métodos en la medida en que estuviera demostrado que
producen una suspensión bacteriana análoga.
(b) Se podrá utilizar cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que
dé los mismos resultados.
▼B
4.4. Mezcla de metanol puro/agua/ácido clorhídrico p.a. (d: 1,18-1,19): 80/
17,5/2,5 (v/v/v).
4.5.Tapónfosfato,pH6,5:
Fosfato bipotásico K2HPO4p.a. 22,15 g
Fosfato monopotásico KH2PO4p.a. 27,85 g
Agua hasta 1 000 ml
4.6. Ácido clorhídrico p.a., d: 1,18-1,194.7. Ácido clorhídrico p.a. 0,1 N4.8. Solución 1 N de hidróxido de sodio p.a.4.9. Solución a 0,04 % (p/v) de púrpura de bromocresol:
Disolver 0,1 g de púrpura de bromocresol en 18,5 ml de solución 0,01 N
de hidróxido de sodio. Completar hasta 250 ml con agua y homoge-
neizar.
4.10. Sustancia patrón: bacitracina-cinc de actividad conocida (en UI).
5. SOLUCIONES PATRÓN
Pesar una cantidad de bacitracina-cinc patrón (4.10) correspondiente a
1 050 UI (según la dosificación indicada). Añadir5 ml de ácido clor hí-
drico 0,1 N (4.7) y dejar reposar 15 minutos. Añadir 30 ml de agua,
ajustarel pH a 4,5 mediante el tapón fosfato pH 6,5 (4.5) (alr ededor
de 4 ml), completarcon agua hasta 50 ml y homogeneizar(1 ml
= 21 UI).
Preparar a partir de dicha solución y por diluciones sucesivas mediante
el tapón fosfato pH 6,5 (4.5) las siguientes soluciones:
S
80,42 UI/ml
S40,21 UI/ml
S20,105 UI/ml
S10,0525 UI/ml
6. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO
6.1.Extracción
6.1.1. Concentrados, premezclas y alimentos minerales
Pesaruna cantidad de muestr a de 2 a 5 g, añadir30 ml de la mezcla
(4.4) y agitar brevemente. Comprobar que el pH es de 2 aproximada-
mente. Agitardur ante 10 minutos, añadir30 ml de tapón fosfato pH
6,5 (4.5) y agitardur ante 15 minutos. Diluirmediante el tapón fosfato
(4.5) para obtener una concentración presunta en bacitracina-cinc de
0,42 UI/ml (= U8).
6.1.2. Concentrados proteínicos
Pesaruna cantidad de muestr a de 10 g, añadir50 ml de la mezcla (4.4)
y agitar brevemente. Comprobar que el pH es de 2 aproximadamente.
Agitardur ante 10 minutos, añadir50 ml de tapón fosfato pH 6,5 (4.5)
y agitar durante 15 minutos. Diluir mediante el tapón fosfato (4.5) para
obtener una concentración presunta en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml
(= U8).
6.1.3. Otros alimentos
Pesar una cantidad de muestra de 10 g (20 g para una presunta concen-
tración en bacitracina-cinc de 5 mg/kg), añadir 25 ml de la mezcla (4.4)
y homogeneizar durante 10 minutos aproximadamente. Añadir 25 ml de
tapón fosfato pH 6,5 (4.5), agitar durante 15 minutos y centrifugar.
Sacar20 ml de la solución que sobr enade y ajustarel pH a 6,5
mediante la solución 1 N de hidróxido de sodio (4.8) utilizando como
indicador la solución de púrpura de bromocresol (4.9). Evaporar hasta
4 ml aproximadamente en un evaporador rotativo a una temperatura
que no sobrepase. 35 ºC. Diluir el residuo con agua para obtener una
presunta concentración en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml (= U8).
6.2.Solucionesdelextracto
Preparar a partir de la solución U8y pordiluciones sucesivas (1 + 1)
mediante el tapón fosfato (4.5) las soluciones U4(presunta concentra-
ción 0,21 UI/ml), U2(presunta concentración: 0,105 UI/ml) y U1(presunta concentración: 0,0525 UI/ml).1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
7. MODALIDADES DE DOSIFICACIÓN
7.1.Inoculacióndelmediodecultivo
Sembrar a 50 ºC aproximadamente el medio de base de dosificación
(4.2) por la suspensión bacteriana (3.2). Mediante ensayos preliminares
sobre placas con el medio (4.2), determinar la cantidad de suspensión
bacteriana que permita obtener para las distintas concentraciones en
bacitracina-cinc zonas de inhibición tan extensas como sea posible y
que permanezcan aún nítidas.
7.2.Preparacióndelascajas
La difusión en gelosa se realizará en cajas con las cuatro concentra-
ciones de la solución patrón (S8,S4,S2,S1) y las cuatro
concentraciones del extracto (U8,U4,U2,U1). Cada caja deberá recibir
necesariamente las cuatro concentraciones del patrón y del extracto. A
tal fin, escogerla dimensión de las cajas de modo que se pueda ahuecar
en el medio de gelosa al menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de
diámetro, cuyos centros no estén a menos de 30 mm de distancia. Se
podrán utilizar como cajas placas de vidrio planas, coronadas por un
anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y
20 mm de altura.
Introducir en las cajas una cantidad del medio (4.2), sembrado como se
indica en 7.1, que permita obtener una capa de unos 2 mm de espesor
(50 ml para una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar,
ahuecarlas cavidades y depositaren ellas volúmenes exactamente
medidos de las soluciones del patrón y del extracto (0,10 a 0,15 ml
porcavidad, según el diámetr o).
Hacer al menos cuatro repeticiones de cada concentración de modo que
cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibi-
ción.
7.3.Incubación
Incubar las cajas de 16 a 18 horas a 30 ºC aproximadamente.
8. EVALUACIÓN
Medir el diámetro de las zonas de inhibición con 0,1 mm de tolerancia.
Para cada concentración, registrar las medidas medias en papel semi-
logarítmico anotando el logaritmo de las concentraciones en frente de
los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas más ajustadas
para la solución patrón y para el extracto procediendo, por ejemplo, de
la siguiente manera.
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución
patrón (SL) mediante la fórmula:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más elevado de la solu-
ción patrón (SH) mediante la fórmula:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto
para el nivel más bajo (UL) y el nivel más elevado (UH) sustituyendo
S1,S2,S4,yS8en las fórmulas antes citadas por U1,U2,U4yU8.
Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico. Juntando los dos
puntos, se obtendrá la recta más ajustada para la solución patrón. Proce-
diendo del mismo modo para UL y UH, se obtendrá la recta más
ajustada para el extracto.
En ausencia de cualquier interferencia, las rectas deberían ser paralelas.
En la práctica, se las considerará como paralelas cuando (SH - SL) y
(UH - UL) no difieren de más de 10 % de su media.
Si las rectas no son paralelas, se podrán eliminar o bien U1yS1, o bien
U8yS8. Los valores SL, SH, UL y UH que permiten conseguir las
rectas más ajustadas se calcularán entonces mediante las fórmulas
siguientes:1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
(a′)5S1þ2S2/C0S4
6o5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)5S4þ2S2/C0S1
6o5S8þ2S4/C0S2
6
y fórmulas análogas para UL y UH. Al utilizar dicha alternativa se
deberá igualmente proceder a una comprobación en cuanto al parale-
lismo de las rectas, como indicado más arriba. Se deberá mencionar en
el boletín de análisis la obtención de un resultado procedente de los tres
niveles.
Cuando las rectas se consideren como paralelas, se calculará el loga-
ritmo de la actividad relativa (log. A) de acuerdo con una de las
fórmulas siguientes.
Para 4 niveles
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Para 3 niveles
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′) log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Actividad real = presunta actividad × actividad relativa.
Cuando se consideren las rectas como no paralelas, se repetirá la deter-
minación. Si la misma continuara sin permitir alcanzar el paralelismo,
se calculará el logaritmo de la actividad relativa (log. A) mediante la
fórmula (c). No obstante se deberá considerar el resultado conseguido
como una aproximación y procederá mencionarlo así en el boletín de
análisis.
9. REPETIBILIDAD
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas con
una misma muestra por un mismo analista no debería pasar de:
20 % del resultado más elevado para contenidos de baciatracina-cinc de
5 a 25 mg/kg,
5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos superiores a 25 mg/kg y
hasta 50 mg/kg,
10 % del resultado más elevado para contenidos superiores a 50 mg/kg.
2.DOSIFICACIÓN DEL FLAVOFOSFOLIPOL POR DIFUSIÓN EN
GELOSA
1. OBJETO Y DOMINIO DE APLICACIÓN
El método permitirá dosificar el flavofosfolipol en los alimentos, los
concentrados y las premezclas. El límite inferior de dosificación será
de 1 mg/kg (1 ppm).
2. PRINCIPIO
Se someterá la muestra a una extracción por metanol diluido mediante
calentamiento por reflujo. El extracto será centrifugado, purificado si
fuere necesario en resinas intercambiadoras de iones y diluido. Se deter-
minará su actividad antibiótica por medida de la difusión del
flavofosfolipol en un medio de gelosa, sembrado con Staphylococcus
aureus. El diámetro de dichas zonas se considerará como si fuera direc-
tamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibiótico
para la gama de las concentraciones utilizadas.1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 7
▼B
3. MICROORGANISMO: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P
3.1.Mantenimientodelextractobase
Sembrar el medio de cultivo (4.1), en tubos inclinados, con Staphylo-
coccus aureus. Incubar 24 horas a 37 ºC, conservar en refrigerador a
4 ºC aproximadamente y renovar la siembra cada mes.
3.2.Preparacióndelasuspensiónbacteriana (a)
Extraer dos tubos que contengan el cultivo-madre (3.1) y renovar la
siembra cada semana. Incubar 24 horas a 37 ºC y conservar en refrige-
rador a 4 ºC aproximadamente.
24 horas antes de la dosificación, sembrar mediante dichos cultivos dos
a cuatro tubos inclinados que contengan el medio de cultivo (4.1).
Incubar de 16 a 18 horas a 37 ºC. Poner luego los gérmenes en suspen-
sión en la solución de cloruro de sodio (4.3). La transmisión luminosa
de la suspensión, medida a 578 nm bajo un espesorde 1 cm porcompa-
ración con la solución de cloruro de sodio, deberá ser de 40 %
aproximadamente.
4. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
4.1.Mediodemantenimientodelextracto base (b)
Peptona de carne 6,0 g
Triptona 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 gExtracto de carne 1,5 g
Glucosa 1,0 g
Gelosa 15,0 g
Agua 1 000 ml
pH 6,5 (después esterilización)
4.2.Mediodebasedeladosificación
4.2.1. Capa inferior (
c)
Peptona de carne 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 gExtracto de carne 1,5 g
Gelosa 10,0 g
Agua 1 000 mlpH 6,5 (después esterilización)
4.2.2. Capa por sembrar
Medio (4.1) sumado a 2 g de emulsión antiespumante de silicona (
d)
4.3. Solución a 0,4 % (p/v) de cloruro de sodio: disolver en agua 4 g de
cloruro de sodio p.a., diluir hasta 1 000 ml y esterilizar.
4.4. Metanol puro.
4.5. Metanol a 50 % (v/v): diluir500 ml de metanol por500 ml de agua.4.6. Metanol a 80 % (v/v): diluir800 ml de metanol (4.4) por200 ml de
agua.
4.7. Tris (hidroximetil) aminometano p.a.
4.8. Solución metanólica a 1,5 % (p/v) de cloruro de potasio: disolver 1,5 g
de cloruro de potasio p.a. en 20 ml de agua, completar hasta 100 ml
con metanol (4.4).
4.9. Intercambiador de cationes: Dowex 50 WX8, 20-50 mesh, forma Na
(cat. Serva n
o41600) o equivalente.
4.10. Intercambiador de aniones: Dowex 1X2, 50-100 mesh, forma Cl (cat.
Serva no41010) o equivalente. Antes de utilizarlo, mantener el producto
durante 12 a 14 horas en metanol a 80 % (4.6).1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 8
(a) Se podrán utilizar otros métodos en la medida en que quede demostrado que producirán
una suspensión bacteriana análoga.
(b) Se podrá utilizar cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que
dé los mismos resultados, por ejemplo Oxoid Antibiotic Medium (CM 327) sumado a
gelosa Oxoid no3 (L 13).
(c) Se podrá utilizar cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que
dé los mismos resultados, por ej. Oxoid Antibiotic Medium 2 (CM 335) sumada agelosa Oxoid n
o3 (L 13).
(d) Porejemplo SE 2 de WackerChemie GmbH, Munich.
▼B
4.11. Lana de vidrio.
4.12. Papel indicadorde pH (pH 6,6-8,1)
4.13. Ácido ascórbico.
4.14. Sustancia patrón: flavofosfolipol de actividad conocida.
5. EQUIPO
5.1. Tubo para cromatografía, de vidrio, diámetro interior: 9 mm, longitud:
150 a 200 mm, provisto de un grifo en la parte afilada de la extremidad
inferior y de un esmerilado normalizado (para empalme del embudo) en
la parte superior.
5.2. Embudo con depósito de 250 ml, con grifo y esmerilado normalizado.
5.3. Frasco cónico de 250 ml, de esmerilado normalizado.
5.4. Refrigerante de reflujo, de esmerilado normalizado.
6. SOLUCIONES PATRÓN
Disolveruna cantidad exactamente pesada de sustancia patr ón (4.14) en
metanol a 50 % (4.5) y diluir para obtener una solución madre de flavo-
fosfolipol a 100 µg/ml. Conservada en frasco tapado a 4º C, dicha
solución será estable durante dos meses.
Preparar a partir de dicha solución y por diluciones sucesivas mediante
metanol a 50 % (4.5) las soluciones siguientes:
S80,2 µg/ml
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025µg/ml
7. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO
7.1.Extracción
7.1.1. Concentrados, premezclas y alimentos minerales
Pesar una cantidad de muestra de 2 a 5 g y añadirle unos 150 mg de
ácido ascórbico (4.13). Mezclar a 150 mg de metanol a 50 % (4.5) en
un frasco (5.3) y ajustar el pH a 8,1-8,2 mediante unos 400 mg de tris
(hidroximetil) aminometano (4.7). Controlar el pH mediante papel indi-
cador(4.12). Dejarmacer ar15 minutos, ajustarde nuevo el pH a 8,1-
8,2 mediante tris (hidroximetil) aminometano (4.7) y luego hacer hervir
durante 10 minutos con refrigerante de reflujo (5.4) agitando constante-
mente. Dejar enfriar, luego centrifugar y decantar el extracto.
7.1.2. Otros alimentos
Pesaruna cantidad de muestr a de 5 a 30 g que contenga al menos 30 µg
de flavofosfolipol. Mezclara 150 ml de metanol a 50 % (4.5) en un
frasco (5.3) y ajustar el pH a 8,1-8,2 mediante unos 400 mg de tris
(hidroximetil) aminometano (4.7). Controlar el pH mediante el papel
indicador(4.12). Dejarmacer ar15 minutos, ajustarde nuevo el pH a
8,1-8,2 mediante tris(hidroximetil) aminometano (4.7) y luego hacer
hervir durante 10 minutos con refrigerante de reflujo (5.4) agitando
constantemente. Dejar enfriar, luego centrifugar y decantar el extracto.
7.2.Purificación (se podrá omitir dicha modalidad para los concen-
trados,laspremezclas ylosalimentosminerales)
Mezclar 110 ml del extracto a 11 g de intercambiador de cationes (4.9),
hacer hervir durante un minuto con refrigerante de reflujo (5.4)
agitando constantemente. Separar el intercambiador de cationes por
centrifugación o filtración. Mezclar 100 ml del extracto a 150 ml de
metanol (4.4) y dejar reposar la solución de 12 a 15 horas a 4 ºC.
Eliminar la materia floculante por filtración en frío.
Poner en el extremo inferior de un tubo (5.1) un tapón de lana de vidrio
(4.11), verter en el tubo 5 ml de intercambiador de aniones (4.10) y
lavarla columna con 100 ml de metanol a 80 % (4.6). Luego tr asvasar
en la columna mediante el embudo (5.2) un volumen de filtrado de
100 ml que se supondrá contiene al menos 16 µg de flavofosfolipol
(200 ml para una muestra de 30 g de alimento a 1 ppm). Si fuere nece-
sario, diluir el filtrado antes de trasvasarlo en la columna mediante
metanol a 80 % (4.6) para obtener una presunta concentración en flavo-
fosfolipol de 16 µg por100 ml. Regularel caudal de salida del líquido
a 2 ml aproximadamente por minuto. Eliminar la totalidad del filtrado.1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
Lavarluego la columna mediante 50 ml de metanol a 80 % (4.6) y
eliminarel filtr ado.
Diluir el flavofosfolipol mediante la solución metanólica de cloruro de
potasio (4.8) manteniendo el caudal de goteo alrededor de 2 ml por
minuto. Recoger 50 ml de la disolución en un matraz aforado, añadir
30 ml de agua y homogeneizar. Esta disolución debería tener un conte-
nido en flavofosfolipol de 0,2 µg/ml (= U8).
7.3.Solucionesdelextracto
Si fuere necesario (en particular en los casos en que se hubiere omitido
la purificación), diluir el extracto obtenido en 7.1.1 con metanol a 50 %
(4.5) para obtener una presunta concentración en flavofosfolipol de
0,2 µg/ml (= U8).
Preparar a partir de la solución U8pordiluciones sucesivas (1 + 1)
mediante metanol a 50 % (4.5) las soluciones U4(presunta concentra-
ción): 0,1 µg/ml), U2(presunta concentración: 0,05 µg/ml) y U1(presunta concentración: 0,025 µg/ml).
8. MODALIDADES DE LA DOSIFICACIÓN
8.1.Inoculacióndelmediodecultivo
Sembrar a 50 ºC aproximadamente el medio de base de la dosificación
(4.2.2) a través de la suspensión bacteriana (3.2). Gracias a ensayos
preliminares en placas con el medio (4.2.2), determinar la cantidad de
suspensión bacteriana que permita obtener para las distintas concentra-
ciones en flavofosfolipol zonas de inhibición tan extensas como sea
posible y que permanezcan aún nítidas (unos 30 ml por litro).
8.2.Preparacióndelascajas
La difusión en gelosa se realizará en cajas con las cuatro concentra-
ciones de la solución patrón (S8,S4,S2,S1) y las cuatro
concentraciones del extracto (U8,U4,U2,U1). Cada caja deberánecesa-
riamente recibir las cuatro concentraciones del patrón y del extracto. A
tal fin, escogerla dimensión de las cajas de for ma tal que se pueda
ahuecaren el medio de gelosa al menos ocho cavidades de 10 a
13 mm de diámetro, cuyos centros no estén separados por menos de
30 mm. Se podrá utilizar como cajas placas de vidrio planas, coronadas
por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro
y 20 mm de altura.
Introducir en las cajas una cantidad del medio (4.2.1) que permita
obtener una capa de 1,5 mm aproximadamente de espesor (45 ml para
una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar y añadir una
cantidad del medio (4.2.2), sembrado como indicado en el punto 8.1,
que permita obtener una capa de 1 mm de espesor (30 ml para una
caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, ahuecar las cavidades
y depositaren las mismas volúmenes exactamente medidos de las solu-
ciones del patrón y del extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad, según el
diámetro).
Hacer al menos cuatro repeticiones de cada concentración de modo que
cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibi-
ción.
8.3.Incubación
Incubarlas cajas de 16 a 18 hor as a 28-30 ºC.
9. EVALUACIÓN
Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una tolerancia de
0,1 mm. Para cada concentración, registrar las medidas medias en papel
semi-logarítmico anotando el logaritmo de las concentraciones frente a
los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas mejor ajus-
tadas para la solución patrón y para el extracto procediendo, por
ejemplo, de la siguiente manera.
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución
patrón (SL) mediante la fórmula:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más elevado de la solu-
ción patrón (SH) mediante la fórmula:1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto
para el nivel más bajo (UL) y el nivel más elevado (UH) sustituyendo
S1,S2,S4yS8en las fórmulas arriba mencionadas por U1,U2,U4yU8.
Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico. Uniendo los dos
puntos, se obtendrá la recta mejor ajustada para la solución patrón.
Procediendo del mismo modo para UL y UH, se conseguirá la recta
mejor ajustada para el extracto.
En ausencia de cualquier interferencia, las rectas deberían ser paralelas.
En la práctica, se las considerará como si fueren paralelas cuando (SH-
SL) y (UH-UL) no diferieren de más del 10 % de su media.
Si las rectas no fueren paralelas, se podrá eliminar o bien U1yS1o bien
U8yS8. Los valores SL, SH, UL y UH que permitan obtener las rectas
mejor ajustadas se calcularán entonces mediante las fórmulas
siguientes:
(a′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6o5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)S H¼5S4þ2S2/C0S1
6o5S8þ2S4/C0S2
6
y fórmulas análogas para UL y UH. La utilización de dicha alternativa
deberá igualmente ser objeto de una verificación en cuanto al parale-
lismo de las rectas como indicado más arriba. Se deberá mencionar en
el boletín de análisis la obtención de un resultado procedente de tres
niveles.
Cuando se consideren las rectas como paralelas, se calculará el loga-
ritmo de la actividad relativa (log. A) mediante alguna de las fórmulas
siguientes.
Para 4 niveles
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Para 3 niveles
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′) log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Actividad real = actividad presunta × actividad relativa.
Cuando las rectas se consideren como no paralelas, repetir la determi-
nación. Si la misma continuara sin permitir alcanzar el paralelismo,
calcular el logaritmo de la actividad relativa (log. A) mediante la
fórmula (c). Sin embargo, se deberá considerar el resultado obtenido
como aproximativo y será procedente mencionarlo en el boletín de
análisis.
10. REPETIBILIDAD
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas en
la misma muestra por el mismo analista no debería sobrepasar:
0,5 mg/kg, en valorabsoluto, par a los contenidos en flavofosfolipol de
1 a 2 mg/kg,
25 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 2 mg/
kg y hasta 10 mg/kg,
20 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 10 mg/
kg y hasta 25 mg/kg,
5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos superiores a 25 mg/kg y
hasta 50 mg/kg,
10 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 50 mg/
kg.1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
3.DOSIFICACIÓN DE LOS OLIGOELEMENTOS HIERRO, COBRE,
MANGANESOYCINC
1. OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN
El método permitirá dosificar los oligoelementos hierro, cobre, manga-
neso y cinc en los alimentos de los animales. Los límites inferiores de
determinación serán los siguientes:
Hierro (Fe) 20 mg/kg,
Cobre (Cu) 10 mg/kgManganeso (Mn) 20 mg/kgCinc (Zn) 20 mg/kg
2. PRINCIPIO
Se meterá en solución la muestra en el ácido clorhídrico después de la
eventual destrucción de las materias orgánicas. Se determinarán los
elementos hierro, cobre, manganeso y cinc, después de dilución apro-
piada, por espectrometría de absorción atómica.
3. REACTIVOS
ObservacionespreliminaresEl agua utilizada para la preparación de los reactivos y de las solu-
ciones requeridas en el transcurso del análisis deberán estar exentos de
los cationes por determinar. Se obtendrá bien por doble destilación en
un aparato de borosilicato o de cuarzo, bien por doble permutación en
resina intercambiadora de iones.
Los reactivos deberán ser al menos de la calidad «para análisis» (p.a.).
La ausencia del elemento por determinar deberá ser controlada por un
ensayo en blanco. Si fuere necesario, se someterán los reactivos a una
purificación más profunda.
Se podrán sustituir las soluciones patrón descritas a continuación por
soluciones patrón comerciales con tal que las mismas sean garantizadas
y controladas antes de su empleo.
3.1. Ácido clorhídrico p.a., d: 1,19.3.2. Ácido clorhídrico p.a., 6 N.
3.3. Ácido clorhídrico p.a., 0,5 N.
3.4. Ácido fluorhídrico a 38-40 % (v/v), con un contenido de hierro inferior
a 1 mg/l y cuyo residuo de evaporación sea inferior a 10 mg (expre-
sados en sulfatos)/l.
3.5. Ácido sulfúrico p.a., d: 1,84.3.6. Agua oxigenada p.a., a 100 vol. aproximadamente de oxígeno (30 % en
peso).
3.7. Solución patrón de hierro (1 000 µg Fe/ml): disolver 1 g de hierro de
hilo p.a. en 200 ml de ácido clorhídrico 6 N (3,2), añadir 16 ml de
agua oxigenada (3.6) y completarcon agua hasta 1 l.
3.7.1. Solución patrón de trabajo (100 µg Fe/ml): diluir la solución patrón
(3.7) con agua a 1 + 9.
3.8. Solución patrón de cobre (100 µg Cu/ml): disolver 1 g de cobre en
polvo pa en 25 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2), añadir 5 ml de agua
oxigenada (3.6) y completarcon agua hasta 1 l.
3.8.1. Solución patrón de trabajo (10 µg Cu/ml): diluir la solución patrón (3.8)
a 1 + 9 con agua; diluirluego con agua la solución obtenida a 1 + 9.
3.9. Solución patrón de manganeso (1 000 µg Mn/ml): disolver 1 g de
manganeso en polvo p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2) y
completarcon agua hasta 1 l.
3.9.1. Solución patrón de trabajo (10 µg Mn/ml): diluir la solución patrón
(3.9) con agua a 1 + 9; diluirluego con agua la solución obtenida a
1+9 .
3.10. Solución patrón de cinc (1 000 µg Zn/ml): disolver 1 g de cinc en cinta
o en placa p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2) y completar con
agua hasta 1 l.1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 12
▼B
3.10.1. Solución patrón de trabajo (10 µg Zn/ml): diluir la solución patrón
(3.10) con agua a 1 + 9; diluirluego la solución obtenida con agua a
1+9 .
3.11. Solución de cloruro de lantano: disolver 12 g de óxido de lantano en
150 ml de agua, añadir 100 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2) y
completarcon agua hasta 1 l.
4. EQUIPO
4.1. Horno de mufla, de termperatura regulable y controlada.4.2. Material de vidrio de borosilicato, resistente. Se recomendará utilizar un
material que sirva exclusivamente para las dosificaciones de los oligoe-
lementos.
4.3. Cápsulas de platino y, eventualmente, de cuarzo.4.4. Espectrofotómetro de absorción atómico, que responda a las exigencias
del método en cuanto a la sensibilidad y a la precisión en la gama de
las medidas útiles.
5. MODO OPERATIVO
5.1.Muestraquecontengacompuestosorgánicos
5.1.1. Incineración y preparación de la solución por analizar (*)
i) Colocarde 5 a 10 g de la muestr a, pesados don 0,2 mg de tole-
rancia, en una cápsula de cuarzo o de platino (4.3) (ver nota b),
secar en la estufa a 105 ºC e introducir la cápsula en el horno de
mufla (4.1) frío. Cerrar el horno (ver nota c) y elevar progresiva-
mente su temperatura para alcanzar de 450 a 475 ºC en 90 minutos
aproximadamente. Mantener dicha temperatura durante 4 a 16 horas
(por ejemplo, durante la noche) de forma a eliminar la materia
carbonosa, abrir luego el horno y dejar enfriar (ver nota d).
Humectar las cenizas con agua, luego trasvasarlas a un vaso precipi-
tado de 250 ml. Enjuagar la cápsula con 5 ml de ácido clorhídrico
(3.1) y trasvasar lentamente y con precaución la solución de
enjuague en el vaso precipitado (se podrá producir una reacción
violenta porfor mación deCO
2. Añadirluego gota a gota ácido
clorhídrico (3.1), agitando al mismo tiempo el contenido del vaso
precipitado, hasta el cese de la efervescencia. Evaporar en seco
agitando periódicamente con una varilla de vidrio.
Añadir al residuo 15 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2) y luego unos
120 ml de agua. Mezclar con la ayuda de una varilla de vidrio, dejar
la misma en el vaso precipitado y recubrir con un vidrio de reloj.
Ponerel líquido en ebullición suave y mantenerla ebullición hasta
que aparentemente ya no se disuelvan las cenizas. Filtrar en un
papel filtro sin cenizas y recoger el filtrado en un matraz aforado
de 250 ml. Lavar el vaso precipitado y el filtro con 5 ml de ácido
clorhídrico 6 N (3.2) caliente y por dos veces con agua hirviente.
Completar con agua hasta su volumen (la concentración en hl será
de 0,5 N aproximadamente).
ii) Si el residuo que se encuentre en el filtro apareciere negro (carbo-
noso), colocarlo de nuevo en el horno e incinerar a 450-475 ºC.
Dicha incineración, que requerirá únicamente algunas horas (3 a 5
horas aproximadamente) se completará cuando las cenizas aparezcan
blancas o casi blancas. Disolverel r esiduo en unos 2 ml de ácido
clorhídrico (3.1), evaporar en seco y añadir 5 ml de ácido clorhí-
drico 6 N (3.2). Calentar, filtrar la solución en el matraz aforado y
completar con agua hasta su volumen (la concentración en hl será de
0,5 N aproximadamente).1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 13
(*) Los forrajes verdes (frescos o deshidratados) podrán contener grandes cantidades de
sílice vegetal que puedan retener oligoelementos y que se deberán eliminar. Sedeberán someter las muestras de dichos alimentos al siguiente tratamiento. Efectuarla operación (5.1.1 i) hasta la fase de la filtración. Lavar el papel filtro que contenga
el residuo insoluble por dos veces con agua hirviente y colocarlo en una cápsula de
platino (4.3). Incinerar en el horno de mufla (4.1) a una temperatura inferior a 550 ºChasta que toda la materia carbonosa hubiere desaparecido por completo. Dejar enfriar,añadiralgunas gotas de agua, luego de 10 a 15 ml de ácido fluor hídr ico (3.4) yevaporar en seco a 150 ºC aproximadamente. Si el residuo conteniere aún sílice,
disolver la misma en algunos ml de ácido fluorhídrico (3.4) y evaporar en seco.
Añadir 5 gotas de ácido sulfúrico (3.5) y calentar hasta desaparición de los humosblancos. Anãdir 5 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2) y 30 ml aproximadamente deagua, calentar, filtrar la solución en un matraz aforado de 250 ml y completar hastasu volumen con agua (la concentración de hl será de 0,5 N aproximadamente). Prose-
guir el procedimiento a partir del punto 5.1.3.
▼B
Observaciones:
a) Al dosificar los oligoelementos, será oportuno llamar la atención en
cuanto a los riesgos de contaminación, en particular por el cinc, el
cobre y el hierro. Por ello los instrumentos utilizados para la prepa-
ración de las muestras deberán ser exentos de dichos metales.
Para reducir los riesgos de contaminación, convendrá trabajar en
atmósfera exenta de polvo, con un material rigurosamente limpio y
aparatos de vidrio cuidadosamente lavados. La dosificación del cinc
será especialmente sensible a las contaminaciones procedentes en
particular de los aparatos de vidrio, de los reactivos, del polvo, etc.
b) Calcular el peso de la muestra por incinerar en función del conte-
nido aproximativo del alimento en oligoelementos por dosificar y
de la sensibilidad del espectrofotómetro utilizado. Para determinados
alimentos pobres en oligoelementos, podrá ser necesario extraer una
muestra de 10 a 20 g y de limitar el volumen de la solución final a
100 ml.
c) Incinerar en un horno cerrado sin inyección de aire o de oxígeno.
d) La temperatura indicada por el pirómetro no deberá sobrepasar los
475 ºC.
5.1.2. Determinación espectrofotométrica
5.1.2.1. Preparación de las soluciones patrón
Preparar para cada oligoelemento por dosificar una gama de soluciones
patrón a partir de las soluciones patrón de trabajo 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 y
3.10.1, de forma que cada solución patrón tuviere una concentración en
HCl de 0,5 N aproximadamente y, en el caso del hierro, del manganeso
y del cinc, una concentración en cloruro de lantano que corresponda a
0,1 % de lantano (p/v). Las concentraciones escogidas en oligoele-
mentos deberán encontrarse en la zona de sensibilidad del
espectrofotómetro utilizado. Los cuadros siguientes darán, a título de
ejemplo, tipos de composición de solución patrón; según el tipo y la
sensibilidad del espectrofotómetro utilizado, podrá ser necesario escoger
otras concentraciones.
Hierro
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml de solución
patrón de trabajo
(3.7.1)
(1 ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml hl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (3.11); completar con agua
hasta 100 ml.
Cobre
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml de solución
patrón de trabajo
(3.8.1)
(1 ml = 10 µg CU) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml hl 6 N (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Completarcon agua hasta 100 ml.
Manganeso
g Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml de solución
patrón de trabajo
(3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml hl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 71978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 14
▼B
g Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (3.11); completar con agua
hasta 100 ml.
Cinc
g Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml de solución
patrón de trabajo
(3.10.1)
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ ml hl 6 N (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (3.11); completar con agua
hasta 100 ml
5.1.2.2. Preparación de la solución por analizar
Para la dosificación del cobre, la solución preparada según 5.1.1 podrá,
como regla general, utilizarse directamente. Si fuere necesario llevar su
concentración a la gama de las concentraciones de las soluciones
patrón, se podrá introducir con una pipeta una parte alícuota en un
matraz aforado de 100 ml y completar con ácido clorhídrico 0,5 N
(3.3) hasta su volumen.
Para la dosificación del hierro, del manganeso y del cinc, introducir con
la pipeta una porción alícuota de la solución preparada según 5.1.1 en
un matraz aforado de 100 ml; añadir 10 ml de solución de cloruro de
lantano (3.11) y completar con ácido clorhídrico 0,5 N (3.3) (ver
también punto 8 «Observación») hasta su volumen.
5.1.2.3. Prueba en blanco
Realizar una prueba en blanco que comprenda todas las etapas pres-
critas del modo operatorio, con exclusión de la presencia de la muestra.
No se deberá utilizar la solución patrón «O» para la prueba en blanco.
5.1.2.4. Medida de la absorción atómica
Medir la absorción de las soluciones patrón y de la solución por
analizar, utilizando una llama oxidante aire-acetileno, con las siguientes
longitudes de onda:
Fe 248,3 nm
Cu 324,8 nmMn 279,5 nm
Zn 213,8 nm.
Realizarcuatr o veces cada medida.
5.2. Compuestos minerales
En ausencia de materia orgánica, será inútil la incineración previa.
Aplicar el modo operatorio a partir del punto 5.5.1 i) del segundo apar-
tado. Se podrá omitir la evaporación en presencia de ácido fluorhídrico.
6. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Calcularla concentr ación en oligoelementos en la solución poranalizar
mediante una curva de contraste y expresar el resultado en mg de
oligoelemento porkg de muestr a (ppm).
7. REPETIBILIDAD
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas
efectuadas sobre la misma muestra por el mismo analista no debiere
sobrepasar:
— 5 mg/kg en valor absoluto, para los contenidos respectivos en
oligoelementos hasta 50 mg/kg,
— 10 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a 50
y hasta 100 mg/kg,
— 10 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos superiores a 100 y
hasta 200 mg/kg,1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 15
▼B
— 5 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a
200 mg/kg.
8. OBSERVACIÓN
La presencia de grandes cantidades de fosfatos podrá interferir en la
dosificación del hierro, del manganeso y del cinc. Se deberá corregir
dicha interferencia por adición de solución de cloruro de lantano
(3.11). Sin embargo, si la muestra tuviere una relación ponderal
CaþMg
p>2 se podrá omitir la adición de solución de cloruro de
lantano (3.11) a la solución poranalizary a las soluciones patr ón.1978L0633 — ES — 19.08.1981 — 001.001 — 16