Este documento es un instrumento de documentación y no compromete la responsabilidad de las instituciones  
►B REGLAMENTO (CE) N  o 440/2008 DE LA COMISIÓN  
de 30 de mayo de 2008  
por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el Reglamento (CE) n  o 1907/2006 del 
Parlamento Europeo y del Consejo relativo al registro, la evaluación, la autorización y la 
restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH)  
(Texto pertinente a efectos del EEE)  
(DO L 142 de 31.5.2008, p. 1)  
Modificado por:  
Diario Oficial  
n° página  fecha  
►M1 Reglamento (CE) n  o 761/2009 de la Comisión de 23 de julio de 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Reglamento (UE) n  o 1152/2010 de la Comisión de 8 de diciembre de 
2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Reglamento (UE) n  o 640/2012 de la Comisión de 6 de julio de 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Reglamento (UE) n  o 260/2014 de la Comisión de 24 de enero de 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Reglamento (UE) n  o 900/2014 de la Comisión de 15 de julio de 2014  L 247  1  21.8.2014  
Rectificado por:  
►C1 Rectificación, DO L 314 de 14.11.2012, p. 47 (640/2012)  2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1
REGLAMENTO (CE) N  o 440/2008 DE LA COMISIÓN  
de 30 de mayo de 2008  
por el que se establecen métodos de ensayo de acuerdo con el 
Reglamento (CE) n  o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del 
Consejo relativo al registro, la evaluación, la autorización y la 
restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH)  
(Texto pertinente a efectos del EEE)  
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,  
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea, 
Visto el Reglamento (CE) n  o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del 
Consejo, de 18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Preparados Químicos, se modifica la Directiva 1999/45/CE y se derogan el Reglamento (CEE) n
 o 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) 
n o 1488/94 de la Comisión así como la Directiva 76/769/CEE del 
Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la Comisión (
 1 ), y, en particular, su artículo 13, 
apartado 3, 
Considerando lo siguiente:  
(1) De acuerdo con el Reglamento (CE) n  o 1907/2006, han de adop ­
tarse a nivel comunitario métodos aplicables a los ensayos que sea necesario hacer con sustancias para obtener información sobre 
las propiedades intrínsecas de dichas sustancias.
 
(2) La Directiva 67/548/CEE del Consejo, de 27 de junio de 1967, 
relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamen ­
tarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y 
etiquetado de las sustancias peligrosas (  2 ), establece en su 
anexo V métodos de ensayo para la determinación de las propie ­
dades fisicoquímicas, toxicológicas y ecotoxicológicas de las sus ­
tancias y preparados. El anexo V de la Directiva 67/548/CEE ha sido suprimido por la Directiva 2006/121/CE del Parlamento Eu ­
ropeo y del Consejo, con efecto a partir del 1 de junio de 2008.
 
(3) Los métodos de ensayo incluidos en el anexo V de la Directiva 
67/548/CEE deben incorporarse al presente Reglamento.  
(4) El presente Reglamento no excluye el uso de otros métodos de 
ensayo, siempre que su uso se ajuste a lo establecido en el artículo 13, apartado 3, del Reglamento (CE) n
 o 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) DO L 396 de 30.12.2006, p. 1; versión corregida en el DO L 136 de 
29.5.2007, p. 3. 
( 2 ) DO 196 de 16.8.1967, p. 1. Directiva modificada en último lugar por la 
Directiva 2006/121/CE del Parlamento Europeo y del Consejo (DO L 396 de 30.12.2006, p. 853; versión corregida en el DO L 136 de 29.5.2007, p. 281).
 (5) Al elaborar los métodos de ensayo, se han de tener plenamente en 
cuenta los principios de sustitución, reducción y perfecciona ­
miento de la experimentación con animales, sobre todo cuando se llegue a disponer de métodos validados adecuados para susti ­
tuir, reducir o perfeccionar los ensayos con animales.
 
(6) Las disposiciones del presente Reglamento se ajustan al dictamen 
del Comité establecido de conformidad con el artículo 133 del Reglamento (CE) n
 o 1907/2006.  
HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:  
Artículo 1  
Los métodos de ensayo que deben aplicarse a efectos del Reglamento 
(CE) n  o 1907/2006 se recogen en el anexo del presente Reglamento.  
Artículo 2  
La Comisión revisará, cuando proceda, los métodos de ensayo incluidos 
en el presente Reglamento con el fin de sustituir, reducir o perfeccionar los ensayos con animales vertebrados.
 
Artículo 3  
Todas las referencias al anexo V de la Directiva 67/548/CEE se enten ­
derán hechas al presente Reglamento.  
Artículo 4  
El presente Reglamento entrará en vigor el día siguiente al de su pu ­
blicación en el  Diario Oficial de la Unión Europea . 
Será aplicable a partir del 1 de junio de 2008.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
ANEXO  
PARTE A: MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS 
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS  
ÍNDICE 
A.1. PUNTO DE FUSIÓN/CONGELACIÓN 
A.2. PUNTO DE EBULLICIÓN 
A3. DENSIDAD RELATIVA A.4. PRESIÓN DE VAPOR 
A.5. TENSIÓN SUPERFICIAL 
A.6. HIDROSOLUBILIDAD A.8. COEFICIENTE DE REPARTO 
A.9. PUNTO DE INFLAMACIÓN 
A.10. INFLAMABILIDAD (SÓLIDOS) A.11. INFLAMABILIDAD (GASES) A.12. INFLAMABILIDAD (EN CONTACTO CON EL AGUA) 
A.13. PROPIEDADES PIROFÓRICAS DE SÓLIDOS Y LÍQUIDOS 
A.14. PROPIEDADES EXPLOSIVAS A.15. TEMPERATURA DE AUTOINFLAMACIÓN (LÍQUIDOS Y GASES) 
A.16. TEMPERATURA RELATIVA DE AUTOINFLAMACIÓN DE 
SÓLIDOS 
A.17. PROPIEDADES COMBURANTES (SÓLIDOS) 
A.18. PESO MOLECULAR MEDIO EN NÚMERO Y DISTRIBUCIÓN 
DE LOS PESOS MOLECULARES DE LOS POLÍMEROS 
A.19. CONTENIDO DE SUSTANCIAS DE BAJO PESO MOLECULAR 
EN LOS POLÍMEROS 
A.20. COMPORTAMIENTO DE DISOLUCIÓN/EXTRACCIÓN A.21. PROPIEDADES COMBURENTES (LÍQUIDOS) 
A.22. DIÁMETRO MEDIO GEOMÉTRICO DE LAS FIBRAS PONDE ­
RADO POR LA LONGITUD
 
▼M4 
A.23. COEFICIENTE DE REPARTO (1-OCTANOL/AGUA): MÉTODO 
DE AGITACIÓN LENTA  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. PUNTO DE FUSIÓN/CONGELACIÓN  
1. MÉTODO  
La mayoría de los métodos descritos se basan en las líneas direc ­
trices de la OCDE (1). Los principios fundamentales se dan en las 
referencias (2) y {3).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Los métodos y los aparatos descritos a continuación se utilizan para 
determinar el punto de fusión de los productos químicos, cualquiera 
que sea su grado de pureza. 
La selección del método dependerá de la naturaleza de la sustancia 
problema. En consecuencia, el factor limitante dependerá de que la sustancia sea fácil, difícilmente o no pulverizable. 
En determinadas sustancias será preferible determinar el punto de 
congelación o de solidificación; las normas para proceder a dichas determinaciones también se recogen en el presente método. 
Cuando, debido a propiedades especiales de la sustancia, no pueda 
medirse convenientemente ninguno de los parámetros mencionados, puede ser adecuado medir el punto de fluidez.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
El punto de fusión se define como la temperatura a la que se produce 
la transición de fase del estado sólido al líquido a presión atmosfé ­
rica normal; esta temperatura corresponde idealmente a la tempera ­
tura de congelación. 
Dado que la transición de fase de numerosas sustancias se extiende 
en una amplia gama de temperaturas, esta se designa muchas veces con el nombre de intervalo de fusión. 
Conversión de las unidades (K a
 o C). 
t = T - 273,15 
t = temperatura Celsius, grado Celsius (  o C) 
T = temperatura termodinámica, keivin (K)  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
No es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que se 
estudie una nueva sustancia. Deberán servir, esencialmente, para comprobar el funcionamiento del método de vez en cuando y para comparar con los resultados obtenidos mediante otros métodos. 
En la referencia (4) se enumeran determinadas sustancias de calibra ­
ción.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se determina la temperatura {o intervalo de temperatura) de transi ­
ción de fase del estado sólido al liquido o viceversa. En la práctica, las temperaturas del inicio y del final del proceso de fusión/conge ­
lación se determinan al calentar/enfriar una muestra de la sustancia 
problema a presión atmosférica. Se describen cinco tipos de méto ­
dos: el método de tubo capilar, el método de superficie caliente, determinación de la temperatura de congelación, métodos de análisis 
térmico y determinación del punto de fluidez (como el método ela ­
borado para derivados del petróleo). 
En algunos casos puede ser conveniente medir la temperatura de 
congelación en lugar de la temperatura de fusión.
 
1.4.1.  Método de tubo capilar  
1.4.1.1.  Dispositivos de temperatura de fusión con baño líquido  
Introducir en un tubo capilar una pequeña cantidad de sustancia 
finamente pulverizada y comprimirla firmemente. Calentar dicho 
tubo al mismo tiempo que un termómetro y ajustar el aumento de temperatura a poco menos de 1 K por minuto, durante la fusión real. Tomar nota de las temperaturas correspondientes al comienzo y al 
final de la fusión.
 
1.4.1.2.  Dispositivos de temperatura de fusión con bloque metálico  
El fundamento es el mismo que el descrito en el punto 1.4.1.1, con 
la diferencia de que el tubo capilar y el termómetro están colocados 
en un bloque de metal calentado y se observan a través de aberturas 
practicadas en este último.  
1.4.1.3.  Detección fotoeléctrica  
Calentar automáticamente en un cilindro metálico la muestra conte ­
nida en el tubo capilar. Por una abertura practicada en el cilindro, 
enviar un rayo de luz a través de la sustancia hacia una célula 
fotoeléctrica cuidadosamente calibrada. En el momento de la fusión, las propiedades ópticas de la mayor parte de las sustancias se mo ­
difican en el sentido de que la opacidad da paso a la transparencia. 
En consecuencia, la intensidad de la luz que llega a la célula fotoe ­
léctrica aumenta y envía una señal de parada al indicador digital que registra la temperatura del termómetro de resistencia de platino co ­
locado en la cámara de calentamiento. Este método no es aplicable a 
determinadas sustancias muy coloreadas.
 
1.4.2.  Método de superficie caliente  
1.4.2.1.  Método de la placa caliente de Kofler  
La placa caliente de Kofler se compone de dos piezas de metal de 
conductividad térmica diferente, que se calientan eléctricamente. Está 
hecha de manera que el gradiente de temperatura sea casi lineal en toda su longitud. La temperatura de dicha placa puede variar de 283 a 573 K gracias a un dispositivo especial de lectura de la temperatura 
que tiene un cursor con un índice y una regleta graduada, especial ­
mente concebido para dicha placa. Para determinar un punto de fusión se deposita una fina capa de sustancia directamente sobre la placa caliente. En unos segundos, se forma una fina línea de división 
entre la fase fluida y la fase sólida. Leer la temperatura a la altura de 
dicha línea, colocando el índice frente a esta última.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Microscopio de fusión  
Se utilizan diferentes microscopios de platina caliente para determi ­
nar puntos de fusión con cantidades de sustancia muy pequeñas. La temperatura se suele medir con un termopar sensible, pero a veces se 
usa un termómetro de mercurio. El dispositivo tipo tiene una carcasa 
de calor que contiene una platina de metal en la que se coloca una lámina de vidrio sobre la que se deposita la muestra. El centro de la platina metálica se atraviesa con un agujero que permite el paso de la 
luz procedente del espejo de iluminación del microscopio. Al utili ­
zarlo, la carcasa se cierra con una placa de vidrio para impedir la entrada de aire a la zona de la 
El calentamiento de la muestra se regula con un reostato. Para re ­
alizar mediciones muy precisas se puede utilizar luz polarizada en el 
análisis de las sustancias ópticamente anisótropas.
 
1.4.2.3.  Método de menisco  
Este método se aplica específicamente a las poliamidas. 
Se determina la temperatura a la cual se observa, a simple vista, el 
desplazamiento de un menisco de aceite de silicona, atrapado entre 
una superficie caliente y un cubreobjetos colocado encima de la muestra de poliamida.
 
1.4.3.  Método de determinación del punto de congelación  
Introducir la muestra en un tubo de ensayo especial y colocarlo en 
un aparato que permita la determinación del punto de congelación. Agitar suavemente la muestra sin interrupción durante el enfriamien ­
to, observando al mismo tiempo la temperatura y registrándola a 
intervalos adecuados. Cuando varias lecturas indiquen una tempera ­
tura constante (previa corrección termométrica), se considera el valor de esta temperatura como el punto de congelación. 
Debe evitarse el sobreenfriamiento manteniendo el equilibrio entre 
las fases sólida y líquida.
 
1.4.4.  Análisis térmico  
1.4.4.1.  Análisis térmico diferencial (ATD)  
Esta técnica registra la diferencia de temperaturas entre ¡a sustancia y 
un material de referencia en función de la temperatura, cuando ¡a 
sustancia y el material de referencia se someten al mismo programa de temperatura controlada. Cuando la muestra sufre una transición que suponga un cambio de entalpia, ese cambio se indicará por una 
desviación endotérmica (fusión) o exotérmica (congelación) de la 
línea de base del registro de temperatura.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Calorimetría diferencial de barrido (CDB)  
Esta técnica registra la diferencia de apone energético a una sustancia 
y a un material de referencia en función de la temperatura, cuando la sustancia y el material de referencia se someten al mismo programa 
de temperatura controlada. Esta energía es la energía necesaria para 
establecer una diferencia de temperatura nula entre la sustancia y el material de referencia. Cuando la muestra sufre una transición que suponga un cambio de entalpia, ese cambio se indicará por una 
desviación endotérmica (fusión) o exotérmica (congelación) de la 
línea de base del registro del flujo de calor.
 
1.4.5.  Punto de fluidez  
Este método, desarrollado para los derivados del petróleo, es ade ­
cuado para utilizarse con sustancias oleosas de baja temperatura de 
fusión. 
Tras un calentamiento previo, se va enfriando la muestra a una 
velocidad específica y se examinan sus características Teológicas a 
intervalos de 3 K. Se registra como punto de fluidez la temperatura 
mínima a la que se aprecia movimiento de la sustancia.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
En el cuadro siguiente se indican las condiciones de aplicación y la 
precisión de los diferentes métodos de determinación del punto de 
fusión/intervalo de fusión.  
CUADRO: APLICABILIDAD DE LOS MÉTODOS  
A. Método de tubo capilar  
Método de medidas Sustancias pulve ­
rizablesSí Sustancias difícil ­
mente pulveriza ­
bles Gama de tempe ­
ratura Precisión 
estimada (  1 ) Norma existente  
Dispositivo de 
temperatura de fu ­
sión con baño li ­
quido Sí Solo algunas De 273 a 
573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Dispositivo de 
temperatura de fu ­
sión con un blo ­
que metálico Sí Solo algunas De 293 a > 
573 K ± 0,5 K ISO 1218(E) 
Detección fotoe ­
léctrica Sí Varias con dis ­
positivos de 
aplicación De 253 a 
573 K ± 0,5 K  
( 1 ) Valor dependiente del tipo de instrumento y del grado de pureza de las sustancias.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Métodos de superficie caliente y de congelación  
Método de medidas Sustancias pulve ­
rizables Sustancias difícil ­
mente pulveriza ­
bles Gama de tempe ­
ratura Precisión 
estimada (  1 ) Norma existente  
Placa caliente Ko ­
fler Sí No De 283 a > 
573K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
345176 
Microscopio de 
fusion Sí Solo algunas De 273 a > 
573K ± 0,5 K DIN 53736 
Método de me ­
nisco No Específico de 
las poliamidas De 293 a > 
573K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Métodos de punto 
de congelación Sí Sí De 223 a 
573 K ± 0,5 K por ejemplo BS 
4695  
( 1 ) Valor dependiente del tipo de instrumento y del grado de pureza de las sustancias.  
C. Análisis térmico  
Método de medidas Sustancias pulve ­
rizables Sustancias difícil ­
mente pulveriza ­
bles Gama de tempe ­
ratura Precisión 
estimada (  1 ) Norma existence  
Análisis térmico 
diferenctal Sí Sí De 173 a 
1 273 K hasta 
600 K±0,5Kh ­
asta 
1 273 K ± 2,0 
K ASTME 53776 
Calorimetría dife ­
rencial de barrido Sí Sí De 173 a 
1 273 K hasta 
600 K±0,5Kh ­
asta 
1 273 K ± 2,0 
K ASTME 53776  
( 1 ) Valor dependiente del tipo de instrumento y del grado depureza de las sustancias.  
D. Punto de fluidez  
Método de medidas Sustancias pulve ­
rizables Sustancias difícil ­
mente pulveriza ­
bles Gama de tempe ­
ratura Precisión 
estimada (  1 ) Norma existente  
Punto de fluidez Para deriva ­
dos del petró ­
leo y sustan ­
cias oleosas Para derivados 
del petróleo y 
sustancias oleo ­
sas Pe 223 a 
323 K ± 3,0 K ASTM D 9766  
( 1 ) Valor dependiente del tipo de instrumento y del grado de pureza de las sustancias.  
1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS 
Los procedimientos de casi todos los métodos de ensayo están des ­
critos en normas internacionales y nacionales (véase el apéndice 1).  
1.6.1.  Métodos de tubo capilar  
Cuando la elevación de temperatura es lenta, las sustancias finamente 
pulverizadas pasarán, normalmente, por las fases de fusión represen ­
tadas en la figura 1:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Figura I
  
Durante la determinación del punto de fusión, conviene anotar la 
temperatura al comienzo y al final de la fusión.  
1.6.1.1.  Dispositivos con baña líquido  
La figura 2 representa un tipo de aparato estandarizado de vidrio 
(JIS K 0064). Todas las dimensiones están expresadas en milímetros.  
Figura 2
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Baño líquido  
El líquido deberá elegirse en función del punto de fusión que deba 
determinarse; por ejemplo, se utilizará parafina líquida para los pun ­
tos de fusión que no pasen de 473 K, aceite de silicona para los puntos de fusión que no pasen de 573 K. 
Podrá utilizarse una mezcla de tres partes de ácido sulfúrico y dos 
partes de sulfato de potasio (en peso) para los puntos de fusión superiores a 523 K. Deben adoptarse precauciones adecuadas cuando se utilice este tipo de mezcla.
 
Termómetro  
Solo podrán utilizarse termómetros que cumplan las exigencias de 
las normas siguientes o de sus equivalentes: 
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Procedimiento  
Pulverizar finamente la sustancia seca en un mortero e introducirla 
en un tubo capilar cerrado en un extremo. La altura del contenido 
será de unos 3 mm después de haberlo comprimido bien. Para ob ­
tener una muestra uniformemente comprimida, hay que dejar caer el tubo capilar desde una altura de unos 700 mm por el interior de un 
tubo de vidrio colocado verticalmente sobre un vidrio de reloj. 
Colocar el tubo capilar, así llenado, en el baño de tal manera que la 
parte central del bulbo de mercurio del termómetro esté en contacto 
con la parte del capilar que contiene la muestra. En general, el tubo 
capilar se introduce en el aparato en el momento en que el baño está a unos 10 K por debajo del punto de fusión. 
Regular el calentamiento del baño de manera que el aumento de la 
temperatura sea de unos 3 K/minuto. Agitar el líquido. Al llegar a unos 10 K por debajo de la temperatura de fusión esperada, regular el aumento de temperatura a un máximo de 1 K/minuto.
 
Cálculo  
El cálculo del punto de fusión se efectúa mediante la fórmula si ­
guiente; 
T = T  D + 0,00016(T  D — T  E ) n 
donde 
T = temperatura de fusión corregida, expresada en K 
T D = temperatura leída en el termómetro D, expresada en K 
T E = temperatura leída en el termómetro E, expresada en K 
n = número de graduaciones de la columna de mercurio del ter ­
mómetro D en el vástago emergente.  
1.6.1.2.  Dispositiva con bloque metálico  
Aparato: 
El aparato consta de:  
— un bloque metálico cilíndrico cuya parte superior está vacía y 
forma un recinto de calentamiento (véase la figura 3), 
— un tapón metálico atravesado por dos o más agujeros que per ­
mitan la introducción de los tubos en el bloque,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— un sistema de calentamiento del bloque metálico; por ejemplo, 
una resistencia eléctrica incorporada al bloque, 
— un reostato para regular la potencia, si se utiliza calentamiento 
eléctrico, 
— cuatro ventanas de vidrio resistente al calor, diametralmente 
opuestas, en ángulo recto, en las paredes laterales del recinto. Frente a una de dichas ventanas se instalará un visor para obser ­
var el tubo capilar. Las otras tres ventanas permitirán iluminar el 
interior del recinto mediante bombillas, 
— un tubo capilar, de vidrio resistente al calor, cerrado en un ex ­
tremo (véase el punto 1.6.1.1).
 
Termómetro  
Véanse las normas citadas en el punto 1.6.1.1. También podrán 
utilizarse elementos termoeléctricos de una precisión equivalente.  
Figura 3
  
1.6.1.3.  Detección fotoeléctrica 
Aparato y procedimiento:  
El aparato consiste en un recinto metálico dotado de un sistema de 
calentamiento automático. Se llenan tres tubos capilares siguiendo las 
instrucciones del punto 1.6.1.1 y se colocan en el horno.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Se pueden hacer varios aumentos lineales de temperatura para cali ­
brar el aparato. El aumento de temperatura apropiado se regula eléc ­
tricamente con una velocidad constante y lineal preseleccionada. Los aparatos registradores indican la temperatura real del horno y la temperatura de la sustancia en los tubos capilares.
 
1.6.2.  Métodos de superficie caliente  
1.6.2.1.  Placa caliente Kofler  
Véase el apéndice.  
1.6.2.2.  Microscopio de fusión  
Véase el apéndice.  
1.6.2.3.  Método de menisco (poliamidas)  
Véase el apéndice. 
El aumento de temperatura en la zona del punto de fusión deberá ser 
inferior a 1 K/min,  
1.6.3.  Métodos de determinación del punto de congelación  
Véase el apéndice.  
1.6.4.  Análisis térmico  
1.6.4.1.  Análisis térmico diferencial  
Véase el apéndice.  
1.6.4.2.  Calorimetría diferencial de barrido  
Véase el apéndice.  
1.6.5.  Determinación del punto de fluidez  
Véase el apéndice.  
2. RESULTADOS  
En determinados casos es necesaria la corrección del termómetro,  
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— método utilizado, 
— especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, 
en su caso, fase de purificación previa, 
— estimación de la precisión. El punto de fusión indicado en el informe será la media entre dos 
mediciones, como mínimo, situadas en la zona de la precisión esti ­
mada (véase el cuadro).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Si la diferencia entre las temperaturas al comienzo y al final de la 
fusión se encuentra dentro de los límites de precisión del método, la 
temperatura leída en la fase final de la fusión se considerará el punto de fusión; de lo contrario, se indicarán las dos temperaturas. 
Si la sustancia se descompone o se sublima antes de alcanzar el 
punto de fusión, se indicará la temperatura a la que se observa el 
efecto. 
Deben indicarse todas las informaciones y observaciones que se 
consideren útiles para la interpretación de los resultados, en particu ­
lar lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council 
C (81) 30 Final. 
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics., Butterworths, Londres, 1975, vol. II, 803-834. 
(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd. ed., Interscience Publ., Nueva York, 1959, Vol I, Part I, Chapter VII. 
(4) IUPAC, Physicochemical Measurements: Catalogue of Reference 
Materials from National Laboratories, Pure and Applied 
Chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Apéndice  
Para más detalles técnicos, se pueden consultar, por ejemplo, las normas 
siguientes:  
1. Métodos de tubo capilar  
1.1. Dispositivos con baño líquido 
ASTM E 324-69 Standard Test Method for Relative Ini ­
tial and Final Melting Points and the 
Melting Range of Organic Chemicals 
BS 4634 Method for the Determination of Mel ­
ting Point and/or Melting Range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren 
J1S K 00-64 Testing Methods for Melting Point of 
Chemical Products  
1.2. Dispositivos con bloque metálico 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristalimen Kunststoffen 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of «melting point»  
2. Métodos de superficie caliente  
2.1. Placa caliente de Kofler 
ANSI/ASTM  D 3451-76 Standard Recommended Practices for 
Testing Polymeric Powder Coatings  
2.2. Microscopio de fusión 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristaliinen Kunststoffen  
2.3. Método de menisco (poliamidas) 
ISO 1218 (E) Plastics-Polyamides-Decermination of 
«Melting- Point»  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard Specification for Acetal Re ­
sin Injection Moulding and Extrusion Materials 
NF T 51050 Resines de polyamides. Determination 
du «point de fusion-. Méthode du mé ­
nisque»
 
3. Métodos de determinación del punto de congelación  
BS 4633 Method for the Determination of 
Crystallizing Point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of Petroleum Wax (Cooling Curve) 
DIN 51421 Besrimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftsroffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: determination de la 
temperature de figeage 
DIN 53175 Besrimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsauren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristalisation (point de congelation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Análisis térmico  
4.1. Análisis térmico diferencial 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by met ­
hods of, differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalyrical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Calorimetría diferencial de barrido 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by met ­
hods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating  
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
5. Determinación del punto de fusión  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des pro ­
duits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monster ­
neming en ontieding van aardoliepro ­
ducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils — Determination of 
pour point.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. PUNTO DE EBULLICIÓN  
1. MÉTODO  
La mayoría de los métodos descritos se basan en las líneas direc ­
trices de la OCDE (1). Los principios fundamentales se dan en las 
referencias (2) y (3).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Los métodos y dispositivos aquí descritos pueden aplicarse a las 
sustancias líquidas y de bajo punto de fusión que no sufran reacción 
química por debajo del punto de ebullición (por ejemplo, autooxida ­
ción, redistribución, degradación, etc.). Los métodos son aplicables a las sustancias líquidas puras e impuras. 
La importancia dada a la descripción de los métodos basados en la 
detección fotoeléctrica y en el análisis térmico se debe al hecho de 
que estos métodos permiten determinar no solo el punto de fusión sino también el punto de ebullición. Además, las medidas pueden efectuarse de manera automática. 
El «método dinámico» tiene la ventaja de poder utilizarse igualmente 
para la determinación de la presión de vapor y hacer innecesaria la corrección de la temperatura de ebullición para llevarla a las condi ­
ciones normales de presión (101,325 kPa), ya que durante la medi ­
ción se puede ajustar la presión normal mediante un manostato.  
Observaciones  
La influencia de las impurezas en la determinación del punto de 
ebullición depende mucho de la naturaleza de la impureza. Si en la muestra hay impurezas volátiles, que pudieran afectar a los resul ­
tados, puede procederse a purificar la sustancia.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La temperatura de ebullición normal se define como la temperatura 
en que la presión de vapor de un líquido es 101,325 kPa. 
Si la temperatura de ebullición no se mide a la presión atmosférica 
normal, la dependencia de la presión de vapor respecto a la tempe ­
ratura puede calcularse cuantitativamente por la ecuación de Clau ­
sius-Clapeyron:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ constante  
donde 
p = presión de vapor de la sustancia en pascales 
A H  v = su calor de vaporización en J mol  -1 
R = constante universal de los gases = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = temperatura termodinámica, expresada en K. 
La temperatura de ebullición se establece con relación a la presión 
ambiente en el momento de la medición.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Conversiones  
Presión (unidad: kPa) 
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(todavía se permite la unidad «bar» pero no es reco ­
mendable). 
133 Pa = 1 mm Hg 
1 Torr (no se permite la unidad «Torr» ni «mm Hg»). 
1 atm = atmósfera normal = 101 325 Pa 
(no se permite la unidad «atm»). 
Temperatura (unidad: K) 
t = T - 273,15 t: temperatura Celsius, grado Celsius (
 o C) 
T: temperatura termodinámica, Kelvin (K)  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
No es necesario utilizar sustancias de referencia cada vez que se estudie 
una nueva sustancia. Dichas sustancias de referencia sirven esencial ­
mente para comprobar la validez del método de vez en cuando y para poder comparar con los resultados según otros métodos. 
En los métodos enumerados en el apéndice figuran algunas sustan ­
cias de calibración.
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Cinco métodos de determinación del punto de ebullición (o del 
intervalo de ebullición) se basan en la medición de la temperatura 
de ebullición; otros dos se basan en el análisis térmico.  
1.4.1.  Método del ebullómetro  
Aunque en un principio los ebullómetros se pensaron para determi ­
nar el peso molecular por elevación del punto de ebullición, se 
prestan también para realizar mediciones exactas del punto de ebu ­
llición. En la norma ASTM D 1120-72 (véase el apéndice), se des ­
cribe un aparato muy sencillo. En dicho aparato, el líquido se ca ­
lienta en condiciones de equilibrio a la presión atmosférica hasta 
ebullición.  
1.4.2.  Método dinámico  
Este método se basa en la medición de la temperatura de reconden ­
sación del vapor mediante un termómetro adecuado que se coloca en 
el reflujo durante la ebullición. En este método puede modificarse la presión.
 
1.4.3.  Método de destilación para el punto de ebullición  
Este método se basa en la destilación del líquido, la medida de la 
temperatura de recondensación del vapor y la determinación de la 
cantidad de destilado.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Método de Siwoloboff  
Se calienta una muestra en un tubo de ensayo, que se sumerge en un 
baño caliente. Se introduce en el tubo de ensayo un capilar cerrado, con una burbuja de aire en su parte inferior.
 
1.4.5.  Detección fotoeléctrica  
De acuerdo con el principio de Siwoloboff, la ascensión de las 
burbujas permite una medición fotoeléctrica automática.  
1.4.6.  Análisis térmico diferencial  
Esta técnica registra la diferencia de temperatura entre la sustancia y 
un material de referencia en función de la temperatura, cuando la sustancia y el material de referencia se someten al mismo programa de temperatura controlada. Cuando la muestra sufre una transición 
que implique un cambio de entalpia, ese cambio se indica con una 
desviación endotérmica (ebullición) respecto a la línea base del re ­
gistro de temperatura.
 
1.4.7.  Calorimetría diferencial de barrido  
Esta técnica registra la diferencia de aporte energético a una sustan ­
cia y a un material de referencia en función de la temperatura, cuando la sustancia y el material de referencia se someten al mismo programa de temperatura controlada. Esta energía es la energía ne ­
cesaria para establecer una diferencia de temperatura nula entre la 
sustancia y el material de referencia. Cuando la muestra sufre una transición que implique un cambio de entalpia, ese cambio se indica con una desviación endotérmica (ebullición) respecto a la línea base 
del registro de flujo de calor.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
La aplicación y la precisión de los diferentes métodos utilizados para 
determinar el punto de ebullición/intervalo de ebullición se indican 
en el cuadro 1.  
Cuadro 1  
Comparación de los métodos  
Método de medición Precisión estimada Norma existente  
Ebullómerro ± 1,4 K (hasta 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (hasta 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Método dinámico ± 0,5 k (hasta 600 K) (  2 ) 
Método de destilación (intervalo de 
ebullición) ± 0,5 k (hasta 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Método de Siwoloboff ± 2 K (hasta 600 K) (  2 ) 
Detección fotoeléctrica ± 0,3 K (a 373 K) (  2 ) 
Calorimetría térmica diferencial ± 0,5 K (hasta 600 K) ± 2,0 K 
(hasta 1 273 K) ASTM E 537-76 
Calorimetría diferencial de barrido ± 0,5 K (hasta 600 K) ± 2,0 K 
(hasta 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Esta precisión solo es válida para aparatos sencillos, como el descrito en la norma ASTM D 1120-72; es posible 
mejorarla utilizando ebullómetros más perfeccionados. 
( 2 ) Válido solamente para sustancias puras. El uso en otras circunstancias debe justificarse.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS 
En las normas internacionales y nacionales (véase el apéndice) se 
describen los procedimientos de algunos métodos de ensayo.  
1.6.1.  Ebullómetro  
Véase el apéndice.  
1.6.2.  Método dinámico  
Véase el método de ensayo A.4 para la determinación de la presión 
de vapor. 
Se considera como temperatura de ebullición la registrada a una 
presión de 101,325 kPa,  
1.6.3.  Método de destilación (intervalo de ebullición)  
Véase el Apéndice,  
1.6.4.  Método de Siwoloboff  
Se introduce la muestra en un tubo de muestra de unos 5 mm de 
diámetro y se calienta en un aparato apropiado para determinar el punto de fusión (véase la figura 1). 
En la figura 1 hay un ejemplo de aparato normalizado apropiado 
para determinar el punto de fusión y el punto de ebullición (JIS K 0064). Las dimensiones están expresadas en milímetros. El 
aparato es de vidrio.
 
Figura 1
  
En el tubo de muestra que contiene la sustancia se introduce un tubo 
capilar (capilar de ebullición), cerrado a aproximadamente 1 cm de 
su extremo inferior. El nivel hasta el que se añade la sustancia problema es tal que la parte cerrada del capilar quede situada por debajo de la superficie del líquido. El tubo de muestra con el capilar 
de ebullición debe estar unido al termómetro mediante una cinta 
elástica o un soporte lateral (véase la figura 2).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Figura 2  
Método de Siwoloboff  Figura 3  
Método modificado
  
El líquido del baño se elige en función de la temperatura de ebu ­
llición. Se puede utilizar aceite de silicona para temperaturas de hasta 573 K. La parafina liquida solo puede usarse para temperaturas inferiores a 473 K. Al principio, el calentamiento del baño debe 
graduarse de manera que se obtenga un aumento de temperatura 
de 3 K por minuto. Hay que agitar el líquido del baño. A unos 10 K por debajo del punto de ebullición supuesto, se reduce el calentamiento de tal manera que el aumento de la temperatura no 
llegue a 1 K/minuto. Al acercarse a la temperatura de ebullición, 
comienzan a salir rápidamente burbujas del capilar de ebullición. 
El punto de ebullición se define como la temperatura a la cual, en un 
enfriamiento momentáneo, se interrumpe el rosario de burbujas y el 
líquido comienza a elevarse súbitamente por el capilar. La tempera ­
tura leída en el termómetro en ese preciso momento corresponde a la temperatura de ebullición de la sustancia de ensayo. 
En el método modificado (véase la figura 3), el punto de ebullición 
se determina en un capilar de punto de fusión. Este último se alarga en una punta fina de unos 2 cm de longitud (a) y se aspira hacia el interior una pequeña cantidad de sustancia. El extremo abierto del 
fino capilar se cierra por fusión, de forma que quede una pequeña 
burbuja de aire en el extremo. Al calentarla en el aparato de punto de fusión (b), la burbuja de aire se va dilatando. El punto de ebullición corresponde a la temperatura a la que el tapón de muestra llega al 
nivel de la superficie del baño de líquido (c).
 
1.6.5.  Detección fotoeléctrica  
Se calienta una muestra de la sustancia en un tubo capilar colocado 
dentro de un bloque metálico de calentamiento. 
Por las aberturas practicadas en el bloque, se envía un haz de luz a 
través de la sustancia hacia una célula fotoeléctrica calibrada en forma precisa. 
Durante el aumento de la temperatura de la muestra, van escapando 
del capilar de ebullición algunas burbujas aisladas de aire. Cuando se 
alcanza la temperatura de ebullición, el número de burbujas aumenta mucho. La consiguiente modificación de la intensidad luminosa es registrada por la célula, que envía una señal de interrupción al indi ­
cador que da la temperatura de un termómetro de resistencia de 
platino colocado en el bloque. 
Este método es especialmente útil, pues permite efectuar determina ­
ciones por debajo de la temperatura ambiente hasta 253,15 K (-20
 o C) 
sin ninguna modificación del aparato. Basta con colocar este en un 
baño refrigerante  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Análisis térmico  
1.6.6.1.  Análisis térmico diferencial  
Véase el apéndice.  
1.6.6.2.  Calorimetría diferencial de barrido  
Véase el apéndice.  
2. RESULTADOS  
Cuando haya diferencias pequeñas respecto a la presión normal 
(máxima de ± 5 kPa), las temperaturas del punto de ebullición po ­
drán normalizarse a T  n mediante la ecuación de valor numérico de 
Sidney Young: 
T n = T + (f  T × Δ p) 
donde 
A p = (101,325 — p) [atención al signo] 
p = medida de la presión, en kPa f
 T = tasa de variación del punto de ebullición con la presión, 
en K/kPa 
T = valor medido de la temperatura de ebullición, en K T
 n = valor de la temperatura de ebullición corregido a presión 
normal, en K. 
Los factores de corrección de la temperatura (f  T ) y las ecuaciones 
para su aproximación figuran en las normas internacionales citadas 
en el texto para numerosas sustancias. 
Por ejemplo, el método DIN 53171 presenta las siguientes correc ­
ciones aproximadas para disolventes contenidos en las pinturas:  
Cuadro 2  
Factores de corrección de la temperatura (f  t ) 
Temperatura T en K Factor de corrección f  T en K/kPa  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— método utilizado, — especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, 
en su caso, fase de purificación previa, 
— estimación de la precisión. 
El punto de ebullición registrado será la media entre dos mediciones, 
como mínimo, situadas en la zona de precisión estimada (véase el cuadro 1). 
Deberán indicarse los valores medidos de los puntos de ebullición 
así como su media, y la presión o presiones a que se hayan efec ­
tuado las mediciones deberán registrarse en kPa. La presión debe, 
preferentemente, ser próxima a la presión atmosférica normal. 
Deben suministrarse todas las informaciones y observaciones que se 
consideren útiles para la interpretación de los resultados, en particu ­
lar lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 103 — Decision of the 
Council C (81) 30 final. 
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, Londres 1975, vol. II. 
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., 
Nueva York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Apéndice  
Para más detalles técnicos, se pueden consultar las normas siguientes:  
1. Ebullómetro  
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Método de destilacion (intervalo de ebullicion)  
ISO/R 918 Test method for distillation (distillation 
yield and distillation range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/'71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe. Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation; determination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Analisis termico diferencial y calorimetria diferencial de barrido  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of dif ­
ferential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoa ­
nalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. DENSIDAD RELATTVA  
1. MÉTODO  
Los métodos descritos se basan en las líneas directrices de la 
OCDE (1). Los principios fundamentales se dan en la referencia (2).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Los métodos descritos de determinación de la densidad relativa son 
aplicables a las sustancias sólidas y líquidas, cualquiera que sea su 
grado de pureza. En el cuadro 1 se indican los diversos métodos utilizables.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La densidad relativa, D  20 4 , de los sólidos o líquidos es la relación 
entre la masa de un volumen de sustancia problema, determinada a 
20 o C, y la masa del mismo volumen de agua, determinada a 4  o C. 
La densidad relativa es un número adimensional. 
La densidad, p, de una sustancia es el cociente de su masa m por su 
volumen v. 
En unidades SI, la densidad, p, se expresa en kilogramos por metro 
cúbico.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA (1) (3) 
No es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que se 
estudie una nueva sustancia. Deben utilizarse, esencialmente, para comprobar la validez del método de vez en cuando y para poder 
comparar con los resultados obtenidos según otros métodos,
 
1.4. PRINCIPIO DE LOS MÉTODOS 
Se aplican cuatro clases de métodos.  
1.4.1.  Métodos de flotabilidad  
1.4.1.1.  Areómetro  (para líquidos) 
Se pueden obtener determinaciones de densidad suficientemente pre ­
cisas y rápidas con areómetros flotantes, que permiten deducir la densidad de un líquido a partir de la profundidad de inmersión leída 
en una escala graduada.
 
1.4.1.2.  Balanza hidrostática  (para sustancias líquidas y sólidas) 
La diferencia entre el peso de una muestra medido en el aire y en un 
líquido adecuado (como el agua) puede servir para determinar su densidad. 
En el caso de los sólidos, la densidad medida solo es representativa 
de la muestra utilizada en concreto. Para determinar la densidad de 
un líquido, se pesa un cuerpo, con un volumen v conocido, primero en el aire y luego en el líquido.
 
1.4.1.3.  Método del cuerpo sumergido  (para las sustancias líquidas) (4) 
En este método, la densidad de un líquido se determina a partir de la 
diferencia entre los resultados de la pesada del líquido, antes y 
después de sumergir un cuerpo de volumen conocido en dicho lí ­
quido problema.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Métodos picnométricos  
Para sólidos o líquidos, se pueden utilizar picnómetros de diversas 
formas cuyos volúmenes sean conocidos. La densidad se calculará a partir de la diferencia de peso entre el picnómetro lleno y el picnó ­
metro vacío, por una parte, y de su volumen conocido, por la otra.
 
1.4.3.  Picnómetro de comparación de aire  (para sólidos) 
La densidad de un sólido, cualquiera que sea su forma, se puede 
medir a la temperatura ambiente mediante un picnómetro de compa ­
ración de gases. El volumen de una sustancia en el aire o en un gas 
inerte se mide en una probeta calibrada de volumen variable. Para el 
cálculo de la densidad, se efectúa una medida de la masa después de la medida del volumen.
 
1.4.4.  Densímetro oscilante  (5) (6) (7) 
La densidad de un líquido se puede medir con un densímetro osci ­
lante. Un oscilador mecánico con forma de tubo en U se hace vibrar 
a la frecuencia de resonancia del oscilador, que depende de su masa. 
La introducción de una muestra modifica la frecuencia de resonancia del oscilador, el cual debe calibrarse con ayuda de dos sustancias líquidas de densidades conocidas. Las sustancias deben elegirse de 
tal manera que sus densidades cubran el intervalo de medición.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
En el cuadro se indica la aplicabilidad de los diferentes métodos que 
se utilizan para determinar la densidad relativa.  
1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS 
Las referencias de las normas citadas como ejemplo, las cuales pue ­
den consultarse para obtener detalles técnicos suplementarios, figuran 
en el apéndice. 
Los ensayos deberán realizarse a la temperatura de 20  o C y deben 
hacerse, al menos, dos medidas.  
2. RESULTADOS  
Véanse las normas.  
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— método utilizado, 
— especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, 
en su caso, fase de purificación previa. 
También se indicarán tanto la densidad relativa, D 20 
4 , según lo definido 
en el punto 1.2, como el estado físico de la sustancia examinada, 
Deben suministrarse todas las informaciones y observaciones que 
sean útiles para la interpretación de los resultados, en particular lo 
referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Cuadro  
Aplicabilidad de los métodos  
Método de medida Densidad Viscosidad diná ­
mica máxima posi ­
ble Normas existentes 
sólido líquido  
1.4.1.1. Areómetro Sí 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Balanza hidrostática a) sólidos Sí ISO 1183 (A) b) líquidos Sí 5 Pa S ISO 901 y 758 
1.4.1.3. Método del cuerpo su ­
mergido Sí 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2. Picnómetro ISO 3507 
a) sólidos Sí ISO 1183 (B), 
NF T 20-053 
b) líquidos Sí 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Picnómetro de compara 
ción de aire Sí DIN 55990 parte 
3, DIN 53243 
1.4.4. Densímetro oscilante Si 5 Pa s
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 109 — Decisión of the 
Council C (81) 30 Final. 
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry. Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Inters ­
cience Publ. Nueva York, 1959, Vol. I, Part 1, 
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realizatíon of 
physico-chemical properties. — Pure and Applied Chemistry, 1976, Vol. 48, 508. 
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Besrimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, Vol 11, 427- 
430. 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, Vol. 19, 297-302. 
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Er ­
zeugnissen — Verfahren zur Dichtebestim-mung bei flüssigen 
Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeuris ­
che Industrie, 1975, Vol. 37, 717-726. 
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenscbaft, 1976, Vol. 9, 253-255.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Apéndice  
Para más detalles técnicos, se pueden consultar las normas siguientes:  
1. Métodos de flotabilidad  
1.1. Areómetro 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer: general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydxometers; standardised 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of liquids — Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters
 
1.2. Balanza hidrostática  
Para sustancias sólidas  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics ex ­
cluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use — 
Determination of the density of solids ot ­
her than powders and cellular products — 
Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density  
Para sustancias líquidas  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density. 
ASTM D 941-55, ASTM D 12 96-67 y ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method  
1.3. Métodos del cuerpo sumergido 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of den ­
sity; immersed body method  
2. Métodos picnométricos  
2.1. Para sustancias líquidas 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pyenometer (for liquids with a kine ­
matic viscosity of less than 100,10  -6 m 2-l at 
15 o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 100, 
10—  6 m 2 s- 1 at 20  o C, applicable in 
particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids 
with higher vapour pressure, approxi ­
mately 1 bar at 90
 o C) ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for 
paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for et ­
hanol-water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by 
pycnometer 
DIN 51757 Point 1: Testing of mineral oils and rela ­
ted materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products — chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic com ­
pounds 
BS 4699 Method for determination of specific gra ­
vity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer method) 
BS 5903 Method for determination of relative den ­
sity and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer met ­
hod 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use— De ­
termination of density of solids in powder 
and liquids — Pyknometric method
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Para sustancias sólidas 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics ex ­
cluding cellular plastics. 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in powder and liquids — Pyknometric met ­
hod 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Picnómetro de comparación de aire  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. PRESIÓN DE VAPOR  
1. MÉTODO  
El presente método es equivalente a las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 104 (2004).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
La presente versión revisada del método A.4 (1) añade un método 
más (método de efusión: termogravimetría isotérmica) pensado para sustancias con presiones muy bajas (hasta un límite inferior de 10
 –10 
Pa). Teniendo presentes las necesidades en lo que se refiere a pro ­
cedimientos, especialmente en relación con la obtención de la pre ­
sión de vapor de sustancias en la que esta es baja, se reexamina asimismo la aplicabilidad en intervalos distintos de otros procedi ­
mientos de este método. 
En situación de equilibrio termodinámico, la presión de vapor de una 
sustancia pura depende exclusivamente de la temperatura. Los prin ­
cipios fundamentales se describen en otro lugar (2) y (3). 
No existe ningún procedimiento de medida que sea aplicable a toda 
la gama de presiones de vapor, desde menos de 10
 –10 hasta 10  5 Pa. 
Se incluyen en el presente método ocho procedimientos de medición 
de la presión de vapor aplicables a distintos intervalos de presión de 
vapor. En el cuadro 1 se comparan todos ellos en lo que se refiere a aplicación e intervalo de medida. Los métodos solo pueden aplicarse a compuestos que no se descompongan en las condiciones del ensa ­
yo. Cuando, por motivos técnicos, no puedan aplicarse los métodos 
experimentales, se puede recurrir a una estimación de la presión de vapor. En el apéndice figura un método de estimación recomendado.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La presión de vapor de una sustancia se define como la presión de 
saturación de la misma en equilibrio con su fase líquida o sólida. 
Debe utilizarse la unidad de presión del SI, que es el pascal (Pa). A 
continuación se citan otras unidades que se han empleado histórica ­
mente, indicando sus factores de conversión: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmósfera = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
La unidad de temperatura en el SI es el Kelvin (K). La conversión de 
grados Celsius a Kelvin se realiza mediante la fórmula: 
T = t + 273,15 
donde T es la temperatura termodinámica o Kelvin y t es la tempe ­
ratura Celsius.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Cuadro 1  
Método de medida Sustancias Repetibilidad 
estimada Reproducibilidad 
estimada Intervalo 
recomendado sólidas líquidas  
Método dinámico bajo punto de 
fusión Sí hasta el 25 % 
del 1 al 5 % hasta el 25 % 
del 1 al 5 % 10 3 a 2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 a 10  5 Pa 
Método estático Sí Sí del 5 al 10 % del 5 al 10 % 10 a 10  5 Pa 
10 –2 a 10  5 Pa (  1 ) 
Método del isote ­
niscopio Sí Sí del 5 al 10 % del 5 al 10 % 10  2 a 10  5 Pa 
Método de efusión: 
balanza de presión de vapor Sí Sí del 5 al 20 % hasta el 50 % 10
 –3 a 1 Pa 
Método de efusión: 
celda de Knudsen Sí Sí del 10 al 30 % — 10  –10 a 1 P 
Método de efusión: 
termogravimetría isotérmica Sí Sí del 5 al 30 % hasta el 50 % 10
 –10 a 1 Pa 
Método de satura ­
ción de gases Sí Sí del 10 al 30 % hasta el 50 % 10  –10 a 10  3 Pa 
Método del rotor Sí Sí del 10 al 20 % — 10  –4 a 0,5 Pa  
( 1 ) Cuando se usa un manómetro de capacitancia.  
1.3. PRINCIPIO DEL ENSAYO 
Por regla general, se determina la presión de vapor a distintas tem ­
peraturas. En un intervalo de temperaturas limitado, el logaritmo de 
la presión de vapor de una sustancia pura es función lineal de la inversa de la temperatura termodinámica, con arreglo a la ecuación de Clapeyron-Clausius simplificada:
 
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ constante  
donde: 
p = presión de vapor en pascales 
ΔHv = calor de vaporización en J mol  –1 
R = constante universal de los gases, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperatura en K.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
No es preciso utilizar sustancias de referencia. Sirven fundamental ­
mente para comprobar de vez en cuando el comportamiento de un método y para poder comparar los resultados obtenidos según dis ­
tintos métodos.
 
1.5. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS  
1.5.1.  Método dinámico (método de Cottrell)  
1.5.1.1.  Principio  
La presión de vapor se determina midiendo el punto de ebullición de 
la sustancia a diversas presiones especificadas comprendidas entre 10
 3 y 10  5 Pa aproximadamente. Este método se recomienda también 
para la determinación de la temperatura de ebullición. Para tal fin es 
útil hasta 600 K. Las temperaturas de ebullición de los líquidos a una profundidad de 3 o 4 cm son superiores a las de la superficie en aproximadamente 0,1 °C, a causa de la presión hidrostática de la 
columna de líquido. En el método de Cottrell (4), el termómetro se 
coloca en el vapor por encima de la superficie del líquido y se obliga al líquido en ebullición a bombearse continuamente sobre el bulbo del termómetro. Una fina capa de líquido que está en equilibrio con 
el vapor a presión atmosférica cubre el bulbo. De este modo, la 
lectura del termómetro indica el verdadero punto de ebullición, sin errores debidos al supercalentamiento o a la presión hidrostática. En la figura 1 se muestra la bomba empleada originalmente por Cottrell. 
El tubo A contiene el líquido en ebullición. Un hilo de platino B 
fijado en el fondo contribuye a que la ebullición sea uniforme. El tubo lateral C desemboca en un condensador, y el revestimiento D impide al condensado frío llegar al termómetro E. Cuando el líquido 
en A hierve, las burbujas y el líquido atrapados por el embudo se 
vierten a través de los dos brazos de la bomba F sobre el bulbo del termómetro.  
Figura 1
 Figura 2
  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Bomba de Cottrell (4) 
A: Termopar 
B: Volumen tampón de vacío C: Indicador de presión 
D: Vacío 
E: Punto de medida F: Elemento calefactor de unos 150 W
 
1.5.1.2.  Aparato  
La figura 2 muestra un aparato muy exacto que aplica el principio 
de Cottrell. Consta de un tubo con una sección de ebullición en la parte inferior, un refrigerante en la media y una salida y una pes ­
taña en la superior. La bomba de Cott rell se coloca en la sección de 
ebullición, que se calienta por medio de un cartucho eléctrico. La 
temperatura la mide un termopar de camisa o un termómetro de resistencia introducido a través de la pestaña de la parte superior. 
La salida se conecta al sistema de regulación de la presión, inte ­
grado por una bomba de vacío, un volumen tampón, un manostato para admitir nitrógeno con fines de regulación de la presión y un manómetro.
 
1.5.1.3.  Procedimiento  
Se coloca la sustancia en la sección de ebullición. Los sólidos no 
pulverulentos pueden presentar problemas, que a veces se resuelven calentando la camisa de refrigeración. Se cierra el aparato con la pestaña y se extrae el gas de la sustancia. Este método no es aplica ­
ble a las sustancias que formen espuma. 
Se regula a la presión más baja prevista y se acciona el sistema de 
calentamiento, conectando, simultáneamente, el termosensor a un registrador. 
Cuando éste indique una temperatura de ebullición fija, a presión 
constante, se habrá alcanzado el equilibrio. Hay que evitar las sacu ­
didas durante la ebullición. Además, debe obtenerse condensación 
completa en el refrigerante. Cuando se determina la presión de vapor 
de sólidos de bajo punto de fusión, hay que evitar que se bloquee el condensador. 
Una vez registrado el punto de equilibrio, se regulará a una presión 
más elevada y se irá repitiendo de nuevo el mismo proceso hasta que 
se alcance una presión de 10
 5 Pa (en total, de 5 a 10 medidas). Los 
puntos de equilibrio deben repetirse a presiones decrecientes para comprobar los resultados.
 
1.5.2.  Método estático  
1.5.2.1.  Principio  
En el método estático (5), se determina la presión de vapor en 
equilibrio termodinámico a una temperatura especificada. Este mé ­
todo resulta adecuado para sustancias y líquidos y sólidos multicom ­
ponente en el intervalo comprendido entre 10  –1 y 10  5 Pa y, si se 
pone el debido cuidado, también en el comprendido entre 1 y 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Aparato  
El aparato consta de un baño de temperatura constante (precisión de 
± 0,2 K), un recipiente para la muestra conectado a un sistema de vacío, un manómetro y un sistema de regulación de la presión. El 
compartimento que contiene la muestra (figura 3a) está conectado al 
sistema de vacío mediante una válvula y un manómetro diferencial (un tubo en forma de U lleno de un líquido manométrico apropiado) que se utiliza como indicador de cero. En el manómetro diferencial 
cabe utilizar mercurio, siliconas o ftalatos, según el intervalo de 
presiones y el comportamiento químico de la sustancia problema. Sin embargo, por motivos medioambientales, debe evitarse el uso 
de mercurio si es posible. La sustancia problema no debe disolverse 
de forma apreciable ni reaccionar con el líquido del tubo en U. En lugar del tubo en U puede utilizarse un indicador de presión (figura 3b). En el manómetro, el mercurio puede utilizarse en el intervalo 
desde la presión atmosférica hasta 10
 2 Pa y los aceites de silicona y 
los ftalatos de 10  2 Pa a 10 Pa. Existen otros tipos de manómetros 
que pueden utilizarse por debajo de 10  2 Pa, y los manómetros de 
capacidad de membrana calentable pueden utilizarse incluso a pre ­
siones inferiores a 10  –1 Pa. La temperatura se mide en la pared 
exterior del compartimento de la muestra o en el interior del propio compartimento.
 
1.5.2.3.  Procedimiento  
Utilizando el equipo descrito en la figura 3a, se llena el tubo en U 
con el líquido previsto, que antes de realizar las lecturas habrá sido 
desgasificado a temperatura elevada. A continuación se introduce en 
el equipo la sustancia problema y se desgasifica a temperatura redu ­
cida. Si se trata de una muestra multicomponente, la temperatura debe ser lo suficientemente baja para garantizar que la composición 
del material no se altere. El equilibrio puede alcanzarse más rápida ­
mente agitando. La muestra puede enfriarse con nitrógeno líquido o hielo seco, pero hay que tener precaución para evitar la condensación de aire o del líquido de la bomba. Se abre la llave que hay sobre el 
recipiente de la muestra y se aplica una succión durante varios 
minutos para extraer el aire. Si resulta necesario, se repite varias veces la operación de desgasificado.  
Figura 3a
 Figura 3b
  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Al calentar la muestra con la válvula cerrada aumenta la presión de 
vapor, lo que hace cambiar el equilibrio del líquido del tubo en U. 
Para compensar este fenómeno, hay que permitir la entrada de ni ­
trógeno o aire en el aparato hasta que el indicador de presión dife ­
rencial del manómetro esté otra vez a cero. La presión necesaria para 
conseguir este efecto puede leerse en el manómetro o en un ins ­
trumento de precisión superior, y corresponde a la presión de vapor de la sustancia a esa temperatura concreta de medida. Si se utiliza el equipo descrito en la figura 3b, la lectura de la presión de vapor se 
efectúa directamente. 
La presión de vapor se determina a pequeños intervalos de tempe ­
ratura adecuados (aproximadamente, entre 5 y 10 puntos de medida 
en total) hasta llegar a la temperatura máxima prevista. 
Las lecturas a baja temperatura deben repetirse como comprobación. 
Si los valores obtenidos en las lecturas repetidas no coinciden con la 
curva obtenida al ir aumentando la temperatura, puede deberse a alguna de las situaciones siguientes: 
i) la muestra sigue conteniendo aire (por ejemplo, en el caso de 
materiales de elevada viscosidad) o sustancias de bajo punto de ebullición, que se liberan durante el calentamiento, 
ii) la sustancia sufre una reacción química en el intervalo de tem ­
peraturas investigado (por ejemplo, descomposición o polimeri ­
zación).
 
1.5.3.  Método del isoteniscopio  
1.5.3.1.  Principio  
El isoteniscopio (6) se basa en el principio del método estático. Se 
trata de colocar una muestra en un bulbo mantenido a temperatura 
constante y conectado a un manómetro y a una bomba de vacío. Las impurezas más volátiles que la sustancia se eliminan desgasificando a temperatura reducida. La presión de vapor de la muestra a la 
temperatura seleccionada se equilibra mediante una presión de gas 
inerte conocida. El isoteniscopio se creó para medir la presión de vapor de determinados hidrocarburos líquidos, pero se presta igual ­
mente a la investigación de sólidos. Este método no suele adecuarse 
a los sistemas multicomponente. Los resultados exhiben solamente 
errores leves en el caso de muestras que contengan impurezas no volátiles. El intervalo recomendado es de 10
 2 a 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Aparato  
En la figura 4 se muestra un ejemplo de dispositivo de medida. En 
ASTM D 2879-86 (6) se encontrará una descripción completa.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Procedimiento  
En el caso de los líquidos, la sustancia misma sirve de líquido de 
llenado para el manómetro diferencial. Se pone en el isoteniscopio una cantidad de líquido suficiente para llenar el bulbo y el extremo corto del manómetro. El isoteniscopio se une entonces a un sistema 
de vacío y, después de hacer el vacío en su interior, se llena de 
nitrógeno. La evacuación y la purga del sistema se repiten dos veces para eliminar el oxígeno residual. El isoteniscopio lleno se coloca en posición horizontal para que la muestra se extienda formando una 
fina capa en el bulbo de la muestra y en el manómetro. Se reduce 
a 133 Pa la presión del sistema y se calienta suavemente la muestra hasta que inicie la ebullición (eliminación de gases disueltos). El isoteniscopio se cambia entonces de posición para que la muestra 
vuelva al bulbo y llene el brazo corto del manómetro. La presión se 
mantiene a 133 Pa. El extremo alargado del bulbo de la muestra se calienta con una pequeña llama hasta que el vapor originado por la muestra se expande suficientemente para desplazar parte de la mues ­
tra desde la porción superior del bulbo y del brazo del manómetro 
hacia el manómetro, creando así un espacio libre de nitrógeno y lleno de vapor. El isoteniscopio se coloca entonces en un baño termostático y se ajusta la presión del nitrógeno hasta que iguala a 
la de la muestra. En equilibrio, la presión del nitrógeno es igual a la 
presión de vapor de la sustancia.
 
Figura 4
  
En el caso de los sólidos, se utilizarán líquidos manométricos tales 
como los aceites de silicona o los ftalatos, según el intervalo de 
temperatura y presión. El líquido manométrico desgasificado se in ­
troduce en un engrosamiento del brazo largo del isoteniscopio. A continuación se introduce en el bulbo de la muestra el sólido pro ­
blema y se desgasifica a temperatura elevada. Después se inclina el 
isoteniscopio de forma que el líquido manométrico se introduzca en 
el tubo en U.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Método de efusión: balanza de presión de vapor  (7) 
1.5.4.1.  Principio  
Se calienta una muestra de la sustancia problema en un horno pe ­
queño y se introduce en una campana en la que se ha hecho el vacío. El horno está cubierto por una tapa que lleva pequeños orificios de diámetros conocidos. El vapor de la sustancia que escapa por uno de 
los orificios se conduce al platillo de una balanza de alta sensibilidad 
que también está encerrada en la campana al vacío. En algunos montajes, el platillo está rodeado por un recinto de refrigeración, que permite que el calor se disipe al exterior por conducción térmica, 
y enfriado por radiación de manera que el vapor que se escapa se 
condense sobre él. El impulso del chorro de vapor actúa sobre la balanza como una fuerza. La presión de vapor se puede obtener de dos maneras: directamente a partir de la fuerza ejercida sobre el 
platillo y también a partir de la velocidad de evaporación utilizando 
la ecuación de Hertz-Knudsen (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
donde: 
G = velocidad de evaporación (kg s  –1 m –2 ) 
M = masa molar (g mol  –1 ) 
T = temperatura (K) R = constante universal de los gases (J mol
 –1 K –1 ) 
p = presión de vapor (Pa) 
El intervalo recomendado es de 10  –3 a 1 Pa.  
1.5.4.2.  Aparato  
El principio general del aparato se ilustra en la figura 5.  
Figura 5
  
A: Base F: Recinto y barra de refrigeración 
B: Instrumento de bobina móvil G: Horno de evaporación 
C: Campana H: Termo con nitrógeno líquido 
D: Balanza con platillo I: Medida de la temperatura de la muestra 
E: Dispositivo de medida de vacío J: Sustancia problema  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Método de efusión: celda de Knudsen  
1.5.5.1.  Principio  
El método se basa en la estimación de la masa de la sustancia 
problema que abandona la celda de Knudsen (8) por unidad de tiempo en forma de vapor a través de un microorificio en condicio ­
nes de ultravacío. La masa del vapor objeto de efusión puede obte ­
nerse bien determinando la pérdida de masa de la celda, bien con ­
densando el vapor a baja temperatura y determinando mediante cro ­
matografía la cantidad de sustancia que se ha volatilizado. La presión de vapor se calcula aplicando la relación de Hertz-Knudsen (véase el 
punto 1.5.4.1) con factores de corrección que dependen de los pará ­
metros del equipo (9). El intervalo recomendado es de 10
 –10 a 1 Pa 
(10) (11) (12) (13) (14).  
1.5.5.2.  Aparato  
El principio general del aparato se ilustra en la figura 6.  
Figura 6
  
1: Conexión al vacío 7: Tapa de rosca 
2: Espacios para el termómetro de resistencia 
de platino o medida y control de la tem ­
peratura 8: Tuercas de mariposa 
3: Tapa del recinto de vacío 9: Pernos 
4: Toro 10: Células de efusión acero inoxidable 
5: Recinto de aluminio para hacer el vacío 11: Cartucho calefactor 
6: Dispositivo para instalar y quitar las 
células de efusión  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Método de efusión: termogravimetría isotérmica  
1.5.6.1.  Principio  
El método se basa en la determinación de las velocidades de eva ­
poración aceleradas de la sustancia problema a presión ambiente y 
temperaturas elevadas usando la termogravimetría (10) (15) (16) 
(17) (18) (19) (20). Las velocidades de evaporación v  T resultan de 
exponer el compuesto seleccionado a una atmósfera de gas inerte que fluye lentamente y controlar el peso perdido a temperaturas isotér ­
micas T en Kelvin definidas a lo largo de períodos de tiempo ade ­
cuados. Las presiones de vapor p
 T se calculan a partir de los valores 
v T utilizando la relación lineal entre el logaritmo de la presión de 
vapor y el logaritmo de la velocidad de evaporación. Si resulta 
necesario, puede hacerse una extrapolación a las temperaturas de 20 y 25 °C mediante análisis de regresión de log p
 T frente a 1/T. 
Este método es adecuado para sustancias cuyas presiones de vapor 
son muy bajas, del orden de 10  –10 Pa (10  –12 mbar) y cuya pureza se 
acerca lo más posible al 100 % para evitar errores en la interpreta ­
ción de las pérdidas de peso medidas.  
1.5.6.2.  Aparato  
En la figura 7 se ilustra el principio general del montaje del expe ­
rimento.  
Figura 7
  
El portamuestras, colgado de una microbalanza en un recinto de 
temperatura controlada, es sometido a una corriente de gas nitrógeno seco que se lleva las moléculas vaporizadas de la sustancia proble ­
ma. Tras abandonar el recinto, la corriente de gas es purificada por 
una unidad de sorción.
 
1.5.6.3.  Procedimiento  
Se aplica la sustancia problema formando una capa homogénea sobre 
la superficie de una placa de vidrio rugosa. Si se trata de un sólido, 
se humedece uniformemente la placa con una solución de la sustan ­
cia en un disolvente adecuado y se seca en una atmósfera inerte. Para la toma de medidas, la placa recubierta se cuelga en el analizador 
termogravimétrico y a continuación se mide continuamente la pér ­
dida de peso en función del tiempo.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
La velocidad de evaporación v  T a una temperatura dada se calcula a 
partir de la pérdida de peso Δm del portamuestras mediante la fór ­
mula  
v T ¼ Δm 
F Ö t gcm  –2 h –1 Ê Ì  
donde F es la superficie revestida de sustancia problema, que nor ­
malmente será la superficie del portamuestras, y t es el tiempo co ­
rrespondiente a una pérdida de peso Δm. 
La presión de vapor p  T se calcula en función de la velocidad de 
evaporación v  T : 
Log p  T = C + D · log v  T 
donde C y D son constantes específicas del montaje experimental 
utilizado que dependen del diámetro del recinto de medida y del caudal del gas. Estas constantes deben determinarse de antemano midiendo un conjunto de compuestos cuya presión de vapor sea 
conocida y calculando la recta de regresión de log p
 T frente a log 
v T (11) (21) (22). 
La relación entre la presión de vapor p  T y la temperatura T en Kelvin 
viene dada por 
Log p  T = A + B · 1/T 
donde A y B son constantes obtenidas calculando la recta de regre ­
sión de log p  T frente a 1/T. Esta ecuación permite calcular por 
extrapolación la presión de vapor para cualquier otra temperatura.  
1.5.7.  Método de saturación de gases (23)  
1.5.7.1.  Principio  
Se hace pasar un gas inerte, a temperatura ambiente y con un caudal 
conocido, a través o por encima de una muestra de sustancia pro ­
blema, con lentitud suficiente para garantizar la saturación, ya que es 
esencial conseguir la saturación en la fase gaseosa. Se recoge la sustancia transportada, por regla general utilizando un sorbente, y se determina su cuantía. Como alternativa a la recogida de vapor y 
su análisis posterior, pueden utilizarse técnicas analíticas incorpora ­
das en serie, como la cromatografía de gases, para determinar la cantidad de material transportada. La presión de vapor se calcula suponiendo que es aplicable la ley de los gases perfectos y que la 
presión total de una combinación de gases es igual a la suma de las 
presiones de los gases que la componen. La presión parcial de la sustancia problema, es decir, la presión de vapor, se calcula a partir del volumen total de gas conocido y del peso del material trans ­
portado. 
El procedimiento de saturación de gases, aplicable a sustancias sóli ­
das o líquidas, puede utilizarse para presiones de vapor de un mí ­
nimo de 10
 –10 Pa (10) (11) (12) (13) (14). El método, no obstante, es 
más fiable para las presiones de vapor inferiores a 10  3 Pa, ya que, 
por encima de este valor, suele arrojar resultados superiores a los reales, probablemente a causa de la formación de aerosoles. Dado que las medidas de la presión de vapor se toman a temperatura 
ambiente, no es necesario extrapolar los datos obtenidos a tempera ­
turas más elevadas, evitándose así un proceso que a menudo genera errores graves.
 
1.5.7.2.  Aparato  
El procedimiento precisa del uso de un recinto a temperatura cons ­
tante. El esquema de la figura 8 muestra un recinto con tres soportes para muestras líquidas y otros tantos para sólidas, que permiten 
realizar un triple análisis de una muestra líquida o sólida. La tem ­
peratura se controla con un margen máximo de ± 0,5 °C.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Figura 8
  
En general se utiliza nitrógeno como gas inerte de arrastre, pero en 
ocasiones puede resultar necesario usar otro gas (24). El gas de arrastre debe estar seco. La corriente de gas se divide en seis subco ­
rrientes controladas por válvulas de aguja (con orificio de aproxima ­
damente 0,79 mm) y se introduce en el recinto mediante tubos de cobre de 3,8 mm de diámetro (d.i.) Tras equilibrar la temperatura, el gas fluye a través de la muestra y el colector de sorbente y sale del 
recinto. 
Las muestras sólidas se cargan en tubos de vidrio de 5 mm de d.i. 
entre tapones de lana de vidrio (véase la figura 9). La figura 10 muestra un soporte para muestras líquidas y el sistema sorbente. El método más reproducible de medir la presión de vapor de un 
líquido es recubrir con él perlas de vidrio o un sorbente inerte tal 
como sílice y rellenar bien el soporte con estas bolas. Alternativa ­
mente, se puede hacer pasar el gas de arrastre por un filtro grosero de frita y hacer que borbotee a través de una columna de la sustancia 
problema líquida.  
Figura 9
 Figura 10
  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
El sistema sorbente contiene una sección frontal y otra de reserva. A 
presiones de vapor muy bajas, el sorbente retiene solamente canti ­
dades muy pequeñas y la adsorción en la lana de vidrio y en los tubos de vidrio entre la muestra y el sorbente puede convertirse en un problema grave. 
Otra manera eficiente de recoger el material vaporizado es el uso de 
colectores enfriados con CO
 2 sólido. No inducen contrapresión en la 
columna del saturador y permiten una fácil retirada cuantitativa del 
material recogido.  
1.5.7.3.  Procedimiento  
Se mide el caudal del gas de arrastre efluente a la temperatura 
ambiente. Debe comprobarse frecuentemente dicho caudal durante 
el experimento para garantizar que se dispone de un valor exacto del volumen total del gas de arrastre. Lo ideal es el seguimiento 
permanente con un caudalímetro de masa. La saturación de la fase 
gaseosa puede exigir un tiempo de contacto considerable y, en con ­
secuencia, unos caudales de gas muy bajos (25). 
Al concluir el experimento, se analizan separadamente las secciones 
de sorbente frontal y de reserva. Se procede a la desorción del compuesto en cada sección mediante la adición de un disolvente y 
se analizan cuantitativamente las soluciones resultantes para determi ­
nar el peso desorbido en cada una de ellas. El método analítico que se seleccione (así como el sorbente y el disolvente de desorción) dependerá de la naturaleza del material problema. La eficiencia de 
la desorción se determinará inyectando una cantidad conocida de 
muestra en el sorbente, desorbiéndola y analizando la cantidad recu ­
perada. Es importante comprobar la eficiencia de la desorción a la concentración de la muestra en las condiciones de ensayo, o próxima 
a ella. 
Para garantizar que el gas de arrastre esté saturado con la sustancia 
problema, se utilizarán tres caudales distintos. Si la presión de vapor 
calculada no muestra dependencia del caudal, se dará por supuesto que el gas está saturado. 
La presión de vapor se calculará utilizando la ecuación:
 
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
donde: 
p = presión de vapor (Pa) 
W = masa de sustancia problema evaporada (g) 
V = volumen de gas saturado (m  3 ) 
R = constante universal de los gases 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatura (K) M = masa molar de la sustancia problema (g mol
 –1 ) 
Los volúmenes medidos deben corregirse para tener en cuenta las 
diferencias de presión y temperatura entre el caudalímetro y el satu ­
rador.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Rotor  
1.5.8.1.  Principio  
Este método utiliza un viscosímetro de rotor cuyo elemento medidor 
es una bolita de acero suspendida en un campo magnético que se hace girar mediante campos rotatorios (26) (27) (28). Unas bobinas 
de detección permiten medir la velocidad de giro. Cuando la bola 
alcanza una velocidad angular dada (generalmente, unas 400 revolu ­
ciones por segundo), se interrumpe la activación y se produce el frenado debido a la fricción con el gas. Se mide entonces el descenso 
de la velocidad angular en función del tiempo. La presión de vapor 
se deduce del frenado, dependiente de la presión, de la bola de acero. El intervalo recomendado es de 10
 –4 a 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Aparato  
En la figura 11 se muestra un esquema de montaje experimental. El 
cabezal de medida se coloca en un recinto termostatizado (regulado con una precisión de 0,1 °C) y el recipiente con la muestra se coloca 
en un recinto aparte, igualmente regulado con un margen de 0,1 °C. 
Todas las demás partes del montaje se mantienen a una temperatura superior con el fin de evitar la condensación. El conjunto del equipo se conecta a un sistema de alto vacío.
 
Figura 11
  
2. RESULTADOS E INFORME  
2.1. RESULTADOS 
Cualquiera que sea el método elegido, la presión de vapor debe 
determinarse, al menos, a dos niveles de temperatura. Son preferibles 
tres niveles, o más, entre 0 y 50 °C, para comprobar la linealidad de la curva de la presión de vapor. En los casos del método de efusión (celda de Knudsen y termogravimetría isotérmica) y del método de 
saturación de gases, se recomienda 120 a 150 °C, en lugar de 0 
a 50 °C, como intervalo de temperaturas de medición.
 
2.2. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: — método utilizado,
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, 
en su caso, fase de purificación previa, 
— al menos dos valores de presión de vapor y temperatura —y 
preferiblemente tres o más— en el intervalo comprendido entre 0 y 50 °C (o entre 120 y 150 °C), 
— al menos una de las temperaturas debe ser igual o inferior a 25 °C, si 
técnicamente lo permite el método elegido, 
— todos los datos originales, 
— una gráfica de log p frente a 1/T, 
— una estimación de la presión de vapor a 20 o 25 °C. 
En caso de transición (cambio de estado, descomposición), hay que 
incluir: 
— naturaleza del cambio, 
— temperatura a la que se produce a la presión atmosférica, 
— presión de vapor a 10 y a 20 °C por debajo de la temperatura de 
transición, así como a 10 y 20 °C por encima de dicha tempe ­
ratura (excepto en el caso de transición del estado sólido al 
estado gaseoso). 
Deben incluirse todas las informaciones y observaciones útiles para 
la interpretación de los resultados, en particular lo referente a las 
impurezas y al estado físico de la sustancia.
 
3. BIBLIOGRAFÍA  
(1) Diario Oficial de las Comunidades Europeas  L 383 A, 
26-47 (1992). 
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London. 
(3) Weissberger, R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., vol. I, Part I. 
Chapter IX, Interscience Publ., New York. 
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York. 
(5) NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa — Static 
method. 
(6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure 
— Temperature relationship and initial decomposition tempe ­
rature of liquids by isoteniscope. 
(7) NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa — Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173. 
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000). Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521-532. 
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth 
Edition (2000). 
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22-28. 
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269-278. 
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122. 
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147. 
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant 
Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide 
Science 5 (1974) 393-400. 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relations ­
hip between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide 
Science 13 (1982), 161-168. 
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric 
Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995), 27-31. 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Ac ­
tive Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravi ­
metry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); 
Pesticide Science, 53 (1998) 300-310. 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 
87(12) (1998), 1512-20. 
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th 
ed.(2000), Vapour Pressure in the Range – 25 °C to 150 °C. 
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, vol. 88 (2002). (23) 40 CFR, 796 (1993), pp. 148-153, Office of the Federal Re ­
gister, Washington DC.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. 
(25) Westcott  et al . (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. 
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. 
(27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642. 
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Apéndice  
Método de estimación  
INTRODUCCIÓN 
Los valores estimados de la presión de vapor pueden utilizarse: 
— para decidir cuál de los métodos experimentales es el adecuado, 
— para dar una estimación o un valor límite en casos en que los métodos 
experimentales no puedan aplicarse por causas técnicas.  
MÉTODO DE ESTIMACIÓN 
La presión de vapor de las sustancias líquidas y sólidas puede estimarse utili ­
zando la correlación de Watson modificada (a). El único dato experimental necesario es el punto de ebullición normal y el método es aplicable en el inter ­
valo de presiones comprendido entre 10
 5 y 10  –5 Pa. 
Se encontrará información detallada sobre este método en el «Handbook of 
Chemical Property Estimation Methods» (b). Véase igualmente OECD Environ ­
mental Monograph No.67 (c).  
PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO 
La presión de vapor se calcula mediante la fórmula:  
lnP vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m–1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5 
donde: 
T = temperatura correspondiente T
 b = punto normal de ebullición 
P vp = presión de vapor a la temperatura T 
ΔH vb = calor de vaporización 
ΔZ b = factor de compresibilidad (estimado en 0,97) 
m = factor empírico que depende del estado físico a la temperatura corres ­
pondiente 
Además,  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
donde K  F es un factor empírico que tiene en cuenta la polaridad de la sustancia. 
La referencia (b) contiene los factores K  F de varios tipos de compuestos.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Es frecuente disponer de datos en los que figura un punto de ebullición a presión 
reducida. En estos casos, la presión de vapor se calcula mediante la fórmula:  
lnP vp ≈ lnP 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 " 
1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m–1 
ln T 
T 1 # 
donde T  1 es el punto de ebullición a la presión reducida P  1 . 
INFORME 
Cuando se aplique el método de estimación, el informe incluirá una documen ­
tación completa de los cálculos.  
BIBLIOGRAFÍA 
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. 
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill. 
(c) OECD Environmental Monograph No. 67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Asses ­
sment (1993).  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. TENSIÓN SUPERFICIAL  
1. MÉTODO  
Los métodos descritos se basan en las líneas directrices de la OCDE (1). 
Los principios fundamentales se dan en la referencia (2).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Los métodos descritos se aplican a la medida de la tensión superfi ­
cial de las soluciones acuosas. 
Antes de efectuar el ensayo, es conveniente disponer de información 
preliminar sobre la solubilidad en el agua, la estructura, las propie ­
dades de hidrólisis y la concentración crítica para la formación de 
micelas de la sustancia. 
Los siguientes métodos son aplicables a la mayor parte de las sus ­
tancias químicas, cualquiera que sea su grado de pureza. 
Las medidas de la tensión superficial por el método del tensiómetro 
de anillo se limita a las soluciones acuosas con una viscosidad dinámica inferior a 200 mPa s, aproximadamente.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La entalpia de superficie libre por unidad de superficie constituye la 
tensión superficial. 
Esta última se expresa en: N/m (en unidades SI) o mN/m (en subunidades SI) 
1 N/m = 10
 3 dinas/cm 
1 mN/m = 1 dina/cm en el sistema CGS (en desuso).  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
No es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que 
se estudie una sustancia nueva. Se deben utilizar esencialmente para comprobar la validez del método de vez en cuando y 
para poder comparar con los resultados obtenidos según otros 
métodos. 
En las referencias (1) y (3) se señalan sustancias de referencia que 
cubren una amplia gama de tensiones superficiales.
 
1.4. PRINCIPIOS DE LOS MÉTODOS 
Los métodos se basan en la medida de la fuerza máxima que es 
preciso ejercer verticalmente sobre una brida o anillo en contacto con la superficie del líquido estudiado, colocado en un recipiente ade ­
cuado, a fin de separarlo de dicha superficie, o sobre una placa, uno 
de cuyos bordes esté en contacto con la superficie, a fin de elevar la 
película formada. 
Las sustancias que sean hidrosolubles al menos a la concentración de 
1 mg/1 se someterán al ensayo en solución acuosa a una sola con ­
centración.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
La precisión de los métodos descritos es mayor de la que normalmente 
se requiere en la evaluación del riesgo para el medio ambiente.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS 
Se prepara una solución de la sustancia en agua destilada. La con ­
centración de esta solución debe ser el 90 % de la concentración de saturación de la sustancia en agua; si esta concentración es superior a 
1 g/1, se utilizará para el ensayo la concentración de 1 g/1. Las 
sustancias cuya solubilidad en agua es inferior a 1 mg/1 no tienen que someterse al ensayo.
 
1.6.1.  Método de la placa  
Véase ISO 304 y NF T 73-060 (Tensioactivos: determinación de la 
tensión superficial por elevación de películas líquidas).  
1.6.2.  Método de la brida  
Véase ISO 304 y NF T 73-060 (Tensioactivos: determinación de la 
tensión superficial por elevación de películas líquidas).  
1.6.3.  Método del anillo  
Véase ISO 304y NF T 73-060 (Tensioactivos: determinación de la 
tensión superficial por elevación de películas líquidas).  
1.6.4.  Método de) anillo armonizado por la OCDE  
1.6.4.1.  Aparato  
Para efectuar esta medida pueden emplearse tensiómetros comercia ­
les. Constan de los elementos siguientes: 
— un portamuestras móvil, — un dinamómetro, — un cuerpo de medida (anillo), — un recipiente de medida.1.6.4.1.1.
 
1.6.4.1.1. P o r t a m u e s t r a s m ó v i l 
El portamuestras móvil sirve de soporte al recipiente de medida 
termostatizado, que contiene el líquido problema. Va montado en la misma peana que el dinamómetro.
 
1.6.4.1.2. D i n a m ó m e t r o 
El dinamómetro (véase la figura) va colocado por encima del porta ­
muestras. El error en la medida de la fuerza no debe pasar de ± 10  -6 
N, lo que equivale a un límite de error de ± 0,1 mg en una medida 
de masa. En la mayoría de los casos, la escala de medidas de los tensiómetros vendidos en el mercado está calibrada en mN/m, de 
manera que se puede leer directamente la tensión superficial en 
mN/m con una precisión de 0,1 mN/m.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. C u e r p o d e m e d i d a ( a n i l l o ) 
El anillo suele estar formado por un hilo de platino-iridio de 
0,4 mm de grosor, aproximadamente, y una circunferencia media 
de 60 mm. Dicho anillo está suspendido horizontalmente de una armadura que va unida por una varilla metálica al dinamómetro (véase la figura).
 
Figura  
Cuerpo de medida  
(todas las dimensiones se expresan en milímetros)
  
1.6.4.1.4. R e c i p i e n t e d e m e d i d a 
El recipiente de medida que contiene la solución problema debe ser 
un recipiente de vidrio termostatizado. Debe estar diseñado de ma ­
nera que, durante la determinación, la temperatura del líquido y de la fase gaseosa por encima de su superficie se mantenga constante y no 
haya evaporación. Los recipientes cilíndricos de vidrio de un diáme ­
tro interior de, al menos, 45 mm cumplen estos requisitos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Preparación del aparato  
1.6.4.2.1. L i m p i e z a 
Los recipientes de vidrio deben limpiarse con cuidado. Si es necesario 
se lavarán con mezcla sulfocrómíca caliente y, a continuación, con ácido fosfórico viscoso (83 a 98 % en peso de H
 3 PO 4 ); se enjuagarán 
abundantemente con agua corriente y luego con agua bidestilada hasta 
el momento en que se obtenga reacción neutra; finalmente, se secarán o 
bien se enjuagarán con parte del líquido que se va a medir. 
El anillo se limpiará con abundante agua para eliminar todos los 
restos de sustancias solubles en agua, se sumergerá unos segundos 
en mezcla sulfocrómica, se enjuagará con agua bidestilada hasta que 
se obtenga reacción neutra y, finalmente, se secará rápidamente sobre una llama de metanol.  
Nota:  
Los restos de sustancias que no se disuelvan ni se destruyan con la 
mezcla sulfocrómica ni con el ácido fosfórico, como las siliconas, deberán ser eliminadas con un disolvente orgánico apropiado.
 
1.6.4.2.2. C a l i b r a d o d e l a p a r a t o 
La validación del aparato consiste en comprobar el punto cero y en 
ajustarlo de tal manera que la indicación dada por el aparato permita una determinación fiable en mN/m.
 
Montaje:  
Se nivelará el aparato, por ejemplo con un nivel de burbuja colocado 
sobre la peana y con tornillos de nivelación.  
Ajuste del punto cero:  
Después de montar el anillo en el aparato y antes de sumergirlo en el 
líquido, debe ajustarse a cero el indicador del tensiómetro y com ­
probarse el paralelismo del anillo con la superficie del líquido. A tal 
fin, puede utilizarse la superficie del líquido como espejo.  
Calibrado:  
El calibrado en sí del aparato puede hacerse con uno de los dos 
métodos siguientes: 
a) con una masa: este procedimiento consiste en utilizar cumiapesos de 
masa conocida (entre 0,1 g y 1,0 g), que se colocan sobre el anillo. El factor de calibrado Φ
 a , por el que habrá que multiplicar todas las 
lecturas del instrumento, se determina mediante la ecuación (1): 
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
donde  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m) 
m = masa del contrapeso (g) g = aceleración de la gravedad (981 cm.s-2 a nivel del mar) 
b = circunferencia media del anillo (cm)
 
Ea = lectura del tensiómetro tras colocación del contrapeso so ­
bre el anillo (mN/m);  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) con agua: este procedimiento utiliza agua pura cuya tensión super ­
ficial, por ejemplo a 23  o C, es igual a 72,3 mN/m. Es más rápido que 
el sistema anterior, pero siempre existe el riesgo de que ¡a tensión superficial del agua se vea modificada por restos de tensioactivos. 
El factor de calibrado Φ
 b , por el que habrá que multiplicar todas 
las lecturas del aparato, se determina mediante la ecuación si ­
guiente (2); 
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
donde 
σ 0 = valor dado en la bibliografía para la tensión superficial del 
agua (mN/m) a la temperatura elegida para el ensayo 
σ g = valor medido de la tensión superficial de¡ agua (mN/m) a 
esa misma temperatura.  
1.6.4.3.  Preparación de la muestra  
Las soluciones acuosas de la sustancia se prepararán teniendo en 
cuenta las concentraciones exigidas. Es imprescindible que la diso ­
lución de la sustancia sea completa. 
La solución así preparada debe mantenerse a una temperatura cons ­
tante (± 0,5  o C). Dado que la tensión superficial de una solución 
colocada en el recipiente de medida se modifica después de cierto tiempo, deben efectuarse varias medidas en momentos diferentes y 
hay que trazar una curva de la tensión superficial en función del 
tiempo. Cuando ya no haya modificaciones, se habrá alcanzado un estado de equilibrio. 
El polvo o los vapores de otras sustancias falsean la medida. La 
operación debe realizarse bajo una campana de protección.
 
1.6.5.  Condiciones del ensayo  
Las medidas deben efectuarse a una temperatura de unos 20  o C, sin 
variaciones de temperatura superiores a ± 0,5  o C. 
1.6.6.  Desarrollo del ensayo  
Se vierte en el recipiente de medida, cuidadosamente limpio, la solu ­
ción que se desea medir, procurando evitar la formación de burbujas y, a continuación, se coloca el recipiente de medida en el portamuestras, elevándolo hasta que el anillo quede sumergido bajo la superficie de la 
solución. Entonces se vuelve a bajar gradual y uniformemente (a una 
velocidad de unos 0,5 cm/min) el portamuestras para separar ei anillo de la superficie hasta llegar a la fuerza máxima. La capa de líquido adherida al anillo no debe desprenderse de este. Una vez acabada la 
medida, se sumerge de nuevo el anillo y se repiten las medidas hasta 
que se obtenga un valor de tensión superficial constante. En cada determinación se anotará el tiempo que haya transcurrido desde la transferencia de la solución al recipiente de medida. Las lecturas deben 
registrarse en el valor máximo de la fuerza necesaria para retirar el 
anillo de la superficie del líquido.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. RESULTADOS  
Para calcular la tensión superficial se multiplicará primero el valor 
leído en el aparato en mN/m por el factor de calibrado Φ a o Φ b (se­
gún el procedimiento de calibrado utilizado). Se obtendrá entonces 
un valor solo aproximadoque, a continuación, deberá corregirse. 
Harkins y Jordán (4) han establecido de manera empírica factores de 
corrección para los valores de tensión superficial obtenidos por el 
método del anillo, que dependen de las dimensiones del anillo, de la 
densidad del líquido y de su tensión superficial. 
Dada la laboriosidad del proceso de determinación del factor de 
corrección para cada medida a partir de las tablas de Harkins y 
Jordán, en las soluciones acuosas se admite la utilización de un procedimiento simplificado de lectura de la tensión superficial to ­
mando directamente los valores corregidos de la tabla siguiente (se 
recurrirá a la interpolación en las lecturas que se sitúen entre dos 
valores de la tabla).
 
Tabla  
Corrección de los valores medidos de la tensión superficial  
Válido solamente para las soluciones acuosas p = 1 g/cm  3 
R = 9,55 mm (radio medio del anillo) 
r = 0,185 mm (radio del hilo que constituye el anillo)  
Valor experimental (mN/m) Valor corregido (mN/m) 
Calibrado con contrapeso [véase el 
punto 1.6.4.2.2.(a)] Calibrado con agua [véase el punto 
1.6.4.2.2.(b)]  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 
40 35,6 38,2 
.42 37,6 40,3 
44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Valor experimental (mN/m) Valor corregido (mN/m) 
Calibrado con contrapeso [véase el 
punto 1.6.4.2.2.(a)] Calibrado con agua [véase el punto 
1.6.4.2.2.(b)]  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 
62 57,2 61,3 
64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — 
Esta tabla se ha elaborado a partir de la corrección de Harkins 
Jordan, y es similar a la de la norma DIN (DIN 53914) para agua 
y soluciones acuosas (densidad p = 1 g/cm
 3 ); se utiliza con un anillo 
existente en el mercado cuyas dimensiones son R = 9,55 mm (radio medio del anillo) y r = 0,185 mm (radio del hilo que constituye el anillo). La tabla da los valores corregidos de las medidas de tensión 
superficial efectuadas tras un calibrado con contrapesos o con agua. 
Otra posibilidad, sin calibrado previo, consiste en calcular la tensión 
superficial por medio de la fórmula siguiente:
 
σ ¼ f x F 
4πR 
donde 
F = fuerza medida en el dinamómetro en el punto de ruptura de la 
película 
R = radio del anillo f = factor de corrección (1).
 
3. INFORME  
3.1. INFORME DEI ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— método utilizado, 
— tipo de agua o de solución utilizada, 
— especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas), 
— resultados de las medidas: tensión superficial (leída) incluyendo a 
la vez las diferentes lecturas y su medida aritmética, así como el 
valor medio corregido (teniendo en cuenta el factor específico del 
equipo y la tabla de corrección),  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— concentración de la solución, 
— temperatura del ensayo, — tiempo de la solución empleada; en particular, el tiempo trans ­
currido entre la preparación de la solución y su medida, 
— evolución de la tensión superficial de la solución con el tiempo a 
partir del momento en que se haya transferido al recipiente de medida, 
— deben señalarse todas las informaciones y observaciones que 
sean útiles para la interpretación de los resultados, especialmente 
lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.
 
3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Dado que el agua destilada tiene una tensión superficial de 72,75 
mN/m a 20  o C, se considerarán sustancias tensioactivas aquellas que 
presenten una tensión superficial inferior a 60 mN/m en las condi ­
ciones de este método.  
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 115, Decision of the 
Council C(81) 30 final. 
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Chapter 
XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Interscience Publ., Nueva York, 1959, vol. I, Part I. 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, 511 
(4) Harlcins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, Vol. 52, 
1751.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. HIDROSOLUBILIDAD  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 105 de la 
OCDE (1995). Es una versión revisada de las TG 105 original que se adoptaron en 1981. No hay diferencias esenciales entre la versión actual y 
la de 1981. Se ha modificado fundamentalmente el formato. La revisión está 
basada en el método de ensayo de la UE "Hidrosolubilidad" (
 1 ). 
CONSIDERACIONES INICIALES 
2. La hidrosolubilidad de una sustancia puede verse considerablemente afec ­
tada por la presencia de impurezas. El presente método se dirige a determi ­
nar la hidrosolubilidad de sustancias esencialmente puras que son estables en agua y no volátiles. Antes de proceder al ensayo, es conveniente disponer 
de información sobre la sustancia problema, como la fórmula estructural, la 
presión de vapor, la constante de disociación y la hidrólisis como función del pH. 
3. En el presente documento se describen dos métodos de ensayo, el método 
de elución en columna y el método del frasco, que abarcan respectivamente 
solubilidades por debajo y por encima de 10
 -2 g/l. Se describe además un 
ensayo preliminar sencillo. Este permite determinar aproximadamente la cantidad adecuada de muestra que deberá emplearse en el ensayo final, 
así como el tiempo necesario para conseguir la saturación.
 
DEFINICIONES Y UNIDADES 
4. La hidrosolubilidad de una sustancia es la concentración de saturación en 
masa de la sustancia en el agua a una temperatura determinada. 
5. Se expresa en masa de soluto por volumen de solución. La unidad SI es 
el kg/m  3 , pero se puede utilizar también g/l.  
SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
6. No es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que se analice 
una sustancia problema.  
DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS  
Condiciones del ensayo  
7. El ensayo debe efectuarse, a ser posible, a 20 °C ± 0,5 °C. La temperatura 
elegida se mantendrá constante en todas las partes importantes del equipo.  
Ensayo preliminar  
8. De manera gradual, añadir volúmenes crecientes de agua a temperatura 
ambiente a alrededor de 0,1 g de muestra (las sustancias sólidas deben estar 
reducidas a polvo) en una probeta de 10 ml con tapón de vidrio. Después de 
la adición de cada cantidad de agua, agitar vigorosamente la mezcla durante 10 minutos y luego comprobar visualmente si contiene partículas de muestra no disueltas. Si después de añadir 10 ml de agua la muestra o determinadas 
partes de esta no se han disuelto, hay que proseguir el experimento en una 
probeta de 100 ml. La solubilidad aproximada se indica, en el cuadro 1, bajo
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
el volumen de agua en que se efectúa la disolución completa de la muestra. 
Cuando la solubilidad es baja, puede hacer falta mucho tiempo para que se 
disuelva la sustancia problema, por lo que habrá que esperar como mínimo 24 horas. Si al cabo de 24 horas la sustancia problema sigue sin disolverse, hay que dejar más tiempo (96 horas como máximo) o bien proceder a una 
nueva dilución a fin de determinar si hay que utilizar el método de elución 
en columna o el método del frasco.
 
Cuadro 1  
ml de agua en que se disuel ­
ven 0,1 g de soluto 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
Solubilidad aproximada en g/l < 1 000 1 000- 
200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1  
Método de elución en columna  
Principio  
9. Este método se basa en la elución con agua de la sustancia problema en una 
microcolumna cargada con un material soporte inerte previamente cubierto con un exceso de sustancia problema (2). La hidrosolubilidad viene deter ­
minada por la concentración en masa del eluato cuando ha alcanzado una 
meseta en función del tiempo.
 
Aparato  
10. El aparato consiste en una microcolumna (figura 1) que se mantiene a 
temperatura constante. Está conectado a una bomba de recirculación (figura 2) o a un recipiente de nivelación (figura 3). La microcolumna contiene un soporte inerte retenido por un pequeño tapón de lana de vidrio que servirá 
también para separar las partículas por filtración. Como soporte se pueden 
emplear bolas de cristal, tierra de diatomeas u otros materiales inertes. 
11. La microcolumna representada en la figura 1 es idónea para funcionar con 
una bomba de recirculación. Tiene un espacio de cabeza correspondiente a cinco volúmenes de lecho de agua (desechados al principio del ensayo) y 
una capacidad para cinco muestras (tomadas para análisis durante el ensa ­
yo). No obstante, se puede reducir la dimensión si es posible añadir agua al sistema durante el ensayo para reemplazar los cinco volúmenes de lecho 
iniciales, eliminados con las impurezas. La columna se conectará mediante 
tubos de material inerte a la bomba de recirculación, que será capaz de suministrar aproximadamente 25 ml/hora. Como bomba de recirculación se podrá utilizar, por ejemplo, una bomba peristáltica o una bomba de 
membrana. Hay que procurar que el material del tubo no sea causa de 
contaminación ni adsorción. 
12. En la figura 3 se muestra el esquema de un sistema con recipiente de 
nivelación. En este sistema la microcolumna lleva acoplada una llave de una vía. La conexión al recipiente de nivelación se hace mediante una junta 
de vidrio esmerilado y tubos de material inerte. El caudal del recipiente de 
nivelación deberá ser de unos 25 ml/hora.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Figura 1
  
Dimensiones en mm 
A Conexión para la junta de vidrio esmerilado 
B. Espacio de cabeza C. Diámetro interior 5 D. Diámetro exterior 19 
E. Tapón de lana de vidrio 
F. Llave
 
Figura 2
  
A Equilibrio con la atmósfera 
B. Caudalímetro 
C. Microcolumna D. Bomba de circulación termostatizada 
E. Bomba de recirculación 
F. Llave de dos vías para la toma de muestras
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Figura 3
  
A. Recipiente de nivelación (por ejemplo, frasco de 2,5 litros) 
B. Columna C. Acumulador de fracciones D. Termostato E. Tubo de teflón F. Junta de vidrio esmerilado G. Tubo para la circulación de agua entre el termostato y la columna, con 
un diámetro interior de aproximadamente 8 mm 
13. Pesar unos 600 mg de material soporte y pasarlos a un matraz de fondo 
redondo de 50 ml. Disolver una cantidad idónea de la sustancia problema en 
un disolvente volátil con calidad de reactivo analítico y añadir al soporte una cantidad adecuada de esta solución. El disolvente debe evaporarse por completo, por ejemplo en un rotavapor; de lo contrario, no se daría la 
saturación en agua del soporte durante la etapa de elución, debido al efecto 
de partición en la superficie. Dejar que se empape el soporte cargado de esta forma durante 2 horas en 5 ml de agua, aproximadamente, y luego pasar la suspensión a la microcolumna. También se podrá verter el soporte cargado 
seco en la microcolumna llena de agua y a continuación equilibrar después 
durante 2 horas. 
14. La carga del soporte puede plantear dificultades que lleven a resultados 
erróneos, por ejemplo si la sustancia problema se deposita en forma de aceite. Las dificultades deben examinarse y han de recogerse los datos 
correspondientes.
 
Procedimiento empleado con una bomba de recirculación  
15. Se inicia la circulación a través de la columna. El caudal recomendado es de 
25 ml/hora, aproximadamente, que equivale a unos 10 volúmenes de lecho 
por hora para la columna arriba descrita. Se descartan como mínimo los 5 primeros volúmenes de lecho a fin de eliminar las impurezas solubles en el agua. Luego se conecta la bomba de recirculación, haciendo funcionar el 
aparato hasta llegar al estado de equilibrio, definido por 5 muestras sucesi ­
vas cuyas concentraciones no difieran de forma aleatoria en más del ± 30 %. Dichas muestras deben estar separadas entre sí por un intervalo de tiempo correspondiente al paso de al menos 10 volúmenes de lecho. Dependiendo 
del método analítico aplicado, puede ser preferible establecer una curva de 
concentración/tiempo para comprobar que se ha alcanzado el equilibrio.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Procedimiento empleado con un recipiente de nivelación  
16. Se recogerán las sucesivas fracciones de eluato y se analizarán según el 
método elegido. Para determinar la hidrosolubilidad, se utilizarán las frac ­
ciones procedentes del intervalo medio de elución cuyas concentraciones 
sean constantes en el intervalo de ± 30 %, al menos en 5 fracciones con ­
secutivas. 
17. Como eluyente se recomienda usar agua bidestilada. También puede usarse 
agua desionizada con una resistividad superior a 10 megaohms/cm y un 
contenido de carbono orgánico total menor del 0,01 %. 
18. Con ambos procedimientos se repetirá la operación, reduciendo el caudal a 
la mitad. Si los resultados de las dos operaciones concuerdan, la prueba es 
satisfactoria. Si se observa una solubilidad aparente más elevada con el caudal inferior, se continuará con la reducción del caudal a la mitad hasta 
que se obtenga la misma solubilidad en dos operaciones sucesivas. 
19. Con ambos procedimientos se debe controlar la posible presencia de materia 
coloidal en las fracciones estudiando la aparición del efecto Tyndall. La 
presencia de partículas invalida el ensayo, y este deberá repetirse después 
de mejorar la eficacia de la filtración de la columna. 
20. Se medirá el pH de cada muestra, preferiblemente con ayuda de tiras indi ­
cadoras específicas.
 
Método del frasco  
Principio  
21. La sustancia problema (los sólidos deben estar pulverizados) se disuelve en 
agua a una temperatura algo superior a la temperatura de ensayo. Cuando se 
alcanza la saturación, se deja enfriar la mezcla y se mantiene a la tempera ­
tura de ensayo. Otra posibilidad es realizar la medida directamente a la temperatura de ensayo siempre que, mediante un muestreo adecuado, se 
garantice que se ha alcanzado el equilibrio de saturación. Luego, se deter ­
mina con un método analítico apropiado la concentración en masa de la sustancia problema en la solución acuosa, que no debe contener ninguna partícula sin disolver (3).
 
Aparato  
22. Se necesita el siguiente instrumental: 
— material de vidrio e instrumentos de laboratorio normales, 
— un dispositivo para agitar las disoluciones a temperatura constante con ­
trolada, 
— si se precisa en el caso de las emulsiones, una centrífuga (preferible ­
mente termostatizada), y 
— equipo analítico.  
Procedimiento  
23. Evaluar, a partir del ensayo preliminar, la cantidad de sustancia problema 
necesaria para saturar el volumen de agua elegido. Pesar aproximadamente 
cinco veces dicha cantidad en cada uno de tres recipientes de vidrio con tapón, también de vidrio (por ejemplo, tubos de centrífuga, matraces). Aña ­
dir a cada recipiente un volumen de agua determinado en función del 
método analítico y del intervalo de solubilidad. Los frascos se tapan firme ­
mente y se agitan después a 30 °C. Utilizar un dispositivo agitador o mez ­
clador que pueda actuar a temperatura constante como, por ejemplo, un agitador magnético en baño de agua termostatizado. Un día después, tomar 
uno de los recipientes y equilibrar durante 24 horas a la temperatura del 
ensayo, agitando de vez en cuando. El contenido del recipiente se centrifuga
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
luego a la temperatura del ensayo y se determina la concentración de la 
sustancia problema en la fase acuosa clara utilizando un método analítico 
adecuado. Los otros dos recipientes se tratan de la misma manera, después de un primer equilibrado a 30 °C durante dos y tres días, respectivamente. Si las concentraciones medidas en al menos los dos últimos recipientes no 
difieren en más del 15 %, la prueba es satisfactoria. Si los resultados de los 
recipientes 1, 2 y 3 acusan una tendencia a la progresión, repetir de nuevo todo el ensayo utilizando tiempos de equilibrado más largos. 
24. El ensayo se puede realizar también sin preincubar a 30 °C. Para evaluar la 
velocidad de adquisición del equilibrio de saturación se irán tomando mues ­
tras hasta que el tiempo de agitación deje de influir en las concentraciones 
medidas. 
25. Se medirá el pH de cada muestra, preferiblemente con ayuda de tiras indi ­
cadoras específicas.
 
Determinaciones analíticas  
26. Es preferible utilizar un método específico de la sustancia, pues pequeñas 
cantidades de impurezas solubles pueden originar errores sensibles en la solubilidad medida. Pueden citarse como ejemplos los siguientes métodos: 
cromatografía de gases o de líquidos, valoración volumétrica, fotometría y 
voltametría.
 
DATOS E INFORME  
Datos  
Método de elución en columna  
27. En cada operación debe calcularse el valor medio y la desviación típica de 
al menos cinco muestras consecutivas tomadas durante la meseta de satura ­
ción. Los valores medios obtenidos en dos ensayos con caudales diferentes 
no deberán diferir en más del 30 %.  
Método del frasco  
28. A partir de los resultados de cada uno de los tres recipientes, que no deberán 
diferir en más del 15 %, se calcularán las medias.  
Informe del ensayo  
Método de elución en columna  
29. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
— resultados del ensayo preliminar, — identidad química e impurezas (etapa de purificación preliminar, en su 
caso), 
— concentraciones individuales, caudales y pH de cada muestra, — desviación típica y media de al menos cinco muestras tomadas durante la 
meseta de saturación de cada operación, 
— promedio de al menos dos operaciones sucesivas, — temperatura del agua durante el proceso de saturación, — método de análisis, — naturaleza del material de soporte, — carga del material de soporte, — disolvente utilizado, — cualquier signo de inestabilidad química de la sustancia durante el en ­
sayo, 
— todas las observaciones útiles para la interpretación de los resultados, en 
particular lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia 
problema.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Método del frasco  
30. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
— resultados del ensayo preliminar, — identidad química e impurezas (etapa de purificación preliminar, en su 
caso), 
— resultados analíticos individuales y su media cuando se determine más 
de un valor para un mismo recipiente, 
— pH de cada muestra, — media de los valores de los diferentes recipientes cuando concuerden, — temperatura del ensayo, — método analítico, — cualquier signo de inestabilidad química de la sustancia durante el en ­
sayo, 
— todas las observaciones útiles para la interpretación de los resultados, en 
particular lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia problema.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Directiva 92/69/CEE de la Comisión, de 31 de Julio de 1992, por la que se 
adapta al progreso técnico, por decimoséptima vez, la Directiva 67/548/CEE del Consejo, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, regla ­
mentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado 
de las sustancias peligrosas (DO L 383 de 29.12.1992, p. 113). 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. 
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. COEFICIENTE DE REPARTO  
1. MÉTODO  
El método de frasco de agitación se basa en las líneas directrices de 
la OCDE (1).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Es conveniente disponer de información preliminar sobre la fórmula 
desarrollada, la constante de disociación, la hidrosolubilidad, la hi ­
drólisis, la solubilidad en n-octanol y la tensión superficial de la 
sustancia antes de proceder al ensayo. 
Las medidas relativas a sustancias ionizables deben hacerse solo 
con la forma no ionizada (ácido libre o base libre) obtenida mediante el uso de una solución amortiguadora con un pH que esté al menos 
una unidad de pH por debajo (ácido libre) o por encima (base libre) 
del pK. 
Este método de ensayo incluye dos procedimientos distintos: el mé ­
todo de frasco de agitación y la cromatografía líquida de alta reso ­
lución (CLAR). El primero puede aplicarse cuando el valor de log P
 ow (véanse más abajo las definiciones) está en el intervalo de - 2 a 
4, y el segundo cuando está en el intervalo de 0 a 6. Antes de llevar 
a cabo ninguno de los procedimientos experimentales es necesario 
obtener una estimación previa del coeficiente de reparto. 
El método de frasco de agitación es aplicable solo a sustancias 
esencialmente puras solubles en agua y n-octanol, y no es aplicable 
a productos tensoactivos (para los que debe darse su valor calculado o una estimación basada en las solubilidades en n-octanol y agua por separado). 
El método de CLAR no puede aplicarse a ácidos o bases fuertes, 
complejos metálicos, materiales tensoactivos ni sustancias que reac ­
cionen con el eluyente. Para estos materiales debe darse un valor 
calculado o una estimación basada en las solubilidades en n-octanol 
y agua por separado. 
El método de CLAR es menos sensible a la presencia de impurezas en 
el compuesto problema que el método de frasco de agitación. Sin 
embargo, las impurezas pueden hacer en algunos casos que la inter ­
pretación de los resultados sea difícil porque la atribución de los picos resulte dudosa. En el caso de mezclas que den una banda sin resolución, hay que establecer los límites superior e inferior de log P.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
El coeficiente de reparto (P) se define como la relación de las con ­
centraciones en equilibrio (c  i ) de una sustancia disuelta en un sistema 
bifásico consistente en dos disolventes considerablemente inmisci ­
bles. En el caso del n-octanol y del agua:  
p ow ¼ c n Ä octanol 
c water 
El coeficiente de reparto (P) es, pues, el cociente de dos concen ­
traciones; se indica generalmente en forma de su logaritmo decimal 
(log P).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA  
Método de frasco de agitación  
No es necesario utilizar sustancias de referencia cada vez que se 
investiga una nueva sustancia. Deben servir esencialmente para com ­
probar de vez en cuando la eficacia del método y para comparar con 
los resultados obtenidos según otros métodos.  
Método de CLAR  
Con el fin de relacionar los datos medidos según la CLAR de un 
compuesto con su P, hay que trazar una gráfica de calibración (log P 
— datos cromatográficos) con al menos 6 puntos de referencia. La selección de las sustancias de referencia adecuadas depende del cri ­
terio del analista. Siempre que sea posible, al menos una sustancia de 
referencia debe tener un P
 ow superior al de la sustancia problema, y 
otra un P  ow inferior al de la sustancia problema. En el caso de 
valores de log P inferiores a 4, la calibración puede basarse en datos 
obtenidos por el método de frasco de agitación. En el caso de valores 
de log P superiores a 4, la calibración puede basarse en valores validados aparecidos en la bibliografía, siempre que estos valores estén de acuerdo con los valores calculados. Para mayor precisión, 
es preferible elegir compuestos de referencia que estén relacionados 
estructuralmente con la sustancia problema. 
Se dispone de amplias listas de valores de log P
 ow de muchos grupos 
de productos químicos (2) (3). Si no se tienen datos sobre los coe ­
ficientes de reparto de compuestos relacionados estructuralmente, puede utilizarse entonces una calibración más general, establecida con otros compuestos de referencia. 
En el apéndice 2 se recoge una relación de sustancias de referencia 
recomendadas con sus valores de P
 ow . 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO  
1.4.1.  Método de frasco de agitación  
Para determinar un coeficiente de reparto, es necesario conseguir un 
equilibrio entre los elementos constitutivos del sistema que se in ­
fluencien mutuamente y determinar las concentraciones de las sus ­
tancias disueltas en las dos fases. Examinando la bibliografía exis ­
tente sobre este tema, se encuentra que pueden utilizarse varias técnicas diferentes para resolver este problema, es decir, la mezcla completa de las dos fases, seguida de su separación, que permita 
determinar la concentración en equilibrio de la sustancia de ensayo.
 
1.4.2.  Método de CLAR  
La CLAR se realiza en columnas analíticas rellenas de una fase 
sólida comercializada con cadenas hidrocarbonadas largas (C  8 , C 18 , 
por ejemplo) unidas por enlaces químicos a la sílice. Los productos 
químicos inyectados en esta columna la recorrerán a diferente velo ­
cidad debido a los diferentes grados de reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria hidrocarbonada. Las mezclas de productos quí ­
micos se eluyen por orden de hidrofobicidad, saliendo antes los 
productos hidrosolubles y después los liposolubles, según su coefi ­
ciente de reparto hidrocarburo-agua. Esto permite establecer una relación entre el tiempo de retención en una columna de este tipo (de fase inversa) y el coeficiente de reparto n-octanol/agua. El coe ­
ficiente de reparto se deduce del factor de capacidad k, dado por la 
expresión
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
donde t  R = tiempo de retención de la sustancia problema y t  o = 
tiempo medio que necesita una molécula de disolvente para recorrer 
la columna (tiempo muerto). 
No es necesario utilizar métodos analíticos cuantitativos, sino solo 
determinar los tiempos de elución.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD  
1.5.1.  Repetibilidad  
Método de frasco de agitación  
Para obtener un coeficiente de reparto preciso, se harán determina ­
ciones por duplicado en tres series de condiciones de ensayo dife ­
rentes, pudiendo variar tanto la cantidad de sustancia especificada como la relación de volumen de los disolventes. Los logaritmos de los valores determinados del coeficiente de reparto deberán situarse 
en un intervalo de ± 0,3 unidades logarítmicas.
 
Método de CLAR  
Para aumentar la confianza de la medida, deben hacerse las deter ­
minaciones por duplicado. Los valores de log P procedentes de las 
distintas medidas deben estar dentro de un intervalo de ± 0,1 unida ­
des logarítmicas.  
1.5.2.  Sensibilidad  
Método de frasco de agitación  
El intervalo de medida del método está determinado por el límite de 
detección del procedimiento analítico. Esto debe ser suficiente para 
evaluar los valores de log P  ow en el intervalo de - 2 a 4 (a veces, 
bajo ciertas condiciones, este intervalo puede ampliarse hasta un log P
 ow de 5), cuando la concentración del soluto en cada fase no 
sobrepase los 0,01 moles por litro.  
Método de CLAR  
El método de CLAR permite la evaluación de coeficientes de reparto 
en el intervalo de log P  ow entre 0 y 6. 
En principio, el coeficiente de reparto de un compuesto puede esti ­
marse en el margen de ± 1 unidad logarítmica del valor obtenido con el frasco de agitación. En la bibliografía se encuentran correlaciones típicas (4) (5) (6) (7) (8). Normalmente puede obtenerse mayor 
precisión cuando los gráficos de correlación se basan en compuestos 
de referencia relacionados estructuralmente (9).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Especificidad  
Método de frasco de agitación  
La ley de reparto de Nernst solo se aplica a temperatura, presión y 
pH constantes para las soluciones diluidas. Estrictamente se aplica a una sustancia pura dispersada entre dos disolventes puros. Los re ­
sultados pueden ser modificados por la aparición simultánea, en una 
o ambas fases, de varios solutos diferentes. 
La disociación o la asociación de las moléculas disueltas se traduce 
en desviaciones respecto a la ley de reparto citada. Estas desviacio ­
nes se observan porque el coeficiente de reparto pasa a depender entonces de la concentración de la solución. 
Debido a los múltiples equilibrios implicados, este método de ensayo 
no debe aplicarse sin corregir a los compuestos ionizables. Para estos compuestos debe considerarse la utilización de soluciones amortigua ­
doras en lugar de agua; el pH de la solución amortiguadora debe 
diferir del pKa de la sustancia al menos en una unidad de pH y hay que tener en cuenta la importancia de este pH para el medio am ­
biente.
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Estimación preliminar del coeficiente de reparto  
El valor del coeficiente de reparto puede estimarse preferentemente 
mediante un método de cálculo (véase el apéndice 1), o bien, cuando 
sea adecuado, utilizando la relación de las solubilidades de la sus ­
tancia de ensayo en los disolventes puros (10).  
1.6.2.  Método de frasco de agitación  
1.6.2.1.  Preparación  
n-Octanol: la determinación del coeficiente de reparto debe hacerse 
recurriendo a un reactivo de calidad analítica. 
Agua: utilizar agua destilada o bidestilada procedente de un aparato 
de cristal o de cuarzo. En el caso de compuestos ionizables, puede ser necesario utilizar soluciones amortiguadoras en lugar de agua.  
Nota:  
Evitar el agua extraída directamente de un intercambiador de iones.
 
1.6.2.1.1. P r e s a t u r a c i ó n d e l o s d i s o l v e n t e s 
Antes de determinar un coeficiente de reparto, se saturan recíproca ­
mente las fases del sistema de disolventes agitándolas a la tempera ­
tura de ensayo. Para realizar esto, es preciso agitar durante 24 horas, en un agitador mecánico, dos grandes frascos que contengan n-oc ­
tanol puro de calidad analítica o agua, con una cantidad suficiente 
del otro disolvente y dejarlos reposar hasta que se separen las fases y 
se alcance el estado de saturación.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P r e p a r a c i ó n p a r a e l e n s a y o 
El volumen del sistema bifásico debe llenar casi completamente el 
recipiente de ensayo para evitar cualquier pérdida de materia debida 
a la volatilización. La relación de volumen y las cantidades de sus ­
tancia que deben utilizarse se determinan de la siguiente manera: 
— estimación preliminar del coeficiente de reparto (véase más 
arriba), 
— cantidad mínima de sustancia de ensayo requerida para el proce ­
dimiento analítico utilizado, 
— límite de concentración máxima en cada fase de 0,01 moles 
por litro. 
Se efectúan tres ensayos. En el primero se utiliza la relación calcu ­
lada de volúmenes de n-octanol y agua, en el segundo se divide por dos esta relación, y en el tercero se multiplica por dos esta relación 
(por ejemplo, 1:1, 1:2, 2:1).
 
1.6.2.1.3. S u s t a n c i a d e e n s a y o 
Se prepara una solución de reserva en n-octanol presaturado con 
agua. La concentración de esta solución de reserva debe determinarse 
con precisión antes de utilizarla para determinar el coeficiente de 
reparto. Esta solución deberá guardarse en condiciones que garanti ­
cen su estabilidad.  
1.6.2.2.  Condiciones de ensayo  
La temperatura de ensayo debe mantenerse constante (± 1  o C) y 
situarse en el intervalo de 20  o C a 25  o C. 
1.6.2.3.  Procedimiento de medida  
1.6.2.3.1. E s t a b l e c i m i e n t o d e l e q u i l i b r i o d e r e p a r t o 
Para cada serie de condiciones de ensayo, preparar recipientes de 
ensayo por duplicado con las cantidades requeridas, cuidadosamente 
medidas, de los dos disolventes, así como la cantidad necesaria de solución de reserva. 
Medir los volúmenes de las fases de n-octanol. Colocar en un agi ­
tador apropiado o agitar a mano los recipientes de ensayo. En caso 
de usar un tubo para centrifugar, un método que se recomienda consiste en hacer girar rápidamente 180 grados alrededor de su eje transversal el tubo, de forma que el aire que pudiera haber quedado 
retenido atraviese las dos fases. La experiencia muestra que 50 giros 
de este tipo suelen ser suficientes para establecer el equilibrio de reparto. Para mayor seguridad, se recomienda hacer 100 giros en 5 minutos.
 
1.6.2.3.2. S e p a r a c i ó n d e l a s f a s e s 
Cuando sea necesario para separar las fases, centrifugar la mezcla. 
Efectuar esta operación con una centrífuga de laboratorio mantenida a temperatura ambiente o, si se utiliza una centrífuga sin control de 
temperatura, equilibrar los tubos de centrífuga a la temperatura de 
ensayo durante por lo menos una hora antes del análisis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Análisis  
Para determinar el coeficiente de reparto, es necesario analizar las 
concentraciones de la sustancia de ensayo en las dos fases. Para ello, se puede extraer una alícuota de cada una de las dos fases de cada 
tubo, para cada serie de condiciones de ensayo, y analizarlas según 
el procedimiento elegido. Debe calcularse la cantidad total de sus ­
tancia presente en las dos fases y compararla con la cantidad intro ­
ducida inicialmente. 
La muestra de la fase acuosa debe tomarse por un procedimiento que 
reduzca al mínimo el riesgo de incorporar trazas de n-octanol: para 
ello se puede utilizar una jeringuilla de cristal con aguja intercam ­
biable; en primer lugar hay que llenar parcialmente de aire la jerin ­
guilla y a continuación expulsarlo lentamente mientras se va intro ­
duciendo al mismo tiempo la aguja a través de la capa de n-octanol. Extraer un volumen adecuado de fase acuosa. Retirar rápidamente la jeringuilla de la solución y quitar la aguja. El contenido de la jerin ­
guilla se podrá utilizar entonces como muestra acuosa. La concen ­
tración en las dos fases diferentes deberá determinarse, preferente ­
mente, mediante un procedimiento específico de la sustancia. Algu ­
nos ejemplos de métodos analíticos que pueden ser adecuados son: 
— métodos fotométricos, — cromatografía en fase gaseosa, — cromatografía líquida de alta resolución.
 
1.6.3.  Método de CLAR  
1.6.3.1.  Preparación  
Aparatos  
Se necesita un cromatógrafo de líquidos, dotado de una bomba de 
caudal constante y un instrumento de detección adecuado. Es reco ­
mendable el uso de una válvula de inyección con circuito de inyec ­
ción. La presencia de grupos polares en la fase estacionaria puede afectar gravemente al funcionamiento de la columna de CLAR; por tanto, las fases estacionarias deben presentar la mínima proporción 
posible de grupos polares (11). Pueden utilizarse rellenos de fase 
inversa con micropartículas o columnas ya rellenas, disponibles co ­
mercialmente. Puede ponerse una columna de seguridad entre el sistema de inyección y la columna de análisis.
 
Fase móvil  
Para preparar el disolvente de elución, del que se eliminarán los 
gases disueltos antes de utilizarlo, se empleará metanol para CLAR y agua para CLAR. Se empleará la elución isocrática. Se utilizarán 
mezclas de metanol/agua en que el contenido mínimo de agua será 
del 25 %. La mezcla típica de metanol-agua en la proporción de 3:1 (v/v) es satisfactoria para eluir compuestos de log P 6 en el plazo de una hora con un caudal de 1 ml/min. En el caso de compuestos de 
mayor log P puede ser necesario abreviar el tiempo de elución (y el 
de los compuestos de referencia) disminuyendo la polaridad de la fase móvil o la longitud de la columna. 
Las sustancias muy poco solubles en n-octanol tienden a dar valores 
de log P
 ow anormalmente bajos con el método de CLAR; los picos 
de estos compuestos acompañan a veces al frente de disolvente. Esto 
se debe probablemente al hecho de que el proceso de reparto es demasiado lento como para alcanzar el equilibrio en el tiempo ne ­
cesario normalmente en una separación por CLAR. Si se disminuye 
el caudal y/o se baja la proporción metanol/agua es posible obtener 
un valor fiable.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Las sustancias de ensayo y de referencia deben ser solubles en la 
fase móvil en concentraciones suficientes para permitir su detección. 
Solo podrán añadirse aditivos a la mezcla metanol-agua en casos excepcionales, ya que los aditivos cambian las propiedades de la columna. Si se trata de cromatogramas con aditivos, es obligatorio 
utilizar una columna independiente del mismo tipo. Si la mezcla 
metanol-agua no es adecuada, pueden utilizarse otras mezclas de disolventes orgánicos con agua, como etanol-agua o acetonitrilo- agua. 
El pH del eluyente es fundamental para los compuestos ionizables. 
Debe situarse en el intervalo de pH de funcionamiento de la colum ­
na, que suele estar entre 2 y 8. Se recomienda el uso de soluciones 
amortiguadoras, Hay que evitar la precipitación de sales y el dete ­
rioro de la columna que se producen con algunas mezclas de fase orgánica con soluciones amortiguadoras. Las medidas de CLAR con fases estacionarias a base de sílice con el pH superior a 8 no son 
recomendables porque el uso de una fase móvil alcalina puede pro ­
vocar una rápida alteración de las características de la columna.
 
Solutos  
Los compuestos de referencia deben tener la mayor pureza posible. 
Si es posible, los compuestos que se vayan a utilizar en el ensayo o en la calibración se disolverán en la fase móvil.
 
Condiciones de ensayo  
La temperatura durante las medidas no debe variar más de ± 2 K.  
1.6.3.2.  Medida  
Cálculo del tiempo muerto t  0 
El tiempo muerto t  0 puede determinarse utilizando una serie homó ­
loga (por ejemplo, n-alquil-metil-cetonas) o bien compuestos orgáni ­
cos no retenidos (por ejemplo, tiourea o formamida). Para calcular el tiempo muerto t
 0 utilizando una serie homóloga, se inyectarán al 
menos 7 miembros de una serie homóloga y se determinarán sus 
respectivos tiempos de retención. Los tiempos de retención, medidos 
directamente, t  r (n c + 1) , se representan gráficamente en función de 
t r(nc) y se determinan la ordenada en el origen a y la pendiente b de 
la ecuación de regresión: 
t r(n c + 1) = a + b t  r(n c ) 
siendo n  c = número de átomos de carbono. El tiempo muerto t  0 viene 
dado por: 
t 0 = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Gráfico de calibración  
El paso siguiente es construir una gráfica de correlación de log k 
frente a log P para los compuestos de referencia adecuados. En la práctica, se inyecta simultáneamente una serie de 5 a 10 compuestos patrón de referencia cuyo log P esté alrededor del intervalo supuesto, 
y se determinan los tiempos de retención, preferiblemente con un 
integrador-registrador unido al sistema de detección. Se calculan los respectivos logaritmos de los factores de capacidad, log K, y se representan en función del log P determinado según el método de 
frasco de agitación. La calibración se realiza a intervalos regulares, al 
menos una vez al día, de forma que puedan tenerse en cuenta los posibles cambios en las características de la columna.
 
Determinación del factor de capacidad de la sustancia de ensayo  
Se inyecta la cantidad más pequeña posible de sustancia de ensayo 
en fase móvil. Se determina (por duplicado) el tiempo de retención para calcular el factor de capacidad k. A partir de la gráfica de 
correlación de los compuestos de referencia puede interpolarse el 
coeficiente de reparto de la sustancia de ensayo. Cuando los coefi ­
cientes de reparto son muy altos o muy bajos es necesario hacer una extrapolación y en estos casos hay que tener muy en cuenta los 
límites de confianza de la línea de regresión.
 
2. RESULTADOS  
Método de frasco de agitación  
La fiabilidad de los valores determinados de P puede verificarse 
procediendo a una comparación de las medias de las determinaciones efectuadas por duplicado frente a la media general.
 
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas), 
— cuando no puedan aplicarse los métodos (por ejemplo, con pro ­
ductos tensoactivos), habrá que dar un valor calculado o una estimación a partir de las solubilidades en n-octanol y agua por separado, 
— toda la información y las observaciones que sean útiles para la 
interpretación de los resultados, especialmente en lo relativo a las impurezas y al estado físico de la sustancia.
 
Para el método de frasco de agitación:  
— resultado de la estimación previa, en su caso, 
— temperatura de la determinación, 
— datos sobre los procedimientos analíticos utilizados para determi ­
nar las concentraciones, 
— tiempo y velocidad de la centrifugación, en su caso,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— concentraciones medidas en ambas fases en cada determinación 
(es decir, hay que indicar un total de 12 concentraciones), 
— peso de la sustancia de ensayo, volumen de cada fase empleado 
en cada recipiente de ensayo y cantidad calculada total de sus ­
tancia de ensayo presente en cada fase tras el equilibrado, 
— valores calculados del coeficiente de reparto (P) y media de cada 
conjunto de condiciones de ensayo, así como la media de todas 
las determinaciones. Si hay alguna indicación de que el coefi ­
ciente de reparto puede variar con la concentración, habrá que señalarlo en el informe, 
— desviación típica de los distintos valores de P respecto a su 
media, 
— media del valor P de todas las determinaciones, expresada tam ­
bién en logaritmo decimal, 
— valor teórico calculado de P
 ow cuando este valor se haya deter ­
minado o cuando el valor medido sea superior a 10  4 , 
— pH del agua utilizada y fase acuosa durante la prueba, — si se utilizan soluciones amortiguadoras, hay que justificar su uso 
en lugar del agua e indicar su composición, concentración y pH, 
así como el pH de la fase acuosa antes y después del ensayo.
 
Para el método de CLAR:  
— resultado de la estimación previa, en su caso, 
— sustancias de ensayo y de referencia, con sus purezas, 
— intervalo de temperatura de las determinaciones, — pH al que se hacen las determinaciones, — características de las columnas de análisis y de seguridad, fase 
móvil y sistema de detección, 
— datos de la retención y valores de log P de la bibliografía co ­
rrespondiente a las sustancias de referencia utilizadas en la cali ­
bración, 
— datos de la recta de regresión ajustada (log K frente a log P), 
— datos de retención media y valor interpolado de log P del com ­
puesto problema, 
— descripción del equipo y condiciones de funcionamiento, — perfiles de elución, 
— cantidades de sustancias problema y de referencia introducidas en 
la columna, 
— tiempo muerto y método para medirlo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council 
C(81) 30 final. 
(2) C. Hansch y A.J. Leo, Substituent Constants for Correlaticn 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, Nueva York, 
1979. 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) 
— Available from Pomona College Medical Chemistry Proiect. 
1982, Pomona College, Claremont, California 91711. 
(4) L. Renberg, G. Sundström y K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 
1981, vol. 80, 683. 
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt y R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 212. 
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73. (7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1. (8) J.E. Haky y A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675. (9) S. Fujisawa y E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, 
vol. 15, 787. 
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (editado por E. Muller), Georg Thieme Verlag, 
Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339. 
(11) R.F. Rekker y H.M. de Kort, Euro. J Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479. 
(12) A. Leo, C. Hansch y D. Elkins, Partition coefficients and their 
uses. Chem. Rev., 1971, Vol. 71, 525. 
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmenta] Constant, Elsevicr, 
Amsterdam, 1977. 
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of partition coefficient — Flask shaking 
method. 
(15) C.V. Eadsforth y P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 459. (16) A. Leo, C. Hansch y D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 
71, 525. 
(17) C. Hansch, A Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani y E.J. 
Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1 207. 
(18) W.B. Neely, D.R. Branson y G.E. Blau, Environ. Sci. Te ­
chnol., 1974, vol. 8, 1 113. 
(19) D.S. Brown y E.W. Flagg,]. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382. (20) J.K. Seydel y K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologis ­
che Aktivitát von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weínheim, 
Nueva York, 1979.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Ams ­
terdam, 1984. 
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, Nueva 
York, Basilea, 1978. 
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Apéndice 1  
Métodos de cálculo y estimación  
INTRODUCCIÓN  
En Handbook of Chemical Property Estimation Methods  (a) se ofrece una in ­
troducción general de los métodos de cálculo, junto con datos y ejemplos. 
Los valores calculados de P  ow pueden utilizarse: 
— para decidir cuál de los métodos experimentales es adecuado (intervalo del 
método de frasco de agitación: log P  ow entre — 2 y 4; intervalo del método 
de CLAR: log P  ow entre 0 y 6), 
— para seleccionar las condiciones de ensayo adecuadas (por ejemplo, sustan ­
cias de referencia para procedimientos de CLAR, relación de volúmenes n- octanol/agua para el método de frasco de agitación), 
— como control interno del laboratorio para detectar posibles errores experimen ­
tales, 
— para dar una estimación de P
 ow en casos en que los métodos experimentales 
no puedan aplicarse por causas técnicas.  
MÉTODO DE ESTIMACIÓN  
Estimación previa del coeficiente de reparto  
El valor del coeficiente de reparto puede estimarse a partir de las solubilidades de 
la sustancia problema en los disolventes puros:  
P estimado ¼ c nÄoctanol  de saturación 
c agua de saturación  
MÉTODOS DE CÁLCULO  
Principio de los métodos de cálculo  
Todos los métodos de cálculo se basan en la fragmentación formal de la molé ­
cula en subestructuras adecuadas de las que se conocen incrementos fiables de log P
 ow . El log P  ow de toda la molécula se calcula entonces como la suma de los 
valores de los fragmentos correspondientes más unos términos de corrección por 
las interacciones intramoleculares. 
Existen listas de constantes de fragmentos y términos de corrección (b) (c) (d) (e). 
Algunas se actualizan periódicamente (b).  
Criterios cualitativos  
En general, la habilidad del método de cálculo va disminuyendo al aumentar la 
complejidad del compuesto estudiado. En el caso de moléculas simples de bajo 
peso molecular y uno o dos grupos funcionales, puede esperarse una desviación de 0,1 a 0,3 unidades logarítmicas de P
 ow entre los resultados de los diferentes 
métodos de fragmentación y el valor medido. Si se trata de moléculas más 
complejas, el margen de error puede ser mayor, dependiendo de la fiabilidad y 
disponibilidad de constantes de fragmentos, así como de la capacidad de detectar interacciones intramoleculares (por ejemplo, enlaces de hidrógeno) y del uso adecuado de los términos de corrección (problema menos arduo con los progra ­
mas de ordenador CLOGP-3) (b). En el caso de compuestos ionizados, es im ­
portante considerar correctamente la carga o el grado de ionización.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Procedimientos de cálculo  
Método de π de Hansch  
La constante del sustituyente hidrofóbico original, π, introducida por Fujita  et al.  
(f) se define como: 
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH) 
donde P  ow (PhX) es el coeficiente de reparto de un derivado aromático y P  ow 
(PhH) el del compuesto original. 
(P.y. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71). 
Según esta definición, el método de π es aplicable principalmente a la sustitución 
aromática. Se han tabulado los valores de π de gran número de sustituyentes (b) 
(c) (d) y se utilizan para calcular el log P  ow de moléculas o subestructuras 
aromáticas.  
Método de Rekker  
Según Rekker (g), el valor de log P  ow se calcula de la manera siguiente:  
log P  ow ¼ X 
i a i f i þ X 
j 
donde f  i representa las constantes de los diferentes fragmentos moleculares y a  i la 
frecuencia de su aparición en la molécula estudiada. Los términos de corrección 
pueden expresarse como integral múltiple de una sola constante C  m (llamada 
«constante mágica»). Las constantes de fragmentos f  i y C  m se han obtenido a 
partir de una lista de 1 054 valores experimentales de P  ow (825 compuestos) 
mediante análisis de regresión múltiple (c) (h). La determinación de los términos 
de interacción se lleva a cabo según normas establecidas recogidas en a biblio ­
grafía (e) (h) (i).  
Método de Hansch-Leo  
Según Hansch y Leo (c), el valor de log P  ow se calcula de la forma siguiente:  
log P  ow ¼ X 
i a i f i þ X 
j b j F j 
donde f  i representa las constantes de los diferentes fragmentos moleculares; F  j , 
los términos de corrección, y a  i y b j las frecuencias correspondientes de presen ­
cia. A partir de valores experimentales de P  ow , se establecieron por el método de 
tanteo una lista de valores de fragmentos atómicos y de grupos y una lista de 
términos de corrección F  j (llamados «factores»). Los términos de corrección se 
han ordenado en varias clases diferentes (a) (c). Es bastante complicado y exige mucho tiempo el tener en cuenta todas las normas y los términos de corrección. Se han ideado programas informáticos (b).
 
Método combinado  
El cálculo de log P  ow de moléculas complejas puede mejorarse considerable ­
mente si se divide la molécula en grandes subestructuras de las que se conozcan 
valores fiables de log P  ow a partir de listas (b) (c) o por mediciones propias. 
Estos fragmentos (por ejemplo, heterociclos, antraquinona, azobenceno) pueden combinarse con los valores π de Hansch o con las constantes de fragmentos de 
Rekker o Leo.
 
Observaciones  
i) Los métodos de cálculo solo pueden aplicarse a compuestos parcial o com ­
pletamente ionizados, si es posible tener en cuenta los necesarios factores de 
corrección.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Si puede suponerse la presencia de enlaces de hidrógeno intramoleculares, 
hay que añadir los correspondientes términos de corrección (aproximadamen ­
te, de + 0,6 a + 1,0 unidades logarítmicas de P  ow ) (a). La presencia de tales 
enlaces puede suponerse a partir de modelos estéricos o datos espectroscó ­
picos de la molécula. 
iii) Si son posibles varias formas tautoméricas, debe usarse como base para el 
cálculo la forma más probable. 
iv) Hay que seguir cuidadosamente las revisiones de las listas de constantes de 
fragmentos.  
Informe  
Cuando se utilicen métodos de cálculo/estimación, el informe del ensayo incluirá, 
a ser posible, la siguiente información: 
— descripción de la sustancia (mezcla, impurezas, etc.), 
— indicación de cualquier posible enlace de hidrógeno intramolecular, disocia ­
ción, carga o cualquier otro efecto poco común (por ejemplo, tautomería), 
— descripción del método de cálculo, — indicación o suministro de la base de datos, — peculiaridades de la selección de los fragmentos, — documentación exhaustiva de los cálculos.
 
BIBLIOGRAFÍA  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl y D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, Nueva York, 1983. 
(b) Pomona College, Medical Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3). 
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, Nueva York, 1979. 
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525. (e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther., 1979, 
vol. 14, 479. 
(f) T. Fujita, J. Iwasa y C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175. (g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, vol. 1 Elsevier, Nueva York, 1977. 
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459. 
(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington D. C, 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Apéndice 2  
Sustancias de referencia recomendadas para el método de CLAR  
№ Sustancia de referencia log P  ow pKa 
1 2-Butanona 0,3 
7 4-Acetilpiridina 0,5 
3 Anilina 0,9 4 Acetanilida 1,0 
5 Alcohol bencílico 1,1 
6 p-Metoxifenol 1,3 pKa = 10,26 
7 Ácido fenoxiacético 1,4 pKa = 3,12 
8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-Dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 Benzonitrilo 1,6 
11 Fenilacetonitrilo 1,6 12 Alcohol 4-metilbencílico 1,6 
13 Acetofenona 1,7 
14 2-Nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 
15 Ácido 3-nitrobenzoico 1,8 pKa = 3,47 
16 4-Cloranilina 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenceno 1,9 
18 Alcohol cinámico 1,9 
19 Ácido benzoico 1,9 pKa = 4,19 20 p-Cresol 1,9 pKa = 10,17 
21 Ácido cinámico 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 
22 Anisol 2,1 
23 Metilbenzoato 2,1 
24 Benceno 2,1 25 Ácido 3-metilbenzoico 2,4 pKa = 4,27 
26 4-Clorofenol 2,4 pKa = 9,1 
27 Tricloroetileno 2,4 28 Atrazina 2,6 
29 Etilbenzoato 2,6 
30 2,6-Diclorobenzonitrilo 2,6 
31 Ácido 3-clorobenzoico 2,7 pKa = 3,82 
32 Tolueno 2,7 33 1-Naftol 2,7 pKa = 9,34 
34 2,3-Dicloroanilina 2,8 
35 Clorobenceno 2,8 36 Alil-feniléter 2,9 
37 Bromobenceno 3,0
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
№ Sustancia de referencia log P  ow pKa 
38 Etilbenceno 3,2 
39 Benzofenona 3,2 
40 4-Fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 
41 Timol 3,3 42 1,4-Diclorobenceno 3,4 43 Difenilamina 3,4 pKa = 0,79 44 Nafraleno 3,6 45 Fenilbenzoato 3,6 46 Isopropilbenceno 3,7 47 2,4,6-Triclorofenol 3,7 pKa = 6 48 Bifenilo 4,0 49 Bencilbenzoato 4,0 50 2,4-Dinitro-6 sec. butilfenol 4,1 
51 1,2,4-Triclorobenceno 4,2 
52 Ácido dodecanoico 4,2 53 Difeniléter 4,2 54 n-Butilbenceno 4,5 55 Fenantreno 4,5 56 Fluoranteno 4,7 57 Dibencilo 4,8 58 2,6-Difenilpiridina 4,9 59 Trifenilamina 5,7 60 DDT 6,2 
Otras sustancias de referencia de bajo log P
 ow 
1 Ácido nicotínico -0,07  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. PUNTO DE INFLAMACIÓN  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Es conveniente disponer de datos preliminares sobre la inflamabilidad 
de la sustancia antes de proceder al ensayo. Este procedimiento es 
aplicable a las sustancias líquidas cuyos vapores pueden ser inflamados por fuentes de ignición. Los métodos de ensayo descritos en el presente documento solo son válidos para los intervalos de punto de inflamación 
especificados en cada uno de los distintos métodos. 
A la hora de seleccionar el método hay que tener en cuenta las 
posibles reacciones químicas entre la sustancia y el soporte de la 
muestra.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
El punto de inflamación es la temperatura mínima, corregida a una 
presión de 101,325 kPa, a la cual un líquido desprende vapores, en las 
condiciones definidas en el método de ensayo, en una cantidad tal que se produzca una mezcla vapor/aire inflamable en el recipiente del ensayo. 
Unidad:
 o C 
t = T - 273,15 
(t en  o C y T en K)  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
No es necesario utilizar sustancias de referencia cada vez que se 
examina una nueva sustancia. Su principal función es la de servir 
para comprobar las características del método de vez en cuando y comparar con los resultados obtenidos según otros métodos.
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se coloca la sustancia en un recipiente de ensayo y se calienta o se 
enfría hasta la temperatura de ensayo según el procedimiento descrito en cada método concreto. Se hacen pruebas de ignición para obser ­
var si la muestra se inflama o no a la temperatura de ensayo.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD  
1.5.1.  Repetibilidad  
La repetibilidad depende del intervalo del punto de inflamación y del 
método de ensayo utilizado; máximo 2  o C. 
1.5.2.  Sensibilidad  
La sensibilidad depende del método de ensayo utilizado.  
1.5.3.  Especificidad  
La especificidad de ciertos métodos de ensayo se limita a algunos 
intervalos de punto de inflamación y depende de las características 
de la sustancia (por ejemplo, alta viscosidad).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Preparación  
Se coloca una muestra de la sustancia problema en un aparato de 
ensayo, de conformidad con los puntos 1.6.3.1 y/o 1.6.3.2. 
Por seguridad, se recomienda para sustancias energéticas o tóxicas 
seguir un método que exija una muestra pequeña, alrededor de 2 cm  3 . 
1.6.2.  Condiciones del ensayo  
Se debe instalar el aparato lejos de corrientes de aire, siempre que 
esto no suponga ningún problema de seguridad.  
1.6.3.  Desarrollo del ensayo  
1.6.3.1.  Método de equilibrio  
Véanse las normas ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 e ISO 3679.  
1.6.3.2.  Métodos de no equilibrio  
Aparato Abel:  
Véanse las normas BS 2000, parte 170, NF M07-011 y NF T66-009.  
Aparato Abel-Pensky:  
Véanse las normas EN 57, DIN 51755 primera parte (para tempera ­
turas de 5 a 65  o C), DIN 51755 segunda parte (para temperaturas 
inferiores a 5  o C) y NF M07-036.  
Aparato Tag:  
Véase la norma ASTM D-56.  
Aparato Pensky-Martens:  
Véanse las normas ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 
2000-34 y NF M07-019.  
Observaciones:  
Cuando el punto de inflamación determinado por un método de no 
equilibrio del punto 1.6.3.2 tiene los siguientes valores: 0 ± 2  o C, 21 
± 2 o C o 55 ± 2  o C, es conveniente confirmarlo mediante un método 
de equilibrio utilizando el mismo aparato. 
Únicamente se pueden utilizar para la notificación los métodos que 
puedan dar la temperatura del punto de inflamación. 
Para determinar el punto de inflamación de líquidos viscosos (pin ­
turas, gomas, etc.) que contengan disolventes, solo se pueden utilizar los aparatos y métodos de ensayo que permitan determinar el punto de inflamación de los líquidos viscosos. 
Véanse las normas ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 y DIN 53213 
primera parte.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. RESULTADOS  
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente informa ­
ción: 
— especificación precisa de la sustancia (identificación e impure ­
zas), 
— descripción del método utilizado, así como cualquier desviación, — los resultados y cualquier otra información u observación que 
pueda ser útil para la interpretación de los resultados.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
Ninguna.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  INFLAMABILIDAD (SÓLIDOS)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Es conveniente disponer de datos preliminares sobre las posibles 
propiedades explosivas de la sustancia antes de proceder al ensayo. 
El presente método solo es aplicable a las sustancias en polvo, 
granulosas o pastosas. 
Para no englobar todas las sustancias que pueden inflamarse, sino 
únicamente aquellas que se queman muy rápidamente o cuya forma 
de combustión es, de una forma u otra, particularmente peligrosa, solo se considerarán como fácilmente inflamables las sustancias cuya velocidad de combustión sobrepase un cierto límite. 
Puede ser especialmente peligroso que la incandescencia se propague 
a través de un polvo metálico debido a las dificultades para apagar 
un fuego. Los polvos metálicos se considerarán fácilmente inflama ­
bles si permiten la difusión de la incandescencia en toda su masa en un tiempo especificado.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
Tiempo de combustión expresado en segundos.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
No se especifican.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
La sustancia se dispone formando una mecha o cinta continua de 
unos 250 mm de longitud y se hace un ensayo exploratorio previo 
para determinar si, al aplicar una llama de gas, se produce la pro ­
pagación de la combustión con llama o sin ella. Si se produce la propagación a lo largo de 200 mm de la mecha dentro de un tiempo 
dado, hay que realizar un ensayo completo para determinar la velo ­
cidad de combustión.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
No se indican.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Ensayo exploratorio previo  
Se pone la sustancia formando una mezcla o cinta continua de unos 
250 mm de longitud, 20 mm de anchura y 10 mm de altura, sobre 
una placa incombustible, no porosa y de baja conductividad térmica. 
Una llama fuerte procedente de un mechero de gas (diámetro míni ­
mo: 5 mm) se aplica a un extremo de la mecha hasta que el polvo empieza a arder o durante un máximo de 2 minutos (5 minutos si se 
trata de polvos de metales o de aleaciones metálicas). Hay que 
observar si la combustión se propaga a lo largo de 200 mm de la mecha durante un período de prueba de 4 minutos (o 40 minutos si 
se trata de polvos metálicos). Si la sustancia no se enciende ni 
propaga la combustión ardiendo con llama o sin ella a lo largo de 200 mm de la mecha en el plazo de 4 minutos (o 40 minutos), entonces la sustancia no debe considerarse fácilmente inflamable y 
no es necesario seguir con las pruebas. Si la sustancia propaga la 
combustión a lo largo de 200 mm de longitud de la mecha en menos de 4 minutos (o menos de 40 minutos si se trata de polvos metáli ­
cos), hay que aplicar el procedimiento descrito a continuación (pun ­
tos 1.6.2 y siguientes).
 
1.6.2.  Ensayo de la velocidad de combustión  
1.6.2.1.  Preparación  
En el caso de sustancias en polvo o granulosas se vierte la sustancia 
sin comprimir dentro de un molde de 250 mm de longitud con una sección transversal triangular de 10 mm de altura interior y 20 mm de anchura. A ambos lados del molde, en sentido longitudinal, se 
colocan dos placas metálicas a modo de soportes laterales, que deben 
sobrepasar en 2 mm el borde superior de la sección triangular trans ­
versal del molde (véase la figura). A continuación se deja caer tres veces el molde desde una altura de 2 cm, sobre una superficie dura. 
Si es necesario, se completa el molde de nuevo. A continuación, se 
retiran las placas laterales y se enrasa. Se coloca sobre el molde una placa no combustible, no porosa y de baja conductividad térmica, se le da la vuelta y se desmolda. 
Las sustancias pastosas se extienden sobre una superficie no com ­
bustible, no porosa y de baja conductividad térmica, formando un 
cordón de 250 mm de longitud y alrededor de 1 cm
 2 de sección.  
1.6.2.2.  Condiciones del ensayo  
En el caso de sustancias sensibles a la humedad, hay que efectuar el 
ensayo lo más rápidamente posible después de retirar la sustancia del recipiente.
 
1.6.2.3.  Desarrollo del ensayo  
Colocar el dispositivo en el tiro de una campana de gases. 
La velocidad del aire debe ser suficiente para evitar que los humos 
pasen al laboratorio y no debe variar mientras dure el ensayo. Alre ­
dedor del dispositivo se pondrá una pantalla. 
Se utiliza una llama fuerte procedente de un mechero de gas (diáme ­
tro mínimo: 5 mm) para encender un extremo de la sustancia. 
Cuando la mecha ha ardido a lo largo de 80 mm, se procede a medir 
la velocidad de combustión a lo largo de los siguientes 100 mm.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
El ensayo se repite seis veces, usando cada vez una placa fría y 
limpia, salvo que se obtenga antes un resultado positivo.  
2. RESULTADOS  
Para proceder a la evaluación es preciso conocer el tiempo de com ­
bustión del ensayo exploratorio previo (1.6.1) y el menor tiempo de 
combustión de un máximo de seis ensayos (1.6.2.3).  
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas), — descripción de la sustancia de ensayo y su estado físico, incluida 
la tasa de humedad, 
— resultados del ensayo exploratorio previo y del ensayo de velo ­
cidad de combustión, en su caso, 
— cualquier observación complementaria que pueda ser útil para la 
interpretación de los resultados.
 
3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Las sustancias pulverulentas, granulosas o pastosas se deberán con ­
siderar fácilmente inflamables cuando el tiempo de combustión de 
cualquier ensayo efectuado según el procedimiento descrito en el punto 1.6.2 sea inferior a 45 segundos. Deberá considerarse que los polvos metálicos o de aleaciones metálicas son fácilmente infla ­
mables cuando puedan encenderse y la llama o la zona de reacción 
se extienda a toda la muestra en 10 minutos o menos.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. De ­
termination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Apéndice  
Figura  
Molde y accesorios necesarios para la formación de las mechas  
(todas las dimensiones expresadas en milímetros)
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  INFLAMABILIDAD (GASES)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente método permite determinar si los gases mezclados con el 
aire a temperatura (alrededor de 20  o C) y presión ambiente son 
inflamables y, en caso positivo, en qué intervalo de concentraciones. Se exponen a una chispa eléctrica mezclas que contengan concen ­
traciones crecientes de gas problema y se observa si se produce la 
inflamación.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
El intervalo de inflamabilidad es el intervalo de concentración entre 
los límites de explosión superior e inferior. Los límites de explosión superior e inferior son los límites de concentración del gas inflama ­
ble en mezcla con el aire a los que el fuego no se propaga.
 
1.3. SUSTANCIA DE REFERENCIA 
No se especifica.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se aumenta gradualmente la concentración del gas en el aire y, en 
cada etapa, se expone la mezcla a una chispa eléctrica.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
No se indican.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Equipo  
El recipiente de ensayo es un cilindro de cristal de un diámetro 
interior de al menos 50 mm y una altura mínima de 300 mm, que 
se pone verticalmente. Los electrodos de ignición distan de 3 a 5 mm 
uno del otro y están situados a 60 mm del fondo del cilindro. El cilindro está equipado con una válvula para reducir la presión. El aparato debe estar protegido por un blindaje para limitar los daños de 
una posible explosión. 
La fuente de ignición es una chispa inductiva constante de 0,5 se ­
gundos de duración, producida por un transformador de alta tensión con una tensión de salida de 10 a 15 kV (la potencia máxima es de 
300 W). En la referencia (2) se describe un ejemplo de equipo 
adecuado.
 
1.6.2.  Condiciones del ensayo  
El ensayo debe efectuarse a temperatura ambiente (alrededor de 20  o C). ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Desarrollo del ensayo  
Mediante bombas dosificadoras se llena el cilindro de cristal con una 
mezcla de aire y gas de concentración conocida. Se hace saltar una chispa en esta mezcla y se observa si se desprende una llama de la 
fuente de ignición y se propaga independientemente. Se irá aumen ­
tando la concentración de gas en un 1 % de volumen cada vez, hasta que se produzca la inflamación descrita anteriormente. 
Si la estructura química del gas indica que debe ser ininflamable y 
puede calcularse la composición de la mezcla estequiométrica con el 
aire, solo será necesario someter a ensayo, en etapas del 1 %, mez ­
clas que estén en el intervalo entre el 10 % por debajo y el 10 % por arriba de la composición estequiométrica.
 
2. RESULTADOS  
La propagación de la llama constituye el único dato válido para la 
determinación de esta propiedad.  
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas), — descripción del aparato utilizado, mencionando las dimensiones, — temperatura en el momento del ensayo, — concentraciones de ensayo, así como los resultados obtenidos, — resultado del ensayo: gas no inflamable o fácilmente inflamable, — si se ha llegado a la conclusión de que el gas no es inflamable, se 
debe indicar el intervalo de concentraciones que se ha sometido a 
ensayo en etapas del 1 %, 
— cualquier información u observación que pueda ser útil para la 
interpretación de los resultados.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases. 
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. 
Redeker y H. Schacke. «Entwicklung einer Standard-Apparatur 
zur Messung von Explosionsgrenzen». Chem.-Ing.-Tech., 1984, 
vol. 56, 126-127.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  INFLAMABILIDAD (EN CONTACTO CON EL AGUA)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Este método de ensayo puede utilizarse para determinar si la reac ­
ción de una sustancia con el agua o el aire húmedo ocasiona el 
desprendimiento de una cantidad peligrosa de un gas o de varios gases, que puedan ser fácilmente inflamables. 
Puede aplicarse tanto a sustancias sólidas como líquidas, pero no a las 
sustancias que se inflaman espontáneamente en contacto con el aire.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
Sustancias fácilmente inflamables: preparados que, en contacto con 
el agua o el aire húmedo, desprenden una cantidad peligrosa de 
gases fácilmente inflamables, a una velocidad mínima de 1 l/kg 
por hora.  
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
El ensayo incluye varias fases sucesivas que se describen a conti ­
nuación; si la inflamación se produce en cualquiera de estas fases no 
es necesario proseguir el ensayo. Si se sabe que la sustancia no 
reacciona violentamente con el agua, se pasa directamente a la fase 4 (1.3.4).
 
1.3.1.  Fase 1  
Se coloca la sustancia problema en una cubeta que contenga agua 
destilada a 20  o C y se observa si el gas desprendido se inflama o no.  
1.3.2.  Fase 2  
Se coloca la sustancia de ensayo en un papel de filtro que flote sobre 
un recipiente lleno de agua destilada a 20  o C y se observa si el gas 
que se desprende se inflama o no. El papel de filtro solo sirve para 
mantener la sustancia en un lugar, lo cual aumenta las probabilidades 
de inflamación.  
1.3.3.  Fase 3  
Se forma con la sustancia de ensayo una pila de 2 cm de altura y 3 cm 
de diámetro, aproximadamente. Se añaden algunas gotas de agua a la pila y se observa si el gas que se desprende se inflama o no.
 
1.3.4.  Fase 4  
Se mezcla la sustancia de ensayo con agua destilada a 20  o C y se mide 
la velocidad de producción de gas durante 7 horas, a intervalos de una hora. Si al cabo de 7 horas la velocidad de producción es variable o va aumentando, debe prolongarse el tiempo de medida hasta un máximo 
de 5 días. Si, en un momento dado, la velocidad de producción supera 1 
l/kg por hora, el ensayo puede darse por acabado.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. SUSTANCIA DE REFERENCIA 
No se especifica.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
No se indican.  
1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS  
1.6.1.  Fase 1  
1.6.1.1.  Condiciones del ensayo  
El ensayo se realiza a temperatura ambiente (alrededor de 20  o C). 
1.6.1.2.  Desarrollo del ensayo  
Se coloca una pequeña cantidad (aproximadamente unos 2 mm de 
diámetro) de la sustancia problema en una cubeta con agua destilada. Observar: i) si hay desprendimiento de gas, y ii) si el gas se inflama. Si se inflama, se considerará que la sustancia es peligrosa y se dará 
por finalizado el ensayo.
 
1.6.2.  Fase 2  
1.6.2.1.  Equipo  
Papel de filtro flotando sobre una superficie de agua destilada en un 
recipiente adecuado, como, por ejemplo, una cubeta de evaporación 
de 100 mm de diámetro.  
1.6.2.2.  Condiciones del ensayo  
El ensayo se realiza a temperatura ambiente (alrededor de 20  o C). 
1.6.2.3.  Desarrollo del ensayo  
Se coloca una pequeña cantidad de la sustancia problema (aproxi ­
madamente 2 mm de diámetro) sobre el centro del papel de filtro. Observar: i) si hay desprendimiento de gas, y ii) si el gas se inflama. Si se inflama, se considerará que la sustancia es peligrosa y se dará 
por finalizado el ensayo.
 
1.6.3.  Fase 3  
1.6.3.1.  Condiciones del ensayo  
El ensayo se realiza a temperatura ambiente (alrededor de 20  o C). 
1.6.3.2.  Desarrollo del ensayo  
Se forma con la sustancia de ensayo una pila de 2 cm de altura y 
3 cm de diámetro, aproximadamente, con un pequeño cráter en la cumbre. Se añaden algunas gotas de agua en el hueco y se observa: i) si hay desprendimiento de gas, y ii) si el gas se inflama. Si se 
inflama, se considerará que la sustancia es peligrosa y se dará por 
finalizado el ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  Fase 4  
1.6.4.1.  Equipo  
El equipo se monta según se muestra en la figura.  
1.6.4.2.  Condiciones del ensayo  
Hay que asegurarse de que el recipiente que contiene la sustancia 
problema está libre de partículas pulverulentas (tamaño de partícula 
< 500 μm). Si estas representan más del 1 % en peso del total, o si la 
muestra es quebradiza, hay que reducir a polvo la sustancia antes de proceder al ensayo, para tener en cuenta la reducción del tamaño de 
las partículas durante su almacenamiento y manipulación; en caso 
contrario, la sustancia se utiliza en su forma original. Debe realizarse el ensayo a temperatura ambiente (alrededor de 20
 o C) y a presión 
atmosférica.  
1.6.4.3.  Desarrollo del ensayo  
Se ponen entre 10 y 20 ml de agua en el embudo cuentagotas del 
equipo y 10 g de sustancia en el matraz cónico. El volumen de gas producido puede medirse con cualquier método adecuado. Se abre la tapa del embudo cuentagotas para que penetre el agua en el matraz 
cónico y se pone en marcha un cronómetro. Se mide la producción 
de gas cada hora a lo largo de un período de 7 horas. Si durante este período la producción de gas es irregular o si al final del período la 
velocidad de producción de gas está en aumento, hay que continuar 
con las medidas hasta un máximo de 5 días. Si en cualquier mo ­
mento de la medida la velocidad de producción de gas pasa de 1 l/kg por hora, puede interrumpirse el ensayo. Este ensayo debe realizarse 
por triplicado. 
Si no se conoce la identidad química del gas, debe analizarse este. Si 
el gas contiene componentes fácilmente inflamables y si, además, se ignora si el conjunto de la mezcla es fácilmente inflamable, hay que 
preparar y someter a ensayo una mezcla de la misma composición, 
de conformidad con el método A.11.
 
2. RESULTADOS  
La sustancia se considera peligrosa si: 
— se produce ignición espontánea en cualquier fase del desarrollo 
del ensayo, 
o 
— se produce gas inflamable a una velocidad superior a 1 l/kg de 
sustancia por hora.  
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas), 
— datos sobre cualquier preparación inicial de la sustancia 
problema,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— resultados de los ensayos (fases 1, 2, 3 y 4), 
— identidad química del gas desprendido, — la velocidad de formación del gas si se realiza la fase 4 (1.6.4), 
— cualquier observación complementaria que sea útil para la inter ­
pretación de los resultados.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, test 
and criteria, 1990, Naciones Unidas, Nueva York. 
(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the 
hydrolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Apéndice  
Figura  
Equipo
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13.  PROPIEDADES PIROFÓRICAS DE SÓLIDOS Y LÍQUIDOS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El procedimiento del ensayo es aplicable a las sustancias sólidas y 
liquidas que pueden inflamarse espontáneamente poco tiempo des ­
pués de haber entrado en contacto con el aire a temperatura ambiente (alrededor de 20
 o C). 
Este método de ensayo no puede aplicarse a las sustancias que tienen 
que exponerse al aire durante varias horas o días a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas antes de inflamarse.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
Se considera que una sustancia tiene propiedades pirofóricas si, en 
las condiciones descritas en el punto 1.6, se inflama o se carboniza. 
También puede ser necesario estudiar la autoinflamabilidad de líqui ­
dos según el método A.15. Temperatura de autoinflamación (líquidos y gases).
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
No se especifican.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se añade la sustancia, sea sólida o líquida, a un soporte inerte y se 
pone en contacto con el aire a temperatura ambiente durante un 
período de 5 minutos. Si las sustancias líquidas no se inflaman, 
entonces se absorben en papel de filtro y se exponen al aire a temperatura ambiente (alrededor de 20
 o C) durante 5 minutos. Si 
un sólido o líquido se inflama, o un líquido inflama o carboniza a 
un papel de filtro, entonces se considera que la sustancia es pirofó ­
rica. 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Repetibilidad: debido a la importancia en relación con la seguridad, 
un solo resultado positivo será suficiente para considerar que la 
sustancia es pirofórica.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.6.1.  Equipo  
Llenar una cubeta de porcelana de unos 10 cm de diámetro con una 
capa de tierra de infusorios, de unos 5 mm de espesor, a temperatura ambiente (alrededor de 20
 o C). 
Observaciones: 
La tierra de infusorios, o cualquier otra sustancia inerte equivalente 
que se obtenga fácilmente, se tomará como representativa de suelo 
sobre el que pudiera esparcirse la sustancia en caso de accidente. 
El papel de filtro seco es necesario para el ensayo de los líquidos que 
no se inflaman en contacto con el aire cuando están unidos a un 
soporte inerte.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Realización del ensayo  
a) Sólidos pulverulentos  
Se vierten 1 o 2 cm  3 de la sustancia problema, desde una altura de 
alrededor de 1 m, sobre una superficie no combustible y se observa 
si la sustancia se inflama durante la caída o durante los primeros 
5 minutos después de depositarse. 
El ensayo se realiza seis veces, salvo que se produzca ignición.  
b) Líquidos  
Se vierten 5 cm  3 del líquido problema en la cubeta de porcelana 
preparada y se observa si la sustancia se inflama en un tiempo de 
5 minutos. 
Si no se observa inflamación durante estos seis ensayos, hay que 
realizar los siguientes ensayos: 
Con una jeringuilla se ponen 0,5 ml de la sustancia en un papel de 
filtro dentado y se observa si se produce inflamación o carbonización del papel de filtro en el plazo de 5 minutos desde la adición del 
líquido. El ensayo se realiza tres veces, salvo que se produzca in ­
flamación o carbonización.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
El ensayo puede interrumpirse tan pronto como se obtenga un resul ­
tado positivo en cualquiera de las pruebas.  
2.2. EVALUACIÓN 
Una sustancia se considera pirofórica si se inflama en el plazo de 
5 minutos cuando se añade a un soporte inerte y se expone al aire, o 
bien cuando la sustancia líquida carboniza o inflama un papel de filtro en el plazo de 5 minutos desde que se pone en contacto con este y se expone al aire.
 
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente informa ­
ción: 
— especificación precisa de la sustancia (identificación e impure ­
zas), 
— resultado del ensayo, — cualquier observación complementaria que sea útil para la inter ­
pretación de los resultados.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids. 
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, Naciones Unidas, Nueva York.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  PROPIEDADES EXPLOSIVAS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Se trata de un método de ensayo que permite determinar si una 
sustancia sólida o pastosa presenta o no peligro de explosión cuando 
se expone al efecto de una llama (sensibilidad térmica) o a un choque o fricción (sensibilidad a estímulos mecánicos), y si una sustancia líquida presenta peligro de explosión cuando se expone 
al efecto de una llama o un choque. 
El método comprende tres partes: 
a) un ensayo de sensibilidad térmica (1); 
b) un ensayo de sensibilidad mecánica respecto al choque (1); 
c) un ensayo de sensibilidad mecánica respecto a la fricción (1). 
El método proporciona datos que permiten evaluar la probabilidad de 
inicio de una explosión por medio de algunos estímulos corrientes. No tiene por objeto determinar si una sustancia puede o no hacer 
explosión en cualesquiera condiciones. 
El método sirve para, determinar si una sustancia presenta peligro de 
explosión (sensibilidad térmica y mecánica) en las condiciones espe ­
cíficas definidas por la Directiva. En el ensayo se utiliza un cierto 
número de equipos ampliamente utilizados internacionalmente (1) y 
que, por regla general, dan resultados convincentes. Hay que reco ­
nocer que el método no es definitivo. Pueden utilizarse equipos distintos a los especificados siempre que estén reconocidos interna ­
cionalmente y se pueda establecer una buena correlación entre los 
resultados obtenidos con el equipo alternativo y los del equipo es ­
pecificado. 
No es necesario realizar los ensayos si los datos termodinámicos 
disponibles (calor de formación, calor de descomposición, etc.) o 
la ausencia de ciertos grupos reactivos (2) en la fórmula desarrollada permiten establecer de forma razonablemente inequívoca que la sus ­
tancia no puede descomponerse rápidamente con formación de gases 
o liberación de calor (dicho de otro modo, si la materia no presenta 
ningún riesgo de explosión). No es necesario realizar un ensayo de sensibilidad a la fricción con las sustancias líquidas.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
Explosivos: 
Sustancias que puedan hacer explosión bajo el efecto de una llama, o 
que sean sensibles al choque o a la fricción en el equipo especificado (o que sean más sensibles mecánicamente que el 1,3-dinitrobenceno en un equipo alternativo).
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
1,3-dinitrobenceno, producto cristalino técnico pasado por tamiz de 
0,5 mm, para los métodos de fricción y choque. 
Perhidro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazina (RDX, hexogen, ciclonita — 
CAS 121-82-4), recristalizado a partir de ciclohexanona acuosa, tamizado por vía húmeda a través de un tamiz de 250 μm y retenido 
en un tamiz de 150 μm y secado a 103 ± 2
 o C durante 4 horas para 
la segunda serie de ensayos de fricción y choque.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se debe realizar un ensayo preliminar para determinar las condicio ­
nes de seguridad que deben presidir la ejecución de los tres ensayos de sensibilidad.
 
1.4.1.  Pruebas de seguridad en la manipulación (3)  
Por razones de seguridad, antes de pasar a los ensayos principales, se 
someten muestras muy reducidas (unos 10 mg) de sustancia a un 
calentamiento sin confinamiento con llama de gas, a choque con cualquier tipo de instrumento adecuado y a fricción utilizando un mazo y un yunque, o cualquier otro tipo de instrumento que sirva 
para producir fricción. El objetivo es determinar si la sustancia es tan 
sensible y explosiva que los ensayos de sensibilidad prescritos, es ­
pecialmente el de sensibilidad térmica, deban realizarse con precau ­
ciones especiales a fin de evitar cualquier daño corporal al operario.
 
1.4.2.  Sensibilidad térmica  
Este método consiste en calentar la sustancia en un tubo de acero 
cerrado por placas horadadas con agujeros de diferentes diámetros, 
para determinar si la sustancia puede hacer explosión en condiciones 
de calor intenso y un confinamiento determinado.  
1.4.3.  Sensibilidad mecánica (choque)  
El método consiste en someter la sustancia al choque producido por 
una masa especificada que se deja caer desde una altura también especificada.
 
1.4.4.  Sensibilidad mecánica (fricción)  
Este método consiste en someter la sustancia sólida o pastosa a una 
fricción entre superficies tipo, en condiciones específicas de carga y 
de movimiento relativo.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
No se indican.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Sensibilidad térmica (efecto de la llama)  
1.6.1.1.  Equipo  
El equipo consiste en un tubo de acero no reutilizable con un sistema 
de cierre reutilizable (figura 1), instalado en un instrumento de ca ­
lefacción y protección. Cada tubo se obtiene por embutido de una lámina de acero (véase el apéndice) y tiene 24 mm de diámetro 
interior, 75 mm de longitud y 0,5 mm de espesor de pared. Los 
tubos tienen un reborde en el extremo abierto para que se puedan cerrar con el dispositivo de la placa horadada. Este dispositivo con ­
siste en una placa horadada resistente a la presión, con un orificio 
central, unido firmemente al tubo mediante una junta aterrajada en 
dos partes (tuerca y abrazadera de rosca); esta junta está hecha de acero al cromo-manganeso (véase el apéndice) exento de chispas hasta 800
 o C. Las placas horadadas tienen 6 mm de espesor, están 
hechas de acero resistente al calor (véase el apéndice) y pueden 
escogerse con varios diámetros de abertura.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Condiciones del ensayo  
Normalmente se somete a ensayo la sustancia tal como llega al 
laboratorio, aunque en algunos casos (por ejemplo, si está prensada, fundida o condensada de alguna otra forma) puede ser necesario 
estudiar la sustancia después de triturarla. 
Si se trata de un sólido, la masa de material que debe utilizarse en 
cada ensayo se determina mediante un proceso seco de dos fases. Se llena un tubo tarado con 9 cm
 3 de sustancia y esta se apisona 
aplicando una fuerza de 80 N a toda la sección transversal del tubo. 
La forma de llenar el tubo puede ser distinta por razones de segu ­
ridad o en caso de que la forma física de la muestra pueda cambiar por la compresión; por ejemplo, si la sustancia es muy sensible a la 
fricción, no puede apisonarse. Si el material es compresible, se añade 
más cantidad y se vuelve a apisonar hasta que la altura del relleno queda a 55 mm de la boca. Se determina la masa total utilizada para llenar el tubo hasta el nivel de 55 mm y se hacen dos adiciones más, 
cada una apisonada con una fuerza de 80 N. Entonces, según sea 
necesario, se añade más material y se apisona o bien se extrae para dejar la altura del relleno a 15 mm de la boca. Se lleva a cabo un segundo proceso seco, empezando con una cantidad igual a un tercio 
de la masa total utilizada en el primer proceso seco, y se apisona esta 
cantidad. Se añaden otros dos incrementos de esta cantidad con apisonamiento de 80 N y se ajusta el nivel de la sustancia en el tubo a 15 mm de la boca por adición o extracción de material, según 
sea necesario. La cantidad de sólido determinada en el segundo 
proceso seco es la que se utilizará en cada ensayo; el llenado se hace en tres cantidades iguales, comprimida cada una a 9 cm
 3 me­
diante la fuerza que sea necesaria. (Puede ser más fácil utilizar 
anillos separadores.) 
Los líquidos y geles se cargan en el tubo hasta una altura de 60 mm 
teniendo especial cuidado con los geles para evitar la formación de vacíos. La abrazadera de rosca se desliza sobre el tubo desde el 
fondo, se inserta la placa horadada correspondiente y se aprieta la 
tuerca después de poner un lubricante a base de disulfuro de molib ­
deno. Es muy importante comprobar que no queda nada de sustancia aprisionada entre el reborde y la placa o en las roscas. 
La fuente de calor es propano procedente de una botella industrial, 
provisto de un regulador de presión (60 a 70 mbar), que pasa a través de un contador y mediante un distribuidor se reparte en cuatro mecheros de forma equilibrada (lo que se comprueba por observa ­
ción visual de las llamas de los mecheros). Los mecheros se colocan 
alrededor del recinto de ensayo según se indica en la figura 1. Los cuatro mecheros suponen un consumo total de unos 3,2 litros de propano por minuto. Pueden utilizarse otros mecheros y gases com ­
bustibles pero la velocidad de calentamiento debe ser la especificada 
en la figura 3. Independientemente del equipo utilizado, es necesario comprobar periódicamente la velocidad de calentamiento mediante tubos llenos de ftalato de dibutilo, según se indica en la figura 3.
 
1.6.1.3.  Desarrollo de los ensayos  
Cada ensayo se realiza hasta que el tubo esté fragmentado o el tubo 
se haya calentado durante 5 minutos. Si el ensayo produce la frag ­
mentación del tubo en tres o más piezas, que en algunos casos pueden estar unidas entre sí por bandas estrechas de metal, según ilustra la figura 2, entonces se considera que el ensayo produce 
explosión. Un ensayo en que se produzcan menos fragmentos o no 
haya fragmentación se considera que no produce explosión.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Se hace primero una serie de tres ensayos con una placa de 6,0 mm 
de diámetro de orificio y, si no se obtienen explosiones, se hace una 
segunda serie de tres ensayos con una placa de 2,0 mm de diámetro de orificio. Desde el momento en que se produzca una explosión en cualquiera de las dos series de ensayos no es necesario seguir re ­
alizando ensayos.
 
1.6.1.4.  Evaluación  
El resultado del ensayo se considera positivo si se produce una 
explosión en cualquiera de las dos series de ensayos.  
1.6.2.  Sensibilidad mecánica (choque)  
1.6.2.1.  Equipo (figura 4)  
Las partes fundamentales de un equipo clásico de martinete son un 
bloque de acero fundido con base, yunque, columna, guías, pesos 
que caen, mecanismo de liberación y un soporte para las muestras. El yunque de acero (100 mm de diámetro por 70 mm de altura) se atornilla a la parte superior de un bloque de acero (230 mm de 
longitud por 250 mm de anchura por 200 mm de altura) con una 
base de fundición (450 mm de longitud por 450 mm de anchura por 60 mm de altura). En un soporte atornillado a la parte posterior del bloque de acero se fija la columna, hecha de tubo de acero estirado 
sin costuras. El aparato se fija con cuatro tornos a un bloque macizo 
de hormigón (de 60 × 60 × 60 cm) de forma que los raíles de guía sean absolutamente verticales y el peso caiga en caída libre. Pueden utilizarse pesos de 5 y 10 kg, de acero macizo. La cabeza de choque 
de cada peso está hecha de acero templado HRC 60 a 63 y tiene un 
diámetro mínimo de 25 mm. 
La muestra problema se pone en un dispositivo de choque, formado por 
dos cilindros coaxiales de acero macizo, uno encima del otro, en un 
anillo de guía de acero en forma de cilindro hueco. Los cilindros de acero macizo deben tener 10 (-0,003, - 0,005) mm de diámetro y 10 mm de altura, sus superficies deben estar pulidas, los bordes redondeados 
(0,5 mm de radio de curvatura) y su dureza debe ser de HRC 58 a 65. El 
cilindro hueco debe tener 16 mm de diámetro exterior, un orificio pulido de 10 (+ 0,005, + 0,010) mm y 13 mm de altura. El dispositivo de choque se monta sobre un yunque intermedio (26 mm de diámetro y 
26 mm de altura) hecho de acero y centrado por un anillo con perfo ­
raciones que dejen escapar los humos.
 
1.6.2.2.  Condiciones de ensayo  
El volumen de muestra debe ser de 40 mm  3 , o bien un volumen 
adecuado para otro tipo de aparato alternativo. Las sustancias sólidas 
deben someterse a ensayo en estado seco y prepararse de la forma 
siguiente: 
a) las sustancias en polvo se pasan por tamiz de 0,5 mm; para las 
pruebas se usa la fracción que haya atravesado el tamiz; 
b) las sustancias prensadas, fundidas o condensadas de alguna otra 
forma se trituran en fragmentos pequeños y se tamizan; la frac ­
ción de diámetro comprendido entre 0,5 y 1 mm es la que se utiliza para los ensayos y debe ser representativa de la sustancia 
original. 
Las sustancias normalmente suministradas como pastas se someterán 
a ensayos en el estado más seco posible o en algún caso, supri ­
miendo al máximo posible la cantidad de diluyente. Las sustancias 
líquidas se estudiarán dejando una separación de 1 mm entre el 
cilindro de acero superior y el inferior.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Desarrollo de los ensayos  
Se ejecuta una serie de seis ensayos dejando caer la masa de 10 kg 
desde la altura de 0,40 m (40 J). Si se obtiene alguna explosión en esta serie de 40 J, hay que realizar otra serie de seis ensayos, dejando 
caer la masa de 5 kg desde la altura de 0,15 m (7,5 J). En otros 
equipos, se compara la muestra con la sustancia de referencia elegida según un procedimiento establecido (por ejemplo, técnica de subida y bajada, etc.).
 
1.6.2.4.  Evaluación  
El resultado del ensayo se considera positivo si se produce una 
explosión (una inflamación y/o una detonación es equivalente a una explosión) al menos una vez en cualquiera de los ensayos con el equipo de choque especificado o si la muestra es más sensible que 
el 1,3-dinitrobenceno o el RDX en un ensayo de choque alternativo.
 
1.6.3.  Sensibilidad mecánica (fricción)  
1.6.3.1.  Equipo (figura 5)  
El equipo para el ensayo de fricción consiste en una base de acero 
fundido sobre la que se monta el dispositivo de fricción. Este con ­
siste en una espiga fija de porcelana y un plato de porcelana móvil. 
El plato de porcelana se fija a una corredera que se desplaza sobre dos rieles. La corredera se conecta a un motor eléctrico por medio de una barra de conexión, una leva y un engranaje de transmisión 
adecuado, de forma que el plato de porcelana se desplace una sola 
vez hacia atrás y hacia adelante por debajo de la espiga de porcelana a lo largo de 10 mm. La espiga de porcelana puede cargarse, por ejemplo, con 120 o 360 N. 
Los platos planos de porcelana están hechos de porcelana técnica 
blanca (rugosidad entre 9 y 32 μm) y sus dimensiones son 25 mm de 
longitud, 25 mm de anchura y 5 mm de altura. La espiga cilíndrica de porcelana también es de porcelana técnica blanca, mide 15 mm de 
longitud y 10 mm de diámetro y sus superficies extremas son esfé ­
ricas y rugosas, con un radio de curvatura de 10 mm.
 
1.6.3.2.  Condiciones de los ensayos  
El volumen de la muestra debe ser de 10 mm  3 , o bien un volumen 
adecuado para otro tipo de aparato alternativo. 
Las sustancias sólidas se someten a ensayo en estado seco y se 
preparan de la forma siguiente: 
a) las sustancias en polvo se pasan por tamiz de 0,5 mm; para las 
pruebas se utiliza toda la fracción que haya atravesado el tamiz; 
b) las sustancias prensadas, fundidas o condensadas de alguna otra 
forma se trituran en fragmentos pequeños y se tamizan; para los ensayos se utiliza la fracción de diámetro inferior a 0,5 mm. 
Las sustancias normalmente suministradas como pastas se someterán 
a ensayos en el estado más seco posible. Si la sustancia no puede ser preparada en estado seco, la pasta (suprimiendo al máximo posible la cantidad de diluyente) es sometida a ensayo en forma de película de 
0,5 mm de espesor, 2 mm de anchura y 10 mm de longitud, prepa ­
rada con una plantilla.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Desarrollo de los ensayos  
Se pone sobre la muestra la espiga de porcelana y se aplica la carga. 
Al realizar el ensayo, las marcas esponjosas del plato de porcelana deben ser transversales a la dirección del movimiento. Hay que 
vigilar para que la espiga se apoye en la muestra, que haya bastante 
sustancia problema bajo la espiga y que el plato se mueva correcta ­
mente bajo la espiga. En el caso de sustancias pastosas, para aplicar la sustancia al plato se utiliza un dosificador de 0,5 mm de espesor 
con una ranura de 2 × 10 mm. El plato de porcelana tiene que 
desplazarse 10 mm hacia adelante y hacia atrás bajo la espiga en el plazo de 0,44 segundos. Cada parte de la superficie del plato y de 
la espiga debe utilizarse solo una vez; los dos extremos de cada 
espiga sirven para dos ensayos y cada una de las dos superficies de un plato sirve para tres ensayos. 
Se ejecuta una serie de seis pruebas con una carga de 360 N. Si se 
obtiene algún resultado positivo durante estas seis pruebas, hay que realizar otra serie de seis pruebas con una carga de 120 N. En otros equipos, se compara la muestra con la sustancia de referencia elegida 
mediante un procedimiento establecido (por ejemplo, técnica de su ­
bida y bajada, etc.).
 
1.6.3.4.  Evaluación  
El resultado del ensayo se considera positivo si se produce una 
explosión (una crepitación y/o una detonación o una inflamación 
equivale a una explosión) al menos una vez en cualquiera de las pruebas con el equipo especificado de fricción o si se satisfacen los criterios equivalentes de otro ensayo alternativo de fricción.
 
2. RESULTADOS  
En principio, se considera que una sustancia presenta peligro de 
explosión en el sentido de la Directiva si se obtiene un resultado positivo en el ensayo de sensibilidad térmica, al choque o a la 
fricción.
 
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— identidad, composición, pureza, grado higrométrico, etc., de la 
sustancia que se somete a ensayo, 
— forma física de la muestra y si se ha triturado, fragmentado o 
tamizado, 
— observaciones durante los ensayos de sensibilidad térmica (por 
ejemplo, masa de la muestra, número de fragmentos, etc.), 
— observaciones durante los ensayos de sensibilidad mecánica (por 
ejemplo, formación de cantidades considerables de humo o des ­
composición completa sin detonación, llamas, chispas, crepita ­
ción, etc.), 
— resultado de cada tipo de ensayo, 
— si se ha utilizado otro aparato alternativo, hay que indicar la 
justificación científica de dicha utilización, así como las pruebas 
de correlación entre los resultados obtenidos con el aparato es ­
pecificado y los obtenidos con aparatos equivalentes,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— cualquier observación que se considere útil, por ejemplo, referen ­
cia a ensayos realizados con productos similares, que puedan ser 
importantes para la interpretación correcta de los resultados, 
— cualquier otra observación importante para la interpretación de 
los resultados.  
3.2. INTERPRETACIÓN Y EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS 
El informe debe indicar los resultados que se consideren erróneos, 
anormales o no representativos. Cuando se rechace un resultado, se 
facilitará una explicación y se indicarán los resultados del ensayo 
sustitutivo o complementario. Si un resultado anormal no pudiera explicarse, se deberá aceptar el valor obtenido y se utilizará para clasificar la sustancia en consecuencia.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, Naciones Unidas, Nueva York. 
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, Londres, ISBN 0-750-60103-5, 1990. 
(3) Koenen, H., Ide, K.H. y Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6-13 y 30-42. 
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — 
Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Apéndice  
Ejemplo de especificación de material para el ensayo de sensibilidad térmica 
(véase DIN 1623)  
(1) Tubo: especificación de material n  o 1.0336.505 g 
(2) Placa horadada: especificación de material n  o 1.4873 
(3) Tuerca y abrazadera de rosca: especificación de material n  o 1.3817  
Figura 1  
Equipo para el ensayo de sensibilidad térmica  
(dimensiones en milímetros)
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Figura 2  
Ensayo de sensibilidad térmica  
Ejemplos de fragmentación
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Figura 3  
Calibración de la velocidad de calentamiento en el ensayo de sensibilidad térmica
  
Curva temperatura/tiempo obtenida al calentar ftalato de dibutilo (27 cm  3 ) en un tubo cerrado (placa 
con orificio de 1,5 mm) utilizando un caudal de propano de 3,2 l/min. La temperatura se mide con 
un termopar de 1 mm de diámetro de alumel/cromel revestido de acero inoxidable, situado en el 
centro a 43 mm por debajo del borde del tubo. La velocidad de calentamiento entre 135  o C y 
285  o C debe estar entre 185 y 215 K/min.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Figura 4  
Equipo del ensayo de choque 
(dimensiones en milímetros)
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Figura 4  
Continuación
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Figura 5  
Equipo de sensibilidad a la fricción
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  TEMPERATURA DE AUTOINFLAMACIÓN (LÍQUIDOS Y 
GASES)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
No deben someterse a este ensayo las sustancias explosivas ni las 
que empiecen a arder espontáneamente en contacto con el aire a temperatura ambiente. El procedimiento de ensayo es aplicable a gases, líquidos y vapores que, en presencia de aire, puedan infla ­
marse por el contacto con una superficie caliente. 
La temperatura de autoinflamación puede reducirse considerable ­
mente por la presencia de impurezas catalíticas, por el material de 
la superficie o por un mayor volumen del recipiente de ensayo.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
El grado de autoinflamabilidad se expresa en términos de tempera ­
tura de autoinflamación. La temperatura de autoinflamación es la temperatura más baja a la que se inflama la sustancia problema, en 
presencia del aire y en las condiciones definidas por el método de 
ensayo.
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Las sustancias de referencia se citan en las normas (véase el punto 
1.6.3). Sirven fundamentalmente para comprobar las características 
del método de vez en cuando y para poder comparar con los resul ­
tados obtenidos según otros métodos.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
El método determina la temperatura mínima de la superficie interna 
de un recinto que provoca la inflamación de un gas, vapor o líquido 
inyectado en el recinto.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
La repetibilidad varía según el intervalo de temperatura de autoin ­
flamación y el método de ensayo utilizado. 
La sensibilidad y la especificidad dependen del método de ensayo 
utilizado.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Equipo  
El equipo se describe en el método que se indica en el punto 1.6.3.  
1.6.2.  Condiciones del ensayo  
Se somete a ensayo una muestra de la sustancia problema según el 
método indicado en el punto 1.6.3.  
1.6.3.  Desarrollo del ensayo  
Véanse las normas CEI-79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 
4056 y NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. RESULTADOS  
Registrar la temperatura de ensayo, la presión atmosférica, la canti ­
dad de muestra utilizada y el intervalo de tiempo que transcurre hasta que se produce la inflamación.
 
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas), 
— cantidad de muestra utilizada, presión atmosférica, — equipo utilizado, — resultados de las medidas (temperaturas de ensayo, resultados 
relativos a la inflamación, intervalos de tiempo correspondientes), 
— cualquier observación complementaria que pueda ser útil para la 
interpretación de los resultados.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
Ninguna.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  TEMPERATURA RELATIVA DE AUTOINFLAMACIÓN DE 
SÓLIDOS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Las sustancias explosivas y las sustancias que se inflaman espontá ­
neamente en contacto con el aire a temperatura ambiente no deben someterse a este ensayo. 
El objetivo del ensayo es proporcionar datos preliminares sobre la 
autoinflamabilidad de las sustancias sólidas a altas temperaturas. 
Si el calor producido, bien por reacción de la sustancia con el oxí ­
geno o bien por descomposición exotérmica, no se disipa con la 
suficiente rapidez en el ambiente, el autocalentamiento ocasiona la autoinflamación. La autoinflamación se produce, en consecuencia, cuando la velocidad de producción de calor sobrepasa la velocidad 
de disipación. 
El procedimiento es útil como ensayo de selección preliminar para 
las sustancias sólidas. Teniendo en cuenta la naturaleza compleja de la inflamación y de la combustión de los sólidos, la temperatura de autoinflamación determinada según este método solo debe servir para 
hacer comparaciones.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La temperatura de autoinflamación, tal como se determina por este 
método, es la temperatura ambiente mínima, expresada en grados centígrados (
 o C), a la que se inflama cierto volumen de una sustan ­
cia en condiciones definidas.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se coloca un volumen definido de la sustancia problema en un horno 
a temperatura ambiente; se registra la curva de temperatura en el centro de la muestra frente al tiempo, elevando la temperatura del 
horno hasta 400
 o C o hasta el punto de fusión, si este es menor, a 
razón de 0,5  o C por minuto. La temperatura del horno a la que la 
temperatura de la muestra alcanza los 400  o C por autocalentamiento 
es la que, a fines del presente ensayo, se denomina temperatura de 
autoinflamación.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Equipo  
1.6.1.1.  Horno  
Horno de laboratorio con temperatura programable (volumen: unos 2 
litros) equipado con circulación natural de aire y una válvula de explosión. Se debe evitar que los gases de descomposición entren 
en contacto con las resistencias eléctricas para evitar cualquier peli ­
gro de explosión.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Cubo de tela de alambre  
Siguiendo el modelo de la figura 1, se corta un pedazo de tela 
metálica de acero inoxidable con abertura de 0,045 mm. Se dobla la tela metálica y se sujeta con alambre para formar un cubo abierto 
por la parte superior.
 
1.6.1.3.  Termopares  
Termopares apropiados.  
1.6.1.4.  Registro  
Cualquier registro de dos canales, calibrado en el intervalo de 0 a 
600  o C o a una tensión correspondiente.  
1.6.2.  Condiciones del ensayo  
El ensayo se efectúa con las sustancias tal y como se reciben.  
1.6.3.  Desarrollo del ensayo  
Se llena el cubo con la sustancia problema, se comprime con cui ­
dado y se añade más sustancia hasta llenar por completo el cubo. Se suspende este en el centro del horno a temperatura ambiente. Se 
coloca un termopar en el centro del cubo y otro entre el cubo y la 
pared del horno para registrar la temperatura de este último. 
Las temperaturas del horno y de la muestra se registran continua ­
mente elevando la temperatura del horno hasta los 400
 o C o hasta el 
punto de fusión del sólido, si este valor es menor, a razón de 0,5  o C 
por minuto. 
Cuando la sustancia se inflame, el termopar colocado en la muestra 
indicará una subida muy fuerte de la temperatura por encima de la temperatura del horno.
 
2. RESULTADOS  
La temperatura del horno a la que la temperatura de la muestra 
alcanza los 400  o C por autocalentamiento es significativa para la 
evaluación (véase la figura 2).  
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente informa ­
ción: 
— descripción de la sustancia problema, — resultados de las medidas, incluida la curva de temperatura- 
tiempo, 
— todas las observaciones complementarias que sean útiles para la 
interpretación de los resultados.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. De ­
termination of the relative temperatura of the spontaneous flamma ­
bility of solids.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Figura 1  
Modelo de cubo de ensayo de 20 mm
  
Figura 2  
Curva tipo temperatura/tiempo
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  PROPIEDADES COMBURANTES (SÓLIDOS)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Es conveniente disponer de información previa sobre las posibles 
propiedades explosivas de la sustancia antes de proceder al ensayo. 
Este ensayo no es aplicable a líquidos, gases, sustancias explosivas o 
fácilmente inflamables ni a los peróxidos orgánicos. 
Este ensayo es innecesario cuando el examen de la estructura quí ­
mica ponga de manifiesto que la sustancia no puede dar reacción 
exotérmica con un combustible. 
Para saber si en este ensayo hay que tomar precauciones especiales, 
debe efectuarse una prueba preliminar.  
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
Tiempo de combustión: tiempo de reacción, expresado en segundos, 
necesario para que la zona de reacción se propague a través de la 
pila, según el procedimiento descrito en el punto 1.6. 
Velocidad de combustión: expresada en milímetros por segundo. 
Velocidad máxima de combustión: el valor más elevado entre las 
velocidades de combustión obtenidas con mezclas que contengan 
desde un 10 a un 90 % en peso de oxidante.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Como sustancia de referencia se utiliza nitrato de bario (de grado 
analítico) tanto para el ensayo como para el ensayo preliminar. 
La mezcla de referencia es la mezcla compuesta por nitrato de bario 
y celulosa en polvo, preparada según lo indicado en el punto 1.6, que tiene la velocidad máxima de combustión (se trata, generalmen ­
te, de una muestra con un 60 % en peso de nitrato de bario).
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Por razones de seguridad se procede a un ensayo preliminar. Este 
ensayo será, por sí solo, suficiente si durante el mismo se observa 
claramente que la sustancia problema tiene propiedades comburantes. En caso contrario, la sustancia deberá someterse al ensayo completo. 
Para efectuar este ensayo completo se mezclan en proporciones va ­
riables la sustancia problema y un combustible definido. Con cada una de las mezclas se forma una pila y esta se enciende por un extremo. La velocidad máxima de combustión observada se compara 
con la velocidad máxima de combustión de la mezcla de referencia.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Cualquier método de trituración y de mezcla que deba emplearse será 
válido siempre que la diferencia entre la velocidad máxima de 
combustión en los seis ensayos y la media aritmética no sobrepase 
el 10 %.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Preparación  
1.6.1.1.  Sustancia problema  
Con el fin de obtener una granulometría inferior a 0,125 mm, se 
somete la muestra al siguiente procedimiento: se tamiza, se tritura la 
parte que quede y se tamiza de nuevo, repitiendo la operación hasta que toda la muestra haya pasado por el tamiz. 
Para triturar y tamizar puede utilizarse cualquier método, siempre 
que se cumplan los criterios de calidad requeridos. 
Antes de hacer la mezcla se desecará la muestra a 105
 o C hasta 
obtener peso constante. Si la temperatura de descomposición de la sustancia es inferior a 105
 o C, se secará a una temperatura inferior 
adecuada.  
1.6.1.2.  Combustible  
El combustible es celulosa en polvo, del tipo utilizado en cromato ­
grafía en capa fina y en columna. Se considera adecuada una celu ­
losa en la que la longitud de más del 85 % de las fibras esté 
comprendida entre 0,020 y 0,075 mm. El polvo de celulosa se tamiza 
con una malla de 0,125 mm. Hay que usar el mismo lote de celulosa en todo el ensayo. 
Antes de preparar la mezcla, hay que secar la celulosa a 105
 o C hasta 
obtener el peso constante. 
Si en el ensayo preliminar se utiliza serrín, se elegirá un serrín de 
madera blanda, que se pasará por un tamiz de 1,6 mm de malla, se mezclará bien y se secará a 105
 o C durante 4 horas en capas de no 
más de 25 mm de espesor. Una vez enfriado, se debe guardar en un 
envase hermético, llenándolo lo más posible. Es preferible utilizar el 
serrín dentro de las 24 horas siguientes al secado.  
1.6.1.3.  Fuente de ignición  
Debe utilizarse la llama fuerte de un mechero de gas (diámetro 
mínimo: 5 mm). Si se utiliza otra fuente de ignición (por ejemplo, 
si se hace el ensayo en atmósfera inerte) hay que dar su descripción 
y justificación.  
1.6.2.  Desarrollo del ensayo  
Nota:  
Las mezclas de comburante con celulosa o serrín deben considerarse 
potencialmente explosivas y tratarse con las debidas precauciones.  
1.6.2.1.  Ensayo preliminar  
La sustancia secada se mezcla bien con celulosa o serrín seco, en una 
proporción en peso de 2 partes de sustancia problema por 1 parte de celulosa o serrín. Con la mezcla se forma una pila cónica de 3,5 cm de diámetro de base y 2,5 cm de altura, llenando sin comprimir un 
molde cónico (por ejemplo, un embudo de laboratorio de cristal con 
el vástago tapado).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
La pila se coloca sobre una superficie fría, incombustible, no porosa 
y de baja conductividad térmica. El ensayo debe realizarse bajo una 
campana extractora (véase el punto 1.6.2.2). 
La fuente de ignición se pone en contacto con el cono. Se observan 
y se anotan la intensidad y la duración de la reacción resultante. 
Si la reacción es intensa, se considerará que la sustancia es combu ­
rante. 
Cuando existan dudas respecto al resultado, será necesario efectuar el 
ensayo completo que se describe a continuación.  
1.6.2.2.  Ensayo completo  
Se preparan mezclas de comburante y de celulosa que contengan de 
un 10 a un 90 % en peso de comburante, en incrementos del 10 %. Para los casos límite, hay que utilizar mezclas intermedias de com ­
burante y celulosa para determinar la velocidad máxima de combus ­
tión con más precisión. 
Se forma la pila con ayuda de un molde metálico de sección trian ­
gular de 250 mm de longitud, 10 mm de altura interior y 20 mm de 
anchura interior. A ambos lados de este molde se colocan en sentido 
longitudinal dos placas metálicas puestas como topes laterales que sobrepasen en 2 mm el borde superior de la sección triangular (véase la figura). Este montaje se llena, sin apretar, con un ligero exceso de 
mezcla. Después de haber dejado caer una vez el molde desde una 
altura de 2 cm sobre una superficie dura, se elimina la materia sobrante por medio de una lámina sostenida oblicuamente. Se quitan entonces los topes laterales y se aplana la superficie del polvo con 
ayuda de un rodillo. Se pone entonces sobre el molde una placa 
incombustible, no porosa y de baja conductividad térmica, se da la vuelta al conjunto y se quita el molde. 
Se pone la pila en el tiro de una campana de gases. Durante el ensayo, la velocidad de aspiración debe ser constante y 
suficiente para evitar que los humos se expandan por el laboratorio. 
Alrededor del aparato se coloca un cortaviento. 
Dadas las propiedades higroscópicas de la celulosa y de algunas 
sustancias problema, el ensayo debe efectuarse lo más rápidamente 
posible. 
Se enciende un extremo de la pila aplicándole la llama. Se mide el tiempo de reacción sobre 200 mm después de que la zona 
de reacción haya recorrido una distancia inicial de 30 mm. 
El ensayo se realiza con la sustancia de referencia y, por lo menos 
una vez, con cada una de las mezclas de sustancia problema con 
celulosa. 
Si se observa una velocidad máxima de combustión significativa ­
mente mayor que la de la mezcla de referencia, puede detenerse el ensayo; si no es así, se repetirá de nuevo cinco veces con cada una 
de las tres mezclas que hayan dado las velocidades de combustión 
más elevadas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Si se sospecha que el resultado es un falso positivo, hay que repetir 
el ensayo con una sustancia inerte que presente un tamaño de par ­
tícula similar, como el kieselguhr, en lugar de la celulosa. Otra posibilidad es someter a ensayo en atmósfera inerte (< 2 % v/v de oxígeno) la mezcla sustancia problema/celulosa que haya dado la 
mayor velocidad de combustión.
 
2. RESULTADOS  
Por razones de seguridad, la velocidad máxima de combustión, en 
lugar de la media, será considerada como la propiedad comburante 
característica de la sustancia examinada. 
En la evaluación se tendrá en cuenta la velocidad de combustión más 
elevada medida en una serie de seis ensayos con una mezcla dada. 
Se representa gráficamente la velocidad de combustión más elevada 
de cada mezcla en función del contenido en comburante. La veloci ­
dad máxima de combustión se obtiene a partir de la gráfica. 
Las seis velocidades de combustión medidas en una serie con la 
mezcla que haya dado la velocidad máxima de combustión, no deben diferir en más de 10 % de la media aritmética. En caso contrario, se 
deberán mejorar los métodos de trituración y mezcla. 
Se compara la velocidad máxima de combustión obtenida con la 
velocidad máxima de combustión de la mezcla de referencia (véase 
el punto 1.3). 
Si se hacen ensayos en atmósfera inerte, se comparará la velocidad 
máxima de reacción con la de la mezcla de referencia en atmósfera inerte.
 
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— identidad, composición, pureza, humedad, etc., de la sustancia 
problema, 
— cualquier tratamiento a que se haya sometido la muestra (por 
ejemplo, triturado o secado), 
— fuente de ignición utilizada en los ensayos, — resultados de las medidas, — tipo de reacción (por ejemplo: combustión rápida superficial, 
combustión en toda la masa, cualquier observación que se refiera a los productos de combustión, etc.), 
— cualquier otra observación que resulte de utilidad para la inter ­
pretación de los resultados, incluida una descripción de la inten ­
sidad (llama, chispa, humo, combustión lenta sin llama, etc.) y la 
duración aproximada de la reacción observada durante el ensayo preliminar de seguridad/selección para la sustancia problema y la sustancia de referencia, 
— resultado de los ensayos con una sustancia inerte, en su caso, — resultado de los ensayos en atmósfera inerte, en su caso.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Se considerará que una sustancia es comburante si: 
a) hay una reacción intensa en el ensayo preliminar; 
b) durante el ensayo completo la velocidad máxima de combustión 
de las mezclas problema es superior o igual a la de la mezcla de 
referencia formada por celulosa y nitrato de bario. 
A fin de evitar los falsos positivos, a la hora de interpretar los 
resultados también habrá que tener en cuenta los valores obtenidos al estudiar la sustancia problema mezclada con material inerte o en 
atmósfera inerte.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. De ­
termination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Apéndice  
Figura  
Molde y accesorios necesarios para formar las pilas  
(rodas las dimensiones expresadas en milímetros)
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  PESO MOLECULAR MEDIO EN NÚMERO Y DISTRIBUCIÓN 
DE LOS PESOS MOLECULARES DE LOS POLÍMEROS  
1. MÉTODO  
Este método de cromatografía de permeación sobre gel (CPG) es 
copia de las directrices TG 118 de la OCDE (1996). Los principios 
fundamentales y demás información técnica se dan en la referencia 1.  
1.1. INTRODUCCIÓN 
La gran diversidad de las propiedades de los polímeros impide des ­
cribir un único método que fije precisamente las condiciones de separación y de evaluación que cubran todas las eventualidades y particularidades que se producen en la separación de los polímeros. 
En particular, es frecuente que los polímeros complejos no puedan 
someterse a la CPG. En este caso, puede determinarse el peso mo ­
lecular diferentemente (véase el anexo). Deberán entonces indicarse todos los datos y la justificación del método utilizado. 
El método descrito aquí se basa en la norma DIN 55672 (1). Se 
encontrará en esta norma DIN información precisa sobre la manera de llevar a cabo las pruebas y de evaluar los datos. Cuando sea 
indispensable introducir modificaciones de las condiciones experi ­
mentales, estos cambios deberán justificarse. Se podrán utilizar otras normas con las debidas referencias. El método descrito utiliza para la 
calibración muestras de poliestireno de polidispersidad conocida y 
puede ser necesario modificarlo para adaptarlo a algunos polímeros como, por ejemplo, los polímeros solubles en el agua o ramificados de cadena larga.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
El peso molecular medio en número M  n y el peso molecular medio 
en peso M  w se determinan con las siguientes ecuaciones: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i x M  i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
donde 
H i = el nivel de la señal del detector a partir de la línea de base para 
el volumen de retención V  i 
M i = el peso molecular de la fracción polimérica de volumen de 
retención V  i 
n = el número de puntos de medición. 
La amplitud de la distribución de los pesos moleculares, que carac ­
teriza la dispersidad del sistema, viene dada por la relación M  w /M n . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Como la CPG es un método relativo, es necesario efectuar una 
calibración. Para eso, se utilizan normalmente patrones de poliesti ­
reno de distribución estrecha y estructura lineal cuyos pesos mole ­
culares medios M  n y M  w se conocen, así como su distribución de 
pesos moleculares. La curva de calibración solo puede servir para determinar el peso molecular de la muestra desconocida si las con ­
diciones de separación de la muestra y de los patrones se han selec ­
cionado de manera idéntica. 
Una relación determinada entre el peso molecular y el volumen de 
elución solo es válida en las condiciones específicas de una expe ­
riencia particular. Estas condiciones son, sobre todo, la temperatura, el disolvente (o la mezcla de disolventes), las condiciones de la cromatografía y la columna o sistema de columnas de separación. 
Los pesos moleculares de la muestra, determinados de esta manera, 
son valores relativos y se describen como «pesos moleculares equi ­
valentes de poliestireno». En otros términos, según las diferencias 
estructurales y químicas entre la muestra y los patrones, los pesos moleculares pueden más o menos desviarse de los valores absolutos. Si se recurre a otros patrones como, por ejemplo, de políetilenglicol, 
de polióxido de etileno, de polimetacrilato de metilo, de poliácido 
acrilico, se explicará esta elección.
 
I.4. PRINCIPIOS DEL MÉTODO DE ENSAYO 
La distribución de pesos moleculares de la muestra y los pesos molecu ­
lares medios (M  n , M  w ) pueden determinarse por CPG. La CPG es una 
cromatografía líquida particular en la cual la muestra se separa según los volúmenes hidrodinámicos de sus componentes (2). 
La separación se efectúa mientras que la muestra pasa por una co ­
lumna rellena de un material poroso, normalmente un gel orgánico. Las moléculas pequeñas consiguen penetrar en los poros, mientras 
que las gruesas quedan excluidas. El recorrido de las moléculas 
grandes es, pues, más corto y se eluyen antes. Las moléculas de tamaño medio penetran en algunos poros y se eluyen posteriormente. 
Las moléculas más pequeñas, con un radio hidrodinámico medio más 
pequeño que los poros del gel, pueden penetrar en todos ellos y se eluyen al final. 
En una situación ideal, la separación depende completamente del 
tamaño de las distintas moléculas, pero en la práctica es difícil evitar la interferencia de al menos algunos efectos de absorción. La situa ­
ción empeora en caso de relleno irregular de la columna o de volú ­
menes muertos (2). 
Se procede a la detección basándose, por ejemplo, en el índice de 
refracción o en la absorción UV para llegar a una curva de distri ­
bución simple. Sin embargo, para precisar sobre la curva valores efectivos de los pesos moleculares, es necesario calibrar la columna haciendo pasar polímeros de peso molecular conocido y, a ser posi ­
ble, de estructura globalmente idéntica, por ejemplo, diversos patro ­
nes de poliestireno. Resulta de manera característica una curva de Gauss, a veces distorsionada por una pequeña cola hacia el lado de los pesos moleculares bajos; el eje vertical indica la cantidad, en 
peso, de las especies de distintos pesos moleculares eluídas, y el 
eje horizontal el logaritmo del peso molecular.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
La repetibilidad (desviación típica relativa: RSD) del volumen de 
elución deberá sobrepasar el 0,3 %. La repetibilidad requerida del análisis estará garantizada por corrección mediante patrón interno si 
se evalúa un cromatograma en función del tiempo y no corresponde 
al criterio previamente mencionado (1). Las polidispersidades depen ­
den de los pesos moleculares de los patrones. En el caso de los patrones de poliestireno, los valores característicos son: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 < M  p < 10  6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w //M  n < 1,20 
(M p es el peso molecular del patrón en el máximo del pico)  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.6.1.  Preparación de las soluciones patrón de poliestireno  
Se disuelven los patrones de poliestireno mezclándolos cuidadosa ­
mente con el eluyente elegido. Se tendrán en cuenta las recomenda ­
ciones del fabricante para la preparación de las soluciones. 
Las concentraciones de los patrones elegidos dependen de distintos 
factores como, por ejemplo, el volumen de inyección, la viscosidad 
de la solución y la sensibilidad del detector analítico. El volumen 
máximo de inyección debe adaptarse a la longitud de la columna, con el fin de evitar las sobrecargas. Generalmente, los volúmenes inyectados para las separaciones analíticas por CPG en una columna 
de 30 cm × ~ 7,8 mm se sitúan entre 40 y 100 ul. Es posible utilizar 
volúmenes mayores, pero no deben sobrepasar los 250 ul. La rela ­
ción óptima entre el volumen de inyección y la concentración debe determinarse antes de la calibración efectiva de la columna.
 
1.6.2.  Preparación de la solución de muestra  
En principio, las mismas exigencias se aplican a la preparación de 
las soluciones de muestras. La muestra se disuelve en un disolvente 
conveniente como, por ejemplo, tetrahidrofurano (THF), agitando 
con cuidado. No debe nunca disolverse en baño de ultrasonidos. En caso necesario, la solución de muestra se purifica con un filtro de membrana cuyo tamaño de poro se sitúa entre 0,2 y 2 μm. 
Debe señalarse en el informe final la presencia de partículas no 
disueltas, puesto que puede tratarse de sustancias de elevado peso 
molecular. Se utilizará un método conveniente para determinar el porcentaje en peso de partículas no disueltas. Las disoluciones se utilizarán en el plazo de 24 horas.
 
1.6.3.  Equipo  
— Depósito de disolvente. 
— Desgasificador (en su caso). — Bomba.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— Amortiguador de pulsaciones (en su caso). 
— Sistema de inyección. — Columnas de cromatografía. — Detector. — Caudalímetro (en su caso). — Conjunto de registro-tratamiento de los datos. — Receptáculo de residuos. Es necesario garantizar que el sistema de CPG es inerte respecto a 
los disolventes utilizados (por ejemplo, utilizando capilares de acero para el disolvente THF).
 
1.6.4.  Sistema de inyección y de distribución del disolvente  
Un volumen definido de la solución de muestra se pasa a la columna 
con ayuda de un muestreador automático o bien manualmente, en 
una zona estrictamente definida. La liberación o la depresión manual 
demasiado rápida del émbolo de la jeringuilla pueden causar modi ­
ficaciones en la distribución de pesos moleculares observada. El 
sistema de distribución del disolvente deberá, en la medida de lo 
posible, estar libre de pulsaciones, y lo ideal es que incluya un amortiguador de pulsaciones. El caudal es del orden de 1 ml/min.
 
1.6.5.  Columna  
Según la muestra, el polímero se caracterizará con ayuda de una 
columna simple o de varias columnas conectadas en secuencia. Está disponible en el comercio diverso material para columnas po ­
rosas, de propiedades definidas (por ejemplo, tamaño de poro, límites 
de exclusión). La elección del gel de separación o de la longitud de la columna depende tanto de las propiedades de la muestra (volú ­
menes hidrodinámicos, distribución de los pesos moleculares) como 
de las condiciones específicas de la separación, como el disolvente, 
la temperatura y el caudal (1) (2) (3).
 
1.6.6.  Platos teóricos  
La columna (o la combinación de columnas) utilizada para la sepa ­
ración debe caracterizarse por el número de platos teóricos. En el caso de tomar el THF como disolvente de elución, es necesario cargar una solución de etilbenceno u otro soluto homopolar ade ­
cuado en una columna de longitud conocida. El número de platos 
teóricos viene dado por la siguiente ecuación: 
N ¼ 5; 54 Í
 V e 
W 1=2 Î 2 
o N ¼ 16 Í V e 
W Î 2 
donde 
N = número de platos teóricos 
V e = volumen de elución en el máximo del pico  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = anchura del pico en la línea de base 
W 1/2 = lanchura del pico a la mitad de la altura.  
1.6.7.  Capacidad de separación  
Además del número de platos teóricos, cantidad que determina la 
anchura de la banda, la capacidad de separación desempeña también un papel y está determinada por la pendiente de la curva de cali ­
bración. La capacidad de separación de una columna viene dada por 
la siguiente relación:
 
V e; M x Ä V e;ð10M  x Þ 
superficie de la secció tranversal de la columna ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
donde 
V e, M x = volumen de elución de un poliestireno de peso 
molecular M  x 
V e(I0M x) = volumen de elución de un poliestireno de peso molecular 
diez veces superior. 
La resolución del sistema se define generalmente deí siguiente modo:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
donde 
V el' V e1 = volúmenes de elución de los dos patrones de poliesti ­
reno en el máximo del pico 
W 1, W 2 = anchuras de los picos en la línea de base 
M 1 , M  2 = pesos moleculares en el máximo del pico (deberían 
diferir en un factor de 10) 
El valor R del sistema de columna debería sobrepasar 1.7 (4),  
1.6.8.  Disolvente  
Todos los disolventes deben ser de gran pureza (para el THF, se 
exigirá una pureza del 99,5 %). El depósito de disolvente (en caso necesario, en una atmósfera de gas inerte) debe ser suficientemente grande para la calibración de la columna y varios análisis de mues ­
tras. El disolvente debe desgasificarse antes de su transporte a la 
columna por la bomba.
 
1.6.9.  Ajuste de la temperatura  
La temperatura de los componentes internos esenciales (circuito de 
inyección, columnas, detector y conducciones) será constante y en 
coherencia con la elección del disolvente.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detector  
El detector tiene por objeto registrar cuantitativamente la concentra ­
ción de muestra eluida de la columna. Para evitar el ensanchamiento inútil de los picos, el volumen de la célula del detector debe ser lo 
más bajo posible. No debería exceder de 10 μl excepto en caso de 
detectores de dispersión de luz y de viscosidad. La detección se hace generalmente por refractometría diferencial. Sin embargo, si alguna propiedad de la muestra o del disolvente de elución lo impone, se 
puede recurrir a otros tipos de detectores, como por ejemplo, detec ­
tores de UV/visible, IR, viscosidad, etc.
 
2. RESULTADOS E INFORMES  
2.1. RESULTADOS 
Hay que remitirse a la norma DIN (1) respecto al detalle de los 
criterios de evaluación así como para los imperativos relativos a la 
recogida y tratamiento de los datos. 
De cada muestra, deben realizarse dos experiencias independientes, 
que será necesaria analizar separadamente. 
M n , M  w , M  w /M n y M  p deben establecerse en cada medición. Es nece ­
sario indicar explícitamente que los valores medidos son valores rela ­
tivos equivalentes a los pesos moleculares de los patrones utilizados. 
Después de la determinación de los volúmenes de retención o del 
tiempo de retención (eventualmente corregidos con ayuda de un 
patrón interno), los valores log M  p (M p es el máximo del pico del 
patrón de calibración) se representan gráficamente en función de una de esas cantidades. Serán necesarios al menos dos puntos de cali ­
bración por década de pesos moleculares y al menos cinco puntos de 
medida para la curva entera, que debe cubrir el peso molecular estimado de la muestra. El peso molecular más bajo de la curva de calibración se define por-el n-hexilbenceno u otro soluto homo ­
polar adecuado. La media en número y la media en peso de los 
pesos moleculares se determinan generalmente por tratamiento infor ­
mático de los datos, sobre la base de las fórmulas del punto 1.2. En caso de digitalización manual, se puede consultar el documento 
ASTM D 3536-91 (3). 
La curva de distribución debe darse en forma de cuadro o de gráfico 
(frecuencia diferencial o porcentajes de las sumas frente al log M). Para la representación gráfica, una década de pesos moleculares 
debería normalmente ocupar unos 4 cm de anchura y el máximo 
del pico debería encontrarse a unos 8 cm de altura. En el caso de curvas de distribución integral, la diferencia de ordenadas entre 0 y 100 % debería ser de cerca de 10 cm.
 
2.2. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe contener la siguiente información:  
2.2.1.  Sustancia de ensayo  
— Información existente sobre la sustancia de ensayo (identidad, 
aditivos, impurezas).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— Descripción del tratamiento de la muestra, observaciones, proble ­
mas. 
2.2.2.  Equipo  
— Depósito de eluyente, gas inerte, desgasificación del eluyente, 
composición del eluyente, impurezas. 
— Bomba, amortiguador de pulsaciones, sistema de inyección. 
— Columnas de separación (fabricante, toda la información sobre 
las características de las columnas como tamaño del poro, natu ­
raleza del material de separación, etc., número, longitud y orden 
de las columnas utilizadas). 
— Número de platos teóricos de la columna (o combinación), ca ­
pacidad de separación (resolución del sistema). 
— Información sobre la simetría de los picos. 
— Temperatura de la columna, naturaleza del ajuste de la tempera ­
tura. 
— Detector (principio de medida, volumen de la célula). 
— Caudalímetro si se utiliza (fabricante, principio de medida). — Sistema de registro y tratamiento de los datos (material y pro ­
gramas informáticos).
 
2.2.3.  Calibración del sistema  
— Descripción precisa del método empleado para construir la curva 
de calibración. 
— Información sobre los criterios de calidad de este método (por 
ejemplo, coeficiente de correlación, suma de cuadrados de error, 
etc.). 
— Explicaciones sobre todas las extrapolaciones, hipótesis y apro ­
ximaciones hechas durante el procedimiento experimental y la 
evaluación y tratamiento de los datos. 
— Todas las medidas utilizadas para construir la curva de calibra ­
ción deben precisarse en un cuadro que incluya la información 
siguiente de cada punto de calibración: 
— nombre de la muestra, — fabricante de la muestra, 
— valores característicos de los patrones M
 p , M  n , M  w , M  w /M n , 
proporcionados por el fabricante o derivados de medidas posteriores, junto con precisiones sobre el método de deter ­
minación, 
— volumen y concentración de inyección,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— valor de M  p utilizado para la calibración, 
— volumen de elución o tiempo de retención corregido medido 
en los máximos de los picos 
— M  p calculado en el máximo de los picos, 
— error porcentual del M  p calculado y del valor de calibración.  
2.2.4.  Evaluación  
— Evaluación en función del tiempo: métodos utilizados para ga ­
rantizar la reproducibilidad requerida (método de corrección, pa ­
trón interno, etc.). 
— Información sobre si la evaluación se ha realizado basándose en 
el volumen de elución o en el tiempo de retención. 
— Información sobre los límites de la evaluación si no se analiza 
completamente un pico. 
— Descripción de los métodos de suavizado, si se utilizan. — Procedimientos de preparación y de tratamiento preliminar de la 
muestra. 
— Posible presencia de partículas no disueltas. 
— Volumen de inyección ( μl) y concentración de inyección (mg/ 
ml). 
— Observaciones sobre los efectos que llevan a divergencias en 
relación con el perfil ideal de la CPG. 
— Descripción detallada de todas las modificaciones de los proce ­
dimientos de ensayo. 
— Precisiones sobre las gamas de errores. — Toda la información y observaciones pertinentes para la interpre ­
tación de los resultados.
 
3. REFERENCIAS  
(1) DIN 55672 (1995).  Gelpermeationschromatographie (GPC) 
mit Tetrabydrofuran (THE) als Elutionsmittel,  Teil 1. 
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979).  Modern 
Size Exclusión Liquid Cbromato- grapby,  J. Wiley and sons. 
(3) ASTM D 3536-91, (1991).  Standard Test Method for Molecu ­
lar Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Cbromato- graphy-GPC).  American Society for Testing and Materials, 
Philadelphia, Pennsylvania. 
(4) ASTM D 5296-92, (1992).  Standard Test Method for Molecu ­
lar Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystirene by High Performance Size-Exclusion Chromato ­
graphy.  American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Anexo  
Ejemplos de otros métodos de determinación del peso molecular promedio 
en número (M) de los polímeros  
La cromatografía por permeación sobre gel (CPG) es el método de elección para 
determinar M  n , en particular cuando se dispone de un conjunto de patrones que 
tienen una estructura comparable a la del polímero. Sin embargo, cuando surgen 
dificultades prácticas en la utilización de la CPG o si se espera por adelantado que la sustancia no cumpla algún criterio M
 n reglamentario (y que exija confir ­
mación) existen otros métodos, por ejemplo:  
1. Utilización de las propiedades coligativas  
1.1. Ebulloscopia/crioscopia: 
ponen en juego la medida de la subida del punto de ebullición 
(ebulloscopia) o del descenso del punto de congelación (crioscopia) 
de un disolvente, cuando se añade el polímero. El método se basa en 
el hecho de que el efecto del polímero disuelto sobre el punto de ebullición congelación del líquido depende del peso molecular del polímero (1) (2). 
Aplicabilidad, M
 n < 20 000. 
1.2. Descenso de la presión de vapor: 
pone en juego la medida de la presión de vapor de un líquido de 
referencia determinado antes y después de la adición de cantidades 
conocidas de polímero (1) (2). 
Aplicabilidad, M < 20 000 (teóricamente, sin embargo, en la prácti ­
ca, su valor es limitado). 
1.3 Osmometría de membrana:  
se basa en el principio de la osmosis, es decir, la tendencia natural de 
las moléculas de disolvente a atravesar una membrana semipermea ­
ble desde una solución diluida hacia una solución concentrada para 
llegar al equilibrio. En el ensayo, la solución diluida tiene una con ­
centración cero, mientras que la solución concentrada contiene el polímero. El efecto del paso del disolvente a través de la membrana causa un diferencial de presión que depende de la concentración y 
del peso molecular del polímero (1) (3) (4). 
Aplicabilidad, M
 n < 20 000 y 200 000. 
1.4 Osmometría en fase de vapor: 
compara la velocidad de evaporación de un aerosol de disolvente 
puro con al menos tres aerosoles que contiene el polímero a distintas 
concentraciones (l) (5) (6). 
Aplicabilidad, M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Análisis de grupos terminales  
Para utilizar este método, es necesario conocer al mismo tiempo la 
estructura global del polímero v la naturaleza de los grupos terminales de las cadenas (que debe ser distinguible del esqueleto principal por, por ejemplo, RMN o valoración/derivación). La determinación de la 
concentración molecular de los grupos terminales presentes en el 
polímero permite determinar un valor del peso molecular (7) (8) 
Aplicabilidad, M
 n hasta 50 000 (con fiabilidad decreciente).  
3. referencias  
(1) Billmeyer, F.W. Jr, (1984).  Textbook of Polymer Science,  3rd 
Edn, John Viley, Nueva York. 
(2) Glover, CA., (1975). «Absolute Colligative Property Methods». 
Chapter 4 In:  Polymer Molecular Weights,  Part I, P.E. Slade, Jr. 
ed, Marcel Dekker, Nueva York. 
(3) ASTM D 3750-79, (1979).  Standard Practicc for Determination 
of Number-Average Molecular Wcight of Polymers by Mem ­
brane Osnwmetry.  American Society for Testing and Materials, 
Philadelphia, Pennsylvania. 
(4) Coll, H. (1989), «Membrane Osmometry. In:  Determination of 
Molecular Weight,  A.R. Cooper ed, I. W'iley and Sons. pp. 25-52». 
(5) ASTM 3592-77, (19").  Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure,  
American Society íor Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 
(6) Morris, C.E.M., (1989), «Vapour Pressure Osmometry-. In:  De­
termination of Molecular Weight,  A.R. Cooper ed., John Wiley 
and Sons». 
(7) Schröder, E., Müller, G., y Arndt, K-F., (1989).  Polymer Cha ­
racterisation,  Carl Hanser Verlag, Munich. 
(8) Garmon, R.G., (1975). «End-Group Determinations», Chapter 3 
In: Polymer Molecular Weights,  Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Mar ­
cel Dekker, Nueva York. 
(9) Amiya, S,  et al.  (1990).  Pure and Applied Chemistry,  62, 
2139-2146.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  CONTENIDO DE SUSTANCIAS DE BAJO PESO 
MOLECULAR EN LOS POLÍMEROS  
1. MÉTODO  
Este método de cromatografía de permeación sobre el gel (CPG) es 
copia de las directrices TG 119 de la OCDE (1996). Los principios 
fundamentales y demás información técnica se dan en la referencia 1.  
1.1. INTRODUCCIÓN 
La gran diversidad de las propiedades de los polímeros impide des ­
cribir un único método que fije precisamente las condiciones de 
separación y de evaluación que cubran todas las eventualidades y particularidades que se producen en la separación de los polímeros. En particular, es frecuente que los polímeros complejos no puedan 
someterse a la CPG. En este caso, puede determinarse el peso mo ­
lecular diferentemente (véase el anexo). Deberán entonces indicarse todos los datos y la justificación del método utilizado. 
El método descrito aquí se basa en la norma DIN 55672 (1). Se 
encontrará en esta norma DIN información precisa sobre la manera de llevar a cabo las pruebas y de evaluar los datos. Cuando sea indispensable introducir modificaciones de las condiciones experi ­
mentales, estos cambios deberán justificarse. Se podrán utilizar otras 
normas con las debidas referencias. El método descrito utiliza para la calibración muestras de poliestireno de polidispersidad conocida y puede ser necesario modificarlo para adaptarlo a algunos polímeros 
como, por ejemplo, los polímeros solubles en el agua o ramificados 
de cadena larga.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
Un peso molecular bajo se define arbitrariamente como un peso 
molecular por debajo de 1 000 dalton. 
El peso molecular medio en número M  ti y el peso molecular medio 
en peso M  w se determinan con las siguientes ecuaciones: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i x M  i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
donde 
H i = nivel de la señal del detector a partir de la línea de base para 
el volumen de retención V  i 
M i = peso molecular de la fracción polimérica de volumen de re ­
tención V  i y n es el número de puntos de medición. 
La amplitud de la distribución de los pesos moleculares, que carac ­
teriza la dispersidad del sistema, viene dada por la relación M  w /M n . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Como la CPG es un método relativo, es necesario efectuar una 
calibración. Para eso, se utilizan normalmente patrones de poliesti ­
reno de distribución estrecha y estructura lineal cuyos pesos mole ­
culares medios M  n y M  w se conocen, así como su distribución de 
pesos moleculares. La curva de calibración solo puede servir para determinar el peso molecular de la muestra desconocida si las con ­
diciones de separación de la muestra y de los patrones se han selec ­
cionado de manera idéntica. 
Una relación determinada entre el peso molecular y el volumen de 
elución solo es válida en las condiciones específicas de una expe ­
riencia particular. Estas condiciones son, sobre todo, la temperatura, 
el disolvente (o la mezcla de disolventes), las condiciones de la cromatografía y la columna o sistema de columnas de separación, 
Los pesos moleculares de la muestra, determinados de esta manera, 
son valores relativos y se describen como «pesos moleculares equi ­
valentes de poliestireno». En otros términos, según las diferencias estructurales y químicas entre la muestra y los patrones, los pesos moleculares pueden más o menos desviarse de los valores absolutos. 
Si se recurre a otros patrones como, por ejemplo, de polietilenglícol, 
de polióxido de etileno, de polimetacrilato de metilo, de poliácido acrílico, se explicará esta elección.
 
1.4. PRINCIPIOS DEL MÉTODO DE ENSAYO 
La distribución del peso molecular de la muestra y los pesos mole ­
culares medios (M  n y M  w ) pueden determinarse por CPG. La CPG 
es una cromatografía líquida particular en la cual la muestra se separa según los volúmenes hidrodinámicos de sus componentes (2). 
La separación se efectúa mientras que la muestra pasa por una co ­
lumna rellena de un material poroso, normalmente un gel orgánico. 
Las moléculas pequeñas consiguen penetrar en los poros, mientras que las gruesas quedan excluidas. El recorrido de las moléculas grandes es, pues, más corto y se eluyen antes. Las moléculas de 
tamaño medio penetran en algunos poros y se eluyen posteriormente. 
Las moléculas más pequeñas, con un radio hidrodinámico medio más pequeño que los poros del gel, pueden penetrar en todos ellos y se eluyen posteriormente. Las moléculas más pequeñas, con un radio 
hidrodinámico medio más pequeño que los poros del gel, pueden 
penetrar en todos ellos y se eluyen al final, 
En una situación ideal, la separación depende completamente del 
tamaño de las distintas moléculas, pero en la práctica es difícil evitar 
la interferencia al menos de algunos efectos de absorción. La situa ­
ción empeora en caso de relleno irregular de la columna o de volú ­
menes muertos (2). 
Se procede a la detección basándose, por ejemplo, en el índice de 
refracción o en la absorción UV para llegar a una curva de distri ­
bución simple. Sin embargo, para precisar sobre la curva valores efectivos de los pesos moleculares, es necesario calibrar la columna haciendo pasar polímeros de peso molecular conocido y, a ser posi ­
ble, de estructura globalmente idéntica, por ejemplo, diversos patro ­
nes de poliestireno. Resulta de manera característica una curva de Gauss, a veces distorsionada por una pequeña cola hacia el lado de los pesos moleculares bajos; el eje vertical indica la cantidad, en 
peso, de las especies de distintos pesos moleculares eluidas, y el 
eje horizontal el logaritmo del peso molecular.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
El contenido en sustancias de bajo peso molecular se obtiene de esta 
curva. El cálculo solo puede ser preciso si las especies de peso 
molecular bajo responden del mismo modo, en función del peso, que el polímero en su conjunto.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
La repetibilidad (desviación típica relativa: RSD) del volumen de 
elución deberá sobrepasar el 0,3 %. La repetibilidad requerida del análisis estará garantizada por corrección mediante patrón interno si se evalúa un cromatograma en función del tiempo y no corresponde 
al criterio previamente mencionado (1). Las polidispersidades depen ­
den de los pesos moleculares de los patrones. En el caso de los patrones de poliestireno, ios valores característicos son. 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p es el peso molecular del patrón en el máximo del pico)  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.6.1.  Preparación de las soluciones patrón de poliestireno  
Se disuelven los patrones de poliestireno mezclándolos cuidadosa ­
mente con el eluyente elegido. Se tendrán en cuenta las recomenda ­
ciones del fabricante para la preparación de las soluciones. 
Las concentraciones de los patrones elegidos dependen de distintos 
factores como, por ejemplo, el volumen de inyección, la viscosidad de la solución y la sensibilidad del detector analítico. El volumen 
máximo de inyección debe adaptarse a la longitud de la columna, 
con el fin de evitar las sobrecargas. Generalmente, los volúmenes inyectados para las separaciones analíticas por CPG en una columna de 30 cm × 7,8 mm se sitúan entre 40 y 100 μl. Es posible utilizar 
volúmenes mayores, pero no deben sobrepasar 250 μl. La relación 
óptima entre el volumen de inyección y la concentración debe de ­
terminarse antes de la calibración efectiva de la columna.
 
1.6.2.  Preparación de la solución de muestra  
En principio, las mismas exigencias se aplican a la preparación de 
las soluciones de muestras. La muestra se disuelve en un disolvente conveniente como, por ejemplo, retrahidrofurano (THF), agitando 
con cuidado. No debe nunca disolverse en baño de ultrasonidos. 
En caso necesario, la solución de muestra se purifica con un filtro de membrana cuyo tamaño de poro se sitúa entre 0,2 y 2 μm. 
Debe señalarse en el informe final la presencia de partículas no 
disueltas, puesto que puede tratarse de sustancias de elevado peso molecular. Se utilizará un método conveniente para determinar el 
porcentaje en peso de partículas no disueltas. Las disoluciones se 
utilizarán en el plazo de 24 horas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Corrección del contenido en impurezas y aditivos  
Es generalmente necesario proceder a una corrección del contenido 
de las sustancias de M < 1 000 para tener en cuenta la contribución de los componentes específicos no poliméricos presentes (por ejem ­
plo, impurezas o aditivos), salvo si el contenido medido es ya < 1 %. 
Esto se hace mediante el análisis directo de la solución polimérica o del eluido de la CPG. 
Cuando el eluido, después de su paso a través de la columna, está 
demasiado diluido para el análisis posterior, hay que concentrarlo. Puede ser necesario evaporarlo hasta estado seco para disolverlo de nuevo a continuación. La concentración del eluido debe hacerse en 
condiciones que garanticen que no sufre ningún cambio. El trata ­
miento del eluido después de la CPG depende del método analítico utilizado para las determinaciones cuantitativas.
 
1.6.4.  Equipo  
La CPG exige el siguiente equipo: 
— depósito de disolvente, 
— desgasificador (en su caso), 
— bomba, 
— amortiguador de pulsaciones (en su caso), 
— sistema de inyección, 
— columnas de cromatografía, — detector, 
— caudalímetro (en su caso), 
— conjunto de registro-tratamiento de los datos, 
— receptáculo de residuos. 
Es necesario garantizar que el sistema de CPG es inerte respecto a 
los disolventes utilizados (por ejemplo, utilizando capilares de acero 
para el disolvente THF).
 
1.6.5.  Sistema de inyección y de distribución del disolvente  
Un volumen definido de la solución de muestra se pasa a la columna 
con ayuda de un muestreador automático o bien manualmente, en una zona estrictamente definida. La liberación o la depresión dema ­
siado rápida del émbolo de la jeringuilla pueden causar modificacio ­
nes en la distribución de pesos moleculares observada. El sistema de distribución del disolvente deberá, en la medida de lo posible, estar libre de pulsaciones, y lo ideal es que incluya un amortiguador de 
pulsaciones. El caudal es del orden de 1 ml/mm.
 
1.6.6.  Columna  
Según la muestra, el polímero se caracterizará con ayuda de una 
columna simple o de varias columnas conectadas en secuencia. Está disponible en el comercio diverso material para columnas po ­
rosas, de propiedades definidas (por ejemplo, tamaño de poro, límites 
de exclusión). La elección del gel de separación o de la longitud de la columna depende tanto de las propiedades de la muestra (volú ­
menes hidrodinámicos, distribución de los pesos moleculares) como 
de las condiciones específicas de la separación, como disolvente, la 
temperatura y el caudal (1) (2) (3).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Platos teóricos  
La columna (o la combinación de columnas) utilizada para la sepa ­
ración debe caracterizarse por el número de platos teóricos. En el caso de tomar el THF como disolvente de elución, es necesario 
cargar una solución de etilbenceno u otro soluto homopolar ade ­
cuado en una columna de longitud conocida. El número de platos teóricos viene dado por la siguiente ecuación: 
N ¼ 5; 54 Í
 V e 
W 1=2 Î 2 
o N ¼ 16 Í V e 
W Î 2 
donde 
N = número de platos teóricos 
V c = volumen de elución en el máximo del pico 
W = anchura del pico en la línea de base 
W 1/2 = anchura del pico a la mitad de la altura.  
1.6.8.  Capacidad de separación  
Además del número de platos teóricos, cantidad que determina la 
anchura de la banda, la capacidad de separación desempeña también un papel y está determinada por la pendiente de la curva de cali ­
bración. La capacidad de separación de una columna viene dada por 
la siguiente relación:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
superficie de la secció tranversal de la columna ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
donde 
V e, M x = volumen de elución de un poliestireno de peso 
molecular M  x 
V e,(10.M x) = volumen de elución de un poliestireno de peso molecular 
diez veces superior. 
La resolución del sistema se define generalmente del siguiente modo:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
donde 
V e1 V e2 = volúmenes de elución de los dos patrones de poliesti ­
reno en el máximo del pico 
W 1 W 2 = anchuras de los picos en la línea de base 
M 1 , M  2 , = pesos moleculares en el máximo del pico (deberán 
diferir en un factor de 10) 
El valor R del sistema de columna debería sobrepasar 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Disolvente  
Todos los disolventes deben ser de gran pureza (para el THF, se 
exigirá una pureza del 99,5 %). El depósito de disolvente (en caso necesario, en una atmósfera de gas inerte) debe ser suficientemente 
grande para la calibración de la columna y varios análisis de mues ­
tras. El disolvente debe desgasificarse antes de su transporte a la columna por la bomba.
 
1.6.10.  Ajuste de la temperatura  
La temperatura de los componentes internos esenciales (circuito de 
inyección, columnas, detector y conducciones) será constante y en 
coherencia con la elección del disolvente.  
1.6.11.  Detector  
De detector tiene por objeto registrar cuantitativamente la concen ­
tración de muestra eluida de la columna. Para evitar el ensancha ­
miento inútil de los picos, el volumen de la célula deí detector debe ser lo más bajo posible. No debería exceder de 10 μl excepto en caso 
de detectores de dispersión de luz y de viscosidad. La detección se 
hace generalmente por refractometría diferencial. Sin embargo, si 
alguna propiedad de la muestra o del disolvente de elución lo im ­
pone, se puede recurrir a otros tipos de detectores, como por ejem ­
plo, detectores de UV/visible, IR, viscosidad, etc.
 
2. RESULTADOS E INFORMES  
2.1. DATOS 
Hay que remitirse a la norma DIN (1) respecto al detalle de los 
criterios de evaluación así como para los imperativos relativos a la recogida y tratamiento de los datos. 
De cada muestra deben realizarse dos experiencias independientes, 
que se analizaran separadamente. En todos los casos, es absoluta ­
mente necesario determinar también los datos procedentes de con ­
troles tratados en las mismas condiciones que la muestra. 
Es necesario indicar explícitamente que los valores medidos son 
valores relativos equivalentes a los pesos moleculares del patrón utilizado. 
Después de la determinación de los volúmenes de retención o del 
tiempo de retención (eventualmente corregidos con ayuda de un 
patrón interno), los valores log M
 p (M p es el máximo del pico del 
patrón de calibración) se representan gráficamente en función de una de estas cantidades. Son necesarios al menos dos puntos de calibra ­
ción por década de pesos moleculares y cinco puntos de medida al 
menos para la curva entera, que debe cubrir el peso molecular esti ­
mado de la muestra. El peso molecular más bajo de la curva de calibración se define con n-hexilbenceno u otro soluto homopolar 
adecuado. La porción de la curva que corresponde a los pesos mo ­
leculares inferiores a 1 000 se determina y se corrige según sea necesario en función de las impurezas y aditivos. Las curvas de elución se evalúan generalmente por tratamiento informático de los 
datos. Si se procede a una digitalización manual, se puede consultar 
el documento ASTM D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Si se retiene cualquier polímero insoluble en la columna, su peso 
molecular será probablemente superior al de la fracción soluble y. si 
no se tiene en cuenta, conducirá a sohrestimar el contenido en pesos moleculares bajos. El anexo propone principios de corrección del contenido en pesos moleculares bajos en función de los polímeros 
insolubles. 
La curva de distribución debe darse en forma de cuadro o de gráfico 
(frecuencia diferencial o porcentajes de las sumas frente al log M). Para la representación gráfica, una década de pesos moleculares 
debería normalmente ocupar unos 4 cm de anchura y el máximo 
del pico debería encontrarse a unos 8 cm de altura. En el caso de curvas de distribución integral, la diferencia de ordenadas entre 0 y 
100 % debería ser de cerca de 10 cm.
 
2.2. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe contener la siguiente información:  
2.2.1.  Sustancia de ensayo  
— información disponible sobre la sustancia de ensayo (identidad, 
aditivos, impurezas), 
— descripción del tratamiento de la muestra, observaciones, proble ­
mas. 
2.2.2.  Equipo  
— Depósito de eluyente, gas inerte, desgasificación del eluyente, 
composición del eluyente, impurezas. 
— Bomba, amortiguador de pulsaciones, sistema de inyección. 
— Columnas de separación (fabricante, toda la información sobre 
las características de las columnas como tamaño del poro, natu ­
raleza del material de separación, etc., número, longitud y orden de las columnas utilizadas). 
— Número de platos teóricos de la columna (o combinación), ca ­
pacidad de separación (resolución del sistema). 
— Información sobre la simetría de los picos. 
— Temperatura de la columna, naturaleza del ajuste de la temperatura. 
— Detector (principio de medida, volumen de la célula). 
— Caudalímetro si se utiliza (fabricante, principio de medida). 
— Sistema de registro y tratamiento de los datos (material y pro ­
gramas informáticos).
 
2.2.3.  Calibración del sistema  
— Descripción precisa del método empleado para construir la curva 
de calibración.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— Información sobre los criterios de calidad de este método (por 
ejemplo, coeficiente de correlación, suma de los cuadrados de los 
errores, etc.). 
— Explicaciones sobre todas las extrapolaciones, hipótesis y apro ­
ximaciones hechas durante el procedimiento experimental y la 
evaluación y tratamiento de los datos. 
— Todas las medidas utilizadas para construir la curva de calibra ­
ción deben precisarse en un cuadro que incluya la información siguiente de cada punto de calibración: 
— nombre de la muestra, 
— fabricante de la muestra, 
— valores característicos de los patrones M
 p , M  n , M  w , M  w /M n , 
proporcionados por el fabricante o derivados de medidas posteriores, junto con precisiones sobre el método de deter ­
minación, 
— volumen y concentración de inyección, 
— valor de M
 p utilizado para la calibración, 
— volumen de elución o tiempo de retención corregido medido 
en los máximos de los picos, 
— M  p calculado en el máximo del pico, 
— error porcentual del M  p calculado y del valor de calibración.  
2.2.4.  Información sobre el contenido en polímeros de bajo peso molecular  
— Descripción del método utilizado para el análisis y manera de 
llevar las experiencias. 
— Información sobre el porcentaje de contenido en especies de bajo 
peso molecular (p/p) en relación con la muestra total. 
— Información sobre las impurezas, aditivos y otras especies no 
poliméricas en porcentaje en peso en relación con la muestra total.
 
2.2.5.  Evaluación  
— Evaluación en función del tiempo: métodos utilizados para ga ­
rantizar la reproducibilidad requerida (método de corrección, pa ­
trón interno, etc.). 
— Información sobre sí la evaluación se ha realizado basándose en 
el volumen de elución o en el tiempo de retención. 
— Información sobre los límites de la evaluación si no se analiza 
completamente un pico. 
— Descripción de los métodos de suavizado, si se utilizan. 
— Procedimientos de preparación y de tratamiento preliminar de la 
muestra. 
— Posible presencia de partículas no disueltas.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— Volumen de inyección ( μl) y concentración de inyección (mg/ml). 
— Observaciones sobre los efectos que llevan a divergencias en 
relación con el perfil ideal de la CPG. 
— Descripción detallada de todas las modificaciones de procedi ­
mientos de ensayo. 
— Precisiones sobre las gamas de errores. — Toda la información y observaciones pertinentes para la interpre ­
tación de los resultados.
 
3. REFERENCIAS  
(1) DIN 55672 (19.95)  Gelpermeationschrornatographie (CPG) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel,  Teil 1. 
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., y Bly, D.D. eds, (1979).  Modern 
Size Exclusión Liquid Chromato- graphy,  J. Wiley and sons. 
(3) ASTM D 3536-91, (1991).  Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Cbromatography (Gel Permeation Chromato-grapby- 
GPC).  American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania. 
(4) ASTM D 5296-92, (1992).  Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tirene by High Performance Size-Exclusion Chromatography.  
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Anexo  
Orientaciones para la corrección del contenido en bajos pesos moleculares 
en presencia de polímeros ínsolubles  
Cuando está presente en una muestra un polímero insoluble, ocasiona una pér ­
dida de masa durante el análisis por CPG. El polímero insoluble se retiene 
irreversiblemente en la columna o filtro de la muestra mientras que la porción 
soluble de la muestra pasa a través de la columna. Cuando puede estimarse o medirse el aumento del índice de refracción (dn/dc) del polímero, se puede estimar la pérdida de masa de la muestra en la columna. En este caso, se procede 
a una corrección mediante calibración externa con materiales patrón de concen ­
traciones y dn/dc conocidas, para calibrar la respuesta del refractómetro. En el siguiente ejemplo, se utiliza un patrón de poli (metilmetacrilato) (pMMA). 
En la calibración externa para el análisis de polímeros acrílicos, se analiza por 
CPG un patrón de pMMA de concentración conocida en tetrahidrofurano y los 
datos resultantes sirven para establecer la constante del refractómetro según la 
ecuación: 
K = R/(C x V x dn/dc) 
donde: K = constante del refractómetro (en microvoltios; segundos/ml) R = respuesta del patrón de pMMA (en microvoltios; segundos) C = concentración del patrón de pMMA (en mg/ml) V = volumen de inyección (en ml) dn/dc = aumento del índice de refracción del pMMA en tetrahidrofurano 
(en ml/mg). 
El patrón de pMMA presenta los siguientes datos característicos. R = 2 937 891 C = 1,07 mg/ml V = 0,1 ml dn/dc = 9 x 10
 -5 ml/mg. 
El valor K resultante 3,05 x 10", se utiliza entonces para calcular la respuesta 
teórica del detector si el 100 % del polímero inyectado eluye a través del 
detector.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  COMPORTAMIENTO DE DISOLUCIÓN/EXTRACCIÓN  
1. MÉTODO  
El método descrito es copia de la versión revisada del documento 
TG 120 de la OCDE (1997). Se encontrará más información técnica 
en la referencia 1.  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Para algunos polímeros como los polímeros emulsionados, puede ser 
necesario un trabajo preparatorio antes de que pueda aplicarse el método indicado. El método no es aplicable a los polímeros líquidos 
ni a los que reaccionan con el agua en las condiciones del ensayo. 
Cuando el proceso es poco práctico o inaplicable, el comportamiento 
de disolución/extracción se puede estudiar por medio de otros mé ­
todos. Deberán entonces indicarse los detalles y la justificación del método empleado.
 
1.2 SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
El comportamiento de disolución/extracción de los polímeros en 
medio acuoso se determina con ayuda del método de frasco (véase A.6, «Hidrosolubilidad, método de frasco») con las modificaciones siguientes.
 
1.4. CRITERIOS DE CALIDAD 
Ninguno.  
1.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.5.1.  Equipo  
Es necesario el equipo siguiente: 
— material de trituración, por ejemplo, triturador que produzca par ­
tículas de tamaño conocido, 
— agitador, con posibilidad de ajuste de la temperatura, — sistema de filtro de membrana, 
— equipo analítico adecuado, 
— tamices normalizados,
 
1.5.2.  Preparación de la muestra  
En primer lugar, una muestra representativa debe reducirse a partí ­
culas de tamaño incluido entre 0,125 y 0,25 mm con ayuda de los tamices convenientes. Puede ser necesario enfriar para garantizar la 
estabilidad de la muestra o para el proceso de trituración. Los ma ­
teriales de carácter gomoso pueden triturarse a la temperatura del nitrógeno líquido (1). 
Si no se puede llegar al tamaño de partículas requerido, se intentará 
reducir el tamaño de las partículas en la medida de lo posible y se 
indicará el resultado. Es necesario que en el informe se indique cómo 
se ha conservado antes del ensayo la muestra triturada.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.53.  Procedimiento  
Se pesan tres muestras de 10 g de sustancia de ensayo en cada uno de 
los tres frascos equipados de tapones de vidrio; se añaden 1 000 ml de agua a cada uno. Si resulta difícil manipular una cantidad de 10 g de 
polímero, se utilizará la cantidad inmediata superior que pueda 
manipularse y se ajustará en consecuencia el volumen de agua. 
Los frascos se tapan firmemente y se agitan después a 20
 o C. El 
dispositivo utilizado para sacudir o agitar será capaz de funcionar a temperatura constante. Después de 24 h, se centrifuga o filtra el 
contenido de cada frasco y se determina por un método de análisis 
conveniente la concentración de polímero en la fase acuosa clara. Si no se dispone de ningún método de análisis adecuado para la fase acuosa, se podrá considerar la solubilidad/extractividad total a partir 
del peso seco del residuo filtrado o del precipitado centrifugado. 
Es generalmente necesario diferenciar cuantitativamente las impure ­
zas y aditivos por una parte, y las especies de bajo peso molecular por otra parte. En caso de determinación gravimétrica, es importante también realizar un ensayo en blanco, sin utilizar la sustancia de 
ensayo, para poder tener en cuenta los residuos derivados del pro ­
cedimiento experimental. 
El comportamiento de disolución/extracción de los polímeros en el 
agua a 37
 o C a pH2 y pH9 puede determinarse como se ha descrito 
para el experimento a 20  o C. Los valores de pH pueden obtenerse 
por adición de amortiguadores convenientes o de ácidos o bases 
adecuados, como ácido clorhídrico, ácido acético, hidróxido de po ­
tasio o de sodio de grado analítico, o NH  3 . 
Según el método de análisis empleado, se procederá a uno o dos 
ensayos. Cuando se disponga de métodos suficientemente específicos para un análisis directo en la fase acuosa del componente polimérico, 
bastará con un ensayo tal como se describe arriba. Sin embargo, 
cuando no se disponga de tales métodos y la determinación del comportamiento de disolución/extracción del polímero se límite a un análisis indirecto que determina solamente el contenido total en 
carbono orgánico (COT) del extracto acuoso, será necesario efectuar 
un segundo ensayo. Este se realizará también por triplicado, con muestras de polímeros diez veces más pequeñas y las mismas can ­
tidades de agua que en el primer ensayo.
 
1.5.4.  Análisis  
1.5.4.1.  Ensayo realizado con un único tamaño de muestra  
Se dispondrá quizá de métodos de análisis directo de los componen ­
tes poliméricos en la fase acuosa. Si no, se podrá considerar también 
un análisis indirecto de los componentes poliméricos disueltos/extraí ­
dos determinando el contenido total de las partes solubles y apor ­
tando las correcciones necesarias que tendrán en cuenta los compo ­
nentes no específicamente poliméricos. 
Se puede proceder al análisis del conjunto de las especies poliméri ­
cas de la fase acuosa: 
con ayuda de un método suficientemente sensible como, por ejemplo: — COT, con digestión por persulfato o bicromato para liberar CO
 2 , 
seguida de una estimación por IR o análisis químico,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— espectrometría de absorción atómica (AAS) o su equivalente de 
emisión de plasma acoplado por inducción (ICP) para polímeros 
que contienen silicio o metales, 
— absorción UV o espectrofluorometría para los polímeros arílicos, 
— espectrometría de masas con cromatografía líquida (LC-MS) para 
las muestras de bajo peso molecular, 
o por evaporación al vacío hasta estado seco del extracto 
acuoso y análisis espectroscopio (IR, UV, etc.} o análisis AAS/ICP del residuo. 
Si el análisis de la fase acuosa como tal no es realizable, el extracto 
acuoso se someterá a extracción con ayuda de un disolvente orgánico inmiscible con el agua, por ejemplo, un hidrocarburo clorado. El 
disolvente se evapora a continuación y el residuo se analiza como 
se índica arriba para determinar su contenido en el polímero corres ­
pondiente. Todos los componentes de este residuo identificados como impurezas o aditivos deben restarse para determinar el grado 
de disolución/extracción del propio polímero. 
Cuando estén presentes cantidades relativamente importantes de 
estos materiales, puede ser necesario someter los residuos a un 
análisis por CLAR o CG, por ejemplo, para diferenciar las 
impurezas presentes de las especies monoméricas y derivadas de los monómeros, de modo que pueda determinarse el con ­
tenido auténtico de estas últimas. 
En algunos casos, pueden bastar la simple evaporación del disolvente 
orgánico hasta el estado seco y el peso del residuo seco.
 
1.5.4.2.  Ensayo realizado con dos tamaños de muestras diferentes  
El COT se analizará en todos los extractos acuosos. 
Se procederá a una determinación por gravimetría de la parte no 
disuelta/no extraída de la muestra. Si después de centrifugación o 
filtrado del contenido de cada frasco, sigue habiendo residuos poli ­
méricos pegados a las paredes de este, se enjuagará con el filtrado hasta que el frasco quede libre de todos los residuos visibles. Luego se filtrará o se centrifugará de nuevo el filtrado. Los residuos que 
permanezcan sobre el filtro o en el tubo de centrifugación se secan a 
40
 o C al vacío y se pesan. La operación de secado se prolonga hasta 
llegar a un peso constante.  
2. RESULTADOS  
2.1. ENSAYO REALIZADO CON UN ÚNICO TAMAÑO DE MUESTRA 
Se darán los resultados individuales de cada uno de los tres frascos y 
los valores medios, expresados en unidades de masa por volumen de solución (normalmente en mg/1) o de masa por masa de muestra de 
polímero (normalmente en mg/g). Además, se indicará también la 
pérdida de peso de la muestra (calculada como el peso de soluto dividido por el peso de la muestra inicial). Se calculará la desviación típica relativa (RSD). Se darán cifras individuales de la sustancia 
total (polímero + aditivos esenciales, etc.) y del polímero solo (es 
decir, después de sustracción de la participación de estos aditivos).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. ENSAYO REALIZADO CON DOS TAMAÑOS DIFERENTES DE 
MUESTRAS 
Se darán los valores de COT individuales de los extractos acuosos de 
las dos experiencias por triplicado y el valor medio de cada expe ­
riencia, en unidades de masa por volumen de solución (normalmente 
en mg C/l), así como en unidades de masa por peso de la muestra inicial (normalmente en mg C/g). 
Sí no hay diferencia entre los resultados con elevada proporción 
muestra/agua y con baja proporción muestra/agua, se podrá suponer 
que todos los componentes, susceptibles de extraerse se han extraído realmente. En este caso, el análisis directo no sería necesario en principio. 
Se darán los pesos individuales de los residuos y se expresarán en 
porcentaje de los pesos inicíales de las muestras. Las medias se 
calcularán para cada experiencia. Las diferencias entre 100 y los porcentajes encontrados representan los porcentajes de materiales solubles y extraíbles en la muestra original.
 
3. INFORME  
3.1 INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe contener la siguiente información:  
3.1.1  Sustancia de ensayo  
— Información disponible sobre la sustancia de ensayo (identidad, 
aditivos, impurezas, contenido en especies de bajo peso molecular).  
3.1.2.  Condiciones experimentales  
— Descripción de los procedimientos utilizados y de las condiciones 
experimentales. 
— Descripción de ios métodos de análisis y de detección.  
3.1.3  Resultados  
— Resultados de solubilidad/extractividad en mg/1; valores indivi ­
duales y medios para los ensayos de extracción en las distintas 
soluciones, desglose del contenido en polímeros e impurezas, 
aditivos, etc. 
— Resultados de solubilidad/extractividad en mg/g de polímero. — Valores de COT de los extractos acuosos, peso del soluto y 
porcentajes calculados, si se miden. 
— pH de cada muestra. 
— Información sobre los valores en blanco. 
— En caso necesario, referencias a la inestabilidad química de la 
sustancia de ensayo, tanto durante el procedimiento de ensayo como durante los análisis. 
— Toda la información importante para la interpretación de los 
resultados.
 
4. REFERENCIAS  
(1) DIN 53733 (1976)  Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für 
Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  PROPIEDADES COMBURENTES (LÍQUIDOS)  
1. MÉTODO  
1.1 INTRODUCCIÓN 
El presente método se ha diseñado para medir el potencial de una 
sustancia líquida de incrementar la velocidad o la intensidad de 
combustión de una sustancia combustible, o de provocar la inflama ­
bilidad espontánea cuando se mezcla homogéneamente con una sus ­
tancia combustible. Se funda en el ensayo de la ONU de líquidos 
comburentes (1) y ambos son equivalentes. No obstante, dado que el 
método A.21 se ha diseñado ante todo para cumplir los requisitos establecidos en la Directiva 67/548/CEE, es suficiente efectuar la 
comparación con una sola sustancia de referencia. Si está previsto 
emplear los resultados del ensayo para otros fines (
 1 ), puede ser 
necesario realizar el ensayo y la comparación con varias sustancias de referencia. 
Si el análisis de la fórmula estructural excluye toda duda razonable 
de que la sustancia pueda reaccionar exotérmicamente con un mate ­
rial combustible, no será preciso realizar el ensayo. 
Antes de llevar a cabo el ensayo, conviene disponer de información 
preliminar sobre las posibles propiedades explosivas de la sustancia. 
Este ensayo no puede realizarse con sólidos, gases, sustancias ex ­
plosivas o altamente inflamables ni peróxidos orgánicos. 
Si ya se dispone de los resultados del ensayo de la ONU de líquidos 
comburentes (1) para la sustancia en cuestión, no será necesario realizar el presente ensayo,
 
1.2 DEFINICIONES Y UNIDADES 
Tiempo medio de aumento de la presión: media de los tiempos 
medidos para que la presión de la mezcla de ensayo aumente de 690 kPa a 2 070 kPa (presión manométrica).
 
1.3 SUSTANCIA DE REFERENCIA 
La sustancia de referencia ha de ser ácido nítrico acuoso (pureza de 
grado analítico) al 65 % (p/p) (  2 ). ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Por ejemplo, en el marco de las normas de transporte de la ONU. 
( 2 ) Debe valorarse el ácido antes del ensayo para confirmar su concentración.
 Si el experimentador prevé que los resultados del ensayo pueden 
emplearse para otros fines, cabe realizar el ensayo con otras sustan ­
cias de referencia (  1 ). 
1.4 PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se mezcla el líquido que va a estudiarse en proporción de 1/1, en 
masa, con celulosa fibrosa y se introduce en un recipiente a presión. 
Si se produce una combustión espontánea durante la mezcla o la 
introducción, no es necesario proseguir el ensayo. 
En caso contrario, se lleva a cabo el ensayo completo. Se calienta]a 
mezcla en el recipiente a presión y se mide el tiempo medio que 
tarda la presión en aumentar de 690 kPa a 2 070 kPa (presión ma ­
nométrica). Se compara el resultado con el tiempo medio de aumento de la presión de una mezcla 1/1 de la sustancia o sustancias de referencia y celulosa.
 
1.5 CRITERIOS DE CALIDAD 
En una serie de cinco pruebas con la misma sustancia ningún resul ­
tado debe diferir en más del 30 % de la media aritmética. En caso contrario, es preciso descartar los resultados que difieran en más del 
30 % de la media aritmética, mejorar la técnica de mezcla e intro ­
ducción y repetir el ensayo.
 
1.6 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1  Preparación  
1.6.1.1  Sustancia combustible,  
Se emplea como material combustible celulosa fibrosa deshidratada, 
cuyas fibras tengan Una longitud comprendida entre 50 y 250 μm y 
un diámetro medio de 25 μm (  2 ). La celulosa se deshidrata hasta 
peso constante en una capa de espesor máximo de 25 mm a 
105  o C durante 4 horas y se conserva en un desecador, con dese ­
cante, hasta que sé enfríe y vaya a utilizarse. El contenido acuoso de la celulosa deshidratada ha de ser inferior al 0,5 % de la masa deshidratada (
 3 ). Si es preciso, se prolonga el tiempo de 
deshidratación (  4 ). Debe emplearse el mismo lote de celulosa para 
todo el ensayo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Por ejemplo, en la referencia bibliográfica 1 se emplean ácido perclórico al 50 % (p/p) y 
clorato de sodio al 40 % (p/p). 
( 2 ) Por ejemplo, celulosa en polvo para columna de cromatografía Whatman CF 11, n  o de 
catálogo 4021 050. 
( 3 ) Confirmado, por ejemplo, mediante valoración de Karl-Fisher. 
( 4 ) También puede obtenerse ese contenido acuoso (por ejemplo) calentando la celulosa a 
105  o C al vacío durante 24 h.
 1.6.1.2  Equipo  
1.6.1.2.1 R e c i p i e n t e a p r e s i ó n 
Se necesita un recipiente a presión, formado por un cilindro de acero 
de 89 mm de largo y 60 mm de diámetro exterior (véase la figura 1). Se practican dos rebajes planos diametralmente opuestos (que redu ­
cen esa sección transversal del recipiente a 50 mm) para inmovili ­
zarlo mientras se ajustan la pieza de encendido y la de sujeción del 
diafragma de seguridad. El recipiente ha de tener una luz de 20 mm, que se ensanchará a ambos extremos del cilindro rebajando las pa ­
redes internas en una longitud de 19 mm y se fileteará de manera 
que pueda alojar una rosca del tipo  British Standard Pipe  (BSP) de 
1" o su equivalente métrico. En la superficie convexa del recipiente, a 35 mm de un extremo y a 90
 ° de los rebajes planos, se enrosca un 
tubo lateral que servirá para medir la presión. El extremo del tubo 
estará provisto de una rosca de 1/2" BSP (o su equivalente métrico), 
que se ajustará en una cavidad de 12 mm de profundidad practicada en la pared del recipiente y fileteada debidamente. Si es necesario, se sella con un material inerte para evitar la fuga de gas. El tubo lateral 
sobresale 55 mm del recipiente a presión y tiene una luz de 6 mm. 
La cara interna del extremo libre del tubo se rebaja y filetea para que pueda alojar un transductor de presión de tipo diafragmático. Puede emplearse cualquier medidor de presión que no sufra alteraciones 
debido a los gases calientes ni a los productos de descomposición 
y que pueda detectar aumentos de presión de 690 a 2 070 kPa en menos de 5 ms. 
Se cierra el extremo del recipiente más alejado del tubo lateral con 
una pieza de encendido provista de dos electrodos, uno de ellos aislado del cuerpo de la pieza y el otro unido a masa con este. El 
otro extremo del recipiente se obtura con un diafragma de seguridad 
(presión aproximada de rotura: 2 200 kPa), que se mantiene en su lugar mediante una pieza de sujeción que presenta una luz de 20 mm. Si es necesario, se sella la pieza de encendido con material 
inerte para evitar la fuga de gas. Para mantener el conjunto en la 
posición correcta durante la utilización, se emplea un soporte de acero suave (figura 2), que suele estar formado por una base de 235 mm × 184 mm × 6 mm y un tubo hueco de sección cuadrada 
(70 mm × 70 mm × 4 mm) de 185 mm de longitud. 
En uno de los extremos del tubo cuadrado se seccionan dos caras 
opuestas, de manera que se obtenga un tubo de 86 mm de largo 
prolongado por dos lados planos a modo de patas, que se cortan para 
que, una vez soldado a la base, el tubo forme un ángulo de 60
 o con 
la horizontal. En el extremo superior de una de las caras del tubo se practica una muesca de 22 mm de ancho y 46 mm de profundidad, 
de manera que, al colocar el recipiente a presión en el soporte con la 
pieza de encendido hacia abajo, el tubo lateral para medir la presión quede alojado en ella. En la cara interna de la pared del tubo orien ­
tada hacia abajo se suelda una pieza de acero de 30 mm de ancho y 
6 mm de grueso para que sirva de separador. En la pared opuesta se 
hacen dos orificios y se enroscan dos tornillos de palomilla de 7 mm para fijar el recipiente a presión. Para sujetar el recipiente desde abajo, se sueldan dos rebordes de acero de 12 mm de ancho y 
6 mm de grueso a los laterales de la parte inferior de la sección 
cuadrada.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2 D i s p o s i t i v o d e i g n i c i ó n 
El dispositivo de ignición está integrado por un hilo de Ni/Cr de 
25 cm de largo y 0,6 mm de sección, con una resistencia de 3,85 
ohm/m. El hilo se enrolla en forma de bobina con una varilla de 5 mm de diámetro y se une a los electrodos de la pieza de encen ­
dido. La bobina ha de ajustarse a uno de los esquemas de la figura 
3. La distancia entre la cara superior de la pieza de encendido y. la 
cara inferior de la bobina de ignición debe ser de 20 mm. Si los electrodos no son regulables, los segmentos de hilo que se encuen ­
tran entre la bobina y la cara superior de la pieza de encendido deben 
aislarse con un revestimiento cerámico. El hilo se calienta mediante 
una alimentación eléctrica-estable que proporcione una intensidad de 10 A como mínimo.
 
1.6.2  Realización del ensayo  ( 1 ) 
Se coloca en el soporte el recipiente montado con el transductor de 
presión y el dispositivo de ignición, pero sin el diafragma de segu ­
ridad, con la pieza de encendido hacia abajo. Se introducen 2,5 g del líquido que vaya a someterse a ensayo y 2,5 g de celulosa deshi ­
dratada en una copa de vidrio y se mezclan con un agitador de 
cristal (
 2 ). Por motivos de seguridad, la persona que realice la mezcla 
debe interponer una pantalla protectora. Si se produce una combus ­
tión espontánea' durante la mezcla o la introducción, no es necesario 
proseguir el ensayo. Se introduce la mezcla en pequeñas cantidades 
en el recipiente a presión dando ligeros golpecitos y se comprueba que la mezcla rodea bien y está en contacto con la bobina de igni ­
ción sin dejar hueco. La bobina no debe deformarse durante este 
proceso, pues ello podría falsear los resultados (
 3 ). Se coloca en su 
lugar el diafragma de seguridad y se enrosca al máximo la pieza de sujeción. Se coloca el recipiente cargado en el soporte con el disco de seguridad hacia arriba y se introduce el conjunto en una campana 
extractora blindada o una cámara de fuego. Se conectan los bornes 
externos de la pieza de encendido a una alimentación eléctrica y se aplica una corriente de 10 A. No deben transcurrir más de 10 minutos entre el inicio de la preparación de la mezcla y el 
momento en que se aplica la corriente. 
La señal emitida por el transductor de presión se recoge en un 
sistema que permita el registro continuo de la curva presión/tiempo 
y su análisis (por ejemplo, un registrador de señales transitorias 
acoplado a un registrador sobre cinta de papel). Se calienta la mezcla hasta que se rompa el diafragma de seguridad o durante un tiempo mínimo de 60 s. Si no se ha roto el diafragma, debe esperarse a que 
la mezcla se enfríe antes de abrir el recipiente con prudencia y 
tomando las debidas precauciones por si estuviera aún a presión. Se realizan cinco ensayos con la mezcla y con la sustancia o sus ­
tancias de referencia. Se registra el tiempo que tarda la presión en 
aumentar de 690 kPa a 2 070 kPa (presión manométrica). Se calcula 
la media de los tiempos registrados. 
En algunos casos, las sustancias pueden generar un aumento de 
presión (demasiado elevado o demasiado escaso) debido a reacciones 
químicas que no son características de las propiedades comburentes de dichas sustancias. Puede entonces ser necesario repetir el ensayo sustituyendo la celulosa por un material inerte, como la diatomita 
(kieselguhr), para cerciorarse de que no se trata de un efecto no 
comburente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Las mezclas de sustancias comburentes y celulosa deben tratarse como potencialmente 
explosivas y manipularse con las debidas precauciones. 
( 2 ) En la práctica, puede prepararse una mezcla 1/1 de líquido problema y celulosa en 
cantidad superior a la necesaria para el ensayo, tomar 5 ± 0,1 g e introducirlos en el 
recipiente a presión. La mezcla debe prepararse justo antes de cada ensayo. 
( 3 ) Debe evitarse sobre todo que entren en contacto las circunvoluciones adyacentes de la 
bobina.
 2. RESULTADOS  
Tiempos de aumento de la presión con la sustancia de ensayo y con 
la sustancia o sustancias de referencia. Tiempos de aumento de la presión con una sustancia inerte, si procede.
 
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Se calcula el tiempo medio de aumento de la presión con la sustancia 
de ensayo y con la sustancia o sustancias de referencia. 
Se calcula el tiempo medio de aumento de la presión con una sus ­
tancia inerte, si procede. 
El cuadro 1 recoge algunos ejemplos de resultados.  
Cuadro 1  
Ejemplos de resultados  ( a ) 
Sustancia (  b ) Tiempo medio de aumento de la presión con una mezcla 
de 1/1 de celulosa 
(ms) 
Ácido nítrico, 65 % 4 767 (  c ) 
Ácido perclórico, 50 % 121 (  c ) 
Ácido perclórico, 55 % 59 Bicromato de amonio, en solución acuosa saturada 20 800 Clorato de sodio, en solución acuosa al 40 % 2 555 (
 c ) 
Nitrato de calcio, en solución acuosa saturada 6 700 Nitrato férrico, en solución acuosa saturada 4 133 Nitrato de níquel, en solución acuosa saturada 6 250 
Nitrato de plata, en solución acuosa saturada (
 d ) 
Nitrato de potasio, en solución acuosa al 30 % 26 690 Nitrato de sodio, en solución acuosa al 45 % 4 133 Perclorato de litio, en solución acuosa saturada 1 686 Perclorato de magnesio, en solución acuosa saturada 777  
Sustancia inerte  
Agua/celulosa (
 d ) 
( a ) Véase la referencia bibliográfica (1) para la clasificación según el régimen de transporte de la ONU. 
( b ) Las soluciones saturadas deben prepararse a 20  o C. 
( c ) Valor medio de ensayos interlaboratorios comparados. 
( d ) No se alcanza la presión máxima de 2 070 kPa.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. INFORME  
3.1 INFORME DEL ENSAYO 
En el informe del ensayo debe figurar la información siguiente: 
— identidad, composición, pureza, etc. de la sustancia de ensayo, 
— concentración de la sustancia de ensayo, 
— procedimiento empleado para deshidratar la celulosa, — contenido acuoso de la celulosa empleada, — resultados de las mediciones, — resultados de los ensayos con la sustancia inerte, si procede, — tiempos medios calculados de aumento de la presión, — cualquier desviación respecto al presente método y justificación 
correspondiente, 
— cualquier información u observación complementaria importante 
para interpretar los resultados;
 
3.2 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS (  1 ) 
La evaluación de los resultados del ensayo se fundará en los siguien ­
tes criterios: 
a) la mezcla de sustancia de ensayo y celulosa se inflama espontá ­
neamente o no; 
b) la comparación del tiempo medio de aumento de la presión de 
690 kPa a 2 070 kPa con el tiempo medio correspondiente a la sustancia o sustancias de referencia. 
Se considerará que una sustancia líquida es comburente si: 
a) una mezcla de 1/1 en masa de dicha sustancia y celulosa se 
inflama espontáneamente, o 
b) el tiempo medio de aumento de la presión de una mezcla de 1/1 
en masa de dicha sustancia y celulosa es inferior ó igual al 
tiempo medio de una mezcla de 1/1 en masa de ácido nítrico 
acuoso al 65 % (p/p) y celulosa. 
Con el fin de evitar falsos positivos, a la hora de interpretar los 
resultados deben tomarse en consideración los resultados del ensayo 
con la sustancia y un material inerte.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Véase la referencia bibliográfica 1 para la interpretación de los resultados conforme a las 
normas de transporte de la ONU en caso de que se utilicen varias sustancias de refe ­
rencia.
 4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Ma ­
nual of Tests and Criteria. 2- edición revisada. Publicación de la ONU n
 o ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test O.2: Test 
for oxidizing liquids.  
Figura 1  
Recipiente a presión
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Figura 2  
Soporte
  
Figura 3  
Dispositivo de ignición
  
Nota: cualquiera de estas dos configuraciones puede ser utilizada.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  DIÁMETRO MEDIO GEOMÉTRICO DE LAS FIBRAS 
PONDERADO POR LA LONGITUD  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente método describe un procedimiento para medir el diáme ­
tro medio geométrico ponderado por la longitud (DMGPL) de las 
fibras minerales artificiales a granel. Como el DMGPL de la pobla ­
ción tendrá una probabilidad del 95 % de encontrarse entre los límites del intervalo de confianza del 95 % [DMGPL ± dos errores 
estándar (EE)] de la muestra, el valor registrado (resultado de la 
prueba) será el límite inferior de confianza del 95 % de la muestra (DMGPL-2EE). El método se basa en la actualización, de junio de 1994, de un proyecto de procedimiento industrial del HSE, adoptado 
en la reunión entre este organismo y la ECFIA que se celebró en 
Chester el 26 de septiembre de 1993, y modificado en relación con un segundo ensayo interlaboratorios (1, 2). Este método de medición puede utilizarse para caracterizar el diámetro de las fibras de sustan ­
cias o productos a granel que contengan fibras minerales artificiales, 
incluidas las fibras cerámicas refractarias, las fibras vítreas artificiales y las fibras cristalinas y policristalinas. 
La ponderación por la longitud es una forma de compensar el efecto 
que tiene sobre la distribución de los diámetros la ruptura de las 
fibras largas en el momento de manipular el material o de tomar muestras de él. Para medir la distribución por tamaños de los diáme ­
tros de las fibras minerales artificiales se utiliza la media geométrica 
porque esta distribución suele aproximarse a la normal logarítmica. 
Sería pesado y llevaría mucho tiempo medir la longitud además del 
diámetro, pero si se miden solo las fibras que tocan una línea infi ­
nitamente fina en un campo de visión del microscopio electrónico de barrido, la probabilidad de seleccionar una fibra determinada es pro ­
porcional a su longitud. Como así se tiene en cuenta la longitud a 
efectos de la ponderación, la única medición necesaria es la del diámetro, y el resultado (DMGPL-2EE) puede calcularse de la forma descrita.
 
1.2. DEFINICIONES  
Partícula : objeto cuya relación longitud/grosor es inferior a 3:1.  
Fibra : objeto cuya relación longitud/grosor (relación de aspecto) es 
al menos de 3:1.  
1.3. ÁMBITO Y LIMITACIONES 
El método está concebido para estudiar distribuciones de diámetros 
con medianas entre 0,5 μm y 6 μm. Es posible medir diámetros más 
grandes mediante el uso de un número menor de aumentos del microscopio electrónico de barrido, pero el método estará más limi ­
tado para distribuciones de fibras más finas, por lo que se reco ­
mienda una medición con microscopio electrónico de transmisión 
si el diámetro medio está por debajo de 0,5 μm.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se toma una serie de muestras cilíndricas representativas de la placa 
de fibras o de las fibras sueltas a granel. Se reduce la longitud de las fibras a granel mediante aplastamiento, y se dispersa en agua una 
submuestra representativa. Se extraen alícuotas que se pasan por un 
filtro de policarbonato de 0,2 μm de diámetro de poro, y se preparan 
para su examen mediante microscopia electrónica de barrido. Se miden los diámetros de las fibras con un número de aumentos en 
pantalla de 10 000 o mayor (
 1 ), utilizando el método de intersección 
con una línea, a fin de obtener una estimación no sesgada del diá ­
metro mediano. Se calcula el límite inferior del intervalo de con ­
fianza del 95 % (a partir de un ensayo unilateral) para obtener una 
estimación del valor mínimo del diámetro medio geométrico de las fibras del material.
 
1.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.5.1.  Seguridad/precauciones  
Debe reducirse al mínimo la exposición del personal a las fibras 
presentes en el aire, y la manipulación de las fibras secas debe efectuarse en una campana de gases o en un aislador (cabina de 
seguridad con guantes). Debe procederse a un seguimiento periódico 
de la exposición del personal para determinar la eficacia de los métodos de reducción. Para manipular fibras minerales artificiales hay que llevar guantes desechables, a fin de reducir la irritación 
de la piel y evitar la contaminación cruzada.
 
1.5.2.  Equipo  
— Prensa y troqueles (capaces de alcanzar 10 MPa). 
— Filtros capilares de policarbonato de 0,2 μm de diámetro de poro 
(25 mm de diámetro). 
— Filtro de membrana de ésteres de celulosa de 5 μm de diámetro 
de poro, utilizado como soporte del filtro. 
— Equipo de filtración de vidrio (o sistema de filtración desechable) 
válido para filtros de 25 mm de diámetro (por ejemplo, equipo de 
microanálisis de vidrio de Millipore, tipo XX10 025 00). 
— Agua recién destilada, pasada por un filtro de 0,2 μm de diáme ­
tro de poro para eliminar los microorganismos. 
— Revestidor de pulverización con objetivo de oro o de oro/paladio. — Microscopio electrónico de barrido capaz de llegar a una resolu ­
ción de 10 nm y de proporcionar 10 000 aumentos. 
— Otro material: espátulas, hojas de bisturí de tipo 24, pinzas, tubos 
de microscopio electrónico de barrido, pegamento de carbono o cinta adhesiva de carbono, plata coloidal. 
— Sonda de ultrasonidos o baño de ultrasonidos de sobremesa. — Muestreador de cilindro o sacabocados, para tomar muestras ci ­
líndricas de una placa de fibras minerales artificiales.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Este número de aumentos está indicado para fibras de 3 μm; en caso de fibras de 6 μm 
puede ser más adecuado utilizar 5 000 aumentos.
 1.5.3.  Procedimiento  
1.5.3.1.  Muestreo  
En caso de mantas o placas, se utiliza un muestreador de cilindro de 
25 mm o un sacabocados para tomar muestras de la sección 
transversal. Las muestras deben tomarse de puntos situados a inter ­
valos iguales a lo ancho de una pequeña longitud de la placa, o bien de zonas aleatorias si se dispone de grandes longitudes de placa. El mismo equipo puede utilizarse para extraer muestras aleatorias de 
fibras sueltas. A ser posible, deben tomarse seis muestras para tener 
en cuenta las variaciones espaciales del material a granel. 
Las seis muestras cilíndricas deben aplastarse en un troquel de 
50 mm de diámetro a la presión de 10 MPa. Se mezcla el material con la espátula y se vuelve a someter a 10 MPa. Después se saca el 
material del troquel y se conserva en un frasco de cristal hermética ­
mente cerrado.
 
1.5.3.2.  Preparación de la muestra  
En caso necesario puede eliminarse el eventual ligante orgánico 
poniendo las fibras en un horno a 450 °C durante una hora aproxi ­
madamente. 
Formar un cono y separar en partes para subdividir la muestra (esta 
operación debe realizarse dentro de una campana de gases). 
Con ayuda de una espátula, añadir una pequeña cantidad (< 0,5 g) de 
muestra a 100 ml de agua recién destilada que se ha pasado a través de un filtro de membrana de 0,2 μm (pueden utilizarse otras fuentes 
de agua ultrapura si se demuestra que son satisfactorias). Dispersar 
totalmente utilizando una sonda de ultrasonidos con una potencia de 100 W y ajustada de forma que se produzca cavitación. (Si no se dispone de sonda, utilizar el método siguiente: agitar repetidamente e 
invertir durante 30 segundos; poner durante cinco minutos en baño 
de ultrasonidos de sobremesa; volver a agitar repetidamente e invertir durante otros 30 segundos.) 
Inmediatamente después de la dispersión de las fibras, tomar una 
serie de alícuotas (por ejemplo, tres alícuotas de 3, 6 y 10 ml) con una pipeta de boca ancha (de 2 a 5 ml de capacidad). 
Filtrar en vacío cada alícuota a través de un filtro de policarbonato 
de 0,2 μm, puesto sobre un filtro de soporte de MEC de 5 μm, 
utilizando un embudo de filtración de vidrio de 25 mm, con depósito 
cilíndrico. Deben ponerse en el embudo unos 5 ml de agua destilada filtrada; la alícuota se pipetea lentamente al interior del agua, man ­
teniendo la punta de la pipeta por debajo del menisco. La pipeta y el 
depósito deben enjuagarse a fondo después, ya que las fibras más 
finas tienden a situarse más en la superficie. 
Tomar cuidadosamente el filtro y separarlo del filtro de soporte antes 
de ponerlo en un recipiente para que se seque.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Cortar una sección de un cuarto o un medio de lo retenido en el 
filtro con una hoja de bisturí de tipo 24, mediante un movimiento de 
vaivén. Poner cuidadosamente la sección cortada en un portaobjetos de microscopio electrónico de barrido utilizando una lengüeta adhe ­
siva de carbono o pegamento de carbono. Debe ponerse plata coloi ­
dal al menos en tres posiciones para mejorar el contacto eléctrico en 
los bordes del filtro y del portaobjetos. Una vez secos el pegamento y la plata coloidal, revestir la superficie de la muestra con aproxi ­
madamente 50 nm de oro u oro/paladio mediante pulverización.
 
1.5.3.3.  Calibración y funcionamiento del microscopio electrónico de barrido  
1.5.3.3.1. C a l i b r a c i ó n 
La calibración del microscopio electrónico de barrido debe compro ­
barse al menos una vez por semana (lo ideal es una vez al día) 
mediante una rejilla de calibración certificada. La calibración debe comprobarse frente a un patrón certificado y, si el valor medido no está en el intervalo de ± 2 % del valor certificado, es necesario 
ajustar la calibración y volver a comprobarla. 
El microscopio debe ser capaz de resolver al menos un diámetro 
visible mínimo de 0,2 μm, utilizando una matriz de muestra real, a 
2 000 aumentos.
 
1.5.3.3.2. F u n c i o n a m i e n t o 
El microscopio debe funcionar a 10 000 aumentos (  1 ), en condiciones 
que den una buena resolución con una imagen aceptable a velocidad 
baja de exploración, como, por ejemplo, 5 segundos por 
pantalla. Aunque pueden variar los requisitos de funcionamiento de los distintos microscopios electrónicos de barrido, para obtener la 
mejor visibilidad y resolución con materiales de peso atómico rela ­
tivamente bajo debe utilizarse en general una tensión de aceleración de 5 a 10 keV, habiéndose fijado un pequeño tamaño del punto y una corta distancia de trabajo. Como se efectúa un recorrido lineal, 
debe utilizarse una inclinación de 0
 o para minimizar el reenfoque o 
bien, si el microscopio tiene una platina eucéntrica, debe utilizarse la distancia de trabajo eucéntrica. Puede utilizarse un número menor de aumentos si el material solo contiene fibras de diámetro grande 
(> 5 μm).
 
1.5.3.4.  Medición  
1.5.3.4.1. E x a m e n c o n p o c o s a u m e n t o s p a r a e v a l u a r l a 
m u e s t r a 
La muestra debe examinarse inicialmente con pocos aumentos para 
ver si hay indicios de aglutinación de fibras grandes y para evaluar la densidad de las fibras. En caso de aglutinamiento excesivo, se reco ­
mienda preparar una muestra nueva. 
Para conseguir una buena exactitud estadística, es necesario medir un 
número mínimo de fibras, y parece conveniente tener una elevada 
densidad de fibras, ya que examinar campos vacíos supone un gasto 
de tiempo que no aporta nada al análisis. Sin embargo, si el filtro está superpoblado, se hace difícil medir todas las fibras medibles y es posible pasar por alto las fibras pequeñas que puedan estar ocultas 
por otras mayores.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) En caso de fibras de 3 μm, véase la nota anterior.
 Puede aparecer un sesgo de sobreestimación del DMGPL si la 
densidad supera las 150 fibras por milímetro de recorrido 
lineal. Por otra parte, una baja concentración de fibras supone un aumento del tiempo de análisis, y suele ser más rentable preparar una muestra con una densidad de fibras próxima a la óptima, en 
vez de seguir haciendo recuentos con filtros de baja 
concentración. La densidad óptima de fibras debe proporcionar una media de una o dos fibras contables por campo de visión a 5 000 aumentos. Sin embargo, la densidad óptima depende del 
tamaño (diámetro) de las fibras, por lo que el operario debe utilizar 
su experiencia para decidir si la densidad de las fibras está próxima a la óptima o no.
 
1.5.3.4.2. P o n d e r a c i ó n d e l o s d i á m e t r o s d e l a s f i b r a s p o r l a 
l o n g i t u d 
Solo se cuentan las fibras que tocan (o cruzan) una línea (infinita ­
mente) fina trazada en la pantalla del microscopio. Con este fin se 
traza una línea horizontal (o vertical) por el centro de la pantalla. 
Otra posibilidad es situar un solo punto en el centro de la pantalla e 
iniciar una exploración en una sola dirección a través del filtro. Se mide y se registra el diámetro de cada fibra cuya relación longitud/ grosor (relación de aspecto) sea superior a 3:1 y que toque o cruce 
este punto.
 
1.5.3.4.3. M e d i c i ó n d e l a s f i b r a s 
Se recomienda medir como mínimo 300 fibras. Cada fibra se mide 
solo una vez en el punto de intersección con la línea o el punto trazado en la imagen (o cerca del punto de intersección si los bordes de las fibras están poco claros). Si se encuentran fibras de secciones 
transversales no uniformes, debe tomarse una medida que represente 
su diámetro medio. Ha de tenerse cuidado al definir el borde y medir la distancia más corta entre los bordes de la fibra. La medición puede hacerse directamente o bien después, con fotografías o imágenes 
grabadas. Son recomendables los sistemas semiautomáticos de me ­
dición de imágenes que descargan datos directamente a una hoja de cálculo, ya que así se ahorra tiempo, se eliminan errores de trans ­
cripción y pueden automatizarse los cálculos. 
Debe comprobarse con pocos aumentos que los extremos de las 
fibras largas no se recurvan en el campo de visión de la medición 
y que solo se miden una vez.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Los diámetros de las fibras no suelen tener una distribución 
normal. Sin embargo, mediante una transformación logarítmica es posible obtener una distribución que se aproxime a la normal. 
Se calculan la media aritmética (lnD medio) y la desviación típica 
(DT
 lnD ) de los logaritmos neperianos (lnD) de los diámetros (D) de 
las n fibras. 
medio lnD ¼ P lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
DT  lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ðlnD – medio lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
La desviación típica se divide por la raíz cuadrada del número de 
mediciones (n) para obtener el error estándar (EE  lnD ). 
EE lnD ¼ DT ﬃﬃﬃ n p (3) 
Se resta de la media dos veces el error estándar y se calcula el 
exponencial del valor obtenido (media menos dos veces el error estándar) para dar la media geométrica menos dos errores estándar 
geométricos. 
DMGPL – 2EE ¼ e
 ðmedio lnD–2SE  lnd Þ (4) 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe dar, como mínimo, la siguiente informa ­
ción: 
— el valor de DMGPL-2EE, — las eventuales desviaciones y, en particular, las que puedan afec ­
tar a la precisión o a la exactitud de los resultados, con su 
justificación pertinente.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999. 
(2) G. Burdett y G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Re ­
sults of the Second inter-laboratory exchange. 
IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Execu ­
tive. Research and Laboratory Services Division. 1994.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23.  COEFICIENTE DE REPARTO (1-OCTANOL/AGUA): MÉTODO 
DE AGITACIÓN LENTA  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 123 (2006) de 
la OCDE. El método de agitación lenta (1) ha permitido determinar con 
exactitud el coeficiente de reparto 1-octanol/agua (P  OW ) con valores de hasta 
un log P  OW de 8,2. Por lo tanto, es un enfoque experimental idóneo para la 
determinación directa del P  OW de sustancias altamente hidrófobas. 
2. Otros métodos para determinar el coeficiente de reparto 1-octanol/agua 
(P OW ) son el método "de frasco de agitación" (2) y la determinación del 
P OW basada en el comportamiento de retención en CLAR de fase inversa 
(3). El método "de frasco de agitación" es proclive a dar artefactos por la transferencia de microgotas de octanol a la fase acuosa. Al aumentar los 
valores de P
 OW , la presencia de estas microgotas en la fase acuosa provoca 
una sobrevaloración creciente de la concentración de la sustancia problema en el agua. Por este motivo es aplicable solo a las sustancias con log P
 OW <4. El segundo método se basa en los datos sólidos de valores de 
P OW medidos directamente para calibrar la relación entre el comportamiento 
de retención en CLAR y los valores medidos de P  OW . Hubo un proyecto de 
directrices de la OCDE para determinar los coeficientes de reparto 1-octa ­
nol/agua de las sustancias ionizables (4), pero ya no está vigente. 
3. Este método de ensayo ha sido desarrollado en los Países Bajos. La preci ­
sión de los métodos aquí descritos ha sido validada y optimizada en un estudio de validación interlaboratorios, en el que participaron quince labo ­
ratorios (5).
 
CONSIDERACIONES INICIALES  
Fundamento y aplicación  
4. Se ha observado una relación altamente significativa entre los coeficientes de 
reparto 1-octanol/agua (P  OW ) de las sustancias orgánicas inertes y su bioacu ­
mulación en los peces. Por lo demás, se ha demostrado que el P  OW posee una 
buena correlación con la toxicidad en peces y también con la sorción de los compuestos químicos a sólidos como suelos y sedimentos. Una amplia visión 
general de estas relaciones se recoge en la bibliografía (6). 
5. Se han establecido muy diversas relaciones entre el coeficiente de reparto 1- 
octanol/agua y otras propiedades de las sustancias relevantes para la química 
y toxicología medioambientales. Por esta razón, el coeficiente de reparto 1- 
octanol/agua se ha convertido en un parámetro clave en la evaluación del riesgo medioambiental de los compuestos químicos y de su destino final en el medio ambiente.
 
Ámbito de aplicación  
6. Se considera que el ensayo de agitación lenta reduce la formación de mi ­
crogotas a partir de las gotitas de 1-octanol en la fase acuosa. Por esta razón 
no hay riesgo de sobrevalorar la concentración acuosa debido a las molé ­
culas de la sustancia problema asociadas a las gotitas. Así pues, el método de agitación lenta es particularmente aplicable a la determinación del P
 OW 
de sustancias con valores esperados de log P  OW de 5 y mayores, en las que 
el método de frasco de agitación (2) tendería a dar resultados erróneos.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINICIONES Y UNIDADES 
7. El coeficiente de reparto de una sustancia entre el agua y un disolvente 
lipófilo (1-octanol) define la distribución en equilibrio del compuesto quí ­
mico entre las dos fases. El coeficiente de reparto entre el agua y el 1- 
octanol (P  OW ) se define como la relación de las concentraciones en equili ­
brio de la sustancia problema en 1-octanol saturado con agua (C  O ) y en agua 
saturada con 1-octanol (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Al ser un cociente entre dos concentraciones es adimensional. Se indica 
generalmente en forma de su logaritmo decimal (log P  OW ). El Pow es 
dependiente de la temperatura, por lo que los datos del informe incluirán 
la temperatura de la medición.  
PRINCIPIO DEL MÉTODO 
8. Con el fin de determinar el coeficiente de reparto, se equilibran el agua, el 
1-octanol y la sustancia problema a temperatura constante. Seguidamente se determinan las concentraciones de la sustancia problema en las dos fases. 
9. Las dificultades experimentales asociadas a la formación de microgotas 
durante el experimento de frasco de agitación se consiguen reducir en el ensayo de agitación lenta que proponemos aquí. En el ensayo de agitación 
lenta, el agua, el 1-octanol y la sustancia problema se equilibran en un 
reactor agitado termostatizado. El intercambio entre las fases se acelera mediante agitación. La agitación introduce una turbulencia limitada, lo que facilita el intercambio entre el 1-octanol y el agua sin que se formen 
microgotas (1).
 
APLICABILIDAD DEL ENSAYO 
10. Dado que la presencia de otras sustancias distintas podría influir en el 
coeficiente de actividad de la sustancia problema, se analizará esta como 
sustancia pura. En el ensayo de reparto 1-octanol/agua se empleará la sus ­
tancia de máxima pureza comercialmente disponible. 
11. El presente método es aplicable a sustancias puras que no se disocian ni 
asocian y que no presentan una actividad interfacial importante. Permite determinar el coeficiente de reparto 1-octanol/agua de estas sustancias y 
de sus mezclas. Cuando el método se aplica a las mezclas, los coeficientes 
de reparto 1-octanol/agua determinados son condicionales, al depender de la composición química de la mezcla analizada y de la composición de elec ­
trolitos utilizada en la fase acuosa. Siempre que se tomen medidas comple ­
mentarias, el método es también aplicable a compuestos que se disocian o 
asocian (punto 12). 
12. Debido a los múltiples equilibrios que intervienen en el reparto 1-octanol/ 
agua de las sustancias que se disocian, como los ácidos orgánicos y los fenoles, las bases orgánicas y los compuestos organometálicos, el coeficiente 
de reparto 1-octanol/agua es una constante condicional que depende inten ­
samente de la composición electrolítica (7) (8). Por consiguiente, para de ­
terminar el coeficiente de reparto 1-octanol/agua es necesario controlar y documentar el pH y la composición electrolítica del ensayo. La evaluación 
de los coeficientes de reparto ha de confiarse al juicio de un experto. A 
partir del valor de la(s) constante(s) de disociación se elegirán los valores de pH idóneos, a fin de determinar un coeficiente de reparto por cada estado de ionización. Cuando se analizan compuestos organometálicos deben em ­
plearse soluciones amortiguadores que no formen complejos (8). Teniendo 
en cuenta los datos conocidos sobre la química en medio acuoso (constantes de complejación, constantes de disociación), se elegirán las condiciones experimentales de modo tal que permita estimar la especiación de la sus ­
tancia problema en la fase acuosa. La fuerza iónica ha de ser idéntica en 
todos los ensayos, para lo cual se empleará un electrolito de fondo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Pueden surgir dificultades analíticas cuando se aplica el ensayo a sustancias 
con hidrosolubilidad baja o con P  OW elevado, pues en ese caso las concen ­
traciones en el agua serán muy bajas, dificultando una determinación exacta. El presente método de ensayo facilita indicaciones para solventar esta difi ­
cultad.
 
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
14. Los reactivos químicos serán de calidad analítica o de más alta pureza. Se 
recomienda el uso de sustancias problema no marcadas de composición química conocida y pureza preferiblemente del 99 %, al menos, o de sus ­
tancias problema radiomarcadas de composición química y pureza radioquí ­
mica conocidas. En caso de marcadores de semivida breve, deben aplicarse correcciones para tener en cuenta su desintegración. En caso de sustancias problema radiomarcadas, deberá emplearse un método de análisis químico 
específico para garantizar que la radiactividad medida está en relación di ­
recta con la sustancia problema. 
15. Puede obtenerse una estimación de log P
 OW con ayuda de programas infor ­
máticos comerciales para tal fin, o bien aplicando la relación de solubilida ­
des en ambos disolventes. 
16. Antes de emprender un ensayo de agitación lenta para la determinación del 
P OW , es preciso conocer la siguiente información acerca de la sustancia 
problema: 
a) fórmula estructural; 
b) métodos analíticos apropiados para determinar la concentración de la 
sustancia en agua y en 1-octanol; 
c) constante(s) de disociación de las sustancias ionizables [Directrices 112 
de la OCDE (9)]; 
d) hidrosolubilidad (10); 
e) hidrólisis abiótica (11); 
f) biodegradabilidad fácil (12); 
g) presión de vapor (13).  
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Material  
17. Se precisa el equipo normal de laboratorio y, en particular, el siguiente: 
— agitadores magnéticos y barras de agitación magnéticas recubiertas de 
teflón para agitar la fase acuosa; 
— instrumental analítico adecuado para determinar la concentración de la 
sustancia problema a las concentraciones esperadas; 
— cubeta de agitación provista de grifo de desagüe. Dependiendo de la 
estimación del log POW y del límite de detección (LOD) de la sustancia problema, se ha planteado usar un recipiente de reacción de las mismas 
proporciones pero con capacidad mayor de un litro, con el fin de obtener 
un volumen de agua suficiente para el análisis y la extracción química. De este modo se obtendrán concentraciones más elevadas en el extracto acuoso y, por ende, una determinación analítica más fiable. En el apén ­
dice 1 figura una tabla que recoge los cálculos del volumen mínimo 
necesario, el LOD de la sustancia, su log POW estimado y su hidroso ­
lubilidad. La tabla se basa en la relación entre el log POW y el cociente de solubilidades en octanol y agua, tal como ha sido definida por Pin ­
suwan  et al.  (14): 
log P
 OW ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
donde:  
SR ¼ S oct=S w (en molaridad); 
y en la relación establecida por Lyman (15) para predecir la hidrosolu ­
bilidad. Los valores de hidrosolubilidad calculados según la ecuación 
que se indica en el apéndice 1 deben considerarse una primera estima ­
ción. Conviene señalar que el usuario tiene libertad para hacer su propia estimación de la hidrosolubilidad por medio de cualquier ecuación que a 
su criterio represente mejor la relación entre hidrofobicidad y solubili ­
dad. Cuando se trata de compuestos sólidos, por ejemplo, se recomienda tener en cuenta el punto de fusión en la predicción de la solubilidad. En caso de aplicar una ecuación modificada, habrá que cerciorarse de que 
sigue siendo válida la ecuación para el cálculo de la solubilidad en 
octanol. En el apéndice 2 se ha representado esquemáticamente una cubeta de agitación con camisa de vidrio de aprox. un litro de capacidad. Las proporciones del recipiente representado en el apéndice 2 han de ­
mostrado ser adecuadas, por lo que deben mantenerse aunque se utilicen 
recipientes de distinto tamaño; 
— es fundamental disponer de algún medio para mantener constante la 
temperatura durante el ensayo de agitación lenta. 
18. Los recipientes serán de material inerte para que la adsorción a sus paredes 
resulte despreciable.
 
Preparación de las soluciones del ensayo  
19. La determinación del P  OW se efectuará con el 1-octanol de la máxima 
pureza comercialmente disponible (como mínimo + 99 %). Se recomienda purificar el 1-octanol por extracción con ácido, álcali y agua y posterior desecación. Se puede emplear además la destilación para purificar el 1- 
octanol. El 1-octanol purificado servirá para preparar soluciones patrón de 
las sustancias problema. En la determinación del P
 OW se empleará agua 
destilada procedente de un aparato de cristal o de cuarzo o agua procedente de un sistema de purificación; también se podrá utilizar agua de calidad 
analítica para CLAR. El agua destilada se habrá filtrado por un filtro de 
0,22 μm, y se emplearán blancos para descartar la presencia de impurezas 
en los extractos concentrados que pudieran interferir con la sustancia pro ­
blema. Si se emplea un filtro de fibra de vidrio, se limpiará calentándolo en 
horno a 400 °C durante tres horas como mínimo. 
20. Los dos disolventes se habrán saturado recíprocamente antes del ensayo, 
dejándolos equilibrar en un recipiente con suficiente capacidad. Esto se 
consigue mediante agitación lenta del sistema bifásico durante dos días. 
21. Se tomará una cantidad adecuada de la sustancia problema y se disolverá 1- 
octanol (saturado con agua). El coeficiente de reparto 1-octanol/agua se ha 
de determinar en soluciones diluidas en estos dos elementos. Por lo tanto, la 
concentración de la sustancia problema no debe exceder del 70 % de su solubilidad ni rebasar un máximo de 0,1 M en cualquiera de las fases (1). Las soluciones de 1-octanol empleadas en el ensayo estarán exentas de 
partículas sólidas de la sustancia problema en suspensión. 
22. Se tomará una cantidad adecuada de la sustancia problema y se disolverá en 
1-octanol (saturado con agua). Si el log P
 OW estimado es superior a 5, habrá 
que cerciorarse de que las soluciones de 1-octanol empleadas en el ensayo 
están exentas de sustancia problema sólida en suspensión. A tal fin, cuando se analicen compuestos químicos con un log P
 OW estimado > 5 se seguirá el 
procedimiento siguiente: 
— disolver la sustancia problema en 1-octanol (saturado con agua),  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— dejar la solución en reposo el tiempo suficiente para que sedimente el 
material sólido en suspensión; durante la fase de sedimentación, com ­
probar la concentración de la sustancia problema, 
— cuando las concentraciones medidas en la solución de 1-octanol hayan 
alcanzado valores estables, diluir la solución madre con un volumen adecuado de 1-octanol, 
— determinar la concentración de la solución madre diluida. Si la concen ­
tración medida es coherente con la dilución, la solución madre diluida se podrá emplear en el ensayo de agitación lenta.
 
Extracción y análisis de las muestras  
23. Para el análisis de la sustancia problema se empleará un método analítico 
validado. Los investigadores deberán aportar pruebas de que las concentra ­
ciones alcanzadas durante el ensayo, tanto en la fase de 1-octanol saturado 
con agua como en la de agua saturada con 1-octanol, están por encima del 
límite de cuantificación de los métodos analíticos empleados. Cuando sea necesario aplicar métodos de extracción, habrá que establecer con anterio ­
ridad al ensayo las recuperaciones analíticas de la sustancia problema a 
partir de la fase acuosa y de la fase de 1-octanol. La señal analítica deberá 
ser corregida con blancos y se extremarán las precauciones para evitar la transferencia del analito de una muestra a otra. 
24. Es probable que antes del análisis haya que proceder a la extracción de la 
fase acuosa con un disolvente orgánico y a la preconcentración del extracto, por cuanto se dan concentraciones excesivamente bajas de las sustancias 
problema hidrófobas en la fase acuosa. Por la misma razón habrá que 
reducir las concentraciones que puedan resultar en el blanco. Para este fin es necesario usar disolventes de alta pureza, preferiblemente específicos para análisis de residuos. Por lo demás, el uso de material de vidrio escrupulo ­
samente limpio(por ejemplo, mediante lavado con solvente o calentamiento 
en horno a alta temperatura) ayudará a evitar la contaminación cruzada. 
25. Se puede obtener una estimación del log P
 OW con ayuda de un programa 
informático o mediante la valoración de un experto. Si su valor es mayor de seis, habrá que supervisar estrechamente las correcciones con el blanco y las 
transferencias de analito. Además, si la estimación de log P
 OW es superior a 
seis, es obligado el uso de un patrón análogo para corregir los valores de recuperación, a fin de obtener factores de preconcentración elevados. Exis ­
ten varios programas informáticos comerciales (
 1 ) para la estimación de log 
P OW , como Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) y ACD log P (19). 
En la bibliografía (20-22) se ofrecen descripciones de los métodos de esti ­
mación. 
26. Los límites de cuantificación (LOQ) para la determinación de la sustancia 
problema en 1-octanol y agua se establecen sobre la base de métodos aceptados. Como regla general, el límite de cuantificación del método se 
puede determinar como la concentración en agua o 1-octanol que produce 
una relación señal/ruido igual a diez. Se elegirá un método adecuado de extracción y preconcentración, además de especificar las recuperaciones analíticas. Se elegirá un factor de preconcentración adecuado a fin de obte ­
ner una señal de la intensidad necesaria para la determinación analítica.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Esta información se facilita exclusivamente para mayor comodidad del usuario. Se pue ­
den utilizar otros programas informáticos siempre que se demuestre que dan lugar a los 
mismos resultados.
 27. Sobre la base de los parámetros del método analítico y de las concentracio ­
nes esperadas, se determina el tamaño de muestra aproximado que hace falta 
para determinar con exactitud la concentración de la sustancia. Se evitará emplear muestras de agua demasiado reducidas como para obtener una señal analítica suficiente. Por otro lado, se evitará también el uso de muestras de 
agua excesivamente voluminosas, pues de otro modo podría quedar una 
cantidad insuficiente para el número mínimo de análisis que se necesitan (n = 5). En el apéndice 1 se indica el volumen mínimo de muestra en función de la capacidad del recipiente, del LOD de la sustancia problema 
y de su solubilidad. 
28. La cuantificación de las sustancias problema se realiza por comparación con 
las curvas de calibración del compuesto correspondiente. Las concentracio ­
nes halladas en las muestras analizadas deberán estar comprendidas entre las 
concentraciones de los patrones. 
29. En caso de sustancias problema con un log P
 OW estimado superior a seis, se 
añadirá un patrón análogo a la muestra de agua antes de la extracción con el 
fin de registrar las pérdidas ocurridas durante la extracción y la preconcen ­
tración de las muestras de agua. Para poder corregir exactamente los valores de recuperación, los análogos deberán tener propiedades muy similares o 
idénticas a las de la sustancia problema. Con este propósito se usan preferi ­
blemente análogos isotópicamente marcados (estables) de las sustancias de interés (por ejemplo, perdeuterados o marcados con
 13 C). Cuando no sea 
posible el uso de isótopos marcados estables, como  13 C o  2 H, habrá que 
demostrar con datos fidedignos de la bibliografía que las propiedades fisi ­
coquímicas del análogo son muy semejantes a las de la sustancia problema. Durante la extracción líquido-líquido de la fase acuosa se pueden formar emulsiones. Es posible reducirlas añadiendo una sal y dejando que la emul ­
sión repose hasta el día siguiente. Es preciso documentar los métodos em ­
pleados para la extracción y preconcentración de las muestras. 
30. Las muestras extraídas de la fase de 1-octanol se pueden, en caso necesario, 
diluir con un disolvente apropiado antes de su análisis. Por lo demás, se recomienda usar patrones análogos para corregir los valores de recuperación de aquellas sustancias que, en los ensayos de recuperación, han mostrado un 
alto grado de variabilidad (desviación típica relativa > 10 %). 
31. El método analítico se documentará detalladamente. La documentación se 
refiere a: método de extracción, factores de preconcentración y de dilución, 
parámetros instrumentales, procedimiento habitual de calibración, intervalo 
de calibración, recuperación analítica de la sustancia problema a partir del agua, adición de patrones análogos para corregir los valores de recuperación, valores del blanco, límites de detección y límites de cuantificación.
 
Realización del ensayo  
Relación óptima de volúmenes 1-octanol/agua  
32. Para decidir qué volúmenes de agua y 1-octanol se van a emplear, hay que 
tener en cuenta el LOQ en 1-octanol y en agua, los factores de preconcen ­
tración aplicados a las muestras acuosas, el volumen de muestreo en 1- octanol y en agua, y las concentraciones esperadas. Por razones experimen ­
tales, en el sistema de agitación lenta el volumen de 1-octanol ha de elegirse 
de manera que la capa de este solvente sea lo bastante espesa (> 0,5 cm) 
para permitir la toma de muestras de la fase de 1-octanol sin alterarla. 
33. En el análisis de compuestos con log P
 OW de 4,5 o superior, la proporción 
típica entre fases es de 20 a 50 ml de 1-octanol por 950 a 980 ml de agua en 
un recipiente de un litro.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Condiciones del ensayo  
34. Durante el ensayo, el recipiente de reacción se mantiene termostatizado para 
reducir la variación de temperatura a menos de 1 °C. El ensayo se efectuará a 25 °C. 
35. El sistema experimental deberá protegerse de la luz diurna, ya sea proce ­
diendo en una sala oscura, ya cubriendo el recipiente de reacción con lámina 
de aluminio. 
36. El ensayo se realizará (en la medida de lo posible) en un ambiente limpio de 
polvo. 
37. El sistema de 1-octanol/agua se agita hasta alcanzar el equilibrio. En un 
ensayo piloto, se establece la duración del período de equilibrado realizando una operación de agitación lenta y tomando periódicamente muestras de 
agua y 1-octanol. Los tiempos de muestreo estarán separados por un lapso 
de cinco horas como mínimo. 
38. Cada determinación de P
 OW se basará al menos en tres ensayos de agitación 
lenta independientes.  
Determinación del tiempo de equilibrado  
39. Se supone que se alcanza el equilibrio cuando la curva de regresión del 
cociente de concentraciones 1-octanol/agua en función del tiempo, represen ­
tada a lo largo de cuatro momentos de muestreo, arroja una pendiente que no es significativamente diferente de cero a un nivel de p de 0,05. El tiempo 
de equilibrado será como mínimo un día antes de comenzar el muestreo. 
Como norma general, el muestreo de sustancias con un log P
 OW estimado 
inferior a cinco puede efectuarse durante los días dos y tres. Los compuestos más hidrófobos pueden necesitar un equilibrado más prolongado. En el caso 
de una sustancia con log P
 OW de 8,23 (decaclorobifenilo), fueron suficientes 
144 horas para llegar al equilibrio. Este se establece mediante muestreo repetido a partir de un único recipiente.
 
Inicio del ensayo  
40. Al iniciar el ensayo, se llena el recipiente de reacción con agua saturada de 
1-octanol. Se deja tiempo suficiente hasta alcanzar la temperatura termosta ­
tizada. 
41. Se toma la cantidad deseada de sustancia problema (disuelta en el volumen 
necesario de 1-octanol saturado con agua) y se añade cuidadosamente al 
recipiente de reacción. Este es un paso crucial del ensayo, en el que hay que 
evitar la mezcla turbulenta de las dos fases. A tal fin, se puede pipetear lentamente la fase de 1-octanol contra la pared del vaso experimental, cerca de la superficie del agua. Acto seguido fluirá por la pared de vidrio para 
formar una película sobre la fase acuosa. Se evitará en todo caso la decan ­
tación del 1-octanol directamente en el matraz; se procurará que no caigan gotas de 1-octanol directamente en el agua. 
42. Después de comenzar la agitación, se aumenta suavemente su velocidad. Si 
no se pudieran ajustar debidamente los motores de agitación habría que considerar el uso de un transformador. La velocidad de agitación se ajusta 
de modo que se cree un vórtice en la interfase entre el agua y el 1-octanol 
con una profundidad de 0,5 cm a 2,5 cm como máximo. Si se sobrepasa esta profundidad de 2,5 cm, habrá que reducir la velocidad de agitación; de lo contrario pueden formarse microgotas a partir de las gotitas de 1-octanol 
en la fase acuosa, lo que llevaría a sobrevalorar la concentración de la 
sustancia problema en el agua. Esta velocidad de agitación máxima que corresponde a 2,5 cm de profundidad se recomienda teniendo en cuenta los resultados del estudio de validación interlaboratorios (5). Se trata de 
una solución intermedia entre conseguir un equilibrado rápido y limitar la 
formación de microgotas de 1-octanol.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Muestreo y tratamiento de las muestras  
43. Antes de proceder al muestreo, se apaga el agitador y se espera a que los 
líquidos estén en reposo. Al finalizar el muestro se vuelve a poner en marcha el agitador a velocidad lenta, como se describe anteriormente, y 
después se aumenta poco a poco la velocidad. 
44. Las muestras de la fase acuosa se toman de un grifo ubicado en el fondo del 
recipiente de reacción. Hay que desechar siempre el volumen muerto de agua contenido en los grifos (alrededor de 5 ml en el recipiente descrito en el apéndice 2). El agua contenida en los grifos no sufre agitación y, por lo 
tanto, no está en equilibrio con el resto de líquido. Se anota el volumen de 
las muestras de agua, verificando que la cantidad de sustancia problema presente en el agua desechada se ha tenido en cuenta al determinar el balance de masa. Las pérdidas por evaporación se reducen al mínimo de ­
jando que el agua fluya suavemente por el embudo de decantación, evitando 
perturbaciones de la capa de agua/1-octanol. 
45. Las muestras de 1-octanol se obtienen tomando una pequeña alícuota 
(aprox. 100 μl) de la capa de 1-octanol con una jeringa de 100 microlitros 
compuesta enteramente de vidrio y metal. Se procurará no perturbar la superficie de interfase. Se anota el volumen del líquido muestreado. Basta 
una pequeña alícuota, puesto que la muestra de 1-octanol se va a diluir. 
46. Es conveniente evitar transferencias innecesarias de la muestra. Por esta 
razón el volumen de muestra debe determinarse gravimétricamente. En el 
caso de las muestras acuosas, esto se consigue recogiéndolas en un embudo de decantación que contenga ya el volumen necesario de disolvente.
 
DATOS E INFORME 
47. En el presente método de ensayo, el P  OW se determina a partir de tres 
ensayos de agitación lenta (tres unidades experimentales) realizados con el compuesto en investigación en idénticas condiciones. La curva de regresión 
que sirve para demostrar que se ha alcanzado el equilibrio deberá basarse en 
los resultados de al menos cuatro determinaciones de C
 o /C w correspondien ­
tes a momentos de muestreo consecutivos. Ello permite calcular la varianza como medida de la incertidumbre del valor medio obtenido por cada unidad 
experimental. 
48. El P
 OW queda definido por la varianza de los datos obtenidos por cada 
unidad experimental. Esta información sirve para calcular el P  OW como 
media ponderada de los resultados de las unidades experimentales indivi ­
duales. Así, la inversa de la varianza de los resultados obtenidos por las unidades experimentales sirve como factor de ponderación. De este modo 
los datos con una gran variación (expresada como varianza) y, por ende, con 
menor fiabilidad, influyen menos en el resultado que los datos con escasa varianza. 
49. De manera análoga se calcula la desviación típica ponderada. Refleja la 
repetibilidad de las mediciones de P
 OW . Una desviación típica ponderada 
reducida indica que la determinación del P  OW tiene alta repetibilidad dentro 
del laboratorio. A continuación se expone el tratamiento estadístico formal 
de los datos.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Tratamiento de los resultados  
Demostración de que se ha alcanzado el equilibrio  
50. Por cada momento de muestreo se calcula el logaritmo del cociente de 
concentraciones de la sustancia problema en 1-octanol y en agua [log (C  O / 
C w )]. Se demuestra que se ha alcanzado el equilibrio químico llevando a una 
gráfica dicho cociente en función del tiempo. Una meseta en esta gráfica a 
lo largo de al menos cuatro momentos de medición consecutivos indica que 
se ha alcanzado el equilibrio, y que el compuesto se ha disuelto realmente en el 1-octanol. De no ser así, habrá que proseguir el ensayo hasta que cuatro puntos de medición consecutivos arrojen una pendiente que no difiera 
significativamente de cero a un nivel p de 0,05, lo que indica que log C
 o /C w 
es independiente del tiempo.  
Cálculo de log P  OW 
51. El valor de log P  OW de la unidad experimental se calcula como la media 
ponderada de log C  o /C w correspondiente a la zona de la curva de log C  o /C w 
en función del tiempo en la que se ha demostrado el estado de equilibrio. La 
media ponderada se calcula ponderando los datos con la inversa de la varianza, de modo que la influencia de los datos en el resultado final sea 
inversamente proporcional a su incertidumbre.
 
Media de log P  OW 
52. Se calcula el valor de log P  OW como la media de los resultados de las 
unidades experimentales individuales ponderados con sus respectivas varian ­
zas. 
El cálculo es el siguiente: 
log P  OW;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
donde: 
log P  OW,i = valor de log P  OW de la unidad experimental individual i; 
log P  OW,Av  = media ponderada de las determinaciones de log P  OW indivi­
duales; 
w i = peso estadístico atribuido al valor de log P  OW de la unidad 
experimental i. 
Como w  i se toma la inversa de la varianza de log P  OW,i 
(w i ¼ varðlog P  OW;i Þ –1 ). 
53. Se estima el error de la media de log P  OW como la repetibilidad de log 
C o /C w determinado durante la fase de equilibrio en las unidades experimen ­
tales individuales. Este se expresa como la desviación típica ponderada de 
log P  OW,Av  (σ log Pow,Av  ), que a su vez da una medida del error asociado a 
log P  OW,Av  . La desviación típica ponderada se puede calcular a partir de la 
varianza ponderada (var  log Pow,Av  ) del modo siguiente: 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW;i Ä log P  OW;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Donde n representa el número de unidades experimentales.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Informe del ensayo  
54. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— nombre común, nombre químico, número CAS, fórmula estructural (in ­
dicando la posición del marcador si se usa material marcado radiactiva ­
mente) y propiedades fisicoquímicas de interés (véase el punto 17), 
— pureza (impurezas) de la sustancia problema, 
— pureza radioquímica de las sustancias marcadas y actividad molar (si 
procede), 
— estimación preliminar de log POW, además del método aplicado para 
obtener su valor.  
Condiciones del ensayo:  
— fechas de realización de los estudios, 
— temperatura durante el ensayo, 
— volúmenes de 1-octanol y agua al inicio del ensayo, — volúmenes de las muestras tomadas de 1-octanol y agua, 
— volúmenes de 1-octanol y agua que quedan en los recipientes de ensayo, 
— descripción de los recipientes de ensayo y las condiciones de agitación 
(dimensiones de la barra agitadora y del recipiente de ensayo, altura del vórtice en mm y, cuando se conozca, velocidad de agitación) empleadas, 
— procedimientos analíticos aplicados para determinar la sustancia pro ­
blema y el límite de cuantificación del método, 
— tiempos de muestreo, — pH de la fase acuosa y soluciones amortiguadoras empleadas cuando se 
ajusta el pH (en caso de moléculas ionizables), 
— número de réplicas.  
Resultados:  
— repetibilidad y sensibilidad de los métodos analíticos utilizados, 
— concentraciones medidas de la sustancia problema en 1-octanol y en 
agua en función del tiempo, 
— demostración del balance de masa, 
— temperatura y desviación típica o intervalo de temperaturas durante el 
ensayo, 
— recta de regresión del cociente de concentraciones en función del tiempo, 
— valor medio de log P
 ow,Av  y su error típico, 
— discusión e interpretación de los resultados,  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— ejemplos de datos en bruto de los análisis representativos (todos los 
datos en bruto tienen que almacenarse de conformidad con las normas 
de BPL), entre ellos los índices de recuperación de los análogos y el número de concentraciones tomadas para la calibración (además de los criterios para definir el coeficiente de correlación de la curva de cali ­
bración), y resultados de garantía de calidad/control de calidad (QA/QC), 
— cuando estén disponibles: informe de validación del método de ensayo 
(con indicación de su referencia bibliográfica).
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the «slow-stirring» method. Envi ­
ron. Toxicol. Chem. 8: 499-512. 
(2) Capítulo A.8 del presente anexo. Coeficiente de reparto. (3) Capítulo A.8 del presente anexo. Coeficiente de reparto. (4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable 
Substances. Paris. 
(5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (POW) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01. 
(6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA. 
(7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. 
(8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. 
Technol. 31: 2596-2602. 
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dis ­
sociation Constants in Water. Paris. 
(10) Capítulo A.6 del presente anexo. Hidrosolubilidad. (11) Capítulo C.7 del presente anexo. Degradación — Degradación abiótica: 
hidrólisis en función del pH. 
(12) Capítulo C.4-Partes II – VII (métodos A a F) del presente anexo. Deter ­
minación de la biodegradabilidad "fácil". 
(13) Capítulo A.4 del presente anexo. Presión de vapor. (14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623- 626. 
(15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, 
Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52. 
(16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Che ­
mical Information Systems, Irvine, CA. 
(17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. (18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest. (19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, 
Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, 
American Chemical Society, Washington, D.C. 
(21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488. 
(22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Che ­
mie: 386-390.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Apéndice 1  
Hoja para el cálculo de los volúmenes mínimos de agua necesarios para la 
detección de sustancias problema con diferentes valores de log P  OW en fase 
acuosa  
Hipótesis: 
— Volumen máximo de las alícuotas individuales = 10 % del volumen total; 5 
alícuotas = 50 % del volumen total. 
— Concentraciúndelassustanciasproblema  ¼ 0; 7 Ü solubilidadencadafase. Si 
las concentraciones son más bajas, se necesitarán volúmenes mayores. 
— Volumen empleado para la determinación del LOD = 100 ml. — Las correspondencias entre log P
 ow y log S  w y entre log P  ow y SR (S  oct /S w ) 
expresan aceptablemente las relaciones que se dan en las sustancias problema.  
Estimación de S  w 
log P  ow Ecuación log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –3,192 6,427E-04  
Estimación de S  oct 
log P  ow Ecuación S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Masa total de 
sustancia problema 
(mg) Masa  oct /Masa  agua Masa  H2O 
(mg) Conc  H2O 
(mg/l) Masa  oct 
(mg) Conc  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Cálculo de los volúmenes  
Volumen mínimo de fase acuosa necesario por cada concentración límite de detección  
log K  ow LOD (microgramos/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volumen em ­
pleado para 
determinar el 
LOD (litros) 0,1 
Leyendas de los cálculos:  
Representa < 10 % del volumen total de la fase acuosa; recipiente de equilibrado 
de 1 litro. 
Representa < 10 % del volumen total de la fase acuosa; recipiente de equilibrado 
de 2 litros. 
Representa < 10 % del volumen total de la fase acuosa; recipiente de equilibrado 
de 5 litros. 
Representa < 10 % del volumen total de la fase acuosa; recipiente de equilibrado 
de 10 litros. 
Sobrepasa incluso el 10 % del recipiente de equilibrado de 10 litros.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Representación de los volúmenes necesarios en función de la hidrosolubilidad y del log P  ow 
Volumen mínimo de fase acuosa necesario por cada concentración límite de detección (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (microgramos/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (microgramos/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volumen empleado para 
determinar el LOD (litros) 0,1 
Apéndice 2  
Ejemplo de recipiente con camisa de vidrio empleado en el ensayo de 
agitación lenta para la determinación del P  ow
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
ANEXO  
PARTE B: MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA 
TOXICIDAD Y OTROS EFECTOS SOBRE LA SALUD  
ÍNDICE 
INTRODUCCIÓN GENERAL DE LA PARTE B 
B.1 bis. TOXICIDAD ORAL AGUDA. MÉTODO DE DOSIS FIJAS B.1 ter. TOXICIDAD ORAL AGUDA. MÉTODO DE LAS CLASES DE 
TOXICIDAD AGUDA 
B.2. TOXICIDAD AGUDA POR INHALACIÓN 
B.3. TOXICIDAD AGUDA POR VÍA CUTÁNEA 
B.4. TOXICIDAD AGUDA: IRRITACIÓN/CORROSIÓN CUTÁNEA B.5. TOXICIDAD AGUDA: IRRITACIÓN/CORROSIÓN OCULAR B.6. SENSIBILIZACIÓN DE LA PIEL B.7. TOXICIDAD ORAL POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA 
(28 DÍAS) EN ROEDORES 
B.8. TOXICIDAD SUBAGUDA POR INHALACIÓN: ESTUDIO DE 
28 DÍAS 
B.9. TOXICIDAD POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (28 
DÍAS) VÍA CUTÁNEA 
B.10. MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE ABERRACIONES CRO ­
MOSÓMICAS  IN VITRO  EN MAMÍFEROS. 
B.11. MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE ABERRACIONES CRO ­
MOSÓMICAS  IN VIVO  EN MÉDULA ÓSEA DE MAMÍFEROS 
B.12. MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE MICRONÚCLEOS EN 
ERITROCITOS DE MAMÍFERO  IN VIVO  
B.13/14. MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE MUTACIÓN INVERSA 
EN BACTERIAS 
B.15. ENSAYOS DE MUTAGÉNESIS Y DETECCIÓN DE CARCI ­
NOGÉNESIS -MUTACIÓN GÉNICA —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
B.16. RECOMBINACIÓN MITÓTICA — SACCHAROMYCES CE ­
REVISIAE 
B.17. MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE MUTACIÓN GÉNICA 
DE CÉLULAS DE MAMÍFERO  IN VITRO  
B.18. LESIÓN Y REPARACIÓN DE DNA — SÍNTESIS DE DNA NO 
PROGRAMADA — CÉLULAS DE MAMÍFEROS  IN VITRO  
B.19. ENSAYO  IN VITRO  DE INTERCAMBIO DE CROMÁTIDAS 
HERMANAS 
B.20. ENSAYO DE LETALIDAD RECESIVA LIGADA AL SEXO EN  
DROSOPHILA MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. ENSAYO DE TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DE MAMÍ ­
FERO  IN VITRO  
B.22. ENSAYO DE LETALIDAD DOMINANTE EN ROEDORES 
B.23. ENSAYO DE ABERRACIONES CROMOSÓMICAS EN ES ­
PERMATOGONIAS DE MAMÍFERO 
B.24. ENSAYO DE LA MANCHA EN EL RATÓN 
B.25. TRANSLOCACIÓN HEREDITARIA EN EL RATÓN 
B.26. ENSAYO DE TOXICIDAD ORAL SUBCRÓNICA — TOXICI ­
DAD ORAL POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (90 DÍAS) EN ROEDORES 
B.27. ENSAYO DE TOXICIDAD ORAL SUBCRÓNICA — TOXICI ­
DAD ORAL POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (90 DÍAS) EN NO ROEDORES 
B.28. TOXICIDAD DÉRMICA SUBCRÓNICA — ENSAYO DE 90 
DÍAS EN ROEDORES 
B.29. TOXICIDAD SUBCRÓNICA POR INHALACIÓN: ESTUDIO 
DE 90 DÍAS 
B.30. ENSAYO DE TOXICIDAD CRÓNICA 
B.31. ESTUDIO DE TOXICIDAD PARA EL DESARROLLO PRENA ­
TAL 
B.32. ENSAYO DE CARCINOGÉNESIS 
B.33. ENSAYO COMBINADO DE TOXICIDAD CRÓNICA Y CAR ­
CINOGÉNESIS 
B.34. ENSAYO DE REPRODUCCIÓN EN UNA GENERACIÓN 
B.35. ESTUDIO DE TOXICIDAD PARA LA REPRODUCCIÓN EN 
DOS GENERACIONES 
B.36. TOXICOCINÉTICA 
B.37. NEUROTOXICIDAD RETARDADA DE SUSTANCIAS ORGA ­
NOFOSFORADAS POR ADMINISTRACIÓN ÚNICA 
B.38. NEUROTOXICIDAD RETARDADA DE SUSTANCIAS ORGA ­
NOFOSFORADAS. ESTUDIO POR ADMINISTRACIÓN CON ­
TINUADA DE 28 DÍAS 
B.39. ENSAYO DE SÍNTESIS DE ADN NO PROGRAMADA (UDS) 
EN HEPATOCITOS DE MAMÍFERO  IN VIVO  
B.40. CORROSIÓN CUTÁNEA  IN VITRO:  ENSAYO DE RESISTEN ­
CIA ELÉCTRICA TRANSCUTÁNEA (RET) 
B.40 BIS. CORROSIÓN CUTÁNEA  IN VITRO:  ENSAYO CON MODELO 
DE PIEL HUMANA
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41. ENSAYO DE FOTOTOXICIDAD  IN VITRO  3T3 ARN (AB ­
SORCIÓN DE ROJO NEUTRO) 
B.42. SENSIBILIZACIÓN CUTÁNEA: ENSAYO CON GANGLIOS 
LINFÁTICOS LOCALES 
B.43. ESTUDIO DE NEUROTOXICIDAD EN ROEDORES 
B.44. ABSORCIÓN CUTÁNEA: MÉTODO  IN VIVO  
B.45. ABSORCIÓN CUTÁNEA: MÉTODO  IN VITRO  
B.46. IRRITACIÓN CUTÁNEA  IN VITRO:  MÉTODO DE ENSAYO 
CON EPIDERMIS HUMANA RECONSTRUIDA 
B.47. MÉTODO DE ENSAYO DE LA OPACIDAD Y PERMEABILI ­
DAD DE LA CÓRNEA DE BOVINO PARA DETECTAR 
AGENTES CORROSIVOS E IRRITANTES INTENSOS PARA LOS OJOS 
B.48. MÉTODO DE ENSAYO DE OJO DE POLLO AISLADO PARA 
DETECTAR AGENTES CORROSIVOS E IRRITANTES IN ­
TENSOS PARA LOS OJOS 
B.49. ENSAYO DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULAS DE MAMÍ ­
FERO  IN VITRO  
B.50. SENSIBILIZACIÓN CUTÁNEA: ENSAYO CON GANGLIOS 
LINFÁTICOS LOCALES: DA 
B.51. SENSIBILIZACIÓN CUTÁNEA: ENSAYO CON GANGLIOS 
LINFÁTICOS LOCALES: BrdU-ELISA
 
▼M4 
B.52. TOXICIDAD AGUDA POR INHALACIÓN. MÉTODO DE LAS 
CLASES DE TOXICIDAD AGUDA  
▼M5 
B.53. ESTUDIO DE NEUROTOXICIDAD PARA EL DESARROLLO 
B.54. BIOENSAYO UTEROTRÓFICO CON ROEDORES: ENSAYO 
DE CRIBADO A CORTO PLAZO DE LAS PROPIEDADES ESTROGÉNICAS 
B.55. BIOENSAYO DE HERSHBERGER CON RATAS: ENSAYO 
DE CRIBADO A CORTO PLAZO DE LAS 
PROPIEDADES (ANTI)ANDROGÉNICAS 
B.56. ESTUDIO AMPLIADO DE TOXICIDAD PARA LA REPRO ­
DUCCIÓN EN UNA GENERACIÓN 
B.57. ENSAYO DE ESTEROIDOGÉNESIS EN CÉLULAS H295R 
B.58. ENSAYOS DE MUTACIÓN GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTI ­
CAS Y REPRODUCTORAS DE ROEDORES TRANSGÉNICOS
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
INTRODUCCIÓN GENERAL DE LA PARTE B  
A. CARACTERIZACIÓN DE LA SUSTANCIA DE ENSAYO  
Antes de iniciar cualquier estudio de toxicidad debe conocerse la 
composición de la sustancia de ensayo, con inclusión de las impu ­
rezas principales, y sus propiedades fisicoquímicas pertinentes, in ­
cluida la estabilidad. 
Las propiedades fisicoquímicas de la sustancia de ensayo proporcio ­
nan datos importantes para la selección de la vía de administración, el diseño de cada estudio particular y el manejo y almacenamiento de la sustancia. 
Antes de iniciarse el estudio debe, desarrollarse un método analítico 
para la determinación cualitativa y cuantitativa de la sustancia de 
ensayo (con inclusión de sus principales impurezas, siempre que sea 
posible) en el medio de administración y en el material biológico. 
Debe incluirse en el informe del ensayo toda la información a la 
identificación, propiedades fisicoquímicas, pureza y comportamiento 
de la sustancia estudiada,
 
B. CUIDADOS DE LOS ANIMALES  
En los estudios de toxicidad es fundamental controlar de forma 
estricta las condiciones ambientales y aplicar técnicas adecuadas de 
cuidado de los animales.  
i) Condiciones de alojamiento  
Las condiciones ambientales de los ¡ocales o recintos destinados a 
los animales de experimentación deben ser adecuadas para la especie que se utilice. Para ratas, ratones y cobayas, la temperatura del local debe ser de 22 ± 3
 o C, con una humedad relativa del 30 al 70 %; 
para los conejos, la temperatura debe ser de 20 ± 3  o C, con una 
humedad relativa del 30 al 70 %. 
Algunas técnicas experimentales son particularmente sensibles a ¡os 
efectos de la temperatura; en tales casos, en la descripción del mé ­
todo de ensayo se incluyen indicaciones detalladas sobre las condi ­
ciones apropiadas. En todas las investigaciones sobre efectos tóxicos deben medirse y registrarse la temperatura y la humedad, y estos 
parámetros deben consignarse en el informe final del estudio. 
La iluminación debe ser artificial, con una alternancia de 12 horas de 
luz y 12 horas de oscuridad, Los datos relativos al programa de 
alumbrado deberán registrarse y consignarse en el informe final del estudio. 
Salvo que el método contenga alguna indicación en contra, los ani ­
males se alojarán individualmente, o estarán en jaulas de pequeños grupos del mismo sexo, En caso de que se utilicen jaulas colectivas, 
no habrá más de 5 animales en cada jaula. 
En los informes sobre los experimentos con animales, es importante 
indicar el tipo de jaula utilizada, así como el número de animales 
alojados en cada una, tanto durante la exposición a la sustancia 
química como durante el período posterior de observación.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Condiciones de alimentación  
La dieta debe cubrir todas ¡as necesidades nutricionales de la especie 
sometida a experimentación. Cuando se incorporen sustancias de ensayo a la dieta de los animales, el valor nutricional puede verse 
reducido por interacciones entre la sustancias y algún componente de 
la dieta. A la hora de interpretar los resultados de los ensayos debe estudiarse la posibilidad de que se dé una interacción de este tipo. Pueden utilizarse dietas convencionales de laboratorio junto con un 
aporte ilimitado de agua potable. La elección de la dieta puede verse 
influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente de la sustancia estudiada si se administra por este método. 
Ningún contaminante de la dieta con influencia conocida sobre la 
toxicidad podrá estar presente en concentraciones que puedan inter ­
ferir.
 
C. ENSAYOS ALTERNATIVOS  
Constituye un objetivo científico de la Unión Europea la elaboración 
y validación de técnicas alternativas que puedan proporcionar el mismo nivel de información que los actuales ensayos con animales, 
pero utilizando menos animales, provocando menos sufrimiento o 
evitando completamente el uso de animales. 
Tales métodos, según vayan existiendo, deben tenerse en cuenta 
siempre que sea posible para la caracterización de riesgos y la co ­
rrespondiente clasificación y etiquetado en función de los riesgos 
intrínsecos.
 
D. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN  
A la hora de evaluar e interpretar los ensayos, deben tenerse en 
cuenta las limitaciones de la extrapolación directa al hombre de los resultados de los estudios realizados  in vitro  o con animales y, 
en consecuencia, deben utilizarse pruebas de la aparición de efectos 
adversos en personas, siempre que sea posible, a fin de confirmar los 
resultados de los ensayos.
 
E. REFERENCIAS  
La mayoría de estos métodos se han elaborado en el marco del 
programa de la OCDE de líneas directrices de ensayo, y deben realizarse de conformidad con los principios de buenas prácticas 
de laboratorio, a fin de garantizar la «aceptación mutua de datos» 
lo más amplia posible. 
Puede encontrarse información adicional en las referencias que se 
dan en las directrices de la OCDE y en otras publicaciones relacio ­
nadas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1 BIS.  TOXICIDAD ORAL AGUDA. MÉTODO DE DOSIS FIJAS  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 420 (2001).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Los métodos tradicionales para evaluar la toxicidad aguda utilizan la 
muerte de los animales como parámetro. En 1984 la British Toxico ­
logy Society propuso un nuevo enfoque de los ensayos de toxicidad 
aguda basado en la administración de una serie de dosis fijas (1) Este enfoque evitaba recurrir a la muerte de los animales como parámetro y se basaba, en cambio, en la observación de signos claros de 
toxicidad a un nivel determinado de una serie de dosis fijas. Tras 
una serie de estudios de validación  in vivo  británicos (2) e interna ­
cionales (3), este procedimiento fue adoptado como método de en ­
sayo en 1992. Posteriormente, se han evaluado las propiedades es ­
tadísticas del método de dosis fijas utilizando modelos matemáticos 
en una serie de estudios (4) (5) (6). Conjuntamente, los estudios  in 
vivo y  los basados en modelos han demostrado que el procedimiento 
es reproducible, requiere menos animales y causa menos sufrimiento 
que los métodos tradicionales. Al mismo tiempo, permite clasificar 
las sustancias de manera parecida a los otros métodos de ensayo de toxicidad aguda. 
En el  Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing  (7) se dan 
directrices sobre la selección del método de ensayo más adecuado en función del objetivo. Además, en este documento orientativo se fa ­
cilita información complementaria sobre la realización e interpreta ­
ción del método de ensayo B.1 bis. 
Es un principio del método que en el estudio principal solo se 
empleen dosis moderadamente tóxicas y que se evite la adminis ­
tración de dosis que se prevean letales. Asimismo, no es necesario administrar dosis de las que se sepa que producen dolor y sufri ­
miento acusados por sus efectos corrosivos o muy irritantes. Los 
animales moribundos o que den muestras claras de dolor o mues ­
tren signos de sufrimiento intenso y continuo serán sacrificados de forma compasiva y en la interpretación de los resultados serán 
considerados de la misma manera que los que hayan muerto du ­
rante el ensayo. En otro documento orientativo (8) se dan criterios para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a sufrimiento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte 
es previsible o inminente. 
El método aporta información sobre las propiedades peligrosas y 
permite clasificar las sustancias de acuerdo con el Sistema Armoni ­
zado Mundial (SAM) [Globally Harmonised System (GHS)] de cla ­
sificación de sustancias químicas que causan toxicidad aguda (9) 
El laboratorio que haga los ensayos debe tener en cuenta toda la 
información disponible sobre la sustancia estudiada antes de llevar a cabo la prueba. Tal información incluirá la identidad y la estructura química de la sustancia, sus propiedades fisicoquímicas, los resulta ­
dos de otros ensayos de toxicidad  in vitro o in vivo,  los datos 
toxicológicos sobre otras sustancias estructuralmente relacionadas, y el uso o usos previstos de la sustancia. Esta información es nece ­
saria para que todos los afectados puedan estar seguros de que el 
ensayo es pertinente para la protección de la salud humana y ayuda a 
la selección de una dosis inicial adecuada.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. DEFINICIONES  
Toxicidad oral aguda:  efectos nocivos que se manifiestan tras la 
administración oral de una dosis única de la sustancia o de dosis múltiples dadas dentro de un período de 24 horas.  
Muerte retardada  significa que el animal no muere ni parece mo ­
ribundo en el plazo de 48 horas sino que muere más tarde durante el 
período de observación de 14 días.  
Dosis:  cantidad de sustancia de ensayo administrada. La dosis se 
expresa en peso de la sustancia de ensayo por unidad de peso del animal sometido al experimento (por ejemplo, mg/kg).  
Toxicidad manifiesta  es un término general que describe signos claros 
de toxicidad tras la administración de una sustancia [véanse ejemplos en (3)]. de tal manera que a la dosis fija inmediatamente superior pueden 
preverse en la mayoría de los animales dolores fuertes y signos conti ­
nuados de sufrimiento grave, agonía [véanse los criterios al respecto en  
Humane Endpoints Guidance Document  (8)] o muerte probable.  
SAM:  Sistema Armonizado Mundial [ Globally Harmonised System  
(GHS)] de clasificación y etiquetado de productos químicos. Activi ­
dad conjunta de la OCDE (salud humana y medio ambiente), el 
Comité de Expertos en Transporte de Mercaderías Peligrosas de 
las Naciones Unidas (propiedades físico-químicas) y la OIT (comu ­
nicación de peligros), coordinada por el Programa Interorganismos para la Gestión Racional de Sustancias Químicas (IOMC, en sus 
siglas inglesas).  
Muerte inminente:  fase en la que se prevé que el animal muera o 
entre en la agonía antes del siguiente momento de observación pre ­
visto. Entre los signos que indican esta situación en los roedores cabe citar: convulsiones, posición lateral, posición yacente y temblo ­
res. [Véase el  Humane Endpoint Guidance Document  (8) para más 
información]. 
DL50  (dosis letal mediana):  dosis única, obtenida por estadística, de 
una sustancia capaz de provocar la muerte del 50 % de los animales a 
los que se haya administrado por vía oral. El valor de la DL
 50 se 
expresa en peso de la sustancia por unidad de peso del animal (mg/kg).  
Dosis límite:  dosis del límite máximo del ensayo (2 000 o 5 000 mg/kg).  
Agonía:  situación en la que el animal se está muriendo o es incapaz 
de sobrevivir aunque reciba tratamiento. [Véase el  Humane Endpoint 
Guidance Document  (8) para más información].  
Muerte previsible:  presencia de signos clínicos que indican la 
muerte en un momento conocido del futuro antes de la terminación prevista del experimento, por ejemplo: incapacidad de alcanzar ali ­
mentos o agua. [Véase el  Humane Endpoint Guidance Document  (8) 
para más información].
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se administran de manera gradual a grupos de animales de un solo 
sexo dosis fijas de 5, 50, 300 y 2 000 mg/kg (excepcionalmente podría considerarse una dosis adicional de 5 000 mg/kg, véase el 
punto 1.6.2). La dosis inicial se determina basándose en un estudio 
preliminar y consiste en la que se prevé que produzca ciertos signos de toxicidad sin causar efectos tóxicos graves ni mortalidad. En un documento orientativo aparte de la OCDE (8) se describen de ma ­
nera detallada las afecciones y los signos clínicos que denotan dolor, 
sufrimiento y muerte inminente. Pueden darse dosis más altas o más bajas a otros grupos de animales según la presencia o ausencia de 
signos de toxicidad o mortalidad. Este procedimiento continúa hasta 
que se determina la dosis que causa toxicidad manifiesta o solo una muerte o cuando no se observan efectos a la dosis más alta o cuando ocurren muertes a la dosis más baja.
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Selección de la especie animal  
La especie de preferencia entre los roedores es la rata, aunque pue ­
den utilizarse otras especies de roedores. Normalmente se emplean 
hembras (7). Se hace así porque la bibliografía sobre los ensayos 
convencionales de DL  50 muestra que normalmente hay poca diferen ­
cia en cuanto a sensibilidad entre los sexos, pero, en los casos en que se observan diferencias, las hembras son generalmente un poco más 
sensibles (10). Sin embargo, si se conocen propiedades toxicológicas 
o toxicocinéticas de sustancias químicas estructuralmente relaciona ­
das que indiquen que es probable que los machos sean más sensi ­
bles, deberá utilizarse este sexo. Cuando el ensayo se haga con 
machos, deberá justificarse adecuadamente. 
Hay que utilizar animales adultos jóvenes y sanos de una cepa de 
laboratorio corriente. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. 
El animal, al inicio de la administración de la sustancia, debe tener entre 8 y 12 semanas de edad y su peso debe estar en un intervalo del ± 20 % del peso medio de los animales a los que previamente se 
haya administrado la sustancia.
 
1.4.2.  Alojamiento y alimentación  
El cuarto de experimentación ha de estar a una temperatura de 22  o C 
(± 3  o C). Aunque la humedad relativa debe ser como mínimo del 
30 % y preferiblemente no superior al 70 %, salvo durante la lim ­
pieza del local, lo ideal es que esté comprendida entre el 50 y el 60 %. Se aplicará una iluminación artificial en una secuencia de 12 
horas de luz y 12 horas de oscuridad. Puede darse una dieta alimen ­
taria corriente para animales de laboratorio y agua potable a volun ­
tad. Los animales pueden alojarse en jaulas agrupados por dosis, pero el número de animales de cada jaula no debe obstaculizar la 
realización de observaciones claras de cada animal.
 
1.4.3  Preparación de los animales  
Se seleccionan al azar los animales, se marcan para permitir su 
identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al 
menos 5 días antes de iniciar la administración de la sustancia, a 
fin de que se aclimaten a las condiciones del laboratorio.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4  Preparación de las dosis  
En general, las sustancias estudiadas deben administrarse en un vo ­
lumen constante para toda la gama de dosis que deban ensayarse, variando la concentración del preparado administrado. Sin embargo, 
cuando deba administrarse una mezcla o producto final líquidos, 
puede resultar más adecuado para la posterior evaluación de riesgos utilizar la sustancia no diluida, es decir, a una concentración cons ­
tante. Algunas autoridades reguladoras establecen este criterio con 
carácter obligatorio. En cualquiera de los dos casos, no debe supe ­
rarse el volumen de dosis máximo. El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del 
animal. En los roedores, el volumen no debe sobrepasar 1 ml/100 g 
de peso corporal, excepto en el caso de las soluciones acuosas, de las que se pueden usar 2 ml/100 g de peso corporal. En cuanto a la formulación del preparado que se administre, se recomienda el uso 
de una solución/suspensión/emulsión acuosa siempre que sea posible, 
seguida, en orden de preferencia, por una solución/suspensión/emul ­
sión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y luego posiblemente por la solución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos 
del agua, deben conocerse sus características tóxicas. Las dosis tie ­
nen que prepararse poco antes de la administración a menos que se conozca la estabilidad del preparado durante el período en que se vaya a utilizar y conste que esta sea aceptable.
 
1.5 PROCEDIMIENTO  
1.5.1  Administración de las dosis  
La sustancia estudiada se administra en una dosis única por alimen ­
tación forzada mediante sonda gástrica o cánula adecuada de intu ­
bación. Cuando se dé el caso, poco habitual, de que no pueda 
administrarse una dosis única, se podrá dividir esta en partes más pequeñas durante un período que no sobrepase las 24 horas. 
Los animales se mantendrán en ayunas antes de la administración de 
la dosis (por ejemplo, las ratas no deberán recibir alimento alguno durante la noche, pero sí agua). Los ratones no deberán ser alimen ­
tados durante 3-4 horas, pero podrán beber agua). Tras el período de 
ayuno, los animales se pesarán antes de la administración de la 
sustancia estudiada. Una vez administrada esta, podrá continuarse el ayuno durante unas 3 o 4 horas en el caso de las ratas y 1 o 2 horas cuando se trate de ratones. Cuando una dosis se administre en 
fracciones a lo largo de un período, podrá ser necesario proporcionar 
a los animales alimento y agua, en función de la duración del pe ­
ríodo.
 
1.5.2  Estudio preliminar  
La finalidad del estudio preliminar es determinar la dosis inicial 
adecuada para el estudio principal. La sustancia estudiada se admi ­
nistra a cada animal de manera secuencial según lo indicado en los gráficos del anexo 1. El estudio preliminar se considera terminado 
cuando puede tomarse una decisión sobre la dosis inicial para el 
estudio principal (o si se observa una muerte a la dosis fija más baja) 
La dosis inicial para el estudio preliminar se selecciona a partir de los 
niveles de dosis fija de 5, 50, 300 y 2 000 mg/kg y consiste en la dosis que se prevé que produzca toxicidad manifiesta, basándose, cuando sea posible, en datos obtenidos  in vivo  e in vitro  referentes a la misma 
sustancia química y a otras sustancias estructuralmente relacionadas. 
A falta de esta información, la dosis inicial será de 300 mg/kg. 
Se dejará transcurrir un plazo mínimo de 24 horas entre las adminis ­
traciones de dosis a cada animal. El período de observación de todos 
los animales debe ser de, al menos, 14 días.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Excepcionalmente, y solo cuando esté justificado por determinados 
imperativos legales, puede considerarse el uso de otra dosis fija 
superior de 5 000 mg/kg (véase el anexo 3). Por razones de bienestar animal, se desaconseja el ensayo de sustancias de la categoría 5 del Sistema Armonizado Mundial (DL
 50 entre 2 000-5 000 mg/kg) con 
animales. Este ensayo solo debe plantearse cuando sea muy probable 
que sus resultados sirvan directamente para la protección de la salud humana o animal o del medio ambiente. 
En los casos en que se ensaye en un animal la dosis fija más baja 
(5 mg/kg) en un estudio preliminar y el animal muera, el procedi ­
miento normal es poner fin al estudio y asignar la sustancia a la categoría 1 del SAM (tal como se indica en el anexo 1). Sin embar ­
go, si se requiere confirmar la clasificación, puede seguirse un pro ­
cedimiento opcional complementario, que se indica a continuación. 
Se administra a otro animal una dosis de 5 mg/kg. Si este muere, queda confirmada la categoría 1 del SAM y se pone fin al estudio inmediatamente. Si el segundo animal sobrevive, se administra una 
dosis de 5 mg/kg a otros tres animales. Dado que habrá un riesgo 
elevado de mortalidad, los animales recibirán la dosis de manera secuencial para proteger el bienestar animal. El intervalo entre la administración de la dosis a cada animal debe ser suficiente para 
que quede claro que el animal anterior tiene probabilidades de so ­
brevivir. Si ocurre una segunda muerte, se pondrá fin inmediatamene a la administración de dosis, y no se dará la sustancia a ningún otro animal. Dado que el hecho de que se produzca una segunda muerte 
(independientemente del número de animales sometidos a ensayo en 
el momento de la terminación) corresponde al resultado A (2 o más muertes), se seguirá la norma de clasificación del anexo 2 a la dosis fija 5 mg/kg (categoría 1 si hay dos o más muertes o categoría 2 si 
solo hay una muerte). Además, el anexo 4 da orientaciones sobre la 
clasificación en el sistema comunitario hasta que se aplique el nuevo SAM.
 
1.5.3  Estudio principal  
1.5.3.1  Número de animales y dosis  
La actuación que debe seguirse tras el ensayo al nivel de dosis inicial 
se indica en los gráficos del anexo 2. Deberá optarse por una de las tres actuaciones siguientes: terminar el ensayo y asignar a la sustan ­
cia la categoría de peligro adecuada, ensayar a una dosis fija superior 
o ensayar a una dosis fija inferior. Sin embargo, para proteger a los 
animales, no se repetirá en el estudio principal ningún nivel de dosis que haya causado un resultado de muerte en el estudio preliminar (véase el anexo 2). La experiencia ha mostrado que el resultado más 
probable al nivel de dosis inicial es que pueda clasificarse la sustan ­
cia y que no sean necesarios más ensayos. 
Para cada nivel de dosis investigado se utilizará normalmente un 
total de cinco animales de un mismo sexo. Este grupo de cinco 
animales estará compuesto de un animal del estudio preliminar al que se haya administrado la sustancia al nivel de dosis seleccionado más otros cuatro (excepto cuando un nivel de dosis utilizado en el 
estudio principal no estuviera incluido en el estudio preliminar, si ­
tuación que es poco frecuente). 
El intervalo de tiempo entre la administración de dosis a cada nivel se 
determina según la aparición, duración y gravedad de los signos tóxi ­
cos. El tratamiento de animales con la dosis siguiente no se realizará 
hasta que haya seguridad sobre la supervivencia de los animales pre ­
viamente tratados. Se recomienda, si es necesario, un período de tres o cuatro días entre la administración de cada nivel de dosis para poder 
observar la toxicidad retardada. Este intervalo puede ajustarse según 
convenga, por ejemplo en caso de respuestas no concluyentes.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Cuando se emplee una dosis fija superior de 5 000 mg/kg, se seguirá el 
procedimiento indicado en el anexo 3 (véase también el punto 1.6.2).  
1.5.3.2  Ensayo límite  
El ensayo límite se utiliza principalmente en situaciones en las que el 
experimentador tiene información de que la sustancia estudiada es probable que no sea tóxica, es decir, solo resulta tóxica por encima 
de las dosis límite reglamentarias. Puede obtenerse información acerca 
de la toxicidad de la sustancia estudiada a partir de los conocimientos disponibles sobre compuestos, mezclas o productos ensayados seme ­
jantes, teniendo en cuenta cuáles son los componentes que se sabe que 
son importantes desde el punto de vista toxicológico y en qué porcen ­
taje aparecen. En situaciones en que se dispone de poca o ninguna información sobre la toxicidad de la sustancia o en la que se prevé que esta será tóxica, se llevará a cabo el ensayo principal. 
Utilizando el procedimiento normal, una dosis inicial en el estudio 
preliminar de 2 000 mg/kg (o excepcionalmente 5 000 mg/kg) se ­
guida por la administración de este nivel de dosis a cuatro animales 
sirve de ensayo límite para las presentes directrices.
 
1.6 OBSERVACIONES 
Tras la administración de la dosis, se observan los animales uno por 
uno, al menos una vez durante los primeros 30 minutos y periódica ­
mente durante las primeras 24 horas, prestando especial atención du ­
rante las primeras 4 horas, y a continuación diariamente, a lo largo de 
un total de 14 días, excepto cuando tengan que eliminarse del estudio y sacrificarse de manera compasiva por razones de bienestar animal o bien cuando resulten muertos. Sin embargo, no debe fijarse rígidamente 
la duración de la observación, sino que esta debe determinarse según 
las reacciones tóxicas, su momento de aparición y la longitud del período de recuperación, por lo que podrá ampliarse cuando se consi ­
dere necesario. Son importantes los momentos en que aparezcan y 
desaparezcan los signos de toxicidad, especialmente si hay tendencia 
a una aparición retardada de los signos tóxicos (11). Todas las obser ­
vaciones se registrarán sistemáticamente en una ficha de cada animal. 
Será necesario proceder a observaciones adicionales si los animales 
siguen presentando signos de toxicidad. Entre las observaciones de ­
ben incluirse los cambios de la piel y del pelaje, ojos y membranas mucosas, y también de los sistemas respiratorio, circulatorio y ner ­
vioso (central y autónomo), así como la actividad locomotriz y las 
pautas de comportamiento. Debe prestarse especial atención a la observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. Se tendrán en cuenta los principios y criterios resu ­
midos en el  Humane Endpoints Guidance Document  (8). Los ani ­
males moribundos y los que muestren dolor intenso o signos conti ­
nuos de sufrimiento intenso deberán sacrificarse de forma compasiva. Cuando se encuentre algún animal muerto o se sacrifique por razones 
compasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el 
momento de la muerte.
 
1.6.1  Peso corporal  
Cada animal se pesará justo antes de la administración de la sustan ­
cia, y después al menos una vez por semana. Se calcularán y regis ­
trarán los cambios de peso. Al final de la prueba, los animales 
supervivientes se pesarán antes de sacrificarse de forma compasiva.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2  Patología  
Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran du ­
rante su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar animal, se someterán a necropsia macroscópica. Se registrarán 
los cambios patológicos macroscópicos de cada animal. Podrá conside ­
rarse también la realización del examen microscópico de los órganos que presenten huellas de patología macroscópica en los animales que sobre ­
vivan un mínimo de 24 horas después de la administración de la dosis 
inicial, ya que este examen puede proporcionar información útil.
 
2 RESULTADOS  
Los resultados de cada animal deben darse por separado. Además, se 
reunirán todos los resultados en un cuadro que presente, por cada grupo de ensayo, el número de animales utilizados, el número de animales que presenten signos de toxicidad, el número de animales 
hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones com ­
pasivas, el momento de la muerte de los distintos animales, la des ­
cripción y la evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversi ­
bilidad, y los resultados de la necropsia.
 
3 INFORME  
3.1 INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información si ­
guiente: 
Sustancia estudiada: — naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquími ­
cas (incluida la isomerización), 
— identificación química, incluido el número CAS. Vehículo (si procede): — justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua. Animales sometidos a ensayo: — especie y cepa utilizadas, — situación microbiológica de los animales, cuando se conozca, — número, edad y sexo de los animales (incluida, cuando proceda, 
una justificación del uso de machos en vez de hembras), 
— procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, etc. Condiciones de ensayo: — información sobre la formulación de la sustancia de ensayo, 
incluida la forma física del material administrado, 
— datos de la administración de la sustancia, incluidos el volumen y 
el momento de la administración, 
— datos sobre la calidad del agua y los alimentos (incluido el 
origen/tipo de la dieta y el origen del agua), 
— justificación de la elección de la dosis inicial.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Resultados: 
— tabulación de las respuestas y los niveles de dosis de cada 
animal (es decir, animales que presenten signos de toxicidad, 
incluida la mortalidad, naturaleza, gravedad y duración de los 
efectos), 
— tabulación del peso corporal y los cambios en el mismo, — peso de cada animal el día en que se administre la dosis, poste ­
riormente a intervalos semanales, y en el momento de la muerte o el sacrificio, 
— fecha y hora de la muerte si es anterior al sacrificio previsto, — cronología de la aparición de signos de toxicidad e indicación de 
si estos son reversibles en cada animal, 
— observaciones de la necropsia y eventuales observaciones histo ­
patológicas de cada animal, si se dispone de ellas. 
Evaluación e interpretación de los resultados. 
Conclusiones.
 
4 REFERENCIAS  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of subs ­
tances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxico]., 3, 85-92. 
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of subs ­
tances and preparations for their acute toxicity. Human Toxi ­
col., 6, 279-291. 
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose pro ­
cedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469-482 (3). 
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324. 
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol., 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol. 
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statisti ­
cal evaluation of the revised fixed dose procedure.-Hum. Exp. 
Toxicol., 21, 183 -196. 
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Che ­
micals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pa ­
ges/home/displaygenera]/0,3380JEN- documents-521 -14-no- 
24-no-0,FF.htmI]. 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. 
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation, in: Principies and Methods of Toxicology. 3
 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, 
USA ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
ANEXO 1  
DIAGRAMA DEL ESTUDIO PRELIMINAR

 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
ANEXO 2  
DIAGRAMA DEL ESTUDIO PRINCIPAL

 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
ANEXO 3  
CRITERIOS PARA LA CLASIFICACIÓN DE SUSTANCIAS CON 
VALORES DL  50 PREVISTOS SUPERIORES A LOS 2 000 MG/KG SIN 
NECESIDAD DE ENSAYO  
Los criterios de la categoría de peligro 5 tienen por objeto permitir la identifi ­
cación de sustancias que tengan un peligro de toxicidad aguda relativamente bajo pero que, en determinadas circunstancias, puedan representar un peligro para 
poblaciones vulnerables. Estas sustancias se prevé que tengan una DL
 50 oral o 
dérmica dentro del intervalo 2 000-5 000 mg/kg o dosis equivalentes por otras vías. Las sustancias estudiadas podrían clasificarse en la categoría de peligro definida por: 2 000 mg/kg < DL
 50 < 5 000 mg/kg (categoría 5 del SAM), en 
los siguientes casos: 
a) cuando cualquiera de los esquemas de ensayo del anexo 2 lleve a esta cate ­
goría, basándose en las cifras de mortalidad; 
b) cuando se disponga ya de datos fiables que indiquen que la DL  50 se sitúa 
dentro del intervalo de los valores de la categoría 5 o cuando otros estudios 
con animales o los efectos tóxicos observados en las personas indiquen un 
peligro agudo para la salud humana; 
c) mediante extrapolación, estimación o medición de datos si no está justificada 
la clasificación en una categoría más peligrosa, y 
— se dispone de información fiable que indique la existencia de efectos 
tóxicos significativos en los seres humanos, o 
— se observe mortalidad cuando se efectúen ensayos hasta la categoría 4 por 
vía oral, o 
— cuando los dictámenes de expertos confirmen que se dan signos clínicos 
significativos de toxicidad al efectuar ensayos hasta los valores de la categoría 4, excepto en el caso de diarrea, piloerección o aspecto despei ­
nado, o 
— cuando los dictámenes de expertos confirmen información fiable obtenida 
a partir de otros estudios con animales que indique un potencial de efectos agudos significativos.
 
ENSAYOS A DOSIS SUPERIORES A 2 000 MG/KG  
Excepcionalmente, y solo cuando esté justificado por determinados imperativos 
legales, puede considerarse el uso de otro nivel de dosis fija superior de 5 000 mg/kg Reconociendo la necesidad de proteger el bienestar animal, se desaconseja el ensayo a la dosis 5 000 mg/kg. Este solo debe plantearse cuando sea muy 
probable que sus resultados sirvan directamente para la protección de la salud 
humana o animal (9).
 
Estudio preliminar  
Las normas para la toma de decisiones que rigen el procedimiento secuencial del 
anexo 1 se amplían de manera que incluyan el nivel de dosis 5 000 mg/kg Por 
tanto, cuando se emplee una dosis inicial en el estudio preliminar de 5 000 mg/kg, el resultado A (muerte) obligará a que se haga un ensayo con otro animal a 2 000 mg/kg; los resultados B y C (toxicidad manifiesta o no toxicidad) 
permitirán la selección de la dosis de 5 000 mg/kg como dosis inicial del estudio 
principal. De la misma manera, si se utiliza una dosis inicial distinta de 5 000 mg/kg se pasará a la de 5 000 mg/kg en caso de que se den los resultados B o C a 2 000 mg/kg; un posterior resultado A a 5 000 mg/kg determinará una dosis 
inicial para el estudio principal de 2 000 mg/kg y los resultados B y C determi ­
narán una dosis inicial para el estudio principal de 5 000 mg/kg.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Estudio principal  
Las normas para la toma de decisiones que rigen el procedimiento secuencial del 
anexo 2 se amplían de manera que incluyan el nivel de dosis de 5 000 mg/kg. Por tanto, cuando se emplee una dosis inicial en el estudio principal de 5 000 mg/kg, el resultado A (> 2 muertes) obligará a que se haga un ensayo 
con un segundo grupo a 2 000 mg/kg; el resultado B (toxicidad manifiesta y/o < 
1 muerte) o C (no toxicidad) determinará que la sustancia se considere no clasificada con arreglo al SAM. De la misma manera, si se utiliza una dosis inicial distinta de 5 000 mg/kg se pasará a la de 5 000 mg/kg en caso de que se 
dé un resultado C a 2 000 mg/kg; un posterior resultado A a 5 000 mg/kg dará 
lugar a que la sustancia se clasifique en la categoría 5 del SAM y los resultados B y C a que se considere no clasificada.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
ANEXO 4  
MÉTODO DE PRUEBA B.1 bis  
Orientaciones sobre clasificación según el plan comunitario para el período de transición hasta la plena aplicación del Sistema  Armonizado Mundial (SAM) [tomado de (8)]

 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1 ter TOXICIDAD ORAL AGUDA. MÉTODO DE LAS CLASES DE 
TOXICIDAD AGUDA  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 423 (2001).  
1.1 INTRODUCCIÓN 
El método de las clases de toxicidad aguda (1) establecido en este 
ensayo es un procedimiento por fases en el que se utilizan 3 anima ­
les de un mismo sexo en cada fase. Según la mortalidad y/o la 
aparición de síntomas de agonía en los animales, pueden requerirse 
2-4 fases para juzgar sobre la toxicidad aguda de la sustancia estu ­
diada. Este procedimiento es reproducible, utiliza muy pocos anima ­
les y permite clasificar sustancias de manera semejante a los demás 
métodos de ensayo de toxicidad aguda. El método de las clases de 
toxicidad aguda se basa en evaluaciones biométricas (2) (3) (4) (5) con dosis fijas, separadas adecuadamente de manera que permitan ordenar una sustancia con fines de clasificación y evaluación de 
riesgos. Este método en su versión de 1996 fue validado amplia ­
mente  in vivo  con respecto a datos DL
 50 tomados de la bibliografía, 
tanto a nivel nacional (6) como internacional (7). 
En el Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8) se dan 
directrices sobre la selección del método de ensayo más adecuado en 
función del objetivo. Además, en este documento orientativo se fa ­
cilita información complementaria sobre la realización e interpreta ­
ción del método de ensayo B.l  ter. 
No es necesario administrar dosis de las que se sepa que producen 
dolor y sufrimiento acusados por sus efectos corrosivos o muy irri ­
tantes. Los animales moribundos o que den muestras claras de dolor o muestren signos de sufrimiento intenso y continuo serán sacrifica ­
dos de forma compasiva y en la interpretación de los resultados 
serán considerados de la misma manera que los que hayan muerto durante el ensayo. En otro documento orientativo (9) se dan criterios para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a 
sufrimiento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte es 
previsible o inminente. 
El método utiliza dosis previamente definidas y los resultados 
permiten ordenar y clasificar las sustancias de acuerdo con el Sis ­
tema Armonizado Mundial (SAM) [Globally Harmonised System 
(GHS)] de clasificación de sustancias químicas que causan toxici ­
dad aguda (10). 
En principio, con este método no se pretende calcular una DL
 50 
precisa, sino determinar unas gamas de exposición definidas en las 
que puede esperarse la aparición de letalidad, ya que la muerte de una parte de los animales sigue siendo su parámetro principal. El método permite la determinación del valor DL
 50 solo cuando al 
menos dos dosis producen una mortalidad superior al 0 % e inferior 
al 100 %. La utilización de dosis previamente definidas, indepen ­
dientemente de la sustancia que se ensaye, y la relación explícita entre la clasificación y el número de animales observados en dife ­
rentes estados, mejora la concordancia entre la información facilitada 
por distintos laboratorios, así como la repetibilidad.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
El laboratorio que haga los ensayos debe tener en cuenta toda la 
información disponible sobre la sustancia estudiada antes de llevar a 
cabo el estudio. Tal información incluirá la identidad y la estructura química de la sustancia sus propiedades fisicoquímicas, los resulta ­
dos de otros ensayos de toxicidad  in vitro  o in vivo,  los datos 
toxicológicos sobre otras sustancias estructuralmente relacionadas, 
y el uso o usos previstos de la sustancia. Esta información es nece ­
saria para que todos los afectados puedan estar seguros de que el ensayo es pertinente para la protección de la salud humana y ayuda a 
la selección de la dosis inicial más adecuada.
 
1.2 DEFINICIONES  
Toxicidad oral aguda:  efectos nocivos que se manifiestan tras la 
administración oral de una dosis única de la sustancia o de dosis múltiples dadas dentro de un período de 24 horas.  
Muerte retardada  significa que el animal no muere ni parece mo ­
ribundo en el plazo de 48 horas sino que muere más tarde durante el período de observación de 14 días.  
Dosis:  cantidad de sustancia de ensayo administrada. La dosis se 
expresa en peso de la sustancia de ensayo por unidad de peso del 
animal sometido al experimento (por ejemplo, mg/kg).  
SAM:  Sistema Armonizado Mundial [Globally Harmonised System 
(GHS)] de clasificación y etiquetado de productos químicos. Activi ­
dad conjunta de la OCDE (salud humana y medio ambiente), el 
Comité de Expertos en Transporte de Mercaderías Peligrosas de las Naciones Unidas (propiedades físico-químicas) y la OIT (comu ­
nicación de riesgos), coordinada por el Programa Interorganismos 
para la Gestión Racional de Sustancias Químicas (IOMC, en sus 
siglas inglesas).  
Muerte inminente:  fase en la que se prevé que el animal muera o 
entre en la agonía antes del siguiente momento de observación pre ­
visto. Entre los signos que indican esta situación en los roedores 
cabe citar: convulsiones, posición lateral, posición yacente y temblo ­
res. [Para más información véase el  Humane Endpoint Guidance 
Document  (9)].  
DL
 50 (dosis letal mediana):  dosis única, obtenida por estadística, de 
una sustancia capaz de provocar la muerte del 50 % de los animales a los que se haya administrado por vía oral. El valor de la DL
 50 se 
expresa en peso de la sustancia por unidad de peso del animal (mg/kg).  
Dosis límite:  dosis del límite máximo del ensayo (2 000 o 5 000 mg/kg).  
Agonía:  situación en la que el animal se está muriendo o es incapaz 
de sobrevivir aunque reciba tratamiento. [Para más información 
véase el  Humane Endpoint Guidance Document  (9)].  
Muerte previsible:  presencia de signos clínicos que indican la 
muerte en un momento conocido del futuro antes de la terminación prevista del experimento, por ejemplo: incapacidad de alcanzar ali ­
mentos o agua. [Para más información, véase el  Humane Endpoint 
Guidance Document  (9)].
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3 PRINCIPIO DEL MÉTODO 
El principio en el que se inspira el ensayo, basado en un procedi ­
miento por fases en cada una de las cuales se utiliza un número mínimo de animales, es obtener información sobre la toxicidad aguda 
de la sustancia estudiada que sea suficiente para permitir su clasifi ­
cación. La sustancia se administra por vía oral a un grupo de ani ­
males de experimentación a una de las dosis definidas. En el ensayo se sigue un procedimiento por fases, utilizándose en cada fase tres 
animales del mismo sexo (normalmente hembras). Según la ausencia 
o presencia de mortalidad debida a la sustancia en los animales tratados en una fase determinada se decide cuál será la fase siguiente, 
es decir: 
— terminación del ensayo (no se requieren más ensayos), — administración de la misma dosis de la sustancia a otros tres 
animales, 
— administración de la dosis inmediatamente superior o inferior a 
otros tres animales. 
En el anexo 1 se dan detalles del procedimiento del ensayo. El 
método permitirá emitir un juicio respecto a la clasificación de la sustancia en una clase de toxicidad dentro de una serie de clases 
definidas mediante valores límite de DL
 50 . 
1.4 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1  Selección de la especie animal  
La especie de preferencia entre los roedores es la rata, aunque pue ­
den utilizarse otras especies de roedores. Normalmente se emplean 
hembras (9). Se hace así porque la bibliografía sobre los ensayos 
convencionales de DL  50 muestra que normalmente hay poca diferen ­
cia en cuanto a sensibilidad entre los sexos, pero, en los casos en que se observan diferencias, las hembras son generalmente un poco más 
sensibles (11). Sin embargo, si se conocen propiedades toxicológicas 
o toxicocinéticas de sustancias químicas estructuralmente relaciona ­
das que indiquen que es probable que los machos sean más sensi ­
bles, deberá utilizarse este sexo. Cuando el ensayo se haga con 
machos, deberá justificarse adecuadamente. 
Hay que utilizar animales adultos jóvenes y sanos de una cepa de 
laboratorio corriente. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. 
El animal, al inicio de la administración de la sustancia, debe tener 
entre 8 y 12 semanas de edad y su peso debe estar en un intervalo del ± 20 % del peso medio de los animales a los que previamente se haya administrado la sustancia.
 
1.4.2  Alojamiento y alimentación  
El cuarto de experimentación ha de estar a una temperatura de 22  o C 
(± 3  o C). Aunque la humedad relativa debe ser como mínimo del 
30 % y preferiblemente no superior al 70 %, salvo durante la lim ­
pieza del local, lo ideal es que esté comprendida entre el 50 y el 
60 %. Se aplica una iluminación artificial en una secuencia de 12 
horas de luz y 12 horas de oscuridad. Puede darse una dieta alimen ­
taria corriente para animales de laboratorio y agua potable a volun ­
tad. Los animales pueden alojarse en jaulas agrupados por dosis, 
pero el número de animales de cada jaula no debe obstaculizar la 
realización de observaciones claras de cada animal.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3  Preparación de los animales  
Se seleccionan al azar los animales, se marcan para permitir su 
identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes de iniciar la administración de la sustancia, a 
fin de que se aclimaten a las condiciones del laboratorio.
 
1.4.4  Preparación de las dosis  
En general, las sustancias estudiadas deben administrarse en un vo ­
lumen constante para toda la gama de dosis que deban ensayarse, 
variando la concentración del preparado administrado. Sin embargo, 
cuando deba administrarse una mezcla o producto final líquidos, puede resultar más adecuado para la posterior evaluación de riesgos utilizar la sustancia no diluida, es decir, a una concentración cons ­
tante. Algunas autoridades reguladoras establecen este criterio con 
carácter obligatorio. En cualquiera de los dos casos, no debe supe ­
rarse el volumen de dosis máximo. El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del 
animal. En los roedores, el volumen no debe sobrepasar 1 ml/100 g 
de peso corporal, excepto en el caso de las soluciones acuosas, de las que se pueden usar 2 ml/100 g de peso corporal. En cuanto a la formulación del preparado que se administre, se recomienda el uso 
de una solución/suspensión/emulsión acuosa siempre que sea posible, 
seguida, en orden de preferencia, por una solución/suspensión/emul ­
sión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y luego posiblemente por la solución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos 
del agua, deben conocerse sus características tóxicas. Las dosis tie ­
nen que prepararse poco antes de la administración a menos que se conozca la estabilidad del preparado durante el período en que se vaya a utilizar y conste que esta es aceptable.
 
1.5 PROCEDIMIENTO  
1.5.1  Administración de las dosis  
La sustancia estudiada se administra en una dosis única por alimen ­
tación forzada mediante sonda gástrica o cánula adecuada de intu ­
bación. Cuando se dé el caso, poco habitual, de que no pueda 
administrarse una dosis única, se podrá dividir esta en pequeñas partes durante un período que no sobrepase las 24 horas. 
Los animales se mantendrán en ayunas antes de la administración de 
la dosis (por ejemplo, las ratas no deberán recibir alimento alguno durante la noche, pero sí agua; los ratones no deberán recibir ali ­
mento durante 3-4 horas, pero sí agua). Tras el período de ayuno, los 
animales se pesarán antes de la administración de la sustancia estu ­
diada. Una vez administrada esta, podrá continuarse el ayuno durante unas 3 o 4 horas en el caso de las ratas y 1 o 2 horas cuando se trate de ratones. Si se administra la dosis en pequeñas partes a lo largo de 
un cierto período podrá ser necesario dar comida y bebida a los 
animales, en función de la duración de dicho período.
 
1.5.2  Número de animales y dosis  
Se utilizarán tres animales en cada fase. La dosis inicial se seleccio ­
nará entre las cuatro dosis fijas, es decir, 5, 50, 300 y 2 000 mg/kg 
de peso corporal. La dosis inicial será la que produzca con mayor 
probabilidad la muerte de algunos de los animales a los que se administre. En los diagramas del anexo 1 se describe el procedi ­
miento que debe seguirse para cada una de las dosis iniciales. Ade ­
más, el anexo 4 da orientaciones sobre la clasificación en el sistema 
comunitario hasta que se aplique el nuevo SAM.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Cuando la información indique que no es probable la aparición de 
mortalidad con la dosis inicial máxima (2 000 mg/kg peso corporal), 
se realizará una prueba límite. Si no hay información sobre una sustancia estudiada, por razones de bienestar animal, se recomienda utilizar como dosis inicial 300 mg/kg peso corporal. 
El intervalo de tiempo entre los grupos de tratamiento se determina 
según la aparición, duración y gravedad de los signos tóxicos. El 
tratamiento de animales con la dosis siguiente no se realizará hasta 
que haya seguridad sobre la supervivencia de los animales previa ­
mente tratados. 
Excepcionalmente, y solo cuando esté justificado por determinados 
imperativos legales, puede considerarse el uso de otro nivel de dosis 
superior de 5 000 mg/kg (véase el anexo 2). Por razones de bienestar 
animal, se desaconseja el ensayo en animales de la categoría 5 del Sistema Armonizado Mundial (2 000-5 000 mg/kg). Este ensayo solo debe plantearse cuando sea muy probable que sus resultados sirvan 
directamente para la protección de la salud humana o animal o del 
medio ambiente.
 
1.5.3  Ensayo límite  
El ensayo límite se utiliza en situaciones en las que el experimenta ­
dor tiene información de que la sustancia estudiada es probable que no sea tóxica, es decir, solo resulta tóxica por encima de las dosis 
límite reglamentarias. Puede obtenerse información acerca de la to ­
xicidad de la sustancia estudiada a partir de los conocimientos dis ­
ponibles sobre compuestos, mezclas o productos ensayados semejan ­
tes, teniendo en cuenta cuáles son los componentes que se sabe que 
son importantes desde el punto de vista toxicológico y en qué por ­
centaje aparecen. En situaciones en que se dispone de poca o nin ­
guna información sobre la toxicidad de la sustancia o en la que se prevé que esta será tóxica, se llevará a cabo el ensayo principal. 
Podrá realizarse un ensayo límite con una sola dosis de 2 000 mg/kg 
peso corporal con seis animales (tres por fase). Podrá realizarse un 
ensayo límite con una sola dosis de 5 000 mg/kg peso corporal con tres animales (véase el anexo 2). Si aparece mortalidad debida a la sustancia, puede ser necesario realizar una prueba complementaria al 
nivel inmediatamente inferior.
 
1.6 OBSERVACIONES 
Tras la administración de la dosis, se observan los animales uno por 
uno, al menos una vez durante los primeros 30 minutos y periódi ­
camente durante las primeras 24 horas, prestando especial atención durante las primeras 4 horas, y a continuación diariamente, a lo largo de un total de 14 días, excepto cuando tengan que eliminarse del 
estudio y sacrificarse de manera compasiva por razones de bienestar 
animal o bien cuando resulten muertos. Sin embargo, no se debería fijar rígidamente la duración de la observación sino que esta debe determinarse según las reacciones tóxicas, su momento de aparición 
y la longitud del período de recuperación, por lo que podrá ampliarse 
cuando se considere necesario. Son importantes los momentos en que aparezcan y desaparezcan los signos de toxicidad, especialmente si hay tendencia a una aparición retardada de los signos tóxicos (12). 
Todas las observaciones se registrarán sistemáticamente en fichas 
individuales de cada animal.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Será necesario hacer más observaciones si los animales siguen pre ­
sentando signos de toxicidad. Entre las observaciones deben incluirse 
los cambios de la piel y del pelaje, ojos y membranas mucosas, y también de los sistemas respiratorio, circulatorio y nervioso (central y autónomo), así como la actividad locomotriz y las pautas de com ­
portamiento. Debe prestarse especial atención a la observación de 
temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. Se tendrán en cuenta los principios y criterios resumidos en el  Hu­
mane Endpoints Guidance Document  (8). Los animales moribundos 
y los que muestren dolor intenso y signos continuos de sufrimiento 
intenso deberán sacrificarse de forma compasiva. Cuando se encuen ­
tre algún animal muerto o se sacrifique por razones compasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la 
muerte.
 
1.6.1  Peso corporal  
Cada animal se pesará justo antes de la administración de la sustan ­
cia, y después al menos una vez por semana. Se calcularán y regis ­
trarán los cambios de peso. Al final de la prueba, los animales supervivientes se pesarán antes de sacrificarse de forma compasiva.
 
1.6.2  Patología  
Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran 
durante su realización y los que se eliminen del estudio por Tazones 
de bienestar animal, se someterán a necropsia macroscópica. Se re ­
gistrarán los cambios patológicos macroscópicos de cada animal. Podrá considerarse también la realización del examen microscópico de los órganos que presenten huellas de patología macroscópica, en 
los animales que sobrevivan un mínimo de 24 horas, ya que este 
examen puede proporcionar información útil.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados de cada animal deben darse por separado. Además, se 
reunirán todos los resultados en un cuadro que presente, por cada grupo de ensayo, el número de animales utilizados, el número de animales que presenten signos de toxicidad, el número de animales 
hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones com ­
pasivas, el momento de la muerte de los distintos animales, la des ­
cripción y la evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversi ­
bilidad, y los resultados de la necropsia.
 
3. INFORME  
3.1 Informe del ensayo  
El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información si ­
guiente: 
Sustancia estudiada: — naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquími ­
cas (incluida la isomerización), 
— identificación química, incluido el número CAS. Vehículo (si procede): — justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua. 
Animales sometidos a ensayo: 
especie y cepa utilizadas, — situación microbiológica de los animales, cuando se conozca,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— número, edad y sexo de los animales (incluida, cuando proceda, 
una justificación del uso de machos en vez de hembras), 
— procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, etc. 
Condiciones de ensayo: — información sobre la formulación de la sustancia de ensayo, 
incluida la forma física del material administrado, 
— datos de la administración de la sustancia, incluidos el volumen y 
el momento de la administración, 
— datos sobre la calidad del agua y los alimentos (incluido el 
origen/tipo de la dieta y el origen del agua), 
— justificación de la elección de la dosis inicial. 
Resultados: — tabulación de las respuestas y los niveles de dosis de cada animal 
(es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la 
mortalidad naturaleza, gravedad y duración de los efectos), 
— tabulación del peso corporal y los cambios en el mismo, 
— peso de cada animal el día en que se administre la dosis, poste ­
riormente a intervalos semanales, y en el 
— momento de la muerte o el sacrificio, 
— fecha y hora de la muerte si es anterior al sacrificio previsto, — cronología de la aparición de signos de toxicidad e indicación de 
si estos son reversibles en cada animal, 
— resultados de la necropsia y eventuales observaciones histopato ­
lógicas de cada animal, si se dispone de ellas. 
Evaluación e interpretación de los resultados. Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Pers ­
pectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86 
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. 
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute- Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734. 
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Met ­
hods: Alterations to LD/LC
 50 Tests. ALTEX 16, 129-134 
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method- 
An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute- Toxic-Cíass Met ­
hod (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670. 
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment N 19. 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental. Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28
 th Joint Meeting 
of the Chemicals Committee and the Working Party on Che ­
micals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://web ­
netl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-docu ­
ments-521-14-no-24-no-0,FF.html]. 
(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, 223-231. 
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology.  Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
ANEXO 1  
PROCEDIMIENTO QUE DEBE SEGUIRSE PARA CADA UNA DE LAS 
DOSIS INICIALES  
OBSERVACIONES GENERALES  
Para cada dosis inicial, el procedimiento que debe seguirse se indica en los 
respectivos esquemas de ensayo que figuran en el presente anexo. 
— Anexo 1 a: la dosis inicial es 5 mg/kg de peso corporal. — Anexo 1 b: la dosis inicial es 50 mg/kg de peso corporal. — Anexo 1 c: la dosis inicial es 300 mg/kg de peso corporal. — Anexo 1 d: la dosis inicial es 2 000 mg/kg de peso corporal. En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, 
el procedimiento de ensayo seguirá las flechas indicadas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
Anexo 1 A  
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO CON UNA DOSIS INICIAL DE 5 MG/KG DE PESO CORPORAL

 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
ANEXO 1B  
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO CON UNA DOSIS INICIAL DE 50 MG/KG DE PESO CORPORAL

 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
ANEXO 1C  
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO CON UNA DOSIS INICIAL DE 300 MG/KG DE PESO CORPORAL

 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
ANEXO 1 D  
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO CON UNA DOSIS INICIAL DE 2 000 MG/KG DE PESO CORPORAL

ANEXO 2  
CRITERIOS PARA LA CLASIFICACIÓN DE SUSTANCIAS CON 
VALORES DL  50 PREVISTOS SUPERIORES A LOS 2 000 MG/KG SIN 
NECESIDAD DE ENSAYO  
Los criterios de la categoría de peligro 5 tienen por objeto permitir la identifi ­
cación de sustancias que tengan un peligro de toxicidad aguda relativamente bajo 
pero que, en determinadas circunstancias, puedan representar un peligro para poblaciones vulnerables. Estas sustancias se prevé que tengan una DL
 50 oral o 
dérmica dentro del intervalo 2 000-5 000 mg/kg o dosis equivalentes por otras 
vías. Las sustancias estudiadas deben clasificarse en la categoría de peligro 
definida por 2 000 mg/kg < DL  50 < 5 000 mg/kg (categoría 5 del SAM), en 
los siguientes casos: 
a) cuando cualquiera de los esquemas de ensayo del anexo 1a-1d lleve a esta 
categoría, basándose en las cifras de mortalidad; 
b) cuando se disponga ya de datos fiables que indiquen que la DL  50 se sitúa 
dentro del intervalo de los valores de la categoría 5; o cuando otros estudios 
en animales o los efectos tóxicos observados en las personas susciten inquie ­
tud grave acerca de la salud humana; 
c) mediante extrapolación, estimación o medición de datos si no está justificada 
la clasificación en una categoría más peligrosa, y 
— se dispone de información fiable que indique la existencia de efectos 
tóxicos significativos en los seres humanos, o 
— se observe mortalidad cuando se efectúen ensayos hasta la categoría 4 por 
vía oral, o 
— cuando los dictámenes de expertos confirmen que se dan signos clínicos 
significativos de toxicidad al efectuar ensayos hasta los valores de la 
categoría 4, excepto en el caso de diarrea, piloerección o aspecto alterado, o 
— cuando los dictámenes de expertos confirmen información fiable obtenida 
a partir de otros estudios en animales que indique un potencial de efectos agudos significativos.
 
ENSAYOS A DOSIS SUPERIORES A 2 000 MG/KG  
Reconociendo la necesidad de proteger el bienestar animal, se desaconseja el ensayo 
de la categoría 5 del Sistema Armonizado Mundial (2 000-5 000 mg/kg) con 
animales. Este solo debe plantearse cuando sea muy probable que sus resultados 
sirvan directamente para la protección de la salud humana o animal (10). No deben hacerse otros ensayos a dosis superiores. 
Cuando tenga que hacerse un ensayo a 5 000 mg/kg, solo se requiere una fase (es 
decir, tres animales). Si el primer animal al que se administre la dosis muere, se 
pasará a la dosis de 2 000 mg/kg de acuerdo con los diagramas del anexo 1. Si el 
primer animal sobrevive, se tratará a dos animales más. Si muere solo uno de los tres animales, se prevé que la DL
 50 supere los 5 000 mg/kg. Si ambos animales 
mueren, se pasará a la dosis de 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
ANEXO 3  
Método de prueba B.1  ter: Orientaciones sobre clasificación según el plan comunitario para el 
período de transición hasta la plena aplicación del Sistema Armonizado Mundial (SAM) 
[tomado de (8)]
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. TOXICIDAD AGUDA POR INHALACIÓN  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 403 de la 
OCDE (2009) (1). Las directrices 403 (TG 403) original para ensayos de toxicidad aguda por inhalación fueron adoptadas en 1981. El presente mé ­
todo de ensayo B.2 (que se considera equivalente a las TG 403 revisadas) se 
ha diseñado para hacerlo más flexible, reducir el uso de animales y respetar la normativa legal. El método de ensayo revisado contempla dos tipos de estudios: un protocolo de CL
 50 tradicional y un protocolo de concentración 
× tiempo (C × t). La principal característica de este método de ensayo es su 
capacidad de proporcionar una relación concentración-respuesta con resulta ­
dos desde no letales hasta letales que permite obtener la concentración letal mediana (CL
 50 ), la concentración umbral no letal (por ejemplo, CL  01 ) y la 
pendiente, además de identificar una posible susceptibilidad ligada al sexo. 
Deberá emplearse un protocolo C × t cuando exista una necesidad científica o normativa específica que imponga la investigación con animales en dife ­
rentes períodos, como es el caso de la planificación de actuaciones de 
urgencia [por ejemplo, para obtener los niveles orientativos de la exposición 
aguda (Acute Exposure Guideline Levels, AEGL), (las directrices de plani ­
ficación de la respuesta en situaciones de emergencia (Emergency Response Planning Guidelines ERPG), o los niveles umbral de exposición aguda 
(Acute Exposure Threshold Levels, AETL)] o de la planificación del uso 
del suelo. 
2. Se encontrará una guía para la realización e interpretación de estudios según 
este método de ensayo en el "Documento de orientación sobre los ensayos de toxicidad por inhalación aguda" [ Guidance Document on Acute Inhala ­
tion Toxicity Testing  (GD 39)] (2). 
3. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se 
facilitan al final del presente capítulo y en GD 39 (2). 
4. Este método de ensayo permite hacer una caracterización de la sustancia 
química problema y una evaluación cuantitativa del riesgo, además de or ­
denar y clasificar los compuestos químicos con arreglo al Reglamento (CE) 
n
 o 1272/2008 (3). El GD 39 (2) proporciona una orientación para seleccio ­
nar el método de ensayo adecuado a los estudios de toxicidad aguda. Cuando solamente se necesite información sobre la clasificación y el eti ­
quetado, se recomienda de manera general consultar el capítulo B.52 de este 
anexo (4) [véase el GD 39 (2)]. El presente método de ensayo B.2 no ha 
sido concebido específicamente para el análisis de productos especializados, como materiales fibrosos o isométricos escasamente solubles o nanomate ­
riales manufacturados.
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
5. Antes de considerar la aplicación de este método de ensayo y con el fin de 
minimizar el sufrimiento animal, el laboratorio de análisis deberá tener en 
cuenta toda la información disponible sobre la sustancia problema, sin ol ­
vidar los estudios existentes [consúltese, por ejemplo, el capítulo B.52 de este anexo (4)] cuyos datos pudieran desaconsejar la realización de nuevas investigaciones. En la selección de especie, variedad, sexo, modo de expo ­
sición y concentraciones analíticas adecuadas serán de ayuda el conoci ­
miento de la identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, los resultados de cualesquiera ensayos de toxicidad  in 
vitro  o in vivo,  los usos y la posible exposición humana previstos, los 
cálculos (Q)SAR y los datos toxicológicos disponibles sobre sustancias 
estructuralmente afines [véase el GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. En la medida de lo posible, deberá evitarse la investigación de sustancias 
irritantes o corrosivas que previsiblemente vayan a provocar dolor o daños 
intensos. Con objeto de esclarecer si es posible prescindir de nuevas inves ­
tigaciones, el potencial corrosivo/irritante deberá ser evaluado por expertos sobre la base de la experiencia en hombres y animales (por ejemplo, estu ­
dios de administración continuada realizados con concentraciones no corro ­
sivas/irritantes), los datos  in vitro  existentes [consúltense los capítulos B.40 
(5) y B.40  bis (6) del presente anexo o las TG 435 de la OCDE (7)], los 
valores de pH, la información acerca de sustancias afines o cualquier otro 
dato pertinente. En caso de necesidades normativas específicas (por ejemplo, 
a los fines de planificar actuaciones de urgencia), se podrá aplicar el pre ­
sente método de ensayo para exponer animales a los productos menciona ­
dos, por cuanto permite al investigador principal o al director del estudio un 
control sobre la selección de las concentraciones de exposición. Ahora bien, 
las concentraciones previstas no deberán provocar efectos de irritación/co ­
rrosión graves, pero sí suficientes para ampliar la curva de concentración- respuesta a un intervalo que cubra el objetivo normativo y científico del 
ensayo. Estas concentraciones se seleccionarán según cada caso y se justi ­
ficará debidamente la selección [véase el GD 39 (2)].
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
7. Este método de ensayo B.2 revisado se ha concebido para obtener una 
información acerca de la toxicidad aguda de la sustancia problema suficiente para permitir su clasificación, así como los datos de letalidad (por ejemplo, 
CL
 50 , CL  01 y pendiente) de uno o ambos sexos que se precisen para la 
evaluación cuantitativa del riesgo. El presente método de ensayo consta de dos métodos. El primer método es un protocolo tradicional en el que varios grupos de animales se exponen a una concentración límite (ensayo límite) o 
a una serie de concentraciones progresivas durante un período predetermi ­
nado que suele ser de 4 horas. Pueden aplicarse otros tiempos de exposición con fines normativos específicos. El segundo método es un protocolo de C × t en el que los grupos de animales se exponen a una sola concentración 
(límite) o a una serie de concentraciones durante diferentes períodos. 
8. Los animales moribundos o que den muestras claras de dolor o de sufri ­
miento intenso y continuo deben ser sacrificados de forma compasiva y en la interpretación del resultado serán considerados de la misma manera que 
los que hayan muerto durante el ensayo. En el documento de orientación 
n
 o 19 de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo ( Guidance 
Document on Humane Endpoints ) (8) se dan criterios para tomar la decisión 
de matar animales moribundos o sometidos a sufrimiento intenso y direc ­
trices para reconocer cuándo la muerte es previsible o inminente.  
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
9. Hay que usar animales adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio 
corriente. La especie recomendada es la rata y, en caso de usar otra especie, 
se justificará debidamente.  
Preparación de los animales  
10. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. El día de la exposición, los 
animales serán adultos jóvenes de 8 a 12 semanas de edad y la diferencia máxima de su peso corporal respecto del peso medio de su sexo calculado en animales previamente expuestos de la misma edad y sexo será del 
± 20 %. Los animales se seleccionan al azar y se marcan para permitir su 
identificación individual. Se mantienen en las jaulas al menos cinco días antes de empezar el estudio para que se acostumbren a las condiciones de laboratorio. Deberán también aclimatarse al equipo del ensayo durante un 
breve período preliminar, para así reducir el estrés provocado por la intro ­
ducción en un entorno nuevo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Zootecnia  
11. La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. La humedad 
relativa se mantendrá idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, si bien esto no siempre es posible cuando se usa el agua como vehículo. Antes 
y después de las exposiciones, los animales deberán enjaularse en principio 
por grupos de sexo y nivel de exposición, pero el número de animales por jaula será tal que permita la observación sin trabas de cada animal y mini ­
mice las pérdidas por agresiones y canibalismo. Cuando la exposición es 
solo por la nariz, puede ser necesario aclimatar a los animales a los tubos de 
sujeción. Estos no deberán ejercer sobre los animales de forma indebida tensiones físicas, térmicas o de inmovilización. La sujeción puede influir en 
parámetros fisiológicos como la temperatura corporal (hipertermia) o el 
volumen respiratorio por minuto. Si se dispone de datos generales en el sentido de que no se producen estos cambios en medida apreciable, se podrá prescindir de la adaptación previa a los tubos de sujeción. Los animales 
expuestos de cuerpo entero a un aerosol se enjaularán de manera individual 
durante la exposición para evitar que el aerosol en estudio se filtre por el pelo de sus compañeros de jaula. Salvo durante la exposición, se podrán administrar las dietas habituales de laboratorio certificadas, acompañadas de 
un suministro ilimitado de agua potable de la traída municipal. Se aplicará 
iluminación artificial en una secuencia de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad.
 
Cámaras de inhalación  
12. Para seleccionar una cámara de inhalación se tendrán en cuenta la naturaleza 
de la sustancia problema y la finalidad del ensayo. El modo de exposición 
preferible es de solo por la nariz (término que abarca los modos de expo ­
sición solo por la cabeza, solo por la nariz y solo por el hocico). Este modo de exposición es el recomendado generalmente para los estudios de aeroso ­
les líquidos o sólidos y de vapores que pueden condensarse formando 
aerosoles. Determinados objetivos de la investigación se podrían alcanzan mejor utilizando el modo de exposición de cuerpo entero, pero esto debe justificarse en el informe del estudio. Para asegurar la estabilidad atmosfé ­
rica cuando se emplea una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los 
animales experimentales no debe exceder del 5 % del volumen de la cáma ­
ra. En el GD 39 (2) se describen los principios de las técnicas de exposición de cuerpo entero y de solo por la nariz y sus ventajas e inconvenientes 
respectivos.
 
CONDICIONES DE EXPOSICIÓN  
Administración de las concentraciones  
13. Las exposiciones solo por la nariz en las ratas pueden tener cualquier 
duración hasta un máximo de 6 horas. En los ratones, las exposiciones 
solo por la nariz no deben sobrepasar en principio las 4 horas. Si se requie ­
ren tiempos experimentales más prolongados deberán justificarse [véase el GD 39 (2)]. Los animales expuestos a aerosoles en cámaras de cuerpo 
entero se enjaularán de manera individual para evitar la ingestión de la 
sustancia problema debido a las conductas de limpieza de los compañeros de jaula. Se suprimirá la alimentación durante el período de exposición. Se puede suministrar agua durante todo el período de exposición de cuerpo 
entero. 
14. Los animales se exponen a la sustancia problema en forma de gas, vapor, 
aerosol o una mezcla de estos. El estado físico que debe utilizarse dependerá 
de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, de la concen ­
tración seleccionada y/o de la forma física más probable que adoptará la sustancia problema durante su manipulación y administración. Las sustan ­
cias higroscópicas y químicamente reactivas deberán estudiarse en condicio ­
nes de aire seco. Se procurará evitar la acumulación de concentraciones 
explosivas.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Granulometría  
15. Se controlará la granulometría de todos los aerosoles y vapores que puedan 
condensarse formando aerosoles. Para facilitar la exposición de todas las zonas de interés de las vías respiratorias, se recomiendan aerosoles que 
tengan un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) de 1 a 4 μm, 
con una desviación típica geométrica ( σ
 g ) en el intervalo de 1,5 a 3,0 (2) (9) 
(10). Se procurará dentro de lo razonable ajustarse a este marco de referen ­
cia, pero si ello no es posible se consultará la opinión de expertos. Por 
ejemplo, los humos metálicos pueden tener un diámetro de partícula menor, 
mientras que las partículas con carga, las fibras y las sustancias higroscó ­
picas (que aumentan de tamaño en el medio húmedo de las vías respirato ­
rias) pueden sobrepasar este límite de referencia.  
Preparación de la sustancia problema en un vehículo  
16. Se puede recurrir a un vehículo para crear una concentración y un tamaño 
de partícula adecuados de la sustancia problema en la atmósfera. Por regla general se dará preferencia al agua. El material particulado se puede someter 
a tratamientos mecánicos para obtener la granulometría deseada, pero pro ­
curando no descomponer ni alterar la sustancia problema. Cuando se con ­
sidere que los procesos mecánicos pueden haber alterado la composición de la sustancia problema (por ejemplo, las temperaturas extremas de una fric ­
ción excesiva por un proceso de trituración), esta se verificará analíticamen ­
te. Se pondrá especial atención para no contaminar la sustancia problema. No es necesario analizar compuestos granulados no friables que han sido intencionadamente formulados como no inhalables. Se recurrirá a una 
prueba de desgaste para demostrar que no se generan partículas respirables 
durante la manipulación del material granulado. Si en la prueba de desgaste se generan sustancias respirables, habrá que efectuar un ensayo de toxicidad por inhalación.
 
Animales de control  
17. No es necesario emplear un grupo de control negativo (con aire) en paralelo. 
Si se usa un vehículo distinto del agua para generar la atmósfera experi ­
mental, solo será necesario recurrir a un grupo de control del vehículo cuando no se disponga de datos anteriores de toxicidad por inhalación. Si 
un ensayo de toxicidad de una sustancia problema formulada en un vehículo 
revela que no hay toxicidad, se deduce que el vehículo es atóxico a la concentración analizada; por lo tanto, no hay necesidad de controlar el vehículo.
 
SUPERVISIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN  
Caudal de aire de la cámara  
18. El caudal de aire de la cámara se controlará minuciosamente, se supervisará 
de manera continuada y se registrará como mínimo cada hora durante cada 
exposición. La supervisión de la concentración (o estabilidad) atmosférica del ensayo constituye una medida integral de todos los parámetros dinámi ­
cos y proporciona un medio indirecto de controlar todos los parámetros 
dinámicos de interés en la generación de una atmósfera. Se pondrá especial 
atención para evitar la reinspiración en las cámaras de exposición solo por la nariz en aquellos casos en los que el caudal de aire a través del sistema de exposición sea insuficiente para crear un flujo continuo del medio atmosfé ­
rico problema. Se han prescrito metodologías capaces de demostrar que no 
tiene lugar la reinspiración en las condiciones operativas establecidas (2) (11). La concentración de oxígeno debe ser como mínimo del 19 %, y la de dióxido de carbono no debe superar el 1 %. Si existen razones para suponer 
que no se van a conseguir estos valores de referencia, habrá que determinar 
las concentraciones de ambos gases.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Temperatura y humedad relativa de la cámara  
19. La temperatura de la cámara se mantendrá en 22 ± 3 °C. La humedad 
relativa en la zona de respiración de los animales, cuando se trate de expo ­
siciones de solo por la nariz y de cuerpo entero, se supervisará y registrará 
al menos tres veces en operaciones de hasta 4 horas, y cada hora en ope ­
raciones más cortas. La humedad relativa debe mantenerse idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, pero este valor de referencia puede ser inalcan ­
zable (por ejemplo, cuando se analizan mezclas acuosas) o imposible de 
medir (cuando hay interferencias de la sustancia problema en el método de 
ensayo).
 
Sustancia problema: concentración nominal  
20. Siempre que sea factible, se calculará y registrará la concentración nominal 
en la cámara de exposición. La concentración nominal es la masa de sus ­
tancia problema generada dividida por el volumen total de aire que recorre el sistema de la cámara. La concentración nominal no se usa para caracte ­
rizar la exposición de los animales, pero la comparación entre la concen ­
tración nominal y la real nos da un índice de la eficiencia generadora del 
sistema experimental, de modo que puede servir para detectar problemas en esta generación.
 
Sustancia problema: concentración real  
21. La concentración real es la concentración de sustancia problema presente en 
la zona de respiración de los animales en una cámara de inhalación. Las 
concentraciones reales se pueden calcular con métodos específicos (por ejemplo, muestreo directo, métodos de adsorción o uso de reactivos quími ­
cos y posterior caracterización analítica) o con métodos inespecíficos como 
la gravimetría por filtración. El análisis gravimétrico es aceptable exclusi ­
vamente para aerosoles de un único componente en polvo o de líquidos de baja volatilidad, y deberá sustentarse en caracterizaciones preliminares es ­
pecíficas de la sustancia problema. La concentración de los aerosoles de 
polvos multicomponentes se puede determinar también por gravimetría. Sin 
embargo, hacen falta datos analíticos que demuestren que la composición del material en el aire es afín a la del material de partida. Si no se dispone de tal información, puede ser necesario repetir el análisis de la sustancia 
problema (idealmente, el aire) a intervalos regulares a lo largo del ensayo. 
Cuando se trate de productos en forma de aerosol capaces de evaporarse o sublimarse, habrá que demostrar que el método elegido es capaz de recoger todas las fases. En el informe del estudio se harán constar las concentracio ­
nes diana, nominales y reales, pero en los análisis estadísticos destinados a 
calcular los valores de concentración letal se emplean solo las concentracio ­
nes reales. 
22. Se usará, a ser posible, un solo lote de sustancia problema, y la muestra de 
ensayo se conservará en condiciones que preserven su pureza, homogenei ­
dad y estabilidad. Antes de iniciar el estudio deberá hacerse una caracteri ­
zación de la sustancia problema consistente en un análisis de pureza y, si es 
técnicamente factible, de identidad y de cuantificación de contaminantes e impurezas. Con este fin se pueden aportar, entre otros, los siguientes datos: tiempo de retención y área relativa bajo el pico, peso molecular determinado 
mediante espectroscopia de masas o cromatografía de gases u otras deter ­
minaciones. Aunque la identidad de la muestra problema no es responsabi ­
lidad del laboratorio de análisis, la prudencia aconseja que este confirme, aunque sea dentro de ciertos límites, la caracterización facilitada por el 
promotor (por ejemplo, color, naturaleza física, etc.). 
23. La atmósfera de exposición se mantendrá constante en la medida de lo 
posible y bajo supervisión continua y/o intermitente, dependiendo del mé ­
todo analítico. Si la técnica de muestreo es intermitente, habrá que tomar 
muestras de la atmósfera de la cámara por lo menos dos veces en un ensayo de cuatro horas. De no ser esto posible por darse concentraciones bajas o un caudal de aire limitado, se podrá tomar una sola muestra en todo el período 
de exposición. Si se producen fluctuaciones importantes de una muestra a 
otra, para analizar las siguientes concentraciones se tomarán cuatro muestras
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
por exposición. Las concentraciones individuales de la cámara no deben 
desviarse de la concentración media en más de ± 10 % cuando se trata 
de gases y vapores, y en más de ± 20 % en caso de aerosoles de líquidos o sólidos. Se calculará y registrará el tiempo de equilibrado de la cámara (t
 95 ). La duración de cualquier exposición abarca el tiempo que tarda en 
generarse la sustancia problema, y tiene en cuenta el tiempo necesario para 
alcanzar t  95 . En el documento de orientación GD 39 (2) se ofrecen indica ­
ciones para el cálculo de t  95 . 
24. Cuando se manejen mezclas muy complejas de gases/vapores y aerosoles 
(por ejemplo, atmósferas de combustión y sustancias problema propulsadas con dispositivos/productos de uso final con fines determinados), cada fase 
puede comportarse de manera diferente en una cámara de inhalación, de 
modo que se seleccionará como mínimo una sustancia indicadora (analito), normalmente la sustancia activa principal de la mezcla, para cada fase (gas/ vapor y aerosol). Si el producto analizado es una mezcla, habrá que docu ­
mentar la concentración analítica de la mezcla y no solo de la sustancia o el 
componente activo (analito). En el documento de orientación GD n
 o 39 (2) 
se ofrece más información acerca de las concentraciones reales.  
Sustancia problema: granulometría  
25. La granulometría de los aerosoles se determinará al menos dos veces por 
cada período de exposición de 4 horas, empleando un impactador de cas ­
cada o un aparato alternativo como un medidor del tamaño aeorodinámico 
de partícula. Si se puede demostrar la equivalencia de los resultados obte ­
nidos con el impactador de cascada y con el aparato alternativo, entonces se podrá emplear este último durante todo el estudio. Se empleará un segundo dispositivo, como un filtro gravimétrico o un sistema de burbujeo o de 
impacto, en paralelo con el equipo principal para confirmar la eficiencia 
de recogida de este último. La concentración en masa obtenida mediante análisis granulométrico tendrá unos límites de desviación razonables con respecto a la concentración de masa obtenida mediante gravimetría por 
filtración [véase GD 39 (2)]. Si es posible demostrar su equivalencia en 
la fase inicial del estudio, podrán omitirse en lo sucesivo las pruebas con ­
firmatorias. Por razones de bienestar animal, se tomarán medidas para mi ­
nimizar la obtención de datos no concluyentes que obligarían a repetir la 
exposición. Se controlará el tamaño de partícula en los vapores cuando 
exista la posibilidad de que la condensación del vapor provoque la forma ­
ción de un aerosol, o cuando se detecten partículas en una atmósfera de vapor que puedan inducir la mezcla de fases (véase el punto 15).
 
PROCEDIMIENTO 
26. A continuación se describen dos tipos de estudios: el protocolo tradicional y 
el protocolo de C × t. Ambos protocolos pueden englobar un estudio pre ­
liminar, un estudio principal y/o un ensayo límite (protocolo tradicional) o 
de concentración límite (C × t). Cuando se sabe que uno de los sexos 
presenta mayor sensibilidad, el director del estudio podrá decidir que los ensayos se realicen solo en este. Cuando se exponen con la técnica de solo por la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos 
máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la es ­
pecie. Antes de comenzar el ensayo, se tomarán en consideración todos los datos disponibles para minimizar el uso de animales. Así, los datos a los que se refiere el capítulo B.52 del presente anexo (4) pueden obviar la necesidad 
de hacer un estudio preliminar, como también demostrar la mayor sensibi ­
lidad de uno de los sexos [véase GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
PROTOCOLO TRADICIONAL  
Consideraciones generales: protocolo tradicional  
27. En un estudio tradicional, se exponen lotes de animales a una sustancia 
problema durante un período establecido (generalmente 4 horas) en una cámara de exposición solo por la nariz o de cuerpo entero. Los animales se exponen a una concentración límite (ensayo límite) o bien a un mínimo 
de tres concentraciones progresivas (estudio principal). Puede realizarse un 
estudio preliminar antes del estudio principal, salvo que se disponga de alguna información acerca de la sustancia problema, como un estudio efec ­
tuado antes siguiendo el método del capítulo B.52 [véase GD 39 (2)].
 
Estudio preliminar: protocolo tradicional  
28. Se recurre al estudio preliminar para calcular la potencia de la sustancia 
problema, identificar las diferencias de sensibilidad en función del sexo y seleccionar los niveles de exposición que se aplicarán en el estudio principal o en el ensayo límite. Para seleccionar los niveles de concentración que se 
aplicarán en el estudio preliminar se recurrirá a toda la información disponi ­
ble, incluidos datos de (Q)SAR y los datos de sustancias afines a la estu ­
diada. A cada concentración no se expondrán más de tres machos y tres hembras (suele ser el mínimo necesario para establecer una diferencia en 
función del sexo). El estudio preliminar puede versar sobre una sola concen ­
tración, pero en caso necesario se pueden analizar más concentraciones. Un estudio preliminar nunca comportará un número de animales y de concen ­
traciones tan elevado como un estudio principal. El estudio preliminar puede 
sustituirse por un estudio B.52 (4) previamente realizado [véase GD 39 (2)].
 
Ensayo límite: protocolo tradicional  
29. El ensayo límite se practica cuando se sabe o supone que la sustancia 
problema es prácticamente atóxica, es decir, que induce una respuesta tóxica solo cuando supera la concentración límite normativa. En un ensayo límite, 
un único lote compuesto por tres machos y tres hembras es expuesto a la 
sustancia problema a una concentración límite. Puede obtenerse información acerca de la toxicidad de la sustancia estudiada a partir de los conocimientos disponibles sobre compuestos afines teniendo en cuenta cuáles son los 
componentes que se sabe que son importantes desde el punto de vista 
toxicológico y en qué porcentaje aparecen. En situaciones en que se dispone de poca o ninguna información sobre la toxicidad de la sustancia o en que se prevé que esta será tóxica, se llevará a cabo el ensayo principal. 
30. La selección de las concentraciones límite depende generalmente de los 
requisitos normativos. En virtud del Reglamento (CE) n
 o 1272/2008, las 
concentraciones límite de los gases, vapores y aerosoles son de 20 000 
ppm, 20 mg/l y 5 mg/l, respectivamente (o la concentración máxima alcan ­
zable) (3). Puede resultar técnicamente complicado generar concentraciones límite de algunas sustancias problema, especialmente de vapores y aerosoles. Cuando se analicen aerosoles, el objetivo principal será obtener un tamaño 
de partícula respirable (MMAD de 1-4 μm). Este se consigue a una concen ­
tración de 2 mg/l para la mayoría de las sustancias problema. El estudio de aerosoles a concentraciones mayores de 2 mg/l solo se emprenderá si se puede obtener un tamaño de partícula respirable [véase GD 39 (2)]. El 
Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 desaconseja los estudios que superen las 
concentraciones límite por razones de bienestar animal (3). El estudio de la concentración límite solo se contemplará cuando haya muchas probabilida ­
des de que sus resultados vayan a incidir directamente en la protección de la 
salud humana (3), lo cual deberá justificarse en el informe del estudio. 
Cuando se trate de sustancias problema potencialmente explosivas, se pro ­
curará evitar las condiciones favorables a una explosión. A fin de evitar el uso innecesario de animales, se hará una operación de prueba sin animales 
antes del ensayo límite, para confirmar que se pueden crear en la cámara las 
condiciones adecuadas para dicho ensayo límite.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Si con la concentración límite se encuentran animales muertos o moribun ­
dos, los resultados del ensayo límite pueden servir de estudio preliminar 
para nuevos ensayos con otras concentraciones (véase el estudio principal). Si las propiedades físicas o químicas de una sustancia problema hacen imposible obtener una concentración límite, se estudiará la concentración 
máxima alcanzable. Si con la concentración máxima alcanzable la letalidad 
es inferior al 50 %, no son necesarios nuevos estudios. En caso de no obtener una concentración límite, el informe del estudio deberá facilitar una explicación respaldada con datos. Si la concentración máxima alcanza ­
ble de un vapor no induce toxicidad, puede ser necesario generar la sustan ­
cia problema en forma de aerosol líquido.
 
Estudio principal: protocolo tradicional  
32. El estudio principal se realiza típicamente con cinco machos y cinco hem ­
bras (o 5 animales del sexo más sensible, si se conoce) por nivel de concen ­
tración, aplicando como mínimo tres niveles de concentración. Deben em ­
plearse niveles de concentración suficientes para obtener un análisis estadís ­
tico sólido. El intervalo de tiempo entre los grupos de exposición se deter ­
mina según la aparición, duración y gravedad de los signos tóxicos. La 
exposición de los animales al siguiente nivel de concentración se retrasará hasta tener una seguridad razonable de la supervivencia de los animales previamente estudiados. Ello permitirá al director del estudio ajustar la 
concentración diana a la que se expondrá el siguiente lote. Dada la depen ­
dencia de tecnologías sofisticadas, esto no siempre es factible en los estudios de inhalación, por lo que la exposición de los animales al siguiente nivel de concentración deberá basarse en la opinión científica y la experiencia pre ­
vias. Consúltese el documento de orientación GD 39 (2) cuando se estudien 
mezclas.
 
PROTOCOLO DE CONCENTRACIÓN × TIEMPO (C × T)  
Consideraciones generales: protocolo de C × t  
33. El estudio de C × t en progresión secuencial representa una alternativa al 
protocolo tradicional en los ensayos de toxicidad por inhalación (12) (13) (14). Con este método los animales se pueden exponer a distintas concen ­
traciones de una sustancia problema durante períodos variables. La totalidad 
del estudio tiene lugar en una cámara de exposición solo por la nariz (las cámaras de cuerpo entero no resultan prácticas en este tipo de estudios). El protocolo se ilustra en un diagrama de flujo del apéndice 1. Un análisis de 
simulación ha demostrado que tanto el protocolo tradicional como el de C × 
t son capaces de rendir valores de CL
 50 sólidos, pero que el protocolo de C 
× t proporciona en general valores más sólidos de CL  01 y de CL  10 (15). 
34. Un análisis de simulación ha demostrado que el uso de dos animales por 
intervalo de C × t (uno de cada sexo, o bien dos del sexo más sensible) es en general adecuado cuando se analizan 4 niveles de concentración y 5 tiempos 
de exposición en un estudio principal. En algunas circunstancias, el director 
del estudio puede decidir el empleo de dos ratas por sexo y por intervalo de C × t (15). El empleo de 2 animales por sexo y por valor de concentración y tiempo puede reducir el sesgo y la variabilidad de los valores estimados, 
aumentar el porcentaje de éxito de la estimación y mejorar el intervalo de 
confianza. No obstante, si el ajuste de los datos para la estimación es insu ­
ficiente (cuando se usa un animal de cada sexo o dos animales del sexo más sensible), puede bastar con agregar un quinto nivel de exposición. En GD 39 
(2) se ofrecen más orientaciones sobre el número de animales y las concen ­
traciones que deben aplicarse en un estudio de C × t.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Estudio preliminar: protocolo de C × t  
35. Se hace un estudio preliminar para estimar la potencia de la sustancia 
problema y seleccionar los niveles de exposición que se aplicarán en el estudio principal. Pueden tener que usarse hasta tres animales por sexo y 
concentración en el estudio preliminar [consúltense los detalles en el apén ­
dice III del documento de orientación GD 39 (2)] para determinar la con ­
centración inicial adecuada del estudio principal y reducir al mínimo el número de animales utilizados. Para establecer diferencias en función del 
sexo puede ser necesario emplear tres animales por sexo. Estos animales 
deberán someterse a una exposición única, por lo general de 240 minutos. La capacidad de generar una atmósfera experimental adecuada se establecerá 
en pruebas técnicas previas realizadas sin animales. Por lo regular, no será 
necesario realizar un estudio preliminar cuando existan datos de mortalidad obtenidos de un estudio previo según el capítulo B.52 (4). Al seleccionar la concentración diana inicial en un estudio B.2, el director del estudio tendrá 
en cuenta las pautas de mortalidad observadas en los estudios B.52 (4) 
previos, en relación con los sexos y con todas las concentraciones estudiadas [véase GD 39 (2)].
 
Concentración inicial: protocolo de C × t  
36. La concentración inicial (sesión de exposición I) (apéndice 1) será una 
concentración límite o bien una concentración seleccionada por el director 
del estudio sobre la base de un estudio preliminar. Lotes de 1 animal/sexo se 
exponen a esta concentración durante diferentes períodos (por ejemplo, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos), hasta sumar un total de 10 animales (es lo que llamamos sesión de exposición I) (apéndice 1). 
37. La selección de las concentraciones límite depende generalmente de los 
requisitos normativos. En virtud del Reglamento (CE) n
 o 1272/2008, las 
concentraciones límite de los gases, vapores y aerosoles son de 20 000 ppm, 20 mg/l y 5 mg/l, respectivamente (o la concentración máxima alcan ­
zable) (3). Puede resultar técnicamente complicado generar concentraciones 
límite de algunas sustancias problema, especialmente de vapores y aerosoles. Cuando se analicen aerosoles, el objetivo principal será obtener un tamaño 
de partícula respirable (es decir, un MMAD de 1-4 μm) a una concentración 
límite de 2 mg/l. Esto se consigue con la mayoría de las sustancias pro ­
blema. El estudio de aerosoles a concentraciones mayores de 2 mg/l solo se emprenderá si se puede obtener un tamaño de partícula respirable [véase GD 
39 (2)]. El Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 desaconseja los estudios que 
superen la concentración límite por razones de bienestar animal (3). Los estudios que superen la concentración límite solo se contemplarán cuando haya muchas probabilidades de que sus resultados vayan a incidir directa ­
mente en la protección de la salud humana (3), lo cual deberá justificarse en 
el informe del estudio. Cuando se trate de sustancias problema potencial ­
mente explosivas, se procurará evitar las condiciones favorables a una ex ­
plosión. A fin de evitar el uso innecesario de animales, se hará una opera ­
ción de prueba sin animales antes de comenzar el estudio a la concentración 
inicial, para confirmar que se crean en la cámara las condiciones adecuadas a esa concentración. 
38. Si con la concentración inicial se encuentran animales muertos o moribun ­
dos, los resultados obtenidos con esta concentración pueden servir como 
punto de partida para nuevos ensayos con otras concentraciones (véase el estudio principal). Si las propiedades físicas o químicas de una sustancia problema hacen imposible obtener una concentración límite, se estudiará la 
concentración máxima alcanzable. Si con la concentración máxima alcanza ­
ble la letalidad es inferior al 50 %, no son necesarios nuevos estudios. En caso de no poder obtener una concentración límite, el informe del estudio deberá facilitar una explicación respaldada con datos. Si la concentración 
máxima alcanzable de un vapor no induce toxicidad, puede ser necesario 
generar la sustancia problema en forma de aerosol líquido.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Estudio principal: protocolo de C × t  
39. La concentración inicial (sesión de exposición I) (apéndice 1) analizada en 
el estudio principal será una concentración límite o bien una concentración seleccionada por el director del estudio sobre la base de un estudio preli ­
minar. Si en el transcurso o después de la sesión de exposición I se observa 
mortalidad, la exposición mínima (C × t) que genere mortalidad se tomará como guía para establecer la concentración y los tiempos de la sesión de exposición II. Cada sesión de exposición sucesiva dependerá de la sesión 
anterior (véase el apéndice 1). 
40. En el caso de muchas sustancias problema, los resultados obtenidos con la 
concentración inicial, unidos a los de otras tres sesiones de exposición con 
un cuadriculado temporal más denso (es decir, el espaciado geométrico de los períodos de exposición, indicado por el factor entre los períodos suce ­
sivos, generalmente √2), serán suficientes para establecer la relación de 
mortalidad C × t (15); sin embargo, puede resultar conveniente agregar 
un quinto nivel de exposición [véanse el apéndice 1 y el documento de orientación GD 39 (2)]. En el apéndice 1 se describe el tratamiento mate ­
mático de los resultados del protocolo C × t.
 
OBSERVACIONES 
41. Los animales se someterán a observación clínica frecuente durante el pe ­
ríodo de exposición. Las observaciones clínicas se llevarán a cabo al menos dos veces el día de la exposición, o más frecuentemente si lo indica la respuesta de los animales al tratamiento, y en lo sucesivo al menos una 
vez al día durante un período total de 14 días. La duración del período de 
observación no es fija, antes bien deberá determinarse en función de la naturaleza y del tiempo de aparición de los signos clínicos y de la longitud del período de recuperación. Son importantes los momentos en que aparez ­
can y desaparezcan los signos de toxicidad, especialmente si hay tendencia a 
una aparición retardada de tales signos de toxicidad. Todas las observacio ­
nes se anotarán sistemáticamente en los registros individuales abiertos para cada animal. Por razones de bienestar animal, los animales moribundos o 
que den muestras de dolor fuerte o signos de sufrimiento intenso y continuo 
deben ser sacrificados de forma compasiva. En el momento de explorar los signos clínicos de toxicidad, se procurará que el mal aspecto inicial y los trastornos respiratorios transitorios, eventualmente derivados del procedi ­
miento de exposición, no se confundan con signos de toxicidad química 
que obligarían al sacrificio prematuro de los animales. Se tendrán en cuenta los principios y criterios resumidos en el  Guidance Document on Humane 
Endpoints  (GD 19) (7). Cuando se encuentre algún animal muerto o se 
sacrifique por razones compasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la muerte. 
42. Las observaciones en la jaula deberían incluir los cambios en la piel y el 
pelo, ojos y membranas mucosas, y también los sistemas respiratorio, cir ­
culatorio, nervioso central y autónomo, así como la actividad somatomotriz y las pautas de comportamiento. Cuando sea posible se anotarán las even ­
tuales diferencias entre los efectos locales y los sistémicos. Debe prestarse 
especial atención a la observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. El registro de la temperatura rectal puede ayudar a detectar una bradipnea refleja o una hipo/hipertermia relacionadas 
con el tratamiento o con el confinamiento.
 
Pesos corporales  
43. Los pesos corporales individuales se registrarán una vez durante el período 
de aclimatación, en el día previo a la exposición (día 0), y al menos en los días 1, 3 y 7 (y, en lo sucesivo, semanalmente) y en el momento de la 
muerte o de la eutanasia si se produce después del día 1. Se acepta que el 
peso corporal es un indicador crítico de la toxicidad, por lo que deberán vigilarse estrechamente los animales que muestren una reducción progresiva de peso ≥ 20 % en comparación con los valores preliminares. Los animales 
supervivientes se pesan y se sacrifican de forma compasiva al final del 
período de post-exposición.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Anatomía patológica  
44. Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran durante 
su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar animal, se someterán a autopsia macroscópica. Si la autopsia no se puede 
practicar inmediatamente después de descubrir la muerte del animal, este 
será refrigerado (no congelado) a temperaturas suficientemente bajas para minimizar la autólisis. Las autopsias se practicarán lo antes posible, normal ­
mente en el plazo de uno o dos días. Se documentarán todas las modifica ­
ciones anatomopatológicas macroscópicas observadas en cada animal, po ­
niendo especial atención en las alteraciones de las vías respiratorias. 
45. Se podrán contemplar otras exploraciones incluidas de antemano en el di ­
seño para ampliar el valor interpretativo del estudio, como la medida del peso pulmonar de las ratas que sobrevivan o el examen microscópico de las vías respiratorias para aportar pruebas de irritación. La exploración de ór ­
ganos puede extenderse a aquellos que muestren signos de anatomopatología 
macroscópica en los animales que sobreviven 24 o más horas y a los órganos que se saben o suponen afectados. El examen microscópico de la totalidad de las vías respiratorias puede proporcionar información útil en el 
caso de sustancias problema que son reactivas con el agua, como las de 
naturaleza ácida o higroscópica.
 
DATOS E INFORME  
Datos  
46. Se documentarán por separado los datos de peso corporal y los resultados de 
la autopsia de cada animal. Los resultados de la observación clínica se 
reunirán en un cuadro que presente, por cada grupo de ensayo, el número 
de animales utilizados, el número de animales que presenten signos especí ­
ficos de toxicidad, el número de animales hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte 
de los distintos animales, la descripción y la evolución temporal de los 
efectos tóxicos y su reversibilidad, y los resultados de la autopsia.
 
Informe del ensayo  
47. El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información siguiente:  
Animales de experimentación y zootecnia  
— Descripción de las condiciones de enjaulado, tales como: número (o 
variación del número) de animales por jaula, materiales de cama, tem ­
peratura ambiente y humedad relativa, fotoperíodo e identificación de la 
dieta. 
— Especie o variedad empleada y justificación para el uso de una especie 
distinta de la rata. 
— Número, edad y sexo de los animales. 
— Método de aleatorización. — Detalles de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo/origen de 
la alimentación y el origen del agua). 
— Descripción de cualquier acondicionamiento previo al estudio, incluidos 
alimentación, cuarentena y tratamiento de enfermedades.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Sustancia problema  
— Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (in ­
cluida la isomerización). 
— Identificación química y número de registro del Chemical Abstracts 
Service (CAS), si se conoce.  
Vehículo  
— Justificación del uso de un vehículo y justificación de la elección del 
mismo (si es distinto del agua). 
— Datos históricos o paralelos que demuestren que el vehículo no interfiere 
en los resultados del estudio.  
Cámara de inhalación  
— Descripción de la cámara de inhalación, incluidos las dimensiones y el 
volumen. 
— Procedencia y descripción del equipo empleado para la exposición de los 
animales y la generación de la atmósfera. 
— Equipo empleado para medir la temperatura, la humedad, el tamaño de 
partícula y la concentración real. 
— Fuente de aire, tratamiento del aire suministrado/extraído y sistema de 
acondicionamiento. 
— Métodos de calibración del equipo para garantizar una atmósfera expe ­
rimental homogénea. 
— Diferencia de presión (positiva o negativa). 
— Puertos de exposición por cámara (solo por la nariz); ubicación de los 
animales en el sistema (de cuerpo entero). 
— Homogeneidad/estabilidad temporal de la atmósfera experimental. — Localización de los sensores de temperatura y humedad, y muestreo de 
la atmósfera experimental en la cámara. 
— Caudales de aire, caudal del aire por puerto de exposición (solo por la 
nariz) o carga de animales por cámara (de cuerpo entero). 
— Descripción del equipo empleado para medir el oxígeno y el dióxido de 
carbono, si procede. 
— Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio (t
 95 ) en la cámara de inha ­
lación. 
— Número de variaciones de volumen por hora. — Dispositivos de dosificación (si procede).  
Datos relativos a la exposición  
— Justificación de la concentración diana seleccionada en el estudio prin ­
cipal. 
— Concentraciones nominales (masa total de sustancia problema generada 
en la cámara de inhalación dividida por el volumen de aire que recorre la cámara). 
— Concentraciones reales de la sustancia problema recuperadas en la zona 
de respiración de los animales; en el caso de mezclas que den lugar a 
estados físicos heterogéneos (gases, vapores, aerosoles), se podrá anali ­
zar cada uno de ellos por separado.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— Todas las concentraciones atmosféricas se registrarán en unidades de 
masa (por ejemplo, mg/l, mg/m  3 , etc.); se podrán indicar además las 
unidades de volumen (por ejemplo, ppm, ppmm, etc.) entre paréntesis. 
— Granulometría, diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) y 
desviación típica geométrica ( σ g ), incluidos los correspondientes méto ­
dos de cálculo; se documentarán los análisis granulométricos individua ­
les. 
Condiciones del ensayo  
— Descripción pormenorizada de la preparación de la sustancia problema y 
de cualquier método empleado para reducir el tamaño de partícula de las materias sólidas o preparar soluciones de la sustancia problema; cuando exista la posibilidad de que los procesos mecánicos hayan alterado la 
composición de la sustancia problema, se incluirán los resultados de los 
análisis realizados para verificar dicha composición. 
— Descripción (preferiblemente acompañada de un diagrama) del equipo 
empleado para generar la atmósfera experimental y para exponer los 
animales a la misma. 
— Descripción pormenorizada del método de análisis químico empleado y 
de la validación del método (incluida la eficacia de recuperación de la 
sustancia problema en el medio ambiente experimental). 
— Justificación de las concentraciones experimentales seleccionadas.  
Resultados  
— Tabulación de los valores de temperatura, humedad y caudal de aire de 
la cámara. 
— Tabulación de las concentraciones nominales y reales de la cámara. 
— Tabulación de los datos de tamaño de partícula, incluidos los de 
recogida de muestras para el análisis, granulometría y cálculos de MMAD y σ
 g . 
— Tabulación de las respuestas y de los niveles de concentración de cada 
animal (es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la mortalidad y la naturaleza, gravedad, momento de aparición y duración 
de los efectos). 
— Pesos corporales de cada animal registrados en el estudio; fecha y hora 
de la muerte si se produce antes de la eutanasia programada; cronología 
de la aparición de los signos de toxicidad e indicación de si estos son 
reversibles en cada animal. 
— Resultados de la autopsia y eventuales observaciones histopatológicas de 
cada animal, si se dispone de ellas. 
— Estimaciones de la letalidad (por ejemplo, CL
 50 , DL  01 ), incluidos los 
límites de confianza del 95 % y la pendiente (si lo permite el método de evaluación). 
— Relación estadística, incluida la estimación del exponente n (protocolo 
de C × t); se indicará el nombre del paquete informático.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Evaluación e interpretación de los resultados  
— Se hará especial hincapié en la descripción de los procedimientos em ­
pleados para cumplir los criterios del presente método de ensayo, esto 
es, la concentración límite o el tamaño de partícula. 
— Se tomará en consideración la respirabilidad de las partículas a la luz de 
los resultados globales, de manera especial si no se cumplen los criterios relativos al tamaño de partícula. 
— Se facilitará una explicación de si ha sido preciso sacrificar de forma 
compasiva animales con signos evidentes de dolor o de sufrimiento 
intenso y duradero, atendiendo a los criterios del documento de orien ­
tación de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo ( Guidance 
Document on Humane Endpoints ) (8). 
— Cuando se haya interrumpido algún estudio conforme al protocolo des ­
crito en el capítulo B.52 del presente anexo (4) para reemplazarlo por el 
presente método de ensayo B.2, se harán las justificaciones pertinentes. 
— En la evaluación global del estudio se expondrá la coherencia de los 
métodos empleados para determinar las concentraciones nominales y reales y la relación entre ellas. 
— Se explicará la causa probable de muerte y el mecanismo de acción 
(sistémico o local) predominante.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Available at: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines] 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/tes ­
tguidelines] 
(3) Reglamento CE n  o 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) n
 o 1907/2006 
(DO L 353 de 31.12.2008, p. 1). 
(4) Capítulo B.52 del presente anexo. Toxicidad aguda por inhalación. Método 
de las clases de toxicidad aguda. 
(5) Capítulo B.40 del presente anexo. Corrosión cutánea in vitro: Ensayo de 
Resistencia eléctrica transcutánea (REI). 
(6) Capítulo B.40 bis del presente anexo. Corrosión cutánea in vitro: Ensayo 
con modelo de piel humana. 
(7) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corro ­
sion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute 
Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. 
(10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160-167. 
(12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290. 
(13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117. 
(14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71. 
(15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.
 
DEFINICIÓN  
Sustancia problema:  Toda sustancia o mezcla analizada mediante este método 
de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Apéndice 1  
Protocolo de C × t  
1. El estudio de concentración × tiempo (C × t) en progresión secuencial 
representa una alternativa al protocolo tradicional en los ensayos de toxici ­
dad por inhalación (12) (13) (14). Se usará preferentemente cuando exista una necesidad científica o normativa específica que imponga la investiga ­
ción con animales en diferentes períodos, como es el caso de la planifica ­
ción de actuaciones de urgencia o del uso del suelo. El protocolo suele comenzar con el estudio de una concentración límite (sesión de exposición I), en el que se exponen los animales a la sustancia problema durante cinco 
intervalos de tiempo (por ejemplo, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos), de modo 
que dentro de una sesión se investigan distintos tiempos de exposición (véase la figura 1). En virtud del Reglamento (CE) n
 o 1272/2008, las con ­
centraciones límite de los gases, vapores y aerosoles son de 20 000 ppm, 20 
mg/l y 5 mg/l, respectivamente. Estas concentraciones solo podrán rebasarse 
cuando exista una necesidad científica o normativa que así lo indique (véase el punto 37 del texto principal de B.2). 
2. En los casos en que exista poca o nula información sobre la toxicidad de 
una sustancia problema se realizará un estudio preliminar, en el que grupos 
de no más de 3 animales de cada sexo se expondrán a las concentraciones 
diana seleccionadas por el director del estudio durante 240 minutos como norma general. 
3. Si se analiza una concentración límite durante la sesión de exposición I y se 
observa una mortalidad inferior al 50 %, no hacen falta más ensayos. Si se plantea una necesidad científica o normativa de establecer una relación 
concentración/tiempo/respuesta a niveles más elevados que la concentración 
límite indicada, la siguiente exposición se establecerá a un nivel tal que suponga dos veces la concentración límite (es decir, 2L en la figura 1). 
4. Si se observa toxicidad a la concentración límite, habrá que hacer nuevos 
ensayos (estudio principal). Estas exposiciones adicionales tendrán lugar, 
bien a concentraciones más bajas (en la figura 1: sesiones de exposición 
II, III o IV’), bien a concentraciones más elevadas pero durante períodos más breves (en la figura 1: sesión de exposición IV), acortando los tiempos de exposición y los intervalos entre ellos. 
5. El ensayo (de la concentración inicial y las adicionales) se lleva a cabo 
empleando 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo, o bien 2 
animales del sexo más sensible por valor de concentración/tiempo. En al ­
gunas circunstancias, el director del estudio puede decidir el uso de 2 ratas por sexo y por valor de concentración/tiempo (o 4 animales del sexo más 
sensible por valor de concentración/tiempo) (15). El empleo de 2 animales 
por sexo y por valor de concentración/tiempo puede reducir el sesgo y la variabilidad de los cálculos, mejorar el porcentaje de éxito de la estimación y aumentar el intervalo de confianza en comparación con el protocolo que 
se describe aquí. Se ofrece más información en el documento de orientación 
GD 39 (2). 
6. Lo ideal es que cada sesión de exposición se efectúe en un día. Esto 
concede la oportunidad de retrasar la siguiente exposición hasta obtener una seguridad razonable de la supervivencia, y permite al director del estu ­
dio ajustar la concentración diana y los tiempos de la siguiente sesión de 
exposición. Se recomienda iniciar cada sesión de exposición con el lote que 
va a estar expuesto más tiempo, es decir, comenzar con el lote de 240 minutos de exposición, seguido del lote de 120 minutos, y así sucesivamen ­
te. Si, por ejemplo, los animales del lote de 240 minutos mueren ya a los 90 
minutos o muestran signos graves de toxicidad (por ejemplo, alteraciones 
importantes de la pauta de respiración, como dificultad al respirar), carece de sentido exponer otro lote a un tiempo de 120 minutos ya que la morta ­
lidad será probablemente del 100 %. De modo que el director del estudio 
seleccionará tiempos de exposición más breves para esa concentración (por 
ejemplo, 90, 65, 45, 33 y 25 minutos).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. La concentración de la cámara se medirá con frecuencia para determinar la 
concentración media ponderada de cada período de exposición. Siempre que 
sea posible, se tomará para el análisis estadístico el momento de la muerte de cada animal (mejor que la duración de la exposición). 
8. Los resultados de las cuatro primeras sesiones de exposición se analizarán 
con objeto de detectar lagunas en los datos de la curva de concentración- tiempo (véase la figura 1). En caso de ajuste insuficiente, se podrá proceder 
a una nueva exposición (5
 a concentración). En ella, la concentración y los 
períodos de exposición se elegirán para cubrir la laguna detectada. 
9. Se tomarán todas las sesiones de exposición (incluida la primera) para 
calcular la relación concentración-tiempo-respuesta aplicando el análisis es ­
tadístico (16). En la medida de lo posible, por cada intervalo de C × t se tomarán la concentración media ponderada en función del tiempo y la 
duración de la exposición hasta el momento de la muerte (si esta se produce 
durante la exposición).
 
Figura 1  
Ilustración hipotética de la relación concentración-tiempo-mortalidad en la 
rata
 
Símbolos huecos = animales supervivientes; símbolos macizos = animales 
muertos 
Triángulos = hembras; círculos = machos Línea continua = valores de CL
 50 (intervalo de 7,5-240 min) de los machos, 
n = 1 
Línea de trazos = valores de CL  50 (intervalo de 7,5-240 min) de las hem ­
bras, n = 1 
Líneas de puntos = valores hipotéticos de CL  50 de machos y hembras, bajo 
el supuesto de n igual a 2 (12). 
Glosario 
Concentración: 
Tiempo de exposición:  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. A continuación se expone un ejemplo de progresión secuencial:  
Sesión de exposición I — Estudio realizado a la concentración límite 
(figura 1)  
— 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en 
total (  a ) 
— Concentración diana (  b ) = concentración límite. 
— Se exponen cinco lotes de animales a esta concentración diana durante 
períodos de 15, 30, 60, 120 y 240 minutos, respectivamente.  
↓ 
Sesión de exposición II  ( c ) — Estudio principal  
— 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en 
total. 
— Se exponen cinco lotes de animales a una concentración inferior (  d ) 
(1/2L) con tiempos de exposición algo más largos (espaciado de factor 
√2; véase la figura 1).  
↓ 
Sesión de exposición III — Estudio principal  
— 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en 
total. 
— Se exponen cinco lotes de animales a una concentración inferior (  d ) 
(1/4L) con tiempos de exposición algo más largos (espaciado de factor √2; véase la figura 1).  
↓
 
Sesión de exposición IV’ — Estudio principal  
— 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en 
total. 
— Se exponen cinco lotes de animales a una concentración inferior (  d ) 
(1/8L) con tiempos de exposición algo más largos (espaciado de factor √2; véase la figura 1).  
↓ o
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Si no se dispone de datos de sensibilidad en función del sexo, se usarán ratas de ambos 
sexos, es decir, 1 animal por sexo y por concentración. De existir información previa, o si se pone de manifiesto en esta sesión de exposición que uno de los sexos es más 
sensible, en los siguientes ensayos se someterán 10 animales del sexo sensible (2 por 
cada valor de concentración/tiempo) a cada nivel de concentración. 
(
 b ) En virtud del Reglamento (CE) n  o 1272/2008, las concentraciones límite de los gases, 
vapores y aerosoles son de 20 000 ppm, 20 mg/l y 5 mg/l, respectivamente. Si cabe 
esperar toxicidad o así lo indican los resultados del estudio preliminar, se seleccionarán 
concentraciones iniciales más bajas. Por necesidades científicas o normativas se podrán 
aplicar concentraciones más elevadas. 
( c ) Idealmente, la exposición de los animales al siguiente nivel de concentración se retrasará 
hasta tener una seguridad razonable de la supervivencia de los animales previamente 
tratados. Ello permitirá al director del estudio ajustar la concentración diana y los tiempos 
de la siguiente sesión de exposición. 
( d ) La dosis mínima (concentración × tiempo) capaz de inducir mortalidad en el estudio de 
la concentración inicial (primera sesión de exposición) se tomará como base para esta ­
blecer la siguiente combinación de concentración y períodos de exposición. Habitual ­
mente, la concentración se reduce a la mitad (1/2L) y los animales se exponen a un 
cuadriculado temporal más denso, aplicando una división geométrica de los períodos de 
exposición según un factor de 1,4 ( √2; véase la referencia 11) en torno al tiempo que 
corresponde a la dosis letal mínima (tiempo × concentración) observada en la primera 
sesión de exposición. Según la figura 1, en la sesión de exposición I se observó mor ­
talidad por primera vez a los 15 minutos; los tiempos aplicados durante la sesión II, por 
tanto, se centrarán en torno a los 30 minutos, y serán de 15, 21, 30, 42 y 60 min. 
Después de las dos primeras exposiciones, resulta muy aconsejable proyectar los resul ­
tados en una gráfica semejante a la indicada más arriba, y comprobar si la relación entre 
concentración y tiempo presenta un ángulo de 45 grados (n = 1), o si la relación 
concentración-tiempo-respuesta es de pendiente menos pronunciada (por ejemplo, n = 
2) o más pronunciada (por ejemplo, n = 0,8). En los dos últimos casos se recomienda 
encarecidamente adaptar en consecuencia los siguientes valores de concentración y 
tiempo aplicados.
 Sesión de exposición IV — Estudio principal  
— 1 animal por sexo y por valor de concentración/tiempo; 10 animales en 
total. 
— Se exponen cinco lotes de animales a una concentración superior (  e ) (2L) 
con tiempos de exposición algo más cortos (espaciado de factor √2; 
véase la figura 1).  
Tratamiento matemático de los resultados obtenidos con el protocolo de 
C × t  
11. Un estudio de C × t con 4 o 5 concentraciones y cinco períodos de expo ­
sición rendirá, respectivamente 20 o 25 puntos de datos. A partir de estos puntos de datos se puede calcular la relación C × t aplicando el análisis 
estadístico (16):  
Ecuación1: 
ProbitðPÞ ¼ b
 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
donde C = concentración; t = período de exposición, o  
Ecuación 2: 
Respuesta ¼ ƒðC n tÞ 
donde  n ¼ b 1=b 2: 
Aplicando la ecuación 1, se puede calcular el valor de CL  50 para un período 
dado (por ejemplo, 4 horas, 1 hora, 30 minutos o cualquier período dentro 
del intervalo de períodos estudiados) haciendo P = 5 (50 % de respuesta). Obsérvese que la regla de Haber solo es aplicable para n = 1. La CL
 01 se 
puede calcular haciendo P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) En determinados casos puede ser necesario aumentar la concentración (2L) y aplicar un 
cuadriculado temporal aún más denso, haciendo una división geométrica de los períodos 
de exposición por un factor de 1,4 ( √2) en torno al tiempo que corresponde a la concen ­
tración letal mínima observada en la primera exposición. El período mínimo de exposi ­
ción rebasará preferiblemente los 5 minutos; el período máximo de exposición no debe 
superar las 8 horas.
 B.3. TOXICIDAD AGUDA POR VÍA CUTÁNEA  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la introducción general de la parte B (letra A).  
1.2. DEFINICIONES 
Véase la introducción general de la parte B (letra B).  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se administran dosis diferentes de la sustancia de ensayo por apli ­
cación cutánea a varios lotes de animales de laboratorio, utilizándose 
una sola dosis por lote. Se observan a continuación los efectos y la 
mortalidad causados por la sustancia. Se realiza la autopsia a los animales que mueran durante el ensayo así como al final de esta, a los que hayan sobrevivido. 
Los animales que muestren signos de dolor y angustia graves y 
duraderos deberán sacrificarse de forma humanitaria. No se adminis ­
trarán sustancias que produzcan dolor y angustia graves debido a sus propiedades corrosivas o irritantes.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Preparación  
Se mantiene a los animales en las jaulas para el experimento en las 
condiciones de alojamiento y alimentación adecuadas para el ensayo 
por lo menos durante los 5 días anteriores. Antes de comenzar el 
ensayo se eligen al azar animales adultos jóvenes y sanos y se reparten entre los diferentes lotes del ensayo. Unas 24 horas antes 
del ensayo se esquila o se rasura el pelo de la región dorsal del 
tronco de los animales, evitando cualquier lesión de la piel que pueda modificar su permeabilidad. La superficie que hay que prepa ­
rar para la aplicación de la sustancia no debe ser inferior al 10 % de 
la superficie corporal. Cuando se sometan a ensayo sólidos, que 
puedan pulverizarse eventualmente, la sustancia deberá humedecerse con agua o, si es preciso, con un vehículo adecuado, para asegurar un buen contacto con la piel. Si se utiliza un vehículo, se habrá de 
tener en cuenta su incidencia sobre la penetración de la sustancia en 
la piel. Las sustancias líquidas, generalmente, se aplican sin diluir.
 
1.6.2.  Condiciones del ensayo  
1.6.2.1.  Animales de laboratorio  
Se pueden utilizar ratas o conejos adultos. Se pueden utilizar igual ­
mente otras especies pero, en tal caso, hay que justificar su utiliza ­
ción. Es preciso utilizar cepas de laboratorio corrientes. Para cada 
sexo, la diferencia de peso al comienzo del ensayo entre los animales 
utilizados no debe exceder de ± 20 % del valor medio apropiado.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Número y sexo  
Para cada dosis se utilizarán al menos 5 animales del mismo sexo. Si 
se utilizan hembras, deberán ser nulíparas y no grávidas. Cuando se disponga de información que demuestre que un sexo es mucho más 
sensible, se utilizarán para la prueba animales de ese sexo.  
Nota:  Se considerará la posibilidad de utilizar un número menor de 
animales cuando se realicen ensayos de toxicidad aguda con anima ­
les de un orden superior al de los roedores. Las dosis se seleccio ­
narán cuidadosamente y se hará todo lo posible por no sobrepasar 
dosis moderadamente tóxicas. Se evitará en esos ensayos la adminis ­
tración de dosis letales de la sustancia de estudio.
 
1.6.2.3.  Dosis  
Las dosis deben ser en número suficiente, al menos tres, y espacia ­
das adecuadamente para producir lotes que presenten variedad de 
efectos tóxicos y de mortalidad, Al elegir las dosis debe tomarse 
en consideración cualquier efecto irritante o corrosivo. Los resultados deben ser suficientes para que se pueda trazar una curva dosis/res ­
puesta y, si fuera posible, permitir una determinación válida de la 
DL
 50 . 
1.6.2.4.  Prueba límite  
Puede realizarse un ensayo límite, con dosificación única de al me ­
nos 2 000 mg/kg de peso corporal, en un grupo de 5 machos y 5 
hembras, utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Si hay mortalidad debida a la sustancia, habrá que considerar la reali ­
zación de un estudio completo.
 
1.6.2.5.  Período de observación  
El período de observación debe ser de, al menos, 14 días. Sin em ­
bargo, su extensión no debe fijarse de forma rígida, sino que debe 
determinarse en función de las reacciones de toxicidad, su velocidad de aparición y la duración del período de curación; por lo tanto, puede prolongarse en caso de necesidad. Es importante el momento 
en el que aparecen y en el que desaparecen los síntomas de toxici ­
dad, así como el momento de la muerte, sobre todo si se observa en la sustancia una tendencia a causar una muerte retardada.
 
1.6.3.  Procedimiento  
Los animales deben estar alojados en jaulas individuales. La sustan ­
cia debe aplicarse sobre una superficie equivalente al 10 % de la superficie total del cuerpo. En el caso de sustancias altamente tóxicas 
la superficie puede ser menor, pero procurando que en toda la su ­
perficie la sustancia forme una película lo más fina y uniforme posible. 
Las sustancias de ensayo deben mantenerse en contacto con la piel 
por medio de un apósito de gasa porosa y un esparadrapo no irritante 
durante 24 horas. Además, la parte tratada debe estar conveniente ­
mente cubierta para mantener en su lugar el apósito de gasa y la sustancia e impedir que los animales puedan ingerir esta última. Se pueden utilizar aparatos de contención para impedir que los animales 
ingieran la sustancia, pero no se recomienda una inmovilización 
completa.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Al término del período de aplicación de la sustancia de ensayo, esta 
deberá eliminarse, a ser posible, con agua o con otro procedimiento 
adecuado de limpieza de la piel. 
Las observaciones se registrarán sistemáticamente a medida que se 
efectúen, abriendo una ficha individual para cada animal. El pri ­
mer día las observaciones deben efectuarse con frecuencia. Deberá hacerse un examen clínico atento al menos cada día laborable. 
Diariamente deberán hacerse otras observaciones actuando de ma ­
nera que se reduzca el número de animales perdidos para el estudio, por ejemplo mediante autopsia o refrigeración de los ani ­
males muertos, así como aislamiento o sacrificio de los animales 
débiles o moribundos. 
Las observaciones deben incluir las modificaciones del pelo, la piel 
tratada, los ojos y las mucosas, el aparato respiratorio, el sistema circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la actividad somato-motriz y el comportamiento. Deben observarse con especial 
atención los temblores, las convulsiones, la salivación, las diarreas, el 
letargo, el sueño y el coma. El momento de la muerte debe anotarse con la mayor precisión posible. Se hará la autopsia a los animales que mueran durante el experimento y, al final del mismo, a los que 
hayan sobrevivido. Deben registrare todas las modificaciones pato ­
lógicas macroscópicas. Si es necesario se extraerán te]idos para un examen histopatológico posterior.
 
Valoración de la toxicidad en el otro sexo  
Tras completar el estudio en uno de los sexos, se hará un estudio con 
al menos un grupo de 5 animales del sexo contrario, de forma que quede establecido que los animales de este sexo no son mucho más sensibles a la sustancia de ensayo. En circunstancias particulares 
podrá justificarse el uso de menor número de animales. Cuando se 
disponga de información adecuada que demuestre que los animales del sexo sometido a prueba son mucho más sensibles, podrá pres ­
cindirse del ensayo en animales del otro sexo.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados deberán inventariarse en un cuadro que indique, para 
cada lote, el número de animales al principio del ensayo, el momento 
de la muerte de cada animal, el número de animales que presenten 
otros síntomas de toxicidad, la descripción de los efectos tóxicos y los resultados de la autopsia. El peso de cada animal debe determi ­
narse y anotarse poco antes de la aplicación de la sustancia y, des ­
pués de la misma, una vez por semana y en el momento de su 
muerte; deben calcularse y registrarse las variaciones de peso cuando la supervivencia del animal supere un día. Los animales que se sacrifiquen de forma humanitaria debido a angustia o dolor causados 
por la sustancia se registrarán como muertes debidas a la sustancia. 
La DL
 50 debe determinarse mediante un método reconocido. 
La evaluación de los resultados debe incluir la eventual relación que 
exista entre la exposición de los animales a la sustancia y la inci ­
dencia y gravedad de todas las anomalías, incluidas las anomalías 
clínicas y del comportamiento, las lesiones macroscópicas, los cam ­
bios de peso corporal, la mortalidad y cualquier otro efecto tóxico.  
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimen ­
tario, etc., 
— condiciones de ensayo (incluido el procedimiento de limpieza de 
la piel y el tipo de apósito: oclusivo o no oclusivo), 
— dosis (indicando las concentraciones y, en su caso, el vehículo), — sexo de los animales utilizados, — tabla de respuestas por sexo y por dosis (número de animales que 
mueren o son sacrificados durante el ensayo, número de animales 
con síntomas de toxicidad, número de animales expuestos), 
— momento de la muerte después de administrar la dosis, motivos y 
criterios para el sacrificio humanitario de los animales, 
— todas las observaciones, — valor de la DL
 50 para el sexo sometido a un estudio completo, 
determinado el decimocuarto día, indicando con precisión el mé ­
todo de cálculo, 
— intervalo de confianza estadística del 95 % para la DL  50 (si es 
posible determinarlo), 
— curva dosis/mortalidad y pendiente de la curva si el método de 
cálculo lo permite, 
— resultados de la autopsia, 
— observaciones histopatológicas, 
— resultado de cualquier ensayo en el sexo contrario, — discusión de los resultados (prestando especial atención al efecto 
que puede tener sobre la DL
 50 calculada el sacrificio humanitario 
de animales durante el ensayo), 
— interpretación de los resultados.  
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la introducción general de la parte B (letra D).  
4. REFERENCIAS  
Véase la introducción general de la parte B (letra E).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. TOXICIDAD AGUDA: IRRITACIÓN/CORROSIÓN CUTÁNEA  
1. MÉTODO  
Este método de evaluación es equivalente al método TG 404 de la 
OCDE (2002).  
1.1 INTRODUCCIÓN 
En el desarrollo la confección de este método actualizado se ha 
prestado atención especial a las posibles mejoras en relación con 
las cuestiones del bienestar de los animales y con la evaluación de toda la información existente sobre la sustancia analizada, para no someter a los animales de laboratorio a pruebas innecesarias. En este 
método se incluye la recomendación de que, antes de llevar a cabo la 
prueba  in vivo  que se describe para evaluar la corrosión/irritación de 
la sustancia, hay que analizar la carga de la prueba que aportan los datos relevantes existentes. Cuando los datos disponibles sean insu ­
ficientes, se podrán obtener mediante la aplicación de secuencias de 
pruebas (1). La estrategia de evaluación recomendada incluye la realización de pruebas  in vitro  validadas y aceptadas, y se recoge 
en un anexo de este método. Además, cuando proceda, se reco ­
mienda la aplicación sucesiva, no simultánea, de tres aplicaciones 
de ensayo a los animales en el ensayo  in vivo  inicial. 
Por interés de la ciencia y del bienestar de los animales no se 
realizarán pruebas  in vivo  hasta que se hayan evaluado todos los 
datos relevantes sobre el potencial de corrosión/irritación cutánea 
de la sustancia en un análisis de la carga de la prueba. Dichos datos 
incluirán los obtenidos en estudios existentes realizados con seres humanos o con animales de laboratorio, los demostrativos de corro ­
sión/irritación por parte de una o más sustancias relacionadas estruc ­
turalmente o por una mezcla de las mismas, los que demuestran la 
elevada acidez o alcalinidad de la sustancia (2) (3) y los obtenidos en pruebas  in vitro  o ex vivo  validadas y aceptadas (4)(5)(5a). Este 
análisis debe reducir la necesidad de realizar pruebas  in vivo  de la 
corrosión/irritación cutánea de aquellas sustancias de las que ya se 
disponga de datos de otros estudios efectuados sobre esos dos crite ­
rios de valoración. 
En un anexo de este método se recoge el orden recomendado para 
efectuar los ensayos, incluidos los ensayos  in vitro  o ex vivo  valida­
dos y aceptados sobre corrosión e irritación. Se trata de una estra ­
tegia desarrollada por un taller de la OCDE, cuyos participantes la recomendaron de manera unánime (6), y ha sido adoptada como estrategia de evaluación por el sistema armonizado global para la 
clasificación de sustancias químicas [ Globally Harmonised System 
for the Classification of Chemical Substances  GHS)] (7). Aunque 
dicha estrategia de evaluación secuencial no forma parte integrante del método de evaluación B.4, se recomienda seguirla antes de llevar 
a cabo ensayos  in vivo.  Es el nuevo enfoque de evaluación escalo ­
nada recomendado para obtener datos científicamente garantizados sobre la corrosión/irritación de la sustancia. Para sustancias existen ­
tes con datos insuficientes sobre su corrosión/irritación cutánea se 
utilizará la estrategia para obtener los datos que falten. Será necesario 
justificar el empleo de una estrategia o procedimiento de evaluación diferente, o la decisión de no utilizar un procedimiento escalonado. 
Si no fuera posible determinar el poder de corrosión o irritación 
mediante un análisis de la carga de la prueba compatible con la 
estrategia secuencial de evaluación, se considerará la posibilidad de 
realizar un ensayo  in vivo  (véase el anexo).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2 DEFINICIONES  
Irritación cutánea:  lesión reversible de la piel tras la aplicación de 
una sustancia de ensayo durante 4 horas.  
Corrosión cutánea:  lesión irreversible de la piel; en concreto, ne ­
crosis visible de la epidermis y la dermis, que se produce tras la 
aplicación de una sustancia de ensayo durante cuatro horas. Las reacciones corrosivas se caracterizan por úlceras, hemorragias, cos ­
tras sanguinolentas y, al cabo de 14 días de observación, cambio de 
coloración por palidez de la piel, zonas completas de alopecia y cicatrices. Para evaluar las lesiones cuestionables se utilizará la his ­
topatología.
 
1.3 PRINCIPIO DEL MÉTODO DE EVALUACIÓN 
La sustancia analizada se aplica en una sola dosis a la piel de un 
animal de experimentación; las zonas de la piel no tratadas de dicho 
animal sirven de control. Se comprueba y puntúa el grado de irrita ­
ción/corrosión a intervalos determinados, y luego se describen para la completa evaluación de los efectos. La duración del estudio ha de 
ser suficiente para evaluar la reversibilidad o irreversibilidad de los 
efectos observados. 
Los animales que muestren signos continuados de deterioro o dolor 
graves en cualquier fase del ensayo deben ser sacrificados, con la 
consiguiente evaluación de la sustancia. Los criterios para sacrificar a 
los animales moribundos y que sufren intensamente se recogen en la referencia (8).
 
1.4 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1  Preparación para el ensayo  in vivo  
1.4.1.1  Selección de las especies de animales  
El animal de laboratorio que se prefiere es el conejo albino; se 
utilizan adultos jóvenes sanos. Si se utilizan otras especies será necesario justificarlo.
 
1.4.1.2  Preparación de los animales  
Aproximadamente 24 horas antes del ensayo se afeitará el pelo con 
cuidado en la zona dorsal del tronco de los animales. Se tendrá cuidado en no dañar la piel, y solo se utilizarán animales con piel sana e intacta. 
Algunas razas de conejo tienen densas placas de pelo que son más 
llamativas en determinadas épocas del año. Dichas zonas no deben utilizarse para las evaluaciones.
 
1.4.1.3  Condiciones de alojamiento y alimentación  
Los animales deben ser alojados de manera individual. La tempera ­
tura de los animalarios debe ser de 20  o C (± 3  o C) para los conejos. 
Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y 
preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 de oscuridad. Para la ali ­
mentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, 
con suministro ilimitado de agua para beber.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2  Procedimiento del ensayo  
1.4.2.1  Aplicación de la sustancia estudiada  
La sustancia en estudio debe aplicarse a una pequeña zona de piel 
(de unos 6 cm  2 ), que se cubrirá con una gasa y se sujetará con 
esparadrapo no irritante. Cuando no sea posible la aplicación directa 
(por ejemplo, líquidos o algunas pastas), la sustancia en estudio se aplicará primero a la gasa, y a continuación a la piel. La gasa debe quedar en contacto suave con la piel mediante el correspondiente 
vendaje semioclusivo durante el período de exposición. Si se aplica 
la sustancia a la gasa, esta debe sujetarse a la piel de forma que el contacto sea bueno y la sustancia se distribuya de manera uniforme 
por la piel. Se evitará que el animal tenga acceso a la gasa y que 
pueda comérsela o inhalar la sustancia. 
Las sustancias líquidas suelen utilizarse sin diluir para su análisis. 
Para evaluar sólidos (que se pueden pulverizar si se considera nece ­
sario) la sustancia se humedecerá con el mínimo de agua posible (o 
con otro vehículo adecuado, si se considera necesario), para garan ­
tizar un buen contacto con la piel. Si se utilizan vehículos distintos del agua, la posible influencia del vehículo sobre la irritación cutánea 
que produce la sustancia en estudio ha de ser mínima o ' nula. 
Finalizado el período de exposición, que normalmente es de 4 horas, 
se eliminarán los residuos de la sustancia cuando ello sea posible, con agua o con un disolvente adecuado que no altere la respuesta 
producida ni la integridad de la epidermis.
 
1.4.2.2  Nivel de dosis  
Se aplicará una dosis de 0,5 ml de líquido o de 0,5 de sólido o pasta 
en el punto de aplicación.  
1.4.2.3  Ensayo inicial (ensayo de irritación/corrosión cutánea in vivo con 
un animal)  
Se recomienda encarecidamente realizar el ensayo  in vivo  inicial­
mente con un solo animal, especialmente cuando se sospecha que la sustancia es corrosiva. 
Esto coincide con la estrategia de evaluación secuencial (véase el 
anexo l) diando el análisis de la carga de la prueba determine que 
una sustancia es corrosiva no se realizarán más ensayos con anima ­
les. En la mayor parte de los casos en que se sospecha que una sustancia es corrosiva no es necesario realizar más ensayos  in vivo.  
Pero cuando se crea necesario disponer de datos adicionales por no 
ser suficientes los obtenidos, pueden hacerse otros ensayos con ani ­
males con arreglo a los siguiente: Se hará un máximo de tres apli ­
caciones secuenciales al animal. La primera se retira a los tres mi ­
nutos. Si no se observa reacción cutánea grave se aplica una segun ­
da, que se retira al cabo de una hora. Si en este momento las observaciones indican que desde un punto humanitario se puede aumentar la exposición hasta cuatro horas, se hace una tercera apli ­
cación que se retira al cabo de cuatro horas, y se gradúa la respuesta. 
Si en alguna de las exposiciones secuenciales se observa un efecto 
corrosivo se suspende la prueba inmediatamente. Si una vez retirada la última aplicación no se observa efecto corrosivo, se somete a 
observación al animal durante 14 días, a menos que aparezca corro ­
sión antes.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
Si no está previsto que la sustancia analizada sea corrosiva pero sí 
irritante, se hará una sola aplicación a un solo animal durante cuatro 
horas.  
1.4.2.4  Ensayo de confirmación (ensayo de irritación cutánea in vivo con 
animales adicionales)  
Si en el ensayo inicial no se observa efecto corrosivo se confirmará 
la respuesta irritante o negativa con un máximo de dos animales más, 
cada uno con una aplicación, durante un período de exposición de 
cuatro horas. Si se observa efecto irritante en el ensayo inicial el ensayo de confirmación debe hacerse de forma secuencial, o expo ­
niendo a otros dos animales a la vez. En el caso excepcional de que 
no se realice el ensayo inicial se podrán tratar dos o tres animales 
con una sola aplicación, que se retirará al cabo de cuatro horas. Cuando se utilicen dos animales no será necesario realizar más en ­
sayos si ambos muestran la misma respuesta. En caso contrario se 
analizará el tercer animal. Si la respuesta es equívoca puede ser 
necesario evaluar a más animales.
 
1.4.2.5  Período de observación  
La duración del período de observación debe ser suficiente para 
evaluar por completo la reversibilidad de los efectos observados. No obstante se dará por finalizado el experimento si en cualquier 
momento el animal presenta signos continuados de dolor o malestar 
graves. Para determinar la reversibilidad de los efectos los animales serán sometidos a observación durante 14 días a partir de la retirada 
de las aplicaciones. Si se observa la irreversibilidad antes de 14 días 
el experimento debe concluir en ese momento.
 
1.4.2.6  Observaciones clínicas y graduación de las reacciones cutáneas  
En todos los animales se examinarán los signos de eritema y edema, 
puntuando las repuestas al cabo de 60 minutos, 24, 48 y 72 horas de la retirada de la aplicación. En el caso de ensayo inicial con un solo 
animal la zona de ensayo también se examina inmediatamente des ­
pués de retirar la aplicación. Las reacciones cutáneas se gradúan y registran conforme a los grados de la siguiente tabla. Si al cabo de 72 horas hay una lesión que no se puede clasificar como irritación o 
corrosión, quizá sea necesario observarla hasta el día 14 para deter ­
minar la reversibilidad de los efectos. Además de observar la irrita ­
ción se realizará una descripción completa de todos los efectos tó ­
xicos, como la destrucción de la grasa de la piel, y de cualquier 
efecto adverso sistémico (por ejemplo, los efectos sobre los signos 
clínicos de toxicidad y el peso corporal), que se registrarán. Puede ser necesaria una evaluación histopatológica para aclarar respuestas equívocas. 
La graduación de las respuestas cutáneas es subjetiva necesariamen ­
te. Para armonizar tal graduación y ayudar a los laboratorios y a quienes efectúan e interpretan las observaciones, el personal encar ­
gado recibirá formación adecuada sobre el sistema de puntuación 
utilizado (véase la tabla siguiente). Puede ser útil disponer de una 
guía ilustrada para graduar la irritación cutánea y otras lesiones (9). La graduación de las respuestas cutáneas debe hacerse en condicio ­
nes ciegas.
 
2. DATOS  
2.1 PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los resultados del estudio se resumirán en tablas; el informe final 
debe cubrir todos los apartados enumerados en la sección 3.1.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2 EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Las puntuaciones de la irritación cutánea deben evaluarse junto con 
la naturaleza y la intensidad de las lesiones, y el hecho de si son reversibles o no. Las puntuaciones individuales no constituyen una 
referencia absoluta de las propiedades irritativas del material, pues 
también se evalúan otros efectos del material evaluado. En su lugar las puntuaciones individuales deben considerarse como valores de referencia, que han de ser evaluadas en combinación con todas las 
demás observaciones del estudio. 
Para evaluar las respuestas irritativas hay que tener en cuenta la 
reversibilidad de las lesiones cutáneas. Si se producen respuestas como alopecia (zona limitada), hiperqueratosis, hiperplasia y desca ­
mación y persisten al final del período de observación de 14 días se 
considerará que la sustancia analizada es un irritante.
 
3. NOTIFICACIÓN  
3.1 INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la siguiente información: 
Justificación del ensayo  in vivo:  análisis de la carga de los ensayos 
realizados anteriormente, incluidos los resultados de la estrategia de evaluación secuencial. 
— descripción de datos relevantes de ensayos realizados anterior ­
mente, 
— datos obtenidos en cada fase de la estrategia de evaluación, — descripción de los ensayos  in vitro  realizados, con detalles de los 
procedimientos los resultados obtenidos con las sustancias anali ­
zadas/de referencia, 
— análisis dela carga de la prueba para realizar el estudio  in vivo.  
Sustancia analizada: — datos de identificación (por ejemplo, número CAS; origen; pure ­
za; impurezas conocidas; número de lote), 
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, vo ­
latilidad, estabilidad, solubilidad), 
— si se trata de una mezcla, composición y porcentajes relativos de 
los componentes. 
Vehículo: — identificación, concentración (en su caso), volumen utilizado, — justificación de la elección del vehículo. Animales de experimentación: — especia/cepa utilizada, justificación del uso de animales que no 
sean conejos albinos, 
— número de animales de cada sexo, — peso de los animales individuales al principio y al final del 
ensayo, 
— edad al inicio del estudio, — origen de los animales, condiciones del alojamiento, dieta, etc.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Condiciones del análisis: 
— técnicas de preparación de la zona donde se realizará el análisis, — detalles de los materiales del parche utilizados, y de la técnica de 
aplicación del parche, 
— detalles de la preparación, aplicación y retirada de la sustancia 
analizada. 
Resultados: — tabulación de las puntuaciones de las respuestas de irritación/co ­
rrosión de cada animal en todos los puntos temporales medidos, 
— descripciones de todas las lesiones observadas, — descripción narrativa de la naturaleza y el grado de irritación o de 
corrosión observado, y hallazgos histopatológicos efectuados, 
— descripción de otros efectos adversos locales (por ejemplo, des ­
trucción de la grasa de la piel) y sistémicos, además de la irri ­
tación o corrosión cutánea. 
— Comentario de los resultados
 
4. REFERENCIAS  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Ver ­
haar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alter ­
native Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro, 2,  19-26. 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. 
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, «Skin Irritation», Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Bru ­
selas. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483-524. 
(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion. (6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Re ­
port of the OECD Workshop on Harmonization of Validation 
and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Pronunciado en Solna, Suecia, 22-24 de enero de 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm). 
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemi ­
cal Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the 
Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, no ­
viembre de 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD En ­
vironmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/mo ­
nos.htm). 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United Sta ­
tes Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, agosto de 1990. 
[Puede solicitarse a la Secretaría de la OCDE].
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabla I  
GRADUACIÓN DE LAS REACCIONES CUTÁNEAS  
Eritema y formación de escaras  
Sin eritema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0  
Eritema muy leve (apenas perceptible) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Eritema bien definido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Eritema moderado a intenso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Eritema intenso (enrojecimiento color carne) o formación de escaras que 
impide graduarlo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Máximo posible 4
 
Formación de edema  
Sin edema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0  
Edema muy leve (apenas perceptible) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Edema ligero (los bordes de la zona están bien definidos por elevacio ­
nes concretas) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Edema moderado (elevación de 1 mm aproximadamente) . . . . . . . . . . . . 3 
Edema intenso (elevación superior a 1 mm y extensión que sobrepasa la 
zona de exposición) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Máximo posible: 4 
Puede ser necesaria una evaluación histopatológica para aclarar respuestas equí ­
vocas.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
ANEXO  
Estrategia de evaluación secuencial de la irritación y la corrosión cutáneas  
CONSIDERACIONES GENERALES  
Aunque la presente estrategia de evaluación secuencial no forma parte integrante 
del método de evaluación B.4., sí expresa el enfoque recomendado para la 
determinación de las características de irritación/corrosión cutáneas. Este enfoque 
representa la práctica óptima y una piedra angular desde el punto de vista ético para el análisis  in vivo  de la irritación/corrosión cutáneas. El método de evalua ­
ción proporciona instrucciones para la realización del ensayo  in vivo,  y resume 
los factores que se han de abordar antes de ponerla en marcha. La estrategia 
proporciona un enfoque para la evaluación de los datos existentes sobre las propiedades de irritación/corrosión cutáneas de las sustancias analizadas, y un enfoque por partes para generar datos relevantes sobre sustancias que necesitan 
estudios adicionales o que no han sido estudiadas. También recomienda la re ­
alización de ensayos  in vitro  o ex vivo  validados y aceptados para la corrosión/ 
irritación cutáneas en circunstancias concretas. 
Es importante evitar el uso innecesario de animales y reducir al mínimo los 
ensayos que con toda probabilidad producen respuestas graves en los animales, por su bienestar y por motivos científicos. Antes de considerar la realización de 
ensayos  in vivo  hay que evaluar toda la información sobre una sustancia en lo 
que respecta a su posible poder corrosivo/irritativo cutáneo. Puede que existan pruebas suficientes para clasificar el potencial corrosivo o irritativo dérmico de una sustancia analizada, sin necesidad de realizar ensayos con animales de labo ­
ratorio. Por eso el uso del análisis de la carga de la prueba y de una estrategia de 
evaluación secuencial reducirá al mínimo la necesidad de realizar ensayos  in 
vivo,  especialmente si es probable que la sustancia produzca reacciones graves. 
Se recomienda utilizar un análisis de la carga de la prueba para evaluar la 
información existente sobre el potencial de irritación y corrosión cutáneas pro ­
ducidas por las sustancias, que permitirá determinar si la realización de estudios 
adicionales, a parte de los cutáneos  in vivo,  ayudaría a caracterizar dicho poten ­
cial. Cuando sean necesarios otros estudios, se recomienda utilizar la estrategia de evaluación secuencial para obtener los datos experimentales relevantes. Para 
sustancias no evaluadas anteriormente, se utilizará la estrategia de evaluación 
secuencial para obtener los datos necesarios para evaluar su potencial corrosivo/ irritativo cutáneo. La estrategia de evaluación que se describe en este Anexo fue desarrollada por un taller de la OCDE (1) y posteriormente confirmada y am ­
pliada por el sistema armonizado integrado de clasificación de peligros para la 
salud humana y efectos ambientales de las sustancias químicas  (Harmonised 
Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances),  y fue aprobada enla reunión XXVIII del Comité 
Conjunto de Productos Químicos  (Chemicals Committee and the Working Party 
on Chemicals)  en noviembre de 1998 (2).
 
DESCRIPCIÓN DE LA ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN  
Antes de llevar a cabo los ensayos que forman parte de la estrategia de evalua ­
ción secuencial (véase la figura), se evaluará toda la información disponible, para 
determinar la necesidad de practicar estudios cutáneos  in vivo.  Aunque se puede 
obtener información significativa a partir de la evaluación de parámetros aislados (por ejemplo, un pH extremo), hay que considerar la totalidad de la información existente. Se evaluarán todos los datos relevantes sobre los efectos de la sustancia 
en cuestión y de sus análogos para tomar una decisión basada en la carga de la 
prueba, y se presentará la justificación de dicha decisión, Se hará especial hin ­
capié en los datos existentes sobre la sustancia en seres humanos y animales, seguidos por el resultado de los ensayos  in vitro  o ex vivo.  Siempre que sea 
posible se evitará realizar estudios  in vivo  con sustancias corrosivas. Los factores 
que se tienen en cuenta en la estrategia de evaluación son:
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Evaluación de datos existentes en seres humanos y en animales (paso I):  En 
primer lugar se tendrán en cuenta los datos existentes sobre seres humanos, por 
ejemplo, estudios clínicos u ocupacionales e informes de casos, y los datos de ensayos realizados con animales, por ejemplo, de estudios sobre toxicidad de la exposición cutánea única o reiterada, pues proporcionan información directa ­
mente relacionada con los efectos producidos en la piel. No es necesario someter 
a estudios  in vivo  a las sustancias irritantes o corrosivas conocidas, ni a las que 
claramente no son lo uno ni lo otro.  
Análisis de las relaciones entre las estructuras (SAR) (paso 2).  Hay que tener en 
cuenta los resultados de los análisis de sustancias relacionadas desde el punto de vista estructural, si es que existen. Cuando se dispone de suficientes datos en 
seres humanos o animales sobre sustancias relacionadas desde el punto de vista 
estructural o sobre mezclas de dichas sustancias que indique su potencial corro ­
sivo/irritativo cutáneo, se puede presuponer que la sustancia analizada producirá 
las mismas respuestas. En estos casos puede que no sea necesario evaluar la 
sustancia en cuestión. Los datos negativos de los estudios sobre sustancias rela ­
cionadas desde el punto de vista estructural o sobre mezclas de estas no cons ­
tituyen demostración suficiente de que una sustancia no será corrosiva ni irritante 
en la estrategia de evaluación secuencial. Para identificar el potencial de corro ­
sión e irritación dérmicas hay que utilizar enfoques SAR validados y aceptados.  
Propiedades fisicoquímicas y reactividad química (paso 3).  Las sustancias con 
pH extremos, como < 2,0 y > 11,5 pueden tener potentes efectos locales. Si el pH extremo es la base para identificar si una sustancia es corrosiva para la piel, entonces también se tendrá en cuenta la reserva de ácido/álcali (o capacidad 
amortiguadora) (3) (4). Si la capacidad amortiguadora sugiere la posibilidad de 
que una sustancia no sea corrosiva para la piel se realizarán mas ensayos para confirmarlo, preferiblemente utilizando un ensayo  in vitro  o ex vivo  validado y 
aceptado (véanse los pasos 5 y 6).  
Toxicidad cutánea (paso 4).  Si se demuestra que una sustancia química es muy 
tóxica por vía cutánea, puede que no sea procedente realizar un estudio sobre 
irritación/corrosión cutáneas  in vivo,  habida cuenta de que la cantidad de sustancia 
que se suele aplicar puede superar una dosis muy tóxica, lo que puede matar a los animales o infligirles graves sufrimientos. Además, cuando ya se hayan realizado 
estudios de toxicidad cutánea en conejos albinos hasta la dosis límites de 2 000 
mg/kg de peso corporal o más sin que se haya observado irritación ni corrosión cutánea, puede que no sea necesario practicar más ensayos de irritación/corrosión cutáneas. Al evaluar la toxicidad cutánea observada en estudios realizados anterior ­
mente hay que tener en cuenta algunas consideraciones. Por ejemplo, puede que la 
información publicada sobre las lesiones cutáneas no esté completa. Puede que los ensayos y las observaciones se hayan efectuado en una especie distinta del conejo, y 
la sensibilidad de las respuestas puede variar mucho de unas especies a otras. 
También puede que la forma de la sustancia analizada que se aplicó a los animales no sea la adecuada para la evaluación de la irritación/corrosión cutáneas (por ejem ­
plo, disolución de las sustancias para los estudios sobre toxicidad cutánea) (5). Pero 
cuando se hayan realizado estudios sobre toxicidad cutánea bien diseñados y eje ­
cutados en conejos, los hallazgos negativos pueden constituir prueba suficiente de que la sustancia no es corrosiva ni irritativa.  
Resultados de los ensayos  in vitro  o ex vivo  (pasos 5 y 6).  Cuando se hayan 
demostrado las propiedades corrosivas o irritantes intensas de una sustancia en un ensayo  in vitro  o ex vivo  validado y aceptado (6) (7) diseñado para la evaluación 
de estos efectos concretos, no será necesario evaluarla en animales. Se puede dar 
por supuesto que dichas sustancias producirán similares efectos intensos  in vivo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
Ensayo  in vivo  en conejos (pasos 7 y 8).  Si a partir de la carga de la prueba se 
toma la decisión de realizar un ensayo  in vivo,  se empezará con un ensayo inicial 
con un solo animal. Si los resultados indican que la sustancia es corrosiva para la piel no se realizarán más ensayos. Si en el ensayo inicial no se observa efecto corrosivo se confirmará la respuesta irritante o negativa con un máximo de dos 
animales más, durante un período de exposición de cuatro horas. Si se observa 
un efecto irritante en el ensayo inicial el ensayo de confirmación debe hacerse de forma secuencial, o exponiendo a otros dos animales a la vez.
 
REFERENCIAS  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Al ­
ternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22- 24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/tests/background.hrm. 
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed 
by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/ HCL6.htm). 
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosión. ATLA 26, 709-720. 
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2(1), 19- 
26. 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 
1-56032-356-6, Chapter 31, 411-436. 
(6) Testing Method B.40. (7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results 
and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483-524.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Figura  
ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN DE LA IRRITACIÓN/CORROSIÓN CUTÁNEA
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. TOXICIDAD AGUDA: IRRITACIÓN/CORROSIÓN OCULAR  
1. MÉTODO  
Este método de evaluación es equivalente al método TG 405 de la 
OCDE (2002)  
1.1 INTRODUCCIÓN 
En el desarrollo de este método actualizado se ha prestado atención 
especial a las posibles mejoras mediante la evaluación de toda la información existente sobre la sustancia analizada, para no someter a los animales de laboratorio a pruebas innecesarias y responder así a 
la preocupación por el bienestar de los animales. En este método se 
incluye la recomendación de que antes de llevar a cabo el ensayo  in 
vivo que se describe para evaluar la corrosión/irritación ocular aguda 
de la sustancia, hay que analizar la carga de la prueba (1) que 
aportan los datos relevantes existentes. Si los datos disponibles son 
insuficientes se recomienda obtenerlos mediante la aplicación de secuencias de ensayos (2) (3). La estrategia de evaluación recomen ­
dada incluye la realización de ensayos  in vitro  validados y aceptados, 
y se recoge en un anexo de este método. Además se recomienda 
utilizar un ensayo de irritación/corrosión cutánea  in vivo  para prede ­
cir la corrosión ocular ante de realizar un ensayo ocular  in vivo.  
Por interés de la ciencia y del bienestar de los animales no se 
realizarán ensayos  in vivo  hasta que se hayan evaluado todos los 
datos relevantes sobre el potencial de corrosión/irritación ocular de la sustancia en un análisis de la carga de la prueba. Dichos datos 
incluirán los obtenidos en estudios existentes realizados con seres 
humanos o con animales de laboratorio, la demostración de corro ­
sión/irritación por parte de una o más sustancias relacionadas estruc ­
turalmente o por una mezcla de las mismas, los que demuestran la 
elevada acidez o alcalinidad de la sustancia (4) (5) y los obtenidos en 
ensayos de corrosión e irritación cutánea  in vitro  o ex vivo  validados 
y aceptados (6) (6a). Los estudios pueden haber sido realizado antes del análisis de la carga de la prueba, o a consecuencia de la misma. 
Para ciertas sustancias dicho análisis puede indicar la necesidad de 
realizar estudios  in vivo  del potencial de corrosión/irritación ocular 
de la sustancia. En todos esos casos antes de considerar el uso de un ensayo ocular  in vivo  es preferible realizar primero un estudio de los 
efectos cutáneos  in vivo  de la sustancia, evaluándolo de conformidad 
con el método de evaluación B.4 (7). La aplicación del análisis de la carga de la prueba y la estrategia de evaluación secuencial debe reducir la necesidad de realizar ensayos  in vivo  de la corrosión/irri ­
tación oculares de aquellas sustancias de las que ya se disponga de 
datos de otros estudios. Si no fuera posible determinar el potencial de corrosión o irritación ocular con la estrategia de evaluación se ­
cuencial, ni siquiera tras realizar un estudio  in vivo  de la corrosión y 
la irritación cutáneas, se podrá llevar a cabo una evaluación de la 
corrosión/irritación oculares  in vivo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
En un anexo de este método se recoge el orden recomendado para 
efectuar los ensayos, incluidos los ensayos  in vitro  o ex vivo  valida­
dos y aceptados sobre corrosión e irritación. Se trata de una estra ­
tegia desarrollada por un taller de la OCDE, cuyos participantes la recomendaron de manera unánime (8), y ha sido adoptada como 
estrategia de evaluación recomendada por el sistema armonizado 
global para la clasificación de sustancias químicas [ Globally Harmo ­
nised System for the Classification of Chemical Substances  (CHS)] 
(9). Aunque dicha estrategia de evaluación secuencial no forma parte 
integrante del método de evaluación B.4, se recomienda seguirla 
antes de llevar a cabo ensayos  in vivo.  Para sustancia nuevas, es 
el nuevo enfoque de evaluación escalonada recomendado para obte ­
ner datos científicamente garantizados sobre la corrosión/irritación de 
la sustancia. Para sustancias existentes con datos insuficientes sobre 
su corrosión/irritación cutánea y ocular se utilizará la estrategia para obtener los datos que falten. Será necesario justificar el empleo de una estrategia o procedimiento de evaluación diferente, o la decisión 
de no utilizar un procedimiento escalonado.
 
1.2 DEFINICIONES  
Irritación ocular:  alteraciones en el ojo tras la aplicación de una 
sustancia de ensayo en la superficie anterior del ojo, completamente 
reversibles en los 21 días siguientes a la aplicación.  
Corrosión ocular:  lesión tisular en el ojo o grave reducción física 
de la vista, tras la aplicación de una sustancia de ensayo en la 
superficie anterior del ojo, que no son completamente reversibles 
en los 21 días siguientes a la aplicación  
1.3 PRINCIPIO DEL MÉTODO DE EVALUACIÓN 
La sustancia analizada se aplica en una sola dosis a uno de los ojos 
de un animal de experimentación; el ojo no tratado actúa como control. Se evalúa el grado de irritación/corrosión ocular a intervalos determinados, mediante la puntuación de las lesiones de la conjun ­
tiva, la córnea y el iris. También se describen otros efectos en el ojo 
y los efectos sistémicos adversos, para proporcionar una evaluación completa de los efectos. La duración del estudio ha de ser suficiente para evaluar la reversibilidad o irreversibilidad de los efectos obser ­
vados. 
Los animales que muestren signos continuados de deterioro o dolor 
graves en cualquier fase del ensayo deben ser sacrificados, con la 
consiguiente evaluación de la sustancia. Los criterios para sacrificar a 
los animales moribundos y que sufren intensamente se recogen en la referencia (10).
 
1.4 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE EVALUACIÓN  
1.4.1  Preparación del ensayo  in vivo  
1.4.1.1  Selección de las especies  
El conejo albino es el animal de laboratorio preferido; se emplean 
individuos adultos jóvenes y sanos. Si se utilizan otras especies será 
necesario justificarlo.  
1.4.1.2  Preparación de los animales  
En las 24 horas previas al inicio del ensayo se examinarán los dos 
ojos de los animales de experimentación provisionalmente seleccio ­
nados para la misma. No se utilizarán animales que muestren irrita ­
ción ocular, defectos oculares o lesión corneal preexistente.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3  Condiciones de alojamiento y alimentación  
Los animales deben ser alojados de manera individual. La tempera ­
tura de los animalarios debe ser de 20  o C (± 3  o C) para los conejos. 
Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y 
preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza 
del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 de oscuridad. Para la ali ­
mentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, 
con suministro ilimitado de agua para beber
 
1.4.2  Procedimiento del ensayo  
1.4.2.1  Aplicación de la sustancia analizada  
La sustancia analizada debe aplicarse a la conjuntiva de un ojo de 
cada animal, separando suavemente el párpado del globo ocular. A continuación se juntan suavemente los párpados durante un segundo, para que no se pierda el material. El otro ojo no se trata y sirve 
como control.
 
1.4.2.2  Irrigación  
No se lavarán los ojos de los animales tratados hasta al menos 24 
horas después de la instilación de la sustancia ensayada excepto en el 
caso de sólidos (véase el punto 1.4.2.3.2) y en caso de producirse efectos corrosivos o irritantes inmediatos. Transcurridas 24 horas se podrán lavar los ojos si se considera necesario. 
No se recomienda utilizar un grupo satélite de animales para inves ­
tigar la influencia del lavado, a menos que esté justificado desde el 
punto de vista estadístico. Si se necesita un grupo satélite estará 
formado por dos conejos. Las condiciones del lavado deben quedar minuciosamente documentadas, por ejemplo, hora del lavado; com ­
posición y temperatura de la solución de lavado; duración, volumen 
y velocidad de la aplicación.
 
1.4.2.3  Nivel de dosis  
1.4.2.3.1  Evaluación de líquidos  
Para evaluar líquidos se emplea una dosis de 0,1 ml. No se deben 
utilizar aerosoles para instilar la sustancia directamente en el ojo. 
Antes de aplicarlo, se expulsa el líquido del aerosol en un recipiente, 
y se instila 0,1 ml en el ojo.  
1.4.2.3.2  Evaluación de sólidos  
Para evaluar sólidos, cremas y sustancias con partículas, la cantidad 
utilizada debe tener un volumen de 0,1 ml o no pesar más de 100 mg. El material analizado debe estar reducido a polvo fino. El 
volumen de material sólido se medirá tras compactarlo con suavidad, 
por ejemplo, golpeando suavemente con los dedos el envase medi ­
dor. Si en el primer punto temporal de observación (1 hora después del tratamiento) la sustancia analizada sólida no ha sido eliminada 
del ojo del animal de ensayo por mecanismos fisiológicos, se puede 
lavar el ojo con suero salino o con agua destilada.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3  Evaluación de aerosoles  
Se recomienda hacer una recogida de los aerosoles antes de instilar 
el producto en el ojo. Son excepción las sustancias que van en 
contenedores en aerosol presurizados, que no se pueden recoger debido a la vaporización. En esos casos hay que sujetar el ojo bien abierto, administrando la sustancia analizada en el ojo con 
una sola pulverización de un segundo aproximadamente, a una dis ­
tancia de 10 cm directamente delante del ojo. Esta distancia puede variar dependiendo de la presión del aerosol y de su contenido. Hay que tener cuidado para no lesionar el ojo con la presión del aerosol. 
En determinados casos puede ser necesario evaluar el potencial de 
lesión «mecánica» del ojo producida por la fuerza del aerosol. 
Es posible calcular la dosis de un aerosol, simulando elensayo como 
se indica a continuación: se pulveriza la sustancia sobre papel de 
pesar, a través de una abertura del tamaño del ojo de un conejo, 
colocada directamente delante del papel. El aumento de peso del papel sirve para calcular aproximadamente la cantidad administrada al ojo. Para sustancias volátiles se puede calcular, la dosis pesando 
un envase antes de aplicar el material de ensayo y después de reti ­
rarlo.
 
1.4.2.4  Ensayo inicial (ensayo de irritación/corrosión ocular in vivo con un 
animal)  
Como ya se ha indicado en la estrategia de evaluación secuencial 
(véase el anexo 1), se recomienda encarecidamente realizar el ensayo  
in vivo  primero con un solo animal. 
Si los resultados de esta indican que la sustancia es muy irritante o 
corrosiva en el ojo, no se harán más ensayos.  
1.4.2.5  Anestésicos locales  
El uso de anestésicos locales se considerará caso por caso. Si el 
análisis de la carga de la prueba indica que la sustancia puede producir dolor, o si la evaluación inicial demuestra que se puede producir una reacción dolorosa, se podrá utilizar un anestésico local 
antes de aplicar la sustancia en estudio. La elección del tipo, la 
concentración y la dosis del anestésico local se hará con cuidado, para asegurarse de que su empleo no produce diferencias en la reacción a la sustancia en estudio. El ojo del control debe de recibir 
la misma anestesia.
 
1.4.2.6  Ensayo de confirmación (ensayo de irritación ocular in vivo con 
animales adicionales)  
Si en el ensayo inicial no se observa efecto corrosivo se confirmará 
la respuesta irritante o negativa con un máximo de dos animales más. Si se observa efecto irritante en el ensayo inicial, indicativo de un 
posible efecto potente (irreversible) en la de confirmación, se reco ­
mienda efectuar esta de forma secuencial exponiendo a los animales de uno a uno, en lugar de exponer a dos a la vez. Si el segundo animal presenta efectos corrosivos o irritantes importantes se suspen ­
derá el ensayo. Puede ser necesario utilizar más animales para con ­
firmar respuestas irritantes débiles o moderadas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7  Período de observación  
La duración del período de observación debe ser suficiente para 
evaluar por completo la reversibilidad de los efectos observados. No obstante se dará por finalizado el experimento si el cualquier 
momento el animal presenta signos continuados de dolor o malestar 
graves (9). Para determinar la reversibilidad de los efectos lo normal es someter a los animales a 21 días de observación a partir de la administración de la sustancia analizada. Si se observa la irreversi ­
bilidad antes de 21 días el experimento debe concluir en ese mo ­
mento.
 
1.4.2.7.1  Observaciones clínicas y graduación de las reacciones oculares  
Se examinarán los ojos 1, 24, 48 y 72 horas después de la aplicación 
de la sustancia analizada. Los animales no permanecerán en el en ­
sayo más tiempo del necesario, una vez obtenida la información definitiva. Los animales que muestren dolor o malestar intenso con ­
tinuados deben ser sacrificados sin demora, con la consiguiente eva ­
luación de la sustancia. Serán sacrificados los animales que presenten 
las siguientes lesiones oculares después de la instilación: perforación corneal o ulceración corneal significativa, incluido el estafiloma; presencia de sangre en la cámara anterior del ojo; opacidad corneal 
de grado 4 que persista durante 48 horas; ausencia de reflejo lumí ­
nico (respuesta del iris de grado 2) que persista durante 72 horas; ulceración de la conjuntiva; necrosis de la conjuntiva o de la mem ­
brana nictitante, o escarificación. Esto se debe a que tales lesiones no 
suelen ser reversibles. 
Los animales que no presenten lesiones oculares deben permanecer 
en observación al menos 3 días después de la instilación. Los ani ­
males con lesiones leves a moderadas deben permanecer en obser ­
vación hasta que desaparezcan las lesiones o hasta transcurridos 21 
días, que es cuando finaliza el estudio. Las observaciones se efec ­
tuarán a los 7, 14 y 21 días, para determinar el estado de las lesiones y si son o no reversibles. 
En cada exploración se anotará el grado de reacción ocular (conjun ­
tiva, córnea e iris) (tabla I). También se notificará cualesquiera otras 
lesiones oculares (por ejemplo, queratitis vascular, manchas oculares) o efectos sistémicos adversos. 
Se puede facilitar el examen de las reacciones mediante el uso de 
una lupa binocular, de una lámpara de hendidura manual, de un 
biomicroscopio o de otro dispositivo adecuado. Tras registrar las observaciones a las 24 horas, las ulteriores exploraciones pueden hacerse con la ayuda de fluoresceína. 
La graduación de las respuestas oculares es subjetiva necesariamente. 
Para armonizar tal graduación y ayudar a los laboratorios y a quienes 
efectúan e interpretan las observaciones, el personal encargado reci ­
birá formación adecuada sobre el sistema de puntuación utilizado. La graduación de las respuestas oculares debe hacerse en condiciones 
ciegas.
 
2. DATOS  
2.2 EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Las puntuaciones de la irritación ocular deben evaluarse junto con la 
naturaleza y la intensidad de las lesiones, y el hecho de si son reversibles o no. Las puntuaciones individuales no constituyen una 
referencia absoluta de las propiedades irritativas del material, pues 
también se evalúan otros efectos del material evaluado. En su lugar las puntuaciones individuales deben considerarse como valores de referencia, que solo serán significativos cuando sean respaldados 
por una descripción completa y la evaluación de todas las demás 
observaciones.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. NOTIFICACIÓN  
3.1 INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la siguiente información: 
Justificación del ensayo  in vivo:  análisis de la carga de la prueba de 
ensayos realizados anteriormente, incluidos los resultados de la es ­
trategia de evaluación secuencial. 
— descripción de datos relevantes de ensayos realizados anterior ­
mente, 
— datos obtenidos en cada fase de la estrategia de evaluación, 
— descripción de los ensayos  in vitro  realizados, con detalles de los 
procedimientos los resultados 
— obtenidos con las sustancias analizadas/de referencia, 
— descripción del estudio sobre irritación/corrosión cutánea  in vivo  
realizado, con los resultados Obtenidos, 
análisis de la carga de la prueba para realizar el estudio  in vivo.  
— Sustancia analizada: 
— datos de identificación (por ejemplo, número CAS; origen; pure ­
za; impurezas conocidas; número de lote), 
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas (por ejemplo pH, 
volatilidad, solubilidad, estabilidad, reacción en agua), 
— si se trata de una mezcla, composición y porcentajes relativos 
de los componentes, si se utiliza anestésico local, identifica ­
ción, pureza, tipo, dosis y posible interacción con la sustancia analizada. 
Vehículo: 
— identificación, concentración (en su caso), volumen utilizado, 
— justificación de la elección del vehículo. 
Animales de experimentación: 
— especia/cepa utilizada, justificación del uso de animales que no 
sean conejos albinos, 
— edad de cada animal al principio del estudio, 
— número de animales de cada sexo en los grupos de prueba y de 
control (en su caso), 
— peso de los animales individuales al principio y al final del 
ensayo, 
— origen de los animales, condiciones del alojamiento, dieta, etc. 
Resultados: 
— descripción del método utilizado para puntuar la irritación en 
cada momento de observación (por ejemplo, lámpara de hendi ­
dura manual, biomicroscopio, fluoresceína),
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— tabulación de los datos de respuesta irritante/corrosiva de cada 
animal en cada momento de observación, hasta la retirada de 
cada animal del ensayo, 
— descripción narrativa del grado y la naturaleza de la irritación o 
la corrosión observadas, 
— descripción de otras lesiones observadas en el ojo (por ejemplo, 
vascularización, queratitis vascular, adherencias, manchas), 
— descripción de efectos adversos locales no oculares y sistémicos, 
y hallazgos histopatológicos, en su caso. 
Comentario de los resultados  
3.2 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
La extrapolación a humanos de los resultados de los estudios de 
irritación ocular realizados con animales de laboratorio solo es válida en cierto grado. En muchos casos, los conejos albinos son más sensibles a los irritantes o corrosivos oculares que los seres humanos. 
Hay que interpretar con cuidado los datos para excluir la irritación 
resultante de una infección secundaria.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Barrette, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429. 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, G, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., 
Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177. 
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro, 2,  19-26. 
(5) Neun, DJ. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227-231. 
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483 - 524. 
(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion. (7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. (8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Re ­
port of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Pronunciado en Solna, Suecia, 22-24 de enero 
de 1996 (http://www.oecd. org/ehs/test/background.htm).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances, as endorsed by the 28  th Joint Meeting of the Chemi ­
cals Committee and the Working Party on Chemicals, noviembre de 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). 
(10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD En ­
vironmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/mo ­
nos.htm).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabla I  
GRADUACIÓN DE LAS LESIONES OCULARES  
Córnea  
Opacidad: grado de densidad (se tendrá en cuenta la zona más densa) (*) 
Sin ulceración ni opacidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Zonas de opacidad diseminadas o difusas (aparte del ligero mate debido a 
la limpieza habitual); los detalles del iris se aprecian con claridad . . . . . . 1 
Zona translúcida fácilmente discernible; los detalles del iris están lige ­
ramente oscurecidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Zona nacarada; no se ven detalles del iris; el tamaño de la pupila apenas 
es discernible . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Córnea opaca; no se distingue el iris a su través . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Máximo posible: 4 
NOTAS  
(*) Hay que tomar nota de la superficie de la opacidad corneal.  
Iris 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Pliegues notablemente hundidos, congestión, inflamación, moderada hi ­
peremia o inyección circuncorneal; iris reactivo a la luz (si la reacción es defectuosa se considera como efecto): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Hemorragia, destrucción visible o ausencia de reacción a la luz . . . . . 2 
Máximo posible: 2
 
Conjuntiva  
Enrojecimiento (se refiere a la conjuntiva palpebral y bulbar; se excluye la córnea 
y el iris) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Algunos vasos sanguíneos hiperémicos (inyectados) . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Coloración carmesí difusa; no se distinguen fácilmente los vasos indi ­
viduales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Coloración carne difusa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Máximo posible: 3
 
Quemosis  
Inflamación (se refiere a los párpados o a las membranas nictitantes) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Cierta hinchazón superior a lo normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Hinchazón evidente con eversión parcial de los párpados . . . . . . . . . . . . 2 Hinchazón con párpados medio cerrados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Hinchazón con párpados más que medio cerrados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Máximo posible: 4
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
ANEXO  
Estrategia de evaluación secuencial de la irritación y la corrosión oculares  
CONSIDERACIONES GENERALES  
Es importante evitar el uso innecesario de animales y reducir al mínimo las 
pruebas que con toda probabilidad produce respuestas graves en los animales, 
por su bienestar y por motivos científicos. Antes de considerar la realización de 
ensayos  in vivo  hay que evaluar toda la información sobre una sustancia en lo 
que respeta a su posible poder corrosivo/irritativo ocular. Puede que existan pruebas suficientes para clasificar el potencial corrosivo o irritativo ocular de 
una sustancia analizada, sin necesidad de realiza ensayos con animales de labo ­
ratorio. Por eso el uso del análisis de la carga de la prueba y de una estrategia de evaluación secuencial reducirá al mínimo la necesidad de realizar ensayos  in 
vivo,  especialmente si es probable que la sustancia produzca reacciones graves. 
Se recomienda utilizar el análisis de la carga de la prueba para evaluar la 
información existente sobre el potencial de irritación y corrosión oculares pro ­
ducidas por las sustancias, para determinar si la realización de estudios adicio ­
nales, a parte de los oculares  in vivo,  ayudaría a caracterizar dicho potencial. 
Cuando sean necesarios otros estudios, se recomienda utilizar la estrategia de evaluación secuencial para obtener los datos experimentales relevantes. Para 
sustancias no evaluadas anteriormente, se utilizará la estrategia de evaluación 
secuencial para obtener los datos necesarios para evaluar su potencial corrosivo/ irritativo ocular. La estrategia de evaluación que se describe en este Anexo fue redactada en un taller de la OECD (1). Posteriormente fue confirmada y ampliada 
por el sistema armonizado integrado de clasificación de peligros para la salud 
humana y efectos ambientales de las sustancias químicas  (Harmonised Integrated 
Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances),  y fue aprobada en la 1 XXVIII reunión del Comité 
Conjunto para productos químicos  (Chemicals Committee and the Working Party 
on Chemicals)  en noviembre de 1998 (2). 
Aunque la presente estrategia de evaluación no forma parte integrante del método 
de evaluación B.5, sí expresa el enfoque recomendado para la determinación de las características de irritación/corrosión oculares. Este enfoque representa la práctica óptima y una piedra angular desde el punto de vista ético para el análisis  
in vivo  de la irritación/corrosión oculares. El método de evaluación proporciona 
instrucciones para la realización del ensayo  in vivo, y  resume los factores que se 
han de abordar antes de ponerla en marcha. La estrategia proporciona un enfoque basado en la carga de la prueba para la evaluación de los datos existentes sobre 
las propiedades de irritación/corrosión oculares de las sustancias analizadas, y un 
enfoque por partes para generar datos relevantes sobre sustancias que necesitan estudios adicionales o que no han sido estudiadas. La estrategia incluye la re ­
alización en primer lugar de ensayos  in vitro  o ex vivo  validados y aceptados y a 
continuación del método de evaluación B.4 estudios de irritación/corrosión cutá ­
nea en condiciones concretas (3) (4).
 
DESCRIPCIÓN DE LA ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN ESCALONADA  
Antes de llevar a cabo 1 los ensayos que forman parte de la estrategia de 
evaluación secuencial (véase la figura), se evaluará toda la información dispo ­
nible, para determinar la necesidad de practicar estudios oculares  in vivo.  
Aunque se puede obtener información significativa a partir de la evaluación 
de parámetros aislados (por ejemplo, un pH extremo), hay que considerar la totalidad de la información existente. Se evaluarán todos los datos relevantes sobre los efectos de la sustancia en cuestión y de sus análogos estructurales, 
para tomar una decisión basada en la carga de la prueba, y se presentará la 
justificación de dicha decisión. Se hará especial hincapié en los datos existen ­
tes sobre la sustancia en seres humanos y animales, seguidos por el resultado de los ensayos  in vitro  o ex vivo.  Siempre que sea posible se evitará realizar 
estudios  in vivo  con sustancias corrosivas. Los factores que se tienen en 
cuenta en la estrategia de evaluación son:
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Evaluación de datos existentes en seres humanos y en animales (paso 1):  En 
primer lugar se tendrán en cuenta los datos existentes sobre seres humanos, por 
ejemplo, estudios clínicos u ocupacionales e informes de casos, y los datos de ensayos realizados con animales en estudios oftalmológicos, pues proporcionan información directamente relacionada con los efectos producidos en los ojos. A 
continuación se evaluarán los datos disponibles de estudios realizados con seres 
humanos o animales para investigar la corrosión/irritación cutáneas. Las sustan ­
cias conocidas por ser corrosivas o intensamente irritantes para el ojo no se aplicarán a los ojos de los animales, ni tampoco aquellas que tengan efectos 
corrosivos o irritantes para la piel; dichas sustancias debe ser consideradas co ­
rrosivas o irritantes para los ojos también. Cuando en estudios oftalmológicos realizados anteriormente se hayan obtenido pruebas suficientes de que una sus ­
tancia no es corrosiva ni imitante, tampoco será sometida a estudios oftalmoló ­
gicos  in vivo. 
Análisis de las relaciones entre las estructuras (SAR) (paso 2).  Hay que tener en 
cuenta los resultados de los análisis de sustancias relacionadas desde el punto de 
vista estructural, si es que existen. Cuando se dispone de suficientes datos en 
seres humanos o animales sobre sustancias relacionadas desde el punto de vista estructural o sobre mezclas de dichas sustancias que indique su potencial corro ­
sivo/irritativo ocular, se puede presuponer que la sustancia analizada producirá 
las mismas respuestas. En estos casos puede que no sea necesario evaluar la 
sustancia en cuestión. Los datos negativos de los estudios sobre sustancias rela ­
cionadas desde el punto de vista estructural o sobre mezclas de estas no cons ­
tituyen demostración suficiente de que una sustancia no será corrosiva ni irritante 
en la estrategia de evaluación secuencial. Para identificar el potencial de corro ­
sión e irritación dérmica y ocular hay que utilizar enfoques SAR validados y aceptados.  
Propiedades fisicoquímicas y reactividad química (paso 3).  Las sustancias con 
pH extremos, como ≤ 2,0 y ≥ 11,5 pueden tener potentes efectos locales. Si el 
pH extremo es la base para identificar si una sustancia es corrosiva o irritante para el ojo, entonces también se tendrá en cuenta la reserva de ácido/álcali (o 
capacidad amortiguadora) (3) (4). Si la capacidad amortiguadora sugiere la po ­
sibilidad de que una sustancia no sea corrosiva para el ojo se realizarán mas pruebas para confirmarlo, preferiblemente utilizando un ensayo  in vitro  o ex vivo  
validado y aceptado (véanse los pasos 5 y 6).  
Consideración de otras informaciones existentes (paso 4).  En esta fase se eva ­
luará toda la información disponible sobre la toxicidad sistémica por vía cutánea. También se tendrá en cuenta la toxicidad cutánea aguda de la sustancia analizada. 
Si se ha demostrado que la sustancia es muy tóxica por vía cutánea puede no ser 
necesario estudiarla en el ojo. Aunque no existe necesariamente una relación entre la toxicidad cutánea aguda y la irritación/corrosión ocular, se puede suponer que si un agente es muy tóxico por vía cutánea también lo será si se aplica al ojo. 
Estos datos también se pueden tener en cuenta entre los pasos 2 y 3.  
Resultados de los ensayos in vitro  o ex vivo (pasos 5 y 6).  Cuando se hayan 
demostrado las propiedades corrosivas o irritativas intensas de una sustancia en 
un ensayo  in vitro  o ex vivo  (7) (8) validado y aceptado para la evaluación 
concreta de la corrosión/irritación ocular o cutánea, no será necesario evaluarla en animales. Se puede dar por supuesto que dichas sustancias producirán simi ­
lares efectos intensos  in vivo.  Si no se dispone de ensayos  in vitrolex vivo  
validados y aceptados, debe prescindirse de los pasos 5 y 6 y pasar directamente 
al paso 7.  
Evaluación del poder irritantivo cutáneo  in vivo  de la sustancia (paso 7).  
Cuando sean insuficientes los datos para realizar un análisis de la carga de la 
prueba concluyente sobre el poder irritante/corrosivo ocular de una sustancia a partir de los datos de los estudios que se han enumerado, se procederá en primer lugar a evaluar el potencial de irritación/corrosión cutánea  in vivo,  utilizando el 
método de evaluación B.4 (4) y el anexo que le acompaña (9). Si se demuestra 
que la sustancia produce corrosión o irritación cutánea intensa, se considerará como corrosiva para el ojo, a menos que haya otros datos en apoyo de otra conclusión. En ese caso no será necesario realizar un ensayo ocular  in vivo.  Si la 
sustancia no es corrosiva ni intensamente irritante para la piel, se realizará un 
ensayo cutáneo  in vivo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
Ensayo  in vivo  en conejos (pasos 8 y 9).  El ensayo ocular  in vivo  empezará con 
un ensayo inicial con un solo animal Si los resultados de esta indican que la 
sustancia es muy irritante o corrosiva en el ojo, no se harán más ensayos. Si dicho ensayo no muestra efectos corrosivos ni irritantes graves, se llevará a cabo un ensayo de confirmación con otros dos animales.
 
REFERENCIAS  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Pronunciado en Solna, Suecia, 
22-24 de enero de 1996 (http://www1 oecd.org/ehs/test/background.htm). 
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals, noviemre de 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm). 
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177. 
(4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion. (5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro, 2,  19-26. 
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227- 231. 
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483-524. 
(8) Testing Method B.40 Skin Corrosion. (9) Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irri ­
tation and Corrosion.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Figura  
ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN DE LA IRRITACIÓN/CORROSIÓN OCULAR
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. SENSIBILIZACIÓN DE LA PIEL  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN  
Observaciones:  
La sensibilidad y capacidad de los ensayos para detectar sustancias 
que pueden sensibilizar la piel humana se consideran importantes para un sistema de clasificación de la toxicidad aplicable a la salud 
pública. 
No hay un método único que detecte todas las sustancias con po ­
tencial de sensibilización de la piel humana y que sea adecuado para 
todas las sustancias. 
Para seleccionar un ensayo deben tenerse en cuenta factores como 
las características físicas de la sustancia, incluyendo su capacidad de 
penetración en la piel. 
Se han elaborado dos tipos de ensayos que utilizan cobayas: los 
ensayos con coadyuvante, en los que se potencia un estado alérgico 
disolviendo o suspendiendo la sustancia estudiada en coadyuvante 
completo de Freund (FCA), y los ensayos sin coadyuvante. 
Es probable que los ensayos con coadyuvante sean más exactos a la 
hora de predecir el efecto sensibilizante probable de una sustancia en 
la piel humana respecto a los métodos que no emplean el coadyu ­
vante completo de Freund, por lo que son los métodos preferidos. 
El ensayo de maximización en cobaya (GPMT) es un ensayo con 
coadyuvante ampliamente utilizado. Aunque se pueden utilizar otros métodos para detectar el potencial sensibilizante de una sustancia, se considera que el GMPT es la técnica con coadyuvante de preferencia. 
Los ensayos sin coadyuvantes (suele utilizarse sobre todo el ensayo 
de Buehler) se consideran menos sensibles con muchas clases de productos químicos. 
En ciertos casos puede haber buenas razones para escoger el ensayo 
de Buehler, que supone una aplicación tópica en vez de la inyección intradérmica utilizada en el ensayo de maximización en cobaya. 
Cuando se use el ensayo de Buehler deberá justificarse científica ­
mente. 
En el presente método se describen el ensayo de maximización en 
cobaya y el ensayo de Buehler. Se pueden utilizar otros métodos 
siempre que estén bien validados y se dé su justificación científica. 
Si se obtiene un resultado positivo en un ensayo de cribado recono ­
cido, podrá designarse una sustancia de ensayo como sensibilizante 
potencial y podrá no ser necesario realizar un nuevo ensayo con 
cobaya. No obstante, si se obtiene un resultado negativo en un ensayo semejante, deberá realizarse un ensayo con cobaya utilizando 
el procedimiento descrito en este método de ensayo. 
Véase también la introducción general de la parte B.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. DEFINICIONES  
Sensibilización de la piel  (dermatitis alérgicas de contacto): es una 
reacción cutánea de origen inmunológico ante una sustancia. En los seres humanos las respuestas pueden caracterizarse por prurito, eri ­
tema, edema, pápulas, vesículas, ampollas o una combinación de 
estos fenómenos. En otras especies, las reacciones pueden ser dife ­
rentes y apreciarse solo eritema y edema.  
Exposición de inducción:  exposición experimental de un sujeto a una 
sustancia con el fin de inducir un estado de hipersensibilidad.  
Período de inducción:  período de al menos una semana a partir de la 
exposición de inducción, durante el cual puede aparecer un estado de 
hipersensibilidad.  
Exposición de provocación:  exposición experimental de un sujeto 
previamente tratado a una sustancia después de un período de 
inducción, a fin de determinar si el sujeto reacciona de forma 
hipersensible.
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
La sensibilidad y fiabilidad de la técnica experimental utilizada de ­
berá evaluarse cada seis meses mediante el empleo de sustancias 
conocidas como dermosensibilizantes suaves o moderados. 
En un ensayo realizado convenientemente, el empleo de un sensibi ­
lizante suave o moderado debe producir una respuesta del 30 % al menos en un ensayo con coadyuvante y del 15 % al menos en un 
ensayo sin coadyuvante. 
Se recomiendan las siguientes sustancias:
 
Número CAS Número EINECS Denominación EINECS Denominación común  
101-86-0 202-983-3 a-hexilcinamaldehído ct-hexilcinamaldehído 
149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (mercapto ­
benzotiazol) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzocaína norcaína 
En ciertas circunstancias se podrán utilizar otras sustancias de control 
que cumplan los criterios citados, justificándose debidamente su elección.
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Los animales utilizados se exponen inicialmente a la sustancia me ­
diante inyecciones intradérmicas o aplicación epidérmica (exposición 
de inducción). Tras un período de descanso de 10 a 14 días (período de inducción), durante el que puede desarrollarse la respuesta inmu ­
nitaria, los animales se someten a una dosis de provocación. La 
amplitud y el grado de la reacción cutánea de los animales ante la 
exposición de provocación se compara con la mostrada por animales de control que reciben un tratamiento simulado durante la inducción y se someten a la exposición de provocación.
 
1.5. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS 
Si se considera necesario eliminar la sustancia estudiada, puede ha ­
cerse utilizando agua o un disolvente adecuado que no altere la 
respuesta obtenida ni la integridad de la epidermis.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Prueba de maximización en cobaya (GPMT)  
1.5.1.1. P r e p a r a c i ó n 
Durante al menos 5 días antes del inicio del ensayo, se aclimatan a 
las condiciones del laboratorio cobayas albinas jóvenes y sanas. 
Antes del ensayo, los animales se eligen al azar y se asignan a los 
lotes de tratamiento. La eliminación del pelo se hace por corte, afeitado o incluso depilación química, en función del método de ensayo utilizado. Debe evitarse la producción de escoriaciones en 
la piel. Los animales se pesarán antes del ensayo y al final del 
mismo.
 
1.5.1.2. C o n d i c i o n e s d e l e n s a y o  
1.5.1.2.1. Animales de laboratorio 
Se utilizan cepas corrientes de laboratorio de cobaya albina.  
1.5.1.2.2. Número y sexo 
Se pueden utilizar animales de ambos sexos. Si se utilizan hembras, 
deben ser nulíparas y no grávidas. 
Se utilizan por los menos 10 animales para el lote tratado y, por lo 
menos, 5 para el lote testigo. Si se utilizan menos de 20 animales 
tratados y 10 testigos, y no es posible concluir que la sustancia estudiada sea sensibilizante, se recomienda con insistencia realizar ensayos complementarios con otros animales hasta completar un 
mínimo de 20 cobayas tratadas y 10 cobayas testigos.
 
1.5.1.2.3. Dosis 
La concentración de la sustancia utilizada para cada exposición de 
inducción debe tolerarse bien sistemáticamente y debe ser la más elevada que produzca irritación cutánea suave o moderada. La con ­
centración utilizada para la exposición de provocación debe ser la 
mayor dosis no irritante. Si necesario, las concentraciones apropiadas 
pueden ser determinadas a partir de un estudio piloto en el que se utilicen dos a tres animales. Debe considerarse la posibilidad de utilizar con este fin animales tratados con FCA.
 
1.5.1.3. P r o c e d i m i e n t o  
1.5.1.3.1. Inducción 
Día 0: lote tratado 
Se administran tres pares de inyecciones intradérmicas de 0,1 ml en 
la región dorsal superior, de la que se habrá eliminado el pelo, de forma que a cada lado de la linea media quede una inyección de cada par. 
Inyección 1: mezcla 1:1 (v/v) FCA/agua o suero fisiológico Inyección 2: la sustancia de ensayo en un vehículo adecuado, en la 
concentración seleccionada 
Inyección 3: la sustancia de ensayo en la concentración seleccionada 
formulada en una mezcla 1:1 (v/v) FCA/agua o suero fisiológico 
En la inyección 3, las sustancias hidrosolubles se disuelven en la fase 
acuosa antes de mezclarse con el FCA. Las sustancias liposolubles o insolubles se suspenden en la FCA antes de combinarse con la fase 
acuosa. La concentración final de la sustancia de ensayo será igual a 
la utilizada en la inyección 2.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Las inyecciones 1 y 2 se ponen próximas entre sí y lo más cerca 
posible de la cabeza, mientras que la inyección 3 se aplica hacia la 
parte caudal de la superficie de ensayo. 
Día 0: lote testigo Se ponen tres pares de inyecciones intradérmicas de 0,1 ml en los 
mismos lugares que en los animales tratados. 
Inyección 1: mezcla 1:1 (v/v) FCA/agua o suero fisiológico Inyección 2: vehículo solo Inyección 3: formulación al 50 % (p/v) del vehículo en una mezcla 
1:1 (v/v) FCA/agua o suero fisiológico. 
Días 5-7: lotes tratado y testigo Aproximadamente 24 horas antes de la aplicación tópica de induc ­
ción, si la sustancia no es irritante de la piel, se trata la superficie de 
ensayo, previo corte al rape del pelo o afeitado del mismo, con 0,5 
ml de lauril-sulfato sódico al 10 % en vaselina, a fin de producir irritación local. 
Días 6-8: lote tratado Se elimina de nuevo el pelo de la superficie de ensayo. Se carga 
totalmente un papel de filtro (2 × 4 cm) con la sustancia de ensayo en un vehículo adecuado, se aplica a la superficie de ensayo y se 
mantiene con un apósito oclusivo durante 48 horas. La elección del 
vehículo debe justificarse. Los productos sólidos se pulverizan fina ­
mente y se incorporan a un vehículo adecuado. Los líquidos pueden aplicarse sin diluir, en caso de que esto sea apropiado. 
Días 6-8: lote testigo Se elimina de nuevo el pelo de la superficie de ensayo. Solo se 
aplica el vehículo, de forma similar, en la superficie de ensayo 
con un apósito oclusivo durante 48 horas.
 
1.5.1.3.2. Provocación 
Días 20-22: lotes tratado y testigo 
Se elimina el pelo de los costados de los animales tratados y de los 
testigos. Se aplica un parche o cámara con la sustancia estudiada 
sobre un costado de los animales y, cuando sea pertinente, también 
se puede aplicar en el otro costado un parche o cámara con el vehículo solo. Los parches se mantienen con un apósito oclusivo durante 24 horas.
 
1.5.1.3.3. Observación y clasificación: lotes tratado y testigo 
— Aproximadamente a las 21 horas de levantar el parche, se limpia 
la superficie de ensaya y, en caso necesario, se elimina el pelo mediante corte al rape, afeitado o depilación. 
— Unas 3 horas después (hacia tas 48 horas del inicio de la 
aplicación de provocación) se observa la reacción cutánea y 
se registra de acuerdo con la clasificación que se recoge en 
el apéndice. 
— Aproximadamente a las 24 horas de esta observación se hace una 
segunda observación (72 horas), que se registra igualmente. 
Se recomienda la lectura ciega de los animales tratados y testigos. En caso necesario para aclarar los resultados obtenidos con la pri ­
mera provocación, debe considerarse la posibilidad de realizar, una semana después de esa primera provocación, una segunda (es decir, 
una «reprovocación»), cuando convenga con un nuevo lote testigo. 
La reprovocación también puede aplicarse al lote testigo original.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Deben observarse y registrarse, de acuerdo con la escala de Mag ­
nusson y Kligman (véase el apéndice) todas las reacciones cutáneas 
y cualquier observación extraña, incluidas las reacciones sistémicas, derivadas de los procesos de inducción y provocación. Para aclarar reacciones dudosas, pueden aplicarse otros procedimientos como, por 
ejemplo, examen histopatológico, medición del espesor del pliegue 
cutáneo, etc.
 
1.5.2.  Ensayo de Buehler  
1.5.2.1. P r e p a r a c i ó n 
Durante al menos 5 días antes del inicio del ensayo, se aclimatan a 
las condiciones del laboratorio cobayas albinos jóvenes y sanos. Antes del ensayo, los animales se eligen al azar y se asignan a los 
lotes de tratamiento. La eliminación del pelo se hace por corte, 
afeitado, o incluso depilación química, en función del método de ensayo utilizado. Debe evitarse la producción de escoriaciones en la piel. Los animales se pesarán antes del ensayo y al final del 
mismo.
 
1.5.2.2. C o n d i c i o n e s d e l e n s a y o  
1.5.2.2.1. Animales de laboratorio 
Se utilizan cepas corrientes de laboratorio de cobaya albina.  
1.5.2.2.2. Número y sexo 
Se pueden utilizar animales de ambos sexos. Si se utilizan hembras, 
deben ser nulíparas y no grávidas. 
Se utilizan por lo menos 20 animales para el lote tratado y, por lo 
menos, 10 animales para el lote testigo.  
1.5.2.2.3. Dosis 
La concentración de sustancia de ensayo utilizada en cada exposición 
de inducción debe ser la más elevada posible que produzca una irritación suave pero no excesiva. La concentración utilizada para la exposición de provocación debe ser la mayor dosis no irritante. 
Si necesario, las concentraciones apropiadas pueden ser determinadas 
a partir de un estudio piloto en el que se utilicen dos o tres animales. 
En caso de sustancias hidrosolubles, es conveniente utilizar agua o 
una solución diluida no irritante de un agente tensoactivo como vehículo. Para otros tipos de sustancias, se recomienda etanol/agua al 80 % para la inducción y acetona para la provocación.
 
1.5.2.3. P r o c e d i m i e n t o  
1.5.2.3.1. Inducción 
Día 0: lote tratado 
Se elimina el pelo de un costado (por corte al rape). El sistema del 
parche de ensayo debe cargarse totalmente con la sustancia en un vehículo adecuado (debe justificarse la elección del vehículo; las sustancias líquidas pueden aplicarse sin diluir, en caso de que sea 
conveniente). 
El sistema del parche de ensayo se aplica a la zona de ensayo y se 
mantiene en contacto con la piel mediante una cámara o parche 
oclusivo y un apósito adecuado durante 6 horas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
El sistema del parche de ensayo debe ser oclusivo. Es apropiado 
utilizar una compresa de algodón, que puede ser circular o cuadrada, 
con una superficie aproximada de 4 a 6 cm  2 . Se recomienda sujetarlo 
utilizando unas bridas adecuadas para garantizar la oclusión. Si se utiliza un envoltorio, puede ser necesario proceder a exposiciones 
complementarias. 
Día 0: lote testigo 
Se elimina el pelo de un costado (por corte al rape). Se aplica el 
vehículo solo de forma similar a la utilizada con el lote tratado. El sistema del parche de ensayo se mantiene en contacto con la piel 
mediante un parche oclusivo o cámara y un apósito adecuado du ­
rante 6 horas. Si puede demostrarse que no es necesario dar placebo al lote testigo, puede omitirse dicho tratamiento. 
Días 6-8 y 13-15: lotes tratado y testigo 
Se realiza la misma aplicación que en el día 0 en la misma superficie 
de ensayo (desprovista de pelo en caso necesario) del mismo costado 
el día 6-8, y de nuevo el día 13-15.
 
1.5.2.3.2. Provocación 
Días 27-29: lotes tratado y testigo 
Se elimina el pelo (mediante corte al rape) del costado no tratado de 
los animales tratados y testigos. Se aplica un parche oclusivo o 
cámara con la cantidad conveniente de sustancia, a la concentración máxima no irritante, a la parte posterior del costado sin tratar de los animales tratados y testigos. 
Cuando sea pertinente, también se aplicará un parche oclusivo o 
cámara con vehículo solo a la parte anterior del costado sin tratar 
de los animales tratados y testigos. Los parches o cámaras se man ­
tienen con un apósito adecuado durante 6 horas.
 
1.5.2.3.3. Observación y clasificación 
— Aproximadamente a las 21 horas de levantar el parche, se eli ­
mina el pelo de la superficie de provocación. 
— Unas 3 horas después (hacia las 30 horas de la aplicación del 
parche de provocación) se observan las reacciones cutáneas y se registran de acuerdo con la clasificación recogida en el apéndice. 
— Aproximadamente a las 24 horas después de la observación de 
las 30 horas (hacia las 54 horas de la aplicación del parche de provocación) se vuelven a observar y registrar las reacciones 
cutáneas. 
Se recomienda la lectura ciega de los animales tratados y testigos. 
En caso necesario para aclarar los resultados obtenidos en la primera 
provocación, puede considerarse la realización de una segunda pro ­
vocación (es decir, una «reprovocación»), en su caso con un nuevo 
lote testigo, a la semana de haber realizado la primera. También 
puede realizarse una reprovocación con el lote testigo original.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Deben observarse y registrarse con arreglo a la escala de Magnusson 
y Kligman (véase el apéndice) todas las reacciones cutáneas y cual ­
quier observación extraña, incluidas las reacciones sistémicas, deri ­
vadas de los procesos de inducción y provocación. Pueden llevarse a cabo otros procedimientos como, por ejemplo, el examen histopato ­
lógico o la medida del espesor de los pliegues cutáneos, a fin de 
aclarar reacciones dudosas.
 
2. RESULTADOS (GPMT Y ENSAYO DE BUEHLER)  
Los resultados deben resumirse en un cuadro que indique tas reac ­
ciones cutáneas de cada animal en cada observación.  
3. INFORME (GPMT Y ENSAYO DE BUEHLER)  
Si se realiza un ensayo de cribado, por ejemplo, ensayo de ganglios 
linfáticos locales (LLNA) o prueba de tumefacción de la oreja del 
ratón (MEST) antes del ensayo con cobayas, deberá darse una des ­
cripción o referencia del ensayo, con datos sobre el método, además de los resultados obtenidos con las sustancias estudiadas y de refe ­
rencia.
 
Informe del ensayo (GPMT y ensayo de Buehler)  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente informa ­
ción: 
Animales de ensayo: 
— cepa de cobaya utilizada, 
— número, edad y sexo de los animales, — origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc., — pesos de cada animal al inicio del ensayo. Condiciones del ensayo: 
— técnica de preparación del lugar para el parche, 
— datos de los materiales y técnica de vendaje, — resultado del estudio piloto con sus conclusiones sobre las con ­
centraciones de inducción y provocación que se deban utilizar en 
el ensayo, 
— datos de la preparación, aplicación y eliminación de la sustancia 
estudiada, 
— justificación de la elección del vehículo, — concentraciones del vehículo y de la sustancia estudiada utiliza ­
das para las exposiciones de inducción y provocación, y cantidad 
total de sustancia aplicada para la inducción y la provocación. 
Resultados: — resumen de los resultados de la última comprobación realizada de 
la sensibilidad y fiabilidad (véase el punto 1.3), incluida la in ­
formación sobre la sustancia, la concentración y el vehículo que 
se hayan utilizado,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— datos de cada animal, incluido el sistema de clasificación, 
— descripción de la naturaleza y grado de los efectos observados, — las eventuales observaciones histopatológicas. 
Discusión de los resultados 
Conclusiones
 
4. REFERENCIAS  
El presente método es análogo a la TG 406 de la OCDE.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Apéndice  
CUADRO  
Escala de clasificación de Magnusson y Kligman para evaluar las reacciones 
del ensayo con parche de provocación  
0 = sin cambios visibles 
1 = eritema ligero o en manchas localizadas 2 = eritema moderado y confluente 
3 = eritema intenso y tumefacción.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. TOXICIDAD ORAL POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (28 
DÍAS) EN ROEDORES  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 407 de la 
OCDE (2008). Las directrices de ensayo 407 originales se adoptaron en 
1981. En 1995 se adoptó una versión revisada con objeto de obtener nuevos 
datos de los animales empleados en el estudio, en particular en materia de neurotoxicidad e inmunotoxicidad. 
2. En 1998, la OCDE promovió una actuación de alta prioridad orientada a 
revisar las directrices de ensayo existentes y desarrollar otras nuevas para la selección y evaluación de los alteradores endocrinos potenciales (8). Una 
faceta de esta actuación consistió en actualizar las directrices de la OCDE 
sobre "los estudios de toxicidad oral por administración continuada (28 días) en roedores" (TG 407), introduciendo parámetros adecuados para detectar la actividad endocrina de las sustancias problema. El procedimiento se sometió 
a un extenso programa internacional para evaluar la pertinencia y la prac ­
ticabilidad de los parámetros añadidos, la funcionalidad de estos parámetros en relación con productos químicos dotados de actividad (anti)estrogénica, (anti)androgénica y (anti)tiroidea, la reproducibilidad intra- e interlaborato ­
rios, y la interferencia entre los nuevos parámetros y los contemplados en 
las TG 407 anteriores. La ingente cantidad de datos así obtenidos se ha recopilado y evaluado minuciosamente en un exhaustivo informe de la OCDE (9). El presente método de ensayo B.7 actualizado (equivalente a 
las directrices TG 407) es el fruto de la experiencia y de los resultados 
derivados del programa de investigación internacional. Este método de en ­
sayo permite poner en relación determinados efectos de mecanismo endo ­
crino con otros efectos toxicológicos.
 
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
3. Al determinar y evaluar las características tóxicas de una sustancia química, 
el estudio de la toxicidad oral por administración continuada puede estar 
indicado cuando los ensayos de toxicidad aguda hayan proporcionado in ­
formación relativa a la toxicidad. El presente método de ensayo se propone investigar los efectos de toxicidad sobre una gran variedad de órganos o sistemas diana. Proporciona información acerca de los posibles riesgos para 
la salud derivados de la exposición continuada durante un período relativa ­
mente limitado, entre ellos los efectos sobre los sistemas nervioso, inmuni ­
tario y endocrino. En relación con estos criterios de valoración específicos, deberá identificar sustancias químicas con potencial neurotóxico que puedan 
justificar investigaciones futuras, o sustancias capaces de interferir en la 
fisiología de la glándula tiroides. También puede aportar datos sobre las sustancias químicas que afectan a los órganos reproductores masculinos o femeninos en los animales adultos jóvenes, o indicaciones sobre los efectos 
inmunológicos. 
4. Los resultados de este método de ensayo B.7 se aplicarán a la identificación 
del peligro y a la evaluación del riesgo. Los resultados obtenidos por medio 
de parámetros endocrinos se valorarán en el "Marco teórico para el estudio y la evaluación de los alteradores endocrinos" ( Conceptual Framework for 
Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals ) de la OCDE 
(11). El método describe el estudio básico de toxicidad por administración 
continuada que puede aplicarse en el caso de sustancias para las que no está justificado un estudio de 90 días (por ejemplo, cuando el volumen de producción no supera ciertos límites), o bien como ensayo preliminar de 
un estudio de toxicidad a largo plazo. La duración de la exposición será de 
28 días.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. El programa internacional de validación de los parámetros adecuados para 
detectar la actividad endocrina potencial de una sustancia química demostró 
que la calidad de los datos obtenidos mediante este método de ensayo B.7 depende en gran medida de la experiencia del laboratorio de ensayo. Esto se refiere específicamente a la determinación histopatológica de los cambios 
cíclicos que se producen en los órganos reproductores femeninos, así como 
de la determinación del peso de órganos con dependencia hormonal que son de pequeño tamaño y difícil disección. Se han puesto a punto unas direc ­
trices de histopatología (19), a las que se puede acceder a través de la 
página web pública de la OCDE, sobre líneas directrices. Con ella se pre ­
tende ayudar a los anatomopatólogos en sus exploraciones y aumentar la sensibilidad del ensayo. Diversos parámetros han resultado ser indicadores de la toxicidad de mediación endocrina y se han incorporado al método de 
ensayo. Aquellos parámetros que, en el programa de validación, dieron lugar 
a datos insuficientes o poco significativos sobre su eficacia para ayudar a la detección de los alteradores endocrinos se proponen como criterios de va ­
loración opcionales (véase el apéndice 2). 
6. Atendiendo a los datos generados en el proceso de validación, conviene 
destacar que la sensibilidad del presente ensayo no es suficiente para iden ­
tificar todas las sustancias con modo de acción (anti)androgénico o (anti)es ­
trogénico (9). Este método de ensayo no se practica en la fase de la vida 
más sensible a la alteración endocrina. No obstante, en el proceso de vali ­
dación el método de ensayo se mostró capaz de identificar sustancias que afectan débil o intensamente a la función tiroidea, así como sustancias con 
actividad endocrina intensa o moderada que actúan por medio de receptores 
estrogénicos o androgénicos, pero en la mayoría de los casos no consiguió identificar sustancias con actividad endocrina que influyen débilmente en los receptores estrogénicos o androgénicos. Por lo tanto, no podemos definirlo 
como un ensayo de cribado de la actividad endocrina. 
7. Por consiguiente, el hecho de no detectar efectos relacionados con estos 
modos de acción no se puede interpretar como prueba de la ausencia de 
efectos sobre el sistema endocrino. Por lo que se refiere a los efectos de 
mecanismo endocrino, la caracterización de la sustancia no debe basarse exclusivamente en los resultados de este método de ensayo, sino que se sopesarán de las pruebas en relación con todos los datos existentes acerca de 
la sustancia química para caracterizar la actividad endocrina potencial. Por 
este motivo, toda decisión normativa acerca de la (o la caracterización de las sustancias con) actividad endocrina ha de tener un enfoque amplio, y no basarse solamente en los resultados de la aplicación del presente método de 
ensayo. 
8. Se entiende que todos los procedimientos relacionados con los animales 
serán conformes a las normas locales de bienestar animal; las descripciones 
de cuidado y tratamiento que se facilitan a continuación constituyen requi ­
sitos de ejecución mínimos sobre los que prevalecerá la normativa local allí donde sea más estricta. La OCDE facilita también directrices sobre el tra ­
tamiento compasivo de los animales (14). 
9. En el apéndice 1 se recogen las definiciones empleadas.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
10. La sustancia problema se administra diariamente por vía oral en dosis gra ­
duadas a distintos lotes de animales de experimentación, a razón de una 
misma dosis por lote durante un período de 28 días. A lo largo del período 
de administración, se observa a los animales todos los días atentamente con el fin de descubrir la posible aparición de signos de toxicidad. Se practicará la autopsia de los animales que mueran o reciban la eutanasia durante el 
estudio, y cuando este concluya se procederá a la eutanasia y autopsia de los 
animales supervivientes. Un estudio de 28 días proporciona información
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
sobre los efectos de la exposición oral continuada y permite determinar la 
necesidad de realizar nuevos estudios a largo plazo. También puede aportar 
datos para seleccionar las concentraciones que se aplicarán en los estudios más prolongados. Los datos derivados de este método de ensayo deben permitir una caracterización toxicológica de la sustancia problema que 
oriente sobre la relación dosis-respuesta y permita determinar la máxima 
concentración sin efectos adversos observados (NOAEL, No Observed Ad ­
verse Effect Level).
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
11. La especie de preferencia entre los roedores es la rata, aunque pueden 
utilizarse otras especies de roedores. Si los parámetros especificados en el presente método de ensayo B.7 se investigan en otra especie de roedor, 
habrá que justificarlo minuciosamente. Si bien es biológicamente posible 
que otras especies respondan a los agentes tóxicos de manera afín a la rata, el uso de especies de menor tamaño conlleva una variabilidad mayor, debido a las dificultades técnicas que plantea la disección de órganos más peque ­
ños. En el programa internacional de validación de la detección de altera ­
dores endocrinos, la única especie utilizada fue la rata. Deben usarse ani ­
males adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en labora ­
torio. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. La administración ha 
de empezar lo antes posible tras el destete y, en cualquier caso, antes de que 
los animales tengan nueve semanas de edad. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo. Cuando se realice un estudio de 
toxicidad oral por administración continuada como fase previa de un estudio 
de toxicidad a largo plazo, es preferible que se utilicen en ambos estudios animales procedentes de la misma cepa y del mismo origen.
 
Alojamiento y alimentación de los animales  
12. Todos los procedimientos serán conformes a las normas habituales del 
cuidado de los animales de laboratorio. La sala de experimentación ha de 
estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa 
debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el ideal es el 50-60 %. La iluminación debe ser artificial, con un fotoperíodo de 12 horas de luz y 
12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de 
laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. Si la sustancia problema se administra con los alimentos, es preciso obtener una mezcla adecuada, lo cual puede influir en la elección de la dieta. Los 
animales se alojarán en pequeños grupos del mismo sexo; podrán alojarse 
individualmente si está científicamente justificado. En caso de que se utili ­
cen jaulas colectivas, no habrá más de 5 animales en cada jaula. 
13. Se analizará regularmente la comida para detectar posibles contaminantes. 
Se conservará una muestra de la dieta hasta el momento de concluir el 
informe.
 
Preparación de los animales  
14. Se reparten al azar animales adultos jóvenes y sanos entre los lotes tratados 
y los lotes de control. Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Se identifica a los 
animales de forma unívoca y se los mantiene en las jaulas al menos 5 días 
antes de empezar el tratamiento experimental para que se acostumbren a las condiciones de laboratorio.
 
Preparación de las dosis  
15. La sustancia problema se administra por sonda o con el alimento o el agua 
de bebida. El método de administración oral depende del objetivo del estu ­
dio y de las propiedades fisicoquímicas y toxicocinéticas de la sustancia 
problema.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. En caso necesario, se disuelve o suspende en un vehículo adecuado. Se 
recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de 
una solución o suspensión acuosa, después el uso de una solución o sus ­
pensión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos del agua, 
deben conocerse sus características toxicológicas. Debe determinarse la es ­
tabilidad de la sustancia problema en el vehículo.
 
PROCEDIMIENTO  
Número y sexo de los animales  
17. Deben utilizarse por los menos 10 animales (cinco hembras y cinco machos) 
por cada dosis. Si está prevista la eutanasia de algunos animales durante el ensayo, debe aumentarse el número total en una cantidad igual a la que vaya a sufrir la eutanasia antes de terminar el estudio. Puede tratarse un lote 
satélite de 10 animales (5 de cada sexo) en los grupos de control y de dosis 
más elevada para observar la reversibilidad, la persistencia o la aparición retardada de efectos tóxicos, al menos durante los 14 días siguientes al tratamiento.
 
Posología  
18. Generalmente, se emplean al menos tres lotes tratados y uno de control; 
pero si, a partir de la evaluación de otros datos, no cabe esperar ningún 
efecto con la dosis de 1 000 mg/kg peso corporal/día, puede realizarse un ensayo límite. Si no se dispone de datos apropiados, puede realizarse un estudio (con animales de la misma cepa y procedencia) para ayudar a 
determinar el intervalo de dosificación que debe emplearse. A excepción 
de la administración de la sustancia problema, los animales del lote de control deben ser tratados de la misma manera que los de los lotes de tratamiento. Si se utiliza un vehículo para administrar la sustancia problema, 
el lote de control recibirá el mayor volumen utilizado de dicho vehículo. 
19. Las dosis deben seleccionarse teniendo en cuenta la eventual toxicidad 
existente y los datos cinéticos o toxicocinéticos disponibles en relación 
con la sustancia problema o compuestos afines. La dosis más elevada 
debe seleccionarse con el propósito de inducir efectos tóxicos pero sin llegar a la muerte ni a un sufrimiento intenso. A partir de ella, debe seleccionarse una secuencia descendente de dosis a fin de poner de manifiesto las posibles 
respuestas en función de la dosis; y como dosis más baja se escogerá la 
máxima dosis sin efectos adversos observados (NOAEL). Los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer los niveles descen ­
dentes y frecuentemente es preferible añadir un cuarto lote de ensayo antes 
que utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo con un factor superior a 
10) entre dosis. 
20. Si se observan signos de toxicidad general (por ejemplo, peso corporal 
reducido, efectos hepáticos, cardíacos, pulmonares o renales, etc.) u otras 
alteraciones que no son necesariamente respuestas tóxicas (por ejemplo, ingesta de alimentos reducida, hiperplasia hepática), habrá que interpretar con prudencia los efectos observados sobre las variables inmunitarias, neu ­
rológicas o endocrinas.
 
Ensayo límite  
21. Si, en un ensayo en el que se administra un solo nivel de dosis de al menos 
1 000 mg/kg peso corporal/día o, en caso de administración en la comida o en el agua de bebida, en el que se alcanza una concentración equivalente en los alimentos o el agua de bebida (según las determinaciones del peso 
corporal) siguiendo los procedimientos descritos en el presente estudio, no 
se produce ningún efecto tóxico observable y si, a partir de datos de sus ­
tancias estructuralmente afines, no debiera esperarse la aparición de toxici ­
dad, puede considerarse innecesario realizar un estudio completo con tres 
dosis. El ensayo límite es válido excepto cuando la exposición humana 
indique la necesidad de utilizar una dosis superior.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Administración de las dosis  
22. Las dosis de la sustancia problema se administran diariamente a los anima ­
les, 7 días por semana, durante 28 días. Si la sustancia de ensayo se admi ­
nistra por sonda, debe hacerse en una sola dosis y con una sonda gástrica o 
una cánula de intubación adecuada. El volumen máximo de líquido que 
puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. Dicho volumen no debe superar 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a 2 ml/100 g de peso corporal. 
Salvo en el caso de sustancias irritantes o corrosivas, que por lo general 
producen efectos exacerbados con concentraciones mayores, deberá redu ­
cirse al mínimo la variabilidad del volumen de ensayo ajustando la concen ­
tración de manera que el volumen sea el mismo en todas las dosis. 
23. En el caso de sustancias administradas con los alimentos o el agua de 
bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia pro ­
blema administradas no interfieren en la nutrición normal o el equilibrio 
hídrico. Cuando la sustancia se administre con los alimentos, puede utili ­
zarse una concentración constante en la dieta (en ppm) o bien una dosis constante en relación con el peso corporal de los animales, pero debe 
indicarse qué método se ha elegido. Si la sustancia se administra por sonda, 
la dosis debe darse todos los días a la misma hora y ajustarse según sea necesario para mantener una dosis constante en relación con el peso corporal del animal. Si se realiza un estudio de administración continuada como fase 
previa de un estudio de toxicidad crónica a largo plazo, deberá utilizarse en 
ambos estudios una dieta similar.
 
Observaciones  
24. El período de observación debe ser de 28 días. Deben mantenerse animales 
en un lote satélite previsto para las observaciones de seguimiento durante al 
menos 14 días sin tratamiento, a fin de detectar la aparición retardada, la 
persistencia o la recuperación de los efectos tóxicos. 
25. Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al día, 
preferentemente a la misma hora cada día y teniendo en cuenta el período 
más agudo de los efectos previstos tras la administración. Se registrará el estado de salud de los animales. Se observarán todos los animales al menos 
dos veces el día para detectar posibles signos de morbilidad y mortalidad. 
26. Todos los animales deben someterse a una observación clínica exhaustiva 
antes de la primera exposición (para permitir realizar comparaciones con un 
mismo sujeto) y, después, a una por semana. Dichas observaciones han de 
efectuarse fuera de la jaula de alojamiento, de preferencia en un ambiente normal y siempre a la misma hora. Las observaciones se registran cuidado ­
samente, preferentemente mediante sistemas de puntuación definidos de 
forma explícita por el laboratorio de ensayo. Debe procurarse que las va ­
riaciones en las condiciones de ensayo sean mínimas y que las observacio ­
nes sean realizadas de preferencia por observadores ajenos al tratamiento. Los signos anotados deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios 
de la piel, pelo, ojos, membranas mucosas, presencia de secreciones y 
excreciones y actividad neurovegetativa (lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila y respiración anómala). Deben registrarse también los cambios en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de 
movimientos clónicos o tónicos, o estereotipados (por ejemplo, realización 
excesiva de movimientos de limpieza o recorridos circulares repetitivos) o comportamientos anómalos (automutilación, marcha hacia atrás, etc.) (2). 
27. En la cuarta semana de exposición se hará una evaluación de la reactividad 
sensorial frente a estímulos de diferente naturaleza (2) (estímulos auditivos, visuales y propioceptivos) (3) (4) (5), así como de la fuerza prensil (6) y de la actividad motriz (7). La bibliografía respectiva recoge más información 
sobre los métodos que pueden seguirse, si bien es posible emplear proce ­
dimientos distintos de los ahí descritos.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Las observaciones funcionales de la cuarta semana de exposición pueden 
omitirse cuando el estudio se realice como fase preliminar de un estudio 
posterior sobre toxicidad subcrónica (de 90 días). En este caso, las obser ­
vaciones funcionales deberán incluirse en este estudio de continuación. Por otra parte, la disponibilidad de datos sobre las observaciones funcionales en 
el estudio de administración continuada puede facilitar la selección de las 
dosis utilizadas en un estudio posterior sobre toxicidad subcrónica. 
29. De forma excepcional, también pueden omitirse las observaciones funcio ­
nales en los lotes que muestren signos de toxicidad de otro tipo tales que 
interfieran significativamente con los resultados de las pruebas funcionales. 
30. En la autopsia se podrá determinar (opcionalmente) el ciclo estral de todas 
las hembras tomando frotis vaginales. Estas observaciones permitirán esta ­
blecer la fase del ciclo estral en el momento del sacrificio y serán de ayuda en la evaluación histológica de los tejidos sensibles a los estrógenos [véase el documento de orientación sobre histopatología (19)].
 
Peso corporal y consumo de alimentos y agua  
31. Al menos una vez por semana se pesarán todos los animales y se calculará 
el consumo de alimentos. Si la sustancia problema se administra con el agua de bebida, deberá medirse también el consumo de agua al menos semanal ­
mente.
 
Hematología  
32. Deben practicarse los siguientes exámenes hematológicos al final del pe ­
ríodo de ensayo: hematocrito, concentraciones de hemoglobina, recuento de eritrocitos y reticulocitos, recuento de leucocitos y fórmula leucocitaria, recuento de plaquetas y medida del tiempo o capacidad de coagulación 
sanguínea. Si se sabe o sospecha que la sustancia problema o sus metabo ­
litos potenciales tienen propiedades oxidantes, habrá que determinar además las concentraciones de metahemoglobina y de cuerpos de Heinz. 
33. Las muestras de sangre deben tomarse de un punto indicado, justo antes de 
la eutanasia de los animales (o como parte del método de eutanasia), y conservarse en condiciones adecuadas. Los animales estarán en ayunas 
desde el día anterior a la eutanasia (
 1 ). 
Bioquímica clínica  
34. Deben hacerse determinaciones bioquímicas para investigar efectos tóxicos 
importantes en los tejidos y, especialmente, en el riñón y el hígado, con muestras sanguíneas obtenidas de todos los animales justo antes de la eu ­
tanasia o como parte del método de eutanasia (aparte de los moribundos o 
sacrificados antes de que termine el ensayo). Los parámetros medidos en el plasma y el suero deben incluir las concentraciones de sodio, potasio, glu ­
cosa, colesterol total, urea, creatinina, proteínas totales y albúminas, al me ­
nos dos enzimas indicadoras de los efectos hepatocelulares (alanina-amino ­
transferasa, aspartato-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, gamma-glutamil- transpeptidasa, o glutamato-deshidrogenasa) y los ácidos biliares. La deter ­
minación de otras enzimas (de origen hepático o no) y de la bilirrubina 
puede proporcionar información útil en ciertas circunstancias. 
35. Pueden realizarse, con carácter facultativo, las siguientes determinaciones en 
la última semana del estudio utilizando la recogida programada de orina: 
aspecto, volumen, osmolalidad o densidad, pH, proteínas, glucosa, sangre y 
células sanguíneas.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) El ayuno desde la víspera es preferible para realizar ciertos análisis en el suero y el 
plasma, sobre todo para la determinación de glucosa. La razón principal es que el 
aumento de la variabilidad que provocaría necesariamente la toma de alimentos podría 
enmascarar efectos más sutiles y dificultar la interpretación. Por otra parte, el ayuno 
desde la víspera puede influir en el metabolismo general de los animales y, especial ­
mente en los estudios en que la sustancia problema se administra con los alimentos, 
puede alterar la exposición diaria a dicha sustancia. Si se adopta el ayuno desde la 
víspera, deben realizarse análisis de bioquímica clínica después de la realización de las 
observaciones funcionales en la cuarta semana del estudio.
 36. Además de ello, debe plantearse el estudio de los marcadores plasmáticos o 
séricos de lesiones histológicas generales. Otras determinaciones que deben 
realizarse si se sabe o sospecha que las propiedades conocidas de la sus ­
tancia estudiada pueden afectar a las funciones metabólicas correspondientes incluyen las concentraciones de calcio, fosfato, triglicéridos, hormonas es ­
pecíficas y colinesterasa. Debe valorarse la necesidad de hacer estos análisis 
con las sustancias químicas de determinadas clases o bien según cada caso. 
37. Aunque durante la evaluación internacional de los parámetros de tipo endo ­
crino no se pudo demostrar una clara ventaja a favor de la determinación de las hormonas tiroideas (T3, T4) y de la TSH, cuando se observen indicios 
de algún efecto sobre el eje hipófiso-tiroideo puede ser de utilidad conservar 
muestras de plasma o suero para hacer valoraciones de T3, T4 y TSH (opcionales). Estas muestras se congelan a – 20 °C para su conservación. Distintos factores pueden influir en la variabilidad y en el valor absoluto de 
las concentraciones hormonales: 
— el momento del sacrificio, debido a la variación diurna de las concen ­
traciones hormonales, 
— el método de eutanasia, que se escogerá para evitar a los animales un 
sufrimiento indebido que pueda influir en las concentraciones hormona ­
les, 
— los kits de análisis hormonal, que pueden presentar diferencias en sus 
curvas patrón. 
El examen histopatológico es más fiable que el hormonal para llegar a una 
identificación definitiva de las sustancias químicos con actividad tiroidea. 
38. Las muestras de plasma destinadas específicamente al análisis hormonal se 
obtendrán a la misma hora del día. Se recomienda contemplar la posibilidad de determinar los valores de T3, T4 y TSH basándose en las alteraciones 
histopatológicas del tiroides. Las cifras obtenidas al analizar concentraciones 
de hormonas varían con los kits comerciales que se usan para el análisis. En consecuencia, no siempre es posible establecer criterios de valoración basa ­
dos en datos históricos uniformes. Por otro lado, los laboratorios procurarán 
mantener los coeficientes de variación por debajo de 25 en el caso de T3 y 
T4, y por debajo de 35 para la TSH. Todas las concentraciones se expre ­
sarán en ng/ml. 
39. Si los datos de referencia previos son insuficientes, habrá que considerar la 
posible determinación de los parámetros hematológicos y de bioquímica 
clínica antes de iniciar la administración o, preferiblemente, en un grupo 
de animales no incluidos en los lotes experimentales.
 
ANATOMÍA PATOLÓGICA  
Autopsia macroscópica  
40. Debe practicarse una autopsia macroscópica completa y detallada a todos los 
animales empleados en el estudio, que incluya un examen detenido de la 
superficie corporal externa, todos los orificios y las cavidades craneana, 
torácica y abdominal con su contenido.  El hígado,  los riñones,  cápsulas  
suprarrenales,  testículos,  epidídimo,  próstata + vesículas seminales con las  
glándulas coagulantes en conjunto,  timo,  bazo,  cerebro y  corazón de todos 
los animales (aparte de los moribundos y/o sacrificados antes de concluir el 
ensayo) han de limpiarse de los tejidos adherentes, según convenga, y pesarse lo antes posible tras la disección para evitar su desecación. Al seccionar la próstata y sus anejos se procurará evitar la punción de las 
vesículas seminales llenas de líquido. Otra posibilidad es diseccionar y pesar 
las vesículas seminales y la próstata después de fijarlas.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Facultativamente, otros dos tejidos se pueden pesar lo antes posible tras la 
disección para evitar su desecación: los ovarios pareados (peso húmedo) y el 
útero y cuello del útero [se ofrecen orientaciones sobre la excisión y pre ­
paración de los tejidos uterinos para determinar su peso en las TG 440 de la OCDE (18)]. 
42. El peso de la glándula tiroides puede determinarse (opcionalmente) después 
de su fijación. Su excisión se hará también de manera cuidadosa y solo después de la fijación para evitar daños tisulares, que comprometerían los resultados del examen histopatológico. 
43. Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el medio 
de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse (véase el punto 47): todas
 
las lesiones macroscópicas,  encéfalo (zonas representativas, con inclusión 
del cerebro, cerebelo y protuberancia),  médula espinal,  ojos,  estómago,  in­ 
testino delgado y grueso (incluidas las placas de Peyer),  hígado,  riñones,  
cápsulas suprarrenales,  bazo,  corazón,  timo,  tiroides,  tráquea y  pulmones 
(conservados mediante inflado con fijador seguido de inmersión),  gónadas  
(testículos y ovarios),  órganos sexuales secundarios (útero y cuello, epidí ­
dimo, próstata + vesículas seminales y glándulas coagulantes),  vagina,  ve­ 
jiga urinaria,  ganglios linfáticos [además del ganglio más proximal debería 
obtenerse otro ganglio linfático, dependiendo de la experiencia del labora ­
torio (15)],  nervios periféricos (ciático o tibial), preferentemente muy pró ­
ximos al músculo,  músculo esquelético y  hueso con la médula ósea (una 
sección o médula ósea aspirada y recién montada). Se recomienda fijar los testículos mediante inmersión en fijador de Bouin o de Davidson modificado 
(16) (17). Con una aguja se punciona suave y superficialmente la túnica 
albugínea por ambos polos del órgano para permitir la rápida penetración del fijador. Las observaciones clínicas y de otro tipo pueden indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también cualquier otro 
órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propiedades conocidas 
de la sustancia problema. 
44. Los siguientes tejidos pueden proporcionar valiosas indicaciones sobre los 
efectos de carácter endocrino: gónadas (ovarios y testículos), órganos sexua ­
les secundarios (útero y cuello, epidídimo, vesículas y glándulas seminales, próstata dorsolateral y ventral), vagina, hipófisis, glándula mamaria de ma ­
chos, tiroides y cápsula suprarrenal. Las alteraciones de las glándulas ma ­
marias de machos no se han documentado suficientemente, pero este pará ­
metro puede ser muy sensible a las sustancias dotadas de actividad estro ­
génica. La observación de los órganos y tejidos que no se recogen en el punto 43 es opcional (véase el apéndice 2). 
45. El documento de orientación sobre histopatología (19) proporciona más 
información detallada acerca de la disección, fijación, sección e histopato ­
logía de los tejidos endocrinos. 
46. En el programa internacional de investigación se obtuvieron indicios en el 
sentido de que es posible identificar los efectos endocrinos sutiles de sus ­
tancias que tienen escasa potencia para afectar a la homeostasis de las hormonas sexuales detectando trastornos en la sincronización del ciclo estral de diversos tejidos, antes que las alteraciones histopatológicas evidentes en 
los órganos sexuales femeninos. Si bien no se ha obtenido una prueba 
definitiva de tales efectos, se recomienda tener en cuenta los signos de posible asincronía del ciclo estral a la hora de interpretar la histopatología de los ovarios (células foliculares, tecales y granulosas), el útero, el cuello y 
la vagina. Si se determina la fase del ciclo a partir de frotis vaginales, se 
podría incluir también en la comparación.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Examen histopatológico  
47. Es preciso practicar un examen histopatológico completo de los órganos y 
tejidos conservados de todos los animales del lote expuesto a la dosis más elevada y del lote de control. En caso de que se hayan observado cambios 
relacionados con el tratamiento en el lote con la dosis más elevada, estos 
exámenes se ampliarán a animales de todos los demás lotes tratados. 
48. Deben examinarse todas las lesiones macroscópicas. 
49. Si se utiliza un lote satélite, debe hacerse un examen histopatológico de los 
órganos y tejidos que presenten efectos en los grupos tratados.
 
RESULTADOS E INFORME  
Resultados  
50. Deben proporcionarse datos de cada animal. Además, deben resumirse todos 
los datos en un cuadro que recoja, por cada lote de ensayo, el número de 
animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de animales que presenten signos de 
toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento 
de su aparición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el porcentaje de animales afectado por cada tipo de lesión. 
51. Siempre que sea posible, los resultados numéricos deberán evaluarse me ­
diante un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. La compa ­
ración de los efectos a lo largo de un intervalo de dosis evitaría el uso de 
múltiples pruebas t. Los métodos estadísticos deben seleccionarse durante el diseño del estudio. 
52. Por motivos de control de calidad, se propone recopilar los datos previos 
relativos a los controles y calcular coeficientes de variación de las variables numéricas, especialmente las relacionadas con la detección de alteradores endocrinos. Estos datos se pueden usar con fines de comparación al evaluar 
los estudios actuales.
 
Informe del ensayo  
53. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas. 
— Datos de identificación.  
Vehículo (si procede):  
— Justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua.  
Animales sometidos a ensayo:  
— Especie y cepa empleada. 
— Número, edad y sexo de los animales. 
— Procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, etc. 
— Peso de cada animal al inicio del ensayo. — Justificación de la especie si es distinta de la rata.  
Condiciones de ensayo:  
— Justificación de la selección de las dosis. 
— Datos sobre la formulación de la sustancia problema o su preparación 
con los alimentos, concentración obtenida, estabilidad y homogeneidad 
del preparado.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— Datos de la administración de la sustancia problema. 
— Factor de conversión de la concentración (ppm) de la sustancia problema 
en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales (mg/kg peso 
corporal/día), si procede. 
— Datos de la calidad de los alimentos y el agua.  
Parámetros opcionales  
— Listado de parámetros opcionales  
Resultados:  
— Peso corporal y variaciones del mismo. — Consumo de alimentos y de agua, si se ha medido. — Datos de respuestas tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos de 
toxicidad. 
— Naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas (sean 
reversibles o no). 
— Evaluación de la actividad sensorial, fuerza de prensión y actividad 
motriz. 
— Pruebas hematológicas con los correspondientes valores de referencia. 
— Pruebas bioquímicas con los correspondientes valores de referencia. — Peso corporal en el momento de la eutanasia y datos sobre el peso de los 
órganos. 
— Observaciones de la autopsia. — Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas. — Datos sobre la absorción, si los hay. — Tratamiento estadístico de los resultados, si procede.  
Discusión de los resultados. Conclusiones.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES  
Actividad antitiroidea:  capacidad de una sustancia para inhibir la acción de una 
hormona tiroidea natural (por ejemplo, T  3 ) en el organismo de un mamífero.  
Actividad tiroidea:  capacidad de una sustancia para actuar como una hormona 
tiroidea natural (por ejemplo, T  3 ) en el organismo de un mamífero.  
Androgenicidad:  capacidad de una sustancia para actuar como una hormona 
androgénica natural (por ejemplo, testosterona) en el organismo de un mamífero.  
Antiandrogenicidad:  capacidad de una sustancia para inhibir la acción de una 
hormona androgénica natural (por ejemplo, testosterona) en el organismo de un mamífero.  
Antiestrogenicidad:  capacidad de una sustancia para inhibir la acción de una 
hormona estrogénica natural (por ejemplo, 17-beta estradiol) en el organismo de 
un mamífero.  
Dosis:  cantidad de sustancia problema administrada. Se expresa en peso de 
sustancia por unidad de peso del animal y por día (por ejemplo, mg/kg peso corporal/día) o en concentración constante en la dieta.  
Estrogenicidad:  capacidad de una sustancia química para actuar como una hor ­
mona estrogénica natural (por ejemplo, 17-beta-estradiol) en el organismo de un mamífero.  
NOAEL:  sigla inglesa correspondiente a la máxima dosis sin efectos adversos 
observados, es decir, la dosis más alta a la que no se observa ningún efecto 
adverso debido al tratamiento.  
Posología:  término general que abarca la dosis administrada, su frecuencia y 
duración.  
Sustancia problema:  cualquier sustancia o mezcla estudiada mediante este mé ­
todo de ensayo.  
Toxicidad evidente:  término general que describe los signos claros de toxicidad 
que aparecen tras la administración de una sustancia problema. Estos signos 
deben ser suficientes para la evaluación del peligro y deben ser tales que, ante un aumento de la dosis administrada, pueda esperarse la aparición de signos tóxicos graves y una mortalidad probable.  
Validación:  procedimiento científico diseñado para caracterizar los requisitos 
operativos y las limitaciones de un método de ensayo y para demostrar su fiabilidad y pertinencia en relación con un propósito determinado.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Apéndice 2  
Parámetros recomendados para la detección de los alteradores 
endocrinos (AE) en el presente método de ensayo B.7  
Parámetros obligatorios Parámetros opcionales 
Peso 
— Testículos 
— Epidídimo 
— Cápsulas suprarrenales 
— Próstata + vesículas seminales y 
glándulas coagulantes — Ovarios 
— Útero y cuello 
— Tiroides  
Examen histopatológico  
— Gónadas: 
— Testículos y — Ovarios 
— Órganos sexuales secundarios: 
— Epidídimo, — Próstata + vesículas seminales y 
glándulas coagulantes 
— Útero y cuello 
— Cápsulas suprarrenales — Tiroides 
— Vagina — Frotis vaginal 
— Glándulas mamarias de machos — Hipófisis
 
Determinaciones hormonales  
— Concentración en sangre de T3 y 
T4 
— Concentración en sangre de TSH  
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the  ad hoc  
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity. 
(2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60 
(3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. 
(4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704. 
(5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. 
(6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Te ­
ratol. 13: 599-609. 
(8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 
407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. 
(10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods 
for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. 
(11) OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of En ­
docrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.htm l 
(12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. 
(13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endo ­
crine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. 
(14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7. 
(15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404-407. 
(16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. 
(17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation 
of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533. 
(18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N
 o 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties. 
(19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endo ­
crine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. TOXICIDAD SUBAGUDA POR INHALACIÓN: ESTUDIO DE 28 
DÍAS  
ÍNDICE 
El presente método de ensayo B.8 ha sido diseñado para caracterizar debida ­
mente la toxicidad por inhalación de una sustancia problema después de la 
exposición continuada durante un período limitado (28 días), y para recabar datos que permitan hacer una evaluación cuantitativa del riesgo por inhalación. Se forman lotes de al menos 5 roedores machos y 5 hembras y se exponen 6 horas 
al día durante 28 días a: a) la sustancia problema a tres o más niveles de 
concentración; b) aire filtrado (control negativo), y/o c) el vehículo (control del vehículo). Habitualmente los animales se exponen 5 días por semana, aunque se acepta exponerlos hasta 7 días por semana. Se estudian siempre animales machos 
y hembras, pero pueden exponerse a diferentes niveles de concentración si se 
sabe que uno de los sexos es más sensible a la sustancia problema. Este método concede al director del estudio suficiente flexibilidad para incluir lotes satélite (reversibilidad), lavados broncoalveolares (BAL), pruebas neurológicas y otras 
evaluaciones anatomopatológicas e histopatológicas orientadas a caracterizar me ­
jor la toxicidad de una sustancia problema.
 
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 412 de la 
OCDE (2009). Las directrices originales sobre ensayos de toxicidad suba ­
guda por inhalación (TG 412) fueron adoptadas en 1981 (1). El presente método de ensayo B.8 (equivalente a las TG 412 revisadas) se ha actuali ­
zado para reflejar el estado actual de la ciencia y satisfacer las necesidades 
normativas actuales y futuras. 
2. Este método permite caracterizar los efectos adversos que se producen des ­
pués de la exposición por inhalación diaria continuada de una sustancia problema durante 28 días: Los datos derivados de los estudios de toxicidad subaguda por inhalación durante 28 días pueden servir para efectuar eva ­
luaciones cuantitativas del riesgo [siempre que no vayan seguidos de un 
estudio de toxicidad subcrónica por inhalación durante 90 días (capítulo B.29 del presente anexo)]. Los mismos datos pueden además orientar en la selección de las concentraciones aplicadas en estudios más prolongados, 
como los de toxicidad subcrónica por inhalación durante 90 días. El presente 
método de ensayo no está específicamente destinado a la investigación de nanomateriales. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan al final del presente capítulo y en el documento GD 
39 (2).
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
3. Antes de comenzar el estudio y con el fin de mejorar su calidad y minimizar 
el sufrimiento animal, el laboratorio de ensayo tendrá en cuenta toda la 
información disponible acerca de la sustancia problema. En la selección 
de las concentraciones idóneas de estudio resulta útil toda información referente a: identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, resultados de anteriores ensayos de toxicidad  in vivo  
o in vitro,  uso(s) previsto(s) y posible exposición humana, datos de (Q)SAR 
previos y datos toxicológicos acerca de compuestos químicos estructural ­
mente afines, y resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad aguda por inhalación. Si se prevé o se observa neurotoxicidad en el transcurso del 
estudio, el director del mismo puede decidir la incorporación de las evalua ­
ciones pertinentes, como una batería de observación funcional (FOB) y registros de la actividad motriz: Si bien el calendario de las exposiciones en relación con las evaluaciones concretas puede ser crítico, la realización 
de estas actividades complementarias no debe interferir en el diseño básico 
del estudio.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Se pueden estudiar diluciones de sustancias corrosivas o irritantes a concen ­
traciones capaces de inducir el grado de toxicidad esperado [véase GD 39 
(2)]. Al exponer los animales a estos productos, las concentraciones diana deben ser lo bastante bajas para no provocar un dolor y sufrimiento inten ­
sos, pero suficientes para obtener una curva de concentración-respuesta que 
satisfaga los objetivos científicos y normativos del ensayo. Dichas concen ­
traciones se escogerán según cada caso, preferiblemente sobre la base de estudios del intervalo analítico debidamente diseñados que arrojen informa ­
ción sobre el parámetro principal, el umbral de irritación y el tiempo de 
aparición de los síntomas (véanse los puntos 11-13). Se justificará la elec ­
ción de las concentraciones. 
5. Los animales moribundos o que presenten signos evidentes de dolor o de 
sufrimiento intenso y duradero deben sacrificarse de forma compasiva. Los 
animales moribundos se contabilizan como muertes durante el ensayo. En el documento de orientación sobre criterios de tratamiento compasivo [Gui ­
dance Document on Humane Endpoints de la OCDE (3)] se dan criterios 
para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a sufri ­
miento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte es previsible o inminente.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
6. Hay que utilizar roedores adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio 
corriente. La especie preferida es la rata. Deberá justificarse el empleo de 
otra especie.  
Preparación de los animales  
7. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. El día de la asignación 
aleatoria, los animales serán adultos jóvenes de entre 7 y 9 semanas de edad. Los pesos corporales se desviarán a lo sumo en ± 20 % del peso 
medio de cada sexo. Se seleccionan al azar los animales, se marcan para 
permitir su identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes de iniciar el ensayo, a fin de que se aclimaten a las condiciones del laboratorio.
 
Zootecnia  
8. Los animales se identificarán de manera individual, a ser posible con trans ­
pondedores subcutáneos, a fin de facilitar la observación y evitar confusio ­
nes. La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. La humedad relativa se mantendrá idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, si bien 
esto no siempre es posible cuando se usa el agua como vehículo. Antes y 
después de las exposiciones, los animales deberán enjaularse en principio por grupos de sexo y nivel de exposición, pero el número de animales por jaula será tal que permita la observación sin trabas de cada animal y mini ­
mice las pérdidas por agresiones y canibalismo. Cuando la exposición es 
solo por la nariz, puede ser necesario acostumbrar a los animales a los tubos de sujeción. Estos no deberán ejercer sobre los animales tensiones físicas, térmicas o de inmovilización. La sujeción puede influir en parámetros fisio ­
lógicos como la temperatura corporal (hipertermia) o el volumen respiratorio 
por minuto. Si se dispone de datos generales en el sentido de que no se producen estos cambios en medida apreciable, se podrá prescindir de la adaptación previa a los tubos de sujeción. Los animales expuestos de cuerpo 
entero a un aerosol se enjaularán de manera individual durante la exposición 
para evitar que el aerosol en estudio se filtre a través del pelo de sus compañeros de jaula. Salvo durante la exposición, se podrán administrar las dietas habituales de laboratorio certificadas, acompañadas de un sumi ­
nistro ilimitado de agua potable de la traída municipal. La iluminación será 
artificial, con una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Cámaras de inhalación  
9. Para seleccionar una cámara de inhalación se tendrán en cuenta la naturaleza 
de la sustancia problema y la finalidad del ensayo. El modo de exposición preferible es de solo la nariz (término que abarca los modos de exposición 
solo por la cabeza, solo por la nariz y solo por el hocico). Este modo de 
exposición es el recomendado generalmente para los estudios de aerosoles líquidos o sólidos y de vapores que pueden condensarse formando aerosoles. Determinados objetivos de la investigación se podrían alcanzan mejor utili ­
zando el modo de exposición de cuerpo entero, pero esto debe justificarse 
en el informe del estudio. Para asegurar la estabilidad atmosférica cuando se emplea una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los animales 
experimentales no debe exceder del 5 % del volumen de la cámara. En el 
documento GD 39 (2) se describen los principios de las técnicas de expo ­
sición de cuerpo entero y de solo por la nariz y sus ventajas e inconvenien ­
tes respectivos.
 
ESTUDIOS DE TOXICIDAD  
Concentraciones límite  
10. A diferencia de los estudios de toxicidad aguda, en los estudios de toxicidad 
subaguda por inhalación durante 28 días no hay concentraciones límite 
definidas. La concentración máxima estudiada dependerá de: 1) la máxima concentración alcanzable, 2) el nivel de exposición humana en "el escenario más desfavorable", 3) la necesidad de mantener un suministro de oxígeno 
adecuado, y/o 4) la atención al bienestar de los animales. Si no se dispone 
de datos de concentración límite, es aplicable el Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 (13) [hasta una concentración máxima de 5 mg/l para los 
aerosoles, de 20 mg/l para los vapores y de 20 000 ppm para los gases; 
véase el documento GD 39 (2)]. Cuando sea preciso superar estos límites en 
el estudio de gases o sustancias problemas altamente volátiles (por ejemplo, refrigerantes), habrá que justificar los motivos. La concentración límite será tal que induzca una toxicidad inequívoca sin provocar un sufrimiento inde ­
bido a los animales ni afectar a su longevidad (3).
 
Estudio de determinación del intervalo  
11. Antes de proceder al estudio principal, puede ser necesario realizar un 
estudio para determinar el intervalo analítico. Un estudio de determinación del intervalo es más completo que un estudio preliminar, por cuanto no se 
limita a la selección de las concentraciones. La información recabada en este 
tipo de estudio puede ser decisiva para el éxito del estudio principal. Un estudio de determinación del intervalo puede, por ejemplo, aportar informa ­
ción técnica referente a los métodos analíticos y a la granulometría, la 
detección de los mecanismos de toxicidad, los parámetros anatomopatológi ­
cos e histopatológicos, y las estimaciones de lo que podrán ser el NOAEL y la concentración tóxica mínima en un estudio principal. El director de la 
investigación decidirá si ha de basarse en el estudio de determinación del 
intervalo para identificar el umbral de irritación de las vías respiratorias (con la histopatología de las vías respiratorias, las pruebas de la función pulmonar o el lavado broncoalveolar), la concentración máxima tolerada sin causar un 
sufrimiento indebido a los animales y los parámetros que caractericen mejor 
la toxicidad de la sustancia problema. 
12. Un estudio de determinación del intervalo puede hacerse con uno o más 
niveles de concentración. A cada nivel de concentración no deben exponerse 
más de tres machos y tres hembras. El estudio de determinación del inter ­
valo tendrá una duración mínima de 5 días y máxima (generalmente) de 14 días. En el informe del estudio se justificará la selección de las concen ­
traciones destinadas al estudio principal. La finalidad del estudio principal es 
demostrar una relación concentración-respuesta basada en lo que se supone el parámetro más sensible. La concentración más baja será idealmente una en la que no se observen efectos adversos, mientras que la concentración 
más alta será tal que induzca una toxicidad inequívoca sin provocar un 
sufrimiento indebido a los animales ni afectar a su longevidad (3).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. A la hora de elegir los niveles de concentración para el estudio de deter ­
minación del intervalo, se tendrá en cuenta toda la información disponible, 
incluidos las relaciones entre estructura y actividad y los datos de sustancias afines (véase el punto 3). Un estudio de determinación del intervalo puede verificar o refutar los parámetros relacionados con los mecanismos de acción 
que a priori  se consideran más sensibles, como la inhibición de la colines ­
terasa por los organofosforados, la formación de metahemoglobina por agen ­
tes eritrotóxicos, las hormonas tiroideas (T
 3 y T  4 ), en el caso de tirotóxicos, 
y la presencia de proteínas, LDH, o neutrófilos en el lavado broncoalveolar 
en el caso de partículas inocuas escasamente solubles o de aerosoles que son 
irritantes pulmonares.  
Estudio principal  
14. El estudio principal de toxicidad subaguda comprende habitualmente tres 
niveles de concentración, además de lotes de control negativo (aire) y/o 
testigo del vehículo (véase el punto 17). Se recurrirá a todos los datos 
disponibles para ayudar a la selección de los niveles de exposición adecua ­
dos, incluidos los resultados de los estudios de toxicidad sistémica, meta ­
bólicos y cinéticos (poniendo especial atención para evitar niveles de con ­
centración elevados que saturen los procesos cinéticos). Cada lote de ensayo 
se compone de al menos 10 roedores (5 machos y 5 hembras), que se exponen a la sustancia química estudiada 6 horas al día en un régimen de 5 días por semana durante un período de 4 semanas (la duración total del 
estudio es de 28 días). También se admite exponer a los animales 7 días por 
semana (por ejemplo, cuando se estudian productos farmacéuticos para in ­
halación). Si se sabe que uno de los sexos es más sensible a la sustancia problema, podrán exponerse los dos sexos a diferentes niveles de concen ­
tración con el fin de optimizar la relación concentración-respuesta, tal como 
se describe en el punto 15. Cuando se exponen con la técnica de solo por la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justi ­
ficarán los motivos cuando el tiempo de exposición sea inferior a 6 horas/ 
día o cuando sea necesario efectuar un estudio de exposición de cuerpo entero de larga duración (por ejemplo, 22 horas/día) [véase el documento GD 39 (2)]. Se privará de comida a los animales durante el período de 
exposición, a menos que este exceda de 6 horas. Se puede suministrar agua 
durante todo el período de exposición de cuerpo entero. 
15. Las concentraciones diana seleccionadas deben servir para identificar el 
órgano o los órganos diana y para demostrar una clara relación concentra ­
ción-respuesta. 
— El nivel de concentración más elevado debe inducir efectos tóxicos, pero 
sin provocar letalidad o daños persistentes que impidan hacer una eva ­
luación significativa. 
— El nivel o los niveles de concentración intermedios se espaciarán para 
obtener una graduación o escala de los efectos tóxicos desde el nivel 
más bajo al más elevado. 
— La concentración más baja debe producir escasos o nulos signos de 
toxicidad.
 
Estudio satélite (de reversibilidad)  
16. Es posible recurrir a un estudio satélite (de reversibilidad) para observar la 
reversibilidad, persistencia o aparición retardada de toxicidad durante un período de duración adecuada, pero nunca inferior a 14 días, después del 
tratamiento. Los lotes satélite (de reversibilidad) se componen de 5 machos 
y 5 hembras, que se exponen simultáneamente a los animales de experi ­
mentación del estudio principal. Los lotes del estudio satélite (de reversibi ­
lidad) deben exponerse a la sustancia problema al nivel de concentración 
más elevado y, en la medida necesaria, se emplearán simultáneamente lotes 
testigo con aire y/o con el vehículo (véase el punto 17).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Animales de control  
17. Los animales de control negativo (con aire) simultáneo se tratan de manera 
idéntica a los animales del lote experimental, excepto en que se exponen al aire filtrado en lugar de a la sustancia problema. Cuando se utiliza agua o 
cualquier otra sustancia para ayudar a crear la atmósfera experimental, en el 
estudio debe incluirse un lote testigo del vehículo, en lugar del lote de control negativo (con aire). Como vehículo se usará agua en la medida de lo posible. Cuando se use agua como vehículo, los animales de control se 
expondrán a una atmósfera de aire con la misma humedad relativa que los 
grupos expuestos a la sustancia problema. La selección de un vehículo idóneo se basará en un ensayo preliminar debidamente realizado o bien 
en los datos históricos. Cuando no se conoce bien la toxicidad de un 
vehículo, el director del estudio puede decidir el uso de ambos lotes, el de control negativo (con aire) y el testigo del vehículo, pero no es en absoluto recomendable. Si los datos previos revelan que un vehículo es 
atóxico, no hay necesidad de emplear un grupo de control negativo (con 
aire), y solo se usará un lote testigo del vehículo. Si un ensayo preliminar de toxicidad de una sustancia problema formulada en un vehículo revela que no hay toxicidad, se deduce que el vehículo es atóxico a la concentración 
analizada y debe utilizarse este control del vehículo.
 
CONDICIONES DE EXPOSICIÓN  
Administración de las concentraciones  
18. Los animales se exponen a la sustancia problema en forma de gas, vapor, 
aerosol o una mezcla de estos. El estado físico investigado dependerá de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, de la concentración seleccionada y/o de la forma física más probable que adoptará dicha sus ­
tancia durante su manipulación y administración. Las sustancias higroscópi ­
cas y químicamente reactivas deberán estudiarse en condiciones de aire seco. Se procurará evitar la acumulación de concentraciones explosivas. 
Los materiales particulados pueden someterse a procesos mecánicos para 
reducir el tamaño de partícula. Se ofrecen más orientaciones en el docu ­
mento de orientación GD 39 (2).
 
Distribución del tamaño de partícula  
19. Se controlará la granulometría de todos los aerosoles y vapores que puedan 
condensarse formando aerosoles. Para facilitar la exposición de todas las zonas de interés de las vías respiratorias, se recomiendan aerosoles que tengan un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) de 1 a 3 μm, 
con una desviación típica geométrica ( σ
 g ) en el intervalo de 1,5 a 3,0 (4). Se 
procurará dentro de lo razonable ajustarse a este marco de referencia, pero si ello no es posible se consultará la opinión de expertos. Así, por ejemplo, las partículas de los humos metálicos pueden tener un tamaño inferior al men ­
cionado intervalo, mientras que las partículas con carga y las fibras pueden 
superarlo.
 
Preparación de la sustancia problema en un vehículo  
20. En condiciones ideales, la sustancia problema debería estudiarse sin ningún 
vehículo. Si es necesario emplear un vehículo para generar una concentra ­
ción de sustancia problema y un tamaño de partícula adecuados, se le dará preferencia al agua. Siempre que una sustancia problema se disuelva en un vehículo, debe demostrarse su estabilidad.
 
SUPERVISIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN  
Caudal de aire de la cámara  
21. El caudal de aire de la cámara de exposición se controlará minuciosamente, 
se supervisará de manera continuada y se registrará como mínimo cada hora 
durante cada exposición. La supervisión en tiempo real de la concentración atmosférica (o la estabilidad temporal) del ensayo constituye una medida integral de todos los parámetros dinámicos y proporciona un medio indirecto 
de controlar todos los parámetros dinámicos de la inhalación que resultan de 
interés. Si la concentración se supervisa en tiempo real, es posible reducir la
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
frecuencia de medición del caudal de aire limitándola a una sola medición 
por exposición y día. Habrá que tomar especiales precauciones para evitar la 
reinspiración en las cámaras de exposición solo por la nariz. La concen ­
tración de oxígeno debe ser como mínimo del 19 %, y la de dióxido de carbono no debe superar el 1 %. Si existen razones para suponer que no se 
van a respetar estos valores de referencia, habrá que medir las concentra ­
ciones de ambos gases. Si las mediciones del primer día de exposición revelan que estos gases están presentes a las concentraciones adecuadas, no serán necesarias nuevas mediciones.
 
Temperatura y humedad relativa de la cámara  
22. La temperatura de la cámara se mantendrá en 22 ± 3 °C. Siempre que sea 
posible, la humedad relativa presente en la zona de respiración de los 
animales, tanto en las exposiciones de solo por la nariz como en las de 
cuerpo entero, se supervisará de manera continua y se registrará cada hora durante la exposición. La humedad relativa debe mantenerse preferiblemente en el intervalo del 30 % al 70 %, pero este valor de referencia puede ser 
inalcanzable (por ejemplo, cuando se analizan mezclas acuosas) o imposible 
de medir (cuando hay interferencias de la sustancia problema con el método de ensayo).
 
Sustancia problema: concentración nominal  
23. Siempre que sea factible, se calculará y registrará la concentración nominal 
en la cámara de exposición. La concentración nominal es la masa de sus ­
tancia problema generada dividida por el volumen total de aire que recorre 
el sistema de la cámara de inhalación. La concentración nominal no se usa para caracterizar la exposición de los animales, pero la comparación entre la concentración nominal y la real nos da un índice de la eficiencia generadora 
del sistema experimental, de modo que puede servir para detectar problemas 
en la generación de la atmósfera.
 
Sustancia problema: concentración real  
24. La concentración real es la concentración de sustancia problema compro ­
bada por muestreo en la zona de respiración de los animales de una cámara de inhalación. Las concentraciones reales se pueden calcular con métodos 
específicos (por ejemplo, muestreo directo, métodos de adsorción o uso de 
reactivos químicos y posterior valoración analítica) o bien con métodos inespecíficos, como la gravimetría por filtración. El análisis gravimétrico es aceptable exclusivamente para aerosoles de un único componente en 
polvo o de líquidos de baja volatilidad, y deberá sustentarse en caracteriza ­
ciones preliminares específicas de la sustancia problema. La concentración de los aerosoles de polvos multicomponentes se puede determinar también por gravimetría. Sin embargo, hacen falta datos analíticos que demuestren 
que la composición del material aerotransportado es afín a la del material de 
partida. Si no se dispone de tal información, puede ser necesario repetir el análisis de la sustancia problema (idealmente, en estado aerotransportado) a intervalos regulares a lo largo del ensayo. Cuando se trata de productos en 
forma de aerosol capaces de evaporarse o sublimarse, habrá que demostrar 
que el método elegido es capaz de recoger todas las fases. 
25. Se usará, a ser posible, un solo lote de sustancia problema durante todo el 
estudio, lote que se conservará en condiciones que preserven su pureza, 
homogeneidad y estabilidad. Antes de iniciar el estudio deberá hacerse 
una caracterización de la sustancia problema consistente en un análisis de pureza y, si es técnicamente factible, de identidad y de cuantificación de contaminantes e impurezas. Con este fin se pueden aportar, entre otros, los 
siguientes datos: tiempo de retención y área relativa del pico, peso molecular 
determinado mediante espectroscopia de masas o cromatografía de gases y otras determinaciones. Si bien la identidad de la muestra de ensayo no es responsabilidad del laboratorio de análisis, la prudencia aconseja que este 
confirme, aunque sea dentro de ciertos límites, la caracterización facilitada 
por el promotor (por ejemplo, color, naturaleza física, etc.).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. La atmósfera de exposición debe mantenerse constante en la medida de lo 
posible. Para demostrar la estabilidad de las condiciones de exposición se 
puede usar un equipo de supervisión en tiempo real, como un fotómetro de proceso para aerosoles o un analizador de hidrocarburos totales para vapo ­
res. La concentración real presente en la cámara deberá medirse al menos 3 
veces por cada nivel y día de exposición. Pero si ello no es posible debido a 
un caudal de aire limitado o a que las concentraciones son bajas, se acepta una muestra por período de exposición. En ese caso, lo ideal es recoger la muestra durante todo el período de exposición. Las concentraciones indivi ­
duales medidas en la cámara no deben desviarse de la concentración media 
en ± 10 % cuando se trata de gases y vapores, ni en más de ± 20 % en el caso de aerosoles de líquidos o sólidos. Se calculará y documentará el tiempo de equilibrado (t
 95 ) de la cámara. La duración de una exposición 
incluye el tiempo durante el cual se genera la sustancia problema. Este 
abarca los tiempos transcurridos hasta alcanzar el equilibrio en la cámara (t
 95 ) y hasta la extinción. Se ofrecen indicaciones para el cálculo de t  95 en el 
documento de orientación n  o 39 (2). 
27. Cuando se manejan mezclas muy complejas formadas por gases/vapores y 
aerosoles (por ejemplo, atmósferas de combustión y sustancias problema 
propulsadas con dispositivos/productos fabricados con fines determinados), cada fase puede comportarse de manera diferente en una cámara de inhala ­
ción. Por consiguiente, se seleccionará como mínimo una sustancia indica ­
dora (analito), normalmente la sustancia activa principal de la mezcla, por 
cada fase (gas/vapor y aerosol). Si el producto analizado es una mezcla, habrá que documentar la concentración analítica de la mezcla total y no solo de la sustancia indicadora o del componente activo (analito). Se ofrece más 
información sobre las concentraciones reales en el documento de orientación 
n
 o 39 (2).  
Sustancia problema: granulometría  
28. La granulometría de los aerosoles debe determinarse al menos con periodi ­
cidad semanal por cada nivel de concentración, con ayuda de un impactador de cascada o un aparato alternativo, como un cribador de partículas. Si se puede demostrar la equivalencia de los resultados obtenidos con el impac ­
tador de cascada y con el aparato alternativo, entonces se podrá emplear este 
último durante todo el estudio. 
29. Se empleará un segundo dispositivo, como un filtro gravimétrico o un 
sistema de burbujeo o de purga, en paralelo con el equipo principal para confirmar la eficiencia de recogida de este último. La concentración en masa 
obtenida mediante análisis por tamaños de partícula tendrá unos límites de 
desviación razonables con respecto a la concentración en masa obtenida mediante gravimetría por filtración [véase el documento GD 39 (2)]. Si es posible demostrar su equivalencia para todas las concentraciones analizadas 
en la fase inicial del estudio, podrán omitirse en lo sucesivo las pruebas 
confirmatorias. Por razones de bienestar animal, se tomarán medidas para minimizar la obtención de datos no concluyentes que obligarían a repetir el ensayo. 
30. Se controlará la granulometría en los vapores cuando exista la posibilidad de 
que la condensación del vapor provoque la formación de un aerosol, o 
cuando se detecten partículas en una atmósfera de vapor que puedan inducir la mezcla de fases.
 
OBSERVACIONES 
31. Los animales se someterán a observación clínica frecuente antes, durante y 
después del período de exposición. Pueden estar indicadas observaciones más frecuentes, dependiendo de la respuesta de los animales durante la 
exposición. Cuando la observación de los animales esté dificultada por el 
uso de tubos de sujeción, por la escasa iluminación de las cámaras de cuerpo entero o por la opacidad ambiental, se someterán a observación minuciosa después de la exposición. Las observaciones realizadas con an ­
terioridad a la exposición del día siguiente permiten determinar la posible 
reversibilidad o exacerbación de los efectos tóxicos.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Todas las observaciones se registrarán en fichas individuales de cada animal. 
Cuando se encuentre algún animal muerto o se sacrifique por razones com ­
pasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la muerte. 
33. Las observaciones en la jaula deberían incluir los cambios en la piel, ojos y 
membranas mucosas; los cambios en los sistemas respiratorio, circulatorio y 
nervioso, así como la actividad somatomotriz y las pautas de comportamien ­
to. Debe prestarse atención especial a la observación de temblores, convul ­
siones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. El registro de la tempe ­
ratura rectal puede ayudar a detectar una bradipnea refleja o una hipo/hi ­
pertermia relacionadas con el tratamiento o con el confinamiento. En el 
protocolo del estudio se pueden incluir otras evaluaciones del tipo de prue ­
bas cinéticas, biovigilancia, pruebas de la función pulmonar, retención de materiales escasamente solubles que puedan acumularse en el tejido pulmo ­
nar y cambios comportamentales.
 
PESO CORPORAL 
34. Se registrará el peso de cada animal poco antes de la primera exposición 
(día 0), y después dos veces por semana (por ejemplo, los viernes y lunes 
para demostrar la recuperación durante un fin de semana sin exposición, o en un intervalo que permita evaluar la toxicidad sistémica) y en el momento de la muerte o la eutanasia. Si no se observan efectos en las 2 primeras 
semanas, el peso corporal se podrá registrar semanalmente durante el resto 
del estudio. Si se utilizan animales satélite (reversibilidad), se seguirán pesando semanalmente durante todo el período de recuperación. Al concluir el estudio, se pesarán todos los animales poco antes del sacrificio para 
permitir calcular sin sesgos la relación entre el peso de los órganos y el 
peso corporal.
 
CONSUMO DE AGUA Y DE ALIMENTOS 
35. El consumo alimentario se medirá cada semana. También se puede medir el 
consumo de agua.  
PATOLOGÍA CLÍNICA 
36. Deben hacerse evaluaciones de patología clínica en todos los animales, 
incluidos los testigo y los satélite (reversibilidad), cuando sean sacrificados. 
Se registrará el intervalo de tiempo transcurrido entre el final de la exposi ­
ción y la toma de muestras de sangre, particularmente si la recuperación del parámetro valorado es rápida. Está indicado obtener muestras al final del 
período de exposición cuando se trata de parámetros con una semivida 
plasmática corta (por ejemplo, COHb, CHE y MetHb). 
37. En el cuadro 1 se recogen los parámetros de patología clínica que se suelen 
exigir en todos los estudios toxicológicos. El análisis de orina no es nece ­
sario de forma sistemática, sino solo en caso de efectos tóxicos probables o 
manifiestos. El director del estudio puede decidir la evaluación de otros 
parámetros para caracterizar mejor la toxicidad de una sustancia problema (colinesterasa, lípidos, hormonas, equilibrio ácido-base, metahemoglobina o cuerpos de Heinz, creatina-cinasa, cociente mieloide/eritroide, troponinas, 
gases en sangre arterial, lactato-deshidrogenasa, sorbitol-deshidrogenasa, 
glutamato-deshidrogenasa y gamma-glutamil-transpeptidasa).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Cuadro 1  
Parámetros de patología clínica habituales  
Hematología  
Recuento de eritrocitos 
Hematocrito 
Concentración de hemoglobina Hemoglobina corpuscular media 
Volumen corpuscular medio 
Concentración de hemoglobina cor ­
puscular media 
Reticulocitos Recuento de leucocitos 
Fórmula leucocitaria 
Recuento de plaquetas Capacidad de coagulación (selec ­
cionar una): 
— Tiempo de protrombina — Tiempo de coagulación — Tiempo de tromboplastina 
parcial
 
Bioquímica  
Glucosa (*) 
Colesterol total Triglicéridos Nitrógeno ureico en sangre 
Bilirrubina total 
Creatinina Proteínas totales 
Albúmina 
Globulinas Alanina-aminotransferasa 
Aspartato-aminotransferasa Fosfatasa alcalina Potasio 
Sodio 
Calcio Fósforo 
Cloruros
 
Análisis de orina (opcional)  
Aspecto (color y turbidez) 
Volumen Densidad y osmolalidad 
pH Proteínas totales 
Glucosa Sangre/células sanguíneas
 
(*) Puesto que un período de ayuno prolongado puede introducir un sesgo en las 
determinaciones de glucosa entre los animales de control y los tratados, el director 
del estudio decidirá si es apropiado o no imponer dicho ayuno a los animales. Si 
se impone un período de ayuno, será acorde a la especie empleada; para las ratas 
puede ser de 16 horas (ayuno desde la víspera). La determinación de la glucosa en 
ayunas puede hacerse con ayuno desde la víspera durante la última semana de 
exposición, o bien con ayuno desde la víspera antes de proceder a la autopsia (en 
este último caso, con la determinación de todos los restantes parámetros de 
patología clínica).  
38. Cuando hay indicios de que las vías respiratorias bajas (alvéolos) son el 
lugar principal de depósito y retención, el lavado broncoalveolar (BAL) 
puede ser la técnica de elección para analizar cuantitativamente los paráme ­
tros hipotéticamente dependientes de la dosis relacionados con la aparición de alveolitis, inflamación pulmonar y fosfolipidosis. Ello permite demostrar 
debidamente la relación dosis-respuesta y la evolución en el tiempo del daño 
alveolar. En el fluido BAL se puede efectuar el recuento de leucocitos y la fórmula leucocitaria, y medir las proteínas totales y la lactato deshidroge ­
nasa. Otros parámetros dignos de tenerse en cuenta son los indicadores de 
daño lisosomal, fosfolipidosis, fibrosis e inflamación alérgica o irritativa, 
como puede ser la determinación de las citocinas o quimiocinas proinfla ­
matorias. Generalmente, las determinaciones realizadas en el BAL son com ­
plementarias de los resultados del examen histopatológico, pero no pueden 
sustituirlos. En el documento GD 39 (2) se facilitan indicaciones sobre el 
modo de realizar un lavado pulmonar.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
ANATOMÍA PATOLÓGICA MACROSCÓPICA Y PESO DE LOS ÓR ­
GANOS 
39. Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran durante 
su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar 
animal, se someterán a sangrado total (de ser factible) y a autopsia macros ­
cópica. Se documentará el tiempo transcurrido entre el final de la última exposición de cada animal y su sacrificio. Si la autopsia no se puede practicar inmediatamente después de comprobar la muerte del animal, este 
será refrigerado (no congelado) a una temperatura suficientemente baja para 
minimizar la autólisis. Las autopsias se practicarán lo antes posible, normal ­
mente en el plazo de uno o dos días. Se documentarán todas las modifica ­
ciones anatomopatológicas macroscópicas observadas en cada animal, po ­
niendo especial atención a las alteraciones de las vías respiratorias. 
40. En el cuadro 2 se indican los órganos y tejidos que durante la autopsia 
macroscópica deben conservarse en un medio idóneo para su examen his ­
topatológico. La conservación de los órganos y tejidos entre corchetes, así como de cualquier otro órgano o tejido, se hará a criterio del director del estudio. Los órganos destacados  en negrita  se deben limpiar de adherencias 
y pesar lo antes posible después de la disección para evitar su desecación. El 
tiroides y los epidídimos solo se pesarán en caso necesario, porque artefac ­
tos debidos a las adherencias pueden dificultar la evaluación histopatológica. Los tejidos y órganos se fijan en formol con amortiguador al 10 % o en otro 
fijador apropiado inmediatamente después de la autopsia, dejando pasar un 
mínimo de 24-48 horas antes de la limpieza de adherencias, dependiendo del fijador empleado.
 
Cuadro 2  
Órganos y tejidos conservados durante la autopsia macroscópica 
Cápsulas suprarrenales  
Médula ósea (y/o aspirado reciente)  
Encéfalo  (incluidos cortes de cerebro, cerebe ­
lo, bulbo y protuberancia) 
[Ojos (retina, nervio óptico) y párpados]  
Corazón Riñones  
Laringe (3 secciones de corte histológico, 1 
de ellas de la base de la epiglotis)  
Hígado Pulmón  (todos los lóbulos en una sección de 
corte, incluidos los bronquios primarios) 
Ganglios linfáticos de la región hiliar del pul ­
món, especialmente cuando se estudian sus ­
tancias problema particuladas escasamente so ­
lubles. Si se trata de exámenes más minucio ­
sos o de carácter inmunológico, pueden to ­
marse en consideración otros ganglios linfáti ­
cos, por ejemplo de las regiones mediastínica, cervical/submandibular o auricular. 
Tejidos nasofaríngeos [como mínimo 4 sec ­
ciones; 1 sección incluirá el conducto nasofa ­
ríngeo y el tejido linfoide asociado a la nariz 
(Nasal Associated Lymphoid Tissue, NALT)] 
Esófago [Bulbo olfativo] 
Ovarios Vesículas seminales 
Médula espinal (cervical, medio dorsal y 
lumbar)  
Bazo  
Estómago  
Testículos Timo  
Tiroides 
Tráquea (como mínimo 2 secciones, 1 
sección longitudinal que pase por la carina traqueal y 1 sección transversal) 
[Vejiga urinaria] Útero Todas las lesiones macroscópicas
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. El pulmón se debe extraer intacto, pesar e instilar con un fijador apropiado a 
una presión de 20-30 cm de agua para asegurar el mantenimiento de la 
estructura pulmonar (5). Se preparan cortes de todos los lóbulos a un solo nivel, incluyendo los bronquios primarios, pero, si se practica un lavado pulmonar, el lóbulo no lavado se seccionará a tres niveles (no en cortes 
seriados). 
42. Deben examinarse como mínimo 4 secciones de los tejidos nasofaríngeos, 
una de los cuales incluirá el conducto nasofaríngeo (5) (6) (7) (8) (9) para 
permitir una observación adecuada de los epitelios escamoso, transicional (respiratorio no ciliado) y olfativo, y el tejido de drenaje linfático [NALT; (10) (11)]. Se examinarán tres secciones de la laringe, una de las cuales 
debe incluir la base de la epiglotis (12). Deben examinarse como mínimo 2 
secciones de la tráquea, entre ellas un corte longitudinal que pase por la carina de bifurcación de los bronquios extrapulmonares y un corte trans ­
versal.
 
EXAMEN HISTOPATOLÓGICO 
43. La evaluación histopatológica de todos los órganos y tejidos mencionados 
en el cuadro 2 se llevará a cabo en el lote de control y en el de concen ­
tración más elevada, así como en todos los animales que mueran o sean 
sacrificados durante el estudio. Se prestará especial atención a las vías 
respiratorias, los órganos diana y las lesiones macroscópicas. Aquellos ór ­
ganos y tejidos que presenten lesiones en el lote de concentración más elevada se examinarán en todos los grupos. Con objeto de demostrar una 
clara relación concentración-respuesta, el director del estudio puede decidir 
la realización de evaluaciones histopatológicas en otros grupos. Si se utiliza un lote satélite (reversibilidad), debe hacerse un examen histopatológico de todos los órganos y tejidos que presenten efectos en los lotes tratados. Si en 
el lote de exposición elevada se producen muertes prematuras u otras con ­
trariedades que comprometan la interpretación de los datos, se practicarán evaluaciones histopatológicas en el lote de la concentración inmediatamente inferior. Se procurará correlacionar las observaciones macroscópicas con los 
hallazgos microscópicos.
 
DATOS E INFORME  
Datos  
44. Se documentarán los datos de cada animal referentes a peso corporal, con ­
sumo de alimento, patología clínica, anatomía patológica macroscópica, peso de los órganos e histopatología. Los resultados de la observación 
clínica se reunirán en un cuadro que presente, por cada lote de ensayo, el 
número de animales utilizados, el número de animales que presenten signos específicos de toxicidad, el número de animales hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte de 
los distintos animales, la descripción y la evolución temporal de los efectos 
tóxicos y la reversibilidad, y los resultados de la autopsia. Todos los resul ­
tados, cuantitativos y fortuitos, se evaluarán por un método estadístico apropiado. Puede usarse cualquier método estadístico reconocido; los méto ­
dos estadísticos aplicados deben seleccionarse durante el diseño del estudio.
 
Informe del ensayo  
45. El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información siguiente:  
Animales de experimentación y zootecnia  
— Descripción de las condiciones de enjaulado, tales como: número (o 
variación del número) de animales por jaula, materiales de cama, tem ­
peratura ambiente y humedad relativa, fotoperíodo e identificación de la 
dieta.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— Especie o variedad empleada y justificación del uso de una especie 
distinta de la rata. Podrán indicarse la procedencia y los datos previos, 
siempre que correspondan a animales sometidos a condiciones parecidas de exposición, alojamiento y alimentación. 
— Número, edad y sexo de los animales. 
— Método de asignación al azar. 
— Descripción de cualquier acondicionamiento previo al estudio, incluidos 
alimentación, cuarentena y tratamiento de enfermedades.  
Sustancia problema  
— Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (in ­
cluida la isomerización). 
— Identificación química y número de registro del Chemical Abstracts 
Service (CAS), si se conoce.  
Vehículo  
— Justificación del uso de un vehículo y justificación de la elección del 
mismo (si es distinto del agua). 
— Datos históricos o paralelos que demuestren que el vehículo no interfiere 
en los resultados del estudio.  
Cámara de inhalación  
— Descripción pormenorizada de la cámara de inhalación, incluido el vo ­
lumen, y acompañada de un diagrama. 
— Procedencia y descripción del equipo empleado para la exposición de los 
animales y la generación de la atmósfera. 
— Instrumental empleado para medir la temperatura, la humedad, el tamaño 
de partícula y la concentración real. 
— Fuente del aire y sistema de acondicionamiento. 
— Métodos de calibración del instrumental para garantizar una atmósfera 
experimental homogénea. 
— Diferencia de presión (positiva o negativa). 
— Puertos de exposición por cámara (solo por la nariz); ubicación de los 
animales en la cámara (de cuerpo entero). 
— Estabilidad de la atmósfera experimental. 
— Localización de los sensores de temperatura y humedad, y muestreo de 
la atmósfera experimental en la cámara. 
— Tratamiento del aire suministrado/extraído. 
— Caudales de aire, caudal de aire por puerto de exposición (solo por la 
nariz) o carga de animales por cámara (de cuerpo entero). 
— Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio (t
 95 ) en la cámara de inha ­
lación. 
— Número de variaciones de volumen por hora. 
— Dispositivos de dosificación (si procede).  
Datos relativos a la exposición  
— Justificación de la concentración diana seleccionada en el estudio prin ­
cipal.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— Concentraciones nominales (masa total de sustancia problema generada 
en la cámara de inhalación dividida por el volumen de aire que recorre 
la cámara). 
— Concentraciones reales de la sustancia problema recuperadas en la zona 
de respiración de los animales; en el caso de mezclas que dan lugar a 
formas físicas heterogéneas (gases, vapores, aerosoles), se podrá analizar cada una de ellas por separado. 
— Todas las concentraciones atmosféricas se registrarán en unidades de 
masa (mg/l, mg/m
 3 , etc.) y no en unidades de volumen (ppm, ppmm, 
etc.). 
— Distribución granulométrica, diámetro aerodinámico mediano de 
masa (MMAD) y desviación típica geométrica ( σ g ), incluidos los corres ­
pondientes métodos de cálculo. Se documentarán los análisis granulo ­
métricos individuales.  
Condiciones del ensayo  
— Pormenores de la preparación de la sustancia problema y de cualquier 
método empleado para reducir el tamaño de partícula de los sólidos o preparar soluciones de la sustancia problema. 
— Descripción (preferiblemente acompañada de un diagrama) del equipo 
empleado para generar la atmósfera experimental y para exponer los animales a la misma. 
— Descripción pormenorizada del instrumental empleado para controlar la 
temperatura, la humedad y el caudal de aire de la cámara (creación de una curva de calibración). 
— Descripción pormenorizada del equipo empleado para tomar las muestras 
con el fin de medir la concentración de la cámara y la distribución por tamaño de partícula. 
— Descripción pormenorizada del método de análisis químico empleado y 
de la validación del método (incluida la eficiencia de recuperación de la sustancia problema en el medio ambiente experimental). 
— Método aleatorio de asignación de los animales a los lotes de exposición 
y de control (testigo). 
— Pormenores sobre la calidad del alimento y del agua (incluido el tipo o 
procedencia de la alimentación y el origen del agua). 
— Justificación de las concentraciones experimentales seleccionadas.  
Resultados  
— Tabulación de los valores de temperatura, humedad y caudal de aire de 
la cámara. 
— Tabulación de las concentraciones nominales y reales de la cámara. 
— Tabulación de los datos de granulometría, incluidos los de recogida de 
muestras para el análisis, distribución granulométrica y cálculos de 
MMAD y σ
 g . 
— Tabulación de las respuestas y de los niveles de concentración de cada 
animal (es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la 
mortalidad y la naturaleza, gravedad, momento de aparición y duración 
de los efectos).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— Tabulación de los pesos de los animales individuales. 
— Tabulación del consumo de alimentos. — Tabulación de los datos de patología clínica. 
— Resultados de la autopsia y eventuales observaciones histopatológicas de 
cada animal, si se dispone de ellas. 
— Tabulación de cualesquiera otros parámetros analizados.  
Evaluación e interpretación de los resultados  
— Se hará especial hincapié en la descripción de los procedimientos em ­
pleados para satisfacer los criterios del presente método de ensayo como, 
por ejemplo, la concentración límite o el tamaño de partícula. 
— Se tomará en consideración la respirabilidad de las partículas a la luz de 
los resultados globales, de manera especial si no se cumplen los criterios 
relativos al tamaño de partícula. 
— En la evaluación global del estudio se expondrá la coherencia de los 
métodos empleados para determinar las concentraciones nominales y reales y la relación entre ellas. 
— Se explicará la causa probable de muerte y el mecanismo de acción 
(sistémico o local) predominante. 
— Se facilitará una explicación de por qué ha sido preciso sacrificar de 
forma compasiva los animales con signos evidentes de dolor o de su ­
frimiento intenso y duradero, atendiendo a los criterios del documento de orientación de la OCDE sobre parámetros de tratamiento compasivo 
(Guidance Document on Humane Endpoints) (3). 
— Se identificarán el órgano o los órganos diana. 
— Se determinarán los valores de NOAEL y LOAEL.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Gui ­
deline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency. 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258. 
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. 
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal dia ­
grams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. 
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijves ­
tijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasop ­
haryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. 
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. 
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428. 
(13) Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de 
sustancias y mezclas y por el que se modifican y derogan las Directivas 
67/548/CEE y 1999/45/CE, y se modifica el Reglamento (CE) n
 o 1907/2006 (DO L 353 de 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Apéndice 1  
DEFINICIÓN  
Sustancia problema:  cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este mé ­
todo de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. TOXICIDAD POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (28 
DÍAS) VÍA CUTÁNEA  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la introducción general de la parte B (letra A).  
1.2. DEFINICIÓN 
Véase la introducción general de la parte B (letra B).  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
La sustancia de ensayo se aplica diariamente por vía cutánea en 
dosis distintas a varios lotes de animales de laboratorio, utilizándose una sola dosis para cada lote, durante un período de 28 días. Durante 
el período de aplicación se observa diariamente a los animales a fin 
de descubrir los síntomas de toxicidad. Se practica la autopsia a los animales que mueren durante el ensayo así como a los que sobrevi ­
ven al final del mismo.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Preparación  
Se mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y 
alimentación adecuadas para el experimento, por lo menos, durante los cinco días anteriores al mismo. Antes de comenzar el ensayo, se 
eligen al azar animales jóvenes y sanos y se reparten en lotes trata ­
dos y lotes testigo. Poco tiempo antes del ensayo se esquila la piel de la región dorsal de los animales. Se puede recurrir al rasurado, pero, en este caso, debe efectuarse unas 24 horas antes del ensayo. Suele 
ser necesario repetir el esquileo o el rasurado aproximadamente cada 
semana. Durante el esquileo o el rasurado hay que procurar no causar lesiones en la piel. La superficie que hay que despejar para aplicar la sustancia de ensayo no debe ser inferior al 10 % de la 
superficie corporal. Debe tenerse en cuenta el peso del animal para 
decidir la zona que hay que despejar y las dimensiones de la super ­
ficie que se va a tratar. Cuando la sustancia sea sólida (que, si es 
preciso, puede pulverizarse), deberá humedecerse con agua o, en su 
caso, con un vehículo apropiado, de forma que se asegure un buen contacto con la piel. Las sustancias líquidas se utilizan generalmente sin diluir. Se procede a una aplicación diaria, entre 5 y 7 días por 
semana.
 
1.6.2.  Condiciones de ensayo  
1.6.2.1.  Animales de laboratorio  
Pueden utilizarse ratas, conejos o cobayas adultos. Se pueden utilizar 
también otras especies pero, en este caso, se habrá de justificar su 
utilización.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Al principio del ensayo la diferencia de peso entre los animales no 
debe exceder del ± 20 % del valor medio adecuado.  
1.6.2.2.  Número y sexo  
Deben utilizarse al menos diez animales (5 hembras y 5 machos) de 
piel sana, para cada dosis. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. Si se van a sacrificar algunos animales durante el ensayo habrá que añadir la cantidad de animales que se haya previsto sa ­
crificar. Además, puede tratarse un lote satélite de 10 animales (5 de 
cada sexo) con el nivel de dosis más elevado durante 28 días para observar la reversibilidad, la persistencia o la aparición tardía de efectos tóxicos durante los 14 días siguientes al tratamiento. Se 
utiliza también un lote satélite de 10 animales testigo (5 de cada 
sexo).
 
1.6.2.3.  Dosis  
Se utilizan al menos tres dosis, así como un lote testigo y, en su 
caso, un lote testigo para el vehículo. El período mínimo de expo ­
sición será de 6 horas diarias. La sustancia de ensayo debe aplicarse 
todos los días a la misma hora y las dosis deben adaptarse semanal ­
mente o bisemanalmente con objeto de conservar un nivel de dosis constante respecto al peso corporal de los animales. A excepción de 
la administración de las sustancias de ensayo, debe tratarse a los 
animales del lote testigo de la misma forma que a los de los lotes experimentales. Cuando para facilitar la administración se utilice un vehículo, este se administrará también al lote testigo, del vehículo en 
las mismas condiciones que a los lotes tratados; la dosis será la 
misma que se administre al grupo tratado con la dosis más elevada. La dosis más elevada debe producir efectos tóxicos que no originen la muerte de ningún animal (o solo de algunos). La dosis más baja 
no debe producir ningún efecto tóxico detectable. Si se dispone de 
una estimación aceptable sobre la exposición del hombre, la dosis más baja administrada debe superar este valor. En condiciones ópti ­
mas la dosis intermedia debe producir unos efectos tóxicos observa ­
bles mínimos. Si se utilizan varias dosis intermedias, la diferencia 
entre ellas debe ser suficiente para producir una graduación de los efectos tóxicos. En los lotes correspondientes a dosis bajas o inter ­
medias, así como en los lotes testigo, la mortalidad debe ser baja 
para que la evaluación de los resultados sea significativa. 
Si la aplicación de la sustancia de ensayo provoca una irritación 
cutánea grave, deben reducirse las concentraciones; esto puede pro ­
ducir una disminución, incluso una desaparición, de otros efectos 
tóxicos en las dosis más elevadas. Si las lesiones cutáneas son 
muy graves, puede resultar necesario detener el experimento y co ­
menzar de nuevo con concentraciones más bajas.
 
1.6.2.4.  Prueba límite  
Si en un experimento preliminar realizado con una dosis de 1 000 
mg/kg, o con una dosis más elevada en función de una posible 
exposición humana (si se conoce), no se ha observado ningún efecto tóxico, puede ser innecesario continuar el experimento.
 
1.6.2.5.  Período de observación  
Se deben observar todos los animales diariamente con el fin de 
descubrir los síntomas de toxicidad. Debe registrarse el momento 
de la muerte, así como el momento en que aparecen y desaparecen 
los síntomas de toxicidad.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Procedimiento  
Los animales deben estar alojados en jaulas individuales. En condi ­
ciones óptimas, la sustancia se administra a los animales todos los días, durante un período de 28 días. Los animales de todos los 
grupos satélites destinados a observaciones complementarias deben 
mantenerse en observación 14 días más, sin tratamiento, para com ­
probar la curación o la persistencia de los efectos tóxicos. La dura ­
ción mínima de la exposición debe ser de 6 horas diarias. 
La sustancia debe aplicarse uniformemente sobre una superficie equi ­
valente más o menos al 10 % de la superficie total corporal. Cuando 
se trata de sustancias altamente tóxicas, la superficie cubierta puede ser menor, pero procurando que al aplicar la sustancia se forme en 
toda la superficie una capa lo más fina y uniforme posible. 
Durante la exposición, la sustancia se mantiene en contacto con la 
piel mediante un apósito de gasa porosa y un esparadrapo no irri ­
tante. Además, la superficie tratada debe estar convenientemente cubierta para mantener en su sitio el apósito de gasa y la sustancia 
e impedir que los animales puedan ingerir esta última. Pueden utili ­
zarse aparatos de contención para impedir la ingestión de la sustan ­
cia, pero no se recomienda una inmovilización completa. Puede usarse un dispositivo protector en forma de collar como método 
alternativo. 
Al término del período de exposición, hay que eliminar cualquier 
residuo de sustancia, a ser posible, con agua, o con cualquier otro procedimiento adecuado de limpieza de la piel. 
Deben observarse todos los animales diariamente y registrar los sín ­
tomas de toxicidad, así como el momento de su aparición, su inten ­
sidad y su duración. La observación incluirá las modificaciones del 
pelo y la piel, los ojos y las mucosas, el aparato respiratorio, el sistema circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la actividad somato-motriz y el comportamiento. Semanalmente deben 
determinarse los pesos de los animales, y se recomienda igualmente 
medir el consumo alimentario cada semana. Es necesario observar regularmente a los animales para procurar que no se pierdan en el experimento por razones como el canibalismo, autolisis de los tejidos 
o error de emplazamiento. Al término de la experiencia se practica la 
autopsia a todos los animales supervivientes de los lotes tratados no satélites. Los animales moribundos y los que presenten angustia o dolor graves se retirarán inmediatamente, se sacrificarán de forma 
humanitaria y se les practicará la autopsia. 
Al terminar el ensayo se efectuarán los siguientes análisis en todos 
los animales (incluidos los del lote testigo): 
1) análisis hematológico que incluya al menos el hematocrito, la 
concentración de hemoglobina, el recuento de hematíes y leuco ­
citos, la fórmula leucocitaria, así como un estudio de la coagula ­
ción; 
2) determinaciones bioquímicas clínicas de la sangre incluyendo al 
menos un parámetro sobre las funciones hepáticas y renal: alani ­
na-aminotransferasa (antiguamente conocida con el nombre de glutamato-piruva to-transaminasa) y aspartato aminotransferasa 
(antiguamente conocido con el nombre de glutamato-oxala- ceta ­
to-transaminasa) del suero, nitrógeno ureico, albúmina, creatinina plasmática, bilirrubina total y proteínas séricas totales. 
Otras determinaciones que pueden ser necesarias para una evaluación 
toxicológica adecuada incluyen el calcio, fósforo, cloruros, sodio, 
potasio, glucosa en ayunas, lípidos, hormonas, el equilibrio ácido- 
básico, metahemo-globina y la actividad colinesterásica.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Si es necesario, pueden realizarse otros análisis bioquímicos para 
profundizar el estudio de los efectos tóxicos observados.  
1.6.4.  Autopsia general  
Se practicará una autopsia general completa a todos los animales 
sometidos al ensayo. Al menos el hígado, los riñones, las glándulas 
suprarrenales y los testículos se deben pesar húmedos, lo más rápi ­
damente posible después de la disección, para evitar que se sequen. Los órganos y tejidos, es decir, la piel normal y tratada, el hígado, los riñones, el bazo, los testículos, las glándulas suprarrenales, el 
corazón y los órganos diana (es decir, los que presentan lesiones 
importantes o modificaciones volumétricas) deben conservarse en un medio apropiado para que puedan realizarse exámenes histopato ­
lógicos posteriores.
 
1.6.5.  Examen histopatológico  
Hay que practicar un examen histopatológico de los órganos y teji ­
dos que se conserven del lote expuesto a la dosis más elevada y del 
lote testigo. Los órganos y los tejidos que presenten lesiones indu ­
cidas por la sustancia de ensayo en el nivel de dosis más elevado, deben examinarse en todos los lotes que hayan estado expuestos a dosis más bajas. Los animales del lote satélite deberán someterse a 
un examen histológico, centrado especialmente en los órganos y 
tejidos en los que se hayan comprobado lesiones en los demás lotes tratados.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados deberán inventariarse en un cuadro que indique, para 
cada lote de ensayo, el número de animales al comienzo del ensayo y el número de animales en los que se haya observado cada tipo de 
lesión. 
Todos los resultados observados deben evaluarse por medio de un 
método estadístico adecuado. Puede utilizarse cualquier método es ­
tadístico reconocido.
 
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— datos relativos a los animales (especie, cepa, origen, condiciones 
ambientales, régimen alimentario, etc.), 
— condiciones de ensayo, (incluido el tipo de apósito: oclusivo o no 
oclusivo), 
— dosis (en su caso, también el vehículo) y concentraciones, — nivel que no produce ningún efecto, si es posible, 
— respuesta tóxica por sexo y dosis, 
— momento de la muerte durante el ensayo o indicación de que los 
animales han sobrevivido, 
— efectos tóxicos u otros, 
— momento de observación de cualquier síntoma anormal y su 
evolución, 
— cantidades de alimento y peso corporal, 
— análisis hematológicos practicados y resultados,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— pruebas bioquímicas clínicas practicadas y resultados, 
— resultados de la autopsia, — descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas, — tratamiento estadístico de los resultados, si es posible, — discusión de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la introducción general de la parte B (letra D).  
4. REFERENCIAS  
Véase la introducción general de la parte B (letra E).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE ABERRACIONES 
CROMOSOMICAS IN VITRO EN MAMÍFEROS  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices del documento OCDE 
TG 473 sobre el ensayo de aberraciones cromosómicas  in vitro  en 
mamíferos (1997).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El ensayo de aberraciones cromosómicas  in vitro  tiene por objeto 
detectar agentes que provocan aberraciones cromosómicas estructu ­
rales en células de mamífero en cultivo (1) (2) (3). Las aberraciones estructurales pueden ser cromosómicas o cromatídicas. La mayoría 
de los rnutágenos químicos dan lugar a aberraciones cromatídicas, 
aunque también pueden producirse aberraciones cromosómicas. Un aumento de la poliploidía puede indicar que una sustancia química es capaz de inducir aberraciones numéricas. No obstante, el presente 
método no está pensado para medir aberraciones de ese tipo ni se 
emplea habitualmente con ese fin. Las mutaciones cromosómicas y los efectos relacionados ocasionan numerosas enfermedades genéti ­
cas humanas. Además de ello, son muchas las pruebas de que las 
mutaciones cromosómicas  y los efectos relacionados que provocan 
alteraciones en los oncogenes y los genes supresores de tumores de las células somáticas intervienen en la inducción de cánceres en los 
seres humanos y los animales de experimentación. 
En el ensayo de aberraciones cromosómicas  in vitro  pueden em ­
plearse cultivos de líneas celulares establecidas, estirpes celulares o 
cultivos de células primarias. Las células deben seleccionarse sobre 
la base de su capacidad de crecimiento en cultivo, la estabilidad cariotípica, el número y la diversidad cromosómica  y la frecuencia 
de las aberraciones cromosómicas espontáneas. 
En los ensayos  in vitro  suele ser necesario emplear un sistema de 
activación metabólica exógena, si bien este no puede reproducir 
todas las condiciones que se dan  in vivo  en los mamíferos. Deben 
evitarse las circunstancias que puedan conducir a resultados posi ­
tivos que no reflejen la mutagenicidad intrínseca sino que se de ­
ban a cambios en el pH, la osmolalidad o altos grados de citoto ­
xicidad (4) (5). 
El ensayo se emplea para detectar las posibles sustancias mutágenas 
o carcinógenas para los mamíferos. Pese a que muchos de los com ­
puestos que dan un resultado positivo en este ensayo son carcinóge ­
nos para los mamíferos, no hay una correlación absoluta entre los resultados del mismo y la carcinogenicidad. La correlación depende de la clase química. Además de ello, cada vez hay más pruebas de 
que existen carcinógenos que el ensayo no detecta, pues, al parecer, 
estos actúan por mecanismos distintos de la lesión directa del ADN. 
Véase asimismo la introducción general de la parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Aberración cromatídica:  lesión cromosómica estructural que con ­
siste en la rotura de una cromátida o la rotura y reunión de 
cromátidas.  
Aberración cromosómica:  lesión cromosómica estructural que con ­
siste en la rotura o en la rotura y reunión de ambas cromátidas en el 
mismo sitio.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endorreduplicación:  proceso en el que, en lugar de entrar en mi ­
tosis tras la fase S de replicación del ADN, el núcleo inicia otra tase 
S, lo cual da lugar a cromosomas con 4, 8, 16, etc. cromátidas.  
Gap:  lesión acromática más estrecha que la cromátida, con alteración 
mínima de la alineación de las cromátidas.  
Índice mitótico:  proporción entre el número de células en metafase 
y el número total de células de una población celular; indica el grado 
de proliferación de dicha población.  
Aberración numérica:  un cambio en el número de cromosomas a 
partir del número normal propio de las células empleadas.  
Poliploidía:  un múltiplo del número de dotación cromosómica ha ­
ploide  (n) superior al diploide (3n, 4n, etc.).  
Aberración estructural:  alteración de la estructura cromosómica 
(deleciones y fragmentos, intracambios o intercambios) detectable 
mediante examen microscópico de la metafase de la división celular.  
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se exponen los cultivos celulares a la sustancia de ensayo, con y sin 
activación metabólica, tras lo cual se tratan a intervalos preestable ­
cidos con una sustancia que detenga la divisón celular en la metafase (por ejemplo, Colcemid
 R o colchicina). Se recolectan las células, se 
tiñen y se observan al microscopio aquellas que se encuentren en la 
metafase con el fin de detectar la presencia de aberraciones cromo ­
sómicas.  
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación  
1.4.1.1.  Células  
Pueden emplearse líneas celulares, estirpes o cultivos de células 
primarias, incluidas las células humanas (fibroblastos de hámster 
chino, linfocitos de la sangre periférica de humanos o de otros ma ­
míferos, etc.).  
1.4.1.2.  Medios y condiciones de cultivo  
Para mantener los cultivos se emplean medios de cultivo y condi ­
ciones de incubación adecuados (recipientes de cultivo, concentra ­
ción de CO  2 , temperatura y humedad). En el caso de las líneas 
celulares establecidas y las estirpes, se comprobará regularmente la 
estabilidad del número cromosómico modal y la ausencia de conta ­
minación por micoplasma. Se desecharán los cultivos contaminados. Debe conocerse la duración del ciclo celular normal de las células 
empleadas en esas condiciones de cultivo.
 
1.4.1.3.  Preparación de los cultivos  
Líneas celulares establecidas y estirpes: las células se obtienen de 
cultivos madre, se siembran en un medio de cultivo a una densidad a 
la cual los cultivos no confluyan antes del momento de la recolec ­
ción y se incuban a 37  o C. ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Linofocitos: se añade sangre completa tratada con un antícoagulante 
(por ejemplo, heparina), o bien linfocitos aislados procedentes de 
sujetos sanos, a un medio de cultivo que contenga un mitógeno (por ejemplo, fitohemaglutinina) y se incuba a 37
 o C. 
1.4.1.4.  Activación metabólica  
Las células deben exponerse a la sustancia de ensayo en presencia 
y en ausencia de un sistema adecuado de activación metabólica. El 
sistema más comúnmente empleado es una fracción postmitocon ­
drial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene de hígados de roedores tratados con inductores enzimátícos como el 
Aroclor 12 54 (6) (7) (8) (9) o una mezcla de fenobarbital β- 
naftoflavona (10) (11) (12). 
La fracción postmitocondrial suele emplearse en concentraciones que 
varían del 1 ai 10 % v/v en el medio de ensayo final. La elección del 
sistema de activación metabólica puede depender de la clase química de la sustancia estudiada. En algunos casos puede ser oportuno utilizar varias concentraciones distintas de fracción postmitocondrial. 
Son varias las técnicas —como la producción mediante ingeniería 
genética de líneas celulares que expresen enzimas activadoras espe ­
cíficas— que pueden proporcionar el potencial de activación endó ­
gena. La elección de las líneas celulares debe justificarse científica ­
mente (por ejemplo, por la importancia de la isoenzima del cito ­
cromo P4 50 para el metabolismo de la sustancia de ensayo, etc.).
 
1.4.1.5.  Preparación de la sustancia de ensayo  
Las sustancias de ensayo sólidas deben disolverse o suspenderse en 
disolventes o vehículos adecuados y, si es preciso, diluirse antes de 
tratar las células. Las sustancias de ensayo líquidas pueden añadirse directamente al sistema de ensayo y/o diluirse antes del tratamiento. Han de emplearse soluciones de la sustancia de ensayo recién pre ­
paradas, salvo que los datos relativos a la estabilidad demuestren que 
es posible conservarlas.
 
1.4.2.  Condiciones del ensayo  
1.4.2.1.  Disolvente o vehículo  
Es preciso cerciorarse de que el disolvente o vehículo no produce 
reacciones químicas con la sustancia de ensayo y es compatible con 
la supervivencia de las células y la actividad de la S9. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de informa ­
ción que avale dicha compatibilidad. Siempre que sea posible, se re ­
comienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o 
vehículo acuoso. Cuando se estudien sustancias inestables en presencia de agua, deberán emplearse disolventes orgánicos que no contengan agua. Esta podrá eliminarse añadiendo un tamiz molecular,
 
1.4.2.2.  Concentraciones de exposición  
Para determinar la mayor concentración de exposición deben consi ­
derarse al menos los siguientes criterios: citotoxicidad, solubilidad en el sistema de ensayo y variaciones del pH o la osmolalidad. 
La citotoxicidad se determinará con y sin activación metabólica en el 
experimento principal mediante un indicador adecuado de la integri ­
dad y el crecimiento celular, como el grado de confluencia, el recuento de células viables o el índice mitótico. Puede ser útil 
determinar la citotoxicidad y la solubilidad en un experimento 
preliminar.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Se emplearán al menos tres concentraciones analizables. Si se pro ­
duce citotoxicidad, la gama de concentraciones deberá abarcar desde 
la toxicidad máxima hasta una toxicidad escasa o nula, lo cual suele significar que la separación entre concentraciones corresponde a un factor comprendido entre 2 y 10. En el momento de la recolección, 
con la concentración mayor debe producirse una reducción conside ­
rable del grado de confluencia, el recuento celular o el índice mitó ­
tico (en todos los casos superior al 50 %). El índice mitótico solo constituye una medida indirecta de los efectos citotóxicos o citostá ­
ticos y está relacionado con el tiempo transcurrido desde el trata ­
miento. No obstante, cabe utilizar dicho índice para los cultivos en suspensión en los cuales las demás mediciones de toxicidad pueden resultar engorrosas y poco prácticas. Los datos relativos a la cinética 
del ciclo celular, como el tiempo medio de generación (TMG), pue ­
den servir de información adicional. Sin embargo, el TMG es una media general que no siempre refleja la existencia de subpoblaciones que presentan retraso. Además de ello, incluso un ligero aumento del 
tiempo medio de generación puede asociarse a un retraso muy im ­
portante en el tiempo de mayor producción de aberraciones. 
En el caso de sustancias escasamente citotóxicas, la concentración 
máxima de ensayo será la menor de estas tres: 5 μl/ml, 5 mg/ml o 
0,01 M 
En el caso de sustancias escasamente solubles que no resultan tóxi ­
cas a concentraciones inferiores al límite de solubilidad, la mayor 
dosis empleada deberá corresponder a una concentración superior a dicho límite en el medio de cultivo final al terminar el período de tratamiento. En algunos casos (por ejemplo, cuando se produce to ­
xicidad únicamente con concentraciones superiores a la concentra ­
ción mínima de insolubilidad), es aconsejable hacer pruebas con varias concentraciones con precipitación visible. Puede ser útil de ­
terminar la solubilidad al principio y al final del tratamiento, pues 
esta pueda variar durante la exposición en el sistema de ensayo 
debido a la presencia de células, S9, suero, etc. La insolubilidad puede detectarse por simple observación. El precipitado no debe interferir en la evaluación del resultado.
 
1.4.2.3.  Controles positivos y negativos  
En todos los experimentos deberán realizarse controles positivos y 
negativos (disolvente o vehículo) en paralelo, con y sin activación metabólica. Cuando se aplique esta, la sustancia del control positivo 
ha de requerir activación para provocar una respuesta mutagénica. 
En los controles positivos debe emplearse un clastógeno conocido 
con grados de exposición en los que quepa esperar un aumento 
reproducible y detectable respecto a la frecuencia espontánea, que 
ponga de manifiesto la sensibilidad del sistema de ensayo. 
Las concentraciones del control positivo deben ser tales que los 
efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al lector la 
identidad de los portaobjetos codificados. A continuación figuran algunos ejemplos de sustancias para los controles positivos:
 
Activación metabólica Sustancia N  o CAS N  o Einecs  
Ausencia de activación metabó ­
lica exógena Metanosulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0 
Metanosulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Activación metabólica Sustancia N  o CAS N  o Einecs  
Etil-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Mitomicina C 50-07-7 212-072-2 
N-óxido de 4-nitroquinolina 56-57-5 200-281-1 
Presencia de activación metabó ­
lica exógena Bcnzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 
Ciclofosfamida 
Monohidrato de ciclofosfamida 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Pueden emplearse otras sustancias adecuadas para los controles po ­
sitivos. Deberá considerarse la utilización en dichos controles de 
sustancias de clases químicas afines, cuando sea posible. 
Se realizarán, para cada período de recolección, controles negativos 
únicamente con el disolvente o vehículo en el medio de tratamiento, y se tratarán de igual manera que los cultivos del ensayo. Se prepa ­
rarán asimismo controles sin tratar, salvo que exista información 
anterior sobre controles que demuestre que el disolvente elegido no induce efectos nocivos ni mutágenos.
 
1.4.3.  Procedimiento  
1.4.3.1.  Tratamiento con la sustancia de ensayo  
Las células en crecimiento se tratan con la sustancia de ensayo en 
presencia y en ausencia de un sistema de activación metabólica. Los 
linfocitos deben empezar a tratarse unas 48 horas después de la estimulación mitogénica. 
1.4.3.2. Como norma, deben prepararse dos cultivos para cada concentración 
y se recomienda seriamente hacer lo propio en el caso de los con ­
troles negativos o el disolvente. Sí se demuestra, sobre la base de datos anteriores, que la diferencia entre los dos cultivos es mínima 
(13) (14), puede bastar un solo cultivo para cada concentración. 
Las sustancias gaseosas o volátiles han de someterse a ensayo con 
métodos adecuados (recipientes de cultivo herméticos, etc.) (15) (16).
 
1.4.3.3.  Recolección de las células 
En el primer experimento se exponen las células a la sustancia de 
ensayo, con y sin activación metabólica, durante 3 a 6 horas. Se toma una muestra transcurrido un período, desde el inicio del trata ­
miento, de aproximadamente 1,5 veces la duración del ciclo celular 
normal (12). Si este protocolo da resultados negativos con y sin activación, debe efectuarse otro experimento sin activación, pero con tratamiento continuo hasta que se tome la muestra tras un pe ­
ríodo de aproximadamente 1,5 veces la duración del ciclo celular 
normal. Algunas sustancias químicas se detectan mejor con un tiempo de tratamiento y toma de muestra superior a dicho período. La obtención de resultados negativos en presencia de activación 
metabólica debe confirmarse caso por caso. Si dicha confirmación 
no se considera necesaria, debe justificarse.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Preparación de los cromosomas  
Se tratan los cultivos celulares con Colcemid  R o colchicina por lo 
general durante un período de 1 a 3 horas antes de la recolección. Los cultivos celulares se recolectan y procesan por separado para 
preparar los cromosomas. Dicha preparación incluye el tratamiento 
hipotónico de las células, la fijación y la tinción.
 
1.4.3.5.  Análisis  
Antes de analizarlas al microscopio, se asignará un código indepen ­
diente a cada preparación, incluidos los controles positivos y nega ­
tivos. Dado que los métodos de fijación provocan con frecuencia la rotura de células en metafase y la pérdida de cromosomas, todos los tipos de células analizadas deben contener un número de centróme ­
ros igual al número modal ± 2. Deben analizarse al menos 
200 metafases bien extendidas en cada concentración y control y, en su caso, repartidas de forma equilibrada entre los cultivos dobles. La cantidad puede ser menor si se observan numerosas aberraciones. 
Pese a que el objeto del ensayo consiste en detectar aberraciones 
cromosómicas estructurales, es importante registrar los posibles casos de poliploidía y endorreduplicación.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Dado que la unidad experimental es la célula, se evaluará el porcen ­
taje de estas que presenta aberraciones cromosómicas estructurales. 
Se hará una relación de los distintos tipos, el número y la frecuencia 
de dichas aberraciones en los cultivos experimentales y los controles. Los gaps  se registrarán por separado y se recogerán en el informe, 
pero por lo general no se incluirán en la frecuencia total de aberra ­
ciones. 
Asimismo, se registrarán las determinaciones de citotoxicidad reali ­
zadas en paralelo en todos los cultivos tratados y los controles ne ­
gativos de los principales experimentos sobre aberraciones. 
Se proporcionarán los datos relativos a cada cultivo y se resumirán 
en forma de tabla. 
No será preciso comprobar los resultados positivos claros, si bien los 
resultados dudosos deberán aclararse mediante más ensayos en los que convendría modificar las condiciones experimentales. En el punto 1.4.3.3 se trata la pertinencia de confirmar los resultados ne ­
gativos. En los experimentos ulteriores se considerará la posibilidad 
de modificar los parámetros del estudio para ampliar la gama de condiciones analizadas. Entre los parámetros modificables se encuen ­
tra la separación entre concentraciones y las condiciones de activa ­
ción metabólica.
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Son varios los criterios para determinar si un resultado es positivo 
(aumento relacionado con la concentración o aumento reproducible 
del número de células que presentan aberraciones cromosómicas, 
etc.). Debe considerarse en primer lugar la importancia biológica de los resultados. Pueden emplearse métodos estadísticos como apoyo para evaluar los resultados del ensayo (3) (13). El hecho de 
que los datos estadísticos sean significativos no ha de ser el único 
factor para determinar que una respuesta es positiva.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
El aumento del número de células poliploides puede indicar que la 
sustancia de ensayo es capaz de inhibir procesos mitóticos y de 
producir aberraciones cromosómicas numéricas. El aumento del nú ­
mero de células con cromosomas endorreduplicados puede indicar que la sustancia de ensayo es capaz de inhibir la progresión del ciclo 
celular (17) (18). 
No se considerarán mutágenas en el sistema de ensayo las sustancias 
que den lugar a resultados que no se ajusten a los criterios anteriores. 
Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán cla ­
ramente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos 
no permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia de ensayo. Con independencia del número de veces que se repita el experimento, los resultados pueden seguir siendo ambi ­
guos o dudosos. 
Un resultado positivo en el ensayo de aberraciones cromosómicas  in 
vitro  indica que la sustancia de ensayo provoca aberraciones cromo ­
sómicas estructurales en los cultivos de células somáticas de mamí ­
fero. Un resultado negativo indica que, en las condiciones del ensa ­
yo, la sustancia de ensayo no provoca aberraciones cromosómicas en los cultivos de células somáticas de mamífero.
 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la información siguiente: 
Disolvente o vehículo: 
— motivación de la elección del vehículo, — solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disol ­
vente o vehículo, si se conocen. 
Células: 
— tipo y procedencia, — características del cariotipo e idoneidad del tipo de células em ­
pleadas, 
— ausencia de micoplasma, si procede, 
— información sobre la duración del ciclo celular, — sexo de los donantes de sangre, sangre completa o linfocitos 
aislados y mitógeno empleado, 
— número de pases, si procede, 
— métodos de mantenimiento del cultivo celular, si procede, — número modal de cromosomas. Condiciones del ensayo: 
— sustancia que detiene la división celular en la metafase, concen ­
tración empleada y duración de la exposición de las células, 
— fundamento de la selección de las concentraciones y del número 
de cultivos (datos relativos a la citotoxicidad, límites de solubi ­
lidad, si se conocen, etc.), 
— composición del medio, concentración de CO
 2 , si procede,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— concentración de la sustancia de ensayo, 
— volumen de vehículo y de sustancia de ensayo añadida, 
— temperatura de incubación, 
— tiempo de incubación, 
— duración del tratamiento, — densidad celular en el momento de la siembra, si procede, 
— tipo y composición del sistema de activación metabólica, inclui ­
dos los criterios de aceptabilidad, 
— controles positivos y negativos, 
— métodos de preparación de los portaobjetos, — criterios de recuento de las aberraciones, 
— número de metafases analizadas, 
— métodos de determinación de la toxicidad, 
— criterios empleadas para considerar que los resultados de los 
estudios son positivos, negativos o ambiguos. 
Resultados: 
— signos de toxicidad (grado de confluencia, datos del ciclo celular, 
recuentos celulares, índice mitótico, etc.), 
— signos de precipitación, 
— datos sobre el pH y la osmolalidad del medio de tratamiento, si 
se han determinado, 
— definición de las aberraciones, incluidos los  gaps , 
— número de células que presentan aberraciones cromosómícas e 
indicación por separado del tipo de dichas aberraciones en cada 
cultivo tratado y cada control, 
— variaciones de la ploidía, en su caso, — relación dosis-respuesta, cuando sea posible, 
— análisis estadísticos, si se han realizado, 
— datos de los controles negativos (disolvente/vehículo) y positivos 
realizados en paralelo, 
— datos sobre controles históricos negativos (disolvente/vehículo) y 
positivos, intervalos, medias y desviaciones estándar. 
Discusión de los resultados. 
Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Evans, H,). (1976), Cytological Methods for Detecting Chemi ­
cal Mutagens, in:  Chemical  mutagens, Principies  and Methods 
for their Detection,  Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, 
New York and London, pp. 1-29. 
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985), The  In Vítro  Chromo­
somal Aberration Test Using Chínese Hams ter Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in:  Progress in Mutation 
Research,  Vol. 5. Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Pu ­
blishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427–432.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Calloway, S. M, Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., 
Brovvn, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, R. Ahmed, 
M, Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Andersen, G. and Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals,  Environs. Molec. Mutagen  10 
(suppl. 10), pp. 1–175. 
(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation Res.,  257, pp. 147—204. 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells,  Mutation Res., 268,  pp. 297–305. 
(6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian Microsome Mutagcnicity Test, Mutation  Res,. 31,  
pp. 347–364. 
(7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res.. 113.  pp. 
173–215. 
(8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. 
and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Car ­
cinogens after Activation in a Microsomal System  In Vitro, }.  
Induction of Chro mosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitro- samine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver 
Microsomes,  Mutation Res.,  37, pp. 83-90. 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. {1979), Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In Vitro, Mutation Res.,  66, pp. 277–290. 
(10) Elliot, B. M., Combes, R., D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay,]. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclar 1254-induced  S9 in In Vitro  Genotoxi ­
city Assays,  Mutagenesis,  7, pp. 175–177. 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Berid, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in  Mutagenesis  Testing, Elsevier, North- 
Holland, pp. 85–88. 
(12) Galloway, S. M., Aardema, M.]., Ishidate, M. Jr., Iven, J. L, 
Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994), 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations, Mutation  Res., 312,  pp. 241–261. 
(13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analy sis of Data from  
In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical  Evaluation of Mu ­
tagenicity Test Data,  Kirkland, D. J., (ed) Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, pp. 141–154. 
(14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are 
not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells,  Mutation Res., 312,  pp. 139–149. 
(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds),  
Genotoxic Effects of Airborne Agents,  New York, Plenum, 
pp. 91–103.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A, P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Muta tion Assay,  Environmental Mutagene ­
sis, 5,  pp. 795–801. 
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
ceils during alpha-radiation induced G2 arrest,  Mutation Res.. 
119. pp. 403–413. 
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (198 3), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  Cancer 
Res.,  43, pp. 1362–1364.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE ABERRACIONES 
CROMOSÓMICAS IN VIVO EN MÉDULA ÓSEA DE MAMÍFEROS  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce tas directrices del documento OCDE 
TG 475 sobre el ensayo de aberraciones cromosómicas en médula 
ósea de mamíferos (1997).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El ensayo de aberraciones cromosómicas in  vivo  en mamíferos se 
realiza para detectar aberraciones cromosómicas estructurales induci ­
das por la sustancia de ensayo en células de médula ósea de animales —por lo general roedores— (1) (2) (3) (4). Las aberraciones estruc ­
turales pueden ser cromosómicas o cromatídicas. Un aumento de la 
poliploidía puede indicar que sustancia química es capaz de inducir 
aberraciones numéricas. La mayoría de los mutágenos químicos dan lugar a aberraciones cromatídicas, aunque también pueden producirse aberraciones cromosómicas. Las mutaciones cromosómicas y los 
efectos relacionados ocasionan numerosas enfermedades genéticas 
humanas. Además de ello, son muchas las pruebas de que las mu ­
taciones cromosómicas y los efectos relacionados que provocan al ­
teraciones en los oncogenes y los genes supresores de tumores guar ­
dan relación con el cáncer en los seres humanos y los sistemas 
experimentales. 
En este ensayo se utilizan habitualmente roedores. El tejido diana es 
la médula ósea por estar muy vascularizada y por contener una 
poblicación de células de ciclo corto que pueden aislarse y tratarse con facilidad. En el presente método no se consideran otras especies ni otros tejidos diana. 
El presente ensayo de aberraciones cromosómicas está especialmente 
indicado para evaluar el riesgo mutagenico, pues permite tomar en consideración factores del metabolismo in vivo, de la toxicocinética y de los procesos de reparación del ADN, si bien dichos factores 
pueden variar según la especie y el tejido. Los ensayos  in vivo  
también resultan útiles para ahondar en el estudio de los efectos mutagénicos detectados en ensayos  in vitro . 
Si hay pruebas de que la sustancia de ensayo o un metabolito re ­
activo no llegan al tejido diana, no procede realizar el presente 
ensayo. 
Véase asimismo la introducción general de la parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Aberración cromatídica:  lesión cromosómica estructural que con ­
siste en la rotura de una cromátida o la rotura y reunión de cromá ­
tidas.  
Aberración cromosómica:  lesión cromosómica estructural que con ­
siste en la rotura o la rotura y reunión de ambas cromátidas en el 
mismo sitio.  
Endorreduplicación:  proceso en el que, en lugar de entrar en mi ­
tosis tras la fase S de replicación del ADN, el núcleo inicia otra fase 
S, lo cual da lugar a cromosomas con 4, 8, 16, etc. cromátidas.  
Gap:  lesión acromática más estrecha que la cromátida, con alteración 
mínima de la alineación de las cromátidas.  
Aberración numérica:  número de cromosomas distinto del número 
normal propio de las células empleadas.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Poliploidía:  un múltiplo del número de dotación cromosómica ha ­
ploide  (n) superior al díploide (3n, 4n, etc.).  
Aberración estructural:  alteración de la estructura cromosómica 
(deleciones y fragmentos, intracambios o intercambios) detectable 
mediante examen microscópico de la metafase de la división celular.  
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se exponen los animales a la sustancia de ensayo por una vía ade ­
cuada y se sacrifican a intervalos apropiados tras el tratamiento. Antes de sacrificarlos, se les administra una sustancia que detenga la división celular en la metafase (por ejemplo, colchicina o Colce ­
mid
 R ). A continuación, se realizan preparaciones de cromosomas de 
células de médula ósea y se tiñen, tras lo cual se analizan las células en metafase para detectar aberraciones cromosómicas.
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación  
1.4.1.1.  Selección de la especie animal  
Si bien suelen emplearse la rata, el ratón y el hámster chino, puede 
utilizarse otra especie de mamíferos apropiada. Deben usarse anima ­
les adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. La variación del peso de los animales al empezar el 
estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ±20 % del peso 
medio de cada sexo.
 
1.4.1.2.  Alojamiento y alimentación de los animales  
Se aplicarán las condiciones generales recogidas en la introducción 
general de la parte B. La humedad debe ser del 50 al 60 %.  
1.4.1.3.  Preparación de los animales  
Se reparten al azar animales adultos jóvenes y sanos entre los lotes 
tratados y los lotes de control. Las jaulas se colocan de manera que los posibles efectos debidos a la posición de las mismas sean míni ­
mos. Se identifica a los animales de forma unívoca y se los acos ­
tumbra a las condiciones de laboratorio durante al menos cinco días.
 
1.4.1.4.  Preparación de las dosis  
Las sustancias de ensayo sólidas deben disolverse o suspenderse en 
disolventes o vehículos adecuados y, si es preciso, diluirse antes de su administración a los animales. Las sustancias de ensayo líquidas 
pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administra ­
ción. Han de emplearse soluciones de la sustancia de ensayo recién preparadas, salvo que los datos relativos a la estabilidad demuestran que es posible conservarlas.
 
1.4.2.  Condiciones del ensayo  
1.4.2.1.  Disolvente o vehículo  
El disolvente o vehículo no deberá producir efectos tóxicos a las 
dosis empleadas. Es preciso cerciorarse de que el disolvente o vehí ­
culo no produce reacciones químicas con la sustancia de ensayo. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información que avale su compatibilidad. Siempre que sea posi ­
ble, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un 
disolvente o vehículo acuoso.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Controles  
Deberán realizarse controles positivos y negativos (disolvente o ve ­
hículo) en paralelo en ambos sexos y en cada ensayo. Salvo por lo que respecta a la exposición a la sustancia de ensayo, los animales 
de los lotes de control deben tratarse exactamente igual que los de 
los lotes tratados. 
En los controles positivos deberían producirse aberraciones estructu ­
rales  in vivo  con grados de exposición en los que quepa esperar un 
aumento detectable respecto a la frecuencia espontánea. Las dosis del control positivo deben ser tales que los efectos sean claros, pero no 
revelen inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos 
codificados. La sustancia empleada en el control positivo podrá ad ­
ministrarse por una vía distinta de la empleada para la sustancia de ensayo  y la toma de muestras podrá realizarse una sola vez. Podrá 
considerarse la utilización en dichos controles de sustancias de clases 
químicas afines, cuando sea posible. A continuación figuran algunos ejemplos de sustancias para los controles positivos:
 
Sustancia N  o CAS N  o Einecs  
Metanosulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 
Etil-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 
Ciclofosfamida 
Monohidrato de ciclofosfamida 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trictilenomelamina 51-18-3 200-083-5 
Salvo que haya datos anteriores sobre controles que pongan de ma ­
nifiesto una variabilidad entre animales y una frecuencia de células 
con aberraciones cromosómicas aceptables, se realizarán, para cada período de muestreo, controles negativos únicamente con el disol ­
vente o vehículo, y se tratarán, por lo demás, de igual manera que 
los lotes tratados. Si se hace una sola toma de muestras en los 
controles negativos, el momento más oportuno para hacerla es tras el primer período de muestreo. Se realizarán asimismo controles sin tratar, salvo que exista información anterior o publicada sobre con ­
troles que demuestre que el disolvente o vehículo elegido no induce 
efectos nocivos ni mutágenos.
 
1.5. PROCEDIMIENTO  
1.5.1.  Número y sexo de los animales  
Los lotes tratados y los controles han de estar compuestos al menos 
por cinco hembras y cinco machos analizables cada uno. Sí en el momento en que se efectúe el estudio se dispone de datos sobre 
otros estudios realizados con la misma especie y la misma vía de 
exposición, que demuestren que no hay diferencia significativa entre sexos en cuanto a la toxicidad, será suficiente el ensayo en un solo sexo. En caso de que la exposición humana a sustancias químicas 
pueda ser específica de un sexo, como sucede con algunos productos 
farmacéuticos, el ensayo se realizará con animales del sexo corres ­
pondiente.
 
1.5.2.  Pauta de tratamiento  
Las sustancias de ensayo se administran preferiblemente en una sola 
vez, aunque también puede dividirse la dosis —por ejemplo, en dos veces al día separadas por algunas horas como máximo— con el fin 
de facilitar la administración de grandes cantidades. Si se siguen 
otras pautas debe justificarse científicamente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Se toman dos muestras en momentos distintos tras el tratamiento 
administrado en un día. En el caso de los roedores, la primera 
muestra se toma transcurrido un período de 1,5 veces la duración del ciclo celular normal (este suele durar de 12 a 18 horas) desde el tratamiento. Dado que el tiempo necesario para que la sustancia de 
ensayo se asimile y se metabolice, así como el efecto de esta sobre la 
cinética del ciclo celular pueden modificar el momento óptimo para detectar aberraciones cromosómicas, se recomienda tomar otra mues ­
tra 24 horas después de la primera. Si se siguen pautas de más de un 
día, ha de tomarse una muestra transcurrido un período de 1,5 veces 
la duración del ciclo celular normal desde la última administración. 
Antes de sacrificar los animales, se les inyecta por vía intraperitoneal 
una dosis adecuada de una sustancia que detenga la división celular 
en la metafase (por ejemplo, Colcemid
 R o colchicina). Se extraen las 
muestras transcurrido un plazo oportuna, que en el caso de los ratones es de unas tres a cinco horas y en el de los hámsters chinos, 
de unas cuatro a cinco horas. Se toman las células de la médula ósea 
y se analizan en busca de aberraciones cromosómicas.
 
1.5.3.  Dosis  
Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación de la gama de 
dosis por falta de datos adecuados, ha de hacerse en el mismo 
laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y protocolo de trata ­
miento que el estudio principal (5). Si se produce toxicidad, se administrarán tres dosis distintas para el primer período de muestreo. 
La gama de dosis deberá abarcar desde la toxicidad máxima hasta 
una toxicidad escasa o nula. En el período de muestreo posterior se administrará únicamente la dosis máxima. Se entenderá por «dosis máxima» la que produzca tales signos de toxicidad que si se admi ­
nistrara una dosis superior según el mismo protocolo resultaría pro ­
bablemente letal. Las sustancias con actividades biológicas específi ­
cas a dosis bajas no tóxicas (como las hormonas y los mitógenos) pueden constituir excepciones en cuanto a los criterios de estableci ­
miento de la dosis y han de evaluarse caso por caso. La dosis 
máxima también puede definirse como la dosis que produce algún signo de toxicidad en la médula ósea (por ejemplo, reducción del índice mitótico superior al 50 %).
 
1.5.4.  Ensayo límite  
Si en un ensayo realizado con una dosis de al menos 2 000 mg/kg de 
peso corporal administrada en una sola vez, o dos veces en el mismo 
día, no se observan efectos tóxicos y si, sobre la base de datos 
relativos a sustancias de estructura afín, no cabe esperar genotoxici ­
dad, puede no ser necesario llevar a cabo un estudio completo con tres dosis diferentes. En el caso de estudios de mayor duración, la 
dosis límite será de 2 000 mg/kg de peso corporal/día cuando el 
tratamiento dure hasta 14 días y de 1 000 mg/kg de peso corporal/día cuando el tratamiento dure más de 14 días. Si se prevé la exposición humana a la sustancia, puede ser preciso administrar una dosis ma ­
yor en el ensayo límite.
 
1.5.5.  Administración de las dosis  
La sustancia de ensayo suele administrarse por sonda gástrica o con 
una cánula de intubación adecuada, o bien por inyección intraperi ­
toneal. Pueden emplearse otras vías de administración, siempre que 
se justifiquen. El volumen máximo de líquido que puede adminis ­
trarse de una sola vez por sonda o inyección depende del tamaño del animal de ensayo, pero no excederá de 2 ml/100 g de peso corporal. 
Deberá justificarse la administración de volúmenes superiores a este. 
Salvo en el caso de sustancias irritantes o corrosivas, que por lo general producen efectos exacerbados con concentraciones mayores, deberá reducirse al mínimo la variabilidad del volumen de ensayo 
ajustando la concentración de manera que el volumen sea el mismo 
en todas las dosis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Preparación de los cromosomas  
Se extrae la médula ósea inmediatamente después del sacrificio, se 
trata con una solución hipotónica y se fija. A continuación, se ex ­
tienden las células en portaobjetos y se tiñen.  
1.5.7.  Análisis  
Se evalúa la citotoxícidad determinando el índice mitótico en un 
mínimo de 1 000 células por animal, en todos los animales tratados (incluidos los controles positivos) y en los controles negativos sin tratar. 
Deben analizarse al menos 100 células de cada animal. La cantidad 
puede ser menor si se observan numerosas aberraciones. Antes de 
analizarlas al microscopio, se asigna un código independiente a cada portaobjetos, incluidos los controles positivos y negativos. Dado que los métodos de preparación de los portaobjetos provocan con fre ­
cuencia la rotura de células en metafase y la pérdida de cromosomas, 
las células analizadas deben contener un número de centrómeros igual a  2n + 2.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de tabla. 
La unidad experimental es el animal. Se determinará en cada animal 
la cantidad de células analizadas, el número de aberraciones por célula y el porcentaje de células que presentan aberraciones cromo ­
sómicas estructurales. Se hará una relación de los distintos tipos, el 
número  y la frecuencia de dichas aberraciones en los lotes tratados y 
los controles. Los  gaps  se registrarán por separado y se recogerán en 
el informe, pero por lo general no se incluirán en la frecuencia total de aberraciones. Si no se observan diferencias en la respuesta de un 
sexo y otro, los datos relativos a ambos sexos pueden considerarse 
conjuntamente en el análisis estadístico.
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Son varios los criterios para determinar si un resultado es positivo 
(aumento de la proporción de células con aberraciones cromosómicas relacionado con la dosis, claro aumento del número de células que 
presentan aberraciones en un lote al que se ha administrado una sola 
dosis y en el que se ha realizado una única toma de muestras, etc.). Debe considerarse en primer lugar la importancia biológica de los resultados. Pueden emplearse métodos estadísticos como apoyo para 
evaluar los resultados del ensayo (6). El hecho de que los datos 
estadísticos sean significativos no ha de ser el único factor para determinar que una respuesta es positiva. Los resultados dudosos deberán aclararse mediante más ensayos en los que convendría mo ­
dificar las condiciones experimentales. 
El aumento de la poliploidía puede indicar que la sustancia de en ­
sayo es capaz de producir aberraciones cromosómicas numéricas. El aumento de la endorreduplicación puede indicar que la sustancia de 
ensayo es capaz de inhibir la progresión del ciclo celular (7) (8). 
No se considerarán mutágenas en el ensayo en cuestión las sustan ­
cias que den lugar a resultados que no se ajusten a los criterios 
anteriores.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán cla ­
ramente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos 
no permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia de ensayo. Con independencia del número de veces que se repita el experimento, los resultados pueden seguir siendo ambi ­
guos o dudosos. 
Un resultado positivo en el ensayo de aberraciones cromosómicas in 
vivo indica que la sustancia de ensayo provoca aberraciones cromo ­
sómicas en la médula ósea de la especie estudiada. Un resultado negativo indica que, en las condiciones del ensayo, la sustancia de 
ensayo no provoca aberraciones cromosómicas en la médula ósea de 
la especie estudiada. 
Deberá estudiarse la probabilidad de que la sustancia de ensayo o sus 
metabolitos pasen al torrente circulatorio o lleguen específicamente al tejido diana (toxicidad sistémica, etc.).
 
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la información siguiente: 
Disolvente o vehículo: — motivación de la elección del vehículo, — solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disol ­
vente o vehículo, si se conocen. 
Animales de ensayo: — especie y cepa utilizadas, — número, edad y sexo de los animales, — procedencia, condiciones de alojamiento, alimentación, etc., — peso de cada animal al principio del ensayo, incluido el intervalo 
del peso corporal, media y desviación estándar de cada lote. 
Condiciones del ensayo: — controles positivos y negativos (vehículo o disolvente), — datos relativos al estudio de determinación del intervalo, si se ha 
llevado a cabo, 
— fundamento de la selección de la dosis, — preparación de la sustancia de ensayo, — administración de la sustancia de ensayo, — fundamento de la elección de la vía de administración, — métodos de comprobación de que la sustancia de ensayo llega al 
torrente circulatorio o al tejido diana, en su caso, 
— conversión de la concentración de la sustancia de ensayo en el 
agua ingerida y/o la dieta (ppm) en la dosis real (mg/kg de peso 
corporal/día), si procede, 
— calidad de los alimentos y el agua, — descripción detallada de las pautas de tratamiento y toma de 
muestras, 
— métodos de determinación de la toxicidad,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— sustancia que detiene la división celular en la metafase, concen ­
tración empleada y duración del trata miento, 
— métodos de preparación de los portaobjetos, 
— criterios de recuento de las aberraciones, — número de células analizadas por animal, 
— criterios empleados para considerar que los resultados de los 
estudios son positivos, negativos o dudosos. 
Resultados: 
— signos de toxicidad, — índice mitótico, — tipo y número de aberraciones observadas en cada animal, 
— número total de aberraciones por lote, medias y desviaciones 
estándar, 
— número de células con aberraciones por lote, medias y desvia ­
ciones estándar, 
— variaciones de la ploidía, en su caso, 
— relación dosis-respuesta, cuando sea posible, — análisis estadísticos, si se han realizado, — datos de los controles negativos realizados en paralelo, 
— datos sobre controles históricos negativos, intervalos, medias y 
desviaciones estándar, 
— datos de los controles positivos realizados en paralelo. 
Discusión de los resultados. Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Adler, 1. D. (1984), Cytogcnetic Tests in Mammals, in:  Muta­
genicity Testing: a Practical Approach,  S. Venitt and J. M. 
Parry (eds.). IRL Press, Oxford, Washington D. C, pp. 275–306. 
(2) Presten, R.)., Dean, B, J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. 
F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow 
Cells,  Mutation Res., 189,  157–165. 
(3) Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D. G., Boot ­
man, J. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogcnetic Assays, 
in: D. J. Kirkland, (ed.), Basic  Mutagenicity Tests, UKEMS 
Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guideli ­
nes for Mutagenicity Testing Report. Pan (revised,  Cambridge 
University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbour ­
ne, Sydney, pp. 115-141. 
(4) Tice, R. R. Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Bla ­
key, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on 
the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration 
Test,  Mutation Res.,  312, pp. 305-312. 
(5) Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Mor ­
ton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays,  
Muta-genesis, 7,  pp. 31 3-319.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cyto ­
genetic Assays, in: UKEMS  Sub-Committee on Guidelínes for 
Mutagenicity Testing. Repon Pan (III. Statistical Evahation of 
Mutagenicity Test Data,  D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge Uni ­
versity Press, Cambridge, pp. 184-232. 
(7) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest,  Mutation Res. 
119, pp. 403-413. 
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  Cancer 
Res., 43,  pp. 1363-1364.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE MICRONÚCLEOS EN 
ERITROCITOS DE MAMÍFERO  IN VIVO  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices del documento OCDE TG 
474 sobre el ensayo de micronúcleos en eritrocitos de mamífero (1997).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El ensayo  in vivo  de micronúcleos en mamíferos se emplea para 
detectar lesiones provocadas por la sustancia de ensayo en los cro ­
mosomas o el aparato mitótico de eritroblastos mediante el análisis 
de eritrocitos tomados de la médula ósea y/o la sangre periférica de animales (por lo general, roedores). 
El ensayo de micronúcleos tiene por objeto determinar las sustancias 
que ocasionan lesiones citogenéticas que dan lugar a la formación de 
micronúcleos con fragmentos de cromosomas o cromosomas enteros 
retardados. 
Cuando los eritroblastos de la médula ósea se transforman en eri ­
trocitos policromáticos, el núcleo principal es expulsado y el micro ­
núcleo, caso de haberse formado, puede permanecer en el citoplas ­
ma, que de lo contrario quedaría anucleado. Resulta más fácil visua ­
lizar los micronúcleos en estas células, pues carecen de núcleo prin ­
cipal. El aumento de la frecuencia de micronúcleos en los eritrocitos 
policromáticos de animales tratados es indicativo de la existencia de 
lesiones cromosómicas inducidas. 
En este ensayo se emplea habitualmente médula ósea de roedores, 
pues es en ese tejido donde se forman los eritrocitos policromáticos. 
La detección de eritrocitos inmaduros (policromáticos) micronuclea ­
dos en la sangre periférica también puede llevarse a cabo en otras especies en las que se haya demostrado que el bazo no es capaz de eliminar los eritrocitos micronucleados o que son suficientemente 
sensibles para detectar agentes que provocan aberraciones cromosó ­
micas numéricas o estructurales. Entre los diversos criterios para distinguir los micronúcleos figura la determinación de la presencia 
o la ausencia de centrómero o de ADN centromérico en los mismos. 
El parámetro principal es la frecuencia de eritrocitos inmaduros (po ­
licromáticos) micronucleados. Si los animales se tratan de forma continua durante cuatro semanas o más, también puede emplearse 
como parámetro en el ensayo el número de eritrocitos maduros 
(normocromáticos) con micronúcleos en la sangre periférica respecto a un número determinado de eritrocitos maduros. 
El presente ensayo  in vivo  de micronúcleos en mamíferos está espe ­
cialmente indicado para evaluar el riesgo mutagénico, ya que permite 
tomar en consideración factores del metabolismo  in vivo,  de la far ­
macocinética y de los procesos de reparación del ADN, si bien dichos factores pueden variar según la especie, el tejido y el aspecto 
genético considerado. Los ensayos  in vivo  también resultan útiles 
para ahondar en el estudio de los efectos mutagénicos detectados en ensayos  in vitro.  
Si hay pruebas de que la sustancia de ensayo o un metabolito re ­
activo no llegan al tejido diana, no procede realizar el presente 
ensayo. 
Véase asimismo la introducción general de la parte B.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. DEFINICIONES  
Centrómero (cinetocoro):  región (o regiones) del cromosoma que 
se asocia a las fibras del huso acromático durante la división celular para permitir el movimiento ordenado de los cromosomas hijos hacia 
los polos de las células hijas.  
Micronúcleo:  núcleo pequeño, adicional al núcleo celular principal y 
separado de él, y producido durante la telofase de la mitosis o la meiosis por fragmentos cromosómicos o cromosomas enteros retar ­
dados.  
Eritrocito normocromático:  eritrocito maduro que carece de ribo ­
somas y que se distingue del eritrocito policromático (inmaduro) 
mediante tinción selectiva de los ribosomas.  
Eritrocito policromático:  eritrocito inmaduro, en una fase interme ­
dia de transformación, que aún tiene ribosomas y puede, por tanto, 
distinguirse del eritrocito normocromático (maduro) mediante tinción selectiva de dichos orgánulos.
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se exponen los animales a la sustancia de ensayo por una vía ade ­
cuada. Si se utiliza médula ósea, se sacrifican los animales a inter ­
valos apropiados tras el tratamiento, se extrae la médula ósea, se 
preparan los portaobjetos y se tiñen (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Si 
se emplea sangre periférica, se extrae a intervalos apropiados tras el tratamiento, se preparan frotis y se tiñen (4) (8) (9) (10). En los estudios con sangre periférica las células deben recolectarse lo antes 
posible después de la última exposición. Se analizan las preparacio ­
nes para detectar la presencia de micronúcleos.
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación  
1.4.1.1.  Selección de la especie animal  
Si se emplea médula ósea, se recomienda el uso de ratones o ratas, 
pero también pueden utilizarse otras especies de mamíferos adecua ­
das. Si se emplea sangre periférica, se recomienda el uso de ratones. Ahora bien, puede utilizarse cualquier otro mamífero adecuado, siempre que se trate de una especie en la que el bazo no elimine 
los eritrocitos micronucleados o en la que se haya demostrado una 
sensibilidad adecuada para detectar agentes que provocan aberracio ­
nes cromosómicas numéricas o estructurales. Deben usarse animales jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. La 
variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser 
mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo.
 
1.4.1.2.  Alojamiento y alimentación de los animales  
Se aplicarán las condiciones generales recogidas en la introducción 
general de la parte B. La humedad debe ser del 50 al 60 %.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Preparación de los animales  
Se reparten al azar animales adultos jóvenes y sanos entre los lotes 
tratados y los lotes control. Se identifica a los animales de forma unívoca y se los acostumbra a las condiciones de laboratorio durante 
al menos cinco días. Las jaulas se colocan de manera que los posi ­
bles efectos debidos a la posición de las mismas sean mínimos.
 
1.4.1.4.  Preparación de las dosis  
Las sustancias de ensayo sólidas deben disolverse o suspenderse en 
disolventes o vehículos adecuados y, si es preciso, diluirse antes de su administración a los animales. Las sustancias de ensayo líquidas 
pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administra ­
ción. Han de emplearse soluciones de la sustancia de ensayo recién preparadas, salvo que los datos relativos a la estabilidad demuestren que es posible conservarlas.
 
1.4.2.  Condiciones del ensayo  
1.4.2.1.  Disolvente o vehículo  
El disolvente o vehículo no deberá producir efectos tóxicos a las 
dosis empleadas. Es preciso cerciorarse de que el disolvente o vehí ­
culo no produce reacciones químicas con la sustancia de ensayo. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información de referencia que avale su compatibilidad. Siempre 
que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utili ­
zación de un disolvente o vehículo acuoso.
 
1.4.2.2.  Controles  
Deberán realizarse controles positivos y negativos (disolvente o ve ­
hículo) en paralelo en ambos sexos y en cada ensayo. Salvo por lo que respecta a la exposición a la sustancia de ensayo, los animales de los lotes de control deben tratarse exactamente igual que los de 
los lotes tratados. 
En los controles positivos deberían formarse micronúcleos  in vivo  
con grados de exposición en los que quepa esperar un aumento 
detectable respecto a la frecuencia espontánea. Las dosis del control positivo deben ser tales que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados. 
La sustancia del control positivo podrá administrarse por una vía 
distinta de la empleada para la sustancia de ensayo y la toma de muestras podrá realizarse una sola vez. Podrá considerarse la utili ­
zación en dichos controles de sustancias de clases químicas afines, 
cuando sea posible. A continuación figuran algunos ejemplos de 
sustancias para los controles positivos:
 
Sustancia N° CAS N° Einecs  
Metanosulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 
N-etilo-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 Cidofosfamida 
Monohidrato de ciclofosfamida 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Salvo que haya datos anteriores sobre controles que pongan de ma ­
nifiesto una variabilidad entre animales y una frecuencia de células 
con micronúdeos aceptables, se realizarán, para cada período de muestreo, controles negativos únicamente con el disolvente o vehí ­
culo, y se tratarán, por lo demás, de igual manera que los lotes 
tratados. Si se hace una sola toma de muestras en los controles 
negativos, el momento más oportuno para hacerla es tras el primer período de muestreo. Se realizarán asimismo controles sin tratar, salvo que exista información anterior o publicada sobre controles 
que demuestre que el disolvente o vehículo elegido no induce efectos 
nocivos ni mutágenos. 
Si se emplea sangre periférica, puede aceptarse como control nega ­
tivo en paralelo una muestra previa al tratamiento, pero únicamente 
en los estudios cortos (por ejemplo, de una a tres administraciones), 
si los resultados se encuentran en el intervalo previsto según con ­
troles anteriores.
 
1.5. PROCEDIMIENTO  
1.5.1.  Número y sexo de los animales  
Cada lote tratado y cada control ha de estar compuesto al menos por 
cinco hembras y cinco machos analizables (11). Si en el momento en que se efectúe el estudio se dispone de datos sobre otros estudios 
realizados con la misma especie y la misma vía de exposición, que 
demuestren que no hay diferencia significativa entre sexos en cuanto a la toxicidad, será suficiente el ensayo en un solo sexo. En caso de que la exposición humana a las sustancias pueda ser específica de un 
sexo, como sucede con algunos productos farmacéuticos, el ensayo 
se realizará con animales del sexo correspondiente.
 
1.5.2.  Pauta de tratamiento  
No se recomienda ninguna pauta normalizada (una, dos o más ad ­
ministraciones a intervalos de 24 horas, etc.). Pueden aceptarse 
muestras tomadas en el marco de estudios de larga duración siempre 
que se haya demostrado que ese tipo de estudio proporciona resul ­
tados positivos o, si los resultados son negativos, que ha habido 
toxicidad o bien que se ha estado aplicando la dosis límite hasta 
el momento de tomar la muestra. También puede dividirse la dosis —por ejemplo, en dos veces al día separadas por algunas horas como máximo— con el fin de facilitar la administración de grandes 
cantidades. 
El ensayo puede realizarse de dos maneras: 
a) se administra la sustancia de ensayo a los animales en una sola 
vez. Se extraen muestras de la médula ósea al menos dos veces, 
la primera de ellas cuando hayan transcurrido más de 24 horas, 
pero menos de 48 horas desde el tratamiento. Debe respetarse un intervalo adecuado entre las tomas. Si se extraen muestras antes de que transcurran 24 horas desde el tratamiento, deberá justifi ­
carse. Las muestras de sangre periférica han de tomarse al menos 
en dos ocasiones, la primera de ellas cuando haya transcurrido un mínimo de 36 horas desde el tratamiento. Tras la primera toma, se respetan intervalos adecuados, sin sobrepasar las 72 horas. Si 
se observa una respuesta positiva en una toma de muestras, no es 
preciso realizar más;
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) si se efectúan dos o más administraciones diarias (por ejemplo, 
dos o más administraciones a intervalos de 24 horas), ha de 
tomarse una muestra transcurridas de 18 a 24 horas desde la última administración si se trata de médula ósea, y de 36 a 48 horas desde la última administración en el caso de la sangre 
periférica (12). 
Si procede, pueden aplicarse otros tiempos de muestreo adicionales.
 
1.5.3.  Dosis  
Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación de la gama de 
dosis por falta de datos adecuados, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y protocolo de trata ­
miento que el estudio principal (13). Si se produce toxicidad, se 
administrarán tres dosis distintas para el primer período de muestreo. La gama de dosis deberá abarcar desde la toxicidad máxima hasta una toxicidad escasa o nula. En el último período de muestreo se 
administrará únicamente la dosis máxima. Se entenderá por «dosis 
máxima» la que produzca tales signos de toxicidad que, si se admi ­
nistrara una dosis superior según el mismo protocolo, resultaría pro ­
bablemente letal. Las sustancias con actividades biológicas específi ­
cas a dosis bajas no tóxicas (como las hormonas y los mitógenos) 
pueden constituir excepciones en cuanto a los criterios de estableci ­
miento de la dosis y han de evaluarse caso por caso. La dosis máxima también puede definirse como la dosis que produce algún 
signo de toxicidad en la médula ósea (por ejemplo, reducción de la 
proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos en la médula ósea o la sangre periférica).
 
1.5.4.  Ensayo límite  
Si en un ensayo realizado con una dosis de al menos 2 000 mg/kg de 
peso corporal administrada en una sola vez, o dos veces en el mismo día, no se observan efectos tóxicos y si, sobre la base de datos 
relativos a sustancias de estructura afín, no cabe esperar genotoxici ­
dad, puede no ser necesario llevar a cabo un estudio completo con tres dosis diferentes. En el caso de estudios de mayor duración, la dosis límite será de 2 000 mg/kg de peso corporal/día cuando el 
tratamiento dure hasta 14 días y de 1 000 mg/kg de peso corporal/día 
cuando el tratamiento dure más de 14 días. Si se prevé la exposición humana a la sustancia, puede ser preciso administrar una dosis ma ­
yor en el ensayo límite.
 
1.5.5.  Administración de las dosis  
La sustancia de ensayo suele administrarse por sonda gástrica o con 
una cánula de intubación adecuada, o bien por inyección intraperí ­
toneal. Pueden emplearse otras vías de administración, siempre que 
se justifiquen. El volumen máximo de líquido que puede adminis ­
tarse de una sola vez por sonda o inyección depende del tamaño del animal de ensayo, pero no excederá de 2 ml/100 g de peso corporal. 
Deberá justificarse la administración de volúmenes superiores a este. 
Salvo en el caso de sustancias irritantes o corrosivas, que por lo general producen efectos exacerbados con concentraciones mayores, deberá reducirse al mínimo la variabilidad del volumen de ensayo 
ajustando la concentración de manera que el volumen sea el mismo 
en todas las dosis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Preparación de la médula ósea o la sangre periférica  
Por lo general, la médula ósea se extrae del fémur o la tibia de los 
animales recién sacrificados. Las células suelen tomarse del fémur o la tibia, se preparan y se tiñen según métodos establecidos. La sangre 
periférica se extrae de la vena caudal o de otro vaso sanguíneo 
adecuado. Las células hemáticas se someten inmediatamente a una tinción supravital (8) (9) (10) o se extienden en frotis y luego se tiñen. Si se emplea un colorante específico del ADN [por ejemplo, 
naranja de acridina (14) o Hoechst 33258 más pironina-Y (15)] 
pueden evitarse algunos de los artefactos que aparecen cuando se utiliza un colorante que no es específico del ADN, pero no por ello 
han de descartarse los colorantes convencionales (coloración de 
Giemsa, etc.). También pueden utilizarse otros sistemas [por ejem ­
plo, columnas de celulosa para eliminar las células nucleadas (16)], siempre que se tenga constancia de que resultan adecuados para la 
preparación de micronúcleos en laboratorio.
 
1.5.7.  Análisis  
Para cada animal, se determina la relación entre los eritrocitos inma ­
duros y el total de eritrocitos (inmaduros + maduros) en un recuento 
de al menos 200 eritrocitos si se trata de médula ósea y de 1 000 si se trata de sangre periférica (17). Antes de analizarlos al microsco ­
pio, se codifican independientemente todos los portaobjetos, inclui ­
dos los controles positivos y negativos. Se determinará la cantidad de 
eritrocitos inmaduros micronucleados en un mínimo de 2 000 eritro ­
citos inmaduros por animal. Puede obtenerse más información con ­
tando los eritrocitos maduros con micronúcleos. En el análisis de los 
portaobjetos la proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total 
de eritrocitos no debe ser inferior al 20 % del valor del control. Si los animales han sido tratados de forma continua durante cuatro 
semanas o más, también puede determinarse la cantidad de micronú ­
cleos en un mínimo de 2 000 eritrocitos maduros por animal. Pueden emplearse sistemas de análisis automatizados (análisis de la imagen o citometría de flujo continua de suspensiones celulares) en lugar del 
recuento manual, siempre que estén debidamente justificados y va ­
lidados.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de tabla. 
La unidad experimental es el animal. Para cada animal analizado se relacionará por separado el número de eritrocitos inmaduros, el de 
eritrocitos inmaduros micronucleados y la proporción de eritrocitos 
inmaduros respecto al total de eritrocitos. Si los animales han sido tratados de forma continua durante cuatro semanas o más, se pro ­
porcionarán también los datos relativos a los eritrocitos maduros, 
caso de haberse recogido. Se facilitarán, para cada animal, la pro ­
porción de eritrocitos inmaduros respecto al total de los mismos y, si procede, el porcentaje de eritrocitos micronucleados. Si no se obser ­
van diferencias en la respuesta de un sexo y otro, los datos relativos 
a ambos sexos pueden considerarse conjuntamente en el análisis 
estadístico.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Son varios los criterios para determinar si un resultado es positivo 
(aumento del número de células micronu-cleadas relacionado con la dosis, claro aumento del número de dichas células en un lote al que 
se ha administrado una sola dosis y en el que se ha realizado una 
única toma de muestras, etc.). Debe considerarse en primer lugar la importancia biológica de los resultados. Pueden emplearse métodos estadísticos como apoyo para evaluar los resultados del ensayo (18) 
(19). El hecho de que los datos estadísticos sean significativos no ha 
de ser el único factor para determinar que una respuesta es positiva. Los resultados dudosos deberán aclararse mediante más ensayos en 
los que convendría modificar las condiciones experimentales. 
No se considerarán mutágenas en el ensayo en cuestión las sustan ­
cias que den lugar a resultados que no se ajusten a los criterios anteriores. 
Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán cla ­
ramente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos no permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la 
sustancia de ensayo. Con independencia del número de veces que 
se repita el experimento, los resultados pueden seguir siendo ambi ­
guos o dudosos. 
Un resultado positivo en el ensayo de micronúcleos indica que la 
sustancia de ensayo induce la formación de micronúcleos, que son 
consecuencia de una lesión de los cromosomas o del aparato mitó ­
tico de los eritro-blastos de la especie estudiada. Un resultado nega ­
tivo indica que, en las condiciones del ensayo, la sustancia de ensayo 
no induce la formación de micronúdeos en los eritrocitos inmaduros 
de la especie estudiada. 
Deberá estudiarse la probabilidad de que la sustancia de ensayo o sus 
metabolitos pasen al torrente circulatorio o lleguen específicamente 
al tejido diana (toxicidad sistémica, etc.).
 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la información siguiente: 
Disolvente o vehículo: 
— motivación de la elección del vehículo, 
— solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disol ­
vente o vehículo, si se conocen. 
Animales de ensayo: 
— especie y cepa utilizadas, 
— número, edad y sexo de los animales, 
— procedencia, condiciones de alojamiento, alimentación, etc., — peso de cada animal al principio del ensayo, incluido el intervalo 
del peso corporal, media y desviación estándar de cada lote. 
Condiciones del ensayo: — datos de los controles positivos y negativos (vehículo o disolvente), 
— datos relativos al estudio de determinación del intervalo de dosis, 
si se ha llevado a cabo,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— fundamento de la selección de la dosis, 
— preparación de la sustancia de ensayo, — administración de la sustancia de ensayo, 
— fundamento de la elección de la vía de administración, 
— métodos de comprobación de que la sustancia de ensayo llega al 
torrente circulatorio o al tejido diana, en su caso, 
— conversión de la concentración de la sustancia de ensayo en el 
agua ingerida y/o la dieta (ppm) en la dosis real (mg/kg de peso corporal/día), si procede, 
— calidad de los alimentos y el agua, 
— descripción detallada de las pautas de tratamiento y toma de 
muestras, 
— métodos de preparación de los portaobjetos, 
— métodos de determinación de la toxicidad, — criterios de recuento de los eritrocitos inmaduros micronucleados, 
— número de células analizadas por animal, 
— criterios empleados para considerar que los resultados de los 
estudios son positivos, negativos o dudosos. 
Resultados: 
— signos de toxicidad, 
— proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritroci ­
tos, 
— número de eritrocitos inmaduros micronucleados observados en 
cada animal, 
— media ± desviación estándar de eritrocitos inmaduros micronu ­
cleados de cada lote, 
— relación dosis-respuesta, cuando sea posible, 
— análisis estadísticos y métodos aplicados, 
— datos de los controles históricos negativos y los realizados en 
paralelo al ensayo, 
— datos de los controles positivos realizados en paralelo. 
— Discusión de los resultados. 
— Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal 
Damage,  Mutation Res.,  18, pp. 187-190. 
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
pp. 9-15, 
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Ma ­
vournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mu ­
tation  Res. 123,  pp. 61-118. 
(4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, 
M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. 
(1983). Micronuclei in CircuLating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in:  Developments in Science and Practice 
of Toxicology,  ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, pp., 555-558. 
(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G, H., 
Ramel, C. Salamone, M. R. Tice, R. R. and Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mam ­
malian Bone Marrow Erythrocytes,  Mutation Res.,  189, pp. 
103-112. 
(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, M. 
E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Mea ­
surement at Steady State Increases Assay Efficiency and Per ­
mits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522. 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, 
Mutation Res., 245, pp. 245-249. 
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryth ­
rocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary 
Repon of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JKMMS, 
MMS, Mutation  Res., 278,  pp. 83-98. 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse perip ­
heral blood micronucleus test,  Mutagenesis,  10, pp. 153-159. 
(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchi ­
crotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994),  In Vivo,  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mu ­
tation Res., 312, pp. 293-304. 
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generali ­
sed sampling time of 30±6 h after double dosing in the 
mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, pp. 313-319. 
(13) Fielder, R. J., Alien, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, C., Mor ­
ton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of 
British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen So ­
ciety Working Group: Dose Setting in  In Vivo  Mutagenicity 
Assays.  Mutagenesis,  7, pp. 313-319. 
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Ap ­
plication of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Mi ­
cronucleus Test,  Mutation Res., 120,  pp. 241-247. 
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, pp. 269-275. 
(16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test, Mututton Res., 213, pp. 91-104. 
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for 
the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 
347, pp. 97-99.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L (1990),  In Vivo  Cytogenotics Assay, 
in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Gui ­
delines for Mutagenícity Testing. Report, Part 1, revised, Cam ­
bridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, pp. 115-141. 
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cyto­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evalualion 
of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Commiltec on Gui ­
delines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Mel ­
bourne, Sydney, pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE MUTACIÓN INVERSA EN 
BACTERIAS  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices del documento OCDE 
TG 471 sobre el ensayo de mutación inversa en bacterias (1997).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
En el ensayo de mutación inversa en bacterias se emplean cepas de  
Salmonella typhimurium  y Escherichia coli  auxotróficas respecto a 
un aminoácido para detectar mutaciones puntuales que impliquen sustitución, adición o deleción de uno o varios pares de bases del 
ADN (1) (2) (3). El ensayo se fundamenta en la detección de mu ­
taciones que revierten mutaciones presentes en las cepas experimen ­
tales y restablecen la capacidad funcional de las bacterias de sinte ­
tizar un aminoácido esencial. Las bacterias revertientes se detectan 
por su capacidad de crecer en ausencia del aminoácido que la cepa 
experimental parental no es capaz de sintetizar. 
Las mutaciones puntuales ocasionan numerosas enfermedades gené ­
ticas humanas. Además de ello, son muchas las pruebas de que dichas mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores de las células somáticas intervienen en la formación de tumores en los 
seres humanos y los animales de experimentación. El ensayo de 
mutación inversa en bacterias es rápido, poco costoso y relativa ­
mente sencillo de realizar. Muchas de las cepas experimentales pre ­
sentan algunas características que las hacen más sensibles para la 
detección de mutaciones: secuencias de ADN sensibles en los sitios 
de reversión, mayor permeabilidad celular a las moléculas grandes y eliminación de sistemas de reparación del ADN o intensificación de los procesos de reparación del ADN propensos a errores. La espe ­
cificidad de las cepas experimentales puede proporcionar informa ­
ción útil sobre los tipos de mutaciones inducidas por sustancias genotóxicas. Existe una importante base de datos relativa a una gran variedad de estructuras que recoge los resultados de ensayos 
de mutación inversa en bacterias. Asimismo, se han desarrollado 
metodologías bien consolidadas para analizar productos químicos, incluidos los compuestos volátiles, con diferentes propiedades fisi ­
coquímicas. 
Véase asimismo la introducción general de la parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Ensayo de mutación inversa  en Salmonella typhimurium  o Esche­
richia coli:  ensayo que permite detectar una mutación en una cepa 
auxótrofa para un aminoácido (histidina y triptófano, respectivamen ­
te), que la transforma en una cepa independiente del aporte externo de dicho aminoácido.  
Mutágenos que provocan la sustitución de un par de bases:  
agentes que provocan el cambio de una base en el ADN. En un ensayo de reversión el cambio puede producirse en el sitio de la 
mutación original o en un segundo sitio del genoma bacteriano.  
Mutágenos que desplazan el marco de lectura:  agentes que pro ­
vocan la adición o deleción de uno o más pares de bases en el ADN, 
lo que modifica el marco de lectura en el ARN.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. CONSIDERACIONES INICIALES 
En el ensayo de mutación inversa en bacterias se utilizan células 
procariotas, que difieren de las células de mamífero en aspectos como la absorción, el metabolismo, la estructura cromosómica y 
los procesos de reparación del ADN. En los ensayos  in vitro  suele 
ser necesario emplear un sistema de activación metabólica exó-gena, si bien tales sistemas no pueden reproducir todas las condiciones que se dan  in vivo  en los mamíferos. Por tanto, el ensayo no proporciona 
información directa sobre la potencia mutagénica y carcinogénica de 
una sustancia determinada en mamíferos. 
El ensayo de mutación inversa en bacterias se emplea habitualmente 
para hacer una selección inicial de la actividad genotóxica y, en 
particular, de la actividad inductora de mutaciones puntuales. Una importante base de datos ha puesto de manifiesto que muchas sus ­
tancias químicas que dan un resultado positivo en este ensayo tam ­
bién presentan actividad mutagénica en otros ensayos. También hay 
agentes mutagénicos que no son detectados por este ensayo. Esas deficiencias pueden deberse a la naturaleza específica del efecto detectado, a diferencias de la activación metabólica o de la biodis ­
ponibilidad. Por otra parte, los factores que incrementan la sensibi ­
lidad del ensayo de mutación inversa en bacterias pueden llevar a sobrestimar la actividad mutagénica. 
El ensayo de mutación inversa en bacterias puede no ser apropiado 
para evaluar determinadas clases de sustancias químicas como los compuestos muy bactericidas (por ejemplo, algunos antibióticos) y aquellos de los que se cree (o se sabe) que interfieren de forma 
específica en el sistema de replicación celular de los mamíferos 
(por ejemplo, algunos inhibidores de la topoisomerasa y algunos análogos de los nucleósidos). En esos casos están más indicados los ensayos de mutaciones en mamíferos. 
Pese a que muchos de los compuestos que dan un resultado positivo 
en este ensayo son carcinógenos para los mamíferos, la correlación no es absoluta, sino que depende de la clase química. Además de 
ello, hay carcinógenos que el ensayo no detecta, pues actúan por 
mecanismos que no son genotóxicos o que no existen en las células bacterianas.
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se exponen las suspensiones de células bacterianas a la sustancia de 
ensayo en presencia y en ausencia de un sistema de activación metabólica exógena. En el método de incorporación en placa, las suspensiones se mezclan con agar de recubrimiento y se vierten 
inmediatamente sobre una placa en medio mínimo. En el método 
de preincubación, la mezcla de tratamiento se incuba y luego se mezcla con agar de recubrimiento antes de verterla sobre una placa 
en medio mínimo. En ambos casos, tras dos o tres días de incuba ­
ción, se cuentan las colonias revertientes y se compara su cantidad con la de colonias revertientes espontáneas en las placas de control con disolvente. 
Entre los diversos procedimientos descritos para realizar el ensayo de 
mutación inversa en bacterias los métodos siguientes se utilizan comúnmente: incorporación en placa (1) (2) (3) (4), preincubación (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluctuación (9) (10) y suspensión (11). 
También se han descrito modificaciones para los ensayos con gases 
y vapores (12).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Los procedimientos descritos en el método corresponden principal ­
mente a la incorporación en placa y a la preincubación. Ambos son 
aceptables para realizar experimentos con y sin activación metabóli ­
ca. El método de preincubación resulta más eficaz para detectar determinadas sustancias que pertenecen a clases químicas que inclu ­
yen nitrosaminas alifáticas de cadena corta, metales divalentes, alde ­
hídos, azocolorantes y diazocom-puestos, alcaloides de la pirolizidi ­
na, compuestos alílicos y nitrocompuestos (3). También se reconoce que algunas clases de mutágenos no siempre se detectan con proce ­
dimientos ordinarios como los métodos de incorporación sobre placa 
y de preincubación. Esos casos deben considerarse «especiales» y se recomienda seriamente utilizar otros procedimientos para detectarlos. Se han determinado los «casos especiales» siguientes (junto con 
ejemplos de procedimientos de detección eficaces): azocolorantes y 
diazocompuestos (3) (5) (6) (13), gases y sustancias químicas volá ­
tiles (12) (14) (15) (16) y glicósidos (17) (18). Cualquier desviación respecto al procedimiento ordinario ha de estar científicamente jus ­
tificada.
 
1.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.5.1.  Preparación  
1.5.1.1.  Bacterias  
Se dejan crecer cultivos bacterianos recientes hasta el final de la fase 
exponencial o hasta el principio de la fase estacionaria (unas 10  9 
células por ml). No deben emplearse cultivos que se encuentren al 
final de la fase estacionaria. Es fundamental que los cultivos utili ­
zados para el experimento contengan un título elevado de bacterias 
viables. El título puede demostrarse sobre la base de datos de con ­
troles anteriores sobre curvas de crecimiento o bien determinando en cada ensayo el número de células viables mediante un experimento 
de cultivo en placas. 
La temperatura de incubación recomendada es de 37
 o C. 
Se emplearán al menos cinco cepas bacterianas, de las cuales cuatro 
serán de  S. typhimurium  (TA1535; TA 1537, TA97a o TA97; TA98 
y TA100), de fiabilidad demostrada y cuya respuesta sea reproduci ­
ble entre laboratorios. Esas cuatro cepas de  S. typhimurium  poseen 
pares de bases GC en el sitio de reversión primaria y se sabe que no 
son capaces de detectar determinados mutágenos oxidantes, agentes 
de entrecruzamiento e hidracinas. Dichas sustancias son detectadas por las cepas  E. coli  WP2 y  S. typhimurium  TA102 (19), que poseen 
un par de bases AT en el sitio de reversión primaria. Así pues, se 
recomienda la combinación de cepas siguiente. 
— S. typhimurium  TA1535, y 
— S. typhimurium  TA1537 y TA97 o TA97a, y 
— S. typhimurium  TA98, y 
— S. typhimurium  TA100, y 
— E. coli  WP2 uvrA o  E. coli  WP2 uvrA (pKM101) o  S. typhimu ­
rium  TA102. 
Para detectar mutágenos de entrecruzamiento puede ser mejor incluir 
TA102 o añadir una cepa de  E. coli  eficaz en la reparación de ADN 
[por ejemplo,  E. coli  WP2 o  E. coli  WP2 (pKM101)].
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Se seguirán procedimientos reconocidos de preparación de cultivos 
madre, comprobación de marcadores y conservación. Debe demos ­
trarse en cada preparación de cultivo madre congelado que es nece ­
sario aportar el aminoácido en cuestión para que haya crecimiento (histidina en las cepas de  S. typhimurium  y triptófano en las de  E. 
coli). Se controlarán de igual manera otras características fenotípicas, 
en concreto la presencia o ausencia de factores R, si procede [resis ­
tencia a la ampicilina en las cepas TA98, TA100 y TA97a o TA97, WP2 uvrA y WP2 uvrA (pKM101), y a la ampicilina + tetraciclina 
en la cepa TA102] y la presencia de mutaciones características (mu ­
tación rfa en  S. typhimurium  mediante la sensibilidad al violeta 
cristal, y mutación uvrA en  E. coli  o uvrB en  S. typhimurium,  
mediante la sensibilidad a la luz ultravioleta) (2) (3). Las cepas 
deben producir un número de colonias revertientes espontáneas por 
placa en las gamas de frecuencia esperadas sobre la base de datos de controles anteriores del laboratorio y preferiblemente en la gama recogida en las publicaciones.
 
1.5.1.2.  Medio  
Se emplearán un agar mínimo adecuado (por ejemplo, con medio 
mínimo E de Vogel-Bonner y glucosa) y un agar de recubrimiento 
con histidina y biotina o triptófano para permitir pocas divisiones 
celulares (1) (2) (9).  
1.5.1.3.  Activación metabólica  
Las bacterias deben exponerse a la sustancia de ensayo en presencia 
y en ausencia de un sistema adecuado de activación metabólica. El sistema más comúnmente empleado es una fracción postmitocon ­
drial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene de hígados 
de roedores tratados con inductores enzimáticos como el Aroclor 
1254 (1) (2) o una mezcla de fenobarbital y  β-naftoflavona (18) 
(20) (21). La fracción postmitocondrial suele emplearse en concen ­
traciones que varían del 5 al 30 % v/v en la mezcla S9. La elección 
y la condición de un sistema de activación metabólica puede de ­
pender de la clase de sustancia estudiada. En algunos casos puede ser oportuno utilizar varias concentraciones distintas de fracción postmitocondrial. En el caso de los azocolorantes y los diazocom ­
puestos puede estar más indicado utilizar un sistema reductor de 
activación metabólica (6) (1 3).
 
1.5.1.4.  Preparación de la sustancia de ensayo  
Las sustancias de ensayo sólidas deben disolverse o suspenderse en 
disolventes o vehículos adecuados y, si es preciso, diluirse antes de tratar las bacterias. Las sustancias de ensayo líquidas pueden aña ­
dirse directamente al sistema de ensayo y/o diluirse antes del trata ­
miento. Han de emplearse soluciones recién preparadas, salvo que 
los datos relativos a la estabilidad demuestren que es posible con ­
servarlas. 
Es preciso cerciorarse de que el disolvente o vehículo no produce 
reacciones químicas con la sustancia de ensayo y es compatible con la supervivencia de las bacterias y la actividad de la S9 (22). Si se 
emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de 
información que avale dicha compatibilidad. Siempre que sea posi ­
ble, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o un vehículo acuoso. Cuando se estudien sustancias 
inestables en presencia de agua, deberán emplearse disolventes or ­
gánicos que no contengan agua.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Condiciones de ensayo  
1.5.2.1.  Cepas de ensayo (véase el punto 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Concentraciones de exposición  
Para determinar la mayor concentración de la sustancia de ensayo 
deben considerarse, entre otros criterios, la citotoxicidad y la solu ­
bilidad en la mezcla de tratamiento final. 
Puede ser útil determinar la toxicidad y la insolubilidad en un ex ­
perimento preliminar. La citotoxicidad puede manifestarse por una 
reducción del número de colonias revertientes, la disminución o la aclaración de la confluencia del césped bacteriano, o la tasa de supervivencia de los cultivos tratados. La citotoxicidad de una sus ­
tancia puede verse alterada en presencia de sistemas de activación 
metabólica. Ha de valorarse la insolubilidad en forma de precipita ­
ción en la mezcla final en las condiciones reales de ensayo, visible por simple observación. 
Si se trata de sustancias de ensayo solubles y no citotóxicas, la 
concentración máxima recomendada es de 5 mg/placa o 5 μl/placa. 
En el caso de sustancias no citotóxicas que no sean solubles a dicha concentración, una o varias de las concentraciones empleadas resul ­
tarán insolubles en la mezcla de tratamiento final. Las sustancias de 
ensayo que ya sean citotóxicas por debajo de 5 mg/placa o 5 μl/placa 
deberán ensayarse a concentraciones que llegarán como máximo hasta la concentración citotóxica. El precipitado no ha de interferir 
en la evaluación. 
Se emplearán al menos cinco concentraciones analizables de la sus ­
tancia de ensayo con intervalos semilogarít-micos aproximadamente 
(√10) para el experimento inicial. Si se está estudiando la relación 
respuesta-concentración, puede estar indicado emplear intervalor me ­
nores. Para evaluar sustancias que contengan cantidades considera ­
bles de impurezas potencialmente mutagénicas podrá considerarse el 
uso de concentraciones superiores a 5 mg/placa o 5 μl/placa.
 
1.5.2.3.  Controles positivos y negativos  
En todos los experimentos deberán realizarse en paralelo controles 
positivos y negativos (disolvente o vehículo) específicos de la cepa 
utilizada, con y sin activación metabólica. Se seleccionarán las con ­
centraciones del control positivo que demuestren ser eficaces en cada experimento. 
En los experimentos con sistema de activación metabólica, la sus ­
tancia o sustancias de referencia del control positivo se elegirán con 
arreglo al tipo de cepa bacteriana empleada. 
A continuación figuran algunos ejemplos de sustancias adecuadas 
para los controles positivos en ensayos con activación metabólica:
 
N° CAS N° Einecs Sustancia  
781-43-1 212-308-4 9,10-Dimetilantraceno 
57-97-6 200-359-5 7,12-Dimetilbenzo[a]aniraceno 
50-32-8 200-028-5 Benzo[a]pireno 
613-13-8 210-330-9 2-Aminoantraceno  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
N° CAS N° Einecs Sustancia  
50-18-0 Ciclofosfamida 
6055-19-2 200-015-4 Monohidrato de ciclofosfamida 
La sustancia siguiente es apropiada para el control positivo del mé ­
todo de activación metabólica reductora:  
Sustancia N° CAS N° Einecs  
Rojo Congo 573-58-0 209-358-4 
El 2-aminoantraceno no ha de emplearse como único indicador de la 
eficacia de la mezcla S9. Caso de emplearlo, todos los lotes de S9 
han de caracterizarse asimismo con un mutágeno que requiera acti ­
vación metabólica mediante enzimas microsomales, corno el ben ­
zo[a]pireno o el dimetilbenzoantraceno. 
A continuación figuran algunos ejemplos de sustancias para los con ­
troles positivos específicas de determinadas cepas para ensayos sin sistema de activación metabólica exógena:
 
N° CAS N° Einecs Sustancia Cepa  
26628-22-8 247-852-1 Azida de sodio TA 1535 yTA 100 
607-57-8 210-138-5 2-Nitrofluoreno TA 98 
90-45-9 201-995-6 9-Aminoacridina TA 1537, TA 97 y TA 97a 
17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 y TA 97a 
80-15-9 201-254-7 Hidroperóxido de cumeno TA 102 50-07-7 200-008-6 Mitomicina C WP2uvrA y TA 102 
70-25-7 200-730-1 N-etil-N-nitro-N-nitrosoguani ­
dina WP2, WP2uvrA y WP2uv ­
rA(pKM101) 
56-57-5 200-281-1 4-Nitroquinolina-l-óxido WP2, WP2uvrA y WP2uv ­
rA(pKM101) 
3688-53-7 Furilfuramida (AF2) Cepas que contengan plásmidos 
Pueden emplearse otras sustancias adecuadas para los controles po ­
sitivos. Deberá considerarse la utilización en dichos controles de sustancias de clases químicas afines, cuando sea posible. 
Se realizarán controles negativos sin sustancia de ensayo, únicamente 
con el disolvente o vehículo, y se tratarán de igual manera que los lotes tratados. Se prepararán asimismo controles sin tratar, salvo que 
exista información anterior sobre controles que demuestre que el 
disolvente elegido no induce efectos nocivos ni mutá-genos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Procedimiento  
En el método de incorporación sobre placa (1) (2) (3) (4), sin acti ­
vación metabólica, suele mezclarse 0,05 ml o 0,1 ml de las solucio ­
nes de ensayo, 0,1 ml de cultivo bacteriano fresco (aproximadamente 
10 8 células viables) y 0,5 ml de solución tampón estéril con 2,0 ml 
de agar de recubrimiento. En el ensayo con activación metabólica suele añadirse 0,5 ml de mezcla de activación metabólica que con ­
tenga una cantidad adecuada de fracción postmitocondrial (del 5 al 
30 % v/v en dicha mezcla) al agar de recubrimiento (2,0 ml), las 
bacterias y la sustancia o solución de ensayo. Se mezcla el contenido de cada tubo y se vierte sobre una placa de agar mínimo. Se deja 
solidificar el agar de recubrimiento antes de incubar. 
En el método de preincubación (2) (3) (5) (6) se incuba la sustancia 
o solución de ensayo con la cepa experimental (aproximadamente 10
 8 células viables) y la solución tampón de ensayo o el sistema de 
activación metabólica (0,5 ml), por lo general durante 20 minutos o 
más a 30-37  o C. Después se añade el agar de recubrimiento y se 
vierte sobre una placa de agar mínimo. Habitualmente se mezcla 0,05 a 0,1 ml de sustancia o solución de ensayo, 0,1 ml de cultivo bacteriano y 0,5 ml de mezcla S9 o solución tampón estéril con 2,0 
ml de agar de recubrimiento. Se airean los tubos durante la prein ­
cubación con un agitador. 
Se prepararán tres placas por cada dosis para estimar adecuadamente 
la variación. Pueden prepararse solo dos placas por dosis si se jus ­
tifica científicamente. La pérdida ocasional de una placa no invalida 
necesariamente el ensayo. 
Las sustancias gaseosas o volátiles han de someterse a ensayo con 
métodos adecuados (recipientes de cultivo herméticos, etc.) (12) (14) 
(15) (16).
 
1.5.4.  Incubación  
Se incuban todas las placas de un mismo ensayo entre 48 y 72 horas 
a 37  o C. Al término de la incubación, se cuenta el número de 
colonias revertientes por placa.  
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Se facilitará el número de colonias revertientes por placa, así como el 
número de colonias revertientes en las placas del control negativo (control con disolvente y control sin tratar, en su caso) y del posi ­
tivo. Debe proporcionarse el recuento por placa, la media de colonias 
revertientes por placa y la desviación estándar correspondientes a la sustancia de ensayo y a los controles positivos y negativos (sin tratar y/o con disolvente). 
No será preciso comprobar los resultados positivos claros, si bien los 
resultados dudosos deberán aclararse mediante más ensayos en los 
que convendría modificar las condiciones experimentales. Los resul ­
tados negativos se confirmarán caso por caso. Los casos en que dicha confirmación no se considere necesaria deberán justificarse. 
En los experimentos ulteriores se considerará la posibilidad de mo ­
dificar los parámetros del estudio para ampliar la gama de condicio ­
nes analizadas. Entre los parámetros modificables se encuentra la separación entre concentraciones, el método de tratamiento (incorpo ­
ración sobre placa o prcincubación líquida) y las condiciones de 
activación metabólica.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Son varios los criterios para determinar si un resultado es positivo 
(aumento relacionado con la concentración en la gama utilizada y/o aumento rcproducible con una o varias concentraciones en el número 
de colonias revertientes por placa al menos en una cepa, con o sin 
sistema de activación metabólica, etc.) (23). Debe considerarse en primer lugar la importancia biológica de los resultados. Pueden em ­
plearse métodos estadísticos como apoyo para evaluar los resultados 
del ensayo (24). No obstante, el hecho de que los datos estadísticos 
sean significativos no ha de ser el único factor para determinar que una respuesta es positiva. 
No se considerarán mutágenas en el ensayo las sustancias que den 
lugar a resultados que no se ajusten a los criterios anteriores. 
Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán cla ­
ramente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos 
no permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la 
sustancia de ensayo. Con independencia del número de veces que se repita el experimento, los resultados pueden seguir siendo ambi ­
guos o dudosos. 
Un resultado positivo en el ensayo de mutación inversa en bacterias 
indica que la sustancia de ensayo induce mutaciones puntuales por sustitución de bases o desplazamientos del marco de lectura en el 
genoma de  Sal-monella typhimurium  y/o Escherichia coli.  Un resul ­
tado negativo indica que, en las condiciones del ensayo, la sustancia de ensayo no resulta mutagénica en la especie estudiada.
 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la información siguiente: 
Disolvente o vehículo: 
— motivación de la elección del disolvente o vehículo, — solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disol ­
vente o vehículo, si se conocen. 
Cepas: — cepas utilizadas, 
— número de células por cultivo, 
— características de las cepas. Condiciones del ensayo: 
— cantidad de sustancia de ensayo por placa (mg/placa o μl/placa), 
fundamento de la selección de las dosis y número de placas por concentración, 
— medios utilizados, 
— tipo y composición del sistema de activación metabólica, inclui ­
dos los criterios de aceptabilidad, 
— procedimientos de tratamiento. 
Resultados: — signos de toxicidad, 
— signos de precipitación, 
— recuentos por placa,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— cantidad media de colonias revertientes por placa y desviación 
estándar, 
— relación dosis-respuesta, cuando sea posible, 
— análisis estadísticos, si se han realizado, 
— datos de los controles negativos (disolvente/vehículo) y positivos 
realizados en paralelo, intervalos, medias y desviaciones estándar, 
— datos sobre controles históricos negativos (disolvente/vehículo) y 
positivos, intervalos, medias y desviaciones estándar. 
Discusión de los resultados. 
Conclusiones.  
4. REFERENCIAS  
(1) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  31, 
pp. 347-364. 
(2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  113, pp. 
173-215. 
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays,  Mutation Res.,  312, pp. 217-233. 
(4) Kier, L. D., Brusick, D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V., F., Dunkel, V., McCann, J., 
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella  typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: 
A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program,  Mutation Res.,  168, pp. 69-240. 
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives,  Cancer Letters, 1,  
pp. 91-96. 
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests, in:  Short-term Test Systems for Detecting 
Carcinogens,  ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C Springer, 
Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285. 
(7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. 
and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in:  Basic 
Mutagenicity Tests: UKEMS Pan  1 Revised , ed. D. J. Kirkland, 
Cambridge University Press, pp. 13-61. 
(8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods,  J. Food Safety,  S, 
pp, 167-177. 
(9) Green, M. H. L, Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of muta ­
gens,  Mutations Res., 38,  pp. 33-42. 
(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L, Gatehouse, D. and Bridges, 
J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in:  Handbook 
of Mutagenicity Test Procedures,  2nd Edition, ed. Kilbey, 
B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, 
Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella typhimurium, Environmental Mutagene ­
sis, 3,  pp. 453-465. 
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Com ­
pounds by Using a Gas Sampling Bag,  Mutation Res., 307,  pp. 
335-344. 
(13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D, and 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Ben ­
zidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Mo ­
dified Salmonella Assay,  Mutation  Res.,  136,  pp. 33-47. 
(14) Zeiger, E., Anderson B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mor ­
telmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals,  Environ. Mol. Mulagen., 
19, pp. 2-141. 
(15) Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutage ­
nic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in  
Progress in Genetic Toxicology,  D. Scott, B. Bridges and F. 
Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258. 
(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, 
L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmone ­
lla Assay,  Environmental Mutagenesis, 9,  pp. 421-441. 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and 
Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring 
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Con ­
jugales in  Salomonella typhimurium, Cancer Res.,  39, pp, 
3780-3782, 
(18) Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
77, pp. 4961-4965. 
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. 
G. (1990), Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 
102 with E scherichia coli  WP2 Tester strains,  Mulagene ­
sis, 5, pp. 285-291. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro  Me­
tabolic Activation in Mutagenesis Testing,  eds, F. J. de Serres 
et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88. 
(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Tatehouse, D. 
G., Gibson, G, G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genotoxi ­
city Assays,  Mutagenesis,  7, pp. 175-177. 
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Micro ­
some Test,  Mulalion Res., 88,  pp. 343-350. 
(23) Claxton, L. D., Allen J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nes ­
tmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity,  Mutation Res., 189,  pp. 83-91.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in:  UKEMS Sub-Committee on 
Guidelines for Mulagenicity Testing, Part II. Slatistical Eva ­
luation of Mutagenicity Test Data,  ed. Kirkland, D. J., Cam ­
bridge University Press, pp. 28-65.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15  ENSAYOS DE MUTAGÉNESIS Y DETECCIÓN DE 
CARCINOGÉNESIS — MUTACIÓN GÉNICA —  
SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIONES 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Diversas cepas haploides y diploides de la levadura  Saccharomyces 
cerevisiae  pueden utilizarse para determinar la producción de muta ­
ciones génicas por agentes químicos con y sin activación metabólica. 
Es posible determinar la mutación directa en cepas haploides, en 
especial mediante la apreciación de la conversión de mutantes rojos 
consumidores de adenina (ade-1, ade-2) en una forma blanca que la 
precisa en cantidad doble, así como por sistemas selectivos, como la inducción de resistencia a la canavanina y la cicloheximida. 
El método de mutación inversa, el más utilizado, comprende la 
utilización de la cepa haploide XV 185-14C, portadora de las mu ­
taciones sin sentido ocres ade2-l, arg4-17, lys 1-1 y trp 5-48, rever ­
sibles mediante mutágenos causantes de sustituciones de bases que 
induzcan mutaciones en un punto específico o mutaciones supresoras 
ocres. La cepa XV 185-14C también lleva el marcador his 1-7, una mutación sin sentido invertida principalmente por mutaciones de segundo punto, y el marcador hom 3-10, invertido por mutágenos 
que desplazan el marco de lectura del código genético  (frameshift 
mutagens).  
De las cepas diploides de  S. cerevisiae,  la única que se utiliza 
ampliamente es D
 7 , homocigota para ilv 1-92.  
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Se prepararán soluciones de las sustancias químicas estudiadas y las 
de control inmediatamente antes de la prueba con ayuda de un 
vehículo apropiado. Cuando se trate de compuestos orgánicos no 
hidrosolubles, los disolventes orgánicos, como etanol, acetona o di ­
metilsulfóxido (DMSO), deberán emplearse en una concentración no superior al 2 % v/v. La concentración final del vehículo no debe 
influir de modo notable en la viabilidad de las células y en las 
características de crecimiento.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
A c t i v a c i ó n m e t a b ó l i c a 
Las células han de exponerse a las sustancias analizadas en presencia 
de un sistema de activación metabólica exógena apropiado. 
El método de uso más frecuente consiste en añadir la fracción pos ­
mitocondrial preparada a partir de hígados de roedores tratados pre ­
viamente con inductores enzimáticos, a la que se añaden cofactores. También puede considerarse oportuno para la activación metabólica el empleo de especies, tejidos, fracciones posmitocondriales o méto ­
dos distintos.
 
Condiciones del ensayo  
C e p a s e x p e r i m e n t a l e s 
La cepa haploide XV 185-14C y la cepa diploide D  7 son las más 
utilizadas en estudios de mutación génica, pero también pueden ser 
apropiadas otras cepas.  
M e d i o s 
Se utilizan medios de cultivo apropiados para la determinación del 
número de supervivientes y mutantes.  
U s o d e t e s t i g o s n e g a t i v o s y p o s i t i v o s 
Se utilizarán testigos positivos no tratados y tratados con disolventes 
de modo simultáneo. Es preciso utilizar sustancias químicas de con ­
trol positivas para cada finalidad de mutación específica.  
C o n c e n t r a c i ó n d e e x p o s i c i ó n 
Se utilizarán, al menos, cinco concentraciones debidamente escalo ­
nadas de la sustancia estudiada. En caso de sustancias tóxicas, la concentración máxima probada no reducirá el índice de superviven ­
cias a menos del 5-10 %. Las sustancias relativamente insolubles en 
agua se estudiarán hasta su límite de solubilidad mediante métodos 
apropiados. En lo que respecta a las sustancias atóxicas claramente hidrosolubles, la concentración más alta se determinará en cada caso.
 
C o n d i c i o n e s d e i n c u b a c i ó n 
Las placas se incuban en la oscuridad, a 28-30  o C, durante 4-7 días.  
F r e c u e n c i a d e m u t a c i ó n e s p o n t á n e a 
Se utilizarán subcultivos cuyas frecuencias de mutaciones espontá ­
neas estén dentro de los límites normales admitidos.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
N ú m e r o d e r e p e t i c i o n e s 
Se utilizarán al menos tres placas por concentración, a fin de deter ­
minar los prototrofos producidos por mutación génica, y para obser ­
var la viabilidad de las células. Si en los experimentos se emplearan marcadores, como hom 3-10, con tasa de mutaciones baja, puede 
aumentarse el número de placas utilizadas para lograr datos estadís ­
ticamente pertinentes.
 
Procedimiento  
Las cepas de  S. cerevisiae  suelen tratarse en el curso de una prueba 
en medio líquido en la que se utilizan células en fase estacionaria o 
de crecimiento. Las experiencias iniciales deberán realizarse sobre células en crecimiento. Se expone a 1-5 × 10
 7 células/ml a la sus ­
tancia objeto de estudio durante un período de hasta 18 horas a 28- 
37 o C, con agitación de la mezcla; durante el tratamiento, se añade 
una cantidad adecuada de un sistema de activación metabólica. Si la primera experiencia da resultados negativos, se procederá a una se ­
gunda, en esta ocasión con células en fase estacionaria; si los resul ­
tados de la primera fueran positivos, se confirmarán en una expe ­
riencia independiente. Al final del tratamiento, las células se centri ­
fugan, lavan y siembran en un medio de cultivo apropiado. Tras la incubación, se examinan las placas para determinar la supervivencia 
y la inducción de mutaciones génicas.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados se presentarán en forma de tablas en las que aparez ­
can el número de colonias contadas, el de mutantes, el índice de supervivencia y la frecuencia de mutantes. Todos los resultados se confirmarán en un experimento independiente. Los resultados se 
evaluarán por métodos estadísticos apropiados.
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— cepa utilizada, — condiciones del ensayo: células en fase estacionaria o de creci ­
miento, composición de los medios, temperatura y duración de la incubación, sistema de activación metabólica, 
— condiciones de tratamiento: niveles de exposición, procedimiento 
y duración del tratamiento, temperatura del tratamiento, controles 
positivos y negativos, 
— número de colonias contadas, número de mutantes, supervivencia 
y frecuencia de mutantes, relación dosis-respuesta si es posible, 
evaluación estadística de los datos, 
— comentario de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  RECOMBINACIÓN MITÓTICA —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIONES 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
En Saccharomyces cerevisiae,  es posible apreciar la recombinación 
mitótica entre los genes (o, más generalmente, entre un gen y su centrómero) y en el interior de ellos. En el primer caso, se habla de  
crossing-over,  generador de intercambios recíprocos, en tanto que, en 
el segundo los intercambios, casi nunca son recíprocos, y se habla de 
conversión génica. El  crossing-over  se determina generalmente por 
la producción de colonias o sectores recesivos homocigotos a partir 
de una cepa heterocigota, mientras que la conversión génica lo es 
mediante la producción de inversores prototróficos en una cepa au ­
xotrofa heteroalélica portadora de dos alelos defectuosos distintos del mismo gen. Las cepas de uso más frecuente para descubrir una 
conversión génica mitótica son D
 4 (heteroalélica para ade 2 y trp 
5), D  7 (heteroalélica para trp 5), BZ  34 (heteroalélica para arg 4) y 
JD1 (heteroalélica para his 4 y trp 5). El  crossing-over  mitótico 
productor de sectores homocigotos de color rojo y rosa se determina 
en D  5 o en D  7 (que también sirve para analizar la conversión génica 
mitótica y la mutación inversa para ilv 1-92), cepas ambas heteroa ­
lélicas complementarias de los alelos ade 2.  
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Se preparan soluciones de las sustancias químicas estudiadas, y de 
los compuestos de control y de referencia, inmediatemente antes del ensayo, con ayuda de un vehículo apropiado. Cuando se trate de compuestos orgánicos no hidrosolubles, los disolventes orgánicos 
como etanol, acetona o dimetilsulfóxido (DMSO), deberán emplearse 
en una concentración no superior al 2 % v/v. La concentración final del vehículo no debe influir de modo notable en la viabilidad de las células ni en las características de crecimiento.
 
A c t i v a c i ó n m e t a b ó l i c a 
Las células han de exponerse a las sustancias analizadas en presencia 
y ausencia de un sistema de activación metabólica exógena apropia ­
do. El método de uso más frecuente consiste en añadir a la fracción 
posmitocondrial preparada a partir de hígados de roedores tratados previamente con inductores enzimáticos, a la que se añaden cofac ­
tores. También puede considerarse oportuno para la activación me ­
tabólica el empleo de especies, tejidos, fracciones posmitocondriales 
o métodos distintos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Condiciones del ensay  
C e p a s e x p e r i m e n t a l e s 
Las cepas que se utilizan con más frecuencia son las diploides D  4 , 
D 5 , D  7 y JD1, pero también pueden considerarse apropiadas otras.  
M e d i o s 
Se utilizan medios de cultivo apropiados para la determinación de la 
supervivencia y de la frecuencia de recombinación mitótica.  
U s o d e t e s t i g o s n e g a t i v o s y p o s i t i v o s 
Se utilizarán testigos positivos no tratados y tratados con disolvente de 
modo simultáneo. Es preciso utilizar sustancias químicas de control 
positivas apropiadas para cada finalidad de recombinación específica.  
C o n c e n t r a c i o n e s d e e x p o s i c i ó n 
Se utilizarán, al menos, cinco concentraciones debidamente escalo ­
nadas de la sustancia estudiada. Entre los factores que deben tenerse en cuenta figuran la citotoxicidad y la solubilidad. La concentración mínima no debe influir en modo alguno en la viabilidad celular. En 
casos de sustancias tóxicas, la concentración máxima probada no 
reducirá el índice de supervivencia a menos del 5-10 %. Las sustan ­
cias relativamente insolubles en agua se estudiarán hasta su límite de solubilidad mediante métodos apropiados. En lo que respecta a las 
sustancias atóxicas claramente hidrosolubles, la concentración más 
alta se determinará en cada caso. 
Las células pueden exponerse a las sustancias estudiadas en la fase 
estacionaria o durante el crecimiento hasta completar períodos de 18 
horas, como máximo. No obstante, si se utilizan períodos de trata ­
miento largos, hay que examinar al microscopio los cultivos por si aparecieran esporas, ya que su presencia invalidaría la prueba.
 
C o n d i c i o n e s d e i n c u b a c i ó n 
Las placas se incuban en la oscuridad, a 28-30  o C, durante cuatro o 
siete días. Las placas que se utilicen para la determinación de los 
sectores homocigotos rojo y rosa producidos por  crossing-over  mi­
tótico se conservarán en frigorífico a ± 4  o C durante uno o dos días 
más antes de la evaluación, a fin de que pueda intensificarse la 
pigmentación de las colonias de interés.  
F r e c u e n c i a d e r e c o m b i n a c i o n e s m i t ó t i c a s e s p o n ­
t á n e a s 
Se utilizarán subcultivos cuyas frecuencias de recombinaciones mi ­
tóticas espontáneas estén dentro de los límites normales admitidos.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
N ú m e r o d e r e p e t i c i o n e s 
Se sembrarán al menos tres placas por concentración para determinar 
tanto la viabilidad como el número de prototrofos producidos por conversión génica mitótica. En caso de determinación de homocigo ­
sis recesiva producida por  crossing-over  mitótico, se aumentará el 
número de placas para obtener un número adecuado de colonias.
 
Procedimiento  
Las cepas de  S. cerevisiae  suelen tratarse en el curso de una prueba 
en medio líquido en la que se utilizan células en fase estacionaria o 
de crecimiento. Las experiencias iniciales deberán realizarse sobre células en crecimiento. Se expone 1-5 × 10
 7 células/ml a la sustancia 
objeto de estudio durante un período de hasta 18 horas a 28-37  o C, 
con agitación de la mezcla; durante el tratamiento, se añade, si 
procede, una cantidad adecuada de un sistema de activación meta ­
bólica. 
Al final del tratamiento, las células se centrifugan, lavan y siembran 
en un medio de cultivo apropiado. Tras la incubación se examinan las placas para determinar la supervivencia y la inducción de recom ­
binación mitótica. 
Si la primera experiencia da resultados negativos, se procederá a una 
segunda, en esta ocasión con células en fase estacionaria; si los resultados de la primera fueran positivos, se confirmarán en una experiencia independiente.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados se presentarán en forma de tablas en las que aparez ­
can el número de colonias contadas, el de recombinantes, el índice de supervivencia y la frecuencia de recombinantes. 
Los resultados se confirmarán en un experimento independiente. 
Los resultados se evaluarán por métodos estadísticos apropiados.
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— cepa utilizada, — condiciones del ensayo: células en fase estacionaria o de creci ­
miento, composición de los medios, temperatura y duración de la 
incubación, sistema de activación metabólica, 
— condiciones del tratamiento: niveles de exposición, procedimiento 
y duración del tratamiento, temperatura del tratamiento; controles 
positivos y negativos, 
— número de colonias contadas, número de recombinantes, super ­
vivencia y frecuencia de recombinación, relación dosis-respuesta si es posible, evaluación estadística de los datos, 
— comentario de los resultados, 
— interpretación de los resultados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENICIDAD — ENSAYO DE MUTACIÓN GÉNICA DE 
CÉLULAS DE MAMÍFERO  IN VITRO  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices del documento OCDE 
TG 476 sobre el ensayo de mutación génica de células de mamífero  
in vitro  (1997).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El ensayo de mutación génica de células de mamífero  in vitro  puede 
realizarse para detectar mutaciones géni-cas inducidas por sustancias 
químicas. Entre las líneas celulares adecuadas para el ensayo se encuentran las células de linfoma de ratón L5178Y, las líneas celu ­
lares CHO, CHO-AS52 y V79 del hámster chino y las células linfo ­
blastoides humanas TK6 (1). En dichas líneas celulares, los paráme ­
tros genéticos más empleados revelan una mutación en los loci de la timidinquinasa (TK) y la hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HPRT), y en un transgen de la xantina guanina fosforibosiltrans ­
ferasa (XPRT). Los ensayos de mutación TK, HPRT y XPRT de ­
tectan diversos espectros de fenómenos genéticos. La localización autosómica de TK y XPRT permite poner de manifiesto fenómenos genéticos (por ejemplo, deleciones importantes) que no se detectan 
en el locus HPRT de los cromosomas X (2) (3) (4) (5) (6). 
En este ensayo pueden emplearse cultivos de líneas celulares esta ­
blecidas o estirpes celulares. Las células deben seleccionarse sobre la 
base de su capacidad de crecimiento en cultivo y la estabilidad de la 
frecuencia de mutaciones espontáneas. 
En los ensayos  in vitro  suele ser necesario emplear un sistema de 
activación metabólica exógena, si bien este no puede reproducir 
todas las condiciones que se dan  in vivo  en los mamíferos. Deben 
evitarse las circunstancias que puedan conducir a resultados que no reflejen la mutagenicidad intrínseca. Los resultados positivos que no reflejan la mutagenicidad intrínseca pueden deberse a cambios en el 
pH, la osmolalidad o altos grados de citotoxicidad (7). 
El ensayo se emplea para detectar las posibles sustancias mutágenas 
o carcinógenas para los mamíferos. Pese a que muchos de los com ­
puestos que dan un resultado positivo en este ensayo con carcinó ­
genos para los mamíferos, no hay una correlación absoluta entre los resultados del mismo y la carcinogenicidad. La correlación depende de la clase química. Además de ello, cada vez hay más pruebas de 
que existen carcinógenos que el ensayo no detecta, pues, al parecer, 
estos actúan por mecanismos no genotóxicos o mecanismos ausentes en las células bacterianas (6). 
Véase asimismo la introducción general de la parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Mutación directa:  mutación génica del tipo parental a la condición 
mutante, que da lugar a una alteración o pérdida de la actividad enzimática o la función de la proteína codificada.  
Mutágenos que provocan la sustitución de un par de bases:  
sustancias que provocan la sustitución de uno o varios pares de bases en el ADN.  
Mutágenos que desplazan el marco de lectura:  sustancias que 
provocan la adición o deleción de uno o más pares de bases en la 
molécula de ADN.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Período de expresión fenotípica:  tiempo que tardan en desaparecer 
los productos génicos inalterados de las células mutadas reciente ­
mente.  
Frecuencia de mutantes:  número de células mutantes dividido por 
el número de células viables.  
Crecimiento total relativo:  aumento del número de células en el 
tiempo respecto a una población celular de control; es el producto del crecimiento en suspensión respecto al control negativo por la eficacia de clonado respecto al control negativo.  
Crecimiento en suspensión relativo:  aumento del número de célu ­
las durante el período de expresión respecto al control negativo.  
Viabilidad:  eficacia de clonado de las células tratadas en el mo ­
mento de la siembra en condiciones selectivas tras el período de 
expresión.  
Supervivencia:  eficacia de clonado de las células tratadas cuando se 
siembran al final del período de tratamiento; suele expresarse res ­
pecto a la supervivencia de la población celular de control.
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Las células deficientes en timidinquinasa (TK) a causa de la muta ­
ción TK  +/- → TK  -/- son resistentes a los efectos citotóxicos de la 
trifluorotimidina (TFT), análogo de la pirimidina. Las células capaces de producir timidinquinasa son sensibles a la TFT, que inhibe el 
metabolismo y detiene la división celular. Así pues, las células imi ­
tantes son capaces de proliferar en presencia de TFT, mientras que las células normales, que contienen timidinquinasa, no lo son. Del mismo modo, las células deficientes en HPRT o XPRT se seleccio ­
nan por su resistencia a la 6-tioguanina (TG) o la 8-azaguanina 
(AG). Si en los ensayos de mutación génica en células de mamífero se utiliza una sustancia de ensayo análoga a una base o un com ­
puesto afín al agente selectivo, deben considerarse detenidamente sus 
propiedades, por ejemplo, cuando se sospeche que la sustancia de 
ensayo presenta toxicidad selectiva en las células mutantes y no mutantes. Así pues, habrá que confirmar la eficacia del sistema o agente de selección cuando se estudien sustancias de estructura afín a 
la del agente selectivo (8). 
Se exponen las células en suspensión o el cultivo en monocapa a la 
sustancia de ensayo, con y sin activación metabólica, durante un período apropiado. Se realiza un subcultivo para determinar la cito ­
toxicidad y dejar que se exprese el fenotipo antes de la selección de 
los mutantes (9) (10) (11) (12) (13). La citotoxicidad suele determi ­
narse midiendo la eficacia relativa de clonado (supervivencia) o el crecimiento total relativo de los cultivos tras el período de tratamien ­
to. Los cultivos tratados se mantienen en un medio de crecimiento 
durante un período de tiempo suficiente y específico para cada locus y tipo celular seleccionado, de manera que la expresión fenotípica de las mutaciones inducidas sea casi óptima. La frecuencia de mutantes 
se determina sembrando un número conocido de células en un medio 
con agente selectivo y en otro medio sin dicho agente para determi ­
nar la eficacia de clonado (viabilidad). Tras un período de incuba ­
ción adecuado, se cuentan las colonias. Se compara el número de 
colonias mutantes en el medio selectivo y en el no selectivo para 
hallar la frecuencia de mutantes.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación  
1.4.1.1.  Células  
Entre los diversos tipos de células apropiados para este ensayo se 
encuentran las de los subclones de L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 
y TK6. Deben emplearse tipos de células que presenten una sensi ­
bilidad probada a los mutágenos químicos, una elevada eficacia de clonado y una frecuencia estable de mutaciones espontáneas. Se 
comprobará la ausencia de contaminación por micoplasma. Se dese ­
charán las células contaminadas. 
El ensayo debe estar diseñado de manera que su sensibilidad y 
potencia estén predeterminadas. El número de células, cultivos y concentraciones de la sustancia de ensayo ha de reflejar dichos pa ­
rámetros previamente definidos (14). En cada fase del ensayo, el 
número mínimo de células viables que sobrevivan al tratamiento deberá estar basado en la frecuencia de mutación espontánea. Por lo general, se emplea una cantidad de células al menos igual a diez 
veces el inverso de dicha frecuencia. Se recomienda, no obstante, 
utilizar un mínimo de 10
 6 células. Para cerciorarse de que el ensayo 
proporciona resultados coherentes deberá disponerse de datos de controles históricos adecuados sobre el sistema celular utilizado.
 
1.4.1.2.  Medios y condiciones de cultivo  
Deben utilizarse medios de cultivo y condiciones de incubación 
apropiados (recipientes de cultivo, temperatura, concentración de 
CO 2 y humedad). Los medios han de elegirse con arreglo a los 
sistemas selectivos y los tipos celulares empleados en el ensayo. Es especialmente importante aplicar condiciones de cultivo que fa ­
vorezcan un crecimiento celular óptimo durante el período de expre ­
sión y la capacidad de las células, mutantes y no mutantes, de formar colonias.
 
1.4.1.3.  Preparación de los cultivos  
Se multiplican células de cultivos madre, se siembran en el medio de 
cultivo y se incuban a 37  o C. Antes de usar los cultivos en el ensayo, 
puede ser necesario lavarlos de las células mutantes que contengan.  
1.4.1.4.  Activación metabólica  
Las células deben exponerse a la sustancia de ensayo en presencia y en 
ausencia de un sistema adecuado de activación metabólica. El sistema más comúnmente empleado es una fracción postmitocondrial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene de hígados de roedores 
tratados con inductores enzimáticos como el Aroclor 1254 (15) (16) 
(17) (19) o una mezcla de fenobarbital y  β-naftoflavona (19) (20). 
La fracción postmitocondrial suele emplearse en concentraciones que 
varían del 1 al 10 % v/v en el medio de ensayo final. La elección y condición de un sistema de activación metabólica puede depender de la clase química de la sustancia estudiada. En algunos casos puede 
ser oportuno utilizar varias concentraciones distintas de fracción pos ­
tmitocondrial.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Son varias las técnicas —como la producción mediante ingeniería 
genética de líneas celulares que expresen enzimas activadoras espe ­
cíficas— que pueden proporcionar el potencial de activación endó ­
gena. La elección de las líneas celulares debe justificarse científica ­
mente (por ejemplo, por la importancia de la isoenzima del cito ­
cromo P450 para el metabolismo de la sustancia de ensayo, etc.).  
1.4.1.5.  Preparación de la sustancia de ensayo  
Las sustancias de ensayo sólidas deben disolverse o suspenderse en 
disolventes o vehículos adecuados y, si es preciso, diluirse antes de tratar las células. Las sustancias de ensayo líquidas pueden añadirse 
directamente al sistema de ensayo y/o diluirse antes del tratamiento. 
Han de emplearse soluciones de la sustancia de ensayo recién pre ­
paradas, salvo que los datos relativos a la estabilidad demuestren que es posible conservarlas.
 
1.4.2.  Condiciones del ensayo  
1.4.2.1.  Disolvente o vehículo  
Es preciso cerciorarse de que el disolvente o vehículo no produce 
reacciones químicas con la sustancia de ensayo y es compatible con la supervivencia de las células y la actividad de S9. Si se emplean 
disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de infor ­
mación que avale dicha compatibilidad. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disol ­
vente o vehículo acuoso. Cuando se estudien sustancias inestables 
en presencia de agua, deberán emplearse disolventes orgánicos que 
no contengan agua. Esta podrá eliminarse añadiendo un tamiz mo ­
lecular.
 
1.4.2.2.  Concentraciones de exposición  
Para determinar la concentración máxima de exposición deben con ­
siderarse al menos los siguientes criterios: citotoxicidad, solubilidad 
en el sistema de ensayo y variaciones del pH o la osmolalidad. 
La citotoxicidad se determinará con y sin activación metabólica en el 
experimento principal mediante un indicador adecuado de la integri ­
dad y el crecimiento celular, como la eficacia de clonado relativa 
(supervivencia) o el crecimiento total relativo. Puede ser útil deter ­
minar la citotoxicidad y la solubilidad en un experimento preliminar. 
Se emplearán al menos cuatro concentraciones analizables. Si se 
produce citotoxicidad, la gama de concentraciones deberá abarcar 
desde la toxicidad máxima hasta una toxicidad escasa o nula, lo cual suele significar que la separación entre concentraciones corres ­
ponde a un factor comprendido entre 1 y √10. En el caso de sus ­
tancias escasamente citotóxicas, la concentración máxima de ensayo 
será la menor de estas tres: 5 mg/ml, 5 μl/ml o 0,01 M.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Las sutancias escasamente solubles deben ensayarse hasta concen ­
traciones iguales o superiores al límite de solubilidad en las condi ­
ciones de cultivo. Ha de ponerse de manifiesto la insolubilidad en el medio de tratamiento final al que se exponen las células. Puede ser útil determinar la solubilidad al principio y al final de tratamiento, 
pues esta puede variar durante la exposición en el sistema de ensayo 
debido a la presencia de células, S9, suero, etc. La insolubilidad puede detectarse por simple observación. El precipitado no debe interferir en la evaluación del resultado.
 
1.4.2.3.  Controles  
En todos los experimentos deberán realizarse controles positivos y 
negativos (disolvente o vehículo) en paralelo, con y sin activación 
metabólica. Cuando se aplique esta, la sustancia del control positivo ha de requerir activación para provocar una respuesta mutagénica. 
A continuación figuran algunos ejemplos de sustancias para el con ­
trol positivo:
 
Activación metabó ­
lica Locus Sustancia N° CAS N° EINECS  
Ausencia de acti ­
vación metabólica 
exógena HPRT Metanosulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 
Etil-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 
TK (colonias 
grandes y 
pequeñas) Metanosulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0 
XPRT Metanosulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 
Etil-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Presencia de acti ­
vación metabólica 
exógena HPRT 3-metilcolantreno 56-49-5 200-276-4 
N-nitrosodimetilamina 62-75-9 200-549-8 
7,12-Dimetilbenzoantraceno 57-97-6 200-359-5 
TK (colonias 
grandes y 
pequeñas) Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 
Monohidrato de ciclofosfamida 6055-19-2 
Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 
3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-nitrosodimetilamina (para gran ­
des cantidades de S9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 
Pueden utilizarse otras sustancias de referencia adecuadas para el 
control positivo, por ejemplo, la 5-bromo 2'-desoxiuridina (n° CAS 59-14-3, n° EINECS 200-415-9), si el laboratorio dispone de una 
base de datos al respecto. Deberá considerarse la utilización en dicho 
control de sustancias de clases químicas afines, cuando sea posible.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Se realizarán controles negativos únicamente con el disolvente o 
vehículo en el medio de tratamiento, y se tratarán de igual manera 
que los lotes tratados. Se prepararán asimismo controles sin tratar, salvo que exista información de controles históricos que demuestre que el disolvente elegido no induce efectos nocivos ni mutágenos.
 
1.4.3.  Procedimiento  
1.4.3.1.  Tratamiento con la sustancia de ensayo  
Las células en crecimiento se tratan con la sustancia de ensayo, en 
presencia y en ausencia de un sistema de activación metabólica. La duración de la exposición ha de ser suficiente (de 3 a 6 horas suelen bastar) y puede ampliarse hasta uno o varios ciclos celulares. 
Pueden realizarse uno o dos cultivos con cada concentración de la 
sustancia de ensayo. En el caso de realizarse uno solo, se aumentará el número de concentraciones con el fin de disponer de suficientes cultivos para el análisis (por ejemplo, un mínimo de ocho concen ­
traciones analizables). Deben realizarse dos cultivos para el control 
negativo (disolvente). 
Las sustancias gaseosas o volátiles han de evaluarse con métodos ade ­
cuados, tales como recipientes de cultivo herméticos, etc. (21) (22).
 
1.4.3.2.  Determinación de la supervivencia, la viabilidad y la frecuencia de 
mutantes  
Al término del período de exposición se lavan las células y se 
cultivan para determinar la supervivencia y dejar que se exprese el fenotipo mutante. La evaluación de la citotoxicidad suele empezarse después del período de tratamiento, determinando la eficacia de clo ­
nado relativa (supervivencia) o el crecimiento total relativo de los 
cultivos. 
Cada locus necesita un tiempo mínimo determinado para que la 
expresión fenotípica de las mutaciones inducidas recientemente sea 
casi óptima (un mínimo de seis a ocho días en el caso de HPRT y 
XPRT y de dos días en el de TK). Las células se cultivan con y sin agente o agentes selectivos para determinar el número de mutantes y la eficacia de clonado, respectivamente. La viabilidad, que sirve para 
calcular la frecuencia de mutantes, empieza a determinarse al final 
del período de expresión colocando los cultivos en un medio no selectivo. 
Si la sustancia de ensayo da un resultado positivo en el ensayo con 
L5178Y TK
 +/- , deben medirse las colonias al menos en uno de los 
cultivos de ensayo (el de la concentración que dé resultados más 
positivos) y en los controles positivos y negativos. Si la sustancia de ensayo da un resultado negativo en el ensayo con L5178Y TK
 +/- , 
deben medirse las colonias en los controles positivos y negativos. 
También pueden medirse las colonias en los estudios realizados con 
TK6TK  +/- . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Los datos deben incluir la determinación de la citotoxicidad y la 
viabilidad, los recuentos de colonias y la frecuencia de mutantes 
en los cultivos tratados y en los controles. Si el resultado del ensayo 
con L5178Y TK  +/- es positivo, las colonias se cuentan distinguiendo 
las grandes de las pequeñas al menos en un cultivo tratado (con la concentración de sustancia de ensayo que dé los resultados más 
positivos) y en los controles positivos y negativos. Debe estudiarse 
detenidamente la naturaleza molecular y citogenética tanto de las colonias grandes como de las pequeñas (23) (24). En el ensayo 
TK
 +/- , las colonias se cuentan distinguiendo las de crecimiento nor ­
mal (grandes) de las de crecimiento lento (pequeñas) (25). Las cé ­
lulas mutantes que han sufrido las lesiones genéticas más importan ­
tes requieren un tiempo de duplicación mayor, de manera que for ­
man colonias pequeñas. Dichas lesiones suelen variar desde la pér ­
dida de un gen entero hasta las aberraciones cromo-sómicas visibles en el cariotipo. La inducción de pequeñas colonias mutantes se ha asociado a sustancias que provocan aberraciones cromosómicas im ­
portantes (26). Las células mutantes menos afectadas crecen a una 
velocidad similar a la de las células parentales y forman colonias grandes. 
Debe proporcionarse el índice de supervivencia (eficacia de clonado 
relativa) o el crecimiento total relativo. La frecuencia de mutantes se expresa como el número de células mutantes respecto al número de 
células supervivientes. 
Se proporcionarán los datos relativos a cada cultivo y se resumirán 
en forma de tabla. 
No será preciso comprobar los resultados positivos claros, si bien los 
resultados dudosos deberán aclararse mediante más ensayos en los que convendría modificar las condiciones experimentales. Es preciso confirmar los resultados negativos caso por caso. Los casos en que 
dicha confirmación no se considere necesaria deberán justificarse 
debidamente. En los experimentos complementarios de aquellos que hayan dado resultados dudosos o negativos, se considerará la posibilidad de modificar los parámetros del estudio para ampliar la 
gama de condiciones analizadas. Entre los parámetros modificables 
se encuentran la separación entre concentraciones y las condiciones de activación metabólica.
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Son varios los criterios para determinar si un resultado es positivo 
(aumento relacionado con la concentración o aumento reproducible 
de la frecuencia de mutantes, etc.). Debe considerarse en primer 
lugar la importancia bilógica de los resultados. Pueden emplearse métodos estadísticos como apoyo para evaluar los resultados del ensayo. El hecho de que los datos estadísticos sean significativos 
no ha de ser el único factor para determinar que una respuesta es 
positiva. 
No se considerarán mutágenas en el sistema en cuestión las sutancias 
que den lugar a resultados que no se ajusten a los criterios anteriores.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados eran clara ­
mente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos 
no permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia de ensayo. Con independencia del número de veces que se repita el experimento, los resultados pueden seguir siendo ambi ­
guos o dudosos. 
Un resultado positivo en el ensayo de mutación génica de células de 
mamífero  in vitro  indica que la sustancia de ensayo provoca muta ­
ciones génicas en los cultivos de células de mamífero utilizadas. El elemento más significativo es la relación dosis-respuesta positiva y 
reproducible. Un resultado negativo indica que, en las condiciones 
del ensayo, la sustancia de ensayo no provoca mutaciones génicas en los cultivos de células de mamífero utilizadas.
 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la información siguiente: 
Disolvente o vehículo: — motivación de la elección del vehículo o disolvente, — solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disol ­
vente o vehículo, si se conocen. 
Células: — tipo y procedencia, — número de cultivos celulares, — número de pases celulares, si procede, — métodos de mantenimiento del cultivo celular, si procede, — ausencia de micoplasma. Condiciones del ensayo: — fundamento de la selección de las concentraciones y del número 
de cultivos (datos relativos a la citotoxicidad, límites de solubi ­
lidad, si se conocen, etc.), 
— composición del medio y concentración de CO
 2 , 
— concentración de la sustancia de ensayo, — volumen de vehículo y de sustancia de ensayo añadida, — temperatura de incubación, — tiempo de incubación, — duración del tratamiento, — densidad celular durante el tratamiento, — tipo y composición del sistema de activación metabólica, inclui ­
dos los criterios de aceptabilidad, 
— controles positivos y negativos,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— duración del período de expresión (con el número de células 
sembradas, subcultivos y pautas de nutrición, si procede), 
— agentes selectivos, — criterios empleados para considerar que los resultados de los 
estudios son positivos, negativos o ambiguos, 
— métodos empleados para contar las células viables y las mutantes, — definición del tamaño  y el tipo de las colonias consideradas 
(incluidos, en su caso, los criterios de distinción de colonias 
«grandes» y «pequeñas»). 
Resultados: — signos de toxicidad, 
— signos de precipitación, 
— datos sobre el pH y la osmolalidad durante la exposición a la 
sustancia de ensayo, si se han determinado, 
— tamaño de las colonias contadas, al menos en los controles po ­
sitivos y negativos, 
— capacidad del laboratorio para detectar mutantes en colonias pe ­
queñas con el sistema L5178Y TK
 +/- , en su caso, 
— relación dosis-respuesta, cuando sea posible, — análisis estadísticos, si se han realizado, — datos de los controles negativos (disolvente/vehículo) y positivos 
realizados en paralelo, 
— datos sobre controles históricos negativos (disolvente/vehículo) y 
positivos, intervalos, medias y desviaciones estándar, 
— frecuencia de mutantes. Discusión de los resultados. 
Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, 
K. R. (eds.) (1987),  Banbury Report 28: Mam-malian Cell 
Mutagenesis,  Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 
(2) Chu, E, H. Y. and Mailing, H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells  In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  
61, pp. 1306-1312. 
(3) Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts,  
Mulation Res., 94,  pp. 467-485. 
(4) Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and 
Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quanti-tation 
at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loct,  
Mulagenesis, 4,  pp. 394-403.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C. S. and Stankowski, Jr. L. F. (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of 
Six Drug Candidates,  Mutation Res., 223,  pp. 121-128. 
(6) Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, 
Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Re ­
port. Report of the International Workshop on Standardisation 
of Genotoxicity Test Procedures. Mutation  Res.,  312, pp. 235- 
239. 
(7) Scott. D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation Res., 257,  pp. 147-204. 
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Ma ­
vournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y 
Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protec ­
tion Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225- 251. 
(9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. 
(1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/ 
Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to 
Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environment Protection Agency Gene- Tox Program, Mutation  Res., 196,  pp. 17-36. 
(10) Li, A, P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., O'Neill, J. R, Riddle, J. C, Stankowski, L. 
F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of 
the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phos ­
phoribosyl Transferase Gene Mutation Assay,  Mutation Res., 
189, pp. 135-141. 
(11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Com ­
parison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus,  Mutation Res., 216,  pp. 9-17. 
(12) Stankowski. L. F. Jr., Tindall. K. R. and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate — and ICR 191-lnduced Molecular Analyses of Ethyl 
Methanosulphonate — and ICR 191-induced Mutation in 
AS52 Cells,  Mutation Res.,  160, pp. 133.147. 
(13) Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedures 
for the L5178Y/TK
 +/- — TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al. (eds.)  Handbook of 
Mutagenichy Test Procedures,  Elsevier Science Publishers, 
New York, pp. 239-268. 
(14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Creen, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), Mamma ­
lian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Forma ­
tion, in:  Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data.  Kirk­
land D. J., ed., Cambridge University Press, pp. 66-101. 
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, C, Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine,  Mutation 
Res., 46,  pp. 365-373. 
(16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  31, 
pp. 347-364.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. R S., Batson, A. G. and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of 
the L5178Y/TK  +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System,  
Mutat Res., 59,  pp. 61-108. 
(18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res., 113,  pp. 
173-215. 
(19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcome, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-lnduced S9 in  In Vitro  Genoto­
xicity Assays,  Mutagenesis, 7,  pp. 175-177. 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, in In Vitro  Me­
labolic Activation in Mutagenesis Testing,  de Serres, F. J., 
Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot. R. M. (eds.) Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. 
(21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids, In: Tice, R. R., Costa, D. L, Schaich, K. M. (eds.),  
Genotoxic Effects of Airborne Agenta,  New York, Plenum, pp. 
91-103. 
(22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in 
the CHO/HGPRT Mutation Assay,  Environmental Mutagene ­
sis, 5, pp. 795-801. 
(23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. 
and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at 
the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse 
Lymphoma Cells, Proc. Natl.  Acad. Sci, USA, 87,  pp. 51-55. 
(24) Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C. Howard, B. L., 
Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFT) and Mutants of L51 78Y/TK
 +/- Mouse Lymphoma Cells,  Mutation Res.  151, pp. 
161-174. 
(25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells,  Mutation Res., 229,  pp. 
89-102. 
(26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient 
Mutant Frequency in L5178Y/TK
 +/- — 3.7.2C Mouse 
Lymphoma Cells,  Mutagenesis  5, pp. 609-614.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  LESIÓN Y REPARACIÓN DE DNA — SÍNTESIS DE DNA NO 
PROGRAMADA — CÉLULAS DE MAMÍFEROS  IN VITRO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
El ensayo de síntesis no programada de DNA (UDS) mide la síntesis 
de reparación del DNA tras escisión y eliminación de un fragmento 
de DNA que contiene la región lesionada por agentes químicos y 
físicos. Se basa en la incorporación de timidina tritiada (  3 H-TdR) al 
DNA de células de mamífero que no se encuentren en la fase S del 
ciclo celular. Es posible determinar la captación de  3 H-TdR mediante 
el examen del DNA procedente de células tratadas por autorradio ­
grafía o recuento en centelleo líquido (LSC): Las células de mamí ­
fero en cultivo, salvo si se utilizan hepatocitos primarios de rata, se 
tratan con la sustancia objeto de estudio con un sistema de activación 
metabólica exógeno y sin él. También es posible determinar la UDS por métodos  in vivo.
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Las sustancias químicas analizadas y las de control o referencia se 
prepararán en un medio de crecimiento, o se disolverán o suspende ­
rán en vehículos apropiados, para diluirse luego aún más en un medio de cultivo antes de utilizarse en el ensayo. La concentración 
final del vehículo no debe influir en la viabilidad celular. 
Pueden utilizarse para este ensayo cultivos primarios de hepatocitos 
de rata, linfocitos humanos o líneas celulares establecidas (por ejem ­
plo, fibroblastos humanos diploides). 
Las células se expondrán a la sustancia química estudiada en pre ­
sencia y ausencia de un sistema de activación metabólica apropiado.
 
Condiciones del ensayo  
N ú m e r o d e c u l t i v o s 
Son necesarios, para cada punto experimental, al menos dos cultivos 
celulares para la autorradiografía y seis (o menos, si está justificado 
científicamente) para el recuento en centelleo líquido.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
U s o d e t e s t i g o s n e g a t i v o s y p o s i t i v o s 
Se incluirán en cada experimento controles positivos y negativos (no 
tratados, con vehículo o ambos) simultáneos, con activación meta ­
bólica y sin ella. 
Son ejemplos de controles positivos para la prueba con hepatocitos 
de ratas el 7,12-dimetilbenzantraceno (7,12-DMBA) o el 2-acetila ­
minfluoreno (2-AAF). En el caso de líneas celulares establecidas, el 4-NQO (4-nitriquinolina-N-óxido) es un ejemplo de control positivo 
para los ensayos por autorradiografía y LSC realizados sin activación 
metabólica; cuando se emplean sistemas de activación metabólica, un ejemplo de compuesto de control positivo sería la N-dimetilnitrosa ­
mina.
 
C o n c e n t r a c i o n e s d e e x p o s i c i ó n 
Se utilizará una gama de concentraciones de la sustancia estudiada 
que permita determinar la respuesta de modo óptimo. La concentra ­
ción máxima debe producir ciertos efectos citotóxicos. Los compues ­
tos relativamente insolubles en agua se estudiarán hasta el límite de 
solubilidad. En lo que respecta a las sustancias atóxicas claramente 
hidrosolubles, la concentración más alta se determinará en cada caso.  
C é l u l a s 
Para mantener los cultivos, se utilizarán medios de crecimiento, 
concentraciones de CO  2 y temperatura y humedad apropiados. Las 
líneas celulares establecidas se examinarán periódicamente para com ­
probar si existe contaminación por mycoptasma.  
A c t i v a c i ó n m e t a b ó l i c a 
En los cultivos primarios de hepatocitos no se utiliza ningún sistema 
de activación metabólica. Por su parte, las líneas celulares estableci ­
das y los linfocitos se exponen a la sustancia estudiada en presencia 
y ausencia de un sistema de activación metabólica apropiado.  
Procedimiento  
P r e p a r a c i ó n d e l o s c u l t i v o s 
Líneas celulares establecidas, derivadas de cultivos madre (por ejem ­
plo, por tripainización o agitación) se siembran con la densidad 
adecuada en recipientes de cultivo y se incuban a 37  o C. 
Se establecen cultivos a corto plazo de hepatocitos de rata permi ­
tiendo a hepatocitos recién disociados en un medio apropiado fijarse a la superficie de crecimiento. 
Los cultivos de linfocitos humanos se establecen por medio de téc ­
nicas apropiadas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
T r a t a m i e n t o d e l o s c u l t i v o s c o n l a s u s t a n c i a e s ­
t u d i a d a  
Hepatocitos primarios de rata 
Los hepatocitos de ratas recién aisladas se tratan con la sustancia 
estudiada, en un medio que contenga  3 H-TdR, durante un período de 
tiempo apropiado. Al final de este, se eliminará el medio, y se 
aclararán, fijarán y secarán las células. Las preparaciones se sumer ­
gen en una emulsión autorradiográfica (también cabe utilizar película fotográfica), se exponen, se revelan, se tiñen y se cuentan.
 
Líneas celulares establecidas y linfocitos  
Técnicas autorradiográficas:  Los cultivos celulares se exponen a la 
sustancia estudiada durante períodos de tiempo adecuados, y se tra ­
tan después con  3 H-TdR. El plazo de exposición dependerá de la 
naturaleza de la sustancia, de la actividad del sistema metabólico y del tipo de células. Para apreciar el pico de UDS, se añadirá
 3 H-TdR 
al mismo tiempo que la sustancia analizada o en los pocos minutos 
posteriores a su exposición. La elección de una u otra de estas 
técnicas vendrá determinada por posibles interacciones entre la sus ­
tancia y la  3 H-TdR. Para distinguir esta última se utiliza, por ejem ­
plo, un medio deficitario en arginina, un contenido de suero bajo o la 
adición de hidroxiurea al medio de cultivo.  
Determinaciones de la UDS por LSC:  Antes de proceder al trata ­
miento con la sustancia objeto de estudio, se bloqueará la entrada de 
las células en la fase S del modo antes indicado; a continuación, se 
expone a las células a la sustancia tal como se describe para la autorradiografía. Al final del período de incubación, se extrae el DNA de las células y se determinan el contenido total de DNA y 
el grado de incorporación de
 3 H-TdR. 
Hay que señalar que cuando se utilicen linfocitos humanos en las 
técnicas expuestas no es necesario suprimir la replicación semicon ­
servadora de DNA en cultivos no estimulados.  
Análisis  
D e t e r m i n a c i o n e s a u t o r r a d i o g r á f i c a s  
Para determinar la UDS en células en cultivo, no se cuentan los 
núcleos en fase S. Se contarán por lo menos 50 células por concen ­
tración. Las preparaciones recibirán un código antes del recuento. Se 
contarán en cada una de ellas varios campos, elegidos al azar y lo bastante alejados entre sí. Se determinará la cantidad de
 3 H-TdR 
incorporada al citoplasma mediante el recuento de tres superficies 
del tamaño del núcleo en el citoplasma de cada célula contada.  
D e t e r m i n a c i ó n p o r L S C 
En las determinaciones de la UDS por LSC debe utilizarse un nú ­
mero adecuado de cultivos para cada concentración y en los con ­
troles.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Todos los resultados se confirmarán en un experimento independiente.  
2. RESULTADOS  
Los resultados se presentarán en forma de tablas.  
2.1. DETERMINACIONES AUTORRADIOGRÁFICAS 
Se registrarán por separado la cantidad de  3 H-TdR incorporada al cito ­
plasma y el número de granos encontrados sobre el núcleo celular. 
Pueden utilizarse la media, la mediana y el modo para describir la 
distribución de la cantidad de  3 H-TdR incorporada en el citoplasma, 
así como el número de granos por núcleo.  
2.2. DETERMINACIONES POR LSC 
Para las determinaciones por LSC, se indicará la incorporación de  
3 H-TdR en forma de dpm/ μg de DNA. Puede utilizarse la media de 
dmp/μg de DNA, con su desviación estándar, para describir la dis ­
tribución de la incorporación. 
Los datos se evaluarán por métodos estadísticos apropiados.  
3. INFORME  
3.1. DATOS EL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— células utilizadas, densidad y número de pases en el momento del 
tratamiento, número de cultivos celulares, 
— métodos utilizados para el mantenimiento de los cultivos celula ­
res, incluidos medio, temperatura y concentración de CO  2 , 
— sustancia estudiada, vehículo, concentraciones y justificación de 
la elección de las concentraciones empleadas en el ensayo, 
— detalles sobre los sistemas de activación metabólica, — programa de tratamiento, — controles positivos y negativos, 
— técnica autorradiográfica utilizada, 
— métodos empleados para bloquear la entrada de las células en la 
fase S, 
— técnicas utilizadas para extraer el DNA y determinar la cantidad 
total de DNA en la determinación por LSC, 
— relación dosis-respuesta, si es posible, — evaluación estadística, 
— comentario de los resultados, 
— interpretación de los resultados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  ENSAYO  IN VITRO  DE INTERCAMBIO DE CROMÁTIDAS 
HERMANAS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
El ensayo de intercambio de cromátidas hermanas (SCE) es una 
prueba a corto plazo encaminada a descubrir intercambios recíprocos 
de DNA entre 2 cromátidas hermanas de un cromosoma de desdo ­
blamiento. Los SCE representan el intercambio recíproco de produc ­
tos de replicación del DNA en loci aparentemente homólogos. Es probable que el proceso de intercambio comprenda la rotura y la 
reunión del DNA, aunque se sabe poco sobre su base molecular. 
Para descubrir los SCE, es necesario poder marcar de forma diferente las cromátidas hermanas, cosa que se consigue mediante la incorpo ­
ración de bromodesoxiuridina (BrdU) al DNA cromosómico durante 
dos ciclos celulares. 
Se exponen células de mamífero  in vitro  a la sustancia objeto de 
estudio en presencia y ausencia de un sistema de activación meta ­
bólica exógena de mamífero, si procede, y se cultivan durante dos ciclos de replicación en un medio que contenga BrdU. Después del tratamiento con un inhibidor del huso (por ejemplo, colchicina) para 
acumular las células en fase de mitosis de tipo metafásico (c-meta ­
fase), se recolectan las células y se realizan preparaciones de cromo ­
somas.
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
— Pueden utilizarse en el ensayo cultivos primarios (linfocitos hu ­
manos) o líneas celulares establecidas (por ejemplo, células ová ­
ricas de hámster chino). Las líneas celulares se controlarán en busca de una posible contaminación por mycoplasma. 
— Se utilizarán medios de cultivo y condiciones de incubación (por 
ejemplo, temperatura, recipientes de cultivo, concentración de 
CO
 2 y humedad) adecuados. 
— Las sustancias estudiadas pueden prepararse en medios de culti ­
vo, o disolverse o suspenderse en vehículos apropiados, antes del 
tratamiento de las células. La concentración final de un vehículo en el sistema de cultivo no debe influir de modo notable en la viabilidad ni en el índice de crecimiento de las células, y los 
efectos sobre la frecuencia de SCE se controlarán con ayuda de 
un control del disolvente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Las células se expondrán a la sustancia estudiada en presencia y 
ausencia de un sistema de activación metabólica exógeno de 
mamífero. Por otro lado, cuando se utilicen tipos de células con actividad metabólica intrínseca, el grado y la naturaleza de la actividad deben ser apropiados para la clase química objeto de 
estudio.
 
Condiciones del ensayo  
N ú m e r o d e c u l t i v o s 
Para cada ensayo, se utilizarán dos cultivos separados, por lo menos.  
U s o d e c o n t r o l e s p o s i t i v o s y n e g a t i v o s 
Deben incluirse en cada experimento controles positivos en los que 
se utilicen una sustancia con acción directa y otra que precisa activación metabólica; también ha de utilizarse un control para 
el vehículo. 
A continuación facilitamos ejemplos de sustancias que pueden utili ­
zarse como controles positivos: 
— compuesto de acción directa: etilmetanosulfonato, 
— compuesto de acción indirecta: ciclofosfamida. 
En caso oportuno, puede incluirse un control positivo complementa ­
rio de la misma clase química que la sustancia estudiada.
 
C o n c e n t r a c i o n e s d e e x p o s i c i ó n 
Se utilizarán al menos tres concentraciones de la sustancia objeto de 
estudio, escalonadas debidamente. La concentración máxima produ ­
cirá un efecto tóxico significativo, pero no impedirá una replicación 
celular adecuada. Las sustancias relativamente insolubles en agua se estudiarán hasta el límite de solubilidad por métodos apropiados. En lo que respecta a las sustancias atóxicas claramente hidrosolubles, la 
concentración más alta se determinará en cada caso.
 
Procedimiento  
P r e p a r a c i ó n d e l o s c u l t i v o s 
Líneas celulares establecidas, derivadas de cultivos madre (por ejem ­
plo, por tripsinización o agitación), se siembran con la densidad adecuada en recipientes de cultivo y se incuban a 37
 o C. En los 
cultivos de una sola capa celular, el número de células por recipiente 
de cultivo debe ajustarse de modo que los cultivos no confluyan en más del 50 % en el momento de la recogida. También es posible utilizar las células en forma de un cultivo en suspensión. Los culti ­
vos de linfocitos humanos se preparan a partir de sangre heparini ­
zada por medio de técnicas apropiadas, y se incuban a 37
 o C. ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
T r a t a m i e n t o 
Se expone a células en fase de crecimiento exponencial a la sustancia 
analizada durante un período de tiempo apropiado; en la mayoría de los casos pueden bastar una o dos horas, pero en determinadas circunstancias puede prolongarse el período de tratamiento hasta 
abarcar dos ciclos celulares completos. Las células sin actividad 
metabólica intrínseca deben exponerse a la sustancia estudiada en presencia y ausencia de un sistema de activación metabólica apro ­
piado. Al final del período de exposición, se lavan las células hasta 
eliminar la sustancia estudiada  y se cultivan en presencia de BrdU 
durante dos ciclos de replicación. Otro método consiste en exponer simultáneamente las células a la sustancia y BrdU durante dos ciclos celulares completos. 
Los cultivos de linfocitos humanos se tratan mientras se encuentran 
en un estado semisincrónico. 
Las células se examinan en su segunda división tras el tratamiento, 
con lo que se garantiza la exposición de las fases más sensibles del 
ciclo celular a la sustancia estudiada. Todos los cultivos a los que se 
añada BrdU se manipularán en la oscuridad o con iluminación débil de lámparas incandescentes hasta la recolección de las células, a fin de reducir la fotolisis del DNA que contenga BrdU.
 
R e c o l e c c i ó n d e l a s c é l u l a s 
Los cultivos celulares se tratan con un inhibidor del huso (por ejemplo, 
colchicina) de 1 a 4 horas antes de la recolección. Cada cultivo se recolecta y trata por separado para la preparación de los cromosomas.
 
P r e p a r a c i ó n y t e ñ i d o d e l o s c r o m o s o m a s 
Las preparaciones de cromosomas se realizan por métodos citogené ­
ticos estándar. Existen varias técnicas para teñirlos de forma que se aprecien los SCE (por ejemplo, el método de fluorescencia con Giemsa).
 
A n á l i s i s 
El número de células analizadas dependerá de la frecuencia espon ­
tánea de control de SCE. Por lo general, se analizan al menos 25 metafases bien escalonadas por cultivo para contar los SCE. 
Las preparaciones reciben un código antes del análisis. En linfocitos 
humanos, solo se analizan las metafases que contienen 46 centróme ­
ros. En las líneas celulares establecidas, solo se analizan las metafa ­
ses que contienen ± 2 centrómeros del número modal. Se precisará si 
una inversión del marcado en el centrómero se considera SCE. Los 
resultados se confirmarán en un experimento independiente.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados se presentarán en forma de tablas. El número de SCE 
para cada metafase y el de SCE por cromosoma han de facilitarse por separado para todos los cultivos tratados y de control. 
Los resultados se analizarán por métodos estadísticos adecuados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— células utilizadas, métodos de mantenimiento del cultivo celular — condiciones del ensayo: composición de los medios, concentra ­
ción de CO
 2 , concentración de la sustancia estudiada, vehículo 
empleado, temperatura de incubación, período de tratamiento, 
inhibidor del huso utilizado, su concentración y duración del tratamiento con él, tipo de sistema de activación de mamífero utilizado, controles positivos y negativos, 
— número de cultivos celulares por ensayo, — detalles de la técnica utilizada para la preparación de las exten ­
siones, 
— número de metafases analizadas (datos facilitados por separado 
para cada cultivo), 
— número medio de SCE por célula y por cromosoma (datos faci ­
litados por separado para cada cultivo), 
— criterio de recuento de los SCE, 
— justificación de la elección de las dosis, 
— relación dosis-respuesta, si es posible, — evaluación estadística, — comentario de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  ENSAYO DE LETALIDAD RECESIVA LIGADA AL SEXO EN  
DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
La prueba de letalidad recesiva ligada al sexo (SLRL) practicada con  
Drosophila melanogaster  descubre la aparición de mutaciones (lo 
mismo mutaciones puntuales que pequeñas deleciones) en la línea germinal del insecto. Se trata de un análisis de mutación capaz de descubrir mutaciones en unos 800 loci de cromosoma X, lo que 
supone alrededor del 80 % del total de loci existentes. El cromosoma 
X supone aproximadamente una quinta parte del genoma haploide completo. 
Las mutaciones del cromosoma X de  Drosophila melanogaster  se 
expresan fenotípicamente en los machos portadores del gen mutante. 
Cuando la mutación es letal en el estado hemicigoto, se deduce su 
presencia por la falta de uno de los grupos de descendencia mascu ­
lina de los dos producidos normalmente por una hembra heterocigo ­
ta. La prueba SLRL aprovecha estas circunstancias por medio de 
cromosomas marcados especialmente y con reordenaciones de su 
estructura.
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
A n i m a l e s d e e x p e r i m e n t a c i ó n 
Pueden utilizarse machos de un linaje de tipo salvaje bien definido, y 
hembras de linaje Muller-5. También cabe emplear otros linajes de hembras debidamente marcadas con cromosomas X invertidos de 
manera múltiple.
 
S u s t a n c i a o b j e t o d e e s t u d i o 
Las sustancias estudiadas se disuelven en agua. Las que sean insolu ­
bles en agua pueden disolverse o suspenderse en vehículos apropia ­
dos (por ejemplo, una mezcla de etanol y Tween-60 u 80), para 
diluirse luego en agua o solución salina antes de la administración. 
Se evitará el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) como vehículo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
N ú m e r o d e a n i m a l e s 
Se determinarán previamente la sensibilidad y la potencia de la 
prueba. La frecuencia de mutantes espontáneos observada en el con ­
trol apropiado influirá intensamente en el número de cromosomas tratados que deba analizarse.
 
V í a d e a d m i n i s t r a c i ó n 
La exposición puede ser oral, por inyección o por exposición a gases 
o vapores. La sustancia objeto de estudio puede administrarse en una solución azucarada. Cuando sea necesario, pueden disolverse las sustancias en una solución de CINa al 0,7 % e inyectarlas así en 
el tórax o el abdomen.
 
U s o d e c o n t r o l e s n e g a t i v o s y p o s i t i v o s 
Se incluirán controles negativos (vehículo) y positivos. No obstante, 
si el laboratorio dispone de datos de controles publicados adecuados, 
no son necesarios controles simultáneos.  
N i v e l e s d e e x p o s i c i ó n 
Se utilizarán tres niveles de exposición. Para una evaluación preli ­
minar, puede utilizarse un solo nivel de exposición de la sustancia 
analizada, que corresponderá a la concentración máxima tolerada o a 
la que produzca ciertos signos de toxicidad. Cuando se trate de sustancias atóxicas, ha de utilizarse la exposición en la concentración máxima posible.
 
P r o c e d i m i e n t o 
Se tratan machos de fenotipo salvaje (de tres a cinco días de edad) 
con la sustancia objeto de estudio y se aparean individualmente con varias hembras vírgenes del linaje Muller-5, o de otro debidamente marcado (con cromosomas invertidos de manera múltiple). Las hem ­
bras se sustituyen por vírgenes nuevas cada dos o tres días para 
cubrir el ciclo germinal completo. Se examina luego la descendencia de estas hembras para apreciar los efectos letales correspondientes a 
los efectos sobre el esperma maduro, las espermátidas en estadios 
precoces, medios y tardíos, los espermatocitos y los espermatogonios en el momento del tratamiento. 
Las hembras F
 1 heterocigotas procedentes de los cruces anteriores se 
aparean individualmente (es decir, una hembra por vial) con sus hermanos. En la generación F
 2 , se examina cada cultivo para descu ­
brir la ausencia de machos del tipo salvaje. Si un cultivo parece 
proceder de una hembra F  1 portadora de un gen letal en el cromo ­
soma X paterno (es decir, no se observa ningún macho portador del cromosoma tratado), se pondrán a prueba las hijas de esta hembra 
que presenten el mismo genotipo para comprobar si la letalidad se 
repite en la generación siguiente.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados se presentarán en forma de tablas en las que se 
consignen el número de cromosomas estudiados, el de machos in ­
fértiles y el de cromosomas letales en cada concentración de expo ­
sición y en cada período de apareamiento, para cada macho tratado. 
Se indicará el número de grupos de tamaños diferentes por macho. 
Los resultados se confirmarán en un experimento independiente.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Se utilizarán métodos estadísticos apropiados para evaluar el ensayo 
de letalidad recesiva ligada al sexo. El reagrupamiento de genes 
letales recesivos procedentes de un solo macho se tendrá en cuenta y se evaluará por un método estadístico adecuado.
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— linajes o cepas de  Drosophila  empleados, edad de los insectos, 
número de machos tratados, número de machos estériles, número 
de cultivos F  2 establecidos, número de cultivos F  2 sin progenie, 
número de cromosomas portadores de un gen letal encontrado en cada estadio de la célula germinal, 
— criterios adoptados para determinar el tamaño de los grupos tra ­
tados, 
— condiciones de la prueba: descripción detallada del programa de 
tratamiento y muestreo, niveles de exposición, datos de toxicidad, 
controles negativos (disolvente) y positivos si procede, 
— criterios de recuento de las mutaciones letales, — relación exposición/efecto, si es posible, 
— evaluación de los datos, 
— comentario de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  ENSAYO DE TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DE 
MAMÍFERO  IN VITRO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Es posible utilizar sistemas de cultivo de células de mamífero para 
descubrir modificaciones fenotípicas  in vitro  inducidas por sustancias 
químicas asociadas con transformación maligna  in vivo.  Entre las 
células de uso más frecuente figuran C3H10T  1/2 , 3T3, SHE, rata 
Fisher; las pruebas se basan en modificaciones de la morfología 
celular, la formación de focos o modificaciones vinculadas con el 
crecimiento o no en agar semisólido. Existen sistemas, empleados con menor frecuencia, que ponen de manifiesto otras alteraciones fisiológicas o morfológicas en las células tras exposición a sustancias 
químicas carcinogénicas. Ninguno de los criterios analizados en estas 
pruebas  in vitro  tiene una relación de mecanismo establecida con el 
cáncer. Algunos de los sistemas de prueba son capaces de descubrir promotores tumorales. Puede determinarse la citotoxicidad averi ­
guando el efecto de la sustancia estudiada sobre la capacidad de 
formación de colonias (eficacia de clonado) o los índices de creci ­
miento de los cultivos. La determinación de la citotoxicidad tiene por objeto establecer si la exposición a la sustancia analizada ha sido 
toxicológicamente significativa, pero no permite calcular la frecuen ­
cia de transformaciones en todas las pruebas, dado que en algunas de estas pueden ser necesarias una incubación prolongada, una nueva siembra o ambas.
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCION DEL MÉTODO  
Preparativos  
C é l u l a s 
Según la prueba de transformación que se realice, pueden utilizarse 
líneas celulares o células primarias diversas. El investigador se en ­
cargará de que las células que se empleen presenten la modificación fenotípica apropiada tras exposición a sustancias carcinogénicas co ­
nocidas, y de que la fiabilidad y la validez de la prueba efectuada en 
su laboratorio estén contrastadas por datos documentados.
 
M e d i o 
Se utilizarán medios y condiciones experimentales apropiados para la 
prueba de transformación elegida.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
S u s t a n c i a o b j e t o d e e s t u d i o 
Las sustancias puestas a prueba pueden prepararse en medios de 
cultivo, disolverse o suspenderse en vehículos apropiados antes de tratar las células. La concentración final del vehículo en el medio de cultivo no influirá en la viabilidad de las células, el índice de creci ­
miento ni en la incidencia de transformación.
 
A c t i v i d a d m e t a b ó l i c a 
Las células se expondrán a la sustancia estudiada en presencia y en 
ausencia de un sistema de activación metabólica de mamífero apro ­
piado. Cuando se utilicen tipos celulares con actividad metabólica 
intrínseca, deberá saberse si la naturaleza de la actividad es apro ­
piada para la clase química analizada.  
Condiciones del ensayo  
U s o d e c o n t r o l e s n e g a t i v o s y p o s i t i v o s 
Se incluirán en cada experimento controles positivos a base de una 
sustancia de acción directa y otra que precise activación metabólica; 
también se utilizará un control negativo (vehículo). 
A continuación se ofrecen ejemplos de sustancias que pueden em ­
plearse como controles positivos: 
— Compuestos de acción directa: 
— etilmentanosulfonato — β-propiolactona 
— Compuestos que precisan activación metabólica: 
— 2-acetilaminofluoreno 
— 4-dimetilaminoazobenceno 
— 7,12-dimetilbenzantraceno 
Cuando se juzgue oportuno, se incluirá un control positivo comple ­
mentario perteneciente a la misma clase química que la sustancia estudiada.
 
C o n c e n t r a c i o n e s d e e x p o s i c i ó n 
Se utilizarán varias concentraciones de la sustancia objeto de estudio, 
que producirán un efecto tóxico acorde con su potencia; así, la concentración máxima provocará una supervivencia escasa, mientras 
que la supervivencia con la concentración mínima será aproximada ­
mente igual a la encontrada en el control negativo. Las sustancias relativamente insolubles en agua se estudiarán hasta el límite de solubilidad por medio de métodos apropiados. En lo que respecta 
a las sustancias atóxicas claramente hidrosolubles, la concentración 
más alta de la sustancia estudiada se determinará en cada caso.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Procedimiento  
Las células deben exponerse durante un período de tiempo adecuado, 
que dependerá del sistema celular utilizado; por tanto, quizá sea necesario un nuevo tratamiento, acompañado de un cambio de medio (y, en caso preciso, de una nueva mezcla de activación metabólica), 
si la exposición es prolongada. Las células carentes de actividad 
metabólica intrínseca suficiente se expondrán a la sustancia estudiada en presencia y en ausencia de un sistema de activación metabólica apropiado. Al final del período de exposición, se lavan las células 
hasta eliminar la sustancia analizada y se cultivan en condiciones que 
permitan la aparición del fenotipo transformado en estudio; se deter ­
mina también la incidencia de esta transformación. Todos los resul ­
tados se confirman en un experimento independiente.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados se presentarán en forma de tablas que recogerán datos 
diversos según el método que se utilice, como, por ejemplo, recuen ­
tos por placa, placas positivas o número de células transformadas. Cuando proceda, se expresará el índice de supervivencia en porcen ­
taje de los índices de control y frecuencia de transformación a modo 
del número de células transformadas frente al de supervivientes. Los 
resultados se evaluarán por métodos estadísticos apropiados.
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— tipo de célula utilizado, número de cultivos celulares, métodos de 
mantenimiento de los cultivos celulares, 
— condiciones del ensayo; concentración de la sustancia estudiada, 
vehículo utilizado, período de incubación, duración y frecuencia 
del tratamiento, densidad celular durante el tratamiento, tipo de 
sistema de activación metabólica exógena utilizado, controles positivos y negativos, especificación del fenotipo estudiado, sis ­
tema selectivo empleado (si procede), justificación de la elección 
de las dosis, 
— método utilizado para contar las células viables y transformadas, 
— evaluación estadística, 
— discusión de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  ENSAYO DE LETALIDAD DOMINANTE EN ROEDORES  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
La letalidad dominante provoca la muerte del embrión o feto. Su 
inducción por exposición a una sustancia química indica que esta ha alterado el tejido embrionario de la especie estudiada. Se admite generalmente que la letalidad dominante se debe a una lesión cro ­
mosómica (anomalías estructurales y numéricas). Si los animales 
tratados son hembras, la muerte del embrión también puede deberse a efectos tóxicos. 
En general, los machos se exponen a la sustancia objeto de estudio y 
se aparean con hembras vírgenes no tratadas. Es posible investigar por separado los distintos estadios de las células embrionarias gracias al empleo de intervalos de apareamiento sucesivos. Un número de 
implantes muertos por hembra, en el grupo tratado, superior al ob ­
servado en el grupo de control, es reflejo de las pérdidas tras la implantación. Por otro lado, es posible calcular las pérdidas antes de ella mediante recuento de los cuerpos lúteos, o por comparación 
entre número total de implantes por hembra en los grupos tratados y 
los de control. El efecto total de letalidad dominante es igual a la suma de las pérdidas antes y después de la implantación. El cálculo 
de tal efecto se basa en la comparación del número de implantes 
vivos por hembra, en el grupo de prueba, en relación con el regis ­
trado para el grupo de control. Una reducción del número de im ­
plantes en determinados intervalos puede deberse a destrucción de 
células (es decir, de espermatocitos, espermatogonios o ambos).
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Cuando sea posible, las sustancias objeto de estudio se disolverán o 
suspenderán en solución salina isotónica. Las sustancias químicas insolubles en agua pueden disolverse o suspenderse en vehículos apropiados. El vehículo utilizado no alterará el compuesto estudiado 
ni producirá efectos tóxicos. Deben emplearse preparaciones recien ­
tes de la sustancia objeto de estudio.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Condiciones del ensayo  
V í a d e a d m i n i s t r a c i ó n 
En general, la sustancia estudiada solo debe administrarse una vez, 
aunque cabe utilizar un programa de tratamiento reiterado si lo aconseja la información toxicológica disponible. Las vías de admi ­
nistración usuales son la intubación oral y la inyección intraperito ­
neal. Pueden ser apropiadas otras vías de administración.
 
A n i m a l e s d e e x p e r i m e n t a c i ó n 
Se recomienda utilizar ratas o ratones, jóvenes y en plena madurez 
sexual, que se distribuirán al azar para formar grupos de tratamiento y de control.
 
N ú m e r o y s e x o 
Se utilizará un número apropiado de machos tratados, teniendo en 
cuenta la frecuencia espontánea del carácter biológico evaluado se ­
gún la cepa empleada. El número elegido se basará en la sensibilidad de detección y el grado de significación, determinados previamente. 
Por ejemplo, en un experimento tipo, el número de machos en cada 
grupo posológico deberá ser suficiente para obtener alrededor de 30 a 50 hembras grávidas por período de apareamiento.
 
U s o d e c o n t r o l e s n e g a t i v o s y p o s i t i v o s 
Se incluirán simultáneamente en cada experimento controles positi ­
vos y negativos (vehículos). Cuando se disponga de resultados acep ­
tables obtenidos con controles positivos en experimentos recientes en el mismo laboratorio, podrán emplearse en lugar de un control po ­
sitivo simultáneo. En lo que respecta a las sustancias de control 
positivas, se utilizará una dosis baja apropiada (por ejemplo, 
MMS, intraperitonalmente, 10 mg/kg) para demostrar la sensibilidad de la prueba.
 
D o s i s 
Normalmente, se utilizan tres niveles posológicos. La dosis alta pro ­
ducirá signos de toxicidad o reducirá la fecundidad de los animales 
tratados. En determinados casos, puede bastar un solo nivel posoló ­
gico alto.  
P r u e b a d e l í m i t e 
Las sustancias atóxicas se estudian en concentración de 5 g/kg en 
caso de administración única, y de 1 g/kg/día en caso de adminis ­
tración reiterada.  
Procedimiento  
Hay varios esquemas de tratamiento posibles. El método más fre ­
cuente es el de la administración única, pero pueden utilizarse otros. 
Cada macho se aparea de forma secuencial con 1 o 2 hembras 
vírgenes no tratadas, a intervalos de tiempo apropiados tras el trata ­
miento. Las hembras se mantendrán con los machos durante al me ­
nos un ciclo estral completo o hasta que se compruebe el aparea ­
miento por la presencia de esperma en la vagina o por la existencia 
de tapón vaginal.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
El número de apareamientos tras el tratamiento dependerá del pro ­
grama de tratamiento, y garantizará la obtención de muestras de 
todos los estadios de células embrionarias tras el tratamiento. 
Las hembras se sacrifican en la segunda mitad de la gestación para 
examinar el contenido de su útero y determinar el número de im ­
plantes vivos y muertos. Pueden inspeccionarse los ovarios para 
averiguar el número de cuerpos lúteos.  
2. RESULTADOS  
Los resultados se presentarán en forma de tablas en las que aparez ­
can el número de machos, el de hembras grávidas y el de hembras no grávidas. Se facilitarán por separado los resultados de cada apa ­
reamiento, incluida la identidad de cada macho y hembra. Se reco ­
gerán, para cada hembra, la semana de apareamiento y la dosis recibida por los machos, así como las frecuencias de implantes vivos y muertos. 
El cálculo del efecto total de la letalidad dominante se basa en la 
comparación del número de implantes vivos por hembra en el grupo 
tratado y en el de control. Se analiza la relación entre implantes vivos y muertos en el grupo tratado, en comparación con la obtenida en el grupo de control, para deducir las pérdidas tras la implantación. 
Si se registran los datos en forma de muertes precoces y tardías, 
se indicará claramente esta diferencia en las tablas. Si se calculan 
las pérdidas antes de la implantación, debe informarse de ellas. Tales pérdidas pueden calcularse a modo de diferencias entre el 
número de cuerpos lúteos y el de implantes, o de reducción del 
número medio de implantes por hembra en relación con los apa ­
reamientos de control. 
Los resultados se evaluarán por métodos estadísticos apropiados.
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— especie, cepa, edad y pesos de los animales utilizados, número de 
animales de cada sexo en los grupos tratados y controles, 
— sustancia estudiada, vehículo, niveles posológicos ensayados y 
justificación de su elección, controles negativos y positivos, datos relativos a la toxicidad, 
— vía y programa de tratamiento, 
— programa de apareamiento, — método utilizado para comprobar el apareamiento, — momento del sacrificio, — criterios de recuento de los efectos de la letalidad dominante, — relación dosis-respuesta, si es posible,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— evaluación estadística, 
— comentario de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  ENSAYO DE ABERRACIONES CROMOSÓMICAS EN 
ESPERMATOGONIAS DE MAMÍFERO  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices del documento OCDE 
TG 483 sobre el ensayo de aberraciones cromosómicas en esperma ­
togonias de mamífero (1997).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El ensayo de aberraciones cromosómicas en espermatogonias de 
mamífero tiene por objeto detectar sustancias que provocan aberra ­
ciones cromosómicas estructurales en espermatogonias de mamífero 
(1) (2) (3) (4) (5). Las aberraciones estructurales pueden ser cromo ­
sómicas o cromatídicas. La mayoría de los mutágenos químicos dan lugar a aberraciones cromatídicas, aunque también pueden producirse 
aberraciones cromosómicas. El presente método no está pensado para 
detectar aberraciones numéricas ni se emplea habítualmente con ese fin. Las mutaciones cromosómicas y los efectos relacionados ocasio ­
nan numerosas enfermedades genéticas humanas. 
El presente ensayo detecta alteraciones cromosómicas en las células 
germinales de las espermatogonias y debería, por tanto, permitir prever la inducción de mutaciones hereditarias en las células germi ­
nales. 
El ensayo suele realizarse con roedores; es un ensayo citogenético  in 
vivo que detecta aberraciones cromosómicas en las mitosis de las 
espermatogonias. El presente método no se refiere a otras células diana. 
Para detectar aberraciones cromatídicas en las espermatogonias es pre ­
ciso analizar la primera mitosis celular después del tratamiento, antes 
de que las lesiones desaparezcan en las divisiones celulares siguientes. Puede obtenerse información adicional del análisis de los cromosomas meióticos de células madre de espermatogonias tratadas, para detectar 
aberraciones cromosómicas de la diacinesis a la metafase I cuando las 
células tratadas se convierten en espermatocitos. 
El presente ensayo  in vivo  está diseñado para determinar si los 
mutágenos de las células somáticas también son activos en las célu ­
las germinales. Asimismo, está indicado para evaluar el riesgo mu ­
tagénico, ya que permite tomar en consideración factores del meta ­
bolismo  in vivo,  de la toxicocinética y de los procesos de reparación 
del ADN. 
Los testículos contienen varias generaciones de espermatogonias, que 
presentan distinta sensibilidad al tratamiento químico. Por tanto, las 
aberraciones detectadas corresponden a una respuesta global de las 
poblaciones de espermatogonias tratadas, en las que predominan las células diferenciadas, que son las más numerosas. Según su locali ­
zación en el testículo y debido a la barrera física y fisiológica de las 
células de Sertoli, así como a la barrera entre la sangre y el testículo, algunas generaciones de espermatogonias están expuestas a la circu ­
lación general y otras no. 
Si hay pruebas de que la sustancia de ensayo o un metabolito re ­
activo no llegan al tejido diana, no procede realizar el presente 
ensayo. 
Véase asimismo la introducción general de la parte B.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. DEFINICIONES  
Aberración cromatídica:  lesión cromosómica estructural que con ­
siste en la rotura de una cromátida o la rotura y reunión de cromá ­
tidas.  
Aberración cromosómica:  lesión cromosómica estructural que con ­
siste en la rotura o en en la rotura y reunión de ambas cromátidas en 
el mismo sitio.  
Gap:  lesión acromática más estrecha que la cromátida, con alteración 
mínima de la alineación de las cromátidas.  
Aberracción numérica:  número de cromosomas distinto del número 
normal propio de los animales empleados.  
Poliploidía:  un múltiplo del número de dotación cromosómica ha ­
ploide (n) superior al diploide (3n, 4n, etc.).  
Aberración estructural:  alteración de la estructura cromosómica 
(deleciones, intracambios o intercambios) detectable mediante exa ­
men microscópico de la metafase de la división celular.  
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se exponen los animales a la sustancia de ensayo por una vía ade ­
cuada y se sacrifican a intervalos apropiados tras el tratamiento. Antes de sacrificarlos, se les administra una sustancia que detenga 
la división celular en la metafase (por ejemplo, colchicina o Colce ­
mid®). A continuación, se realizan preparaciones de cromosomas de células germinales y se tiñen, tras lo cual se analizan las células en metafase para detectar aberraciones cromo-sómicas.
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación  
1.4.1.1.  Selección de la especie animal  
Si bien suelen emplearse hámsters chinos y ratones machos, pueden 
utilizarse machos de otra especie de mamíferos apropiada. Deben usarse animales adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitual ­
mente en laboratorio. La variación del peso de los animales al em ­
pezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del 
peso medio.
 
1.4.1.2.  Alojamiento y alimentación de los animales  
Se aplicarán las condiciones generales recogidas en la Introducción 
general de la parte B. La humedad debe ser del 50 al 60 %.  
1.4.1.3.  Preparación de los animales  
Se reparten al azar machos adultos jóvenes y sanos entre los lotes 
tratados y los lotes de control. Las jaulas se colocan de manera que los posibles efectos debidos a la posición de las mismas sean míni ­
mos. Se identifica a los animales de forma unívoca y se los acos ­
tumbra a las condiciones de laboratorio durante al menos cinco días 
antes de empezar el estudio.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Preparación de las dosis  
Las sustancias de ensayo sólidas deben disolverse o suspenderse en 
disolventes o vehículos adecuados y, si es preciso, diluirse antes de su administración a los animales. Las sustancias de ensayo líquidas 
pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administra ­
ción. Han de emplearse soluciones de la sustancia de ensayo recién preparadas, salvo que los datos relativos a la estabilidad demuestren que es posible conservarlas.
 
1.4.2.  Condiciones del ensayo  
1.4.2.1.  Disolvente o vehículo  
El disolvente o vehículo no deberá producir efectos tóxicos a las 
dosis empleadas. Es preciso cerciorarse de que el disolvente o vehí ­
culo no produce reacciones químicas con la sustancia de ensayo. Si 
se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información que avale su compatibilidad. Siempre que sea posi ­
ble, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un 
disolvente o vehículo acuoso.
 
1.4.2.2.  Controles  
Deberán realizarse controles positivos y negativos (disolvente o ve ­
hículo) en paralelo en cada ensayo. Salvo por lo que respecta a la 
exposición a la sustancia de ensayo, los animales de los lotes de 
control deben tratarse exactamente igual que los de los lotes tratados. 
En los controles positivos deberían producirse aberraciones cromo ­
sómicas estructurales en las espermatogo-nias  in vivo  con grados de 
exposición en los que quepa esperar un aumento detectable respecto al nivel de fondo. 
Las dosis del control positivo deben ser tales que los efectos sean 
claros, pero no revelen immediatamente al lector la identidad de los 
portaobjetos codificados. La sustancia empleada en el control posi ­
tivo podrá administrarse por una vía distinta de la empleada para la sustancia de ensayo y la toma de muestras podrá realizarse una sola 
vez. Podrá considerarse la utilización en dichos controles de sustan ­
cias de clases químicas afines, cuando sea posible. A continuación figuran algunos ejemplos de sustancias para los controles positivos:
 
Sustancia N° CAS N° EINECS  
Ciclofosfamida 
Monohidrato de ciclofosfamida 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Ciclohexilamina 108-91-8 203-629-0 
Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 
Monómero de acrilamida 79-06-1 201-173-7 Trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5 
Salvo que haya datos anteriores sobre controles que pongan de ma ­
nifiesto una variabilidad entre animales y una frecuencia de células con aberraciones cromosómicas aceptables, se realizarán, para cada 
período de muestreo, controles negativos únicamente con el disol ­
vente o vehículo, y se tratarán, por lo demás, de igual manera que los lotes tratados. Se realizarán asimismo controles sin tratar, salvo que exista información anterior o publicada sobre controles que de ­
muestre que el disolvente o vehículo elegido no induce efectos no ­
civos ni mutágenos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. PROCEDIMIENTO  
1.5.1.  Número de animales  
Los lotes tratados y los controles han de estar compuestos al menos 
por cinco machos analizables cada uno.  
1.5.2.  Pauta de tratamiento  
Las sustancias de ensayo se administrarán preferiblemente una o dos 
veces (uno o dos tratamientos), aunque también puede dividirse la dosis —por ejemplo, en dos veces al día separadas por algunas horas como máximo— con el fin de facilitar la administración de grandes 
cantidades. Si se siguen otras pautas debe justificarse científicamente. 
En el lote al que se ha administrado la dosis máxima se toman dos 
muestras tras el tratamiento. Dado que la sustancia de ensayo puede afectar a la cinética del ciclo celular, suele tomarse la primera mues ­
tra hacia las 24 horas y la segunda, unas 48 horas después del 
tratamiento. En los demás lotes se toma una muestra transcurridas 
24 horas o un período de 1,5 veces la duración del ciclo celular desde el tratamiento, salvo que se conozca otro período de muestreo más adecuado para detectar los efectos estudiados (6). 
Pueden seguirse otros períodos de muestreo. Por ejemplo, en el caso 
de sustancias que puedan provocar la pérdida de cromosomas o tener 
efectos independientes de la fase S, pueden estar indicados períodos de muestreo más cortos (1). 
Debe valorarse caso por caso la pertenencia de una pauta de admi ­
nistración repetida. Si se aplica una pauta de ese tipo, los animales 
deben sacrificarse 24 horas (1,5 veces la duración del ciclo celular) después de la última administración. Cuando proceda, pueden apli ­
carse períodos de muestreo complementarios. 
Antes de sacrificar los animales, se les inyecta por vía intraperitoneal 
una dosis adecuada de una sustancia que detenga la división celular 
en la metafase (por ejemplo, Colcemid
 ® o colchicina). Se extraen las 
muestras transcurrido un plazo oportuno, que en el caso de los ratones es de unas 3 a 5 horas y en el de los hámsters chinos, de 
unas 4 a 5 horas.
 
1.5.3.  Dosis  
Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación de la gama de 
dosis por falta de datos adecuados, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa y protocolo de tratamiento que el estudio principal (7). Si se produce toxicidad, se administrarán 
tres dosis distintas para el primer período de muestreo. La gama de 
dosis deberá abarcar desde la toxicidad máxima hasta una toxicidad escasa o nula. En el último período de muestreo se administrará únicamente la dosis máxima. Se entenderá por «dosis máxima» la 
que produzca tales signos de toxicidad que, si se administrara una 
dosis superior según el mismo protocolo resultaría problamente letal.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Las sustancias con actividades biológicas específicas a dosis bajas no 
tóxicas (como las hormonas y los mitó-genos) pueden constituir 
excepciones en cuanto a los criterios de establecimiento de la dosis y han de evaluarse caso por caso. La dosis máxima también puede definirse como la dosis que produce algún signo de toxicidad en las 
espermatogonias (por ejemplo, disminución de la proporción entre el 
número de mitosis de las espermatogonias y el número de metafases I y II de la meiosis; la disminución no ha de ser superior al 50 %).
 
1.5.4.  Ensayo límite  
Si en un ensayo realizado con una dosis de al menos 2 000 mg/kg de 
peso corporal/día administrada en una sola vez, o dos veces en el mismo día, no se observan efectos tóxicos y si, sobre la base de datos relativos a sustancias de estructura afín, no cabe esperar geno ­
toxicidad, puede no ser necesario llevar a cabo un estudio completo 
con tres dosis diferentes. Si se prevé la exposición humana a la sustancia, puede ser preciso administrar una dosis mayor en el en ­
sayo límite.
 
1.5.5.  Administración de las dosis  
La sustancia de ensayo suele administrarse por sonda gástrica o con 
una cánula de intubación adecuada, o bien por inyección intraperi ­
toneal. Pueden emplearse otras vías de administración, siempre que 
se justifiquen. El volumen máximo de líquido que puede adminis ­
trarse de una sola vez por sonda o inyección depende del tamaño del animal de ensayo, pero no excederá de 2 ml/100 g de peso corporal. Deberá justificarse la administración de volúmenes superiores a este. 
Salvo en el caso de sustancias irritantes o corrosivas, que por lo 
general producen efectos exacerbados con concentraciones mayores, deberá reducirse al mínimo la variabilidad del volumen de ensayo ajustando la concentración de manera que el volumen sea el mismo 
en todas las dosis.
 
1.5.6.  Preparación de los cromosomas  
Immediatamente después del sacrificio, se preparan suspensiones con 
células de uno o ambos testículos, se tratan con una solución hipo ­
tónica y se fijan. A continuación, se distribuyen las células en por ­
taobjetos y se tiñen.  
1.5.7.  Análisis  
Deben analizarse al menos 100 metafases bien extendidas de cada 
animal (es decir, un mínimo de 500 meta-fases por lote). La cantidad puede ser menor si se observan numerosas aberraciones. Antes de analizarlos al microscopio, se asigna un código independiente a cada 
portaobjetos, incluidos los controles positivos y negativos. Dado que 
los métodos de fijación provocan con frecuencia la rotura de células en metafase y la pérdida de cromosomas, las células analizadas deben contener un número de centrómeros iqual a 2n ± 2.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de tabla. 
La unidad experimental es el animal. Se determinará en cada animal 
la cantidad de células con aberraciones cromosómicas estructurales y 
el número de aberraciones cromosómicas por célula. Se hará una relación de los distintos tipos, el número y la frecuencia de dichas aberraciones en los lotes tratados y los controles. Los gaps se regis ­
trarán por separado y se recogerán en el informe, pero por lo general 
no se incluirán en la frecuencia total de aberraciones.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Si se observan tanto mitosis como meiosis, se determinará la relación 
entre las mitosis de espermatogonias y la primera y segunda metafases 
meióticas en una muestra de 100 células en división por cada animal de los lotes tratados y de los controles negativos, con el fin de establecer si ha habido citotoxicidad. Si se observan mitosis únicamente, se deter ­
minará el índice mitótico al menos en 1 000 células por animal.
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Son varios los criterios para determinar si un resultado es positivo 
(aumento de la proporción de células con aberraciones cromosómicas 
relacionado con la dosis, claro aumento del número de células que presentan aberraciones en un lote al que se ha administrado una sola dosis y en el que se ha realizado una única toma de muestras, etc.). 
Debe considerarse en primer lugar la importancia biológica de los 
resultados. Pueden emplearse métodos estadísticos como apoyo para evaluar los resultados del ensayo (8). El hecho de que los datos 
estadísticos sean significativos no ha de ser el único factor para 
determinar que una respuesta es positiva. Los resultados dudosos deberán aclararse mediante más ensayos en los que convendría mo ­
dificar las condiciones experimentales. 
No se considerarán mutágenas en el ensayo en cuestión las sustancias 
que den lugar a resultados que no se ajusten a los criterios anteriores. 
Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán clara ­
mente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos no 
permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia de ensayo. Con independencia del número de veces que se repita el ex ­
perimento, los resultados pueden seguir siendo ambiguos o dudosos. 
Un resultado positivo en el ensayo de aberraciones cromosómicas en 
espermatogonias  in vivo  indica que la sustancia de ensayo provoca 
aberraciones cromosómicas estructurales en las células germinales de 
la especie estudiada. Un resultado negativo indica que, en las con ­
diciones del ensayo, la sustancia de ensayo no provoca aberraciones cromosómicas en las células germinales de la especie estudiada. 
Deberá estudiarse la probabilidad de que la sustancia de ensayo o sus 
metabolitos lleguen al tejido diana.
 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la información siguiente: 
Disolvente o vehículo: — motivación de la elección del vehículo, — solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disol ­
vente o vehículo, si se conocen. 
Animales de ensayo: — especie y cepa utilizadas, — número y edad de los animales, — procedencia, condiciones de alojamiento, alimentación, etc., — peso de cada animal al principio del ensayo, incluido el intervalo 
del peso corporal, media y desviación estándar de cada lote.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Condiciones del ensayo: 
— datos relativos al estudio de determinación del intervalo, si se ha 
llevado a cabo, 
— fundamento de la selección de la dosis, — fundamento de la elección de la vía de administración, — preparación de la sustancia de ensayo, — administración de la sustancia de ensayo, — fundamento de la elección del momento del sacrificio, — conversión de la concentración de la sustancia de ensayo en el 
agua ingerida y/o la dieta (ppm) en la dosis real (mg/kg de peso corporal/día), si procede, 
— calidad de los alimentos y el agua, — descripción detallada de las pautas de tratamiento y toma de 
muestras, 
— métodos de determinación de la toxicidad, — sustancia que detiene la división celular en la metafase, concen ­
tración empleada y duración del tratamiento, 
— métodos de preparación de los portaobjetos, — criterios de recuento de las aberraciones, — número de células analizadas por animal, — criterios empleados para considerar que los resultados de los 
estudios son positivos, negativos o dudosos. 
Resultados: — signos de toxicidad, — índice mitótico, — proporción entre el número de mitosis de espermatogenias y el 
número de metafases I y II de la meiosis, 
— tipo y número de aberraciones observadas en cada animal, — número total de aberraciones por lote, — número de células con aberraciones por lote, — relación dosis-respuesta, cuando sea posible, 
— análisis estadísticos, si se han realizado, 
— datos de los controles negativos realizados en paralelo, — datos anteriores sobre controles negativos, intervalos, medias y 
desviaciones estándar, 
— datos de los controles positivos realizados en paralelo, — variaciones de la ploidía, en su caso. Discusión de los resultados. Conclusiones.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. REFERENCIAS  
(1) Adler, I. D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Sperma ­
togonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifkations, in:  Genetic Toxicology of Environmental Che ­
micals , Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis,  
Ramel, C., Lambert B., and Magnusson, J. (eds.) Liss, New York, pp. 477-484. 
(2) Adler, I. D. (1984). Cytogenic tests in Mammals, in:  Mutage­
nicity Testing: a Practical Approach,  ed. S. Venitt and J. M. 
Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 27 5-306. 
(3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air- 
Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Tes ­
tes, Cytogenetics and Cell Genetics,  3, pp. 289-294. 
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D., G., and 
Henderson L. (1990),  ln Vivo  Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (ed.),  Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing. Report. Part I revised,  Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141. 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes,  Mu­
tation Res., 52,  pp. 207-209. 
(6) Adler, I. D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka, N. (1994), Inter ­
national Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Pro ­
cedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian 
Germ Cell Tests,  Mutation Res., 312,  pp. 313-318. 
(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Mor ­
ton, D. B., Kirkland D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working group: Dose setting in  ln Vivo  Mutagenicity Assays,  
Mutagenesis,  7, pp. 313-319. 
(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  ln Vivo  Cytoge­
netic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.),  Slatistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III , Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  ENSAYO DE LA MANCHA EN EL RATÓN  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se trata de una prueba que se realiza  in vivo  en ratones, cuyos 
embriones en desarrollo se exponen a la sustancia estudiada. Las células efectoras de los embriones en desarrollo son los melanoblas ­
tos, y los genes efectores son los responsables de la pigmentación 
del pelo. Los embriones son heterocigotos para cierto número de estos genes. Una mutación en el alelo dominante de tal gen o su pérdida (a consecuencia de fenómenos genéticos diversos) en un 
melanoblasto provoca la expresión del fenotipo recesivo en sus cé ­
lulas descendientes, con la aparición consiguiente de una mancha de otro color en el pelo del ratón resultante. Se cuenta el número de descendientes portadores de manchas (mutaciones), y se compara su 
frecuencia con la observada en la descendencia procedente del desa ­
rrollo de embriones tratados únicamente con el disolvente. La prueba de la mancha en el ratón descubre supuestas mutaciones somáticas en las células fetales.
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Cuando sea posible, las sustancias se disuelven u suspenden en 
solución salina isotónica. Las que sean insolubles en agua se disol ­
verán o suspenderán en vehículos apropiados. El vehículo utilizado 
no debe alterar la sustancia estudiada ni provocar efectos tóxicos. 
Deben emplearse preparaciones recientes de la sustancia objeto de estudio.
 
A n i m a l e s d e e x p e r i m e n t a c i ó n 
Se aparean animales de la cepa T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink 
eye, c  ch p/c ch p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spot ­
ting, s/s) con la cepa HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, in fz/ln fz; pearlpe/pe) o con la C57 BL (nona ­
gouti, a/a). Pueden utilizarse otros cruces apropiados, como entre 
NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) y DBA (nonagouti, a/a; brown, 
b/b; dilute d/d), siempre que produzcan descendencia nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
N ú m e r o y s e x o 
Se tratan hembras grávidas suficientes para obtener un número de 
descendientes vivos apropiado para cada nivel posológico utilizado. El tamaño de la muestra dependerá del número de manchas obser ­
vadas en los ratones tratados y de la importancia del número de 
datos de control. Solo se considerará aceptable un resultado negativo 
si se han examinado al menos 300 descendientes de hembras tratadas con la dosis máxima.
 
U s o d e c o n t r o l e s n e g a t i v o s y p o s i t i v o s 
Ha de disponerse de datos de control simultáneos procedentes de 
ratones tratados solo con el vehículo (controles negativos). Pueden 
agruparse datos de control históricos obtenidos en el mismo labora ­
torio para mejorar la sensibilidad de la prueba, siempre que tales datos sean homogéneos. Si la sustancia analizada no resulta ser 
mutágena, deberá disponerse de datos de control positivos obtenidos 
en fecha reciente en el mismo laboratorio con una sustancia de potencial mutágeno conocido en esta prueba.
 
V í a d e a d m i n i s t r a c i ó n 
Las vías de administración usuales son la intubación oral y la inyec ­
ción intraperitoneal de las hembras grávidas. Cuando convenga, se 
recurrirá al tratamiento por inhalación u otras vías de administración.  
D o s i s 
Se utilizan al menos dos niveles posológicos, incluido uno que ori ­
gine signos de toxicidad o reduzca el tamaño de las camadas. En 
caso de sustancias atóxicas, la exposición se efectuará a la dosis 
máxima practicable.  
Procedimiento  
Normalmente, se administra un tratamiento único los días 8,9 o 10 
de la gestación, considerando como día 1 aquel en que se observe 
por primera vez el tapón vaginal. Estos días corresponden, a 7,25, 
8,25 y 9,25 días tras la concepción. Pueden efectuarse, pasados estos días, tratamientos sucesivos.
 
A n á l i s i s 
Al cabo de tres o cuatro semanas del nacimiento, se asignan códigos 
a la descendencia y se comprueba si existen manchas. Se distinguen 
tres clases de manchas: 
a) las manchas blancas a menos de 5 mm de la línea mesoventral, 
que se suponen consecuencia de muerte celular (WMVS), 
b) las manchas amarillas, de tipo agouti, asociadas con los pezones, 
los órganos sexuales, la garganta, las regiones axilar e inguinal y 
la parte central de la frente, que se suponen debidas a falta de diferenciación (MDS), y 
c) las manchas pigmentadas y blancas repartidas al azar por el 
pelaje, que se creen resultado de mutaciones somáticas (RS).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Se cuentan las tres clases, pero solo la última, la RS, tiene signifi ­
cación genética. Los problemas que plantea la diferenciación de las 
clases MDS y RS pueden solucionarse examinando muestras de pelo con el microscopio de fluorescencia. 
Se observarán las anomalías morfológicas macroscópicas evidentes 
de la descendencia.
 
2. RESULTADOS  
Los datos se presentarán en forma del número total de crías examinadas y 
del número de las que presenten una o varias manchas supuestamente 
debidas a mutación somática. Se compararán por métodos apropiados los 
datos de los animales tratados y los controles negativos. Asimismo, se ofrecerán los resultados considerando la camada como unidad.
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— cepas utilizadas en el cruce, — número de hembras grávidas en los grupos experimental y de 
control, 
— tamaño medio de las camadas en los grupos experimentales y de 
control en el nacimiento y al destete, 
— dosis de la sustancia estudiada, 
— disolvente utilizado, — día de la gestación en que se administró el tratamiento, — vía de administración, — número total de descendientes examinados, y número con 
WMVS, MDS y RS en los grupos experimental y de control, 
— anomalías morfológicas macroscópicas, — relación dosis/respuesta de RS, si es posible, — evaluación estadística, — comentario de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  TRANSLOCACIÓN HEREDITARIA EN EL RATÓN  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
La prueba de translocación hereditaria en el ratón descubre altera ­
ciones cromosómicas estructurales y numéricas en las células em ­
brionarias de mamíferos, tal como se ponen de manifiesto en la 
descendencia de primera generación. Los tipos de alteraciones cro ­
mosómicas apreciados son translocaciones recíprocas y, si se incluye la descendencia femenina, pérdida del cromosoma X. Los portadores de translocaciones y las hembras XO muestran una fertilidad redu ­
cida que permite la selección de una descendencia F
 1 para practicar 
un análisis citogenético. Una esterilidad total es consecuencia de tipos de translocación determinados (autosoma X y tipo c-t). Las translocaciones se observan citogenéticamente en las células meióti ­
cas en diacinesis-metafase I de los individuos machos, ya sean ma ­
chos F
 1 o hijos de hembras F  1 . Las hembras XO se identifican 
citogenéticamente por la presencia de solo 39 cromosomas en las mitosis de la médula ósea.
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Las sustancias objeto de estudio se disuelven en solución salina 
isotónica. Si son insolubles en agua, se disuelven o suspenden en 
vehículos apropiados. Se emplean soluciones recién preparadas de la sustancia estudiada. Si se utiliza un vehículo para facilitar la admi ­
nistración, no debe alterar el compuesto analizado ni provocar efec ­
tos tóxicos.
 
V í a d e a d m i n i s t r a c i ó n 
Las vías de administración usuales son la intubación oral y la inyec ­
ción intraperitoneal, aunque pueden ser apropiadas otras vías.  
A n i m a l e s d e e x p e r i m e n t a c i ó n 
Para facilitar la reproducción y la verificación citológica, estos ex ­
perimentos se realizan con ratones; no es preciso que sean de una 
cepa determinada. Sin embargo, el tamaño medio de una camada de 
la cepa empleada deberá ser superior a 8, y relativamente constante. 
Se utilizarán animales sanos y sexualmente maduros.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
N ú m e r o d e a n i m a l e s 
El número de animales necesario depende de la frecuencia de trans ­
locaciones espontáneas, así como del índice mínimo de inducción preciso para obtener un resultado positivo. 
La prueba suele realizarse mediante análisis de la descendencia mas ­
culina F
 1 . Al menos 500 descendientes machos F  1 se analizan por 
grupo de dosis. Si se incluye la descendencia femenina F  1 son ne­
cesarios 300 machos y 300 hembras.  
U s o d e c o n t r o l e s n e g a t i v o s y p o s i t i v o s 
Debe disponerse de datos sobre controles adecuados procedentes de 
pruebas realizadas simultáneamente y de controles históricos. Si exis ­
ten resultados aceptables de controles positivos procedentes de ex ­
perimentos efectuados en fecha reciente en el mismo laboratorio, pueden utilizarse en lugar de un control positivo simultáneo.
 
D o s i s 
Se prueba una dosis, por lo general la máxima asociada con la 
producción de efectos tóxicos mínimos pero que no altere el com ­
portamiento reproductor ni la supervivencia. Para establecer una re ­
lación dosis/respuesta, son necesarias otras dos dosis. En caso de 
sustancias atóxicas, la exposición se efectuará a la dosis máxima posible.
 
Procedimiento  
T r a t a m i e n t o y a p a r e a m i e n t o 
Existen dos programas de tratamiento. De ellos, el más utilizado es 
la administración única de la sustancia estudiada. La sustancia tam ­
bién puede administrarse los 7 días de la semana durante 35 días. El 
número de apareamientos tras el tratamiento dependerá del programa 
de administración, y garantizará la obtención de muestras de todos los estadios de las células embrionarias tratadas. Al final del período de apareamiento, se coloca a las hembras en jaulas individuales. 
Cuando dan a luz, se registra la fecha, el tamaño de la camada y 
el sexo de los descendientes. Se desteta a toda la descendencia masculina y se descarta toda la femenina, salvo si se incluyen en el experimento.
 
B ú s q u e d a d e l o s h e t e r o c i g o t o s d e t r a n s l o c a c i ó n 
Se utiliza uno de los dos métodos posibles: 
— estudio de la fertilidad de la descendencia F  1 , y verificación 
posterior de posibles portadores de translocaciones por análisis citogenéticos, 
— análisis citogenético de toda la progenie F
 1 masculina sin selec ­
ción previa mediante estudio de fertilidad. 
a) Estudio de la fertilidad 
Es posible determinar la fertilidad reducida de un individuo F  1 
observando el tamaño de la camada, analizando el contenido 
uterino de su compañera femenina o por ambos medios. 
Es necesario fijar los criterios de determinación de la fertilidad 
normal y reducida de la cepa de ratón utilizada.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Observación del tamaño de la camada:  Los machos F  1 someti­
dos a estudio se colocan en jaulas individuales con hembras 
procedentes del mismo experimento o de la colonia. Las jaulas se inspeccionan a diario a partir de los 18 días tras el aparea ­
miento. Se registran, en el momento del nacimiento, el tamaño de 
la camada y el sexo de la descendencia F
 2 , y se descartan luego 
las crías. Si se estudia la descendencia femenina F  1 , se conserva 
la descendencia F  2 procedente de camadas pequeñas para un 
análisis en mayor profundidad. Las hembras portadoras de una 
translocación se someten a verificación por análisis citogenético 
de una translocación en cualquiera de sus descendientes machos. Las hembras XO se identifican por la modificación de sexos en su descendencia, que pasa de 1:1 a 1:2 machos/hembras. En un 
método secuencial, los machos F
 1 normales no se someten a 
nueva verificación si la primera camada F  2 alcanza o supera un 
valor normal predeterminado; de lo contrario, se observan una segunda y una tercera camadas F
 2 . 
Los animales F  1 que no puedan clasificarse como normales tras 
observación de hasta un máximo de tres camadas F  2 se some­
ten a un nuevo control mediante análisis del contenido uterino de sus compañeras femeninas, o sufren directamente análisis 
citogenético.  
Análisis del contenido uterino:  La reducción del tamaño de las 
camadas en los portadores de translocaciones se debe a la muerte 
de embriones, por lo que un número alto de implantes muertos 
indica la presencia de una translocación en el animal sometido a la prueba. Cada macho F
 1 estudiado se aparea con 2 o 3 hem ­
bras. Se comprueba si existe concepción mediante el examen 
matinal diario para descubrir la presencia de tapones vaginales. 
Las hembras se sacrifican 14 o 16 días después, y se registra el número de implantes vivos y muertos presentes en su útero. 
b) Análisis citogenético 
Se obtienen preparaciones de testículos por el método de secado 
con aire. Los portadores de translocaciones se identifican por la presencia de configuraciones multivalentes en diacinesis metafase I en los espermatocitos primarios. La observación de al menos 
dos células con una asociación multivalente constituye la prueba 
necesaria de que el animal estudiado es portador de una trans ­
locación. 
Si no se ha realizado selección mediante análisis de la fecundi ­
dad, se practica estudio citogenético en todos los machos F
 1 . 
Deben analizarse al microscopio un mínimo de 25 células en diacinesis/metafase I por macho. En los machos F
 1 con testículos 
pequeños y que presenten una detención meiótica antes de la 
diacinesis, o en las hembras F  1 que se sospeche sean XO, es 
necesario el examen de las metafases mitóticas en los esperma ­
togonios o en la médula ósea. La presencia de un cromosoma desusadamente largo o corto en 10 células, demuestra la existen ­
cia de una translocación especial que origina la esterilidad del 
macho (tipo c-t). Algunas translocaciones X autosomas que pro ­
vocan la esterilidad del macho solo pueden identificarse mediante un análisis de las bandas de cromosomas mitóticos. La presencia 
de 39 cromosomas en la totalidad de 10 micosis es demostrativa 
de un estado XO en una hembra.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados se presentarán en forma de tablas. 
Se registran, en el nacimiento y el destete para cada período de 
apareamiento, el tamaño medio de las camadas y la relación entre 
sexos.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
En lo que respecta a la evaluación de la fertilidad de los animales F  1 , 
se expondrán el tamaño medio de las camadas procedentes de todos 
los apareamientos normales, así como el tamaño de cada una de las surgidas de animales F
 1 portadores de translocación. En cuanto al 
análisis del contenido uterino, se harán constar el número medio de 
implantes vivos y muertos producto de apareamientos normales, y el 
de implantes vivos y muertos de cada apareamiento de portadores de translocación. 
Respecto al análisis citogenético de la diacinesis-metafase I, se enu ­
merarán el número de tipos diferentes de configuraciones multiva ­
lentes y el número total de células en cada portador de translocación. 
Se comunicarán el número total de apareamientos y la duración del 
período de apareamiento de los individuos estériles F
 1 . Se facilitarán 
asimismo el peso de los testículos y detalles del análisis citogenético. 
Para hembras XO, se dan resultados del tamaño medio de la camada, 
de la razón de sexos de la progenie F  2 y del análisis citogenético. 
Cuando se preseleccionan, por pruebas de fertilidad, posibles F  1 
portadores de translocación, las tablas deben incluir información 
relativa a cuántos de estos eran heterocigotos de translocación con ­
firmados. 
Se dan también datos de los experimentos de control negativo y 
control positivo.  
3. INFORME  
3.1. DATOS DE LA PRUEBA 
El informe incluirá los datos siguientes: 
— cepa de ratones, edad de los animales, pesos de los animales 
tratados, 
— número de animales reproductores de cada sexo en los grupos 
experimentales y de control, 
— condiciones de la prueba, descripción detallada del tratamiento, 
niveles de las dosis, disolventes, frecuencia de apareamientos, 
— número y sexo de los descendientes por cada hembra, número y 
sexo de los descendientes criados para análisis de translocación, 
— tiempos y criterios de análisis de translocación, 
— número y descripción detallada de los portadores de transloca ­
ción, incluyendo datos de reproducción y de contenido uterino, 
cuando proceda, 
— procedimientos citogenéticos y detalles del análisis microscópico, 
preferiblemente con fotografías, 
— evaluación estadística, 
— discusión de resultados, — interpretación de resultados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  ENSAYO DE TOXICIDAD ORAL SUBCRÓNICA TOXICIDAD 
ORAL POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (90 DÍAS) EN 
ROEDORES  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo de toxicidad oral subcrónica reproduce 
las directrices del documento OCDE TG 408 (1998).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Al determinar y evaluar las características tóxicas de una sustancia 
química, el estudio de la toxicidad oral subcrónica por administra ­
ción continuada puede estar indicado cuando los ensayos de toxici ­
dad aguda o por administración continuada durante 28 días hayan proporcionado información relativa a la toxicidad. El estudio de 90 días aporta información sobre los peligros que puede presentar para 
la salud una exposición continuada durante un período prolongado, 
que abarque la maduración posterior al destete y el crecimiento hasta la edad adulta. La información obtenida se refiere a los efectos tóxicos principales, los órganos diana y la posibilidad de acumula ­
ción, y puede proporcionar una estimación de la dosis de exposición 
sin efectos adversos observados, que puede emplearse para seleccio ­
nar las dosis de los estudios de toxicidad crónica y establecer los criterios de inocuidad de la exposición humana. 
El presente método hace especial hincapié en los parámetros neuro ­
lógicos y proporciona una indicación de los efectos sobre el sistema 
inmunitario y la reproducción. Cabe destacar la necesidad de realizar observaciones clínicas detenidas de los animales, a fin de obtener la máxima información posible. El método sirve para detectar sustan ­
cias químicas que pueden tener efectos tóxicos sobre el sistema 
nervioso, inmunitario o los órganos reproductores, lo cual puede justificar la realización de estudios más exhaustivos. 
Véase también la introducción general de la Parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Dosis:  cantidad de sustancia de ensayo administrada. Se expresa en 
peso (g, mg), en peso de sustancia de ensayo por unidad de peso del 
animal (por ejemplo, mg/kg) o en concentración constante en la dieta 
(ppm).  
Posología:  termino general que abarca la dosis administrada, su 
frecuencia y duración.  
NOAEL:  sigla inglesa referente a la dosis de exposición sin efectos 
adversos observados, es decir, la dosis más alta a la que no se observa ningún efecto adverso debido al tratamiento.
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se administra diariamente la sustancia de ensayo por vía oral en 
dosis graduadas a distintos lotes de animales de experimentación, a 
razón de una dosis por lote durante 90 días. A lo largo del período de administración, se observa atentamente a los animales por si aparecen signos de toxicidad. Se practica la autopsia a los animales 
que mueran o sean sacrificados durante el ensayo, así como a los que 
sobrevivan al final del mismo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación de los animales  
Deben emplearse animales sanos, que se hayan mantenido al menos 
5 días en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que 
no hayan sido sometidos a experimentos previos. Se caracteriza la 
especie, cepa, procedencia, sexo, peso y/o edad de los animales de experimentación. Estos se reparten al azar entre los lotes tratados y los de control. Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al 
mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Se asigna a 
cada animal un número de identificación distinto.
 
1.4.2.  Preparación de las dosis  
La sustancia de ensayo se administra por sonda o con el alimento o 
el agua de bebida. El método de administración oral depende del 
objetivo del estudio y de las propiedades fisicoquímicas de la sus ­
tancia. 
En caso necesario, la sustancia de ensayo se disuelve o suspende en 
un vehículo adecuado. Se recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, 
después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en 
aceite de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehícu ­
los. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus características toxicológicas. Debe determinarse la estabilidad de la 
sustancia de ensayo en las condiciones de administración.
 
1.4.3.  Condiciones del ensayo  
1.4.3.1.  Animales de experimentación  
La especie idónea es la rata, si bien pueden emplearse otras especies 
de roedores como el ratón. Hay que utilizar animales adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio habitual. Las hembras han de ser 
nulíparas y no grávidas. La administración ha de empezar lo antes 
posible tras el destete y, en cualquier caso, antes de que los animales tengan nueve semanas de edad. Al principio del experimento, la diferencia de peso entre los animales empleados ha de ser mínima 
y no superar el ± 20 % del peso medio de cada sexo. Cuando el 
ensayo se realice, como fase previa de un estudio de toxicidad crónica a largo plazo, deben utilizarse en ambos estudios, animales de la misma cepa y procedencia.
 
1.4.3.2.  Número y sexo  
Deben utilizarse por lo menos 20 animales (10 hembras y 
10 machos) para cada dosis. Si se van a sacrificar animales durante 
el experimento, habrá que añadir el número de animales que se haya previsto sacrificar antes de acabar el estudio. Sobre la base de los conocimientos previos relativos a la sustancia química u otra sustan ­
cia muy próxima, puede tratarse un lote satélite de 10 animales (5 de 
cada sexo) en el control y con la dosis más elevada para observar la reversibilidad o persistencia de efectos tóxicos una vez finalizado el tratamiento. La duración del período de observación posterior al 
tratamiento ha de establecerse adecuadamente en función de los 
efectos observados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Posología  
Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control, salvo 
si se lleva a cabo un ensayo límite (véase el punto 1.4.3.4). Para establecer las dosis pueden emplearse los resultados de los estudios 
de administración continuada o de determinación de dosis y debe 
tomarse en consideración toda la información toxicológica y toxico ­
cinética disponible sobre la sustancia de ensayo o productos afines. A menos que las características fisicoquímicas o los efectos biológi ­
cos de la sustancia de ensayo impongan restricciones, la dosis supe ­
rior debe seleccionarse con el propósito de inducir efectos tóxicos, pero sin llegar a provocar la muerte ni un sufrimiento intenso. Se 
selecciona una serie de dosis decrecientes para poner de manifiesto 
las respuestas en función de la dosis. La dosis mínima será la dosis sin efectos adversos observados (NOAEL). Los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer las dosis decrecientes 
y a menudo es preferible añadir un cuarto lote de ensayo en lugar de 
utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo, con un factor superior a 6-10) entre dosis. 
El lote de control no recibe la sustancia de ensayo, pero sí recibe el 
vehículo en caso de que este se utilice para la sustancia. A excepción de la administración de la sustancia de ensayo, los animales del lote de control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de 
ensayo. Si se emplea un vehículo, el lote de control ha de recibir el 
mayor volumen utilizado. Si la sustancia de ensayo se administra con los alimentos y provoca una disminución de la ingesta, puede ser útil utilizar un lote de control alimentado en paralelo para saber si la 
disminución se debe a las características organolépticas o a altera ­
ciones toxicológicas del modelo de ensayo. 
Debe prestarse atención a las siguientes características del vehículo u 
otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribu ­
ción, metabolismo o retención de la sustancia de ensayo; efectos sobre las propiedades químicas de la sustancia de ensayo que puedan modificar su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y 
agua o sobre el estado nutricional de los animales.
 
1.4.3.4.  Ensayo límite  
Si en un ensayo con una sola dosis equivalente, al menos, a 1 000 
mg/kg peso corporal/día y siguiendo el procedimiento descrito en el 
presente estudio, no se produce ningún efecto adverso observable y si, a la luz de los datos de sustancias estructuralmente afines, no cabe esperar efectos tóxicos, puede considerarse innecesario realizar un 
estudio completo con tres dosis. El ensayo límite es válido excepto 
cuando la exposición humana indique la necesidad de utilizar una dosis superior.
 
1.5. PROCEDIMIENTO  
1.5.1.  Administración de las dosis  
Las dosis de ensayo se administran diariamente a los animales du ­
rante 90 días. Cualquier otra posología, por ejemplo, de 5 días por semana, debe justificarse. Si la sustancia de ensayo se administra por 
sonda, debe hacerse en una sola dosis y con una sonda gástrica o una 
cánula de intubación adecuada. El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal y no debe superar 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de 
las soluciones acuosas, en que puede llegarse a 2 ml/100 g de peso 
corporal. Excepto en el caso de sustancias irritantes o corrosivas que provoquen normalmente efectos exacerbados a concentraciones su ­
periores, la variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al 
mínimo ajustando la concentración para que el volumen sea cons ­
tante en todas las dosis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
En el caso de sustancias administradas con los alimentos o el agua 
de bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sus ­
tancia de ensayo administradas no interfieren con la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. Cuando la sustancia de ensayo se administre con los alimentos, puede utilizarse una concentración constante en la 
dicta (ppm) o bien una dosis constante en términos de peso corporal 
de los animales, pero debe indicarse qué método se ha elegido. Si la sustancia se administra por sonda, la dosis debe darse todos los días a la misma hora y ajustarse según sea necesario para mantener una 
dosis constante en términos de peso corporal del animal. Si se realiza 
un estudio de 90 días como fase previa de un estudio de toxicidad crónica a largo plazo, debe emplearse la misma dieta en ambos.
 
1.5.2.  Observaciones  
El período de observación debe durar al menos 90 días. Deben 
mantenerse animales en un lote satélite para las observaciones de seguimiento durante un período adecuado y sin tratamiento, a fin de 
detectar la persistencia o la desaparición de los efectos tóxicos. 
Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al 
día, preferentemente a la misma hora y teniendo en cuenta el período 
más agudo de los efectos previstos tras la administración. Se registra 
el estado clínico de los animales. Se examinan todos los animales al menos dos veces al día, por lo general a primera y a última hora, para detectar signos de morbilidad y mortalidad. 
Todos los animales deben someterse al menos a una observación 
clínica exhaustiva antes de la primera exposición (para poder realizar 
comparaciones en un mismo sujeto) y, después, a una por semana. 
Dichas observaciones han de efectuarse fuera de la jaula de aloja ­
miento, de preferencia en un ambiente normal y siempre a la misma hora. Las observaciones se registran cuidadosamente, preferente ­
mente mediante sistemas de puntuación definidos de forma explícita 
por el laboratorio de ensayo. Debe procurarse que las variaciones en las condiciones de observación sean mínimas. Los signos anotados deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios de la piel, 
pelo, ojos, mucosas, presencia de secreciones y excreciones y acti ­
vidad neurovegetativa (lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila, respiración anómala, etc.). Deben registrarse también los cambios en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la pre ­
sencia de movimientos clónicos o tónicos, o estereotipados (por 
ejemplo, realización excesiva de movimientos de limpieza o recorri ­
dos circulares repetitivos) o comportamientos anómalos (automutila ­
ción, marcha hacia atrás, etc.) (1). 
Debe realizarse una exploración oftalmológica con un oftalmoscopio 
o equipo similar adecuado antes de administrar la sustancia de en ­
sayo y al término del estudio, a ser posible en todos los animales, 
pero al menos en el lote con la dosis más alta y en el lote de control. Si se observan cambios oculares en esos animales, deben examinarse todos los demás. 
Hacia el final del período de exposición, pero en ningún caso antes 
de la undécima semana, debe evaluarse la reactividad sensorial frente 
a estímulos de distintos tipos (1) (por ejemplo, auditivos, visuales y 
propioceptivos) (2) (3) (4), la fuerza de prensión (5) y la actividad motriz (6). La bibliografía respectiva recoge más información sobre los métodos que pueden seguirse, si bien es posible emplear proce ­
dimientos distintos de los ahí descritos. 
Las observaciones funcionales hacia el final del estudio pueden omi ­
tirse si se dispone de datos sobre dichas observaciones realizadas en 
otros estudios y las observaciones clínicas diarias no ponen de ma ­
nifiesto alteraciones funcionales.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
De forma excepcional, también pueden omitirse las observaciones 
funcionales en los lotes que muestren signos de toxicidad de otro 
tipo tales que interfieran significativamente con los resultados de las pruebas funcionales.
 
1.5.2.1.  Peso corporal y consumo de alimentos y agua  
Al menos una vez por semana deben pesarse todos los animales, 
medirse el consumo de alimentos y, si la sustancia de ensayo se 
administra con el agua de bebida, también el consumo de agua. Este último puede vigilarse, asimismo, en los estudios en que la sustancia de ensayo se administra con los alimentos o mediante 
sonda y la ingestión de agua pueda verse alterada.
 
1.5.2.2.  Hematología y bioquímica clínica  
Las muestras de sangre deben tomarse de un punto indicado y con ­
servarse, si procede, en condiciones adecuadas. Al final del período de ensayo, las muestras se toman justo antes del sacrificio de los 
animales o como parte del método de sacrificio. 
Deben practicarse los siguientes exámenes hematológicos al final del 
período de ensayo y con las muestras tomadas a lo largo del mismo: hematocrito, concentración de hemoglobina, recuento de eritrocitos, 
recuento de leucocitos y fórmula leucocitaria, recuento de plaquetas 
y medida del tiempo o capacidad de coagulación sanguínea. 
Deben hacerse determinaciones bioquímicas para investigar efectos 
tóxicos importantes en los tejidos, y especialmente en el riñón y el hígado, con muestras sanguíneas obtenidas de todos los animales 
justo antes de su sacrificio o como parte del método de sacrificio 
(aparte de los moribundos o sacrificados a lo largo del ensayo). Al igual que los exámenes hematológicos, los análisis de bioquímica clínica pueden realizarse en muestras tomadas en el transcurso del 
ensayo. Se recomienda que los animales estén en ayunas desde el día 
anterior a la toma de muestras (
 1 ). Los parámetros medidos en el 
plasma y el suero deben incluir las concentraciones de sodio, pota ­
sio, glucosa, colesterol total, urea, nitrógeno residual en sangre, 
creatinina, proteínas totales y albúmina, y al menos dos enzimas 
indicadoras de los efectos hepatocelulares (alanina aminotrans-ferasa, aspartato aminotransferasa, fosfatasa alcalina, gamma-glutamil trans ­
peptidasa o sorbitol deshidroge-nasa). La determinación de otras 
enzimas (de origen hepático o no) y de ácidos biliares puede pro ­
porcionar información útil en ciertas circunstancias. 
Pueden realizarse, con carácter facultativo, las siguientes determina ­
ciones en la última semana del estudio utilizando la recogida pro ­
gramada de orina: aspecto, volumen, osmolalidad o densidad, pH, 
proteínas, glucosa, sangre y células sanguíneas. 
Además de ello, debe plantearse el estudio de los marcadores séricos 
de lesiones tisulares generales. Otras determinaciones que deben 
realizarse si se sabe o sospecha que las propiedades conocidas de 
la sustancia de ensayo pueden afectar a las funciones metabólicas correspondientes incluyen la concentración de calcio, fósforo, trigli ­
céridos en ayunas, hormonas específicas, metahemoglobina y coli ­
nesterasa. Debe valorarse la necesidad de hacer estos análisis con las 
sustancias de determinadas clases o bien según cada caso.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) El ayuno desde la víspera es preferible para ciertas medidas en el suero y el plasma, 
sobre todo para la determinación de glucosa. La razón principal es que el aumento de la 
variabilidad que provocaría necesariamente la toma de alimentos podría enmascarar 
efectos más sutiles y dificultar la interpretación. Por otra parte, no obstante, el ayuno 
desde la víspera puede inferir con el metabolismo general de los animales y, especial ­
mente en los estudios en que la sustancia de ensayo se administra en los alimentos, 
puede alterar la exposición diaria a dicha sustancia. Si se opta por el ayuno desde la 
víspera, las determinaciones de bioquímica clínica deben realizarse después de las ob ­
servaciones funcionales del estudio.
 Por lo general, debe aplicarse un enfoque flexible, en función de las 
especies y los efectos observados o esperados con una sustancia 
determinada. 
Si los datos disponibles sobre antecedentes no son adecuados, debe 
plantearse la determinación de variables hematológicas y bioquímicas clínicas antes de iniciar la administración de la sustancia; por lo gene ­
ral, se desaconseja obtener dichos datos antes del tratamiento (7).
 
1.5.2.3.  Autopsia macroscópica  
Debe practicarse una autopsia macroscópica completa y detallada a 
todos los animales empleados en el estudio, que incluya un examen 
detenido de la superficie corporal externa, todos los orificios y las 
cavidades craneana, torácica y abdominal con su contenido. El híga ­
do, los riñones, cápsulas suprarrenales, testículos, epidí-dimos, útero, ovarios, timo, bazo, cerebro y corazón de todos los animales (aparte 
de los moribundos y/o sacrificados a lo largo del ensayo) han de 
limpiarse de los tejidos adherentes, según convenga, y pesarse lo antes posible tras la disección para evitar su desecación. 
Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el 
medio de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse: 
todas las lesiones macroscópicas, encéfalo (zonas representativas, 
con inclusión del cerebro, cerebelo y protuberancia), médula espinal (cervical, torácica media y lumbar), hipófisis, tiroides, paratiroides, timo, esófago, glándulas salivares, estómago, intestino delgado y 
grueso (incluidas las placas de Peyer), hígado, páncreas, riñones, 
cápsulas suprarrenales, bazo, corazón, tráquea y pulmones (conser ­
vados mediante inflado con fijador, seguido de inmersión), aorta, gónadas, útero, órganos sexuales secundarios, glándula mamaria de 
las hembras, próstata, vejiga urinaria, vesícula biliar (ratón), ganglios 
linfáticos (preferentemente un ganglio relacionado con la vía de administración y otro distante de la misma para tener en cuenta los efectos sistémicos), nervios periféricos (ciático o tibial), preferen ­
temente muy próximos al músculo, una sección de la médula ósea 
(y/o médula ósea aspirada y recién montada), piel y ojos (si se han observado cambios durante los exámenes oftalmológicos). Las ob ­
servaciones clínicas y de otro tipo pueden indicar la necesidad de 
examinar otros tejidos. También deben conservarse todos los posi ­
bles órganos diana, según las propiedades conocidas de la sustancia de ensayo.
 
1.5.2.4.  Examen histopatológico  
Es preciso practicar un examen histopatológico completo de los 
órganos y tejidos conservados de todos los animales del lote ex ­
puesto a la dosis más elevada y del lote de control. En caso de 
que se hayan observado cambios relacionados con el tratamiento 
en el lote con la dosis más elevada, estos exámenes se ampliarán a animales de todos los demás lotes tratados. 
Deben examinarse todas las lesiones macroscópicas. Si se utiliza un lote satélite, debe hacerse un examen histopatológico 
de los órganos y tejidos que presenten efectos en los grupos tratados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. RESULTADOS E INFORME  
2.1. RESULTADOS 
Deben proporcionarse datos de cada animal. Además, deben resu ­
mirse todos los datos en un cuadro que recoja, para cada lote de 
ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de 
animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de animales que presenten signos de toxicidad, una des ­
cripción de dichos signos (con inclusión del momento de su apa ­
rición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el porcentaje de animales afectado 
por cada tipo de lesión. 
Siempre que sea posible, deben evaluarse los resultados numéricos 
mediante un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. 
La elección de los métodos estadísticos y de los datos que vayan a analizarse debe efectuarse en la fase de diseño del estudio.
 
2.2. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
2.2.1.  Sustancia de ensayo:  
— naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas, 
— identificación química, 
— vehículo (si procede): justificación de la elección del vehículo, si 
es distinto del agua.  
2.2.2.  Especie sometida a ensayo:  
— especie y cepa empleada, 
— número, edad y sexo de los animales, 
— procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, etc., — peso de cada animal al inicio del ensayo.
 
2.2.3.  Condiciones de ensayo:  
— justificación de la elección de las dosis, 
— datos sobre la formulación de la sustancia de ensayo o su pre ­
paración con los alimentos, concentración obtenida, estabilidad y homogeneidad del preparado, 
— datos de la administración de la sustancia de ensayo, — dosis reales (mg/kg peso corporal/día) y factor de conversión de 
la concentración (ppm) de la sustancia de ensayo en los alimen ­
tos o en el agua de bebida a dosis reales, en su caso, 
— datos de la calidad de los alimentos y el agua.
 
2.2.4.  Resultados:  
— peso corporal y cambios en el mismo, 
— consumo de alimentos y de agua, en su caso, — datos de reacciones tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos 
de toxicidad,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas 
(reversibles o no), 
— resultados del examen oftalmológico, 
— evaluación de la actividad sensorial, fuerza de prensión y activi ­
dad motriz (si procede), 
— pruebas hematológicas con los correspondientes valores de refe ­
rencia, 
— pruebas de bioquímica clínica con los correspondientes valores 
de referencia, 
— peso corporal y peso de los órganos en el momento del sacrificio, 
y relación peso órgano/peso corporal, 
— hallazgos de la autopsia, — descripción pormenorizada de todas las observaciones histopato ­
lógicas, 
— datos sobre la absorción, si los hay, — tratamiento estadístico de los resultados, si procede. Discusión de los resultados. Conclusiones.
 
3. REFERENCIAS  
(1) IPCS (1986). Principies and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No. 60. 
(2) Tupper, D.E., Wallace. R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003. 
(3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9. 691-704. 
(4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, .M. (1991). Rat Strain 
and Stock Comparisons Using a Functional Observational Bat ­
tery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283. 
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A 
Method for the Routine Assessment of Foreand Hind-limb 
grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233- 
236. 
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter 
L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Com ­
parison of Motor Activity Experiments: Implication for Neuro ­
toxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609. 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al.  (1996). «Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Stu ­
dies», Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198-201.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  ENSAYO DE TOXICIDAD ORAL SUBCRÓNICA TOXICIDAD 
ORAL POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (90 DÍAS) EN 
NO ROEDORES  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo de toxicidad oral subcrónica reproduce 
las directrices del documento OCDE TG 409 (1998).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Al determinar y evaluar las características tóxicas de una sustancia 
química, el estudio de la toxicidad oral subcrónica por administra ­
ción continuada puede estar indicado cuando los ensayos de toxici ­
dad aguda o por administración continuada durante 28 días hayan proporcionado información relativa a la toxicidad. El estudio de 90 
días aporta información sobre los peligros que puede presentar para 
la salud una exposición continuada durante un período de creci ­
miento rápido hasta el principio de la edad adulta. La información obtenida se refiere a los efectos tóxicos principales, los órganos 
diana y la posibilidad de acumulación, y puede proporcionar una 
estimación de la dosis de exposición sin efectos adversos observa ­
dos, que puede emplearse para seleccionar las dosis de los estudios de toxicidad crónica y establecer los criterios de inocuidad de la 
exposición humana. 
El presente ensayo pone de manifiesto los efectos adversos, en ani ­
males no roedores, de la exposición a sustancias químicas y está 
indicado solo en los casos siguientes: 
— cuando los efectos observados en otros estudios indiquen la ne ­
cesidad de aclarar y precisar algunos aspectos en una especie no roedora, o 
— cuando los estudios toxicocinéticos indiquen que los animales de 
experimentación idóneos han de pertenecer a una especie deter ­
minada no roedora, o 
— cuando haya otros motivos concretos para emplear una especie 
no roedora. 
Véase también la introducción general de la Parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Dosis:  cantidad de sustancia de ensayo administrada. Se expresa en 
peso (g, mg), en peso de sustancia de ensayo por unidad de peso del animal (por ejemplo, mg/kg) o en concentración constante en la dieta 
(ppm).  
Posología:  término general que abarca la dosis administrada, su 
frecuencia y duración.  
NOAEL:  sigla inglesa referente a la dosis de exposición sin efectos 
adversos observados, es decir, la dosis más alta a la que no se observa ningún efecto adverso debido al tratamiento.
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se administra diariamente la sustancia de ensayo por vía oral en 
dosis graduadas a distintos lotes de animales de experimentación, a 
razón de una dosis por lote durante 90 días. A lo largo del período de administración, se observa atentamente a los animales por si aparecen signos de toxicidad. Se practica la autopsia a los animales 
que mueran o sean sacrificados durante el ensayo, así como a los que 
sobrevivan al final del mismo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Selección de la especie animal  
Suele emplearse el perro, preferiblemente de una raza definida. Con 
frecuencia se utiliza el sabueso. También pueden emplearse otras 
especies como el cerdo o el cerdo enano. No se recomiendan los 
primates; su uso ha de justificarse. Deben emplearse animales jóve ­
nes y sanos y, en el caso del perro, la administración de sustancia de ensayo debe comenzar preferiblemente a la edad de 4-6 meses, pero 
nunca después de los 9 meses. Si el ensayo se realiza como fase 
previa de un estudio de toxicidad crónica a largo plazo, deben uti ­
lizarse en ambos estudios animales de la misma especie y raza.
 
1.4.2.  Preparación de los animales  
Deben emplearse animales jóvenes y sanos, que se hayan mantenido 
en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no 
hayan sido sometidos a experimentos previos. La duración de la aclimatación dependerá de la especie de ensayo seleccionada y de su procedencia: se recomienda un mínimo de 5 días para los perros y 
los cerdos criados con ese propósito en un animalario del laboratorio, 
y de dos semanas si proceden de una fuente exterior. Se caracteriza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y/o edad de los animales de experimentación. Estos se reparten al azar entre los lotes tratados y 
los de control. Las jaulas se ponen de forma que se reduzcan al 
mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Se asigna a cada animal un número de identificación distinto.
 
1.4.3.  Preparación de las dosis  
La sustancia de ensayo se administra con el alimento o el agua de 
bebida, por sonda o en cápsulas. El método de administración oral 
depende del objetivo del estudio y de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia. 
En caso necesario, la sustancia de ensayo se disuelve o suspende en 
un vehículo adecuado. Se recomienda considerar en primer lugar, 
siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, 
después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehícu ­
los. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus 
características toxicoló-gicas. Debe determinarse la estabilidad de la 
sustancia de ensayo en las condiciones de administración.
 
1.5. PROCEDIMIENTO  
1.5.1.  Número y sexo de los animales  
Deben utilizarse por lo menos 8 animales (4 hembras y 4 machos) 
para cada dosis. Si se van a sacrificar animales durante el experi ­
mento, habrá que añadir el número de animales que se haya previsto 
sacrificar antes de acabar el estudio. El número de animales vivos al término del estudio debe permitir una evaluación significativa de los efectos tóxicos. Sobre la base de los conocimientos previos relativos 
a la sustancia química u otra sustancia muy próxima, puede tratarse 
un lote satélite de 8 animales (4 de cada sexo) en el control y con la dosis más elevada para observar la reversibilidad o persistencia de efectos tóxicos una vez finalizado el tratamiento. La duración del 
período de observación posterior al tratamiento ha de establecerse 
adecuadamente en función de los efectos observados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Posología  
Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control, salvo 
si se lleva a cabo un ensayo límite (véase el punto 1.5.3). Para establecer las dosis pueden emplearse los resultados de los estudios 
de administración continuada o de determinación de dosis y debe 
tomarse en consideración toda la información toxi-cológica y toxi ­
cocinética disponible sobre la sustancia de ensayo o productos afi ­
nes. A menos que las características fisicoquímicas o los efectos 
biológicos de la sustancia de ensayo impongan restricciones, la dosis 
superior debe seleccionarse con el propósito de inducir efectos tóxi ­
cos, pero sin llegar a provocar la muerte ni un sufrimiento intenso. 
Se selecciona una serie de dosis decrecientes para poner de mani ­
fiesto las respuestas en función de la dosis. La dosis mínima será la dosis sin efectos adversos observados (NOAEL). Los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer las dosis de ­
crecientes y a menudo es preferible añadir un cuarto lote de ensayo 
en lugar de utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo, con un factor superior a 6-10) entre dosis. 
El lote de control no recibe la sustancia de ensayo, pero sí recibe el 
vehículo en caso de que este se utilice para la sustancia. A excepción 
de la administración de la sustancia de ensayo, los animales del lote 
de control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de ensayo. Si se emplea un vehículo, el lote de control ha de recibir el mayor volumen utilizado. Si la sustancia de ensayo se administra con 
los alimentos y provoca una disminución de la ingesta, puede ser útil 
utilizar un lote de control alimentado en paralelo para saber si la disminución se debe a las características organolépticas o a altera ­
ciones toxicológicas del modelo de ensayo. 
Debe prestarse atención a las siguientes características del vehículo u 
otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribu ­
ción, metabolismo o retención de la sustancia de ensayo, efectos sobre las propiedades químicas de la sustancia de ensayo que puedan modificar su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y 
agua o sobre el estado nutricional de los animales.
 
1.5.3.  Ensayo límite  
Si en un ensayo con una sola dosis equivalente, al menos, a 1 000 
mg/kg peso corporal/día y siguiendo el procedimiento descrito en el presente estudio, no se produce ningún efecto adverso observable y si, a la luz de los datos de sustancias estructuralmente afines, no cabe 
esperar efectos tóxicos, puede considerarse innecesario realizar un 
estudio completo con tres dosis. El ensayo límite es válido excepto cuando la exposición humana indique la necesidad de utilizar una dosis superior.
 
1.5.4.  Administración de las dosis  
Las dosis de ensayo se administran diariamente a los animales du ­
rante 90 días. Cualquier otra posología, por ejemplo, de 5 días por 
semana, debe justificarse. Si la sustancia de ensayo se administra por sonda, debe hacerse en una sola dosis y con una sonda gástrica o una cánula de intubación adecuada. El volumen máximo de líquido que 
puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. 
Por lo general, el volumen ha de ser el mínimo posible. Excepto en el caso de sustancias irritantes o corrosivas que provoquen normal ­
mente efectos exacerbados a concentraciones superiores, la variabi ­
lidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la 
concentración para que el volumen sea constante en todas las dosis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
En el caso de sustancias administradas con los alimentos o el agua 
de bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sus ­
tancia de ensayo administradas no interfieren con la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. Cuando la sustancia de ensayo se administre con los alimentos, puede utilizarse una concentración constante en la 
dieta (ppm) o bien una dosis constante en términos de peso corporal 
de los animales, pero debe indicarse qué método se ha elegido. Si la sustancia se administra por sonda o en cápsulas, la dosis debe darse todos los días a la misma hora y ajustarse según sea necesario para 
mantener una dosis constante en términos de peso corporal del ani ­
mal. Si se realiza un estudio de 90 días como fase previa de un estudio de toxicidad crónica a largo plazo, debe emplearse la misma dieta en ambos.
 
1.5.5.  Observaciones  
El período de observación debe durar al menos 90 días. Deben 
mantenerse animales en un lote satélite para las observaciones de 
seguimiento durante un período adecuado y sin tratamiento, a fin de 
detectar la persistencia o la desaparición de los efectos tóxicos. 
Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al 
día, preferentemente a la misma hora y teniendo en cuenta el período más agudo de los efectos previstos tras la administración. Se registra el estado clínico de los animales. Se examinan todos los animales al 
menos dos veces al día, por lo general a primera y a última hora, 
para detectar signos de morbilidad y mortalidad. 
Todos los animales deben someterse al menos a una observación 
clínica exhaustiva antes de la primera exposición (para poder realizar comparaciones en un mismo sujeto) y, después, a una por semana. 
Dichas observaciones han de efectuarse, si es posible, fuera de la 
jaula de alojamiento en un ambiente normal y de preferencia siempre a la misma hora. Debe procurarse que las variaciones en las condi ­
ciones de observación sean mínimas. Los signos de toxicidad han de 
anotarse cuidadosamente, así como el momento de aparición, la 
gravedad y la duración. Las observaciones deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios de la piel, pelo, ojos, mucosas, pre ­
sencia de secreciones y excreciones y actividad neurovegetativa (la ­
grimeo, piloerección, tamaño de la pupila, respiración anómala, etc.). 
Deben registrarse también los cambios en la marcha, postura y res ­
puesta a la manipulación, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, o estereotipados (por ejemplo, realización exce ­
siva de movimientos de limpieza o recorridos circulares repetitivos) 
o comportamientos anómalos. 
Debe realizarse una exploración oftalmológica con un oftalmoscopio 
o equipo similar adecuado antes de administrar la sustancia de en ­
sayo y al término del estudio, a ser posible, de todos los animales, pero al menos en el lote con la dosis más alta y en el lote de control. 
Si se observan en esos animales cambios oculares relacionados con 
el tratamiento, deben examinarse todos los demás.
 
1.5.5.1.  Peso corporal y consumo de alimentos y agua  
Al menos una vez por semana deben pesarse todos los animales, 
medirse el consumo de alimentos y, si la sustancia de ensayo se administra con el agua de bebida, también el consumo de agua. Este último puede vigilarse, asimismo, en los estudios en que la 
sustancia de ensayo se administra con los alimentos o mediante 
sonda y la ingestión de agua pueda verse alterada.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hematología y bioquímica clínica  
Las muestras de sangre deben tomarse de un punto indicado y con ­
servarse, si procede, en condiciones adecuadas. Al final del período de ensayo, las muestras se toman justo antes del sacrificio de los 
animales o como parte del método de sacrificio. 
Al principio del ensayo y, a continuación, bien una vez al mes bien a 
la mitad del período de ensayo, así como al término del mismo, debe practicarse un examen hematológico) que incluya hematocrito, con ­
centración de hemoglobina, recuento de eritrocitos, recuento de leu ­
cocitos y fórmula leucocitaria, recuento de plaquetas y medida de la capacidad de coagulación como el tiempo de coagulación, de pro ­
trombina o de trom-boplastina. 
Deben hacerse determinaciones bioquímicas para investigar efectos 
tóxicos importantes en los tejidos, y especialmente en el riñón y el hígado, con muestras sanguíneas obtenidas de todos los animales al principio del ensayo y, a continuación, bien una vez al mes bien a la 
mitad del período de ensayo, así como al término del mismo. Debe 
estudiarse el equilibrio electrolítico, el metabolismo glucídico y las funciones hepática y renal. La elección de determinados análisis dependerá de las observaciones sobre el modo de actuación de la 
sustancia de ensayo. Los animales deben estar en ayunas antes de las 
tomas de sangre, durante un período adecuado según la especie. Se propone determinar el calcio, fósforo, cloro, sodio, potasio, glucosa en ayunas, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, or ­
nitina descarboxilasa, gamma-gluta-mil transpeptidasa, nitrógeno re ­
sidual, albúmina, creatinina en sangre, bilirrubina total y proteínas séricas totales. 
Deben practicarse análisis de orina, como mínimo, al inicio, a la 
mitad y al final del ensayo, utilizando la recogida programada, con 
el fin de estudiar los parámetros siguientes: aspecto, volumen, os ­
molalidad o densidad, pH, proteínas, glucosa, sangre y células san ­
guíneas. Si es necesario, pueden analizarse otros parámetros adicio ­
nales para profundizar el estudio de los efectos observados. 
Además de ello, debe plantearse el estudio de los marcadores de lesio ­
nes tisulares generales. Para realizar una evaluación toxicológica ade ­
cuada pueden ser necesarias otras determinaciones como el análisis de 
los lípidos, hormonas, equilibrio ácido-básico, metahemoglobina e in ­
hibición de la colinesterasa. Si es preciso, pueden realizarse análisis de bioquímica clínica adicionales para profundizar el estudio de los efec ­
tos observados. Debe valorarse la necesidad de hacer estos análisis con 
las sustancias de determinadas clases o bien según cada caso. 
Por lo general, debe aplicarse un enfoque flexible, en función de las 
especies y los efectos observados o esperados con una sustancia determinada.
 
1.5.5.3.  Autopsia macroscópica  
Debe practicarse una autopsia macroscópica completa y detallada a 
todos los animales empleados en el estudio, que incluya un examen detenido de la superficie corporal externa, todos los orificios y las cavidades craneana, torácica y abdominal con su contenido. El hí ­
gado y la vesícula biliar, los riñones, cápsulas suprarrenales, testícu ­
los, epidídimos, ovarios, útero, glándulas tiroides y paratiroides, ti ­
mo, bazo, cerebro y corazón de todos los animales (aparte de los moribundos y/o sacrificados a lo largo del ensayo) han de limpiarse 
de los tejidos adherentes, según convenga, y pesarse lo antes posible 
tras la disección para evitar su desecación.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el 
medio de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de 
tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse: todas las lesiones macroscópicas, encéfalo (zonas representativas, con inclusión del cerebro, cerebelo y protuberancia), médula espinal 
(cervical, torácica media y lumbar), hipófisis, ojos, tiroides, parati ­
roides, timo, esófago, glándulas salivares, estómago, intestino del ­
gado y grueso (incluidas las placas de Peyer), hígado, vesícula biliar, páncreas, riñones, cápsulas suprarrenales, bazo, corazón, tráquea y 
pulmones, aorta, gónadas, útero, órganos sexuales secundarios, glán ­
dula mamaria de las hembras, próstata, vejiga urinaria, ganglios linfáticos (de preferencia un ganglio relacionado con la vía de ad ­
ministración y otro distante de la misma para tener en cuenta los 
efectos sistémicos), nervios periféricos (ciático o tibial), preferente ­
mente muy próximos al músculo, una sección de la médula ósea (y/o médula ósea aspirada y recién montada) y piel. Las observaciones clínicas y de otro tipo pueden indicar la necesidad de examinar otros 
tejidos. También deben conservarse todos los posibles órganos diana, 
según las propiedades conocidas de la sustancia de ensayo.
 
1.5.5.4.  Examen histopatológico  
Es preciso practicar un examen histopatológico completo de los 
órganos y tejidos conservados, al menos, de todos los animales del lote expuesto a la dosis más elevada y del lote de control. En caso de que se hayan observado cambios relacionados con el tratamiento en 
el lote con la dosis más elevada, este examen se ampliará a animales 
de todos los demás lotes tratados. 
Deben examinarse todas las lesiones macroscópicas. 
Si se utiliza un lote satélite, debe hacerse un examen histopatológico 
de los órganos y tejidos que presenten efectos en los grupos tratados.
 
2. RESULTADOS E INFORME  
2.1. RESULTADOS 
Deben proporcionarse datos de cada animal. Además, deben resu ­
mirse todos los datos en un cuadro que recoja, para cada lote de 
ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por ra ­
zones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número 
de animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo 
de lesiones y el porcentaje de animales afectado por cada tipo de 
lesión. 
Siempre que sea posible, deben evaluarse los resultados numéricos 
mediante un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. 
La elección de los métodos estadísticos y de los datos que vayan a analizarse debe efectuarse en la fase de diseño del estudio.
 
2.2. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Sustancia de ensayo:  
— naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas, 
— identificación química, — vehículo (si procede): justificación de la elección del vehículo, si 
es distinto del agua.
 
2.2.2.  Especie sometida a ensayo:  
— especie y cepa empleada, 
— número, edad y sexo de los animales, — procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, etc., — peso de cada animal al inicio del ensayo.
 
2.2.3.  Condiciones de ensayo:  
— justificación de la elección de las dosis, 
— datos sobre la formulación de la sustancia de ensayo o su pre ­
paración con los alimentos, concentración obtenida, estabilidad y homogeneidad del preparado, 
— datos de la administración de la sustancia de ensayo, — dosis reales (mg/kg peso corporal/día) y factor de conversión de 
la concentración (ppm) de la sustancia de ensayo en los alimen ­
tos o en el agua de bebida a dosis reales, en su caso, 
— datos de la calidad de los alimentos y el agua.
 
2.2.4.  Resultados:  
— peso corporal y cambios en el mismo, 
— consumo de alimentos y de agua, en su caso, — datos de reacciones tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos 
de toxicidad, 
— naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas 
(reversibles o no), 
— examen oftalmológico, — pruebas hematológicas con los correspondientes valores de refe ­
rencia, 
— pruebas de bioquímica clínica con los correspondientes valores 
de referencia, 
— peso corporal y peso de los órganos en el momento del sacrificio, 
y relación peso órgano/peso corporal, 
— hallazgos de la autopsia, — descripción pormenorizada de todas las observaciones histopato ­
lógicas, 
— datos sobre la absorción, si los hay, — tratamiento estadístico de los resultados, si procede. Discusión de los resultados. 
Conclusiones.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  TOXICIDAD DÉRMICA SUBCRÓNICA ENSAYO DE 90 DÍAS 
EN ROEDORES  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIONES 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se aplican a diario dosis crecientes de la sustancia estudiada en la 
piel de animales de experimentación integrados en varios grupos, a razón de una dosis por grupo durante un período de 90 días. Durante 
el período de aplicación se observa diariamente a los animales en 
busca de signos de toxicidad. Los animales que mueren durante la prueba se someten a autopsia, que se practica también a los super ­
vivientes al concluir el estudio.
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Se mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y 
alimentación experimentales durante al menos 5 días previos a la 
prueba. Antes de comenzarla, se distribuye al azar a los animales, que serán jóvenes y sanos, para formar grupos de tratamiento y de 
control. Antes de proceder a la aplicación, se elimina el pelo de la 
región dorsal del tronco de los animales. Puede emplearse afeitado, pero deberá practicarse aproximadamente 24 horas antes de la prue ­
ba. Suelen ser necesarios cortes o afeitados reiterados del pelo, más o 
menos a intervalos semanales. Al practicarlos, hay que cuidar de no 
lesionar la piel. Deberá dejarse despejada, para la aplicación de la sustancia en estudio, una superficie no inferior al 10 % de la cor ­
poral. Para decidir la zona que debe despejarse y las dimensiones de 
la superficie a tratar, se tendrá en cuenta el peso del animal. Cuando 
se prueben sólidos, que pueden pulverizarse si se considera oportu ­
no, se humedecerá lo suficiente la sustancia estudiada con agua o, en caso necesario, un vehículo apropiado para garantizar un buen con ­
tacto con la piel. Las sustancias líquidas se emplean por lo general 
sin diluir. Se practican aplicaciones diarias 5 o 7 días a la semana.
 
Condiciones del ensayo  
A n i m a l e s d e e x p e r i m e n t a c i ó n 
Pueden emplearse ratas, conejos o cobayas adultos. Es posible em ­
plear otras especies, pero su uso exigiría justificación. Al principio de la prueba, los pesos no diferirán en un porcentaje superior al ± 20 % del peso medio. Cuando se realice una prueba dérmica sub ­
crónica como preliminar a una de índole crónica, se utilizará en 
ambas la misma especie y cepa.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
N ú m e r o y s e x o 
Se utilizarán al menos 20 animales (10 hembras y 10 machos) con 
piel sana para cada dosis. Las hembras serán nulíparas y no estarán preñadas. Si está previsto el sacrificio de algunos animales durante la prueba, debe aumentarse su número en una cantidad igual a la de los 
que vayan a sacrificarse antes de terminar el estudio. Además, puede 
tratarse a un grupo satélite de 20 animales (10 de cada sexo) con la dosis más alta durante 90 días para observar en ellos la reversibili ­
dad, la persistencia o la aparición tardía de efectos tóxicos durante 
28 días tras el tratamiento.
 
D o s i s 
Se utilizarán al menos tres niveles posológicos y un control, o un 
control para el vehículo si se emplea este. El período de exposición no será inferior a 6 horas diarias. La aplicación de la sustancia de prueba debe hacerse a las mismas horas todos los días, y la cantidad 
del producto se ajustará a intervalos (semanales o quincenales) de 
forma que se mantenga una dosis constante en relación con el peso del animal. Salvo por la omisión de la sustancia estudiada, los ani ­
males del grupo de control deben recibir un trato idéntico al de los 
integrantes del grupo de prueba. Cuando se utilice un vehículo para 
facilitar la administración, el grupo de control lo recibirá de igual modo que los grupos tratados, y en cantidad igual a la administrada al grupo con dosis más alta. La dosis más alta debe originar efectos 
tóxicos, pero producir pocos fallecimientos, o ninguno. La dosis más 
baja no debe originar signo alguno de toxicidad. Cuando se disponga de una estimación válida de la exposición humana, la dosis mínima será superior a ese valor. Lo ideal sería que la dosis media produjera 
el efecto tóxico mínimo observable. Si se emplea más de una dosis 
intermedia, la diferencia entre dosis será suficiente para que los efectos tóxicos resultantes sean escalonados. En los grupos con dosis bajas e intermedias, así como en los controles, la mortalidad debe ser 
baja, a fin de permitir una evaluación significativa de los resultados. 
Si la aplicación de la sustancia probada provoca una irritación cutá ­
nea grave, se reducirán las concentraciones, lo que quizá origine una 
reducción, o la ausencia, de otros efectos tóxicos con la dosis alta. Si 
la piel ha sufrido lesiones importantes, quizá sea necesario dar por concluido el estudio y emprender uno nuevo a concentraciones me ­
nores.
 
Prueba de límite  
Si una experiencia previa realizada con una dosis de 1 000 mg/kg, o 
superior, en función de la posibilidad de exposición humana (siem ­
pre que esta se conozca) no ha provocado efecto tóxico alguno, cabe considerar inútil la continuación de la experiencia.
 
Período de observación  
Es preciso observar a diario a los animales de experimentación en 
busca de signos de toxicidad. Hay que tomar nota del momento del 
fallecimiento y del de aparición y desaparición de signos de toxici ­
dad. ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
Procedimiento  
Los animales se alojarán en jaulas individuales. El régimen ideal 
comprende la administración, a los animales, de la sustancia ensa ­
yada los 7 días de la semana durante un período de 90 días. 
Los animales de grupos satélites destinados a observaciones comple ­
mentarias deben observarse 28 días más sin tratamiento para apreciar la recuperación de los efectos tóxicos, o su persistencia. El período de exposición diario será de 6 horas. 
La sustancia estudiada se aplicará uniformemente sobre una zona que 
corresponda aproximadamente al 10 % de la superficie corporal total. En caso de sustancias muy tóxicas, la zona tratada puede ser inferior, 
pero se cubrirá con una capa lo más uniforme y delgada posible. 
Durante la exposición, la sustancia estudiada se mantiene en contacto 
con la piel con ayuda de un apósito de gasa poroso y esparadrapo no 
irritante. Además, la zona tratada se cubrirá de forma que se man ­
tengan colocados el apósito y la sustancia y se impida a los animales la ingestión de esta. Cabe utilizar dispositivos de sujeción para evitar la ingestión de la sustancia objeto de estudio, pero no se recomienda 
la inmovilización completa. 
Al final del período de exposición, se eliminará la sustancia restante, 
siempre que sea posible, por medio de agua o algún otro método 
apropiado de limpieza de la piel. 
Es preciso observar a diario a todos los animales y registrar los signos 
de toxicidad, incluidos el momento de comienzo, el grado y la dura ­
ción. Entre las observaciones que deben practicarse sobre los animales 
enjaulados destacan las de modificaciones de la piel y el pelo, los ojos y las membranas mucosas, así como de los sistemas respiratorio, circu ­
latorio, autonómico y nervioso central, la actividad somatomotriz y el 
comportamiento. Cada semana, se determinarán el consumo de ali ­
mento y el peso de los animales. Son necesarias observaciones perió ­
dicas de los animales para evitar en lo posible la pérdida de alguno por causa de canibalismo, autólisis de tejidos o enjaulamiento erróneo. Al 
final del período de prueba, se realiza la autopsia a todos los supervi ­
vientes de los grupos de tratamiento no satélites. Los animales moribundos se retirarán y someterán a autopsia. 
En todos los animales, incluidos los controles, se practican habitual ­
mente los exámenes siguientes: 
a) Exploración oftalmológica con un oftalmoscopio o equipo apro ­
piado equivalente, antes de administrar la sustancia estudiada y al 
final del estudio, preferiblemente en todos los animales, pero por lo menos en los grupos con dosis altas y de control. Si se apre ­
ciaran alteraciones oculares, se examinará a todos los animales. 
b) Pruebas hematológicas al final del período de estudio: hemato ­
crito, concentración de hemoglobina, recuento eritrocitario, re ­
cuento y fórmula leucocitarios, y determinación de la coagulación 
por pruebas como tiempo de coagulación, tiempo de protrombina, 
tiempo de tromboplastina o recuento de plaquetas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) Determinaciones bioquímicas clínicas en la sangre al final del 
período de prueba. Se consideran aspectos de interés en todos 
los estudios el balance electrolítico, el metabolismo de hidratos de carbono y las funciones hepáticas y renal. En la selección de las pruebas concretas influirán las observaciones sobre el modo de 
acción de la sustancia. Se sugiere la determinación de los pará ­
metros siguientes: calcio, fósforo, cloruro, sodio, potasio, glucosa en ayunas (con período de ayuno apropiado a cada especie), transaminasas glutamicopirúvica (
 1 ) y gluamicooxaloacética (  2 ) 
séricas, ornitindescarboxilasa, gammaglutamiltranspeptidasa, ni ­
trógeno ureico, albúmina, creatinina plasmática, bilirrubina total y proteínas séricas totales. Entre otras determinaciones que pue ­
den ser necesarias para una evaluación toxicológica adecuada 
figuran los análisis de lípidos, hormonas, equilibrio acidobásico, 
metahemoglobina y actividad de colinesterasa. Siempre que sea preciso, se emplearán otras pruebas bioquímicas clínicas para ampliar la investigación de los efectos observados. 
d) El análisis de orina no es necesario de forma sistemática, sino 
solo en caso de efectos tóxicos probables o manifiestos. 
Si los datos de referencia previos son insuficientes, habrá que con ­
siderar la posible determinación de los parámetros hematológicos y 
de bioquímica clínica antes de iniciar la administración.
 
A u t o p s i a 
Se practicará en todos los animales una autopsia completa que com ­
prenda la inspección de la superficie externa del cuerpo, todos sus 
orificios y las cavidades craneal, torácica y abdominal y sus conte ­
nidos. Hígado, riñones, suprarrenales y testículos deben pesarse fres ­
cos lo antes posible tras la disección, a fin de evitar la desecación. Se 
conservarán en un medio adecuado para un posible examen histopa ­
tológico posterior los órganos y tejidos siguientes: todas las lesiones macroscópicas, el cerebro —incluidos cortes de bulbo/protuberan ­
cia—, corteza cerebelosa y encefálica, hipófisis, tiroides/paratiroides, 
tejido tímico, (tráquea), pulmones, corazón, aorta, (glándulas saliva ­
les), hígado, bazo, riñones, suprarrenales, páncreas, gónadas, útero, órganos genitales accesorios, vesícula biliar (si existe), esófago, es ­
tómago, duodeno, yeyuno, íleon, ciego, colon, recto, vejiga urinaria, 
ganglio linfático representativo, (glándula mamaria femenina), (mus ­
culatura del muslo), nervio periférico, (ojos), (esternón con médula ósea), (fémur, incluida superficie articular), (médula espinal a tres niveles: cervical, mesotorácico y lumbar) y (glándulas lagrimales 
exorbitarias). Los tejidos que aparecen entre paréntesis solo se exa ­
minarán si así lo aconsejan los signos de toxicidad o afectación del órgano efector.
 
E x a m e n h i s t o p a t o l ó g i c o 
a) Se someterán a un examen histopatológico completo la piel nor ­
mal y la tratada, y los órganos y tejidos de los animales de los grupos de control y los de dosis máxima. 
b) Se examinarán todas las lesiones macroscópicas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Conocida actualmente como alaninaminotransferasa sérica. 
( 2 ) Conocida actualmente como aspartatoaminotransferasa sérica.
 c) Se examinarán los órganos efectores de los animales de grupos 
con otras dosis. 
d) Si se utilizan ratas, se someterán los pulmones de los animales 
integrantes de los grupos con dosis mínimas e intermedias a 
examen histopatológico en busca de signos de infección, ya que esta medida permite una evaluación cómoda del estado de salud de los animales. Es posible que en los animales de estos grupos 
no sean necesarios por sistema exámenes histopatológicos com ­
plementarios, pero siempre se llevarán a cabo en los órganos de los del grupo con dosis máxima que presenten indicios de lesio ­
nes. 
e) Cuando se utilice un grupo satélite, se practicará un examen 
histopatológico de los tejidos y órganos que presenten signos 
de toxicidad en los grupos tratados.
 
2. RESULTADOS  
Los resultados se resumirán en forma de tabla, y mostrarán para cada 
grupo de prueba el número de animales al comienzo del ensayo, el de los que presenten lesiones y el porcentaje de animales con cada 
tipo de lesión. Los resultados se evaluarán por un método estadístico 
apropiado. Puede usarse cualquier método estadístico reconocido.
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá si fuera posible: 
— especie, cepa, origen, condiciones ambientales, alimentación, — condiciones de la prueba, — dosis (incluido el vehículo, si procede) y concentraciones, 
— datos de respuesta tóxica en función del sexo y la dosis, 
— dosis carente de efectos, si es posible, — momento de la muerte durante el estudio, o indicación de que los 
animales sobrevivieron a la experiencia, 
— descripción de los efectos tóxicos o de otro tipo, 
— momento de observación de cada signo anómalo y evolución de este, — datos sobre alimentación y peso, — hallazgos oftalmológicos, — pruebas hematológicas practicadas y sus resultados completos, — pruebas de bioquímica clínica empleadas y sus resultados com ­
pletos (incluidos los del análisis de orina, si procede), 
— hallazgos de autopsia,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— descripción detallada de los hallazgos histopatológicos, 
— tratamiento estadístico de los resultados, si es posible, — comentario de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  TOXICIDAD SUBCRÓNICA POR INHALACIÓN: ESTUDIO DE 90 
DÍAS  
RESUMEN 
El presente método de ensayo B.29 se ha diseñado para caracterizar debidamente 
la toxicidad por inhalación de una sustancia química después de una exposición 
subcrónica (90 días de duración), y para recabar datos robustos que permitan 
hacer una evaluación cuantitativa del riesgo por inhalación. Se forman lotes de al menos 10 roedores machos y 10 hembras y se exponen 6 horas al día durante un período de 90 días (13 semanas) a: a) la sustancia problema a tres o más niveles 
de concentración; b) aire filtrado (testigo negativo), y/o c) el vehículo (testigo del 
vehículo). Habitualmente los animales se exponen 5 días por semana, aunque se acepta una pauta de 7 días por semana. Se estudian siempre animales machos y hembras, pero pueden exponerse a diferentes niveles de concentración si se sabe 
que uno de los sexos es más sensible a la sustancia problema. Este método 
concede al director del estudio suficiente flexibilidad para incluir lotes satélite (reversibilidad), sacrificios durante el ensayo, lavados broncoalveolares (BAL), pruebas neurológicas y otras evaluaciones de patología clínica y de histopatología 
orientadas a caracterizar mejor la toxicidad de una sustancia problema.
 
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 413 de la 
OCDE (2009). Las directrices originales sobre ensayos de toxicidad sub ­
crónica por inhalación (TG 413) fueron adoptadas en 1981 (1). El presente método de ensayo B.29 [equivalente a las TG 413 (2009) revisadas] se ha 
actualizado para reflejar el estado actual de la ciencia y satisfacer las nece ­
sidades normativas actuales y futuras. 
2. Los estudios de toxicidad subcrónica por inhalación sirven fundamental ­
mente para establecer las concentraciones normativas que permitan evaluar 
el riesgo de los trabajadores en el entorno laboral. Permiten además evaluar 
el riesgo en la vivienda humana, el transporte y el medio ambiente. Este método permite caracterizar los efectos adversos que se producen después de la exposición por inhalación diaria continuada de una sustancia problema 
durante 90 días (aproximadamente el 10 % de la vida de la rata). A partir de 
los datos derivados de los estudios de toxicidad subcrónica por inhalación, se pueden hacer evaluaciones cuantitativas del riesgo y seleccionar las con ­
centraciones aplicables a los estudios de toxicidad crónica. El presente 
método de ensayo no está específicamente destinado a la investigación de 
nanomateriales. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se facilitan al final del presente capítulo y en el documento de orientación n
 o 39 (2).  
CONSIDERACIONES INICIALES 
3. Antes de comenzar el estudio y con el fin de mejorar su calidad y minimizar 
el sufrimiento animal, el laboratorio de ensayo tendrá en cuenta toda la 
información disponible acerca de la sustancia problema. En la selección de las concentraciones idóneas de estudio resulta útil toda información referente a: identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de 
la sustancia problema, resultados de anteriores ensayos de toxicidad  in vivo  
o in vitro,  uso(s) previsto(s) y posible exposición humana, datos de (Q)SAR 
previos y datos toxicológicos acerca de compuestos químicos estructural ­
mente afines, y resultados obtenidos en otros estudios de exposición conti ­
nuada. Si se prevé o se observa neurotoxicidad en el transcurso del estudio, 
el director del mismo puede decidir la incorporación de las evaluaciones pertinentes, como una batería de observación funcional (FOB) y registros de la actividad motriz. Si bien el calendario de las exposiciones en relación con 
las evaluaciones concretas puede ser crítico, la realización de estas activi ­
dades complementarias no debe interferir en el diseño básico del estudio.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Las diluciones de sustancias problema corrosivas o irritantes se pueden 
estudiar a concentraciones capaces de inducir el grado de toxicidad espera ­
do. Se ofrece más información en el documento de orientación n  o 39 (2). Al 
exponer los animales a estos productos, las concentraciones diana deben ser lo bastante bajas para no provocar un dolor y sufrimiento intensos, pero 
suficientes para obtener una curva de concentración-respuesta que satisfaga 
los objetivos científicos y normativos del ensayo. Dichas concentraciones se escogerán según cada caso, preferiblemente sobre la base de estudios del intervalo analítico debidamente diseñados que arrojen información sobre el 
parámetro crítico principal, el eventual umbral de irritación y el tiempo de 
aparición de los síntomas (véanse los puntos 11-13). Se justificará la elec ­
ción de las concentraciones. 
5. Los animales moribundos o que presenten signos evidentes de dolor o de 
sufrimiento intenso y duradero deben sacrificarse de forma compasiva. Los 
animales moribundos se contabilizan como muertes durante el ensayo. En el documento de orientación n
 o 19 de la OCDE sobre criterios de tratamiento 
compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (3) se dan criterios 
para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a sufri ­
miento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte es previsible o inminente.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
6. Hay que utilizar roedores adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio 
corriente. La especie preferida es la rata. Deberá justificarse el empleo de otra especie.
 
Preparación de los animales  
7. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. El día de la asignación 
aleatoria, los animales serán adultos jóvenes de entre 7 y 9 semanas de 
edad. Los pesos corporales se desviarán a lo sumo ± 20 % del peso medio 
de cada sexo. Se seleccionan al azar los animales, se marcan para permitir su identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes de iniciar el ensayo, a fin de que se aclimaten a las condiciones 
del laboratorio.
 
Zootecnia  
8. Los animales se identificarán de manera individual, preferiblemente con 
transpondedores subcutáneos, a fin de facilitar la observación y evitar con ­
fusiones. La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. La humedad relativa se mantendrá idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, 
si bien esto no siempre es posible cuando se usa el agua como vehículo. 
Antes y después de las exposiciones, los animales deberán enjaularse en principio por lotes de sexo y nivel de exposición, pero el número de ani ­
males por jaula será tal que permita la observación sin trabas de cada animal 
y minimice las pérdidas por agresiones y canibalismo. Cuando la exposición 
es solo por la nariz, puede ser necesario aclimatar a los animales a los tubos de sujeción. Estos no deberán ejercer sobre los animales tensiones físicas, térmicas o de inmovilización. La sujeción puede influir en parámetros fisio ­
lógicos como la temperatura corporal (hipertermia) o el volumen respiratorio 
por minuto. Si se dispone de datos generales en el sentido de que no se producen estos cambios en medida apreciable, se podrá prescindir de la adaptación previa a los tubos de sujeción. Los animales expuestos de cuerpo 
entero a un aerosol se enjaularán de manera individual durante la exposición 
para evitar que el aerosol en estudio se filtre por el pelo de sus compañeros de jaula. Salvo durante la exposición, se podrán administrar las dietas ha ­
bituales de laboratorio certificadas, acompañadas de un suministro ilimitado 
de agua potable de la traída municipal. La iluminación será artificial, con 
una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Cámaras de inhalación  
9. Para seleccionar una cámara de inhalación se tendrán en cuenta la naturaleza 
de la sustancia problema y la finalidad del ensayo. El modo de exposición preferible es de solo la nariz (término que abarca los modos de exposición 
solo por la cabeza, solo por la nariz y solo por el hocico). Este modo de 
exposición es el recomendado generalmente para los estudios de aerosoles líquidos o sólidos y de vapores que pueden condensarse formando aerosoles. Determinados objetivos de la investigación se podrían alcanzan mejor utili ­
zando el modo de exposición de cuerpo entero, pero esto debe justificarse 
en el informe del estudio. Para asegurar la estabilidad atmosférica cuando se emplea una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los animales 
experimentales no debe exceder del 5 % del volumen de la cámara. En el 
documento de orientación n
 o 39 (2) se describen los principios de las téc ­
nicas de exposición de cuerpo entero y solo por la nariz y sus ventajas e inconvenientes respectivos.
 
ESTUDIOS DE TOXICIDAD  
Concentraciones límite  
10. A diferencia de los estudios de toxicidad aguda, en los estudios de toxicidad 
subcrónica por inhalación no hay concentraciones límite definidas. La con ­
centración máxima estudiada dependerá de: 1) la máxima concentración 
alcanzable, 2) el nivel de exposición humana en el caso más desfavorable, 
3) la necesidad de mantener un suministro de oxígeno adecuado, y/o 4) la atención al bienestar de los animales. Si no se dispone de datos de concen ­
tración límite, es aplicable el Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 (13) [hasta una 
concentración máxima de 5 mg/l para los aerosoles, de 20 mg/l para los 
vapores y de 20 000 ppm para los gases; véase el documento GD 39 (2)]. Cuando sea preciso superar estos límites en el estudio de gases o sustancias altamente volátiles (por ejemplo, refrigerantes), habrá que justificar los mo ­
tivos. La concentración límite será tal que induzca una toxicidad inequívoca 
sin provocar un sufrimiento indebido a los animales ni afectar a su longe ­
vidad (3).
 
Estudio de determinación del intervalo  
11. Antes de proceder al estudio principal, generalmente es necesario realizar un 
estudio para determinar el intervalo analítico. Un estudio de determinación 
del intervalo es más completo que un estudio preliminar, por cuanto no se 
limita a la selección de las concentraciones. La información recabada en este tipo de estudio puede ser decisiva para el éxito del estudio principal. Un estudio de determinación del intervalo puede, por ejemplo, aportar informa ­
ción técnica referente a los métodos analíticos y al tamaño de partícula, la 
detección de los mecanismos de toxicidad, los datos de patología clínica y de histopatología, y las estimaciones de lo que podrán ser el NOAEL y la concentración tóxica mínima en un estudio principal. El director de la 
investigación decidirá si basarse en el estudio de determinación del intervalo 
para identificar el umbral de irritación de las vías respiratorias (con la histopatología de las vías respiratorias, las pruebas de la función pulmonar o el lavado broncoalveolar), la concentración máxima tolerada sin causar un 
sufrimiento indebido a los animales y los parámetros que caractericen mejor 
la toxicidad de la sustancia problema. 
12. Un estudio de determinación del intervalo puede hacerse con uno o más 
niveles de concentración. Dependiendo de los parámetros elegidos, a cada 
nivel de concentración se expondrán de tres a seis machos y de tres a seis 
hembras. El estudio de determinación del intervalo tendrá una duración mínima de 5 días y máxima (generalmente) de 28 días. En el informe del estudio se justificará la selección de las concentraciones destinadas al estu ­
dio principal. La finalidad del estudio principal es demostrar una relación 
concentración-respuesta basada en lo que se prevé como el parámetro más sensible. La concentración más baja será idealmente una en la que no se observen efectos adversos, mientras que la concentración más alta será tal 
que induzca una toxicidad inequívoca sin provocar un sufrimiento indebido 
a los animales ni afectar a su longevidad (3).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. A la hora de elegir los niveles de concentración para el estudio de deter ­
minación del intervalo, se tendrá en cuenta toda la información disponible, 
incluidos las relaciones entre estructura y actividad y los datos de sustancias afines (véase el punto 3). Un estudio de determinación del intervalo puede verificar o refutar los parámetros relacionados con los mecanismos de acción 
que a priori  se consideran más sensibles, como la inhibición de la colines ­
terasa por los organofosforados, la formación de metahemoglobina por agen ­
tes eritrotóxicos, las hormonas tiroideas (T
 3 y T  4 ), en el caso de tirotóxicos, 
y la presencia de proteínas, LDH o neutrófilos en el lavado broncoalveolar 
en el caso de partículas inocuas escasamente solubles o de aerosoles que son 
irritantes pulmonares.  
Estudio principal  
14. El estudio principal de toxicidad subcrónica comprende habitualmente tres 
niveles de concentración, además de lotes de control negativo (aire) y/o testigo del vehículo (véase el punto 18). Se recurrirá a todos los datos 
disponibles para basar la selección de los niveles de exposición adecuados, 
incluidos los resultados de los estudios de toxicidad sistémica, metabólicos y cinéticos (poniendo especial atención para evitar niveles de concentración elevados que saturen los procesos cinéticos). Cada lote de ensayo se com ­
pone de 10 roedores machos y de 10 hembras, que se exponen a la sustancia 
química 6 horas al día en un régimen de 5 días por semana durante un período de 13 semanas (la duración total del estudio es de 90 días como mínimo). También se admite exponer a los animales 7 días por semana (por 
ejemplo, cuando se estudian productos farmacéuticos para inhalación). Si se 
sabe que uno de los sexos es más sensible a la sustancia problema, podrán exponerse los dos sexos a diferentes niveles de concentración con el fin de optimizar la relación concentración-respuesta, tal como se describe en el 
punto 15. Cuando se exponen con la técnica de solo por la nariz roedores 
distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justificarán los motivos cuando el tiempo de exposición sea inferior a 6 horas/día o cuando 
sea necesario efectuar un estudio de exposición de cuerpo entero de larga 
duración (por ejemplo, 22 horas/día) [véase el documento GD 39 (2)]. Se privará de comida a los animales durante el período de exposición, a menos que este exceda de 6 horas. Se puede suministrar agua durante todo el 
período de exposición de cuerpo entero. 
15. Las concentraciones diana seleccionadas deben servir para identificar el 
órgano o los órganos diana y para demostrar una clara relación concentra ­
ción-respuesta. 
— El nivel de concentración más elevado debe inducir efectos tóxicos, pero 
sin provocar letalidad o daños persistentes que impidan hacer una eva ­
luación significativa. 
— El nivel o los niveles de concentración intermedios se espaciarán para 
obtener una graduación o escala de los efectos tóxicos desde el nivel más bajo al más elevado. 
— La concentración más baja debe producir escasos o nulos signos de 
toxicidad.
 
Sacrificios durante el estudio  
16. Si se proyecta hacer sacrificios durante la investigación, el número de ani ­
males incluido en cada nivel de exposición se incrementará en el número que vaya a ser sacrificado antes de que concluya el estudio. Se justificará la 
necesidad de hacer tales sacrificios, que se computarán oportunamente en 
los análisis estadísticos.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Estudio satélite (de reversibilidad)  
17. Es posible recurrir a un estudio satélite (de reversibilidad) para observar la 
reversibilidad, persistencia o aparición retardada de toxicidad durante un período de duración adecuada, pero nunca inferior a 14 días, después del 
tratamiento. Los lotes satélite (de reversibilidad) se componen de 10 machos 
y 10 hembras, que se exponen simultáneamente a los animales de experi ­
mentación del estudio principal. Los lotes del estudio satélite (de reversibi ­
lidad) deben exponerse a la sustancia problema al nivel de concentración 
más elevado y, en la medida necesaria, se emplearán simultáneamente lotes 
de control con aire y/o con el vehículo (véase el punto 18).
 
Animales de control  
18. Los animales de control negativo (con aire) en paralelo se tratan de manera 
idéntica a los animales del lote experimental, excepto en que se exponen al aire filtrado en lugar de a la sustancia problema. Cuando se utiliza agua o cualquier otra sustancia para ayudar a crear la atmósfera experimental, en el 
estudio debe incluirse un lote testigo del vehículo, en lugar del lote de 
control negativo (con aire). Como vehículo se usará agua en la medida de lo posible. Cuando se use agua como vehículo, los animales de control se expondrán a una atmósfera de aire con la misma humedad relativa que los 
grupos expuestos a la sustancia problema. La selección de un vehículo 
idóneo se basará en un ensayo preliminar debidamente realizado o bien en los datos previos. Cuando no se conoce bien la toxicidad de un vehículo, 
el director del estudio puede decidir el uso de ambos grupos, el de control 
negativo (con aire) y el testigo del vehículo, pero no es en absoluto reco ­
mendable. Si los datos previos revelan que un vehículo es atóxico, no hay necesidad de emplear un grupo de control negativo (con aire), y solo se 
usará un lote testigo del vehículo. Si un ensayo preliminar de toxicidad de 
una sustancia problema formulada en un vehículo revela que no hay toxi ­
cidad, se deduce que el vehículo es atóxico a la concentración analizada y es el que debe utilizarse como control.
 
CONDICIONES DE EXPOSICIÓN  
Administración de las concentraciones  
19. Los animales se exponen a la sustancia problema en forma de gas, vapor, 
aerosol o una mezcla de estos. El estado físico investigado dependerá de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, de las concentraciones seleccionadas y/o de la forma física más probable que adoptará la sustancia 
química durante su manipulación y administración. Las sustancias higroscó ­
picas y químicamente reactivas deberán estudiarse en condiciones de aire seco. Se procurará evitar la acumulación de concentraciones explosivas. Las materias particuladas pueden someterse a procesos mecánicos para reducir el 
tamaño de partícula. Se ofrecen más orientaciones en el documento de 
orientación n
 o 39 (2).  
Distribución granulométrica  
20. Se controlará el tamaño de partícula en todos los aerosoles y vapores que 
puedan condensarse formando aerosoles. Para facilitar la exposición de todas las zonas de interés de las vías respiratorias, se recomiendan aerosoles que tengan un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) de 1 a 
3 μm, con una desviación típica geométrica ( σ
 g ) en el intervalo de 1,5 a 3,0 
(4). Se procurará dentro de lo razonable ajustarse a este marco de referencia, pero si ello no es posible se consultará la opinión de expertos. Así, por ejemplo, las partículas de los humos metálicos tienen un tamaño inferior al 
mencionado intervalo, mientras que las partículas con carga y las fibras 
pueden superarlo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Preparación de la sustancia problema en un vehículo  
21. En condiciones ideales, la sustancia problema debería estudiarse sin ningún 
vehículo. Si es necesario emplear un vehículo para generar una concentra ­
ción de sustancia problema y un tamaño de partícula adecuados, se le dará 
preferencia al agua. Siempre que una sustancia problema se disuelva en un 
vehículo, debe demostrarse su estabilidad.  
SUPERVISIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN  
Caudal de aire de la cámara  
22. El caudal de aire de la cámara de exposición se controlará minuciosamente, 
se supervisará de manera continuada y se registrará como mínimo cada hora 
durante cada exposición. La supervisión en tiempo real de la concentración atmosférica (o la estabilidad temporal) del ensayo constituye una medida integral de todos los parámetros dinámicos y proporciona un medio indirecto 
de controlar todos los parámetros dinámicos de la inhalación que resultan de 
interés. Si la concentración se supervisa en tiempo real, es posible reducir la frecuencia de medición del caudal de aire limitándola a una sola medición por exposición y día. Habrá que tomar especiales precauciones para evitar la 
reinspiración en las cámaras de solo por la nariz. La concentración de 
oxígeno debe ser como mínimo del 19 %, y la de dióxido de carbono no debe superar el 1 %. Si existen razones para suponer que no se van a conseguir estos valores de referencia, habrá que determinar las concentra ­
ciones de ambos gases. Si las mediciones del primer día de exposición 
revelan que estos gases están presentes a las concentraciones adecuadas, no serán necesarias nuevas determinaciones.
 
Temperatura y humedad relativa de la cámara  
23. La temperatura de la cámara se mantendrá en 22 ± 3 °C. Siempre que sea 
posible, la humedad relativa presente en la zona de respiración de los animales, tanto en las exposiciones de solo por la nariz como de cuerpo 
entero, se supervisará de manera continua y se registrará cada hora durante 
la exposición. La humedad relativa debe mantenerse preferiblemente en el intervalo del 30 % al 70 %, pero este valor de referencia puede ser inalcan ­
zable (por ejemplo, cuando se analizan mezclas acuosas) o imposible de 
medir (cuando hay interferencias de la sustancia con el método de ensayo).
 
Sustancia problema: concentración nominal  
24. Siempre que sea factible, se calculará y registrará la concentración nominal 
en la cámara de exposición. La concentración nominal es la masa de sus ­
tancia problema generada dividida por el volumen total de aire que recorre el sistema de la cámara de inhalación. La concentración nominal no se usa para caracterizar la exposición de los animales, pero la comparación entre la 
concentración nominal y la real nos da un índice de la eficiencia generadora 
del sistema experimental, de modo que puede servir para detectar problemas en la generación de la atmósfera.
 
Sustancia problema: concentración real  
25. La concentración real es la concentración de sustancia problema compro ­
bada por muestreo en la zona de respiración de los animales en una cámara de inhalación. Las concentraciones reales se pueden calcular con métodos específicos (por ejemplo, muestreo directo, métodos de adsorción o uso de 
reactivos químicos y posterior valoración analítica) o bien con métodos 
inespecíficos como la gravimetría por filtración. El análisis gravimétrico es aceptable exclusivamente para aerosoles de un único componente en polvo o de líquidos de baja volatilidad, y deberá sustentarse en caracteriza ­
ciones preliminares específicas de la sustancia problema. La concentración 
de los aerosoles de polvos multicomponentes se puede determinar también
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
por gravimetría. Sin embargo, hacen falta datos analíticos que demuestren 
que la composición del material aerotransportado es afín a la del material de 
partida. Si no se dispone de tal información, puede ser necesario repetir el análisis de la sustancia problema (idealmente, en estado aerotransportado) a intervalos regulares a lo largo del ensayo. Cuando se trata de productos en 
forma de aerosol capaces de evaporarse o sublimarse, habrá que demostrar 
que el método elegido es capaz de recoger todas las fases. 
26. Se usará, a ser posible, un solo lote de sustancia problema a lo largo de todo 
el estudio, lote que se conservará en condiciones que preserven su pureza, 
homogeneidad y estabilidad. Antes de iniciar el estudio deberá hacerse una 
caracterización de la sustancia consistente en un análisis de pureza y, si es técnicamente factible, de identidad y de cuantificación de contaminantes e impurezas. Con este fin se pueden aportar, entre otros, los siguientes datos: 
tiempo de retención y área relativa del pico, peso molecular determinado 
mediante espectroscopia de masas o cromatografía de gases y otras deter ­
minaciones. Si bien la identidad de la muestra de ensayo no es responsabi ­
lidad del laboratorio de análisis, la prudencia aconseja que este confirme, 
aunque sea dentro de ciertos límites, la caracterización facilitada por el 
promotor (por ejemplo, color, naturaleza física, etc.). 
27. La atmósfera de exposición debe mantenerse constante en la medida de lo 
posible. Para demostrar la estabilidad de las condiciones de exposición se 
puede usar un equipo de supervisión en tiempo real, como un fotómetro de proceso para aerosoles o un analizador de hidrocarburos totales para análisis de vapores. La concentración real presente en la cámara deberá medirse al 
menos 3 veces por cada nivel y día de exposición. Pero si ello no es posible 
debido a un caudal de aire limitado o a que las concentraciones son bajas, se acepta una muestra por período de exposición. En ese caso, lo ideal es recoger la muestra durante todo el período de exposición. Las concentracio ­
nes individuales medidas en la cámara no deben desviarse de la concen ­
tración media en más de un ± 10 % cuando se trata de gases y vapores, ni en más de un ± 20 % en el caso de aerosoles de líquidos o sólidos. Se calculará y documentará el tiempo de equilibrado (t
 95 ) de la cámara. La 
duración de una exposición incluye el tiempo durante el cual se genera la 
sustancia problema. Este abarca los tiempos transcurridos hasta alcanzar el equilibrio en la cámara (t
 95 ) y hasta la extinción. Se ofrecen indicaciones 
para el cálculo de t  95 en el documento de orientación n  o 39 (2). 
28. Cuando se manejan mezclas muy complejas formadas por gases/vapores y 
aerosoles (por ejemplo, atmósferas de combustión y sustancias problema propulsadas con dispositivos/productos fabricados con fines determinados), 
cada fase puede comportarse de manera diferente en una cámara de inhala ­
ción. Por consiguiente, se seleccionará como mínimo una sustancia indica ­
dora (analito), normalmente el componente activo principal de la mezcla, para cada fase (gas/vapor y aerosol). Si el producto analizado es una mezcla, 
habrá que documentar la concentración analítica de la mezcla total y no solo 
de la sustancia indicadora o el componente activo (analito). Se ofrece más información sobre las concentraciones reales en el documento de orientación n
 o 39 (2).  
Sustancia problema: distribución granulométrica  
29. La distribución granulométrica de los aerosoles debe determinarse al menos 
con periodicidad semanal por cada nivel de concentración, con ayuda de un 
impactador de cascada o un aparato alternativo, como un medidor del ta ­
maño aeorodinámico de partícula (APS). Si se puede demostrar la equiva ­
lencia de los resultados obtenidos con el impactador de cascada y con el 
aparato alternativo, entonces se podrá emplear este último durante todo el 
estudio.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Se empleará un segundo dispositivo, como un filtro gravimétrico o un 
sistema de burbujeo o de purga, en paralelo con el equipo principal para 
confirmar la eficiencia de recogida de este último. La concentración en masa obtenida mediante análisis granulométrico tendrá unos límites de desviación razonables con respecto a la concentración en masa obtenida mediante gra ­
vimetría por filtración [véase el documento GD 39 (2)]. Si es posible de ­
mostrar su equivalencia para todas las concentraciones analizadas en la fase inicial del estudio, podrán omitirse en lo sucesivo las pruebas confirmato ­
rias. Por razones de bienestar animal, se tomarán medidas para minimizar la 
obtención de datos no concluyentes que obligarían a repetir el ensayo. 
31. Se controlará el tamaño de partícula en los vapores cuando exista la posi ­
bilidad de que la condensación del vapor provoque la formación de un aerosol, o cuando se detecten partículas en una atmósfera de vapor que puedan inducir la mezcla de fases.
 
OBSERVACIONES 
32. Los animales se someterán a observación clínica frecuente antes, durante y 
después del período de exposición. Pueden estar indicadas observaciones 
más frecuentes, dependiendo de la respuesta de los animales durante la 
exposición. Cuando la observación de los animales esté dificultada por el uso de tubos de sujeción, por la escasa iluminación de las cámaras de cuerpo entero o por la opacidad ambiental, se someterán a observación 
minuciosa después de la exposición. Las observaciones realizadas con an ­
terioridad a la exposición del día siguiente permiten determinar la posible reversibilidad o exacerbación de los efectos tóxicos. 
33. Todas las observaciones se registrarán en fichas individuales de cada animal. 
Cuando se encuentre algún animal muerto o se sacrifique por razones com ­
pasivas, deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la muerte. 
34. Las observaciones fuera de la jaula deberían incluir los cambios en la piel, 
pelo, ojos y membranas mucosas; los cambios en los sistemas respiratorio, 
circulatorio y nervioso, así como la actividad somatomotriz y las pautas de 
comportamiento. Debe prestarse atención especial a la observación de tem ­
blores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma. El registro de la temperatura rectal puede ayudar a detectar una bradipnea refleja o una 
hipo/hipertermia relacionadas con el tratamiento o con el confinamiento. En 
el protocolo del estudio se pueden incluir otras evaluaciones del tipo de pruebas cinéticas, biovigilancia, pruebas de la función pulmonar, retención de materiales escasamente solubles que puedan acumularse en el tejido 
pulmonar y cambios comportamentales.
 
PESO CORPORAL 
35. Se registrará el peso de cada animal poco antes de la primera exposición 
(día 0), y después dos veces por semana (por ejemplo, los viernes y lunes 
para demostrar la recuperación durante un fin de semana sin exposición, o con un intervalo que permita evaluar la toxicidad sistémica) y en el mo ­
mento de la muerte o la eutanasia. Si no se observan efectos en las 4 
primeras semanas, el peso corporal se podrá registrar semanalmente durante 
el resto del estudio. Si se utilizan animales satélite (reversibilidad), se se ­
guirán pesando semanalmente durante todo el período de recuperación. Al concluir el estudio, se pesarán todos los animales poco antes del sacrificio 
para permitir calcular sin sesgos la relación entre el peso de los órganos y el 
peso corporal.
 
CONSUMO DE AGUA Y DE ALIMENTOS 
36. El consumo alimentario se medirá cada semana. También se puede medir el 
consumo de agua.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
PATOLOGÍA CLÍNICA 
37. Deben hacerse evaluaciones de patología clínica en todos los animales, 
incluidos los testigo y los satélite (reversibilidad), cuando sean sacrificados. Se registrará el intervalo de tiempo transcurrido entre el final de la exposi ­
ción y la toma de muestras de sangre, particularmente si la recuperación del 
parámetro valorado es rápida. Está indicado obtener muestras al final del período de exposición cuando se trata de parámetros con una semivida plasmática corta (por ejemplo, COHb, CHE y MetHb). 
38. En el cuadro 1 se recogen los parámetros de patología clínica que se suelen 
exigir en todos los estudios toxicológicos. El análisis de orina no es nece ­
sario hacerlo de forma sistemática, sino solo en caso de efectos tóxicos probables o manifiestos. El director del estudio puede decidir la evaluación 
de otros parámetros para caracterizar mejor la toxicidad de una sustancia 
problema (colinesterasa, lípidos, hormonas, equilibrio ácido-base, metahe ­
moglobina o cuerpos de Heinz, creatina-cinasa, cociente mieloide/eritroide, troponinas, gases en sangre arterial, lactato-deshidrogenasa, 
sorbitol-deshidrogenasa, glutamato-deshidrogenasa y gamma-glutamil-trans ­
peptidasa).
 
Cuadro 1  
Parámetros de patología clínica habituales  
Hematología  
Recuento de eritrocitos 
Hematocrito 
Concentración de hemoglobina 
Hemoglobina corpuscular media Volumen corpuscular medio Concentración de hemoglobina cor ­
puscular media 
Reticulocitos Recuento de leucocitos 
Fórmula leucocitaria 
Recuento de plaquetas 
Capacidad de coagulación (selec ­
cionar una): 
— Tiempo de protrombina 
— Tiempo de coagulación 
— Tiempo de tromboplastina 
parcial
 
Bioquímica clínica  
Glucosa (*) 
Colesterol total Triglicéridos 
Nitrógeno ureico en sangre 
Bilirrubina total Creatinina 
Proteínas totales 
Albúmina Globulinas Alanina-aminotransferasa 
Aspartato-aminotransferasa Fosfatasa alcalina 
Potasio 
Sodio Calcio 
Fósforo 
Cloruros
 
Análisis de orina (opcional)  
Aspecto (color y turbidez) 
Volumen 
Densidad y osmolalidad pH Proteínas totales 
Glucosa 
Sangre/células sanguíneas
 
(*) Puesto que un período de ayuno prolongado puede introducir un sesgo en las 
determinaciones de glucosa entre los animales testigo y los tratados, el director del 
estudio decidirá si es apropiado o no imponer dicho ayuno a los animales. Si se 
impone un período de ayuno, será acorde a la especie empleada; para las ratas 
puede ser de 16 horas (ayuno desde la víspera). La determinación de la glucosa en 
ayunas puede hacerse previo ayuno desde la víspera durante la última semana de 
exposición, o bien previo ayuno desde la víspera antes de proceder a la autopsia 
(en este último caso, con la determinación de los restantes parámetros de patología 
clínica).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Cuando hay indicios de que las vías respiratorias bajas (alvéolos) son el 
lugar principal de depósito y retención, el lavado broncoalveolar (BAL) 
puede ser la técnica de elección para analizar cuantitativamente los paráme ­
tros hipotéticamente dependientes de la dosis relacionados con la aparición de alveolitis, inflamación pulmonar y fosfolipidosis. Ello permite demostrar 
debidamente la relación dosis-respuesta y la evolución en el tiempo del daño 
alveolar. En el fluido BAL se pueden analizar el recuento de leucocitos y la fórmula leucocitaria, las proteínas totales y la lactato-deshidrogenasa. Otros parámetros dignos de tenerse en cuenta son los indicadores de daño lisoso ­
mal, fosfolipidosis, fibrosis e inflamación alérgica o irritativa, como puede 
ser la determinación de las citocinas o quimiocinas proinflamatorias. Gene ­
ralmente, las determinaciones realizadas en el BAL son complementarias de los resultados del examen histopatológico, pero no pueden sustituirlos. En el 
documento GD 39 (2) se facilitan indicaciones sobre el modo de realizar un 
lavado pulmonar.
 
EXAMEN OFTALMOLÓGICO 
40. Con ayuda de un oftalmoscopio o instrumento equivalente, se realizarán 
exploraciones oftalmológicas del fondo de ojo, los medios refringentes, el 
iris y la conjuntiva de todos los animales antes de la administración de la sustancia problema, y del grupo sometido a concentración más elevada al 
concluir el estudio. Si se apreciaran alteraciones oculares, se examinará a 
todos los animales, incluidos los del lote satélite (de reversibilidad).
 
ANATOMÍA PATOLÓGICA MACROSCÓPICA Y PESO DE LOS ÓR ­
GANOS 
41. Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran durante 
su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar animal, se someterán a autopsia macroscópica. Se documentará el tiempo transcurrido entre el final de la última exposición de cada animal y su 
sacrificio. Si la autopsia no se puede practicar inmediatamente después de 
descubrir la muerte del animal, este será refrigerado (no congelado) a una temperatura suficientemente baja para minimizar la autólisis. Las autopsias se practicarán lo antes posible, normalmente en el plazo de uno o dos días. 
Se documentarán todas las modificaciones anatomopatológicas macroscópi ­
cas observadas en cada animal, poniendo especial atención en las alteracio ­
nes de las vías respiratorias. 
42. En el cuadro 2 se indican los órganos y tejidos que durante la autopsia 
macroscópica deben conservarse en un medio idóneo para su examen his ­
topatológico. La conservación de los órganos y tejidos entre corchetes, así 
como de cualquier otro órgano o tejido, se hará a criterio del director del estudio. Los órganos destacados  en negrita  se deben limpiar de adherencias 
y pesar lo antes posible después de la disección para evitar su desecación. El 
tiroides y los epidídimos solo se pesarán en caso necesario, porque los 
artefactos debidos a las adherencias pueden dificultar la evaluación histopa ­
tológica. Los tejidos y órganos se fijan en formol con amortiguador al 10 % o en otro fijador apropiado inmediatamente después de la autopsia, dejando 
pasar un mínimo de 24-48 horas antes de la limpieza de adherencias, de ­
pendiendo del fijador empleado.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 431
Cuadro 2  
Órganos y tejidos conservados durante la autopsia macroscópica 
Cápsulas suprarrenales  
Aorta Médula ósea (y/o aspirado reciente)  
Encéfalo  (incluidos cortes de cerebro, cerebe ­
lo, bulbo y protuberancia) 
Intestino ciego Colon Duodeno [Epidídimos ] 
[Ojos (retina, nervio óptico) y párpados] 
Fémur y articulación tibiofemoral Vesícula biliar (de estar presente) [Glándula de Harder]  
Corazón  
Íleo Yeyuno  
Riñones  
[Glándulas lacrimales (extraorbitarias)] Laringe (3 secciones, incluida la base de la 
epiglotis)  
Hígado Pulmón  (todos los lóbulos en una sección de 
corte, incluidos los bronquios primarios) 
Ganglios linfáticos de la región hiliar del pul ­
món, especialmente cuando se estudian sus ­
tancias problema particuladas escasamente so ­
lubles. Si se trata de exámenes más minucio ­
sos o de carácter inmunológico, pueden to ­
marse en consideración otros ganglios linfáti ­
cos, por ejemplo de las regiones mediastínica, 
cervical/submandibular o auricular. 
Ganglios linfáticos (distales de la vía de ac ­
ceso) 
Glándulas mamarias (femeninas) Músculo (muslo) Tejidos nasofaríngeos [como mínimo 4 sec ­
ciones; una sección incluirá el conducto na ­
sofaríngeo y el tejido linfoide asociado a la nariz (Nasal Associated Lymphoid Tissue, 
NALT)] Esófago 
[Bulbo olfativo]  
Ovarios  
Páncreas Glándulas paratiroides Nervios periféricos (ciático o tibial, preferi ­
blemente próximos al músculo) 
Hipófisis Próstata Recto Glándulas salivales Vesículas seminales Piel Médula espinal (cervical, medio-dorsal y 
lumbar)  
Bazo  
Esternón Estómago Dientes  
Testículos Timo Glándula tiroides  
[Lengua] 
Tráquea (como mínimo 2 secciones, 1 lon ­
gitudinal que pase por la carina traqueal y 1 sección transversal) 
[Uréteres] [Uretra] [Vejiga urinaria]  
Útero  
Órganos diana 
Todas las masas y lesiones macroscópicas
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. El pulmón se debe extraer intacto, pesar e instilar con un fijador apropiado a 
una presión de 20-30 cm de agua para asegurar el mantenimiento de la 
estructura pulmonar (5). Se preparan cortes de todos los lóbulos a un solo nivel, incluyendo los bronquios primarios, pero, si se practica un lavado pulmonar, el lóbulo no lavado se seccionará a tres niveles (no en cortes 
seriados). 
44. Deben examinarse como mínimo 4 secciones de los tejidos nasofaríngeos, 
una de las cuales incluirá el conducto nasofaríngeo (5) (6) (7) (8) (9) para 
permitir una observación adecuada de los epitelios escamoso, transicional 
(respiratorio no ciliado) y olfativo, y el tejido de drenaje linfático (NALT) (10) (11). Se examinarán tres secciones de la laringe, una de las cuales debe incluir la base de la epiglotis (12). Deben examinarse como mínimo 2 
secciones de la tráquea, entre ellas un corte longitudinal que pase por la 
carina de bifurcación de los bronquios extrapulmonares y un corte trans ­
versal.
 
EXAMEN HISTOPATOLÓGICO 
45. La evaluación histopatológica de todos los órganos y tejidos mencionados 
en el cuadro 2 se llevará a cabo en el lote de control y en el de concen ­
tración más elevada, así como en todos los animales que mueran o sean sacrificados durante el estudio. Se prestará especial atención a las vías respiratorias, los órganos diana y las lesiones macroscópicas. Aquellos ór ­
ganos y tejidos que presenten lesiones en el lote de concentración más 
elevada se examinarán en todos los grupos. Con objeto de demostrar una clara relación concentración-respuesta, el director del estudio puede decidir 
la realización de evaluaciones histopatológicas en otros lotes. Si se utiliza un 
lote satélite (reversibilidad), debe hacerse un examen histopatológico de todos los órganos y tejidos que presenten efectos en los lotes tratados. Si en el lote de exposición elevada se producen muertes prematuras u otras 
dificultades que comprometan la interpretación de los datos, se practicarán 
evaluaciones histopatológicas en el lote de la concentración inmediatamente inferior. Se procurará correlacionar las observaciones macroscópicas con los hallazgos microscópicos.
 
DATOS E INFORME  
Datos  
46. Se documentarán los datos de cada animal referentes a peso corporal, con ­
sumo de alimento, patología clínica, anatomía patológica macroscópica, 
peso de los órganos e histopatología. Los resultados de la observación clínica se reunirán en un cuadro que presente, por cada grupo de ensayo, el número de animales utilizados, el número de animales que presenten 
signos específicos de toxicidad, el número de animales hallados muertos 
durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte de los distintos animales, la descripción y la evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversibilidad, y los resultados de la autopsia. 
Todos los resultados, cuantitativos y fortuitos, se evaluarán por un método 
estadístico apropiado. Puede usarse cualquier método estadístico reconocido; los métodos estadísticos aplicados deben seleccionarse durante el diseño del estudio.
 
Informe del ensayo  
47. El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información siguiente:  
Animales de experimentación y zootecnia  
— Descripción de las condiciones de enjaulado, tales como: número (o 
variación del número) de animales por jaula, materiales de cama, tem ­
peratura ambiente y humedad relativa, fotoperíodo e identificación de la 
dieta.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— Especie o variedad empleada y justificación del uso de una especie 
distinta de la rata. Podrán indicarse la procedencia y los datos previos, 
siempre que correspondan a animales sometidos a condiciones parecidas de exposición, alojamiento y alimentación. 
— Número, edad y sexo de los animales. 
— Método de asignación al azar. 
— Descripción de cualquier acondicionamiento previo al estudio, incluidos 
alimentación, cuarentena y tratamiento de enfermedades.  
Sustancia problema  
— Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (in ­
cluida la isomerización). 
— Identificación química y número de registro del Chemical Abstracts 
Service (CAS), si se conoce.  
Vehículo  
— Justificación del uso de un vehículo y justificación de la elección del 
mismo (si es distinto del agua). 
— Datos históricos o paralelos que demuestren que el vehículo no interfiere 
en los resultados del estudio.  
Cámara de inhalación  
— Descripción pormenorizada de la cámara de inhalación, incluido el vo ­
lumen, y acompañada de un diagrama. 
— Procedencia y descripción del equipo empleado para la exposición de los 
animales y la generación de la atmósfera. 
— Instrumental empleado para medir la temperatura, la humedad, el tamaño 
de partícula y la concentración real. 
— Fuente del aire y sistema de acondicionamiento. 
— Métodos de calibración del instrumental para garantizar una atmósfera 
experimental homogénea. 
— Diferencia de presión (positiva o negativa). 
— Puertos de exposición por cámara (solo por la nariz); ubicación de los 
animales en la cámara (de cuerpo entero). 
— Estabilidad de la atmósfera experimental. 
— Localización de los sensores de temperatura y humedad, y muestreo de 
la atmósfera experimental en la cámara. 
— Tratamiento del aire suministrado/extraído. 
— Caudales de aire, caudal de aire por puerto de exposición (solo por la 
nariz) o carga de animales por cámara (de cuerpo entero). 
— Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio (t
 95 ) en la cámara de inha ­
lación. 
— Número de variaciones de volumen por hora. 
— Dispositivos de dosificación (si procede).  
Datos relativos a la exposición  
— Justificación de la concentración diana seleccionada en el estudio prin ­
cipal.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— Concentraciones nominales (masa total de sustancia problema generada 
en la cámara de inhalación dividida por el volumen de aire que recorre 
la cámara). 
— Concentraciones reales de la sustancia problema recuperadas en la zona 
de respiración de los animales; en el caso de mezclas que dan lugar a 
formas físicas heterogéneas (gases, vapores, aerosoles), se podrá analizar cada una de ellas por separado. 
— Todas las concentraciones atmosféricas se registrarán en unidades de 
masa (mg/l, mg/m
 3 , etc.) y no en unidades de volumen (ppm, ppmm, 
etc.). 
— Distribución granulométrica, diámetro aerodinámico mediano de 
masa (MMAD) y desviación típica geométrica ( σ g ), incluidos los corres ­
pondientes métodos de cálculo. Se documentarán los análisis granulo ­
métricos individuales.  
Condiciones del ensayo  
— Descripción pormenorizada de la preparación de la sustancia problema y 
de cualquier método empleado para reducir el tamaño de partícula de las materias sólidas o preparar soluciones de la sustancia problema. 
— Descripción (preferiblemente acompañada de un diagrama) del equipo 
empleado para generar la atmósfera experimental y para exponer los animales a la misma. 
— Descripción pormenorizada del instrumental empleado para controlar la 
temperatura, la humedad y el caudal de aire de la cámara (creación de una curva de calibración). 
— Descripción pormenorizada del equipo empleado para tomar las muestras 
con el fin de medir la concentración de la cámara y la distribución por tamaño de partícula. 
— Descripción pormenorizada del método de análisis químico empleado y 
de la validación del método (incluida la eficiencia de recuperación de la sustancia problema en el medio ambiente experimental). 
— Método aleatorio de asignación de los animales a los lotes de exposición 
y de control (testigo). 
— Pormenores de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo/origen 
de la alimentación y el origen del agua. 
— Justificación de las concentraciones experimentales seleccionadas.  
Resultados  
— Tabulación de los valores de temperatura, humedad y caudal de aire de 
la cámara. 
— Tabulación de las concentraciones nominales y reales de la cámara. 
— Tabulación de los datos de granulometría, incluidos los de recogida de 
muestras para el análisis, distribución granulométrica y cálculos de 
MMAD y σ
 g . 
— Tabulación de las respuestas y de los niveles de concentración de cada 
animal (es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la 
mortalidad y la naturaleza, gravedad, momento de aparición y duración 
de los efectos).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— Tabulación de los pesos de los animales individuales. 
— Tabulación del consumo de alimentos. 
— Tabulación de los datos de patología clínica. — Resultados de la autopsia y eventuales observaciones histopatológicas de 
cada animal, si se dispone de ellas.  
Evaluación e interpretación de los resultados  
— Se hará especial hincapié en la descripción de los procedimientos em ­
pleados para satisfacer los criterios del presente método de ensayo como, 
por ejemplo, la concentración límite o el tamaño de partícula. 
— Se tomará en consideración la respirabilidad de las partículas a la luz de 
los resultados globales, de manera especial si no se cumplienlos criterios 
relativos al tamaño de partícula. 
— En la evaluación global del estudio se expondrá la coherencia de los 
métodos empleados para determinar las concentraciones nominales y 
reales y la relación entre ellas. 
— Se explicará la causa probable de muerte y el mecanismo de acción 
(sistémico o local) predominante. 
— Se facilitará una explicación de por qué ha sido preciso sacrificar de 
forma compasiva los animales con signos evidentes de dolor o de su ­
frimiento intenso y duradero, atendiendo a los criterios del documento 
de orientación de la OCDE sobre parámetros de tratamiento compasivo 
(Guidance Document on Humane Endpoints) (3). 
— Se identificarán el órgano o los órganos diana. 
— Se determinarán los valores de NOAEL y LOAEL.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Gui ­
deline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(4) Whalan E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258. 
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. 
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal dia ­
grams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. 
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijves ­
tijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasop ­
haryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. 
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. 
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428. 
(13) Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de 
sustancias y mezclas y por el que se modifican y derogan las Directivas 
67/548/CEE y 1999/45/CE, y se modifica el Reglamento (CE) n
 o 1907/2006 (DO L 353 de 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Apéndice 1  
DEFINICIÓN  
Sustancia problema:  cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este mé ­
todo de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  ENSAYO DE TOXICIDAD CRÓNICA  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 452 de la 
OCDE (2009). Las TG 452 originales fueron adoptadas en 1981. Se consi ­
deró necesario adaptar este método de ensayo B.30 para dar cuenta de los 
avances recientes en materia de bienestar animal que plantean nuevas nece ­
sidades normativas (1) (2) (3) (4). La actualización de este método de ensayo B.30 se ha realizado en paralelo con las revisiones de los capítulos 
del presente anexo B.32. Ensayo de carcinogénesis y B.33. Ensayo combi ­
nado de toxicidad crónica y carcinogénesis, con el fin de obtener más información acerca de los animales utilizados en el estudio y recabar nuevos datos sobre la selección de las dosis. El presente método de ensayo ha sido 
diseñado para el estudio de una amplia gama de sustancias, incluso plagui ­
cidas y productos químicos industriales. 
2. La mayoría de los ensayos de toxicidad crónica se realizan con especies de 
roedores, por lo que este método de ensayo se ha diseñado básicamente para el estudio de dichas especies. Cuando fuere preciso realizar estos ensayos en especies no roedoras, serán así mismo de aplicación los principios y proce ­
dimientos descritos en este método de ensayo, además de los descritos en el 
capítulo B.27 del presente anexo, Ensayo de toxicidad oral por administra ­
ción continuada (90 días) en no roedores (5), con las debidas modificacio ­
nes, tal como se especifica en el documento de orientación n
 o 116 de la 
OCDE sobre diseño y realización de los estudios de toxicidad crónica y 
carcinogénesis (6). 
3. Las tres vías de administración principales que se estudian en los ensayos de 
toxicidad crónica son la oral, la cutánea y la inhalatoria. La elección de una 
de ellas dependerá de las características físicas y químicas de la sustancia estudiada y de la vía de exposición predominante en seres humanos. Se ofrece más información sobre la vía de exposición en el documento de 
orientación n
 o 116 de la OCDE (6). 
4. El presente método de ensayo centra el interés en la exposición por vía oral, 
la más frecuentemente usada en los estudios de toxicidad crónica. Si bien 
los estudios de toxicidad crónica a largo plazo que entrañan la exposición por vía cutánea o inhalatoria pueden ser igualmente necesarios en la eva ­
luación del riesgo para la salud humana o en determinados marcos legisla ­
tivos, estas dos vías de exposición plantean una complejidad técnica consi ­
derable. Tales estudios tendrán que diseñarse según cada caso; sin embargo, el método de ensayo que aquí se describe para la determinación y evalua ­
ción de la toxicidad crónica por administración oral podría sentar las bases 
de un protocolo para los estudios de toxicidad por inhalación o absorción 
dérmica en lo que se refiere a recomendación de períodos de tratamiento, parámetros clínicos e histopatológicos, etc. La OCDE dispone de documen ­
tación de orientación sobre la administración de las sustancias problema por 
inhalación (6) (7) y por vía cutánea (6). Para el diseño de estudios a más 
largo plazo que contemplen la exposición por vía inhalatoria deben consul ­
tarse específicamente los capítulos B.8 (8) y B.29 (9) del presente anexo, además del documento de orientación de la OCDE sobre estudios de toxi ­
cidad aguda por inhalación (7). Cuando se trate de estudios que contemplen 
la vía cutánea se consultará el capítulo B.9 (10) del presente anexo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Un ensayo de toxicidad crónica proporciona información sobre el peligro 
para la salud que supone la exposición continuada de la especie estudiada 
durante una parte considerable de su ciclo vital. El estudio proporciona información sobre los efectos tóxicos de la sustancia problema; indica los órganos diana y la posibilidad de acumulación. Puede proporcionar además 
una estimación del nivel máximo sin efectos adversos observados, que 
puede ser útil para establecer los criterios de seguridad de la exposición humana. Cabe destacar la necesidad de realizar observaciones clínicas dete ­
nidas de los animales, a fin de obtener la máxima información posible. 
6. Los objetivos de los estudios realizados según este método de ensayo son: 
— la identificación de la toxicidad crónica de una sustancia problema, — la identificación de los órganos diana, — la caracterización de la relación dosis-respuesta, — la identificación del nivel máximo sin efectos adversos 
observados (NOAEL), o punto de partida para determinar una dosis de referencia (Benchmark Dose, BMD), 
— la predicción de los efectos de toxicidad crónica que se producirán a los 
niveles de exposición humana, 
— la recopilación de datos para investigar las hipótesis referentes al meca ­
nismo de acción (6).
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
7. En la determinación y evaluación de las características toxicológicas de una 
sustancia problema, el laboratorio de ensayo deberá tener en cuenta toda la 
información disponible acerca de la sustancia química antes de emprender el estudio, para así poder centrarse de manera más eficaz en la toxicidad crónica potencial y minimizar el uso de animales. En el diseño del estudio 
serán de ayuda el conocimiento de la identidad, estructura química y pro ­
piedades fisicoquímicas de la sustancia problema; cualquier información referente al mecanismo de acción; los resultados de cualesquiera ensayos de toxicidad  in vitro  o in vivo;  el uso o los usos previstos y la exposición 
humana potencial; los datos de (Q)SAR previos y los datos toxicológicos 
sobre sustancias estructuralmente afines; los datos toxicocinéticos disponi ­
bles (cinética de dosis única y, en su caso, de acumulación por dosis repetidas) y los datos derivados de otros estudios de exposición continuada. 
La determinación de la toxicidad crónica solo debe emprenderse una vez 
que se ha recabado la información toxicológica inicial en los ensayos de toxicidad por administración repetida durante 28 días y/o 90 días. Se hará 
un planteamiento escalonado de los estudios de toxicidad crónica como 
parte de la evaluación global de los potenciales efectos adversos que puede tener para la salud una sustancia determinada (11) (12) (13) (14). 
8. Antes de iniciar el estudio se establecerán los métodos estadísticos más 
adecuados para el análisis de los resultados, en función del diseño y de los objetivos experimentales. Una cuestión importante es si la evaluación 
estadística debe incorporar ajustes de la supervivencia y los análisis en caso 
de terminación prematura de uno o varios lotes. Se ofrecen orientaciones para realizar el análisis estadístico adecuado y referencias a los métodos estadísticos internacionalmente aceptados en el documento de 
orientación (GD) n
 o 116 (6) y en el GD n  o 35 sobre análisis y evaluación 
de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis (15).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Cuando se efectúa un estudio de toxicidad crónica, son de aplicación los 
principios y consideraciones recogidos en el documento de orientación n  o 19 
de la OCDE sobre el reconocimiento, la evaluación y la aplicación de los signos clínicos con criterios compasivos en los animales experimentales que se usan para evaluar la seguridad (16), en particular su punto 62. Dicho 
punto especifica que en los estudios de administración continuada, cuando 
un animal muestre signos clínicos progresivos que entrañen un deterioro creciente de su estado, habrá que decidir con conocimiento de causa si se sacrifica de forma compasiva. La decisión sopesará el valor de la informa ­
ción que puede obtenerse si se mantiene al animal en el estudio frente al 
desgaste de su estado general. Si se decide mantener al animal en el ensayo, se aumentará la frecuencia de las observaciones en la medida necesaria. Cabe también la posibilidad de, sin perjudicar a los fines de la investigación, 
suspender temporalmente la administración para aliviar el dolor o sufrimien ­
to, o reducir la dosis experimental. 
10. Se ofrecen orientaciones y comentarios detallados sobre los principios que 
deben orientar la selección de la dosis en los estudios de toxicidad crónica y 
carcinogénesis en el documento de orientación n
 o 116 (6) y en dos publi ­
caciones del International Life Sciences Institute (17) (18). El núcleo de la estrategia de selección de la dosis depende del objetivo o los objetivos 
principales del estudio (punto 6). Al elegir un intervalo posológico adecua ­
do, debe buscarse un equilibrio entre el cribado de los peligros, por un lado, y la caracterización de las respuestas ante dosis bajas y su importancia, por otro. Ello tiene especial trascendencia cuando se proyecta (punto 11) un 
ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 
del presente anexo). 
11. Se considerará la posibilidad de efectuar un ensayo combinado de toxicidad 
crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 de este anexo) en lugar de realizar 
por separado un ensayo de toxicidad crónica (presente método de ensayo B.30) y un ensayo de carcinogénesis (capítulo B.32 de este anexo). El ensayo combinado permite una mayor eficiencia que los estudios separados 
en términos de tiempo y costes, sin comprometer la calidad de los datos ni 
en la fase de toxicidad crónica ni en la fase de carcinogénesis. Sin embargo, cuando se emprenda un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcino ­
génesis (capítulo B.33 de este anexo) habrá que considerar detenidamente 
los principios de la selección de la dosis (puntos 9 y 20-25) y, por otro lado, 
se entiende que determinados marcos legislativos pueden imponer la reali ­
zación de ensayos separados. 
12. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se 
facilitan al final del presente capítulo y en el documento GD 116 (6).
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
13. La sustancia problema se administra diariamente en dosis escalonadas a 
varios lotes de animales experimentales, normalmente durante un período de 12 meses, si bien este puede reducirse o prolongarse en función de los 
requisitos normativos (véase el punto 33). Dicho período se ha seleccionado 
por ser suficientemente largo para permitir que se manifiesten los eventuales efectos de toxicidad acumulativa, pero sin que se confundan con las altera ­
ciones geriátricas. Toda desviación de este período de exposición de 12 
meses deberá justificarse, particularmente si es en el sentido de acortarlo. 
La sustancia problema se administra generalmente por vía oral, aunque también se aceptan las vías inhalatoria y cutánea. El diseño del estudio puede contemplar el sacrificio de uno o más animales durante el ensayo, 
por ejemplo a los 3 y a los 6 meses, y a tal efecto se podrán prever lotes 
complementarios de animales (véase el punto 19). A lo largo del período de administración, se observa atentamente a los animales por si aparecen signos de toxicidad. Se practica la autopsia a los animales que mueran o sean 
sacrificados durante el ensayo y, al final del mismo, se sacrifican y someten 
a autopsia los animales supervivientes.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
14. El presente método de ensayo se destina principalmente a la evaluación de 
la toxicidad crónica en roedores (véase el punto 2), si bien se acepta que en determinados marcos legislativos puedan hacerse estudios parecidos en es ­
pecies no roedoras. Se justificará la elección de la especie. El diseño y la 
realización de los estudios de toxicidad crónica en especies no roedoras, 
cuando proceda, se basará en los principios que se recogen en el presente método de ensayo y en el capítulo B.27 de este anexo, Toxicidad oral por administración continuada (28 días) en no roedores (5). Se ofrece más 
información sobre la elección de la especie y la cepa de laboratorio en el 
documento de orientación n
 o 116 de la OCDE (6). 
15. La especie recomendada en este método de ensayo es la rata, si bien pueden 
emplearse otras especies de roedores como el ratón. Las ratas y los ratones se prefieren como modelos experimentales debido a su ciclo vital relativa ­
mente corto, su amplia utilización en los estudios farmacológicos y toxico ­
lógicos, su sensibilidad a la inducción tumoral y la disponibilidad de cepas de laboratorio suficientemente caracterizadas. Debido a todas estas caracte ­
rísticas, se ha podido hacer un gran acopio de información acerca de su 
fisiología y anatomopatología. Se escogerán animales adultos jóvenes y 
sanos de una variedad de laboratorio de uso habitual. El estudio de toxicidad crónica debe efectuarse en animales de la misma variedad y procedencia que los usados en el estudio o los estudios preliminares de toxicidad de más 
breve duración. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas.
 
Condiciones de alojamiento y alimentación  
16. Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del 
mismo sexo; el enjaulamiento individual se considerará solo si está cientí ­
ficamente justificado (19) (20) (21). Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. La sala de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aun ­
que la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente 
no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el ideal es el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio con ­
vencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La dieta debe 
satisfacer todas las necesidades nutricionales de la especie estudiada, y se mantendrá en el mínimo posible su contenido en contaminantes alimenta ­
rios, entre otros los residuos de plaguicidas, contaminantes orgánicos per ­
sistentes, fitoestrógenos, metales pesados y micotoxinas que pudieran influir 
en los resultados experimentales. La información analítica sobre el contenido de nutrientes y contaminantes alimentarios se consignará de forma periódica, como mínimo al inicio del estudio y cada vez que se varíe el lote de 
producto empleado, y se documentará en el informe final. Así mismo se 
consignará la información analítica sobre el agua de bebida empleada en el estudio. Cuando la sustancia problema se administra con el alimento, la elección de la dieta se basa en la necesidad de conseguir una mezcla apro ­
piada de la sustancia problema y de satisfacer al mismo tiempo las necesi ­
dades nutricionales de los animales.
 
Preparación de los animales  
17. Deben emplearse animales sanos, que se hayan mantenido al menos 7 días 
en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no hayan sido 
sometidos a experimentos previos. En el caso de los roedores, la adminis ­
tración comenzará lo antes posible tras su destete y aclimatación, preferi ­
blemente antes de que los animales cumplan 8 semanas de edad. Se carac ­
teriza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y edad de los, animales de 
experimentación. La diferencia de peso entre los animales al empezar el  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de 
cada sexo. Los animales se reparten al azar entre los lotes tratados y los de 
control. Después de la asignación al azar, no debe haber diferencias signi ­
ficativas entre los grupos en las medias de peso corporal de cada sexo. De observarse diferencias estadísticamente significativas, el proceso de asigna ­
ción aleatoria a los grupos deberá repetirse en la medida de lo posible. Se 
asigna a cada animal un número de identificación distinto, con el que se marca de manera permanente mediante tatuaje, implante de microchip o cualquier otro medio adecuado.
 
PROCEDIMIENTO  
Número y sexo de los animales  
18. Se emplearán animales de ambos sexos. Se empleará un número de indivi ­
duos tal que al concluir el estudio queden suficientes animales en cada 
grupo para permitir una exhaustiva evaluación biológica y estadística. Tra ­
tándose de roedores, se emplean al menos 20 animales por sexo y lote en cada nivel de dosificación, mientras que en el caso de no roedores se 
recomienda un mínimo de 4 animales por sexo y lote. En los ensayos 
con ratones puede hacer falta un suplemento de animales en cada grupo de dosificación para llevar a cabo todas las valoraciones hematológicas necesarias.
 
Provisión de animales para el sacrificio durante el ensayo, los lotes 
satélite y los lotes centinela  
19. Si está científicamente justificado, se podrán hacer provisiones para el sa ­
crificio de animales (como mínimo 10 por sexo y lote) durante el ensayo, 
por ejemplo a los 6 meses, a fin de obtener información sobre la progresión 
de las alteraciones toxicológicas y sobre el mecanismo de acción. Si tal información ha sido ya proporcionada por estudios previos de toxicidad por administración repetida realizados con la misma sustancia problema, 
el sacrificio de animales durante el ensayo puede no estar científicamente 
justificado. Cabe la posibilidad de incluir lotes satélite para controlar la reversibilidad de las eventuales alteraciones tóxicas inducidas por la sustan ­
cia problema; generalmente, se limitan al lote del nivel de dosis más elevado 
del estudio y al lote testigo. Se podrá incluir además un lote de animales 
centinela (habitualmente 5 individuos de cada sexo) para supervisar su estado en cuanto a enfermedades, en caso necesario, durante el estudio (22). Si está previsto el sacrificio de animales durante el ensayo o la inclusión de 
lotes satélite o centinela, el diseño experimental se incrementará en el nú ­
mero de animales que vaya a ser sacrificado antes de que concluya el estudio. Estos animales se someten generalmente a las mismas observacio ­
nes (peso corporal, consumo de agua y alimentos, valoraciones de hemato ­
logía y bioquímica clínica e investigaciones anatomopatológicas) que los animales observados en la fase de toxicidad crónica del estudio principal, aunque se puede establecer que en los lotes que se sacrifiquen durante el 
ensayo, se restrinja dicha evaluación a aspectos cruciales como la neuroto ­
xicidad o la inmunotoxicidad.
 
Grupos de dosis y posología  
20. Se ofrecen indicaciones sobre todos los aspectos de la selección de la dosis 
y los intervalos entre las dosis en el documento de orientación n  o 116 (6). 
Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control, salvo si se 
lleva a cabo un ensayo límite (véase el punto 27). Los niveles de dosis se basan generalmente en los resultados de los estudios de determinación del intervalo o realizados con dosis repetidas a corto plazo, y deben tener en 
cuenta los datos toxicológicos y toxicocinéticos de que se disponga en 
relación con la sustancia problema o con sustancias afines.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Salvo limitaciones impuestas por la naturaleza fisicoquímica o los efectos 
biológicos de la sustancia problema, el nivel de dosis más elevado se esco ­
gerá a fin de identificar los principales órganos diana y efectos tóxicos pero evitando una toxicidad intensa, el sufrimiento, la morbilidad o la muerte de los animales. Tomando en consideración los factores que se indican en el 
punto 22 que sigue, el nivel de dosis más elevado será tal que provoque 
signos de toxicidad, por ejemplo, manifestada por una merma de la ganancia de peso corporal (aproximadamente el 10 %). 
22. Ahora bien, dependiendo de los objetivos del estudio (véase el punto 6), se 
puede establecer un techo de dosis inferior al nivel que provoque signos de toxicidad, por ejemplo si una dosis induce un efecto adverso de interés que, 
sin embargo, tiene escasa repercusión en el período de vida o el peso 
corporal. La dosis más elevada no debe exceder de 1 000 mg/kg peso corporal/día (dosis límite, véase el punto 27). 
23. Los niveles de dosis y la frecuencia de administración serán tales que 
permitan establecer una relación dosis-respuesta y un valor de NOAEL o cualesquiera otras determinaciones previstas, como el valor de BMD o dosis 
de referencia más baja (véase el punto 25). Para establecer las dosis más 
bajas se tendrán en cuenta factores como la pendiente esperada de la curva dosis-respuesta, así como los niveles a los que cabe esperar cambios impor ­
tantes en el metabolismo o en el mecanismo de la acción tóxica, cuando se 
prevea un umbral o que constituyan un punto de partida para extrapolar la 
dosis más baja. 
24. La frecuencia de administración de las dosis dependerá de las características 
de la sustancia problema y no corresponde especificarla en este método de ensayo; los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para esta ­
blecer los niveles descendentes y frecuentemente es preferible añadir un 
cuarto lote de ensayo antes que utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo 
con un factor superior a 6-10) entre dosis. En general se evitará aplicar factores superiores a 10, que en todo caso deberán justificarse. 
25. Tal como se recoge en el documento de orientación n
 o 116 (6), para la 
selección de las dosis se tendrán en cuenta los siguientes factores: 
— los intervalos supuestos o conocidos de no linealidad o puntos de in ­
flexión en la relación dosis-respuesta, 
— la toxicocinética y los intervalos posológicos en los que pueda haber o 
no inducción metabólica, saturación o no linealidad entre la dosimetría externa e interna, 
— las lesiones precursoras, los marcadores de efecto o los indicadores de la 
intervención de los principales mecanismos biológicos subyacentes, 
— aspectos importantes (hipotéticos o comprobados) del modo de acción, 
como la dosis a partir de la cual se manifiesta toxicidad, los niveles 
hormonales que resultan afectados, los mecanismos homeostáticos que 
se alteran, etc., 
— aquellas regiones de la curva dosis-respuesta en las que se precisa hacer 
una estimación especialmente robusta, como el intervalo de la dosis de referencia prevista o el umbral hipotético, 
— los niveles de exposición humana que cabe prever.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Se emplea un lote de control en paralelo, que no recibe la sustancia pro ­
blema, pero sí el vehículo de la misma en caso de que se utilice. A excep ­
ción de la administración de la sustancia problema, los animales del lote de control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de trata ­
miento. En su caso, el lote de control ha de recibir el mayor volumen de 
vehículo que se haya utilizado. Si la sustancia problema se administra con 
los alimentos y provoca una disminución importante de la ingesta debido a que empeoran las características organolépticas de la dieta, puede ser útil utilizar un lote de control alimentado en paralelo para conseguir una com ­
paración más rigurosa. 
27. Si sobre la base de los estudios preliminares es posible prever que, en un 
ensayo con una sola dosis equivalente, al menos, a 1 000 mg/kg peso 
corporal/día y siguiendo el procedimiento descrito en el presente estudio, 
no se produce ningún efecto adverso observable y si, a la luz de los datos de sustancias estructuralmente afines, no cabe esperar efectos tóxicos, puede considerarse innecesario realizar un estudio completo con tres dosis. Se 
puede establecer un límite de 1 000 mg/kg peso corporal/día, salvo si la 
exposición humana previsible indica la necesidad de emplear un nivel de dosis más elevado.
 
Preparación de las dosis y administración de la sustancia problema  
28. La sustancia problema se administra habitualmente por vía oral, mediante 
sonda o con el alimento o el agua de bebida. Se ofrece más información 
sobre las vías y los métodos de administración en el documento de orien ­
tación n  o 116 de la OCDE (6). La vía y el método de administración 
dependerán de la finalidad del estudio, las propiedades fisicoquímicas de 
la sustancia problema, su biodisponibilidad y la vía y el modo de exposición 
predominantes en los seres humanos. Se justificará debidamente la vía y el método de administración elegidos. Por razones de bienestar animal, la alimentación oral por sonda se elegirá solo cuando exista una posibilidad 
razonable de que la exposición humana a la sustancia química se vaya a 
producir por la misma vía y el mismo medio de administración (como es el caso de los productos farmacéuticos). Cuando se trata de sustancias alimen ­
tarias o ambientales, entre ellas los plaguicidas, la administración se efectúa 
habitualmente con los alimentos o el agua de bebida. Sin embargo, en otros 
escenarios de estudio, como la exposición ocupacional, puede ser más con ­
veniente la administración por otras vías. 
29. En caso necesario, la sustancia problema se disuelve o suspende en un 
vehículo adecuado. Debe prestarse atención a las siguientes características del vehículo u otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribución, metabolismo o retención de la sustancia problema, efectos 
sobre las propiedades químicas de dicha sustancia que puedan modificar 
su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y agua o el estado nutricional de los animales. Se recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, 
después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite 
de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus características tóxicas. Se recabará información acerca de la estabilidad de la sustancia 
problema y su homogeneidad de concentración en las disoluciones o en 
las dietas (en su caso) que se emplean para la administración. 
30. Si la sustancia problema se administra con los alimentos o el agua de 
bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia pro ­
blema administradas no interfieren con la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. En los estudios de toxicidad a largo plazo en los que la sustancia problema se administra con los alimentos, su concentración no debe superar 
generalmente el límite del 5 % de la ingesta total para evitar desequilibrios 
nutricionales. Cuando la sustancia problema se administra con los alimentos, se puede usar una concentración constante en la dieta (mg/kg de alimento o ppm) o bien una dosis constante en términos de peso corporal (mg/kg peso 
corporal), calculada con periodicidad semanal. Deberá indicarse qué alter ­
nativa se ha seguido.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. En el caso de la administración oral, las dosis de la sustancia problema se 
administran diariamente a los animales (siete días por semana), en general 
por un período de 12 meses (véase también el punto 33), si bien los requisitos normativos pueden imponer una duración mayor. Cualquier otra pauta posológica, por ejemplo, de 5 días por semana, debe justificarse. En el 
caso de la administración cutánea, los animales se tratan con la sustancia 
problema como mínimo 6 horas al día con una pauta de 7 días por semana, según se especifica en el capítulo B.9 del presente anexo (10), durante un período de 12 meses. La exposición por vía inhalatoria se efectúa durante 6 
horas al día con una pauta de 7 días por semana pero, si se justifica, es 
admisible una pauta de 5 días por semana. El período de exposición será habitualmente de 12 meses. Cuando se exponen con la técnica de solo la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de 
exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justi ­
ficará debidamente cualquier período de exposición inferior a 6 horas dia ­
rias. Véase también el capítulo B.8 del presente anexo (8). 
32. Si la sustancia problema se administra por sonda, debe hacerse con una 
sonda gástrica o una cánula de intubación adecuada y todos los días a la misma hora. La dosis única se administra normalmente una vez al día; pero 
si la sustancia problema es un irritante local, cabe la posibilidad de mantener 
la dosis total diaria repartiendo la administración en dosis divididas (dos veces al día). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. El volumen se mantendrá en el 
mínimo posible, y en los roedores no debe exceder generalmente de 1 
ml/100 g peso corporal (22). La variabilidad en el volumen utilizado debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para garantizar un volumen constante en todas las dosis. Constituyen una excepción las sustancias po ­
tencialmente corrosivas o irritantes, que deben diluirse para evitar efectos 
locales graves. Se evitará la administración de concentraciones que puedan ser corrosivas o irritantes del tubo digestivo gastrointestinal.
 
Duración del estudio  
33. Si bien este método de ensayo ha sido diseñado principalmente como estu ­
dio de toxicidad crónica durante 12 meses, su diseño permite aplicarlo a ensayos de duración menor (6 o 9 meses) o mayor (18 o 24 meses), en función de los requisitos normativos particulares o de los mecanismos es ­
pecíficos que se pretenda investigar. Toda desviación de este período de 
exposición de 12 meses deberá justificarse, particularmente si es en el sentido de acortarlo. Concluida la exposición, los lotes satélite incluidos para comprobar la reversibilidad de las eventuales alteraciones tóxicas in ­
ducidas por la sustancia problema deben mantenerse sin administración 
durante un período no inferior a 4 semanas ni superior a un tercio de la duración total del estudio. Se ofrecen más indicaciones, entre otras, sobre la supervivencia en el estudio en el documento de orientación n
 o 116 (6).  
OBSERVACIONES 
34. Se observará la morbilidad o la mortalidad en todos los animales, general ­
mente a primera y última hora del día, incluidos los fines de semana y festivos. Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora y teniendo en cuenta el período más 
agudo de los efectos previstos tras la administración cuando esta se haga por 
sonda.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Se someterán todos los animales a observación clínica exhaustiva como 
mínimo antes de la primera exposición (para permitir realizar comparaciones 
con un mismo sujeto), al concluir la primera semana de estudio y, en lo sucesivo, con periodicidad mensual. El protocolo de tales observaciones se organizará con el fin de minimizar las variaciones entre los observadores 
individuales y entre los distintos lotes experimentales. Dichas observaciones 
han de efectuarse fuera de la jaula de alojamiento, de preferencia en un ambiente normal y siempre a la misma hora. Las observaciones se registran cuidadosamente, preferentemente mediante sistemas de puntuación definidos 
de forma explícita por el laboratorio de ensayo. Debe procurarse que las 
variaciones en las condiciones de observación sean mínimas. Los signos anotados deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios de la piel, pelo, ojos, membranas mucosas, presencia de secreciones y excreciones y 
actividad neurovegetativa (lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila y 
respiración anómala). Deben registrarse también los cambios en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de movimien ­
tos clónicos o tónicos, o estereotipados (por ejemplo, realización excesiva de 
movimientos de limpieza o recorridos circulares repetitivos) o comporta ­
mientos anómalos (automutilación, marcha hacia atrás, etc.) (24). 
36. Debe realizarse una exploración oftalmológica con un oftalmoscopio o 
equipo similar adecuado a todos los animales antes de administrar la sus ­
tancia problema. Al concluir el estudio, el mismo examen se practicará 
preferiblemente a todos los animales y, obligatoriamente, a los lotes de control y de dosis más elevada. Si se observan en esos animales cambios oculares relacionados con el tratamiento, deben examinarse todos los demás. 
Si el análisis estructural o cualquier otra información indica toxicidad oftál ­
mica, se aumentará la frecuencia de las exploraciones oftalmológicas. 
37. Cuando se trate de sustancias para las que estudios previos de toxicidad por 
administración repetida durante 28 días o 90 días hayan demostrado efectos 
neurotóxicos, las pruebas de reactividad sensorial a estímulos de diferentes tipos (24) [por ejemplo, auditivos, visuales y propioceptivos (25) (26) (27)], así como la evaluación de la fuerza prensil (28) y de la actividad motriz 
(29), podrán hacerse facultativamente antes de iniciar el estudio, a intervalos 
de 3 meses durante el mismo hasta un máximo de 12 meses inclusive, y a la conclusión del estudio (si dura más de 12 meses). La bibliografía respectiva recoge más información sobre los métodos que pueden seguirse, si bien es 
posible emplear procedimientos distintos de los ahí descritos. 
38. Cuando los estudios previos de toxicidad por administración continuada 
durante 28 días o 90 días indiquen que la sustancia tiene capacidad inmu ­
notóxica, al concluir el estudio se podrán proseguir las investigaciones de 
este parámetro.
 
Peso corporal, consumo de alimentos y agua y eficiencia alimentaria  
39. Deben pesarse todos los animales al comenzar el tratamiento, como mínimo 
una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Se medirán la ingesta de alimento y la eficiencia alimentaria como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras 
semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Si la sustancia se 
administra con el agua de bebida, se medirá la ingesta de agua como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. La determinación de la ingesta de 
agua se contemplará así mismo en aquellos estudios en los que esté alterada 
la actividad de beber.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematología y bioquímica clínica  
40. En las investigaciones realizadas con roedores, se practicarán exámenes 
hematológicos como mínimo en 10 machos y 10 hembras de cada grupo, siempre los mismos, a los 3, 6 y 12 meses y al concluir el estudio (si dura 
más de 12 meses). En los ensayos con ratones puede hacer falta un suple ­
mento de animales satélite para llevar a cabo todas las valoraciones hema ­
tológicas necesarias (véase el punto 18). Cuando se trate de especies no roedoras, se tomarán muestras más pequeñas de animales (por ejemplo, 4 
animales por sexo y grupo en el caso de los perros) para las valoraciones 
realizadas durante el ensayo y a su conclusión. Se trate de especies roedoras o no, las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han 
observado efectos sobre los parámetros hematológicos en los estudios pre ­
vios efectuados durante 90 días con dosis afines. Las muestras de sangre se extraerán de una zona que deberá indicarse, por ejemplo por punción car ­
diaca o del seno retro-orbital, bajo anestesia. 
41. Se investigarán los siguientes parámetros (30): recuento de leucocitos y 
fórmula leucocitaria, recuento de eritrocitos y de plaquetas, concentración 
de hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio (MCV), hemo ­
globina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpus ­
cular media (MCHC), tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina 
parcial activada. Pueden determinarse además otros parámetros hematológi ­
cos como los cuerpos de Heinz, la morfología de otros eritrocitos atípicos o los valores de metahemoglobina, en función de la toxicidad de la sustancia problema. El planteamiento general ha de ser flexible, y adaptado a los 
efectos observados o esperados de la sustancia problema. Si esta ejerce 
efectos sobre el sistema hematopoyético, pueden estar indicados recuentos de reticulocitos y una citología de la médula ósea, que no son valoraciones habituales. 
42. En los intervalos de tiempo especificados para determinar las variables 
hematológicas, se realizarán análisis de bioquímica clínica para investigar los principales efectos tóxicos sobre los tejidos y, específicamente, sobre los riñones y el hígado como mínimo en 10 machos y 10 hembras de cada 
grupo, siempre los mismos. En el caso de los ratones, pueden hacer falta 
animales satélite para efectuar todas las valoraciones necesarias de bioquí ­
mica clínica. Cuando se trate de especies no roedoras, se tomarán muestras de menos animales (por ejemplo, 4 animales por sexo y grupo en el caso de 
los perros) para las valoraciones realizadas durante el ensayo y a su con ­
clusión. Se trate de especies roedoras o no, las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los parámetros de bioquímica clínica en los estudios previos efectuados durante 90 días con 
dosis afines. Se recomienda que los animales (a excepción de los ratones) 
guarden ayuno desde el día anterior a la extracción de las muestras de sangre. Se investigarán los siguientes parámetros (30): glucosa, urea (nitró ­
geno ureico), creatinina, proteínas totales, albúmina, calcio, sodio, potasio, 
colesterol total, al menos dos pruebas completas de la función hepatocelular 
(alanina-aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa, glutamato-deshidroge ­
nasa, ácidos biliares totales) (31) y al menos dos pruebas completas de la función hepatobiliar (fosfatasa alcalina, gamma-glutamiltransferasa, 5’-nu ­
cleotidasa, bilirrubina total, ácidos biliares totales) (31). Cuando proceda y 
a tenor de la toxicidad de la sustancia problema, pueden hacerse otras valoraciones de bioquímica clínica como las de triglicéridos en ayunas, hormonas específicas y colinesterasa. Por lo general, debe aplicarse un 
enfoque flexible, en función de los efectos observados o esperados con 
una sustancia química determinada.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Se practicarán análisis de orina como mínimo en 10 machos y 10 hembras 
de cada grupo, sobre muestras recogidas respetando los mismos intervalos 
que en los análisis de hematología y bioquímica clínica. Las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los análisis de orina en un estudio previo efectuado durante 90 días con dosis 
afines. Las recomendaciones hechas por expertos acerca de los estudios de 
patología clínica incluyen los siguientes parámetros (30): aspecto, volumen, osmolalidad o densidad, pH, proteínas totales y glucosa. Otras valoraciones son cuerpos cetónicos, urobilinógeno, bilirrubina y sangre oculta. Si es 
necesario, pueden analizarse otros parámetros adicionales para profundizar 
el estudio de los efectos observados. 
44. De manera general, se acepta que es necesario disponer de valores basales 
de hematología y bioquímica clínica antes de someter a estudio a los perros, pero no en el caso de las especies roedoras (30). Ahora bien, si los datos basales históricos (véase el punto 50) son insuficientes, se considerará la 
oportunidad de generar estos datos.
 
Anatomía patológica  
Autopsia macroscópica  
45. Como norma debe practicarse una autopsia macroscópica completa y deta ­
llada a todos los animales empleados en el estudio, que incluya un examen detenido de la superficie corporal externa, todos los orificios y las cavidades 
craneana, torácica y abdominal con su contenido. Sin embargo, se puede 
prever además la realización solo (en lotes satélite o animales sacrificados durante el ensayo) de valoraciones clave específicas, por ejemplo de neuro ­
toxicidad o inmunotoxicidad (véase el punto 19). Estos animales no tienen 
que someterse a autopsia ni a las consiguientes exploraciones que se des ­
criben a continuación. La autopsia de los animales centinela se decidirá según cada caso, a criterio del director del estudio. 
46. Se registrará el peso de los órganos de todos los animales, salvo los que 
quedan excluidos en la última parte del punto 45. Las cápsulas suprarrena ­
les, encéfalo, epidídimo, corazón, riñones, hígado, ovarios, bazo, testículos, 
tiroides (que se pesará después de la fijación, con las paratiroides) y útero de 
todos los animales (aparte de los moribundos y/o sacrificados a lo largo del ensayo) han de limpiarse de los tejidos adherentes, según convenga, y se 
determinará el peso húmedo lo antes posible tras la disección para evitar su 
desecación. En los estudios con ratones, el pesaje de las cápsulas suprarre ­
nales es opcional. 
47. Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el medio 
de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el examen histopatológico a que vayan a someterse (32) (opcional en el caso 
de los tejidos entre corchetes): 
Todas las lesiones macros ­
cópicas Corazón Páncreas Estómago (rumen, estómago 
glandular) 
Glándulas suprarrenales Íleo Glándulas paratiroides [Dientes] 
Aorta Yeyuno Nervios periféricos Testículos 
Encéfalo (incluidos cortes 
de cerebro, cerebelo, bulbo y protuberancia) Riñón Hipófisis Timo 
Intestino ciego Glándulas lacrimales 
(extraorbitales) Próstata Tiroides 
Cuello del útero Hígado Recto [Lengua]
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
Glándulas coagulantes Pulmón Glándulas salivales Tráquea 
Colon Ganglios linfáticos (su ­
perficiales y profundos) Vesículas seminales Vejiga urinaria 
Duodeno Glándulas mamarias 
(obligatoriamente las fe ­
meninas y, sin son visi ­
blemente diseccionables, también las masculinas) Músculo esquelético Útero (y cuello) 
Epidídimo [Vías respiratorias altas, 
incluidos nariz, cornetes y senos paranasales] Piel [Uréteres] 
Ojos (y retina) Esófago Médula espinal (tres 
secciones: cervical, 
medio-dorsal y lumbar) [Uretra] 
[Fémur y articulación tibio ­
femoral] [Bulbo olfativo] Bazo Vagina 
Vesícula biliar (en especies 
distintas de la rata) Ovarios [Esternón] Sección de médula ósea y/o 
aspirado reciente de médula 
Glándula de Harder 
En el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se 
conservarán ambos órganos. Las observaciones clínicas y de otro tipo pue ­
den indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también 
cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propie ­
dades conocidas de la sustancia problema. En los estudios que entrañen la vía de administración cutánea, se conservarán los mismos órganos que en el 
caso de la administración oral, pero además es fundamental establecer un 
protocolo específico para la obtención y conservación de muestras de piel de la zona de aplicación. En los estudios de inhalación, los tejidos de las vías respiratorias se conservarán y examinarán siguiendo las recomendaciones de 
los capítulos B.8 (8) y B.29 (9) del presente anexo. Los restantes órganos y 
tejidos (además de los tejidos de las vías respiratorias específicamente con ­
servados), se examinarán igual que se ha establecido en el caso de la administración oral.
 
Examen histopatológico  
48. Se puede consultar el documento de orientación sobre buenas prácticas en la 
realización de los estudios de toxicopatología (32). Como mínimo, el exa ­
men histopatológico debe hacerse sobre: 
— todos los tejidos de los animales de control y del grupo con dosis 
máxima, 
— todos los tejidos de los animales muertos o sacrificados durante el 
estudio, 
— todos los tejidos que presenten alteraciones macroscópicas, 
— los tejidos diana (o los tejidos que presentaban alteraciones relacionadas 
con el tratamiento en el grupo de dosis máxima) de todos los animales 
pertenecientes a los restantes grupos de dosis, 
— en el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se 
examinarán ambos órganos.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
DATOS E INFORME  
Datos  
49. Se documentarán los datos de todos los parámetros evaluados en cada 
animal. Además, deben resumirse todos los datos en un cuadro que recoja, por cada lote de ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por 
razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de 
animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el 
porcentaje de animales afectado por cada tipo de lesión. Los cuadros de 
datos agrupados reflejarán las medias y desviaciones típicas (en el caso de variables continuas) de los animales que presenten lesiones o efectos tóxi ­
cos, además de una escala de clasificación de las lesiones. 
50. Los datos sobre controles históricos pueden resultar de ayuda en la inter ­
pretación de los resultados del estudio, por ejemplo cuando haya indicios de 
que los resultados arrojados por los controles simultáneos se desvían esen ­
cialmente de los datos recientes obtenidos en animales controles del mismo animalario o colonia. De ser evaluados, los datos sobre controles históricos 
deben proceder del mismo laboratorio, y corresponder a animales de edades 
y cepas afines, y haberse generado en los cincos años precedentes al estudio en cuestión. 
51. Siempre que sea posible, deben evaluarse los resultados numéricos mediante 
un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. La elección de los 
métodos estadísticos y de los datos que vayan a analizarse debe efectuarse 
en la fase de diseño del estudio (punto 8). Para ello se tendrán en cuenta los ajustes de la supervivencia, en su caso.
 
Informe del ensayo  
52. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas. — Datos de identificación. — Procedencia de la sustancia. — Número de lote. — Certificado de análisis químico.  
Vehículo (si procede):  
— Justificación de la elección del vehículo (si es distinto del agua).  
Animales de ensayo:  
— Especie y cepa utilizada y motivos para elegirla. — Número, edad y sexo de los animales al inicio del ensayo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— Origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc. 
— Peso de cada animal al inicio del ensayo.  
Condiciones del ensayo:  
— Fundamento de la elección de la vía de administración y la dosis. 
— Cuando proceda, métodos estadísticos aplicados al análisis de los datos. — Pormenores de la formulación de la sustancia o de su preparación con la 
comida. 
— Datos analíticos acerca de la concentración obtenida, la estabilidad y la 
homogeneidad de la preparación. 
— Vía y método de administración de la sustancia problema. 
— En los estudios de inhalación se indicará si es de solo por la nariz o de 
cuerpo entero. 
— Dosis reales (mg/kg peso corporal/día) y factor de conversión de la 
concentración (mg/kg o ppm) de la sustancia problema en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales, en su caso. 
— Datos de la calidad de los alimentos y el agua.  
Resultados (se presentarán cuadros de datos agrupados así como los datos 
de cada animal):  
— Datos de supervivencia. 
— Peso corporal y variaciones del mismo. 
— Ingesta de alimento, cálculos de la eficiencia alimentaria, si se han 
hecho, e ingesta de agua cuando proceda. 
— Datos de respuestas tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos de 
toxicidad. 
— Naturaleza, incidencia (y, si se ha clasificado, gravedad) y duración de 
las observaciones clínicas (reversibles o no). 
— Examen oftalmológico. 
— Pruebas hematológicas. 
— Análisis de bioquímica clínica. — Análisis de orina. 
— Resultados de cualesquiera investigaciones de neurotoxicidad o inmuno ­
toxicidad. 
— Peso corporal en el momento de la muerte. — Pesaje de los órganos (y pesos relativos, cuando proceda). 
— Observaciones de la autopsia. 
— Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas rela ­
cionadas con el tratamiento. 
— Datos sobre la absorción, si los hay.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Tratamiento estadístico de los resultados, según proceda. 
La discusión de los resultados comprende lo siguiente:  
— La relación dosis-respuesta. 
— Otras informaciones sobre el modo de acción. 
— La discusión de cualquier hipótesis o modelo teórico. 
— Valores de BMD, NOAEL o LOAEL. 
— Datos sobre controles históricos. — Relevancia para los seres humanos.  
Conclusiones
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208. 
(3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191. 
(4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Pro ­
gramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. 
(5) Capítulo B.27 del presente anexo. Ensayo de toxicidad oral subcrónica. 
Toxicidad oral por administración continuada (90 días) en no roedores. 
(6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453-Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, avai ­
lable on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines. 
(7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N
 o 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris. 
(8) Capítulo B.8 del presente anexo. Toxicidad subaguda por inhalación: estu ­
dio de 28 días. 
(9) Capítulo B.29 del presente anexo. Toxicidad subcrónica por inhalación: 
estudio de 90 días. 
(10) Capítulo B.9 del presente anexo. Toxicidad por administración continuada 
(28 días) por vía cutánea. 
(11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Che ­
mical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of 
Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. 
(12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. 
(13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 69-98. 
(15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. 
(16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837. 
(18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. 
(19) Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de 
septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (DO L 276 de 20.10.2010, p. 33). 
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
(21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255- 04-2. 
(22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems. 
(23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. 
(24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60. 
(25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. 
(26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. 
(27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. 
(28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. 
(29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Te ­
ratol. 13: 599-609.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201. 
(31) EMEA (draft) document «Non-clinical guideline on drug-induced hepato ­
toxicity» (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). 
(32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Apéndice 1  
DEFINICIÓN  
Sustancia problema:  cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este mé ­
todo de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  ESTUDIO DE TOXICIDAD PARA EL DESARROLLO 
PRENATAL  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 414 (2001).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente ensayo de toxicidad para el desarrollo tiene por objeto 
proporcionar información general sobre los efectos de la exposición 
prenatal en la hembra grávida sometida a ensayo y en el organismo intrauterino en desarrollo; incluye, en particular, la evaluación de los efectos sobre la madre, así como la muerte, anomalías estructurales y 
alteraciones del crecimiento del feto. Pese a que las deficiencias 
funcionales constituyen un aspecto importante del crecimiento, no se contemplan en el presente método de ensayo. Pueden investigarse al margen o como complemento de este método en un estudio de 
neurotoxicidad para el desarrollo. Este último y el estudio de toxi ­
cidad para la reproducción en dos generaciones pueden emplearse para detectar deficiencias funcionales y otros efectos postnatales. 
En algunos casos particulares, puede ser necesario adaptar el proto ­
colo de este ensayo, en función, por ejemplo, de las propiedades fisicoquímicas o toxicológicas de la sustancia de ensayo. La adapta ­
ción será aceptable si se dispone de datos científicos convincentes 
que indiquen que de esa manera el ensayo proporcionará mayor 
información. En tal caso, esos datos científicos deberán incluirse minuciosamente en el informe del ensayo.
 
1.2. DEFINICIONES  
Toxicología del desarrollo:  estudio de los efectos adversos sobre un 
organismo en desarrollo, que pueden producirse tras la exposición antes de la concepción y durante el desarrollo prenatal y postnatal 
hasta la maduración sexual. Los principales signos de la toxicidad 
para el desarrollo son la muerte del organismo, las anomalías estruc ­
turales, la alteración del crecimiento y las deficiencias funcionales. Antiguamente, la toxicología del desarrollo solía denominarse tera ­
tología.  
Efecto adverso:  toda alteración respecto a una situación de referen ­
cia, relacionada con el tratamiento, que disminuya la capacidad del 
organismo para sobrevivir, reproducirse o adaptarse al entorno. La 
toxicología del desarrollo, considerada en su sentido más amplio, incluye todos los efectos que afectan al desarrollo normal del pro ­
ducto de la concepción, antes y después del nacimiento.  
Alteración del crecimiento:  alteración que afecte al peso o el ta ­
maño del cuerpo o los órganos de la descendencia.  
Alteraciones (anomalías):  alteraciones estructurales en el desarrollo, 
que incluyen las malformaciones y las variaciones (28).  
Malformación/anomalía grave:  cambio estructural que se considere 
perjudicial (también puede resultar letal) para el animal y, por lo 
general, infrecuente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Variación/anomalía leve:  cambio estructural que se considere poco 
o nada perjudicial para el animal; puede tener carácter transitorio y 
ser relativamente frecuente en la población de control.  
Producto de la concepción:  conjunto de los derivados de un óvulo 
fecundado, en cualquier fase del desarrollo, desde la fecundación 
hasta el nacimiento, incluidas las membranas extraembrionarias y el embrión o el feto.  
Implantación (anidación):  fijación del blastocisto en la túnica epi ­
telial del útero, que incluye la penetración por el epitelio uterino y la inserción en el endometrio.  
Embrión:  primera fase del desarrollo de un organismo, en particular, 
la fase de desarrollo de un huevo fecundado desde que aparece el eje mayor hasta que quedan representadas las estructuras principales.  
Embriotoxicidad:  novicidad para la estructura, el desarrollo, el cre ­
cimiento y/o la viabilidad normales de un embrión.  
Feto:  descendencia nonata en el período postembrionario.  
Fetotoxicidad:  novicidad para la estructura, el desarrollo, el creci ­
miento y/o la viabilidad normales de un feto.  
Aborto:  expulsión prematura del útero de los productos de la con ­
cepción (embrión o feto no viable).  
Resorción:  absorción de un producto de la concepción que muere 
una vez implantado en el útero.  
Resorción precoz:  signos de implantación sin embrión ni feto reco ­
nocible.  
Resorción tardía:  embrión o feto muerto, que presenta 
cambios degenerativos externos.  
NOAEL:  sigla inglesa referente a la dosis de exposición sin efec ­
tos adversos observados, es decir, la dosis o grado de exposición más alto al que no se observa ningún efecto adverso debido al 
tratamiento.
 
1.3. SUSTANCIA DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Por lo general, se administra la sustancia de ensayo a las hembras 
grávidas al menos desde la implantación hasta la víspera del sacri ­
ficio, que debe llevarse a cabo tan cerca como sea posible de la 
fecha probable del parto, pero no demasiado tarde, para evitar la 
pérdida de datos en caso de parto prematuro. El método de ensayo no se refiere únicamente al período de la organogénesis (del 5° al 15° día en los roedores y del 6° al 18° en el conejo), sino que 
estudia asimismo los efectos a lo largo de toda la gestación, desde 
la fase previa a la implantación, en su caso, hasta la víspera de la cesárea. Las hembras se sacrifican poco antes de la cesárea. Se estudia el contenido uterino y se examinan los fetos para detectar 
las anomalías externas visibles y los cambios en los tejidos blandos y 
el esqueleto.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.5.1.  Selección de la especie animal  
Se recomienda realizar el ensayo con la especie más adecuada y 
utilizar las especies y cepas de laboratorio más comunes en los 
ensayos de toxicidad para el desarrollo prenatal. El roedor idóneo 
es la rata y, entre los no roedores, el conejo. Deberá justificarse el empleo de otra especie.
 
1.5.2.  Alojamiento y alimentación  
El cuarto de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C 
(± 3°) en el caso de los roedores y de 18 °C (+ 3°) en el caso de los 
conejos, y con una humedad relativa mínima del 30 % y preferible ­
mente inferior al 70 %, salvo durante la limpieza del local, si bien lo ideal es que esté comprendida entre el 50 y el 60 %. Se aplica una 
iluminación artificial en una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas 
de oscuridad. Se proporciona una dieta alimentaria corriente para animales de laboratorio y agua potable a voluntad. 
El apareamiento debe llevarse a cabo en jaulas adecuadas. Si bien es 
preferible colocar a los animales apareados en jaulas individuales, 
también pueden alojarse en grupos reducidos.
 
1.5.3.  Preparación de los animales  
Deben emplearse animales sanos, que se hayan mantenido al menos 
5 días en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no hayan sido sometidos a experimentos previos. Se caracteriza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y/o edad de los animales de 
experimentación. El peso y la edad de los animales de experimen ­
tación debe ser lo más uniforme posible en todos los lotes de ensayo. Deben emplearse hembras adultas jóvenes y nulíparas para cada dosis. Las hembras han de aparearse con machos de la misma espe ­
cie y cepa y debe evitarse el apareamiento entre animales hermanos. 
En el caso de los roedores, el día 0 de la gestación es el día en que se observa un tapón vaginal y/o la presencia de semen; en el caso de los conejos, suele ser el día del coito o de la inseminación artificial, 
si se emplea esta técnica. Las hembras apareadas se reparten al azar 
entre los lotes tratados y los de control. Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Se asigna a cada animal un número de identificación 
distinto. Si el apareamiento se efectúa por grupos, los animales de un 
mismo grupo se repartirán de forma uniforme entre los distintos lotes. Asimismo, las hembras inseminadas por un mismo macho se repartirán de manera uniforme entre los lotes.
 
1.6. PROCEDIMIENTO  
1.6.1.  Número y sexo de los animales  
Cada lote de ensayo y de control deberá estar integrado por una 
cantidad de hembras que permita practicar la autopsia de unos 20 ejemplares que presenten puntos de implantación. Los lotes de me ­
nos de 16 hembras con puntos de implantación pueden resultar 
inadecuados. La mortalidad materna no invalida necesariamente el 
estudio, siempre y cuando no supere el 10 % aproximadamente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Preparación de las dosis  
Si se emplea un aditivo u otro vehículo para facilitar la dosificación, 
deberán tenerse presentes los efectos sobre la absorción, distribución, metabolismo y retención o excreción de la sustancia de ensayo, los 
efectos sobre las propiedades químicas de esta que puedan modificar 
su toxicidad, y los efectos sobre el consumo de alimentos y agua y sobre el estado nutricional de los animales. El vehículo no debe ser tóxico para el desarrollo ni afectar a la reproducción.
 
1.6.3.  Posología  
Por lo general, la sustancia de ensayo se administra todos los días 
desde la implantación (por ejemplo, el quinto día después del apa ­
reamiento) hasta la víspera del día en que esté prevista la cesárea. Si los estudios preliminares disponibles no señalan un riesgo elevado de pérdidas preimplantatorias, puede administrarse el tratamiento du ­
rante todo el período de gestación, desde el apareamiento hasta la 
víspera de la cesárea. Se sabe que el estrés y la manipulación inde ­
bida durante la gestación pueden ocasionar pérdidas prenatales. Con objeto de evitar las pérdidas prenatales independientes del tratamien ­
to, debe evitarse la manipulación innecesaria de las hembras grávidas 
y el estrés debido a factores externos como el ruido. 
Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control en 
paralelo. Los animales sanos se distribuyen al azar entre el lote de control y los lotes de ensayo. Las dosis han de ser progresivas para obtener una gradación de efectos tóxicos. A menos que las caracte ­
rísticas fisicoquímicas o las propiedades biológicas de la sustancia de 
ensayo impongan restricciones, la dosis superior debe seleccionarse con el propósito de inducir efectos tóxicos para el desarrollo y/o en 
la madre (signos clínicos o disminución del peso corporal), pero sin 
llegar a provocar la muerte ni un sufrimiento intenso. Al menos una dosis intermedia debe producir los efectos tóxicos mínimos observa ­
bles. La dosis mínima no debe resultar tóxica en absoluto para la 
madre ni para el desarrollo. Se selecciona una serie de dosis decre ­
cientes para poner de manifiesto las respuestas en función de la dosis y la dosis sin efectos adversos observados (NOAEL). Los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer las dosis 
decrecientes y a menudo es preferible añadir un cuarto lote de en ­
sayo en lugar de utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo, con un factor superior a 10) entre dosis. Si bien es cierto que se trata de determinar la NOAEL en la madre, los estudios que no permiten 
determinarla también son aceptables (1). 
Las dosis deben establecerse tomando en consideración todos los 
datos disponibles sobre la toxicidad y la información complementaria 
relativa al metabolismo y la toxicocinética de la sustancia de ensayo o productos afines. Dicha información servirá asimismo para justifi ­
car la pertinencia de la gama de dosis. 
Se emplea un lote de control en paralelo, que no recibe la sustancia 
de ensayo, pero sí el vehículo en caso de que este se utilice para la 
sustancia. Debe administrarse el mismo volumen de sustancia de 
ensayo o de vehículo a todos los lotes. Los animales del lote o lotes de control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de ensayo. Los lotes de control a los que se administra el vehículo han 
de recibir el mayor volumen que se haya utilizado (el que se admi ­
nistre al lote tratado con la dosis inferior).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Ensayo límite  
Si en un ensayo con una sola dosis equivalente, al menos, a 1 000 
mg/kg peso corporal/día, administrada por vía oral y siguiendo el procedimiento descrito en el presente estudio no se produce ningún 
efecto tóxico observable en las hembras grávidas ni en la progenie y 
si, a la luz de los datos disponibles (por ejemplo, sobre sustancias con características estructurales y/o metabólicas similares), no cabe esperar efectos tóxicos, puede considerarse innecesario realizar un 
estudio completo con tres dosis. Según el grado previsto de exposi ­
ción humana, puede ser preciso administrar una dosis oral superior en el ensayo límite. Si se trata de otras vías de administración, como 
la inhalación o la aplicación cutánea, suelen ser las características 
fisicoquímicas de la sustancia de ensayo las que determinan y limitan el grado máximo de exposición que puede alcanzarse (por ejemplo, la aplicación cutánea no debe producir toxicidad local grave).
 
1.6.5.  Administración de las dosis  
La sustancia de ensayo y el vehículo suelen administrarse mediante 
intubación oral. Si se opta por otra vía de administración, deberá 
motivarse y justificarse, y procederse a las modificaciones pertinen ­
tes (2) (3) (4). La sustancia de ensayo debe administrarse todos los días a la misma hora más o menos. 
Por lo general, la dosis que se administra a cada animal se calcula 
con arreglo a la última determinación del peso corporal, si bien conviene ser prudente al adaptar la dosis en el último período de 
la gestación. Debe considerarse la información disponible para se ­
leccionar la dosis de manera que se evite una toxicidad excesiva para la madre. Si, a pesar de todo, se observa una toxicidad excesiva en las madres tratadas, deberán sacrificarse por métodos compasivos. Si 
varias hembras grávidas presentan signos de toxicidad excesiva, se 
contemplará la posibilidad de sacrificar todo el lote tratado con esa dosis. Si la sustancia de ensayo se administra por sonda, debe ha ­
cerse en una sola dosis y con una sonda gástrica o una cánula de 
intubación adecuada. El volumen máximo de líquido que puede 
administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal y no debe superar 1 ml/l00 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a 2 ml/l00 g de peso 
corporal. En caso de que se emplee aceite de maíz como vehículo, 
el volumen no debe superar 0,4 ml/l00 g de peso corporal. La variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajus ­
tando la concentración para que el volumen sea constante en todas 
las dosis.
 
1.6.6.  Observación de las madres  
Las observaciones clínicas y el correspondiente registro deben 
efectuarse al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora y teniendo en cuenta el período más agudo de los efectos previstos tras la administración. Se registra el estado clínico de los 
animales y, en particular, los animales muertos o moribundos, las 
alteraciones pertinentes del comportamiento y todos los signos de toxicidad manifiesta.
 
1.6.7.  Peso corporal y consumo de alimentos  
Los animales deben pesarse el día 0 de la gestación o, a más tardar, 
el día 3 si se trata de animales ya apareados procedentes de un criador externo; a continuación, el primer día de tratamiento, al 
menos cada 3 días durante el período de administración y, por últi ­
mo, el día del sacrificio.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Se registra el consumo de alimentos cada 3 días, coincidiendo con 
los días en que se pesen los animales.  
1.6.8.  Autopsia  
Se sacrifican las hembras la víspera del día previsto para al parto. 
Aquellas que presenten signos de aborto o parto prematuro antes de 
la fecha en que esté previsto darles muerte serán sacrificadas y sometidas a un examen macroscópico exhaustivo. 
Tras el sacrificio o la muerte en el transcurso del estudio, las hem ­
bras se someten a un examen macroscópico para detectar cualquier cambio patológico o anomalía estructural. Con objeto de minimizar 
los sesgos, es preferible efectuar la observación de las madres du ­
rante la cesárea y el examen posterior del feto sin conocer la dosis administrada.
 
1.6.9.  Examen del contenido uterino  
Inmediatamente después del sacrificio o tan pronto como sea posible 
tras la muerte del animal, se extrae el útero y se comprueba el estado 
de gravidez. También se examinarán los úteros que no parezcan 
grávidos (por ejemplo, mediante tinción de sulfuro amónico en el caso de los roedores y tinción de Salewski u otro método adecuado, en el de los conejos) para confirmar la ausencia de gravidez (5). 
Se pesan los úteros grávidos con el cuello, salvo los de las hembras 
que hayan muerto durante el estudio. 
Se cuenta el número de cuerpos amarillos en las hembras grávidas. Se examina el contenido uterino para determinar el número de em ­
briones o fetos muertos y de fetos viables. Es preciso describir el 
grado de resorción para calcular la fecha aproximada de la muerte 
del producto de la concepción (véase el apartado 1.2).
 
1.6.10.  Examen de los fetos  
Se determina el sexo y el peso corporal de cada feto. 
Se examinan todos los fetos para ver si presentan alteraciones 
externas (6). 
Se ve, asimismo, si presentan alteraciones del esqueleto o los tejidos 
blandos (por ejemplo, variaciones y malformaciones o anomalías) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Es aconsejable, pero no indispensable, clasificar las alte ­
raciones fetales. Si se efectúa la clasificación, deben establecerse 
claramente los criterios que definan cada clase. Se estudiará deteni ­
damente si ha habido alteraciones en el desarrollo del tracto genital. 
En el caso de los roedores, se prepara aproximadamente la mitad de 
cada camada para estudiar las alteraciones del esqueleto. El resto se prepara para el estudio de las alteraciones de los tejidos blandos, que 
se efectuará en cortes seriados realizados por métodos reconocidos o 
apropiados o mediante técnicas finas de disección macroscópica.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Si se han empleado no roedores, por ejemplo conejos, todos los fetos 
se someten a examen para detectar posibles alteraciones de los teji ­
dos blandos y el esqueleto. Se diseccionan cuidadosamente los cuer ­
pos de los fetos para buscar alteraciones de los tejidos blandos; esta operación puede incluir técnicas que permitan examinar más exhaus ­
tivamente la estructura cardíaca interna (25). Se toman las cabezas de 
la mitad de los fetos analizados de esta manera y se preparan para evaluar las alteraciones de los tejidos blandos (en particular, ojos, cerebro, conductos nasales y lengua), mediante técnicas clásicas de 
cortes seriados (26) u otro método que presente la misma sensibili ­
dad. Se preparan los cuerpos de esos fetos y los de los fetos intactos restantes para el estudio de las alteraciones del esqueleto mediante los métodos descritos para los roedores.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Deben proporcionarse datos de cada madre y su progenie y resu ­
mirse en un cuadro que recoja, para cada lote de ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados 
muertos durante el mismo o sacrificados por razones compasivas, el 
momento de la muerte o sacrificio compasivo, el número de hembras grávidas, el número de animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento de su 
aparición, duración y gravedad), los tipos de observaciones de los 
embriones o fetos y todos los datos pertinentes sobre la camada. 
Los resultados numéricos deben evaluarse mediante un método es ­
tadístico adecuado y comúnmente aceptado, tomando la camada como unidad para el análisis de los datos. La elección de los méto ­
dos estadísticos debe efectuarse en la fase de diseño del estudio y 
justificarse. Deben registrarse también los datos relativos a los ani ­
males que no sobrevivan hasta la fecha programada para el sacrificio y, si procede, pueden incluirse en las medias de los lotes. La perti ­
nencia de dichos datos y, por tanto, la decisión de incluirlos o no en 
las medias de los lotes, debe valorarse caso por caso y justificarse.
 
2.2. EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los resultados del estudio de toxicidad para el desarrollo prenatal 
deben evaluarse respecto a los efectos observados. La evaluación 
debe incluir la información siguiente: 
— resultados de los ensayos en las madres y los embriones o fetos, 
incluida la evaluación de la relación, o la ausencia de relación, entre la exposición de los animales a la sustancia de ensayo y la 
incidencia y gravedad de todos los efectos observados, 
— criterios aplicados, en su caso, para clasificar las alteraciones 
fetales externas, de los tejidos blandos y del esqueleto,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— si procede, datos previos relativos a los controles para afinar la 
interpretación de los resultados del estudio, 
— cifras empleadas en el cálculo de todos los índices o porcentajes, 
— análisis estadístico apropiado de los resultados del estudio e in ­
clusión de información suficiente sobre el método empleado, de manera que un revisor o estadístico independiente pueda ree ­
valuarlo y reconstruirlo. 
Si el estudio no pone de manifiesto ningún efecto tóxico, debe 
valorarse la pertinencia de efectuar experimentos complementarios para determinar la absorción y la biodisponibilidad de la sustancia 
de ensayo.
 
2.3. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los estudios de toxicidad para el desarrollo prenatal proporcionan 
información sobre los efectos de la exposición repetida a una sus ­
tancia administrada durante la gravidez en las madres y en el desa ­
rrollo intrauterino de su progenie. Los resultados del estudio han de interpretarse a la luz de los de los estudios de toxicidad subcrónica, 
reproducción, toxicocinéticos y de otro tipo. Dado que el estudio se 
centra tanto en la toxicidad general para la madre como en la toxi ­
cidad para el desarrollo, los resultados permiten distinguir en cierta medida los efectos sobre el desarrollo que se producen en ausencia 
de toxicidad general de los que se manifiestan únicamente a dosis 
que también son tóxicas para la madre (27).
 
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancia de ensayo: 
— naturaleza física y, si procede, propiedades fisicoquímicas. 
— identificación, incluido el número CAS si se conoce; 
— pureza. 
Vehículo (si procede): 
— justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua. Animales sometidos a ensayo: 
— especie y cepa empleada, 
— número y edad de los animales, 
— procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, etc., 
— peso de cada animal al inicio del ensayo. 
Condiciones de ensayo: 
— justificación de la elección de las dosis, 
— datos sobre la formulación de la sustancia de ensayo o su pre ­
paración con los alimentos, concentración obtenida, estabilidad y 
homogeneidad del preparado,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— datos de la administración de la sustancia de ensayo, 
— factor de conversión de la concentración (ppm) de la sustancia de 
ensayo en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales 
(mg/kg peso corporal/día), si procede, 
— condiciones ambientales, — datos de la calidad de los alimentos y el agua. Resultados: Datos relativos a la toxicidad para la madre en función de las dosis, 
indicando al menos lo siguiente: 
— número de animales al principio del ensayo, número de animales 
supervivientes, número de hembras grávidas, número de abortos 
y número de partos prematuros, 
— fecha de las muertes sobrevenidas durante el ensayo y número de 
animales que han sobrevivido hasta el sacrificio, 
— datos sobre los animales que no hayan sobrevivido hasta el sa ­
crificio, y no incluidos, en las comparaciones estadísticas entre lotes, 
— día de la observación de cada signo clínico anómalo y evolución 
posterior, 
— peso corporal, variación del mismo y peso del útero grávido, con 
inclusión facultativa de la variación del peso corporal corregida en función del peso del útero grávido, 
— consumo de alimentos y de agua, si se ha medido, — hallazgos de la autopsia, incluido el peso uterino, — NOAEL relativas a los efectos sobre la madre y sobre el desa ­
rrollo. 
Datos relativos al desarrollo por dosis y camada (con implantacio ­
nes), en particular: 
— número de cuerpos amarillos, — número de implantaciones, número y porcentaje de fetos vivos y 
muertos y número de resorciones, 
— número y porcentaje de pérdidas pre y postimplantatorias. Datos relativos al desarrollo por dosis y camada (con fetos vivos), en 
particular: 
— número y porcentaje de crías vivas, — proporción de machos y hembras, — peso corporal de los fetos, preferiblemente por sexo y sin distin ­
ción por sexo, 
— malformaciones externas, de los tejidos blandos y el esqueleto y 
otras alteraciones pertinentes, 
— criterios de clasificación, si procede,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— número total y porcentaje de fetos y de camadas que presenten 
alguna alteración externa, de los tejidos blandos o el esqueleto; 
tipos e incidencia de cada anomalía y demás alteraciones perti ­
nentes. 
Discusión de los resultados. Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399-410. 
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal 
Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386-398. 
(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1-8. 
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Speci ­
fic Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation De ­
velopmental Toxicity Study. 
(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archivfur Pharmakologie und Experi ­
mentelle Pathologie  247:367. 
(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology.  D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY. 
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171-173. 
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32; :381-391. 
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47:229-242. 
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476. 
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for ­
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127:291-306. 
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11; 313-320. 
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9;:398-408. 
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309-316. 
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169-181.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foe ­
tuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histo ­
logical Study of Viscera.  Supplement to Teratology Workshop 
Manual,  pp. 163-173. 
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possi ­
ble Influence of the Sex Factor.  American Journal of Anatomy  
41; 411-445. 
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61 -63. 
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) 
Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313-355. 
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exa ­
mination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
181-188. 
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton.  Thomas, Springfield, IL. 
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principies and Techniques,  Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277. 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of 
Teratology,  Vol. 4. Plenum, NY. 
(24) Vamagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techni ­
ques in the Evaluation of Pesticida Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung.  28; 233-239. 
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mam ­
malian Foetuses.  Teratology  9; 37-38. 
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., Mer ­
ker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, 
Chicago, IL, pp. 126-144. 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798-63826. 
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Ab ­
nornialities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Te ­
ratology 55; 249-292.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  ENSAYO DE CARCINOGÉNESIS  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 451 de la 
OCDE (2009). Las TG 451 originales sobre los estudios de carcinogénesis se adoptaron en 1981. Se consideró necesario adaptar este método de ensayo 
B.32 para dar cuenta de los avances recientes en materia de bienestar animal 
que plantean nuevas necesidades normativas (2) (3) (4) (5) (6). La actuali ­
zación de este método de ensayo B.32 se ha realizado en paralelo con las revisiones de los capítulos del presente anexo B.30. Ensayo de toxicidad 
crónica y B.33. Ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis, 
con el fin de obtener más, información acerca de los animales utilizados en el estudio y recabar nuevos datos sobre la selección de las dosis. Este método de ensayo B.32 ha sido diseñado para el estudio de una amplia 
gama de sustancias, incluso plaguicidas y productos químicos industriales. 
Conviene señalar, no obstante, que algunos pormenores y requisitos pueden variar en el caso de los productos farmacéuticos (véase el documento de orientación S1B de la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH), 
para los ensayos de carcinogénesis de los productos farmacéuticos). 
2. La mayoría de los ensayos de carcinogénesis se realizan con especies de 
roedores, por lo que este método de ensayo se ha diseñado básicamente para 
el estudio de dichas especies. Cuando fuere preciso realizar estos ensayos en 
especies no roedoras, serán así mismo de aplicación los principios y proce ­
dimientos descritos en este método de ensayo, además de los descritos en el capítulo B.27 del presente anexo, Ensayo de toxicidad oral por administra ­
ción continuada (90 días) en no roedores (6), con las debidas modificacio ­
nes. Se ofrecen más indicaciones sobre el diseño y la realización de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis en el documento de orienta ­
ción n
 o 116 de la OCDE (7). 
3. Las tres vías de administración principales que se estudian en los ensayos de 
carcinogénesis son la oral, la cutánea y la inhalatoria. La elección de una de ellas dependerá de las características físicas y químicas de la sustancia estudiada y de la vía de exposición predominante en seres humanos. Se 
ofrece más información sobre la elección de la vía de exposición en el 
documento de orientación n
 o 116 de la OCDE (7). 
4. El presente método de ensayo centra el interés en la exposición por vía oral, 
la más frecuentemente usada en los estudios de carcinogénesis. Si bien los 
estudios de carcinogénesis que entrañan la exposición por vía cutánea o inhalatoria pueden ser igualmente necesarios en la evaluación del riesgo para la salud humana o en determinados marcos legislativos, estas dos 
vías de exposición plantean una complejidad técnica considerable. Tales 
estudios tendrán que diseñarse según cada caso; sin embargo, el método de ensayo que aquí se describe para la determinación y evaluación de la carcinogénesis por administración oral podría sentar las bases de un proto ­
colo para los estudios de toxicidad por inhalación o absorción dérmica en lo 
que se refiere a recomendación de períodos de tratamiento, parámetros clínicos e histopatológicos, etc. La OCDE dispone de documentación orien ­
tativa sobre la administración de las sustancias problema por inhalación (7) 
(8) y por vía cutánea (7). Para el diseño de estudios a más largo plazo que 
contemplen la exposición por vía inhalatoria deben consultarse específica ­
mente los capítulos B.8 (9) y B.29 (10) del presente anexo, además del documento de orientación de la OCDE sobre estudios de toxicidad aguda 
por inhalación (8). Cuando se trate de estudios que contemplen la vía 
cutánea se consultará el capítulo B.9 (11) del presente anexo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Un estudio de carcinogénesis proporciona información sobre los factores de 
riesgo para la salud derivados de la exposición continuada durante un pe ­
ríodo que puede llegar a ocupar la vida entera de la especie animal inves ­
tigada. El estudio proporciona información sobre los efectos tóxicos de la sustancia problema, incluida la carcinogénesis potencial, y puede ayudar a 
determinar los órganos diana y la posibilidad de acumulación. Puede faci ­
litar una estimación del máximo nivel de dosis sin efectos tóxicos observados (NOAEL) y, en el caso de carcinógenos no genotóxicos, de las respuestas tumorales, que servirá para establecer los criterios de seguri ­
dad de la exposición humana. Cabe destacar la necesidad de realizar obser ­
vaciones clínicas detenidas de los animales, a fin de obtener la máxima información posible. 
6. Los objetivos de los estudios de carcinogénesis realizados según este mé ­
todo de ensayo son: 
— la identificación de las propiedades cancerígenas de una sustancia pro ­
blema que puedan provocar una incidencia elevada de neoplasias, una mayor proporción de neoplasias malignas o una reducción del tiempo de 
aparición de las neoplasias, en comparación con los grupos de control, 
— la identificación del órgano o los órganos diana de la carcinogénesis, 
— la determinación del tiempo que tardan en aparecer las neoplasias, — la caracterización de la relación dosis-respuesta tumoral, 
— la identificación del nivel máximo sin efectos adversos 
observados (NOAEL), o punto de partida para determinar una dosis 
de referencia (Benchmark Dose, BMD), 
— la extrapolación de los efectos cancerígenos a los niveles de dosificación 
inferiores de la exposición humana, 
— la recopilación de datos para investigar las hipótesis referentes al meca ­
nismo de acción (2) (7) (12) (13) (14) (15).
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
7. En la determinación y evaluación de la carcinogenicidad potencial de una 
sustancia problema, el laboratorio de ensayo deberá tener en cuenta toda la 
información disponible acerca de la sustancia estudiada antes de emprender el 
estudio, para así poder centrarse de manera más eficaz en la carcinogenicidad potencial y minimizar el uso de animales. La información previa y la consi ­
deración en torno al modo de acción de un supuesto cancerígeno (2) (7) (12) 
(13) (14) (15) reviste particular importancia, toda vez que el diseño óptimo 
del ensayo de una sustancia química variará según se trate o no de un cancerígeno genotóxico hipotético o conocido. Se ofrecen otras consideracio ­
nes sobre el modo de acción en el documento de orientación n
 o 116 (7). 
8. En el diseño del estudio serán de ayuda el conocimiento de la identidad, 
estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema; 
los resultados de cualesquiera ensayos de toxicidad  in vitro  o in vivo,  
incluidos los ensayos de genotoxicidad; el uso o usos previstos y la expo ­
sición humana potencial; los datos de (Q)SAR previos y los datos de mu ­
tagenicidad/genotoxicidad, carcinogenicidad y otros datos toxicológicos so ­
bre sustancias estructuralmente afines; los datos toxicocinéticos disponibles 
(cinética de dosis única y, en su caso, de acumulación por dosis repetidas) y  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
los datos derivados de otros estudios de exposición continuada. La evalua ­
ción de la carcinogénesis debe emprenderse una vez que se ha recabado la 
información inicial en los ensayos de toxicidad por administración conti ­
nuada durante 28 días y/o 90 días. También pueden aportar una información valiosa los ensayos de inducción-estimulación de cáncer a corto plazo. Se 
hará un planteamiento secuencial de los estudios de carcinogénesis como 
parte de la evaluación global de los efectos adversos que puede tener para la salud una sustancia determinada (16) (17) (18) (19). 
9. Antes de iniciar el estudio se establecerán los métodos estadísticos más 
adecuados para el análisis de los resultados, en función del diseño y de 
los objetivos experimentales. Aspectos importantes son el ajuste de la su ­
pervivencia en el análisis estadístico, el análisis de los riesgos tumorales acumulativos en relación con el tiempo de supervivencia, el análisis del 
tiempo que tarda en aparecer el tumor y el análisis en caso de terminación 
prematura de uno o más grupos. Se ofrecen orientaciones para realizar el análisis estadístico adecuado y se hace referencia a los métodos estadísticos internacionalmente aceptados en el documento de orientación (GD) n
 o 116 
(7) y en el GD n  o 35 sobre análisis y evaluación de los estudios de toxicidad 
crónica y carcinogénesis (20). 
10. Cuando se efectúa un estudio de carcinogénesis, son de aplicación los 
principios y consideraciones recogidos en el documento de orientación 
n o 19 de la OCDE sobre el reconocimiento, la evaluación y la aplicación 
de signos clínicos como parámetros compasivos en los animales experimen ­
tales que se usan para evaluar la seguridad (21), en particular su punto 62. 
Dicho punto especifica que en los estudios de administración continuada, 
cuando un animal muestre signos clínicos progresivos que entrañen un deterioro creciente de su estado, habrá que decidir con conocimiento de causa si se sacrifica de forma compasiva. La decisión sopesará el valor de 
la información que puede obtenerse si se mantiene al animal en el estudio 
frente al desgaste de su estado general. Si se decide mantener al animal en el ensayo, se aumentará la frecuencia de las observaciones en la medida ne ­
cesaria. Cabe también la posibilidad de, sin perjudicar a los fines de la 
investigación, suspender temporalmente la administración para aliviar el 
dolor o el sufrimiento, o reducir la dosis experimental. 
11. Se ofrecen orientaciones y comentarios detallados sobre los principios que 
deben orientar la selección de la dosis en los estudios de toxicidad crónica y 
carcinogénesis en el documento de orientación n
 o 116 (7) y en dos publi ­
caciones del International Life Sciences Institute (22) (23). El núcleo de la estrategia de selección de la dosis depende del objetivo u objetivos princi ­
pales del estudio (punto 6). Al elegir un intervalo posológico adecuado, 
debe buscarse un equilibrio entre el cribado de los factores de riesgo, por un lado, y la caracterización de las respuestas ante dosis bajas y de su importancia, por otro. Ello tiene especial trascendencia cuando se proyecta 
(punto 12) un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis 
(capítulo B.33 del presente anexo). 
12. Se considerará la posibilidad de efectuar un ensayo combinado de toxicidad 
crónica y carcinogénesis (capítulo B.33 de este anexo) en lugar de realizar 
por separado un ensayo de toxicidad crónica (capítulo B.30 de este anexo) y 
un ensayo de carcinogénesis (presente método de ensayo B.32). El ensayo combinado permite mayor eficiencia que los estudios separados en términos de tiempo y costes, sin comprometer la calidad de los datos ni en la fase de 
toxicidad crónica ni en la fase de carcinogénesis. Sin embargo, cuando se 
emprenda un ensayo combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis (ca ­
pítulo B.33 de este anexo) habrá que considerar detenidamente los princi ­
pios de la selección de la dosis (puntos 11 y 22-25) y, por otro lado, se 
entiende que determinados marcos legislativos pueden imponer la realiza ­
ción de ensayos separados.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se 
facilitan al final del presente capítulo y en el documento de orientación 
n o 116 (7).  
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
14. La sustancia problema se administra diariamente en dosis escalonadas, ha ­
bitualmente por vía oral, a varios grupos de animales de experimentación durante la mayor parte de su existencia. También se aceptan las vías inha ­
latoria o cutánea. Se observa atentamente a los animales por si aparecen 
signos de toxicidad o lesiones neoplásicas. Se practica la autopsia a los animales que mueran o sean sacrificados durante el ensayo y, al final del mismo, se sacrifican y someten a autopsia los animales supervivientes.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
15. El presente método de ensayo está diseñado fundamentalmente para la deter ­
minación y evaluación de la carcinogénesis en roedores (punto 2). Se podrá 
considerar el uso de especies no roedoras cuando los datos previos indiquen que son más útiles para la predicción de los efectos sobre la salud humana. Se justificará la elección de la especie. La especie idónea es la rata, si bien 
pueden emplearse otras especies de roedores como el ratón. Si bien el uso 
de ratones en los ensayos de carcinogénesis puede ser de utilidad limitada (24) (25) (26), algunas normativas en vigor siguen exigiendo que se realicen ensayos de carcinogénesis en ratones a no ser que se establezca que son 
científicamente innecesarios. Las ratas y los ratones se prefieren como mo ­
delos experimentales debido a su ciclo vital relativamente corto, su amplia utilización en los estudios farmacológicos y toxicológicos, su sensibilidad a la inducción tumoral y la disponibilidad de cepas de laboratorio suficientemente 
caracterizadas. Debido a todas estas características, se ha podido hacer un 
gran acopio de información acerca de su fisiología y anatomopatología. Se ofrece más información sobre la elección de la especie y la cepa de labora ­
torio en el documento de orientación n
 o 116 de la OCDE (7). 
16. Se escogerán animales adultos jóvenes y sanos de una variedad de labora ­
torio de uso habitual. Los ensayos de carcinogénesis se efectuarán preferi ­
blemente en animales de la misma procedencia y cepa que los empleados en 
los estudios preliminares de toxicidad de duración menor; ahora bien, si los 
animales de esa procedencia y variedad han demostrado incapacidad para cumplir los criterios de supervivencia normalmente aceptados para los es ­
tudios a largo plazo [véase el documento de orientación n
 o 116 (7)], se 
planteará la posibilidad de usar una cepa que presente una tasa de supervi ­
vencia aceptable en los ensayos a largo plazo. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas.
 
Alojamiento y alimentación de los animales  
17. Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del 
mismo sexo; el enjaulamiento individual se considerará solo si está cientí ­
ficamente justificado (27) (28) (29). Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. La sala de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aun ­
que la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente 
no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el ideal es el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio con ­
vencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La dieta debe 
satisfacer todas las necesidades nutricionales de la especie estudiada, y se
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
mantendrá en el mínimo posible su contenido en contaminantes alimenta ­
rios, entre otros los residuos de plaguicidas, contaminantes orgánicos per ­
sistentes, fitoestrógenos, metales pesados y micotoxinas que pudieran influir en los resultados experimentales. La información analítica sobre el contenido de nutrientes y contaminantes alimentarios se consignará de forma periódica, 
como mínimo al inicio del estudio y cada vez que se varíe el lote de 
producto empleado, y se documentará en el informe final. Así mismo se consignará la información analítica sobre el agua de bebida empleada en el estudio. Cuando la sustancia problema se administra con el alimento, la 
elección de la dieta se basa en la necesidad de conseguir una mezcla apro ­
piada de dicha sustancia y de satisfacer al mismo tiempo las necesidades nutricionales de los animales.
 
Preparación de los animales  
18. Deben emplearse animales sanos, que se hayan mantenido al menos 7 días 
en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no hayan sido sometidos a experimentos previos. En el caso de los roedores, la adminis ­
tración comenzará lo antes posible tras su destete y aclimatación, preferi ­
blemente antes de que los animales cumplan 8 semanas de edad. Se carac ­
teriza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y edad de los, animales de 
experimentación. La diferencia de peso entre los animales al empezar el 
estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo. Los animales se reparten al azar entre los lotes tratados y los de control. Después de la asignación al azar, no debe haber diferencias 
significativas entre los grupos en las medias de peso corporal de cada sexo. 
De observarse diferencias estadísticamente significativas, el proceso de asig ­
nación aleatoria a los grupos deberá repetirse en la medida de lo posible. Se asigna a cada animal un número de identificación distinto, que se le grabará 
de manera permanente mediante tatuaje, implante de microchip o cualquier 
otro medio pertinente.
 
PROCEDIMIENTO  
Número y sexo de los animales  
19. Se emplearán animales de ambos sexos. Se estudiará un número de animales 
suficiente para permitir una exhaustiva evaluación biológica y estadística. 
Por consiguiente, cada grupo de dosis y de control deberá contener como mínimo 50 animales de cada sexo. Dependiendo de la finalidad del estudio, cabe la posibilidad de aumentar la potencia estadística de las estimaciones 
esenciales haciendo una asignación diferencial de los animales a los distintos 
grupos de dosis, de modo que haya más de 50 individuos en los grupos de dosis inferior; esto permite estimar el potencial carcinógeno a dosis bajas. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que un aumento moderado del 
tamaño del grupo incrementará relativamente poco la potencia estadística 
del estudio. Se ofrece más información sobre el diseño estadístico y la selección de los niveles de dosis para maximizar la potencia estadística 
del estudio en el documento de orientación n
 o 116 (7).  
Provisión de animales para el sacrificio durante el ensayo, los lotes 
satélite y los lotes centinela  
20. Si está científicamente justificado, se puede hacer una provisión de animales 
para sacrificarlos durante el ensayo y así obtener datos sobre la progresión de las alteraciones neoplásicas y sobre los mecanismos de acción. Si tal información ha sido ya proporcionada por estudios previos de toxicidad por 
administración continuada realizados con la misma sustancia problema, el 
sacrificio de animales durante el ensayo puede no estar científicamente justificado. Si en el diseño experimental se incluyen animales para sacrifi ­
carlos durante el ensayo, lo habitual es que el lote sacrificado esté com ­
puesto por 10 animales de cada sexo, y el número total de animales inves ­
tigados se incrementará en esta misma medida. Se podrá incluir además un lote de animales centinela (habitualmente 5 individuos de cada sexo) para supervisar su estado en cuanto a enfermedades, en caso necesario, durante el 
estudio (30). Se ofrecen más indicaciones en el documento de orientación 
n
 o 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Grupos de dosis y posología  
21. En el documento de orientación n  o 116 (7) se facilitan indicaciones sobre 
todos los aspectos de la selección de la dosis y los intervalos entre las dosis. Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control en paralelo. 
Los niveles de dosis se basan generalmente en los resultados de los estudios 
de determinación del intervalo o realizados con dosis repetidas a corto plazo, y deben tener en cuenta los datos toxicológicos y toxicocinéticos de que se disponga en relación con la sustancia problema o con sustancias afines. 
22. Salvo limitaciones impuestas por la naturaleza fisicoquímica o los efectos 
biológicos de la sustancia problema, el nivel de dosis más elevado se esco ­
gerá a fin de identificar los principales órganos diana y efectos tóxicos pero evitando una toxicidad intensa, el sufrimiento, la morbilidad o la muerte de 
los animales. Tomando en consideración los factores que se indican en el 
punto 23 que sigue, normalmente el nivel de dosis más elevado será tal que provoque signos de toxicidad, por ejemplo, manifestada por una merma de la ganancia de peso corporal (aproximadamente el 10 %). Ahora bien, de ­
pendiendo de los objetivos del estudio (véase el punto 6), se puede esta ­
blecer un techo de dosis inferior al nivel que provoque signos de toxicidad, por ejemplo si una dosis induce un efecto adverso de interés que, sin embargo, tiene escasa repercusión en el período de vida o el peso corporal. 
23. Los niveles de dosis y la frecuencia de administración serán tales que 
permitan establecer una relación dosis-respuesta y, dependiendo del modo de acción de la sustancia problema, un valor de NOAEL o cualesquiera otras determinaciones previstas, como el valor de BMD o dosis de referencia 
más baja (véase el punto 25). Para establecer las dosis inferiores se tendrán 
en cuenta factores como la pendiente esperada de la curva dosis-respuesta, así como los niveles a los que cabe esperar cambios importantes en el metabolismo o en el mecanismo de la acción tóxica, cuando se prevea un 
umbral, o que constituyan un punto de partida para extrapolar la dosis más 
baja. 
24. La frecuencia de administración de las dosis dependerá de las características 
de la sustancia y no corresponde especificarla en este método de ensayo; los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer los 
niveles descendentes y frecuentemente es preferible añadir un cuarto lote 
de ensayo antes que utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo con un factor superior a 6-10) entre dosis. En general se evitará aplicar factores superiores a 10, que en todo caso deberán justificarse. 
25. Tal como se expone en el documento de orientación n
 o 116 (7), para la 
selección de las dosis se tendrán en cuenta los siguientes factores: 
— los intervalos supuestos o conocidos de no linealidad o puntos de in ­
flexión en la relación dosis-respuesta, 
— la toxicocinética y los intervalos posológicos en los que pueda haber o 
no inducción metabólica, saturación o no linealidad entre la dosimetría 
externa e interna, 
— las lesiones precursoras, los marcadores de efecto o los indicadores de la 
intervención de los principales mecanismos biológicos subyacentes, 
— aspectos importantes (hipotéticos o comprobados) del modo de acción, 
como la dosis a partir de la cual se manifiesta toxicidad, los niveles 
hormonales que resultan afectados, los mecanismos homeostáticos que 
se alteran, etc.,  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— aquellas regiones de la curva dosis-respuesta en las que se precisa hacer 
una estimación especialmente robusta, como el intervalo de la dosis de 
referencia prevista o el umbral hipotético, 
— los niveles de exposición humana que cabe prever. 
26. Se emplea un lote de control en paralelo, que no recibe la sustancia pro ­
blema, pero sí el vehículo de la misma en caso de que se utilice. A excep ­
ción de la administración de la sustancia problema, los animales del lote de 
control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de trata ­
miento. En su caso, el lote de control ha de recibir el mayor volumen de vehículo que se haya utilizado. Si la sustancia problema se administra con los alimentos y provoca una disminución importante de la ingesta debido a 
que empeoran las características organolépticas de la dieta, puede ser útil 
utilizar un lote de control alimentado en paralelo para conseguir una com ­
paración más rigurosa.
 
Preparación de las dosis y administración de la sustancia problema  
27. La sustancia problema se administra habitualmente por vía oral, mediante 
sonda o con el alimento o el agua de bebida. Se ofrece más información 
sobre las vías y los métodos de administración en el documento de orien ­
tación n  o 116 de la OCDE (7). La vía y el método de administración 
dependerán de la finalidad del estudio, las propiedades fisicoquímicas de 
la sustancia problema, su biodisponibilidad y la vía y el modo de exposición 
predominantes en los seres humanos. Se justificará debidamente la vía y el método de administración elegidos. Por razones de bienestar animal, la alimentación oral por sonda se elegirá solo cuando exista una posibilidad 
razonable de que la exposición humana a la sustancia problema se vaya a 
producir por la misma vía y el mismo medio de administración (como es el caso de los productos farmacéuticos). Cuando se trata de sustancias alimen ­
tarias o ambientales, entre ellas los plaguicidas, la administración se efectúa 
habitualmente con los alimentos o el agua de bebida. Sin embargo, en otros 
escenarios de estudio como la exposición ocupacional, puede ser más con ­
veniente la administración por otras vías. 
28. En caso necesario, la sustancia problema se disuelve o suspende en un 
vehículo adecuado. Debe prestarse atención a las siguientes características del vehículo u otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribución, metabolismo o retención de la sustancia problema, efectos 
sobre las propiedades químicas de dicha sustancia que puedan modificar 
su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y agua o el estado nutricional de los animales. Se recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, 
después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite 
de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehículos. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus características tóxicas. Se recabará información acerca de la estabilidad de la sustancia 
problema y su homogeneidad de concentración en las disoluciones o en 
las dietas (en su caso) que se emplean para la administración. 
29. Si la sustancia se administra con los alimentos o el agua de bebida, es 
importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia problema adminis ­
tradas no interfieren con la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. En los estudios de toxicidad a largo plazo en los que la sustancia problema se administra con los alimentos, su concentración no debe superar general ­
mente el límite del 5 % de la ingesta total para evitar desequilibrios nutri ­
cionales. Cuando la sustancia problema se administra con los alimentos, se puede usar una concentración constante en la dieta (mg/kg de alimento o ppm) o bien una dosis constante en términos de peso corporal (mg/kg peso 
corporal), calculada con periodicidad semanal. Deberá indicarse qué alter ­
nativa se ha seguido.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. En los ensayos de administración oral, la sustancia problema se administra a 
los animales diariamente (siete días por semana), durante un período que 
suele ser de 24 meses en el caso de los roedores (véase también el punto 32). Cualquier otra pauta posológica, por ejemplo, de 5 días por semana, debe justificarse. En el caso de la administración cutánea, los 
animales se tratan con la sustancia problema como mínimo 6 horas al día 
con una pauta de 7 días por semana, según se especifica en el capítulo B.9 del presente anexo (11), durante un período de 24 meses. La exposición por vía inhalatoria se efectúa durante 6 horas al día con una pauta de 7 días por 
semana pero, si se justifica, es admisible una pauta de 5 días por semana. El 
período de exposición será habitualmente de 24 meses. Cuando se exponen con la técnica de solo la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico 
de la especie. Se justificará debidamente cualquier período de exposición 
inferior a 6 horas diarias. Véase también el capítulo B.8 del presente anexo (9). 
31. Si la sustancia problema se administra por sonda, debe hacerse con una 
sonda gástrica o con una cánula de intubación adecuada y todos los días a la misma hora. La dosis única se administra normalmente una vez al día; pero si la sustancia es un irritante local, cabe la posibilidad de mantener la 
dosis total diaria repartiendo la administración en dosis divididas (dos veces 
al día). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. El volumen se mantendrá en el mínimo 
posible, y en los roedores no debe exceder generalmente de 1 ml/100 g peso 
corporal (31). La variabilidad en el volumen utilizado debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para garantizar un volumen constante en todas las dosis. Constituyen una excepción las sustancias potencialmente 
corrosivas o irritantes, que deben diluirse para evitar efectos locales graves. 
Se evitará la administración de concentraciones que puedan ser corrosivas o irritantes del tubo digestivo.
 
Duración del estudio  
32. La duración del estudio suele ser de 24 meses en el caso de los roedores, lo 
que constituye la mayor parte del período de existencia de los animales 
investigados. Siempre que se justifique, se podrán aplicar períodos mayores o menores en función del ciclo de vida de la especie y la cepa investigadas. En el caso de determinadas cepas de ratones, como AKR/J, C3H/J o 
C57BL/6J, puede estar más justificada una duración de 18 meses. Seguida ­
mente se facilitan algunas indicaciones acerca de la duración, la terminación del estudio y la supervivencia; otras consideraciones, entre ellas la acepta ­
bilidad de un resultado de carcinogénesis negativa en función de la super ­
vivencia observada en el estudio, se pueden consultar en el documento de 
orientación n
 o 116 de la OCDE (7) sobre el diseño y la realización de los 
estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis. 
— Se planteará la terminación del estudio cuando el número de supervi ­
vientes en los grupos de dosis más baja o de control sea menor del 25 por ciento. 
— Si las muertes prematuras por toxicidad se producen solo en el grupo de 
dosis más elevada, ello no debe motivar la terminación del estudio. 
— Se contabilizará por separado la supervivencia de cada sexo. 
— El estudio no debe prolongarse más allá del instante en que los datos 
derivados del mismo se muestren insuficientes para permitir una evalua ­
ción estadísticamente significativa.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
OBSERVACIONES 
33. Se observará la morbilidad o la mortalidad en todos los animales, general ­
mente a primera y última hora del día, incluidos los fines de semana y festivos. Debe hacerse además una observación diaria de los eventuales 
signos específicos de importancia toxicológica, teniendo en cuenta el pe ­
ríodo más agudo de los efectos previstos tras la administración cuando esta se haga por sonda. Se prestará especial atención al desarrollo de tumores; se registrarán el momento de aparición y localización, dimensiones, aspecto y 
progresión de todo tumor visible macroscópica o palpablemente.
 
Peso corporal, consumo de alimentos y agua y eficiencia alimentaria  
34. Deben pesarse todos los animales al comenzar el tratamiento, como mínimo 
una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al 
menos una vez al mes. Se medirán el consumo de alimento y la eficiencia alimentaria como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Si la sustancia pro ­
blema se administra con el agua de bebida, se medirá la ingesta de agua 
como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. La determinación de la ingesta de agua se contemplará así mismo en aquellos estudios en los que esté alterada la 
actividad de beber.
 
Hematología, bioquímica clínica y otras valoraciones  
35. Con el fin de maximizar la información derivada de la investigación, espe ­
cialmente en lo que se refiere al modo de acción, a criterio del director del 
estudio se podrán tomar muestras de sangre para análisis hematológicos y de 
bioquímica clínica. También pueden estar indicados los análisis de orina. En el documento de orientación n
 o 116 (7) se comenta el interés de obtener este 
tipo de muestras en el marco de un ensayo de carcinogénesis. Si se consi ­
dera oportuno, se podrán obtener muestras de sangre para hematología y 
bioquímica clínica y muestras de orina para análisis, como mínimo en 10 animales de cada sexo y lote, tanto antes del sacrificio durante el ensayo (punto 20) como en el momento de su conclusión. Las muestras de sangre 
se extraerán de una zona que deberá indicarse, por ejemplo por punción 
cardiaca o del seno retro-orbital, bajo anestesia y, en su caso, se conservarán en las debidas condiciones. También se pueden preparar frotis de sangre, especialmente si se sospecha que la médula ósea es el órgano diana, aunque 
se ha cuestionado el valor de estas muestras para la evaluación del potencial 
cancerígeno u oncógeno (32).
 
ANATOMÍA PATOLÓGICA  
Autopsia macroscópica  
36. Todos los animales del estudio excepto los centinela (véase el punto 20) y 
otros animales satélite se someterán a una autopsia completa que comprenda 
la inspección de la superficie externa del cuerpo, todos sus orificios y las 
cavidades craneal, torácica y abdominal y sus contenidos. La autopsia de los animales centinela y de otros animales satélite se decidirá según cada caso, a criterio del director del estudio. El pesaje de los órganos no suele formar 
parte de un estudio de carcinogénesis, dado que los cambios geriátricos y, 
en fases más avanzadas, el desarrollo de tumores introducen confusión en la interpretación de los datos sobre el peso de los órganos. No obstante, estos datos pueden ser cruciales para sopesar las pruebas y, especialmente, las 
consideraciones sobre el modo de acción. Si forman parte de un estudio 
satélite, se recogerán a lo más tardar un año después de iniciar el estudio.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el medio 
de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el 
examen histopatológico a que vayan a someterse (33) (opcional en el caso de los tejidos entre corchetes): 
Todas las lesiones macros ­
cópicas Corazón Páncreas Estómago (rumen, estómago 
glandular) 
Cápsulas suprarrenales Íleo Glándulas paratiroides [Dientes] Aorta Yeyuno Nervios periféricos Testículos Encéfalo (incluidos cortes 
de cerebro, cerebelo, bulbo y protuberancia) Riñón Hipófisis Timo 
Intestino ciego Glándulas lacrimales 
(extraorbitales) Próstata Tiroides 
Cuello del útero Hígado Recto [Lengua] 
Glándulas coagulantes Pulmón Glándulas salivales Tráquea Colon Ganglios linfáticos (su ­
perficiales y profundos) Vesículas seminales Vejiga urinaria 
Duodeno Glándulas mamarias 
(obligatoriamente las fe ­
meninas y, sin son visi ­
blemente diseccionables, también las masculinas) Músculo esquelético Útero (y cuello) 
Epidídimo [Vías respiratorias altas, 
incluidos nariz, cornetes 
y senos paranasales] Piel [Uréteres] 
Ojos (y retina) Esófago Médula espinal (tres 
secciones: cervical, medio-dorsal y lumbar) [Uretra] 
[Fémur y articulación tibio ­
femoral] [Bulbo olfativo] Bazo Vagina 
Vesícula biliar (en especies 
distintas de la rata) Ovarios [Esternón] Sección de médula ósea y/o 
aspirado reciente de médula 
Glándula de Harder 
En el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se 
conservarán ambos órganos. Las observaciones clínicas y de otro tipo pue ­
den indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propie ­
dades conocidas de la sustancia problema. En los estudios que entrañen la 
vía de administración cutánea, se conservarán los mismos órganos que en el caso de la administración oral, pero además es fundamental establecer un protocolo específico para la obtención y conservación de muestras de piel de 
la zona de aplicación. En los estudios de inhalación, los tejidos de las vías 
respiratorias se conservarán y examinarán siguiendo las recomendaciones de los capítulos B.8 y B.29 del presente anexo. Los restantes órganos y tejidos (además de los tejidos de las vías respiratorias específicamente conserva ­
dos), se examinarán igual que se ha establecido en el caso de la adminis ­
tración oral.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Examen histopatológico  
38. Se puede consultar el documento de orientación sobre buenas prácticas en la 
realización de los estudios de toxicopatología (33). Como mínimo se exa ­
minarán los siguientes tejidos: 
— todos los tejidos de los animales de control y del grupo con dosis 
máxima, 
— todos los tejidos de los animales muertos o sacrificados durante el 
estudio, 
— todos los tejidos que presenten alteraciones macroscópicas, incluidos 
tumores, 
— cuando se observen alteraciones histopatológicas relacionadas con el 
tratamiento en el grupo de dosis más elevada, los mismos tejidos afec ­
tados se examinarán en todos los animales de los restantes grupos de dosis, 
— en el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se 
examinarán ambos órganos.
 
DATOS E INFORME  
Datos  
39. Se documentarán los datos de todos los parámetros evaluados en cada 
animal. Además, deben resumirse todos los datos en un cuadro que recoja, 
por cada lote de ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el 
número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos 
signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y gravedad), 
el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el porcentaje de animales afectado por cada tipo de lesión. Los cuadros de datos agrupados reflejarán las medias y desviaciones típicas (en el caso de 
variables continuas) de los animales que presenten lesiones o efectos tóxi ­
cos, además de una escala de clasificación de las lesiones. 
40. Los datos sobre controles históricos pueden resultar de ayuda en la inter ­
pretación de los resultados del estudio, por ejemplo cuando haya indicios de que los resultados arrojados por los controles simultáneos se desvían esen ­
cialmente de los datos recientes obtenidos en animales de control del mismo 
animalario o colonia. De ser evaluados, los datos sobre controles históricos deben proceder del mismo laboratorio, y corresponder a animales de edades y cepas afines, y haberse generado en los cincos años precedentes al estudio 
en cuestión. 
41. Siempre que sea posible, deben evaluarse los resultados numéricos mediante 
un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. La elección de los métodos estadísticos y de los datos que vayan a analizarse debe efectuarse en la fase de diseño del estudio (punto 9). Para ello se tendrán en cuenta los 
ajustes de la supervivencia, en su caso.
 
Informe del ensayo  
42. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas. — Datos de identificación.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— Procedencia de la sustancia. 
— Número de lote. — Certificado de análisis químico.  
Vehículo (si procede):  
— Justificación de la elección del vehículo (si es distinto del agua).  
Animales de ensayo:  
— Especie y cepa utilizada y motivos para elegirla. — Número, edad y sexo de los animales al inicio del ensayo. — Origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc. — Peso de cada animal al inicio del ensayo.  
Condiciones del ensayo:  
— Fundamento de la elección de la vía de administración y la dosis. — Cuando proceda, métodos estadísticos aplicados al análisis de los datos. — Pormenores de la formulación de la sustancia o de su preparación con la 
comida. 
— Datos analíticos acerca de la concentración obtenida, la estabilidad y la 
homogeneidad de la preparación. 
— Vía y método de administración de la sustancia problema. — En los estudios de inhalación se indicará si es de solo por la nariz o de 
cuerpo entero. 
— Dosis reales (mg/kg peso corporal/día) y factor de conversión de la 
concentración (mg/kg o ppm) de la sustancia problema en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales, en su caso. 
— Datos sobre la calidad de los alimentos y del agua.  
Resultados (se presentarán cuadros de datos agrupados así como los datos 
de cada animal) 
Generalidades  
— Datos de supervivencia. — Peso corporal y variaciones del mismo. 
— Ingesta de alimento, cálculos de la eficiencia alimentaria, si se han 
hecho, e ingesta de agua cuando proceda. 
— Datos toxicocinéticos (en su caso). 
— Oftalmoscopia (en su caso). — Hematología (en su caso). — Bioquímica clínica (en su caso).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Observaciones clínicas:  
— Signos de toxicidad. — Incidencia (y, si se ha valorado, gravedad) de cualquier anomalía. 
— Naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas (sean 
reversibles o no).  
Resultados de la autopsia:  
— Peso corporal en el momento de la muerte. 
— Pesaje de los órganos (y pesos relativos, cuando proceda). 
— Observaciones de la autopsia; incidencia y gravedad de las anomalías.  
Examen histopatológico:  
— Observaciones histopatológicas de carácter no neoplásico. 
— Observaciones histopatológicas neoplásicas. 
— Correlación entre las observaciones macro y microscópicas. 
— Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas rela ­
cionadas con el tratamiento, con una clasificación de su gravedad. 
— Informes sobre las eventuales evaluaciones de las preparaciones efectua ­
das por otros científicos.  
Tratamiento estadístico de los resultados, según proceda. 
La discusión de los resultados comprende lo siguiente:  
— Discusión de cualquier hipótesis o modelo teórico. — Relación dosis-respuesta. 
— Datos sobre controles históricos. 
— Otras informaciones sobre el modo de acción. — Valores de BMD, NOAEL o LOAEL. 
— Relevancia para los seres humanos.  
Conclusiones
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. 
(3) Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208. 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191. 
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Pro ­
gramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) Capítulo B.27 del presente anexo. Ensayo de toxicidad oral subcrónica. 
Toxicidad oral por administración continuada (90 días) en roedores. 
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453-Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, avai ­
lable on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(9) Capítulo B.8 del presente anexo. Toxicidad subaguda por inhalación: estu ­
dio de 28 días. 
(10) Capítulo B.29 del presente anexo. Toxicidad subcrónica por inhalación: 
estudio de 90 días. 
(11) Capítulo B.9 del presente anexo. Toxicidad por administración continuada 
(28 días) por vía cutánea. 
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801. 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of 
Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589. 
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56. 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653. 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemi ­
cal Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. 
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. 
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Syste ­
mic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 37-68. 
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 69-98. 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Ap ­
proaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC. 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214. 
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp. 279-284. 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Re ­
sults and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203. 
(27) Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de 
septiembre de 2010 relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (DO L 276 de 20.10.2010, p. 33). 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of 
Health and Human Services. 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal 
Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255- 04-2. 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems. 
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. 
(32) Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201. 
(33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 
131.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Apéndice 1  
DEFINICIÓN  
Sustancia problema:  cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este mé ­
todo de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  ENSAYO COMBINADO DE TOXICIDAD CRÓNICA Y 
CARCINOGÉNESIS  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 453 de la 
OCDE (2009). Las TG 453 originales fueron adoptadas en 1981. Se consi ­
deró necesario adaptar este método de ensayo B.33 para dar cuenta de los avances recientes en materia de bienestar animal que plantean nuevas nece ­
sidades normativas (1) (2) (3) (4) (5). La actualización de este método de 
ensayo B.33 se ha realizado en paralelo con las revisiones de los capítulos 
del presente anexo B.32. Ensayo de carcinogénesis y B.30. Ensayo de toxicidad crónica, con el fin de obtener más información acerca de los animales utilizados en el estudio y recabar nuevos datos sobre la selección 
de las dosis. El presente método de ensayo ha sido diseñado para el estudio 
de una amplia gama de sustancias, incluso plaguicidas y productos químicos industriales. Conviene señalar, no obstante, que algunos pormenores y re ­
quisitos pueden variar en el caso de los productos farmacéuticos (véase el 
documento de orientación S1B de la Conferencia Internacional sobre 
Armonización (ICH), para los ensayos de carcinogénesis de los productos farmacéuticos). 
2. La mayoría de los ensayos de toxicidad crónica y de carcinogénesis se 
realizan con especies de roedores, por lo que este método de ensayo se 
ha diseñado básicamente para el estudio de dichas especies. Cuando fuere preciso realizar estos ensayos en especies no roedoras, serán así mismo de aplicación los principios y procedimientos descritos en este método de 
ensayo, además de los descritos en el capítulo B.27 del presente anexo, 
Ensayo de toxicidad oral por administración continuada (90 días) en no roedores (6), con las debidas modificaciones, tal como se especifica en el documento de orientación n
 o 116 de la OCDE sobre Diseño y realización de 
los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis (7). 
3. Las tres vías de administración principales que se estudian en los ensayos de 
toxicidad crónica y carcinogénesis son la oral, la cutánea y la inhalatoria. La elección de una de ellas dependerá de las características físicas y químicas de la sustancia estudiada y de la vía de exposición predominante en seres 
humanos. Se ofrece más información sobre la elección de la vía de expo ­
sición en el documento de orientación n
 o 116 de la OCDE (7). 
4. El presente método de ensayo centra el interés en la exposición por vía oral, 
la más frecuentemente usada en los estudios de toxicidad crónica y de 
carcinogénesis. Si bien los estudios de toxicidad crónica a largo plazo que 
entrañan la exposición por vía cutánea o inhalatoria pueden ser igualmente necesarios en la evaluación del riesgo para la salud humana o en determi ­
nados marcos legislativos, estas dos vías de exposición plantean una com ­
plejidad técnica considerable. Tales estudios tendrán que diseñarse según 
cada caso; sin embargo, el método de ensayo que aquí se describe para la determinación y evaluación de la toxicidad crónica y de la carcinogénesis por administración oral podría sentar las bases de un protocolo para los 
estudios de toxicidad por inhalación o absorción dérmica en lo que se refiere 
a recomendación de períodos de tratamiento, variables clínicas e histopato ­
lógicas, etc. La OCDE dispone de documentación orientativa sobre la ad ­
ministración de las sustancias problema por inhalación (7) (8) y por vía 
cutánea (7). Para el diseño de estudios a más largo plazo que contemplen 
la exposición por vía inhalatoria deben consultarse específicamente los ca ­
pítulos B.8 (9) y B.29 (10) del presente anexo, además del documento de orientación de la OCDE sobre estudios de toxicidad aguda por inhalación 
(8). Cuando se trate de estudios que contemplen la vía cutánea se consultará 
el capítulo B.9 (11) del presente anexo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Un estudio combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis proporciona 
información sobre los factores de riesgo para la salud derivados de la 
exposición continuada durante un período que puede llegar a ocupar la vida entera de la especie animal investigada. El estudio proporciona infor ­
mación sobre los efectos tóxicos de la sustancia problema, incluida la car ­
cinogénesis potencial, y puede ayudar a determinar los órganos diana y la 
posibilidad de acumulación. Puede facilitar una estimación del máximo nivel de dosis sin efectos tóxicos observados (NOAEL) y, en el caso de cance ­
rígenos no genotóxicos, de las respuestas tumorales, que servirá para esta ­
blecer los criterios de seguridad de la exposición humana. Cabe destacar la 
necesidad de realizar observaciones clínicas detenidas de los animales, a fin de obtener la máxima información posible. 
6. Los objetivos de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis realiza ­
dos según este método de ensayo son: 
— la identificación de las propiedades cancerígenas de una sustancia pro ­
blema que puedan provocar una incidencia elevada de neoplasias, una 
mayor proporción de neoplasias malignas o una reducción del tiempo de 
aparición de las neoplasias, en comparación con los grupos de control, 
— la determinación del tiempo que tardan en aparecer las neoplasias, — la identificación de la toxicidad crónica de una sustancia problema, — la identificación del órgano o los órganos diana de la toxicidad crónica y 
de la carcinogénesis, 
— la caracterización de la relación dosis-respuesta, — la identificación del nivel máximo sin efectos adversos 
observados (NOAEL), o punto de partida para determinar una dosis de referencia (Benchmark Dose, BMD), 
— la extrapolación de los efectos cancerígenos a los niveles de dosificación 
inferiores de la exposición humana, 
— la predicción de los efectos de toxicidad crónica que se producirán a los 
niveles de exposición humana, 
— la recopilación de datos para investigar las hipótesis referentes al meca ­
nismo de acción (2) (7) (12) (13) (14) (15).
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
7. En la determinación y evaluación del potencial de carcinogénesis y de 
toxicidad crónica de una sustancia, el laboratorio de ensayo deberá tener en cuenta toda la información disponible acerca de la sustancia problema antes de emprender el estudio, para así poder centrarse de manera más eficaz 
en sus propiedades toxicológicas y minimizar el uso de animales. La infor ­
mación previa y la consideración en torno al modo de acción de un supuesto cancerígeno (2) (7) (12) (13) (14) (15) reviste particular importancia, toda vez que el diseño óptimo del ensayo variará según se trate o no de un 
cancerígeno genotóxico hipotético o conocido. Se ofrecen otras considera ­
ciones sobre el modo de acción en el documento de orientación n
 o 116 (7). 
8. En el diseño del estudio serán de ayuda el conocimiento de la identidad, 
estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, cualquier información referente al mecanismo de acción, los resultados de 
cualesquiera ensayos de toxicidad  y de genotoxicidad  in vitro  o in vivo,  el 
uso o usos previstos y la exposición humana potencial, los datos de (Q)SAR previos, los datos de mutagenicidad/genotoxicidad, carcinogénesis y otros datos toxicológicos sobre sustancias estructuralmente afines, los datos toxi ­
cocinéticos disponibles (cinética de dosis única y, en su caso, de acumula ­
ción por dosis repetidas) y los datos derivados de otros estudios de
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
exposición continuada. La determinación de la toxicidad crónica y la carci ­
nogénesis solo debe emprenderse una vez que se ha recabado la información 
toxicológica inicial en los ensayos de toxicidad por administración conti ­
nuada durante 28 días y/o 90 días. También pueden aportar una información valiosa los ensayos de inducción-estimulación de cáncer a corto plazo. Se 
hará un planteamiento escalonado de los estudios de carcinogénesis como 
parte de la evaluación global de los potenciales efectos adversos que puede tener para la salud una sustancia determinada (16) (17) (18) (19). 
9. Antes de iniciar el estudio se establecerán los métodos estadísticos más 
adecuados para el análisis de los resultados, en función del diseño y de 
los objetivos experimentales. Aspectos importantes son el ajuste de la su ­
pervivencia en el análisis estadístico, el análisis de los riesgos tumorales acumulativos en relación con el tiempo de supervivencia, el análisis del 
tiempo que tarda en aparecer el tumor y el análisis en caso de terminación 
prematura de uno o más grupos. Se ofrecen orientaciones para realizar el análisis estadístico adecuado y se hace referencia a los métodos estadísticos 
internacionalmente aceptados en el documento de orientación (GD) n
 o 116 
(7) y en el GD n  o 35 sobre análisis y evaluación de los estudios de toxicidad 
crónica y carcinogénesis (20). 
10. Cuando se efectúa un estudio de carcinogénesis, son de aplicación los 
principios y consideraciones recogidos en el documento de orientación 
n o 19 de la OCDE sobre el reconocimiento, la evaluación y la aplicación 
de signos clínicos como parámetros compasivos en los animales experimen ­
tales que se usan para evaluar la seguridad (21), en particular su punto 62. 
Dicho punto especifica que en los estudios de administración continuada, 
cuando un animal muestre signos clínicos progresivos que entrañen un deterioro creciente de su estado, habrá que decidir con conocimiento de causa si se sacrifica de forma compasiva. La decisión sopesará el valor de 
la información que puede obtenerse si se mantiene al animal en el estudio 
frente al desgaste de su estado general. Si se decide mantener al animal en el ensayo, se aumentará la frecuencia de las observaciones en la medida ne ­
cesaria. Cabe también la posibilidad de, sin perjudicar a los fines de la 
investigación, suspender temporalmente la administración para aliviar el dolor o sufrimiento, o reducir la dosis experimental. 
11. Se ofrecen orientaciones y comentarios detallados sobre los principios que 
deben orientar la selección de la dosis en los estudios de toxicidad crónica y 
carcinogénesis en el documento de orientación n
 o 116 (7) y en dos publi ­
caciones del International Life Sciences Institute (22) (23). El núcleo de la estrategia de selección de la dosis depende del objetivo u objetivos princi ­
pales del estudio (punto 6). Al elegir un intervalo posológico adecuado, 
debe buscarse un equilibrio entre el cribado de los factores de riesgo, por un lado, y la caracterización de las respuestas ante dosis bajas y de su relevancia, por otro. Ello reviste particular importancia en este estudio com ­
binado de toxicidad crónica y carcinogénesis. 
12. Se considerará la posibilidad de efectuar el presente estudio combinado de 
toxicidad crónica y carcinogénesis en lugar de realizar por separado un 
ensayo de toxicidad crónica (capítulo B.30 de este anexo) y un ensayo de 
carcinogénesis (capítulo B.32 de este anexo). El ensayo combinado permite una mayor eficiencia que los estudios separados en términos de tiempo y costes, y reduce en cierta medida el uso de animales, sin comprometer la 
calidad de los datos ni en la fase de toxicidad crónica ni en la fase de 
carcinogénesis. Sin embargo, cuando se emprenda un estudio combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis habrá que considerar detenidamente los principios de la selección de la dosis (puntos 11 y 22-26) y, por otro 
lado, se entiende que determinados marcos legislativos pueden imponer la 
realización de ensayos separados. En el documento de orientación n
 o 116 (7) 
se facilitan más indicaciones sobre el diseño de los estudios combinados de toxicidad crónica y carcinogénesis dentro de los principios de máxima efi ­
ciencia para reducir el número de animales empleados y de aprovechamiento 
racional de los distintos métodos experimentales.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se 
facilitan al final del presente capítulo y en el documento de orientación 
n o 116 (7).  
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
14. El diseño del estudio consta de dos fases paralelas, una de toxicidad crónica 
y otra de carcinogénesis (consúltense sus duraciones respectivas en los puntos 34 y 35). La sustancia problema se administra generalmente por vía oral, aunque también se aceptan las vías inhalatoria y cutánea. En la 
fase de toxicidad crónica, la sustancia problema se administra diariamente en 
dosis escalonadas a varios lotes de animales experimentales, a razón de un nivel de dosis por lote, normalmente durante un período de 12 meses, si bien este puede reducirse o prolongarse en función de los requisitos norma ­
tivos (véase el punto 34). La duración del estudio será suficiente para 
permitir que se manifiesten los posibles efectos de toxicidad acumulativa, pero sin que se confundan con las alteraciones geriátricas. El diseño del estudio puede contemplar el sacrificio de uno o más animales durante el 
ensayo, por ejemplo a los 3 y a los 6 meses, y a tal efecto se podrán prever 
lotes complementarios de animales (véase el punto 20). En la fase de car ­
cinogénesis, la sustancia problema se administra diariamente a varios lotes 
de animales experimentales durante la mayor parte de su existencia. Se 
observa atentamente a los animales en ambas fases por si aparecen signos de toxicidad o lesiones neoplásicas. Se practica la autopsia a los animales que mueran o sean sacrificados durante el ensayo y, al final del mismo, se 
sacrifican y someten a autopsia los animales supervivientes.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
15. El presente método de ensayo está diseñado fundamentalmente para la 
determinación y evaluación de la toxicidad crónica y la carcinogénesis en 
roedores (punto 2). Se podrá considerar el uso de especies no roedoras 
cuando los datos previos indiquen que son más útiles para la predicción de los efectos sobre la salud humana. Se justificará la elección de la especie. La especie idónea es la rata, si bien pueden emplearse otras especies de 
roedores como el ratón. Si bien el uso de ratones en los ensayos de carci ­
nogénesis puede ser de utilidad limitada (24) (25) (26), algunas normativas en vigor siguen exigiendo que se realicen ensayos de carcinogénesis en ratones a no ser que se establezca que son científicamente innecesarios. 
Las ratas y los ratones se prefieren como modelos experimentales debido 
a su ciclo vital relativamente corto, su amplia utilización en los estudios farmacológicos y toxicológicos, su sensibilidad a la inducción tumoral y la disponibilidad de cepas de laboratorio suficientemente caracterizadas. De ­
bido a todas estas características, se ha podido hacer un gran acopio de 
información acerca de su fisiología y anatomopatología. El diseño y la realización de los estudios de toxicidad crónica y carcinogénesis en especies no roedoras, cuando proceda, se basará en los principios que se recogen en 
el presente método de ensayo y en el capítulo B.27 de este anexo, Toxicidad 
oral por administración continuada (28 días) en no roedores (6). Se ofrece más información sobre la elección de la especie y la cepa de laboratorio en el documento de orientación n
 o 116 de la OCDE (7). 
16. Se escogerán animales adultos jóvenes y sanos de una variedad de labora ­
torio de uso habitual. Los estudios combinados de toxicidad crónica y carcinogénesis se efectuarán preferiblemente en animales de la misma pro ­
cedencia y cepa que los empleados en los estudios preliminares de toxicidad 
de duración menor; ahora bien, si los animales de esa procedencia y varie ­
dad han demostrado incapacidad para cumplir los criterios de supervivencia normalmente aceptados para los estudios a largo plazo [véase el documento de orientación n
 o 116 (7)], se planteará la posibilidad de usar una cepa que 
presente una tasa de supervivencia aceptable en los ensayos a largo plazo. 
Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Alojamiento y alimentación  
17. Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del 
mismo sexo; el enjaulamiento individual se considerará solo si está cientí ­
ficamente justificado (27) (28) (29). Las jaulas se disponen de forma que se 
reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. La sala 
de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aun ­
que la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el ideal es el 
50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de 
oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio con ­
vencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La dieta debe 
satisfacer todas las necesidades nutricionales de la especie estudiada, y se 
mantendrá en el mínimo posible su contenido en contaminantes alimenta ­
rios, entre otros los residuos de plaguicidas, contaminantes orgánicos per ­
sistentes, fitoestrógenos, metales pesados y micotoxinas que pudieran influir 
en los resultados experimentales. La información analítica sobre el contenido 
de nutrientes y contaminantes alimentarios se consignará de forma periódica, como mínimo al inicio del estudio y cada vez que se varíe el lote de producto empleado, y se documentará en el informe final. Asímismo se 
consignará la información analítica sobre el agua de bebida empleada en 
el estudio. Cuando la sustancia se administra con el alimento, la elección de la dieta se basa en la necesidad de conseguir una mezcla apropiada de la sustancia problema y de satisfacer al mismo tiempo las necesidades nutri ­
cionales de los animales.
 
Preparación de los animales  
18. Deben emplearse animales sanos, que se hayan mantenido al menos 7 días 
en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no hayan sido 
sometidos a experimentos previos. En el caso de los roedores, la adminis ­
tración comenzará lo antes posible tras su destete y aclimatación, preferi ­
blemente antes de que los animales cumplan 8 semanas de edad. Se carac ­
teriza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y edad de los animales de experimentación. La diferencia de peso entre los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio 
de cada sexo. Los animales se reparten al azar entre los lotes tratados y los 
de control. Después de la asignación al azar, no debe haber diferencias significativas entre los grupos en las medias de peso corporal de cada sexo. De observarse diferencias estadísticamente significativas, el proceso de asig ­
nación aleatoria a los grupos deberá repetirse en la medida de lo posible. Se 
asigna a cada animal un número de identificación distinto, que se le grabará de manera permanente mediante tatuaje, implante de microchip o cualquier otro medio pertinente.
 
PROCEDIMIENTO  
Número y sexo de los animales  
19. Se emplearán animales de ambos sexos. Se empleará un número de animales 
suficiente para permitir una exhaustiva evaluación biológica y estadística. En el caso de los roedores, por tanto, cada grupo de dosis (como se describe en 
el punto 22) y de control simultáneo empleados en la fase de carcinogénesis 
del estudio deberá contener como mínimo 50 animales de cada sexo. De ­
pendiendo de la finalidad del estudio, cabe la posibilidad de aumentar la potencia estadística de las estimaciones esenciales haciendo una asignación 
diferencial de los animales a los distintos grupos de dosis, de modo que 
haya más de 50 individuos en los grupos de dosis inferior; esto permite estimar el potencial carcinógeno a dosis bajas. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que un aumento moderado del tamaño del grupo incrementará 
relativamente poco la potencia estadística del estudio. En el caso de los 
roedores, cada grupo de dosis (como se describe en el punto 22) y de
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
control simultáneo empleado en la fase de toxicidad crónica del estudio 
deberá contener como mínimo 10 animales de cada sexo. Conviene señalar 
que este número es menor que en el estudio de toxicidad crónica (capítulo B.30 del presente anexo). No obstante, la interpretación de los datos obte ­
nidos con los lotes reducidos en la fase de toxicidad crónica de este estudio 
combinado estará respaldada por los datos de los lotes más numerosos 
empleados en la fase de carcinogénesis. En los ensayos con ratones puede hacer falta un suplemento de animales en cada grupo de dosificación de la fase de toxicidad crónica para llevar a cabo todas las valoraciones hemato ­
lógicas necesarias. Se ofrece más información sobre el diseño estadístico y 
la selección de los niveles de dosis para maximizar la potencia estadística del estudio en el documento de orientación n
 o 116 (7).  
Provisión de animales para el sacrificio durante el ensayo, los lotes 
satélite y los lotes centinela  
20. Si está científicamente justificado, se puede hacer una provisión de animales 
para sacrificarlos durante el ensayo, por ejemplo a los 6 meses en la fase de 
toxicidad crónica, y así obtener datos sobre la progresión de las alteraciones 
no neoplásicas y sobre los mecanismos de acción. Si tal información ha sido ya proporcionada por estudios previos de toxicidad por administración con ­
tinuada realizados con la misma sustancia problema, el sacrificio de anima ­
les durante el ensayo puede no estar científicamente justificado. Los anima ­
les sacrificados en el transcurso de la fase de toxicidad crónica del estudio, normalmente de 12 meses de duración (punto 34), proporcionan datos útiles para la fase de carcinogénesis, lo que permite reducir el número global de 
animales estudiados. Cabe la posibilidad de incluir lotes satélite en la fase 
de toxicidad crónica del estudio para controlar la reversibilidad de las even ­
tuales alteraciones tóxicas inducidas por la sustancia problema. Generalmen ­
te, estos se limitan al lote del nivel de dosis más elevado del estudio y al 
lote de control. Se podrá incluir además un lote de animales centinela 
(habitualmente 5 individuos de cada sexo) para supervisar el estado en cuanto a enfermedades, en caso necesario, durante el estudio (30). En el documento de orientación n
 o 116 (7) se facilitan más indicaciones sobre el 
diseño del estudio y la provisión del mínimo número posible de animales 
para el sacrificio y para los lotes satélite y centinela. 
21. Si en el diseño experimental se incluyen animales satélite y/o para sacrifi ­
carlos durante el ensayo, lo habitual es que los lotes destinados a estos fines estén compuestos por 10 animales de cada sexo, y el número total de 
animales investigados se incrementará en esta misma medida. Los animales 
satélite y los sacrificados durante el ensayo se someten generalmente a las mismas observaciones (peso corporal, consumo de agua y alimentos, valo ­
raciones de hematología y bioquímica clínica e investigaciones anatomopa ­
tológicas) que los animales observados en la fase de toxicidad crónica del 
estudio principal, aunque se puede establecer que, en los lotes que se sa ­
crifiquen durante el ensayo, se restrinja dicha evaluación a aspectos cruciales como la neurotoxicidad o la inmunotoxicidad.
 
Grupos de dosis y posología  
22. En el documento de orientación n  o 116 (7) se facilitan indicaciones sobre 
todos los aspectos de la selección de la dosis y los intervalos entre las dosis. 
Tanto en la fase de toxicidad crónica como en la de carcinogénesis, se 
emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control en paralelo. Los niveles de dosis se basan generalmente en los resultados de los estudios de determinación del intervalo o realizados con dosis repetidas a corto plazo, 
y deben tener en cuenta los datos toxicológicos y toxicocinéticos de que se 
disponga en relación con la sustancia problema o con sustancias afines.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. En la fase de toxicidad crónica puede no ser necesario hacer un estudio 
completo con tres niveles de dosis, si se considera que no cabe esperar 
efectos adversos con un nivel de dosis equivalente como mínimo a 1 000 mg/kg peso corporal/día. Esta decisión se basará en informaciones proce ­
dentes de estudios preliminares y en la consideración de que no cabe esperar 
toxicidad a tenor de los datos de sustancias estructuralmente afines. Se 
puede establecer un límite de 1 000 mg/kg peso corporal/día, salvo si la exposición humana previsible indica la necesidad de emplear un nivel de dosis más elevado. 
24. Salvo limitaciones impuestas por la naturaleza fisicoquímica o los efectos 
biológicos de la sustancia problema, el nivel de dosis más elevado se esco ­
gerá a fin de identificar los principales órganos diana y efectos tóxicos pero 
evitando una toxicidad intensa, el sufrimiento, la morbilidad o la muerte de los animales. Normalmente, el nivel de dosis superior se seleccionará de modo que induzca signos de toxicidad, como una merma en la ganancia de 
peso corporal (de aproximadamente el 10 %). Ahora bien, dependiendo de 
los objetivos del estudio (véase el punto 6), se puede establecer un techo de dosis inferior al nivel que provoque signos de toxicidad, por ejemplo si una dosis induce un efecto adverso de interés que, sin embargo, tiene escasa 
repercusión en el período de vida o el peso corporal. 
25. Los niveles de dosis y la frecuencia de administración serán tales que 
permitan establecer una relación dosis-respuesta y, dependiendo del modo 
de acción de la sustancia problema, un valor de NOAEL o cualesquiera otras determinaciones previstas, como el valor de BMD o dosis de referencia 
más baja (véase el punto 27). Para establecer las dosis inferiores se tendrán 
en cuenta factores como la pendiente esperada de la curva dosis-respuesta, así como los niveles a los que cabe esperar cambios importantes en el metabolismo o en el mecanismo de la acción tóxica, cuando se prevea un 
umbral, o que constituyan un punto de partida para extrapolar la dosis más 
baja. Cuando se lleva a cabo un estudio combinado de toxicidad crónica y carcinogénesis, la finalidad principal es obtener información que permita evaluar el riesgo de carcinogénesis y, normalmente, la información sobre 
la toxicidad crónica es secundaria. Habrá que tener esto en cuenta al selec ­
cionar los niveles de dosis y los intervalos de administración. 
26. La frecuencia de administración de las dosis dependerá de los objetivos del 
estudio y de las características de la sustancia problema y no corresponde especificarla en este método de ensayo; los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer los niveles descendentes y frecuentemente 
es preferible añadir un cuarto lote de ensayo antes que utilizar intervalos 
muy amplios (por ejemplo con un factor superior a 6-10) entre dosis. En general se evitará aplicar factores superiores a 10, que en todo caso deberán justificarse. 
27. Tal como se recoge en el documento de orientación n
 o 116 (7), para la 
selección de las dosis se tendrán en cuenta los siguientes factores: 
— los intervalos supuestos o conocidos de no linealidad o puntos de in ­
flexión en la ecuación dosis-respuesta, 
— la toxicocinética y los intervalos posológicos en los que pueda haber o 
no inducción metabólica, saturación o no linealidad entre las dosis ex ­
ternas e internas, 
— las lesiones precursoras, los marcadores de efecto o los indicadores de la 
intervención de los principales mecanismos biológicos subyacentes,  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— aspectos importantes (hipotéticos o comprobados) del modo de acción, 
como la dosis a partir de la cual se manifiesta toxicidad, los niveles 
hormonales que resultan afectados, los mecanismos homeostáticos que se alteran, etc., 
— aquellas regiones de la curva dosis-respuesta en las que se precisa hacer 
una estimación especialmente robusta, como el intervalo de la dosis de referencia prevista o el umbral hipotético, 
— los niveles de exposición humana que cabe prever, especialmente 
cuando se seleccionan las dosis intermedias y bajas. 
28. Se emplea un lote de control en paralelo, que no recibe la sustancia pro ­
blema, pero sí el vehículo de la misma en caso de que se utilice. A excep ­
ción de la administración de la sustancia problema, los animales del lote de 
control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de trata ­
miento. En su caso, el lote de control ha de recibir el mayor volumen de vehículo que se haya utilizado. Si la sustancia problema se administra con 
los alimentos y provoca una disminución importante de la ingesta debido a 
que empeoran las características organolépticas de la dieta, puede ser útil utilizar un lote de control alimentado en paralelo para conseguir una com ­
paración más rigurosa.
 
Preparación de las dosis y administración de la sustancia problema  
29. La sustancia problema se administra habitualmente por vía oral, mediante 
sonda o con el alimento o el agua de bebida. Se ofrece más información sobre las vías y los métodos de administración en el documento de orien ­
tación n
 o 116 de la OCDE (7). La vía y el método de administración 
dependerán de la finalidad del estudio, las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, su biodisponibilidad y la vía y el modo de exposición predominantes en los seres humanos. Se justificará debidamente la vía y el 
método de administración elegidos. Por razones de bienestar animal, la 
alimentación oral por sonda se elegirá solo cuando exista una posibilidad razonable de que la exposición humana a la sustancia se vaya a producir por la misma vía y el mismo medio de administración (como es el caso de los 
productos farmacéuticos). Cuando se trata de sustancias alimentarias o am ­
bientales, entre ellas los plaguicidas, la administración se efectúa habitual ­
mente con los alimentos o el agua de bebida. Sin embargo, en otros esce ­
narios de estudio como la exposición ocupacional, puede ser más conve ­
niente la administración por otras vías. 
30. En caso necesario, la sustancia problema se disuelve o suspende en un 
vehículo adecuado. Debe prestarse atención a las siguientes características 
del vehículo u otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribución, metabolismo o retención de la sustancia problema, efectos sobre las propiedades químicas de dicha sustancia que puedan modificar 
su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y agua o el estado 
nutricional de los animales. Se recomienda considerar en primer lugar, siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite 
de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehículos. Si se 
emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus características tóxicas. Se recabará información acerca de la estabilidad de la sustancia problema y su homogeneidad de concentración en las disoluciones o en 
las dietas (en su caso) que se emplean para la administración. 
31. Si la sustancia se administra con los alimentos o el agua de bebida, es 
importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia problema adminis ­
tradas no interfieren con la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. En los estudios de toxicidad a largo plazo en los que la sustancia problema se administra con los alimentos, su concentración no debe superar general ­
mente el límite del 5 % de la ingesta total para evitar desequilibrios nutri ­
cionales. Cuando la sustancia problema se administre con los alimentos, puede utilizarse una concentración constante en la dieta (mg/kg de alimento o ppm) o bien una dosis constante en relación con el peso corporal de los 
animales (mg/kg peso corporal), calculada con periodicidad semanal. Deberá 
indicarse qué alternativa se ha seguido.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. En el caso de la administración oral, las dosis de la sustancia problema se 
administran diariamente a los animales (7 días por semana) durante un 
período de 12 meses (fase de toxicidad crónica) o de 24 meses (fase de carcinogénesis); véanse también los puntos 33 y 34. Cualquier otra pauta posológica, por ejemplo, de 5 días por semana, debe justificarse. En el caso 
de la administración cutánea, los animales se tratan con la sustancia pro ­
blema como mínimo 6 horas al día con una pauta de 7 días por semana, según se especifica en el capítulo B.9 del presente anexo (11), durante un período de 12 meses (fase de toxicidad crónica) o de 24 meses (fase de 
carcinogénesis). La exposición por vía inhalatoria se efectúa durante 6 horas 
al día con una pauta de 7 días por semana pero, si se justifica, es admisible una pauta de 5 días por semana. El período de exposición es habitualmente de 12 meses (fase de toxicidad crónica) o de 24 meses (fase de carcinogé ­
nesis). Cuando se exponen con la técnica de solo por la nariz roedores 
distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. Se justificará debi ­
damente cualquier período de exposición inferior a 6 horas diarias. Véase 
también el capítulo B.8 del presente anexo (9). 
33. Si la sustancia problema se administra por sonda, debe hacerse con una 
sonda gástrica o una cánula de intubación adecuada y todos los días a la misma hora. La dosis única se administra normalmente una vez al día; pero si la sustancia es un irritante local, cabe la posibilidad de mantener la dosis 
total diaria repartiendo la administración en dosis divididas (dos veces al 
día). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. El volumen se mantendrá en el mínimo posible, y en los roedores no debe exceder generalmente de 1 ml/100 g peso 
corporal (31). La variabilidad en el volumen utilizado debe reducirse al 
mínimo ajustando la concentración para garantizar un volumen constante en todas las dosis. Constituyen una excepción las sustancias potencialmente corrosivas o irritantes, que deben diluirse para evitar efectos locales graves. 
Se evitará la administración de concentraciones que puedan ser corrosivas o 
irritantes del tubo digestivo.
 
Duración del estudio  
34. Si bien el período de administración y la duración de la fase crónica de este 
estudio es normalmente de 12 meses, su diseño permite aplicarlo a ensayos 
de duración menor (6 o 9 meses) o mayor (18 o 24 meses), en función de los requisitos normativos particulares o de los mecanismos específicos que se pretenda investigar. Toda desviación de este período de exposición de 12 
meses deberá justificarse, particularmente si es en el sentido de acortarlo. 
Los animales de todos los grupos de dosis asignados a esta fase serán sacrificados en el momento previsto para la evaluación de la toxicidad 
crónica y las alteraciones anatomopatológicas no neoplásicas. Concluida la 
exposición, los lotes satélite incluidos para comprobar la reversibilidad de las eventuales alteraciones tóxicas inducidas por la sustancia problema de ­
ben mantenerse sin administración durante un período no inferior a 4 se ­
manas ni superior a un tercio de la duración total del estudio. 
35. La duración de la fase de carcinogénesis de este estudio suele ser de 24 
meses en el caso de los roedores, lo que constituye la mayor parte del 
período de existencia de los animales investigados. Siempre que se justifi ­
que, se podrán aplicar períodos mayores o menores en función del ciclo de vida de la especie y la cepa investigadas. En el caso de determinadas cepas 
de ratones, como AKR/J, C3H/J o C57BL/6J, puede estar más justificada 
una duración de 18 meses. Seguidamente se facilitan algunas indicaciones acerca de la duración, la terminación del estudio y la supervivencia; otras consideraciones, entre ellas la aceptabilidad de un resultado de carcinogé ­
nesis negativa en función de la supervivencia observada en el estudio, se 
pueden consultar en el documento de orientación n
 o 116 de la OCDE (7).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Se planteará la terminación del estudio cuando el número de supervi ­
vientes en los grupos de dosis más baja o de control sea menor del 25 
por ciento. 
— Si las muertes prematuras por toxicidad se producen solo en el grupo de 
dosis más elevada, ello no debe motivar la terminación del estudio. 
— Se contabilizará por separado la supervivencia de cada sexo. 
— El estudio no debe prolongarse más allá del instante en que los datos 
derivados del mismo se muestren insuficientes para permitir una evalua ­
ción estadísticamente significativa.  
OBSERVACIONES (FASE DE TOXICIDAD CRÓNICA) 
36. Se observará la morbilidad o la mortalidad en todos los animales, general ­
mente a primera y última hora del día, incluidos los fines de semana y 
festivos. Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora y teniendo en cuenta el período más agudo de los efectos previstos tras la administración cuando esta se haga por 
sonda. 
37. Se someterán todos los animales a observación clínica exhaustiva como 
mínimo antes de la primera exposición (para permitir realizar comparaciones 
con un mismo sujeto), al concluir la primera semana de estudio y, en lo sucesivo, con periodicidad mensual. El protocolo de tales observaciones se 
organizará con el fin de minimizar las variaciones entre los observadores 
individuales y entre los distintos lotes experimentales. Dichas observaciones han de efectuarse fuera de la jaula de alojamiento, de preferencia en un ambiente normal y siempre a la misma hora. Las observaciones se registran 
cuidadosamente, preferentemente mediante sistemas de puntuación definidos 
de forma explícita por el laboratorio de ensayo. Debe procurarse que las variaciones en las condiciones de observación sean mínimas. Los signos anotados deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios de la piel, 
pelo, ojos, membranas mucosas, presencia de secreciones y excreciones y 
actividad neurovegetativa (lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila y respiración anómala). Deben registrarse también los cambios en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de movimien ­
tos clónicos o tónicos, o estereotipados (por ejemplo, realización excesiva de 
movimientos de limpieza o recorridos circulares repetitivos) o comporta ­
mientos anómalos (automutilación, marcha hacia atrás, etc.) (32). 
38. Debe realizarse una exploración oftalmológica con un oftalmoscopio o 
equipo similar adecuado a todos los animales antes de administrar la sus ­
tancia problema. Al concluir el estudio, el mismo examen se practicará 
preferiblemente a todos los animales y, obligatoriamente, a los lotes de 
control y de dosis más elevada. Si se observan en esos animales cambios oculares relacionados con el tratamiento, deben examinarse todos los demás. Si el análisis estructural o cualquier otra información indica toxicidad oftál ­
mica, se aumentará la frecuencia de las exploraciones oftalmológicas. 
39. Cuando se trate de sustancias para las que estudios previos de toxicidad por 
administración continuada durante 28 días o 90 días hayan demostrado 
efectos neurotóxicos, las pruebas de reactividad sensorial a estímulos de diferentes tipos (32) [por ejemplo, auditivos, visuales y propioceptivos (33) (34) (35)], así como la evaluación de la fuerza prensil (36) y de la 
actividad motriz (37), podrán hacerse facultativamente antes de iniciar el 
estudio, a intervalos de 3 meses durante el mismo hasta un máximo de 12 meses inclusive, y a la conclusión del estudio (si dura más de 12 meses). La bibliografía respectiva recoge más información sobre los métodos que pue ­
den seguirse, si bien es posible emplear procedimientos distintos de los ahí 
descritos.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. Cuando los estudios previos de toxicidad por administración continuada 
durante 28 días o 90 días indiquen que la sustancia tiene capacidad inmu ­
notóxica, al concluir el estudio se podrán proseguir las investigaciones de este parámetro.
 
Peso corporal, consumo de alimentos y agua y eficiencia alimentaria  
41. Deben pesarse todos los animales al comenzar el tratamiento, como mínimo 
una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al 
menos una vez al mes. Se medirán el consumo de alimento y la eficiencia 
alimentaria como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Si la sustancia pro ­
blema se administra con el agua de bebida, se medirá la ingesta de agua 
como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo 
sucesivo, al menos una vez al mes. La determinación de la ingesta de agua se contemplará asimismo en aquellos estudios en los que esté alterada la actividad de beber.
 
Hematología y bioquímica clínica  
42. En las investigaciones realizadas con roedores, se practicarán exámenes 
hematológicos en todos los animales de ensayo (10 machos y 10 hembras por cada grupo) a los 3, 6 y 12 meses y al concluir el estudio (si dura más de 12 meses). En los ensayos con ratones puede hacer falta un suplemento 
de animales satélite para llevar a cabo todas las valoraciones hematológicas 
necesarias (véase el punto 19). Cuando se trate de especies no roedoras, se tomarán muestras más pequeñas de animales (por ejemplo, 4 animales por sexo y grupo en el caso de los perros) para las valoraciones realizadas 
durante el ensayo y a su conclusión. Se trate de especies roedoras o no, 
las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado efectos sobre los parámetros hematológicos en los estudios previos efectua ­
dos durante 90 días con dosis afines. Las muestras de sangre se extraerán de 
una zona que deberá indicarse, por ejemplo por punción cardiaca o del seno 
retro-orbital, bajo anestesia. 
43. Se investigarán los siguientes parámetros (38): recuento de leucocitos y 
fórmula leucocitaria, recuento de eritrocitos y de plaquetas, concentración 
de hemoglobina, hematocrito, volumen corpuscular medio (MCV), hemo ­
globina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpus ­
cular media (MCHC), tiempo de protrombina y tiempo de tromboplastina 
parcial activada. Pueden determinarse además otros parámetros hematológi ­
cos como los cuerpos de Heinz, la morfología de otros eritrocitos atípicos o los valores de metahemoglobina, en función de la toxicidad de la sustancia problema. El planteamiento general ha de ser flexible, y adaptado a los 
efectos observados o esperados de la sustancia problema. Si esta ejerce 
efectos sobre el sistema hematopoyético, pueden estar indicados recuentos de reticulocitos y una citología de la médula ósea, que no son valoraciones habituales. 
44. En los intervalos de tiempo especificados para determinar las variables 
hematológicas, se realizarán valoraciones de bioquímica clínica para inves ­
tigar los principales efectos tóxicos sobre los tejidos y, específicamente, 
sobre los riñones y el hígado en las muestras de sangre obtenidas de todos 
los animales de ensayo (10 machos y 10 hembras por cada grupo). En el caso de los ratones, pueden hacer falta animales satélite para efectuar todas las valoraciones necesarias de bioquímica clínica. Cuando se trate de espe ­
cies no roedoras, se tomarán muestras de menos animales (por ejemplo, 4 
animales por sexo y grupo en el caso de los perros) para las valoraciones realizadas durante el ensayo y a su conclusión. Se trate de especies roedoras o no, las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han 
observado efectos sobre los parámetros de bioquímica clínica en los estudios 
previos efectuados durante 90 días con dosis afines. Se recomienda que los
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
animales (a excepción de los ratones) estén en ayunas desde el día anterior a 
la toma de muestras (  1 ). Se investigarán los siguientes parámetros (38): 
glucosa, urea (nitrógeno ureico), creatinina, proteínas totales, albúmina, cal ­
cio, sodio, potasio, colesterol total, al menos dos pruebas completas de la función hepatocelular (alanina-aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa, 
glutamato-deshidrogenasa, ácidos biliares totales) (39) y al menos dos prue ­
bas completas de la función hepatobiliar (fosfatasa alcalina, gamma-glutamiltransferasa, 5’-nucleotidasa, bilirrubina total, ácidos biliares totales) (39). Cuando proceda y a tenor de la toxicidad de la sustancia 
problema, pueden hacerse otras valoraciones de bioquímica clínica como 
las de triglicéridos en ayunas, hormonas específicas y colinesterasa. Por lo general, debe aplicarse un enfoque flexible, en función de los efectos ob ­
servados o esperados con una sustancia determinada. 
45. Se practicarán análisis de orina en todos los animales de ensayo (10 machos 
y 10 hembras por cada grupo), sobre muestras recogidas respetando los mismos intervalos que en los análisis de hematología y bioquímica clínica. 
Las valoraciones a los 3 meses no serán necesarias si no se han observado 
efectos sobre los análisis de orina en un estudio previo efectuado durante 90 días con dosis afines. Las recomendaciones hechas por expertos acerca de los estudios de patología clínica incluyen los siguientes parámetros (38): 
aspecto, volumen, osmolalidad o densidad, pH, proteínas totales y glucosa. 
Otras valoraciones son cuerpos cetónicos, urobilinógeno, bilirrubina y san ­
gre oculta. Si es necesario, pueden analizarse otros parámetros adicionales 
para profundizar el estudio de los efectos observados. 
46. De manera general, se acepta que es necesario disponer de valores basales 
de hematología y bioquímica clínica antes de someter a estudio a los perros, 
pero no en el caso de las especies roedoras (38). Ahora bien, si los datos 
basales históricos (véase el punto 58) son insuficientes, se considerará la oportunidad de generar estos datos.
 
ANATOMÍA PATOLÓGICA  
Autopsia macroscópica  
47. Como norma debe practicarse una autopsia macroscópica completa y deta ­
llada a todos los animales empleados en el estudio, que incluya un examen 
detenido de la superficie corporal externa, todos los orificios y las cavidades 
craneana, torácica y abdominal con su contenido. Sin embargo, se puede prever además la realización solo (en lotes satélite o animales sacrificados durante el ensayo) de valoraciones clave específicas, por ejemplo de neuro ­
toxicidad o inmunotoxicidad (véase el punto 21). Estos animales no tienen 
que someterse a autopsia ni a las consiguientes exploraciones que se des ­
criben a continuación. La autopsia de los animales centinela se decidirá según cada caso, a criterio del director del estudio.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) El ayuno desde la víspera es preferible para realizar ciertos análisis en el suero y el 
plasma, sobre todo para la determinación de glucosa. La razón principal es que el 
aumento de la variabilidad que provocaría necesariamente la toma de alimentos podría 
enmascarar efectos más sutiles y dificultar la interpretación. Por otra parte, el ayuno 
desde la víspera puede influir en el metabolismo general de los animales y, especial ­
mente en los estudios en que la sustancia problema se administra con los alimentos, 
puede alterar la exposición diaria a dicha sustancia. Todos los animales se deben exa ­
minar en las mismas condiciones fisiológicas, por lo que se aconseja programar las 
evaluaciones neurológicas y detalladas en un día distinto del destinado a la toma de 
muestras para bioquímica clínica.
 48. Se registrará el peso de los órganos de todos los animales, salvo los que 
quedan excluidos en la última parte del punto 47. Las cápsulas suprarrena ­
les, encéfalo, epidídimo, corazón, riñones, hígado, ovarios, bazo, testículos, tiroides (que se pesará después de la fijación, con las paratiroides) y útero de todos los animales (aparte de los moribundos y/o sacrificados a lo largo del 
ensayo) han de limpiarse de los tejidos adherentes, según convenga, y se 
determinará el peso húmedo lo antes posible tras la disección para evitar su desecación. 
49. Los tejidos que se enumeran a continuación deben conservarse en el medio 
de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el 
examen histopatológico a que vayan a someterse (40) (opcional en el caso de los tejidos entre corchetes): 
Todas las lesiones macros ­
cópicas Corazón Páncreas Estómago (rumen, estómago 
glandular) 
Glándulas suprarrenales Íleo Glándulas paratiroides [Dientes] 
Aorta Yeyuno Nervios periféricos Testículos 
Encéfalo (incluidos cortes 
de cerebro, cerebelo y pro ­
tuberancia) Riñón hipófisis Timo 
Intestino ciego Glándulas lacrimales 
(extraorbitarias) Próstata Tiroides 
Cuello del útero Hígado Recto [Lengua] 
Glándulas coagulantes Pulmón Glándulas salivales Tráquea 
Colon Ganglios linfáticos (su ­
perficiales y profundos) Vesículas seminales Vejiga urinaria 
Duodeno Glándulas mamarias 
(obligatoriamente las fe ­
meninas y, sin son visi ­
blemente diseccionables, también las masculinas) Músculo esquelético Útero (y cuello) 
Epidídimo [Vías respiratorias altas, 
incluidos nariz, cornetes y senos paranasales] Piel [Uréteres] 
Ojos (y retina) Esófago Médula espinal (tres 
secciones: cervical, me ­
dio dorsal y lumbar) [Uretra] 
[Fémur y articulación tibio ­
femoral] [Bulbo olfatorio] Bazo Vagina 
Vesícula biliar (en especies 
distintas de la rata) Ovarios [Esternón] Sección de médula ósea y/o 
aspirado reciente de médula 
Glándula de Harder
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
En el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se 
conservarán ambos órganos. Las observaciones clínicas y de otro tipo pue ­
den indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propie ­
dades conocidas de la sustancia problema. En los estudios que entrañen la 
vía de administración cutánea, se examinarán los mismos órganos que en el 
caso de la administración oral, pero además es fundamental establecer un protocolo específico para la obtención y conservación de muestras de piel de la zona de aplicación. En los estudios de inhalación, los tejidos de las vías 
respiratorias se conservarán y examinarán siguiendo las recomendaciones de 
los capítulos B.8 (9) y B.29 (10) del presente anexo. Los restantes órganos y tejidos (además de los tejidos de las vías respiratorias específicamente con ­
servados), se examinarán igual que se ha establecido en el caso de la 
administración oral.
 
Examen histopatológico  
50. Se puede consultar el documento de orientación sobre buenas prácticas en la 
realización de los estudios de toxicopatología (40). Como mínimo, el exa ­
men histopatológico debe hacerse sobre: 
— todos los tejidos de los animales de control y del grupo con dosis 
máxima, 
— todos los tejidos de los animales muertos o sacrificados durante el 
estudio, 
— todos los tejidos que presenten alteraciones macroscópicas, 
— los tejidos diana (o los tejidos que presenten alteraciones relacionadas 
con el tratamiento en el grupo de dosis máxima) de todos los animales 
pertenecientes a los restantes grupos de dosis, 
— en el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se 
examinarán ambos órganos.  
OBSERVACIONES (FASE DE CARCINOGÉNESIS) 
51. Se observará la morbilidad o la mortalidad en todos los animales, general ­
mente a primera y última hora del día, incluidos los fines de semana y 
festivos. Debe hacerse además una observación diaria de los eventuales 
signos específicos de importancia toxicológica. En los ensayos en que se emplee sonda, los animales se examinarán en el período inmediatamente posterior a la administración. Se prestará especial atención al desarrollo de 
tumores; se registrarán el momento de aparición y localización, dimensiones, 
aspecto y progresión de todo tumor visible macroscópica o palpablemente. 
52. Deben pesarse todos los animales al comenzar el tratamiento, como mínimo 
una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Se medirán el consumo de alimento y la eficiencia alimentaria como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras 
semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. Si la sustancia pro ­
blema se administra con el agua de bebida, se medirá la ingesta de agua como mínimo una vez por semana durante las 13 primeras semanas y, en lo sucesivo, al menos una vez al mes. La determinación de la ingesta de agua 
se contemplará así mismo en aquellos estudios en los que esté alterada la 
actividad de beber.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematología, bioquímica clínica y otras valoraciones  
53. Con el fin de maximizar la información derivada de la investigación, espe ­
cialmente en lo que se refiere al modo de acción, a criterio del director del estudio se podrán tomar muestras de sangre para análisis hematológicos y de 
bioquímica clínica. También pueden estar indicados los análisis de orina. 
Los datos de los animales empleados en la fase de toxicidad crónica del estudio, normalmente de 12 meses de duración (punto 34), proporcionarán información sobre dichos parámetros. En el documento de orientación 
n
 o 116 (7) se comenta el interés de obtener este tipo de muestras en el 
marco de un ensayo de carcinogénesis. Si se toman muestras de sangre será al final del período de ensayo, justo antes del sacrificio de los animales o 
como parte del método de sacrificio. Las muestras de sangre se extraerán de 
una zona que deberá indicarse, por ejemplo por punción cardiaca o del seno retro-orbital, bajo anestesia. También se pueden preparar frotis de sangre, especialmente si se sospecha que la médula ósea es el órgano diana, aunque 
se ha cuestionado el valor de obtener estas muestras en la fase de carcino ­
génesis para la evaluación del potencial cancerígeno u oncógeno (38).
 
ANATOMÍA PATOLÓGICA  
Autopsia macroscópica  
54. Todos los animales del estudio excepto los centinela y otros animales saté ­
lite (véase el punto 20) se someterán a una autopsia completa que com ­
prenda la inspección de la superficie externa del cuerpo, todos sus orificios 
y las cavidades craneal, torácica y abdominal y sus contenidos. La autopsia de los animales centinela y de otros animales satélite se decidirá según cada caso, a criterio del director del estudio. El pesaje de los órganos no suele 
formar parte de un estudio de carcinogénesis, dado que los cambios geriá ­
tricos y, en fases más avanzadas, el desarrollo de tumores introducen con ­
fusión en la interpretación de los datos sobre el peso de los órganos. No obstante, estos datos pueden ser cruciales para sopesar las pruebas y, 
especialmente, las consideraciones sobre el modo de acción. Si forman parte 
de un estudio satélite, se recogerán a lo más tardar un año después de iniciar el estudio. 
55. Los tejidos que se mencionan a continuación deben conservarse en el medio 
de fijación más adecuado teniendo en cuenta tanto el tipo de tejido como el 
examen histopatológico a que vayan a someterse (40) (opcional en el caso 
de los tejidos entre corchetes): 
Todas las lesiones macros ­
cópicas Corazón Páncreas Estómago (rumen, estómago 
glandular) 
Cápsulas suprarrenales Íleo Glándulas paratiroides [Dientes] Aorta Yeyuno Nervios periféricos Testículos Encéfalo (incluidos cortes 
de cerebro, cerebelo, bulbo y protuberancia) Riñón Hipófisis Timo 
Intestino ciego Glándulas lacrimales 
(extraorbitales) Próstata Tiroides 
Cuello del útero Hígado Recto [Lengua] 
Glándulas coagulantes Pulmón Glándulas salivales Tráquea Colon Ganglios linfáticos (su ­
perficiales y profundos) Vesículas seminales Vejiga urinaria
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
Duodeno Glándulas mamarias 
(obligatoriamente las fe ­
meninas y, sin son visi ­
blemente diseccionables, 
también las masculinas) Músculo esquelético Útero (y cuello) 
Epidídimo [Vías respiratorias altas, 
incluidos nariz, cornetes 
y senos paranasales] Piel [Uréteres] 
Ojos (y retina) Esófago Médula espinal (tres 
secciones: cervical, medio-dorsal y lumbar) [Uretra] 
[Fémur y articulación tibio ­
femoral] [Bulbo olfativo] Bazo Vagina 
Vesícula biliar (en especies 
distintas de la rata) Ovarios [Esternón] Sección de médula ósea y/o 
aspirado reciente de médula 
Glándula de Harder 
En el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se 
conservarán ambos órganos. Las observaciones clínicas y de otro tipo pue ­
den indicar la necesidad de examinar otros tejidos. Se conservará también 
cualquier otro órgano que se considere diana teniendo en cuenta las propie ­
dades conocidas de la sustancia problema. En los estudios que entrañen la vía de administración cutánea, se examinarán los mismos órganos que en el 
caso de la administración oral, pero además es fundamental establecer un 
protocolo específico para la obtención y conservación de muestras de piel de la zona de aplicación. En los estudios de inhalación, los tejidos de las vías respiratorias se conservarán y examinarán siguiendo las recomendaciones de 
los capítulos B.8 (8) y B.29 (9) del presente anexo. Los restantes órganos y 
tejidos (además de los tejidos de las vías respiratorias específicamente con ­
servados), se examinarán igual que se ha establecido en el caso de la administración oral.
 
Examen histopatológico  
56. Se puede consultar el documento de orientación sobre buenas prácticas en la 
realización de los estudios de toxicopatología (40). Como mínimo se exa ­
minarán los siguientes tejidos: 
— todos los tejidos de los animales de control y del grupo con dosis 
máxima, 
— todos los tejidos de los animales muertos o sacrificados durante el 
estudio, 
— todos los tejidos que presenten alteraciones macroscópicas, incluidos 
tumores, 
— cuando se observen alteraciones histopatológicas relacionadas con el 
tratamiento en el grupo de dosis más elevada, los mismos tejidos afec ­
tados se examinarán en todos los animales de los restantes grupos de 
dosis, 
— en el caso de órganos pares, como riñones o cápsulas suprarrenales, se 
examinarán ambos órganos.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
DATOS E INFORME (TOXICIDAD CRÓNICA Y CARCINOGÉNESIS)  
Datos  
57. Se documentarán los datos de todos los parámetros evaluados en cada 
animal. Además, deben resumirse todos los datos en un cuadro que recoja, por cada lote de ensayo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrificados por 
razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el número de 
animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de dichos signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y gravedad), el número de animales que presenten lesiones, el tipo de lesiones y el 
porcentaje de animales afectado por cada tipo de lesión. Los cuadros de 
datos agrupados reflejarán las medias y desviaciones típicas (en el caso de variables continuas) de los animales que presenten lesiones o efectos tóxi ­
cos, además de una escala de clasificación de las lesiones. 
58. Los datos sobre controles históricos pueden resultar de ayuda en la inter ­
pretación de los resultados del estudio, por ejemplo cuando haya indicios de que los resultados arrojados por los controles simultáneos se desvían esen ­
cialmente de los datos recientes obtenidos en animales de control del mismo 
animalario o colonia. De ser evaluados, los datos sobre controles históricos 
deben proceder del mismo laboratorio, y corresponder a animales de edades y cepas afines que hayan sido analizados en los cincos años precedentes al estudio en cuestión. 
59. Siempre que sea posible, deben evaluarse los resultados numéricos mediante 
un método estadístico adecuado y comúnmente aceptado. La elección de los métodos estadísticos y de los datos que vayan a analizarse debe efectuarse en la fase de diseño del estudio (punto 9). Para ello se tendrán en cuenta los 
ajustes de la supervivencia, en su caso. 
60. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Naturaleza física, pureza y propiedades fisicoquímicas. 
— Datos de identificación. — Procedencia de la sustancia. — Número de lote. 
— Certificado de análisis químico.  
Vehículo (si procede):  
— Justificación de la elección del vehículo (si es distinto del agua).  
Animales de ensayo:  
— Especie y cepa utilizada y motivos para elegirla. 
— Número, edad y sexo de los animales al inicio del ensayo. 
— Origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc. — Peso de cada animal al inicio del ensayo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Condiciones del ensayo:  
— Fundamento de la elección de la vía de administración y la dosis. — Cuando proceda, métodos estadísticos aplicados al análisis de los datos. — Pormenores de la formulación de la sustancia o de su preparación con la 
comida. 
— Datos analíticos acerca de la concentración obtenida, la estabilidad y la 
homogeneidad de la preparación. 
— Vía y método de administración de la sustancia problema. — En los estudios de inhalación se indicará si es de solo por la nariz o de 
cuerpo entero. 
— Dosis reales (mg/kg peso corporal/día) y factor de conversión de la 
concentración (mg/kg o ppm) de la sustancia problema en los alimentos 
o en el agua de bebida a dosis reales, en su caso. 
— Datos de la calidad de los alimentos y el agua.  
Resultados (se presentarán cuadros de datos agrupados así como los datos 
de cada animal). 
Generalidades:  
— Datos de supervivencia. — Peso corporal y variaciones del mismo. — Ingesta de alimento, cálculos de la eficiencia alimentaria, si se han 
hecho, e ingesta de agua cuando proceda. 
— Datos toxicocinéticos, si los hay. — Oftalmoscopia (en su caso). — Hematología (en su caso). — Bioquímica clínica (en su caso).  
Observaciones clínicas:  
— Signos de toxicidad. 
— Incidencia (y, si se ha valorado, gravedad) de cualquier anomalía. — Naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas (sean 
reversibles o no).  
Resultados de la autopsia:  
— Peso corporal en el momento de la muerte. — Pesaje de los órganos (y pesos relativos, cuando proceda). — Observaciones de la autopsia; incidencia y gravedad de las anomalías.  
Examen histopatológico:  
— Observaciones histopatológicas de carácter no neoplásico. — Observaciones histopatológicas neoplásicas.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— Correlación entre las observaciones macro y microscópicas. 
— Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas rela ­
cionadas con el tratamiento, con una escala de clasificación de su gra ­
vedad. 
— Informes sobre las eventuales evaluaciones de las preparaciones efectua ­
das por otros científicos.  
Tratamiento estadístico de los resultados, según proceda. Discusión de los resultados:  
— Discusión de cualquier hipótesis o modelo teórico. 
— Relación dosis-respuesta. 
— Datos sobre controles históricos. — Otras informaciones sobre el modo de acción. 
— Valores de BMD, NOAEL o LOAEL. 
— Relevancia para los seres humanos.  
Conclusiones
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. 
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191 
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Pro ­
gramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445 
(6) Capítulo B.27 del presente anexo. Ensayo de toxicidad oral subcrónica. 
Toxicidad oral por administración continuada (90 días) en no roedores. 
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453-Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, avai ­
lable on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(9) Capítulo B.8 del presente anexo. Toxicidad subaguda por inhalación: estu ­
dio de 28 días. 
(10) Capítulo B.29 del presente anexo. Toxicidad subcrónica por inhalación: 
estudio de 90 días. 
(11) Capítulo B.9 del presente anexo. Toxicidad por administración continuada 
(28 días) por vía cutánea.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801. 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589. 
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56. 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653. 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Che ­
mical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7. 
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35. 
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68. 
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98. 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris. 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214. 
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp. 279-284. 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Re ­
sults and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de 
septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para 
fines científicos (DO L 276 de 20.10.2010, p. 33). 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Struc ­
ture of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. 
ISBN 3-906255-06-9. 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. 
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23. 
(32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. 
(33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. 
(34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. 
(35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. 
(36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. 
(37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Te ­
ratol. 13: 599-609. 
(38) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198-201. 
(39) EMEA (draft) document «Non-clinical guideline on drug-induced hepato ­
toxicity» (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). 
(40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Apéndice 1  
DEFINICIÓN  
Sustancia problema:  cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este mé ­
todo de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  ENSAYO DE REPRODUCCIÓN EN UNA GENERACIÓN  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.2. DEFINICIONES 
Véase la Introducción general, Parte B.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se administra la sustancia objeto de estudio, en dosis crecientes, a 
varios grupos de machos y hembras. Los machos deberán tratarse en 
la fase de crecimiento y durante al menos un ciclo de espermatogé ­
nesis completo (unos 56 días en el ratón y 70 días en la rata) para que la sustancia estudiada pueda provocar algún efecto adverso en la espermatogénesis. 
Las hembras de la generación parental (P) recibirán tratamiento du ­
rante dos ciclos estrales completos, por lo menos, para que la sus ­
tancia estudiada pueda provocar algún efecto adverso en el estro. A 
continuación, se aparea a los animales. La sustancia ensayada se 
administra a los dos sexos durante el período de apareamiento, y luego únicamente a las hembras en los períodos de gestación y lactancia. El método deberá modificarse si se pretende administrar 
la sustancia por inhalación.
 
1.5. CRITERIOS CUALITATIVOS 
Ninguno.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Antes de la prueba, se distribuye al azar a los animales, que serán 
jóvenes y sanos, para formar grupos de tratamiento y de control. Los 
animales se mantienen en las condiciones de alojamiento y alimen ­
tación experimentales durante al menos 5 días previos a la prueba. Se recomienda la administración de la sustancia estudiada con la 
alimentación o en el agua de bebida, pero también son aceptables 
otras vías de administración. Todos los animales se tratarán por el mismo método durante el período experimental apropiado. Si se utiliza un vehículo u otros aditivos para facilitar la administración, 
estos no deberán ser tóxicos. Se administrará la sustancia los 7 días 
de la semana.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
A n i m a l e s d e e x p e r i m e n t a c i ó n  
Las especies preferidas son la rata y el ratón. 
Han de utilizarse animales sanos, no sometidos a experimentación 
previa. No se utilizarán cepas de baja fecundidad. Se especificará la especie, la cepa, el sexo, el peso y la edad de los animales empleados. 
Para evaluar debidamente la fecundidad, se estudiará tanto a los 
machos como a las hembras. Todos los animales tratados y de con ­
trol deberán estar destetados antes del comienzo del tratamiento.
 
Número y sexo 
Cada grupo tratado y de control comprenderá un número de ani ­
males suficiente para obtener unas 20 hembras grávidas a término 
o cerca de él. 
El objetivo es conseguir gestaciones y progenie suficientes para 
permitir una evaluación significativa de la influencia de la sustancia en la fertilidad, la gestación y el comportamiento materno de los 
animales de la generación P así como en la lactancia, el crecimiento 
y el desarrollo de la generación F, desde la concepción al destete.
 
C o n d i c i o n e s d e l e n s a y o 
Se suministrarán alimento y agua  ad libitum.  Al acercarse el mo ­
mento del parto, se aislará a las hembras grávidas en jaulas indivi ­
duales para partos o de maternidad, y pueden suministrárseles mate ­
riales de nidificación.  
D o s i s 
Se utilizarán al menos tres grupos tratados y uno de control. Si se 
utiliza un vehículo para administrar la sustancia probada, el grupo de control recibirá este vehículo en el volumen máximo empleado. Si una sustancia objeto de estudio causa una reducción de la ingesta o 
del aprovechamiento de la alimentación, puede considerarse necesa ­
rio el uso de un grupo de control emparejado. Lo ideal sería que, a menos que lo impidan la naturaleza física/química, o los efectos biológicos de la sustancia estudiada, la dosis máxima provoque to ­
xicidad, pero no mortalidad, en los animales paternos (P). La o las 
dosis intermedias generarán efectos tóxicos mínimos atribuibles a la sustancia ensayada, y la dosis mínima no inducirá efectos adversos observables ni en los progenitores ni en la descendencia. Cuando la 
sustancia se administre por alimentación forzada o en cápsulas, la 
dosis dada a cada animal deberá basarse en el peso de cada uno y adaptarse semanalmente a las modificaciones que experimente. En las hembras grávidas, el tratamiento puede establecerse, si se desea, 
en función del peso corporal en el día 0 o 6 de gestación.
 
P r u e b a d e l í m i t e 
Cuando se trate de una sustancia dé toxicidad escasa, si una dosis de 
al menos 1 000 mg/kg no produce signo de alteración del rendi ­
miento reproductor, serán necesarios estudios con otras dosis. Si un estudio preliminar con la dosis máxima muestra signos claros 
de toxicidad materna, pero ningún efecto adverso en la fertilidad, 
serán necesarios estudios con otras dosis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
Procedimiento  
P l a n e s e x p e r i m e n t a l e s 
La administración diaria de la sustancia a los progenitores machos 
(P) se iniciará cuando tengan unas 5 a 9 semanas de edad, previo destete y aclimatación durante al menos 5 días. En las ratas, el 
tratamiento continúa durante 10 semanas antes del período de apa ­
reamiento (8 semanas en ratones). Los machos se sacrificarán y examinarán al final del período de apareamiento, o bien se les man ­
tendrá con vida y en tratamiento por si se considerara conveniente la 
producción de una segunda camada; se les sacrificará y examinará en 
algún momento antes de finalizar el estudio. En las hembras proge ­
nitoras (P), la administración se iniciará después de 5 días de acli ­
matación, por lo menos, y continuará durante al menos 2 semanas 
antes del apareamiento. El tratamiento diario de las hembras P pro ­
seguirá durante todo el período de apareamiento de 3 semanas, en la gestación y hasta el destete de la generación F
 1 . Cabe considerar la 
introducción de modificaciones del esquema posológico si se dispone 
de otros datos sobre la sustancia estudiada, como la inducción del 
metabolismo o la bioacumulación.  
M é t o d o d e a p a r e a m i e n t o 
En los estudios de toxicidad para la reproducción puede utilizarse 
apareamiento 1:1 (1 macho con 1 hembra) o 1:2 (1 macho con 2 hembras). 
Si el apareamiento es 1:1, cada hembra se colocará con el mismo 
macho hasta que exista gestación o hayan transcurrido 3 semanas. Se 
examinará todas las mañanas a las hembras para determinar la pre ­
sencia de esperma o tapones vaginales. Se considera día 0 de la gestación aquel en que se encuentre un tapón vaginal o esperma. 
Las parejas que no se apareen se examinarán para determinar la 
causa de la infertilidad aparente. 
Para ello, cabe recurrir a métodos como nuevas oportunidades de 
aparearse con machos o hembras que ya hayan procreado, examen 
microscópico de los órganos reproductores y examen del ciclo estral 
o de la espermatogénesis.
 
T a m a ñ o d e l a c a m a d a 
Se permitirá a los animales tratados durante el estudio de fertilidad 
parir naturalmente y criar a su camada libremente hasta el destete. 
Cuando se recurra a un método de homogeneización de las camadas, 
se sugiere la técnica siguiente. Entre los días 1 y 4 tras el nacimien ­
to, puede adaptarse el tamaño de cada camada mediante la elimina ­
ción por selección de las crías sobrantes para obtener, en la medida de lo posible, 4 machos y 4 hembras por camada. 
Cuando el número de crías machos y hembras impida lograr que 
cada camada cuente con 4 de cada sexo, es aceptable una adaptación 
parcial (por ejemplo, 5 machos y 3 hembras). Los ajustes no serán 
posibles con camadas de menos de 8 crías.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
O b s e r v a c i o n e s 
Se observará a cada animal al menos una vez al día durante la 
totalidad del período de prueba. Se anotarán los cambios de conducta pertinentes, los signos de parto difícil o prolongado y todos los signos de toxicidad, incluida la mortalidad. En los períodos de prea ­
pareamiento y de apareamiento, puede determinarse a diario el con ­
sumo de alimento. Tras el parto y durante la lactancia, se determi ­
nará el consumo de alimento (o de agua cuando la sustancia en estudio se administre en el agua de bebida) en los mismos días en 
que se pesen las camadas. Los machos y hembras P se pesarán el 
primer día de tratamiento, y luego semanalmente. Estas observacio ­
nes se anotarán por separado para cada animal adulto. 
La duración de la gestación se calculará a partir del día 0 de gesta ­
ción. Cada camada se examinará lo antes posible tras el alumbra ­
miento para establecer el número y sexo de las crías, las nacidas muertas, las vivas y la presencia de anomalías macroscópicas. 
Las crías muertas y las sacrificadas en el día 4 se conservarán y 
estudiarán en busca de posibles defectos. Se contarán las crías vivas y se pesarán las camadas la mañana siguiente al nacimiento, los días 4 y 7 siguientes y, por fin, semanalmente hasta la conclusión del 
estudio, momento en que debe pesarse por separado a los animales. 
Se registrarán las anomalías físicas o de conducta observadas en las 
madres o su progenie.
 
Patología  
A u t o p s i a 
Cuando los animales de la generación P se sacrifiquen, o si han 
muerto a lo largo del estudio, se examinarán al microscopio en 
busca de anomalías estructurales o alteraciones patológicas, pres ­
tando una atención especial a los órganos del sistema reproductor. Las crías muertas o moribundas se examinarán por si sufrieran 
malformaciones.
 
E x a m e n h i s t o p a t o l ó g i c o 
Se conservarán para examen microscópico ovarios, útero, cérvix, 
vagina, testículos, epidídimos, vesículas seminales, próstata, glándula coagulante, hipófisis y órganos efectores de todos los animales P. En caso de que estos órganos no se hayan examinado en otros estudios 
con varias dosis, se estudiarán al microscopio en todos los animales 
con dosis máxima y en los controles y en los animales que mueran durante el estudio, siempre que sea posible. 
Se examinarán entonces, en todos los demás animales P, los órganos 
que muestren anomalías en aquellos. En estos casos, se practicará 
examen microscópico de todos los tejidos que muestren alteraciones patológicas macroscópicas. Como se ha indicado al exponer los métodos de apareamiento, pueden someterse a examen microscópico 
los órganos reproductores de los animales que se sospeche sufren 
esterilidad.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. RESULTADOS  
Los resultados se resumirán en forma de tabla y mostrarán, para cada 
grupo de prueba, el número de animales al comienzo del ensayo, el de machos fértiles, el de hembras grávidas, los tipos de alteraciones 
y el porcentaje de animales que mostraban cada alteración, 
Cuando sea posible, los resultados numéricos se enumerarán por un 
método estadístico apropiado. Puede usarse cualquier método esta ­
dístico reconocido.
 
3. INFORME  
3.1. DATOS DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— especie y cepa utilizada, — datos de respuesta tóxica en función del sexo y la dosis, inclui ­
dos los índices de fertilidad, gestación y viabilidad, 
— momento de la muerte durante el estudio, o indicación de que los 
animales sobrevivieron hasta el día previstopara el sacrificio al 
final del estudio, 
— tabla en la que aparezcan los pesos de cada camada, los pesos 
medios de las crías y los pesos de las distintas crías tras concluir el estudio, 
— efectos tóxicos o de otro tipo sobre la reproducción, la progenie 
y el crecimiento postnatal, 
— día de observación de cada signo anómalo y su evolución, — datos de peso de los animales P, — hallazgos de autopsia, — descripción detallada de todos los hallazgos microscópicos, — tratamiento estadístico de los resultados, cuando proceda, — comentario de los resultados, — interpretación de los resultados.
 
3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN 
Véase la Introducción general, Parte B.  
4. REFERENCIAS  
Véase la Introducción general, Parte B.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  ESTUDIO DE TOXICIDAD PARA LA REPRODUCCIÓN EN 
DOS GENERACIONES  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 416 (2001).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente método de ensayo de toxicidad para la reproducción en 
dos generaciones tiene por objeto proporcionar información general 
sobre los efectos de una sustancia de ensayo en la integridad y 
funcionamiento del aparato reproductor del macho y la hembra, en particular, la función gonadal, ciclo estrual, comportamiento relativo al apareamiento, concepción, gestación, parto, lactancia y destete, así 
como el desarrollo y crecimiento de la progenie. El estudio también 
puede mostrar los efectos de la sustancia de ensayo en la morbilidad y mortalidad neonatales, proporcionar datos preliminares sobre la toxicidad para el desarrollo prenatal y postnatal y servir de orienta ­
ción para ensayos posteriores. Además de estudiar el desarrollo y 
crecimiento de la generación F1, el ensayo tiene por objeto evaluar la integridad y el funcionamiento del aparato reproductor del macho y la hembra, así como el desarrollo y crecimiento de la generación 
F2. Puede obtenerse mayor información sobre la toxicidad para el 
desarrollo y las deficiencias funcionales completando el presente protocolo mediante estudios descritos en los ensayos de toxicidad para el desarrollo y/o neurotoxicidad para el desarrollo, según pro ­
ceda, o estudiando dichos aspectos de forma independiente em ­
pleando métodos de ensayo apropiados.
 
1.2. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se administra la sustancia de ensayo en dosis escalonadas a varios 
lotes de machos y hembras. En el caso de los machos de la gene ­
ración P (generación parental), se administra a lo largo del creci ­
miento y al menos durante un ciclo de espermatogénesis completo (unos 56 días en el ratón y 70 en la rata) para poder observar los posibles efectos adversos sobre la espermatogénesis. Los efectos en 
el esperma se valoran mediante diversos parámetros (morfología y 
motilidad de los espermatozoides, etc.), preparaciones tisulares y análisis histopatológico exhaustivo. Si se dispone de datos relativos a la espermatogénesis obtenidos en estudios previos con dosis repe ­
tidas de duración suficiente (por ejemplo, 90 días), no será preciso 
incluir los machos de la generación P en la evaluación. No obstante, se recomienda conservar muestras o grabaciones digitales del es ­
perma de esta generación para su posterior evaluación. La sustancia 
de ensayo se administra a las hembras de la generación P durante el 
crecimiento y a lo largo de varios ciclos estruales completos para detectar todos los efectos adversos en el ciclo estrual. Asimismo, se administra a los animales de la generación P durante el período de 
apareamiento y las gravideces resultantes hasta el destete de su des ­
cendencia (generación F1). Tras el destete, se sigue administrando la sustancia a la generación F1 durante todo el crecimiento, el período de apareamiento y el nacimiento de la generación F2, hasta el destete 
de esta última. 
Se someten todos los animales a observación clínica y examen pa ­
tológico para detectar signos de toxicidad. El examen tendrá por objeto principal evaluar los efectos sobre la integridad y el funcio ­
namiento del aparato reproductor de las hembras y los machos y 
sobre el desarrollo y crecimiento de la descendencia.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.3.1.  Selección de la especie animal  
La especie idónea para el ensayo es la rata. Si se emplea otra 
distinta, debe justificarse y procederse a las adaptaciones pertinentes. 
Debe evitarse la utilización de cepas que presenten un bajo índice de 
fertilidad o una incidencia notoriamente elevada de anomalías del desarrollo. Al principio del experimento, la variación ponderal de los animales empleados ha de ser mínima y no superar el ± 20 % 
del peso medio de cada sexo.
 
1.3.2.  Condiciones de alojamiento y alimentación  
El cuarto de experimentación ha de estar a una temperatura de 22  o C 
(± 3  o ) y con una humedad relativa mínima del 30 % y preferible ­
mente inferior al 70 %, salvo durante la limpieza del local, si bien lo 
ideal es que esté comprendida entre el 50 y el 60 %. Se aplica una 
iluminación artificial en una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Puede proporcionarse una dieta alimentaria corriente para animales de laboratorio y agua potable a voluntad. Si la sus ­
tancia de ensayo se administra con los alimentos, es preciso obtener 
una mezcla adecuada, lo cual puede influir en la elección de la dieta. 
Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos 
del mismo sexo. El apareamiento debe llevarse a cabo en jaulas adecuadas al efecto. Una vez comprobado el apareamiento, las hem ­
bras que se hayan apareado se colocarán en jaulas individuales pre ­
paradas para el parto y la maternidad. También pueden enjaularse en grupos reducidos y separarse uno o dos días antes del parto. Cuando se acerque la fecha de este, se les proporcionará material adecuado y 
determinado de nidificación.
 
1.3.3.  Preparación de los animales  
Deben emplearse animales jóvenes sanos, que se hayan mantenido al 
menos 5 días en las condiciones de laboratorio para su aclimatación y que no hayan sido sometidos a experimentos previos. Se caracte ­
riza la especie, cepa, procedencia, sexo, peso y/o edad de los ani ­
males de experimentación. Es preciso conocer las relaciones de con ­
sanguinidad entre los animales para evitar el apareamiento entre hermanos. Los animales se reparten al azar entre los lotes tratados 
y los de control (se recomienda agruparlos por niveles ponderales). 
Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Se asigna a cada animal un número de identificación distinto. Los animales de la generación 
P deben numerarse antes de iniciar el tratamiento y los de la gene ­
ración F1 que se seleccionen para el apareamiento, en el momento del destete. Debe registrarse la camada de origen de todos los ani ­
males de la generación F1 seleccionados. Además de ello, se reco ­
mienda identificar cada cría tan pronto como sea posible tras el 
nacimiento si se tiene intención de pesarlas por separado o someter ­
las a ensayos funcionales. 
Los animales de la generación P han de tener entre 5 y 9 semanas de 
edad cuando se inicie el tratamiento. Los lotes de ensayo han de ser 
tan homogéneos como sea posible por lo que respecta al peso y edad 
de los animales.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. PROCEDIMIENTO  
1.4.1.  Número y sexo de los animales  
Cada lote de ensayo y de control debe estar integrado por una 
cantidad de animales que permita disponer de un mínimo de 20 
hembras grávidas a término o casi. En el caso de las sustancias 
que provocan efectos indeseables (por ejemplo, esterilidad o toxici ­
dad excesiva a la dosis más alta), puede resultar imposible. Se trata de obtener un número suficiente de hembras grávidas para realizar 
una evaluación significativa de los efectos de la sustancia de ensayo 
sobre la fertilidad, la gestación y el comportamiento materno, así como sobre la lactancia, desarrollo y crecimiento dé la descendencia 
F1 desde la concepción hasta la madurez, y sobre el desarrollo de la 
generación F2 hasta el destete. Por consiguiente, el hecho de no conseguir el número deseado de hembras grávidas (es decir, 20) no invalida necesariamente el estudio y debe valorarse caso por caso.
 
1.4.2.  Preparación de las dosis  
Se recomienda administrar la sustancia de ensayo por vía oral (con el 
alimento o el agua de bebida o por sonda), salvo que se considere más apropiado emplear otra vía (cutánea o inhalatoria). 
En caso necesario, la sustancia de ensayo se disuelve o suspende en 
un vehículo adecuado. Se recomienda considerar en primer lugar, 
siempre que sea posible, el uso de una solución o suspensión acuosa, después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y, por último, la posible disolución en otros vehícu ­
los. Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus 
características tóxicas. Debe determinarse la estabilidad de la sustan ­
cia de ensayo en el vehículo.
 
1.4.3.  Posología  
Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un lote de control en 
paralelo. A menos que las características fisicoquímicas o las pro ­
piedades biológicas de la sustancia de ensayo impongan restriccio ­
nes, la dosis superior debe seleccionarse con el propósito de inducir 
efectos tóxicos, pero sin llegar a provocar la muerte ni un sufri ­
miento intenso. En caso de que se produzca un índice de mortalidad inesperado, si el correspondiente a la generación P es inferior al 10 % aproximadamente, el estudio sigue siendo aceptable. Se selec ­
ciona una serie de dosis decrecientes para poner de manifiesto las 
reacciones en función de la dosis y la dosis sin efectos adversos observados (NOAEL). Los intervalos del doble al cuádruple suelen ser óptimos para establecer las dosis decrecientes y a menudo es 
preferible añadir un cuarto lote de ensayo en lugar de utilizar inter ­
valos muy amplios (por ejemplo, con un factor superior a 10) entre dosis. Si la sustancia de ensayo se añade a los alimentos, el intervalo entre las dosis no debe superar un factor de 3. Las dosis deben 
establecerse tomando en consideración todos los datos disponibles 
sobre la toxicidad, en particular los resultados de los estudios de dosis repetidas, y la información complementaria relativa al metabo ­
lismo y la cinética de la sustancia de ensayo o productos afines. 
Dicha información servirá asimismo para justificar la pertinencia 
de la gama de dosis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Se emplea un lote de control en paralelo, que no recibe la sustancia 
de ensayo, pero sí el vehículo en caso de que este se utilice para la 
sustancia. Salvo por lo que respecta a la administración de sustancia de ensayo, los animales del lote de control deben tratarse de la misma manera que los de los lotes de ensayo. En su caso, los lotes 
de control han de recibir el mayor volumen de vehículo que se haya 
utilizado. Si la sustancia de ensayo se administra con los alimentos y provoca una disminución de la ingesta o asimilación, puede ser útil utilizar un lote de control alimentado en paralelo. En lugar de ello, 
pueden emplearse los resultados de estudios de control destinados a 
evaluar los efectos de la disminución del consumo de alimentos sobre los parámetros de la reproducción. 
Debe prestarse atención a las siguientes características del vehículo u 
otros aditivos, según proceda: efectos sobre la absorción, distribu ­
ción, metabolismo o retención de la sustancia de ensayo, efectos 
sobre las propiedades químicas de la sustancia de ensayo que puedan 
modificar su toxicidad y efectos sobre el consumo de alimentos y agua o el estado nutricional de los animales.
 
1.4.4.  Ensayo límite  
Si en un ensayo con una sola dosis equivalente al menos a 1 000 
mg/kg peso corporal/día, administrada por vía oral, o un porcentaje 
equivalente si se incorpora en los alimentos o el agua, y siguiendo 
el procedimiento descrito en el presente estudio, no se produce ningún efecto tóxico observable en los padres ni en la progenie y si, a la luz de los datos disponibles (por ejemplo, sobre sustan ­
cias con características estructurales y/o metabólicas similares), no 
cabe esperar efectos tóxicos, puede considerarse innecesario reali ­
zar un estudio completo con varias dosis. El ensayo límite es válido excepto cuando la exposición humana indique la necesidad 
de utilizar una dosis oral superior. Si se trata de otras vías de 
administración, como la inhalación o la aplicación cutánea, suelen ser las características fisicoquímicas de la sustancia de ensayo (solubilidad, etc.) las que determinan y limitan el grado máximo 
de exposición que puede alcanzarse.
 
1.4.5.  Administración de las dosis  
La sustancia de ensayo se administra diariamente a los animales, los 
7 días de la semana y preferiblemente por vía oral (con los alimentos o el agua de bebida o por sonda). En caso de emplearse otra vía, debe justificarse y efectuarse las modificaciones oportunas. Se utili ­
zará la misma forma de administración para todos los animales du ­
rante el período experimental apropiado. Si la sustancia de ensayo se administra por sonda, debe hacerse con una sonda gástrica. El volu ­
men máximo de líquido administrado de una sola vez no debe su ­
perar 1 ml/100 g de peso corporal (0,4 ml/100 g de peso corporal en 
caso de que se emplee aceite de maíz como vehículo), salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a 2 ml/100 g de peso corporal. Excepto en el caso de sustancias irritantes o co ­
rrosivas que provoquen normalmente efectos exacerbados a concen ­
traciones superiores, la variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para que el volumen sea constante en todas las dosis. En los ensayos en que se emplee 
sonda, en principio las crías reciben la sustancia de ensayo indirec ­
tamente a través de la leche materna hasta que se inicia la adminis ­
tración directa en el destete. En los estudios en que la sustancia de ensayo se mezcla con los alimentos o el agua de bebida, las crías 
también la reciben directamente cuando empiezan a alimentarse solas 
en la última semana de lactancia.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
Si la sustancia se administra con los alimentos o el agua de bebida, 
es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia de en ­
sayo administradas no interfieren con la nutrición normal ni el equi ­
librio hídrico. Cuando la sustancia de ensayo se administre con los alimentos, puede utilizarse una concentración constante en la dieta 
(ppm) o bien una dosis constante respecto al peso corporal de los 
animales, pero debe indicarse qué método se ha elegido. Si la sus ­
tancia se administra por sonda, la dosis debe darse todos los días a la misma hora y ajustarse al menos una vez por semana para mantener 
una dosis constante respecto al peso corporal del animal. El ajuste 
deberá tener presente la difusión placentaria.
 
1.4.6.  Programa experimental  
La administración diaria de la sustancia de ensayo a los machos y las 
hembras de la generación P se inicia cuando tienen entre 5 y 9 
semanas de edad y a los de la generación F1, en el destete. Debe tenerse presente que cuando la sustancia se administra con los ali ­
mentos o el agua de bebida, las crías de la generación F1 ya han 
estado expuestas directamente durante la lactancia. Se sigue adminis ­
trando la sustancia a los animales de ambos sexos de las generacio ­
nes P y F1 al menos durante 10 semanas antes del período de apareamiento y durante las dos semanas de dicho período. Los ma ­
chos que no vayan a emplearse para evaluar los efectos sobre la 
reproducción se sacrifican por métodos compasivos y se estudian. La sustancia de ensayo sigue administrándose a las hembras de la generación P durante la gestación y hasta el destete de su progenie 
F1. Puede ser oportuno modificar el programa de administración de 
las dosis a la luz de la información disponible sobre la sustancia de ensayo, en particular sobre la toxicidad, la inducción metabólica o la bioacumulación. Por lo general, la dosis que se administra a cada 
animal se calcula con arreglo a la última determinación del peso 
corporal, si bien conviene ser prudente al adaptar la dosis en el último período de la gestación. 
Los machos y hembras de las generaciones P y F1 siguen recibiendo 
sustancia de ensayo hasta que sean sacrificados por métodos com ­
pasivos, cuando ya no sean necesarios para evaluar los efectos sobre la reproducción. Los descendientes F1 que no se seleccionen para el 
apareamiento y todos los descendientes F2 se sacrificarán por méto ­
dos compasivos después del destete.
 
1.4.7.  Apareamiento  
1.4.7.1.  Apareamiento de la generación parental (P)  
Para cada apareamiento, se juntan una hembra y un macho tratados 
con la misma dosis (apareamiento 1:1) hasta que se produzca la cópula o durante 2 semanas. Las hembras se observan todos los días para detectar la presencia de esperma o tapón vaginal. El día 
0 de la gestación es el día en que se observa un tapón vaginal o la 
presencia de esperma. Si no se produce apareamiento, puede plan ­
tearse otro intento con hembras y machos de comprobada capacidad reproductora del mismo lote. Las parejas deben quedar claramente 
identificadas en los resultados. Debe evitarse el apareamiento entre 
animales hermanos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  Apareamiento de la generación F1  
Se seleccionan al menos un macho y una hembra de cada camada de 
la generación F1 en el momento del destete con objeto de aparearlos con otras crías tratadas con la misma dosis, pero pertenecientes a otra 
camada, para obtener la generación F2. La selección de las crías de 
la misma camada debe hacerse al azar si no presentan diferencias significativas de peso corporal ni de aspecto. Si se observan diferen ­
cias, se seleccionan los mejores ejemplares de cada camada. Desde el 
punto de vista pragmático, resulta más fácil seleccionarlos en función 
del peso corporal, si bien puede estar más indicado basarse en el aspecto. Los descendientes F1 no deben aparearse antes de alcanzar 
la plena madurez sexual. 
Las parejas sin descendencia deben estudiarse con objeto de deter ­
minar la causa aparente de infertilidad. Para ello, puede dárseles otras oportunidades de aparearse con machos o hembras de compro ­
bada capacidad reproductora, efectuarse el examen microscópico de 
los órganos reproductores o estudiarse los ciclos estruales o la es ­
permatogénesis.
 
1.4.7.3.  Segundo apareamiento  
En algunos casos, en particular cuando las dimensiones de la camada 
se ven modificadas por el tratamiento o cuando se observa un efecto equívoco en el primer apareamiento, se recomienda volver a aparear los adultos P o F1 para obtener una segunda camada. Conviene 
volver a aparear las hembras o machos que no hayan engendrado 
con un reproductor o reproductora de capacidad comprobada. Si se considera necesaria una segunda camada de alguna de las generacio ­
nes, los animales deben aparearse más o menos una semana después 
del destete de la primera camada.
 
1.4.7.4.  Dimensión de la camada  
Se deja que los animales paran y críen con normalidad a su progenie 
hasta el destete. La normalización de la dimensión de las camadas es 
facultativa. Si se lleva a cabo, debe describirse detalladamente el 
método empleado.  
1.5. OBSERVACIONES  
1.5.1.  Observaciones clínicas  
Debe hacerse una observación clínica general una vez al día y, en 
caso de administración por sonda, teniendo en cuenta el período más agudo de los efectos previstos tras la administración. Se registran los cambios en el comportamiento, los signos de parto difícil o prolon ­
gado y todos los signos de toxicidad. Además de ello, al menos una 
vez por semana se examinan todos los animales de forma más ex ­
haustiva; puede hacerse coincidiendo con los días en que se pesen los animales. Se examinan todos los animales dos veces al día y una 
vez al día durante los fines de semana, según proceda, para detectar 
signos de morbilidad y mortalidad.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2.  Peso corporal y consumo de alimentos y agua de los animales 
parentales  
Los animales de las generaciones P y F1 deben pesarse el día de la 
primera administración y a continuación al menos una vez por se ­
mana. Las madres (P y F1) se pesan, al menos, los días 0, 7, 14 y 20 
o 21 de la gestación; durante la lactancia, los mismos días en que se pesen las crías y, por último, el día del sacrificio. Los resultados se registran para cada animal adulto por separado. Durante el período 
previo al apareamiento y durante la gestación, se mide al menos una 
vez por semana el consumo de alimentos. Si la sustancia de ensayo se administra con el agua, el consumo de esta se mide al menos una 
vez por semana.
 
1.5.3.  Ciclo estrual  
Se estudia la duración y normalidad del ciclo estrual en las hembras 
P y F1 mediante frotis vaginales antes del apareamiento y, con carácter facultativo, durante este, hasta que se compruebe que ha 
habido apareamiento. La toma de células vaginales o cervicales ha 
de hacerse con cuidado para no dañar la mucosa y evitar una pseu ­
dogestación (1).
 
1.5.4.  Parámetros de evaluación del esperma  
Se registra el peso de los testículos y epidídimos de todos los ma ­
chos P y F1 tras el sacrificio y se conserva un ejemplar de cada órgano para el examen histopatológico (véanse los apartados 1.5.7 y 1.5.8.1). Se conservan los testículos y epidídimos restantes de un 
sublote integrado al menos por 10 machos de cada grupo de machos 
P y F1, para contar las espermátides resistentes a la homogeneización y los espermatozoos almacenados en la cola del epidídimo, respec ­
tivamente. En ese mismo sublote de machos, se recoge el contenido 
de la cola del epidídimo o el conducto deferente para evaluar la 
motilidad y morfología de los espermatozoides. Si se observan efec ­
tos relacionados con el tratamiento o los resultados de otros estudios 
ponen de manifiesto que la sustancia de ensayo puede afectar a la 
espermatogénesis, debe efectuarse la evaluación del esperma en to ­
dos los machos de cada lote tratado; en caso contrario, el recuento puede limitarse a los machos P y F1 del lote de control y los lotes 
tratados con la dosis superior. 
Debe contarse la totalidad de las espermátides testiculares resistentes 
a la homogeneización y los espermatozoos de la cola del epidídimo (2) (3). La reserva caudal de espermatozoos puede deducirse de la 
concentración y el volumen presentes en la suspensión utilizada para 
completar las evaluaciones cualitativas y de la cantidad de esperma ­
tozoos recuperados tras triturar u homogeneizar el tejido caudal res ­
tante. El recuento debe efectuarse inmediatamente después del sacri ­
ficio, en el sublote de machos seleccionados en los grupos tratados 
con las distintas dosis, salvo que se realicen grabaciones digitales o de vídeo, o se congelen las muestras para su posterior análisis. En estos casos pueden analizarse en primer lugar el lote de control y el 
tratado con la dosis más alta y, si no se observan efectos relaciona ­
dos con el tratamiento (por ejemplo, en la cantidad, motilidad o morfología de los espermatozoides), no es preciso analizar los demás lotes. Si se observan efectos relacionados con el tratamiento en el 
lote tratado con la dosis más alta, deberán someterse a análisis los 
lotes tratados con dosis inferiores.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Debe evaluarse o grabarse en soporte de vídeo inmediatamente des ­
pués del sacrificio la motilidad de los espermatozoides en el epidí ­
dimo o el conducto deferente. Se toma una muestra de esperma evitando al máximo dañar los tejidos y se diluye para estudiar la motilidad mediante métodos aceptables (4). El porcentaje de esper ­
matozoides progresivamente móviles se determina de forma objetiva 
o subjetiva. Si se realiza un análisis de la motilidad asistido por ordenador (5) (6) (7) (8) (9) (10), la motilidad progresiva se evalúa con arreglo a umbrales de velocidad media de trayectoria y movi ­
miento en línea recta o índice lineal, definidos por el usuario. Si las 
muestras se graban en vídeo (11) o se graban las imágenes de otra manera en el momento de la autopsia, el análisis posterior puede limitarse a los machos P y F1 del lote de control y del tratado con la 
dosis más alta, salvo que se hayan observado efectos relacionados 
con el tratamiento, en cuyo caso habrá que evaluar asimismo los lotes tratados con dosis inferiores. Si no se dispone de imágenes de vídeo ni digitales, se analizarán en la autopsia todas las muestras 
de todos los lotes tratados. 
Se llevará a cabo el análisis morfológico de una muestra de esperma del 
epidídimo o el conducto deferente. Los espermatozoides (al menos 200 por muestra) se fijan y analizan en preparaciones húmedas (12), y se clasifican entre normales o anómalos. Las anomalías morfológicas de 
los espermatozoides incluyen las fusiones, las cabezas aisladas y las 
cabezas o las colas deformadas. La evaluación ha de efectuarse en el sublote de machos seleccionados de los grupos tratados con las distin ­
tas dosis, inmediatamente después del sacrificio o posteriormente a 
partir de grabaciones de vídeo o digitales. Una vez fijados, los frotis 
también pueden analizarse en un momento posterior. En estos casos pueden analizarse en primer lugar el lote de control y el tratado con la dosis más alta y, si no se observan efectos relacionados con el trata ­
miento (sobre la morfología de los espermatozoides, por ejemplo), no 
es preciso analizar los demás lotes. Si se observan efectos relacionados con el tratamiento en el lote tratado con la dosis más alta, deberán someterse a análisis los lotes tratados con dosis inferiores. 
Si alguno de los parámetros mencionados de evaluación del esperma 
ya ha sido analizado en un estudio de toxicidad sistémica de 90 días 
al menos, no es necesario repetir el análisis en el estudio de la toxicidad en dos generaciones. Se recomienda, no obstante, conser ­
var muestras o grabaciones digitales del esperma de la generación P 
para poder repetir la evaluación, si fuera necesario.
 
1.5.5.  Descendencia  
Se examinan todas las camadas lo antes posible después del parto (día 0 
de la lactancia) para determinar el número y sexo de las crías, la mortinatalidad, el número de nacidos vivos y la presencia de anomalías macroscópicas. Es preferible examinar las crías halladas muertas el día 
0, si no están maceradas, para detectar posibles anomalías y determinar 
la causa de la muerte y, a continuación, conservarlas. Las crías vivas se cuentan y pesan por separado al nacer (día 0 de la lactancia) o el día 1 y luego de forma periódica (por ejemplo, los días 4, 7, 14 y 21 de la 
lactancia). Se registran las anomalías físicas y las alteraciones del 
comportamiento de las madres y las crías.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Se registra el desarrollo físico de la progenie, anotando la ganancia 
de peso corporal. Otros parámetros físicos (apertura de las orejas y 
los ojos, erupción de dientes, crecimiento del pelo, etc.) pueden proporcionar información adicional, si bien es preferible emplear esos datos para evaluar la madurez sexual (edad y peso corporal 
en el momento de la apertura de la vagina o la separación balano ­
prepucial, etc.) (13). Si no forma parte de otros estudios, se reco ­
mienda efectuar la valoración funcional (actividad motriz, funciones sensoriales, ontogenia de los reflejos, por ejemplo) de la progenie F1 
antes y/o después del destete, sobre todo por lo que respecta a la 
maduración sexual. En los descendientes F1 recién destetados y seleccionados para el apareamiento debe determinarse la edad a la que se produzca la apertura de la vagina y la separación balanopre ­
pucial. Si se observa una alteración de la proporción de machos y 
hembras o de la edad de maduración sexual en la generación F1, debe medirse la distancia anogenital en las crías F2 el día del naci ­
miento. 
Las observaciones funcionales no son obligatorias en los lotes que 
presenten signos evidentes de toxicidad (disminución significativa de la ganancia de peso, etc.). Si se efectúan exploraciones funcionales, se harán en las crías que no se hayan seleccionado para el aparea ­
miento.
 
1.5.6.  Autopsia macroscópica  
Justo después del sacrificio o la muerte ocurrida durante el estudio, 
se someten a examen macroscópico para detectar toda anomalía 
estructural o cambio patológico todos los animales parentales (P y 
F1), todas las crías que presenten anomalías externas o signos clíni ­
cos y una cría seleccionada al azar de cada sexo y camada de las generaciones F1 y F2. Se prestará especial atención a los órganos 
reproductores. Deben examinarse y conservarse las crías moribundas 
que se sacrifiquen por métodos compasivos y las crías muertas, si no están maceradas, para detectar posibles anomalías y establecer la causa de la muerte. 
Debe procederse al examen de los úteros de todas las hembras 
primíparas, sin comprometer la evaluación histopatológica, para de ­
tectar la presencia de puntos de implantación y contarlos.
 
1.5.7.  Pesaje de los órganos  
Tras el sacrificio, se determina el peso corporal de todos los animales 
parentales P y F1, así como el de los órganos siguientes (los órganos 
pares se pesarán por separado): 
— utero y ovarios, 
— testículos y epidídimos (enteros y colas), 
— próstata, — vesículas seminales con glándulas coagulantes y sus líquidos, y 
próstata (conjunto), 
— cerebro, hígado, riñones, bazo, hipófisis, glándula tiroides, glán ­
dulas suprarrenales y órganos diana conocidos. 
Se determina el peso corporal de las crías F1 y F2 sacrificadas que 
se hayan seleccionado para la autopsia, así como el peso del cerebro, 
bazo y timo de una cría seleccionada al azar de cada sexo y camada 
(véase el apartado 1.5.6).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Si es posible, los resultados de la autopsia macroscópica y del pesaje 
de órganos se interpretan a la luz de las observaciones realizadas en 
otros estudios con dosis repetidas.  
1.5.8.  Histopatología  
1.5.8.1.  Animales parentales  
Los siguientes órganos y tejidos de los animales parentales (P y F1), 
o muestras representativas de estos, se fijan y conservan en un medio apropiado con vistas al examen histopatológico: 
— vagina, útero con cuello, y ovarios (conservados en un fijador 
apropiado), 
— un testículo (conservado en líquido de Bouin o un fijador com ­
parable), un epidídimo, las vesículas seminales, la próstata y una glándula coagulante, 
— órgano u órganos diana previamente identificados de todos los 
animales P y F1 seleccionados para el apareamiento. 
Debe realizarse un examen histopatológico completo de los órganos 
y tejidos antes mencionados de todos los animales P y F1 del lote de control y el lote tratado con la dosis más alta, que se hayan selec ­
cionado para el apareamiento. El examen de los ovarios de las hem ­
bras P es facultativo. Deben examinarse, asimismo, los órganos que presenten alteraciones relacionadas con el tratamiento en los lotes tratados con las dosis inferior y media, con objeto de facilitar la 
determinación de la NOAEL. Además de ello, se someterán a eva ­
luación histopatológica los órganos reproductores de los animales tratados con las dosis inferior y media, en los que se sospeche una disminución de la fertilidad, por ejemplo, los que no se hayan apa ­
reado, no hayan concebido, no hayan engendrado o no hayan tenido 
una progenie sana, o en los que se hayan observado alteraciones del ciclo estrual o de la cantidad, motilidad o morfología de los esper ­
matozoides. Se examinarán todas las lesiones macroscópicas como 
atrofias o tumores. 
Debe efectuarse un examen histopatológico pormenorizado de los 
testículos (por ejemplo, con líquido de Bouin, inclusión en parafina 
y cortes transversales de 4-5 μm de espesor) para poner de manifiesto 
los efectos relacionados con el tratamiento como la retención de espermátides, la ausencia de algunas capas o tipos de células germi ­
nales, la presencia de células gigantes plurinucleadas o el despren ­
dimiento de células espermatogénicas a la luz de los túbulos semi ­
níferos (14). El examen del epidídimo intacto ha de abarcar la ca ­
beza, el cuerpo y la cola, y puede efectuarse en una sección longi ­
tudinal. Se analiza el epidídimo para ver si hay infiltración leucoci ­
taria, cambios en la frecuencia de los tipos celulares, células abe ­
rrantes y fagocitosis de espermatozoides. El análisis de los órganos reproductores de los machos puede realizarse mediante coloración 
con PAS o hematoxilina. 
Tras la lactancia, el ovario debe contener folículos primordiales, 
folículos en crecimiento y grandes cuerpos amarillos de la lactancia. 
El examen histopatológico debe poner de manifiesto la depleción 
cualitativa de la población de folículos primordiales. Debe efectuarse una evaluación cuantitativa de los folículos primordiales de las hem ­
bras F1; el número de animales, la elección de la sección ovárica y 
el tamaño de las muestras de secciones han de ser válidas desde el 
punto de vista estadístico para el método de evaluación empleado. En el examen debe hacerse el recuento de los folículos primordiales, que pueden estar combinados con pequeños folículos en crecimiento, 
para efectuar la comparación de los ovarios de las hembras de los 
lotes tratados y del de control (15) (16) (17) (18) (19).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2. Crías destetadas 
Se fijan y conservan en un medio adecuado para el posterior examen 
histopatológico los tejidos que presenten anomalías macroscópicas y los órganos diana de todas las crías que presenten anomalías externas 
o signos clínicos, así como de la cría seleccionada al azar de cada 
sexo y camada de las generaciones F1 y F2, que no haya sido seleccionada para el apareamiento. La descripción histopatológica completa de los tejidos conservados se centrará sobre todo en los 
órganos reproductores.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Deben proporcionarse datos de cada animal por separado y resumirse 
en un cuadro que recoja, para cada lote de ensayo y cada generación, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales 
hallados muertos durante el mismo o sacrificados por razones com ­
pasivas, el momento de la muerte o sacrificio compasivo, el número de animales fértiles, el número de hembras grávidas, el número de animales que presenten signos de toxicidad, una descripción de di ­
chos signos (con inclusión del momento de su aparición, duración y 
gravedad), los tipos de observaciones de los animales parentales y las crías, los tipos de cambios histopatológicos y todos los datos pertinentes sobre la camada. 
Los resultados numéricos deben evaluarse mediante un método es ­
tadístico adecuado y comúnmente aceptado. La elección de los mé ­
todos estadísticos debe efectuarse en la fase de diseño del estudio y 
justificarse. Los modelos estadísticos aplicables a las relaciones do ­
sis-respuesta pueden resultar útiles para analizar los resultados. El informe debe recoger información suficiente sobre el método y el 
programa informático empleados, de manera que un revisor o esta ­
dístico independiente pueda reevaluar y reconstruir el análisis.
 
2.2. EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los resultados del estudio de toxicidad para la reproducción en dos 
generaciones deben evaluarse respecto a los efectos observados, en 
particular en la autopsia y los exámenes microscópicos. La evalua ­
ción debe referirse a la relación, o la ausencia de relación, entre la 
dosis de sustancia de ensayo y la presencia o ausencia, incidencia y 
gravedad de las anomalías, incluyendo lesiones macroscópicas, ór ­
ganos diana identificados, alteración de la fertilidad, anomalías clí ­
nicas, alteración de la capacidad de reproducción y del rendimiento 
de la camada, cambios del peso corporal, efectos sobre la mortalidad 
y cualquier otro efecto tóxico. Los resultados del estudio han de interpretarse teniendo presentes las propiedades fisicoquímicas de la sustancia de ensayo y, en su caso, los datos toxicocinéticos. 
Un ensayo de toxicidad para la reproducción correctamente realizado 
debe proporcionar una estimación satisfactoria de la dosis sin efecto y poner de manifiesto los efectos adversos sobre la reproducción, el 
parto, la lactancia y el desarrollo postnatal, en particular el creci ­
miento y la maduración sexual.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
El estudio de toxicidad para la reproducción en dos generaciones 
proporciona información sobre los efectos de la exposición repetida a una sustancia durante todas las fases del ciclo de reproducción y, 
en particular, sobre los parámetros de la reproducción y el desarrollo, 
crecimiento, maduración y supervivencia de la descendencia. Los resultados del estudio han de interpretarse a la luz de los de los estudios subcrónicos, de desarrollo prenatal, toxicocinéticos y de 
otro tipo. Los resultados del presente estudio pueden servir para 
valorar la necesidad de realizar más ensayos con una sustancia quí ­
mica. La validez de la extrapolación de los resultados del estudio al 
hombre es limitada. Resultan más útiles para determinar las dosis sin 
efecto y el grado de exposición humana aceptable (20) (21) (22) (23).
 
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancia de ensayo: 
— naturaleza física y, si procede, propiedades fisicoquímicas, 
— identificación, 
— pureza. 
Vehículo (si procede): 
— justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua.  
Animales sometidos a ensayo:  
— especie y cepa empleada, 
— número, edad y sexo de los animales, 
— procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, material de nidi ­
ficación, etc., 
— peso de cada animal al inicio del ensayo.  
Condiciones de ensayo:  
— justificación de la elección de las dosis, 
— datos sobre la formulación de la sustancia de ensayo o su pre ­
paración con los alimentos y concentración obtenida, 
— estabilidad y homogeneidad del preparado, 
— datos de la administración de la sustancia de ensayo, 
— factor de conversión de la concentración (ppm) de la sustancia de 
ensayo en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales (mg/kg peso corporal/día), si procede, 
— datos de la calidad de los alimentos y el agua.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Resultados: 
— consumo de alimentos y agua, si se ha medido, rendimiento 
alimentario (ganancia de peso corporal por gramo de alimentos 
consumidos) y sustancia de ensayo consumida por los animales P 
y F1, salvo durante el período de cohabitación y, al menos, el último tercio de la lactancia, 
— datos relativos a la absorción (si procede), — peso corporal de los animales P y F1 seleccionados para el 
apareamiento, 
— datos sobre las camadas y peso de las crías, — peso corporal en el momento del sacrificio y peso absoluto y 
relativo de los órganos de los animales parentales, 
— naturaleza, gravedad y duración de los signos clínicos (reversi ­
bles o no), 
— fecha de las muertes sobrevenidas durante el ensayo y animales 
que han sobrevivido hasta el sacrificio, 
— reacción tóxica por sexo y dosis, incluidos los índices de aparea ­
miento, fecundidad, gestación, natalidad, viabilidad y lactancia; el informe debe mencionar las cifras empleadas para calcular los índices, 
— efectos tóxicos o de otro tipo sobre la reproducción, la progenie, 
el crecimiento postnatal, etc., 
— hallazgos de la autopsia, 
— descripción detallada de todos los hallazgos histopatológicos, 
— número de hembras P y F1 con ciclos normales y duración del 
ciclo, 
— número total de espermatozoides en la cola del epidídimo, por ­
centaje de espermatozoides progresivamente móviles, porcentaje de espermatozoides de morfología normal y porcentaje de esper ­
matozoides por anomalía detectada, 
— tiempo transcurrido hasta el apareamiento, expresado en días, — duración de la gestación, — número de implantaciones, cuerpos amarillos, dimensión de la 
camada, 
— número de nacidos vivos y de pérdidas postimplantatorias, — número de crías con anomalías macroscópicas y número de crías 
retrasadas, si se ha determinado, 
— parámetros físicos evaluados en las crías y otros datos relativos al 
desarrollo postnatal; los parámetros físicos evaluados han de jus ­
tificarse, 
— observaciones funcionales realizadas en las crías y los adultos, 
según proceda, 
— tratamiento estadístico de los resultados, si procede,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Discusión de los resultados, 
Conclusiones, incluida la NOAEL en la madre y la progenie.  
4. REFERENCIAS  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, En:  Reproduc ­
tion in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston 
and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York. 
(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Met ­
hoxychlor-lnduced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  
12:92-108. 
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epi ­
didymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal 
of Reproduction and Fertility  54:103-107. 
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Signifícantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology  5:39 44. 
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Con ­
sensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3):237- 244. 
(6) Chapin, R.E. et al., (1992). Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6:267-273. 
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Di ­
methanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13:409-421. 
(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Met ­
hodologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5:449-458. 
(9) Slott, V.L. y Perreault, S.D. (1993). Computer-Assisted Sperm 
Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Ha ­
milton-Thorn Motility Analyzer. En:  Methods in Toxicology,  
Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319-333. 
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat 
Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Admi ­
nistration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415. 
(11) Working, P.K. y M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicro ­
graphic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337. 
(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive 
Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505. 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an Ex ­
ternal Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction 17:298303. 
(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Flo ­
rida. 
(15) Heindel, J.J. y R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Or ­
lando, Florida. 
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarían 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarían Toxicity. En: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, 
New York, pp. 421-426. 
(17) Manson, J.M. y Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing 
Female Reproductive and Developmental Toxicology. En: 
Principies and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Ra ­
ven, New York.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, BJ. et al. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive To ­
xicology 5:379-383. 
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. En: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston, and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC. 
(20) Thomas, J.A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. En: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, 
J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York. 
(21) Zenick, H. y E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Repro ­
ductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. En: Principies and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, 
New York. 
(22) Palmer, A.K. (1981). En: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York. 
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOXICOCINÉTICA  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 417 de la 
OCDE (2010). Se realizan estudios para investigar la toxicocinética de una sustancia problema a fin de obtener la debida información sobre su 
absorción, distribución, biotransformación (metabolismo) y excreción, rela ­
cionar la concentración o la dosis con la toxicidad observada y llegar a comprender los mecanismos toxicológicos. La toxicocinética puede ayudar a entender mejor los estudios toxicológicos demostrando que los animales 
de experimentación están expuestos de manera sistémica a la sustancia 
problema y revelando cuáles son las fracciones circulantes (la sustancia original o sus metabolitos). Los parámetros toxicocinéticos básicos que se determinan en estos estudios indican además la capacidad de acumulación 
de la sustancia problema en los tejidos y órganos, así como el potencial de 
inducción metabólica tras la exposición a dicha sustancia. 
2. Los datos toxicocinéticos pueden ayudar a determinar la idoneidad y rele ­
vancia de extrapolar los datos de toxicidad animal a la evaluación del riesgo y/o del peligro para la especie humana. Por otro lado, los estudios toxico ­
cinéticos pueden aportar información muy útil para determinar los niveles 
posológicos en los estudios de toxicidad (cinética lineal y no lineal), los efectos de la vía de administración, la biodisponibilidad y otras cuestiones 
relacionadas con el diseño experimental. Algunos de estos datos pueden 
servir de ayuda en el desarrollo de un modelo toxicocinético basado en la fisiología (PBTK). 
3. Los datos toxicocinéticos y de los metabolitos tienen aplicaciones importan ­
tes en la medida en que indican posibles toxicidades y modos de acción, así 
como su relación con el nivel de dosis y la vía de exposición. Además, los 
datos sobre el metabolismo resultan útiles para evaluar la importancia toxi ­
cológica de la exposición a metabolitos de la sustancia problema que son de origen exógeno. 
4. Una información toxicocinética adecuada será de ayuda para respaldar la 
mayor aceptabilidad y aplicabilidad de los modelos de relación estructura-actividad cuantitativa o de extrapolación o agrupación estructural cuando se pretende evaluar la seguridad de la sustancias. Finalmente, los 
datos cinéticos pueden servir para evaluar la importancia toxicológica de 
otras investigaciones ( in vivo /in vitro ). 
5. Mientras no se mencione otra vía de administración (véanse en particular los 
puntos 74 a 78), el presente método de ensayo es aplicable a la adminis ­
tración oral de la sustancia problema.
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
6. Los sistemas normativos imponen diferentes requisitos y necesidades en 
torno a los criterios de valoración y parámetros que se usan para evaluar 
la toxicocinética de las diferentes clases de productos químicos (plaguicidas, biocidas, productos químicos industriales, etc.). Contra la que es habitual, este método de ensayo describe el estudio de la toxicocinética, que abarca 
múltiples determinaciones y criterios de valoración. En el futuro se podrán 
desarrollar distintos métodos de ensayo y/o documentos de orientación para describir cada criterio de valoración detenidamente y por separado. En la aplicación del presente método de ensayo, los análisis y evaluaciones que se 
lleven a cabo quedarán especificados por los requisitos y las necesidades de 
cada sistema normativo en particular.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Son numerosos los estudios que se podrían realizar para evaluar el compor ­
tamiento toxicocinético de una sustancia problema dentro de un marco 
regulador. Dependiendo de las situaciones o necesidades normativas con ­
cretas, sin embargo, no tiene por qué ser obligatorio efectuar todos los estudios posibles para la evaluación de una sustancia. En el diseño de los 
estudios toxicocinéticos es importante la flexibilidad para tomar en consi ­
deración las características de la sustancia química que se pretende estudiar. En algunos casos solo habrá que investigar algunos aspectos determinados para hacer una valoración del riesgo y del peligro asociados a la sustancia 
problema. En algunas situaciones, se pueden recopilar los datos toxicociné ­
ticos como parte de la evaluación de otros estudios toxicológicos. En otros casos serán necesarios estudios toxicocinéticos complementarios y más ex ­
haustivos, en función de las necesidades normativas o de que surjan nuevos 
interrogantes al evaluar la sustancia problema. 
8. Antes de comenzar el estudio y con el fin de mejorar su calidad y minimizar 
el sufrimiento animal, el laboratorio de ensayo tendrá en cuenta toda la 
información disponible acerca de la sustancia problema y de sus principales 
metabolitos y análogos, en la que pueden incluirse datos de otros métodos de ensayo pertinentes (estudios  in vivo  e in vitro,  o evaluaciones  in silico ). 
En la planificación del estudio y la interpretación de sus resultados pueden 
ser de ayuda las propiedades fisicoquímicas, como el coeficiente de parti ­
ción octanol-agua (expresado como log P
 OW ), el pKa, la hidrosolubilidad, la 
presión de vapor, y el peso molecular de la sustancia química. Estas pro ­
piedades se pueden determinar con los procedimientos adecuados que se 
describen en los correspondientes métodos de ensayo.  
LIMITACIONES 
9. El presente método de ensayo no ha sido diseñado para contemplar circuns ­
tancias especiales, como es el caso de las hembras grávidas o lactantes y de su progenie, ni para evaluar los residuos potenciales en los animales pro ­
ductores de alimentos que han estado expuestos. Sin embargo, los datos 
obtenidos de un estudio B.36 pueden aportar una valiosa información de base para el diseño de investigaciones específicas en este sentido. El pre ­
sente método de ensayo no está destinado a la investigación de nanomate ­
riales. El informe de una revisión preliminar de las directrices de 
ensayo (TG) de la OCDE para determinar su aplicabilidad a los nanomate ­
riales indica que la TG 417 (equivalente a este método de ensayo B.36) no siempre es aplicable a los nanomateriales (1).
 
DEFINICIONES 
10. Las definiciones de términos relacionados con este método de ensayo se 
pueden consultar en el apéndice.  
CONSIDERACIONES SOBRE EL BIENESTAR ANIMAL 
11. Se ofrecen indicaciones sobre el trato compasivo de los animales en el 
documento de orientación (GD) n  o 19 de la OCDE (2). Se recomienda 
consultar dicho GD en relación con todos los estudios  in vivo  e in vitro  
descritos en este método de ensayo.  
DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS  
Estudios piloto  
12. Se recomienda y se insta a realizar estudios piloto para la selección de los 
parámetros experimentales de los estudios toxicocinéticos (metabolismo, ba ­
lance de masas, procedimientos analíticos, determinación del intervalo de 
dosis, exhalación de CO  2 , etc.). La caracterización de algunos de estos pará ­
metros puede no necesitar el uso de sustancias marcadas radiactivamente.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Selección de los animales  
Especie  
13. La especie animal (y cepa) empleada en la investigación toxicocinética será, 
preferiblemente, la misma que en otros estudios toxicológicos efectuados con la sustancia química de interés. Normalmente se prefiere la rata, por cuanto se utiliza ampliamente en los estudios toxicológicos. El uso com ­
plementario de otras especies puede estar justificado si los estudios críticos 
de toxicología aportan pruebas de toxicidad importante en estas especies, o si la toxicidad/toxicocinética en estas resulta más relevante para la especie humana. Se justificará la elección de la especie animal y de la cepa. 
14. Mientras no se indique lo contrario, el presente método de ensayo se refiere 
a la rata como especie experimental. Si se usan otras especies experimen ­
tales es posible que deban modificarse determinados aspectos metodológi ­
cos.
 
Edad y cepa  
15. Se escogerán animales adultos jóvenes y sanos (normalmente de 6-12 se ­
manas en el momento de la administración; véanse también los puntos 13 y 
14). Se justificará el uso de animales que no sean adultos jóvenes. Todos los 
animales deben tener edades parecidas al principio del estudio. El peso de los animales no debe diferir en un porcentaje superior a ± 20 % del valor medio del grupo experimental. Idealmente, la cepa empleada debe ser la 
misma que se haya usado para obtener la base de datos toxicológicos de la 
sustancia problema.
 
Número y sexo de los animales  
16. Por cada nivel de dosis investigado se emplearán como mínimo cuatro 
animales de un sexo. Se justificará la elección del sexo de los animales 
empleados. Se planteará usar animales de ambos sexos (4 machos y 4 
hembras) si hay indicios para sospechar variaciones importantes de la toxi ­
cidad en función del sexo.  
Alojamiento y alimentación  
17. Como norma, los animales deben ser enjaulados de manera individual du ­
rante el período de estudio. El enjaulamiento en grupo puede estar justifi ­
cado en circunstancias especiales. Se aplicará iluminación artificial en una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La sala de experi ­
mentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (± 3 °C) y a una hume ­
dad relativa del 30-70 %. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de 
laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber.
 
Sustancia problema  
18. Se utilizará una sustancia química marcada radiactivamente con  14 C para 
investigar todos los aspectos del estudio relacionados con el balance de 
masas y la identificación de los metabolitos; ahora bien, si se puede demos ­
trar que: 
— es posible evaluar adecuadamente el balance de masas y la identificación 
de los metabolitos empleando la sustancia problema sin marcar, 
— la especificidad y sensibilidad analíticas del método usado con la sus ­
tancia problema no radiactiva son iguales o superiores a las que se 
obtendrían con la sustancia química radiomarcada,  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
entonces no será necesario marcar radiactivamente la sustancia problema. 
Por lo demás, se pueden usar otros isótopos radiactivos y estables, particu ­
larmente si son responsables o forman parte de la fracción tóxica de la sustancia problema. Cuando sea posible, el marcador radiactivo se ubicará en una fracción nuclear de la molécula metabólicamente estable (no inter ­
cambiable, no eliminada metabólicamente en forma de CO
 2 y que no pase a 
formar parte de la reserva de moléculas de un solo átomo de carbono del organismo). Puede ser necesario el radiomarcado de distintos sitios o regio ­
nes específicas de la molécula para seguir el destino metabólico de la 
sustancia problema. 
19. Las sustancias problema, radiomarcadas o no, se analizarán con los métodos 
adecuados para establecer su pureza y su identidad. La pureza radiactiva de la sustancia problema radiomarcada debe ser la máxima posible para esa sustancia en particular (lo ideal es que supere el 95 %) y se procurará por 
todos los medios identificar los niveles de impurezas del 2 % o superiores. 
Se documentarán la pureza, la identidad y los porcentajes de impurezas que se hayan detectado. Cada marco regulador podrá proporcionar más indica ­
ciones que orienten en la definición y las especificaciones de las sustancias 
que son mezclas, así como en la elección de métodos para la determinación 
de la pureza.
 
Selección de la dosis  
Estudio piloto  
20. Generalmente es suficiente una dosis oral única para realizar el estudio 
piloto. La dosis debe ser atóxica, pero lo bastante elevada para permitir la 
identificación de los metabolitos en las excretas (y, si procede, en el plasma) y el cumplimiento de la finalidad enunciada del estudio piloto, según se expone en el punto 12 del presente método de ensayo.
 
Estudios principales  
21. En los estudios principales se prefiere usar como mínimo dos dosis, por 
cuanto la información derivada de al menos dos grupos posológicos permite 
establecer los niveles de dosis en otros estudios de toxicidad y contribuye a 
evaluar la relación dosis-respuesta observada en los estudios de toxicidad previos. 
22. Cuando se administran dos dosis, ambas deben ser lo bastante elevadas para 
permitir la identificación de los metabolitos en las excretas (y, si procede, en 
el plasma). En la selección de las dosis se tendrá en cuenta la información de los estudios de toxicidad previos. Cuando no se disponga de tal infor ­
mación (de estudios de toxicidad oral aguda que hayan documentado los 
signos clínicos de toxicidad, o de estudios de administración continuada), se 
podrá considerar para la dosis más elevada un valor por debajo de la DL
 50 
(por las vías oral y cutánea) o la CL  50 (por inhalación) estimadas, o bien por 
debajo del límite inferior del intervalo de toxicidad aguda estimado. La dosis 
más baja será una fracción de la más elevada. 
23. Cuando solo se investiga una dosis, lo ideal es que sea lo bastante elevada 
para permitir la identificación de los metabolitos en las excretas (y, si procede, en el plasma) sin provocar toxicidad aparente. Se justificarán los motivos de no incluir un segundo nivel posológico. 
24. Cuando sea necesario establecer el efecto de la posología sobre los procesos 
cinéticos, puede ser que no basten dos dosis, y al menos una de ellas será lo 
bastante elevada para saturar dichos procesos. Si el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo (AUC) no es lineal entre dos niveles de dosis empleados en el estudio principal, ello indica con bastante certeza que 
se está produciendo la saturación de uno o más procesos cinéticos en algún 
punto entre los dos niveles de dosificación.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Cuando la sustancia problema posea escasa toxicidad, se empleará una dosis 
máxima de 1 000 mg/kg peso corporal por las vías oral y cutánea (si la vía 
es inhalatoria, consúltese el capítulo B.2 del presente anexo; típicamente, esta dosis no debe superar los 2 mg/l). En función de las necesidades normativas y de las características específicas de la sustancia, puede hacer 
falta una dosis más elevada. Se justificará siempre la selección de la dosis. 
26. La toxicocinética de dosis única y los datos de distribución en los tejidos 
pueden ser suficientes para determinar el potencial de acumulación y de 
persistencia. Sin embargo, en algunas circunstancias se requiere la adminis ­
tración de dosis repetidas: 1) para investigar mejor el potencial de acumu ­
lación y de persistencia o los cambios de toxicocinética (caso de la induc ­
ción o inhibición enzimáticas), o 2) cuando así lo exige el marco regulador 
de aplicación. En los estudios de administración continuada, si bien suele bastar con la administración continuada de dosis bajas, determinadas cir ­
cunstancias imponen además la administración continuada de dosis elevadas 
(véase también el punto 57).
 
Administración de la sustancia problema  
27. La sustancia problema se debe disolver o suspender de manera homogénea 
en el mismo vehículo que se haya empleado en los estudios de toxicidad oral con administración por sonda gástrica, si se dispone de esa información. 
Se justificará la elección del vehículo. En el diseño del estudio se tendrán en 
cuenta la elección del vehículo y el volumen de administración. El método habitual de administración es por sonda gástrica; no obstante, en determi ­
nadas situaciones puede resultar ventajosa la administración del producto en 
una cápsula de gelatina o mezclado con el alimento (se justificará en ambos 
casos). Se documentará la verificación de la dosis real que se administra a cada animal. 
28. El volumen máximo de líquido que se puede administrar de una vez por 
sonda gástrica depende del tamaño de los animales experimentales, del tipo de vehículo y de si se priva a los animales de alimento antes de adminis ­
trarles la sustancia problema. Se justificarán los motivos de alimentar a los 
animales o de restringir la comida antes de administrar la dosis. Normal ­
mente, el volumen será lo más bajo posible, se trate de vehículos acuosos o no. En el caso de los roedores, el volumen de administración no debe 
exceder generalmente de 10 ml/kg peso corporal. Cuando se trata de sus ­
tancias químicas más lipófilas, el volumen de vehículo puede ser en prin ­
cipio de 4 ml/kg peso corporal. Si la administración es continuada, de modo que esté contraindicado el ayuno diario, se contemplará un volumen menor 
de administración (2-4 ml/kg peso corporal). Siempre que sea posible se 
procurará utilizar un volumen de dosis coherente con el administrado en otros estudios realizados con la misma sustancia introducida por sonda gástrica. 
29. Con el fin de establecer la biodisponibilidad o la absorción oral relativa, se 
puede recurrir a la administración intravenosa (i.v.) de la sustancia problema 
y a la determinación de sus concentraciones en la sangre o las excretas. En 
el estudio i.v. se administra, en un vehículo adecuado, una dosis única (que suele ser equivalente pero no superior a la dosis oral más baja; véase la selección de la dosis) de la sustancia problema. El producto se administrará 
en un volumen adecuado (por ejemplo, 1 ml/kg peso corporal), en el lugar 
de aplicación establecido, como mínimo a 4 animales del sexo seleccionado para la investigación (pueden ser ambos sexos, siempre que se justifique; véase el punto 16). Para la administración i.v. de la sustancia problema se 
requiere la suspensión o disolución completa de la dosis preparada. El 
vehículo de la administración i.v. no debe afectar a la circulación ni a la
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
integridad de la sangre. Si la sustancia problema se administra en infusión, 
se documentará la velocidad de la misma y se normalizará en todos los 
animales siempre y cuando se emplee una bomba. Se empleará anestesia cuando se vaya a canular (ya sea para la administración de la sustancia química o para tomar muestras de sangre) la vena yugular o la arteria 
femoral. Se considerará detenidamente el tipo de anestesia usado, ya que 
puede influir en la toxicocinética. Se permitirá a los animales recuperarse debidamente antes de administrarles la sustancia problema y el vehículo. 
30. Con determinadas sustancias se pueden emplear otras vías de administra ­
ción, como la cutánea o la inhalatoria (véanse los puntos 74-78), depen ­
diendo de sus propiedades fisicoquímicas y del uso o del grado de exposi ­
ción humana previsibles.
 
Mediciones  
Balance de masas  
31. El balance de masas viene determinado por la suma del porcentaje de la 
dosis (radiactiva) administrada que se excreta en la orina, las heces y el aire espirado y el porcentaje que está presente en los tejidos, el resto del cuerpo 
y los líquidos de lavado de la jaula (véase el punto 46). En general se 
considera aceptable una recuperación total de la dosis (radiactiva) adminis ­
trada > 90 %.
 
Absorción  
32. Es posible hacer una estimación inicial de la absorción excluyendo del 
balance de masas el porcentaje de la dosis presente en el aparato digestivo 
y/o en las heces. En el punto 33 se puede consultar el cálculo del porcentaje de absorción. En los puntos 44-49 se describe la investigación de las ex ­
cretas. Cuando el estudio del balance de masas no permita establecer la 
magnitud exacta de la absorción que sigue a la administración oral (por 
ejemplo, cuando se detecte en las heces más del 20 % de la dosis adminis ­
trada), pueden ser necesarias otras investigaciones. Estas pueden ser de dos tipos: 1) administración oral de la sustancia problema y medición de su 
contenido en la bilis, o 2) administración oral o i.v. de la sustancia problema 
y medición, por cada una de las dos vías, de su contenido neto en orina + aire espirado + cuerpo. En los dos tipos de diseño, la medida de la radiac ­
tividad se efectúa como un método subsidiario del análisis químico especí ­
fico de la sustancia problema y sus metabolitos. 
33. En los estudios de excreción biliar la vía de administración tradicional es la 
oral. En este tipo de estudios, se canulan los conductos biliares de al menos 4 animales del sexo seleccionado (o de ambos sexos, siempre que se justi ­
fique) y se les administra una dosis única de la sustancia problema. Después 
de la administración se supervisa la excreción de la radiactividad/sustancia problema en la bilis durante el tiempo necesario para calcular el porcentaje de la dosis administrada que se excreta por esta vía, el cual se aplica 
directamente al cálculo de la absorción oral según la fórmula siguiente: 
Porcentaje de absorciún  ¼ ðcantidad presente en bilis  þ orina þ aire espirado 
þ cuerpo salvo el contenido del aparato digestivo Þ
=cantidad administrada  Ü 100 
34. Con determinadas sustancias se produce la secreción directa por la mucosa 
intestinal de la dosis absorbida. En tales casos, la medición del porcentaje de 
dosis en heces después de la administración oral en ratas sometidas a ca ­
nulación del conducto biliar no se considera representativa de la dosis no absorbida. Se recomienda que, cuando sea previsible la secreción intestinal, 
el cálculo del porcentaje de dosis absorbida se base en una comparación de 
la dosis excretada después de las administraciones oral e i.v. (ratas con el conducto biliar intacto o canulado; véase el punto 35). Se recomienda tam ­
bién que, cuando se juzgue necesario cuantificar la secreción intestinal, se 
mida la excreción que sigue a la administración de una dosis i.v. en ratas 
con el conducto biliar canulado.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biodisponibilidad  
35. La biodisponibilidad se puede determinar por la cinética plasmática/sanguí ­
nea medida en los grupos de administración oral e i.v., según se describe en los puntos 50-52, mediante análisis químico específico de la sustancia pro ­
blema y de sus metabolitos principales, de modo que no se requiere el 
marcado radiactivo. El cálculo de la biodisponibilidad (F) de la sustancia problema o de sus metabolitos principales se puede hacer según la fórmula siguiente: 
F ¼ ðAUC
 exp=AUC  IV Þ Ü ðDosis  IV=Dosis  exp Þ 
donde AUC es el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo, y 
exp es la vía de administración experimental (oral, cutánea o inhalatoria). 
36. En la evaluación del riesgo de efectos sistémicos, en general se prefiere 
calcular la biodisponibilidad del componente tóxico antes que el porcentaje de absorción cuando se comparan las concentraciones sistémicas observadas en animales experimentales con los datos análogos de biovigilancia obteni ­
dos en estudios de exposición ocupacional. La situación puede hacerse más 
compleja si las dosis se sitúan en el intervalo de no linealidad, por lo que conviene que el cribado toxicocinético determine las dosis del intervalo lineal.
 
Distribución en los tejidos  
37. El conocimiento de la distribución en los tejidos de una sustancia y de sus 
metabolitos es importante para la identificación de los tejidos diana, la 
comprensión de los mecanismos que subyacen a la toxicidad, y la calibra ­
ción del potencial de acumulación y persistencia que tienen la sustancia y 
sus metabolitos. El porcentaje de la dosis (radiactiva) total presente en los 
tejidos y en el resto del cuerpo se medirá como mínimo al concluir el ensayo de excreción (habitualmente, hasta 7 días después de administrar la dosis, o menos dependiendo del comportamiento de la sustancia concre ­
ta). Cuando no se detecte la sustancia problema en los tejidos al concluir el 
estudio (por ejemplo, porque tenga una semivida corta y se haya eliminado antes), conviene ser precavido para no malinterpretar los datos. En estas situaciones, se investigará la distribución en los tejidos en un momento que 
coincida con el pico de concentración plasmática/sanguínea (T
 máx ) de la 
sustancia (y/o de sus metabolitos) o con la tasa máxima de excreción uri ­
naria, según convenga (véase el punto 38). Puede ser necesario, además, tomar muestras de tejido en otros momentos para determinar la distribución 
de la sustancia problema y/o sus metabolitos, para evaluar (cuando proceda) 
la dependencia del tiempo, para ayudar a establecer el balance de masas o porque así lo estipule la autoridad competente. Se tomarán muestras de los tejidos siguientes: adiposo, hígado, aparato digestivo, riñón, bazo, sangre 
completa, resto del cuerpo, órganos diana y otros tejidos (tiroides, eritroci ­
tos, órganos reproductores, piel y ojos, especialmente en animales pigmen ­
tados) que puedan revestir importancia para la evaluación toxicológica de la sustancia problema. Se contemplará el análisis de otros tejidos en los mis ­
mos tiempos de medición con el fin de maximizar el uso de los animales, 
pero también en el caso de que se observe toxicidad en un órgano diana en los estudios de toxicidad crónica o subcrónica. Se documentará además la concentración (radiactiva) residual y la relación de concentraciones en teji ­
dos/plasma (sangre). 
38. Puede ser también necesario, o requerido por la autoridad competente, el 
estudio de la distribución en los tejidos en un momento que coincida con el pico de concentración plasmática/sanguínea (T
 máx ) o con la tasa máxima de 
excreción urinaria, determinada en los correspondientes ensayos de cinética 
plasmática/sanguínea o de excreción. Tal información puede ser útil para esclarecer la toxicidad y el potencial de acumulación y persistencia de la sustancia problema y sus metabolitos. Se justificará la selección de las 
muestras de tejido; en general, las muestras para análisis deben ser idénticas 
a las ya mencionadas (véase el punto 37).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. En los estudios de distribución en los tejidos, la cuantificación de la radiac ­
tividad se puede hacer mediante disección de órganos, homogeneización, 
combustión y/o solubilización, seguidas de recuento de centelleo líquido (LSC) de los residuos retenidos. Algunas técnicas que se encuentran en distintas fases de desarrollo, como la autorradiografía cuantitativa del 
cuerpo entero y la autorradiografía microscópica de receptores, pueden ser 
útiles para medir la distribución de una sustancia problema en los órganos y los tejidos (3) (4). 
40. Cuando la vía de exposición es distinta de la oral, se deben tomar y analizar 
muestras de tejidos específicos, como son los pulmones en los estudios de 
inhalación y la piel en los estudios dermatológicos. Véanse los puntos 74 
a 78.
 
Metabolismo  
41. Se tomarán muestras de excretas (y de plasma, según proceda) para la 
identificación y la cuantificación de la sustancia problema intacta y de sus metabolitos, tal como se describe en los puntos 44-49. Se acepta la agru ­
pación de las excretas para facilitar la identificación metabólica en un grupo 
posológico dado. Se recomienda hacer un perfil de los metabolitos a inter ­
valos de tiempo determinados. Si la carencia de muestras o de radiactividad lo impide, se admite la agrupación de la orina y las heces recogidas en distintos momentos, pero nunca es aceptable la agrupación entre distintos 
sexos o grupos de dosis. Se emplearán los oportunos métodos cualitativos y 
cuantitativos para valorar la radiactividad en orina, en heces y espirada, y si procede en la bilis de los animales tratados. 
42. Se procurará por todos los medios identificar todos los metabolitos con un 
contenido igual o superior al 5 % de la dosis administrada y proporcionar un 
esquema metabólico de la sustancia problema. Deberán identificarse las sustancias problema que se hayan detectado en las excretas con un conte ­
nido igual o superior al 5 % de la dosis administrada. Por identificación se 
entiende la determinación estructural exacta de sus componentes. Habitual ­
mente, la identificación se acomete mediante co-cromatografía del metabo ­
lito y de sustancias patrón conocidas aplicando dos sistemas no afines, o mediante técnicas que permiten una identificación estructural positiva como 
son la espectrometría de masas, la resonancia magnética nuclear (RMN), etc. 
En el caso de la co-cromatografía, las técnicas cromatográficas que emplean la misma fase estacionaria con dos sistemas de solvente distintos no se consideran un método adecuado de doble verificación de la identidad del 
metabolito, puesto que no son independientes. La identificación mediante 
co-cromatografía debe hacerse con dos sistemas no afines, analíticamente independientes, como son la cromatografía en capa fina (TLC) de fase normal e inversa y la cromatografía de líquidos de alta 
resolución (HPLC). La confirmación por medios espectroscópicos no será 
necesaria, siempre que la separación cromatográfica sea de calidad acepta ­
ble. Se puede llegar también a una identificación inequívoca con métodos que proporcionan información estructural, tales como: cromatografía de lí ­
quidos/espectrometría de masas (LC-MS) o cromatografía de líquidos con 
espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), cromatografía de gases/ espectrometría de masas (GC-MS) y espectroscopia de RMN. 
43. Cuando no sea posible la identificación de los metabolitos con un contenido 
igual o superior al 5 % de la dosis administrada, se agregará una justifica ­
ción o explicación en el informe final. Para llegar a una comprensión mejor 
de la vía metabólica que permita evaluar el riesgo o factor de riesgo que supone la sustancia problema, puede ser conveniente identificar los meta ­
bolitos con un contenido inferior al 5 % de la dosis administrada. Siempre 
que sea posible se aportará la confirmación estructural. Puede incluirse el 
perfil en plasma, sangre u otros tejidos.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Excreción  
44. La tasa y la velocidad de excreción de la dosis administrada se determinará 
midiendo el porcentaje recuperado de la dosis (radiactiva) en orina, heces y aire espirado. Estos datos ayudarán, entre otras cosas, a establecer el balance 
de masas. A intervalos adecuados se determinarán las cantidades de sustan ­
cia problema (radiactividad) eliminada en orina, heces y aire espirado (véanse los puntos 47-49). Los ensayos de administración continuada deben diseñarse correctamente con el fin de recopilar datos de excreción que 
cumplan los objetivos descritos en el punto 26. Así será posible la compa ­
ración con los ensayos de dosis única. 
45. Si un estudio piloto ha demostrado (de conformidad con el punto 49) que no 
se excreta en el aire espirado una cantidad importante de la sustancia pro ­
blema (radiactividad), no será necesario tomar muestras de aire espirado en 
el estudio definitivo. 
46. Cada animal se ubicará en una unidad metabólica aparte para la recogida de 
las excretas (orina, heces y aire espirado). Al concluir cada período de recogida (véanse los puntos 47-49), las unidades metabólicas se lavan con 
el disolvente adecuado (lo que se llama "lavado de la jaula") para garantizar 
la máxima recuperación de la sustancia problema (radiactividad). La reco ­
gida de las excretas concluirá al cabo de 7 días o cuando se haya recuperado al menos el 90 % de la dosis administrada, lo que ocurra antes. 
47. La cantidad total de sustancia problema (radiactividad) en la orina se deter ­
minará como mínimo en dos momentos del día 1 de recogida, uno de ellos a 
las 24 horas de la administración, y en lo sucesivo diariamente hasta la conclusión del estudio. Se recomienda establecer más de dos momentos de muestreo en el día 1 (por ejemplo, a las 6, 12 y 24 horas). Se analizarán los 
resultados de los estudios piloto para obtener información sobre otros mo ­
mentos, complementarios o alternativos, de recogida. Se justificarán debida ­
mente los programas de recogida de muestras. 
48. La cantidad total de sustancia problema (radiactividad) en las heces se 
determinará diariamente, comenzando a las 24 horas de la administración 
y hasta la conclusión del estudio, salvo que los estudios piloto indiquen 
otros momentos, complementarios o alternativos, de recogida. Se justificará debidamente cualquier otro programa de recogida de muestras. 
49. En un experimento concreto se podrá interrumpir la recogida del CO
 2 y de 
otras sustancias volátiles en el aire espirado cuando en el mismo se detecte 
menos del 1 % de la dosis administrada durante un período de recogida de 
24 horas.  
Estudios cinéticos  
Cinética plasmática/sanguínea  
50. La finalidad de estos estudios es hacer estimaciones de los principales 
parámetros toxicocinéticos [C  máx , T máx , semivida (t  1/2 ), AUC] de la sustan ­
cia problema. Estos estudios se pueden realizar con una sola dosis o, más 
frecuentemente, con dos o más dosis. La posología dependerá de la natu ­
raleza y del objeto de la investigación. Los datos cinéticos son a veces necesarios para resolver cuestiones como la biodisponibilidad de la sustancia 
problema o evaluar el efecto de la dosis sobre el aclaramiento (por ejemplo, 
evaluar si el aclaramiento se satura de manera dependiente de la dosis). 
51. En este tipo de estudios deben emplearse como mínimo 4 animales de un 
mismo sexo por cada grupo de dosis. Se justificará la elección del sexo de los animales empleados. Se planteará usar animales de ambos sexos (4 
machos y 4 hembras) si hay indicios para sospechar variaciones importantes 
de la toxicidad en función del sexo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Tras la administración de la sustancia problema (radiomarcada), se tomarán 
muestras de sangre de cada animal en los momentos indicados y con una 
metodología de muestreo apropiada. El volumen y el número de las mues ­
tras de sangre que se pueden tomar de cada animal pueden estar limitados por los posibles efectos del muestreo reiterado sobre la salud y fisiología de 
los animales o sobre la sensibilidad del método analítico. Se analizarán las 
muestras de cada animal por separado. En algunas circunstancias (por ejem ­
plo, caracterización de los metabolitos), puede estar indicado agrupar las muestras de varios animales. Las muestras agrupadas se identificarán clara ­
mente y se justificará el motivo de agruparlas. Cuando se usan sustancias 
químicas radiomarcadas, puede estar indicado el análisis de la radiactividad total presente. En tal caso se analizará la radiactividad total en la sangre completa y en el plasma, o bien en el plasma y los eritrocitos, para poder 
calcular el cociente de distribución sangre/plasma. En otras situaciones se 
precisan estudios más específicos, que exigen la identificación del com ­
puesto parental y/o de sus metabolitos o del grado de afinidad por las proteínas.
 
Cinética en otros tejidos  
53. La finalidad de estos estudios es conocer cómo evolucionan con el tiempo 
las concentraciones de la sustancia problema en los diversos tejidos, para dar respuesta a interrogantes como el mecanismo de la acción tóxica, la bioa ­
cumulación y la biopersistencia. La selección de los tejidos y de la frecuen ­
cia de medición dependerá del aspecto concreto que se pretenda investigar y de la base de datos toxicológicos de la sustancia estudiada. Para el diseño de estos estudios cinéticos complementarios se tendrá en cuenta la información 
acumulada, tal como se describe en los puntos 37-40. En estos estudios la 
administración puede ser única o continuada. Se justificará detalladamente el método elegido. 
54. Los motivos para efectuar estudios cinéticos en otros tejidos pueden ser los 
siguientes: 
— que haya indicios de una semivida prolongada en sangre, con posible 
acumulación de la sustancia problema en varios tejidos, o 
— que interese comprobar si se ha alcanzado un estado estacionario en 
tejidos concretos (por ejemplo, en los estudios de administración conti ­
nuada, aunque se haya alcanzado un estado estacionario aparente en 
sangre, puede ser interesante determinar si se ha alcanzado ese mismo estado estacionario en los tejidos diana). 
55. En este tipo de investigación cinética, se administra una dosis oral apropiada 
de la sustancia problema como mínimo a 4 animales por cada dosis y 
tiempo de medición, y se supervisa la distribución en los tejidos seleccio ­
nados a lo largo del tiempo. Se puede usar un solo sexo de animales, salvo que haya indicios de toxicidad asociada al sexo. Se analizará la radiactividad total o bien el compuesto parental y/o sus metabolitos, dependiendo del 
aspecto que se pretenda investigar. La distribución en los tejidos se evaluará 
con las técnicas apropiadas.
 
Inducción e inhibición enzimáticas  
56. El estudio de los posibles efectos de inducción o inhibición enzimáticas o de 
la biotransformación de la sustancia problema puede ser necesario en alguna 
de las siguientes situaciones: 
1) hay indicios de una relación entre la biotransformación de la sustancia 
problema y el aumento de la toxicidad; 
2) los datos de toxicidad disponibles indican una relación no lineal entre la 
dosis y el metabolismo;  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3) los resultados de los estudios de identificación de metabolitos apuntan a 
la formación de un metabolito potencialmente tóxico por una vía meta ­
bólica inducida por la sustancia problema; 
4) para hallar explicación a efectos hipotéticamente vinculados a fenómenos 
de inducción enzimática; 
5) si se observan alteraciones toxicológicamente significativas en el perfil 
metabólico de la sustancia problema, ya sea en ensayos  in vitro  o in vivo  
realizados con diferentes especies o condiciones experimentales, puede 
estar indicada la caracterización de las enzimas que intervienen (por 
ejemplo, enzimas de fase I como las isoenzimas del sistema de la mo ­
nooxigenasa dependiente del citocromo P450, enzimas de fase II como el sistema enzimático de la sulfotransferasa o de la uridina-difosfato-glucu ­
ronosiltransferasa, u otras). Tal información podría ser de ayuda para 
evaluar la pertinencia de las extrapolaciones entre especies. 
57. Deben emplearse protocolos experimentales adecuados para evaluar las al ­
teraciones toxicocinéticas relacionadas con la sustancia problema, debida ­
mente validados y justificados. Ejemplos de tales protocolos serían la ad ­
ministración continuada de una sustancia problema sin marcar, seguida de 
una dosis radiomarcada el día 14, o la administración continuada de una sustancia radiomarcada con muestreos los días 1, 7 y 14 para determinar los 
perfiles metabólicos. La administración continuada de una sustancia radio ­
marcada también puede aportar datos sobre su bioacumulación (véase el punto 26).
 
OTROS PLANTEAMIENTOS 
58. Otros planteamientos complementarios de los estudios  in vivo  que se des ­
criben en el presente método de ensayo pueden proporcionar informaciones útiles sobre la absorción, distribución, metabolismo o eliminación de una sustancia problema en ciertas especies.
 
Uso de la información  in vitro  
59. Algunos aspectos del metabolismo de la sustancia problema se pueden 
investigar en ensayos  in vitro  con la metodología adecuada. Para el estudio 
de los posibles metabolitos se pueden emplear aislados o cultivos recientes 
de hepatocitos y fracciones subcelulares (por ejemplo, microsomas y citosol o fracción S9) de hígado. El metabolismo local del órgano diana, como el pulmón, puede ser de interés para la evaluación del riesgo. A este efecto 
resultan útiles las fracciones microsomales de los tejidos diana. Las inves ­
tigaciones con microsomas pueden ayudar a entender las posibles diferencias en función del sexo y de la edad y a caracterizar los parámetros enzimáticos (K
 m y V  máx ) de interés para evaluar la dependencia del metabolismo en 
función de la dosis o los niveles de exposición. Además, las investigaciones 
con microsomas pueden ayudar a identificar las enzimas microsomales es ­
pecíficas que intervienen en el metabolismo de la sustancia problema, lo que tendría relevancia de cara a la extrapolación entre especies (véase también el 
punto 56). La capacidad de inducir biotransformación se puede investigar 
también en fracciones subcelulares de hígado (por ejemplo, microsomas y citosol) de animales previamente tratados con la sustancia de interés,  in vitro  
en estudios de inducción de hepatocitos o a partir de líneas celulares espe ­
cíficas que expresen las enzimas relevantes. En circunstancias especiales y 
en las condiciones adecuadas, se podría contemplar el uso de fracciones subcelulares de tejidos humanos para investigar las posibles diferencias de biotransformación entre distintas especies. Los resultados de las investiga ­
ciones  in vitro  pueden ser útiles para el desarrollo de modelos toxicociné ­
ticos basados en la fisiología (PBTK) (5).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Los estudios de absorción dérmica  in vitro  pueden proporcionar una infor ­
mación suplementaria para caracterizar la absorción (6). 
61. Es posible usar cultivos celulares primarios de hepatocitos y extensiones de 
tejido fresco para hacer investigaciones similares a las realizadas con mi ­
crosomas hepáticos. En ciertos casos es posible resolver cuestiones concre ­
tas empleando líneas celulares con una expresión definida de la enzima relevante o producidas mediante ingeniería genética. En otros casos resultará útil el estudio  in vitro  de la inhibición y la inducción de las isoenzimas del 
citocromo P450 (CYP1A1, 2E1, 1A2, y otras) y/o de las enzimas de fase II 
provocada por el compuesto parental. La información obtenida puede ser aplicable a otros compuestos estructuralmente afines.
 
Uso de los datos toxicocinéticos de los estudios de toxicidad como in ­
formación complementaria  
62. El análisis de las muestras de sangre, tejidos o excretas obtenidas en el 
transcurso de cualesquiera otros estudios de toxicidad pueden proporcionar datos sobre la biodisponibilidad, la variación de las concentraciones plas ­
máticas con el tiempo (AUC, C
 máx ), la capacidad de bioacumulación, la 
velocidad de eliminación y los cambios metabólicos y cinéticos dependien ­
tes de la edad y del sexo. 
63. Se puede enfocar el diseño del estudio para intentar dar respuesta a cues ­
tiones relacionadas con los niveles de dosis más elevadas, como son: la saturación de las vías de absorción, biotransformación o excreción; la inter ­
vención de nuevas vías metabólicas, y la limitación de los metabolitos 
tóxicos. 
64. La evaluación de los factores de riesgo puede hacerse extensiva a cuestiones 
como: 
— el cambio de la sensibilidad con la edad, debido a variaciones en el 
estado de la barrera hematoencefálica, la función renal o la capacidad 
destoxificadora del hígado, 
— el cambio de la sensibilidad con las subpoblaciones, debido a diferencias 
en la capacidad de biotransformación o a otras variaciones toxicocinéti ­
cas, 
— el grado de exposición del feto, por el paso de las sustancias a través de 
la placenta, o del recién nacido por transmisión con la leche materna.
 
Aplicación de los modelos toxicocinéticos  
65. Los modelos toxicocinéticos son aplicables a diversos aspectos de la eva ­
luación del riesgo y de los factores de riesgo, como cuando se trata de 
prever la exposición sistémica y la concentración alcanzada en los tejidos internos. Permiten valorar también aspectos concretos del modo de acción y constituyen una base para la extrapolación entre especies y el esclareci ­
miento de las vías de exposición, las pautas de administración y la evalua ­
ción del riesgo humano. En el desarrollo de modelos PBTK para una sus ­
tancia problema y una especie determinadas son de ayuda los siguientes datos: 1) coeficientes de reparto; 2) constantes bioquímicas y parámetros 
fisiológicos; 3) parámetros específicos de la vía de absorción, y 4) datos 
cinéticos  in vivo  para la evaluación del modelo [por ejemplo, valores de 
aclaramiento en las vías de excreción principales (> 10 %), K
 m y V  máx para 
valorar el metabolismo]. Los datos experimentales que se tomen para el 
desarrollo del modelo han de basarse en métodos científicamente reconoci ­
dos, y los resultados del modelo deben ser validados. A menudo se deter ­
minan los parámetros específicos de la sustancia problema y de la especie, como la velocidad de absorción, el coeficiente de reparto entre sangre y 
tejidos y las constantes metabólicas, para facilitar el desarrollo de modelos 
no compartimentales o basados en la fisiología (7).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
DATOS E INFORME 
66. Es recomendable que el informe del estudio vaya acompañado de un índice.  
Cuerpo principal del informe  
67. El cuerpo principal del informe debe contener la información que se recoge 
en este método de ensayo, organizada en secciones y puntos de la manera 
siguiente:  
Resumen  
68. Esta sección del informe debe contener un resumen del diseño del estudio y 
una descripción de los métodos empleados. Debe destacar así mismo los principales resultados referentes al balance de masas, la naturaleza y mag ­
nitud de los metabolitos, los residuos en tejidos, la velocidad de eliminación, 
la capacidad de bioacumulación, las diferencias en función del sexo, etc. El resumen se presentará con el detalle suficiente para permitir la evaluación de los resultados.
 
Introducción  
69. Esta sección del informe debe contener los objetivos del estudio, su justi ­
ficación y diseño, así como cualquier información histórica o de referencia pertinente.
 
Material y métodos  
70. En esta sección se hará una descripción pormenorizada de toda la informa ­
ción pertinente. 
a) Sustancia problema 
Esta subsección debe facilitar la identificación de la sustancia problema: 
denominación química, estructura molecular, determinación cualitativa y cuantitativa de la composición química, pureza y, siempre que sea posi ­
ble, tipo de impurezas y sus cantidades. Debe contener además informa ­
ción sobre propiedades fisicoquímicas tales como el estado físico, color, solubilidad macroscópica o coeficiente de partición, estabilidad y, en su caso, corrosividad. Cuando proceda, se facilitará información acerca de 
los isómeros. Si se trata de una sustancia radiomarcada, esta subsección 
debe contener además los siguientes datos: tipo de radionucleido, posi ­
ción del marcador, actividad específica y pureza radioquímica. 
Se indicará el tipo o la descripción de cualesquiera vehículo, diluyentes, 
agentes de suspensión, emulsionantes y demás productos empleados para la administración de la sustancia problema. 
b) Animales de ensayo 
Esta subsección debe contener la información referente a los animales de 
ensayo, como la selección y justificación de la especie, cepa y edad al 
principio del estudio, el sexo y el peso corporal, el estado de salud y la 
zootecnia. 
c) Métodos 
Esta subsección debe contener los pormenores del diseño del estudio y la 
metodología empleada. Debe incluir una descripción de: 
1) la justificación de cualquier cambio de la vía o de las condiciones de 
exposición, cuando proceda;
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2) la justificación para seleccionar los niveles o concentraciones de las 
dosis; 
3) una descripción de los estudios piloto utilizados en el diseño expe ­
rimental de los estudios de seguimiento, cuando proceda; se presen ­
tarán los datos que respalden el estudio piloto; 
4) se describirá la forma de preparar la disolución de la dosis y, en su 
caso, el tipo de disolvente o vehículo; 
5) el número de lotes o grupos de tratamiento y el número de animales 
por grupo; 
6) las concentraciones y el volumen de las dosis (y la actividad espe ­
cífica de la dosis cuando sea radiactiva); 
7) la(s) vía(s) y los métodos de administración; 8) la frecuencia de administración; 9) el período de ayuno (en su caso); 
10) la radiactividad total por animal; 
11) la manipulación de los animales; 12) la recogida y el tratamiento de las muestras; 13) los métodos analíticos aplicados a la separación, cuantificación e 
identificación de los metabolitos; 
14) el límite de detección de los métodos empleados; 15) otros procedimientos y medidas experimentales empleados (entre 
ellos, la validación de los métodos de análisis de los metabolitos). 
d) Análisis estadístico 
Si se hace un análisis estadístico de los resultados, el informe debe 
recoger información suficiente sobre el método y el programa informá ­
tico empleados, de manera que un revisor o estadístico independiente pueda reevaluar y reconstruir el análisis. 
En el caso de estudios de modelización de sistemas como el PBTK, la 
presentación de los modelos debe comprender una descripción de los 
mismos que permita su reconstrucción y validación independientes 
(véanse el punto 65 y la definiciones del apéndice):
 
Resultados  
71. En esta sección se deben presentar todos los datos de manera descriptiva en 
el texto, así como resumidos y tabulados con la pertinente evaluación esta ­
dística. Los datos de recuento radiactivo deben resumirse y expresarse de forma adecuada a la naturaleza del estudio, habitualmente en microgramos o miligramos equivalentes por masa de muestra, aunque pueden usarse otras 
unidades. Esta sección debe contener ilustraciones gráficas de los resultados, 
una reproducción de los datos cromatográficos y espectrométricos represen ­
tativos, la identificación y cuantificación de los metabolitos y las rutas 
metabólicas propuestas, acompañadas de la estructura molecular de los me ­
tabolitos. Debe contener además, cuando proceda, la siguiente información: 
1) Recuperación absoluta y relativa de la radiactividad en orina, heces, aire 
espirado y líquidos de lavado (de orina y heces) de la jaula. 
— En los estudios dermatológicos, se incluirán también los datos de 
recuperación de la sustancia problema en la piel tratada y los lavados epidérmicos; y radiactividad residual en el dispositivo de cobertura de la piel y en la unidad metabólica, así como en los líquidos analizados 
del lavado epidérmico. Se ofrecen más observaciones en los puntos 
74 a 77.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— En los estudios de inhalación se incluirán también los datos de re ­
cuperación de la sustancia problema en los pulmones y tejidos nasa ­
les (8). Se ofrecen más observaciones en el punto 78. 
2) Distribución en los tejidos, expresada en porcentaje de la dosis adminis ­
trada y en concentración (microgramos equivalentes por gramo de teji ­
do), y coeficiente de reparto tejidos-sangre o tejidos-plasma. 
3) Se calculará el balance de masas en todos los estudios en que se valoren 
los tejidos corporales y las excretas. 
4) Concentraciones plasmáticas y parámetros toxicocinéticos (biodisponibi ­
lidad, AUC, C  máx , T máx , eliminación, semivida) medidos después de la 
administración por la vía o vías de exposición principales. 
5) Velocidad y porcentaje de absorción de la sustancia problema después de 
su administración por la vía o vías de exposición principales. 
6) Cantidades de la sustancia problema y de sus metabolitos (expresadas en 
porcentaje de la dosis administrada) que se recuperan en las excretas. 
7) Referencias a los datos del apéndice que reflejan los resultados indivi ­
duales de cada animal en todos los parámetros (dosis administrada, por ­
centaje de recuperación, concentraciones, parámetros toxicocinéticos, etc.). 
8) representación gráfica de las rutas metabólicas propuestas y las estructu ­
ras moleculares de los metabolitos.
 
Discusión y conclusiones  
72. En esta sección el autor o autores deben: 
1) proponer una ruta metabólica hipotética basada en los resultados de 
metabolismo y eliminación de la sustancia problema; 
2) comentar cualquier posible diferencia de eliminación y/o biotransforma ­
ción de la sustancia problema en función de la especie y del sexo; 
3) tabular y comentar la identificación y la cuantificación de los metaboli ­
tos, velocidades de eliminación, capacidad de bioacumulación y nivel 
residual en los tejidos del compuesto parental o de sus metabolitos y, 
en su caso, las posibles variaciones toxicocinéticas dependientes de la dosis; 
4) incorporar a esta sección cualesquiera datos toxicocinéticos de interés 
que se hayan obtenido en el transcurso de los estudios de toxicidad; 
5) presentar una conclusión concisa que esté respaldada por los resultados 
del estudio; 
6) añadir las secciones que se juzguen necesarias o pertinentes. 
73. Se pueden añadir secciones para adjuntar referencias bibliográficas, tablas, 
figuras, apéndices, etc.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
VÍAS DE EXPOSICIÓN ALTERNATIVAS  
Cutánea  
Tratamiento cutáneo  
74. En esta sección se recoge información específicamente relacionada con la 
investigación toxicocinética de la sustancia problema por vía cutánea. La 
absorción cutánea se describe en el capítulo B.44 de este anexo [Absorción cutánea: método  in vivo  (9)]. Para otros parámetros como los relacionados 
con la distribución y el metabolismo puede aplicarse este método de ensayo 
B.36. En el tratamiento cutáneo se aplican una o más concentraciones de la 
sustancia problema. La sustancia problema (material puro, diluido o formu ­
lado que contiene la sustancia problema y que se aplica a la piel) debe ser la misma (o un análogo realista) que aquella a la que pudiera verse expuesto el 
hombre u otra posible especie diana. Las dosis deben seleccionarse de 
conformidad con los puntos 20-26 de este método de ensayo. En la selec ­
ción de la dosis cutánea se tendrán en cuenta factores como la exposición humana previsible y las concentraciones a las que se haya observado toxi ­
cidad en otros estudios de toxicidad cutánea. La dosis cutánea se disolverá, 
si es preciso, en un vehículo adecuado y se aplicará en el volumen necesario para liberar la dosis prevista. Antes de proceder a la aplicación, se recorta el pelo de la región dorsal del tronco de los animales. Se puede recurrir al 
rasurado, pero, en este caso, debe efectuarse unas 24 horas antes del ensayo. 
En ambos casos hay que cuidar de no lesionar la piel, lo que podría alterar su permeabilidad. Deberá dejarse despejada, para la aplicación de la sustan ­
cia problema, una superficie equivalente aproximadamente al 10 % de la 
corporal. Cuando se trata de sustancias muy tóxicas, la superficie despejada 
puede ser inferior al 10 %, pero deberá cubrirse en todo lo posible con una capa delgada y uniforme del producto. En todos los grupos de tratamiento cutáneo se tratará una superficie de piel de la misma extensión. Las zonas 
tratadas se protegerán con un apósito bien sujeto. Los animales se enjaularán 
por separado. 
75. Debe hacerse un estudio de lavado epidérmico para evaluar la fracción de la 
dosis de sustancia química aplicada que se puede eliminar de la piel lavando 
la zona tratada con agua y un jabón suave. Este estudio puede servir tam ­
bién para establecer el balance de masas cuando la sustancia problema se administra por vía cutánea. En el estudio de lavado epidérmico se aplica una 
dosis única de la sustancia problema a dos animales. La selección de la 
dosis se hará de conformidad con el punto 23 de este método de ensayo (véase también el tiempo de contacto epidérmico en el punto 76). Se deter ­
minan las cantidades de la sustancia problema que se recuperan en los 
líquidos de lavado, a fin de evaluar la eficacia con que dicho lavado elimina 
la sustancia de la piel. 
76. Salvo que sea corrosiva, la sustancia problema se aplica y mantiene sobre la 
piel durante un tiempo mínimo de 6 horas. En el momento de retirar el 
apósito, la zona tratada se lava siguiendo el procedimiento descrito en el 
estudio de lavado epidérmico (véase el punto 75). Se analizará el contenido de sustancia residual en el apósito y en los líquidos de lavado. Al concluir la investigación, se sacrificará cada animal de manera compasiva, de confor ­
midad con (2), y se le retirará la piel tratada. Se prepara debidamente un 
corte de piel tratada para analizarlo y valorar la sustancia (radiactividad) residual. 
77. En la evaluación toxicocinética de los productos farmacéuticos puede ser 
necesario aplicar diversos procedimientos, de conformidad con el marco 
regulador apropiado.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalación  
78. Se emplea una concentración única (o más, si es necesario) de la sustancia 
problema. Las concentraciones deben seleccionarse de conformidad con los puntos 20-26 de este método de ensayo. Los tratamientos de inhalación 
deben hacerse con un equipo inhalador de "cono nasal" o de "solo la 
cabeza" para evitar la absorción por otras vías (8). Si las condiciones de exposición son otras, habrá que justificar y documentar los cambios. Se definirá el tiempo de inhalación; es habitual una exposición de 4-6 horas.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Ma ­
nufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris. 
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N
 o 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris. 
(3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81. 
(4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40. 
(5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt 
W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically 
based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411. 
(6) Capítulo B.45 del presente anexo. Absorción cutánea: método  in vitro . 
(7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organiza ­
tion, International Programme on Chemical Safety. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris. 
(9) Capítulo B.44 del presente anexo. Absorción cutánea: método  in vivo . 
(10) Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. 
(11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Apéndice  
DEFINICIONES  
Absorción : conjunto de procesos por los que una sustancia pasa a los tejidos 
orgánicos. El término se refiere a la absorción del compuesto parental y de todos 
sus metabolitos. No debe confundirse con la "biodisponibilidad".  
Absorción oral : porcentaje de la dosis de sustancia que es absorbido en el lugar 
de administración (es decir, el aparato digestivo). Este importante parámetro sirve 
para conocer la fracción de la sustancia química administrada que llega a la vena porta y, posteriormente, al hígado.  
Acumulación : (bioacumulación)aumento del contenido de una sustancia en los 
tejidos a lo largo del tiempo (generalmente en el tejido adiposo y por adminis ­
tración continuada); si la velocidad a la que penetra una sustancia en el orga ­
nismo es superior a la velocidad con que se elimina, la sustancia se acumula en 
el organismo y puede alcanzar concentraciones tóxicas.  
ADME : siglas de "Absorción, Distribución, Metabolismo y Excreción".  
AUC : (área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo): área bajo la curva 
que resulta de representar la concentración plasmática de una sustancia problema en función del tiempo. Representa la cantidad total de la sustancia problema que 
ha absorbido el organismo en un período establecido. En condiciones de linea ­
lidad, el AUC (desde el tiempo cero al infinito) es proporcional a la cantidad total de la sustancia problema que absorbe el organismo, independientemente de cuál sea la velocidad de absorción.  
Autorradiografía : (autorradiografía de cuerpo entero): empleada para determinar 
cualitativa o cuantitativamente la localización de una sustancia química radiactiva en los tejidos, esta técnica se vale de las imágenes de rayos X o, más reciente ­
mente, de la fluoroscopia digital para visualizar moléculas (o fragmentos de 
moléculas) marcadas radiactivamente registrando la radiación emitida en la vís ­
cera o tejido que se desea estudiar. Comparada con la disección de órganos, la 
autorradiografía cuantitativa de cuerpo entero puede aportar ciertas ventajas para 
valorar la distribución de la sustancia problema, la recuperación total y la reso ­
lución del material radiactivo en los tejidos. Otra ventaja importante es que se puede aplicar a un modelo animal pigmentado para valorar la posible asociación 
de la sustancia problema con la melanina, capaz de unirse a ciertas moléculas. 
No obstante, y aunque puede facilitar una interesante visión global de los sitios de unión de alta capacidad y baja afinidad, esta técnica tendría limitaciones para reconocer regiones diana específicas, como los sitios de unión a receptores, para 
cuya detección se precisa una resolución relativamente alta y una elevada sensi ­
bilidad. Cuando se usa la autorradiografía deben realizarse, en un grupo aparte o en un estudio separado del ensayo de distribución en los tejidos, investigaciones para determinar el balance de masas del compuesto administrado, en las que 
todas las excretas (con la posible inclusión del aire espirado) y los restos del 
cuerpo de los animales sean homogeneizados y analizados con contador de centelleo líquido.  
Autorradiografía microscópica de receptores : (o microautorradiografía): téc ­
nica que puede servir para comprobar la interacción de una sustancia xenobiótica con poblaciones celulares o sitios específicos de los tejidos, como en el caso de las investigaciones de la unión a los receptores o de los mecanismos de acción 
específicos, donde se precisan una resolución y una sensibilidad elevadas que no 
se consiguen con otras técnicas como la autorradiografía de cuerpo entero.  
Balance de masas : expresa la cantidad de sustancia que entra y sale del sistema.  
Balance de materia : véase "balance de masas".
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Bioacumulación : véase "Acumulación".  
Biodisponibilidad : fracción de la dosis administrada que pasa a la circulación 
sistémica o está disponible en los tejidos para ejercer su actividad fisiológica. 
Frecuentemente, la biodisponibilidad de una sustancia se refiere al compuesto parental, pero también puede referirse a su metabolito. Tiene en cuenta solamente una forma química.  Nota bene:  no confundir biodisponibilidad con absorción. 
Así, la diferencia entre la absorción oral (contenido de la sustancia en la mucosa 
intestinal y en la circulación portal) y la biodisponibilidad (contenido en la sangre circulante y en los tejidos) puede deberse, entre otros factores, a: 1) la degrada ­
ción química efectuada por digestión en la mucosa intestinal, 2) la circulación 
enterohepática que devuelve parte de la sustancia a la luz intestinal, o 3) el 
metabolismo hepático de primer paso (10). La biodisponibilidad del componente tóxico (compuesto parental o metabolito) es un parámetro esencial en la evalua ­
ción del riesgo humano (extrapolación entre dosis altas y bajas, o entre distintas 
vías), ya que permite obtener un valor interno partiendo de los valores de 
NOAEL o BMD (dosis administrada), que son externos. Para evaluar los efectos hepáticos que siguen a una administración oral, basta con conocer la absorción 
oral. En cambio, cuando se estudian los efectos en lugares distintos de la vía de 
entrada, la biodisponibilidad es en general un parámetro más fiable que la ab ­
sorción para evaluar el riesgo.  
Biopersistencia : véase "persistencia".  
Biotransformación : conversión química (generalmente enzimática) de la sustan ­
cia de interés en un producto diferente, que tiene lugar en el organismo. Es 
sinónimo de "metabolismo".  
C
 máx : concentración máxima (pico) en sangre (plasma o suero), o bien excreción 
máxima (pico) en orina y heces, que se produce después de la administración.  
Coeficiente de reparto : también llamado coeficiente de distribución, es una 
medida de la solubilidad diferencial de una sustancia en dos solventes.  
Compartimento : parte (o unidad) estructural o bioquímica de un organismo, 
tejido o célula que puede diferenciarse del resto.  
Concentración máxima (pico) en sangre (plasma o suero) : máxima concen ­
tración (o pico) que se alcanza en la sangre (plasma o suero) después de admi ­
nistrar una sustancia (véase también "C  máx "). 
Concentraciones sanguíneas (plasmáticas) en estado estacionario : estado de 
no equilibrio de un sistema abierto, en el que todas las fuerzas que actúan sobre él están exactamente contrarrestadas por fuerzas opuestas de manera tal que todos 
sus componentes se hallan en concentración estacionaria pese a que fluye materia 
a través del sistema.  
Correlación o "read across" : método por el cual se toman los datos conocidos 
de una variable en respuesta a una o varias sustancias para predecir el compor ­
tamiento de esa variable en respuesta a la sustancia problema.  
Distribución : dispersión de una sustancia problema y de sus metabolitos por 
todo el organismo.  
Distribución en los tejidos : movimiento reversible de una sustancia problema 
por los distintos tejidos orgánicos. La distribución en los tejidos se puede estudiar 
mediante disección de órganos, homogeneización, combustión y recuento de 
centelleo líquido, o mediante autorradiografía cualitativa y cuantitativa del cuerpo entero. El primer método resulta válido para obtener la concentración y el por ­
centaje de recuperación en los tejidos y en el resto del cuerpo de un mismo 
animal, pero puede no alcanzar resolución adecuada en todos los tejidos y puede arrojar una recuperación total inferior a de lo deseable (< 90 %). Consúltense más arriba las definiciones del segundo método.  
Enzimas/isoenzimas : proteínas que catalizan las reacciones bioquímicas. Las 
isoenzimas son enzimas que catalizan reacciones bioquímicas semejantes, pero 
que presentan secuencias de aminoácidos diferentes.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Excreción biliar : excreción que tiene lugar a través de los conductos biliares.  
Excreción : conjunto de procesos por los que una sustancia administrada y/o sus 
metabolitos son eliminados del organismo.  
Exógeno : generado o introducido desde fuera del organismo o sistema orgánico.  
Extrapolación : método por el que se infiere uno o más valores desconocidos a 
partir de otros conocidos u observados.  
Inducción enzimática : síntesis enzimática que se produce como respuesta a un 
estímulo ambiental o una molécula inductora.  
Linealidad/cinética lineal : un proceso tiene una cinética lineal cuando todos los 
intercambios entre compartimentos se producen a una velocidad proporcional a la 
concentración o cantidad presente; es una cinética de primer orden. En conse ­
cuencia, los volúmenes de eliminación y distribución son constantes, al igual que 
la semivida. Las concentraciones alcanzadas son proporcionales al nivel de dosis 
(exposición) y la acumulación es más facil de predecir. La existencia o no de linealidad se puede determinar comparando los parámetros oportunos, como el AUC, después de administrar dosis diferentes o después de exposiciones únicas y 
repetidas. La falta de dependencia de la dosis puede indicar saturación de las 
enzimas que intervienen en el metabolismo del compuesto; un aumento del AUC después de la exposición continuada en comparación con la exposición única puede indicar inhibición del metabolismo; y una disminución del AUC puede 
indicar, a su vez, inducción del metabolismo [véase también (11)].  
Mecanismo (modo) de toxicidad/mecanismo (modo) de acción : por mecanismo 
de acción se entienden las interacciones bioquímicas específicas por las que una 
sustancia química produce su efecto. Por modo de acción se entienden las prin ­
cipales rutas o vías más generales por las que una sustancia llega a producir su efecto (o toxicidad).  
Metabolismo : es sinónimo de "biotransformación".  
Metabolitos : productos del metabolismo o de los procesos metabólicos.  
Modelización de sistemas  (toxicocinética basado en la fisiología, basada en la 
farmacocinética, farmacocinética basada en la fisiología, basada en la biología, 
etc.): modelo abstracto que aplica el lenguaje matemático para describir el com ­
portamiento de un sistema.  
Parámetros enzimáticos : K
 m (constante de Michaelis) y V  máx (velocidad máxi ­
ma). 
Persistencia (biopersistencia) : presencia prolongada de una sustancia en un 
sistema biológico debido a que resiste la degradación/eliminación.  
Saturación : estado en virtud del cual uno o varios procesos cinéticos (absorción, 
metabolismo o eliminación) se encuentran en su límite máximo, es decir, satu ­
rados.  
Semivida (t  1/2 ): tiempo necesario para que la concentración de una sustancia se 
reduzca a la mitad en un compartimento dado. Normalmente se refiere a la concentración plasmática o a la cantidad de sustancia en todo el organismo.  
Sensibilidad : capacidad de un método o instrumento para reflejar pequeñas 
diferencias en el grado de respuesta de una variable de interés.  
Sustancia problema : cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este mé ­
todo de ensayo.  
Tejido diana : tejido en el que se manifiesta el efecto adverso principal de un 
agente tóxico.  
T
 máx : tiempo que se tarda en alcanzar la C  máx . ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Toxicocinética  (farmacocinética): estudio de los procesos de absorción, distribu ­
ción, metabolismo y excreción de las sustancias a lo largo del tiempo.  
Validación de los modelos : proceso por el cual se evalúa la adecuación de un 
modelo para describir de manera coherente los datos toxicocinéticos disponibles. 
Los modelos se pueden evaluar mediante comparación visual y estadística de las predicciones del modelo con los valores experimentales obtenidos para una va ­
riable independiente común (por ejemplo, el tiempo). Se ha de justificar la 
magnitud de la evaluación en relación con el uso que se pretende dar al modelo.  
Velocidad (o tasa) de aclaramiento : es una medida cuantitativa de la cantidad 
de una sustancia problema que se elimina de la sangre, el plasma o un determi ­
nado tejido por unidad de tiempo.  
Vía de administración  (oral, i.v., cutánea, inhalatoria, etc.): medio por el cual se 
administran las sustancias químicas al organismo (por ejemplo, por vía oral con 
los alimentos o mediante sonda gástrica, por inyección intravenosa, por vía 
cutánea a través de la piel, por inhalación con el aire aspirado, etc.).  
Vías de destoxificación : conjunto de procesos que llevan a la eliminación de las 
sustancias tóxicas del organismo, ya sea por degradación metabólica o por ex ­
creción.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  NEUROTOXICIDAD RETARDADA DE SUSTANCIAS 
ORGANOFOSFORADAS POR ADMINISTRACIÓN ÚNICA  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
En la evaluación de los efectos tóxicos de las sustancias, es impor ­
tante considerar el potencial de ciertas clases de sustancias para causar tipos específicos de neurotoxicidad que pueden no detectarse con otros estudios de toxicidad. Se ha visto que ciertas sustancias 
organofosforadas producen neurotoxicidad retardada, por lo que debe 
considerarse su evaluación. 
Pueden emplearse ensayos de cribado  in vitro  para detectar las sus ­
tancias capaces de producir polineuropatía retardada; sin embargo, 
unos resultados negativos en los estudios  in vitro  no excluyen que la 
sustancia estudiada sea neurotóxica. 
Véase la Introducción general, Parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Sustancias organofosforadas:  ésteres organofosforados sin carga, 
tioésteres o anhídridos de ácidos organofosfóricos, organofosfónicos u organofosforamídicos, o de ácidos fosforotioicos, fosfono-tioicos o 
fosforotioamídicos afines, u otras sustancias que puedan producir la 
neurotoxicidad retardada que a veces se aprecia en esta clase se sustancias.  
Neurotoxicidad retardada:  síndrome asociado con la aparición retar ­
dada y prolongada de ataxia, axonopatías distales en la médula es ­
pinal y en los nervios periféricos, e inhibición y envejecimiento de la esterasa diana de la neuropatía (NTE) en el tejido nervioso.
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Puede someterse a ensayo una sustancia de referencia con un lote de 
control positivo como medio para demostrar que, en las condiciones 
de ensayo del laboratorio, no cambia significativamente la respuesta de las especies utilizadas. 
Como ejemplo de neurotóxico de amplia utilización está el folfato de 
tri-o-tolilo [n
 o CAS 78-30-8, n  o EINECS 201-103-5, denominación 
CAS: tris(2-metilfenil) éster del ácido fosfórico], conocido también 
como tri-o-cresilfosfato.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se da una sola dosis oral de la sustancia estudiada a gallinas domés ­
ticas, protegidas de los efectos colinérgicos agudos, cuando conven ­
ga. Se observa durante 21 días la aparición en los animales de 
anomalías de comportamiento, ataxia y parálisis. Se realizan medidas 
bioquímicas, especialmente la inhibición de la esterasa diana de la neuropatía (NTE), en gallinas seleccionadas aleatoriamente de cada lote, normalmente a las 24 y 48 horas de la administración. A los 21 
días de la exposición, se sacrifican las gallinas restantes y se procede 
al examen histopatológico de tejidos nerviosos seleccionados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.5.1.  Preparación  
Se seleccionan al azar gallinas jóvenes sanas, libres de enfermedades 
víricas que puedan interferir y sin tratamiento médico, que no pre ­
senten anomalías de la marcha, se asignan a los lotes de tratamiento 
y de control y se aclimatan a las condiciones del laboratorio durante un mínimo de 5 días antes del inicio del estudio. 
Deben utilizarse jaulas o recintos de la capacidad suficiente para 
permitir la libre movilidad de las gallinas y la fácil observación de 
su marcha. 
La sustancia estudiada se administrará normalmente por vía oral, 
utilizando sondas gástricas, cápsulas de gelatina o un método similar. 
Los líquidos pueden administrarse sin diluir o disueltos en un vehí ­
culo apropiado, como el aceite de maíz; los sólidos deben disolverse siempre que sea posible, ya que las grandes dosis de productos sólidos en cápsulas de gelatina pueden no absorberse de forma efi ­
caz. Respecto a los vehículos no acuosos, deben conocerse sus ca ­
racterísticas tóxicas; en caso de no conocerse, se determinarán antes de la prueba.
 
1.5.2.  Condiciones del ensayo  
1.5.2.1.  Animales de experimentación  
Se recomienda la gallina ponedora doméstica adulta  (Gallus gallus 
domesticus),  de una edad comprendida entre 8 y 12 meses. Deben 
emplearse razas y variedades de tamaño normal y las gallinas se habrán criado normalmente en condiciones que permitan su movili ­
dad libre.
 
1.5.2.2.  Número y sexo  
Además del lote de tratamiento, se utilizarán tanto un lote de control 
del vehículo como un lote de control positivo. El lote de control del vehículo debe tratarse de la misma forma que el lote de tratamiento, 
salvo que se omitirá la administración de la sustancia estudiada. 
En cada lote de aves debe utilizarse un número suficiente de gallinas 
de forma que puedan matarse al menos 6 aves para hacer las deter ­
minaciones bioquímicas (3 en cada uno de los dos momentos selec ­
cionados) y otras 6 puedan sobrevivir durante el período de 21 días 
de observación de las patologías. 
El lote de control positivo puede estudiarse a la vez o bien ser un 
lote de control estudiado recientemente. Debe incluir al menos 6 gallinas, tratadas con un neurotóxico conocido de efecto retardado, 
de las que 3 se destinarán a las pruebas bioquímicas y otras 3 a la 
observación de la patología. Se recomienda la actualización periódica de los datos de los antecedentes. Deben obtenerse nuevos datos de lotes de control positivo cuando el laboratorio que realice las pruebas 
haya cambiado algún elemento fundamental de estas (por ejemplo, 
raza, alimentación, condiciones de alojamiento).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Dosis  
Debe realizarse un estudio preliminar con un número adecuado de 
gallinas y lotes de distintas dosis, a fin de determinar la dosis que debe utilizarse en el estudio principal. En el estudio preliminar es 
necesario que se produzca letalidad, a fin de definir una dosis ade ­
cuada para el estudio principal. No obstante, para evitar la muerte debida a los efectos colinérgicos agudos, puede utilizarse atropina u otro agente protector que no interfiera con las respuestas neurotóxi ­
cas retardadas. Pueden utilizarse diversos métodos de ensayo para 
evaluar la dosis máxima no letal de las sustancias estudiadas (véase el método B.1  bis). También puede ayudar a seleccionar la dosis la 
consideración de datos de antecedentes de las gallinas u otra infor ­
mación toxicológica. 
La dosis de la sustancia en el estudio principal debe ser lo más 
elevada posible, teniendo en cuenta los resultados del estudio preli ­
minar de selección de la dosis y el límite superior a 2 000 mg/kg de peso corporal. La mortalidad que pueda darse no debe interferir con 
la supervivencia de animales suficientes para las pruebas bioquímicas 
(6) e histológicas (6) hasta el día 21. Debe utilizarse atropina u otro agente protector que no interfiera con las respuestas neurotóxicas retardadas, para evitar la muerte por efectos colinérgicos agudos.
 
1.5.2.4.  Ensayo límite  
Si un ensayo con una dosis de al menos 2 000 mg/kg de peso 
corporal/día, siguiendo los procedimientos descritos para el presente 
estudio, no produce ningún efecto tóxico observable y si, a partir de los datos procedentes de sustancias relacionadas estructuralmente, no cabe esperar la aparición de fenómenos tóxicos, puede considerarse 
innecesario un estudio con una dosis superior. El ensayo límite es 
aplicable excepto cuando la exposición humana indique la necesidad de utilizar una dosis superior.
 
1.5.2.5.  Período de observación  
El período de observación debe ser de 21 días.  
1.5.3.  Procedimiento  
Tras administrar un protector para evitar la muerte por efectos coli ­
nérgicos agudos, se administra una sola dosis de la sustancia estu ­
diada.  
1.5.3.1. Observación general 
La observación debe iniciarse inmediatamente tras la administración. 
Todas las gallinas deben observarse cuidadosamente varías veces 
durante los 2 primeros días y posteriormente al menos una vez al día durante un período de 21 días o hasta el sacrificio programado. Deben registrarse todos los signos de toxicidad, con inclusión del 
momento de aparición, tipo, gravedad y duración de las anomalías de 
comportamiento. La ataxia debe medirse con una escala de clasifi ­
cación ordinal consistente en un mínimo de cuatro niveles, y debe registrarse la eventual parálisis. Al menos dos veces por semana 
deben sacarse de las jaulas las gallinas seleccionadas para la obser ­
vación de las patologías y someterse a un período de actividad motriz forzada (como subida de una escalera) a fin de facilitar la observación de efectos tóxicos mínimos. Los animales moribundos o 
que presenten dolor o sufrimiento intenso deben sacarse en cuanto se 
observen, sacrificarse de forma compasiva y someterse a autopsia.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2. Peso corporal 
Deben pesarse todas las gallinas justo antes de la administración de la 
sustancia estudiada y al menos una vez por semana posteriormente.  
1.5.3.3. Bioquímica 
En el plazo de unos días después de la administración, deben sacri ­
ficarse 6 gallinas seleccionadas aleatoriamente de cada uno de los 
lotes de tratamiento y de control del vehículo, y tres del lote de 
control positivo (cuando este lote se utilice en paralelo). El cerebro y la médula lumbar se prepararán y estudiarán para detectar la acti ­
vidad de inhibición de la esterasa diana de la neuropatía. Además, 
también puede ser útil preparar y estudiar tejido del nervio ciático 
para medir la actividad de inhibición de la esterasa diana de la neuropatía. Normalmente, se sacrificarán 3 aves del lote de control y de cada lote de tratamiento a las 24 horas, y otras tres a las 48 
horas, mientras que las tres gallinas de los controles positivos se 
sacrificarán a las 24 horas. Si la observación de signos clínicos de intoxicación (esta puede evaluarse frecuentemente observando el mo ­
mento de aparición de signos colinérgicos) indica que el agente 
tóxico se elimina muy despacio, podrá ser preferible tomar dos veces 
tejidos de 3 aves entre las 24 y las 72 horas a partir de la adminis ­
tración. 
También pueden hacerse análisis de la acetilcolinesterasa (ACE) con 
estas muestras, si se considera conveniente. No obstante, puede darse  
in vivo  una reactivación espontánea de la ACE, llevando así a una 
subestimación de la potencia de la sustancia como inhibidora de la 
ACE.
 
1.5.3.4. Autopsia macroscópica 
La autopsia macroscópica de todos los animales (sacrificados de 
forma programada y sacrificados por encontrarse moribundos) debe incluir la observación del aspecto del cerebro y de la médula espinal.
 
1.5.3.5. Examen histopatológico 
Se someterán a examen microscópico muestras de tejido nervioso de 
los animales supervivientes al final del período de observación que 
no se hayan utilizado en los estudios bioquímicos. Los tejidos se 
fijarán  in situ,  utilizando técnicas de perfusión. Las secciones serán 
del cerebelo (nivel medio longitudinal), bulbo raquídeo, médula es ­
pinal y nervios periféricos. Las secciones de la médula espinal deben 
tomarse del segmento cervical superior y de las regiones media- dorsal y lumbo-sacra. Deben tomarse también secciones de la región distal del nervio tibial y sus ramificaciones al músculo gastrocnemio 
y del nervio ciático. Las secciones se someterán a tinción con colo ­
rantes adecuados específicos de la mielina y del axón.
 
2. RESULTADOS  
La obtención de resultados negativos respecto a los parámetros se ­
leccionados en este método (bioquímica, histopatología y observa ­
ción del comportamiento) no requiere normalmente la realización de más ensayos de neurotoxicidad retardada. La obtención de resultados 
dudosos o ambiguos respecto a estos parámetros sí puede hacer 
necesaria otra evaluación. 
Deben proporcionarse datos individuales. Además, todos los datos 
deben resumirse en forma tabular, indicando para cada lote de en ­
sayo el número de animales al inicio de la prueba, el número de animales que presenten lesiones o efectos bioquímicos o de compor ­
tamiento, los tipos y gravedad de estas alteraciones, y el porcentaje 
de animales que presenten cada tipo y grado de alteración.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Las observaciones del presente estudio deben evaluarse en términos 
de incidencia, gravedad y correlación de los efectos bioquímicos, 
histopatológicos y de comportamiento, así como cualquier otro efecto observado en los lotes tratados y de control. 
Los resultados numéricos deben evaluarse mediante métodos estadís ­
ticos adecuados de aceptación general. Los métodos estadísticos de ­
ben seleccionarse durante el diseño del estudio.
 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente informa ­
ción: 
Animales de ensayo: — variedad utilizada, — número y edad de los animales, — origen, condiciones de alojamiento, etc., — peso de cada animal al inicio de la prueba. Condiciones del ensayo: — datos sobre la preparación, estabilidad y homogeneidad de la 
sustancia estudiada, cuando convenga, 
— justificación de la elección del vehículo, — datos sobre la administración de la sustancia estudiada, — datos sobre la calidad de los alimentos y del agua, — justificación de la selección de la dosis, — especificación de las dosis administradas, con datos sobre el 
vehículo, el volumen y la forma física del material administrado 
— identidad y datos de la administración de cualquier protector. Resultados: 
— datos sobre el peso corporal, 
— datos de la respuesta tóxica por lotes, incluida la mortalidad, — naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas 
(tanto si son reversibles como si no), 
— descripción detallada de los métodos y observaciones bioquími ­
cas, 
— observaciones de la autopsia, 
— descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas, 
— tratamiento estadístico de los resultados, cuando convenga. Discusión de tos resultados. Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
El presente método es análogo a la TG 418 de la OCDE  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  NEUROTOXICIDAD RETARDADA DE SUSTANCIAS 
ORGANOFOSFORADAS. ESTUDIO POR ADMINISTRACIÓN 
CONTINUADA DE 28 DÍAS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
En la evaluación de los efectos tóxicos de las sustancias, es impor ­
tante considerar el potencial de ciertas clases de sustancias para causar tipos específicos de neurotoxicidad que pueden no detectarse 
con otros estudios de toxicidad. Se ha visto que ciertas sustancias 
organofosforadas producen neurotoxicidad retardada, por lo que debe considerarse su evaluación. 
Pueden emplearse ensayos de cribado  in vitro  para detectar las sus ­
tancias capaces de producir polineuropatía retardada; sin embargo, 
unos resultados negativos en los estudios  in vitro  no excluyen que la 
sustancia estudiada sea neurotóxica. 
Este ensayo de 28 días de neurotoxicidad retardada proporciona 
información sobre los riesgos sanitarios que puede provocar una exposición repetida a lo largo de un período limitado de tiempo. 
Da información sobre la respuesta a las dosis y proporciona una 
estimación del nivel sin efectos adversos observados que puede ser útil para establecer criterios de seguridad de la exposición. 
Véase la Introducción general, Parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Sustancias organofosforadas:  ésteres organofosforados sin carga, 
tioésteres o anhídridos de ácidos organofosfóricos, organofosfóricos 
u organofosforamídicos, o de ácidos fosforotioicos, fosfono-tioicos o fosforotioamídicos afines, u otras sustancias que puedan producir la neurotoxicidad retardada que a veces se aprecia en esta clase de 
sustancias.  
Neurotoxicidad retardada:  síndrome asociado con la aparición retar ­
dada y prolongada de ataxia, axonopatías distales en la médula es ­
pinal y en los nervios periféricos, e inhibición y envejecimiento de la 
esterasa diana de la neuropatía (NTE) en el tejido nervioso.
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se dan dosis orales diarias de la sustancia estudiada a gallinas do ­
mésticas durante 28 días. Se observa al menos diariamente la apari ­
ción en los animales de anomalías de comportamiento, ataxia y parálisis, hasta que pasen 14 días desde la última administración. 
Se realizan medidas bioquímicas, especialmente la inhibición de la 
esterasa diana de la neuropatía (NTE), en gallinas seleccionadas aleatoriamente de cada lote, normalmente a las 24 y 48 horas de la última administración. A las dos semanas de la última dosis, se 
sacrifican las gallinas restantes y se procede al examen histopatoló ­
gico de tejidos nerviosos seleccionados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación  
Se seleccionan al azar gallinas jóvenes sanas, libres de enfermedades 
víricas que puedan interferir y sin tratamiento médico, que no pre ­
senten anomalías de la marcha, se asignan a los lotes de tratamiento 
y de control y se aclimatan a las condiciones del laboratorio durante un mínimo de 5 días antes del inicio del estudio. 
Deben utilizarse jaulas o recintos de la capacidad suficiente para 
permitir la libre movilidad de las gallinas y la fácil observación de 
su marcha. 
La sustancia estudiada se administrará todos y cada uno de los días 
por vía oral, de preferencia utilizando sondas gástrica o cápsulas de 
gelatina. Los líquidos pueden administrarse sin diluir o disueltos en 
un vehículo apropiado, como el aceite de maíz; los sólidos deben disolverse siempre que sea posible, ya que las grandes dosis de productos sólidos en cápsulas de gelatina pueden no absorberse de 
forma eficaz. Respecto a los vehículos no acuosos, deben conocerse 
sus características tóxicas; en caso de no conocerse, se determinarán antes de la prueba.
 
1.4.2.  Condiciones del ensayo  
1.4.2.1.  Animales de experimentación  
Se recomienda la gallina ponedora doméstica adulta  (Gallus gallus 
domesticus),  de una edad comprendida entre 8 y 12 meses. Deben 
emplearse razas y variedades de tamaño normal y las gallinas se habrán criado normalmente en condiciones que permitan su movili ­
dad libre.
 
1.4.2.2.  Número y sexo  
Se utilizarán generalmente al menos tres lotes de tratamiento y un 
lote de control del vehículo. El lote de control del vehículo debe tratarse de la misma forma que el lote de tratamiento, salvo que se 
omitirá la administración de la sustancia estudiada. 
En cada lote de aves debe utilizarse un número suficiente de gallinas 
de forma que puedan matarse al menos 6 aves para hacer las deter ­
minaciones bioquímicas (3 en cada uno de los dos momentos selec ­
cionados) y otras 6 puedan sobrevivir durante el período de 14 días 
tras la exposición destinado a la observación.
 
1.4.2.3.  Dosis  
Las dosis deben seleccionarse teniendo en cuenta los resultados de 
un ensayo de neurotoxicidad aguda retardada y cualesquiera otros datos existentes sobre toxicidad o cinética del compuesto estudiado. 
La dosis superior debe elegirse con el fin de inducir efectos tóxicos, 
de preferencia neurotoxicidad retardada, pero sin producir la muerte ni sufrimiento patente. Posteriormente, debe seleccionarse una se ­
cuencia descendente de dosis destinadas a demostrar la eventual 
relación dosis-respuesta y la ausencia de efectos adversos observados 
con la dosis inferior.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4.  Ensayo límite  
Si un ensayo con una dosis de al menos 1 000 mg/kg de peso 
corporal/día, siguiendo los procedimientos descritos para el presente estudio, no produce ningún efecto tóxico observable y si, a partir de 
los datos procedentes de sustancias relacionadas estructuralmente, no 
cabe esperar la aparición de fenómenos tóxicos, puede considerarse innecesario un estudio con una dosis superior. El ensayo límite es aplicable excepto cuando la exposición humana prevista indique la 
necesidad de utilizar una dosis superior
 
1.4.2.5.  Período de observación  
Todos los animales se observarán al menos una vez al día durante el 
período de exposición y durante 14 días después, salvo en los casos de autopsia prevista.
 
1.4.3.  Procedimiento  
Los animales reciben la sustancia estudiada todos y cada uno de los 
días durante un período de 28 días.  
1.4.3.1.  Observación general  
La observación debe iniciarse inmediatamente tras el inicio del trata ­
miento. Todas las gallinas deben observarse cuidadosamente al menos una vez al día durante cada uno de los 28 días del tratamiento y durante 14 días tras la última administración o hasta el sacrificio programado. 
Deben registrarse todos los signos de toxicidad, con inclusión del 
momento de aparición, tipo, gravedad y duración. Las observaciones incluirán las anomalías del comportamiento, sin limitarse a ellas. La ataxia debe medirse con una escala de clasificación ordinal consistente 
en un mínimo de cuatro niveles, y debe registrarse la eventual parálisis. 
Al menos dos veces por semana deben sacarse de las jaulas las gallinas y someterse a un período de actividad motriz forzada (como subida de 
una escalera) a fin de facilitar la observación de efectos tóxicos míni ­
mos. Los animales moribundos o que presenten dolor o sufrimiento intenso deben sacarse en cuanto se observen, sacrificarse de forma compasiva y someterse a autopsia.
 
1.4.3.2.  Peso corporal  
Deben pesarse todas las gallinas justo antes de la primera adminis ­
tración de la sustancia estudiada y al menos una vez por semana 
posteriormente.  
1.4.3.3.  Bioquímica  
En el plazo de unos días después de la última administración, deben 
sacrificarse 6 gallinas seleccionadas aleatoriamente de cada uno de los lotes de tratamiento y de control del vehículo. El cerebro y la 
médula lumbar se prepararán y estudiarán para detectar la actividad 
de inhibición de la esterasa diana de la neuropatía. Además, también puede ser útil preparar y estudiar tejido del nervio ciático para medir la actividad de inhibición de la esterasa diana de la neuropatía. 
Normalmente, se sacrificarán 3 aves del lote de control y de cada 
lote de tratamiento a las 24 horas, y otras 3 a las 48 horas de la última administración. Si de datos procedentes del estudio de toxi ­
cidad aguda o de otros estudios (por ejemplo, de toxicocinética), se 
deduce que es preferible utilizar otros tiempos de sacrificio tras la 
última administración, entonces deberán aplicarse estos tiempos aportando la justificación pertinente. 
También pueden hacerse análisis de la acetilcolinesterasa (ACE) con 
estas muestras, si se considera conveniente. No obstante, puede darse  in 
vivo una reactivación espontánea de la ACE, llevando así a una subes ­
timación de la potencia de la sustancia como inhibidora de la ACE.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4.  Autopsia macroscópica  
La autopsia macroscópica de todos los animales (sacrificados de 
forma programada y sacrificados por encontrarse moribundos) debe incluir la observación del aspecto del cerebro y de la médula espinal.
 
1.4.3.5.  Examen histopatológico  
Se someterán a examen microscópico muestras de tejido nervioso de 
los animales supervivientes al final del período de observación que no 
se hayan utilizado en los estudios bioquímicos. Los tejidos se fijarán  in 
situ, utilizando técnicas de perfusión. Las secciones serán del cerebelo 
(nivel medio longitudinal), bulbo raquídeo, médula espinal y nervios 
periféricos. Las secciones de la médula espinal deben tomarse del 
segmento cervical superior y de las regiones media-dorsal y lumbo- sacra. Deben tomarse también secciones de la región distal del nervio tibial y sus ramificaciones al músculo gastrocnemio y del nervio ciáti ­
co. Las secciones se someterán a tinción con colorantes adecuados 
específicos de la mielina y del axón. En principio, debe hacerse el examen microscópico de los tejidos conservados de todos los animales de los lotes de control y de dosis alta. Cuando haya pruebas de efectos 
en el lote de dosis alta, deberá hacerse también el examen microscópico 
de las gallinas de los lotes de dosis intermedia y baja.
 
2. RESULTADOS  
La obtención de resultados negativos respecto a los parámetros se ­
leccionados en este método (bioquímica, histopatología y observa ­
ción del comportamiento) no requiere normalmente la realización de más ensayos de neurotoxicidad retardada. La obtención de resultados 
dudosos o ambiguos respecto a estos parámetros sí puede hacer 
necesaria otra evaluación. 
Deben proporcionarse datos individuales. Además, todos los datos 
deben resumirse en forma tabular, indicando para cada lote de en ­
sayo el número de animales al inicio de la prueba, el número de animales que presenten lesiones o efectos bioquímicos o de compor ­
tamiento, los tipos y gravedad de estas alteraciones, y el porcentaje 
de animales que presenten cada tipo y grado de alteración. 
Las observaciones del presente estudio deben evaluarse en términos 
de incidencia, gravedad y correlación de los efectos bioquímicos, histopatológicos y de comportamiento, así como cualquier otro efecto observado en los lotes tratados y de control. 
Los resultados numéricos deben evaluarse mediante métodos estadís ­
ticos adecuados de aceptación general. Los métodos estadísticos de ­
ben seleccionarse durante el diseño del estudio.
 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente informa ­
ción: 
Animales de ensayo: — variedad utilizada, — número y edad de los animales, 
— origen, condiciones de alojamiento, etc., 
— peso de cada animal al inicio de la prueba.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
Condiciones del ensayo: 
— datos sobre la preparación, estabilidad y homogeneidad de la 
sustancia estudiada, cuando convenga, 
— justificación de la elección del vehículo, — datos sobre la administración de la sustancia estudiada, — datos sobre la calidad de los alimentos y del agua, — justificación de la selección de la dosis, — especificación de las dosis administradas, con datos sobre el 
vehículo, el volumen y la forma física del material administrado, 
— justificación de la elección de los tiempos para las determinacio ­
nes bioquímicas, en caso de que no sean 24 y 48 horas. 
Resultados: — datos sobre el peso corporal, — datos de la respuesta tóxica por lotes, incluida la mortalidad, — nivel sin efectos adversos observados, — naturaleza, gravedad y duración de las observaciones clínicas 
(tanto si son reversibles como si no), 
— descripción detallada de los métodos y observaciones bioquími ­
cas, 
— observaciones de la autopsia, — descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas, — tratamiento estadístico de los resultados, cuando convenga. Discusión de los resultados Conclusiones
 
4. REFERENCIAS  
El presente método es análogo a la TG 419 de la OCDE.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  ENSAYO DE SÍNTESIS DE ADN NO PROGRAMADA (UDS) EN 
HEPATOCITOS DE MAMÍFERO  IN VIVO  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices del documento OCDE 
TG 486 sobre el ensayo de síntesis de ADN no programada (UDS) 
en hepatocitos de mamífero  in vivo  (1997).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El ensayo de síntesis de ADN no programada (UDS) en hepatocitos 
de mamífero  in vivo  tiene por objeto determinar sustancias de ensayo 
que inducen la reparación del ADN en los hepatocitos de animales 
tratados (1) (2) (3) (4). 
El presente ensayo  in vivo  constituye un método de investigación de 
los efectos genotóxicos de los productos químicos en el hígado y sirve para detectar lesiones en el ADN y su posterior reparación en 
las células hepáticas. El hígado suele ser el lugar donde más se 
metabolizan los compuestos absorbidos y por ello constituye el ór ­
gano más apropiado para la detección de lesiones del ADN  in vivo.  
Si hay pruebas de que la sustancia de ensayo no llega al tejido diana, 
no procede realizar el presente ensayo. 
La síntesis de ADN no programada (UDS) se determina midiendo la 
incorporación de nucleósidos marcados en células que no se encuen ­
tran en la fase S de síntesis programada de ADN. La técnica más empleada consiste en determinar la captación de timidina tritiada (
 3 H-TdR) por autorradiografía. Para los ensayos de UDS  in vivo  es 
preferible utilizar hígados de rata. También pueden emplearse otros 
tejidos, si bien no se tratan en las presentes directrices. 
La detección de una respuesta de UDS depende del número de bases 
del ADN eliminadas y repuestas en el sitio de la lesión. De ahí que 
el ensayo de UDS sea particularmente útil para detectar la reparación 
de secuencias largas (20 a 30 bases; secuencias largas de reparación) inducida por una sustancia. Sin embargo, la sensibilidad del ensayo para detectar la reparación de secuencias cortas (1 a 3 bases; secuen ­
cias cortas de reparación) es mucho menor. Por otra parte, las alte ­
raciones mutagénicas pueden deberse a una falta de reparación o a una reparación o replicación erróneas de las lesiones del ADN. La magnitud de la respuesta de UDS no es indicativa de la fidelidad del 
proceso de reparación. Además de ello, es posible que un mutágeno 
reaccione con el ADN, pero que la lesión de este no se repare por un mecanismo de reparación de escisión. La falta de información espe ­
cífica sobre la actividad mutagénica que caracteriza al ensayo UDS 
se ve compensada por su sensibilidad potencial, ya que detecta los 
efectos en todo el genoma. 
Véase asimismo la Introducción general de la parte B.
 
1.2. DEFINICIONES  
Células en reparación:  células con un número neto de granulacio ­
nes nucleares (NGN) superior a un número preestablecido que el laboratorio donde se realiza el ensayo ha de fundamentar.  
Número neto de granulaciones nucleares (NGN):  medida cuanti ­
tativa de la síntesis de ADN no programada en las células por 
autorradiografía: se calcula restando el número medio de granulacio ­
nes citoplasmáti-cas (GC) en las zonas citoplasmáticas equivalentes al núcleo del número de granulaciones nucleares (GN): NGN = GN - 
GC. Primero se calcula el NGN de cada célula y después el corres ­
pondiente a todo un cultivo o a cultivos paralelos, etc.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Síntesis de ADN no programada (UDS):  síntesis de reparación de 
ADN tras la escisión y eliminación de un segmento de ADN que 
contiene una región dañada por sustancias químicas o agentes físi ­
cos. 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
El ensayo de síntesis de ADN no programada en hepatocitos de 
mamífero  in vivo  detecta la síntesis de reparación del ADN tras la 
escisión y eliminación de un segmento de ADN que contiene una región dañada por sustancias químicas o agentes físicos. El ensayo suele fundarse en la incorporación de
 3 H-TdR al ADN de hepatocitos 
de los cuales una escasa proporción se encuentra en la fase S del 
ciclo celular. La incorporación de  3 H-TdR suele determinarse por 
autorradiografía, ya que esta técnica no es tan sensible a las interfe ­
rencias debidas a las células en fase S como lo es, por ejemplo, el 
recuento por centelleo de líquidos.  
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación  
1.4.1.1.  Selección de la especie animal  
Si bien suelen emplearse ratas, pueden utilizarse otras especies de 
mamíferos apropiadas. Deben usarse animales adultos jóvenes y sa ­
nos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no 
debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo.
 
1.4.1.2.  Alojamiento y alimentación de los animales  
Se aplicarán las condiciones generales recogidas en la Introducción 
general de la parte B. La humedad debe ser del 50 al 60 %.  
1.4.1.3.  Preparación de los animales  
Se reparten al azar animales adultos jóvenes y sanos entre los lotes 
tratados y los lotes de control. Las jaulas se colocan de manera que los posibles efectos debidos a la posición de las mismas sean míni ­
mos. Se identifica a los animales de forma unívoca y se los mantiene 
en las jaulas al menos 5 días antes de empezar el estudio para que se 
acostumbren a las condiciones de laboratorio.
 
1.4.1.4.  Preparación de la sustancia de ensayo  
Las sustancias de ensayo sólidas deben disolverse o suspenderse en 
disolventes o vehículos adecuados y, si es preciso, diluirse antes de 
su administración a los animales. Las sustancias de ensayo líquidas pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administra ­
ción. Han de emplearse soluciones de la sustancia de ensayo recién 
preparadas, salvo que los datos relativos a la estabilidad demuestren 
que es posible conservarlas.
 
1.4.2.  Condiciones del ensayo  
1.4.2.1.  Disolvente o vehículo  
El disolvente o vehículo no deberá producir efectos tóxicos a las 
dosis empleadas. Es preciso cerciorarse de que el disolvente o vehí ­
culo no produce reacciones químicas con la sustancia de ensayo. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información que avale su compatibilidad. Siempre que sea posi ­
ble, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un 
disolvente o vehículo acuoso.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Controles  
Deberán realizarse controles positivos y negativos (disolvente o ve ­
hículo) en paralelo en cada parte independiente del experimento. Salvo por lo que respecta a la exposición a la sustancia de ensayo, 
los animales de los lotes de control deben tratarse exactamente igual 
que los de los lotes tratados. 
En los controles positivos se emplearán sustancias de las que se sepa 
que inducen la síntesis de ADN no programada cuando se adminis ­
tran en dosis con las que se prevé un aumento detectable respecto a la frecuencia espontánea. Los controles positivos que requieran ac ­
tivación metabólica se realizarán con dosis que provoquen una res ­
puesta moderada (4). Las dosis del control positivo pueden ser tales 
que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados. A continuación figuran algunos ejemplos de sustancias para los controles positivos:
 
Período de muestreo Sustancia N  o CAS N  o EINECS  
Corto (2 a 4 horas) N-nitrosodimetilamina 62-75-9 200-249-8 
Largo (12 a 16 horas) N-2-fluorenilacetamida (2-AAF) 53-96-3 200-188-6 
Pueden emplearse otras sustancias adecuadas para los controles po ­
sitivos. La sustancia del control positivo puede administrarse por una 
vía distinta de la de la sustancia de ensayo.  
1.5. PROCEDIMIENTO  
1.5.1.  Número y sexo de los animales  
El número de animales deberá decidirse tomando en consideración la 
variación biológica natural de la respuesta al ensayo. Cada lote estará 
constituido al menos por 3 animales analizables. Si se dispone de una base de datos de controles históricos importante, bastarán 1 o 2 
animales para los lotes de los controles negativos y positivos reali ­
zados en paralelo. 
Si en el momento en que se efectúe el estudio se dispone de datos 
sobre otros estudios realizados con la misma especie y la misma vía 
de exposición, que demuestren que no hay diferencia significativa 
entre sexos en cuanto a la toxicidad, será suficiente el ensayo en un solo sexo, preferiblemente en machos. En caso de que la exposición humana a sustancias químicas pueda ser específica de un sexo, como 
sucede con algunos productos farmacéuticos, el ensayo se realizará 
con animales del sexo correspondiente.
 
1.5.2.  Pauta de tratamiento  
Las sustancias de ensayo suelen administrarse en una sola vez.  
1.5.3.  Dosis  
En principio, se administran al menos dos dosis distintas. Se en ­
tiende por «dosis máxima» la que produce tales signos de toxicidad que, si se administrara una dosis superior según el mismo protocolo, 
resultaría probablemente letal. Por lo general, la dosis inferior es del 
50 % al 25 % de la dosis máxima.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Las sustancias con actividades biológicas específicas a dosis bajas no 
tóxicas (como las hormonas y los mitó-genos) pueden constituir 
excepciones en cuanto a los criterios de establecimiento de la dosis y han de evaluarse caso por caso. Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación de la gama de dosis por falta de datos 
adecuados, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma 
especie, cepa, sexo y protocolo de tratamiento que el estudio prin ­
cipal. 
La dosis máxima también puede definirse como la dosis que produce 
algún signo de toxicidad hepática (por ejemplo, núcleos picnóticos).
 
1.5.4.  Ensayo límite  
Si en un ensayo realizado con una dosis de al menos 2 000 mg/kg de 
peso corporal administrada en una sola vez, o dos veces en el mismo 
día, no se observan efectos tóxicos y si, sobre la base de datos relativos a sustancias de estructura afín, no cabe esperar genotoxici ­
dad, puede no ser necesario llevar a cabo un estudio completo. Si se 
prevé la exposición humana a la sustancia, puede ser preciso admi ­
nistrar una dosis mayor en el ensayo límite.
 
1.5.5.  Administración de las dosis  
La sustancia de ensayo suele administrarse por sonda gástrica o con 
una cánula de intubación adecuada. Pueden emplearse otras vías de 
administración, siempre que se justifiquen. La vía intraperitoneal no está indicada, ya que podría exponer el hígado a la sustancia de ensayo directamente en lugar de a través del sistema circulatorio. 
El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una 
sola vez por sonda o inyección depende del tamaño del animal de ensayo, pero no excederá de 2 ml/100 g de peso corporal. Deberá justificarse la administración de volúmenes superiores a este. Salvo 
en el caso de sustancias irritantes o corrosivas, que por lo general 
producen efectos exacerbados con concentraciones mayores, deberá reducirse al mínimo la variabilidad del volumen de ensayo ajustando la concentración de manera que el volumen sea el mismo en todas 
las dosis.
 
1.5.6.  Preparación de los hepatocitos  
Se extraen hepatocitos de los animales tratados, por lo general de 12 
a 16 horas después de la administración de la sustancia de ensayo. 
Suele ser necesaria otra toma previa (generalmente de 2 a 4 horas 
después del tratamiento), salvo que a las 12-16 horas haya una respuesta positiva clara. No obstante, pueden aplicarse otros períodos de muestreo, si así lo justifican los datos toxicocinéticos. 
Los cultivos de hepatocitos de mamífero a corto plazo se realizan 
perfundiendo el hígado  in situ  con colage-nasa y dejando que los 
hepatocitos recién disociados se adhieran a una superficie adecuada. 
La viabilidad de los hepatocitos de los animales del control negativo 
ha de ser del 50 % como mínimo (5).
 
1.5.7.  Determinación de la síntesis de ADN no programada  
Los hepatocitos de mamífero recién aislados se incuban en un medio 
con  3 H-TdR durante un tiempo adecuado, por ejemplo, de 3 a 8 
horas. Al término de la incubación, se retiran las células del medio y pueden entonces incubarse en otro medio con un exceso de timi ­
dina sin tratar con el fin de reducir la radiactividad no incorporada  
(cold chase).  A continuación, se aclaran las células, se fijan y se 
tiñen. Esta segunda incubación puede no ser necesaria si la primera ha sido más larga. Se bañan los portaobjetos en una emulsión auto- rradiográfica, se exponen en la oscuridad (por ejemplo, refrigerados, 
de 7 a 17 días), se revelan y tiñen y se cuentan los granos de plata 
expuestos. Se preparan dos o tres portaobjetos por animal.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Análisis  
Las preparaciones han de contener un número suficiente de células 
de morfología normal para que la evaluación de la síntesis de ADN no programada sea significativa. 
Se observan las preparaciones al microscopio en busca de signos de 
citotoxicidad manifiesta (por ejemplo, picnosis, índice reducido de 
marcado radiactivo, etc.). 
Se codifican los portaobjetos antes del recuento de granulaciones. 
Por lo general, se cuentan 100 células por animal, en dos portaob ­
jetos como mínimo. El recuento de menos de 100 células por animal deberá estar debidamente justificado. Si bien los núcleos en fase S no se consideran en el recuento de granulaciones, puede registrarse 
la proporción de células en fase S. 
Se determinará con métodos apropiados la cantidad de
 3 H-TdR in ­
corporada en los núcleos y el citoplasma de las células con morfo ­
logía normal, revelada por el depósito de granos de plata.  
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Se proporcionarán los datos de cada portaobjetos y de cada animal. 
Se resumirán todos los datos en forma de tabla. Se calculará el número neto de granulaciones nucleares (NGN) por célula, por ani ­
mal y por dosis y tiempo restando el número de GC del de GN. Si se 
cuentan las células en reparación, se motivará el criterio aplicado para definir las «células en reparación», que deberá fundarse en datos relativos a controles históricos negativos o realizados en paralelo al 
ensayo. Los resultados numéricos pueden evaluarse por medio de 
métodos estadísticos, que deberán seleccionarse y justificarse antes de llevar a cabo el estudio.
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Entre los criterios para determinar si una respuesta es positiva o 
negativa se encuentran los siguientes: 
respuesta po ­
sitiva: i) el NGN es superior a un valor preestablecido 
fundado en datos de controles históricos obte ­
nidos en el laboratorio, o 
ii) el NGN supera de forma significativa al de los 
controles realizados en paralelo; 
respuesta ne ­
gativa: i) el NGN no supera el umbral correspondiente a 
controles históricos, o 
ii) el NGN no supera de forma significativa al de 
los controles realizados en paralelo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Debe considerarse la importancia biológica de los resultados. Se 
tomarán en consideración, por ejemplo, la variabilidad entre anima ­
les, la relación dosis-respuesta y la citotoxicidad. Pueden emplearse métodos estadísticos como apoyo para evaluar los resultados del ensayo. El hecho de que los datos estadísticos sean significativos 
no ha de ser el único factor para determinar que una respuesta es 
positiva. 
Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán cla ­
ramente positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos no permitirá emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia de ensayo. Con independencia del número de veces que 
se repita el experimento, los resultados pueden seguir siendo ambi ­
guos o dudosos. 
Un resultado positivo en el ensayo de síntesis de ADN no progra ­
mada en hepatocitos de mamífero  in vivo  indica que la sustancia de 
ensayo provoca lesiones del ADN en los hepatocitos de mamífero  in 
vivo que pueden repararse por síntesis de ADN no programada  in 
vitro.  Un resultado negativo indica que, en las condiciones del en ­
sayo, la sustancia de ensayo no provoca lesiones del ADN detecta ­
bles mediante este ensayo. 
Deberá estudiarse la probabilidad de que la sustancia de ensayo pase 
al torrente circulatorio o llegue específicamente al tejido diana (to ­
xicidad sistémica, etc.).
 
3. INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo incluirá la información siguiente: 
Disolvente o vehículo: — motivación de la elección del vehículo, — solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disol ­
vente o vehículo, si se conocen. 
Animales de ensayo: 
— especie y cepa utilizadas, 
— número, edad y sexo de los animales, — procedencia, condiciones de alojamiento, alimentación, etc., — peso de cada animal al principio del ensayo, incluido el intervalo 
del peso corporal, media y desviación estándar de cada lote. 
Condiciones del ensayo: — controles positivos y negativos (vehículo o disolvente), 
— datos relativos al estudio de determinación del intervalo, si se ha 
llevado a cabo, 
— fundamento de la selección de la dosis, 
— preparación de la sustancia de ensayo, 
— administración de la sustancia de ensayo, — fundamento de la elección de la vía de administración, — métodos de comprobación de que la sustancia de ensayo llega al 
torrente circulatorio o al tejido diana, en su caso,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— conversión de la concentración de la sustancia de ensayo en el 
agua ingerida y/o la dieta (ppm) en la dosis real (mg/kg de peso 
corporal/día), si procede, 
— calidad de los alimentos y el agua, 
— descripción detallada de las pautas de tratamiento y toma de 
muestras, 
— métodos de determinación de la toxicidad, 
— métodos de preparación y cultivo de los hepatocitos, 
— técnica autorradiográfica utilizada, — criterios de evaluación, 
— criterios empleados para considerar que los resultados de los 
estudios son positivos, negativos o dudosos. 
Resultados: 
— media de granulaciones nucleares, granulaciones citoplasmáticas 
y granulaciones nucleares netas por portaobjetos, animal y lote, 
— relación dosis-respuesta, cuando sea posible, 
— evaluación estadística, si se ha realizado, — signos de toxicidad, 
— datos de los controles negativos (disolvente o vehículo) y posi ­
tivos realizados en paralelo, 
— datos de controles históricos negativos (disolvente o vehículo) y 
positivos, intervalos, medias y desviaciones estándar, 
— número de «células en reparación», si se ha determinado, — número de células en fase S, si se ha determinado, 
— viabilidad de las células. 
Discusión de los resultados. 
Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Ashby, J., Lefevre, F. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay,  Miuation Res.,  156, pp. 1-18. 
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermúdez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst G. and Williams, G. (1987), A Protocol 
and Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay,  
Mutation  Res.,  189,  pp. 123-133. 
(3) Kennelly, J. C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson 
B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell I. de G. (1993), In 
Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., 
(eds.),  Suppkmentary Mutage-nicity  Tests; U KEM Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing Repon. Part II revised,  Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 52-77.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., 
Doolittle, D. J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C. A. and 
Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and In Vivo, Mutations Res,  312, pp. 263-285. 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993), Assessment of the Relation Bet-ween the Initital Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocy ­
tes Used for the  In Vivo/In Vitro  DNA Repair Assay (UDS),  
Mutation  Res.,  291,  pp. 21-27. 
(6) Mirsalis, J. C, Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), 
Detection of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  
Hepatocyte DNA Repair Assay,  Environ Mutagen,  4, 
pp. 553-562.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  CORROSIÓN CUTÁNEA  IN VITRO:  ENSAYO DE 
RESISTENCIA ELÉCTRICA TRANSCUTÁNEA (RET)  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de 
ensayo de la OCDE TG 430 (2004).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
La corrosión cutánea se refiere a la producción de daños tisulares irre ­
versibles en la piel tras la aplicación de una sustancia [según la definición del Sistema Armonizado Mundial  (Globally Harmonized System,  GHS) 
de clasificación y etiquetado de productos químicos] (1). El presente 
método contempla un procedimiento para evaluar la corrosividad sin recurrir a animales vivos. 
Tradicionalmente, la evaluación de la corrosividad cutánea se hacía 
con animales de laboratorio (2). La preocupación por el dolor y el 
sufrimiento de los animales utilizados en esa evaluación se ha tenido 
en cuenta en la revisión del método de ensayo B.4, para permitir la determinación de la corrosión cutánea mediante métodos alternativos,  
in vitro,  que eviten el dolor y el sufrimiento. 
Un primer paso hacia la definición de métodos alternativos que se 
pudieran utilizar en los ensayos de corrosividad cutánea con fines 
normativos fue la realización de estudios de prevalidación (3). Pos ­
teriormente se llevó a cabo un estudio oficial de validación de mé ­
todos  in vitro  para evaluar la corrosión cutánea (4) (5) (6) (7) (8). 
Como consecuencia de estos estudios y de otros datos publicados, se 
llegó a la recomendación de que los siguientes métodos podían utilizarse para predecir el efecto corrosivo  in vivo  de la piel (9) 
(10) (11): el ensayo con un modelo de piel humana (véase el método 
de ensayo 40  bis) y el ensayo de resistencia eléctrica transcutánea (el 
presente método). 
Mediante un estudio de validación y otros estudios publicados se ha 
sabido que el ensayo de resistencia eléctrica transcutánea (RET) (12) (13) puede discriminar de forma fiable entre agentes corrosivos y no 
corrosivos conocidos de la piel (5) (9). 
El ensayo descrito en el presente método permite la identificación de 
sustancias químicas y mezclas corrosivas. Asimismo permite la iden ­
tificación de sustancias y mezclas no corrosivas con el apoyo de prue ­
bas sopesadas derivadas de otro tipo de información disponible (por 
ejemplo, pH, relaciones estructura-actividad, datos con hombres o ani ­
males) (1) (2) (11) (14). No da información sobre la irritación cutánea ni permite la subcategorización de sustancias corrosivas que se con ­
templa en el Sistema Armonizado Mundial de clasificación (1). 
Para una evaluación completa de los efectos cutáneos locales tras 
una única exposición de la piel, se recomienda seguir la estrategia de 
ensayos secuenciales que figura adjunta al método de ensayo B.4 (2) y que proporciona el Sistema Armonizado Mundial (1). Esta estra ­
tegia de ensayos incluye la realización de pruebas  in vitro  de corro ­
sión cutánea (como las descritas en el presente método) y de irrita ­
ción cutánea antes de considerar las pruebas con animales vivos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. DEFINICIÓN 
Se entenderá por:  corrosión cutánea  in vivo  la producción de lesio ­
nes cutáneas irreversibles consistentes en necrosis visible en todo el espesor de la epidermis y hasta en la dermis, debida a la aplicación 
de una sustancia durante hasta 4 horas; las reacciones de corrosión se 
tipifican como úlceras, hemorragia, costras hemorrágicas y, hacia el final del período de observación de 14 días, como decoloración de la piel, zonas de alopecia completa y cicatrices; debe recurrirse a la 
histopatología para evaluar las lesiones dudosas;  
resistencia eléctrica transcutánea (RET)  la medida de la impedan ­
cia eléctrica de la piel, como valor de resistencia en kiloohmios; se trata de un método simple y sólido para evaluar la función de ba ­
rrera, consistente en registrar el paso de iones a través de la piel 
mediante el uso de un puente de Wheatstone.
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA  
Cuadro 1  
Sustancias de referencia  
Denominación N  o EINECS N  o CAS 
1,2-diaminopropano 201-155-9 78-90-0 Fuertemente corrosivo 
Ácido acrílico 201-177-9 79-10-7 Fuertemente corrosivo 2-terc-butilfenol 201-807-2 88-18-6 Corrosivos 
Hidróxido de potasio (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosivos 
Ácido sulfúrico (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosivos Ácido octanoico (ácido caprílico) 204-677-5 124-07-02 Corrosivos 
4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 No corrosivo 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 No corrosivo Bromuro de fenetilo 203-130-8 103-63-9 No corrosivo 
Tetracloroetileno 204-825-9 27-18-4 No corrosivo 
Ácido isoesteárico 250-178-0 30399-84-9 No corrosivo 4-(metiltio)-benzaldehído 222-365-7 3446-89-7 No corrosivo 
La mayoría de estas sustancias proceden de la lista de sustancias 
seleccionadas para el estudio internacional de validación del EC ­
VAM (4). Su elección se basa en los criterios siguientes: 
i) igual número de sustancias corrosivas y no corrosivas,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) sustancias disponibles en el comercio y representativas de la 
mayoría de las clases químicas pertinentes, 
iii) inclusión de sustancias fuertemente corrosivas y de sustancias 
menos corrosivas para permitir la discriminación según la poten ­
cia corrosiva, 
iv) elección de sustancias que puedan manipularse en un laboratorio 
sin plantear peligros graves aparte de la corrosividad.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
La sustancia problema se aplica durante un máximo de 24 horas en 
la superficie epidérmica de discos de piel en un sistema de ensayo bicompartimental, donde los discos hacen de separación entre los 
compartimentos. Los discos de piel se toman de ratas, sacrificadas 
de forma compasiva a los 28 o 30 días de edad. Las sustancias corrosivas se caracterizan por su capacidad de producir una pérdida de la integridad de la capa córnea normal y de la función de barrera. 
Esta pérdida se mide como reducción de la RET por debajo de un 
umbral (12). En relación con la RET de ratas, se ha elegido un valor límite de 5 k Ω basándose en muchos datos sobre una amplia gama 
de sustancias, ya que la gran mayoría de valores estaba claramente 
muy por encima (a menudo > 10 k Ω), o muy por debajo (a menudo 
< 3 kΩ) de este valor (12). Generalmente, el valor de la RET 
reducida por los materiales que no son corrosivos para los animales, tanto si son irritantes como si no, queda por encima de este límite. 
Por otra parte, el uso de otros preparados de piel o de otros equipos 
puede alterar el valor límite, lo que hace necesaria otra validación. 
Se incorpora al procedimiento una fase de fijación de colorante para 
confirmar los resultados positivos con la RET, incluidos los casos de valores próximos a 5 k Ω. La fijación de colorante determina si el 
aumento de la permeabilidad iónica se debe a la destrucción física de 
la capa córnea. Se ha visto que el método de RET con piel de rata sirve para predecir el valor de la corrosividad  in vivo  del conejo, 
evaluada según el método de ensayo B.4 (2). Debe señalarse que el 
ensayo  in vivo  con conejos da unos valores muy moderados de 
corrosividad cutánea y de irritación cutánea si se compara con el ensayo del parche de piel humana (15).
 
1.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.5.1.  Animales  
La rata es la especie elegida porque ya se ha demostrado previa ­
mente la sensibilidad de su piel a las sustancias de esta prueba (10). La edad (en el momento de tomar la piel) y la cepa de la rata son especialmente importantes para conseguir que los folículos pilosos 
estén en fase latente antes de que se inicie el crecimiento del pelo de 
los adultos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Se quita cuidadosamente con maquinilla pequeña el pelo dorsal y 
lateral de ratas jóvenes, de unos 22 días de edad, machos o hembras, 
de una cepa derivada de la Wistar o de otra comparable. A conti ­
nuación se lavan los animales frotándolos cuidadosamente al mismo tiempo que se cubre la zona pelada con una solución antibiótica (que 
contenga, por ejemplo, estreptomicina, penicilina, cloranfenicol y 
anfotericina en concentraciones que sean eficaces para inhibir el crecimiento bacteriano). Los animales se vuelven a lavar con anti ­
bióticos al tercer o cuarto día después del primer lavado y se utilizan 
en el plazo de 3 días desde el segundo lavado, cuando la capa córnea 
se ha recuperado de la eliminación del pelo.
 
1.5.2.  Preparación de los discos de piel  
Los animales se sacrifican compasivamente cuando tienen de 28 a 30 
días (esta edad es de importancia fundamental). A continuación se 
retira la piel dorsolateral de cada animal y se le quita el exceso de grasa subcutánea, separando esta cuidadosamente de la piel. Se to ­
man discos de piel de un diámetro aproximado de 20 mm. Puede 
guardarse la piel antes de utilizar los discos si se demuestra que los 
datos obtenidos con controles positivos y negativos son equivalentes a los obtenidos con piel fresca. 
Cada disco de piel se coloca sobre uno de los extremos de un tubo 
de PTFE (politetrafluoretileno), comprobando que la superficie epi ­
dérmica esté en contacto con el mismo. Se coloca a presión un anillo de goma en el extremo del tubo para mantener la piel en su sitio y se 
recorta el tejido sobrante. En la figura 2 se dan las dimensiones del 
anillo y del tubo. Después se sella con cuidado el anillo de goma al extremo del tubo de PTFE con vaselina. El tubo se sujeta mediante una pinza de muelle dentro de una cámara receptora que contiene 
una solución de MgSO
 4 (154 mM) (figura 1). El disco de piel debe 
quedar totalmente sumergido en la solución de MgSO  4 . De la piel de 
una sola rata pueden obtenerse hasta 10 o 15 discos de piel. 
Antes de iniciar el ensayo, se mide la resistencia eléctrica de dos 
discos de piel, para controlar la calidad de la piel de cada animal. El valor de la resistencia de ambos discos debe ser superior a 10 k Ω 
para que los discos restantes puedan utilizarse en el ensayo. Si el 
valor de la resistencia es inferior a 10 k Ω, hay que desechar los 
discos restantes de la misma piel.
 
1.5.3.  Aplicación de las sustancias problema y de control  
En cada estudio deben utilizarse a la vez controles positivos y ne ­
gativos para garantizar el funcionamiento adecuado del modelo ex ­
perimental. Han de utilizarse discos de piel procedentes de un solo animal. Las sustancias de control positivo y negativo que se propo ­
nen son ácido clorhídrico 10 M y agua destilada, respectivamente. 
Las sustancias problema líquidas (150 μL) se aplican uniformemente 
a la superficie epidérmica dentro del tubo. Cuando se prueban ma ­
terias sólidas se aplica uniformemente al disco una cantidad sufi ­
ciente del sólido de tal manera que quede cubierta toda la superficie 
de la epidermis. A continuación se vierte encima del sólido agua desionizada (150 μL) y se agita suavemente el tubo. A fin de con ­
seguir el contacto máximo con la piel, es posible que los sólidos 
deban calentarse a 30
 o C para fundir o reblandecer la sustancia 
problema, o bien molerse para obtener polvo o material granuloso.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Para cada sustancia problema y de control se utilizan tres discos de 
piel. Las sustancias problema se aplican durante 24 horas a 20- 
23 o C; luego se eliminan lavando con un chorro de agua del grifo 
a una temperatura máxima de 30  o C, hasta que no pueda eliminarse 
más material.  
1.5.4.  Mediciones de la RET  
La impedancia de la piel, tomada como RET, se mide con un puente 
de Wheatstone de corriente alterna y baja tensión (13). Las especi ­
ficaciones generales del puente son una tensión de funcionamiento de 1-3 V, una corriente alterna de forma sinusoidal o rectangular de 
50-1 000 Hz, y un intervalo de medición como mínimo de 0,1 a 30 
kΩ. El puente utilizado en el estudio de validación medía valores de 
inductancia, capacitancia y resistencia de hasta 2 000 H, 2 000 μF, y 
2 MΩ, respectivamente, a frecuencias de 100 Hz o 1 kHz, utilizando 
montajes en serie o en paralelo. A efectos de la RET, las mediciones 
del ensayo de corrosividad se registran como resistencia, a la fre ­
cuencia de 100 Hz y utilizando montajes en serie. Antes de medir la resistencia eléctrica, se reduce la tensión superficial de la piel aña ­
diendo el volumen suficiente de etanol al 70 % para cubrir la epi ­
dermis. Tras unos segundos se retira el etanol y después se hidrata el tejido aplicando 3 mL de una solución de MgSO
 4 (154 mM). Los 
electrodos del puente se colocan a ambos lados del disco de piel para 
medir la resistencia en k Ω/disco de piel (figura 1). En la figura 2 se 
dan las dimensiones de los electrodos y la longitud del electrodo expuesta por debajo de las pinzas de cocodrilo. La pinza que sujeta el electrodo interior se apoya encima del tubo de PTFE durante la 
medición de la resistencia para asegurarse de que es constante la 
longitud del electrodo que queda sumergida en la solución de MgSO
 4 . El electrodo exterior se coloca dentro de la cámara receptora 
de manera que se apoye en el fondo de la misma. La distancia entre 
la pinza de muelle y el fondo del tubo de PTFE se ha de mantener 
constante (figura 2), ya que afecta al valor de la resistencia obtenido. Por tanto, la distancia entre el electrodo interior y el disco de piel debe ser constante y mínima (1-2 mm). 
Si el valor medido de la resistencia es superior a 20 k Ω, puede 
deberse a que haya restos de la sustancia problema recubriendo la superficie epidérmica del disco de piel. Puede intentarse la elimina ­
ción de este recubrimiento, por ejemplo, sellando el tubo de PTFE 
con el pulgar cubierto de un guante y agitándolo aproximadamente 
10 segundos; se tira la solución de MgSO
 4 y se repite la medición de 
la resistencia con solución nueva de MgSO  4 . 
Las propiedades y dimensiones del instrumental y el procedimiento 
experimental utilizado pueden influir en los valores obtenidos de 
RET. El umbral de corrosión de 5 k Ω se ha determinado a partir 
de datos obtenidos con el instrumental y el procedimiento concretos descritos en el presente método. Si se modifican las condiciones del ensayo o se utiliza un instrumental diferente, es posible que deban 
aplicarse diferentes umbrales y valores de control. Por tanto, es 
necesario calibrar el método y los valores umbral de resistencia sometiendo a ensayo una serie de de patrones de referencia elegidos de entre las sustancias utilizadas en el estudio de validación (4) (5) o 
de clases químicas similares a las sustancias problema. En el cuadro 
1 se ofrece un conjunto de sustancias de referencia adecuadas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Métodos de fijación de colorante  
La exposición de determinados materiales no corrosivos puede dar 
lugar a una reducción de la resistencia por debajo del umbral de 5 kΩ por permitir el paso de iones a través de la capa córnea, reduciendo 
así la resistencia eléctrica (5). Por ejemplo, los productos orgánicos 
neutros y las sustancias químicas que tienen propiedades tensoactivas (incluidos los detergentes, emulgentes y otros agentes tensoactivos) pueden eliminar lípidos cutáneos, lo que aumenta la permeabilidad 
de la barrera a los iones. Así pues, si los valores de RET de una 
sustancia problema están por debajo o cerca de 5 k Ω, sin que visual ­
mente se aprecien lesiones, deberá efectuarse una evaluación de la 
penetración de colorante en los tejidos tratado y de control, a fin de 
determinar si los valores de RET obtenidos son resultado de un au ­
mento de la permeabilidad de la piel o bien de la corrosión de esta (3) (5). En este último caso, si la capa córnea está destruida, el colorante 
sulforrodamina B aplicado a la superficie de la piel penetra rápidamente 
en el tejido subyacente y lo tiñe. Este colorante en particular es estable ante una amplia gama de sustancias y no se ve afectado por el proce ­
dimiento de extracción que se describe más abajo.
 
1.5.5.1.  Aplicación y eliminación del colorante sulforrodamina B  
Tras la evaluación de la RET, se retira el sulfato de magnesio del tubo y 
se examina cuidadosamente la piel para detectar la presencia de lesio ­
nes evidentes. Si no hay ninguna lesión evidente importante, se aplican durante 2 horas a la superficie epidérmica de cada disco de piel 150 μL 
de una dilución al 10 % (p/v) del colorante sulforrodamina B (Acid Red 
52; C.I. 45100; n
 o EINECS 222-529-8; n  o CAS 3520-42-1) en agua 
destilada. Después se lavan estos discos de piel con agua del grifo, durante unos 10 segundos y a temperatura no superior a la ambiente, 
para eliminar el exceso de colorante no fijado. Cada disco de piel se 
retira cuidadosamente del tubo de PTFE y se coloca en un frasco (por ejemplo, un frasco de cristal de centelleo de 20 mL) con agua desio ­
nizada (8 mL). Los frascos se agitan suavemente durante 5 minutos 
para eliminar los eventuales restos de colorante no fijado. Este proce ­
dimiento de aclarado se repite a continuación, después de lo cual se retiran los discos cutáneos y se colocan en frascos que contengan 5 ml de dodecilsulfato sódico (SDS) al 30 % (p/v) en agua destilada y se 
dejan incubar una noche a 60
 o C. 
Después de la incubación, se retiran y desechan los discos de piel y 
la solución restante se centrifuga durante 8 minutos a 21  o C (fuerza 
centrífuga relativa ~175 × g). Luego, se diluye de 1 a 5 (v/v) [es 
decir, 1 mL + 4 mL] una alícuota de 1 mL del sobrenadante con 
dodecilsulfato sódico al 30 % (p/v) en agua destilada. Se mide la densidad óptica (DO) de la solución a 565 nm.
 
1.5.5.2.  Cálculo del contenido de colorante  
El contenido del colorante sulforrodamina B por disco se calcula a 
partir de los valores de DO (5) (coeficiente de extinción molar del 
colorante sulforrodamina B a 565 nm = 8,7 × 10  4 ; peso molecular = 
580). Se determina el contenido de colorante de cada disco de piel utilizando una curva de calibración adecuada, y después se calcula la 
media del contenido de colorante de las muestras paralelas.
 
2. DATOS  
Deben indicarse en un cuadro los valores de resistencia (k Ω) y los 
valores medios de contenido de colorante ( μg/disco), en su caso, 
correspondientes al material problema y a los controles positivos y negativos (todos los datos del ensayo y las medias ± D.T.), incluidos 
los datos de las muestras paralelas o de experimentos repetidos, las 
medias y cada uno de los valores.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los resultados medios de la RET se aceptan a condición de que los 
valores de los controles positivos y negativos correspondientes que ­
den dentro de los intervalos aceptables para el método en el labora ­
torio de ensayo. Los intervalos aceptables de resistencia del método 
y del instrumental antes descritos se indican en el cuadro siguiente:  
Control Sustancia Intervalo de 
resistencia (k Ω) 
Positivo Ácido clorhídrico 10 M 0,5-1,0 
Negativo Agua destilada 10-25 
Los resultados medios de fijación del colorante se aceptan a condi ­
ción de que los valores de los controles correspondientes queden dentro de los intervalos aceptables para el método. A continuación se dan los intervalos de contenido de colorante aceptables que se 
proponen para las sustancias de control con el método y el instru ­
mental antes descritos:
 
Control Sustancia Intervalo del 
contenido de 
colorante ( μg/ 
disco)  
Positivo Ácido clorhídrico 10 M 40-100 
Negativo Agua destilada 15-35 
Se considera que la sustancia problema no es corrosiva para la piel: 
i) si el valor medio de RET de la sustancia que se ha obtenido es 
superior a 5 k Ω, o 
ii) si el valor medio de RET es inferior o igual a 5 k Ω, y 
— el disco de piel no muestra ninguna lesión evidente, y 
— el contenido medio de colorante del disco está muy por de ­
bajo del contenido medio de colorante del disco del control 
positivo de HC1 10 M obtenido en paralelo. 
Se considera que la sustancia problema es corrosiva para la piel: 
i) si el valor medio de RET es inferior o igual a 5 k Ω y el disco de 
piel muestra lesiones evidentes, o 
ii) si el valor medio de RET es inferior o igual a 5 k Ω, y 
— el disco de piel no muestra ninguna lesión evidente, pero — el contenido medio de colorante del disco es mayor o igual al 
contenido medio de colorante del disco del control positivo de 
HC1 10 M obtenido en paralelo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DE ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancias problema y de control: — denominación química, como nombre IUPAC o CAS y número 
CAS, si se conoce, 
— pureza y composición de la sustancia o preparado (en porcentaje 
ponderal) y naturaleza física, 
— propiedades físico-químicas pertinentes para la realización del 
estudio, como estado físico, pH, estabilidad o hidrosolubilidad, 
— tratamiento de las sustancias problema y de control antes del 
ensayo, en su caso (por ejemplo, calentamiento, trituración), 
— estabilidad, si se conoce. Animales de ensayo: — cepa y sexo utilizados, — edad de los animales en el momento de quitarles la piel, — procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, etc., — datos de la preparación de la piel. Condiciones de los ensayos: — curvas de calibración del instrumental del ensayo, — curvas de calibración para el ensayo de fijación de colorante, — características del método utilizado para las mediciones de 
la RET, 
— características del método utilizado para la evaluación de la fija ­
ción del colorante, en su caso, 
— descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento 
del ensayo, 
— descripción de los criterios de evaluación seguidos. Resultados: — cuadro de datos del ensayo de RET y del de fijación de colorante 
(en su caso) correspondientes a los distintos animales y a las 
distintas muestras de piel, 
— descripción de los eventuales efectos observados. Discusión de los resultados. Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
1 OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Subs ­
tances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:// 
www.olis.oecd.org/olis/2001 doc.nsf/LinkTo/env-jm-mo ­
no(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2 Método de ensayo B.4. Toxicidad aguda: irritación/corrosión 
cutánea. 
3 Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Le ­
wis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). 
A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. The 
report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255. 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international valida ­
tion study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection and 
distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471-482. 
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by 
the Management Team. Toxic. In Vitro 12, 483-524. 
6. OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Harmo ­
nization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative 
Toxicological Test Methods, 62 pp. 
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spiel ­
mann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the valida ­
tion of toxicity test procedures. The report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147. 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory 
Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
docs/guidelines/validate.pdf 
9. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280. 10. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test met ­
hods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicolo ­
gical Methods, National Institute of Environmental Health Scien ­
ces, Research Triangle Park, NC, USA. http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf. 
11. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27
 th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat 
12. Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  in 
vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13. Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. 
(1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an interla ­
boratory trial. Toxic. in Vitro 6, 191-194. 
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 
709-720. 
15. Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., 
Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852. 
16. Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Inicial 
Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7-17.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Figura 1  
Instrumental para el ensayo de la RET en piel de rata
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Figura 2  
Dimensiones del tubo de politetrafluoretileno (PTFE), de la cámara receptora y de 
los electrodos usados
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Factores críticos del instrumental mostrado arriba:  
— el diámetro interior del tubo de PTFE, — la longitud de los electrodos respecto al tubo de PTFE y a la 
cámara receptora, de forma que el disco de piel no toque los 
electrodos y que haya en contacto con la solución de MgSO
 4 una 
longitud fijada de electrodo, 
— la cantidad de solución de MgSO  4 presente en la cámara recep ­
tora debe hacer que el líquido tenga cierta profundidad respecto al nivel dentro del tubo de PTFE, como se indica en la figura 1, 
— el disco de piel debe fijarse bien al tubo de PTFE, de forma que 
la resistencia eléctrica sea una medida fiel de las propiedades de 
la piel.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40  BIS. CORROSIÓN CUTÁNEA  IN VITRO:  ENSAYO CON MODELO 
DE PIEL HUMANA  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de 
ensayo de la OCDE TG 431(2004).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
La corrosión cutánea se refiere a la producción de daños tisulares 
irreversibles en la piel tras la aplicación de una sustancia [según la 
definición del Sistema Armonizado Mundial  (Globally Harmonized 
System,  GHS) de clasificación y etiquetado de productos químicos] 
(1). El presente método de ensayo no exige el uso de animales vivos 
ni de tejidos animales para la evaluación de la corrosividad cutánea. 
Tradicionalmente, la evaluación de la corrosividad cutánea se hacía 
con animales de laboratorio (2). La preocupación por el dolor y el 
sufrimiento que implicaba esa evaluación se ha tenido en cuenta en 
la revisión del método de ensayo B.4, para permitir la determinación de la corrosión cutánea mediante métodos alternativos,  in vitro,  que 
eviten el dolor y el sufrimiento de los animales. 
Un primer paso hacia la definición de métodos alternativos que se 
pudieran utilizar en los ensayos de corrosividad cutánea con fines 
normativos fue la realización de estudios de prevalidación (3). Pos ­
teriormente se llevó a cabo un estudio oficial de validación de mé ­
todos  in vitro  para evaluar la corrosión cutánea (4) (5) (6) (7) (8). 
Como consecuencia de estos estudios y de otros datos publicados 
(9), se llegó a la recomendación de que los siguientes métodos 
podían utilizarse para predecir el efecto corrosivo  in vivo  de la 
piel (10) (11) (12) (13): el ensayo con un modelo de piel humana (el presente método) y el ensayo de resistencia eléctrica transcutánea 
(véase el método de ensayo B.40). 
Los estudios de validación han señalado que los ensayos que utilizan 
modelos de piel humana (3) (4) (5) (9) pueden discriminar de manera 
fiable entre agentes corrosivos y no corrosivos cutáneos conocidos. 
El protocolo del ensayo puede distinguir asimismo entre agentes corrosivos cutáneos fuertes y menos fuertes. 
El ensayo descrito en el presente método permite la identificación de 
sustancias químicas y mezclas corrosivas. Asimismo, permite la identificación de sustancias y mezclas no corrosivas con el apoyo 
de pruebas sopesadas derivadas de otro tipo de información disponi ­
ble (por ejemplo, pH, relaciones estructura-actividad, datos con hom ­
bres o animales) (1) (2) (13) (14). En principio, no da información adecuada sobre la irritación cutánea ni permite la subcategorización 
de sustancias corrosivas que se contempla en el Sistema Armonizado 
Mundial de clasificación (1). 
Para una evaluación completa de los efectos cutáneos locales tras 
una única exposición de la piel, se recomienda seguir la estrategia de 
ensayos secuenciales que figura adjunta al método de ensayo B.4 (2) y que proporciona el Sistema Armonizado Mundial (1). Esta estra ­
tegia de ensayos incluye la realización de pruebas  in vitro  de corro ­
sión cutánea (como las descritas en el presente método) y de irrita ­
ción cutánea antes de considerar las pruebas con animales vivos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. DEFINICIONES 
Se entenderá por:  
corrosión cutánea  in vivo  la producción de lesiones cutáneas irre ­
versibles consistentes en necrosis visible en todo el espesor de la 
epidermis y hasta en la dermis, debida a la aplicación de una sus ­
tancia durante hasta 4 horas; las reacciones de corrosión se tipifican como úlceras, hemorragia, costras hemorrágicas y, hacia el final del 
período de observación de 14 días, como decoloración de la piel, 
zonas de alopecia completa y cicatrices; debe recurrirse a la histo ­
patología para evaluar las lesiones dudosas;  
viabilidad celular  el parámetro que mide la actividad total de una 
población celular (por ejemplo, capacidad de las deshidrogenasas 
mitocondriales celulares para reducir el colorante vital MTT), que, según el efecto que se mida y el tipo de ensayo realizado, se co ­
rresponde con el número total o con la vitalidad de las células.
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA  
Cuadro 1  
Sustancias de referencia  
Denominación N  o EINECS N  o CAS 
1,2-diaminopropano 201-155-9 78-90-0 Fuertemente corrosivo 
Ácido acrílico 201-177-9 79-10-7 Fuertemente corrosivo 
2-terc-butilfenol 201-807-2 88-18-6 Corrosivos 
Hidróxido de potasio (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosivos Ácido sulfúrico (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosivos Ácido octanoico (ácido caprílico) 204-677-5 124-07-02 Corrosivos 4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 No corrosivo Eugenol 202-589-1 97-53-0 No corrosivo 
Bromuro de fenetilo 203-130-8 103-63-9 No corrosivo 
Tetracloroetileno 204-825-9 27-18-4 No corrosivo Ácido isoesteárico 250-178-0 30399-84-9 No corrosivo 4-(metiltio)-benzaldehído 222-365-7 3446-89-7 No corrosivo 
La mayoría de estas sustancias proceden de la lista de sustancias 
seleccionadas para el estudio internacional de validación del EC ­
VAM (4). Su elección se basa en los criterios siguientes: 
i) igual número de sustancias corrosivas y no corrosivas, 
ii) sustancias disponibles en el comercio y representativas de la 
mayoría de las clases químicas pertinentes, 
iii) inclusión de sustancias fuertemente corrosivas y de sustancias 
menos corrosivas para permitir la discriminación según la poten ­
cia corrosiva,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) elección de sustancias que puedan manipularse en un laboratorio 
sin plantear peligros graves aparte de la corrosividad.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
El material problema se aplica tópicamente a un modelo tridimen ­
sional de piel humana que comprende al menos una epidermis re ­
construida con una capa córnea funcional. Los materiales corrosivos 
se caracterizan por su capacidad de producir una disminución de la 
viabilidad celular [determinada, por ejemplo, utilizando el ensayo de reducción del MTT (15)] por debajo de determinados umbrales en períodos de exposición especificados. El principio del ensayo con 
modelo de piel humana se basa en la hipótesis de que las sustancias 
corrosivas pueden penetrar en la capa córnea por difusión o erosión, y son citotóxicas para las células de las capas subyacentes.
 
1.4.1.  Procedimiento  
1.4.1.1.  Modelos de piel humana  
Los modelos de piel humana pueden construirse u obtenerse en el 
comercio (por ejemplo, los modelos EpiDerm  MR y EPISKIN  MR ) (16) 
(17) (18) (19), o bien desarrollarse o construirse en el laboratorio de ensayo (20) (21). Se sabe que el uso de piel humana es objeto de 
condiciones y consideraciones éticas tanto nacionales como interna ­
cionales. Todo nuevo modelo debe validarse (al menos en la medida descrita en el punto 1.4.1.1.2). Los modelos de piel humana utiliza ­
dos para este ensayo deben cumplir las siguientes condiciones:
 
1.4.1.1.1. C o n d i c i o n e s g e n e r a l e s d e l m o d e l o 
Para construir el epitelio deben utilizarse queratinocitos humanos. 
Bajo una capa córnea funcional, debe haber presentes múltiples ca ­
pas de células epiteliales viables. El modelo de piel puede tener 
asimismo una capa de componentes del estroma. La capa córnea 
debe constar de múltiples estratos con el perfil lipídico necesario para constituir una barrera funcional con la suficiente resistencia contra la penetración rápida de marcadores citotóxicos. Las propie ­
dades de aislamiento del modelo deben evitar que pase material 
rodeando la capa córnea hasta el tejido viable. El paso de sustancias problema rodeando la capa córnea reduce la calidad del modelo en 
cuanto a la exposición de la piel. El modelo de piel debe estar exento 
de contaminación por bacterias (incluidos micoplasmas) y hongos.
 
1.4.1.1.2. C o n d i c i o n e s f u n c i o n a l e s d e l m o d e l o 
La magnitud de la viabilidad se cuantifica normalmente utilizando 
MTT o los otros colorantes vitales que se transforman en el meta ­
bolismo. En estos casos, la densidad óptica (DO) del colorante ex ­
traído (solubilizado) del tejido de control negativo debe ser al menos 20 veces mayor que la DO del disolvente de extracción solo [para 
una visión general, consúltese (22)]. El tejido de control negativo 
debe ser estable en cultivo (proporcionar unas mediciones similares de la viabilidad) durante la duración del tiempo de exposición del ensayo. La capa córnea debe tener la suficiente resistencia contra la 
penetración rápida de determinados marcadores citotóxicos (por 
ejemplo, tritón X-100 al 1 %). Esta propiedad puede estimarse me ­
diante el tiempo de exposición necesario para reducir la viabilidad celular en un 50 % (TE
 50 ) (por ejemplo, en el caso de los modelos 
EpiDerm  MR y EPISKIN  MR , es > 2 horas). Los resultados obtenidos 
con el tejido han de poder reproducirse posteriormente y, de prefe ­
rencia, en otros laboratorios. Por otra parte, el tejido ha de ser tal que permita prever el potencial corrosivo de las sustancias de referencia 
(véase el cuadro 1) cuando se utiliza en el protocolo de ensayo 
seleccionado.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Aplicación de las sustancias problema y de control  
Por cada tratamiento (tiempo de exposición), incluidos los controles, se 
utilizan dos muestras de tejido. En caso de materiales líquidos, debe aplicarse una cantidad de sustancia problema suficiente para cubrir 
uniformemente la superficie cutánea (un mínimo de 25 μL/cm
 2 . 
En caso de materiales sólidos, tiene que aplicarse uniformemente una cantidad suficiente de sustancia problema para cubrir la piel y debe humedecerse con agua desionizada o destilada para asegurar un buen 
contacto con la piel. Cuando convenga, deberán triturarse los sólidos 
para transformarlos en polvo antes de su aplicación. El método de apli ­
cación debe ser adecuado para la sustancia problema (véase, por ejemplo, 
la cita bibliográfica 5). Al final del período de exposición, el material 
problema debe retirarse cuidadosamente de la superficie de la piel lavando con una solución amortiguadora adecuada o con NaCl al 0,9 %. 
En cada estudio deben utilizarse a la vez controles positivos y 
negativos para garantizar el funcionamiento adecuado del modelo 
experimental. Las sustancias de control positivo que se proponen son ácido acético glacial o KOH 8 N. Los controles negativos propuestos son NaCl al 0,9 % o agua.
 
1.4.1.3.  Medición de la viabilidad celular  
Para medir la viabilidad celular solo pueden emplearse métodos cuan ­
titativos validados. Por otra parte, la medición de la viabilidad debe ser compatible con el uso de un modelo de tejido tridimensional. La me ­
dición de la viabilidad no debe sufrir ninguna interferencia con una 
fijación inespecífica del colorante. Por tanto, no son adecuados los 
colorantes que se fijan a proteínas ni los que no se transforman en el metabolismo (por ejemplo, el rojo neutro). El ensayo más utilizado es la reducción del MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil ­
tetrazolio, azul de tiazolilo: número EINECS 206-069-5, número CAS 
298-93-1)], que, según se ha demostrado, da resultados exactos y re ­
producibles (5), pero también pueden utilizarse otros. La muestra de piel se coloca en una solución de MTT de la concentración adecuada 
(por ejemplo, 0,3-1 mg/mL), a una temperatura adecuada de incuba ­
ción, durante 3 horas. A continuación, utilizando un disolvente (iso ­
propanol), se extrae el precipitado que se produce de formazano azul y se mide la concentración de formazano determinando la DO a una 
longitud de onda entre 540 y 595 nm. 
Es posible que la acción química de la sustancia problema sobre el 
colorante vital imite a la del metabolismo celular, provocando una estimación falsa de la viabilidad. Se ha visto que esto sucede cuando 
una sustancia problema de este tipo no se elimina completamente de 
la piel mediante lavado (9). Si la sustancia problema actúa directa ­
mente sobre el colorante vital, deben utilizarse controles adicionales para detectar y corregir la interferencia de la sustancia problema con 
la medición de la viabilidad (9) (23).
 
2. DATOS  
Respecto a cada tejido, deben recogerse en un cuadro los valores de 
DO y los porcentajes calculados de viabilidad celular de la sustancia problema y de los controles positivo y negativo, incluidos los datos 
de los experimentos repetidos paralelos en su caso, con cada uno de 
los valores obtenidos y la media.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los valores de DO obtenidos con cada muestra problema pueden utili ­
zarse para calcular un porcentaje de viabilidad respecto al control nega ­
tivo, que se fija arbitrariamente en el 100 %. Es necesario definir clara ­
mente y documentar, así como demostrar que es adecuado, el porcentaje 
límite de viabilidad celular que permite distinguir entre sustancias pro ­
blema corrosivas y no corrosivas (o discriminar entre diferentes tipos de sustancias corrosivas), o el método o métodos estadísticos utilizados para 
evaluar los resultados y señalar las sustancias corrosivas. En general, 
estos valores límite se establecen durante la fase de optimización del ensayo, se prueban durante una fase de prevalidación y se confirman en 
un estudio de validación. Como ejemplo, la predicción de corrosividad 
asociada con el modelo EpiDerm
 MR es la siguiente (9): 
Se considera que la sustancia problema es  corrosiva para la piel: 
i) si la viabilidad tras 3 minutos de exposición es inferior al 50 %, o 
ii) si la viabilidad tras 3 minutos de exposición es superior o igual al 
50 % y la viabilidad tras una hora de exposición es inferior al 15 %. 
Se considera que la sustancia problema  no es corrosiva para la piel: 
i) si la viabilidad tras 3 minutos de exposición es superior o igual al 
50 % y la viabilidad tras una hora de exposición es superior o igual al 15 %.
 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DE ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancias problema y de control: — denominación química, como nombre IUPAC o CAS y número 
CAS, si se conoce, 
— pureza y composición de la sustancia o preparado (en porcentaje 
ponderal), 
— propiedades físico-químicas pertinentes para la realización del 
estudio, como estado físico, pH, estabilidad, hidrosolubilidad; 
— tratamiento de las sustancias problema y de control antes del 
ensayo, en su caso (por ejemplo, calentamiento, trituración), 
— estabilidad, si se conoce. Justificación del modelo de piel y del protocolo utilizados. Condiciones de ensayo: 
— sistema celular utilizado, 
— información sobre la calibración del aparato utilizado para medir 
la viabilidad celular (por ejemplo, espectrofotómetro),
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— información complementaria completa sobre el modelo concreto 
de piel utilizado, incluida su validez, 
— particularidades del procedimiento de ensayo empleado, — dosis utilizadas en el ensayo, 
— descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento 
del ensayo, 
— referencia a datos anteriores del modelo, 
— descripción de los criterios de evaluación seguidos. 
Resultados: 
— cuadro de datos de las distintas muestras problema, 
— descripción de otros efectos observados. Discusión de los resultados. 
Conclusión.
 
4. REFERENCIAS  
1. OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Subs ­
tances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment 
Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:// www.olis.oecd.org/olis/200 1doc.nsf/LinkTo/env-jm-mo ­
no(2001)6. 
2. Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corro ­
sion. 
3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Le ­
wis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). 
A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. The 
report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23,219- 255. 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international valida ­
tion study on  in Vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection and 
distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471-482. 
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team.  Toxic. In Vitro 12, 483-524.  
6. OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62pp. 
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147. 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Scien ­
ces, Research Triangle Park, NC, USA. http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9. Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM pre ­
validation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371-401. 
10. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280. 
11. ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67. 12. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDerm
 TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test met ­
hods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. 
NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicolo ­
gical Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf. 
13. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2nd 
November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27
 th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat 
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720. 
15. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55-63. 
16. Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy tes ­
ting. Toxic. In Vitro 8, 889-891. 
17. Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characte ­
rization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211-225. 
18. Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Pou ­
radier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133-140 
19. Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, Thi ­
volet J (1991). In vitro and post -transplantation differentiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Re ­
search 193:310-319 
20. Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosen ­
berg, H. (1992). The organotypic culture of human skin kerati ­
nocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytote ­
chnology 9, 163-171. 
21. Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Pa ­
rentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, 747-756.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22. Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical as ­
sessment of the use of microculture tetrazolium assays to mea ­
sure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84. 
23. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C., Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. In  Vitro  15, 57-93.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  ENSAYO DE FOTOTOXICIDAD  IN VITRO  3T3 ARN 
(ABSORCIÓN DE ROJO NEUTRO)  
1. MÉTODO  
El presente método es equivalente a las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 432 (2004).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
La fototoxicidad se define como una respuesta tóxica ante una sus ­
tancia aplicada al cuerpo que es provocada o aumentada (se hace 
perceptible a dosis menores) tras una exposición posterior a la luz, o 
que es inducida por irradiación de la piel tras la administración sistémica de una sustancia. 
El ensayo de fototoxicidad  in vitro  3T3 ARN se emplea para iden ­
tificar el potencial fototóxico de una sustancia problema inducido por la sustancia excitada tras su exposición a la luz. El ensayo evalúa la fototoxicidad mediante la reducción relativa de la viabilidad de las 
células expuestas a la sustancia en presencia de luz, respecto a las 
expuestas en la oscuridad. Es probable que las sustancias identifica ­
das mediante este ensayo sean fototóxicas  in vivo,  tras su aplicación 
sistémica seguida de su distribución a la piel, o tras una aplicación 
tópica. 
Se han señalado numerosos tipos de sustancias químicas que produ ­
cen efectos fototóxicos (1) (2) (3) (4). Tienen en común la capacidad 
de absorber energía luminosa del espectro de la luz solar. Con arre ­
glo a la primera ley de la fotoquímica (ley de Grotthaus-Draper), para que se produzca una fotorreacción es necesaria la absorción suficiente de cuantos de luz. Por tanto, antes de plantearse la reali ­
zación de ensayos biológicos, debe determinarse el espectro de ab ­
sorción de luz UV/visible de la sustancia problema según las direc ­
trices de ensayo TG 101 de la OCDE. Se ha indicado la escasa probabilidad de que una sustancia sea fotorreactiva si su coeficiente 
de absorción/extinción molar es inferior a 10 litros × mol
 -1 × cm  -1 . 
Es posible que las sustancias de este tipo no tengan que someterse al ensayo de fototoxicidad  in vitro  3T3 ARN ni a ningún otro ensayo 
biológico de efectos fotoquímicos adversos (1) (5). Véase también a 
este respecto el anexo 1. 
La fiabilidad y la pertinencia del ensayo de fototoxicidad  in vitro  
3T3 ARN se han evaluado recientemente (6) (7) (8) (9). Se ha 
comprobado que este ensayo sirve para predecir los efectos de foto ­
toxicidad aguda  in vivo  en animales y en el hombre. Por el contrario, 
no está concebido para predecir otros efectos adversos que puedan deberse a la acción combinada de una sustancia y de la luz; así, por 
ejemplo, no se refiere a la fotogenotoxicidad, a la fotoalergia ni a la 
fotocarcinogénesis, y tampoco permite la evaluación de la potencia fototóxica. Tampoco se ha designado el ensayo para estudiar meca ­
nismos indirectos de fototoxicidad, efectos de metabolitos de la sus ­
tancia problema ni efectos de mezclas. 
Si bien en general es necesario utilizar sistemas de metabolización en 
todos los ensayos  in vitro  de predicción del potencial genotóxico o 
carcinogénico, en el caso de la fototoxicología hasta la fecha solo se 
conocen escasos ejemplos de que una sustancia química requiera una transformación metabólica para actuar como fototoxina  in vivo  o in 
vitro.  Por consiguiente, no resulta necesario ni está fundado cientí ­
ficamente realizar el presente ensayo con un sistema de activación 
metabólica.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. DEFINICIONES 
Se entenderá por:  
irradiancia  la intensidad de luz ultravioleta (UV) o visible que 
incide en una superficie, medida en W/m  2 o mW/cm  2 ; 
dosis de luz  la cantidad (= intensidad × tiempo) de radiación ultra ­
violeta (UV) o visible que incide en una superficie, expresada en 
julios (= W × s) por unidad de superficie, por ejemplo J/m  2 o J/cm  2 ; 
bandas de luz UV  las siguientes designaciones recomendadas por la 
CIE (Commission Internationale de l'Eclairage):  UVA (315- 
400 nm), UVB (280-315 nm) y UVC (100-280 nm); también se 
emplean otras designaciones: la separación entre UVB y UVA se sitúa con frecuencia en 320 nm y las radiaciones UVA pueden subdividirse en UV-A1 y UV-A2, con una separación a 340 nm 
aproximadamente;  
viabilidad celular  el parámetro que mide la actividad total de una 
población celular (por ejemplo, absorción del colorante vital rojo neutro por los lisosomas celulares), que, según el efecto que se 
mida y el tipo de ensayo realizado, se corresponde con el número 
total o con la vitalidad de las células;  
viabilidad celular relativa  la viabilidad celular respecto a la de los 
controles negativos (disolvente) que se someten a todo el procedi ­
miento de ensayo (+ Irr o - Irr), pero no se tratan con la sustancia problema;  
PIF (Photo Irritation Factor  — factor de fotoirritación)  el factor 
que se obtiene comparando dos concentraciones citotóxicas igual ­
mente eficaces (CI50) de la sustancia problema con irradiación no citotóxica de luz UVA/visible (+ Irr) y sin dicha irradiación (- Irr); 
CI
 50 la concentración de la sustancia problema a la que la viabilidad 
celular se reduce en un 50 %;  
MPE  (Mean Photo Effect  — fotoefecto medio)  la medida derivada 
del análisis matemático de las curvas respuesta-concentración obte ­
nidas con una irradiación no citotóxica de luz UVA/visible (+ Irr) y sin dicha irradiación (- Irr);  
fototoxicidad  la reacción tóxica aguda provocada tras una primera 
exposición de la piel a determinadas sustancias químicas y su pos ­
terior exposición a la luz, o inducida análogamente por irradiación de la piel tras la administración sistémica de una sustancia química.
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
El ensayo de fototoxicidad  in vitro  3T3 ARN se basa en la compa ­
ración de la citotoxicidad de una sustancia cuando se somete a ensayo con exposición y sin exposición a una dosis no citotóxica 
de luz solar simulada. La citotoxicidad en este ensayo se expresa 
como la disminución, ligada a la concentración, de la absorción del colorante vital rojo neutro a las 24 horas de la administración de la sustancia problema y la irradiación (10). El rojo neutro es un colo ­
rante catiónico débil que penetra fácilmente a través de las mem ­
branas celulares por un mecanismo distinto de la difusión, y se acumula intracelularmente en los lisosomas. Las alteraciones de la superficie de la sensible membrana de los lisosomas provocan un 
aumento de la fragilidad de estos, junto con otros cambios que 
gradualmente se van haciendo irreversibles. Tales cambios inducidos por la acción de agentes xenobióticos ocasionan un descenso de la absorción y fijación del rojo neutro, con lo que es posible distinguir 
entre células viables, lesionadas y muertas, lo que constituye la base 
del ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Se mantienen en cultivo células Balb/c 3T3 durante 24 horas para 
que se formen monocapas. Se preincuban durante 1 hora dos placas 
de 96 pocillos por sustancia problema, con 8 concentraciones dife ­
rentes de esta sustancia. Después se expone una de las dos placas a la dosis máxima de irradiación no citotóxica, mientras que la otra 
placa se mantiene a oscuras. A continuación se sustituye en ambas 
placas el medio de tratamiento por medio de cultivo y, tras otras 24 horas de incubación, se determina la viabilidad celular mediante la absorción de rojo neutro. La viabilidad celular se expresa en porcen ­
taje respecto a los controles de disolvente sin tratar y se calcula para 
cada una de las concentraciones del ensayo. Para predecir el poten ­
cial fototóxico, se comparan las respuestas a las distintas concentra ­
ciones obtenidas con y sin irradiación, por lo general al nivel CI
 50 , 
es decir, a la concentración que reduce la viabilidad celular en un 
50 % respecto a los controles sin tratar.  
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Preparación  
1.4.1.1.  Células  
En el estudio de validación se utilizó una línea celular de fibroblastos 
permanentes de ratón, la Balb/c 3T3, clon 31, bien de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, VA, EEUU, o bien de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury, 
Wiltshire, RU, por lo que se recomienda obtenerla de una colección 
reconocida. También pueden utilizarse con el mismo protocolo de ensayo otras células o líneas celulares, siempre y cuando las condi ­
ciones de cultivo se adapten a las necesidades particulares de las 
células, si bien en tal caso debe demostrarse la equivalencia de los 
resultados. 
Debe comprobarse periódicamente que las células están libres de 
contaminación por micoplasmas y solo se utilizarán si se confirma 
la ausencia de estos microorganismos (11). 
Es importante comprobar periódicamente la sensibilidad de las célu ­
las a las radiaciones UV conforme al procedimiento de control de calidad descrito en el presente método. Dado que la sensibilidad de las células a las radiaciones UVA puede aumentar con el número de 
pases, deben emplearse células Balb/c 3T3 sometidas al menor nú ­
mero posible de pases, preferentemente menos de 100. (Véanse el punto 1.4.2.2.2 y el anexo 2).
 
1.4.1.2.  Medios y condiciones de cultivo  
Deben emplearse medios de cultivo y condiciones de incubación 
apropiados para los pases celulares corrientes y durante el ensayo; 
por ejemplo, en el caso de células Balb/c 3T3, el medio de cultivo es DMEM  (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)  enriquecido con un 
10 % de suero de ternera recién nacida, glutamina 4 mM, penicilina 
(100 UI) y estreptomicina (100 μg/ml), y la incubación ha de hacerse 
en atmósfera humidificada, a 37
 o C, con 5-7,5 % de CO  2 según el 
amortiguador (véase el segundo párrafo del punto 1.4.1.4). Es parti ­
cularmente importante que las condiciones del cultivo celular permi ­
tan mantener la duración del ciclo celular dentro de los límites 
normales conocidos de la línea celular o las células utilizadas.  
1.4.1.3.  Preparación de los cultivos  
Se siembran en medio de cultivo, a una densidad apropiada, células 
procedentes de cultivos madre congelados y se subcultivan al menos 
una vez antes de utilizarlas en el ensayo de fototoxicidad  in vitro  
3T3 ARN.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Para el ensayo de fototoxicidad, las células se siembran en el medio 
de cultivo a una densidad apropiada de manera que los cultivos no 
confluyan antes de que finalice el ensayo, es decir, cuando se deter ­
mine la viabilidad celular 48 horas después de la siembra celular. Para las células Balb/c 3T3 cultivadas en placas de 96 pocillos, se 
recomienda una densidad de siembra de 1 × 10
 4 células por pocillo. 
Por cada sustancia problema se siembran las células de igual modo 
en dos placas distintas de 96 pocillos, que se mantendrán en paralelo 
en condiciones de cultivo idénticas a lo largo de todo el ensayo, excepto durante el tiempo en que una de ellas se irradia (+ Irr) y la 
otra se mantiene en la oscuridad (- Irr).
 
1.4.1.4.  Preparación de la sustancia problema  
Las sustancias problema deben prepararse justo antes de su empleo, 
salvo que se disponga de datos que demuestren que pueden conser ­
varse estables. Se recomienda efectuar todas las manipulaciones quí ­
micas y el tratamiento inicial de las células en unas condiciones 
luminosas que eviten la fotoactivación o la degradación de la sus ­
tancia problema antes de la irradiación. 
Las sustancias problema se disuelven en soluciones salinas amorti ­
guadoras, como la solución salina equilibrada de Earle  (Earle's Ba ­
lanced Salt Solution,  EBSS) u otras soluciones amortiguadoras equi ­
libradas fisiológicamente, que no deben contener componentes pro ­
teínicos ni absorbentes de la luz (por ejemplo, colorantes indicadores de pH y vitaminas), con el fin de evitar interferencias durante la irradiación. Como durante la irradiación las células se mantienen 
unos 50 minutos fuera de la incubadora de CO
 2 , debe tenerse cui ­
dado para evitar la alcalinización. Si se utilizan amortiguadores dé ­
biles, como la EBSS, esto puede conseguirse incubando las células con un 7,5 % de CO
 2 . Si las células se incuban solo con un 5 % de 
CO 2 , debe elegirse un amortiguador más fuerte. 
Las sustancias problema de hidrosolubilidad limitada deben disol ­
verse en un disolvente adecuado. Si se emplea un disolvente, debe encontrarse a un volumen constante en todos los cultivos, es decir, en los controles negativos (disolvente) y en todas las concentraciones 
de la sustancia problema, y a esa concentración no debe ser citotó ­
xico. Las concentraciones de la sustancia problema deben elegirse de manera que se evite la aparición de precipitados o de turbidez. 
Se recomienda el uso de los disolventes dimetilsulfóxido (DMSO) y 
etanol (EtOH). También pueden ser útiles otros disolventes de baja 
citotoxicidad. Antes de utilizar cualquier disolvente, hay que com ­
probar ciertas propiedades del mismo como, por ejemplo, su capa ­
cidad de reacción con la sustancia problema, de atenuación del efecto fototóxico, de captación de radicales, o la estabilidad de la 
sustancia en el disolvente. 
Para facilitar la solubilización puede utilizarse un agitador mecánico, 
un baño de ultrasonidos o el calentamiento a temperatura adecuada, 
siempre que no se altere la estabilidad de la sustancia problema.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Condiciones de irradiación  
1.4.1.5.1. F u e n t e l u m i n o s a 
En el ensayo de fototoxicidad, es fundamental la elección de una 
fuente luminosa y de unos filtros adecuados. La luz de las regiones visible y UVA suele relacionarse con reacciones fototóxicas  in vivo  
(3) (12), mientras que generalmente la UVB reviste menor impor ­
tancia pero es muy citotóxica; la citotoxicidad se multiplica por 
1 000 cuando la longitud de onda pasa de 313 a 280 nm (13). Entre los criterios para elegir una fuente luminosa adecuada debe figurar el requisito de que esta emita longitudes de onda absorbidas por la 
sustancia problema (espectro de absorción) y que la dosis de luz 
(conseguida en un tiempo de exposición razonable) sea suficiente para detectar sustancias fotocitotóxicas conocidas. Además, las lon ­
gitudes de onda y las dosis empleadas no han de ser excesivamente 
nocivas para el sistema de ensayo, por ejemplo debido a la emisión 
de calor (región del infrarrojo). 
Se considera que la mejor fuente luminosa artificial son los simula ­
dores solares. La distribución de potencia de irradiación del simula ­
dor solar filtrado debe parecerse a la de la luz diurna al aire libre que se indica en (14). Se utilizan como simuladores solares tanto los arcos de xenón como los arcos de haluro metálico y mercurio (ce ­
bado) (15). Estos últimos presentan la ventaja de emitir menos calor 
y de ser más baratos, pero no reproducen la luz solar tan bien como los arcos de xenón. Dado que todos los simuladores solares emiten cantidades importantes de rayos UVB, deben emplearse los filtros 
adecuados para atenuar estas longitudes de onda altamente citotóxi ­
cas. Debido a que el material plástico para cultivo celular contiene estabilizadores de UV, el espectro debe medirse a través del mismo tipo de tapa de placa de 96 pocillos que se vaya a utilizar en el 
ensayo. Independientemente de las medidas tomadas para atenuar 
partes del espectro mediante filtración o mediante efectos filtrantes inevitables del equipo, el espectro registrado por debajo de estos filtros no debe desviarse de la luz diurna al aire libre normalizada 
(14). En (8) y (16) se recoge un ejemplo de la distribución de la 
irradiancia espectral del simulador solar con filtro utilizado en el estudio de validación del ensayo de fototoxicidad  in vitro  
3T3 ARN. Véase también la figura 1 del anexo 2.
 
1.4.1.5.2. D o s i m e t r í a 
La intensidad de la luz (irradiancia) debe comprobarse periódica ­
mente antes de cada ensayo de fototoxicidad utilizando un medidor 
adecuado de UV de banda ancha. La intensidad debe medirse a través del mismo tipo de tapa de placa de 96 pocillos que se vaya a utilizar en el ensayo. El medidor de UV tiene que haberse cali ­
brado en función de la fuente luminosa. Ha de comprobarse el 
correcto funcionamiento de dicho aparato, para lo cual se recomienda utilizar otro medidor de UV de referencia, del mismo tipo y cali ­
brado de igual manera. Lo ideal, a intervalos mayores, sería emplear 
un espectrorradiómetro para medir la irradiancia espectral de la 
fuente luminosa filtrada y comprobar el calibrado del medidor de UV de banda ancha. 
Se ha visto que una dosis de 5 J/cm
 2 (medida en la región UVA) no 
es citotóxica para las células Balb/c 3T3 y tiene la potencia sufi ­
ciente de excitación de sustancias químicas para producir reacciones fototóxicas (6) (17), por ejemplo para conseguir 5 J/cm
 2 dentro de un 
plazo de 50 min, se ajustó la irradiancia a 1,7 mW/cm  2 . Véase la 
figura 2 del anexo 2. Si se utiliza otra línea celular o una fuente 
luminosa diferente, es posible que la dosis de irradiación haya de calibrarse de manera que pueda elegirse un régimen de dosis inocuas para las células pero suficientes para excitar fototoxinas de referen ­
cia. La duración de la exposición a la luz se calcula de la manera 
siguiente:
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ dosis de irradiación  ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
irradiancia ðmW=cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Ws)  
1.4.2.  Condiciones del ensayo  
1.4.2.1.  Concentraciones de la sustancia problema  
Las gamas de concentraciones de la sustancia estudiada en presencia 
(+ Irr) y en ausencia (- Irr) de luz deben determinarse de forma adecuada mediante experimentos destinados a este fin. Puede ser útil evaluar la solubilidad al principio y a los 60 minutos (o el 
tiempo correspondiente al tratamiento que se vaya a utilizar), ya 
que la solubilidad puede cambiar a lo largo del tiempo o durante el proceso de exposición. Para evitar la toxicidad debida a unas condiciones de cultivo inadecuadas o a la presencia de sustancias 
muy ácidas o alcalinas, el pH de los cultivos celulares con la sus ­
tancia problema debe situarse entre 6,5 y 7,8. 
La concentración máxima de la sustancia problema debe respetar las 
condiciones fisiológicas de la prueba; por ejemplo, han de evitarse 
las tensiones osmóticas y de pH. Según la sustancia problema, puede 
ser necesario estudiar otras propiedades físico-químicas como posi ­
bles factores de limitación de la concentración máxima. Cuando se trate de sustancias relativamente insolubles que no sean tóxicas a 
concentraciones de hasta el punto de saturación, debe utilizarse la 
concentración máxima que se pueda conseguir. En general, debe evitarse la precipitación de la sustancia problema en cualquiera de las concentraciones del ensayo. La concentración máxima de una 
sustancia problema no debe superar los 1 000 μg/ml y la osmolaridad 
no debe pasar de 10 mmolar. Debe utilizarse una serie de diluciones geométricas de 8 concentraciones de la sustancia problema con un 
factor de dilución constante (véase el punto 2.1, párrafo segundo). 
Si se sabe (por un experimento de determinación de la gama de 
concentraciones) que la sustancia problema no es citotóxica hasta la concentración límite en el experimento sin luz (- Irr), pero es 
muy citotóxica cuando se ha irradiado (+ Irr), la gama de concen ­
traciones que debe seleccionarse para el experimento (+ Irr) puede ser diferente de la elegida para el experimento (- Irr) a fin de cumplir los requisitos de calidad de los datos.
 
1.4.2.2.  Controles  
1.4.2.2.1. S e n s i b i l i d a d d e l a s c é l u l a s a n t e l a r a d i a c i ó n ; o b ­
t e n c i ó n d e d a t o s p r e v i o s 
Debe comprobarse periódicamente (más o menos, cada cinco pases) 
la sensibilidad de las células ante la fuente luminosa, evaluando su viabilidad tras la exposición a dosis crecientes de radiación. En esta evaluación deben utilizarse varias dosis de radiación, incluyendo 
dosis sustancialmente más elevadas que las utilizadas en el ensayo 
de toxicidad 3T3 ARN. Lo más fácil es cuantificar estas dosis por mediciones de la banda UV de la fuente luminosa. Las células se siembran a la densidad utilizada en el ensayo de fototoxicidad  in 
vitro  3T3 ARN y se irradian al día siguiente. La viabilidad de las 
células se determina un día después mediante la absorción de rojo neutro. Debe demostrarse que la dosis máxima no citotóxica obte ­
nida (por ejemplo, en el estudio de validación: 5 J/cm
 2 [UVA]) es 
suficiente para clasificar correctamente las sustancias de referencia 
(cuadro 1).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. S e n s i b i l i d a d a n t e l a r a d i a c i ó n ; c o m p r o b a c i ó n d e l 
e n s a y o e n c u r s o 
El ensayo cumple los criterios de calidad si los controles negati ­
vos/de disolvente irradiados presentan una viabilidad superior al 80 % respecto a los controles negativos/de disolvente no irradiados.
 
1.4.2.2.3. V i a b i l i d a d d e l o s c o n t r o l e s d e d i s o l v e n t e 
La densidad óptica absoluta (DO  540 ARN  ) del rojo neutro extraído de 
los controles de disolvente indica si las 1 × 10  4 células sembradas 
por pocillo han crecido con un tiempo de generación normal durante 
los dos días del ensayo. Un ensayo cumple los criterios de aceptación si la media de la DO
 540 ARN  de los controles sin 
tratar es > 0,4 (es decir, unas 20 veces la absorbancia de fondo 
del disolvente).  
1.4.2.2.4. C o n t r o l p o s i t i v o 
Por cada ensayo de fototoxicidad  in vitro  3T3 ARN, debe someterse 
a ensayo en paralelo una sustancia fototóxica conocida. Se reco ­
mienda el uso de la clorpromazina (CPZ). Se han definido los cri ­
terios de aceptación siguientes para el uso de CPZ conforme al 
protocolo normalizado en el ensayo de fototoxicidad  in vitro  
3T3 ARN: CPZ irradiada (+ Irr), CI  50 = 0,1 a 2,0 μg/ml; CPZ no 
irradiada (- Irr), CI  50 = 7,0 a 90,0 μg/ml. El factor de fotoirritación 
(PIF) debe ser > 6. Deben supervisarse los datos previos sobre el 
comportamiento del control positivo. 
En lugar de la clorpromazina, pueden emplearse para los controles 
positivos en paralelo otras sustancias fototóxicas que convengan a la 
clase química o a las características de solubilidad de la sustancia estudiada.
 
1.4.3.  Procedimiento del ensayo (6) (7) (8) (16) (17)  
1.4.3.1.  1  er día 
Se ponen 100 μl de medio de cultivo en los pocillos periféricos de 
una placa de microvaloración de cultivo tisular de 96 pocillos (= 
blancos). En los demás pocillos se vierten 100 μl de una suspensión 
de 1 × l0  5 células/ml en medio de cultivo (= 1 × 10  4 células/pocillo). 
Deben prepararse dos placas con cada serie de concentraciones de las distintas sustancias problema, así como de los controles positivos y 
de disolvente. 
Se incuban las células durante 24 horas (véase el punto 1.4.1.2) hasta 
que formen una monocapa semiconfluyente. Este período de incuba ­
ción permite la recuperación, la adherencia y el crecimiento expo ­
nencial de las células.
 
1.4.3.2.  2  o día 
Tras la incubación, se decanta el medio de cultivo separándolo de las 
células y se lava cuidadosamente con 150 μl de la solución amorti ­
guadora utilizada para la dilución. Se añaden 100 μl de la solución 
amortiguadora con la concentración adecuada de la sustancia pro ­
blema o del disolvente (control de disolvente). Se utilizan 8 concen ­
traciones distintas de la sustancia problema. Se incuban las células con la sustancia problema en la oscuridad durante 60 minutos (véanse el punto 1.4.1.2 y el punto 1.4.1.4, segundo párrafo). 
De las dos placas preparadas con cada serie de concentraciones de la 
sustancia problema y con los controles, se elige una, generalmente al azar, para la determinación de la citotoxicidad (- Irr) (es decir, la 
placa de control), y otra (la placa de tratamiento) para la determina ­
ción de la fotocitotoxicidad (+ Irr).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Para efectuar la exposición + Irr, se someten las células a la dosis 
máxima de radiación que no es citotóxica, durante 50 minutos, a 
través de la tapa de la placa de 96 pocillos, a temperatura ambiente (véase también el anexo 2). Las placas que no se irradian (- Irr) se mantienen a temperatura ambiente en la oscuridad durante 
50 minutos (= tiempo de exposición a la luz). 
Se decanta la solución de ensayo y se lava cuidadosamente dos veces 
con 150 μl de la solución amortiguadora utilizada para la incubación, 
pero sin sustancia problema. Se sustituye la solución amortiguadora por medio de cultivo y se incuban (véase el punto 1.4.1.2.) hasta el día siguiente (18-22 horas).
 
1.4.3.3.  3  er día 
1.4.3.3.1. E v a l u a c i ó n m i c r o s c ó p i c a 
Deben examinarse las células atendiendo a su crecimiento y morfo ­
logía, así como a la integridad de la monocapa, utilizando un mi ­
croscopio de contraste de fase. Deben registrarse los cambios en la 
morfología y los efectos sobre el crecimiento de las células.  
1.4.3.3.2. E n s a y o d e a b s o r c i ó n d e r o j o n e u t r o 
Se lavan las células con 150 μl de solución amortiguadora previa ­
mente calentada. Se elimina la solución de lavado con unos golpe ­
citos suaves. Se añaden 100 μl de una solución de 50 μg/ml de rojo 
neutro (RN) (clorhidrato de 3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazina, número EINECS 209-035-8; número CAS 553-24-2; C.I. 50040) en medio de cultivo sin suero (16) y se incuba durante 3 horas como se 
indica en el punto 1.4.1.2. Tras la incubación, se elimina el medio de 
RN y se lavan las células con 15 μL de la solución amortiguadora. 
Se decanta y se elimina el exceso de solución amortiguadora con material absorbente o por centrifugación. 
Se añaden exactamente 150 μl de solución de desorción de RN 
(recién preparada con 49 partes de agua + 50 partes de etanol + 1 
parte de ácido acético). 
Se agita suavemente la placa de microvaloración en un agitador de 
placas durante 10 minutos, hasta que el RN se haya extraído de las células y forme una solución homogénea. 
Se mide la densidad óptica del extracto de RN a 540 nm en un 
espectrofotómetro, utilizando los blancos como referencia. Los datos se conservan en un archivo electrónico adecuado para su análisis 
posterior.
 
2. DATOS  
2.1. CALIDAD Y CANTIDAD DE LOS RESULTADOS 
Los datos del ensayo deben permitir el análisis significativo de la 
relación respuesta-oncentración con y sin irradiación, y, a ser posi ­
ble, determinar la concentración de la sustancia problema a la que se 
reduce al 50 % la viabilidad de las células (CI  50 ). Si se comprueba 
que hay citotoxicidad, tanto la gama de concentraciones como el intervalo entre las distintas concentraciones deben establecerse de manera que se pueda ajustar una curva a los datos experimentales. 
En caso de resultados tanto claramente positivos como claramente 
negativos (véase el punto 2.3, párrafo primero), puede ser suficiente 
el experimento primario, con el apoyo de uno o más experimentos 
previos para determinar la gama de las dosis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
En caso de resultados ambiguos, en el límite o dudosos deben ha ­
cerse más ensayos (véase también el punto 2.4, párrafo segundo). En 
tal caso, debe plantearse la modificación de las condiciones experi ­
mentales. Entre las condiciones que podrían modificarse figuran la gama de concentraciones o sus intervalos, el tiempo de preincuba ­
ción y la duración de la exposición a la radiación. En el caso de las 
sustancias inestables en el agua puede ser conveniente reducir dicha duración.
 
2.2. EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Para permitir la evaluación de los resultados, puede calcularse el 
factor de fotoirritación (PIF) o el fotoefecto medio (MPE). 
Para calcular las medidas de fotocitotoxicidad (véase más abajo) hay 
que trazar una curva continua y adecuada respuesta-concentración 
(modelo) que se aproxime al conjunto de valores discretos de res ­
puestas a las concentraciones. El ajuste de la curva a los datos se suele hacer mediante un método de regresión no lineal (18). Para 
evaluar la influencia de la variabilidad de los datos sobre la curva 
ajustada se recomienda un procedimiento  bootstrap.  
El factor de fotoirritación (PIF) se calcula mediante la siguiente 
fórmula:
 
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Si no puede calcularse la CI  50 en presencia o en ausencia de luz, no 
es posible determinar el PIF de la sustancia problema. El fotoefecto 
medio (MPE) se basa en la comparación de las curvas completas respuesta-concentración (19). Se define como la media ponderada de un conjunto representativo de valores de fotoefecto.
 
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
El fotoefecto PE  c a una concentración C se define como el producto 
del efecto de respuesta RE  c por el efecto de dosis DE  c ; es decir, PE  c 
= RE  c × DE  c . El efecto de respuesta RE  c es la diferencia entre las 
respuestas observadas en ausencia y en presencia de luz, es decir 
RE c = R  c (- Irr) — R  c (+ Irr). El efecto de dosis viene dado por la 
fórmula siguiente:  
DE  c ¼ Æ Æ Æ Æ
 C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ
 
donde C* representa la concentración equivalente, es decir, la con ­
centración a la que la respuesta + Irr iguala a la respuesta - Irr a la concentración C. Si C* no puede determinarse porque los valores de respuesta de la curva + Irr son sistemáticamente más altos o más 
bajos que RC(- Irr), el efecto de dosis se fija en 1. Los factores de 
ponderación w
 i vienen dados por el valor máximo de respuesta, es 
decir, w  i = MAX {R  i (+ Irr), R  i (- Irr)}. El cuadro de concentra ­
ciones C  i se elige de forma que caiga el mismo número de puntos 
en cada uno de los intervalos de concentración definidos por los 
valores de concentración utilizados en el experimento. El cálculo del MPE se limita al valor máximo de concentración al que al menos una de las dos curvas sigue mostrando un valor de respuesta 
de al menos el 10 %. Si esta concentración máxima es más elevada 
que la concentración más alta utili zada en el experimento + Irr, la 
parte residual de la curva + Irr se fija en el valor de respuesta «0». En función de que el valor de MPE sea o no mayor que un valor 
límite adecuadamente elegido (MPE
 c = 0,15), la sustancia se clasi ­
fica como fototóxica o no.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
En la referencia (20) puede obtenerse un programa informático para 
el cálculo de PIF y MPE.  
2.3. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Según el estudio de validación (8), una sustancia problema con un 
PIF < 2 o un MPE < 0,1 no es fototóxica. Un PIF > 2 y < 5 o un 
MPE > 0,1 y < 0,15 indica fototoxicidad probable, y un PIF > 5 o un MPE > 0,15 indica fototoxicidad. 
Cualquier laboratorio que efectúe este ensayo por primera vez debe 
hacerlo con las sustancias de referencia del cuadro 1 antes de pro ­
ceder al ensayo de la fototoxicidad de sustancias problema. Los 
valores de PIF o MPE deben ser similares a los valores indicados en el cuadro 1.
 
Cuadro 1  
Nombre químico N  o EINECS N  o CAS PIF MPE Pico de absor ­
ción Disolvente (  1 ) 
Amiodarona 
HCl 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27-0,54 242 nm 
300 nm 
(hombro) etanol 
Clorpromazina 
HCl 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33-0,63 309 nm etanol 
Norfloxacina 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34-0,90 316 nm acetonitrilo 
Antraceno 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19-0,81 356 nm acetonitrilo 
Protoporfirina 
IX, disodio 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54-0,74 402 nm etanol 
L-histidina [7006-35-1] sin PIF 0,05-0,10 211 nm agua 
Hexaclorofeno 200-733-8 [70-30-4] 1,1-1,7 0,00-0,05 299 nm 
317 nm 
(hombro) etanol 
Laurilsulfato de 
sodio 205-788-1 [151-21-3] 1,0-1,9 0,00-0,05 sin absor ­
ción agua  
( 1 ) Disolvente utilizado para medir la absorción.  
2.4. INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS 
Si se observan efectos fotocitotóxicos solo a la mayor concentra ­
ción de ensayo (especialmente en caso de sustancias problema hi ­
drosolubles), para la evaluación del peligro puede ser necesario 
tener en cuenta otros aspectos, entre los que se pueden incluir datos sobre la absorción cutánea y la acumulación de la sustancia en la piel, así como datos procedentes de otros ensayos, como el del 
efecto de la sustancia  in vitro  sobre piel humana o animal, o sobre 
modelos de piel.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Si no se pone de manifiesto ningún efecto tóxico (+ Irr y - Irr) y si la 
baja solubilidad limita las concentraciones que se pueden utilizar en 
el ensayo, puede dudarse de la compatibilidad de la sustancia pro ­
blema con el ensayo y ha de estudiarse la posibilidad de efectuar un ensayo de confirmación, por ejemplo con otro modelo.
 
3. INFORMES  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe dar, como mínimo, la información si ­
guiente: 
Sustancia de ensayo: — identificación, nombres genéricos comunes y números IUPAC y 
CAS, si se saben, 
— naturaleza física y pureza, — propiedades físico-químicas importantes para la realización del 
estudio, 
— espectro de absorción UV/visible, — estabilidad y fotoestabilidad, si se conocen. Disolvente: — justificación de la elección del disolvente, — solubilidad de la sustancia problema en el disolvente, — porcentaje de disolvente presente en el medio de tratamiento. Células: — tipo y procedencia, — ausencia de micoplasmas, — número de pases celulares, si se conoce; — sensibilidad de las células a la radiación, determinada con el 
equipo de irradiación utilizado en el ensayo de fototoxicidad  in 
vitro  3T3 ARN. 
Condiciones de la prueba (1);  incubación antes y después del trata ­
miento:  
— tipo y composición del medio de cultivo, — condiciones de incubación (concentración de CO
 2 , temperatura y 
humedad), 
— duración de la incubación (antes y después del tratamiento). Condiciones de la prueba (2);  tratamiento con la sustancia:  
— fundamento de la elección de las concentraciones de la sustancia 
problema empleadas en presencia y en ausencia de radiación, 
— en caso de que la sustancia problema sea escasamente soluble y 
no sea citotóxica: fundamento de la elección de la mayor concen ­
tración empleada, 
— tipo y composición del medio de tratamiento (solución salina 
amortiguadora), 
— duración del tratamiento con la sustancia. Condiciones de la prueba (3);  irradiación:  
— fundamento de la elección de la fuente luminosa empleada,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— fabricante y tipo de la fuente luminosa y del radiómetro, 
— características de la irradiancia espectral de la fuente luminosa, 
— características de transmisión y absorción del filtro o filtros uti ­
lizados, 
— características del radiómetro y condiciones de calibrado, — distancia entre la fuente luminosa y el sistema de ensayo, — irradiancia UVA a esa distancia, expresada en mW/cm
 2 , 
— duración de la exposición a la luz UV/visible, — dosis de radiación UVA (irradiancia × tiempo), expresada en 
J/cm
 2 , 
— temperatura de los cultivos celulares durante su irradiación y de 
los mantenidos en la oscuridad en paralelo. 
Condiciones de la prueba (4);  ensayo de viabilidad con rojo neutro:  
— composición del medio de tratamiento para el ensayo con rojo 
neutro, 
— duración de la incubación con rojo neutro, — condiciones de incubación (concentración de CO
 2 , temperatura y 
humedad), 
— condiciones de extracción del rojo neutro (agente de extracción, 
duración), 
— longitud de onda empleada para la lectura espectrofotométrica de 
la densidad óptica del rojo neutro, 
— segunda longitud de onda (referencia), si procede, — contenido del blanco del espectrofotómetro, si procede. Resultados: — viabilidad celular obtenida con cada concentración de la sustancia 
problema, expresada en porcentaje de la viabilidad media de los 
controles con disolventes en paralelo, 
— curvas respuesta-concentración (viabilidad celular relativa frente 
a la concentración de la sustancia problema), obtenidas en los 
experimentos + Irr y - Irr realizados en paralelo, 
— análisis de las curvas respuesta-concentración: si es posible, cál ­
culo de la CI
 50 (+ Irr) y de la CI  50 (- Irr), 
— comparación de las dos curvas respuesta-concentración obtenidas 
con y sin irradiación, calculando bien el factor de fotoirritación 
(PIF) o bien el fotoefecto medio (MPE), 
— criterios de aceptación del ensayo; control con el disolvente en 
paralelo: 
— viabilidad absoluta (densidad óptica del extracto de rojo neutro) 
de las células irradiadas y no irradiadas, 
— datos anteriores sobre controles negativos y de disolvente, medias 
y desviaciones típicas. 
— criterios de aceptación del ensayo; control positivo en paralelo:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— CI  50 (+ Irr) y CI  50 (- Irr) y PIF/MPE de la sustancia del control 
positivo; 
— datos anteriores sobre la sustancia del control positivo: 
CI 50 (+ Irr) y CI  50 (- Irr) y PIF/MPE, medias y desviaciones típi ­
cas. 
Discusión de los resultados. Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
1. Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of subs ­
tances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 95-102. 
2. Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In «Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry» Vol. 3 part 1. North Holland Publishing 
Co. Amsterdam. p XI-XXXV. 
3. Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Mau ­
rer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladows ­
ki, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report and 
recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA,  22, 314- 
348. 
4. Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In «The science of Pho ­
tobiology» Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, p 79-110. 
5. OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 «Guidance Document 
On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water» Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris. 
6. Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kal ­
weit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, 
W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., 
Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell 
phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793-796. 
7. Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7-8. 
8. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., 
Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannen ­
becker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA  In 
vitro  phototoxicity validation study: results of phase II (blind 
trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, 305-327. 
9. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 
30
 th -31 th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
15 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat. 
10. Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red ab ­
sorption. Toxicology Lett., 24,119-124. 
11. Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12. Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In «Dermatotoxicology», edi ­
ted by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p. 515-530. 
13. Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epider ­
mal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829. 
14. ISO 10977. (1993). Photography — Processed photographic 
colour films and paper prints — Methods for measuring image stability. 
15. Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vien ­
na, 1993, ISBN 3900734275 
16. ZEBET/ECVAM/COLIPA — Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 
1998. 18 pgs. 
17. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union  Directive 76/768/EEC,  
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679-708. 
18. Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical mode ­
ling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems
 3, 
127-138. 
19. Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
445-462. 
20. http ://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_ 2649 34377 
2349687 _1_1_1_1, 00.html  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
ANEXO 1  
Función del ensayo de fototoxicidad 3T3 ARN en un enfoque secuencial de los ensayos de 
fototoxicidad de sustancias químicas
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
ANEXO 2  
Figura 1  
Distribución espectral de potencia de un simulador solar con filtro
  
(véase el punto 1.4.1.5, párrafo segundo) 
La figura 1 muestra un ejemplo de distribución aceptable de la irradiancia espectral de un simulador 
solar con filtro. Procede de la fuente de haluro metálico cebado utilizada en la prueba de validación 
del ensayo de fototoxicidad 3T3 ARN (6) (8) (17). Se indica el efecto de dos filtros distintos y el 
efecto filtrante adicional de la tapa de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. El filtro H2 solo se ha utilizado con sistemas de ensayo que pueden tolerar una cantidad elevada de UVB (ensayo con modelo de piel y ensayo de fotohemólisis de eritrocitos). En el ensayo de fototoxicidad 
3T3 ARN se utilizó el filtro H1. La figura muestra que el efecto filtrante adicional de la tapa de 
la placa se observa sobre todo en la banda de UVB, pero queda en el espectro de irradiación una cantidad suficiente de UVB para excitar sustancias que absorben normalmente en esta banda, como 
la amiodarona (véase el cuadro 1).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Figura 2  
Sensibilidad de las células Balb/c 3T3 ante la irradiación (medida en la banda UVA)  
Viabilidad de las células (porcentaje de la absorción de rojo neutro respecto a los controles 
mantenidos en la oscuridad)
  
(Véanse el punto 1.4.1.5.2, párrafo segundo, y los puntos 1.4.2.2.1 y 1.4.2.2.2) 
Sensibilidad de las células Balb/c 3T3 ante la irradiación con el simulador solar utilizado en la 
prueba de validación del ensayo de fototoxicidad 3T3 ARN, medida en la banda UVA. La figura muestra los resultados obtenidos en siete laboratorios diferentes en el estudio de prevalidación (1). 
Las dos curvas con símbolos huecos se obtuvieron con células viejas (gran número de pases), que 
tuvieron que sustituirse por nuevas poblaciones celulares, mientras que las curvas con símbolos macizos corresponden a células con una tolerancia aceptable a la irradiación. 
Con estos datos se determinó que la dosis máxima de irradiación no citotóxica es de 5 J/cm
 2 (línea 
discontinua vertical). La línea discontinua horizontal muestra además el efecto aceptable máximo de 
irradiación contemplado en el punto 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  SENSIBILIZACIÓN CUTÁNEA: ENSAYO CON GANGLIOS 
LINFÁTICOS LOCALES  
INTRODUCCIÓN 
1. Las directrices de ensayo de productos químicos de la OCDE (TG, por su 
nombre en inglés) y los métodos de ensayo de la UE basados en ellas se revisan periódicamente en función de los avances científicos, los cambios en las nece ­
sidades normativas y las consideraciones de bienestar de los animales. Ya se ha 
adoptado el método de ensayo (ME) original para la determinación de la sen ­
sibilización cutánea con ratones, la prueba con ganglios linfáticos locales (LLNA, de su nombre en inglés, que corresponde a la TG 429 de la OCDE, 
capítulo B.42 del presente anexo) (1). Se han publicado los datos de la valida ­
ción del LLNA, así como una revisión de los trabajos asociados (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). El LLNA actualizado se basa en la evaluación de la experiencia y de los datos científicos (12). Este es el segundo ME que se diseña 
para evaluar el potencial de sensibilización cutánea de los productos químicos 
(sustancias y mezclas) en animales. El otro ME (es decir, el correspondiente a la TG 406 de la OCDE, capítulo B.6 del presente anexo) utiliza ensayos con cobayas, en concreto el ensayo de maximización en cobaya y el ensayo de 
Buehler (13). El LLNA resulta más ventajoso que el método B.6 y la TG 406 
de la OCDE (13) en cuanto al bienestar de los animales. El presente ME LLNA actualizado incluye un conjunto de normas de comportamiento (NC) (apéndice 1) que puede utilizarse para evaluar la situación de la validación de 
métodos de ensayo nuevos o modificados que sean similares, desde el punto de 
vista funcional y mecánico, al LLNA, de acuerdo con los principios del docu ­
mento de orientación n
 o 34 de la OCDE (14). 
2. El LLNA estudia la fase de inducción de la sensibilización cutánea y 
proporciona datos cuantitativos adecuados para la evaluación de la relación dosis-respuesta. Ha de señalarse que los sensibilizantes suaves o moderados que se recomiendan como productos químicos adecuados para el control 
positivo (CP) en métodos de ensayo con cobayas (es decir, el B.6, TG 406 
de la OCDE) (13), son también apropiados para utilizarse en el LLNA (6) (8) (15). En este ME se describe también la opción de un LLNA reducido (rLLNA), que podría suponer una reducción de hasta el 40 % del número 
de animales utilizados (16) (17) (18). El rLLNA puede utilizarse cuando sea 
necesario a efectos normativos confirmar una predicción negativa de poten ­
cial de sensibilización cutánea, siempre que se respeten todas las demás especificaciones del protocolo del LLNA, como se describe en el presente 
ME. La predicción de un resultado negativo debe efectuarse sobre la base 
de toda la información disponible según se describe en el punto 4. Antes de aplicar el rLLNA, debe aportarse una justificación clara y científicamente motivada de su uso. Si, contra lo esperado, se obtiene un resultado positivo 
o dudoso en el rLLNA, puede ser necesario efectuar más ensayos para 
interpretar o aclarar la observación. El rLLNA no debe utilizarse para identificar el peligro de sustancias problema que sean sensibilizantes cutá ­
neos cuando se necesite información sobre la relación dosis-respuesta, tal 
como la subcategorización a efectos del Reglamento (CE) n
 o 1272/2008, 
sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y del Sistema Globalmente Armonizado de las Naciones Unidas de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos.
 
DEFINICIONES 
3. En el apéndice 2 se dan las definiciones utilizadas.  
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
4. El LLNA constituye un método alternativo para identificar productos quí ­
micos que pueden ser sensibilizantes cutáneos. Esto no implica necesaria ­
mente que deba utilizarse en todos los casos el LLNA en lugar de los 
ensayos con cobayas (es decir, el B.6, TG 406 de la OCDE) (13), sino que, como su valor es equivalente, el LLNA puede emplearse como alter ­
nativa en la que, generalmente, los resultados positivos y negativos ya no 
necesitan una confirmación posterior. Antes de efectuar el estudio, el labo ­
ratorio de ensayo debe considerar toda la información disponible sobre
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
la sustancia problema. Tal información ha de incluir la identidad y la 
estructura química de esta sustancia, sus propiedades fisicoquímicas, los 
resultados de cualquier otro ensayo de toxicidad  in vitro  o in vivo  efectuado 
con ella, y los datos toxicológicos disponibles sobre sustancias relacionadas estructuralmente. Es necesario sopesar esta información a fin de determinar 
si el LLNA es apropiado para cada sustancia problema (dada la incompa ­
tibilidad de ciertos tipos de productos químicos con el LLNA; véase el punto 5) y de ayudar en la selección de las dosis. 
5. El LLNA es un método  in vivo , por lo que no elimina el uso de animales 
para la evaluación de la sensibilización alérgica por contacto. No obstante, puede reducir el número de animales necesarios para este fin. Además 
supone un refinamiento sustancial (menos dolor y molestias) de la forma 
de utilizar animales en los ensayos de sensibilización alérgica por contacto. El LLNA se basa en la consideración de fenómenos inmunológicos desen ­
cadenados por sustancias químicas durante la fase de inducción de la sen ­
sibilización. Al contrario que los ensayos que utilizan cobayas (es decir, los 
del capítulo B.6, TG 406 de la OCDE) (13), el LLNA no necesita que se provoquen reacciones cutáneas de hipersensibilidad. Tampoco exige el uso de coadyuvantes, como ocurre en el ensayo de maximización con cobayas 
(13). Por consiguiente, el LLNA reduce el dolor y las molestias para los 
animales. A pesar de las ventajas que supone con respecto al ensayo del capítulo B.6 y a la TG 406 de la OCDE, ha de reconocerse que hay ciertas limitaciones que pueden obligar a utilizar el capítulo B.6 o la TG 406 de la 
OCDE (13) (por ejemplo, los resultados falsos negativos que se producen 
en el LLNA con determinados metales, los falsos positivos con algunos irritantes cutáneos (como algunos productos químicos del tipo de los agen ­
tes tensioactivos) (19) (20), o la solubilidad de la sustancia problema). 
Además, las sustancias o clases químicas que contienen grupos funcionales 
de los que se haya visto que actúan como posibles factores de confusión (21) pueden hacer necesario el uso de ensayos con cobayas (es decir, el B.6 o la TG 406 de la OCDE) (13). Por otra parte, según la limitada base de 
datos de la validación, que se refiere principalmente a formulaciones de 
plaguicidas, el LLNA tiene mayor probabilidad que el ensayo con cobayas de dar un resultado positivo con estos tipos de sustancias problema (22). Sin embargo, cuando se somete a ensayo una formulación, podría conside ­
rarse la inclusión de sustancias similares con resultados conocidos como 
sustancias de evaluación comparativa para demostrar que el LLNA funciona correctamente (véase el punto 16). Dejando aparte estas limitaciones detec ­
tadas, el LLNA debería ser aplicable para el ensayo de cualquier sustancia, 
salvo que haya propiedades asociadas a esta que puedan interferir con la exactitud del LLNA.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
6. El principio básico del LLNA es el de que los sensibilizantes inducen una 
proliferación de linfocitos en los ganglios linfáticos que drenan la zona de aplicación de la sustancia problema. Esta proliferación es proporcional a la 
dosis y a la potencia del alérgeno aplicado y proporciona un método senci ­
llo para obtener una medida cuantitativa de la sensibilización. La prolifera ­
ción se mide comparando la proliferación media de cada grupo de ensayo con la proliferación media del grupo de control tratado con el 
vehículo (CV). Se determina la relación entre la proliferación media obser ­
vada en cada grupo tratado y la del grupo de CV paralelo, denominada índice de estimulación (IE), y que debe ser ≥ 3 para que se pueda justificar 
la clasificación de la sustancia problema como posible sensibilizante cutá ­
neo. Los procedimientos aquí descritos se basan en el uso de marcado 
radiactivo  in vivo  para medir el aumento del número de células en prolife ­
ración presentes en los ganglios linfáticos auriculares que drenan la zona. Sin embargo, pueden emplearse otros parámetros para evaluar el número de 
células en proliferación, siempre que se cumplan plenamente los requisitos 
de las normas de comportamiento (apéndice 1).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO  
Selección de la especie animal  
7. El ratón es la especie elegida para este ensayo. Se utilizan hembras adultas 
jóvenes de las cepas CBA/Ca o CBA/J, nulíparas y que no estén preñadas. 
Al comienzo del estudio los animales deben tener una edad de 8 a 12 semanas; la variación del peso de los animales debe ser mínima, sin superar el 20 % del peso medio. También se podrán utilizar otras cepas y machos, 
si se aportan datos suficientes para demostrar que no existen diferencias 
significativas específicas de la cepa o del sexo en la respuesta del LLNA.
 
Alojamiento y alimentación  
8. Los ratones deben alojarse en grupos (23), salvo que se aporten pruebas 
científicas adecuadas que avalen su alojamiento individual. La temperatura 
de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. Aunque la humedad relativa debe 
ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. 
Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, 
con suministro ilimitado de agua para beber.
 
Preparación de los animales  
9. Se eligen los animales al azar, se marcan para su identificación individual 
(pero no en las orejas) y se mantienen en sus jaulas al menos cinco días hasta el inicio de la administración de la sustancia, para que se aclimaten a 
las condiciones del laboratorio. Antes de iniciar el tratamiento, todos los 
animales serán examinados para comprobar que no presentan lesiones cu ­
táneas observables.
 
Preparación de las soluciones administradas  
10. Las sustancias sólidas deben disolverse o suspenderse en disolventes o 
vehículos y diluirse, cuando proceda, antes de aplicarse a la oreja del ratón. 
Las sustancias líquidas pueden aplicarse puras o diluidas antes de su admi ­
nistración. Las sustancias insolubles, como las que se ven generalmente en los productos sanitarios, deben someterse a extracción forzada en un disol ­
vente apropiado con el fin de recoger todos los componentes extraíbles para 
el ensayo antes de efectuar la aplicación a la oreja del ratón. Las soluciones problema deben prepararse cada día, salvo que mediante datos de estabili ­
dad se demuestre que es posible conservarlas.
 
Verificación de la fiabilidad  
11. Se utilizan sustancias de control positivo (CP) para demostrar que el ensayo 
funciona apropiadamente, respondiendo con la sensibilidad adecuada y re ­
producible cuando se aplica una sustancia problema sensibilizante de la que se ha caracterizado bien la magnitud de la respuesta. Se recomienda la inclusión de un CP en paralelo porque demuestra la competencia del labo ­
ratorio para efectuar con éxito cada ensayo y permite la evaluación de la 
reproducibilidad y comparabilidad intra e interlaboratorios. Por otra parte, ciertas autoridades normativas requieren la utilización de un CP en cada estudio, por lo que se aconseja a los usuarios que consulten con las auto ­
ridades competentes antes de efectuar el LLNA. En consecuencia, se reco ­
mienda el uso sistemático de un CP en paralelo para evitar la necesidad, que podría surgir del uso de un CP periódico, de tener que efectuar ensayos adicionales con animales para cumplir los requisitos (véase el punto 12). El 
CP debe dar una respuesta positiva en el LLNA con un nivel de exposición 
calculado para producir un aumento del índice de estimulación > 3 con
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
respecto al grupo de control negativo (CN). La dosis del CP debe ser tal 
que no provoque un exceso de irritación cutánea ni toxicidad sistémica, y 
que la inducción sea reproducible pero no excesiva (por ejemplo, un índice de estimulación > 20 sería excesivo). Los controles positivos preferidos son aldehído hexilcinámico (n
 o del Chemical Abstracts Service [CAS] 101-86-0) 
al 25 % en acetona: aceite de oliva (4:1, v/v) y mercaptobenzotiazol 
(n o CAS 149-30-4) al 5 % en  N,N -dimetilformamida (véase el apéndice 
1, cuadro 1). Puede haber circunstancias en que sea posible utilizar otros controles positivos, mediante una justificación adecuada y siempre que se 
cumplan los criterios antes mencionados. 
12. Aunque se recomienda la inclusión de un grupo de CP en paralelo, puede 
haber situaciones en que sea adecuado hacer ensayos periódicos (es decir, a 
intervalos ≤ 6 meses) del CP en caso de laboratorios que efectúan regular ­
mente el LLNA (es decir, lo efectúan con una frecuencia no inferior a una vez al mes) y tienen una base de datos de controles positivos históricos que demuestra la capacidad del laboratorio para obtener resultados reproducibles 
y exactos con dichos controles. El laboratorio puede demostrar que tiene la 
competencia adecuada para realizar el LLNA mediante la obtención cons ­
tante de resultados positivos con los controles positivos en al menos diez ensayos independientes llevados a cabo en un plazo razonable (es decir, de 
menos de un año). 
13. Debe incluirse un grupo de CP en paralelo siempre que haya un cambio de 
procedimiento del LLNA (por ejemplo, cambio del personal cualificado, 
cambio de los materiales o reactivos utilizados en el método de ensayo, 
cambio en el equipo analítico, cambio en el origen de los animales), y tales cambios deben documentarse en los informes del laboratorio. Debe pres ­
tarse atención al efecto de estos cambios sobre la idoneidad de la base de 
datos históricos previamente establecida cuando se deba decidir si es nece ­
sario establecer una nueva base de datos históricos para documentar la constancia de los resultados sobre los controles positivos. 
14. Los investigadores no deben olvidar que la decisión de realizar un estudio 
con controles positivos de forma periódica en lugar de en paralelo tiene consecuencias sobre la idoneidad y aceptabilidad de los resultados negativos 
obtenidos en ensayos efectuados sin CP en paralelo en el intervalo entre dos 
estudios periódicos con CP. Por ejemplo, si se obtiene un resultado falso negativo en un estudio con CP periódico, es posible dudar de los resultados negativos obtenidos con las sustancias problema en el intervalo transcurrido 
entre el último estudio con CP periódico aceptable y el estudio con CP 
periódico inaceptable. Las consecuencias de estos resultados deben sope ­
sarse cuidadosamente a la hora de decidir si se incluye un CP en paralelo o si solo se hace de forma periódica. Debe considerarse igualmente el uso de 
menos animales en el grupo de CP en paralelo cuando esté justificado 
científicamente y si el laboratorio demuestra, sobre la base de datos histó ­
ricos propios del laboratorio, que es posible utilizar menos ratones (12). 
15. Aunque el CP debe someterse al ensayo en un vehículo conocido por 
provocar una respuesta uniforme (por ejemplo, acetona: aceite de oliva; 4:1, v/v), puede haber ciertas situaciones legales en las que también sea necesario utilizar un vehículo no estándar (formulación relevante desde el 
punto de vista clínico o químico) (24). Si para el CP en paralelo se utiliza 
un vehículo diferente del de la sustancia problema, debe incluirse un CV aparte para el CP en paralelo. 
16. En los casos en que se evalúen sustancias problema de una clase química o 
gama de respuestas específica, puede ser también útil emplear sustancias de evaluación comparativa para demostrar que el método de ensayo funciona 
adecuadamente en cuanto a la detección del potencial de sensibilización 
cutánea de estos tipos de sustancias problema. Para ser adecuadas, las sustancias de evaluación comparativa deben presentar las siguientes propie ­
dades: 
— similitud estructural y funcional con la clase de la sustancia problema 
que se está evaluando, 
— características físicas y químicas conocidas, 
— datos de apoyo procedentes del LLNA, 
— datos de apoyo procedentes de otros modelos animales o de seres hu ­
manos.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO  
Número de animales y niveles de dosis  
17. Se utilizará un mínimo de cuatro animales por grupo de dosis, con un 
mínimo de tres concentraciones de la sustancia problema, más un grupo 
de control negativo (CN) en paralelo tratado solo con el vehículo utilizado para la sustancia problema y un control positivo (CP) (en paralelo o recien ­
te, según la estrategia del laboratorio en relación con los puntos 11 a 15). 
Debe estudiarse la posibilidad de utilizar varias dosis del CP, sobre todo 
cuando este se someta a ensayo de forma intermitente. Excepto por la ausencia de tratamiento con la sustancia problema, los animales de los grupos de control deben ser manejados y tratados de manera idéntica a la 
utilizada con los animales de los grupos tratados. 
18. La elección de las dosis y del vehículo debe basarse en las recomendaciones 
que se recogen en las referencias (3) y (5). Normalmente se eligen dosis consecutivas a partir de una serie adecuada de concentraciones, como 100 
%, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. La elección de la serie 
de concentraciones utilizada debe justificarse científicamente. Para seleccio ­
nar las tres concentraciones consecutivas, ha de tenerse en cuenta toda la información toxicológica (por ejemplo, sobre toxicidad aguda e irritación 
cutánea) y la información estructural y fisicoquímica existente de que se 
pueda disponer respecto a la sustancia problema (o sustancias relacionadas estructuralmente con ella), de forma que la concentración más alta logre la máxima exposición evitando a la vez la toxicidad sistémica y la excesiva 
irritación cutánea local (3) (25). A falta de tal información, puede ser 
necesario realizar un ensayo inicial de cribado previo (véanse los puntos 21 a 24). 
19. El vehículo no debe interferir con el resultado del ensayo ni sesgarlo, y 
debe seleccionarse con el propósito de maximizar la solubilidad para con ­
seguir la mayor concentración posible y de obtener a la vez una solución o suspensión que sea adecuada para la aplicación de la sustancia problema. Los vehículos recomendados son acetona: aceite de oliva (4:1, v/v),  N,N - 
dimetilformamida, metil-etil-cetona, propilenglicol y dimetilsulfóxido (19), 
pero se pueden utilizar otros si se aporta una justificación científica sufi ­
ciente. En determinadas situaciones, puede ser necesario utilizar un disol ­
vente relevante desde el punto de vista clínico o la formulación comercial 
en que se vende la sustancia analizada, como control adicional. Se tendrá 
especial cuidado en velar por que las sustancias problema hidrófilas se incorporen a un sistema de vehículo que humedezca la piel y no se escurra inmediatamente, mediante la incorporación de los solubilizadores adecuados 
(por ejemplo, Pluronic® L92 al 1 %). Por tanto, se evitarán los vehículos 
totalmente acuosos. 
20. El estudio de los ganglios linfáticos de cada uno de los ratones permite 
evaluar la variabilidad interanimales y comparar estadísticamente la diferen ­
cia entre las mediciones efectuadas en el grupo de la sustancia problema y 
las efectuadas en el grupo de CV (véase el punto 35). Además, cuando se obtienen datos de cada uno de los animales, se puede evaluar la posibilidad de reducir el número de ratones del grupo de CP (12). Por otra parte, ciertas 
autoridades normativas exigen la recogida de datos de cada animal. Sin 
embargo, algunas autoridades normativas pueden considerar aceptables los datos de conjuntos de animales; en tales situaciones, los usuarios pueden elegir entre recoger datos de cada animal o de conjuntos de animales.
 
Ensayo de cribado previo  
21. A falta de información para determinar la dosis máxima que se debe utilizar 
en el ensayo (véase el punto 18), hay que efectuar un ensayo de cribado previo a fin de definir el nivel adecuado de dosis para el LLNA. La finalidad del ensayo de cribado previo es orientar para la selección del 
nivel máximo de dosis que debe utilizarse en el estudio LLNA principal, 
en caso de que no se disponga de información sobre la concentración que induce toxicidad sistémica (véase el punto 24) o excesiva irritación cutánea local (véase el punto 23). El nivel máximo de dosis para este ensayo debe 
ser del 100 % de la sustancia problema en caso de líquidos, o la mayor 
concentración posible en caso de sólidos o suspensiones.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. El ensayo de cribado previo se realiza bajo las mismas condiciones que el 
estudio LLNA principal, con la diferencia de que no hay evaluación de la 
proliferación en los ganglios linfáticos y de que pueden utilizarse menos animales por grupo de dosis. Se sugiere emplear uno o dos animales por grupo de dosis. Todos los ratones deben observarse diariamente para de ­
tectar posibles signos de toxicidad sistémica o irritación local en el punto de 
aplicación. Los pesos corporales se registran al inicio del ensayo y antes de que termine (día 6). Se observan ambas orejas de cada ratón, para detectar eventuales eritemas, y se puntúan según el cuadro 1 (25). Se mide el 
espesor de la oreja con un calibrador de espesores (por ejemplo, de micró ­
metro digital o calibrador de espesores de escala circular de Peacock) el día 1 (antes de la administración), el día 3 (unas 48 horas tras la administración de la primera dosis), y el día 6. Además, el día 6 se puede medir el espesor 
de la oreja determinando el peso de un bocado de la de la misma, obtenido 
con un sacabocados después del sacrificio compasivo de los animales. La excesiva irritación cutánea local viene indicada por una puntuación de eritema ≥ 3 o por un aumento del espesor de la oreja ≥ 25 % cualquiera 
de los días de la medición (26) (27). La dosis máxima seleccionada para el 
estudio LLNA principal será la dosis inmediatamente inferior a la que, dentro de la serie de concentraciones del ensayo de cribado previo (véase el punto 18), induce toxicidad sistémica o excesiva irritación cutánea local.
 
Cuadro 1  
Puntuación del eritema  
Observación Puntuación  
Sin eritema 0 
Eritema muy leve (apenas perceptible) 1 
Eritema bien definido 2 Eritema de moderado a intenso 3 Eritema intenso (rojo de remolacha) o formación de escaras 
que impide la clasificación del eritema 4 
23. Además de un aumento del 25 % del espesor de la oreja (26) (27), también 
se ha utilizado para señalar irritantes en el LLNA un aumento estadística ­
mente significativo del espesor de la oreja de los ratones tratados respecto a 
los ratones de control (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Sin embargo, aunque puede haber aumentos del espesor de la oreja inferiores al 25 %, estadísticamente significativos, estos no se han asociado específicamente 
con una irritación excesiva (30) (32) (33) (34). 
24. Las siguientes observaciones clínicas pueden indicar toxicidad sistémica 
(35) (36) cuando forman parte de una evaluación integrada y, por tanto, 
pueden indicar el nivel máximo de dosis que debe utilizarse en el LLNA principal: cambios en la función del sistema nervioso (por ejemplo, piloe ­
rección, ataxia, temblores y convulsiones), cambios en el comportamiento 
(por ejemplo, agresividad, cambios en las actividades de limpieza, cambio 
marcado en el nivel de actividad), cambios en las pautas respiratorias (es decir, cambios en la frecuencia e intensidad de la respiración, tales como disnea, jadeos y estertores), y cambios en el consumo de agua y comida. 
También deben tenerse en cuenta en la evaluación los eventuales signos de 
letargo o ausencia de respuesta a estímulos, los signos clínicos de dolor o sufrimiento que no sean ligeros o momentáneos, y la reducción > 5 % del peso corporal desde el día 1 al día 6, así como la mortalidad. Los animales 
moribundos o que presenten signos evidentes de dolor o de sufrimiento 
intenso y duradero deben sacrificarse de forma compasiva (37).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Calendario experimental del estudio principal  
25. El calendario experimental del ensayo es el siguiente: 
— Día 1:  Se identifica cada animal y se toma nota de su peso, así como de 
las eventuales observaciones clínicas. En el dorso de cada oreja se 
aplican 25 μl de la dilución apropiada de la sustancia problema, del 
vehículo solo o del control positivo (en paralelo o reciente, según la estrategia del laboratorio en relación con los puntos 11 a 15). 
— Días 2 y 3:  Se repite el procedimiento de aplicación del día 1. 
— Días 4 y 5:  Sin tratamiento. 
— Día 6:  Se toma nota del peso de cada animal. Se inyectan 250 μl de 
solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) estéril que contenga 20 μCi (7,4 × 10
 5 Bq) de  3 H-metil-timidina (tritiada) a todos los ratones 
(de evaluación y de control) a través de la vena de la cola. Otra 
posibilidad es inyectar 250 μL de PBS estéril con 2 μCi (7,4 × 10  4 
Bq) de  125 I-yododesoxiuridina y fluorodesoxiuridina 10  -5 M a todos los 
ratones por la vena de la cola. Al cabo de cinco horas (5 h), se sa ­
crifican los animales de forma compasiva. Se extirpan los ganglios 
linfáticos auriculares de cada oreja de los ratones y se sumergen en PBS, poniendo juntos los de cada animal (enfoque por animales indi ­
viduales); la otra posibilidad consiste en extirpar los ganglios linfáticos 
de cada oreja y sumergirlos en PBS, poniendo juntos los procedentes de 
cada grupo de tratamiento (enfoque de acumulación en conjuntos por grupo de tratamiento). En la referencia (12) se recogen los detalles y diagramas de la identificación y disección de los ganglios linfáticos. 
Para seguir mejor la respuesta cutánea local en el estudio principal, 
pueden incluirse en el protocolo del estudio parámetros adicionales, tales como la puntuación del eritema auricular o las medidas del espesor de la oreja (obtenidas con un calibrador de espesor, o determinando el 
peso de un bocado de la oreja, en la autopsia).
 
Preparación de las suspensiones celulares  
26. Se prepara una suspensión de células sueltas de los ganglios 
linfáticos (CGL) extraídos bilateralmente siguiendo el enfoque por animales individuales o, alternativamente, el de acumulación en conjuntos por grupo 
de tratamiento, mediante disgregación mecánica suave a través de una malla 
de acero inoxidable de 200 μm de luz, u otra técnica aceptable que permita 
obtener una suspensión de células sueltas. Las suspensiones de CGL se lavan dos veces con un exceso de PBS y el ADN se precipita con ácido 
tricloroacético (ATC) al 5 %, a 4 °C durante 18 h (3). A continuación el 
sedimento se vuelve a suspender en 1 mL de ATC y se traslada a viales de centelleo con 10 mL de líquido de centelleo para el recuento de
 3 H, o se 
transfiere directamente a tubos de recuento γ para el recuento de  125 I. 
Determinación de la proliferación celular (radiactividad incorporada)  
27. La incorporación de  3 H-metil-timidina se mide con el contador de cente ­
lleo β, que cuenta las desintegraciones por minuto (DPM). La incorpo ­
ración de  125 I-yododesoxiuridina se mide por el recuento de  125 I y tam­
bién se expresa en DPM. Dependiendo del enfoque utilizado, la incor ­
poración se expresará como DPM/ratón (enfoque por animales individua ­
les) o DPM/grupo de tratamiento (enfoque de acumulación en conjuntos por grupo de tratamiento).
 
LLNA reducido  
28. En ciertas situaciones, cuando sea necesario a efectos normativos confirmar 
una predicción negativa de potencial de sensibilización cutánea, es posible 
utilizar un protocolo de LLNA reducido (rLLNA) (16) (17) (18) con menos 
animales, siempre que se respeten todas las demás especificaciones del protocolo del LLNA, como se describe en el presente ME. Antes de aplicar el rLLNA, debe aportarse una justificación clara y científicamente motivada 
de su uso. Si se obtiene un resultado positivo o dudoso en el rLLNA, puede 
ser necesario efectuar más ensayos para interpretar o aclarar la observación.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. La reducción del número de grupos de dosis es la única diferencia entre los 
protocolos del LLNA y del rLLNA, por lo que este rLLNA no proporciona 
información sobre la relación dosis-respuesta. En consecuencia, no debe utilizarse el rLLNA cuando se necesite obtener información sobre dicha relación. Como en el LLNA de dosis múltiples, la máxima concentración 
de la sustancia problema evaluada en el rLLNA debe ser la concentración 
máxima que no induzca en el ratón toxicidad sistémica manifiesta ni exce ­
siva irritación cutánea local (véase el punto 18).
 
OBSERVACIONES  
Observaciones clínicas  
30. Al menos una vez al día se realizará una observación minuciosa de cada 
animal en busca de signos clínicos, bien de irritación local en el punto de 
aplicación o bien de toxicidad sistémica. Todas las observaciones se regis ­
trarán sistemáticamente en fichas individuales de cada animal. Los planes de seguimiento deben incluir criterios para detectar rápidamente a los rato ­
nes que presenten toxicidad sistémica, excesiva irritación cutánea local o 
corrosión cutánea, a fin de someterlos a sacrificio compasivo (37).
 
Pesos corporales  
31. Como se indica en el punto 25, hay que medir el peso corporal de cada 
animal al empezar el ensayo y en la fecha prevista para el sacrificio com ­
pasivo.  
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS 
32. Los resultados de cada grupo de tratamiento se expresan como IE. Si se 
emplea el enfoque por animales individuales, el IE se obtiene dividiendo la 
media de los valores de DPM de los ratones dentro de cada grupo tratado 
con la sustancia problema, y la del grupo de control positivo (CP), por la media de los valores de DPM de los ratones del grupo de control del vehículo (CV) o disolvente. El IE medio del CV es entonces la unidad. 
Si se emplea el enfoque de acumulación en conjuntos por grupo de trata ­
miento, el IE se obtiene dividiendo la incorporación de radiactividad del conjunto de cada grupo de tratamiento por la incorporación de radiactividad del conjunto del grupo de CV; así se obtiene un IE medio. 
33. En el proceso de toma de decisiones se considera que un resultado es 
positivo si el IE es ≥ 3. Sin embargo, la fuerza de la relación 
dosis-respuesta, la significación estadística y la coherencia de las respuestas de los grupos de disolvente o vehículo y de CP pueden utilizarse también a 
la hora de determinar si un resultado dudoso se declara positivo (4) (5) (6). 
34. Si fuera necesario aclarar los resultados obtenidos, se tendrán en cuenta 
diversas propiedades de la sustancia problema, por ejemplo si está relacio ­
nada estructuralmente con sensibilizantes cutáneos conocidos, si produce 
excesiva irritación cutánea local en el ratón, y la naturaleza de la relación 
dosis-respuesta observada. Estas y otras consideraciones se comentan con detalle en otro lugar (7). 
35. La recogida de datos de radiactividad de cada ratón permite el análisis 
estadístico de los datos en cuanto a la presencia y el grado de la relación 
dosis-respuesta. Toda valoración estadística puede incluir una evaluación de la relación dosis-respuesta, así como comparaciones adecuadamente ajusta ­
das de los grupos de ensayo (por ejemplo, comparaciones por parejas entre 
grupos tratados y grupos de CV paralelos). Los análisis estadísticos pueden 
incluir, por ejemplo, la regresión lineal o la prueba de William para evaluar las tendencias de la relación dosis-respuesta, y la prueba de Dunnett para hacer comparaciones por parejas. Para elegir el método de análisis estadís ­
tico adecuado, el investigador debe conocer las posibles desigualdades de 
las varianzas y otros problemas asociados, que pueden exigir una trans ­
formación de los datos o el uso de un análisis estadístico no paramétrico. En cualquier caso, es posible que el investigador tenga que efectuar cálculos 
del IE y análisis estadísticos con y sin algunos puntos de datos (a veces 
llamados «valores atípicos»).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
DATOS E INFORME  
Datos  
36. Se resumirán los datos en forma de cuadro. Si se emplea el enfoque por 
animales individuales, deben indicarse los valores de DPM de cada animal, 
la media de DPM/animal del grupo, su término del error asociado (por ejemplo, DT, EEM), y el IE medio de cada grupo tratado con la sustancia problema, comparado con el del grupo de CV en paralelo. Si se emplea el 
enfoque de acumulación en conjuntos por grupo de tratamiento, ha de 
indicarse la media o la mediana del valor de DPM, y la media del IE de cada grupo de tratamiento, comparado con el grupo de CV en paralelo.
 
Informe del ensayo  
37. El informe del ensayo contendrá la siguiente información: 
Sustancias problema y de control: 
— datos de identificación [por ejemplo, números CAS y CE (si se cono ­
cen), origen, pureza, impurezas conocidas, número de lote], 
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, volatilidad, 
estabilidad, solubilidad), 
— si se trata de una mezcla, composición y porcentajes relativos de sus 
componentes. 
Disolvente o vehículo: 
— datos de identificación [pureza, concentración (en su caso), volumen 
utilizado], 
— justificación de la elección del vehículo. 
Animales de experimentación: 
— procedencia de los ratones CBA, 
— situación microbiológica de los animales, cuando se conozca, — número y edad de los animales, 
— procedencia de los animales, condiciones de alojamiento, dieta, etc. 
Condiciones del ensayo: 
— detalles de la preparación y aplicación de la sustancia problema, 
— justificación de las dosis elegidas (con los resultados del ensayo de 
cribado previo, si se ha efectuado), 
— concentraciones empleadas del vehículo y de la sustancia problema, y 
cantidad total de sustancia problema aplicada, 
— detalles de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo u origen de 
la dieta y el origen del agua), 
— descripción detallada de las pautas de tratamiento y toma de muestras, 
— métodos de determinación de la toxicidad, — criterios para considerar los estudios positivos o negativos, 
— detalles sobre las eventuales desviaciones del protocolo y explicación 
sobre cómo afectan estas al diseño y a los resultados del estudio. 
Verificación de la fiabilidad: — resumen de los resultados de la última verificación de la fiabilidad 
realizada, con información sobre la sustancia problema, la concentración y el vehículo utilizados, 
— datos de los CP en paralelo o históricos y de los CN en paralelo del 
laboratorio que realiza el ensayo,
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— si no se ha incluido un CP en paralelo, la fecha y el informe de 
laboratorio del CP periódico más reciente y un informe donde se espe ­
cifiquen los datos de los CP históricos del laboratorio, para justificar la ausencia de un CP en paralelo. 
Resultados: — peso de cada ratón al inicio del tratamiento y en la fecha prevista para el 
sacrificio, así como la media y el término del error asociado (por ejem ­
plo, DT, EEM) de cada grupo tratado, 
— cronología del inicio y signos de toxicidad, incluida la irritación cutánea 
en el punto de administración para cada animal, en su caso, 
— un cuadro con los valores de DPM y del IE de cada ratón (enfoque por 
animales individuales) o medios (enfoque de acumulación en conjuntos 
por grupo de tratamiento), correspondientes a cada grupo de tratamiento, 
— la media y el término del error asociado (por ejemplo, DT, EEM) de los 
valores de DPM/ratón de cada grupo de tratamiento y los resultados del análisis de los valores atípicos de cada grupo de tratamiento, cuando se 
utilice el enfoque por animales individuales, 
— el valor del IE calculado y una medida adecuada de la variabilidad que 
tenga en cuenta la variabilidad interanimales tanto en los grupos tratados con la sustancia problema como en los de control, cuando se utilice el enfoque por animales individuales, 
— la relación dosis-respuesta, 
— el análisis estadístico, en su caso. Discusión de los resultados: — un breve comentario sobre los resultados, el análisis de la relación 
dosis-respuesta y los análisis estadísticos, en su caso, con la conclusión de si la sustancia problema debe ser considerada o no sensibilizante 
cutáneo.
 
BIBLIOGRAFÍA 
(1) OCDE (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Gui ­
deline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Disponible en la direc ­
ción: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. 
Toxicol. , 30, 165-169. 
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol. , 93, 13-31. 
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  
J. Toxicol. Environ. Health , 53, 563-79. 
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol. , 34, 999-1002. 
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol. , 34, 985-997. 
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327-33.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins,  Toxicol. , 146, 49-59. 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258-273. 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274-286. 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249-257. 
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible 
en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ LLNAPerfStds.pdf] 
(13) OCDE (1992),  Skin Sensitisation.  OECD Guideline for Testing of Chemi ­
cals No 406, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines] 
(14) OCDE (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , En­
vironment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Asses ­
sment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, París. Disponible en la 
dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kim ­
ber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol. , 18, 281-284. 
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181-185. 
(17) Comité Científico Consultivo del CEVMA (2007), Statement on the Redu ­
ced Local Lymph Node Assay (rLLNA), Comisión Europea, Dirección 
General Centro Común de Investigación, Instituto de Sanidad y Protección 
de los Consumidores, Centro Europeo para la Validación de Métodos Al ­
ternativos, april 2007. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf] 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Met ­
hod Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Poten ­
tial of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research 
Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/] 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordina ­
ted by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alter ­
native Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Intera ­
gency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible 
en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llna ­
rep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Phar ­
macol., 55, 90-96. 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication 
Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, Disponible en la dirección: [http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/] 
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press. 
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89. 
(25) OCDE (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Disponible en la dirección: http://www.oecd.org/document/40/ 0,3343,en_2649_34377_37051368_ 1_1_1_1,00.html] 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances, Toxicologist, 96, 235. 
(27) ICCVAM (2009), Non-radiactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: [http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf] 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206. 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  To­
xicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83-94. 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals,  Toxicol. Meth. , 8, 245-256. 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol. , 22, 491-506. 
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and 
Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol. , 212, 
60-68. 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol. , 79, 721-728. 
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect. , 115, 
1023-1028. 
(35) OCDE (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Disponible en la dirección: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
acutetox/Tox_workshop.htm] 
(37) OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Apéndice 1  
Normas de comportamiento para la evaluación de métodos de ensayo LLNA 
similares o modificados que se propongan para determinar la sensibilización 
cutánea  
INTRODUCCIÓN 
1. El objetivo de las normas de comportamiento (NC) consiste en comunicar la 
base por la que puede determinarse si un nuevo método de ensayo, tanto protegido (es decir, sujeto a derechos de autor, patentado, registrado) como no protegido, presenta la suficiente exactitud y fiabilidad para determinados 
fines de ensayo. Estas normas de comportamiento, basadas en métodos de 
ensayo validados y aceptados, pueden utilizarse para evaluar la fiabilidad y la exactitud de otros métodos similares (conocidos como ensayos «de imi ­
tación») que se basan en principios científicos similares y miden o predicen 
el mismo efecto biológico o tóxico (14). 
2. Antes de la adopción de métodos modificados (es decir, posibles mejoras 
propuestas para un método de ensayo aprobado), debe efectuarse una eva ­
luación para determinar el efecto que tienen los cambios propuestos sobre el comportamiento del ensayo y el grado en que tales cambios afectan a la 
información disponible para los demás componentes del proceso de valida ­
ción. En función del número y de la naturaleza de los cambios propuestos, de los datos generados y de la documentación justificativa de tales cambios, estos métodos deben someterse o bien al mismo proceso de validación 
descrito para un nuevo ensayo o bien, si procede, a una evaluación limitada 
de la fiabilidad y de la pertinencia utilizando normas de comportamiento establecidas (14). 
3. Los métodos similares o modificados cuyo uso se proponga con arreglo al 
presente método de ensayo deben evaluarse para determinar su fiabilidad y 
exactitud utilizando sustancias representativas de toda la gama de resultados 
del LLNA. Para evitar el uso injustificado de animales, se recomienda insistentemente que los diseñadores de modelos consulten con las autorida ­
des competentes antes de iniciar los estudios de validación de acuerdo con 
las normas de comportamiento y las orientaciones recogidas en el presente 
método de ensayo. 
4. Estas normas de comportamiento se basan en las normas de comporta ­
miento armonizadas del ICCVAM de EE. UU., del CEVMA de la Comi ­
sión Europea y del CVAM de Japón (12), para evaluar la validez de 
versiones similares o modificadas del LLNA. Las normas de comporta ­
miento consisten en componentes fundamentales del método de ensayo, sustancias de referencia recomendadas y niveles de exactitud y fiabilidad que el método propuesto debe cumplir o superar.
 
I. Componentes fundamentales del método de ensayo  
5. Para garantizar que un método de LLNA similar o modificado es análogo, 
desde el punto de vista funcional y mecánico, al LLNA y mide el mismo efecto biológico, deben incluirse en el protocolo del método de ensayo los siguientes componentes: 
— la sustancia problema debe aplicarse tópicamente en ambas orejas del 
ratón, 
— la proliferación de linfocitos debe medirse en los ganglios linfáticos que 
drenan la zona donde se aplica la sustancia problema, 
— la proliferación de linfocitos debe medirse durante la fase de inducción 
de la sensibilización cutánea,
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— respecto a las sustancias problema, la dosis más alta seleccionada debe 
ser la concentración máxima que no induzca toxicidad sistémica ni 
excesiva irritación cutánea local en el ratón. Respecto a las sustancias de referencia positivas, la dosis más alta debe ser al menos tan elevada como los valores de CE3 de las correspondientes sustancias de referen ­
cia del LLNA (véase el cuadro 1) sin producir toxicidad sistémica ni 
excesiva irritación cutánea local en el ratón, 
— en cada estudio debe incluirse un CV en paralelo y, cuando sea perti ­
nente, también un CP en paralelo, 
— debe utilizarse un mínimo de cuatro animales por grupo de dosis, — pueden recogerse datos de cada animal o bien de conjuntos de animales. Si no se cumple alguno de estos criterios, no pueden utilizarse estas normas 
de comportamiento para la validación del método similar o modificado.
 
II. Lista mínima de sustancias de referencia  
6. Las normas de comportamiento armonizadas del ICCVAM de EE. UU., del 
CEVMA de la Comisión Europea y del CVAM de Japón (12) señalan 18 
sustancias de referencia mínimas que deben utilizarse y otras cuatro opta ­
tivas [es decir, sustancias que producen resultados falsos positivos o falsos negativos en el LLNA, cuando se comparan con los resultados obtenidos con seres humanos y cobayas (el B.6, o la TG 406 de la OCDE) (13), por 
lo que brindan la oportunidad de demostrar un comportamiento igual o 
mejor que el del LLNA] que están incluidas en las normas de comporta ­
miento del LLNA. Los criterios de selección para escoger estas sustancias son los siguientes: 
— la lista de sustancias de referencia representa los tipos de sustancias que 
se someten normalmente a ensayo para determinar el potencial de sen ­
sibilización cutánea y la gama de respuestas que el LLNA es capaz de medir o predecir, 
— las sustancias tienen una estructura química bien definida, — respecto a cada sustancia se dispone de datos de apoyo para el LLNA 
procedentes de ensayos con cobayas (es decir, el capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE) (13) y, en la medida de lo posible, de datos obtenidos 
con seres humanos, 
— las sustancias pueden conseguirse fácilmente a través de un proveedor 
comercial. 
En el cuadro 1 se recogen las sustancias de referencia recomendadas, que 
deben evaluarse en el vehículo con el que figuran en el cuadro 1. En caso de que no se disponga de una sustancia de la lista, pueden utilizarse otras sustancias que cumplan los criterios de selección mencionados, aportando la 
justificación correspondiente.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Cuadro 1  
Sustancias de referencia recomendadas para las normas de comportamiento del LLNA  
Número Sustancias (  1 ) N  o CAS Forma Veh. (  2 ) CE3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5 x – 2,0 x CE3 Rango real 
CE3 LLNA/ 
cobayas LLNA/seres 
humanos  
1 5-Cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona (CMI) y 2- 
metil-4-isotiazolin-3-ona (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Líq. DMF 0,009 1 0,0045-0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Sól. AOO 0,049 15 0,025-0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-Fenilendiamina 106-50-3 Sól. AOO 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 
4 Cloruro de cobalto 7646-79-9 Sól. DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 5 Isoeugenol 97-54-1 Líq. AOO 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 6 2-Mercaptobenzotiazol 149-30-4 Sól. DMF 1,7 1 0,85-3,4 NC +/+ +/+ 7 Citral 5392-40-5 Líq. AOO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 8 AHC 101-86-0 Líq. AOO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 
9 Eugenol 97-53-0 Líq. AOO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Benzoato de fenilo 93-99-2 Sól. AOO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 11 Alcohol cinámico 104-54-1 Sól. AOO 21 1 10,5-42 NC +/+ +/+ 12 Imidazolidinil-urea 39236-46-9 Sól. DMF 24 1 12-48 NC +/+ +/+ 13 Metacrilato de metilo 80-62-6 Líq. AOO 90 1 45-100 NC +/+ +/+ 14 Clorobenceno 108-90-7 Líq. AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15 Isopropanol 67-63-0 Líq. AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Número Sustancias (  1 ) N  o CAS Forma Veh. (  2 ) CE3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5 x – 2,0 x CE3 Rango real 
CE3 LLNA/ 
cobayas LLNA/seres 
humanos  
16 Ácido láctico 50-21-5 Líq. DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Salicilato de metilo 119-36-8 Líq. AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 Ácido salicílico 69-72-7 Sól. AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Sustancias optativas para demostrar un comportamiento mejorado respecto al LLNA 
19 Laurilsulfato de sodio 151-21-3 Sól. DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Dimetacrilato de etilenglicol 97-90-5 Líq. MEK 28 1 14-56 NC +/– +/+ 21 Xileno 1330-20-7 Líq. AOO 95,8 1 47,9-100 NC +/ (**) +/– 22 Cloruro de níquel 7718-54-9 Sól. DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Abreviaturas: AOO = Acetona: aceite de oliva (4:1, v/v); n  o CAS = número del Chemical Abstracts Service; DMF =  N,N -dimetilformamida; DMSO = dimetilsulfóxido; DNCB = 2,4-dinitroclorobenceno; CE3 = concentración 
estimada que se considera necesaria para producir un índice de estimulación de 3; cobayas = resultado del ensayo con cobayas (e s decir, el B. 6 o TG 406 de la OCDE) (13); AHC = aldehído hexilcinámico; Líq. = líquido; LLNA 
= resultado del ensayo con ganglios linfáticos locales de múrido (es decir, el B. 42 o TG 429 de la OCDE) (1); MEK = metil-etil -cetona; NA = no aplicable por ser el índice de estimulación < 3; NC = no calculado al haberse 
obtenido los datos de un solo estudio; Sól. = sólido; Veh. = vehículo del ensayo. 
(*) Se supone que no es sensibilizante en seres humanos, ya que no se han encontrado resultados clínicos de la prueba del parch e, no está incluido en el juego de alérgenos de la prueba del parche y tampoco se han encontrado 
informes de casos de sensibilización en seres humanos. 
(**) No se dispone de datos de ensayos con cobayas. 
( 1 ) Las sustancias deben prepararse cada día, salvo que mediante datos de estabilidad se demuestre que es posible conservarlas. 
( 2 ) Debido al posible efecto del uso de vehículos diferentes sobre el comportamiento del LLNA, debe utilizarse el vehículo recome ndado para cada sustancia de referencia (24) (32). 
( 3 ) El valor medio si se dispone de más de un valor de CE3. En caso de sustancias negativas (es decir, con un índice de estimulac ión < 3), se proporcionará la concentración de ensayo más elevada. 
( 4 ) Número de estudios de LLNA de los que se han obtenido datos. 
( 5 ) Disponible comercialmente como Kathon CG (n  o CAS 55965-84-9), que es una mezcla 3:1 de CMI y MI. Las concentraciones relativas de cada componente varían del 1,1 % al 1,25 %  (CMI) y del 0,3 % al 0,45 % (MI). 
Los componentes inactivos son sales de magnesio (del 21,5 % al 24 %) y nitrato de cobre (del 0,15 % al 0,17 %), y el resto de l a formulación consiste en agua, entre el 74 % y el 77 %. Puede adquirirse fácilmente Kathon 
CG a través de Sigma-Aldrich y Rohm and Haas (actualmente, Dow Chemical Corporation).
 III. Niveles definidos de fiabilidad y exactitud  
7. La exactitud de un método de LLNA similar o modificado debe ser al 
menos igual a la de las normas de comportamiento del LLNA cuando se 
evalúa con las 18 sustancias de referencia mínimas que deben utilizarse. El método nuevo o modificado debe llevar a una clasificación correcta basada en una decisión de tipo «sí/no». Sin embargo, es posible que el método 
nuevo o modificado no clasifique correctamente todas las sustancias de 
referencia mínimas que deben utilizarse. Si, por ejemplo, queda mal clasi ­
ficado uno de los sensibilizantes débiles, podría tenerse en cuenta, a efectos de demostración de la equivalencia de comportamiento, una justificación de 
la clasificación errónea y la aportación de datos adicionales (por ejemplo, 
resultados del ensayo que proporcionen clasificaciones correctas de otras sustancias con propiedades físicas, químicas y sensibilizantes similares a las de la sustancia de referencia mal clasificada). En tales circunstancias, la 
situación de la validación del método de ensayo LLNA nuevo o modificado 
podría evaluarse caso por caso.
 
Reproducibilidad intralaboratorios  
8. Para determinar la reproducibilidad intralaboratorios de un método de 
LLNA nuevo o modificado, hay que utilizar una sustancia sensibilizante 
que esté bien caracterizada en el LLNA. Por tanto, las normas de compor ­
tamiento del LLNA se basan en la variabilidad de los resultados obtenidos con el aldehído hexilcinámico (AHC) en ensayos repetidos. Para evaluar la 
fiabilidad intralaboratorios, deben obtenerse valores de concentración esti ­
mada umbral (CEu) del AHC en cuatro ocasiones distintas, con un intervalo de al menos una semana entre los ensayos. Una reproducibilidad intralabo ­
ratorios aceptable viene indicada por la capacidad del laboratorio de obte ­
ner, en cada ensayo con AHC, unos valores de CEu entre el 5 % y el 20 %, 
que representan un rango de 0,5-2,0 veces el valor medio de CE3 especi ­
ficado para el AHC (10 %) en el LLNA (véase el cuadro 1).
 
Reproducibilidad interlaboratorios  
9. Para determinar la reproducibilidad interlaboratorios de un método de 
LLNA nuevo o modificado, hay que utilizar dos sustancias sensibilizantes que estén bien caracterizadas en el LLNA. Las normas de comporta ­
miento del LLNA se basan en la variabilidad de los resultados obtenidos 
con el AHC y el 2,4-dinitroclorobenceno (DNCB) en ensayos realizados 
en diferentes laboratorios. Los valores de CEu deben obtenerse indepen ­
dientemente a partir de un solo estudio llevado a cabo en al menos tres laboratorios distintos. Para demostrar que la reproducibilidad interlabora ­
torios es aceptable, cada laboratorio debe obtener unos valores de CEu 
del 5 % al 20 % con el AHC y del 0,025 % al 0,1 % con el DNCB, que representan un rango de 0,5-2,0 veces el valor medio de CE3 especifi ­
cado para el AHC (10 %) y el DNCB (0,05 %), respectivamente, en el 
LLNA (véase el cuadro 1).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
Apéndice 2  
Definiciones  
Exactitud:  Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de 
ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del com ­
portamiento del método de ensayo y es un aspecto de su pertinencia. Este 
término y el de «concordancia» se suelen usar indistintamente para indicar la 
proporción de resultados correctos de un método de ensayo (14).  
Sustancia de evaluación comparativa:  Sustancia sensibilizante o no sensibilizante 
utilizada como patrón de comparación con una sustancia problema. Las sustan ­
cias de evaluación comparativa deben presentar las siguientes propiedades: i) fuente de procedencia coherente y fiable, ii) similitud estructural y funcional 
con la clase de las sustancias problema, iii) características fisicoquímicas cono ­
cidas, iv) datos de apoyo sobre los efectos conocidos, y v) potencia conocida en la gama de respuestas deseada.  
Concentración estimada umbral (CEu):  Concentración estimada de una sustancia 
problema que se necesita para conseguir un índice de estimulación indicativo de una respuesta positiva.  
Concentración estimada tres (CE3):  Concentración estimada de una sustancia 
problema que se necesita para conseguir un índice de estimulación de tres.  
Falso negativo:  Sustancia problema identificada incorrectamente como negativa o 
inactiva por un método de ensayo, cuando en realidad es positiva o activa.  
Falso positivo:  Sustancia problema identificada incorrectamente como positiva o 
activa por un método de ensayo, cuando en realidad es negativa o inactiva.  
Peligro:  Posibilidad de que se dé un efecto adverso sobre la salud o el medio 
ambiente. El efecto adverso se manifiesta solamente si hay un nivel suficiente de 
exposición.  
Reproducibilidad interlaboratorios:  Medida del grado en que diferentes labora ­
torios cualificados, utilizando el mismo protocolo y sometiendo a ensayo las 
mismas sustancias problema, pueden proporcionar resultados cualitativa y cuan ­
titativamente similares. La reproducibilidad interlaboratorios se determina durante los procesos de prevalidación y validación, e indica el grado en que un ensayo 
puede transferirse con éxito entre laboratorios; se denomina también reproduci ­
bilidad entre laboratorios (14).  
Reproducibilidad intralaboratorios:  Determinación del grado en que personas 
cualificadas del mismo laboratorio pueden repetir con éxito los resultados en momentos diferentes, utilizando un protocolo especificado. También se denomina reproducibilidad dentro del laboratorio (14).  
Ensayo de imitación:  Denominación de un método de ensayo que es estructural y 
funcionalmente similar a un método de ensayo de referencia, validado y acepta ­
do. Tales métodos de ensayo serían candidatos para una validación de actuali ­
zación. También se pueden denominar métodos de ensayo similares (14).  
Valor atípico:  Una observación que es muy diferente de los otros valores en una 
muestra aleatoria de una población.  
Normas de comportamiento:  Normas, basadas en un método de ensayo validado, 
que proporcionan la base para evaluar la comparabilidad de un método de ensayo 
propuesto, que es similar desde el punto de vista funcional y mecánico. Se incluyen aquí: i) los componentes fundamentales del método de ensayo, ii) una lista mínima de sustancias de referencia seleccionadas de entre las sustancias 
utilizadas para demostrar el comportamiento aceptable del método de ensayo 
validado, y iii) los niveles similares de exactitud y fiabilidad que, sobre la base de lo obtenido con el método de ensayo validado, debe mostrar el método de ensayo propuesto cuando se evalúa con la lista mínima de sustancias de 
referencia (14).  
Método de ensayo protegido:  Método de ensayo cuyos elementos tienen la 
fabricación y distribución restringida por patentes, derechos de autor, marcas 
registradas, etc.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Garantía de calidad:  Proceso de gestión por el que personas independientes de 
las que efectúan el ensayo evalúan el cumplimiento de las normas, los requisitos 
y los procedimientos de registro de los ensayos de laboratorio, así como la exactitud de los datos transferidos.  
Sustancias de referencia:  Sustancias seleccionadas para utilizarse en el proceso 
de validación, cuyas respuestas en el sistema de ensayo de referencia  in vitro  o in 
vivo o en la especie de interés ya se conocen. Estas sustancias deben ser repre ­
sentativas de las clases de sustancias con las que esté previsto utilizar el método 
de ensayo, y deben representar toda la gama de respuestas que puede esperarse de las sustancias con las que pueda utilizarse, desde fuertes hasta débiles e incluso negativas. Es posible que se necesiten distintos conjuntos de sustancias 
de referencia para las diferentes fases del proceso de validación y para los 
distintos métodos de ensayo y usos de los ensayos (14).  
Pertinencia:  Descripción de la relación del ensayo con el efecto de interés y 
de si es significativo y útil para un objetivo concreto. Es el grado en que el ensayo mide o predice correctamente el efecto biológico de interés. La perti ­
nencia incorpora la consideración de la exactitud (concordancia) de un método 
de ensayo (14).  
Fiabilidad:  Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de 
forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproduci ­
bilidad intra e interlaboratorios (14).  
Sensibilización cutánea:  Proceso inmunológico que se observa cuando un indi ­
viduo predispuesto sufre una exposición tópica a una sustancia alergénica induc ­
tora, la cual provoca una respuesta inmunitaria cutánea que puede llevar a la aparición de sensibilización por contacto.  
Índice de estimulación (IE):  Valor calculado para evaluar el potencial de sensi ­
bilización cutánea de una sustancia problema y que es la relación entre la pro ­
liferación en los grupos tratados y la del grupo de control del vehículo en 
paralelo.  
Sustancia problema (o producto químico problema):  Toda sustancia o mezcla 
sometida a ensayo con este ME.  
Método de ensayo validado:  Método de ensayo sobre el cual se han completado 
los estudios de validación para determinar su pertinencia (incluida su exactitud) y su fiabilidad con respecto a un fin específico. Es importante señalar que un 
método de ensayo validado podría no tener un comportamiento suficiente en 
términos de exactitud y fiabilidad como para considerarse aceptable a efectos del fin propuesto (14).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  ESTUDIO DE NEUROTOXICIDAD EN ROEDORES  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 424 (1997). 
Este método de ensayo tiene por objeto obtener la información ne ­
cesaria para confirmar o caracterizar de manera más precisa la posi ­
ble neurotoxicidad de sustancias químicas en animales adultos. Puede combinarse con los actuales métodos de ensayo de los estu ­
dios de toxicidad por administración continuada o bien realizarse 
como estudio independiente. Se recomienda consultar el documento 
orientativo de la OCDE sobre estrategias y métodos de ensayo de neurotoxicidad (1)  (OECD Guidance Document on Neurotoxicity 
Testing Strategies and Methods),  que puede servir de ayuda para 
la concepción de estudios basados en este método de ensayo. Esta 
consulta es especialmente importante cuando se recomienden modi ­
ficaciones de las observaciones y procedimientos de ensayo para el uso habitual del presente método. El documento orientativo se ha 
preparado a fin de facilitar la selección de otros procedimientos de 
ensayo que puedan emplearse en determinadas circunstancias. 
En el presente método no se trata la evaluación de la neurotoxicidad 
para el desarrollo.
 
1.1. INTRODUCCIÓN 
En la evaluación de las características tóxicas de las sustancias quí ­
micas, es importante considerar el potencial de efectos neurotóxicos. 
El método de ensayo de toxicidad sistémica por administración con ­
tinuada incluye ya observaciones para detectar la posible neurotoxi ­
cidad. El presente método de ensayo puede utilizarse para preparar un estudio destinado a obtener más información sobre los efectos 
neurotóxicos observados en los estudios de toxicidad sistémica por 
administración continuada o para confirmar tales efectos. Sin embar ­
go, según la valoración que se haga de la posible neurotoxicidad de ciertas clases de sustancia químicas puede considerarse más conve ­
niente evaluarlas mediante este método sin indicación previa de la 
posible neurotoxicidad a partir de estudios de toxicidad sistémica por administración continuada. Entre los aspectos que deben tenerse en cuenta para ello pueden citarse los siguientes: 
— observación de signos neurológicos o lesiones neuropatológicas 
en estudios de toxicidad distintos de los estudios de toxicidad 
sistémica por administración continuada, o 
— relación estructural u otro tipo de información que los relacione 
con neurotóxicos conocidos. 
Además puede haber otros casos en los que sea adecuado utilizar 
este método de ensayo, para más información véase (1). 
El presente método se ha concebido de manera que pueda ajustarse a 
distintas necesidades concretas a la hora de confirmar la neurotoxicidad 
histopatológica y comportamental de una sustancia, y de aportar una 
caracterización y cuantificación de las respuestas neurotóxicas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Anteriormente, la neurotoxicidad se equiparaba a la neuropatía que 
implicaba lesiones neuropatológicas o disfunciones neurológicas, 
como convulsiones, parálisis o temblores. Aunque la neuropatía es una manifestación importante de la neurotoxicidad, actualmente se sabe que hay muchos otros signos que indican toxicidad en el sis ­
tema nervioso (por ejemplo, pérdida de coordinación motora, defi ­
ciencias sensoriales y disfunciones del aprendizaje y la memoria) y que pueden no aparecer en estudios de neuropatía o en otros tipos de estudios. 
El presente método de ensayo de neurotoxicidad está pensado para 
detectar efectos neuropatológicos y neurocomportamentales en roedo ­
res adultos. Aunque los efectos en el comportamiento, incluso en au ­
sencia de cambios morfológicos, pueden dar cuenta de un impacto nocivo en el organismo, no todas las alteraciones del comportamiento están relacionadas con el sistema nervioso. Por lo tanto, cualquier 
cambio observado tiene que evaluarse junto con datos correlativos de 
tipo bioquímico, hematológico e histopatológico, y con datos sobre otros tipos de toxicidad sistémica. Las pruebas prescritas en este mé ­
todo para obtener la caracterización y cuantificación de las respuestas 
neurotóxicas incluyen procedimientos comportamentales e histopato ­
lógicos que pueden ir apoyados de manera complementaria por inves ­
tigaciones bioquímicas y/o electrofisiológicas (1) (2) (3) (4). 
Los neurotóxicos pueden actuar sobre un número de dianas dentro 
del sistema nervioso y mediante una gran variedad de mecanismos. Dado que no hay ningún conjunto de ensayos que, por sí solo, sea 
capaz de evaluar perfectamente el potencial neurotóxico de todas las 
sustancias, puede ser necesario utilizar otros ensayos  in vivo  o in 
vitro  aplicables concretamente al tipo de neurotoxicidad observada o 
prevista. 
Este método de ensayo puede aplicarse también junto con las orien ­
taciones establecidas en el documento de la OCDE denominado  
OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies 
and Methods  (1) a fin de preparar estudios destinados a caracterizar 
de manera más precisa la cuantificación dosis-respuesta o a aumentar la sensibilidad de esta, de manera que pueda estimarse más exacta ­
mente un nivel sin efectos adversos observados o comprobar peligros 
sospechados o conocidos de la sustancia. Por ejemplo, pueden pre ­
pararse estudios para determinar y evaluar los mecanismos neurotó ­
xicos o para complementar los datos ya disponibles a partir de los 
procedimientos básicos de observación neuropatológica y neurocom ­
portamental. No es necesario que estos estudios generen de nuevo datos que se obtendrían también a partir de los procedimientos es ­
tándar recomendados en el presente método, si estos datos ya son 
conocidos y no se consideran necesarios para la interpretación de los 
resultados del estudio. 
Este estudio de neurotoxicidad, cuando se realiza solo o en combi ­
nación con otros, aporta información que puede: 
— determinar si el sistema nervioso está afectado de manera per ­
manente o reversible por la sustancia ensayada; 
— contribuir a la caracterización de las alteraciones del sistema 
nervioso relacionadas con la exposición a la sustancia y a la 
comprensión de los mecanismos que intervienen;
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— determinar las relaciones entre dosis y tiempo de respuesta a fin 
de estimar un nivel sin efectos adversos observados (que pueda 
utilizarse con objeto de establecer criterios de seguridad para la sustancia). 
En este método de ensayo se administra la sustancia estudiada por 
vía oral. Otras vías de administración (por ejemplo, por vía dérmica 
o por inhalación) pueden resultar más adecuadas y requerir modifi ­
caciones de los procedimientos recomendados. La elección de la vía de administración depende del perfil de exposición humana y de la información cinética y toxicológica disponible.
 
1.2. DEFINICIONES  
Efecto adverso:  toda alteración respecto a una situación de referen ­
cia, relacionada con el tratamiento, que disminuya la capacidad del 
organismo para sobrevivir, reproducirse o adaptarse al entorno.  
Dosis:  cantidad de sustancia de ensayo administrada. Se expresa en 
peso (g, mg), en peso de sustancia de ensayo por unidad de peso del 
animal (por ejemplo, mg/kg) o en concentración constante en la dieta 
(ppm).  
Posología:  término general que abarca la dosis administrada, su 
frecuencia y duración.  
Neurotoxicidad:  alteración adversa de la estructura o función del 
sistema nervioso debida a la exposición a un agente físico, biológico 
o químico.  
Neurotóxico:  cualquier agente físico, biológico o químico que pueda 
provocar neurotoxicidad.  
NOAEL:  sigla inglesa referente a la dosis de exposición sin efectos 
adversos observados, es decir, la dosis más alta a la que no se 
observa ningún efecto adverso debido al tratamiento.  
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se administra por vía oral una serie de dosis de la sustancia a varios 
grupos de roedores de laboratorio. Normalmente se requiere una administración continuada y el período de administración puede ser 
28 días, 90 días (toxicidad subcrónica) o 1 año o más (toxicidad 
crónica). Los procedimientos establecidos en este método de ensayo pueden aplicarse también a un estudio de neurotoxicidad aguda. Los animales se someten a ensayo para detectar anomalías neurológicas o 
del comportamiento o para caracterizarlas. Durante cada período de 
observación se evalúa una gama de comportamientos que podría estar afectada por neurotóxicos. Al final del ensayo, se hace una perfusión  in situ  a un subgrupo de animales de cada sexo y de 
cada grupo, y se preparan y examinan secciones de los nervios 
periféricos y de la médula espinal y el cerebro. 
Cuando se trate de un estudio único independiente destinado a detectar 
neurotoxicidad o a caracterizar los efectos neurotóxicos, los animales de cada grupo no empleados para perfusión y posterior histopatología 
(véase el cuadro 1) pueden utilizarse para otros procedimientos con ­
cretos de tipo electrofisiológico, neuroquímico, neuropatológico o neu ­
rocomportamental que puedan complementar los datos obtenidos a partir de los exámenes estándar prescritos en el presente método (1). 
Estos procedimientos complementarios pueden ser especialmente útiles 
cuando las observaciones empíricas o los efectos previstos indiquen un tipo determinado o una diana de neurotoxicidad química. Otra posibi ­
lidad es utilizar los animales restantes para evaluaciones como las 
prescritas en los métodos de ensayo para estudios de toxicidad por 
administración continuada en roedores.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Cuando los procedimientos del presente método de ensayo se com ­
binen con los de otros métodos, se necesita un número suficiente de 
animales para que puedan cumplirse todos los requisitos de las ob ­
servaciones de ambos estudios.  
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Selección de la especie animal  
La especie de preferencia entre los roedores es la rata, aunque pue ­
den utilizarse otras especies de roedores. Deben usarse animales 
adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en labo ­
ratorio. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. La adminis ­
tración ha de empezar lo antes posible tras el destete, preferiblemen ­
te, antes de que los animales tengan 6 semanas de edad y, en cual ­
quier caso, antes de que tengan 9 semanas. No obstante, cuando este estudio se combine con otros, podrían tener que ajustarse estos re ­
quisitos de edad. Al principio del estudio, la diferencia de peso entre 
los animales empleados no debe superar el ± 20 % del peso medio 
de cada sexo. Cuando se realice un estudio de la toxicidad oral por administración continuada como fase previa de un estudio de toxi ­
cidad a largo plazo, deben utilizarse en ambos estudios animales 
procedentes de la misma cepa y del mismo origen.
 
1.4.2.  Alojamiento y alimentación  
El cuarto de experimentación ha de estar a una temperatura de 22  o C 
(± 3  o C). Aunque la humedad relativa ha de ser, como mínimo, del 
30 % y preferiblemente no superior al 70 %, salvo durante la lim ­
pieza del local, lo ideal es que esté comprendida entre el 50 y el 
60 %. Se aplicará una iluminación artificial en una secuencia de 12 
horas de luz y 12 horas de oscuridad. Debe mantenerse al mínimo el ruido fuerte intermitente. Puede proporcionarse una dieta alimentaria corriente para animales de laboratorio y agua a voluntad. Si la sus ­
tancia de ensayo se administra con los alimentos, es preciso obtener 
una mezcla adecuada, lo cual puede influir en la elección de la dieta. Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del mismo sexo.
 
1.4.3.  Preparación de los animales  
Se eligen al azar animales jóvenes y sanos y se reparten en los lotes 
testigo y tratado. Las jaulas se colocan de manera que los posibles 
efectos debidos a la posición de las mismas sean mínimos. Los animales se identifican individualmente y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes del inicio del ensayo, a fin de permitir 
su aclimatación a las condiciones del laboratorio.
 
1.4.4.  Vía de administración y preparación de las dosis  
En este método de ensayo se administra la sustancia estudiada por 
vía oral. La administración de la sustancia por vía oral puede hacerse mediante una sonda, la dieta, el agua o cápsulas. Pueden usarse otras vías de administración (por ejemplo: cutánea o inhalación) pero en 
este caso pueden tener que modificarse los procedimientos recomen ­
dados. La elección de la vía de administración depende del perfil de exposición humana y de la información cinética y toxicológica dis ­
ponible. Deberá justificarse adecuadamente la elección de la vía de 
administración, así como las consiguientes modificaciones de los 
procedimientos del método de ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
En caso necesario, la sustancia estudiada se disolverá o suspenderá 
en un vehículo adecuado. Se recomienda considerar en primer lugar 
el uso de una solución o suspensión acuosa, después el uso de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz) y, por último, la posible solución o suspensión en otros vehículos. Las 
características tóxicas del vehículo deben ser conocidas. Además, 
deben valorarse las siguientes características del vehículo: efectos en la absorción, la distribución, el metabolismo o la retención de la sustancia estudiada que puedan alterar sus características tóxicas; y 
efectos en el consumo de alimentos y agua o en el estado nutricional 
de los animales.
 
1.5. PROCEDIMIENTOS  
1.5.1.  Número y sexo de los animales  
Cuando se trate de un estudio único independiente, se utilizarán al 
menos 20 animales (10 hembras y 10 machos) en cada grupo tratado y de control para la evaluación de las observaciones clínicas y fun ­
cionales, que deben ser detalladas. Como mínimo 5 machos y 5 
hembras, seleccionados entre estos 10 machos y 10 hembras, deben ser perfundidos  in situ  y utilizados para hacer una histopatología 
detallada al final del estudio. En los casos en que solo se observe 
un número limitado de animales en un grupo determinado para de ­
tectar efectos neurotóxicos, se considerará la inclusión de estos ani ­
males entre los seleccionados para perfusión. Cuando el estudio se 
lleve a cabo en combinación con un estudio de toxicidad por admi ­
nistración continuada, deberá usarse un número adecuado de anima ­
les para que puedan alcanzarse los objetivos de ambos estudios. En el cuadro 1 se da el número mínimo de animales por grupo para 
varias combinaciones de estudios. Si van a sacrificarse animales 
durante el experimento o están previstos grupos para observar la reversibilidad, persistencia o aparición retardada de efectos tóxicos con posterioridad al tratamiento, o cuando se plantee la realización 
de observaciones complementarias, habrá de aumentarse el número 
de animales para asegurar que se dispone de los animales necesarios para observación e histopatología.
 
1.5.2.  Lote tratado y lote testigo  
Deben utilizarse, al menos, tres grupos para tratamiento y uno para 
control. No obstante, si, a partir de la evaluación de otros datos, no son previsibles efectos a una dosis continuada de 1 000 mg/kg de 
peso corporal, podrá realizarse un ensayo límite. Si no se dispone de 
datos apropiados, puede realizarse un estudio para ayudar a determi ­
nar la gama de dosis que debe emplearse. A excepción de la admi ­
nistración de la sustancia de ensayo, los animales del lote testigo 
deben ser tratados de la misma manera que los de los lotes de ensayo. Si se utiliza un vehículo para la administración de la sus ­
tancia de ensayo, el lote testigo recibirá el mayor volumen utilizado 
de dicho vehículo.
 
1.5.3.  Control de fiabilidad  
El laboratorio que lleve a cabo el estudio debe presentar datos que 
demuestren su capacidad de realizarlo y la sensibilidad de los procedi ­
mientos que emplee. Tales datos han de acreditar su capacidad de detectar y cuantificar, en su caso, los cambios en los diferentes pará ­
metros cuya observación se recomienda, como signos neurovegetati ­
vos, reactividad sensorial, fuerza de prensión y actividad motriz. En la 
bibliografía (referencias 2 a 29) puede encontrarse información sobre sustancias que causan diferentes tipos de respuestas neurotóxicas y que pueden usarse para controles positivos. Pueden utilizarse datos de re ­
ferencia anteriores si se mantienen los aspectos esenciales de los pro ­
cedimientos experimentales. Se recomienda la actualización periódica de los datos de referencia anteriores. Deben obtenerse nuevos datos que demuestren que los procedimientos mantienen la sensibilidad requerida 
cuando el laboratorio haya modificado alguno de los aspectos esencia ­
les del ensayo o los procedimientos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4.  Selección de la dosis  
Las dosis deben seleccionarse teniendo en cuenta la toxicidad pre ­
viamente observada y los datos cinéticos y de toxicidad disponibles referentes a la sustancia de ensayo o productos afines. La dosis más 
elevada debe seleccionarse con el propósito de inducir efectos neu ­
rotóxicos o efectos tóxicos sistémicos evidentes. Posteriormente, debe seleccionarse una secuencia descendente de dosis destinadas a demostrar cualquier posible relación dosis-respuesta y la ausencia de 
efectos adversos observados con la dosis inferior. En principio, las 
dosis deben fijarse de manera que los efectos tóxicos primarios en el sistema nervioso puedan distinguirse de los relacionados con la to ­
xicidad sistémica. Los intervalos del doble al triple suelen ser ópti ­
mos para establecer las dosis decrecientes y a menudo es preferible añadir un cuarto lote de ensayo en lugar de utilizar intervalos muy amplios (por ejemplo, con un factor superior a 10) entre dosis. Si se 
dispone de una estimación razonable sobre la exposición del hombre, 
esta deberá también tenerse en cuenta.
 
1.5.5  Ensayo límite  
Si en un estudio con una dosis de, al menos, 1 000 mg/kg de peso 
corporal/día, siguiendo el procedimiento descrito, no se produce nin ­
gún efecto neurotóxico observable y si, a la luz de los datos de sustancias estructuralmente afines, no cabe esperar efectos tóxicos, puede considerarse innecesario realizar un estudio completo con 3 
dosis. Según el grado previsto de exposición humana, puede ser 
preciso administrar una dosis oral superior en el ensayo límite. Si se trata de otras vías de administración, como la inhalación o la 
aplicación cutánea, suelen ser las características fisicoquímicas de 
la sustancia de ensayo las que determinan el grado máximo de exposición que puede alcanzarse. Para la realización de un estudio de toxicidad oral aguda, la dosis de un ensayo límite debe ser, al 
menos, 2 000 mg/kg.
 
1.5.6.  Administración de las dosis  
Las dosis de sustancia se administran a los animales todos y cada 
uno de los días del período de 28; es necesario justificar la aplica ­
ción de una posología de solo 5 días por semana o un período de 
exposición más corto. Si la sustancia de ensayo se administra por sonda, debe hacerse en una sola dosis y con una sonda gástrica o una 
cánula de intubación adecuada. El volumen máximo de líquido que 
puede administrarse de una sola vez depende del tamaño del animal. El volumen no debe superar 1 ml/100 g de peso corporal; no obs ­
tante, en el caso de las soluciones acuosas puede considerarse la 
posibilidad de administrar 2 ml/100 g de peso corporal. Salvo en 
el caso de sustancias irritantes o corrosivas, que por lo general producen efectos exacerbados con concentraciones mayores, deberá reducirse al mínimo la variabilidad del volumen de ensayo ajustando 
la concentración de manera que el volumen sea el mismo en todas 
las dosis. 
Si la sustancia se administra con los alimentos o el agua de bebida, 
es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia de en ­
sayo administradas no interfieren la nutrición normal ni el equilibrio hídrico. Cuando la sustancia de ensayo se administre con los alimen ­
tos, puede utilizarse una concentración constante en la dieta (en 
ppm) o bien una dosis constante en relación con el peso corporal 
de los animales; debe precisarse el método escogido. Si la sustancia se administra por sonda, la dosis debe darse todos los días a la misma hora y ajustarse según sea necesario para mantener una dosis 
constante en relación con el peso corporal del animal. Cuando se 
utilice un estudio de administración continuada como fase previa de un estudio a largo plazo, deberá utilizarse en ambos estudios una dieta similar. Para estudios de toxicidad aguda, si no es posible 
utilizar una dosis única, podrá administrarse la sustancia en fraccio ­
nes menores a lo largo de un período que no excederá de 24 horas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6. OBSERVACIONES  
1.6.1.  Frecuencia de las observaciones y ensayos  
En los estudios de administración continuada, el período de obser ­
vación debe cubrir todo el período de administración. En los estudios 
de toxicidad aguda, debe haber un período de observación de 14 días 
posterior al tratamiento. En el caso de los animales de grupos satélite que se mantengan sin exposición durante el período posterior al tratamiento, las observaciones deben cubrir también este período. 
Las observaciones deben hacerse con la frecuencia suficiente para 
que sea máxima la probabilidad de detección de cualquier anomalía neurológica o del comportamiento. Las observaciones deben hacerse preferiblemente a las mismas horas cada día prestando atención al 
período más agudo de los efectos previstos tras la administración. En 
el cuadro 2 se resume la frecuencia de las observaciones clínicas y las pruebas funcionales. Si, a partir de estudios anteriores, se dispone de datos cinéticos o de otro tipo que muestren la necesidad de 
utilizar tiempos diferentes para las observaciones, pruebas o períodos 
post-observación, se aplicará otro programa a fin de conseguir el máximo de información. Los cambios en el programa habrán de justificarse debidamente.
 
1.6.1.1.  Observaciones del estado general de salud y de la mortalidad/mor ­
bilidad  
Deberán observarse cuidadosamente todos los animales al menos una 
vez al día para comprobar su estado de salud y al menos dos veces al día para comprobar la mortalidad y la morbilidad.
 
1.6.1.2.  Observaciones clínicas detalladas  
Se someterán a observación clínica detallada todos los animales 
seleccionados con este fin (véase el cuadro 1) una vez antes de la primera exposición (para poder hacer comparaciones con un mismo sujeto) y después a diferentes intervalos según la duración 
del estudio (véase el cuadro 2). Deberán hacerse observaciones 
clínicas detalladas sobre lotes satélite de recuperación al final del período de recuperación. Las observaciones clínicas detalladas se harán fuera de la jaula de alojamiento en un ambiente normal y se 
registrarán cuidadosamente utilizando sistemas de puntuación que 
incluyan criterios o escalas de puntuación para cada medición de las observaciones. Los criterios o escalas deberán ser definidos explícitamente por el laboratorio que lleve a cabo el ensayo. 
Debe procurarse que las variaciones en las condiciones de ensayo 
sean mínimas (no relacionadas sistemáticamente con el tratamiento) y que las observaciones sean realizadas por observadores especia ­
lizados ajenos al tratamiento. 
Se recomienda que las observaciones se hagan de manera estructu ­
rada aplicando sistemáticamente criterios bien definidos (incluida la 
definición del «intervalo» normal) a cada animal en cada momento de observación. El «intervalo normal» deberá documentarse adecua ­
damente. Se registrarán todos los signos observados. Siempre que 
sea factible, se registrará también la magnitud de los signos obser ­
vados. Las observaciones clínicas deben incluir, entre otras cosas, los cambios de la piel, pelo, ojos, membranas mucosas, presencia de secreciones y excreciones y actividad neurovegetativa (por ejemplo, 
lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila, así como respiración por 
la boca, cualquier signo de orina o defecación y orina descolorida).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
También habrá de anotarse cualquier respuesta no habitual en lo que 
se refiere a la posición del cuerpo, el nivel de actividad (por ejemplo, 
aumento o disminución de la exploración del ambiente normal en el que se mueva) y la coordinación de los movimientos. Deben regis ­
trarse también los cambios observados en la marcha (por ejemplo, 
contoneo o ataxia), postura (por ejemplo, espalda encorvada) y res ­
puesta a la manipulación, la colocación u otros estímulos ambienta ­
les, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, con ­
vulsiones o temblores, estereotipos (por ejemplo, realización excesiva 
de movimientos de limpieza, movimientos anómalos de la cabeza, 
recorridos repetitivos en círculo) o comportamientos anómalos (por ejemplo, lamido excesivo o mordiscos, automutilación, marcha hacia atrás y vocalización) o agresión.
 
1.6.1.3.  Pruebas funcionales  
De manera semejante a las observaciones clínicas detalladas, deben 
efectuarse también pruebas funcionales una vez antes de la exposi ­
ción y frecuentemente a continuación en todos los animales selec ­
cionados con este fin (véase el cuadro 1). La frecuencia de estas pruebas depende también de la duración del estudio (véase el cuadro 2). Además de los períodos de observación establecidos en 
el cuadro 2, se llevarán a cabo observaciones funcionales de lotes 
satélite de recuperación lo más cercanas que sea posible al sacrificio final. Las pruebas funcionales deben incluir la reactividad sensorial frente a estímulos de diferentes tipos [por ejemplo, auditivos, visua ­
les y propioceptivos (5) (6) (7)], y la evaluación de la fuerza de 
prensión (8) y de la actividad motriz (9). La actividad motriz se medirá con un dispositivo automático capaz de detectar tanto aumen ­
tos como disminuciones de actividad. Si se usa otro sistema definido, 
este deberá ser cuantitativo y su sensibilidad y fiabilidad deberán 
demostrarse. Se probará cada dispositivo para asegurar la fiabilidad a lo largo del tiempo y la concordancia entre diferentes dispositivos. En las referencias respectivas se da más información sobre los pro ­
cedimientos que pueden seguirse. Si no hay datos (por ejemplo, 
relaciones estructura-actividad, datos epidemiológicos, otros estudios toxicológicos...) que indiquen los posibles efectos neurotóxicos, debe considerarse la inclusión de pruebas más especializadas de funciones 
sensoriales o motrices o del aprendizaje y la memoria, para estudiar 
estos posibles efectos más detalladamente. En (1) se da más infor ­
mación sobre pruebas más especializadas y su aplicación. 
Excepcionalmente, puede omitirse la prueba a animales que muestren 
signos de toxicidad en un grado tal que interfiera de manera signi ­
ficativa la prueba funcional. La eliminación de animales de cualquier 
prueba funcional se justificará debidamente.
 
1.6.2.  Peso corporal y consumo de alimento y agua  
Para estudios de hasta 90 días de duración, tienen que pesarse todos 
los animales al menos una vez por semana y deben hacerse medi ­
ciones del consumo de alimentos (consumo de agua, cuando la sus ­
tancia estudiada se administre por este medio) al menos semanal ­
mente. Para estudios a largo plazo, deben pesarse todos los animales 
al menos una vez por semana durante las primeras 13 semanas y al 
menos una vez cada 4 semanas a continuación. Se medirá el con ­
sumo de alimentos (consumo de agua, cuando la sustancia estudiada se administre por este medio) al menos semanalmente durante las 
primeras 13 semanas y luego a intervalos de unos 3 meses, a menos 
que el estado de salud o el peso corporal aconsejen otra cosa.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3.  Oftalmología  
Para estudios de más de 28 días de duración, debe realizarse una 
exploración oftalmológica con un oftalmoscopio o equipo equiva ­
lente adecuado antes de administrar la sustancia de ensayo y al 
término del estudio, preferiblemente, de todos los animales, y al 
menos del lote con la dosis más alta y del lote de control. Si se observan cambios oculares o si los signos clínicos lo exigen, deben examinarse todos los demás animales. Para estudios a largo plazo, 
debe efectuarse una exploración oftalmológica a las 13 semanas. Las 
exploraciones oftalmológicas no serán necesarias si se conocen ya estos datos a partir de otros estudios de duración parecida y a dosis 
semejantes.
 
1.6.4.  Hematología y bioquímica clínica  
Cuando el estudio de neurotoxicidad se haga en combinación con un 
estudio de toxicidad sistémica por administración continuada, se 
practicarán exámenes hematológicos y determinaciones bioquímicas clínicas según lo indicado en el respectivo método del estudio de toxicidad sistémica. La recogida de muestras debe hacerse de tal 
manera que se reduzcan al mínimo los posibles efectos en el neuro ­
comportamiento.
 
1.6.5.  Histopatología  
Los análisis neuropatológicos tienen que estar pensados de manera 
que complementen y amplíen las observaciones efectuadas durante la fase in vivo  del estudio. Se fijarán  in situ  tejidos de, al menos, 5 
animales por sexo y por grupo (véase el cuadro 1 y el parágrafo 
siguiente), utilizando técnicas de fijación y perfusión ampliamente reconocidas (véase la referencia 3 del capítulo 5 y la referencia 4 del capítulo 50). Deben registrarse todas las modificaciones macroscópi ­
cas observables. Cuando se trate de un estudio único independiente 
destinado a detectar neurotoxicidad o a caracterizar efectos neurotó ­
xicos, el resto de los animales puede utilizarse o bien para otros procedimientos concretos de tipo electrofisiológico (10) (11) (16) 
(17), neuroquímico (10) (11) (14) (15), neuropatológico (10) (11) 
(12) (13) o neurocomportamental (10) (11) que puedan complemen ­
tar los procedimientos y análisis descritos aquí o bien para aumentar el número de sujetos examinados para detectar histopatologías. Estos 
procedimientos complementarios pueden ser especialmente útiles 
cuando las observaciones empíricas o los efectos previstos indiquen un tipo determinado o una diana de neurotoxicidad (2) (3). Otra posibilidad es utilizar el resto de los animales para las evaluaciones 
patólogicas habituales descritas en el método sobre estudios de to ­
xicidad por administración continuada. 
Se aplicará un procedimiento general de tinción, como hematoxilina- 
eosina, en todas las muestras de tejido incluidas en parafina y se hará un examen microscópico. Cuando se observen o se sospechen signos de neuropatía periférica, deberán examinarse muestras incluidas en 
plástico de tejido de nervios periféricos. Según los signos clínicos 
que aparezcan podrán examinarse otros tejidos o utilizarse procedi ­
mientos de tinción especiales. En (3) y (4) se dan orientaciones sobre otros tejidos que pueden examinarse. Pueden ser útiles también (18) 
otros colorantes especiales para demostrar determinados tipos de 
alteraciones patológicas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Se someterán a examen histológico secciones representativas de los 
sistemas nerviosos central y periférico (véase la referencia 3 del 
capítulo 5 y la referencia 4 del capítulo 50). Las zonas examinadas tienen que incluir normalmente: el prosencéfalo, el centro del cere ­
bro, incluida una sección del hipocampo, el mesencéfalo, el cerebelo, 
la protuberancia anular, el bulbo raquídeo, el ojo con el nervio óptico 
y la retina, la médula espinal en los engrosamientos cervical y lum ­
bar, los ganglios de la raíz dorsal, las fibras de la raíz ventral y dorsal, el nervio ciático en su parte próxima (en la rodilla) y el 
nervio tibial en sus ramificaciones del músculo de la pantorrilla. 
Las secciones de la médula espinal y de los nervios periféricos tienen que incluir tanto una sección transversal como una longitudinal. Debe prestarse atención a la vasculatura del sistema nervioso. Se 
examinará también una muestra de músculo esquelético, especial ­
mente del de la pantorrilla. Hay que prestar especial atención a las zonas de los sistemas nerviosos central y periférico con estructura celular y fibrosa que se sabe que resultan particularmente afectadas 
por neurotóxicos. 
En las referencias (3) y (4) se dan orientaciones sobre las alteracio ­
nes neuropatológicas que derivan normalmente de la exposición a 
sustancias tóxicas. Se recomienda un examen por fases de las mues ­
tras de tejido empezando por una comparación de las secciones del lote de dosis alta con las del lote testigo. Si no se observan altera ­
ciones neuropatológicas en las muestras de estos lotes, no se requie ­
ren más análisis. Si se observan alteraciones neuropatológicas en el 
lote de dosis alta, deben codificarse y examinarse secuencialmente muestras de cada uno de los tejidos posiblemente afectados pertene ­
cientes a los lotes de dosis intermedia y baja. 
Si en el examen cualitativo se encuentran pruebas de alteraciones 
neuropatológicas, se realizará otro examen en todas las regiones del 
sistema nervioso que muestren estas alteraciones. Deberán codifi ­
carse y examinarse al azar, sin conocimiento del código, secciones de todos los lotes de cada una de las regiones posiblemente afecta ­
das. Debe registrarse la frecuencia y gravedad de cada lesión. Des ­
pués de que todos los lotes hayan sido clasificados, puede revelarse 
el código y entonces pueden hacerse análisis estadísticos para eva ­
luar relaciones dosis-respuesta. Deberán darse ejemplos que muestren diferentes niveles de gravedad de cada lesión. 
Los resultados neuropatológicos tienen que evaluarse en el contexto 
de observaciones y mediciones del comportamiento, así como en 
relación con otros datos de estudios de toxicidad sistémica de la 
sustancia anteriores y realizados al mismo tiempo.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Deben proporcionarse datos de cada animal. Además, tienen que 
resumirse todos los datos en un cuadro que recoja, para cada lote de ensayo o testigo, el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales hallados muertos durante el mismo o sacrifica ­
dos por razones compasivas, el momento de la muerte o sacrificio, el 
número de animales que presenten signos de toxicidad, una descrip ­
ción de los signos observados, con inclusión del momento de su aparición, la duración y la gravedad de los efectos tóxicos, el número 
de animales que presenten lesiones, y el tipo y la gravedad de las 
lesiones.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los resultados del estudio deben evaluarse en lo que se refiere a la 
incidencia, gravedad y correlación de los efectos neurocomportamen ­
tales y neuropatológicos (así como a los efectos electrofisiológicos y 
neuroquímicos si se incluyen exámenes complementarios) y a cual ­
quier otro efecto adverso observado. Siempre que sea posible, los resultados numéricos deberán evaluarse mediante un método estadís ­
tico adecuado y de amplia aceptación. Los métodos estadísticos 
deben seleccionarse durante el diseño del estudio.
 
3. INFORME  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo deberá incluir la información siguiente: 
Sustancia estudiada: — naturaleza física (incluyendo isomerismo, pureza y propiedades 
fisicoquímicas); 
— identificación química. Vehículo (si procede): — motivación de la elección del vehículo. Animales sometidos a ensayo: 
— especie y cepa utilizadas, 
— número, edad y sexo de los animales, — procedencia, condiciones de alojamiento, aclimatación, dieta, etc., — peso de cada animal al inicio del ensayo. Condiciones de ensayo: — datos sobre la formulación de la sustancia de ensayo o su pre ­
paración con los alimentos, concentración obtenida, estabilidad y homogeneidad del preparado, 
— especificación de las dosis administradas, con datos sobre el 
vehículo, el volumen y la forma física del material administrado, 
— datos de la administración de la sustancia de ensayo, 
— justificación de la selección de la dosis; — justificación de la vía y la duración de la exposición, — factor de conversión de la concentración (ppm) de la sustancia de 
ensayo en los alimentos o en el agua de bebida a dosis reales 
(mg/kg peso corporal/día), si procede, 
— datos de la calidad de los alimentos y el agua. 
Procedimientos de observación y prueba: 
— información detallada sobre la asignación de los animales de 
cada grupo a los subgrupos de perfusión, 
— información detallada sobre los sistemas de puntuación, inclu ­
yendo criterios y escalas de puntuación para cada medición den ­
tro de las observaciones clínicas detalladas,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— información detallada sobre las pruebas funcionales de reactivi ­
dad sensorial a estímulos de diferentes tipos (por ejemplo, audi ­
tivos, visuales y propioceptivos); para la evaluación de la fuerza de prensión; para la evaluación de la actividad motriz (incluida información detallada sobre dispositivos automáticos para la de ­
tección de actividad); y otros procedimientos empleados, 
— información detallada acerca de los exámenes oftalmológicos y, 
en su caso, los exámenes hematológicos y las pruebas bioquími ­
cas clínicas con valores de referencia pertinentes, 
— información detallada sobre procedimientos neurocomportamen ­
tales, neuropatológicos, neuroquímicos o electrofisiológicos. 
Resultados: — peso corporal/cambios en el peso corporal, incluyendo peso cor ­
poral en el momento del sacrificio, 
— consumo de alimentos y de agua, en su caso, — datos de reacciones tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos 
de toxicidad y mortalidad, 
— naturaleza, gravedad y duración (momento de aparición y evolu ­
ción posterior) de las observaciones clínicas detalladas (reversi ­
bles o no), 
— descripción pormenorizada de todos los resultados de las pruebas 
funcionales, 
— resultados de la autopsia, — descripción detallada de todos los resultados neurocomportamen ­
tales, neuropatológicos y neuroquímicos o electrofisiológicos, si se conocen, 
— datos sobre la absorción, si los hay, — tratamiento estadístico de los resultados, cuando convenga. Discusión de los resultados — información sobre la respuesta a la dosis, — relación entre otros efectos tóxicos y la conclusión acerca del 
potencial neurotóxico de la sustancia de ensayo, 
— nivel sin efectos adversos observados. Conclusiones — se considera conveniente una declaración concreta sobre la neu ­
rotoxicidad general de la sustancia estudiada.
 
4. REFERENCIAS  
1. OEDC Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies 
and Test Methods. OCDE, Paris. In preparation. 
2. Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation. 
3. World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principies and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Che ­
micals. 
4. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
5. Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurolo ­
gical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003. 
6. Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9,691-704. 
7. Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283. 
8. Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). 
A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb 
Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233- 
236. 
9. Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599-609. 
10. Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York. 
11. Chang, L.W., ed. (1995). Principies of Neurotoxicology. Marcel 
Dekker, New York. 
12. Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity 
Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695. 
13. Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydrox ­
yethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.ToxicoL, 18, 343-352. 
14. O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452. 
15. O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in 
Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378. 
16. Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, 
pp 299-335. 
17. Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuroto ­
xicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wil ­
kins Co., Baltimore/London, pp. 726-742. 
18. Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice 
of Histological Techniques. Chapter 17, europathological 
Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Cuadro 1  
Número mínimo de animales por grupo cuando el estudio de neurotoxicidad se realiza por separado o en 
combinación con otros estudios  
ESTUDIO DE NEUROTOXICIDAD 
Como estudio aparte Combinado con el es ­
tudio de 28 días Combinado con el es ­
tudio de 90 días Combinado con el es ­
tudio de toxicidad cró ­
nica 
Número total de animales 
por lote 10 machos y 10 
hembras 10 machos y 10 
hembras 15 machos y 15 
hembras 25 machos y 25 
hembras 
Número de animales selec ­
cionados para pruebas fun ­
cionales incluidas observa ­
ciones clínicas detalladas 10 machos y 10 
hembras 10 machos y 10 
hembras 10 machos y 10 
hembras 10 machos y 10 
hembras 
Número de animales selec ­
cionados para perfusión  in 
situ y  neurohistopatología 5 machos y 5 
hembras 5 machos y 5 
hembras 5 machos y 5 
hembras 5 machos y 5 hem ­
bras 
Número de animales selec ­
cionados para observaciones de toxicidad por adminis ­
tración continuada/subcróni ­
ca/crónica, hematología, 
bioquímica clínica, histopa ­
tología, etc., según lo indi ­
cado en las respectivas  
Orientaciones.  5 machos y 5 
hembras 10 machos (
 1 ) y 10 
hembras (  1 ) 20 machos (  1 ) y 20 
hembras (  1 ) 
Observaciones complemen ­
tarias, según corresponda 5 machos y 5 
hembras  
( 1 ) Incluye 5 animales seleccionados para pruebas funcionales y observaciones clínicas detalladas dentro del estudio de neurotoxi cidad.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Cuadro 2  
Frecuencia de las observaciones y pruebas funcionales  
Tipo de observaciones Duración del estudio 
T. aguda 28 días 90 días T. crónica  
En todos los ani ­
males Estado general 
de salud diariamente diariamente diariamente diariamente 
Mortalidad/mor ­
bilidad dos veces al día dos veces al día dos veces al día dos veces al día 
En animales selec ­
cionados para ob ­
servaciones funcio ­
nales Observaciones 
clínicas detalla ­
das — antes de la 
primera ex ­
posición 
— dentro de las 
8 horas si ­
guientes a la administra ­
ción en el 
momento es ­
timado del efecto más agudo 
— el día 7 y 14 
después de la adminis ­
tración — antes de la 
primera ex ­
posición 
— una vez por 
semana a 
continuación — antes de la 
primera ex ­
posición 
— una vez du ­
rante la pri ­
mera o se ­
gunda se­
mana de ex ­
posición 
— mensual ­
mente a continuación — antes de la 
primera expo ­
sición 
— una vez al fi ­
nal del primer 
mes de expo ­
sición 
— cada 3 meses 
a continua ­
ción 
Pruebas funcio ­
nales — antes de la 
primera ex ­
posición 
— dentro de las 
8 horas si ­
guientes a la 
administra ­
ción en el momento es ­
timado del 
efecto más agudo 
— el día 7 y 14 
después de 
la adminis ­
tración — antes de la 
primera ex ­
posición 
— durante la 
cuarta se­
mana de tra ­
tamiento tan cerca como sea posible 
del final del 
período de exposición — antes de la 
primera ex ­
posición 
— una vez du ­
rante la pri ­
mera o se ­
gunda se­
mana de ex ­
posición 
— mensual ­
mente a continuación — antes de la 
primera expo ­
sición 
— una vez al fi ­
nal del primer 
mes de expo ­
sición 
— cada 3 meses 
a continua ­
ción
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  ABSORCIÓN CUTÁNEA: MÉTODO  IN VIVO  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de 
ensayo de la OCDE TG 427 (2004).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
La exposición a muchas sustancias se produce principalmente a tra ­
vés de la piel, pero en la mayoría de los estudios toxicológicos efectuados con animales de laboratorio se utiliza la administración por vía oral. El estudio de absorción cutánea  in vivo  que se recoge en 
las presentes directrices permite la extrapolación a partir de los es ­
tudios orales cuando se efectúa la evaluación de la seguridad tras una exposición dérmica. 
Antes de llegar a la circulación, las sustancias deben atravesar mu ­
chas capas de células de la piel. Para la mayoría de las sustancias, la 
capa que limita la tasa de esa incorporación es la capa córnea, formada por células muertas. La permeabilidad a través de la piel depende no solo de la lipofilia de la sustancia y del espesor de la 
capa exterior de la epidermis, sino también de otros factores, como el 
peso molecular y la concentración de la sustancia. En general, la piel de ratas y conejos es más permeable que la humana, mientras que la permeabilidad cutánea de cobayas y monos es más parecida a la 
nuestra. 
Los métodos para medir la absorción cutánea pueden clasificarse en 
dos categorías:  in vivo  e in vitro.  Los métodos  in vivo  pueden propor ­
cionar buena información sobre la absorción cutánea de varias especies 
de laboratorio. Más recientemente se han elaborado métodos  in vitro.  
Estos utilizan el transporte a través de piel humana o animal, con un espesor bien íntegro o bien parcial, hasta un depósito de líquidos. En otro método aparte (1) se describe el ensayo  in vitro.  Se recomienda 
consultar el documento orientativo de la OCDE sobre realización de 
estudios de absorción cutánea (2) para seleccionar el método más ade ­
cuado en cada situación, ya que en él se da más información sobre la idoneidad de los métodos tanto  in vivo  como  in vitro.  
El método  in vivo,  descrito en el presente texto, permite la determi ­
nación de la penetración de la sustancia problema a través de la piel hasta el compartimento sistémico. La técnica se utiliza ampliamente desde hace muchos años (3) (4) (5) (6) (7). Aunque en muchos casos 
pueden ser adecuados los estudios  in vitro  de absorción a través de la 
piel, es posible que haya situaciones en las que solo se puedan obtener los datos necesarios mediante estudios  in vivo.  
Las ventajas del método  in vivo  radican en que utiliza un sistema 
fisiológica y metabólicamente intacto, recurre a una especie común a 
muchos estudios de toxicidad y puede modificarse para utilizarlo con 
otras especies. Sus desventajas consisten en el uso de animales vi ­
vos, en la necesidad de utilizar sustancias radiomarcadas para con ­
seguir unos resultados fiables, en las dificultades para determinar la 
fase de absorción precoz y en las diferencias de permeabilidad de la 
especie preferida (rata) respecto a la piel humana. La piel animal suele ser más permeable y, por tanto, puede llevar a una sobreesti ­
mación de la absorción a través de la piel humana (6) (8) (9). 
No deben ensayarse con animales vivos las sustancias cáusticas o 
corrosivas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. DEFINICIONES 
Se entenderá por:  
Dosis no absorbida:  la dosis lavada de la superficie cutánea tras la 
exposición y la presente en las protecciones no oclusivas, incluida la que se haya visto que se volatiliza de la piel durante la exposición.  
Dosis absorbida  (in vivo):  la dosis presente en la orina, líquidos de 
lavado de la jaula, heces, aire espirado (si se mide), sangre, tejidos (si se recogen) y el resto del cuerpo, tras la eliminación de la piel 
correspondiente al lugar de aplicación.  
Dosis absorbible:  la dosis presente en la superficie o en el interior 
de la piel tras el lavado.
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
La sustancia problema, preferentemente radiomarcada, se aplica a la 
piel esquilada de los animales, a una o más dosis apropiadas, en 
forma de preparado representativo en uso. Se deja el preparado 
problema en contacto con la piel durante un plazo fijo bajo una protección adecuada (no oclusiva, semioclusiva u oclusiva) para evi ­
tar la ingestión del preparado. Al final del plazo de exposición, se 
quita la protección y se limpia la piel con un agente adecuado (tanto 
la protección como el material de lavado se conservan para su aná ­
lisis), y se aplica otra protección. Los animales están alojados antes, durante y después del plazo de exposición en jaulas de metabolismo 
individuales y las excretas y el aire espirado en estos periodos se 
recogen para su análisis. Puede omitirse la recogida del aire espirado si se dispone de información suficiente sobre la ausencia o poca importancia de la formación de metabolitos radiactivos volátiles. 
En cada estudio participan normalmente varios grupos de animales 
que se exponen al preparado problema. Un grupo se sacrifica al final del período de exposición. Otros grupos se sacrifican posteriormente a intervalos programados (2). Al final del tiempo de muestreo se 
sacrifican los animales restantes, se recoge su sangre para analizarla, 
se extrae la piel de los lugares de aplicación para su análisis y se analiza también el resto del cuerpo para buscar las posibles sustan ­
cias no excretadas. Se efectúa la determinación de las muestras con 
los medios adecuados y se calcula el grado de absorción a través de 
la piel (6) (8) (9).
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.4.1.  Selección de la especie animal  
La rata es la especie más utilizada, pero también pueden emplearse 
cepas y especies sin pelo que presenten unas tasas de absorción cutánea más parecidas a las del hombre (3) (6) (7) (8) (9). Deben 
emplearse animales adultos jóvenes, con buena salud, de un solo 
sexo (en principio, machos) de cepas de laboratorio utilizadas nor ­
malmente. Al empezar el estudio, la variación del peso de los ani ­
males utilizados no debe superar el ± 20 % del peso medio. Por 
ejemplo, son adecuadas las ratas machos de 200 g–250 g, especial ­
mente de la mitad superior de esta banda.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Número y sexo de los animales  
Para cada preparado problema y cada tiempo programado de sacri ­
ficio debe utilizarse un grupo de al menos 4 animales del mismo sexo. Cada grupo de animales se sacrificará tras un plazo diferente, 
por ejemplo al final del plazo de exposición (normalmente 6 o 24 
horas) y en momentos posteriores (por ejemplo, 48 y 72 horas). Si se dispone de datos que demuestren la existencia de diferencias impor ­
tantes en cuanto a la toxicidad dérmica entre machos y hembras, se 
elegirá el sexo más sensible. En ausencia de tales datos, puede 
utilizarse cualquiera de los sexos.
 
1.4.3.  Alojamiento y alimentación  
El cuarto de animales de experimentación ha de estar a una tempe ­
ratura de 22  o C (± 3  o C). Aunque la humedad relativa ha de ser, 
como mínimo, del 30 % y preferentemente no superar el 70 %, salvo durante la limpieza del local, lo ideal es que esté comprendida entre 
el 50 y el 60 %. Se aplicará iluminación artificial en una secuencia 
de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Puede proporcionarse una dieta alimentaria corriente para animales de laboratorio; la can ­
tidad no debe estar limitada, y tampoco el suministro de agua pota ­
ble. Durante el estudio y, de preferencia, también durante la fase de 
aclimatación, los animales se alojarán en jaulas de metabolismo individuales. Como el vertido de agua y piensos puede afectar a los resultados, debe reducirse al mínimo la probabilidad de que 
ocurra.
 
1.4.4.  Preparación de los animales  
Los animales se marcan para identificarlos individualmente y se man ­
tienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes del inicio del estudio, 
a fin de permitir su aclimatación a las condiciones del laboratorio. 
Tras la fase de aclimatación, y unas 24 horas antes de la adminis ­
tración de la sustancia, se esquila una zona de piel de los hombros y del dorso de cada animal. Las propiedades de permeabilidad de la piel lesionada son diferentes de las de la piel intacta, por lo que debe 
procurarse no excoriar la piel. Una vez efectuado el esquileo y unas 
24 horas antes de la aplicación de la sustancia problema a la piel (véase el punto 1.4.7), la superficie cutánea debe limpiarse con ace ­
tona para eliminar el sebo cutáneo. No se recomienda limpiar con 
agua y jabón porque un eventual resto de jabón podría aumentar la 
absorción de la sustancia problema. La superficie debe ser lo bas ­
tante grande para permitir un cálculo fiable de la cantidad absorbida de sustancia problema por centímetro cuadrado de piel, por lo que, 
de preferencia, ha de tener un mínimo de 10 cm
 2 . Esta superficie 
puede conseguirse con ratas de 200-250 g de peso corporal. Tras esta preparación, los animales se devuelven a las jaulas de metabolismo.
 
1.4.5.  Sustancia problema  
La sustancia problema es aquella cuyas características de penetración 
se van a estudiar. Lo mejor es que la sustancia problema esté radio ­
marcada.  
1.4.6.  Preparación de las pruebas  
El preparado de la sustancia problema (por ejemplo, material puro, 
diluido o formulado que contiene la sustancia problema y que se aplica a la piel) debe ser el mismo (o un análogo realista) que aquel 
al que pueda verse expuesto el hombre u otra posible especie diana. 
Deben justificarse las eventuales desviaciones respecto al preparado «en uso». En caso necesario, la sustancia problema se disuelve o suspende en un vehículo adecuado. En caso de que el vehículo sea 
distinto al agua, deben conocerse sus características de absorción y 
su posible interacción con la sustancia problema.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  Aplicación a la piel  
Se delimita en la piel el lugar de aplicación, con una superficie 
específica. Después se aplica de forma homogénea en ese lugar una cantidad conocida del preparado problema. Esta cantidad debe 
reflejar en principio la posible exposición humana, normalmente de 1 
a 5 mg/cm
 2 en caso de preparado sólido o hasta 10 μl/cm  2 en caso 
de líquidos. Si se emplean otras cantidades, hay que justificarlo en función de las condiciones previstas de uso, de los objetivos del 
estudio o de las características físicas del preparado problema. Tras 
la aplicación, hay que proteger el sitio tratado para que el animal no se lo frote. En la figura 1 se muestra un ejemplo de dispositivo 
clásico. Normalmente, el lugar de aplicación ha de llevar una pro ­
tección no oclusiva (por ejemplo, una gasa de nailon permeable). Sin embargo, si la dosis es muy grande hay que ocluir el lugar de aplicación. En caso de que la evaporación de sustancias problema 
semivolátiles reduzca la tasa de recuperación de la sustancia pro ­
blema hasta extremos inaceptables (véase también el párrafo primero del punto 1.4.10), será necesario recoger la sustancia evaporada en un filtro de carbón activo que recubra el dispositivo de aplicación 
(véase la figura 1). Es importante que los eventuales dispositivos no 
lesionen la piel, ni absorban el preparado problema ni reaccionen con él. Los animales se devuelven a sus jaulas de metabolismo indivi ­
duales para recoger las excretas.
 
1.4.8.  Duración de la exposición y toma de muestras  
La duración de la exposición es el plazo entre la aplicación y la 
eliminación del preparado problema mediante lavado de la piel. El plazo de exposición debe tener una duración apropiada (normalmente 6 o 24 horas), según la duración prevista de la exposición humana. 
Tras la exposición, los animales se mantienen en las jaulas de me ­
tabolismo hasta el momento previsto para su sacrificio. De forma periódica a lo largo de toda la duración del estudio, hay que observar si los animales presentan signos de toxicidad o reacciones anormales. 
Al final de la exposición, hay que ver si la piel tratada presenta 
signos visibles de irritación. 
Las jaulas de metabolismo deben permitir la recogida aparte de la 
orina y las heces a lo largo de todo el estudio. También deben 
permitir la recogida de dióxido de carbono
 14 C y de compuestos 
volátiles de carbono  14 C, que deben analizarse si se producen en 
gran cantidad (> 5 %). La orina, las heces y los fluidos recogidos 
(por ejemplo, dióxido de carbono  14 C y compuestos volátiles de 
carbono  14 C) deben tomarse por separado de cada grupo y en cada 
momento de muestreo. Si se sabe con suficiente seguridad que la formación de metabolitos radiactivos volátiles es nula o muy limita ­
da, pueden utilizarse jaulas abiertas. 
Las excretas se recogen durante la exposición, hasta 24 horas tras el 
contacto inicial con la piel, y después cada día hasta el final del experimento. Aunque en principio es suficiente con tres intervalos de 
recogida de excretas, la finalidad prevista del preparado problema o 
los eventuales datos cinéticos pueden indicar la necesidad de utilizar intervalos adicionales o más adecuados para el estudio. 
Al final de la exposición se retira el dispositivo protector de cada 
animal, y se conserva aparte para su análisis. La piel tratada de todos 
los animales debe lavarse al menos tres veces con un agente de lim ­
pieza, utilizando hisopos adecuados. Debe procurarse no contaminar otras partes del cuerpo. El agente de limpieza debe ser representativo de 
la práctica higiénica normal; por ejemplo, puede consistir en una solu ­
ción acuosa de jabón. Por último, hay que secar la piel. Todos los hisopos y líquidos de lavado se guardan para su análisis. Antes de devolver los animales a sus jaulas individuales, se les aplica una pro ­
tección nueva en el lugar del tratamiento, en caso de que formen parte 
de grupos que se vayan a estudiar posteriormente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Procedimiento final  
Los distintos animales de cada grupo se sacrificarán en el momento 
previsto y se recogerá su sangre para analizarla. El apósito o dispositivo protector se recogerá para su análisis. De cada animal se tomará la piel 
del lugar de aplicación y una superficie similar de piel esquilada que no 
haya recibido la sustancia, y se analizarán por separado. El lugar de aplicación podrá fraccionarse para separar la capa córnea de la epider ­
mis subyacente, a fin de obtener más información sobre la distribución 
de la sustancia. La determinación de esta distribución a lo largo del 
tiempo tras la exposición debe indicar el destino de cualquier sustancia problema en la capa córnea. Para facilitar el fraccionamiento de la piel 
(tras el lavado final de esta y el sacrificio del animal), se retirarán todos 
los dispositivos protectores. Se extirpará de la rata la piel del lugar de aplicación, con una banda anular de piel adyacente, y se sujetará en un tablero con alfileres. Con una presión suave se aplicará a la superficie 
de la piel un trozo de cinta adhesiva, que se retirará junto con parte de la 
capa córnea. Se aplicarán trozos sucesivos de cinta hasta que esta deje de adherirse a la superficie de la piel, momento en que se habrá retirado la totalidad de la capa córnea. Todos los trozos de cinta procedentes de 
un mismo animal podrán reunirse en un solo envase al que se añadirá 
un agente para digerir tejidos, a fin de solubilizar la capa córnea. Los posibles tejidos diana se podrán recoger para someterlos a mediciones aparte antes de proceder a la determinación de la dosis absorbida en el 
cuerpo restante. Se conservarán los cuerpos de los distintos animales 
para su análisis. Normalmente será suficiente realizar el análisis del contenido total. Los órganos diana se podrán recoger para someterlos a análisis aparte (si así lo indican otros estudios). La orina presente en la 
vejiga en el momento del sacrificio programado se añadirá a la orina 
recogida previamente. Tras la recogida de las excretas de las jaulas de metabolismo en el momento del sacrificio programado, las jaulas y los colectores se lavarán con un disolvente adecuado. El resto del material 
que pueda estar contaminado se analizará análogamente.
 
1.4.10.  Análisis  
En todos los estudios debe conseguirse una recuperación adecuada 
(es decir, una media del 100 ± 10 % de la radiactividad). Deberán 
justificarse los casos en que la recuperación no esté en dicha banda. La cantidad de la dosis administrada presente en cada muestra se analizará mediante métodos validados adecuadamente. 
El estudio estadístico debe incluir una medida de la varianza entre 
las réplicas de cada aplicación.
 
2. DATOS  
Deben hacerse las siguientes mediciones con cada animal, en cada 
tiempo de muestreo, respecto a la sustancia problema y sus metabo ­
litos (además de los datos individuales, deben comunicarse en forma 
de media los datos agrupados por tiempos de muestreo): 
— cantidad relativa a los dispositivos protectores, 
— cantidad que puede extraerse de la piel, — cantidad en el interior o en la superficie de la piel que no puede 
retirarse mediante lavado,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— cantidad en la sangre de la muestra, 
— cantidad en las excretas y en el aire espirado (en su caso), 
— cantidad restante en el cuerpo y en los eventuales órganos toma ­
dos para su análisis aparte. 
La cantidad de sustancia problema y sus metabolitos presente en las 
excretas, aire espirado, sangre y cuerpo permitirá la determinación de 
la cantidad total absorbida en cada intervalo. También puede calcularse 
la cantidad de sustancia problema absorbida por centímetro cuadrado de piel expuesta a la sustancia problema a lo largo del tiempo de exposición.
 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir los requisitos establecidos en el 
protocolo, con una justificación del sistema de ensayo utilizado y con los datos siguientes: 
Sustancia de ensayo: 
— datos de identificación [por ejemplo, número CAS, si se conoce; 
origen; pureza (pureza radioquímica); impurezas conocidas; nú ­
mero de lote], 
— naturaleza física, propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, pH, 
volatilidad, solubilidad, estabilidad, peso molecular y log P
 ow ). 
Preparado problema: 
— formulación y justificación del uso, 
— datos del preparado problema, cantidad aplicada, concentración 
conseguida, vehículo, estabilidad y homogeneidad. 
Animales de ensayo: 
— especie y cepa utilizadas, 
— número, edad y sexo de los animales, 
— procedencia de los animales, condiciones de alojamiento, dieta, etc., 
— peso de cada animal al inicio del ensayo. 
Condiciones de ensayo: 
— datos de la administración del preparado problema (lugar de la 
aplicación, métodos de determinación, oclusión/no oclusión, vo ­
lumen, extracción, detección), 
— datos de la calidad de los alimentos y del agua. 
Resultados: 
— eventuales signos de toxicidad, 
— cuadros de datos de absorción (expresados en tasa, cantidad o 
porcentaje),  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— porcentaje de recuperación total del experimento, 
— interpretación de los resultados, comparación con otros datos 
eventualmente disponibles sobre la absorción de la sustancia pro ­
blema a través de la piel. 
Discusión de los resultados. 
Conclusiones.  
4. REFERENCIAS  
1. Método de ensayo B.45. Absorción cutánea: método  in vitro.  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris. 
3. ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20. 
4. Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for En ­
vironmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. Toxi ­
col. 8(5), 829-835. 
5. Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin ab ­
sorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA. 
6. EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and En ­
vironmental Assessment. 
7. EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances. 
8. Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 369-373. 
9. Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  54, 399-404.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Figura 1  
Ejemplo de diseño de dispositivo clásico utilizado para definir y proteger el lugar 
de aplicación dérmica en los estudios  in vivo  de absorción a través de la piel
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  ABSORCIÓN CUTÁNEA: MÉTODO  IN VITRO  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de 
ensayo de la OCDE TG 428 (2004).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El objetivo del presente método es proporcionar información sobre la 
absorción de una sustancia problema aplicada a la piel extirpada. Puede combinarse con el método  in vivo  del ensayo de absorción cutánea (1) o 
realizarse independientemente. Se recomienda consultar el documento 
orientativo de la OCDE sobre realización de estudios de absorción cutánea (2), que puede servir de ayuda para la concepción de estudios basados en este método de ensayo. El documento orientativo se ha 
preparado para facilitar la selección de los procedimientos  in vitro  
adecuados según las distintas circunstancias, a fin de garantizar la fiabilidad de los resultados obtenidos con este método. 
Los métodos para medir la absorción cutánea y la transferencia 
dérmica pueden clasificarse en dos categorías:  in vivo  e in vitro.  
Los métodos  in vivo  están bien comprobados y proporcionan infor ­
mación farmacocinética con una serie de especies animales. En otro 
método aparte (1) se describe un ensayo  in vivo.  Se lleva muchos 
años utilizando también métodos  in vitro  para medir la absorción 
cutánea. Aunque no se han efectuado estudios oficiales de validación de los ensayos  in vitro  correspondientes al presente método de en ­
sayo, los expertos de la OCDE consideraron en 1999 que se disponía 
de suficientes datos evaluados para apoyar el método  in vitro  (3). En 
el documento orientativo (2) se incluye más información que avala este apoyo, con inclusión de un número significativo de compara ­
ciones directas de métodos  in vitro  e in vivo.  Hay una serie de 
monografías que examinan este aspecto y proporcionan datos por ­
menorizados sobre el uso de un método  in vitro  (4) (5) (6) (7) (8) (9) 
(10) (11) (12). Los métodos  in vitro  miden la difusión de sustancias 
a la piel y, a través de esta, hasta un depósito de líquidos, y pueden utilizar piel muerta para medir solo la difusión, o piel reciente, activa metabólicamente, para medir simultáneamente la difusión y el meta ­
bolismo cutáneo. Tales métodos se utilizan particularmente en el 
cribado para comparar la transferencia de sustancias a la piel y a través de esta desde distintas formulaciones, y también pueden pro ­
porcionar modelos útiles para la evaluación de la absorción a través 
de la piel humana. 
Es posible que el método  in vitro  no se pueda aplicar a todas las 
situaciones ni a todas las clases de sustancias. Quizá se pueda utilizar el método de ensayo  in vitro  para una evaluación cualitativa inicial 
de la penetración cutánea. En algunos casos puede ser necesario 
completarla con datos  in vivo.  Debe consultarse el documento orien ­
tativo (2) para considerar las situaciones en que pueda ser adecuado 
el método  in vitro.  En (3) se encuentra más información detallada 
para avalar la decisión. 
El presente método presenta los principios generales para medir la 
absorción cutánea y la transferencia de una sustancia problema uti ­
lizando piel extirpada. Puede utilizarse piel procedente de muchas 
especies de mamíferos, incluido el hombre. Las propiedades de per ­
meabilidad de la piel se mantienen tras su extirpación del cuerpo porque la principal barrera contra la difusión es la capa córnea, 
formada por células muertas, ya que no se ha encontrado transporte 
activo de sustancias a través de la piel. Se ha visto que la piel es capaz de metabolizar ciertas sustancias durante la absorción a través de ella (6), pero este proceso no es limitante en cuanto a la tasa de la 
dosis absorbida realmente, aunque puede afectar a la naturaleza de la 
sustancia que llega a la corriente sanguínea.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. DEFINICIONES 
Se entenderá por:  
dosis no absorbida  la dosis lavada de la superficie cutánea tras la 
exposición y la presente en las protecciones no oclusivas, además de 
la que se haya visto que se volatiliza de la piel durante la exposición;  
dosis absorbida  (in vitro)  la masa de sustancia problema que llega 
al líquido receptor o a la circulación sistémica dentro de un plazo 
especificado;  
dosis absorbible  (in vitro)  la dosis presente en la superficie o en el 
interior de la piel tras el lavado.  
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
La sustancia problema, que puede estar radiomarcada, se aplica a la 
superficie de una muestra de piel que separa las dos cámaras de una célula de difusión. La sustancia permanece sobre la piel durante un 
tiempo dado, en condiciones determinadas, antes de eliminarse me ­
diante un procedimiento adecuado de limpieza. Se toman muestras del líquido receptor a ciertos intervalos a lo largo del experimento y se determina su contenido en sustancia problema y metabolitos de 
esta. 
Cuando se utilizan sistemas metabólicamente activos, pueden anali ­
zarse con métodos adecuados los metabolitos de la sustancia proble ­
ma. Al final del experimento se cuantifica la distribución de la 
sustancia problema y sus metabolitos, en su caso. 
Aplicando las condiciones adecuadas, descritas en este método y en 
el documento orientativo (2), se mide la absorción de la sustancia 
problema durante un plazo determinado mediante el análisis del 
líquido receptor y de la piel tratada. La sustancia problema que permanece en la piel debe considerarse absorbida, salvo que se de ­
muestre que la absorción se puede determinar a partir de solo los 
valores del líquido receptor. El análisis de los otros componentes 
(material extraído de la piel por lavado y material restante dentro de las capas de la piel) permite una evaluación de los datos más 
avanzada, con inclusión de la distribución de toda la sustancia pro ­
blema y el porcentaje de recuperación. 
Para demostrar la eficacia y fiabilidad del sistema de ensayo en el 
laboratorio que lo aplique, debe disponerse de los resultados corres ­
pondientes a sustancias de referencia apropiadas, los cuales deben 
concordar con los publicados en la bibliografía en relación con el método utilizado. Este requisito puede cumplirse sometiendo a en ­
sayo una sustancia de referencia apropiada (de preferencia con una 
lipofilia similar a la de la sustancia problema) en paralelo con esta, o 
bien presentando datos previos adecuados sobre una serie de sustan ­
cias de referencia de lipofilia diferente (por ejemplo, cafeína, ácido benzoico y testosterona).
 
1.4. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.4.1.  Célula de difusión  
Una célula de difusión consiste en una cámara donadora y una 
cámara receptora, entre las que se coloca la piel (en la figura 1 se 
muestra un ejemplo de disposición normal). La célula debe quedar 
bien cerrada alrededor de la piel, permitir con facilidad la toma de muestras y la mezcla adecuada de la solución receptora en contacto con la parte inferior de la piel, así como un buen control de la 
temperatura de la célula y de su contenido. Son válidas tanto las 
células de difusión estática como las de difusión dinámica. En prin ­
cipio, las cámaras donadoras se dejan sin ocluir durante la exposi ­
ción a una dosis pequeña de un preparado problema. Sin embargo, 
con las aplicaciones de grandes dosis, y en ciertos casos de pequeñas 
dosis, es posible que las cámaras donadoras queden ocluidas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Líquido receptor  
Se recomienda el uso de un líquido receptor fisiológicamente ade ­
cuado, aunque también es posible utilizar otros en casos justificados. Debe indicarse la composición exacta del líquido receptor. Debe 
demostrarse que la sustancia problema es suficientemente soluble 
en el líquido receptor, de forma que este no actúe de barrera contra la absorción. Además, el líquido receptor no debe afectar a la inte ­
gridad del preparado de piel. En un sistema dinámico, el caudal no 
debe dificultar la difusión de la sustancia problema al líquido recep ­
tor. En un sistema estático, hay que agitar continuamente el líquido y tomar muestras de él periódicamente. Si se estudia el metabolismo, 
el líquido receptor debe permitir que la piel siga estando viva a lo 
largo de todo el experimento.
 
1.4.3.  Preparados de piel  
Puede utilizarse piel de origen humano o animal. Se sabe que el uso 
de piel humana es objeto de condiciones y consideraciones éticas tanto 
nacionales como internacionales. Aunque se prefiere la piel viva, también puede utilizarse piel muerta, siempre que pueda demostrarse su integridad. Son válidas las membranas epidérmicas (separadas en ­
zimática, térmica o químicamente) o la piel con la epidermis y parte 
de la dermis (normalmente de 200 a 400 μm de espesor), preparadas 
con un dermatomo. Puede utilizarse piel completa (con la epidermis y toda la dermis), pero ha de evitarse el espesor excesivo (aprox. > 
1 mm), salvo que sea necesario específicamente para la determinación 
de la sustancia problema en las capas de la piel. Deben justificarse la elección de la especie, el lugar anatómico y la técnica de preparación. Es necesario conseguir datos aceptables de un mínimo de cuatro en ­
sayos en paralelo de cada preparado problema.
 
1.4.4.  Integridad del preparado de piel  
Es fundamental que la piel se prepare adecuadamente. Un trata ­
miento inapropiado puede provocar lesiones en la capa córnea, por 
lo que debe comprobarse la integridad de la piel preparada. Si se 
investiga el metabolismo de la piel, debe utilizarse lo antes posible piel recién extirpada, y en condiciones que permitan la actividad 
metabólica. Como norma general, la piel recién extirpada debe uti ­
lizarse en el plazo de 24 horas, pero el plazo de conservación acep ­
table puede variar en función del sistema enzimático que intervenga en la metabolización y de la temperatura de conservación (13). En 
caso de que los preparados de piel no sean recientes cuando se vayan 
a utilizar, deben presentarse pruebas de que mantienen la función de barrera.
 
1.4.5.  Sustancia problema  
La sustancia problema es aquella cuyas características de penetración 
se van a estudiar. Lo mejor es que la sustancia problema esté radio ­
marcada.  
1.4.6.  Preparado problema  
El preparado de la sustancia problema (por ejemplo, material puro, 
diluido o formulado que contiene la sustancia problema y que se aplica a la piel) debe ser el mismo (o un análogo realista) que aquel al que pueda verse expuesto el hombre u otra posible especie diana. 
Deben justificarse las eventuales desviaciones respecto al preparado 
«en uso».
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  Concentraciones y formulaciones de las sustancias problema  
Normalmente se utiliza más de una concentración de la sustancia 
problema, en la banda superior de la posible exposición humana. Análogamente, debe considerarse someter a ensayo una gama de 
formulaciones representativas.
 
1.4.8.  Aplicación a la piel  
En condiciones normales de exposición humana a las sustancias 
químicas, se suelen encontrar dosis pequeñas. Por tanto, debe apli ­
carse una cantidad que refleje la exposición humana, normalmente 1- 
5 mg/cm  2 de piel en caso de sólidos y hasta 10 μl/cm  2 en caso de 
líquidos. La cantidad debe justificarse en función de las condiciones previstas de uso, de los objetivos del estudio o de las características físicas del preparado problema. Por ejemplo, las aplicaciones a la 
superficie cutánea pueden ser de grandes dosis cuando se aplican 
volúmenes importantes por unidad de superficie.
 
1.4.9.  Temperatura  
La difusión pasiva de sustancias (y, en consecuencia, su absorción 
por la piel) depende de la temperatura. La cámara de difusión y la piel deben mantenerse a temperatura constante, cerca de la tempera ­
tura normal de la piel (32 ± 1
 o C). Según el diseño de la célula, será 
necesario tener temperaturas diferentes en el baño de agua o en el bloque de calentamiento para garantizar que el receptor y la piel están en condiciones fisiológicas. La humedad debe situarse de pre ­
ferencia entre el 30 y el 70 %.
 
1.4.10.  Duración de la exposición y toma de muestras  
La exposición de la piel al preparado problema puede mantenerse 
durante todo el experimento o bien durante plazos más breves (para imitar un tipo específico de exposición humana). El exceso del pre ­
parado problema debe lavarse de la piel con un agente de limpieza 
adecuado y los líquidos de lavado se deben recoger para su análisis. 
El procedimiento de eliminación del preparado problema dependerá de las condiciones previstas de uso, y debe justificarse. Normalmente 
hace falta tomar muestras durante un período de 24 horas, para poder 
caracterizar de forma adecuada la variación de la absorción. Como la integridad de la piel puede empezar a fallar a partir de las 24 horas, el muestreo no debe durar en principio más de ese tiempo. En caso 
de sustancias problema que penetran rápidamente en la piel, esto 
puede no ser necesario, pero con sustancias problema que penetran despacio es posible que haga falta un plazo más prolongado. La frecuencia de la toma de muestras de líquido receptor debe permitir 
la representación gráfica de la variación de la absorción de la sus ­
tancia problema.
 
1.4.11.  Procedimiento final  
Hay que analizar todos los componentes del sistema de ensayo y 
determinar la recuperación. Se incluyen la cámara donadora, los líquidos de lavado de la superficie de la piel, el preparado de piel 
y la cámara con el líquido receptor. En ciertos casos, la piel puede 
fraccionarse en superficie expuesta y en superficie bajo las pestañas de la célula, y en capa córnea, epidermis y dermis, para efectuar análisis aparte.
 
1.4.12.  Análisis  
En todos los estudios debe conseguirse una recuperación adecuada 
(el objetivo es conseguir una media del 100 ± 10 % de la radiacti ­
vidad, y habrá que justificar las eventuales desviaciones). Debe ana ­
lizarse la cantidad de sustancia problema que se encuentra en el líquido receptor, en el preparado de piel, en los líquidos de lavado 
de la superficie de la piel y en el líquido de lavado del material, 
utilizando una técnica adecuada.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. DATOS  
Deben indicarse el análisis del líquido receptor, la distribución de la 
sustancia problema en el sistema de ensayo y la variación de la absorción a lo largo del tiempo. Cuando se utilizan condiciones de 
exposición con dosis pequeñas, deben calcularse la cantidad lavada 
de la piel, la cantidad ligada a la piel (y a las diferentes capas de piel, si se analizan por separado) y la cantidad presente en el líquido receptor (tasa, y cantidad o porcentaje de la dosis aplicada). La 
absorción de la piel puede expresarse a veces utilizando solo datos 
del líquido receptor. Sin embargo, si al final del estudio queda sustancia en la piel, puede ser necesario tenerlo en cuenta para 
calcular la cantidad total absorbida [véase el punto 66 de la referen ­
cia (3)]. Cuando se utilizan condiciones de exposición con dosis grandes, los datos pueden permitir el cálculo de una constante de permeabilidad (Kp). En estas últimas condiciones, no es importante 
el porcentaje absorbido.
 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir los requisitos establecidos en el 
protocolo, con una justificación del sistema de ensayo utilizado y con los datos siguientes: 
Sustancia problema: — naturaleza física, propiedades fisicoquímicas (al menos, peso mo ­
lecular y log P
 ow ), pureza (pureza radioquímica), 
— información para la identificación (por ejemplo, número de lote), — solubilidad en el líquido receptor. Preparado problema: — formulación y justificación del uso, — homogeneidad. Condiciones de ensayo: — procedencia y lugar de la piel, método de preparación, condicio ­
nes de conservación antes del uso, tratamientos previos eventua ­
les (limpieza, tratamiento con antibióticos, etc.), medidas de la 
integridad de la piel, situación metabólica, justificación del em ­
pleo, 
— diseño de la célula de difusión, composición del líquido receptor, 
caudal de líquido receptor o momentos y procedimientos de la toma de muestras, 
— datos sobre la aplicación del preparado problema y cuantificación 
de la dosis aplicada, 
— duración de la exposición, — datos de la eliminación del preparado problema de la piel, como, 
por ejemplo, lavado de esta, 
— datos del análisis de la piel y de las eventuales técnicas de 
fraccionamiento empleadas para poner de manifiesto la distribu ­
ción en la piel,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— método de lavado de la célula de difusión y del material, 
— métodos de determinación, técnicas de extracción, límites de 
detección y validación del método analítico. 
Resultados: — recuperación total del experimento (dosis aplicada ≡ líquidos de 
lavado de la piel + piel + líquido receptor + líquidos de lavado de la célula), 
— cuadros de recuperaciones de las distintas células de difusión en 
cada compartimento, 
— variación de la absorción, — cuadros de datos de absorción (expresados en tasa, cantidad o 
porcentaje), 
Discusión de los resultados. Conclusiones.
 
4. REFERENCIAS  
1. Método de ensayo B.44. Absorción cutánea: método  in vivo.  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris. 
3. OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, An ­
nex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris. 
4. Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press, Boca Raton. 
5. Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In Vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications,  RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237-241. 
6. Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton. 
7. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels. 
8. Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Du ­
puis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test 
Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption and 
Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, FdChem Tox, 37, 191-205. 
9. Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65. 
10. Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al. (1996). Met ­
hods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop 
Report ATLA 24, 81 R10.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11. Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel. 
12. Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York. 
13. Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlo ­
robenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356-365.  
Figura 1  
Ejemplo de diseño clásico de célula de difusión estática para estudios  in vitro  de 
absorción a través de la piel
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IRRITACIÓN CUTÁNEA  IN VITRO:  MÉTODO DE ENSAYO CON 
EPIDERMIS HUMANA RECONSTRUIDA  
INTRODUCCIÓN 
1. La irritación cutánea se refiere a la producción de una lesión reversible de la 
piel como consecuencia de la aplicación de una sustancia problema durante 
un período de hasta 4 horas [según la definición del Sistema Globalmente Armonizado (SGA) de las Naciones Unidas de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos y del Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 del Parla ­
mento Europeo y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasifi ­
cación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (1) (3)]. El presente método de ensayo (ME) proporciona un procedimiento  in vitro  que puede 
utilizarse para identificar el peligro de productos químicos irritantes (sus ­
tancias y mezclas) de acuerdo con la categoría 2 del SGA de la ONU y del 
sistema de clasificación, etiquetado y envasado (CLP, de su nombre en inglés) de la UE (1) (2) (3). En la UE y en otras regiones que no han 
adoptado la categoría 3 optativa del SGA de la ONU (irritantes suaves), el 
presente ME puede utilizarse también para identificar productos químicos no clasificados, es decir, los «sin categoría» del SGA de la ONU y del CLP de la UE (1) (3). El presente ME puede emplearse para determinar la 
capacidad de irritación cutánea de los productos químicos, como un ensayo 
independiente de sustitución del ensayo de irritación cutánea  in vivo , dentro 
de una estrategia de evaluación secuencial (punto 4 y capítulo B.4 del presente anexo). 
2. La evaluación de la irritación cutánea, generalmente, ha implicado el uso de 
animales de laboratorio (véase la TG 404 de la OCDE, capítulo B.4 del presente anexo) (4). Respondiendo a la preocupación por el bienestar de los animales, el ME B.4 se revisó en 2004 para tener en cuenta la determina ­
ción de la corrosión o irritación cutánea aplicando una estrategia de ensayos 
secuenciales, utilizando métodos de ensayo validados  in vitro  o ex vivo , lo 
que evita infligir daños y sufrimiento a los animales.  ►
C1 Se han adop ­
tado como TG 430, 431 y 435 de la OCDE ◄ tres métodos de ensayo  in 
vitro  validados (5) (6) (7), y dos de ellos como capítulos B.40 y B.40  bis 
del presente anexo, para su uso en la parte correspondiente a la corrosión de la estrategia de evaluación secuencial del capítulo B.4 o de la TG 404 de la 
OCDE (4). 
3. El presente ME se refiere al efecto sobre la salud humana denominado 
irritación cutánea. Se basa en la epidermis humana reconstruida (EhR), que, en su diseño general (utilización de queratinocitos epidérmicos no 
transformados, obtenidos de seres humanos, como origen de las células, y 
de un tejido y una arquitectura celular representativos), imita bien las pro ­
piedades bioquímicas y fisiológicas de las capas superiores de la piel hu ­
mana, es decir, la epidermis. Este ME incluye también un conjunto de 
normas de comportamiento (NC) (apéndice 2) para la evaluación de méto ­
dos similares y modificados, basados en la EhR, y desarrollados por el CEVMA de la Comisión Europea (8), de acuerdo con los principios del 
documento de orientación n
 o 34 de la OCDE (9). 
4. Hay tres métodos validados que se adhieren al presente ME. Se han com ­
pletado los estudios de prevalidación, optimización y validación de un método  in vitro  (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), 
que utiliza un modelo de EhR, disponible comercialmente como EpiSkin
 TM 
(designado como método validado de referencia – MVR). Los otros dos 
métodos de irritación cutánea  in vitro  con EhR, disponibles comercialmente, 
han mostrado resultados similares a los del MVR según una validación 
basada en NC (21); se trata de los métodos EpiDerm  TM SIT (EPI-200) y 
SkinEthic  TM RHE (22).  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Antes de poder utilizar con fines normativos un método con EhR  in vitro  
distinto del MVR, del EpiDerm  TM SIT (EPI-200) y del SkinEthic  TM RhE, 
es necesario determinar su fiabilidad, pertinencia (exactitud) y limitaciones respecto al objetivo perseguido, a fin de garantizar que puede considerarse similar al MVR, de acuerdo con los requisitos de las NC establecidas en el 
presente ME (apéndice 2). Por otra parte, se recomienda consultar el docu ­
mento explicativo de base de la OCDE sobre los ensayos de irritación cutánea  in vitro  antes de desarrollar y validar un método de EhR  in vitro  
similar o modificado y de presentarlo para su adopción reglamentaria (23).
 
DEFINICIONES 
6. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.  
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
7. Una limitación del ME, puesta de manifiesto en el estudio de validación 
(16), es que no permite la clasificación de los productos químicos en la categoría 3 optativa del SGA de la ONU (irritantes suaves) (1). Cuando se 
utilice como ensayo de sustitución parcial, es posible que se exija la re ­
alización de ensayos de seguimiento  in vivo , para caracterizar plenamente el 
potencial de irritación cutánea (4 y capítulo B.4 del presente anexo). Se reconoce que el uso de piel humana está sujeto a condiciones y considera ­
ciones éticas tanto nacionales como internacionales. 
8. El presente ME se refiere al componente de irritación cutánea  in vitro  de la 
estrategia de ensayos secuenciales del ME B.4 (TG 404 de la OCDE) sobre corrosión o irritación cutánea (4). Aunque el presente ME no aporta infor ­
mación adecuada sobre la corrosión cutánea, ha de observarse que el ME 
B.40  bis (TG 431 de la OCDE) sobre corrosión cutánea se basa en el 
mismo sistema de ensayo con EhR, si bien utilizando un protocolo distinto (capítulo B.40  bis). El presente ME se basa en modelos de EhR que utilizan 
queratinocitos humanos, los cuales, por lo tanto, representan  in vitro  el 
órgano diana de la especie de interés. Además, cubre directamente la fase inicial de la cascada inflamatoria o mecanismo de acción (el daño celular y el daño tisular que provocan traumatismo localizado) que sucede durante la 
irritación  in vivo.  Durante la validación del presente ME se ha sometido a 
ensayo una amplia variedad de productos químicos, y la base de datos empíricos del estudio de validación contaba con 58 sustancias en total (16) (18) (23). El ME es aplicable a sólidos, líquidos, semisólidos y ceras. 
Los líquidos pueden ser acuosos o no acuosos; los sólidos pueden ser 
solubles o insolubles en agua. Cuando sea posible, deberán triturarse los sólidos para transformarlos en polvo fino antes de su aplicación; no es necesario realizar ningún otro tratamiento previo de la muestra. Aún no 
se ha efectuado ningún estudio de validación con gases y aerosoles (24). 
Aunque no hay que descartar que estos tipos de sustancias puedan estu ­
diarse utilizando la tecnología de EhR, el ME actual no permite ensayar 
gases ni aerosoles. Ha de señalarse asimismo que los productos químicos 
muy coloreados pueden interferir con la medición de la viabilidad celular, lo que haría necesario utilizar controles adaptados para corregir esta interfe ­
rencia (véanse los puntos 24 a 26). 
9. Una sola tanda de ensayos, formada por tres réplicas del tejido, debería ser 
suficiente para una sustancia problema, si la clasificación es inequívoca. Sin 
embargo, en casos de resultados dudosos, como el de mediciones no con ­
cordantes de las réplicas o el de un porcentaje de viabilidad media igual al 50 ± 5 %, debería plantearse la conveniencia de efectuar una segunda tanda, 
así como una tercera en caso de resultados discordantes entre las dos 
primeras.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
10. La sustancia problema se aplica tópicamente a un modelo de EhR tridimen ­
sional, formado por queratinocitos epidérmicos no transformados, obtenidos 
de seres humanos, que se han cultivado para formar un modelo de la epidermis humana bien diferenciado en varias capas. Consiste en las capas organizadas basal, espinosa y granulosa, y en un estrato córneo con varias 
capas intercelulares laminares de lípidos, que representan las principales 
clases de lípidos, análogas a las que se encuentran  in vivo.  
11. La irritación cutánea inducida por un producto químico, que se manifiesta 
como eritema y edema, es el resultado de una cascada de acontecimientos 
que se inicia con la penetración en el estrato córneo y el daño en las capas 
subyacentes de los queratinocitos. Los queratinocitos que van muriendo liberan mediadores que inician la cascada inflamatoria, la cual actúa sobre las células de la dermis, particularmente las células estrómicas y endotelia ­
les. La dilatación y el aumento de la permeabilidad de las células endote ­
liales son los factores que producen el eritema y el edema observados (24). Los métodos basados en la EhR miden los acontecimientos que inician la cascada. 
12. La viabilidad celular de los modelos de EhR se determina por la trans ­
formación enzimática del colorante vital MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetil ­
tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, azul de tiazolilo; número CAS 298-93-1] en 
una sal azul de formazano que se mide cuantitativamente tras su extracción 
de los tejidos (25). Las sustancias irritantes se identifican por su capacidad de reducir la viabilidad celular por debajo de unos umbrales definidos (es decir, ≤ 50 %, en el caso los de irritantes de la categoría 2 del SGA de la 
ONU o del CLP de la UE). En función del marco normativo en que se 
utilicen los resultados de este ME, los productos químicos que producen viabilidades celulares por encima del nivel umbral definido, pueden consi ­
derarse no irritantes (es decir, > 50 %, «sin categoría»).
 
DEMOSTRACIÓN DE LA COMPETENCIA 
13. Antes de proceder al uso sistemático de cualquiera de los tres métodos 
validados que se adhieren al presente ME, los laboratorios deben demostrar su competencia técnica, utilizando las diez sustancias de referencia que se 
recogen en el cuadro 1. En caso de métodos similares desarrollados con 
arreglo al presente ME o de modificaciones de cualquiera de los tres mé ­
todos validados, antes de utilizar el método para ensayos normativos es necesario cumplir los requisitos de las normas de comportamiento descritos 
en el apéndice 2 del presente ME. 
14. Como parte del ejercicio de demostración de la competencia, se recomienda 
que el usuario verifique las propiedades de barrera de los tejidos tras su recepción, siguiendo las especificaciones del fabricante del modelo de EhR. 
Este aspecto es particularmente importante si el envío de los tejidos implica 
grandes distancias o largos plazos. Una vez se haya establecido con éxito un método y se haya demostrado la competencia para su uso, no será necesario efectuar esta verificación de forma sistemática. Sin embargo, 
cuando se utilice sistemáticamente un método, se recomienda seguir eva ­
luando las propiedades de barrera a intervalos periódicos.
 
Cuadro 1  
Sustancias de referencia  ( 1 ) 
Sustancia N  o CAS Puntuación  in 
vivo ( 2 ) Estado físico Categoría del SGA de 
la ONU o del CLP de 
la UE  
Ácido naftaleno-acético 86-87-3 0 Sólido Sin categoría 
Isopropanol 67-63-0 0,3 Líquido Sin categoría  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Sustancia N  o CAS Puntuación  in 
vivo ( 2 ) Estado físico Categoría del SGA de 
la ONU o del CLP de 
la UE  
Estearato de metilo 112-61-8 1 Sólido Sin categoría 
Butirato de heptilo 5870-93-9 1,7 Líquido Sin categoría  
(Categoría opta ­
tiva 3)  ( 3 ) ( 4 ) 
Salicilato de hexilo 6259-76-3 2 Líquido Sin categoría  
(Categoría opta ­
tiva 3)  ( 3 ) ( 4 ) 
Aldehído ciclámico 103-95-7 2,3 Líquido Cat. 2 1-Bromohexano 111-25-1 2,7 Líquido Cat. 2 
Hidróxido de potasio (solución acuosa 
al 5 %) 1310-58-3 3 Líquido Cat. 2 
1-Metil-3-fenil-1-piperazina 5271-27-2 3,3 Sólido Cat. 2 
Heptanal 111-71-7 3,4 Líquido Cat. 2
 
( 1 ) Estas sustancias de referencia son un subconjunto de las sustancias de referencia utilizadas en el estudio de validación. 
( 2 ) Puntuación  in vivo  de acuerdo con el ME B.4 y la TG 404 de la OCDE (4). 
( 3 ) Según el presente método de ensayo, la categoría optativa 3 del SGA de la ONU (irritante suave) (1) no se considera como 
categoría. 
( 4 ) La categoría optativa 3 del SGA de la ONU no es aplicable según el sistema CLP de la UE.  
PROCEDIMIENTO 
15. A continuación se recoge una descripción de los componentes y procedi ­
mientos de un método con modelo de EhR para evaluar la irritación cutá ­
nea. El modelo de EHR debe reconstruirse, y puede prepararse en el propio laboratorio u obtenerse comercialmente. Existen procedimientos de trabajo 
normalizados disponibles para el EpiSkin
 TM , el EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
y el SkinEthic  TM RhE (26) (27) (28). La realización de los ensayos debe 
tener en cuenta los siguientes aspectos:  
Componentes del método de ensayo EhR  
Condiciones generales  
16. Para reconstruir el epitelio deben utilizarse queratinocitos humanos no trans ­
formados. Bajo un estrato córneo funcional, deben encontrarse varias capas 
de células epiteliales viables (capa basal, capa espinosa, capa granulosa). El 
estrato córneo debe constar de varias capas con el perfil lipídico necesario para constituir una barrera funcional con la suficiente resistencia contra la penetración rápida de marcadores citotóxicos como, por ejemplo, dodecil ­
sulfato de sodio (DSS) o tritón X-100. La existencia de la función de 
barrera debe demostrarse, y puede evaluarse determinando la concentración a la que el marcador reduce la viabilidad de los tejidos en un 50 % (CI
 50 ) 
tras un tiempo fijo de exposición, o bien determinando el tiempo de expo ­
sición necesario para reducir la viabilidad celular en un 50 % (TE  50 ) tras la 
aplicación del marcador a una concentración fija especificada. Las propie ­
dades de aislamiento del modelo de EhR deben evitar que pase material del estrato córneo al tejido viable, lo que reduciría la calidad del modelo en 
cuanto a la exposición de la piel. El modelo de EhR debe estar exento de 
contaminación por bacterias, virus, micoplasmas u hongos.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Condiciones funcionales  
Viabilidad 
17. El ensayo utilizado para determinar la magnitud de la viabilidad es el del 
MTT (25). Los usuarios del modelo de EhR deben asegurarse de que cada 
lote utilizado de este modelo cumple los criterios definidos en relación con el control negativo (CN). La densidad óptica (DO) del disolvente de ex ­
tracción solo debe ser suficientemente reducida, es decir, DO < 0,1. El 
diseñador o proveedor del modelo de EhR establece un rango de aceptabi ­
lidad (con un límite inferior y un límite superior) de los valores de DO de los controles negativos (en las condiciones del método de ensayo de irrita ­
ción cutánea), y en el cuadro 2 se indican los rangos de aceptabilidad de los 
tres métodos validados. Hay que demostrar documentalmente que los tejidos 
tratados con el CN son estables en cultivo (proporcionan unas mediciones similares de la viabilidad) durante todo el tiempo de exposición del ensayo.
 
Cuadro 2  
Rangos de aceptabilidad de los valores de DO de los controles negativos  
Límite inferior de aceptación Límite superior de aceptación  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Función de barrera 
18. El estrato córneo y su composición lipídica deben ser suficientes para 
impedir la penetración rápida de determinados marcadores citotóxicos 
(por ejemplo, DSS o tritón X-100), evaluada mediante la CI  50 o el TE  50 
(véase el cuadro 3).  
Morfología 
19. Debe efectuarse un examen histológico del modelo de EhR que demuestre 
una estructura similar a la de la epidermis humana (incluido un estrato 
córneo de varias capas).  
Reproducibilidad 
20. Los resultados de los controles positivos (CP) y negativos (CN) del método 
de ensayo deben demostrar su reproducibilidad a lo largo del tiempo.  
Control de calidad (CC) 
21. El diseñador o proveedor del modelo de EhR debe velar por que cada lote 
utilizado de este modelo cumpla los criterios definidos de aprobación de la producción, los más importantes de los cuales son los relativos a la  viabi­
lidad  (punto 17), a la  función de barrera  (punto 18) y a la  morfología  
(punto 19), y debe demostrar dicho cumplimiento. Estos datos deben pro ­
porcionarse a los usuarios del método, de manera que puedan incluirlos en el informe del ensayo. El diseñador o proveedor del modelo de EhR (o el 
investigador en caso de utilización de un modelo del propio laboratorio) 
debe establecer un rango de aceptabilidad (con límites superior e inferior) de la CI
 50 o del TE  50 . Para conseguir una predicción fiable de la clasifica ­
ción en cuanto al efecto irritante, solo pueden aceptarse los resultados 
obtenidos con tejidos adecuados. En el cuadro 3 se dan, como ejemplo, 
los rangos de aceptabilidad de los tres métodos validados.  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Cuadro 3  
Ejemplos de criterios de control de calidad para la aprobación de un lote  
Límite inferior de aceptación Límite superior de aceptación  
EpiSkin  TM (SM) 
(18 horas de tratamiento con DSS) 
(26) CI 50 = 1,0 mg/ml CI  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(tritón X-100 al 1 %) (27) TE 50 = 4,8 h TE  50 = 8,7 h 
SkinEthic  TM RHE 
(tritón X-100 al 1 %) (28) TE 50 = 4,0 h TE  50 = 9,0 h  
Aplicación de las sustancias problema y de control  
22. En cada tanda deben utilizarse al menos tres réplicas para cada sustancia 
problema y cada control. En caso de sustancias líquidas, así como sólidas, debe aplicarse una cantidad de sustancia problema suficiente para cubrir 
uniformemente la superficie de la epidermis pero evitando una dosis exce ­
siva, es decir, un mínimo de 25 μL/cm
 2 o 25 mg/cm  2 . En caso de sustancias 
sólidas, antes de aplicarlas debe humedecerse la superficie de la epidermis con agua desionizada o destilada, para mejorar el contacto de dicha super ­
ficie con la sustancia problema. Siempre que sea posible, los sólidos deben 
someterse a ensayo en forma de polvo fino. Al final del período de expo ­
sición, la sustancia problema debe retirarse cuidadosamente de la superficie de la epidermis lavando con una solución amortiguadora acuosa o con NaCl 
al 0,9 %. En función de cuál de los tres métodos validados de EhR se 
utilice, el tiempo de exposición varía entre 15 y 60 minutos, y la tempera ­
tura de incubación entre 20 y 37 °C. Estos tiempos de exposición y tem ­
peraturas se optimizan para cada método de EhR y representan las distintas 
propiedades intrínsecas de los métodos; puede obtenerse información más 
detallada en los procedimientos de trabajo normalizados correspondientes a los métodos (26) (27) (28). 
23. En cada tanda deben utilizarse controles negativos (CN) y positivos (CP) en 
paralelo para demostrar que la viabilidad (con el CN), la función de barrera 
y la sensibilidad tisular resultante (con el CP) de los tejidos se encuentran dentro de un rango histórico de aceptación definido. Como CP se sugiere una solución acuosa de DSS al 5 %. Como CN se sugiere agua o una 
solución salina amortiguadora de fosfato (PBS).
 
Medición de la viabilidad celular  
24. El elemento más importante del procedimiento de ensayo consiste en que 
las mediciones de la viabilidad no se realicen inmediatamente después de la exposición a las sustancias problema, sino después de un período de incu ­
bación de los tejidos lavados, en medio fresco, durante un tiempo suficiente 
tras el tratamiento. Este período permite tanto la recuperación de los even ­
tuales efectos citotóxicos débiles como la aparición de efectos citotóxicos 
claros. En la fase de optimización del ensayo (11) (12) (13) (14) (15) se 
demostró que la duración óptima del período de incubación tras el trata ­
miento es de 42 horas. 
25. El ensayo del MTT es un método cuantitativo validado que debe utilizarse 
para medir la viabilidad celular según el presente ME. Es compatible con el 
uso de un modelo de tejido tridimensional. La muestra de tejido se coloca 
en una solución de MTT de la concentración adecuada (por ejemplo, de 0,3 a 1 mg/mL) durante 3 horas. A continuación, utilizando un disolvente (por ejemplo, isopropanol, isopropanol ácido), se extrae del tejido el precipitado 
que se produce de formazano azul y se mide la concentración de este 
determinando la DO a 570 nm, con un paso de banda máximo de ± 30 nm.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Las propiedades ópticas de la sustancia problema o su acción química sobre 
el MTT pueden interferir con el ensayo y llevar a una estimación errónea de 
la viabilidad (debido a que la sustancia problema puede impedir o invertir la formación de color, así como provocarla). Puede ocurrir así cuando una sustancia problema determinada no se elimina completamente del tejido por 
el lavado o cuando penetra en la epidermis. Si la sustancia problema actúa 
directamente sobre el MTT (es un reductor de este), tiene color natural o se colorea durante el tratamiento del tejido, deben utilizarse controles adicio ­
nales para detectar y corregir la posible interferencia de la sustancia pro ­
blema con la técnica de medición de la viabilidad. En los procedimientos de 
trabajo normalizados correspondientes a los tres métodos validados puede encontrarse una descripción pormenorizada de la forma de corregir la re ­
ducción directa del MTT y las interferencias debidas a agentes colorantes 
(26) (27) (28).
 
Criterios de aceptabilidad  
27. En cada método en que se utilicen lotes válidos de modelos de EhR (véase 
el punto 21), los tejidos tratados con el CN deben presentar una DO que refleje la calidad de los tejidos que hayan pasado por las fases de transporte 
y recepción y por todos los procesos del protocolo. Los valores de DO del 
control no deben ser inferiores a los límites históricamente establecidos. Análogamente, los tejidos tratados con el CP, es decir, DSS en solución acuosa al 5 %, deben reflejar su capacidad de responder a una sustancia 
irritante en las condiciones del ME (26) (27) (28). Deben definirse unas 
medidas asociadas y adecuadas de la variabilidad entre las réplicas del tejido [por ejemplo, si se utilizan desviaciones típicas (DT), deben estar dentro del intervalo de tolerancia del 95 % unilateral calculado a partir de 
los datos históricos; en el caso del MVR, la DT es < 18 %].
 
Interpretación de los resultados y modelo de predicción  
28. Los valores de DO obtenidos con cada sustancia problema pueden utilizarse 
para calcular el porcentaje de viabilidad respecto al CN, que se fija en el 100 %. Es necesario definir claramente y documentar, así como demostrar 
que son adecuados, el valor de corte del porcentaje de viabilidad celular que 
permite distinguir las sustancias problema irritantes de las no clasificadas, y el procedimiento o procedimientos estadísticos utilizados para evaluar los resultados e identificar las sustancias irritantes. A continuación se indican 
los valores de corte para la predicción del efecto irritante: 
— se considera que la sustancia problema es irritante para la piel de 
acuerdo con la categoría 2 del SGA de la ONU o del CLP de la UE si la viabilidad del tejido después de la exposición y la incubación tras 
el tratamiento es inferior o igual ( ≤) al 50 %, 
— en función del marco normativo en el que se utilicen los resultados del 
presente ME, la sustancia problema podrá considerarse no irritante para la piel de acuerdo con la categoría «sin categoría» del SGA de la ONU 
o del CLP de la UE, si la viabilidad del tejido después de la exposición 
y la incubación tras el tratamiento es superior (>) al 50 %.
 
DATOS E INFORME  
Datos  
29. Respecto a cada tanda, deben recogerse en un cuadro los datos obtenidos 
con las distintas réplicas de los tejidos (por ejemplo, los valores de DO y 
los de los porcentajes de viabilidad celular calculados para cada sustancia 
problema, con la clasificación), incluidos los datos de los experimentos repetidos, en su caso. Además, deben indicarse las medias ± desviación típica de cada tanda. Con respecto a cada sustancia estudiada, deben indi ­
carse las interacciones observadas con el reactivo MTT y las sustancias 
problema coloreadas.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Informe del ensayo  
30. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancias problema y de control: 
— denominación o denominaciones químicas, como nombre y número 
CAS, o nombre y número CE, si se conocen, 
— pureza y composición de la sustancia (en porcentaje del peso), 
— propiedades físicas y químicas pertinentes para la realización del estudio 
(por ejemplo, estado físico, estabilidad, volatilidad, pH e hidrosolubili ­
dad, si se conocen), 
— tratamiento de las sustancias problema y de control antes del ensayo, en 
su caso (por ejemplo, calentamiento, trituración), 
— condiciones de almacenamiento. 
Justificación del modelo de EhR y del protocolo utilizados 
Condiciones del ensayo: 
— sistema celular utilizado, 
— información justificativa completa sobre el modelo concreto de EhR 
utilizado, incluido su comportamiento; debe comprender, entre otras 
cosas: 
i) la viabilidad, 
ii) la función de barrera, 
iii) la morfología, 
iv) la reproducibilidad y capacidad de predicción, 
v) los controles de calidad del modelo, 
— particularidades del procedimiento de ensayo empleado, 
— dosis utilizadas en el ensayo, duración de la exposición y del período de 
incubación tras el tratamiento, 
— descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento del en ­
sayo, 
— referencia a datos históricos del modelo; debe comprender, entre otras 
cosas: 
i) aceptabilidad de los datos de control de calidad con referencia a los 
datos históricos de los lotes, 
ii) aceptabilidad de los valores de los controles positivos y negativos 
con referencia a las medias y rangos de los controles positivos y 
negativos, 
— descripción de los criterios de evaluación utilizados, incluida la justifi ­
cación de la selección de los valores límite del modelo de predicción, 
— referencia a los datos históricos del control.  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Resultados: 
— cuadro con los datos individuales de las distintas sustancias problema 
correspondientes a cada tanda y cada medición con una muestra repe ­
tida, 
— indicación de los controles utilizados para sustancias problema que son 
reductores directos del MTT o colorantes, 
— descripción de otros efectos observados. 
Discusión de los resultados Conclusión
 
BIBLIOGRAFÍA 
(1) Naciones Unidas (2009), Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación 
y Etiquetado de Productos Químicos (SGA), tercera edición revisada, Na ­
ciones Unidas, Nueva York y Ginebra. Disponible en la dirección: [http:// www.unece.org/es/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_s.html] 
(2) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2009), Statement on the 
«Performance under UN GHS of three  in vitro  assays for skin irritation 
testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accu ­
racy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards», issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. 
Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(3) Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 
67/548/CEE y 1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) n
 o 1907/2006. 
DO L 353 de 31.12.2008, p. 1. 
(4) OCDE (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Disponible en la dirección: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(5) OCDE (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines] 
(6) OCDE (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(7) OCDE (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(8) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2009), Performance Stan ­
dards for  in vitro  skin irritation test methods based on Reconstructed human 
Epidermis (EHR)? Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.euro ­
pa.eu] 
(9) OCDE (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Disponible 
en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A 
prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93. 
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 
16, 765–770.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114. 
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367. 
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation 
process, ATLA 33, 329-349. 
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to 
the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129. 
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601. 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. 
and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 
603-619. 
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy-Results 
and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358. 
(20) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2007), Statement on the 
validity of  in vitro  tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific 
Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(21) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2007), Performance Stan ­
dards for applying human skin models to  in vitro  skin irritation testing. 
Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(22) EC-ECVAM (CEVMA de la Comisión Europea) (2008), Statement on the 
scientific validity of  in vitro  tests for skin irritation testing, issued by the 
ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Disponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(23) OCDE (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http:// www.oecd.org/document/24/ 0,3746,en_2649_34377_47858904_ 1_1_1_1,00.html] 
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231-243.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55-63. 
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 
min-42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Dis ­
ponible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Dispo ­
nible en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of 
chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Disponible 
en la dirección: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] 
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp. 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York. 
(30) Directiva 2001/59/CE de la Comisión, de 6 de agosto de 2001, por la que 
se adapta, por vigésima octava vez, al progreso técnico la Directiva 
67/548/CEE del Consejo relativa a la aproximación de las disposiciones 
legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, emba ­
laje y etiquetado de las sustancias peligrosas (DO L 225 de 21.8.2001, p. 1). 
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Con ­
tact Dermatitis 51, 1-4. 
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irrita ­
tion and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal in vivo  data, ALTEX, 14, 359-365. 
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch 
test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Der ­
matitis, 62, 109-116.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Apéndice 1  
Definiciones  
Exactitud:  Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de 
ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del com ­
portamiento del método de ensayo y es un aspecto de su pertinencia. Este 
término y el de «concordancia» se suelen usar indistintamente para indicar la 
proporción de resultados correctos de un método de ensayo (9).  
Viabilidad celular:  Parámetro que mide la actividad total de una población 
celular como, por ejemplo, la capacidad de las deshidrogenasas mitocondriales 
celulares para reducir el colorante vital MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- 
il)-2,5-difeniltetrazolio, azul de tiazolilo], que, según el efecto considerado y el diseño del ensayo realizado, se corresponde con el número total o con la vita ­
lidad de las células vivas.  
Concordancia:  Se trata de una medida del comportamiento del método de ensayo 
que da un resultado categórico, y es un aspecto de su pertinencia. Este término y el de «exactitud» se pueden usar indistintamente, y se define como la proporción de todas las sustancias estudiadas que se clasifican correctamente como positivas 
o negativas (9).  
TE
 50 : Puede estimarse determinando el tiempo de exposición necesario para 
reducir la viabilidad celular en un 50 % tras la administración de la sustancia marcadora a una concentración fija determinada; véase también CI
 50 . 
Sistema CLP de la UE [Reglamento (CE) n  o 1272/2008 del Parlamento Europeo 
y del Consejo, de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas]:  Aplica en la Unión Europea (UE) el sistema 
SGA de la ONU para la clasificación y etiquetado de los productos químicos 
(sustancias y mezclas) (3).  
SGA [(Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Pro ­
ductos Químicos de las Naciones Unidas (ONU)]:  Sistema que propone la cla ­
sificación de productos químicos (sustancias y mezclas) según tipos y niveles 
normalizados de peligros físicos, para la salud y para el medio ambiente, y que 
hace referencia a los elementos correspondientes de comunicación, como picto ­
gramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus 
efectos adversos con el fin de proteger a la población (incluidos empresarios, 
trabajadores, transportistas, consumidores y personal de protección civil) y al medio ambiente (1).  
CI
 50 : Puede estimarse determinando la concentración a la que una sustancia 
marcadora reduce la viabilidad de los tejidos en un 50 % (CI  50 ) tras un tiempo 
fijo de exposición; véase también TE  50 . 
Dosis excesiva:  Cantidad de sustancia problema aplicada a la epidermis que 
supera a la cantidad necesaria para cubrir completa y uniformemente la superficie 
de la epidermis.  
Ensayos de imitación:  Denominación de un método de ensayo que es estructural 
y funcionalmente similar a un método de ensayo de referencia, validado y acep ­
tado. Tales métodos de ensayo serían candidatos para una validación de actua ­
lización. También se pueden denominar métodos de ensayo similares (9).  
Normas de comportamiento (NC):  Normas, basadas en un método de ensayo 
validado, que proporcionan la base para evaluar la comparabilidad de un método de ensayo propuesto, que es similar desde el punto de vista mecánico y funcio ­
nal. Se incluyen aquí: i) los componentes fundamentales del método de ensayo, 
ii) una lista mínima de sustancias de referencia seleccionadas de entre las sus ­
tancias utilizadas para demostrar el comportamiento aceptable del método de ensayo validado, y iii) los niveles similares de exactitud y fiabilidad que, sobre la base de lo obtenido con el método de ensayo validado, debe mostrar el método 
de ensayo propuesto cuando se evalúa con la lista mínima de sustancias de 
referencia (9).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Sustancias de referencia:  Sustancias seleccionadas para utilizarse en el proceso 
de validación, cuyas respuestas en el sistema de ensayo de referencia  in vitro  o in 
vivo o en la especie de interés ya se conocen. Estas sustancias deben ser repre ­
sentativas de las clases de sustancias con las que esté previsto utilizar el método de ensayo, y deben representar toda la gama de respuestas que puede esperarse 
de las sustancias con las que pueda utilizarse, desde fuertes hasta débiles e 
incluso negativas. Es posible que se necesiten distintos conjuntos de sustancias de referencia para las diferentes fases del proceso de validación y para los distintos métodos de ensayo y usos de los ensayos (9).  
Pertinencia:  Descripción de la relación del ensayo con el efecto de interés y de si es 
significativo y útil para un objetivo concreto. Es el grado en que el ensayo mide o 
predice correctamente el efecto biológico de interés. La pertinencia incorpora la 
consideración de la exactitud (concordancia) de un método de ensayo (9).  
Fiabilidad:  Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de 
forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproduci ­
bilidad intra e interlaboratorios (9).  
Ensayo de sustitución:  Ensayo que se diseña para sustituir un ensayo utilizado de 
forma sistemática y aceptado para la identificación del peligro o la evaluación del riesgo, y del que se ha determinado que proporciona una protección equivalente o mejorada de la salud humana o del medio ambiente, según corresponda, res ­
pecto al ensayo aceptado, en relación con todas las situaciones de ensayo y todas 
las sustancias posibles (9).  
Sensibilidad:  Proporción de todas las sustancias positivas o activas que se clasi ­
fican correctamente mediante el ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categóricos, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (9).  
Irritación cutánea:  Producción de una lesión reversible de la piel como consecuencia 
de la aplicación de una sustancia problema durante un período de hasta 4 horas. La 
irritación cutánea es una reacción no inmunogénica que se presenta localmente y aparece poco tiempo después de la estimulación (29). Su característica principal es consistir en un proceso reversible con la presencia de reacciones inflamatorias y la 
mayoría de los signos clínicos característicos de la irritación (eritema, edema, prurito y 
dolor) en relación con un proceso inflamatorio.  
Especificidad:  Proporción de todas las sustancias negativas o inactivas que se 
clasifican correctamente mediante el ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados categóricos, y un factor importante en 
la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo (9).  
Estrategia de ensayos secuenciales:  Utilización de métodos de ensayo de manera 
secuencial; los métodos de ensayo seleccionados en cada nivel sucesivo se de ­
ciden sobre la base de los resultados del nivel anterior de ensayos (9).  
Sustancia problema (o producto químico problema):  Toda sustancia o mezcla 
sometida a ensayo con este ME.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Apéndice 2  
Normas de comportamiento para la evaluación de métodos de epidermis 
humana reconstruida (EhR) similares o modificados que se propongan 
para determinar la irritación cutánea  
INTRODUCCIÓN 
1. El objetivo de las normas de comportamiento (NC) consiste en comunicar la 
base por la que puede determinarse si un nuevo método, tanto protegido (es 
decir, sujeto a derechos de autor, patentado, registrado) como no protegido, presenta la suficiente exactitud y fiabilidad para determinados fines de ensayo. Estas normas de comportamiento, basadas en métodos validados 
y aceptados, pueden utilizarse para evaluar la fiabilidad y la exactitud de 
otros métodos similares (conocidos como ensayos «de imitación») que se basan en principios científicos similares y miden o predicen el mismo efecto biológico o tóxico (9). 
2. Antes de la adopción de métodos modificados (es decir, posibles mejoras 
propuestas para un método aprobado), debe efectuarse una evaluación para 
determinar el efecto que tienen los cambios propuestos sobre el comporta ­
miento del ensayo y la medida en que tales cambios afectan a la informa ­
ción disponible para los demás componentes del proceso de validación. En 
función del número y de la naturaleza de los cambios propuestos, de los 
datos generados y de la documentación justificativa de tales cambios, estos métodos deben someterse o bien al mismo proceso de validación descrito para un nuevo ensayo o bien, si procede, a una evaluación limitada de la 
fiabilidad y de la pertinencia utilizando normas de comportamiento estable ­
cidas (9). 
3. Los métodos similares o modificados respecto a cualquiera de los tres 
métodos validados [EpiSkin
 TM (método validado de referencia– MVR), 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) y SkinEthic  TM RHE] propuestos para utilizarse 
con arreglo al presente ME deben evaluarse a fin de determinar su fiabilidad 
y exactitud, utilizando sustancias representativas de toda la gama de pun ­
tuaciones de la prueba de irritación de Draize. Los métodos similares o modificados propuestos, cuando se evalúan con las veinte sustancias de 
referencia recomendadas de las normas de comportamiento (cuadro 1), 
deben presentar unos valores de fiabilidad y exactitud comparables a los del MVR o mejores que estos (cuadro 2) (2) (16). Los valores de fiabilidad y exactitud que deben alcanzarse se presentan en los puntos 8 a 12 del 
presente apéndice. Se incluyen sustancias no clasificadas («sin categoría» 
según el SGA de la ONU o el CLP de la UE) y clasificadas (categoría 2 del SGA de la ONU o del CLP de la UE) (1), que representan diferentes clases químicas, de forma que la fiabilidad y la exactitud (sensibilidad, especifi ­
cidad y exactitud general) del método propuesto puedan compararse con las 
del MVR. Antes de utilizar un método para ensayar nuevas sustancias problema, debe determinarse su fiabilidad, así como su capacidad para detectar correctamente las sustancias irritantes de la categoría 2 del SGA 
de la ONU o del CLP de la UE, y, en función del marco normativo para el 
que se obtienen los datos, también su capacidad para detectar correctamente las sustancias «sin categoría» según el SGA de la ONU o el CLP de la UE. 
4. Estas NC se basan en las NC del CEVMA de la Comisión Europea (8), 
actualizadas de acuerdo con los sistemas de clasificación y etiquetado SGA 
de la ONU y CLP de la UE (1) (3). Las NC originales se definieron tras la realización del estudio de validación (21) y se basaban en el sistema de clasificación de la UE establecido en la Directiva 2001/59/CE de la Comi ­
sión, de 6 de agosto de 2001, por la que se adapta, por vigésima octava vez, 
al progreso técnico la Directiva 67/548/CEE del Consejo relativa a la apro ­
ximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas (
 1 ). 
Debido a la adopción del sistema SGA de clasificación y etiquetado  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) DO L 225 de 21.8.2001, p. 1.
 de la ONU en la UE (sistema CLP de la UE) (3), que tuvo lugar entre la 
finalización del estudio de validación y la elaboración del presente ME, las 
NC se han actualizado (8). Esta actualización consiste en cambios que se refieren principalmente: i) al conjunto de sustancias de referencia de las NC, y ii) a los valores definidos de fiabilidad y exactitud (2) (23).
 
NORMAS DE COMPORTAMIENTO DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO  IN 
VITRO  CON EHR PARA DETERMINAR LA IRRITACIÓN CUTÁNEA 
5. Las NC comprenden los tres elementos siguientes (9): 
I) Componentes fundamentales del método de ensayo; 
II) Lista mínima de sustancias de referencia; 
III) Valores definidos de exactitud y fiabilidad.  
I) Componentes fundamentales del método de ensayo  
6. Consisten en los elementos fundamentales de carácter estructural, funcional 
y de procedimiento de un método validado que deben incluirse en el pro ­
tocolo de un método propuesto modificado o similar desde el punto de vista mecánico y funcional. Estos componentes incluyen características únicas del método, aspectos críticos del procedimiento y medidas de control de cali ­
dad. El mantenimiento de los componentes fundamentales del método de 
ensayo contribuye a garantizar que un método propuesto modificado o similar se basa en los mismos conceptos que el MVR correspondiente (9). Los componentes fundamentales del método de ensayo se describen 
con detalle en los puntos 16 a 21 del ME y los ensayos deben realizarse 
atendiendo a los siguientes aspectos: 
— Condiciones generales (punto 16) 
— Condiciones funcionales, que incluyen: 
— viabilidad (punto 17), 
— función de barrera (punto 18), 
— morfología (punto 19), 
— reproducibilidad (punto 20), y — control de calidad (punto 21).
 
II) Lista mínima de sustancias de referencia  
7. Las sustancias de referencia se utilizan para determinar si la fiabilidad y la 
exactitud de un método propuesto similar o modificado, del que se haya 
demostrado que presenta una similitud al MVR suficiente desde el punto de 
vista estructural y funcional, o que represente una modificación poco im ­
portante de uno de los tres métodos validados, son comparables a las del MVR o mejores que estas (2) (8) (16) (23). Entre las veinte sustancias de 
referencia recomendadas que figuran en el cuadro 1 se encuentran sustan ­
cias representativas de diferentes clases químicas (es decir, categorías quí ­
micas basadas en grupos funcionales) y de toda la gama de puntuaciones de la prueba de irritación de Draize (desde no irritantes hasta muy irritantes). 
Las sustancias incluidas en esta lista comprenden diez sustancias de la 
categoría 2 del SGA de la ONU o del CLP de la UE, y otras diez sustancias
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
sin categoría, de las que tres son sustancias de la categoría optativa 3 del 
SGA de la ONU. Según el presente método de ensayo, la categoría optativa 
3 no se considera categoría («sin categoría»). Las sustancias recogidas en el cuadro 1 se han elegido entre las sustancias utilizadas en la fase de opti ­
mización tras la prevalidación y en el estudio de validación del MVR, 
teniendo en cuenta los grupos funcionales químicos y el estado físico 
(14) (18). Estas sustancias de referencia representan el número mínimo de sustancias que deben utilizarse para evaluar la exactitud y la fiabilidad de un método propuesto similar o modificado, pero no deben utilizarse para el 
desarrollo de nuevos métodos. En situaciones en que no se disponga de 
alguna sustancia de la lista, se podrán utilizar otras sustancias para las que se disponga de datos de referencia  in vivo  adecuados, en principio del grupo 
de sustancias utilizadas en la fase de optimización tras la prevalidación o en 
el estudio de validación del MVR. Si así se desea, esta lista mínima de 
sustancias de referencia puede complementarse con sustancias adicionales representativas de otras clases químicas y para las que se disponga de datos de referencia  in vivo  adecuados, con el fin de evaluar mejor la exactitud del 
método propuesto.
 
Cuadro 1  
Lista mínima de sustancias de referencia para la determinación de los valores de exactitud y fiabilidad de los 
métodos similares o modificados de irritación cutánea con EhR  ( 1 ) 
Sustancia Número CAS Estado físico Puntuación  in 
vivo Cat. MVR  in 
vitro  Cat. SGA de la ONU 
o CLP de la UE  in 
vivo 
1-Bromo-4-clorobutano 6940-78-9 Líquido 0 Cat. 2 Sin categoría 
Ftalato de dietilo 84-66-2 Líquido 0 Sin categoría Sin categoría 
Ácido naftaleno-acético 86-87-3 Sólido 0 Sin categoría Sin categoría 
Fenoxiacetato de alilo 7493-74-5 Líquido 0,3 Sin categoría Sin categoría Isopropanol 67-63-0 Líquido 0,3 Sin categoría Sin categoría 
4-Metil-tio-benzaldehído 3446-89-7 Líquido 1 Cat. 2 Sin categoría 
Estearato de metilo 112-61-8 Sólido 1 Sin categoría Sin categoría Butirato de heptilo 5870-93-9 Líquido 1,7 Sin categoría Sin categoría Salicilato de hexilo 6259-76-3 Líquido 2 Sin categoría Sin categoría 
Cinamaldehído 104-55-2 Líquido 2 Cat. 2 Sin categoría  
(Categoría optativa 
3) (
 3 ) 
1-decanol  ( 2 ) 112-30-1 Líquido 2,3 Cat. 2 Cat. 2  
Aldehído ciclámico 103-95-7 Líquido 2,3 Cat. 2 Cat. 2 
1-Bromohexano 111-25-1 Líquido 2,7 Cat. 2 Cat. 2 Clorhidrato de 2-clorometil- 
3,5-dimetil-4-metoxipiridina 86604-75-3 Sólido 2,7 Cat. 2 Cat. 2  
Disulfuro de di-n-propilo  (
 2 ) 629-19-6 Líquido 3 Sin categoría Cat. 2  
Hidróxido de potasio (solu ­
ción acuosa al 5 %) 1310-58-3 Líquido 3 Cat. 2 Cat. 2 
5-(1,1-Dimetiletil)-2-metil ­
bencenotiol 7340-90-1 Líquido 3,3 Cat. 2 Cat. 2 
1-Metil-3-fenil-1-piperazina 5271-27-2 Sólido 3,3 Cat. 2 Cat. 2  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Sustancia Número CAS Estado físico Puntuación  in 
vivo Cat. MVR  in 
vitro  Cat. SGA de la ONU 
o CLP de la UE  in 
vivo 
Heptanal 111-71-7 Líquido 3,4 Cat. 2 Cat. 2 
Tetracloroetileno 127-18-4 Líquido 4 Cat. 2 Cat. 2  
( 1 ) La elección de las sustancias se basa en los criterios siguientes: i) las sustancias se encuentran en el comercio, ii) son re presentativas de toda 
la gama de puntuaciones de la prueba de irritación de Draize (desde no irritantes hasta muy irritantes), iii) tienen una estruc tura química bien 
definida; iv) son representativas de los grupos funcionales químicos utilizados en el proceso de validación, y v) no están asoc iadas con 
un perfil extremadamente tóxico (por ejemplo, carcinogénesis o toxicidad para el sistema reproductor) ni con unos costes de eli minación 
prohibitivos. 
( 2 ) Sustancias que son irritantes en conejos pero para las que existen pruebas fiables de que no son irritantes en seres humanos (31) (32) (33). 
( 3 ) Con arreglo al SGA de la ONU, pero no en el CLP de la UE.  
III) Valores definidos de exactitud y fiabilidad  
8. A efectos de establecer la fiabilidad y pe rtinencia de métodos propuestos similares 
o modificados que se vayan a transferir entre laboratorios, es necesario ensayar la 
totalidad de las veinte sustancias de refe rencia del cuadro 1 en, al menos, tres 
laboratorios. Sin embargo, si el método propuesto se va a utilizar en un único laboratorio, no es necesario para la validación hacer el ensayo multilaboratorios. Sin embargo, es fundamental que tales estudios de validación sean evaluados 
independientemente por órganos de validación reconocidos internacionalmente, 
de acuerdo con directrices in ternacionales (9). En cada laboratorio, debe someterse 
a ensayo la totalidad de las veinte sustancias de referencia, en tres tandas inde ­
pendientes, realizadas con diferentes lote s del tejido y a intervalos suficientemente 
separados. Cada tanda debe consistir como mínimo en tres réplicas del tejido ensayadas en paralelo con cada sustancia problema, el CN y el CP. 
9. El cálculo de los valores de fiabilidad y exactitud del método propuesto 
debe efectuarse atendiendo a la totalidad de los cuatro criterios recogidos a 
continuación, velando por que los valores de fiabilidad y pertinencia se 
calculen de forma coherente y definida con anterioridad: 
1. Para el cálculo de la variabilidad intra e interlaboratorios y de la capa ­
cidad de predicción (exactitud) del método se tendrán en cuenta única ­
mente los datos procedentes de secuencias de tandas completas. 
2. La clasificación final de cada sustancia de referencia en cada laboratorio 
participante debe obtenerse utilizando el valor medio de la viabilidad de las distintas tandas realizadas en una secuencia de tandas completa. 
3. Para el cálculo de la variabilidad interlaboratorios del método se tendrán 
en cuenta únicamente los datos obtenidos con sustancias que se hayan 
sometido a secuencias de tandas completas en todos los laboratorios 
participantes. 
4. El cálculo de los valores de exactitud se efectuará sobre la base de las 
predicciones individuales de los laboratorios obtenidas para las veinte sustancias de referencia por los distintos laboratorios participantes. 
En este contexto, una  secuencia de tandas  consiste en tres tandas indepen ­
dientes realizadas en un laboratorio con una sustancia problema. Una  se­
cuencia de tandas completa  es una secuencia de tandas realizadas en un 
laboratorio con una sustancia problema cuando las tres tandas son válidas. 
Esto significa que una sola tanda inválida anula la validez de toda una 
secuencia de tres tandas.
 
Reproducibilidad intralaboratorios  
10. La evaluación de la reproducibilidad intralaboratorios debe indicar que la 
concordancia de las clasificaciones (categoría 2 y «sin categoría» del SGA de la ONU o del CLP de la UE) obtenidas en tandas de ensayo diferentes e 
independientes, con las veinte sustancias de referencia, dentro de un mismo 
laboratorio, es igual o superior ( ≥) al 90 %.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Reproducibilidad interlaboratorios  
11. Si el método propuesto se va a utilizar solamente en un laboratorio, no es 
fundamental evaluar la reproducibilidad interlaboratorios. En caso de que el 
método se vaya a transferir entre laboratorios, la concordancia de las cla ­
sificaciones (categoría 2 y «sin categoría» del SGA de la ONU o del CLP de la UE) obtenidas en tandas de ensayo diferentes e independientes, con 
las veinte sustancias de referencia, entre preferentemente un mínimo de tres 
laboratorios, debe ser igual o superior ( ≥) al 80 %.
 
Capacidad de predicción (exactitud)  
12. La exactitud (sensibilidad, especificidad y exactitud general) del método 
propuesto similar o modificado debe ser comparable a la del MVR o mejor 
que esta, teniendo en cuenta la información adicional relativa a la pertinen ­
cia en la especie de interés (cuadro 2). La sensibilidad debe ser igual o superior ( ≥) al 80 % (2) (8) (23). Sin embargo, se aplica otra restricción 
específica a la sensibilidad del método  in vitro  propuesto , ya que solamente 
dos sustancias de la categoría 2  in vivo,  el 1-decanol y el disulfuro de di-n- 
propilo, pueden ser clasificados erróneamente como «sin categoría» por más de un laboratorio participante. La especificidad debe ser igual o superior ( ≥) 
al 70 % (2) (8) (23). No hay ninguna otra restricción respecto a la especi ­
ficidad del método  in vitro  propuesto, es decir, cualquier laboratorio parti ­
cipante puede clasificar erróneamente cualquier sustancia «sin categoría» in 
vivo siempre que la especificidad final del método de ensayo se mantenga 
dentro del rango aceptable. La exactitud general debe ser igual o superior 
(≥) al 75 % (2) (8) (23). Aunque la sensibilidad del MVR calculada con las 
veinte sustancias de referencia recogidas en el cuadro 1 sea igual al 90 %, el valor mínimo definido de sensibilidad que se exige para que un método 
similar o modificado se considere válido está fijado en el 80 %, ya que se 
sabe que tanto el 1-decanol (sustancia dudosa) como el disulfuro de di-n- propilo (falso negativo en el MVR) no son irritantes para los seres humanos (31) (32) (33), aunque estén identificados como irritantes en la prueba con 
conejos. Como los modelos de EhR están basados en células de origen 
humano, es posible que clasifiquen estas sustancias como no irritantes («sin categoría» según el SGA de la ONU o el CLP de la UE).
 
Cuadro 2  
Valores requeridos de capacidad de predicción en cuanto a la sensibilidad, especificidad y 
exactitud general para que un método similar o modificado se considere válido  
Sensibilidad Especificidad Exactitud general  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Criterios de aceptación del estudio  
13. Es posible que uno o varios de los ensayos correspondientes a una o más 
sustancias problema no cumplan los criterios de aceptación del ensayo en 
cuanto a las sustancias problema y de control, o no sean aceptables por 
otros motivos. Para completar los datos que falten respecto a cada sustancia problema se puede efectuar un máximo de dos ensayos adicionales (repe ­
ticiones del ensayo). Más precisamente, como en caso de repetición del 
ensayo también hay que ensayar en paralelo el CP y el CN, puede realizarse un máximo de dos tandas adicionales para cada sustancia problema. 
14. No hay que descartar que, incluso después de repetir el ensayo, no se 
obtenga el número mínimo de tres tandas válidas requerido para cada 
sustancia estudiada en relación con cada sustancia de referencia en cada uno de los laboratorios participantes, lo que dejaría incompleto el cuadro de datos. En tales casos, deben cumplirse los siguientes tres criterios conjun ­
tamente para poder considerar aceptables los conjuntos de datos: 
1. Cada una de las veinte sustancias de referencia debe tener al menos una 
secuencia de tandas completa.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. En cada uno de los, como mínimo, tres laboratorios participantes, debe 
completarse un mínimo del 85 % de las secuencias de tandas (con veinte 
sustancias, esto significa que en un mismo laboratorio se pueden produ ­
cir tres secuencias de tandas inválidas). 
3. Es necesario que se complete como mínimo el 90 % de todas las posi ­
bles secuencias de tandas de los, como mínimo, tres laboratorios (con veinte sustancias ensayadas en tres laboratorios, esto equivale a permitir 
un total de seis secuencias de tandas inválidas).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47.  MÉTODO DE ENSAYO DE LA OPACIDAD Y PERMEABILIDAD 
DE LA CÓRNEA DE BOVINO PARA DETECTAR AGENTES CO ­
RROSIVOS E IRRITANTES INTENSOS PARA LOS OJOS  
INTRODUCCIÓN 
1. El método de ensayo de la opacidad y permeabilidad de la córnea de bovino 
(Bovine Corneal Opacity and Permeability , BCOP) es un procedimiento  in 
vitro  que puede utilizarse, en ciertas circunstancias y con limitaciones es ­
pecíficas, para clasificar sustancias y mezclas como «agentes corrosivos e 
irritantes intensos para los ojos» (1) (2) (3). A efectos de este método de 
ensayo, se entiende por «agentes irritantes intensos» aquellos que inducen lesiones oculares que persisten en el conejo durante al menos 21 días tras su administración. Aunque no se considera válido para sustituir completamente 
al ensayo  in vivo  en ojo de conejo, se recomienda utilizar el BCOP como 
parte de una estrategia de ensayo gradual para la clasificación normativa y el etiquetado dentro de un ámbito específico de aplicabilidad (4) (5). Las sustancias y mezclas problema (6) pueden clasificarse como agentes corro ­
sivos o irritantes intensos sin necesidad de efectuar más pruebas con cone ­
jos. Las sustancias que den resultado negativo tendrían que someterse a ensayo con conejos siguiendo una estrategia de ensayo secuencial, como se describe en las Directrices de ensayo 405 de la OCDE (7) (método B. 5 
del presente anexo). 
2. El objetivo del presente método de ensayo es describir los procedimientos 
utilizados para evaluar la posible corrosividad o capacidad de irritación intensa para los ojos de una sustancia problema en función de su capacidad 
para inducir opacidad y aumento de la permeabilidad en una córnea aislada 
de bovino. Los efectos tóxicos para la córnea se miden mediante a) el descenso de la transmisión luminosa (opacidad) y b) el aumento del paso del pigmento fluoresceína sódica (permeabilidad). Los resultados de la eva ­
luación de la opacidad y de la permeabilidad de la córnea tras su exposición 
a la sustancia problema se combinan para obtener una puntuación de la capacidad de irritación  in vitro  (conocida por sus siglas en inglés, IVIS), 
que se utiliza para clasificar el nivel de capacidad de irritación de la sus ­
tancia problema. 
3. También se han ensayado utilizando el método de ensayo BCOP agentes 
irritantes oculares que provocan lesiones que desaparecen en menos de 21 días, así como sustancias no irritantes. Sin embargo, no se han evaluado 
oficialmente la exactitud ni la fiabilidad del método de ensayo BCOP 
respecto a las sustancias de estas categorías. 
4. En el apéndice 1 se dan las definiciones pertinentes.
 
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
5. El presente método de ensayo se basa en el protocolo del método de ensayo 
BCOP del Comité de Coordinación Interagencias sobre la Validación de Mé ­
todos Alternativos estadounidense (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) (8), elaborado siguiendo un 
estudio de validación internacional (4) (5) (9), con aportaciones del Centro 
Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) y del Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (Japanese Center for the Validation of 
Alternative Methods, JaCVAM). El protocolo se basa en información obtenida 
del Protocolo 124 del Institute for In Vitro Sciences (IIVS) e INVITTOX (10), que representa el protocolo utilizado en el estudio de prevalidación del ensayo BCOP, financiado por la Comunidad Europea y realizado en 1997-1998. 
Ambos protocolos se basan en la metodología del ensayo BCOP comunicada 
por primera vez por Gautheron  et al.  (11).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. Las limitaciones que se han detectado en este método de ensayo están 
relacionadas con la elevada tasa de falsos resultados positivos de alcoholes 
y cetonas y la elevada tasa de falsos resultados negativos de sólidos, ob ­
servadas en la base de datos de validación (véase el punto 44) (5). Si se excluyen de la base de datos las sustancias de estas clases químicas y 
físicas, mejora sustancialmente la exactitud del ensayo BCOP en los siste ­
mas de clasificación de la UE, EPA y SGA (5). Teniendo en cuenta el objeto de este ensayo (es decir, tan solo identificar agentes corrosivos o irritantes intensos para los ojos), no importa que sean elevadas las tasas de 
falsos resultados negativos, ya que las sustancias correspondientes se some ­
terían posteriormente a ensayo con conejos o a otros ensayos  in vitro  
validados adecuadamente, en función de las exigencias normativas, utili ­
zando una estrategia de ensayo secuencial en un enfoque de ponderación de 
los datos. Por otra parte, la actual base de datos de validación no permite 
una evaluación adecuada de algunas clases de sustancias o productos (por ejemplo, mezclas). Sin embargo, los investigadores pueden considerar la posibilidad de utilizar este método de ensayo con todos los tipos de material 
problema (incluidas las mezclas), con lo cual un resultado positivo podría 
aceptarse como indicación de una respuesta corrosiva o irritante intensa para los ojos. Sin embargo, los resultados positivos obtenidos con alcoholes o cetonas deben interpretarse con precaución, debido al riesgo de sobrepre ­
dicción. 
7. Todos los procedimientos con ojos de bovino y córneas de bovino deben 
ajustarse a las normas y procedimientos aplicables de la instalación de 
ensayo en relación con la manipulación de materiales derivados de anima ­
les, entre los que figuran los tejidos o los líquidos intersticiales. Se reco ­
mienda observar las precauciones universales de laboratorio (12). 
8. Una de las limitaciones del método de ensayo consiste en que, a pesar de 
que tiene en cuenta algunos de los efectos oculares evaluados con el método 
de ensayo de la capacidad de irritación ocular en el conejo y, hasta cierto 
punto, su gravedad, no atiende a las lesiones de la conjuntiva ni del iris. Asimismo, aunque la reversibilidad de las lesiones de la córnea no puede evaluarse  per se  en el ensayo BCOP, se ha propuesto, sobre la base de los 
estudios en ojo de conejo, que la evaluación de la profundidad inicial de la 
lesión de la córnea puede utilizarse para distinguir entre efectos reversibles e irreversibles (13). Finalmente, el BCOP no permite la evaluación del potencial de toxicidad sistémica asociado con la exposición ocular. 
9. Se está trabajando actualmente para seguir caracterizando la utilidad y las 
limitaciones del ensayo BCOP para detectar los agentes irritantes no inten ­
sos y los agentes no irritantes (véase también el punto 45). También se anima a los usuarios a presentar muestras o datos a las organizaciones de validación para una evaluación oficial de posibles usos futuros del método 
de ensayo BCOP, incluida la detección de agentes irritantes no intensos y 
agentes no irritantes. 
10. Cuando algún laboratorio establezca inicialmente este ensayo, deben utili ­
zarse las sustancias para demostrar la aptitud que se indican en el apéndice 2. Los laboratorios pueden utilizar estas sustancias para demostrar su com ­
petencia técnica en la realización del método de ensayo BCOP antes de 
presentar, con fines de clasificación normativa de peligros, los datos obte ­
nidos con este ensayo.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
11. El método de ensayo BCOP es un modelo organotípico con mantenimiento 
a corto plazo del funcionamiento fisiológico y bioquímico normal de la córnea de bovino  in vitro . En este método de ensayo, la lesión provocada 
por la sustancia problema se evalúa mediante la medición cuantitativa de los 
cambios producidos en la opacidad y en la permeabilidad de la córnea, 
utilizando un opacímetro y un espectrofotómetro de luz visible, respectiva ­
mente. Las dos mediciones se combinan para calcular la IVIS, que se utiliza para asignar una categoría de clasificación de peligro por irritación  in vitro  
a fin de predecir el potencial de irritación ocular  in vivo  de una sustancia 
problema (véanse los criterios de decisión).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. El método de ensayo BCOP utiliza córneas aisladas de ojos de ganado 
bovino recién sacrificado. La opacidad de la córnea se mide cuantitativa ­
mente como cantidad de luz transmitida a través de la córnea. La permea ­
bilidad se mide cuantitativamente como cantidad del pigmento fluoresceína sódica que atraviesa todo el espesor de la córnea y se detecta así en el 
medio que se encuentra en la cámara posterior. Las sustancias problema se 
aplican a la superficie epitelial de la córnea poniéndolas en la cámara anterior del soporte de córnea. En el apéndice 3 se ofrece una descripción y un diagrama de un soporte de córnea utilizado en el BCOP. Los soportes 
de córnea pueden obtenerse de diferentes fuentes comerciales o bien cons ­
truirse en el propio laboratorio.
 
Fuente y edad de los ojos de bovino y selección de la especie animal  
13. El ganado bovino enviado a los mataderos se sacrifica normalmente para 
el consumo humano o con otros fines comerciales. Como fuente de 
córneas para el BCOP se utilizan solo animales sanos que se consideren 
adecuados para entrar en la cadena alimentaria humana. Debido a que el ganado bovino presenta una amplia variedad de peso, en función de la raza, edad y sexo, no se recomienda ningún peso concreto del animal en 
el momento del sacrificio. 
14. Puede variar el tamaño de la córnea cuando se utilizan ojos de animales de 
distintas edades. Las córneas con un diámetro horizontal > 30,5 mm y un espesor central de la córnea (ECC) ≥ 1 100 μm suelen obtenerse de anima ­
les de más de ocho años, mientras que las córneas con un diámetro hori ­
zontal < 28,5 mm y un ECC < 900 μm suelen proceder de animales de 
menos de cinco años (14). Por este motivo, no suelen utilizarse ojos de animales de más de sesenta meses de edad. Tradicionalmente no se utilizan 
tampoco ojos de animales de menos de doce meses, ya que estos ojos están 
aún en fase de desarrollo y el espesor y el diámetro de su córnea son considerablemente más pequeños que los observados en ojos de bovinos 
adultos. Sin embargo, es admisible el uso de córneas de animales jóvenes 
(es decir, de entre seis y doce meses de edad) porque presentan ciertas ventajas, como una mayor disponibilidad, una variabilidad pequeña en cuanto a la edad, y un peligro reducido en cuanto a la posible exposición 
de los trabajadores a la encefalopatía espongiforme bovina (15). Como 
puede ser útil una evaluación más completa del efecto del tamaño o del espesor de la córnea sobre la sensibilidad ante sustancias corrosivas e irritantes, se anima a los usuarios a informar sobre la edad o el peso 
estimados de los animales de los que proceden las córneas utilizadas en 
un estudio.
 
Recogida y transporte de los ojos al laboratorio  
15. Los ojos son recogidos por los empleados del matadero. Para minimizar las 
lesiones mecánicas o de otro tipo que pueden sufrir los ojos, estos deben 
enuclearse lo antes posible tras la muerte. A fin de evitar la exposición de 
los ojos a sustancias potencialmente irritantes, los empleados del matadero no deben utilizar detergentes cuando laven la cabeza del animal. 
16. Los ojos deben sumergirse completamente en solución salina equilibrada de 
Hank (conocida por sus siglas en inglés, HBSS) en un recipiente de tamaño 
adecuado, y transportarse al laboratorio de manera que se reduzcan al mínimo su deterioro y su contaminación bacteriana. Como los ojos se recogen durante el proceso de sacrificio, pueden estar expuestos a la sangre 
y a otras sustancias biológicas, además de bacterias y otros microorganis ­
mos. Por tanto, es importante garantizar que se reduce al mínimo el riesgo de contaminación (por ejemplo, manteniendo en hielo el recipiente con los ojos o añadiendo antibióticos a la HBSS utilizada para conservar los ojos 
durante el transporte [por ejemplo, 100 UI/mL de penicilina y 100 g/mL de 
estreptomicina]).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la recogida de los 
ojos y la utilización de las córneas en el BCOP (lo normal es efectuar todo 
el proceso en un solo día), y hay que demostrar que ese tiempo no altera los resultados del ensayo. Estos resultados se basan en los criterios de selección de los ojos, así como en las respuestas obtenidas con controles positivos y 
negativos. Todos los ojos utilizados en el ensayo deben proceder del mismo 
grupo de ojos recogidos un día concreto.
 
Criterios de selección de los ojos utilizados en el BCOP  
18. Tras su llegada al laboratorio, los ojos se someten a un atento examen para 
detectar posibles defectos, como un aumento de la opacidad, arañazos o neovascularización. Solo deben utilizarse las córneas de ojos que no pre ­
senten estos defectos. 
19. La calidad de cada córnea se evalúa también en otras fases posteriores del 
ensayo. Se deben rechazar las córneas que, tras un periodo inicial de esta ­
bilización de una hora, tengan una opacidad de más de siete unidades de opacidad (nota: el opacímetro debe calibrarse con los patrones de opacidad 
utilizados para establecer las unidades de opacidad; véase el apéndice 3). 
20. Cada grupo de tratamiento (sustancia problema, controles negativos y positi ­
vos simultáneos) consiste en un mínimo de tres ojos. Para el control negativo en el ensayo BCPO deben utilizarse tres córneas. Puesto que todas las córneas se extraen del globo entero y se montan en las cámaras de córnea, existe la 
posibilidad de que haya artefactos procedentes de la manipulación que influ ­
yan en los distintos valores de opacidad y permeabilidad de la córnea (incluido el control negativo). Por otra parte, los valores de opacidad y permeabilidad de las córneas de control negativo se utilizan para corregir los valores de opacidad 
y permeabilidad de las córneas tratadas con la muestra problema y con los 
controles positivos a efectos del cálculo de la IVIS.
 
PROCEDIMIENTO  
Preparación de los ojos  
21. Se disecan córneas libres de defectos, a las que les queda un borde de 2 o 
3 mm de esclerótica para facilitar la manipulación posterior, atendiendo a 
no lesionar el epitelio ni el endotelio de la córnea. Las córneas aisladas se 
montan en soportes de córnea, diseñados especialmente, que consisten en un compartimento anterior y otro posterior, en contacto respectivamente con el lado epitelial y el lado endotelial de la córnea. Ambas cámaras se llenan 
hasta rebosar con medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) precalentado, 
empezando por la cámara posterior y evitando la formación de burbujas. El dispositivo se estabiliza después a 32 ± 1 °C durante al menos una hora para que las córneas alcancen un estado de equilibrio con el medio y 
consigan una actividad metabólica normal, dentro de lo posible (la tempe ­
ratura aproximada de la superficie de la córnea  in vivo  es de 32 °C). 
22. Tras el periodo de estabilización, se añade a ambas cámaras nuevo EMEM 
precalentado y se toman lecturas de la opacidad de base de cada córnea. Deben desecharse las córneas que muestren lesiones tisulares macroscópicas 
(por ejemplo, arañazos, pigmentación, neovascularización) o una opacidad 
de más de siete unidades de opacidad. Se calcula la opacidad media de todas las córneas estabilizadas. Se seleccionan como control negativo (o de disolvente) al menos tres córneas con valores de opacidad próximos al valor 
medio de todas las córneas. El resto de las córneas se distribuye después en 
grupos de tratamiento y de control positivo.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Como la capacidad térmica del agua es superior a la del aire, el agua ofrece 
condiciones de temperatura más estables para la incubación. Por tanto, se 
recomienda utilizar un baño de agua para mantener los soportes de córnea y su contenido a 32 ± 1 °C. Sin embargo, también pueden utilizarse incuba ­
doras de aire, si se toman precauciones para mantener la estabilidad de la 
temperatura (por ejemplo, precalentando los soportes y los medios).
 
Aplicación de la sustancia problema  
24. Se utilizan dos protocolos de tratamiento diferentes, uno para líquidos y 
agentes tensioactivos (sólidos o líquidos) y otro para sólidos que no son agentes tensioactivos. 
25. Los líquidos se someten a ensayo sin diluir, mientras que los agentes 
tensioactivos se llevan antes a una concentración del 10 % p/v en solución de cloruro sódico al 0,9 %, agua destilada u otro disolvente del que se haya demostrado que no posee efectos negativos sobre el sistema de ensayo. Los 
semisólidos, cremas y ceras se someten a ensayo en principio como líqui ­
dos. Debe justificarse adecuadamente si se utilizan otras concentraciones de dilución. Las córneas se exponen a los líquidos y agentes tensioactivos durante 10 minutos. La utilización de otros tiempos de exposición exige 
una explicación científica adecuada. 
26. Los sólidos que no son agentes tensioactivos se someten a ensayo en 
principio como soluciones o suspensiones a una concentración del 20 % en solución de cloruro sódico al 0,9 %, agua destilada u otro disolvente del que se haya demostrado que no posee efectos negativos sobre el sistema de 
ensayo. En ciertas circunstancias y con una justificación científica adecuada, 
es posible someter a ensayo los sólidos sin diluir mediante aplicación directa sobre la superficie de la córnea, utilizando el método de cámara 
abierta (véase el punto 29). Las córneas se exponen a los sólidos durante 
cuatro horas, pero, como sucede con los líquidos y agentes tensioactivos, es posible utilizar otros tiempos de exposición si se cuenta con una explicación científica adecuada. 
27. Pueden utilizarse distintos métodos de tratamiento, en función de la natu ­
raleza física y de las características químicas de la sustancia problema (por 
ejemplo, sólidos, líquidos, líquidos viscosos frente a líquidos no viscosos). El factor crítico consiste en velar por que la sustancia problema cubra adecuadamente la superficie epitelial y se elimine adecuadamente durante 
las fases de lavado. Suele utilizarse un método de cámara cerrada cuando se 
estudian sustancias problema líquidas desde no viscosas hasta ligeramente viscosas, mientras que se usa en principio un método de cámara abierta con 
sustancias problema líquidas viscosas y semiviscosas, así como con sólidos 
sin diluir. 
28. En el método de cámara cerrada, se introduce en la cámara anterior (a través de 
los orificios de administración que se encuentran en la superficie superior de la cámara) una cantidad suficiente de sustancia problema (750 μL) para cubrir la 
cara epitelial de la córnea, y los agujeros se tapan a continuación con los 
tapones de la cámara durante la exposición. Es importante que cada córnea quede expuesta a una sustancia problema durante el periodo adecuado. 
29. En el método de cámara abierta, antes del tratamiento se retiran el anillo de 
cierre de la ventana y la ventana de cristal de la cámara anterior. La 
sustancia problema o de control (750 μL, o una cantidad suficiente de 
sustancia problema para cubrir completamente la córnea) se aplica directa ­
mente sobre la superficie epitelial de la córnea utilizando una micropipeta. 
Si una sustancia problema resulta difícil de pipetear, puede introducirse a 
presión en una pipeta del tipo de desplazamiento positivo para facilitar su aplicación. La punta de pipeta de la pipeta de desplazamiento positivo se inserta en la punta de dispensación de la jeringa, de forma que el material 
pueda cargarse en la punta de desplazamiento bajo presión. Simultáneamen ­
te, se oprime el émbolo de la jeringa mientras se arrastra hacia arriba el pistón de la pipeta. Si aparece alguna burbuja de aire en la punta de la pipeta, se retira (se expulsa) el producto problema y se repite el proceso 
hasta que la punta se quede llena sin ninguna burbuja de aire. En caso 
necesario, puede utilizarse una jeringa normal (sin aguja), ya que permite medir un volumen exacto de sustancia problema y facilita su aplicación sobre la superficie epitelial de la córnea. Tras la aplicación de la sustancia, 
se vuelve a colocar la ventana de cristal de la cámara anterior para crear de 
nuevo un sistema cerrado.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Incubación tras la exposición  
30. Tras el periodo de exposición, la sustancia problema, el control negativo o 
la sustancia de control positivo se retiran de la cámara anterior y se lava el 
epitelio al menos tres veces (o hasta que no quede ningún rastro visible de la sustancia problema) utilizando EMEM con rojo de fenol. Se utiliza para el lavado el medio con rojo de fenol porque observando el cambio de color 
de esta sustancia puede determinarse la efectividad del lavado de materias 
ácidas o alcalinas. Las córneas se lavan más de tres veces si el rojo de fenol sigue sin colorearse (amarillo o púrpura) o sigue viéndose la sustancia problema. Una vez el medio ha quedado libre de sustancia problema, se 
lavan las córneas una última vez con EMEM sin rojo de fenol. Se utiliza 
EMEM sin rojo de fenol en el lavado final para eliminar el rojo de fenol de la cámara anterior antes de medir la opacidad. La cámara anterior vuelve a llenarse a continuación con EMEM nuevo sin rojo de fenol. 
31. En el caso de líquidos o agentes tensioactivos, las córneas, una vez lavadas, 
se incuban otras dos horas a 32 ± 1 °C. En ciertas circunstancias puede ser útil prolongar este tiempo tras la exposición, extremo que debe estudiarse 
en cada caso. Las córneas tratadas con sólidos se lavan a fondo al final del 
periodo de exposición de cuatro horas, pero no es necesario prolongar su incubación. 
32. Al final del periodo de incubación tras la exposición en el caso de líquidos 
y agentes tensioactivos y al final del periodo de exposición de cuatro horas en el caso de sólidos que no son agentes tensioactivos, se registran la opacidad y la permeabilidad de cada córnea. Asimismo, se observa visual ­
mente cada córnea y se registran las observaciones pertinentes (por ejemplo, 
abrasión tisular, sustancia problema residual, opacidad no uniforme). Estas observaciones pueden ser importantes ya que pueden reflejarse en variacio ­
nes de las lecturas del opacímetro.
 
Sustancias de control  
33. En cada experimento se incluyen controles simultáneos negativos (o del 
disolvente/vehículo) y positivos. 
34. Cuando se somete a ensayo una sustancia líquida al 100 %, se incluye en el 
método de ensayo BCOP un control negativo simultáneo (por ejemplo, solución de cloruro sódico al 0,9 % o agua destilada), de forma que puedan 
detectarse los eventuales cambios inespecíficos del sistema de ensayo y se 
disponga de una base de referencia para los parámetros del ensayo. Tam ­
bién permite evitar que las condiciones del ensayo provoquen de forma inadecuada una respuesta de irritación. 
35. Cuando se somete a ensayo una sustancia líquida diluida, un agente ten ­
sioactivo o un sólido, se incluye en el método de ensayo BCOP un grupo de control simultáneo del disolvente/vehículo, de forma que puedan detec ­
tarse los eventuales cambios inespecíficos del sistema de ensayo y se dis ­
ponga de una base de referencia para los parámetros del ensayo. Solo pueden utilizarse disolventes/vehículos de los que se haya demostrado que carecen de efectos adversos sobre el sistema de ensayo. 
36. Se incluye como control positivo simultáneo en cada experimento un agente 
irritante ocular conocido, a fin de verificar que se provoca una respuesta adecuada. Como en el presente método se utiliza el ensayo BCOP para 
identificar agentes corrosivos o irritantes intensos, lo mejor es que el control 
positivo sea una sustancia de referencia que induzca una respuesta intensa con este método de ensayo. Sin embargo, para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del control positivo a lo largo del 
tiempo, no debe ser excesiva la magnitud de la respuesta de irritación. 
37. Pueden citarse como ejemplos de controles positivos en caso de sustancias 
problema líquidas la dimetilformamida o el hidróxido sódico al 1 %. Como 
ejemplo de control positivo en caso de sustancias problema sólidas está el 
imidazol al 20 % (peso/volumen) en solución de cloruro sódico al 0,9 %.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Es útil disponer de sustancias de referencia para evaluar el potencial de 
irritación ocular de sustancias desconocidas dentro de una clase específica 
de sustancias o productos, o para evaluar la capacidad de irritación relativa de un agente irritante ocular dentro de una gama específica de respuestas de irritación.
 
Parámetros medidos  
39. La opacidad se determina mediante la cantidad de luz transmitida a través 
de la córnea. La opacidad de la córnea se mide cuantitativamente con ayuda 
de un opacímetro, que permite medir los valores de opacidad en una escala continua. 
40. La permeabilidad se determina por la cantidad de pigmento fluoresceína 
sódica que penetra en todas las capas de células de la córnea (es decir, 
desde el epitelio de la superficie exterior de la córnea hasta el endotelio de 
su superficie interior). Se añade a la cámara anterior del soporte de córnea 1 mL de solución de fluoresceína sódica (4 o 5 mg/mL cuando se estudian líquidos y agentes tensioactivos o sólidos no tensioactivos, respectivamen ­
te), en contacto con el lado epitelial de la córnea, mientras que la cámara 
posterior, en contacto con el lado endotelial de la córnea, se llena con EMEM nuevo. El soporte se incuba a continuación en posición horizontal durante 90 ± 5 min a 32 ± 1 °C. La cantidad de fluoresceína sódica que 
atraviesa la córnea hasta la cámara posterior se mide cuantitativamente 
mediante espectrofotometría UV/VIS. Las mediciones espectrofotométricas evaluadas a 490 nm se registran como valores de absorbancia o densidad óptica (DO
 490 ), medidos en una escala continua. Los valores de permeabi ­
lidad a la fluoresceína se determinan utilizando los valores de DO  490 con­
seguidos mediante un espectrofotómetro de luz visible con un camino óp ­
tico normal de 1 cm. 
41. También puede utilizarse un lector de placa de microvaloración de 96 
pocillos siempre que: a) pueda establecerse la banda de linealidad del lector 
de placas para determinar los valores de DO  490 de fluoresceína; y b) se 
utilice el volumen correcto de muestras de fluoresceína en la placa de 96 pocillos para obtener unos valores de DO
 490 equivalentes a los conseguidos 
con un camino óptico normal de 1 cm (esto puede exigir que los pocillos 
estén completamente llenos [generalmente, 360 μL]). 
DATOS E INFORME  
Evaluación de los datos  
42. Una vez corregidos los valores de opacidad y de permeabilidad media 
(DO  490 ) para tener en cuenta los valores de opacidad de fondo y de per ­
meabilidad (DO  490 ) del control negativo, los valores medios de opacidad y 
permeabilidad (DO  490 ) se combinan en una fórmula empírica para calcular 
la puntuación de la capacidad de irritación  in vitro  (IVIS) de cada grupo de 
tratamiento, de la manera siguiente: 
IVIS = valor medio de opacidad + (15 × valor medio de permeabilidad 
[DO  490 ]) 
Sina et al.  (16) comunican que esta fórmula se ha obtenido mediante 
estudios internos e interlaboratorios. Los datos obtenidos con una serie de 
36 compuestos en un estudio interlaboratorios se sometieron a análisis con 
múltiples variables para determinar la ecuación que se ajustara mejor a los datos in vivo e in vitro. Este análisis fue efectuado por científicos de dos empresas diferentes, que propusieron ecuaciones casi idénticas. 
43. Los valores de opacidad y permeabilidad deben evaluarse también indepen ­
dientemente para determinar si una sustancia problema ha inducido corro ­
sividad o irritación intensa mediante solo uno de los dos parámetros (véase 
la parte siguiente, sobre criterios de decisión).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Criterios de decisión  
44. Las sustancias que induzcan una IVIS ≥ 55,1 se definen como corrosivas o 
irritantes intensas. Como se indica en el punto 1, si la sustancia problema 
no se identifica como corrosiva o irritante intensa para los ojos, deben realizarse otras pruebas con fines de clasificación y etiquetado. El método de ensayo BCOP tiene una exactitud general del 79 % (113/143) al 81 % 
(119/147), una tasa de falsos positivos del 19 % (20/103) al 21 % (22/103), 
y una tasa de falsos negativos del 16 % (7/43) al 25 % (10/40), en relación con los datos obtenidos mediante el método de ensayo de ojos de conejo  in 
vivo, clasificados según los sistemas de clasificación de la EPA (1), UE (2), 
o SGA (3). Si se excluyen de la base de datos las sustancias de ciertas 
clases químicas (es decir, alcoholes y cetonas) o físicas (es decir, sólidos), la exactitud del método BCOP en el conjunto de los sistemas de clasifica ­
ción de la UE, EPA y SGA varía del 87 % (72/83) al 92 % (78/85), las 
tasas de falsos positivos van del 12 % (7/58) al 16 % (9/56), y las tasas de 
falsos negativos van del 0 % (0/27) al 12 % (3/26). 
45. Incluso aunque una sustancia problema no se clasifique como corrosiva o 
irritante intensa para los ojos, los datos del BCOP pueden ser útiles, junto con los datos del ensayo  in vivo  con ojos de conejo o de otro ensayo  in 
vitro  validado adecuadamente, para seguir evaluando la utilidad y las limi ­
taciones del método de ensayo BCOP a efectos de la detección de agentes irritantes no intensos y agentes no irritantes (se está elaborando un docu ­
mento de orientación sobre el uso de métodos de ensayo  in vitro  de la 
toxicidad ocular).
 
Criterios de aceptación del estudio  
46. Se considera que un ensayo es aceptable si el control positivo da una IVIS 
comprendida en el intervalo de dos desviaciones típicas respecto a la media histórica del momento, que debe actualizarse al menos cada tres meses, o cada vez que se efectúe un ensayo aceptable en caso de laboratorios en los 
que no sea frecuente efectuar estos ensayos (es decir, con una frecuencia 
que no llegue a mensual). Las respuestas de los controles negativos o del disolvente/vehículo deben llevar a unos valores de opacidad y permeabili ­
dad inferiores a los límites superiores establecidos para los valores de 
opacidad y permeabilidad de fondo de las córneas de bovino tratadas con 
el respectivo control negativo o del disolvente/vehículo.
 
Informe del ensayo  
47. El informe del ensayo debe incluir la siguiente información, en caso de que 
corresponda a la realización del estudio:  
Sustancias problema y de control  
Denominación o denominaciones químicas, como la denominación estruc ­
tural utilizada por el Chemical Abstracts Service (CAS), seguida por otras 
denominaciones, si se conocen; 
El número de registro CAS, si se conoce; 
La pureza y la composición de la sustancia o mezcla (en porcentajes en 
peso), en la medida en que se disponga de esta información; 
Propiedades físico-químicas pertinentes para la realización del estudio, 
como estado físico, volatilidad, pH, estabilidad, clase química o hidrosolu ­
bilidad; 
Tratamiento de las sustancias problema y de control antes del ensayo, en su 
caso (p. ej., calentamiento, trituración); 
Estabilidad, si se conoce.  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Información referente al promotor y al laboratorio  
Nombre y dirección del promotor, laboratorio y director del estudio; 
Identificación de la fuente de los ojos (es decir, instalación en la que se han 
recogido); 
Condiciones de almacenamiento y transporte de los ojos (por ejemplo, fecha y 
hora de recogida de los ojos, plazo transcurrido hasta el inicio del ensayo, medios 
de transporte y condiciones de temperatura, uso eventual de antibióticos); 
Características específicas de los animales de los que se han extraído los ojos 
(por ejemplo, edad, sexo, peso del animal), si se dispone de estos datos.  
Justificación del método de ensayo y del protocolo utilizados  
Integridad del método de ensayo  
Procedimiento utilizado para garantizar la integridad (es decir, la exactitud y la 
fiabilidad) del método de ensayo a lo largo del tiempo (por ejemplo, ensayo periódico de sustancias utilizadas para demostrar la aptitud, utilización de datos 
anteriores de controles negativos y positivos).
 
Criterios de aceptabilidad del ensayo  
Bandas aceptables de controles positivos y negativos simultáneos según los datos 
anteriores; 
Cuando corresponda, bandas aceptables de controles de referencias simultáneos 
según los datos anteriores.  
Condiciones del ensayo  
Descripción del sistema de ensayo utilizado; 
Tipo de soporte de córnea utilizado; 
Información sobre la calibración de los dispositivos utilizados para medir la 
opacidad y la permeabilidad (por ejemplo, opacímetro y espectrofotómetro); 
Información sobre las córneas de bovino utilizadas, incluidas declaraciones sobre 
su calidad; 
Particularidades del procedimiento de ensayo empleado; 
Concentraciones utilizadas de la sustancia problema; 
Descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento del ensayo; Referencia a datos anteriores del modelo (por ejemplo, controles negativos y 
positivos, sustancias utilizadas para demostrar la aptitud, sustancias de referen ­
cia); 
Descripción de los criterios de evaluación seguidos.
 
Resultados  
Presentación en forma de cuadro de los datos correspondientes a las distintas 
muestras problema (por ejemplo, valores de opacidad y DO  490 e IVIS calculada 
para la sustancia problema y los controles positivos, negativos y de referencia [si se utilizan], incluidos los datos procedentes de los experimentos repetidos en paralelo cuando corresponda, y las medias ± la desviación típica de cada expe ­
rimento); 
Descripción de otros efectos observados.
 
Discusión de los resultados  
Conclusión  
BIBLIOGRAFÍA 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. 
Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Reglamento (CE) n  o 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de 
sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) n
 o 1907/2006. 
DO L 353 de 31.12.2008, p. 1. 
(3) Naciones Unidas (2007). Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación 
y Etiquetado de Productos Químicos (SGA), segunda edición revisada, Naciones Unidas, Nueva York y Ginebra, 2007. Disponible en la dirección: 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_s.html] 
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective 
study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify potential 
ocular corrosives and severe eye irritants. Disponible en la dirección: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm] 
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular Toxi ­
city Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Intera ­
gency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponible en la 
dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(6) Reglamento (CE) n
 o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Preparados Químicos, se 
modifica la Directiva 1999/45/CE y se derogan el Reglamento (CEE) 
n
 o 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) n  o 1488/94 de la Comisión, 
así como la Directiva 76/769/CEE del Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la Comisión. DO 
L 396 de 30.12.2006, p. 1. 
(7) OCDE (2002). Directrices de ensayo TG 405. OECD Guidelines for Testing 
of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Disponible en la dirección: 
[http://www.oecd.org/document/40/ 
0,2340,en_2649_34377_37051368_ 1_1_1_1,00.html] 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. 
In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular Toxicity 
Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Inte ­
ragency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Intera ­
gency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponible en la 
dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Identifying 
Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Per ­
meability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponible en la dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm] 
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability 
Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italia: European 
Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal 
opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular irritancy.  Fundam. 
Appl. Toxicol.  18:442-449. 
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare 
Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Iso ­
lation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Health ­
care Settings. Disponible en la dirección: 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf]. 
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury 
as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommen ­
dations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. Pharmacol.  
36:106-117. 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morp ­
hology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  Can. J. Zool.  
73:2159-2165. 
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 
349: 636-641. 
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., 
Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative 
evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using phar ­
maceutical intermediates.  Fundam Appl Toxicol  26:20-31. 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro 
Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine 
Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Disponible en la 
dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm] 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro 
Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isola ­
ted Chicken Eye (ICE) Test Method. Disponible en la dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES  
Exactitud:  Grado de concordancia entre los resultados obtenidos con el método 
de ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del 
comportamiento del método de ensayo y es un aspecto de su «pertinencia». Este término y el de «concordancia» se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo.  
Sustancias de referencia:  Sustancias utilizadas como patrón para comparar con 
una sustancia problema. Las sustancias de referencia deben presentar las siguien ­
tes propiedades: a) una fuente coherente y fiable; b) similitud estructural y funcional con la clase de las sustancias problema; c) características físicas y químicas conocidas; d) datos de apoyo sobre los efectos conocidos, y e) potencia 
conocida en la banda de la respuesta deseada.  
Córnea:  Parte transparente delantera del globo ocular que cubre el iris y la 
pupila y permite el paso de la luz al interior.  
Opacidad de la córnea:  Medición del grado de opacidad de la córnea tras su 
exposición a una sustancia problema. Un aumento de la opacidad de la córnea 
indica que esta ha sufrido una lesión. La opacidad puede evaluarse subjetiva ­
mente, como se hace en el ensayo con ojo de conejo de Draize, u objetivamente con un instrumento como un «opacímetro».  
Permeabilidad de la córnea:  Medición cuantitativa de la lesión del epitelio 
corneal mediante determinación de la cantidad del pigmento fluoresceína sódica 
que pasa a través de todas las capas de células corneales.  
Categoría 1 de la EPA:  Corrosión (destrucción irreversible del tejido ocular) o 
afectación o irritación de la córnea, persistente durante más de 21 días (1).  
Categoría R41 de la UE:  Producción de una lesión de los tejidos oculares o un 
deterioro físico importante de la visión, como consecuencia de la aplicación de una sustancia problema a la superficie anterior del ojo, y que no es totalmente 
reversible en los 21 días siguientes a la aplicación (2).  
Tasa de falsos negativos:  Proporción de todas las sustancias positivas identifi ­
cadas erróneamente como negativas por un método de ensayo. Es uno de los indicadores del comportamiento del método de ensayo.  
Tasa de falsos positivos:  Proporción de todas las sustancias negativas identifi ­
cadas erróneamente como positivas por un método de ensayo. Es uno de los 
indicadores del comportamiento del método de ensayo.  
SGA (Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de 
Productos Químicos):  Sistema que propone la clasificación de sustancias quí ­
micas y sus mezclas según tipos y niveles normalizados de peligros físicos, 
sanitarios y ambientales, y que hace referencia a los elementos correspondientes 
de comunicación, como pictogramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a 
la población (incluidos empresarios, trabajadores, transportistas, consumidores y 
personal de respuesta a emergencias) y al medio ambiente (3).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
Categoría 1 del SGA:  Producción de una lesión de los tejidos oculares o 
una degradación física severa de la vista, como consecuencia de la aplicación 
de una sustancia problema en la superficie anterior del ojo, y que no es total ­
mente reversible en los 21 días siguientes a la aplicación (3).  
Peligro:  Propiedad inherente de un agente o situación que tiene capacidad para 
provocar efectos adversos cuando un organismo, sistema o (sub)población se 
expone a dicho agente.  
Puntuación de la capacidad de irritación  in vitro  (In Vitro  Irritancy Score, 
IVIS):  Fórmula empírica utilizada en el ensayo BCOP mediante la cual se 
combinan en una sola puntuación  in vitro  los valores medios de opacidad y de 
permeabilidad de cada grupo de tratamiento. IVIS = valor medio de opacidad + (15 x valor medio de permeabilidad).  
Control negativo:  Muestra paralela no tratada que contiene todos los compo ­
nentes de un sistema de ensayo. Esta muestra se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con sustancia problema y otras muestras de control para 
determinar si el disolvente interactúa con el sistema de ensayo.  
Sustancias no irritantes:  Sustancias no clasificadas como irritantes oculares en 
las categorías I, II, o III de la EPA, en la categoría R41 o R36 de la UE, ni en las 
categorías 1, 2A o 2B del SGA.  
Sustancias corrosivas oculares:  a) Sustancias que provocan una lesión irreversible 
de los tejidos oculares; b) sustancias clasificadas como irritantes oculares de la 
categoría 1 del SGA, categoría I de la EPA, o categoría R41 de la UE (1) (2) (3).  
Sustancias irritantes oculares:  a) Sustancias que producen un cambio reversible 
en el ojo como consecuencia de su aplicación a la superficie anterior de este; b) 
sustancias clasificadas como irritantes oculares de la categoría II o III de la EPA, 
categoría R36 de la UE, o en las categorías 2A o 2B del SGA (1) (2) (3).  
Sustancias irritantes intensas oculares:  a) Sustancias que provocan lesiones de 
los tejidos oculares como consecuencia de su aplicación a la superficie anterior 
del ojo, y que no se resuelven en los 21 días siguientes a la aplicación, o una degradación física severa de la visión; b) sustancias clasificadas como irri ­
tantes oculares de la categoría 1 del SGA, categoría I de la EPA, o categoría R41 
de la UE (1) (2) (3).  
Opacímetro:  Instrumento utilizado para medir la opacidad de la córnea eva ­
luando cuantitativamente la transmisión de la luz a través de esta. El instrumento clásico tiene dos compartimentos, cada uno provisto de su propia fuente de luz y 
una célula fotoeléctrica. Un compartimento se utiliza para la córnea tratada, y el 
otro para calibrar y poner a cero el instrumento. Se envía la luz de una lámpara halógena a una célula fotoeléctrica a través de un compartimento de control 
(cámara vacía sin ventanas ni líquido) y se compara con la luz enviada a una 
célula fotoeléctrica a través del compartimento experimental, que alberga a la cámara que contiene la córnea. Se compara la diferencia en la transmisión lumi ­
nosa a partir de las células fotoeléctricas y se presenta un valor numérico de 
opacidad en un indicador digital.  
Control positivo:  Muestra paralela que contiene todos los componentes de un 
sistema de ensayo y que se trata con una sustancia de la que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de 
las respuestas del control positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la 
intensidad de la respuesta.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Fiabilidad:  Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de 
forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio o en distintos 
laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproduci ­
bilidad intra e interlaboratorios y la repetibilidad intralaboratorios.  
Control del disolvente/vehículo:  Muestra no tratada que contiene todos los 
componentes de un sistema de ensayo, incluido el disolvente o vehículo, y que se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con sustancia pro ­
blema y otras muestras de control, a fin de determinar la respuesta de base 
correspondiente a las muestras tratadas con la sustancia problema disuelta en el mismo disolvente o vehículo. Cuando se somete a ensayo con un control negativo simultáneo, esta muestra pone de manifiesto también si el disolvente 
o vehículo interactúa con el sistema de ensayo.  
Ensayo gradual:  Estrategia de ensayo por fases, en la que se revisa toda la 
información existente sobre una sustancia problema, siguiendo un orden especi ­
ficado, en un proceso de ponderación de los datos en cada fase, a fin de deter ­
minar si se dispone de información suficiente para tomar una decisión sobre la 
clasificación de un peligro, antes de pasar a la fase siguiente. Si puede estable ­
cerse la capacidad de irritación de una sustancia problema con la información disponible, no hace falta efectuar más ensayos. Si no puede establecerse la capacidad de irritación de una sustancia problema con la información disponible, 
se aplica un procedimiento secuencial de ensayos con animales por fases hasta 
que pueda efectuarse una clasificación inequívoca.  
Método de ensayo validado:  Método de ensayo sobre el cual se han completado 
estudios de validación para determinar su pertinencia (incluida su exactitud) y su fiabilidad con un fin específico. Es importante señalar que un método de ensayo 
validado puede tener un comportamiento insuficiente en términos de exactitud y 
fiabilidad como para considerarse aceptable a efectos del fin propuesto.  
Ponderación de los datos:  Proceso de consideración de los aspectos favorables y 
desfavorables de los distintos elementos de información a efectos de alcanzar y confirmar una conclusión en cuanto al peligro potencial de una sustancia.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 685
Apéndice 2  
Sustancias utilizadas para demostrar la aptitud del método de ensayo BCOP  
Antes de proceder al uso sistemático de un método de ensayo que se ajuste al 
presente método de ensayo, es posible que los laboratorios deseen demostrar su 
aptitud técnica, identificando correctamente la clasificación de las diez sustancias recomendadas del cuadro 1 en cuanto a su corrosividad ocular. Estas sustancias se han seleccionado para representar la gama de respuestas de irritación/corrosión 
ocular local, sobre la base de los resultados conseguidos en el ensayo con ojo de 
conejo  in vivo  (TG 405) (es decir, categorías 1, 2A, 2B o no clasificada ni etiquetada 
según el SGA de la ONU (3) (7). Sin embargo, considerando la utilidad validada de estos ensayos (es decir, identificar solamente sustancias corrosivas/irritantes inten ­
sas oculares), solo hay dos resultados del ensayo a efectos de clasificación (sustan ­
cia corrosiva / irritante intensa o sustancia no corrosiva / no irritante intensa) para demostrar la aptitud del método. Otros criterios de selección son que las sustancias se encuentren en el mercado, que se disponga de datos de referencia  in vivo  de 
calidad, y que haya datos de calidad procedentes de los dos métodos  in vitro  para los 
que se están elaborando directrices de ensayo. Por este motivo, se han seleccionado sustancias irritantes de la lista recomendada por el ICCVAM de 122 sustancias de referencia para la validación de métodos de ensayo de la toxicidad ocular  in vitro  
(véase el apéndice H: Sustancias de referencia recomendadas por el ICCVAM) (5). 
Se encuentran datos de referencia en los documentos de revisión de fondo del ICCVAM para el método de ensayo BCOP y para el de ojo de pollo aislado (ICE) (17) (18).
 
Cuadro 1  
Sustancias recomendadas para demostrar la aptitud técnica con el BCOP  
Sustancia N  o CAS Clase química (  1 ) Estado físico Clasificación  in 
vivo ( 2 ) Clasificación  in vitro  ( 3 ) 
Cloruro de benzal ­
conio (5 %) 8001-54-5 Compuesto onio Líquido Categoría 1 Corrosivo/irritante intenso 
Clorhexidina 55-56-1 Amina, amidina Sólido Categoría 1 Corrosivo/irritante intenso 
Ácido 
dibenzoil-L-tartá ­
rico 2743-38-6 Ácido carboxíli ­
co, éster Sólido Categoría 1 Corrosivo/irritante intenso 
Imidazol 288-32-4 Heterociclo Sólido Categoría 1 Corrosivo/irritante intenso 
Ácido tricloroacé ­
tico (30 %) 76-03-9 Ácido carboxí ­
lico Líquido Categoría 1 Corrosivo/irritante intenso 
Cloruro de 2,6-di ­
clorobenzoílo 4659-45-4 Haluro de acilo Líquido Categoría 2A No corrosivo/no irritante 
intenso 
2-Metil-acetoace ­
tato de etilo 609-14-3 Cetona, éster Líquido Categoría 2B No corrosivo/no irritante 
intenso 
Nitrato de amonio 6484-52-2 Sal inorgánica Sólido Categoría 2A No corrosivo/no irritante 
intenso  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Sustancia N  o CAS Clase química (  1 ) Estado físico Clasificación  in 
vivo ( 2 ) Clasificación  in vitro  ( 3 ) 
Glicerol 56-81-5 Alcohol Líquido Noetiquetado No corrosivo/no irritante 
intenso 
n-Hexano 110-54-3 Hidrocarburo 
(acíclico) Líquido Noetiquetado No corrosivo/no irritante 
intenso  
Abreviaturas: N  o CAS: número de registro del Chemical Abstracts Service 
( 1 ) La clase química se ha asignado a cada sustancia problema utilizando un sistema de clasificación habitual, basado en el siste ma de 
clasificación de materias médicas de la National Library of Medicine (MeSH) (se puede encontrar en la dirección http//www.nlm. 
nih.gov/mesh). 
( 2 ) Sobre la base de los resultados obtenidos en el ensayo con ojos de conejo  in vivo  (TG 405 de la OCDE) y utilizando el SGA de la 
ONU (3) (7). 
( 3 ) Sobre la base de los resultados obtenidos con el método de ensayo BCOP y con el ICE.  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Apéndice 3  
SOPORTE DE CÓRNEA PARA EL MÉTODO BCOP 
1. Los soportes de córnea para el método BCOP se hacen de material inerte, como 
polipropileno. Los soportes están formados por dos mitades (una cámara anterior y una cámara posterior), y tienen dos cámaras internas cilíndricas similares. Cada cámara alberga un volumen de 5 mL y termina en una ventana de cristal, a través 
de la cual se efectúan las mediciones de la opacidad. Cada cámara interna tiene 
unas dimensiones de 1,7 cm de diám etro y 2,2 cm de profundidad (
 1 ). Para evitar 
fugas se utiliza una junta tórica situada en la cámara posterior. Las córneas se 
colocan, con el lado endotelial hacia abajo, sobre la junta tórica de las cámaras 
posteriores, y las cámaras anteriores se colocan sobre el lado epitelial de las 
córneas. Las cámaras se mantienen en su posición mediante tres tornillos inoxi ­
dables situados en los bordes externos de la cámara. El extremo de cada cámara 
tiene una ventana de cristal que puede retir arse para facilitar el acceso a la córnea. 
Para evitar fugas, se pone también una junta tórica entre la ventana de cristal y la 
cámara. En la parte superior de cada cámara hay dos agujeros que permiten introducir y retirar el medio y las sustancias problema. Se cierran con tapones de goma durante los periodos de tratamiento y de incubación.
 
Glosario  
Glass disc: Disco de cristal 
PTFE-O-ring: Junta tórica de PTFE Refill: Relleno Hanger: Asa Cap: Tapón Nut: Tuerca O-ring: Junta tórica Posterior compartment: Compartimento posterior Anterior compartment: Compartimento anterior Fixing screws: Tornillos de fijación
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Estas dimensiones corresponden al soporte de córnea utilizado para vacas de entre 12 y 
60 meses de edad. En caso de que se utilicen animales de entre 6 y 12 meses de edad, 
puede ser necesario diseñar el soporte de manera que cada cámara albergue un volumen 
de 4 mL, y cada una de las cámaras internas mida 1,5 cm de diámetro y 2,2 cm de 
profundidad. Es importante que en todos los soportes de córnea de nuevo diseño la 
proporción entre la superficie de córnea expuesta y el volumen de la cámara posterior 
sea la misma que en el soporte de córnea tradicional. Se trata de una condición necesaria 
para asegurar que los valores de permeabilidad se determinan correctamente a efectos del 
cálculo de la puntuación IVIS con la fórmula propuesta.
 OPACÍMETRO 
2. El opacímetro es un dispositivo que mide la transmisión luminosa. Se envía 
a una célula fotoeléctrica la luz de una lámpara halógena a través de un 
compartimento de control (cámara vacía sin ventanas ni líquido) y se compara con la luz enviada a una célula fotoeléctrica a través del compar ­
timento experimental, que alberga la cámara que contiene la córnea. Se 
compara la diferencia en la transmisión luminosa a partir de las células 
fotoeléctricas y se presenta un valor numérico de opacidad en un indicador digital. Se determina el número de unidades de opacidad. 
3. Las respuestas del opacímetro deben ser lineales a lo largo de una gama de 
lecturas de opacidad que incluya los valores de corte utilizados para las 
diferentes clasificaciones descritas por el modelo de predicción (es decir, 
hasta el valor de corte que determina la corrosividad / capacidad de irrita ­
ción intensa). Para garantizar que las lecturas son lineales y exactas hasta la zona de 75-80 unidades de opacidad, es necesario calibrar el opacímetro 
utilizando una serie de calibradores. Estos (que son unas hojas opacas de 
poliéster) se introducen en la cámara de calibración (cámara para córneas diseñada para contener los calibradores) y se toman las lecturas en el opacímetro. La cámara de calibración está designada para mantener los 
calibradores a la misma distancia aproximadamente entre la luz y la célula 
fotoeléctrica a la que se colocarían las córneas durante las mediciones de la opacidad. El opacímetro se calibra en primer lugar a cero unidades de opacidad utilizando la cámara de calibración sin ningún calibrador. A con ­
tinuación se ponen en esta cámara tres calibradores diferentes, uno a uno, y 
se miden las opacidades correspondientes. A los calibradores 1, 2 y 3 deben corresponderles unas lecturas de opacidad iguales a sus valores establecidos de 75, 150, y 225 unidades de opacidad, respectivamente, ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B. 48.  MÉTODO DE ENSAYO DE OJO DE POLLO AISLADO PARA 
DETECTAR AGENTES CORROSIVOS E IRRITANTES 
INTENSOS PARA LOS OJOS  
INTRODUCCIÓN 
1. El método de ensayo de ojo de pollo aislado ( Isolated Chicken Eye , ICE) es un 
procedimiento  in vitro  que puede utilizarse, en ciertas circunstancias y con 
limitaciones específicas, para clasificar sustancias y mezclas como agentes 
corrosivos e irritantes intensos para los ojos (1) (2) (3). A efectos de este método de ensayo, se entiende por «agentes irritantes intensos» aquellos que inducen lesiones oculares que persisten en el conejo durante al menos 21 días tras su 
administración. Aunque no se considera válido para sustituir completamente al 
ensayo  in vivo  en ojo de conejo, se recomienda utilizar el ICE como parte de 
una estrategia de ensayo gradual para la clasificación normativa y el etiquetado 
dentro de un ámbito específico de aplicabilidad (4) (5). Las sustancias y 
mezclas problema (6) que den resultado positivo en este ensayo pueden clasi ­
ficarse como agentes corrosivos o irritantes intensos sin necesidad de efectuar más pruebas con conejos. Las sustancias que den resultado negativo tendrían 
que someterse a ensayo con conejos siguiendo una estrategia de ensayo 
secuencial, como se describe en las Directrices de ensayo 405 de la OCDE (7) (método B.5 del presente anexo). 
2. El objetivo del presente método de ensayo es describir los procedimientos 
utilizados para evaluar la posible corrosividad o capacidad de irritación 
intensa para los ojos de una sustancia problema en función de su capacidad para causar toxicidad en un ojo enucleado de pollo. Los efectos tóxicos sobre la córnea se miden mediante a) una evaluación cualitativa de la opacidad, b) 
una evaluación cualitativa de las lesiones provocadas al epitelio sobre la base 
de una aplicación de fluoresceína en el ojo (retención de fluoresceína), c) una medición cuantitativa del aumento del espesor (inflamación), y d) una eva ­
luación cualitativa de las lesiones morfológicas macroscópicas de la super ­
ficie. Las evaluaciones de la opacidad, la inflamación y las lesiones de la 
córnea tras la exposición de esta a una sustancia problema se efectúan por separado y después se combinan para llegar a una clasificación de la capa ­
cidad de irritación ocular. 
3. También se han ensayado utilizando el método ICE agentes irritantes ocu ­
lares que provocan lesiones que desaparecen en menos de 21 días, así como agentes no irritantes. Sin embargo, no se han evaluado oficialmente la exac ­
titud ni la fiabilidad del método de ensayo ICE respecto a las sustancias de 
estas categorías. 
4. En el apéndice 1 se dan las definiciones pertinentes.
 
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
5. El presente método de ensayo se basa en el protocolo del método de ensayo 
ICE del Comité de Coordinación Interagencias sobre la Validación de Mé ­
todos Alternativos estadounidense (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) (8), elaborado siguiendo 
un estudio de validación internacional (4) (5) (9), con aportaciones del 
Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (European Cen ­
tre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM), del Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (Japanese Center for the Vali ­
dation of Alternative Methods, JaCVAM), y del Departamento de Toxicolo ­
gía y Farmacología Aplicada de Calidad de la Vida de TNO de los Países Bajos (TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Phar ­
macology). El protocolo se basa en la información obtenida a partir de 
protocolos publicados, así como del protocolo actualmente utilizado por 
TNO (10) (11) (12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. Las limitaciones que se han detectado en este método están relacionadas con 
la tasa de falsos resultados positivos de alcoholes y con las tasas de falsos 
resultados negativos de sólidos y sustancias tensioactivas (véase el punto 47) (4). Si se excluyen de la base de datos las sustancias de estas clases químicas y físicas, mejora sustancialmente la exactitud del ensayo ICE en los sistemas 
de clasificación de la UE, EPA y SGA (4). Teniendo en cuenta el objeto de 
este ensayo (es decir, tan solo identificar agentes corrosivos o irritantes intensos para los ojos), no importa que sean elevadas las tasas de falsos resultados negativos, ya que las sustancias correspondientes se someterían 
posteriormente a ensayo con conejos o a otros ensayos  in vitro  validados 
adecuadamente, en función de las exigencias normativas, utilizando una estrategia de ensayo secuencial en un enfoque de ponderación de los datos. Por otra parte, la actual base de datos de validación no permite una evalua ­
ción adecuada de algunas clases de sustancias o productos (por ejemplo, 
mezclas). Sin embargo, los investigadores pueden considerar la posibilidad de utilizar este método de ensayo para estudiar todos los tipos de material (incluidas las mezclas), con lo cual un resultado positivo podría aceptarse 
como indicación de una respuesta corrosiva o irritante intensa para los ojos. 
Sin embargo, los resultados positivos obtenidos con alcoholes deben inter ­
pretarse con precaución, debido al riesgo de sobrepredicción. 
7. Todos los procedimientos con ojos de pollo deben ajustarse a las normas y 
procedimientos aplicables de la instalación de ensayo en relación con la 
manipulación de materiales derivados del hombre o de animales, entre los 
que figuran los tejidos o los líquidos intersticiales. Se recomienda observar las precauciones universales de laboratorio (15). 
8. Una de las limitaciones del método de ensayo consiste en que, a pesar de 
que tiene en cuenta algunos de los efectos oculares evaluados con el método de ensayo de la capacidad de irritación ocular en el conejo y, hasta cierto 
punto, su gravedad, no atiende a las lesiones de la conjuntiva ni del iris. 
Asimismo, aunque la reversibilidad de las lesiones de la córnea no puede evaluarse  per se  en el ensayo ICE, se ha propuesto, sobre la base de los 
estudios en ojo de conejo, que la evaluación de la profundidad inicial de la 
lesión de la córnea puede utilizarse para distinguir entre efectos reversibles e irreversibles (16). Finalmente, el método de ensayo ICE no permite la eva ­
luación del potencial de toxicidad sistémica asociado con la exposición 
ocular. 
9. Se está trabajando actualmente para seguir caracterizando la utilidad y las 
limitaciones del método de ensayo ICE para detectar los agentes irritantes no 
intensos y los agentes no irritantes (véase también el punto 48). También se anima a los usuarios a presentar muestras o datos a las organizaciones de validación para una evaluación oficial de posibles usos futuros del método de 
ensayo ICE, incluida la detección de agentes irritantes no intensos y agentes 
no irritantes. 
10. Cuando algún laboratorio establezca inicialmente este ensayo, deben utili ­
zarse las sustancias para demostrar la aptitud que se indican en el apéndice 2. Los laboratorios pueden utilizar estas sustancias para demostrar su compe ­
tencia técnica en la realización del método de ensayo ICE antes de presentar, 
con fines de clasificación normativa de peligros, los datos obtenidos con este ensayo.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
11. El método de ensayo ICE es un modelo organotípico con mantenimiento a 
corto plazo del ojo de pollo  in vitro . En este método de ensayo, las lesiones 
provocadas por la sustancia problema se evalúan determinando la inflama ­
ción, la opacidad y la retención de fluoresceína en la córnea. Mientras que los dos últimos parámetros implican una evaluación cualitativa, el análisis de la inflamación de la córnea permite una evaluación cuantitativa. Cada me ­
dición se convierte en una puntuación cuantitativa utilizada para calcular un 
índice general de irritación, o bien se somete a una categorización cualitativa para asignarle una clasificación de corrosividad y capacidad de irritación intensa ocular  in vitro . Cada uno de estos resultados puede utilizarse a 
continuación para predecir el potencial de corrosividad o capacidad de irri ­
tación intensa de una sustancia problema (véanse los criterios de decisión).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Fuente y edad de los ojos de pollo  
12. Tradicionalmente se han venido utilizando para este ensayo los ojos tomados 
de pollos obtenidos de mataderos donde se sacrifican para el consumo hu ­
mano, con lo que se suprime la necesidad de disponer de animales de laboratorio. Solo se utilizan los ojos de animales sanos considerados adecua ­
dos para entrar en la cadena alimentaria humana. 
13. Aunque aún no se ha efectuado ningún estudio comparativo para evaluar la 
edad óptima de los pollos, la edad y el peso de los pollos usados tradicio ­
nalmente en este método de ensayo corresponden a los pollos tiernos que se 
suelen tratar en los mataderos de aves de corral (es decir, de unas siete 
semanas de edad y entre 1, 5 y 2,5 kg).
 
Recogida y transporte de los ojos al laboratorio  
14. Las cabezas deben retirarse inmediatamente después de la sedación de los 
pollos, generalmente por choque eléctrico, y de la incisión del cuello para su 
sangrado. Las fuentes locales de pollos deben estar situadas cerca del labo ­
ratorio de forma que las cabezas puedan transferirse desde el matadero al laboratorio en poco tiempo, a fin de reducir al mínimo el deterioro y la 
contaminación bacteriana. Debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido 
entre la recogida de las cabezas de pollo y la utilización de los ojos en el método de ensayo ICE (lo normal es que no exceda de dos horas), y hay que demostrar que ese tiempo no altera los resultados del ensayo. Estos resulta ­
dos se basan en los criterios de selección de los ojos, así como en las 
respuestas obtenidas con controles positivos y negativos. Todos los ojos utilizados en el ensayo deben proceder del mismo grupo de ojos recogidos un día concreto. 
15. Como los ojos se disecan en el laboratorio, las cabezas intactas se trans ­
portan desde el matadero a temperatura ambiente en cajas de plástico humi ­
dificadas mediante toallas mojadas con solución salina isotónica.
 
Criterios de selección de los ojos utilizados en el ICE  
16. Se desechan los ojos que tienen una elevada tinción de fluoresceína de base 
(es decir, > 0,5) o una elevada puntuación de opacidad de la córnea (es decir, > 0,5) una vez han sido enucleados. 
17. Cada grupo de tratamiento y control positivo simultáneo consiste en al 
menos tres ojos. El grupo de control negativo o el control del disolvente (si se utiliza un disolvente distinto de la solución salina) consiste en al 
menos un ojo.
 
PROCEDIMIENTO  
Preparación de los ojos  
18. Se cortan los párpados cuidadosamente, procurando no dañar la córnea. se 
evalúa rápidamente la integridad de la córnea mediante la aplicación de 
una gota de fluoresceína sódica al 2 % (p/v) a la superficie de la córnea durante unos segundos, seguida de lavado con solución salina isotónica. Los ojos tratados con fluoresceína se examinan a continuación con un 
microscopio de lámpara de hendidura para asegurarse de que la córnea 
está ilesa (es decir, tiene puntuaciones de retención de fluoresceína y de opacidad de la córnea ≤ 0,5). 
19. Los ojos que no presenten lesiones se extraen del cráneo, teniendo cuidado 
de no lesionar la córnea. El globo ocular se extrae de la órbita sujetando 
firmemente con pinzas quirúrgicas la membrana nictitante, y los músculos del ojo se cortan con unas tijeras curvas de punta roma. Es importante no 
causar lesiones a la córnea por una presión excesiva (es decir, artefactos de 
compresión). 
20. Cuando se retira el ojo de la órbita, debe quedar con él una porción visible 
del nervio óptico. Una vez retirado de la órbita, el ojo se pone en una gasa 
hidrófila y se retiran, cortándolos, la membrana nictitante y demás tejidos 
conjuntivos.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. El ojo enucleado se monta en un soporte de acero inoxidable, con la córnea 
situada verticalmente. El soporte se transfiere a continuación a la cámara de 
un aparato de perfusión (16), donde se posiciona de manera que toda la córnea reciba el goteo de solución salina isotónica. Las cámaras de los aparatos de perfusión deben estar termostatizadas a 32 ± 1,5 °C. El apéndice 
3 incluye un diagrama de un aparato de perfusión normal y del soporte para 
los ojos, que pueden obtenerse comercialmente o bien construirse en el propio laboratorio. El aparato puede modificarse para cubrir las necesidades de un laboratorio concreto (por ejemplo, para albergar un número diferente 
de ojos). 
22. Una vez colocados en el aparato de perfusión, los ojos se vuelven a exami ­
nar con un microscopio de lámpara de hendidura para asegurarse de que no 
han sufrido ninguna lesión durante el proceso de disección. También debe 
medirse en este momento el espesor de la córnea en el vértice corneal, utilizando el medidor de profundidad con el microscopio de lámpara de hendidura. Deben sustituirse los ojos que presenten a) una puntuación de 
retención de fluoresceína > 0,5; b) una opacidad corneal > 0,5; o c) cualquier 
otro signo de lesión. En cuanto a los ojos que no se hayan rechazado por ninguno de estos criterios, deberán rechazarse también los ojos con una espesor de la córnea que se desvíe en más de un 10 % del valor medio 
de todos los ojos. Los usuarios deben ser conscientes de que con los mi ­
croscopios de lámpara de hendidura pueden obtenerse diferentes mediciones del espesor de la córnea con diferentes ajustes de la anchura de la hendidura. Esta debe fijarse en 0,095 mm. 
23. Una vez examinados y aprobados todos los ojos, se incuban durante unos 45 
o 60 minutos para estabilizarlos con el sistema de ensayo antes de adminis ­
trar la sustancia. Tras el periodo de estabilización, se registra una medición 
de referencia inicial del espesor y de la opacidad de la córnea que sirva como referencia de base (es decir, a tiempo = 0). La puntuación de fluores ­
ceína determinada en el momento de la disección se utiliza como medición 
de base respecto a este parámetro.
 
Aplicación de la sustancia problema  
24. Inmediatamente después de efectuar las mediciones de referencia inicial, se 
retira el ojo (en su soporte) del aparato de perfusión, se pone en posición 
horizontal y se aplica a la córnea la sustancia problema. 
25. Normalmente, las sustancias problema líquidas se estudian sin diluir, pero, 
en caso necesario, pueden someterse a dilución (por ejemplo, como parte del 
diseño del estudio). El disolvente preferido para disolver estas sustancias es la solución salina fisiológica. Sin embargo, también pueden utilizarse otros disolventes en condiciones controladas, pero es necesario demostrar la ido ­
neidad de los disolventes que sean distintos de la solución salina fisiológica. 
26. Las sustancias problema líquidas se aplican a la córnea de forma que quede 
cubierta con la sustancia problema toda la superficie de la córnea de forma 
homogénea; el volumen normal es de 0,03 mL. 
27. Cuando sea posible, las sustancias sólidas deben triturarse de la manera más 
fina posible con un mortero o con otro instrumento de trituración compara ­
ble. El polvo resultante se aplica a la córnea de forma que su superficie quede cubierta uniformemente con la sustancia problema; la cantidad normal es de 0,03 g. 
28. La sustancia problema (líquida o sólida) se aplica durante 10 segundos y 
después se retira del ojo lavando con solución salina isotónica (aproximada ­
mente 20 mL) a temperatura ambiente. El ojo (en su soporte) se vuelve a 
poner a continuación en el aparato de perfusión, en la posición vertical inicial.
 
Sustancias de control  
29. En cada experimento se deben incluir controles simultáneos negativos (o del 
disolvente/vehículo) y positivos.  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Cuando se estudian líquidos al 100 % o sólidos, se utiliza solución salina 
fisiológica como control negativo simultáneo en el método de ensayo ICE a 
fin de detectar cambios inespecíficos del sistema de ensayo y garantizar que las condiciones del ensayo no provocan inadecuadamente una respuesta de irritación. 
31. Cuando se estudian líquidos diluidos, se incluye en el método de ensayo un 
grupo de control simultáneo del disolvente/vehículo a fin de detectar cambios inespecíficos del sistema de ensayo y garantizar que las condiciones del ensayo no provocan inadecuadamente una respuesta de irritación. Como se 
indica en el punto 25, solo pueden utilizarse los disolventes/vehículos de los 
que se haya demostrado que carecen de efectos adversos sobre el sistema de ensayo. 
32. Se incluye como control positivo simultáneo en cada experimento un agente 
irritante ocular conocido, a fin de verificar que se provoca una respuesta 
adecuada. Como en el presente método se utiliza el ensayo ICE para iden ­
tificar agentes corrosivos o irritantes intensos, el control positivo debe ser una sustancia de referencia que induzca una respuesta intensa con este mé ­
todo de ensayo. No obstante, para asegurar la posibilidad de evaluar la 
variabilidad de las respuestas del control positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la intensidad de la respuesta. Debe generarse una 
cantidad suficiente de datos  in vitro  del control positivo, de forma que se 
pueda calcular una banda aceptable, definida estadísticamente, para el control positivo. Si no se dispone de datos anteriores adecuados con el método de ensayo ICE respecto a un control positivo determinado, es posible que deban 
efectuarse estudios para conseguir esta información. 
33. Pueden citarse como ejemplo de controles positivos para sustancias problema 
líquidas el ácido acético al 10 % o el cloruro de benzalconio al 5 %, mien ­
tras que son ejemplos de controles positivos para sustancias problema sólidas 
el hidróxido sódico o el imidazol. 
34. Es útil disponer de sustancias de referencia para evaluar el potencial de 
irritación ocular de sustancias desconocidas dentro de una clase específica de sustancias o productos, o para evaluar la capacidad de irritación relativa 
de un irritante ocular dentro de una gama específica de respuestas de irrita ­
ción.
 
Parámetros medidos  
35. Las córneas tratadas se evalúan antes de su tratamiento y empezando a los 
30, 75, 120, 180 y 240 minutos (± 5 minutos) después del lavado tras el 
tratamiento. Esta cadencia permite conseguir un número adecuado de medi ­
ciones a lo largo del periodo de tratamiento de cuatro horas, dejando tiempo suficiente entre mediciones para que puedan efectuarse las observaciones 
requeridas con todos los ojos. 
36. Los parámetros evaluados son la opacidad de la córnea, la inflamación, la 
retención de fluoresceína y los efectos morfológicos (por ejemplo, lesiones 
punteadas o aflojamiento del epitelio). A cada uno de los tiempos antes 
citados se determinan todos los parámetros, salvo la retención de fluoresceína (que se determina solo antes del tratamiento y a los 30 minutos tras la exposición a la sustancia problema). 
37. Se recomienda tomar fotografías para documentar la opacidad de la córnea, 
la retención de fluoresceína, los efectos morfológicos y, en su caso, la histopatología. 
38. Tras el examen final a las cuatro horas, los usuarios deberían conservar los 
ojos en un fijador adecuado (por ejemplo, formol neutro amortiguado) para 
su eventual examen histopatológico.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. La inflamación de la córnea se determina mediante mediciones del espesor 
de la córnea efectuadas con un paquímetro óptico en un microscopio de 
lámpara de hendidura. Se expresa en porcentaje y se calcula con la fórmula siguiente a partir de las mediciones del espesor de la córnea:  
8 
> > :
 espesor de la cúrnea al tiempo t  Ä espesor de la cúrnea al tiempo t  ¼ 0 
espesor de la cúrnea al tiempo t  ¼ 0 9 
> > ; Ü 100 
40. Se calcula el porcentaje medio de inflamación de la córnea de todos los ojos 
del ensayo a todos los tiempos de observación. A partir de la mayor pun ­
tuación media de inflamación de la córnea, observada a cualquiera de los tiempos seleccionados, se adjudica a cada sustancia problema una puntuación general de categoría. 
41. La puntuación de la opacidad de la córnea se calcula utilizando el área de 
esta opacificada más densamente. Se calcula el valor medio de opacidad de 
la córnea de todos los ojos del ensayo a todos los tiempos de observación. A 
partir de la mayor puntuación media de opacidad de la córnea, observada a cualquiera de los tiempos seleccionados, se adjudica a cada sustancia pro ­
blema una puntuación general de categoría (cuadro 1).
 
Cuadro 1  
Puntuaciones de opacidad de la córnea  
Puntuación Observación  
0 Sin opacidad 
0,5 Opacidad muy débil 1 Zonas diseminadas o difusas; los detalles del iris se aprecian con claridad. 
2 Zona translúcida fácilmente discernible; los detalles del iris están ligeramente 
oscurecidos. 
3 Opacidad de la córnea intensa; no se ve ningún detalle preciso del iris; el 
tamaño de la pupila es apenas discernible. 
4 Opacidad de la córnea completa; iris invisible 
42. El valor medio de retención de fluoresceína de todos los ojos del ensayo se 
calcula solo al tiempo de observación de 30 minutos, y se utiliza para 
obtener la puntuación general de categoría asignada a cada sustancia pro ­
blema (cuadro 2).
 
Cuadro 2  
Puntuaciones de retención de fluoresceína  
Puntuación Observación  
0 Sin retención de fluoresceína 
0,5 Tinción muy débil de células aisladas 
1 Tinción de células aisladas dispersas por toda el área tratada de la córnea 
2 Tinción densa de células aisladas focalizada o confluente 3 Fluoresceína retenida en grandes áreas confluentes de la córnea
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Entre los efectos morfológicos figuran el «punteamiento» de las células del 
epitelio corneal, el «aflojamiento» del epitelio, la rugosidad «de la superficie 
corneal y el»«pegado» de la sustancia problema a la córnea. Estas observa ­
ciones pueden presentar una intensidad variable y darse simultáneamente. La clasificación de estas observaciones es subjetiva, según la interpretación del 
investigador.
 
DATOS E INFORME  
Evaluación de los datos  
44. Los resultados de la opacidad de la córnea, de la inflamación y de la 
retención de fluoresceína deben evaluarse por separado a fin de llegar a 
una clasificación ICE para cada parámetro. Las clases ICE de cada parámetro se combinan a continuación para generar una clasificación según la capaci ­
dad de irritación de cada sustancia problema.
 
Criterios de decisión  
45. Una vez evaluado cada uno de los parámetros, pueden asignarse las clases 
ICE en función de unas bandas predeterminadas. La interpretación del espe ­
sor de la córnea (cuadro 3), la opacidad (cuadro 4), y la retención de 
fluoresceína (cuadro 5) utilizando cuatro clases ICE se efectúa según las siguientes escalas:
 
Cuadro 3  
Criterios de clasificación ICE según el espesor de la córnea  
Inflamación media de la córnea (%) (*) Clase ICE  
0 a 5 I 
> 5 a 12 II > 12 a 18 (> 75 min tras el tratamiento) II > 12 a 18 ( ≤ 75 min tras el tratamiento) III 
> 18 a 26 III > 26 a 32 (> 75 min tras el tratamiento) III > 26 a 32 ( ≤ 75 min tras el tratamiento) IV 
> 32 IV
 
(*) Puntuaciones de inflamación de la córnea aplicables solo si el espesor se mide con un microscopio de 
lámpara de hendidura Haag-Streit BP900 con un medidor de profundidad n  o I y una anchura de la 
hendidura ajustada a 9½, lo que equivale a 0,095 mm. Los usuarios deben tener en cuenta que los 
microscopios de lámpara de hendidura pueden dar diferentes mediciones del espesor de la córnea con 
diferentes ajustes de la anchura de la hendidura.  
Cuadro 4  
Criterios de clasificación ICE según la opacidad  
Puntuación media de la opacidad máxima (*) Clase ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Véase el cuadro 1.  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Cuadro 5  
Criterios de clasificación ICE según la retención media de fluoresceína  
Puntuación media de la recepción de fluoresceína a 
los 30 minutos tras el tratamiento (*) Clase ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Véase el cuadro 2.  
46. La clasificación general de capacidad de irritación  in vitro  de una sustancia 
problema se evalúa leyendo la clasificación de capacidad de irritación co ­
rrespondiente a la combinación de categorías obtenidas con la inflamación de 
la córnea, la opacidad de esta y la retención de fluoresceína, y aplicando el esquema presentado en el cuadro 6.
 
Cuadro 6  
Clasificación general de la capacidad de irritación  in vitro  
Clasificación Combinaciones de los tres parámetros  
Corrosivo / irritante intenso 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 2 × IV, 1 × I (*) 
Opacidad de la córnea ≥ 3 a los 30 min (en al 
menos dos ojos) Opacidad de la córnea = 4 a cualquier tiempo (en al menos dos ojos) 
Aflojamiento intenso del epitelio (en al menos 
un ojo)
 
(*) Combinaciones menos probables.  
47. Como se indica en el punto 1, si la sustancia problema no se identifica como 
corrosiva o irritante intensa para los ojos, deben realizarse otras pruebas con 
fines de clasificación y etiquetado. El método de ensayo ICE tiene una 
exactitud general del 83 % (120/144) al 87 % (134/154), una tasa de falsos positivos del 6 % (7/122) al 8 % (9/116), y una tasa de falsos negativos del 
41 % (13/32) al 50 % (15/30) respecto a la detección de agentes corrosivos e 
irritantes intensos para los ojos, en relación con los datos obtenidos mediante el método de ensayo de ojos de conejo  in vivo , clasificados según los 
sistemas de clasificación de la EPA (1), UE (2), o SGA (3). Si se excluyen 
de la base de datos las sustancias de ciertas clases químicas (es decir, 
alcoholes y agentes tensioactivos) y físicas (es decir, sólidos), la exactitud del método ICE en el conjunto de los sistemas de clasificación de la UE, EPA y SAE varía del 91 % (75/82) al 92 % (69/75), las tasas de falsos 
positivos van del 5 % (4/73) al 6 % (4/70), y las tasas de falsos negativos 
van del 29 % (2/7) al 33 % (3/9) (4). 
48. Incluso aunque una sustancia problema no se clasifique como corrosiva o 
irritante intensa para los ojos, los datos del ICE pueden ser útiles, junto con 
los datos del ensayo  in vivo  con ojos de conejo o de otro ensayo  in vitro  
validado adecuadamente, para seguir evaluando la utilidad y las limitaciones del método de ensayo ICE a efectos de la detección de agentes irritantes no 
intensos y agentes no irritantes (se está elaborando un documento de orien ­
tación sobre el uso de métodos de ensayo  in vitro  de la toxicidad ocular).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Criterios de aceptación del estudio  
49. Se considera que un ensayo es aceptable si los controles negativos o del 
vehículo/disolvente simultáneos y los controles positivos simultáneos reciben 
una clasificación de capacidad de irritación correspondiente a las clases de agentes no irritantes y de agentes irritantes intensos / corrosivos, respectiva ­
mente.
 
Informe del ensayo  
50. El informe del ensayo debe incluir la siguiente información, en caso de que 
corresponda a la realización del estudio:  
Sustancias problema y de control  
Denominación o denominaciones químicas, como la denominación estructu ­
ral utilizada por el Chemical Abstracts Service (CAS), seguida por otras denominaciones, si se conocen; 
El número de registro CAS, si se conoce; 
La pureza y la composición de la sustancia o mezcla (en porcentajes en 
peso), en la medida en que se disponga de esta información; 
Propiedades físico-químicas pertinentes para la realización del estudio, como 
estado físico, volatilidad, pH, estabilidad, clase química o hidrosolubilidad; 
Tratamiento de las sustancias problema y de control antes del ensayo, en su 
caso (p. ej., calentamiento, trituración); 
Estabilidad, si se conoce.
 
Información referente al promotor y al laboratorio  
Nombre y dirección del promotor, laboratorio y director del estudio; 
Identificación de la fuente de los ojos (es decir, instalación en la que se han 
recogido); 
Condiciones de almacenamiento y transporte de los ojos (por ejemplo, fecha 
y hora de recogida de los ojos, plazo transcurrido hasta el inicio del ensayo); 
Características específicas de los animales de los que se han extraído los ojos 
(por ejemplo, edad, sexo, peso del animal), si se dispone de estos datos.  
Justificación del método de ensayo y del protocolo utilizados  
Integridad del método de ensayo  
Procedimiento utilizado para garantizar la integridad (es decir, la exactitud y 
la fiabilidad) del método de ensayo a lo largo del tiempo (por ejemplo, ensayo periódico de sustancias utilizadas para demostrar la aptitud, utiliza ­
ción de datos anteriores de controles negativos y positivos).
 
Criterios de aceptabilidad del ensayo  
Cuando corresponda, bandas aceptables de controles de referencias simultá ­
neos según los datos históricos.  
Condiciones del ensayo  
Descripción del sistema de ensayo utilizado; 
Microscopio de lámpara de hendidura utilizado (por ejemplo, modelo); Ajustes instrumentales del microscopio de lámpara de hendidura utilizado; 
Información sobre los ojos de pollo utilizados, incluidas declaraciones sobre 
su calidad;
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Particularidades del procedimiento de ensayo empleado; 
Concentraciones utilizadas de la sustancia problema; 
Descripción de las eventuales modificaciones del procedimiento del ensayo; Referencia a datos anteriores del modelo (por ejemplo, controles negativos y 
positivos, sustancias utilizadas para demostrar la aptitud, sustancias de refe ­
rencia); 
Descripción de los criterios de evaluación seguidos.
 
Resultados  
Descripción de otros efectos observados; 
En su caso, fotografías del ojo.  
Discusión de los resultados  
Conclusión  
BIBLIOGRAFÍA 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency. 
(2) Reglamento (CE) n  o 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, 
de 16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE y se modifica el 
Reglamento (CE) n
 o 1907/2006 (DO L 353 de 31.12.2008, p. 1). 
(3) Naciones Unidas (2007). Sistema Globalmente Armonizado de Clasifi ­
cación y Etiquetado de Productos Químicos (SGA), segunda edición revisada, Naciones Unidas, Nueva York y Ginebra, 2007. Disponible 
en: 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_s.html] 
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Co ­
rrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Disponible en la dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify 
potential ocular corrosives and severe eye irritants. Disponible en la dirección: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]. 
(6) Reglamento (CE) n
 o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, 
de 18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la auto ­
rización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias 
y Preparados Químicos, se modifica la Directiva 1999/45/CE y se dero ­
gan el Reglamento (CEE) n
 o 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) 
n o 1488/94 de la Comisión, así como la Directiva 76/769/CEE del Con ­
sejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE 
de la Comisión (DO L 396 de 30.12.2006, p. 1). 
(7) OCDE (2002). Directrices de ensayo TG 405. OECD Guidelines for 
Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Disponible en la dirección: 
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html]
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. 
In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular Toxicity 
Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) In ­
teragency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological 
Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponible en la dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm] 
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Identif ­
ying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test 
Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: Na ­
tional Toxicology Program. Disponible en la dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm] 
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuclea ­
ted eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  31:69-76. 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Disponible en la dirección: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]. 
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929. 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion po ­
tential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296. 
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/pre ­
diction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37. 
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline 
for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents 
in Healthcare Settings. Disponible en la dirección: 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf]. 
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117. 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Disponible en la dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm] 
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Disponible en la direc ­
ción: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES  
Exactitud:  Grado de concordancia entre los resultados obtenidos con el método 
de ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del 
comportamiento del método de ensayo y es un aspecto de su «pertinencia». Este término y el de «concordancia» se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo.  
Sustancias de referencia:  Sustancias utilizadas como patrón para comparar con 
una sustancia problema. Las sustancias de referencia deben presentar las siguien ­
tes propiedades: a) un origen coherente y fiable; b) similitud estructural y fun ­
cional con la clase de sustancias problema; c) características físicas y químicas conocidas; c) datos de apoyo sobre los efectos conocidos, y e) potencia conocida 
en la banda de la respuesta deseada.  
Córnea:  Parte transparente delantera del globo ocular que cubre el iris y la 
pupila y permite el paso de la luz al interior.  
Opacidad de la córnea:  Medida del grado de opacidad de la córnea tras su 
exposición a una sustancia problema. Un aumento de la opacidad de la córnea 
indica que esta ha sufrido una lesión.  
Inflamación de la córnea:  Medición objetiva en el ensayo ICE de la magnitud 
de la dilatación de la córnea tras su exposición a una sustancia problema. Se expresa en porcentaje y se calcula a partir de las mediciones del espesor de la 
córnea de referencia de base (antes de la administración de la sustancia) y de los 
espesores registrados a intervalos regulares tras la exposición a la sustancia problema en el ensayo ICE. El grado de inflamación de la córnea indica las lesiones que esta ha sufrido.  
Categoría 1 de la EPA:  Corrosión (destrucción irreversible del tejido ocular) o 
afectación o irritación de la córnea, persistente durante más de 21 días (1).  
Categoría R41 de la UE:  Producción de una lesión de los tejidos oculares o un 
deterioro físico importante de la visión, como consecuencia de la aplicación de una sustancia problema en la superficie anterior del ojo, y que no es totalmente 
reversible en los 21 días siguientes a la aplicación (2).  
Tasa de falsos negativos:  Proporción de todas las sustancias positivas identifi ­
cadas erróneamente como negativas por un método de ensayo. Es uno de los indicadores del comportamiento del método de ensayo.  
Tasa de falsos positivos:  Proporción de todas las sustancias negativas identifi ­
cadas erróneamente como positivas por un método de ensayo. Es uno de los 
indicadores del comportamiento del método de ensayo.  
Retención de fluoresceína:  Medición subjetiva en el ensayo ICE de la cantidad 
de fluoresceína sódica retenida por las células epiteliales de la córnea tras la 
exposición de esta a una sustancia problema. El grado de retención de fluores ­
ceína indica las lesiones que ha sufrido el epitelio de la córnea.  
SGA (Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de 
Productos Químicos):  Sistema que propone la clasificación de sustancias quí ­
micas y sus mezclas según tipos y niveles normalizados de peligros físicos, 
sanitarios y ambientales, y que hace referencia a los elementos correspondientes 
de comunicación, como pictogramas, palabras de advertencia, indicaciones de peligro, consejos de prudencia, y fichas de datos de seguridad, a efectos de proporcionar información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a 
la población (incluidos empresarios, trabajadores, transportistas, consumidores y 
personal de respuesta a emergencias) y al medio ambiente (3).
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
Categoría 1 del SGA:  Producción de una lesión de los tejidos oculares o 
una degradación física severa de la vista, como consecuencia de la aplicación 
de una sustancia problema en la superficie anterior del ojo, y que no es total ­
mente reversible en los 21 días siguientes a la aplicación (3).  
Peligro:  Propiedad inherente de un agente o situación que tiene capacidad para 
provocar efectos adversos cuando un organismo, sistema o (sub)población se expone a dicho agente.  
Control negativo:  Muestra paralela no tratada que contiene todos los compo ­
nentes de un sistema de ensayo. Esta muestra se somete al mismo proceso que 
las muestras tratadas con sustancia problema y otras muestras de control para determinar si el disolvente interactúa con el sistema de ensayo.  
Sustancias no irritantes:  Sustancias no clasificadas como irritantes oculares en 
las categorías I, II, o III de la EPA, en la categoría R41 o R36 de la UE, ni en las 
categorías 1, 2A o 2B del SGA (1) (2) (3).  
Sustancias corrosivas oculares:  a) Sustancias que provocan una lesión irreversible 
de los tejidos oculares; b) sustancias clasificadas como irritantes oculares de la 
categoría 1 del SGA, categoría I de la EPA, o categoría R41 de la UE (1) (2) (3).  
Sustancias irritantes oculares:  a) Sustancias que producen un cambio reversible 
en el ojo como consecuencia de su aplicación a la superficie anterior de este; b) sustancias clasificadas como irritantes oculares en las categorías II, o III de la 
EPA, categoría R36 de la UE, o en las categorías 2A o 2B del SGA (1) (2) (3).  
Sustancias irritantes intensas oculares:  a) Sustancias que provocan lesiones de 
los tejidos oculares como consecuencia de su aplicación en la superficie anterior del ojo, y que no se resuelven en los 21 días siguientes a la aplicación, o una degradación física severa de la visión; b) sustancias clasificadas como irri ­
tantes oculares de la categoría 1 del SGA, categoría I de la EPA, o categoría R41 
de la UE (1) (2) (3).  
Control positivo:  Muestra paralela que contiene todos los componentes de un 
sistema de ensayo y que se trata con una sustancia de la que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del control positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la 
intensidad de la respuesta.  
Fiabilidad:  Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de 
forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio o en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproduci ­
bilidad intra e interlaboratorios y la repetibilidad intralaboratorios.  
Microscopio de lámpara de hendidura:  Instrumento utilizado para examinar 
directamente el ojo con el aumento de un microscopio binocular creando una 
imagen estereoscópica en vertical. En el método de ensayo ICE, este instrumento se utiliza para ver las estructuras anteriores del ojo del pollo, así como para medir objetivamente el espesor de la córnea con ayuda de un medidor de profundidad.  
Control del disolvente/vehículo:  Muestra no tratada que contiene todos los 
componentes de un sistema de ensayo, incluido el disolvente o vehículo, y 
que se somete al mismo proceso que las muestras tratadas con sustancia pro ­
blema y otras muestras de control a fin de determinar la respuesta de base correspondiente a las muestras tratadas con la sustancia problema disuelta en el mismo disolvente o vehículo. Cuando se somete a ensayo con un control 
negativo simultáneo, esta muestra pone de manifiesto también si el disolvente 
o vehículo interactúa con el sistema de ensayo.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Ensayo gradual:  Estrategia de ensayo por fases, en la que se revisa toda la 
información existente sobre una sustancia problema, siguiendo un orden especi ­
ficado en un proceso de ponderación de los datos en cada fase, a fin de deter ­
minar si se dispone de información suficiente para tomar una decisión sobre la clasificación de un peligro, antes de pasar a la fase siguiente. Si puede estable ­
cerse la capacidad de irritación de una sustancia problema con la información 
disponible, no hace falta efectuar más ensayos. Si no puede establecerse la capacidad de irritación de una sustancia problema con la información disponible, se aplica un procedimiento secuencial de ensayos con animales por fases hasta 
que pueda efectuarse una clasificación inequívoca.  
Método de ensayo validado:  Método de ensayo sobre el cual se han completado 
estudios de validación para determinar su pertinencia (incluida su exactitud) y su 
fiabilidad con un fin específico. Es importante señalar que un método de ensayo validado puede tener un comportamiento insuficiente en términos de exactitud y fiabilidad como para considerarse aceptable a efectos del fin propuesto.  
Ponderación de los datos:  Proceso de consideración de los aspectos favorables y 
desfavorables de los distintos elementos de información a efectos de alcanzar y 
confirmar una conclusión en cuanto al peligro potencial de una sustancia.
 ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Apéndice 2  
SUSTANCIAS UTILIZADAS PARA DEMOSTRAR LA APTITUD DEL MÉ ­
TODO DE ENSAYO ICE 
Antes de proceder al uso sistemático de un método de ensayo que se ajuste a este 
método de ensayo, es posible que los laboratorios deseen demostrar su aptitud técnica, identificando correctamente la clasificación de las diez sustancias recomen ­
dadas del cuadro 1 en cuanto a su corrosividad ocular. Estas sustancias se ha 
seleccionado para representar la gama de respuestas de irritación/corrosión ocular 
local, sobre la base de los resultados conseguidos en el ensayo con ojo de conejo  in 
vivo (TG 405) (es decir, categorías 1, 2A, 2B o no clasificada o etiquetada según el 
SGA de la ONU (3) (7). Sin embargo, considerando la utilidad validada de estos 
ensayos (es decir, identificar solamente sustancias corrosivas/irritantes intensas 
oculares), solo hay dos resultados del ensayo a efectos de clasificación (sustancia corrosiva/irritante intensa o sustancia no corrosiva/no irritante intensa) para demos ­
trar la aptitud del método. Otros criterios de selección son que las sustancias se 
encuentren en el mercado, que se disponga de datos de referencia  in vivo  de calidad, 
y que haya datos de calidad procedentes de los dos métodos  in vitro  para los que se 
están elaborando directrices de ensayo. Por este motivo, se han seleccionado sus ­
tancias irritantes de la lista recomendada por el ICCVAM de 122 sustancias de 
referencia para la validación de métodos de ensayo de la toxicidad ocular  in vitro  
(véase el apéndice H: Lista de sustancias de referencia recomendadas por el IC ­
CVAM) (4). Se encuentran datos de referencia en los documentos de revisión de fondo del ICCVAM para el método de ensayo de la opacidad y permeabilidad de la 
córnea de bovino (BCOP) y para el ICE (18) (19).
 
Cuadro 1  
Sustancias recomendadas para demostrar la aptitud técnica con ICE  
Productos químicos N  o CAS Clase química (  1 ) Estado físico Clasificación (  2 ) 
in vivo  Clasificación (  3 ) in vitro  
Cloruro de benzalco ­
nio (5 %) 8001-54-5 Compuesto 
onio Líquido Categoría 1 Corrosivo/irritante 
intenso 
Clorhexidina 55-56-1 Amina, amidina Sólido Categoría 1 Corrosivo/irritante 
intenso 
Ácido dibenzoil-L- 
tartárico 2743-38-6 Ácido carboxí ­
lico, éster Sólido Categoría 1 Corrosivo/irritante 
intenso 
Imidazol 288-32-4 Heterociclo Sólido Categoría 1 Corrosivo/irritante 
intenso 
Ácido tricloroacético 
(30 %) 76-03-9 Ácido carboxí ­
lico Líquido Categoría 1 Corrosivo/irritante 
intenso 
Cloruro de 2,6-diclo ­
robenzoílo 4659-45-4 Haluro de acilo Líquido Categoría 2A No corrosivo/no irri ­
tante intenso 
2-metil-acetoacetato 
de etilo 609-14-3 Cetona, éster Líquido Categoría 2B No corrosivo/no irri ­
tante intenso 
Nitrato de amonio 6484-52-2 Sal inorgánica Sólido Categoría 2A No corrosivo/no irri ­
tante intenso  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Productos químicos N  o CAS Clase química (  1 ) Estado físico Clasificación (  2 ) 
in vivo  Clasificación (  3 ) in vitro  
Glicerol 56-81-5 Alcohol Líquido No etiquetado No corrosivo/no irri ­
tante intenso 
n-Hexano 110-54-3 Hidrocarburo 
(acíclico) Líquido No etiquetado No corrosivo/no irri ­
tante intenso  
Abreviaturas: N  o CAS: número de registro del Chemical Abstracts Service 
( 1 ) La clase química se ha asignado a cada sustancia problema utilizando un sistema de clasificación habitual, basado en el siste ma de 
clasificación de materias médicas de la National Library of Medicine (MeSH) (se puede encontrar en la dirección http// 
www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Sobre la base de los resultados obtenidos en el ensayo con ojos de conejo  in vivo  (TG 405 de la OCDE) y utilizando el SGA de la 
ONU (3) (7). 
( 3 ) Sobre la base de los resultados obtenidos con el método de ensayo BCOP y con el ICE.  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Apéndice 3  
Diagramas del aparato de perfusión y del soporte para los ojos utilizados en 
el método ICE  
(En Burton et al. (17) se encuentran otras descripciones genéricas del aparato 
de perfusión y del soporte para los ojos)
  ▼M2 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  ENSAYO DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULAS DE MAMÍFERO  
IN VITRO  
INTRODUCCIÓN 
1. El ensayo de micronúcleos  in vitro  (MNvit) es un ensayo de genotoxicidad 
para la detección de micronúcleos (MN) en el citoplasma de células en 
interfase. Los micronúcleos pueden proceder de fragmentos cromosómicos acéntricos (es decir, que carecen de centrómero) o de cromosomas comple ­
tos que no pueden migrar a los polos durante la anafase de la división 
celular. El ensayo detecta la actividad de productos químicos clastogénicos 
y aneugénicos (sustancias y mezclas) (1) (2) en células que han sufrido la división celular durante la exposición a la sustancia problema o después de la misma. El presente método de ensayo (ME) permite el uso de protocolos 
con y sin citocalasina B (citoB), que es un inhibidor de la polimerización de 
la actina. La adición de citoB antes de la mitosis diana permite la identi ­
ficación y el análisis selectivo de la frecuencia de micronúcleos en las 
células que han completado una sola mitosis porque dichas células son 
binucleadas (3) (4). Este ME permite también el uso de protocolos sin bloqueo de la citocinesis, siempre que haya pruebas de que la población celular analizada ha experimentado la mitosis. 
2. Además de utilizar el ensayo de MNvit para identificar productos químicos 
(sustancias y mezclas) que inducen micronúcleos, el uso del bloqueo de la 
citocinesis, del etiquetado inmunoquímico de cinetocoros, o de la hibrida ­
ción con sondas centroméricas o teloméricas [hibridación fluorescente  in 
situ (FISH)] puede aportar también información sobre los mecanismos del 
daño cromosómico y de la formación de micronúcleos (5) (6) (7) (8) (9) 
(10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Los procedimientos de etiquetado e hibridación pueden utilizarse cuando hay un aumento en la formación de micronúcleos y el investigador desea determinar si el aumento es conse ­
cuencia de sucesos clastogénicos o aneugénicos. 
3. Los micronúcleos representan un daño que se ha transmitido a las células 
hijas, mientras que las aberraciones cromosómicas registradas en las células en metafase pueden no transmitirse. Debido a que los micronúcleos de las 
células en interfase pueden evaluarse de forma relativamente objetiva, el 
personal de laboratorio solamente tiene que determinar si las células han sufrido o no la división y cuántas células contienen un micronúcleo. Como resultado, las preparaciones pueden evaluarse de forma relativamente rápida 
y el análisis puede automatizarse. Esto hace que sea factible evaluar miles 
en lugar de cientos de células por tratamiento, lo que aumenta el poder del ensayo. Finalmente, como los micronúcleos pueden derivarse de cromoso ­
mas retardados, existe la posibilidad de detectar agentes inductores de 
aneuploidía que son difíciles de estudiar en ensayos convencionales de 
aberraciones cromosómicas como, por ejemplo, la TG 473 de la OCDE (capítulo B.10 del presente anexo) (17). Sin embargo, el ensayo de MNvit no permite diferenciar las sustancias que inducen poliploidía de las que 
inducen efectos clastogénicos sin recurrir a técnicas especiales como la 
FISH mencionada en el punto 2. 
4. El ensayo de MNvit es un método  in vitro  que utiliza normalmente células 
cultivadas de roedor o humanas. Proporciona una base general para inves ­
tigar el potencial de causar daño cromosómico in vitro  porque permite de ­
tectar tanto anéugenos como clastógenos. 
5. El ensayo de MNvit es sólido y efectivo con una diversidad de tipos 
celulares, y tanto en presencia como en ausencia de citoB. Hay muchos datos que apoyan la validez del ensayo de MNvit con diversas líneas 
celulares de roedor (CHO, V79, CHL/IU y L5178Y) y con linfocitos hu ­
manos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Aquí se incluyen, en particular, los estudios internacionales de validación coordinados por la Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) 
(19) (20) (21) (22) y los informes del International Workshop on Genoto ­
xicity Testing (4) (16). Los datos disponibles también se han vuelto
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
a evaluar en un estudio de validación retrospectiva con ponderación de los 
datos, por parte del Centro Europeo para la Validación de Métodos 
Alternativos (CEVMA) de la Comisión Europea, y el método de ensayo ha sido avalado en cuanto a su validez científica por el Comité científico consultivo del CEVMA (ESAC) (32) (33) (34). Se ha descrito el uso de la 
línea celular linfoblastoide humana TK6 (35), de células HepG2 (36) (37) y 
de células primarias de embrión de hámster sirio (38), aunque no se han utilizado en los estudios de validación.
 
DEFINICIONES 
6. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.  
CONSIDERACIONES INICIALES 
7. Los ensayos realizados  in vitro  suelen exigir la utilización de una fuente 
exógena de activación metabólica, salvo que las células sean competentes metabólicamente respecto a las sustancias que se ensayan. El sistema exó ­
geno de activación metabólica no reproduce completamente las condiciones  
in vivo.  Debe procurarse también evitar las circunstancias que puedan con ­
ducir a resultados falsos positivos que no reflejen la mutagenicidad intrín ­
seca y que puedan deberse a factores tales como cambios en el pH o en la osmolalidad, o a altos niveles de citotoxicidad (39) (40) (41). Si la sustancia 
problema provoca un cambio en el pH del medio en el momento de su 
incorporación, hay que ajustar el pH, preferentemente amortiguando la so ­
lución madre de forma que todos los volúmenes en todas las concentracio ­
nes de ensayo, y respecto a todos los controles, se mantengan iguales. 
8. Para analizar la inducción de la formación de micronúcleos, es fundamental 
que haya habido mitosis en los cultivos tanto tratados como sin tratar. La 
fase que proporciona más información para evaluar la formación de micro ­
núcleos es la de las células que han completado una sola mitosis durante el tratamiento con la sustancia problema, o después de este tratamiento.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
9. Los cultivos celulares de origen humano o de mamífero se exponen a la 
sustancia problema tanto con una fuente exógena de activación metabólica como sin ella, salvo que se utilicen células con una capacidad adecuada de 
metabolización. En todos los ensayos se incluyen un control positivo (CP) y 
un control del disolvente o vehículo (CV) en paralelo. 
10. Durante la exposición a la sustancia problema, o después de la misma, las 
células se cultivan durante un tiempo suficiente para que el daño cromosó ­
mico o del huso acromático provoquen la formación de micronúcleos en las células en interfase. Para la inducción de aneuploidía, es necesario normal ­
mente que la sustancia problema esté presente durante la mitosis. Las 
células en interfase se recogen, se tiñen y se analizan para detectar la 
presencia de micronúcleos. Lo ideal es que los micronúcleos se evalúen solamente en las células que hayan completado la mitosis durante la expo ­
sición a la sustancia problema o durante el período tras la exposición, en su 
caso. En los cultivos que se hayan tratado con un bloqueante de la citoci ­
nesis, esto se consigue evaluando únicamente las células binucleadas. En ausencia de bloqueante de la citocinesis es importante demostrar la proba ­
bilidad de que las células analizadas hayan experimentado la división celu ­
lar durante la exposición a la sustancia problema o después de dicha expo ­
sición. En relación con todos los protocolos, es importante demostrar que ha habido proliferación celular en los cultivos tanto tratados como de control, y el grado de citotoxicidad o citostasis inducido por la sustancia problema 
debe estimarse en los cultivos (o en cultivos paralelos) que se examinan 
para evaluar la presencia de micronúcleos en ellos.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO  
Preparativos  
11. Pueden utilizarse cultivos primarios de linfocitos de sangre periférica hu ­
mana (5) (19) (42) (43) y una serie de líneas celulares de roedor, tales como 
CHO, V79, CHL/IU, y L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). El uso de otros tipos y líneas celulares debe justificarse por la demos ­
tración de su comportamiento en el ensayo, como se describe en la 
sección de criterios de aceptabilidad. Como la frecuencia espontánea de 
la formación de micronúcleos influye en la sensibilidad del ensayo, se recomienda la utilización de tipos celulares con una frecuencia espontánea de micronúcleos que sea baja y estable. 
12. Los linfocitos de sangre periférica humana deben obtenerse de individuos 
no fumadores, sanos, jóvenes (de entre 18 y 35 años de edad, aproxima ­
damente), que no hayan estado expuestos recientemente a radiaciones ni a sustancias genotóxicas conocidas. Si se combinan las células procedentes de 
más de un donante, debe especificarse el número de donantes. La frecuencia 
de micronúcleos aumenta con la edad y esta tendencia es más pronunciada en las mujeres que en los varones (44), lo que debe tenerse en cuenta al efectuar la selección de las células de los donantes para su combinación.
 
Medios y condiciones de cultivo 
13. Para el mantenimiento de los cultivos deben utilizarse medios de cultivo y 
condiciones de incubación (recipientes de cultivo, concentración de CO  2 , 
temperatura y humedad) adecuados. Las cepas y líneas celulares estableci ­
das deben examinarse sistemáticamente para comprobar la estabilidad del número modal de cromosomas y la ausencia de contaminación por mico ­
plasmas, y deben dejar de utilizarse si se contaminan o si hay un cambio en 
el número modal de cromosomas. Debe conocerse la duración del ciclo celular normal en las condiciones de cultivo aplicadas en el laboratorio 
de ensayo. Si se utiliza el método de bloqueo de la citocinesis, la concen ­
tración del inhibidor de la citocinesis debe optimizarse para el tipo de células específico que se utilice y debe demostrarse que proporciona un buen rendimiento de células binucleadas para la evaluación.
 
Preparación de los cultivos 
14. Cepas y líneas celulares establecidas: las células se propagan a partir de 
cultivos madre, se siembran en medio de cultivo a una densidad tal que los 
cultivos no lleguen a confluir en monocapas, y los cultivos en suspensión no alcancen una densidad excesiva antes del momento de la recogida, y se incuban a 37 °C. 
15. Linfocitos: se cultiva sangre completa tratada con un anticoagulante (por 
ejemplo, heparina), o bien linfocitos aislados, en presencia de un mitógeno [por ejemplo, fitohemaglutinina (PHA)] antes de la exposición a la sustancia problema y a la citoB.
 
Activación metabólica 
16. Se debe recurrir a sistemas de metabolización exógenos cuando se utilizan 
células con una capacidad metabólica endógena inadecuada. El sistema más 
comúnmente empleado es una fracción postmitocondrial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene a partir del hígado de roedores tratados con inductores enzimáticos como el aroclor 1254 (45) (46) o una combi ­
nación de fenobarbital y β-naftoflavona (46) (47) (48) (49). Esta última 
combinación no infringe el Convenio de Estocolmo sobre contaminantes orgánicos persistentes (50) ni el Reglamento (CE) n
 o 850/2004, sobre con ­
taminantes orgánicos persistentes (66), y se ha visto que es tan efectiva 
como el aroclor 1254 para inducir las oxidasas de función mixta (46) (47) 
(48) (49). La fracción S9 se utiliza normalmente a concentraciones que varían entre el 1 y el 10 % (v/v) en el medio de ensayo final. La elección de un sistema de activación metabólica puede depender de la clase de 
sustancia que se estudia y, en algunos casos, puede ser adecuado utilizar 
más de una concentración de S9.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Las líneas celulares genéticamente modificadas que expresan enzimas de 
activación, humanas o de roedores, pueden suprimir la necesidad de 
utilizar un sistema de activación metabólica exógeno, y pueden utilizarse como células de ensayo. En estos casos, la elección de las líneas celu ­
lares utilizadas debe justificarse científicamente, por ejemplo, por la per ­
tinencia de las oxidasas de función mixta para el metabolismo de la 
sustancia problema (51), y por su capacidad de respuesta a clastógenos y anéugenos conocidos (véase la sección sobre criterios de aceptabilidad). Debe reconocerse que la sustancia estudiada puede no ser metabolizada 
por la oxidasa u oxidasas de función mixta expresadas; en este caso, los 
resultados negativos no indicarían que la sustancia problema no puede inducir micronúcleos.
 
Preparación de la sustancia problema 
18. Las sustancias sólidas deben disolverse en disolventes o vehículos ade ­
cuados y, si es conveniente, diluirse antes de tratar las células. Las 
sustancias líquidas pueden añadirse directamente al sistema de ensayo o 
diluirse antes del tratamiento. Las sustancias gaseosas o volátiles deben ensayarse aplicando modificaciones adecuadas a los protocolos normales, tales como el tratamiento en recipientes sellados (52) (53). Han de em ­
plearse soluciones de la sustancia problema recién preparadas, salvo que 
los datos relativos a la estabilidad demuestren que es posible su conser ­
vación.
 
Condiciones del ensayo  
Disolvente o vehículo 
19. El disolvente o vehículo no debe reaccionar con la sustancia problema ni 
ser incompatible con la supervivencia de las células ni con el manteni ­
miento de la actividad de la fracción S9 a la concentración utilizada. Para 
utilizar algún disolvente o vehículo distinto de los bien establecidos (por ejemplo, agua, medio de cultivo celular, dimetilsulfóxido), debe disponerse de datos justificativos que indiquen su compatibilidad con la sustancia 
problema y su ausencia de toxicidad genética. Siempre que sea posible, 
se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso.
 
Utilización de citoB como bloqueante de la citocinesis 
20. Una de las consideraciones más importantes en la realización del ensayo 
de MNvit es la de velar por que las células que se examinen hayan 
completado la mitosis durante el tratamiento o en el período de incuba ­
ción tras el mismo, en su caso. La citoB es el agente más ampliamente utilizado para bloquear la citocinesis, ya que inhibe el ensamblaje de la actina, con lo que impide la separación de las células hijas tras la 
mitosis, y así se forman células binucleadas (5) (54) (55). Así pues, el 
recuento de micronúcleos puede limitarse a las células que han experi ­
mentado la mitosis durante el tratamiento o después de este. El efecto de la sustancia problema sobre la cinética de la proliferación celular puede 
medirse simultáneamente. La citoB debe utilizarse como bloqueante de la 
citocinesis cuando se utilizan linfocitos humanos, ya que la duración de los ciclos celulares es variable dentro de los cultivos y entre los donan ­
tes, y debido a que no todos los linfocitos responden a la PHA. Al 
examinar líneas celulares, se han utilizado otros métodos para determinar 
si las células que se evalúan han experimentado la división; estos méto ­
dos se consideran más abajo (véase el punto 26). 
21. El laboratorio debe determinar la concentración adecuada de citoB para 
cada tipo de células con el fin de conseguir la frecuencia óptima de células binucleadas en los cultivos de control del disolvente o vehículo. 
La concentración adecuada de citoB está generalmente entre 3 y 
6 μg/ml.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Medición de la proliferación celular y de la citotoxicidad, y selección de las 
concentraciones de exposición 
22. Cuando se determina la concentración máxima de sustancia problema que 
se va a estudiar, debe evitarse llegar a concentraciones que puedan producir respuestas positivas falsas, tales como las provocadas por una citotoxicidad excesiva, precipitación en el medio de cultivo, y cambios fuertes del pH o 
de la osmolalidad (39) (40) (41). 
23. Se mide la proliferación celular para asegurarse de que las células tratadas 
han efectuado una mitosis durante el ensayo y de que los tratamientos se efectúan a los niveles adecuados de citotoxicidad (véase el punto 29). La citotoxicidad debe determinarse con y sin activación metabólica en las 
células que requieren activación metabólica, utilizando el aumento relativo 
del recuento de células (ARRC) o la duplicación relativa de la población (DRP) (véanse las fórmulas en el apéndice 2), salvo que se emplee la citoB. Cuando se emplea esta sustancia, es posible determinar 
la citotoxicidad utilizando el índice de replicación (IR) (véase la fórmula en 
el apéndice 2). 
24. El tratamiento de los cultivos con citoB, junto con la medición de las 
frecuencias relativas de células mononucleadas, binucleadas y multinuclea ­
das en el cultivo, constituye un método exacto de cuantificación del efecto 
sobre la proliferación celular y de la actividad citotóxica o citostática de un 
tratamiento (5), y garantiza que solamente se evalúan las células que se han dividido durante el tratamiento o después de este. 
25. En los estudios con citoB, la citostasis o la citotoxicidad pueden cuantifi ­
carse mediante el índice de proliferación con bloqueo de la 
citocinesis (IPBC) (5) (26) (56), o pueden derivarse del IR de, al menos, 500 células por cultivo (véanse las fórmulas en el apéndice 2). Cuando se utiliza la citoB para evaluar la proliferación celular, hay que determinar el 
IPBC o el IR basándose en un mínimo de 500 células por cultivo. Estas 
mediciones, entre otras, pueden utilizarse para estimar la citotoxicidad com ­
parando los valores obtenidos con los cultivos tratados y con los controles. La evaluación de otros indicadores de citotoxicidad (por ejemplo, confluen ­
cia, número de células, apoptosis, necrosis, recuento de las células en 
metafase) puede aportar información útil. 
26. En los estudios sin citoB, es necesario demostrar que las células evaluadas 
en el cultivo se han dividido durante el tratamiento con la sustancia pro ­
blema o tras este tratamiento; en caso contrario, pueden obtenerse respues ­
tas negativas falsas. Entre los métodos que se han utilizado para garantizar 
que las células objeto de evaluación se han dividido figuran los siguientes: la incorporación y posterior detección de bromodesoxiuridina (BrdU) para identificar las células que se han replicado (57), la formación de clones 
cuando se tratan células de líneas celulares permanentes y se evalúan  in situ  
en el portaobjetos de un microscopio [índice de proliferación (IP)] (25) (26) (27) (28), o la medición de la duplicación relativa de la población (DRP) o del aumento relativo del recuento de células (ARRC) u otros métodos 
comprobados (16) (56) (58) (59) (véanse las fórmulas en el apéndice 2). 
La evaluación de otros indicadores de citotoxicidad o de la citostasis (por ejemplo, confluencia, número de células, apoptosis, necrosis, recuento de las células en metafase) puede aportar información útil. 
27. Deben evaluarse al menos tres concentraciones de ensayo analizables. Con 
este fin, puede ser necesario realizar el experimento utilizando un número 
mayor de concentraciones próximas entre sí y analizar la formación de micronúcleos en las concentraciones que aporten el rango apropiado de citotoxicidades. Otra estrategia posible consiste en efectuar un ensayo pre ­
liminar de citotoxicidad a fin de estrechar el rango para el ensayo definitivo. 
28. El objetivo es que la concentración máxima provoque una citotoxicidad del 
55 ± 5 %. Unos niveles más elevados podrían inducir daño cromosómico como efecto secundario de la citotoxicidad (60). Cuando se produce cito ­
toxicidad, las concentraciones de ensayo seleccionadas deben cubrir un 
rango que vaya desde la que provoca una citotoxicidad del 55 ± 5 % hasta 
la que no provoca citotoxicidad o solo débilmente.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Si no se observa citotoxicidad ni precipitado, la concentración de ensayo 
máxima debe corresponder a la más baja del grupo siguiente: 0,01 M, 5 
mg/mL o 5 μl/mL. Las concentraciones seleccionadas para el análisis no 
deben estar separadas, en general, por un factor de más de 10. En el caso de sustancias problema que muestran una curva de concentración-respuesta de 
gran pendiente, puede ser necesario reducir más la separación entre las 
concentraciones de la sustancia problema, de forma que se evalúen cultivos en los rangos de toxicidad moderada y baja. 
30. En caso de que la solubilidad constituya un factor limitante, la concentra ­
ción máxima, si no está limitada por la citotoxicidad, debe ser la concen ­
tración más baja a la que un precipitado mínimo es visible en los cultivos, 
siempre que esto no interfiera con el recuento. La valoración de la preci ­
pitación debe realizarse con métodos como la microscopia óptica, anotando el precipitado que persiste, o el que aparece durante el cultivo (hacia el final 
del tratamiento).
 
Controles 
31. En todos los experimentos deben incluirse controles positivos (CP) y del 
disolvente o vehículo en paralelo, con y sin activación metabólica. 
32. Los CP son necesarios para demostrar la capacidad de las células utiliza ­
das y del protocolo de ensayo para identificar clastógenos y anéugenos,  
►C1 y confirmar la actividad metabólica de la preparación de S9. ◄ 
Los CP deben emplear inductores conocidos de la formación de micronú ­
cleos a concentraciones a las que se prevea que se van a obtener aumentos 
pequeños, pero reproducibles, sobre la frecuencia espontánea, y demostrar 
la sensibilidad del sistema de ensayo. Las concentraciones de los CP deben ser tales que los efectos sean claros, pero no revelen inmediata ­
mente al lector la identidad de los portaobjetos codificados. 
33. Debe utilizarse un clastógeno que requiera activación metabólica (por ejem ­
plo, ciclofosfamida, benzo[a]pireno) para demostrar tanto la competencia 
metabólica como la capacidad del sistema de ensayo para detectar clastó ­
genos. Si está justificado, pueden utilizarse otros CP. Debido a que algunos CP que necesitan activación metabólica pueden ser activos sin activación 
metabólica exógena en ciertas condiciones de tratamiento o en ciertas líneas 
celulares, la necesidad de activación metabólica y la actividad de la prepa ­
ración de S9 deben probarse en la línea celular seleccionada y a las concen ­
traciones seleccionadas. 
34. Por el momento, no se conoce ningún anéugeno que necesite activación 
metabólica para su actividad genotóxica (16). Como ejemplos de CP acep ­
tados actualmente para la actividad aneugénica pueden citarse la colchicina y la vimblastina. Pueden utilizarse otras sustancias si inducen micronúcleos 
solamente, o principalmente, a través de su actividad aneugénica. Para 
evitar tener que recurrir a dos CP (para la clastogenicidad y para la aneu ­
genicidad) sin activación metabólica, el control de aneugenicidad puede servir como CP sin S9, y el control de clastogenicidad puede utilizarse 
para comprobar la idoneidad del sistema de activación metabólica utilizado. 
En células que no requieren S9 deben utilizarse CP tanto para la clastoge ­
nicidad como para la aneugenicidad. En el apéndice 3 se recogen los CP sugeridos. 
35. Puede considerarse la utilización de un CP en función de las clases quími ­
cas, si se dispone de sustancias adecuadas. Todos los CP utilizados deben 
ser adecuados para el tipo de células y para las condiciones de activación.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Deben incluirse controles del disolvente o vehículo para cada tiempo de 
recogida. Se realizarán asimismo controles negativos (CN) sin tratar (sin 
disolvente ni vehículo), salvo que exista información publicada o datos de los controles históricos del laboratorio que demuestre que, a las concen ­
traciones utilizadas, el disolvente elegido no provoca efectos genotóxicos ni 
otro tipo de efectos nocivos.
 
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO  
Pauta de tratamiento  
37. Para maximizar la probabilidad de detectar un anéugeno o un clastógeno 
que actúe en una fase específica del ciclo celular, es importante que se trate con la sustancia problema un número suficiente de células en todas las fases 
de su ciclo celular. Por tanto, es posible que la pauta de tratamiento de 
líneas celulares y de cultivos celulares primarios difiera en algunos aspectos de la aplicada a los linfocitos, que requieren estimulación mitogénica para empezar su ciclo celular; este tema se trata en los puntos 41 a 43 (16). 
38. Una serie de consideraciones teóricas, junto con datos publicados (18), 
indica que la mayoría de los anéugenos y clastógenos se detectan con un 
corto período de tratamiento, de entre 3 y 6 horas en presencia y ausencia de S9, seguido de la eliminación de la sustancia problema y de un período de crecimiento de entre 1,5 y 2,0 ciclos celulares (6). Las células se recogen 
a un tiempo equivalente a unas 1,5-2,0 veces la duración del ciclo celular 
normal (es decir, sin tratamiento), bien tras el inicio o bien al final del tratamiento (véase el cuadro 1). Los tiempos de la toma de muestras o los de recuperación pueden ampliarse si se sabe o se sospecha que la sustancia 
problema afecta a la duración del ciclo celular (por ejemplo, cuando se 
someten a ensayo análogos de nucleósidos). 
39. Debido a la posible citotoxicidad de las preparaciones de S9 para las células 
de mamífero cultivadas, se aplica un tratamiento con exposición prolongada 
de 1,5-2,0 ciclos celulares normales solamente en ausencia de S9. En el 
tratamiento prolongado, se ofrecen opciones que permiten el tratamiento de las células con la sustancia problema en ausencia y en presencia de citoB. Estas opciones se refieren a situaciones en que puede haber preocupación 
respecto a posibles interacciones entre la sustancia problema y la citoB. 
40. Las pautas sugeridas de tratamiento de las células se presentan en el cuadro 
1. Estas pautas generales de tratamiento pueden modificarse en función de la estabilidad o reactividad de la sustancia problema o de las características particulares de crecimiento de las células utilizadas. Todos los tratamientos 
deben iniciarse y terminarse mientras las células están en la fase de creci ­
miento exponencial. Estas pautas se presentan con más detalle en los puntos 41 a 47 siguientes.
 
Cuadro 1  
Tratamiento de las células y tiempos de recogida para el ensayo de MNvit  
Linfocitos, células primarias y líneas celula ­
res tratadas con citoB + S9 Tratar durante 3-6 horas en presencia de S9; 
retirar la fracción S9 y el medio de tratamiento; añadir medio fresco y citoB; 
recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos 
celulares normales. 
– S9 
Exposición corta Tratar durante 3-6 horas; 
retirar el medio de tratamiento; 
añadir medio fresco y citoB; 
recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos 
celulares normales.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Exposición prolon ­
gada  Opción A:  Tratar durante 1,5-2,0 ciclos celula ­
res normales en presencia de citoB; 
recoger al final del período de exposición.  
Opción B:  Tratar durante 1,5-2,0 ciclos celula ­
res normales; 
retirar la sustancia problema; 
añadir medio fresco y citoB; recoger cuando hayan pasado 1,5-2,0 ciclos 
celulares normales. 
Líneas celulares tratadas sin citoB 
(Igual que las pautas de tratamiento indicadas más arriba, salvo que no se añade citoB)
 
Linfocitos, células primarias y líneas celulares tratadas con citoB  
41. En el caso de los linfocitos, el enfoque más eficiente es iniciar la exposición 
a la sustancia problema a las 44-48 horas de la estimulación con PHA, 
cuando la sincronización del ciclo habrá desaparecido (5). En el ensayo 
inicial, se tratan las células durante 3 a 6 horas con la sustancia problema en ausencia y en presencia de S9. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco que contiene citoB, y las células se recogen 
cuando ha pasado un tiempo equivalente a 1,5-2,0 ciclos celulares normales. 
42. Si ambos ensayos iniciales de tratamiento corto (3-6 horas) son negativos o 
dudosos, se aplica un tratamiento posterior con exposición prolongada sin 
S9. Se dispone de dos opciones de tratamiento, que son igualmente acepta ­
bles. Sin embargo, podría ser más adecuado seguir la opción A en caso de 
linfocitos estimulados en que el crecimiento exponencial podría declinar a 
las 96 horas de la estimulación. Asimismo, los cultivos de células no deben haber alcanzado la confluencia en el momento del muestreo final en la opción B. 
— Opción A: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5- 
2,0 ciclos celulares normales, y se recogen al final del período de 
tratamiento. 
— Opción B: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5- 
2,0 ciclos celulares normales. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco, y las células se recogen cuando han pasado otros 1,5-2,0 ciclos celulares normales. 
43. Las células primarias y las líneas celulares deben tratarse de forma similar a 
los linfocitos, salvo que no es necesario estimularlas con PHA durante 44- 
48 horas. Las células distintas de los linfocitos deben exponerse de forma 
tal que, al final del estudio, las células estén aún en fase de crecimiento logarítmico.
 
Líneas celulares tratadas sin citoB  
44. Las células deben tratarse durante 3-6 horas en presencia y en ausencia de 
S9. El medio de tratamiento se retira y se sustituye con medio fresco, y las 
células se recogen al cabo de un tiempo equivalente a 1,5-2,0 ciclos celu ­
lares normales.  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Si ambos ensayos iniciales de tratamiento corto (3-6 horas) son negativos o 
dudosos, se aplica un tratamiento posterior con exposición prolongada (sin 
S9). Se dispone de dos opciones de tratamiento, que son igualmente acep ­
tables. 
— Opción A: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5- 
2,0 ciclos celulares normales, y se recogen al final del período de 
tratamiento. 
— Opción B: Las células se tratan con la sustancia problema durante 1,5- 
2,0 ciclos celulares normales. El medio de tratamiento se retira y se 
sustituye con medio fresco, y las células se recogen cuando han pasado 
otros 1,5-2,0 ciclos celulares normales. 
46. En las monocapas, es posible que haya células mitóticas (identificables por 
su forma redondeada y por despegarse de la superficie) al final del trata ­
miento de 3-6 horas. Como las células mitóticas se despegan con facilidad, pueden perderse cuando se retira el medio que contiene la sustancia pro ­
blema. Debe procurarse recogerlas cuando se lavan los cultivos, y devol ­
verlas a estos, para evitar la pérdida de células en mitosis, y que podrían 
presentar micronúcleos, en el momento de la recogida final.
 
Número de cultivos  
47. Los cultivos deben hacerse por duplicado con cada concentración de la 
sustancia problema y en el caso de los cultivos del vehículo o disolvente 
y del CN. Si se puede demostrar, sobre la base de datos históricos del laboratorio, que la diferencia entre los cultivos duplicados es mínima, cabe la posibilidad de que resulte aceptable un cultivo único. Si se utilizan 
cultivos únicos, se recomienda que se analice un número mayor de concen ­
traciones.
 
Recogida de las células y preparación de los portaobjetos  
48. Cada cultivo se recoge y se manipula por separado. La preparación de las 
células puede implicar un tratamiento hipotónico, pero esta fase no es 
necesaria si se consigue de otra manera una extensión adecuada de las células. Pueden usarse distintas técnicas para la preparación de los portaob ­
jetos, siempre que lleven a la obtención de preparaciones celulares de buena 
calidad para su evaluación. Debe conservarse el citoplasma celular para 
poder detectar los micronúcleos y también (si se aplica el método de blo ­
queo de la citocinesis) identificar de forma fiable las células binucleadas. 
49. Las preparaciones pueden teñirse siguiendo varios métodos, tales como la 
tinción de Giemsa o la aplicación de colorantes fluorescentes específicos del 
ADN (59). Si se emplea un colorante específico del ADN [por ejemplo, naranja de acridina (61) o Hoechst 33258 más pironina-Y (62)] pueden evitarse algunos de los artefactos que aparecen cuando se utiliza un colorante 
que no es específico del ADN. Si resulta interesante obtener información 
sobre los mecanismos implicados en su formación, para identificar el conte ­
nido (cromosoma o fragmento cromosómico) de los micronúcleos pueden utilizarse anticuerpos anti-cinetocoro, la técnica FISH con sondas pancentro ­
méricas de ADN o el etiquetado  in situ  del cebado con cebadores pancen ­
troméricos específicos, junto con una tinción de contraste adecuada del ADN (15) (16). Pueden utilizarse otros métodos para diferenciar entre clastógenos y anéugenos, siempre que se haya comprobado que son eficaces.
 
Análisis  
50. Antes de analizarlos al microscopio, se asigna un código independiente a 
todos los portaobjetos, incluidos los del disolvente o vehículo y los de los controles. Otra posibilidad es analizar las muestras codificadas utilizando un 
sistema automático de análisis de imágenes o citometría de flujo que esté 
validado.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. En los cultivos tratados con citoB, deben analizarse las frecuencias de los 
micronúcleos en al menos 2 000 células binucleadas por cada concentración 
(al menos 1 000 células binucleadas por cultivo y dos cultivos por concen ­
tración). Si se utilizan cultivos únicos, deben evaluarse al menos 2 000 células binucleadas por concentración de cada cultivo. Si para la evaluación 
a cada concentración se dispone de un número sustancialmente inferior a 
1 000 de células binucleadas por cultivo, o a 2 000 si se utiliza un cultivo único, y si no se detecta un aumento significativo de micronúcleos, debe repetirse el ensayo utilizando más células, o a concentraciones menos tóxi ­
cas, según sea más conveniente. Ha de procurarse no tener en cuenta para la 
evaluación las células binucleadas con formas irregulares o en las que los dos núcleos difieran mucho por su tamaño; tampoco deben confundirse las células binucleadas con células multinucleadas mal extendidas. Las células 
que contengan más de dos núcleos principales no deben tenerse en cuenta 
para el análisis de micronúcleos, ya que la frecuencia espontánea de mi ­
cronúcleos puede ser más elevada en estas células (63) (64). Puede acep ­
tarse incluir en la evaluación las células mononucleadas si se demuestra que 
la sustancia problema interfiere con la actividad de la citoB. 
52. En las líneas celulares sometidas a ensayo sin tratamiento con citoB, debe 
evaluarse la presencia de micronúcleos en al menos 2 000 células por 
concentración (al menos 1 000 células por cultivo y dos cultivos por con ­
centración). Cuando se utilice un cultivo único por concentración, se eva ­
luarán al menos 2 000 células de cada cultivo. 
53. Cuando se utiliza la citoB, para evaluar la proliferación celular hay que 
determinar el IPBC o el IR (véase el apéndice 2) basándose en un mínimo 
de 500 células por cultivo. Cuando se hacen los tratamientos en ausencia de citoB, es fundamental aportar pruebas de que las células que se están considerando han proliferado, como se indica en los puntos 24 a 27.
 
Criterios de aceptabilidad  
54. Los laboratorios que se propongan utilizar el ensayo de MNvit descrito en 
el presente ME deben demostrar su capacidad de detectar de forma fiable y 
exacta las sustancias de actividad aneugénica y clastogénica conocida, con y 
sin activación metabólica, así como las que se sabe que son negativas, utilizando las sustancias de referencia del apéndice 3. Para demostrar su capacidad de aplicar el presente ME correctamente, el laboratorio debe 
aportar pruebas de que las células que se evalúan para la formación de 
micronúcleos han completado una sola división nuclear si el ensayo se lleva a cabo sin utilizar citoB. 
55. Se recomienda utilizar las sustancias del apéndice 3 ·como sustancias de 
referencia. Pueden incluirse otras sustancias en lugar de las de la lista, o además de ellas, si se conoce su actividad y si inducen la formación de micronúcleos por los mismos mecanismos de acción, y si se demuestra que 
son pertinentes para las sustancias que se van a ensayar con el procedi ­
miento de MNvit. La justificación podría incluir un estudio de validación en que se haya utilizado una amplia variedad de sustancias o que se haya centrado en un espectro más reducido basado en la clase química de la 
sustancia problema o en el mecanismo del daño que se estudie. 
56. El control del disolvente o vehículo y los cultivos sin tratar deben mostrar 
de forma reproducible unas frecuencias bajas y consistentes de micronú ­
cleos (normalmente, 5-25 micronúcleos/1 000 células para los tipos de cé ­
lulas señalados en el punto 11). Es posible que otros tipos de células tengan 
diferentes rangos de respuestas, las cuales deben determinarse cuando se validen para su utilización en el ensayo de MNvit. Deben utilizarse los datos del CN, del disolvente y del CP para establecer los rangos de los 
controles históricos. Estos valores deben utilizarse en la toma de decisiones 
sobre la idoneidad de los CN o CP en paralelo para un experimento.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Si se proponen para el ensayo cambios en el protocolo que sean de poca 
importancia (por ejemplo, uso de técnicas de recuento automáticas en vez 
de manuales, uso de un nuevo tipo de células), será necesario demostrar la efectividad del cambio antes de que se pueda considerar que es aceptable la utilización del protocolo modificado. La demostración de la efectividad 
incluye la demostración de que pueden detectarse los principales mecanis ­
mos de rotura cromosómica y ganancia o pérdida de cromosomas, y de que pueden obtenerse resultados positivos y negativos apropiados para la clase de cada sustancia, o para la amplia gama de sustancias, que se van a 
ensayar.
 
DATOS E INFORME  
Tratamiento de los resultados  
58. Si se utiliza la técnica de bloqueo de la citocinesis, para la evaluación de la 
inducción de micronúcleos se emplearán solo las frecuencias de las células 
binucleadas con micronúcleos (independientemente del número de micronú ­
cleos por célula). El tener en cuenta para la evaluación cuántas células tienen uno, dos o más micronúcleos puede aportar información útil, pero 
no es obligatorio. 
59. También deben medirse en paralelo la citotoxicidad o la citostasis para 
todos los cultivos tratados y los de control del disolvente o vehículo (58). 
Los valores del IPBC y del IR deben calcularse para todos los cultivos 
tratados y de control, como medidas de retraso del ciclo celular cuando se utiliza el método de bloqueo de la citocinesis. En ausencia de citoB, debe utilizarse la DRP o el ARRC o el IP (véase el apéndice 2). 
60. Deben proporcionarse datos de cada cultivo. Además, se resumirán todos 
los datos en forma de cuadro. 
61. Las sustancias que inducen micronúcleos en el ensayo de MNvit pueden 
deber esta propiedad a su capacidad de inducir rotura cromosómica, pérdida de cromosomas, o una combinación de ambas. Para determinar si el meca ­
nismo de inducción de micronúcleos se debe a actividad clastogénica y/o 
aneugénica, pueden realizarse análisis más detallados utilizando anticuerpos 
anti-cinetocoro, sondas  in situ  específicas del centrómero, u otros métodos.
 
Evaluación e interpretación de los resultados  
62. No se requiere ninguna verificación mediante ensayos adicionales en caso 
de una respuesta positiva o negativa clara. Los resultados dudosos pueden aclararse mediante el análisis de otras 1 000 células procedentes de todos los cultivos, para mantener el carácter ciego del ensayo. Si con este enfoque 
no se resuelve el resultado, deben efectuarse más ensayos. En los siguientes 
experimentos se considerará la posibilidad de modificar los parámetros del estudio en una gama de condiciones ampliada o restringida, según proceda. Entre los parámetros del estudio que podrían modificarse figuran el espa ­
ciado entre las concentraciones del ensayo, los períodos de tratamiento y de 
recogida de las células, o las condiciones de activación metabólica. 
63. Son varios los criterios para determinar un resultado positivo, tales como un 
aumento relacionado con la concentración o un aumento estadísticamente 
significativo del número de células que presentan micronúcleos. Debe con ­
siderarse en primer lugar la importancia biológica de los resultados. Para la evaluación de la significación biológica de la respuesta puede servir de 
orientación considerar si los valores observados se encuentran dentro o 
fuera del rango del control histórico. Pueden emplearse métodos estadísticos adecuados como apoyo para evaluar los resultados del ensayo (65). Sin embargo, los resultados de las pruebas estadísticas deben evaluarse respecto 
a la relación dosis-respuesta. También deben tenerse en cuenta la reprodu ­
cibilidad y los datos históricos.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Si bien en la mayoría de los experimentos los resultados serán claramente 
positivos o negativos, en algunos casos el conjunto de datos no permitirá 
emitir un juicio definitivo sobre la actividad de la sustancia problema. Estas respuestas dudosas o cuestionables pueden darse con independencia del número de veces que se repita el experimento. 
65. Un resultado positivo en el ensayo de MNvit indica que la sustancia pro ­
blema induce roturas cromosómicas o pérdida de cromosomas en células de 
mamífero cultivadas. Un resultado negativo indica que, en las condiciones en que se realiza el ensayo, la sustancia problema no induce roturas cro ­
mosómicas ni pérdida o ganancia de cromosomas en las células de mamí ­
fero cultivadas.
 
Informe del ensayo  
66. El informe del ensayo debe incluir como mínimo la siguiente información, 
si es importante para la realización del estudio:  
Sustancia problema:  
— datos de identificación y número de registro del Chemical Abstracts 
Service y número CE, 
— naturaleza física y pureza, 
— propiedades físico-químicas importantes para la realización del estudio, — reactividad de la sustancia problema con el disolvente o vehículo o con 
el medio de cultivo de las células.  
Disolvente o vehículo:  
— justificación de la elección del disolvente o vehículo, 
— solubilidad y estabilidad de la sustancia problema en el disolvente o 
vehículo.  
Células:  
— tipo y procedencia de las células utilizadas, 
— idoneidad del tipo de células utilizado, 
— ausencia de micoplasmas, si procede, — información sobre la duración del ciclo celular, tiempo de duplicación o 
índice de proliferación, 
— en caso de que se utilicen linfocitos, indicación del sexo, edad, y nú ­
mero de los donantes de sangre, si procede, 
— en caso de que se utilicen linfocitos, si lo que se expone a la sustancia 
es la sangre completa o son los linfocitos aislados, 
— número de pases, si procede, 
— métodos de mantenimiento de los cultivos celulares, si procede, 
— número modal de cromosomas, — duración del ciclo celular normal (control negativo).  
Condiciones del ensayo:  
— identidad de la sustancia de bloqueo de la citocinesis (por ejemplo, 
citoB), si se utiliza, y su concentración, junto con la duración de la 
exposición de las células, 
— justificación de la selección de las concentraciones y del número de 
cultivos, incluidos los datos de citotoxicidad y los límites de solubilidad, 
si se dispone de ellos, 
— composición del medio, concentración de CO
 2 , si procede, 
— concentraciones de la sustancia problema,  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— concentración (y volumen) del vehículo y de la sustancia problema 
añadidos, 
— temperatura y duración de la incubación, — duración del tratamiento, — momento de la recogida tras el tratamiento, — densidad celular en el momento de la siembra, si procede, — tipo y composición del sistema de activación metabólica, incluidos los 
criterios de aceptabilidad, 
— sustancias de control positivo y controles negativos, 
— métodos de preparación de los portaobjetos y técnica de tinción utiliza ­
dos, 
— criterios para la identificación de micronúcleos, — números de células analizadas, — métodos de determinación de la citotoxicidad, — cualquier información adicional relativa a la citotoxicidad, 
— criterios empleados para considerar si los resultados de los estudios son 
positivos, negativos o dudosos, 
— métodos utilizados de análisis estadístico, — métodos, como la utilización de anticuerpos anti-cinetocoro, para carac ­
terizar si los micronúcleos contienen cromosomas completos o fragmen ­
tos, en su caso.  
Resultados:  
— parámetro utilizado para medir la citotoxicidad como, por ejemplo, 
IPBC o IR en caso de aplicación de bloqueo de la citocinesis, o ARRC, DRP o IP cuando no se aplica este bloqueo; otras observaciones perti ­
nentes como, por ejemplo, confluencia celular, apoptosis, necrosis, re ­
cuento de metafases, frecuencia de células binucleadas, 
— signos de precipitación, — datos sobre el pH y la osmolalidad del medio de tratamiento, si se han 
determinado, 
— definición de células aceptables para el análisis, 
— distribución de las células mono, bi y multinucleadas si se utiliza un 
método de bloqueo de la citocinesis, 
— número de células con micronúcleos, indicado por separado para cada 
cultivo tratado y de control, precisándose si corresponden a células binucleadas o mononucleadas, en su caso, 
— relación concentración-respuesta, cuando sea posible, 
— datos del control negativo (disolvente o vehículo) y de la sustancia de 
control positivo (concentraciones y disolventes) en paralelo, 
— datos históricos del control negativo (disolvente o vehículo) y de las 
sustancias utilizadas como control positivo, con los rangos, las medias y 
la desviación típica e intervalo de confianza (por ejemplo, 95 %), 
— análisis estadístico; valores p, si se dispone de ellos.  
Discusión de los resultados Conclusiones
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
BIBLIOGRAFÍA 
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1-4. 
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3-15. 
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233-246. 
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen. , 35, 167-172. 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084-1104. 
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus met ­
hod in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193-198. 
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34-43. 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9-20. 
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with 
biotinylated gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297-302. 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329-334. 
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a 
centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205-213. 
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519-525. 
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of 
hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocy ­
tes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using 
multicolor fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation 
Res., 322, 9-20. 
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific cen ­
tromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 
372, 233-245. 
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211-219. 
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153-163.  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OCDE (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Disponible en la dirección: [www.oecd.org/env/testguidelines] 
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13-36. 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37-60. 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61-87. 
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, 
K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, 
E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus 
test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 88-124. 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125-152. 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187-208. 
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Com ­
parative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  chromosome 
aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 45-59. 
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81-116. 
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemi ­
cally induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183-190. 
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55-71. 
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells-results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res. , 468, 137-163. 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 517, 123-134. 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569-580.  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1-152. 
(32) CEVMA (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
thein vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16-17 November, 2006. Disponible en la dirección: [http:// 
ecvam.jrc.it/index.htm] 
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Re ­
view, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, Summary 
and Conclusions of the Peer Review Panel, Disponible en la dirección: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm] 
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271-283. 
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and So ­
funi, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105-115. 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B
 1 is genotoxic in human derived he ­
patoma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257-260. 
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315-328. 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, 
R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei 
in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell 
transformation assay for National Toxicology Program test chemicals,  
Mutation Res. , 392, 61-70. 
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under ex ­
treme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147-205. 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of 
low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 297-305. 
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen. , 8, 789-886. 
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in 
lymphocytes,  Mutation Res. , 147, 29-36. 
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11-18. 
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31-45.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173-215. 
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55-65. 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175-177. 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85-88. 
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51-59. 
(50) PNUMA (2001), Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes Orgánicos 
Persistentes, Programa de las Naciones Unidas para el Medio 
Ambiente (PNUMA). Disponible en la dirección: [http://www.pops.int/do ­
cuments/convtext/convtext_sp.pdf] 
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation 
into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in 
metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 247-274. 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mu ­
tation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., 
Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. 
New York, Plenum, pp. 91-103. 
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795-801. 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detai ­
led description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35-44. 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 521, 103-112. 
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to «Report from the  in vitro  micronucleus assay working group»,  Mutation 
Res., 564, 97-100. 
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61-65. 
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1-3. 
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169-184. 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro:  
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191-201.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241-247. 
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269-275. 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation Res. , 
120, 241-247. 
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65-75. 
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467. 
(66) Reglamento (CE) n
 o 850/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
29 de abril de 2004, sobre contaminantes orgánicos persistentes y por el que se modifica la Directiva 79/117/CE, DO L 229 de 30.4.2004, p. 5.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Apéndice 1  
Definiciones  
Anéugeno:  Sustancia o proceso que, por interacción con los componentes del 
ciclo de división celular mitótica y meiótica, produce aneuploidía en células u organismos.  
Aneuploidía:  Desviación respecto al número diploide (o haploide) normal de 
cromosomas en relación con uno o varios cromosomas, pero no con dotaciones completas de cromosomas (poliploidía).  
Apoptosis:  Muerte celular programada, caracterizada por una serie de fases que 
llevan a la desintegración de las células para formar partículas limitadas por 
membranas que se eliminan a continuación por fagocitosis o por liberación.  
Proliferación celular:  Aumento del número de células como resultado de divi ­
siones celulares mitóticas.  
Centrómero:  Región del ADN de un cromosoma en la que se mantienen juntas 
las dos cromátidas y a la que se unen lateralmente los dos cinetocoros.  
Clastógeno:  Sustancia o proceso que provoca aberraciones cromosómicas estruc ­
turales en poblaciones de células u organismos.  
Citocinesis:  Proceso de división celular que sigue inmediatamente a la mitosis 
para formar dos células hijas, cada una de las cuales contiene un solo núcleo.  
Índice de proliferación con bloqueo de la citocinesis (IPBC, o CBPI, por su 
nombre en inglés):  Proporción de células de segunda división en la población 
tratada con respecto al control sin tratar (véase la fórmula en el apéndice 2).  
Citostasis:  Inhibición del crecimiento celular (véase la fórmula en el apéndice 2).  
Citotoxicidad:  Efecto nocivo para la función o la estructura celular, que provoca 
finalmente la muerte de la célula.  
Genotoxicidad:  Término general que engloba todos los tipos de daño al ADN o 
al cromosoma, incluidas roturas, reorganizaciones de aductos, mutaciones, abe ­
rraciones cromosómicas, y aneuploidía. No todos los tipos de efectos genotóxicos resultan en mutaciones o en daño cromosómico estable.  
Células en interfase:  Células que no se encuentran en fase mitótica.  
Cinetocoro:  Estructura proteínica que se encuentra en el centrómero de un cro ­
mosoma y a la cual se asocian las fibras del huso acromático durante la división celular para permitir el movimiento ordenado de los cromosomas hijos hacia los 
polos de las células hijas.  
Micronúcleos:  Núcleos pequeños, adicionales a los núcleos principales de las 
células y separados de ellos, y producidos durante la telofase de la mitosis o de la meiosis por fragmentos cromosómicos o por cromosomas enteros retarda ­
dos. 
Mitosis:  División del núcleo de la célula, generalmente formada por profase, 
prometafase, metafase, anafase y telofase.  
Índice mitótico:  Relación entre el número de células en metafase y el número 
total de células observadas en una población celular; indica el grado de prolife ­
ración celular de dicha población.  
Mutágeno:  Agente que provoca un cambio, en una o varias de las secuencias de 
pares de bases del ADN o en la estructura de los cromosomas (aberraciones 
cromosómicas), que es hereditario.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
No disyunción:  Caso en que las cromátidas emparejadas no se separan ni se 
segregan adecuadamente para repartirse entre las células hijas en formación, lo 
que provoca que las células hijas presenten un número anormal de cromosomas.  
Poliploidía:  Aberraciones cromosómicas numéricas en células u organismos que 
afectan a dotaciones completas de cromosomas, en contraste con las aberraciones que afectan solo a cromosomas individuales (aneuploidía).  
Índice de proliferación (IP):  Método de medición de la citotoxicidad cuando no 
se utiliza la citoB (véase la fórmula en el apéndice 2).  
Aumento relativo del recuento de células (ARRC, o RICC por su nombre en 
inglés):  Método de medición de la citotoxicidad cuando no se utiliza la citoB 
(véase la fórmula en el apéndice 2).  
Duplicación relativa de la población (DRP, o RPD por su nombre en inglés):  
Método de medición de la citotoxicidad cuando no se utiliza la citoB (véase la fórmula en el apéndice 2).  
Índice de replicación (IR):  Proporción de ciclos de división celular completados 
en un cultivo tratado con respecto al control sin tratar, durante el período de 
exposición y de recuperación (véase la fórmula en el apéndice 2).  
Sustancia problema (o producto químico problema):  Toda sustancia o mezcla 
sometida a ensayo con este ME.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Apéndice 2  
Fórmulas para la evaluación de la citotoxicidad  
1. Cuando se utiliza citoB,  la evaluación de la citotoxicidad debe basarse en el 
índice de proliferación con bloqueo de la citocinesis (IPBC) o en el índice de 
replicación (IR) (16) (58). El IPBC indica el número medio de ciclos celulares 
por célula durante el período de exposición a la citoB, y puede utilizarse para calcular la proliferación celular. El IR indica el número de núcleos presentes en los cultivos tratados respecto al de los cultivos de control y puede utilizarse para 
calcular el porcentaje de citostasis: 
% citostasis = 100 – 100{(IPBC
 T – 1) ÷ (IPBC  C – 1)} 
donde: T = cultivo de tratamiento de la sustancia problema C = cultivo de control del vehículo y: 
IPBC ¼
 ððn o células mononucleadas Þ þ ð2 Ü n o células binucleadas Þ þ ð3 Ü n o células multinucleadas ÞÞ 
ðnúmero total de células Þ 
Así pues, un IPBC de 1 (todas las células son mononucleadas) es equivalente al 
100 % de citostasis. 
Citostasis = 100 – IR 
IR ¼ ððn o células binucleadas Þ þ ð2 Ü n o células multinucleadas ÞÞ ö ðn o células totalesÞ T 
ððn o células binucleadas Þ þ ð2 Ü n o células multinucleadas ÞÞ ö ðn o células totalesÞ C Ü 100 
donde: 
T = cultivos tratados C = cultivos de control 
2. Así pues, un IR del 53 % significa que, respecto al número de células que 
se han dividido para formar células binucleadas y multinucleadas en el cultivo de 
control, solo el 53 % de este número se ha dividido en el cultivo tratado, es decir, hay un 47 % de citostasis. 
3. Cuando no se utiliza citoB,  se recomienda evaluar la citotoxicidad sobre la 
base del aumento relativo del recuento celular (ARRC) o de la duplicación relativa de la población (DRP) (58), ya que ambos parámetros tienen en cuenta 
la proporción de la población celular que se ha dividido. 
ARRC ¼
 ðAumento del número de células en los cultivos tratados  ðn o final – n  o inicialÞÞ 
ðAumento del número de células en los cultivos de control  ðn o final – n  o inicialÞÞ Ü 100 
DRP ¼ ðno de duplicaciones de la población en los cultivos tratados Þ 
ðno de duplicaciones de la población en los cultivos de control Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
donde: 
Duplicación de la población = [log (n  o células tras el tratamiento ÷ n  o células 
iniciales)] ÷ log 2 
4. Así pues, un ARRC o una DRP del 53 % indica un 47 % de citotoxicidad 
o citostasis. 
5. Si se utiliza el índice de proliferación (IP), es posible evaluar la citotoxi ­
cidad mediante el recuento de los clones formados por una célula (cl1), dos 
células (cl2), de tres a cuatro células (cl4) y de cinco a ocho células (cl8): 
IP ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. El IP se ha utilizado como un parámetro válido y fiable de citotoxicidad 
también para líneas celulares cultivadas  in situ  en ausencia de citoB (25) (26) 
(27) (28).  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Apéndice 3  
Sustancias de referencia recomendadas para evaluar el comportamiento  ( 1 ) 
Categoría Sustancia N  o CAS N  o CE 
1. Clastógenos activos sin activación metabólica 
Arabinósido de citosina 147-94-4 205-705-9 Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 
2. Clastógenos que necesitan activación metabólica 
Benzo(a)pireno 50-32-8 200-028-5 
Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 
3. Anéugenos 
Colchicina 64-86-8 200-598-5 Vimblastina 143-67-9 205-606-0 
4. Sustancias negativas 
Ftalato de di-(2-etilhexilo) 117-81-7 204-211-0 
Ácido nalidíxico 389-08-2 206-864-7 Pireno 129-00-0 204-927-3 Cloruro sódico 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Las sustancias de referencia son aquellas cuyo uso se recomienda. Pueden incluirse otras sustancias en lugar de las de la lis ta de 
sustancias de referencia, o además de ellas, si se conoce su actividad y si inducen la formación de micronúcleos por los mismos  meca- 
nismos de acción, y si se demuestra que son pertinentes para las sustancias que se van a ensayar con el procedimiento de MNvit.  En 
función del objetivo, la justificación podría incluir asimismo un estudio de validación en que se haya utilizado una amplia var iedad de 
sustancias o que se haya centrado en un espectro más reducido basado en la clase química de la sustancia problema o en el mecan ismo del 
daño que se estudie.  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  SENSIBILIZACIÓN CUTÁNEA: ENSAYO CON GANGLIOS 
LINFÁTICOS LOCALES: DA  
INTRODUCCIÓN 
1. Las directrices de ensayo de productos químicos de la OCDE (TG, por su 
nombre en inglés) y los métodos de ensayo de la UE se revisan periódica ­
mente en función de los avances científicos, los cambios en las necesidades 
normativas y las consideraciones de bienestar de los animales. Se ha revisado 
el primer método de ensayo (ME) para la determinación de la sensibilización cutánea con ratones, la prueba con ganglios linfáticos locales (LLNA, de su nombre en inglés, que corresponde a la TG 429 de la OCDE, capítulo B.42 
del presente anexo) (1). Se han publicado los datos de la validación del 
LLNA, así como una revisión de los trabajos asociados (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). En el LLNA, para medir la proliferación de linfocitos se utilizan timidina o yodo radioisotópicos, por lo que el ensayo tiene una utilidad 
limitada, dados los problemas que implica la adquisición, utilización y eli ­
minación de sustancias radiactivas. El LLNA: DA (desarrollado por Daicel Chemical Industries, Ltd.) es una modificación no radiactiva del LLNA, en la que se cuantifica mediante bioluminiscencia el contenido de trifosfato de 
adenosina (ATP) como indicador de la proliferación de los linfocitos. El 
método de ensayo LLNA: DA ha sido validado y examinado, y recomen ­
dado por un grupo internacional de examen por pares, que lo ha considerado útil para identificar tanto sustancias que son sensibilizantes cutáneos como 
sustancias que no lo son, con ciertas limitaciones (10) (11) (12) (13). Este 
ME está diseñado para evaluar el potencial de sensibilización cutánea de los productos químicos (sustancias y mezclas) en animales. En el capítulo B.6 del presente anexo y en la TG 406 de la OCDE se utilizan ensayos con 
cobayas, en concreto el ensayo de maximización en cobaya y el ensayo de 
Buehler (14). Tanto el LLNA (capítulo B.42 del presente anexo, TG 429 de la OCDE) como sus dos modificaciones no radiactivas, el LLNA: DA (ca ­
pítulo B.50 del presente anexo, TG 442 A de la OCDE) y el LLNA: 
BrdU-ELISA (capítulo B.51 del presente anexo, TG 422 B de la OCDE), 
suponen una ventaja respecto a los ensayos con cobayas del capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE (14) en cuanto a la reducción y refinamiento del uso de animales. 
2. El LLNA: DA, de forma similar al LLNA, estudia la fase de inducción de la 
sensibilización cutánea y proporciona datos cuantitativos adecuados para la 
evaluación de la relación dosis-respuesta. Además, su capacidad de detectar sensibilizantes cutáneos sin necesidad de utilizar el marcado radiactivo del ADN suprime la posibilidad de que haya exposición ocupacional a la ra ­
diactividad y problemas de eliminación de residuos. Esto, a su vez, permitiría 
un mayor uso de los ratones para detectar sensibilizantes cutáneos, lo que podría reducir aún más la utilización de cobayas en ensayos que determinen el potencial de sensibilización cutánea (es decir, el capítulo B.6; TG 406 de 
la OCDE) (14).
 
DEFINICIONES 
3. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.  
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
4. El LLNA: DA es un método LLNA modificado para identificar posibles 
sensibilizantes cutáneos, con limitaciones específicas. Esto no implica nece ­
sariamente que deba utilizarse en todos los casos el LLNA: DA en lugar del 
LLNA o de los ensayos con cobayas (es decir, el ME B.6, TG 406 de la 
OCDE) (14) sino que, como su valor es equivalente, el LLNA: DA puede emplearse como alternativa en la que, generalmente, los resultados positivos y negativos ya no necesitan una confirmación posterior (10) (11). Antes de 
efectuar el estudio, el laboratorio de ensayo debe considerar toda la infor ­
mación disponible sobre la sustancia problema. Tal información ha de
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
incluir la identidad y la estructura química de esta sustancia, sus propiedades 
fisicoquímicas, los resultados de cualquier otro ensayo de toxicidad  in vitro  o 
in vivo  efectuado con ella, y los datos toxicológicos disponibles sobre sus ­
tancias relacionadas estructuralmente. Es necesario sopesar esta información a fin de determinar si el LLNA: DA es apropiado para la sustancia problema 
[dada la incompatibilidad de ciertos tipos de productos químicos con el 
LLNA: DA (véase el punto 5)] y para ayudar en la selección de las dosis. 
5. El LLNA: DA es un método  in vivo , por lo que no elimina el uso de 
animales para la evaluación de la sensibilización alérgica por contacto. Sin embargo, ofrece la posibilidad de reducir el uso de animales con este obje ­
tivo, respecto al nivel exigido por los ensayos con cobayas (capítulo B.6; TG 
406 de la OCDE) (14). Además, el LLNA: DA supone un refinamiento 
sustancial (menos dolor y molestias) de la forma de utilizar animales en los ensayos de sensibilización alérgica por contacto, ya que, al contrario que los ensayos del capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE, no necesita 
que se provoquen reacciones cutáneas de hipersensibilidad. A pesar de las 
ventajas que supone el LLNA: DA con respecto al capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE (14), tiene ciertas limitaciones que pueden obligar a utilizar estos métodos (capítulo B.6 y TG 406 de la OCDE), como, por ejemplo, los 
ensayos de ciertos metales, los resultados falsos positivos que se producen 
con determinados irritantes cutáneos (como algunas sustancias de tipo ten ­
sioactivo) (6) (1 y capítulo B.42 del presente anexo) o la solubilidad de la sustancia problema. Además, las sustancias o clases químicas que contienen 
grupos funcionales de los que se haya visto que actúan como posibles 
factores de confusión (16) pueden hacer necesario el uso de ensayos con cobayas (es decir, el ME B.6 o la TG 406 de la OCDE) (14). Se ha recomendado que las limitaciones señaladas para el LLNA (1 y 
capítulo B.42 del presente anexo) se apliquen también al LLNA: DA (10). 
Además, puede que no sea apropiado recurrir al LLNA: DA para ensayar sustancias que afectan a los niveles de ATP (por ejemplo, sustancias que actúan como inhibidores del ATP) o en aquellos casos en que se vea afec ­
tada la medición exacta del contenido de ATP intracelular (por ejemplo, 
presencia de enzimas que degradan el ATP, presencia de ATP extracelular en el ganglio linfático). Dejando aparte estas limitaciones identificadas, el LLNA: DA debe ser aplicable para el ensayo de cualquier sustancia, salvo 
que esta tenga propiedades asociadas que puedan interferir con la exactitud 
del LLNA: DA. Por otra parte, debe contemplarse la posibilidad de resulta ­
dos positivos dudosos cuando se obtienen valores del índice de estimulación (IE) entre 1,8 y 2,5 (véanse los puntos 31 y 32). Esto se 
justifica por la base de datos de validación de 44 sustancias utilizando un 
IE ≥ 1,8 (véase el punto 6) de las que el LLNA: DA identificó correctamente 
la totalidad de los 32 sensibilizantes del LLNA, pero identificó incorrecta ­
mente tres de los doce productos no sensibilizantes con valores del IE entre 
1,8 y 2,5 (es decir, positivos dudosos) (10). Sin embargo, como se ha 
utilizado el mismo conjunto de datos para establecer los valores del IE y para calcular las propiedades de predicción del ensayo, los resultados indi ­
cados pueden suponer una sobreestimación de las propiedades de predicción 
reales.
 
PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
6. El principio básico del LLNA: DA es el de que los sensibilizantes inducen 
una proliferación de linfocitos en los ganglios linfáticos que drenan la zona de aplicación de la sustancia problema. Esta proliferación es proporcional a la dosis y a la potencia del alérgeno aplicado y proporciona un método 
sencillo para obtener una medida cuantitativa de la sensibilización. La pro ­
liferación se mide comparando la proliferación media de cada grupo de ensayo con la proliferación media del grupo de control tratado con el vehículo (CV). Se determina la relación entre la proliferación media obser ­
vada en cada grupo tratado y la del grupo de CV paralelo, denominada 
índice de estimulación (IE), y que debe ser ≥ 1,8 para que se pueda
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
justificar el seguir con la evaluación de la sustancia problema como posible 
sensibilizante cutáneo. Los procedimientos descritos aquí se basan en el uso 
del contenido de ATP, medido por bioluminiscencia y del que se sabe que se corresponde con el número de células vivas (17), para indicar un aumento del número de células en proliferación en los ganglios linfáticos auriculares 
(18) (19). El método de bioluminiscencia utiliza la enzima luciferasa para 
catalizar la formación de luz a partir de ATP y luciferina de acuerdo con la siguiente reacción:  
ATP + Luciferina  + O
 2
 Oxiluciferina  + AMP  + PP  i + CO  2 + Luz 
La intensidad de la luz emitida está relacionada linealmente con la concen ­
tración de ATP y se mide con un luminómetro. El ensayo con luciferina-luciferasa es un método sensible para cuantificar el ATP, utilizado en una amplia variedad de aplicaciones (20).
 
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO  
Selección de la especie animal  
7. El ratón es la especie elegida para este ensayo. Los estudios de validación 
del LLNA: DA se han efectuado exclusivamente con la cepa CBA/J, por lo 
que se considera que esta es la cepa preferida (12) (13). Se utilizan hembras jóvenes adultas, nulíparas y no preñadas. Al comienzo del estudio los ani ­
males deben tener una edad de 8 a 12 semanas; la variación del peso de los 
animales debe ser mínima, sin superar el 20 % del peso medio. También se 
podrán utilizar otras cepas y machos, si se aportan datos suficientes para demostrar que en la respuesta del LLNA: DA no existen diferencias signi ­
ficativas relacionadas con la cepa o el sexo.
 
Alojamiento y alimentación  
8. Los ratones deben alojarse en grupos (21), salvo que se aporten pruebas 
científicas adecuadas que avalen su alojamiento individual. La temperatura 
de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. Aunque la humedad relativa debe 
ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. 
Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, 
con suministro ilimitado de agua para beber.
 
Preparación de los animales  
9. Se eligen los animales al azar, se marcan para su identificación individual 
(pero no en las orejas) y se mantienen en sus jaulas al menos cinco días hasta el inicio de la administración de la sustancia, para que se aclimaten a 
las condiciones del laboratorio. Antes de iniciar el tratamiento, todos los 
animales serán examinados para comprobar que no presentan lesiones cutá ­
neas observables.
 
Preparación de las soluciones administradas  
10. Las sustancias sólidas deben disolverse o suspenderse en disolventes o ve ­
hículos y diluirse, cuando proceda, antes de aplicarse a la oreja del ratón. Las sustancias líquidas pueden aplicarse puras o diluidas antes de su adminis ­
tración. Las sustancias insolubles, como las que se ven generalmente en los 
productos sanitarios, deben someterse a extracción forzada en un disolvente apropiado con el fin de recoger todos los componentes extraíbles para el ensayo antes de efectuar la aplicación a la oreja del ratón. Las soluciones 
problema deben prepararse cada día, salvo que mediante datos de estabilidad 
se demuestre que es posible conservarlas.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Verificación de la fiabilidad  
11. Se utilizan sustancias de control positivo (CP) para demostrar que el ensayo 
funciona apropiadamente, respondiendo con la sensibilidad adecuada y re ­
producible cuando se aplica una sustancia problema sensibilizante de la que se ha caracterizado bien la magnitud de la respuesta. Se recomienda la inclusión de un CP en paralelo porque demuestra la competencia del labo ­
ratorio para efectuar con éxito cada ensayo y permite la evaluación de la 
reproducibilidad y comparabilidad intra e interlaboratorios. Por otra parte, ciertas autoridades normativas requieren la utilización de un CP en cada estudio, por lo que se aconseja a los usuarios que consulten con las autori ­
dades competentes antes de efectuar el LLNA: DA. En consecuencia, se 
recomienda el uso sistemático de un CP en paralelo para evitar la necesidad, que podría surgir del uso de un CP periódico, de tener que efectuar ensayos adicionales con animales para cumplir los requisitos (véase el punto 12). El 
CP debe dar una respuesta positiva en el LLNA: DA con un nivel de 
exposición calculado para producir un aumento del IE ≥ 1,8 con respecto 
al grupo de control negativo (CN). La dosis del control positivo debe ser tal que no provoque un exceso de irritación cutánea ni toxicidad sistémica, y 
que la inducción sea reproducible pero no excesiva (por ejemplo, un IE > 10 
se consideraría excesivo). Los CP preferidos son aldehído hexilcinámico (n
 o del Chemical Abstracts Service [CAS] 101-86-0) y eugenol (n  o CAS 
97-53-0), ambos al 25 % en acetona: aceite de oliva (4:1, v/v). Puede haber 
circunstancias en que sea posible utilizar otros controles positivos, mediante 
una justificación adecuada y siempre que se cumplan los criterios antes mencionados. 
12. Aunque se recomienda la inclusión de un grupo de CP en paralelo, puede 
haber situaciones en que sea adecuado hacer ensayos periódicos (es decir, a 
intervalos ≤ 6 meses) del control positivo en caso de laboratorios que efec ­
túan regularmente el LLNA: DA (es decir, lo efectúan con una frecuencia no inferior a una vez al mes) y tienen una base de datos de CP históricos que 
demuestra la capacidad del laboratorio para obtener resultados reproducibles 
y exactos con dichos controles. El laboratorio puede demostrar que tiene la competencia adecuada para realizar el LLNA: DA mediante la obtención constante de resultados positivos con los CP en al menos diez ensayos 
independientes llevados a cabo en un plazo razonable (es decir, de menos 
de un año). 
13. Debe incluirse un grupo de CP en paralelo siempre que haya un cambio de 
procedimiento del LLNA: DA (por ejemplo, cambio del personal cualificado, 
cambio de los materiales o reactivos utilizados en el método de ensayo, 
cambio en el equipo analítico, cambio en el origen de los animales), y tales cambios deben documentarse en los informes del laboratorio. Debe prestarse atención al efecto de estos cambios sobre la idoneidad de la base de datos 
históricos previamente establecida cuando se deba decidir si es necesario 
establecer una nueva base de datos históricos para documentar la constancia de los resultados sobre los controles positivos. 
14. Los investigadores no deben olvidar que la decisión de realizar un estudio con 
controles positivos de forma periódica en lugar de en paralelo tiene consecuen ­
cias sobre la idoneidad y aceptabilidad de los resultados negativos obtenidos en ensayos efectuados sin control positivo en paralelo en el intervalo entre dos estudios periódicos con control positivo. Por ejemplo, si se obtiene un resultado 
falso negativo en un estudio con control positivo periódico, es posible dudar de 
los resultados negativos obtenidos con las sustancias problema en el intervalo transcurrido entre el último estudio con control positivo periódico aceptable y el estudio con control positivo periódico inaceptable. Las consecuencias de estos 
resultados deben sopesarse cuidadosamente a la hora de decidir si se incluye un 
control positivo en paralelo o si solo se hace de forma periódica. Debe consi ­
derarse igualmente el uso de menos animales en el grupo de control positivo en paralelo cuando esté justificado científicamente y si el laboratorio demuestra, 
sobre la base de datos históricos propios del laboratorio, que es posible utilizar 
menos ratones (22).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Aunque el producto utilizado como CP debe someterse al ensayo en un 
vehículo conocido por provocar una respuesta uniforme (por ejemplo, ace ­
tona: aceite de oliva; 4:1, v/v), puede haber ciertas situaciones legales en las que también sea necesario utilizar un vehículo no estándar (formulación relevante desde el punto de vista clínico o químico) (23). Si para el CP 
en paralelo se utiliza un vehículo diferente del de la sustancia problema, 
debe incluirse un CV aparte para el CP en paralelo. 
16. En los casos en que se evalúen sustancias de una clase química o gama de 
respuestas específica, puede ser útil también emplear sustancias de evalua ­
ción comparativa para demostrar que el método de ensayo funciona adecua ­
damente en cuanto a la detección del potencial de sensibilización cutánea de 
estos tipos de sustancias. Para ser adecuadas, las sustancias de evaluación 
comparativa deben presentar las siguientes propiedades: 
— similitud estructural y funcional con la clase de la sustancia problema que 
se está evaluando, 
— características físicas y químicas conocidas, — datos de apoyo procedentes del LLNA: DA, — datos de apoyo procedentes de otros modelos animales o de seres huma ­
nos.
 
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO  
Número de animales y niveles de dosis  
17. Se utilizará un mínimo de cuatro animales por grupo de dosis, con un 
mínimo de tres concentraciones de la sustancia problema, más un grupo 
de control negativo (CN) en paralelo tratado solo con el vehículo utilizado para la sustancia problema y un control positivo (CP) (en paralelo o reciente, según la estrategia del laboratorio en relación con los puntos 11 a 15). Debe 
estudiarse la posibilidad de utilizar varias dosis del CP, sobre todo cuando 
este se someta a ensayo de forma intermitente. Excepto por la ausencia de tratamiento con la sustancia problema, los animales de los grupos de control deben ser manejados y tratados de manera idéntica a la utilizada con los 
animales de los grupos tratados. 
18. La elección de las dosis y del vehículo debe basarse en las recomendaciones 
que se recogen en las referencias (2) y (24). Normalmente se eligen dosis consecutivas a partir de una serie adecuada de concentraciones, como 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. La elección de la serie de 
concentraciones utilizada debe justificarse científicamente. Para seleccionar 
las tres concentraciones consecutivas, ha de tenerse en cuenta toda la infor ­
mación toxicológica (por ejemplo, sobre toxicidad aguda e irritación cutánea) y la información estructural y fisicoquímica existente de que se pueda dis ­
poner respecto a la sustancia problema (o sustancias relacionadas estructu ­
ralmente con ella), de forma que la concentración más alta logre la máxima exposición evitando a la vez la toxicidad sistémica y la excesiva irritación cutánea local (24) (25). A falta de tal información, puede ser necesario 
realizar un ensayo inicial de cribado previo (véanse los puntos 21 a 24). 
19. El vehículo no debe interferir con el resultado del ensayo ni sesgarlo, y debe 
seleccionarse con el propósito de maximizar la solubilidad para conseguir la mayor concentración posible y de obtener a la vez una solución o suspensión que sea adecuada para la aplicación de la sustancia problema. Los vehículos 
recomendados son acetona: aceite de oliva (4:1, v/v),  N,N -dimetilformamida, 
metil-etil-cetona, propilenglicol y dimetilsulfóxido (6), pero se pueden utili ­
zar otros si se aporta una justificación científica suficiente. En determinadas situaciones, puede ser necesario utilizar un disolvente relevante desde el 
punto de vista clínico o la formulación comercial en que se vende la sus ­
tancia analizada, como control adicional. Se tendrá especial cuidado en velar por que las sustancias hidrófilas se incorporen a un sistema de vehículo que humedezca la piel y no se escurra inmediatamente, mediante la incorporación 
de los solubilizadores adecuados (por ejemplo, Pluronic® L92 al 1 %). Por 
tanto, se evitarán los vehículos totalmente acuosos.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. El estudio de los ganglios linfáticos de cada uno de los ratones permite 
evaluar la variabilidad interanimales y comparar estadísticamente la diferen ­
cia entre las mediciones efectuadas en el grupo de la sustancia problema y las efectuadas en el grupo de CV (véase el punto 33). Además, se puede evaluar la posibilidad de reducir el número de ratones del grupo de CP 
solamente cuando se toman datos de los distintos animales (22). Por otra 
parte, ciertas autoridades normativas exigen la recogida de datos de cada animal. La recogida periódica de datos de cada animal aporta una ventaja en cuanto al bienestar de los animales al evitar la duplicación de ensayos, 
que podrían ser necesarios si los resultados sobre la sustancia problema 
recogidos inicialmente de una manera (por ejemplo, por datos de conjuntos de animales) tuvieran que ser considerados posteriormente por las autorida ­
des normativas con otros requisitos (por ejemplo, de datos de cada animal).
 
Ensayo de cribado previo  
21. A falta de información para determinar la dosis máxima que se debe utilizar 
en el ensayo (véase el punto 18), hay que efectuar un ensayo de cribado previo a fin de definir el nivel adecuado de dosis para el LLNA: DA. La 
finalidad del ensayo de cribado previo es orientar para la selección del nivel 
máximo de dosis que debe utilizarse en el estudio LLNA: DA principal, en caso de que no se disponga de información sobre la concentración que 
induce toxicidad sistémica (véase el punto 24) o excesiva irritación cutánea 
local (véase el punto 23). El nivel máximo de dosis para este ensayo debe ser del 100 % de la sustancia problema en caso de líquidos, o la mayor concen ­
tración posible en caso de sólidos o suspensiones. 
22. El ensayo de cribado previo se realiza bajo las mismas condiciones que el 
estudio LLNA: DA principal, con la diferencia de que no hay evaluación de la proliferación en los ganglios linfáticos y de que pueden utilizarse menos 
animales por grupo de dosis. Se sugiere emplear uno o dos animales por 
grupo de dosis. Todos los ratones deben observarse diariamente para detectar posibles signos de toxicidad sistémica o irritación local en el punto de apli ­
cación. Los pesos corporales se registran al inicio del ensayo y antes de que 
termine (día 8). Se observan ambas orejas de cada ratón, para detectar 
eventuales eritemas, y se puntúan según el cuadro 1 (25). Se mide el espesor de la oreja con un calibrador de espesores (por ejemplo, de micrómetro digital o calibrador de espesores de escala circular de Peacock) el día 1 
(antes de la administración), el día 3 (unas 48 horas tras la administración 
de la primera dosis), el día 7 (24 horas antes del final) y el día 8. Además, el día 8 se puede medir el espesor de la oreja determinando el peso de un bocado de la misma, obtenido con un sacabocados después del sacrificio 
compasivo de los animales. La excesiva irritación local viene indicada por 
una puntuación de eritema ≥ 3 o por un aumento del espesor de la oreja ≥ 
25 % cualquiera de los días de medición (26) (27). La dosis máxima selec ­
cionada para el estudio LLNA: DA principal será la dosis inmediatamente 
inferior a la que, dentro de la serie de concentraciones del ensayo de cribado 
previo (véase el punto 18), induce toxicidad sistémica o excesiva irritación cutánea local.
 
Cuadro 1  
Puntuación del eritema  
Observación Puntuación  
Sin eritema 0 
Eritema muy leve (apenas perceptible) 1 Eritema bien definido 2
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Observación Puntuación  
Eritema de moderado a intenso 3 
Eritema intenso (rojo de remolacha) o formación de escaras que impide la 
clasificación del eritema 4 
23. Además de un aumento del 25 % del espesor de la oreja (26) (27), también 
se ha utilizado para señalar irritantes en el LLNA un aumento estadística ­
mente significativo del espesor de la oreja de los ratones tratados respecto a los ratones de control (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Sin embargo, 
aunque puede haber aumentos del espesor de la oreja inferiores al 25 % 
que sean estadísticamente significativos, estos no se han asociado específi ­
camente con una irritación excesiva (30) (31) (32) (33) (34). 
24. Las siguientes observaciones clínicas pueden indicar toxicidad sistémica (35) 
cuando forman parte de una evaluación integrada y, por tanto, pueden indicar el nivel máximo de dosis que debe utilizarse en el LLNA: DA principal: 
cambios en la función del sistema nervioso (por ejemplo, piloerección, ata ­
xia, temblores y convulsiones), cambios en el comportamiento (por ejemplo, agresividad, cambios en las actividades de limpieza, cambio marcado en el nivel de actividad), cambios en las pautas respiratorias (es decir, cambios en 
la frecuencia e intensidad de la respiración, tales como disnea, jadeos y 
estertores), y cambios en el consumo de agua y comida. También deben tenerse en cuenta en la evaluación los eventuales signos de letargo o ausen ­
cia de respuesta a estímulos, los signos clínicos de dolor o sufrimiento que 
no sean ligeros o momentáneos, y la reducción > 5 % del peso corporal 
desde el día 1 al día 8, así como la mortalidad. Los animales moribundos o que presenten signos de dolor o de sufrimiento intenso deben sacrificarse de forma compasiva (36).
 
Calendario experimental del estudio principal  
25. El calendario experimental del ensayo es el siguiente: 
— Día 1:  Se identifica cada animal y se toma nota de su peso, así como de 
las eventuales observaciones clínicas. Se aplica al dorso de cada oreja 
una solución acuosa de laurilsulfato de sodio (LSS) al 1 %, utilizando un 
pincel impregnado con la solución de LSS de modo que con cuatro o cinco pinceladas se cubra todo el dorso de cada oreja. Una hora tras la aplicación del LSS, se aplican en el dorso de cada oreja 25 μL de la 
dilución apropiada de la sustancia problema, del vehículo solo o del 
control positivo (en paralelo o reciente, según la estrategia del laborato ­
rio en relación con los puntos 11 a 15). 
— Días 2, 3 y 7:  Se repite el procedimiento de aplicación efectuado el día 
1, con aplicación previa de la solución acuosa de LSS al 1 %, seguida de 
la aplicación de la sustancia problema. 
— Días 4, 5 y 6:  Sin tratamiento. 
— Día 8:  Se toma nota del peso de cada animal, así como de las eventuales 
observaciones clínicas. Unas 24 o 30 horas tras el inicio de la aplicación 
del día 7, se sacrifican los animales de forma compasiva. Se extirpan los 
ganglios linfáticos auriculares de cada oreja de los ratones y se ponen en solución amortiguadora de fosfato (PBS), separando los de cada animal. En la referencia (22) se recogen los detalles y diagramas de la identifi ­
cación y disección de los ganglios linfáticos. Para seguir mejor la res ­
puesta cutánea local en el estudio principal, pueden incluirse en el pro ­
tocolo del estudio parámetros adicionales, tales como la puntuación del eritema auricular o las medidas del espesor de la oreja (obtenidas con un 
calibrador de espesor, o determinando el peso de un bocado de la oreja, 
en la autopsia).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Preparación de las suspensiones celulares  
26. De cada ratón se prepara una suspensión de células sueltas de los ganglios 
linfáticos extirpados bilateralmente colocando los ganglios linfáticos entre 
dos portaobjetos de vidrio y aplicando una presión ligera, para aplastarlos. Tras confirmar que el tejido se ha extendido finamente, se separan los dos portaobjetos. Se suspende en LSS el tejido presente en ambos portaobjetos, 
poniéndolos en ángulo sobre una placa Petri y lavando con PBS, separando a 
la vez el tejido del portaobjetos con un raspador celular. Por otra parte, como los ganglios linfáticos de los animales del CN son pequeños, es importante extremar el cuidado para evitar la aparición de efectos artificiales en los 
valores del IE. Para el lavado de ambos portaobjetos debe utilizarse un 
volumen total de 1 mL de PBS. La suspensión de células de los ganglios linfáticos en la placa Petri debe homogeneizarse ligeramente con el raspador celular. Se toma a continuación con una micropipeta una alícuota de 20 μL 
de esta suspensión, procurando no incluir la membrana, visible a simple 
vista, y se mezcla después con 1,98 mL de PBS para obtener una muestra de 2 mL. Después se prepara otra muestra de 2 mL siguiendo el mismo procedimiento, de forma que de cada animal se obtienen dos muestras.
 
Determinación de la proliferación celular (medición del contenido de ATP de 
los linfocitos)  
27. Los aumentos del contenido de ATP en los ganglios linfáticos se miden con 
el método de la luciferina/luciferasa, utilizando un juego de medición de 
ATP, que mide la bioluminiscencia en unidades relativas de luminiscencia (URL). El tiempo transcurrido entre el momento del sacrificio 
de los animales y la medición del contenido de ATP de cada animal deber 
ser uniforme, y no sobrepasar aproximadamente los 30 minutos, porque se considera que el contenido de ATP va disminuyendo gradualmente según transcurre el tiempo a partir del sacrificio de los animales (12). Así pues, la 
serie de operaciones desde la extracción de los ganglios linfáticos auriculares 
hasta la medición del ATP debe efectuarse en el plazo de 20 minutos, siguiendo una pauta temporal preestablecida, que será la misma con todos los animales. Se debe medir la luminiscencia del ATP en cada muestra de 2 
mL, de forma que de cada animal se efectúan dos mediciones del ATP. A 
continuación se determina la luminiscencia media del ATP, que es el valor utilizado para los cálculos posteriores (véase el punto 30).
 
OBSERVACIONES  
Observaciones clínicas  
28. Al menos una vez al día se realizará una observación minuciosa de cada 
animal en busca de signos clínicos, bien de irritación local en el punto de 
aplicación o bien de toxicidad sistémica. Todas las observaciones se regis ­
trarán sistemáticamente en fichas individuales de cada animal. Los planes de seguimiento deben incluir criterios para detectar rápidamente a los ratones que presenten toxicidad sistémica, excesiva irritación cutánea local o corro ­
sión cutánea, a fin de someterlos a sacrificio compasivo (36).
 
Pesos corporales  
29. Como se indica en el punto 25, hay que medir el peso corporal de cada 
animal al empezar el ensayo y en la fecha prevista para el sacrificio com ­
pasivo.  
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS 
30. Los resultados de cada grupo de tratamiento se expresan como IE medio. El 
IE se obtiene dividiendo la media de los valores de URL de los ratones dentro de cada grupo tratado con la sustancia problema y la del grupo de control positivo (CP), por la media de los valores de URL de los ratones del 
grupo de control del vehículo (CV) o disolvente. El IE medio del CV es 
entonces la unidad.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. En el proceso de toma de decisiones se considera que un resultado es 
positivo si el IE es ≥ 1,8 (10). Sin embargo, la fuerza de la relación 
dosis-respuesta, la significación estadística y la coherencia de las respuestas de los grupos de disolvente o vehículo y CP pueden utilizarse también a la hora de determinar si un resultado dudoso (es decir, con un valor del IE entre 
1,8 y 2,5) se declara positivo (2) (3) (37). 
32. En caso de una respuesta positiva dudosa, con un IE entre 1,8 y 2,5, es 
posible que los usuarios deseen considerar información adicional, tal como la 
relación dosis-respuesta, las pruebas de toxicidad sistémica o de irritación excesiva, y, en su caso, la significación estadística, junto con los valores del IE para confirmar si tales resultados son positivos (10). Deben tenerse tam ­
bién en cuenta diversas propiedades de la sustancia problema, por ejemplo si 
está relacionada estructuralmente con sensibilizantes cutáneos conocidos, si produce excesiva irritación cutánea en el ratón, y la naturaleza de la relación dosis-respuesta observada. Estas y otras consideraciones se comentan con 
detalle en otro lugar (4). 
33. La recogida de datos de cada ratón permite el análisis estadístico de los datos 
para la presencia y grado de la relación dosis-respuesta. Toda valoración 
estadística puede incluir una evaluación de la relación dosis-respuesta, así como comparaciones adecuadamente ajustadas de los grupos de ensayo (por ejemplo, comparaciones por parejas entre grupos tratados y grupos paralelos 
de control de disolvente o vehículo). Los análisis estadísticos pueden incluir, 
por ejemplo, la regresión lineal o la prueba de William para evaluar las tendencias de la relación dosis-respuesta, y la prueba de Dunnett para hacer comparaciones por parejas. Para elegir el método de análisis estadístico 
adecuado, el investigador debe conocer las posibles desigualdades de las 
varianzas y otros problemas asociados, que pueden exigir una transformación de los datos o el uso de un análisis estadístico no paramétrico. En cualquier caso, es posible que el investigador tenga que efectuar cálculos del IE y 
análisis estadísticos con y sin algunos puntos de datos (a veces llamados 
«valores atípicos»).
 
DATOS E INFORME  
Datos  
34. Los datos deben resumirse en forma de cuadro, con indicación de los valores 
de URL de cada animal, la media de los valores de URL de los animales del grupo, su término del error asociado (por ejemplo, DT, EEM), y el IE medio 
de cada grupo tratado con la sustancia problema, comparado con el del grupo 
paralelo de control del disolvente o vehículo.
 
Informe del ensayo  
35. El informe del ensayo contendrá la siguiente información: 
Sustancias problema y de control: 
— datos de identificación [por ejemplo, números CAS y CE (si se conocen), 
origen, pureza, impurezas conocidas, número de lote], 
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, volatilidad, 
estabilidad, solubilidad), 
— si se trata de una mezcla, composición y porcentajes relativos de sus 
componentes. 
Disolvente o vehículo: 
— datos de identificación [pureza, concentración (en su caso), volumen 
utilizado], 
— justificación de la elección del vehículo.  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Animales de experimentación: 
— procedencia de los ratones CBA, — situación microbiológica de los animales, cuando se conozca, — número y edad de los animales, — procedencia de los animales, condiciones de alojamiento, dieta, etc. 
Condiciones del ensayo: 
— origen del juego de medición del ATP, su número de lote y los datos del 
control o garantía de calidad de su fabricante, 
— detalles de la preparación y aplicación de la sustancia problema, 
— justificación de las dosis elegidas (con los resultados del ensayo de 
cribado previo, si se ha efectuado), 
— concentraciones empleadas del vehículo y de la sustancia problema, y 
cantidad total de sustancia problema aplicada, 
— detalles de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo u origen de 
la dieta y el origen del agua), 
— descripción detallada de las pautas de tratamiento y toma de muestras, 
— métodos de determinación de la toxicidad, — criterios para considerar los estudios positivos o negativos, — detalles sobre las eventuales desviaciones del protocolo y explicación 
sobre cómo afectan estas al diseño y a los resultados del estudio. 
Verificación de la fiabilidad: — resumen de los resultados de la última verificación de la fiabilidad re ­
alizada, con información sobre la sustancia problema, la concentración y el vehículo utilizados, 
— datos de los CP en paralelo o históricos y de los CN (disolvente o 
vehículo) en paralelo del laboratorio que realiza el ensayo, 
— si no se ha incluido un CP en paralelo, la fecha y el informe de labo ­
ratorio del CP periódico más reciente y un informe donde se especifiquen 
los datos de los CP históricos del laboratorio, para justificar la ausencia de un CP en paralelo. 
Resultados: — peso de cada ratón al inicio del tratamiento y en la fecha prevista para el 
sacrificio, así como la media y el término del error asociado (por ejem ­
plo, DT, EEM) de cada grupo tratado, 
— cronología del inicio y signos de toxicidad, incluida la irritación cutánea 
en el punto de administración para cada animal, en su caso, 
— momento del sacrificio del animal y momento de la medición del ATP de 
cada animal, 
— un cuadro con los valores de URL y del IE de cada ratón, dentro de cada 
grupo de tratamiento, 
— la media y el término del error asociado (por ejemplo, DT, EEM) de los 
valores de URL/ratón de cada grupo de tratamiento y los resultados del 
análisis de los valores atípicos de cada grupo de tratamiento,
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— el valor del IE calculado y una medida adecuada de la variabilidad que 
tenga en cuenta la variabilidad interanimales tanto en los grupos de la 
sustancia problema como en los de control, 
— la relación dosis-respuesta, 
— el análisis estadístico, en su caso. 
Discusión de los resultados: — un breve comentario sobre los resultados, el análisis de la relación 
dosis-respuesta y los análisis estadísticos, en su caso, con la conclusión 
de si la sustancia problema debe ser considerada o no un sensibilizante 
cutáneo.
 
BIBLIOGRAFÍA 
(1) OCDE ( 2010 ), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponible 
en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol. , 34, 999-1002. 
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol. , 34, 985-997. 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327-333. 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins.  Toxicol. , 146, 49-59. 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Disponible en la direc ­
ción: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258-273. 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274-286. 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249-257. 
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioac ­
tive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences. Disponible en la dirección: [http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Upda ­
ted validation status of new versions and applications of the murine local 
lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNA ­
PRPRept2009.pdf]. 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Charac ­
terization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. 
Meth. , 58, 1-10. 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. 
(2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11-26. 
(14) OCDE (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines] 
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol. , 46, 1896-1904. 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Phar ­
macol. , 55, 90-96. 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth. , 160, 81-88. 
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth. , 72, 127-132. 
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacte ­
rial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27-34. 
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly  ►
C1 luciferasa ◄ in ATP-related assays 
of biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol. , 305, 346-370. 
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press. 
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Disponible 
en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf] 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol. , 238, 71-89. 
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol. , 93, 13-31. 
(25) OCDE (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponible en la direc ­
ción: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235. 
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: [http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol. , 21, 195-206. 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  To­
xicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83-94. 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245-256. 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol. , 22, 491-506. 
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and 
Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol. , 212, 
60-68. 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol. , 79, 721-728. 
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect. , 115, 
1023-1028. 
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Disponible en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ acutetox/Tox_workshop.htm] 
(36) OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53 563-79. 
(38) OCDE (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , En­
vironment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment 
No. 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Paris. Disponible en la direc ­
ción: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES  
Exactitud:  Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de 
ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del com ­
portamiento del método de ensayo y es un aspecto de su pertinencia. Este término y el de «concordancia» se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo (38).  
Sustancia de evaluación comparativa:  Sustancia sensibilizante o no sensibilizante 
utilizada como patrón de comparación con una sustancia problema. Las sustan ­
cias de evaluación comparativa deben presentar las siguientes propiedades: i) fuente de procedencia coherente y fiable, ii) similitud estructural y funcional con la clase de las sustancias problema, iii) características fisicoquímicas cono ­
cidas, iv) datos de apoyo sobre los efectos conocidos, y v) potencia conocida en 
la gama de respuestas deseada.  
Falso negativo:  ►
C1 Sustancia problema identificada incorrectamente ◄ como 
negativa o inactiva por un método de ensayo, cuando en realidad es positiva o activa.  
►
C1 Falso positivo:  Sustancia problema identificada incorrectamente ◄ como 
positiva o activa por un ensayo, cuando en realidad es negativa o inactiva.  
Peligro:  Posibilidad de que se dé un efecto adverso sobre la salud o el medio 
ambiente. El efecto adverso se manifiesta solamente si hay un nivel suficiente de 
exposición.  
Reproducibilidad interlaboratorios:  Medida del grado en que diferentes labora ­
torios cualificados, utilizando el mismo protocolo y sometiendo a ensayo las mismas sustancias problema, pueden proporcionar resultados cualitativa y cuan ­
titativamente similares. La reproducibilidad interlaboratorios se determina durante 
los procesos de prevalidación y validación, e indica el grado en que un ensayo 
puede transferirse con éxito entre laboratorios; se denomina también reproduci ­
bilidad entre laboratorios (38).  
Reproducibilidad intralaboratorios:  Determinación del grado en que personas 
cualificadas del mismo laboratorio pueden repetir con éxito los resultados en 
momentos diferentes, utilizando un protocolo especificado. También se denomina 
reproducibilidad dentro del laboratorio (38).  
Valor atípico:  Una observación que es muy diferente de los otros valores en una 
muestra aleatoria de una población.  
Garantía de calidad:  Proceso de gestión por el que personas independientes de 
las que efectúan el ensayo evalúan el cumplimiento de las normas, los requisitos y los procedimientos de registro por parte de los ensayos de laboratorio, así como 
la exactitud de los datos transferidos.  
Fiabilidad:  Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de 
forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproduci ­
bilidad intra e interlaboratorios (38).  
Sensibilización cutánea:  Proceso inmunológico que se observa cuando un indi ­
viduo predispuesto sufre una exposición tópica a una sustancia alergénica induc ­
tora, la cual provoca una respuesta inmunitaria cutánea que puede llevar a la 
aparición de sensibilización por contacto.  
Índice de estimulación (IE):  Valor calculado para evaluar el potencial de sensi ­
bilización cutánea de una sustancia problema y que es la relación entre la pro ­
liferación en los grupos tratados y la del grupo de control del vehículo en 
paralelo.  
Sustancia problema (o producto químico problema):  Toda sustancia o mezcla 
sometida a ensayo con este ME.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  SENSIBILIZACIÓN CUTÁNEA: ENSAYO CON GANGLIOS 
LINFÁTICOS LOCALES: BrdU-ELISA  
INTRODUCCIÓN 
1. Las directrices de ensayo de productos químicos de la OCDE (TG, por su 
nombre en inglés) y los métodos de ensayo de la UE se revisan periódica ­
mente en función de los avances científicos, los cambios en las necesidades 
normativas y las consideraciones de bienestar de los animales. Se ha revi ­
sado el primer método de ensayo (ME) para la determinación de la sensi ­
bilización cutánea con ratones, la prueba con ganglios linfáticos locales (LLNA, de su nombre en inglés, que corresponde a la TG 429 de la OCDE, 
capítulo B.42 del presente anexo) (1). Se han publicado los datos de la 
validación del LLNA y una revisión de los trabajos relacionados (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). En el LLNA, para medir la proliferación de linfocitos se utilizan timidina o yodo radioisotópicos, por lo que el ensayo tiene una 
utilidad limitada, dados los problemas que implica la adquisición, utiliza ­
ción y eliminación de sustancias radiactivas. El LLNA: BrdU-ELISA (en ­
sayo de inmunoabsorción enzimática) es una modificación no radiactiva del LLNA que utiliza 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) sin marcado radiactivo 
(n
 o del Chemical Abstracts Service [CAS] 59-14-3) en un sistema de ensayo 
basado en el ELISA, para medir la proliferación de los linfocitos. El método de ensayo LLNA: BrdU-ELISA ha sido validado y examinado, y recomen ­
dado por un grupo internacional de científicos independientes de examen 
por pares, que lo ha considerado útil para identificar tanto sustancias que 
son sensibilizantes cutáneos como sustancias que no lo son, con ciertas limitaciones (10) (11) (12). Este ME está diseñado para evaluar el potencial de sensibilización cutánea de los productos químicos (sustancias y mezclas) 
en animales. En el capítulo B.6 del presente anexo y en la TG 406 de la 
OCDE se utilizan ensayos con cobayas, en concreto el ensayo de maximi ­
zación en cobaya y el ensayo de Buehler (13). Tanto el LLNA (capítulo B.42 del presente anexo, TG 429 de la OCDE) como sus dos modificacio ­
nes no radiactivas, el LLNA: BrdU-ELISA (capítulo B.51 del presente 
anexo, TG 422B de la OCDE) y el LLNA: DA (capítulo B.50 del presente anexo, TG 442A de la OCDE), suponen una ventaja respecto a los ensayos con cobayas del capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE (13) en cuanto a la 
reducción y refinamiento del uso de animales. 
2. El LLNA: BrdU-ELISA, de forma similar al LLNA, estudia la fase de 
inducción de la sensibilización cutánea y proporciona datos cuantitativos 
adecuados para la evaluación de la relación dosis-respuesta. Además, su 
capacidad de detectar sensibilizantes cutáneos sin la necesidad de utilizar el marcado radiactivo del ADN suprime la posibilidad de que haya expo ­
sición ocupacional a la radiactividad y problemas de eliminación de resi ­
duos. Esto, a su vez, permitiría un mayor uso de los ratones para detectar sensibilizantes cutáneos, lo que podría reducir aún más la utilización de cobayas en ensayos que determinen el potencial de sensibilización cutánea 
(es decir, el capítulo B.6; TG 406 de la OCDE) (13).
 
DEFINICIONES 
3. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.  
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
4. El LLNA: BrdU-ELISA es un método LLNA modificado para identificar 
posibles sensibilizantes cutáneos, con limitaciones específicas. Esto no im ­
plica necesariamente que deba utilizarse en todos los casos el LLNA: 
BrdU-ELISA en lugar del LLNA o de los ensayos con cobayas (es decir, 
el ME B.6, TG 406 de la OCDE) (13) sino que, como su valor es equiva ­
lente, el LLNA: BrdU-ELISA puede emplearse como alternativa en la que, generalmente, los resultados positivos y negativos ya no necesitan una 
confirmación posterior (10) (11). Antes de efectuar el estudio, el laboratorio 
de ensayo debe considerar toda la información disponible sobre la sustancia
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
problema. Tal información ha de incluir la identidad y la estructura química 
de esta sustancia, sus propiedades fisicoquímicas, los resultados de cual ­
quier otro ensayo de toxicidad  in vitro  o in vivo  efectuado con ella, y los 
datos toxicológicos disponibles sobre sustancias relacionadas estructural ­
mente. Es necesario sopesar esta información a fin de determinar si el 
LLNA: BrdU-ELISA es apropiado para la sustancia problema [dada la 
incompatibilidad de ciertos tipos de productos químicos con el LLNA: BrdU-ELISA (véase el punto 5)] y para ayudar en la selección de las dosis. 
5. El LLNA: BrdU-ELISA es un método  in vivo , por lo que no eliminará el 
uso de animales para la evaluación de la sensibilización alérgica por con ­
tacto. Sin embargo, ofrece la posibilidad de reducir el uso de animales con 
este objetivo, respecto al nivel exigido por los ensayos con cobayas (capí ­
tulo B.6; TG 406 de la OCDE) (13). Además, el LLNA: BrdU-ELISA supone un refinamiento sustancial de la forma de utilizar animales en los ensayos de sensibilización alérgica por contacto, ya que, al contrario que los 
ensayos del capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE, no necesita que se 
provoquen reacciones cutáneas de hipersensibilidad. Tampoco exige el uso de coadyuvantes, como ocurre en el ensayo de maximización con cobayas (capítulo B.6 del presente anexo, 13). Por consiguiente, el LLNA: 
BrdU-ELISA reduce las molestias para los animales. A pesar de las ventajas 
que supone el LLNA: BrdU-ELISA con respecto al capítulo B.6 y la TG 406 de la OCDE (13), tiene ciertas limitaciones que pueden obligar a utilizar estos métodos (capítulo B.6 y TG 406 de la OCDE), como, por 
ejemplo, los ensayos de ciertos metales, los resultados falsos positivos que 
se producen con determinados irritantes cutáneos (como algunas sustancias de tipo tensioactivo) (6) (1 y capítulo B.42 del presente anexo) o la solu ­
bilidad de la sustancia problema. Además, las sustancias o clases químicas 
que contienen grupos funcionales de los que se haya visto que actúan como 
posibles factores de confusión (15) pueden hacer necesario el uso de ensa ­
yos con cobayas (es decir, el ME B.6 o la TG 406 de la OCDE) (13). Se ha recomendado que las limitaciones señaladas para el LLNA (1 y 
capítulo B.42 del presente anexo) se apliquen también al LLNA: 
BrdU-ELISA (10). Dejando aparte estas limitaciones detectadas, el LLNA: BrdU-ELISA debería ser aplicable para el ensayo de cualquier sustancia, salvo que haya propiedades asociadas a esta que puedan interferir con la 
exactitud del LLNA: BrdU-ELISA. Por otra parte, debe contemplarse la 
posibilidad de resultados positivos dudosos cuando se obtienen valores del índice de estimulación (IE) entre 1,6 y 1,9 (véanse los puntos 31 y 32). Esto se justifica por la base de datos de validación de 43 sustancias 
utilizando un IE ≥ 1,6 (véase el punto 6) de las que el LLNA: BrdU-ELISA 
identificó correctamente la totalidad de los 32 sensibilizantes del LLNA, pero identificó incorrectamente dos de los once productos no sensibilizantes con valores de IE entre 1,6 y 1,9 (es decir, positivos dudosos) (10). Sin 
embargo, como se ha utilizado el mismo conjunto de datos para establecer 
los valores del IE y para calcular las propiedades de predicción del ensayo, los resultados indicados pueden suponer una sobreestimación de las propie ­
dades de predicción reales.
 
PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
6. El principio básico del LLNA: BrdU-ELISA es el de que los sensibilizantes 
inducen una proliferación de linfocitos en los ganglios linfáticos que drenan 
la zona de aplicación de la sustancia química. Esta proliferación es propor ­
cional a la dosis y a la potencia del alérgeno aplicado y proporciona un método sencillo para obtener una medida cuantitativa de la sensibilización. 
La proliferación se mide comparando la proliferación media de cada grupo 
de ensayo con la proliferación media del grupo de control tratado con el vehículo (CV). Se determina la relación entre la proliferación media obser ­
vada en cada grupo tratado y la del grupo de CV paralelo, denominada 
índice de estimulación (IE), y que debe ser ≥ 1,6 para que se pueda 
justificar el seguir con la evaluación de la sustancia problema como posible
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
sensibilizante cutáneo. Los procedimientos aquí descritos se basan en medir 
el contenido de BrdU y utilizarlo para indicar el aumento del número de 
células en proliferación presentes en los ganglios linfáticos auriculares que drenan la zona. El BrdU es un análogo de la timidina y se incorpora de forma similar en el ADN de las células en proliferación. La incorporación 
del BrdU se mide mediante ELISA, que utiliza un anticuerpo específico del 
BrdU, marcado también con peroxidasa. Cuando se añade el sustrato, la peroxidasa reacciona con este y se obtiene un producto coloreado, que se cuantifica a una absorbancia específica con un lector de placas de microti ­
tulación.
 
DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO  
Selección de la especie animal  
7. El ratón es la especie elegida para este ensayo. Los estudios de validación 
del LLNA: BrdU-ELISA se han efectuado exclusivamente con la cepa CBA/J, por lo que se considera que esta es la cepa preferida (10) (12). Se utilizan hembras jóvenes adultas, nulíparas y no preñadas. Al comienzo 
del estudio los animales deben tener una edad de 8 a 12 semanas; la 
variación del peso de los animales debe ser mínima, sin superar el 20 % del peso medio. También se podrán utilizar otras cepas y machos, si se aportan datos suficientes para demostrar que en la respuesta del LLNA: 
BrdU-ELISA no existen diferencias significativas relacionadas con la cepa 
o el sexo.
 
Alojamiento y alimentación  
8. Los ratones deben alojarse en grupos (16), salvo que se aporten pruebas 
científicas adecuadas que avalen su alojamiento individual. La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. Aunque la humedad relativa debe 
ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto 
durante la limpieza del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, 
con suministro ilimitado de agua para beber.
 
Preparación de los animales  
9. Se eligen los animales al azar, se marcan para su identificación individual 
(pero no en las orejas) y se mantienen en sus jaulas al menos cinco días hasta el inicio de la administración de la sustancia, para que se aclimaten a las condiciones del laboratorio. Antes de iniciar el tratamiento, todos los 
animales serán examinados para comprobar que no presentan lesiones cu ­
táneas observables.
 
Preparación de las soluciones administradas  
10. Las sustancias sólidas deben disolverse o suspenderse en disolventes o 
vehículos y diluirse, cuando proceda, antes de aplicarse a la oreja del ratón. Las sustancias líquidas pueden aplicarse puras o diluidas antes de su admi ­
nistración. Las sustancias insolubles, como las que se ven generalmente en 
los productos sanitarios, deben someterse a extracción forzada en un disol ­
vente apropiado con el fin de recoger todos los componentes extraíbles para el ensayo antes de efectuar la aplicación a la oreja del ratón. Las soluciones 
problema deben prepararse cada día, salvo que mediante datos de estabili ­
dad se demuestre que es posible conservarlas.
 
Verificación de la fiabilidad  
11. Se utilizan sustancias de control positivo (CP) para demostrar que el ensayo 
funciona apropiadamente, respondiendo con la sensibilidad adecuada y re ­
producible cuando se aplica una sustancia problema sensibilizante de la que 
se ha caracterizado bien la magnitud de la respuesta. Se recomienda la 
inclusión de un CP en paralelo porque demuestra la competencia del labo ­
ratorio para efectuar con éxito cada ensayo y permite la evaluación de la reproducibilidad y comparabilidad intra e interlaboratorios. Por otra parte, 
ciertas autoridades normativas requieren la utilización de un CP en cada 
estudio, por lo que se aconseja a los usuarios que consulten con las
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
autoridades competentes antes de efectuar el LLNA: BrdU-ELISA. En con ­
secuencia, se recomienda el uso sistemático de un CP en paralelo para 
evitar la necesidad, que podría surgir del uso de un CP periódico, de tener que efectuar ensayos adicionales con animales para cumplir los requisitos (véase el punto 12). El CP debe dar respuesta positiva en el LLNA: 
BrdU-ELISA con un nivel de exposición calculado para producir un au ­
mento del IE ≥ 1,6 con respecto al grupo de control negativo (CN). La 
dosis del CP debe ser tal que no provoque un exceso de irritación cutánea ni toxicidad sistémica, y que la inducción sea reproducible pero no excesiva 
(por ejemplo, un IE > 14 se consideraría excesivo). Los CP preferidos son 
aldehído hexilcinámico (n
 o CAS 101-86-0) y eugenol (n  o CAS 97-53-0), 
ambos al 25 % en acetona: aceite de oliva (4:1, v/v). Puede haber circuns ­
tancias en que sea posible utilizar otros controles positivos, mediante una 
justificación adecuada y siempre que se cumplan los criterios antes men ­
cionados. 
12. Aunque se recomienda la inclusión de un grupo de CP en paralelo, puede 
haber situaciones en que sea adecuado hacer ensayos periódicos (es decir, a 
intervalos ≤ 6 meses) del CP en caso de laboratorios que efectúan regular ­
mente el LLNA: BrdU-ELISA (es decir, lo efectúan con una frecuencia no inferior a una vez al mes) y tienen una base de datos de CP históricos que demuestra la capacidad del laboratorio para obtener resultados reproducibles 
y exactos con dichos controles. El laboratorio puede demostrar que tiene la 
competencia adecuada para realizar el LLNA: BrdU-ELISA mediante la obtención constante de resultados positivos con los CP en al menos diez ensayos independientes llevados a cabo en un plazo razonable (es decir, de 
menos de un año). 
13. Debe incluirse un grupo de CP en paralelo siempre que haya un cambio de 
procedimiento del LLNA: BrdU-ELISA (por ejemplo, cambio del personal 
cualificado, cambio de los materiales o reactivos utilizados en el método de 
ensayo, cambio en el equipo analítico, cambio en el origen de los animales), y tales cambios deben documentarse en los informes del laboratorio. Debe prestarse atención al efecto de estos cambios sobre la idoneidad de la base 
de datos históricos previamente establecida cuando se deba decidir si es 
necesario establecer una nueva base de datos históricos para documentar la constancia de los resultados de los CP. 
14. Los investigadores no deben olvidar que la decisión de realizar un estudio 
con controles positivos de forma periódica en lugar de en paralelo tiene consecuencias sobre la idoneidad y aceptabilidad de los resultados negativos obtenidos en ensayos efectuados sin control positivo en paralelo en el 
intervalo entre dos estudios periódicos con control positivo. Por ejemplo, 
si se obtiene un resultado falso negativo en un estudio con control positivo periódico, es posible dudar de los resultados negativos obtenidos con sus ­
tancias problema en el intervalo transcurrido entre el último estudio con 
control positivo periódico aceptable y el estudio con control positivo perió ­
dico inaceptable. Las consecuencias de estos resultados deben sopesarse cuidadosamente a la hora de decidir si se incluye un CP en paralelo o si solo se hace de forma periódica. Debe considerarse igualmente el uso de 
menos animales en el grupo de CP en paralelo cuando esté justificado 
científicamente y si el laboratorio demuestra, sobre la base de datos histó ­
ricos propios del laboratorio, que es posible utilizar menos ratones (17). 
15. Aunque el producto utilizado como CP debe someterse al ensayo en un 
vehículo conocido por provocar una respuesta uniforme (por ejemplo, ace ­
tona: aceite de oliva; 4:1, v/v), puede haber ciertas situaciones legales en las que también sea necesario utilizar un vehículo no estándar (formulación relevante desde el punto de vista clínico o químico) (18). Si para el CP 
en paralelo se utiliza un vehículo diferente del de la sustancia problema, 
debe incluirse un CV aparte para el CP en paralelo.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. En los casos en que se evalúen sustancias problema de una clase química o 
gama de respuestas específica, puede ser útil también emplear sustancias de 
evaluación comparativa para demostrar que el método de ensayo funciona adecuadamente en cuanto a la detección del potencial de sensibilización cutánea de estos tipos de sustancias problema. Para ser adecuadas, las 
sustancias de evaluación comparativa deben presentar las siguientes propie ­
dades: 
— similitud estructural y funcional con la clase de la sustancia problema 
que se está evaluando, 
— características físicas y químicas conocidas, 
— datos de apoyo procedentes del LLNA: BrdU-ELISA, 
— datos de apoyo procedentes de otros modelos animales o de seres hu ­
manos.
 
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO  
Número de animales y niveles de dosis  
17. Se utilizará un mínimo de cuatro animales por grupo de dosis, con un 
mínimo de tres concentraciones de la sustancia problema, más un grupo 
de control negativo (CN) en paralelo tratado solo con el vehículo utilizado para la sustancia problema y un control positivo (CP) (en paralelo o recien ­
te, según la estrategia del laboratorio en relación con los puntos 11 a 15). 
Debe estudiarse la posibilidad de utilizar varias dosis del CP, sobre todo 
cuando este se someta a ensayo de forma intermitente. Excepto por la ausencia de tratamiento con la sustancia problema, los animales de los grupos de control deben ser manejados y tratados de manera idéntica a la 
utilizada con los animales de los grupos tratados. 
18. La elección de las dosis y el vehículo debe basarse en las recomendaciones 
que se recogen en las referencias (2) y (19). Normalmente se eligen dosis consecutivas a partir de una serie adecuada de concentraciones, como 100 
%, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. La elección de la serie 
de concentraciones utilizada debe justificarse científicamente. Para seleccio ­
nar las tres concentraciones consecutivas, ha de tenerse en cuenta toda la información toxicológica (por ejemplo, sobre toxicidad aguda e irritación 
cutánea) y la información estructural y fisicoquímica existente de que se 
pueda disponer respecto a la sustancia problema (o sustancias relacionadas estructuralmente con ella), de forma que la concentración más alta logre la máxima exposición evitando a la vez la toxicidad sistémica y la excesiva 
irritación cutánea local (19) (20 y capítulo B.4 del presente anexo). A falta 
de tal información, puede ser necesario realizar un ensayo inicial de cribado previo (véanse los puntos 21 a 24). 
19. El vehículo no debe interferir con el resultado del ensayo ni sesgarlo, y 
debe seleccionarse con el propósito de maximizar la solubilidad para con ­
seguir la mayor concentración posible y de obtener a la vez una solución o suspensión que sea adecuada para la aplicación de la sustancia problema. Los vehículos recomendados son acetona: aceite de oliva (4:1, v/v),  N,N - 
dimetilformamida, metil-etil-cetona, propilenglicol y dimetilsulfóxido (6), 
pero se pueden utilizar otros si se aporta una justificación científica sufi ­
ciente. En determinadas situaciones, puede ser necesario utilizar un disol ­
vente relevante desde el punto de vista clínico o la formulación comercial 
en que se vende la sustancia analizada, como control adicional. Se tendrá 
especial cuidado en velar por que las sustancias problema hidrófilas se incorporen a un sistema de vehículo que humedezca la piel y no se escurra inmediatamente, mediante la incorporación de los solubilizadores adecuados 
(por ejemplo, Pluronic® L92 al 1 %). Por tanto, se evitarán los vehículos 
totalmente acuosos.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. El estudio de los ganglios linfáticos de cada uno de los ratones permite 
evaluar la variabilidad interanimales y comparar estadísticamente la diferen ­
cia entre las mediciones efectuadas en el grupo de sustancia problema y las efectuadas en el grupo de CV (véase el punto 33). Además, se puede evaluar la posibilidad de reducir el número de ratones del grupo de CP 
solamente cuando se toman datos de los distintos animales (17). Por otra 
parte, ciertas autoridades normativas exigen la recogida de datos de cada animal. La recogida periódica de datos de cada animal aporta una ventaja en cuanto al bienestar animal al evitar la duplicación de ensayos, que podrían 
ser necesarios si los resultados sobre la sustancia problema recogidos ini ­
cialmente de una manera (por ejemplo, por datos de conjuntos de animales) tuvieran que ser considerados posteriormente por las autoridades normativas con otros requisitos (por ejemplo, de datos de cada animal).
 
Ensayo de cribado previo  
21. A falta de información para determinar la dosis máxima que se debe utilizar 
en el ensayo (véase el punto 18), hay que efectuar un ensayo de cribado previo a fin de definir el nivel adecuado de dosis para el LLNA: BrdU-ELISA. La finalidad del ensayo de cribado previo es orientar para 
la selección del nivel máximo de dosis que debe utilizarse en el estudio 
LLNA: BrdU-ELISA principal, en caso de que no se disponga de informa ­
ción sobre la concentración que induce toxicidad sistémica (véase el punto 24) o excesiva irritación cutánea local (véase el punto 23). El nivel 
máximo de dosis para este ensayo debe ser una concentración del 100 % de 
la sustancia problema en caso de líquidos, o la mayor concentración posible en caso de sólidos o suspensiones. 
22. El ensayo de cribado previo se realiza bajo las mismas condiciones que el 
estudio LLNA: BrdU-ELISA principal, con la diferencia de que no hay 
evaluación de la proliferación en los ganglios linfáticos y de que pueden utilizarse menos animales por grupo de dosis. Se sugiere emplear uno o dos animales por grupo de dosis. Todos los ratones deben observarse diaria ­
mente para detectar posibles signos de toxicidad sistémica o irritación local 
en el punto de aplicación. Los pesos corporales se registran al inicio del ensayo y antes de que termine (día 6). Se observan ambas orejas de cada ratón, para detectar eventuales eritemas, y se puntúan según el cuadro 1 (20, 
y capítulo B.4 del presente anexo). Se mide el espesor de la oreja con un 
calibrador de espesores (por ejemplo, de micrómetro digital o calibrador de espesores de escala circular de Peacock) el día 1 (antes de la administra ­
ción), el día 3 (unas 48 horas tras la administración de la primera dosis), y 
el día 6. Además, el día 6 se puede medir el espesor de la oreja determi ­
nando el peso de un bocado de la misma, obtenido con un sacabocados después del sacrificio compasivo de los animales. La excesiva irritación local viene indicada por una puntuación de eritema ≥ 3 o por un espesor 
de la oreja ≥ 25 % cualquiera de los días de medición (21) (22). La dosis 
máxima seleccionada para el estudio LLNA: BrdU-ELISA principal será la dosis inmediatamente inferior a la que, dentro de la serie de concentraciones del ensayo de cribado previo (véase el punto 18) induce toxicidad sistémica 
o excesiva irritación cutánea local.
 
Cuadro 1  
Puntuación de eritema  
Observación Puntuación  
Sin eritema 0 
Eritema muy leve (apenas perceptible) 1 Eritema bien definido 2
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Observación Puntuación  
Eritema de moderado a intenso 3 
Eritema intenso (rojo de remolacha) o formación de escaras 
que impide la clasificación del eritema 4 
23. Además de un aumento del 25 % del espesor de la oreja (21) (22), también 
se ha utilizado para señalar irritantes en el LLNA un aumento estadística ­
mente significativo del espesor de la oreja de los ratones tratados respecto a los ratones de control (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Sin embargo, 
aunque puede haber aumentos del espesor de la oreja inferiores al 25 %, 
estadísticamente significativos, estos no se han asociado específicamente con una irritación excesiva (25) (26) (27) (28) (29). 
24. Las siguientes observaciones clínicas pueden indicar toxicidad sistémica 
(30) cuando forman parte de una evaluación integrada y, por tanto, pueden indicar el nivel máximo de dosis que debe utilizarse en el LLNA: BrdU-ELISA principal: cambios en la función del sistema nervioso (por 
ejemplo, piloerección, ataxia, temblores y convulsiones), cambios en el 
comportamiento (por ejemplo, agresividad, cambios en las actividades de limpieza, cambio marcado en el nivel de actividad), cambios en las pautas respiratorias (es decir, cambios en la frecuencia e intensidad de la respira ­
ción, tales como disnea, jadeos y estertores), y cambios en el consumo de 
agua y comida. También deben tenerse en cuenta en la evaluación los eventuales signos de letargo o ausencia de respuesta a estímulos, los signos clínicos de dolor o sufrimiento que no sean ligeros o momentáneos, y la 
reducción > 5 % del peso corporal desde el día 1 al día 6, así como la 
mortalidad. Los animales moribundos o que presenten signos de dolor o de sufrimiento intenso deben sacrificarse de forma compasiva (31).
 
Calendario experimental del estudio principal  
25. El calendario experimental del ensayo es el siguiente: 
— Día 1:  Se identifica cada animal y se toma nota de su peso, así como de 
las eventuales observaciones clínicas. En el dorso de cada oreja se aplican 25 μL de la dilución apropiada de la sustancia problema, del 
vehículo solo o del control positivo (en paralelo o reciente, según la 
estrategia del laboratorio en relación con los puntos 11 a 15). 
— Días 2 y 3:  Se repite el procedimiento de aplicación del día 1. 
— Día 4:  Sin tratamiento. 
— Día 5:  Se inyectan por vía intraperitoneal 0,5 mL (5 mg/ratón) de una 
solución de BrdU (10 mg/mL). 
— Día 6:  Se toma nota del peso de cada animal, así como de las even ­
tuales observaciones clínicas. A las 24 horas, aproximadamente, de la 
inyección de BrdU, se sacrifican los animales de forma compasiva. Se 
extirpan los ganglios linfáticos auriculares de cada oreja de los ratones y se sumergen en solución amortiguadora de fosfato (PBS), separando los de cada animal. En la referencia (17) se recogen los detalles y 
diagramas de la identificación y disección de los ganglios linfáticos. 
Para seguir mejor la respuesta cutánea local en el estudio principal, pueden incluirse en el protocolo del estudio parámetros adicionales, tales como la puntuación del eritema auricular o las medidas del espesor 
de la oreja (obtenidas con un calibrador de espesor, o determinando el 
peso de un bocado de la oreja, en la autopsia).
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Preparación de las suspensiones celulares  
26. De cada ratón se prepara una suspensión de células sueltas de los ganglios 
linfáticos (CGL) extirpados bilateralmente, mediante disgregación mecánica 
suave a través de una malla de acero inoxidable de 200 μm de luz, u otra 
técnica aceptable que permita obtener una suspensión de células sueltas (por ejemplo, uso de un mortero de plástico desechable para aplastar los ganglios 
linfáticos, seguido del paso por una malla de nailon de 70 μm). El proce ­
dimiento de preparación de la suspensión de CGL es de importancia crítica en este ensayo y por tanto cada operario debe adquirir de forma anticipada habilidad para efectuarlo. Por otra parte, como los ganglios linfáticos de los 
animales del CN son pequeños, es importante extremar el cuidado para 
evitar la aparición de efectos artificiales en los valores del IE. En cada caso, el volumen final de la suspensión de CGL debe ajustarse a un volu ­
men optimizado determinado (de unos 15 mL). El volumen optimizado se 
basa en lograr una absorbancia media del grupo de CN entre 0,1 y 0,2.
 
Determinación de la proliferación celular (medición del contenido de BrdU 
en el ADN de los linfocitos)  
27. El contenido de BrdU se mide mediante ELISA utilizando un juego comer ­
cial (por ejemplo, el de Roche Applied Science, Mannheim, Alemania, 
n o de catálogo 11 647 229 001). En resumen, a los pocillos de una micro ­
placa de fondo plano se añaden por triplicado 100 μL de la suspensión de 
CGL. Tras la fijación y desnaturalización de las CGL, se añade a cada pocillo anticuerpo anti-BrdU y se deja reaccionar. Después se elimina por 
lavado el anticuerpo anti-BrdU y, a continuación, se añade la solución de 
sustrato y se deja que se produzca el cromógeno. Entonces, se mide la absorbancia a 370 nm con una longitud de onda de referencia de 492 nm. En todos los casos, deben optimizarse las condiciones del ensayo 
(véase el punto 26).
 
OBSERVACIONES  
Observaciones clínicas  
28. Al menos una vez al día se realizará una observación minuciosa de cada 
animal en busca de signos clínicos, bien de irritación local en el punto de 
aplicación o bien de toxicidad sistémica. Todas las observaciones se regis ­
trarán sistemáticamente en fichas individuales de cada animal. Los planes de seguimiento deben incluir criterios para detectar rápidamente a los rato ­
nes que presenten toxicidad sistémica, excesiva irritación cutánea local o 
corrosión cutánea, a fin de someterlos a sacrificio compasivo (31).
 
Pesos corporales  
29. Como se indica en el punto 25, hay que medir el peso corporal de cada 
animal al empezar el ensayo y en la fecha prevista para el sacrificio com ­
pasivo.  
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS 
30. Los resultados de cada grupo de tratamiento se expresan como IE medio. El 
IE se obtiene dividiendo la media de los valores del índice de marcado con BrdU de los ratones dentro de cada grupo tratado con la sustancia proble ­
ma, y la del grupo de control positivo (CP), por la media de los valores del 
índice de marcado con BrdU de los ratones del grupo de control del disol ­
vente o vehículo (CV). El IE medio del CV es entonces la unidad. 
El índice de marcado con BrdU se define de la manera siguiente: 
Índice de marcado con BrdU = (ABS
 le – ABS blanco  le ) – (ABS  ref – ABS blanco  ref ) 
donde: le = longitud de onda de emisión; y ref = longitud de onda de 
referencia.  ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. En el proceso de toma de decisiones se considera que un resultado es 
positivo si el IE es ≥ 1,6 (10). Sin embargo, la fuerza de la relación 
dosis-respuesta, la significación estadística y la coherencia de las respuestas de los grupos del disolvente o vehículo y del CP pueden utilizarse también a la hora de determinar si un resultado dudoso (es decir, con un valor del IE 
entre 1,6 y 1,9) se declara positivo (3) (6) (32). 
32. En caso de una respuesta positiva dudosa, con un IE entre 1,6 y 1,9, es 
posible que los usuarios deseen considerar información adicional, tal como la relación dosis-respuesta, las pruebas de toxicidad sistémica o de irritación 
excesiva, y, en su caso, la significación estadística, junto con los valores del 
IE para confirmar si tales resultados son positivos (10). Deben tenerse también en cuenta diversas propiedades de la sustancia problema, por ejem ­
plo si está relacionada estructuralmente con sensibilizantes cutáneos cono ­
cidos, si produce excesiva irritación cutánea en el ratón, y la naturaleza de 
la relación dosis-respuesta observada. Estas y otras consideraciones se co ­
mentan con detalle en otro lugar (4). 
33. La recogida de datos de cada ratón permite el análisis estadístico de los 
datos para la presencia y grado de la relación dosis-respuesta. Toda valo ­
ración estadística puede incluir una evaluación de la relación dosis-respuesta, así como comparaciones adecuadamente ajustadas de los grupos de ensayo (por ejemplo, comparaciones por parejas entre grupos 
tratados y grupos paralelos de control de disolvente o vehículo). Los aná ­
lisis estadísticos pueden incluir, por ejemplo, la regresión lineal o la prueba de William para evaluar las tendencias de la relación dosis-respuesta, y la 
prueba de Dunnett para hacer comparaciones por parejas. Para elegir el 
método de análisis estadístico adecuado, el investigador debe conocer las posibles desigualdades de las varianzas y otros problemas asociados, que pueden exigir una transformación de los datos o el uso de un análisis 
estadístico no paramétrico. En cualquier caso, es posible que el investigador 
tenga que efectuar cálculos del IE y análisis estadísticos con y sin algunos puntos de datos (a veces llamados «valores atípicos»).
 
DATOS E INFORME  
Datos  
34. Los datos deben resumirse en forma de cuadro, con indicación de los 
valores del índice de marcado con BrdU de cada animal, la media de los valores del índice de marcado con BrdU de los animales del grupo, su término del error asociado (por ejemplo, DT, EEM), y el IE medio de 
cada grupo tratado con la sustancia problema, comparado con el del grupo 
paralelo de control de disolvente o vehículo.
 
Informe del ensayo  
35. El informe del ensayo contendrá la siguiente información: 
Sustancias problema y de control: 
— datos de identificación [por ejemplo, números CAS y CE (si se cono ­
cen), origen, pureza, impurezas conocidas, número de lote), 
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, volatilidad, 
estabilidad, solubilidad), 
— si se trata de una mezcla, composición y porcentajes relativos de sus 
componentes. 
Disolvente o vehículo: — datos de identificación [pureza, concentración (en su caso), volumen 
utilizado], 
— justificación de la elección del vehículo.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Animales de experimentación: 
— procedencia de los ratones CBA, 
— situación microbiológica de los animales, cuando se conozca, — número y edad de los animales, — procedencia de los animales, condiciones de alojamiento, dieta, etc. 
Condiciones del ensayo: 
— origen del juego de ELISA, su número de lote y los datos del control o 
garantía de calidad de su fabricante (sensibilidad y especificidad del 
anticuerpo y límite de detección), 
— detalles de la preparación y aplicación de la sustancia problema, — justificación de las dosis elegidas (con los resultados del ensayo de 
cribado previo, si se ha efectuado), 
— concentraciones empleadas del vehículo y de la sustancia problema, y 
cantidad total de sustancia problema aplicada, 
— detalles de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo u origen de 
la dieta y el origen del agua), 
— descripción detallada de las pautas de tratamiento y toma de muestras, — métodos de determinación de la toxicidad, — criterios para considerar los estudios positivos o negativos, 
— detalles sobre las eventuales desviaciones del protocolo y explicación 
sobre cómo afectan estas al diseño y a los resultados del estudio. 
Verificación de la fiabilidad: 
— resumen de los resultados de la última verificación de la fiabilidad 
realizada, con información sobre la sustancia problema, la concentración y el vehículo utilizados, 
— datos de los CP en paralelo o históricos y de los CN (disolvente o 
vehículo) en paralelo del laboratorio que realiza el ensayo, 
— si no se ha incluido un CP en paralelo, la fecha y el informe de 
laboratorio del CP periódico más reciente y un informe donde se espe ­
cifiquen los datos de los CP históricos del laboratorio, para justificar la 
ausencia de un CP en paralelo. 
Resultados: — peso de cada ratón al inicio del tratamiento y en la fecha prevista para el 
sacrificio compasivo, así como la media y el término del error asociado 
(por ejemplo, DT, EEM) de cada grupo tratado, 
— cronología del inicio y signos de toxicidad, incluida la irritación cutánea 
en el punto de administración para cada animal, en su caso, 
— un cuadro con los valores del índice de marcado con BrdU y del IE de 
cada ratón, dentro de cada grupo de tratamiento, 
— la media y el término del error asociado (por ejemplo, DT, EEM) de los 
valores del índice de marcado con BrdU/ratón de cada grupo de trata ­
miento y los resultados del análisis de los valores atípicos de cada grupo 
de tratamiento,
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— el valor del IE calculado y una medida adecuada de la variabilidad que 
tenga en cuenta la variabilidad interanimales tanto en los grupos de la 
sustancia problema como en los de control, 
— la relación dosis-respuesta, 
— el análisis estadístico, en su caso. 
Discusión de los resultados: — un breve comentario sobre los resultados, el análisis de la relación 
dosis-respuesta y los análisis estadísticos, en su caso, con la conclusión 
de si la sustancia problema debe ser considerada o no sensibilizante 
cutáneo.
 
BIBLIOGRAFÍA 
(1) OCDE (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Dis ­
ponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002. 
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997. 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33. 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins. Toxicol., 146, 49-59. 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Disponible en la direc ­
ción: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273. 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286. 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257. 
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioac ­
tive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la 
dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/ 
TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Upda ­
ted validation status of new versions and applications of the murine local 
lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNA ­
PRPRept2009.pdf] 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134. 
(13) OCDE (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines] 
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Phar ­
macol., 55, 90-96. 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible 
en la dirección:[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ LLNAPerfStds.pdf] 
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89. 
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 
13-31. 
(20) OCDE (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Disponible en la direc ­
ción: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. 
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: [http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206. 
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. To ­
xicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506. 
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 
60-68. 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. 
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. 
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Disponible en la dirección: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ acutetox/Tox_workshop.htm]. 
(31) OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79. 
(33) OCDE (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES  
Exactitud:  Grado de coincidencia entre los resultados obtenidos con el método de 
ensayo y los valores de referencia aceptados. Se trata de una medida del com ­
portamiento del método de ensayo y es un aspecto de su pertinencia. Este término y el de «concordancia» se suelen usar indistintamente para indicar la proporción de resultados correctos de un método de ensayo (33).  
Sustancia de evaluación comparativa:  Sustancia sensibilizante o no sensibilizante 
utilizada como patrón de comparación con una sustancia problema. Las sustan ­
cias de evaluación comparativa deben presentar las siguientes propiedades: i) fuente de procedencia coherente y fiable, ii) similitud estructural y funcional con la clase de las sustancias problema, iii) características físicas y químicas 
conocidas, iv) datos de apoyo sobre los efectos conocidos, y v) potencia cono ­
cida en la gama de respuestas deseada.  
Falso negativo:  Sustancia problema identificada incorrectamente como negativa o 
inactiva por un método de ensayo, cuando en realidad es positiva o activa (33).  
Falso positivo:  Sustancia problema identificada incorrectamente como positiva o 
activa por un ensayo, cuando en realidad es negativa o inactiva (33).  
Peligro:  Posibilidad de que se dé un efecto adverso sobre la salud o el medio 
ambiente. El  efecto adverso se manifiesta solamente si hay un nivel suficiente de 
exposición. 
Reproducibilidad interlaboratorios:  Medida del grado en que diferentes labora ­
torios cualificados, utilizando el mismo protocolo y sometiendo a ensayo la 
misma sustancia problema pueden proporcionar resultados cualitativa y cuantita ­
tivamente similares. La reproducibilidad interlaboratorios se determina durante los procesos de prevalidación y validación, e indica el grado en que un ensayo 
puede transferirse con éxito entre laboratorios; se denomina también reproduci ­
bilidad entre laboratorios (33).  
Reproducibilidad intralaboratorios:  Determinación del grado en que personas 
cualificadas del mismo laboratorio pueden repetir con éxito los resultados en momentos diferentes, utilizando un protocolo especificado. También se denomina 
reproducibilidad dentro del laboratorio (33).  
Valor atípico:  Una observación que es muy diferente de los otros valores en una 
muestra aleatoria de una población.  
Garantía de calidad:  Proceso de gestión por el que personas independientes de 
las que efectúan el ensayo evalúan el cumplimiento de las normas, los requisitos y los procedimientos de registro por parte de los ensayos de laboratorio, así como la exactitud de los datos transferidos.  
Fiabilidad:  Medida del grado en que un método de ensayo puede aplicarse de 
forma reproducible a lo largo del tiempo, en un mismo laboratorio y en distintos 
laboratorios, utilizando el mismo protocolo. Se evalúa calculando la reproduci ­
bilidad intra e interlaboratorios (33).  
Sensibilización cutánea:  Proceso inmunológico que se observa cuando un indi ­
viduo predispuesto sufre una exposición tópica a una sustancia alergénica induc ­
tora, la cual provoca una respuesta inmunitaria cutánea que puede llevar a la 
aparición de sensibilización por contacto.  
Índice de estimulación (IE):  Valor calculado para evaluar el potencial de sensi ­
bilización cutánea de una sustancia problema y que es la relación entre la pro ­
liferación en los grupos tratados y la del grupo de control del vehículo en paralelo.  
Sustancia problema (o producto químico problema):  Toda sustancia o mezcla 
sometida a ensayo con este ME.
 ▼M3 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  TOXICIDAD AGUDA POR INHALACIÓN. MÉTODO DE LAS 
CLASES DE TOXICIDAD AGUDA  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método reproduce las directrices de ensayo (TG) 436 de la 
OCDE (2009). Las primeras TG 403 de toxicidad aguda por inhalación se 
adoptaron en 1981 y desde entonces han sido revisadas [véase el 
capítulo B.2 de este anexo (1)]. Se consideró apropiado desarrollar un método de clases de toxicidad aguda por inhalación [Acute Toxic Class o ATC, (2) (3) (4)] después de adoptar el método de las clases de toxicidad 
aguda por vía oral (capítulo B.1  ter de este anexo) (5). Una evaluación 
retrospectiva de los resultados del método de las clases de toxicidad aguda por inhalación reveló que es adecuado para los fines de clasificación y etiquetado (6). El método de las clases de toxicidad aguda por inhalación 
permite aplicar una progresión serial de concentraciones previamente defi ­
nidas para obtener una escala de toxicidad de la sustancia problema. El criterio de valoración principal es la letalidad, pero los animales moribundos o que presenten signos de dolor, angustia o sufrimiento intenso y duradero 
deben sacrificarse de forma compasiva para minimizar su sufrimiento. Se 
recomienda consultar el documento de orientación n
 o 19 de la OCDE sobre 
criterios de tratamiento compasivo (7). 
2. Se ofrece una guía para la realización e interpretación de estudios según este 
método de ensayo en el documento de orientación n  o 39 sobre los ensayos 
de toxicidad por inhalación aguda (GD 39) (8). 
3. Las definiciones empleadas en el contexto de este método de ensayo se 
facilitan en el apéndice 1 y en el documento GD 39 (8). 
4. El método de ensayo proporciona información acerca de los factores de 
riesgo y facilita la ordenación y clasificación de la sustancia problema de conformidad con el Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 en relación con la 
clasificación de las sustancias químicas que provocan toxicidad aguda (9). 
Cuando sea preciso calcular valores puntuales de CL50 o analizar la relación concentración-respuesta, el método de ensayo recomendable es el que se describe en el capítulo B.2 del presente anexo (1). Se ofrecen más orienta ­
ciones sobre la selección del método de ensayo en el documento de 
orientación (GD) n
 o 39 (8). El presente método de ensayo no ha sido 
concebido específicamente para el análisis de productos especializados, como materiales fibrosos o isométricos escasamente solubles o nanoproduc ­
tos manufacturados.
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
5. Antes de considerar la aplicación de este método de ensayo y con el fin de 
minimizar el sufrimiento animal, el laboratorio de análisis deberá tener en 
cuenta toda la información disponible sobre la sustancia problema, sin ol ­
vidar los estudios existentes cuyos datos pudieran desaconsejar la realización de nuevas investigaciones. En la selección de la especie, cepa, sexo y modo de exposición más apropiados resulta útil toda información referente a: 
identidad, estructura química y propiedades fisicoquímicas de la sustancia 
problema; resultados de anteriores ensayos de toxicidad  in vivo  o in vitro ; 
uso(s) previsto(s) y posible exposición humana; datos de (Q)SAR previos y datos toxicológicos acerca de sustancias estructuralmente afines. No deberán 
investigarse con este método de ensayo concentraciones que previsiblemente 
provoquen un dolor o sufrimiento intensos debido a efectos corrosivos (
 1 ) o 
irritantes graves [véase el documento GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) La evaluación de la corrosividad puede basarse en la opinión de expertos con informa ­
ción sobre: experiencia en animales y humanos, datos ( in vitro ) disponibles [capítulos 
B.40 (10) y B.40  bis (11) de este anexo y TG 435 de la OCDE (12)], valores de pH, 
información acerca de sustancias afines o cualesquiera otros datos pertinentes.
 PRINCIPIO DEL ENSAYO 
6. El ensayo se basa en un procedimiento secuencial, en el que se obtiene 
suficiente información sobre la toxicidad aguda por inhalación de la sustan ­
cia problema durante un período de exposición de 4 horas, para permitir su 
clasificación. Pueden aplicarse otros tiempos de exposición con fines nor ­
mativos específicos. Cada una de las fases de concentración definidas se investiga en 3 animales de cada sexo. Dependiendo del número de animales que se encuentren muertos o moribundos, pueden bastar 2 fases de concen ­
tración para evaluar la toxicidad aguda de la sustancia problema. Si hay 
indicios de que uno de los sexos es más sensible que el otro, la investiga ­
ción debe proseguir únicamente con el sexo más sensible. El resultado de la 
fase preliminar determina cuál será la fase siguiente, de manera que: 
a) no se requieran más ensayos, 
b) se investiguen tres animales de cada sexo, o 
c) se investiguen solo 6 animales del sexo más sensible; es decir, el cálculo 
del límite inferior de la clase tóxica debe basarse en 6 animales por 
grupo de concentración experimental, independientemente del sexo. 
7. Los animales moribundos o que den muestras claras de dolor o muestren 
signos de sufrimiento intenso y continuo deben ser sacrificados de forma compasiva y en la interpretación de los resultados serán considerados de la 
misma manera que los que hayan muerto durante el ensayo. En el docu ­
mento de orientación n
 o 19 de la OCDE sobre criterios de tratamiento 
compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (7) se dan criterios para tomar la decisión de matar animales moribundos o sometidos a sufri ­
miento intenso y directrices para reconocer cuándo la muerte es previsible o 
inminente.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
8. Hay que usar animales adultos jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio 
corriente. La especie recomendada es la rata y, en caso de usar otra especie, 
se justificará debidamente.  
Preparación de los animales  
9. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. El día de la exposición, los 
animales serán adultos jóvenes de 8 a 12 meses de edad y su peso corporal no se desviará en más del ± 20 % del peso medio de su sexo calculado en 
animales previamente expuestos de la misma edad. Los animales se selec ­
cionan al azar y se marcan para permitir su identificación individual. Se mantiene a los animales en las jaulas al menos cinco días antes de empezar el estudio para que se acostumbren a las condiciones de laboratorio. Debe ­
rán también aclimatarse al equipo del ensayo durante un breve período 
preliminar, para así reducir el estrés provocado por la introducción en un entorno nuevo.
 
Zootecnia  
10. La temperatura de los animalarios debe ser de 22 ± 3 °C. La humedad 
relativa se mantendrá idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, si bien esto no siempre es posible cuando se usa el agua como vehículo. Antes 
y después de las exposiciones, los animales deberán enjaularse en principio 
por grupos de sexo y nivel de exposición, pero el número de animales por jaula será tal que permita la observación sin trabas de cada animal y mini ­
mice las pérdidas por agresiones y canibalismo. Cuando la exposición es 
solo por la nariz, puede ser necesario aclimatar a los animales a los tubos de 
sujeción. Estos no deberán ejercer sobre los animales tensiones físicas,
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
térmicas o de inmovilización. La sujeción puede influir en parámetros fisio ­
lógicos como la temperatura corporal (hipertermia) o el volumen respiratorio 
por minuto. Si se dispone de datos generales en el sentido de que no se producen estos cambios en medida apreciable, se podrá prescindir de la adaptación previa a los tubos de sujeción. Los animales expuestos de cuerpo 
entero a un aerosol se enjaularán de manera individual durante la exposición 
para evitar que el aerosol en estudio se filtre por el pelo de sus compañeros de jaula. Salvo durante la exposición, se podrán administrar las dietas ha ­
bituales de laboratorio certificadas, acompañadas de un suministro ilimitado 
de agua potable de la traída municipal. Se aplicará iluminación artificial en 
una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
 
Cámaras de inhalación  
11. Para seleccionar una cámara de inhalación se tendrán en cuenta la naturaleza 
de la sustancia problema y la finalidad del ensayo. El modo de exposición 
preferible es de solo por la nariz (término que abarca los modos de expo ­
sición solo por la cabeza, solo por la nariz y solo por el hocico). Este modo de exposición es el recomendado generalmente para los estudios de aeroso ­
les líquidos o sólidos y de vapores que pueden condensarse formando 
aerosoles. Determinados objetivos de la investigación se podrían alcanzar mejor utilizando el modo de exposición de cuerpo entero, pero esto debe justificarse en el informe del estudio. Para asegurar la estabilidad atmosfé ­
rica cuando se emplea una cámara de cuerpo entero, el volumen total de los 
animales experimentales no debe exceder del 5 % del volumen de la cáma ­
ra. En el documento GD 39 (8) se describen los principios de las técnicas de exposición de cuerpo entero y de solo por la nariz y sus ventajas e incon ­
venientes respectivos.
 
CONDICIONES DE EXPOSICIÓN  
Administración de las concentraciones  
12. Se recomienda un período de exposición prefijado de cuatro horas, sin 
contar el tiempo de equilibrado. El período puede variar dependiendo de 
las necesidades concretas, pero se justificarán los motivos en el informe del 
estudio [véase el documento GD 39 (8)]. Los animales expuestos en cáma ­
ras de cuerpo entero se enjaularán de manera individual para evitar la ingestión de la sustancia problema debido a las conductas de limpieza de 
los compañeros de jaula. Se suprimirá la alimentación durante el período de 
exposición. Se puede suministrar agua durante todo el período de exposición de cuerpo entero. 
13. Los animales se exponen a la sustancia problema en forma de gas, vapor, 
aerosol o una mezcla de estos. Las condiciones físicas de la investigación 
dependerán de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema, de 
la concentración seleccionada y/o de la forma física más probable que adoptará dicha sustancia durante su manipulación y administración. Las sustancias higroscópicas y químicamente reactivas deberán estudiarse en 
condiciones de aire seco. Se procurará evitar la acumulación de concentra ­
ciones explosivas.
 
Distribución granulométrica  
14. Se controlará el tamaño de partícula en todos los aerosoles y vapores que 
puedan condensarse formando aerosoles. Para facilitar la exposición de 
todas las zonas de interés de las vías respiratorias, se recomiendan aerosoles que tengan un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) de 1 a 4 μm, con una desviación típica geométrica ( σg) en el intervalo de 1,5 a 3,0 
(8) (13) (14). Se procurará dentro de lo razonable ajustarse a este marco de 
referencia, pero si ello no es posible se consultará la opinión de expertos. Por ejemplo, los humos metálicos pueden tener un diámetro de partícula menor, mientras que las partículas con carga, las fibras y las sustancias 
higroscópicas (que aumentan de tamaño en el medio húmedo de las vías 
respiratorias) pueden sobrepasar este límite de referencia.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Preparación de la sustancia problema en un vehículo  
15. Se puede recurrir a un vehículo para crear una concentración y un tamaño 
de partícula adecuados de la sustancia problema en la atmosfera. Por regla general se dará preferencia al agua. El material particulado se puede someter 
a tratamientos mecánicos para obtener la distribución granulométrica desea ­
da, pero procurando no descomponer ni alterar la sustancia problema. Cuando se considere que los procesos mecánicos pueden haber alterado la composición de la sustancia problema (por ejemplo, las temperaturas extre ­
mas de una fricción excesiva), esta se verificará analíticamente. Se pondrá 
especial atención para no contaminar la sustancia problema. No es necesario analizar compuestos granulados no friables que han sido intencionadamente 
formulados como no inhalables. Se recurrirá a una prueba de desgaste para 
demostrar que no se generan partículas respirables durante la manipulación del material granulado. Si en la prueba de desgaste se generan partículas respirables, habrá que efectuar un ensayo de toxicidad por inhalación.
 
Animales de control  
16. No es necesario emplear un grupo de control negativo (con aire) en paralelo. 
Si se usa un vehículo distinto del agua para generar la atmósfera experi ­
mental, solo será necesario recurrir a un grupo de control del vehículo cuando no se disponga de datos anteriores de toxicidad por inhalación. Si 
un ensayo de toxicidad de una sustancia problema formulada en un vehículo 
revela que no hay toxicidad, se deduce que el vehículo es atóxico a la concentración analizada; por lo tanto, no se precisa un control del vehículo.
 
SUPERVISIÓN DE LAS CONDICIONES DE EXPOSICIÓN  
Caudal de aire de la cámara  
17. El caudal de aire de la cámara se controlará minuciosamente, se supervisará 
de manera continuada y se registrará como mínimo cada hora durante cada 
exposición. La supervisión de la concentración (o estabilidad) atmosférica del ensayo constituye una medida integral de todos los parámetros dinámi ­
cos y proporciona un medio indirecto de controlar todos los parámetros 
dinámicos de interés en la generación de un escenario atmosférico. Se 
pondrá especial atención para evitar la reinspiración en las cámaras de solo por la nariz en aquellos casos en los que el caudal de aire a través del sistema de exposición sea insuficiente para crear un flujo continuo del 
medio atmosférico de ensayo. Se han descrito metodologías capaces de 
demostrar que no tiene lugar la reinspiración en las condiciones operativas establecidas (8) (15). La concentración de oxígeno debe ser como mínimo del 19 %, y la de dióxido de carbono no debe superar el 1 %. Si existen 
razones para suponer que no están consiguiendo estos valores de referencia, 
habrá que determinar las concentraciones de ambos gases.
 
Temperatura y humedad relativa de la cámara  
18. La temperatura de la cámara se mantendrá en 22 ± 3 °C. La humedad 
relativa en la zona de respiración de los animales, cuando se trata de expo ­
siciones de solo por la nariz y de cuerpo entero, se supervisará y registrará 
al menos tres veces en operaciones de hasta 4 horas, y cada hora en ope ­
raciones más cortas. La humedad relativa debe mantenerse idealmente en el intervalo del 30 % al 70 %, pero este valor de referencia puede ser inalcan ­
zable (por ejemplo, cuando se analizan mezclas acuosas) o imposible de 
medir (cuando hay interferencias de la sustancia con el método de ensayo).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Sustancia problema: concentración nominal  
19. Siempre que sea factible, se calculará y registrará la concentración nominal 
en la cámara de exposición. La concentración nominal es la masa de sus ­
tancia problema generada dividida por el volumen total de aire que recorre 
el sistema de la cámara. La concentración nominal no se usa para caracte ­
rizar la exposición de los animales, pero la comparación entre la concen ­
tración nominal y la real nos da un índice de la eficiencia generadora del sistema experimental, de modo que puede servir para detectar problemas en 
la generación de la atmósfera.
 
Sustancia problema: concentración real  
20. La concentración real es la concentración de sustancia problema presente en 
la zona de respiración de los animales en una cámara de inhalación. Las concentraciones reales se pueden calcular con métodos específicos (por 
ejemplo, muestreo directo, métodos de adsorción o uso de reactivos quími ­
cos y posterior valoración analítica) o bien con métodos inespecíficos como la gravimetría por filtración. El análisis gravimétrico es aceptable exclusi ­
vamente para aerosoles de un único componente en polvo o de líquidos de 
baja volatilidad, y deberá sustentarse en caracterizaciones preliminares es ­
pecíficas de la sustancia de ensayo. La concentración de los aerosoles de polvos multicomponentes se puede determinar también por gravimetría. Sin embargo, hacen falta datos analíticos que demuestren que la composición 
del material aerotransportado es afín a la del material de partida. Si no se 
dispone de tal información, puede ser necesario repetir el análisis de la sustancia problema (idealmente, en estado aerotransportado) a intervalos regulares a lo largo del ensayo. Cuando se trate de productos en forma 
de aerosol capaces de evaporar o sublimar, habrá que demostrar que el 
método elegido es capaz de recoger todas las fases. En el informe del estudio se harán constar las concentraciones diana, nominales y reales, pero en los análisis estadísticos destinados a calcular los valores de concen ­
tración letal se emplean solo las concentraciones reales. 
21. Se usará, a ser posible, un solo lote de sustancia problema, que se conser ­
vará en condiciones que preserven su pureza, homogeneidad y estabilidad. 
Antes de iniciar el estudio deberá hacerse una caracterización de la sustancia 
problema consistente en un análisis de pureza y, si es técnicamente factible, de identidad y de cuantificación de contaminantes e impurezas. Con este fin se pueden aportar, entre otros, los siguientes datos: tiempo de retención y 
área relativa del pico, peso molecular determinado mediante espectroscopia 
de masas o cromatografía de gases y otras determinaciones. Si bien la identidad de la muestra de ensayo no es responsabilidad del laboratorio de análisis, la prudencia aconseja que este confirme, aunque sea dentro de 
ciertos límites, la caracterización facilitada por el promotor (por ejemplo, 
color, naturaleza física, etc.). 
22. La atmósfera de exposición se mantendrá constante en la medida de lo 
posible y bajo supervisión continua y/o intermitente, dependiendo del mé ­
todo analítico. Si la técnica de muestreo es intermitente, habrá que tomar 
muestras atmosféricas de la cámara por lo menos dos veces en un ensayo de cuatro horas. De no ser esto posible por darse concentraciones bajas o un caudal de aire limitado, se podrá tomar una muestra en todo el período de 
exposición. Si se producen fluctuaciones importantes de una muestra a otra, 
para analizar las siguientes concentraciones se tomarán cuatro muestras por exposición. Las concentraciones individuales medidas en la cámara no de ­
ben desviarse de la concentración media en ± 10 % cuando se trata de gases 
y vapores, y en ± 20 % en el caso de aerosoles de líquidos o sólidos. Se 
calculará y registrará el tiempo de equilibrado de la cámara (t
 95 ). La dura ­
ción de cualquier exposición abarca el tiempo que tarda en generarse la sustancia problema, lo que incluye el tiempo necesario para alcanzar t
 95 . 
Se ofrecen indicaciones para el cálculo de t  95 en el documento de orienta ­
ción n  o 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. Cuando se manejan mezclas muy complejas de gases/vapores y aerosoles 
(por ejemplo, atmósferas de combustión y sustancias problema propulsadas 
con dispositivos/productos fabricados con fines determinados), cada fase puede comportarse de manera diferente en una cámara de inhalación, de modo que se seleccionará como mínimo una sustancia indicadora (analito), 
normalmente la sustancia activa principal de la mezcla, para cada fase (gas/ 
vapor y aerosol). Si el producto analizado es una mezcla, habrá que docu ­
mentar la concentración analítica de la mezcla total y no solo de la sustancia indicadora o del componente activo (analito). Se ofrece más información 
sobre las concentraciones reales en el documento de orientación n
 o 39 (8).  
Sustancia problema: distribución granulométrica  
24. La distribución granulométrica en los aerosoles se determinará al menos dos 
veces por cada período de exposición de 4 horas, empleando un impactador de cascada o un aparato alternativo como un medidor del tamaño aeorodi ­
námico de partícula. Si se puede demostrar la equivalencia de los resultados 
obtenidos con el impactador de cascada y con el aparato alternativo, enton ­
ces se podrá emplear este último durante todo el estudio. Se empleará un segundo dispositivo, como un filtro gravimétrico o un sistema de burbujeo o 
de purga, en paralelo con el equipo principal para confirmar la eficiencia de 
recogida de este último. La concentración en masa obtenida mediante aná ­
lisis granulométrico tendrá unos límites de desviación razonables con res ­
pecto a la concentración en masa obtenida mediante gravimetría por filtra ­
ción [véase el documento GD 39 (8)]. Si es posible demostrar su equiva ­
lencia en la fase inicial del estudio, podrán omitirse en lo sucesivo las pruebas confirmatorias. Por razones de bienestar animal, se tomarán medidas para minimizar la obtención de datos no concluyentes que obligarían a 
repetir la exposición. Se controlará el tamaño de partícula en los vapores 
cuando exista la posibilidad de que la condensación del vapor provoque la formación de un aerosol, o cuando se detecten partículas en una atmósfera de vapor que puedan inducir la mezcla de fases (véase el punto 14).
 
PROCEDIMIENTO  
Ensayo principal  
25. En cada fase se estudian tres animales de cada sexo, o bien seis animales del 
sexo más sensible. Cuando se exponen con la técnica de solo la nariz roedores distintos de la rata, podrán ajustarse los tiempos máximos de exposición para minimizar el sufrimiento específico de la especie. La con ­
centración que se usará en la fase inicial se selecciona de entre una a cuatro 
concentraciones predefinidas, y debe ser aquella que provoque más proba ­
blemente toxicidad en algunos de los animales tratados. Los esquemas de ensayo de gases, vapores y aerosoles (apéndices 2 a 4) se articulan en torno 
a los valores de corte de las categorías 1-4 del Reglamento CLP (9) para 
gases (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 horas; apéndice 2), para vapores (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 horas; apéndice 3) y para aerosoles (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 horas; apéndice 4). La categoría 5, que no se contempla en el 
Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 (9), corresponde a concentraciones por en ­
cima de las respectivas concentraciones límite. A cada concentración inicial se le aplica el correspondiente esquema de ensayo. En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, el procedimiento de 
ensayo seguirá las flechas indicadas hasta establecer una categoría. 
26. El intervalo de tiempo entre los grupos de exposición se determina según la 
aparición, duración y gravedad de los signos tóxicos. La exposición de los 
animales al siguiente nivel de concentración se retrasará hasta tener una 
seguridad razonable de la supervivencia de los animales previamente estu ­
diados. Se recomienda un período de tres o cuatro días entre la adminis ­
tración de cada nivel de dosis para poder observar la toxicidad retardada. 
Este intervalo puede ajustarse según convenga, por ejemplo en caso de 
respuestas no concluyentes.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Ensayo límite  
27. El ensayo límite se practica cuando se sabe o supone que la sustancia 
problema es prácticamente atóxica, es decir, que induce una respuesta tóxica solo cuando supera la concentración límite normativa. Puede obtenerse in ­
formación acerca de la toxicidad de la sustancia estudiada a partir de los 
conocimientos disponibles sobre sustancias o mezclas afines, teniendo en cuenta cuáles son los componentes que se sabe que son importantes desde el punto de vista toxicológico y en qué porcentaje aparecen. En situaciones en 
que se disponga de poca o ninguna información sobre la toxicidad de la 
sustancia o en las que se prevea que esta será tóxica, se llevará a cabo el ensayo principal [se ofrecen más indicaciones en el documento de 
orientación (GD) n
 o 39 (8)]. 
28. Según el procedimiento habitual se exponen tres animales de cada sexo, o 
seis animales del sexo más sensible, a concentraciones de 20 000 ppm de 
gases, 20 mg/l de vapores o 5 mg/l de polvos/nieblas, respectivamente y 
siempre que se puedan alcanzar, lo que constituye el ensayo límite de este método. Cuando se analicen aerosoles, el objetivo principal será obtener un tamaño de partícula respirable (es decir, un MMAD de 1-4 μm). El estudio 
de aerosoles a concentraciones mayores de 2 mg/l solo se emprenderá si se 
puede obtener un tamaño de partícula respirable [véase el documento GD 39 (8)]. De conformidad con el SGA (16), por razones de bienestar animal se desaconseja investigar más allá de las concentraciones límite. La realización 
de pruebas en la categoría 5 (16) del SGA, que no está recogida en el 
Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 (9), solo se contemplará cuando haya mu ­
chas probabilidades de que sus resultados vayan a incidir directamente en la protección de la salud humana, lo cual deberá justificarse en el informe del 
estudio. Cuando se trate de sustancias problema potencialmente explosivas, 
se procurará evitar las condiciones favorables a una explosión. A fin de evitar el uso innecesario de animales, se hará una operación de prueba sin animales antes del ensayo límite, para confirmar que se crean en la cámara 
las condiciones adecuadas para dicho ensayo límite.
 
CONTEXTO 
29. Los animales se someterán a observación clínica frecuente durante el pe ­
ríodo de exposición. Las observaciones clínicas se repetirán al menos dos veces el día de la exposición, o más frecuentemente si lo indica la respuesta 
de los animales al tratamiento, y en lo sucesivo al menos una vez al día 
durante un período total de 14 días. La duración del período de observación no es fija, antes bien deberá determinarse en función de la naturaleza y el tiempo de aparición de los signos clínicos y de la longitud del período de 
recuperación. Es importante conocer el momento en el que aparecen y 
desaparecen los signos de toxicidad, especialmente si hay tendencia a una aparición retardada de los signos tóxicos. Todas las observaciones se regis ­
trarán sistemáticamente en fichas individuales de cada animal. Por razones 
de bienestar animal, los animales moribundos o que den muestras de dolor o 
signos de sufrimiento intenso y continuo deben ser sacrificados de forma compasiva. En el momento de explorar los signos clínicos de toxicidad, se procurará que el mal aspecto inicial y los trastornos respiratorios transitorios, 
derivados del procedimiento de exposición, no se confundan con efectos 
relacionados con el tratamiento. Se tendrán en cuenta los principios y cri ­
terios resumidos en el documento de orientación sobre criterios de trata ­
miento compasivo [Humane Endpoints Guidance Document (7)]. Cuando se 
encuentre algún animal muerto o se sacrifique por razones compasivas, 
deberá registrarse con la mayor precisión posible el momento de la muerte.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Las observaciones en de la jaula deberían incluir los cambios en la piel, 
pelo, ojos y membranas mucosas, y también los sistemas respiratorio, cir ­
culatorio, nervioso central y autónomo, así como la actividad somatomotriz y las pautas de comportamiento. Cuando sea posible se diferenciarán los efectos locales de los sistémicos. Debe prestarse atención especial a la 
observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño 
y coma. El registro de la temperatura rectal puede ayudar a detectar una bradipnea refleja o una hipo/hipertermia relacionadas con el tratamiento o con el confinamiento.
 
Peso corporal  
31. Los pesos corporales individuales se registrarán una vez durante el período 
de aclimatación, en el día previo a la exposición (día 0), y al menos en los 
días 1, 3 y 7 (y, en lo sucesivo, semanalmente) y en el momento de la muerte o la eutanasia si se produce después del día 1. Se acepta que el peso corporal es un indicador crítico de la toxicidad, por lo que deberán vigilarse 
estrechamente los animales que muestren una reducción progresiva de peso 
≥ 20 % en comparación con los valores preliminares. Los animales super ­
vivientes se pesan y se sacrifican de forma compasiva al final del período de post-exposición.
 
Anatomía patológica  
32. Todos los animales sometidos al ensayo, incluidos los que mueran durante 
su realización y los que se eliminen del estudio por razones de bienestar animal, se someterán a autopsia macroscópica. Si la autopsia no se puede practicar inmediatamente después de comprobar la muerte del animal, este 
será refrigerado (no congelado) a temperaturas suficientemente bajas para 
minimizar la autólisis. Las autopsias se practicarán lo antes posible, normal ­
mente en el plazo de uno o dos días. Se documentarán todas las modifica ­
ciones anatomopatológicas macroscópicas observadas en cada animal, po ­
niendo especial atención en las alteraciones de las vías respiratorias. 
33. Se podrán contemplar otras exploraciones incluidas de antemano en el di ­
seño para ampliar el valor interpretativo del estudio, como la medida del 
peso pulmonar de las ratas que sobrevivan o el examen microscópico de las 
vías respiratorias para aportar pruebas de irritación. La exploración de ór ­
ganos puede extenderse a aquellos que muestran signos de anatomapatología macroscópica en los animales que sobreviven 24 o más horas y a los 
órganos que se saben o suponen afectados. El examen microscópico de la 
totalidad de las vías respiratorias puede proporcionar información útil en el caso de sustancias problema que son reactivas con el agua, como las de naturaleza ácida o higroscópica.
 
DATOS E INFORME  
Datos  
34. Se documentarán por separado los datos de peso corporal y los resultados de 
la autopsia de cada animal. Los resultados de la observación clínica se 
reunirán en un cuadro que presente, por cada grupo de ensayo, el número 
de animales utilizados, el número de animales que presenten signos especí ­
ficos de toxicidad, el número de animales hallados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, el momento de la muerte 
de los distintos animales, la descripción y la evolución temporal de los 
efectos tóxicos y sin reversibilidad, y los resultados de la autopsia.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Informes de los ensayos  
35. El informe del ensayo debe incluir, en su caso, la información siguiente:  
Animales de experimentación y zootecnia  
— Descripción de las condiciones de enjaulado, tales como: número (o 
variación del número) de animales por jaula, materiales de cama, tem ­
peratura ambiente y humedad relativa, fotoperíodo e identificación de la 
dieta. 
— Especie o variedad empleada y justificación del uso de una especie 
distinta de la rata. 
— Número, edad y sexo de los animales. — Método de asignación al azar. — Pormenores de la calidad del alimento y el agua (incluido el tipo/origen 
de la alimentación y el origen del agua) . 
— Descripción de cualquier acondicionamiento previo al estudio, incluidos 
alimentación, cuarentena y tratamiento de enfermedades.  
Sustancia problema:  
— Naturaleza física, pureza y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (in ­
cluida la isomerización). 
— Identificación química y número de registro del Chemical Abstracts 
Service (CAS), si se conoce.  
Vehículo:  
— Justificación del uso de un vehículo y justificación de la elección del 
mismo (si es distinto del agua) . 
— Datos históricos o paralelos que demuestren que el vehículo no interfiere 
en los resultados del estudio.  
Cámara de inhalación:  
— Descripción de la cámara de inhalación, incluidos las dimensiones y el 
volumen. 
— Procedencia y descripción del equipo empleado para la exposición de los 
animales y la generación de la atmósfera. 
— Equipo empleado para medir la temperatura, la humedad, el tamaño de 
partícula y la concentración real. 
— Fuente de aire, tratamiento del aire suministrado/extraído y sistema de 
acondicionamiento. 
— Métodos de calibración del equipo para garantizar una atmósfera expe ­
rimental homogénea. 
— Diferencia de presión (positiva o negativa). 
— Puertos de exposición por cámara (de solo por la nariz); ubicación de los 
animales en el sistema (de cuerpo entero). 
— Homogeneidad/estabilidad temporal de la atmósfera experimental. 
— Localización de los sensores de temperatura y humedad, y muestreo de 
la atmósfera experimental en la cámara. 
— Caudales de aire, caudal del aire por puerto de exposición (solo por la 
nariz) o carga de animales por cámara (de cuerpo entero). 
— Descripción del equipo empleado para medir el oxígeno y el dióxido de 
carbono, si procede.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— Tiempo necesario para alcanzar el equilibrio (t  95 ) en la cámara de inha ­
lación. 
— Número de variaciones de volumen por hora. 
— Dispositivos de dosificación (si procede).  
Datos relativos a la exposición:  
— Justificación de la concentración diana seleccionada en el estudio prin ­
cipal. 
— Concentraciones nominales (masa total de sustancia problema generada 
en la cámara de inhalación dividida por el volumen de aire que recorre 
la cámara). 
— Concentraciones reales de la sustancia problema recuperadas en la zona 
de respiración de los animales; en el caso de mezclas que dan lugar a 
formas físicas heterogéneas (gases, vapores, aerosoles), se podrá analizar 
cada una de ellas por separado. 
— Todas las concentraciones atmosféricas se registrarán en unidades de 
masa (mg/l, mg/m  3 , etc.); se podrán indicar además las unidades de 
volumen (ppm, ppmm) entre paréntesis. 
— Distribución del tamaño de partícula, diámetro aerodinámico mediano de 
masa (MMAD) y desviación típica geométrica ( σg), incluidos los co ­
rrespondientes métodos de cálculo; se documentarán los análisis granu ­
lométricos individuales.  
Condiciones del ensayo:  
— Descripción pormenorizada de la preparación de la sustancia problema y 
de cualquier método empleado para reducir el tamaño de partícula de las materias sólidas o preparar soluciones de la sustancia problema; cuando 
exista la posibilidad de que los procesos mecánicos hayan alterado la 
composición de la sustancia problema, se incluirán los resultados de los análisis realizados para verificar dicha composición. 
— Descripción (preferiblemente acompañada de un diagrama) del equipo 
empleado para generar la atmósfera experimental y para exponer los animales a la misma. 
— Descripción pormenorizada del método de análisis químico empleado y 
de la validación del método (incluida la eficiencia de recuperación de la sustancia problema en el medio ambiente experimental). 
— Justificación de las concentraciones experimentales seleccionadas.  
Resultados:  
— Tabulación de los valores de temperatura de la cámara, humedad y 
caudal de aire. 
— Tabulación de las concentraciones nominales y reales de la cámara. 
— Tabulación de los datos de tamaño de partícula, incluidos los de reco ­
gida de muestras para el análisis, distribución granulométrica y cálculos de MMAD y σ
 g . 
— Tabulación de las respuestas y niveles de concentración de cada animal 
(es decir, animales que presenten signos de toxicidad, incluidas la mor ­
talidad y la naturaleza, gravedad y duración de los efectos), 
— Pesos corporales de cada animal registrados en el estudio; fecha y hora 
de la muerte si se produce antes de la eutanasia programada; cronología 
de la aparición de los signos de toxicidad e indicación de si estos son 
reversibles en cada animal.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— Resultados de la autopsia y observaciones histopatológicas de cada ani ­
mal, si se dispone de ellas. 
— Categoría de la clasificación CLP y valor de corte de la CL  50 . 
Evaluación e interpretación de los resultados:  
— Se hará especial hincapié en la descripción de los procedimientos em ­
pleados para cumplir los criterios del presente método de ensayo, esto es, la concentración límite o el tamaño de partícula. 
— Se tomará en consideración la respirabilidad de las partículas a la luz de 
los resultados globales, de manera especial si no se cumplen los criterios 
relativos al tamaño de partícula. 
— En la evaluación global del estudio se expondrá la coherencia de los 
métodos empleados para determinar las concentraciones nominales y reales y la relación entre ellas. 
— Se explicará la causa probable de muerte y el mecanismo de acción 
(sistémico o local) predominante. 
— Se facilitará una explicación de por qué ha sido preciso sacrificar de 
forma compasiva los animales con signos evidentes de dolor o de su ­
frimiento intenso y duradero, atendiendo a los criterios del documento de orientación de la OCDE sobre criterios de tratamiento compasivo (Guidance Document on Humane Endpoints) (7).
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Capítulo B.2 del presente anexo. Toxicidad aguda por inhalación. 
(2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biome ­
tric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. 
Toxicol. 77: 243-254. 
(3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549. 
(4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134. 
(5) Capítulo B.1  ter del presente anexo. Toxicidad oral aguda. Método de las 
clases de toxicidad aguda. 
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation 
Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing 
and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/ env/testguidelines] 
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines] 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines] 
(9) Reglamento (CE) n
 o 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
16 de diciembre de 2008, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 
67/548/CEE y 1999/45/CE, y se modifica el reglamento (CE) n
 o 1907/2006 
(DO L 353 de 31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) Capítulo B.40 del presente anexo. Corrosión cutánea  in vitro : ensayo de 
resistencia eléctrica transcutánea (RET). 
(11) Capítulo B.40  bis del presente anexo. Corrosión cutánea  in vitro : ensayo 
con modelo de piel humana. 
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York. 
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute 
Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. 
(15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167 
(16) Naciones Unidas (2007), Sistema globalmente Armonizado de Clasificación 
y Etiquetado de Productos Químicos (SGA), ST/SG/AC.10/30, Naciones Unidas, Nueva York y Ginebra. Disponible en la dirección: [http:// 
www.unece.org.es/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_s.html]
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Apéndice 1  
DEFINICIÓN  
Sustancia problema:  cualquier sustancia o mezcla analizada mediante este mé ­
todo de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Apéndice 2  
Procedimiento de ensayo según la concentración inicial en caso de gases 
(ppm/4 horas)  
Observaciones generales (  1 ) 
Por cada concentración inicial, el procedimiento que debe seguirse se indica en 
los respectivos esquemas de ensayo que figuran en el presente anexo. 
Apéndice 2a: concentración inicial de 100 ppm Apéndice 2b: concentración inicial de 500 ppm Apéndice 2c: concentración inicial de 2 500 ppm Apéndice 2d: concentración inicial de 20 000 ppm En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, 
el procedimiento de ensayo seguirá las flechas indicadas.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) En los cuadros siguientes se hace referencia al SGA (sistema globalmente armonizado de 
clasificación y etiquetado de productos químicos). El equivalente de la UE es el 
Reglamento (CE) n  o 1272/2008. En el caso de la toxicidad aguda por inhalación, el 
Reglamento (CE) n  o 1272/2008 (9) no contempla la categoría 5.
 Apéndice 2a  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicialde 100 
ppm/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Apéndice 2b  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicialde 500 
ppm/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Apéndice 2c  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicialde 2 500 
ppm/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Apéndice 2d  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicialde 20 000 ppm/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Apéndice 3  
Procedimiento de ensayo según la concentración inicial en caso de vapores 
(mg/l/4 horas)  
Observaciones generales (  1 ) 
Por cada concentración inicial, el procedimiento que debe seguirse se indica en 
los respectivos esquemas de ensayo que figuran en el presente anexo. 
Apéndice 3a: concentración inicial de 0,5 mg/l Apéndice 3b: concentración inicial de 2,0 mg/l Apéndice 3c: concentración inicial de 10 mg/l Apéndice 3d: concentración inicial de 20 mg/l En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, 
el procedimiento de ensayo seguirá las flechas indicadas.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) En los cuadros siguientes se hace referencia al SGA (sistema globalmente armonizado de 
clasificación y etiquetado de productos químicos). El equivalente de la UE es el 
Reglamento (CE) n  o 1272/2008. En el caso de la toxicidad aguda por inhalación, el 
Reglamento (CE) n  o 1272/2008 (9) no contempla la categoría 5.
 Apéndice 3a  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de vapores con una concentración inicial de 0,5 mg/l/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Apéndice 3b  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de gases con una concentración inicial de 2 mg/l/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Apéndice 3c  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de vapores con una concentración inicial de 10 mg/l/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Apéndice 3d  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de vapores con una concentración inicial de 20 mg/l/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Apéndice 4  
Procedimiento de ensayo según la concentración inicial en caso de aerosoles 
(mg/l/4 horas)  
Observaciones generales (  1 ) 
Por cada concentración inicial, el procedimiento que debe seguirse se indica en 
los respectivos esquemas de ensayo que figuran en el presente anexo. 
Apéndice 4a: concentración inicial de 0,05 mg/l Apéndice 4b: concentración inicial de 0,5 mg/l Apéndice 4c: concentración inicial de 1 mg/l Apéndice 4d: concentración inicial de 5 mg/l En función del número de animales muertos o sacrificados de forma compasiva, 
el procedimiento de ensayo seguirá las flechas indicadas.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) En los cuadros siguientes se hace referencia al SGA (sistema globalmente armonizado de 
clasificación y etiquetado de productos químicos). El equivalente de la UE es el 
Reglamento (CE) n  o 1272/2008. En el caso de la toxicidad aguda por inhalación, el 
Reglamento (CE) n  o 1272/2008 (9) no contempla la categoría 5.
 Apéndice 4a  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de vapores con una concentración inicial de 0,05 
mg/l/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Apéndice 4b  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de aerosoles con una concentración inicial de 0,5 
mg/l/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Apéndice 4c  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de aerosoles con una concentración inicial de 1 
mg/l/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Apéndice 4d  
Toxicidad aguda por inhalación:  
Procedimiento de ensayo de aerosoles con una concentración inicial de 5 
mg/l/4 horas
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  ESTUDIO DE NEUROTOXICIDAD PARA EL DESARROLLO  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de 
la OCDE TG 426 (2007). En Copenhague, en junio de 1995, un grupo de 
trabajo de la OCDE sobre toxicidad para la reproducción y el desarrollo 
debatió la necesidad de actualizar las vigentes directrices de ensayo de la OCDE sobre la toxicidad para la reproducción y el desarrollo, así como de elaborar nuevas directrices sobre parámetros aún no incluidos (1). El grupo 
de trabajo recomendó que se escribieran unas directrices de ensayo sobre la 
neurotoxicidad para el desarrollo, sobre la base de unas directrices de la Agencia de Protección del Medio Ambiente estadounidense (EPA), que después han sido revisadas (2). En junio de 1996 se celebró en Copenhague 
una segunda reunión de consulta para facilitar a la Secretaría orientaciones 
para el esbozo de unas nuevas directrices de ensayo sobre la neurotoxicidad para el desarrollo, incluidos los principales elementos como, por ejemplo, los datos sobre la elección de la especie animal, el período de adminis ­
tración, el período de las pruebas, los parámetros que deben evaluarse, y los 
criterios para la evaluación de los resultados. En 1998 se publicaron unas directrices de evaluación del riesgo de neurotoxicidad de EE. UU. (3). En octubre de 2000 se celebraron consecutivamente una reunión de consulta de 
expertos de la OCDE y un taller del Instituto de Ciencias del Riesgo del 
ILSI, y en 2005 tuvo lugar en Tokio una reunión de consulta de expertos. Estas reuniones se celebraron para debatir las cuestiones científicas y téc ­
nicas relacionadas con las vigentes directrices de ensayo, y en ellas se 
elaboraron recomendaciones (4)(5)(6)(7) que se tuvieron en cuenta para 
desarrollar el presente método de ensayo. En los documentos de orientación de la OCDE n
 o 43 sobre ‘Reproductive Toxicity Testing and Assessment’ 
(Ensayo y evaluación de la toxicidad para la reproducción) (8) y n  o 20 
sobre ‘Neurotoxicity Testing’ (Ensayo de la neurotoxicidad) (9) se encuen ­
tra información adicional sobre la realización, interpretación y terminología correspondientes al presente método de ensayo.
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
2. Se sabe que una serie de sustancias produce efectos neurotóxicos en el 
desarrollo de los seres humanos y de otras especies (10)(11)(12)(13). Con el fin de valorar y evaluar las características tóxicas de una sustancia puede 
ser necesario determinar su posible neurotoxicidad para el desarrollo. Se 
han diseñado estudios de neurotoxicidad para el desarrollo con el fin de ofrecer datos, incluida la caracterización de la relación dosis-respuesta, en relación con los posibles efectos funcionales y morfológicos sobre el sis ­
tema nervioso en desarrollo de la descendencia que puedan derivarse de la 
exposición durante la gestación y durante las primeras fases de la vida. 
3. El estudio de la neurotoxicidad para el desarrollo puede llevarse a cabo 
como estudio aparte, incorporarse en un estudio de la toxicidad para la 
reproducción o de la neurotoxicidad para los adultos [por ejemplo, métodos de ensayo B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)], o añadirse a un estudio de toxicidad para el desarrollo prenatal [por ejemplo, método de ensayo B.31 
(17)]. Cuando el estudio de neurotoxicidad para el desarrollo está incorpo ­
rado o añadido a otro estudio, es imperativo preservar la integridad de los dos tipos de estudios. Todos los ensayos deben cumplir la legislación aplicable o las directrices gubernamentales o institucionales para el uso 
de animales de laboratorio en la investigación (por ejemplo, 18). 
4. Antes de efectuar el estudio, el laboratorio de ensayo debe considerar toda 
la información disponible sobre la sustancia problema. Tal información ha de incluir la identidad y la estructura de la sustancia, sus propiedades 
fisicoquímicas, los resultados de otros eventuales ensayos de toxicidad  in 
vitro  o in vivo  efectuados con ella, los datos toxicológicos disponibles sobre 
sustancias relacionadas estructuralmente, y el uso o usos previstos de la sustancia. Esta información es necesaria para que todos los interesados 
puedan estar seguros de que el ensayo es pertinente para la protección de 
la salud humana, y ayudará a la selección de una dosis inicial adecuada.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
5. La sustancia problema se administra a los animales durante la gestación y 
lactancia. Se someten a ensayo animales madres para evaluar los efectos en 
las hembras gestantes y lactantes y también para obtener información com ­
parativa (madres/descendientes). Se seleccionan aleatoriamente descendien ­
tes dentro de las camadas para realizar la evaluación de la neurotoxicidad. 
Esta evaluación consiste en realizar observaciones para detectar anomalías 
conductuales y neurológicas macroscópicas, incluida la evaluación del de ­
sarrollo físico, la ontogenia del comportamiento, la actividad motriz, las funciones motrices y sensitivas, y el aprendizaje y la memoria, así como 
la evaluación del peso del encéfalo y de la neuropatología durante el pe ­
ríodo de desarrollo postnatal y la edad adulta. 
6. Cuando el método de ensayo se lleva a cabo como estudio aparte, pueden 
utilizarse animales disponibles adicionales de cada grupo para aplicarles procedimientos específicos neuroconductuales, neuropatológicos, neuroquí ­
micos o electrofisiológicos, con el fin de completar los datos obtenidos a 
partir de los exámenes recomendados por este método de ensayo 
(16)(19)(20)(21). Los procedimientos complementarios pueden ser especial ­
mente útiles cuando la observación empírica, los efectos previstos o el mecanismo o modo de acción indiquen un tipo determinado de neurotoxi ­
cidad. Estos procedimientos complementarios pueden utilizarse con las ma ­
dres y también con las crías. Además, pueden utilizarse también procedi ­
mientos  ex vivo  o in vitro,  en la medida en que dichos procedimientos no 
alteren la integridad de los procedimientos  in vivo.
 
PREPARACIÓN DEL ENSAYO  
Selección de la especie animal  
7. La especie de ensayo preferida es la rata, pero pueden utilizarse otras 
especies cuando sea pertinente. Téngase en cuenta, no obstante, que los 
días de gestación y postnatales especificados en este método de ensayo 
son específicos de las cepas de ratas utilizadas habitualmente, y deben seleccionarse días comparables si se utiliza una especie diferente o una cepa poco usual. La utilización de otra especie debe justificarse con datos 
toxicológicos, farmacocinéticos o de otro tipo. La justificación debe incluir 
la disponibilidad de evaluaciones neuroconductuales y neuropatológicas postnatales propias de la especie. Si existe un ensayo anterior que haya suscitado inquietud, debe considerarse utilizar la especie o cepa que haya 
suscitado tal inquietud. Debido a las diferencias de comportamiento que 
presentan las diferentes cepas de rata, debe demostrarse que la cepa selec ­
cionada para su uso presenta una fecundidad y una capacidad de respuesta adecuadas. Deben estar documentadas la fiabilidad y la sensibilidad de otras 
especies para detectar la neurotoxicidad para el desarrollo.
 
Condiciones de alojamiento y alimentación  
8. El local de los animales de experimentación ha de estar a una temperatura 
de 22 ± 3 °C. Aunque la humedad relativa ha de ser, como mínimo, del 
30 % y preferentemente sin superar el 70 %, salvo durante la limpieza del local, lo ideal es que esté comprendida entre el 50 y el 60 %. La ilumina ­
ción será artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. También es 
posible invertir el ciclo de luz antes del apareamiento y en toda la duración 
del estudio, a fin de efectuar las evaluaciones de los parámetros funcionales y de comportamiento durante el período de oscuridad (con luz roja), es decir, durante el tiempo en que los animales están normalmente activos 
(22). Los eventuales cambios en el ciclo de luz-oscuridad deben incluir 
un tiempo adecuado de aclimatación para que los animales puedan adap ­
tarse al nuevo ciclo. Puede proporcionarse una dieta alimentaria corriente para animales de laboratorio y agua a voluntad. Los tipos de alimentos y de 
agua deben notificarse y ambos elementos deben analizarse para la detec ­
ción de eventuales contaminantes.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Los animales pueden enjaularse por separado o en pequeños grupos del 
mismo sexo. El apareamiento debe llevarse a cabo en jaulas adecuadas al 
efecto. Una vez comprobado el apareamiento o como tarde el día 15 de la gestación, los animales que se hayan apareado deben colocarse por separado en jaulas preparadas para el parto y la maternidad. Las jaulas se colocan de 
manera que los posibles efectos debidos a la puesta de los animales en las 
mismas sean mínimos. Cuando se acerque la fecha del parto, a las hembras apareadas se les proporcionará material adecuado y determinado de nidifi ­
cación. Se sabe que el estrés o la manipulación indebida durante la gesta ­
ción pueden ocasionar resultados adversos, como muerte fetal y alteraciones 
del desarrollo fetal y postnatal. Para prevenir las muertes fetales debidas a factores ajenos al tratamiento, los animales deben tratarse con precaución durante la gestación, y debe evitarse el estrés debido a factores externos 
como el ruido excesivo.
 
Preparación de los animales  
10. Deben emplearse animales sanos, que estén aclimatados a las condiciones 
del laboratorio y que no se hayan sometido a experimentos previos, a 
menos que el estudio esté incorporado a otro estudio (véase el punto 3). Deben caracterizarse los animales de experimentación en cuanto a su espe ­
cie, cepa, procedencia, sexo, peso y edad. A cada animal se le debe asignar 
un número de identificación único, con el que estará marcado. Los animales de todos los grupos de ensayo han de ser tan homogéneos como resulte posible en cuanto a su peso y edad, y deben estar en el intervalo normal de 
la especie y cepa en estudio. Deben emplearse hembras adultas jóvenes y 
nulíparas para cada dosis. Los hermanos no deben aparearse, y debe pres ­
tarse atención para garantizar este extremo. El día de gestación (DG) 0 es el día en el que se observa la presencia de un tapón vaginal o de semen. Debe 
dejarse un tiempo adecuado de aclimatación (por ejemplo, de 2 o 3 días), al 
comprar a un proveedor animales con un tiempo conocido de gestación. Las hembras apareadas se deben repartir sin sesgos entre los grupos tratados y los de control, y en la medida de lo posible deben distribuirse de manera 
equilibrada entre los grupos (por ejemplo, se recomienda un procedimiento 
aleatorio estratificado para conseguir una distribución equilibrada entre to ­
dos los grupos, tal como el basado en el peso corporal). Las hembras inseminadas por un mismo macho deben repartirse de forma igualitaria 
entre los grupos.
 
PROCEDIMIENTO  
Número y sexo de los animales  
11. Cada grupo tratado y de control debe incluir un número suficiente de 
hembras grávidas que se expondrán a la sustancia problema a fin de con ­
seguir un número adecuado de descendientes para la evaluación de la neurotoxicidad. Se recomienda un total de 20 camadas para cada nivel de 
dosis. Se permiten diseños de la administración en grupos duplicados y en 
grupos escalonados siempre que se consiga el número total de camadas por grupo y se utilicen modelos estadísticos adecuados para tener en cuenta las duplicaciones. 
12. En el día postnatal (DPN) 4 (el DPN 0 es el del parto) o antes del mismo, 
se debe ajustar el tamaño de cada camada mediante la eliminación de las 
crías sobrantes por selección aleatoria para obtener un tamaño uniforme de 
todas las camadas (23). El tamaño de la camada no debe superar el tamaño medio de las camadas de la cepa de roedores utilizados (8-12). Las camadas deben tener, en la medida de lo posible, un número igual de crías machos y 
hembras. No es apropiada la eliminación selectiva de las crías, por ejemplo 
en función del peso corporal. Tras la normalización de las camadas (sacri ­
ficio de las crías sobrantes) y antes de realizar las pruebas de los parámetros funcionales, las crías concretas que se asignen a los ensayos anteriores o 
posteriores al destete deben identificarse de manera inequívoca, utilizando 
cualquier método no cruel adecuado a tal fin (por ejemplo, 24).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Asignación de los animales a los ensayos funcionales y de comporta ­
miento, pesajes del encéfalo y evaluaciones neuropatológicas  
13. El método de ensayo permite diferentes enfoques con respecto a la asigna ­
ción de animales expuestos en el útero y a través de la lactancia a ensayos funcionales y de comportamiento, determinación de la maduración sexual, pesaje del encéfalo, y evaluación neuropatológica (25). Se pueden añadir 
otros ensayos de la función neuroconductual (por ejemplo, el comporta ­
miento social), de neuroquímica o de neuropatología según cada caso, siempre que no se vea comprometida la integridad de los ensayos originales requeridos. 
14. Se seleccionan las crías de cada grupo de dosis y se asignan para la 
evaluación de los parámetros el DPN 4 o después. Deben seleccionarse las crías de tal modo que, en la medida de lo posible, estén representados 
igualmente en todas las pruebas los dos sexos de cada camada en cada 
grupo de dosis. Para el ensayo de la actividad motriz, debe someterse a ensayo el mismo par de crías machos y hembras a todas las edades antes del destete (véase el punto 35). Para todos los demás ensayos, es posible 
asignar a las diferentes pruebas de comportamiento el mismo par de ani ­
males machos y hembras u otros distintos. Puede ser necesario asignar crías diferentes a los ensayos de la función cognitiva de animales destetados frente a los de animales adultos con el fin de evitar la confusión entre 
los efectos de la edad y los del entrenamiento previo sobre estas mediciones 
(26)(27). En el momento del destete (DPN 21), las crías que no se hayan seleccionado para algún ensayo pueden desecharse de forma compasiva. Todas las eventuales alteraciones de las asignaciones de las crías deben 
recogerse en el informe. La unidad estadística de medida debe ser la ca ­
mada (o la madre) y no la cría. 
15. Existen diversas maneras de asignar las crías a los exámenes anteriores y 
posteriores al destete, ensayos cognitivos, exámenes patológicos, etc. (véase 
la figura 1 en cuanto al diseño general y el apéndice 1 en cuanto a ejemplos de asignación). Los números mínimos recomendados de animales en cada grupo tratado para los exámenes anteriores y posteriores al destete son los 
siguientes: 
Observaciones clínicas y de peso corporal Todos los animales 
Observaciones clínicas detalladas 20/sexo (1/sexo/camada) Peso del encéfalo (tras la fijación) DPN 11-22 10/sexo (1/camada) Peso del encéfalo (sin fijar) ~ DPN 70 10/sexo (1/camada) 
Neuropatología (fijación por inmersión o 
perfusión) DPN 11-22 10/sexo (1/camada) 
Neuropatología (fijación por perfusión) ~ 
DPN 70 10/sexo (1/camada) 
Maduración sexual 20/sexo (1/sexo/camada) 
Otros parámetros del desarrollo (optativos) Todos los animales 
Ontogenia del comportamiento 20/sexo (1/sexo/camada) Actividad motriz 20/sexo (1/sexo/camada) Funciones motrices y sensitivas 20/sexo (1/sexo/camada) Aprendizaje y memoria 10/sexo (
 a ) (1/camada)  
( a ) Dependiendo de la sensibilidad de los ensayos de la función cognitiva, debe 
considerarse a veces la investigación de un número mucho más elevado de ani ­
males, por ejemplo, hasta 1 macho y 1 hembra por camada (sobre las asignaciones 
de animales, véase el apéndice 1) [se encuentra más información sobre el tamaño 
de la muestra en el documento de orientación de la OCDE 43 (8)].  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Posología  
16. Se emplean al menos tres dosis de ensayo y un grupo de control en para ­
lelo. Las dosis han de ser espaciadas para obtener una gradación de efectos 
tóxicos. Salvo cuando esté limitada por la naturaleza fisicoquímica o las propiedades biológicas de la sustancia, la dosis más elevada debe elegirse de forma que induzca cierta toxicidad para la madre (por ejemplo, signos 
clínicos, descenso del aumento de peso corporal (en no más del 10 %), o 
pruebas de toxicidad limitante de la dosis en un órgano diana). La dosis más alta puede limitarse a 1 000 mg/kg/día de peso corporal, con algunas excepciones; por ejemplo, la exposición humana prevista puede indicar la 
necesidad de utilizar una dosis superior. Otra posibilidad consiste en realizar 
estudios piloto o estudios preliminares para determinar el intervalo de con ­
centraciones, a fin de establecer la dosis máxima utilizable que debe pro ­
ducir un grado mínimo de toxicidad para la madre. Si se ha comprobado 
que la sustancia problema es tóxica para el desarrollo, ya sea en un estudio 
normal de toxicidad para el desarrollo o en un estudio piloto, la dosis más alta debe ser la dosis máxima que no induce toxicidad excesiva para los descendientes ni muerte fetal o neonatal ni malformaciones, lo que sería 
suficiente para no permitir una evaluación significativa de la neurotoxicidad. 
La dosis más baja debe aspirar a no provocar ningún signo de toxicidad para la madre ni para el desarrollo, incluida la neurotoxicidad. Debe selec ­
cionarse una secuencia decreciente de dosis con vistas a demostrar la even ­
tual relación dosis-respuesta y la existencia de un nivel sin efectos adversos 
observados (NOAEL), o dosis cerca del límite de detección que permitan la determinación de una dosis de referencia. Los intervalos del doble al cuá ­
druple suelen ser óptimos para establecer las dosis decrecientes y a menudo 
es preferible añadir un cuarto grupo de ensayo en lugar de utilizar intervalos 
muy amplios (por ejemplo, con un factor superior a 10) entre dosis. 
17. Las dosis deben establecerse tomando en consideración todos los datos 
disponibles sobre la toxicidad y la información complementaria relativa al 
metabolismo y la toxicocinética de la sustancia problema o productos afi ­
nes. Dicha información puede ayudar asimismo a justificar la pertinencia de la posología. Debe considerarse la administración directa de dosis a las crías en función de la información sobre la exposición y la farmacocinética 
(28)(29). Antes de realizar estudios de administración directa de dosis deben 
considerarse cuidadosamente sus ventajas e inconvenientes (30). 
18. El grupo de control en paralelo debe ser un grupo de control que no recibe 
tratamiento, o un grupo de control del vehículo si se utiliza este para 
administrar la sustancia problema. En principio, todos los animales deben 
recibir el mismo volumen de sustancia problema o de vehículo por unidad de peso corporal. Si se utiliza un vehículo u otro aditivo para facilitar la administración, debe atenderse a las siguientes características: efectos sobre 
la absorción, distribución, metabolismo o retención de la sustancia proble ­
ma; efectos sobre las propiedades químicas de la sustancia problema que puedan modificar sus características de toxicidad; y efectos sobre el con ­
sumo de alimentos y agua o sobre el estado nutricional de los animales. El 
vehículo no debe provocar efectos que puedan interferir con la interpreta ­
ción del estudio y tampoco debe ser tóxico neuroconductual ni afectar a la reproducción o al desarrollo. En caso de nuevos vehículos, debe incluirse un grupo de control que no reciba tratamiento, además de un grupo de 
control del vehículo. Los animales del grupo o grupos de control deben 
tratarse de la misma manera que los de los grupos de ensayo.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Administración de las dosis  
19. La sustancia problema o el vehículo deben administrarse por la vía más 
pertinente para la posible exposición humana, y sobre la base de la infor ­
mación disponible relativa al metabolismo y distribución en los animales de ensayo. La vía de administración será generalmente oral (por ejemplo, vía oral forzada, con la alimentación, con el agua de bebida), pero pueden 
utilizarse otras vías (por ejemplo, cutánea, por inhalación), en función de 
las características y de las vías de exposición humana previstas o conocidas (se dan más orientaciones en el documento de orientación 43 (8). Debe facilitarse una justificación de la vía de administración elegida. La sustancia 
problema debe administrarse todos los días a la misma hora más o menos. 
20. La dosis administrada a cada animal debe basarse normalmente en la última 
determinación del peso corporal. No obstante, hay que ser prudente al 
adaptar la dosis en el último tercio de la gestación. Si se observa una 
toxicidad excesiva en las madres tratadas, estas deberán sacrificarse por métodos compasivos. 
21. La sustancia problema o el vehículo deben administrarse como mínimo una 
vez al día a las hembras apareadas desde el momento de la implantación (DG 6) hasta el final de la lactancia (DPN 21), de forma que las crías estén expuestas a la sustancia durante su desarrollo neurológico, tanto pre como 
postnatal. La edad a la que se inicia la administración, así como la duración 
y la frecuencia de esta, podrán ajustarse en caso de que haya pruebas que apoyen otro diseño experimental más pertinente para la exposición humana. La duración de la administración debe ajustarse en caso de que se utilicen 
otras especies, para garantizar la exposición durante todas las fases tempra ­
nas del desarrollo del encéfalo (es decir, las equivalentes al crecimiento del encéfalo humano en los períodos prenatal y postnatal temprano). La admi ­
nistración puede comenzar desde el inicio de la gestación (DG 0), aunque 
debe prestarse atención al potencial de la sustancia problema para causar la 
muerte del embrión antes de la implantación. Si la administración comen ­
zara el DG 6 se evitaría este riesgo, pero no se tratarían las fases de desarrollo entre los DG 0 y 6. Cuando un laboratorio compra animales 
ya apareados, es imposible comenzar la administración el DG 0, por lo 
que el DG 6 sería una buena opción para empezarla. El laboratorio de ensayo debe fijar la posología según la información pertinente disponible sobre los efectos de la sustancia problema, la experiencia previa y las 
consideraciones logísticas; puede incluirse la continuación de la adminis ­
tración pasado el destete. No debe administrarse la sustancia problema el día del parto a los animales que no hayan terminado de parir completamen ­
te. En general, se acepta que la exposición de las crías tiene lugar a través 
de la leche materna; sin embargo, debe considerarse la administración di ­
recta de la sustancia a las crías en los casos en que falten pruebas de la continuidad de la exposición de la descendencia. Pueden obtenerse estas 
pruebas de que la exposición continúa a partir de, por ejemplo, la informa ­
ción farmacocinética, la toxicidad para la descendencia o cambios en bio ­
marcadores (28).
 
OBSERVACIONES  
Observaciones sobre las madres  
22. Todas las madres deben observarse cuidadosamente al menos una vez al día 
para comprobar su estado de salud, incluida la morbimortalidad. 
23. Durante los períodos de tratamiento y de observación, deben realizarse 
periódicamente (al menos dos veces durante el período de administración 
en la gestación y dos veces durante el período de administración en la lactancia) observaciones clínicas más detalladas, utilizando al menos diez madres por nivel de dosis. Los animales serán observados, fuera de su jaula 
de alojamiento, por técnicos especializados que no estén advertidos del 
tratamiento de los animales, utilizando procedimientos normalizados para minimizar el estrés de los animales y los sesgos de los observadores, y maximizar la fiabilidad entre los observadores. Cuando sea posible, se 
recomienda que todas las observaciones de un determinado estudio sean 
hechas por el mismo técnico.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. La presencia de signos observados debe consignarse. Siempre que sea 
factible, se registrará también la magnitud de los signos observados. Las 
observaciones clínicas deben incluir, entre otras cosas, los cambios de la piel, pelo, ojos, mucosas, la presencia de secreciones y la actividad neuro ­
vegetativa (por ejemplo, lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila, pauta 
inusual de respiración y/o respiración por la boca, y cualquier signo anó ­
malo de micción o defecación). 
25. También habrá de anotarse cualquier respuesta no habitual en lo que se 
refiere a la posición del cuerpo, el nivel de actividad (por ejemplo, aumento o disminución de la exploración de la zona normal) y la coordinación de los movimientos. Deben registrarse también los cambios observados en la mar ­
cha (por ejemplo, contoneo o ataxia), postura (por ejemplo, espalda encor ­
vada) y respuesta a la manipulación, a la colocación o a otros estímulos ambientales, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, convulsiones, temblores, estereotipias (por ejemplo, realización excesiva 
de movimientos de limpieza, movimientos anómalos de la cabeza, recorri ­
dos repetitivos en círculo) o comportamientos anómalos (por ejemplo, la ­
mido excesivo o mordiscos, automutilación, marcha hacia atrás, vocaliza ­
ción) o de agresión. 
26. Los signos de toxicidad han de anotarse, incluidos el día de inicio, la hora 
del día, el grado y la duración. 
27. Los animales deben pesarse en el momento en que se les administra la 
sustancia, al menos una vez por semana a lo largo de todo el estudio, el 
día del parto o cerca de este, y el día DPN 21 (destete). En los ensayos en que se emplee la vía oral forzada, las madres deben pesarse como mínimo dos veces por semana. Las dosis deben adaptarse en el momento de cada 
determinación del peso corporal, según proceda. El consumo de alimentos 
debe medirse al menos una vez por semana durante la gestación y lactancia. Debe medirse el consumo de agua al menos semanalmente, si la exposición es a través del suministro de agua.
 
Observaciones sobre los descendientes  
28. Todos los descendientes deben observarse cuidadosamente al menos una 
vez al día para detectar los signos de toxicidad y la morbimortalidad. 
29. Durante los períodos de tratamiento y de observación, deben llevarse a cabo 
observaciones clínicas más detalladas de los descendientes. Los descendien ­
tes (al menos una cría/sexo/camada) serán observados por técnicos especia ­
lizados que no estén advertidos del tratamiento de los animales, utilizando 
procedimientos normalizados para minimizar los sesgos y maximizar la 
fiabilidad entre los observadores. Cuando sea posible, se recomienda que las observaciones sean hechas por el mismo técnico. Como mínimo, deben supervisarse los parámetros descritos en los puntos 24 y 25 en la medida 
adecuada para la fase de desarrollo que se esté observando. 
30. Han de anotarse todos los signos de toxicidad observados en los descen ­
dientes, incluidos el día de inicio, la hora del día, el grado y la duración.
 
Parámetros físicos y del desarrollo  
31. Los cambios en los parámetros del desarrollo previos al destete (por ejem ­
plo, despliegue de las orejas, apertura de los ojos, erupción de los incisivos) están muy correlacionados con el peso corporal (30)(31). El peso corporal puede ser el mejor indicador del desarrollo físico. La medición de paráme ­
tros del desarrollo se recomienda, por lo tanto, solo en el caso de que haya 
pruebas de que estos parámetros van a aportar información adicional. El calendario para la evaluación de estos parámetros se indica en el cuadro 1. En función de los efectos previstos y de los resultados de las mediciones 
iniciales, puede ser recomendable añadir puntos de medición adicionales o 
realizar las mediciones en otras fases del desarrollo.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Es recomendable utilizar la edad post-coital en lugar de la edad postnatal al 
evaluar el desarrollo físico (33). Si se someten a ensayo las crías el día del 
destete, se recomienda hacerlo antes del destete en sí, para evitar un efecto de confusión debido al estrés asociado con el destete. Además, debe evitarse realizar cualquier ensayo con las crías durante los dos días siguientes al 
destete.
 
Cuadro 1  
Calendario de la evaluación de los parámetros físicos y del desarrollo, y de los 
parámetros funcionales/de comportamiento  ( a ). 
Períodos de 
edad 
Parámetros Antes del destete (  b ) Antes de la madurez (  b ) Adultos jóvenes (  b ) 
Parámetros físicos y del desarrollo  
Peso corporal y obser ­
vaciones clínicas Semanalmente (  c ) Al menos cada dos 
semanas Al menos cada dos 
semanas 
Peso del encéfalo DPN 22 (  d ) En el momento del 
sacrifico 
Neuropatología DPN 22 (  d ) En el momento del 
sacrifico 
Maduración sexual — Cuando corresponda — Otros parámetros del 
desarrollo (
 e ) Cuando corresponda — —  
Parámetros funcionales y de comportamiento  
Ontogenia del compor ­
tamiento Al menos dos medi ­
ciones 
Actividad motriz (in ­
cluida la habituación) 1–3 veces (  f ) — Una vez 
Funciones motrices y 
sensitivas — Una vez Una vez 
Aprendizaje y memoria — Una vez Una vez  
( a ) Este cuadro presenta el número mínimo de veces que se deben efectuar las mediciones. En función de 
los efectos previstos y de los resultados de las mediciones iniciales, puede ser recomendable añadir 
puntos de medición adicionales (por ejemplo, animales viejos) o realizar las mediciones en otras fases del desarrollo. 
(
 b ) Se recomienda que las crías no se sometan a ensayo durante los dos días siguientes al destete (véase el 
punto 32). Las edades recomendadas para los ensayos con animales inmaduros son las siguientes: 
aprendizaje y memoria = DPN 25 ± 2; funciones motrices y sensitivas = DPN 25 ± 2. La edad 
recomendada para los ensayos con adultos jóvenes es DPN 60-70. 
( c ) Los pesos corporales deben medirse al menos dos veces por semana cuando se administra la sustancia 
directamente a las crías, con el fin de ajustar las dosis en un período de rápido aumento del peso 
corporal. 
( d ) El peso del encéfalo y la neuropatología pueden evaluarse en algún momento anterior (por ejemplo, 
DPN 11), cuando sea oportuno (véase el punto 39). 
( e ) Deben registrarse cuando corresponda otros parámetros del desarrollo, además del peso corporal (por 
ejemplo, apertura de los ojos) (véase el punto 31). 
( f ) Véase el punto 35.  
33. Debe procederse al recuento de las crías vivas y a su asignación de sexo, 
por ejemplo por inspección visual o medición de la distancia anogenital 
(34)(35), y debe pesarse individualmente cada cría de una camada, al nacer 
o poco después, al menos una vez por semana a lo largo del período de lactancia, y posteriormente al menos una vez cada dos semanas. Al evaluar la madurez sexual, debe determinarse, al menos en un macho y una hembra 
por camada, la edad y el peso corporal del animal cuando se observe la 
permeabilidad vaginal (36) o la separación del prepucio (37).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Ontogenia del comportamiento  
34. La ontogenia de determinados comportamientos debe medirse al menos en 
una cría/sexo/camada durante el período de edad apropiado, utilizándose las 
mismas crías en todos los días de ensayo en relación con todos los com ­
portamientos evaluados. Los días de medición debe estar espaciados uni ­
formemente a lo largo de dicho período para determinar si el cambio en la 
ontogenia del comportamiento es normal o si está relacionado con el trata ­
miento (38). A continuación se indican ejemplos de comportamientos cuya ontogenia puede evaluarse: reflejo de enderezamiento, geotaxia negativa y actividad motriz (38)(39)(40).
 
Actividad motriz  
35. La actividad motriz debe supervisarse (41)(42)(43)(44)(45) durante el pe ­
ríodo de edad anterior al destete y en la edad adulta. Sobre los ensayos en el momento del destete, véase el punto 32. La sesión de ensayo debe ser lo suficientemente larga para demostrar la habituación dentro de la sesión de 
los controles no tratados. Se recomienda encarecidamente utilizar la activi ­
dad motriz para evaluar la ontogenia del comportamiento. Si se utiliza como ensayo de la ontogenia del comportamiento, deben utilizarse los mismos animales en todas las sesiones de ensayo previas al destete. Las observa ­
ciones deben hacerse con la frecuencia suficiente para evaluar la ontogenia 
de la habituación dentro de cada sesión (44). De esta manera, puede ser necesario recurrir a tres o más momentos de observación hasta el día del 
destete, este incluido (por ejemplo, DPN 13, 17, 21). También deben exa ­
minarse los mismos animales, o los compañeros de camada, en la edad adulta, casi al final del estudio (por ejemplo, DPN 60-70). Podrán realizarse ensayos en días adicionales en caso necesario. La actividad motriz debe 
supervisarse con un aparato de registro automático de la actividad, que debe 
ser capaz de detectar tanto los aumentos como los descensos de esta (es decir, la actividad de referencia medida por el dispositivo no debe ser tan baja que no se puedan detectar los eventuales descensos, ni tan elevada que 
no se puedan detectar los eventuales aumentos de la actividad). Cada dis ­
positivo debe comprobarse mediante procedimientos estándar para garanti ­
zar, en la medida de lo posible, la fiabilidad del funcionamiento con dife ­
rentes dispositivos y en diferentes días. En la medida de lo posible, los 
grupos tratados deben repartirse de forma equilibrada entre los distintos 
dispositivos. Cada animal debe ser objeto de ensayo por separado. Los grupos tratados deben equilibrarse en cuanto a los momentos del ensayo a fin de evitar confusiones debidas a los ritmos circadianos de actividad. 
Debe procurarse que las variaciones en las condiciones de ensayo sean 
mínimas y no estén relacionadas sistemáticamente con el tratamiento. Entre las variables que pueden afectar a muchas mediciones del comportamiento, incluida la actividad motriz, están el nivel sonoro, el tamaño y la forma de 
las jaulas de ensayo, la temperatura, la humedad relativa, las condiciones de 
iluminación, los olores, el uso de las jaulas de alojamiento o de jaulas de ensayo distintas y las distracciones del entorno.
 
Funciones motrices y sensitivas  
36. Las funciones motrices y sensitivas deben estudiarse detalladamente al me ­
nos una vez en el período previo a la madurez y una vez a lo largo del 
período de adultos jóvenes (por ejemplo, DPN 60-70). Sobre los ensayos en el momento del destete, véase el punto 32. Debe realizarse un número suficiente de ensayos a fin de garantizar un muestreo cuantitativo adecuado 
de modalidades sensitivas (por ejemplo, somatosensitiva, vestibular) y de 
funciones motrices (por ejemplo, fuerza, coordinación). Pueden citarse como ejemplos de ensayos de las funciones motrices y sensitivas los si ­
guientes: reflejo de empuje extensor (46), reflejo de enderezamiento 
(47)(48), habituación al sobresalto acústico (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54), y 
potenciales provocados (55).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Ensayos de aprendizaje y memoria  
37. Debe realizarse un ensayo de aprendizaje asociativo y memoria tras el 
destete (por ejemplo, 25 ± 2 días) y en el período de adultos jóvenes 
(DPN 60 y después). Sobre los ensayos en el momento del destete, véase el punto 32. En estas dos fases de desarrollo, pueden utilizarse los mismos ensayos u otros distintos. Se permite cierta flexibilidad en la elección de los 
ensayos de aprendizaje y memoria con ratas destetadas y adultas. Sin em ­
bargo, los ensayos deben concebirse de forma que cumplan dos criterios. En primer lugar, el aprendizaje debe evaluarse bien como un cambio en varias pruebas o sesiones de aprendizaje repetidas, o bien, en caso de ensayos que 
supongan una única prueba, con referencia a una condición de control de 
los efectos no asociativos de la experiencia de formación. En segundo lugar, los ensayos deben incluir alguna medida de la memoria (a corto o a largo plazo) además del aprendizaje original (adquisición), pero esta medida de la 
memoria no puede notificarse si se carece de una medida de la adquisición 
obtenida en el mismo ensayo. Si los ensayos de aprendizaje y memoria ponen de manifiesto la existencia de un efecto de la sustancia problema, puede considerarse la realización de ensayos adicionales para descartar las 
interpretaciones alternativas basadas en alteraciones de las capacidades sen ­
sitivas, motivacionales o motrices. Además de los dos criterios anteriores, se recomienda que el ensayo de aprendizaje y memoria se elija sobre la base de su sensibilidad probada para la clase de la sustancia problema, si se 
dispone de dicha información en la bibliografía. A falta de tal información, 
los siguientes son ejemplos de ensayos que podrían hacerse para cumplir los criterios citados: evitación pasiva (43)(56)(57), ajuste retrasado para la po ­
sición de las ratas adultas (58) y de las ratas lactantes (59), condiciona ­
miento olfativo (43)(60), laberinto de agua de Morris (61)(62)(63), laberinto 
de Biel o Cincinnati (64)(65), laberinto de brazos radiales (66), laberinto en T (43), y adquisición y retención de comportamientos programados (26)(67)(68). En la bibliografía se encuentran descripciones de ensayos 
adicionales para ratas destetadas (26)(27) y ratas adultas (19)(20).
 
Autopsia  
38. Los animales madre pueden sacrificarse después del destete de su 
descendencia. 
39. La evaluación neuropatológica de la descendencia se efectuará utilizando 
los tejidos de los animales sacrificados de forma compasiva el DPN 22 o en un momento anterior, entre el DPN 11 y el DPN 22, así como al final del estudio. En el caso de los descendientes sacrificados hasta el DPN 22, 
deben evaluarse los tejidos del encéfalo; en el caso de los animales sacri ­
ficados al final del estudio, deben evaluarse los tejidos tanto del sistema nervioso central (SNC) como del sistema nervioso periférico (SNP). Los 
tejidos de los animales sacrificados el DPN 22 o antes pueden fijarse por 
inmersión o por perfusión; los de los animales sacrificados al final del estudio deben fijarse por perfusión. Todos los aspectos de la preparación de las muestras de tejido, desde la perfusión de los animales hasta la 
disección de las muestras de tejido, el tratamiento de los tejidos y la tinción 
de las preparaciones microscópicas, deben seguir un diseño equilibrado de forma que cada lote contenga muestras representativas de cada grupo de dosis. En el documento de orientación n
 o 20 de la OCDE (9) se encuentran 
orientaciones adicionales; véase también (103).  
Tratamiento de las muestras de tejido  
40. Deben registrarse todas las anomalías macroscópicas visibles en el momento 
de la autopsia. Las muestras de tejidos tomadas deben representar todas las 
regiones principales del sistema nervioso. Las muestras de tejidos deben conservarse en un fijador adecuado y tratarse de acuerdo con protocolos histológicos publicados y normalizados (69)(70)(71)(103). La inclusión en 
parafina es aceptable para los tejidos del SNC y del SNP, pero puede ser 
apropiada la utilización de osmio tras la fijación, junto con la inclusión en
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
epoxirresina, cuando se necesite un mayor grado de resolución (por ejem ­
plo, para los nervios periféricos cuando se sospeche una neuropatía perifé ­
rica, o para el análisis morfométrico de los nervios periféricos). Los tejidos del encéfalo recogidos para el análisis morfométrico deben incluirse en los medios apropiados al mismo tiempo para todos los niveles de dosis, a fin de 
evitar artefactos por retracción que pueden asociarse con una conservación 
prolongada en el fijador (6).
 
Examen neuropatológico  
41. Los objetivos del examen cualitativo son los siguientes: 
i) detectar las regiones del sistema nervioso que presentan indicios de 
alteraciones neuropatológicas; 
ii) identificar los tipos de alteraciones neuropatológicas resultantes de la 
exposición a la sustancia problema; así como 
iii) determinar el grado de gravedad de las alteraciones neuropatológicas. Un anatomopatólogo con formación adecuada debe examinar al microsco ­
pio secciones histológicas representativas de las muestras de tejido para detectar los eventuales indicios de alteraciones neuropatológicas. A todas 
las alteraciones neuropatológicas se les debe asignar un grado subjetivo de 
gravedad. Una tinción con hematoxilina y eosina puede ser suficiente para evaluar las secciones del encéfalo de los animales sacrificados de forma compasiva el DPN 22 o antes. Sin embargo, se recomienda realizar una 
tinción de mielina (por ejemplo, azul de luxol rápido/violeta de cresilo) y 
una tinción de plata (por ejemplo, tinciones de Bielschowsky o de Bodian) para las secciones de tejidos del SNC y del SNP de los animales sacrifi ­
cados al final del estudio. Según la opinión profesional del anatomopató ­
logo y el tipo de alteraciones observadas, pueden resultar adecuadas otras 
tinciones para identificar y caracterizar tipos concretos de alteraciones [por ejemplo, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) o histoquímica de lectinas para evaluar las alteraciones de la glía y de la microglía (72), fluoro-jade para 
detectar necrosis (73)(74), o tinciones de plata específicas de la degenera ­
ción neuronal (75)]. 
42. Ha de efectuarse una evaluación morfométrica (cuantitativa), ya que estos 
datos pueden ayudar a la detección de un efecto relacionado con el trata ­
miento y son valiosos para la interpretación de las diferencias de peso o 
morfología del encéfalo relacionadas con el tratamiento (76)(77). Deben tomarse muestras de tejido nervioso, que han de prepararse para permitir las evaluaciones morfométricas. Entre estas se pueden incluir, por ejemplo, 
las mediciones lineales o superficiales de regiones específicas del encéfalo 
(78). Tales mediciones exigen la utilización de secciones homólogas, cui ­
dadosamente seleccionadas en función de referencias microscópicas fiables (6). Puede utilizarse la estereología para identificar efectos relacionados con 
el tratamiento sobre parámetros tales como el volumen o el número de 
células de determinadas regiones neuroanatómicas (79)(80)(81)(82)(83)(84). 
43. Debe examinarse el encéfalo para detectar los eventuales indicios de alte ­
raciones neuropatológicas relacionadas con el tratamiento y deben tomarse muestras adecuadas de todas sus regiones principales (por ejemplo, bulbos 
olfativos, corteza cerebral, hipocampo, ganglios basales, tálamo, hipotálamo, 
mesencéfalo (techo, tegmento y pedúnculos cerebrales), protuberancia, bulbo raquídeo, cerebelo) para garantizar un examen exhaustivo. Es impor ­
tante que se tomen las secciones de todos los animales en el mismo plano. 
En el caso de los adultos sacrificados de forma compasiva al final del 
estudio, deben tomarse muestras de las secciones representativas de la médula espinal y del SNP. Las zonas examinadas deben incluir el ojo con el nervio óptico y la retina, la médula espinal en los engrosamientos 
cervical y lumbar, las fibras de las raíces anteriores y posteriores, el nervio 
ciático mayor proximal, el nervio ciático poplíteo interno proximal (en la rodilla) y las ramas del nervio ciático poplíteo interno que inervan los músculos de la pantorrilla. Las secciones de la médula espinal y de los 
nervios periféricos tienen que incluir tanto una sección transversal como una 
longitudinal.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. La evaluación neuropatológica debe incluir un examen para detectar even ­
tuales signos de alteraciones del desarrollo del sistema nervioso 
(6)(85)(86)(87)(88)(89), además de alteraciones celulares (por ejemplo, va ­
cuolización, degeneración o necrosis neuronal) y cambios histológicos (por ejemplo, gliosis, infiltración de leucocitos, formación de quistes). A este 
respecto, es importante que se distingan los efectos relacionados con el 
tratamiento de los acontecimientos normales del desarrollo que se sepa que se producen en una fase del desarrollo correspondiente al momento del sacrificio (90). Pueden citarse como ejemplos de alteraciones significa ­
tivas que indican daño para el desarrollo las siguientes, sin ánimo de 
exhaustividad: 
— alteraciones en el tamaño o la forma macroscópicos de los bulbos 
olfativos, el cerebro o el cerebelo; 
— alteraciones en el tamaño relativo de las diversas regiones del encéfalo, 
como las disminuciones o aumentos del tamaño de regiones derivados 
de la pérdida o persistencia de poblaciones de células o proyecciones axónicas de carácter normalmente pasajero (por ejemplo, capa germinal externa del cerebelo, cuerpo calloso); 
— alteraciones de la proliferación, migración y diferenciación, indicadas 
por zonas de necrosis o apoptosis excesivas, poblaciones agrupadas o 
dispersas de neuronas ectópicas, desorientadas o deformes, o alteracio ­
nes del tamaño relativo de diversos estratos de las estructuras corticales; 
— alteraciones de las pautas de mielinización, como la reducción global del 
tamaño o la alteración de la tinción de las estructuras mielinizadas; 
— signos de hidrocefalia, en particular la dilatación de los ventrículos, la 
estenosis del acueducto de Silvio y el adelgazamiento de los hemisferios 
cerebrales.
 
Análisis de la relación dosis-respuesta de las alteraciones neuropatoló ­
gicas  
45. Se recomienda seguir el siguiente procedimiento por fases para los análisis 
neuropatológicos cualitativos y cuantitativos. En primer lugar, se comparan 
las secciones del grupo de dosis alta con las del grupo de control. En caso 
de que no se detecten alteraciones neuropatológicas en los animales del grupo de dosis alta, no se requiere continuar el análisis. Si se encuentran indicios de alteraciones neuropatológicas en el grupo de dosis alta, se 
examinan los animales de los grupos de dosis intermedia y baja. Si el grupo 
de dosis alta se termina por causa de muerte o de otro tipo de toxicidad que implique confusión, deben analizarse los grupos de dosis alta e intermedia para detectar las eventuales alteraciones neuropatológicas. Si hay alguna 
indicación de neurotoxicidad en los grupos de la dosis inferior, debe reali ­
zarse con esos grupos el análisis neuropatológico. En caso de que en el examen cualitativo o cuantitativo se observen alteraciones neuropatológicas relacionadas con el tratamiento, deben determinarse la relación entre la 
dosis y la incidencia, y la frecuencia y el grado de gravedad de las lesiones 
o de las alteraciones morfométricas, sobre la base de una evaluación de todos los animales de todos los grupos de dosis. Deben incluirse en esta evaluación todas las regiones del encéfalo que presenten algún signo de 
alteración neuropatológica. Para cada tipo de lesión, deben describirse los 
criterios utilizados para definir los distintos grados de gravedad, indicando las características utilizadas para distinguir cada grado. Deben registrarse la frecuencia de cada tipo de lesión y su grado de gravedad, y debe realizarse 
un análisis estadístico para evaluar la naturaleza de la relación 
dosis-respuesta. Se recomienda el uso de preparaciones codificadas (91).
 
DATOS E INFORME  
Datos  
46. Los datos deben notificarse individualmente y resumirse en forma de cua ­
dro, mostrándose para cada grupo de ensayo los tipos de cambio y el número de madres, de descendientes por sexo, y de camadas en las que se haya observado cada tipo de cambio. Si se ha utilizado la exposición 
postnatal directa de la descendencia, han de notificarse la vía, la duración y 
el período de la exposición.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Evaluación e interpretación de los resultados  
47. Un estudio de neurotoxicidad para el desarrollo debe proporcionar informa ­
ción sobre los efectos de la exposición continuada a una sustancia durante 
la vida intrauterina y en las primeras fases del desarrollo postnatal. Dado que el estudio se centra en parámetros tanto de toxicidad general como de neurotoxicidad para el desarrollo, los resultados deben permitir distinguir 
los efectos sobre el desarrollo neurológico que se producen en ausencia de 
toxicidad general para la madre frente a los que se manifiestan únicamente a dosis que también son tóxicas para la madre. Debido a la compleja inte ­
rrelación entre el diseño del estudio, el análisis estadístico y la significación 
biológica de los datos, la interpretación adecuada de los datos de neuroto ­
xicidad para el desarrollo implica el juicio de expertos (107)(109). Para la interpretación de los resultados del ensayo debe aplicarse un enfoque de ponderación de las pruebas (20)(92)(93)(94). Deben ser objeto de discusión 
las pautas de las eventuales observaciones conductuales o morfológicas, así 
como los datos sobre la relación dosis-respuesta. Deben incluirse en esta caracterización los datos de todos los estudios pertinentes para la evaluación de la neurotoxicidad para el desarrollo, incluidos los estudios epidemioló ­
gicos o los informes de casos humanos, y los estudios con animales de 
experimentación (por ejemplo, datos de toxicocinética, información sobre la relación estructura-actividad, datos de otros estudios de toxicidad). Esto incluye la relación entre las dosis de la sustancia problema y la presencia 
o ausencia, la incidencia y el alcance de cualesquiera efectos neurotóxicos 
para cada sexo (20)(95). 
48. La evaluación de los datos debe incluir una discusión de la significación 
tanto biológica como estadística. El análisis estadístico debe considerarse 
como una herramienta que orienta para la interpretación de los datos, más que determinarla. La falta de significación estadística no debe ser el único motivo para concluir que no hay ningún efecto relacionado con el trata ­
miento, al igual que la presencia de significación estadística no puede ser la 
única justificación para concluir que se da algún efecto relacionado con el tratamiento. Para evitar posibles resultados negativos falsos y las dificulta ­
des inherentes a «comprobar un resultado negativo», deben discutirse los 
datos sobre los controles positivos e históricos disponibles, especialmente 
cuando no se observen efectos relacionados con el tratamiento (102)(106). La probabilidad de encontrar positivos falsos debe discutirse a la luz de la 
evaluación estadística total de los datos (96). La evaluación debe incluir la 
posible relación existente entre las alteraciones neuropatológicas y conduc ­
tuales observadas. 
49. Todos los resultados deben analizarse utilizando modelos estadísticos ade ­
cuados para el diseño experimental (108). La elección de un análisis para ­
métrico o no paramétrico debe justificarse teniendo en cuenta factores tales como la naturaleza de los datos (transformados o no) y su distribución, así 
como la relativa solidez de los análisis estadísticos seleccionados. El obje ­
tivo y el diseño del estudio deben guiar la elección del análisis estadístico para minimizar los errores de tipo I (positivos falsos) y de tipo II (negativos falsos) (96)(97)(104)(105). Los estudios sobre el desarrollo con especies 
multíparas en los que se estudian varias crías por camada deben incluir la 
camada en el modelo estadístico para evitar un aumento de los índices de errores de tipo I (98)(99)(100)(101). La unidad estadística de medida debe ser la camada y no la cría. Los experimentos deben diseñarse de manera 
que las crías de una misma camada no se traten como observaciones inde ­
pendientes. Cualquier parámetro medido varias veces en el mismo sujeto se analizará utilizando modelos estadísticos que tengan en cuenta el carácter no independiente de dichas medidas.
 
Informe del ensayo  
50. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— naturaleza física y, si procede, propiedades fisicoquímicas; 
— datos de identificación, incluido el origen;  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— pureza del preparado, e impurezas conocidas o previstas.  
Vehículo (si procede):  
— justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua o de la 
solución salina fisiológica.  
Animales de experimentación:  
— especie y cepa empleada, y justificación en caso de que sea distinta de 
la rata; 
— proveedor de los animales de experimentación; — número, edad al inicio del ensayo, y sexo de los animales; 
— origen, condiciones de alojamiento, dieta, agua, etc.; 
— peso de cada animal al inicio del ensayo.
 
Condiciones del ensayo:  
— justificación de la selección de las dosis; 
— justificación de la vía y del período de administración; 
— especificación de las dosis administradas, con datos sobre el vehículo, el 
volumen y la forma física del material administrado; 
— datos sobre la formulación de la sustancia problema o su preparación 
con los alimentos, concentración obtenida, estabilidad y homogeneidad del preparado; 
— método utilizado para la identificación inequívoca de las madres y de su 
descendencia; 
— descripción detallada del procedimiento o procedimientos de aleatoriza ­
ción utilizados para asignar las madres a los grupos de tratamiento, para 
seleccionar las crías sobrantes que deben sacrificarse, y para asignar las 
crías a los grupos de ensayo; 
— datos sobre la administración de la sustancia problema; — conversión de la concentración (ppm) de la sustancia problema en los 
alimentos, en el agua de bebida o en el dispositivo de inhalación a dosis 
reales (mg/kg peso corporal/día), en su caso; 
— condiciones ambientales; 
— datos de la calidad de los alimentos y del agua (por ejemplo, si es agua 
del grifo o destilada); 
— fechas de inicio y terminación del estudio.
 
Procedimientos de observación y ensayo:  
— descripción detallada de los procedimientos utilizados para normalizar 
las observaciones y procedimientos, así como definiciones operativas para asignar puntuación a las observaciones; 
— lista de todos los procedimientos de ensayo utilizados y justificación de 
su empleo; 
— datos de los procedimientos utilizados para los estudios conductuales/ 
funcionales, anatomopatológicos, neuroquímicos o electrofisiológicos, 
con información y detalles sobre los dispositivos automáticos; 
— procedimientos para calibrar y garantizar la equivalencia de los dispo ­
sitivos y el equilibrio de los grupos de tratamiento en los procedimien ­
tos de ensayo; 
— breve justificación de todas las decisiones que impliquen una opinión 
profesional.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Resultados (por separado y en resumen, incluidas la media y la varianza 
cuando proceda):  
— número de animales al comienzo del estudio y número al final del 
mismo; 
— número de animales y de camadas utilizadas para cada ensayo; — número de identificación de cada animal y camada de la que procede; 
— tamaño de las camadas y peso medio al nacer por sexo; 
— datos del peso corporal y de los cambios de este, incluido el peso 
corporal final de las madres y de su descendencia; 
— datos sobre consumo de alimentos, y de agua si procede (por ejemplo, si 
la sustancia problema se administra con el agua); 
— datos de reacciones tóxicas por sexo y dosis, incluidos los signos de 
toxicidad o mortalidad, con el momento y la causa de la muerte, si 
procede; 
— naturaleza, gravedad, duración, día de inicio, hora del día, y evolución 
posterior de las observaciones clínicas detalladas; 
— puntuación de cada parámetro del desarrollo (peso, maduración sexual y 
ontogenia del comportamiento) en cada momento de observación; 
— descripción detallada de todas las observaciones conductuales, funcio ­
nales, neuropatológicas, neuroquímicas y electrofisiológicas por sexo, 
incluidos tanto los aumentos como los descensos respecto a los 
controles; 
— observaciones de la autopsia; — peso del encéfalo; 
— eventuales diagnósticos derivados de lesiones y signos neurológicos, 
incluidas las enfermedades o procesos naturales; 
— imágenes de observaciones modelo; 
— imágenes de baja resolución para evaluar la homología de las secciones 
empleadas en relación con la morfometría; 
— datos sobre la absorción y el metabolismo, incluidos los datos comple ­
mentarios de un estudio toxicocinético aparte, si se dispone de ellos; 
— tratamiento estadístico de los resultados, incluidos los modelos estadís ­
ticos utilizados para analizar los datos, y los resultados, con indepen ­
dencia de que sean significativos o no; 
— lista del personal del estudio, incluida su formación profesional.
 
Discusión de los resultados:  
— información sobre la relación dosis-respuesta, por sexo y grupo; 
— relación de otros eventuales efectos tóxicos con la conclusión acerca del 
potencial neurotóxico de la sustancia problema, por sexo y grupo; 
— impacto de cualquier información toxicocinética sobre las conclusiones; 
— semejanzas con los efectos de cualquier neurotóxico conocido;  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— datos en apoyo de la fiabilidad y sensibilidad del método de ensayo (es 
decir, datos sobre controles positivos e históricos); 
— eventual relación entre efectos neuropatológicos y funcionales; — NOAEL o dosis de referencia para las madres y los descendientes, por 
sexo y grupo.
 
Conclusiones:  
— discusión de la interpretación global de los datos sobre la base de los 
resultados, incluida la conclusión de si la sustancia problema ha provo ­
cado neurotoxicidad para el desarrollo y el NOAEL.  
BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhague, Dinamarca, 13- 14 de junio de 1995. 
(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. 
US EPA 712-C-98-239. Disponible en la dirección: [http://www.epa.gov/ opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Se ­
ries/]. 
(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Disponible en la dirección: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/ 
recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479]. 
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize de ­
velopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral 
effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91. 
(5) Dorman, D.C., Allen, SL, Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, SL, Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental 
neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111. 
(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize develop ­
mental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93-100. 
(7) OCDE (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23- 25 October 2000. 
(8) OCDE (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian 
Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OCDE, París. Julio de 2008. Disponible en la dirección: [http:// search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mo ­
no(2008)16&doclanguage = en]. 
(9) OCDE (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OCDE, París, septiembre de 2003. Dis ­
ponible en la dirección: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_ 
2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html]. 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. In ­
terlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292. 
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, Nueva York.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197. 
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology, 1  st Edition,  ISBN 0126488606, Academic Press, New York. 
(14) Capítulo B.34 del presente anexo, Ensayo de reproducción en una gene ­
ración. 
(15) Capítulo B.35 del presente anexo, Estudio de toxicidad para la reproduc ­
ción en dos generaciones. 
(16) Capítulo B.43 del presente anexo, Estudio de neurotoxicidad en roedores. (17) Capítulo B.31 del presente anexo, Estudio de toxicidad para el desarrollo 
prenatal. 
(18) Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de 
septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para 
fines científicos, DO L 276 de 20.10.2010, p. 33. 
(19) OMS (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals,  (Environmental Health Criteria 
60), Albany, Nueva York: Centro de Publicaciones de la Organización Mundial de la Salud, Estados Unidos de América. Disponible en la direc ­
ción: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm]. 
(20) OMS (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), Publicaciones de la 
Organización Mundial de la Salud, Ginebra. Disponible en la dirección: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm]. 
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and Met ­
hods, 1
 st Edition,  ISBN 012168055X, Academic Press, Nueva York. 
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Interlabo ­
ratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neuro ­
toxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509. 
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6. 
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110-112. 
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a pri ­
mary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136. 
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory.  
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, Nueva Jersey. 
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  Pe­
rinatal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic Press, 
Orlando. 
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research.  ILSI Press, 
Washington, DC. 
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning ro ­
dents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert 
working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94. 
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4. 
(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use. 
(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age 
to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gesta ­
tion length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457. 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Re ­
prod. Toxicol., 13:383-390. 
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. 
Toxicol. Sci., 58:350-365. 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. To ­
xicol. Teratol., 7:579-586. 
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. 
Reprod., 17:298-303. 
(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implica ­
tion for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95. 
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920. 
(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. En:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
Nueva York, pp. 67-100. 
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66. 
(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology,  
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
Nueva York, pp. 37-82. 
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3 ′-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129. 
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260. 
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor 
activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. 
Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609. 
(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405-411. 
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory ani ­
mals.Physiol. Behav., 64:661-669. 
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591. 
(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. En:  Neural Mecha ­
nisms of Startle Behavior,  Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, Nueva York, 
pp. 287-351 
(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128. 
(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology,  Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, Nueva York, pp. 181-211.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199-211. 
(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxi ­
city in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30. 
(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437–445. 
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked po ­
tentials into neurotoxicity test schemes. En:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity,  Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, Nueva 
York. pp. 125-145. 
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3 ′-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105:321-332. 
(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296. 
(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237-244. 
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working me ­
mory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105. 
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465-479. 
(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60. 
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69. 
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90. 
(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241. 
(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399. 
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332. 
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342-352. 
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term me ­
mory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341. 
(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122-131. 
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology,  American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, pp. 84-107. 
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques,  5
 th edition, Churchill Livingstone, Londres.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304. 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130. 
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365-372. 
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and 
semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and 
physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561. 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., 
Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) 
Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755. 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Ca ­
llaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental 
neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432. 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135. 
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy,  Springer-Verlag, New 
York. 
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practi ­
cal primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310. 
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total num ­
bers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an un ­
biased stereological method. Brain Res., 609: 262-268. 
(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710. 
(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 
22:51-61. 
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831. 
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121. 
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298. 
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. En:  Handbook of Developmental Neurotoxicology,  Slik­
ker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, Nueva York, pp. 3-41. 
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70-74.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060. 
(90) Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology.  Segunda edición. 
Springer-Verlag, Berlín. 
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133. 
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure es ­
tándares: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405. 
(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A. 
(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274-56322. 
(95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefo ­
ged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P. 
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5:113-126. 
(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emp ­
hasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27. 
(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental stu ­
dies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335. 
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165-172. 
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221-228. 
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90. 
(102) Crofton, K.M., Makris, SL, Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) 
A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmen ­
tal neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352. 
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. 
(2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in 
developmental neurotoxicity testing for today. Toxicol. Pathol. 34:296- 313. 
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analy ­
sis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205- 210. 
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 
41:295-301. 
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental 
neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology,  30(4):266-287. 
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute ex ­
pert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology,  30(4):288-325.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology,  30(4):326-348. 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology,  30(4):349-381.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Figura 1  
Esquema general de los ensayos funcionales/conductuales, de evaluación neuropatológica y de 
pesaje del encéfalo. Este diagrama se basa en la descripción recogida en los puntos 13-15 
(DPN = día postnatal). En el apéndice 1 se recogen ejemplos de asignación de los animales
  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Apéndice 1  
1. A continuación se describen ejemplos de posibles asignaciones y se recogen 
en cuadros. Estos ejemplos se adjuntan para ilustrar que la asignación de los 
animales de experimentación a los distintos paradigmas de ensayo puede llevarse a cabo de varias maneras.
 
Ejemplo 1  
2. Para los ensayos de ontogenia del comportamiento anteriores al destete se 
utiliza un conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De estos animales, 10 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se sacrifican de forma compasiva el día DPN 22. Se 
retira el encéfalo, se pesa y se prepara para su evaluación histopatológica. 
Por otra parte, se recogen los datos del peso de los encéfalos sin fijar de los 10 machos y 10 hembras restantes por dosis. 
3. Para los ensayos funcionales/conductuales posteriores al destete (observa ­
ciones clínicas detalladas, actividad motriz, sobresalto acústico y ensayo de la función cognitiva en el período previo a la madurez) y para evaluar la 
edad de la maduración sexual, se utiliza otro conjunto de 20 animales/sexo/ 
dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, 10 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se aneste ­
sian y se fijan por perfusión al finalizar el estudio (alrededor del día DPN 
70). Previa fijación adicional  in situ,  se retira el encéfalo y se prepara para 
su evaluación neuropatológica. 
4. Para el ensayo de la función cognitiva en adultos jóvenes (por ejemplo, 
DPN 60-70), se utiliza un tercer conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 
macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, se sacrifican al final del estudio 10 animales/sexo/grupo (1 macho o 1 hembra por camada), y se retira y pesa su encéfalo. 
5. Los restantes 20 animales/sexo/grupo se reservan para eventuales ensayos 
adicionales.
 
Cuadro 1  
Cría n  o ( a ) N o de crías asignado al 
ensayo Examen/ensayo 
m h  
1 5 20 m + 20 h Ontogenia del comportamiento 
10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatolo ­
gía/morfometría DPN 22 
10 m + 10 h Pesaje del encéfalo DPN 22 
2 6 20 m + 20 h Observaciones clínicas detalla ­
das 
20 m + 20 h Actividad motriz 
20 m + 20 h Maduración sexual 20 m + 20 h Funciones motrices y sensitivas 
20 m + 20 h Aprendizaje y memoria (DPN 
25) 
10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatolo ­
gía/morfometría de adultos jóve ­
nes ~DPN 70
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Cría n  o ( a ) 
N o de crías asignado al 
ensayo Examen/ensayo 
m h  
3 7 20 m + 20 h Aprendizaje y memoria (adultos 
jóvenes) 
10 m + 10 h Pesaje del encéfalo de adultos 
jóvenes ~DPN 70 
4 8 — Animales de reserva para susti ­
tuciones o ensayos adicionales  
( a ) Para este ejemplo, se sacrifican los animales sobrantes de las camadas para dejar 4 
machos + 4 hembras; las crías macho se numeran del 1 al 4, y las hembras del 5 al 8.  
Ejemplo 2  
6. Para los ensayos de ontogenia del comportamiento anteriores al destete se 
utiliza un conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por 
camada). De estos animales, 10 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 
hembra por camada) se sacrifican de forma compasiva el día DPN 11. Se retira el encéfalo, se pesa y se prepara para su evaluación histopatológica. 
7. Para los ensayos posteriores al destete (observaciones clínicas detalladas, 
actividad motriz, evaluación de la edad de la maduración sexual y funciones 
motrices y sensitivas) se utiliza otro conjunto de 20 animales/sexo/dosis (es 
decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, 10 animales/ sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se anestesian y se fijan por perfusión al finalizar el estudio (alrededor del día DPN 70). Previa 
fijación adicional  in situ,  se retira el encéfalo, se pesa y se prepara para su 
evaluación neuropatológica. 
8. Para el ensayo de la función cognitiva en el período previo a la madurez y en 
adultos jóvenes, se utilizan 10 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada). Se utilizan animales distintos para los ensayos de la función 
cognitiva realizados el día DPN 23 y para los realizados con adultos jóvenes. 
Al finalizar el estudio, se sacrifican 10 animales/sexo/grupo de entre los uti ­
lizados para el ensayo con adultos, se retira el encéfalo y se pesa. 
9. Los 20 animales/sexo/grupo restantes que no se han seleccionado para los 
ensayos se eliminan al destete.
 
Cuadro 2  
Cría n  o ( a ) N o de crías asignado al 
ensayo Examen/ensayo 
m h  
1 5 20 m + 20 h Ontogenia del comportamiento 
10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatolo ­
gía/morfometría DPN 11 
2 6 20 m + 20 h Observaciones clínicas detalla ­
das 
20 m + 20 h Actividad motriz 20 m + 20 h Maduración sexual 20 m + 20 h Funciones motrices y sensitivas 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatolo ­
gía/morfometría de adultos jóve ­
nes ~DPN 70
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Cría n  o ( a ) N o de crías asignado al 
ensayo Examen/ensayo 
m h  
3 7 10 m + 10 h (  b ) Aprendizaje y memoria (DPN 
23) 
3 7 10 m + 10 h (  b ) Aprendizaje y memoria (adultos 
jóvenes) 
Pesaje del encéfalo de adultos 
jóvenes 
4 8 — Animales sacrificados y dese ­
chados el día DPN 21  
( a ) Para este ejemplo, se sacrifican los animales sobrantes de las camadas para dejar 4 
machos + 4 hembras; las crías macho se numeran del 1 al 4, y las hembras del 5 
al 8. 
( b ) Se utilizan crías diferentes para los ensayos de la función cognitiva realizados el día 
DPN 23 y para los realizados con adultos jóvenes (por ejemplo, de las camadas 
pares/impares del total de 20).  
Ejemplo 3  
10. Para el pesaje del encéfalo y la evaluación de la neuropatología del día DPN 
11 se utiliza un conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 
hembra por camada). De estos animales, 10 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por camada) se sacrifican de forma compasiva el día DPN 11, y se les retira el encéfalo, que se pesa y se prepara para su 
evaluación histopatológica. Por otra parte, se recogen los datos del peso de 
los encéfalos sin fijarde los 10 machos y 10 hembras restantes por cada dosis. 
11. Para los ensayos de ontogenia del comportamiento (actividad motriz), los 
exámenes posteriores al destete (actividad motriz y evaluación de la edad de 
la maduración sexual), y el ensayo de la función cognitiva en el período previo a la madurez, se utiliza otro conjunto de 20 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). 
12. Para los ensayos de las funciones motrices y sensitivas (sobresalto acústico) 
y las observaciones clínicas detalladas, se utiliza otro conjunto de 20 ani ­
males/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este 
conjunto, 10 animales/sexo/dosis (es decir, 1 macho o 1 hembra por cama ­
da) se anestesian y se fijan por perfusión al finalizar el estudio (alrededor del día DPN 70). Previa fijación adicional  in situ,  se retira el encéfalo, se 
pesa y se prepara para su evaluación neuropatológica. 
13. Para el ensayo de la función cognitiva en adultos jóvenes, se utiliza otro 
conjunto de 20 crías/sexo/dosis (es decir, 1 macho y 1 hembra por camada). De este conjunto, se sacrifican al final del estudio 10 animales/sexo/grupo 
(1 macho o 1 hembra por camada), y se retira y pesa su encéfalo.
 
Cuadro 3  
Cría n  o ( a ) N o de crías asignado al 
ensayo Examen/ensayo 
m h  
1 5 10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatolo ­
gía/morfometría DPN 11 
10 m + 10 h Pesaje del encéfalo DPN 11 
2 6 20 m + 20 h Ontogenia del comportamiento 
(actividad motriz) 
20 m + 20 h Actividad motriz 20 m + 20 h Maduración sexual 20 m + 20 h Aprendizaje y memoria (DPN 
27)
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Cría n  o ( a ) N o de crías asignado al 
ensayo Examen/ensayo 
m h  
3 7 20 m + 20 h Sobresalto acústico (período 
previo a la madurez y adultos jóvenes) 
20 m + 20 h Observaciones clínicas detalla ­
das 
10 m + 10 h Pesaje del encéfalo/neuropatolo ­
gía/morfometría de adultos jóve ­
nes ~DPN 70 
4 8 20 m + 20 h Aprendizaje y memoria (adultos 
jóvenes) 
10 m + 10 h Pesaje del encéfalo de adultos 
jóvenes
 
( a ) Para este ejemplo, se sacrifican los animales sobrantes de las camadas para dejar 4 
machos + 4 hembras; las crías macho se numeran del 1 al 4, y las hembras del 5 
al 8. ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Apéndice 2  
Definiciones  
Sustancia: Sustancia o mezcla 
Sustancia problema: Toda sustancia o mezcla estudiada con este método de 
ensayo.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  BIOENSAYO UTEROTRÓFICO CON ROEDORES: ENSAYO DE 
CRIBADO A CORTO PLAZO DE LAS PROPIEDADES 
ESTROGÉNICAS  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de 
la OCDE TG 440 (2007). La OCDE lanzó en 1998 una actividad muy prioritaria para revisar las directrices existentes y elaborar nuevas directrices 
sobre los ensayos de cribado y finales de posibles alteradores endocrinos 
(1). Uno de los elementos de la actividad consistía en elaborar unas direc ­
trices para el bioensayo uterotrófico con roedores. El bioensayo uterotrófico con roedores se sometió entonces a un completo programa de validación, 
con la recopilación de un detallado documento de referencia (2)(3) y la 
realización de unos amplios estudios intra e interlaboratorios para demostrar la pertinencia y la reproducibilidad del bioensayo con un potente estrógeno de referencia, con agonistas débiles de los receptores estrogénicos, con un 
antagonista fuerte de los receptores estrogénicos, y con una sustancia de 
referencia negativa (4)(5)(6)(7)(8)(9). El presente método B.54 se basa en la experiencia obtenida con el programa de validación del ensayo y en los 
resultados conseguidos de esta manera con agonistas estrogénicos. 
2. El bioensayo uterotrófico es un ensayo de cribado a corto plazo cuyo origen 
data de la década de 1930 (27)(28) y fue normalizado por primera vez con este carácter por un comité de expertos en 1962 (32)(35). Se basa en el 
aumento del peso del útero o respuesta uterotrófica (véase una revisión en la 
referencia 29). Evalúa la posibilidad de que una sustancia provoque activi ­
dades biológicas que concuerden con las de agonistas o antagonistas de los estrógenos naturales (por ejemplo, el 17ß-estradiol); sin embargo, su uso 
para detectar efectos antagonistas es mucho menos frecuente que para de ­
tectar efectos agonistas. El útero responde a los estrógenos de dos maneras. Una primera respuesta es el aumento de peso debido a la imbibición de agua. Esta respuesta va seguida de un aumento de peso debido al creci ­
miento tisular (30). Las respuestas del útero en ratas y ratonas son compa ­
rables cualitativamente. 
3. Este bioensayo sirve de ensayo de cribado  in vivo  y su aplicación debe 
considerarse en el contexto del ‘OECD Conceptual Framework for the 
Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals’ (Marco con ­
ceptual de la OCDE para el ensayo y evaluación de los alteradores endo ­
crinos) (apéndice 2). En este marco conceptual el bioensayo uterotrófico figura en el nivel 3 como ensayo  in vivo  que proporciona datos sobre un 
solo mecanismo endocrino, a saber, la estrogenicidad. 
4. Se pretende incluir el bioensayo uterotrófico en una batería de ensayos  in 
vitro  e in vivo  para identificar las sustancias con potencial para interactuar 
con el sistema endocrino, lo que desembocará finalmente en evaluaciones 
del riesgo para la salud humana o el medio ambiente. El programa de 
validación de la OCDE ha utilizado agonistas estrogénicos tanto fuertes como débiles, a fin de evaluar el comportamiento del ensayo en cuanto a la detección de sustancias estrogénicas (4)(5)(6)(7)(8). De este modo, se ha 
demostrado bien la sensibilidad del procedimiento de ensayo para los ago ­
nistas estrogénicos, además de una buena reproducibilidad intra e interlaboratorios. 
5. Por lo que se refiere a sustancias negativas, se incluyó en el programa de 
validación una única sustancia «negativa» de referencia que ya se había 
considerado negativa en el ensayo uterotrófico, así como en ensayos  in vitro  
de receptores y de unión a receptores, pero se han evaluado datos adicio ­
nales del ensayo, no relacionados con el programa de validación de la 
OCDE, que refuerzan el apoyo a la especificidad del bioensayo uterotrófico 
para el cribado de agonistas estrogénicos (16).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
6. Los agonistas y antagonistas estrogénicos actúan como ligandos de los 
receptores estrogénicos α y b, y pueden activar o inhibir, respectivamente, 
la acción transcripcional de los receptores. Esto podría provocar peligros para la salud, incluidos ciertos efectos sobre la reproducción y el desarrollo. Por lo tanto, es necesario evaluar con rapidez las sustancias como posibles 
agonistas o antagonistas estrogénicos. Aunque de carácter informativo, la 
afinidad de un ligando por un receptor estrogénico o la activación trans ­
cripcional de genes marcadores  in vitro  son solo uno de los varios factores 
determinantes de un posible peligro. Otros factores determinantes pueden 
ser la activación y la desactivación metabólica de la sustancia al entrar en el 
organismo, su distribución en los tejidos diana, y la eliminación del orga ­
nismo, que dependen, al menos en parte, de la vía de administración y de la sustancia estudiada. Esto conduce a la necesidad de detectar la posible 
actividad de una sustancia  in vivo  en condiciones pertinentes, salvo que 
las características de la sustancia en relación con su absorción, distribución, metabolismo y eliminación (ADME) ya aporten la información adecuada. Los tejidos uterinos responden con un crecimiento rápido y vigoroso al 
estímulo de los estrógenos, especialmente en el caso de los roedores de 
laboratorio, en los que el ciclo estral dura unos 4 días. Diversas especies de roedores, en particular la rata, se utilizan también ampliamente en estudios de toxicidad para la caracterización de los peligros. Por lo tanto, el útero de 
los roedores es un órgano diana adecuado para el ensayo de cribado  in vivo  
de los agonistas y antagonistas estrogénicos. 
7. El presente método de ensayo se basa en los protocolos empleados en el 
estudio de validación de la OCDE que han demostrado ser fiables y repeti ­
bles en estudios intra e interlaboratorios (5)(7). Actualmente se dispone de 
dos métodos, a saber, el de hembras adultas ovariectomizadas (método de 
las adultas ovx) y el de hembras inmaduras no ovariectomizadas (método de las inmaduras). En el programa de validación de ensayos de la OCDE se ha demostrado que estos métodos presentan una sensibilidad y una reproduci ­
bilidad comparables. Sin embargo, el método de las hembras inmaduras, por 
tener estas intacto el eje hipotálamo-hipófisis-gónadas (HPG), es en cierto modo menos específico, pero abarca un ámbito de investigación más amplio que el método de las hembras ovariectomizadas, ya que puede responder a 
las sustancias que interactúan con el eje HPG y no tan solo con el receptor 
estrogénico. El eje HPG de la rata es funcional a los 15 días de edad, aproximadamente. Antes de ese momento, no es posible acelerar la pubertad con tratamientos tales como la administración de la hormona liberadora de 
gonadotropina (Gn-RH). Cuando las hembras comienzan a alcanzar la pu ­
bertad, antes de la apertura vaginal, la hembra tiene varios ciclos silenciosos que no dan lugar a la apertura de la vagina ni a la ovulación, pero sí a algunas fluctuaciones hormonales. Si una sustancia estimula entonces di ­
recta o indirectamente el eje HPG, puede provocar una pubertad precoz, una 
ovulación precoz y una apertura vaginal acelerada. No solo las sustancias que actúan sobre el eje HPG tienen este efecto, sino que algunas dietas con 
niveles de energía metabolizable más altos que otras pueden estimular el 
crecimiento y acelerar la apertura de la vagina sin ser de efecto estrogénico. Tales sustancias no inducen una respuesta uterotrófica en animales adultos ovx ya que el eje HPG de estos no funciona. 
8. Por razones de bienestar de los animales debe darse preferencia al método 
que utiliza ratas inmaduras, evitando así el pretratamiento quirúrgico de los 
animales y también el riesgo de no poder utilizar los animales que muestren 
algún signo de inicio del ciclo estral (véase el punto 30).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. La respuesta uterotrófica no es totalmente de origen estrogénico, es decir, es 
posible que la produzcan otras sustancias, distintas de los agonistas o an ­
tagonistas estrogénicos. Por ejemplo, pueden dar lugar a esta respuesta dosis relativamente altas de progesterona, de testosterona, o de diversas proges ­
tinas sintéticas (30). Las eventuales respuestas pueden analizarse histológi ­
camente para detectar la posible queratinización de la vagina (30). Indepen ­
dientemente del posible origen de la respuesta, un resultado positivo en un bioensayo uterotrófico debería lanzar en principio el procedimiento para aclarar la situación. Pueden obtenerse pruebas adicionales de estrogenicidad 
mediante ensayos  in vitro,  tales como el ensayo de unión a receptores 
estrogénicos y el ensayo de activación transcripcional, o mediante otros ensayos  in vivo  tales como el ensayo sobre la pubertad con hembras. 
10. Teniendo en cuenta que el bioensayo uterotrófico sirve de ensayo de cri ­
bado  in vivo,  el enfoque de validación adoptado ha tenido en cuenta tanto el 
bienestar de los animales como la configuración de una estrategia de ensa ­
yos secuencial. Con este fin, el esfuerzo se ha dirigido a la validación rigurosa de la reproducibilidad y de la sensibilidad en cuanto a la estroge ­
nicidad, que es la principal preocupación relativa a muchas sustancias, pero 
se ha insistido poco en cuanto al componente antiestrogénico del ensayo. Solo se ha sometido a ensayo un antiestrógeno con actividad fuerte, ya que es muy limitado el número de sustancias con un perfil antiestrogénico claro 
(sin interferencias por alguna actividad estrogénica). Por lo tanto, el pre ­
sente método de ensayo está dedicado al protocolo estrogénico, mientras que el protocolo que describe el modo del ensayo de antagonistas se incluye en un documento de orientación (37). La reproducibilidad y la sensibilidad 
del ensayo para sustancias con actividad puramente antiestrogénica se de ­
finirán después de manera más clara, un vez que se haya utilizado sistemá ­
ticamente el procedimiento de ensayo durante algún tiempo y se hayan detectado más sustancias con esta modalidad de acción. 
11. Se acepta que todos los procedimientos en los que se utilicen animales se 
atendrán a las normas locales de tratamiento de animales; las descripciones de tratamiento y atención de animales recogidas más adelante constituyen 
los requisitos mínimos de comportamiento, y quedarán anuladas por las 
normas locales, tales como la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Euro ­
peo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (38). La OCDE proporciona 
más orientaciones sobre el tratamiento compasivo de los animales (25). 
12. Como con todos los ensayos en que se utilicen animales vivos, es esencial 
asegurarse de que los datos son realmente necesarios antes del inicio del ensayo. Por ejemplo, dos situaciones en que puede cumplirse esta condición 
son las siguientes: 
— una elevada exposición potencial (nivel 1 del marco conceptual, apén ­
dice 2) o indicios de estrogenicidad (nivel 2), a fin de analizar si estos 
efectos pueden producirse  in vivo;  
— efectos indicadores de estrogenicidad en ensayos  in vivo  de nivel 4 o 5, 
para justificar que los efectos se referían a un mecanismo estrogénico que no puede dilucidarse utilizando un ensayo  in vitro.  
13. Las definiciones utilizadas en el presente método de ensayo se recogen en 
el apéndice 1.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
14. El bioensayo uterotrófico basa su sensibilidad en un sistema de ensayo con 
animales en los que el eje hipotálamo-hipófisis-ovarios no está funcional, lo 
que provoca que los niveles endógenos de estrógenos circulantes sean bajos. De esta manera se garantiza que el peso uterino de referencia sea bajo y que se obtenga una banda máxima de respuesta a los estrógenos administrados. 
En las hembras de los roedores se dan dos situaciones de sensibilidad a los 
estrógenos que cumplen este requisito: 
i) hembras inmaduras tras el destete y antes de la pubertad, y 
ii) hembras adultas jóvenes después de la ovariectomía, con tiempo sufi ­
ciente para que retrocedan los tejidos uterinos. 
15. La sustancia problema se administra diariamente por vía oral forzada o 
inyección subcutánea. Se administran dosis graduadas de la sustancia pro ­
blema a un mínimo de dos grupos de tratamiento (véase el punto 33 al respecto) de animales de experimentación, utilizando un solo nivel de dosis por grupo, con un período de administración de tres días consecutivos en el 
método de hembras inmaduras y un período mínimo de administración de 
tres días consecutivos en el método de las hembras adultas ovx. Tras unas 24 h después de la administración de la última dosis se procede a realizar la autopsia de los animales. Para detectar los agonistas estrogénicos, se evalúa 
la media del peso del útero de los grupos de animales tratados con la 
sustancia problema, comparando con el grupo al que se ha administrado solo el vehículo, atendiendo a un posible aumento estadísticamente signifi ­
cativo. Un aumento estadísticamente significativo de la media del peso del 
útero de un grupo de ensayo indica una respuesta positiva en este 
bioensayo.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de la especie animal  
16. Pueden utilizarse cepas de roedores de uso común en laboratorios. A modo 
de ejemplo, durante la validación se han utilizado las cepas de ratas 
Sprague-Dawley y Wistar. No deben utilizarse cepas de cuyos úteros se 
sepa o se sospeche que son menos sensibles. El laboratorio debe demostrar la sensibilidad de la cepa utilizada, según se describe en los puntos 26 y 27. 
17. Las ratas y los ratones son especies utilizadas sistemáticamente en el bioen ­
sayo uterotrófico desde la década de 1930. Los estudios de validación de la 
OCDE solo se han realizado con ratas, ya que se piensa que estas especies 
son equivalentes y, por lo tanto, debe ser suficiente una sola especie para la validación a escala mundial, con el fin de ahorrar recursos y animales. La rata es la especie elegida en la mayoría de los estudios de toxicidad para la 
reproducción y el desarrollo. Teniendo en cuenta que existe una gran base 
de datos históricos sobre los ratones y para ampliar el ámbito de aplicación del método del bioensayo uterotrófico en roedores al uso de ratones como especie de ensayo, se ha realizado un estudio limitado de validación com ­
plementaria con ratones (16). Se ha seleccionado un enfoque comparativo 
con un número limitado de sustancias problema y de laboratorios partici ­
pantes, y sin muestras codificadas, de acuerdo con la intención original de ahorrar recursos y animales. Este estudio de validación comparativo para el 
bioensayo uterotrófico en ratonas adultas jóvenes ovariectomizadas muestra 
que los datos obtenidos en ratas y ratones se corresponden bien, tanto cualitativa como cuantitativamente. Cuando el resultado del bioensayo ute ­
rotrófico pueda ser un dato preliminar para un estudio a largo plazo, se 
permitirá que se utilicen en ambos estudios los animales de la misma cepa y 
del mismo origen. El enfoque comparativo se limita a las ratonas ovx y el informe no aporta un conjunto sólido de datos para validar el modelo con hembras inmaduras, por lo que no se considera que el modelo con animales 
inmaduros quede incluido, en el caso de los ratones, en el ámbito de 
aplicación del presente método de ensayo.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. Por lo tanto, en algunos casos es posible utilizar ratones en lugar de ratas. 
Debe darse una justificación si se usa esta especie, basada en estudios 
toxicológicos o farmacocinéticos o en otros criterios. Es posible que resulte necesario modificar el protocolo en el caso de los ratones. Por ejemplo, el consumo de alimentos de los ratones por unidad de peso corporal es más 
elevado que el de las ratas y, por lo tanto, el contenido de fitoestrógenos en 
los alimentos deberá ser menor en el caso de los ratones que en el de las ratas (9)(20)(22).
 
Condiciones de alojamiento y alimentación  
19. Todos los procedimientos deben atenerse a las normas locales de trata ­
miento de animales de laboratorio. Estas descripciones de tratamiento y atención de animales constituyen los requisitos mínimos, y quedarán anu ­
ladas por las normas locales, tales como la Directiva 2010/63/UE del Par ­
lamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos (38). El local de 
los animales de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C 
(con una oscilación máxima aproximada de ± 3 °C). La humedad relativa debe ser como mínimo del 30 % y de preferencia no exceder del 70 %, salvo durante la limpieza del local. El objetivo debe ser conseguir una 
humedad relativa del 50-60 %. La iluminación debe ser artificial. La se ­
cuencia diaria de iluminación debe ser de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. 
20. Debe darse una dieta de laboratorio y agua de bebida  ad libitum.  Los 
animales adultos jóvenes pueden estar en jaulas individuales o bien en grupos de hasta tres animales. Debido a la corta edad de los animales 
inmaduros, se recomienda su alojamiento en grupos sociales. 
21. Se sabe que un alto nivel de fitoestrógenos en las dietas de laboratorio hace 
aumentar el peso del útero de los roedores en un grado suficiente para 
interferir con el bioensayo uterotrófico (13)(14)(15). Unos niveles elevados de fitoestrógenos y de energía metabolizable en las dietas de laboratorio 
pueden dar lugar también a una pubertad precoz en animales inmaduros, si 
son estos los utilizados. La presencia de fitoestrógenos procede fundamen ­
talmente de la inclusión de productos de soja y de alfalfa en las dietas de laboratorio, y se ha demostrado que las concentraciones de fitoestrógenos 
varían de un lote a otro en las dietas normales de laboratorio (23). El peso 
corporal es una variable importante, puesto que la cantidad de alimentos consumidos está relacionada con el peso corporal. Por consiguiente, la dosis realmente consumida de fitoestrógenos procedentes de la misma dieta puede 
variar según la especie y la edad (9). En el caso de las ratas hembras 
inmaduras, el consumo de alimentos por unidad de peso corporal puede ser aproximadamente el doble que en el de hembras adultas jóvenes ova ­
riectomizadas. En el caso de las ratonas adultas jóvenes, el consumo de 
alimentos por unidad de peso corporal puede ser aproximadamente el cuá ­
druple que en el de ratas adultas jóvenes ovariectomizadas. 
22. Sin embargo, los resultados del bioensayo uterotrófico (9)(17)(18)(19) in ­
dican que la presencia de cantidades limitadas de fitoestrógenos en la dieta es aceptable y no reduce la sensibilidad del bioensayo. Como orientación, los niveles alimentarios de fitoestrógenos no deben superar los 350 μg de 
equivalentes de genisteína/gramo de dieta de laboratorio en el caso de las 
ratas hembras inmaduras de las cepas Sprague Dawley y Wistar (6)(9). Estas dietas deben ser apropiadas también cuando se someten a ensayo las ratas adultas jóvenes ovariectomizadas porque el consumo de alimentos 
por unidad de peso corporal es menor en adultos jóvenes que en animales 
inmaduros. Si se van a utilizar ratonas adultas ovariectomizadas o ratas más sensibles a los fitoestrógenos, debe considerarse una reducción proporcional en los niveles de fitoestrógenos de la dieta (20). Además, las diferencias en 
la energía metabólica disponible de las distintas dietas puede provocar 
cambios temporales del inicio de la pubertad (21)(22).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Antes del estudio debe seleccionarse cuidadosamente una dieta sin un nivel 
elevado de fitoestrógenos [véanse al respecto las referencias (6) y (9)] o de 
energía metabolizable para evitar introducir confusión en los resultados (15)(17)(19)(22)(36). El garantizar el comportamiento adecuado del sistema de ensayo utilizado por el laboratorio como se indica en los puntos 26 y 27 
es una comprobación importante de estos dos factores. Como medida de 
seguridad coherente con unas buenas prácticas de laboratorio (BPL), deben tomarse muestras representativas de cada uno de los lotes de la dieta ad ­
ministrados durante el estudio, con vistas a efectuar posibles análisis del 
contenido de fitoestrógenos (por ejemplo, en el caso de unos elevados pesos 
uterinos de los animales de control respecto a los controles históricos, o de una respuesta inadecuada al estrógeno de referencia, el 17-alfa-etinil-estra ­
diol). Deben analizarse alícuotas como parte del estudio o bien congelarse a 
– 20 °C o de forma que se evite que la muestra se descomponga antes de su 
análisis. 
24. Algunos materiales de cama pueden contener sustancias estrogénicas o 
antiestrogénicas naturales (por ejemplo, se sabe que las mazorcas de maíz 
afectan a los ciclos estrales de las ratas y actúan como antiestrógenos). El material de cama seleccionado debe contener el mínimo posible de fitoes ­
trógenos.
 
Preparación de los animales  
25. Los animales de experimentación, que no deben mostrar signos de ningún 
tipo de enfermedad ni anomalías físicas, se reparten aleatoriamente entre los 
grupos de tratamiento y los de control. Las jaulas se colocan de manera que los posibles efectos debidos a la puesta de los animales en las mismas sean mínimos. Los animales se identifican inequívocamente. Es preferible que 
los animales inmaduros se alojen con sus madres o con madres de sustitu ­
ción hasta el destete durante la aclimatación. La fase de aclimatación antes del inicio del estudio debe durar aproximadamente 5 días en el caso de los animales adultos jóvenes y en el de los animales inmaduros entregados con 
sus madres o con madres de sustitución. Si se obtienen animales inmaduros 
ya destetados sin las madres, puede imponerse una duración más corta de la fase de aclimatación, ya que la administración de la sustancia problema debe iniciarse inmediatamente tras el destete (véase el punto 29).
 
PROCEDIMIENTO  
Verificación de la competencia del laboratorio  
26. Para verificar la competencia del laboratorio pueden utilizarse dos opciones 
distintas: 
— verificación periódica, sobre la base de un estudio del control positivo 
de referencia inicial (véase el punto 27); al menos cada 6 meses y cada 
vez que se produzca una modificación que pueda influir en el compor ­
tamiento del ensayo (por ejemplo, una nueva formulación de la dieta, un cambio en el personal que efectúe las disecciones, un cambio en la cepa de animales o en su proveedor, etc.) debe verificarse la sensibilidad del 
sistema de ensayo (modelo animal) utilizando una dosis adecuada (sobre 
la base del estudio del control positivo de referencia descrito en el punto 27) de un estrógeno de referencia: el 17a-etinil-estradiol (n
 o CAS 57-63-6) (EE); 
— uso de controles simultáneos, mediante la inclusión de un grupo al que 
se le administra una dosis adecuada del estrógeno de referencia en cada 
ensayo. 
Si el sistema no es capaz de responder según lo esperado, hay que examinar 
las condiciones experimentales y modificarlas en consecuencia. Se reco ­
mienda que la dosis del estrógeno de referencia utilizada en ambos enfoques 
sea aproximadamente la DE70 u 80.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Estudio del control positivo de referencia  Antes de que un laboratorio 
realice un estudio por primera vez según el presente método de ensayo, 
debe demostrar su competencia determinando la sensibilidad del modelo animal y estableciendo la relación dosis-respuesta de un estrógeno de refe ­
rencia, el 17a-etinil-estradiol (n
 o CAS 57-63-6) (EE), con un mínimo de 
cuatro dosis. La respuesta del peso del útero se comparará con los datos 
históricos establecidos [véase la referencia (5)]. Si este estudio del control positivo de referencia no produce los resultados previstos, deberán exami ­
narse y modificarse las condiciones experimentales.
 
Número y estado de los animales  
28. Cada grupo tratado y de control ha de incluir al menos 6 animales (para los 
protocolos tanto del método con animales inmaduros como del de animales adultos ovx).
 
Edad de los animales inmaduros  
29. Para el bioensayo uterotrófico con animales inmaduros debe especificarse el 
día de nacimiento. La administración de la sustancia problema ha de em ­
pezar lo suficientemente pronto como para garantizar que al término de 
dicha administración no ha tenido lugar aún la subida fisiológica de los 
estrógenos endógenos asociada a la pubertad. Por otra parte, hay indicios de que los animales muy jóvenes puede ser menos sensibles. Para definir la edad óptima, cada laboratorio debe tomar en consideración sus propios 
datos de referencia sobre la maduración. 
Como norma general, la administración a ratas puede comenzar inmediata ­
mente tras un destete temprano, el día postnatal 18 (considerándose que el 
día postnatal 0 es el del nacimiento). La administración a ratas debe estar 
completada de preferencia el día postnatal 21 y en cualquier caso antes del día postnatal 25, ya que a partir de esta edad se hace funcional el eje 
hipotálamo-hipófisis-ovarios y es posible que empiecen a subir los niveles 
de estrógenos endógenos, con una elevación concomitante de la media del peso uterino de referencia y un aumento de las desviaciones típicas de los grupos (2)(3)(10)(11)(12).
 
Procedimiento para la ovariectomía  
30. Respecto a las ratas y ratonas que se han de ovariectomizar (grupos tanto de 
tratamiento como de control), la ovariectomía debe efectuarse cuando tienen entre 6 y 8 semanas de edad. En el caso de las ratas, deben pasar al menos 
14 días entre la ovariectomía y el primer día de la administración, a fin de 
permitir que el útero retroceda a un peso de referencia estable y mínimo. En el caso de las ratonas, deben pasar al menos 7 días entre la ovariectomía y el primer día de la administración. Como una pequeña cantidad de tejido 
ovárico es suficiente para producir niveles significativos de estrógenos cir ­
culantes (3), antes de utilizar a los animales hay que examinarlos obser ­
vando las células epiteliales recogidas por frotis vaginal durante al menos cinco días consecutivos (por ejemplo, los días 10-14 tras la ovariectomía en 
el caso de las ratas). No deben utilizarse los animales que presenten algún 
signo de inicio de un ciclo estral. Además, en la autopsia, deben examinarse los muñones ováricos para comprobar si queda algo de tejido ovárico. En caso afirmativo, el animal no debe utilizarse en los cálculos (3). 
31. El procedimiento de ovariectomía se inicia con el animal, una vez aneste ­
siado correctamente, en decúbito prono. La incisión de apertura de la pared abdominal dorso-lateral debe tener una longitud aproximada de 1 cm en el 
punto medio entre el reborde costal inferior y la cresta ilíaca, y estar a unos 
pocos milímetros del borde lateral del músculo lumbar. El ovario debe extraerse de la cavidad abdominal y ponerse en un campo aséptico. El ovario debe desconectarse en la unión del oviducto con el cuerpo uterino. 
Tras confirmar que no se está produciendo ninguna hemorragia fuerte, la 
pared abdominal se cierra mediante sutura y la piel mediante autoclips o sutura adecuada. En la figura 1 se indican esquemáticamente los puntos de ligadura. Debe aplicarse una analgesia postoperatoria adecuada, según lo 
recomendado por un veterinario con experiencia en el tratamiento de 
roedores.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Peso corporal  
32. En el método con hembras adultas ovx, el peso corporal y el peso uterino 
no están correlacionados puesto que el peso uterino se ve afectado por 
hormonas como los estrógenos, pero no por los factores de crecimiento que regulan el tamaño corporal. Por el contrario, el peso corporal está relacionado con el peso uterino en el modelo con hembras inmaduras, en 
la fase de maduración (34). Así pues, al principio del experimento, la 
variación de peso entre los animales empleados en el modelo con hembras inmaduras ha de ser mínima y no superar el ± 20 % del peso medio. Esto significa que el tamaño de la camada debe ser normalizado por el criador, 
para garantizar que los descendientes de madres diferentes se alimentan de 
forma aproximadamente igual. Los animales deben asignarse a los grupos (tanto de control como de tratamiento) mediante distribución aleatorizada de los pesos, de forma que la media del peso corporal de cada grupo no sea 
estadísticamente diferente de la de los demás grupos. Debe prestarse aten ­
ción para evitar la asignación de animales de la misma camada al mismo grupo de tratamiento, en la medida de lo posible, sin incrementar el número de camadas que deban utilizarse en la investigación.
 
Posología  
33. Con el fin de establecer si una sustancia problema puede tener acción 
estrogénica  in vivo,  normalmente es suficiente con dos grupos tratados y 
un grupo de control, por lo que este diseño es el preferido por razones de 
bienestar de los animales. Si la finalidad es obtener una curva 
dosis-respuesta o bien extrapolar a dosis más bajas, son necesarios al menos tres grupos tratados. Si hace falta obtener información más allá de la iden ­
tificación de una actividad estrogénica (tal como una estimación de la 
potencia), debe considerarse una posología diferente. A excepción de la 
administración de la sustancia problema, los animales del grupo de control deben tratarse de la misma manera que los de los grupos de ensayo. Si se 
utiliza un vehículo para la administración de la sustancia problema, el grupo 
de control recibirá la misma cantidad de vehículo utilizado con los grupos tratados (o el mayor volumen utilizado con los grupos de ensayo si hay diferencias entre los grupos). 
34. El objetivo en el caso del bioensayo uterotrófico es seleccionar las dosis 
que garanticen la supervivencia y que no impliquen toxicidad significativa ni malestar para los animales después de tres días consecutivos de adminis ­
tración de la sustancia hasta una dosis máxima de 1 000 mg/kg/d. Todas las 
dosis deben proponerse y seleccionarse teniendo en cuenta los eventuales 
datos existentes sobre toxicidad, cinética o toxicocinética para la sustancia problema o productos afines. La dosis más alta debe tener en cuenta en primer lugar la DL50 y la información disponible sobre la toxicidad aguda, 
a fin de evitar la muerte y el sufrimiento o el dolor intenso de los animales 
(24)(25)(26). La dosis más alta debe representar la dosis máxima tolerada (DMT); también es aceptable un estudio realizado con una dosis 
que haya inducido una respuesta uterotrófica positiva. Como ensayo de 
cribado, es aceptable en general utilizar grandes intervalos entre las distintas dosis, como, por ejemplo, de media unidad logarítmica, correspondiente a un factor de progresión de las dosis de 3,2, o incluso hasta una unidad 
logarítmica. Si no se dispone de datos apropiados, puede realizarse un 
estudio de determinación de la gama de dosis. 
35. También, si la potencia estrogénica de un agonista puede estimarse con 
datos  in vitro  o in silico,  es posible tener en cuenta estos datos para la 
selección de las dosis. Por ejemplo, la cantidad de la sustancia problema 
que produciría respuestas uterotróficas equivalentes a las del agonista de referencia (etinil-estradiol) se calcula a partir de su potencia  in vitro  en 
comparación con la del etinil-estradiol. La dosis máxima de ensayo se 
obtendría multiplicando esta dosis equivalente por un factor adecuado co ­
mo, por ejemplo, 10 o 100.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Consideraciones para la determinación de la gama de dosis  
36. En caso de necesidad, puede llevarse a cabo con unos pocos animales un 
estudio previo de determinación de la gama de dosis. A este respecto, puede 
utilizarse el documento de orientación n  o 19 de la OCDE (25), donde se 
definen los signos clínicos indicativos de toxicidad o de malestar de los animales. Cuando sea posible en este estudio de determinación de la gama 
de dosis, tras administrar la sustancia durante tres días, puede extraerse el 
útero y pesarse, una vez hayan transcurrido unas 24 horas desde la adminis ­
tración de la última dosis. Estos datos pueden utilizarse a continuación para ayudar a diseñar el estudio principal (selección de la dosis máxima acepta ­
ble y de las dosis más bajas, y recomendación del número de grupos de 
dosis).
 
Administración de las dosis  
37. La sustancia problema se administra por vía oral forzada o inyección sub ­
cutánea. A la hora de elegir la vía de administración, han de tenerse en 
cuenta las consideraciones sobre el bienestar de los animales, junto con aspectos toxicológicos como la pertinencia para la vía de exposición hu ­
mana a la sustancia (por ejemplo, vía oral forzada para simular la ingestión, 
inyección subcutánea para simular la inhalación o la adsorción cutánea), las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema y, en especial, la in ­
formación toxicológica disponible y los datos sobre metabolismo y cinética 
(por ejemplo, necesidad de evitar el metabolismo de primer paso, mayor 
eficacia a través de una vía concreta). 
38. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la 
utilización de una solución o suspensión acuosa. Sin embargo, dado que 
la mayoría de los ligandos estrogénicos o sus precursores metabólicos tien ­
den a ser hidrófobos, el enfoque más común es el uso de una solución o suspensión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz, de cacahuete, de sésamo 
o de oliva). Sin embargo, estos aceites presentan diferentes contenidos de 
calorías y de grasas, con lo que el vehículo podría afectar al total de energía metabolizable (EM), lo que podría alterar ciertos parámetros medidos, como el peso del útero, particularmente en el método con hembras inmaduras 
(33). Por lo tanto, antes de realizar el estudio, hay que someter a ensayo 
todos los vehículos utilizados, frente a controles sin vehículos. Las sustan ­
cias problema pueden disolverse en una cantidad mínima de etanol al 95 % u otro disolvente adecuado, y diluirse en el vehículo del ensayo hasta 
alcanzar las concentraciones finales de trabajo. Deben conocerse las carac ­
terísticas tóxicas del disolvente, y este debe someterse a ensayo por sepa ­
rado, en un grupo de control al que se administre solo el disolvente. Si la sustancia problema se considera estable, es posible recurrir a un calenta ­
miento suave y a una acción mecánica vigorosa para ayudar a disolverla. 
Debe determinarse la estabilidad de la sustancia problema en el vehículo. Si es estable en toda la duración del estudio, puede prepararse una alícuota inicial de la sustancia problema, y después preparar cada día las diluciones 
especificadas para la administración. 
39. El calendario de la administración dependerá del modelo utilizado (véase el 
punto 29 en relación con el modelo de hembras inmaduras y el punto 30 en 
relación con el de hembras adultas ovx). Las ratas inmaduras reciben la 
sustancia problema diariamente, durante tres días consecutivos. Se reco ­
mienda también un tratamiento de tres días para ratas ovariectomizadas, pero pueden aceptarse exposiciones más largas, con la posibilidad de me ­
jorar la detección de sustancias débilmente activas. Con ratonas ovariecto ­
mizadas, la aplicación durante tres días debe ser suficiente, y no aporta ninguna ventaja significativa la extensión del plazo a hasta siete días con agonistas estrogénicos fuertes; sin embargo, esta relación no se ha demos ­
trado en el estudio de validación (16) en el caso de los estrógenos débiles, 
por lo que la administración debe ampliarse a hasta siete días consecutivos en ratonas adultas ovx.Las dosis deben administrarse todos los días a una hora similar. Deben ajustarse según sea necesario para mantener una dosis 
constante en términos de peso corporal del animal (por ejemplo, mg de 
sustancia problema por kg de peso corporal por día). En lo que respecta al volumen de ensayo, su variabilidad, por unidad de peso corporal, debe reducirse al mínimo ajustando la concentración de la solución administrada 
para garantizar un volumen constante por unidad de peso corporal con todas 
las dosis y con todas las vías de administración.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Cuando la sustancia problema se administra por vía oral forzada, debe 
hacerse en una sola dosis diaria y con una sonda gástrica o una cánula 
de intubación adecuada. El volumen máximo de líquido que puede adminis ­
trarse en una sola vez depende del tamaño del animal utilizado. Deben seguirse las normas locales de tratamiento de animales, pero el volumen 
no debe superar los 5 ml/kg de peso corporal, salvo en el caso de las 
soluciones acuosas, con las que pueden utilizarse 10 ml/kg de peso corporal. 
41. Cuando la sustancia problema se administra por inyección subcutánea, debe 
hacerse en una sola dosis diaria. Las dosis deben administrarse en las regiones dorsoescapular o lumbar con una aguja estéril (por ejemplo de calibre de 23 o 25 G) y una jeringuilla de tuberculina. Es opcional rasurar 
el lugar de la inyección. Deben registrarse los eventuales vertidos, las fugas 
en el punto de inyección o la administración incompleta de la sustancia problema. El volumen total inyectado por rata al día no debe superar los 5 ml/kg de peso corporal, dividido en dos lugares de inyección, excepto en el 
caso de soluciones acuosas, de las que pueden utilizarse 10 ml/kg de peso 
corporal.
 
Observaciones  
Observaciones generales y clínicas  
42. Deben hacerse observaciones clínicas generales al menos una vez al día, y 
con más frecuencia si se observan signos de toxicidad. Las observaciones 
deben llevarse a cabo preferentemente a la misma hora cada día y teniendo en cuenta el período previsto de efecto máximo tras la administración. Todos los animales deben observarse para registrar su mortalidad y morbi ­
lidad y los signos clínicos generales, tales como cambios en el comporta ­
miento, la piel, el pelo, los ojos, las mucosas, la presencia de secreciones y excreciones, y la actividad neurovegetativa (por ejemplo, lagrimeo, piloe ­
rección, tamaño de la pupila, respiración anómala, etc.).
 
Peso corporal y consumo de alimentos  
43. Todos los animales deben pesarse diariamente con precisión de 0,1 g, 
empezando justo antes de que se inicie el tratamiento, es decir, cuando los animales se asignan a los grupos. Con carácter optativo, es posible medir por jaula la cantidad de alimentos consumidos durante el período 
del tratamiento, pesando los alimentadores. Los resultados del consumo 
de alimentos deben expresarse en gramos por rata y por día.
 
Disección y pesaje del útero  
44. Veinticuatro horas después del último tratamiento, las ratas se sacrificarán 
de forma compasiva. Lo ideal es que el orden de la autopsia se aleatorice 
entre los distintos grupos para evitar una progresión directa de los grupos de más dosis a los de menos (o viceversa), que podría afectar sutilmente a los datos. El objetivo del bioensayo es medir el peso de los úteros tanto hú ­
medos como secos. El peso húmedo incluye el útero y el contenido de 
líquido luminal. El peso seco se mide después de haber exprimido y reti ­
rado el contenido luminal del útero. 
45. Antes de su disección, la vagina se examinará para observar su estado de 
apertura en los animales inmaduros. El procedimiento de disección co ­
mienza con la apertura de la pared abdominal a partir de la sínfisis púbica. A continuación, se desprenden de la pared abdominal dorsal los cuernos 
uterinos y los ovarios, si están presentes. La vejiga urinaria y los uréteres se 
separan de las caras ventral y lateral del útero y de la vagina. Se desprenden las adherencias fibrosas entre el recto y la vagina hasta que pueda identi ­
ficarse la unión del orificio vaginal con la piel perineal. El útero y la vagina 
se desprenden del cuerpo cortando la pared vaginal justo por encima de la 
unión con la piel perineal como se muestra en la figura 2. El útero debe
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
separarse del cuerpo cortando delicadamente el mesenterio uterino en el 
punto de su inserción a lo largo de toda la longitud de la cara dorsolateral 
de cada cuerno uterino. Una vez retirado del cuerpo, la manipulación del útero debe ser lo suficientemente rápida para impedir la desecación de los tejidos. La pérdida de peso debida a la desecación se vuelve más importante 
con tejidos pequeños, tales como el útero (23). Si están presentes, los 
ovarios se retiran a la altura de los oviductos, evitando la pérdida de líquido luminal por el cuerno uterino. Si el animal ha sido ovariectomizado, hay que examinar los muñones para detectar la posible presencia de algún tejido 
ovárico. Debe retirarse el exceso de grasa y de tejido conjuntivo. La vagina 
se retira del útero justo por debajo del cuello uterino, de forma que este siga unido al cuerpo del útero, como se indica en la figura 2. 
46. Cada útero debe transferirse a un recipiente marcado de manera inequívoca 
y tarado (por ejemplo, una placa de Petri o una navecilla de pesaje de plástico), prestando siempre atención para evitar la desecación antes del 
pesaje (por ejemplo, puede colocarse en el recipiente un trozo de papel 
de filtro ligeramente humedecido con solución salina). Debe pesarse el útero con el líquido luminal (peso uterino húmedo), con una precisión de 0,1 mg. 
47. Cada útero se trata a continuación por separado para retirarle el líquido 
luminal. Los dos cuernos uterinos se perforan o cortan longitudinalmente. 
El útero se coloca sobre un trozo de papel de filtro ligeramente humedecido 
(por ejemplo, Whatman n
 o 3) y se le aplica una ligera presión con otro 
trozo de papel de filtro ligeramente humedecido, para eliminar completa ­
mente el líquido luminal. Debe pesarse el útero sin el contenido luminal 
(peso uterino seco), con una precisión de 0,1 mg. 
48. El peso del útero en el momento del sacrificio puede utilizarse para asegu ­
rarse de que no se ha superado la edad adecuada en la rata inmadura intacta; 
sin embargo, son decisivos al respecto los datos históricos de la cepa de ratas utilizada en el laboratorio (véase el punto 56 en cuanto a la interpre ­
tación de los resultados).
 
Investigaciones optativas  
49. Tras efectuar el pesaje, los úteros pueden fijarse en formol al 10 % amor ­
tiguado a pH neutro para su examen histopatológico previa tinción con 
hematoxilina y eosina (HE). La vagina puede investigarse adecuadamente 
(véase el punto 9). Además, puede efectuarse con fines de comparación cuantitativa una medición morfométrica del epitelio del endometrio.
 
DATOS E INFORME  
Datos  
50. Los datos del estudio deben incluir: 
— el número de animales al inicio del ensayo, — el número y la identidad de los animales encontrados muertos durante el 
ensayo o sacrificados por razones compasivas, y la fecha y la hora de la muerte o del sacrificio compasivo, 
— el número y la identidad de los animales que presenten signos de 
toxicidad, y una descripción de los signos de toxicidad observados, 
con inclusión del momento de aparición, la duración y la gravedad de 
los efectos tóxicos, y 
— el número y la identidad de los animales que presenten lesiones y una 
descripción del tipo de lesiones.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Deben registrarse los datos de cada animal relativos al peso corporal, el 
peso uterino húmedo, y el peso uterino seco. Deben utilizarse análisis 
estadísticos unilaterales de los agonistas para determinar si la administración de una sustancia problema ha provocado un aumento estadísticamente sig ­
nificativo (p < 0,05) del peso uterino. Deben llevarse a cabo análisis esta ­
dísticos apropiados para determinar los eventuales cambios del peso uterino 
seco y húmedo relacionados con el tratamiento. Por ejemplo, los datos pueden evaluarse mediante un análisis de la covarianza (ANCOVA) con el peso corporal en la autopsia como covariable. Antes del análisis de los 
datos uterinos, se les puede aplicar una transformación logarítmica de es ­
tabilización de la varianza. La prueba de Dunnett y Hsu es adecuada para hacer comparaciones por parejas de cada uno de los grupos tratados res ­
pecto a los grupos de control del vehículo, y para calcular los intervalos de 
confianza. Pueden utilizarse gráficas residuales estudentizadas para detectar 
posibles valores atípicos y evaluar la homogeneidad de las varianzas. Estos procedimientos se aplicaron en el programa de validación de la OCDE utilizando el PROC GLM en el sistema de análisis estadísticos (SAS Ins ­
titute, Cary, NC), versión 8 (6)(7). 
52. El informe final debe contener lo siguiente:
 
Instalaciones de ensayo:  
— Personal responsable y sus tareas en el estudio 
— Datos del ensayo del control positivo de referencia y datos de los 
controles positivos periódicos (véanse los puntos 26 y 27)  
Sustancia problema:  
— Caracterización de las sustancias problema 
— Naturaleza física y, cuando sea pertinente, propiedades fisicoquímicas 
— Método y frecuencia de la preparación de las diluciones — Eventuales datos obtenidos sobre la estabilidad 
— Eventuales análisis de las soluciones administradas
 
Vehículo:  
— Caracterización del vehículo del ensayo (naturaleza, proveedor y lote) 
— Justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua  
Animales de experimentación:  
— Especie y cepa, y justificación de su elección 
— Proveedor e instalación específica del proveedor 
— Edad de suministro con la fecha de nacimiento 
— En caso de animales inmaduros, si se han suministrado o no con sus 
madres o con madres de sustitución, y la fecha del destete 
— Datos del procedimiento de aclimatación de los animales 
— Número de animales de cada jaula 
— Datos y método de identificación de cada animal y de los grupos  
Condiciones del ensayo:  
— Datos del proceso de aleatorización (es decir, método utilizado) 
— Justificación de la selección de la dosis  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— Datos sobre la formulación de la sustancia problema, su concentración 
obtenida, estabilidad y homogeneidad 
— Datos de la administración de la sustancia problema y justificación de la 
elección de la vía de exposición 
— Dieta (denominación, tipo, proveedor, contenido, y, si se conocen, los 
niveles de fitoestrógenos) 
— Origen del agua (por ejemplo, agua del grifo o agua filtrada) y suminis ­
tro (por tubos a partir de un gran depósito, en botellas, etc.) 
— Camas (denominación, tipo, proveedor y contenido) — Registro de las condiciones de alojamiento en las jaulas, intervalo de 
iluminación, temperatura y humedad del local, limpieza de este 
— Descripción detallada de los procedimientos de autopsia y de pesaje de 
los úteros 
— Descripción de los métodos estadísticos
 
Resultados  
Respecto a cada animal:  
— Todos los pesos corporales individuales diarios (desde la asignación en 
grupos hasta la autopsia) (con precisión de 0,1 g) 
— Edad de cada animal (en días contados a partir del día de nacimiento, 
que es el día 0) cuando se inicia la administración de la sustancia problema 
— Fecha y hora de cada administración de la sustancia problema 
— Volúmenes y cantidades calculados que se han administrado y observa ­
ciones de las eventuales pérdidas de dosis durante o tras la adminis ­
tración 
— Anotación diaria del estado de los animales, incluidos los síntomas y 
observaciones pertinentes 
— Causa sospechada de la muerte (si durante el estudio se encuentran 
animales moribundos o muertos) 
— Fecha y hora del sacrificio compasivo, con el intervalo de tiempo trans ­
currido desde la última administración 
— Peso uterino húmedo (con precisión de 0,1 mg) y eventuales observa ­
ciones sobre pérdidas del líquido luminal durante la disección y la preparación para el pesaje 
— Peso uterino seco (con precisión de 0,1 mg)
 
Respecto a cada grupo de animales:  
— MEDIA de los pesos corporales diarios (con precisión de 0,1 g) y 
desviaciones típicas (desde la asignación en grupos hasta la autopsia) 
— MEDIA de los pesos uterinos húmedos y media de los pesos uterinos 
secos (con precisión de 0,1 mg) y desviaciones típicas 
— Si se ha medido, el consumo diario de alimentos (calculado como 
gramos de alimentos consumidos por animal)  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— Resultados de los análisis estadísticos de comparación de los pesos 
uterinos húmedo y seco de los grupos tratados respecto a los mismos 
parámetros medidos en los grupos de control del vehículo 
— Resultados de los análisis estadísticos de comparación de los pesos 
corporales totales y del aumento de peso corporal de los grupos tratados respecto a los mismos parámetros medidos en los grupos de control del 
vehículo. 
53. Resumen de los datos importantes del método de ensayo
 
Ratas Ratonas  
Animales  
Cepa Cepa de roedores utilizada habitualmente en laboratorio Número de animales Mínimo de 6 animales por grupo de dosis Número de grupos Mínimo de dos grupos de tratamiento (véase el punto 33 al 
respecto) y un grupo de control negativo 
En los puntos 26 y 27 se encuentran orientaciones sobre los 
grupos de control positivo.  
Condiciones de alojamiento y alimentación  
T° en el local de los ani ­
males 22 °C ± 3 °C 
Humedad relativa 50-60 %, y no inferior al 30 % ni superior al 70 % 
Secuencia de iluminación 
diaria 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad 
Dieta y agua de bebida Ad libitum 
Alojamiento Individualmente o en grupos de hasta tres animales (se reco ­
mienda el alojamiento en grupos sociales para los animales inmaduros) 
Dieta y cama Bajo nivel de fitoestrógenos recomendado en la dieta y en la 
cama  
Protocolo  
Método Método con hembras inmadu ­
ras no ovariectomizadas (mé ­
todo preferido) 
Método con hembras adultas 
ovariectomizadas Método con hembras adultas 
ovariectomizadas 
Edad a la que se adminis ­
tra la sustancia a los ani ­
males inmaduros DPN 18 como pronto. La ad ­
ministración debe estar termi ­
nada antes del DPN 25. No pertinente en el ámbito de 
aplicación del presente método 
de ensayo 
Edad a la que se efectúa 
la ovariectomía Entre 6 y 8 semanas de edad 
Edad a la que se adminis ­
tra la sustancia a los ani ­
males ovariectomizados Deben pasar al menos 14 días 
entre la ovariectomía y el pri ­
mer día de la administración. Deben pasar al menos 7 días 
entre la ovariectomía y el pri ­
mer día de la administración. 
Peso corporal La variación del peso corporal debe ser mínima y no superar el 
± 20 % del peso medio.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Ratas Ratonas  
Administración de la sustancia  
Vía de administración Vía oral forzada o inyección subcutánea 
Frecuencia de la adminis ­
tración Una sola dosis diaria 
Volumen administrado 
por vía oral forzada o 
por inyección ≤ 5ml/kg peso corporal (o hasta 10 ml/kg peso corporal en caso 
de soluciones acuosas) (en 2 lugares de inyección si se utiliza la 
vía subcutánea) 
Duración de la administra ­
ción 3 días consecutivos con anima ­
les inmaduros 
Mínimo de 3 días consecutivos 
con animales ovx Mínimo de 7 días consecutivos 
con animales ovx 
Momento de la autopsia Unas 24 horas desde la administración de la última dosis  
Resultados  
Respuesta positiva Aumento estadísticamente significativo del peso medio del útero 
(húmedo y/o seco) 
Estrógeno de referencia 17 α-etinil-estradiol  
ORIENTACIÓN PARA LA INTERPRETACIÓN Y LA ACEPTACIÓN 
DE LOS RESULTADOS 
54. En general, debe considerarse que un ensayo de estrogenicidad es positivo 
si en él se ve un aumento estadísticamente significativo del peso uterino (p 
< 0,05), al menos con la dosis más elevada, comparando con el grupo de control del disolvente. El resultado positivo se ve respaldado también por la demostración de una relación verosímil desde el punto de vista biológico 
entre la dosis y la magnitud de la respuesta, teniendo en cuenta que el 
solapamiento de las actividades estrogénicas y antiestrogénicas de la sus ­
tancia problema puede afectar a la forma de la curva dosis-respuesta. 
55. Debe tenerse cuidado de no sobrepasar la dosis máxima tolerada, para que 
se pueda hacer una interpretación significativa de los datos. A este respecto, 
deben evaluarse a fondo la eventual reducción del peso corporal, la presen ­
cia de signos clínicos y otras observaciones. 
56. Una consideración importante para la aceptación de los datos del bioensayo 
uterotrófico es la de los pesos uterinos del grupo de control del vehículo. 
Unos elevados valores del control pueden comprometer la sensibilidad del 
bioensayo y su capacidad de detectar agonistas estrogénicos muy débiles. Del análisis de la bibliografía y de los datos obtenidos durante la validación del bioensayo uterotrófico se deduce que hay casos espontáneos de medias 
elevadas en los controles, sobre todo en animales inmaduros (2)(3)(6)(9). 
Como el peso uterino de las ratas inmaduras depende de muchas variables, como la cepa o el peso corporal, no puede indicarse ningún límite superior definitivo para este peso. A modo de guía, si los pesos uterinos secos de las 
ratas de control inmaduras están comprendidos entre 40 y 45 mg, los 
resultados deben considerarse sospechosos y unos pesos uterinos superiores a 45 mg pueden justificar que se repita el ensayo. Sin embargo, esto debe estudiarse caso por caso (3)(6)(8). Cuando se utilizan ratas adultas, si la 
ovariectomía es incompleta quedará tejido ovárico que puede producir es ­
trógenos endógenos y frenar el retroceso del peso uterino.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Se ha visto que se obtienen resultados aceptables con unos pesos uterinos 
secos del control del vehículo inferiores al 0,09 % del peso corporal en el 
caso de las ratas inmaduras e inferiores al 0,04 % en el de las adultas jóvenes ovariectomizadas [véase el cuadro 31 (2)]. Si los pesos uterinos del control son superiores a estas cifras, deberían examinarse diversos fac ­
tores, como la edad de los animales, la calidad de la ovariectomía, la 
presencia de fitoestrógenos en la dieta, etc., y habría que considerar con precaución un resultado del ensayo negativo (sin indicación de actividad estrogénica). 
58. Deben mantenerse en el laboratorio los datos históricos de los grupos de 
control del vehículo. También deben conservarse en el laboratorio los datos históricos de las respuestas a estrógenos positivos de referencia, tales como 
el 17a-etinil-estradiol. Los laboratorios pueden ensayar también la respuesta 
a agonistas estrogénicos débiles conocidos. Todos estos datos pueden com ­
pararse con los datos disponibles (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8), con el fin de asegu ­
rarse de que los métodos del laboratorio ofrecen la suficiente sensibilidad. 
59. En el estudio de validación de la OCDE, los pesos uterinos secos han 
mostrado menos variabilidad que los pesos uterinos húmedos (6)(7). Sin embargo, una respuesta significativa en alguna de las dos medidas indicaría 
que la sustancia problema es positiva para la actividad estrogénica. 
60. La respuesta uterotrófica no es únicamente de origen estrogénico; no obs ­
tante, un resultado positivo del bioensayo uterotrófico debe interpretarse 
generalmente como prueba de potencial estrogénico  in vivo,  y debe lanzar 
en principio el procedimiento para aclarar la situación (véase el punto 9 y el «Marco conceptual de la OCDE para el ensayo y evaluación de los altera ­
dores endocrinos», anexo 2).
 
Figura 1  
Diagrama esquemático de la extracción quirúrgica de los ovarios
  
El procedimiento se inicia con la apertura de la pared abdominal 
dorso-lateral en el punto medio entre el reborde costal inferior y la cresta ilíaca, y a unos pocos milímetros del borde lateral del músculo lumbar. 
Dentro de la cavidad abdominal, hay que localizar los ovarios. En un campo 
aséptico, a continuación se extraen los ovarios físicamente de la cavidad abdominal, se hace una ligadura entre el ovario y el útero para detener la hemorragia, y se separa el ovario mediante incisión por encima de la 
ligadura en la unión entre el oviducto y cada cuerno uterino. Tras confirmar 
que no persiste ninguna hemorragia significativa, la pared abdominal se cierra mediante sutura y la piel mediante autoclips o sutura adecuada, por ejemplo. Debe dejarse un mínimo de 14 días antes de utilizar los animales, 
para que puedan recuperarse de la operación y que retroceda el peso de los 
úteros.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Figura 2  
Separación y preparación de los tejidos uterinos para el pesaje
  
El procedimiento comienza con la apertura de la pared abdominal al nivel de la 
sínfisis púbica. A continuación, cada uno de los ovarios, si están presentes, y los 
cuernos uterinos se desprenden de la pared abdominal dorsal. La vejiga urinaria y 
los uréteres se separan de las caras ventral y lateral del útero y de la vagina. Se desprenden las adherencias fibrosas entre el recto y la vagina hasta que pueda identificarse la unión del orificio vaginal con la piel perineal. El útero y la vagina 
se desprenden del cuerpo cortando la pared vaginal justo por encima de la unión 
con la piel perineal como se muestra en la figura. El útero debe separarse del cuerpo cortando delicadamente el mesenterio uterino en el punto de su inserción a lo largo de toda la longitud de la cara dorsolateral de cada cuerno uterino. Una 
vez desprendido el útero del organismo, se retira el exceso de grasa y de tejido 
conjuntivo. Si están presentes, los ovarios se retiran a la altura de los oviductos evitando la pérdida de líquido luminal por el cuerno uterino. Si el animal ha sido ovariectomizado, hay que examinar los muñones para detectar la posible presen ­
cia de algún tejido ovárico. La vagina se retira del útero justo por debajo del 
cuello uterino, de forma que este siga unido al cuerpo del útero, como se indica en la figura. En ese momento puede pesarse el útero.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES  
Antiestrogenicidad : Capacidad de una sustancia de suprimir la acción del 17ß- 
estradiol en un mamífero.  
Sustancia : Sustancia o mezcla  
Fecha de nacimiento : Día postnatal 0.  
Posología : Término general que abarca la dosis administrada, y la frecuencia y 
duración de la administración.  
Dosis : Cantidad de sustancia problema administrada. Para el bioensayo uterotró ­
fico, la dosis se expresa en peso de sustancia problema por unidad de peso corporal del animal sometido al experimento por día (por ejemplo, mg/kg peso corporal/día).  
Dosis máxima tolerable (DMT) : La mayor cantidad de una sustancia que, 
cuando se introduce en el organismo, no mata a los animales de experimentación 
(indicada con la sigla DL
 0 ) (IUPAC 1993).  
Estrogenicidad : Capacidad de una sustancia de actuar como el 17ß-estradiol en 
un mamífero.  
Día postnatal X : Día n  o X de vida a partir de la fecha de nacimiento.  
Sensibilidad : Proporción de todas las sustancias activas/positivas que se clasifi ­
can correctamente mediante el ensayo. Es una medida de la exactitud de un método de ensayo que produce resultados inequívocos, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo.  
Especificidad : Proporción de todas las sustancias inactivas/negativas que se 
clasifican correctamente mediante el ensayo. Es una medida de la exactitud de 
un método de ensayo que produce resultados inequívocos, y un factor importante en la evaluación de la pertinencia de un método de ensayo.  
Sustancia problema : Toda sustancia o mezcla estudiada con este método de 
ensayo.  
Uterotrófico : Término utilizado para describir un efecto positivo sobre el creci ­
miento de los tejidos uterinos.  
Validación : Proceso científico diseñado para caracterizar las exigencias y limi ­
taciones operativas de un método de ensayo y demostrar su fiabilidad y perti ­
nencia para un fin particular.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Apéndice 2
  
VMG mamm: Grupo de gestión de la validación de ensayos con mamíferos y su evaluación
 NOTAS RELATIVAS AL MARCO CONCEPTUAL  
Nota 1.  Es posible entrar en el marco y dejarlo en cualquier nivel, en 
función de la naturaleza de la información que se necesite para la 
evaluación del peligro y del riesgo.  
Nota 2.  En el nivel 5, la ecotoxicología debe incluir parámetros que indi ­
quen los mecanismos de los efectos adversos y los posibles daños a la población.  
Nota 3.  Cuando un modelo multimodal cubre varios ensayos de un mismo 
parámetro, este modelo puede sustituir a los ensayos individuales 
de ese parámetro.  
Nota 4.  La evaluación de cada sustancia debe hacerse caso por caso, te ­
niendo en cuenta toda la información disponible, sin olvidar la función de cada uno de los niveles del marco conceptual.  
Nota 5.  No debe considerarse que el marco conceptual sea exhaustivo en el 
momento actual. En los niveles 3, 4 y 5 se incluyen ensayos que están disponibles o cuya validación está en curso. Con respecto a 
estos últimos, su inclusión tiene carácter provisional. Una vez de ­
sarrollados y validados, se inscribirán oficialmente en el marco conceptual.  
Nota 6.  No debe considerarse que el nivel 5 incluya solo ensayos definiti ­
vos. Se considera que los ensayos incluidos en este nivel contribu ­
yen a la evaluación general del peligro y del riesgo.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(2) OCDE (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioas ­
say. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1. 
(3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Ute ­
rotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Pro ­
tocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520. 
(4) OCDE (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay-Phase 1. OECD Environmental Health 
and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/ JM/MONO(2006)33. 
(5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785-94. 
(6) OCDE (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2-Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34. 
(7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two-Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549 
(8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two Co ­
ded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558. 
(9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567. 
(10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolifera ­
tive pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587. 
(11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- estradiol. Endocrinology 117:2229-2237. 
(12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleis ­
chmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active 
UV screens. SÖFW-J. 127:10-15. 
(13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science 118:650-651. 
(14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. To ­
xicol. 13:425-427. 
(15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  res­
ponses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Pers ­
pec.106:369-373.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
(16) OCDE (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Ute ­
rotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67. 
(17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157. 
(18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525. 
(19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620. 
(20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, Fors ­
ythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485. 
(21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343-347. 
(22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature 
CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381- 
393. 
(23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. 
Sci.37:596-601. 
(24) OCDE (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425. 
(25) OCDE (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
(26) OCDE (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4. 
(27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320-333. 
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 19: 33-41. 
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fun ­
dam. Appl. Toxicol. 34: 288-305. 
(30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284 — 291. 
(31) OCDE (1982). Organization for Economic Co-operation and 
Development-Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64- 12367-9, Paris. 
(32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. Nueva York, Aca ­
demic Press. 
(33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endo ­
crine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401-416.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
(34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159-184. 
(35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808. 
(36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Eva ­
luation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414. 
(37) OCDE (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. 
No. 71. 
(38) Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de 
septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos, DO L 276 de 20.10.2010, p. 33.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  BIOENSAYO DE HERSHBERGER CON RATAS: ENSAYO DE 
CRIBADO A CORTO PLAZO DE LAS PROPIEDADES 
(ANTI)ANDROGÉNICAS  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de 
la OCDE TG 441 (2009). La OCDE lanzó en 1998 una actividad muy prioritaria para revisar las directrices existentes y elaborar nuevas directrices 
sobre los ensayos de cribado y finales de posibles alteradores endocrinos 
(1). Uno de los elementos de la actividad consistía en elaborar unas direc ­
trices para el bioensayo de Hershberger con ratas. Este ensayo, después de haberse utilizado durante varias décadas en el sector farmacéutico, fue 
normalizado por primera vez en 1962 por un comité de expertos oficiales, 
como herramienta para el cribado de sustancias androgénicas (2). Entre 2001 y 2007, el bioensayo de Hershberger con ratas ha sido objeto de un amplio programa de validación, que incluía la elaboración de un documento 
de revisión de referencia (23), la recopilación de un documento detallado 
sobre métodos (3), la elaboración de una guía sobre disección (21) y la realización de extensos estudios intra e interlaboratorios para mostrar la 
fiabilidad y la reproducibilidad del bioensayo. Estos estudios de validación 
se llevaron a cabo con un potente andrógeno de referencia [propionato de testosterona (PT)], dos potentes andrógenos sintéticos (acetato de trembo ­
lona y metil-testosterona), un potente medicamento antiandrogénico (fluta ­
mida), un potente inhibidor (finasterida) de la síntesis del andrógeno natural 
dihidrotestosterona (DHT), varios plaguicidas débilmente antiandrogénicos (linurón, vinclozolina, procimidona, p,p'-DDE), un potente inhibidor de la 5α-reductasa (finasterida) y dos sustancias negativas conocidas (dinitrofenol 
y nonilfenol) (4)(5)(6)(7)(8). El presente método de ensayo es el resultado 
de la larga experiencia histórica con el bioensayo y de la experiencia adquirida durante el programa de validación, así como de los resultados obtenidos en este. 
2. El bioensayo de Hershberger es un ensayo de cribado a corto plazo  in vivo  
que utiliza tejidos secundarios del aparato reproductor masculino. El ensayo 
surgió en la década de 1930 y se modificó en la de 1940 para incluir 
músculos del aparato reproductor masculino sensibles a los andrógenos (2)(9-15). En la década de 1960 se evaluaron más de 700 posibles andró ­
genos utilizando una versión normalizada del protocolo (2)(14), y en esa 
misma década se consideró utilizar el ensayo como un método normalizado 
para estudiar tanto andrógenos como antiandrógenos (2)(15). El bioensayo actual se basa en los cambios de peso de cinco tejidos de ratas macho castradas peripuberales, tejidos que son sensibles a los andrógenos. Evalúa 
la capacidad de una sustancia para provocar actividades biológicas caracte ­
rísticas de agonistas o antagonistas androgénicos, o de inhibidores de la 5 α- 
reductasa. Los cinco tejidos diana sensibles a los andrógenos que se inclu ­
yen en el presente método de ensayo son la próstata ventral (PV), la 
vesícula seminal (VS) (con los líquidos y las glándulas coagulantes), el 
músculo elevador del ano con el músculo bulbocavernoso (EABC), la pa ­
reja de glándulas de Cowper (GCW) y el glande del pene (GP). En las ratas macho castradas peripuberales, estos cinco tejidos responden a los andró ­
genos con un aumento del peso absoluto. Cuando estos mismos tejidos se 
estimulan para incrementar su peso mediante la administración de un an ­
drógeno potente de referencia, estos cinco tejidos responden a los antian ­
drógenos con una disminución de su peso absoluto. El modelo primario 
para el bioensayo de Hershberger es el macho peripuberal castrado quirúr ­
gicamente, que se validó en las fases 1, 2 y 3 del programa de validación de Hershberger. 
3. Este bioensayo de Hershberger sirve de ensayo de cribado del mecanismo  
in vivo  de agonistas y antagonistas androgénicos y de inhibidores de la 5a- 
reductasa, y su aplicación debe considerarse en el contexto del ‘OECD 
Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine 
Disrupting Chemicals’ (Marco conceptual de la OCDE para el ensayo y
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
evaluación de los alteradores endocrinos) (apéndice 2). En este marco con ­
ceptual el bioensayo de Hershberger figura en el nivel 3 como ensayo  in 
vivo que proporciona datos sobre un solo mecanismo endocrino, es decir, la 
(anti)androgenicidad. Se pretende incluir este bioensayo en una batería de ensayos  in vitro  e in vivo  para identificar las sustancias con potencial para 
interactuar con el sistema endocrino, lo que desembocará finalmente en 
evaluaciones del peligro y del riesgo para la salud humana o el medio ambiente. 
4. Debido a las preocupaciones que implica la castración sobre el bienestar de 
los animales, se buscó un modelo alternativo para el bioensayo de Hers ­
hberger con machos intactos (sin castrar) destetados estimulados, a fin de 
evitar la fase de castración. Se validó el método de ensayo con animales destetados estimulados (24); sin embargo, en los estudios de validación no se vio que la versión del bioensayo de Hershberger con estos animales 
destetados pudiera detectar sistemáticamente los efectos que tienen, sobre 
el peso de los órganos sensibles a los andrógenos, las sustancias antian ­
drogénicas débiles a las dosis estudiadas. Por lo tanto, no se incluye en el presente método de ensayo. Sin embargo, reconociendo que su uso no solo 
puede mejorar el bienestar de los animales, sino también ofrecer informa ­
ción sobre otros modos de acción, se encuentra en el documento de orien ­
tación de la OCDE 115 (25).
 
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
5. Los agonistas y antagonistas androgénicos actúan como ligandos del recep ­
tor androgénico y pueden activar o inhibir, respectivamente, la transcripción 
de genes controlada por el receptor. Además, algunas sustancias inhiben la 
conversión de la testosterona en dihidrotestosterona, que es un andrógeno natural más potente, en algunos tejidos diana de los andrógenos (inhibidores de la 5a-reductasa). Estas sustancias pueden provocar peligros para la salud, 
incluidos ciertos efectos sobre la reproducción y el desarrollo. Por lo tanto, 
desde el punto de vista de la normativa es necesario evaluar con rapidez las sustancias que puedan ser agonistas o antagonistas androgénicos o inhibi ­
dores de la 5a-reductasa. Aunque de carácter informativo, la afinidad de un 
ligando por un receptor androgénico, medida por la unión al receptor o por 
la activación transcripcional de genes marcadores  in vitro,  no es el único 
factor determinante de un posible peligro. Otros factores determinantes son la activación y desactivación metabólica de la sustancia al entrar en el 
organismo, su distribución en los tejidos diana, y su eliminación del orga ­
nismo. Esto lleva a la necesidad de detectar la posible actividad de una sustancia  in vivo  en las condiciones y exposición relevantes. La evaluación  
in vivo  es menos crítica si se conocen las características de la sustancia en 
cuanto a su absorción — distribución — metabolismo — 
eliminación (ADME). Los tejidos sensibles a los andrógenos responden con un rápido y vigoroso crecimiento cuando se estimulan con andrógenos, especialmente en las ratas macho castradas peripuberales. Diversas especies 
de roedores, especialmente la rata, se utilizan también ampliamente en 
estudios de toxicidad para la caracterización de los peligros. Por consiguien ­
te, la versión del ensayo que utiliza ratas peripuberales castradas y los cinco tejidos diana es adecuada para el cribado  in vivo  de los agonistas y anta ­
gonistas androgénicos y de los inhibidores de la 5a-reductasa. 
6. El presente método de ensayo se basa en los protocolos empleados en el 
estudio de validación de la OCDE que han demostrado ser fiables y repro ­
ducibles en estudios intra e interlaboratorios (4)(5)(6)(7)(8). En el presente método de ensayo se recogen procedimientos para sustancias tanto andro ­
génicas como antiandrogénicas. 
7. Aunque ha habido cierta variación en la dosis de PT utilizada, para detectar 
antiandrógenos en el programa de validación del bioensayo de Hershberger de la OCDE, por los diferentes laboratorios (0,2 frente a 0,4 mg/kg/día, en inyección subcutánea), se ha encontrado poca diferencia entre estas dos 
variantes del protocolo en cuanto a la capacidad de detectar una actividad 
antiandrogénica débil o fuerte. Sin embargo, es evidente que la dosis de PT no ha de ser tan alta como para bloquear los efectos de los antagonistas débiles del receptor androgénico (RA) ni tan baja como para que los tejidos 
androgénicos tengan una respuesta de escaso crecimiento incluso sin la 
administración conjunta de un antiandrógeno.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. La respuesta de crecimiento de los distintos tejidos sensibles a los andró ­
genos no es únicamente de origen androgénico, es decir, ciertas sustancias 
que no son agonistas androgénicos pueden alterar el peso de determinados tejidos. Sin embargo, una respuesta de crecimiento de varios tejidos de forma concomitante avala que se trata de un mecanismo androgénico más 
específico. Por ejemplo, con dosis elevadas de estrógenos potentes se puede 
aumentar el peso de las vesículas seminales; sin embargo, los demás tejidos sensibles a los andrógenos utilizados en el ensayo no responden de forma similar. Las sustancias antiandrogénicas pueden actuar bien como antago ­
nistas del receptor androgénico o bien como inhibidores de la 5a-reductasa. 
Los inhibidores de la 5a-reductasa tienen un efecto variable, ya que la conversión en dihidrotestosterona, más potente, varía según el tejido. Los antiandrógenos que inhiben la 5 α — reductasa, como la finasterida, tienen 
efectos más pronunciados en la próstata ventral que en los otros tejidos, en 
comparación con un antagonista potente del RA, como la flutamida. Esta diferencia en la respuesta según los tejidos puede aprovecharse para distin ­
guir entre los modos de acción mediados por el RA y los mediados por la 
5α — reductasa. Además, el receptor androgénico está relacionado evolu ­
tivamente con el de otras hormonas esteroideas, y algunas otras hormonas, si se administran a dosis altas, suprafisiológicas, pueden unirse a los recep ­
tores y antagonizar los efectos de aumento del crecimiento del PT (13). 
Además, también es verosímil que un aumento del metabolismo de los 
esteroides y el consiguiente descenso de la testosterona presente en el suero reduzcan el crecimiento de los tejidos sensibles a los andrógenos. Por tanto, un eventual resultado positivo en el bioensayo de Hershberger debe eva ­
luarse normalmente aplicando un planteamiento de ponderación de las prue ­
bas, con inclusión de ensayos  in vitro,  tales como los ensayos de unión 
alRAy a los receptores estrogénicos (RE) y los correspondientes ensayos de activación de la transcripción, o con otros ensayos  in vivo  que examinen 
tejidos diana androgénicos similares, tales como el ensayo sobre la pubertad 
con machos, el ensayo con machos adultos intactos de 15 días, o los estudios con administración continuada de 28 o de 90 días. 
9. La experiencia indica que los andrógenos xenobióticos son más raros que 
los antiandrógenos xenobióticos. Puede esperarse, pues, que el bioensayo de Hershberger se utilice con más frecuencia para el cribado de antiandróge ­
nos. No obstante, el procedimiento de ensayo de andrógenos podría reco ­
mendarse para sustancias esteroideas o similares, o para sustancias de las cuales se haya deducido una indicación de posibles efectos androgénicos con los métodos que figuran en los niveles 1 o 2 del marco conceptual 
(apéndice 2). Del mismo modo, en los ensayos de nivel 5 se pueden 
observar efectos adversos asociados con perfiles (anti)androgénicos, lo que hace necesario evaluar si una sustancia actúa siguiendo un modo de acción endocrino. 
10. Se acepta que todos los procedimientos en los que se utilicen animales 
deben atenerse a las normas locales de tratamiento de animales; las des ­
cripciones de tratamiento y atención de animales recogidas más adelante 
constituyen requisitos mínimos de comportamiento, y quedarán anuladas por las normas locales, tales como la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protec ­
ción de los animales utilizados para fines científicos (26). La OCDE pro ­
porciona más orientaciones sobre el tratamiento compasivo de los animales (17). 
11. Como en cualquier bioensayo con animales de experimentación, debe pres ­
tarse una atención especial a la necesidad de llevar a cabo el estudio. Básicamente, puede haber dos motivos para tomar una decisión de ese tipo: 
— un elevado potencial de exposición (nivel 1 del marco conceptual) o 
indicios de (anti)androgenicidad en ensayos  in vitro  (nivel 2) que avalen 
la realización de investigaciones sobre si estos efectos pueden produ ­
cirse  in vivo;  
— efectos concordantes con (anti)androgenicidad en ensayos  in vivo  de los 
niveles 4 o 5 que avalen la realización de investigaciones sobre el modo 
de acción específico, por ejemplo para determinar si los efectos se deben 
a una mecanismo (anti)androgénico.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Las definiciones utilizadas en el presente método se recogen en el 
apéndice 1.  
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
13. El bioensayo de Hershberger consigue su sensibilidad utilizando machos 
con una producción mínima de andrógenos endógenos. Esto se logra me ­
diante el uso de machos castrados, siempre que se deje pasar un plazo 
razonable tras la castración para que los tejidos diana puedan retroceder a un peso de referencia mínimo y uniforme. De esta manera, cuando se efectúa un cribado de la posible actividad androgénica, se encuentran bajos 
niveles endógenos de andrógenos circulantes, que el eje hipotálamo-hipófi ­
sis-gónadas es incapaz de compensar por mecanismos de retroalimentación, se maximiza la capacidad de los tejidos para responder, y se minimiza la variabilidad del peso inicial de los tejidos. Cuando se efectúa un cribado de 
la posible actividad antiandrogénica, puede lograrse un aumento más siste ­
mático del peso de los tejidos a la hora de estimularlos con un andrógeno de referencia. En consecuencia, el bioensayo de Hershberger exige solo 6 animales por grupo de dosis, mientras que en otros ensayos con machos 
púberes o adultos intactos se sugiere la utilización de 15 animales por grupo 
de dosis. 
14. La castración de las ratas machos peripuberales debe realizarse de manera 
adecuada, utilizando anestesia y un procedimiento aséptico. Deben adminis ­
trarse analgésicos en los primeros días tras la operación para eliminar las molestias posquirúrgicas. La castración mejora la precisión del ensayo para 
detectar andrógenos y antiandrógenos débiles al eliminar los mecanismos 
compensatorios de retroalimentación endocrina presentes en los animales intactos que pueden atenuar los efectos de los andrógenos y antiandrógenos administrados, y al eliminar la gran variabilidad interindividual de los ni ­
veles de testosterona en suero. Por lo tanto, la castración reduce el número 
de animales necesarios para el cribado de estas actividades endocrinas. 
15. Cuando se efectúa un cribado de la posible actividad androgénica, la sus ­
tancia problema se administra diariamente por vía oral forzada o por inyec ­
ción subcutánea durante un período de diez días consecutivos. Las sustan ­
cias problema se administran a un mínimo de dos grupos de tratamiento de animales de experimentación, a razón de una dosis por grupo. Tras unas 24 
horas después de la administración de la última dosis se procede a realizar 
la autopsia de los animales. Un aumento estadísticamente significativo en el peso de dos o más órganos diana de los grupos a los que se ha administrado la sustancia problema en comparación con el grupo de control del vehículo 
indica que dicha sustancia es positiva en cuanto a una posible actividad 
androgénica (véase el punto 60). Los andrógenos, como la trembolona, que no pueden reducirse en 5 α tienen efectos más pronunciados en el EABC y 
el GP en comparación con el PT, pero todos los tejidos deben mostrar un 
aumento del crecimiento. 
16. Cuando se efectúa un cribado de la posible actividad antiandrogénica, la 
sustancia problema se administra diariamente por vía oral forzada o por 
inyección subcutánea durante un período de diez días consecutivos, a la vez 
que se administran por inyección subcutánea dosis diarias de PT (0,2 o 0,4 mg/kg/d). En el programa de validación se determinó que podía utilizarse tanto una dosis de 0,2 como de 0,4 mg/kg/d de PT, ya que ambas eran 
eficaces para la detección de antiandrógenos, por lo que solo debía selec ­
cionarse una dosis para el ensayo. La sustancia problema se administra en dosis graduadas a un mínimo de tres grupos de tratamiento de animales de experimentación, a razón de una dosis por grupo. Tras unas 24 horas 
después de la administración de la última dosis se procede a realizar la 
autopsia de los animales. Un descenso estadísticamente significativo en el peso de dos o más órganos diana de los grupos a los que se ha administrado la sustancia problema más el PT en comparación con el grupo de control al 
que solo se ha administrado el PT indica que dicha sustancia es positiva en 
cuanto a una posible actividad antiandrogénica (véase el punto 61).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Selección de especies y cepas  
17. La rata es la especie utilizada sistemáticamente en el bioensayo de Hers ­
hberger desde la década de 1930. Aunque es biológicamente verosímil que 
tanto la rata como el ratón muestren respuestas similares, tras la experiencia de 70 años con el modelo de la rata se puede afirmar que esta es la especie preferida para el bioensayo de Hershberger. Además, como los datos del 
bioensayo de Hershberger pueden servir de datos preliminares para un 
estudio multigeneracional a largo plazo, es posible utilizar en ambos estu ­
dios animales de la misma especie, cepa y origen. 
18. El presente protocolo permite a los laboratorios seleccionar la cepa de rata 
que vaya a utilizarse en el ensayo y que, por lo general, debe ser la utilizada habitualmente por el laboratorio participante. Pueden utilizarse cepas de rata de uso común en laboratorios; sin embargo, no deben utilizarse cepas que 
tarden bastante más de 42 días en madurar, ya que la castración de estos 
machos a los 42 días puede impedir el pesaje del glande del pene, que solo puede llevarse a cabo después de que el prepucio se haya separado del cuerpo del pene. Así pues, no deben utilizarse cepas de rata derivadas de la 
Fisher 344, salvo en casos especiales. La rata Fisher 344 tiene un calendario 
de desarrollo sexual diferente del de otras cepas utilizadas habitualmente, como son la Sprague Dawley o la Wistar (16). Si va a utilizarse dicha cepa, el laboratorio debe castrar los animales a una edad levemente superior y ha 
de poder demostrar la sensibilidad de la cepa empleada. El laboratorio debe 
indicar claramente las razones que justifiquen la elección de la cepa de rata. Cuando el ensayo de cribado pueda utilizarse como preliminar para un estudio de la toxicidad oral con administración continuada, para un estudio 
de la toxicidad para la reproducción y el desarrollo, o para un estudio a 
largo plazo, deberán utilizarse preferentemente en todos los estudios anima ­
les de la misma cepa y del mismo origen.
 
Condiciones de alojamiento y alimentación  
19. Todos los procedimientos deben atenerse a todas las normas locales de 
tratamiento de animales de laboratorio. Estas descripciones de tratamiento y atención de animales constituyen los requisitos mínimos, y quedan anu ­
ladas por normas locales de carácter más estricto, tales como la Directiva 
2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 
2010, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científi ­
cos (26). El local de los animales de experimentación ha de estar a una temperatura de 22 °C (con una oscilación aproximada de ± 3 °C). La hu ­
medad relativa debe ser como mínimo del 30 % y de preferencia no exceder 
del 70 %, salvo durante la limpieza del local. El objetivo debe ser conseguir una humedad relativa del 50-60 %. La iluminación debe ser artificial. La secuencia diaria de iluminación debe ser de 12 horas de luz y 12 horas de 
oscuridad. 
20. El alojamiento en grupo es preferible al aislamiento, debido a la corta edad 
de los animales y al hecho de que las ratas son animales sociales. El 
alojamiento de dos o tres animales por jaula evita el hacinamiento y el 
estrés que este conlleva y que pueden interferir con el control hormonal del desarrollo de los tejidos sexuales secundarios. Las jaulas deben lim ­
piarse a fondo para eliminar los posibles contaminantes presentes y se 
colocan de manera que los posibles efectos debidos a la puesta de los 
animales en las mismas sean mínimos. Con unas jaulas del tamaño ade ­
cuado (~ 2 000 cm
 2 ) se evitará el hacinamiento. 
21. Cada animal debe identificarse inequívocamente (por ejemplo, etiqueta o 
marca auricular) utilizando un método incruento. Debe consignarse el mé ­
todo de identificación.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Debe darse una dieta de laboratorio y agua de bebida  ad libitum.  Los 
laboratorios que efectúen el bioensayo de Hershberger deben utilizar la dieta 
que apliquen normalmente en sus tareas de ensayo de sustancias. En los estudios de validación del bioensayo no se observaron efectos ni variabili ­
dad que pudieran atribuirse a la dieta. Se registrará la dieta utilizada y se 
conservará una muestra de la dieta de laboratorio para posibles futuros 
análisis.
 
Criterios de comportamiento en relación con el peso de los órganos 
sensibles a los andrógenos  
23. Durante el estudio de validación, no se encontraron indicios de que una 
disminución del peso corporal afectara incrementando o disminuyendo el aumento del peso de los tejidos diana (es decir, los que deben pesarse en 
este estudio). 
24. Entre las diferentes cepas de rata utilizadas con éxito en el programa de 
validación, el peso de los órganos sensibles a los andrógenos es mayor en 
las cepas de rata más pesadas que en las más ligeras. Por tanto, los criterios 
de comportamiento del bioensayo de Hershberger no incluyen ningún valor absoluto previsto del peso de los órganos de los controles positivos ni de los negativos. 
25. Como el coeficiente de variación (CV) de un tejido tiene una relación 
inversa con la potencia estadística, los criterios de comportamiento del 
bioensayo de Hershberger se basan en unos valores máximos del CV de 
cada tejido (cuadro 1). Los CV proceden de los estudios de validación de la OCDE. En caso de resultados negativos, los laboratorios deben examinar los CV del grupo de control y del grupo tratado con la dosis más elevada 
para determinar si se ha respetado el criterio de comportamiento relativo al 
CV máximo. 
26. El estudio deberá repetirse cuando: 1) tres o más de los diez posibles CV 
individuales de los grupos de control y de dosis más elevada superen los máximos indicados para los estudios de agonistas y de antagonistas en el cuadro 1, y 2) al menos dos tejidos diana hayan sido marginalmente sig ­
nificativos, es decir, con valores r entre 0,05 y 0,10.
 
Cuadro 1  
CV máximos autorizados para los tejidos sexuales secundarios diana, 
determinados con el modelo de ratas castradas en los estudios de 
validación de la OCDE  ( 1 ). 
Tejido Efectos antiandrogéni ­
cos Efectos androgénicos  
Vesículas seminales 40 % 40 % 
Próstata ventral 40 % 45 % 
EABC 20 % 30 % 
Glándulas de Cowper 35 % 55 % 
Glande del pene 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) El CV umbral para un determinado tejido se obtuvo a partir de un gráfico de valores de 
CV —ordenados de menor a mayor de forma secuencial— de todas las medias de todos 
los experimentos del ejercicio de validación con un modelo específico (agonista o anta ­
gonista). El CV umbral se lee en el punto en que los incrementos entre los CV siguientes 
más elevados de la serie son mucho más grandes que entre los CV anteriores más 
próximos, es decir, en el «punto de ruptura». Cabe señalar que, aunque este análisis 
identificó «puntos de ruptura» relativamente fiables en el caso del modelo del ensayo 
para antagonistas, las curvas de CV en el ensayo para agonistas mostraron un aumento 
más uniforme, por lo que la identificación de un CV umbral por este método tiene algo 
de arbitrario en el último caso.
 PROCEDIMIENTO  
Cumplimiento de la normativa y verificación del laboratorio  
27. A diferencia del ensayo uterotrófico (capítulo B.54 del presente anexo), con 
el bioensayo de Hershberger no es necesario demostrar la competencia del 
laboratorio antes del inicio del estudio, ya que se llevan a cabo, como parte integrante del ensayo, controles concurrentes positivos (propionato de tes ­
tosterona y flutamida) y negativos.
 
Número y estado de los animales  
28. Cada grupo tratado y de control debe incluir un mínimo de 6 animales. Esto 
se aplica a los protocolos tanto con andrógenos como con antiandrógenos.  
Castración  
29. Debe dejarse un período de aclimatación inicial de varios días tras la 
recepción de los animales a fin de garantizar que estos están sanos y se desarrollan bien. Como es posible que los animales castrados antes de tener 42 días de edad, es decir, antes del día postnatal (DPN) 42, no presenten la 
separación del prepucio, hay que castrar a los animales el DPN 42 o 
después, pero no antes. Los animales se castran bajo anestesia haciendo una incisión en el escroto y eliminando ambos testículos y epidídimos, con ligadura de los vasos sanguíneos y de los conductos seminíferos. Tras 
confirmar que no se está produciendo ninguna hemorragia, ha de cerrarse 
el escroto con sutura o con autoclips. Durante los primeros días después de la operación, deben administrarse a los animales analgésicos para paliar las molestias debidas a la misma. Si los animales castrados se adquieren de un 
proveedor de animales, este debe garantizar la edad de los animales y su 
fase de madurez sexual.
 
Aclimatación tras la castración  
30. Los animales deben continuar la aclimatación a las condiciones del labora ­
torio para que retrocedan los pesos de los tejidos diana, durante un mínimo de 7 días a partir de la castración. Es preciso observar a diario a los 
animales, y deben suprimirse los animales que presenten signos de enfer ­
medad o anomalías físicas. Por tanto, el tratamiento con la sustancia pro ­
blema puede comenzar como muy pronto el día DPN 49, y como muy tarde 
el DPN 60. La edad a la que se efectúa la autopsia no debe superar el DPN 
70. Esta flexibilidad permite al laboratorio programar con eficacia las tareas experimentales.
 
Peso corporal y aleatorización de los grupos  
31. Las diferencias en el peso corporal de los distintos animales son una fuente 
de variabilidad de los pesos de los tejidos, tanto dentro de cada grupo como 
entre los distintos grupos de animales. El aumento de la variabilidad del 
peso de los tejidos provoca un aumento del coeficiente de variación (CV) y disminuye la potencia estadística del ensayo (a veces denominada sensibi ­
lidad del ensayo). Por consiguiente, las variaciones de peso corporal deben 
estar controladas, tanto de manera experimental como estadística. 
32. El control experimental implica que sean pequeñas las variaciones del peso 
corporal dentro de los grupos de estudio y entre ellos. En primer lugar, 
deben evitarse los animales excepcionalmente grandes o pequeños y no incluirlos en la cohorte del estudio. Al inicio del estudio, la variación de peso de los animales empleados no debe exceder de ± 20 % del peso medio 
(por ejemplo, 175g ± 35 g en el caso de las ratas peripuberales castradas). 
En segundo lugar, los animales deben asignarse a los grupos (tanto de control como de tratamiento) mediante distribución aleatorizada de los pe ­
sos, de forma que la media del peso corporal de cada grupo no sea esta ­
dísticamente diferente de la de los demás grupos. Debe consignarse debi ­
damente el procedimiento de aleatorización por bloques utilizado.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Debido a que la toxicidad puede reducir el peso corporal de los grupos 
tratados en relación con el grupo de control, puede emplearse como cova ­
riable estadística el peso corporal en el primer día de la administración de la sustancia problema, en lugar del peso corporal en el momento de la autopsia.
 
Posología  
34. Con el fin de establecer si una sustancia problema puede tener acción 
androgénica  in vivo,  normalmente es suficiente con dos grupos tratados 
con dicha sustancia y un grupo de control positivo y otro de control nega ­
tivo (vehículo) (véase el punto 43), por lo que este diseño es el preferido 
por razones de bienestar de los animales. Si la finalidad es obtener una 
curva dosis-respuesta o bien extrapolar a dosis más bajas, son necesarios al menos tres grupos tratados. Si hace falta obtener información más allá de la identificación de una actividad androgénica (tal como una estimación de la 
potencia), debe considerarse una posología diferente. Para hacer un ensayo 
de antiandrógenos, se administra la sustancia problema junto con un ago ­
nista androgénico de referencia. Debe utilizarse un mínimo de 3 grupos de ensayo con dosis diferentes de la sustancia problema, y un control positivo 
y otro negativo (véase el punto 44). A excepción de la administración de la 
sustancia problema, los animales del grupo de control deben tratarse de la misma manera que los de los grupos de ensayo. Si se utiliza un vehículo para la administración de la sustancia problema, el grupo de control debe 
recibir el mayor volumen de vehículo utilizado con los grupos de ensayo. 
35. Todas las dosis deben proponerse y seleccionarse teniendo en cuenta la 
eventual toxicidad existente y los datos cinéticos o toxicocinéticos disponi ­
bles en relación con la sustancia problema o productos afines. La dosis más alta debe tener en cuenta, en primer lugar, la DL
 50 y la información dis ­
ponible sobre la toxicidad aguda, a fin de evitar la muerte, el sufrimiento 
intenso o el malestar de los animales (17)(18)(19)(20) y, en segundo lugar, la información disponible sobre las dosis utilizadas en los estudios de toxicidad crónica y subcrónica. En general, la dosis más alta no debe 
provocar una reducción del peso corporal final de los animales mayor del 
10 % del peso de control. La dosis más alta debe ser o bien 1) la dosis más alta que garantice la supervivencia de los animales y que no implique toxicidad significativa ni malestar para los animales después de 10 días 
consecutivos de administración de la sustancia hasta una dosis máxima de 
1 000 mg/kg/d (véase el punto 36), o bien 2) una dosis que induzca efectos (anti)androgénicos, si esta es inferior. Como ensayo de cribado, es aceptable 
en general utilizar grandes intervalos entre las distintas dosis, como, por 
ejemplo, de media unidad logarítmica, correspondiente a un factor de pro ­
gresión de las dosis de 3,2, o incluso de una unidad logarítmica. Si no se dispone de datos apropiados, puede realizarse un estudio de determinación 
de la gama de dosis (véase el punto 37), con el fin de ayudar a determinar 
las dosis convenientes.
 
Dosis límite  
36. Si mediante un ensayo con la dosis límite de 1 000 mg/kg de peso corporal 
al día y con una dosis menor utilizando los procedimientos descritos para el presente estudio no se consigue provocar un cambio estadísticamente sig ­
nificativo del peso de los órganos genitales, puede considerarse que no hace 
falta aplicar otras dosis diferentes. La dosis límite es aplicable siempre, excepto cuando haya datos de exposición humana que indiquen la necesidad 
de utilizar una dosis superior.
 
Consideraciones para la determinación de la gama de dosis  
37. En caso de necesidad, puede llevarse a cabo con unos pocos animales un 
estudio previo de determinación de la gama de dosis, a fin de seleccionar los grupos de dosis adecuados [utilizando los métodos de ensayo de la toxicidad aguda (capítulos B.1  bis,  B.1  tris  del presente anexo (27), 
OCDE TG 425 (19))]. El objetivo en el caso del bioensayo de Hershberger 
es seleccionar las dosis que garanticen la supervivencia y que no impliquen
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
toxicidad significativa ni malestar para los animales después de diez días 
consecutivos de administración de la sustancia hasta una dosis límite de 
1 000 mg/kg/d como se indica en los puntos 35 y 36. A este respecto, puede utilizarse el documento de orientación de la OCDE (17), donde se definen los signos clínicos indicativos de toxicidad o de malestar de los 
animales. Cuando sea posible en este estudio de determinación de la gama 
de dosis, tras administrar la sustancia durante diez días, pueden extraerse los tejidos diana y pesarse, una vez hayan transcurrido unas 24 horas desde la administración de la última dosis. Estos datos podrían utilizarse posterior ­
mente para contribuir a la selección de las dosis del estudio principal.
 
Sustancias de referencia y vehículo  
38. El agonista androgénico de referencia debe ser el propionato de 
testosterona (PT), n  o CAS 57-82-5. La dosis de referencia del PT puede 
ser o bien 0,2 mg/kg-pc/d o bien 0,4 mg/kg-pc/d. El antagonista androgé ­
nico de referencia debe ser la flutamida (FT), n  o CAS 1311-84-7. La dosis 
de referencia de la FT debe ser 3 mg/kg-pc/d y la FT debe administrarse 
conjuntamente con la dosis de referencia del PT. 
39. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la 
utilización de una solución o suspensión acuosa. Sin embargo, dado que 
muchos ligandos androgénicos o sus precursores metabólicos tienden a ser hidrófobos, el enfoque más común es el uso de una solución o suspensión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz, de cacahuete, de sésamo o de oliva). 
Las sustancias problema pueden disolverse en una cantidad mínima de 
etanol al 95 % u otro disolvente adecuado, y diluirse en el vehículo del ensayo hasta alcanzar las concentraciones finales de trabajo. Deben cono ­
cerse las características tóxicas del disolvente, y este debe someterse a 
ensayo por separado, en un grupo de control al que se administre solo el 
disolvente. Si la sustancia problema se considera estable, es posible recurrir a un calentamiento suave y a una acción mecánica vigorosa para ayudar a disolverla. Debe determinarse la estabilidad de la sustancia problema en el 
vehículo. Si la sustancia problema es estable a lo largo de todo el estudio, 
puede prepararse una sola alícuota inicial de ella, y después preparar cada día las diluciones especificadas para la administración, con cuidado para 
evitar la contaminación y el deterioro de las muestras.
 
Administración de las dosis  
40. El PT debe administrarse por inyección subcutánea, y la FT por vía oral 
forzada. 
41. La sustancia problema se administra por vía oral forzada o por inyección 
subcutánea. A la hora de elegir la vía de administración debe considerarse 
el bienestar de los animales y las propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema. Además, deben tenerse en cuenta aspectos toxicológicos como la pertinencia para la vía de exposición humana a la sustancia (por ejemplo, 
vía oral forzada para simular la ingestión, inyección subcutánea para simu ­
lar la inhalación o la adsorción cutánea), y la información toxicológica disponible y los datos sobre metabolismo y cinética (por ejemplo, necesidad de evitar el metabolismo de primer paso, mayor eficacia a través de una vía 
concreta), antes de iniciar amplios ensayos a largo plazo si se obtienen 
resultados positivos por inyección. 
42. Los animales deben recibir las dosis de la misma manera y con la misma 
secuencia temporal durante diez días consecutivos, con unos intervalos aproximados de 24 horas. El nivel de dosis debe ajustarse diariamente sobre la base de las medidas diarias del peso corporal tomadas de forma paralela. 
El volumen de las dosis y el momento en que se administren deben regis ­
trarse cada día de la exposición. Debe tenerse cuidado de no sobrepasar la dosis máxima descrita en el punto 35, para que se pueda hacer una inter ­
pretación significativa de los datos. A este respecto, deben evaluarse a 
fondo una eventual reducción de peso corporal, la presencia de signos 
clínicos y otras observaciones. En el caso de la vía oral forzada, debe
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
utilizarse una sonda gástrica o una cánula de intubación adecuada. El vo ­
lumen máximo de líquido que puede administrarse en una sola vez depende 
del tamaño del animal utilizado. Deben seguirse las normas locales de tratamiento de animales, pero el volumen no debe superar los 5 ml/kg de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, con las que 
pueden utilizarse 10 ml/kg de peso corporal. En el caso de las inyecciones 
subcutáneas, las dosis deben administrarse en las regiones dorsoescapular o lumbar con una aguja estéril (por ejemplo, de calibre de 23 o 25 G) y una jeringuilla de tuberculina. Es opcional rasurar el lugar de la inyección. 
Deben registrarse los eventuales vertidos, las fugas en el punto de inyección 
o la administración incompleta de la sustancia problema. El volumen total inyectado por rata al día no debe superar los 0,5 ml/kg de peso corporal
 
Procedimientos específicos para los agonistas androgénicos  
43. Para el ensayo de agonistas androgénicos, el vehículo es el control negativo 
y el grupo tratado con PT es el control positivo. La actividad biológica 
característica de los agonistas androgénicos se somete a ensayo adminis ­
trando las dosis seleccionadas de la sustancia problema a los grupos de tratamiento durante 10 días consecutivos. Los pesos de los cinco tejidos 
sexuales secundarios de los grupos a los que se administra la sustancia 
problema se comparan con los del grupo del vehículo para detectar un eventual aumento estadísticamente significativo del peso.
 
Procedimientos específicos para los antagonistas androgénicos y para 
los inhibidores de la 5 α-reductasa  
44. En el ensayo de antagonistas androgénicos y de inhibidores de la 5 α-reduc­
tasa, el grupo tratado con PT es el control negativo, y el grupo al que se 
administran conjuntamente las dosis de referencia de PT y de FT es el control positivo. La actividad biológica característica de los antagonistas 
androgénicos y de los inhibidores de la 5 α-reductasa se somete a ensayo 
administrando una dosis de referencia de PT y la sustancia problema du ­
rante 10 días consecutivos. Los pesos de los cinco tejidos sexuales secun ­
darios de los grupos a los que se administra el PT más la sustancia pro ­
blema se comparan con los del grupo de referencia al que se administra solo 
el PT para detectar un eventual descenso estadísticamente significativo del peso.
 
OBSERVACIONES  
Observaciones clínicas  
45. Deben hacerse observaciones clínicas generales al menos una vez al día, y 
con más frecuencia si se aprecian signos de toxicidad. Las observaciones 
deben llevarse a cabo preferentemente a la misma hora cada día y teniendo en cuenta el período previsto de efecto máximo tras la administración. Todos los animales deben observarse para registrar su mortalidad y morbi ­
lidad y los signos clínicos generales, tales como cambios en el comporta ­
miento, la piel, el pelo, los ojos, las mucosas, la presencia de secreciones y excreciones, y la actividad neurovegetativa (por ejemplo, lagrimeo, piloe ­
rección, tamaño de la pupila, respiración anómala, etc.). 
46. Todos los animales hallados muertos deben retirarse y eliminarse sin más 
análisis de los datos. La eventual mortalidad de los animales antes de la 
autopsia debe incluirse en el registro del estudio, junto con los motivos aparentes de la mortalidad. Los animales moribundos deben sacrificarse de forma compasiva. Los animales que se encuentren moribundos y se sacri ­
fiquen posteriormente deben incluirse en el registro del estudio con los 
motivos aparentes de la morbilidad.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Peso corporal y consumo de alimentos  
47. Todos los animales deben pesarse diariamente con precisión de 0,1 g, 
empezando justo antes de que se inicie el tratamiento, es decir, cuando 
los animales se asignan a los grupos. Con carácter optativo, es posible medir por jaula la cantidad de alimentos consumidos durante el período del tratamiento, pesando los alimentadores. Los resultados del consumo 
de alimentos deben expresarse en gramos por rata y por día.
 
Disección y pesaje de los tejidos y órganos  
48. Aproximadamente 24 horas después de la última administración de la sus ­
tancia problema, las ratas deben sacrificarse y desangrarse según los pro ­
cedimientos normales del laboratorio correspondiente, y debe efectuarse la 
autopsia. El método de sacrifico compasivo debe registrarse en el informe 
del laboratorio. 
49. Lo ideal es que el orden de la autopsia se aleatorice entre los distintos 
grupos para evitar una progresión directa de los grupos de más dosis a 
los de menos (o viceversa), que podría afectar a los datos. Debe registrarse 
y comunicarse cualquier observación que se haga en la autopsia, es decir, las eventuales alteraciones patológicas o lesiones visibles. 
50. Han de pesarse los cinco tejidos sensibles a los andrógenos (PV, VS, 
EABC, GCW, GP). Estos tejidos deben extraerse y limpiarse cuidadosa ­
mente retirando el exceso de tejidos y de grasa adheridos; a continuación se determina su peso fresco (sin fijar). Cada tejido debe manipularse con especial cuidado para evitar la pérdida de líquidos y la desecación, que 
pueden introducir errores significativos y aumentar la variabilidad al reducir 
los pesos registrados. Algunos de los tejidos pueden ser muy pequeños o difíciles de extraer, lo que aumenta la variabilidad. Por lo tanto, es impor ­
tante que las personas que lleven a cabo la disección de los tejidos sexuales 
secundarios estén familiarizadas con los procedimientos normalizados de 
esta disección. La OCDE ha publicado un manual de procedimientos nor ­
malizados de trabajo (PNT) para la disección (21). Una formación cuida ­
dosa, siguiendo la guía de PNT, reducirá al mínimo esta fuente potencial de 
variación del estudio. Idealmente, el mismo disector debe encargarse de la 
disección de un determinado tejido para eliminar las diferencias interindi ­
viduales en el tratamiento de los tejidos. Si esto no es posible, la autopsia debe diseñarse de manera que cada disector extraiga un determinado tejido 
de todos los grupos de tratamiento, en lugar de que una sola persona 
extraiga todos los tejidos de un grupo de control, mientras que otra persona se encarga de los grupos tratados. Cada uno de los tejidos sexuales secun ­
darios debe pesarse, sin secarse previamente, con precisión de 0,1 mg, y se 
registran los pesos de cada animal. 
51. Algunos de los tejidos pueden ser muy pequeños o difíciles de extraer, lo 
que aumenta la variabilidad. En trabajos anteriores se ha indicado una banda de coeficientes de variación (CV) que parece diferir según la com ­
petencia del laboratorio. En unos pocos casos, se han observado dentro de 
un mismo laboratorio grandes diferencias en el peso absoluto de tejidos como la PV y las GCW. 
52. También pueden pesarse, con carácter opcional, el hígado, la pareja de 
riñones y la de cápsulas suprarrenales. También estos órganos se deben 
limpiar para quedar libres del eventual tejido conjuntivo y de la grasa 
adheridos. El hígado debe pesarse y el resultado registrarse con precisión de 0,1 g, y la pareja de riñones y la de cápsulas suprarrenales con precisión de 0,1 mg. El hígado, los riñones y las cápsulas suprarrenales son sensibles 
no solo a los andrógenos, sino que también proporcionan indicios útiles 
sobre la toxicidad sistémica.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Es opcional la medición de la concentración en el suero de la hormona 
luteinizante (LH), de la hormona foliculoestimulante (FSH) y de la 
testosterona (T). Los niveles de T en suero son útiles para determinar si la sustancia problema activa el metabolismo hepático de la testosterona, lo que reduciría dichos niveles. Sin los datos de la T, podría parecer que este 
efecto se debe a un mecanismo antiandrogénico. Los niveles de LH pro ­
porcionan información sobre la capacidad de una sustancia antiandrogénica no solo de reducir el peso de los órganos, sino también de afectar a la función hipotalámico-hipofisaria, lo que en estudios a largo plazo puede 
inducir tumores de testículo. La FSH es una hormona importante para la 
espermatogénesis. La medición de los niveles en suero de T4 y T3 también es opcional y aporta información suplementaria útil sobre la capacidad de alterar la homeostasis de la hormona tiroidea. Si se van a medir los niveles 
hormonales, las ratas deben anestesiarse antes de la autopsia y se les toma 
sangre por punción cardíaca; el método de la anestesia debe seleccionarse con cuidado para que no afecte a la medición hormonal. Deben registrarse el método de preparación del suero, el origen del equipo del radioinmunoa ­
nálisis o de otros equipos de medición, los métodos analíticos y los resul ­
tados. Los niveles de LH deben indicarse en ng/ml de suero, y la T también debe indicarse en las mismas unidades. 
54. La disección de los tejidos se describe a continuación, y se basa en una guía 
de disección pormenorizada con fotografías, publicada como material su ­
plementario incluido en el programa de validación (21). En la página web del organismo oficial de alimentos y medicamentos de Corea se encuentra también un vídeo sobre la disección (22). 
— Con la superficie ventral del animal hacia arriba, se determina si el 
prepucio se ha separado del glande del pene. En caso positivo, se retrae el prepucio y se extrae el glande del pene, se pesa (con precisión de 0,1 mg) y se registra el peso. 
— Se abren la piel y la pared abdominal, exponiendo las vísceras. Si se 
pesan los órganos opcionales, se extrae el hígado y se pesa con preci ­
sión de 0,1 g, se extraen el estómago y los intestinos, se extraen la 
pareja de riñones y la de cápsulas suprarrenales y se pesan con precisión 
de 0,1 mg. Esta extracción deja expuesta la vejiga y permite la disección de los tejidos secundarios masculinos diana. 
— Para extraer la PV, hay que separar la vejiga de la capa muscular ventral 
cortando el tejido conjuntivo a lo largo de la línea media. Se desplaza la 
vejiga hacia adelante, en el sentido de las vesículas seminales (VS), lo que deja a la vista los lóbulos izquierdo y derecho de la próstata ventral (cubiertos por una capa de grasa). Se separa cuidadosamente la grasa de 
los lóbulos derecho e izquierdo de la PV. Se desplaza suavemente el 
lóbulo derecho de la PV respecto a la uretra y se separa de esta me ­
diante un corte. Sosteniendo aún el lóbulo derecho de la PV, se desplaza suavemente el lóbulo izquierdo respecto a la uretra y luego se separa 
mediante un corte; pesar con precisión de 0,1 mg y registrar el peso. 
— Para extraer la vesícula seminal con las glándulas coagulantes (VSGC), 
se desplaza la vejiga hacia la cola, dejando así a la vista los conductos deferentes y los lóbulos derecho e izquierdo de las vesículas seminales 
más las glándulas coagulantes. Para evitar fugas de líquido se fija una 
pinza hemostática en la base de la VSGC, donde el conducto deferente se une a la uretra. Se extrae cuidadosamente la VSGC, sin retirar la pinza hemostática se limpia de la grasa y de los elementos anejos, se 
coloca en una navecilla de pesaje ya tarada, se quita la pinza, se pesa 
con precisión de 0,1 mg y se registra el peso.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Para extraer el músculo elevador del ano más el músculo 
bulbocavernoso (EABC), se exponen estos músculos y la base del pene. 
Los músculos EA envuelven el colon, mientras que los músculos EA anterior y BC se fijan a los bulbos del pene. Se eliminan la piel y los elementos anejos de la región perianal que va desde la base del pene 
hasta el extremo anterior del ano. Los músculos BC se van cortando 
gradualmente a partir del bulbo del pene y de los demás tejidos. El colon se corta en dos y así puede diseccionarse y extraerse el conjunto de los EABC. Los EABC deben limpiarse de la grasa y elementos 
anejos y pesarse con precisión de 0,1 mg; el peso se registra. 
— Después de haberse retirado los EABC, pueden verse las glándulas de 
Cowper redondas o glándulas bulbouretrales (GCW), en la base de los bulbos del pene, en posición ligeramente dorsal. Es necesario prestar 
atención en la disección para no cortar la fina cápsula y evitar así que se 
escape el líquido contenido. Pesar la pareja de GCW con precisión de 0,1 mg y registrar el peso. 
— Además, debe indicarse si se escapa algún líquido de cualquier glándula 
durante la autopsia y disección. 
55. En caso de que la evaluación de cada sustancia requiera la autopsia de más 
animales de lo que sea razonable para un solo día, el inicio del estudio podrá escalonarse en dos días consecutivos, con lo que se conseguirá esca ­
lonar en dos días la autopsia y el trabajo correspondiente. Al aplicar este 
escalonamiento, hay que usar cada día la mitad de los animales por grupo 
de tratamiento. 
56. Los cadáveres deben eliminarse de manera adecuada tras la realización de la 
autopsia.
 
INFORME DEL ENSAYO  
Datos  
57. Los datos deben notificarse individualmente (es decir, el peso corporal, el 
peso de los tejidos sexuales secundarios, las mediciones opcionales y las otras respuestas y observaciones) y por cada grupo de animales (las medias 
y desviaciones típicas de cada medida). Los datos deben resumirse en forma 
de cuadro y deben indicar el número de animales al comienzo del ensayo, el de los animales encontrados muertos durante el ensayo o encontrados con signos de toxicidad, la descripción de los signos de toxicidad, así como el 
momento de aparición, la duración y la gravedad. 
58. El informe final debe contener lo siguiente:
 
Instalaciones de ensayo  
— Nombre de la instalación y ubicación 
— Director y demás personal del estudio, con sus responsabilidades en el 
mismo 
— Fechas de inicio y final del estudio, es decir, el primer día de la admi ­
nistración de la sustancia problema y el último día de la autopsia, respectivamente
 
Sustancia problema  
— Origen, número de lote, identidad, pureza, dirección completa del pro ­
veedor y caracterización de la sustancia o sustancias problema 
— Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas — Condiciones de almacenamiento y método y frecuencia de la prepara ­
ción de las diluciones 
— Eventuales datos obtenidos sobre la estabilidad — Eventuales análisis de las soluciones o suspensiones administradas
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Vehículo  
— Caracterización del vehículo (identidad, proveedor y número de lote) 
— Justificación de la elección del vehículo (si es distinto del agua)  
Animales de ensayo y procedimientos de cría de los animales  
— Especie y cepa utilizadas y justificación de la elección 
— Origen o proveedor de los animales, con la dirección completa 
— Número y edad de los animales proporcionados — Condiciones de alojamiento (temperatura, iluminación, etc.) — Dieta (denominación, tipo, proveedor, número de lote, contenido, y, si 
se conocen, niveles de fitoestrógenos) 
— Camas (denominación, tipo, proveedor y contenido) — Condiciones de alojamiento en las jaulas y número de animales de cada 
jaula.
 
Condiciones del ensayo  
— Edad de los animales en el momento de la castración y duración de la 
aclimatación una vez castrados 
— Peso de cada animal al inicio del estudio (con precisión de 0,1 g) — Proceso de aleatorización y registro de la asignación a los grupos (de 
control del vehículo, de referencia, de tratamiento con la sustancia pro ­
blema) y a las jaulas 
— MEDIA y desviación típica de los pesos corporales de cada grupo en 
cada día de pesaje a lo largo de todo el estudio 
— Justificación de la selección de las dosis — Vía de administración de la sustancia problema y justificación de la 
elección de la vía de exposición 
— Si se trata de un ensayo de antiandrogenicidad, el tratamiento con PT 
(dosis y volumen) 
— Tratamiento con la sustancia problema (dosis y volumen), — Momento de la administración — Procedimientos de autopsia, incluidos los medios del desangrado y la 
eventual anestesia 
— Si se efectúan análisis de suero, deben proporcionarse detalles del mé ­
todo. Por ejemplo, si se utiliza el radioinmunoanálisis (RIA), deben 
recogerse en el informe el procedimiento de RIA, el origen y la fecha de caducidad de los equipos de RIA, el procedimiento para el recuento de centelleo, y la normalización.
 
Resultados  
— Observaciones diarias de cada animal durante la administración, incluido 
lo siguiente: 
— Pesos corporales (con precisión de 0,1 g) — Signos clínicos (en su caso) — Eventual medición o notas del consumo de alimentos — Observaciones de la autopsia de cada animal, en particular:
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— Fecha de la autopsia 
— Grupo de tratamiento de los animales 
— Código de identificación del animal 
— Disector 
— Hora del día en que se realizan la autopsia y la disección 
— Edad de los animales 
— Peso corporal final en la autopsia, con indicación de los eventuales 
aumentos o disminuciones estadísticamente significativos 
— Orden del sangrado y de la disección de los animales en la autopsia 
— Pesos de los cinco tejidos diana sensibles a los andrógenos: 
— Próstata ventral (con precisión de 0,1 mg) 
— Vesículas seminales más glándulas coagulantes, incluidos los líquidos 
(por parejas, con precisión de 0,1 mg) 
— Complejo de músculos elevador del ano y bulbocavernoso (con preci ­
sión de 0,1 mg) 
— Glándulas de Cowper (peso fresco — por parejas, con precisión de 0,1 
mg) 
— Glande del pene (peso fresco, con precisión de 0,1 mg) 
— Pesos de los tejidos opcionales, si se determinan: 
— Hígado (con precisión de 0,1 g) 
— Riñones (por parejas, con precisión de 0,1 mg) 
— Cápsulas suprarrenales (por parejas, con precisión de 0,1 mg) 
— Observaciones generales y comentarios 
— Análisis de las hormonas en el suero, si se efectúa: 
— LH en suero (opcional — ng por ml de suero), y 
— T en suero (opcional — ng por ml de suero) 
— Observaciones generales y comentarios  
Resumen de los datos  
Los datos deben resumirse en forma de cuadro con el tamaño de la muestra 
de cada grupo, la media del valor, y el error estándar de la media o la 
desviación típica. Los cuadros deben incluir los pesos corporales en el momento de la autopsia, los cambios de peso corporal desde el inicio de la administración de la sustancia hasta la autopsia, los pesos de los tejidos 
sexuales secundarios diana, y los eventuales pesos de órganos opcionales.
 
Discusión de los resultados  
Análisis de los resultados  
59. Los pesos corporales y de los órganos en el momento de la autopsia deben 
analizarse estadísticamente en relación con características tales como la 
homogeneidad de la varianza, con las adecuadas transformaciones de datos que puedan ser necesarias. Los grupos de tratamiento deben compararse con un grupo de control, utilizando técnicas tales como la ANOVA, y a con ­
tinuación deben realizarse comparaciones por parejas (por ejemplo, la 
prueba unilateral de Dunnett) y aplicarse el criterio de diferencia estadística, por ejemplo, p ≤ 0,05. Deben señalarse los grupos que alcancen significa ­
ción estadística. Sin embargo, deben evitarse los pesos «relativos de órga ­
nos», debido a las hipótesis estadísticas inválidas en que se basa esta 
manipulación de datos.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. En el caso de los agonistas androgénicos, el control debe ser el grupo de 
ensayo del vehículo solo. Las características del modo de acción de una 
sustancia problema pueden dar lugar a diferentes respuestas relativas según los tejidos; por ejemplo, la trembolona, que no puede sufrir la reducción 5- alfa, tiene efectos más pronunciados sobre los EABC y el GP que el PT. Un 
aumento estadísticamente significativo (p ≤ 0,05) en los pesos de al menos 
dos de los cinco tejidos diana sensibles a los andrógenos (PV, EABC, GP, GCW y VSGC) debe considerarse como resultado positivo de acción ago ­
nista androgénica, y todos los tejidos diana deben presentar algún grado de 
aumento del crecimiento. Puede conseguirse una evaluación combinada de 
todas las respuestas de los tejidos de los órganos sexuales secundarios mediante el adecuado análisis de datos con múltiples variables. Esto podría mejorar el análisis, sobre todo en los casos en que es un único tejido el que 
da una respuesta estadísticamente significativa. 
61. En el caso de los antagonistas androgénicos, el control debe ser el grupo de 
ensayo del andrógeno de referencia (propionato de testosterona solo). Las 
características del modo de acción de una sustancia problema pueden dar lugar a diferentes respuestas relativas según los tejidos; por ejemplo, los inhibidores de la 5-alfa-reductasa, como la finasterida, tienen efectos más 
pronunciados sobre la próstata ventral que sobre otros tejidos, en compara ­
ción con antagonistas potentes de los RA, como la flutamida. Una reduc ­
ción estadísticamente significativa (p ≤ 0,05) en los pesos de al menos dos 
de los cinco tejidos diana sensibles a los andrógenos (PV, EABC, GP, 
GCW y VSGC) en comparación con el tratamiento solo con PT debe 
considerarse como resultado positivo de acción antagonista androgénica, y todos los tejidos diana deben presentar algún grado de reducción del cre ­
cimiento. Puede conseguirse una evaluación combinada de todas las res ­
puestas de los tejidos de los órganos sexuales secundarios mediante el 
adecuado análisis de datos con múltiples variables. Esto podría mejorar el análisis, sobre todo en los casos en que es un único tejido el que da una respuesta estadísticamente significativa. 
62. Los datos deben resumirse en forma de cuadro con la media, el error 
estándar de la media (también podría aceptarse la desviación típica) y el 
tamaño de la muestra de cada grupo. También deben incluirse cuadros con 
los datos individuales. Deben examinarse los valores individuales y los valores de la media, el error estándar (o desviación típica) y los CV de los datos de los controles para determinar si cumplen los criterios aceptables 
de coherencia con los valores históricos previstos. En caso de que los CV 
hallados superen los valores de los CV del cuadro 1 (véanse los puntos 25 y 26) relativos a los pesos de los distintos órganos, hay que determinar si hay errores en el registro o en la introducción de los datos, o si el laboratorio no 
domina aún la disección con precisión de los tejidos sensibles a los andró ­
genos por lo que sería necesario mejorar la formación o práctica. General ­
mente, los CV (la desviación típica dividida por el peso medio del órgano) son reproducibles de un laboratorio a otro, y de un estudio a otro. Los datos 
presentados deben incluir al menos: los pesos de la próstata ventral, de las 
vesículas seminales, de los músculos elevador del ano y bulbocavernoso, de las glándulas de Cowper, del glande del pene y del hígado, los pesos corporales y la variación del peso corporal desde el inicio de la adminis ­
tración de la sustancia hasta la autopsia. Los datos también pueden presen ­
tarse después de haber ajustado la covarianza en función del peso corporal, pero ello no debe sustituir a la presentación de los datos sin ajustar. Ade ­
más, si no se produce la separación del prepucio en alguno de los grupos, la 
incidencia de esta separación debe registrarse y compararse estadísticamente 
con respecto al grupo de control, utilizando la prueba exacta de Fisher.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Al verificar la exactitud de los datos introducidos en el ordenador respecto a 
las fichas originales de datos, es necesario examinar atentamente los valores 
de peso de los órganos que no sean biológicamente verosímiles o se separen en más de tres desviaciones típicas de las medias de los grupos de trata ­
miento, y es posible que tengan que desecharse tales valores, que proba ­
blemente sean errores de registro. 
64. La comparación de los resultados del estudio con los valores de CV de la 
OCDE (cuadro 1) suele ser un paso importante en la interpretación en 
cuanto a la validez de los resultados del estudio. Deben mantenerse en el laboratorio los datos históricos de los grupos de control del vehículo. Tam ­
bién deben conservarse en el laboratorio los datos históricos de las respues ­
tas a las sustancias positivas de referencia, tales como el PT y la FT. Los 
laboratorios pueden también someter a ensayo periódicamente la respuesta a agonistas y antagonistas androgénicos débiles conocidos y conservar esos datos. Dichos resultados pueden compararse con los datos disponibles de la 
OCDE para garantizar que los métodos del laboratorio proporcionan sufi ­
ciente precisión y potencia estadísticas.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES  
Androgénico : Término utilizado para describir un efecto positivo sobre el cre ­
cimiento de los tejidos sensibles a los andrógenos.  
Antiandrogenicidad : Capacidad de una sustancia de suprimir la acción del PT 
en un mamífero.  
Sustancia : Sustancia o mezcla.  
Fecha de nacimiento : Día postnatal 0.  
Dosis : Cantidad de sustancia administrada. Para el bioensayo de Hershberger, la 
dosis se expresa en peso de sustancia problema por unidad de peso corporal del animal sometido al experimento por día (por ejemplo, mg/kg peso corporal al día). 
Posología : Término general que abarca la dosis administrada, y la frecuencia y 
duración de la administración.  
Moribundo : Término utilizado para describir a un animal que está a punto de 
morir.  
Día postnatal X : Día n
 o X de vida a partir de la fecha de nacimiento.  
Sensibilidad : Capacidad de un método de ensayo para identificar correctamente 
las sustancias que tienen la propiedad objeto del ensayo.  
Especificidad : Capacidad de un método de ensayo para identificar correctamente 
las sustancias que no tienen la propiedad objeto del ensayo.  
Sustancia problema : Toda sustancia o mezcla estudiada con este método de 
ensayo.  
Validación : Procedimiento científico diseñado para caracterizar las exigencias y 
limitaciones operativas de un método de ensayo y demostrar su fiabilidad y pertinencia para un fin particular.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Apéndice 2
  
VMG mamm: Grupo de gestión de la validación de ensayos con mamíferos y su evaluación
 NOTAS RELATIVAS AL MARCO CONCEPTUAL  
Nota 1.  Es posible entrar en el marco y dejarlo en cualquier nivel, en 
función de la naturaleza de la información que se necesita para la 
evaluación del peligro y del riesgo.  
Nota 2.  En el nivel 5, la ecotoxicología debe incluir parámetros que indi ­
quen los mecanismos de los efectos adversos y los posibles daños a la población.  
Nota 3.  Cuando un modelo multimodal cubre varios ensayos de un mismo 
parámetro, este modelo puede sustituir a los ensayos individuales de ese parámetro.  
Nota 4.  La evaluación de cada sustancia debe hacerse caso por caso, te ­
niendo en cuenta toda la información disponible, sin olvidar la función de los niveles del marco conceptual.  
Nota 5.  No debe considerarse que el marco conceptual sea exhaustivo en el 
momento actual. En los niveles 3, 4 y 5 se incluyen ensayos que 
están disponibles o cuya validación está en curso. Con respecto a 
estos últimos, su inclusión tiene carácter provisional. Una vez desa ­
rrollados y validados, se inscribirán oficialmente en el marco conceptual.  
Nota 6.  No debe considerarse que el nivel 5 incluya solo ensayos definiti ­
vos. Se considera que los ensayos incluidos en este nivel contribu ­
yen a la evaluación general del peligro y del riesgo.
 
BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY. 
(3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antian ­
drogenic activity in castrate-immature male rats. En:  Current Protocols in 
Toxicology  16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc. 
(4) OCDE (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testos ­
terone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental 
Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N  o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30. 
(5) OCDE (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Fase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple La ­
boratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing 
and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3. 
(6) OCDE (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20. 
(7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized proto ­
col. Env. Health Persp. 114:1265-1269.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
(8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8. 
(9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413-422. 
(10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306- 
1314. 
(11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38-44. 
(12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119. 
(13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180. 
(14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service. 
(15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. En: Methods in Hor ­
mone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220. 
(16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. Nueva York: 
Humana Press, p. 38. 
(17) OCDE (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
(18) OCDE (1982). Organization for Economic Co-operation and 
Development-Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64- 
12367-9, París. 
(19) OCDE (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425. 
(20) OCDE (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4. 
(21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf. 
(22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hers ­
hberger assay procedure, including a dissection video. http:// 
rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html. 
(23) OCDE (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17. 
(24) OCDE (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay. 
(25) OCDE (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bioas ­
say in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. 
Series on Testing and Assessment, Number 115.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
(26) Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de 
septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados para 
fines científicos, DO L 276 de 20.10.2010, p. 33. 
(27) Los capítulos siguientes del presente anexo: 
B.1 bis. Toxicidad oral aguda. Método de dosis fijas 
B.1 ter. Toxicidad oral aguda. Método de las clases de toxicidad aguda  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56.  ESTUDIO AMPLIADO DE TOXICIDAD PARA LA 
REPRODUCCIÓN EN UNA GENERACIÓN  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de 
la OCDE TG 443 (2012). Se basa en la propuesta del comité técnico de evaluación de la seguridad de las sustancias utilizadas en la agricultura (ACSA), del Instituto de Ciencias de la Salud y el Medio 
ambiente (HESI), del Instituto Internacional de Ciencias de la 
Vida (ILSI), en relación con un estudio ampliado de toxicidad para la reproducción en una generación F
 1 sobre distintas fases de la vida, publi ­
cado en Cooper  et al. , 2006 (1). Se han aportado varias mejoras y aclara ­
ciones al diseño del estudio a fin de darle flexibilidad y de hacer hincapié 
en la importancia de partir de los conocimientos existentes, utilizando al mismo tiempo las observaciones en vivo para orientar y adaptar los ensa ­
yos. El presente método de ensayo proporciona una descripción detallada de 
la realización de un estudio ampliado de toxicidad para la reproducción en 
una generación. El método de ensayo describe tres cohortes de animales de la generación F
 1 : 
Cohorte 1: evalúa parámetros de la reproducción/del desarrollo; esta cohorte 
puede ampliarse para abarcar una generación F  2 . 
Cohorte 2: evalúa el posible impacto de la exposición a la sustancia sobre el 
desarrollo del sistema nervioso. 
Cohorte 3: evalúa el posible impacto de la exposición a la sustancia sobre el 
desarrollo del sistema inmunitario. 
2. Las decisiones sobre si procede evaluar la segunda generación y omitir la 
cohorte de la neurotoxicidad para el desarrollo o la cohorte de la inmuno ­
toxicidad para el desarrollo deben reflejar los conocimientos existentes 
sobre la sustancia que se va a evaluar, así como las necesidades derivadas 
de las diversas autoridades normativas. La finalidad del método de ensayo es proporcionar detalles sobre cómo puede realizarse el estudio y tratar sobre cómo hay que evaluar a cada cohorte. 
3. En el documento de orientación de la OCDE 117 (39) se describe un 
procedimiento decisorio sobre el desencadenamiento interno del estudio de la 2
 a generación, a la intención de las autoridades normativas que utili ­
zan factores desencadenantes internos.  
Consideraciones iniciales y objetivos 
4. El objetivo principal del estudio ampliado de toxicidad para la reproducción 
en una generación es evaluar ciertas fases de la vida no cubiertas por otros 
tipos de estudios de toxicidad y examinar los efectos que se pueden pro ­
ducir como consecuencia de una exposición pre y postnatal a la sustancia. Respecto a los parámetros reproductivos, se prevé que, para detectar los efectos sobre los órganos genitales de machos y hembras, se utilice, como 
primera etapa y en caso de disponibilidad, la eventual información derivada 
de estudios con administración continuada [incluidos los ensayos de cribado de la toxicidad para la reproducción, como las TG 422 de la OCDE (32)], o los ensayos de cribado de alteradores endocrinos a corto plazo (por ejemplo, 
el ensayo uterotrófico -método de ensayo B.54 (36), y el ensayo de Hers ­
hberger –método de ensayo B.55 (37). Esto podría incluir la espermatogé ­
nesis (histopatología testicular) en los machos y los ciclos estrales, los recuentos foliculares/maduración de ovocitos y la integridad de los ovarios 
(histopatología) en las hembras. El estudio ampliado de toxicidad para la 
reproducción en una generación sirve entonces como ensayo de parámetros reproductores que exigen la interacción de machos con hembras, de las hembras con los productos de la concepción, y de las hembras con la prole 
y la generación F
 1 hasta después de la madurez sexual [véase el documento 
de orientación de la OCDE 151 en apoyo de este método de ensayo (40)].  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. El presente método de ensayo está diseñado con el objetivo de proporcionar 
una evaluación de los efectos pre y postnatales de las sustancias sobre el 
desarrollo, así como una evaluación completa de la toxicidad sistémica en las hembras gestantes y lactantes y en los descendientes jóvenes y adultos. Mediante el examen detallado de los principales parámetros del desarrollo, 
tales como la viabilidad de la descendencia, la salud neonatal, el grado de 
desarrollo al nacer y el desarrollo físico y funcional hasta la edad adulta, se espera poder identificar los órganos diana específicos de los descendientes. Además, el estudio debe facilitar o confirmar la información relativa a los 
efectos de la sustancia problema sobre la integridad y el comportamiento 
del aparato reproductor de los adultos, tanto machos como hembras. De forma específica, pero sin ánimo de exclusividad, se consideran los paráme ­
tros siguientes: función gonadal, ciclo estral, maduración del esperma epi ­
didimario, conducta de apareamiento, concepción, gestación, parto y lactan ­
cia. Además, la información obtenida de las evaluaciones de la neurotoxi ­
cidad para el desarrollo y de la inmunotoxicidad para el desarrollo permitirá caracterizar los efectos potenciales en esos sistemas. Los datos obtenidos de 
estos ensayos deben permitir la determinación de los niveles sin efectos 
adversos observados (NOAEL), de los niveles más bajos con efectos ad ­
versos observados (LOAEL) o de las dosis de referencia para los diversos parámetros, o utilizarse para caracterizar los efectos detectados en anteriores 
estudios con administración continuada o servir de orientación para ensayos 
posteriores. 
6. En la figura 1 se muestra un esquema del protocolo. La sustancia problema 
se administra de manera continua en dosis graduadas a varios grupos de machos y hembras sexualmente maduros. Esta generación parental (P) re ­
cibe la sustancia durante un período determinado antes del apareamiento 
(seleccionado en función de la información disponible sobre la sustancia problema, pero de un mínimo de dos semanas) y durante dos semanas del período de apareamiento. Los machos P se siguen tratando por lo menos 
hasta el destete de la generación F
 1 . El tiempo mínimo de tratamiento para 
ellos es de 10 semanas. Pueden tratarse durante más tiempo si es necesario para aclarar los efectos sobre la reproducción. El tratamiento de las hembras P continúa durante la gestación y lactancia hasta su sacrificio tras el destete 
de las camadas (es decir, 8-10 semanas de tratamiento). A los descendientes 
F
 1 se les sigue administrando la sustancia problema desde el destete hasta la 
edad adulta. Si se evalúa una segunda generación [véase el documento de orientación de la OCDE 117 (39)], la descendencia F
 1 se mantiene bajo 
tratamiento hasta el destete de la generación F  2 , o hasta la terminación del 
estudio. 
7. Se someten todos los animales a observación clínica y examen patológico 
para detectar signos de toxicidad, insistiendo especialmente en los efectos sobre la integridad y el comportamiento del aparato reproductor de las 
hembras y de los machos, y sobre la salud, el crecimiento, el desarrollo 
y la actividad de los descendientes. En el momento del destete, se asignan los descendientes seleccionados a los distintos subgrupos (cohortes 1-3, véanse los puntos 33 y 34 y la figura 1) para efectuar más investigaciones, 
incluidas las relativas a la maduración sexual, la integridad y el funciona ­
miento de los órganos sexuales, los parámetros neurológicos y conductua ­
les, y el funcionamiento del sistema inmunitario. 
8. Al realizar el estudio, deben aplicarse los principios y consideraciones 
básicos recogidos en el documento de orientación de la OCDE n
 o 19 sobre 
el reconocimiento, evaluación y utilización de los signos clínicos como 
parámetros de tratamiento compasivo para los animales de experimentación 
empleados en las evaluaciones de la seguridad (34).  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Cuando se disponga de un número suficiente de estudios para determinar el 
impacto de este nuevo diseño de estudio, se revisará el método de ensayo y, 
en caso necesario, se modificará a la luz de la experiencia adquirida.  
Figura 1  
Esquema del estudio ampliado de toxicidad para la reproducción en una generación
  
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO/PREPARACIÓN PARA EL ENSAYO  
Animales  
Selección de la especie y de la cepa de los animales  
10. La elección de la especie empleada en el ensayo de toxicidad para la 
reproducción tiene que considerarse con detenimiento a la vista de toda 
la información disponible. Sin embargo, debido a la amplitud de los datos previos y a la comparabilidad con los ensayos de toxicidad general, la rata es normalmente la especie preferida, y los criterios y recomendaciones 
formulados en el presente método de ensayo se refieren a esta especie. Si 
se utiliza otra especie, debe justificarse, y será necesario modificar el pro ­
tocolo. Debe evitarse la utilización de cepas que presenten un bajo índice de fertilidad o una incidencia notoriamente elevada de anomalías espontáneas 
del desarrollo.
 
Edad, peso corporal y criterios de inclusión  
11. Deben utilizarse animales parentales sanos, que no se hayan sometido a 
experimentos previos. Deben estudiarse tanto machos como hembras, y estas deben ser nulíparas y no gestantes. Los animales P deben ser sexual ­
mente maduros, de peso similar (dentro de cada sexo) al inicio de la 
administración, de edad similar (de unos 90 días) en el momento del apa ­
reamiento, y representativos de la especie y cepa estudiada. Los animales deben aclimatarse durante al menos 5 días después de su llegada. Se asig ­
nan aleatoriamente a los grupos de control y de tratamiento de forma que se 
obtengan unos valores similares de peso corporal medio de los grupos (es 
decir, con una desviación ± 20 % de la media).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Condiciones de alojamiento y alimentación  
12. El local de los animales de experimentación ha de estar a una temperatura 
de 22 °C (± 3 °C). La humedad relativa debe encontrarse entre el 30 y el 70 %, siendo ideal el intervalo del 50-60 %. La iluminación, artificial, debe 
fijarse a una secuencia de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Pueden 
utilizarse dietas convencionales de laboratorio junto con un aporte ilimitado de agua de bebida. Se debe prestar especial atención al contenido en fitoes ­
trógenos de la dieta, ya que un nivel elevado de estos fitoestrógenos podría 
afectar a algunos parámetros de reproducción. Se recomienda utilizar dietas 
normalizadas, de composición abierta, en las que se haya reducido el con ­
tenido de sustancias estrogénicas (2)(30). La elección de la dieta puede 
verse influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente de 
la sustancia problema si se administra por este método. Deben determinarse el contenido, la homogeneidad y la estabilidad de la sustancia problema en las dietas. La comida y el agua de bebida deben analizarse periódicamente 
para detectar la posible presencia de contaminantes. Deben conservarse en 
condiciones apropiadas (por ejemplo, congeladas a – 20 °C) muestras de cada lote de la dieta empleada durante el estudio hasta la terminación del informe, por si acaso resultara necesario analizar de nuevo los ingredientes 
de la dieta. 
13. Los animales se deben alojar en jaulas en pequeños grupos del mismo sexo 
y grupo de tratamiento. Pueden ser alojados individualmente, a fin de evitar 
posibles daños (por ejemplo, los machos después del período de aparea ­
miento). El apareamiento debe llevarse a cabo en jaulas adecuadas al efecto. Una vez comprobada la cópula, las hembras que se supone están gestantes se alojan por separado en jaulas de parto o de maternidad, donde se les 
aporta material de nidificación adecuado y definido. Las camadas se alojan 
con sus madres hasta el destete. Los animales F
 1 deben alojarse en peque ­
ños grupos del mismo sexo y grupo de tratamiento desde el destete hasta el sacrificio. Cuando esté científicamente justificado, los animales pueden alo ­
jarse individualmente. El nivel de fitoestrógenos contenido en el material de 
cama seleccionado debe ser mínimo.
 
Número e identificación de los animales  
14. Normalmente, cada grupo de ensayo y de control debe contener un número 
suficiente de parejas para conseguir al menos 20 hembras gestantes por 
grupo de dosis. El objetivo es conseguir suficientes gestaciones para garan ­
tizar una evaluación significativa del potencial de la sustancia problema para afectar a la fertilidad, gestación y comportamiento materno de la 
generación P, y al crecimiento y desarrollo de los descendientes F
 1 , desde 
la concepción hasta la madurez. El no conseguir el número deseado de hembras gestantes no invalida necesariamente el estudio y cada caso debe valorarse individualmente, teniendo en cuenta una posible relación causal 
con la sustancia problema. 
15. A cada animal P se le asigna un número de identificación único antes de 
que se inicie la administración de la sustancia. Si los datos históricos del 
laboratorio indican la posibilidad de que una proporción significativa de las 
hembras no presente ciclos estrales regulares (de 4 o 5 días), se aconseja efectuar una evaluación de los ciclos estrales antes del comienzo del trata ­
miento. También se puede aumentar el tamaño de los grupos para asegu ­
rarse de que al menos 20 hembras de cada grupo tienen ciclos estrales 
regulares (de 4 o 5 días) al inicio del tratamiento. Todos los descendientes F
 1 se identifican inequívocamente cuando se examinan los neonatos por 
primera vez el día postnatal (DPN) 0 o 1. A lo largo de todo el estudio 
debe mantenerse un registro donde se indique la camada de origen de todos 
los animales de la generación F  1 , y de la F  2 en su caso.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Sustancia problema  
Información disponible sobre la sustancia problema  
16. El examen de la información existente es importante para tomar decisiones 
sobre la vía de administración, la elección del vehículo, la selección de la 
especie animal, la selección de las dosis y las posibles modificaciones del 
calendario de administración. Por lo tanto, al diseñar el estudio ampliado de toxicidad para la reproducción en una generación debe tomarse en consi ­
deración toda la información disponible sobre la sustancia problema, es 
decir, sobre sus propiedades fisicoquímicas, toxicocinéticas (incluido el 
metabolismo específico de la especie) y toxicodinámicas, las relaciones estructura-actividad, los procesos metabólicos  in vitro,  los resultados de 
anteriores estudios de toxicidad y la información pertinente sobre análogos 
estructurales. Puede obtenerse información preliminar sobre absorción, dis ­
tribución, metabolismo y eliminación (ADME) y bioacumulación a partir de la estructura química, los datos fisicoquímicos, el grado de unión a proteí ­
nas plasmáticas o los estudios toxicocinéticos (TC), mientras que los resul ­
tados de los estudios de toxicidad dan información adicional, por ejemplo, 
sobre el NOAEL, el metabolismo o la inducción metabólica.
 
Consideración de los datos toxicocinéticos  
17. Aunque no sean obligatorios, los datos TC de los estudios de determinación 
de la gama de dosis o de otro tipo llevados a cabo previamente son muy útiles para la planificación del diseño del estudio, la selección de las dosis y 
la interpretación de los resultados. De especial utilidad son los datos que: 1) 
verifican la exposición de los fetos y crías en desarrollo a la sustancia problema (o a sus metabolitos pertinentes), 2) proporcionan una estimación de la dosimetría interna, y 3) evalúan el potencial de saturación de los 
procesos cinéticos en función de la dosis. También debe prestarse atención 
a los datos toxicocinéticos adicionales de que se disponga, tales como perfiles de metabolitos, evolución de la concentración a lo largo del tiempo, etc. Asimismo, pueden recogerse datos toxicocinéticos adicionales durante 
el estudio principal, siempre que ello no interfiera con la recogida e inter ­
pretación de los parámetros principales de dicho estudio. 
Como orientación de carácter general, los siguientes conjuntos de datos 
toxicocinéticos pueden ser útiles en la planificación del estudio ampliado 
de toxicidad para la reproducción en una generación: 
— Sangre materna y sangre fetal al final de la gestación (por ejemplo, en el 
día de gestación 20) 
— Sangre materna, sangre de las crías y/o leche a mediados del período de 
lactancia (DPN 10) 
— Muestras de sangre de los animales destetados al poco tiempo del 
destete (por ejemplo, DPN 28). 
Debe aplicarse cierta flexibilidad para la determinación de los analitos 
específicos (por ejemplo, sustancia madre o sus metabolitos) y para el programa de muestreo. Por ejemplo, el número y la hora de la recogida 
de las muestras en un determinado día de muestreo dependerán de la vía de 
exposición y del conocimiento previo de las propiedades toxicocinéticas de los animales no gestantes. En el caso de los estudios que implican adminis ­
tración con los alimentos, una única muestra tomada a la misma hora cada 
día puede ser suficiente, mientras que si la administración se hace por vía 
oral forzada puede estar justificado el muestreo en momentos adicionales para obtener una mejor estimación de la gama de dosis internas. Sin em ­
bargo, no es necesario generar una curva completa de concentración-tiempo 
para cada día de muestreo. En caso necesario, se puede agrupar la sangre 
por sexos dentro de las camadas para los análisis fetales y neonatales.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Vía de administración  
18. La selección de la vía debe tener en cuenta la vía o vías más pertinentes 
para la exposición humana. Aunque el protocolo está diseñado para la administración de la sustancia problema con la dieta, puede modificarse 
para contemplar la administración por otras vías (agua de bebida, vía oral 
forzada, inhalación, a través de la piel) en función de las características de la sustancia y de la información requerida.
 
Elección del vehículo  
19. En caso necesario, la sustancia problema se disuelve o suspende en un 
vehículo adecuado. Se recomienda que, siempre que sea posible, se consi ­
dere en primer lugar el uso de una solución o suspensión acuosa, y solo después el de una solución o emulsión oleosa (por ejemplo, en aceite de maíz). Si se emplean vehículos distintos del agua, deben conocerse sus 
características tóxicas. Debe evitarse la utilización de vehículos con poten ­
cial de toxicidad intrínseca (por ejemplo, acetona, DMSO). Debe determi ­
narse la estabilidad de la sustancia problema en el vehículo. Debe prestarse atención a las siguientes características si se utiliza un vehículo u otro 
aditivo para facilitar la administración de la sustancia problema: los efectos 
sobre la absorción, distribución, metabolismo o retención de dicha sustan ­
cia; los efectos sobre las propiedades químicas de la sustancia problema que puedan modificar sus características de toxicidad; y los efectos sobre el 
consumo de alimentos y agua o sobre el estado nutricional de los animales.
 
Selección de las dosis  
20. Normalmente, el estudio debe incluir al menos tres dosis y un control en 
paralelo. A la hora de seleccionar los niveles adecuados de dosis, el inves ­
tigador ha de considerar toda la información disponible, incluida la infor ­
mación sobre dosis procedente de estudios anteriores, los datos toxicociné ­
ticos de animales gestantes o no gestantes, la medida de la transferencia por la leche y las estimaciones de la exposición humana. Si se dispone de datos toxicocinéticos que indiquen saturación de los procesos toxicocinéticos en 
función de la dosis, debe tenerse cuidado para evitar niveles altos de dosis 
que provoquen claramente la saturación, siempre, por supuesto, que la exposición humana prevista esté bastante por debajo del punto de satura ­
ción. En tales casos, la dosis más alta debe estar en el punto de inflexión de 
la transición a un comportamiento toxicocinético no lineal, o justo ligera ­
mente por encima de dicho punto. 
21. En ausencia de datos toxicocinéticos pertinentes, las dosis deben basarse en 
los efectos tóxicos, a menos que las características fisicoquímicas de la 
sustancia problema impongan alguna limitación. Si las dosis se basan en la toxicidad, la dosis más alta debe seleccionarse con el propósito de inducir ciertos efectos de toxicidad sistémica, pero sin llegar a provocar la muerte 
ni un sufrimiento intenso de los animales. 
22. Debe seleccionarse una secuencia descendente de dosis con el fin de de ­
mostrar la existencia de una eventual relación del efecto con la dosis y de 
establecer los niveles sin efecto adverso observado (NOAEL), o las dosis 
cerca del límite de detección que permitan la determinación de una dosis de referencia para el parámetro o parámetros más sensibles. Para evitar grandes separaciones entre los NOAEL y los LOAEL, suele ser adecuado un inter ­
valo del doble o cuádruple. A menudo es preferible añadir un cuarto grupo 
de ensayo antes que utilizar un intervalo muy grande entre dosis (por ejemplo, con un factor superior a 10). 
23. A excepción de la administración de la sustancia problema, los animales del 
grupo de control deben tratarse de la misma manera que los de los grupos de ensayo. Este grupo de control no debe recibir tratamiento, o recibir un placebo, o ser un grupo de control del vehículo si este se utiliza para 
administrar la sustancia. En este caso, el grupo de control ha de recibir el 
mayor volumen de vehículo que se haya utilizado.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Ensayo límite  
24. Es posible que no sea necesario llevar a cabo un estudio con varias dosis 
diferentes si no hay indicios de toxicidad a una dosis de al menos 1 000 mg/kg de peso corporal al día en estudios con administración continuada, o 
si no se prevé que haya toxicidad según los datos sobre sustancias relacio ­
nadas estructural o metabólicamente, que indiquen similitud en las propie ­
dades metabólicas  in vivo/in vitro.  En tales casos, el estudio ampliado de 
toxicidad para la reproducción en una generación puede efectuarse con un 
grupo de control y una sola dosis de al menos 1 000 mg/kg de peso 
corporal al día. Sin embargo, en caso de que con esta dosis límite se encuentren indicios de toxicidad para la reproducción o para el desarrollo, 
será necesariollevar a cabomás estudios a dosis menores para determinar un 
NOAEL. Estas consideraciones sobre el ensayo límite son aplicables solo cuando la exposición humana no indique la necesidad de utilizar una dosis superior.
 
PROCEDIMIENTOS  
Exposición de la descendencia  
25. La exposición alimentaria es el método preferido de administración. Si se 
realizan ensayos por vía oral forzada, debe tenerse en cuenta que normal ­
mente las crías reciben la sustancia problema solo indirectamente a través de la leche materna, hasta que se inicie la administración directa tras el destete. 
En los estudios en que la sustancia problema se mezcla con los alimentos o el 
agua de bebida, las crías también la reciben directamente cuando empiezan a alimentarse solas en la última semana de lactancia. Debe estudiarse la con ­
veniencia de modificar el diseño del estudio cuando la excreción de la 
sustancia problema en la leche sea escasa y cuando no haya pruebas de una exposición continua de los descendientes. En estos casos, debe conside ­
rarse la administración directa de la sustancia a las crías durante la lactancia, 
según la información disponible sobre toxicocinética, toxicidad para la pro ­
genie o cambios en los biomarcadores (3)(4). Antes de realizar estudios de administración directa de la sustancia a las crías lactantes, deben considerarse cuidadosamente sus ventajas e inconvenientes (5).
 
Calendario y administración de las dosis  
26. A partir de estudios anteriores de toxicidad con administración continuada de 
una duración adecuada puede conseguirse cierta información sobre los ciclos estrales, la histopatología de los aparatos reproductores masculinos y feme ­
ninos, y el análisis del esperma testicular o epididimario. Por lo tanto, la 
duración del tratamiento antes del apareamiento en el estudio ampliado de 
toxicidad para la reproducción en una generación tiene como objetivo la detección de efectos sobre los cambios funcionales que pueden interferir con la conducta de apareamiento y la fertilización. El tratamiento antes del 
apareamiento debe ser lo bastante largo para lograr unas condiciones estables 
de exposición en los machos y hembras P. En la mayoría de los casos se considera adecuado un período de 2 semanas de tratamiento antes del apa ­
reamiento para ambos sexos. En el caso de las hembras, esto incluye 3-4 
ciclos estrales completos y debe ser suficiente para detectar cualquier efecto 
adverso sobre dichos ciclos. En los machos, esto equivale al tiempo necesario para el tránsito epididimario de los espermatozoides en maduración y debe permitir la detección de los efectos post-testiculares en el esperma (durante 
las fases finales de la espermiogénesis y la maduración espermática en el 
epidídimo) sobre el apareamiento. En el momento del sacrificio, cuando están programados el estudio de la histopatología testicular y epididimaria y el análisis de los parámetros del esperma, los machos P y F
 1 se habrán expuesto 
durante al menos un ciclo de espermatogénesis completo (6)(7)(8)(9); véase 
también el documento de orientación de la OCDE 151 (40).  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Las situaciones de exposición de los machos antes del apareamiento pueden 
modificarse si en estudios anteriores se han identificado claramente toxici ­
dad testicular (alteración de la espermatogénesis) o efectos sobre la integri ­
dad y la función del esperma. Del mismo modo, en el caso de las hembras, pueden justificarse diferentes situaciones de exposición antes del aparea ­
miento si se conoce algún efecto de la sustancia problema sobre el ciclo 
estral y, por tanto, sobre la receptividad sexual. En casos especiales puede ser aceptable que el tratamiento de las hembras P no comience hasta ha ­
berse obtenido un frotis con presencia de esperma [véase el documento de 
orientación de la OCDE 151 (40)]. 
28. Una vez establecido el período de tratamiento antes del apareamiento, se 
administra a los animales la sustancia problema a un ritmo de 7 días por semana, de forma continua hasta la autopsia. Todos los animales deben 
recibir la sustancia de la misma manera. La administración de la sustancia 
debe continuar durante el período de apareamiento de 2 semanas y, en el caso de las hembras P, a lo largo de la gestación y lactancia hasta el día del sacrificio, después del destete. Los machos deben tratarse de la misma 
manera, hasta su sacrificio en el momento en que se desteten los animales 
de la generación F
 1 . Para la autopsia, debe darse prioridad a las hembras 
cuya autopsia ha de realizarse en el mismo día de lactancia, o en uno similar. La autopsia de los machos puede repartirse a lo largo de un número 
mayor de días, en función de las instalaciones del laboratorio. A menos que 
ya se haya iniciado durante la lactancia, la administración directa a los machos y hembras seleccionados de la generación F
 1 debe comenzar en 
el destete y proseguir hasta la autopsia prevista, dependiendo de la cohorte 
asignada. 
29. En el caso de sustancias administradas con los alimentos o el agua de 
bebida, es importante cerciorarse de que las cantidades de sustancia pro ­
blema administradas no interfieren con la nutrición normal ni con el equili ­
brio hídrico. Cuando la sustancia problema se administre con el alimento, se puede utilizar una concentración alimentaria constante (ppm) o bien una dosis constante por unidad de peso corporal de los animales; debe especi ­
ficarse la opción elegida. 
30. Cuando la sustancia problema se administre por vía oral forzada, el volu ­
men de líquido administrado no debe en principio exceder de 1 ml/100 g peso corporal (o de 0,4 ml/100 g peso corporal en caso de aceite como, por 
ejemplo, aceite de maíz). Excepto en el caso de sustancias irritantes o 
corrosivas que provoquen normalmente efectos exacerbados a concentracio ­
nes superiores, la variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para que el volumen sea constante en 
todas las dosis. El tratamiento debe administrarse todos los días a una hora 
similar. La dosis que se administra a cada animal debe calcularse normal ­
mente con arreglo a la última determinación de su peso corporal y ajustarse al menos una vez por semana en los machos adultos y en las hembras 
adultas no gestantes, y cada dos días en las hembras gestantes y en los 
animales de la generación F
 1 cuando se administre antes del destete y 
durante las dos semanas siguientes a este. Si los datos indican una baja transferencia placentaria de la sustancia problema, puede ser necesario ajus ­
tar la dosis administrada por vía oral forzada en la última semana de 
gestación para evitar que sea excesivamente tóxica para la madre. El día del parto, las hembras no deben recibir la sustancia por vía oral forzada, ni por cualquier otra vía de tratamiento que exija la manipulación del animal; 
es preferible no administrar la sustancia problema ese día antes que pertur ­
bar el proceso del parto.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Apareamiento  
31. Cada hembra P debe ponerse con un solo macho sin parentesco con ella, 
seleccionado al azar, del mismo grupo de tratamiento (emparejamiento 1: 1) 
hasta que se observen signos de cópula o hayan pasado 2 semanas. Si es insuficiente el número de machos, por ejemplo debido a mortalidad mas ­
culina antes del apareamiento, es posible emparejar con una segunda hem ­
bra (1:1) a machos que se hayan apareado antes con otra, de forma que se 
emparejen todas las hembras. El día 0 de la gestación se define como el día en que se confirman los signos de apareamiento (se observa la presencia de un tapón vaginal o de esperma). Los animales deben separarse tan pronto 
como sea posible, una vez observados los signos del apareamiento. Si no ha 
habido apareamiento al cabo de 2 semanas, los animales deben separarse sin darles más oportunidades para aparearse. Las parejas deben quedar clara ­
mente identificadas en los resultados.
 
Tamaño de la camada  
32. El día 4 tras el nacimiento, puede adaptarse el tamaño de cada camada 
mediante la eliminación por selección aleatoria de las crías sobrantes para 
obtener, en la medida de lo posible, cinco machos y cinco hembras por 
camada. No es apropiada la eliminación selectiva de las crías, por ejemplo en función del peso corporal. Cuando el número de crías machos y hembras impida lograr que cada camada cuente con cinco de cada sexo, es aceptable 
una adaptación parcial (por ejemplo, seis machos y cuatro hembras).
 
Selección de las crías para los estudios tras el destete (véase la figura 1)  
33. En el momento del destete (alrededor del DPN 21) se seleccionan para su 
examen posterior crías de todas las camadas disponibles, hasta 20 por grupo 
de tratamiento y de control, y se conservan hasta su madurez sexual (salvo que se tengan que someter a ensayo antes). Las crías se seleccionan alea ­
toriamente, con la salvedad de que no se incluirán los animales con retraso 
evidente (animales con un peso corporal que se encuentre más de dos 
desviaciones típicas por debajo del peso medio de las crías de la camada respectiva), dado que es poco probable que sean representativos del grupo de tratamiento. 
El DPN 21, las crías F
 1 seleccionadas se asignan aleatoriamente a una de 
las tres cohortes siguientes: 
Cohorte 1 (1A y 1B)= ensayo de toxicidad para la reproducción o el 
desarrollo 
Cohorte 2 (2A y 2B)= ensayo de neurotoxicidad para el desarrollo Cohorte 3= ensayo de inmunotoxicidad para el desarrollo 
Cohorte 1A: Un macho y una hembra por camada y grupo (20/sexo/grupo): 
selección prioritaria para la evaluación primaria de efectos sobre los apara ­
tos reproductores y de la toxicidad general. 
Cohorte 1B: Un macho y una hembra por camada y grupo (20/sexo/grupo): 
selección prioritaria para la posterior evaluación del comportamiento repro ­
ductor apareando animales F
 1 , en su caso [véase el documento de orienta ­
ción de la OCDE 117 (39)], y para obtener datos adicionales de histopato ­
logía en caso de que se sospeche que la sustancia es tóxica para la repro ­
ducción o para el sistema endocrino, o cuando los resultados de la cohorte 
1A sean dudosos. 
Cohorte 2A: Un total de 20 crías por grupo (10 machos y 10 hembras por 
grupo; un macho o una hembra por camada) asignadas para el ensayo neuroconductual seguido de la evaluación de la neurohistopatología como adultos. 
Cohorte 2B: Un total de 20 crías por grupo (10 machos y 10 hembras por 
grupo; un macho o una hembra por camada) asignadas para la evaluación de la neurohistopatología en el momento del destete (DPN 21 o 22). Si es 
insuficiente el número de animales, debe darse preferencia a la asignación 
de animales a la cohorte 2A.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Cohorte 3: Un total de 20 crías por grupo (10 machos y 10 hembras por 
grupo; un animal por camada, en la medida de lo posible). Puede ser 
necesario disponer de más crías del grupo de control para que actúen como animales de control positivo en el ensayo de respuesta de anticuerpos dependiente de linfocitos T (TDAR) en el DPN 56 ± 3. 
34. En caso de que sea insuficiente el número de crías de una camada para 
cubrir todas las cohortes, tendrá prioridad la cohorte 1, ya que puede ampliarse para producir una generación F
 2 . Pueden asignarse crías adicio ­
nales a cualquiera de las cohortes en caso de preocupación específica, por 
ejemplo si se sospecha que una sustancia es neurotóxica, inmunotóxica o tóxica para la reproducción. Estas crían podrán utilizarse para exámenes en diferentes momentos o para la evaluación de parámetros adicionales. En las 
crías no asignadas a ninguna cohorte se estudiará la bioquímica clínica 
(punto 55) y se someterán a autopsia macroscópica (punto 68).
 
Segundo apareamiento de los animales P  
35. No se recomienda normalmente un segundo apareamiento para los animales 
P, ya que implica la pérdida de información importante sobre el número de puntos de implantación (y, por tanto, de datos de muerte postimplantación y perinatal, indicadores de un eventual potencial teratogénico) de la primera 
camada. La necesidad de comprobar o aclarar un efecto en las hembras 
expuestas se puede satisfacer mejor ampliando el estudio para incluir un apareamiento de la generación F
 1 . Sin embargo, un segundo apareamiento 
de los machos P con hembras sin tratar es siempre una opción para aclarar 
resultados dudosos o para caracterizar mejor los efectos sobre la fertilidad 
observados en el primer apareamiento.  
OBSERVACIONES EN VIVO  
Observaciones clínicas  
36. Con los animales P y con los F  1 seleccionados, se hace una observación 
clínica general una vez al día. En caso de administración por vía oral forzada, el momento de las observaciones clínicas debe ser antes y después 
de la administración de la sustancia (para detectar posibles signos de toxi ­
cidad asociados con la concentración plasmática máxima). Se registran los cambios pertinentes en el comportamiento, los signos de parto difícil o prolongado y todos los signos de toxicidad. Dos veces al día, y una vez 
al día durante los fines de semana, todos los animales se observan para 
detectar los casos de toxicidad grave, morbilidad y mortalidad. 
37. Además, semanalmente se efectúa un examen más detallado de todos los 
animales P y F
 1 (tras el destete); puede hacerse coincidiendo con una 
ocasión en que se pesen los animales, lo que reduciría al mínimo el estrés de la manipulación. Las observaciones deben llevarse a cabo cuidadosa ­
mente y registrarse utilizando sistemas de puntuación que hayan sido defi ­
nidos por el laboratorio de ensayo. Debe procurarse que las variaciones en 
las condiciones de ensayo sean mínimas. Los signos anotados deben incluir, sin ánimo de exhaustividad, los cambios de la piel, pelo, ojos, mucosas, la presencia de secreciones y excreciones y la actividad neurovegetativa (por 
ejemplo, lagrimeo, piloerección, tamaño de la pupila, respiración anómala). 
Deben registrarse también los cambios observados en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, estereotipias (por ejemplo, realización excesiva de movimientos 
de limpieza, recorridos repetitivos en círculo) o comportamientos anómalos 
(por ejemplo, automutilación, marcha hacia atrás).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Peso corporal y consumo de alimento y agua  
38. Los animales P se pesan el día de la primera administración y a continua ­
ción al menos una vez por semana. Además, las hembras P se pesan durante 
la lactancia, los mismos días en que se pesen las crías de sus camadas (véase el punto 44). Todos los animales F
 1 se pesan individualmente el 
día del destete (DPN 21) y a continuación al menos una vez por semana. El 
peso corporal se registra también el día en que el animal alcanza la pubertad 
(finalización de la separación del prepucio o permeabilidad vaginal). Todos los animales se pesan en el momento del sacrificio. 
39. Durante el estudio, se registra el consumo de alimentos y agua (en el caso 
de la administración de la sustancia problema con el agua de bebida) al menos una vez por semana, los mismos días en que se determinan los pesos 
corporales de los animales (excepto durante la cohabitación). El consumo de 
alimentos de cada jaula de animales F
 1 se registra semanalmente, empe ­
zando en el momento de la asignación a la cohorte respectiva.  
Ciclos estrales  
40. Puede disponerse de información preliminar sobre efectos en el ciclo estral 
relacionados con la sustancia, procedente de estudios de toxicidad con administración continuada, y esa información puede utilizarse en el diseño 
de un protocolo del estudio ampliado de toxicidad para la reproducción en 
una generación que sea específico de la sustancia problema. Normalmente la evaluación de los ciclos estrales (por citología vaginal) empezará al 
principio del período de tratamiento y proseguirá hasta la confirmación 
del apareamiento o el final del período de apareamiento de 2 semanas. Si las hembras se han sometido a ensayo de cribado para comprobar que tienen ciclos estrales normales antes del tratamiento, es útil continuar ha ­
ciendo frotis desde el inicio del tratamiento, pero si hay alguna preocupa ­
ción en cuanto a posibles efectos inespecíficos al comienzo del tratamiento (como una reducción inicial significativa del consumo de alimentos), es posible dejar a los animales que se adapten al tratamiento durante un 
máximo de dos semanas antes de empezar el período de recogida de frotis 
de dos semanas que precede al emparejamiento. Si el período de tratamiento de las hembras se amplía de esta manera (es decir, hasta cuatro semanas de tratamiento previo al apareamiento) se debería considerar la adquisición de 
animales más jóvenes y la ampliación del período de tratamiento de los 
machos antes del emparejamiento. La toma de células vaginales o cervicales ha de hacerse con cuidado para no dañar la mucosa y evitar una pseudo ­
gestación (10)(11). 
41. Deben examinarse diariamente los frotis vaginales de todas las hembras F
 1 
de la cohorte 1A, tras el inicio de la permeabilidad vaginal, hasta que se 
registre el primer frotis cornificado, para determinar el intervalo de tiempo 
entre estos dos acontecimientos. También deben supervisarse los ciclos estrales de todas las hembras F
 1 de la cohorte 1A durante dos semanas, a 
partir del DPN 75, aproximadamente. Por otra parte, si fuera necesario 
aparear la generación F  1 , se supervisará la citología vaginal de la cohorte 
1B desde el momento del emparejamiento hasta que se observen signos de apareamiento.
 
Apareamiento y gestación  
42. Además de los parámetros normales (por ejemplo, peso corporal, consumo 
de alimentos, observaciones clínicas, incluidos los controles de mortalidad/ morbilidad), se registrarán las fechas de emparejamiento, de inseminación y 
de parto, y se calcularán el intervalo precoital (entre el emparejamiento y la 
inseminación) y la duración de la gestación (de la inseminación al parto). Las hembras P deben examinarse atentamente en el momento previsto del parto para detectar posibles signos de distocia. Deberán registrarse las 
eventuales anomalías observadas en la conducta de nidificación o de lacta ­
ción.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. El día en que se produce el parto es el día 0 de la lactancia (DL 0) para la 
madre y el día postnatal (DPN 0) para la descendencia. Alternativamente, 
todas las comparaciones pueden basarse también en el tiempo postcoital para eliminar la confusión en los datos de desarrollo postnatal debida a diferencias en la duración de la gestación; sin embargo, también deberá 
registrarse el calendario en relación con el parto. Esto es especialmente 
importante si la sustancia problema ejerce alguna influencia sobre la dura ­
ción de la gestación.
 
Parámetros de los descendientes  
44. Se examinan todas las camadas lo antes posible después del parto (DPN 0 o 
1) para determinar el número y sexo de las crías, la mortinatalidad, el 
número de nacidos vivos y la presencia de anomalías macroscópicas (ano ­
malías visibles externamente, incluido el paladar hendido; las hemorragias subcutáneas; las anomalías en el color o la textura de la piel; la presencia de cordón umbilical; la falta de leche en el estómago; la presencia de secre ­
ciones secas). Además, el primer examen clínico de los recién nacidos debe 
incluir una evaluación cualitativa de la temperatura corporal, del estado de actividad y de la reacción a la manipulación. Las crías halladas muertas el DPN 0 o posteriormente deben examinarse para detectar posibles anomalías 
y determinar la causa de la muerte. Las crías vivas se cuentan y se pesan 
individualmente el DPN 0 o el DPN 1, y periódicamente a continuación como, por ejemplo, al menos los DPN 4, 7, 14 y 21. Los exámenes clínicos, según proceda en función de la edad de los animales, deben repetirse 
cuando se pesen los descendientes, o más a menudo si en el momento 
del nacimiento ha habido observaciones específicas. Los signos anotados pueden incluir, sin ánimo de exhaustividad, las anomalías externas, los cambios de la piel, pelo, ojos, mucosas, la presencia de secreciones y 
excreciones y la actividad neurovegetativa. Deben registrarse también los 
cambios observados en la marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de movimientos clónicos o tónicos, estereotipias o com ­
portamientos anómalos. 
45. Debe medirse la distancia anogenital (DAG) de cada cría, al menos en una 
ocasión entre el DPN 0 y el DPN 4. El peso corporal de las crías debe 
recogerse el día en que se mida la DAG y esta DAG se debe normalizar en función de una medida del tamaño de las crías, de preferencia la raíz cúbica del peso corporal (12). Debe comprobarse la presencia de pezones/areolas 
en las crías macho el DPN 12 o 13. 
46. Todos los animales F
 1 seleccionados se evalúan diariamente en cuanto a la 
separación balano-prepucial o la permeabilidad vaginal, según sean machos o hembras, respectivamente, comenzando antes de la fecha prevista para la aparición de dichos signos, a fin de detectar si se produce una maduración 
sexual precoz. Deben anotarse las eventuales anomalías de los órganos 
genitales, tales como la hebra vaginal persistente, la hipospadia o el pene hendido. La madurez sexual de los animales F
 1 se compara con el desarro ­
llo físico mediante la determinación de la edad y del peso corporal en el 
momento de la separación balano-prepucial o de la apertura de la vagina, 
según se trate de machos o hembras, respectivamente.  
Evaluación de la posible neurotoxicidad para el desarrollo (cohortes 2A 
y 2B)  
47. Deben utilizarse para la evaluación de la neurotoxicidad los diez machos y 
diez hembras de la cohorte 2A y los diez machos y diez hembras de la 
cohorte 2B, de cada grupo de tratamiento (para cada cohorte: 1 macho o 1 
hembra por camada; todas las camadas representadas por un mínimo de 1 cría; con selección aleatoria). Los animales de la cohorte 2A deben some ­
terse al ensayo de sobresalto acústico, a la batería de observaciones funcio ­
nales, y a la evaluación de la actividad motriz (véanse los puntos 48-50) y 
de la neuropatología (véanse los puntos 74-75). Debe procurarse que las
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
variaciones en todas las condiciones de ensayo sean mínimas y no estén 
relacionadas sistemáticamente con el tratamiento. Entre las variables que 
pueden afectar al comportamiento se encuentran el nivel sonoro (por ejem ­
plo, ruido intermitente), la temperatura, la humedad, la iluminación, los olores, la hora del día y las distracciones del entorno. Los resultados de 
los ensayos de neurotoxicidad deben interpretarse en relación con las ban ­
das de referencia adecuadas de los controles históricos. Los animales de la cohorte 2B deben utilizarse para la evaluación de la neuropatología el DPN 21 o 22 (véanse los puntos 74-75). 
48. El DPN 24 (± 1 día) debe llevarse a cabo un ensayo de sobresalto acústico 
con los animales de la cohorte 2A. El día del ensayo deben compensarse los 
grupos de tratamiento y de control. Cada sesión consiste en 50 pruebas. Al realizar el ensayo de sobresalto acústico, debe determinarse la amplitud de la respuesta media de cada bloque de 10 pruebas (5 bloques de 10 pruebas), 
con las condiciones de ensayo optimizadas para lograr la habituación dentro 
de la sesión. Estos procedimientos deben ser compatibles con el método de ensayo B.53 (35). 
49. En un momento adecuado entre el DPN 63 y el DPN 75, los animales de la 
cohorte 2A se someten a una batería de observaciones funcionales y a un 
ensayo automatizado de la actividad motriz. Estos procedimientos deben ser compatibles con los métodos de ensayo B.43 (33) y B.53 (35). La batería de observaciones funcionales incluye una descripción detallada del aspecto, 
del comportamiento y de la integridad funcional del animal. La evaluación 
se efectúa mediante observaciones en la jaula de alojamiento, después de trasladar al animal a un ámbito normalizado de observación (campo abierto) donde pueda moverse libremente, y mediante pruebas de manipulación. Los 
ensayos deben graduarse desde el menos hasta el más interactivo. En el 
apéndice 1 se presenta una lista de medidas. Todos los animales deben ser observados cuidadosamente por observadores cualificados que no conozcan la situación de los animales respecto al tratamiento, utilizando procedimien ­
tos normalizados para reducir al mínimo la variabilidad del observador. En 
la medida de lo posible, es conveniente que el mismo observador evalúe a los animales en un ensayo determinado. Si esto no es posible, hay que demostrar la fiabilidad inter-observadores. Para cada parámetro de la batería 
de ensayos de comportamiento deben emplearse escalas y criterios de pun ­
tuación explícitos, definidos desde el punto de vista operativo. Si es posible, deben elaborarse medidas cuantitativas objetivas para los parámetros de observación, que implican una clasificación subjetiva. Para la actividad 
motriz, cada uno de los animales se somete a ensayo individualmente. La 
sesión de ensayo debe ser lo suficientemente larga para demostrar la habi ­
tuación de los controles dentro de la sesión. La actividad motriz debe supervisarse con un aparato automático de registro de la actividad, que 
debe ser capaz de detectar tanto los aumentos como los descensos de la 
misma (es decir, la actividad de referencia medida por el dispositivo no debe ser tan baja que no se puedan detectar los eventuales descensos, ni tan 
elevada que no se puedan detectar los eventuales aumentos de la actividad). 
Cada dispositivo debe comprobarse mediante procedimientos estándar para garantizar, en la medida de lo posible, la fiabilidad del funcionamiento con diferentes dispositivos y en diferentes días. En la medida de lo posible, los 
grupos tratados deben repartirse de forma equilibrada entre los distintos 
dispositivos. Los grupos tratados deben equilibrarse en cuanto a los mo ­
mentos del ensayo a fin de evitar confusiones debidas a los ritmos circa ­
dianos de actividad. 
50. Si existe información que indique la necesidad de hacer otras pruebas 
funcionales (por ejemplo, sensitivas, sociales, cognitivas), estas deben inte ­
grarse sin comprometer la integridad de las otras evaluaciones efectuadas en el estudio. Si estas pruebas se realizan con los mismos animales utilizados para hacer el ensayo de sobresalto acústico, la batería de observaciones 
funcionales y el ensayo de actividad motriz, deben programarse los ensayos 
diferentes de forma que se reduzca al mínimo el riesgo de comprometer la integridad de dichos ensayos. Puede ser especialmente útil realizar proce ­
dimientos complementarios cuando la observación empírica, los efectos 
previstos o el mecanismo o modo de acción indiquen un tipo determinado 
de neurotoxicidad.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Evaluación de la posible inmunotoxicidad para el desarrollo (cohorte 3)  
51. El día DPN 56 (± 3 días), los 10 machos y 10 hembras de la cohorte 3 
procedentes de cada grupo de tratamiento (1 macho o 1 hembra por cama ­
da; todas las camadas representadas por un mínimo de 1 cría; con selección aleatoria) deben utilizarse en un ensayo de respuesta de anticuerpos depen ­
diente de linfocitos T, es decir, la respuesta primaria de anticuerpos IgM a 
un antígeno dependiente de linfocitos T, como los eritrocitos de 
oveja (SRBC) o la hemocianina de la lapa californiana (KLH), de acuerdo con los actuales procedimientos de ensayo de la inmunotoxicidad (14)(15). La respuesta puede evaluarse mediante el recuento de células que forman 
calvas específicas (PFC) en el bazo o por la determinación del título de 
anticuerpos de tipo IgM específicos de KLH o de SRBC en el suero mediante ELISA, en el máximo de la respuesta. Las respuestas, por lo general, presentan un máximo a los cuatro (PFC) o cinco (ELISA) días 
después de la inmunización por vía intravenosa. Si la respuesta primaria de 
anticuerpos se comprueba mediante el recuento de células que forman cal ­
vas, es posible evaluar subgrupos de animales en días distintos, siempre que: la inmunización y el sacrificio del subgrupo se programen de manera 
que las PFC se cuenten en el máximo de la respuesta; que los subgrupos 
contengan un número igual de descendientes machos y hembras de todos los grupos de dosis, incluidos los controles; y que los subgrupos se evalúen a aproximadamente la misma edad postnatal.La exposición a la sustancia 
problema continuará hasta el día antes de recoger los bazos para ver la 
respuesta de PFC o el suero para la prueba ELISA.
 
Evaluación complementaria de la posible toxicidad para la reproduc ­
ción (cohorte 1B)  
52. Los animales de la cohorte 1B pueden mantenerse en tratamiento después 
del DPN 90 y criarse para obtener una generación F  2 en caso necesario. 
Deben cohabitar machos y hembras del mismo grupo de dosis (evitando el 
emparejamiento de hermanos) durante un período de hasta dos semanas, 
empezando como pronto el DPN 90, pero sin exceder del DPN 120. Los procedimientos deben ser similares a los de los animales P. Sin embargo, basándose en la ponderación de las pruebas, puede bastar si se sacrifican las 
camadas el DPN 4 en lugar de mantenerlas hasta el destete o incluso 
después.
 
OBSERVACIONES FINALES  
Bioquímica clínica y hematología  
53. Deben supervisarse los efectos sistémicos en los animales P. En el sacrificio 
se toman muestras de sangre en ayunas, de un lugar definido, de diez machos y hembras P seleccionados al azar, por grupo de dosis; estas mues ­
tras se conservan en condiciones adecuadas y se someten a un examen 
parcial o completo de hematología, bioquímica clínica, ensayo de T4 y 
TSH, o a otros exámenes sugeridos por el perfil conocido de efectos de la sustancia problema [véase el documento de orientación de la OCDE 151 (40)]. Deben examinarse los siguientes parámetros hematológicos: hemato ­
crito, concentración de hemoglobina, recuento de eritrocitos, recuento total 
y diferencial de leucocitos, recuento de plaquetas y potencial/tiempo de coagulación. Entre las investigaciones en plasma o suero deben figurar las siguientes: glucosa, colesterol total, urea, creatinina, proteínas totales, 
albúmina y al menos dos enzimas indicadoras de efectos hepatocelulares 
(tales como la alanina-aminotransferasa, la aspartato-aminotransferasa, la fosfatasa alcalina, la gamma-glutamil-transpeptidasa y la sorbitol-deshidro ­
genasa). La determinación de otras enzimas y de ácidos biliares puede 
proporcionar información útil en ciertas circunstancias. Además, es posible 
extraer sangre de todos los animales y almacenarla para realizar eventuales análisis en un momento posterior con el fin de clarificar efectos dudosos o para generar datos de exposición interna. Si no se contempla un segundo 
apareamiento entre los animales P, las muestras de sangre se obtienen justo 
antes del procedimiento del sacrificio previsto, o como parte del mismo. En
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
el caso de que se mantengan en vida los animales, las muestras de sangre 
deben recogerse unos días antes de que se apareen por segunda vez. Salvo 
que haya datos de estudios con administración continuada que indiquen que el parámetro no se ve afectado por la sustancia problema, debe efectuarse un análisis de orina antes del sacrificio y hay que evaluar los parámetros 
siguientes: aspecto, volumen, osmolalidad o densidad, pH, contenido en 
proteínas, glucosa, sangre y células sanguíneas, y restos celulares. También puede recogerse la orina para supervisar la excreción de la sustancia pro ­
blema o de sus metabolitos. 
54. También deben supervisarse los efectos sistémicos en los animales F
 1 . En el 
sacrificio se toman muestras de sangre en ayunas, de un lugar definido, de diez machos y hembras de la cohorte 1A seleccionados al azar, por grupo de dosis; estas muestras se conservan en condiciones adecuadas y se so ­
meten a un examen de bioquímica clínica normal, incluida la evaluación de 
los niveles en suero de las hormonas tiroideas (T4 y TSH), yde hematología (recuento total y diferencial de leucocitos y recuento de eritrocitos), así como a un análisis de orina. 
55. El excedente de crías se somete a autopsia macroscópica el DPN 4 y se 
sopesa la medición de las concentraciones de la hormona tiroidea (T4) en el suero. En caso necesario, puede agruparse la sangre de los neonatos (DPN 4) por camadas para los análisis bioquímicos o de la hormona tiroidea. 
También se recoge sangre para los análisis de T4 y TSH de los animales 
destetados que se someten a autopsia macroscópica el DPN 22 (crías F
 1 no 
seleccionadas para las cohortes).  
Parámetros del esperma  
56. Los parámetros del esperma deben medirse en todos los machos de la gene ­
ración P, salvo que se disponga de datos que indiquen que tales parámetros no se ven afectados en un estudio de 90 días. El examen de los parámetros del esperma debe realizarse con todos los machos de la cohorte 1A. 
57. En el momento del sacrificio se registran los pesos de los testículos y 
epidídimos de todos los machos P y F
 1 (cohorte 1A). Al menos un testículo 
y un epidídimo se reservan para el examen histopatológico. Los epidídimos restantes se utilizan para el recuento de las reservas de esperma de la cola 
del epidídimo (16)(17). Además, se recoge el esperma de la cola del epi ­
dídimo (o del conducto deferente) utilizando métodos que reduzcan al mínimo las alteraciones para la evaluación de la motilidad y morfología de los espermatozoides (18). 
58. La movilidad del esperma puede evaluarse inmediatamente después del sa ­
crificio o grabarse para su posterior análisis. El porcentaje de espermatozoides progresivamente móviles puede determinarse de forma subjetiva u objetiva mediante el análisis del movimiento con ayuda de ordenador 
(19)(20)(21)(22)(23)(24). Para la evaluación de la morfología de los esper ­
matozoides, debe examinarse una muestra de esperma epididimario (o del conducto deferente) como preparación fijada o en fresco (25) y hay que clasificar al menos 200 espermatozoides por muestra como normales (tienen 
normales tanto la cabeza y el segmento medio como la cola) o anormales. 
Las anomalías morfológicas de los espermatozoides incluyen las fusiones, las cabezas aisladas y las cabezas o las colas deformes (26). La presencia de cabezas deformes o grandes puede indicar alteraciones de la espermiogénesis. 
59. Si se congelan muestras de esperma, se fijan los frotis y se graban imágenes 
para el análisis de la movilidad del esperma en el momento de la autopsia (27), es posible limitar los análisis posteriores a los machos de control y a los que han recibido la dosis alta. No obstante, si se observan efectos 
relacionados con el tratamiento, también deben evaluarse los grupos que 
han recibido las dosis inferiores.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Autopsia macroscópica  
60. En el momento del sacrifico o de la muerte prematura, todos los animales P 
y F  1 se someten a autopsia y a examen macroscópico para detectar los 
eventuales cambios patológicos o anomalías estructurales. Se prestará espe ­
cial atención a los órganos genitales. Deben registrarse las crías moribundas que se sacrifiquen por métodos compasivos y las crías muertas, y, si no 
están descompuestas, deben examinarse para detectar posibles anomalías y 
establecer la causa de la muerte, y conservarse posteriormente. 
61. En el caso de las hembras adultas P y F
 1 , se examina el día de la autopsia 
un frotis vaginal para determinar la fase del ciclo estral y poder establecer 
una correlación con la histopatología de los órganos genitales. Los úteros de 
todas las hembras P (y de las hembras F  1 , si procede) se examinan para 
detectar la posible presencia de puntos de implantación y contar su número, de una manera que no comprometa la evaluación histopatológica.
 
Pesaje de los órganos y conservación de los tejidos — animales adultos 
P y F  1 
62. En el momento del sacrificio, se determinan el peso corporal y el peso 
húmedo de los órganos enumerados a continuación (lo antes posible tras la disección a fin de evitar su desecación) de todos los animales P y de 
todos los adultos F
 1 , de las cohortes pertinentes, como se indica a conti ­
nuación. Estos órganos deben conservarse posteriormente en condiciones adecuadas. A menos que se especifique lo contrario, los órganos pares pueden pesarse por separado o combinados, de forma coherente con la 
práctica habitual del laboratorio correspondiente. 
— Útero (con oviductos y cuello), ovarios — Testículos, epidídimos (totales y colas de las muestras utilizadas en los 
recuentos de esperma) 
— Próstata (partes dorsolateral y ventral combinadas). Hay que extremar el 
cuidado cuando se cortan los tejidos adherentes del complejo de la próstata para evitar la perforación de las vesículas seminales llenas de líquido. En caso de efectos sobre el peso total de la próstata relaciona ­
dos con el tratamiento, deben separarse cuidadosamente los segmentos 
dorsolateral y ventral, previa fijación, y pesarse aparte. 
— Vesículas seminales con las glándulas coagulantes y sus líquidos (como 
una sola unidad) 
— Encéfalo, hígado, riñones, corazón, bazo, timo, hipófisis, glándula tiroi ­
dea (tras su fijación), cápsulas suprarrenales y órganos o tejidos diana conocidos. 
63. Además de los órganos enumerados anteriormente, deben conservarse, en 
condiciones adecuadas, muestras de los nervios periféricos, músculos, mé ­
dula espinal, ojos más nervio óptico, tubo digestivo, vejiga urinaria, pul ­
món, tráquea (con las glándulas tiroidea y paratiroideas), médula ósea, conducto deferente (machos), glándula mamaria (machos y hembras) y 
vagina. 
64. Todos los órganos de los animales de la cohorte 1A se pesarán y se 
conservarán para su estudio histopatológico. 
65. Para la investigación de los efectos inmunotóxicos inducidos antes y des ­
pués del nacimiento, 10 machos y 10 hembras de la cohorte 1A de cada 
grupo de tratamiento (1 macho o 1 hembra por camada; todas las camadas representadas por un mínimo de 1 cría; con selección aleatoria) serán objeto de lo siguiente: 
— pesaje de los ganglios linfáticos asociados con la vía de exposición y 
distantes de ella (además del pesaje de las cápsulas suprarrenales, el 
timo y el bazo, ya realizado en todos los animales de la cohorte 1A),
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— análisis de las subpoblaciones de linfocitos esplénicos (linfocitos T CD 
4+ y CD 8+, linfocitos B y linfocitos citolíticos naturales), utilizando la 
mitad del bazo, ya que la otra mitad se reserva para la evaluación histopatológica. 
El análisis de las subpoblaciones de linfocitos esplénicos en animales no 
inmunizados (cohorte 1A) determinará si la exposición está relacionada con 
un cambio de la distribución en el equilibrio inmunológico de los linfocitos 
derivados del timo «cooperadores» (CD 4+) o citotóxicos (CD 8+) o de los linfocitos citolíticos naturales (respuestas rápidas a las células neoplásicas y a los patógenos). 
66. De los animales de la cohorte 1B deben pesarse los órganos siguientes, y 
los tejidos correspondientes se preparan en tacos de biopsia: 
— Vagina (no pesada) — Útero con cuello — Ovarios 
— Testículos (por lo menos uno) 
— Epidídimos — Vesículas seminales y glándulas coagulantes — Próstata — Hipófisis — Órganos diana identificados. El estudio de histopatología de la cohorte 1B se llevará a cabo si los 
resultados de la cohorte 1A son dudosos o si se sospecha que la sustancia 
es tóxica para la reproducción o para el sistema endocrino. 
67. Cohortes 2A y 2B: Ensayo de neurotoxicidad para el desarrollo (DPN 21 o 
DPN 22 y descendientes adultos). Los animales de la cohorte 2A se sa ­
crifican tras los ensayos de comportamiento, se registra el peso de su 
encéfalo y se hace un estudio completo de neurohistopatología con fines de evaluación de la neurotoxicidad. Los animales de la cohorte 2B se sacrifican el DPN 21 o el DPN 22, se registra el peso de su encéfalo y 
se hace un examen microscópico del encéfalo con fines de evaluación de la 
neurotoxicidad. La fijación por perfusión es obligatoria para los animales de la cohorte 2A y opcional para los de la cohorte 2B, como se contempla en el método de ensayo B.53 (35).
 
Pesaje de los órganos y conservación de los tejidos — animales deste ­
tados F  1 
68. Las crías que no se hayan seleccionado para las cohortes, incluidos los 
animales con retraso, se sacrifican tras el destete, el DPN 22, salvo que los resultados indiquen la necesidad de continuar las investigaciones en 
vivo. Las crías sacrificadas se someten a autopsia macroscópica, incluida 
una evaluación de los órganos genitales, como se describe en los puntos 62 y 63. Se pesarán y conservarán en condiciones adecuadas el encéfalo, el bazo y el timo de hasta 10 crías por sexo y por grupo, del máximo de 
camadas posible. Además, podrán conservarse para su análisis microscópico 
posterior los tejidos mamarios de estas crías machos y hembras (
 1 ) [véase el 
documento de orientación de la OCDE 151 (40)]. Deben conservarse las anomalías macroscópicas y los tejidos diana para un posible examen histo ­
lógico.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) La investigación realizada ha puesto de manifiesto que la glándula mamaria, especial ­
mente su desarrollo durante las primeras fases de la vida, constituye un parámetro 
sensible de la acción de los estrógenos. Se recomienda incluir en el presente método 
de ensayo, tras la validación, parámetros relativos a las glándulas mamarias de ambos 
sexos.
 Examen de histopatología — animales P  
69. Se lleva a cabo un examen completo de histopatología de los órganos 
enumerados en los puntos 62 y 63 procedentes de todos los animales P 
de los grupos de dosis alta y de control. También deben examinarse los órganos que muestren cambios relacionados con el tratamiento, procedentes de todos los animales de los grupos tratados con las dosis inferiores, para 
ayudar a determinar el NOAEL. Además de ello, se someterán a evaluación 
histopatológica los órganos genitales de todos los animales en los que se sospeche una disminución de la fertilidad como, por ejemplo, los que no se hayan apareado, no hayan concebido, no hayan engendrado o no hayan 
tenido una progenie sana, o en los que se hayan observado alteraciones 
del ciclo estral o de la cantidad, movilidad o morfología de los espermato ­
zoides, así como todas las lesiones macroscópicas.
 
Examen de histopatología — animales F  1 
Animales de la cohorte 1  
70. Se lleva a cabo un examen completo de histopatología de los órganos 
enumerados en los puntos 62 y 63 procedentes de todos los animales 
adultos de la cohorte 1A de los grupos de dosis alta y de control. Todas las camadas deben estar representadas por un mínimo de 1 cría por sexo. También deben examinarse los órganos y tejidos que muestren cambios 
relacionados con el tratamiento y todas las lesiones macroscópicas de todos 
los animales de los grupos tratados con las dosis inferiores para ayudar a determinar el NOAEL. Para la evaluación de los efectos inducidos antes y después del nacimiento sobre los órganos linfáticos, debe procederse tam ­
bién al examen de la histopatología de los ganglios linfáticos y de la médula 
ósea recogidos de 10 machos y 10 hembras de la cohorte 1A, además de la evaluación histopatológica del timo, el bazo y las cápsulas suprarrenales, ya realizada con todos los animales de la cohorte 1A. 
71. Si se sospecha que la sustancia es tóxica para la reproducción o para el 
sistema endocrino, se efectuará el examen de la histopatología de los tejidos genitales y endocrinos de todos los animales de la cohorte 1B, preparados 
en tacos de biopsia como se describe en el punto 66. Si los resultados de la 
cohorte 1A son dudosos, también deberá someterse a examen histopatoló ­
gico la cohorte 1B. 
72. Los ovarios de las hembras adultas deben contener folículos primordiales y 
en crecimiento, así como cuerpos lúteos; por lo tanto, el examen histopa ­
tológico debe estar orientado a la evaluación cuantitativa de los folículos primordiales y de los pequeños folículos en crecimiento, así como de los 
cuerpos lúteos, en las hembras F
 1 ; el número de animales, la elección de la 
sección ovárica y el tamaño de la muestra de lasección han de ser adecua ­
dos desde el punto de vista estadístico para el procedimiento de evaluación empleado. El recuento folicular puede realizarse en primer lugar con los 
animales de control y con los que han recibido la dosis máxima y, en caso 
de que se observe un efecto adverso en los últimos, realizarse entonces con los animales de las dosis más bajas. En el examen debe hacerse el recuento de los folículos primordiales, que pueden estar combinados con los peque ­
ños folículos en crecimiento, para efectuar la comparación de los ovarios de 
las hembras de los grupos tratados y los del grupo de control [véase el documento de orientación de la OCDE 151 (40)]. La evaluación de los cuerpos lúteos debe efectuarse en paralelo con el ensayo de los ciclos 
estrales, de forma que en la evaluación pueda tenerse en cuenta la fase 
del ciclo. Se examinan el oviducto, el útero y la vagina, en cuanto al desarrollo correcto de cada órgano. 
73. Se realizan exámenes histopatológicos detallados de los testículos de los 
machos F
 1 a fin de detectar efectos relacionados con el tratamiento sobre la 
diferenciación y el desarrollo de los testículos y sobre la espermatogénesis (38). Cuando sea posible, deben examinarse secciones de la red testicular. Se examinan la cabeza, el cuerpo y la cola del epidídimo y el conducto 
deferente en cuanto al desarrollo correcto de cada órgano, así como en 
cuanto a los parámetros requeridos para los machos P.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Animales de la cohorte 2  
74. Se hace una evaluación de la neurohistopatología de todos los animales de 
la cohorte 2A de los grupos de dosis alta y de control, por sexo, tras haberse realizado los ensayos neuroconductuales (después del DPN 75, 
pero sin sobrepasar el DPN 90). Se hace un examen de la histopatología 
del encéfalo de todos los animales de la cohorte 2B de los grupos de dosis alta y de control, por sexo, el DPN 21 o el DPN 22. También deben examinarse los órganos o tejidos que muestren cambios relacionados con 
el tratamiento, procedentes de todos los animales de los grupos tratados con 
las dosis inferiores para contribuir a determinar el NOAEL. Se examinan secciones múltiples del encéfalo de los animales de las cohortes 2A y 2B, 
para evaluar los bulbos olfativos, la corteza cerebral, el hipocampo, los 
núcleos basales, el tálamo, el hipotálamo, el mesencéfalo (techo, tegmento y pedúnculos cerebrales), el tronco encefálico y el cerebelo. Se examinan los ojos (retina y nervio óptico) y muestras de los nervios periféricos, 
músculos y médula espinal, solo de los animales de la cohorte 2A. Todos 
los procedimientos neurohistológicos deben ser compatibles con el método de ensayo B.53 (35). 
75. Deben llevarse a cabo evaluaciones morfométricas (cuantitativas) de zonas 
representativas del encéfalo (secciones homólogas cuidadosamente seleccio ­
nadas en función de puntos de referencia microscópicos fiables) y pueden 
incluir mediciones lineales o de superficies de regiones específicas del 
encéfalo. Al nivel de cada punto de referencia deben hacerse al menos tres secciones consecutivas para seleccionar la sección más homóloga y representativa de la zona específica del encéfalo que deba evaluarse. El 
neuropatólogo debe aplicar su juicio para decidir si las secciones preparadas 
para la medición son homólogas de otras del conjunto de la muestra y, por tanto, adecuadas para incluirse, ya que las mediciones lineales en particular pueden cambiar dentro de una distancia relativamente corta (28). No deben 
utilizarse secciones que no sean homólogas. Aunque el objetivo sea tomar 
muestras de todos los animales reservados con tal fin (10/sexo/dosis), puede ser válido también un número inferior. Sin embargo, a efectos del presente método de ensayo no se considerará en general suficiente que las muestras 
procedan de menos de 6 animales/sexo/dosis. Puede utilizarse la estereolo ­
gía para identificar efectos relacionados con el tratamiento sobre parámetros tales como el volumen o el número de células de determinadas regiones neuroanatómicas. Todos los aspectos de la preparación de las muestras de 
tejido, desde la fijación de los tejidos hasta la disección de las muestras de 
tejido, el tratamiento de los tejidos y la tinción de las preparaciones mi ­
croscópicas, deben seguir un diseño equilibrado de forma que cada lote contenga muestras representativas de cada grupo de dosis. Cuando vayan 
a aplicarse análisis morfométricos o estereológicos, el tejido del encéfalo 
debe incluirse en el medio apropiado al mismo tiempo para todos los niveles de dosis, a fin de evitar artefactos por retracción asociados con una conservación prolongada en el fijador.
 
INFORMES  
Datos  
76. Los datos se facilitan por separado y se resumen en forma de cuadro. 
Cuando proceda, de cada grupo de ensayo y cada generación, debe indi ­
carse lo siguiente: el número de animales al inicio del ensayo, el número de animales encontrados muertos durante el ensayo o sacrificados por razones compasivas, la fecha y la hora de las eventuales muertes o sacrificios 
compasivos, el número de animales fértiles, el número de hembras gestan ­
tes, el número de hembras que paren una camada, y el número de animales que muestran signos de toxicidad. Debe recogerse también una descripción de la toxicidad, con inclusión del momento de la aparición, la duración y la 
gravedad. 
77. Los resultados numéricos deben evaluarse mediante un método estadístico 
adecuado y aceptado. Los métodos estadísticos deben elegirse en la fase de 
diseño del estudio y deben tratar de forma adecuada los datos no normales (por ejemplo, los datos de los recuentos), los datos no considerados (p, ej., debido a un tiempo de observación limitado), la falta de independencia (por 
ejemplo, efectos de camada y repetición de medidas), y las varianzas desi ­
guales. Los modelos mixtos lineales generalizados y los modelos de
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
dosis-respuesta cubren una amplia categoría de instrumentos analíticos que 
pueden ser adecuados para los datos generados con arreglo al presente 
método de ensayo. El informe debe recoger información suficiente sobre el método de análisis y el programa informático empleados, de manera que un revisor o estadístico independiente pueda evaluar o reevaluar el análisis.
 
Evaluación de los resultados  
78. Los resultados deben evaluarse en términos de efectos observados, inclu ­
yendo las observaciones microscópicas y las de la autopsia. La evaluación incluye la relación, o la ausencia de relación, entre la dosis y la presencia, incidencia y gravedad de las anomalías, incluidas las lesiones macroscópi ­
cas. También deben evaluarse los órganos diana, la fertilidad, las anomalías 
clínicas, el comportamiento reproductor y con la prole, los cambios de peso corporal, la mortalidad y demás efectos tóxicos y sobre el desarrollo. Debe prestarse especial atención a los cambios específicos de un sexo. A la hora 
de evaluar los resultados del ensayo deben tenerse en cuenta las propiedades 
fisicoquímicas de la sustancia problema y, si están disponibles, los datos toxicocinéticos, incluidas la transferencia placentaria y la excreción en la leche.
 
Informe del ensayo  
79. El informe del ensayo debe incluir la siguiente información obtenida en el 
presente estudio de los animales P, F  1 y F  2 (si procede):  
Sustancia problema:  
— Toda la información pertinente de que se disponga sobre las propiedades 
químicas, toxicocinéticas y toxicodinámicas de la sustancia problema; 
— Datos de identificación; — Pureza;
 
Vehículo (si procede):  
— Justificación de la elección del vehículo, si es distinto del agua;  
Animales de experimentación:  
— Especie y cepa utilizada; 
— Número, edad y sexo de los animales; — Procedencia, condiciones de alojamiento, dieta, material de nidificación, 
etc.; 
— Peso de cada animal al inicio del ensayo; — Datos de los frotis vaginales de las hembras P antes del inicio del 
tratamiento (si se han recogido datos en ese momento); 
— Registros del emparejamiento de la generación P que indiquen el macho 
y la hembra de un apareamiento y si este ha tenido éxito; 
— Registros de la camada de origen de los adultos de la generación F
 1 ; 
Condiciones del ensayo:  
— Justificación de la selección de las dosis; 
— Datos sobre la formulación de la sustancia problema o su preparación 
con los alimentos y concentración obtenida;  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— Estabilidad y homogeneidad del preparado en el vehículo o portador 
(por ejemplo, alimentos, agua de bebida), en la sangre o en la leche, en 
las condiciones de utilización y almacenamiento entre utilizaciones; 
— Datos sobre la administración de la sustancia problema; — Conversión de la concentración (ppm) de la sustancia problema en los 
alimentos o en el agua de bebida a la dosis alcanzada (mg/kg peso corporal y por día), si procede; 
— Detalles de la calidad de los alimentos y del agua (incluida la compo ­
sición de la dieta, si se conoce); 
— Descripción detallada de los procedimientos de aleatorización en la 
selección de crías para su eliminación y para su asignación a los grupos de ensayo; 
— Condiciones ambientales; — Lista del personal del estudio, incluida su formación profesional.
 
Resultados (resumen y datos individuales por sexo y dosis):  
— Consumo de alimentos, consumo de agua si se ha medido, rendimiento 
alimentario (ganancia de peso corporal por gramo de alimentos consu ­
midos, salvo durante el período de cohabitación y la lactancia), y con ­
sumo de la sustancia problema (en caso de administración con los alimentos o el agua de bebida) de los animales P y F
 1 ; 
— Datos relativos a la absorción (si se dispone de ellos); — Datos de peso corporal de los animales P; — Datos sobre el peso corporal de los animales F
 1 seleccionados tras el 
destete; 
— Fecha de las muertes sobrevenidas durante el estudio o si los animales 
han sobrevivido hasta el sacrificio; 
— Naturaleza, gravedad y duración de los signos clínicos (reversibles o 
no); 
— Datos de los análisis hematológicos, de orina y de química clínica, 
incluidas las hormonas TSH y T4; 
— Análisis fenotípico de las células del bazo (linfocitos T, linfocitos B, 
linfocitos citolíticos naturales); 
— Estudio de las células de la médula ósea; — Datos de la respuesta tóxica; — Número de hembras P y F
 1 con ciclo estral normal y anormal y dura ­
ción del ciclo; 
— Tiempo del apareamiento (intervalo precoital, que es el número de días 
entre emparejamiento y apareamiento); 
— Efectos tóxicos o de otro tipo sobre la reproducción, incluidos los 
números y porcentajes de los animales que han llevado a cabo el apa ­
reamiento, la gestación, el parto y la lactancia, de los machos que han provocado una gestación, de las hembras con signos de distocia o parto difícil o prolongado; 
— Duración de la gestación y, si se dispone de este dato, del parto; — Número de implantaciones, tamaño de la camada y porcentaje de crías 
machos; 
— Número y porcentaje de pérdidas postimplantación, de nacidos vivos y 
de mortinatos;
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— Datos del peso de la camada y del peso de las crías (machos, hembras y 
combinados), el número de animales con retraso si se ha determinado; 
— Número de crías con anomalías visibles macroscópicamente; — Efectos tóxicos o de otro tipo sobre la progenie, el crecimiento pos ­
tnatal, la viabilidad, etc.; 
— Datos sobre puntos de referencia físicos evaluados en las crías y otros 
datos relativos al desarrollo postnatal; 
— Datos sobre la maduración sexual de los animales F
 1 ; 
— Datos sobre las observaciones funcionales realizadas en las crías y los 
adultos, según proceda; 
— Peso corporal en el momento del sacrificio y peso absoluto y relativo de 
los órganos de los animales P y de los adultos F  1 ; 
— Observaciones de la autopsia; — Descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas; — Número total de espermatozoides en la cola del epidídimo, porcentaje de 
espermatozoides progresivamente móviles, porcentaje de espermatozoi ­
des de morfología normal y porcentaje de espermatozoides con cada anomalía detectada, correspondientes a los machos P y F
 1 ; 
— Número y fases de maduración de los folículos contenidos en los ova ­
rios de las hembras P y F  1 , en su caso; 
— Recuento de cuerpos lúteos en los ovarios de las hembras F  1 ; 
— Tratamiento estadístico de los resultados, si procede.  
Parámetros de la cohorte 2:  
— Descripción detallada de los procedimientos utilizados para normalizar 
las observaciones y los procedimientos, así como las definiciones ope ­
rativas para asignar puntuación a las observaciones; 
— Lista de todos los procedimientos de ensayo utilizados y justificación de 
su empleo; 
— Datos de los procedimientos utilizados para los estudios conductuales/ 
funcionales, neuropatológicos y morfométricos, con información y deta ­
lles sobre los dispositivos automáticos; 
— Procedimientos para calibrar y garantizar la equivalencia de los dispo ­
sitivos y el reparto equilibrado de los grupos de tratamiento en los procedimientos de ensayo; 
— Breve justificación de las decisiones que impliquen un juicio 
profesional; 
— Descripción detallada de todas las observaciones conductuales/funciona ­
les, neuropatológicas y morfométricas por sexo y grupo de dosis, in ­
cluidos tanto los aumentos como los descensos respecto a los controles; 
— Peso del encéfalo; — Eventuales diagnósticos derivados de lesiones y signos neurológicos, 
incluidas las enfermedades o procesos naturales; 
— Imágenes de observaciones modelo; 
— Imágenes de baja resolución para evaluar la homología de las secciones 
empleadas en relación con la morfometría;
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— Tratamiento estadístico de los resultados, incluidos los modelos estadís ­
ticos utilizados para analizar los datos, y los resultados, con indepen ­
dencia de que sean significativos o no; 
— Relación de otros eventuales efectos tóxicos con la conclusión acerca 
del potencial neurotóxico de la sustancia problema, por sexo y grupo de 
dosis; 
— Impacto de cualquier información toxicocinética sobre las conclusiones; 
— Datos que apoyan la fiabilidad y sensibilidad del método de ensayo (es 
decir, datos de resultados positivos y de controles históricos); 
— Eventual relación entre efectos neuropatológicos y funcionales; 
— NOAEL o dosis de referencia para las madres y los descendientes, por 
sexo y grupo de dosis; 
— Discusión de la interpretación global de los datos sobre la base de los 
resultados, incluidas la conclusión de si la sustancia problema ha pro ­
vocado neurotoxicidad para el desarrollo y el NOAEL.  
Parámetros de la cohorte 3:  
— Títulos de anticuerpos de tipo IgM en el suero (sensibilización a SRBC 
o a KLH) o unidades de PFC en el bazo en respuesta a la IgM (sen ­
sibilización a SRBC); 
— El comportamiento del ensayo de respuesta de anticuerpos dependiente 
de linfocitos T (TDAR) debe confirmarse como parte del proceso de 
optimización por el laboratorio que establezca el ensayo por primera 
vez, y periódicamente (por ejemplo, una vez al año) por todos los laboratorios; 
— Discusión de la interpretación global de los datos sobre la base de los 
resultados, incluidas la conclusión de si la sustancia problema ha pro ­
vocado inmunotoxicidad para el desarrollo y el NOAEL.
 
Discusión de los resultados  
Conclusiones, incluidos los valores del NOAEL para efectos sobre los 
padres y sobre la progenie  
También debe incluirse la eventual información no obtenida durante el 
estudio, pero que sea útil para la interpretación de los resultados (por 
ejemplo, semejanzas con los efectos de agentes neurotóxicos conocidos).  
Interpretación de los resultados  
80. Un estudio ampliado de toxicidad para la reproducción en una generación 
proporciona información sobre los efectos de la exposición continuada a una sustancia durante todas las fases del ciclo reproductivo, según sea necesario. En particular, el estudio proporciona información sobre el aparato 
reproductor, y sobre el desarrollo, el crecimiento, la supervivencia y los 
parámetros funcionales de las crías hasta el DPN 90. 
81. La interpretación de los resultados del estudio debe tener en cuenta toda la 
información disponible sobre la sustancia, incluidas las propiedades fisico ­
químicas, toxicocinéticas y toxicodinámicas, la información disponible per ­
tinente sobre análogos estructurales, y los resultados de estudios de toxici ­
dad realizados previamente con la sustancia problema (por ejemplo, toxici ­
dad aguda, toxicidad tras administración continuada, estudios del meca ­
nismo y estudios para evaluar si se producen diferencias cualitativas y cuantitativas importantes en las propiedades metabólicas  in vivo  o in vitro  
de una especie a otra). Si es posible, los resultados de la autopsia macros ­
cópica y del pesaje de los órganos deben interpretarse a la luz de las observaciones realizadas en otros estudios con administración continuada. La disminución del crecimiento de los descendientes podría considerarse en 
relación con la influencia de la sustancia problema sobre la composición de 
la leche (29).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Cohorte 2 (neurotoxicidad para el desarrollo)  
82. Los resultados de los estudios neuroconductuales y neuropatológicos deben 
interpretarse en el contexto de todas las observaciones realizadas, utilizando 
un planteamiento basado en la ponderación de las pruebas con el juicio de los expertos. Deben ser objeto de discusión las pautas de las eventuales observaciones conductuales o morfológicas, así como las pruebas de una 
relación dosis-respuesta. Debe incluirse en esta caracterización la evaluación 
de la neurotoxicidad para el desarrollo, incluidos los estudios epidemioló ­
gicos o los informes de casos humanos, y los estudios con animales de experimentación (por ejemplo, datos de toxicocinética, información sobre la 
relación estructura-actividad, datos de otros estudios de toxicidad). La eva ­
luación de los datos debe incluir una discusión de la significación tanto biológica como estadística. La evaluación debe incluir la eventual relación que pueda existir entre las alteraciones neuropatológicas y conductuales 
observadas. Para obtener orientaciones sobre la interpretación de los resul ­
tados de neurotoxicidad para el desarrollo, véanse el método de ensayo B.53 (35) y Tyl  et al. , 2008 (31).
 
Cohorte 3 (inmunotoxicidad para el desarrollo)  
83. La supresión o el refuerzo de la función inmunológica según lo evaluado 
mediante el ensayo TDAR (respuesta de anticuerpos dependiente de linfo ­
citos T) debe valorarse en el contexto de todas las observaciones realizadas. 
La significación del resultado del ensayo TDAR puede reforzarse con el 
apoyo de otros efectos sobre indicadores relacionados con factores inmu ­
nológicos (por ejemplo, estudio de las células de la médula ósea, el pesaje y el examen histopatológico de los tejidos linfáticos, la distribución de las 
subpoblaciones de linfocitos). Los efectos establecidos mediante el ensayo 
TDAR pueden ser menos significativos en caso de que se observen otros efectos tóxicos a menores concentraciones de exposición. 
84. Debe consultarse el documento de orientación de la OCDE 43 para obtener 
ayuda en la interpretación de los resultados de neurotoxicidad y toxicidad para la reproducción (26).
 
BIBLIOGRAFÍA  
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, SL Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers 
and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology,  
36, 69-98. 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula 
Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530- 536. 
(3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, 
Washington, DC. 
(4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI 
Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87-94. 
(5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating Re ­
search to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicological 
Sciences,  49, 1-4. 
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Re ­
production — a Literature Survey’,  Journal of the American College of 
Toxicologists,  14, 293-327. 
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology,  37, 356-369.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats-overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences,  25, 1-21. 
(9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of To ­
xicologic Pathology’,  Birth Defects Research,  Part B, 68, 408-415. 
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research,  Part B, 
80 (2), 84-97. 
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization,  
Cambridge, New York. 
(12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Rey ­
nolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in 
Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383-390. 
(13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Se ­
paration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’,  
Biological Reproduction,  17, 298-303. 
(14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods,  41, 9-19. 
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemoc ­
yanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology,  197, 
23-35. 
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology,  12, 92-108. 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility,  54, 103-107. 
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Fo ­
llowing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproduc ­
tive Toxicology,  5, 39-44. 
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, SL Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology,  10, 
237- 244. 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology,  6, 267-273. 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology,  13, 409-421. 
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology,  5, 449- 
458.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A,  Academic, Orlando, Florida. 
pp. 319-333. 
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epi ­
chlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology,  10, 401-415. 
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology,  6, 491-505. 
(26) OCDE (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment,  Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OCDE, París. 
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology,  8, 330-337. 
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee 
(2006), ‘A “Best Practices” Approach to Neuropathologic Assessment in 
Developmental Neurotoxicity Testing — for Today’,  Toxicological Patho ­
logy,  34, 296-313. 
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of 
their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology,  44, 8-16. 
(30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in 
Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717-1726. 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. So ­
botka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neuro ­
toxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science 
Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints’,  Neu­
rotoxicology and Teratology,  30: 349-381. 
(32) OCDE (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test,  OECD Guideline for Tes ­
ting of Chemicals, No. 422, OECD, París. 
(33) Capítulo B.43 del presente anexo, Estudio de neurotoxicidad en roedores. (34) OCDE (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations,  Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OCDE, París. 
(35) Capítulo B.53 del presente anexo, Estudio de neurotoxicidad para el desa ­
rrollo 
(36) Capítulo B.54 del presente anexo, Bioensayo uterotrófico con roedores: 
ensayo de cribado a corto plazo de las propiedades estrogénicas. 
(37) Capítulo B.55 del presente anexo, Bioensayo de Hershberger con ratas: 
ensayo de cribado a corto plazo de las propiedades (anti)androgénicas.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
(38) OCDE (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OCDE, París. 
(39) OCDE (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OCDE, París. 
(40) OCDE (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Asses ­
sment, No. 151, OCDE, París.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Apéndice 1  
Medidas y observaciones recogidas en la batería de observaciones funcionales (cohorte 2A)  
En la jaula de alojamiento y en campo 
abierto Con la manipulación Fisiológicas  
Postura Facilidad para sacar al animal Temperatura 
Movimientos clónicos y tónicos 
involuntarios Facilidad de manipulación Peso corporal 
Cierre palpebral Tono muscular Reflejo pupilar 
Piloerección Respuesta a la aproximación Tamaño de la pupila Salivación Respuesta al contacto Lagrimeo Respuesta auditiva 
Vocalizaciones Respuesta al pellizco de la 
cola 
Encabritamiento Reflejo de enderezamiento 
Anomalías de la marcha Ensanchamiento del pie al to ­
mar contacto con el suelo 
Nivel de alerta Fuerza de prensión de las pa ­
tas delanteras 
Estereotipias Fuerza de prensión de las pa ­
tas traseras 
Comportamientos anómalos 
Manchas 
Anomalías respiratorias
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Apéndice 2  
Definiciones  
Sustancia : Sustancia o mezcla.  
Sustancia problema : Toda sustancia o mezcla estudiada con este método de 
ensayo.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  ENSAYO DE ESTEROIDOGÉNESIS EN CÉLULAS H295R  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de 
la OCDE TG 456 (2011). La OCDE lanzó en 1998 una actividad muy 
prioritaria para revisar las directrices existentes y elaborar nuevas directrices sobre los ensayos de cribado y finales de posibles alteradores endocrinos. El ‘OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endo ­
crine Disrupting Chemicals’ (Marco conceptual de la OCDE para el ensayo 
y evaluación de los alteradores endocrinos) de 2002 comprende cinco ni ­
veles, cada uno de los cuales corresponde a un nivel diferente de comple ­
jidad biológica (1). El ensayo de esteroidogénesis en células H295R  in vitro  
(ensayo H295R) descrito en el presente método de ensayo utiliza una línea 
celular de adrenocarcinoma humano (células NCI-H295R) y constituye un ensayo  in vitro  de nivel 2 que aporta datos sobre el mecanismo y que puede 
utilizarse con fines de cribado y de asignación de prioridades. La elabora ­
ción y la normalización del ensayo para el cribado de efectos de las sus ­
tancias sobre la esteroidogénesis, específicamente la producción de 17 β- 
estradiol (E2) y de testosterona (T), se llevaron a cabo en un proceso 
multifásico. El ensayo H295R está optimizado y validado (2)(3)(4)(5). 
2. El objetivo del ensayo de esteroidogénesis H295R es detectar sustancias que 
afecten a la producción de E2 y de T. El ensayo H295R se propone 
identificar sustancias xenobióticas cuyo sitio diana sean los componentes 
endógenos que constituyen la ruta bioquímica intracelular iniciada con la secuencia de reacciones a partir del colesterol para producir E2 o T. El ensayo H295R no tiene por objeto identificar sustancias que afecten a la 
esteroidogénesis actuando sobre el eje hipotálamo-hipófisis-gónadas (HPG). 
Su finalidad es proporcionar una respuesta de tipo SÍ/NO en lo que se refiere a la posibilidad de que una sustancia induzca o inhiba la producción de T y E2; sin embargo, es posible obtener resultados cuantitativos en 
algunos casos (véanse los puntos 53 y 54). Los resultados del ensayo se 
expresan como cambios relativos en la producción hormonal, respecto a los controles de disolvente. El ensayo no pretende ofrecer información sobre el mecanismo específico relativo a la interacción de la sustancia problema con 
el sistema endocrino. Se han realizado investigaciones con la línea celular 
para identificar los efectos sobre ciertas enzimas y hormonas intermedias, tales como la progesterona (2). 
3. Las definiciones y abreviaturas utilizadas en el presente método de ensayo 
se recogen en el apéndice. En los apéndices I-III del documento de la OCDE ‘Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production’ se incluye 
un protocolo detallado con instrucciones sobre cómo preparar las solucio ­
nes, cultivar las células y realizar diversos aspectos del ensayo (4).
 
CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES 
4. Hay cinco enzimas diferentes que catalizan seis reacciones diferentes de la 
biosíntesis de hormonas esteroideas sexuales. La conversión enzimática de 
colesterol en pregnenolona por la enzima CYP11A, que es del grupo del citocromo P450 (CYP) y que separa la cadena lateral del colesterol, cons ­
tituye la etapa inicial de una serie de reacciones bioquímicas que culmina en 
la síntesis de los productos finales esteroideos. En función del orden de las 
dos reacciones siguientes, el proceso de esteroidogénesis se divide en dos caminos, la vía de los Δ
 5 -hidroxiesteroides y la vía de los Δ 4 -cetoesteroides, 
que convergen en la producción de androstenodiona (figura 1). 
5. La androstenodiona se convierte en testosterona (T) por la acción de la 17 β- 
hidroxiesteroide-deshidrogenasa (17 β-HSD). La testosterona es tanto un 
producto intermedio como una hormona final. En los machos, la T puede 
convertirse en dihidrotestosterona (DHT) por la 5 α-reductasa, que se en ­
cuentra en las membranas celulares, la membrana nuclear y el retículo endoplásmico de los tejidos diana de la acción androgénica, como la prós ­
tata y las vesículas seminales. La DHT es significativamente más potente 
como andrógeno que la T y también se considera una hormona final. El 
ensayo H295R no mide la DHT (véase el punto 10).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. La enzima de la vía esteroidogénica que convierte las sustancias androgé ­
nicas en sustancias estrogénicas es la aromatasa (CYP19). Esta transforma 
la T en 17 β-estradiol (E2) y la androstenodiona en estrona. Tanto el E2 
como la T se consideran hormonas finales de la vía esteroidogénica. 
7. La especificidad de la actividad liásica de la CYP17 difiere en cuanto a los 
sustratos intermedios en las distintas especies. En la especie humana, la enzima favorece los sustratos de la vía de los Δ
 5 -hidroxiesteroides (pregne ­
nolona), mientras que en la rata se ven favorecidos los sustratos de la vía de 
los Δ 4 -cetoesteroides (progesterona) (19). Tales diferencias en la actividad 
liásica de la CYP17 pueden explicar algunas diferencias según las especies en cuanto a la respuesta a sustancias que alteran la esteroidogénesis  in vivo  
(6). Se ha comprobado que las células H295 reflejan muy bien la expresión 
enzimática suprarrenal y el patrón de producción de esteroides de los adul ­
tos de nuestra especie (20), pero se sabe que expresan enzimas tanto de la vía de los Δ
 5 -hidroxiesteroides como de la de los Δ 4 -cetoesteroides para la 
síntesis de andrógenos (7)(11)(13)(15).  
Figura 1  
Vía esteroidogénica de las células H295R
  
Nota:  
Las enzimas están en cursiva, las hormonas, en negrita, y las flechas indican 
la dirección de la síntesis. El fondo gris indica vías/productos de la cate ­
goría de los corticoesteroides. Las vías/productos de la categoría de los 
esteroides sexuales están en el círculo. CYP = citocromo P450; HSD = hidroxiesteroide-deshidrogenasa; DHEA = deshidroepiandroesterona. 
8. La línea celular de adrenocarcinoma H295R humano es útil como modelo  
in vitro  para la investigación de efectos sobre la síntesis de hormonas 
esteroideas (2)(7)(8)(9)(10). La línea celular H295R expresa los genes que codifican todas las enzimas clave para la esteroidogénesis indicadas 
más arriba (11)(15) (figura 1). Se trata de una característica única porque 
la expresión  in vivo  de estos genes es específica de ciertos tejidos y de 
ciertas fases del desarrollo, y lo normal es que no haya un solo tejido o una sola fase del desarrollo que exprese todos los genes que participan en la 
esteroidogénesis (2). Las células H295R tienen características fisiológicas 
de las células suprarrenales sin diferenciación zonal de los fetos humanos (11). Las células representan un sistema  in vitro  único, ya que tienen la 
capacidad de producir todas las hormonas esteroideas que se encuentran en 
la corteza suprarrenal y en las gónadas de los adultos, lo que permite 
realizar ensayos sobre los efectos en la síntesis de corticoesteroides y en
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
la producción de hormonas esteroideas sexuales, como los andrógenos y los 
estrógenos, aunque el ensayo está validado solo para detectar T y E2. Los 
cambios detectados por el sistema de ensayo en forma de alteración de la producción de T y E2 pueden ser resultado de una multitud de distintas interacciones de las sustancias problema con las funciones de la esteroido ­
génesis que se expresan en las células H295R. Entre estas se incluyen la 
modulación de la expresión, de la síntesis o de la función de las enzimas que participan en la producción, transformación o eliminación de las hor ­
monas esteroideas (12)(13)(14). La inhibición de la producción hormonal 
puede deberse a una unión competitiva directa a una enzima de la vía, al 
impacto sobre cofactores tales como el NADPH (fosfato de nicotinamida-adenin-dinucleótido) y el cAMP (monofosfato de adenosina cíclico), o al incremento del metabolismo de los esteroides o a la supresión 
de la expresión génica de algunas enzimas de la vía de la esteroidogénesis. 
Aunque la inhibición puede ser función de procesos tanto directos como indirectos relacionados con la producción de hormonas, la inducción tiene normalmente un carácter indirecto; puede deberse, por ejemplo, a la altera ­
ción de cofactores como el NADPH y el cAMP (como en el caso de la 
forskolina), a la reducción del metabolismo de los esteroides (13) o a la activación de la expresión génica de la esteroidogénesis. 
9. El ensayo H295R ofrece varias ventajas: 
— Permite la detección tanto de incrementos como de disminuciones de la 
producción de T y de E2. 
— Permite la evaluación directa del efecto potencial de una sustancia sobre 
la viabilidad celular y la citotoxicidad. Esta es una característica impor ­
tante, ya que permite discriminar entre los efectos debidos a la citoto ­
xicidad y los debidos a la interacción directa de las sustancias con las vías esteroidogénicas, lo cual no es posible en sistemas de tejidos ex ­
plantados que están compuestos por múltiples tipos de células con sen ­
sibilidades y funcionalidades diferentes; 
— No exige la utilización de animales; — La línea celular H295R está disponible en el comercio. 
10. Las limitaciones principales del ensayo son las siguientes: 
— Su capacidad metabólica es desconocida, pero probablemente es bas ­
tante limitada; por lo tanto, es probable que las sustancias que tienen que activarse metabólicamente pueden pasarse por alto en este ensayo. 
— Dado que proceden del tejido suprarrenal, las células H295R poseen las 
enzimas capaces de producir gluco y mineralocorticoides, así como 
hormonas sexuales; por tanto, los efectos sobre la producción de gluco y mineralocorticoides pueden influir en los niveles de T y E2 observa ­
dos en este ensayo. 
— Aquí no se mide la DHT, por lo que no se espera que se detecten las 
sustancias que inhiben la 5 α-reductasa, en cuyo caso puede utilizarse el 
ensayo de Hershberger (16). 
— El ensayo H295R no detecta las sustancias que interfieren con la este ­
roidogénesis por afectar al eje hipotálamo-hipófisis-gónadas (HPG), ya 
que esto solo puede estudiarse en animales intactos.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
11. El objetivo del ensayo es la detección de las sustancias que afectan a la 
producción de T y de E2. La T es también un producto intermedio de la vía 
que lleva al E2. El ensayo puede detectar sustancias que característicamente 
inhiben o inducen enzimas de la vía de la esteroidogénesis.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. El ensayo suele efectuarse en condiciones normales de cultivo celular, en 
placas de cultivo de 24 pocillos. También pueden utilizarse placas de otros 
tamaños para realizar el ensayo; sin embargo, la siembra y las condiciones experimentales deben adaptarse en consecuencia para mantener el cumpli ­
miento de los criterios de comportamiento. 
13. Tras un período de aclimatación de 24 h en placas con múltiples pocillos, se 
exponen las células durante 48 h a siete concentraciones de la sustancia 
problema, al menos por triplicado. Como controles, negativo y positivos, se 
aplican el disolvente y un inhibidor y un inductor de la producción de hormonas conocidos, a una concentración fijada. Al final del período de exposición, se retira el medio de cada pocillo. Se analiza la viabilidad 
celular en cada pocillo inmediatamente después de retirar el medio. Las 
concentraciones de las hormonas en el medio pueden medirse utilizando una serie de métodos, incluidos equipos disponibles en el comercio para la 
medición de hormonas, o técnicas instrumentales como la cromatografía de 
líquidos-espectrometría de masas (LC-MS). Los datos se expresan como el factor multiplicador del cambio respecto al control del disolvente y como la concentración con efecto mínimo observado (LOEC). Si el ensayo es ne ­
gativo, la mayor concentración utilizada en el ensayo se recoge como la 
concentración sin efecto observado (NOEC). Las conclusiones sobre la capacidad de una sustancia para afectar a la esteroidogénesis deben basarse, como mínimo, en dos tandas de ensayos independientes. La primera tanda 
de ensayos puede servir para determinar la gama de concentraciones, que se 
ajustan posteriormente para las tandas 2 y 3, en su caso, si se detectan problemas de solubilidad o de citotoxicidad, o si la actividad de la sustancia parece estar al final de la gama de concentraciones empleada en el ensayo.
 
PROCEDIMIENTO DE CULTIVO  
Línea celular  
14. Las células NCI-H295R se pueden conseguir comercialmente de la Ameri ­
can Type Culture Collection (ATCC) previa firma de un acuerdo de trans ­
ferencia de material (ATM) (  1 ). 
Introducción  
15. Debido a los cambios en la capacidad de producción de E2 de las células al 
aumentar la edad o el número de pases (2), es necesario que las células se 
cultiven según un protocolo específico, antes de utilizarse, y hay que anotar 
el número de pases desde la descongelación de las células, así como el número de pases al que las células se han congelado y colocado en nitró ­
geno líquido para su almacenamiento. El primer número indica el número 
real de pases celulares y el segundo número es el de pases al que las células 
se han congelado y almacenado. Por ejemplo, unas células congeladas después del pase 5, y que luego se han descongelado y resembrado tres veces (4 pases contando las células recién descongeladas como pase 1) 
después de haberse cultivado de nuevo se etiquetarían como pase 4.5. En 
el apéndice I del informe de validación se ilustra un ejemplo del sistema de numeración (4). 
16. Se utiliza un medio de partida como base para los medios suplementado y 
de congelación. El medio suplementado es un componente necesario para el 
cultivo de las células. El medio de congelación está concebido específica ­
mente para permitir la congelación de las células para su almacenamiento a largo plazo sin problemas. Antes de su utilización, debe analizarse el suero Nu-serum (o un suero comparable de propiedades similares del que se haya 
demostrado que sirve para producir datos que cumplen los requisitos de 
control de calidad y de comportamiento del ensayo), que es un componente de los medios suplementados, en cuanto a sus concentraciones de base de T y de E2. En el apéndice II del informe de validación se describe la prepa ­
ración de estas soluciones (4).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Tras el inicio de un cultivo de células H295R a partir de un lote original de 
la ATCC, hay que cultivar las células a lo largo de cinco pases (es decir, 
hay que resembrarlas 4 veces). Las células del pase 5 se congelan en nitrógeno líquido para su almacenamiento. Antes de congelar las células, se cultiva una muestra de células del pase 4 anterior en una placa de control 
de calidad (véanse los puntos 36 y 37) para verificar si la producción basal 
de hormonas y la respuesta a las sustancias de control positivo cumplen los criterios de control de calidad del ensayo, definidos en el cuadro 5. 
18. Las células H295R deben cultivarse, congelarse y almacenarse en nitrógeno 
líquido para asegurarse de que siempre hay células del paso/edad apropiado 
disponibles para su cultivo y utilización. El número máximo de pases tras poner en cultivo un lote nuevo (
 1 ) o congelado (  2 ) de células aceptable para 
su uso en el ensayo H295R no debe superar los 10. Por ejemplo, los pases 
aceptables para los cultivos de células de un lote congelado en el pase 5 van 
de 4.5 a 10.5. Con las células cultivadas a partir de estos lotes congelados, debe seguirse el procedimiento contemplado en el punto 19. Estas células deben cultivarse durante al menos cuatro (4) pases adicionales (pase 4.5) 
antes de utilizarse en el ensayo.
 
Cultivo de células a partir de material congelado  
19. El procedimiento para cultivar células a partir de material congelado debe 
utilizarse en los casos en que se toma un lote nuevo de células de su 
almacenamiento en nitrógeno líquido para su cultivo y utilización en el ensayo. Los detalles de este procedimiento son los indicados en el apéndice III del informe de validación (4). Las células se retiran de su almacena ­
miento en nitrógeno líquido, se descongelan rápidamente, se colocan en 
medio suplementado en un tubo de centrífuga, se centrifugan a temperatura ambiente, se vuelven a suspender en medio suplementado, y se transfieren a un matraz de cultivo. El medio debe cambiarse el día siguiente. Las células 
H295R se cultivan en estufa a 37 °C en atmósfera de aire con un 5 % de 
CO
 2 , y el medio se renueva 2-3 veces por semana. Cuando las células 
presentan una confluencia del 85-90 % aproximadamente, deben resembrar ­
se. La resiembra de las células es necesaria para garantizar su salud y 
crecimiento y para mantenerlas con vistas a la realización de bioensayos. 
Las células se lavan tres veces con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS, sin Ca
 2+ ni Mg  2+ y se liberan del matraz de cultivo mediante la 
adición de una enzima adecuada de separación como, por ejemplo, la trip ­
sina, en PBS (sin Ca  2+ ni Mg  2+ ). Inmediatamente después de que las células 
se hayan desprendido del matraz de cultivo, debe detenerse la acción de la enzima con la adición de medio suplementado en la proporción de tres veces el volumen que se ha utilizado para el tratamiento enzimático. Las 
células se ponen en un tubo de centrífuga y se centrifugan a temperatura 
ambiente, el sobrenadante se elimina y el precipitado de células se vuelve a suspender en medio suplementado. Se coloca en el nuevo matraz de cultivo la cantidad apropiada de suspensión de células. La cantidad de suspensión 
de células debe ajustarse de forma que las células se hagan confluentes en 
el plazo de 5 a 7 días. La proporción recomendada de subcultivo es de 1:3 a 1:4. La placa debe etiquetarse cuidadosamente. Las células están entonces dispuestas para utilizarse en el ensayo y las células excedentarias deben 
congelarse en nitrógeno líquido como se describe en el punto 20.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) Por «lote nuevo» se entiende un lote de células recién recibido de la ATCC. 
( 2 ) Por «lote congelado» se entiende el de células que se han cultivado y congelado pre ­
viamente en un laboratorio distinto de la ATCC.
 Congelación de las células H295R (preparación para su almacena ­
miento en nitrógeno líquido)  
20. A fin de preparar las células H295R para su congelación, el procedimiento 
descrito anteriormente para resembrar las células debe seguirse hasta la etapa de nueva suspensión del precipitado de células del fondo del tubo de centrífuga. En este caso, el precipitado de células se vuelve a suspender 
en medio de congelación. La suspensión se transfiere a un tubo criogénico, 
etiquetado de forma apropiada, y se congela a – 80 °C durante 24 horas, tras lo cual el tubo criogénico se transfiere a nitrógeno líquido para su almacenamiento. Los detalles de este procedimiento son los indicados en 
el apéndice III del informe de validación (4).
 
Siembra en placas y preincubación de las células para el ensayo  
21. El número necesario de placas de 24 pocillos, preparadas como se indica en 
el punto 19, dependerá del número de sustancias que se hayan de someter al ensayo y de la confluencia de las células en los matraces de cultivo. Como 
norma general, un solo matraz de cultivo (75 cm
 2 ) de células con una 
confluencia del 80-90 % proporciona bastantes células para poblar de 1 a 1,5 placas (de 24 pocillos) con una densidad objetivo de 200 000 a 300 000 células por ml de medio, que resulta en una confluencia aproximada del 50- 
60 % en los pocillos al cabo de 24 horas (figura 2). Esta es normalmente la 
densidad celular óptima para la producción de hormonas en el ensayo. Con densidades superiores, se altera el patrón de producción de T y de E2. Antes de realizar el ensayo por primera vez, se recomienda probar diferen ­
tes densidades de inóculo, entre 200 000 y 300 000 células por ml, y 
seleccionar para el resto de los experimentos la densidad que procure una confluencia del 50-60 % en el pocillo al cabo de 24 horas.
 
Figura 2  
Microfotografías de células H295R con una densidad de inóculo del 50 % en una placa 
de cultivo de 24 pocillos a las 24 horas, tomadas en el borde (A) y en el centro (B) de un 
pocillo
  
22. Con pipeta, se retira el medio del matraz de cultivo, y las células se lavan 3 
veces con PBS estéril (sin Ca  2+ ni Mg  2+ ). Se añade una solución enzimática 
(en PBS) para desprender las células del matraz de cultivo. Tras un tiempo adecuado para que las células se desprendan, debe detenerse la acción de la enzima con la adición de medio suplementado en la proporción de tres 
veces el volumen que se ha utilizado para el tratamiento enzimático. Las 
células se ponen en un tubo de centrífuga, se centrifugan a temperatura
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
ambiente, el sobrenadante se elimina y el precipitado de células se vuelve a 
suspender en medio suplementado. La densidad celular se calcula utilizan ­
do, por ejemplo, un hemocitómetro o un contador celular. La suspensión celular debe diluirse hasta obtener la deseada densidad de siembra en placa y mezclarse bien para conseguir una densidad celular homogénea. Las 
células deben ponerse en las placas a razón de 1 ml de la suspensión celular 
por pocillo, y las placas y pocillos deben etiquetarse. Las placas sembradas se incuban a 37 °C en atmósfera de aire con 5 % de CO
 2 durante 24 horas 
para que las células puedan adherirse a los pocillos.  
REQUISITOS DE CONTROL DE CALIDAD 
23. Es fundamental que se pongan en los pocillos los volúmenes exactos de las 
soluciones y muestras al realizar el ensayo, ya que estos volúmenes deter ­
minan las concentraciones utilizadas para calcular los resultados del ensayo. 
24. Antes de iniciar el cultivo celular y cualesquiera otras pruebas posteriores, 
cada laboratorio debe demostrar la sensibilidad de su sistema de medición 
de hormonas (puntos 29-31). 
25. Si se van a aplicar sistemas de medición de hormonas que utilizan anti ­
cuerpos, debe analizarse antes de iniciar el ensayo el potencial de las sustancias problema para interferir con el sistema de medición aplicado 
para cuantificar la T y el E2 como se indica en el punto 32. 
26. El DMSO es el disolvente recomendado para este ensayo. Si se utiliza otro 
disolvente, debe determinarse lo siguiente: 
— la solubilidad de la sustancia problema, de la forskolina y del procloraz 
en el disolvente, así como 
— la citotoxicidad en función de la concentración de disolvente. 
Se recomienda que la concentración máxima permisible de disolvente no 
supere una dilución de 10 veces la menor concentración citotóxica del disolvente. 
27. Antes de llevar a cabo el ensayo por primera vez, el laboratorio debe 
realizar un experimento de evaluación de la aptitud, en el que se demuestre 
que el laboratorio es capaz de mantener y lograr unos cultivos celulares 
adecuados y las condiciones experimentales necesarias para los ensayos de sustancias, como se describe en los puntos 33-35. 
28. Cuando se inicie un ensayo con un lote nuevo de células, debe aplicarse el 
procedimiento a una placa de control antes de utilizar el lote nuevo, a fin de 
evaluar el comportamiento de las células, como se describe en los puntos 36 y 37.
 
Comportamiento del sistema de medición de hormonas  
Sensibilidad, exactitud, precisión y reactividad cruzada con la matriz de 
muestra  
29. Cada laboratorio puede utilizar el sistema de medición de hormonas que 
prefiera para el análisis de la producción de T y de E2 por las células H295R siempre que cumpla los criterios de comportamiento, incluido el límite de cuantificación (LC). Los valores de este límite son, en principio, 
100 pg/ml para T y 10 pg/ml para E2, establecidos según los niveles 
hormonales basales observados en los estudios de validación. No obstante, puede ser apropiado aplicar niveles superiores o inferiores en función de los niveles hormonales basales obtenidos en el laboratorio 
que realice el ensayo. Antes de iniciar la placa de control de calidad y las 
tandas de ensayo, el laboratorio debe demostrar que el sistema hormonal
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
que se va a utilizar puede medir las concentraciones hormonales en el 
medio suplementado, con la suficiente exactitud y precisión para cumplir 
los criterios de control de calidad especificados en los cuadros 1 y 5, mediante el análisis del medio suplementado al que se ha añadido un control interno de hormona. Al medio suplementado se le deben añadir al 
menos tres concentraciones de cada hormona (por ejemplo, 100, 500 y 
2 500 pg/ml de T; 10, 50 y 250 pg/ml de E2; o también, como concen ­
traciones añadidas más bajas de T y de E2, pueden usarse las concentra ­
ciones más bajas posibles según los límites de detección del sistema de 
medición hormonal elegido), y a continuación se analiza. Las concentracio ­
nes hormonales medidas en muestras no extraídas no deben alejarse más del 30 % de las concentraciones nominales, y la variación entre mediciones replicadas de la misma muestra no debe superar el 25 % (véanse también 
en el cuadro 8 criterios adicionales de control de calidad). Si se cumplen 
estos criterios de control de calidad, se supone que el sistema seleccionado de medición hormonal es suficientemente exacto, preciso y no presenta reactividad cruzada con los componentes del medio (matriz de la muestra) 
de modo que pudiera preverse una influencia significativa sobre el resultado 
del ensayo. En tal caso, no es necesario proceder a ninguna extracción de las muestras antes de realizar las mediciones hormonales. 
30. En caso de que no se cumplan los criterios de control de calidad de los 
cuadros 1 y 8, puede estar dándose un efecto matricial significativo, y debe llevarse a cabo un experimento con medio al que se ha añadido la hormona 
y luego se ha sometido a extracción. En el apéndice II del informe de 
validación se describe un ejemplo de procedimiento de extracción (4). Las mediciones de las concentraciones hormonales en las muestras extraídas deben hacerse por triplicado (
 1 ). Si se puede demostrar que, previa extrac ­
ción, los componentes del medio no interfieren con el método de detección 
de las hormonas según lo definido por los criterios de control de calidad, todos los experimentos posteriores deben realizarse utilizando muestras ex ­
traídas. Si los criterios de control de calidad no pueden cumplirse ni si ­
quiera después de efectuar la extracción, es que el sistema de medición 
hormonal utilizado no es adecuado para los fines del ensayo de esteroido ­
génesis H295R, y hay que emplear un método alternativo de detección hormonal.
 
Curva patrón  
31. Las concentraciones hormonales de los controles de disolvente (CD) deben 
situarse en la porción lineal de la curva patrón. Es preferible que los valores 
de CD queden cerca del centro de la porción lineal para garantizar que puedan medirse la inducción y la inhibición de la síntesis de las hormonas. Las diluciones del medio (o extractos) que hayan de medirse deben selec ­
cionarse en consecuencia. La relación lineal debe determinarse mediante un 
método estadístico adecuado.
 
Prueba de interferencia de las sustancias  
32. Si para medir las hormonas van a utilizarse sistemas con intervención de 
anticuerpos, tales como los ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y los radioimmunoanálisis (RIA), debe probarse cada sustancia 
en cuanto a su posible interferencia con el sistema de medición hormonal 
que vaya a emplearse, antes del inicio de los ensayos propiamente dichos de la sustancia [apéndice III del informe de validación (4)], ya que algunas sustancias pueden interferir con estos sistemas (17). Si se produce una 
interferencia, esto es, un aumento ≥ 20 % de la producción basal de hor ­
monas T y/o E2, según lo determinado por el análisis hormonal, debe llevarse a cabo la prueba de interferencia del sistema de medición hormonal con la sustancia [tal como se describe en la sección 5.0 del apéndice III del 
informe de validación (4)] con todas las diluciones de la solución madre de 
la sustancia problema, a fin de identificar la dosis umbral a partir de la que se produce una interferencia significativa ( ≥ 20 %). Si la interferencia
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Nota:  Si es necesario realizar la extracción, se efectúan tres mediciones replicadas de 
cada extracto. Cada muestra se extrae una sola vez.
 es inferior al 30 %, es posible corregir los resultados para tener en cuenta la 
interferencia. Si la interferencia es superior al 30 %, los datos correspon ­
dientes a esas concentraciones son inválidos y hay que descartarlos. En caso de que haya interferencia significativa de una sustancia problema con un sistema de medición hormonal a más de una concentración no citotóxica, 
debe utilizarse un sistema de medición hormonal diferente. Con el fin de 
evitar la interferencia de las sustancias contaminantes, se recomienda que se extraigan las hormonas del medio utilizando un disolvente adecuado; pue ­
den encontrarse posibles métodos en el informe de validación (4).
 
Cuadro 1  
Criterios de comportamiento de los sistemas de medición hormonal  
Parámetro Criterio  
Sensibilidad del método de medi ­
ción Límite de cuantificación (LC) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
Eficacia de la extracción hormonal 
(solo cuando haga falta efectuar la 
extracción) Las tasas de recuperación medias (a 
partir de mediciones triplicadas) de 
las cantidades añadidas de hormona 
no deben desviarse en más del 30 % de la cantidad añadida. 
Interferencia con la sustancia (solo 
para sistemas que utilizan anticuer ­
pos) No debe haber reactividad cruzada 
importante ( ≥ 30 % de la producción 
basal de la hormona respectiva) con 
ninguna de las hormonas producidas 
por las células (
 b ) ( c ). 
( a ) Nota:  Los límites del método de medición se basan en los valores de producción 
hormonal basal que se recogen en el cuadro 5, y son función del comportamiento. 
Si se puede conseguir una mayor producción hormonal basal, el límite puede ser 
mayor. 
( b ) Algunos anticuerpos contra la T y el E2 pueden presentar reacción cruzada con la 
androstenodiona y la estrona, respectivamente, en un porcentaje mayor. En tales 
casos, no es posible determinar exactamente los efectos sobre la 17 β-HSD. Sin 
embargo, los datos pueden seguir proporcionando información útil en relación con 
los efectos sobre la producción de estrógenos o de andrógenos en general. En estos casos, los datos deben expresarse como respuestas androgénicas/estrogéni ­
cas, más que como E2 y T. 
(
 c ) Entre estas figuran las siguientes: colesterol, pregnenolona, progesterona, 11-de ­
soxicorticosterona, corticosterona, aldosterona, 17 α-pregnenolona, 17 α-progeste­
rona, desoxicortisol, cortisol, DHEA, androstenodiona, estrona.  
Prueba de competencia del laboratorio  
33. Antes de ensayar sustancias desconocidas, el laboratorio debe demostrar que 
tiene capacidad para mantener y lograr unos cultivos celulares adecuados y las condiciones experimentales necesarias para la correcta realización del 
ensayo, efectuando la prueba de competencia del laboratorio. Dado que el 
comportamiento de un ensayo está relacionado directamente con el personal del laboratorio que lo lleva a cabo, estos procedimientos deben repetirse parcialmente si se produce algún cambio en el personal del laboratorio. 
34. Esta prueba de competencia se efectuará en las mismas condiciones reco ­
gidas en los puntos 38 a 40, exponiendo las células a siete concentraciones 
crecientes de inductores e inhibidores fuertes, moderados y débiles, así como a una sustancia negativa (véase el cuadro 2). En concreto, las sus ­
tancias que deben utilizarse son las siguientes: el inductor fuerte forskolina 
(n
 o CAS 66575-29-9); el inhibidor fuerte procloraz (n  o CAS 67747-09-5); el 
inductor moderado atrazina (n  o CAS 1912-24-9); el inhibidor moderado  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
aminoglutetimida (n  o CAS 125-84-8); el inductor débil (producción de E2) 
e inhibidor débil (producción de T) bisfenol A (n  o CAS 80-05-7); y la 
sustancia negativa gonadotropina coriónica humana (HCG) (n  o CAS 
9002-61-3), como se indica en el cuadro 2. Se utilizan placas separadas para todas las sustancias siguiendo el formato indicado en el cuadro 6. En 
cada tanda diaria debe incluirse una placa de control de calidad (cuadro 4, 
puntos 36-37) para las sustancias de la prueba de competencia.
 
Cuadro 2  
Sustancias de la prueba de competencia y concentraciones de exposición  
Sustancia de la prueba de 
competencia Concentraciones de ensayo [ μM] 
Procloraz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskolina 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrazina 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutetimida 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Bisfenol A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Control de disolvente (DMSO) (0), 1 μl DMSO/pocillo  
Las células H295R deben exponerse a las sustancias de la prueba de com ­
petencia en placas de 24 pocillos durante la prueba de competencia del laboratorio. Las unidades de concentración son μM para las dosis de todas 
las sustancias de la prueba. Las sustancias deben aplicarse disueltas en 
DMSO al 0,1 % v/v por pocillo. Todas las concentraciones de la prueba deben ensayarse en pocillos por triplicado (cuadro 6). Se utilizan placas separadas para cada sustancia. En cada tanda diaria se incluye una placa de 
control de calidad. 
35. Deben efectuarse el análisis de la viabilidad celular y los análisis hormo ­
nales según lo establecido en los puntos 42 a 46. El valor umbral (concen ­
tración mínima con efecto observado, LOEC) y la decisión sobre la clasi ­
ficación deben comunicarse y compararse con los valores del cuadro 3. Los datos se consideran aceptables si cumplen el valor umbral de LOEC y la 
clase de decisión del cuadro 3.
 
Cuadro 3  
Valores umbrales (LOEC) y clases de decisión para las sustancias de la prueba de 
competencia  
N o CAS LOEC [μM] Clase de decisión 
T E2 T E2  
Procloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (Inhibición) + (Inhibición) 
Forskolina 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (Inducción) + (Inducción) 
Atrazina 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (Inducción) + (Inducción) 
Aminogluteti ­
mida 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (Inhibición) + (Inhibición)  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
N o CAS LOEC [μM] Clase de decisión 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (Inhibición) + (Inducción) 
HCG 9002-61-3 N. a. N. a. Negativa Negativa  
( a ) +, positiva 
N a., no aplicable ya que no debe haber cambios tras la exposición a concentraciones no citotóxicas del control negativo.
 
Placa de control de calidad  
36. La placa de control de calidad se utiliza para verificar el comportamiento de 
las células H295R en condiciones normales de cultivo, y para establecer una base de datos históricos de las concentraciones hormonales en los controles 
de disolvente y en los controles positivos y negativos, así como otras 
medidas de control de calidad a lo largo del tiempo. 
— El comportamiento de las células H295R debe evaluarse utilizando una 
placa de control de calidad para cada lote nuevo de la ATCC o después 
de utilizar por primera vez una población congelada de células, salvo 
que se haya efectuado con ese lote de células la prueba de competencia del laboratorio (puntos 32-34). 
— Una placa de control de calidad proporciona una evaluación completa de 
las condiciones del ensayo (por ejemplo, viabilidad de las células, con ­
troles de disolvente, controles negativos y positivos, así como variabi ­
lidad intra e inter-ensayos) cuando se estudian las sustancias, y debe 
formar parte de cada tanda del ensayo. 
37. La prueba de control de calidad se efectúa en una placa de 24 pocillos, con 
los mismos procedimientos de incubación, administración, viabilidad celu ­
lar/citotoxicidad, extracción hormonal y análisis hormonal que se describen 
en los puntos 38 a 46 para las sustancias problema. La placa de control de 
calidad incluye blancos, controles del disolvente y dos concentraciones de un inductor (forskolina, 1, 10 μM) y de un inhibidor (procloraz, 0,1, 1 μM) 
conocidos de la síntesis de E2 y de T. Además, se utiliza MeOH en 
determinados pocillos como control positivo del ensayo de viabilidad o 
de citotoxicidad. En el cuadro 4 se recoge una descripción detallada del diseño de la placa. En el cuadro 5 se indican los criterios que debe cumplir la placa de control de calidad. Tanto los pocillos de control de disolvente 
como los pocillos en blanco deben respetar el nivel mínimo de producción 
hormonal basal de T y de E2.
 
Cuadro 4  
Diseño de la placa de control de calidad para comprobar el comportamiento de las 
células H295R sin exponer y de las células expuestas a un inhibidor (PRO = 
procloraz) y a un inductor (FOR = forskolina) conocidos de la producción de E2 y de 
T. Una vez terminado el experimento de exposición y tras haber retirado el medio, se añade una solución de metanol al 70 % a todos los pocillos de MeOH para servir de control positivo de la citotoxicidad [véase el ensayo de citotoxicidad en el apéndice III del 
informe de validación (4)]
 
1 2 3 4 5 6  
A Blanco (  a ) Blanco (  a ) Blanco (  a ) Blanco (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Blanco (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Blanco (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Las células de los pocillos en blanco solo reciben medio (es decir, sin disolvente). 
( b ) El metanol (MeOH) se añade  después  de que haya terminado la exposición y se haya retirado el medio 
de estos pocillos. 
( c ) Control del disolvente DMSO (1 μl/pocillo).  
Cuadro 5  
Criterios de comportamiento de la placa de control de calidad  
T E2  
Producción hormonal 
basal en el control del disolvente (CD) ≥ 5 veces el límite de 
cuantificación ≥ 2,5 veces el límite de 
cuantificación 
Inducción (10 μM de 
forskolina) ≥ 1,5 veces el CD ≥ 7,5 veces el CD 
Inhibición (1 μM de pro ­
cloraz) ≤ 0,5 veces el CD ≤ 0,5 veces el CD
 
PROCEDIMIENTO DE EXPOSICIÓN A LAS SUSTANCIAS 
38. Las células preincubadas se retiran de la estufa (punto 21) y se observan al 
microscopio para asegurarse de que están en buenas condiciones (fijación, morfología) antes de la administración de la sustancia. 
39. Las células se colocan en una campana de bioseguridad y se retira el medio 
suplementado, que se sustituye por medio suplementado nuevo (1 ml/poci ­
llo). El DMSO es el disolvente preferido para este método de ensayo. Sin embargo, si existen razones para utilizar otros disolventes, deberá descri ­
birse la justificación científica. Se exponen las células a la sustancia pro ­
blema añadiendo 1 μl de la solución adecuada en DMSO [véase el apéndice 
II del informe de validación (4)] por ml de medio suplementado (volumen del pocillo). Así se consigue una concentración final del 0,1 % de DMSO 
en los pocillos. Para garantizar una mezcla adecuada, en general es preferi ­
ble que la solución adecuada de la sustancia problema en DMSO se mezcle con medio suplementado para obtener la concentración final deseada en relación con cada dosis, y la mezcla se añade a cada pocillo inmediatamente 
después de la retirada del medio viejo. Si se utiliza esta opción, la concen ­
tración de DMSO (0,1 %) debe ser la misma en todos los pocillos. Los pocillos con las dos mayores concentraciones se someten a evaluación visual utilizando una lupa binocular para detectar la posible formación de 
precipitados o turbidez, la cual indicaría que la sustancia de ensayo no se ha 
disuelto completamente. Si se observan estas condiciones (turbidez, forma ­
ción de precipitados), se examinarán también los pocillos que contengan las concentraciones inmediatamente inferiores (y así sucesivamente) y se ex ­
cluirán del análisis y evaluación posteriores las concentraciones a las que la 
solución no sea completa. La placa se vuelve a poner en la estufa a 37
 o C 
en atmósfera de aire con 5 % de CO  2 durante 48 horas. En el cuadro 6 se 
indica el diseño de la placa de la sustancia problema. Las soluciones 1-7 
indican la distribución de las dosis de la sustancia problema en orden 
creciente.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Cuadro 6  
Esquema de las dosis para la exposición de las células H295R a las sustancias problema 
en una placa de 24 pocillos  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Solución 4 Solución 4 Solución 4 
B Solución 1 Solución 1 Solución 1 Solución 5 Solución 5 Solución 5 C Solución 2 Solución 2 Solución 2 Solución 6 Solución 6 Solución 6 
D Solución 3 Solución 3 Solución 3 Solución 7 Solución 7 Solución 7 
40. Tras 48 horas de exposición, se retiran las placas de la estufa y cada pocillo 
se observa al microscopio para ver las condiciones de las células (fijación, 
morfología, grado de confluencia) y los eventuales signos de citotoxicidad. El medio de cada pocillo se divide en dos porciones iguales (de unos 490 μl 
cada una) que se transfieren a dos tubos distintos, etiquetados de la forma 
adecuada (una de las alícuotas servirá de muestra de reserva de cada poci ­
llo). Para evitar que las células se desequen, el medio se va retirando al ritmo de una fila o columna a la vez y se va sustituyendo con medio para el ensayo de viabilidad celular/citotoxicidad. Si no se va a medir inmediata ­
mente la viabilidad celular/citotoxicidad, hay que añadir a cada pocillo 200 
μl de PBS con Ca
 2+ y Mg  2+ . Los medios se congelan a – 80 °C hasta que 
se proceda a analizar las concentraciones hormonales (véanse los puntos 44- 46). Si bien la T y el E2 en el medio mantenido a – 80 °C son estables en 
general durante al menos 3 meses, es necesario documentar la estabilidad de 
las hormonas durante el almacenamiento en cada laboratorio. 
41. Inmediatamente después de retirar el medio, se determina la viabilidad 
celular/citotoxicidad de cada placa de exposición.
 
Determinación de la viabilidad celular  
42. Para determinar el impacto potencial de la sustancia problema sobre la 
viabilidad celular puede utilizarse el ensayo de viabilidad celular/citotoxi ­
cidad que se prefiera. El ensayo debe ser capaz de proporcionar una medida 
real del porcentaje de células viables presentes en un pocillo, o ha de demostrarse que es directamente comparable a una función lineal del ensayo Live/Dead® [véase el apéndice III del informe de validación (4)]. Un 
ensayo alternativo del que se ha demostrado que funciona igual de bien 
es el ensayo del MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difenil- tetrazolio] (18). La evaluación de la viabilidad celular utilizando los méto ­
dos anteriormente mencionados es una medición relativa que no tiene ne ­
cesariamente una relación lineal con el número absoluto de células de un 
pocillo. Por lo tanto, el analista debe llevar a cabo en paralelo una evalua ­
ción visual subjetiva de cada pocillo, y han de tomarse fotos digitales de los controles de disolvente y de las dos mayores concentraciones no citotóxicas, 
fotos que deben conservarse para permitir la evaluación posterior de la 
densidad celular real, en caso de que fuera necesario. Si la inspección visual o el ensayo de viabilidad celular/citotoxicidad parecen indicar un aumento del número de células, habrá que verificar dicho aumento aparente. Si se 
confirma el aumento del número de células, este extremo debe reflejarse en 
el informe del ensayo. La viabilidad celular se expresará en relación con la respuesta media en los controles de disolvente, que se considera el 100 % de células viables, y se calcula de la forma adecuada según el ensayo de 
viabilidad celular/citotoxicidad que se haya empleado. Con el ensayo del 
MTT se podrá utilizar la fórmula siguiente:
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% células viables =  (respuesta en el pocillo – respuesta media en los 
pocillos tratados con MeOH [= mortalidad del 100 %]) ÷ (respuesta media 
en los pocillos de control del disolvente – respuesta media en los pocillos tratados con MeOH [= mortalidad del 100 %]) 
43. No deben incluirse en el análisis final de los datos los pocillos con una 
viabilidad inferior al 80 %, respecto a la viabilidad media de los controles 
de disolvente (= viabilidad del 100 %). Hay que evaluar cuidadosamente la 
inhibición de la esteroidogénesis que se dé en presencia de una citotoxici ­
dad de casi el 20 %, para asegurarse de que la citotoxicidad no es la causa de la inhibición.
 
Análisis hormonal  
44. Cada laboratorio puede utilizar el sistema de medición hormonal que pre ­
fiera para el análisis de la T y del E2. Las alícuotas de medio de reserva de cada grupo de tratamiento pueden utilizarse para preparar diluciones a fin de llevar la concentración a la porción lineal de la curva patrón. Como se 
indica en el punto 29, cada laboratorio debe demostrar la conformidad de su 
sistema de medición hormonal (por ejemplo, ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) con los criterios de control de calidad analizando medio su ­
plementado al que se ha añadido un patrón interno de hormona antes de 
efectuar las tandas de control de calidad o de llevar a cabo el ensayo de las 
sustancias problema. A fin de garantizar que los componentes del sistema de ensayo no interfieren con la medición de las hormonas, es posible que se tengan que extraer estas de los medios antes de medirlas (véase el punto 30 
sobre las condiciones que hacen necesaria la extracción de las hormonas). 
Se recomienda llevar a cabo la extracción siguiendo los procedimientos del apéndice III del informe de validación (4). 
45. Si se utiliza un equipo de ensayo comercial para medir la producción de 
hormonas, el análisis de estas debe realizarse según lo especificado en los 
manuales proporcionados por el fabricante del equipo de ensayo. La mayo ­
ría de los fabricantes tienen un procedimiento original para efectuar dichos análisis. Las diluciones de las muestras deben ajustarse de manera que las 
concentraciones hormonales previstas para los controles de disolvente cai ­
gan en el centro del intervalo lineal de la curva patrón del ensayo concreto de que se trate [apéndice III del informe de validación (4)]. Deben recha ­
zarse los valores que queden fuera de la porción lineal de la curva patrón. 
46. Las concentraciones hormonales finales se calcularán de la manera 
siguiente: 
Ejemplo: 
Extracción: 450 μl de medio 
Reconstitución en: 250 μl de amortiguador del ensayo 
Dilución en el ensayo: 1:10 (para llevar la muestra al intervalo 
lineal de la curva patrón) 
Concentración hormonal en el 
ensayo: 150 pg/ml (ya ajustada a la concentra ­
ción por ml de muestra analizada) 
Recuperación: 89 % Concentración hormonal final = (concentración hormonal (por ml) ÷ re ­
cuperación) (factor de dilución) 
Concentración hormonal final = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Selección de las concentraciones de ensayo  
47. Debe llevarse a cabo un mínimo de dos tandas independientes del ensayo. 
Salvo que se disponga de información anterior, por ejemplo sobre los 
límites de solubilidad o sobre la citotoxicidad, que permita seleccionar las concentraciones de ensayo, se recomienda que las concentraciones de la sustancia problema en la tanda inicial estén separadas por intervalos loga ­
rítmicos, siendo 10
 -3 M la concentración máxima. Si la sustancia es soluble, 
y no es citotóxica a ninguna de las concentraciones ensayadas, y la primera tanda ha sido negativa para todas las concentraciones, hay que confirmar entonces con otra tanda aplicando las mismas condiciones que en la primera 
(cuadro 7). Si los resultados de la primera tanda son  dudosos  (es decir, si el 
factor multiplicador del cambio es estadísticamente significativo respecto al control de disolvente solo a una concentración) o positivos (es decir, el factor multiplicador del cambio es estadísticamente significativo a dos o 
más concentraciones adyacentes), debe repetirse el ensayo tal como se 
indica en el cuadro 7, afinando las concentraciones de ensayo seleccionadas. Las concentraciones de ensayo de las tandas dos y tres (en su caso) deben ajustarse en función de los resultados de las concentraciones extremas de la 
tanda inicial que hayan provocado efectos utilizando un intervalo semilo ­
garítmico entre concentraciones (por ejemplo, si con la serie original de 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM se han inducido efectos a 1 y 10 μM, 
las concentraciones usadas en la segunda tanda deberán ser 0,1, 0,3, 1, 3, 
10, 30, 100 μM), salvo que haya que emplear concentraciones inferiores 
para conseguir una LOEC. En este último caso, deben utilizarse en la segunda tanda por lo menos cinco concentraciones por debajo de la menor concentración estudiada en la primera tanda, aplicando una escala semilo ­
garítmica. Si esta segunda tanda no confirma los resultados de la primera 
(es decir, no se encuentra significación estadística a la concentración de ensayo que anteriormente ha dado resultado positivo, con un incremento de concentración de ± 1), se realizará un tercer ensayo utilizando las condi ­
ciones de ensayo originales. Los resultados dudosos de la primera tanda se 
consideran negativos si el efecto observado no puede confirmarse en nin ­
guna de las dos tandas siguientes. Los resultados dudosos se consideran 
positivos (hay efecto) si la respuesta puede confirmarse en al menos una 
tanda más con un incremento de concentración de ± 1 (véase en el punto 55 el procedimiento de interpretación de los datos).
 
Cuadro 7  
Matriz de decisiones según las situaciones posibles  
Tanda 1 Tanda 2 Tanda 3 Decisión 
Situación Decisión Situación Decisión Situación Positiva Negativa  
Negativa Confirmar (  a ) Negativa Parar X 
Negativa Confirmar (  a ) Positiva Afinar (  b ) Negativa X 
Dudosa (  c ) Afinar (  b ) Negativa Confirmar (  a ) Negativa X 
Dudosa (  c ) Afinar (  b ) Negativa Confirmar (  a ) Positiva X 
Dudosa (  c ) Afinar (  b ) Positiva X 
Positiva Afinar (  b ) Negativa Confirmar (  a ) Positiva X  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Tanda 1 Tanda 2 Tanda 3 Decisión 
Situación Decisión Situación Decisión Situación Positiva Negativa  
Negativa Confirmar (  a ) Positiva Afinar (  b ) Positiva X 
Positiva Afinar (  b ) Positiva Parar X  
( a ) Confirmar la tanda anterior con el mismo diseño experimental. 
( b ) Hacer otra tanda con intervalos semilogarítmicos de concentración, englobando la concentración que había dado resultados 
significativamente diferentes en el experimento anterior. 
( c ) El factor multiplicador del cambio es estadísticamente diferente de forma significativa respecto al resultado del CD a una so la 
concentración.  
Control de calidad de la placa de ensayo  
48. Además de los criterios de la placa de control de calidad, deben cumplirse 
otros criterios de calidad (indicados en el cuadro 8) que se refieren a la variación aceptable entre pocillos replicados, experimentos replicados, la linealidad y la sensibilidad de los sistemas de medición de hormonas, la 
variabilidad entre mediciones replicadas de hormonas de la misma muestra, 
y el porcentaje de recuperación de las hormonas añadidas, tras la extracción del medio (en su caso, véase el punto 30 en cuanto a los requisitos de la extracción). Para ser considerados en una evaluación posterior, los datos 
deben quedar dentro de los intervalos aceptables definidos para cada pará ­
metro. Si dichos criterios no se cumplen, la hoja de cálculo debe recoger que la muestra en cuestión no cumplía los criterios de control de calidad, y la muestra debe volver a analizarse o bien se elimina del conjunto de datos.
 
Cuadro 8  
Bandas y/o variaciones (%) aceptables de los parámetros de la placa de ensayo del 
ensayo H295R.  
LDC: límite de cuantificación del sistema de medición hormonal. CV: coeficiente de variación; 
CD: control del disolvente; DPM: desintegraciones por minuto  
Comparación T E2  
Producción basal de hor ­
mona en los CD Factor multiplicador res ­
pecto al LDC ≥ 5 veces ≥ 2,5 veces 
Experimentos de exposi ­
ción — CV de los CD 
dentro de una placa (poci ­
llos replicados) Concentraciones absolutas ≤ 30 % ≤ 30 % 
Experimentos de exposi ­
ción — CV de los CD en ­
tre placas (experimentos replicados) Factor multiplicador del 
cambio ≤ 30 % ≤ 30 % 
Sistema de medición hor ­
monal –Sensibilidad Factor de reducción de ­
tectable respecto al CD ≥ 5 veces ≥ 2,5 veces 
Sistema de medición hor ­
monal — CV de de las 
medidas replicadas de los CD (
 a ) Concentraciones absolutas ≤ 25 % ≤ 25 % 
Extracción del medio — 
Recuperación del patrón interno de
 3 H (en su caso) DPM ≥ 65 % del valor nominal  
( a ) Se refiere a las medidas replicadas de la misma muestra.  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ANÁLISIS DE LOS DATOS E INFORME  
Análisis de los datos  
49. Para evaluar el aumento/descenso relativo de la producción hormonal alte ­
rada químicamente, los resultados deben normalizarse teniendo en cuenta el 
valor medio de los controles de disolvente de cada placa de ensayo, y los resultados se expresan como cambios respecto al control de disolvente de cada placa de ensayo. Todos los datos se deben expresar como media ± 1 
desviación típica (DT). 
50. Deben incluirse en el análisis de datos tan solo los datos hormonales de los 
pocillos donde la citotoxicidad haya sido inferior al 20 %. Los cambios 
relativos deben calcularse de la manera siguiente:  
Cambio relativo  = (concentración hormonal en cada pocillo) ÷ (concen ­
tración hormonal media en todos los pocillos de control del disolvente). 
51. Si la inspección visual del pocillo o el ensayo de viabilidad celular/citoto ­
xicidad descrito en el punto 42 parecen indicar un aumento del número de células, habrá que verificar dicho aumento aparente. Si se confirma el 
aumento del número de células, este extremo debe reflejarse en el informe 
del ensayo. 
52. Antes de llevar a cabo análisis estadísticos, deben evaluarse las hipótesis de 
normalidad y de homogeneidad de la varianza. La normalidad debe eva ­
luarse utilizando gráficos de probabilidad normal u otro método estadístico 
apropiado (por ejemplo, la prueba de Shapiro-Wilk). Si los datos (factor multiplicador del cambio) no se distribuyen normalmente, debe intentarse su transformación para aproximarlos a una distribución normal. Si los datos se 
distribuyen normalmente o se aproximan a una distribución normal, las 
diferencias entre los grupos a los que se han administrado las concentra ­
ciones de sustancia problema y los grupos de control del disolvente deben analizarse mediante una prueba paramétrica (por ejemplo, la prueba de 
Dunnett) tomando la  concentración  como variable independiente y la  res­
puesta  (factor multiplicador del cambio) como dependiente. Si los datos no 
se distribuyen normalmente, debe utilizarse una prueba no paramétrica ade ­
cuada (por ejemplo, la prueba de Kruskal Wallis, la prueba de rango de 
muchos a uno de Steel). Las diferencias se consideran significativas a  p ≤ 
0,05.  Las evaluaciones estadísticas se hacen sobre la base de los valores 
medios de cada pocillo, que representan puntos de datos replicados inde ­
pendientes. Se prevé que, debido al amplio espaciado entre las dosis en la 
primera tanda (escala logarítmica), en muchos casos no será posible des ­
cribir una relación clara entre concentración y respuesta cuando las dos dosis mayores se encuentren en la porción lineal de la curva sigmoidea. 
Por lo tanto, para la primera tanda o para cualquier otro conjunto de datos 
en los que se dé esta condición (por ejemplo, en los casos en que no pueda estimarse una eficacia máxima) se aplicará un análisis estadístico de varia ­
ble fijada de tipo I, tal y como se describe anteriormente. 
53. Si hay más de dos puntos de datos en la porción lineal de la curva y si 
pueden calcularse las eficacias máximas (como se prevé con algunas se ­
gundas tandas que se llevan a cabo utilizando espaciados semilogarítmicos 
entre las concentraciones de exposición), deben utilizarse cálculos con pro ­
bit, logit u otros modelos adecuados de regresión para calcular las concen ­
traciones eficaces (por ejemplo, CE50 y CE20). 
54. Los resultados se deben dar en forma de gráficos (gráficos de barras que 
representen la media ± 1 DT) y de cuadros (LOEC/NOEC, dirección del 
efecto, y magnitud de la respuesta máxima que forma parte de la banda de dosis-respuesta de los datos) (en la figura 3 se ofrece un ejemplo). La evaluación de los datos se considera válida solo si se basa al menos en 
dos tandas llevadas a cabo de forma independiente. Un experimento o tanda 
se considera independiente si se ha llevado a cabo en una fecha diferente, utilizando un nuevo conjunto de soluciones y de controles. El intervalo de concentraciones utilizadas en las tandas 2 y 3 (en su caso) puede adaptarse 
sobre la base de los resultados de la tanda 1 para definir mejor la banda de 
dosis-respuesta que contiene el LOEC (véase el punto 47).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Figura 3  
Ejemplo de presentación y evaluación de los datos obtenidos durante la realización del ensayo H295R en 
forma de gráfico y de cuadro.  
Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas respecto al control de disolvente ( p < 0,05 ). 
LOEC: concentración mínima con efecto observado; Factor multiplicador máximo del cambio: magnitud máxima de la respuesta observada a cualquier concentración respecto a la respuesta media del control de 
disolvente (= 1)
 
Sustancia LOEC Factor multiplicador má ­
ximo del cambio  
Forskolina 0,01 29 veces 
Letrozol 0,001 0,15 veces  
Procedimiento de interpretación de los datos  
55. Se considera que una sustancia problema es positiva si el factor multipli ­
cador de la inducción es estadísticamente diferente ( p ≤ 0,05) respecto al 
control del disolvente a dos concentraciones adyacentes en al menos dos 
tandas independientes (cuadro 7). La sustancia problema se considera ne ­
gativa a raíz de dos tandas negativas independientes, o de tres tandas cuando dos de ellas son negativas y una es dudosa o positiva. Si los datos 
generados en tres experimentos independientes no cumplen los criterios de 
decisión que figuran en el cuadro 7, no es posible interpretar los resultados experimentales. Los resultados correspondientes a concentraciones que su ­
peren los límites de solubilidad o a concentraciones citotóxicas no deben 
incluirse en la interpretación de los resultados.
 
Informe del ensayo  
56. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Instalación de ensayo  
— Nombre de la instalación y ubicación; 
— Director y demás personal del estudio, con sus responsabilidades en el 
mismo; 
— Fechas de inicio y final del estudio;  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Sustancia problema, reactivos y controles  
— Identidad (nombre/n  o CAS, según proceda), origen, número de lote, 
pureza, proveedor y caracterización de la sustancia problema, de los 
reactivos y de los controles; 
— Naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes de la sustan ­
cia problema; 
— Condiciones de almacenamiento y método y frecuencia de la prepara ­
ción de las sustancias problema, de los reactivos y de los controles; 
— Estabilidad de la sustancia problema;  
Células  
— Fuente y tipo de células; 
— Número de pases (código de pases) de las células utilizadas en el 
ensayo; 
— Descripción de los procedimientos de mantenimiento de los cultivos 
celulares;  
Requisitos previos al ensayo, en su caso  
— Descripción y resultados de la prueba de interferencia del sistema de 
medición hormonal con la sustancia problema; 
— Descripción y resultados de las mediciones de la eficacia de la extrac ­
ción hormonal; 
— Curvas patrón y de calibración de todos los ensayos analíticos que se 
van a realizar; 
— Límites de detección correspondientes a los ensayos analíticos 
seleccionados;  
Condiciones del ensayo  
— Composición de los medios; 
— Concentración de la sustancia problema; 
— Densidad celular (concentraciones celulares estimadas o medidas a las 
24 y a las 48 horas); 
— Solubilidad de la sustancia problema (límite de solubilidad, si se ha 
determinado); 
— Tiempo y condiciones de incubación;  
Resultados del ensayo  
— Datos en bruto de cada pocillo de los controles y de las sustancias 
problema-cada medida replicada, en la forma de los datos originales proporcionados por el instrumento utilizado para medir la producción hormonal (por ejemplo, DO, unidades de fluorescencia, DPM, etc.); 
— Validación de la normalidad o explicación de la transformación de los 
datos; 
— Respuestas medias ± 1 desviación típica de cada pocillo medido; — Datos de citotoxicidad (concentraciones de ensayo que han causado 
citotoxicidad); 
— Confirmación de que se han cumplido los requisitos en materia de 
control de calidad (CC);
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— Cambio relativo en comparación con el control de disolvente corregido 
para tener en cuenta la citotoxicidad; 
— Gráfico de barras que indique el cambio relativo (factor multiplicador 
del cambio) en cada concentración, la desviación típica y la significa ­
ción estadística según se describe en los puntos 49-54;  
Interpretación de los datos  
— Aplicación del procedimiento de interpretación de los datos a los resul ­
tados y discusión de las observaciones;  
Discusión  
— ¿Aporta indicios el estudio en lo que respecta a la posibilidad de que los 
datos de T/E2 puedan estar influidos por efectos indirectos sobre las 
vías de los gluco y mineralocorticoides?  
Conclusiones  
BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Asses ­
sment of Endocrine Disrupting Chemicals (Marco conceptual de la OCDE 
para el ensayo y evaluación de los alteradores endocrinos), en el apéndice 2 del capítulo B.54 del presente anexo. 
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone pro ­
duction,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114-124. 
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. 
P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res. , 14, 23 — 30. 
(4) OCDE (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production,  
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, París. Disponible en la dirección: [http://www.oecd.org/do ­
cument/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html] 
(5) OCDE (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, París. Disponible en la dirección: [http:// www.oecd.org/document/30/0,3746,en_264 9_34377_1916638_1_1_1_1,00. 
html] 
(6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis. Disponible en 
la dirección: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_fi ­
nal_3_29_05.pdf] 
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), 
Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78-89. 
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  
Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44-54. 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265-272.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137-1148. 
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocorti ­
cal carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid bios ­
ynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488-5496. 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the ste ­
roidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in 
the H295R cell line,  Chemosphere,  80:578-584. 
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777-2785. 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137-1148. 
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731-737. 
(16) Capítulo B.55 del presente anexo, Bioensayo de Hershberger con ratas: 
ensayo de cribado a corto plazo de las propiedades (anti)androgénicas. 
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222-231. 
(18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55-63. 
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606. 
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484- 
492.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Apéndice  
DEFINICIONES  
Confluencia : Cobertura o proliferación que pueden tener las células en el medio 
de cultivo.  
Sustancia : Sustancia o mezcla.  
CV: Coeficiente de variación, que es la relación entre la desviación típica de una 
distribución y su media aritmética.  
CYP : Mono-oxigenasas del citocromo P450, que son una familia de genes y de 
enzimas codificadas por estos, y que participan en la catálisis de una amplia variedad de reacciones bioquímicas, entre las que se incluyen la síntesis y el 
metabolismo de las hormonas esteroideas.  
DPM : Desintegraciones por minuto. Es el número de átomos presentes en una 
determinada cantidad de material radiactivo cuya desintegración se detecta en un 
minuto.  
E2: El 17β-estradiol, que es el estrógeno más importante de los mamíferos.  
Células H295R : Células de adrenocarcinoma humano que tienen las caracterís ­
ticas fisiológicas de las células suprarrenales sin diferenciación zonal de los fetos 
humanos y que expresan todas las enzimas de la vía de la esteroidogénesis. 
Pueden conseguirse de la ATCC.  
Medio de congelación : Se utiliza para congelar las células y mantenerlas con ­
geladas. Consiste en el medio de partida al que se ha añadido BD NuSerum y 
dimetil-sulfóxido.  
Intervalo lineal : Rango dentro de la curva patrón de un sistema de medición 
hormonal en el que los resultados son proporcionales a la concentración del analito presente en la muestra.  
LDC : Significa «límite de cuantificación» y es la cantidad más pequeña de una 
sustancia cuya presencia puede distinguirse de su ausencia (valor en blanco), dentro de un límite de confianza establecido. A los efectos de este método, el LDC suele estar definido por el fabricante de los sistemas de ensayo, si no se 
especifica lo contrario.  
LOEC : Concentración mínima con efecto observado, que es la concentración 
más baja a la cual la respuesta del ensayo es estadísticamente diferente de la del 
control del disolvente.  
NOEC : Concentración sin efecto observado, que es la mayor concentración 
estudiada si el ensayo no proporciona respuesta positiva.  
Pase : Número de veces que se resiembran las células después de la iniciación de 
un cultivo a partir de un material congelado. Al primer pase que procede del 
material congelado se le asigna el número 1. Las células que se resiembran una vez se etiquetan como de pase 2, etc.  
PBS: Solución salina amortiguadora de fosfato de Dulbecco.  
Control de calidad (abreviado a CC) : Medidas necesarias para garantizar la 
obtención de datos válidos.  
Placa de control de calidad : Placa de 24 pocillos que contiene dos concen ­
traciones de los controles positivos y negativos para supervisar el comporta ­
miento de un lote nuevo de células o aportar los controles positivos del ensayo cuando se estudian sustancias problema.  
Tanda : Experimento independiente que se caracteriza por un nuevo conjunto de 
soluciones y de controles.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Medio de partida : Base para la preparación de los demás reactivos. Consiste en 
una mezcla 1:1 del medio de Eagle modificado por Dulbecco y de mezcla 
nutritiva F-12 de Ham (DMEM/F12) en solución amortiguadora HEPES 15 mM sin rojo de fenol ni bicarbonato de sodio. El bicarbonato de sodio se añade como amortiguador, véase el apéndice II del informe de validación (4).  
Medio suplementado : Medio de partida más BD Nu-Serum e ITS+ premium 
mix; véase el apéndice II del informe de validación (4).  
Esteroidogenesis : Vía de síntesis que lleva del colesterol a las distintas hormo ­
nas esteroideas. Varios intermedios de la síntesis esteroidea, como la progeste ­
rona y la testosterona, son importantes hormonas por sí mismas, pero también sirven de precursores de otras hormonas que se sintetizan más adelante en la vía.  
T: Testosterona, uno de los dos más importantes andrógenos de los mamíferos.  
Sustancia problema : Toda sustancia o mezcla estudiada con este método de 
ensayo.  
Placa de ensayo : Placa en la que las células H295R se exponen a las sustancias 
problema. Las placas de ensayo contienen el control del disolvente y la sustancia 
problema a siete niveles de concentración por triplicado.  
Tripsina 1X : Solución diluida de la enzima tripsina, que es una serina-proteasa 
pancreática, utilizada para liberar las células de una placa de cultivo celular; véase el apéndice III del informe de validación (4).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  ENSAYOS DE MUTACIÓN GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTICAS 
Y REPRODUCTORAS DE ROEDORES TRANSGÉNICOS  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de 
la OCDE TG 488 (2013). Hay métodos de ensayo de la UE para una amplia gama de ensayos de mutación  in vitro  que permiten detectar mutaciones 
génicas o cromosómicas. Se dispone de métodos de ensayo para algunos 
parámetros  in vivo  (es decir, aberraciones cromosómicas y síntesis de ADN 
no programada); sin embargo, estos no miden las mutaciones génicas. Los ensayos de mutación en roedores transgénicos (RTG) satisfacen la demanda de ensayos  in vivo  de mutaciones génicas que sean prácticos y estén am ­
pliamente disponibles. 
2. Los ensayos de mutación en RTG han sido objeto de una extensa revisión 
(24)(33). Utilizan ratas y ratones transgénicos que contienen múltiples co ­
pias de vectores lanzadera de plásmidos o de bacteriófagos, integradas en 
los cromosomas. Los transgenes contienen genes marcadores para la detec ­
ción de diversos tipos de mutaciones inducidas  in vivo  por las sustancias 
problema. 
3. Las mutaciones que se producen en los roedores se detectan a través de la 
recuperación del transgén y del análisis del fenotipo del gen marcador en un 
hospedador bacteriano que carece de dicho gen marcador. Los ensayos de 
mutación génica en RTG miden las mutaciones inducidas en genes genéti ­
camente neutros recuperados de prácticamente cualquier tejido de los roe ­
dores. Estos estudios, por tanto, soslayan muchas de las actuales limitacio ­
nes relativas al estudio de las mutaciones génicas  in vivo  en genes endó ­
genos (por ejemplo, la gama limitada de tejidos adecuados para el análisis, la selección positiva/negativa frente a las mutaciones). 
4. La ponderación de las pruebas sugiere que los transgenes responden a los 
mutágenos de manera similar a la de los genes endógenos, especialmente 
por lo que se refiere a la detección de sustituciones de un par de bases, desplazamiento del marco de lectura, y pequeñas deleciones e inserciones (24). 
5. Los talleres internacionales sobre ensayos de genotoxicidad (International 
Workshops on Genotoxicity Testing, IWGT) han refrendado la inclusión de 
los ensayos de mutación génica en RTG para la detección  in vivo  de 
mutaciones génicas, y han recomendado un protocolo para su aplicación (15)(29). El presente método se basa en estas recomendaciones. En apoyo 
del presente protocolo se pueden encontrar más análisis en (16). 
6. Se prevé que en el futuro se pueda combinar un ensayo de mutación génica 
en RTG con un estudio de toxicidad por administración continuada (método de ensayo B. 7 del presente anexo). Sin embargo, hacen falta datos para 
garantizar que la sensibilidad de los ensayos de mutación génica en RTG no 
se ve afectada por la diferencia del plazoentre el final del período de administración y el momento del muestreo, plazo que es de un día en el estudio de toxicidad por administración continuada, más breve que el plazo 
de tres días utilizado en los ensayos de mutación génica en RTG. También 
hacen falta datos que indiquen que el comportamiento del ensayo por administración continuada no se ve afectado negativamente por utilizar una cepa de roedores transgénicos en lugar de una cepa de roedores tradi ­
cionales. Cuando se disponga de estos datos, se actualizará el presente 
método de ensayo. 
7. Las definiciones de los términos clave figuran en el apéndice.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
CONSIDERACIONES INICIALES 
8. Los ensayos de mutación génica en RTG de los que se dispone de sufi ­
cientes datos para avalar su utilización en el presente método de ensayo son 
los siguientes: ratón con el bateriófago  lacZ  (Muta™Mouse); ratón con el 
plásmido  lacZ;  ratón y rata  gpt delta ( gpt y Spi  – ); ratón y rata  lacI  (Big 
Blue®), llevados a cabo en condiciones normales. Además, el ensayo de 
selección positiva  cII puede utilizarse para evaluar las mutaciones en los 
modelos Big Blue® y Muta™Mouse. La mutagénesis en los modelos de RTG se evalúa normalmente como la frecuencia de mutantes; cuando sea preciso, sin embargo, el análisis molecular de las mutaciones puede pro ­
porcionar información adicional (véase el punto 24). 
9. Estos ensayos de mutación génica  in vivo  en roedores están especialmente 
indicados para evaluar el peligro mutagénico, ya que las respuestas de los 
ensayos dependen del metabolismo  in vivo,  de la farmacocinética, de los 
procesos de reparación del ADN, y de la síntesis de ADN translesión, si bien dichos factores pueden variar según la especie, según el tejido y según 
los tipos de lesiones del ADN. Un ensayo  in vivo  de mutación génica es útil 
para ahondar en el estudio de los efectos mutagénicos detectados en ensa ­
yos in vitro,  y para el seguimiento de los resultados de ensayos que utilizan 
otros parámetros  in vivo  (24). Además de estar asociada como causa de la 
inducción del cáncer, la mutación génica es un parámetro importante para la predicción de enfermedades distintas del cáncer basadas en mutaciones en tejidos somáticos (12)(13), así como de enfermedades transmitidas por las 
células germinales. 
10. Si hay indicios de que la sustancia problema o un metabolito relevante no 
va a alcanzar ninguno de los tejidos de interés, no es apropiado llevar a 
cabo un ensayo de mutación génica en RTG.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
11. En los ensayos descritos en el punto 8, el gen diana procede de una bacteria 
o de un bacteriófago y el medio para recuperarlo del ADN genómico del roedor es la incorporación del transgén a un vector de lanzadera de bacte ­
riófagos λ o de plásmidos. El procedimiento implica la extracción de ADN 
genómico del tejido del roedor de interés, el tratamiento  in vitro  del ADN 
genómico (es decir, la encapsidación de los vectores λ, o la ligadura y 
electroporación de plásmidos para recuperar el vector de lanzadera), y la 
posterior detección de las mutaciones en hospedadores bacterianos en con ­
diciones adecuadas. Los ensayos emplean transgenes neutros que son fácil ­
mente recuperables de la mayor parte de los tejidos. 
12. El experimento de mutación génica en RTG de base implica el tratamiento 
de los roedores con una sustancia a lo largo de un plazo. Las sustancias pueden administrarse por cualquier vía adecuada, incluida la implantación 
(por ejemplo, ensayos de productos sanitarios). El plazo total durante el cual 
se administra la sustancia a un animal se denomina período de adminis ­
tración. La administración suele ir seguida de un período de tiempo, antes del sacrificio de los animales, durante el cual no se administra la sustancia y 
en el cual se fijan las lesiones de ADN no reparadas convirtiéndose en 
mutaciones estables. En la bibliografía, este período recibe diversas deno ­
minaciones, como tiempo de manifestación, tiempo de fijación o tiempo de expresión; este período termina en el momento del muestreo (15)(29). Des ­
pués de que se sacrifique el animal, se aísla el ADN genómico del tejido o 
tejidos de interés y se purifica.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Normalmente se agregan los datos obtenidos con un solo tejido por animal 
a partir de múltiples encapsidaciones/ligaduras, y la frecuencia de mutantes 
se evalúa en general utilizando un total de entre 10  5 y 10  7 unidades for ­
madoras de calvas o formadoras de colonias. Cuando se utilicen métodos de selección positiva, el total de unidades formadoras de calvas se determinará 
con un conjunto separado de placas no selectivas. 
14. Se han elaborado métodos de selección positiva para facilitar la detección 
de mutaciones en el gen  gpt  [ratón y rata  gpt  delta, fenotipo  gpt
 – 
(20)(22)(28)] y en el gen  lacZ  [Muta™Mouse o ratón con el plásmido  
lacZ (3)(10)(11)(30)], mientras que las mutaciones del gen  lacI  en animales 
Big Blue® se detectan mediante un método no selectivo que identifica las mutaciones mediante la generación de calvas de color (azul). También se dispone de una metodología de selección positiva para detectar las muta ­
ciones puntuales que se producen en el gen  cII del vector de lanzadera del 
bacteriófago λ [ratón o rata Big Blue®, y Muta™Mouse (17)] y las muta ­
ciones de deleción en los genes λ red y gam  [selección Spi
 – en ratón y rata  
gpt delta (21)(22)(28)]. La frecuencia de mutantes se calcula dividiendo el 
número de calvas/plásmidos que contienen mutaciones en el transgén por el 
número total de calvas/plásmidos recuperados de la misma muestra de ADN. En los estudios de mutación génica en RTG, el parámetro comuni ­
cado es la frecuencia de mutantes. Además, la frecuencia de mutación 
puede determinarse como la fracción de células que portan mutaciones independientes; este cálculo requiere que se apliquen correcciones para tener en cuenta la expansión clonal secuenciando los mutantes recuperados 
(24). 
15. Las mutaciones objeto de puntuación en los ensayos de mutación puntual en  
lacI, lacZ, cII  and gpt consisten principalmente en mutaciones de sustitu ­
ción de un par de bases, en mutaciones de desplazamiento del marco de 
lectura y en pequeñas inserciones y deleciones. La proporción relativa de 
estos tipos de mutación entre las mutaciones espontáneas es similar a la observada en el gen  Hprt  endógeno. Las grandes deleciones solo se detec ­
tan con los ensayos de selección de Spi
 – y del plásmido  lacZ  (24). Las 
mutaciones de interés son las mutaciones  in vivo  que se producen en el 
ratón o en la rata. Las mutaciones  in vitro  y ex vivo,  que pueden darse 
durante la recuperación, replicación o reparación de los bacteriófagos/plás ­
midos, son relativamente raras, y en algunos sistemas pueden identificarse 
específicamente, o excluirse del sistema de hospedador bacteriano/selección positiva.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Preparativos  
Selección de la especie animal  
16. Actualmente se dispone de una variedad de modelos para la detección de 
mutaciones génicas en ratones transgénicos, y estos sistemas ya se han 
utilizado más ampliamente que los modelos de ratas transgénicas. Cuando la rata sea un modelo claramente más adecuado que el ratón (por ejemplo, para investigar el mecanismo de la carcinogénesis de un tumor que solo se 
ha visto en ratas, para establecer una correlación con un estudio de toxici ­
dad en ratas, o si se sabe que el metabolismo de las ratas es más represen ­
tativo del metabolismo humano), debe considerarse la utilización de mode ­
los de ratas transgénicas.
 
Condiciones de alojamiento y alimentación  
17. Lo ideal es que el local de los animales de experimentación esté a una 
temperatura de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser, como 
mínimo, del 30 % y preferentemente no superar el 70 %, salvo durante la limpieza del local, debe procurarse que esté comprendida entre el 50 y el 60 %. La iluminación debe ser artificial, con una secuencia diaria de 12 
horas de luz y 12 horas de oscuridad. Puede proporcionarse una dieta 
alimentaria corriente para animales de laboratorio y agua a voluntad. La
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
elección de la dieta puede verse influida por la necesidad de garantizar una 
mezcla conveniente de la sustancia problema si se administra por esta vía. 
Los animales deben alojarse en grupos pequeños (no más de cinco animales juntos) del mismo sexo si no se espera una conducta agresiva. Los animales pueden alojarse por separado, si está justificado científicamente.
 
Preparación de los animales  
18. Se asignan aleatoriamente a los grupos de control y de tratamiento animales 
sanos, adultos jóvenes, maduros sexualmente (8-12 semanas de edad al inicio del tratamiento). Los animales se identifican inequívocamente y se aclimatan a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días. Las 
jaulas se colocan de manera que los posibles efectos debidos a la puesta de 
los animales en las mismas sean mínimos. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder de ± 20 % del peso medio de cada sexo.
 
Preparación de las dosis  
19. Las sustancias problema sólidas deben disolverse o suspenderse en disol ­
ventes o vehículos adecuados, o mezclarse con la dieta o con el agua de bebida, antes de su administración a los animales. Las sustancias problema líquidas pueden administrarse directamente o diluirse antes de la adminis ­
tración. En lo que respecta a la exposición por inhalación, las sustancias 
problema pueden administrarse en forma de gas, de vapor o de aerosol sólido o líquido, dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas. Han de emplearse preparaciones recientes de la sustancia problema, salvo que haya 
datos de estabilidad que demuestren que es posible conservarlas.
 
Condiciones del ensayo  
Disolvente o vehículo  
20. El disolvente o vehículo no debe producir efectos tóxicos a los volúmenes 
de dosis empleados, y no debe haber ninguna sospecha de que reaccione químicamente con la sustancia problema. Si se emplean disolventes o ve ­
hículos poco conocidos, debe disponerse de información de referencia que 
avale su compatibilidad. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso.
 
Controles positivos  
21. Normalmente deben utilizarse animales de control positivo en paralelo. Sin 
embargo, en el caso de laboratorios que hayan demostrado su competencia 
(véase el punto 23) y utilicen estos ensayos sistemáticamente, para confir ­
mar el éxito del método es posible incluir en cada estudio el ADN de animales de control positivo tratados anteriormente. Este ADN de experi ­
mentos anteriores debe obtenerse de la misma especie y de los mismos 
tejidos de interés, y estar almacenado correctamente (véase el punto 36). Cuando se utilicen controles positivos en paralelo, no es necesario adminis ­
trarlos por la misma vía que la sustancia problema; sin embargo, debe 
tenerse la certeza de que los controles positivos inducen mutaciones en 
uno o varios de los tejidos de interés para la sustancia problema. Las dosis de las sustancias de control positivo deben seleccionarse de manera que generen efectos débiles o moderados que sirvan para evaluar críticamente el 
comportamiento y la sensibilidad del ensayo. En el cuadro 1 se incluyen 
ejemplos de sustancias de control positivo y algunos de sus tejidos diana.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Cuadro 1  
Ejemplos de sustancias de control positivo y algunos de sus tejidos diana  
Sustancia de control positivo 
y n  o CAS Nombre EINECS y 
n o EINECS Características Tejido diana de la mutación 
Ratas Ratones  
N-etil-N-nitrosourea 
[N o CAS: 759-73-9] N-etil-N-nitrosourea 
[212-072-2] Mutágeno de ac ­
ción directa Hígado, pul ­
món Médula ósea, colon, 
epitelio del colon, intestino, hígado, 
pulmones, bazo, ri ­
ñones, células de la granulosa del ovario, células germinales 
masculinas 
Carbamato de etilo (ureta ­
no) 
[N
 o CAS: 51-79-6] Uretano 
[200-123-1] Mutágeno, re ­
quiere metabo ­
lismo pero tiene solo efectos débi ­
les Médula ósea, parte 
anterior del estóma ­
go, intestino delga ­
do, hígado, pulmo ­
nes, bazo 
2,4-Diaminotolueno 
[n
 o CAS 95-80-7] 4-Metil-m-fenilendia ­
mina 
[202-453-1] Mutágeno, re ­
quiere metabolis ­
mo, también posi ­
tivo en el ensayo Spi
 – Hígado Hígado 
Benzo[e]pireno 
[n o CAS 50-32-8] Benzo[def]criseno 
[200-028-5] Mutágeno, re ­
quiere metabo ­
lismo Hígado, epi ­
plones Médula ósea, mama, 
colon, parte anterior 
del estómago, estó ­
mago glandular, hí ­
gado, corazón, pul ­
mones, células ger ­
minales masculinas  
Controles negativos  
22. Deben incluirse controles negativos en cada momento de muestreo, tratados 
únicamente con el disolvente o vehículo, pero por lo demás de la misma 
manera que los grupos de tratamiento. Si no se tienen datos de control, históricos o publicados, que indiquen que el disolvente/vehículo elegido no induce ningún efecto perjudicial ni mutagénico, deben incluirse también en 
cada momento de muestreo controles sin tratar, a fin de establecer que es 
aceptable el control del vehículo.
 
Verificación de la competencia del laboratorio  
23. Debe establecerse la competencia en estos ensayos demostrando la capaci ­
dad de reproducir los resultados previstos a partir de los datos publicados (24) en relación con: 1) la frecuencia de mutantes con sustancias de control 
positivo (incluidas las respuestas débiles) como las que figuran en el cuadro 
1, con no mutágenos, y con controles del vehículo; y 2) la recuperación de transgenes a partir del ADN genómico (por ejemplo, eficacia de la encap ­
sidación).
 
Secuenciación de los mutantes  
24. A efectos normativos, no es necesario secuenciar el ADN de los mutantes, 
en particular en caso de que se obtenga un resultado positivo o negativo claro. Sin embargo, los datos de secuenciación pueden ser útiles si se 
observa una elevada variación entre individuos. En estos casos, la secuen ­
ciación puede utilizarse para excluir la posibilidad de «botes» o
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
sucesos clonales determinando la proporción de mutantes individuales de un 
tejido concreto. La secuenciación de unos diez mutantes por tejido y por 
animal debe ser suficiente para determinar simplemente si los mutantes clonales contribuyen a la frecuencia de mutantes; puede ser necesario llegar a secuenciar 25 mutantes para corregir matemáticamente la frecuencia de 
mutantes en cuanto a la clonalidad. También puede pensarse en realizar la 
secuenciación de mutantes cuando se encuentren pequeños aumentos de la frecuencia de mutantes (es decir, que esta sea muy poco superior a los valores del control sin tratar). La presencia de un efecto mutagénico puede 
verse reforzada si se encuentran diferencias en el espectro de mutantes entre 
las colonias mutantes de los animales tratados y las de los animales sin tratar (29). Asimismo, los espectros de mutación pueden ser útiles para elaborar hipótesis sobre mecanismos. Cuando la secuenciación vaya a in ­
cluirse como parte del protocolo del estudio, debe ponerse especial cuidado 
en el diseño de dichos estudios, en particular en lo que se refiere al número de mutantes secuenciados por muestra, para alcanzar una potencia adecuada de acuerdo con el modelo estadístico utilizado (véase el punto 43).
 
PROCEDIMIENTO  
Número y sexo de los animales  
25. El número de animales de cada grupo debe determinarse previamente de 
forma que sea suficiente para proporcionar la potencia estadística necesaria 
a fin de detectar, como mínimo, una duplicación de la frecuencia de mu ­
tantes. Los grupos consistirán en un mínimo de cinco animales; no obstante, si la potencia estadística es insuficiente, debe aumentarse el número de 
animales en la medida necesaria. Normalmente deben utilizarse animales 
machos. Puede haber casos en que esté justificado utilizar solo hembras; por ejemplo, cuando se realicen pruebas de medicamentos específicos para mujeres, o cuando se investigue el metabolismo específico de la mujer. 
Si existen diferencias importantes entre sexos en términos de toxicidad o 
metabolismo, será necesario utilizar tanto machos como hembras.
 
Período de administración  
26. Sobre la base de observaciones que demuestran que las mutaciones se 
acumulan con cada tratamiento, es necesario aplicar un régimen de adminis ­
tración continuada, con tratamientos diarios durante un período de 28 días. 
En general, esto se considera aceptable tanto para producir una acumulación 
suficiente de mutaciones debidas a mutágenos débiles, como para conseguir un tiempo de exposición adecuado que permita detectar las mutaciones en los órganos de proliferación lenta. Otros regímenes de tratamiento pueden 
ser apropiados para algunas evaluaciones; en tal caso, tienen que justificarse 
científicamente en el protocolo. Los tratamientos no deben ser más breves que el tiempo necesario para la completa inducción de todas las enzimas de metabolización pertinentes, y los tratamientos más cortos pueden requerir el 
uso de múltiples momentos de muestreo que sean idóneos para órganos con 
diferentes velocidades de proliferación. En cualquier caso, toda la informa ­
ción disponible (por ejemplo, sobre toxicidad general o sobre metabolismo y toxicocinética) debe utilizarse para justificar un protocolo, especialmente 
cuando este no se atiene a las citadas recomendaciones normales. Si bien 
pueden incrementar la sensibilidad, el recurrir a tratamientos de más de 8 semanas de duración debe explicarse de forma clara y justificada, ya que los tratamientos largos pueden provocar un aparente incremento de la frecuen ­
cia de mutantes debido a la expansión clonal (29).
 
Dosis  
27. Las dosis deben basarse en los resultados de un estudio de determinación de 
la gama de dosis en el que se determine la toxicidad general utilizando la 
misma vía de exposición, o bien en los resultados de estudios anteriores de toxicidad subaguda. Para la determinación de la gama de dosis pueden utilizarse animales no transgénicos de la misma cepa de roedores. En el 
ensayo principal, a fin de obtener información sobre la relación 
dosis-respuesta, para que el estudio sea completo debe incluir un grupo
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
de control negativo (véase el punto 22) y un mínimo de tres dosis debida ­
mente espaciadas, excepto en caso de que se haya utilizado la dosis límite 
(véase el punto 28). La dosis superior debe representar la dosis máxima tolerada (DMT). Esta DMT se define como la dosis que produce signos de toxicidad tales que, si se administrara una dosis superior según el mismo 
protocolo de administración, resultaría probablemente letal. Las sustancias 
que tienen actividades biológicas específicas a dosis bajas no tóxicas (tales como las hormonas y los mitógenos) y las sustancias que presentan satu ­
ración de las propiedades toxicocinéticas pueden constituir excepciones para 
los criterios de determinación de las dosis y deben evaluarse caso por caso. 
La gama de dosis utilizada deberá abarcar desde la toxicidad máxima hasta una toxicidad escasa o nula.
 
Prueba límite  
28. Si los experimentos destinados a determinar la gama de dosis, o los datos 
existentes procedentes de cepas relacionadas de roedores, indican que un 
régimen de tratamiento con, como mínimo, la dosis límite (véase más adelante) no produce efectos tóxicos observables, y si no es previsible que se produzca genotoxicidad sobre la base de los datos de sustancias 
estructuralmente relacionadas, entonces podrá no considerarse necesario re ­
alizar un estudio completo con tres niveles de dosis. Para un período de administración de 28 días (es decir, 28 tratamientos diarios), la dosis límite es de 1 000 mg/kg peso corporal al día. Para períodos de administración de 
14 días o menos, la dosis límite es de 2 000 mg/kg peso corporal al día (las 
posologías que se aparten del régimen de 28 tratamientos diarios deben justificarse científicamente en el protocolo; véase el punto 26).
 
Administración de las dosis  
29. La sustancia problema suele administrarse por vía oral forzada mediante 
sonda gástrica o con una cánula de intubación adecuada. En general, a la hora de diseñar el ensayo debe tenerse en cuenta la vía prevista de expo ­
sición humana. Por consiguiente, puede ser aceptable, siempre que se jus ­
tifique, utilizar otras vías de exposición (tales como el agua de bebida, la 
inyección subcutánea o intravenosa, la vía tópica, la inhalación, la adminis ­
tración intratraqueal, los alimentos, o la implantación). No se recomienda la inyección intraperitoneal, ya que no es una vía fisiológicamente pertinente 
para la exposición humana. El volumen máximo de líquido que puede 
administrarse de una sola vez por vía oral forzada o por inyección depende del tamaño del animal utilizado. El volumen no debe superar los 2 ml/100 g de peso corporal. El uso de volúmenes superiores a este deberá justificarse. 
Excepto en el caso de sustancias irritantes o corrosivas que provoquen 
normalmente efectos exacerbados a concentraciones superiores, la variabi ­
lidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concen ­
tración para que el volumen sea constante en todas las dosis.
 
Momento del muestreo  
Células somáticas  
30. El momento del muestreo es una variable crítica, ya que viene determinado 
por el período necesario para que las mutaciones queden fijadas. Este 
período depende de cada tejido y parece estar relacionado con la velocidad de renovación de la población celular; así, la médula ósea y el intestino responden rápidamente, mientras que el hígado es mucho más lento. Un 
compromiso adecuado para la medición de la frecuencia de mutantes en 
tejidos que proliferan tanto deprisa como despacio es el de 28 tratamientos diarios consecutivos (como se indica en el punto 26), con la realización del muestreo tres días después del último tratamiento, aunque la frecuencia 
máxima de mutantes puede no manifestarse en estas condiciones en los 
tejidos de proliferación lenta. Si son de particular importancia los tejidos de proliferación lenta, puede ser más adecuado hacer el muestreo después, a los 28 días de haber acabado el período de administración de 28 días 
(16)(29). En estos casos, el momento del muestreo posterior sustituiría al 
muestreo a los tres días, y exigiría una justificación científica.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Células germinales  
31. Los ensayos con RTG son adecuados para el estudio de la inducción de 
mutaciones génicas en células germinales masculinas (7)(8)(27), en las que están bien definidos el calendario y la cinética de la espermatogénesis (27). 
El bajo número de óvulos disponible para el análisis, incluso después de 
una superovulación, y el hecho de que no haya síntesis de ADN en el ovocito, impiden la determinación de mutaciones en las células germinales femeninas utilizando ensayos transgénicos (31). 
32. Los momentos del muestreo para las células germinales masculinas deben 
seleccionarse de forma que se tomen muestras de la gama de tipos de 
células expuestas a lo largo de todo el desarrollo de las células germinales, y que la fase diana del muestreo haya recibido una suficiente exposición. El tiempo necesario para que las células germinales en desarrollo pasen de la 
fase de espermatogonios a la de esperma maduro que alcanza el conducto 
deferente/cola del epidídimo es de unos 49 días en el caso del ratón (36) y de unos 70 días en el de la rata (34)(35). Tras una exposición de 28 días 
con un plazo posterior de tres días antes de realizar el muestreo, el esperma 
acumulado recogido del conducto deferente/cola del epidídimo (7)(8) repre ­
senta a la población de células expuestas durante aproximadamente la se ­
gunda mitad de la espermatogénesis, que incluye los períodos meiótico y 
postmeiótico, pero no el período de espermatogonio o célula precursora. 
Para tomar muestras adecuadas de células del conducto deferente/cola del epidídimo que eran espermatogonios durante el período de exposición, hace falta un muestreo adicional cuando hayan pasado al menos siete semanas 
(ratones) o diez semanas (ratas) desde el final del tratamiento. 
33. Las células extraídas de los túbulos seminíferos después de un régimen de 
28 + 3 días comprenden una población mixta enriquecida con todas las fases de las células germinales en desarrollo (7)(8). El muestreo de estas células para la detección de mutaciones génicas no proporciona una eva ­
luación tan precisa de las fases en las que se inducen las mutaciones de las 
células germinales como la que puede conseguirse con el muestreo de los espermatozoides del conducto deferente/cola del epidídimo (ya que las cé ­
lulas germinales recogidas de los túbulos son de diversos tipos, y habrá 
algunas células somáticas que contaminen a esta población celular). Sin 
embargo, el muestreo de las células de los túbulos seminíferos además del de los espermatozoides del conducto deferente/cola del epidídimo des ­
pués de solo un régimen de muestreo de 28 + 3 días incluiría en cierta 
medida las células expuestas durante la mayoría de las fases del desarrollo 
de las células germinales, y podría ser útil para detectar ciertos mutágenos de las células germinales.
 
Observaciones  
34. Debe hacerse una observación clínica general al menos una vez al día, 
preferentemente a la misma hora cada día y teniendo en cuenta el período 
más agudo de los efectos previstos tras la administración. Se registrará el 
estado de salud de los animales. Al menos dos veces al día, se debe observar la posible morbilidad y mortalidad de todos los animales. Deben pesarse todos los animales al menos una vez por semana y en el momento 
del sacrificio. El consumo de alimentos debe medirse al menos semanal ­
mente. Si la sustancia problema se administra con el agua de bebida, debe medirse el consumo de agua cada vez que se cambie el agua y al menos una vez por semana. Los animales que presenten signos de toxicidad exce ­
siva pero no letal deben sacrificarse antes de que termine el período del 
ensayo (23).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Recogida de tejidos  
35. Debe definirse claramente la justificación de la recogida de tejidos. Te ­
niendo en cuenta que es posible estudiar la inducción de mutaciones en 
prácticamente cualquier tejido, la selección de los tejidos que van a reco ­
gerse ha de basarse en el motivo de la realización del estudio y en los eventuales datos disponibles sobre mutagenicidad, carcinogenicidad o toxi ­
cidad de la sustancia problema. Entre los factores importantes que deben 
considerarse están la vía de administración (sobre la base de la probable vía o vías de exposición humana), la distribución tisular prevista y el posible mecanismo de acción. A falta de información de base, deben recogerse 
varios tejidos somáticos que puedan ser de interés. Estos deben ser repre ­
sentativos de tejidos de proliferación rápida, de los de proliferación lenta y de los del lugar de contacto. Por otra parte, deben recogerse espermatozoi ­
des del conducto deferente/cola del epidídimo y células germinales en de ­
sarrollo de los túbulos seminíferos (como se describe en los puntos 32 y 
33), y reservarse por si en el futuro es necesario hacer estudios de muta ­
genicidad en células germinales. Debe obtenerse el peso de los órganos y, en el caso de los órganos grandes, hay que recoger la misma zona de todos 
los animales.
 
Almacenamiento de tejidos y ADN  
36. Los tejidos (o sus homogeneizados) deben conservarse a una temperatura 
igual o inferior a – 70 °C y usarse para aislar el ADN en el plazo de cinco 
años. Lo ideal es que el ADN aislado, conservado en refrigeración a 4 °C 
en solución amortiguadora adecuada, se utilice en el plazo de un año para el análisis de las mutaciones.
 
Selección de tejidos para análisis de mutantes  
37. La selección de tejidos debe basarse en las consideraciones siguientes: 1) la 
vía de administración o el lugar de primer contacto (por ejemplo, el estó ­
mago glandular si la administración es oral, el pulmón si la administración se hace por inhalación, o la piel si se utiliza la aplicación tópica); y 2) los parámetros farmacocinéticos observados en los estudios de toxicidad gene ­
ral, que indican la eliminación, la retención o la acumulación en los tejidos, 
o los órganos diana de la toxicidad. Cuando se realicen estudios de segui ­
miento de estudios de carcinogenicidad, deben tenerse en cuenta los tejidos diana de la carcinogenicidad. La selección de los tejidos para el análisis 
debe maximizar la detección de sustancias que sean mutágenos de acción 
directa  in vitro,  las rápidamente metabolizadas, las muy reactivas o poco 
absorbidas, o aquellas cuyo tejido diana esté determinado por la vía de administración (6). 
38. A falta de información de base y teniendo en cuenta el lugar de contacto 
debido a la vía de administración, debe evaluarse la mutagenicidad en el hígado y, al menos, en un tejido que se divida rápidamente (por ejemplo, el estómago glandular o la médula ósea). En la mayoría de los casos, los 
requisitos anteriores pueden cumplirse analizando dos tejidos seleccionados 
cuidadosamente, pero en algunos casos pueden ser necesarios tres o más. Si hay razones para una preocupación específica por los efectos sobre las células germinales, incluidas las respuestas positivas en células somáticas, 
debe evaluarse la inducción de mutaciones en los tejidos de las célulasger ­
minales.
 
Métodos de medición  
39. Se dispone de métodos de laboratorio normales o publicados para la detec ­
ción de mutantes con los modelos transgénicos recomendados: bacteriófago 
lambda y plásmido  lacZ  (30); ratón  lacI  (2)(18); ratón  gpt delta (22); rata  
gpt delta (28);  cII (17). Las eventuales modificaciones deben justificarse y 
documentarse adecuadamente. Pueden agregarse los datos de las diversas encapsidaciones, y utilizarse para llegar a un número adecuado de calvas o 
colonias. No obstante, la necesidad de un número elevado de reacciones de 
encapsidación para alcanzar el número adecuado de calvas puede ser un
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
signo de la mala calidad del ADN. En estos casos, los datos deben consi ­
derarse con precaución, ya que podrían ser poco fiables. El número total 
óptimo de calvas o colonias por muestra de ADN se rige por la probabi ­
lidad estadística de detectar un número suficiente de mutantes con una determinada frecuencia de mutantes espontáneos. En general, hace falta 
un mínimo de 125 000 a 300 000 calvas si la frecuencia de mutantes es ­
pontáneos es del orden de 3 × 10
 –5 (15). Para el ensayo con  lacI  en 
animales Big Blue®, es importante demostrar que toda la gama de fenotipos de color mutante puede detectarse mediante la inclusión de controles de 
color adecuado en paralelo con cada siembra en placa. Los tejidos y las 
consiguientes muestras (elementos) deben procesarse y analizarse utilizando un diseño en bloques, de forma que se procesen juntos los elementos del grupo de control del vehículo/disolvente, los del grupo de control positivo 
(en caso de utilizarse) o los del ADN de control positivo (en su caso), y los 
de cada grupo de tratamiento.
 
DATOS E INFORME  
Tratamiento de los resultados  
40. Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de cuadro. La 
unidad experimental es el animal. El informe debe incluir el número total de 
unidades formadoras de calvas o de unidades formadoras de colonias, el 
número de mutantes, y la frecuencia de mutantes para cada tejido de cada animal. Si hay varias reacciones de encapsidación/rescate, debe indicarse el número de reacciones por muestra de ADN. Aunque hay que conservar los 
datos de cada una de las reacciones, solo es necesario recoger en el informe 
el número total de unidades formadoras de calvas o de colonias. Deben comunicarse en el informe los datos sobre toxicidad y los signos clínicos, según lo establecido en el punto 34. Deben presentarse los resultados de las 
eventuales secuenciaciones de cada mutante analizado, y deben indicarse los 
cálculos de la frecuencia de mutación resultante para cada animal y tejido.
 
Evaluación estadística e interpretación de los resultados  
41. Son varios los criterios para determinar si un resultado es positivo, tales 
como el aumento en la frecuencia de mutantes relacionado con la dosis, o 
un claro aumento en la frecuencia de mutantes en un único grupo tratado 
con la sustancia problema, en comparación con el grupo de control del disolvente o vehículo. Deben analizarse al menos tres grupos tratados con la sustancia problema a fin de obtener datos suficientes para el análisis de la 
relación dosis-respuesta. Si bien la consideración principal corresponde a la 
importancia biológica de los resultados, pueden utilizarse métodos estadís ­
ticos adecuados como ayuda para evaluar los resultados del ensayo (4)(14)(15)(25)(26). Las pruebas estadísticas utilizadas deben considerar 
como unidad experimental al animal. 
42. Una sustancia problema cuyos resultados no se ajusten a los criterios ante ­
riores en ningún tejido se considerará no mutagénica en este ensayo. En cuanto a la importancia biológica de un resultado negativo, debe confir ­
marse la exposición tisular. 
43. Para los análisis de secuenciación del ADN, se dispone de una serie de 
enfoques estadísticos para ayudar a la interpretación de los resultados (1)(5)(9)(19). 
44. Para la evaluación de la significación biológica de la respuesta puede servir 
de orientación considerar si los valores observados se encuentran dentro o 
fuera del rango del control histórico (32).
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Informe del ensayo  
45. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— datos de identificación y n  o CAS, si se conoce; 
— origen y número de lote, si está disponible; 
— naturaleza física y pureza; 
— propiedades fisicoquímicas importantes para la realización del estudio; 
— estabilidad de la sustancia problema, si se conoce;  
Disolvente o vehículo:  
— justificación de la elección del vehículo; 
— solubilidad y estabilidad de la sustancia problema en el disolvente o 
vehículo, si se conocen; 
— preparación de formulaciones para la administración con los alimentos, 
con el agua de bebida o por inhalación; 
— determinaciones analíticas de las formulaciones (por ejemplo, estabili ­
dad, homogeneidad, concentraciones nominales);  
Animales de experimentación:  
— especie y cepa utilizadas y justificación de la elección; 
— número, edad y sexo de los animales; 
— origen, condiciones de alojamiento, dieta, etc. 
— peso de cada animal al principio del ensayo, incluido el intervalo de 
pesos corporales, la media y la desviación típica de cada grupo;  
Condiciones del ensayo:  
— datos de los controles positivos y negativos (vehículo o disolvente); 
— datos del estudio de determinación de la gama de dosis; 
— justificación de la selección de las dosis; 
— detalles de la formulación de la sustancia problema; 
— datos sobre la administración de la sustancia problema; 
— fundamento de la elección de la vía de administración; 
— métodos de determinación de la toxicidad para los animales, incluidos 
los eventuales análisis histopatológicos o hematológicos y la frecuencia 
con que se han medido los pesos corporales y se han realizado las 
observaciones de los animales; 
— métodos de comprobación de que la sustancia problema ha alcanzado el 
tejido diana, o la circulación general, si se obtienen resultados 
negativos;  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— dosis reales (mg/kg peso corporal/día), calculadas a partir del consumo y 
de la concentración (ppm) de la sustancia problema en los alimentos o 
en el agua de bebida, en su caso; 
— datos sobre la calidad de los alimentos y del agua; — descripción detallada de las pautas de tratamiento y muestreo y justifi ­
cación de las decisiones; 
— método de sacrificio compasivo; — procedimientos de aislamiento y conservación de los tejidos; — métodos de aislamiento del ADN genómico de los roedores, rescate del 
transgén desde el ADN genómico, y transferencia del ADN transgénico a un hospedador bacteriano; 
— origen y números de lote de todas las células, equipos y reactivos 
(cuando proceda); 
— métodos de recuento de mutantes; — métodos de análisis molecular de mutantes y su utilización para la 
corrección de la clonalidad o para el cálculo de las frecuencias de 
mutación, en su caso;
 
Resultados:  
— estado de los animales antes y a lo largo de la prueba, incluidos los 
signos de toxicidad; 
— peso corporal y de los órganos en el momento del sacrificio; — respecto a cada tejido o animal, número de mutantes, número de calvas 
o de colonias evaluadas, frecuencia de mutantes; 
— respecto a cada grupo de tejidos o de animales, número de reacciones de 
encapsidación por muestra de ADN, número total de mutantes, frecuen ­
cia media de mutantes, desviación típica; 
— relación dosis-respuesta, cuando sea posible; — respecto a cada tejido o animal, número de mutantes independientes y 
frecuencia media de mutación, cuando se haya llevado a cabo el análisis molecular de las mutaciones; 
— datos sobre los controles negativos en paralelo y los históricos, con las 
gamas, medias y desviaciones típicas; 
— datos del control positivo en paralelo (o del control positivo de ADN no 
en paralelo); 
— determinaciones analíticas, si se dispone de ellas (por ejemplo, concen ­
traciones de ADN utilizadas para la encapsidación, datos de secuencia ­
ción del ADN); 
— análisis estadísticos y métodos aplicados;
 
Discusión de los resultados  
Conclusión  ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
BIBLIOGRAFÍA  
(1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol. , 194: 391-396. 
(2) Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107–112. 
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  
Mutations’  Nature,  377(6550): 657–659 
(4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’  , Environ. Mol. Mutagen,  25(3): 
246–255. 
(5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413. 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis,  14(1): 141–151. 
(7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. Sci. USA,  
92: 7485-7489. 
(8) Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2-3): 197-212. 
(9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics,  156: 1411–1418. 
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  86(20): 7971–7975. 
(11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques,  14(3): 326, 330. 
(12) Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125-136. 
(13) Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96-106 . 
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis,  13(3): 249–255. 
(15) Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Dou ­
glas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Sko ­
pek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen. , 35: 253-259. 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mu ­
tagen. , 41: 1-6.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  Mu­
tations in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. Sci. 
USA,  93(17): 9073–9078. 
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mu ­
tagenicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218. 
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772-778. 
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi  – 
and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470. 
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen. , 34(1): 9–15. 
(22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215. 
(23) OCDE (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, 
ENV/JM/MONO(2000)7, OCDE, París. 
(24) OCDE (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OCDE, París. 
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245. 
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289. 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164-193. 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78. 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glick ­
man, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Transgenic Mu ­
tation Assays’,  Mutation Res. , 540: 141-151. 
(30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo’  in: G. Pfeifer (ed.),  
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  Ple­
num Press, New York, NY, USA, pp. 391–410.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res. , 578(1-2): 117- 
123. 
(32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control 
Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007. 
(33) OCDE (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test Gui ­
deline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays,  Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OCDE, París. 
(34) Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198- 236. 
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epididy ­
mis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, 
J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, 
the Netherlands, pp. 1071-1148. 
(36) Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Apéndice  
DEFINICIONES  
Período de administración : Período total durante el cual se administra la sus ­
tancia problema a los animales.  
Sustitución de un par de bases : Tipo de mutación que provoca la sustitución de 
una sola base nucleotídica del ADN por otra base nucleotídica del ADN.  
Cápside : Cápsula de proteína que rodea a una partícula vírica.  
Sustancia : Sustancia o mezcla.  
Expansión clonal : Producción de muchas células a partir de una sola célula 
(mutante).  
Unidad formadora de colonias : Medida del número de bacterias viables.  
Concatémero : Larga biomolécula continua formada por múltiples copias idénti ­
cas unidas en serie.  
Sitio cos : Segmento de doce nucleótidos de ADN monocatenario que existe a 
ambos extremos del genoma bicatenario del bacteriófago lambda.  
Deleción : Mutación en la que el genoma pierde uno o varios nucleótidos (se ­
cuenciales).  
Electroporación : Aplicación de impulsos eléctricos para aumentar la permeabi ­
lidad de las membranas celulares.  
Gen endógeno : Gen originario del genoma.  
Variación extrabinomial : Variabilidad en las estimaciones repetidas de una 
proporción de la población que es mayor que la que se podría esperar si la población tuviera una distribución binomial.  
Mutación de desplazamiento del marco de lectura : Mutación genética causada 
por inserciones o deleciones de un número de nucleótidos que no es divisible exactamente por tres dentro de una secuencia de ADN que codifica para una 
proteína o péptido.  
Inserción : Adición de uno o varios pares de bases nucleotídicas a una secuencia 
de ADN.  
«Bote» : Gran número de mutantes obtenidos mediante la expansión clonal de 
una sola mutación.  
Grandes deleciones : Deleciones en el ADN de más de varias kilobases (que se 
detectan eficazmente con los ensayos de selección de Spi
 – y del plásmido  lacZ ). 
Ligadura : Unión covalente de dos extremos de las moléculas de ADN mediante 
una ADN-ligasa.  
Mitógeno : Sustancia que estimula a una célula para comenzar la división celular, 
provocando la mitosis (es decir, la división celular).  
Gen neutro : Gen que no se ve afectado por presiones selectivas positivas ni 
negativas.  
Encapsidación : Síntesis de partículas infecciosas de un fago a partir de una 
preparación de proteínas de la cápside y de la cola del fago y de un concatémero 
de moléculas de ADN del fago. Se usa comúnmente para encapsidar ADN 
clonado en un vector lambda (separado por sitios cos) a fin de integrarlo en partículas lambda infecciosas.  
Eficacia de la encapsidación : Eficacia con la que se recuperan en las bacterias 
hospedadoras los bacteriófagos encapsidados.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Unidad formadora de calvas : Medida del número de bacteriófagos viables.  
Mutación puntual : Término general que designa a las mutaciones que solo 
afectan a una pequeña secuencia de ADN y que incluyen a las pequeñas inser ­
ciones, deleciones y sustituciones de un par de bases.  
Selección positiva : Método que permite sobrevivir solo a los mutantes.  
Gen marcador : Gen cuyo producto génico mutante se detecta fácilmente.  
Momento del muestreo : Final del plazo, antes del sacrificio, durante el cual no 
se administra la sustancia problema y en el cual se fijan las lesiones de ADN no 
reparadas convirtiéndose en mutaciones estables.  
Vector de lanzadera : Vector construido de manera que pueda propagarse en dos 
especies hospedadoras diferentes; en consecuencia, el ADN insertado en un vector de lanzadera puede ser objeto de examen o de manipulación en dos tipos de células diferentes o en dos organismos diferentes.  
Sustancia problema : Sustancia o mezcla estudiada con este método de ensayo.  
Transgénico : Relativo a un organismo cuyo genoma ha sido alterado por la 
transferencia de uno o varios genes de otra especie.
 ▼M5 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
PARTE C: MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA 
ECOTOXICIDAD  
ÍNDICE 
C.1. TOXICIDAD AGUDA EN PECES 
C.2. ENSAYO DE INMOVILIZACIÓN AGUDA DE  DAPHNIA  SP 
C.3. PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE ALGAS Y 
CIANOBACTERIAS DE AGUA DULCE 
C.4. DETERMINACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD «FÁCIL» 
PARTE I. CONSIDERACIONES GENERALES 
PARTE II. ENSAYO BASADO EN LA PÉRDIDA DE COD (Método C.4-A) 
PARTE III. ENSAYO DE DETECCIÓN DE LA OCDE MODIFICADO (Mé ­
todo C.4-B) 
PARTE IV. ENSAYO DE DESPRENDIMIENTO DE CO  2 (Método C.4-C) 
PARTE V. RESPIROMETRÍA MANOMÉTRICA (Método C.4-D) PARTE VI. ENSAYO DEL FRASCO CERRADO (Método C.4-E) 
PARTE VII. ENSAYO DEL M.I.T.I. (Método C.4-F) 
C.5 DEGRADACIÓN: DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXÍGENO 
C.6. DEGRADACIÓN: DEMANDA QUÍMICA DE OXÍGENO C.7. DEGRADACIÓN — DEGRADACIÓN ABIÓTICA: HIDRÓLI ­
SIS EN FUNCIÓN DEL PH 
C.8. TOXICIDAD PARA GUSANOS DE TIERRA 
C.9. BIODEGRADACIÓN — PRUEBA ZAHN-WELLENS 
C.10. PRUEBA DE SIMULACIÓN DE TRATAMIENTO AERÓBICO 
DE AGUAS RESIDUALES: C.10-A: UNIDADES DE LODO 
ACTIVADO — C.10-B: BIOPELÍCULAS 
C.11. BIODEGRADACIÓN — LODO ACTIVADO: PRUEBA DE IN ­
HIBICIÓN DE LA RESPIRACIÓN 
C.12. BIODEGRADACIÓN — PRUEBA LASC MODIFICADA 
C.13 BIOCONCENTRACIÓN: ENSAYO DINÁMICO CON PECES 
C.14. ENSAYO DE CRECIMIENTO EN PECES JUVENILES 
C.15. ENSAYO DE TOXICIDAD A CORTO PLAZO EN  EMBRIO ­
NES DE PEZ Y ALEVINES 
C.16. ENSAYO DE TOXICIDAD ORAL AGUDA EN ABEJAS 
C.17. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA POR CONTACTO EN 
ABEJAS 
C.18. ADSORCIÓN/DESORCIÓN SEGÚN UN MÉTODO EQUILI ­
BRADO POR LOTES
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. CÁLCULO DEL COEFICIENTE DE ADSORCIÓN  (K  OC ) EN 
SUELOS Y EN LODOS DE AGUAS RESIDUALES ME ­
DIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLU ­
CIÓN (HPLC) 
C.20 ENSAYO DE REPRODUCCIÓN EN  DAPHNIA MAGNA  
C.21. MICROORGANISMOS DEL SUELO: ENSAYO DE TRANS ­
FORMACIÓN DEL NITRÓGENO 
C.22. MICROORGANISMOS DEL SUELO: ENSAYO DE TRANS ­
FORMACIÓN DEL CARBONO 
C.23. TRANSFORMACIÓN AEROBIA Y ANAEROBIA EN EL 
SUELO 
C.24. TRANSFORMACIÓN AEROBIA Y ANAEROBIA EN SISTE ­
MAS DE SEDIMENTOS ACUÁTICOS 
C.25. MINERALIZACIÓN AEROBIA EN AGUAS SUPERFICIALES. 
ENSAYO DE SIMULACIÓN DE LA BIODEGRADACIÓN 
C.26. PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE  LEMNA  SPP. 
▼M4 
C.27. ENSAYO DE TOXICIDAD PARA QUIRONÓMIDOS EN SIS ­
TEMAS SEDIMENTO-AGUA CON SEDIMENTO ENRIQUE ­
CIDO 
C.28. ENSAYO DE TOXICIDAD PARA QUIRONÓMIDOS EN SIS ­
TEMAS SEDIMENTOS-AGUA CON AGUA ENRIQUECIDA 
C.29. BIODEGRADABILIDAD FÁCIL—CO  2 EN RECIPIENTES SE ­
LLADOS (ENSAYO DEL ESPACIO DE CABEZA) 
C.30. BIOACUMULACIÓN EN OLIGOQUETOS TERRESTRES  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. TOXICIDAD AGUDA EN PECES  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El objeto de este ensayo es determinar la toxicidad letal aguda de 
una sustancia en peces de agua dulce. Es conveniente disponer, en la 
medida de lo posible, de una amplia información sobre la hidroso ­
lubilidad, la presión de vapor, la estabilidad química, las constantes de disociación y la biodegradabilidad de la sustancia de ensayo, con 
el fin de seleccionar el método de ensayo más apropiado (estático, 
semiestático, dinámico), que permita garantizar concentraciones constantes de la sustancia de ensayo durante todo el período de 
ensayo. 
Tanto en la planificación del ensayo como en la interpretación de los 
resultados deberá tenerse en cuenta otro tipo de información suple ­
mentaria (por ejemplo, la fórmula estructural, el grado de pureza, la naturaleza y porcentaje de impurezas significativas, la presencia y cantidad de aditivos, así como el coeficiente de reparto n-octanol/ 
agua)
 
1.2. DEFINICIÓN Y UNIDADES 
La toxicidad aguda es el efecto adverso, discernible, inducido en un 
organismo como consecuencia de la exposición a una sustancia dada durante un corto período de tiempo (días). En el presente ensayo, la toxicidad aguda viene expresada como la concentración letal media 
(CL
 50 ), es decir, la concentración que, en el agua, causa la muerte 
del 50 % de los peces de un lote sometido a ensayo durante un período de exposición continuo que debe indicarse. 
Todas las concentraciones de la sustancia de ensayo se expresan en 
peso por volumen (mg/l). Pueden expresarse también en peso por 
peso (mg/kg
 -1 ). 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Se podrá efectuar un ensayo con una sustancia de referencia a fin de 
demostrar que, en las condiciones experimentales de laboratorio, la 
respuesta de la especie sometida al ensayo no ha variado significa ­
tivamente. 
Para este ensayo no se especifica ninguna sustancia de referencia.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Puede realizarse una prueba límite a 100 mg/l, para demostrar que la 
CL 50 es mayor que esta concentración. 
Se exponen los peces a la sustancia o sustancias de ensayo añadidas 
al agua, durante un período de 96 horas y en un intervalo de concen ­
traciones determinado. Se registra la mortalidad, como mínimo, cada 
24 horas y se calculan, si es posible, las concentraciones causantes de la muerte del 50 % de los peces (CL
 50 ) en cada período de 
observación.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Los criterios de calidad se aplicarán tanto al ensayo límite como al 
método de ensayo definitivo. 
La mortalidad de los testigos, no debe sobrepasar el 10 % al final del 
ensayo (o un pez si se utilizan menos de 10). 
La concentración de oxígeno disuelto debe ser superior al 60 % del 
valor de saturación, a la largo de todo el ensayo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
La concentración de la sustancia de ensayo debe ser superior al 80 % 
de la concentración inicial durante todo el ensayo. 
Para las sustancias que se disuelven fácilmente en el medio de 
ensayo, produciendo soluciones estables, es decir, que no se volati ­
lizan, degradan, hidrolizan ni adsorben en cantidad significativa, la 
concentración inicial puede considerarse equivalente a la concentra ­
ción nominal. Se demostrará que se han mantenido las concentracio ­
nes a lo largo del ensayo y de que se han satisfecho los criterios de 
calidad. 
En cuanto a las sustancias 
i) poco solubles en el medio de ensayo, o 
ii) capaces de formar emulsiones o dispersiones estables, o 
iii) no estables en soluciones acuosas, se tomará como concentración inicial la concentración medida en la 
solución (o, si no es técnicamente posible, medida en la columna de agua) al comienzo del ensayo. La concentración se determinará tras un período de equilibrio pero antes de introducir los peces de ensayo. 
En cualquiera de estos casos se harán mediciones complementarias, 
durante el ensayo, con el fin de confirmar la concentración de ex ­
posición real o que se han mantenido los criterios de calidad. 
El pH no variará más de 1 unidad.
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Pueden utilizarse tres tipos de procedimientos.  
Ensayo estático  
Ensayo de toxicidad durante el cual no hay renovación de la solu ­
ción de ensayo {las soluciones no se renuevan durante todo el en ­
sayo).  
Ensayo semiestático  
Ensayo sin renovación continua de la solución de ensayo, pero con 
renovación periódica, de las soluciones de ensayo después de perío ­
dos prolongados (por ejemplo, cada 24 horas).  
Ensayo dinámico  
Ensayo de toxicidad durante el cual se va renovando constantemente 
el agua de los recipientes de ensayo. El producto químico sometido a ensayo se transporta con el agua utilizada para renovar el medio de ensayo.
 
1.6.1.  Reactivos  
1.6.1.1.  Soluciones de las sustancias de ensayo  
Las soluciones madre a las concentraciones requeridas se preparan 
disolviendo la sustancia en agua desionizada o en agua según el 
punto 1.6.1.2. 
Las concentraciones elegidas para el ensayo se preparan mediante 
dilución de la solución madre. Si se procede a un ensayo a concen ­
traciones elevadas, la sustancia puede disolverse directamente en el 
agua de dilución.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
En general, las sustancias se ensayaran solo hasta su límite de solu ­
bilidad. En el caso de algunas sustancias (por ejemplo, aquellas que 
son poco hidrosolubles, que tienen un elevado P  ow o que forman en 
el agua dispersiones estables más que verdaderas soluciones), se puede aceptar una concentración de ensayo por encima del límite 
de solubilidad de la sustancia a fin de garantizar que se obtiene la 
máxima concentración soluble/estable. Es importante, sin embargo, que esta concentración no altere por otra parte el sistema de ensayo (por ejemplo, formación en la superficie del agua de una película de 
la sustancia que impida la oxigenación del agua, etc.) 
Puede utilizarse dispersión ultrasónica, solventes orgánicos, emulgen ­
tes o dispersantes para favorecer la preparación de las soluciones 
madre de las sustancias poco hidrosolubles o para que dichas sus ­
tancias se dispersen mejor en el medio de ensayo. Cuando se utilicen estas sustancias auxiliares, todas las concentraciones de ensayo de ­
berán contener la misma cantidad de sustancia auxiliar y se expondrá 
un lote de peces como testigo suplementario a la misma concentra ­
ción de la sustancia auxiliar que la utilizada en las series del ensayo. La concentración de esas sustancias auxiliares debe reducirse al mí ­
nimo, y en ningún caso será superior a 100 mg por litro en el medio 
de ensayo. 
El ensayo debe realizarse sin ajustar el pH. Si se produjera un 
cambio significativo del pH, debe repetirse el ensayo ajustando el 
pH y registrar los resultados. En ese caso, el valor del pH de la 
solución madre debe ajustarse al valor del pH del agua de dilución, excepto que existan razones concretas que lo impidan. Para ajustar el pH se utilizará, preferentemente, HC1 o NaOH. Este ajuste del pH 
debe efectuarse de forma que no se modifique significativamente la 
concentración de la sustancia de ensayo en la solución madre. Si el ajuste ocasiona una reacción química o una precipitación física de la sustancia de ensayo, deberá mencionarse en el informe.
 
1.6.1.2.  Agua de mantenimiento y de dilución  
Se podrá utilizar agua potable (no contaminada por concentraciones 
potencialmente peligrosas de cloro, metales pesados u otras sustan ­
cias), agua natural de buena calidad o agua reconstituida (véase el 
Apéndice 1). Se preferirán las aguas cuya dureza total esté compren ­
dida entre 10 y 250 mg por litro (como CaCO  3 ), y un pH compren ­
dido entre 6,0 y 8,5.  
1.6.2.  Equipo  
El equipo debe ser de material químicamente inerte: 
— sistema de dilución automático (para el ensayo dinámico), 
— aparato para medir el oxígeno, 
— aparato para determinar la dureza del agua, 
— equipo apropiado para el control de la temperatura, 
— pHmetro.  
1.6.3.  Peces del ensayo  
Los peces deben gozar de buena salud y estar exentos de malforma ­
ciones visibles.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Se recomienda que la especie utilizada se elija en función de criterios 
prácticos como disponibilidad inmediata durante todo el año, fácil 
mantenimiento, comodidad para el ensayo, sensibilidad relativa a las sustancias químicas, y todos los demás factores significativos eco ­
nómicos, biológicos o ecológicos. Debe tenerse también en cuenta, al 
seleccionar la especie de peces, la necesidad de que los datos sean 
comparables y la existencia de una armonización internacional en vigor (referencia 1). 
Las especies que se recomiendan para la realización de este ensayo 
figuran en el apéndice 2; las especies preferidas son el pez cebra y la 
trucha.
 
1.6.3.1.  Mantenimiento  
Los peces que se someten al ensayo deberán provenir preferente ­
mente de un solo lote, siendo todos los individuos de longitud y 
edad similares. Deben mantenerse, al menos durante 12 días, en las siguientes condiciones.  
Carga:  
apropiada al sistema (recirculación o ensayo dinámico) y a la especie 
de peces.  
Agua:  
véase el punto 1.6.1.2.  
Luz: 
fotoperíodo de 12 a 16 horas por día.  
Concentración de oxigeno disuelto:  
al menos 80 % del valor de saturación.  
Alimentación:  
diariamente o 3 veces por semana; la alimentación debe ser inte ­
rrumpida 24 horas antes de comenzar el ensayo.
 
1.6.3.2.  Mortalidad  
Se registrará la mortalidad después de un período inicial de 48 horas. 
Se juzgará la calidad del lote según los siguientes criterios: 
— mortalidad superior al 10 % de la población en 7 días: 
se rechaza todo el lote, 
— mortalidad al cabo de 7 días comprendida entre el 5 y el 10 % de 
la población: 
se prolongará el período de observación 7 días más. Si no aparecen nuevas mortalidades, se admite el lote, en caso 
contrario debe rechazarse, 
— mortalidad inferior al 5 % de la población: 
se admite el lote.
 
1.6.4.  Adaptación  
Los peces deben mantenerse en las condiciones de ensayo (calidad y 
temperatura del agua), durante al menos 7 días antes de su utiliza ­
ción. ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Procedimiento del ensayo  
Antes del ensayo definitivo se puede proceder a un ensayo para 
determinar el intervalo de concentraciones eficaces, el cual propor ­
cionará información sobre el intervalo de concentraciones que debe ­
rán utilizarse en el ensayo definitivo. 
Se efectuará un control (o testigo), sin sustancia de ensayo y, si se 
considera importante, un control (o testigo) con la sustancia auxiliar, 
además de las concentraciones de ensayo propiamente dichas. 
Se elegirá un método estático, semiestático o dinámico, en función 
de las propiedades físicas y químicas de la sustancia de ensayo, para 
cumplir los criterios de calidad. 
Los peces estarán expuestos a la sustancia de ensayo en las siguien ­
tes condiciones: 
— duración: 96 horas, 
— número de animales: al menos 7 por concentración, 
— recipientes: de una capacidad apropiada, en función de la carga 
recomendada, 
— carga: se recomienda una carga máxima de 1,0 g por litro para 
los ensayos estáticos y semiestáticos; para los ensayos dinámicos 
se puede aceptar una carga más elevada, 
— concentraciones de ensayo: al menos cinco concentraciones de 
ensayo que difieran en un factor constante no mayor de 2,2 y 
abarcando si es posible el intervalo de 0 a 100 % de mortalidad, 
— agua: véase el punto 1.6.1.2, 
— luz: fotoperíodo de 12 a 16 horas por día, 
— temperatura: apropiada para la especie elegida (apéndice 2), pero 
en los límites de ± 1  o C, en cualquier ensayo concreto, 
— concentración en oxígeno disuelto: al menos el 60 % del valor de 
la saturación a la temperatura elegida, 
— alimento: ninguno. 
Los peces se observaran después de las 2 a 4 primeras horas y, al 
menos, a intervalos de 24 horas. Los peces son considerados muertos si el toque del pedúnculo caudal no produce reacción alguna y no se 
percibe ningún movimiento respiratorio. Los peces muertos se reti ­
rarán en el momento de cada observación y se registrará la morta ­
lidad. Se registrarán las anomalías visibles (por ejemplo, pérdida de equilibrio, cambios en el comportamiento natatorio, función respira ­
toria, pigmentación, etc.). 
Diariamente se medirá el pH, el oxígeno disuelto y la temperatura.
 
Ensayo límite  
Puede realizarse un ensayo límite a 100 mg por litro, utilizando los 
procedimientos descritos en este método de ensayo, con el fin de 
demostrar que la CL  50 es mayor que dicha concentración. 
Si la naturaleza de la sustancia no permite alcanzar una concentra ­
ción de 100 mg por litro en el agua de ensayo, el ensayo límite debe ser realizado a una concentración igual a la solubilidad de la sustan ­
cia (o a la máxima concentración que forme una dispersión estable) 
en el medio utilizado (véase también el punto 1.6.1.1).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
El ensayo límite se realizará utilizando de 7 a 10 peces, y el mismo 
número en los controles (o testigos). (La teoría binomial indica que 
cuando se utilizan 10 peces y la mortalidad es cero, hay un limite de confianza del 99,9 % de que la CL
 50 es mayor que la concentración 
usada en el ensayo límite. Si se utilizan 7, 8 o 9 peces, la ausencia 
de mortalidad proporciona un límite de confianza del 99 % de que la 
CL 50 es mayor que la concentración usada.) 
Si aparece mortalidad, debe ser realizado un estudio completo. Si se 
observan efectos subletales, deben registrarse.  
2. RESULTADOS Y EVALUACIÓN  
Se trazará sobre papel log-probit el porcentaje de mortalidad en 
función de la concentración, para cada período en que se registren 
observaciones (24, 48, 72 y 96 horas). 
Cuando sea posible y para cada tiempo de observación, se calculará 
la CL  50 con sus límites de confianza (p = 0,05) utilizando procedi ­
mientos estandardizados; estos valores se redondearán a una o, como mucho, dos cifras significativas (ejemplos de redondeo a dos cifras: 170 en lugar de 173,5; 0,13 en lugar de 0,127; 1,2 en lugar de 1,21). 
Si la pendiente de la curva de concentración/porcentaje de respuesta 
es demasiado acentuada como para permitir calcular la CL
 50 , bastará 
con una estimación gráfica de este valor. 
Si dos concentraciones consecutivas, con una razón de 2,2, dan solo 
0 y 100 % de mortalidad, estos dos valores serán suficientes para 
indicar el rango en el que se encuentra la CL  50 . 
Si se observa que la estabilidad o la homogeneidad de la sustancia de 
ensayo no puede mantenerse, se mencionará en el informe y se 
tendrá en cuenta al interpretar los resultados.  
3. INFORME  
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente informa ­
ción: 
— información acerca del pez de ensayo (nombre científico, cepa, 
proveedor, tratamiento previo eventual, tamaño y número utili ­
zado en cada concentración de ensayo), 
— origen del agua de dilución y sus principales características quí ­
micas (pH, dureza, temperatura), 
— en el caso de una sustancia poco hidrosoluble, método de pre ­
paración de la solución madre y de las soluciones de ensayo, 
— concentraciones de las eventuales sustancias auxiliares, — relación de las concentraciones utilizadas y cualquier información 
disponible sobre la estabilidad, a dichas concentraciones, de la sustancia en la solución de ensayo, 
— si se realizan análisis químicos, los métodos utilizados y los 
resultados obtenidos, 
— resultados del ensayo límite, si se ha realizado, 
— motivos de la elección y los detalles del procedimiento de ensayo 
utilizado (por ejemplo, sistema estático, semiestático, dinámico, 
velocidad de administración, tasa de renovación, aireación o no, 
carga de peces, etc.),
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— descripción del equipo de ensayo, 
— régimen de iluminación, 
— concentraciones del oxígeno disuelto, valores de pH y tempera ­
turas de las soluciones de ensayo cada 24 horas, 
— pruebas de que se han respetado los criterios de calidad, — tabla que muestre la mortalidad acumulada para cada concentra ­
ción y para el testigo (y, en su caso, el testigo con producto 
auxiliar) para cada uno de los tiempos de observación recomen ­
dados, 
— representación gráfica de los porcentajes de mortalidad en fun ­
ción de las concentraciones al final del ensayo, 
— si es posible, valores de la CL
 50 en cada uno de los tiempos de 
observación recomendados (límite de confianza del 95 %), 
— métodos estadísticos utilizados para determinar los valores de 
la CL  50 , 
— si se utiliza una sustancia de referencia, resultados obtenidos, 
— concentración máxima utilizada que no haya causado mortalidad 
durante el período de ensayo, 
— concentración mínima utilizada que haya causado un 100 % de 
mortalidad durante el período de ensayo.  
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OCDE, París 1981, Test Guideline 203, Decisión del Consejo 
C(81) 30 final, y actualizaciones. 
(2) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Bracbydanio rerio  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-303 June 1985. 
(3) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Salmo gairdneri  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-305 June 1985. 
(4) ISO 7346/1,/2 and/3 — Water Quality — Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish  
(Bracbydanio rerio  Hamilton-Buchanan — Teleostei, Cyprini ­
dae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method. 
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Suiza, Richtlinien für 
Probenahme und Normung von Wasserun- tersuchungsmetho ­
den — Part II 1974. 
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und 
L (15). 
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. (8) NEN 6506 — Water — Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van Poecilia  reticulata,  1980. 
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The 
Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975. 
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory,  Office of Research and Development , 
EPA-600/4-78-012, January 1978.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979. 
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975. 
(13) Comisión de las Comunidades Europeas, Inter-Laboratory test 
programme concerning the study of the ecotoxicity of a che ­
mical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 
22 March 1979. 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grund ­
lagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltche ­
mikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. 
(15) Litchfield, J.T. y Wilcoxon, F., A simplified method for eva ­
luating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99. 
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K, 1978. 
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol.3, 793–821. 
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Il 
Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, 
vol. 4, 3-32. 
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC
 50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink), American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634, 1977, 65-84. 
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. y Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC
 50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Apéndice 1  
Agua reconstituida  
Ejemplo de agua de dilución adecuada  
Los productos químicos deben ser de calidad analítica. 
El agua debe ser agua destilada de buena calidad, o agua desionizada de una 
conductividad inferior a 5 μScm  -1 . 
El aparato para la destilación del agua no contendrá ningún componente de 
cobre.  
Soluciones madre  
CaCl  2 . 2H  2 O (cloruro de calcio dihidratado): 
disolver y enrasar a un litro con agua. 11,76 g 
MgSO  4 . 7H  2 O (sulfato de magnesio heptahidratado): 
disolver y enrasar a un litro con agua. 4,93 g 
NaHCO  3 (carbonato ácido de sodio): 
disolver y enrasar a un litro con agua. 2,59 g 
KCl (cloruro de potasio): 
disolver y enrasar a un litro con agua. 0,23 g  
Agua de dilución reconstituida  
Mezclar 25 ml de cada una de las cuatro soluciones madre y completar hasta un 
litro con agua. 
Airear hasta que la concentración de oxígeno disuelto sea igual al valor de 
saturación del aire. 
El pH debe ser 7,8 ± 0,2. Si es necesario, ajustado con NaOH (hidróxido de sodio) o HCl (ácido clorhí ­
drico). 
El agua de dilución así preparada se deja reposar durante unas 12 horas y no 
debe ser aireada posteriormente. 
La suma de iones Ca/Mg en esta solución es igual a 2,5 mmol/l. La relación de 
los iones Ca:Mg es de 4:1, la de los iones Na:K de 10:1. La alcalinidad total de esta solución es igual a 0,8 mmol/1. 
Cualquier desviación en la preparación del agua de dilución no debe modificar su 
composición ni sus propiedades.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Apéndice 2  
Especies de peces recomendadas para el ensayo  
Especies recomendadas Intervalo reco ­
mendado de tem ­
peraturas de en ­
sayo (  o C) Longitud total re ­
comandada del 
pez de ensayo 
(cm) 
Bracbydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Pez cebra 20 a 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales prometas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Pez cabeza gorda 20 a 24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linnaeus 1758) Carpa común 20 a 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliiae) 
Cyprinodontidae  (Tomminck y Schlegel 
1850) Medaka 20 a 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Guppy 20 a 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae)  (Rafínesque Linnaeus 1758) Agallas 
azules 20 a 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) Trucha arco iris 12 a 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
naeus 1758) Caho 20 a 24 6,0 ± 2,0  
Aprovisionamiento  
Los peces que se mencionan arriba son fáciles de criar y se puede disponer 
fácilmente de ellos durante todo el año. Pueden reproducirse y desarrollarse en 
explotaciones piscícolas o en el laboratorio, en condiciones sanitarias controladas, de forma que el animal que se someta al ensayo esté sano y su origen sea conocido. Estos peces están disponibles en casi todo el mundo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Apéndice 3  
Ejemplo de curva de procentaje de mortalidad/concentración  
Ejemplo de determinación de la CL  50 en un papel log-probit
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. ENSAYO DE INMOVILIZACIÓN AGUDA DE  DAPHNIA  SP. 
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo de inmovilización aguda es equiva ­
lente a las directrices de ensayo de la OCDE TG 202 (2004).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente método describe un ensayo de toxicidad aguda para 
evaluar los efectos de las sustancias químicas en los dáfnidos. En la medida de lo posible se han utilizado los métodos de ensayo 
existentes (1) (2) (3).
 
1.2. DEFINICIONES 
A efectos del presente método, se entenderá por: 
«CE 50 »: la concentración estimada que inmoviliza al 50 % de los 
dáfnidos en un plazo de exposición definido; si se utiliza otra defi ­
nición, deberá indicarse junto con su referencia, 
«inmovilización »: la situación de los animales incapaces de nadar en 
el plazo de 15 segundos tras una agitación suave del recipiente de ensayo (aunque puedan seguir moviendo las antenas).
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se exponen dáfnidos jóvenes, de menos de 24 horas de edad al 
inicio del ensayo, a una gama de concentraciones de la sustancia 
problema durante 48 horas. Se registra la inmovilización a las 24 y a las 48 horas, y se compara con los valores de los controles. Se 
analizan los resultados para calcular la CE
 50 a las 48 horas (véanse 
las definiciones del punto 1.2). La determinación de la CE  50 a las 24 
horas es optativa.  
1.4. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
Hay que conocer la solubilidad en agua y la presión de vapor de la 
sustancia problema; también se debe disponer de un método analítico 
fiable para cuantificar la sustancia en las soluciones problema con la eficiencia de recuperación y el límite de determinación establecidos. Entre la información útil se incluyen la fórmula estructural de la 
sustancia problema, su pureza, estabilidad en el agua y a la luz, 
P
 ow , y los resultados de un ensayo de biodegradabilidad fácil (véase 
el método C.4). 
Nota: En la referencia (4) se ofrece orientación sobre los ensayos de 
sustancias con propiedades fisicoquímicas que dificultan estos ensayos.  
1.5. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Puede estudiarse la CE  50 de una sustancia de referencia como forma 
de garantizar la fiabilidad de las condiciones del ensayo. Con este fin 
se recomienda utilizar sustancias tóxicas empleadas en ensayos in ­
terlaboratorios internacionales (1)(5) (  1 ). La frecuencia de los ensayos 
con una sustancia de referencia debe ser preferentemente mensual, y 
al menos semestral.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Los resultados de estos ensayos interlaboratorios y unas correcciones técnicas de la 
norma ISO 6341 indican una CE  50 -24 h de dicromato potásico (K  2 Cr 2 O 7 ) en la banda 
de 0,6 mg/l a 1,7 mg/l.
 1.6. CRITERIOS DE CALIDAD 
Para que un ensayo sea válido, los resultados deben cumplir los 
siguientes criterios: 
— en los controles, incluido el que contiene el agente solubilizante, 
no debe quedar inmovilizado más del 10 % de los dáfnidos, 
— la concentración de oxígeno disuelto al final del ensayo debe ser 
≥ 3 mg/l en los recipientes de control y de ensayo. 
Nota: Respecto al primer criterio, no más del 10 % de los dáfnidos 
de control pueden presentar inmovilización u otros signos de enfer ­
medad o presión, por ejemplo, decoloración o comportamiento anó ­
malo, como quedar retenidos en la superficie del agua.  
1.7. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.7.1.  Equipo  
Los recipientes de ensayo y demás equipo que hayan de entrar en 
contacto con las soluciones problema serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte. Los recipientes de ensayo 
consistirán normalmente en tubos de ensayo o vasos de precipitados; 
deben lavarse antes de cada utilización siguiendo procedimientos normalizados de laboratorio. Los recipientes de ensayo deben cu ­
brirse de forma no hermética para reducir la pérdida de agua debida 
a la evaporación y para evitar la entrada de polvo en las soluciones. 
Los ensayos con sustancias volátiles deben realizarse en recipientes cerrados y completamente llenos, de volumen suficiente para evitar que el oxígeno llegue a un nivel limitante o demasiado bajo (véanse 
el punto 1.6 y el párrafo primero del punto 1.8.3). 
Además se utilizarán algunos de los instrumentos siguientes o todos 
ellos: oxigenómetro (con microelectrodo u otro equipo que sea con ­
veniente para medir el oxígeno disuelto en muestras de pequeño 
volumen), pH-metro, instrumento adecuado para controlar la tempe ­
ratura, equipo para determinar la concentración de carbono orgánico total (COT), equipo para determinar la demanda química de oxígeno (DQO), aparato para determinar la dureza, etc.
 
1.7.2.  Organismo de ensayo  
La especie recomendada es  Daphnia magna  Straus, aunque pueden 
utilizarse en este ensayo otras especies adecuadas de  Daphnia  (por 
ejemplo,  Daphnia pulex).  Los animales tendrán una edad inferior a 
24 horas al principio del ensayo y, para reducir la variabilidad, se 
recomienda fervientemente que no sean progenie de primera nidada. 
Han de proceder de una población sana (es decir, sin signos de presión, tales como mortalidad elevada, presencia de machos y efi ­
pios, retraso de la producción de la primera nidada, animales deco ­
lorados, etc.). Todos los organismos utilizados para un ensayo con ­
creto deben proceder de cultivos establecidos a partir de la misma población de dáfnidos. Los animales del cultivo madre deben man ­
tenerse en condiciones (luz, temperatura, medio) similares a las que 
se vayan a usar en el ensayo. Si el medio de cultivo de dáfnidos que 
se va utilizar en el ensayo es diferente del utilizado en cultivos normales de dáfnidos, es adecuado incluir una fase de aclimatación previa al ensayo. Con este objetivo, los dáfnidos de la nidada deben 
mantenerse en agua de dilución a la temperatura del ensayo durante 
al menos 48 horas antes del inicio del ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Agua de mantenimiento y de dilución  
Puede utilizarse como agua de mantenimiento y de dilución el agua 
natural (superficial o subterránea), el agua reconstituida o el agua del grifo desclorada, siempre que los dáfnidos sobrevivan en ella durante 
las fases de cultivo, aclimatación y ensayo sin mostrar signos de 
presión. Es adecuada como agua de ensayo cualquier agua que se ajuste a las características químicas de un agua de dilución aceptable según se indica en el anexo 1. La calidad del agua ha de ser cons ­
tante a lo largo de todo el ensayo. El agua reconstituida puede 
obtenerse añadiendo al agua desionizada o destilada cantidades es ­
pecíficas de reactivos de pureza analítica reconocida. En el anexo 2 y 
en las referencias (1) y (6) se dan ejemplos de agua reconstituida. 
Obsérvese que, para el ensayo de sustancias con metales, ha de evitarse utilizar medios que contengan agentes quelantes conocidos, como los medios M4 y M7 del anexo 2. El pH debe encontrarse en 
la banda de 6 a 9. La dureza recomendada es de entre 140 y 
250 mg/l (en CaCO
 3 ) para  Daphnia magna,  pero con otras especies 
de Daphnia  también puede ser adecuada una dureza menor. El agua 
de dilución tiene que airearse antes de su utilización en el ensayo, de 
forma que la concentración de oxígeno disuelto llegue a la satura ­
ción. 
Si se utiliza agua natural, deben medirse los parámetros de calidad al 
menos dos veces al año o siempre que se sospeche la posibilidad de algún cambio significativo en estas características (véanse el párrafo 
anterior y el anexo 1). Debe medirse también la concentración de 
metales pesados (por ejemplo, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Si se utiliza agua del grifo desclorada, es recomendable hacer cada día un análisis del cloro. Si el agua de dilución es de una fuente de agua superficial 
o subterránea, deben medirse la conductividad y el carbono orgánico 
total (COT) o la demanda química de oxígeno (DQO).
 
1.7.4.  Soluciones problema  
Las soluciones problema con las concentraciones elegidas se prepa ­
ran normalmente por dilución de una solución madre. Preferentemen ­
te, estas soluciones madre deben prepararse disolviendo la sustancia problema en agua de dilución. Debe evitarse, en la medida de lo 
posible, el uso de disolventes, emulgentes o dispersantes. Sin em ­
bargo, estos compuestos pueden ser necesarios en algunos casos para obtener una solución madre a la concentración deseada. En la refe ­
rencia (4) se dan orientaciones sobre disolventes, emulgentes y dis ­
persantes adecuados. En cualquier caso, la cantidad de sustancia 
problema contenida en las soluciones problema no debe sobrepasar el límite de solubilidad en el agua de dilución. 
El ensayo debe realizarse sin ajustar el pH. Si el pH no queda en la 
banda de 6 a 9, puede realizarse un segundo ensayo en el que se 
ajuste el pH de la solución madre al del agua de dilución antes de la 
adición de la sustancia problema. El ajuste del pH debe hacerse de forma que la concentración de la solución madre no cambie de forma significativa y no se produzca ninguna reacción química ni precipi ­
tación de la sustancia problema. Las sustancias recomendadas son 
HCl y NaOH.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. PROCEDIMIENTO  
1.8.1.  Condiciones de exposición  
1.8.1.1.  Grupos de ensayo y controles  
Los recipientes de ensayo se llenan con volúmenes adecuados de 
agua de dilución y de soluciones de la sustancia problema. La pro ­
porción de volumen de aire y de agua en el recipiente debe ser la misma en los grupos de ensayo y de control. A continuación se ponen los dáfnidos en los recipientes de ensayo. Con cada concen ­
tración de ensayo y cada control deben utilizarse al menos 20 ani ­
males, de preferencia divididos en cuatro grupos de cinco animales cada uno. Para cada animal deben preverse al menos 2 ml de solu ­
ción problema (es decir, un volumen de 10 ml para cinco dáfnidos 
en cada recipiente de ensayo). La prueba puede realizarse con un sistema de renovación semiestática o dinámica si no es estable la concentración de la sustancia problema. 
Además de la serie de tratamiento, debe utilizarse una serie de con ­
trol con el agua de dilución y, si procede, otra serie de control con el 
agente solubilizante.
 
1.8.1.2.  Concentraciones de ensayo  
Puede efectuarse un experimento previo para determinar la gama de 
concentraciones que se han de utilizar en el ensayo definitivo, salvo 
que se disponga de información sobre la toxicidad de la sustancia 
problema. A tal fin, los dáfnidos se exponen a una serie de concen ­
traciones de la sustancia problema muy diferentes entre sí. Deben exponerse cinco dáfnidos a cada concentración de ensayo durante un 
máximo de 48 horas, y no es necesario efectuar ninguna prueba en 
paralelo. Es posible abreviar el plazo de exposición (por ejemplo, a 24 horas o menos) si pueden obtenerse en menos tiempo datos adecuados para los fines del experimento de determinación de la 
gama de concentraciones. 
Se emplearán al menos cinco concentraciones de ensayo, que forma ­
rán una progresión geométrica con una razón preferentemente no superior a 2,2. Si se usan menos de cinco concentraciones, hay 
que justificarlo. La mayor concentración estudiada debe provocar 
de preferencia una inmovilización del 100 %, y la menor concen ­
tración estudiada no debe provocar de preferencia ningún efecto observable.
 
1.8.1.3.  Condiciones de incubación  
La temperatura debe estar entre 18  o C y 22  o C, y en cada uno de los 
ensayos debe mantenerse constante, con una variación máxima de ± 
1 o C. Se recomienda un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de 
oscuridad. También puede aceptarse la oscuridad completa, especial ­
mente si la sustancia problema es inestable a la luz. 
Los recipientes de ensayo no deben airearse durante el ensayo. El 
ensayo se realiza sin ajustar el pH. No se debe proporcionar alimento a los dáfnidos durante el ensayo.
 
1.8.1.4.  Duración  
La duración del ensayo es de 48 horas.  
1.8.2.  Observaciones  
Debe comprobarse si hay dáfnidos inmovilizados en cada recipiente 
de ensayo a las 24 y 48 horas desde el inicio del ensayo (véanse las 
definiciones del punto 1.2). Además de la inmovilidad, debe indi ­
carse todo eventual aspecto o comportamiento anormal.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Mediciones analíticas  
El oxígeno disuelto y el pH se miden al inicio y al final del ensayo 
en los recipientes de los controles y en los de la mayor concentración de sustancia problema. La concentración de oxígeno disuelto de los 
controles debe cumplir el criterio de validez (véase el punto 1.6). El 
pH no debe variar en principio más de 1,5 unidades en ninguno de los ensayos. La temperatura se suele medir en los recipientes de control o en el aire ambiente y debe registrarse preferentemente de 
forma continua durante el ensayo o, como mínimo, al inicio y al 
final del mismo. 
La concentración de la sustancia problema debe medirse, como mí ­
nimo, en los recipientes con la concentración más elevada y más baja, al principio y al final del ensayo (4). Se recomienda basar los 
resultados en las concentraciones medidas. No obstante, si los datos 
disponibles muestran que la concentración de la sustancia problema se ha mantenido debidamente a lo largo de todo el ensayo en un intervalo de ± 20 % de la concentración inicial nominal o medida, 
los resultados pueden fundarse en estos valores iniciales nominales o 
medidos.
 
1.9. ENSAYO LÍMITE 
Siguiendo los procedimientos descritos en el presente método, puede 
efectuarse un ensayo límite con 100 mg/l de sustancia problema o hasta su límite de solubilidad en el medio de ensayo, si este es inferior, a fin de demostrar que la CE
 50 es mayor que esta concen ­
tración. El ensayo límite debe hacerse utilizando 20 dáfnidos (pre ­
ferentemente divididos en cuatro grupos de cinco), con igual número en el control o controles. Si se observa alguna inmovilización, debe realizarse un estudio completo. Deben registrarse los eventuales com ­
portamientos anormales observados.
 
2. DATOS  
Los datos deben resumirse en forma de cuadro, indicando respecto a 
cada grupo de tratamiento y de control el número de dáfnidos utili ­
zados y la inmovilización en cada observación. Deben representarse gráficamente los porcentajes de inmovilización a las 24 y 48 horas 
frente a las concentraciones de sustancia problema. Los datos se 
analizan mediante métodos estadísticos apropiados (por ejemplo, análisis de probit, etc.) para calcular las pendientes de las curvas y la CE
 50 con unos límites de confianza del 95 % (p = 0,05) (7) (8). 
Cuando los métodos normales de cálculo de la CE  50 no sean aplica ­
bles a los datos obtenidos, se utilizarán la concentración más elevada 
que no provoque inmovilidad y la concentración más baja que pro ­
voque un 100 % de inmovilidad para estimar la CE  50 , considerada 
como la media geométrica de estas dos concentraciones.  
3. INFORMES  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancia problema: — naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— identificación química, incluida la pureza. 
Especie de ensayo: — procedencia y especie de  Daphnia,  proveedor original (si se 
conoce) y condiciones de cultivo utilizadas (con inclusión de la procedencia, el tipo y la cantidad del pienso, así como la fre ­
cuencia de la alimentación). 
Condiciones de ensayo: 
— descripción de los recipientes de ensayo: tipo de recipientes, 
volumen de solución, número de dáfnidos por recipiente de en ­
sayo, número de recipientes de ensayo (en paralelo) por concen ­
tración, 
— métodos de preparación de las soluciones madre y problema, in ­
cluido el eventual uso de dispersantes; concentraciones utilizadas, 
— origen del agua de dilución y características cualitativas del agua 
(pH, dureza, proporción Ca/Mg, proporción Na/K, alcalinidad, conductividad, etc.); composición del agua reconstituida si se utiliza, 
— condiciones de incubación: temperatura, intensidad y periodici ­
dad de la luz, oxígeno disuelto, pH, etc. 
Resultados: — número y porcentaje de dáfnidos inmovilizados o que presentan 
cualquier efecto nocivo (incluido un comportamiento anormal) en los controles y en cada grupo de tratamiento, en cada momento 
de observación, y descripción de la naturaleza de los efectos 
observados, 
— resultados y fecha del ensayo efectuado con la sustancia de re ­
ferencia, si se conocen, 
— concentraciones nominales de ensayo y resultados de todos los 
análisis para determinar la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo; también deben indicarse la eficiencia de recuperación del método y el límite de determinación, 
— todas las mediciones fisicoquímicas de temperatura, pH y oxí ­
geno disuelto efectuadas durante el ensayo, 
— la CE
 50 de inmovilización a las 48 horas, con intervalos de 
confianza y gráficos del modelo ajustado utilizado para su cál ­
culo, las pendientes de las curvas dosis-respuesta y su error 
típico, métodos estadísticos utilizados para la determinación de la CE
 50 (también deben indicarse estos datos en relación con la 
inmovilización a las 24 horas si se han obtenido), 
— explicación de las eventuales desviaciones respecto al método de 
ensayo y de la medida en que afecten a los resultados de ensayo.  
4. REFERENCIAS  
1. ISO 6341. (1996). Water quality — Determination of the inhibi ­
tion of the mobility  of Daphnia magna  Straus (Cladocera, Crus ­
tacea) — Acute toxicity test. Third edition, 1996. 
2. EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guideli ­
nes — Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
3. Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada. 
4. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Sa ­
fety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 
2000. 
5. Comisión de las Comunidades Europeas. Study D8369. (1979). 
Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daphnia.  
6. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998. 
7. Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC
 50 . In Aqua ­
tic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 — American Society for Tes ­
ting and Materials. p. 65-84 
8. Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3
 rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
Anexo 1  
ALGUNAS CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE UN AGUA DE 
DILUCIÓN ACEPTABLE  
Sustancia Concentración  
Partículas < 20 mg/l 
Carbono orgánico total < 2 mg/l 
Amoniaco no ionizado < 1 μg/l 
Cloro residual < 10 μg/l 
Plaguicidas organofosforados totales < 50 ng/l Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlorados < 50 ng/l Cloro orgánico total < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
Anexo 2  
EJEMPLOS DE AGUA RECONSTITUIDA ACEPTABLE PARA EL 
ENSAYO  
Agua de ensayo iso (1)  
Soluciones madre (una sola sustancia) Para preparar el agua recons ­
tituida, añádanse los volúmenes 
siguientes de soluciones madre 
a 1 litro de agua (*) Sustancia Cantidad añadida a 1 litro 
de agua (*)  
Cloruro de calcio 
CaCl  2 . 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Sulfato de magnesio 
MgSO  4 . 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Bicarbonato de sodio 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Cloruro de potasio 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Agua de pureza adecuada como, por ejemplo, agua desionizada, destilada o tratada 
mediante ósmosis inversa con una conductividad que de preferencia no exceda de 10 
μS.cm  -1 . 
Medios M7 y M4 de Elendt  
Aclimatación a los medios M4 y M7 de Elendt  
Algunos laboratorios han tenido dificultades para transferir directamente las daf ­
nias a los medios M4 y M7. Sin embargo, se han obtenido resultados bastante 
buenos con una aclimatación gradual, esto es, cambiando del medio propio a Elendt al 30 %, luego al 60 % y por último al 100 %. El período de aclimatación necesario puede ser bastante largo, incluso de un mes.
 
Preparación  
Oligoelementos  
Se empieza por preparar soluciones madre distintas (I) de cada oligoelemento en 
agua de pureza apropiada (desionizada, destilada o tratada mediante ósmosis inversa). A partir de estas soluciones madre (I) se prepara una segunda solución 
madre única (II) que contiene todos los oligoelementos (solución combinada), de 
la forma siguiente:
 
Soluciones madre I (una sola 
sustancia) Cantidad añadida al 
agua (mg/l) Concentración (en rela ­
ción con el medio M4) Para preparar la solución madre II combinada, se 
añade al agua la siguiente cantidad de solución 
madre I (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 veces 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000 veces 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 veces 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Soluciones madre I (una sola 
sustancia) Cantidad añadida al 
agua (mg/l) Concentración (en rela ­
ción con el medio M4) Para preparar la solución madre II combinada, se 
añade al agua la siguiente cantidad de solución 
madre I (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000 veces 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000 veces 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 veces 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000 veces 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000 veces 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 veces 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000 veces 1,0 1,0 
KI 65 20 000 veces 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 veces 1,0 1,0 
NH4VO3 11,5 20 000 veces 1,0 1,0 Na
 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000 veces — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000 veces — — 
Las soluciones de Na  2 EDTA y FeSO  4 se preparan por separado, después se reúnen y se esterilizan en autoclave 
inmediatamente. 
Se obtiene así: 
2 l de solución de Fe- 
EDTA 1 000 veces 20,0 5,0  
Medios M4 y M7  
Los medios M4 y M7 se preparan a partir de la solución madre II con los 
macronutrientes y las vitaminas que siguen:  
Cantidad añadida al 
agua (mg/l) Concentración (en rela ­
ción con el medio M4) Cantidad de solución madre II añadida para pre ­
parar el medio (ml/l) 
M4 M7  
Solución madre II (combi ­
nación de oligoelementos) 20 veces 50 50 
Soluciones madre de ma ­
cronutrientes (una sola 
sustancia) 
CaCl  2 • 2H  2 0 293 800 1 000 veces 1,0 1,0 
MgSO  4 • 7H  2 O 246 600 2 000 veces 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 veces 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 veces 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 • 9H  2 O 50 000 5 000 veces 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 veces 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 veces 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 veces 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Cantidad añadida al 
agua (mg/l) Concentración (en rela ­
ción con el medio M4) Cantidad de solución madre II añadida para pre ­
parar el medio (ml/l) 
M4 M7  
Solución madre de vitami ­
nas combinadas — 10 000 veces 0,1 0,1 
La solución madre de vitaminas combinadas se prepara añadiendo las 3 vitaminas a 1 litro de agua como se indica a 
continuación: 
Clorhidrato de tiamina 750 10 000 veces 
Cianocobalamina (B12) 10 10 000 veces Biotina 7,5 10 000 veces 
La solución madre de vitaminas combinadas se conserva congelada en pequeñas 
partes alícuotas. Las vitaminas se incorporan a los medios poco antes de usarlos.  
Nota : Para evitar la precipitación de sales al preparar los medios completos, se 
incorporan las partes alícuotas de las soluciones madre a aproximadamente 500-800 ml de agua desionizada y a continuación se completa hasta ob ­
tener 1 litro.  
Nota : La primera publicación del medio M4 puede encontrarse en Elendt, B.P. 
(1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE ALGAS Y 
CIANOBACTERIAS DE AGUA DULCE  
1. MÉTODO  
El presente método es equivalente a las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 201 (2006) (1).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Los métodos de ensayo se revisan y actualizan periódicamente en 
función de los avances científicos. Era necesario revisar el método de 
ensayo C.3 para incluir más especies y para ajustarlo a los requisitos 
de evaluación del peligro y clasificación de sustancias químicas. La revisión se ha efectuado basándose en la amplia experiencia práctica, en los avances científicos en el campo de los estudios toxicológicos 
de las algas y en la amplia aplicación de la normativa que ha tenido 
lugar desde la adopción inicial.
 
1.2. DEFINICIONES 
En relación con el presente método de ensayo se entenderá por:  
Biomasa : el peso seco de materia viva presente en una población y 
expresado en términos de un volumen dado como, por ejemplo, mg de algas/litro de solución problema. Generalmente, la «biomasa» se define como masa, pero en este ensayo la palabra se refiere a masa 
por volumen. También en este ensayo, lo que se mide normalmente 
son indicadores de la biomasa, como recuentos celulares, fluorescen ­
cia, etc., por lo que el término de «biomasa» se refiere también a estos indicadores.  
Coeficiente de variación : una medida adimensional de la variabili ­
dad de un parámetro, definida como el cociente entre la desviación 
típica y la media. Puede expresarse también como valor porcentual. El valor promedio del coeficiente de variación de una tasa media de crecimiento específico en cultivos de control replicados (en paralelo) 
debe calcularse de la manera siguiente: 
1. Se calcula el CV porcentual de una tasa media de crecimiento 
específico a partir de las tasas de crecimiento diarias/de cada sección en las réplicas respectivas. 
2. Se calcula el valor medio de todos los valores calculados según el 
punto 1 para obtener el coeficiente medio de variación de la tasa de crecimiento específico diaria/de cada sección en las réplicas de 
los cultivos de control.  
EC
 x : la concentración de la sustancia problema disuelta en el medio 
de ensayo que produce una reducción del x % (por ejemplo, del 50 %) en el crecimiento del organismo de ensayo dentro de un plazo de exposición definido (que debe indicarse explícitamente si es dis ­
tinto de la duración completa o normal del ensayo). Para expresar de 
forma inequívoca el valor de EC obtenido a partir de la tasa de crecimiento o del rendimiento, se usan respectivamente los símbolos «EC
 t » y «EC  r ». 
Medio de crecimiento : el medio de cultivo sintético y completo en 
que crecen las algas del ensayo cuando se exponen a la sustancia 
problema. Esta se disuelve en principio en el medio de ensayo.  
Tasa de crecimiento (tasa media de crecimiento específico) : el 
aumento logarítmico de la biomasa durante el período de exposición.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : la concen ­
tración estudiada mínima a la que se observa que la sustancia ejerce 
un efecto estadísticamente significativo de reducción del crecimiento (con p < 0,05) cuando se compara con el control, dentro de un tiempo dado de exposición. Sin embargo, todas las concentraciones 
de ensayo superiores a la LOEC han de ejercer un efecto nocivo 
superior o igual al que se observa con dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explicación com ­
pleta sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por tanto, la NOEC).  
Concentración sin efecto observado (NOEC) : la concentración es ­
tudiada que se encuentra inmediatamente por debajo de la LOEC.  
Variable de respuesta : una variable para la estimación de la toxi ­
cidad derivada de cualquier parámetro medido que describa la bio ­
masa por distintos métodos de cálculo. A efectos del presente mé ­
todo, las tasas de crecimiento y el rendimiento son variables de respuesta obtenidas midiendo la biomasa directamente o bien me ­
diante alguno de los indicadores mencionados.  
Tasa de crecimiento específico : una variable de respuesta definida 
como el cociente de la diferencia de los logaritmos naturales de un parámetro de observación (en el presente método de ensayo, la bio ­
masa) y el respectivo plazo de tiempo.  
Rendimiento : el valor de una variable de medición al final del 
período de exposición menos el valor de la variable de medición al inicio del período de exposición; indica el aumento de biomasa 
durante el ensayo.
 
1.3. APLICABILIDAD DEL ENSAYO 
Este método de ensayo se aplica más fácilmente a las sustancias 
hidrosolubles que, en las condiciones del ensayo, tienen probabilidad de permanecer en el agua. Para el ensayo de sustancias volátiles, que se adsorben fuertemente, coloreadas, poco hidrosolubles o que pue ­
den afectar a la disponibilidad de nutrientes o minerales en el medio 
de ensayo, puede ser necesario modificar el procedimiento descrito (por ejemplo, sistema cerrado, acondicionamiento de los recipientes de ensayo). En (2), (3) y (4) se dan orientaciones sobre algunas 
modificaciones pertinentes.
 
1.4. PRINCIPIO DEL ENSAYO 
El objeto de este ensayo es determinar los efectos de una sustancia 
sobre el crecimiento de microalgas o cianobacterias de agua dulce. Los organismos del ensayo, en fase de crecimiento exponencial, se 
exponen a la sustancia problema en cultivos discontinuos, normal ­
mente durante un plazo de 72 horas. A pesar de la relativamente reducida duración del ensayo, es posible evaluar los efectos sobre varias generaciones. 
La respuesta del sistema es la reducción del crecimiento en una serie 
de cultivos de algas (unidades de ensayo) expuestos a distintas con ­
centraciones de una sustancia problema. La respuesta se evalúa como función de la concentración de exposición comparándola con el cre ­
cimiento medio en cultivos de control (sin exposición) replicados. 
Para que se exprese plenamente la respuesta del sistema a los efectos tóxicos (sensibilidad óptima), se permite que los cultivos crezcan exponencialmente sin ninguna restricción, con la presencia de sufi ­
cientes nutrientes y luz continua durante un tiempo suficiente para 
medir la reducción de la tasa de crecimiento específico.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
El crecimiento y su inhibición se cuantifican midiendo la biomasa de 
las algas en función del tiempo. La biomasa de las algas se define 
como el peso seco por volumen, por ejemplo mg de algas/litro de solución problema. Sin embargo, es difícil medir el peso seco, por lo que se utilizan parámetros indicadores, de los que los más utilizados 
son los recuentos celulares. Otros indicadores son el volumen celu ­
lar, la fluorescencia, la densidad óptica, etc. Debe disponerse de un factor de conversión entre el indicador y la biomasa. 
El criterio del ensayo es la inhibición del crecimiento, expresado 
como aumento logarítmico de la biomasa (tasa media de crecimiento específico) durante el tiempo de exposición. A partir de las tasas medias de crecimiento específico registradas con una serie de solu ­
ciones problema, se determina la concentración que produce una 
inhibición especificada del x % de la tasa de crecimiento (por ejem ­
plo, del 50 %) y se expresa como EC
 tx (por ejemplo, EC  t50 ). 
Para la aplicación del presente método en el marco normativo co ­
munitario, el cálculo de los resultados debe basarse en una tasa media de crecimiento específico por los motivos recogidos en el punto 2.2. Otra variable de respuesta utilizada en este método de 
ensayo es el rendimiento, lo que puede ser necesario para cumplir 
obligaciones normativas específicas en algunos países. Se define como la biomasa al final del tiempo de exposición menos la biomasa al inicio de este tiempo. A partir del rendimiento registrado en una 
serie de soluciones problema, se determina la concentración que 
produce una inhibición especificada del x % del rendimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como EC
 rx (por ejemplo, EC  r50 ). 
Además, pueden determinarse estadísticamente la concentración mí ­
nima con efecto observado (LOEC) y la concentración sin efecto observado (NOEC).
 
1.5. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
Entre la información sobre la sustancia problema que puede ser útil 
para establecer las condiciones del ensayo, figuran su fórmula es ­
tructural, pureza, estabilidad ante la luz, estabilidad en las condicio ­
nes del ensayo, propiedades de absorción de la luz, pKa y resultados 
de estudios de transformación, incluida la biodegradabilidad en el agua. 
Deben conocerse la hidrosolubilidad, el coeficiente de reparto octa ­
nol/agua (P
 ow ) y la presión de vapor de la sustancia problema, y un 
método validado para cuantificar la sustancia en las soluciones pro ­
blema con una eficiencia de recuperación y un límite de detección 
establecidos.  
1.6. SUSTANCIA DE REFERENCIA 
Para comprobar el procedimiento del ensayo pueden someterse a 
ensayo sustancias de referencia, como el 3,5-diclorofenol utilizado 
en el ensayo de intercalibración internacional (4). También puede 
utilizarse el dicromato de potasio como sustancia de referencia con algas verdes. Es aconsejable someter a ensayo una sustancia de referencia al menos dos veces al año.
 
1.7. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Para que un ensayo sea válido, su realización debe cumplir los 
siguientes criterios:  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— La biomasa de los cultivos de control debe haber aumentado 
exponencialmente con un factor de al menos 16 en el plazo de 
las 72 horas del ensayo. Esto corresponde a una tasa de creci ­
miento específico de 0,92 días  –1 . Con las especies más utilizadas, 
la tasa de crecimiento suele ser mucho mayor (véase el 
apéndice 1). Este criterio puede no cumplirse cuando se utilizan 
especies de crecimiento más lento que las indicadas en el apéndice 1. En tal caso, debe prolongarse el plazo de ensayo hasta obtener un crecimiento por un factor de al menos 16 en 
los cultivos de control, siendo exponencial el crecimiento durante 
todo este tiempo. El plazo de ensayo puede reducirse hasta un mínimo de 48 horas para mantener el crecimiento exponencial sin límites durante el ensayo, siempre que se cumpla el requisito 
de un factor de multiplicación mínimo de 16. 
— El coeficiente promedio de variación de las tasas de crecimiento 
específico de cada sección (días 0-1, 1-2 y 2-3, en caso de 
ensayo de 72 horas) en los cultivos de control (véase «Coefi ­
ciente de variación» en el punto 1.2) no debe pasar del 35 %. Para el cálculo de la tasa de crecimiento específico de cada sección, véase el párrafo segundo del punto 2.2.1. Este criterio 
se aplica al valor promedio de los coeficientes de variación cal ­
culados de los cultivos de control replicados. 
— El coeficiente de variación de las tasas medias de crecimiento 
específico durante toda la duración del ensayo en los cultivos de 
control replicados no debe superar el 7 % en ensayos con  Pseu­
dokirchneriella subcapitata  y Desmodesmus subspicatus . Con 
otras especies menos utilizadas, el valor no debe superar el 10 %.
 
1.8. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.8.1.  Equipo  
Los recipientes de ensayo y demás dispositivos que hayan de entrar 
en contacto con las soluciones problema serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte. Todos los artículos se lava ­
rán cuidadosamente para que no tengan contaminantes orgánicos ni 
inorgánicos que puedan interferir con el crecimiento de las algas o con los componentes de las soluciones problema. 
Los recipientes de ensayo serán en principio matraces de vidrio de 
dimensiones que permitan acoger un volumen suficiente de cultivo para la realización de mediciones durante el ensayo y la entrada de una masa suficiente de CO
 2 desde la atmósfera (véase el párrafo 
segundo del punto 1.8.9). Téngase en cuenta que el volumen de 
líquido debe ser suficiente para que se efectúen las determinaciones analíticas (véase el párrafo quinto del punto 1.8.11). 
Además, hará falta el siguiente equipo, en todo o en parte: 
— Dispositivo de cultivo se recomienda una cámara o recinto en 
que se pueda mantener la temperatura elegida de incubación con 
una precisión de 2 °C. 
— Instrumentos de medición de la luz: es importante tener en cuenta 
que el método de medición de la intensidad de la luz y, en 
particular, el tipo de receptor (colector) afectan al valor medido. 
Las mediciones deben hacerse preferentemente utilizando un re ­
ceptor esférico (4 π) (que responda a la luz directa y reflejada 
desde todos los ángulos por encima y por debajo del plano de 
medición) o un receptor 2 π (que responda a la luz desde todos 
los ángulos por encima del plano de medición).
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Dispositivo para determinar la biomasa de las algas. El recuento 
celular, que es el indicador más utilizado para determinar la 
biomasa de las algas, puede obtenerse con un contador electró ­
nico de partículas, un microscopio con cámara de recuento, o un citómetro de flujo. Es posible medir otros indicadores con un 
citómetro de flujo, un fluorímetro, un espectrofotómetro o un 
colorímetro. Es útil calcular un factor de conversión que rela ­
cione el recuento celular con el peso seco. Para obtener medi ­
ciones útiles también con bajas concentraciones de biomasa 
cuando se utiliza un espectrofotómetro, puede ser necesario uti ­
lizar cubetas con un paso de luz de 4 cm como mínimo.
 
1.8.2.  Organismos de ensayo  
Pueden utilizarse diversas especies de microalgas y cianobacterias 
sueltas. Se ha visto que las cepas citadas en el apéndice 1 son adecuadas para el procedimiento especificado en este método de 
ensayo. 
Si se utilizan otras especies, debe mencionarse en el informe el 
nombre o el origen de las cepas. Ha de confirmarse que el creci ­
miento exponencial de las algas seleccionadas puede mantenerse durante toda la duración del ensayo en las condiciones reinantes.
 
1.8.3.  Medio de cultivo  
Se recomiendan dos medios de cultivo: el medio de la OCDE y el 
medio AAP. Sus composiciones se muestran en el 
apéndice 2. Téngase en cuenta que el valor inicial de pH y la capacidad de tamponamiento (regulación del aumento del pH) son diferentes en los dos medios. Por tanto, los resultados de los ensayos 
pueden ser diferentes según el medio utilizado, en particular cuando 
se estudien sustancias que se ionizan. 
Puede ser necesario modificar los medios de cultivo en ciertos casos, 
por ejemplo para estudiar metales y agentes quelantes o para efectuar el ensayo a diferentes valores de pH. Si se modifica un medio es 
necesario describir pormenorizadamente y justificar la 
modificación (3) (4).
 
1.8.4.  Concentración inicial de biomasa  
La biomasa inicial de los cultivos de ensayo debe ser la misma en 
todos ellos y lo bastante baja para que pueda darse crecimiento exponencial a lo largo de todo el período de incubación sin peligro 
de que se agoten los nutrientes. La biomasa inicial no debe superar 
los 0,5 mg/l en peso seco. Se recomiendan las siguientes concen ­
traciones celulares al inicio:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 × 10
 3 a 10  4 células/ml  
Desmodesmus subspicatus  2 a 5 × 10  3 células/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 células/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 células/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 a 10  5 células/ml  
1.8.5.  Concentraciones de la sustancia problema  
Se pueden efectuar pruebas preliminares para determinar el intervalo 
de concentraciones en el que es previsible que ocurran los efectos. Para el ensayo definitivo, deben seleccionarse al menos cinco con ­
centraciones dispuestas en una progresión geométrica de razón no 
superior a 3,2. En caso de sustancias problema que presenten una curva concentración-respuesta plana, puede justificarse una razón más elevada. La serie de concentraciones debe abarcar preferente ­
mente el intervalo que provoca una inhibición del 5 a 75 % de la 
tasa de crecimiento de las algas.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Réplicas y controles  
Cada concentración de ensayo contará con tres réplicas. Si no es 
necesario determinar la NOEC, el diseño de la prueba puede modi ­
ficarse para aumentar el número de concentraciones y reducir el 
número de réplicas por concentración. El número de réplicas de 
control debe ser como mínimo de tres, aunque se recomienda que sea el doble del número de réplicas utilizadas con cada concentración de ensayo. 
Puede prepararse una serie aparte de soluciones problema para efec ­
tuar las determinaciones analíticas de las concentraciones de la sus ­
tancia problema (véanse los párrafos cuarto y sexto del punto 1.8.11). 
Cuando se utiliza un disolvente para solubilizar la sustancia proble ­
ma, el diseño del ensayo debe incluir controles adiciones con el 
disolvente a la misma concentración utilizada en los cultivos de 
ensayo.
 
1.8.7.  Preparación del cultivo del inóculo  
Para adaptar las algas a las condiciones del ensayo y garantizar que 
se encuentran en fase de crecimiento exponencial cuando se utilicen para inocular las soluciones problema, debe prepararse un cultivo de 
inóculo en el medio de ensayo de 2 a 4 días antes del inicio del 
ensayo. La biomasa de las algas debe ajustarse para que haya cre ­
cimiento exponencial en el cultivo de inóculo hasta que empiece el ensayo. El cultivo de inóculo se incubará en las mismas condiciones 
que los cultivos de ensayo. Ha de medirse el aumento de la biomasa 
en el cultivo de inóculo para asegurarse de que el crecimiento está en el intervalo normal de la cepa utilizada en las condiciones de cultivo aplicadas. En el apéndice 3 se describe un ejemplo de procedimiento 
de cultivo de algas. Para evitar divisiones celulares sincrónicas du ­
rante el ensayo, puede ser necesario efectuar una segunda fase de propagación del cultivo de inóculo.
 
1.8.8.  Preparación de las soluciones problema  
Todas las soluciones problema deben contener las mismas concen ­
traciones de medio de cultivo y la misma biomasa inicial de algas. 
Las soluciones problema de las concentraciones elegidas se preparan 
normalmente mezclando una solución madre de la sustancia pro ­
blema con medio de cultivo y con cultivo de inóculo. En principio, estas soluciones madre se preparan disolviendo la sustancia en medio 
de ensayo. 
Pueden utilizarse disolventes (por ejemplo, acetona, alcohol  t-butílico 
y dimetil-formamida) como vehículo para añadir al medio de ensayo sustancias poco hidrosolubles (2) (3). La concentración del disol ­
vente no debe superar los 100 μl/l, y debe ser igual en todos los 
cultivos (incluidos los controles) de la serie de ensayo.
 
1.8.9.  Incubación  
Los recipientes de ensayo deben taparse con tapones permeables al 
aire. Se agitan los recipientes y se colocan en el dispositivo de 
cultivo. Durante el ensayo es necesario mantener las algas en sus ­
pensión y facilitar el paso del CO  2 , por lo que debe efectuarse una 
agitación constante. Los cultivos han de mantenerse a una tempera ­
tura entre 21 y 24 °C, con variaciones máximas de 2 °C. En caso de 
especies distintas de las indicadas en el apéndice 1 como, por ejem ­
plo, especies tropicales, puede ser apropiada una temperatura supe ­
rior, siempre que se puedan cumplir los criterios de validez. Se 
recomienda distribuir aleatoriamente los matraces en la incubadora 
y cambiarlos de posición cada día.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
El pH del medio de control no debe subir más de 1,5 unidades 
durante el ensayo. En caso de metales y compuestos que se ionicen 
parcialmente a un pH próximo al del ensayo, puede ser necesario limitar la variación de pH para obtener unos resultados reproducibles y bien definidos. Técnicamente puede conseguirse una variación 
< 0,5 unidades de pH procurando una entrada suficiente de CO
 2 a 
la solución problema desde la atmósfera ambiente, por ejemplo, aumentando la intensidad de la agitación. Otra posibilidad es conte ­
ner la demanda de CO
 2 reduciendo la biomasa inicial o la duración 
del ensayo. 
La superficie en que se incuban los cultivos debe recibir una ilumi ­
nación fluorescente uniforme, por ejemplo, del tipo «blanca fría» o 
«diurna». Las necesidades de luz de las algas y cianobacterias varían con la cepa. Debe seleccionarse la intensidad de la luz que sea más adecuada para el organismo utilizado en el ensayo. Si se utilizan las 
especies recomendadas de algas verdes, la intensidad luminosa al 
nivel de las soluciones problema debe estar en el intervalo de 60 a 120 μE·m
 –2 ·s –1 cuando se mide en la banda de longitudes de onda 
correspondiente a la fotosíntesis (400-700 nm) utilizando un receptor 
adecuado. Algunas especies, en particular  Anabaena flos-aquae , cre­
cen bien con intensidades luminosas más bajas y pueden sufrir daños con intensidades superiores. Para tales especies debe elegirse una intensidad luminosa media en el intervalo de 40 a 60 μE·m
 –2 ·s –1 . 
(Con instrumentos de medición de la luz calibrados en luxes, una 
gama equivalente de 4 440 a 8 880 lux con luz blanca fría corres ­
ponde aproximadamente a la intensidad luminosa recomendada de 60 a 120 μE·m
 –2 ·s –1 ). La intensidad luminosa no debe variar en más del 
15 % respecto a la intensidad luminosa media en toda la superficie 
de incubación.  
1.8.10.  Duración del ensayo  
La duración del ensayo es en principio de 72 horas. Sin embargo, 
pueden elegirse duraciones más largas o más breves, siempre que se puedan cumplir los criterios de validez del punto 1.7.
 
1.8.11.  Mediciones y determinaciones analíticas  
La biomasa de las algas de cada matraz se determina al menos una 
vez al día mientras dure el ensayo. Si se toman con pipeta pequeños volúmenes de la solución problema para efectuar mediciones, dichos 
volúmenes no deben reponerse. 
La medición de la biomasa se efectúa por recuento manual de células 
con microscopio o bien con un contador electrónico de partículas (por recuento de células o biovolumen). Pueden utilizarse otras téc ­
nicas como, por ejemplo, la citometría de flujo, la fluorescencia 
clorofílica  in vitro  o in vivo  (6) (7), o la densidad óptica, siempre 
que se pueda demostrar una correlación satisfactoria con la biomasa en todo el intervalo de biomasas correspondiente al ensayo. 
El pH de las soluciones debe medirse tanto al principio como al final 
del ensayo. 
Siempre que se disponga de un método analítico para la determina ­
ción de la sustancia problema en el intervalo de concentraciones utilizadas, debe procederse a analizar las soluciones problema para 
verificar las concentraciones iniciales y el mantenimiento de las 
concentraciones de exposición durante el ensayo.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Puede ser suficiente analizar la concentración de la sustancia pro ­
blema al inicio y al final del ensayo a una concentración de ensayo 
baja y otra alta, así como a una concentración próxima a la EC  50 
prevista, si es probable que las concentraciones de exposición varíen 
durante el ensayo en menos del 20 % respecto a sus valores nomi ­
nales. Se recomienda el análisis a todas las concentraciones de en ­
sayo al inicio y al final del ensayo si es poco probable que perma ­
nezcan en la banda del 80 a 120 % de su valor nominal. En caso de sustancias problema que sean volátiles, inestables o se adsorban 
fuertemente, se recomienda tomar muestras adicionales para analizar ­
las a intervalos de 24 horas durante el período de exposición, a fin de definir mejor las pérdidas de sustancia problema. Con estas sus ­
tancias se necesitarán más réplicas. En todos los casos, la determi ­
nación de las concentraciones de la sustancia problema solo tendrá 
que efectuarse en uno de los recipientes replicados de cada concen ­
tración de ensayo (o en los contenidos reunidos de los recipientes replicados). 
Los medios de ensayo preparados específicamente para el análisis de 
las concentraciones de exposición durante el ensayo se tratarán de la misma forma que los empleados para el ensayo, es decir, se inocu ­
larán con algas y se incubarán en condiciones idénticas. Si hace falta 
analizar la concentración de la sustancia problema disuelta, puede ser necesario separar las algas del medio. Se recomienda hacer la sepa ­
ración por centrifugación con una fuerza  g baja, suficiente para 
sedimentar las algas. 
Si está demostrado que la concentración de la sustancia problema se 
ha mantenido satisfactoriamente a lo largo de todo el ensayo dentro de un intervalo de 20 % de la concentración nominal o de la medida 
inicialmente, el análisis de los resultados puede basarse en los valo ­
res nominales o medidos inicialmente. Si la desviación respecto a la concentración nominal o medida inicialmente es superior al 20 %, el análisis de los resultados debe basarse en la media geométrica de la 
concentración durante la exposición o en modelos que describan el 
descenso de la concentración de la sustancia problema (3) (8). 
El ensayo de inhibición del crecimiento de las algas es un sistema 
más dinámico que la mayoría de los otros ensayos de toxicidad 
acuática a corto plazo. En consecuencia, puede ser difícil definir las concentraciones reales de exposición, especialmente cuando se estudian a baja concentración sustancias que se adsorben. En tales 
casos, la desaparición de la sustancia de la solución por su adsorción 
a la biomasa de las algas en aumento no significa que se haya separado del sistema de ensayo. Cuando se analiza el resultado del ensayo, debe comprobarse si un descenso en la concentración de la 
sustancia problema a lo largo del ensayo va acompañado por un 
descenso de la inhibición del crecimiento. En caso afirmativo, puede estudiarse la aplicación de un modelo adecuado que describa el descenso de la concentración de la sustancia problema (8). En 
caso negativo, puede ser adecuado basar el análisis de los resultados 
en las concentraciones iniciales (nominales o medidas).
 
1.8.12.  Otras observaciones  
Debe procederse a una observación microscópica para verificar que 
el aspecto del cultivo del inóculo es normal y sano y detectar un 
eventual aspecto anormal de las algas (que podría ser debido a la 
exposición a la sustancia problema) al final del ensayo.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Ensayo límite  
Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando un ensayo preliminar 
indica que la sustancia problema no tiene efectos tóxicos a concen ­
traciones de hasta 100 mg·l  –1 , o hasta su límite de solubilidad en el 
medio de ensayo si este valor es más bajo, puede efectuarse un 
ensayo límite comparando las respuestas de un grupo de control y de un único grupo de tratamiento (100 mg·l
 –1 o una concentración 
igual al límite de solubilidad). Se recomienda vivamente que esto se 
apoye en un análisis de la concentración de exposición. Todas las 
condiciones de ensayo y criterios de validez antes descritos son aplicables al ensayo límite, con la excepción de que el número de 
réplicas de tratamiento ha de ser como mínimo seis. Las variables de 
respuesta en el grupo de control y en el de tratamiento pueden analizarse mediante un estudio estadístico para comparar las medias, por ejemplo, una prueba t de Student. Si las varianzas de los dos 
grupos son desiguales, debe procederse a una prueba t ajustada para 
varianzas desiguales.
 
1.8.14.  Modificación para sustancias fuertemente coloreadas  
La irradiación (intensidad de la luz) debe estar en el extremo supe ­
rior de la banda establecida en el presente método de ensayo: 120 μE m
 –2 s –1 como mínimo. 
El paso de luz debe acortarse reduciendo el volumen de las solucio ­
nes problema (en la banda de 5 a 25 ml). 
Debe aplicarse una agitación suficiente (por ejemplo, sacudiendo de 
forma moderada) a fin de que sea elevada la frecuencia de exposi ­
ción de las algas a la alta irradiación en la superficie del cultivo.  
2. RESULTADOS  
2.1. TRAZADO DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO 
La biomasa en los recipientes de ensayo puede expresarse en unida ­
des del indicador utilizado para la medición (por ejemplo, número de 
células, fluorescencia). 
Ha de ponerse en un cuadro la concentración estimada de biomasa 
en los cultivos de ensayo y en los controles, junto con las concen ­
traciones de la sustancia problema y los tiempos de las mediciones, registrados con una resolución mínima de horas completas, para 
trazar las curvas de crecimiento. En esta primera fase pueden ser 
útiles tanto las escalas logarítmicas como las lineales, pero las loga ­
rítmicas son obligatorias y en general presentan mejor las variaciones del crecimiento durante el período de ensayo. Téngase en cuenta que 
el crecimiento exponencial da una línea recta cuando se representa 
en escala logarítmica, y que la inclinación de la línea (pendiente) indica la tasa de crecimiento específico. 
Utilizando las gráficas, ha de comprobarse si los cultivos de control 
crecen durante todo el ensayo exponencialmente y a la tasa prevista. 
Deben examinarse críticamente todos los puntos de datos y el as ­
pecto de las gráficas, y ha de comprobarse que no hay errores en los datos en bruto ni en los procedimientos. Se deben comprobar en particular los puntos que parezcan desviarse por un error sistemático. 
Si está claro que puede señalarse o considerarse muy probable que 
haya habido errores de procedimiento, el punto concreto se marcará como anómalo y no se incluirá en el posterior análisis estadístico. (Una concentración de algas igual a cero en uno de dos o tres 
recipientes replicados puede indicar que el recipiente no se había 
inoculado correctamente, o se había limpiado mal.) En el informe del ensayo deben constar claramente los motivos para rechazar un punto por ser anómalo. Los motivos aceptados son solo los errores 
de procedimiento (raros), y no simplemente una mala precisión. Los 
métodos estadísticos para la detección de valores anómalos tienen una utilidad limitada con este tipo de problema y no pueden sustituir al juicio experto. Es preferible mantener los valores anómalos (se ­
ñalados como tales) entre los puntos recogidos en cualquier presen ­
tación posterior de datos en forma de gráfica o de cuadro.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. VARIABLES DE RESPUESTA 
El objetivo del ensayo es determinar los efectos de la sustancia 
problema sobre el crecimiento de las algas. El presente método de ensayo describe dos variables de respuesta, ya que los Estados miembros tienen distintas preferencias y necesidades normativas. 
Para que los resultados del ensayo sean aceptables en todos los 
Estados miembros, los efectos deben evaluarse utilizando las dos variables de respuesta a) y b) que se describen a continuación: 
a) Tasa media de crecimiento específico: esta variable de respuesta 
se calcula basándose en el aumento logarítmico de la biomasa 
durante el período de ensayo, expresado por día. 
b) Rendimiento: esta variable de respuesta es la biomasa al final del 
ensayo menos la biomasa al inicio. 
Para la aplicación del presente método en el marco normativo co ­
munitario, el cálculo de los resultados debe basarse en una tasa media de crecimiento específico por los motivos recogidos a conti ­
nuación. Ha de señalarse que los valores de toxicidad calculados a 
partir de estas dos variables de respuesta no son comparables y es necesario reconocer esta diferencia cuando se utilicen los resultados del ensayo. Los valores de EC
 x basados en la tasa media de creci ­
miento específico (EC  tx ) son normalmente más elevados que los 
basados en el rendimiento (EC  rx ) si se respetan las condiciones del 
presente método de ensayo, debido al fundamento matemático de los planteamientos respectivos. Esto no debe interpretarse como una 
diferencia en la sensibilidad de las dos variables de respuesta, sino 
como una diferencia puramente matemática entre los valores. El concepto de tasa media de crecimiento específico se basa en el modelo general de crecimiento exponencial de las algas en cultivos 
no limitados, en los que la toxicidad se estima en función de los 
efectos sobre la tasa de crecimiento, sin depender del nivel absoluto de la tasa de crecimiento específico del control, de la pendiente de la curva concentración-respuesta ni de la duración del ensayo. Por el 
contrario, los resultados basados en la variable de respuesta «rendi ­
miento» dependen de todas estas otras variables. La EC
 rx depende de 
la tasa de crecimiento específico de la especie de algas utilizada en cada ensayo y de la tasa máxima de crecimiento específico, que 
puede variar de una especie a otra e incluso de una cepa a otra. 
Esta variable de respuesta no debe utilizarse para comparar la sen ­
sibilidad de distintas especies o incluso distintas cepas ante un agente tóxico. Aunque científicamente se prefiere el uso de la tasa media de 
crecimiento específico para estimar la toxicidad, en el presente mé ­
todo de ensayo se incluye también la estimación a partir del rendi ­
miento para cumplir los requisitos normativos vigentes en ciertos países.
 
2.2.1.  Tasa media de crecimiento  
La tasa media de crecimiento específico durante un período determi ­
nado se calcula como el incremento logarítmico de la biomasa en 
cada uno de los recipientes de control y de tratamiento, mediante la siguiente ecuación.
 
μ i-j ¼ lnX j – lnX i 
t j – t i (día  –1 ) 
donde: μ
 i-j es la tasa media de crecimiento específico entre el tiempo  i y el j; 
X i es la biomasa en el tiempo  i; 
X j es la biomasa en el tiempo  j. ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Respecto a cada grupo de tratamiento y de control ha de calcularse 
un valor medio de la tasa de crecimiento y una estimación de la 
varianza. 
La tasa media de crecimiento específico a lo largo de toda la dura ­
ción del ensayo (en principio, días 0-3) se calcula utilizando como 
valor inicial la biomasa teórica inoculada en vez de un valor inicial 
medido, ya que de esta manera puede obtenerse normalmente una precisión mayor. Si el dispositivo utilizado para medir la biomasa permite determinar con suficiente precisión la pequeña biomasa del 
inóculo (por ejemplo, citómetro de flujo), entonces podrá utilizarse la 
concentración medida de la biomasa inicial. También se determinará la tasa de crecimiento de cada sección, calculada como las tasas de crecimiento específico de cada día durante la realización del ensayo 
(días 0-1, 1-2 y 2-3) y se examinará si la tasa de crecimiento de los 
controles permanece constante (véanse los criterios de validez, punto 1.7). Si la tasa de crecimiento específico del día uno es sig ­
nificativamente más baja que la tasa media de crecimiento específico, 
es posible que haya un tiempo de latencia. Aunque es posible mi ­
nimizar y eliminar prácticamente el tiempo de latencia en los cultivos de control mediante la propagación adecuada de un cultivo previo, un tiempo de latencia en los cultivos de tratamiento puede indicar 
que se produce una recuperación tras la agresión tóxica inicial o una 
reducción de la exposición por una pérdida de sustancia problema (incluida la sorción en la biomasa de las algas) tras la exposición inicial. Por tanto, puede considerarse la tasa de crecimiento de cada 
sección para evaluar el efecto de la sustancia problema presente 
durante el período de exposición. Una diferencia importante entre la tasa de crecimiento de cada sección y la tasa media de crecimiento indica que hay una desviación respecto al crecimiento exponencial 
constante y que han de examinarse con detalle las curvas de creci ­
miento. 
El porcentaje de inhibición en tasa de crecimiento de cada réplica de 
tratamiento se calcula con la siguiente ecuación:
 
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
donde: 
%I t es el porcentaje de inhibición en tasa media de crecimiento 
específico; 
μ C es el valor promedio de la tasa media de crecimiento específico 
(μ) en el grupo de control; 
μ T es la tasa media de crecimiento específico en la réplica de 
tratamiento. 
Si se utilizan disolventes en la preparación de las soluciones pro ­
blema, para el cálculo del porcentaje de inhibición deben emplearse controles con disolvente en vez de controles sin disolvente.
 
2.2.2.  Rendimiento  
El rendimiento se calcula restando a la biomasa presente al final del 
ensayo la biomasa inicial en cada recipiente de los controles y de 
los tratamientos. Respecto a cada grupo de tratamiento y de control ha de calcularse un valor promedio del rendimiento y una estima ­
ción de la varianza. El porcentaje de inhibición en rendimiento 
(%I
 y ) puede calcularse de la manera siguiente con cada réplica de 
tratamiento:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
donde: 
% I  r es el porcentaje de inhibición en rendimiento; 
Y C es el valor promedio del rendimiento en el grupo de control; 
Y T es el valor del rendimiento en la réplica de tratamiento.  
2.3. TRAZADO DE LA CURVA CONCENTRACIÓN-RESPUESTA 
Se representa el porcentaje de inhibición frente al logaritmo de la 
concentración de sustancia problema y se examina la representación, desechando los datos que se hayan marcado como anómalos en la primera fase. Se ajusta una línea suave a los puntos correspondientes 
a los datos, manualmente o mediante interpolación con ordenador, 
para obtener una primera impresión de la relación concentración- respuesta; después se aplica un método más detallado, de preferencia uno estadístico informatizado. En función del uso previsto de los 
datos, la calidad (precisión) y la cantidad de los mismos, así como 
la disponibilidad de herramientas de análisis, puede decidirse (y a veces justificarse plenamente) terminar en esta fase el análisis de los datos para leer simplemente las cifras clave EC
 50 y EC  10 (o EC  20 ) a 
partir de la curva ajustada visualmente (véase también el punto si ­
guiente sobre los efectos de estimulación). Pueden considerarse vá ­
lidas las siguientes razones para no utilizar un método estadístico: 
— Los datos no son adecuados para producir, con métodos infor ­
matizados, resultados más fiables que los obtenidos por el juicio experto; en tales situaciones, algunos programas informáticos 
pueden incluso no proporcionar una solución fiable (las iteracio ­
nes pueden no converger, etc.). 
— Las respuestas de estimulación del crecimiento no pueden tratarse 
adecuadamente con los programas informáticos disponibles (véase más abajo).
 
2.4. PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS 
El objetivo es obtener una relación cuantitativa concentración-res ­
puesta mediante análisis de regresión. Es posible utilizar una regre ­
sión lineal ponderada después de haber efectuado una linealización 
de los datos de respuesta como, por ejemplo, en probit o logit o 
unidades Weibull (9), pero son preferibles los procedimientos de regresión no lineal porque con ellos se tratan mejor las inevitables irregularidades de los datos y las desviaciones respecto a distribu ­
ciones suaves. Si la inhibición está próxima al 0 o al 100 %, la 
transformación puede magnificar tales irregularidades, interfiriendo así con el análisis (9). Debe señalarse que los métodos normales de análisis que utilizan las transformaciones en probit, logit o de 
Weibull están previstos para aplicarse a datos cuantales (por ejemplo, 
mortalidad o supervivencia), y que es necesario modificarlos para aplicarlos a datos de crecimiento o biomasa. En (10), (11) y (12) pueden encontrarse métodos específicos de determinación de los 
valores de EC
 x a partir de datos continuos. En el apéndice 4 se da 
más información sobre el uso de análisis de regresión no lineal.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Respecto a cada variable de respuesta que haya de analizarse, se 
utilizará la relación concentración-respuesta para calcular estimacio ­
nes puntuales de los valores de EC  x . Cuando sea posible, se deter ­
minarán los límites de confianza del 95 % de cada estimación. La bondad del ajuste de los datos de respuesta al modelo de regresión se 
evaluará de forma gráfica o estadística. El análisis de regresión se 
efectuará utilizando las respuestas de las distintas réplicas y no los promedios de los grupos de tratamiento. Si, no obstante, es difícil o imposible el ajuste de una curva no lineal, debido a una dispersión 
demasiado grande de los datos, el problema puede evitarse efec ­
tuando la regresión con promedios de grupos como forma práctica de reducir la influencia de los valores anómalos sospechados. El recurso a esta opción debe indicarse en el informe del ensayo 
como desviación del procedimiento normal porque el ajuste de la 
curva con los valores de las distintas réplicas no llevaba a un buen resultado. 
Las estimaciones de la EC
 50 y los límites de confianza pueden 
obtenerse también utilizando la interpolación lineal con remuestreo (bootstrapping ) (13) si los métodos o modelos de regresión disponi ­
bles no son adecuados para los datos. 
Para la estimación de los valores de LOEC y, por tanto, de NOEC, y 
los efectos de la sustancia problema sobre la tasa de crecimiento, es necesario comparar los promedios de tratamiento utilizando técnicas de análisis de la varianza (ANOVA). A continuación se ha de com ­
parar el promedio obtenido a cada concentración con el del control 
aplicando un método apropiado de comparación múltiple o de prueba de tendencia. Pueden ser útiles las pruebas de Dunnett o Williams (14) (15) (16) (17) (18). Hay que comprobar si se sostiene la hipó ­
tesis del ANOVA de homogeneidad de la varianza. Esta comproba ­
ción puede realizarse gráficamente o mediante una prueba en regla (18). Son adecuadas las pruebas de Levene o Bartlett. El incumpli ­
miento de la hipótesis de homogeneidad de las varianzas puede 
corregirse a veces mediante la transformación logarítmica de los 
datos. Si la heterogeneidad de la varianza es extrema y no puede corregirse mediante transformación, ha de considerarse la posibilidad de efectuar un análisis por métodos como las pruebas de tendencia 
de Jonkheere de ajuste secuencial de residuos. En (12) puede encon ­
trarse más información sobre la determinación de la NOEC. 
Los recientes avances científicos han llevado a recomendar el aban ­
dono del concepto de NOEC para sustituirlo por el de estimaciones puntuales de EC
 x basadas en la regresión. Aún no se ha determinado 
un valor adecuado de x para esta prueba con algas. Parece que es 
apropiado el intervalo del 10 al 20 % (según la variable de respuesta elegida) y lo mejor es indicar tanto la EC
 10 como la EC  20 . 
2.5. ESTIMULACIÓN DEL CRECIMIENTO 
A veces se observa una estimulación del crecimiento 
(inhibición negativa) a bajas concentraciones. Esto puede deberse a la hormesis («estimulación tóxica») o a la adición de factores esti ­
mulantes del crecimiento al poner el material problema en el medio 
mínimo utilizado. Téngase en cuenta que la adición de nutrientes inorgánicos no debería tener ningún efecto directo porque el medio de ensayo ha de presentar un exceso de nutrientes a lo largo de todo 
ensayo. Normalmente, la estimulación a dosis bajas puede ignorarse 
al calcular la EC
 50 , salvo en casos extremos. Sin embargo, cuando 
sea extrema o deba calcularse un valor de EC  x para una x baja, 
puede ser necesario aplicar algún procedimiento especial. Siempre 
que sea posible debe evitarse la eliminación de las respuestas de 
estimulación del análisis de datos, y, si los programas informáticos disponibles para el ajuste de las curvas no son capaces de aceptar una estimulación poco importante, puede utilizarse la interpolación 
lineal con remuestreo ( bootstrapping ). Si la estimulación es extrema, 
puede considerarse la aplicación de un modelo de hormesis (19).
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO POR SUSTANCIAS NO TÓ ­
XICAS 
Los materiales problema que absorben la luz pueden producir una 
reducción de la tasa de crecimiento porque el sombreado que pro ­
vocan reduce la cantidad disponible de luz. Tales efectos de tipo 
físico deben distinguirse de los efectos tóxicos mediante la modifi ­
cación de las condiciones del ensayo y deben figurar aparte en los informes. Puede encontrarse información al respecto en (2) y (3).
 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancia problema: — naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes, in ­
cluido el límite de hidrosolubilidad, 
— identificación química, incluida la pureza. 
Especie de ensayo: 
— cepa, proveedor u origen y condiciones de cultivo aplicadas. Condiciones de ensayo: — fecha de inicio y duración del ensayo, — descripción del diseño del ensayo: recipientes de ensayo, volú ­
menes de cultivo, densidad de biomasa al inicio del ensayo, 
— composición del medio, — concentraciones de ensayo y réplicas (por ejemplo, número de 
réplicas en paralelo, número de concentraciones de ensayo y progresión geométrica utilizada), 
— descripción de la preparación de soluciones problema, incluido el 
uso de disolventes, etc., 
— dispositivo de cultivo, — intensidad y calidad de la luz (fuente, homogeneidad), — temperatura, — concentraciones estudiadas: concentraciones nominales de ensayo 
y eventuales resultados de análisis para determinar la concentra ­
ción de la sustancia problema en los recipientes de ensayo; deben comunicarse la eficiencia de recuperación del método y el límite de cuantificación de la matriz de ensayo, 
— todas las desviaciones respecto al presente método de ensayo, 
— método de determinación de la biomasa y pruebas de la correla ­
ción entre el parámetro medido y el peso seco. 
Resultados: — valores de pH al inicio y al fin del ensayo en todos los recipien ­
tes de tratamiento, 
— biomasa de cada matraz en cada punto de medida y método de 
medición de la biomasa,
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— curvas de crecimiento (biomasa frente al tiempo), 
— variables de respuesta calculadas de cada réplica de tratamiento, 
con valores promedios y coeficiente de variación de las réplicas, 
— representación gráfica de la relación concentración-efecto, — estimaciones de la toxicidad correspondiente a variables de res ­
puesta, por ejemplo, EC
 50 , EC  10 , EC  20 , e intervalos de confianza 
asociados; en caso de que se calculen la LOEC y la NOEC, se 
indicarán sus valores y los métodos estadísticos utilizados en su 
determinación, 
— si se ha utilizado el ANOVA, el tamaño del efecto que puede 
observarse (por ejemplo, la diferencia significativa mínima), 
— la eventual estimulación del crecimiento que se haya observado 
en cualquier recipiente de tratamiento, 
— cualquier otro efecto observado como, por ejemplo, cambios 
morfológicos de las algas, 
— discusión de los resultados, incluida la eventual influencia que 
tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OECD TG 201 (2006). Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test. 
(2) ISO 1998: Water quality — Guidance for algal growth inhibi ­
tion tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442. 
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health 
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, 
No. 23. 
(4) ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667-16. 
(5) ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. ISO 
8692. 
(6) Mayer, P., Cuhel, R., y Nyholm, N. (1997). A simple  in vitro  
fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531. 
(7) Slovacey, R.E., y Hanna, P.J.  In vivo  fluorescence determina ­
tions of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceano ­
graphy 22,5 (1977), pp. 919-925. 
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L., y Batley, G.E. 
(2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079. 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Te ­
chnol. 19, 713-718.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N., Sørensen, P.S., Kusk, K.O., y Christensen, E.R. 
(1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167. 
(11) Bruce, R.D., y Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494. 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
(13) Norberg-King, T.J. (1988). An interpolation estimate for chro ­
nic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity As ­
sessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, 
MN. 
(14) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121. 
(15) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482-491. 
(16) Williams, D.A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. 
(17) Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. 
(18) Draper, N.R., y Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York. 
(19) Brain P., y Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Apéndice 1  
Cepas conocidas por ser adecuadas para el ensayo  
Algas verdes  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (antes conocida como  Selenastrum capricor ­
nutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG 
— Desmodesmus subspicatus  (antes conocida como  Scenedesmus subspicatus ) 
86.81 SAG  
Diatomeas  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cianobacterias  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A 
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Orígenes de las cepas  
Las cepas recomendadas pueden conseguirse en forma de cultivos procedentes de 
una sola célula de alga en las siguientes colecciones (por orden alfabético): 
ATCC: American Type Culture Collection 
10801 University Boulevard 
Manassas, Virginia 20110-2209 
EE. UU. 
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa 
Institute of Freshwater Ecology 
Windermere Laboratory Far Sawrey, Amblerside 
Cumbria 
LA22 0LP REINO UNIDO 
Sammlung von Algenkulturen 
Albrecht-von-Haller-Institut 
Universität Göttingen Nikolausberger Weg 18 
37073 Gotinga 
ALEMANIA 
UTEX Culture Collection of Algae 
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology 
School of Biological Sciences The University of Texas at Austin 
Austin, Tejas 78712 
EE. UU.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Aspecto y características de las especies recomendadas  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Aspecto Células cur ­
vadas y retor ­
cidas, aisladas Células ova ­
les, en su 
mayoría aisla ­
das Forma cilín ­
drica Cadenas de 
células ovales Forma cilín ­
drica 
Tamaño (longitud por anchura), 
en μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Volumen celular ( μm 3 /célula) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Peso seco celular (mg/célula) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Tasa de crecimiento (  3 ) (día  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Medido con un contador electrónico de partículas. 
( 2 ) Calculado a partir del tamaño. 
( 3 ) Tasa de crecimiento observada con mayor frecuencia en el medio de la OCDE con una intensidad luminosa aproximada de 
70 μE·m  –2 ·s –1 y 21 °C.  
Recomendaciones específicas de cultivo y manipulación de las especies de 
ensayo recomendadas  
Pseudokirchneriella subcapitata  y Desmodesmus subspicatus  
Generalmente es fácil mantener estas algas verdes en diversos medios de cultivo. 
Las colecciones de cultivos proveen información sobre los medios adecuados. 
Las células están normalmente aisladas, y las mediciones de la densidad celular 
pueden efectuarse fácilmente con un contador electrónico de partículas o un microscopio.
 
Anabaena flos-aquae  
Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo de inóculo. 
Es especialmente importante evitar que el cultivo discontinuo pase de la fase 
logarítmica de crecimiento al renovarse, ya que la recuperación es difícil después.  
Anabaena flos-aquae  forma agregados de cadenas encajadas de células. El ta ­
maño de estos agregados puede cambiar según las condiciones de cultivo. Puede 
ser necesario romper estos agregados si, para determinar la biomasa, se hace un recuento con microscopio o se utiliza un contador electrónico de partículas. 
Es posible someter submuestras a un baño de ultrasonidos para romper las 
cadenas, a fin de reducir la variabilidad del recuento. Si el baño dura más tiempo del necesario para romper las cadenas en segmentos más cortos, puede que se destruyan las células. La intensidad y la duración del baño de ultrasonidos deben 
ser las mismas con todos los recipientes de tratamiento. 
Debe contarse un número suficiente de campos en el hemocitómetro (al menos 
400 células) para compensar la variabilidad. Así mejora la fiabilidad de las 
determinaciones de densidad efectuadas con el microscopio. 
Para la determinación del volumen celular total de  Anabaena  puede utilizarse un 
contador electrónico de partículas tras romper las cadenas de células mediante un 
baño de ultrasonidos aplicado cuidadosamente. Es necesario ajustar la energía de 
los ultrasonidos para evitar destruir las células. 
Utilícese un mezclador vortex o un método similar adecuado para que la sus ­
pensión de algas utilizada para inocular los recipientes de ensayo esté bien 
mezclada y sea homogénea.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Los recipientes de ensayo deben colocarse en un agitador orbital o recíproco, a 
unas 150 revoluciones por minuto. Otra posibilidad es utilizar una agitación 
intermitente para reducir la tendencia de  Anabaena  a agregarse. Si se produce 
la agregación, hay que tener cuidado para tomar muestras representativas con el fin de medir la biomasa. Para romper los agregados de algas puede ser necesario 
agitar vigorosamente antes de tomar la muestra.
 
Synechococcus leopoliensis  
Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo de inóculo. 
Las colecciones de cultivos proveen información sobre los medios adecuados.  
Synechococcus leopoliensis  crece en forma de células aisladas de forma cilín ­
drica. Las células son muy pequeñas, lo que hace difícil utilizar el recuento con microscopio para medir la biomasa. Son útiles los contadores electrónicos de partículas equipados para contar partículas de hasta un tamaño aproximado de 
1 μm. También puede aplicarse la técnica de medición fluorométrica  in vitro .
 
Navicula pelliculosa  
Pueden utilizarse diversos medios de cultivo para mantener un cultivo de inóculo. 
Las colecciones de cultivos proveen información sobre los medios adecuados. 
Obsérvese el requisito de que el medio tenga silicato.  
Navicula pelliculosa  puede formar agregados en ciertas condiciones de creci ­
miento. Debido a la producción de lípidos, las células de las algas tienden a veces a acumularse en la película superficial. En tales circunstancias, hay que 
adoptar medidas especiales cuando se toman submuestras para la determinación 
de la biomasa a fin de que las muestras sean representativas. Puede ser necesario agitar enérgicamente, por ejemplo utilizando un mezclador vortex.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Apéndice 2  
Medios de cultivo  
Puede utilizarse uno de los dos medios de cultivo siguientes: 
Medio de la OCDE: medio original de las directrices de ensayo de la OCDE TG 
201, también de acuerdo con la norma ISO 8692. 
Medio AAP de la EPA estadounidense, también de acuerdo con la ASTM. 
Para preparar estos medios deben utilizarse sustancias de grado analítico o re ­
activo y agua desionizada.  
Composición del medio AAP (EPA estadounidense) y del medio de la OCDE TG 201  
Componente EPA OCDE 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) La proporción molar del EDTA respecto al hierro sobrepasa ligeramente la unidad. Así se evita la precipi ­
tación del hierro y, a la vez, se reduce al mínimo la quelación de iones de metales pesados.  
En el ensayo con la diatomea  Navivcula pelliculosa , ambos medios deben 
recibir un suplemento de Na  2 SiO  3 · 9H  2 0 para obtener una concentración de 
1,4 mg Si/l. 
El pH del medio se mide en equilibrio entre el carbonato del medio y la presión 
parcial de CO  2 del aire atmosférico. He aquí la relación aproximada entre el pH 
a 25 °C y la concentración molar de bicarbonato: 
pH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Con 15 mg NaHCO  3 /l, pH  eq = 7,5 (medio de la EPA estadounidense) y 
con 50 mg NaHCO  3 /l, pH  eq = 8,1 (medio de la OECD).  
Composición en elementos de los medios de ensayo  
Elemento EPA OCDE 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Preparación del medio de la OCDE  
Nutriente Concentración en la solución madre 
Solución madre 1: macronutrientes  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Solución madre 2: hierro  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Solución madre 3: oligoelementos  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Solución madre 4: bicarbonato  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Las soluciones madre se esterilizan mediante filtración por membrana (diámetro 
medio de poro 0,2 μm) o en autoclave (120 °C, 15 min). Las soluciones se 
guardan en la oscuridad a 4 °C. 
Las soluciones madre 2 y 4 no deben esterilizarse en autoclave, sino mediante 
filtración por membrana.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
El medio de cultivo se prepara añadiendo a agua un volumen adecuado de las 
soluciones madre 1 a 4: 
A 500 ml de agua destilada se añaden: 
— 10 ml de solución madre 1, — 1 ml de solución madre 2, — 1 ml de solución madre 3, — 1 ml de solución madre 4. Se enrasa a 1 000 ml con agua esterilizada. 
Hay que dejar un tiempo suficiente para que el medio llegue al equilibrio con el 
CO
 2 de la atmósfera, en caso necesario burbujeando aire esterilizado por filtra ­
ción durante varias horas.  
Preparación del medio AAP  
A1.1. Se añade 1 ml de cada solución madre de A1.2.1-A1.2.7 a unos 900 ml 
de agua destilada o desionizada y después se diluye hasta 1 litro. 
A1.2. Se preparan soluciones madre de macronutrientes disolviendo las si ­
guientes sustancias en 500 ml de agua destilada o desionizada. Los 
reactivos A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3, y A1.2.4 pueden combinarse en una única solución madre. 
A1.2.1.  NaNO
 3 — 12,750 g 
A1.2.2.  MgCl  2 · 6H 2 O -6,082 g 
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O -2,205 g 
A1.2.4.  Solución madre de micronutrientes  (véase A1.3). 
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O -7,350 g 
A1.2.6.  K  2 HPO  4 -0,522 g 
A1.2.7.  NaHCO  3 -7,500 g 
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O (véase la nota A1.1)  
Nota A1.1 : Utilícese solo para el ensayo con las especies de diatomeas. 
Puede añadirse directamente (202,4 mg) o en forma de solución madre para dar una concentración final de 20 mg/l Si en el medio. 
A1.3. La solución madre de micronutrientes se prepara disolviendo las si ­
guientes sustancias en 500 ml de agua destilada o desionizada: 
A1.3.1.  H
 3 BO 3 — 92,760 mg 
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O — 207,690 mg 
A1.3.3.  ZnCl  2 — 1,635 mg 
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O — 79,880 mg 
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O — 0,714 mg 
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O — 3,630 mg 
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O — 0,006 mg 
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O — 150,000 mg 
[(etilendinitrilo)tetraacetato de disodio]  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O — 0,005 mg (véase la nota A1.2)  
Nota A1.2 : Utilícese solo en el medio para los cultivos madre de 
especies de diatomeas. 
A1.4. Se ajusta el pH a 7,5 ± 0,1 con NaOH o HCl 0,1  N o 1,0  N. 
A1.5. Se pasan los medios a un recipiente estéril filtrando por un filtro de 
membrana de 0,22 μm si se va a utilizar un contador de partículas o 
por un filtro de 0,45 μm en caso contrario. 
A1.6. Los medios se guardan en la oscuridad a unos 4 °C hasta que se vayan 
a utilizar.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Apéndice 3  
Ejemplo de procedimiento de cultivo de algas  
Observaciones generales  
El objetivo del cultivo mediante el siguiente procedimiento es obtener cultivos de 
algas para ensayos de toxicidad. 
Deben utilizarse métodos apropiados que garanticen que los cultivos de algas no 
están infectados con bacterias. Puede ser conveniente utilizar cultivos axénicos, 
pero se deben obtener y utilizar cultivos procedentes de una sola célula de alga. 
Todas las operaciones deben llevarse a cabo en condiciones estériles, con el fin 
de evitar la contaminación con bacterias u otras algas.  
Equipo y material  
Véase el epígrafe «Equipo» del método de ensayo.  
Procedimientos para la obtención de cultivos de algas  
Preparación de las soluciones de nutrientes (medios)  
Todas las sales nutrientes del medio se preparan como soluciones madre concen ­
tradas y se mantienen en lugar fresco y oscuro. Estas soluciones se esterilizan por 
filtración o en autoclave. 
El medio se prepara añadiendo a agua destilada la cantidad correcta de solución 
madre, teniendo cuidado de que no se produzca ninguna contaminación. Para 
conseguir un medio sólido se añade un 0,8 % de agar.  
Cultivos madre  
Los cultivos madre son pequeños cultivos de algas que se trasfieren periódica ­
mente a un medio fresco para hacer de material inicial del ensayo. Si los cultivos 
no se utilizan regularmente, se extienden en tubos de agar inclinado. De aquí se 
transfieren a medio fresco al menos cada dos meses. 
Los cultivos madre se cultivan en matraces Erlenmeyer que contienen un volu ­
men de unos 100 ml de medio apropiado. Cuando las algas se incuban a 20 °C con iluminación continua, hay que pasar a un nuevo cultivo cada semana. 
En este pase se transfiere una cantidad del cultivo «viejo» con pipetas estériles a 
un matraz de medio fresco, de forma que la concentración inicial en caso de una especie de rápido crecimiento sea unas 100 veces menor que en el cultivo viejo. 
La tasa de crecimiento de una especie puede determinarse a partir de la curva de 
crecimiento. Si se conoce, será posible calcular la densidad a la cual deberá 
transferirse el cultivo al nuevo medio. Esto deberá realizarse antes de que el 
cultivo alcance su fase letal.
 
Precultivo  
El objetivo del precultivo es obtener una cantidad apropiada de algas para la 
inoculación de los cultivos de ensayo. Dicho precultivo debe incubarse en las 
condiciones del ensayo y utilizarse cuando esté aún en fase de crecimiento exponencial, normalmente después de un período de incubación de 2 a 4 días. Si los cultivos de algas contienen células deformadas o anormales, deberán 
eliminarse.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Apéndice 4  
Análisis de datos por regresión no lineal  
Consideraciones generales  
La respuesta en los ensayos con algas y otros ensayos de crecimiento microbiano 
(a saber, el incremento de la biomasa) es por su naturaleza una variable continua 
o métrica: la tasa de un proceso si se utiliza la tasa de crecimiento, o su integral a 
lo largo del tiempo si se elige la biomasa. Ambas tienen como referencia la respuesta promedio correspondiente de unos controles no expuestos, en réplicas paralelas, que muestran una respuesta máxima en las condiciones aplicadas, 
siendo la luz y la temperatura los principales factores que influyen en el ensayo 
de las algas. El sistema es distribuido u homogéneo y la biomasa puede consi ­
derarse como un continuo sin tener en cuenta las células en sí. La distribución de la varianza del tipo de respuesta de un sistema de estas características depende 
solo de los factores experimentales (lo que se describe típicamente con una 
distribución de errores normal o log-normal). Esto contrasta con las respuestas típicas de bioensayos con datos cuantales, respecto a los cuales se supone con frecuencia que el componente dominante de la varianza es la tolerancia (con una 
distribución típicamente binomial) de cada uno de los organismos. Las respuestas 
del control están en este caso a nivel de base o cero. 
En la situación sin complicación, la respuesta normalizada o relativa, r, dismi ­
nuye de forma monótona desde 1 (inhibición nula) hasta 0 (inhibición del 100 %). Obsérvese que todas las respuestas tienen un error asociado, y que es 
posible calcular inhibiciones negativas aparentes solo como resultado de errores 
aleatorios.
 
Análisis de regresión  
Modelos  
El objeto de un análisis de regresión es describir cuantitativamente la curva 
concentración-respuesta en forma de una función de regresión matemática 
Y = f (C) o, más frecuentemente, F (Z), donde Z = log C. De forma inversa C = f
 –1 (Y) permite calcular valores de EC  x , como las EC  50 , EC  10 y EC  20 , y sus 
límites de confianza del 95 %. Se ha visto que algunas formas funcionales 
matemáticas simples describen bien las relaciones concentración-respuesta obte ­
nidas en los ensayos de inhibición del crecimiento de las algas. Entre estas funciones figuran, por ejemplo, la ecuación logística, la ecuación asimétrica de 
Weibull y la función de distribución log-normal, todas las cuales son curvas 
sigmoideas que se aproximan asintóticamente a uno cuando C → 0, y a cero 
cuando C → infinito. 
Recientemente se ha propuesto el uso de modelos de función de umbral continua 
(por ejemplo, el modelo de Kooijman «de inhibición del crecimiento de la población», Kooijman  et al . 1996) como alternativa a los modelos asintóticos. 
Este modelo supone que no hay efectos a concentraciones por debajo de cierto 
umbral, EC0+, que se calcula mediante extrapolación de la relación concentra ­
ción-respuesta hasta su intersección con el eje de las concentraciones utilizando 
una función continua simple que no es diferenciable en el punto inicial. 
Obsérvese que el análisis puede ser una simple minimización de sumas de 
cuadrados residuales (suponiendo una varianza constante) o cuadrados pondera ­
dos si se compensa la heterogeneidad de la varianza.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Procedimiento  
El procedimiento puede describirse de la manera siguiente: se selecciona una 
ecuación funcional apropiada, Y = f (C), y se ajusta a los datos mediante regresión no lineal. Es mejor utilizar las mediciones de cada matraz en lugar de los promedios de las réplicas, a fin de obtener de los datos el máximo de 
información posible. Si la varianza es alta, por otra parte, la experiencia práctica 
sugiere que los valores promedios de las réplicas pueden dar una estimación matemática más sólida, menos influida por los errores aleatorios de los datos, que si se atiende a los datos de cada uno de los matraces. 
Se traza la curva ajustada y los datos medidos, y se examina si es adecuado el 
ajuste de la curva. El análisis de residuales puede ser una herramienta muy útil a este respecto. Si la relación funcional elegida para ajustar la respuesta a la concentración no describe toda la curva o alguna parte fundamental de ella, 
como la respuesta a concentraciones bajas, debe elegirse otra opción de ajuste 
de la curva como, por ejemplo, una curva asimétrica como la función de Weibull, en lugar de una simétrica. Las inhibiciones negativas pueden ser un problema 
con, por ejemplo, la función de distribución log-normal, y también en este caso 
ha de aplicarse otra función de regresión. No se recomienda asignar un valor nulo ni uno positivo pequeño a tales valores negativos porque así se distorsiona la distribución del error. Puede ser adecuado hacer ajustes distintos en partes 
de la curva tales como la de inhibición baja para calcular valores de EC
 x . bajo . 
A partir de la ecuación ajustada se calculan [por «estimación inversa», C = f
 –1 (Y)], unas estimaciones de varias EC  x en puntos característicos y se 
comunican como mínimo las estimaciones de EC  50 y una o dos de EC  x . bajo . La 
experiencia en la práctica demuestra que la precisión del ensayo de las algas 
suele permitir una estimación razonablemente exacta del nivel de inhibición del 10 % si hay suficientes puntos de datos, salvo que haya estimulación a bajas concentraciones, lo que sería un factor de confusión. La precisión de una esti ­
mación de CE
 20 suele ser bastante mejor que la de una EC  10 , porque la EC  20 
suele corresponder a la parte aproximadamente lineal del centro de la curva 
concentración-respuesta. A veces es difícil interpretar la EC  10 debido a la esti ­
mulación del crecimiento. Así pues, aunque la EC  10 se puede obtener normal ­
mente con suficiente exactitud, se recomienda asimismo indicar la EC  20 . 
Factores de ponderación  
La varianza experimental no es constante en general e incluye típicamente un 
componente proporcional, por lo que es mejor efectuar sistemáticamente una 
regresión ponderada. Se acepta normalmente que los factores de ponderación de un análisis de este tipo son inversamente proporcionales a la varianza. 
W
 i = 1/Var(r  i ) 
Muchos programas de regresión permiten la opción de hacer un análisis de 
regresión ponderada con los factores de ponderación incluidos en un cuadro. 
Es conveniente normalizar los factores de ponderación multiplicándolos por 
n/∑ w i (n es el número de puntos de datos) de forma que su suma sea igual a 
uno. 
Respuestas de normalización  
La normalización por la respuesta promedio de control plantea varios problemas 
de principio y ocasiona una estructura de varianza bastante compleja. Al dividir las respuestas por la respuesta promedio del control para obtener el porcentaje de 
inhibición, se introduce un error más debido al error del promedio del control. 
Salvo que este error sea despreciable, es necesario corregir los factores de pon ­
deración de la regresión y los límites de confianza para tener en cuenta la covarianza con el control (17). Obsérvese que es importante una elevada preci ­
sión del promedio estimado de la respuesta del control a fin de minimizar la 
varianza general de la respuesta relativa. La varianza se indica a continuación:
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
(el subíndice i se refiere al nivel de concentración i y el subíndice 0 a los 
controles) 
Y i = Respuesta relativa = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
con una varianza: 
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂ Y i / ∂ r i ) 2 . Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
y como 
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 y (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
con una distribución normal de los datos y las réplicas m  i y m  0 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
la varianza total de la respuesta relativa, Y  i , se convierte entonces en: 
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
El error en el promedio del control es inversamente proporcional a la raíz cua ­
drada del número de réplicas del control contabilizadas para la media, y a veces se puede justificar la inclusión de datos de antecedentes y, así, reducir mucho el error. Otra posibilidad consiste en no normalizar los datos y ajustar las respuestas 
absolutas, con inclusión de los datos de la respuesta del control, pero introdu ­
ciendo el valor de la respuesta del control como parámetro adicional que debe ajustarse con regresión no lineal. Con una ecuación usual de regresión de 2 parámetros, este método necesita el ajuste de 3 parámetros, por lo que exige 
más puntos de datos que la regresión no lineal de datos que se normalizan 
mediante una respuesta del control preestablecida.
 
Intervalos de confianza inversos  
El cálculo de intervalos de confianza de regresión no lineal por estimación 
inversa es bastante complejo y no es una opción frecuentemente disponible en 
los paquetes normales de programas informáticos de estadística. Pueden obte ­
nerse unos límites de confianza aproximados con programas normales de regre ­
sión no lineal con reparametrización (Bruce y Versteeg, 1992), lo que implica 
reescribir la ecuación matemática con las estimaciones de los puntos deseados, 
por ejemplo, la EC  10 y la EC  50 como parámetros que deben estimarse. [Sea la 
función I = f ( α, β, concentración) y utilícense las relaciones de la definición f ( α, 
β, EC  10 ) = 0,1 y f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 para sustituir f ( α, β, concentración) por una 
función equivalente g (EC  10 , EC  50 , concentración.] 
Se realiza un cálculo más directo (Andersen  et al ., 1998) manteniendo la ecua ­
ción original y utilizando un desarrollo de Taylor en torno a los promedios de r  i 
y r 0 . 
Últimamente se han popularizado los «métodos de remuestreo» ( boot strap ). 
Tales métodos utilizan los datos medidos y un remuestreo frecuente dirigido 
por un generador de números aleatorios para calcular una distribución empírica de la varianza.
 
Bibliografía  
Kooijman, S.A.L.M., Hanstveit, A.O., Nyholm, N. (1996). No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632. 
Bruce, R.D., y Versteeg, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485-1494. 
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A., & Nyholm, N. 
(1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. DETERMINACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD «FACIL»  
PARTE I.  CONSIDERACIONES GENERALES  
I.1. INTRODUCCIÓN 
Se describen seis métodos de ensayo que permiten detectar la biode ­
gradabilidad fácil de los productos químicos en medio acuoso aero ­
bio; 
a) pérdida de carbono orgánico disuelto (COD) (Método C.4-A); 
b) prueba de detección de la OCDE modificada — Pérdida de COD 
(Método C.4-B); 
c) desprendimiento de dióxido de carbono (CO  2 ) (prueba de Sturm 
modificada) (Método C.4-C); 
d) respirometría manométrica (Método C.4-D); 
e) frasco cerrado (Método C.4-E); 
f) MITI (Ministerio de Industria y Comercio Internacional de Japón) 
(Método C.4-F). 
En la Parte I del presente método se recogen consideraciones gene ­
rales y consideraciones comunes a los seis ensayos. Los aspectos específicos de los distintos métodos se tratan en las partes II a 
VII. Los anexos contienen definiciones, fórmulas y material comple ­
mentario. 
Un estudio comparativo interlaboratorios, realizado por la OCDE en 
1988, demostró la homogeneidad de los resultados obtenidos con 
estos métodos. Sin embargo, las características físicas de la sustancia problema pueden hacer que se prefiera un método a los otros.
 
I.2. SELECCIÓN DEL MÉTODO ADECUADO 
Para seleccionar el método más adecuado es fundamental poseer 
información sobre la solubilidad, presión de vapor y características de absorción del producto químico. Debería conocerse la estructura química o la fórmula para calcular los valores teóricos o comprobar 
los valores obtenidos en las mediciones de parámetros, como DTO, 
CO
 2 T, COD, COT o DQO (véanse los anexos I y II). 
Las sustancias problema con una hidrosolubilidad no inferior a 
100 mg/l pueden estudiarse con cualquier método, siempre que no 
sean volátiles ni sufran absorción. En el cuadro 1 se indican los métodos adecuados para los productos químicos poco hidrosolubles, volátiles o que sufran absorción. En el anexo III se describe cómo 
pueden tratarse las sustancias poco hidrosolubles y las volátiles. Las 
sustancias moderadamente volátiles pueden estudiarse con el método de pérdida de COD si hay bastante espacio para el gas en los recipientes utilizados (que debieran estar convenientemente cerra ­
dos). En este caso, es necesario utilizar un control abiótico para tener 
en cuenta las posibles pérdidas físicas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Cuadro 1  
Aplicabilidad de los métodos de ensayo  
Prueba Método analítico Adecuación para sustancias: 
poco solubles volátiles absorbibles  
Pérdida de COD Carbono orgánico disuelto — — +/- 
Pérdida OECD modificada Carbono orgánico disuelto — — +/- Desprendimiento de CO
 2 Respirometría: desprendi ­
miento de CO  2 + — + 
Respirometría manométrica Respirometría manométrica: 
consumo de oxígeno + +/- + 
Frasco cerrado Respirometría: oxígeno di ­
suelto +/- + + 
MITI Respirometría: consumo de 
oxígeno + +/- + 
Es necesario disponer de información sobre la pureza o las propor ­
ciones relativas de los principales componentes del producto pro ­
blema para interpretar los resultados obtenidos, especialmente 
cuando estos son bajos o dudosos. 
El disponer de datos sobre la toxicidad de la sustancia problema para 
bacterias (anexo IV) puede ser muy útil para seleccionar las concen ­
traciones adecuadas para el ensayo y puede ser fundamental para interpretar correctamente los valores bajos de la biodegradación.
 
I.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Para comprobar el procedimiento se someten a ensayo sustancias de 
referencia que cumplan los criterios de biodegradabilidad fácil; para 
ello se introduce, en paralelo con el ensayo a realizar, una muestra con la sustancia de referencia adecuada. 
La anilina (recién destilada), el acetato sódico y el benzoato sódico 
son sustancias adecuadas. Todas estas sustancias de referencia se degradan con estos métodos aunque no se añada inóculo delibe ­
radamente. 
Se pensó en buscar una sustancia de referencia que fuera fácilmente 
biodegradable pero que necesitara para su biodegradación la adición 
de inóculo. Se ha propuesto el uso del ftalato ácido de potasio pero 
es necesario disponer de más información sobre esta sustancia antes de que pueda ser aceptada como sustancia de referencia. 
En el ensayo respirométrico, los compuestos que contengan nitró ­
geno pueden afectar a la captación de oxígeno debido a la nitrifica ­
ción (véanse los anexos II y V).
 
I.4. PRINCIPIO DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO 
Se inocula una solución o suspensión de la sustancia problema en un 
medio mineral y se incuba en condiciones aerobias en la oscuridad o 
bajo luz difusa. La cantidad de COD en la solución problema debida al inóculo debería mantenerse lo más baja posible respecto a la cantidad de COD debida a la sustancia problema. Para tener en 
cuenta la actividad endógena del inóculo, se realizan ensayos para ­
lelos en blanco, que contienen inóculo pero sin sustancia problema, si bien la actividad endógena de las células en presencia de la sustancia no corresponderá exactamente con la del control endógeno. 
Se trabajará en paralelo con una sustancia de referencia para con ­
trolar el funcionamiento de los procedimientos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
En general, la degradación se sigue mediante la determinación de 
parámetros, como el COD, la producción de CO  2 y el consumo de 
oxígeno, tomando medidas con la frecuencia suficiente para permitir la identificación del comienzo y de la finalización de la biodegrada ­
ción. Con los respirómetros automáticos, la medición es continua. El 
COD se mide a veces junto con otro parámetro, pero esto suele 
hacerse solo al principio y al final del ensayo. También puede uti ­
lizarse el análisis químico específico para evaluar la degradación primaria de la sustancia problema y determinar la concentración de 
las sustancias intermedias formadas eventualmente (esto es obligato ­
rio en la prueba del MITI). 
El ensayo dura normalmente 28 días. Sin embargo, es posible ter ­
minar los ensayos antes del día 28, por ejemplo en el caso de que la 
curva de biodegradación haya alcanzado un nivel constante en, al menos, 3 determinaciones. También es posible prolongar los ensayos mas de 28 días cuando la curva indique que la biodegradación se ha 
iniciado pero sin que se haya alcanzado el nivel constante el día 28.
 
I.5. CRITERIOS DE CALIDAD  
I.5.1.  Reproducibilidad  
Debido a la naturaleza de la biodegradación y de las poblaciones 
bacterianas mixtas utilizadas como inóculos, las determinaciones de ­
ben realizarse al menos por duplicado. 
La experiencia indica que la variación entre duplicados será menor 
cuanto mayor sea la concentración de microorganismos añadida ini ­
cialmente al medio de ensayo. También se ha visto en estudios interlaboratorios que pueden darse grandes variaciones entre los re ­
sultados obtenidos por diferentes laboratorios; no obstante, con los 
compuestos químicos que son fácilmente biodegradables se obtienen normalmente resultados concordantes.
 
I.5.2.  Validez del ensayo  
Un ensayo se considera válido si la máxima diferencia entre los 
duplicados respecto a los valores de la eliminación de la sustancia problema en la parte de la gráfica en forma de meseta, al final del test o al final del período de diez días, es inferior al 20 % y si 
la degradación porcentual de la sustancia de referencia alcanza el 
nivel de biodegradabilidad fácil antes de los 14 días. Si no se cumple alguna de estas condiciones, es necesario repetir el ensayo. Debido al rigor de los métodos, la obtención de bajos porcentajes 
de biodegradación no significa necesariamente que la sustancia 
problema no sea biodegradable en condiciones ambientales, sino que indica que será necesario realizar más estudios para establecer la biodegradabilidad. 
Si en un ensayo de toxicidad, realizado con la sustancia problema 
junto con una sustancia de referencia, se obtiene en 14 días menos del 35 % de degradación (según el COD) o menos del 25 % (según 
la DTO o el CO
 2 T), se supone que la sustancia de ensayo es inhi ­
bidora (véase también el anexo IV). La serie de ensayo debe repe ­
tirse, a ser posible, utilizando una concentración inferior de sustancia 
problema o una concentración superior de inóculo, que no exceda de 
30 mg de sólidos/litro.  
I.6. PREPARATIVOS Y PROCEDIMIENTOS GENERALES 
En el cuadro 2 se resumen las condiciones generales aplicables a los 
ensayos. El material y las demás condiciones experimentales relati ­
vas específicamente a un ensayo concreto se describen después bajo 
el título de cada ensayo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Cuadro 2  
Condiciones de los ensayos  
Ensayo Perdida de 
DOC Desprendi ­
miento de CO  2 Respiración 
manométrica Detección de la 
OCDE modifi ­
cada Frasco cerrado MITI-(I)  
Concentración 
de sustancia problema 
mg/l 100 2-10 100 mg COD/l 10-40 10-20 10-40 mg DTO/l 50-100 5-10 
Concentración 
de inóculo (en células/l, aproximada ­
mente) ≤ 30 mg/l SS 
o ≤ 100 ml efluente/l 
(10
 7 -10 8 ) 0,5 ml 
efluente se ­
cundario/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
efluente/l 
(10 4 -10 6 ) 30mg/l SS 
(10 7 -10 8 ) 
Concentración 
de elementos 
en el medio 
mineral (en mg/1): 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05-0,1 0,05-0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 preferente ­
mente 7,0 
Temperatura 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
COD = Carbono orgánico disuelto DTO = Demanda teórica 
de oxígeno SS = Sólidos en suspen ­
sión 
I.6.1.  Agua de dilución  
Se usará agua desionizada o destilada, exenta de sustancias tóxicas (por 
ejemplo, iones Cu  + + ) a concentraciones inhibidoras. No debe contener 
más del 10 % del contenido en carbono orgánico introducido por la 
sustancia problema. Esta elevada pureza del agua es necesaria para no 
obtener valores elevados en la prueba en blanco. La contaminación puede proceder de impurezas inherentes, y también, de las resinas cambiadoras de iones y de residuos materiales procedentes de bacterias 
y algas. Para cada serie de ensayos debe utilizarse un solo lote de agua, 
comprobado previamente mediante análisis de COD. Esta comproba ­
ción no es necesaria para el ensayo del frasco cerrado, pero el consumo de oxígeno del agua debe ser bajo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Soluciones madre de elementos minerales  
Las soluciones de ensayo se prepararán a partir de soluciones madre 
de elementos minerales en concentración adecuada. Las siguientes soluciones madre pueden utilizarse (con diferentes factores de dilu ­
ción) en los métodos de pérdida de COD, detección de la OCDE 
modificada, desprendimiento de CO
 2 , respirometria manométrica y 
frasco cerrado. 
Los factores de dilución y, en el caso de la prueba MITI, la prepa ­
ración específica del medio mineral se recogen bajo el encabeza ­
miento de cada prueba específica.  
Soluciones madre:  
Hay que preparar las siguientes soluciones madre, utilizando reacti ­
vos de grado analítico. 
a) Ortofosfato diácido de potasio, KH  2 PO 4 8,50 g 
Ortofosfato ácido de potasio, K  2 HPO  4 21,75 g 
Ortofosfato ácido de, sodio dihidratado Na  2 HPO  4 . 
2 H  2 O 33,40 g 
Cloruro amónico, NH  4 CL 0,50 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro. El pH de la 
solución debe ser 7,4 
b) Cloruro calcico, anhidro, CaCl  2 o 27,50 g 
Cloruro cálcico dihidratado, CaCl  2 - 2 H  2 O 36,40 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro 
c) Sulfato magnésico heptahidratado, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro 
d) Cloruro de hierro (III) hexahidratado, FeCl  3 . 6 H  2 O 0,25 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro  
Nota:  Con el fin de no tener que preparar esta solución inmediata ­
mente antes de su uso, añádase una gota de HC1 concentrado o 0,4 g de EDTA (sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético) por litro.
 
I.6.3.  Soluciones madre de productos químicos  
Por ejemplo, disolver de 1 a 10 g, según se considere adecuado, de 
sustancia problema o de referencia en agua desionizada y enrasar a 1 
litro cuando la solubilidad sea superior a 1 g/l. En caso contrario, 
preparar soluciones madre en el medio mineral o añadir los produc ­
tos químicos directamente en el medio mineral. Para el tratamiento de productos químicos menos solubles, véase el anexo III, pero 
teniendo en cuenta que en la prueba del MITI (Método C.4-F) no 
pueden utilizarse ni disolventes ni emulgentes.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Inóculos  
El inóculo puede proceder de diversas fuentes: lodo activado, aguas 
residuales efluentes (no cloradas), aguas superficiales, suelos o una mezcla de todo ello. En el caso de los ensayos de pérdida de COD, 
desprendimiento del CO
 2 y respirometría manométrica, si se utiliza 
lodo activado, este debe proceder de una planta depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba predominantemente aguas resi ­
duales domésticas. Se ha visto que los inóculos procedentes de otras 
fuentes dan resultados más dispersos. En el caso de la prueba de 
detección de la OCDE modificada y de la prueba de frasco cerrado, es necesario un inóculo más diluido sin flóculos de lodo y la fuente 
preferida es un efluente secundario procedente de una depuradora de 
aguas residuales domésticas o de una instalación de laboratorio. En el caso del método MITI, el inóculo se obtiene mezclando material procedente de distintas fuentes y se describe bajo el encabezamiento 
específico de esta prueba.
 
I.6.4.1.  Inóculo procedente de lodos activados  
Se recoge una muestra de lodo activado recién obtenido del depósito 
de aireación de una planta depuradora de aguas residuales o de una instalación de laboratorio que trate predominantemente aguas resi ­
duales domésticas. En caso necesario, se retiran las partículas grue ­
sas, por filtración a través de un tamiz fino y a continuación se 
mantiene el lodo en condiciones aerobias. 
Otra posibilidad es dejar sedimentar o centrifugar (por ejemplo, a 
1 100 g durante 10 minutos) después de eliminar las posibles partí ­
culas gruesas. Se desecha el sobrenadante. El lodo puede ser lavado 
en el medio mineral. Se suspende el lodo concentrado en medio 
mineral para obtener una concentración de 3 a 5 g de sólidos sus ­
pendidos/1 y se somete a aireación hasta que se utilice. 
El lodo debería obtenerse de una planta convencional que trabaje 
adecuadamente. Si tiene que obtenerse el lodo de una planta depu ­
radora de elevado rendimiento o cuando se píense que contiene inhibidores, debería lavarse el lodo. El lodo resuspendido se mezcla bien y se deja sedimentar o se centrifuga, se desecha el sobrenadante 
del lodo lavado y se vuelve a resuspender en otro volumen de medio 
mineral. Este procedimiento se repite hasta que se considere que el lodo queda exento de un exceso de sustrato o de inhibidores. 
Después de conseguir la resuspensión completa, o con el lodo sin 
tratar, se toma una muestra justo antes de su utilización para deter ­
minar el peso seco de los sólidos en suspensión. 
Otra posibilidad diferente es homogeneizar el lodo activado (de 3 a 
5 g de sólidos suspendidos/1). Se trata el lodo en un agitador me ­
cánico durante 2 minutos a velocidad media. El lodo agitado se deja 
sedimentar durante 30 minutos, o más en caso necesario, y se de ­
canta el líquido para utilizarlo como inóculo en la proporción de 10 ml/l de medio mineral.
 
I.6.4.2.  Otras fuentes de inóculos  
Este inóculo puede obtenerse a partir del efluente secundario de una 
planta depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba 
predominantemente aguas residuales domésticas. Se toma una mues ­
tra reciente y se mantiene en condiciones aerobias durante el trans ­
porte. Se deja sedimentar durante 1 hora o se filtra a través de papel de filtro grueso y el efluente decantado o el filtrado se mantiene en 
condiciones aerobias hasta su utilización. Pueden utilizarse hasta 
100 ml de este tipo de inóculo por cada litro de medio.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Otra fuente adicional de inóculo es el agua superficial. En este caso, 
se recoge una muestra de un agua superficial adecuada como, por 
ejemplo, ríos o lagos, y se mantiene en condiciones aerobias hasta su utilización. En caso necesario, se concentra el inóculo por filtración o centrifugación.
 
I.6.5.  Acondicionamiento previo de los inóculos  
Los inóculos pueden estar preacondicionados a las condiciones ex ­
perimentales, pero no preadaptados a la sustancia problema. El acon ­
dicionamiento previo consiste en la aireación del lodo activado en 
medio mineral o bien del efluente secundario durante 5 o 7 días a la 
temperarura del ensayo. El acondicionamiento previo mejora a veces la precisión de los métodos de ensayo reduciendo los valores del blanco. El acondicionamiento previo se considera innecesario para el 
inóculo del MITI.
 
I.6.6.  Controles abióticos  
Cuando sea necesario, se estudiará la posible degradación abiótica de 
la sustancia problema determinando la eliminación de COD, el con ­
sumo de oxígeno o el desprendimiento de dióxido de carbono en controles estériles que no contengan inóculo. La esterilización se consigue mediante filtración a través de membrana (0,2-0,45 micró ­
metros) o mediante la adición de una sustancia tóxica adecuada a la 
concentración conveniente. Si se utiliza una membrana de filtración, coger las muestras de forma aséptica para mantener la esterilidad. A no ser que la absorción de la sustancia problema haya sido excluida 
de antemano, las pruebas en las que se mide la biodegradación como 
la eliminación de COD, especialmente con lodo activado como inó ­
culo, debieran incluir un control abiótico inoculado v envenenado.
 
I.6.7.  Número de frascos  
El número de frascos en un ensayo normal se describe bajo el 
encabezamiento de cada ensayo. 
Pueden utilizarse los siguientes tipos de frasco: — Suspensión de ensayo: conteniendo la sustancia problema y el 
inóculo. 
— Inóculo aislado: conteniendo únicamente inóculo. 
— Control del procedimiento: conteniendo sustancia problema e 
inóculo. 
— Control estéril abiótico: estéril, conteniendo la sustancia pro ­
blema (véase el punto I.6.6). 
— Control de absorción: conteniendo la sustancia problema, inóculo 
y agente esterilizante. 
— Control de toxicidad: conteniendo la sustancia problema, la sus ­
tancia de referencia e inóculo. 
La determinación en la suspensión de ensayo y la determinación en 
el inóculo aislado deberían realizarse obligatoriamente en paralelo. Es aconsejable realizar las determinaciones en los otros frascos tam ­
bién en paralelo. 
Sin embargo, esto puede no ser siempre posible. Hay que asegurarse 
de que se toman bastantes muestras o lecturas para tener la certeza 
de que se alcanza el porcentaje de eliminación adecuado durante el 
período de tiempo de 10 días.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7 DATOS Y EVALUACIÓN 
Para el cálculo de D  t , degradación porcentual, se utilizan los valores 
medios de las medidas de los parámetros, realizadas por duplicado en los dos recipientes del ensayo y en el blanco. Las fórmulas vienen 
dadas en las secciones específicas correspondientes a cada ensayo. El 
curso de la degradación se representa gráficamente y se indica el período de observación de 10 días. Se calcula y se registra la pérdida porcentual al final del período de observación de 10 días y el valor 
en la fase estacionaria o al final del ensayo, según se considere 
adecuado. 
En los ensayos respirométricos, los compuestos nitrogenados pueden 
afectar al consumo de oxígeno debido a la nitrificación (véanse los anexos II y V).
 
I.7.1.  Medida de la degradación basada en la determinación del COD  
El porcentaje de degradación (D  t ) en cada momento en que se tome 
una muestra debiera calcularse separadamente para los frascos con ­
teniendo la sustancia problema, utilizando los valores medios de las 
medidas por duplicado del COD con el fin de valorar la validez de la prueba (véase el punto 1.5.2). Se calcula utilizando la siguiente ecuación:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100  
donde: 
D t = degradación porcentual en el tiempo t. 
C o = concentración media inicial de COD en el medio de cultivo 
inoculado con la sustancia problema (mg COD/l), 
C t = concentración media de COD en el medio de cultivo ino ­
culado con sustancia problema en el tiempo t (mg COD/l), 
C bo = concentración media inicial de COD en el medio mineral 
en blanco inoculado (mg COD/l), 
C bt = concentración media de COD en el medio mineral en 
blanco inoculado, en el tiempo t (mg COD/l). 
Todas las concentraciones son las obtenidas experimentalmente.  
I.7.2.  Degradación medida por análisis específicos  
Cuando se tienen datos analíticos específicos, la biodegradación pri ­
maria se calcula con la fórmula siguiente:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
donde: 
D t = degradación porcentual en el tiempo t, normalmente 28 días 
S a = cantidad residual de sustancia problema en el medio inocu ­
lado al final de la prueba (mg) 
S b = cantidad residual de sustancia problema en la prueba en 
blanco con agua o medio a los que solo se ha añadido la 
sustancia problema (mg).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3.  Degradación abiótica  
Cuando se utilice un control abiótico estéril, calcular el porcentaje 
de degradación abiótica utilizando:  
% abiotic degradation  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
Donde: 
C s(o) = concentración COD en el control estéril el día 0, 
C s(t) = concentración COD en el control estéril el día t.  
I.8. INFORME 
El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: 
— sustancias problema y de referencia así como su pureza, 
— condiciones del ensayo, 
— inóculo: naturaleza y lugar o lugares de recogida, concentración 
y posible tratamiento de acondicionamiento previo, 
— proporción y naturaleza de los residuos industriales presentes en 
las aguas residuales, si se conocen, 
— tiempo de duración del ensayo y temperatura a la que se ha 
realizado, 
— en caso de sustancias problema poco solubles, tratamiento reali ­
zado, 
— método de ensayo utilizado; motivos científicos y explicación en 
caso de que se haya realizado algún cambio en el procedimiento, 
— ficha de recogida de datos, 
— cualquier fenómeno de inhibición que se haya observado, — cualquier degradación abiótica que se haya observado, 
— datos químicos analíticos específicos, si se tienen, 
— datos analíticos sobre los intermediarios, si se tienen, — gráfica de la degradación porcentual frente al tiempo para las 
sustancias problema y de referencia; hay que indicar claramente 
la fase de latencia, la fase de degradación, el período de obser ­
vación de 10 días y la pendiente (anexo I). Si la prueba ha cumplido con los criterios de validez, podrá utilizarse para la gráfica la media de los porcentajes de degradación de los frascos 
que contengan la sustancia problema, 
— porcentaje de eliminación obtenido después del período de ob ­
servación de 10 días, en la fase estacionaria y al final de la prueba.
 
PARTE II.  ENSAYO BASADO EN LA PÉRDIDA DE COD  
(Método C.4-A)  
II.1. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Un volumen medido de medio mineral inoculado con una concen ­
tración conocida de la sustancia problema (10-40 mg COD/l) como 
única fuente nominal de carbono orgánico se somete a aireación en 
la oscuridad o bajo luz difusa a 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
La degradación se va siguiendo mediante el análisis del COD a 
intervalos frecuentes durante un período de 28 días. El grado de 
biodegradación se calcula expresando la concentración de COD eli ­
minada (corregida con los valores obtenidos en el blanco con inó ­
culo) como porcentaje de la concentración presente inicialmente. El 
grado de biodegradación primaria también puede calcularse mediante 
análisis químico complementario realizado al principio y al final de la incubación.
 
II.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
II.2.1.  Equipo  
a) Matraces cónicos, por ejemplo de 250 ml hasta 2 l, según el 
volumen necesario para los análisis de COD. 
b) Agitador para matraces cónicos, bien con control automático de 
la temperatura o bien situado en una sala a temperatura constante. La agitación debe ser suficiente como para mantener condiciones aerobias en todos los matraces. 
c) Equipo de filtración con membranas adecuadas. 
d) Analizador de COD. 
e) Equipo para determinar el oxígeno disuelto. 
f) Centrífuga.
 
II.2.2.  Preparación del medio mineral  
Para la preparación de la solución madre, véase el punto I.6.2. 
Se mezclan 10 ml de solución (a) con 800 ml de agua de dilución, se 
añade 1 ml de las soluciones (b) a (d) y se enrasa a 1 1 con agua de dilución.
 
II.2.3.  Preparación y acondicionamiento previo del inóculo  
El inóculo puede obtenerse de diversas fuentes: lodo activado, aguas 
residuales efluentes, aguas superficiales, suelos, o de una combina ­
ción de ellos. 
Véanse los puntos I.6.4, I.6.4.I, I.6.4.2 y I.6.5.  
II.2.4.  Preparación de los matraces  
Como ejemplo, se introducen alícuotas de 800 ml de medio mineral 
en matraces cónicos de 2 litros y se añaden volúmenes suficientes de las soluciones madre de las sustancias problema y de referencia a los 
distintos matraces para obtener una concentración de sustancia equi ­
valente a 10-40 mg COD/l. Controlar los valores del pH y ajustar a 7,4 si es necesario. Se inoculan los matraces con lodo activado u otra fuente de inóculo (véase el punto I.6.4), para obtener una concen ­
tración final que no exceda de 30 mg de sólidos en 
suspensión/1. También hay que preparar controles del inóculo en el medio mineral pero sin sustancia problema ni de referencia. 
En caso necesario, puede utilizarse un recipiente para comprobar el 
posible efecto inhibidor de la sustancia problema inoculando una 
solución que contenga, en el medio mineral, concentraciones com ­
parables tanto de la sustancia problema como de la sustancia de referencia. 
También, en caso necesario, puede prepararse otro matraz estéril para 
observar si la sustancia problema se degrada abióticamente. Para 
ello, se utiliza una solución de la sustancia problema sin inoculo 
(véase el punto 1.6.6).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Además, si se sospecha que la sustancia problema puede adsorberse 
de forma significativa en las paredes o fondo del recipiente utilizado 
para la realización del ensayo, en los lodos, etc., hay que hacer una evaluación previa para determinar la importancia de la adsorción y, en consecuencia, la idoneidad de la prueba para esa sustancia (véase 
el cuadro 1). Preparar un matraz conteniendo la sustancia problema, 
el inoculo y el agente esterilizante. 
Todos los matraces se enrasan a 1 1 con medio mineral y, tras 
mezclar, se toma una muestra de cada matraz para determinar la 
concentración inicial de COD (véase el anexo II.4). Por ejemplo, 
se tapa la boca de los matraces con papel de aluminio, de forma que se permita la libre circulación de aire entre el matraz y la atmósfera ambiente. A continuación se ponen los recipientes en el 
agitador para iniciar el ensayo.
 
II.2.5.  Número de matraces en un ensayo normal  
Matraces 1 y 2: suspensión de ensayo 
Matraces 3 y 4: con inóculo solo (blanco con inóculo) Matraz 5: control de procedimiento 
Preferentemente y cuando sea necesario: 
Matraz 6: control estéril abiótico Matraz 7: control de adsorción Matraz 8: control de toxicidad. 
Véase también el punto 1.6.7.
 
II.2.6.  Realización del ensayo  
A lo largo de todo el ensayo, hay que determinar la concentración de 
COD en cada matraz por duplicado a intervalos de tiempo conocidos con la suficiente frecuencia para poder determinar el principio del período de observación de 10 días y la pérdida porcentual al final de 
dicho período de 10 días. Debe limitarse al mínimo el volumen de 
suspensión problema tomado para cada determinación. 
Antes de tomar las muestras, hay que compensar las pérdidas por 
evaporación de los matraces añadiendo agua de dilución (véase el 
anexo I.6.1) en la cantidad necesaria. Antes de tomar las muestras hay que homogeneizar bien el medio de cultivo y asegurarse de que el material que se adhiere a las paredes de los recipientes se disuelve 
o resuspende. Inmediatamente después de tomar la muestra, esta se 
filtra por membrana o se centrifuga (véase el anexo II.4). La muestra filtrada o centrifugada se analiza el mismo día; en caso contrario, se conserva a 2-4
 o C durante un máximo de 48 horas, o por debajo de - 
18 o C durante un período mayor.  
II.3. DATOS E INFORME  
II.3.1.  Tratamiento de los resultados  
Calcular la degradación porcentual al tiempo t según se indica en el 
punto I.7.1. (determinación de COD) y, de forma optativa, en el punto I.7.2 (análisis específico). 
Todos los resultados deben registrarse en las fichas de recogida de 
datos presentadas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Validez de los resultados.  
Véase el punto I.5.2.  
II.3.3.  Informe  
Véase el punto I.8.  
II.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOS 
A continuación se da un ejemplo de la ficha de recogida de datos.  
ENSAYO DE PÉRDIDA DE COD 
1. LABORATORIO  
2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA  
3. SUSTANCIA A EXAMINAR  
Nombre:… 
Concentración de la solución madre: … mg/l en sustancia quí ­
mica 
Concentración inicial en el medio, t  o : … mg/l en sustancia 
química  
4. INÓCULO  
Fuente:… 
Tratamiento realizado: Acondicionamiento previo en su caso:… Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de 
ensayo: … mg/l
 
5. DETERMINACIONES DE CARBONO  
Analizador de carbono:  
Matraz n  o COD tras n días (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Substancia pro ­
blema más inóculo 
1 a 1 
a 2 
a, media 
C a(t) 
2 b 2 
b 2 
b, media 
C b(t) ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Matraz n  o COD tras n días (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Ensayo en blanco 
con inóculo pero sin substancia problema 3 c
 2 
c 2 
c, media C  b(t) 
4 d 2 
d 2 
d, media 
C b(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS  
Matraz n  o % de degradación tras n días 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Media (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Si existe una diferencia considerable entre D  1 y D  2 , no debe calcularse el término medio.  
Nota:  Pueden utilizarse fórmulas similares para la sustancia de refe ­
rencia y los controles de toxicidad.  
7. CONTROL ABIóTICO  (optativo)  
Tiempo (días) 
0 t  
conc. de COD (mg/l) en el control estéril C s(o) 
% de degradación abiótica  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. ANÁLISIS QUÍMICO ESPECÍFICO  (optativo)  
Cantidad residual de la 
substancia química al final de la 
prueba (mg/l) % degradacíon  
Control estéril S  b ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Cantidad residual de la 
substancia química al final de la 
prueba (mg/l) % degradacíon  
Prueba con el media inoculado S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTE III.  ENSAYO DE DETECCIÓN DE LA OCDE MODI ­
FICADO  (Método C.4-B)  
III. 1. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Un volumen medido de medio mineral con una concentración cono ­
cida de la sustancia problema (10-40 mg COD/l) como única fuente nominal de carbono orgánico se inocula con 0,5 ml de efluente por litro de medio. La mezcla se airea en la oscuridad o bajo luz difusa a 
22 ± 2
 o C. 
La degradación se va siguiendo mediante análisis del COD a inter ­
valos frecuentes a lo largo de un período de 28 días. El grado de biodegradación se calcula expresando la concentración de COD eli ­
minado (corregida con los valores obtenidos en el blanco con ino ­
culo) como porcentaje de la concentración presente inicialmente. El grado de biodegradación primaria también puede calcularse a partir de análisis químicos suplementarios realizados al principio y al final 
de la incubación.
 
III.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
III.2.1. Equipo 
a) Matraces cónicos, por ejemplo de 250 ml a 2 l, según el volumen 
necesario para el análisis de COD. 
b) Agitador para matraces cónicos, bien con control automático de 
temperatura o bien situado en una sala de temperatura constante. La agitación debe ser suficiente como para mantener condiciones 
aerobias en todos los matraces. 
c) Equipo de filtración con membranas adecuadas. 
d) Analizador de COD. 
e) Equipo para determinar el oxígeno disuelto. 
f) Centrífuga.
 
III.2.2.  Preparación del medio mineral  
Para la preparación de la solución madre, véase el punto I.6.2. 
Se mezclan 10 ml de la solución (a) con 800 ml de agua de dilución, 
se añade 1 ml de las soluciones (b) a (d) y se enrasa a 1 1 con agua 
de dilución. 
Este método utiliza tan solo 0,5 ml de efluente/l como inoculo y, por 
tanto, puede ser necesario enriquecer el medio con oligoelementos y 
factores de crecimiento. Esto se consigue añadiendo 1 ml de cada 
una de las siguientes soluciones por litro de medio final:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Solución de oligoelementos: 
Sulfato de manganeso tetrahidratado, MnSO  4 . 4H  2 39,9 mg 
Acido bórico, H  3 BO 3 57,2 mg 
Sulfato de zinc heptahidratado, ZnSO  4 . 7H  2 42,8 mg 
Heptamolibdato de amonio (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Quelato de hierro (FeCl  3 ácido etilendiamínotetraa ­
cético) 100,0 mg 
Disolver en agua de dilución y llevar a 1 000 ml. 
Solución de vitaminas: Extracto de levadura 15,0 mg 
Disolver el extracto de levadura en 100 ml de agua. Esterilizar 
mediante filtración por membrana de 0,2 micrómetros o bien prepa ­
rar extemporáneamente.
 
III.2.3.  Preparación y acondicionamiento previo del inóculo  
El inóculo está derivado de un efluente secundario de una planta depu ­
radora o de una instalación de laboratorio que reciba de manera primor ­
dial aguas residuales domésticas. Véanse los puntos I.6.4.2. y I.6.5. 
Se usan 0,5 ml por litro de medio mineral.  
III.2.4.  Preparación de los matraces  
Se introducen porciones de, por ejemplo, 800 ml de medio minera] 
en matraces cónicos de 2 litros y se añaden volúmenes suficientes de las soluciones madre de las sustancias problema y de referencia a los distintos matraces para obtener una concentración de sustancia equi ­
valente a 10-40 rng COD/l. Revise el valor pH y ajústelo si es 
necesario, a 7,4. Se inoculan los matraces con efluente de aguas residuales en la proporción de 0,5 ml/l (véase el punto I.6.4.2). También deben prepararse controles del inóculo con el medio mine ­
ral pero sin sustancia problema ni de referencia. 
En caso necesario, puede utilizarse un matraz para comprobar el 
posible efecto inhibidor de la sustancia problema inoculando una 
solución que contenga, en medio mineral, concentraciones compara ­
bles tanto de la sustancia problema como de una sustancia de refe ­
rencia. 
También, en caso necesario, puede prepararse otro matraz estéril para 
comprobar si la sustancia problema se degrada abioticamente utili ­
zando una solución de esta sustancia sin inóculo (véase el punto I.6.6). 
Además, si se sospecha que la sustancia problema puede adsorberse 
de forma significativa en el recipiente utilizado para el ensayo, en los 
lodos, etc., debe hacerse una prueba previa para determinar el al ­
cance probable de la absorción y, en consecuencia, la adecuación de la prueba para esa sustancia concreta (véase el cuadro 1). Prepárese 
un matraz conteniendo la sustancia problema, el inóculo y un agente 
esterilizante. 
Todos los matraces se enrasan a 1 1 con medio mineral y, después 
de agitar, se toma una muestra de cada matraz para determinar la 
concentración inicial de COD (véase el anexo II.4). Se tapan las bocas de los matraces con papel de aluminio, por ejemplo, de forma que se permita la libre circulación de aire entre el matraz y la 
atmósfera circundante. A continuación se ponen los recipientes en 
el agitador para iniciar el ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Número de matraces en un ensayo normal  
Matraces 1 y 2: suspensión de ensayo 
Matraces 3 y 4: con inoculo solo (blanco con inóculo) 
Matraz 5: control de procedimiento 
Preferentemente y cuando sea necesario: Matraz 6: control estéril abiótico 
Matraz 7: control de adsorción 
Matraz 8: control de toxicidad. 
Véase también el punto I.6.7.
 
III.2.6.  Realización del ensayo  
A lo largo del ensayo hay que determinar las concentraciones de 
COD en cada matraz por duplicado a intervalos de tiempo conoci ­
dos, con la suficiente frecuencia como para poder determinar el 
inicio del período de observación de 10 días y el porcentaje de 
eliminación al final de dicho período de 10 días. Para cada determi ­
nación debe tomarse solo el volumen mínimo necesario de suspen ­
sión problema. 
Antes de tomar las muestras, hay que compensar las pérdidas que se 
han producido por evaporación del medio de ensayo en los matraces, 
añadiendo la cantidad necesaria de agua de dilución (I.6.1). Antes de 
tomar las muestras hay que agitar bien el medio de cultivo y asegu ­
rarse de que el material que se hubiera adherido a las paredes de los recipientes se disuelve o se resuspende. Se filtra por membrana o se 
centrifuga (véase el anexo II.4) inmediatamente después de haber 
tomado la muestra. Las muestras filtradas o centrifugadas se analizan el mismo día; en caso contrario, se conservan a 2-4
 o C durante 48 
horas como máximo o por debajo de - 18  o C durante un período más 
prolongado  
III.3. DATOS E INFORME  
III.3.1.  Tratamiento de los resultados  
Se calcula el porcentaje de degradación en el tiempo t según se 
indica en I.7.1 (determinación de COD) y, de forma optativa, en 
I.7.2 (análisis específico). 
Todos los resultados deben registrarse en las fichas de recogida de 
datos indicadas.  
III.3.2. Validez de los resultados 
Véase el punto I.5.2.  
III.3.3. Informe 
Véase el punto I.8.  
III.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOS 
A continuación se ofrece un ejemplo de ficha de recogida de datos.  
ENSAYO DE DETECCIÓN DE LA OECD MODIFICADO 
1. LABORATORIO  
2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. SUSTANCIA A EXAMINAR  
Nombre: 
Concentración de la solución madre: … mg/l en sustancia quí ­
mica 
Concentración inicial en el medio, t  0 : … mg/l en sustancia 
química  
4. INÓCULO  
Fuente: 
Tratamiento realizado: 
Acondicionamiento previo en su caso: 
Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de reac ­
ción: mg/1  
5. DETERMINACIONES DE CARBONO  
Analizador de carbono:  
Matraz n  o COD tras n días (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Substancia pro ­
blema más inóculo 
1 a 1 
a 2 
a, media 
C a(t) 
2 b 2 
b 2 
b, media 
C b(t) 
Blanco con inó ­
culo pero sin 
substancia pro ­
blema 3 c 2 
c 2 
c, media C  b(t) 
4 d 2 
d 2 
d, media 
C b(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS  
Matraz % de degradación trasndías 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Matraz % de degradación trasndías 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
media (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Si existe una diferencia considerable entre D  1 y D  2 , no debe calcularse el término medio.  
Nota:  Pueden utilizarse fórmulas similares para la sustancia de refe ­
rencia y los controles de toxicidad.  
7. CONTROL ABIÓTICO  (optativo)  
Tiempo (dias) 
0 t  
conc. de COD (mg/l) en el control estéril C s(o) C s(t) 
% de degradación abiótica  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. ANALISIS QUÍMICO ESPECÍFICO  (optativo)  
Cantidad residual de la substan ­
cia química al final de la prueba % degradacíib primaria  
Control estéril S  b 
Prueba con el medio inoculado S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTE IV. ENSAYO DE DESPRENDIMIENTO DE CO  2 
(Método C.4-C)  
IV.1. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se hace pasar una corriente de aire exento de dióxido de carbono a 
velocidad controlada, en la oscuridad o bajo luz difusa, a través de un volumen medido de medio mineral inoculado que contiene una concentración conocida de la sustancia problema (10-20 mg COD o 
COT/l) como única fuente nominal de carbono orgánico. 
La degradación se observa a lo largo de 28 días determinando el dióxido de carbono producido, que se recoge en hidróxido de sodio o de bario y se mide por valoración del hidróxido residual o como 
carbono inorgánico. La cantidad de dióxido de carbono producido a 
partir de la sustancia problema (con las correcciones necesarias se ­
gún el resultado del blanco con inóculo) se expresa como porcentaje de CO
 2 T. El grado de biodegradación también puede calcularse 
mediante un análisis complementario de COD realizado al principio 
y al final de la incubación.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
IV.2.1.  Equipo  
a) Matraces, 2-5 litros, provisto cada uno de un tubo de aireación, 
que llegue practicamente al fondo del recipiente, y de una salida. 
b) Agitadores magnéticos, cuando se trate de sustancias poco solu ­
bles. 
c) Frascos de absorción de gases. 
d) Aparato para controlar y medir el flujo de aire. 
e) Aparato para eliminar el dióxido de carbono en la preparación de 
aire exento de dióxido de carbono; otra posibilidad es utilizar una 
mezcla de oxigeno exento de CO  2 y de nitrógeno exento de CO  2 , 
provenientes de sendas botellas, en las proporciones correctas (20 % O
 2 :80 % N  2 ). 
f) Equipo para determinar el dióxido de carbono, bien volumétrica ­
mente o bien con un analizador de carbono inorgánico. 
g) Equipo de filtración por membrana (opcional). 
h) Analizador de COD (opcional).  
IV.2.2.  Preparación del medio mineral  
Para la preparación de las soluciones madre, véase el puanto I.6.2. 
Se mezclan 10 ml de solución (a) con 800 ml de agua de dilución; se 
añade 1 ml de las soluciones (b) a (d) y se enrasa a 1 1 con agua de 
dilución.  
IV.2.3.  Preparación y acondicionamiento previo del inóculo  
El inóculo puede obtenerse de diversas fuentes: lodo activado, aguas 
residuales efluentes, aguas superficiales, suelos, o de una combina ­
ción de ellos. 
Véanse los puntos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 y I.6.5.  
IV.2.4.  Preparación de los matraces  
Los siguientes volúmenes y pesos, dados meramente como ejemplo, 
indican los valores apropiados para matraces de 5 litros que conten ­
gan 3 1 de suspensión. Si se utilizan volúmenes más pequeños hay que modificar los valores en consecuencia, pero hay que asegurarse de que el dióxido de carbono formado puede medirse con precisión. 
A cada matraz de 5 litros se añaden 2 400 ml de medio mineral. Se 
añade a continuación un volumen adecuado del lodo activado ya preparado (véanse los puntos I.6.4.1 y I.6.5) para tener una concen ­
tración de sólidos en suspensión que no exceda de 30 mg/l en el 
volumen final de 3 l de mezcla inoculada. Otra posibilidad es diluir 
en primer lugar el lodo preparado para obtener una suspensión de 500-1 000 mg/1 en el medio mineral antes de añadir una alícuota al 
contenido del matraz de 5 litros para obtener una concentración final 
de 30 mg/l; de esta forma se consigue mayor precisión. También pueden utilizarse otras fuentes de inóculos (véase el punto I.6.4.2). Añadir una alícuota al contenido del matraz de 5 litros para obtener 
una concentración final de 30 mg/l; de esta forma se consigue mayor 
precisión. También pueden utilizarse otras fuentes de inóculos (véase el punto I.6.4.2). 
Estas mezclas inoculadas se someten a un flujo de aire exento de 
CO
 2 durante una noche para purgar el dióxido de carbono del 
sistema.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Se añade a los matraces, por separado y por duplicado, la sustancia 
problema y la sustancia de referencia procedentes de sendas solucio ­
nes madre, en volúmenes conocidos, como para obtener concentra ­
ciones de 10 a 20 mg de COD o COT/l, procedente de las sustancias añadidas; algunos matraces se dejan como controles del inóculo sin 
añadirles ninguna sustancia. Las sustancias problema poco solubles 
se añaden directamente, a los matraces teniendo en cuenta una rela ­
ción de peso o de volumen, o bien se opera según se describe en el anexo III. 
En caso necesario, puede utilizarse un matraz para comprobar el 
posible efecto inhibidor de la sustancia problema añadiendo tanto sustancia problema como sustancia de referencia en las mismas con ­
centraciones que se dan en los otros matraces. 
También, en caso necesario, puede utilizarse un matraz estéril para 
comprobar si la sustancia problema se degrada abioticamente utili ­
zando una solución de la sustancia sin inóculo (véase I.6.6.). Este ­
rilícese mediante la adición de una sustancia tóxica en la concen ­
tración apropiada. 
Se llevan los volúmenes de las suspensiones de todos los matraces a 
3 1 mediante adición de medio mineral previamente aireado con aire 
exento de CO
 2 . Otra posibilidad es tomar muestras para el análisis 
del COD (véase el anexo II.4.) o análisis específicos. Se conectan los frascos de absorción a las salidas de aire de los matraces. 
Si se utiliza hidróxido de bario, hay que conectar a cada matraz de 5 
litros tres frascos de absorción puestos en serie, cada uno con 100 ml 
de solución de hidróxido de bario 0,0125 M. La solución debe estar exenta de sulfatos y carbonatos precipitados y su concentración debe determinarse justo antes de ser utilizada. Si se utiliza hidróxido de 
sodio, se conectan dos frascos, de los que el segundo actúa como 
control para comprobar que todo el dióxido de carbono ha quedado absorbido en el primero. Son adecuados los frascos de absorción provistos de cierres de botellas de suero. A cada frasco se añaden 
200 ml de solución de hidróxido de sodio 0,05 M, cantidad sufi ­
ciente para absorber todo el dióxido de carbono producido si la sustancia química se degrada por completo. La solución de hidróxido 
de sodio, incluso cuando se prepara extemporáneamente, contiene 
trazas de carbonatos; esto se corrige deduciendo la cantidad de car ­
bonatos presentes en el blanco.
 
IV.2.5.  Número de matraces en un ensayo normal  
Matraces 1 y 2: suspensión de ensayo 
Matraces 3 y 4: con inóculo solo (blanco con inóculo) 
Matraz 5: control de procedimiento Preferentemente y cuando sea necesario: 
Matraz 6: control estéril abiótico 
Matraz 7: control de toxicidad. Véase también el punto I.6.7.
 
IV.2.6.  Realización del ensayo  
El ensayo se inicia haciendo borbotear aire exento de CO  2 a través 
de las suspensiones a la velocidad de 30-100 ml/min. Periódicamente 
se toman muestras del absorbente de dióxido de carbono para ana ­
lizar el contenido de CO  2 . Durante los primeros 10 días se reco ­
mienda que los análisis se hagan cada dos o tres días y, después, 
cada cinco días hasta llegar al día 28, de forma que pueda determi ­
narse el período de observación de 10 días.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
El día 28 se toman muestras (opcionalmente) para el análisis de 
COD o análisis específicos, se mide el pH de las suspensiones y 
se añade 1 ml de ácido clorhídrico concentrado a cada matraz; se airean los frascos durante una noche para arrastrar el dióxido de carbono presente en las suspensiones problema. El día 29 se hace 
el último análisis del dióxido de carbono producido. 
Los días en que se haga la medición del CO
 2 , se desconecta el 
absorbente de hidróxido de bario más próximo al matraz y se valora 
la solución de hidróxido con HC1 0,05 M utilizando fenolftaleína 
como indicador. Los restantes absorbentes se unen al matraz y se coloca en el extremo libre de la serie un nuevo absorbente con 
100 ml de hidróxido de bario 0,0125 M recién preparado. Hay 
que hacer valoraciones según sea necesario, por ejemplo, cuando se observe la aparición de un precipitado importante en el primer frasco y antes de que aparezca en el segundo, o al menos una vez 
por semana. Cuando se utiliza NaOH como absorbente, se toma con 
jeringa una muestra pequeña (según las características del analizador de carbono utilizado) de la solución de hidróxido de sodio del ab ­
sorbente más próximo al matraz. Se inyecta la muestra en la parte CI 
del analizador de carbono para analizar directamente el dióxido de 
carbono producido. 
El contenido del segundo frasco solo se analiza al final de la prueba 
para introducir las correcciones necesarias en caso de que se haya producido arrastre de dióxido de carbono.
 
IV.3. DATOS E INFORME  
IV.3.1.  Tratamiento de los resultados  
La cantidad de CO  2 retenida en un absorbente viene dada por: 
mgCO2 = (100 × C  B - 0,5 × V × C  A ) × 44 
donde: 
V = volumen de HC1 utilizado para valorar los 100 ml del ab ­
sorbente (ml) 
C B = concentración de la solución de hidróxido de bario (M) 
C A = concentración de la solución de ácido clorhídrico (M). 
Si C  B es 0,0125 M y C  A es 0,05 M, el resultado de la valoración de 
100 ml de hidróxido de bario es 50 ml y el peso de CO  2 viene dado por:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCI valorado  ¼ 1; 1 Ü ml HCI  
Así pues, para pasar el volumen de HC1 valorado a mg de CO  2 
producido, el factor en este caso es 1,1. 
Se calculan los pesos de CO  2 producido del inóculo solo y del inóculo 
más la sustancia problema utilizando los respectivos resultados de valoración y la diferencia es el peso de CO
 2 producido a partir de la 
sustancia problema sola. 
Por ejemplo, si el inóculo solo da una valoración de 48 ml y el 
inóculo con la sustancia problema da 45 ml, 
CO 2 del inóculo = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 del inóculo con la sustancia problema = 1,1 × (50-45) = 5,5 mg 
y, por tanto, el peso de CO  2 producido a partir de la sustancia 
problema es 3,3 mg. 
El porcentaje de biodegradación se calcula con la fórmula siguiente:  
% degradación ¼ mg CO  2 producido Ü 100 
CO  2 T Ü mg de substancia problema añadida  
o bien  
% degradación ¼ mg CO  2 producido Ü 100 
mg COT añadido en la prueba  Ü 3; 67 
3,67 es el factor de conversión (44/12) para pasar de carbono a 
dióxido de carbono. 
El porcentaje de degradación tras un intervalo cualquiera de tiempo 
se obtiene sumando los valores porcentuales de CO  2 T calculados 
para cada uno de los días hasta el momento en que se haya medido. 
En el caso de absorbentes de hidróxido de sodio, la cantidad de dióxido 
de carbono producido, expresado como CI (mg) se calcula multipli ­
cando la concentración de CI en el absorbente por el volumen de este. 
El porcentaje de degradación se calcula con la fórmula siguiente:  
% CO  2 T ¼ mg CI del matraz problema  Ä mg CI del blanco 
MG COT añadido como substancia problema  Ü 100  
La pérdida de COD se calcula opcionalmente según se describe en 
1.7. Se registran estos resultados y todos los demás en las fichas de 
datos mencionadas.  
IV.3.2.  Validez de los resultados  
El contenido en CI de la suspensión de sustancia problema en el 
medio mineral al inicio de la prueba debe ser inferior al 5 % del CT, y el desprendimiento total de CO
 2 en el blanco con inóculo al final 
de la prueba no debe exceder normalmente de 40 mg/l por término 
medio. Si se obtienen valores superiores a 70 mg CO  2 /l, es necesario 
revisar críticamente los datos y la técnica experimental. 
Véase también el punto I.5.2.  
IV.3.3.  Informe  
Véase el punto I.8.  
IV.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOS 
A continuación se presenta un ejemplo de ficha de recogida de datos.  
ENSAYO DE DESPRENDIMIENTO DE DIÓXIDO DE CAR ­
BONO 
1. LABORATORIO  
2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA  
3. SUSTANCIA A EXAMINAR  
Nombre:… 
Concentración de la solución madre: … mg/l en sustancia química  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Concentración inicial en el medio: … mg/l en sustancia química 
Carbono total añadido al matraz: … mg C 
CO 2 T: … mg CO  2 
4. INOCULO  
Fuente: … 
Tratamiento realizado: … 
Acondicionamiento previo en su caso: … 
Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de reac ­
ción: … mg/l  
Tiemp 
(día) CO 2 formado 
(mg) CO 2 formado blanco 
(mg) C0 2 formado acumu ­
lado (mg) 
(ensayo menos blanco) % CO  2 
CO  2 acumulado 
CO  2 T Ü 100 
1 
2 media 3 
4 media 1 2 1 2 media  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Nota:  Pueden utilizarse otros formatos similares para la sustancia de 
referencia y los controles de toxicidad  
5. PRODUCCION DE DIOXIDO DE CARBONO Y DEGRA ­
DABILIDAD:  
Método: Ba(OH)  2 /NaOH/otro  
6. ANALISIS DE CARBONO  (opcional) 
Analizador de carbono:  
Tiempo (día) blanco mg/1 sustancia problema mg/1  
0 C  b(o) C 0 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) O al final de la incubación.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% COD eliminado  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C t Ä C bðoÞ Î 
Ü 100  
7. DEGRADACIÓN ABIÓTICA  (opcional) 
% degrad : abiót : ¼ formac : de CO  2 en el matraz estéril tras 28 días  ðmgÞ 
CO  2 T ðmgÞ Ü 100  
PARTE V.  RESPIROMETRÍA MANOMÉTRICA  (Método C.4-D)  
V.I. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se somete a agitación en un frasco cerrado a temperatura constante 
(± 1  o C o más exacto), durante 28 días, un volumen medido de 
medio mineral inoculado que contenga una concentración conocida 
de la sustancia química de ensayo (100 mg/l de la sustancia de 
ensayo, para dar al menos 50-100 mg DTO/l) como única fuente nominal de carbono orgánico. Se determina el consumo de oxígeno midiendo la cantidad de oxígeno (producido por electrólisis) reque ­
rido para mantener un volumen constante de gas en el frasco del 
respirómetro, o a partir de los cambios de volumen o presión (o una combinación de ambas cosas) en el aparato. El dióxido de carbono producido se absorbe en una solución de hidróxido potásico u otro 
absorbente adecuado. La cantidad de oxígeno consumido por la sus ­
tancia problema (corregida según el consumo del blanco con inóculo, realizada en paralelo) se expresa como porcentaje de DTO o DQO. Opcionalmente, se puede calcular también la biodegradación prima ­
ria mediante un análisis adicional específico realizado al comienzo y 
al final de la incubación, y la biodegradación última mediante un análisis de COD.
 
V.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
V.2.1.  Equipo  
a) Respirómetro adecuado. 
b) Control de temperatura, manteniéndolo con un margen de ± 1  o C 
o más exacto. 
c) Conjunto de membrana y filtros (opcional). 
d) Analizador de carbono (opcional).  
V.2.2.  Preparación del medio mineral  
Para la preparación de las soluciones madre, véase I.6.2. 
Mezclar 10 ml de la solución (a) con 800 ml de agua de dilución, añadir 
1 ml de las soluciones (b) a (d) y enrasar hasta 1 1 con agua de dilución.  
V.2.3.  Preparación y acondicionamiento previo del inóculo  
El inóculo puede obtenerse de diversas fuentes: lodo activado, aguas 
residuales efluentes, aguas superficiales, suelos, o de una combina ­
ción de ellos. 
Véanse los puntos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 y I.6.5.  
V.2.4.  Preparación de los frascos  
Preparar soluciones de las sustancias problema y de referencia, en 
lotes separados, en un medio mineral equivalente a una concentra ­
ción, normalmente, de 100 mg de sustancia/l (que dé al menos 50- 
100 mg DTO/l) utilizando soluciones madre.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
Calcular la DTO sobre la base de la formación de sales de amonio 
salvo que se prevea nitrificación; en este caso, el cálculo debe ba ­
sarse en la formación de nitratos (véase el anexo II.2). 
Determinar los valores de pH y, si es necesario, ajustarlos a 7,4 
± 0,2. 
Las sustancias débilmente solubles deben añadirse en un estadio 
posterior (véase más abajo). 
Si hay que determinar la toxicidad de la sustancia problema, preparar 
posteriormente otra solución en medio mineral que contenga tanto la 
sustancia problema como la de referencia a las mismas concentra ­
ciones que las utilizadas para el ensayo. 
Si se necesita una medida del consumo fisicoquímico de oxígeno, 
preparar una solución de la sustancia problema, generalmente, a una concentración de 100 mg DTO/1. Esterilizar dicha solución mediante la adición de una sustancia tóxica adecuada (véase el punto I.6.6). 
Introducir en frascos, al menos por duplicado, el volumen necesario 
de soluciones de sustancias problema y de referencia. Añadir a los siguientes frascos solamente medio mineral (para controles de inó ­
culos) y, si es necesario, la solución con mezcla de sustancia pro ­
blema y de referencia y la solución estéril. 
Si la sustancia problema es poco soluble, se añadirá directamente en 
este estadio basándose en el volumen o en el peso o actuando como se describe en el anexo III. Añadir hidróxido de potasio con cal sodada u otro absorbente a los compartimentos de absorción de CO
 2 . 
V.2.5.  Número de frascos en un ensayo normal  
Matraces 1 y 2: suspensión de ensayo 
Matraces 3 y 4: con inóculo solo (blanco con inóculo) 
Matraz 5: control de procedimiento Preferentemente y cuando sea necesario: 
Matraz 6: control estéril 
Matraz 7: control de toxicidad. Véase también el punto I.6.7.
 
V.2.6.  Realización del ensayo  
Se deja que los recipientes alcancen la temperatura deseada y se 
inoculan los recipientes adecuados con lodo activado preparado u 
otra fuente de inóculo para obtener una concentración de sólidos 
suspendidos no superior a 30 mg/l. Se monta el equipo, se pone en marcha el agitador y se controla la impermeabilidad al aire, comenzando en este momento la medición del consumo de oxígeno. 
Generalmente no hay que hacer más que tomar las lecturas necesa ­
rias y los controles diarios para asegurarse de que se mantienen la temperatura correcta y la agitación adecuada. 
Calcular el consumo de oxígeno según las lecturas tomadas a inter ­
valos frecuentes y regulares, utilizando los métodos proporcionados por el fabricante del equipo. Ai final de la incubación, normalmente 28 días, medir el pH del contenido de los frascos, especialmente si el 
consumo de oxígeno es inferior o superior a la DTO
 NH4 (en aquellos 
compuestos que contengan nitrógeno).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Si es necesario, se tomarán muestras de los frascos del respirómetro, al 
comienzo y al final, para analizar el COD o realizar un análisis químico 
específico (véase el anexo II.4). Cuando se haga la primera toma de muestras, hay que asegurarse de que se conoce el volumen de suspen ­
sión problema que queda en el frasco. Cuando la sustancia problema 
nitrogenada consuma oxígeno, determinar el aumento de la concen ­
tración de nitrito y nitrato en 28 días y calcular la corrección teniendo en cuenta el oxígeno consumido por nitrificación (véase el anexo V).
 
V.3. DATOS E INFORME  
V.3.1.  Tratamiento de los resultados  
Dividir el consumo de oxígeno (mg) de la sustancia problema des ­
pués de un tiempo dado (corregido según el blanco con inóculo 
después del mismo tiempo) entre el peso de la sustancia problema utilizada. Esto dará la DBO expresada en mg de oxígeno/mg de sustancia problema, es decir
 
DBO ¼ ðmg O  2 consumido por la sust : problema Ä O  2 consumido por el blanco Þ 
ðmg de substancia problema en el frasco Þ 
= mg de O  2 por mg de substancia problema 
calcular el porcentaje de biodegradación, bien a partir de:  
% de biodegradación  ¼ % DOT ¼ DBOðmg O  2=mg substanciaÞ 
DOTðmg O  2=mg substanciaÞ Ü 100 ; 
o bien de:  
% DQO ¼ DBOðmg O  2=mg substanciaÞ 
DQOðmg O  2=mg substanciaÞ Ü 100  
Debe señalarse que estos dos métodos no dan necesariamente el 
mismo valor. Es preferible usar el primero. 
En el caso de sustancias a examinar que contengan nitrógeno, se 
utiliza la DTO (NH  4 o NO  3 ) adecuada según se espere o se sepa que 
va haber nitrificación o no (véase el anexo II.2). Si hay nitrificación pero no es completa, se calcula una corrección según el oxígeno consumido por nitrificación basándose en los cambios de la concen ­
tración de nitrito y nitrato (véase el anexo V). 
Cuando se hagan determinaciones opcionales de carbono orgánico o 
análisis químicos específicos, calcular la degradación porcentual, tal como se describe en el punto I.7. 
Registrar todos los resultados en las fichas de datos adjuntas.
 
V.3.2.  Validez de los resultados  
El consumo de oxígeno del blanco con inóculo es normalmente de 
20-30 mg O  2 /l y no debe ser superior a 60 mg/l en 28 días. Los 
valores superiores a 60 mg/l exigirán un examen crítico de los datos y de las técnicas experimentales. Si el valor del pH está fuera del rango 6-8,5 y el consumo de oxígeno por la sustancia problema es 
inferior al 60 %, debe repetirse el ensayo con menor concentración 
de la sustancia problema. 
Véase también el punto I.5.2.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Informe  
Véase el punto I.8.  
V.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOS  
A continuación se da un ejemplo de una ficha de recogida de datos.  
RESPIROMETRÍA MANOMÉTRICA 
1. LABORATORIO  
2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA  
3. SUSTANCIA A EXAMINAR  
Nombre: … 
Concentración de la solución madre: … mg/l 
Concentración inicial en el medio, C  o : … mg/l 
Volumen en el matraz de prueba (V): … ml 
DTO de sustancia/DQO de sustancia: … mg O  2 /mg de sustancia 
a examinar (NH  4 , NO  3 ) 
4. INÓCULO  
Fuente: … 
Tratamiento realizado: … Acondicionamiento previo en su caso: … 
Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de reac ­
ción: … mg/l
 
5. CONSUMO DE OXÍGENO: BIODEGRADABILIDAD  
Tiempo (dias) 
0 7 14 21 28  
O 2 consumido 
(mg) sust. pro ­
blema 1 
2 
a, media 
O 2 consumido 
(mg) blanco 3 
4 
b, media 
DBO (mg) co ­
rregida (a 1 — b  m ) 
(a 2 — b  m ) 
DBO por mg 
de sustancia problema
 ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Tiempo (dias) 
0 7 14 21 28  
% degradación  
DBO 
DOT Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Media (*)  
V = volumen de medio en los frascos del ensayo. 
(*) Si existe una diferencia considerable entre D  1 y D  2 , no debe calcularse el término medio.  
Nota:  Pueden utilizarse formatos similares para las sustancias de 
referencia y los controles de toxicidad.  
6. CORRECCIÓN POR NITRIFICACIÓN  (véase el anexo V)  
Día 0 28 Diferencia  
(i) Concentración de nitrato (mg N/l) (N) 
(ii) Equivalente de oxígeno (4,57 × N × V) (mg) — (iii) Concentración de nitrito (mg N/l) (N) (iv) Equivalente de oxígeno (3,43 × N × V) (mg) — — (ii + iv) Equivalente total de oxígeno — —
 
7. ANÁLISIS DE CARBONO  (opcional) 
Analizador de carbono:  
Tiempo (da) Blanco mg/l Sustancia problema mg/l  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) O al final de la incubación.  
% COD eliminado  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100  
8. ANÁLISIS QUÍMICO ESPECÍFICO  (opcional) 
S b = concentración en el control fisicoquímico (estéril) a los 
28 días. 
S a = concentración en el frasco inoculado a los 28 días.  
% biodegradación ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
9. DEGRADACIÓN ABIÓTICA  (opcional) 
a = consumo de oxígeno en frascos estériles después de 
28 días, mg. 
consumo de oxígeno por rag de sustancia problema  ¼ a 
C o V ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(véanse las secciones 1 y 3)  
% degradación abiótica  ¼ a Ü 100 
C o V Ü DTO  
PARTE VI.  ENSAYO DEL FRASCO CERRADO  (Método C.4-E)  
VI. 1. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se prepara una solución de la sustancia problema en medio mineral, 
generalmente con una concentración de 2-5 mg/l. Esta solución se 
inocula con un número relativamente pequeño de microorganismos de una población mixta y se mantiene en frascos cerrados comple ­
tamente llenos, en la oscuridad y a temperatura constante. 
La degradación se sigue mediante el análisis del oxígeno disuelto 
durante un período de 28 días. La cantidad de oxígeno consumido por la sustancia problema, corregido según el consumo de oxígeno por parte del blanco con inóculo realizado en paralelo, se expresa 
como porcentaje de DTO o DQO.
 
VI.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
VI.2.1.  Equipo  
a) Frascos de DBO, con tapones de cristal de, por ejemplo, 250- 
300 ml. 
b) Baño maría o incubadora, para mantener los frascos a tempera ­
tura constante (± 1  o C o más exacto) en la oscuridad. 
c) Frascos de cristal grandes (2-5 1) para la preparación de medios y 
para rellenar los frascos de DBO. 
d) Electrodo de oxígeno y oxímetro o equipamiento y reactivos para 
la valoración según Winkler,  
VI.2.2.  Preparación del medio mineral  
Para la preparación de la solución madre, véase el punto I.6.2. 
Mezclar 1 ml de las soluciones (a) a (d) y rellenar hasta 1 l con agua 
de dilución.  
VI.2.3.  Preparación del inóculo  
El inóculo se deriva normalmente de un efluente secundario de una 
planta depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba predominantemente aguas residuales domésticas. Otra fuente posible 
de inóculo es el agua superficial. Utilizar normalmente desde una 
gota (0,05 ml) hasta 5 ml de filtrado por litro de medio; se pueden necesitar varias pruebas para descubrir el volumen óptimo para un efluente dado. (Véanse los puntos I.6.4.2 y I.6.5)
 
VI.2.4.  Preparación de los frascos  
Se airea intensamente el medio mineral durante 20 minutos por lo 
menos. Realizar cada serie de ensayos con el mismo medio mineral. 
Generalmente, el medio está listo para su uso después de dejarlo 
reposar 20 horas, a la temperatura del ensayo. Determinar la concen ­
tración de oxígeno disuelto como control; debe dar un valor de unos 9 mg/l a 20
 o C. Todas las operaciones de transferencia y llenado de 
medio saturado de aire y sin burbujas, se harán, por ejemplo, me ­
diante sifones.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Se preparan grupos paralelos de frascos de DBO para la determi ­
nación de sustancias problema y de referencia en series experi ­
mentales simultáneas. Reunir un número suficiente de frascos de DBO, incluyendo blancos con inóculo, para permitir hacer, al menos por duplicado, mediciones de consumo de oxígeno a los 
intervalos deseados, por ejemplo, a los 0, 7, 14, 21 y 28 días. 
Pueden ser necesarios más frascos si se quiere determinar el pe ­
ríodo de observación de 10 días. 
Se añade medio mineral bien aireado a frascos grandes de manera que 
estén llenos aproximadamente hasta un tercio de su capacidad. A con ­
tinuación se añade suficiente cantidad de las soluciones madre de las sustancias problema y de las sustancias de referencia a frascos grandes 
por separado de forma que la concentración final de las sustancias 
químicas no exceda normalmente de 10 mg/l. No se añadirá ninguna sustancia al blanco de control contenido en otro frasco grande. 
La concentración de oxígeno disuelto no debe bajar por debajo de 
0,5 mg/l en los frascos de DBO, para poder garantizar la no limita ­
ción de la actividad del inóculo. Esto limita la concentración de la 
sustancia problema a unos 2 mg/l. Sin embargo, en caso de com ­
puestos poco degradables y de aquéllos que tienen baja DTO, puede usarse una concentración de 5-10 mg/l. En algunos casos, es acon ­
sejable realizar series paralelas de sustancias problema a dos concen ­
traciones diferentes, por ejemplo, 2 y 5 mg/l. Normalmente, se cal ­
culará la DTO basándose en la formación de sales de amonio pero, si se espera o se sabe que va a haber nitrificación, se calculará basán ­
dose en la formación de nitrato (DTO
 NO3 : véase el anexo II.2). 
No obstante, si hay nitrificación pero no es completa, se corregirá 
de acuerdo con los cambios en la concentración de nitrito y nitrato, determinada por análisis (véase el anexo V). 
Si se va a investigar la toxicidad de la sustancia problema (en el 
caso, por ejemplo, de que se haya encontrado previamente un valor de biodegradabilidad bajo), será necesaria otra serie de frascos. 
Se prepara otro frasco grande que contenga medio mineral aireado 
(alrededor de un tercio de su volumen) más la sustancia problema y 
la de referencia a concentraciones finales normalmente iguales a las 
de los otros frascos grandes. 
Se inoculan las soluciones en los frascos grandes con efluente se ­
cundario (desde una gota, alrededor de 0,05 ml, hasta 5 ml/l) o con otra fuente como agua de río (véase el punto I.6.4.2). Finalmente se llevan las soluciones al volumen deseado con medio mineral aireado 
utilizando un tubo que llegue hasta el fondo del frasco para conse ­
guir una mezcla adecuada.
 
VI.2.5.  Número de frascos en una serie típica  
En una serie típica se usan los siguientes frascos: 
— al menos 10 que contengan la sustancia problema y el inóculo 
(suspensión de ensayo), 
— al menos 10 que solo contengan el inóculo (blanco con inóculo), — al menos 10 que contengan la sustancia de referencia y el inóculo 
(control de procedimiento),
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— y, cuando sea necesario, 6 frascos que contengan la sustancia 
problema, la sustancia de referencia y el inóculo (control de 
toxicidad). Sin embargo, puede necesitarse al menos el doble de frascos si se desea garantizar la posibilidad de determinar el período de observación de 10 días.
 
VI.2.6. Realización del ensayo 
Se introduce inmediatamente cada solución preparada en el respec ­
tivo grupo de frascos de DBO mediante un tubo desde el cuarto 
inferior (no el fondo) del frasco grande apropiado, de forma que se rellenen completamente todos los frascos de DBO. Se golpea ligeramente para eliminar toda burbuja de aire. Se analizan inmedia ­
tamente los frascos para determinar el oxigeno disuelto a tiempo 
cero, mediante los métodos de Winkler o de electrodo. Pueden pre ­
servarse los contenidos de los frascos, para su análisis ulterior, me ­
diante el método de Winkler añadiendo sulfato de manganeso (II) e 
hidróxido sódico (el primer reactivo del método Winkler); estos 
frascos, que contienen el oxígeno fijado como óxido hidratado de manganeso (III) (precipitado marrón), se pueden almacenar en la oscuridad y a 10-20
 o C durante no más de 24 horas antes de con ­
tinuar con el análisis según el método de Winkler. Se tapan los 
restantes frascos replicados asegurándose de que no quedan burbujas dentro de ellos y se incuban a 20
 o C en la oscuridad. Cada serie debe 
acompañarse de una serie paralela completa para la determinación en 
el blanco inoculado. Retirar al menos frascos duplicados de todas las 
series para el análisis del oxígeno disuelto a intervalos de tiempo (al menos semanalmente) durante los 28 días de incubación. 
Las muestras semanales permitirán la valoración del porcentaje de 
eliminación en un período de observación de 14 días, mientras que las muestras tomadas cada 3 o 4 días permitirán determinar el pe ­
ríodo de observación de 10 días, lo que requerirá aproximadamente 
el doble de frascos. 
En el caso de las sustancias que contengan nitrógeno, deberán ha ­
cerse correcciones del consumo de oxígeno si tiene lugar cualquier tipo de nitrificación. Con este fin, se usará el método del electrodo 
de O
 2 a fin de determinar la concentración de oxígeno disuelto y 
sacar una muestra del frasco de DBO para análisis de nitrito y nitrato. El oxígeno utilizado se calculará a partir del aumento de concentración de nitrito y nitrato (véase el anexo V).
 
VI.3. DATOS E INFORME  
VI.3.1.  Tratamiento de los resultados  
Se calcula en primer lugar la DBO obtenida tras cada período de 
tiempo sustrayendo la depleción de oxígeno (mg O  2 /l) del blanco 
con inóculo de la que presenta la sustancia problema. Se divide esta depleción corregida entre la concentración (mg/l) de la sustancia 
problema a fin de obtener la DBO específica en mg de oxígeno 
por mg de sustancia problema, Se calcula la biodegradabilidad por ­
centual dividiendo la DBO específica entre la DTO específica (cal ­
culada de acuerdo con el anexo II.2) o la DQO (determinada por 
análisis, véase el anexo II.3); así pues:
 
DBO ¼ mg de consumo O  2 de sustancia problema  Ä mg O  2 consumo blanco 
mg sustancia problema en el frasco  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg de O  2 por mg de sustancia problema  
% degradación ¼ DBO ðmg O  2=mg sustancia problema Þ 
DTOðmg O  2=mg sustancia problema Þ Ü 100  
o 
% degradación ¼ BOD ðmg O  2=mg sustancia problema Þ 
DQOðmg O  2=mg sustancia problema Þ Ü 100  
En el caso de sustancias que contengan nitrógeno, se utiliza la DTO 
(NH  4 o NO  3 ) adecuada según se espere o se sepa que va haber 
nitrificación o no (véase el anexo II.2), Si hay nitrificación pero no es completa, se calcula una corrección según el oxígeno consu ­
mido por nitrificación basándose en los cambios de la concentración 
de nitrito y nitrato (véase el anexo V).
 
VI.3.2.  Validez de los resultados  
La depleción de oxígeno en el blanco con inóculo no debe sobrepasar 
1,5 mg de oxígeno disuelto/l después de 28 días. Si hay valores supe ­
riores a este, deberá hacerse una revisión de las técnicas experimenta ­
les. La concentración residual de oxígeno en los frascos del ensayo no 
deberá bajar por debajo de 0,5 mg/l en ningún momento. Estos valores 
tan bajos de oxígeno solo son válidos si el método de determinación del oxigeno disuelto es capaz de medir dichos niveles con exactitud. 
Véase también el punto I.5.2
 
VI.3.3.  Informe  
Véase el punto I.8.  
VI.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOS 
A continuación se da un ejemplo de ficha de recogida de datos.  
ENSAYO DEL FRASCO CERRADO 
1. LABORATORIO  
2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA  
3. SUSTANCIA A EXAMINAR  
Nombre: 
Concentración de la solución madre: … mg/l 
Concentración inicial en el frasco: … mg/l 
DTO/DQO: mg O  2 /mg de sustancia a examinar  
4. INÓCULO  
Fuente: 
Tratamiento realizado:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
Acondicionamiento previo en su caso: 
Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de reac ­
ción: … mg/l  
5. DETERMINACIÓN DEL OD  
Método: Winkler/electrodo  
Análisis de los frascos  
Tiempo de incubación (d) OD (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Blanco sin sustancia 
problema 1 C  1 
2 C  2 
Media 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Substancia problema 1 a  1 
2 a  2 
Media 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Nota:  Pueden utilizarse formatos similares para las sustancias de 
referencia y los controles de toxicidad.  
6. CORRECCIÓN POR NITRIFICACIÓN  (véase el anexo V)  
Tiempo de incubación (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Concentración de nitrato (mg N/l) 
(ii) Cambio en la concentración de nitrato (mg N/l) — (iii) Equivalente de oxígeno (mg/l) — (iv) Concentración de nitrito (mg N/l) 
(v) Cambio en la concentración de nitrito (mg N/l) — 
(vi) Equivalente de oxígeno (mg/l) — (iii + vi) Equivalente total de oxígeno (mg/l) —
 
7. DEPLECIÓN DE OD: % DE DEGRADACIÓN  
Depleción tras n días (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
Frasco 1: (m  to - m  tx ) — (m  bo - m  bx ) 
Frasco 2: (m  to - m  tx ) — (m  bo - m  bx ) ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Depleción tras n días (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
Frasco1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
del ensayo Ü DTO sustancia 
Frasco 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
del ensayo Ü DTO sustancia 
% D media (*) =  D 1 þ D 2 
2 
(*) No tener en cuenta si hay una diferencia considerable en las repeticiones.  
m to = valor a tiempo 0 en el frasco de la prueba 
m tx = valor a tiempo t en el frasco de la prueba 
m bo = valor medio del blanco a tiempo 0 
m bx = valor medio del blanco a tiempo x 
Se aplicará también una corrección según la nitrificación basándose 
en iii + vi de la sección 6.  
8. DEPLECIÓN DE OD EN EL BLANCO  
Consumo de oxígeno por el blanco: (m  bo - m  b28 ) mg/l. Este 
consumo es importante para la validez del ensayo. Debe ser 
menor de 1,5 mg/l.  
PARTE VII.  ENSAYO DEL M.I.T.I.  (Método C.4-F)  
VII.1. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
Se mide automáticamente durante un período de 28 días, en un 
respirómetro cerrado, a 25 ± 1  o C y en la oscuridad, el consumo 
de oxígeno en una solución o suspensión agitada, de la sustancia 
problema en un medio mineral, inoculado con un inóculo especial de 
microorganismos no adaptados. El dióxido de carbono producido es absorbido por cal sodada. La biodegradabilidad se expresa como porcentaje de consumo de oxígeno (corregido según el consumo 
del blanco) sobre el consumo teórico (DTO). El porcentaje de bio ­
degradabilidad primaria se calcula también basándose en los análisis químicos específicos adicionales hechos al comienzo y al final de la incubación y, opcionalmente, por análisis de COD.
 
VII.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
VII.2.1.  Equipo  
a) Medidor electrolítico automático de DBO o respirómetro normal ­
mente equipado con seis frascos, de 300 ml cada uno y que 
llevan cápsulas para el absorbente de CO  2 . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Temperatura ambiente constante o baño maría a 25  o C ± 1  o C o 
más exacta. 
c) Conjunto de membrana y filtros (opcional). 
d) Analizador de carbono (opcional).  
VII.2.2.  Preparación del medio mineral  
Se prepararán las siguientes soluciones madre, utilizando reactivos de 
calidad analítica y agua (véase el punto I.6.1): 
(a) Ortofosfato diácido de potasio, KH  2 PO 4 8,50 g 
Ortofosfato monoácido de potasio, K  2 HPO  4 21,75 g 
Ortofosfato monoácido de sodio dodecahidratado 
Na 2 HPO  4 .12 H  2 O 44,60 g 
Cloruro amónico, NH  4 Cl 1,70 g 
Disolver en agua y enrasar hasta 1 litro 
El pH de la solución debe ser de 7,2 
(b) Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO  4 - 7 
H 2 O 22,50 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro 
(c) Cloruro cálcido anhidro, CaCl  2 27,50 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro 
(d) Cloruro de hierro (III) hexahidratado, FeCl  3 .6 
H 2 O 0,25 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro 
Se toman 3 ml de cada solución (a), (b), (c) y (d) y se 
enrasa a 1 litro.  
VII.2.3.  Preparación del inóculo  
Se recogen muestras frescas de no menos de 10 puntos, sobre todo 
en zonas donde se utilicen y viertan diversos productos químicos. En 
los sitios como las instalaciones de tratamiento de aguas residuales, 
tratamiento industrial de aguas residuales, ríos, lagos, mares, se re ­
cogerá muestras de 1 litro de lodo, suelo superficial, agua, etc. y se mezclarán cuidadosamente. Despues de eliminar la materia flotante y 
de dejar sedimentar, el sobrenadante se ajustará a pH 7 ± 1 con 
hidróxido sódico o ácido fosfórico. 
Se utiliza un volumen adecuado del sobrenadante filtrado para relle ­
nar un recipiente de decantación de lodo activado y se airea el líquido durante 23 h 30 min. Treinta minutos después de detener la aireación, se elimina alrededor de un tercio del volumen total de 
sobrenadante y se añade al material sedimentado un volumen igual 
de una solución (pH 7) que contenga 0,1 % respectivamente de glucosa, peptona y ortofosfato monopotásico, volviendo a comenzar la aireación. Este procedimiento se repite una vez al día. La unidad 
de lodo funcionará de acuerdo con las prácticas correctas: los efluen ­
tes deben estar limpios, la temperatura debe permanecer a 25 ± 2
 o C, 
el pH debe ser 7 ± 1, el lodo debe estar bien sedimentado, debe haber aireación suficiente para mantener la mezcla en aerobiosis en 
todo momento, los protozoos deben estar presentes; al menos cada 
tres meses se hará un ensayo de la actividad del lodo frente a una sustancia de referencia. No se debe utilizar lodo como inóculo hasta al menos un mes después de la operación, pero no más de cuatro 
meses después. Posteriormente, tomar muestras de al menos 10 sitios 
a intervalos regulares, una vez cada tres meses.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
A fin de mantener la misma actividad en el lodo reciente y en el 
antiguo, se mezcla el sobrenadante filtrado de un lodo activado en 
uso con un volumen igual de sobrenadante filtrado de una mezcla reciente recogida de diez fuentes y se cultiva el líquido combinado tal como se ha dicho anteriormente. Se toma el lodo para usarlo 
como inóculo de 18 a 24 horas después de haber alimentado la 
unidad.
 
VII.2.4.  Preparación de los frascos  
Se preparan los seis frascos siguientes: 
N o 1: sustancia problema en agua de dilución en concentración de 
100 mg/l. 
N os 2, 3 y 4: sustancia problema en medio mineral en concentración 
de 100 mg/l. 
N o 5: sustancia de referencia (por ejemplo, anilina) en medio mineral 
en concentración de 100 mg/l. 
N o 6: medio mineral solo. 
Las sustancias problema poco solubles se añaden directamente cal ­
culadas en peso o en volumen o se actúa como se describe en el 
anexo III, excepto que no se utilizan ni disolventes ni agentes emul ­
sificantes. Se añade el absorbente de CO  2 a todos los frascos en las 
cápsulas especiales. Se ajusta el pH a 7,0 en los frascos n  os 2, 3 y 4.  
VII.2.5.  Realización del ensayo  
Se inoculan los frascos n  os 2, 3 y 4 (suspensiones problema), n  o 5 
(control de actividad) y n  o 6 (blanco con inóculo) con un pequeño 
volumen del inóculo de manera que dé una concentración de 30 mg/l 
de sólidos suspendidos. No se añade inóculo al frasco n  o 1 que sirve 
como control abiótico. Se monta el equipo, se controla la impermea ­
bilidad al aire, se ponen en marcha los agitadores y se comienza la medición del consumo de oxígeno en condiciones de oscuridad. Se 
controla diariamente la temperatura, el agitador y el registrador cu ­
lombimétrico de consumo de oxígeno, tomando nota de cualquier cambio de color del contenido de los frascos. El consumo de oxí ­
geno se leerá directamente de los seis frascos por un método apro ­
piado, por ejemplo a partir del registrador gráfico de seis puntos, 
dando lugar a una curva de DBO. Al final de la incubación, nor ­
malmente 28 días, se mide el pH del contenido de los frascos y se determina la concentración de la sustancia problema y/o residual y 
cualquier intermediario y, en el caso de una sustancia soluble en el 
agua, la concentración de COD (véase el anexo II.4). Se tendrá un cuidado especial en el caso de sustancias volátiles. Si se supone que 
va a haber nitrificación, se determina la concentración de nitrato y de 
nitrito en la medida de lo posible.
 
VII.3. DATOS E INFORME  
VII.3.1.  Tratamiento de los resultados  
Se divide el consumo de oxígeno (mg) de la sustancia problema 
después de un tiempo dado, corregido según el consumo del blanco con inóculo después del mismo tiempo, entre el peso de la sustancia problema utilizada. Con ello obtenemos la DBO expresada en mg de 
oxígeno/mg de sustancia problema, es decir:
 
DBO ¼ mg de consumo de O  2 sustancia problema  Ä mg de O  2 consumo blanco 
mg sustancia problema en el frasco  
= mg O  2 /mg substancia problema  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
La biodegradación porcentual se obtiene de la siguiente manera:  
% biodegradación  ¼ % DTO ¼ DBO ðmg O  2=mg sustanciaÞ 
DTO ðmg O  2=mg sustanciaÞ Ü 100  
En las mezclas, se calcula la DTO basándose en el análisis elemen ­
tal, como si fuera una sustancia simple. Se utilizará la DTO adecuada 
(DTO  NH4 o DTO  NO3 ) según haya nitrificación nula o completa 
(véase el anexo II.2). No obstante, si hay nitrificación pero es in ­
completa, se corregirá según el oxígeno consumido por la nitrifica ­
ción, calculado según los cambios en las concentraciones de nitrito y 
nitrato (véase el anexo V). 
Se calcula el porcentaje de biodegración primaria a partir de la 
pérdida de sustancia química originaria específica (véase el punto I.7.2).
 
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Si ha habido en el frasco No. 1 una pérdida de sustancia problema 
que dé la medida de la eliminación fisicoquímica, se informará de 
ello y se utilizará la concentración de la sustancia problema (S  b ) 
después de 28 días en este frasco para calcular el porcentaje de biodegradación. 
Cuando se hagan determinaciones de COD opcional), el porcentaje 
de biodegradación última se calculará con la siguiente fórmula:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Î 
Ü 100  
como se describe en el punto I.7.1. Si ha habido en el frasco n  o 1 
una pérdida de COD, que mide la eliminación fisicoquímica, se 
utilizará la concentración de COD en este frasco para calcular el porcentaje de biodegradación. 
Se registrarán todos los resultados en la ficha de datos adjunta.
 
VII.3.2.  Validez de los resultados  
El consumo de oxígeno del blanco con inóculo es normalmente de 
20 a 30 mg O  2 /l y no debe ser mayor de 60 mg/l en 28 días. Los 
valores superiores a 60 mg/l exigirán una revisión crítica de los datos y de las técnicas experimentales. Si el pH cae fuera del rango 6-8,5 y 
el consumo de oxígeno con la sustancia problema es menor del 
60 %, debe repetirse el ensayo con una concentración inferior de la sustancia problema. 
Véase también el punto I.5.2. Si el porcentaje de degradación de anilina calculado a partir del 
consumo de oxígeno no excede del 40 % después de 7 días y del 65 % después de 14 días, el ensayo se considerará no válido.
 
VII.3.3.  Informe  
Véase el punto I.8.  
VII.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOS 
A continuación se da un ejemplo de una ficha de recogida de datos.  
PRUEBA DEL MITI (I) 
1. LABORATORIO  
2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. SUSTANCIA A EXAMINAR  
Nombre: . . . 
Concentración de la solución madre: … mg/l, en sustancia 
Concentración inicial en el medio, C  o : … mg/l, en sustancia 
Volumen de la mezcla de reacción, V: … ml 
DTO de la sustancia: … mg O  2 /l 
4. INÓCULO  
Puntos de muestreo del lodo: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 3) … 8) … 
4) … 9) … 
5) … 10) … 
Concentración de sólidos en suspensión en el lodo activado tras 
aclimatación con vertidos sintéticos … mg/l 
Volumen de lodo activado por litro de medio final = … ml 
Concentración de lodo en el medio final = … mg/l
 
5. CONSUMO DE OXÍGENO: BIODEGRADABILIDAD  
Tipo de respirómetro usado:  
Tiempo (dias) 
0 7 14 21 28  
Consumo O  2 (mg) 
de la substancia 
problema a 1 
a 2 
a 3 
Consumo O  2 (mg) 
blanco b 
Consumo O  2 co­
rregido (mg) (a 1 - b) 
(a 2 - b) 
(a 3 - b) 
DBO por mg de 
sustancia pro ­
blema ða Ä bÞ 
C o V Frasco 1 
Frasco 2 Frasco 3 
% degradación
 
DBO 
DTO Ü 100 1 
2 
3 
media (*)  
(*) No tener en cuenta si hay una diferencia considerable en las repeticiones.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Nota:  Pueden utilizarse formatos similares para las sustancias de 
referencia y los controles de toxicidad.  
6. ANÁLISIS DE CARBONO  (opcional) 
Analizador de carbono:  
Matraz COD 
% COD eliminado Media 
Medido Corregido  
Agua + sustancia a examinar a 
Lodo + sustancia a examinar b  1 b 1 -c 
Lodo + sustancia a examinar b  2 b 2 -c 
Lodo + sustancia a examinar b  3 b 3 -c 
Control blanco c —  
% COD eliminado  ¼ a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100  
7. DATOS DEL ANÁLISIS QUÍMICO ESPECÍFICO  
Cantidad residual de sust. problema al 
final del ensayo % degradación  
Ensayo blanco con agua S  b 
Medio inoculado S al 
S a2 
S a3 
% degradación ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Calcular % de degradación de los frascos a  1 a 2 y a 3 respectiva ­
mente.  
8. COMENTARIOS  
Se adjuntará una curva de DBO en función del tiempo, si se 
disponede ella.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
Anexo I  
ABREVIATURAS Y DEFINICIONES  
OD: Oxígeno disuelto (mg/l); es la concentración de oxígeno disuelto en una 
muestra acuosa. 
DBO: Demanda bioquímica de oxígeno (g); es la cantidad de oxígeno consu ­
mido por los microorganismos que metabolizan una sustancia problema; se expresa también como gramos de oxígeno consumido por gramo de sustancia problema. (Véase el método C.5.). 
DQO: Demanda química de oxígeno (g); es la cantidad de oxígeno consumido 
durante la oxidación de una sustancia problema con dicromato en medio ácido caliente. Proporciona una medida de la cantidad de sustancia oxi ­
dable presente; se expresa también como gramos de oxígeno consumido 
por gramo de sustancia problema. (Véase el método C.6.) 
COD: Carbono orgánico disuelto; es el carbono orgánico presente en solución o 
el que pasa a través de un filtro de 0,45 micrómetros o permanece en el sobrenadante tras centrifugación a 40 000 m.s
 -2 (± 4 000 g) durante 
15 minutos. 
DTO: Demanda teórica de oxígeno (mg); es la cantidad total de oxígeno nece ­
sario para oxidar completamente una sustancia; se calcula basándose en la fórmula molecular (véase el anexo II.2) y se expresa también como mg 
de oxígeno requeridos por mg de sustancia problema. 
CO
 2 T: Dióxido de carbono teórico (mg); es la cantidad de dióxido de carbono 
que se calcula que va a producirse a partir del contenido en carbono, 
conocido o medido, de la sustancia problema cuando se mineraliza com ­
pletamente; se expresa también como mg de dióxido de carbono produ ­
cido por mg de sustancia de ensayo. 
COT: Carbono orgánico total; es la suma total del carbono orgánico en solu ­
ción y en suspensión en una muestra. 
CI: Carbono inorgánico, 
CT: Carbono total; es el total del carbono orgánico e inorgánico presente en 
una muestra.  
Biodegradación primaria:  
Es la alteración de la estructura química de una sustancia, producida por acción 
biológica y que da lugar a la pérdida de las propiedades específicas de esa sustancia.
 
Biodegradación última (aerobia):  
Es el nivel de degradación al que llega la sustancia de ensayo cuando es total ­
mente utilizada por microorganismos dando lugar a la producción de dióxido de 
carbono, agua, sales minerales y nuevos constituyentes celulares microbianos 
(biomasa).  
Fácilmente biodegradable:  
Categoría arbitraria de sustancias químicas que han pasado determinados ensayos 
específicos de clasificación en cuanto a la biodegradabilidad última; estos ensa ­
yos son tan estrictos que es asumido que, según ellos, estos compuestos 
deben degradarse rápida y completamente en medio ambiente acuático en con ­
diciones de aerobiosis.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Intrínsecamente biodegradable:  
Categoría de sustancias químicas en las que hay evidencia inequívoca de biode ­
gradación (primaria o última) en un ensayo de biodegradabilidad reconocido.  
Tratabilidad:  
Es la capacidad de las sustancias de ser eliminadas durante el tratamiento bio ­
lógico de los residuos acuosos sin afectar negativamente ai funcionamiento nor ­
mal de los procesos de tratamiento. Generalmente, los compuestos fácilmente biodegradables son tratables, pero no todos los compuestos intrínsecamente bio ­
degradables son tratables. Pueden darse también procesos abióticos.
 
Tiempo de latencia  
En una prueba de pérdida, es el tiempo transcurrrido desde la inoculación hasta 
que el porcentaje de degradación aumenta hasta al menos el 10 %. El tiempo de latencia suele ser muy variable y poco reproducible.
 
Tiempo de degradación  
Es el tiempo transcurrido desde el final del tiempo de latencia hasta el momento 
en que se alcanza el 90 % del nivel máximo de degradación.  
Período de observación de 10 días  
Son los 10 días que siguen inmediatamente al momento en que se alcanza el 
10 % de degradación.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
Anexo II  
CÁLCULO Y DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS 
INDICATIVOS ADECUADOS  
Dependiendo del método elegido, se necesitarán determinados parámetros indi ­
cativos. La sección siguiente describe el cálculo de esos valores. El uso de estos 
parámetros se describe en cada uno de los métodos.  
1. Contenido en carbono  
El contenido en carbono se calcula basándose en la composición elemental 
conocida o determinada por análisis elemental de la sustancia problema.  
2. Demanda teórica de oxígeno (DTO)  
La demanda teórica de oxígeno (DTO) puede calcularse si se conoce la 
composición.elemental o se determina mediante análisis elemental. Para un 
compuesto: 
C c H h Cl d N n Na na O 0 P p S s 
sin nitrificación,  
DTO  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
Pm mg/mg 
o con nitrification  
DTO  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
Pm mg/mg  
3. Demanda química de oxígeno (DQO)  
La demanda química de oxígeno (DQO) se determina de acuerdo con el 
método C.6.  
4. Carbono orgánico disuelto (COD)  
El carbono orgánico disuelto (COD) es, por definición, el carbono orgánico 
de cualquier sustancia o mezcla de sustancias en agua que pasa a través de 
un filtro de 0,45 micrómetros. 
Se toman muestras de los recipientes de ensayo y se filtran inmediatamente 
en el equipo de filtración utilizando un filtro de membrana adecuado. Se 
desprecian los primeros 20 ml de filtrado (puede disminuirse la cantidad si 
se utilizan filtros más pequeños). Si se inyectan volúmenes de 10 a 20 ml o menores (el volumen depende de la cantidad necesaria para el analizador de 
carbono), se guardan para el análisis de carbono. La concentración de COD 
se determina mediante un analizador de carbono orgánico capaz de medir exactamente una concentración de carbono equivalente o inferior al 10 % de la concentración de COD inicial utilizada en el ensayo. 
Las muestras filtradas que no puedan analizarse en el mismo día de trabajo 
pueden conservarse almacenadas en un refrigerador a 2-4
 o C durante 48 
horas, o por debajo de - 18  o C durante períodos más prolongados.  
Comentarios:  
Los filtros de membrana vienen a menudo impregnados con agentes ten ­
soactivos para hacerlos hidrófilos. Así pues, el filtro puede contener varios mg de carbono orgánico soluble que puede interferir en las determinaciones 
de biodegradabilidad. Los agentes tensoactivos y otros compuestos orgáni ­
cos solubles se eliminan de los filtros hirviendo éstos en agua desionizada durante tres períodos de 1 hora cada uno. Los filtros pueden almacenarse a continuación en agua durante una semana. Si se utilizan cartuchos de filtro 
de un solo uso, cada lote debe controlarse para confirmar que no libera 
carbono orgánico soluble.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
Dependiendo del tipo de filtro de membrana, la sustancia puede ser retenida 
por absorción. Por ello, es aconsejable asegurarse de que la sustancia 
problema no queda retenida en el filtro. 
Puede usarse centrifugación, en lugar de filtración, a 40 000 m.sec  -2 
(4 000 g) durante 15 minutos para diferenciar el COT del COD. El método 
no es fiable con una concentración inicial < 10 mg COD/l ya que ni se 
eliminan todas las bacterias ni se redisuelve el carbono que forma parte del 
plasma bacteriano.  
REFERENCIAS  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen De ­
mand, 1965, p 65. 
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139. — DIN-Entwurf 38409 Teil 41 — Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser- 
, Abwasser- und Schlammuntersu chung, Summarische Wirkungs- und 
Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoff 
bedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V. 
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble com ­
pounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13 (1), 169.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
Anexo III  
EVALUACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD DE LAS SUSTANCIAS 
POCO SOLUBLES  
Debe prestarse una atención especial, en los ensayos de biodegradabilidad de 
sustancias poco solubles, a los aspectos siguientes. 
Aunque los líquidos homogéneos rara vez presentarán problemas de muestreo, se 
recomienda homogeneizar los materiales sólidos por medios apropiados para 
evitar errores debidos a la no homogeneidad. Debe prestarse una atención espe ­
cial cuando se necesiten muestras representativas de unos miligramos tomadas de mezclas de sustancias químicas o de sustancias con grandes cantidades de im ­
purezas. 
Pueden utilizarse durante los ensayos diversas formas de agitación. Debe tenerse 
cuidado de usar solo la agitación suficiente para mantener la dispersión de la sustancia, evitando el sobrecalentamiento, la formación excesiva de espuma y las fuerzas de cizallamiento excesivas. 
Puede utilizarse un emulsificante que dé una dispersión estable de la sustancia 
química. Debe ser atóxico para las bacterias y no debe biodegradarse ni producir espuma en las condiciones del ensayo. 
Se aplicarán a los solventes los mismos criterios que a los emulsificantes. No se recomienda utilizar vehículos sólidos para los ensayos de sustancias sóli ­
das, pero pueden ser adecuados en el caso de sustancias oleosas. 
Cuando se utilicen sustancias auxiliares corno emulsificantes, solventes y porta ­
dores, debe realizarse un ensayo en blanco con las sustancias auxiliares. 
Puede utilizarse para estudiar la biodegradabilidad de las sustancias poco solubles 
cualquiera de los tres ensayos respirométricos CO
 2 , DBO o MITI.  
REFERENCIAS  
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly- soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833. 
— Gerike, P. The Biodegradabiliry testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
Anexo IV  
EVALUACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD DE SUSTANCIAS 
QUÍMICAS QUE PUEDEN SER TÓXICAS PARA EL INÓCULO  
Cuando se someta una sustancia química a ensayos de biodegradabilidad fácil y 
se vea que no es biodegradable, se recomienda el procedimiento siguiente si se 
desea distinguir si la sustancia es inhibidora o es inerte (Reynolds et al.; 1987). 
Deben utilizarse inóculos similares o idénticos para los ensayos de toxicidad y de 
biodegradación. 
Cuando se considere necesario disponer de un medio para valorar la toxicidad de 
las sustancias químicas estudiadas en los ensayos de biodegradabilidad fácil, puede ser apropiado aplicar uno o varios de los métodos siguientes: inhibición 
de la tasa de respiración del lodo (ensayo de inhibición de respiración del lodo 
activado — Directiva 88/302/CEE), DBO o inhibición del crecimiento. 
Si hay que evitar la inhibición debida a la toxicidad, se sugiere que las concen ­
traciones de la sustancia problema utilizadas en las pruebas de biodegradabilidad 
fácil sean inferiores a 1/10 de la CE
 50 (o inferiores a los valores de la CE  20 ) 
obtenida en los ensayos de toxicidad. No es probable que sustancias con una CE
 50 superior a 300 mg/l tengan efectos tóxicos en los ensayos de biodegrada ­
bilidad fácil. 
Los valores EC  50 inferiores a 20 mg/l pueden presentar problemas en las pruebas 
subsiguientes. Se emplearán bajas concentraciones de ensayo, haciendo necesario 
el uso de pruebas sensibles y estrictas como el ensayo del frasco cerrado o el uso de material marcado con
 14 C. Como alternativa, un inóculo aclimatado puede 
permitir el uso de concentraciones más elevadas de la sustancia problema. En 
este último caso, sin embargo, se pierde el criterio específico del ensayo de 
biodegradabilidad fácil.  
REFERENCIAS  
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
Anexo V  
CORRECCIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO POR INTERFERENCIA 
DE LA NITRIFICACIÓN  
Si la sustancia problema no contiene nitrógeno, los errores debidos a no tener en 
cuenta la nitrificación, en el cálculo del consumo de oxígeno, son despreciables 
(no superiores al 5 %), incluso si la oxidación del N amónico en el medio se da 
irregularmente en los distintos recipientes de ensayo y blanco. No obstante, en el caso de sustancias que contienen N, pueden darse errores graves. 
Si ha habido nitrificación pero no es completa, el consumo de oxígeno que se ha 
observado en la mezcla de reacción puede corregirse según la cantidad de oxí ­
geno utilizado para oxidar el amonio a nitrito y nitrato, sí se determinan los 
cambios en la concentración del nitrito y del nitrato durante la incubación me ­
diante las ecuaciones siguientes: 
2 NH
 4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HC1 + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Globalmente: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HC1 + 2 H  2 O (3) 
En la ecuación (1) el consumo de oxigeno por 28 g de nitrógeno contenidos en 
cloruro amónico (NH  4 Cl) al ser oxidado a nitrito es de 96 g, es decir, un factor 
de 3,43 (96/28). Del mismo modo, en la ecuación (3) el consumo de oxígeno por 28 g de nitrógeno al ser oxidado a nitrato es de 128 g, es decir, un factor de 4,57 
(128/28). 
Como las reacciones son  secuenciales , desencadenadas por especies bacterianas 
diferentes bien determinadas, es posible que la concentración de nitrito aumente o disminuya; en este último caso, se formará una concentración equivalente de 
nitrato. Así pues, el oxígeno consumido en la formación de nitrato es 4,57 
multiplicado por el aumento de la concentración de nitrato, mientras que el oxígeno relacionado con la formación de nitrito es 3,43 multiplicado por el aumento en la concentración de nitrito o bien con la disminución de su concen ­
tración, la pérdida de oxígeno es - 3,43 multiplicado por la disminución de la 
concentración. 
Es decir: 
O
 2 consumido en la formación de nitrato-N = 4,57 × aumento en 
la concentración de nitrato  Y (4) 
O 2 consumido en la formación de nitrito-N = 3,43 × aumento en 
la concentración de nitrito (5) 
y 
O 2 perdido en la desaparición de nitrito-N = - 3,43 × disminu ­
ción en la concentración de nitrito de forma que (6) 
consumo de O  2 debido a la nitrificación = ± 3,43 × cambio en 
concentración de nitrito-N + 4,57 × aumento en concentración 
de nitrato (7) 
y, por consiguiente, 
consumo de O  2 debido a oxidación del C = consumo total 
observado menos consumo debido a nitrificación (8) 
Si solo se determina el N oxidado total, puede considerarse que el consumo de 
oxígeno debido a la nitrificación es, como primera aproximación, 4,57 × aumento 
del N oxidado. 
El valor corregido del consumo de oxígeno debido a la oxidacion del C se 
compara entonces con la DTO NH  4 tal como se calcula en el anexo II.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. DEGRADACIÓN: DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXÍGENO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El objetivo del ensayo es medir la demanda bioquímica de oxígeno 
(DBO) de las sustancias orgánicas, sólidas o líquidas. 
Los resultados que se obtienen con este método de ensayo son 
representativos, sobre todo, cuando se aplica a los compuestos hi ­
drosolubles; no obstante, al menos en principio, el método puede hacerse extensible a los compuestos volátiles y los compuestos de 
baja hidrosolubilidad. 
El método solo es aplicable a las sustancias orgánicas que no pro ­
duzcan efectos inhibidores sobre las bacterias a la concentración de ensayo. Si la sustancia de ensayo no es soluble a la concentración de ensayo, se puede recurrir a procedimientos especiales, tales como la 
dispersión por ultrasonidos, a fin de lograr una dispersión satisfac ­
toria de la sustancia de ensayo. 
Es conveniente disponer de información sobre la toxicidad de la 
sustancia para poder interpretar los resultados bajos y para elegir la concentración de ensayo adecuada.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La DBO se define como la masa de oxígeno disuelto necesario para 
asegurar, en condiciones determinadas, la oxidación bioquímica de 
un volumen dado de una solución de la sustancia sometida a ensayo. 
Los resultados se expresan en gramos de DBO por gramo de sus ­
tancia de prueba.  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Es conveniente la utilización de una sustancia de referencia apro ­
piada para verificar la actividad del inóculo.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se siembra con microorganismos y se incuba en la oscuridad a una 
temperatura ambiente constante dada, una cantidad determinada de sustancia, disuelta o dispersa en un medio apropiado y aireado. 
La DBO se determina por la diferencia entre el contenido en oxígeno 
disuelto al principio y al final del ensayo. La duración mínima del 
ensayo es de cinco días y la máxima, de 28. 
Debe efectuarse un ensayo paralelo en blanco, sin sustancia de en ­
sayo.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
La determinación de la DBO no puede considerarse como una de ­
terminación válida de la biodegradabilidad de la sustancia. Esta prueba solo puede considerarse como prueba exploratoria.
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se prepara una solución o una dispersión preliminar de la sustancia, 
con el fin de obtener una concentración de DBO compatible con el 
método utilizado. La DBO se determina entonces aplicando un mé ­
todo nacional o internacional normalizado que sea apropiado.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. RESULTADOS Y EVALUACIÓN  
La DBO contenida en la solución preliminar se calcula según el 
método normalizado elegido y se expresa en gramos de DBO por gramo de sustancia de ensayo.
 
3. INFORME  
Debe indicarse el método utilizado. 
La demanda bioquímica de oxígeno debe ser la media de al menos 
tres mediciones válidas. 
Para facilitar la interpretación de los resultados deben incluirse todos 
los datos y observaciones que sean pertinentes, especialmente en lo referente a impurezas, estado físico, efectos tóxicos y propiedades 
específicas de la sustancia que puedan afectar a los resultados. 
Debe mencionarse si se ha utilizado un aditivo inhibidor de la ni ­
trificación biológica.
 
4. REFERENCIAS 
Lista de métodos normalizados, por ejemplo: 
NF T 90-103: Determination of the Biochemical Oxygen Demand NBN 407: Biochemical Oxygen Demand NBN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik 
(BZV) 
The Determination of Biochemical Oxygen Demand, Methods 
for the Examination of Water and Associates Materials, HMSO, Londres. 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand 
after n days.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. DEGRADACIÓN: DEMANDA QUÍMICA DE OXÍGENO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El objetivo del ensayo es medir la demanda química de oxígeno 
(DQO) de las sustancias orgánicas, sólidas o líquidas, mediante la 
aplicación de cualquier procedimiento normalizado, en condiciones de laboratorio determinadas. 
Es conveniente disponer de información sobre la fórmula de la sus ­
tancia para facilitar la realización del ensayo y la interpretación de 
los resultados obtenidos (por ejemplo, sales halógenas, sales ferrosas 
de compuestos orgánicos, compuestos organoclorados).
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La demanda química de oxígeno es la medida de la oxidabilidad de 
una sustancia, definida como la cantidad equivalente en oxígeno de un reactivo oxidante consumida por la sustancia en condiciones de laboratorio determinadas. 
El resultado se expresa en gramos de DQO por gramo de sustancia 
de ensayo.
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
No es preciso emplear sustancias de referencia cada vez que se 
analiza una nueva sustancia. Dichas sustancias de referencia sirven, 
principalmente, para calibrar periódicamente el método y permitir la comparación de resultados cuando se apliquen métodos distintos.
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Una cantidad determinada de sustancia, disuelta o dispersa en agua, 
se oxida con dicromato de potasio en presencia de ácido sulfúrico concentrado, con catalizador de sulfato de plata, en caliente y con 
reflujo durante dos horas. El dicromato residual se valora con ayuda 
de sulfato ferroso amónico titulado. 
En el caso de las sustancias con cloro, se debe añadir sulfato mer ­
cúrico (las soluciones que contienen sales de mercurio deben ser tratadas, después de su utilización, pra evitar que pase mercurio al 
medio ambiente) para atenuar la interferencia de los cloruros.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Dada la arbitrariedad del método de determinación de la DQO, ésta 
debe considerarse como un «indicador de oxidabilidad» y se utiliza 
en calidad de tal como método práctico de evaluación de la materia orgánica. 
Los cloruros pueden interferir en este ensayo; las sustancias inorgá ­
nicas reductoras u oxidantes pueden interferir igualmente con la 
determinación de la DQO. 
Algunos compuestos cíclicos y muchas sustancias volátiles (p.ej., 
ácidos grasos de cadena corta) no se oxidan totalmente durante el 
ensayo.
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se prepara una solución o una dispersión preliminar de la sustancia, 
para conseguir una DQO de 250 a 600 mg por litro.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1028
 
Notas:  
Cuando se trata de sustancias poco solubles y que no se dispersan, se 
puede pesar una cantidad de sustancia finamente pulverizada, o en 
estado líquido, correspondiente a unos 5 mg de DQO, e introducirla en el aparato experimental añadiendo agua. 
La demanda química de oxígeno (DQO) se determina a menudo 
mejor, sobre todo en el caso de sustancias poco solubles, con una 
variante del método, es decir, en un sistema cerrado con ecualizador 
de presión (H. Kellcenberg, 1975). Con esta modificación puede conseguirse cuantificar sustancias que se determinan con mucha di ­
ficultad cuando se usa el método convencional (por ejemplo, ácido 
acético). Sin embargo, el método falla igualmente en el caso de la 
piridina. Si se alcanza una concentración de dicromato potásico de 0,25 N (0,0416 M), como se prescribe en la referencia (1), se facilita la adición directa de 5-10 mg de sustancia, lo que resulta esencia] 
para la determinación de la DQO de las sustancias poco hidrosolu ­
bles [referencia (2)]. 
Por lo demás, la DQO se determina a continuación aplicando cual ­
quier método nacional o internacional normalizado que sea adecuado.
 
2. RESULTADOS Y EVALUACIÓN  
Se calcula la DQO contenida en el frasco experimental según el 
método normalizado elegido y se expresa en gramos de DQO por 
gramo de sustancia de ensayo.  
3. INFORME  
Debe indicarse el método utilizado. 
La demanda química de oxigeno debe ser la media de al menos tres 
mediciones. Se incluirán iodos los datos y observaciones que puedan facilitai la interpretación de los resultados, especialmente los referen ­
tes a impurezas estado físico y propiedades especificas de la sustan ­
cia (si se conocen) que puedan afectar a los resultados. 
Debe mencionarse si se na usado sulfato mercurico para reducir la 
interferencia de los cloturos.
 
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasssrforschung, 1975, 
vol. 8, 146. 
(2) Gerike, P. The biodegradibility testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169. 
Lista de métodos normalizados, por ejemplo: 
NBN T 91-201 Determination of the Chemical Oxygen De ­
mand 
ISBN 0 11 7512494 Chemical Oxygen Demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters 
NF T 90-101 Determination of the Chemical Demand DS 217 — Water Determination of the Chemical Oxygen 
Demand 
Analysis DIN 38409-H-41 Determination of the Chemical Oxygen De ­
mand (COD) within the range above 15 mg/l 
KEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik 
ISO 6060 Water Quality: Chemical Oxygen Demand Dichro ­
mate Methods
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. DEGRADACIÓN — DEGRADACIÓN ABIÓTICA: HIDRÓLISIS 
EN FUNCIÓN DEL pH  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de 
ensayo de la OCDE TG 111 (2004).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Las sustancias químicas pueden llegar a las aguas superficiales por 
vías como la aplicación directa, los aerosoles erráticos, la escorrentía, el drenaje, la eliminación de residuos, los efluentes industriales, domésticos o agrícolas y la deposición atmosférica, y pueden trans ­
formarse en dichas aguas mediante procesos químicos (por ejemplo, 
hidrólisis, oxidación), fotoquímicos y microbianos. Las presentes directrices describen un método de ensayo de laboratorio para eva ­
luar la transformación hidrolítica abiótica de sustancias químicas en 
sistemas acuáticos a valores de pH que se encuentran normalmente 
en el medio ambiente (pH de 4 a 9) y se basa en otras directrices anteriores [(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)]. 
Con los experimentos se pretende determinar: i) la velocidad de 
hidrólisis de la sustancia problema en función del pH, y ii) la iden ­
tidad o naturaleza y las velocidades de formación y destrucción de los productos de hidrólisis a los que pueden estar expuestos los organismos. Tales estudios pueden ser necesarios en relación con 
sustancias que se aplican directamente al agua o que pueden llegar 
al medio ambiente por las otras vías antes citadas.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
Véase el anexo 2.  
1.3. APLICABILIDAD DEL MÉTODO 
El método es aplicable en general a todas las sustancias químicas 
(tanto marcadas como sin marcar) para las que se disponga de un método analítico de suficiente exactitud y sensibilidad. Es aplicable a compuestos ligeramente volátiles y no volátiles que tengan la sufi ­
ciente hidrosolubilidad. El ensayo no debe aplicarse a sustancias 
químicas que sean muy volátiles a partir del agua (por ejemplo, fumigantes o disolventes orgánicos) y, por tanto, no se puedan man ­
tener en solución en las condiciones experimentales del ensayo. 
Puede ser difícil efectuar el ensayo con sustancias muy poco hidro ­
solubles (8).
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se tratan con la sustancia problema soluciones acuosas estériles 
amortiguadoras con diferentes valores de pH (pH de 4, 7 y 9), y se incuban en la oscuridad en condiciones de laboratorio controladas 
(a temperaturas constantes). A intervalos determinados, se analiza el 
contenido de sustancia problema y de productos de su hidrólisis en las soluciones amortiguadoras. Si se utiliza una sustancia problema marcada (por ejemplo,
 14 C) es más fácil calcular el balance de masa. 
Este método de ensayo está diseñado según un enfoque secuencial 
que se muestra y explica en el anexo 1. A cada etapa de la secuencia 
se pasa en función de los resultados de la etapa anterior.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA DE ENSAYO 
Para medir la velocidad de hidrólisis puede utilizarse una sustancia 
problema marcada o sin marcar. Generalmente se prefiere utilizar material marcado para estudiar la ruta de la hidrólisis y para esta ­
blecer el balance de masa; sin embargo, el marcado puede no ser 
absolutamente necesario en casos especiales. Se recomienda el mar ­
cado con
 14 C, pero también puede resultar de utilidad el uso de otros 
isótopos, tales como  13 C, 15 N o  3 H. En la medida de lo posible, el 
marcador debe ubicarse en la parte o partes más estables de la 
molécula. Por ejemplo, si la sustancia problema contiene un solo anillo, es preciso marcar ese anillo; si contiene dos o más anillos, 
puede resultar necesario efectuar estudios separados para evaluar el 
destino de cada anillo marcado y obtener información adecuada sobre la formación de los productos de hidrólisis. La pureza de la sustancia problema debe ser de al menos del 95 %. 
Antes de llevar a cabo un ensayo de hidrólisis, debe disponerse de la 
información siguiente sobre la sustancia problema: 
a) hidrosolubilidad (método de ensayo A.6); 
b) solubilidad en disolventes orgánicos; 
c) presión de vapor (método de ensayo A.4) o constante de la ley de 
Henry; 
d) coeficiente de reparto n-octanol/agua (método de ensayo A.8); 
e) constante de disociación (pK
 a ) (directrices OCDE 112) (9); 
f) velocidad de fototransformación directa e indirecta en agua, en su 
caso. 
Debe disponerse de métodos analíticos de cuantificación de la sus ­
tancia problema y, cuando sea pertinente, de identificación y cuan ­
tificación de los productos de su hidrólisis en soluciones acuosas 
(véase también el punto 1.7.2).  
1.6. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
A ser posible, deben utilizarse sustancias de referencia para la iden ­
tificación y cuantificación de los productos de la hidrólisis mediante 
métodos espectroscópicos y cromatográficos, u otros métodos con la 
sensibilidad adecuada.  
1.7. CRITERIOS DE CALIDAD  
1.7.1.  Recuperación  
Mediante el análisis de soluciones amortiguadoras, cuando menos 
con dos réplicas en paralelo, o de sus extractos inmediatamente 
después de la adición de la sustancia problema se obtiene una pri ­
mera indicación de la repetibilidad del método analítico y de la uniformidad del procedimiento de aplicación de la sustancia proble ­
ma. Los valores de recuperación correspondientes a etapas posterio ­
res de los experimentos los dan los balances de masa respectivos 
(cuando se utiliza material marcado). Las tasas de recuperación tie ­
nen que oscilar entre el 90 % y el 110 % de las sustancias tanto marcadas como sin marcar (7). En caso de que sea técnicamente 
difícil llegar a esta banda, puede aceptarse una recuperación del 
70 % de sustancias sin marcar, pero debe justificarse la situación.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Repetibilidad y sensibilidad del método analítico  
La repetibilidad del método o métodos analíticos utilizados para 
cuantificar la sustancia problema y los productos de hidrólisis pos ­
teriormente puede comprobarse mediante análisis de réplicas en pa ­
ralelo de las mismas soluciones amortiguadoras (o de sus extractos) 
después de que se hayan formado cantidades de productos de hidró ­
lisis suficientes para su cuantificación. 
El método analítico debe tener la sensibilidad suficiente para cuan ­
tificar concentraciones de sustancia problema iguales o inferiores al 
10 % de la concentración inicial. En su caso, los métodos analíticos 
deben tener también la suficiente sensibilidad para cuantificar cual ­
quier producto de hidrólisis que represente el 10 % o más de la cantidad aplicada (en cualquier momento a lo largo del estudio) hasta 
el 25 % o menos de su concentración máxima.
 
1.7.3.  Intervalos de confianza de los datos cinéticos de la hidrólisis  
Deben calcularse y presentarse los intervalos de confianza de todos 
los coeficientes de regresión, constantes de velocidad, semividas y 
cualesquiera otros parámetros cinéticos (por ejemplo, TD50).  
1.8. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.8.1.  Equipo y material  
El estudio debe realizarse en recipientes de vidrio (por ejemplo, 
tubos de ensayo, frascos pequeños) en condiciones estériles y de oscuridad, en caso necesario, salvo que se disponga de información 
previa (como el coeficiente de reparto n-octanol/agua) que indique la 
posibilidad de adherencia de la sustancia problema al vidrio. En tal situación, puede ser necesario considerar la utilización de otros ma ­
teriales (como el teflón). También puede caber la posibilidad de 
solucionar el problema de la adherencia al vidrio con uno o más de los métodos siguientes: 
— determinación de la masa de la sustancia problema y productos 
de hidrólisis que adsorbe el recipiente de ensayo, 
— empleo de un baño de ultrasonidos, — lavado con disolventes de todo el material de vidrio en cada 
intervalo de muestreo, 
— utilización de productos formulados, — uso de una cantidad mayor de cosolvente para añadir la sustancia 
problema al sistema; si se utiliza un cosolvente, éste no debe 
hidrolizar la sustancia problema. 
Normalmente es necesario utilizar agitadores de baños de agua con 
temperatura controlada o incubadores termostáticos para la incuba ­
ción de las diversas soluciones problema. 
Se precisa el equipo normal de laboratorio y, en particular, el si ­
guiente: 
— pHmetro;
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— instrumentos analíticos tales como equipos de cromatografía (de 
gases, de líquidos de alta resolución o de capa fina), incluidos los 
sistemas de detección adecuados para el análisis de sustancias radiomarcadas y sin marcar o un método inverso de dilución isotópica, 
— instrumentos de identificación (por ejemplo, espectrometría de 
masas, cromatografía de gases con espectrometría de masas, cro ­
matografía de líquidos de alta resolución con espectrometría de 
masas, resonancia magnética nuclear, etc.), 
— contador de centelleo de líquidos, — ampollas de decantación para la extracción líquido-líquido; 
— instrumental para concentrar soluciones y extractos (por ejemplo, 
evaporador rotatorio); 
— equipo de control de la temperatura (por ejemplo, baño de agua). 
Entre los reactivos químicos figuran, por ejemplo: 
— disolventes orgánicos, con grado analítico de pureza, tales como 
hexano, diclorometano, etc., 
— líquido de centelleo, — soluciones amortiguadoras (véase el punto 1.8.3). Debe esterilizarse todo el material de vidrio, así como el agua de 
grado reactivo y las soluciones amortiguadoras que se utilicen en los 
ensayos de hidrólisis.
 
1.8.2.  Aplicación de la sustancia problema  
La sustancia problema debe añadirse como solución acuosa a las 
diferentes soluciones amortiguadoras (véase el anexo 3). Cuando 
sea necesario para conseguir una disolución adecuada, se permite 
utilizar pequeñas cantidades de disolventes miscibles con el agua (como acetonitrilo, acetona o etanol) para la aplicación y distribución 
de la sustancia problema, pero sin sobrepasar en principio el 1 % 
v/v. Cuando se desee recurrir a una concentración superior de disol ­
ventes (por ejemplo, en caso de sustancias problema poco solubles), esta podría autorizarse solo si se demuestra que el disolvente no 
afecta a la hidrólisis de la sustancia problema. 
No se recomienda en principio el uso de productos formulados, ya 
que no puede excluirse que los componentes de la formulación 
influyan sobre el proceso de hidrólisis. Sin embargo, cuando se trate de sustancias problema poco hidrosolubles o que se adhieran al vidrio (véase el punto 1.8.1), puede ser una alternativa adecuada el 
empleo de material formulado. 
Debe utilizarse una sola concentración de la sustancia problema, sin 
pasar de 0,01 M o de la mitad de la concentración de saturación 
(véase el anexo 1).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Soluciones amortiguadoras  
El ensayo de hidrólisis debe efectuarse a pH de 4, 7 y 9. Para 
conseguirlo, deben prepararse soluciones amortiguadoras utilizando agua y sustancias de grado reactivo. En el anexo 3 se presentan 
varios sistemas amortiguadores útiles. Debe observarse que el sis ­
tema amortiguador utilizado puede afectar a la velocidad de la hi ­
drólisis; en caso de que sea así, debe emplearse otro sistema amortiguador (
 1 ). 
Debe comprobarse el pH de cada solución amortiguadora con un 
pHmetro calibrado que tenga una precisión mínima de 0,1 a la temperatura necesaria.
 
1.8.4.  Condiciones del ensayo  
1.8.4.1.  Temperatura del ensayo  
Los experimentos de hidrólisis deben efectuarse a temperatura cons ­
tante. A efectos de extrapolación, es importante que la variación máxima de la temperatura sea de ± 0,5
 o C. 
Debe realizarse un ensayo preliminar (etapa 1) a la temperatura de 
50 o C si no se conoce el comportamiento hidrolítico de la sustancia 
problema. Deben efectuarse ensayos cinéticos de etapas superiores con un mínimo de tres temperaturas (incluido el ensayo a 50
 o C), 
salvo que la sustancia problema sea estable frente a la hidrólisis 
según el ensayo de la etapa 1. Se sugiere la banda de temperaturas 
de 10-70  o C (de preferencia con al menos una temperatura por 
debajo de 25  o C), que incluye la temperatura de 25  o C consignada 
en el informe y la mayoría de las temperaturas observadas sobre el 
terreno.  
1.8.4.2.  Luz y oxígeno  
Todos los ensayos de hidrólisis deben realizarse siguiendo un mé ­
todo adecuado para evitar efectos fotolíticos. Deben tomarse todas las medidas necesarias para evitar la presencia de oxígeno (por 
ejemplo, burbujeando helio, nitrógeno o argón durante 5 minutos 
antes de la preparación de la solución).
 
1.8.4.3.  Duración del ensayo  
El ensayo preliminar debe efectuarse durante cinco días, mientras 
que los ensayos de etapas más avanzadas deben mantenerse hasta 
conseguir la hidrólisis del 90 % de la sustancia problema, o bien 
durante 30 días si este plazo es más breve.  
1.8.5.  Realización del ensayo  
1.8.5.1.  Ensayo preliminar (etapa 1)  
El ensayo preliminar se efectúa a 50 ±0,5  o C y a un pH de 4,0, 7,0 y 
9,0. Si al cabo de cinco días se observa menos del 10 % de hidrólisis 
(t 0,525 o C > 1 año), se considera que la sustancia problema es 
hidrolíticamente estable y, en principio, no es necesario hacer más ensayos. Si se sabe que la sustancia es inestable a temperaturas 
pertinentes para el medio ambiente (
 2 ), no es necesario efectuar el 
ensayo preliminar. El método analítico debe tener la precisión y sensibilidad suficientes para detectar una reducción del 10 % de la concentración inicial.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey y Mill recomiendan los amortiguadores de borato o acetato en lugar de los de 
fosfato (11). 
( 2 ) Esta información puede proceder de fuentes distintas, como datos bibliográficos de la 
hidrólisis de compuestos similares estructuralmente o mediante otros ensayos prelimina ­
res semicuantitativos de hidrólisis de la sustancia problema en una fase anterior del 
desarrollo.
 1.8.5.2.  Hidrólisis de sustancias inestables (etapa 2)  
El ensayo en etapas superiores debe realizarse a los valores de pH a 
los que se haya visto que la sustancia problema es inestable según el ensayo preliminar antes citado. Las soluciones amortiguadoras de la 
sustancia problema deben mantenerse constantemente a las tempera ­
turas seleccionadas. Para hacer un ensayo respecto a una cinética de primer orden, cada solución de reacción debe analizarse a intervalos que proporcionen datos de un mínimo de seis puntos espaciados, 
normalmente entre el 10 % y el 90 % de hidrólisis de la sustancia 
problema. Deben tomarse muestras distintas en paralelo (un mínimo de dos réplicas procedentes de recipientes de reacción diferentes) 
para analizar su contenido en, como mínimo, 6 momentos de mues ­
treo (para tener un mínimo de 12 puntos de datos en paralelo). Se considera inadecuado utilizar una sola solución a granel de la que se van tomando alícuotas individuales de la solución problema tras cada 
intervalo de muestreo, ya que esto no permite el análisis de la 
variabilidad de los datos y puede provocar problemas de contamina ­
ción de la solución problema. Deben realizarse pruebas de confirma ­
ción de la esterilidad al final del ensayo en etapas superiores (es 
decir, con el 90 % de hidrólisis o a los 30 días). Sin embargo, si no 
se observa ninguna degradación (es decir, transformación) no es necesario realizar pruebas de esterilidad.
 
1.8.5.3.  Identificación de los productos de la hidrólisis (etapa 3)  
Con métodos analíticos adecuados, deben identificarse todos los 
productos importantes de la hidrólisis, al menos los que representen una proporción > 10 % de la dosis aplicada.
 
1.8.5.4.  Ensayos facultativos  
Puede ser necesario efectuar ensayos complementarios con valores 
de pH distintos de 4, 7 y 9 en relación con sustancias problema 
hidrolíticamente inestables. Así, puede ser necesario por motivos 
fisiológicos efectuar un ensayo en condiciones más ácidas (por ejem ­
plo, a un pH de 1,2) utilizando una única temperatura pertinente a efectos fisiológicos (37
 o C). 
2. DATOS  
Las cantidades de sustancia problema y de productos de su hidrólisis, 
en su caso, deben indicarse como porcentaje de la concentración 
inicial aplicada y, cuando corresponda, en mg/l respecto a cada 
intervalo de muestreo y cada pH y temperatura de ensayo. Además, debe darse un balance de masa en porcentaje de la concentración inicial aplicada cuando se haya utilizado una sustancia problema 
marcada. 
Debe proporcionarse una representación gráfica del logaritmo de la 
concentración de la sustancia problema frente al tiempo. Deben 
identificarse todos los productos importantes de la hidrólisis, al me ­
nos los que constituyan una proporción > 10 % de la dosis aplicada, y sus concentraciones logarítmicas deben representarse de la misma 
manera que la sustancia original para mostrar sus velocidades de 
formación y destrucción.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Utilizando cálculos según modelos cinéticos adecuados, deben obte ­
nerse determinaciones más exactas de las semividas o valores de TD
 50 . Se consignarán los valores de semivida y TD  50 (incluidos 
los límites de confianza) respecto a cada pH y temperatura, junto 
con la descripción del modelo utilizado, el orden de la cinética y el coeficiente de determinación (r
 2 ). Si procede, se aplicarán los cálcu ­
los asimismo a los productos de la hidrólisis. 
Si se trata de estudios de velocidad efectuados a varias temperaturas, 
las constantes de velocidad de hidrólisis de pseudo-primer orden 
(k obs ) deberán describirse en función de la temperatura. Los cálculos 
se basarán tanto en la separación de k  obs en constantes de velocidad 
en relación con la hidrólisis catalizada por ácidos, la neutra y la 
catalizada por bases (kH, kneutral y k  OH respectivamente) como en 
la ecuación de Arrhenius:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
donde A  i y B  i son constantes de regresión de la ordenada en el 
origen y de la pendiente, respectivamente, de las rectas mejor ajus ­
tadas obtenidas por regresión lineal de ln k  i frente a la inversa de la 
temperatura absoluta en grados Kelvin (T). Mediante el uso de las 
relaciones de Arrhenius respecto a la hidrólisis catalizada por ácidos, la neutra y la catalizada por bases, es posible calcular constantes de velocidad de pseudo-primer orden y, por tanto, semividas, relativas a 
otras temperaturas a las que sea difícil efectuar directamente la de ­
terminación experimental de una constante de velocidad (10).
 
2.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
La mayoría de las reacciones de hidrólisis muestran una velocidad de 
reacción de primer orden aparente y, por lo tanto, las semividas son independientes de la concentración (véase la ecuación 4 del 
anexo 2). Esto permite normalmente aplicar a condiciones ambien ­
tales (concentraciones < 10
 -6 M) los resultados de laboratorio deter ­
minados a concentraciones de 10  -2 a 10  -3 M (10). Mabey y Mill (11) 
han presentado varios ejemplos de concordancia entre velocidades de 
hidrólisis medidas en agua tanto pura como natural respecto a diver ­
sas sustancias, con la condición de que se hubieran medido tanto el pH como la temperatura.
 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe dar, como mínimo, la información si ­
guiente: 
Sustancia de ensayo: — nombre común, nombre químico, número CAS, fórmula estruc ­
tural (indicando la posición del marcador si se usa material mar ­
cado radiactivamente) y propiedades fisicoquímicas de interés 
(véase el punto 1.5), 
— pureza (impurezas) de la sustancia problema, — pureza radioquímica de la sustancia marcada y actividad molar 
(si procede).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Soluciones amortiguadoras: 
— fechas y datos de su preparación, — amortiguadores y aguas utilizados, 
— molaridad y pH de las soluciones amortiguadoras. 
Condiciones de ensayo: 
— fechas de realización de los estudios, 
— cantidad de la sustancia problema aplicada, — métodos y disolventes (tipo y cantidad) utilizados para la aplica ­
ción de la sustancia problema, 
— volumen incubado de las soluciones amortiguadoras con la sus ­
tancia problema, 
— descripción del sistema de incubación utilizado, 
— pH y temperatura durante el estudio, — tiempos de muestreo, 
— métodos de extracción, 
— métodos de identificación y cuantificación de la sustancia pro ­
blema y de los productos de su hidrólisis en las soluciones amortiguadoras, 
— número de réplicas en paralelo. Resultados: 
— repetibilidad y sensibilidad de los métodos analíticos utilizados, 
— tasas de recuperación (en el punto 1.7.1 se dan los porcentajes 
necesarios para la validez del estudio), 
— datos de las réplicas en paralelo y medias en forma tabular, — balance de masa durante los estudios y al final de estos (si se 
utilizan sustancias problema marcadas), 
— resultados del ensayo preliminar, 
— evaluación e interpretación de los resultados, — todos los datos y figuras originales. 
La siguiente información es necesaria solo en caso de que se deter ­
mine la velocidad de hidrólisis: 
— representación gráfica de la concentración frente al tiempo co ­
rrespondiente a las sustancias problema y, en su caso, a los 
productos de la hidrólisis a cada valor de pH y temperatura, 
— cuadros de resultados de la ecuación de Arrhenius para la tem ­
peratura de 20 - 25
 o C, con los valores de pH, constante de 
velocidad [h  -1 o día  -1 ], semivida o TD  50 , temperaturas [  o C], 
incluidos los límites de confianza y coeficientes de correlación (r
 2 ) u otra información comparable, 
— ruta propuesta de hidrólisis.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. REFERENCIAS  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Gui ­
deline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981. 
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25
 o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate. 
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
(4) Unión Europea (UE) (1995). Directiva 95/36/CE de la Comi ­
sión, por la que se modifica la Directiva 91/414/CEE del Con ­
sejo relativa a la comercialización de productos fitosanitarios. 
anexo V: Destino y comportamiento en el medio ambiente. 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (Octo ­
ber 1980). 
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. 
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and Asses ­
sment Nr.23. 
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals. 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, Novem ­
ber 1993). 
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental condi ­
tions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
Anexo 1  
Esquema del ensayo de hidrólisis en etapas
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
Anexo 2  
Definiciones y unidades  
Siempre deben utilizarse  unidades del Sistema Internacional . 
Sustancia problema:  cualquier sustancia, sea el compuesto original o los co ­
rrespondientes productos de transformación.  
Productos de transformación:  todas las sustancias procedentes de reacciones de 
transformación biótica o abiótica de la sustancia problema.  
Productos de hidrólisis:  todas las sustancias procedentes de reacciones de trans ­
formación hidrolítica de la sustancia problema.  
Hidrólisis:  reacción de una sustancia problema RX con el agua, con la sustitu ­
ción final del grupo X por el OH en el centro de reacción: 
RX + HOH → ROH + HX [1] 
La velocidad a la que disminuye la concentración de RX en este proceso sim ­
plificado viene dada por: 
velocidad = k [H  2 O] [RX] reacción de segundo orden 
o 
velocidad = k [RX] reacción de primer orden 
según la fase determinante de la velocidad. Como hay un gran exceso de agua 
respecto a la sustancia problema, este tipo de reacción se suele describir como 
reacción de pseudo-primer orden, y la constante de velocidad observada viene 
dada por la fórmula siguiente: 
k obs = k [H  2 O] [2] 
and can be determined from the expression (*) 
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
donde 
t = tiempo 
y C  o , C t = concentraciones de RX a los tiempos 0 y t. 
Las unidades de esta constante tienen las dimensiones de (tiempo)  -1 y la semivida 
de la reacción (tiempo para que reaccione el 50 % de RX) viene dada por: 
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Semivida:  (t 0,5 ) tiempo necesario para la hidrólisis del 50 % de una sustancia 
problema cuando puede describirse la reacción mediante una cinética de primer orden; es independiente de la concentración.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Si la representación gráfica del logaritmo de los datos frente al tiempo no indica una 
función lineal (identificada con una velocidad de reacción de primer orden), no es 
apropiado utilizar la ecuación [3] para determinar la constante de la velocidad de hi ­
drólisis de la sustancia problema.
 TD 50 (tiempo de desaparición 50):  tiempo necesario para que la concentración 
de la sustancia problema se reduzca en un 50 %; es diferente de la semivida (t  0,5 ) 
si la reacción no sigue una cinética de primer orden.  
Estimación de k a temperatura diferente  
Si se conocen las constantes de velocidad correspondientes a dos temperaturas, 
pueden calcularse las constantes de velocidad a otras temperaturas utilizando la ecuación de Arrhenius:
 
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T o ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
La representación gráfica de ln k frente a l/T es una línea recta con una pendiente 
de -E/R 
donde: k = constante de velocidad, medida a temperaturas diferentes E = energía de activación [kJ/mol] T = temperatura absoluta [K] R = R = constante de los gases [8,314 J/mol.K]. La energía de activación se calcula por análisis de regresión o con la siguiente 
ecuación:
 
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
donde: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
Anexo 3  
Sistemas amortiguadores  
A. CLARK Y LUBS:  
Mezclas amortiguadoras de CLARK y LUBS  (*) 
Composición pH  
HCl 0,2 N y KCl 0,2 N a 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl diluido hasta 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl diluido hasta 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl diluido hasta 100 ml 1,4 13,15 ml HCl + 25 ml KCl diluido hasta 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl diluido hasta 100 ml 1,8 5,3 ml HCl + 25 ml KCl diluido hasta 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl diluido hasta 100 ml 2,2  
Biftalato potásico 0,1 M + HCl 0,1 N a 20
 o C 
46,70 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 2,2 39,60 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 2,4 
32,95 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 2,6 
26,42 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 2,8 20,32 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 3,0 14,70 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 3,2 
9,90 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 3,4 5,97 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 3,6 2,63 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 3,8  
Biftalato potásico 0,1 M + NaOH 0,1 N a 20
 o C 
0,40 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 4,0 3,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 4,2 
7,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 4,4 
12,15 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 4,6 17,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Los valores de pH indicados en estos cuadros se han calculado a partir de mediciones del potencial utilizando 
las ecuaciones tipo de Sörensen (1909). Los valores correspondientes de pH son 0,04 unidades superiores a 
los valores de los cuadros.
 Composición pH  
23,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 5,0 
29,95 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 5,2 35,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 5,4 39,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 5,6 43,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 5,8 45,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalato hasta 100 ml 6,0
 
Mezclas amortiguadoras de CLARK y LUBS (continuación) 
Fosfato monopotásico 0,1 M + NaOH 0,1 N a 20  o C 
5,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 6,0 8,60 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 6,2 
12,60 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 6,4 17,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 6,6 23,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 6,8 29,63 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 7,0 35,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 7,2 
39,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 7,4 
42,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 7,6 45,20 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 7,8 46,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfato hasta 100 ml 8,0  
H
 3 BO  3 0,1 M en KCl 0,1 M + NaOH 0,1 N a 20  o C 
2,61 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 7,8 3,97 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 8,0 5,90 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 8,2 
8,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 8,4 
12,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 8,6 16,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 8,8 21,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 9,0 26,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 9,4 
36,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 9,6 
40,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 9,8 
43,90 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico hasta 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF Y VLEESCHHOUWER:  
Amortiguadores de citrato de KOLTHOFF y VLEESCHHOUWER  (*) 
Composición pH  
Citrato monopotásico 0,1 M y HCl 0,1 N a 18  o C (*) 
49,7 ml. HCl 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 2,2 
43,4 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 2,4 
36,8 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 2,6 30,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 2,8 
23,6 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 3,0 
17,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 3,2 
10,7 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 3,4 
4,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 3,6  
Citrato monopotásico 0,1 M y NaOH 0,1 N a 18
 o C (*) 
2,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 3,8 
9,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 4,0 
16,3 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 4,2 
23,7 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 4,4 31,5 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 4,6 
39,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 4,8 
46,7 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 5,0 
54,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 5,2 
61,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 5,4 68,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 5,6 
74,4 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 5,8 
81,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrato hasta 100 ml 6,0
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Se añaden pequeños cristales de timol u otra sustancia similar para evitar el crecimiento 
de mohos.
 C. SÖRENSEN:  
Mezclas de borato de SÖRENSEN  
Composición Sörensen 
18 o C Walbum, pH a 
ml de bórax ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
Bórax 0,05 M + HCl 0,1 N  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
Bórax 0,05 M + NaOH 0,1 N  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Mezclas de fosfato de SÖRENSEN  
Composición pH  
Fosfato monopotásico 0,0667 M + fosfato disódico 0,0667 M a 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8 TOXICIDAD PARA GUSANOS DE TIERRA-ENSAYO  
CON SUELO ARTIFICIAL  
1. MÉTODO.  
1.1. INTRODUCCIÓN 
En este ensayo de laboratorio, la sustancia con la que se va a expe ­
rimentar se añade a un suelo artificial en el que se colocan gusanos durante 14 días, Después de este período (que, opcionalmente, puede ser de 7 días) se examina el efecto letal de la sustancia sobre los 
gusanos. Este ensayo provee un método que permite investigar, a 
relativamente corto plazo, los efectos causados por sustancias quími ­
cas sobre los gusanos, por absorción oral o cutánea.
 
1.2. DEFINICIÓN Y UNIDADES 
CL 50 : Concentración de una sustancia que se considera la causante 
de la muerte del 50 % de los animales investigados durante el 
período de ensayo.  
1.3. SUSTANCIA DE REFERENCIA 
Se utiliza periódicamente una sustancia de referencia como medio 
para demostrar que la sensibilidad del sistema de ensayo no ha 
cambiado de manera significativa. 
Se recomienda que esta sustancia sea la cloroacetamida de grado 
analítico.  
1.4. PRINCIPIO DEL ENSAYO 
Por ser el suelo un medio variable, para este ensayo se utiliza marga 
artificial definida cuidadosamente. Los gusanos adultos de la especie  
Eisenia foetida  (véase la nota del anexo) se mantienen en una tierra 
artificial que se trata con diferentes concentraciones de la sustancia 
de ensayo. El contenido de los recipientes se extiende sobre una bandeja a los 14 días (opcionalmente, pueden ser 7) del comienzo del ensayo y se cuenten los gusanos supervivientes para cada con ­
centración.
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
El ensayo se proyecta de forma que sea lo más reproducible posible 
con respecto al sustrato y al organismo de ensayo. La mortalidad en 
los controles no debe exceder del 10 % al final del ensayo, o de lo contrario este no es válido.
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.6.1.  Materiales  
1.6.1.1. S u s t r a t o d e e n s a y o 
Como sustrato básico de ensayo usa un suelo artificial definido. 
a) Sustrato básico (los porcentajes se expresan en términos de peso 
en seco: 
— 10 % de turba esfágnea (con un pH lo más cercano posible a 
5,5-6,0, sin restos visibles de plantas y finamente molida),  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % de arcilla de caolinita, preferiblemente con más de un 
50 % de caolinita 
— alrededor del 69 % de arena de cuarzo industrial (predomi ­
nando la arena fina, en la que más del 50 % de sus partículas sean de un tamaño de 0,05 a 0,2 mm). Si la sustancia no es lo suficientemente dispersable en agua, se deberán mantener dis ­
ponibles 10 g por cada recipiente de ensayo para mezclarlos 
con la sustancia de ensayo más adelante, 
— alrededor de un 1 % de carbonato calcico (CO
 2 Ca), pulveri ­
zado y químicamente puro, que se añade con el fin de que el valor del pH sea de 6,0 ± 0,5. 
b) Sustrato de ensayo: 
El sustrato de ensayo contiene el sustrato básico, la sustancia de 
ensayo y agua desionizada. 
El contenido de agua oscila entre el 25 y el 42 % del peso en 
seco del sustrato básico. El contenido de agua de un sustrato se determina secando una muestra a una temperatura de 105
 o C, 
hasta alcanzar un peso constante. El criterio clave consiste en 
humedecer la tierra artificial hasta un punto en que no quede 
agua estancada. Se debe tener cuidado al hacer la mezcla, de manera que se obtenga una distribución uniforme de la sustancia de ensayo y del sustrato. Deberá registrarse la manera en que se 
introduce la sustancia de ensayo en el sustrato. 
c) Sustrato de control: 
El sustrato de control contiene el sustrato básico y agua. Si se usa 
un agente aditivo, el sustrato de control adicional debe contener la misma cantidad de agente aditivo.
 
1.6.1.2. R e c i p i e n t e s d e e n s a y o 
Se utilizan recipientes de cristal (cubiertos adecuadamente con mem ­
branas, tapaderas o película de plástico con agujeros de ventilación) aproximadamente de un litro de capacidad y llenos de una cantidad 
de sustrato de ensayo húmedo o de control que sea equivalente a un 
peso en seco de 500 g de sustrato.
 
1.6.2.  Condiciones del ensayo  
Los recipientes se deberán mantener en cámaras climatizadas, a una 
temperatura de 20 (± 2)  o C, con luz continua. La intensidad de la luz 
será de 400 a 800 lux. 
El período de ensayo dura 14 días, aunque, opcíonalmente, se puede 
evaluar la mortalidad a los 7 días del comienzo del ensayo.  
1.6.3.  Procedimiento de ensayo  
C o n c e n t r a c i o n e s d e l e n s a y o 
Las concentraciones de la sustancia de ensayo se expresan en peso 
de sustancia por peso en seco de sustrato básico (mg/kg).  
E n s a y o p a r a d e t e r m i n a r l a g a m a d e c o n c e n t r a ­
c i o n e s 
Por medio de este ensayo se determina la gama de concentraciones 
que ocasiona porcentajes de mortalidad de 0 a 100; con esta infor ­
mación se establece la gama de concentraciones que se vaya a uti ­
lizar en el ensayo definitivo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
La sustancia se estudiará a las siguientes concentraciones: 1 000, 
100, 10, 1, 0,1 mg de sustancia/kg de sustrato de ensayo (peso en 
seco). 
Cuando vaya a realizarse un ensayo definitivo, bastará con un lote de 
ensayo para cada concentración y otro para el sustrato de control sin 
tratar, cada uno de ellos con diez gusanos, para llevar a cabo el ensayo de determinación de la gama de concentraciones.
 
E n s a y o d e f i n i t i v o 
Los resultados del ensayo para determinar la gama de concentracio ­
nes se usan para elegir cinco concentraciones como mínimo, en serie 
geométrica, que abarquen la gama de mortalidad del cero al 100 % y 
que difieran entre sí en un factor constante que no exceda de 1,8. 
En los ensayos en que se utilice esta serie de concentraciones se 
estimará el valor de CL  50 y de sus límites de confianza de la manera 
más precisa posible. 
En el ensayo definitivo se utilizan, como mínimo, cuatro lotes de 
ensayo por concentración y cuatro sustratos de control sin tratar, cada uno de ellos con diez gusanos. Los resultados de estos lotes reproducidos son la media y la desviación típica. 
Cuando de dos concentraciones consecutivas, en una proporción de 
1,8, solo se obtienen los porcentajes de mortalidad de 0 % y 100 %, 
estos dos valores son suficientes para indicar la gama en la que se 
encuentra el valor de CL
 50 . 
M e z c l a d e l s u s t r a t o d e e n s a y o b á s i c o y d e l a s u s ­
t a n c i a d e e n s a y o 
Siempre que sea posible, el sustrato de ensayo no deberá estar com ­
puesto de ningún otro agente adicional que no sea agua. Inmediata ­
mente antes del comienzo del ensayo, se mezcla una emulsión o 
dispersión de la sustancia de ensayo en agua desionizada disolvente con el sustrato de ensayo básico, o se rocía dicha emulsión sobre éste de manera uniforme con un rociador cromatográfico fino o con 
un aparato similar. 
Si la sustancia de ensayo no es soluble en agua, puede disolverse en 
el mínimo volumen posible de un disolvente orgánico apropiado (por 
ejemplo, hexano, acetona o cloroformo). 
Para solubilizar, dispersar o emulsionar la sustancia de ensayo solo 
pueden utilizarse los agentes que se volatilizan rápidamente. El sus ­
trato de ensayo debe ser ventilado antes de usarlo. Se repondrá la cantidad de agua evaporada. El sustrato de control deberá contener la misma cantidad de agente aditivo. 
Si la sustancia de ensayo no fuese soluble, dispersable o emulsiona ­
ble en disolventes orgánicos, se mezclarán 10 g de una mezcla de 
arena de cuarzo finamente molido y la cantidad necesaria de sustan ­
cia de ensayo para tratar 500 g (peso en seco) de suelo artificial, con 490 g (peso en seco) de sustrato de ensayo. 
Por cada lote de ensayo, se coloca en cada recipiente de cristal una 
cantidad de sustrato de ensayo húmedo equivalente a 500 g de peso en seco, y en la superficie del mismo se colocan diez gusanos, que han sido acondicionados durante 24 horas en un sustrato básico 
húmedo similar y a los que, después de lavarlos rápidamente, se 
les ha extraído el exceso de agua con papel de filtro antes de usarlos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Los recipientes se cubren con tapas de plástico perforado, platos o 
película para evitar el secado del sustrato, y se guardan bajo las 
condiciones de ensayo durante 14 días. 
Se evaluarán los resultados después de 14 días (u opcionalmente, 
después de 7 días) del comienzo del ensayo. El sustrato se extiende en una placa de vidrio o de acero inoxidable. Se examinan los gusanos y se determina el número de supervivientes. Los gusanos 
te consideran muertos si no responden a un suave estímulo mecánico 
en la parte frontal de su cuerpo. 
Cuando el examen se efectúa a los 7 días, el recipiente se vuelve a 
llenar con el sustrato y los gusanos supervivientes se colocan otra vez en la superficie del mismo.
 
1.6.4.  Organismos de ensayo  
Los organismos de ensayo deberán ser adultos de la especie  Eisenia 
foetida  (véase la nota en el anexo) (como mínimo con dos meses de 
edad y con clitelo) y de un peso húmedo de 300 a 600 mg (véase el anexo para el método de reproducción).
 
2. DATOS  
2.1. TRATAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Las concentraciones de la sustancia ensayada se registran con refe ­
rencia a los porcentajes correspondientes de gusanos de tierra muer ­
tos. 
Cuando los datos son adecuados, el valor de CL  50 y los límites de 
fiabilidad(p = 0,05) se determinan por medio de métodos estándar (como el de Litchfield y Wilcoxon, 1949, o un método equivalente). El valor de CL
 50 debe ser expresado en mg de sustancia de ensayo 
por kg de sustrato de ensayo (peso en seco). 
En los casos en que la pendiente de la curva de concentración es tan 
pronunciada que no puede calcularse el valor de CL  50 , se considera 
suficiente una estimación gráfica de este valor. 
Cuando de dos concentraciones consecutivas en una proporción de 
1,8 solo se obtienen porcentajes de mortalidad de 0 % y 100 %, 
estos dos valores son suficientes para indicar la gama en la que se 
encuentra el valor de CL  50 . 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— declaración en la que conste que el ensayo se ha efectuado de 
conformidad con los criterios de calidad mencionados anterior ­
mente, 
— tipo de ensayo efectuado (ensayo de determinación de la gama de 
concentraciones y/o ensayo definitivo), 
— descripción exacta de las condiciones del ensayo o declaración en 
la que conste que el ensayo se ha efectuado de conformidad con el método; se informará de cualesquiera diferencias con respecto a dicho método, 
— descripción exacta de la manera en que se ha mezclado la sus ­
tancia de ensayo con el sustrato de ensayo básico, 
— información acerca de los organismos de ensayo (especie, edad, 
peso medio y gama de variación, condiciones relativas a repro ­
ducción y cría, abastecedor),
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— método usado en la determinación del valor de CL  50, 
— resultados del ensayo, incluidos todos los datos utilizados, 
— descripción de los síntomas o de los cambios en el comporta ­
miento de los organismos de ensayo que se hayan observado, 
— mortalidad en los sustratos de control, — valor de CL
 50 o la máxima concentración con mortalidad y la 
mínima con una mortalidad del 100 %, después de 14 días (y opcionalmente después de siete días) del comienzo del ensayo, 
— trazado de la curva de concentración — respuesta, 
— resultados obtenidos con la sustancia de referencia, ya sea en 
relación con el ensayo actual o con ejercicios previos de control de calidad.
 
4. REFERENCIAS  
(1) OCDE, París, 1981,  Directriz para pruebas  207. Decisión del 
Consejo C(81) 30 final. 
(2) Edwards, D. A. and Lofty, J. R., 1977.  Biology of Earthworms.  
London: Chapman and Hall, 331 pp. 
(3) Bouche, M. B. 1972.  Lombriciens de France, Ecologie et Syste ­
matique.  Publ. Institut National de la Recherche Agronomique, 
671 pp. 
(4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., 1949. A simpliefied method 
of evaluating dose-effect experiments.J.  Pharm. Exp. Therap., 
96, 99-113. 
(5) CEE 1983.  Development of a standardized laboratory method 
for assessing the toxictty of chemical substances to earthworms.  
Report EUR 8714 EN. 
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrens vorschlag «Toxizitäts ­
test am Regenwurm Eisern a foetid a in künstlichem Boden», in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Apéndice  
Reproducción y cría de los gusanos con anterioridad at ensayo  
A fines de reproducción, se colocan en una caja de cría con sustrato fresco de 30 
a 50 gusanos adultos, y se sacan después de 14 días. Estos animales se pueden utilizar para lotes de reproducción adicionales. Los gusanos nacidos de los capu ­
llos se utilizan en los ensayos una vez que han alcanzado la madurez (según las 
condiciones prescritas, después de 2 a 4 meses).
 
Condiciones de reproducción y cría  
Cámara climatizada: a una temperatura de 20 (± 2)  o C, preferiblemente con 
luz continua (intensidad de 400 a 800 lux). 
Cajas de reproducción: recipientes poco profundos apropiados, con un volu ­
men de 10 a 20 litros. 
Sustrato:  Eisenia foetida:  Se puede criar en los excrementos de 
varios animales. Como medio de crianza se reco ­
mienda utilizar una mezcla con un 50 % en volumen 
de turba y el otro 50 % de excrementos de vaca o 
caballo. Este medio debe tener un valor aproximado de pH entre 6 y 7 (regulado con carbonato cálcico) y 
una conductividad iónica baja (menos de 6 mmhos o 
una concentración de sal del 0,5 %). 
El sustrato debe estar húmedo, pero no demasiado 
mojado. 
Además del método expuesto anteriormente, se pueden 
utilizar otros procedimientos con éxito.  
Nota:  Existen dos razas de  Eisenia foetida,  que algunos taxonomistas han suh ­
dividido en especies (Bouche, 1972). Estas dos razas son morfológicamente 
similares, aunque una de ellas, la  Eisenia foetida foetida,  exhibe rayas o bandas 
transversales típicas en los segmentos, mientras que a la otra, la  Eisenia foetida 
andrei,  de color rojizo jaspeado, le faltan. Siempre que sea posible se utilizará la  
Eisenia foetida andrei.  Se pueden utilizar otras especies, siempre que se disponga 
de la metodología necesaria.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIODEGRADACIÓN  
PRUEBA ZAHNWELLENS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El objeto de este método es la evaluación de la máxima degradación 
potencial de sustancias orgánicas solubles en agua y no volátiles, cuando se encuentran expuestas a concentraciones relativamente ele ­
vadas de microorganismos en un ensayo estático. 
Puede producirse una absorción físico-química sobre los sólidos en 
suspensión y esto hay que tenerlo en cuenta a la hora de interpretar los resultados (véase el punto 3.2). 
Las sustancias que vayan a estudiarse serán utilizadas en concentra ­
ciones equivalentes a valores de COD entre los 50 y 400 mg/litro o valores de DQO entre los 100 y 1 000 mg/litro(COD = carbón orgánico disuelto; DQO = demanda química de oxígeno). Estas con ­
centraciones relativamente elevadas tienen la ventaja de ser analíti ­
camente fiables. Los compuestos con propiedades tóxicas pueden retardar o inhibir el proceso de degradación. 
En este método, la medida de la concentración de carbón orgánico 
disuelto, o la demanda de oxígeno químico, se utiliza para calcular la biodegradación máxima de la sustancia objeto del ensayo. 
La utilización simultánea de un método analítico específico puede 
permitir calcular la biodegradación primaria de la sustancia (desapa ­
rición de la estructura química madre). 
Este método es aplicable solamente a aquellas sustancias orgánicas 
que, a la concentración utilizada en el ensayo: 
— sean solubles en agua en las condiciones del ensayo, 
— tengan una presión de vapor insignificante en las condiciones del 
ensayo, 
— no provoquen inhibición en las bacterias, 
— sean absorbidas dentro del sistema del ensayo solo hasta un 
cierto punto limitado, 
— no se pierdan a causa de la formación de espuma a partir de la. 
solución del ensayo. 
La información sobre las proporciones relativas de los principales 
componentes del material del ensayo será necesaria para la interpre ­
tación de los resultados obtenidos, particularmente en los casos en 
que los resultados sean reducidos o marginales. 
La información sobre la toxicidad de la sustancia para los microor ­
ganismos resulta conveniente para la interpretación de resultados 
reducidos y para la selección de las concentraciones apropiadas 
para el ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La cantidad de degradación alcanzada al final del ensayo se presenta 
como la biodegradabilidad en la prueba Zahn — Wellens:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C V Þ 
ðC D Ä C VD Þ # 
Ü 100  
donde: 
D T = biodegradación ( %) en el tiempo T 
C D = valores de COD (o DQO) en la mezcla del ensayo medidos 
tres horas después del comienzo del mismo (mg/l) (COD = Carbón orgánico disueleo; DQO = demanda química de 
oxígeno) 
C
 T = valores de COD o DQO e la mezcla del ensayo en el 
momento en que se toma la muestra (mg/l) 
C V = valores de COD o DQO del blanco en el momento de la 
toma de la muestra (mg/l) 
C Vd = valores de COD y DQO en el blanco, medidos 3 horas 
después del comienzo de la prueba (mg/l). 
El alcance de la degradación se redondea hasta llegar a completar la 
unidad de porcentaje más cercana. 
El porcentaje de degradación se expresa como el porcentaje de su ­
presión de COD (o DQO) de la sustancia objeto del ensayo. 
La diferencia entre los valores medidos tras 3 horas y el valor inical 
calculado, o preferiblemente medido, puede proporcionar una infor ­
mación útil sobre la eliminación de la sustancia (véase el punto 3.2, 
«Interpretación de los resultados»).  
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
En algunos casos, cuando se están investigando sustancias nuevas, 
las sustancias de referencia pueden resultar útiles; no obstante, toda ­
vía no se pueden recomendar sustancias de referencia específicas.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se ponen juntos, en un recipiente de vidrio de 1 a 4 litros de 
capacidad y equipado con un mezclador y un aireador, lodo activado, nutrientes minerales y et material del ensayo como única fuente de 
carbón en solución acuosa. Se remueve y se airea la mezcla a 20- 
25
 o C, bajo una iluminación difusa o en un cuarto oscuro por un 
período de hasta 28 días. El proceso de degradación se controla por medio de la determinación de los valores de COD (o DQO) en la 
solución filtrada a intervalos diarios o a intervalos regulares que 
resulten apropiados. La relación entre la cantidad de COD (DQO) eliminada tras cada intervalo y el valor 3 horas después del comien ­
zo, se expresa en forma de porcentaje de biodegradación y sirve de 
medida del alcance de la degradación en ese momento. El resultado 
se indica en un gráfico en función del tiempo para obtener así la curva de biodegradación. 
Cuando se utiliza un método analítico específico, pueden medirse los 
cambios en la concentración de la molécula madre debidos a la 
biodegradación (biodegradabilidad primaria),
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Ha quedado demostrado que la reproducibilidad de esta prueba es 
satisfactoria en una prueba en varios centros. 
La sensibilidad de este método viene determinada en gran medida 
por la variabilidad del blanco y, en menor medida, por la precisión de la determinación del carbón orgánico disuelto y el nivel del 
compuesto del ensayo en Ja mezcla liquida.
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO  
1.6.1.  Preparativos  
1.6.1.1. R e a c t i v o s 
Agua de ensayo: agua potable con un cotenido de carbón orgánico 
menor de 5 mg/l. La concentración de iones de calcio y magnesio juntos no puede exceder los 2,7 mmoles/l; de otra manera, es nece ­
saria una dilución suficiente con agua desionizada o destilada. 
Ácido sulfúrico, reactivo analítico (R.A.): 50 g/l 
Solución de hidróxído de sodio R.A.: 40 g/l Solución de nutriente mineral: disuélvase en un litro de 
agua desionizada: 
cloruro de amonio, NH
 4 Cl, R.A.: 38,5 g 
dihidrógeno fosfato de sodio, NaH  2 PO 4 ,. 2H  2 O, R.A.: 33,4 g 
dihidrógeno fosfato de potasio, KH  2 PO 4 , R.A.: 8,5 g 
monohidrógeno fosfato de dipotasio, K  2 HPO  4 , R.A.: 21,75 g. 
La mezcla sirve a la vez de elemento nutritivo y de sistema tampón.  
1.6.1.2. A p a r a t o s 
Recipientes de vidrio de un volumen de 1 a 4 litros (por ejemplo, 
recipientes cilindricos). 
Mezclador con un agitador de vidrio o metal colocado en un eje 
apropiado. (El agitador debe girar a 5-10 cm por encima del fondo 
del recipiente). Se puede utilizar en su lugar un agitador magnético 
con una varilla de 7-10 cm de larga. 
Un tubo de vidrio de 2 a 4 mm de diámetro interior para introducir 
aire. La abertura del tubo debe estar a, más o menos, 1 cm por encima del fondo del recipiente. 
Una centrífuga (unos 3 550 g). Un medidor de pH. 
Un medidor de oxígeno disuelto. 
Filtros de papel.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Un aparato de filtración por membrana. 
Filtros de membrana, tamaño de los poros 0,45 um. Los filtros de 
membrana son apropiados si es seguro que ni desprenden carbón ni absorben la sustancia en la fase de filtración. 
Un equipo analítico para determinar el contenido de carbón orgánico 
y la demanda química de oxígeno.
 
1.6.1.3. P r e p a r a c i ó n d e l i n ó c u l o 
Se lava (repetidamente) el lodo activado recogido en una planta de 
tratamiento biológico, centrifugándolo o dejándolo sedimentarse con 
agua de iguales características a la que se usa para el ensayo (antes 
citado). 
El lodo activado tiene que estar en condiciones adecuadas. Este 
fango puede encontrarse en una planta depuradora de aguas residua ­
les que funcione debidamente. Para coger tantas especies o cepas de 
bacterias diferentes como sea posible, puede ser preferible mezclar inóculos de diferentes fuentes (por ejemplo, diferentes plantas depu ­
radoras, extractos de suelos, aguas de río, etc.). La mezcla debe ser 
tratada como se describe anteriormente. 
Para comprobar la actividad del lodo activado, véase «Control fun ­
cional».
 
1.6.1.4. P r e p a r a c i ó n d e l a s s o l u c i o n e s d e l e n s a y o 
Pónganse, en el recipiente que se utiliza para el ensayo, 500 ml de 
agua de ensayo, 2,5 ml/l de una solución de nutrientes minerales y lodo activado en una cantidad equivalente a 0,2 a 1,0 g/l de materia seca en la mezcla final. Añádase suficiente solución madre de la 
sustancia a ensayar como para que en la mezcla final se obtenga 
una concentración de COD de 50 a 400 mg/l. Los valores corres ­
pondientes de DQO son 100-1 000 mg/l. Añádase agua de ensayo hasta llegar a un volumen total de 1 a 4 litros. El volumen toral que 
se elija dependerá del número de muestras que se vayan a tomar para 
las determinaciones del COD y DQO y las cantidades necesarias para el procedimiento analítico. 
Normalmente, puede considerarse satisfactorio un volumen de 2 li ­
tros. Se dispone por lo menos un recipiente de control (blanco), paralelamente a cada una de las series de ensayo, que contenga tan solo una solución de lodo activado y la solución de nutrientes 
minerales, que se completará con agua de ensayo hasta alcanzar un 
volumen total igual al de los recipientes de ensayo.
 
1.6.2.  Realización del ensayo  
Se agitan los recipientes del ensayo con agitadores magnéticos o 
hélices bajo una iluminación difusa o en un cuarto oscuro a 20- 
25 o C. La aireación se efectúa con aire comprimido limpiado por 
medio de un filtro de algodón y lana y un frasco lavador si fuera necesario. Hay que asegurarse de que el lodo no sedimenta y de que la concentración de oxígeno no cae por debajo de los 2 mg/l. 
Hay que controlar el pH a intervalos regulares (por ejemplo, cada 
día) y, si fuera necesario, corregirlo ajustándolo a 7-8.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Las pérdidas por evaporación se compensan, justo antes de tomar 
cada muestra, con agua desionizada o destilada en las cantidades 
necesarias. Un buen procedimiento es marcar el nivel del líquido sobre el recipiente antes de iniciar el ensayo. Se harán marcas nuevas después de cada toma (sin aireación y sín remover). Las primeras 
muestras se toman siempre 3 horas después del comienzo del ensayo, 
para detectar la absorción del material de ensayó por parte del lodo activado. 
La eliminación del material de ensayo se controla por medio de las 
determinaciones de COD y DQO hechas diariamente o a intervalos regulares. Las muestras del recipiente utilizado para el ensayo y del 
recipiente de control son filtradas con un filtro de papel cuidadosa ­
mente lavado. Se desechan los primeros 5 ml de la solución filtrada. Los lodos difíciles de filtrar pueden ser separados previamente cen ­
trifugándolos durante 10 minutos. Las determinaciones de COD y 
DQO deben hacerse por lo menos por duplicado. El ensayo se lleva 
a cabo durante un período de hasta 28 días.  
Nota:  Las muestras que todavía estén turbias son filtradas con filtros 
de membrana. Los filtros de membrana no han de desprender ni absorber material orgánico alguno.
 
C o n t r o l f u n c i o n a l d e l l o d o a c t i v a d o 
En un recipiente que contenga una sustancia conocida deben llevarse 
a cabo paralelamente cada serie de pruebas, con vistas a controlar la 
capacidad funcional del lodo activado. Se ha comprobado que el dietilcnoglicol es de utilidad para este propósito.
 
A d a p t a c i ó n 
Si los análisis se llevan a cabo a intervalos relativamente cortos (por 
ejemplo, diariamente), se puede reconocer claramente la adaptación 
por medio de la curva de degradación (véase la figura 2). Así pues, 
el ensayo no debe iniciarse justo antes del fin de semana. 
Si la adaptación tiene lugar al final del período, el ensayo puede 
prolongarse hasta que finalice la degradación.  
Nota:  Si fuera necesario un conocimiento más amplio del compor ­
tamiento del lodo adaptado, se expone de nuevo el mismo lodo activado al mismo material del ensayo, de acuerdo con el siguiente 
procedimiento: 
Desconéctense el agitador y el aireador y permítase que el lodo 
activado se sedimente. Vacíese el líquido sobrenadante, añádase 
agua de ensayo hasta alcanzar los 2 litros, agítese durante 15 minutos y déjese sedimentar de nuevo. Después de haber vaciado de nuevo el líquido sobrenadante, utilícese el lodo que queda para 
repetir el ensayo con el mismo material, de acuerdo con los puntos 
1.6.1.4 y 1.6.2. Se puede aislar el lodo activado centrifugando en vez de dejándolo sedimentar. 
El lodo adaptado puede mezclarse con lodo fresco hasta alcanzar un 
total de 0,2 a 1 g de peso en seco, por litro.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
M e d i o s a n a l í t i c o s 
Normalmente, se filtran las muestras con un filtro de papel cuidado ­
samente lavado (para lavarlo, utilícese agua desionizada). 
Las muestras que sigan estando turbias se filtrarán con filtros de 
membrana (0,45 μm). 
La concentración de COD se determina por duplicado en las mues ­
tras de líquido filtrado (se desechan los primeros 5 ml) por medio del instrumento TOC. Si el líquido filtrado no puede ser analizado el 
mismo día, tiene que almacenarse en el refrigerador hasta el día 
siguiente. No se recomienda un almacenaje más prolongado. 
La concentración de DQO se determina por duplicado en las mues ­
tras de líquido filtrado con un sistema analítico siguiendo el proce ­
dimiento descrito en la referencia (2) posterior.
 
2. DATOS Y EVALUACIÓN  
Las concentraciones de COD y DQO se determinan en las muestras, 
por lo menos por duplicado, de acuerdo con el punto 
1.6.2. La degradación en el tiempo T se calcula según la fórmula 
(con definiciones) dada en el punto 1.2. 
El alcance de la degradación se redondea hasta llegar a completar la 
unidad de porcentaje más cercana. La cantidad de degradación lo ­
grada al final del ensayo se presenta como la «biodegradabilidad en 
la prueba Zahn — Wellens».  
Nota:  Si se logra una degradación completa antes de que termine el 
período de duración del ensayo y si este resultado es confirmado por un segundo análisis al día siguiente, el ensayo puede darse por 
concluido.
 
3. PRESENTACIÓN DEL INFORME  
3.1. INFORME SOBRE EL ENSAYO 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— la concentración inicial de la sustancia, — cualquier otra información y los resultados experimentales rela ­
tivos a la sustancia objeto del ensayo, a la sustancia de referen ­
cia, si se utiliza alguna, y al control, 
— la concentración después de tres horas, — la curva de biodegradación con una descripción, — fecha y lugar en que se tomaron las muestras de los organismos 
utilizados en el ensayo, status de adaptación, concentración uti ­
lizada, etc., 
— causas científicas de cualquier cambio en el procedimiento del 
ensayo.
 
3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
La eliminación de COD (o DQO) que tiene lugar gradualmente, 
durante días o semanas, indica que la sustancia objeto del ensayo 
se está biodegradando.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
No obstante, la absorción físico-química puede, en algunos casos, 
desempeñar un papel, y esto se pone de manifiesto cuando hay una 
eliminación completa o parcial desde el principio, dentro de las tres primeras horas, y la diferencia entre las mezclas líquidas sobrena ­
dantes del control y del ensayo se mantienen a un nivel inesperada ­
mente bajo. 
Son necesarias pruebas adicionales si se quiere establecer una dife ­
rencia entre biodegradación (o biodegradación parcial) y absorción. 
Esto puede hacerse de varias maneras, pero lo más conveniente es 
usar el sobrenadante como inóculo en un ensayo de base fija (una prueba respírométrica preferentemente). 
Las sustancias que en este ensayo den una eliminación de COD (o 
DQO) alta, y no debida a la absorción, deben ser consideradas como potencialmente biodegradables. Una eliminación parcial y no debida a la absorción indica que el producto químico puede sufrir al menos 
cierta biodegradación. Una eliminación baja o nula de COD (o 
DQO) puede deberse a que la sustancia objeto del ensayo provoca la inhibición de los microorganismos. Esto puede asimismo ponerse de manifiesto a través de una desintegración y pérdida del lodo, 
produciendo sobrenadantes turbios. Se debe repetir el ensayo utili ­
zando una concentración inferior de la sustancia objeto de estudio. 
La utilización de un método analítico específico para el compuesto, o 
de una sustancia del ensayo marcada con
 14 C, puede permitir una 
mayor sensibilidad. En el caso del compuesto de ensayo marcado 
con  14 C la obtención de  14 CO 2 confirmará que se ha producido 
biódegradación. 
Cuando los resultados se presenten en términos de bíodegradación 
primaria, se debe dar, si fuera posible, una explicación sobre el 
cambio de estructura química que lleva a la pérdida de respuesta 
de la sustancia madre utilizada en el ensayo. 
La validación del método analítico tiene que presentarse junto con la 
respuesta encontrada con el medio de ensayo control (blanco).  
REFERENCIAS  
(1) OCDE, París, 1981,  Directriz para pruebas  302 B. Decisión del 
Consejo C(81) 30 final. 
(2) anexo V C.9 Degradación: Demanda química de oxígeno, 
Directiva 84/449/CEE de la Comisión,  Diario Oficial de las 
Comunidades Europeas  N o L 251 de 19.9.1984.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Anexo  
EJEMPLO DE EVALUACIÓN 
Compuesto orgánico: Ácido 4-Etoxibenzoico 
Concentración teórica de ensayo: 600 mg/l COD teórico: 390 mg/l 
inóculo: Planta depuradora de aguas residuales . . . 
Concentración: 1 g de material seco/litro Status de adaptación: No adaptado Análisis: Determinación de COD 
Cantidad de muestra: 3 ml 
Sustancia de control: Dietilenglicol Toxicidad del compuesta: Sin efectos tóxicos por debajo de los 1 000 mg/l. 
Ensayo utilizado: Ensayo de fermentación con 
tubos.
 
Tiempo de 
ensayo Sustancia de control Sustancia de ensayo 
COD (  1 ) 
del control 
mg/l COD (  1 ) 
mg/l COD neto 
mg/l Degrada­
ción 
% COD (  1 ) 
mg/l COD neto 
mg/l Degrada­
ción 
( %) 
0 — — 300,0 — — 390,0 _ 
3h 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 1 d 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 2d 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 d 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6d 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7d 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 d 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 d 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 d 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Valores medios de determinaciones por triplicado.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Figura 1  
Ejemplos de curvas de biodegradación
  
Figura 2  
Ejemplos de adaptación del lodo
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  PRUEBA DE SIMULACIÓN DE TRATAMIENTO AERÓBICO DE 
AGUAS RESIDUALES: C.10-A: UNIDADES DE LODO ACTIVADO — 
C.10-B: BIOPELÍCULAS  
C.10-A: Unidades de lodo activado  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 303 (2001). En la década de 1950 se observó que los agentes tensioactivos de reciente introducción provocaban la formación excesiva de 
espuma en las depuradoras de aguas residuales y en los ríos. El tratamiento 
aeróbico no era suficiente para eliminarlos totalmente y en algunos casos limitaban la eliminación de otros tipos de materia orgánica. Esta situación dio pie a que se pusieran en marcha muchas investigaciones sobre cómo 
eliminar los agentes tensioactivos de las aguas residuales y sobre si las 
nuevas sustancias producidas por la industria podían someterse al trata ­
miento de las aguas residuales. Con este objetivo, se utilizaron unidades 
modelo que representaban a los dos tipos principales de tratamiento bioló ­
gico aeróbico de las aguas residuales (lodo activado y filtración por perco ­
lación o por goteo). Habría sido poco práctico y muy caro distribuir cada sustancia nueva y controlar las grandes depuradoras, incluso de forma local.
 
CONSIDERACIONES INICIALES  
Unidades de lodo activado  
2. Se han descrito unidades modelo de lodo activado en una gama de 300 a 
unos 2 000 ml. Algunas simulaban muy bien las condiciones de las ins ­
talaciones de escala real, y disponían de tanques de sedimento de lodo en 
los que el lodo sedimentado se bombeaba de nuevo al tanque de aireación, 
mientras que otras no tenían dispositivos de sedimentación como, por ejem ­
plo, Swisher (1). El tamaño del aparato representa un compromiso: por una parte, debe ser suficientemente grande para un funcionamiento mecánico 
adecuado y para permitir la toma de un volumen suficiente de muestras 
sin que el funcionamiento se vea afectado, pero, por otra parte, no debe ser tan grande que sus necesidades de espacio y de materiales sean excesi ­
vas. 
3. Dos formas de aparatos que se han utilizado ampliamente y dando satisfac ­
ción son las unidades Husmann (2) y las unidades de depósito poroso (3) (4), que son las utilizadas en primer lugar en el estudio de tensioactivos; estas se describen en el presente método de ensayo. Hay otros tipos que 
también se han utilizado con éxito, como el de Eckenfelder (5). Debido a 
que son relativamente elevados el coste y el esfuerzo necesarios para aplicar esta prueba de simulación, se han investigado en paralelo otros ensayos exploratorios más simples y baratos, recogidos ahora en el capítulo C.4-A 
a F del presente anexo (6). La experiencia con muchos tensioactivos y otras 
sustancias ha puesto de manifiesto que los que pasaban los ensayos explo ­
ratorios (fácilmente biodegradables) también se degradaban en el ensayo de simulación. Algunos de los que no pasaban los ensayos exploratorios sí 
conseguían pasar los ensayos de biodegradabilidad intrínseca [capítulos 
C.12 (7) y C.19 (8) del presente anexo], pero solo algunos de este último grupo eran degradados en el ensayo de simulación, mientras que las sustan ­
cias que no pasaban los ensayos de biodegradabilidad intrínseca tampoco 
se degradaban en los ensayos de simulación (9) (10) (11). 
4. Para algunos fines son suficientes los ensayos de simulación efectuados con 
un solo conjunto de condiciones de funcionamiento; los resultados se ex ­
presan en porcentaje de la eliminación de la sustancia problema o del carbono orgánico disuelto (COD). En el presente método de ensayo se 
describe un método de este tipo. Sin embargo, a diferencia de la versión 
anterior del presente capítulo, que describía un solo tipo de aparato para
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
depurar agua residual sintética en el método de unidades acopladas utili ­
zando un método relativamente sencillo de retirada de lodo, el presente texto 
ofrece una serie de variaciones. Se describen alternativas del tipo de aparato, del modo de funcionamiento y de eliminación de las aguas residuales y de retirada del lodo. El texto sigue de cerca el de la norma ISO 11733 (12), que 
fue objeto de mucha atención durante su preparación, aunque el método no 
se ha sometido a estudio interlaboratorios. 
5. Para otros fines, es necesario determinar con mayor precisión la concen ­
tración de la sustancia problema en el efluente, para lo cual hace falta un método de mayor envergadura. Por ejemplo, la proporción de lodo retirado 
debe regularse de forma más precisa a lo largo de cada día y de cada fase 
del ensayo, y las unidades deben funcionar a diversas proporciones de retirada. Para que el método sea totalmente exhaustivo, es necesario hacer ensayos a dos o tres temperaturas diferentes. Un método de este tipo es 
descrito por Birch (13) (14) y se resume en el apéndice 6. Sin embargo, los 
conocimientos actuales son insuficientes para decider cuál de los modelos cinéticos es aplicable a la biodegradación de las sustancias en la depuración de aguas residuales y en el medio acuático en general. La aplicación de una 
cinética de Monod, señalada en el apéndice 6 como ejemplo, se limita a las 
sustancias presentes a una concentración de 1 mg/l o más pero, en opinión de algunos autores, incluso este extremo está aún por confirmar. En el apéndice 7 se indican ensayos a concentraciones que reflejan con mayor 
fidelidad las que se encuentran en las aguas residuales, pero estos ensayos, 
así como los del apéndice 6, se incluyen como apéndices en lugar de publicarse como métodos de ensayo aparte.
 
Filtros  
6. Se ha prestado mucha menos atención a los modelos de filtros percoladores, 
quizá debido a que son más engorrosos y menos compactos que los modelos de instalaciones de lodo activado. Gerike  et al.  desarrollaron unas unidades 
de filtros por goteo y las utilizaron con el método de unidades acopladas 
(15). Estos filtros son relativamente grandes (2 m de altura y 60 l de volumen) y cada uno requiere hasta 2 l/h de aguas residuales. Baumann  
et al.  (16) simularon filtros de goteo insertando tiras de "lana" de poliéster 
en tubos de 1 m (14 mm de diámetro interior) después de haberlas sumer ­
gido en lodo activado concentrado durante 30 min. Se introdujo desde arriba en el tubo vertical la sustancia problema como única fuente de C en una solución de sales minerales, y se evaluó la biodegradación midiendo el COD 
en el efluente y el CO
 2 en el gas emitido. 
7. Se han simulado biofiltros de otra manera (15): se ponían en contacto las 
superficies internas de tubos giratorios, inclinados levemente respecto a la horizontal, con aguas residuales (con un flujo de unos 250 ml/h), tanto con la sustancia problema como sin ella, y en los efluentes recogidos se exami ­
naba la concentración de COD o la de la sustancia problema.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
8. El presente método está concebido para determinar la eliminación y la 
biodegradación primaria o la final de sustancias orgánicas hidrosolubles 
por microorganismos aerobios en un sistema de ensayo de funcionamiento continuo que simula el proceso del lodo activado. Las fuentes de carbono y energía para los microorganismos son un medio orgánico fácilmente biode ­
gradable y la sustancia problema orgánica. 
9. Se disponen dos unidades de prueba en funcionamiento continuo (instala ­
ciones de lodo activado o depósitos porosos), en paralelo y en las mismas condiciones, elegidas como idóneas para el objetivo del ensayo. Normal ­
mente, el tiempo medio de retención hidráulica es de 6 h y la edad media 
del lodo (tiempo de retención del lodo) está entre 6 y 10 días. El lodo se 
retira por uno de los dos métodos, la sustancia problema se añade normal ­
mente al afluente (medio orgánico) de una sola de las unidades, a una concentración de entre 10 y 20 mg/l de carbono orgánico disuelto (COD). 
La segunda unidad sirve de control para determinar la biodegradación del 
medio orgánico.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. Se toman muestras frecuentes de los efluentes y en ellas se determina 
preferentemente el COD, o bien la demanda química de oxígeno (DQO), 
junto con la concentración de la sustancia problema (en caso necesario) mediante análisis específico, en el efluente de la unidad a la que se añade dicha sustancia. Se acepta que la diferencia entre las concentraciones de 
COD o de DQO en los efluentes de las unidades de ensayo y de control 
se debe a la sustancia problema o a sus metabolitos orgánicos. Esta dife ­
rencia se compara con la concentración en los afluentes de COD o de DQO debida a la sustancia problema, a fin de determinar la eliminación de dicha 
sustancia. 
11. Normalmente es posible distinguir la biodegradación de la bioadsorción 
mediante un examen atento de la curva de eliminación respecto al tiempo, y se puede confirmar mediante un ensayo de biodegradación fácil utilizando 
un inóculo aclimatado procedente de la unidad que recibe la sustancia 
problema.
 
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
12. Es necesario conocer las características de pureza, hidrosolubilidad, volati ­
lidad y adsorción de la sustancia problema para poder interpretar correcta ­
mente los resultados. Normalmente no es posible hacer el ensayo con sus ­
tancias volátiles e insolubles, salvo que se adopten precauciones especiales (véase el apéndice 5). También debe conocerse la estructura química, o al menos la fórmula empírica, para poder calcular los valores teóricos o com ­
probar los valores medidos de ciertos parámetros, como la demanda teórica 
de oxígeno (DTO), el carbono orgánico disuelto (COD) y la demanda química de oxígeno (DQO). 
13. El disponer de datos sobre la toxicidad de la sustancia problema para los 
micororganismos (véase el apéndice 4) puede ser útil para seleccionar las concentraciones adecuadas para el ensayo y puede ser fundamental para interpretar correctamente los valores bajos de la biodegradación.
 
UMBRALES 
14. En la aplicación original de este ensayo (confirmatorio) de simulación a la 
biodegradación primaria de tensioactivos, se exige una eliminación del 80 % 
de la sustancia específica para poder comercializar el tensioactivo. Si no se alcanza el valor del 80 %, puede aplicarse este ensayo (confirmatorio) de simulación y el tensioactivo puede comercializarse solamente si se elimina 
más del 90 % de la sustancia específica. Con las sustancias en general, no se 
trata de pasar un umbral sino de que el valor obtenido del porcentaje de la eliminación pueda utilizarse para calcular aproximadamente la concentración probable en el medio ambiente que deba utilizarse en la evaluación del 
peligro planteado por las sustancias. Los resultados tienden a seguir un 
modelo de todo o nada. En una serie de estudios de sustancias puras, se observó que el porcentaje de la eliminación de COD era > 90 % en más de 
tres cuartos y > 80 % en más del 90 % de las sustancias que mostraban un 
grado significativo de biodegradabilidad. 
15. Son relativamente pocas las sustancias (por ejemplo, tensioactivos) que 
están presentes en las aguas residuales a las concentraciones utilizadas en 
el presente ensayo (alrededor de 10 mg C/l). Algunas sustancias pueden 
resultar inhibidoras a estas concentraciones, mientras que la cinética de eliminación de otras puede ser diferente a concentraciones bajas. Podría conseguirse una evaluación más exacta de la degradación utilizando méto ­
dos modificados, con concentraciones de la sustancia problema a un nivel 
más bajo próximo a las situaciones reales, y los datos recogidos podrían utilizarse para calcular las constantes cinéticas. Sin embargo, aún no se han validado las técnicas experimentales necesarias, y tampoco se han estable ­
cido los modelos cinéticos que describen las reacciones de biodegradación 
(véase el apéndice 7).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
16. Para asegurarse de la correcta ejecución del procedimiento experimental, es 
conveniente someter a ensayo ocasionalmente sustancias cuyo comporta ­
miento se conozca, a la vez que se investigan sustancias problema. Entre 
esas sustancias se cuentan el ácido adípico, el 2-fenil-fenol, el 1-naftol, el 
ácido difénico, el ácido 1-naftoico, etc. (9) (10) (11).  
REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO 
17. Ha habido muchos menos informes de estudios de ensayos de simulación 
que de ensayos de la biodegradabilidad fácil. La reproducibilidad obtenida con muestras en paralelo es buena (dentro del 10-15 %) en el caso de las 
sustancias problema degradadas en un 80 % o más, pero la variabilidad es 
mayor cuando se trata de sustancias que se degradan menos bien. Asimismo, con algunas sustancias límite se han encontrado resultados muy dispares (por ejemplo, 10 %, 90 %) en distintas ocasiones dentro del plazo de 9 
semanas permitido en el ensayo. 
18. Se ha observado poca diferencia en los resultados obtenidos con los dos 
tipos de equipo, pero algunas sustancias se han degradado de forma más amplia y sistemática en presencia de agua residual doméstica que con el 
agua residual sintética de la OCDE.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
Equipo  
Sistema de ensayo  
19. El sistema de ensayo para una sola sustancia problema consiste en una 
unidad de ensayo y una unidad de control, pero cuando solo se efectúan análisis específicos (biodegradación primaria) únicamente hace falta la uni ­
dad de ensayo. Una misma unidad de control puede utilizarse con varias 
unidades de ensayo que reciban la misma o diferentes sustancias problema. En caso de acoplamiento (apéndice 3), cada unidad de ensayo debe disponer de su propia unidad de control. El sistema de ensayo puede ser bien un 
modelo de instalación de lodo activado, unidad Husmann (apéndice 1, figura 
1), o bien un depósito poroso (apéndice 1, figura 2). En ambos casos es necesario disponer de recipientes de almacenamiento de tamaño suficiente para los afluentes y efluentes, así como bombas para dosificar el afluente, 
bien mezclado con una disolución de la sustancia problema o bien aparte. 
20. Cada instalación de lodo activado consiste en un recipiente de aireación con 
una capacidad conocida de unos 3 litros de lodo activado y en un separador (depósito de decantación secundario) de una capacidad de unos 1,5 litros; 
los volúmenes pueden modificarse en cierta medida ajustando la altura del 
depósito de decantación. Pueden utilizarse recipientes de tamaños diferentes si funcionan con presiones hidráulicas comparables. Si no es posible man ­
tener la temperatura de la sala de ensayo en la banda deseada, se recomienda 
utilizar recipientes con camisa de agua a temperatura regulada. Se utiliza 
una bomba de elevación por aire comprimido o una bomba dosificadora para reciclar el lodo activado, pasándolo desde el depósito de decantación al recipiente de aireación, bien de forma continua o bien de forma intermitente, 
a intervalos periódicos. 
21. El sistema de depósito poroso consiste en un cilindro interior, poroso, de 
fondo cónico, incluido en un recipiente algo más grande, de la misma forma, pero hecho de material plástico impermeable. El recipiente poroso puede estar hecho, por ejemplo, de polietileno poroso con un diámetro 
máximo de poro de 90 μm y 2 mm de espesor. La separación del lodo 
respecto al medio orgánico tratado se efectúa mediante el paso diferencial a través de la pared porosa. Los efluentes se recogen en el espacio anular a partir del cual rebosan al recipiente de recogida. No se produce sedimenta ­
ción y, por tanto, no hay retorno del lodo. El sistema en conjunto puede 
estar montado en un baño de agua de temperatura regulada. Los depósitos
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
porosos se pueden bloquear y rebosar en las fases iniciales. En tal caso, se 
debe sustituir el forro poroso por uno limpio, pasando previamente con sifón 
el lodo del depósito a un cubo limpio y extrayendo el forro bloqueado. Tras limpiar el cilindro exterior impermeable, se inserta un forro limpio y se devuelve el lodo al depósito. El lodo que pueda quedar adherido a los lados 
del forro bloqueado se raspa cuidadosamente y se transfiere también. Los 
depósitos bloqueados se limpian primero con un chorro fino de agua para eliminar el lodo restante; luego se sumergen en solución diluida de hipo ­
clorito sódico y después en agua; finalmente, se enjuagan a fondo con agua. 
22. Para la aireación del lodo en los recipientes de aireación de ambos sistemas, 
es necesario aplicar técnicas adecuadas como, por ejemplo, cubos sinteriza ­
dos (piedras difusoras) y aire comprimido. El aire se limpiará, en caso 
necesario, pasándolo por un filtro adecuado y lavándolo. Debe pasar sufi ­
ciente aire a través del sistema para mantener las condiciones aeróbicas y mantener en suspensión los flóculos de lodo todo el tiempo que dure el 
ensayo.
 
Equipo de filtración o centrífuga  
23. Dispositivo de filtración de muestras con filtros de membrana de porosidad 
adecuada (diámetro de abertura nominal de 0,45 μm) que adsorban sustan ­
cias orgánicas solubles y liberen carbono orgánico en un grado mínimo. Si se utilizan filtros que liberan carbono orgánico, lavar cuidadosamente los filtros con agua caliente para eliminar el carbono orgánico lixiviable. Otra 
posibilidad es utilizar una centrífuga que pueda alcanzar una aceleración de 
40 000 m/s
 2 . 
Equipo analítico  
24. Equipo necesario para determinar: 
— el COD (carbono orgánico disuelto) y el COT (carbono orgánico total), 
o la DQO (demanda química de oxígeno), 
— la sustancia específica, en su caso, — los sólidos en suspensión, el pH, la concentración de oxígeno en el agua, — la temperatura, la acidez y la alcalinidad, — el amonio, el nitrito y el nitrato, si el ensayo se efectúa en condiciones 
de nitrificación.
 
Agua  
25. Agua del grifo, con menos de 3 mg/l de COD. Debe determinarse la alca ­
linidad, en caso de que no se conozca previamente. 
26. Agua desionizada, con menos de 2 mg/l de COD.  
Medio orgánico  
27. Como medio orgánico puede aceptarse agua residual sintética, agua residual 
doméstica o una mezcla de ambos tipos. Se ha observado (11) (14) que el 
uso de agua residual doméstica sola suele llevar a un mayor porcentaje de eliminación del COD y que incluso permite la eliminación y la biodegra ­
dación de algunas sustancias no biodegradadas cuando se utiliza el agua 
residual sintética de la OCDE. Asimismo, la adición constante o intermitente 
de agua residual doméstica suele estabilizar el lodo activado, incluida la capacidad crucial de sedimentar bien. Así pues, se recomienda el uso de agua residual doméstica. Debe medirse la concentración de COD o de DQO 
en cada nuevo lote de medio orgánico. Es necesario conocer la acidez o la 
alcalinidad del medio orgánico. Es posible que el medio orgánico requiera la adición de un amortiguador adecuado (carbonato de hidrógeno y sodio, o fosfato de dihidrógeno y potasio) si es baja su acidez o su alcalinidad, para 
mantener durante el ensayo un pH de alrededor de 7,5 ± 0,5 en el recipiente 
de aireación. Debe decidirse en cada caso la cantidad de amortiguador que ha de añadirse, y en qué momento hacerlo. Cuando se hagan mezclas tanto de forma continua como de forma intermitente, es necesario mantener apro ­
ximadamente constante el valor del COD (o de la DQO) de la mezcla, por 
ejemplo mediante dilución con agua.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Agua residual sintética  
28. Disuélvase en cada litro de agua del grifo: peptona, 160 mg; extracto de 
carne, 110 mg; urea, 30 mg; fosfato de hidrógeno y dipotasio anhidro (K
 2 HPO  4 ), 28 mg; cloruro de sodio (NaCl), 7 mg; cloruro de calcio dihi ­
dratado (CaCl  2 .2H  2 O), 4 mg; sulfato de magnesio heptahidratado 
(Mg  2 SO 4 .7H  2 O), 2 mg. El agua residual sintética de la OCDE es un ejemplo 
y da una concentración media de COD en el afluente de unos 100 mg/l. También es posible utilizar otras composiciones, con la misma concentra ­
ción aproximada de COD, que se acerquen más al agua residual real. Si 
hace falta un afluente menos concentrado, puede diluirse el agua residual sintética, por ejemplo en la proporción 1:1, con agua del grifo para obtener 
una concentración de unos 50 mg/l. Este afluente más débil permitirá un 
mejor crecimiento de los organismos nitrificantes, y esta modificación debe utilizarse si se tiene que investigar la simulación de las instalaciones de aguas residuales nitrificantes. El agua residual sintética puede elaborarse 
con agua destilada en forma concentrada y conservarse a alrededor de 
1 °C durante una semana como máximo. En el momento en que se necesite, se diluye con agua del grifo. (Este medio no es satisfactorio ya que, por ejemplo, la concentración de nitrógeno es muy elevada y el contenido de 
carbono es relativamente bajo, pero no se ha sugerido nada mejor, salvo 
añadir más fosfato como amortiguador y peptona adicional.)
 
Agua residual doméstica  
29. Debe utilizarse agua residual recién decantada, recogida cada día en una 
depuradora que reciba predominantemente agua residual doméstica. Debe 
recogerse, antes de la sedimentación primaria, del canal del rebosadero del tanque de sedimentación primaria o de la alimentación a la instalación de lodo activado y encontrarse exenta en gran medida de partículas gruesas. El 
agua residual puede seguir utilizándose tras guardarse varios días (pero en 
general no más de siete días) a una temperatura de unos 4 °C, si se de ­
muestra que el COD (o la DQO) no ha descendido de forma significativa (es decir, en menos del 20 %) durante el almacenamiento. A fin de limitar las 
perturbaciones del sistema, el COD (o la DQO) de cada lote nuevo debe 
ajustarse a un nivel constante adecuado, antes de utilizarlo, por ejemplo, mediante dilución con agua del grifo.
 
Lodo activado  
30. Debe recogerse lodo activado para la inoculación, a partir del tanque de 
aireación de una depuradora de aguas residuales que funcione bien o de una unidad de lodo activado de laboratorio que trate predominantemente aguas 
residuales domésticas.
 
Soluciones madre de sustancia problema  
31. Con sustancias de solubilidad adecuada, deben prepararse soluciones madre 
a concentraciones apropiadas (por ejemplo, de 1 a 5 g/l) en agua desioni ­
zada, o en la porción mineral del agua residual sintética (respecto a las 
sustancias insolubles y volátiles, véase el apéndice 5). Hay que determinar el COD y el carbono orgánico total (COT) de la solución madre y repetir las mediciones con cada lote nuevo. Si la diferencia entre el COD y el COT es 
superior al 20 %, ha de comprobarse la hidrosolubilidad de la sustancia 
problema. Hay que comparar los valores nominales con los valores de COD o la concentración de la sustancia problema medidos por análisis específico de la solución madre, para considerar si la recuperación es sufi ­
cientemente buena (normalmente puede esperarse > 90 %). Ha de compro ­
barse, especialmente en el caso de dispersiones, si el COD puede utilizarse como parámetro analítico o si solo es posible utilizar una técnica analítica específica para la sustancia problema. En el caso de dispersiones es nece ­
sario centrifugar las muestras. Con cada lote nuevo hay que medir el COD, 
la DQO o la sustancia mediante análisis específico.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Determínese el pH de la solución madre. La presencia de valores extremos 
indica que la adición de la sustancia puede influir en el pH de lodo activado 
en el sistema de ensayo. En este caso, haya que neutralizar la solución madre para obtener un pH de 7 ± 0,5, utilizando pequeñas cantidades de ácidos o bases inorgánicos, pero evitando la precipitación de la sustancia 
problema.
 
PROCEDIMIENTO 
33. Se describe el procedimiento para las unidades de instalaciones de lodo 
activado; para el sistema de depósito poroso ha de adaptarse ligeramente.  
Preparación del inóculo  
34. Inocúlese el sistema de ensayo al inicio del ensayo con lodo activado o bien 
con un inóculo que contenga una pequeña concentración de microorganis ­
mos. Manténgase el inóculo aireado a temperatura ambiente hasta que se 
vaya a utilizar, en el plazo máximo de 24 h. En el primer caso, tómese una muestra de lodo activado del tanque de aireación de una depuradora bioló ­
gica de aguas residuales que funcione con eficiencia o bien de una depura ­
dora de laboratorio, que reciba predominantemente aguas residuales domés ­
ticas. Si se van a simular condiciones de nitrificación, tómese lodo de una depuradora de aguas residuales de nitrificación. Determínese la concentra ­
ción de sólidos en suspensión y, en caso necesario, concéntrese el lodo por 
sedimentación, de forma que el volumen añadido al sistema de ensayo sea 
mínimo. Ha de asegurarse que la concentración inicial de materia seca es de alrededor de 2,5 g/l. 
35. En el segundo caso, utilícense como inóculo entre 2 ml/l y 10 ml/l de un 
efluente procedente de una depuradora biológica de aguas residuales domés ­
ticas. Para conseguir tantas especies diferentes de bacterias como sea posi ­
ble, puede ser conveniente añadir inóculos procedentes de otras fuentes diversas como, por ejemplo, aguas superficiales. En este caso, el lodo acti ­
vado se va a desarrollar y crecer en el sistema de ensayo.
 
Dosificación del medio orgánico  
36. Hay que asegurarse de que los recipientes del afluente y del efluente, así 
como los tubos que los unen, se limpian a fondo para eliminar la eventual proliferación microbiana, tanto al principio como durante todo el ensayo. 
Móntense los sistemas de ensayo en salas donde la temperatura esté regu ­
lada (normalmente en la banda de 20-25 °C) o utilícense unidades de ensayo provistas de camisas de agua. Prepárese un volumen suficiente del medio orgánico requerido (puntos 27-29). Llénese inicialmente el recipiente de 
aireación y el depósito de decantación con el medio orgánico y añádase 
el inóculo (puntos 34 y 35). Iníciese la aireación de forma que el lodo se mantenga en suspensión y en condiciones aeróbicas, y empiécese a intro ­
ducir el afluente y a reciclar el lodo sedimentado. Pásese medio orgánico de 
los recipientes de almacenamiento a los de aireación (puntos 20 y 21) de las 
unidades de ensayo y de control, y recójanse los efluentes respectivos en recipientes de almacenamiento similares. Para conseguir el tiempo normal de 
retención hidráulica de 6 h, el medio orgánico se bombea con un caudal de 
0,5 l/h. A fin de confirmar este extremo, mídase la cantidad diaria de medio orgánico introducido anotando la reducción de volumen del medio presente en los recipientes de almacenamiento. Serían necesarios otros modos de 
dosificación para determinar los efectos de una liberación intermitente y 
de una aportación de sustancias de "choque". 
37. Si el medio orgánico se prepara para utilizarlo durante un plazo superior a 1 
día, es necesario enfriarlo a unos 4 °C o aplicar otros métodos adecuados de conservación para impedir el crecimiento microbiano y la biodegradación fuera de las unidades de ensayo (punto 29). Si se utiliza agua residual 
sintética, es posible preparar y conservar a unos 4 °C una solución madre 
concentrada (por ejemplo, a una concentración 10 veces superior a la nor ­
mal, punto 28) Esta solución madre puede mezclarse bien con el volumen adecuado de agua del grifo antes de utilizarla; otra posibilidad consiste en 
bombearla directamente a la vez que se bombea aparte la cantidad adecuada 
de agua del grifo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dosificación de la sustancia problema  
38. Añádase un volumen adecuado de la solución madre de sustancia problema 
(punto 31) al recipiente de almacenamiento del afluente o introdúzcase directamente con una bomba aparte en el recipiente de aireación. La concen ­
tración de ensayo media normal en el afluente debe situarse entre 10 y 20 
mg/l de COD, con una concentración máxima no superior a 50 mg/l. Si la hidrosolubilidad de la sustancia problema es baja o resulta probable que aparezcan efectos tóxicos, puede reducirse la concentración a 5 mg/l de 
COD, o incluso menos, pero solo si existe y se utiliza un método analítico 
específico adecuado (las sustancias problema dispersadas que son poco hidrosolubles pueden añadirse mediante técnicas de dosificación especiales, 
véase el apéndice 5). 
39. Se empieza a añadir la sustancia problema cuando el sistema se haya esta ­
bilizado y ya esté reduciendo eficientemente el COD del medio orgánico 
(alrededor del 80 %). Es importante comprobar que todas las unidades 
funcionan con la misma eficiencia antes de la adición de la sustancia pro ­
blema; en caso contrario, suele ser útil mezclar los distintos lodos y volver a repartirlos en cantidades iguales a cada unidad. Cuando se utilice un inóculo 
de unos 2,5 g/l (en peso seco), es posible añadir la sustancia problema desde 
el inicio del ensayo ya que la adición directa de cantidades crecientes desde el principio ofrece la ventaja de que el lodo activado puede adaptarse mejor a la sustancia problema. Independientemente de la manera de añadir la 
sustancia problema, se recomienda que se midan a intervalos regulares el 
caudal pertinente y/o los volúmenes de los recipientes de almacenamiento.
 
Manipulación del lodo activado  
40. La concentración de sólidos del lodo activado suele estabilizarse entre unos 
límites durante el ensayo, independientemente del inóculo utilizado, en la 
banda de 1 a 3 g/l (en peso seco), en función de la calidad y de la concen ­
tración del medio orgánico, las condiciones de funcionamiento, la naturaleza de los microorganismos presentes y la influencia de la sustancia problema. 
41. Procédase bien a determinar los sólidos en suspensión de los recipientes de 
aireación al menos una vez por semana y desechar el exceso de lodo para 
mantener la concentración entre 1 y 3 g/l (en peso seco), o bien a controlar 
la edad media del lodo para conseguir un valor constante, normalmente en la banda de 6 a 10 días. Si, por ejemplo, se elige un tiempo de retención del lodo de 8 días, hay que eliminar cada día 1/8 del volumen del lodo activado 
presente en el recipiente de aireación y desecharlo. Esta operación debe 
realizarse cada día o, preferentemente, mediante una bomba que funcione de forma automática e intermitente. El mantener constante (o dentro de unos límites estrechos) la concentración de sólidos en suspensión no mantiene 
constante el tiempo de retención del lodo (TRL), que es la variable operativa 
que determina el valor de la concentración de la sustancia problema en el efluente. 
42. A lo largo de todo el ensayo debe retirarse, con una fecuencia al menos 
diaria, todo el lodo que se adhiera a las paredes del recipiente de aireación y del depósito de decantación, de forma que se vuelva a suspender. Obsér ­
vense y límpiense periódicamente todos los tubos para evitar el crecimiento 
de biopelículas. El lodo sedimentado del depósito de decantación se recicla introduciéndolo de nuevo en el recipiente de aireación, de preferencia me ­
diante bombeo intermitente. En el sistema de depósito poroso no se efectúa 
ningún reciclado, pero ha de asegurarse la introducción de cilindros internos 
limpios antes de que el volumen del recipiente aumente significativamente (punto 21). 
43. En las unidades Husmann puede darse escasa sedimentación y pérdida de 
lodo. Estas unidades pueden rectificarse aplicando una o varias de las me ­
didas que figuran a continuación, en paralelo en las unidades de ensayo y de 
control: 
— puede añadirse a intervalos periódicos (por ejemplo, cada semana) lodo 
nuevo o floculante (por ejemplo, 2 ml/recipiente de solución de FeCl
 3 de 
50 g/l), pero asegurándose de que no se produce ninguna precipitación 
ni reacción de la sustancia problema con el FeCl  3 , ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— puede sustituirse la bomba de elevación por aire comprimido mediante 
una bomba peristáltica, permitiendo así un flujo de recirculación de lodo 
que compensa aproximadamente el flujo de afluente que debe utilizarse y permitiendo el desarrollo de una zona anaerobia en el lodo sedimen ­
tado (la geometría de la bomba de aire comprimido limita el caudal 
mínimo del lodo retornado a unas 12 veces el del afluente), 
— puede bombearse intermitentemente lodo desde el depósito de de ­
cantación al recipiente de aireación (por ejemplo, 5 min. cada 2,5 h para reciclar entre 1 l/h y 1,5 l/h), 
— puede utilizarse un agente antiespumante no tóxico a una concen ­
tración mínima, para evitar pérdidas por formación de espuma (por 
ejemplo, aceite de silicona), 
— puede pasarse aire a través del lodo en el depósito de decantación en 
forma de fuertes impulsos breves (por ejemplo, de 10 sec cada hora), 
— es posible añadir el medio orgánico al recipiente de aireación a 
intervalos (por ejemplo, de 3 a 10 min cada hora).
 
Muestreo y análisis  
44. A intervalos periódicos debe medirse la concentración de oxígeno disuelto, 
la temperatura y el valor del pH del lodo activado presente en los recipientes 
de aireación. Hay que velar por que siempre se disponga de oxígeno sufi ­
ciente (> 2 mg/l) y que la temperatura se mantenga en la banda necesaria (normalmente, de 20 a 25 °C). Manténgase el pH a 7,5 ± 0,5 añadiendo al recipiente de aireación o al afluente pequeñas cantidades de base o ácido 
inorgánico, o aumentando la capacidad de amortiguación del medio orgá ­
nico (véase el punto 27). Cuando se efectúa la nitrificación se produce ácido: la oxidación de 1 mg de N produce el equivalente de unos 7 mg de CO
 3 – . La frecuencia de las mediciones depende del parámetro que se 
mida y de la estabilidad del sistema, y puede variar entre diaria y semanal. 
45. Mídanse el COD o la DQO en los afluentes que entran en los recipientes de 
control y de ensayo. Mídase la concentración de la sustancia problema en el afluente de la unidad de ensayo mediante análisis específico o estímese a partir de la concentración en la solución madre (punto 31), el volumen 
utilizado y la cantidad de agua residual introducida en la unidad de ensayo. 
Se recomienda calcular la concentración de la sustancia problema para reducir la variabilidad de los datos de concentración. 
46. Tómense muestras adecuadas del afluente recogido (por ejemplo, muestras 
compuestas de 24 h) y fíltrense por una membrana de 0,45 μm de diámetro 
de poro, o centrifúguense a unos 40 000 m/s
 2 durante 15 min aproximada ­
mente. La centrifugación debe utilizarse si resulta difícil realizar la filtración. Determínese el COD o la DQO al menos por duplicado para medir la 
biodegradación final y, en caso necessario, la biodegradación primaria me ­
diante un análisis específico de la sustancia problema. 
47. El uso del COD puede ocasionar problemas analíticos a concentraciones 
bajas, por lo que se recomienda solo si se utiliza una concentración sufi ­
cientemente alta de la sustancia problema (unos 30 mg/l). Asimismo, en 
caso de sustancias muy adsorbentes, se recomienda medir la cantidad de 
sustancia adsorbida en el lodo mediante una técnica analítica específica de la sustancia problema. 
48. La frecuencia del muestreo depende de la duración prevista del ensayo. Es 
recomendable una frecuencia de tres veces por semana. Una vez que las 
unidades estén funcionando con eficiencia, debe dejarse pasar entre 1 se ­
mana y un máximo de 6 semanas después de la introducción de la sustancia problema, para permitir que se alcance el estado de equilibrio. Es preferible obtener al menos 15 valores válidos en la fase de meseta (punto 59), que 
dura normalmente 3 semanas, para la evaluación del resultado del ensayo. El 
ensayo puede completarse si se alcanza un grado suficiente de eliminación (por ejemplo, > 90 %) y se dispone de estos 15 valores, que representan análisis efectuados cada día laborable durante 3 semanas. Normalmente, no 
debe llegarse a una duración del ensayo superior a 12 semanas tras la 
adición de la sustancia problema.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Si se produce nitrificación en el lodo, y si se quiere estudiar los efectos de la 
sustancia problema sobre la nitrificación, debe analizarse el contenido de 
amonio y/o de nitrito más nitrato en muestras tomadas del afluente de las unidades de ensayo y de control, al menos una vez por semana. 
50. Todos los análisis deben llevarse a cabo lo antes posible, especialmente las 
determinaciones de nitrógeno. Si resulta necesario retrasar un análisis, las 
muestras deben conservarse a unos 4 °C a oscuras, en frascos llenos y bien cerrados. Si resulta necesario almacenar las muestras durante más de 48 h, hay que conservarlas por ultracongelación, por acidificación (por ejemplo, 
10 ml/l de una solución de ácido sulfúrico de 400 g/l) o por adición de una 
sustancia tóxica adecuada [por ejemplo, 20 ml/l de una solución de cloruro de mercurio (II) de 10 g/l]. Hay que verificar que la técnica de conservación no altera los resultados de los análisis.
 
Acoplamiento de unidades de ensayo  
51. Si se utiliza el acoplamiento (apéndice 3), hay que intercambiar cada día la 
misma cantidad de lodo activado (entre 150 y 1 500 ml en el caso de 
recipientes de aireación que contienen 3 litros de líquido) entre los recipien ­
tes de aireación de la unidad de ensayo y de su unidad de control. Si la sustancia problema se adsorbe fuertemente al lodo, debe cambiarse solo el 
sobrenadante de los depósitos de decantación. En ambos casos hay que 
aplicar un factor de corrección para calcular los resultados del ensayo (punto 55).
 
DATOS E INFORME  
Tratamiento de los resultados  
52. Calcúlese el porcentaje de eliminación de la sustancia problema en términos 
de COD o de DQO respecto a cada evaluación programada en el tiempo, con ayuda de la ecuación siguiente: 
D
 t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
donde: 
D t = % de eliminación del COD o de la DQO al tiempo t 
C s = valores de COD o DQO en el afluente debidos a la sustancia pro ­
blema, de preferencia estimados a partir de la solución madre (mg/l) 
E = valores de COD o DQO medidos en el efluente de ensayo al tiempo t 
(mg/l) 
E o = valores de COD o DQO medidos en el afluente de control al tiempo t 
(mg/l) 
53. El grado de eliminación del COD o de la DQO del medio orgánico en la 
unidad de control es un dato útil para evaluar la actividad de biodegradación 
del lodo activado durante el ensayo. Calcúlese el porcentaje de eliminación 
con ayuda de la ecuación siguiente: 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
donde: 
D B = % de eliminación del COD o de la DQO del medio orgánico de la 
unidad de control al tiempo t 
C M = valores de COD o de DQO del medio orgánico en el afluente de 
control (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
También es posible calcular el porcentaje de eliminación del COD o de la 
DQO debidos al medio orgánico más la sustancia problema en la unidad de 
ensayo, con ayuda de la ecuación siguiente: 
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
donde: 
D T = % de eliminación del COD o de la DQO en la totalidad del afluente 
de ensayo 
C T = valores de COD o de DQO de la totalidad del afluente de ensayo o 
calculados a partir de las soluciones madre (mg/l) 
54. Calcúlese la eliminación de la sustancia problema si se mide con un método 
analítico específico en cada evaluación programada en el tiempo, con ayuda 
de la ecuación siguiente: 
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
donde: 
D ST = % de eliminación primaria de la sustancia problema al tiempo t 
S i = concentración medida o estimada de la sustancia problema en el 
afluente de ensayo (mg/l) 
S e = concentración medida de la sustancia problema en el efluente de 
ensayo al tiempo t (mg/l) 
55. Si se ha utilizado el modo de acoplamiento, compénsese la dilución de la 
sustancia problema en el recipiente de aireación debida al intercambio de lodo utilizando un factor de corrección (véase el apéndice 3). Si se ha 
aplicado un tiempo medio de retención hidráulica de 6 h y el intercambio 
de la mitad del volumen del lodo activado en el recipiente de aireación, es necesario corregir los valores de eliminación determinados diariamente (D
 t , 
punto 52) para obtener el grado real de eliminación, D  tc , de la sustancia 
problema con ayuda de la ecuación siguiente: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Expresión de los resultados del ensayo  
56. Represéntese el porcentaje de eliminación D  t (o D  tc ) y D  st , si está disponi ­
ble, frente al tiempo (véase el apéndice 2). Es posible extraer conclusiones 
sobre el proceso de eliminación a partir de la forma de la curva de elimi ­
nación de la sustancia problema (en sí misma o como COD).  
Adsorción  
57. Si desde el inicio del ensayo se observa una elevada eliminación del COD 
de la sustancia problema, es probable que esta se elimine por adsorción a los 
sólidos del lodo activado. Es posible comprobar este extremo determinando la sustancia problema adsorbida mediante análisis específico. No es normal que la eliminación del COD de sustancias adsorbidas se mantenga elevada 
durante todo el ensayo; normalmente la eliminación es intensa al principio y 
después va cayendo gradualmente hasta alcanzar un valor de equilibrio. Si, no obstante, la sustancia problema adsorbida pudiera causar de alguna forma la aclimatación de la población microbiana, la eliminación del COD de la 
sustancia problema aumentaría posteriormente y alcanzaría un elevado nivel 
de meseta.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Tiempo de latencia  
58. Como en los ensayos estáticos exploratorios, muchas sustancias problema 
requieren una fase de latencia antes de que se produzca la biodegradación plena. En esta fase de latencia tiene lugar la aclimatación o adaptación de 
las bacterias de degradación, sin que haya apenas eliminación de la sustan ­
cia problema; después empieza el crecimiento de estas bacterias. Esta fase termina y se supone que comienza la fase de degradación cuando se ha eliminado alrededor del 10 % de la cantidad inicial de sustancia problema 
(después de tener en cuenta la adsorción, en su caso). La fase de latencia 
suele ser muy variable y poco reproducible.
 
Fase de meseta  
59. La fase de meseta de una curva de eliminación en un ensayo continuo se 
define como la fase en que se produce el máximo de degradación. La fase 
de meseta debe durar al menos 3 semanas y permitir la medición de unos 15 valores válidos.
 
Grado medio de eliminación de la sustancia problema  
60. Calcular la media de los valores de eliminación (D  t ) de la sustancia pro ­
blema en la fase de meseta. Redondeado al entero más próximo (1 %), es el 
grado de eliminación de la sustancia problema. Se recomienda calcular asimismo el intervalo de confianza del 95 % para la media.
 
Eliminación del medio orgánico  
61. Represéntese frente al tiempo el porcentaje de eliminación del COD o de la 
DQO del medio orgánico en la unidad de control (D  B ). Indíquese el grado 
medio de eliminación de la misma forma que con la sustancia problema (punto 60).
 
Indicación de la biodegradación  
62. Si la sustancia problema no se adsorbe significativamente al lodo activado y 
la curva de eliminación tiene la forma típica de una curva de biodegradación con fases de latencia, de degradación y de meseta (puntos 58 y 59), la eliminación medida puede atribuirse con seguridad a la biodegradación. Si 
ha tenido lugar una eliminación inicial importante, el ensayo de simulación 
no puede diferenciar entre el proceso de eliminación biológico y el abiótico. En tales casos, y en otros en que haya alguna duda sobre la biodegradación (por ejemplo, si se produce eliminación), se deben analizar las sustancias 
problema adsorbidas o efectuar ensayos adicionales de biodegradación es ­
tática, con parámetros que indiquen claramente si se trata de procesos bio ­
lógicos. Tales ensayos son los métodos de consumo de oxígeno [capítulo C.4-D, E y F del presente anexo (6)] o un ensayo con medición de la 
producción de dióxido de carbono [capítulo C.4-C del presente 
anexo (6)], o el método del espacio de cabeza de la ISO (18), utilizando un inóculo preexpuesto del ensayo de simulación. Si se han medido tanto la eliminación del COD como la eliminación específica de la sustancia, una 
diferencia significativa (siendo la primera más baja que la segunda) entre los 
porcentajes de eliminación indica la presencia en los efluentes de productos orgánicos intermedios que pueden ser más difíciles de degradar que la sus ­
tancia original.
 
Validez de los resultados del ensayo  
63. Mediante la determinación del grado de eliminación del medio orgánico 
(punto 53) en la unidad de control se consigue información sobre el com ­
portamiento normal de biodegradación del inóculo. Se considera que el ensayo es válido si el grado de eliminación del COD o de la DQO en la 
unidad o unidades de control es > 80 % tras dos semanas y no se han 
observado fenómenos inusuales.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Si se ha utilizado una sustancia (de referencia) fácilmente biodegradable, el 
grado de biodegradación (D  t , punto 52) debe ser > 90 %. 
65. Si el ensayo se realiza en condiciones de nitrificación, la concentración 
media en los efluentes debe ser < 1 mg/l de N amoniacal y < 2 mg/l de N nitroso. 
66. Si no se cumplen estos criterios (puntos 63-65), repítase el ensayo utilizando 
un inóculo de una fuente diferente, sométase a ensayo una sustancia de 
referencia y revísense todos los procedimientos experimentales.
 
Informe del ensayo  
67. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Datos de identificación. 
— Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas.  
Condiciones de ensayo:  
— Tipo de sistema de ensayo, eventuales modificaciones para el ensayo de 
sustancias insolubles y volátiles. 
— Tipo de medio orgánico. 
— Proporción y naturaleza de los residuos industriales presentes en las 
aguas residuales, si se conocen. 
— Inóculo, naturaleza y lugar o lugares de recogida, concentración y posi ­
ble tratamiento previo. 
— Solución madre de sustancia problema: contenido de COD y COT, 
forma de preparación si se trata de una suspensión, concentración utili ­
zada en el ensayo, justificación del eventual recurso a concentraciones fuera de la banda de 10 a 20 mg/l de COD, método de adición, fecha de la primera adición, cambios eventuales. 
— Edad media del lodo y tiempo medio de retención hidráulica, método de 
retirada del lodo, métodos para solucionar la aglomeración, la pérdida de lodo, etc. 
— Técnicas analíticas empleadas. 
— Temperatura del ensayo. 
— Cualidades de la aglomeración del lodo, índice volumétrico de 
lodo (IVL), sólidos en suspensión en el licor mixto (SSLM). 
— Eventuales desviaciones respecto a los procedimientos normalizados y 
circunstancias que puedan afectar a los resultados.  
Resultados del ensayo:  
— Todos los datos medidos (COD, DQO, análisis específicos, pH, tempe ­
ratura, concentración de oxígeno, sólidos en suspensión, sustancias ni ­
trogenadas (cuando sea pertinente). 
— Todos los valores calculados de D
 t (o D  tc ), D  B , D St obtenidos en formato 
tabular y las curvas de eliminación. 
— Información de las fases de latencia y de meseta, duración del ensayo, 
grado de eliminación de la sustancia problema y del medio orgánico en la unidad de control, junto con información estadística y declaraciones 
sobre la biodegradabilidad y la validez del ensayo. 
— Discusión de los resultados.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Swisher RD (1987). "Surfactant Biodegradation", 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, 1085 pp. 
(2) German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents 
in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706. 
(3) Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Med ­
menham, UK. 
(4) Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. 
Res. 12: 909-915. 
(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA. (6) Capítulo C.4 del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad 
"fácil". 
(7) Capítulo C.12 del presente anexo. Biodegradación — Prueba LASC mo ­
dificada. 
(8) Capítulo C.19 del presente anexo. Cálculo del coeficiente de 
adsorción (KOC) en suelos y en lodos de aguas residuales mediante cro ­
matografía líquida de alta resolución (HPLC). 
(9) Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 
3:157-173. 
(10) Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and con ­
clusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55. 
(11) Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp. 113-138, In: Laboratory tests for si ­
mulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. 
Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. 
(12) ISO 11733 (1995; revisada de 2004). Evaluación de la eliminación y de la 
biodegradabilidad de los compuestos orgánicos en medio acuoso-ensayo de 
simulación de lodos activados. 
(13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jorna ­
das Com. Español. Deterg.: 33-48. 
(14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340-343. 
(15) Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. 
Wat. Res. 14: 753-758. 
(16) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF-Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214-220. 
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91- 98 ISBN 011 751661 9. 
(18) ISO 14593 (1998). Calidad del agua-Evaluación de la biodegradabilidad 
final de los compuestos orgánicos en medio acuoso. Método de análisis del 
carbono inorgánico en recipientes cerrados.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Apéndice 1  
Figura 1  
Equipo utilizado para evaluar la biodegradabilidad  
Unidad de Husmann
  
A. Recipiente de almacenamiento 
B. Bomba dosificadora C. Cámara de aireación (3 l de capacidad) D. Recipiente de sedimentación E. Bomba de elevación por aire comprimido 
F. Recipiente de recogida G. Aireador H. Caudalímetro de aire
 
Figura 2  
Equipo utilizado para evaluar la biodegradabilidad  
Depósito poroso
  
A. Recipiente de almacenamiento 
B. Bomba dosificadora C. Recipiente de aireación poroso D. Recipiente impermeable exterior E. Recipiente de recogida 
F. Difusor G. Caudalímetro de aire
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Figura 3  
Detalles del recipiente de aireación con depósito poroso de tres litros
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Apéndice 2  
Ejemplo de curva de eliminación
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Apéndice 3  
[CON CARÁCTER INFORMATIVO]  
ACOPLAMIENTO DE LAS UNIDADES DE ENSAYO 
A fin de equilibrar las poblaciones microbianas de los lodos presentes en la 
unidad de ensayo, que recibe el agua residual más la sustancia problema, y en 
la unidad de control, que solo recibe el agua residual, se introdujo el intercambio diario de lodos (1). El procedimiento se denominó acoplamiento y el método se conoce como el de unidades acopladas. El acoplamiento se llevó a cabo inicial ­
mente utilizando las unidades de lodo activado de Husmann, pero también se ha 
aplicado a unidades de depósito poroso (2) (3). No se han encontrado diferencias significativas entre los resultados obtenidos utilizando unidades acopladas y los obtenidos utilizando unidades no aclopadas, ni con unidades Husmann ni con 
depósitos porosos, por lo que no ofrece ninguna ventaja dedicar tiempo y energía 
a acoplar las unidades. 
Los intercambios de lodos pueden dar la apariencia de una eliminación conside ­
rable, ya que parte de la sustancia problema se transfiere y las concentraciones de 
esta sustancia problema en los efluentes de ensayo y de control llegan a equili ­
brarse más. Así pues, es necesario utilizar factores de corrección, que dependen de la fracción intercambiada y del tiempo medio de retención hidráulica. Se han publicado más detalles del cálculo (1). 
Calcúlese el grado corregido de eliminación de COD o de DQO utilizando la 
fórmula general siguiente: 
D
 tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ% 
donde: 
D tc = porcentaje corregido de eliminación de COD o de DQO 
D t = porcentaje determinado de eliminación de COD o de DQO 
a = fracción intercambiada del volumen de las unidades de lodo activado r = tiempo medio de retención hidráulica (h) Si, por ejemplo, se intercambia la mitad del volumen del tanque de aireación (a = 
0,5) y el tiempo medio de retención hidráulica es de 6 h, la fórmula de correc ­
ción es la siguiente: 
D
 tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled 
Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135. 
(2) Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Acti ­
vated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for Simu ­
lation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. 
(3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Apéndice 4  
EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DEL LODO ACTIVADO  
Procedimiento con sustancias problema  
1. Es posible que una sustancia (o un agua residual) no se degrade ni se elimine 
en el ensayo de simulación, e incluso que tenga un efecto inhibidor sobre los 
microorganismos del lodo. Otras sustancias se biodegradan a pequeñas con ­
centraciones pero son inhibidoras a concentraciones más elevadas (hormesis). Los efectos inhibidores pueden haberse puesto de manifiesto en una fase 
anterior o haberse determinado en un ensayo de toxicidad, utilizando un 
inóculo similar o idéntico al utilizado en el ensayo de simulación (1). Tales métodos son la inhibición del consumo de oxígeno [capítulo C.11 del pre ­
sente anexo (2) y norma ISO 8192(3)] o la inhibición del crecimiento de los 
organismos del lodo [ISO 15522 (4)]. 
2. En el ensayo de simulación, la eventual inhibición se manifiesta en que la 
diferencia en carbono orgánico disuelto (COD) o en demanda química de oxígeno (DQO) entre el efluente del recipiente de ensayo y el del recipiente 
de control es mayor que el COD añadido como sustancia problema. Dicho de 
otra manera, el porcentaje de eliminación de COD [(y de demanda bioquí ­
mica de oxígeno (DBO), de demanda química de oxígeno (DQO) y/o de NH
 + 4 )] del medio orgánico en tratamiento se ve reducido por la presencia de 
la sustancia problema. Si ocurre esto, es necesario repetir el ensayo redu ­
ciendo la concentración de la sustancia problema hasta que se alcance un nivel al que no se produzca inhibición, y quizás reduciendo aún más la concentración hasta que la sustancia problema sea biodegradada. Sin embar ­
go, si la sustancia problema (o el agua residual) tiene efectos negativos sobre 
el proceso a todas las concentraciones ensayadas, se puede deducir que la sustancia es difícil, o incluso imposible, de tratar biológicamente, pero puede merecer la pena repetir el ensayo con lodo activado procedente de otra fuente 
o someter el lodo a una aclimatación más gradual. 
3. Inversamente, si la sustancia problema se bioelimina al primer intento en el 
ensayo de simulación, debe aumentarse su concentración cuando se necesite saber si esta sustancia puede ser inhibidora. 
4. Al tratar de determinar el grado de inhibición, ha de tenerse presente que 
puede cambiar la población del lodo activado, de forma que con el tiempo 
los microorganismos pueden desarrollar tolerancia frente a una sustancia 
inhibidora. 
5. Cálculo del grado de inhibición: 
Los porcentajes generales de eliminación R
 o , de DBO, COD, DQO, etc., de 
las unidades de ensayo y de control pueden calcularse con ayuda de la 
fórmula siguiente: 
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
donde: 
I = concentración de DBO, COD, DQO, etc., en los afluentes de los 
recipientes de ensayo o de control (mg/l) 
E = concentraciones en los efluentes respectivos (mg/l) Es necesario corregir I y E para tener en cuenta el COD debido a la sustancia 
problema en las unidades de ensayo; en caso contario, serán incorrectos los 
cálculos del porcentaje de inhibición.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
El grado de inhibición debido a la presencia de la sustancia problema puede 
calcularse con ayuda de la fórmula siguiente: 
% inhibicion ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
donde: 
R c = porcentaje de eliminación en los recipientes de control 
R t = porcentaje de eliminación en los recipientes de ensayo  
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Reynolds L  et al.  (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259. 
(2) Capítulo C.11 del presente anexo. Biodegradación — Lodo activado: Prueba 
de inhibición de la respiración. 
(3) ISO 8192 (2007): Calidad del agua — Ensayo de inhibición del consumo de 
oxígeno por lodos activados por oxidación del carbono y del amonio. 
(4) ISO 15522 (1999) Calidad del agua — Determinación del efecto inhibidor de 
los componentes del agua sobre los microoganismos de los lodos activados.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Apéndice 5  
Sustancias problema poco hidrosolubles — sustancias volátiles  
Sustancias poco hidrosolubles  
Parece que se han publicado pocos informes sobre la posibilidad de someter las 
sustancias poco hidrosolubles e insolubles a ensayos de simulación del trata ­
miento de las aguas residuales (1) (2) (3). 
No hay un solo método de dispersión de la sustancia problema que pueda 
aplicarse a todas las sustancias insolubles. Parece que dos de los cuatros tipos de métodos descritos en la norma ISO 10634 (4) pueden ser adecuados para 
intentar dispersar las sustancias problema para el ensayo de simulación; consisten 
en el uso de emulgentes y de energía de ultrasonidos. Hay que determinar la estabilidad de la dispersión resultante a lo largo de períodos de al menos 24 h. La 
dispersión estabilizada de forma adecuada en un depósito con agitación constante 
(punto 38) se pasa al tanque de aireación aparte del agua residual doméstica (o sintética). 
Si las dispersiones son estables, investíguese cómo puede determinarse la sus ­
tancia problema en la forma dispersa. Resulta poco probable que el COD sea 
adecuado, por lo que debería establecerse un método analítico específico para la 
sustancia problema que pueda aplicarse a los efluentes, a los sólidos del efluente y al lodo activado. Entonces se determinaría el destino de la sustancia problema en la simulación del proceso del lodo activado, tanto en la fase líquida como en 
la sólida. Por tanto, se establecería un "balance de masas" para decidir si la 
sustancia problema se ha degradado. Sin embargo, de esta forma se indicaría solo la biodegradación primaria. Debe intentarse demostrar la biodegradación final mediante un ensayo de respirometría (capítulo C.4-C, F o D del presente 
anexo) (5) utilizando como inóculo lodo expuesto a la sustancia problema en el 
ensayo de simulación.
 
Sustancias volátiles  
La aplicación de simulaciones de la depuración de agua residual a las sustancias 
volátiles es controvertida y problemática. Igual que en el caso de las sustancias poco hidrosolubles, se encuentran muy pocos informes publicados sobre ensayos de simulación de sustancias volátiles. Se adapta un tipo convencional de aparato 
de mezcla completa sellando los tanques de aireación y de sedimentación, mi ­
diendo y controlando el flujo de aire con caudalímetros y pasando el gas de salida por trampas para recoger la materia orgánica volátil. En ciertos casos se utiliza una bomba de vacío para extraer el gas de salida a través de una trampa 
"fría" o una trampa de purga que contenga Tenax y gel de sílice para efectuar 
después análisis cromatográficos de gases. La sustancia problema presente en la trampa puede determinarse analíticamente. 
El ensayo se lleva a cabo en dos partes. En primer lugar se hacen funcionar las 
unidades sin lodo pero bombeando al tanque de aireación el agua residual sin ­
tética más la sustancia problema. Se toman muestras del afluente, del efluente y del gas de salida, y se analizan para determinar su contenido en sustancia pro ­
blema durante varios días. A partir de los datos obtenidos, es posible calcular el 
porcentaje (R
 vs ) de sustancia problema eliminado del sistema. 
A continuación se efectúa el ensayo biológico normal (con lodo), en condiciones 
de funcionamiento idénticas a las del estudio de eliminación. También se toman mediciones del COD o de la DQO para comprobar que las unidades funcionan de forma eficiente. Se efectúan análisis ocasionales para determinar la presencia de 
sustancia problema en el afluente, en el efluente y en el gas de salida de la 
primera parte del ensayo; tras la aclimatación se efectúan análisis con más frecuencia. También aquí es posible calcular, a partir de los datos del estado de equilibrio, el porcentaje de eliminación de la sustancia problema a partir de la 
fase líquida mediante todos los procesos (R
 T ) (físicos y biológicos), así como la 
proporción (R  V ) eliminada del sistema.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Cálculo 
a) En el ensayo no biológico, es posible calcular el porcentaje (R  VP ) de sustancia 
problema eliminado del sistema con ayuda de la fórmula siguiente: 
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
donde: 
R VP = eliminación de la sustancia problema por volatilización (%), 
S VP = sustancia problema recogida en la trampa, expresada en concentración 
equivalente de la fase líquida (mg/l), 
S IP = concentración de la sustancia problema en el afluente (mg/l). 
b) En el ensayo biológico, es posible calcular el porcentaje (R  V ) de sustancia 
problema eliminado del sistema con ayuda de la fórmula siguiente: 
R V ¼ S V 
S I · 100 
donde: 
R V = eliminación de la sustancia problema por volatilización en el ensayo 
biológico (%), 
S V = sustancia problema recogida en la trampa en el ensayo biológico, 
expresada en concentración equivalente del afluente líquido (mg/l), 
S I = concentración de la sustancia problema en el afluente (mg/l). 
c) En el ensayo biológico, el porcentaje de sustancia problema eliminado por 
todos los procesos viene dado por la fórmula siguiente: 
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
donde: 
S E = concentración de la sustancia problema en el efluente (líquido) (mg/l). 
d) Así pues, el porcentaje (R  BA ) eliminado por biodegradación más adsorción 
puede calcularse con ayuda de la fórmula siguiente: 
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Deben llevarse a cabo ensayos separados para determinar si la sustancia 
problema se adsorbe; en caso afirmativo, es posible aplicar otra corrección 
más. 
e) La comparación entre la proporción de sustancia problema eliminada de los 
sistemas de ensayo biológico (R  v ) y no biológico (R  vp ) indica el efecto 
general que ha tenido el tratamiento biológico sobre la emisión de la sustancia problema a la atmósfera.  
Ejemplo:  Benceno 
Tiempo de retención del lodo = 4 días Agua residual sintética; tiempo de retención = 8 h 
S
 IP = S  I = 150 mg/l 
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l 
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Así pues, 
R VP = 100 %, R  V = 15 % 
R T = 100 % y R  BA = 85 %. 
Se deduce que el benceno no es adsorbido por el lodo.  
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854. 
(2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA. 
(3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97. 
(4) ISO 10634 (1995) Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación y 
tratamiento de los compuestos orgánicos poco solubles en agua para la subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso. 
(5) Capítulo C.4 del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad 
"fácil".
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Apéndice 6  
Efectos del tiempo de retención del lodo (TRL) para el tratamiento de 
las sustancias  
INTRODUCCIÓN 
1. El método descrito en el texto principal se ideó para determinar si las 
sustancias objeto del ensayo (generalmente, aquellas de las que se sabe que son intrísecamente biodegradables, pero no fácilmente biodegradables) pueden biodegradarse dentro de los límites impuestos en las depuradoras de 
aguas residuales. Los resultados se expresan en términos de porcentaje de 
eliminación y de porcentaje de biodegradación. Las condiciones de funcio ­
namiento de las unidades de lodo activado y la elección del afluente per ­
miten variaciones bastante amplias en la concentración de la sustancia pro ­
blema en el efluente. Los ensayos se efectúan a una sola concentración 
nominal o a un solo tiempo nominal de retención del lodo (TRL) y los regímenes de retirada de lodo descritos pueden hacer que el valor del TRL varíe considerablemente tanto de un día a otro como a lo largo de un mismo 
día. 
2. En esta variante (1) (2), el TRL se controla dentro de unos límites mucho 
más estrechos durante la totalidad de cada período de 24 h (igual que sucede 
a gran escala), lo que hace que la concentración en los efluentes sea más 
constante. Se recomienda utilizar agua residual doméstica porque da unos porcentajes de eliminación más constantes y elevados. Asimismo, se inves ­
tigan los efectos de una serie de valores del TRL y es posible determinar en 
un estudio más detallado los efectos de una serie de temperaturas sobre la 
concentración en el efluente. 
3. No hay acuerdo general sobre qué modelos cinéticos son aplicables cuando 
se biodegradan sustancias en las condiciones de la depuración de aguas 
residuales. Se eligió el modelo de Monod de crecimiento bacteriano y de 
utilización del sustrato (1) (2) para aplicarlo a los datos recogidos, ya que el método estaba destinado a aplicarse solo a las sustancias producidas en grandes cantidades, lo que lleva a concentraciones superiores a 1 mg/l en 
las aguas residuales. La validez del modelo simplificado y de las suposi ­
ciones aceptadas se estableció utilizando una serie de etoxilatos de alcohol con diversos grados de biodegradabilidad primaria (2) (3).  
Nota:  Esta variante del método sigue muy de cerca el grueso del texto del 
método de ensayo C.10-A, y a continuación se indican solo los detalles en que difiere.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
4. Se utilizan depósitos porosos de lodo activado, diseñados para facilitar la 
retirada (casi) continua de mezcla líquida para permitir un control muy preciso del tiempo de retención del lodo (TRL, o θ
 s ), en modo sin acopla ­
miento con una serie de TRL y, de forma optativa, con una serie de tem ­
peraturas. El tiempo de retención suele ser de 2 a 10 días y la temperatura 
varía entre 5 y 20 °C. Se introducen en las unidades, por separado, el agua residual, preferentemente de tipo doméstico, y la solución de la sustancia problema, a un caudal que permita alcanzar el tiempo deseado de retención 
del agua residual (de 3 a 6 horas) y la concentración deseada de sustancia 
problema en el afluente. Con fines comparativos, se hacen funcionar en paralelo unidades de control sin sustancia problema. 
5. Pueden utilizarse otros tipos de aparatos, pero debe ponerse mucha atención 
para velar por que se consiga un buen control del TRL. Por ejemplo, cuando 
se utilicen instalaciones que incorporen un sedimentador, puede ser necesa ­
rio tener en cuenta la pérdida de sólidos a través del efluente de la depu ­
radora. Por otra parte, deben tomarse precauciones especiales para evitar 
errores debidos a la variación en la cantidad de lodo presente en el sedi ­
mentador.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Las unidades se hacen funcionar bajo cada conjunto seleccionado de con ­
diciones y, una vez alcanzado el equilibrio, se obtienen a lo largo de unas 
tres semanas las concentraciones medias de la sustancia problema en el estado de equilibrio en los efluentes y, de forma optativa, los valores de COD. Además de evaluar el porcentaje de eliminación de la sustancia 
problema y, opcionalmente, del COD, debe expresarse de forma gráfica la 
relación entre las condiciones de funcionamiento de la instalación y la concentración en el efluente. A partir de aquí pueden calcularse constantes cinéticas orientativas y es posible predecir bajo qué condiciones podrá de ­
purarse la sustancia problema.
 
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
7. Son aplicables los puntos 12 y 13 del capítulo C.10-A.  
UMBRALES 
8. Son aplicables los puntos 14 y 15 del capítulo C.10-A.  
SUSTANCIA DE REFERENCIA 
9. Es aplicable el punto 16 del capítulo C.10-A.  
REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO 
10. Son aplicables los puntos 17 y 18 del capítulo C.10-A.  
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Equipo  
11. Una unidad adecuada es la consituida por el sistema del depósito poroso 
modificado (apéndice 6.1). Consiste en un recipiente interior (o revestimien ­
to) hecho de polipropileno poroso de 3,2 mm de espesor y un diámetro de poro de unos 90 μm, con la junta soldada a tope (de esta manera, la unidad 
es más sólida que la descrita en el punto 21 del presente capítulo, C.10 A). 
El revestimiento se introduce en un recipiente exterior de polietileno imper ­
meable, que consiste en dos partes: una base circular en la que se perforan agujeros para alojar dos tubos de aire y un tubo de retirada de lodo, y un cilindro superior que se atornilla a la base y que tiene una salida situada de 
forma que pase un volumen conocido (3 l) al recipiente del depósito poroso. 
Uno de los tubos de aire está provisto de una piedra difusora y el otro tiene el extremo abierto y está colocado en ángulo recto respecto a la piedra del depósito. Este sistema produce la turbulencia necesaria para garantizar que 
el contenido del depósito se mezcla completamente, y que la concentración 
de oxígeno disuelto es > 2 mg/l. 
12. Se mantiene el número adecuado de unidades a una temperatura controlada 
en el rango de 5 a 20 °C (± 1 °C), bien en baño de agua o bien en salas de 
temperatura constante. Se requieren bombas que introduzcan en los recipien ­
tes de aireación la solución de la sustancia problema y el lodo sedimentado, al caudal necesario (0-1,0 ml/min y 0-25 ml/min, respectivamente), y una tercera bomba que elimine el lodo residual de los recipientes de aireación. El 
caudal necesario, que debe ser muy bajo, de lodo residual se consigue con 
una bomba regulada a un caudal superior y que funcione de forma intermi ­
tente por medio de un temporizador que la active, por ejemplo, durante 10 s cada minuto, si el caudal de la bomba es de 3 ml/min, lo que da un caudal 
de retirada de lodo de 0,5 ml/min.
 
Equipo de filtración o centrífuga  
13. Es aplicable el punto 23 del capítulo C10-A.  
Equipo analítico  
14. Es aplicable el punto 24 del capítulo C.10-A.  
Agua  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Son aplicables los puntos 25 y 26 del capítulo C.10-A.  
Medio orgánico  
16. Es aplicable el punto 27 del capítulo C.10-A.  
Agua residual sintética  
17. Es aplicable el punto 28 del capítulo C.10-A.  
Agua residual doméstica  
18. Es aplicable el punto 29 del capítulo C.10-A.  
Lodo activado  
19. Es aplicable el punto 30 del capítulo C10-A.  
Soluciones madre de sustancia problema  
20. Son aplicables los puntos 31 y 32 del capítulo C.10-A.  
PROCEDIMIENTO  
Preparación del inóculo  
21. Es aplicable solamente el punto 34 del capítulo C.10-A. Utilícese lodo 
activado (con una concentración en torno a 2,5 g/l).  
Número de unidades de ensayo  
22. Para un ensayo sencillo, es decir, para medir el porcentaje de eliminación, 
solo se necesita un único TRL, pero para conseguir los datos necesarios para calcular las constantes cinéticas orientativas hacen falta 4 o 5 valores de 
TRL. Generalmente se eligen valores de entre 2 y 10 días. En la práctica, es 
conveniente efectuar el ensayo con 4 o 5 TRL simultáneamente a una única temperatura; en estudios ampliados se utilizan los mismos valores de TRL, o 
quizá una gama diferente de valores, pero a otras temperaturas en el rango 
de 5 a 20 °C. Para la degradación primaria (uso principal), normalmente solo es necesaria una unidad por conjunto de condiciones. Sin embargo, para estudiar la biodegradabilidad final hay que disponer de una unidad de 
control, con cada conjunto de condiciones, que reciba el agua residual pero 
no la sustancia problema. Si se piensa que la sustancia problema se encuen ­
tra en el agua residual utilizada, será necesario utilizar unidades de control cuando se haga la evaluación de la biodegradación primaria, y aplicar las 
correcciones pertinentes en los cálculos.
 
Introducción del medio orgánico y de la sustancia problema  
23. Aplíquense los puntos 36 a 39 del capítulo C.10-A, pero obsérvese que la 
solución de sustancia problema se introduce aparte y que se utilizan diversas proporciones de retirada de lodo. Debe procederse a medir y ajustar, en caso necesario, en una banda de ± 10 %, los caudales de los afluentes, efluentes 
y lodo retirado, con frecuencia, por ejemplo, dos veces al día. Si se encuen ­
tran dificultades en los métodos analíticos cuando se utiliza agua residual doméstica, efectúese el ensayo con agua residual sintética, pero asegurán ­
dose de que los medios diferentes proporcionan datos cinéticos comparables.
 
Manipulación de las unidades de lodo activado  
24. Son aplicables los puntos 40 a 43 del capítulo C.10-A, pero hay que con ­
trolar el TRL solamente por medio de la retirada "constante" de lodo.  
Muestreo y análisis  
25. Son aplicables los puntos 44 a 50 del capítulo C.10-A, salvo que aquí debe 
determinarse la concentración de la sustancia problema y es opcional la 
determinación del COD; no debe utilizarse la DQO.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
DATOS E INFORME  
Tratamiento de los resultados  
26. Son aplicables los puntos 52 a 54 del capítulo C.10-A.  
Expresión de los resultados del ensayo  
27. Son aplicables los puntos 56 a 62 del capítulo C.10-A.  
Cálculo de las constantes cinéticas  
28. Es más realista indicar la concentración media de la sustancia problema en 
el estado de equilibrio en el efluente y describir cómo varía en función de las condiciones de funcionamiento de la instalación, en lugar de indicar el porcentaje de biodegradación primaria. Puede hacerse atendiendo a la ecua ­
ción (6) del apéndice 6.2, con la que se pueden obtener valores de K
 S , μ m y 
θ SC , que es el tiempo crítico de retención de lodo. 
[Otra posibilidad consiste en obtener valores aproximados de K  S y μm 
utilizando un sencillo programa informático para ajustar a los valores expe ­
rimentales obtenidos la curva teórica calculada a partir de la ecuación 2 (apéndice 6.2). Aunque las eventuales soluciones dadas no serán únicas, 
puede obtenerse una aproximación razonable de K
 S y μ m ]. 
Variabilidad de los resultados  
29. Es una experiencia común obtener valores variables de los parámetros ci ­
néticos para las distintas sustancias. Se piensa que en los valores resultantes 
influyen mucho las condiciones en las que se ha formado el lodo, así como 
las condiciones reinantes durante el ensayo efectuado (como en el punto 5 y en otros ensayos). Grady  et al.  (4) han discutido un aspecto de esta varia ­
bilidad y han sugerido que los términos "existente" e "intrínseca" deben 
aplicarse a dos situaciones extremas que representan los límites del estado 
fisiológico que un cultivo puede alcanzar durante un experimento cinético. Si no se permite que cambie el estado durante el ensayo, los valores de los parámetros cinéticos reflejan las condiciones del ambiente del que se han 
tomado los microorganismos; estos valores se denominan "existentes" o 
presentes en el momento. Al otro extremo, si las condiciones del ensayo son tales que permiten el pleno desarrollo del sistema de síntesis de proteí ­
nas y así alcanzar la tasa de crecimiento más elevada posible, los parámetros 
cinéticos obtenidos se denominan "intrínsecos", y solo dependen de la na ­
turaleza del sustrato y de los tipos de bacterias del cultivo. Como referencia, se obtendrán valores existentes manteniendo baja la proporción de concen ­
tración del sustrato respecto a los microorganismos competentes (S
 o /X o ), por 
ejemplo 0,025, y los valores intrínsecos aparecen cuando la proporción es 
elevada, es decir, de al menos 20. En ambos casos, S  o debe igualar o 
superar al valor pertinente de Ks, la constante de semisaturación. 
30. En un reciente taller de la SETAC (5) se discutieron la variabilidad y otras 
facetas de la cinética de la biodegradación. De tales estudios, tanto de los ya publicados como de los que aún están en fase de proyecto, debe obtenerse 
una visión más clara de la cinética de las depuradoras, a fin de permitir una 
mejor interpretación de los datos disponibles, y para sugerir mejoras de los futuros métodos de ensayo.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornadas 
Com. Español. Deterg.: 33-48. 
(2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340-343. 
(3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742-748. 
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Apéndice 6.1  
Depósito poroso con control del TRL
  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Apéndice 6.2  
Cálculo de las constantes cinéticas  
1. Aceptando que se aplica la cinética de Monod y considerando un balance de 
masas de sólidos activos y de sustrato en todo el sistema de lodo activado (1), pueden obtenerse las siguientes expresiones del estado de equilibrio:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
o 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
donde: 
S 1 = concentración de sustrato en el efluente (mg/l) 
K S = constante de semisaturación, concentración a la que μ = μ m /2 (mg/l) 
μ = tasa de crecimiento específico (d  –1 ) 
μ m = valor máximo de μ m (d –1 ) 
K d = tasa de degradación específica de los sólidos activos (d  –1 ) 
θ S = tiempo medio de retención del lodo, TRL (d) 
Del examen de esta ecuación se deducen las conclusiones siguientes: 
i) la concentración del efluente es independiente de la del afluente (S  0 ); 
por tanto, el porcentaje de biodegradación varía con la concentración del 
afluente, S  0 , 
ii) el único parámetro de control de la instalación que afecta a S  1 es el 
tiempo de retención del lodo, θ S , 
iii) para una concentración dada en el afluente, S  0 , habrá un tiempo crítico 
de retención del lodo tal que:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
donde: 
θ SC = tiempo crítico de retención del lodo, por debajo del cual los 
microorganismos competentes serán arrastrados fuera de la ins ­
talación, 
iv) dado que los demás parámetros de la ecuación (2) están asociados con la 
cinética de crecimiento, es probable que la temperatura afecte al nivel 
del sustrato del efluente y a la edad crítica del lodo, es decir, el tiempo de retención del lodo necesario para obtener cierto grado de depuración aumentará según descienda la temperatura. 
2. A partir del balance de masas de sólidos en el sistema del depósito poroso, y 
aceptando que la concentración de sólidos en el efluente de la instalación, X
 2 , es baja respecto a la del recipiente de aireación, X  1 , el tiempo de 
retención del lodo es:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
y 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
donde: 
V = volumen del recipiente de aireación (l) 
X 1 = concentración de sólidos en el recipiente de aireación (mg/l) 
X 2 = concentración de sólidos en el efluente (mg/l) 
Q 0 = caudal del afluente (l/d) 
Q 1 = caudal del lodo residual (l/d). 
Así pues, es posible fijar el tiempo de retención del lodo a cualquier valor 
preseleccionado mediante el control del caudal del lodo residual, Q  1 . 
Conclusiones: 
3. En consecuencia, el objetivo principal del ensayo consiste en poder prever la 
concentración del efluente y, por tanto, los niveles de sustancia problema en 
las aguas receptoras. 
4. Mediante la representación gráfica de S  1 frente a θ S , a veces puede evaluarse 
fácilmente el tiempo crítico de retención del lodo, θ SC ; véase por ejemplo la 
curva 3 de la figura 1. Cuando esto no es posible, se puede calcular θ SC , 
junto con los valores aproximados de μ m y K  S , representando S  1 frente a 
S 1 •θ S . 
Una reordenación de la ecuación (1) da el resultado siguiente:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Si K  d es pequeña, entonces 1 + θ s · K d ~ 1 y [5] se convierte en lo 
siguiente:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Así pues, la gráfica deberá ser una línea recta (véase la figura 2) de pen ­
diente 1/μ m y ordenada en el origen K  S /μ m ; también θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Figura 1  
Tres temperaturas; cinco TRL
  
Figura 2  
Recta de regresión TRL · S 1 frente a S  1 a T = 5 °C
  
Glosario:  
TRL Concentración del efluente
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Apéndice 7  
ENSAYO CON UN RANGO DE CONCENTRACIONES BAJAS ( μg/l) 
1. En el medio acuático suele haber muchas sustancias presentes, incluso en las 
aguas residuales, a concentraciones muy bajas ( μg/l). A tales concentracio ­
nes, no es probable que sirvan de sustratos primarios que permitan el cre ­
cimiento, pero es más probable que se degraden como sustratos secundarios, 
no responsables del crecimiento, en paralelo con otras diversas sustancias 
carbonadas presentes de forma natural. Por tanto, la degradación de tales sustancias no se ajustará al modelo descrito en el apéndice 6. Hay muchos modelos que podrían aplicarse y, bajo las condiciones reinantes en los 
sistemas de depuración de aguas residuales, podrían estar operativos simul ­
táneamente más de uno. Es mucha la investigación que ha de hacerse todavía para poder resolver este problema. 
2. Mientras tanto, puede seguirse el procedimiento indicado en el texto prin ­
cipal (capítulo C.10-A), pero solo en relación con la biodegradabilidad primaria, utilizando concentraciones suficientemente bajas (< 100 μg/l) y 
un procedimiento analítico validado. Puede calcularse el porcentaje de bio ­
degradación (véase el punto 54 del método de ensayo) siempre que se tengan en cuenta los eventuales procesos abióticos (adsorción, volatilidad, etc.). Puede citarse como ejemplo el estudio de Nyholm y sus asociados (1) 
(2), con un ciclo de 4 h en un sistema de llenado y recogida. Calcularon 
constantes de pseudoprimer orden respecto a 5 sustancias añadidas a un agua residual a concentraciones entre 5 y 100 μg/l. Para la biodegradabili ­
dad final, pueden utilizarse sustancias marcadas con
 14 C. Queda fuera del 
ámbito del presente método de ensayo recoger una descripción de esta 
posibilidad, ya que por ahora no se dispone de procedimientos aprobados, aunque un método propuesto para la norma ISO 14592 (3) contiene orien ­
taciones sobre el uso de sustancias marcadas con
 14 C. 
Prueba LASC  
3. Después se propuso un ensayo más simple en dos etapas (4) (5) (6); el 
método del lodo activado semicontinuo (LASC) va seguido por ensayos cinéticos a corto plazo con muestras tomadas de las unidades de LASC. El sistema LASC funciona con tasas conocidas de retirada de lodo (a dife ­
rencia del método de ensayo C.12 original) y se alimenta con agua residual 
sintética de la OCDE modificada o con agua residual doméstica. El agua residual sintética se modificó (debido a que el valor de pH variaba y a que la capacidad de sedimentación del lodo era baja) por la adición de fosfato 
como amortiguador, extracto de levadura, cloruro de hierro (III) y sales de 
oligoelementos, y se aumentó su DQO hasta alrededor de 750 mg/l por la elevación de la concentración de peptona y extracto de carne. Las unidades 
funcionaban en ciclos de 24 h: aireación durante 23 h, retirada del lodo, 
sedimentación, retirada del sobrenadante (efluente) seguida de la adición del agua residual sintética más la sustancia problema, hasta 100 μg/l, (es decir, a 
la misma concentración aproximadamente que en el ensayo a corto plazo). 
Una vez por semana, el 10 % del lodo total se sustituye con lodo nuevo a 
fin de mantener la población microbiana en equilibrio. 
4. Se miden las concentraciones de la sustancia problema al inicio y al final de 
la aireación, y el ensayo prosigue hasta que se estabilice la eliminación de la 
sustancia problema; esto puede necesitar desde una semana hasta varios meses.
 
Ensayo a corto plazo  
5. Se lleva a cabo un ensayo a corto plazo (por ejemplo, 8 horas) para deter ­
minar la constante cinética de velocidad de (pseudo) primer orden de la 
degradación de la sustancia problema en lodo activado de orígenes e histo ­
riales conocidos pero diferentes. En particular, se toman muestras de lodo de los reactores LASC —al final de un período de aireación cuando la concen ­
tración de sustrato orgánico es baja— durante la realización de un experi ­
mento de aclimatación (puntos 3, 4). También puede tomarse lodo de una
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
unidad paralela de LASC no expuesta a la sustancia problema, con fines 
comparativos. Se airean las mezclas de lodo y de sustancia problema aña ­
dida a dos o más concentraciones en el rango de 1-50 μg/l, sin adición de 
agua residual sintética ni otro sustrato orgánico. Se determina el contenido de sustancia problema que queda en disolución a intervalos periódicos co ­
mo, por ejemplo, cada hora, en función de la degradabilidad de la sustancia, 
durante no más de 24 h. Se centrifugan las muestras antes de someterlas a un análisis adecuado.
 
Cálculos  
6. Los datos de las unidades LASC se utilizan para calcular el porcentaje de 
eliminación de la sustancia problema (punto 54). Asimismo es posible calcu ­
lar la constante media de velocidad, K  1 , (normalizada para tener en cuenta la 
concentración de sólidos en suspensión) con ayuda de la ecuación siguiente: 
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
donde: 
t = tiempo de aireación (23 h) 
C e = concentración al final del período de aireación ( μg/l) 
C i = concentración al inicio de la aireación ( μg/l) 
SS = concentración de sólidos en el lodo activado (mg/l) 
7. En el ensayo a corto plazo, se representa frente al tiempo el log del por ­
centaje de la concentración restante, y la pendiente de la parte inicial (de ­
gradación del 10-50 %) de la gráfica es equivalente a K  1 , la constante de 
(pseudo) primer orden. La constante se normaliza respecto a la concentra ­
ción de sólidos en el lodo dividiendo la pendiente por la concentración de 
sólidos en el lodo. El resultado comunicado debe incluir asimismo datos de las concentraciones iniciales de la sustancia problema y de los sólidos en suspensión, tiempo de retención del lodo, carga y origen del lodo, así como 
datos de la eventual exposición previa a la sustancia problema.
 
Variabilidad de los resultados  
8. En un reciente taller de la SETAC (7) se discutieron la variabilidad y otras 
facetas de la cinética de la biodegradación. De tales estudios, tanto de los ya publicados como de los que aún están en fase de proyecto, debe obtenerse 
una visión más clara de la cinética de las depuradoras, a fin de permitir una 
mejor interpretación de los datos disponibles, y para sugerir mejoras de los futuros métodos de ensayo.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and 
Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge 
reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353. 
(2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510. 
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Calidad del agua. Eva ­
luación de la biodegradabilidad aerobia de compuestos orgánicos a baja 
concentración en el agua.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864. 
(5) Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and estándar 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735. 
(6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biode ­
gradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen. 
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. 
King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biopelículas  
INTRODUCCIÓN 
1. Los ensayos de simulación se aplican normalmente a sustancias que no han 
superado un ensayo exploratorio de la biodegradabilidad fácil [(capítulo C.4- A a F del presente anexo (9)], pero sí han pasado un ensayo de biodegra ­
dabilidad intrínseca. Con carácter excepcional, también se aplican los ensa ­
yos de simulación a cualquier sustancia de la que se requiera más informa ­
ción, especialmente sustancias comercializadas en grandes cantidades, y normalmente se aplica el ensayo del lodo activado (C.10-A). Sin embargo, en ciertas circunstancias, es necesario conseguir información específica re ­
lativa al comportamiento de una sustancia ante métodos de depuración de 
aguas residuales con participación de biopelículas: filtros percoladores o por goteo, biodiscos giratorios, lechos fluidizados. Se han diseñado diversos dispositivos para satisfacer esta necesidad. 
2. Gerike  et al.  (1) han utilizado grandes filtros por goteo de laboratorio, en 
modo de acoplamiento. Estos filtros ocupaban mucho espacio y necsitaban 
volúmenes relativamente grandes de agua residual natural o sintética. Trues ­
dale et al.  (2) han descrito filtros más pequeños (6 pies × 6 pulgadas de 
diámetro) que aceptaban aguas residuales naturales exentas de agentes ten ­
sioactivos, pero seguían necesitando volúmenes bastante grandes. Para que 
se formara una biopelícula "madura" hacían falta hasta 14 semanas, y se 
necesitaba un plazo adicional de 4-8 semanas tras la primera introducción del agente tensioactivo antes de que se realizara la aclimatación. 
3. Baumann  et al.  (3) han desarrollado un filtro mucho más pequeño utilizando 
"lana" de poliéster previamente remojada en lodo activado como medio inerte de soporte de la biopelícula. Se utilizaba como única fuente de car ­
bono la sustancia problema, y se evaluaba la biodegradabilidad a partir de 
mediciones del carbono orgánico disuelto (COD) en el afluente y en el efluente, y de la cantidad de CO
 2 en el gas de salida. 
4. Gloyna  et al.  (4), aplicando un enfoque bastante diferente, inventaron el 
reactor tubular giratorio. Sobre la superficie interna del tubo giratorio se cultivaba una biopelícula sobre un área conocida pasando el afluente intro ­
ducido por la parte superior del tubo, que se encontraba inclinado ligera ­
mente respecto a la horizontal. Este reactor se ha utilizado para estudiar la biodegradabilidad de los tensioactivos (5), y también para investigar el 
espesor óptimo de la biopelícula y la difusión a través de la película (6). 
Estos últimos autores han seguido desarrollando el reactor, incluso modifi ­
cándolo para que pueda determinarse el CO
 2 en el gas de salida. 
5. El Standing Committee of Analysts (Comité Permanente de Analistas del 
Reino Unido) ha adoptado el reactor tubular giratorio como método normal para evaluar tanto la biodegradabilidad de las sustancias (7) como la posi ­
bilidad de tratar las aguas residuales y su toxicidad (8). El método aquí 
descrito reúne las ventajas de ser simple, compacto y reproducible y de necesitar un volumen relativamente reducido de medio orgánico.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
6. A la superficie interna de un tubo inclinado que gira lentamente se aplica 
agua residual sintética o doméstica, y la sustancia problema, mezclada o 
sola. En esa superficie interna se forma una capa de microorganismos, similar a las presentes en los medios de los biofiltros. Las condiciones de trabajo del reactor se eligen de manera que permitan la eliminación ade ­
cuada de la materia orgánica y, cuando sea necesario, la oxidación del 
amonio.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Se recoge el efluente del tubo y se sedimenta y/o se filtra antes de analizarlo 
para determinar la concentración de carbono orgánico disuelto (COD) y/o la 
de la sustancia problema mediante un método específico. Con fines compa ­
rativos, se hacen funcionar en paralelo y bajo las mismas condiciones uni ­
dades de control sin sustancia problema. Se acepta que la diferencia entre 
las concentraciones de COD en los efluentes de las unidades de ensayo y de 
control se debe a la sustancia problema y a sus metabolitos orgánicos. Para calcular la eliminación de la sustancia problema, se compara esta diferencia con la concentración de la sustancia problema añadida (como COD). 
8. Normalmente puede distinguirse la biodegradación de la bioadsorción exa ­
minando atentamente la curva de la eliminación frente al tiempo. General ­
mente puede confirmarse aplicando el ensayo de biodegradación fácil (con ­
sumo de oxígeno o producción de dióxido de carbono) con un inóculo aclimatado, tomado al final del ensayo de los reactores que reciben la sustancia problema.
 
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
9. Es necesario conocer las características de pureza, hidrosolubilidad, volati ­
lidad y adsorción de la sustancia problema para poder interpretar correcta ­
mente los resultados. 
10. Normalmente no es posible hacer el ensayo con sustancias volátiles y poco 
solubles, salvo que se adopten precauciones especiales (véase el apéndice 5 
del capítulo C.10-A). También debe conocerse la estructura química, o al menos la fórmula empírica, para poder calcular los valores teóricos o com ­
probar los valores medidos de ciertos parámetros, como la demanda teórica 
de oxígeno (DTO) o el COD. 
11. El disponer de datos sobre la toxicidad de la sustancia problema para los 
microorganismos (véase el apéndice 4 del capítulo C.10-A) puede ser útil 
para seleccionar las concentraciones adecuadas para el ensayo y puede ser fundamental para interpretar correctamente los valores bajos de biodegrada ­
ción.
 
UMBRALES 
12. Originalmente se exigía que la biodegradación primaria de tensioactivos 
llegara como mínimo al 80 % para poder comercializar la sustancia. Si no 
se alcanza el valor del 80 %, puede aplicarse este ensayo (confirmatorio) de 
simulación y el tensioactivo puede comercializarse solamente si se elimina más del 90 % de la sustancia específica. Con las sustancias en general, no se trata de pasar un umbral sino de que el valor de eliminación porcentual 
pueda utilizarse para calcular aproximadamente la concentración probable en 
el medio ambiente que deba utilizarse en la evaluación del peligro planteado por las sustancias. En una serie de estudios de sustancias puras, se observó que el porcentaje de eliminación del COD era > 90 % en más de las tres 
cuartas partes, y > 80 % en más del 90 %, de las sustancias que mostraban 
un grado significativo de biodegradabilidad.
 
SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
13. Para asegurarse de la correcta ejecución del procedimiento experimental, es 
conveniente someter ocasionalmente a ensayo sustancias de referencia cuyo 
comportamiento se conozca. Entre esas sustancias se cuentan el ácido adí ­
pico, el 2-fenil-fenol, el 1-naftol, el ácido difénico y el ácido 1-naftoico.  
REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS DEL ENSAYO 
14. Un laboratorio del Reino Unido dedujo que la desviación típica relativa era 
del 3,5 % dentro de un ensayo y del 5 % entre ensayos (7).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Equipo  
Reactores tubulares giratorios  
15. El dispositivo (véanse las figuras 1 y 2 del apéndice 8) consiste en un banco 
de tubos acrílicos, cada uno de los cuales mide 30,5 cm de longitud y 5 cm 
de diámetro interior, apoyado en ruedas con borde de caucho, con un marco metálico de soporte. Cada tubo tiene una pestaña exterior, de unos 0,5 cm de profundidad, para mantenerlo sobre las ruedas, la superficie interior se ha 
hecho rugosa con lana de acero basta, y hay una pestaña interior de 0,5 cm 
de profundidad en el extremo superior (de alimentación) para retener el líquido. Los tubos presentan una inclinación de un grado aproximadamente respecto a la horizontal para conseguir el tiempo de contacto necesario 
cuando se aplica el medio de ensayo a un tubo limpio. Las ruedas con 
borde de caucho se hacen girar mediante un motor de velocidad lenta y variable. La temperatura de los tubos está controlada por su instalación en una zona de temperatura constante. 
16. Si se encierra cada reactor de tubos dentro de un tubo taponado, ligeramente 
mayor, y se vela por que las conexiones sean estancas, es posible recoger el 
CO
 2 de salida en una solución alcalina para su medición posterior (6). 
17. En un recipiente de almacenamiento de 20 l se pone el suministro de 24 h, 
para cada tubo, de medio orgánico con la sustancia problema añadida, en su 
caso (A) (véase la figura 2). Cuando sea necesario, se podrá añadir aparte la 
solución de la sustancia problema. Cerca del fondo de cada recipiente de almacenamiento hay una salida conectada mediante los tubos adecuados (por ejemplo, de caucho de silicona) a través de una bomba peristáltica a 
un tubo de alimentación acrílico o de vidrio que se introduce 2-4 cm en el 
extremo superior (alimentación) del tubo inclinado (C). Se deja que el efluente gotee desde el extremo inferior del tubo inclinado para recogerse en otro recipiente de almacenamiento (D). El efluente se somete a sedimen ­
tación o filtración antes de proceder a su análisis.
 
Equipo de filtración y centrífuga  
18. Dispositivo de filtración de muestras con filtros de membrana de porosidad 
adecuada (diámetro de abertura nominal de 0,45 μm) que adsorban sustan ­
cias orgánicas solubles o liberen carbono orgánico en un grado mínimo. Si 
se utilizan filtros que liberan carbono orgánico, lavarlos cuidadosamente con agua caliente para eliminar el carbono orgánico lixiviable. Otra posibilidad es utilizar una centrífuga que pueda alcanzar una aceleración de 40 000 
m/s
 2 . 
19. Equipo analítico para determinar: 
— el COD, el carbono orgánico total (COT), o la demanda química de 
oxígeno (DQO), 
— la sustancia específica (por HPLC, CG, etc.), cuando sea necesario, 
— pH, temperatura, acidez, alcalinidad, 
— amonio, nitrito y nitrato, si los ensayos se efectúan en condiciones de 
nitrificación.  
Agua  
20. Agua del grifo, con menos de 3 mg/l de COD. 
21. Agua destilada o desionizada, con menos de 2 mg/l de COD.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Medio orgánico  
22. Como medio orgánico puede utilizarse agua residual sintética, agua residual 
doméstica o una mezcla de ambos tipos. Se ha observado que el uso de agua residual doméstica sola suele llevar a un mayor porcentaje de eliminación 
del COD (en las unidades de lodo activado) y que incluso permite la 
biodegradación de algunas sustancias que no se biodegradan cuando se utiliza el agua residual sintética de la OCDE. Así pues, se recomienda el uso de agua residual doméstica. Debe medirse la concentración de COD (o 
de DQO) en cada nuevo lote de medio orgánico. Es necesario conocer la 
acidez o la alcalinidad del medio orgánico. Es posible que el medio orgánico requiera la adición de un amortiguador adecuado (carbonato de hidrógeno y 
sodio, o fosfato de hidrógeno y potasio) si es baja su acidez o su alcalinidad, 
para mantener durante el ensayo un pH de alrededor de 7,5 ± 0,5 en el reactor. Debe decidirse en cada caso la cantidad de amortiguador que ha de añadirse, y en qué momento hacerlo.
 
Agua residual sintética  
23. Disuélvase en cada litro de agua del grifo: peptona, 160 mg; extracto de 
carne, 110 mg; urea, 30 mg; fosfato de hidrógeno y dipotasio anhidro (K
 2 HPO  4 ), 28 mg; cloruro de sodio (NaCl), 7 mg; cloruro de calcio dihi ­
dratado (CaCl  2 .2H  2 O), 4 mg; sulfato de magnesio heptahidratado 
(MgSO  4 .7H  2 O), 2 mg. El agua residual sintética de la OCDE es un ejemplo 
y da una concentración media de COD en el afluente de unos 100 mg/l. También es posible utilizar otras composiciones, con la misma concentra ­
ción aproximada de COD, que se acerquen más al agua residual real. El 
agua residual sintética puede elaborarse con agua destilada en forma concen ­
trada y conservarse a alrededor de 1 °C durante una semana como máximo. En el momento en que se necesite, se diluye con agua del grifo. (Este medio no es satisfactorio: la concentración de nitrógeno es muy elevada y el 
contenido de carbono es relativamente bajo, por ejemplo, pero no se ha 
sugerido nada mejor, salvo añadir más fosfato como amortiguador y peptona adicional.)
 
Agua residual doméstica  
24. Debe utilizarse agua residual recién decantada, recogida cada día en una 
depuradora que reciba predominantemente agua residual doméstica. Debe 
recogerse del canal del rebosadero del tanque de sedimentación primaria, o de la alimentación a la instalación de lodo activado, y encontrarse exenta en 
gran medida de partículas gruesas. El agua residual puede seguir utilizán ­
dose tras guardarse varios días a unos 4 °C, si se demuestra que el COD (o la DQO) no ha descendido de forma significativa (es decir, en menos del 20 %) en ese plazo. A fin de limitar las perturbaciones del sistema, el COD 
(o la DQO) de cada lote nuevo debe ajustarse a un nivel constante adecua ­
do, antes de utilizarlo, por ejemplo, mediante dilución con agua del grifo.
 
Lubricante  
25. Puede aplicarse glicerol o aceite de oliva para lubricar los rodillos de la 
bomba peristáltica: ambos productos son adecuados para utilizarse con tubos 
de caucho de silicona.  
Soluciones madre de sustancia problema  
26. Con sustancias de solubilidad adecuada, preparar soluciones madre a con ­
centraciones apropiadas (por ejemplo, de 1 a 5 g/l) en agua desionizada, o en la porción mineral del agua residual sintética. Respecto a las sustancias 
insolubles, véase el apéndice 5 del capítulo C.10-A. Este método no es 
adecuado para las sustancias volátiles si no se modifican los reactores tu ­
bulares (punto 16). Hay que determinar el COD y el COT de la solución madre y repetir las mediciones con cada lote nuevo. Si la diferencia entre el 
COD y el COT es superior al 20 %, ha de comprobarse la hidrosolubilidad 
de la sustancia problema. Comparar con los valores nominales el COD o la
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
concentración de la sustancia problema medida por análisis específico de la 
solución madre, para considerar si la recuperación es suficientemente buena 
(normalmente puede esperarse > 90 %). Ha de evaluarse, especialmente en el caso de las dispersiones, si el COD puede utilizarse como parámetro analítico o si solo es posible utilizar una técnica analítica específica de la 
sustancia problema. En el caso de las dispersiones es necesario centrifugar 
las muestras. Con cada lote nuevo hay que medir el COD, la DQO o la sustancia mediante análisis específico. 
27. Determínese el pH de la solución madre. La presencia de valores extremos 
indica que la adición de la sustancia puede influir en el pH de lodo activado en el sistema de ensayo. En este caso, haya que neutralizar la solución 
madre para obtener un pH de 7 ± 0,5, utilizando pequeñas cantidades de 
ácidos o bases inorgánicos, pero evitando la precipitación de la sustancia problema.
 
PROCEDIMIENTO  
Preparación del medio orgánico para su introducción  
28. Hay que asegurarse de que todos los recipientes del afluente y del efluente, 
así como los tubos que los unen, se limpian a fondo para eliminar la 
eventual proliferación microbiana, tanto al principio como a lo largo del 
ensayo. 
29. Prepárese el agua residual sintética (punto 23) cada día de nuevo, bien a 
partir de los sólidos o bien a partir de la solución madre concentrada mediante la dilución adecuada con agua del grifo. Mídase la cantidad ne ­
cesaria con una probeta y añádase a un recipiente de afluente limpio. Tam ­
bién, cuando sea necesario, añádase al agua residual sintética, antes de la 
dilución, la cantidad necesaria de solución madre de la sustancia problema o de la sustancia de referencia. Si es más conveniente o necesario para evitar pérdidas de la sustancia problema, prepárese una solución diluida aparte de 
la sustancia problema en un depósito aparte y añádase a los tubos inclinados 
mediante una bomba dosificadora diferente. 
30. Otra posibilidad, preferible, es utilizar agua residual doméstica decantada 
(punto 24), recogida de nuevo cada día, cuando sea posible.
 
Funcionamiento de los reactores tubulares giratorios  
31. Para la evaluación de una sola sustancia problema, hacen falta dos reactores 
tubulares idénticos montados en una sala de temperatura constante, normal ­
mente a 22 ± 2 °C. 
32. Ajústense las bombas peristálticas para que lleven un caudal de 250 ± 25 
ml/h de medio orgánico (sin la sustancia problema) a los tubos inclinados, 
que giran a 18 ± 2 rpm. Aplíquese el lubricante (punto 25) a los tubos de la bomba al inicio y periódicamente a lo largo del ensayo, para conseguir un 
funcionamiento adecuado y prolongar la vida de los tubos. 
33. Ajústese el ángulo de inclinación de los tubos respecto a la horizontal para 
conseguir un tiempo de residencia de 125 ± 12,5 s de la alimentación en un 
tubo limpio. Estímese el tiempo de retención añadiendo a la alimentación un 
marcador no biológico (por ejemplo, NaCl, un colorante inerte): se acepta que el tiempo necesario para alcanzar la concentración máxima en el efluente es el tiempo medio de retención (cuando la película es máxima, 
el tiempo de retención puede aumentar hasta unos 30 min). 
34. Se ha comprobado que estas tasas, velocidades y tiempos proporcionan 
retiradas adecuadas (> 80 %) del COD (o de la DQO) y producen efluentes 
nitrificados. La velocidad de flujo debe modificarse si la eliminación es insuficiente o si ha de simularse el comportamiento de una depuradora particular. En este último caso, ajústese la proporción de medio orgánico 
introducido hasta que el comportamiento del reactor se alinee con el de la 
depuradora.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inoculación  
35. La inoculación aérea puede ser suficiente para iniciar el crecimiento de los 
microorganismos cuando se utiliza agua residual sintética; en caso contrario, añádase a la alimentación durante 3 días 1 ml/l de agua residual decantada.
 
Mediciones  
36. A intervalos periódicos, compruébese que las dosis de introducción de 
material y velocidades de giro se ajustan a los límites requeridos. Asimismo, 
mídase el pH del efluente, especialmente si se espera que haya nitrificación.  
Muestreo y análisis  
37. El método, la pauta y la frecuencia del muestreo deben elegirse de manera 
que se ajusten al propósito del ensayo. Por ejemplo, tómense muestras ins ­
tantáneas de afluente y de efluente, o bien recójanse muestras a lo largo de 
un período más largo (por ejemplo, de 3 a 6 h). En el primer período, sin 
sustancia problema, tómense muestras dos veces por semana. Fíltrense las muestras por membrana o centrifúguense a alrededor de 40 000 m/s
 2 durante 
unos 15 min (punto 18). Puede ser necesario sedimentar las muestras y/o 
pasarlas por un filtro grueso antes de proceder a la filtración por membrana. 
Determínese el COD (o la DQO) al menos por duplicado y, en caso nece ­
sario, la DBO y el contenido de amonio y de nitrito/nitrato. 
38. Todos los análisis deben efectuarse lo antes posible tras la recogida y 
preparación de las muestras. Si resulta necesario retrasar un análisis, las 
muestras deben conservarse a unos 4 °C a oscuras, en frascos llenos y bien cerrados. Si es necesario almacenar las muestras durante más de 48 h, hay que conservarlas por congelación, por acidificación o por adición de 
una sustancia tóxica adecuada [por ejemplo, 20 ml/l de una solución de 
cloruro de mercurio (II) de 10 g/l]. Hay que verificar que la técnica de conservación no altera los resultados de los análisis.
 
Período de rodaje  
39. En este período, la biopelícula superficial crece hasta alcanzar un espesor 
óptimo, lo que generalmente necesita unas 2 semanas y no debe superar las 
6 semanas. La eliminación de COD (o de DQO) (punto 44) va aumentando 
hasta alcanzar un valor de meseta. Una vez alcanzada la meseta con un valor similar en ambos tubos, se selecciona uno de ellos como control para el resto del ensayo, durante el cual su comportamiento debe mantenerse cons ­
tante.
 
Introducción de la sustancia problema  
40. Añádase en este momento la sustancia problema al otro reactor, a la concen ­
tración requerida, generalmente de 10 a 20 mg C/l. El control sigue reci ­
biendo solamente el medio orgánico.  
Período de aclimatación  
41. Continúese haciendo los análisis del COD (o de la DQO) dos veces por 
semana y, si hay que evaluar la biodegradabilidad primaria, mídase también 
la concentración de la sustancia problema mediante un análisis específico. 
Déjese de 1 a 6 semanas (o incluso más en condiciones especiales) una vez añadida por primera vez la sustancia problema, para permitir que se dé la aclimatación. Cuando el porcentaje de eliminación (puntos 43 a 45) alcance 
el valor máximo, obténganse de 12 a 15 valores válidos en la fase de meseta 
a lo largo de unas 3 semanas, para evaluar el porcentaje medio de elimina ­
ción. Se considera que el ensayo está completado si se alcanza un nivel suficientemente elevado de eliminación. Normalmente, no debe llegarse a 
una duración del ensayo superior a 12 semanas tras la primera adición de la 
sustancia problema.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Arranque de la película  
42. A intervalos relativamente periódicos, se produce la brusca eliminación de 
grandes cantidades del excedente de película de los tubos, o "arranque". Para garantizar que esto no afecta a la comparabilidad de los resultados, 
permítase que los ensayos abarquen al menos dos ciclos completos de 
crecimiento y de arranque.
 
DATOS E INFORME  
Tratamiento de los resultados  
43. Calcúlese el porcentaje de eliminación de la sustancia problema en términos 
de COD (o de DQO) respecto a cada evaluación programada en el tiempo, con ayuda de la ecuación siguiente: 
D
 t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
donde: 
D t = porcentaje de eliminación del COD (o de la DQO) al tiempo t, 
Cs = concentración de COD (o DQO) en el afluente debida a la sustancia 
problema, de preferencia estimada a partir de la concentración en la solución madre y del volumen añadido de esta (mg/l), 
E = valores de COD (o DQO) medidos en el efluente de ensayo al 
tiempo t (mg/l), 
Eo = valores de COD (o DQO) medidos en el efluente de control al 
tiempo t (mg/l). 
Repítase el cálculo con la eventual sustancia de referencia utilizada.
 
Comportamiento del reactor de control  
44. El grado de eliminación del COD (o de la DQO) (D  B ) del medio orgánico 
en los reactores de control es un dato útil para evaluar la actividad de 
biodegradación de la biopelícula durante el ensayo. Calcúlese el porcentaje de eliminación con ayuda de la ecuación siguiente: 
D
 B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
donde: 
Cm = valores de COD (o de DQO) del medio orgánico en el afluente de 
control (mg/l). 
45. Calcúlese la eliminación (D  ST ) de la sustancia problema si se mide con un 
método analítico específico en cada evaluación programada en el tiempo, con ayuda de la ecuación siguiente: 
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
donde: 
Si = concentración medida o, de preferencia, estimada de la sustancia pro ­
blema en el afluente de ensayo (mg/l), 
Se = concentración medida de la sustancia problema en el efluente de 
ensayo al tiempo t (mg/l).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Si el método analítico da un valor positivo en el agua residual no modifi ­
cada equivalente a S  c mg/l, calcúlese el porcentaje de eliminación (D  SC ) con 
ayuda de la fórmula siguiente: 
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Expresión de los resultados del ensayo  
46. Represéntese el porcentaje de eliminación D  t y D  ST (o D  SC ), si está dispo ­
nible, frente al tiempo (véase el apéndice 2 del capítulo C.10 A). Tómese la 
media (redondeada al número entero más próximo) y la desviación típica de los 12-15 valores de D
 T (y de D  ST , si se dispone de ellos) obtenidos en la 
fase de meseta como porcentaje de eliminación de la sustancia problema. De 
la forma de la curva de eliminación pueden deducirse ciertas conclusiones 
sobre los procesos de eliminación.  
Adsorción  
47. Si al inicio del ensayo se observa una elevada eliminación del COD de la 
sustancia problema, es probable que esta se elimine por adsorción a la biopelícula. Quizá sea posible comprobar este extremo determinando la sustancia problema adsorbida a los sólidos arrancados de la película. 
No es normal que la eliminación del COD de sustancias adsorbibles se 
mantenga elevada durante todo el ensayo; normalmente la eliminación es intensa al principio y después va cayendo gradualmente hasta alcanzar un valor de equilibrio. Si, no obstante, la sustancia problema adsorbida pudiera 
causar de alguna forma la aclimatación de la población microbiana, la 
eliminación del COD de la sustancia problema aumentaría posteriormente y alcanzaría un elevado nivel de meseta.
 
Tiempo de latencia  
48. Como en los ensayos exploratorios estáticos, muchas sustancias problema 
requieren una fase de latencia antes de que se produzca la biodegradación plena. En esta fase de latencia, tiene lugar la aclimatación o adaptación de las bacterias competentes, sin que haya apenas eliminación de la sustancia 
problema; después empieza el crecimiento de estas bacterias. Esta fase 
termina y se acepta arbitrariamente que comienza la fase de degradación cuando se ha eliminado alrededor del 10 % de la cantidad inicial de sus ­
tancia problema (después de tener en cuenta la adsorción, en su caso). La 
fase de latencia suele ser muy variable y poco reproducible.
 
Fase de meseta  
49. La fase de meseta de una curva de eliminación en un ensayo continuo se 
define como la fase en que se produce el máximo de degradación. Esta fase 
debe durar al menos 3 semanas y permitir la medición de unos 12-15 valores válidos.
 
Grado medio de eliminación de la sustancia problema  
50. Calcúlese la media de los valores de eliminación D  t (y D  st , cuando se 
disponga de ellos) de la sustancia problema en la fase de meseta. Redon ­
deado al entero más próximo (1 %), es el grado de eliminación de la sustancia problema. Se recomienda calcular asimismo el intervalo de con ­
fianza del 95 % para la media. De forma análoga, calcúlese el grado medio 
(D
 B ) de eliminación del medio orgánico en el recipiente de control.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Indicación de la biodegradación  
51. Si la sustancia problema no se adsorbe significativamente a la biopelícula y 
la curva de eliminación tiene la forma típica de una curva de biodegradación con fases de latencia, de degradación y de meseta (puntos 48 y 49), la 
eliminación medida puede atribuirse con seguridad a la biodegradación. Si 
ha tenido lugar una eliminación inicial importante, el ensayo de simulación no puede diferenciar entre el proceso de eliminación biológico y el abiótico. En tales casos, y en otros en que haya alguna duda sobre la biodegradación 
(por ejemplo, si se produce eliminación), se deben analizar en muestras de la 
película las sustancias problema adsorbidas o efectuar ensayos adicionales estáticos (exploratorios) de la biodegradación, en relación con parámetros 
que indiquen claramente si se trata de procesos biológicos. Tales ensayos 
son los métodos de consumo de oxígeno (capítulo C.4-D, E y F del presente anexo) (9) o un ensayo con medición de la producción de CO
 2 (capítulo 
C.4-C del presente anexo) o el método del espacio de cabeza (10); debe 
utilizarse como inóculo biopelícula preexpuesta del reactor adecuado. 
52. Si se han medido tanto la eliminación del COD como la eliminación espe ­
cífica de la sustancia, una diferencia significativa (siendo la primera más 
baja que la segunda) entre los porcentajes de eliminación indica la presencia 
en los efluentes de productos orgánicos intermedios que pueden ser más difíciles de degradar; habrá que investigar tales productos.
 
Validez de los resultados del ensayo  
53. Se considera que el ensayo es válido si el grado de eliminación (D  B ) del 
COD (o de la DQO) en las unidades de control es > 80 % tras dos semanas y no se han observado fenómenos inusuales. 
54. Si se ha sometido a ensayo una sustancia (de referencia) fácilmente biode ­
gradable, el grado de biodegradación debe ser > 90 % y la diferencia entre los valores de los duplicados no debe superar el 5 %. Si no se cumplen estos dos criterios, revísense los procedimientos experimentales u obténgase 
agua residual doméstica de otra fuente. 
55. Análogamente, las diferencias entre los valores de la biodegradación de 
unidades duplicadas (en su caso) en que se trate una sustancia problema 
no deben superar el 5 %. Si no se cumple este criterio pero las eliminacio ­
nes son altas, continúese el análisis durante otras tres semanas. Si la elimi ­
nación es baja, investíguense los efectos inhibidores de la sustancia pro ­
blema si no se conocen, y repítase el ensayo con una concentración menor 
de la sustancia problema, cuando sea posible.
 
Informe del ensayo  
56. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Datos de identificación. 
— Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas.  
Condiciones de ensayo:  
— Eventuales modificaciones del sistema de ensayo, especialmente si se 
han estudiado sustancias insolubles o volátiles. 
— Tipo de medio orgánico. 
— Proporción y naturaleza de los residuos industriales presentes en las 
aguas residuales, si se utilizan y conocen. 
— Método de inoculación.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— Solución madre de sustancia problema: contenido en COD (carbono 
orgánico disuelto) y COT (carbono orgánico total), forma de preparación 
si se trata de una suspensión, concentración o concentraciones usadas y justificación si están fuera de la banda de 10 a 20 mg/l de COD, método de adición, fecha de la primera adición, cambios eventuales en la con ­
centración. 
— Tiempo medio de retención hidráulica (sin crecimiento), velocidad de 
giro del tubo, ángulo aproximado de inclinación, si es posible. 
— Detalles del arranque, tiempo e intensidad. 
— Temperatura del ensayo y banda. — Técnicas analíticas empleadas.  
Resultados del ensayo:  
— Todos los datos medidos: COD, DQO, análisis específicos, pH, tempe ­
ratura, sustancias nitrogenadas (cuando sea pertinente). 
— Todos los valores calculados de D
 t (o D  tc ), D  B , D S obtenidos en formato 
tabular y las curvas de eliminación. 
— Información sobre las fases de latencia y de meseta, duración del ensayo, 
grado de eliminación de la sustancia problema, de la sustancia de refe ­
rencia (si se utiliza) y del medio orgánico (en la unidad de control), 
junto con información estadística y declaraciones sobre la biodegradabi ­
lidad y la validez del ensayo. 
— Discusión de los resultados.  
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753-758. 
(2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444. 
(3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF-Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214-220. 
(4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357. 
(5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trick ­
ling filter. JAOCS 43: 92-94. 
(6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881. 
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London. 
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, London. 
(9) Capítulo C.4 del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad 
"fácil" A-F. 
(10) ISO 14593 (1998). Calidad del agua-Evaluación de la biodegradabilidad 
final de las sustancias orgánicas en medio acuoso. Método de análisis del 
carbono inorgánico liberado en recipientes cerrados.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Apéndice 8  
Figura 1  
Tubos giratorios
  
Glosario:  
Planta 
Vista A/B 
Ruedas motrices Ruedas locas Motor Engranaje reductor Pestaña interior Mecanismo basculante Engranaje cónico de transmisión
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Figura 2  
Diagrama de flujo
  
A: Tanque de alimentación 
B: Bomba peristáltica C: Tubo giratorio D: Recipiente de recogida del efluente
 
DEFINICIONES:  
a. Sustancia problema: Toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este 
método de ensayo. 
b. Sustancias: Ha de señalarse que en los acuerdos de la CNUMAD y en los 
documentos subsiguientes se usa el término "producto químico" para referirse a sustancias, productos, mezclas, preparados, o cualesquiera otras denominaciones utilizadas en los sistemas actuales para describir los productos químicos en 
cuestión. En el presente documento se utiliza el término "sustancia" en este 
mismo sentido amplio.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIODEGRADACIÓN  
LODO ACTIVADO: PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA RESPIRACIÓN  
MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El método descrito en este anexo sirve para evaluar el efecto que la 
sustancia objeto de ensayo tiene sobre los microorganismos, mi ­
diendo la tasa de respiración en unas condiciones determinadas y en presencia de concentraciones diferentes de la misma. 
El propósito de este método consiste en establecer un método de 
investigación rápido por el que se puedan identificar las sustancias 
que afectan de manera adversa a las plantas de tratamiento micro ­
biano aeróbico, así como indicar las concentraciones no inhibitorias apropiadas de las sustancias objeto de ensayo que vayan a ser utili ­
zadas en las pruebas de biodegradabilidad. 
Una prueba preliminar puede realizarse antes de la prueba definitiva. 
Esta nos facilitará información acerca del rango de concentraciones 
que deben utilizarse en la prueba final. 
Al proyectar la prueba se incluyen dos muestras control sin la sus ­
tancia objeto de ensayo, una al principio y otra al final de la serie de 
pruebas. Cada lote de lodo activado debe ser revisado utilizando una sustancia de referencia, 
Este método es más fácilmente aplicable a sustancias que, debido a 
su solubilidad en agua y a su baja volatilidad, es probable que permanezcan en el agua. 
Para sustancias con solubilidad limitada en el medio de prueba, 
puede que no sea posible la determinación del valor CE
 50 . 
Cuando la sustancia de prueba es propensa a provocar la fosforila ­
ción oxídativa, los resultados basados en la disminución de oxígeno 
pueden conducir a conclusiones erróneas. 
Para realizar el ensayo conviene disponer de la siguiente informa ­
ción: 
— solubilidad en agua, — presión de vapor, — fórmula estructural, 
— pureza de la sustancia objeto del ensayo.
 
Recomendación.  
El lodo activado puede contener organismos potencialmente patóge ­
nos; manéjese con cuidado.  
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES 
La tasa de respiración es el consumo de oxígeno que tiene lugar en 
el lodo activado en condiciones aerobias por los microorganismos 
procedentes de aguas residuales; se expresa generalmente en mg O  2 
por mg de lodo en una hora.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Para poder calcular el efecto inhibitorio de una sustancia de prueba a 
una determinada concentración, la tasa de respiración se expresa 
como porcentaje de la media de las tasas de respiración de las dos muestras control:
 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
Ü 100 ¼ parcentajeinhibiciún  
donde: 
R s = consumo de oxígeno de la sustancia de prueba a la concen ­
tración utilizada en el ensayo 
RC 1 = consumo de oxígeno de la muestra control 1 
RC 2 = consumo de oxígeno de la muestra control 2. 
En este método el valor CE  50 expresa la concentración de la sustan ­
cia de prueba en la que la tasa de respiración es el 50 % de la obtenida en la muestra control, en las condiciones descritas en el 
método de ensayo.
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Como sustancia de referencia, se recomienda utilizar 3,5-didorofenol, 
conocido inhibidor de la respiración, efectuando una prueba para determinar el valor de CE
 50 en cada lote de lodo activado, a fin 
de comprobar que la sensibilidad del lodo no es anormal.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
La tasa de respiración de un lodo activado alimentado con una 
cantidad estándar de agua residual sintética, se determina después 
de un tiempo de contacto de 30 minutos, o de 3 horas, o de ambos. La tasa de respiración del mismo lodo activado se mide también en presencia de varias concentraciones de la sustancia de prueba y en 
condiciones idénticas. El efecto inhibitorio de la sustancia de prueba, 
a una determinada concentración, se expresa como porcentaje de la media de las tasas de respiración de dos muestras control. El valor de CE
 50 se calcula mediante determinaciones realizadas a diferentes 
concentraciones.  
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
Los resultados de la prueba son válidos si: 
— las tasas de respiración de las muestras de control difieren una de 
la otra en menos de 15 %, 
— el valor de CE  50 (30 minutos y/o tres horas) del 3,5-diclorofenol 
está dentro de los límites aceptados de 5 a 30 mg/l.  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Reactivos  
1.6.1.1. S o l u c i o n e s d e l a s u s t a n c i a d e p r u e b a 
Las soluciones de la sustancia objeto del ensaya se preparan en el 
momento de comenzar el estudio, usando una solución madre. Para 
esta solución, es apropiada una concentración de 0,5 gr/l, si se sigue 
el procedimiento recomendado más abajo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. S o l u c i ó n d e l a s u s t a n c i a d e c o n t r o l 
Puede prepararse por ejemplo una Solución de 3,5-diclorofenol di ­
solviendo 0,5 g de 3,5-diclorofenol en 10 ml de NaOH, 1 M, dilu ­
yendo esta mezcla con agua destilada hasta un volumen de 30 ml 
aproximadamente, añadiendo a continuación y a la ver que se agita 
H 2 SO 4 0,5 M hasta el punto de precipitación incipiente, para lo que 
se requieren 8 ml aproximadamente de H  2 SO 4 0,5 M, y finalmente 
diluyendo la mezcla con agua destilada hasta obtener un litro de 
solución. El pH de esta solución deberá estar entre 7 y 8.  
1.6.1.3. A g u a s r e s i d u a l e s s i n t é t i c a s 
El agua residual sintética para alimentación de los lodos se obtiene 
disolviendo las siguientes cantidades de sustancias en un litro de agua: 
— 16 g de peptona, — 11 g de extracto de carne, — 3 g de urea, — 0,7 g de NaCl, — 0,4 g de CaCl
 2 2H 2 O, 
— 0,2 g de MgSo  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g de K  2 HPO  4 . 
Nota 1:  Estas aguas residuales sintéticas están 100 veces más con ­
centradas que las descritas en el Informe Técnico de la OCDE, 
«Método propuesto para la determinación de la biodegradabilidad 
de los tensoactivos utilizados en los detergentes sintéticos» del 11 de junio de 1976; además se les añade fosfato bipotásico.  
Nota 2:  Si el medio así preparado no va a utilizarse inmediatamente, 
deberá conservarse en la oscuridad y a una temperatura de 0 a 4
 o C, 
durante un período que no exceda de una semana y en condiciones que no provoquen cambio alguno en su composición. También puede esterilizarse antes de su conservación, o bien añadir los ex ­
tractos de peptona y carne poco antes de efectuar la prueba. Antes de 
utilizar la solución, deberá mezclarse a fondo y regular su pH.
 
1.6.2.  Aparato de medida  
El dibujo exacto no es crítico. Sin embargo, no debe quedar espacio 
en la cabeza y la muestra debe encajar herméticamente en el cuello del frasco de medida. 
Se necesita un equipamiento normal de laboratorio y, especialmente, 
lo siguiente: 
— aparato de medida, — dispositivo de aireación, — electrodo de pH y equipo de medida, — electrodo de O
 2 . 
1.6.3.  Preparación del inóculo  
El inóculo microbiano para esta prueba proviene del lodo activado 
procedente de una planta de tratamiento de aguas residuales predo ­
minantemente domésticas. 
Si es necesario, al volver al laboratorio, pueden eliminarse las par ­
tículas gruesas o grumos dejando sedimentar un poco, por ejemplo durante 15 minutos, y decantando la capa superior de sólidos más 
finos para su uso. También puede mezclarse el lodo con un mez ­
clador durante algunos segundos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Si se piensa que puede hallarse presente material inhibidor, deberá 
lavarse el lodo con agua corriente o con una solución isotómica. 
Después de centrifugar se decanta el sobrenadante (este procedi ­
miento se repite tres veces). 
Seguidamente, se pesa y se seca una pequeña cantidad de lodo 
lavado. A partir de estos resultados, se puede calcular la cantidad 
de lodo húmedo que debe ser suspendida en agua para obtener un lodo activado con un rango de concentración de sólidos en suspen ­
sión de 2 a 4 gr/l. Este nivel supone una concentración entre 0,8 y 
1,6 gr/l en el medio de prueba, si se sigue el procedimiento reco ­
mendado más adelante. 
Si no pudiera utilizarse el lodo el mismo día en que se ha recogido, 
se añadirán 50 ml de aguas residuales sintéticas a cada litro de lodo 
activado que haya sido preparado como se describe anteriormente; esta mezcla se airea durante la noche a una temperatura de 20 ± 2
 o C, y se mantiene en estas condiciones durante el día, preparado 
para su utilización, Antes de utilizarlo, se comprueba el pH y, si es 
necesario, este se ajusta hasta un valor de entre 6,0 y 8,0. El nivel de sólidos en suspensión se determina como se describe en el párrafo anterior. 
Si en días posteriores (cuatro como máximo), es necesario utilizar el 
mismo lote de lodo, se le añaden 50 ml de aguas residuales sintéticas por litro de lodo al final de cada día de trabajo.
 
1.6.4.  Realización de la prueba  
Duración/tiempo de con ­
tacto: 30 minutos y/o 3 horas, tiempo durante 
el cual tiene lugar la aireación. 
Agua: Agua potable (si es necesario, declora ­
da). 
Suministro de aire: Aire limpio, sin aceite. Caudal de aire 
de 0,5 a 1 litro/minuto. 
Aparato de medida: Matraz de fondo plano, como por ejem ­
plo, un frasco DBO (véase la figura 1). 
Medidor de oxígeno: Electrodo de oxígeno adecuado, con un 
registrador. 
Solución nutritiva: Aguas residuales sintéticas (véase más 
arriba). 
Sustancia de prueba: La solución de prueba se prepara en el 
momento de comenzar la prueba. 
Sustancia de referencia: Por ejemplo, 3,5-diclorofenol (tres con ­
centraciones como mínimo). 
Muestra de control: Muestra inoculada sin sustancia de 
prueba. 
Temperatura: 20 ± 2  o C. 
A continuación se sugiere un procedimiento experimental, que puede 
seguirse para ambas sustancias, la de prueba y la de referencia, y 
para un período de contacto de 3 horas: 
Se utilizan varios recipientes (por ejemplo, vasos de precipitado de 1 
litro), 
Se usarán como mínimo cinco concentraciones, distanciadas por un 
factor constante que, preferiblemente, no exceda de 3,2. 
A tiempo «O», se mezclan 16 ml de cultivo de aguas residuales 
sintéticas con agua, hasta obtener 300 mi, a los que se añaden 
200 ml de inóculo microbiano, y la mezcla total (500 ml) se vierte 
en el primer recipiente (primera muestra de control, C  t ). Los reci ­
pientes de la prueba deberán airearse continuamente para asegurar que el O
 2 disuelto no se hace menor de 2,5 mg/l y que, justo antes 
de la medida de la tasa de respiración, la concentración de O  2 deberá 
ser de unos 6,5 mg/l.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
A los 15 minutos (15 minutos es un intervalo arbitrario, aunque 
conveniente), se repite el procedimiento anterior, con la diferencia 
de que, antes de añadir agua hasta llegar a 300 ml e inóculo mi ­
crobiano hasta obtener un volumen de 500 ml, se añaden 100 ml de la solución madre de sustancia de prueba a los 16 ml de aguas 
residuales sintéticas. Seguidamente, esta mezcla se vierte en un se ­
gundo recipiente y se airea como se ha expuesto anteriormente. Este proceso se repite a intervalos de 15 minutos con diferentes volúme ­
nes de solución madre de sustancia de prueba, para obtener una serie 
de recipientes que contengan concentraciones diferentes de la sus ­
tancia de prueba, Finalmente, se prepara una segunda muestra de control (C
 2 ). 
Después de tres horas se mide el pH y se vierte bien mezclado el 
contenido del primer recipiente en el aparato de medida, en el que se mide la tasa de respiración durante un período de hasta 10 minutos. 
Esta determinación se repite a intervalos de 15 minutos con el con ­
tenido de cada recipiente, de tal manera que el tiempo de contacto de 
cada recipiente sea de 3 horas. 
La sustancia de referencia se prueba en cada lote de inóculo micro ­
biano siguiendo el mismo procedimiento. 
Cuando vayan a tomarse las medidas después de 30 minutos de 
contacto, se necesitará un régimen diferente (por ejemplo, más de 
un medidor de oxígeno). 
Cuando sea necesario medir el consumo químico de oxígeno, se 
preparan más recipientes que contengan la sustancia de prueba, el 
medio nutriente de aguas residuales sintéticas y agua, pero no lodo activado. 
El consumo de oxígeno se mide y se registra después de un tiempo 
de aireación de 30 minutos y/o de tres horas (tiempo de contacto).
 
2. DATOS Y EVALUACIÓN  
La tasa de respiración se calcula a partir del trazado del registrador 
en mg O  2 /l.h, con valores aproximados de entre: 6,5 mg O  2 /l y 2,5 
mg O  2 /l, o cuando la tasa de respiración sea baja, durante un período 
de 10 minutos. La parte de la curva de respiración sobre la que se mide la tasa de respiración debe ser lineal. 
Cuando las tasas de respiración de las dos muestras de control di ­
fieran en más del 15 por ciento o el valor de CE
 50 (30 minutos y/o 3 
horas) de la sustancia de referencia no quede dentro de la gama 
aceptada (de 5 a 30 mg/l para el 3,5-diclorofenol), la prueba no será válida y deberá repetirse. 
El porcentaje de inhibición se calcula para cada concentración de 
prueba como se ha descrito anteriormente, y se representa gráfica ­
mente en función de la concentración en un papel logarítmico normal 
(o logaritmo-probabilidad); para obtener el valor de CE
 50 . 
Los límites de confianza del 95 % de los valores de CE  50 se pueden 
determinar usando procedimientos establecidos.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DE LA PRUEBA 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— sustancia de prueba: datos de identificación química, — sistema de prueba: fuente, concentración y cualquier tratamiento 
previo del lodo activado, 
— condiciones de la prueba: 
— pH de la mezcla de reacción antes de la medición de la 
respiración, 
— temperatura de prueba, — duración de la prueba, — sustancia de referencia y su valor medido de CE
 50 , 
— absorción abiótica de oxígeno (si la hubiere), 
— resultados: 
— todos los datos medidos, — curva de inhibición y método para calcular el valor de CE
 50 , 
— valor de CE  50 y, si es posible, límites de confianza del 95 %, 
CE 10 y CE  10 , 
— todas las observaciones y cualquier desviación de este mé ­
todo de prueba que pueda haber influido sobre el resultado.  
3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS 
El valor de CE  50 se considerará solamente como indicación de los 
probables efectos tóxicos de la sustancia de prueba sobre los mi ­
croorganismos de aguas residuales o de depuración de lodo activado, si se tiene en cuenta que las complejas interacciones que ocurren en el medio ambiente no pueden ser simuladas con precisión de una 
prueba de laboratorio. Además, las Sustancias de prueba que pueden 
ejercer un efecto inhibitorio sobre la oxidación amónica pueden producir también curvas de inhibición atípicas. En razón de esto, dichas curvas deberán interpretarse con cautela.
 
REFERENCIAS  
(1) International Standard ISO 8192-1986. 
(2) Broccker, B., and Zahn, R.,  Water Research  11, 165 (1977). 
(3) Brown, D., Hitz, H. R., and Schaefer, L.,  Chemosphere  10, 245 
(1981). 
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries),  Recommended Method  No. 103, also 
describid  by: 
(5) Robra, B.,  Vasser/Abwasser  117, 80 (1976). 
(6) Schefer, W.,  Textilveredlung  6, 247 (1977). 
(7) OCDE, París, 1981,  Directriz para pruebas 209,  Decisión del 
Consejo C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIODEGRADACIÓN  
PRUEBA LASC MODIFICADA  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El objetivo del método es la evaluación del potencial de biodegra ­
dabilídad última o total de sustancias orgánicas hidrosolubles y no- volátiles, cuando se exponen a concentraciones relativamente altas de microorganismos durante un largo período de tiempo. Se mantiene 
durante este período la viabilidad de los microorganismos añadiendo 
diariamente una alimentación de aguas residuales decantadas. Para las necesidades del fin de semana, pueden almacenarse las aguas 
residuales a 4
 o C. Pueden emplearse como alternativa las aguas 
residuales sintéticas de la prueba de confirmación OCDE. 
Puede producirse una absorción fisicoquímica sobre los sólidos en 
suspensión, y este hecho deberá tomarse en cuenta al interpretar los resultados (véase el punto 3.2). 
Debido al largo período de retención de la fase líquida (36 horas) y a 
la adición intermitente de nutrientes, la prueba no simula las condi ­
ciones reinantes en una planta depuradora de aguas residuales. Los resultados obtenidos con diversas sustancias de prueba indican que la 
prueba tiene un elevado potencial de biodegradación. 
Las condiciones que la prueba establece son muy favorables a la 
selección y/o adaptación de microorganismos capaces de degradar el compuesto de prueba (el procedimiento puede utilizarse también para 
obtener inóculos aclimatados destinados a emplearse en otras prue ­
bas). 
En este método se emplea la medida de la concentración del carbono 
orgánico disuelto para evaluar la biodegradabilidad total de las sus ­
tancias de prueba. Resulta preferible determinar el COD por acidifi ­
cación y purgado más que por la diferencia de C
 total -C iriorginico.  . 
El empleo simultáneo de un método analítico específico puede per ­
mitir también evaluar la degradación primaria de la sustancia (desa ­
parición de la estructura química madre). 
El método solo es aplicable a las sustancias orgánicas de prueba que, 
a la concentración empleada en la prueba, 
— sean solubles en agua, (como mínima, 20 mg de carbono orgá ­
nico dísuelto/l), 
— posean una presión de vapor despreciable, — no posean efecto inhibidor sobre las bacterias, — no se absorban significativamente dentro del sistema de prueba, 
— no escapen de la solución de prueba por formación de espumas. 
Deberá determinarse el contenido de carbono orgánico del material 
de prueba.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Para interpretar los resultados obtenidos, será útil la información 
sobre las proporciones relativas de los principales componentes de 
la sustancia de prueba, particularmente en los casos para los que los resultados sean bajos o marginales. 
Para la interpretación de resultados bajos y para la selección de una 
concentración de prueba idónea podrá ser útil la información sobre la toxicidad de la sustancia de prueba para los microorganismos.
 
1.2. DEFINICIONES DE U NIDADES 
C T = concentración del compuesto de prueba como carbono orgá ­
nico presente o añadido a las aguas residuales sedimentadas al 
comienzo del período de aireación (mg/l). 
C 2 = concentración del carbono orgánico disuelto, encontrada en el 
líquido sobrenadante de la prueba al término del período de 
aireación (mg/l). 
C c = concentración del carbono orgánico disuelto, encontrada en el 
líquido sobrenadante del control al término del período de aireación (mg/l). 
En este método, la biodegradación se define como la desaparición 
del carbono orgánico. La biodegradación puede expresarse como: 
1. La eliminación porcentual  D
 2d de la cantidad de sustancia añadida 
diariamente;  
D da ¼ C t Ä ðC t Ä C c Þ 
C t Ü 100 [1] 
D ad = degradación/adición diaria. 
2. La eliminación porcentual D  id de la cantidad de sustancia presente 
al inicio de cada día: 
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100 [2 (a)] 
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2 (b)] 
D sid = degradación/substancia al inicio del día. 
Donde los índices i e (i + 1) se refieren al día de la medición. 
Se recomienda la ecuación [2 a)] si el COD efluente varía de día a 
día, mientras que la ecuación [2 b)] puede emplearse cuando el COD 
efluente permanezca relativamente constante de un día para otro.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
En algunos casos, al investigar una sustancia nueva, serán útiles las 
sustancias de referencia; sin embargo, no se recomienda en el mé ­
todo ninguna sustancia de referencia específica. 
Se proporcionan los datos de diversos compuestos evaluados en 
pruebas efectuadas en varios laboratorios (véase el anexo 1). En principio esto puede ser llevado a cabo periódicamente como cali ­
bración del método y para comparar los resultados obtenidos cuando 
se emplea un método distinto.
 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE LA PRUEBA 
Se coloca en una unidad de lodo activado semicontinuo (LASC) lodo 
activado procedente de una planta depuradora de aguas residuales. Se añaden el compuesto de prueba y aguas residuales domésticas 
decantadas, aireándose la mezcla durante 23 horas. Se interrumpe 
entonces la aireación, permitiéndose que el lodo se deposite por sedimentación y retirándose el líquido sobrenadante. 
Se mezcla a continuación el lodo que permanece en la cámara de 
aireación con una cantidad igual del compuesto de prueba y de aguas 
residuales, repitiéndose el ciclo. 
La biodegradación se determina por el contenido en carbono orgá ­
nico disuelto del líquido sobrenadante. Se compara dicho valor con 
el obtenido en un tubo de control en el que se han introducido solo aguas residuales decantadas. 
Cuando se utiliza un método analítico específico, pueden medirse los 
cambios en la concentración de la molécula madre debidos a la 
biodegradación (biodegradabilidad primaria).
 
1.5. CRITERIOS DE CALIDAD 
No ha sido bien establecida aún la reproducibilidad de este método 
basado en la eliminación del carbono orgánico disuelto (cuando se considera la biodegradación primaria, se obtienen datos muy precisos 
para las sustancias degradadas en gran medida), 
La sensibilidad del método viene determinada en gran parte por la 
variabilidad del control y, en menor grado, por la precisión de la determinación del carbono orgánico disuelto y por el contenido del 
compuesto de prueba en el líquido al comienzo de cada ciclo.
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA  
1.6.1.  Preparativos  
Se reúne un número suficiente de unidades limpias de aireación 
(también puede usarse alternativamente la unidad original de prueba 
LASC de 1,5 l) y de tubos de entrada de aire (figura 1) para cada 
sustancia de prueba  y para los controles. El aire comprimido sumi ­
nistrada a las unidades de prueba, que se purifica pasándolo por un filtro de lana de algodón, debe hallarse exento de carbono orgánico y 
presaturado con agua, a fin de reducir las pérdidas por evaporación. 
Se toma una muestra de líquido mixto, que contenga de 1 a 4 g de 
sólidos en suspensión por litro de una central depuradora de lodo activado en la que se depuren sobre todo aguas residuales domésti ­
cas. Para cada unidad de aireación se requieren aproximadamente 
150 ml de líquido mixto.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Se preparan en agua destilada soluciones madre de la sustancia de 
prueba; la concentración exigida normalmente es de 400 mg/l como 
carbono orgánico, lo que supone una concentración del compuesto de prueba de 20 mg/l de carbono al inicio de cada ciclo de aireación, si no tiene lugar una biodegradación. 
Pueden emplearse concentraciones más altas si la toxicidad frente a 
los microorganismos lo permite. 
Se mide el contenido en carbono orgánico de las soluciones madre.
 
1.6.2.  Condiciones de la prueba  
La prueba deberá llevarse a cabo a 20 a 25  o C. 
Se utiliza una concentración elevada de microorganismos aerobios 
(de 1 a 4 g/l de sólidos en suspensión), y el período efectivo de 
retención es de 36 horas. La materia carbonada existente en las aguas 
residuales que sirven de alimentación resulta oxidada en gran medi ­
da, normalmente al cabo de 8 horas tras el inicio de cada ciclo de aireación. A continuación, el lodo respira endógenamente durante el 
resto del período de aireación, siendo entonces el compuesto de 
prueba el único sustrato disponible, a menos que este resulte también rápidamente metabolizado. Estos factores, junto con el de la reino ­
culación diaria de la solución de prueba cuando se utilizan como 
medio aguas residuales domesticas, ofrecen condiciones muy favora ­
bles para que se produzcan la aclimatación y un alto grado de biodegradación.
 
1.6.3.  Ejecución de la prueba  
Se toma una muestra de líquido mixto de una estación de depuración 
de lodo activado predominantemente de origen doméstico, ó bien de un laboratorio, y se mantiene en condiciones aerobias hasta em ­
plearla en el laboratorio. Se llena cada unidad de aireación, y la 
unidad de control, con 150 ml (si se utiliza la unidad original de' prueba LASC, deben multiplicarse los volúmenes dados por 10) de líquido mixto, y se da inicio a la aireación. Transcurridas 23 horas, 
se interrumpe la aireación y se permite que el lodo sedimente durante 
45 minutos. Se abre sucesivamente la espita de cada recipiente, y se retiran de cada uno 100 ml del líquido sobrenadante. Se toma, in ­
mediatamente antes de su uso, una muestra de aguas residuales 
domésticas decantadas y se añaden 100 ml al lodo que permanece 
en cada unidad de aireación. Se vuelve a comenzar la aireación. En esta fase no se añaden sustancias de prueba, y las unidades se alimentan diariamente con aguas residuales domésticas solo hasta 
que se obtenga un líquido sobrenadante transparente después de la 
decantación. El tiempo necesario para ello es por lo general de 2 semanas, transcurridas las cuales el carbono orgánico disuelto con ­
tenido en el líquido sobrenadante al término de cada ciclo de airea ­
ción se acerca a un valor constante, 
Al término de este período, se mezclan Jos diferentes lodos decan ­
tados, y se añaden a cada unidad 50 mL del lodo compuesto resul ­
tante. 
Se añaden 95 ml de aguas residuales decantadas y 5 ml de agua a las 
unidades control; por su parte, a las unidades de ensayo se añaden 
95 ml de aguas residuales decantadas y 5 ml de la solución madre 
(400 mg/l) del compuesto en estudio. Se recomienza la aireación y se mantiene durante 23 horas. Se deja entonces que el lodo decante durante 45 minutos, recogiéndose a continuación el líquido sobrena ­
dante y analizándose el mismo, a fin de establecer su contenido en 
carbono orgánico disuelto. 
Se repite diariamente durante toda la duración de la prueba el pro ­
cedimiento mencionado de llenado y recogida.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Antes de la sedimentación, puede resultar necesario limpiar las pa ­
redes de las unidades para impedir que se acumulen sólidos por 
encima del nivel de líquido. Se utiliza para cada unidad un raspador o un cepillo individual, a fin de impedir que se produzca una con ­
taminación cruzada. 
Idealmente, eí carbono orgánico disuelto en los líquidos sobrenadan ­
tes se determinará diariamente, aunque puede permitirse una frecuen ­
cia menor de análisis. Antes de efectuar el análisis, se filtran los 
líquidos a través de filtros de membrana de 0,45 μm lavados o se 
centrifugan los mismos. Los filtros de membrana son adecuados si es seguro que ni liberan carbono ni absorben sustancia en la fase de filtración. La temperatura de la muestra no debe superar los 40
 o C 
mientras se halle dentro de la centrífuga. 
La duración de la prueba para compuestos con poca o 
ninguna degradación es indeterminada, pero la experiencia sugiere 
que generalmente debería alcanzar al menos 12 semanas, sin superar 
las 26.  
2. DATOS Y EVALUACIÓN  
Se representan en un diagrama frente al tiempo, los valores del 
carbono orgánico disuelto en los líquidos sobrenadantes de las uni ­
dades de prueba y de las unidades de control. 
Según se va produciendo la biodegradación, el nivel encontrado en 
la muestra se aproximará al nivel del control. Una vez que la dife ­
rencia entre los dos niveles resulta constante para tres medidas con ­
secutivas, se efectúa el número de medidas adicionales que sea su ­
ficiente para permitir el tratamiento estadístico de los datos, y se 
calcula con ellos la biodegradación porcentual del compuesto de prueba (D
 ad o D  sid , véase el punto 1.2).  
3. INFORME  
3.1. INFORME DE LA PRUEBA 
El informe sobre el ensayo incluirá, si fuera posible: 
— toda la información sobre el tipo de aguas residuales, el tipo de 
unidad empleado y los resultados experimentales relativos a la 
sustancia probada, la sustancia de referencia (si se usa), y el control, 
— la temperatura, 
— la curva de eliminación, con descripción y método de cálculo 
(véase 1,2), 
— la fecha y el emplazamiento donde se tomó la muestra del lodo 
activado y de las aguas residuales, el estado de adaptación, con ­
centración, etc., 
— razones científicas para efectuar cualquier modificación del pro ­
cedimiento de la prueba, 
— firma y fecha.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Dado que la sustancia que deberá probarse con este método no será 
fácilmente biodegradable, toda eliminación del COD debida exclusi ­
vamente a la biodegradación será normalmente gradual, extendién ­
dose durante días o semanas, excepto en los casos en los que la 
aclimatación sea brusca, como indica una desaparición abrupta que tenga lugar tras algunas semanas. 
Sin embargo, la absorción fisicoquímica puede jugar en ocasiones un 
papel importante; esto se apreciará cuando se produzca desde el 
principio una eliminación completa o parcial del COD añadido. Lo que sucede a continuación depende de factores tales como los grados de absorción y la concentración de sólidos en suspensión en la 
descarga del efluente. Generalmente, la diferencia entre las concen ­
traciones del COD en los líquidos de control y en los líquidos sobrenadantes de la prueba se incrementa gradualmente a partir de un valor inicial bajo, permaneciendo a continuación con el nuevo 
valor durante el resto del experimento a menos que tenga lugar la 
aclimatación. 
Si debe llevarse a cabo una distinción entre la biodegradación (o la 
biodegradación parcial) y la absorción, son necesarias otras pruebas. Estas pueden efectuarse de diversas maneras, pero la más convin ­
cente consiste en utilizar el líquido sobrenadante, o el lodo, como 
inóculo para una prueba de grupo base (preferiblemente una prueba respirométrica). 
Las sustancias de prueba que produzcan una eliminación alta y no 
adsortiva del COD en esta prueba deberán considerarse como poten ­
cialmente biodegradables. La eliminación parcial y no adsortiva in ­
dica que el producto químico experimenta al menos algo de biode ­
gradación. 
Las eliminaciones bajas o nulas del COD pueden ser debidas a que 
la sustancia de prueba tiene efecto inhibidor sobre los microorganis ­
mos, y esto puede quedar de manifiesto también por lisis y pérdida de lodo, produciéndose sobrenadantes turbios. En este caso, deberá repetirse la prueba empleando una concentración menor de la sus ­
tancia de prueba. 
El empleo de un método analítico específico, o de una sustancia de 
prueba marcada con
 14 C puede proporcionar una mayor sensibilidad. 
En el caso del compuesto de prueba marcado con  I4 C, la recupera ­
ción de  14 CO 2 confirmará que ha tenido lugar la biodegradación. 
Cuando los resultados se expresen también en términos de biodegra ­
dación primaria, deberá explicarse también, si ello es posible, el cambio en la estructura química que produce la pérdida de respuesta de la sustancia inicial de prueba. 
Deberá indicarse la validación del método analítico junto con la 
respuesta encontrada con el medio del control.
 
4. REFERENCIAS  
(1) OCDE, París, 1981,  Directriz para pruebas 302 A,  Decisión del 
Consejo C(81) 30 final.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Apéndice 1  
Prueba LASC: Ejemplo de resultados  
Sustancia C T 
(mg/l) C T -C e 
(mg/l) Porcentaje de 
biodegradación 
(D od ) Duración del en ­
sayo 
(días)  
4-acetil aminobenceno sulfonato 17,2 2,0 85,0 40 
Tetra propilen benceno sultanato 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenil 16,9 0,8 95,3 40 
Dieril glicol 16,5 0,2 98,8 40 
Anilina 16,9 1,7 95,9 40 Tetra ciclopentano carboxilato 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Apéndice 2  
Ejemplo del aparato de ensayo  
Figure 1
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13  BIOCONCENTRACIÓN: ENSAYO DINÁMICO CON PECES  
1. MÉTODO  
El presente método de bioconcentración reproduce las directrices de 
la OCDE TG 305 (1996).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente método describe un procedimiento para caracterizar el 
potencial de bioconcentración de algunas sustancias en peces en 
condiciones dinámicas. Son preferibles los regímenes de ensayos dinámicos, pero los regímenes semiestátícos son también aceptables 
en la medida en que se satisfagan los criterios de validez. 
El método da toda la información necesaria para la ejecución del 
ensayo pero deja libertad suficiente para la adaptación del diseño experimental a las condiciones específicas de cada laboratorio y para variar las características de las sustancias de ensayo. Conviene 
especialmente a los productos orgánicos estables cuyos valores de 
log P
 ow están entre 1,5 y 6,0 (1) pero también es aplicable a las 
sustancias superlipofílicas (log P  ow > 6,0). Para estas últimas, el 
valor estimado del factor de bioconcentración (FBC), a veces deno ­
minado K  B , será probablemente superior al valor del factor de bio ­
concentración en estado de equilibrio (FBC  SS ) que se puede esperar 
en un experimento de laboratorio. Pueden calcularse valores estima ­
dos del factor de bioconcentración de los productos orgánicos cuyos 
valores de log P  ow llegan hasta alrededor de 9,0 con ayuda de la 
ecuación de Binteín et al. (2). El potencial de bioconcentración se caracteriza por algunos parámetros, como la constante de la veloci ­
dad de absorción (k
 1 ), la constante de la velocidad de depuración 
(k 2 ) y el FBC  SS . 
Puede facilitarse el análisis de las muestras de agua y de peces con 
ayuda de sustancias de ensayo radiomarcadas, que pueden también servir para definir si se deben identificar y cuantificar las 
sustancias degradadas. Si se miden los residuos radiactivos totales 
(por ejemplo, por combustión o disolución de los tejidos), el FBC se basará en el compuesto de origen, todos los metabolitos retenidos y el carbono asimilado. El FBC basado en los residuos radiactivos 
totales puede, entonces, no ser directamente comparable a un FBC 
derivado de un análisis químico específico exclusivamente del com ­
puesto de origen. 
Se podrán aplicar procedimientos de limpieza en los estudios radio ­
marcados para determinar el FBC sobre la base del compuesto de 
origen; los principales metabolitos se determinarán sí se considera necesario. Es posible también combinar un estudio del metabolismo de los peces con un estudio de bioconcentración por análisis e iden ­
tificación de los residuos en los tejidos orgánicos y órganos.
 
1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES  
Bioconcentración/bioacumulación:  es el aumento de la concentración 
de la sustancia de ensayo en el interior o en la superficie de un organismo (en tejidos específicos de este) en relación con la concen ­
tración de esta sustancia en el medio ambiente.  
Factor de bioconcentración  (FBC o K
 B ): en cualquier momento 
durante la fase de absorción de este ensayo de acumulación es la concentración de la sustancia de ensayo en el pez, o en tejidos determinados de este, [C
 p expresada en μg/g (ppm)] dividida por 
la concentración de la sustancia en el medio ambiente [C  w , expresada 
en μg/ml (ppm)].  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Factor de bioconcentración en estado de equilibrio  (FBC  SS o K  B ): 
no cambia notablemente durante un plazo de tiempo prolongado, al 
ser constante la concentración de la sustancia de ensayo en el medio ambiente durante este mismo período.  
Meseta o estado de equilibrio:  en la representación gráfica de la 
concentración de sustancia de ensayo en el pez (C
 f ) en función del 
tiempo, se alcanza cuando la curva se hace paralela al eje del tiempo 
y tres análisis sucesivos de C realizados con muestras tomadas a intervalos de, al menos, dos días presentan una diferencia máxima del ± 20 % entre sí, y no hay diferencias significativas entre los tres 
períodos de muestreo. Cuando se analizan muestras puestas conjun ­
tamente, es necesario proceder al menos a cuatro análisis sucesivos. Si las sustancias de ensayo son absorbidas con lentitud, se optará preferiblemente por intervalos semanales.  
Factores de bioconcentración:  calculados directamente a partir de las 
constantes cinéticas (k
 1 /k 2 ) se llaman factores de concentración ci ­
néticos, FBC  k . 
Coeficiente de reparto octanol-agua  (P  ow ): es la relación entre la 
solubilidad de una sustancia en n-octanol y en agua, en equilibrio 
(método A.8); también se denomina K  ow . El logaritmo de P  ow indica 
el potencial de bioconcentración de una sustancia por los organismos acuáticos.  
Fase de exposición o de absorción:  es el tiempo durante el cual se 
exponen los peces a la sustancia de ensayo.  
Constante de velocidad de absorción  (k,): es el valor numérico que 
define la velocidad de aumento de la concentración de la sustancia 
de ensayo en los peces del ensayo (o en tejidos específicos de estos) cuando se expone a esta sustancia (k
 1 se expresa en días  -1 ). 
Fase de post-exposición o de depuración (pérdida):  es el tiempo, 
tras la transferencia de los peces de un medio que contiene la sus ­
tancia de ensayo a un medio libre de esta, durante el cual se estudia la depuración (o pérdida neta) de la sustancia a partir de los peces del ensayo (o de los tejidos específicos).  
Constante de velocidad de depuración (pérdida)  (k
 2 ): es el valor 
numérico que define la velocidad de disminución de la concentración 
de la sustancia de ensayo en los peces del ensayo (o en tejidos específicos) tras su transferencia de un medio que contiene la sus ­
tancia de ensayo a un medio que está libre de ella (k
 2 se expresa en 
días  -1 ). 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 
El ensayo se divide en dos fases: la de exposición (absorción) y la de 
post-exposición (depuración). Durante la fase de absorción, se expo ­
nen grupos distintos de peces de una sola especie a al menos dos concentraciones de la sustancia de ensayo. Luego se transfieren a un medio libre de esta sustancia, para la fase de depuración. Esta última 
es siempre necesaria, excepto cuando la absorción de la sustancia 
durante la fase de absorción es poco importante (por ejemplo, si el FBC es inferior a 10). La concentración de la sustancia de ensayo en los peces (o tejidos específicos) se mide durante las dos fases del 
ensayo. Además de las dos concentraciones de ensayo, se mantiene 
un grupo testigo de peces en condiciones idénticas, salvo que no se exponen a la sustancia de ensayo. Esto sirve para relacionar los posibles efectos nocivos observados en el ensayo de bioconcentra ­
ción con un grupo testigo correspondiente, y deducir las concentra ­
ciones de fondo de la sustancia de ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
La fase de absorción dura 28 días salvo si se demuestra que el 
equilibrio se alcanza antes. Puede preverse la duración de la fase 
de absorción y el tiempo necesario para la obtención del estado de equilibrio gracias a la ecuación del anexo 3. El período de depura ­
ción comienza entonces con la transferencia de los peces a otro 
recipiente limpio que contiene el mismo medio, pero esta vez sin 
la sustancia de ensayo. Cuando sea posible, se calculará el factor de bioconcentración preferiblemente como relación entre (FBC
 SS ) de la 
concentración en los peces (C  f ) y en el agua (C  w ) en el estado de 
equilibrio aparente y también como factor de bioconcentración ciné ­
tico, FBC  K , que es la relación entre las constantes de velocidad de 
absorción (k  1 ) y de depuración (k  2 ), suponiendo una cinética de 
primer orden. Si es evidente que no se sigue una cinética de primer 
orden, deberán aplicarse modelos más complejos (véase el anexo 5). 
Si no se llega a un estado de equilibrio en el plazo de 28 días, la fase 
de absorción se prolongará hasta alcanzar este estado de equilibrio, o 
durante 60 días si esto supone un plazo menor; luego comenzará la fase de depuración. 
La constante de la velocidad de absorción, la constante de la velo ­
cidad de depuración (pérdida) (o las constantes, cuando entren en 
juego modelos más complejos), el factor de bioconcentración y, si es 
posible, los intervalos de confianza de cada uno de estos parámetros, se calculan a partir del modelo que describa mejor las concentracio ­
nes medidas de la sustancia de ensayo en los peces y en el agua. 
El FBC se expresa en función del peso total húmedo de los peces. 
Sin embargo, para algunos estudios pueden utilizarse tejidos u órga ­
nos específicos (por ejemplo, músculos, hígado) si los peces son suficientemente grandes o si es posible separar las partes comestibles (filetes) y no comestibles (vísceras). Como hay una clara relación 
entre el potencial de bioconcentración y la lipofilia de numerosas 
sustancias orgánicas, también hay una relación correspondiente entre el contenido en lípidos de los peces del ensayo y las bioconcentra ­
ciones observadas de estas sustancias. Así pues, para reducir esta 
fuente de variabilidad en los resultados de los ensayos relativos a 
las sustancias con fuerte lipofilia (es decir, con log P
 ow > 3), la 
bioconcentración debe expresarse en función del contenido lipídico, ademas del peso corporal total. 
El contenido lipídico se establecerá, si es posible, con los mismos 
materiales biológicos que se utilicen para determinar la concentración 
de la sustancia de ensayo.
 
1.4. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA DE ENSAYO 
Antes de emprender el ensayo de bioconcentración, deberán reunirse 
los datos siguientes respecto a la sustancia de ensayo: 
a) solubilidad en el agua; 
b) coeficiente de reparto octanol-agua P  ow (denominado 
también K  ow , determinado por un método de CLAR en A.8); 
c) hidrólisis; 
d) características de fototransformación en el agua bajo irradiación 
solar natural o artificial y en las condiciones de irradiación del 
ensayo de bioconcentración (3);  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
e) tensión superficial (para las sustancias cuyo log P  ow no pueda 
determinarse); 
f) presión de vapor; 
g) biodegradabilidad «fácil» (en su caso). 
Será necesario también conocer la toxicidad relativa a la especie de 
peces utilizada en el ensayo, preferiblemente la CL  5O asintótica (es 
decir, independiente del tiempo). Es indispensable disponer de un método analítico correcto, de una exactitud, de una precisión y de una sensibilidad conocidas para la cuantificación de la sustancia de 
ensayo en las soluciones de ensayo y en el material biológico, así 
como de datos precisos sobre la preparación y la conservación de las muestras. Es necesario también conocer el límite de detección ana ­
lítica de la sustancia de ensayo tanto en el agua como en los tejidos 
de los peces. Si se utiliza una sustancia de ensayo marcada con
 14 C, 
deberá conocerse el porcentaje de radiactividad asociada a las impu ­
rezas.  
1.5. CONDICIONES DE VALIDEZ DEL ENSAYO 
Para que un ensayo sea válido, deberán darse las condiciones si ­
guientes: 
— la variación de temperatura será inferior a ± 2  o C, 
— la concentración de oxígeno disuelto no caerá por debajo del 
60 % del nivel de saturación, 
— la concentración de la sustancia de ensayo en los recipientos o 
armarios se mantendrá en la banda del ± 20 % de la media de los 
valores medidos durante la fase de absorción, 
— la mortalidad y otros efectos adversos o enfermedades tanto entre 
los peces testigo como entre los tratados serán inferiores al 10 % 
al final del ensayo; cuando el ensayo se prolongue a lo largo de 
varias semanas o meses, la mortalidad y los otros efectos adver ­
sos en los dos conjuntos de peces deberán ser inferiores al 5 % al mes y no exceder del 30 % en total.
 
1.6. COMPUESTOS DE REFERENCIA 
La utilización de compuestos de referencia con un potencial de 
bioconcentración conocido podrá ayudar al control del procedimiento experimental, en caso necesario. No se puede aún, sin embargo, 
recomendar ninguna sustancia específica.
 
1.7 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.7.1.  Equipo  
Se tendrá cuidado de evitar los materiales que puedan presentar 
fenómenos de disolución, sorción o lixiviación o tener algún efecto 
adverso sobre los peces, y esto en todas las partes del equipo. Se utilizarán tanques normales rectangulares o cilíndricos, de materiales químicamente inertes y de una capacidad adaptada a la tasa de carga. 
Se reducirá al mínimo el uso de tubos de plástico flexible. Serán 
preferibles los tubos de teflon (R), acero inoxidable o vidrio. La experiencia pone de manifiesto que para las sustancias que presentan fuertes coeficientes de adsorción, como los piretroides sintéticos por 
ejemplo, pudiera ser necesario el vidrio silanizado. Será necesario, en 
estos casos, deshacerse de los equipos una vez usados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Agua  
Se utiliza generalmente para el ensayo en agua natural procedente de 
una fuente no contaminada y de calidad uniforme. El agua de dilu ­
ción debe ser tal que permita la supervivencia de la especie de la 
especie de peces elegida, durante los períodos de aclimatación y de 
ensayo, sin que aparezcan ningún comportamiento ni aspecto anor ­
males. Idealmente, se debería demostrar que las especies sometidas al ensayo pueden sobrevivir, crecer y reproducirse en el agua de 
dilución (por ejemplo, mediante cría en laboratorio o un estudio de 
toxicidad sobre un ciclo biológico). El agua se caracterizará al menos por su pH, dureza, materia sólida total, carbono orgánico total y 
también, preferentemente, su contenido en amoniaco y en nitratos, 
su alcalinidad y, para las especies marinas, su salinidad. Se conocen perfectamente los parámetros importantes para el bienestar óptimo de los peces, pero el anexo 1 indica las concentraciones máximas reco ­
mendadas de una serie de parámetros relativos al agua de ensayo, 
dulce y salada. 
Durante toda la duración de un ensayo, el agua tendrá calidad cons ­
tante. El pH se mantendrá entre 6,0 y 8,5, pero durante un ensayo dado permanecerá dentro de una gama de ± 0,5 unidades de pH. 
Para garantizar que el agua de dilución no influye indebidamente en 
los resultados del estudio (por ejemplo, por complejación de la sus ­
tancia de ensayo) ni afecta negativamente al comportamiento de las poblaciones de peces, se tomarán regularmente muestras para análi ­
sis. Cuando se sepa que un agua de dilución es de calidad relativa ­
mente constante, convendrá proceder, por ejemplo cada tres meses, a la determinación de los metales pesados (por ejemplo, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), aniones y cationes principales (por ejemplo, Ca, Mg, 
Na, K, Cl, SO
 4 ), plaguicidas (por ejemplo, organofosforados totales 
y organoclorados totales), carbono orgánico total y sólidos en sus ­
pensión. Si se demuestra que la calidad del agua es constante al menos durante un año, estos análisis podrán ser menos frecuentes 
y sus intervalos más espaciados (por ejemplo, cada seis meses). 
El contenido en partículas naturales así como el carbono orgánico 
total (COT) del agua de dilución será lo más bajo posible para evitar la adsorción de la sustancia de ensayo en la materia orgánica, lo que podría reducir su biodisponibilidad (4). El valor máximo admisible 
es de 5 mg/l para las partículas (materia seca que no atraviesa un 
filtro de 0,45 μm) y 2 mg/l para el carbono orgánico total (véase el 
anexo 1). En caso necesario, el agua se filtrará antes de usarse. La aportación de los peces (excretas) y los residuos alimentarios al 
contenido del agua en carbono orgánico deberá ser lo más baja 
posible. A lo largo del ensayo, la concentración de carbono orgánico en el recipiente del ensayo no deberá sobrepasar en más de 10 mg/l (± 20 %) la del carbono orgánico procedente de la sustancia de 
ensayo y, en su caso del agente de disolución.
 
1.7.3.  Soluciones de ensayo  
Se prepara una solución madre de la sustancia de ensayo, a una 
concentración adecuada. La solución madre será preparada preferi ­
blemente por simple mezcla o agitación de la sustancia de ensayo en el agua de dilución. No se recomienda la utilización de disolventes o de dispersantes (agentes de disolución); se puede recurrir a ellos, sin 
embargo, en algunos casos para obtener una solución madre de la 
concentración necesaria. Los disolventes que pueden utilizarse son el etanol, el metanol, el éter monometílico de etilenglicol, el éter dime ­
tílico de etilenglicol, la dimetilformamida y el trietilenglicol. Los 
dispersantes utilizables son Cremaphor RH40, Tween 80, metilcelu ­
losa al 0,01 % y HCOI-40. Se tomarán precauciones en caso de utilización de agentes fácilmente biodegradables, ya que estos pue ­
den causar problemas de crecimiento bacteriano en los ensayos di ­
námicos. La sustancia de ensayo puede ir radiomarcada y deberá ser 
del nivel más alto de pureza (por ejemplo, preferiblemente > 98 %).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Para los ensayos dinámicos, un equipo aportará y diluirá continua ­
mente la solución madre de la sustancia de ensayo (por ejemplo, 
bomba dosificadora, diluyente proporcional, sistema saturador) para conseguir las concentraciones de ensayo en los recipientes. Será preferible prever al menos cinco volúmenes de sustitución al día 
para cada recipiente de ensayo. Se preferirá el método dinámico, 
pero en caso de imposibilidad (por ejemplo, cuando los organismos del ensayo sufran efectos adversos) podrá aplicarse una técnica semi ­
estática sí siguen cumpliéndose los criterios de validez. Los regíme ­
nes de flujo de las soluciones madre y del agua de dilución se 
controlarán 48 horas antes del ensayo y luego al menos diariamente durante este. Este control incluirá la determinación del flujo en cada recipiente de ensayo y garantizará que dicho flujo no varía en más 
del 20 % dentro de cada recipiente ni entre recipientes distintos.
 
1.7.4.  Selección de las especies  
Entre los criterios importantes de selección de las especies figuran el 
que sean de fácil disponibilidad, que puedan obtenerse de los tama ­
ños adecuados y que puedan mantenerse satisfactoriamente en el 
laboratorio. Otros criterios de selección de las especies de peces son su importancia recreativa, comercial o ecológica, así como una sensibilidad comparable, haber producido buenos resultados anterior ­
mente, etc. 
En el anexo 2 figura una lista de especies recomendadas para los 
ensayos. Pueden utilizarse otras especies pero es posible entonces 
tener que adaptar el procedimiento de ensayo para obtener condicio ­
nes experimentales convenientes. En tal caso se expondrá la motiva ­
ción de la elección de las especies y el método experimental elegido.
 
1.7.5.  Mantenimiento de los peces  
Es necesario aclimatar la población de peces durante dos semanas al 
menos en agua a la temperatura del ensayo y aportar una cantidad de comida suficiente y del mismo tipo que se vaya a utilizar durante el 
ensayo. 
Después de un período de adaptación de 48 horas, se registra la 
mortalidad y se aplican los criterios siguientes: 
— mortalidad superior al 10 % de la población en 7 días: se rechaza 
el lote entero, 
— mortalidad entre el 5 y el 10 % de la población en 7 días: se 
prolonga la aclimatación durante 7 días más, 
— mortalidad inferior al 5 % de la población en 7 días: se acepta el 
lote; si la mortalidad sobrepasa el 5 % durante los siete días siguientes, se rechaza el lote entero. 
Hay que asegurarse de que los peces utilizados para los ensayos no 
presentan enfermedades ni anomalías observables. Se descartan todos los peces enfermos. Los peces no deben recibir tratamiento contra 
ninguna enfermedad durante las dos semanas que preceden al ensayo 
ni durante este.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. REALIZACIÓN DEL ENSAYO  
1.8.1.  Ensayo preliminar  
Puede ser útil proceder a una experimentación preliminar para opti ­
mizar las condiciones de realización del ensayo definitivo, como, por 
ejemplo, la selección de las concentraciones de la sustancia de en ­
sayo o la duración de las fases de absorción y de depuración.  
1.8.2.  Condiciones de exposición  
1.8.2.1. D u r a c i ó n d e l a f a s e d e a b s o r c i ó n 
Se puede prever la duración de la fase de absorción basándose en la 
experiencia práctica (por ejemplo, a partir de un estudio previo o de un producto químico que tenga propiedades similares de acumula ­
ción) o a partir de algunas relaciones empíricas fundadas en el co ­
nocimiento de la solubilidad en el agua o de coeficiente de reparto octanol/agua de la sustancia de ensayo (véase el anexo 3). 
La fase de absorción durará 28 días salvo si puede demostrarse que 
se alcanza antes el equilibrio. Si no se llega al estado de equilibrio en el plazo de 28 días, se prolongará la fase de absorción y se 
procederá a otras mediciones hasta conseguir el estado de equilibrio, 
o durante 60 días si esto supone un plazo menor.
 
1.8.2.2. D u r a c i ó n d e l a f a s e d e d e p u r a c i ó n 
La mitad de la duración de la fase de absorción es generalmente 
suficiente para que se produzca una reducción conveniente (por ejemplo, 95 %) de la carga corporal de la sustancia de ensayo (véanse las explicaciones del cálculo en el anexo 3). Si el tiempo 
necesario para llegar a una pérdida del 95 % es excesivamente largo, 
sobrepasando por ejemplo dos veces la duración normal de la fase de absorción (es decir, más de 56 días), se podrá utilizar un período más corto (hasta que la concentración de la sustancia de ensayo sea 
inferior al 10 % de la concentración en el estado de equilibrio). 
Sin embargo, para las sustancias con prepiedades de absorción y depuración más complejas que el modelo de peces con un único compartimento, que da una cinética de primer orden, se aplicarán 
fases de depuración más largas para determinar las constantes de la 
velocidad de pérdida. Sin embargo, este plazo de tiempo puede regirse por el período durante el cual la concentración de la sustancia de ensayo en los peces permanece por encima del límite de detección 
analítico.
 
1.8.2.3. N ú m e r o d e p e c e s d e l e n s a y o 
El número de peces por concentración del ensayo debe elegirse de 
modo que, como mínimo, se disponga de cuatro peces por muestra 
en cada muestreo. Si se desea una estadística más fina, deberá au ­
mentar el número de peces por muestra. 
Si se utilizan peces adultos, hay que indicar si son machos o 
hembras o si se utilizan los dos sexos en el experimento. En este último caso, antes de empezar la exposición, será necesario comprobar que no son significativas las diferencias de contenido 
lipídico entre sexos; podrá ser necesario reunir todos los machos y 
todas las hembras.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
En todos los ensayos se elegirán peces de peso similar, de modo que 
el peso del más pequeño no sea inferior a dos tercios del peso del 
mayor. Pertenecerán a la misma clase de edad y procederán de la misma fuente. Dado que, al parecer, el peso y la edad de un pez tienen a veces efectos notables sobre los valores de FBC (1), estos 
datos se registrarán con precisión. Se recomienda pesar una sub ­
muestra de la población de peces antes del ensayo, para calcular el peso medio.
 
1.8.2.4. C a r g a 
Se utiliza una relación elevada agua/peces con el fin de minimizar la 
reducción de C  w debida a la introducción de los peces al principio 
del ensayo, y también para evitar el descenso de la concentración de oxígeno disuelto. Es importante que la tasa de carga sea adaptada a la especie utilizada para el ensayo. De todos modos, se recomienda 
una tasa de carga de 0,1-1,0 g de peces (peso húmedo) por litro de 
agua al día. Se pueden realizar cargas de tasa elevada si se demuestra que la concentración requerida de sustancia de ensayo puede man ­
tenerse en la banda del ± 20 %, y que la concentración de oxígeno 
disuelto no cae por debajo del 60 % del nivel de saturación. 
Se tendrá en cuenta el hábitat normal de la especie de peces al elegir 
la tasa de carga. Los peces bentónicos, por ejemplo, pueden necesitar 
un acuario que tenga más superficie de fondo que las especies pe ­
lágicas, para un mismo volumen de agua.
 
1.8.2.5. A l i m e n t a c i ó n 
Durante los períodos de aclimatación y de ensayo, se alimentará a 
los peces con una dieta conveniente que tenga un contenido cono ­
cido en lípidos y proteínas totales, en cantidades suficientes para mantenerlos en buena salud y conservar el peso corporal. Se alimen ­
tará a los peces diariamente durante los períodos de aclimatación y 
de ensayo en la proporción de alrededor del 1 o 2 % del peso 
corporal cada día; se mantiene así en la mayoría de las especies una concentración lipídica de un nivel relativamente constante du ­
rante el ensayo. La cantidad de comida deberá volver a calcularse 
una vez por semana, por ejemplo, con el fin de mantener constantes 
el peso corporal y el contenido lipídico. Para ese cálculo, el peso de los peces de cada recinto de ensayo se evaluará a partir del peso de los peces muestreados últimamente en ese recinto. No hay que pesar 
los peces que permanecen en el recinto. 
La comida no consumida y los excrementos son evacuados de los 
recipientes de ensayo mediante sifón cada día poco después de la 
alimentación (30 minutos a una hora). Los recipientes se tendrán lo 
más limpios posible a lo largo del ensayo de modo que la concen ­
tración de materia orgánica permanezca al nivel más bajo posible, puesto que la presencia de carbono orgánico puede limitar la biodis ­
ponibilidad de la sustancia de ensayo (1). 
Como muchos alimentos son derivados de harinas de pescado, se 
analizarán para determinar su contenido en sustancia de ensayo. Es 
conveniente también analizar el contenido de estos alimentos en 
plaguicidas y metales pesados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. I l u m i n a c i ó n y t e m p e r a t u r a 
El período de iluminación es generalmente de 12 a 16 horas y la 
temperatura (± 2  o C) corresponderá a la especie utilizada (véase el 
anexo 2). Se definirán claramente el tipo y las características de la 
iluminación. Será necesario prestar atención a la posible fototrans ­
formación de la sustancia de ensayo en las condiciones de irradica ­
ción del estudio. Se utilizará un alumbrado adecuado que no ex ­
ponga a los peces a fotoproductos no naturales. En algunos casos, 
puede ser conveniente utilizar un filtro para eliminar los rayos UV 
por debajo de 290 nm.  
1.8.2.7. C o n c e n t r a c i o n e s d e l e n s a y o 
Se exponen los peces en condiciones dinámicas a dos concentracio ­
nes al menos de la sustancia de ensayo en agua. Normalmente, la 
concentración mas alta de la sustancia de ensayo será del 1 % de su 
CL 50 aguda asintótica, y al menos diez veces superior a su límite de 
detección en el agua por el método de análisis elegido. 
La concentración mas alta del ensayo puede establecerse también 
dividiendo la CL  50 a 96 horas por una relación adecuada aguada/ 
crónica (las relaciones adecuadas de algunos productos químicos pueden ir de 3 a 100). Si es posible, la otra u otras concentraciones 
deben elegirse de modo que la diferencia con la antes citada alcance 
un factor de diez. En caso de imposibilidad debido al criterio del 1 % de la CL
 50 y del límite analítico, podrá utilizarse un factor 
inferior a diez o se pensará en el uso de una sustancia radiomarcada 
con  14 C. Ninguna concentración podrá superar la solubilidad en agua 
de la sustancia de ensayo. 
Cuando se utilice un agente de disolución, su concentración no 
deberá sobrepasar 0,1 ml/l y deberá ser idéntica en todos los reci ­
pientes del ensayo. Debe conocerse su contribución, junto con la de 
la sustancia de ensayo, al contenido global de carbono orgánico en el agua del ensayo. Sin embargo, se hará todo lo posible para evitar recurrir a este tipo de materiales.
 
1.8.2.8. C o n t r o l e s 
Se utilizará un control (testigo) del agua de dilución o, en su caso, 
un control con el agente de disolución, además de la serie de ensayo, en la medida en que se haya establecido que el agente no tiene ningún efecto sobre los peces. En caso contrario, se establecerán 
ambos controles.
 
1.8.3.  Frecuencia de las medidas de la calidad del agua  
Durante el ensayo se medirán en todos los recipientes el oxígeno 
disuelto, el COT, el pH y la temperatura. La dureza total, y la salinidad eventualmente, se medirán en los controles y en un reci ­
piente que contenga la concentración más alta. Por lo menos, el 
oxígeno disuelto y eventualmente la salinidad se medirán tres veces —al principio, hacia el medio y al final de período de absorción— y una vez por semana durante el período de depuración. El COT se 
medirá al principio del ensayo (24 y 48 horas antes del comienzo de 
la fase de absorción), antes de la adición de los peces y al menos una vez por semana durante los períodos de absorción y de depuración. La temperatura se medirá diariamente, el pH al principio y al final de 
cada período y la dureza una vez en cada ensayo. La temperatura se 
medirá preferiblemente de forma continua en un recipiente al menos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Muestreo y análisis de los peces y del agua  
1.8.4.1. C a l e n d a r i o d e m u e s t r e o d e l o s p e c e s y d e l a g u a 
Se tomará agua de los recipientes de ensayo para determinar la 
concentración de la sustancia de ensayo antes de la introducción 
de los peces y durante las fases de absorción y de depuración. Por 
lo menos, el agua se tomará al mismo tiempo que los peces y antes de darles de comer. Durante la fase de absorción, se determinarán las concentraciones de sustancia de ensayo para comprobar que satisfa ­
cen los criterios de validez. 
Se muestrearán los peces en cinco ocasiones al menos durante la fase 
de absorción y en cuatro ocasiones al menos durante la fase de depuración. Como a veces es difícil calcular una estimación razona ­
blemente precisa del FBC a partir de este número de muestras, en 
particular cuando hay una cinética de depuración distinta de la sim ­
ple de primer orden, puede ser recomendable muestrear con mayor frecuencia en los dos períodos (véase el anexo 4). Las muestras 
suplementarias se conservarán y analizarán solamente si los resulta ­
dos de la primera serie de análisis se revelan insuficientes para el cálculo del FBC con la precisión requerida. 
En el anexo 4 se encuentra un ejemplo de calendario de muestreo 
aceptable. Pueden establecerse otros calendarios fácilmente sobre la 
base de otros valores supuestos del P
 ow para calcular el tiempo de 
exposición que corresponde a una absorción del 95 %. 
Se prosigue el muestreo durante la fase de absorción hasta el esta ­
blecimiento de un estado de equilibrio o durante 28 días, si esto 
supone un plazo menor. Si no se llega a un estado de equilibrio en 28 días, el muestreo continúa hasta la obtención de un estado de equilibrio o durante 60 días, si esto supone un plazo menor, Antes de 
empezar la fase de depuración, se trasladan los peces a los tanques 
limpios.
 
1.8.4.2. M u e s t r e o y p r e p a r a c i ó n d e l a s m u e s t r a s 
Se toman las muestras de agua destinadas a los análisis, por ejemplo 
mediante sifonado a través de un tubo inerte desde un punto central del recinto de ensayo. Puesto que parece que no siempre se puede 
separar ni por centrifugación ni por filtración la fracción no biodis ­
ponible de la sustancia de ensayo de la que es biodisponible (en particular en el caso de los productos químicos superlipofílicos, es decir, que tienen un log P
 ow > 5) (1) (5), las muestras pueden no 
someterse a estos tratamientos. 
En su lugar, será necesario procurar que los tanques se mantengan lo 
más limpios posible y que el contenido en carbono orgánico total se mida a lo largo de las fases de absorción y de depuración. 
Se toma un número conveniente de peces (normalmente 4 como 
mínimo) de cada recipiente de ensayo en cada momento de mues ­
treo. Los peces tomados se lavan rápidamente con agua, se secan con material absorbente, y se sacrifican instantáneamente de la manera 
más adecuada e incruenta posible, y luego se pesan. 
Es preferible analizar los peces y el agua inmediatamente después 
del muestreo para evitar toda degradación u otras pérdidas y para calcular aproximadamente las tasas de absorción y de depuración mientras el ensayo continúa. El análisis inmediato evita también 
retrasos en la determinación del momento en que se alcanza una 
meseta.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
A falta de un análisis inmediato, las muestras se conservan según un 
método conveniente. Antes del principio del estudio, se reunirá in ­
formación sobre el método de conservación adecuado de la sustancia de ensayo correspondiente como, por ejemplo, congelación, mante ­
nimiento a 4
 o C, duración de la conservación, extracción, etc.  
1.8.4.3. C a l i d a d d e l m é t o d o a n a l í t i c o 
Como la totalidad del procedimiento se regula principalmente por la 
exactitud, la precisión y la sensibilidad del método analítico utilizado 
para la sustancia de ensayo, es necesario controlar experi-mental ­
mente que la precisión y la reproducibilidad del análisis químico, así como la recuperación de la sustancia de ensayo tanto en el agua como en los peces son satisfactorias en el método particular. Ha de 
comprobarse también que la sustancia de ensayo no es detectable en 
el agua de dilución utilizada. 
En caso necesario, los valores de C y C, derivados de los ensayos se 
corregirán a la luz de los valores de recuperación y de fondo de los controles. Las muestras de peces y de agua se manejan permanen ­
temente para minimizar las contaminaciones y las pérdidas (deriva ­
das, por ejemplo de la adsorción por el equipo de muestreo).
 
1.8.4.4. A n á l i s i s d e l o s p e c e s m u e s t r e a d o s 
Si se utilizan para el ensayo materiales radiomarcados, se puede 
analizar el marcado radiactivo total (es decir, compuestos de origen y metabolitos) o se pueden purificar las muestras de modo que sea 
posible analizar separadamente los compuestos de origen. Por otro 
lado, los principales metabolitos pueden caracterizarse en el estado de equilibrio al final de la fase de absorción, si esto supone un plazo menor. Si el FBC en términos de residuos radiomarcados totales es ≥ 
1 000 %, puede ser bueno (y, para algunas categorías de productos 
químicos como los plaguicidas, muy recomendable), identificar y cuantificar los productos de degradación que representen ≥ 10 % 
de los residuos totales en los tejidos de los peces en el estado de 
equilibrio. Si estos productos que representan > 10 % de los residuos 
totales radiomarcados en los tejidos de peces se identifican y cuan ­
tifican, se recomienda entonces identificarlos y cuantificarlos también en el agua del ensayo. 
La concentración de la sustancia de ensayo debería generalmente 
determinarse en cada pez pesado aparte. Si eso no es posible, se 
podrán poner conjuntamente las muestras en cada muestreo, pero esta mezcla limita los procedimientos estadísticos que pueden apli ­
carse a los datos. Si se desean un procedimiento y una potencia 
estadísticos, convendrá entonces utilizar en el ensayo un número 
adecuado de peces para conciliar el procedimiento de mezcla con la precisión estadística deseada (6) (7). 
El FBC se expresará en función del peso húmedo total y también, en 
caso de sustancias muy lipofílicas, en función del contenido lipídico. 
El contenido lipídico de los peces se determina si es posible en cada 
muestreo. Se utilizarán métodos adaptados para determinar el conte ­
nido en lípidos (referencias 8 y 2 del anexo 3). Se puede recomendar la técnica de extracción por cloroformo/metanol como método nor ­
mal (9). Los diversos métodos no dan valores idénticos (10), por lo 
que es importante precisar bien el método utilizado. El análisis de los lípidos se hará, si es posible, con el mismo extracto que el consa ­
grado al análisis de la sustancia de ensayo, puesto que los lípidos 
deben a menudo retirarse del extracto antes de que este se pueda 
analizar por cromatografía. El contenido lipídico de los peces (en rng/kg de peso húmedo) al final del experimento no debería sepa ­
rarse de la del principio en más del ± 25 %. El porcentaje en solidos 
de los tejidos también se indicará para permitir la conversión de la 
concentración lipídica de peso húmedo a la de peso seco.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. DATOS  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
La curva de absorción de la sustancia de ensayo se obtiene repre ­
sentando su concentración en los peces (o tejidos específicos) du ­
rante la fase de absorción en función del tiempo, con una escala 
aritmética. Si la curva alcanza una meseta, es decir, adopta aproxi ­
madamente una disposición asintótica al eje del tiempo, se calculará del siguiente modo el FBC
 SS en el estado de equilibrio:  
C f en estado de equilibrio  ðmediaÞ 
C w en estado de equilibrio  ðmediaÞ 
Cuando no se llega a ningún estado de equilibrio, es posible calcular 
un FBC  SS de una precisión suficiente para la evaluación de los 
riesgos a partir de un «estado de equilibrio» al 80 % (1,6/k,) o 95 % (3,0/k
 2 ) del equilibrio. 
También se determina el factor de concentración (FBCJ como la 
relación de k  1 /k 2 las dos constantes cinéticas de primer orden. La 
constante de la velocidad de depuración (k  2 ) se determina general ­
mente a partir de la curva de depuración (es decir, representación de la disminución de la concentración de la sustancia de ensayo en los 
peces en función del tiempo). La constante de la velocidad de ab ­
sorción (k
 1 ) se calcula entonces en función de k  2 y de un valor de C  f 
derivado de la curva de absorción (véase también el anexo 5). El 
método de elección para obtener FBC  k y las constantes de velocidad 
k, y k  2 es recurrir a métodos informáticos de estimación de paráme ­
tros no lineales (11). Alternativamente, se pueden utilizar métodos gráficos para calcular k
 1 y k 2 . Si la curva de depuración es eviden ­
temente de orden distinto del primero, entonces convendrá utilizar 
modelos más complejos (véanse las referencias en el anexo 3) y 
buscar el consejo de un bioestadístico.  
2.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los resultados se interpretarán con precaución cuando las concen ­
traciones medidas de las soluciones de ensayo se encuentren a nive ­
les cercanos al límite de detección del método de análisis. 
La claridad de definición de las curvas de absorción y de pérdida 
indican la buena calidad de los datos de bioconcentración. La varia ­
ción de las constantes de absorción/depuración entre las dos concen ­
traciones de ensayo debería ser inferior al 20 %. Las diferencias 
notables observadas en las velocidades de absorción/depuración entre las dos concentraciones de ensayo se registrarán y explicarán si es posible. En general el límite de confianza del FBC se acerca al ± 
20 % en los estudios bien diseñados.
 
3. INFORME  
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
3.1. SUSTANCIA DE ENSAYO 
— naturaleza física y, en su caso, propiedades físico-químicas, 
— datos de identificación química (incluido el contenido en carbono 
orgánico, si procede), 
— en caso de marcado radiactivo, posición precisa de los átomos 
marcados y porcentaje de radiactividad asociada a las impurezas.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. ESPECIES UTILIZADAS 
— Denominación científica, estirpe, fuente, eventuales tratamientos 
previos, aclimatación, edad, rango de tamaños, etc.  
3.3. CONDICIONES DEL ENSAYO 
— procedimiento seguido (por ejemplo, dinámico o semiestático), 
— tipo y características del alumbrado utilizado y períodos de ilu ­
minación, 
— diseño del ensayo (por ejemplo, número y tamaño de los reci ­
pientes de ensayo, régimen de sustitución de los volúmenes de agua, numero de grupos y de peces por grupo, número de con ­
centraciones de ensayo, duración de las fases de absorción y 
depuración, frecuencia de los muestreos de peces y de agua), 
— método de preparación de las soluciones madre y frecuencia de 
renovación (se indicarán el agente de disolución, su concentra ­
ción y su contribución al contenido en carbono orgánico del agua 
del ensayo, en su caso), 
— las concentraciones de ensayo nominales, las medias de los va ­
lores medidos y sus desviaciones típicas en los recipientes de ensayo y su método de obtención, 
— fuente del agua de dilución, descripción de los eventuales trata ­
mientos previos, resultados de las posibles demostraciones de la 
aptitud de los peces utilizados para vivir en esta agua y caracte ­
rísticas de esta: pH, dureza, temperatura, concentración en oxí ­
geno disuelto, niveles de cloro residual (si se mide), carbono 
orgánico total, sólidos en suspensión, salinidad del medio de 
ensayo (en su caso), y todas las demás medidas realizadas, 
— calidad del agua en los recipientes de ensayo, pH, dureza, COT, 
temperatura y concentración en oxígeno disuelto, 
— información precisa sobre la alimentación (por ejemplo tipo de 
comida, fuente, composición —al menos contenido en lípidos y 
proteínas si es posible— cantidad dada y frecuencia), 
— información sobre el tratamiento de las muestras de peces y de 
agua, incluidos datos de preparación, almacenamiento, extracción y procedimientos (y precisión) del análisis de la sustancia de 
ensayo y del contenido en lípidos (si se mide).
 
3.4. RESULTADOS 
— resultados de los eventuales estudios preliminares efectuados, 
— mortalidad de los peces de control y de los peces de cada recinto 
de ensayo y todos los comportamientos anormales observados, 
— contenido lipídico de los peces (si se determina con motivo del 
ensayo), 
— curvas (con todos los datos medidos) que muestren la absorción 
y la depuración de las sustancias de ensayo en los peces, el 
tiempo de acceso al estado de equilibrio,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f y C  w (con desviación típica y gama, en su caso) en el mo ­
mento de cada muestreo [C  f expresado en μg/g de peso húmedo 
(ppm) de todo el animal o de algunos de sus tejidos, por ejemplo lípidos, y C
 w en (μg/ml (ppm)] valores de C  w de la serie de 
control (indicar también la concentración de fondo), 
— factor de bioconcentración en el estado de equilibrio (FBC  SS ) o 
factor de concentración cinético (FBC  k ) y, en su caso, límites de 
confianza del 95 % de las constantes de la velocidad de absor ­
ción y de depuración (pérdida) todo expresado respecto al cuerpo 
entero y al contenido total en lípidos, si se mide, del animal (o de sus tejidos especificados), límites de confianza y desviación tí ­
pica (si se dispone de ella), métodos de cálculo/análisis de los 
datos para cada concentración de sustancia de ensayo utilizada, 
— cuando se utilicen sustancias radiomarcadas, podrá exponerse la 
acumulación de todos los metabolitos detectados sí es necesario, 
— toda observación inusual relativa al ensayo, toda divergencia 
respecto a estos procedimientos y toda la información pertinente. 
Minimizar los resultados «no detectado al límite de detección» me ­
diante la aplicación de un método de ensayo preliminar y el diseño 
experimental, puesto que estos resultados son inutilizables para los 
cálculos de las constantes de velocidad.
 
4. REFERENCIAS  
(1) Connell D.W. (1988). «Bioaccumulation behaviour of persis ­
tent chemicals with aquatic organisms».  Rev. Environ. Contam. 
Toxicol.  102, pp. 117-156. 
(2) Bintein S., Devillers, J. and Karcher W. (1993). N onlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octano/water parti ­
tion coefficient. SAR and OSAR in Environmental Research.  1, 
29-390. 
(3) OECD, París (1996).  Direct Phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety guidance document series on Testing and Assessment of Chemicals  No 3. 
(4) Kristensen P. (1991).  Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM tes ­
ting methods: influence of particulate organic matter to the 
bioavailability of chemicals.  Water Quality Institute, Denmark. 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994)  Great Lake Water Ouality Ini ­
tiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine 
Bioaccumulation Factors.  July 1994. 
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision.  Plaguicide 
analytical manual,  1, 5600 Fisher's Lane Rockville, MD 
20852, July 1975. 
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). «Analysis of Human or Ani ­
mal Adipose Tissue»,  in Analysis of Plaguicide Residues in 
Human and Evironmental Samples,  Thompson J.F. (ed.) Re ­
search Triangle Park, N.C. 27711. 
(8) Compaan H. (1980) en «The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic invironment: degradation, toxicity, bioaccumulation», Ch. 2.3, 
Part II. Government Publi- shing Office, The Hague, The Net ­
herlands.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al, (1995).  Limn.  & Oceanogr.  30, 1099-1105. 
(10) Randall R.C, Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991).  Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol.  Chem. 10, pp. 
1431-1436. 
(11) CEC.  Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through metbod-Ring test programme, 1984-1985. Final 
report March 1987.  Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. 
(12) ASTME E-1022-84 (Reapproved 1988)  Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fisches and Saltwater Bivalve Molluscs.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
Anexo 1  
Características químicas aceptables del agua de dilución  
Sustancia Límite de concentración  
1 Materia en suspensión 5 mg/l 
2 Carbono orgánico total 2mg/l 3 Amoníaco no ionizado 1 μg/l 
4 Cloro residual 10 ng/l 5 Plaguicidas organofosforados totales 50 μg/l 
6 Plaguicidas organoclorados totales más policlorobifeni ­
los 50 μg/l 
7 Cloro orgánico total 25 ng/l 
8 Aluminio 1 ng/l 
9 Arsénico 1 μg/l 
10 Cromo 1 μg/l 
11 Cobalto 1 μg/l 
12 Cobre 1 μg/l 
13 Hierro 1 μg/l 
14 Plomo 1 μg/l 
15 Níquel 1 μg/l 
16 Cinc 1 μg/l 
17 Cadmio 100 ng/l 18 Mercurio 100 ng/l 19 Plata 100 μg/l
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
Anexo 2  
Especies de peces recomendadas para los ensayos  
Especies recomendadas Gamas de tempe ­
raturas recomen ­
dadas para los 
ensayos (en  o C) Longitud total 
recomendada de 
los animales uti ­
lizados (en cm)  
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae)  (Hamilton- 
Buchanan) pez cebra 20-25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas  (Teleostei, Cyprinidae)  (Rafi­
nesque) pez cabeza gorda 20-25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio  (Teleostei, Cyprinidae)  (Linnaeus) 
carpa común 20-25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes  (Teleostei, Poeciliidae)  (Temminck y 
Schlegel) medaka 20-25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata  (Teleostei, Poeciliidae)  (Peters) 
guppy 20-25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus  (Teleostei, Cenirarchidae)  
(Rafinesque) agallas azules 20-25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss  (Teleostei Salmortidae)  (Wal­
baum) trucha arco iris 13-17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus  (Teleostei, Gasterosteidae)  
(Linnaeus) espinoso 18-20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231.  
Se han utilizado distintas especies marinas y de estuarios en algunos países como, por ejemplo:  
Leiostomus xanthurus 
Cyprinodon variegatus, Menidia beryllina 
Cymatogaster aggregata, 
Parophrys vetulus Leptocottus armatus, 
Gasterosteus aculeatus 
Dicentracus labrax Alburnus alburnus.
 
Aprovisionamiento  
Los peces de agua dulce enumerados en el cuadro anterior son fáciles de criar o están fácilmente 
disponibles a lo largo del año, mientras que la disponibilidad de las especies marinas o de estuario se limita en parte a los países correspondientes. Pueden reproducirse y desarrollarse en explotacio ­
nes piscícolas o en laboratorio, en condiciones donde las enfermedades y los parásitos están bajo 
control; los animales utilizados serán, pues, sanos y de origen conocido. Estos peces se encuentran en muchas partes del mundo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
Anexo 3  
Previsión de la duración de las fases de absorción y de depuración  
Previsión de la duración de la fase de absorción  
Antes de realizar el ensayo, podrá obtenerse una estimación de k  2 y, en conse ­
cuencia, un porcentaje del tiempo necesario para llegar al estado de equilibrio, a 
partir de relaciones empíricas entre k  3 y el coeficiente de reparto n-octanol/agua 
(P ow ) o k  2 y la solubilidad en el agua (s). 
Se puede estimar k  2 (días  -1 ), por ejemplo a partir de la relación empírica si ­
guiente (1): 
log 10 k 2 = - 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (ecuación 1) 
Para las otras relaciones, véase la referencia (2). 
Si el coeficiente de reparto (P  ow ) es desconocido, se procederá a una estimación 
(3) a partir de la solubilidad de la sustancia en el agua según: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (ecuación 2) 
donde s = solubilidad (moles/l): (n = 36). 
Estas relaciones solo se aplican a los productos químicos cuyos valores de log 
P ow se sitúan entre 2 y 6,5 (4). 
El tiempo necesario para alcanzar un determinado porcentaje del estado de equi ­
librio puede obtenerse, aplicando la estimación de k  2 , de la ecuación cinética 
general que describe la absorción y la depuración (cinética de primer orden):  
dC f 
dt ¼ k 1 ·C w Ä k 2 · C f 
o, si C . es constante:  
C f ¼ k 1 
k 2 ·C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (ecuación 3)  
C f ¼ k 1 
k 2:C w or C f /C w = k  1 /k 2 = BCF 
La relación k  1 /k 2 . C w se acerca entonces a la concentración en el pez en el 
«estado de equilibrio» (C  fs ). 
La ecuación 3 puede así transcribirse:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ o C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (ecuación 4) 
El tiempo necesario para alcanzar un determinado porcentaje del estado de equi ­
librio puede preverse aplicando la ecuación 4, cuando k  2 se estima con ayuda de 
las ecuaciones 1 o 2.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
A título indicativo, la duración óptima estadísticamente de la fase de absorción 
que permite obtener datos estadísticamente aceptables (FBC  k ) es el período ne ­
cesario para que la curva del logaritmo de la concentración de la sustancia de ensayo en el pez representado frente al tiempo lineal, llegue a su punto medio, o 1,6/k, o un 80 % del estado de equilibrio, pero sin sobrepasar 3,0/k
 2 o un 95 % 
del estado de equilibrio (7). 
El tiempo para llegar al 80 % del estado de equilibrio es (ecuación 4): 
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 o t 80 ¼ 1; 6 
k 2 (ecuación 5) 
Del mismo modo, para un 95 % del estado de equilibrio: 
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 [equation 6] 
Por ejemplo, la duración de la fase de absorción (abs.) de una sustancia de 
ensayo que tenga un log P  ow = 4 sería (con las ecuaciones 1, 5 y 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 días  -1 
abs. (80 %) = 1,6/0,652, es decir, 2,45 días (59 horas) 
o abs. (95 %) = 3,0/0,652, es decir, 4,60 días (110 horas) Del mismo modo, para una sustancia de ensayo con s = 10
 -5 mol/l (log(s) = - 5,0), 
la duración de la absorción sería (ecuaciones 1, 2, 5 y 6): 
log 10 (P ow ) = -0,862. (-5,0) + 0,710 = 5,02 
log 10 k 2 = -0,414. (5,02) + 1,47 
k 2 = 0,246 días  -1 
abs. (80 %) = 1,6/0,246, es decir, 6,5 días (156 horas) 
o abs. (95 %) = 3,0/0,246, es decir, 12,2 días (293 horas) Se utiliza, como alternativa, la expresión: t
 eq = 6,54 x 10  -3 P ow + 55,31 (horas) 
para calcular el tiempo de llegada al estado de equilibrio efectivo (4).  
Previsión de la duración de la fase de depuración  
Se podrá también prever el tiempo necesario para que (a carga corporal se 
reduzca a un determinado porcentaje de la concentración inicial gracias a la ecuación general que describe la absorción y la depuración (cinética de primer 
orden) (1) (8). 
Para la fase de depuración, C
 w se supone nulo. La ecuación puede reducirse a:  
dC f 
dt ¼ Äk 2 C f o C  f ¼ C f;o ·e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
donde C  f.o es la concentración al principio del período de depuración. Se llegará 
a una depuración del 50 % en el tiempo (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 o t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Del mismo modo, el 95 % de depuración se alcanzará en el tiempo:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Si se utiliza el 80 % de la absorción para el primer período (l,6/k  2 ) y el 95 % de 
perdida en la fase de depuración (3,0/k  2 ), entonces la fase de depuración será 
aproximadamente el doble de la depuración de la fase de absorción. 
Es importante, sin embargo, tener en cuenta que estas estimaciones se basan en la 
hipótesis de que los esquemas de absorción y de depuración siguen una cinética 
de primer orden. Si es evidente que no se cumple esta condición, deberán emplearse modelos más complejos [por ejemplo, la referencia (1)].
 
REFERENCIAS 
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982)  Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fisb.  Environ. Toxicol. and Ch. 1, pp. 309- 
320. 
(2) Kristensen P. (1991)  Bioconcentration is fisb: comparison of BCF's derived 
from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to 
the bioavailability of chemicals.  Danish Water Quality Institute. 
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982).  Partitionmg of organic com ­
pounds in octanol-water systems.  Environ: Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10. 
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988).  Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinewtics with fish.  Wat. Res. 22 
(6), pp. 701-707. 
(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975).  Trans­
actions of the American Fisheries Society,  104 (4), pp. 785-792. 
(6) Ernst W. (1985). «Accumulation in Acuatic Organisms». In:  Appraisal of 
tests to predict the environe-mental behaviour of chemicah.  Ed. by Sheeh ­
man P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4, pp. 243- 
255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd, N.Y. 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. 
(1977).  Guidelines for the optimal design of experiments lo estimate para ­
meters in first order kenetic models,  Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622. 
(8) Kónemann H. and Van Leeuwen K. (1980).  Toxicokinetics in fish: Accumu ­
lation and elimination of six Chlorobenzenes by Guppies.  Chemosphere, 9, 
pp. 3-19,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
Anexo 4  
Ejemplos teóricos de calendarios de muestreo para los ensayos de bioconcentración de sustancias con log P  ow = 4 
Muestreos de peces Calendario de muestreo 
Número de muestra Número de peces por 
muestra Frecuencia mínima re ­
querida (días) Muestreos suplementarios  
Fase de absorción - 1 
0 2 (*) 
2 añadir 45-80 peces 
V 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3 a 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4 a 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5 a 4,7 2 6 
Fase de depuración Trasladar los peces a 
agua libre del pro ­
ducto de ensayo 
6 a 5,0 5,3 4 
(4) 
7 a 5,9 7,0 4 
(4) 
8 a 9,3 11,2 4 
(4) 
9 a 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Tomar el agua después de transferir al menos 3 volúmenes de recinto. 
Los valores entre paréntesis son los números de muestras (agua, peces) que se toman si se procede a un muestreo suplementario.  
Nota : La estimación antes del ensayo de k  n para un log P  ow de 4,0 es de 0,652 días  -1 La duración total de la experiencia se fija en: 3 x 
abs. = 3 x 4,6 días, o sea 14 días. Remitirse al anexo 3 para el cálculo de «abs.».  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
Anexo 5  
Discriminación de los modelos  
Se supone que la mayoría de los datos de bioconcentración se describen «razo ­
nablemente» bien con un modelo simple de dos compartimentos/dos parámetros, según indica la curva rectilínea que une aproximadamente los puntos de las 
concentraciones medidas en los peces durante la fase de depuración, cuando se 
representan sobre papel semilogarítmico [cuando estos puntos no pueden unirse con una recta, conviene recurrir a modelos más complejos; véase, por ejemplo, Spacie and Hamelink, referencia (1) en el anexo 3].
 
Método gráfico de determinación de la constante de la velocidad de 
depuración (pérdida) k  2 
Llevar sobre papel semilogarítmico la concentración de la sustancia de ensayo 
encontrada en cada muestra de peces, frente al tiempo de muestreo. La pendiente 
de esta recta es k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Atención: las divergencias en relación con esta línea recta pueden indicar un 
régimen de depuración más complejo que una cinética de primer orden. Puede aplicarse un método gráfico para solucionar los tipos de depuración que se desvían de la cinética de primer orden.
 
Método gráfico de determinación de la constante de la velocidad de 
absorción k  1 
Dada K  2 , se calcula k  1 del modo siguiente: 
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (ecuación 1) 
Se lee el valor de C  t en el punto medio de la curva de absorción suavizada 
obtenida con los datos cuando se representa la concentración logarítmica frente al 
tiempo (en escala aritmética).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Método de cálculo informático de las constantes de las velocidades de 
absorción y de depuración (pérdida)  
Para obtener el factor de bioconcentración y las constantes de velocidad k  1 y 
k 2 se utilizarán preferiblemente métodos informáticos de estimación de paráme ­
tros no lineales. Estos programas establecen los valores de k  1 y de k  2 en 
función de un conjunto de datos secuenciales de concentración en el tiempo 
y del modelo:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c (ecuación 2)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c (ecuación 2) 
donde t  c = tiempo al final de la fase de absorción. 
Este proceso desemboca en una estimación de la desviación típica para k  1 y k  2 
Puesto que k  2 puede estimarse en la mayoría de los casos a partir de la curva de 
depuración con una precisión relativamente grande, y puesto que existe una fuerte correlación entre los dos parámetros k
 l y k 2 si se estiman simultáneamente, 
puede ser deseable calcular en primer lugar k  2 a partir de los datos de depuración 
solamente, y luego calcular k  1 a partir de los datos de absorción con ayuda de 
una regresión lo lineal.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  ENSAYO DE CRECIMIENTO EN PECES JUVENILES  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo de toxicidad para el crecimiento re ­
produce las directrices del documento OCDE TG 215 (2000).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente ensayo tiene por objeto determinar los efectos de la 
exposición prolongada a sustancias químicas sobre el crecimiento de peces juveniles y se funda en un método elaborado y sometido 
a un estudio interlaboratorios (1) (3) en la Unión Europea para 
valorar los efectos de las sustancias químicas en el crecimiento de juveniles de trucha arco iris  (Oncorhynchus mykiss)  en condiciones 
dinámicas. Pueden emplearse otras especies de peces bien estudiadas. 
Por ejemplo, se dispone de una cierta experiencia en ensayos de 
crecimiento con el pez cebra  (Danio rerio) (2) (4) (5) y el medaka  
(Oryzias (atipes)  (6) (7) (8). 
Véase también la parte C de la introducción general.
 
1.2. DEFINICIONES  
Concentración mínima con efecto observado (LOEC):  concentra ­
ción más baja de sustancia de ensayo con la que se observa un efecto 
significativo (para p < 0,05) en comparación con el control. Además, todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC han de provocar un efecto nocivo superior o igual al que se observa con 
dicha concentración.  
Concentración (máxima) sin efecto observado (NOEC):  concen­
tración de ensayo inmediatamente inferior a la LOEC. 
EC
 X : en el presente método de ensayo, concentración de sustancia de 
ensayo que produce una variación del x % en la tasa de crecimiento de los peces respecto a los controles.  
Tasa de carga:  peso húmedo de peces por unidad de volumen de 
agua.  
Densidad de población:  número de peces por unidad de volumen de 
agua.  
Tasa de crecimiento específico de cada pez:  tasa de crecimiento de 
un pez respecto a su peso inicial.  
Tasa de crecimiento específico medio por recipiente:  tasa de cre ­
cimiento medio de la población de un recipiente a una concentración determinada.  
Tasa de crecimiento pseudoespecífico:  tasa de crecimiento indivi ­
dual respecto al peso inicial medio de la población del recipiente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1146
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Después de haberlos pesado, se colocan peces juveniles en fase de 
crecimiento exponencial en recipientes de ensayo y se exponen a una gama de concentraciones subletales de la sustancia de ensayo di ­
suelta en agua, preferiblemente en condiciones dinámicas (flujo con ­
tinuo) o, de no ser posible, en condiciones semiestáticas adecuadas (renovación discontinua). La duración del ensayo es de 28 días. Se proporciona alimento a los peces todos los días. La ración alimen ­
taria se determina en función del peso inicial de los peces y puede 
volverse a calcular transcurridos 14 días. Al final del ensayo, se vuelven a pesar los peces. Se analizan los efectos sobre la tasa de 
crecimiento mediante un modelo de regresión con el fin de estimar la 
concentración que produciría una variación del x % de dicha tasa, es decir, EC
 x (EC  10 , EC  20 o EC  30 , por ejemplo). También pueden 
compararse los datos con los valores de los controles para determinar 
la concentración mínima con efecto observado (LOEC) y. de ahí, la 
concentración (máxima) sin efecto observado (NOEC).  
1.4. INFORMACIÓN RELATIVA A LA SUSTANCIA DE ENSAYO 
Debe disponerse de los resultados de un ensayo de toxicidad aguda 
(véase el método C.1) efectuado preferiblemente con la especie ob ­
jeto del presente ensayo y conocerse la solubilidad en el agua y la presión de vapor de la sustancia de ensayo. Para calcular la cantidad 
de sustancia en las soluciones de ensayo debe aplicarse un método 
analítico fiable, cuyo limite de detección y precisión sean conocidos y figuren en el informe. 
La información útil para establecer las condiciones de ensayo incluye 
la fórmula estructural de la sustancia de ensayo, su pureza, estabili ­
dad en el agua y a la luz, pK
 a , P ow y los resultados de un ensayo de 
biodegradabilidad fácil (véase el método C.4).  
1.5. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Para que el ensayo sea válido deben darse las condiciones siguientes: 
— la mortalidad en los controles no ha de superar el 10 % al final 
del ensayo, 
— el peso medio de los peces de los controles debe haber aumen ­
tado lo suficiente para poder detectar la variación mínima de la 
tasa de crecimiento que se considere significativa. Un ensayo interlaboratorios (3) ha puesto de manifiesto que, en el caso de la trucha arco iris, al cabo de 28 días el peso medio de los peces 
de los controles ha de haberse incrementado al menos en la mitad 
(50 %) de su peso medio inicial. Por ejemplo, si el peso inicial es de 1 g/pez (= 100 %), el peso final tras 28 días ha de ser  ≥ 
1,5 g/pez ( ≥ 150 %), 
— la concentración de oxígeno disuelto ha de ser, al menos, del 
60 % del valor de saturación en el aire a lo largo de todo el 
ensayo, 
— en ningún momento del ensayo la temperatura del agua debe 
variar en más de ± 1
 o C entre los recipientes de ensayo y debe 
mantenerse en un intervalo de 2  o C dentro de las gamas esta ­
blecidas para la especie sometida a ensayo (apéndice 1).  
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Equipo  
Se empleará el equipo común de laboratorio y, en particular: 
a) medidores de oxígeno y de pH;  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
b) equipo para determinar la dureza y alcalinidad del agua: 
c) dispositivo adecuado de regulación de la temperatura, preferible ­
mente continua: 
d) recipientes de material químicamente inerte y de capacidad ade ­
cuada a la carga y la densidad de población recomendadas (véase el punto 1.8.5 y el apéndice 1); 
e) balanza suficientemente precisa (precisión de ± 0,5 %).
 
1.6.2.  Agua  
Puede utilizarse para el ensayo toda agua en la que la especie so ­
metida a ensayo muestre una tasa de crecimiento y supervivencia a largo plazo adecuadas. La calidad ha de ser constante a todo lo largo del ensayo. El pH debe hallarse entre 6,5 y 8,5, si bien a lo largo de 
un mismo ensayo debe permanecer en un intervalo de ± 0,5 pH 
unidades. Se recomienda una dureza superior a 140 mg/l (CaCO
 3 ). 
Deben tomarse periódicamente muestras para análisis con el fin de cerciorarse de que el agua de dilución no interfiere en los resultados 
del ensayo (por ejemplo, por complejación de la sustancia de ensa ­
yo). Cuando se sepa que un agua de dilución es de calidad relativa ­
mente constante, conviene proceder, por ejemplo, cada tres meses, a la determinación de los metales pesados (por ejemplo, Cu, Pb, Zn, 
Hg, Cd y Ni), aniones y cationes principales (por ejemplo, Ca, Mg, 
Na, K, Cl y SO
 4 ), plaguicidas (por ejemplo, organofosforados totales 
y organoclorados totales), carbono orgánico total y sólidos en sus ­
pensión. Si se demuestra que la calidad del agua es constante al 
menos durante un año, los análisis pueden ser menos frecuentes y 
espaciarse más (por ejemplo, cada seis meses). En el apéndice 2 se recogen algunas características químicas de un agua de dilución aceptable.
 
1.6.3.  Soluciones de ensayo  
Las soluciones de ensayo a las concentraciones elegidas se preparan 
por dilución de la solución madre. 
La solución madre se prepara preferiblemente por simple mezcla o 
agitación mecánica de la sustancia de ensayo en el agua de dilución (por ejemplo, mediante un agitador o ultrasonidos). Pueden em ­
plearse columnas de saturación (columnas de solubilidad para lograr 
la concentración adecuada de solución madre. 
En algunos casos puede ser necesario usar disolventes o dispersantes 
(agentes de disolución) para obtener una solución madre a la concen ­
tración deseada. Puede entonces utilizarse como disolvente acetona, 
etanol, meta-nol. dimetilsulfóxido, dimetilformamida o trietílenglicol, y como dispersante Cremophor RH40, Tween 80, metilcelulosa al 0,01 % o HCO-40. Deben tomarse precauciones si se emplean agen ­
tes fácilmente biodegrada-bles (como la acetona) y/o muy volátiles, 
pues estos pueden dar lugar a una proliferación bacteriana en los ensayos dinámicos. Si se emplea un agente de disolución, no debe actuar de forma significativa sobre el crecimiento de los peces ni 
producir efectos nocivos visibles en los juveniles, lo cual ha de 
demostrarse en un lote de control que solo contenga disolvente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Para los ensayos dinámicos se requiere un sistema que aporte y 
diluya continuamente la solución madre de la sustancia de ensayo 
(por ejemplo, bomba dosificadora, diluyente proporcional o sistema saturador) para distribuir una serie de concentraciones en los reci ­
pientes de ensayo. Los regímenes de flujo de las soluciones madre y 
del agua de dilución deben supervisarse con regularidad, preferible ­
mente todos los días, y no debería variar en más del 10 % a lo largo del ensayo. Con arreglo a un ensayo interlaboratorios (3), en el caso de la trucha arco iris se considera adecuado un régimen de renova ­
ción del agua durante el ensayo equivalente a 6 1/g de pez/día (véase 
el punto 1.8.2.2). 
En el caso de los ensayos semiestáticos, la frecuencia de renovación 
del medio dependerá de la estabilidad de la sustancia de ensayo, si bien se recomienda renovarlo todos los días. Si los ensayos prelimi ­
nares de estabilidad (véase el punto 1.4) ponen de manifiesto que la 
concentración de la sustancia de ensayo no es estable (es decir, queda fuera del intervalo del 80 al 120 % de la concentración no ­
minal o cae por debajo del 80 % de la concentración medida al 
inicio) entre dos renovaciones, debe plantearse la realización de un 
ensayo dinámico.
 
1.6.4.  Selección de la especie  
Se recomienda realizar el ensayo con la trucha arco iris  (Oncorhyn ­
chus mykiss),  pues es la especie que más se ha empleado en el 
ensayo interlaboratorios (1) (3). También es posible emplear otras especies bien estudiadas, aunque entonces podría ser necesario adap ­
tar el procedimiento para que las condiciones de ensayo sean ade ­
cuadas. Por ejemplo, se dispone asimismo de experiencia con el pez cebra  (Danio rerio)  (4) (5) y el medaka  (Oryzias latipes)  (6) (7) (8). 
En tal caso, deben justificarse la elección de la especie y el método 
experimental.
 
1.6.5.  Preparación de los peces  
Se seleccionan los peces de ensayo de una misma población, y 
preferentemente de un mismo desove, que se haya mantenido al menos dos semanas antes del ensayo en condiciones de calidad del agua e iluminación similares a las del ensayo. Debe proporcionárse ­
les una ración alimentaria diaria del 2 % de su peso corporal como 
mínimo y preferiblemente del 4 % mientras duren la preparación y el ensayo. 
Transcurridas 48 horas en esas condiciones, se registra la mortalidad 
y se aplican los criterios siguientes: 
— si la mortalidad es superior al 10 % de la población en siete días, 
se rechaza todo el lote, 
— si la mortalidad se halla entre el 5 y el 10 % de la población, se 
prolonga otros siete días el período de aclimatación; si durante este segundo período la mortalidad supera el 5 %, se rechaza todo el lote, 
— si la mortalidad es inferior al 5 % de la población en siete días, 
se acepta el lote. 
Los peces no deben recibir tratamiento terapéutico alguno durante el 
ensayo ni en las dos semanas anteriores al mismo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. DISEÑO DEL ENSAYO 
Se entenderá por «diseño del ensayo» la selección del número de 
concentraciones de ensayo y el intervalo entre las mismas, el número de recipientes por concentración y el número de peces por recipiente. 
Lo más idóneo es diseñar el ensayo con arreglo a: 
a) el objetivo del estudio; 
b) el método de análisis estadístico que vaya a emplearse; 
c) la disponibilidad y el coste de los recursos experimentales. 
En la medida de lo posible, el enunciado del objetivo debe especi ­
ficar la potencia estadística necesaria para detectar una diferencia determinada (por ejemplo, de tasa de crecimiento) o la precisión 
con la que ha de proporcionarse la EC
 x (por ejemplo, x — 10, 20 
o 30 y preferiblemente no por debajo de 10) para poder hacer una estimación. Sin ello no puede darse una, indicación precisa de la escala del estudio. 
Es importante ser consciente de que un diseño idóneo (que saca 
mayor partido de los recursos) para un método de análisis estadístico 
no lo es necesariamente para otro. Así pues, el diseño recomendado para la estimación de una LOEC/NOEC no será el mismo que se recomiende para un análisis por regresión. 
En la mayoría de los casos, es preferible el análisis de regresión al 
análisis de la varianza, por los motivos que exponen Stephan y 
Rogers (9). Sin embargo, si no se encuentra un modelo de regresión 
adecuado (r
 2 < 0,9), debe recurrirse a la NOEC/LOEC.  
1.7.1.  Diseño para el análisis por regresión  
Los aspectos importantes para el diseño de un ensayo que vaya a 
analizarse por regresión son los siguientes: 
a) Es conveniente que las concentraciones empleadas incluyan la 
concentración con efecto (EC  1O,2O,3O  , etc.) y la gama de concen ­
traciones en la sustancia de ensayo. La precisión con la que puede estimarse la concentración con efecto será mayor si dicha 
concentración se halla en el medio de la gama de concentraciones 
empleada en el ensayo. Para seleccionar las concentraciones de ensayo adecuadas puede resultar útil un ensayo previo de deter ­
minación de gama; 
b) para que la modelización estadística sea satisfactoria, el ensayo 
debe incluir al menos un recipiente de control y otros cinco 
recipientes con distintas concentraciones. En su caso, si se emplea 
un agente de disolución, debe realizarse, además de las series tratadas con la sustancia de ensayo, un control con agente de disolución a la concentración de ensayo más elevada (véanse 
los puntos 1.8.3 y 1.8.4); 
c) puede emplearse una serie geométrica o logarítmica apropiada 
(10) (véase el apéndice 3). Es preferible un espaciamiento loga ­
rítmico entre las concentraciones de ensayo;
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
d) si se dispone de más de seis recipientes, los que sobrepasen dicha 
cantidad se emplearán como recipientes en paralelo o se distri ­
buirán en la gama de concentraciones para reducir el espacia ­
miento entre estas.Ambas opciones son igualmente válidas.  
1.7.2.  Diseño para la estimación de la NOEC/LOEC mediante análisis 
de la varianza (ANOVA)  
Conviene disponer de varios recipientes en paralelo para cada 
concentración y realizar el análisis estadístico por recipiente (11). 
Sin recipientes en paralelo no puede tenerse en cuenta la variabi ­
lidad entre recipientes además de la que existe entre los peces. No obstante, la experiencia ha puesto de manifiesto (12) que en el 
caso estudiado la variabilidad entre recipientes era muy escasa en 
relación con la variabilidad dentro de un mismo recipiente (es decir, entre los peces). Así pues, una opción relativamente acepta ­
ble consiste en efectuar el análisis estadístico a escala individual 
con cada pez. 
Normalmente se emplea una serie geométrica de al menos cinco 
concentraciones de sustancia de ensayo, espaciadas por un factor que no supere 3,2. 
Por lo general, si se realizan ensayos con recipientes en paralelo, el 
número de recipientes de control en paralelo y, por tanto, el número de peces ha de ser el doble del empleado con cada concentración de ensayo, que debe ser constante (13) (14) (15). De no usarse reci ­
pientes en paralelo, el número de peces del grupo de control ha de 
ser igual al empleado en cada concentración de ensayo. 
Si el análisis de la varianza (ANOVA) se realiza en los recipientes y 
no a nivel individual [lo cual requeriría marcar todos los peces o 
utilizar las tasas de crecimiento pseudoespecífico (véase el punto 
2.1.2)], se necesita una cantidad suficiente de recipientes en paralelo para poder determinar la desviación estándar de los recipientes con la misma concentración, lo cual significa que el error del análisis de la 
varianza tendrá al menos 5 grados de libertad (11). Si solo se em ­
plean recipientes en paralelo para los controles, se corre el riesgo de que la variabilidad del error esté sesgada, pues podría aumentar con el valor medio de la tasa de crecimiento en cuestión. Dado que es 
probable que la tasa de crecimiento disminuya cuando aumente la 
concentración, se tendería a sobrestimar la variabilidad.
 
1.8. PROCEDIMIENTO  
1.8.1.  Selección y pesaje de los peces  
Es importante que el peso de los peces varíe lo menos posible al 
inicio del ensayo. En el apéndice I figuran las gamas de peso apro ­
piadas en cada una de las especies recomendadas para el ensayo. 
Conviene que, al principio del ensayo, la gama de pesos de todo el lote de peces utilizados se mantenga en un intervalo de ± 10 % de la media aritmética y, en cualquier caso, no supere el 25 %. Se reco ­
mienda pesar una submuestra de peces antes del ensayo para calcular 
el peso medio.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
No se proporciona alimento alguno a los peces durante las 24 horas 
anteriores al inicio del ensayo. A continuación, se toman los peces al 
azar. Se emplea un anestésico general [por ejemplo, una solución acuosa de 100 mg/l de metanosulfonato de tricaína (MS 222) neu ­
tralizada mediante adición de dos partes de bicarbonato sódico por 
parte de MS 222] para pesar cada sujeto en húmedo (secado con 
material absorbente) con la precisión indicada en el apéndice 1. Se apartan los peces cuyo peso se halla en el intervalo deseado y se reparten al azar entre los recipientes de ensayo. Se registra el peso 
húmedo total de los peces de cada recipiente. Tanto el uso de anes ­
tésico como la manipulación (incluido el secado y pesaje) pueden afectar y herir a los peces juveniles, sobre todo si se trata de especies de pequeño tamaño. Por ello, deben manipularse los animales objeto 
del ensayo con la mayor precaución para evitar cualquier agresión. 
Se vuelven a pesar los peces el 28
 o día de ensayo (véase el punto 
1.8.6). No obstante, si se considera necesario ajustar la ración ali ­
mentaria, pueden pesarse los peces el 14  o día de ensayo (véase el 
punto 1.8.2.3). Para valorar las variaciones de tamaño de los peces y, 
de ahí, ajustar la ración alimentaria, también puede emplearse otro método como el fotográfico.
 
1.8.2.  Condiciones de exposición  
1.8.2.1.  Duración  
La duración del ensayo es > 28 días.  
1.8.2.2.  Tasa de carga y densidad de población  
Es importante que la tasa de carga y la densidad sean apropiadas 
para la especie de ensayo empleada (véase el apéndice 1). La tensión que genera a los peces una densidad de población demasiado elevada 
produce una disminución de la tasa de crecimiento y posiblemente la 
enfermedad. Por el contrario, si la densidad es demasiado baja, puede dar lugar a un comportamiento territorial, lo cual también puede afectar al crecimiento. En cualquier caso, la tasa de carga 
debe ser suficientemente baja para poder mantener sin aireación 
una concentración mínima de oxígeno disuelto del 60 % del valor de saturación en el aire. Un ensayo interlaboratorios (3) ha puesto de manifiesto que, en el caso de la trucha arco iris, resulta aceptable una 
tasa de carga de 16 truchas de 3 a 5 g en un volumen de 40 1. Se 
recomienda una frecuencia de renovación del agua durante el ensayo de 6 l/g de pez/día.
 
1.8.2.3.  Alimentación  
Debe proporcionarse a los peces una dieta suficiente y adecuada 
(apéndice 1) para permitir una tasa de crecimiento aceptable, al 
tiempo que se evita la proliferación bacteriana y la turbidez del agua. En el caso de la trucha arco iris, esas condiciones deberían conse ­
guirse con una ración diaria del 4 % de su peso corporal (3) (16) 
(17) (18). La ración diaria puede dividirse en dos partes iguales y 
administrarse en dos veces, con un mínimo de 5 horas de intervalo. La ración es función del peso inicial total de los peces de cada recipiente de ensayo. Si los peces se pesan otra vez el 14
 o día de 
ensayo, se vuelve a calcular la ración. La alimentación debe supri ­
mirse durante las 24 horas anteriores al pesaje.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Todos los días debe limpiarse cuidadosamente por succión el fondo 
de los recipientes de ensayo para eliminar los alimentos que no se 
hayan consumido y la materia fecal.  
1.8.2.4.  Iluminación y temperatura  
El fotoperíodo y la temperatura del agua han de ser adecuados para 
la especie utilizada (véase el apéndice 1).  
1.8.3.  Concentraciones de ensayo  
Normalmente se necesitan cinco concentraciones de sustancia de 
ensayo, sea cual sea el diseño del mismo (véase el punto l.7.2). Para seleccionar las concentraciones apropiadas es útil conocer pre ­
viamente la toxicidad de la sustancia de ensayo (por ejemplo, gracias 
a un ensayo de toxicidad aguda o un estudio de determinación de 
gamas). El empleo de menos de cinco concentraciones debe justifi ­
carse. Las sustancias no deben someterse a ensayo en concentracio ­
nes superiores a su límite de solubilidad en el agua. 
Si se emplea un agente de disolución para facilitar la preparación de 
la solución madre, su concentración final ha de ser preferiblemente la misma en todos los recipientes de ensayo y no debe superar 0,1 ml/l 
(véase el punto 1.6.3). No obstante, debe evitarse en la medida de lo 
posible el empleo de tales agentes.
 
1.8.4.  Controles  
El número de recipientes de control con agua de dilución dependerá 
del diseño del ensayo (véanse los puntos 1.7 a 1.7.2). Si se emplea 
un agente de disolución, se realizará la misma cantidad de controles con agua de dilución que con agente de disolución.
 
1.8.5.  Frecuencia de los análisis y mediciones  
Las concentraciones de la sustancia de ensayo deben determinarse 
periódicamente durante el mismo (véase más adelante). 
En los ensayos dinámicos, debe comprobarse periódicamente, a ser 
posible todos los días, los flujos de diluyente y de solución madre de 
sustancia tóxica. Dichos flujos no deberían variar en más del 10 % a 
lo largo del ensayo. Cuando la concentración de la sustancia deba permanecer entre el ± 20 % de la concentración nominal (es decir, en el intervalo del 80 al 120 %; véanse los puntos 1.6.2 y 1.6.3), se 
recomienda analizar, como mínimo, la concentración de ensayo más 
baja y la más alta al principio del ensayo y, a continuación, una vez por semana. En los ensayos en que no quepa esperar que la concen ­
tración de sustancia de ensayo permanezca en un intervalo de ± 
20 % de la concentración nominal (con arreglo a los datos de esta ­
bilidad de la sustancia), es preciso analizar todas las concentraciones de ensayo, pero según el mismo régimen. 
En los ensayos semiestáticos (con renovación) en que la concentra ­
ción de la sustancia debe permanecer entre el + 20 % de la concen ­
tración nominal, se recomienda analizar, como mínimo, la concen ­
tración de ensayo más baja y la más alta en cuanto se preparen y 
justo antes de renovar el medio al principio del estudio y, a conti ­
nuación, una vez por semana. En los ensayos en que no quepa esperar que la concentración de sustancia de ensayo permanezca en un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal, es preciso 
analizar todas las concentraciones de ensayo según el mismo régi ­
men que el empleado con las sustancias más estables.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Se recomienda basar los resultados en las concentraciones medidas. 
No obstante, si los datos disponibles muestran que la concentración 
de la sustancia de ensayo en la solución se ha mantenido debida ­
mente a lo largo de todo el ensayo en un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal o de la concentración medida al inicio, los 
resultados pueden fundarse en las concentraciones nominales o en las 
medidas. 
En algunos casos puede estar indicado filtrar (por ejemplo, con un 
filtro de poros de 0,45 μm) o centrifugar las muestras. Aunque la 
centrifugación es el método recomendado, si el medio de ensayo no se absorbe en los filtros, también puede emplearse la filtración. 
Durante el ensayo debe medirse en todos los recipientes de ensayo el 
oxígeno disuelto, el pH y la temperatura. En los controles y en un 
uno de los recipientes con la concentración más alta se medirán la 
dureza total, la alcalinidad y la salinidad, si procede. El oxígeno disuelto y la salinidad, cuando proceda, se medirán como mínimo tres veces: al principio, a la mitad y al final del ensayo. En los 
ensayos semiestáticos se recomienda medir el oxígeno disuelto más 
a menudo, preferiblemente antes y después de cada renovación del agua o al menos una vez por semana. El pH ha de medirse al principio y al final de cada período de renovación del agua en los 
ensayos semiestáticos y al menos una vez por semana en los diná ­
micos. La dureza y la alcalinidad se medirán una vez en cada ensa ­
yo. La temperatura debería someterse a control continuo al menos en un recipiente de ensayo.
 
1.8.6.  Observaciones  
Peso: al final del ensayo deben pesarse en húmedo (secados con 
material absorbente) todos los peces vivos, en grupos por recipiente 
de ensayo o individualmente. Es preferible pesar los animales por 
recipiente, pues el pesaje individual requiere marcar todos los peces. Si se determina la tasa de crecimiento específico de cada pez (pesaje individual), se optará por una técnica de marcado que no perturbe a 
los animales (en lugar del criomar-cado puede emplearse, por ejem ­
plo, hilo fino de pescar de colores). 
Deben examinarse los peces todos los días durante el ensayo y 
registrarse toda anomalía externa (hemorragias, despigmentación, etc.) y todo comportamiento anómalo. Se tomará nota de todas las 
muertes y se retirarán los peces muertos lo antes posible. Estos no se 
sustituirán, ya que la tasa de carga y la densidad de población son suficientemente elevadas para evitar que la variación del número de peces en un recipiente afecte al crecimiento. Sin embargo, deberá 
adaptarse la ración alimentaria.
 
2. RESULTADOS E INFORME  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Es aconsejable que participe un estadístico tanto en el diseño como 
en el análisis del ensayo, pues el presente método da cabida a 
variaciones considerables en el procedimiento experimental, por ejemplo, en cuanto al número de recipientes y de concentrationes de ensayo, el número de peces, etc. Debido a las diversas posibili ­
dades en el diseño del ensayo, no se proporcionan aqui directrices 
concretas sobre los métodos estadísticos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
No es preciso calcular la tasa de crecimiento en los recipientes de 
ensayo en los que la mortalidad es superior al 10 %, si bien debe 
indicarse la tasa de mortalidad a todas las concetraciones de ensayo. 
Con independencia del método empleado par analizar los datos, el 
concepto central es la tasa de crecimiento específico  r entre el mo ­
mento t  1 y el momento t  2, que puedo definirse de varias formas 
según si los peces se han marcado individualmente o no o si se 
necessita una media por recipiente.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
donde: 
r 1 = tasa de crecimiento específico de cada pez, 
r 2 = tasa de crecimiento específico medio por recipiente, 
r 3 = tasa de crecimiento pseudoespecífico, 
w 1 , w 2 = peso de un pez determinado en los momentos t  1 y t 2 , 
respectivamente, 
log e w 1 = logaritmo del peso de un pez determinado al inicio del 
período de estudio, 
log e w 2 = logaritmo del peso de un pez determinado al final del 
período de estudio, 
log e W 1 = media de los logaritmos de los valores w  1 de los peces 
del recipiente al inicio del período de estudio, 
log e W 2 = media de los logaritmos de los valores w  2 de los peces 
del recipiente al final del período de estudio. 
t 1 , t 2 = tiempo (días) inicial y fin del período de estudio 
r 1 , r 2 , r 3 pueden calcularse para el período comprendido entr el día 0 
y el día 28 y, si procede (es decir, si se han realizado mediciones el 
día 14), para los períodos entre los días 0 y 14, y 14 y 28.  
2.1.1.  Análisis de los resultados por regresión (modelización concentra ­
ción-repuesta)  
Este método de análisis establece una relación matemática adecuada 
entre la tasa de crecimiento específico y la concentración, lo cual 
permite calcular la «EC  x », es decir, todo valor de EC necesario. Con 
este método no es preciso calcular (r  2 ). Es preferible este ultimo 
método y, además, resultas más adecuado si se utilizan especies más pequeñas. 
Con el fin de estudiar la relación concentratión-respuesta, debe ha ­
cerce una representación gráfica de las tasas de crecimiento especí ­
fico medio por recipiente  (r
 2 ) en función de la concentración.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Para expresar la relación entre  r 2 y la concentración, debe elegirse un 
modelo adecuado y justificarse la elección mediante un razonamiento 
pertinente. 
Si el número de peces que sobreviven varía de un recipiente a otro, 
debe ponderarse el proceso de ajuste del modelo para tener en cuenta 
el tamaño desigual de los grupos. 
El método de ajuste del modelo debe permitir estimar, por ejemplo, 
la EC  20 y deducir su dispersión (error típico o intervalo de con ­
fianza). El gráfico del modelo ajustado debe figurar junto a los datos para poder valorar la adecuación del ajuste del modelo (9) (19) (20) (21).
 
2.1.2.  Análisis de los resultados para calcular la LOEC  
Si en el ensayo se han utilizado series en paralelo para todas las 
concentraciones, la estimación de la LOEC podría basarse en el análisis de la varianza (ANOVA) de la tasa de crecimiento específico 
medio de cada recipiente (véase el punto 2.1), seguido de un método 
adecuado [por ejemplo, el de Dunnett o de Williams (13) (14) (15) (22)] para comparar la media r a cada concentración con la media r de los controles con el fin de determinar la concentración mínima a 
la que dicha diferencia es significativa para p = 0,05. Si las hipótesis 
necesarias relativas a los métodos paramétricos no se cumplen —dis ­
tribución no normal (por ejemplo, prueba de Shapiro-Wilk) o va ­
rianza heterogénea (prueba de Bartlett)—, deberá estudiarse la posi ­
bilidad de transformar los datos para homogeneizar las varianzas 
antes de efectuar el análisis de la varianza (ANOVA) o el análisis ponderado de la varianza (ANOVA). 
Si en el ensayo no se han utilizado series en paralelo para todas las 
concentraciones, el análisis de la varianza (ANOVA) basado en los recipientes resultará insensible o imposible. En ese caso, puede con ­
siderarse aceptable basar el análisis de la varianza (ANOVA) en la 
tasa de crecimiento pseudoespecífico r
 3 de cada pez. 
A continuación puede compararse la media r, para cada concentra ­
ción de ensayo con la media r  3 de los controles, tras lo cual puede 
determinarse la LOEC como anteriormente. Debe admitirse que este método no tiene cuenta en absoluto la variabilidad entre recipientes, al margen de la imputable a la variabilidad entre los peces. Sin 
embargo, la experiencia ha puesto de manifiesto (9) que la variabi ­
lidad entre recipientes es muy escasa en relación con la variabilidad dentro de un mismo recipiente (es decir, entre los peces). Si el análisis no incluye los datos relativos a cada pez, deberá indicarse 
el método de identificación de los valores atípicos y justificarse su 
utilización.
 
2.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los resultados deben interpretarse con prudencia si las concentracio ­
nes medidas de las sustancias tóxicas en las soluciones de ensayo se 
aproximan a los límites de detección del método de análisis o, en los ensayos semi-estáticos, si la concentración de sustancia de ensayo disminuye entre el momento en que se prepara la solución y el 
momento previo a la renovación.
 
2.3. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Sustancia de ensayo:  
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes, 
— identificación química, incluida la pureza y el método de análisis 
cuantitativo de la sustancia de ensayo, si procede.  
2.3.2.  Especie sometida a ensayo:  
— denominación científica, 
— cepa, tamaño, proveedor, tratamientos previos, etc.  
2.3.3.  Condiciones de ensayo:  
— método empleado (por ejemplo, semiestático/renovación o diná ­
mico, carga, densidad de población, etc.), 
— diseño del ensayo (por ejemplo, número de recipientes de ensa ­
yo, de concentraciones de ensayo y de recipientes en paralelo, número de peces por recipiente), 
— método de preparación de las soluciones madre y frecuencia de 
renovación (en su caso, se especificarán el agente de disolución empleado y su concentración), 
— concentraciones nominales de ensayo, medias de los valores de ­
terminados analíticamente en los recipientes de ensayo, desvia ­
ciones estándar de estos, método de obtención y datos que mues ­
tren que las mediciones se refieren a las concentraciones de la 
sustancia de ensayo en disolución verdadera, 
— características del agua de dilución: pH, dureza, alcalinidad, tem ­
peratura, concentración de oxígeno disuelto, contenido de cloro 
residual (si se ha medido), carbono orgánico total, sólidos en suspensión, salinidad del medio de ensayo (si se ha medido) y cualquier otra medición realizada, 
— calidad del agua en los recipientes de ensayo: pH, dureza, tem ­
peratura y concentración de oxígeno disuelto, 
— información detallada de la alimentación (por ejemplo, tipo de 
alimento o alimentos, procedencia, cantidad proporcionada y fre ­
cuencia).
 
2.3.4.  Resultados:  
— datos que demuestren que los controles cumplen los criterios de 
validez relativos a la supervivencia y datos de la mortalidad observada en todas las concentraciones de ensayo, 
— técnicas de análisis estadístico aplicadas, estadísticas basadas en 
las series en paralelo o en los peces, tratamiento de los datos y justificación de los métodos empleados, 
— cuadros que recojan el peso individual y medio de los peces los 
días 0, 14 (si se han pesado) y 28, valores de las medias por recipiente o tasas de crecimiento pseudoespecífico (si procede) correspondientes a los períodos de 0 a 28 días o, en su caso, de 0 
a 14 y de 14 a 28, 
— resultados del análisis estadístico [análisis de regresión o análisis 
de la varianza (ANOVA)], preferiblemente nen forma de cuadro 
y de gráfico. LOEC (p = 0,05) y NOEC o EC con sus errores 
típicos, si es posible.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— incidencia de toda reacción anómala de los peces y de todo 
efecto visible producido por la sustancia de ensayo.  
3. REFERENCIAS 
(1) Solbe J.F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 93 50 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. 
WRc Report No. PRD 1388-M/2. 
(2) Meyer, A., Bierman, C.H. y Orti, G. (1993). The phylogenetic 
position of the zebrafish  (Danio reno),  a model system in 
developmental biology: an invitation to the comparative met ­
hod, Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236 
(3) Ashley S., Mallett M.J. y Grandy N.J. (1990). EEC Ring Test 
of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the 
European Communities. WRc Report No EEC 2600-M. Cros ­
sland N.O. (1985). A method to evalúate effects of toxic che ­
micals on fish growth. Chemosphere, 14, pp 1855-1870. 
(4) Crossland N.O. (1985). A method to evalúate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp 1855-1870. 
(5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M, 
Munk R., Scholz N. y Hófte B.B. (1991). Effect of 3.4-dichlo ­
roaniline on the early life stages of the Zebrafish  (Brachydanio 
rerio):  results of a comparative laboratory study. Ecotox. En ­
viron. Safety. 21. pp 157-164. 
(6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biologi ­
cal field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Pu ­
blish. Tokio. Japón. 
(7) Holcombe . G.W.. Benoit D.A., Hammermeister, D.E., Leo ­
nard, E.N. y Johnson, R.D. (1995). Acute and long-term ef ­
fects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias lati ­
pes). Arch. Environ. Coma. Toxicol. 28, pp 287-297. 
(8) Benoit, D.A., Holcombe, GAV. y Spehar, R.L. (199l). Guide ­
lines for conducting early life toxicity tests with Japanese me ­
daka ( Oryzias latipes).  Ecological Research Series EPA-600:3- 
91-06 3. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth. Mi ­
nesota. 
(9) Stephan CE. y Rogers J.W. (1985). Advantages of using re ­
gression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Sympo ­
sium, ASTM STP 891, R C Bahner y D J Hansen. Eds. Ame ­
rican Society for Testing and Materials, Filadelfia, pp 328-338. 
(10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS l/RM/28, 81 p. 
(11) Cox D.R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt. 
(12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham. UK, 10- 
12 diciembre de 1991. 
(13) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, pp 1096-1121.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp 482-491. 
(15) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp 103-117. 
(16) Johnston, W.L., Atkinson. J.L., Glanville NT. (1994). A te ­
chnique using sequential feedings of different coloured food 
to determine food intake by individual rainbow trout,  On­
corhynchus mykiss:  effect of feeding level. Aquaculture 120, 
123-13 3. 
(17) Quinton, J. C. y Blake, R.W. (1990). The effect of feed 
cycling and radon level on the compensatory growth response 
in rainbow trout,  Oncorhynhus  mykiss. Journal of Fish Bio ­
logy, 37, 33-41. 
(18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, 
Inc. Neptune City. Nueva Jersey, E.E.U.U. 288 P. 
(19) Bruce, R.D. y Vorsteeg D.J. (1992). A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data . Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494. 
(20) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, 
J.H., Dean, Marcus, M.D. y Mclntyre, D.O. (1989). Precision 
of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (Ameri ­
can Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power 
Research Institute, Palo Alto, CA. 
(21) Norbert-King T.J. (1988). An interpolation estímate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment 
Center. Sept. 1988. 12 pp. 
(22) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, pp 510-531.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
Apéndice 1  
ESPECIES DE PECES RECOMENDADAS Y CONDICIONES ADECUADAS PARA EL ENSAYO  
Especie Gama de 
temperatura 
recomendada 
( o C) Fotoperíodo 
(horas) Gama recomen ­
dada de peso 
inicial de los peces 
(g) Precisión exigida de 
la medición Tasa de carga 
(g/l) Densidad de 
población 
(por litro) Alimentación Duración del 
ensayo 
(días)  
Especie recomendada:  
Oncorhynchus mykiss  
Trucha arco iris 12,5 - 16,0 12-16 1-5 100 mg 1,2 - 2,0 4 Especialidad alimentaria seca 
para crías de salmónidos > 28  
Otras especies bien documen ­
tadas:  
Danio rerio  
Pez cebra 21-25 12-16 0,050 - 0,100 1 mg 0,2 - 1,0 5-10 Alimento vivo  (Brachionus ar ­
temia)  > 28  
Oryzias latipes  
Medaka 21-25 12-16 0,050 - 0,100 To nearest 1 mg 0,2 - 1,0 5-20 Alimento vivo  (Brachionus ar ­
temia)  > 28
Apéndice 2  
ALGUNAS CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE UN AGUA DE 
DILUCIÓN ACEPTABLE  
Sustancia Concentraciones  
Materia en suspensión < 20 mg/l 
Carbono orgánico total < 2 mg/l 
Amoniaco no ionizado < 1 μg/l 
Cloro residual < 10 μg/l 
Plaguicidas organofosforados totales < 50 ng/l Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlora ­
dos < 50 ng/l 
Cloro orgánico total < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
Apéndice 3  
Series logarítmicas de concentraciones válidas para un ensayo de toxicidad (10)  
Columna (Número de concentraciones entre 100 y 10, o entre 10 y 1) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Puede seleccionarse una serie de 5 (o más) concentraciones sucesivas en una columna. Los puntos medios entre las concentrac iones 
de la columna (x) se encuentran en la columna (2x + 1)l Los valores recogidos pueden representar concentraciones expresadas 
como porcentaje en volumen o en peso (mg/l o μg/l). Los valores pueden multiplicarse o dividirse por la potencia de 10 adecuada. 
Puede emplearse la primera columna si el grado de toxicidad es muy incierto.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  ENSAYO DE TOXICIDAD A CORTO PLAZO EN  EMBRIONES  
DE PEZ Y ALEVINES  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo de toxicidad a corto plazo reproduce 
las directrices del documento OCDE TG 212 (1998).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente ensayo de toxicidad a corto plazo en embriones de pez y 
alevines abarca la exposición del animal desde la fase de huevo 
recién fecundado hasta el final de la fase de alevín. No se propor ­
ciona alimento alguno a embriones y alevines durante el ensayo, que debe, por tanto, concluir cuando los alevines sigan nutriéndose de la vesícula vitelina. 
El presente ensayo tiene por objeto determinar los efectos letales y, 
en menor medida, subletales de sustancias químicas en fases con ­
cretas de la vida de las especies sometidas al mismo. Proporciona 
información útil, pues puede: a) constituir un nexo entre los ensayos 
letales y subletales; b) servir de ensayo de detección de cara a un ensayo completo en las primeras fases de la vida o a los ensayos de toxicidad crónica, y c) emplearse para estudiar especies en relación 
con las cuales las técnicas de cría no estén suficientemente avanza ­
das para abarcar el período de transición de la alimentación endó ­
gena a la exógena. 
Cabe señalar que los ensayos que abarcan todas las fases de la vida 
de los peces son los únicos que suelen permitir una estimación precisa de la toxicidad crónica de las sustancias químicas en estos animales y que, si se limita la exposición de manera que no cubra 
una u otra fase de la vida, puede perderse sensibilidad y, por tanto, 
subestimarse la toxicidad crónica. Por consiguiente, el ensayo en embriones y alevines resultará menos sensible que un ensayo com ­
pleto en las primeras fases de la vida, sobre todo si se trata de 
sustancias muy lipó-filas (log P
 ow > 4) o sustancias que posean 
una forma de actuación tóxica particular. Cabe esperar, no obstante, que la diferencia de sensibilidad entre los dos ensayos sea menor con 
las sustancias de acción narcótica no específica (1). 
Hasta la publicación del presente ensayo, el ensayo con embriones y 
alevines se ha llevado a cabo principalmente con el pez de agua 
dulce  Danio rerio  Hamilton-Buchanan (teleósteos, ciprínidos, nom ­
bre común: pez cebra); de ahí que en el apéndice 1 figuren indica ­
ciones detalladas para la realización del mismo con esa especie, si bien pueden emplearse otras con las que se disponga de experiencia 
(cuadros 1A y 1B).
 
1.2. DEFINICIONES  
Concentración mínima con efecto observado (LOEC):  concentra ­
ción más baja de sustancia de ensayo con la que se observa un efecto significativo (para p < 0,05) en comparación con el control. Además, 
todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC han de 
provocar un efecto nocivo superior o igual al que se observa con dicha concentración.  
Concentración (máxima) sin efecto observado (NOEC):  concen­
tración de ensayo inmediatamente inferior a la LOEC.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. PRINCIPIO DEL ENSAYO 
Se exponen los embriones de pez y los alevines a una gama de 
concentraciones de la sustancia de ensayo disuelta en agua. El pro ­
tocolo permite elegir entre un procedimiento semiestático o dinámi ­
co, según la naturaleza de la sustancia de ensayo. El ensayo co ­
mienza cuando se colocan los huevos fecundados en los recipientes de ensayo y finaliza justo antes de que la vesícula vitelina de cual ­
quiera de las larvas de cualquiera de los recipientes sea reabsorbida 
por completo o antes de que los animales del lote de control empie ­
cen a morir de inanición. Los efectos letales y subletales se evalúan y comparan con los valores del control con el fin de determinar la 
concentración mínima con efecto observado y, de ahí, la concentra ­
ción máxima sin efecto observado. Los efectos también pueden ana ­
lizarse mediante un modelo de regresión a fin de calcular la concen ­
tración que provocaría un porcentaje de efecto determinado (CL/ 
EC
 X , donde x es un porcentaje de efecto definido).  
1.4. INFORMACIÓN RELATIVA A LA SUSTANCIA DE ENSAYO 
Debe disponerse de los resultados de un ensayo de toxicidad aguda 
(véase el método C.1) efectuado preferiblemente con la especie objeto 
del presente ensayo, ya que pueden resultar útiles para seleccionar una gama apropiada de concentraciones para el ensayo en las primeras fases de la vida. Debe conocerse la solubilidad en el agua (incluida la solu ­
bilidad en el agua del ensayo) y la presión de vapor de la sustancia de 
ensayo. Para calcular la cantidad de sustancia en las soluciones de ensayo debe aplicarse un método analítico fiable, cuyo límite de detec ­
ción y precisión sean conocidos y figuren en el informe. 
La información útil para establecer las condiciones de ensayo incluye la 
fórmula estructural de la sustancia de ensayo, su pureza, estabilidad a la 
luz, estabilidad en las condiciones de ensayo, pKa, P
 ow y los resultados 
de un ensayo de biodegradabilidad fácil (véase el método C.4).  
1.5. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Para que el ensayo sea válido deben darse las condiciones siguientes: 
— la tasa global de supervivencia de los huevos fecundados en los 
lotes de control y, en su caso, en los recipientes que solo con ­
tengan disolvente ha de ser superior o igual a los límites esta ­
blecidos en los apéndices 2 y 3, 
— la concentración de oxígeno disuelto ha de situarse entre el 60 y 
el 100 % del valor de saturación en el aire a lo largo del ensayo, 
— en ningún momento del ensayo la temperatura del agua debe 
variar en más de ± 1,5  o C entre los recipientes de ensayo ni 
entre dos días sucesivos y debe mantenerse en las gamas esta ­
blecidas para la especie sometida a ensayo (apéndices 2 y 3).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Recipientes de ensayo  
Puede emplearse cualquier recipiente de cristal u otro material inerte 
químicamente, de dimensiones suficientes para que se cumplan los 
criterios de carga (véase el punto 1.7.1.2). Se recomienda colocar los 
recipientes al azar en la zona donde se lleve a cabo el ensayo. Si en el laboratorio hay efectos sistemáticos que pueden paliarse mediante el agrupamiento, es preferible colocar los recipientes según un esquema 
de agrupamiento aleatorizado (velando por que todos los tratamientos 
se apliquen en todos los grupos) que según un esquema completamente aleatorizado. En caso de que se agrupen los recipientes, debe tenerse 
presente en el análisis posterior de los datos. Los recipientes de ensayo 
han de protegerse de toda perturbación indeseada.
 
1.6.2.  Selección de la especie de peces  
Las especies de peces recomendadas figuran en el cuadro 1A, aun ­
que es posible emplear otras (cuadro 1B), si bien entonces puede ser necesario adaptar el procedimiento para que las condiciones de en ­
sayo sean adecuadas. En tal caso, deben justificarse la elección de la 
especie y el método experimental.
 
1.6.3.  Manipulación de los peces reproductores  
Las directrices de ensayo 210 de la OCDE (  1 ) y las referencias (2) 
(3) (4) (5) (6) de la bibliografía recogen indicaciones detalladas sobre la manipulación de peces reproductores en condiciones satisfactorias.
 
1.6.4.  Manipulación de los embriones y las larvas  
Los embriones y las larvas pueden colocarse en receptáculos provis ­
tos de paredes o extremos de malla dentro del recipiente principal para permitir el flujo de la solución de ensayo. Puede provocarse un 
flujo no turbulento a través de los pequeños receptáculos suspen ­
diéndolos de un brazo que los desplace en sentido vertical, pero de manera que los organismos permanezcan siempre sumergidos. Puede emplearse, asimismo, un sistema de sifón. Los huevos fecundados de 
salmónidos pueden depositarse en rejillas o mallas con aperturas de 
dimensiones suficientes para que las larvas pasen a través después de la eclosión. En los ensayos semiestáticos con renovación diaria y 
completa del medio, conviene utilizar pipetas Pasteur para la toma 
de embriones y larvas (véase el punto 1.6.6). 
Si se utilizan cubetas, rejillas o mallas para mantener los huevos en 
el recipiente principal de ensayo, deben retirarse después de la eclo ­
sión de las larvas (
 1 ), pero deben conservarse las mallas que impidan 
que los peces se escapen. Si es necesario trasladar las larvas, no 
deben exponerse al aire ni emplearse redes para sacar a los peces de los recipientes que contengan los huevos (con algunas especies menos frágiles, como la carpa, estas precauciones pueden resultar 
superfluas). El momento de dicho traslado varía según la especie y 
no siempre es necesario. En los ensayos semiestáticos, pueden em ­
plearse vasos de laboratorio o recipientes poco profundos y provis ­
tos, en su caso, de una rejilla a escasa distancia del fondo. Si el 
volumen de esos recipientes es suficiente para que se cumplan los 
requisitos de carga (véase el punto 1.7.1.2), no es preciso trasladar los embriones o larvas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, París. 1992. Directrices de ensayo 210. «Ensayo de toxicidad en las primeras 
fases de la vida en peces».
 1.6.5.  Agua  
Puede utilizarse para el ensayo toda agua que se ajuste a las carac ­
terísticas químicas de un agua de dilución aceptable enumeradas en el apéndice 4 y en la que la especie sometida a ensayo muestre una 
tasa de supervivencia en el lote de control al menos igual que la 
recogida en los apéndices 2 y 3. Su calidad ha de ser constante a todo lo largo del ensayo. La variación del pH debe permanecer en un intervalo de ± 0,5 unidades. Deben tomarse muestras periódicamente 
para análisis con el fin de cerciorarse de que el agua de dilución no 
interfiere en los resultados del ensayo (por ejemplo, por compleja ­
ción de la sustancia de ensayo) ni altera el comportamiento de los 
peces reproductores. Cuando se sepa que un agua de dilución es de 
calidad relativamente constante, conviene proceder, por ejemplo, cada 3 meses, a la determinación de los metales pesados (por ejem ­
plo, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd y Ni), aniones y cationes principales (por 
ejemplo, Ca, Mg, Na, K, Cl y SO
 4 ), plaguicidas (por ejemplo, or ­
ganofosforados totales y organoclorados totales), carbono orgánico total y sólidos en suspensión. Si se demuestra que la calidad del agua es constante al menos durante un año, los análisis pueden ser menos 
frecuentes y espaciarse más (por ejemplo, cada 6 meses).
 
1.6.6.  Soluciones de ensayo  
Las soluciones de ensayo a las concentraciones elegidas se preparan 
por dilución de la solución madre. 
La solución madre se prepara preferiblemente por simple mezcla o 
agitación mecánica de la sustancia de ensayo en el agua de dilución (por ejemplo, mediante un agitador o ultrasonidos). Pueden em ­
plearse columnas de saturación (columnas de solubilidad) para lograr 
la concentración adecuada de solución madre. Debe evitarse, en la medida de lo posible, el uso de disolventes o dispersantes (agentes de disolución); sin embargo, en algunos casos pueden ser necesarios 
para obtener una solución madre a la concentración deseada. Puede 
entonces utilizarse como disolvente acetona, etanol, metanol, dime ­
tilformamida o trietilenglicol, y como dispersante Cremophor RH40, Tween 80, metilcelulosa al 0,01 % o HCO-40. Deben tomarse pre ­
cauciones si se emplean agentes fácilmente biodegradables (como la 
acetona) y/o muy volátiles, pues estos pueden dar lugar a una pro ­
liferación bacteriana en los ensayos dinámicos. Si se emplea un 
agente de disolución, no debe actuar de forma significativa sobre 
la supervivencia ni producir efectos nocivos visibles en las primeras fases de la vida, lo cual ha de demostrarse en un lote de control que solo contenga disolvente. No obstante, debe hacerse todo lo posible 
por evitar el uso de dichas sustancias. 
En el caso de los ensayos semiestáticos, pueden aplicarse dos méto ­
dos distintos de renovación: o bien se preparan sustancias de ensayo 
nuevas en recipientes limpios y se transfieren cuidadosamente los 
huevos y larvas supervivientes en un pequeño volumen de la solu ­
ción antigua, evitando exponerlos al aire, o bien se dejan los orga ­
nismos sometidos a ensayo en su recipiente y se cambian al menos 
las tres cuartas partes del agua de ensayo. La frecuencia de renova ­
ción del medio dependerá de la estabilidad de la sustancia de ensayo, si bien se recomienda renovarlo todos los días. Si los ensayos pre ­
liminares de estabilidad (véase el punto 1.4) ponen de manifiesto que 
la concentración de la sustancia de ensayo no es estable (es decir, 
queda fuera del intervalo del 80 al 120 % de la concentración no ­
minal o cae por debajo del 80 % de la concentración medida al inicio) entre dos renovaciones, debe plantearse la realización de un 
ensayo dinámico. En cualquier caso, debe velarse por evitar toda 
agresión a las larvas durante la renovación del agua.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Para los ensayos dinámicos se requiere un sistema que aporte y 
diluya continuamente la solución madre de la sustancia de ensayo 
(por ejemplo, bomba dosificadora, diluyente proporcional o sistema saturador) para distribuir una serie de concentraciones en los reci ­
pientes de ensayo. Los regímenes de flujo de las soluciones madre y 
del agua de dilución deben supervisarse con regularidad, preferible ­
mente todos los días, y no debería variar en más del 10 % a lo largo del ensayo. Se considera adecuado un régimen de flujo equivalente al menos a 5 veces el volumen del recipiente de ensayo cada 24 
horas (2).
 
1.7. PROCEDIMIENTO 
Se ha publicado información útil sobre la realización de los ensayos 
de toxicidad en embriones de pez y alevines. La bibliografía del presente texto recoge algunos ejemplos (7) (8) (9) de tales publica ­
ciones.
 
1.7.1.  Condiciones de exposición  
1.7.1.1.  Duración  
Conviene iniciar el ensayo en los 30 minutos siguientes a la fecun ­
dación de los huevos. Los embriones se sumergen en la solución de 
ensayo antes o después (pero lo antes posible) de que comience la 
fase de división del blastodisco y, en cualquier caso, antes de que empiece la fase de gástrula. Si los huevos proceden de un proveedor comercial, puede resultar imposible iniciar el ensayo inmediatamente 
después de la fecundación. Dado que un retraso en el inicio del 
ensayo puede afectar seriamente a la sensibilidad del mismo, debería iniciarse en las 8 horas siguientes a la fecundación. Puesto que no se 
proporciona alimento a las larvas durante el período de exposición, 
el ensayo debe finalizar justo antes de que se haya reabsorbido por completo la vesícula vitelina de una cualquiera de las larvas de cualquiera de los recipientes de ensayo o antes de que haya muertes 
por inanición en los lotes de control. La duración del ensayo depen ­
derá de la especie utilizada. Los apéndices 2 y 3 recogen recomen ­
daciones al respecto.
 
1.7.1.2.  Carga  
El número de huevos fecundados al principio del ensayo ha de ser 
suficiente para responder a las necesidades estadísticas. Se reparten 
al azar entre los distintos tratamientos y se coloca un mínimo de 30 huevos fecundados, repartidos equitativamente (o lo más equitativa ­
mente posible, ya que con algunas especies es difícil obtener lotes 
iguales) entre, al menos, tres recipientes de ensayo en paralelo por 
cada concentración. La tasa de carga (biomasa por volumen de en ­
sayo de solución) debe ser suficientemente baja para poder mantener sin aireación una concentración mínima de oxígeno disuelto del 
60 % del valor de saturación en el aire. En los ensayos dinámicos, 
se recomienda una tasa de carga que no supere 0,5 g/l en 24 horas ni 5 g/l de solución en cualquier momento (2).
 
1.7.1.3.  Iluminación y temperatura  
El fotoperíodo y la temperatura del agua han de ser adecuados para 
la especie utilizada (apéndices 2 y 3). Para vigilar la temperatura 
puede ser conveniente emplear un recipiente de ensayo adicional.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Concentraciones de ensayo  
Normalmente se necesitan 5 concentraciones de sustancia de ensayo 
espaciadas por un factor constante que no supere 3.2. Para seleccio ­
nar la gama de concentraciones de ensayo debe tenerse presente la 
curva CL  50 /período de exposición del estudio de toxicidad aguda. En 
algunos casos puede estar indicado utilizar menos de 5 concentra ­
ciones, por ejemplo, en los ensayos límite, y un intervalo más pe ­
queño entre concentraciones. El empleo de menos de 5 concentra ­
ciones debe justificarse. No es preciso someter a ensayo concentra ­
ciones superiores a la CL  50 tras 96 horas, o a 100 mg/l, si esta 
concentración es inferior a dicha CL  50 . Las sustancias no deben 
someterse a ensayo en concentraciones superiores a su límite de 
solubilidad en el agua de ensayo. 
Si se emplea un agente de disolución para facilitar la preparación de 
las soluciones de ensayo (véase el punto 1.6.6), su concentración 
final ha de ser la misma en todos los recipientes de ensayo y no debe superar 0,1 ml/l.
 
1.7.3.  Controles  
Paralelamente a las series tratadas con la sustancia de ensayo, debe 
hacerse un lote de control con agua de dilución (en tantos ejemplares como sea necesario) y, si procede, otro control con agente de diso ­
lución (en tantos ejemplares como sea necesario).
 
1.7.4.  Frecuencia de los análisis y medidas  
Las concentraciones de la sustancia de ensayo deben determinarse 
periódicamente durante el mismo. 
En los ensayos semiestáticos en que la concentración de la sustancia 
debe permanecer entre el ± 20 % de la concentración nominal (es 
decir, en el intervalo del 80 al 120 %; véanse los puntos 1.4 y 1.6.6), 
se recomienda analizar, como mínimo, la concentración de ensayo más baja y la más alta en cuanto se preparen y justo antes de renovar el medio, al menos en tres ocasiones regularmente espaciadas a lo 
largo del ensayo (los análisis deben practicarse en muestras de la 
misma solución, tomadas justo después de su preparación y en el momento de la renovación). 
En los ensayos en que no quepa esperar que la concentración de 
sustancia de ensayo permanezca en un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal (con arreglo a los datos de estabilidad de la 
sustancia), es preciso analizar todas las concentraciones de ensayo 
cuando se acaben de preparar y en el momento de la renovación, pero según el mismo régimen, es decir, al menos tres veces re ­
gularmente espaciadas a lo largo del ensayo. Es suficiente con 
determinar las concentraciones de la sustancia de ensayo antes 
de la renovación del medio en un solo recipiente por concentra ­
ción. Las determinaciones no han de espaciarse más de 7 días. Se recomienda basar los resultados en las concentraciones medidas. 
No obstante, si los datos disponibles muestran que la concentra ­
ción de la sustancia de ensayo en la solución se ha mantenido debidamente a lo largo de todo el ensayo en un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal o de la concentración medida al 
inicio, los resultados pueden fundarse en estas. 
En los ensayos dinámicos, conviene aplicar un régimen de muestreo 
similar al descrito para los ensayos semiestáticos (si bien en este 
caso no cabe hacer determinaciones antes de renovar las soluciones). No obstante, si el ensayo dura más de 7 días, puede ser oportuno incrementar el número de tomas de muestras durante la primera 
semana (por ejemplo, tres series de medidas) para cerciorarse de 
que las concentraciones de ensayo permanecen estables.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
En algunos casos puede estar indicado filtrar (por ejemplo, con un 
filtro de poros de 0,45 μm) o centrifugar las muestras, pero, como ni 
la filtración ni la centrifugación permiten siempre separar la fracción no biodispo-nible de la sustancia de ensayo de su fracción biodispo ­
nible, no es indispensable efectuarlas. 
Durante el ensayo debe medirse en todos los recipientes de ensayo 
el oxígeno disuelto, el pH y la temperatura. En los controles y en un uno de los recipientes con la concentración más alta se medirá la dureza total y la salinidad, si procede. El oxígeno disuelto y la 
salinidad, cuando proceda, se medirán como mínimo tres veces: al 
principio, a la mitad y al final del ensayo. En los ensayos semi ­
estáticos se recomienda medir el oxígeno disuelto más a menudo, preferiblemente antes y después de cada renovación del agua o al 
menos una vez por semana. El pH ha de medirse al principio y al 
final de cada período de renovación del agua en los ensayos semiestáticos y al menos una vez por semana en los dinámicos. La dureza se medirá una vez en cada ensayo. La temperatura 
debería medirse todos los días y lo ideal sería un control continuo 
al menos en un recipiente de ensayo.
 
1.7.5.  Observaciones  
1.7.5.1.  Fase de desarrollo embrionario  
Al principio de la exposición a la sustancia de ensayo debe com ­
probarse con tanta precisión como sea posible la fase embrionaria 
(gástrula) en una muestra representativa de huevos debidamente con ­
servados y limpiados. Puede asimismo consultarse la bibliografía, que recoge descripciones e ilustraciones de las fases embrionarias 
(2) (5) (10) (11).
 
1.7.5.2.  Eclosión y supervivencia  
Al menos una vez al día deben observarse y contarse las eclosiones y 
los supervivientes. Puede ser conveniente efectuar observaciones más 
frecuentes al principio del ensayo (por ejemplo, cada 30 minutos 
durante las tres primeras horas), pues en algunos casos el tiempo de supervivencia puede ser más significativo que solo el número de muertes (por ejemplo, si se producen efectos tóxicos agudos). Las 
larvas y embriones muertos deben retirarse en cuanto se localicen, ya 
que pueden descomponerse rápidamente. Dicha retirada ha de ha ­
cerse con sumo cuidado para no tocar ni dañar físicamente los hue ­
vos y larvas adyacentes, pues son extremadamente delicados y sen ­
sibles. Los criterios para considerar que un organismo está muerto 
varían según la fase del desarrollo: 
— huevos:  sobre todo en la fase más temprana, disminución acu ­
sada de translucidez y cambio de la coloración debido a la coa ­
gulación y/o precipitación de proteínas, que les dan un aspecto 
blanco opaco, 
— embriones:  ausencia de movimientos corporales y/o ausencia de 
latido cardíaco y/o decoloración opaca en las especies cuyos 
embriones son translúcidos normalmente, 
— larvas:  inmovilidad y/o ausencia de movimiento respiratorio y/o 
ausencia de latido cardíaco y/o coloración blanca opaca del sis ­
tema nervioso central y/o ausencia de reacción a los estímulos 
mecánicos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Aspecto anómalo  
El número de larvas que presenten anomalías corporales y/o pigmen ­
tarias, así como la fase de reabsorción de la vesícula vitelina deben registrarse a intervalos adecuados con arreglo a la duración del en ­
sayo y la naturaleza de la anomalía observada. Cabe señalar que la 
aparición de larvas y embriones anómalos ocurre en condiciones normales y que su proporción puede alcanzar varias unidades por cada 100 en los controles de algunas especies. Los animales que 
presenten anomalías solo deben retirarse de los recipientes de ensayo 
cuando estén muertos.
 
1.7.5.4.  Comportamiento anómalo  
Las anomalías como la hiperventilación, natación descoordinada o 
inactividad atípica deben registrarse a intervalos adecuados según 
la duración del ensayo. Pese a ser difíciles de cuantificar, estos 
efectos pueden contribuir a interpretar los datos de mortalidad proporcionando información sobre el modo de actuación tóxica de la sustancia.
 
1.7.5.5.  Longitud  
Se recomienda medir la longitud de cada sujeto al final del ensayo 
utilizando la longitud estándar, la longitud a la horquilla o la longi ­
tud total. Si se observa una descomposición de la aleta caudal o un desgaste de las aletas, debe emplearse la longitud estándar. Por lo 
general, en un ensayo realizado correctamente, el coeficiente de 
variación de la longitud entre los distintos recipientes de los con ­
troles ha de ser 20 %.
 
1.7.5.6.  Peso  
Puede pesarse cada sujeto al final del ensayo; el peso seco (24 horas 
a 60  o C) es preferible al peso húmedo (secados con material absor ­
bente). Por lo general, en un ensayo realizado correctamente, el 
coeficiente de variación del peso entre los distintos recipientes de los controles ha de ser ≤ 20 %. 
Gracias a las observaciones anteriores, se obtienen algunos o todos 
los datos siguientes para el análisis estadístico: 
— mortalidad acumulativa, — número de larvas sanas al final del ensayo, — momento en que empieza y acaba la eclosión (90 % de eclosio ­
nes en cada recipiente en paralelo), 
— número de larvas que eclosionan cada día, — longitud (y peso) de los animales supervivientes al final del 
ensayo, 
— número de larvas con deformidades o aspecto anómalo, 
— número de larvas que presenten un comportamiento anómalo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. RESULTADOS E INFORME  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Es aconsejable que participe un estadístico tanto en el diseño como 
en el análisis del ensayo, pues el presente método da cabida a 
variaciones considerables en el procedimiento experimental, por 
ejemplo, en cuanto al número de recipientes y de concentraciones de ensayo, al número inicial de huevos fecundados y a los paráme ­
tros medidos. Debido a las diversas posibilidades en el diseño del 
ensayo, no se proporcionan aquí directrices concretas sobre los mé ­
todos estadísticos. 
Si tienen que calcularse la LOEC y la NOEC, será preciso analizar 
las variaciones en cada serie en paralelo mediante el análisis de la varianza (ANOVA) o las tablas de contingencia. El método de Dun ­
nett puede resultar útil para realizar comparaciones múltiples entre 
los resultados obtenidos con cada concentración y los de los con ­
troles (12) (13). Las referencias (14) y (15) de la bibliografía recogen otros ejemplos útiles. Debe calcularse y registrarse la magnitud del 
efecto detectable mediante el análisis de la varianza (ANOVA) u 
otros métodos (es decir, la potencia del ensayo). Cabe señalar que no todas las observaciones relacionadas en el punto 1.7.5.6 se pres ­
tan al tratamiento estadístico por análisis de la varianza (ANOVA). 
Así, por ejemplo, la mortalidad acumulativa y el número de larvas 
sanas al final del ensayo pueden analizarse por métodos de probita. 
Si procede calcular la CL y la EC
 X , una o varias curvas adecuadas, 
como puede ser la curva logística, deben ajustarse a los resultados pertinentes mediante un método estadístico como el de los mínimos cuadrados o los mínimos cuadrados no lineales. Las curvas deben 
parametrarse de manera que puedan estimarse directamente la CL y 
la EC
 X que interese y su error estándar. Así se facilitará en gran 
medida el cálculo de los límites de confianza en torno a la CL y la EC
 X . Salvo que haya razones de peso para preferir otros niveles de 
confianza, se seleccionarán límites del 95 % en ambas direcciones. 
Es preferible que el método de ajuste permita evaluar la significación de la falta de ajuste. Pueden emplearse métodos gráficos para ajustar las curvas. Todas las observaciones enumeradas en el punto 1.7.5.6 
se prestan al análisis de regresión.
 
2.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Los resultados deben interpretarse con prudencia cuando las concen ­
traciones medidas de las sustancias tóxicas en las soluciones de 
ensayo se aproximen a los límites de detección del método de aná ­
lisis. Asimismo, los resultados relativos a concentraciones superiores a la solubilidad de la sustancia en el agua han de interpretarse con 
precaución.
 
2.3. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
2.3.1.  Sustancia de ensayo:  
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes, 
— identificación química, incluida la pureza y el método de análisis 
cuantitativo de la sustancia de ensayo, si procede.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Especie sometida a ensayo:  
— denominación científica, variedad, número de peces parentales 
(es decir, número de hembras empleadas para obtener la cantidad de huevos necesarios para el ensayo), fuente y método de reco ­
gida de los huevos fecundados y manipulaciones posteriores.
 
2.3.3.  Condiciones de ensayo:  
— método empleado (por ejemplo, semiestático o dinámico, tiempo 
transcurrido entre la fecundación y el inicio del ensayo, carga, etc.), 
— fotoperíodo(s), 
— diseño del ensayo (por ejemplo, número de recipientes de ensayo 
y número de recipientes en paralelo, número de embriones por 
recipiente en paralelo), 
— método de preparación de las soluciones madre y frecuencia de 
renovación (en su caso, se especificarán el agente de disolución empleado y su concentración), 
— concentraciones nominales de ensayo, valores medidos en los 
recipientes de ensayo, medias y desviaciones estándar de estos y método de obtención; si la sustancia de ensayo es soluble en el 
agua a concentraciones inferiores a las de ensayo, debe demos ­
trarse que las mediciones se refieren a las concentraciones de la sustancia de ensayo en disolución, 
— características del agua de dilución: pH, dureza, temperatura, 
concentración de oxígeno disuelto, contenido de cloro residual (si se ha medido), carbono orgánico total, sólidos en suspensión, 
salinidad del medio de ensayo (si se ha medido) y cualquier otra 
medición realizada, 
— calidad del agua en los recipientes de ensayo: pH, dureza, tem ­
peratura y concentración de oxígeno disuelto.
 
2.3.4.  Resultados:  
— resultados de los posibles estudios preliminares relativos a la 
estabilidad de la sustancia de ensayo, 
— datos que demuestren que los controles cumplen la norma gene ­
ral de aceptabilidad en materia de supervivencia de la especie sometida a ensayo (apéndices 2 y 3), 
— datos de la mortalidad y la supervivencia en las fases de embrión 
y de larva y tasas globales de mortalidad y supervivencia, 
— días transcurridos hasta la eclosión y número de eclosiones, — longitud (y peso), — incidencia y descripción de las anomalías morfológicas, en su 
caso, 
— incidencia y descripción de los efectos sobre el comportamiento, 
en su caso, 
— análisis estadístico y tratamiento de los datos, — en el caso de los ensayos sometidos al análisis de la varianza, la 
concentración mínima con efecto observado (LOEC) para p = 0,05 y la concentración máxima sin efecto observado (NOEC) para cada respuesta evaluada, así como una descripción de los 
métodos estadísticos empleados y una indicación de la magnitud 
del efecto que puede detectarse,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— en el caso de los ensayos analizados mediante técnicas de regre ­
sión, la CL/EC  x , e intervalos de confianza, y un gráfico del 
modelo ajustado que se haya utilizado para su cálculo, 
— justificación de toda desviación respecto al presente método de 
ensayo.  
3. REFERENCIAS  
(1) Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS 
Test Methods. Final report to the Commission of the European 
Communities, pp. 60. Junio de 1990. 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp. 
(3) Brauhn J.L. y Schoettger R.A. (1975). Acquisition and Culture 
of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA- 660/3-75-011, Duluth, Minnesota. 
(4) Brungs W.A. y Jones B.R. (1977) Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, Ecological 
Research Series EPA-600/3-77-061. Duluth, Minnesota. 
(5) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish  
(Brachydanio rerio)  in Fisheries Research. A Literature Re ­
view. J. Biol. 10, 121-173. 
(6) Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Bra­
chydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328-330. 
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J.E., Rosander B.  
y Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity 
Test with Zebrafish  (Brachydanio rerio)  Using Chromium and 
Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, pp. 61-71. 
(8) Birge J.W., Black J.A. y Westerman A.G. (1985). Short-term 
Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determinmg the 
Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807-821. 
(9) Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. y Mol F. (1986) Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Com ­
pounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129-145. 
(10) Kirchen R.V. y W. R. West (1969). Teleostean Development. 
Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Com ­
pany. 
(11) Kirchen R.V. y W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its 
care and Development. Carolina Biological Supply Company, Carolina del Norte. 36 pp. 
(12) Dunnett C.W. (1955) A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp 1096-1121. 
(13) Dunnett C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, 482-491. 
(14) Mc Clave J.T., Sullivan J.H. y Pearson J.G. (1980). Statistical 
Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 
4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Filadelfia.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. y Hermes J. (1990). Quan ­
titative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life 
Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334. 
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS l/RM/28, Diciembre de 1992, pp. 81. 
(17) Dave G. y Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury. Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio.  Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, 126-134. 
(18) Meyer A., Bierman C.H. y Orti G. (199 3). The phylogenetic 
position of the Zebrafish ( Danio rerio ). A model system in 
developmental biology — an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 
231-236. 
(19) Ghillebaert F. Chaillou C, Deschamps F. y Roubaud P. (1995). 
Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecu ­
les on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environ ­
mental Safety 32, 19-28. 
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Meda ­
ka, Oryzias latipes . EPA repon EPA/600/3-91/064, Dic. 
1991. EPA, Duluth. 
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, ( Oryzias latipes ). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dic. 1991, EPA, Duluth. 
(22) De Graeve G.M., Cooney J.D., McIntyre D.O., Poccocic T.L., 
Reichenbach N.G. Dean J.H. y Marcus M.D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimep ­
hales promelas) larval survival and growth test: an intra- and 
interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189-1203. 
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells. 
Oxford. Vol. 1, capítulo 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish. 
(24) Balon E.K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, 280 pp. 
(25) Blaxter J.H.S. (1988). Pattern and variety in development, In: 
W.S. Hoar y D.J. Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, 
Academic press, pp. 1-58.
 
Cuadro 1A  
Especies de peces recomendadas para el ensayo  
Agua dulce  
Oncorhynchus mykiss  
Trucha arco iris (9) (16)  
Danio rerio  
Pez cebra (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Carpa común (8) (19)  
Oryzias latipes  
Medaka (20) (21)  
Pimephales promelas  
Piscardo (8) (22)  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Cuadro 1B  
Ejemplos de otras especies bien documentada que también han sido utilizadas  
Agua dulce Agua salada  
Carassius auratus  
Carpa dorada (8)  Menidia peninsulae  
Pejerrey del Atlántico Occidental (23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  
Pez sol de agallas azules (8)  Clupea harengus  
Arenque (24) (25)  
Gadus morhua  
Bacalao (24) (25)  
Cyprinodon variegatus  
Pelota (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
Apéndice 1  
DIRECTRICES SOBRE LA REALIZACIÓN DE UN ENSAYO DE 
TOXICIDAD EN EMBRIONES Y ALEVINES DE PEZ CEBRA  
(BRACHYIANIO RERIO)  
INTRODUCCIÓN 
El pez cebra es originario de la costa de Coromandel en la India, donde vive en 
ríos de corriente rápida. Es una especie común de acuario, que pertenece a la familia de las carpas. La información relativa a los métodos de cría y los cui ­
dados que requieren figuran en los manuales de referencia sobre peces tropicales. 
Laale ha estudiado su biología y su empleo en la investigación relacionada con la 
pesca (1). 
Este pez rara vez supera los 45 mm de longitud. Su cuerpo cilíndrico posee entre 
7 y 9 rayas horizontales de color azul oscuro y plateado, que se prolongan hasta 
las aletas caudal y anal. El dorso es verde aceituna. Los machos son más estre ­
chos que las hembras, y estas son más plateadas y presentan un abdomen más distendido, en particular antes del desove. 
Los peces adultos soportan grandes variaciones de temperatura, pH y dureza. Sin 
embargo, para obtener peces sanos que produzcan huevos de buena calidad debe 
mantenérselos en condiciones óptimas. 
Durante el desove, el macho persigue a la hembra y le da golpes con la cabeza. 
Los huevos son fecundados apenas expulsados. Los huevos, que son transparen ­
tes y no adherentes, caen al fondo, donde pueden ser ingeridos por los padres. La luz influye en el desove. Si la luz de la mañana es suficiente, los peces suelen desovar en las horas siguientes al amanecer. 
Una hembra puede realizar desoves de varios centenares de huevos a intervalos 
de una semana.
 
ESTADO DE LOS PECES PARENTALES, REPRODUCCIÓN Y PRIMERAS 
FASES DE LA VIDA 
Se selecciona un número adecuado de peces sanos y se mantienen en un agua 
apropiada (véase el apéndice 4, por ejemplo) al menos durante dos semanas antes de la fecha prevista para el desove. Los peces han de reproducirse al menos una 
vez antes de producir los huevos que vayan a emplearse en el ensayo. La 
densidad en este período no debe superar 1 gramo de peces por litro. La reno ­
vación regular del agua y la utilización de sistemas de purificación pueden dar lugar a densidades mayores. La temperatura en los acuarios debe mantenerse a 25 
± 2 °C y debe proporcionarse a los peces un régimen alimentario variado, que 
puede consistir, por ejemplo, en alimentos deshidratados adecuados que se en ­
cuentran en el comercio, Artemia vivos recién eclosionados, quironómidos, Daf ­
nia o gusanos blancos (Enquitreidos). 
A continuación se recogen dos métodos con los que se han obtenido en la 
práctica camadas suficientes de huevos fecundados sanos de cara a la realización de un ensayo: 
i) se colocan 8 hembras y 16 machos en un acuario con 50 litros de agua de 
dilución y protegido de la luz directa. Debe evitarse en la mayor medida posible perturbarlos al menos durante 48 horas. En la tarde del día anterior al inicio del ensayo se coloca en el fondo del acuario un soporte para el 
desove, formado por un bastidor (de plexiglás u otro material adecuado) de 5 
a 7 cm de alto, con una red de malla gruesa (2-5 mm) en la parte superior y una red de malla fina (10-30 μm) en la parte inferior. Se atan a la malla 
gruesa del soporte varios «árboles de desove», consistentes en una cuerda de 
nailon sin retorcer. Se deja a los peces 12 horas en la oscuridad y, a conti ­
nuación, se enciende una luz tenue para que empiece el desove. Entre 2 y 4 horas después de este, se retira el soporte y se recogen los huevos. El soporte impide que los peces ingieran los huevos, al tiempo que facilita la recogida de 
estos. Los peces deben haber desovado al menos una vez antes de recoger los 
huevos que vayan a emplearse en el ensayo;
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) se mantienen de 5 a 10 peces machos y hembras en acuarios individuales 
durante un mínimo de 2 semanas antes de la fecha prevista para el desove. 
Entre 5 y 10 días después, el abdomen de las hembras se distiende y sus papilas genitales se hacen visibles. Los machos no tienen papilas. El desove se lleva a cabo en recipientes provistos de un falso fondo de malla (véase más 
arriba). El recipiente se llena con agua de dilución hasta una altura de 5 a 
10 cm por encima de la malla. Se colocan una hembra y dos machos en el recipiente la víspera de la fecha prevista para el desove. Se aumenta progre ­
sivamente la temperatura del agua hasta un grado por encima de la tempera ­
tura de aclimatación. Se apaga la luz y se evita en la mayor medida posible 
toda perturbación de los peces. Por la mañana, se enciende una luz tenue para que empiece el desove. Entre 2 y 4 horas más tarde, se retiran los peces y se recogen los huevos. Si se necesitan más huevos de los que puede poner una 
hembra, pueden disponerse en paralelo los acuarios que sean necesarios. Si se 
registra la capacidad de reproducción de cada hembra antes del ensayo (vo ­
lumen de la camada y calidad de los huevos), podrán seleccionarse para este las que tengan mayor capacidad reproductora. 
Los huevos se trasladan a los recipientes de ensayo en tubos de vidrio, de 
diámetro interno superior o igual a 4 mm y provistos de una pera de succión. 
El trasvase de huevos debe realizarse con la menor cantidad de agua posible. Los huevos pesan más que el agua y caen fuera del tubo. Debe evitarse que los huevos (y las larvas) estén en contacto con el aire. Se practica un examen 
microscópico de una o varias muestras del lote o lotes para cerciorarse de que 
no hay anomalías en las primeras fases del desarrollo. No está permitido desin ­
fectar los huevos. 
La tasa de mortalidad de los huevos más elevada se da durante las 24 horas 
siguientes a la fecundación. A menudo se observa durante ese período una tasa 
de mortalidad del 5 al 40 %. La degeneración de los huevos se debe a una 
fertilización fallida o a problemas en el desarrollo. Al parecer, la calidad de los huevos depende de la hembra, ya que algunas producen siempre huevos de buena calidad, mientras que otras no lo consiguen nunca. Además, el ritmo de desa ­
rrollo y de eclosión varía de una camada a otra. La tasa de supervivencia de los 
huevos correctamente fecundados y de las larvas suele ser elevada, por lo general superior al 90 %. A 25
 o C, los huevos eclosionan entre 3 y 5 días después de la 
fecundación y la vesícula vitelina se reabsorbe unos 13 días después de esta. 
Hisaoka y Battle han estudiado a fondo el desarrollo embrionario (2). La trans ­
parencia de los huevos y de las larvas eclosionadas permite seguir el desarrollo 
de los peces y detectar la presencia de malformaciones. Unas 4 horas después del desove ya pueden distinguirse los huevos fecundados de los no fecundados (3). Para ello, se colocan los huevos y las larvas en recipientes de ensayo pequeños y 
se estudian al microscopio. 
Las condiciones de ensayo aplicables a las primeras fases de la vida figuran en el 
apéndice 2. Los valores óptimos de pH y dureza del agua de dilución son de 7,8 y de 250 mg CaCO
 3 /l, respectivamente.  
CÁLCULOS Y ESTADÍSTICAS 
Se propone un procedimiento en dos etapas. En primer lugar, se hace un análisis 
estadístico de los datos relativos a la mortalidad, las anomalías en el desarrollo y el momento de la eclosión. A continuación, se hace una evaluación estadística de la longitud corporal de los peces con las concentraciones a las que no se haya 
observado ningún efecto adverso sobre esos tres parámetros. Se recomienda 
proceder así porque las sustancias tóxicas pueden matar selectivamente a los peces más pequeños, retrasar el momento de la eclosión e inducir malformacio ­
nes macroscópicas, lo cual puede sesgar las mediciones de longitud. Además de 
ello, la cantidad de peces por medir con cada tratamiento será más o menos la 
misma, lo cual garantiza la validez del análisis estadístico del ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
DETERMINACIÓN DE LA CL  50 Y LA EC  50 
Se calcula el porcentaje de huevos y larvas supervivientes y se corrige en función 
de la mortalidad en los controles mediante la fórmula de Abbott (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 
C Ü 100 Í Î  
donde: 
P = porcentaje de supervivientes corregido, P' = porcentaje de supervivientes observado en la concentración de ensayo, C = porcentaje de supervivientes en los controles. Si es posible, la Cl
 50 se determina por un método apropiado al final del ensayo. 
Si se desea incluir las anomalías morfológicas en el tratamiento estadístico de la 
EC 50 pueden encontrarse indicaciones al respecto en el artículo de Stephan (5).  
ESTIMACIÓN DE LA LOEC Y LA NOEC 
Uno de los objetivos del ensayo con huevos y alevines es comparar los lotes 
sometidos a concentraciones positivas con los controles para determinar la 
LOEC, para lo cual habrá que emplear métodos de comparaciones múltiples (6) (7) (8) (9) (10).
 
REFERENCIAS 
(l) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachyianio 
rerio)  in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 121- 
173. 
(2) Hisaoka K.K. y Battle H.L. (1958). The Normal Development Stages of the 
Zebrafish  Brazhydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) I. Morph., 102, pp. 311. 
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling 
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology. 
2. pp. 173-181. 
(4) Finney D.J. (1971). Probit Analysis, 3  a ed., Cambridge University Press, 
Gran Bretaña, pp. 1-333. 
(5) Stephan CE. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster y W.E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69-81. 
(6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp 1096- 
1121. 
(7) Dunnett C.W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a Con ­
trol. Biometrics, 20, pp. 482-491. 
(8) Williams D.A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Bio ­
metrics, 27, pp. 103-117. 
(9) Williams D.A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531. 
(10) Sokal R.R. y Rohlf F.J. (1981). Biometry, the Principies and Practice of 
Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
Apéndice 2  
CONDICIONES Y DURACIÓN DEL ENSAYO Y CRITERIOS DE SUPERVIVENCIA PARA LAS ESPECIES RECOMENDADAS  
Especie Temperaturea 
( o C) Salinidad 
(0/00) Fotoperíodo 
(horas) Duración de las fases 
(días) 
Duración habitual del ensayo Supervivencia en los controles 
( % mínimo) 
Embrión Alevín Tasa de eclosio ­
nes satisfactorias Tras la eclosión  
Agua dulce  
Brachydanio rerio  
Pez cebra 25 ±1 — 12-16 3-5 8-10 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 5 días des ­
pués de la eclosión (8-10 días) 80 90  
Onicorhynchus mykiss  
Trucha arco iris 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30-35 25-30 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 20 días des ­
pués de la eclosión (50-55 días) 66 70  
Cyprinus carpio  
Carpa común 21-25 — 12-16 5 > 4 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 4 días des ­
pués de la eclosión (8-9 días) 80 75  
Oryzias latipes  
Medaka 24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12-16 8-11 4-8 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 5 días des ­
pués de la eclosión (13-16 días) 80 80  
Pimephales promelas  
Piscardo 25 ± 2 — 16 4-5 5 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 4 días des ­
pués de la eclosión (8-9 días) 60 70  
( 1 ) Para los embriones. 
( 2 ) Para las larvas. 
( a ) Embriones y larvas en la oscuridad hasta una semana después de la eclosión, salvo durante las observaciones. Después, luz ten ue hasta el final del ensayo.
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
Apéndice 3  
Condiciones y duración del ensayo y criterios de supervivencia para otras especies bien documentadas  
Especie Temperatura 
( o C) Salinidat(0/00) Fotoperíodo(ho ­
ras) Duración de las fases (días) 
Duración habitual del ensayo con embriones y 
alevines Supervivencia en los controles (% 
minimo) 
Embriones Alevín Tasa de eclosio ­
nes satisfactorias Tras la eclosión  
AGUA DULCE  
Carassius auratus  
Carpa dorada 24 ± 1 — — 3 — 4 > 4 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 4 días des ­
pués de la eclosión (7 días) — 80  
Leopomis macrochirus  
Pez sol do agallas azules 21 ± 1 — 16 3 > 4 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 4 días des ­
pués de la eclosión (7 días) — 75 
AGUA SALADA  
Menidia peninsulae  
Pejerrey del Atlántico Occidental 22-25 15-22 12 1,5 10 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 5 días des ­
pués de la eclosión (6-7 días) 80 60  
Clupea harengus  
Arenque 10 ± 1 8-15 12 20-25 3-5 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 3 días des ­
pués de la eclosión (23-27 días) 60 80  
Gadus morhua  
Bacalao 5 ± 1 5-30 12 14-16 3-5 Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 3 días des ­
pués de la eclosión (18 días) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Petota 25 ± 1 15-30 12 — — Desde lo antes posible tras la fecundación 
(fase precoz de gástrula) hasta 4-7 días des ­
pués de la eclosión (28 días) > 75 80
APÉNDICE 4  
ALGUNAS CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE UN AGUA DE 
DILUCIÓN ACEPTABLE  
Sustancia Concentraciones  
Materia en partículas < 20 mg/l 
Carbono orgánico total < 2 mg/l 
Amoniaco no ionizado < 1 μg/l 
Cloro residual < 10 μg/l 
Plaguicidas organofosforados totales < 50 ng/l Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlora ­
dos < 50 ng/l 
Cloro orgánico total < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  ENSAYO DE TOXICIDAD ORAL AGUDA EN ABEJAS  
1. MÉTODO  
El presente ensayo de toxicidad aguda reproduce las directrices del 
documento OCDE TG 213 (1998).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente ensayo de toxicidad consiste en un método de laboratorio 
diseñado para determinar la toxicidad oral aguda de los productos fitosanitanos y otros productos químicos en abejas obreras adultas. 
Para determinar y evaluar las características tóxicas de una sustan ­
cia puede ser preciso estudiar la toxicidad oral aguda en abejas, por ejemplo, cuando es probable que estas queden expuestas a un 
producto químico determinado. El ensayo de toxicidad oral aguda 
se realiza para determinar la toxicidad inherente de los plaguicidas y otras sustancias para las abejas. Sus resultados se emplean para saber si es necesario profundizar en la evaluación. En particular, el 
método puede emplearse en programas de evaluación del peligro 
de los plaguicidas para las abejas, basados en una progresión secuencial desde los ensayos de toxicidad en laboratorio hasta los experimentos de semicampo y de campo (1). Los plaguicidas 
pueden someterse a ensayo en forma de principios activos (p.a.) o 
de productos formulados. 
Debe emplearse un tóxico de referencia para comprobar la sensibi ­
lidad de las abejas y la precisión del procedimiento de ensayo.
 
1.2. DEFINICIONES  
Toxicidad oral aguda:  efectos nocivos que se manifiestan durante 
un período máximo de 96 horas tras la administración oral de una 
dosis única de la sustancia de ensayo.  
Dosis:  cantidad de sustancia de ensayo consumida. Se expresa en 
peso de la sustancia por animal de ensayo ( μg/abeja). Dado que la 
alimentación es colectiva, no puede calcularse la dosis real por abeja, 
pero puede hacerse una estimación de la dosis media (sustancia de ensayo consumida en su totalidad/número de abejas en una jaula).  
DL
 50 (dosis letal media) oral:  dosis única, obtenida por estadís ­
tica, de una sustancia que puede provocar la muerte del 50 % de los animales a los que se haya administrado por vía oral. La DL
 50 
se expresa en μg de sustancia de ensayo por abeja. En el caso de 
los plaguicidas, la sustancia de ensayo puede ser un principio 
activo (p.a.) o un producto formulado que contenga uno o varios principios activos.  
Mortalidad:  número de animales muertos, es decir, completamente 
inmóviles.
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se expone a las abejas obreras adultas  (Apis mellifera)  a una gama 
de dosis de la sustancia de ensayo dispersada en una solución de 
sacarosa. A continuación, se alimenta a las abejas de la misma forma, pero sin sustancia de ensayo. Se registra la mortalidad todos los días, al menos durante 48 horas, y se compara con las cifras del 
control. Si la tasa de mortalidad aumenta entre las 24 y las 48 horas 
y la mortalidad del control permanece a un nivel aceptable, es decir, ≤ 10 %, está indicado prolongar el ensayo hasta un máximo de 96 
horas. Se analizan los resultados para calcular la DL
 50 a las 24 y a 
las 48 horas y, en caso de que se haya prolongado el estudio, a las 
72 y a las 96 horas.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Para que el ensayo sea válido han de darse las condiciones siguien ­
tes: 
— la mortalidad media del total de los controles no ha de superar el 
10 % al final del ensayo, 
— la DL  50 del tóxico de referencia debe ajustarse a la gama espe ­
cificada.  
1.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.5.1.  Recolección de las abejas  
Deben emplearse ejemplares adultos jóvenes de abejas obreras de la 
misma raza, edad, alimentación, etc. Las abejas han de proceder de colonias sanas y bien alimentadas, a ser posible sin enfermedades y 
con reina, y con antecedentes y estado fisiológico conocidos. Pueden 
recolectarse la mañana del día en que vaya a realizarse el ensayo, o la víspera por la tarde y mantenerse en condiciones de ensayo hasta 
el día siguiente. Pueden emplearse abejas procedentes de cuadros sin 
cría, pero debe evitarse la recolección a principios de la primavera o a finales del otoño, pues en esas épocas las abejas modifican su fisiología. Si es preciso realizar el ensayo en esas épocas, las abejas 
pueden colocarse en una incubadora y criarse durante una semana 
con pan de abejas (polen tomado del panal) y solución de sacarosa. Si se utilizan abejas tratadas con productos químicos como antibió ­
ticos, anti-varroa, etc., antes de iniciar el ensayo de toxicidad habrá 
que esperar 4 semanas desde el final del último tratamiento.
 
1.5.2.  Alojamiento y alimentación  
Se emplean jaulas fáciles de limpiar, bien ventiladas, de cualquier 
material apropiado, como acero inoxidable, tela metálica, plástico, 
madera desechable, etc., y de tamaño apropiado, es decir, suficien ­
temente espaciosas para el número de abejas. Es preferible colocar grupos de 10 abejas en cada jaula. 
Las abejas se mantienen en la oscuridad en un cuarto de experimen ­
tación a 25 ± 2
 o C. Debe registrarse a lo largo del ensayo la hume ­
dad relativa, que será por lo general del 50-70 %. Tanto el manejo como el tratamiento y las observaciones pueden realizarse con luz 
(del día). Se alimenta a las abejas con solución acuosa de sacarosa 
con una concentración final de 500 g/l (50 % w/v). Tras las dosis de ensayo, se las alimenta  ad libi-tum.  El sistema de alimentación debe 
permitir registrar la ingesta de cada jaula (véase el punto 1.6.3.1). 
Puede emplearse un tubo de vidrio de unos 50 mm de largo por 
10 mm de ancho, con un extremo abierto de unos 2 mm de diámetro.
 
1.5.3.  Preparación de las abejas  
Se asignan las abejas de forma aleatoria a las jaulas, que se colocan, 
también de forma aleatoria, en el cuarto de experimentación.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Conviene suprimir la alimentación de las abejas 2 horas antes de 
iniciar el ensayo. Se recomienda esta práctica con el fin de que el 
contenido intestinal de todos los animales sea el mismo cuando comience el ensayo. Deben retirarse las abejas moribundas y susti ­
tuirse por otras sanas antes de empezar el ensayo.
 
1.5.4.  Preparación de las dosis  
Si la sustancia de ensayo puede mezclarse con agua, se añade direc ­
tamente a una solución de sacarosa al 50 %. Si se trata de productos de calidad técnica o de sustancias escasamente solubles en agua, 
pueden emplearse disolventes orgánicos, emulgentes o dispersantes 
poco tóxicos para las abejas (por ejemplo, acetona, dimetilformamida o dimetilsulfóxido). La concentración del excipiente dependerá de la 
solubilidad de la sustancia de ensayo y ha de ser la misma para todas 
las concentraciones que se empleen en el ensayo. Por lo general, resulta adecuada una concentración de excipiente del 1 %, que no debe sobrepasarse. 
Se preparan soluciones de control adecuadas, lo cual significa que, 
cuando se utilice un disolvente o dispersante para solubilizar la 
sustancia de ensayo, han de emplearse dos grupos de control distin ­
tos: una solución acuosa y una solución de sacarosa con el disol ­
vente o excipiente a la concentración empleada en las dosis de ensayo.
 
1.6. PROCEDIMIENTO  
1.6.1.  Grupos de ensayo y controles  
El número de dosis y pruebas en paralelo ha de ser suficiente desde 
el punto de vista estadístico para poder determinar la DL  50 con un 
límite de confianza del 95 %. Suele ser necesaria una serie geomé ­
trica de 5 dosis con un factor que no sobrepase el 2,2 y que incluya la gama de la DL
 50 . No obstante, el factor de dilución y el número 
de concentraciones han de determinarse con arreglo a la pendiente de 
la curva de toxicidad (dosis/mortalidad) y al método estadístico que se haya elegido para analizar los resultados. Las concentraciones apropiadas para el tratamiento pueden establecerse tras un experi ­
mento de determinación de gamas. 
Con cada concentración de ensayo deben tratarse al menos 3 grupos 
en paralelo, de 10 abejas cada uno. Además de la serie de ensayo, 
deben efectuarse al menos 3 lotes de control, de 10 abejas cada uno. También deben efectuarse lotes de control para los disolventes/exci ­
pientes que se utilicen (véase el punto 1.5.4).
 
1.6.2.  Tóxico de referencia  
Debe incluirse un tóxico de referencia en la serie de ensayo. Se 
utilizarán al menos 3 dosis que abarquen la DL  50 , prevista. Para 
cada dosis de ensayo se emplearán al menos 3 jaulas en paralelo, 
con 10 abejas cada una. El tóxico de referencia idóneo es el dime ­
toato, cuya DL  50 -24 horas tras administración oral es del orden de 
0,10-0,35 μg p.a./abeja (2). También pueden emplearse otros tóxicos 
si se dispone de datos suficientes para comprobar que la relación 
dosis/respuesta es la esperada (por ejemplo, paratión).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Exposición  
1.6.3.1.  Administración de las dosis  
Debe administrarse a cada grupo de abejas 100-200 μl de solución 
acuosa de sacarosa al 50 % con la sustancia de ensayo a la concentración 
adecuada. Si la sustancia es poco soluble, poco tóxica o su concentración 
en la formulación es escasa, ha de administrarse un volumen mayor, pues se necesita una mayor cantidad de sustancia en la solución de sacarosa. Se controla la cantidad de alimento tratado que consume cada grupo. 
Una vez consumido el alimento (por lo general tras 3-4 horas), se retira el 
comedero de la jaula y se sustituye por otro con solución de sacarosa únicamente, que se proporciona  ad libitum.  El rechazo de la dosis de 
ensayo de algunos productos a concentraciones superiores puede dar 
lugar a un consumo escaso o nulo de alimento. Tras un máximo de 6 horas, el alimento tratado que no haya sido consumido se sustituye por solución de sacarosa sola. Se calcula el consumo de alimento tratado (por 
ejemplo, midiendo el volumen/peso del alimento tratado que haya so ­
brado).
 
1.6.3.2.  Duración  
Conviene que el ensayo dure hasta 48 horas después de la sustitu ­
ción de la solución de ensayo por la de sacarosa sola. Si la morta ­
lidad sigue aumentando en más del 10 % tras las primeras 24 horas, 
debe prolongarse el ensayo hasta un máximo de 96 horas, siempre y 
cuando la mortalidad del control no supere el 10 %.  
1.6.4.  Observaciones  
Se registra la mortalidad a las 4, las 24 y las 48 horas del inicio del 
ensayo (es decir, de la administración de la dosis). Si es necesario 
prolongar el período de observación, se harán registros cada 24 
horas, hasta un máximo de 96 horas, siempre y cuando la mortalidad del control no supere el 10 %. 
Se calcula la cantidad de alimento consumido en cada grupo. Para 
saber si el alimento tratado es apetecible puede compararse el con ­
sumo de este y el de alimento sin tratar, durante un período de 6 horas. 
Debe registrarse todo comportamiento anormal observado durante el 
período de ensayo.
 
1.6.5.  Ensayo límite  
En algunos casos (por ejemplo, cuando se piense someter a ensayo 
una sustancia escasamente tóxica), puede realizarse un ensayo límite con 100 μg p.a./abeja para demostrar que la DL
 50 es superior a ese 
valor. Debe seguirse el mismo procedimiento, incluidos los 3 grupos 
de ensayo en paralelo, con la dosis de ensayo, los controles perti ­
nentes, el tóxico de referencia y para el cálculo de la cantidad de alimento tratado que se ha consumido. Si mueren abejas debe reali ­
zarse un estudio completo. Deben registrarse los efectos subletales, 
en caso de producirse (véase el punto 1.6.4).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. RESULTADOS E INFORME  
2.1. RESULTADOS 
Se resumen los resultados en un cuadro que recoja, para cada 
grupo tratado, grupo de control y grupo con el tóxico de referen ­
cia, el número de abejas empleadas, la mortalidad en cada una de 
las observaciones y el número de abejas que presenten alteraciones del comportamiento. Se analizan los datos relativos a la mortalidad con métodos estadísticos apropiados (por ejemplo, análisis por 
probitas, media móvil, probabilidad bino-mial) (3) (4). Se trazan 
las curvas de dosis-respuesta correspondientes a todas las observa ­
ciones recomendadas y se calculan las pendientes de las mismas y 
las dosis letales medias (DL
 50 ) con un límite de confianza del 
95 %. La mortalidad de los controles puede corregirse mediante la corrección de Abbott (4) (5). Si el alimento tratado no se ha consumido en su totalidad, se calcula la cantidad de sustancia de 
ensayo consumida en cada grupo. La DL
 50 se expresa en μg de 
sustancia de ensayo por abeja.  
2.2. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
2.2.1.  Sustancia de ensayo:  
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes (esta ­
bilidad en el agua, presión de vapor, etc.), 
— identificación química: fórmula estructural, pureza, etc. (en el 
caso de los plaguicidas, identidad y concentración del principio o principios activos).
 
2.2.2.  Especie sometida a ensayo:  
— denominación científica, raza, edad aproximada (en semanas), 
método y fecha de recolección, 
— información sobre las colonias de donde proceden las abejas de 
ensayo: estado de salud, enfermedades de los sujetos adultos, tratamientos previos, etc.
 
2.2.3.  Condiciones de ensayo:  
— temperatura y humedad relativa en el cuarto de experimentación, 
— condiciones de alojamiento, incluido el tipo, tamaño y material 
de las jaulas, 
— método de preparación de la solución madre y de ensayo (en su 
caso, el disolvente y su concentración), 
— diseño del ensayo, por ejemplo, número de concentraciones y 
concentraciones de ensayo, número de controles, etc., 
— para cada concentración de ensayo y control, número de jaulas 
utilizadas en paralelo y número de abejas por jaula, fecha del 
ensayo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Resultados:  
— resultados del estudio previo de determinación de gamas, si pro ­
cede, 
— datos en bruto: mortalidad con cada dosis de ensayo en cada 
período de observación, 
— gráfico de las curvas de dosis-respuesta al final del ensayo, — valores de la DL
 50 con un límite de confianza del 95 % en cada 
período de observación recomendado, con la sustancia de ensayo y el tóxico de referencia, 
— métodos estadísticos empleados para calcular la DL
 50 , 
— mortalidad en los controles, 
— otros efectos biológicos observados o medidos en las abejas, 
como alteraciones del comportamiento (incluido el rechazo de la sustancia de ensayo), tasa de consumo del alimento tratado y sin tratar, etc., 
— toda desviación de los protocolos de ensayo aquí descritos y 
cualquier otra información de interés.
 
3. REFERENCIAS  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Pro ­
ducts — Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151- 165. Marzo de 1993. 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees  (Apis mellifera L.)  1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, 119-125. 
(3) Litchfield, J.T. y Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour, Pharmacol. and Exper. 
Ther., 96, 99-113. 
(4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3
 a ed., Cambridge, Lon ­
dres y Nueva York. 
(5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, 265-267.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA POR CONTACTO EN 
ABEJAS  
1. MÉTODO  
El presente ensayo de toxicidad aguda reproduce las directrices del 
documento OCDE TG 214 (1998).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El presente ensayo de toxicidad consiste en un método de laboratorio 
diseñado para determinar la toxicidad aguda por contacto de los productos fitosanitarios y otros productos químicos en abejas obreras adultas. 
Para determinar y evaluar las características tóxicas de una sustancia 
puede ser preciso estudiar la toxicidad aguda por contacto en abejas, 
por ejemplo, cuando es probable que estas queden expuestas a un producto químico determinado. El ensayo de toxicidad aguda por contacto se realiza para determinar la toxicidad inherente de los 
plaguicidas y otras sustancias para las abejas. Sus resultados se 
emplean para saber si es necesario profundizar en la evaluación. En particular, el método puede emplearse en programas de evalua ­
ción del peligro de los plaguicidas para las abejas, basados en una 
progresión secuencial desde los ensayos de toxicidad en laboratorio 
hasta los experimentos de semicampo y de campo (1). Los plagui ­
cidas pueden someterse a ensayo en forma de principios activos (p.a.) o de productos formulados. 
Debe emplearse un tóxico de referencia para comprobar la sensibi ­
lidad de las abejas y la precisión del procedimiento de ensayo.
 
1.2. DEFINICIONES  
Toxicidad aguda por contacto:  efectos nocivos que se manifiestan 
durante un período máximo de 96 horas tras la aplicación tópica de una dosis única de una sustancia.  
Dosis:  cantidad de sustancia de ensayo aplicada. Se expresa en peso 
de la sustancia por animal de ensayo ( μg/abeja).  
DL
 50 (dosis letal media) por contacto:  dosis única, obtenida por 
estadística, de una sustancia que puede provocar la muerte del 50 % 
de los animales a los que se haya aplicado. La DL  50 se expresa en 
μg de sustancia de ensayo por abeja. En el caso de los plaguicidas, la 
sustancia de ensayo puede ser un principio activo (p.a.) o un pro ­
ducto formulado que contenga uno o varios principios activos.  
Mortalidad:  número de animales muertos, es decir, completamente 
inmóviles.  
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se expone a las abejas obreras adultas  (Apis mellifera),  por aplica ­
ción directa en el tórax (gotitas), a una gama de dosis de la sustancia de ensayo disuelta en un excipiente adecuado. El ensayo dura 48 horas. Si la tasa de mortalidad aumenta entre las 24 y las 48 horas y 
la mortalidad del control permanece a un nivel aceptable, es decir, 
<10 %, está indicado prolongar el ensayo hasta un máximo de 96 horas. Se registra la mortalidad todos los días y se compara con las cifras del control. Se analizan los resultados para calcular la DL
 50 a 
las 24 y a las 48 horas y, en caso de que se haya prolongado el 
estudio, a las 72 y a las 96 horas.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Para que el ensayo sea válido han de darse las condiciones siguien ­
tes: 
— la mortalidad media del total de los controles no ha de superar el 
10 % al final del ensayo, 
— la DL  50 del tóxico de referencia debe ajustarse a la gama espe ­
cificada.  
1.5. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.5.1.  Recolección de las abejas  
Deben emplearse ejemplares adultos jóvenes de abejas obreras de la 
misma raza, edad, alimentación, etc. Las abejas han de proceder de colonias sanas y bien alimentadas, a ser posible sin enfermedades y con reina, y con antecedentes y estado fisiológico conocidos. Pueden 
recolectarse la mañana del día en que vaya a reali-zarse el ensayo, o 
la víspera por la tarde y mantenerse en condiciones de ensayo hasta el día siguiente. Pueden emplearse abejas procedentes de cuadros sin cría, pero debe evitarse la recolección a principios de la primavera o 
finales del otoño, pues en esas épocas las abejas modifican su fisio ­
logía. Si es preciso realizar el ensayo en esas épocas, las abejas pueden colocarse en una incubadora y criarse durante una semana con pan de abejas (polen tomado del panal) y solución de sacarosa. 
Si se utilizan abejas tratadas con productos químicos como antibió ­
ticos, anti-varroa, etc., antes de iniciar el ensayo de toxicidad habrá que esperar 4 semanas desde el final del último tratamiento.
 
1.5.2.  Alojamiento y alimentación  
Se emplean jaulas fáciles de limpiar, bien ventiladas, de cualquier 
material apropiado, como acero inoxidable, tela metálica, plástico, 
madera desechable, etc., y de tamaño apropiado, es decir, suficien ­
temente espaciosas para el número de abejas. Es preferible colocar 
grupos de 10 abejas en cada jaula. 
Las abejas se mantienen en la oscuridad en un cuarto de experimen ­
tación a 25 ± 2  o C Debe registrarse a lo largo del ensayo la humedad 
relativa, que será por lo general del 50-70 %. Tanto el manejo como 
el tratamiento y las observaciones pueden realizarse con luz (del día). Se alimenta a las abejas con solución acuosa de sacarosa con una concentración final de 500 g/l (50 % w/v). Esta se proporciona  ad 
libitum  mientras dure el ensayo en un comedero de abejas, que 
puede ser un tubo de vidrio de unos 50 mm de largo por 10 mm de ancho, con un extremo abierto de unos 2 mm de diámetro.
 
1.5.3.  Preparación de las abejas  
Antes de aplicar la sustancia de ensayo, pueden anestesiarse las 
abejas con anhídrido carbónico o nitrógeno. Debe reducirse al mí ­
nimo la cantidad de anestésico aplicado y el tiempo de exposición. Se retiran las abejas moribundas y se sustituyen por otras sanas antes 
de empezar el ensayo.
 
1.5.4.  Preparación de las dosis  
La sustancia de ensayo se diluye en un excipiente, que puede ser un 
disolvente orgánico o una solución acuosa con un humectante. La acetona es el disolvente orgánico más conveniente, si bien pueden 
emplearse otros escasamente tóxicos para las abejas (por ejemplo, 
dimetilformamida o dimetilsulfóxido). Si se trata de formulados dis ­
persados en agua o de sustancias orgánicas de gran polaridad insolu ­
bles en disolventes orgánicos, puede resultar más fácil aplicarlos en 
una solución débil de un humectante de una marca comercial (Agral, 
Cittowett, Lubrol, Triton, Tween, etc.).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Se preparan soluciones de control adecuadas, lo cual significa que, 
cuando se utilice un disolvente o dispersante para solubilizar la 
sustancia de ensayo, han de emplearse dos grupos de control distin ­
tos: uno con agua y otro con disolvente/dispersante.  
1.6. PROCEDIMIENTO  
1.6.1.  Grupos de ensayo y controles  
El número de dosis y pruebas en paralelo ha de ser suficiente desde 
el punto de vista estadístico para poder determinar la DL  50 con un 
límite de confianza del 95 %. Suele ser necesaria una serie geomé ­
trica de 5 dosis con un factor que no sobrepase el 2,2 y que incluya la gama de la DL
 50 . No obstante, el número de concentraciones ha 
de determinarse con arreglo a la pendiente de la curva de toxicidad 
(dosis/mortalidad) y al método estadístico que se haya elegido para analizar los resultados. Las concentraciones apropiadas para el trata ­
miento pueden establecerse tras un experimento de determinación de 
gamas. 
Con cada concentración de ensayo deben tratarse al menos 3 grupos 
en paralelo, de 10 abejas cada uno. 
Además de la serie de ensayo, deben efectuarse al menos 3 lotes de 
control, de 10 abejas cada uno. En su caso, deben hacerse 3 lotes de control adicionales, de 10 abejas cada uno, con el disolvente orgá ­
nico o humectante.
 
1.6.2.  Tóxico de referencia  
Debe incluirse un tóxico de referencia en la serie de ensayo. Se 
utilizarán al menos 3 dosis que abarquen la DL  50 prevista. Para 
cada dosis de ensayo se emplearán al menos 3 jaulas en paralelo, con 10 abejas cada una. El tóxico de referencia idóneo es el dime ­
toato, cuya DL
 50 -24 horas por contacto es del orden de 0,10-0,35 μg 
p.a./abeja (2). También pueden emplearse otros tóxicos si se dispone de datos suficientes para comprobar que la relación dosis/respuesta es la esperada (por ejemplo, paratión).
 
1.6.3.  Exposición  
1.6.3.1.  Administración de las dosis  
Se hace una aplicación local a cada una de las abejas anestesiadas. 
Las abejas se asignan de forma aleatoria para las distintas dosis de ensayo y los controles. Con un microaplicador, se aplica a cada abeja en la cara dorsal del tórax 1 μl de solución con sustancia de ensayo a 
la concentración adecuada. Si procede, pueden aplicarse otros volú ­
menes. Después de la aplicación, se colocan las abejas en las jaulas de ensayo y se les proporciona solución de sacarosa.
 
1.6.3.2.  Duración  
Conviene que el ensayo dure 48 horas. Si la mortalidad sigue au ­
mentando en más del 10 % entre las 24 y las 48 horas, debe pro ­
longarse el ensayo hasta un máximo de 96 horas, siempre y cuando 
la mortalidad del control no supere el 10 %.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Observaciones  
Se registra la mortalidad a las 4, las 24 y las 48 horas de la adminis ­
tración de la dosis. Si es necesario prolongar el período de observa ­
ción, se harán registros cada 24 horas, hasta un máximo de 96 horas, 
siempre y cuando la mortalidad del control no supere el 10 %. 
Debe registrarse todo comportamiento anormal observado durante el 
período de ensayo.  
1.6.5.  Ensayo límite  
En algunos casos (por ejemplo, cuando se piense someter a ensayo 
una sustancia escasamente tóxica), puede realizarse un ensayo límite con 100 μg p.a./abeja para demostrar que la DL
 50 es superior a ese 
valor. Debe seguirse el mismo procedimiento, incluidos los 3 grupos 
de ensayo en paralelo, con la dosis de ensayo, los controles perti ­
nentes y el tóxico de referencia. Si mueren abejas debe realizarse un estudio completo. Deben registrarse los efectos subletales, en caso de producirse (véase el punto 1.6.4).
 
2. RESULTADOS E INFORME  
2.1. RESULTADOS 
Se resumen los resultados en un cuadro que recoja, para cada grupo 
tratado, grupo de control y grupo con el tóxico de referencia, el 
número de abejas empleadas, la mortalidad en cada una de las ob ­
servaciones y el número de abejas que presenten alteraciones del comportamiento. Se analizan los datos relativos a la mortalidad 
con métodos estadísticos apropiados (por ejemplo, análisis por pro ­
bitas, media móvil, probabilidad bino-mial) (3) (4). Se trazan las curvas de dosis-respuesta correspondientes a todas las observaciones recomendadas (a las 24, 48 y, en su caso, 72 horas y 96 horas) y se 
calculan las pendientes de las mismas y las dosis letales medias 
(DL
 50 ) con un límite de confianza del 95 %. La mortalidad de los 
controles puede corregirse mediante la corrección de Abbott (4) (5). La DL
 50 , se expresa en μg de sustancia de ensayo por abeja.  
2.2. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
2.2.1.  Sustancia de ensayo:  
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas (estabilidad en el 
agua, presión de vapor, etc.), 
— identificación química: fórmula estructural, pureza, etc. (en el 
caso de los plaguicidas, identidad y concentración del principio 
o principios activos).  
2.2.2.  Especie sometida a ensayo:  
— denominación científica, raza, edad aproximada (en semanas), 
método y fecha de recolección, 
— información sobre las colonias de donde proceden las abejas de 
ensayo: estado de salud, enfermedades de los sujetos adultos, 
tratamientos previos, etc.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Condiciones de ensayo:  
— temperatura y humedad relativa en el cuarto de experimentación, 
— condiciones de alojamiento, incluido el tipo, tamaño y material 
de las jaulas, 
— método de administración de la sustancia de ensayo: disolvente, 
volumen de solución de ensayo, anestésicos empleados, etc., 
— diseño del ensayo, por ejemplo, número de concentraciones y 
concentraciones de ensayo, número de controles, etc.; para cada concentración de ensayo y control, número de jaulas utili ­
zadas en paralelo y número de abejas por jaula, 
— fecha del ensayo.
 
2.2.4.  Resultados:  
— resultados del estudio previo de determinación de gamas, si pro ­
cede, 
— datos en bruto: mortalidad con cada concentración de ensayo en 
cada período de observación, 
— gráfico de las curvas de dosis-respuesta al final del ensayo, — valores de la DL
 50 con un límite de confianza del 95 % en cada 
período de observación recomendado, con la sustancia de ensayo 
y el tóxico de referencia, 
— métodos estadísticos empleados para calcular la DL  50 , 
— mortalidad en los controles, — otros efectos biológicos observados o medidos en las abejas, así 
como cualquier reacción anormal, 
— toda desviación de los protocolos de ensayo aquí descritos y 
cualquier otra información de interés.
 
3. REFERENCIAS  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the 
Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N. 1, 151-165. Marzo de 1993. 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees  (Apis mellifera L. , 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22119-125. 
(3) Litchfield, J.T. y Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. 
Ther., 96, 99-113. 
(4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3
 a ed., Cambridge, Lon ­
dres y Nueva York. 
(5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. jour. Econ. Entomol. 18, 265-267.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  ADSORCIÓN/DESORCIÓN SEGÚN UN MÉTODO DE 
EQUILIBRIO POR LOTES  
1. MÉTODO  
Este método reproduce las directrices de la OCDE TG 106 para la 
determinación de la adsorción/desorción en el suelo, según un mé ­
todo de equilibrio por lotes (2000).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El método tiene en cuenta una prueba de anillo y un taller para la 
selección de suelo con vistas al desarrollo de una prueba de adsor ­
ción (1) (2) (3) (4), así como distintas directrices nacionales vigentes (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). 
Los estudios de adsorción/desorción son útiles para proporcionar 
información esencial sobre la movilidad de las sustancias químicas y su distribución en los compartimentos edáfico, acuático y aéreo de la biosfera (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Esta 
información puede ser utilizada en la predicción o estimación, por 
ejemplo, de la capacidad de una sustancia química para su degradación (22) (23), transformación y absorción por organismos (24), lixiviación a través del perfil edáfico (16) (18) (19) (21) (25) 
(26) (27) (28), volatilidad desde el suelo (21) (29) (30) o arrastre 
desde la tierra hasta las aguas naturales (18) (31) (32). Los datos de adsorción pueden utilizarse para establecer comparaciones y modelos (19) (33) (34) (35). 
La distribución de una sustancia química entre las fases edáfica y 
acuosa es un proceso complejo que depende de diversos factores: la naturaleza química de la sustancia (12) (36) (37) (38) (39) (40), las 
características del suelo (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) 
(46) (47) (48) (49) y factores climáticos tales como las precipitacio ­
nes, la temperatura, la luz solar y el viento. Así pues, los numerosos fenómenos y mecanismos implicados en el proceso de adsorción de 
una sustancia química por el suelo no pueden definirse completa ­
mente con un modelo simplificado de laboratorio como es el pre ­
sente método. Sin embargo, esta tentativa, aunque no puede cubrir todos los casos ambientalmente posibles, proporciona información 
valiosa sobre la importancia ambiental de la adsorción de una sus ­
tancia química. 
Véase también la Introducción general.
 
1.2. OBJETO 
El objeto del método es estimar el comportamiento de adsorción/ 
desorción de una sustancia en los suelos. Lo que se pretende es obtener un valor de sorción que pueda utilizarse para predecir el reparto en diversas condiciones ambientales; con este fin, se deter ­
minan los coeficientes de adsorción en el equilibrio de una sustancia 
química en diversos suelos en función de las características de estos (por ejemplo, contenido de carbono orgánico, contenido de arcilla y textura del suelo y pH). Hay que utilizar diversos tipos de suelo para 
cubrir lo más ampliamente posible las interacciones de una sustancia 
dada con suelos naturales. 
En este método, la adsorción representa el proceso de enlace de una 
sustancia química a las superficies de los suelos; no se distingue 
entre diversos procesos de adsorción (adsorción física y química) y procesos tales como la degradación catalizada en superficie, la ad ­
sorción en la masa o las reacciones químicas. La adsorción que 
pueda darse en las partículas coloidales (diámetro < 0,2 μm) gene­
radas por los suelos no se tiene en cuenta completamente.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Los parámetros del suelo que se consideran más importantes para la 
adsorción son los siguientes: contenido de carbono orgánico (3) (4) 
(12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48); contenido de arcilla y textura del suelo (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) y pH para los compuestos ionizables (3) (4) (42). Otros parámetros del 
suelo que pueden influir en la adsorción/desorción de determinadas 
sustancias son la capacidad efectiva de intercambio catiónico (ECEC), el contenido de óxidos amorfos de hierro y aluminio, par ­
ticularmente en caso de suelos volcánicos y tropicales (4), y la 
superficie específica (49). 
La prueba se diseña para evaluar la adsorción de una sustancia 
química en distintos tipos de suelo con una amplia gama de conte ­
nido de carbono orgánico, contenido de arcilla y textura del suelo, y pH. Comprende tres etapas:  
Etapa 1:  Estudio preliminar para determinar: 
— la proporción suelo/solución, — el tiempo de equilibrio para la adsorción y la cantidad 
de sustancia problema adsorbida en el equilibrio, 
— la adsorción de la sustancia problema en las superfi ­
cies de los recipientes del ensayo y la estabilidad de 
dicha sustancia durante el período de prueba.  
Etapa 2:  Prueba de barrido: se estudia la adsorción en 5 tipos 
diversos de suelo mediante cinética de adsorción con una sola concentración y determinación del coeficiente 
de distribución K
 d y K  oc . 
Etapa 3:  Determinación de las isotermas de adsorción de Freund ­
lich para determinar la influencia de la concentración so ­
bre el grado de adsorción en los suelos. 
Estudio de la desorción mediante cinética de desorción/ 
isotermas de desorción de Freundlich (apéndice 1).  
1.3. DEFINICIONES Y UNIDADES  
Símbolo Definición Unidad  
A t i Adsorción porcentual al tiempo t  i % 
A eq Adsorción porcentual en el equilibrio de adsorción %  
m ads 
s ðt i Þ Masa de la sustancia problema adsorbida en el suelo al 
tiempo t  i μg 
m ads 
s ðΔt i Þ Masa de la sustancia problema adsorbida en el suelo du ­
rante el intervalo de tiempo Δt i μg 
m ads 
s ðeqÞ Masa de la sustancia problema adsorbida en el suelo en el 
equilibrio de adsorción μg 
m 0 Masa de la sustancia problema en el tubo de ensayo, al 
principio de la prueba de adsorción μg 
m ads 
m ðt i Þ Masa de la sustancia problema medida en una alícuota 
(v a A ) al tiempo t  i μg 
m ads 
aq ðeqÞ Masa de la sustancia en la solución en el equilibrio de 
adsorción μg 
m soil Cantidad de la fase edáfica, expresada en masa seca de 
suelo g ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Símbolo Definición Unidad  
C st Concentración en masa de la solución madre de la sus ­
tancia μg cm  -3 
C 0 Concentración inicial en masa de la solución problema en 
contacto con el suelo μg cm  -3 
C ads 
aq ðt i Þ Concentración en masa de la sustancia en la fase acuosa al 
tiempo t  i en que se realiza el análisis μg cm  -3 
C ads 
s ðeqÞ Contenido de la sustancia adsorbida en el suelo en el 
equilibrio de adsorción μg g -1 
C ads 
aq ðeqÞ Concentración en masa de la sustancia en la fase acuosa en 
el equilibrio de adsorción μg cm  -3 
V 0 Volumen inicial de la fase acuosa en contacto con el suelo 
durante la prueba de adsorción cm 3 
v a A Volumen de la alícuota en que se mide la sustancia pro ­
blema cm 3 
K d Coeficiente de distribución de la adsorción cm  -3 g -1 
K oc Coeficiente de adsorción normalizado para tener en cuenta 
el carbono orgánico cm 3 
K om Coeficiente de distribución, normalizado para tener en 
cuenta la materia orgánica cm 3 g -1 
K ads 
F Coeficiente de adsorción de Freundlich -1/n (cm  3 ) 1/n g  —1 
l/n Exponente de Freundlich  
D t i Desorción porcentual al tiempo t  i % 
D Δt i Desorción porcentual en el intervalo de tiempo Δt i % 
K des Coeficiente de desorción aparente cm  3 
K F des Coeficiente de desorción de Freundlich μg -11/n (cm  3 ) 1/ng  -1 
m des 
aq ðt i Þ Masa de la sustancia problema desorbida del suelo al 
tiempo t  i μg 
m m des ðΔt i Þ Masa de la sustancia problema desorbida del suelo durante 
el intervalo de tiempo Δt i μg 
m m des ðeqÞ Masa de la sustancia determinada analíticamente en la fase 
acuosa en el equilibrio de desorción μg 
m des 
aq ðeqÞ Masa total de la sustancia problema desorbida en el equi ­
librio de desorción μg 
m des 
s ðΔt i Þ Masa de la sustancia que permanece adsorbida en el suelo 
después del intervalo de tiempo Δt i μg 
m aq A Masa de la sustancia que queda en solución después de 
alcanzado el equilibrio de adsorción debido a la sustitución 
incompleta del volumen μg 
C des 
s ðeqÞ Contenido de la sustancia problema que permanece ad ­
sorbida en el suelo en el equilibrio de desorción μg g -1 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Símbolo Definición Unidad  
C des 
aq ðeqÞ Concentración en masa de la sustancia problema en la fase 
acuosa en el equilibrio de desorción μg cm  -3 
v T Volumen total de la fase acuosa en contacto con el suelo 
durante el experimento de cinética de desorción llevado a 
cabo con el método en serie cm 3 
v R Volumen del sobrenadante retirado del tubo después de 
alcanzar el equilibrio de adsorción y sustituido por el mismo volumen de solución de CaCl
 2 0,01 M cm 3 
v a D Volumen de la alícuota tomada para el análisis a partir del 
tiempo (i), durante el experimento de cinética de desorción realizado con el método en serie cm
 3 
V ra i D Volumen de la solución tomada del tubo (i) para la medida 
de la sustancia problema, en el experimento de cinética de 
desorción (método paralelo) cm 3 
V r F Volumen de la solución tomada del tubo para la medida de 
la sustancia problema, en el equilibrio de desorción cm 3 
MB Balance de masa % 
m E Masa total de la sustancia problema extraída del suelo y de 
las paredes del recipiente del ensayo en dos pasos μg 
V rec Volumen del sobrenadante recuperado después del equili ­
brio de adsorción cm 3 
p ow Coeficiente de reparto octanol/agua 
pKa Constante de disociación 
S w Hidrosolubilidad gl  -1 
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
A las muestras de suelo de peso seco conocido que se han pree ­
quilibrado en CaCl  2 0,01 M se añaden volúmenes conocidos de 
soluciones de concentración también conocida de la sustancia pro ­
blema, no marcada ni radiomarcada, en CaCl  2 0,01 M. La mezcla se 
agita durante un tiempo adecuado. Las suspensiones de suelo se 
separan entonces por centrifugación y, si se desea, por filtración, y 
se analiza la fase acuosa. La cantidad de sustancia problema adsor ­
bida en la muestra de suelo se calcula como la diferencia entre la cantidad de sustancia problema inicialmente presente en la solución 
y la cantidad que permanece al final del experimento (método indi ­
recto). 
Como opción, la cantidad de sustancia problema adsorbida puede 
determinarse también directamente por análisis del suelo (método directo). Este procedimiento, que implica someter el suelo a extrac ­
ción gradual con el solvente apropiado, se recomienda en caso de 
que no pueda determinarse exactamente la diferencia de concentra ­
ción de la sustancia en la solución. Los siguientes son ejemplos de tales casos: adsorción de la sustancia problema en la superficie de los recipientes del ensayo, inestabilidad de la sustancia problema en la 
escala de tiempo del experimento, adsorción débil que dé solamente 
un pequeño cambio de concentración en la solu-ción, y adsorción fuerte que deje una concentración tan baja que no pueda determi ­
narse exactamente. Si se utiliza una sustancia radiomarcada, la ex ­
tracción del suelo puede evitarse mediante análisis de la fase edáfica 
por combustión y recuento de centelleo líquido. Sin embargo, el recuento de centelleo líquido es una técnica inespecífica que no puede distinguir entre productos parentales y productos de transfor ­
mación; por lo tanto, debe utilizarse solamente si la sustancia pro ­
blema es estable durante la duración del estudio.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
Los reactivos químicos deben ser de grado analítico. Se recomienda 
el uso de sustancias problema no marcadas de composición conocida y pureza preferiblemente del 95 %, al menos, o de sustancias pro ­
blema radio-marcadas de composición y radiopureza conocidas. En 
caso de marcadores de semivida breve, deben aplicarse correcciones para tener en cuenta su desintegración. 
Antes de llevar a cabo una prueba de adsorción/desorción, debe 
disponerse de la siguiente información sobre la sustancia problema: 
a) hidrosolubilidad (A.6); 
b) presión de vapor (A.4) o constante de la ley de Henry; 
c) degradación abiótica: hidrólisis en función del pH (C.7); 
d) coeficiente de reparto (A.8); 
e) biodegradabilidad fácil (C.4) o transformación aerobia y anaero ­
bia en el suelo; 
f) pKa de las sustancias ionizables; 
g) fotólisis directa en agua (es decir, espectro de absorción ultravio ­
leta-visible en el agua, rendimiento cuántico) y fotodegradación 
en el suelo.
 
1.6. APLICABILIDAD DE LA PRUEBA 
La prueba es aplicable a las sustancias químicas respecto de las 
cuales se dispone de un método analítico con la suficiente exactitud. 
Un parámetro importante que puede influir en la fiabilidad de los 
resultados, especialmente cuando se sigue el método indirecto, es la estabilidad de la sustancia problema en la escala de tiempo de la prueba. Así pues, es necesario comprobar la estabilidad en un estu ­
dio preliminar; si se observa alguna transformación en la escala de 
tiempo de la prueba, se recomienda que el estudio principal se re ­
alice analizando tanto la fase edáfica como la acuosa. 
Pueden surgir dificultades en la realización de esta prueba con sus ­
tancias problema cuya hidrosolubilidad sea baja (S
 w < 10  -4 g l -1 ), así 
como con sustancias muy cargadas, debido al hecho de que la con ­
centración en la fase acuosa no puede medirse analíticamente con la suficiente exactitud. En estos casos hay que tomar medidas adicio ­
nales. En las secciones pertinentes del presente método se dan indi ­
caciones sobre cómo tratar estos problemas. 
Al probar sustancias volátiles, debe tenerse cuidado para evitar pér ­
didas durante el estudio.
 
1.7. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.7.1.  Instrumentos y reactivos químicos  
Equipo normal de laboratorio, especialmente el siguiente: 
a) tubos o recipientes para llevar a cabo los experimentos. Es im ­
portante que estos tubos o recipientes: 
— ajusten directamente en la centrifugadora para minimizar los 
errores de manipulación y transferencia, 
— estén hechos de un material inerte que minimice la adsorción 
de la sustancia problema en su superficie;  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) dispositivo de agitación: agitador rotatorio o equipo equivalente: 
el dispositivo de agitación debe mantener el suelo en suspensión 
durante la agitación; 
c) centrifugadora: preferiblemente de alta velocidad con, por ejem ­
plo, fuerzas de centrifugación > 3 000 g, con temperatura con ­
trolada, capaces de retirar de la solución acuosa partículas con un 
diámetro mayor de 0,2 μm. Los recipientes deben estar cerrados 
durante la agitación y la centrifugación para evitar fenómenos de volatilidad y pérdidas de agua; para minimizar la adsorción sobre 
ellos, deben utilizarse tapones desactivados, tales como tapones 
de rosca con revestimiento de teflón; 
d) opcional: dispositivo de filtración: filtros de 0,2 μm de porosidad, 
estériles, de un solo uso. Debe tenerse especial cuidado en la 
selección del material del filtro, a fin de evitar cualquier pérdida 
de la sustancia problema sobre él; para las sustancias problema poco solubles no se recomienda usar material orgánico; 
e) instrumentación analítica, adecuada para medir la concentración 
de la sustancia problema; 
f) estufa de laboratorio, capaz de mantener una temperatura de 103 
a 110
 o C. 
1.7.2.  Caracterización y selección de los suelos  
Los suelos deben caracterizarse por tres parámetros considerados en 
gran parte responsables de la capacidad de adsorción: carbono orgá ­
nico, contenido de arcilla y textura de suelo, y pH. Como ya se ha mencionado (véase el punto 1.2) la adsorción/desorción de ciertas 
sustancias puede verse afectada por otras propiedades fisicoquímicas 
del suelo, que deben considerarse en tales casos. 
Los métodos utilizados para la caracterización de suelo son muy 
importantes y pueden tener una influencia significativa en los resul ­
tados. Por lo tanto, se recomienda que se mida el pH del suelo en 
una solución de CaCl
 2 0,01 M (que es la solución utilizada en la 
prueba de adsorción/desorción) según el método correspondiente de la ISO (por ejemplo, ISO-10390-1). También se recomienda que las 
otras propiedades pertinentes del suelo se determinen según métodos 
normalizados [por ejemplo, el Manual de análisis de suelo  (Hand­
book of Soil Analysis)]  de la ISO: esto permite que el análisis de los 
datos de sorción se base en parámetros del suelo normalizados en 
conjunto. En el punto 3, «Referencias» (50-52), se da información sobre métodos normalizados existentes de análisis y caracterización del suelo. Para el calibrado de los métodos de prueba del suelo, se 
recomienda el uso de suelos de referencia. 
En el cuadro 1 se da información sobre la selección de suelos para 
los experimentos de adsorción/desorción. Los 7 suelos seleccionados cubren los tipos de suelo de las zonas geográficas templadas. En 
caso de sustancias problema ionizables, los suelos seleccionados 
deben cubrir una gama amplia de pH, para poder evaluar la adsor ­
ción de la sustancia en sus formas ionizada y no ionizada. En el punto 1.9, «Realización de la prueba», figuran orientaciones sobre 
cuántos suelos distintos han de utilizarse en las diversas fases de la 
prueba. 
Si se prefieren otros tipos de suelo, deben caracterizarse por los 
mismos parámetros y ser similares a los descritos en el cuadro 1 
en cuanto a la variación de sus propiedades, incluso aunque no se 
ajusten exactamente a los criterios.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Cuadro 1  
Información sobre la selección de muestras de suelo para los estudios de adsorción/desorción  
Tipo de suelo Gama de pH (en 
CaCl  2 0,01 M) Contenido de carbono 
orgánico ( %) Contenido de arcilla 
( %) Textura del suelo (  1 ) 
1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65-80 Arcilla 
2 > 7,5 3,5 - 5,0 20-40 Franco-arcilloso 
3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15-25 Franco-limoso 4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15-30 Franco 5 < 4,0 - 6,0 (
 2 ) < 0,5 - 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) Franco-arenoso 
6 > 7,0 < 0,5 - 1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 Franco-arcilloso/ ar ­
cilla 
7 < 4,5 > 10 < 10 Arena/franco-are ­
noso  
( 1 ) Según el sistema de la FAO y los Estados Unidos de América (85). 
( 2 ) Las variables respectivas deben mostrar preferentemente valores dentro de la gama considerada. Si, no obstante, hay 
dificultades para encontrar material de suelo adecuado, se aceptarán valores por debajo del mínimo indicado. 
( 3 ) Los suelos con menos del 0,3 % de carbono orgánico pueden perturbar la correlación entre el contenido orgánico y la 
adsorción. Así pues, se recomienda el uso de suelos con un contenido mínimo de carbono orgánico del 0,3 %.  
1.7.3.  Recogida y conservación de muestras de suelo  
1.7.3.1.  Recogida  
No se recomienda ninguna técnica o herramienta de muestreo espe ­
cífica; la técnica de muestreo depende del propósito del estudio (53) (54) (55) (56) (57) (58). 
Deben considerarse los elementos siguientes: 
a) es necesario tener información detallada sobre las circunstancias 
del yacimiento, incluyendo la situación, cubierta vegetal, trata ­
mientos con plaguicidas y fertilizantes, adiciones biológicas o 
contaminación accidental. Deben seguirse las recomendaciones de la norma de la ISO sobre muestreo del suelo (ISO 10381-6) en cuanto a la descripción del sitio de muestreo; 
b) hay que definir el sitio de muestreo por sus coordenadas UTM 
(proyección universal transversal de Merca-tor/cero geodésico ho ­
rizontal europeo) o geográficas; así se puede volver a recoger en el futuro un suelo particular o definir el suelo bajo diversos sistemas de clasificación utilizados en países diferentes. Sola ­
mente debe recogerse el horizonte A hasta una profundidad má ­
xima de 20 cm. Especialmente en el caso del suelo de tipo 7, si hay un horizonte O
 h , presente como parte del suelo, debe in ­
cluirse en el muestreo. 
Las muestras de suelo deben transportarse utilizando recipientes y 
bajo condiciones de temperatura que garanticen que no se alteran 
perceptiblemente las propiedades iniciales del suelo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Conservción  
Se prefiere el uso de suelos tomados recientemente del yacimiento. 
Solamente si esto no es posible, el suelo puede conservarse a tem ­
peratura ambiente y secado al aire. No se recomienda ningún límite 
de tiempo de conservación, pero los suelos almacenados durante más 
de 3 años deben volver a analizarse en cuanto a su contenido de carbono orgánico, pH y capacidad de intercambio catiónico (CEC), antes de que se utilicen.
 
1.7.3.3.  Manipulación y preparación de las muestras de suelo para la prueba  
Los suelos se secan al aire a temperatura ambiente (preferiblemente 
entre 20 y 25  o C). La desagregación debe llevarse a cabo con la 
fuerza mínima, de modo que la textura original del suelo cambie lo 
menos posible. Los suelos se tamizan a un tamaño de partícula ≤ 
2 mm; deben seguirse las recomendaciones de la norma de la ISO sobre muestreo de suelo (ISO 10381-6) en cuanto al proceso de 
tamizado. Se recomienda una homoge-neización cuidadosa, ya que 
aumenta la reproducibilidad de los resultados. El índice de humedad de cada suelo se determina en tres alícuotas mediante calentamiento a 105
 o C hasta que no haya ningún cambio significativo en el peso 
(aproximadamente 12 horas). Para todos los cálculos, la masa del 
suelo hace referencia a la masa seca en estufa, es decir, el peso del suelo corregido para descontar el índice de humedad.
 
1.7.4.  Preparación de la sustancia problema para su aplicación al suelo  
La sustancia problema se disuelve en una solución de CaCl  2 0,01 M 
en agua destilada o desionizada; la solución de CaCl  2 se utiliza como 
fase solvente acuosa para mejorar la centrifugación y minimizar el intercambio catiónico. La concentración de la solución madre debe 
ser preferiblemente 3 órdenes de magnitud más alta que el límite de 
detección del método analítico utilizado. Este umbral garantiza la exactitud de las medidas en cuanto a la metodología seguida en este método; además, la concentración de la solución madre debe 
estar por debajo de la hidrosolubilidad de la sustancia problema. 
La solución madre debe prepararse de preferencia justo antes de la 
aplicación a las muestras de suelo y debe guardarse cerrada en la 
oscuridad a 4
 o C. El tiempo de conservación depende de la estabi ­
lidad de la sustancia problema y de su concentración en la solución. 
Solamente en el caso de las sustancias poco solubles (S  w < 10  -4 g l -1 ), 
puede ser necesario añadir un agente de solubilización apropiado cuando sea difícil disolver la sustancia problema. Este agente de solubilización: a) debe ser miscible con agua, como el metanol o el 
acetonitrilo; b) su concentración no debe exceder del 1 % del volumen 
total de la solución madre y debe constituir menos de ese límite en la solución de la sustancia problema que se vaya a poner en contacto con el suelo (preferentemente menos del 0,1 %), y c) no debe ser un agente 
tensoactivo ni experimentar reacciones solvolíticas con la sustancia 
problema. El uso de un agente de solubilización debe constar y justificarse en el informe sobre los datos. 
Otra opción para sustancias poco solubles es añadir al sistema de 
prueba sustancia problema ya disuelta: esta sustancia se disuelve en un solvente orgánico, del cual se añade una alícuota al sistema de suelo y solución de CaCl
 2 0,01 M en agua destilada o desionizada. 
El contenido del solvente orgánico en la fase acuosa debe mante ­
nerse lo más bajo posible, normalmente sin exceder del 0,1 %. La utilización de un solvente orgánico puede adolecer de irreproducibi ­
lidad del volumen. Así pues, puede introducirse un error adicional ya 
que la concentración de sustancia problema y de cosolvente no será 
la misma en todas las pruebas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. REQUISITOS PREVIOS PARA LLEVAR A CABO LA PRUEBA 
DE ADSORCIÓN/DESORCIÓN  
1.8.1.  Método analítico  
Entre los parámetros clave que pueden influir en la exactitud de las 
medidas de sorción se incluyen la exactitud del método analítico en 
el análisis de las fases tanto de solución como adsorbida, la estabi ­
lidad y la pureza de la sustancia problema, el logro del equilibrio de sorción, la magnitud del cambio de concentración de la solución, la 
proporción suelo/solución y los cambios en la estructura del suelo 
durante el proceso de equilibrado (35) (59) (60) (61) (62). En el apéndice 2 figuran algunos ejemplos donde se tratan estos problemas 
de exactitud. 
Debe comprobarse la fiabilidad del método analítico utilizado en la 
gama de concentración que pueda darse durante la prueba. El expe ­
rimentador debe ser libre para elaborar un método apropiado con la exactitud, la precisión, la reproducibilidad, los límites de detección y 
la recuperación apropiados. A continuación se dan orientaciones 
sobre cómo llevar a cabo tal prueba. 
Un volumen apropiado de CaCl
 2 0,01 M (por ejemplo, 100 cm  3 ) se 
agita durante 4 horas con un peso determinado de suelo (por ejem ­
plo, 20 g) de alta capacidad de adsorción, es decir, con un alto 
contenido de carbono orgánico y de arcilla; estos pesos y volúmenes 
pueden variar dependiendo de las necesidades analíticas, pero una proporción suelo/solución de 1:5 es un punto de partida conveniente. Se centrifuga la mezcla y puede filtrarse la fase acuosa. Se añade a 
esta cierto volumen de la solución madre de sustancia problema para 
alcanzar una concentración nominal dentro de la gama de concen ­
tración que pueda darse durante la prueba. Este volumen no debe exceder del 10 % del volumen final de la fase acuosa, para cambiar 
lo menos posible la naturaleza de la solución de preequilibrado. Se 
analiza la solución. 
Debe realizarse una prueba en blanco con el sistema suelo + solución 
de CaCl
 2 (sin la sustancia problema), para comprobar la presencia de 
artefactos en el método analítico y de efectos de matriz causados por 
el suelo. 
Entre los métodos analíticos que pueden utilizarse para las medidas 
de sorción se incluyen la cromatografía gas-líquido (GLC), la cro ­
matografía líquida de alta resolución (HPLC), la espectrometría (por 
ejemplo, cromatografía gaseosa/espectrometría de masas, HPLC/es ­
pectrometría de masas) y el recuento de centelleo líquido (para sus ­
tancias radiomarcadas). Sea cual sea el método analítico utilizado, se considera conveniente si la recuperación está entre el 90 y el 110 % 
del valor nominal. Para permitir la detección y la evaluación después 
de que haya tenido lugar el reparto, los límites de detección del método analítico deben estar al menos 2 órdenes de magnitud por debajo de la concentración nominal. 
Las características y los límites de detección del método analítico 
disponible para llevar a cabo los estudios de adsorción desempeñan 
un papel importante en la definición de las condiciones de prueba y de la realización de todo el experimento. Este método sigue una vía experimental general y proporciona recomendaciones y orientaciones 
sobre soluciones alternativas cuando el método analítico y las ins ­
talaciones de laboratorio impongan limitaciones.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Selección de las proporciones óptimas suelo/solución  
La selección de proporciones apropiadas suelo/solución para los es ­
tudios de sorción depende del coeficiente de distribución K  d y del 
grado relativo de adsorción deseado. El cambio de concentración de 
la sustancia en la solución determina la exactitud estadística de la 
medida basada en la forma de la ecuación de adsorción y el límite de la metodología analítica, respecto a la detección de la concentración de la sustancia química en la solución. Por lo tanto, en la práctica 
general es útil partir de algunas proporciones fijadas, para las cuales 
el porcentaje adsorbido sea de más del 20 %, y preferiblemente > 50 % (62), mientras que debe tenerse cuidado para mantener bastante 
alta la concentración de sustancia problema en la fase acuosa a fin de 
poder medirla con exactitud. Esto es particularmente importante en caso de altos porcentajes de adsorción. 
Un planteamiento conveniente de la selección de las proporciones 
adecuadas suelo/agua se basa en una estimación del valor de K
 d por 
estudios preliminares o por técnicas aceptadas de estimación (apén ­
dice 3). La selección de una proporción adecuada puede entonces 
basarse en la gráfica de la proporción suelo/solución frente a Kd con 
porcentajes fijos de adsorción (figura 1). En esta gráfica se asume que la ecuación de adsorción es lineal (
 1 ). La relación aplicable se 
obtiene reordenando la ecuación (4) de Kd en la forma de la 
ecuación (1):  
V 0 
m soil ¼ m 0 
m ads 
s ðeqÞ Ä 1 Í Î  
K d (1) 
o en su forma logarítmica suponiendo que R = m  soil /V 0 y A  eq %/100 
= m s ads ðeqÞ 
m 0 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Figura 1.  Relación entre las proporciones suelo/solución y K  d con diversos porcen ­
tajes de adsorción de la sustancia problema  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C ads 
s ðeqÞ ¼ K d ·C ads 
aq ðeqÞ:
 La figura 1 muestra las proporciones suelo/solución necesarias en 
función de K  d para diversos niveles de adsorción. Por ejemplo, 
con una proporción suelo/solución de 1:5 y un K  d de 20, habrá 
aproximadamente un 80 % de adsorción. Para obtener una adsorción del 50 % con el mismo K
 d , debe utilizarse una proporción de 
1:25. Este planteamiento de la selección de las proporciones suelo/ 
solución adecuadas da al investigador la flexibilidad suficiente para satisfacer sus necesidades experimentales. 
Los casos que son más difíciles de tratar son aquellos en que la 
sustancia química se adsorbe mucho o muy poco. En los casos en 
que se dé adsorción baja, se recomienda una proporción suelo/solu ­
ción de 1:1, aunque con algunos tipos de suelo muy orgánico pueden ser necesarias proporciones más pequeñas para obtener una mezcla fluida. Debe tenerse cuidado con la metodología analítica para medir 
pequeños cambios en la concentración de la solución; si no, la 
medida de la adsorción será inexacta. Por otra parte, en caso de coeficientes de distribución K
 d muy altos, puede llegarse hasta una 
proporción suelo/solución de 1:100 para dejar una cantidad signifi ­
cativa de sustancia química en la solución. Sin embargo, debe te ­
nerse cuidado para asegurar una buena mezcla, y dejarse tiempo suficiente para que el sistema se equilibre. Un planteamiento alter ­
nativo es predecir el valor de K
 d aplicando técnicas de estimación 
basadas, por ejemplo, en los valores de P  ow (apéndice 3). Esto podría 
ser útil especialmente para las sustancias químicas poco adsorbidas/ polares con P
 ow < 20 y para las sustancias lipofílicas/de alta sorción 
con P  ow > 10  4 . 
1.9. REALIZACIÓN DE LA PRUEBA  
1.9.1.  Condiciones de la prueba  
Todos los experimentos se hacen a temperatura ambiente y, si es 
posible, a una temperatura constante situada entre 20 y 25  o C. 
Las condiciones de la centrifugación permitirán eliminar de la solu ­
ción las partículas de más de 0,2 μm. Este valor corresponde a la 
partícula más pequeña que se considera partícula sólida, y es el 
límite entre partículas sólidas y coloidales. En el apéndice 4 figuran orientaciones sobre cómo determinar las condiciones de la centrifu ­
gación. 
Si el equipo de centrifugación no puede garantizar la eliminación de 
las partículas de más de 0,2 μm, puede utilizarse una combinación de 
centrifugación y de filtración con filtros de 0,2 μm. Estos filtros 
deben hacerse de un material inerte conveniente para evitar cualquier 
pérdida de la sustancia problema en ellos. En todo caso, debe demos ­
trarse que no se produce durante la filtración ninguna pérdida de sustancia problema.
 
1.9.2.  Etapa 1: Estudio preliminar  
La finalidad de llevar a cabo un estudio preliminar figura ya en el 
punto 1.2 «Objeto». Con el experimento sugerido más adelante se 
dan orientaciones sobre la realización de tal prueba.  
1.9.2.1.  Selección de las proporciones óptimas suelo/solución  
Se utilizan 2 tipos de suelo y 3 proporciones suelo/solución (6 
experimentos). Un tipo de suelo tendrá alto contenido de carbono orgánico y bajo contenido de arcilla; el otro, bajo contenido de carbono orgánico y alto contenido de arcilla. Se sugieren las propor ­
ciones siguientes: 
— 50 g de suelo y 50 cm
 3 de solución acuosa de la sustancia 
problema (proporción 1:1),  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g de suelo y 50 cm  3 de solución acuosa de la sustancia 
problema (proporción 1:5), 
— 2 g de suelo y 50 cm  3 de solución acuosa de la sustancia pro ­
blema (proporción 1:25). 
La cantidad mínima de suelo con la cual puede llevarse a cabo el 
experimento depende de las instalaciones del laboratorio y de las 
características de los métodos analíticos utilizados. Sin embargo, se recomienda utilizar por lo menos 1 g, y preferiblemente 2 g, para obtener resultados fiables en la prueba. 
Una muestra de control con solamente la sustancia problema en 
solución de CaCl
 2 0,01 M (sin suelo) se somete precisamente al 
mismo tratamiento que los sistemas de prueba, para comprobar la 
estabilidad de la sustancia problema en solución de CaCl  2 y su 
posible adsorción a las superficies de los recipientes del ensayo. 
Una muestra en blanco por suelo con la misma cantidad de suelo y 
el volumen total de 50 cm  3 de solución de CaCl  2 0,01 M (sin 
sustancia problema) se somete al mismo procedimiento de prueba, 
con el fin de servir de contraste durante el análisis para detectar sustancias de interferencia o suelos contaminados. 
Todos los experimentos, incluidos los controles y los blancos, deben 
llevarse a cabo al menos por duplicado. El número total de muestras que deben prepararse para el estudio puede calcularse en función de 
la metodología seguida. 
Los métodos para el estudio preliminar y el estudio principal son 
generalmente los mismos; se mencionan las excepciones en su caso. 
Las muestras de suelo secadas al aire se equilibran agitándolas con 
un volumen mínimo de 45 cm
 3 de CaCl  2 0,01 M durante una noche 
(12 horas) antes del día del experimento. Después se añade cierto volumen de la solución madre de sustancia problema para ajustar el 
volumen final a 50 cm
 3 . Este volumen añadido de la solución 
madre: a) no debe exceder del 10 % del volumen final de 50 cm  3 
de la fase acuosa para cambiar lo menos posible la naturaleza de la 
solución de preequilibrado, y b) debe suponer preferiblemente una 
concentración inicial de la sustancia problema en contacto con el 
suelo (C  o ) por lo menos dos órdenes de magnitud más alta que el 
límite de detección del método analítico; este umbral garantiza la posibilidad de llevar a cabo medidas exactas incluso en caso de 
adsorción fuerte (> 90 %) y de determinar más tarde las isotermas 
de adsorción. También se recomienda que, a ser posible, la concentración inicial de sustancia (C
 o ) no supere la mitad de su 
límite de solubilidad. 
Se da más abajo un ejemplo de cómo calcular la concentración de la 
solución madre (C  st ). Se supone un límite de detección de 0,01 
μg cm  -3 y una adsorción del 90 %; así pues, la concentración inicial 
de la sustancia problema en contacto con el suelo debe ser preferi ­
blemente 1 μg cm  -3 (dos órdenes de magnitud más alta que el límite 
de detección). Suponiendo que se añade el volumen recomendado 
máximo de la solución madre (es decir, 5 cm  3 a 45 cm  3 de solución 
de equilibrado de CaCl  2 0,01 M (= el 10 % de la solución madre 
hasta un volumen total de 50 cm  3 de fase acuosa), la concentración 
de la solución madre debe ser 10 μg cm  -3 , que es tres órdenes de 
magnitud más alta que el límite de detección del método analítico. 
El pH de la fase acuosa debe medirse antes y después del contacto 
con el suelo, puesto que desempeña un papel importante en todo el 
proceso de adsorción, especialmente en caso de sustancias ionizables.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Se agita la mezcla hasta que se alcance el equilibrio de adsorción. El 
tiempo de equilibrado de los suelos es muy variable, dependiendo de 
la sustancia química y del suelo; generalmente es suficiente un pe ­
ríodo de 24 horas (77). En el estudio preliminar pueden recogerse muestras secuencialmente durante un período de 48 horas desde la 
mezcla (por ejemplo, a las 4, 8, 24, 48 horas). Sin embargo, los 
tiempos de análisis deben considerarse con flexibilidad para tener en cuenta el horario de trabajo del laboratorio. 
Hay dos opciones para el análisis de la sustancia problema en la 
solución acuosa: a) el método paralelo, y b) el método en serie. Debe 
insistirse en que, aunque el método paralelo sea experimentalmente más pesado, el tratamiento matemático de los resultados es más simple (apéndice 5). Sin embargo, la elección de la metodología 
seguida corresponde al experimentador, que habrá de considerar las 
instalaciones y los recursos disponibles del laboratorio. 
a) Método paralelo: se preparan tantas muestras con la misma pro ­
porción de suelo/solución como intervalos de tiempo a que se 
desee estudiar la cinética de adsorción. Después de la centrifuga ­
ción y, en su caso, filtración, la fase acuosa del primer tubo se recupera lo más completamente posible y se analiza después de, 
por ejemplo, 4 horas, la del segundo tubo después de 8 horas, la 
del tercero después de 24, etc. 
b) Método en serie: se prepara solamente una muestra por duplicado 
de cada proporción suelo/solución. A los intervalos de tiempo 
definidos se centrifuga la mezcla para separar las fases. Se deter ­
mina inmediatamente la sustancia problema en una pequeña alí ­
cuota de la fase acuosa: el experimento continúa con la mezcla original. Si se aplica la filtración después de la centrifugación, el 
laboratorio debe tener instalaciones para realizar la filtración de 
pequeñas alícuotas acuosas. Se recomienda que el volumen total de las alícuotas tomadas no exceda del 1 % del volumen total de la solución, para no cambiar mucho la proporción suelo/solución 
ni disminuir la masa de soluto disponible para la adsorción du ­
rante la prueba. 
La adsorción porcentual se calcula a cada tiempo
 A t i en función de 
la concentración inicial nominal y de la concentración medida a ese 
tiempo de muestreo (t  i ), corregido para tener en cuenta el valor del 
blanco. Se realizan las gráficas de  A t i frente al tiempo (figura 1 del 
apéndice 5) para estimar la llegada a la meseta de equilibrio (  1 ). 
También se calcula el valor de K  d en el equilibrio. Tomando 
como base este valor de K  d , a partir de la figura 1 se seleccionan 
proporciones adecuadas suelo/solución, de modo que la adsorción porcentual alcance más del 20 % y, preferiblemente, > 50 % (61). 
Todas las ecuaciones y principios de gráficas aplicables figuran en el 
punto 2, de «Datos e informes», y en el apéndice 5.
 
1.9.2.2.  Determinación del tiempo de equilibrado de adsorción y de la can ­
tidad de sustancia problema adsorbida en el equilibrio  
Como ya se ha mencionado, las gráficas de  A t i o C aq ads frente al 
tiempo permiten la estimación del logro del equilibrio de adsorción y 
de la cantidad de sustancia problema adsorbida en el equilibrio. Las figuras 1 y 2 del apéndice 5 muestran ejemplos de tales gráficas. El tiempo de equilibrado es el que necesita el sistema para alcanzar una 
meseta.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) También pueden utilizarse gráficas de la concentración de la sustancia problema en la 
fase acuosa  C aq ads frente al tiempo para estimar la llegada a la meseta de equilibrio 
(véase la figura 2 del apéndice 5).
 Si, con un suelo determinado, no se llega a ninguna meseta sino que 
hay un aumento constante, puede deberse a la complicación por 
factores tales como la biodegradación o la difusión lenta. La biode ­
gradación puede comprobarse repitiendo el experimento con una muestra esterilizada del suelo. Si no se logra ninguna meseta incluso 
en este caso, el experimentador debe realizar estudios específicos 
para buscar otros fenómenos que pudieran darse: puede hacerse con modificaciones apropiadas de las condiciones del experimento (temperatura, tiempos de agitación, proporciones suelo/solución). Co ­
rresponde al experimentador decidir si continúa con el procedimiento 
de prueba a pesar de que posiblemente no se llegue a lograr el equilibrio.
 
1.9.2.3.  Adsorción en la superficie del recipiente del ensayo y estabilidad de 
la sustancia problema  
Analizando las muestras de control puede obtenerse información 
sobre la adsorción de la sustancia problema en la superficie de los recipientes del ensayo, así como sobre su estabilidad. Si se observa 
una disminución superior al error típico del método analítico, puede 
haber fenómenos de degradación abiótica o adsorción en la superfi ­
cie del recipiente del ensayo. Puede conseguirse distinguir entre estos 
dos fenómenos lavando a fondo las paredes del recipiente con un 
volumen conocido de un solvente apropiado y determinando la sus ­
tancia problema en la solución de lavado. Si no se observa ninguna adsorción en la superficie de los recipientes del ensayo, la disminu ­
ción confirma la inestabilidad abiótica de la sustancia problema. Si 
se encuentra adsorción, es necesario cambiar el material de los reci ­
pientes del ensayo. Sin embargo, los datos sobre la adsorción en la superficie de los recipientes del ensayo obtenidos de este experi ­
mento no pueden extrapolarse directamente al experimento con sue ­
lo/solución. La presencia de suelo afecta a esta adsorción. 
Puede obtenerse información adicional sobre la estabilidad de la 
sustancia problema mediante la determinación del balance de masa parental a lo largo del tiempo. Esto significa que se determina la sustancia problema en la fase acuosa, en los extractos de suelo y en 
las paredes del recipiente del ensayo. La diferencia entre la masa de 
la sustancia problema añadida y la suma de las masas de la sustancia problema en la fase acuosa, extractos de suelo y paredes de los recipientes del ensayo es igual a la masa degradada, volatilizada o 
no extraída. Para llevar a cabo una determinación del balance de 
masa, debe haberse alcanzado el equilibrio de adsorción en el tiempo que dure el experimento. 
El balance de masa se lleva a cabo en ambos suelos y con una 
proporción suelo/solución por suelo que dé una disminución por encima del 20 % (preferiblemente > 50 %) en el equilibrio. Cuando 
se termine el experimento de selección de la proporción con el 
análisis de la última muestra de la fase acuosa después de 48 horas, las fases se separan por centrifugación y, si se desea, filtración. Se recupera lo más posible de la fase acuosa, y se añade al suelo un 
solvente de extracción conveniente (coeficiente de extracción de por 
lo menos el 95 %) para extraer la sustancia problema. Se recomienda hacer por lo menos dos extracciones sucesivas. Se determina la cantidad de sustancia problema presente en los extractos de recipien ­
tes del ensayo y del suelo, y se calcula el balance de masa (ecuación 
10 en el punto 2.1.2). Si es inferior al 90 %, se considera que la sustancia problema es inestable en la escala de tiempo de la prueba. Sin embargo, los estudios podían aún continuar, teniendo en cuenta 
la inestabilidad de la sustancia problema; en este caso se recomienda 
analizar ambas fases en el estudio principal.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.3.  Etapa 2: Cinética de adsorción con una concentración de la sus ­
tancia problema  
Se utilizan 5 suelos, seleccionados a partir del cuadro 1. Es conve ­
niente la inclusión entre estos 5 suelos de algunos o de todos los 
suelos utilizados en el estudio preliminar, si procede. En tal caso, la 
etapa 2 no tiene que repetirse con los suelos utilizados en el estudio preliminar. 
El tiempo de equilibrado, la proporción suelo/solución, el peso de la 
muestra de suelo, el volumen de la fase acuosa en contacto con el 
suelo y la concentración de la sustancia problema en la solución se seleccionan basándose en los resultados del estudio preliminar. Es mejor hacer el análisis aproximadamente después de un tiempo del 
contacto de 2, 4, 6, 8 (quizás también 10) y 24 horas; el tiempo de 
agitación puede ampliarse a un máximo de 48 horas en caso de que una sustancia requiera un tiempo más largo de equilibrado según los resultados de la selección de la proporción. Sin embargo, los tiempos 
de análisis pueden considerarse con flexibilidad. 
Se hace cada experimento (un suelo y una solución) al menos por 
duplicado para poder estimar la varianza de los resultados. En cada experimento se lleva a cabo una prueba en blanco, con suelo y 
solución de CaCl
 2 0,01 M, sin sustancia problema, y con un peso 
y un volumen, respectivamente, idénticos a los del experimento. Se somete al mismo procedimiento de prueba una muestra de control con solamente la sustancia problema en solución de CaCl
 2 0,01 M 
(sin suelo) como precaución frente a fenómenos inesperados. 
La adsorción porcentual se calcula a cada tiempo  A t i o intervalo de 
tiempo  A Δt i (según sea necesario) y se representa gráficamente frente 
al tiempo. También se calcula el coeficiente de distribución K  d en el 
equilibrio, así como el coeficiente de adsorción normalizado para 
tener en cuenta el carbono orgánico K  oc (con sustancias orgánicas 
no polares). 
Resultados de la prueba de cinética de adsorción El valor lineal de K
 d es generalmente exacto para describir el com ­
portamiento respecto a la sorción en el suelo (35) (78) y refleja la 
movilidad inherente de las sustancias químicas en el suelo. Por ejemplo, en general, las sustancias con K
 d < 1 cm  3 g -1 se consideran 
cualitativamente móviles. Del mismo modo, MacCall  et al.  (16) han 
elaborado un sistema de clasificación de la movilidad basado en 
valores de K  oc (16). Además, hay sistemas de clasificación de la 
lixiviación basados en la relación entre K  oc y DT-50 (  1 ) (32) (79). 
También, según estudios de análisis de error (61), los valores de K  d 
inferiores a 0,3 cm  3 g -1 no pueden estimarse exactamente a partir de 
una disminución de la concentración en la fase acuosa, incluso cuando se aplica la proporción más favorable suelo/solución (desde el punto de vista de la exactitud), es decir, 1:1. En este caso se 
recomienda el análisis de ambas fases, suelo y solución.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: tiempo necesario para la degradación del 50 % de la sustancia problema.
 En cuanto a las observaciones mencionadas, se recomienda que el 
estudio del comportamiento de la adsorción de una sustancia química 
en el suelo y de su movilidad potencial continúe mediante la deter ­
minación de las isotermas de adsorción de Freundlich para los sis ­
temas de los cuales sea posible una determinación exacta de K  d con 
el protocolo experimental seguido en este método de ensayo. La 
determinación exacta es posible si el valor que resulta de multiplicar K
 d por la proporción suelo/solución es >, cuando las medidas se 
basan en la disminución de la concentración de la fase acuosa (mé ­
todo indirecto), o bien >, cuando se analizan ambas fases (método 
directo) (61).  
1.9.4.  Etapa 3: Isotermas de adsorción y cinética de desorción/isotermas 
de desorción  
1.9.4.1. I s o t e r m a s d e a d s o r c i ó n 
Se utilizan 5 concentraciones de sustancia problema que cubran 
preferiblemente dos órdenes de magnitud; en la selección de estas 
concentraciones deben tenerse en cuenta la hidrosolubilidad y las concentraciones acuosas resultantes en el equilibrio. Debe mante ­
nerse la misma proporción suelo/solución por suelo a lo largo del 
estudio. La prueba de adsorción se lleva a cabo según lo descrito 
anteriormente, con la única diferencia de que la fase acuosa se analiza solamente una vez, al tiempo necesario para alcanzar el equilibrio según lo determinado antes en la etapa 2. Se determinan 
las concentraciones de equilibrio en la solución y se calcula la can ­
tidad adsorbida a partir de la disminución de la sustancia problema en la solución o con el método directo. La masa adsorbida por 
unidad de masa del suelo se representa gráficamente en función de 
la concentración de la sustancia problema en el equilibrio (véase el punto 2, «Datos e informes»). 
Resultados del experimento de isotermas de adsorción Entre los modelos matemáticos de adsorción propuestos hasta ahora, 
el de las isotermas de Freundlich es el utilizado más frecuentemente para describir procesos de adsorción. En las referencias (41) (45) 
(80) (81) (82) se proporciona información más detallada sobre la 
interpretación e importancia de los modelos de adsorción. 
Nota: Debe indicarse que es posible comparar los valores de K
 F 
(coeficiente de adsorción de Freundlich) de diferentes sustancias 
solamente si estos valores de K  F se expresan en las mismas uni ­
dades (83).  
1.9.4.2. C i n é t i c a d e d e s o r c i ó n 
El propósito de este experimento es investigar si una sustancia quí ­
mica se adsorbe reversible o irreversiblemente a un suelo. Esta in ­
formación es importante, puesto que el proceso de desorción también desempeña un papel destacado en el comportamiento de las sustan ­
cias en el suelo de campo. Por otra parte, los datos de desorción son 
útiles para la modelización por ordenador de la lixiviación y la simulación del arrastre de sustancias disueltas. Si se desea hacer un estudio de desorción, se recomienda que el estudio descrito a 
continuación se lleve a cabo con cada sistema para el cual haya 
sido posible una determinación exacta de K
 d en el experimento 
anterior de cinética de adsorción. 
Análogamente al estudio de cinética de adsorción, hay dos opciones 
para proceder con el experimento de cinética de desorción: a) el método paralelo, y b) el método en serie. La selección de la meto ­
dología seguida corresponde al experimentador, que tendrá en cuenta 
las instalaciones y los recursos del laboratorio.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Método paralelo: de cada suelo seleccionado para realizar el es ­
tudio de desorción se preparan tantas muestras con la misma 
proporción suelo/solución como intervalos de tiempo a que se desee estudiar la cinética de desorción. Es preferible utilizar los mismos intervalos de tiempo que en el experimento de cinética de 
adsorción: sin embargo, el tiempo total puede ampliarse según sea 
necesario para que el sistema alcance el equilibrio de desorción. En cada experimento (un suelo, una solución) se lleva a cabo una prueba en blanco, con suelo y solución de CaCl
 2 0,01 M, sin la 
sustancia problema, y con un peso y un volumen, respectivamen ­
te, idénticos a los del experimento. Como muestra de control, la sustancia problema en solución de CaCl
 2 0,01 M (sin suelo) se 
somete al mismo procedimiento de prueba. Todas las mezclas del 
suelo con la solución se agitan basta que se alcance el equilibrio 
de adsorción (según lo determinado antes en la etapa 2). Enton ­
ces, las fases se separan por centrifugación y las fases acuosas se retiran en la mayor proporción posible. El volumen de solución 
retirado se sustituye con un volumen igual de CaCl
 2 0,01 M sin 
sustancia problema y las nuevas mezclas se agitan otra vez. La fase acuosa del primer tubo se recupera lo más completamente posible y se analiza después de, por ejemplo, 2 horas, la del 
segundo tubo después de 4 horas, la del tercero después de 6 
horas, etc., hasta que se alcance el equilibrio de desorción. 
b) Método en serie: después del experimento de cinética de adsor ­
ción, se centrifuga la mezcla y se retira lo más posible la fase acuosa. El volumen de solución retirado se sustituye con un 
volumen igual de CaCl
 2 0,01 M sin sustancia problema. La nueva 
mezcla se agita hasta que se alcance el equilibrio de desorción. Durante este período, a intervalos de tiempo definidos, se cen ­
trifuga la mezcla para separar las fases. En una pequeña alícuota 
de la fase acuosa se determina inmediatamente la sustancia pro ­
blema; el experimento continúa después con la mezcla original. El volumen de cada alícuota debe ser menos del 1 % del volumen total. Se añade a la mezcla la misma cantidad de solución de 
CaCl
 2 0,01 M para mantener la proporción suelo/solución, y 
continúa la agitación hasta el intervalo siguiente. 
La desorción porcentual se calcula a cada tiempo  ðD t i Þ o intervalo de 
tiempo ðD Δt i Þ (según las necesidades del estudio) y se representa 
frente al tiempo. También se calcula el coeficiente de desorción 
K des en el equilibrio. Todas las ecuaciones aplicables figuran en el 
punto 2, «Datos e informes», y en el apéndice 5. 
Resultados del experimento de cinética de desorción Las gráficas comunes de la desorción
 D t i y la adsorción  A t i porcen­
tuales frente al tiempo permiten valorar la reversibilidad del proceso 
de adsorción. Si el equilibrio de desorción se logra incluso dentro del 
doble del tiempo de equilibrio de adsorción, y la desorción total es de más del 75 % de la cantidad adsorbida, se considera que la adsorción es reversible.
 
1.9.4.3. I s o t e r m a s d e d e s o r c i ó n 
Las isotermas de desorción de Freundlich se determinan con los 
suelos utilizados en el experimento de las isotermas de adsorción. La prueba de desorción se lleva a cabo según lo descrito en el punto 1.9.2.5.2, «Cinética de desorción», con la única diferencia de que la 
fase acuosa se analiza solamente una vez, en el equilibrio de desor ­
ción. Se calcula la cantidad de sustancia problema desorbida. El contenido de sustancia problema que permanece adsorbida al suelo en el equilibrio de desorción se representa en función de la concen ­
tración de equilibrio de la sustancia problema en la solución (véase a 
continuación «Datos e informes» y el apéndice 5).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. DATOS E INFORMES  
Los datos analíticos se presentan en forma de cuadro (véase el 
apéndice 6). Se dan las medidas y las medias calculadas. Se propor ­
cionan las representaciones gráficas de las isotermas de adsorción. Se 
hacen los cálculos según lo descrito más adelante. 
Para la prueba, se considera que el peso de 1 cm  3 de solución acuosa 
es 1 g. La proporción suelo/solución puede expresarse en unidades 
de peso/peso o de peso/volumen con la misma cifra.  
2.1. ADSORCIÓN 
La adsorción  A t i se define como el porcentaje de sustancia adsorbida 
en el suelo en relación con la cantidad presente al principio de la 
prueba, en las condiciones de prueba. Si la sustancia problema es estable y no se adsorbe significativamente a la pared del recipiente,
 
A t i se calcula a cada tiempo t  i , según la ecuación:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ·100 
m 0 ð%Þ (3) 
donde:  
A t i = adsorción porcentual al tiempo t  i ( %),  
m ads 
s ðt i Þ = masa de la sustancia problema adsorbida en el suelo al 
tiempo t  i (μg), 
m 0 = masa de la sustancia problema en el tubo de ensayo, al 
principio de la prueba ( μg). 
En el apéndice 5 figura información detallada sobre el cálculo de la 
adsorción porcentual  A t i con los métodos paralelo y en serie. 
El coeficiente de distribución K  d es la proporción entre el contenido 
de sustancia en la fase edáfica y la concentración en masa de la 
sustancia en la solución acuosa, en las condiciones de prueba, cuando se alcanza el equilibrio de adsorción:
 
K d ¼ C ads 
s ðeqÞ 
C ads 
aq ðeqÞ ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m ads aq ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
donde:  
C ads 
s ðeqÞ = contenido de la sustancia adsorbida en el suelo en el 
equilibrio de adsorción ( μg g  -1 ), 
C ads 
aq ðeqÞ = concentración en masa de la sustancia en la fase acuosa 
en el equilibrio de adsorción ( μg cm  -3 ); esta concentra ­
ción se determina analíticamente teniendo en cuenta los valores obtenidos en las pruebas en blanco,
 
m ads 
s ðeqÞ = masa de la sustancia adsorbida en el suelo en el equili ­
brio de adsorción ( μg), 
m ads 
aq ðeqÞ = masa de la sustancia en la solución en el equilibrio de 
adsorción ( μg), 
m soil = cantidad de la fase edáfica, expresada en masa seca de 
suelo (g), 
V o = volumen inicial de la fase acuosa en contacto con el 
suelo (cm  3 ). 
La relación entre A  eq y K  d se da en la ecuación siguiente:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
donde: 
A eq = adsorción porcentual en el equilibrio de adsorción ( %). 
El coeficiente de adsorción normalizado para tener en cuenta el 
carbono orgánico K  oc relaciona el coeficiente de distribución K  d 
con el contenido de carbono orgánico de la muestra de suelo:  
K oc ¼ K d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
donde: 
% OC = porcentaje de carbono orgánico en la muestra de suelo 
(g g  -1 ). 
El coeficiente K  oc representa un solo valor que caracteriza el reparto 
principalmente de las sustancias orgánicas no polares entre el car ­
bono orgánico del suelo o sedimento y el agua. La adsorción de estas sustancias está correlacionada con el contenido orgánico del sólido 
de sorción (7): así pues, los valores de K
 oc dependen de las carac ­
terísticas específicas de las fracciones húmicas que difieren conside ­
rablemente en su capacidad de sorción, debido a diferencias de ori ­
gen, génesis, etc.  
2.1.1.  Isotermas de adsorción  
La ecuación de las isotermas de adsorción de Freundlich relaciona la 
cantidad de sustancia problema adsorbida con la concentración de sustancia problema en la solución en el equilibrio (ecuación 8). 
Los datos se tratan como en el punto 2.1, «Adsorción», y, de cada 
tubo de ensayo, se calcula el contenido de sustancia problema ad ­
sorbida en el suelo después de la prueba de adsorción [
C s ads ðeqÞ, en 
otras partes expresado como x/m]. Se acepta que se ha logrado el 
equilibrio y que  C ads 
s ðeqÞ representa el valor de equilibrio:  
C ads 
s ðeqÞ ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m soil ¼ h 
C 0 Ä C ads 
aq ðeqÞ i
:V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
La ecuación de adsorción de Freundlich es la siguiente (8):  
C ads 
s ðeqÞ ¼ K ads 
F:C ads 
aq ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
o, en forma lineal:  
logC  ads 
s ðeqÞ ¼ logK  ads 
F þ 1=n·logC  ads 
aq ðeqÞ (9) 
donde:  
K ads 
F = coeficiente de adsorción de Freundlich: su dimensión 
es cm  3 g -1 solo si l/n = 1; en los demás casos, se introduce 
la pendiente 1/n en la dimensión ce  K ads 
F (μg 1-l/n (cm  3 ) l/n g -1 ) 
n = constante de regresión: l/n generalmente oscila entre 0,7 y 
1,0, indicando que los datos de sorción suelen ser ligera ­
mente no lineales. 
Se representan gráficamente las ecuaciones (8) y (9) y se calculan los 
valores de  K F ads y 1/n por análisis de regresión utilizando la ecua ­
ción 9. También se calcula el coeficiente de correlación r  2 de la 
ecuación logarítmica. En la figura 2 se da un ejemplo de tales 
representaciones:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Figura 2.  Representación de la adsorción de Freundlich, normal y 
linealizada  
2.1.2.  Balance de masa  
El balance de masa (MB) se define como el porcentaje de sustancia 
que puede recuperarse analíticamente después de una prueba de adsorción respecto a la cantidad nominal de sustancia presente al 
principio de la prueba. 
El tratamiento de los datos será diferente si el solvente es comple ­
tamente miscible con agua. En caso de un solvente miscible con agua, el tratamiento de los datos descrito en el punto 2.2, «Desor ­
ción» puede aplicarse para determinar la cantidad de sustancia recu ­
perada por la extracción con el solvente. Si el solvente es menos miscible con agua, hay que hacer la determinación de la cantidad recuperada. 
El balance de masa MB de la adsorción se calcula del siguiente 
modo; se supone que el término m
 E corresponde a la suma de las 
masas de la sustancia problema extraídas del suelo y de la superficie del recipiente del ensayo con un solvente orgánico:
 
MB ¼ Ê 
V rec · C ads 
aq ðeqÞ þ m E Ì 
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
donde: 
MB = balance de masa ( %) m
 E = masa total de la sustancia problema extraída del suelo y de 
las paredes del recipiente del ensayo en dos fases ( μg), 
C o = concentración inicial en masa de la solución problema en 
contacto con el suelo ( μg cm  -3 ), 
V rec = volumen de sobrenadante recuperado después del equili ­
brio de adsorción (cm  -3 ). 
2.2. DESORCIÓN 
La desorción (D) se define como el porcentaje de sustancia problema 
que se desorbe, en relación con la cantidad de sustancia adsorbida 
previamente, en las condiciones de prueba:  
D t i ¼ m des 
aq ðt i Þ 
m ads s ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
donde:  
D t i = desorción porcentual a un tiempo t  i ( %),  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m des 
aq ðt i Þ = masa de la sustancia problema desorbida del suelo a 
un tiempo t  i (μg), 
m ads 
s ðeqÞ = masa de la sustancia problema adsorbida en el suelo en 
el equilibrio de adsorción ( μg). 
En el apéndice 5 figura información detallada sobre cómo calcular la 
desorción porcentual  D 
t i con los métodos paralelo y en serie. 
El coeficiente de desorción aparente (K  des ) es, en las condiciones de 
prueba, la proporción entre el contenido de sustancia que permanece 
en la fase edáfica y la concentración en masa de la sustancia desor ­
bida en la solución acuosa, cuando se alcanza el equilibrio de de ­
sorción:  
K des ¼ m ads 
s ðeqÞ Ä m des 
aq ðeqÞ 
m des 
aq ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
donde: 
K des = coeficiente de desorción (cm  3 g -1 ), 
m des 
aq ðeqÞ = masa total de la sustancia problema desorbida del 
suelo en el equilibrio de desorción ( μg), 
V T = volumen total de la fase acuosa en contacto con el suelo 
durante la prueba de cinética de desorción (cm  3 ). 
En el apéndice 5, en la sección «Desorción», figuran directrices para 
calculan  m des 
aq ðeqÞ 
Observación Si la prueba de adsorción precedente se ha llevado a cabo con el 
método paralelo, se considera que el volumen V
 T de la ecuación 12 
es igual a V  o . 
2.2.1.  Isotermas de desorción  
La ecuación de isotermas de desorción de Freundlich relaciona el 
contenido de la sustancia problema que permanece adsorbida en el 
suelo con la concentración de la sustancia problema en la solución 
en el equilibrio de desorción (ecuación 16). 
Para cada tubo de prueba, el contenido de sustancia que permanece 
adsorbida en el suelo en el equilibrio de desorción se calcula del modo siguiente:
 
C des 
s ðeqÞ ¼ m ads 
s ðeqÞ Ä m des 
aq ðeqÞ 
m soil (μg g -1 ) (13) 
m des 
aq ðeqÞ se define como:  
m des 
aq ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ · V 0 
V r F Ä m aq A (μg) (14) 
donde:  
C des 
s ðeqÞ = contenido de la sustancia problema que permanece 
adsorbida en el suelo en el equilibrio de desorción 
(μg g  -1 ), 
m m des ðeqÞ = masa de la sustancia determinada analíticamente en la 
fase acuosa en el equilibrio de desorción ( μg), ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = masa de la sustancia problema que queda en solución 
después de alcanzado el equilibrio de adsorción de ­
bido a la sustitución incompleta del volumen ( μg), 
m des 
aq ðeqÞ = masa de la sustancia en la solución en el equilibrio de 
adsorción ( μg); 
m aq A ¼ m ads 
aq ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(15) 
V r F = volumen de solución tomada del tubo para la medida de la 
sustancia problema, en el equilibrio de desorción (cm  3 ), 
V R = volumen del sobrenadante retirado del tubo después de al ­
canzar el equilibrio de adsorción y sustituido por el mismo volumen de solución de CaCl
 2 0,01 M (cm  3 ). 
A continuación se muestra la ecuación de desorción de Freundlich:  
C des 
s ðeqÞ ¼ K F des ·C des 
aq ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
o, en forma lineal:  
logC  des 
s ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n·logC  des 
aq ðeqÞ (17) 
donde:  
K F des = coeficiente de desorción de Freundlich, 
n = constante de regresión,  
C des 
aq ðeqÞ = concentración en masa en la sustancia en la fase 
acuosa en el equilibrio de desorción ( μg cm  -3 ). 
Las ecuaciones 16 y 17 pueden representarse gráficamente y el valor 
de K F des y el de 1/n se calculan por análisis de regresión utilizando 
la ecuación 17. 
Observación Si el exponente l/n de adsorción o desorción de Freundlich es igual a 
1, la constante de enlace de adsorción o desorción de Freundlich (
K ads 
F y K F des ) será respectivamente igual a la constante de equilibrio 
de adsorción o desorción (K  d y K  des ), y las gráficas de C  s frente a 
C aq serán lineales. Si los exponentes no son iguales a 1, las gráficas 
de C  s frente a C  aq no serán lineales y las constantes de adsorción y 
desorción variarán a lo largo de las isotermas.  
2.2.2.  Informe de la prueba  
El informe de la prueba debe incluir la información siguiente: 
— identificación completa de las muestras de suelo utilizadas, in ­
cluyendo: 
— referencia geográfica del sitio (latitud, longitud), 
— fecha del muestreo,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— tipo de uso (por ejemplo, suelo agrícola, bosque, etc.), 
— profundidad del muestreo, — contenido de arena/limo/arcilla, — valores de pH (en CaCl
 2 0,01 M), 
— contenido de carbono orgánico, 
— contenido de materia orgánica, — contenido de nitrógeno, — proporción C/N, 
— capacidad de intercambio canónico (mmol/kg), 
— toda la información relativa a la recogida y conservación de las 
muestras de suelo, 
— en su caso, toda información pertinente para la interpretación de 
la adsorción/desorción de la sustancia problema, 
— referencia de los métodos utilizados para la determinación de 
cada parámetro; 
— información sobre la sustancia problema según el caso; — temperatura de los experimentos; — condiciones de centrifugación; 
— procedimiento analítico utilizado para analizar la sustancia pro ­
blema; 
— justificación del uso eventual de agentes de solubilización para la 
preparación de la solución madre de la sustancia problema; 
— explicación de las correcciones hechas en los cálculos, en su 
caso; 
— datos según las fichas (apéndice 6) y representaciones gráficas; 
— toda la información y observaciones útiles para la interpretación 
de los resultados de la prueba.
 
3. REFERENCIAS  
(1) Kukowski H. and Brummer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02045, Part II. 
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L, (1987). Selection of Re ­
presentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, 
Part I. 
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication no. 
1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994. 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18- 20 January 1995 (June 1995). 
(5) US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N., Chemistry; Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting. 540/09-SS-096, Date: 1/1988.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances. OPPTS Harmonized Test Guidelines. Series 
835-Fate, Transpon and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorp ­
tion Isotherm. EPA No: 71 2-C-96-048. April 1996. 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for De ­
termining a Sorption Constant (K
 oc ) for an Organic Chemical 
in Soil and Sediments. 
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Gui ­
delines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987. 
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dan ­
gerous to health or especially harmful to the environment. 
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Pro ­
tection Products, Biological Research Centre for Agriculture 
and Forestry, Braunschweig, Germany. 
(12) Calvet R., (1989), 'Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticidas in soils', in Met ­
hodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in 
Soil (ed. P. Jamet), INRA, París, (Review). 
(13) Calvet R., (1980) 'Adsorption-Desorption Phenomena' in Inte ­
ractions between herbicides and the soil. (R.J. Hance ed.), 
Academic Press, London, pp. 83-122. 
(14) Hasset J.J., and Banwart W.L. (1989), The sorption of nonpo ­
lar organics by soils and sediments' in Reactions and Move ­
ment of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of 
America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp 31-44. 
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., 
(1974), 'An evaluation of kinetic and equilibrium equations 
for the prediction of pesticide movement through porous me ­
dia'. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), 29-35. 
(16) McCall P.J., Laskowski D.A. Swann R.I., and Dishburger H.J., 
(1981), 'Measurement of sorption coefficients of organic che ­
micals and their use, in environmental fate analysis', in Test 
Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC. 
(17) Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965), 
'Movement and sorption of chemicals applied to the soil'. 
Weeds, 13, 185-190. 
(18) Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) 'Determina ­
tion of mobility and adsorption of agrochemicals in soils'. 
J.Agric.Food Chem., 18, 524-528. 
(19) Russell M.H., (1995), 'Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil' in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John Wiley & 
Sons Ltd. 
(20) Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.R., Vonk 
J.W. and Holland P.T., (1988), 'Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides', 
IUPAC Reports on Pesticidas (24). Pure Appl. Chem., 60, 
901-932.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), 'Experimen ­
tal models for studying the persistence of pesticides in soils'. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Her ­
bicides, pp 137-157, BCPC, Surrey, UK. 
(22) Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967), 'Persistence of 
herbicides in soil'. J. Sci. Fd Agric, 18, 269-273. 
(23) Burkhard N., and Guth J.A., (1981). 'Chemical hydrolysis of 2- 
Chloro-4,6-bis(aikylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption'. Pestic. 
Sci. 12, 45-52. 
(24) Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977). 'Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avai ­
lability of soil-applied pesticides'. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, 961-971. 
(25) Osgerby J.M., (1973), 'Process affecting herbicide action in 
soil'. Pestic. Sci., 4, 247-258. 
(26) Guth J.A., (1972), 'Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden'. Schr. Reihe Ver. Wass.-Bo ­
den-Lufthyg. Berlm-Dahlem, Heft 37, 143-154. 
(27) Hamaker J.W., 1975), The interpretation of soil leaching ex ­
periments', in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Flaque and V.H. freed). pp. 1 3 5-172, Plenum Press, NY. 
(28) Helling C.S., (1971). 'Pesticide mobility in soils'. Soil Sci. Soc. 
Amer. Proc. 35, 732-210. 
(29) Hamaker J.W., (1972), 'Diffusion and volatilization' in Organic 
chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J.W. 
Hamaker eds), Vol. I, 49-143. 
(30) Burkhard N. and Guth J.A., (1981), 'Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system'. Pestic. Sci. 12, 37-44. 
(31) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), 'Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses', in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC. 
(32) Gustafson D.I., (1989), 'Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability'. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4). 339-357. 
(33) Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). 'Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils'. J. of Soil 
Sci., 28, 340-350. 
(34) Bromilov R.H., and Leistra M. (1980), 'Measured and simula ­
ted behavior of aldicarb and its oxydation producís in fallow soils'. Pest. Sci., 11, 389-395. 
(35) Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), 'Sorption estimates 
for modeling', in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80-101. 
(36) Lambert S.M., (1967), 'Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure'. J. Agri. Food Chem., 15, 
572-576.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R.J., (1969), 'An empirical relationship between chemi ­
cal structure and the sorption of some herbicides by soils'. J. 
Agri. Food Chem., 17, 667-668. 
(38) Briggs G.G. (1969), 'Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils'. Nature, 223, 1288. 
(39) Briggs G.G. (1981). 'Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coeffícients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor'. J. Agric. Food Chem., 29, 1050-1059. 
(40) Sabljic A., (1984), 'Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology'. J. 
Agrie. Food Chem., 32, 243-246. 
(41) Bailey G.W., and White J.L., (1970), 'Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil'. Residue Rev., 32, 29-92. 
(42) Bailey G.W., J.L. White and Y. Rothberg. (1968), 'Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate'. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32:222-234. 
(43) Karickhoff S.W., (1981) 'Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils'. Che ­
mosphere 10, 83 3-846. 
(44) Paya-Pérez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), 'Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners'. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, 1-17. 
(45) Hamaker J.W., and Thompson J.M, (1972). 'Adsorption in 
organic cbemicals' in Organic Chemicals ir. the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York. NY, 1972, pp. 49-143. 
(46) Deli J., and Warren G.F., 1971, 'Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils'. Weed Sci. 19:67-69. 
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M, and Santelmann, 
(1975), 'Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils'. Weed Science, Vol. 23, 454-457. 
(48) Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) 'Ad ­
sorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations' in 
Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, Interna ­
tional. Atomic Energy Agency, Vienna. 
(49) Pionke H.B., and Deangelis R.J. (1980), 'Methods for distribu ­
ting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase', CREAMS. in A Field Scale Model for Che ­
micals, Run-off and Erosión from Agricultural Management 
Systems, Chapter 19. Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report. 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality — Ge ­
neral aspeets; chemical and physical methods of analysis; bio ­
logical methods of analysis. First Edition (1994). 
(51) Scheffer F. and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F., 
Enke Verlag. Stuttgart (1982), 11 th edition. 
(52) Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark 
F.E., eds. «Methods of Soil Analysis», Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality — Sampling — Part 1: Gui ­
dance on the design of sampling programmes. 
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality — Sampling — Part 2: Gui ­
dance on sampling techniques. 
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality — Sampling — Part 3: Gui ­
dance on safety of sampling. 
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality — Sampling — Part 4: Gui ­
dance on the investigation of natural and cultivated soils. 
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality — Sampling — Part 5: Gui ­
dance on the investigation of soil contamination of urban and 
industrial sites. 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality — Sampling — Part 6: Gui ­
dance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(59) Green R.E., and Yamane V.K., (1970) «Precision in pesticide 
adsorption measurements». Soil Sci. Am. Proc, 34, 353-354. 
(60) Grover R., and Hance R.J. (1970), «Effect of ratio of 
soil to water on adsorption of linuron and atrazine». Soil Sci., 109-138. 
(61) Boesten, J.J.T.I, 'Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system'. 
Pest. Sci. 1990, 30, 31-41. 
(62) Boesten, J.J.T.I. «Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD gui ­
deline 106» Proceedings of 5th international workshop on en ­
vironmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, 
Bmssels, 26-29 April 1994. 
(63) Bastide J., Cantier J.M., et Coste C, (1980), «Comportement 
de substances herbicides dans le sol en fonction de leur struc ­
ture chimique». Weed Res. 21, 227-231. 
(64) Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), «Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments»). Envi ­
ron.Qual., 10(3), 382-386. 
(65) Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), 
«Partition equilibria of non-ionic organic compounds bet ­
ween soil organic matter and water». Environ. Sci. Te ­
chnol., 17(4), 227-231. 
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), 'Sorption of organic 
substances by soils and sediments'. J. Environm. Sci. Health, 
B19 (3), 297-312. 
(67) Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), 'Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons'. Chemosphere, 16(1), 109-116. 
(68) Lyman W.J., Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods. Environmen ­
tal Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC. 
(69) Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980). «Relationship between 
water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and 
concentration of chemicals in the biota» in Aquatic Toxicology 
(eds J.G. Eaton, et al.), pp.78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979), «A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic com ­
pounds». Science, Vol. 206, 831-832. 
(71) Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., 
(1981). 'Sorption of/-Naphtol: implications concerning the li ­
mits of hydrophobic sorption'. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 38-42. 
(72) Karickhoff S.W., (1981), «Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils». 
Chemosphere, Vol. 10(8), 8 3 3-846. 
(73) Moreale A., van Bladel R.. (1981), 'Adsorption de 13 herbici ­
des et insecticides par le sol. Relation solubilité — reactivité. 
Revue de l'Agric. 34 (4), 319-322'. 
(74) Müller M., Kördel W. (1996), «Comparison of screening met ­
hods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil». Chemosphere. 32(12), 2493-2504. 
(75) Kördel \V., Kotthoff G.. Müller M. (1995), 'HPLC — scree ­
ning method for the determination of the adsorption coeffi ­
cient on soil — results of a ring test'. Chemosphere 30 (7), 1373-1 3S4. 
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), 'HPLC — screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil — comparison of different stationary phases'. Chemos ­
phere 27 (12), pp. 2341-2352. 
(77) Hance, R.J., (1967), 'The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides'. Weed Re ­
search, Vol. 7, pp. 29-36. 
(78) Koskinen W.C., and Harper S S., (1990), 'The retention pro ­
cesses: mechanisms' in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin. 
(79) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G. 
(1984), 'Potential pesticide contamination of groundwater 
from agricultural uses', in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC. 
(80) Giles C.H., (1970), 'Interpretation and use of sorption isot ­
herms' in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14-32. 
(81) Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, 
(1960), 'Studies in adsorption: XI, A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of 
adsorption mechanisms and in measurements of pesticides sur ­
face areas of soils'. J. Chem. Soc, pp. 3973-93. 
(82) Calvet R., Tercé M, and Arvien J.C., (1980), 'Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de l'adsorption'. Ann. Agron. 31: pp. 239-251. 
(83) Bedbur E., (1996), 'Anomalies in the Freundlich equation', 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK. 
(84) Guth, J.A., (1985), 'Adsorption/desorption', in Joint Internatio ­
nal Symposium, Physicochemical Properties and their Role in 
Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK. 
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 3 3, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
Apéndice 1  
Esquema de la prueba
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
Apéndice 2  
INFLUENCIA DE LA EXACTITUD DEL MÉTODO ANALÍTICO Y DEL 
CAMBIO DE CONCENTRACIÓN SOBRE LA EXACTITUD DE LOS 
RESULTADOS DE LA ADSORCIÓN  
A partir del cuadro siguiente (84), se ve que, cuando la diferencia entre la masa 
inicial (m  0 = 110 μg) y la masa en el equilibrio [ m ads 
aq ðeqÞ = 100 μg] de la sustancia 
problema en la solución es muy pequeña, un error del 5 % en la medida de la concentración en el equilibrio origina un error del 50 % en el cálculo de la masa de la sustancia adsorbida en el suelo [
m ads 
s ðeqÞ] y del 52,4 % en el cálculo de K  d . 
Cantidad de suelo m  soil = 10 g 
Volumen de solución V  o = 100 cm  3 
m ads 
aq ðeqÞ 
(μg) C ads 
aq ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m ads 
s ðeqÞä 
(μg) C ads 
s ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R t K d * R  t 
PARA A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg o 
Co ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 Valor 
verd. 10 1,00 Valor 
verd. 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
PARA A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg o 
C o ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 Valor 
verd. 60,0 6,00 Valor 
verd. 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 
55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
PARA A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg o 
Cn ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 Valor 
verd. 108,9 10,89 Valor 
verd. 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 % 
donde: 
äm ads 
s ðeqÞ = m 0 Ä m ads 
aq ðeqÞ; C ads 
s ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C ads 
aq ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m ads aq ðeqÞ V 0 
m soil 
m ads 
s ðeqÞ = masa de la sustancia problema en la fase edáfica en el equilibrio ( μg), 
m ads 
aq ðeqÞ = masa de la sustancia problema en la fase acuosa en el equilibrio ( μg), 
C ads 
s ðeqÞ = contenido de la sustancia problema en la fase edáfica en el equilibrio ( μg g-  1 ), 
C ads 
aq ðeqÞ = concentración en masa de la sustancia problema en la fase acuosa en el equilibrio ( μg cm-  3 ), 
R = error analítico en la determinación de  m ads 
aq ðeqÞ, 
R: = error calculado debido al error analítico R.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
Apéndice 3  
TÉCNICAS DE ESTIMACIÓN DE K  d 
1. Las técnicas de estimación permiten dar un valor de K  d a partir de corre ­
laciones observadas con, por ejemplo, valores de P  OW (12) (39) (63) (64) 
(65) (66) (67) (68), datos de hidrosolubilidad (12) (19) (21) (39) (68) (69) 
(70) (71) (72) (73), o datos de polaridad obtenidos por aplicación de HPLC 
en fase inversa (74) (75) (76). Como se muestra en los cuadros 1 y 2, a partir de estas ecuaciones se calcula K
 oc o K  om y después, indirectamente, 
se obtiene K  d con las ecuaciones:  
K oc ¼ K d · 100 
% oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
% oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Estas correlaciones se basan en dos suposiciones: 1) la materia orgánica del 
suelo es el factor que más influye en la adsorción de una sustancia, y 2) las 
interacciones implicadas son principalmente no polares. En consecuencia, estas correlaciones: 1) no son aplicables a las sustancias polares (o solo lo son de forma limitada), y 2) no son aplicables a los casos en que el 
contenido de materia orgánica del suelo es muy pequeño (12). Por otra 
parte, aunque se han encontrado correlaciones satisfactorias entre P
 ow y 
adsorción (19), no puede decirse lo mismo de la relación entre hidrosolu ­
bilidad y grado de adsorción (19) (21): en este sentido, los estudios son 
muy contradictorios. 
3. En los cuadros 1 y 2 se dan ejemplos de correlaciones del coeficiente de 
adsorción con el coeficiente de reparto octanol-agua y con la hidrosolubi ­
lidad, respectivamente.  
Cuadro 1  
Ejemplos de correlaciones entre el coeficiente de distribución de la adsorción y el coeficiente de reparto 
octanol-agua; pueden verse más ejemplos en (12) (68)  
Sustancias Correlaciones Autores  
Ureas sustituidas log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Aromáticas cloradas log K  oc - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (1983) (65) 
Diversos plaguicidas log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl y Mingelgrin (1984) (66) 
Hidrocarburos aromáticos log K  oc = -2,53 + 1,15 log P  ow Vowles y Mantoura (1987) (67)  
Cuadro 2  
Ejemplos de correlaciones entre el coeficiente de distribución de la adsorción y la hidrosolubilidad; pueden 
verse más ejemplos en (68) (69)  
Sustancias Correlaciones Autores  
Diversos plaguicidas log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl y Mingelgrin (1984) (66) 
Sustancias cloradas aromáti ­
cas, alifáticas log K  om = (4,040 +/- 0,038) - (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
a-naftol logK  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Sustancias aromáticas alifáti ­
cas, cíclicas logK  oc = -1,405 - 0,921 log S  w 
-0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Diversos compuestos log K  om = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
Apéndice 4  
CÁLCULOS PARA DEFINIR LAS CONDICIONES DE LA 
CENTRIFUGACIÓN  
1. El tiempo de centrifugación viene dado por la siguiente fórmula, supo ­
niendo partículas esféricas:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Con fines de simplificación, todos los parámetros se dan en unidades ajenas 
al SI (g, cm), 
donde: 
(i) = velocidad de giro (=2 Π rpm/60) (rad s  -1 ), 
rpm = revoluciones por minuto, η = viscosidad de la solución (g s
 -1 cm -1 ), 
r p = radio de las partículas (cm), 
p s = densidad del suelo (g cm  -3 ), 
ρ aq = densidad de la solución (g cm  -3 ), 
R t = distancia desde el centro del rotor de centrifugación hasta el nivel 
de la solución en el tubo de centrífuga (cm), 
R b = distancia desde el centro del rotor de centrifugación hasta el 
fondo del tubo de centrífuga (cm), 
R b -R t = longitud de la mezcla suelo/solución en el tubo de centrífuga (cm). 
En la práctica general, se utiliza un tiempo doble del calculado para con ­
seguir una separación completa. 
2. La ecuación (1) puede simplificarse más si consideramos que la viscosidad 
(η) y la densidad ( ρ aq ) de la solución son iguales a la viscosidad y la 
densidad del agua a 25  o C: por tanto, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 and ρ aq 
= 1,0 g, cm  -3 . 
Entonces, el tiempo de centrifugación se obtiene con la ecuación 2):  
t ¼ 3; 7 
ðrpmÞ 2 · r p 2 ðρ s Ä 1Þ ln Rb 
Rt (2) 
3. En la ecuación 2 se ve que hay dos parámetros importantes para definir las 
condiciones de la centrifugación, es decir, el tiempo (t) y la velocidad (rpm) 
necesarios para conseguir la separación de las partículas de un tamaño deter ­
minado (en nuestro caso, de 0,1 μm de radio): 1) la densidad del suelo, y 2) la 
altura de la mezcla en el tubo de centrífuga (R  b -R t ), es decir, la distancia que 
recorre una partícula de suelo desde el nivel superior de la solución hasta el 
fondo del tubo: evidentemente, con un volumen determinado, la altura de la mezcla en el tubo dependerá del cuadrado del radio del tubo. 
4. La figura 1 presenta las variaciones del tiempo de centrifugación (1) frente a la 
velocidad de centrifugación (rpm) con diferentes densidades de suelo ( ρ
 s ) 
(figura 1a) y diferentes alturas de la mezcla en los tubos de centrífuga (figura 
2a). En la figgura 1a queda de manifiesto la influencia de la densidad del 
suelo: por ejemplo, con una centrifugación clásica de 3 000 rpm el tiempo de centrifugación es de aproximadamente 240 minutos para una densidad de suelo de 1,2 g cm
 -3 , mientras que es de solo 50 minutos para 2,0 g cm  -3 . 
Análogamente, según la figura 1b, con una centrifugación clásica de 3 000 
rpm el tiempo de centrifugación es de aproximadamente 50 minutos para una altura de la mezcla de 10 cm y de solo 7 minutos para una altura de 1 cm. No obstante, es importante encontrar la relación óptima entre la centrifugación 
que requiera la menor altura posible y una manipulación fácil para el experi ­
mentador al separar las fases tras la centrifugación.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Por otra parte, al definir las condiciones experimentales para la separación 
de las fases suelo/solución, es importante considerar la posible existencia de 
una tercera «pseudofase», los coloides. Estas partículas, de tamaño inferior a 0,2 μm, pueden afectar considerablemente a todo el mecanismo de la 
adsorción de una sustancia en una suspensión de suelo. Cuando se realiza 
la centrifugación según se describe anteriormente, los coloides se quedan en 
la fase acuosa y se someten a análisis junto con la fase acuosa, con lo que se pierde la información sobre su influencia. 
Si el laboratorio donde se realiza la prueba tiene equipos de ultracentrifu ­
gación o ultrafiltración, es posible estudiar con mayor profundidad la ad ­
sorción/desorción de una sustancia en el suelo, con información sobre la 
adsorción de la sustancia en los coloides. En este caso, para separar las 3 fases (suelo, coloides, solución) debe realizarse una ultracentrifugación a 60 000 rpm/minuto o una ultrafiltración con una porosidad de 100 000 
Dalton. También hay que modificar en consonancia el protocolo del ensa ­
yo, a fin de determinar la sustancia en las 3 fases.
 
Figura 1a.
  
Variaciones del tiempo de centrifugación (t) frente a la velocidad de cen ­
trifugación (rpm) con diferentes densidades de suelo ( ρ s ). R  t = 10 cm; R  b - 
R t = 10 cm; η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 and ρ aq = 1,0 g cm  -3 at 25  o C 
Figura 1b.
  
Variaciones del tiempo de centrifugación (t) frente a la velocidad de centri ­
fugación (rpm) con diferentes alturas de la mezcla en el tubo de centrífuga (R
 D -R t ) = L; R  t = 10 cm; η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 ; ρ aq = 1,0 g cm  -3 a 25  o C y 
ρ 5 = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
Apéndice 5  
CÁLCULO DE LA ADSORCIÓN A (%) Y DE LA DESORCIÓN D (%)  
El esquema temporal del procedimiento es el siguiente:
  
A efectos de los cálculos, se supone que la sustancia problema es estable y no se 
adsorbe de forma importante a las paredes del recipiente.  
ADSORCIÓN A (A%)  
a) Método paralelo  
La adsorción porcentual se calcula con cada tubo de ensayo (i) a cada 
tiempo (t  i ), según la ecuación:  
A t i ¼ m ads 
s ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Los términos de esta ecuación pueden calcularse de la forma siguiente: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m ads 
s ðt i Þ ¼ m 0 Ä C ads 
aq ðt i Þ V 0 (μg) (3) 
donde:  
A t i = adsorción porcentual ( %) al tiempo t  i , 
m ads 
s ðt i Þ = masa de la sustancia problema en el suelo al tiempo t  i en que 
se realiza el análisis ( μg), 
m 0 = masa de la sustancia problema en el tubo de ensayo, al inicio 
de la prueba ( μg), 
C 0 = concentración inicial en masa de la solución problema en 
contacto con el suelo ( μg cm  -3 ), ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C ads 
aq ðt i Þ = concentración en masa de la sustancia en la fase acuosa al 
tiempo t  i en que se realiza el análisis ( μg cm  -3 ); esta concen ­
tración se determina analíticamente teniendo en cuenta los valores obtenidos en la prueba en blanco, 
V
 0 = volumen inicial de la solución problema en contacto con el 
suelo (cm  3 ). 
Los valores de la adsorción porcentual  A t i o C ads 
aq ðt i Þ se representan gráfi ­
camente frente al tiempo y se determina el tiempo al que se alcanza el 
equilibrio de sorción. En las figuras 1 y 2 se recogen ejemplos de tales gráficas.
 
Figura 1.  
Gráfica de equilibrio de adsorción
  
Figura. 2.  
Concentración en masa dela sustancia problema en la dase acuosa (C  aq ) frente al tiempo  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Método en serie  
Las siguientes ecuaciones tienen en cuenta que el procedimiento de adsor ­
ción se sigue con mediciones de la sustancia problema en pequeñas alí ­
cuotas de la fase acuosa a intervalos de tiempo especificados. 
— Durante cada intervalo de tiempo, la cantidad de sustancia adsorbida en 
el suelo se calcula de la manera siguiente: 
— para el primer intervalo de tiempo Δt 1 = t 1 - t 0 
m ads 
s ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m ads 
m ðt 1 Þ · V 0 
v A a Í Î  (4) 
— para el segundo intervalo de tiempo Δt2 = t2 - t1  
m ads 
s ðΔt 2 Þ ¼ m ads 
m ðt 1 Þ · V 0 
v A a Í Î 
Ä m ads 
m ðt 2 Þ · V 0 Ä v A 
a 
v A a Í Î  (5) 
— para el tercer intervalo de tiempo Δt3 = t3-t2  
m ads 
s ðΔt 3 Þ ¼ m ads 
m ðt 2 Þ· V 0 Ä v A 
a 
v A a Í Î 
Ä m ads 
m ðt 3 Þ· V 0 Ä 2·v A 
a 
v A a Í Î  (6) 
— para el enésimo intervalo de tiempo Δtn = tn - tn-1  
m ads 
s ðΔt n Þ ¼ m ads 
m ðt nÄ1 Þ · V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v A 
a 
v A a Í Î  
Ä m ads 
m ðt n Þ · ðV 0 Ä ðn Ä 1Þ · v A 
a Þ 
v A a Í Î  (7) 
— El porcentaje de adsorción a cada intervalo de tiempo;  A Δt i , se calcula 
con la ecuación siguiente:  
A Δt i ¼ m ads 
s ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) 
mientras que el porcentaje de adsorción  A t i al tiempo t  i viene dado por 
la ecuación:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Los valores de la adsorción  A t i o A Δt i (según las necesidades del 
estudio) se representan gráficamente frente al tiempo y se determina 
el tiempo al que se alcanza el equilibrio de sorción. 
— Al tiempo de equilibrado t  eq : 
— la masa de la sustancia problema adsorbida en el suelo es:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— la masa de la sustancia problema en la solución es:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— y la adsorción porcentual en el equilibrio es:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
Los parámetros usados en estas ecuaciones se definen de la forma siguien ­
te: 
m ads 
s ðΔt 1 Þ; m ads 
s ðΔt 2 Þ; :::; m ads 
s ðΔt n Þ = masa de la sustancia adsorbida en 
el suelo durante los intervalos de 
tiempo Δ t1 , Δ t2 ,..., Δ tn respectiva ­
mente (μg); 
m ads 
m ðt 1 Þ; m  ads 
m ðt 2 Þ; :::;  m  n ads ðt n Þ = masa de la sustancia medida en 
una alícuota v  v A 
a a los tiempos 
t 1 , t 2 ,t n respectivamente ( μg); 
m ads 
s ðeqÞ = masa de la sustancia adsorbida en 
el suelo en el equilibrio de adsor ­
ción (μg); 
m ads 
aq ðeqÞ = masa de la sustancia en la solución 
en el equilibrio de adsorción ( μg); 
v A 
a = volumen de la alícuota donde se 
mide la sustancia problema (cm  3 ); 
A Δt i = adsorción porcentual correspon ­
diente al intervalo de tiempo Δt i 
(%); 
A eq = adsorción porcentual en el equili ­
brio de adsorción ( %)  
DESORCIÓN D (%) 
El tiempo t  0 al que se inicia el experimento de cinética de desorción se considera 
que es el momento en que el volumen recuperado máximo de la solución de 
sustancia problema (después de alcanzarse el equilibrio de adsorción) es susti ­
tuido por un volumen igual de solución de CaCl  2 0,01 M.  
a) Método paralelo  
A un tiempo t  i , la masa de la sustancia problema se mide en la fase acuosa 
tomada del tubo i  Ä 
V i 
r Ö 
, y la masa desor-bida se calcula con arreglo a la 
ecuación siguiente:  
m des 
aq ðt i Þ ¼ m des 
m ðt i Þ· Í V 0 
v r i Î 
Ä m A 
aq (13) 
En el equilibrio de desorción t  i = t eq por lo que  m des 
aq ðt i Þ = m des 
aq ðeqÞ 
La masa de la sustancia problema desorbida durante un intervalo de tiempo 
(At i ) se da en la ecuación:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
La desorción porcentual se calcula: 
— a un tiempo t  i a partir de la ecuación:  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
— y durante un intervalo de tiempo ( Δt i ) a partir de la ecuación:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
donde:  
D t i = desorción porcentual al tiempo t  i ( %),  
D Δt i = desorción porcentual correspondiente al intervalo de tiempo 
Δt i ( %),  
m des 
aq ðt 1 Þ = masa de la sustancia problema desorbida al tiempo t  i (μg), 
m des 
aq ðΔt 1 Þ = masa de la sustancia problema desorbida durante el inter ­
valo de tiempo Δt i (μg), 
m des 
m ðt i Þ = masa de la sustancia problema medida analíticamente al 
tiempo t  i en un volumen de solución  V r i , que se toma 
para el análisis ( μg), 
m A 
aq = masa de la sustancia problema que queda en solución una 
vez alcanzado el equilibrio de adsorción debido a la susti ­
tución incompleta del volumen ( μg). 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m ads 
aq ðeqÞ = masa de la sustancia problema en la solución en el equili ­
brio de adsorción ( μg), 
V R = volumen de sobrenadante retirado del tubo después de que se 
haya alcanzado el equilibrio de adsorción y sustituido por el mismo volumen de una solución de CaCl
 2 0,01 M (cm  
V r i = volumen de solución tomado del tubo (i) para la medida de 
la sustancia problema, en el experimento de cinética de 
desorción (cm  3 ). 
Los valores de desorción  D t i o D Δt i (según las necesidades del estudio) se 
representan frente al tiempo y se determina el tiempo al que se alcanza el equilibrio de desorción.
 
b) Método en serie  
Las siguientes ecuaciones tienen en cuenta que el procedimiento de adsor ­
ción presentado se ha seguido con mediciones de la sustancia problema en 
pequeñas alícuotas ( ðv A 
a Þ) de la fase acuosa (método en serie en el punto 
1.9, «Realización de la prueba»). Se supone que: a) el volumen de sobre ­
nadante retirado del tubo tras el experimento de cinética de adsorción se ha sustituido con el mismo volumen de solución de CaCl
 2 0,01 M (V  R ), y b) 
el volumen total de fase acuosa en contacto con el suelo (V  T ) durante el 
experimento de cinética de desorción se mantiene constante y viene dado por la ecuación:
 
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Al tiempo t  i : 
— La masa de la sustancia problema se mide en una pequeña alícuota  
ðv a D Þ y la masa desorbida se calcula con arreglo a la ecuación siguiente:  
m des 
aq ðt i Þ ¼ m des 
m ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m A 
aq · Ê 
V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ì 
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— Al equilibrio de desorción t  i = t eq , por lo que  m des 
aq ðt i Þ = m des 
aq ðeqÞ 
— La desorción porcentual  D t i se calcula a partir de la ecuación siguiente:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
Al intervalo de tiempo ( Δt i ): 
Durante cada intervalo de tiempo, la cantidad de sustancia desorbida se 
calcula de la forma siguiente: 
— para el primer intervalo de tiempo Δt 1 = t 1 —t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— para el segundo intervalo de tiempo Δt 2 = t 2 -t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
and 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— para el enésimo intervalo de tiempo Δt n = t n -t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Finalmente, la desorción porcentual a cada intervalo de tiempo,  D Δt i , se 
calcula con la ecuación siguiente:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
mientras que la desorción porcentual  D t i al tiempo t  i viene dada por la 
ecuación:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
definiéndose los parámetros utilizados de la forma siguiente:  
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = masa de la sustancia que per ­
manece adsorbida en el suelo 
tras los intervalos de tiempo Δt
 1 , Δt 2 ,..., Δt n respectiva ­
mente (μg), 
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = masa de la sustancia que per ­
manece adsorbida en el suelo 
tras los intervalos de tiempo Δt
 1 , Δt 2 ,..., Δt n respectiva ­
mente (μg), 
m s des ðt 1 Þ, m s des ðt 2 Þ,... , m s des ðt n Þ = masa de la sustancia medida 
en una alicuota ðv D 
a Þ a los 
tiempo t  1 ,t 2 ,..., t  n , respectiva ­
mente (μg), 
V T = volumen total de la fase 
acuosa en contacto con el 
suelo durante et el experi ­
mento de cinética de desor ­
cióh realizado con el método 
en serie (cm  3 ), 
m A 
aq = masa de la sustancia problema 
que queda en solución una vez alcanzado el equilibr de 
adsorcióh debido a la sustitu ­
ción incompleta del volumen (μg):
 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = volumen de sobrenadante reti ­
rado del tubo después de al ­
canzar el equilibrio de adsor ­
ción y sustituido por el 
mismo volumen de solución de CaCl
 2 0,01 M (cm  3 ), 
v D 
a = volumen de la alícuota tomada 
del tubo para el análisis (i), 
durante el experimento de 
cinética de desorción realizado con el método en serie (cm
 3 ): 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
Apéndice 6  
ADSORCIÓN-DESORCIÓN EN SUELOS: FICHAS DE COMUNICACIÓN DE DATOS  
Sustancia estudiada: 
Suelo estudiado: 
Contenido en masa seca del suelo (105  o C, 12 horas): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adecuación del método analítico  
Suelo pesado g 
Suelo: masa seca g 
Volumen de la solución de CaCl  2 cm 3 
Concentración final nominal sol de la solución μg cm  -3 
Concentración final analítica sol de la solución μg cm  -3 
Principio del método analítico utilizado: 
Calibración del método analítico: 
Sustancia estudiada: Suelo estudiado: Contenido en masa seca del suelo (105
 o C, 12 horas): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Metodología analítica seguida: Indirecta  □ Paralela  □ En serie  □ 
Directa  □ 
Prueba de adsorción: muestras de ensayo  
Simbolo Unidades Tiempo equili ­
brado Tiempo de 
equilibrado Tiempo de 
equilibrado Tiempo de 
equilibrado  
N o tubo 
Suelo pesado — g Suelo: masa seca m
 soil g 
Volumen de agua en el suelo 
pesado (calculado) V ws cm 3 
Volumen de solución  CaCl,  
0,01 M para equilibrar el suelo cm 3 
Volumen de solución madre cm  3 
Volumen total tic fase acuosa en 
contacto con el suelo V o cm 3 
Concentración inicial de la so ­
lución problema C o μg cm  -3 
Masa de la sustancia problema 
ni inicio de la prueba m0 μg ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Simbolo Unidades Tiempo equili ­
brado Tiempo de 
equilibrado Tiempo de 
equilibrado Tiempo de 
equilibrado  
Iras agitación y centrifugación  
MÉTODO INDIRECTO 
Método paralelo 
Concentración de la sustancia 
problema lase acuosa, incluida corrección por blanco
 C ads 
aq ðt i Þ μg cm  -3 
Método en serie 
Musa de la sustancia problema 
medida en la alícuota V  a m ads 
s ðt i Þ μg 
MÉTODO DIRECTO 
Masa de la sustancia problema 
adsorbida en el suelo  m ads 
s ðt i Þ μg 
Calculo de la adsorción 
Adsorción  A  t i % 
A Δt i % 
Me-Jias 
Coeficiente K  e cm 3 g -1 
Medias 
Coefidence K  oc cm 3 g -1 
Medias 
Sustancia estudiada: 
Suelo estudiado: 
Contenido en masa seca del suelo (105  o C, 12 horas): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Prueba de adsorción: blancos y control  
Símbolo Unidad Blanco Blanco Control  
N o tubo 
Suelo pesado g 0 0 Cantidad de agua en el suelo pesado 
(calculada) cm
 3 — — 
Volumen añadido de solución CaCl  2 
0,01 M cm 3 
Volumen añadido de la solución ma ­
dre de le sustancia problema cm 3 0 0 
Volumen total de fase acuosa (calcu ­
lado) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Símbolo Unidad Blanco Blanco Control  
Concentración inicial de la sustancia 
problema en la fase acuosa μg cm  -3 
Tras agitación y centrifugación  
Concentración en la fase acuosa μg cm  -3 
Nota:  Añádanse columnas en caso necesario. 
Sustancia estudiada: Suelo estudiado: Contenido en masa seca del suelo (105
 o C, 12 horas): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Balance de masa  
Símbolo Unidad  
N o tubo 
Suelo pesado — g Suelo: masa seca m
 soil g 
Volumen de agua en suelo pesado (cal ­
culado) V ws ml 
Volumen sol de la solución de CaCl  2 
0,01 M para equilibrar el suelo ml 
Volumen de solución madre cm  3 
Volumen total de fase acuosa en con ­
tacto con el suelo V 0 cm 3 
Concentración inicial de la solución 
problema C 0 μg cm  -3 
Tiempo de equilibrado — h  
Tras agitación y centrifugación  
Concentración de la sustancia problema 
en fase acuosa en equilibrio adsorción, 
incluida corrección por blanco  C ads 
aq ðeqÞ μg cm  -3 
Tiempo de equilibrado t  eq h 
1 a dilución con solvente 
Volumen retirado fase acuosa V  rec cm 3 
Volumen añadido solvente ΔV cm  3 
1 a extracción con solvente 
Señal analizada en fase solvente S  E1 var. 
Concentración de la sustancia problema 
en solvente C E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Símbolo Unidad  
Masa sustancia extraída del suelo y pa ­
redes recipiente m E1 μg 
2 a dilución con solvente 
Volumen retirado solvente ΔV 5 cm 3 
Volumen añadido solvente ΔV cm  3 
2 a extracción con solvente 
Señal analizada en fase solvente S  E2 var 
Concentración de la sustancia problema 
en sol-vente C E2 μg cm  -3 
Masa sustancia extraída del suelo y pa ­
redes recipiente m E2 μg 
Total masa sustancia problema extraída 
en dos pasos m E μg 
Balance de masa MB % 
Sustancia estudiada: 
Suelo estudiado: Contenido en masa seca del suelo (105
 o C, 12 horas): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Isotermas de adsorción  
Símbol Unidad  
N o tubo 
Suelo pesado — g Suelo: masa seca E g Volumen de agua en suelo pe ­
sado (calculado) V
 ws cm 3 
Volumen de la solución de 
CaCl  2 0,01 M para equilibrar el 
suelo cm 3 
Volumen de solución madre 
añadido cm 3 
Volumen total de fase acuosa en 
contacto con suelo (calculado) V 0 cm 3 
Concentración solución C  0 Μg cm  -3 
Tiempo de equilibrado — h  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Símbol Unidad  
Tras agitación y centrifugación  
Concentración de la sustan-cia 
en fase acuosa, incluida correc ­
ción por blanco  C ads 
aq ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatura  o C 
Masa adsorbida por unidad 
suelo  C ads 
s ðeqÞ μg g -1 
Análisis de regresión: 
valor de K  F ads : 
valor de 1/n: 
coeficiente de regresión r  2 : 
Sustancia estudiada: Suelo estudiado: Contenido en masa seca del suelo (105
 o C, 12 horas): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . % 
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Metodología analítica seguida: Indirecta  □ Paralela  □ En serie  □ 
Prueba de desorción  
Símbolo Unidades Intervalo 
de tiempo Intervalo 
de tiempo Intervalo 
de tiempo Intervalo 
de tiempo  
N o tubo de la fase de adsorción 
Masa de sustancia adsorbida en el suelo 
en el equilibrio de adsorción  m ads 
s ðeqÞ μg 
Volumen retirado de fase acuosa, susti ­
tuido por CaCl  2 0,01 M V R cm 3 
Volumen total de fase 
acuosa en contacto con suelo PM SM V
 0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Masa de la sustancia problema que queda 
en la solución una vez alcanzado el equilibrio de adsorción debido a sustitu ­
ción incompleta del volumen
 m A 
aq μg 
Cinética de desorción  
Masa medida de sustancia desorbida del 
suelo al tiempo t  i m des 
m ðt i Þ μg 
Volumen de solución to ­
mado del tubo (i) para 
medir la sustancia pro ­
blema PM  V1 r cm 3 
SM cm  3 
Masa de sustancia desorbida del suelo al 
tiempo t  i (calculada)  m des 
aq ðt i Þ μg 
Masa de sustancia desorbida del suelo 
durante el intervalo de tiempo Δt i (cal­
culada)  m des 
aq ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Símbolo Unidades Intervalo 
de tiempo Intervalo 
de tiempo Intervalo 
de tiempo Intervalo 
de tiempo  
Desorción porcentual  
Desorción al tiempo t  i % 
Desorción al intervalo de tiempo Δt i % 
Coeficiente de desorción aparente 
PM: Método paralelo. 
SM: Método en serie.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  CALCULO DEL COEFICIENTE DE ADSORCIÓN ( K OC ) EN 
SUELOS Y EN LODOS DE AGUAS RESIDUALES 
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA 
RESOLUCIÓN (HPLC)  
1. MÉTODO  
El presente método de ensayo reproduce las directrices del docu ­
mento TG 121 de la OCDE (2000).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El comportamiento que presentan los compuestos en cuanto a su 
adsorción en suelos o en lodos de agua; residuales puede describirse 
mediante ciertos parámetros, para cuya determinación experimental se puede aplicar el método de ensayo C.18. Un parámetro importante es el coeficiente de adsorción, definido como la relación entre la 
concentración del compuesto en la muestra de suelo o lodo y la 
concentración del mismo en la fase acuosa, cuando la adsorción llega al equilibrio. El coeficiente de adsorción normalizado con respecto a contenido de carbono orgánico presente en el suelo, K
 oc , constituye 
un útil indicador de la capacidad que presenta un producto químico 
para unirse a la materia orgánica de los suelos o los lodos de aguas residuales; este valor permite establecer comparaciones entre los diversos productos químicos. Se puede calcular este parámetro a 
través de correlaciones con la hidrosolubilidad y con el coeficiente 
de reparto n-octanol/agua (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). 
El método experimental descrito en este ensayo hace uso de una 
técnica de HPLC para calcular el coeficiente de adsorción, K
 oc , en 
suelos y lodos de aguas residuales (8). La fiabilidad de los valores 
así obtenidos es superior a la de los cálculos efectuados por QSAR (9). Como método de cálculo, no puede sustituir completamente a los experimentos de equilibrio de lotes contemplados en el método 
de ensayo C.18. A pesar de ello, el K
 oc calculado puede ser útil para 
escoger los parámetros de ensayo adecuados en los estudios de ad ­
sorción/desorción que siguen el método de ensayo C.18 calculando los valores K
 d (coeficiente de distribución) o K  f (coeficiente de 
adsorción de Freundlich) según la ecuación 3 (véase el punto 1.2 
a continuación).  
1.2. DEFINICIONES  
K d : coeficiente de distribución, que se define como la relación exis ­
tente entre las concentraciones en el equilibrio (C) de una sustancia problema disuelta en un sistema de dos fases: un adsorbente (suelo o 
lodo) más una fase acuosa; es un valor adimensional, cuando las 
concentraciones en ambas fases se expresan como peso/peso. Si la concentración del compuesto en la fase acuosa viene expresada como peso/volumen, las unidades de K
 d son ml g  -1 . K  d puede variar en 
función de las propiedades del adsorbente.  
K d ¼ C soil 
C aq o C sludge 
C aq (1) 
donde: 
C soil = concentración de la sustancia problema en el suelo  
(soil),  una vez alcanzado el equilibrio ( μg . g  -1 ) 
C sludge  = concentración de la sustancia problema en el lodo  
(sludge),  una vez alcanzado el equilibrio ( μg . g  -1 ) 
C aq = concentración de la sustancia problema en la fase acuosa, 
una vez alcanzado el equilibrio ( μg . g  -1 ) μg . ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : coeficiente de adsorción de Freundlich, que se define como la 
concentración de la sustancia problema en el suelo o en el lodo de 
aguas residuales  (x/m)  cuando la concentración en la fase acuosa, 
llegado el equilibrio  aq , toma el valor 1; unidades: μg . g  -1 de adsor­
bente. El valor puede variar en función de las propiedades del ad ­
sorbente.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·log C  aq (2) 
donde: 
x/m = cantidad de sustancia problema  x (μg g  -1 ) adsorbida por 
masa de adsorbente m (g), en el equilibrio, 
1/n = pendiente de la isoterma de adsorción de Freundlich, C
 aq = concentración de la sustancia problema en la fase acuosa, 
en el equilibrio ( μg ml  -1 ). 
AtC aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
Cuando  
K oc : coeficiente de distribución (K  d ) o coeficiente de adsorción de 
Freundlich (K  f ) normalizado con respecto al contenido de carbono 
orgánico (f  oc ) de un adsorbente; en el caso particular de productos 
químicos no ionizados, resulta un indicador aproximado para conocer la magnitud de la adsorción de un compuesto y permite establecer 
comparaciones entre diversos productos químicos. Según sean las 
dimensiones de K
 d y K  f , K  oc puede ser adimensional o bien venir 
expresado en las unidades siguientes: ml . g  -1 o μg . g  -1 de materia 
orgánica.  
Koc ¼ Kd 
foc adimensional o ml · g Ä1 Ê Ì  
o bien  Kf 
foc ðμg·g Ä1 Þ (3) 
La relación entre los coeficientes K  oc y K  d no siempre es lineal; así 
pues, la posible diferencia de los valores de K  oc entre uno y otro 
suelo es muy reducida, en comparación con la de los valores K  d o 
K f . 
A partir del coeficiente de distribución másica (k'), empleando un 
gráfico de calibración de log k' frente a log K  oc (registrado con los 
compuestos de referencia elegidos), se deduce el coeficiente de ad ­
sorción (K  oc ). 
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
donde: 
t R = tiempo de retención (en el cromatograma de HPLC) del 
compuesto problema o del compuesto de referencia (minutos), 
t 0 = tiempo de retención de la fase móvil en la columna de HPLC 
(minutos) (véase el punto 1.8.2). 
P ow coeficiente de reparto octanol/agua, que se define como el co ­
ciente entre la concentración de la sustancia disuelta en n-octanol y la concentración de la misma disuelta en la fase acuosa; se trata de 
un valor adimensional.
 
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3. COMPUESTOS DE REFERENCIA 
Es necesario conocer, antes de aplicar el método, cuál es la fórmula 
estructural del compuesto, así como su pureza y su constante de disociación (en caso pertinente). Resulta útil contar con datos adi ­
cionales tales como la solubilidad en agua y, en disolventes orgáni ­
cos, el coeficiente de reparto octanol/agua y las características de 
hidrólisis.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
A fin de establecer una correlación entre los datos de retención obte ­
nidos mediante HPLC, relativos a la sustancia problema, y el coefi ­
ciente de adsorción de la misma, K  oc , se debe trazar un gráfico de 
calibración (log K  oc frente a log k'). Se empleará un mínimo de 6 
puntos de referencia, al menos uno de ellos por encima y otro por 
debajo del valor previsto para la sustancia problema. La exactitud del 
método mejorará significativamente si se emplean compuestos de re ­
ferencia que guarden una relación estructural con la sustancia proble ­
ma. Si el analista no cuenta con este tipo de datos, deberá ser él quien 
elija los compuestos adecuados para la calibración. En tal caso, se 
optará por una serie más general de compuestos heterogéneos desde el punto de vista estructural. En el apéndice figura una lista de com ­
puestos y de valores de K
 oc aplicables para los análisis de lodos de 
aguas residuales (cuadro 1) o de suelos (cuadro 3). La elección de otros 
compuestos para la calibración deberá ser justificada.  
1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se lleva a cabo una HPLC en columnas analíticas rellenas de una 
fase sólida de tipo cianopropilo, de las disponibles en el mercado, 
que contiene tanto grupos lipófilos como grupos polares. Se utiliza 
una fase estacionaria moderadamente polar basada en una matriz de sílice: 
— O — Si — CH
 2 — CH  2 — CH  2 — CN 
silice grupo apolar separador grupo polar 
El principio del método de ensayo es similar al del método de 
ensayo A.8 (coeficiente de reparto, método de HPLC). Al ir atrave ­
sando la columna, junto con la fase móvil, la sustancia problema interacciona con la fase estacionaria. Como resultado del reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria, la sustancia problema 
experimenta una retención. La composición ambifílica de la fase 
estacionaria (partes polares y partes apolares) permite una interacción de los diversos grupos polares o apolares de cada molécula similar a la que tiene lugar en el caso de la materia orgánica en matrices tales 
como lodos de aguas residuales o suelos. Este hecho posibilita esta ­
blecer una relación entre el tiempo de retención en la columna y el coeficiente de adsorción en la materia orgánica. 
El pH ejerce una significativa influencia sobre la adsorción, particu ­
larmente en el caso de los compuestos polares. En el caso de suelos de cultivo o tanques de plantas de tratamiento de aguas residuales, el pH suele estar comprendido entre 5,5 y 7,5. Cuando se desea ana ­
lizar compuestos ionizables, se debe llevar a cabo un ensayo con la 
forma ionizada y otro con la no ionizada, empleando las soluciones tampón adecuadas, aunque solo en aquellos casos en que al menos el 10 % del compuesto analizado se disocie a un pH de entre 5,5 y 7,5. 
Para la evaluación se utiliza exclusivamente la relación entre la reten ­
ción en la columna de HPLC y el coeficiente de adsorción, de modo 
que no es preciso aplicar un método de análisis cuantitativo: tan solo es 
necesario determinar el tiempo de retención. Si se dispone de una serie adecuada de compuestos de referencia y es posible aplicar las condi ­
ciones experimentales normales, el método constituye un modo rápido 
y eficaz para calcular el coeficiente de adsorción, K
 oc . 
1.5. APLICABILIDAD DEL ENSAYO 
El método de HPLC es aplicable a aquellos productos químicos (mar ­
cados o no) para los cuales se disponga de un sistema de detección apropiado (por ejemplo, un espectrofotómetro, un detector de radiac ­
tividad) y que sean suficientemente estables durante todo el experimen ­
to. Puede resultar especialmente útil para analizar productos químicos cuyo estudio sea difícil mediante otros sistemas experimentales (com ­
puestos volátiles, compuestos cuya solubilidad en agua no alcance una 
concentración que pueda determinarse desde el punto de vista analítico, 
compuestos con una elevada afinidad por la superficie de los sistemas de incubación). Se puede utilizar este método para analizar mezclas que originen al eluir bandas sin resolución. En este caso, se debe definir un 
margen de límites superior e inferior para los valores de log K
 oc co­
rrespondientes a los compuestos de la mezcla problema.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
La presencia de impurezas puede dificultar a veces la interpretación 
de los resultados de la HPLC; no obstante, su importancia será de 
índole menor en la medida en que se cuente con análisis que per ­
mitan identificar con claridad la sustancia problema y distinguirla de las impurezas. 
Se ha validado el uso del método para analizar las sustancias citadas 
en el cuadro 1 del apéndice; igualmente, el método ha sido aplicado 
al análisis de muchos otros productos químicos comprendidos en las familias químicas siguientes: 
— aminas aromáticas (por ejemplo, trifluralina, 4-cloroanilina, 
3,5-dinitroanilina, 4-metilanilina, N-metilani-lina, l-naftilamina), 
— ésteres de ácidos carboxílicos aromáticos (por ejemplo, benzoato 
de metilo, 3,5-dinitrobenzoato de etilo), 
— hidrocarburos aromáticos (por ejemplo, tolueno, xileno, etilben ­
ceno, nitrobenceno), 
— ésteres de ácidos ariloxifenoxipropiónicos (por ejemplo, metil 
diclofop, etil fenoxaprop, P-etil fenoxaprop), 
— fungicidas con estructura de tipo imidazol o benzimidazol (por 
ejemplo, carbendazima, fuberidazol, tria-zóxido), 
— amidas de ácidos carboxílicos (por ejemplo, 2-clorobenzamida, 
N,N-dimetilbenzamida, 3,5-dinitrobenza-mida, N-metilbenzami ­
da, 2-nitrobenzamida, 3-nitrobenzamida), 
— hidrocarburos clorados (por ejemplo, endosulfán, DDT, hexaclo ­
robenceno, quintoceno, 1,2,3-tricloroben-ceno), 
— insecticidas organofosforados (por ejemplo, metil azinfos. disul ­
fotón, fenamifos, isofenfos, pirazofos, sul-profos, triazofos), 
— fenoles (por ejemplo, fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaclo ­
rofenol, 2.4,6-triclorofenol, 1-naftol), 
— derivados de la fenilurea (por ejemplo, isoproturón, monolinurón, 
pencicurón), 
— colorantes (por ejemplo, Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct 
Red 81), 
— hidrocarburos poliaromáticos (por ejemplo, acenafteno, nafta ­
leno), 
— herbicidas con estructura de 1,3,5-triazina (por ejemplo, prome ­
trina, propazina, simazina, terbutrina), 
— derivados de tipo triazol (por ejemplo, tebuconazol, triadimefon, 
tradimenol, triapentenol). 
No es aplicable el método a aquellas sustancias que den lugar a una 
reacción con el eluyente o con la fase estacionaria. Tampoco a 
aquellas sustancias que interaccionen con componentes inorgánicos de modo específico (por ejemplo, las que formen complejos en racimo con los minerales de las arcillas). Puede ocurrir que el mé ­
todo no sirva en el caso de tensioactivos, compuestos inorgánicos y 
ácidos y bases orgánicos moderados o fuertes. Es posible determinar valores de log K
 oc comprendidos entre 1,5 y 5,0. Para analizar 
compuestos ioni-zables, se debe emplear una fase móvil tamponada; 
no obstante, se tendrá cuidado de evitar que los componentes del 
tampón o la sustancia problema precipiten.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. CRITERIOS DE CALIDAD  
1.6.1.  Exactitud  
Normalmente, se puede calcular que el coeficiente de adsorción de 
una sustancia problema estará comprendido en el intervalo de ± 0,5 
unidades logarítmicas del valor determinado por el método de equi ­
librio de lotes (véase el cuadro 1 del apéndice). Es posible lograr una mayor exactitud si los compuestos de referencia empleados guardan una relación estructural con la sustancia problema.
 
1.6.2.  Repetibilidad  
Se debe efectuar al menos un duplicado de cada determinación. Los 
valores de log K  oc obtenidos a partir de cada medición deben encon ­
trarse en un intervalo de 0,25 unidades logarítmicas.  
1.6.3.  Reproducibilidad  
La experiencia hasta ahora adquirida en la aplicación del método 
confirma la validez del mismo. Un estudio del método de HPLC, en el que se utilizaron 48 sustancias (plaguicidas en su mayoría) para 
las que se disponía de datos fiables respecto al K
 oc en suelos, dio 
como resultado un coeficiente de correlación R = 0,95 (10) (11). 
Con objeto de mejorar y validar el método, se llevó a cabo un 
ensayo comparativo en el que participaron 11 laboratorios (12). Los resultados están recogidos en el cuadro 2 del apéndice.
 
1.7. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.7.1.  Estimación preliminar del coeficiente de adsorción  
Tanto el coeficiente de reparto octanol/agua P  ow (= K  ow ) como, en 
cierta medida, la hidrosolubilidad pueden servir de indicadores del 
grado de adsorción, particularmente en el caso de compuestos no ioni ­
zados, de modo que pueden ser utilizados para prever la gama de valores. Existen numerosas correlaciones útiles publicadas, relativas 
a varios grupos de productos químicos (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
1.7.2.  Aparato  
Se debe disponer de un cromatógrafo de líquidos equipado con una 
bomba continua y un detector adecuado. Es conveniente utilizar una válvula de inyección junto con un bucle al efecto. Se emplearán resinas comerciales con grupos cianopropílicos enlazados covalente ­
mente a un sustrato de sílice (por ejemplo, Hypersil y Zor-bax CN). 
Se puede intercalar una precolumna del mismo material entre el sistema de inyección y la columna en la que se realiza el análisis. Puede existir una considerable variabilidad entre las columnas que 
procedan de diferentes proveedores, manifestada en su eficacia para 
lograr la separación. Se deberán lograr los siguientes coeficientes de distribución másica, k', expuestos aquí como valores orientativos: log k' > 0,0 cuando log K
 oc = 3,0, y log k' > -0,4 for cuando log K  oc = 
2,0, al emplear como fase móvil una mezcla de metanol/agua 
(55 %/45 %).  
1.7.3.  Fases móviles  
Se han estudiado varias fases móviles: se recomienda utilizar las dos 
siguientes: 
— metanol/agua (55 %/45 % v/v), — metanol/tampón de citrato 0,01M (pH = 6,0), (55 %/45 % v/v).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Para preparar el disolvente de elución, se emplea una mezcla de 
metanol para HPLC y agua destilada o tampón de citrato. La mezcla 
se desgasifica antes de ser utilizada. Se efectuará una elución iso ­
crática. En el caso de que las mezclas de metanol/agua no sean apropiadas, es posible investigar mezclas de otros disolventes con 
agua, por ejemplo etanol/agua o bien acetonitrilo/agua. En el caso de 
compuestos ionizables, se recomienda emplear una solución tampón a fin de estabilizar el pH. Se debe procurar evitar la precipitación de sales y el deterioro de la columna, situaciones posibles al utilizar 
algunas mezclas de fase orgánica + tampón. 
No es posible incluir aditivos tales como reactivos tipo par iónico, ya 
que pueden alterar las características de adsorción de la fase estacio ­
naria. Tales alteraciones de la fase estacionaria pueden ser irreversi ­
bles. Así pues, los experimentos en los que intervengan aditivos 
deben ser realizados en columnas independientes.
 
1.7.4.  Solutos  
Se utilizará la fase móvil para disolver tanto la sustancia problema 
como los compuestos de referencia.  
1.8. REALIZACIÓN DEL ENSAYO  
1.8.1.  Condiciones de ensayo  
Se registrará la temperatura a la que se realizan las mediciones. Es 
muy conveniente servirse de un compartimento termostatizado para 
la columna, para garantizar la constancia de las condiciones en que transcurre la calibración y las cromatografías para los cálculos o las 
mediciones de la sustancia problema.
 
1.8.2.  Determinación del tiempo de retención de la fase móvil, t  0 
Para determinar el tiempo de retención de la fase móvil, t  0 , se 
pueden emplear dos métodos distintos (véase también el punto 1.2).  
1.8.2.1.  Determinación del tiempo de retención de la fase móvil, t  0 , mediante 
una serie homóloga  
Se ha demostrado que este procedimiento da lugar a valores de t  0 
fiables y normalizados. Véase información detallada en el método de 
ensayo A.8: coeficiente de reparto (n-octanol/agua), método de 
HPLC.  
1.8.2.2.  Determinación del tiempo de retención de la fase móvil, t  0 , utili­
zando compuestos inertes no retenidos por la columna  
Esta técnica consiste en inyectar soluciones de formamida, urea o 
nitrato de sodio. Se debe efectuar al menos un duplicado de cada 
medición.  
1.8.3.  Determinación de los tiempos de retención, t  R 
Se elegirán compuestos de referencia conforme a lo descrito en el 
punto 1.3. Se puede efectuar una inyección de los mismos a modo de patrón mixto para determinar sus tiempos de retención, siempre que 
se haya confirmado que no existen interferencias recíprocas que 
alteren estos valores. Periódicamente, al menos 2 veces al día, se llevará a cabo una calibración, para tener en cuenta las potenciales variaciones imprevistas en cuanto a la eficacia de la columna. Una 
práctica muy adecuada consiste en efectuar las inyecciones de cali ­
bración tanto antes como después de inyectar la sustancia problema, al objeto de confirmar que no hayan variado los tiempos de reten ­
ción. Se inyecta por separado cada sustancia problema, en cantidades 
tan reducidas como sea posible (para evitar una sobrecarga de la 
columna) y se procede a determinar sus tiempos de retención.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Para lograr una mayor fiabilidad de las mediciones, se realizará al 
menos un duplicado de cada determinación. Los valores de log K  oc 
obtenidos a partir de cada medición deben encontrarse en un inter ­
valo de 0,25 unidades logarítmicas.  
1.8.4.  Evaluación  
A partir del tiempo de retención de la fase móvil, t  0 , y de los 
tiempos de retención de los compuestos de referencia elegidos, t  R , 
se calculan los coeficientes de distribución másica,  k' aplicando la 
ecuación 4 (véase el punto 1.2). A continuación, se traza un gráfico en el que se representan los datos relativos al valor log k' de los compuestos de referencia frente a los respectivos valores log K
 oc 
procedentes de los experimentos de equilibrio de lotes, mostrados 
en los cuadros 1 y 3 del apéndice. Interpolando en este gráfico el valor log k' correspondiente a cada sustancia problema, se obtiene entonces el respectivo valor log K
 oc . Si los resultados reales indican 
que el log K  oc de la sustancia problema se sale del intervalo de 
calibración, se debe repetir el ensayo, empleando en este caso otros compuestos de referencia más apropiados.
 
2. DATOS E INFORME  
El informe debe incluir la información siguiente: 
— identidad y pureza de la sustancia problema y de los compuestos 
de referencia, así como valores de pKa en caso de que sea 
relevante. 
— descripción del equipo y de las condiciones de trabajo, por ejem ­
plo: tipo y dimensiones de la columna en la que se efectúa el 
análisis (y de la precolumna), medios de detección, fase móvil 
(proporción de los distintos componentes, pH), intervalo de tem ­
peraturas durante las mediciones, 
— tiempo de retención de la fase móvil y método empleado para 
determinarlo, 
— cantidades de la sustancia problema y de los compuestos de 
referencia introducidas en la columna, 
— tiempos de retención de los compuestos de referencia utilizados 
para la calibración, 
— representación gráfica y detalles relativos a la recta de regresión 
ajustada (log k' frente a log K  oc ), 
— datos sobre la retención media y valor log K  oc calculado para el 
compuesto problema, 
— cromatogramas.  
3. REFERENCIAS  
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, 
McGraw-Hill, New York. 
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the ad ­
sorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 167. 
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the pa ­
rachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059. 
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol, 17, pp. 227-231. 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substan ­
ces by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 
pp. 297-312.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic com ­
pounds, Science, 106, pp. 831-832. 
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Che ­
mosphere, 10, pp. 83 3-846. 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the ad ­
sorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128. 
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening met ­
hods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Che ­
mosphere, 32(12), pp. 2493-2504. 
(10) W. Kördel,). Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening met ­
hod for the determination of the adsorption coefficient in soil- comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27 ­
(12), pp. 2341-2352. 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of non ­
polar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD 
Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304. 
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
Apéndice  
Cuadro 1  
Comparación entre los valores de K  oc observados en suelos y en lodos de aguas residuales y los datos 
calculados aplicando el método de HPLC  ( 1 ) ( 2 ) 
Compuesto N  o CAS log K  oc (lo­
dos) log K  oc 
(HPLC) Δ log K  OC 
(suelos) Log K  OC 
(HPLC) Δ 
Atrazina 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linurón 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fentión 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monurón 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantreno 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 
Benzoato de fenilo 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 
Benzamida 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-Nitrobenzamida 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Acetanilida 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Anilina 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dichloroanilina 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s 
Chemosphere, 35 (1/2), pp. 107-119.  
Cuadro 2  
Resultados de un estudio comparativo, realizado en diferentes laboratorios para mejorar y validar el método de 
HPLC  ( 1 ) (11 laboratorios participantes)  
Compuesto N  o CAS log K  oc K oc log K  oc 
(OCDE 106) (método de HPLC)  
Atrazina 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapentenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fention 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Cuadro 3  
Compuestos de referencia recomendados para aplicar el método de HPLC conforme a los datos de adsorción a 
los suelos  
Compuesto de referencia N  o CAS log K  OC (valores 
promedio), equi ­
librio de lotes N o de datos 
(K OC ) log de la desvia ­
ción estándar Fuente  
Acetanilida 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamida 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-dimetilbenzamida 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Metilbenzamida 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Benzoato de metilo 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazina 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturón 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamida 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilina 62-53-3 2,07 4 1,73 (  b ) 
3,5-Dinitrobenzamida 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazima 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazóxido 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linurón 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftaleno 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfán-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-8 5-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Triclorobenceno 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fention 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pirazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfán 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Metil diclofop 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantreno 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (mezcla) 26850-47-5 
122,0-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel. J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen. W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, pp. 285-304. 
( c ) Datos facilitados por la industria.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  ENSAYO DE REPRODUCCIÓN EN  DAPHNIA MAGNA  
1. MÉTODO  
El presente ensayo de toxicidad para la reproducción es copia de las 
directrices TG 211 de la OCDE (1998).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
La principal finalidad de este ensayo es evaluar el efecto de los 
productos químicos sobre el resultado reproductor de  Daphnia 
magna.  
1.2. DEFINICIÓN Y UNIDADES  
Parentales:  hembras de  Dafnia  presentes al principio del ensayo y 
cuyo resultado reproductor constituye el objeto del presente estudio.  
Descendientes:  ejemplares de  Dafnia  jóvenes producidos por los 
parentales en el curso del ensayo.  
Concentración mínima con efecto observado (LOEC):  concentra ­
ción de ensayo mínima a la cual se ha observado que la sustancia 
ejerce un efecto significativo sobre la reproducción y la mortalidad de los parentales (para p < 0,05) en comparación con el control y dentro del período de exposición establecido. Además, todas las 
concentraciones de ensayo superiores a la LOEC deben ejercer un 
efecto nocivo igual o mayor que el observado a dicha concentración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una explica ­
ción completa del modo en que se ha elegido la LOEC (y, por tanto, 
la NOEC).  
Concentración sin efecto observado (NOEC):  concentración de 
ensayo inmediatamente inferior a la LOEC que, en comparación con el control, no ejerce ningún efecto estadísticamente significativo (p < 0,05) dentro del período de exposición establecido.  
EC
 X : concentración de la sustancia de ensayo disuelta en agua que 
produce una reducción del x % en la reproducción de  Daphnia 
magna  dentro del período de exposición establecido.  
Tasa intrínseca de aumento:  medida del crecimiento de la pobla ­
ción que integra el resultado reproductor y la mortalidad específica 
de la edad (20) (21) (22). En poblaciones en equilibrio estacionario 
es cero. En poblaciones en crecimiento es positiva, y negativa en las que disminuyen. Obviamente, toda tasa negativa es insostenible y conduce a la extinción.  
Límite de detección:  concentración mínima que puede detectarse, 
aunque no cuantificarse.  
Límite de determinación:  concentración mínima que puede medirse 
cuantitativamente.  
Mortalidad:  un animal se considera muerto cuando está inmóvil, es 
decir, cuando es incapaz de nadar o cuando no mueve los apéndices ni la región posterior del abdomen 15 segundos después de la agi ­
tación suave del recipiente de ensayo (si se usa otra definición, debe 
documentarse junto con la referencia correspondiente).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Las hembras jóvenes de  Dafnia  (los parentales), con una edad infe ­
rior a 24 horas al principio del ensayo, se exponen a la sustancia de ensayo añadida al agua a una gama de concentraciones. La duración 
del ensayo es de 21 días. Al final de este se evalúa el número total 
de descendientes vivos producidos por cada parental vivo. Esto sig ­
nifica que se excluyen de los cálculos los organismos inmaduros producidos por adultos que han muerto durante el ensayo. El resul ­
tado reproductor de los parentales se puede expresar de otras formas 
(por ejemplo, como número de descendientes vivos producidos por animal y por día a partir del primero en que se observa descenden ­
cia), pero estas deben documentarse además del número total de 
inmaduros producidos por parental vivo al final del ensayo. El re ­
sultado reproductor de los animales expuestos a la sustancia de ensayo se compara con el de los controles para determinar la con ­
centración mínima con efecto observado (LOEC) y, por tanto, la 
concentración sin efecto observado (NOEC). Además, y en la me ­
dida de lo posible, los datos se analizan con ayuda de un modelo de regresión para estimar la concentración que provocaría una reducción 
del x % en el resultado reproductor (EC
 50 , EC  20 o EC  10 ). 
También hay que documentar la supervivencia de los parentales y el 
momento de la producción de la primera camada. Asimismo, pueden 
examinarse otros efectos vinculados con la sustancia sobre variables tales como el crecimiento (la longitud) y, posiblemente, la tasa in ­
trínseca de aumento.
 
1.4. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA DE ENSAYO 
Es preciso disponer de resultados de un ensayo de toxicidad aguda 
(véase la parte I del método C.2) realizado con  Daphnia magna.  El 
resultado puede ser útil para seleccionar un intervalo adecuado de 
concentraciones en los ensayos de reproducción. Deben conocerse la solubilidad en agua y la presión de vapor de la sustancia de ensayo, así como contar con un método analítico fiable para cuantificar la 
sustancia en las soluciones de ensayo con la eficiencia de recupera ­
ción y el límite de determinación establecidos. 
Otros datos de la sustancia de ensayo potencialmente útiles para 
establecer las condiciones de ensayo son la fórmula estructural, la pureza de la sustancia, la estabilidad a la luz, la estabilidad en las condiciones del ensayo, los valores de pKa y P
 ow y los resultados del 
ensayo de biodegradabilidad fácil (véase el método C.4).  
1.5. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Para que el ensayo sea válido, los controles deben cumplir los cri ­
terios de comportamiento siguientes: 
— la mortalidad de los parentales (hembras de  Dafnia ) no debe ser 
superior al 20 % al final del ensayo, 
— el número medio de descendientes vivos producidos por cada 
parental superviviente al final del ensayo ha de ser ≥ 60. 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.6.1.  Equipo  
Los recipientes de ensayo y demás instrumentos que hayan de entrar 
en contacto con las soluciones de ensayo serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte. Los recipientes de 
ensayo serán normalmente matraces de vidrio. 
Además harán falta algunos de los instrumentos siguientes o todos 
ellos: 
— aparato para medir el oxígeno (con microelectrodo o cualquier 
otro equipo que sea conveniente para medir el oxígeno disuelto 
en muestras de pequeño volumen),
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— aparato adecuado para el control de la temperatura, 
— medidor de pH, — aparato para determinar la dureza del agua, 
— aparato para determinar la concentración total de carbono orgá ­
nico (TOC) del agua o la demanda química de oxígeno (COD), 
— aparato adecuado para controlar el régimen de iluminación y 
medir la intensidad luminosa.
 
1.6.2.  Organismo de ensayo  
La especie usada en el ensayo es  Daphnia magna  Straus. También 
pueden usarse otras especies de  Dafnia  siempre que reúnan los cri ­
terios de validez apropiados (el criterio de validez relativo al resul ­
tado reproductor de los controles debe ser relevante para la especie elegida). Si se usan otras especies de  Dafnia , es preciso identificarlas 
con claridad y justificar su uso. 
De preferencia, el clon debe identificarse genotípicamente. Las in ­
vestigaciones realizadas (1) han demostrado que el comportamiento 
reproductor del clon A (procedente del IRCHA en Francia) (3) cum ­
ple siempre el criterio de validez de una media de ≥ 60 60 descen ­
dientes por parental que sobrevive cuando se cultiva en las condi ­
ciones descritas en este método. No obstante, son aceptables otros 
clones siempre que se demuestre que el cultivo de  Dafnia  cumple los 
criterios de validez del ensayo. 
Al principio del ensayo, los animales tendrán una edad inferior a 24 
horas y no deben ser progenie de primera camada. Han de proceder de una estirpe saludable (es decir, sin signos de agresión, tales como mortalidad elevada, presencia de machos y efipios, retraso de la 
producción de la primera camada, animales decolorados, etc.). Los 
animales de la estirpe deben mantenerse en condiciones de cultivo (luz, temperatura, medio, nutrición y animales por unidad de volu ­
men) similares a las usadas en el ensayo. Cuando el medio de cultivo 
que vaya a usarse en el ensayo sea distinto del usado en el cultivo 
sistemático de  Dafnia , es recomendable prever un período de acli ­
matación anterior al ensayo, por lo general de 3 semanas de duración (es decir, una generación), para evitar el estrés en los parentales.
 
1.6.3.  Medio de ensayo  
Es recomendable usar en este ensayo un medio definido completa ­
mente. Con ello se evita el uso de aditivos (tales como algas mari ­
nas, extracto de suelo, etc.) difíciles de caracterizar y aumentan en 
consecuencia las oportunidades de normalización entre laboratorios. 
Se ha observado que los medios Elendt M4 (4) y M7 (véase el apéndice 1) son adecuados para este propósito. No obstante, son aceptables medios distintos [por ejemplo, (5) (6)], siempre que se 
demuestre que el comportamiento del cultivo de Dafnia cumple los 
criterios de validez del ensayo. 
Si se usan medios con aditivos sin definir, estos deben especificarse 
con claridad, y en el informe del ensayo hay que aportar información sobre su composición, en particular el contenido en carbono, pues podría contribuir a la dieta suministrada. Es recomendable determinar 
en la preparación madre del aditivo orgánico el carbono orgánico 
total (TOC), la demanda química de oxígeno (TOC) o las dos cosas, así como hacer una estimación de la contribución resultante al TOC y a la COD en el medio de ensayo. Conviene que la concentración 
de TOC en el medio (antes de incorporar las algas) sea inferior a 
2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Si se ensayan sustancias que contengan metales, es importante tener 
en cuenta que las propiedades del medio de ensayo (por ejemplo, 
dureza, capacidad quelante) pueden afectar a la toxicidad de dichas sustancias. Por ello es deseable usar un medio totalmente definido. Sin embargo, en este momento, los únicos medios completamente 
definidos adecuados para el cultivo prolongado de  Daphnia magna  
que se conocen son los Elendt M4 y M7. Ambos contienen el agente quelante EDTA. La práctica ha demostrado (2) que la «toxicidad aparente» del cadmio es generalmente inferior cuando el ensayo de 
reproducción se hace en medios M4 o M7 que cuando se hace en 
medios exentos de EDTA. Por tanto, M4 y M7 no son recomenda ­
bles para ensayar sustancias con metales, y deben evitarse asimismo en estos casos otros medios que contengan agentes quelan-tes cono ­
cidos. En el caso de sustancias que contengan metales, puede ser 
aconsejable usar otros medios como, por ejemplo, agua dulce dura reconstituida según ASTM (7), que no contiene EDTA, enriquecida con extracto de algas marinas (8). Esta combinación de agua dulce 
dura reconstituida según ASTM y extracto de algas marinas es tam ­
bién apropiada para el cultivo prolongado y los ensayos con  Daph­
nia magna  (2), aun cuando ejerce una ligera acción quelante debida 
al componente orgánico del extracto de algas marinas. 
Al principio del ensayo y durante este, la concentración de oxígeno 
disuelto debe ser superior a 3 mg/l. El pH debe estar comprendido entre 6 y 9, y normalmente no debe oscilar en más de 1,5 unidades en ninguno de los ensayos. Se recomienda utilizar una dureza supe ­
rior a 140 mg/l (expresada como CaCO
 3 ). Los ensayos realizados 
con valores iguales o superiores a este han demostrado un compor ­
tamiento reproductor compatible con los criterios de validez (9) (10).  
1.6.4.  Soluciones de ensayo  
Las soluciones de ensayo de las concentraciones elegidas se preparan 
por dilución de una solución de reserva. A ser posible, estas solu ­
ciones madre deben prepararse disolviendo la sustancia en medio de ensayo. 
En algunos casos puede ser necesario usar disolventes o dispersantes 
orgánicos para obtener una solución madre de concentración adecua ­
da, aunque es preciso evitar en la medida de lo posible el uso de esta clase de materiales. Son ejemplos de disolventes adecuados la ace ­
tona, el etanol, el metanol, la dimetilformamida y el trietilenglicol. 
Son dispersantes adecuados el Cremophor RH40, la metilcelulosa al 0,01 % y el HCO-40. En cualquier caso, la cantidad de sustancia de ensayo contenida en las soluciones de ensayo no debe sobrepasar el 
límite de solubilidad en el medio de ensayo. 
Los disolventes se usan para obtener una solución madre que pueda 
dosificarse con exactitud en agua. A la concentración de disolvente recomendada en el medio de ensayo final (< 0,1 ml/l), los disolven ­
tes indicados en el párrafo anterior no son tóxicos y no aumentan la 
solubilidad en agua de la sustancia. 
Los dispersantes pueden facilitar la dosificación exacta y la disper ­
sión. A la concentración recomendada en el medio de ensayo final (< 
0,1 ml/l), los dispersantes indicados en el párrafo anterior no son 
tóxicos y no aumentan la solubilidad en agua de la sustancia.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. DISEÑO DEL ENSAYO 
Hay que asignar los tratamientos a los recipientes de ensayo y re ­
alizar todas las manipulaciones posteriores de dichos recipientes de forma aleatoria. De otro modo podría introducirse un sesgo suscepti ­
ble de ser interpretado como efecto de una concentración. En parti ­
cular, si las unidades experimentales se manipulan en orden de tra ­
tamiento o de concentración, determinados efectos vinculados con el tiempo, como la fatiga u otros errores del operador, podrían ejercer 
un efecto más acusado a concentraciones más elevadas. Además, si 
hay alguna probabilidad de que los resultados se vean afectados por una condición inicial o ambiental del ensayo, como la posición en el 
laboratorio, hay que pensar en la conveniencia de practicar agrupa ­
mientos.
 
1.8. PROCEDIMIENTO  
1.8.1.  Condiciones de exposición  
1.8.1.1.  Duración  
La duración del ensayo es de 21 días.  
1.8.1.2.  Carga  
Los parentales se mantienen separados, uno por recipiente de ensayo, 
con un volumen de 50 a 100 ml de medio en cada recipiente. 
En ocasiones hay que emplear un volumen mayor para satisfacer los 
requisitos del método analítico usado para determinar la concentra ­
ción de la sustancia de ensayo, aunque también se permite acumular los recipientes en paralelo para el análisis químico. Si se usan vo ­
lúmenes superiores a 100 ml, puede ser necesario aumentar la ración 
administrada a  Dafnia  para garantizar una disponibilidad suficiente 
de nutrientes y para cumplir con los criterios de validez. En ensayos dinámicos pueden considerarse, por razones técnicas, otros diseños (por ejemplo, 4 grupos de 10 animales en un volumen de ensayo 
mayor); en cualquier caso, es preciso documentar cualquier modifi ­
cación del diseño.
 
1.8.1.3.  Número de animales  
En ensayos semiestáticos, se mantienen por separado al menos 10 
animales a cada concentración de ensayo y al menos 10 animales en 
la serie de control. 
En ensayos dinámicos, se ha demostrado (1) que es adecuado repartir 
40 animales en 4 grupos de 10 a cada concentración de ensayo. Puede usarse un número inferior de organismos de ensayo, y se 
recomienda un mínimo de 20 animales por concentración repartidos 
en 2 o más recipientes en paralelo de igual número de animales (por ejemplo, 4 recipientes en paralelo con 5 dáfnidos cada uno). Obsér ­
vese que en los ensayos en los cuales se mantengan los animales en 
grupos, si los parentales mueren, no será posible expresar el resul ­
tado reproductor como número total de descendientes vivos produ ­
cidos por parental vivo al final del ensayo. En tal caso, el resultado 
reproductor debe expresarse como «número total de descendientes 
vivos producidos por parental presente al principio del ensayo».
 
1.8.1.4.  Alimentación  
En ensayos semiestáticos, la alimentación debe ser preferentemente 
diaria; en cualquier caso, tendrá una frecuencia mínima de 3 veces por semana (es decir, en correspondencia con los cambios de medio). 
Deben documentarse las desviaciones con respecto a esta pauta (por 
ejemplo, ensayos dinámicos).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Durante el ensayo, la dieta de los parentales estará formada prefe ­
rentemente por algas vivas de una o varias de las siguientes especies:  
Chlorella  sp, Selenastrum capricornutum  (ahora  Pseudokirchneriella 
subcapitata  (11) y  Scenedesmus subspicatus.  La dieta suministrada 
se basará en la cantidad de carbono orgánico (C) proporcionado a 
cada parental. Las investigaciones realizadas (12) han demostrado 
que, en el caso de  Daphnia magna,  son suficientes raciones com ­
prendidas entre 0,1 y 0,2 mg C/Dafnia/día para alcanzar el número de descendientes necesarios para cumplir los criterios de validez. La 
ración puede administrarse a una tasa constante durante todo el 
período de ensayo o, si se prefiere, a una tasa inferior al principio que se va incrementando en función del crecimiento de los parenta ­
les. No obstante, en este caso, las raciones deben permanecer en todo 
momento dentro del intervalo recomendado de 0,1 a 0,2 mg C/ Daf­
nia/día. 
Si es preciso recurrir a parámetros indirectos, como el número de 
células de algas o la absorbancia luminosa, para determinar la ración 
adecuada (por razones de comodidad, pues medir el contenido de 
carbono requiere mucho tiempo), cada laboratorio debe crear su propio nomograma para la medición indirecta del contenido de car ­
bono del cultivo de algas (véanse algunos consejos sobre construc ­
ción de nomogramas en el apéndice 2). Los nomogramas deben 
revisarse al menos una vez al año, y con mayor frecuencia si cam ­
bian las condiciones de los cultivos de algas. Se ha observado que la 
absorbancia luminosa proporciona una indicación del contenido de 
carbono mejor que el número de células (13). 
Para reducir al mínimo el volumen de medio de cultivo de algas 
trasvasado a los recipientes de ensayo, la suspensión de algas admi ­
nistrada a  Dafnia  como alimento debe ser concentrada. Las algas 
pueden concentrarse mediante centrifugación seguida de resuspen ­
sión en agua destilada, agua desionizada o medio de cultivo de  
Dafnia .
 
1.8.1.5.  Iluminación  
16 horas de luz a una intensidad no superior a 15-20 μE m  -2 s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatura  
La temperatura del medio de ensayo debe encontrarse en el intervalo 
18-22  o C. No obstante, en un mismo ensayo, la temperatura no debe 
variar, a ser posible, más de 2  o C dentro de estos límites (por 
ejemplo, 18-20, 19-21 o 20-22  o C). Puede ser conveniente utilizar 
un recipiente de ensayo adicional con el fin de vigilar la temperatura.  
1.8.1.7.  Aireación  
Los recipientes de ensayo no recibirán aireación durante el ensayo.  
1.8.2.  Concentraciones de ensayo  
Normalmente se prepararán al menos 5 concentraciones de ensayo en 
una serie geométrica con un factor de separación preferentemente no 
superior a 3,2; también hay que usar un número apropiado de reci ­
pientes en paralelo con cada concentración de ensayo (véase el punto 1.8.1.3). Si se usan menos de 5 concentraciones, hay que justificarlo. 
Las sustancias no deben someterse a ensayo en concentraciones 
superiores a su límite de solubilidad en el medio de ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Al determinar la gama de concentraciones, debe tenerse en cuenta lo 
siguiente: 
i) si el objetivo es determinar los valores LOEC y NOEC, la con ­
centración de ensayo mínima ha de ser lo suficientemente baja para que la fecundidad a esa concentración no sea significativa ­
mente inferior a la del control. En caso contrario, será necesario 
repetir el ensayo a una concentración mínima menor; 
ii) si el objetivo es determinar los valores LOEC y NOEC, la con ­
centración de ensayo máxima ha de ser lo suficientemente alta 
para que la fecundidad a esa concentración sea significativa ­
mente inferior a la del control. En caso contrario, será necesario repetir el ensayo a una concentración máxima mayor; 
iii) si se estima el valor de EC
 X para los efectos sobre la reproduc ­
ción, es aconsejable usar concentraciones suficientes para definir 
dicho valor con un nivel de confianza adecuado. Si se estima la EC
 50 para los efectos sobre la reproducción, es aconsejable que 
la concentración de ensayo máxima sea superior a dicha EC  50 . 
De otro modo, aunque seguiría siendo posible estimar el EC  50 , el 
intervalo de confianza sería muy grande y no se podría evaluar satisfactoriamente la idoneidad del modelo ajustado; 
iv) A ser posible, la gama de concentraciones de ensayo no debe 
incluir ninguna concentración que ejerza un efecto estadística ­
mente significativo sobre la supervivencia de adultos, puesto que esto cambiaría la naturaleza del ensayo, que de simple ensayo de reproducción se transformaría en un ensayo de re ­
producción y mortalidad, que exige un análisis estadístico mu ­
cho más complejo. 
El conocimiento previo de la toxicidad de la sustancia de ensayo 
(derivado, por ejemplo, de estudios de toxicidad aguda y de deter ­
minación de gama) ayudará a elegir las concentraciones de ensayo adecuadas. 
Si se usa un disolvente o un dispersante para facilitar la preparación 
de las soluciones de ensayo (véase el punto 1.6.4), su concentración 
final en los recipientes de ensayo no sobrepasará el valor de 0,1 ml/l, y será igual en todos los recipientes.
 
1.8.3.  Controles  
Además de la serie de ensayo, debe realizarse una serie de control 
con el medio de ensayo y, si procede, otra que contenga el disol ­
vente o el dispersante. En este caso, la concentración de disolvente o 
dispersante ha de ser igual a la usada en los recipientes que contie ­
nen la sustancia de ensayo. Hay que emplear el número adecuado de 
recipientes en paralelo (véase el punto 1.8.1.3). 
Por lo general, en un ensayo bien ejecutado, el coeficiente de varia ­
ción con respecto al número medio de supervivientes vivos produ ­
cido por cada parental de control debe ser ≤ 25 %; este valor debe 
documentarse para diseños de ensayo en los que se usen animales 
mantenidos por separado.  
1.8.4.  Renovación del medio de ensayo  
La frecuencia de renovación del medio depende de la estabilidad de 
la sustancia de ensayo, pero debe ser al menos de 3 veces por semana. Si de los ensayos de estabilidad preliminares (véase el punto 
1.4) se deduce que la concentración de la sustancia de ensayo no es 
estable (es decir, si está fuera del intervalo comprendido entre el 80 y el 120 % del valor nominal o si cae por debajo del 80 % de la concentración inicial medida) a lo largo del período de renovación 
máximo (3 días), hay que considerar la renovación más frecuente del 
medio o la realización de un ensayo dinámico.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Al renovar el medio en ensayos semidinámicos, se prepara una 
segunda serie de recipientes de ensayo y los parentales se transfieren 
a estos con ayuda, por ejemplo, de una pipeta de vidrio de diámetro adecuado. El volumen de medio transferido con los ejemplares de  
Dafnia  debe reducirse al mínimo.
 
1.8.5.  Observaciones  
Los resultados de las observaciones hechas durante el ensayo deben 
consignarse en fichas de datos (véanse ejemplos en los apéndices 3 y 
4). Si hacen falta otras mediciones (véanse los puntos 1.3 y 1.8.8), puede ser necesario realizar más observaciones.
 
1.8.6.  Descendientes  
Preferiblemente, los descendientes producidos por cada parental se 
retirarán y contarán a diario desde el nacimiento de la primera ca ­
mada para evitar que consuman el alimento destinado al adulto. A 
los efectos de este método, solo es necesario contar el número de descendientes vivos, aunque debe registrarse la presencia de huevos abortados o de descendientes muertos.
 
1.8.7.  Mortalidad  
La mortalidad de los parentales se registrará preferiblemente a diario 
y al menos en las mismas ocasiones en que se cuenten los descen ­
dientes.  
1.8.8.  Otras variables  
Aunque este método se ha diseñado principalmente para evaluar los 
efectos sobre la reproducción, quizá sea posible cuantificar otros 
efectos en medida suficiente para admitir el análisis estadístico. 
Las determinaciones relativas al crecimiento son muy interesantes, pues aportan información sobre posibles efectos subletales que pue ­
den resultar más útiles que la simple determinación relativa a la 
reproducción; es recomendable proporcionar la determinación rela ­
tiva a los parentales (la longitud del cuerpo sin contar la espina anal) al término del ensayo. Otras variables que podrían medirse o calcu ­
larse son el tiempo transcurrido hasta la producción de la primera 
camada (y de las siguientes), el número y el tamaño de las camadas 
por animal, el número de cama-das abortadas, la presencia de ma ­
chos o efipios y la tasa intrínseca de aumento de la población.
 
1.8.9.  Frecuencia de los análisis y mediciones  
La concentración de oxígeno, la temperatura, la dureza y el pH 
deben medirse al menos una vez a la semana en los medios nuevo 
y antiguo, en los controles y a la concentración máxima de la sus ­
tancia de ensayo. 
Durante el ensayo, las concentraciones de la sustancia analizada 
deben determinarse a intervalos regulares. 
En ensayos semiestáticos en los que se espere que la concentración 
de la sustancia de ensayo se mantenga dentro del ± 20 % de la concentración nominal (es decir, en el intervalo del 80-120 %, véanse los puntos 1.4 y 1.8.4), se recomienda que las concentracio ­
nes de ensayo máxima y mínima se analicen recién preparadas y en 
el momento de su renovación al menos una vez durante la primera semana del ensayo (es decir, los análisis deben efectuarse en una muestra de la misma solución, recién preparada y en el momento de 
su renovación). A partir de este momento, las determinaciones han 
de repetirse a intervalos al menos semanales.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
En ensayos en los que no se espere que la concentración de la 
sustancia de ensayo se mantenga dentro del ± 20 % de la concen ­
tración nominal, es preciso analizar todas las concentraciones de ensayo recién preparadas y en el momento de su renovación. No obstante, en los ensayos en los que la concentración inicial 
medida de la sustancia de ensayo no esté dentro del ± 20 % de la 
concentración nominal, pero en los que puedan aportarse pruebas suficientes de que las concentraciones iniciales son repetibles y esta ­
bles (es decir, que están dentro del intervalo del 80-120 % de la 
concentración inicial), las determinaciones químicas podrían limitarse 
en las semanas 2 y 3 del ensayo a las concentraciones máxima y mínima. En todos los casos, la determinación de las concentraciones de la sustancia de ensayo antes de la renovación solo debe realizarse 
en un recipiente en paralelo de cada concentración de ensayo. 
Para los ensayos dinámicos es apropiado un régimen de muestreo 
similar al descrito para los semiestáticos (si bien en este caso no cabe 
hacer determinaciones antes de renovar las soluciones). Sin embargo, 
puede ser aconsejable aumentar el número de ocasiones de muestreo durante la primera semana (tres series de mediciones, por ejemplo) para garantizar que las concentraciones de ensayo permanezcan esta ­
bles. En esta clase de ensayos, los regímenes de flujo de diluyente y 
sustancia de ensayo deben verificarse a diario. 
Si se demuestra que la concentración de la sustancia de ensayo se ha 
mantenido satisfactoriamente a lo largo de todo el ensayo dentro de un intervalo de ± 20 % de la concentración nominal o de la medida inicialmente, los resultados pueden basarse en los valores nominales 
o medidos inicialmente. Si la desviación con respecto a la concen ­
tración nominal o inicial medida es superior al ± 20 %, los resultados deben expresarse en términos de media ponderada en función del tiempo (véase el apéndice 5).
 
2. RESULTADOS E INFORME  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
El objeto de este ensayo es determinar el efecto de la sustancia de 
ensayo sobre el número total de descendientes vivos producidos por 
cada parental vivo al final del mismo. El número total de descen ­
dientes por parental debe calcularse para cada recipiente de ensayo (es decir, para cada recipiente en paralelo). Si en uno cualquiera de los recipientes en paralelo el parental muere durante el ensayo o 
resulta ser macho, dicho recipiente se excluye del análisis. Por tanto, 
este se basará en un número reducido de recipientes en paralelo. 
Para estimar la LOEC y, por tanto, la NOEC, correspondiente a los 
efectos del producto químico sobre el resultado reproductor, es pre ­
ciso calcular el resultado reproductor medio de los recipientes en paralelo para cada concentración y la desviación estándar residual 
acumulada, lo que puede hacerse mediante un análisis de la varianza 
(ANOVA). A continuación se compara la media obtenida a cada concentración con la del control aplicando un método de compara ­
ción múltiple apropiado. Las pruebas de Dunnett o Williams pueden 
ser útiles (14) (15) (16) (17). Hay que comprobar si se sostiene la 
hipótesis del ANOVA de homogeneidad de la varianza. Es recomen ­
dable realizar esta verificación gráficamente en lugar de mediante una prueba formal de significación (18); una alternativa adecuada 
es aplicar una prueba de Bartlett. Si la hipótesis no se sostiene, 
hay que considerar la transformación de los datos para homogeneizar las varianzas antes de aplicar el ANOVA, o bien la realización de un ANOVA ponderado. Hay que calcular y documentar la magnitud del 
efecto detectable con el ANOVA (es decir, la mínima diferencia 
significativa).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Para estimar la concentración que provocaría la reducción en un 
50 % del resultado reproductor (es decir, la EC  50 ), hay que ajustar 
a los datos una curva adecuada, tal como la curva logística, mediante un método estadístico como el de los mínimos cuadrados. La curva puede parametrarse de manera que la EC
 50 y su error estándar pue ­
dan estimarse directamente. Esto facilitará considerablemente el cál ­
culo de los límites de confianza en torno a la EC  50 . Salvo que haya 
razones de peso para preferir otros, deben darse límites de confianza bilaterales del 95 %. El método de ajuste debe proporcionar prefe ­
rentemente un medio para evaluar la significación de la falta de 
ajuste. Esto puede hacerse gráficamente o dividiendo la suma resi ­
dual de cuadrados en «falta de ajuste» y «componentes de error puro» y efectuando una prueba de significación para la falta de 
ajuste. Como los tratamientos que inducen fecundidad elevada tienen 
más probabilidades de inducir una varianza más elevada del número de inmaduros producidos que aquellos que inducen fecundidad re ­
ducida, hay que considerar la conveniencia de ponderar los valores 
observados de manera que reflejen las distintas varianzas de los 
diferentes grupos de tratamiento [véase información de tipo general en la referencia (18)]. 
En el análisis de los datos del estudio final interlaboratorios (2) se ha 
ajustado una curva logística usando el modelo siguiente, aunque 
pueden usarse otros adecuados:
 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
donde: 
Y = número total de inmaduros por parental vivo al final del 
ensayo (calculado para cada recipiente) 
x = concentración de sustancia 
c = número esperado de inmaduros cuando x = 0 
x 0 = EC  50 en la población 
b = parámetro «pendiente». Este modelo será probablemente adecuado en gran número de situa ­
ciones, pero habrá ensayos para los cuales no sea apropiado. Es 
preciso comprobar la validez del modelo tal como se ha sugerido en párrafos anteriores. En algunos casos puede estar indicado un modelo de hormesis, según el cual concentraciones bajas producen 
efectos amplificados (19). 
También pueden estimarse otras concentraciones que provoquen un 
porcentaje de efecto determinado, como la EC
 10 o EC  20 , aunque 
quizá sea preferible parametrar el modelo de una forma distinta a la empleada para estimar la EC
 50 . 
2.2. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
2.2.1.  Sustancia de ensayo:  
— naturaleza física y propiedades fisicoquímicas pertinentes,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— identificación química, incluida la pureza.  
2.2.2.  Especie sometida a ensayo:  
— clon (si se ha tipificado genéticamente), proveedor u origen (si se 
conoce) y condiciones de cultivo aplicadas. Si se ha usado una 
especie distinta de  Daphnia magna,  debe consignarse y justifi ­
carse.  
2.2.3.  Condiciones de ensayo:  
— método de ensayo utilizado (por ejemplo, semiestático o dinámi ­
co, con indicación de volumen y carga expresada en número de individuos de  Dafnia  por litro), 
— fotoperíodo e intensidad luminosa, — diseño del ensayo (por ejemplo, número de recipientes en para ­
lelo, número de parentales por recipiente en paralelo), 
— detalles del medio de cultivo usado, — si se usan, complementos de materia orgánica, con su composi ­
ción, origen, método de preparación, TOC/COD de las prepara ­
ciones madre, estimación de los valores TOC/COD obtenidos en 
el medio de ensayo, 
— información detallada de la alimentación, con indicación de la 
cantidad (en mg C/ Dafnia /día) y el programa (tipo de alimento, 
con indicación en su caso del nombre específico (especie) del alga y, si se conocen, la cepa y las condiciones de cultivo), 
— método de preparación de las soluciones madre y frecuencia de 
renovación (si se usan, hay que indicar el disolvente o disper ­
sante y su concentración).
 
2.2.4.  Resultados:  
— resultados de cualesquiera estudios preliminares de estabilidad de 
la sustancia de ensayo, 
— concentraciones de ensayo nominales y resultados de todos los 
análisis para determinar la concentración de la sustancia de en ­
sayo en los recipientes de ensayo (véase un ejemplo de ficha de 
datos en el apéndice 4); también deben indicarse la eficiencia de 
recuperación del método y el límite de determinación, 
— calidad del agua en los recipientes de ensayo (pH, temperatura y 
concentración de oxígeno disuelto además de TOC y COD y dureza cuando proceda) (véase un ejemplo de ficha de datos 
en el apéndice 3), 
— registro completo de los descendientes vivos de cada parental 
(véase un ejemplo de ficha de datos en el apéndice 3), 
— número de muertes entre los parentales y día en que se hayan 
producido (véase un ejemplo de ficha de datos en el apéndice 3), 
— coeficiente de variación de la fecundidad de los controles (basada 
en el número total de descendientes vivos por parental vivo al final del ensayo), 
— representación gráfica del número total de descendientes vivos 
por parental (para cada recipiente en paralelo) vivo al final del 
ensayo frente a concentración de la sustancia de ensayo, 
— concentración mínima con efecto observado (LOEC) para la re ­
producción, acompañada de una descripción de los métodos es ­
tadísticos aplicados y de una indicación de la magnitud del efecto detectable; concentración (máxima) sin efecto observado (NOEC) 
para la reproducción; si procede, valores de LOEC y NOEC para 
la mortalidad de los parentales,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— si procede, EC  X para la reproducción e intervalos de confianza, 
así como una representación gráfica del modelo ajustado usado 
para su cálculo, la pendiente de la curva dosis-respuesta y su error estándar, 
— otros efectos biológicos observados o medidos; hay que docu ­
mentar todos los demás efectos biológicos observados o medidos 
(crecimiento de los parentales, por ejemplo) y la correspondiente 
justificación, 
— explicación de cualquier desviación respecto al método de ensayo.
 
3. REFERENCIAS  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993. 
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997. 
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A. M. V. M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia  magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265. 
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  
Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33. 
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Or ­
ganisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), 
USEPA, Cincinnati, Ohio. 
(6) Vigano L, (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna.  Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, pp. 775-782. 
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 
88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. 20 pp. 
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; pro ­
blems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Con ­
ference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148. 
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia  magna.  
Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8. 
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196. 
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, 
F-1990. Biologice Prace, 36, 209. 
(12) Sims 1. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a stan ­
dard Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459-466. 
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control.]. Amer. Statist. 
Assoc., 50, pp. 1096-1121. 
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491. 
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103-117. 
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531. 
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y. 
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, pp. 93-96. 
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Popu ­
lation Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers. 
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, pp. 
532. 
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
Apéndice 1  
PREPARACIÓN DE MEDIOS ELENDT M7 Y M4 TOTALMENTE 
DEFINIDOS  
Aclimatación a los medios Elendt M7 y M4  
Algunos laboratorios han tenido dificultades para transferir directamente Dafnia a 
los medios M4 (1) y M7. Se han obtenido resultados bastante buenos con una 
aclimatación gradual, esto es, cambiando del medio propio a Elendt al 30 %, luego al 60 % y por último al 100 %. El período de aclimatación necesario puede ser bastante largo, incluso de un mes.
 
PREPARACIÓN  
Oligoelementos  
Se empieza por preparar soluciones madre distintas (I) de cada oligoelemento en 
agua de pureza apropiada (desionizada, destilada o tratada mediante ósmosis 
inversa). A partir de estas soluciones madre (I) se prepara una única solución 
madre (II) que contiene todos los oligoelementos (solución combinada):  
Soluciones madre I 
(una sola sustancia) Cantidad añadida 
al agua 
(mg/l) Concentración (en 
relación con el 
medio M4) 
(veces) Para preparar la solución madre II 
combinada, se añade al agua la siguiente 
cantidad de solución madre 
I (ml/l) 
M 4 M 7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 0 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 0 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 0 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Las soluciones Na  2 EDTA v FeSO  4 se preparan por separado, se vierten juntas y se esterilizan en autoclave inmedia ­
tamente. Se obtiene así: 
Solución 21 Fe-EDTA 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
Medios M4 y M7  
Los medidos M4 y M7 se preparan a partir de la solución madre II con los 
macronutrientes y las vitaminas que siguen:  
Cantidad añadida 
al agua 
(mg/l) Concentración (en 
relación con el 
medio M4) 
(vecces) Cantidad de solución madre añadida 
para preparar el medio 
(ml/l) 
M 4 M 7  
Solución madre II (combinación de oli-goe ­
lementos) II 20 50 50 
Soluciones madre de macronutrientes (una sustancia por solución) 
CaCl  2 * 2 H  2 0 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Solución madre de vitaminas combinadas — 10 000 0,1 0,1 La solución madre de vitaminas combinadas se prepara añadiendo las 3 vitaminas a 1 litro de agua como se indica a 
continuación: 
Clorhidrato de tiamina 750 10 000 — — 
Cianocobalamina (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotina 7,5 10 000 — —  
La solución madre de vitaminas combinadas se conserva congelada en pequeñas partes alícuotas. Las vitaminas se incorporan a los  
medios poco antes de usarlos.  
Notas:  Para evitar la precipitación de las sales al preparar los medios completos, se incorporan las partes alícuotas de las solucion es 
madre a aproximadamente 500-800 ml de agua desionizada y a continuación se completa hasta obtener 1 litro. 
La primera publicación del medio M4 puede encontrarse en Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultras ­
tructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154. pp. 25-33.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
Apéndice 2  
ANÁLISIS DEL CARBONO ORGÁNICO TOTAL (TOC) Y 
ELABORACIÓN DE UN NOMOGRAMA DEL CONTENIDO EN COT 
DEL ALIMENTO DE ALGAS  
Es sabido que el contenido en carbono del alimento de algas no suele medirse 
directamente, sino por medio de correlaciones (es decir, de nomogramas) con 
medidas indirectas, como el número de células de algas o la absorbancia de luz. 
El TOC debe medirse por oxidación a alta temperatura y no con los métodos UV 
o del persulfato. (Véase: The Instrumental Determination of Total Organic Car ­
bon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 
High Holborn, London WC1V 6HB). 
Para elaborar el nomograma, las algas se separan del medio de crecimiento por 
centrifugación seguida de resuspensión en agua destilada. Se mide la variable indirecta y la concentración de TOC en cada una de las muestras por triplicado. Hay que analizar controles con agua destilada únicamente y deducir la concen ­
tración de TOC a partir de la observada en la muestra de algas. 
El nomograma debe ser lineal dentro del intervalo necesario de concentraciones 
de carbono. A continuación se ilustran algunos ejemplos.  
Nota:  No deben usarse para hacer conversiones; es esencial que cada laboratorio 
prepare sus propios nomogramas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
Apéndice 3  
EJEMPLO DE FICHA DE DATOS RELATIVA A LA RENOVACIÓN DEL MEDIO, LA VIGILANCIA FISICOQUÍMICA Y LA ALIMENTACIÓN, REPRODUCCIÓN Y 
MORTALIDAD DE ADULTOS DE DAFNIA  
Experimento N  o : Fecha de inicio: Clon: Medio: Tipo de alimento: Sustancia de ensayo: Concentración nominal: 
Día 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Renov. medio (mar ­
car) 
pH nuevo 
antiguo 
O 2 mg/l neuevo 
antiguo 
Temperatura (  o C) nuevo 
antiguo 
Aporte alim. 
N o descendientes 
vivos (  1 ) Total 
Recipiente 1 
2 
3 
4 5
 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Experimento N  o : Fecha de inicio: Clon: Medio: Tipo de alimento: Sustancia de ensayo: Concentración nominal: 
Día 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Total 
Mortalidad acumulada adul- 
tos (
 2 ) 
( 1 ) Las camadas abortadas se registran escribiendo «AB» en la casilla correspondiente. 
( 2 ) La mortalidad de los animales adultos se registra escribiendo «M» en la casilla correspondiente.
 Apéndice 4  
EJEMPLO DE FICHA DE DATOS RELATIVA A LOS RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS QUÍMICOS  
(a) Concentraciones medidas  
Concentración 
nominal Muestra semana 1 Muestra semana 2 Muestra semana 3 
Después de la 
renovación Antes de la re ­
novación Después de la 
renovación Antes de la re ­
novación Después de la 
renovación Antes de la re ­
novación  
(b) Concentraciones medidas en porcentaje de la nominal  
Concentración 
nominal Muestra semana 1 Muestra semana 2 Muestra semana 3 
Después de la 
renovación Antes de la re ­
novación Después de la 
renovación Antes de la re ­
novación Después de la 
renovación Antes de la re ­
novación  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
Apéndice 5  
CÁLCULO DE UNA MEDIA PONDERADA EN FUNCIÓN DEL TIEMPO  
Media ponderada en función del tiempo  
Puesto que la concentración de la sustancia de ensayo puede disminuir a lo largo 
del tiempo comprendido entre las sucesivas renovaciones del medio, es preciso 
considerar cuál es la concentración que debe elegirse como representativa de la 
gama de concentraciones aplicadas a los parentales de Dafnia. La elección debe basarse en consideraciones biológicas y estadísticas. Si, por ejemplo, se piensa que la mayor influencia en la reproducción la ejerce la máxima concentración 
aplicada, debe usarse este valor máximo. En cambio, si se considera más impor ­
tante el efecto acumulado o a plazo más largo, la concentración media es más relevante. En este caso, una media apropiada es la concentración media ponde ­
rada en función del tiempo, pues tiene en cuenta la variación de la concentración 
instantánea a lo largo del tiempo.
 
figura 1  
Ejemplo de media ponderada en función del tiempo
  
La figura 1 ilustra un ejemplo de ensayo (simplificado) de 7 días de duración en 
el cual el medio se renueva los días 0, 2 y 4. 
— La línea delgada en zigzag representa la concentración a lo largo del tiempo. 
Se supone que el descenso de la concentración es exponencial. 
— Los 6 puntos representados corresponden a las concentraciones medidas al 
principio y al final de cada período de renovación. 
— La línea gruesa indica la posición de la media ponderada en función del 
tiempo. 
La media ponderada en función del tiempo se calcula de manera que el área 
situada bajo ella sea igual al área situada bajo la curva de concentración. El 
cálculo correspondiente al ejemplo anterior se ilustra en el cuadro 1.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Cuadro 1  
Cálculo de la media ponderada en función del tiempo  
Renovación n  o Días Conc0 Conc1 Ln(Conc0) Ln(Conc1) Área  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Días totales: 7 Área total 50,091 
Media PT 7,156
 
Días : número de días del período de renovación.  
Conc0 : concentración medida al principio de cada período de renovación.  
Conc1 : concentración medida al final de cada período de renovación.  
Ln(Conc0) : logaritmo natural de Conc0.  
Área : área comprendida bajo la curva exponencial para cada período de renovación. Se 
calcula como sigue:  
Ln(Conc1) : logaritmo natural de Conc1.  
Area ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü Days  
La media ponderada en función del tiempo  (Media P T) es igual al  Área total  
dividida por los  Días totales . 
Naturalmente, en el caso de un ensayo de reproducción de  Dafnia , el cuadro 
debería cubrir 21 días. 
Es obvio que, si solo se hacen observaciones al principio y al final de cada 
período de renovación, es imposible confirmar que el proceso de disminución 
sea, en efecto, exponencial. Una curva distinta daría lugar a un cálculo de  Área  
distinto. En cualquier caso, la disminución exponencial es una hipótesis plausi ­
ble, y esta es probablemente la curva mejor a falta de más datos. 
Es preciso hacer una advertencia para el caso de que el análisis químico no logre 
detectar ninguna sustancia al final del período de renovación. Salvo que se pueda 
estimar la velocidad con que la sustancia desaparece de la solución, será imposi ­
ble obtener un área bajo la curva realista y, por tanto, obtener una media pon ­
derada en función del tiempo que sea razonable.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  MICROORGANISMOS DEL SUELO: ENSAYO DE 
TRANSFORMACIÓN DEL NITRÓGENO  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 216 (2000).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
Este método de ensayo es un método de laboratorio destinado a 
investigar los efectos a largo plazo de productos químicos, tras una exposición única, en la transformación del nitrógeno por los microorganismos del suelo. El ensayo se basa principalmente en 
las recomendaciones de la Organización Europea y Mediterránea 
para la Protección de las Plantas (1). Sin embargo, se han tenido en cuenta otras directrices, como las del Biologische Bundesanstalt (2) de Alemania, la Environmental Protection Agency de los Estados 
Unidos (3) la Sociedad de Química y Toxicología Medioambientales  
(Society of Environmental Toxicology and Chemistry,  SETAC) (4) y 
la Organización Internacional de Normalización (ISO) (5). En un taller de la OECD sobre selección de suelos/sedimentos, celebrado 
en Belgirate, Italia, en 1995 (6) se acordó el número y el tipo de 
suelos que deben usarse en este ensayo. Las recomendaciones sobre recogida, manejo y almacenamiento de muestras de suelo se basan en un documento orientativo de la ISO (7) y en las recomendaciones 
del taller de Belgirate. En la valoración y evaluación de las caracte ­
rísticas de las sustancias de ensayo, puede resultar necesaria la de ­
terminación de los efectos de la actividad microbiana en el suelo, por ejemplo, cuando se requieran datos sobre los posibles efectos secun ­
darios de los productos fitosanitarios en la microflora del suelo o 
cuando sea previsible la exposición de los microorganismos del suelo a los productos químicos distintos de los fitosanitarios. El ensayo de transformación del nitrógeno se lleva a cabo para determinar los 
efectos de estos productos químicos en la microflora del suelo. Si 
se ensayan productos agroquímicos (por ejemplo, productos fitosa ­
nitarios, abonos y productos químicos para la silvicultura), se lleva ­
rán a cabo tanto ensayos de transformación del nitrógeno como del 
carbono. Si se ensayan productos no agroquímicos, es suficiente el 
ensayo de transformación del nitrógeno. Sin embargo, si los valores EC
 50 del ensayo de transformación del nitrógeno de estos productos 
químicos se sitúan dentro del intervalo encontrado para los inhibi ­
dores de la nitrificación disponibles en el comercio (por ejemplo, la 
nitrapirina), puede hacerse un ensayo de transformación del carbono para obtener más información. 
Los suelos están formados por componentes vivos y no vivos que se 
dan en mezclas complejas y heterogéneas. Los microorganismos 
desempeñan un papel importante en la descomposición y transfor ­
mación de la materia orgánica en los suelos fértiles. Existen muchas especies que contribuyen de diversas maneras a la fertilidad del suelo. Cualquier interferencia a largo plazo en estos procesos bio ­
químicos podría perturbar el ciclo de los nutrientes y alterar la fer ­
tilidad del suelo. La transformación del carbono y del nitrógeno se da en los suelos fértiles. Aunque las comunidades microbianas res ­
ponsables de estos procesos difieren de unos suelos a otros, las vías 
de transformación son esencialmente las mismas. 
Este método de ensayo está destinado a detectar los efectos negativos 
a largo plazo de una sustancia en el proceso de transformación del nitrógeno en los suelos aerobios de superficie. El método también permite calcular los efectos de una sustancia en la transformación del 
carbono por la microflora del suelo. La formación de nitratos se 
produce tras la degradación de los enlaces carbono-nitrógeno. Por tanto, si se encuentran índices iguales de producción de nitratos en suelos tratados y suelos de control, es muy probable que las princi ­
pales rutas de degradación del carbono estén intactas y funcionales. 
El sustrato elegido para el ensayo (la harina de alfalfa) tiene una proporción carbono/nitrógeno favorable (normalmente entre 12/1 y 16/1). Por eso, la privación de carbono durante el ensayo es reducida 
y las comunidades microbianas, si resultan dañadas por una sustancia 
química, pueden recobrarse dentro de un plazo de 100 días.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Los ensayos a partir de los cuales se desarrolló este método estaban 
pensados principalmente para sustancias respecto a las cuales puede 
preverse la cantidad que llegará al suelo. Este es el caso, por ejem ­
plo, de los productos fitosanitarios cuyo índice de aplicación al campo es conocido. Para los productos agroquímicos, es suficiente 
el ensayo de 2 dosis con arreglo al índice de aplicación estimado o 
previsto. Los productos agroquímicos pueden someterse a ensayo en forma de principios activos (p.a.) o de productos formulados. Sin embargo, el ensayo no se limita a los productos agroquímicos. Cam ­
biando tanto las cantidades de la sustancia de ensayo aplicada al 
suelo como la manera en que se evalúan los datos, el ensayo puede usarse también para productos químicos cuando se desconozca la cantidad de estos que llegará al suelo. De este modo, en el caso 
de los productos químicos distintos de los agrícolas, se determinan 
los efectos de una serie de concentraciones en la transformación del nitrógeno. A continuación, se utilizan los datos de estos ensayos para trazar una curva dosis-respuesta y calcular los valores EC
 X , donde x 
es el porcentaje de efecto definido.  
1.2. DEFINICIONES  
Transformación del nitrógeno:  es la degradación última por mi ­
croorganismos de materia orgánica que contenga nitrógeno, mediante un proceso de amonificación y nitrificación, hasta llegar al nitrato 
inorgánico respectivo.  
EC
 X (concentración efectiva):  es la concentración de la sustancia 
de ensayo en el suelo que da lugar a un porcentaje x de inhibición de la transformación de nitrógeno en nitrato.  
EC
 50 (concentración efectiva mediana):  es la concentración de la 
sustancia de ensayo en el suelo que da lugar a un 50 % de inhibición de la transformación de nitrógeno en nitrato.
 
1.3 COMPUESTOS DE REFERENCIA 
Ninguno.  
1.4 PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Al suelo tamizado se le añade harina vegetal y, a continuación, se 
trata una parte con la sustancia de ensayo y se deja la otra sin tratar 
(control). Cuando se ensayen productos agroquímicos, se recomienda un mínimo de 2 concentraciones de ensayo, que deben elegirse en relación con la concentración más alta prevista para el campo. Des ­
pués de 0,7, 14 y 28 días de incubación, se extraen muestras de 
suelos tratados y de control con un disolvente apropiado y se deter ­
minan las cantidades de nitrato en los extractos. El índice de forma ­
ción de nitratos en las muestras tratadas se compara con el de las de 
control y se calcula el porcentaje de desviación de las muestras tratadas respecto a las de control. Todos los ensayos tendrán una duración mínima de 28 días. Si, al 28
 o día, la diferencia entre los 
suelos tratados y los no tratados es igual o superior al 25 %, se 
continuarán las mediciones hasta un máximo de 100 días. Cuando se ensayen productos químicos no agrícolas, se añadirá a las muestras de suelo una serie de concentraciones de la sustancia de ensayo y se 
medirán al cabo de 28 días de incubación la cantidades de nitratos 
formadas en las muestras tratadas y de control. Los resultados de los ensayos con concentraciones múltiples se analizarán utilizando un modelo de regresión y se calcularán los valores EC
 X (es decir, EC  50 , 
EC 25 y/o EC  10 ). Véanse las definiciones.  
1.5. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Las evaluaciones de los resultados de los ensayos se basan en dife ­
rencias relativamente pequeñas (es decir, un valor medio de ± 25 %) entre concentraciones de nitratos en las muestras tratadas y de con ­
trol, de modo que grandes variaciones en las muestras de control 
pueden dar lugar a resultados falsos. Por ello, la variación entre 
muestras de control en paralelo debe ser inferior al ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.6.1.  Equipo  
Se utilizarán recipientes de ensayo hechos de material químicamente 
inerte. Estos recipientes deben ser de capacidad adecuada de acuerdo 
con el procedimiento utilizado para la incubación de suelos, es decir, 
incubación en una muestra única o en una serie de muestras sepa ­
radas (véase el punto 1.7.1.2). Hay que procurar reducir al mínimo la pérdida de agua y permitir el intercambio de gas durante el ensayo 
(por ejemplo, los recipientes pueden cubrirse con láminas de polie ­
tileno perforado). Cuando se ensayen sustancias volátiles, deben usarse recipientes sellables y herméticos cuyo tamaño sea tal que 
aproximadamente un cuarto de su volumen esté ocupado por la 
muestra de suelo. 
Se utilizará equipo de laboratorio estándar, incluyendo: — mecanismo de agitación: agitador mecánico o equipo equivalente, — dispositivo de centrifugado (3 000 g) o filtrado (utilizando papel 
de filtro sin nitratos), 
— instrumental de sensibilidad y reproductibilidad adecuadas para el 
análisis de nitratos.
 
1.6.2.  Selección y número de suelos  
Se utilizará un único suelo cuyas características recomendadas serán 
las siguientes: 
— contenido de arena: entre el 50 % y el 75 %, 
— pH: 5,5-7,5, — contenido de carbono orgánico: 0,5-1,5 % — debe medirse la masa microbiana (8) (9), cuyo contenido de 
carbono tiene que ser al menos el 1 % del total de carbono 
orgánico en el suelo. 
En la mayoría de los casos, un suelo con estas características repre ­
senta la situación más desfavorable, ya que la adsorción de la sus ­
tancia química de ensayo es mínima y su disponibilidad para la 
microflora es máxima. Por lo tanto, no son necesarios, por lo gene ­
ral, ensayos de otros suelos. Sin embargo, en algunas circunstancias, por ejemplo, cuando la sustancia de ensayo esté indicada principal ­
mente para determinados suelos, como los suelos forestales ácidos, o 
en el caso de productos químicos cargados electrostáticamente, 
puede resultar necesario utilizar algún otro suelo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Recogida y almacenamiento de muestras de suelo  
1.6.3.1.  Recogida  
Deberá contarse con información detallada sobre la historia del 
campo de donde se recoja la tierra para el ensayo. Se necesitan 
datos, entre otras cosas, de la localización exacta, la cubierta vegetal, 
fechas de tratamiento con productos fitosanitarios, tratamientos con abonos orgánicos e inorgánicos, aplicación de sustancias biológicas o contaminación accidental. El lugar elegido para la recogida de suelo 
tiene que ser tal que permita un uso a largo plazo. Se consideran 
adecuados los pastos permanentes, los campos con cosechas anuales de cereales (excepto el maíz) o los abonos verdes sembrados densa ­
mente. El lugar donde se recojan las muestras no debe haberse 
tratado con productos fitosanitarios durante un mínimo de un año antes de la recogida de estas. Además, no debe haberse aplicado ningún abono orgánico durante al menos 6 meses. El uso de abonos 
minerales solo es aceptable cuando esté en concordancia con las 
necesidades del cultivo, en ese caso no deben tomarse muestras hasta transcurridos, al menos, 3 meses desde la aplicación del abono. Debe evitarse el uso de suelo tratado con abonos con efectos biocidas 
conocidos (por ejemplo, cianamida de calcio). 
Hay que evitar la toma de muestras durante o inmediatamente des ­
pués de períodos prolongados (de más de 30 días) de sequía o 
encharcamiento. En el caso de los suelos arados, deben tomarse 
muestras a una profundidad de 0 a 20 cm. Cuando se trate de pastizales u otros suelos que no se aren durante períodos más largos (al menos un ciclo de cultivo), la profundidad máxima del muestreo 
puede ser ligeramente superior a 20 cm (por ejemplo, 25 cm). 
Las muestras de suelo deben transportarse en recipientes y en con ­
diciones de temperatura que garanticen que las propiedades iniciales 
del suelo no se alteren significativamente.
 
1.6.3.2.  Almacenamiento  
Es preferible el uso de muestras de suelo recién recogidas. Si no se 
puede evitar el almacenamiento en el laboratorio, las muestras de suelo pueden guardarse en la oscuridad a 4 ± 2
 o C durante un 
máximo de 3 meses. Durante el almacenamiento, debe asegurarse 
el mantenimiento de condiciones aerobias. Si se recogen muestras de suelo de zonas que estén congeladas durante, al menos, tres meses al año, puede considerarse la posibilidad de almacenarlas durante 
6 meses a entre - 18
 o C y - 22  o C. Se medirá la biomasa microbiana 
de las muestras almacenadas antes de cada experimento. La cantidad de carbono en la biomasa debe ser como mínimo el 1 % del total de carbono orgánico de la muestra de suelo (véase el punto 1.6.2).
 
1.6.4.  Manejo y preparación del suelo para el ensayo  
1.6.4.1.  Preincubación  
Cuando las muestras de suelo hayan estado almacenadas (véase el 
punto 1.6.3.2), se recomienda preincubar durante un período de entre 2 y 28 días. La temperatura y la humedad del suelo durante la 
preincubación deben ser semejantes a las que se den durante el 
ensayo (véanse los puntos 1.6.4.2 y 1.7.1.3).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Características fisicoquímicas  
Se separarán manualmente los objetos grandes (por ejemplo, piedras, 
trozos de plantas, etc.) de la muestra de suelo y, a continuación, se tamizará la muestra por vía húmeda sin secar en exceso para obtener 
un tamaño de las partículas no superior a 2 mm. Deberá ajustarse el 
contenido de humedad de la muestra con agua destilada o desioni ­
zada para llegar a un valor entre el 40 % y el 60 % de la capacidad máxima de retención de agua.
 
1.6.4.3.  Adición de sustrato orgánico  
La muestra de suelo debe mezclarse con un sustrato orgánico ade ­
cuado, por ejemplo, harina de alfalfa-hierba-forraje verde (principal 
componente:  Medicago sativa)  con una proporción C/N entre 1271 y 
16/1. La proporción alfalfa-muestra de suelo recomendada es 5 g de alfalfa por kilo de muestra (peso en seco).
 
1.6.5.  Preparación de la sustancia de ensayo para la aplicación al suelo  
La sustancia de ensayo se aplica normalmente utilizando un vehícu ­
lo. El vehículo puede ser agua (para las sustancias solubles en el 
agua) o un sólido inerte como arena fina de cuarzo (tamaño de las 
partículas: 0,1-0,5 mm). Deben evitarse los vehículos líquidos dis ­
tintos del agua (por ejemplo, disolventes orgánicos como la acetona o el cloroformo) porque pueden dañar la microflora. Si se usa arena 
como vehículo, puede recubrirse con la sustancia de ensayo disuelta 
o suspendida en un disolvente apropiado. En tal caso, debe elimi ­
narse el disolvente por evaporación antes de mezclarse con la mues ­
tra de suelo. Para una distribución óptima de la sustancia de ensayo 
en el suelo, se recomienda una proporción de 10 g de arena por kilo de suelo (peso en seco). Las muestras de control se tratarán solo con una cantidad equivalente de agua y/o arena de cuarzo. 
Cuando se ensayen sustancias químicas volátiles, deben evitarse 
pérdidas durante el tratamiento en la medida de lo posible y habrá 
que procurar conseguir una distribución homogénea en la muestra de suelo (por ejemplo, deberá inyectarse la sustancia de ensayo en la muestra en varios sitios).
 
1.6.6.  Concentraciones de ensayo  
Cuando se ensayen productos agroquímicos, deberán utilizarse al 
menos 2 concentraciones. La concentración más baja debe corres ­
ponder, al menos, a la cantidad máxima que se prevé que llegue al 
suelo en la práctica mientras la concentración más alta tiene que ser un múltiplo de la concentración más baja. Las concentraciones de la sustancia de ensayo añadida al suelo se calcula suponiendo una 
incorporación uniforme a una profundidad de 5 cm y una densidad 
aparente del suelo de 1,5. Para los productos agroquímicos que se aplican directamente al suelo o para las sustancias químicas para las cuales puede calcularse la cantidad que llega al suelo, las concen ­
traciones de ensayo recomendadas son la máxima concentración am ­
biental prevista [Predicted Environmental Concentration (PEC)]. Las sustancias destinadas a ser aplicadas a los suelos varias veces a lo largo de un ciclo tiene que ensayarse a concentraciones resultantes 
de multiplicar la PEC por el número máximo de aplicaciones pre ­
visto. Sin embargo, la concentración superior ensayada no debe su ­
perar 10 veces el índice máximo para una aplicación. Si se ensayan productos químicos no agrícolas, se empleará una serie geométrica 
de, al menos, 5 concentraciones. Las concentraciones ensayadas han 
de cubrir el intervalo necesario para determinar los valores EC
 X . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. REALIZACIÓN DEL ENSAYO  
1.7.1.  Condiciones de exposición  
1.7.1.1.  Tratamiento y control  
Cuando se ensayen productos agroquímicos, la muestra de suelo se 
dividirá en 3 partes de igual peso. Dos partes se mezclarán con el 
vehículo que contenga el producto y la otra, con el vehículo sin el producto (control). Se recomienda un mínimo de 3 copias para am ­
bos tipos de muestras, las tratadas y las no tratadas. Cuando se 
ensayen productos químicos no agrícolas, la muestra de suelo se 
dividirá en 6 partes de igual peso. 5 de las muestras se mezclarán con el vehículo que contenga la sustancia de ensayo y la sexta, con 
el vehículo sin la sustancia. Se recomienda preparar 3 copias tanto 
para las muestras tratadas como para las de control. Debe procurarse una distribución homogénea de la sustancia de ensayo en las mues ­
tras tratadas. Durante la mezcla, se evitará la compactación de la 
muestra o la formación de grumos.
 
1.7.1.2.  Incubación de las muestras de suelo  
La incubación de las muestras de suelo puede hacerse de dos ma ­
neras: como dos muestras únicas, una de suelo tratado y otra de 
suelo no tratado, o como una serie de submuestras separadas de 
igual tamaño de suelo tratado, por una parte, y de suelo no tratado, por otra. Sin embargo, cuando se ensayen sustancias volátiles, el ensayo solo debe hacerse con una serie de submuestras separadas. 
Cuando las muestras de suelo se incuben en una muestra única, se 
prepararán grandes cantidades de suelo tratado y no tratado, y se tomarán las submuestras que deban analizarse según se necesite a lo largo del ensayo. La cantidad preparada inicialmente para las mues ­
tras tratadas y para las de control dependerá del tamaño de las 
submuestras, el número de ejemplares utilizados para el análisis y el número máximo previsto de períodos de muestreo. Las muestras de suelo incubadas como muestra única deben mezclarse bien antes 
de preparar submuestras. Cuando la incubación se haga en una serie 
de muestras separadas, las dos muestras únicas, una de suelo tratado y otra de suelo no tratado, se dividirán en el número de submuestras requerido, y estas se utilizarán según se necesite. En los experimen ­
tos en los que puedan preverse más de dos tiempos de muestreo, 
habrán de prepararse las submuestras suficientes, teniendo en cuenta los ejemplares y los tiempos de muestreo. Deberán incubarse, al menos, 3 copias de las muestras de ensayo en condiciones aerobias 
(véase el punto 1.7.1.1). Durante todos los ensayos, se utilizarán 
recipientes adecuados con suficiente espacio libre para evitar la apa ­
rición de condiciones anaerobias. Sin embargo, cuando se ensayen sustancias volátiles, el ensayo solo debe hacerse con una serie de 
submuestras separadas.
 
1.7.1.3.  Condiciones y duración del ensayo  
El ensayo se hará en la oscuridad a una temperatura de 20 ± 2  o C. 
La humedad de las muestras se mantendrá durante el ensayo entre el 
40 % y el 60 % de la capacidad máxima de retención de agua del suelo (véase el punto 1.6.4.2) con una variación máxima del ±5 %. Podrá añadirse agua destilada y desionizada según se necesite. 
La duración mínima del ensayo es de 28 días. Cuando se ensayen 
productos agroquímicos, se compararán los índices de formación de nitrato en las muestras tratadas y de control. Si estos índices difieren 
en más del 25 % al 28
 o día, se continuará el ensayo hasta que se 
obtenga una diferencia igual o menor al 25 % o bien durante un máximo de 100 días. En el caso de los productos químicos no agrícolas, se pondrá fin al ensayo a los 28 días. Al 28
 o día, se 
determinarán las cantidades de nitratos en las muestras tratadas y 
de control y se calcularán los valores EC  X . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Toma de muestras y análisis de suelos  
1.7.2.1.  Calendario de toma de muestras  
Cuando se ensayen productos agroquímicos, se hará el análisis de 
nitratos en las muestras de suelo los días 0, 7, 14 y 28. Cuando se 
necesite un ensayo prolongado, se harán nuevas mediciones a inter ­
valos de 14 de días a partir del 28o día. 
Cuando se ensayen productos químicos no agrícolas, se utilizarán 
como mínimo 5 concentraciones de ensayo y se hará el análisis de 
nitratos en las muestras de suelo al principio (día 0) y al final del 
período de exposición (28 días). Si se considera necesario, puede añadirse una medición intermedia, por ejemplo, al séptimo día. Los datos obtenidos al 28
 o día se utilizarán para hallar el valor EC  x de la 
sustancia química. Si se desea, pueden utilizarse los datos de las 
muestras de control obtenidos el día 0 para indicar la cantidad inicial de nitratos en el suelo.
 
1.7.2.2.  Análisis de las muestras de suelo  
La cantidad de nitratos formada en cada ejemplar de muestra tratado 
y de control se determinará en cada tiempo de muestreo. Los nitratos 
se extraerán de la muestra de suelo agitándola con un disolvente de 
extracción adecuado, por ejemplo, una solución 0,1 M de cloruro de potasio. Se recomienda una proporción de 5 ml de KCl por gramo equivalente de suelo en peso seco. Para optimizar la extracción, los 
recipientes que contengan la muestra de suelo y la solución de 
extracción no deberán llenarse más de la mitad. Las mezclas se agitarán a 150 rpm durante 60 minutos. A continuación, se centri ­
fugarán o filtrarán y se analizará la fase líquida para hallar los 
nitratos. Los extractos líquidos sin partículas pueden almacenarse 
antes del análisis a menos 20 ± 5
 o C hasta 6 meses.  
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMIENTO DE RESULTADOS 
Si se hacen ensayos con productos agroquímicos, deberán registrarse 
las cantidades de nitratos formadas en cada copia de muestra de suelo y darse en forma de tabla los valores medios de todos los 
ejemplares. Se evaluarán los índices de transformación del nitrógeno 
mediante métodos estadísticos apropiados y generalmente aceptables (por ejemplo, test-F, nivel de significación del 5 %). Las cantidades 
de nitrato formadas se expresarán en mg de nitrato/kg de muestra 
(peso seco)/día. La tasa de formación de nitrato en cada tratamiento se comparará con el de la muestra de control y se calculará el porcentaje de desviación respecto a esta. 
Cuando se ensayen productos químicos no agrícolas, se determinará 
la cantidad de nitratos formada en cada copia y se trazará una curva 
dosis-respuesta para el cálculo de los valores EC
 x . Las cantidades de 
nitratos (es decir, mg de nitratos/kg de muestra en peso seco) ha ­
lladas en las muestras tratadas a los 28 días se compararán con las 
halladas en las muestras de control. A partir de estos datos, se 
calculará los valores porcentuales de inhibición para cada concen ­
tración de ensayo. Estos porcentajes se representarán en un gráfico en función de la concentración y, a continuación, se utilizarán pro ­
cedimientos estadísticos para calcular los valores EC
 X . Los límites de 
confianza (p = 0,95) para el valor EC  X calculado se hallarán también 
utilizando procedimientos estándar (10) (11) (12). 
Las sustancias de ensayo que contengan grandes cantidades de ni ­
trógeno pueden contribuir a las cantidades de nitratos formados du ­
rante el ensayo. Si estas sustancias se ensayan a concentraciones 
altas (por ejemplo, sustancias químicas que esté previsto utilizar en aplicaciones repetidas), deben incluirse en el ensayo muestras de control apropiadas (es decir, muestra de suelo más sustancia de 
ensayo, pero sin harina vegetal). Los datos de estas muestras de 
control deben tenerse en cuenta en los cálculos de la EC
 X . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Cuando se evalúen los resultados de los ensayos con productos 
agroquímicos y la diferencia en los índices de formación de nitratos entre el tratamiento más bajo (es decir, la concentración máxima 
prevista) y la muestra de control no supere el 25 % en cualquier 
tiempo de muestreo a partir del 28
 o día, el producto podrá conside ­
rarse que no tiene influencia a largo plazo en la transformación de nitrógeno en el suelo. Cuando se evalúen los resultados de ensayos 
con sustancias químicas no agrícolas, se utilizarán los valores EC
 50 , 
EC 25 y/o EC  10 . 
3. INFORME  
El informe del ensayo debe incluir los datos siguientes: 
Identificación completa del suelo utilizado, incluyendo: 
— referencia geográfica del lugar (latitud y longitud), 
— información sobre la historia del lugar (es decir, cubierta vegetal, 
tratamientos con productos fitosanitarios, tratamientos con abo ­
nos, contaminación accidental, etc.), 
— tipo de uso (por ejemplo, suelo agrícola, bosque, etc.), 
— profundidad de muestreo (cm), 
— contenido de arena/limo/arcilla ( % peso seco), 
— pH (en agua), 
— contenido de carbono orgánico ( % peso seco), — contenido de nitrógeno ( % peso seco), 
— concentración inicial de nitratos (mg nitratos/kg peso seco), 
— capacidad de intercambio de cationes (mmol/kg), — biomasa microbiana en porcentaje del carbono orgánico total, 
— referencia de los métodos utilizados para la determinación de 
cada parámetro, 
— toda la información sobre la recogida y almacenamiento de las 
muestras de suelo, 
— datos de la preincubación del suelo, si procede. Sustancia de ensayo: 
— naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas, 
— identificación química, en su caso, incluyendo fórmula estructu ­
ral, pureza (es decir, en el caso de los productos fitosanitarios, el porcentaje de principio activo) y contenido de nitrógeno. 
Sustrato: — origen del sustrato, 
— composición (es decir, harina de alfalfa, harina de alfalfa-hierba- 
forraje verde), 
— contenido de carbono y nitrógeno ( % peso seco), 
— tamaño del tamiz (mm).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Condiciones de ensayo: 
— información sobre la adición al suelo del sustrato orgánico, 
— número de concentraciones de la sustancia de ensayo utilizada y, 
en su caso, justificación de las concentraciones seleccionadas, 
— datos de la aplicación de la sustancia de ensayo al suelo, 
— temperatura de incubación, 
— contenido de humedad al principio y durante el ensayo, 
— método de incubación del suelo utilizado (es decir, en una mues ­
tra única o en una serie de submuestras separadas), 
— número de ejemplares, — tiempos de muestreo, 
— método utilizado para la extracción de nitratos del suelo. 
Resultados: 
— procedimiento analítico y equipo empleado para analizar los ni ­
tratos, 
— tabla de resultados incluyendo los distintos valores de las medi ­
ciones de nitratos y los valores medios, 
— variación entre los ejemplares de las muestras tratadas y la mues ­
tras de control, 
— explicación de las correcciones efectuadas en los cálculos, si 
procede, 
— variación porcentual de los índices de formación de nitratos en 
cada tiempo de muestreo o, si procede, el valor EC
 50 con un 
límite de confianza del 95 %, otros valores EC  x (es decir, EC  25 o 
EC 10 ) con intervalos de confianza, y una gráfica de la curva 
dosis-respuesta, 
— tratamiento estadístico de los resultados, 
— cualquier información u observación complementaria importante 
para interpretar los resultados.  
4. REFERENCIAS  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994. 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
delines; Proposed rule. September 28, 1987. 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels. 
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of Ni ­
trogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the In ­
fluence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality -Biological Methods.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 
1995. 
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method. 
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method. 
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and 
Exper. Ther., 96, 99-113. 
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New-York. 
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  MICROORGANISMOS DEL SUELO: ENSAYO DE 
TRANSFORMACIÓN DEL CARBONO  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 217 (2000).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
En el presente método de ensayo se describe un método de laboratorio 
diseñado para investigar los efectos potenciales a largo plazo de una 
exposición única a productos fitosanitarios y posiblemente otras sus ­
tancias químicas sobre la actividad de transformación del carbono por los microorganismos del suelo. El ensayo se basa principalmente en las 
recomendaciones de la Organización Europea y Mediterránea para la 
Protección de las Plantas (1). Sin embargo, se han tenido en cuenta otras directrices, como las del Biologische Bundesanstalt (2) de Ale ­
mania, la Environmental Protection Agency de Estados Unidos (3) y la 
SETAC (4). En un seminario de la OCDE sobre selección de suelos y 
sedimentos celebrado en Belgirate (Italia) en 1995 (5) se alcanzó un acuerdo sobre el número y tipos de suelos que deben utilizarse en estos ensayos. Las recomendaciones sobre recogida, manipulación y 
conservación de muestras de suelo se basan en un documento orienta ­
tivo de la ISO (6) y en las recomendaciones del seminario de Belgirate. 
En la valoración y evaluación de las características de las sustancias de 
ensayo, puede resultar necesaria la determinación de los efectos de la 
actividad microbiana en el suelo, por ejemplo, cuando se requieran datos sobre los posibles efectos secundarios de los productos fitosani ­
tarios en la microflora del suelo o cuando sea previsible la exposición 
de los microorganismos del suelo a productos químicos distintos de los 
fitosanitarios. El ensayo de transformación del carbono se lleva a cabo para determinar los efectos de estos productos químicos en la micro ­
flora del suelo. Si se ensayan productos agroquímicos (por ejemplo, 
productos fitosanitarios, abonos y productos químicos para la silvicul ­
tura), se llevarán a cabo tanto ensayos de transformación del carbono como del nitrógeno. Si se trata de productos no agroquímicos, es sufi ­
ciente el ensayo de transformación del nitrógeno. Sin embargo, si los 
valores EC
 50 del ensayo de transformación del nitrógeno de estos 
productos químicos se sitúan dentro del intervalo encontrado para los inhibidores de la nitrificación disponibles en el comercio (por ejemplo, 
la nitrapirina), puede hacerse un ensayo de transformación del carbono 
para obtener más información. 
Los suelos están formados por componentes vivos y no vivos que se 
dan en mezclas complejas y heterogéneas. Los microorganismos 
desempeñan un papel importante en la descomposición y transfor ­
mación de la materia orgánica en los suelos fértiles. Existen muchas especies que contribuyen de diversas maneras a la fertilidad del 
suelo. Cualquier interferencia a largo plazo en estos procesos bio ­
químicos podría perturbar el ciclo de los nutrientes y alterar la fer ­
tilidad del suelo. La transformación del carbono y del nitrógeno se da en todos los suelos fértiles. Aunque las comunidades microbianas 
responsables de estos procesos difieren de unos suelos a otros, las 
rutas de transformación son esencialmente las mismas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Este método de ensayo está pensado para detectar los efectos nega ­
tivos a largo plazo de una sustancia en el proceso de transformación 
del carbono en los suelos aerobios de superficie. El ensayo es sensi ­
ble a alteraciones de la envergadura y la actividad de las comunida ­
des microbianas responsables de la transformación del carbono, al 
someterlas a estrés químico y privación de carbono. Se utiliza un 
suelo arenoso con bajo contenido de materia orgánica. Se trata este suelo con la sustancia de ensayo y se incuba en condiciones que permitan un rápido metabolismo microbiano. En estas condiciones, 
las fuentes de carbono de fácil obtención se agotan rápidamente en el 
suelo. Este hecho ocasiona una privación de carbono que causa la muerte de las células microbianas e induce el letargo y/o la esporu ­
lación. Si el ensayo se prolonga durante más de 28 días, puede 
medirse la suma de estas reacciones en controles (de suelo no trata ­
do) como pérdida progresiva de biomasa microbiana metabólica ­
mente activa (7). Si la biomasa del suelo sometido a estrés de car ­
bono, en las condiciones del ensayo, se ve afectada por la presencia 
de un producto químico, puede que no regrese al mismo nivel que el 
control. Por ello, las perturbaciones causadas por la sustancia de ensayo en cualquier momento de la realización de este persistirán frecuentemente hasta su finalización. 
Los ensayos a partir de los cuales se desarrolló este método estaban 
pensados principalmente para sustancias respecto a las cuales puede 
preverse la cantidad que llegará al suelo. Este es el caso, por ejem ­
plo, de los productos fitosanitarios, cuyo índice de aplicación en el campo es conocido. Para los productos agroquímicos, es suficiente el ensayo de dos dosis con arreglo al índice de aplicación estimado o 
previsto. Los productos agroquímicos pueden someterse a ensayo en 
forma de principios activos (p.a.) o de productos formulados. Sin embargo, el ensayo no se limita a los productos químicos con con ­
centraciones en el medio ambiente previsibles. Cambiando tanto las 
cantidades de la sustancia de ensayo aplicada al suelo como la 
manera en que se evalúan los datos, el ensayo puede usarse también para productos químicos de los cuales se desconozca la cantidad que llegará al suelo. De este modo, en el caso de los productos no 
agroquímicos, se determinan los efectos de una serie de concentra ­
ciones en la transformación del carbono. A continuación, se utilizan los datos de estos ensayos para trazar una curva dosis-respuesta y calcular los valores EC, donde x es el porcentaje de efecto definido.
 
1.2 DEFINICIONES  
Transformación del carbono:  es la degradación por microorganis ­
mos de la materia orgánica hasta formar dióxido de carbono como 
producto final.  
EC X (concentración efectiva):  es la concentración de la sustancia 
de ensayo en el suelo que da lugar a un porcentaje x de inhibición de 
la transformación del carbono en dióxido de carbono.  
EC 50 (concentración efectiva mediana):  es la concentración de la 
sustancia de ensayo en el suelo que da lugar a un 50 % de inhibición de la transformación del carbono en dióxido de carbono.
 
1.3 SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Ninguna.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4 PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se trata parte del suelo tamizado con la sustancia de ensayo y se deja 
otra sin tratar (control). Cuando se ensayen productos agroquímicos, se recomienda un mínimo de dos concentraciones de ensayo, que 
deberán elegirse en relación con la concentración más alta prevista 
sobre el terreno. Después de 0, 7, 14 y 28 días de incubación, se mezclarán muestras de suelos tratados y de control con glucosa y se medirán las tasas de respiración inducidas por la glucosa durante 12 
horas consecutivas. Las tasas de respiración se expresan como dió ­
xido de carbono liberado (mg dióxido de carbono/kg suelo seco/h) u oxígeno consumido (mg oxígeno/kg suelo/h). Se comparará la tasa 
de respiración en las muestras de suelo tratado con la de control y se 
calculará el porcentaje de desviación respecto a esta. Todos los ensayos tendrán una duración mínima de 28 días. Si, al 28
 o día, la 
diferencia entre los suelos tratados y los no tratados es igual o 
superior al 25 %, se continuarán las mediciones a intervalos de 14 
días hasta un máximo de 100 días. Cuando se ensayen productos no agroquímicos, se añadirá a las muestras de suelo una serie de con ­
centraciones de la sustancia de ensayo y se medirán al cabo de 28 
días las tasas de respiración inducidas por glucosa (es decir, la media 
de las cantidades de dióxido de carbono formado u oxígeno consu ­
mido). Se analizarán los resultados de los ensayos con una serie de concentraciones utilizando un modelo de regresión y se calcularán 
los valores EC
 X (es decir, EC  50 , EC  25 y/o EC  10 ). Véanse las defi ­
niciones.  
1.5 VALIDEZ DEL ENSAYO 
Las evaluaciones de los resultados de los ensayos con productos 
agroquímicos se basan en diferencias relativamente pequeñas (de 
un valor medio de ± 25 %) entre el dióxido de carbono liberado o el oxígeno consumido en (o por) las muestras de suelo tratado y de 
control, por lo que grandes variaciones en las muestras de control 
pueden dar lugar a resultados falsos. Por este motivo, la variación entre muestras de control en paralelo deberá ser inferior al ± 15 %.
 
1.6 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.6.1  Equipo  
Se utilizarán recipientes de ensayo hechos de material químicamente 
inerte. Estos recipientes deberán ser de capacidad adecuada de acuerdo con el procedimiento utilizado para la incubación de suelos, 
es decir, incubación en una muestra única o en una serie de muestras 
separadas (véase el punto 1.7.1.2). Hay que procurar reducir al mí ­
nimo la pérdida de agua y permitir el intercambio de gas durante el ensayo (por ejemplo, pueden cubrirse los recipientes con láminas de 
polietileno perforado). Cuando se ensayen sustancias volátiles, debe ­
rán usarse recipientes sellables y herméticos cuyo tamaño sea tal que aproximadamente un cuarto de su volumen esté ocupado por la muestra de suelo. 
Para la determinación de la respiración inducida por glucosa, se 
precisarán sistemas e instrumentos de incubación que permitan medir 
la producción de dióxido de carbono o el consumo de oxígeno. Se encontrarán ejemplos de este tipo de sistemas e instrumentos en la bibliografía, referencias (8) (9) (10) (11).
 
1.6.2  Selección y número de suelos  
Se utilizará un único suelo cuyas características recomendadas serán 
las siguientes: 
— contenido de arena: no inferior al 50 % ni superior al 75 %,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5-7,5, 
— contenido de carbono orgánico: 0,5-1,5 % 
— deberá medirse la masa microbiana (12)(13), cuyo contenido de 
carbono deberá ser al menos el 1 % del total de carbono orgánico 
en el suelo. 
En la mayoría de los casos, un suelo de estas características repre ­
senta la situación más desfavorable, ya que la adsorción de la sus ­
tancia química de ensayo es mínima y su disponibilidad para la microflora es máxima. Por lo tanto, no son necesarios, por lo gene ­
ral, ensayos de otros suelos. Sin embargo, en algunas circunstancias, 
por ejemplo cuando la sustancia de ensayo esté indicada principal ­
mente para determinados suelos, como los suelos forestales ácidos, o en el caso de productos químicos cargados electrostáticamente, puede resultar necesario utilizar un suelo adicional.
 
1.6.3  Recogida y conservación de muestras de suelo  
1.6.3.1  Recogida  
Deberá contarse con información detallada sobre la historia del lugar 
donde se haya recogido el suelo de ensayo. En particular, localiza ­
ción precisa, cubierta vegetal, fechas de tratamiento con productos 
fitosanitarios, con abonos orgánicos e inorgánicos, adición de mate ­
riales biológicos o contaminación accidental. El lugar elegido para la recogida de suelo tiene que ser tal que permita un uso a largo plazo. 
Se consideran adecuados los pastos permanentes, los campos con 
cosechas anuales de cereales (excepto el maíz) o los abonos verdes sembrados densamente. El lugar donde se recojan las muestras no deberá haber sido tratado con productos fitosanitarios durante un 
mínimo de un año antes de la recogida de estas. Además, no deberá 
haberse aplicado ningún abono orgánico durante al menos seis me ­
ses. El uso de abonos minerales solo será aceptable cuando responda a las necesidades del cultivo, y en ese caso no deberán tomarse 
muestras hasta transcurridos, al menos, tres meses desde la aplica ­
ción del abono. Deberá evitarse el uso de suelo tratado con abonos de efectos biocidas conocidos (por ejemplo, cianamida de calcio). 
Deberá evitarse la toma de muestras durante o inmediatamente des ­
pués de períodos prolongados (de más de 30 días) de sequía o encharcamiento. En el caso de los suelos arados, deberán tomarse 
muestras a una profundidad de 0 a 20 cm. Cuando se trate de 
pastizales u otros suelos que no se aren durante períodos más largos (al menos un ciclo de cultivo), la profundidad máxima del muestreo podrá ser ligeramente superior a 20 cm (por ejemplo, 25 cm). Las 
muestras de suelo se transportarán en recipientes y en condiciones de 
temperatura que garanticen que las propiedades iniciales del suelo no se alteren significativamente.
 
1.6.3.2  Conservación  
Es preferible el uso de muestras de suelo recién recogidas. Si no se 
puede evitar el almacenamiento en el laboratorio, las muestras de 
suelo podrán guardarse en la oscuridad a 4 ± 2  o C durante un 
máximo de tres meses. Durante el almacenamiento, deberá asegu ­
rarse el mantenimiento de unas condiciones aerobias. Si se recogen 
muestras de suelo de zonas que estén heladas durante, al menos, tres 
meses al año, podrá considerarse la posibilidad de almacenarlas du ­
rante seis meses a - 18  o C. Se medirá la biomasa microbiana de las 
muestras almacenadas antes de cada experimento. La cantidad de 
carbono en la biomasa deberá ser como mínimo el 1 % del total 
de carbono orgánico de la muestra de suelo (véase el punto 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4  Manipulación y preparación del suelo para el ensayo  
1.6.4.1  Preincubación  
Cuando las muestras de suelo hayan estado almacenadas (véanse los 
puntos 1.6.4.2 y 1.7.1.3), se recomienda preincubar durante un pe ­
ríodo de entre 2 y 28 días. La temperatura y el contenido de hume ­
dad del suelo durante la preincubación deberán ser semejantes a las que se den durante el ensayo (véanse los puntos 1.6.4.2 y 1.7.1.3).
 
1.6.4.2  Características fisicoquímicas  
Se separarán manualmente los objetos grandes (por ejemplo, piedras, 
trozos de plantas, etc.) de la muestra de suelo y, a continuación, se 
tamizará la muestra por vía húmeda sin secar en exceso para obtener 
un tamaño de las partículas no superior a 2 mm. Deberá ajustarse el contenido de humedad de la muestra con agua destilada o desioni ­
zada para llegar a un valor entre el 40 % y el 60 % de la capacidad 
de retención de agua máxima.
 
1.6.5  Preparación de la sustancia de ensayo para la aplicación al suelo  
La sustancia de ensayo se aplica normalmente utilizando un vehícu ­
lo. El vehículo podrá ser agua (para las sustancias solubles en el 
agua) o un sólido inerte como arena fina de cuarzo (tamaño de las partículas: 0,1-0,5 mm). Se evitarán los vehículos líquidos distintos del agua (por ejemplo, disolventes orgánicos como la acetona o el 
cloroformo), porque pueden dañar la microflora. Si se usa arena 
como vehículo, podrá recubrirse con la sustancia de ensayo disuelta o suspendida en un disolvente apropiado. En tal caso, deberá elimi ­
narse el disolvente por evaporación antes de mezclarse con la mues ­
tra de suelo. Para una distribución óptima de la sustancia de ensayo 
en el suelo, se recomienda una proporción de 10 g de arena por kilo de suelo (peso en seco). Las muestras de control se tratarán solo con la cantidad equivalente de agua y/o arena de cuarzo. 
Cuando se ensayen sustancias químicas volátiles, deberán evitarse las 
pérdidas durante el tratamiento y se procurará conseguir una distri ­
bución homogénea en la muestra de suelo (por ejemplo, deberá inyectarse la sustancia de ensayo en la muestra en varios sitios).
 
1.6.6  Concentraciones de ensayo  
Si se someten a ensayo productos fitosanitarios u otros productos 
químicos cuyas concentraciones en el medio ambiente sean predeci ­
bles, deberán utilizarse al menos dos concentraciones. La concen ­
tración más baja corresponderá, al menos, a la cantidad máxima que 
se prevé que llegue al suelo en la práctica, y la concentración más alta será un múltiplo de la concentración más baja. Las concentra ­
ciones de la sustancia de ensayo añadida al suelo se calcularán 
suponiendo una incorporación uniforme hasta una profundidad de 
5 cm y una densidad aparente del suelo de 1,5. Para los productos agroquímicos que se aplican directamente al suelo o para las sustan ­
cias químicas para las cuales puede predecirse la cantidad que llega 
al suelo, las concentraciones de ensayo recomendadas son la concen ­
tración ambiental prevista (PEC) y cinco veces esa concentración. Las sustancias destinadas a ser aplicadas a los suelos varias veces en 
la misma temporada se ensayarán a las concentraciones resultantes 
de multiplicar la PEC por el número máximo de aplicaciones pre ­
visto. Sin embargo, la concentración máxima ensayada no deberá superar diez veces el índice máximo para una aplicación. 
Si se ensayan productos no agroquímicos, se empleará una serie 
geométrica de, al menos, cinco concentraciones. Las concentraciones 
ensayadas deberán cubrir el intervalo necesario para determinar los 
valores EC
 X . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7 REALIZACIÓN DEL ENSAYO  
1.7.1  Condiciones de exposición  
1.7.1.1  Tratamiento y control  
Cuando se ensayen productos agroquímicos, la muestra de suelo se 
dividirá en tres partes de igual peso. Dos partes se mezclarán con el 
vehículo que contenga el producto, y la otra, con el vehículo sin el producto (control). Se recomienda un mínimo de tres ejemplares para ambos tipos de muestras, las tratadas y las no tratadas. Cuando se 
ensayen productos no agroquímicos, la muestra de suelo se dividirá 
en seis partes de igual peso. Cinco de las muestras se mezclarán con el vehículo que contenga la sustancia de ensayo, y la sexta, con el 
vehículo sin la sustancia. Se recomienda preparar tres ejemplares 
tanto para las muestras tratadas como las de control. Deberá procu ­
rarse una distribución homogénea de la sustancia de ensayo en las muestras tratadas. Durante la mezcla, se evitará la compactación de 
la muestra o la formación de grumos.
 
1.7.1.2  Incubación de las muestras de suelo  
La incubación de las muestras de suelo puede hacerse de dos ma ­
neras: como dos muestras únicas, una de suelo tratado y otra de suelo no tratado, o como una serie de submuestras de igual tamaño de suelo tratado, por una parte, y de suelo no tratado, por otra. Sin 
embargo, cuando se ensayen sustancias volátiles, solo deberá hacerse 
el ensayo con una serie de submuestras separadas. Cuando las mues ­
tras de suelo se incuben en una muestra única, se prepararán grandes cantidades de suelo tratado y no tratado, y se tomarán las submues ­
tras que deban analizarse según se necesite a lo largo del ensayo. La 
cantidad preparada inicialmente para las muestras tratadas y para las de control dependerá del tamaño de las submuestras, el número de ejemplares utilizados para el análisis y el número máximo previsto 
de períodos de muestreo. Deberán mezclarse bien las muestras de 
suelo incubadas como muestra única antes de preparar las submues ­
tras. Cuando la incubación se haga en una serie muestras separadas, se dividirán las dos muestras, de suelo tratado y de suelo no tratado, 
en el número de submuestras requerido, y estas se utilizarán según se 
necesite. En los experimentos en los que puedan preverse más de dos tiempos de muestreo, habrán de prepararse las submuestras suficien ­
tes, teniendo en cuenta los ejemplares y los tiempos de muestreo. 
Deberán incubarse, al menos, tres ejemplares de las muestras de ensayo en condiciones aerobias (véase el punto 1.7.1.1). Durante todos los ensayos, se utilizarán recipientes adecuados con suficiente 
espacio libre para evitar la aparición de condiciones anaerobias. Sin 
embargo, cuando se ensayen sustancias volátiles, solo deberá reali ­
zarse el ensayo con una serie de submuestras separadas.
 
1.7.1.3  Condiciones y duración del ensayo  
El ensayo se hará en la oscuridad a una temperatura ambiente de 20± 
2 o C. El contenido de humedad de las muestras se mantendrá durante 
el ensayo entre el 40 % y el 60 % de la capacidad de retención de 
agua máxima del suelo (véase el punto 1.6.4.2) con una variación máxima del ± 5 %. Podrá añadirse agua destilada y desionizada según se necesite. 
La duración mínima del ensayo será de 28 días. Si se están ensa ­
yando productos agroquímicos, se compararán las cantidades de dió ­
xido de carbono liberado u oxígeno consumido en las muestras tratada y de control. Si difieren en más del 25 % al 28
 o día, se 
continuará el ensayo hasta que se obtenga una diferencia igual o 
menor al 25 % o bien durante un máximo de 100 días. En el caso de los productos no agroquímicos, se pondrá fina al ensayo a los 28 días. Al 28
 o día, se determinarán las cantidades de dióxido de car ­
bono liberado u oxígeno consumido en las muestras tratada y de 
control y se calcularán los valores EC  X . ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2  Toma de muestras y análisis de suelos  
1.7.2.1  Calendario de toma de muestras  
Cuando se ensayen productos agroquímicos, se hará el análisis de 
tasas de respiración inducida por glucosa en las muestras de suelo 
los días 0, 7, 14 y 28. Cuando se necesite un ensayo prolongado, se 
efectuarán nuevas mediciones a intervalos de 14 días a partir del 28
 o día. 
Cuando se ensayen productos no agroquímicos, se utilizarán como 
mínimo cinco concentraciones de ensayo y se hará el análisis de la 
respiración inducida por glucosa en las muestras de suelo al principio 
(día 0) y al final del período de exposición (28 días). Si se considera necesario, podrá añadirse una medición intermedia, por ejemplo, al séptimo día. Se utilizarán los datos obtenidos al 28
 o día para hallar el 
valor EC  X de la sustancia química. Si se desea, podrán utilizarse los 
datos de las muestras de control obtenidos el día 0 para estimar las cantidades iniciales de biomasa microbiana metabólicamente activa en el suelo (12).
 
1.7.2.2  Medida de las tasas de respiración inducida por glucosa  
Se determinará la tasa de respiración inducida por glucosa en cada 
ejemplar de muestra tratada y de control en cada momento de mues ­
treo. Se mezclarán las muestras de suelo con una cantidad de glucosa 
suficiente para suscitar una respuesta respiratoria máxima inmediata. Dicha cantidad de glucosa necesaria para suscitar una respuesta res ­
piratoria máxima en un suelo dado puede determinarse en un ensayo 
preliminar utilizando una serie de concentraciones de glucosa (14). 
Sin embargo, en el caso de suelos arenosos con 0,5-1,5 % de car ­
bono orgánico, suelen resultar suficientes de 2 000 mg a 4 000 mg de glucosa por kg de suelo (peso en seco). Es posible obtener un 
polvo mezclando la glucosa con arena de cuarzo limpia (10 g de 
arena/kg de suelo, peso en seco) y mezclarlo con el suelo de manera homogénea. 
Se incubarán las muestras de suelo enmendadas con glucosa en un 
aparato adecuado para medir las tasas de respiración continuamente, 
cada hora o cada dos horas (véase el punto 1.6.1) a 20 ± 2
 o C. Se 
medirá el dióxido de carbono liberado o el oxígeno consumido du ­
rante 12 horas consecutivas, iniciándose las medidas lo antes posible, es decir, de 1 a 2 horas después de añadido el suplemento de glu ­
cosa. Se medirán las cantidades totales de dióxido de carbono libe ­
rado u oxígeno consumido durante las 12 horas y se determinarán las tasas de respiración promedio.
 
2 RESULTADOS  
2.1 TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Si se trata de productos agroquímicos, deberán registrarse las canti ­
dades de dióxido de carbono liberado u oxígeno consumido en cada 
ejemplar de muestra de suelo, tabulándose además los valores pro ­
medio de todos los ejemplares. Se evaluarán los resultados mediante métodos estadísticos apropiados y generalmente aceptables (por ejemplo, prueba F, nivel de significación del 5 %). Las tasas de 
respiración inducida por glucosa se expresan en mg de dióxido de 
carbono/kg suelo, peso en seco/h o en mg oxígeno/suelo, peso en seco/h. Se comparará la tasa promedio de formación de dióxido de carbono o la tasa promedio de consumo de oxígeno en cada trata ­
miento con la de control, calculándose la desviación porcentual con 
respecto al control.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Cuando se ensayen productos no agroquímicos, se determinarán las 
cantidades de dióxido de carbono liberadas o de oxígeno consumidas 
por cada ejemplar y se trazará una curva dosis-respuesta para estimar los valores EC
 x . Se compararán las tasas de respiración inducida por 
glucosa (es decir, mg de dióxido de carbono/kg suelo, peso en seco/h 
o mg oxígeno/suelo, peso en seco/h) que presenten las muestras 
tratadas transcurridos 28 días con las que presenten las muestras de control. A partir de estos datos, se calcularán los valores porcen ­
tuales de inhibición para cada concentración de ensayo. Se represen ­
tarán gráficamente estos porcentajes frente a la concentración, utili ­
zándose luego procedimientos estadísticos para calcular los valores EC
 X . Utilizando asimismo procedimientos estándar, se determinarán 
los limites de confianza (p = 0,95) para los EC  X calculados (10) ­
(11)(12).  
2.2 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Cuando se evalúen los resultados de los ensayos con productos 
agroquímicos y la diferencia en las tasas de respiración entre el tratamiento más bajo (es decir, la concentración máxima prevista) 
y la muestra de control no supere el 25 % en ningún momento de 
muestreo a partir del 28
 2 día, podrá considerarse que el producto no 
tiene influencia a largo plazo en la transformación de carbono en el suelo. Cuando se evalúen los resultados de ensayos con productos no 
agroquímicos, se utilizarán los valores EC
 50 , EC  25 y/o EC  10 
3 INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo deberá incluir la información siguiente: 
Identificación completa del suelo utilizado, incluyendo: — referencia geográfica del lugar (latitud y longitud), 
— información sobre la historia del lugar (es decir, cubierta vegetal, 
tratamientos con productos fitosanitarios, tratamientos con abo ­
nos, contaminación accidental, etc.), 
— tipo de uso (por ejemplo, suelo agrícola, bosque, etc.), 
— profundidad de muestreo (cm), — contenido de arena/limo/arcilla ( % peso seco), 
— pH (en agua), 
— contenido de carbono orgánico ( % peso seco), — contenido de nitrógeno ( % peso seco), 
— capacidad de intercambio de cationes (mmol/kg), 
— biomasa microbiana inicial en porcentaje del carbono orgánico 
total, 
— referencia de los métodos utilizados para la determinación de 
cada parámetro, 
— toda la información sobre la recogida y almacenamiento de las 
muestras de suelo, 
— datos de la preincubación del suelo, si procede.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Sustancia de ensayo: 
— naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas, — identificación química, en su caso, incluyendo fórmula estructu ­
ral, pureza (es decir, en el caso de los productos fitosanitarios, el 
porcentaje de principio activo) y contenido de nitrógeno. 
Condiciones de ensayo: 
— información sobre la adición al suelo de sustrato orgánico, 
— número de concentraciones de la sustancia de ensayo utilizadas y, 
en su caso, justificación de las concentraciones seleccionadas, 
— datos de la aplicación de la sustancia de ensayo al suelo, — temperatura de incubación, 
— contenido de humedad al principio y durante el ensayo, 
— método de incubación del suelo utilizado (es decir, muestra única 
o serie de submuestras separadas), 
— número de ejemplares, — tiempos de muestreo. 
Resultados: 
— método y equipo utilizados para medir las tasas de respiración, — datos tabulados, incluyendo los distintos valores y los valores 
promedio de las cantidades de dióxido de carbono u oxígeno, 
— variación entre los ejemplares de las muestras tratadas y las 
muestras de control, 
— explicación de la correcciones efectuadas en los cálculos, si procede, — variación porcentual de las tasas de respiración inducida por 
glucosa en cada momento de muestreo o, si procede, el valor EC
 50 con un límite de confianza del 95 %, otros valores EC  x 
(es decir, EC  25 o EC  10 ) con intervalos de confianza, y una grá ­
fica de la curva dosis-respuesta, 
— tratamiento estadístico de los resultados, si procede, 
— cualquier información u observación complementaria de interés 
para la interpretación de los resultados.  
4 REFERENCIAS  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994. 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
delines; Proposed rule. September 28, 1987.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels. 
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995. 
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment 
of aerobic microbial processes in the laboratory. 
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in «Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra». Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3:45-60. 
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in «Methods of Soil 
Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Properties». Agronomy Monograph N
 o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41:831-871. 
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality — Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions. 
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. 
(11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81. 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method. 
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation- extraction method. 
(14) Malkomes, H.-P. (1986). EinfluB von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflan ­
zenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (In ­
fluence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbi ­
cide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., 
Braunschweig, 38: 113-120. 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113. 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New-York. 
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  TRANSFORMACIÓN AEROBIA Y ANAEROBIA EN EL 
SUELO  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 307 (2002).  
1.1 INTRODUCCIÓN 
El presente método se basa en las actuales directrices (1)(2)(3)(4)(5) ­
(6)(7)(8)(9). El método está pensado para evaluar la transformación aerobia y anaerobia de las sustancias químicas en el suelo. Con los 
experimentos se pretende determinar: i) la tasa de transformación de la 
sustancia de ensayo, y ii) la naturaleza y las tasas de formación y disminución de los productos de transformación a los que pueden estar expuestos los vegetales y los organismos del suelo. Se precisa de 
dichos estudios para las sustancias químicas que se aplican directa ­
mente al suelo o es probable que alcancen el medio edáfico. Los resul ­
tados de los estudios pueden utilizarse igualmente para elaborar proto ­
colos de muestreo y análisis para estudios de campo afines. 
Por regla general, para evaluar las vías de transformación bastará 
efectuar estudios aerobios y anaerobios con un tipo de suelo (8)(10)(l 1). Las tasas de transformación, sin embargo, deberán determinarse por lo menos en otros tres suelos (8)(10). 
En un seminario de la OCDE sobre selección de suelos y sedimentos 
celebrado en Belgirate (Italia) en 1995 (10) se alcanzó un acuerdo, en particular, sobre el número y tipos de suelos que deben utilizarse en estos ensayos. Los tipos de suelos sometidos a ensayo deben ser 
representativos de las condiciones ambientales en las que tendrá 
lugar el uso o la liberación. Por ejemplo, las sustancias químicas que vayan a liberarse en climas tropicales o subtropicales deben ensayarse en ferralsoles y nitosoles (sistema FAO). Dicho seminario 
formuló asimismo recomendaciones sobre recogida, manipulación y 
conservación de muestras de suelos (15). También se examina en este método el uso de suelos de (arroz) paddy.
 
1.2 DEFINICIONES  
Sustancia de ensayo:  cualquier sustancia, sea el compuesto original 
o los correspondientes productos de transformación.  
Productos de transformación:  todas las sustancias resultantes de las 
reacciones de transformación biótica o abiótica de la sustancia de ensayo, incluido el CO
 2 y los productos que se encuentran en los 
residuos ligados.  
Residuos ligados:  compuestos del suelo, la planta o el animal que 
persisten en la matriz en forma de sustancia original o de sus pro ­
ductos de transformación/metabolitos tras la extracción. El método 
de extracción no debe modificar sustancialmente ni los propios com ­
puestos ni la estructura de la matriz. La naturaleza del vínculo puede aclararse parcialmente mediante métodos de extracción que alteren la matriz y técnicas analíticas sofisticadas. Así por ejemplo, hasta la 
fecha se han identificado de esta manera enlaces covalentes, iónicos 
y de sorción, así como atrapamientos. En general, la formación de residuos ligados reduce de manera significativa la bioaccesibilidad y la biodisponibilidad (12) [modificado de IUPAC 1984 (13)].  
Transformación aerobia:  reacciones que se producen en presencia 
de oxígeno molecular (14).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Transformación anaerobia:  reacciones que se producen en ausencia 
de oxígeno molecular (14).  
Suelo:  mezcla de constituyentes químicos minerales y orgánicos; 
estos últimos contienen compuestos de elevado contenido en carbono 
y en nitrógeno y de peso molecular elevado, animados por pequeños organismos (principalmente microorganismos). El suelo puede mani ­
pularse en dos estados: 
a) no perturbado, tal como se ha desarrollado en el tiempo, en capas 
características de diversos tipos de suelo; 
b) perturbado, como suele encontrarse en los campos cultivables o 
como se presenta cuando se toman muestras mediante excavación para utilizarlas en el presente método de ensayo (14).  
Mineralización:  degradación completa de un compuesto orgánico a 
CO
 2 y H  2 O en condiciones aerobias y a CH  4 , CO  2 y H  2 O en con ­
diciones anaerobias. En el contexto del presente método, cuando se 
utiliza un compuesto marcado con  14 C, mineralización significa la 
amplia degradación durante la que se oxida un átomo de carbono marcado con liberación de la cantidad apropiada de
 14 CO 2 (14).  
Semivida:  to, s, es el tiempo que tarda la transformación del 50 % 
de una sustancia de ensayo cuando puede describirse dicha trans ­
formación mediante una cinética de primer orden; es independiente de la concentración.  
DT
 50 (tiempo de desaparición 50):  es el tiempo que tarda la con ­
centración de la sustancia de ensayo en reducirse en un 50 %; es distinto de la semivida t
 0 , 5 cuando la transformación no sigue una 
cinética de primer orden.  
DT 75 (tiempo de desaparición 75):  es el tiempo que tarda la con ­
centración de la sustancia de ensayo en reducirse en un 75 %.  
DT 90 (tiempo de desaparición 90):  es el tiempo que tarda la con ­
centración de la sustancia de ensayo en reducirse en un 90 %.  
1.3 SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
Deberán utilizarse sustancias de referencia para la caracterización y/o 
identificación de los productos de transformación por métodos espec ­
troscópicos o cromatográficos.  
1.4 APLICABILIDAD DEL ENSAYO 
El método es aplicable a todas las sustancias químicas (no marcadas 
o marcadas radiactivamente) para las que se dispone de un método 
analítico de suficiente exactitud y sensibilidad. Es aplicable a com ­
puestos ligeramente volátiles, no volátiles, solubles en agua o inso ­
lubles en agua. El ensayo no deberá aplicarse a sustancias químicas que sean muy volátiles a partir del suelo (por ejemplo, fumigantes o 
disolventes orgánicos) y, por tanto, no se puedan mantener en el 
suelo en las condiciones experimentales del presente ensayo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5 INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA DE ENSAYO 
Para medir la tasa de transformación podrá utilizarse una sustancia 
de ensayo marcada o no marcada. Para estudiar la vía de transfor ­
mación y establecer un balance de materia se requiere material mar ­
cado. Se recomienda el marcado con  14 C, pero también puede resul ­
tar de utilidad el uso de otros isótopos, tales como  13 C, 15 N, 3 H o  
32 P. El marcador deberá ubicarse, en la medida de lo posible, en la 
parte o las partes más estables de la molécula (  1 ). La pureza de la 
sustancia de ensayo deberá ser de al menos el 95 %. 
Antes de realizar un ensayo sobre la transformación aerobia o anae ­
robia en el suelo, deberá contarse con la siguiente información rela ­
tiva a la sustancia de ensayo. 
a) solubilidad en agua (Método A.6); 
b) solubilidad en disolventes orgánicos; 
c) presión de vapor (Método A.4) y constante de la ley de Henry; 
d) coeficiente de reparto n-octanol/agua (Método A.8); 
e) estabilidad química en la oscuridad (hidrólisis) (Método C.7); 
f) pK  a si una molécula es susceptible de protonación o desprotona ­
ción [Directriz 112 de la OCDE] (16). 
También pueden resultar de utilidad los datos sobre la toxicidad de 
la sustancia de ensayo para los microorganismos del suelo [Métodos de ensayo C.21 y C.22] (16). 
Deberá contarse con métodos analíticos (incluidos métodos de ex ­
tracción y depuración) para la cuantificación e identificación de la 
sustancia de ensayo y de sus productos de transformación.
 
1.6 PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
Se tratan las muestras de suelo con la sustancia de ensayo y se 
incuban en la oscuridad en un matraz biométrico o en sistemas de flujo en condiciones de laboratorio controladas (a humedad del suelo y temperatura constantes). A intervalos de tiempo adecuados, se 
extraen muestras del suelo y se analizan en ellas la sustancia original 
y los productos de transformación. También se recogen los productos volátiles para su análisis con los dispositivos de absorción adecua ­
dos. Utilizando material marcado con C es posible medir las diversas 
tasas de mineralización de la sustancia de ensayo atrapando el
 14 CO 2 
resultante y establecer un balance de materia, incluyendo la forma ­
ción de residuos ligados al suelo.  
1.7 CRITERIOS DE CALIDAD  
1.7.1  Recuperación  
La extracción y el análisis de muestras de suelo cuando menos 
duplicadas inmediatamente después de la adición de la sustancia 
de ensayo dan una primera indicación de la repetibilidad del método 
analítico y de la uniformidad del procedimiento de aplicación de la sustancia de ensayo. Los valores de recuperación para fases poste ­
riores del experimento los dan los balances másicos respectivos. 
Dichos valores deberán situarse entre el 90 % y el 110 % para 
sustancias químicas marcadas (8) y entre el 70 % y el 110 % para sustancias químicas no marcadas (3).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Por ejemplo, si la sustancia de ensayo contiene un anillo, es preciso marcar ese anillo: si 
contiene dos o más anillos, puede resultar necesario efectuar estudios separados para 
evaluar el destino de cada anillo marcado y obtener información adecuada sobre la 
formación de los productos de transformación.
 1.7.2  Repetibilidad y sensibilidad del método analítico  
La repetibilidad del método analítico (excluida la eficiencia de ex ­
tracción inicial) para cuantificar la sustancia de ensayo y los produc ­
tos de transformación puede comprobarse realizando un análisis por 
duplicado del mismo extracto de suelo incubado durante tiempo 
suficiente para que se formen productos de transformación. 
El límite de detección (LOD) del método analítico de la sustancia de 
ensayo y de los productos de transformación deberá alcanzar, como mínimo, el menor de los siguientes valores: 0,01 mg-kg
 -1 de suelo 
(como sustancia de ensayo) o un 1 % de la dosis aplicada. También 
deberá especificarse el límite de cuantificación (LOQ).  
1.7.3  Exactitud de los datos de transformación  
El análisis de regresión de las concentraciones de la sustancia de 
ensayo en función del tiempo facilita la información apropiada sobre, la fiabilidad de la curva de transformación y permite calcular los límites de confianza de las semividas (en el caso de la cinética de 
pseudo primer orden) o los valores DT
 50 y, si procede, DT  75 y DT  90 . 
1.8 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.8.1  Equipos y reactivos químicos  
Los sistemas de incubación consisten en sistemas cerrados estáticos 
o sistemas de flujo adecuados (7) (17). En las figuras 1 y 2 se muestran ejemplos de, respectivamente, aparatos de flujo de incuba ­
ción de suelo y matraces biométricos adecuados. Los dos tipos de 
sistema de incubación tienen sus ventajas y sus limitaciones (7) (17). 
Se precisa el equipo estándar de laboratorio y, en particular: — instrumentos analíticos tales como equipos GLC, HPLC, TLC, 
incluidos los sistemas de detección adecuados para el análisis de sustancias marcadas o no marcadas o el método de dilución isotópica inversa, 
— instrumentos de identificación (por ejemplo, MS, GC-MS, 
HPLC-MS, NMR, etc.), 
— contador de centelleo de líquidos, 
— cámara de combustión oxidante de material radiactivo, — centrifugadora, — aparato de extracción (por ejemplo, tubos de centrifugación para 
extracción en frío y aparato Soxhlet para extracción continua a 
reflujo), 
— instrumental para concentrar soluciones y extractos (por ejemplo, 
evaporador rotatorio), 
— baño maria, — dispositivo mezclador mecánico (por ejemplo, amasadora, mez ­
cladora rotatoria).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Entre los reactivos químicos figuran, por ejemplo: 
— NaOH, pureza de grado analítico, 2 mol dm  -3 , u otra base apro ­
piada (por ejemplo, KOH, etanolamina), 
— H  2 SO 4 , pureza de grado analítico, 0,05 mol dm  -3 
— glicol etileno, pureza de grado analítico, 
— materiales sólidos de absorción, tales como cal sodada y piezas 
de poliuretano, 
— disolventes orgánicos, pureza de grado analítico, tales como ace ­
tona, metanol, etc., 
— líquido de centelleo.  
1.8.2  Aplicación de la sustancia de ensayo  
Para incorporarla al suelo y distribuirla en él, podrá disolverse la 
sustancia de ensayo en agua (desionizada o destilada) o, si resulta 
necesario, en cantidades mínimas de acetona u otro disolvente orgá ­
nico (6) en el que la sustancia de ensayo sea suficientemente soluble y estable. No obstante, la cantidad de disolvente seleccionada no 
deberá tener una influencia significativa sobre la actividad micro ­
biana del suelo (véanse los puntos 1.5 y 1.9.2-1.9.3. Deberá evitarse el uso de disolventes inhibidores de la actividad microbiana, tales como cloroformo, diclorometano y otros disolventes halogenados. 
Podrá incorporarse asimismo la sustancia de ensayo en forma sólida, 
por ejemplo, mezclada con arena de cuarzo (6) o en una pequeña submuestra del suelo sometido a ensayo que se haya secado al aire y esterilizado. Si se incorpora la sustancia de ensayo utilizando un 
disolvente, deberá permitirse que este se evapore antes de incorporar 
la submuestra a la muestra de suelo original no estéril. 
Para las sustancias químicas ordinarias, cuya principal vía de entrada 
en el suelo es a través de los lodos de depuración o la actividad 
agraria, deberá incorporarse primero la sustancia de ensayo al lodo, que luego se introducirá en la muestra de suelo, (véanse los puntos 1.9.2 y 1.9.3). 
No se recomienda la utilización rutinaria de productos formulados. 
No obstante, su utilización podría constituir una alternativa apropia ­
da, por ejemplo, en el caso de sustancias de ensayo poco solubles.
 
1.8.3  Suelos  
1.8.3.1  Selección de suelos  
Para determinar la vía de transformación, podrá utilizarse un suelo 
representativo; se recomienda un suelo franco arenoso o franco li ­
moso o franco o arenoso franco [según la clasificación de FAO y USDA (18)] con un pH de 5,5-8,0, un contenido de carbono orgá ­
nico de 0,5-2,5 % y una biomasa microbiana de al menos 1 % del 
carbono orgánico total (10). 
Para estudios de tasa de transformación deberán utilizarse al menos 
tres suelos adicionales representativos de la gama de suelos relevan ­
te. Estos suelos deben variar en cuanto a contenido de carbono 
orgánico, pH, contenido de arcilla y biomasa microbiana (10).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Deberán caracterizarse todos los suelos, cuando menos, en cuanto a 
textura ( % arena, % limo, % arcilla) [según la clasificación de FAO 
y USDA (18)], pH, capacidad de intercambio de cationes, carbono orgánico, densidad aparente, característica de retención de agua (
 1 ) y 
biomasa microbiana (solo para estudios aerobios). Cualquier otra 
información sobre las propiedades del suelo podría resultar de utili ­
dad para la interpretación de los resultados. Para la determinación de las características del suelo, podrán utilizarse los métodos recomen ­
dados en las referencias (19)(20)(21)(22)(23). La biomasa micro ­
biana se determinará utilizando el método de respiración inducida 
por el sustrato (SIR) (25)(26) o un método alternativo (20).
 
1.8.3.2  Recogida, manipulación y conservación de suelos  
Deberá contarse con información detallada sobre la historia del lugar 
donde se haya recogido el suelo de ensayo. En particular, localiza ­
ción precisa, cubierta vegetal, tratamientos con sustancias químicas, 
tratamientos con abonos orgánicos e inorgánicos, adición de mate ­
riales biológicos u otro tipo de contaminación. No deberán utilizarse para estudios sobre transformación suelos que hayan sido tratados con la sustancia de ensayo o un análogo estructural de la misma 
dentro de los cuatro años precedentes (10)(15). 
La muestra deberá haber sido recogida recientemente (del horizonte A 
o capa superior de 20 cm) y su contenido en agua deberá facilitar su tamizado. Salvo en el caso de los suelos de arrozales paddy, deberá 
evitarse la toma de muestras durante o inmediatamente después de un 
largo período (> 30 días) de sequía, helada o inundación (14). Las muestras deberán transportarse de manera que el contenido en agua del suelo varíe lo menos posible y mantenerse en la oscuridad y ven ­
tiladas en la mayor medida posible. Suele estar indicado el uso de una 
bolsa de polietileno sin cerrar completamente. 
Una vez tomada la muestra, deberá procesarse el suelo lo antes 
posible. Deberá retirarse la vegetación, la fauna edáfica de mayor 
tamaño y las piedras antes de hacer pasar el suelo por un tamiz de 
2 mm que permita retirar los restos de vegetales y animales y pe ­
queñas piedras. Se procurará evitar el secado y aplastamiento exce ­
sivos del suelo antes del tamizado (15). 
Cuando resulte difícil tomar muestras en invierno (por hallarse el 
suelo helado o cubierto por una capa de nieve), podrá extraerse de un lote de suelo almacenado en el invernadero bajo cubierta vegetal (por ejemplo, hierba o mezcla de hierba y trébol). Pese a preferirse 
claramente los estudios con suelos recién recogidos del campo, si es 
preciso almacenar el suelo recogido y procesado antes de comenzar el estudio, las condiciones de conservación deberán ser las adecuadas y el plazo de almacenamiento limitado (4 ± 2
 o C durante un máximo 
de tres meses) para mantener la actividad microbiana (  2 ). Se encon ­
trarán instrucciones detalladas sobre la recogida, manipulación y conservación de suelos con vistas a su uso en experimentos de biotransformación en (8)(10)(15)(26)(27).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) La característica de retención de agua de un suelo puede medirse como capacidad de 
campo, como capacidad de retención de agua o como tensión de succión de agua (pF). 
Más explicaciones en el anexo 1. Deberá consignarse en el informe del ensayo si las 
características de retención de agua y la densidad aparente de los suelos se determinaron 
en muestras no perturbadas o en muestras perturbadas (procesadas). 
( 2 ) Según los resultados de recientes investigaciones, los suelos de las zonas templadas 
pueden almacenarse también a - 20  o C durante más de tres meses (28) (29) sin pérdida 
significativa de actividad microbiana.
 Antes de utilizar en este ensayo el suelo procesado, deberá preincu ­
barse este para hacer posible la germinación y eliminación de las 
semillas y restablecer el equilibrio del metabolismo microbiano tras el paso de las condiciones de muestreo o conservación a las de incubación. En general resulta adecuado un período de preincubación 
de entre 2 y 28 días en condiciones de temperatura y humedad 
próximas a las del ensayo real (15). La suma de los períodos de conservación y de preincubación no deberá exceder de tres meses.
 
1.9 REALIZACIÓN DEL ENSAYO  
1.9.1  Condiciones de ensayo  
1.9.1.1  Temperatura del ensayo  
Durante la totalidad del período de ensayo, deberán incubarse los 
suelos en la oscuridad a una temperatura constante que sea repre ­
sentativa de las condiciones climáticas en que tendrá lugar el uso o la liberación. Se recomienda una temperatura de 20 ± 2
 o C para 
todas las sustancias de ensayo que puedan llegar al suelo en climas 
templados. Deberá controlarse esta temperatura. 
Si se trata de sustancias químicas aplicadas o liberadas en climas 
más fríos (por ejemplo, en países septentrionales, durante el otoño o el invierno), deberán incubarse muestras de suelo adicionales pero a una temperatura inferior (por ejemplo, 10± 2
 o C). 
1.9.1.2  Contenido de humedad  
Para los ensayos de transformación en condiciones aerobias, deberá 
ajustarse el contenido de humedad (  1 ) del suelo a un pF situado entre 
2,0 y 2,5 y mantenerse en ese valor (3) El contenido de humedad del 
suelo se expresa como cociente entre masa de agua y masa de suelo seco y debe ser controlado periódicamente (por ejemplo, a intervalos de 2 semanas) pesando los recipientes de incubación y compensando 
las pérdidas de agua mediante la adición de, preferiblemente, agua de 
grifo esterilizada por filtración. Habrá que procurar evitar o reducir al mínimo las pérdidas de sustancia de ensayo y/o productos de trans ­
formación por volatilización y/o fotodegradación (en su caso) du ­
rante la adición de humedad. 
Para los ensayos de transformación en condiciones anaerobias y de 
arrozal, se satura de agua el suelo mediante inundación.
 
1.9.1.3  Condiciones aerobias de incubación  
En los sistemas de flujo, se mantendrán las condiciones aerobias 
mediante baldeo intermitente o ventilación continua con aire húme ­
do. En los matraces biométricos, se mantendrá el intercambio de aire mediante difusión.
 
1.9.1.4  Condiciones aerobias estériles  
Con el fin de obtener información sobre la importancia de la trans ­
formación abiótica de una sustancia de ensayo, las muestras de suelo 
podrán ser esterilizadas [sobre métodos de esterilización, véanse las referencias (16) y (29)], tratadas con una sustancia de ensayo estéril (por ejemplo, adición de solución a través de un filtro estéril) y 
aireadas con aire humidificado estéril según se describe en el punto 
1.9.1.3. En el caso de los suelos de arrozal, será preciso esterilizar el suelo y el agua, y efectuar la incubación según se describe en el punto 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) El suelo no deberá estar ni demasiado húmedo ni demasiado seco para mantener una 
aireación y nutrición adecuadas de la microflora edáfica. El contenido de humedad 
recomendado para un crecimiento microbiano óptimo se sitúa entre 40-60 % de capaci ­
dad de retención de agua (WHC) y entre 0,1-0,33 bar (6). Este último intervalo equivale 
a un pF comprendido entre 2,0 y 2,5. En el anexo 2 se dan los contenidos de humedad 
típicos de varios tipos de suelo.
 1.9.1.5  Condiciones anaerobias de incubación  
Para crear y mantener unas condiciones anaerobias, se procede a 
cubrir de agua (capa de 1-3 cm de agua) el suelo previamente tratado con la sustancia de ensayo e incubado en condiciones aerobias du ­
rante 30 días o una semivida o DT
 50 (el valor que sea más pequeño) 
y a inyectar un gas inerte (por ejemplo, nitrógeno o argón) en el sistema de incubación (
 1 ). El sistema de ensayo deberá permitir la 
medición del pH, la concentración de oxígeno y el potencial redox e 
incluir dispositivos de fijación de productos volátiles. El sistema 
biométrico deberá estar cerrado, para evitar la entrada de aire por difusión.
 
1.9.1.6  Condiciones de incubación de arrozal  
Para estudiar la transformación en suelos de arrozal, se inundará el 
suelo con una capa de agua de 1-5 cm y se aplica la sustancia de ensayo 
a la fase acuosa (9). Se recomienda que la profundidad del suelo sea de 
al menos 5 cm. El sistema se ventila con aire como en condiciones aerobias. Deberán controlarse y registrarse el pH, la concentración de oxígeno y el potencial redox de la capa acuosa. Será necesario un 
período de preincubación de al menos dos semanas antes de dar co ­
mienzo a los estudios de transformación (véase el punto 1.8.3.2).
 
1.9.1.7  Duración del ensayo  
Los estudios de tasa y vía no deberán exceder normalmente de 120 
días (  2 ) (3)(6)(8), porque transcurrido ese plazo es de esperar un decre ­
cimiento de la actividad microbiana del suelo con el tiempo en un sis ­
tema artificial de laboratorio sin posibilidad de reconstitución natural. 
Cuando resulte necesario para caracterizar el declive de la sustancia de 
ensayo y la formación y declive de los principales productos de trans ­
formación, podrán prolongarse los estudios durante períodos más largos (por ejemplo, 6 o 12 meses) (8). El uso de un período de incubación más 
largo deberá quedar justificado en el informe del ensayo y acompañarse 
de medidas de biomasa durante y al final del período.
 
1.9.2  Realización del ensayo  
Se colocan de 50 a 200 g de suelo (peso seco) en cada recipiente de 
incubación (véanse las figuras 1 y 2 del anexo 3) y se trata el suelo con la sustancia de ensayo mediante uno de los métodos descritos en el punto 1.8.2. Cuando se utilicen disolventes orgánicos para la aplicación 
de la sustancia de ensayo, deberán retirarse del suelo por evaporación. 
A continuación, se mezcla bien el suelo con una espátula y/o agitando el recipiente. Si el estudio se realiza en condiciones de arrozal, se mezclarán bien el suelo y el agua tras la aplicación de la sustancia de 
ensayo. Se analizarán pequeñas partes alícuotas (por ejemplo, 1 g) de 
los suelos tratados para comprobar la distribución uniforme de la sus ­
tancia de ensayo. Más adelante se presentan métodos alternativos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Las condiciones aerobias son dominantes en los suelos superficiales e incluso en los 
situados debajo de la superficie, según demuestra un proyecto de investigación patroci ­
nado por la UE [K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: 
Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, 
Sigtuna, Sweden]. Las condiciones anaerobias se presentan tan solo ocasionalmente con 
motivo de la inundación del suelo tras lluvias intensas o cuando se establecen las 
condiciones de arrozal. 
(
 2 ) Los estudios aerobios podrían terminar mucho antes de estos 120 días siempre que se 
haya establecido manifiestamente la vía de transformación última y la mineralización 
última. Es posible asimismo la terminación del ensayo a los 120 días, o cuando se haya 
transformado el 90 % de la sustancia de ensayo, pero solo si se ha formado al menos un 
5 % de CO  2 .
 La tasa de tratamiento debe corresponder a la tasa de aplicación más 
elevada de un producto fitosanitario recomendada en las instruccio ­
nes de empleo y a incorporación uniforme a una profundidad apro ­
piada en el campo [por ejemplo, capa superior (  1 ) de 10 cm de 
suelo]. Por ejemplo, para productos químicos aplicados sobre el 
follaje o el suelo sin incorporación, la profundidad apropiada para 
calcular la cantidad de producto químico que debe añadirse a cada recipiente es de 2,5 cm. Para productos químicos incorporados al suelo, la profundidad apropiada es la profundidad de incorporación 
especificada en las instrucciones de empleo. Para productos químicos 
ordinarios, deberá calcularse la tasa de aplicación sobre la base de la vía de penetración más importante; por ejemplo, cuando la vía prin ­
cipal de penetración en el suelo sean los lodos de depuración, deberá 
dosificarse el producto químico en el lodo a una concentración que 
corresponda a la concentración prevista en el lodo y deberá añadirse al suelo una cantidad de lodo que corresponda a su carga normal en los suelos agrícolas. Si esta concentración no es suficientemente 
elevada para permitir la identificación de los principales productos 
de transformación, podrá proceder la incubación de muestras de suelo independientes que contengan tasas superiores, pero deben evitarse las tasas excesivas que influyan en las funciones microbianas 
del suelo (véanse los puntos 1.5 y 1.8.2). 
Alternativamente, se podrá tratar un lote de suelo mayor (de 1 a 
2 kg) con la sustancia de ensayo, mezclándolo bien en una máquina mezcladora adecuada y transfiriéndolo luego en porciones pequeñas 
de 50 a 200 g a los recipientes de incubación (por ejemplo utilizando 
separadores de muestras). Se analizarán pequeñas partes alícuotas (por ejemplo, 1 g) del lote de suelo tratado para comprobar la dis ­
tribución uniforme de la sustancia de ensayo. Resulta preferible este 
procedimiento porque hace posible una distribución más uniforme de 
la sustancia de ensayo en el suelo. 
Por otra parte, se incuban muestras de suelo no tratadas en las 
mismas condiciones (aerobias) de las muestras tratadas con la sus ­
tancia de ensayo. Estas muestras se utilizan para medición de bio ­
masa durante los estudios y al finalizar estos. 
Cuando se aplica al suelo la sustancia de ensayo disuelta en uno o 
más disolventes orgánicos, se incuban muestras de suelo tratadas con 
la misma cantidad de disolvente(s) en las mismas condiciones (ae ­
robias) que las muestras tratadas con la sustancia de ensayo. Estas muestras se utilizan para medir la biomasa al comienzo, durante y al 
final de los estudios, con el fin de comprobar los efectos del disol ­
vente o los disolventes en la biomasa microbiana. 
Los recipientes con el suelo tratado serán conectados al sistema de 
flujo descrito en la figura 1 o cerrados con la columna de absorción 
mostrada en la figura 2 (véase el anexo 3).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) La concentración inicial en una superficie se calcula utilizando la ecuación siguiente:  
C soil mg=kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg=kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d kg  soil=m 3 h i  
C soil = concentración inicial en el suelo [mg.kg  -1 ] 
A = tasa de aplicación [kg.ha  -1 ]; 1 = espesor de la capa de suelo en el campo [m]; 
d = densidad aparente en seco del suelo [kg-m  -3 ]. 
A título indicativo, una tasa de aplicación de 1 kg.ha  -1 da por resultado una concen ­
tración en el suelo de aproximadamente 1 mg.kg  -1 en una capa de 10 cm (supuesta una 
densidad aparente de 1 g . cm  -3 ).
 1.9.3  Muestreo y medidas  
Se retirarán los recipientes de incubación duplicados a intervalos de 
tiempo apropiados, extrayéndose muestras de suelo con disolventes adecuados de distinta polaridad y analizándose para medir la sustan ­
cia de ensayo y/o los productos de transformación. Un estudio bien 
diseñado deberá incluir recipientes suficientes, de manera que pue ­
dan sacrificarse dos en cada toma de muestras. De la misma manera, se retirarán soluciones de absorción o materiales sólidos de absorción 
a distintos intervalos temporales (de 7 días durante el primer mes y 
de 17 días posteriormente) durante y al final de la incubación de cada muestra de suelo y se analizan para medir productos volátiles. 
Además de la muestra de suelo tomada directamente tras la aplica ­
ción (muestra del día cero), deberán incluirse al menos 5 puntos de muestreo adicionales. Se escogerán los intervalos de tiempo de ma ­
nera que se pueda determinar el patrón de declive de la sustancia de 
ensayo y los patrones de formación y declive de los productos de 
transformación (por ejemplo, 0, 1, 3, 7 días; 2,3 semanas; 1, 2, 3 meses, etc.). 
Cuando se use una sustancia de ensayo marcada con
 14 C, se cuan ­
tificará la radiactividad no extraíble mediante combustión y se cal ­
culará un balance de materia para cada intervalo de muestreo. 
En caso de incubación anaerobia o de arrozal, se podrán analizar 
conjuntamente las fases de suelo y agua para medir la sustancia de ensayo y los productos de transformación, o separarlas por filtración 
o centrifugado antes de la extracción y el análisis.
 
1.9.4  Ensayos facultativos  
Podría resultar de utilidad la realización de estudios aerobios no 
estériles para otros valores de temperatura y humedad del suelo 
para estimar la influencia de la temperatura y la humedad del suelo sobre la tasa de transformación de una sustancia de ensayo y/o de sus productos de transformación en el suelo. 
Puede intentarse otra caracterización de la radiactividad no extraíble 
utilizando, por ejemplo, extracción mediante fluido supercrítico.
 
2 RESULTADOS  
2.1 TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
Las cantidades de sustancia de ensayo, productos de transformación, 
sustancias volátiles (solo en porcentaje) y no extraíbles se expresarán 
en porcentaje de la concentración inicial aplicada y, cuando proceda, 
en mg.kg  -1 de suelo (sobre la base del peso del suelo en seco) para 
cada intervalo de muestreo. El balance de materia se expresará en porcentaje de la concentración inicial aplicada para cada intervalo de 
muestreo. La representación gráfica de las concentraciones de la 
sustancia de ensayo en función del tiempo permitirá estimar la se ­
mivida de su transformación o DT
 50 . Deberán identificarse los prin ­
cipales productos de transformación y se representarán gráficamente 
sus concentraciones en función del tiempo para mostrar sus tasas de 
formación y declive. Se considerará producto de transformación prin ­
cipal cualquier producto que represente ≥ 10 % de la dosis aplicada 
en cualquier momento del estudio. 
Los productos volátiles fijados dan una indicación de la volatilidad 
potencial de la sustancia de ensayo y de sus productos de trans ­
formación a partir del suelo.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Se obtendrán determinaciones más exactas de las semividas o valores 
DT 50 y, si procede, valores DT  75 y DT  90 , mediante cálculos con los 
modelos cinéticos apropiados. Se consignarán los valores de semi ­
vida y DT  50 junto con la descripción del modelo utilizado, el orden 
de la cinética y el coeficiente de determinación (r  2 ). Se prefiere la 
cinética de primer orden salvo que r  2 < 0,7. Si procede, se aplicarán 
los cálculos asimismo a los principales productos de transformación. En las referencias (31) a (35) se describen ejemplos de modelos adecuados. 
Si se trata de estudios de tasas efectuados a varias temperaturas, las 
tasas de transformación deberán describirse como función de la tem ­
peratura dentro del intervalo de temperaturas experimental utilizando 
la relación de Arrhenius de la forma:
 
k ¼ A·e ÄB=T o lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
donde ln A y B son constantes de regresión que corresponden a la 
ordenada en el origen y la pendiente, respectivamente, de una recta de mejor ajuste generada por regresión lineal de ln k frente a 1/T, k 
es la constante de tasa a temperatura T y T es la temperatura en 
Kelvin. Deberá prestarse atención al intervalo limitado de tempera ­
turas en el que será válida la relación de Arrhenius en el caso de que la transformación esté gobernada por la acción microbiana.
 
2.2 EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Aunque los estudios se realizan en un sistema artificial de laborato ­
rio, los resultados permitirán estimar la tasa de transformación de la sustancia de ensayo e igualmente la tasa de formación y declive de 
los productos de transformación en condiciones de campo (36)(37). 
El estudio de la vía de transformación de una sustancia de ensayo 
aporta información sobre la transformación estructural de la sustancia 
aplicada en el suelo por reacciones químicas y microbianas.
 
3 INFORME  
INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancia de ensayo: 
— nombre común, nombre químico, número CAS, fórmula estruc ­
tural (indicando la(s) posición(es) del marcador(es) cuando se usa 
material marcado radiactivamente) y propiedades fisicoquímicas 
de interés (véase el punto 1.5), 
— pureza (impurezas) de la sustancia de ensayo, 
— pureza radioquímica de la sustancia química marcada y actividad 
específica (si procede). 
Sustancias de referencia: — nombre químico y estructura de las sustancias de referencia uti ­
lizadas para caracterizar y/o identificar los productos de trans ­
formación. 
Suelos de ensayo: 
— detalles del lugar donde se recogieron, 
— fecha y procedimiento de muestreo,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— propiedades de los suelos, tales como pH, contenido de carbono 
orgánico, textura ( % arena, % limo, % arcilla), capacidad de 
intercambio de cationes, densidad aparente, característica de re ­
tención de agua y biomasa microbiana, 
— duración del almacenamiento y condiciones de conservación (si 
se ha almacenado). 
Condiciones de ensayo: — fechas de realización de los estudios, 
— cantidad de la sustancia de ensayo aplicada, 
— disolventes utilizados y método de aplicación de la sustancia de 
ensayo, 
— peso del suelo tratado inicialmente y muestreado a cada intervalo 
para su análisis, 
— descripción del sistema de incubación utilizado, 
— tasas de flujo de aire (solo para sistemas de flujo), 
— temperatura de la configuración experimental, — contenido de humedad del suelo durante la incubación, 
— biomasa microbiana al comienzo, durante y al final de los estu ­
dios aerobios, 
— pH, concentración de oxígeno y potencial redox al comienzo, 
durante y al final de los estudios anaerobios y de arrozal, 
— método(s) de extracción, — métodos de cuantificación e identificación de la sustancia de 
ensayo y de los principales productos de transformación en el 
suelo y los materiales de absorción, 
— número de duplicados y número de controles. 
Resultados: 
— resultado de la determinación de la actividad microbiana, — repetibilidad y sensibilidad de los métodos analíticos utilizados, 
— tasas de recuperación (en el punto 1.7.1 se dan los valores por ­
centuales para un estudio válido), 
— cuadros de resultados expresados como porcentaje de la dosis 
inicial aplicada y, si procede, en mg.kg
 -1 de suelo (sobre la 
base del peso en seco), 
— balance de materia durante y al final de los estudios, 
— caracterización de la radiactividad no extraíble (ligada) o los 
residuos en el suelo, 
— cuantificación del CO  2 y otros compuestos volátiles liberados, 
— representación gráfica de concentración en el suelo en función 
del tiempo de la sustancia de ensayo y, si procede, de los prin ­
cipales productos de transformación, 
— semivida o DT  50 , DT  75 y DT  90 de la sustancia de ensayo y, si 
procede, de los principales productos de transformación, inclu ­
yendo límites de confianza,  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— estimación de la tasa de degradación abiótica en condiciones 
estériles, 
— valoración de la cinética de transformación de la sustancia de 
ensayo y, si procede, de los principales productos de transforma ­
ción, 
— vías de transformación propuestas, si procede, 
— evaluación e interpretación de los resultados, 
— datos en bruto (muestras de cromatogramas, muestras de cálculos 
de tasas de transformación y medios utilizados para identificar los productos de transformación).
 
4 REFERENCIAS  
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide As ­
sessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmen ­
tal Fate. 
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fa ­
te. Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
(3) Unión Europea (UE) (1995). Directiva 95/36/CE de la Comi ­
sión, de 14 de julio de 1995, por la que se modificà la 
Directiva 91/414/CEE del Consejo relativa a la comercializa ­
ción de productos Fitosanitarios. Anexo II, parte A y anexo III, parte A: Destino y comportamiento en el medio 
ambiente. 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air. 
(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflan ­
zenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutz ­
mitteln im Boden — Abbau, Umwandlung und Metabolis ­
mus. 
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on labora ­
tory tests for biodegradation of organic chemicals in soil — 
Part 1: Aerobic conditions. 
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemi ­
cals in soil under aerobic conditions. 
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed. 
(9) MAFF — Japan 2000 — Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil — Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded). 
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995. 
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interac ­
tions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 123-157. 
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley — VCH (1998). (13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56,945-956 (IUPAC 1984) 
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in 
Soil (adopted 12 May 1981)
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality — Sampling — Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the labora ­
tory. 
(16) Anexo V de la Dir. 67/548/CEE. (17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Bioche ­
mistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114. 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962). 
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mine ­
ralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Mi ­
crobiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. 
Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition. 
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
— General aspects; chemical and physical methods of analy ­
sis; biological methods of analysis. First Edition. 
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geolo ­
gischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrolo ­
gischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main. 
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart. 
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological met ­
hod for the quantitative measurement of microbial biomass in 
soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221. 
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality — Determination of 
soil microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respira ­
tion method. Part 2: fumigation-extraction method. 
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60. 
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transforma ­
tion in the environment: Aerobic and biotransformation of 
pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16
 th 
Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120. 
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbio ­
logy and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe). 
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and 
cold storage of soil on microbial activities and biomass. In 
Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SE ­
TAC-Europe). 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of 
ethylene oxide on soil microbial content and some chemical 
characteristics. Plant and Soil 102, 197-200. 
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feu ­
chte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im 
Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VU, 141-146.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical mo ­
delling to the soil persistence and accumulation of pesticides. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Her ­
bicides, 181-199. 
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In 
«Environmental Dynamics of Pesticides». R. Haque and V.H. 
Freed, Eds., 135-172. 
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz — Nachrichten 
Bayer 39, 188-204. 
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pes ­
ticide residues. I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer 33, 
47-60. 
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dis ­
sipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041. 
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 83-122.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
Anexo 1  
TENSIÓN DE AGUA, CAPACIDAD DE CAMPO (FC) Y CAPACIDAD DE RETENCIÓN 
DE AGUA (WHC)  ( 1 ) 
Altura de la columna de agua 
[cm] PF (  a ) bar (  b ) Observaciones  
10' 7 10  4 Suelo seco 
1,6 .10  4 4,2 16 Punto de marchitamiento 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6.10  2 2,8 0,6 
3,3 • 10  2 2,5 0,33 (  c ) 
Gama de 
Capacidad de campo (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHC (aproximación) 
1 0 0,001 Suelo saturado de agua
 
( a ) pF = log de Ja altura en cm de la columna de agua. 
( b ) 1 bar= 10  5 Pa. 
( c ) Corresponde a un contenido de agua aproximado de 10 % en arena, 35 % en suelo franco y 45 % en arcilla. 
( d ) La capacidad de campo no es constante, sino que varía con el tipo de suelo entre pF 1,5 y 2,5.  
La tensión de agua  se mide en cm de columna de agua o en bar. Dada la amplia gama de valores 
posibles, la tensión de succión se expresa sencillamente como el valor pF equivalente al logaritmo 
de la altura en cm de la columna de agua. 
La capacidad de campo  se define como la cantidad de agua que puede almacenar un suelo natural 
contra la gravedad 2 días después de un largo período de lluvia o tras una irrigación suficiente. Se determina sobre el terreno en un suelo no perturbado. Por ello, la medida no es aplicable a muestras de suelo de laboratorio perturbadas. Los valores de FC determinados en suelos perturbados pueden 
mostrar grandes varianzas sistemáticas. 
La capacidad de retención de agua  (WHC) se determina en el laboratorio con suelo perturbado y 
no perturbado mediante saturación con agua de una columna de suelo por transporte capilar. Resulta especialmente útil para suelos perturbados y puede ser hasta un 30 % superior a la capacidad de 
campo (1). Además, experimentalmente es más fácil determinar la WHC que valores de FC fiables. 
Notas
 
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen 
und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
Anexo 2  
CONTENIDO DE HUMEDAD DEL SUELO (g de agua por 100 g de suelo seco) DE 
VARIOS TIPOS DE SUELO DE DIVERSOS PAÍSES  
Contenido de humedad del suelo a 
Tipo de suelo País 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Arena Alemania 28,7 8,8 3,9 
Suelo arenoso franco Alemania 50,4 17,9 12,1 
Suelo arenoso franco Suiza 44,0 35,3 9,2 
Suelo franco limoso Suiza 72,8 56,6 28,4 Suelo franco arcilloso Brasil 69,7 38,4 27,3 Suelo franco arcilloso Japón 74,4 57,8 31,4 Suelo franco arenoso Japón 82,4 59,2 36,0 Suelo franco limoso EE.UU. 47,2 33,2 18,8 Suelo franco arenoso EE.UU. 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Capacidad de retención de agua.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
Anexo 3  
Figura 1  
Ejemplo de aparato de flujo para estudiar la transformación de las sustancias químicas en el 
suelo  ( 1 ) ( 2 )
 
Figura 2  
Ejemplo de matraz biométrico para el estudio de la transformación de las sustancias químicas 
en el suelo  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soi] (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VU, 141-146.
 C.24.  TRANSFORMACIÓN AEROBIA Y ANAEROBIA EN 
SISTEMAS DE SEDIMENTOS ACUÁTICOS  
1. MÉTODO  
El presente método reproduce las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 308 (2002).  
1.1 INTRODUCCIÓN 
Los productos químicos pueden llegar a las aguas superficiales a 
nivel profundo o poco profundo por vías como la aplicación directa, 
los aerosoles erráticos, la escorrentía, la eliminación de residuos, los 
efluentes domésticos o agrícolas y la deposición atmosférica. Este método de ensayo consiste en un método de laboratorio para evaluar la transformación aerobia y anaerobia de las sustancias químicas 
orgánicas en los sistemas de sedimentos acuáticos. El método se 
basa en directrices ya existentes (1)(2)(3)(4)(5)(6). En un seminario de la OCDE sobre selección de suelos y sedimentos celebrado en Belgirate (Italia) en 1995 (7) se alcanzó un acuerdo, en particular, 
sobre el número y tipos de sedimentos que deben utilizarse en este 
ensayo. Dicho seminario formuló asimismo recomendaciones sobre recogida, manipulación y conservación de muestras de sedimentos, basadas en la Directriz ISO correspondiente (8). Estos estudios son 
necesarios para las sustancias químicas que se apliquen directamente 
al agua o que tengan probabilidades de llegar al medio ambiente acuático por las vías mencionadas anteriormente. 
Las condiciones en los sistemas de sedimentos acuáticos naturales son 
a menudo aerobias en la fase acuosa superior. La capa superficial del sedimento puede ser o bien aerobia o bien anaerobia, mientras que el sedimento más profundo normalmente es anaerobio. Para abarcar to ­
das estas posibilidades, en el presente documento se describen tanto 
ensayos aerobios como anaerobios. El ensayo aerobio simula una columna de agua aerobia sobre una capa de sedimento aerobio a la que subyace una gradiente anaerobio. El ensayo anaerobio simula un 
sistema de sedimento acuático completamente anaerobio. Si las cir ­
cunstancias indican que es necesario desviarse significativamente de estas recomendaciones, por ejemplo utilizando núcleos de sedimentos intactos o sedimentos que haya estado expuestos a las sustancia de 
ensayo, se dispone de otros métodos con este fin (9).
 
1.2 DEFINICIONES 
En cualquier caso deben utilizarse unidades internacionales (Standard 
International (SI) units).  
Sustancia de ensayo:  cualquier sustancia, sea el compuesto original 
o los correspondientes productos de transformación.  
Productos de transformación:  todas las sustancias resultantes de las 
reacciones de transformación biótica o abiótica de la sustancia de 
ensayo, incluido el CO  2 y los residuos ligados.  
Residuos ligados:  compuestos del suelo, la planta o el animal que 
persisten en la matriz en forma de sustancia original o de sus pro ­
ductos de transformación/metabolitos tras la extracción. El método de extracción no debe modificar sustancialmente ni los propios com ­
puestos ni la estructura de la matriz. La naturaleza del vínculo puede 
aclararse parcialmente mediante métodos de extracción que alteren la 
matriz y técnicas analíticas sofisticadas. Así por ejemplo, hasta la fecha se han identificado de esta manera enlaces covalentes, iónicos y de sorción, así como atrapamientos. En general, la formación de 
residuos ligados reduce de manera significativa la bioaccesibilidad y 
la biodisponibilidad (10) [modificado de TUPAC 1984 (11)].
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Transformación aerobia:  (oxidación) reacciones que se producen 
en presencia de oxígeno molecular (12).  
Transformación anaerobia:  (reducción) reacciones que se producen 
en ausencia de oxígeno molecular (12).  
Aguas naturales:  aguas superficiales obtenidas de estanques, ríos, 
arroyos, etc.  
Sedimento:  mezcla de constituyentes químicos minerales y orgáni ­
cos; estos últimos contienen compuestos de elevado contenido en carbono y en nitrógeno y de peso molecular elevado. El sedimento 
es depositado por las aguas naturales y forma una interfaz con el 
agua.  
Mineralización:  degradación completa de un compuesto orgánico a 
CO
 2 y H  2 O en condiciones aerobias y a CH  4 , CO  2 y H  2 O en con ­
diciones anaerobias. En el contexto del presente método, cuando se 
utiliza un compuesto radiomarcado, mineralización significa la 
amplia degradación de una molécula durante la cual se oxida un átomo de carbono marcado o se reduce cuantitativamente con libe ­
ración de la cantidad apropiada de
 14 CO 2 o 14 CH 4 , respectivamente.  
Semivida:  t 0,5 , es el tiempo que tarda la transformación del 50 % de 
una sustancia de ensayo cuando puede describirse dicha transforma ­
ción mediante una cinética de primer orden; es independiente de la concentración inicial.  
DT
 50 (tiempo de desaparición SO):  es el tiempo que tarda la con ­
centración inicial de la sustancia de ensayo en reducirse en un 50 %.  
DT 75 (tiempo de desaparición 75):  es el tiempo que tarda la con ­
centración inicial de la sustancia de ensayo en reducirse en un 75 %.  
DT 90 (tiempo de desaparición 90):  es el tiempo que tarda la con ­
centración inicial de la sustancia de ensayo en reducirse en un 90 %.  
1.3 COMPUESTOS DE REFERENCIA 
Deben utilizarse sustancias de referencia para la cuantificación e 
identificación de los productos de transformación por métodos espec ­
troscópicos o cromatográficos.  
1.4 INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA DE ENSAYO 
Para medir la tasa de transformación podrá utilizarse una sustancia 
de ensayo no marcada o marcada con un isótopo, aunque se prefiere 
el material marcado. Para estudiar la vía de transformación y esta ­
blecer un balance de materia se requiere material marcado. Se reco ­
mienda el marcado con  14 C, pero también puede resultar de utilidad 
el uso de otros isótopos, tales como  13 C, 15 N, 3 H o  32 P. El marcador 
deberá ubicarse, en la medida de lo posible, en la parte o las partes 
más estables de la molécula (  1 ). La pureza química y/o radioquímica 
de la sustancia de ensayo debe ser de al menos el 95 %. 
Antes de llevar a cabo el ensayo, debe disponerse de la información 
siguiente sobre la sustancia de ensayo: 
a) solubilidad en agua (Método A.6); 
b) solubilidad en disolventes orgánicos; 
c) presión de vapor (Método A.4) y constante de la ley de Henry;  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Por ejemplo, si la sustancia de ensayo contiene un anillo, es preciso marcar ese anillo: si 
contiene dos o más anillos, puede resultar necesario efectuar estudios separados para 
evaluar el destino de cada anillo marcado y obtener información adecuada sobre la 
formación de los productos de transformación.
 d) coeficiente de reparto n-octanol/agua (Método A.8); 
e) coeficiente de adsorción (K  d , Kf o K  oc , en su caso) (Método C. 
18); 
f) hidrólisis (Método C.7); 
g) constante de disociación (pK  a ) [Directriz OECD 112] (13); 
h) estructura química de la sustancia de ensayo y posición de la 
marca o marcas isotópicas, en su caso.  
Nota:  Debe indicarse la temperatura a la que se hicieron estas me ­
diciones. 
Además, puede incluirse otra información de utilidad como datos 
sobre la toxicidad de la sustancia de ensayo para los microorganis ­
mos, sobre la biodegrabilidad inherente o inmediata, y sobre la trans ­
formación aerobia y anaerobia en el suelo. 
Debe contarse con métodos analíticos (incluidos métodos de extrac ­
ción y depuración) para la cuantificación e identificación de la sus ­
tancia de ensayo y de sus productos de transformación en el agua y los sedimentos (véase el punto 1.7.2).
 
1.5 PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO 
El método descrito en este ensayo emplea un sistema de sedimento 
acuático aerobio y anaerobio (véase el anexo 1) que permite: 
i) la medición de la tasa de transformación de la sustancia de 
ensayo en un sistema de sedimento-agua, 
ii) la medición de la tasa de transformación de la sustancia de 
ensayo en el sedimento, 
iii) la medición de la tasa de mineralización de la sustancia de 
ensayo y/o sus productos de transformación (cuando se utiliza una sustancia de ensayo marcada con
 14 C), 
iv) la identificación y cuantificación de los productos de transforma ­
ción en las fases acuática y de sedimentaria incluido el balance 
de materia (cuando se utilice una sustancia de ensayo marcada), 
v) la medición de la distribución de la sustancia de ensayo y sus 
productos de transformación entre las dos fases durante un pe ­
ríodo de incubación en la oscuridad (para evitar, por ejemplo, floraciones de algas) a temperatura constante; las semividas y los 
valores DT50, DT75 y DT
 90 se determinarán cuando los datos lo 
permitan, pero no deben extrapolarse mucho más allá del período experimental (véase el punto 1.2). 
Se requieren al menos dos sedimentos y sus aguas asociadas para 
cada uno de los estudios aerobio y anaerobio (7). Sin embargo, puede haber casos en los que se usen más de dos sedimentos acuá ­
ticos, por ejemplo, para una sustancia química que pueda estar pre ­
sente en entornos de aguas dulces y/o marinas.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6 APLICABILIDAD DEL ENSAYO 
El método es aplicable en general a todas las sustancias químicas (no 
marcadas o marcadas) para las que se disponga de un método ana ­
lítico de suficiente exactitud y sensibilidad. Es aplicable a compues ­
tos ligeramente volátiles, no volátiles, solubles en agua o poco solu ­
bles en agua. El ensayo no deberá aplicarse a sustancias químicas que sean muy volátiles a partir del agua (por ejemplo, fumigantes o disolventes orgánicos) y, por tanto, no se puedan mantener en el 
agua y/o el sedimento en las condiciones experimentales del presente 
ensayo. 
Este método se ha aplicado hasta ahora para estudiar la transforma ­
ción de sustancias químicas en aguas dulces y sedimentos, pero, en principio, se puede aplicar también a sistemas marinos/de estuarios. No es adecuado para simular las condiciones de aguas corrientes (por 
ejemplo, ríos) o el mar abierto.
 
1.7 CRITERIOS DE CALIDAD  
1.7.1  Recuperación  
La extracción y el análisis de muestras de agua y sedimento, cuando 
menos duplicadas, inmediatamente después de la adición de la sus ­
tancia de ensayo dan una primera indicación de la repetibilidad del método analítico y de la uniformidad del procedimiento de aplica ­
ción de la sustancia de ensayo. Los valores de recuperación para 
fases posteriores del experimento los dan los balances de materia respectivos (cuando se utiliza material marcado). Dichos valores deben situarse entre el 90 % y el 110 % para sustancias químicas 
marcadas (6) y entre el 70 % y el 110 % para sustancias químicas no 
marcadas.
 
1.7.2  Repetibilidad y sensibilidad del método analítico  
La repetibilidad del método analítico (excluida la eficiencia de ex ­
tracción inicial) para cuantificar la sustancia de ensayo y los produc ­
tos de transformación puede comprobarse realizando un análisis por duplicado del mismo extracto de las muestras de agua o sedimento que fueron incubadas durante tiempo suficiente para que se formaran 
productos de transformación. 
El límite de detección (LOD) del método analítico de la sustancia de 
ensayo y de los productos de transformación debe alcanzar, como 
mínimo, el menor de los siguientes valores: 0,01 mg.kg
 -1 de agua o 
sedimento (como sustancia de ensayo) o un 1 % de la cantidad inicial aplicada a un sistema de ensayo. También debe especificarse 
el límite de cuantificación (LOQ).
 
1.7.3  Exactitud de los datos de transformación  
El análisis de regresión de las concentraciones de la sustancia de 
ensayo en función del tiempo facilita la información apropiada sobre 
la fiabilidad de la curva de transformación y permite calcular los límites de confianza de las semividas (en el caso de la cinética de pseudo primer orden) o los valores DT
 50 y, si procede, DT  75 y DT  90 . 
1.8 DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.8.1  Sistema de ensayo y equipo  
El estudio debe hacerse en recipientes de vidrio (por ejemplo, fras ­
cos, tubos de centrifugación), a menos que se disponga de informa ­
ción preliminar (como el coeficiente de reparto n-octanol/agua, datos 
sobre adsorción, etc.) que indiquen que la sustancia de ensayo puede adherirse al vidrio, en este caso tendrá que estudiarse la posibilidad de emplear un material alternativo (como Teflon). Cuando se sepa 
que la sustancia de ensayo se adhiere al vidrio, podrá paliarse el 
problema recurriendo a uno o varios de los métodos siguientes:
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— determinar la masa de la sustancia de ensayo y los productos de 
transformación que adsorbe el vidrio, 
— hacer un lavado con disolvente de todos los recipientes de vidrio 
al final del ensayo, 
— utilizar productos formulados (véase también el punto 1.9.2), — utilizar una cantidad mayor de co-disolvente para añadir la sus ­
tancia de ensayo al sistema; si se emplea un co-disolvente debe 
tratarse de uno que no solvate la sustancia de ensayo. 
En los anexos 2 y 3, respectivamente, se muestran ejemplos de 
aparatos de ensayo habituales, por ejemplo, sistemas de flujo de 
gas y biométricos (14). En la referencia 15 se describen otros siste ­
mas útiles de incubación. El diseño del aparato experimental debe permitir el intercambio de aire o nitrógeno y la fijación de los 
productos volátiles. Las dimensiones del aparato deben ser tales 
que se cumplan los requisitos del ensayo (véase el punto 1.9.1). Podrá ventilarse o bien mediante un burbujeo suave o bien haciendo pasar aire o nitrógeno sobre la superficie del agua. En este último 
caso puede ser aconsejable agitar suavemente el agua desde arriba 
para una mejor distribución del oxígeno o el nitrógeno en esta. No debe usarse aire sin CO
 2 ya que puede aumentar el pH del agua. 
En cualquiera de los dos casos, no es conveniente remover el sedi ­
mento, cosa que debe evitarse todo lo posible. Las sustancias quí ­
micas ligeramente volátiles deben ensayarse en sistema biométrico con una agitación suave de la superficie del agua. También pueden utilizarse recipiente cerrados con un espacio libre o bien de aire 
atmosférico o bien de nitrógeno y frascos internos para la fijación 
de productos volátiles (16). En el ensayo aerobio se requiere un intercambio regular del gas del espacio libre a fin de compensar el consumo de oxígeno de la biomasa. 
Entre los fijadores adecuados para recoger productos de transforma ­
ción volátiles cabe citar, de manera no exhaustiva, las soluciones lmol.dm
 -3 de hidróxido de potasio o hidróxido de sodio para el 
dióxido de carbono (  1 ) y el etileno glicol, la etanolamina o la para ­
fina al 2 % en xileno para los compuestos orgánicos. Los compues ­
tos volátiles formados en condiciones anaerobias, como el metano, pueden recogerse, por ejemplo, mediante tamices moleculares. Estos compuestos volátiles pueden convertirse, por ejemplo, en CO
 2 por 
combustión haciendo pasar el gas por un tubo de cuarzo lleno de 
CuO a una temperatura de 900  o C y captando el CO  2 formado en un 
absorbedor con una base (17). 
Se requiere un equipo de laboratorio para el análisis químico de la 
sustancia de ensayo y los productos de transformación (por ejemplo, 
cromatografía líquida de gases (GLC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de capa fina (TLC), espectrosco ­
pia de masas (MS), cromatografía de gases-espectroscopia de masas 
(GC-MS), espectrometría de masas-cromatografía líquida (LC-MS), 
resonancia magnética nuclear (RMN), etc.), incluidos sistemas de detección para sustancias químicas radiomarcadas o no radiomarca ­
das, según corresponda. Cuando se utilice material radiomarcado se 
necesitará también un contador de centelleo de líquidos y una cámara 
de combustión oxidante (para la combustión de muestras de sedi ­
mento antes del análisis de radiactividad). 
Además se necesitará, según corresponda, otro equipo de laboratorio 
estándar para análisis fisicoquímicos y biológicos (véase el cuadro 1, 
punto 1.8.2.2), así como recipientes de vidrio, sustancias químicas y reactivos.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Como estas soluciones de absorción alcalinas absorben también el dióxido de carbono 
del aire de la ventilación y el formado por la respiración en los experimentos aerobios, 
tienen que cambiarse a intervalos regulares para evitar su saturación y, así, la pérdida de 
su capacidad de absorción.
 1.8.2  Selección y número de sedimentos acuáticos  
Los lugares donde se tomen las muestras deberán seleccionarse con 
arreglo a la finalidad del ensayo en cualquier situación dada. Al seleccionar los lugares donde se tomen las muestras, se tendrá en 
cuenta su historia en cuanto a posibles aportaciones de origen agrí ­
cola, industrial o doméstico a la cuenca o los ríos o arroyos aguas arriba. No deben usarse sedimentos si han sido contaminados con la sustancia de ensayo o sus análogos estructurales durante los 4 años 
anteriores.
 
1.8.2.1  Selección de sedimentos  
Para los estudios aerobios se utilizarán normalmente dos sedimentos 
(7). Los dos sedimentos seleccionados tienen que ser distintos en 
cuanto a contenido de carbono orgánico y textura. Un sedimento ha de tener un elevado contenido de carbono orgánico (2,5-7,5 %) y una textura fina, y el otro, un bajo contenido de carbono orgánico 
(0,5-2,5 %) y una textura gruesa. La diferencia en cuanto al conte ­
nido de carbono orgánico debe ser normalmente, al menos, del 2 %. Se entiende por «textura fina» un contenido de [arcilla+limo] (
 1 ) 
>50 % y por «textura gruesa», un contenido de [arcilla+limo] de 
<50 %. La diferencia en cuanto al contenido de [arcilla+limo] debe 
ser normalmente, al menos, del 20 %. En los casos en que una sustancia química pueda llegar también a las aguas marinas, al me ­
nos uno de los sistemas de sedimentos acuáticos deberá ser de origen 
marino. 
Para el estudio estrictamente anaerobio, deben tomarse muestras de 
dos sedimentos (incluidas sus aguas asociadas) de las zonas anaero ­
bias de las masas de agua superficiales (7). Tanto el sedimento como las fases acuáticas tienen que manejarse y transportarse cuidadosa ­
mente en condiciones de exclusión de oxígeno. 
Puede haber otros parámetros que sean importantes para la selección 
de los sedimentos y que deban considerarse caso por caso. Por 
ejemplo, el pH de los sedimentos sería importante para ensayar sustancias químicas cuando su transformación y/o adsorción pueda depender de este. La dependencia de la adsorción con respecto al pH 
podría venir dada por la pK
 a de la sustancia de ensayo.  
1.8.2.2  Caracterización de las muestras sedimento-agua  
En el cuadro a continuación se resumen los parámetros clave que 
deben medirse e indicarse (con referencia al método utilizado) tanto 
para el agua como para el sedimento, y la fase del ensayo en la que 
deben determinarse. En la bilbiografía, referencias (18)(19)(20) y (21), se dan, a título informativo, los métodos de determinación de estos parámetros. 
Además, puede ser necesario medir e indicar caso por caso otros 
parámetros (por ejemplo, para las aguas dulces: partículas, alcalini ­
dad, dureza, conductividad y NO
 3 /PO  4 (proporción y valores de cada 
compuesto); para los sedimentos: capacidad de intercambio de catio ­
nes, capacidad de retención de agua, carbonates, fósforo y nitrógeno 
totales; y para los sistemas marinos: salinidad. El análisis de los 
sedimentos y el agua para detectar nitratos, sulfatos, hierro biodis ­
ponible y posiblemente otros aceptadores de electrones puede ser útil también al valorar las condiciones redox, especialmente en relación 
con la transformación anaerobia.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) [Arcilla+limo] es la fracción mineral del sedimento con un tamaño de partícula < 50 μm.
 Medición de parámetros para la caracterización de las muestras agua-sedimentos (7)(22)(23)  
Parametro Fase del procedimiento de ensayo 
muestreo in 
situ manejo 
posterior inicio de la 
aclimatación al inicio del 
ensayo durante el 
ensayo al final del 
ensayo  
Agua  
Origen/fuente x 
Temperatura x pH* x x x x x COT x x x 
Concentración de O
 2 * x x x x x 
Potencial redox* x x x x  
Sedimento  
Origen/fuente x 
Profundidad de la capa x 
pH (*) x x x x x Distribución del tama ňo de las 
partículas x 
COT x x x x 
Biomasa microbiana (**) x x x Potencial redox (*) Observa ­
ción (co­
lor/olor) x x x x
 
(*) Los resultados de investigaciones recientes han mostrado que las mediciones de las concentraciones de oxígeno en el 
agua y los potenciales redox no tienen un valor mecáno ni predictivo on lo que se refiere al crecimiento y desarrollo 
de poblaciones microbianas en aguas superficiales (24)(25). La determinacíon de la demanda bioquímica de oxígeno 
(DBO en la toma de muestras, el inicio y el final del ensayo) y de las concentraciones de  los micro/macronutrientes  
Ca, Mg y Mn (al inicio y al final del ensayo) en el agua, y la medición de N y el P totales en los sedimentos (en la 
toma de muestras y al final del ensayo) pueden ser instrumentos mejores para interpretar y evaluar las tasas y las vías 
de biotransformación aerobia. 
(**) Método de la tasa de respiración microbiana (26), método de la fumigación (27) o mediciones de recuento en placas 
(por ejemplo, bacterias, actinomicetos, hongos y colonias totales) para estudios anaerobios; tasa de metanogénesis 
para estudios anaerobios  
1.8.3  Recogida, manejo y almacenamiento  
1.8.3.1  Recogida  
Para la toma de muestras de sedimentos, deberá utilizarse el proyecto 
de Directriz ISO sobre la toma de muestras de sedimentos de 
fondo (8). Las muestras de sedimento se tomarán de toda la capa superior de 5 a 10 cm del sedimento. El agua asociada debe reco ­
gerse del mismo lugar y al mismo tiempo que el sedimento. Para el 
estudio anaerobio, las muestras de sedimento y agua asociada deben 
tomarse en condiciones de exclusión de oxígeno (28) (véase el punto 1.8.2.1). En la bibliografía se describen algunos aparatos de toma de muestras (8) (23).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2  Manejo  
El sedimento se separa del agua por filtración y se tamiza por va 
húmeda a través de una criba de 2 mm utilizando el agua del lugar de recogida sobrante que luego se tira. A continuación, las cantidades 
conocidas de sedimentos y agua se mezclan en la proporción deseada 
(véase el punto 1.9.1) en los recipientes de incubación y se preparan para el período de aclimatación (véase el punto 1.8.4). Para el estudio anaerobio, todas las etapas del manejo tiene que llevarse a cabo en 
condiciones de exclusión de oxígeno (29) (30) (31) (32) y (33).
 
1.8.3.3  Almacenamiento  
Se recomienda encarecidamente utilizar sedimentos y agua recién 
recogidos, pero, si es necesario el almacenamiento, el sedimento y el agua tiene que tamizarse como se ha descrito anteriormente y 
almacenarse juntos, empapados en agua (en una capa de agua de 
6-10 cm), en la oscuridad y a 4 ± 2
 o C 4 durante un máximo de 4 
semanas (7) (8) (23). Las muestras utilizadas par estudios aerobios 
tienen que almacenarse de manera que el aire pueda acceder libre ­
mente (por ejemplo, en recipientes abiertos), mientras que las de estudios anaerobios tiene que estar en condiciones de exclusión de oxígeno. No debe haber congelación del sedimento y el agua ni 
secado del sedimento durante el transporte y el almacenamiento.
 
1.8.4  Preparación de las muestras de sedimento/agua para el ensayo  
Tiene que haber un período de aclimatación antes de añadir la sus ­
tancia de ensayo, teniendo en cuenta que cada muestra de sedimento/ agua ha de colocarse en el recipiente de incubación que se vaya a 
usar en el ensayo principal, y que la aclimatación ha de llevarse a 
cabo exactamente en las mismas condiciones que la incubación para el ensayo (véase el punto 1.9.1). El período de aclimatación es el tiempo necesario para alcanzar una estabilidad razonable del sistema, 
expresada mediante el pH, la concentración de oxígeno en el agua, el 
potencial redox del sedimento y el agua, y la separación macroscó ­
pica de las fases. El período de aclimatación debe durar normalmente entre una y dos semanas y no debe superar las cuatro semanas. Se 
indicarán los resultados de las determinaciones efectuadas durante 
este período.
 
1.9 REALIZACIÓN DEL ENSAYO  
1.9.1  Condiciones del ensayo  
El ensayo deberá hacerse en el aparato de incubación (véase el punto 
1.8.1) con una proporción agua/sedimento en volumen entre 3:1 y 
4:1, y urta capa de sedimento de 2,5 cm (± 0,5 cm). Se recomienda una cantidad mínima de sedimento de 50 g (en peso seco) por recipiente de incubación. 
El ensayo se hará en la oscuridad a una temperatura constante dentro 
de un intervalo de 10 a 30
 o C. Se considera apropiada una tempe ­
ratura de 20 ± 2  o C. En su caso, podría considerarse otra temperatura 
más baja (por ejemplo, 10  o C) en determinados casos concretos, 
según la información que desee obtenerse del ensayo. Deberá con ­
trolarse e indicarse la temperatura de incubación.  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1316
 
1.9.2  Tratamiento y aplicación de la sustancia de ensayo  
Se utilizará una única concentración para el ensayo. Para productos 
fitosanitarios aplicados directamente a las masas de agua, la dosifi ­
cación máxima indicada en la etiqueta debe tomarse como la tasa de 
aplicación máxima calculada basándose en la superficie del agua en 
el recipiente de ensayo. En todos los demás casos, la concentración que ha de emplearse tiene que basarse en las previsiones de emisio ­
nes medioambientales. Se procurará aplicar una concentración ade ­
cuada de la sustancia de ensayo a fin de caracterizar la vía de trans ­
formación y la formación y la desaparición de productos de trans ­
formación. Puede resultar necesario aplicar dosis superiores (por 
ejemplo, 10 veces más) cuando las concentraciones de la sustancia 
de ensayo estén próximas a los límites de detección al inicio del estudio y/o cuando no puedan detectarse fácilmente productos de transformación importantes que estén presentes al 10 % de la tasa 
de aplicación de la sustancia de ensayo. Sin embargo, si se usan 
concentraciones de ensayo más altas, no deberán tener un efecto perjudicial significativo en la actividad microbiana del sistema sedi ­
mento-agua. Para conseguir una concentración constante de la sus ­
tancia de ensayo en recipientes de diferentes dimensiones puede 
considerarse adecuado un ajuste según la cantidad del material apli ­
cado, basándose en la altura de la columna de agua en el recipiente en relación con la profundidad del agua en el campo (que se supone 
que es 100 cm, aunque pueden utilizarse otras alturas). En el anexo 4 
se da un ejemplo de cálculo. 
El procedimiento ideal es aplicar la sustancia de ensayo como una 
solución acuosa en la fase acuosa del sistema de ensayo. Si es 
inevitable, se permite el uso de cantidades pequeñas de disolventes miscibles con agua (como la acetona y el etanol) para la aplicación y distribución de la sustancia de ensayo, pero estas cantidades no 
deben superar el 1 % v/v ni tener efectos perjudiciales para la acti ­
vidad microbiana del sistema de ensayo. Debe procederse con cui ­
dado al generar la solución acuosa de la sustancia de ensayo: puede resultar necesario utilizar aparatos de columnas y pre-mezclado para 
asegurar una homogeneidad completa. Tras añadir la solución acuosa 
al sistema de ensayo, se recomienda mezclar suavemente la fase acuosa, removiendo el sedimento lo menos posible. 
No se recomienda por lo general el uso de productos formulados ya 
que los ingredientes de la fórmula pueden afectar a la distribución de la sustancia de ensayo y/o los productos de transformación entre las fases acuosa y sedimentaria. No obstante, en el caso de sustancias de 
ensayo poco solubles en agua, su utilización puede constituir una 
alternativa apropiada. 
El número de recipientes de incubación depende del número de 
tiempos de muestreo (véase el punto 1.9.3). Debe incluirse un nú ­
mero suficiente de sistemas de ensayo de manera que puedan sacri ­
ficarse dos sistemas en cada tiempo de muestreo. Cuando se empleen unidades de control de cada sistema de sedimento acuático, estas no 
deben tratarse con la sustancia de ensayo. Las unidades de control 
pueden utilizarse para determinar la biomasa microbiana del sedi ­
mento y el carbono orgánico total del agua y del sedimento al final del estudio. Dos de las unidades de control (es decir, una unidad de 
control de cada sedimento acuático) pueden utilizarse para controlar 
los parámetros requeridos en el sedimento y el agua durante el período de aclimatación (véase el cuadro del punto 1.8.2.2). Hay que incluir dos unidades de control adicionales en caso de que la 
sustancia de ensayo se aplique mediante un disolvente para medir los 
efectos negativos del sistema de ensayo en la actividad microbiana.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1317
 
1.9.3  Duración del ensayo y muestreo  
La duración del experimento no superará normalmente los 100 días 
(6). El experimento ha de continuar hasta que queden establecidas la vía de degradación y el modelo de distribución sedimento/agua o 
cuando el 90 % de la sustancia de ensayo se haya disipado por 
transformación y/o volatilización. El número de tiempos de muestreo debe ser seis, como mínimo, (incluido el tiempo 0), teniendo en cuenta que deberá hacerse un estudio opcional preliminar (véase el 
punto 1.9.4) para establecer un régimen de muestreo adecuado y la 
duración del ensayo, a menos que se disponga de datos suficientes sobre la sustancia de ensayo a partir de estudios previos. Para las 
sustancias de ensayo hidrofóbicas, puede ser necesaria la inclusión 
de otros puntos de muestreo durante el período inicial del estudio a fin de determinar la tasa de distribución entre las fases acuosa y sedimentaria. 
Puede ser útil un ensayo con una segunda concentración para sus ­
tancias químicas que lleguen a las aguas superficiales por diferentes vías de entrada en concentraciones significativamente diferentes, siempre que la concentración más baja pueda analizarse con sufi ­
ciente exactitud. A los tiempos de muestreo adecuados, se separan 
los recipientes de incubación completos (copias) para su análisis. Se analizan por separado el sedimento y el agua que sobrenada (
 1 ). El 
agua superficial tiene que separarse con cuidado procurando remover 
el sedimento lo menos posible. La extracción y caracterización de la 
sustancia de ensayo y los productos de transformación deben hacerse conforme a procedimientos analíticos adecuados. Se pondrá cuidado en separar el material que pueda haber sido adsorbido en el reci ­
piente de incubación o los tubos de interconexión utilizados para 
atrapar sustancias volátiles.
 
1.9.4  Ensayo preliminar opcional  
Si no puede calcularse la duración ni el régimen de muestreo a partir 
de otros estudios sobre la sustancia de ensayo, puede resultar ade ­
cuado un ensayo preliminar opcional, que debe hacerse en las mis ­
mas condiciones de ensayo propuestas para el estudio definitivo. Si 
se lleva a cabo el ensayo preliminar, se informará brevemente sobre sus condiciones experimentales y sus resultados.
 
1.9.5  Mediciones y análisis  
Se medirá y se indicará la concentración de la sustancia de ensayo y 
los productos de transformación en cada tiempo de muestreo en el 
agua y el sedimento (como, concentración y como porcentaje de la sustancia aplicada). En general, deberán identificarse los productos de transformación detectados a >10 % de la radiactividad aplicada en 
todo el sistema agua-sedimento en cualquier tiempo de muestreo, a 
no ser que esté razonablemente justificado no hacerlo. Habrá de tomarse en consideración la identificación de los productos de trans ­
formación cuyas concentraciones aumenten continuamente durante el 
estudio, aunque las concentraciones no superen los límites indicados 
anteriormente, ya que este aumento puede indicar persistencia. Este aspecto se considerará caso por caso, justificándolo debidamente en el informe. 
Los resultados de los sistemas de fijación de gases/sustancias volá ­
tiles (CO
 2 y otros, por ejemplo, compuestos orgánicos volátiles) 
deberán indicarse en cada tiempo de muestreo. Se indicarán las tasas de mineralización. Asimismo, se indicarán los residuos no extraíbles 
(ligados) en el sedimento en cada punto de muestreo.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) Cuando pueda darse fácilmente una reoxidación rápida de los productos de la trans ­
formación anaerobia, se mantendrán las condiciones anaerobias durante el muestreo y el 
análisis.
 2 RESULTADOS  
2.1 TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS 
En cada tiempo de muestreo se calculará el balance total de materia 
o la recuperación (véase el punto 1.7.1) de la radiactividad añadida. 
Los resultados deberán indicarse en porcentaje de la radiactividad 
añadida. La distribución de la radiactividad entre el agua y el sedi ­
mento se expresará en concentraciones y porcentajes en cada tiempo de muestreo. 
La semivida, el DT
 50 y, en su caso, el DT  75 y el DT  90 deberán 
calcularse junto con sus límites de confianza (véase el punto 1.7.3) Podrá obtenerse información sobre la tasa de disipación de la sus ­
tancia de ensayo en el agua y el sedimento mediante el uso de 
instrumentos de evaluación adecuados. Estos instrumentos pueden 
ir desde la aplicación de cinética de pseudo primer orden a técnicas empíricas de ajuste de curvas con soluciones gráficas o numéricas y evaluaciones más complejas utilizando; por ejemplo, modelos uni ­
compartimentales o multicompartimentales. Para más información 
puede consultarse la bibliografía correspondiente (35) (36) (37). 
Todos los planteamientos al respecto tienen sus ventajas e inconve ­
nientes y varían considerablemente en cuanto a complejidad. El su ­
puesto de una cinética de primer orden puede ser una simplificación 
excesiva de los procesos de degradación y distribución, pero, cuando es posible, da un término (constante de velocidad o semivida) que es fácilmente comprensible y valioso en la modelización por simulación 
y en los cálculos de las concentraciones previstas en el medio am ­
biente. Los planteamientos empíricos o las transformaciones lineales pueden dar lugar a un mejor ajuste de las curvas a los datos y, por tanto, permitir una mejor estimación de las semividas, los valores 
DT
 50 y, en su caso, los DT  75 y DT  90 . Sin embargo, el uso de las 
constantes derivadas es limitado. Los modelos compartimentales pue ­
den generar una serie de constantes de valor útiles en la evaluación de riesgos que describen la velocidad de degradación en diferentes 
compartimentos y la distribución de la sustancia química. Asimismo, 
estos modelos deben utilizarse para el cálculo de constantes de ve ­
locidad en la formación y degradación de los principales productos de transformación. En todos los casos, el método elegido debe jus ­
tificarse y el experimentador ha de demostrar gráfica o estadística ­
mente la corrección del ajuste.
 
3 INFORME  
3.1 INFORME DEL ENSAYO 
El informe debe comprender la siguiente información: 
Sustancia de ensayo: 
— nombre común, nombre químico, número CAS, fórmula estruc ­
tural (indicando la posición del marcador cuando se usa material marcado radiactivamente) y propiedades fisicoquímicas de interés, 
— pureza (impurezas) de la sustancia de ensayo, 
— pureza radioquímica de la sustancia química marcada y actividad 
molar (si procede).
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Sustancias de referencia: 
— nombre químico y estructura de las sustancias de referencia uti ­
lizadas para caracterizar y/o identificar los productos de trans ­
formación. 
Sedimentos y aguas del ensayo: 
— ubicación y descripción de los lugares donde se han tomado las 
muestras de sedimentos acuáticos incluyendo, si se puede, un 
historial de la contaminación, 
— toda la información sobre la recogida, almacenamiento (si lo hay) 
y aclimatación de los sistemas agua- sedimento, 
— características de las muestras agua-sedimento según lo indicado 
en el cuadro del punto 1.8.2.2. 
Condiciones de ensayo: — sistema de ensayo utilizado (por ejemplo, sistema de flujo, sis ­
tema biométrico, forma de ventilación, método de agitado, volu ­
men de agua, masa del sedimento, grosor de la capa de sedi ­
mento y agua, dimensión del recipiente de prueba, etc.), 
— aplicación de la sustancia de ensayo al sistema de ensayo: con ­
centración de ensayo utilizada, número de copias y testigos, 
forma de aplicación de la sustancia de ensayo (por ejemplo, utilización de disolventes, en su caso) etc., 
— temperatura de incubación, — tiempos de muestreo, — métodos de extracción y sus rendimientos, así como métodos 
analíticos y límites de detección, 
— métodos de caracterización/identificación de productos de trans ­
formación, 
— desviaciones del protocolo de ensayo o de las condiciones de 
ensayo durante el estudio. 
Resultados: — cifras en bruto de los análisis representativos (todos los datos en 
bruto tienen que almacenarse en el archivo BPL), 
— repetibilidad y sensibilidad de los métodos analíticos utilizados, — tasas de recuperación (en el punto 1.7.1 se dan los valores por ­
centuales para un estudio válido), 
— tablas de resultados expresada en % de la dosis aplicada y en 
mg.kg
 -1 en el agua, el sedimento y el sistema completo (solo %) 
para la sustancia de ensayo y, si procede, para los productos de 
transformación y la radiactividad no extraíble, 
— balance de materia durante y al final de los estudios, — representación gráfica de la transformación en las fracciones 
acuosa y sedimentaria y en el sistema completo (incluida la mineralización), 
— tasas de mineralización,
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— semivida, DT50, y, en su caso, DT  75 y DT  90 de la sustancia de 
ensayo y, si procede, de los principales productos de transforma ­
ción, incluyendo límites de confianza en el agua, el sedimento y el sistema completo, 
— valoración de la cinética de transformación de la sustancia de 
ensayo y, si procede, de los principales productos de transforma ­
ción, 
— vía de transformación propuesta, si procede, 
— discusión de los resultados.
 
REFERENCIAS  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Ger ­
many. 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for re ­
gistration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the 
product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 
(a). The Netherlands. 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary gui ­
deline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in 
natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United- Kingdom. 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) — Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37. 
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Che ­
mistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism. 
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels. 
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995. 
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality — Sampling — Part 
12: Guidance on sampling of bottom sediments. 
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080. 
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998). 
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984). 
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981). 
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals. 
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC — Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons. 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637. 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with
 14 C-la­
belled model surfactants. Water Research 21, 661-667. 
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Mo ­
nograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison. 
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17  th edition). American Public Health Asso ­
ciation, American Water Works Association and Water Pollu ­
tion Control Federation, Washington D.C. 
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman. 
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential mea ­
surements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039. 
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on tes ­
ting procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop «A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests», 3-4 July 1991. 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity As ­
sessment (WOSTA), 8-10 November 1993.Eds.: I.R. Hill, P. 
Matthiessen and F. Heimbach. 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide bio ­
transformation in surface waters: multivariate analyses of en ­
vironmental factors at field sites. Water Research 31, 2858- 
2868. 
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on micTobial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338. 
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203. 
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method. 
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21. 
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857. 
(30) Birch, R.R., Biver, G, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550. 
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for asses ­
sing the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597- 3603. 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic che ­
micals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 
712-C-98-090. 
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. To ­
xicol. 58, 961-968. 
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 39, 187-203. 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of 
pesticide residues I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 33, 47-60. 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference — Pest and Diseases, pp 1349-1354.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
Anexo 1  
DIRECTRIZ SOBRE LOS SISTEMAS DE ENSAYO AEROBIOS Y 
ANAEROBIOS  
Sistema de ensayo aerobio  
El sistema de ensayo aerobio descrito en este método de ensayo consiste en una 
capa de agua aerobia (cuyas concentraciones de oxígeno oscilan normalmente 
entre 7 y 10 mg l-1) y una capa de sedimento, aerobio en la superficie y anaerobio por debajo de la superficie (cuyos potenciales redox medios (Eh) oscilan normalmente en la zona anaerobia del sedimento entre - 80 y 
- 190 mV). Se hará circular aire húmedo sobre la superficie del agua en cada 
unidad de incubación para mantener suficiente oxígeno en el espacio libre.
 
Sistema de ensayo anaerobio  
Para el sistema de ensayo anaerobio, el procedimiento del ensayo es esencial ­
mente el mismo que el descrito para el sistema aerobio con la excepción de que 
el nitrógeno humedecido se pasa por la superficie del agua en cada unidad de incubación para mantener un espacio libre de nitrógeno. El sedimento y el agua se consideran anaerobios cuando el potencial redox (Eh) sea inferior a - 100 mV. 
En el ensayo anaerobio, la valoración de la mineralización incluye la medición 
del dióxido de carbono y el metano liberados.
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
Anexo 2  
EJEMPLO DE APARATO DE RUJO
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
Anexo 3  
EJEMPLO DE APARATO BIOMÉTRICO
  ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
Anexo 4  
EJEMPLO DE CÁLCULO DE LA DOSIS QUE DEBE APLICARSE A 
LOS RECIPIENTES DE ENSAYO  
Diámetro interno del cilindro: = 8 cm 
Altura de la columna de agua sin incluir el sedi ­
mento: = 12 cm 
Área de la superficie: 3,142 × 4  2 = 50,3 cm  2 
Tasa de aplicación: 500 g de la sustancia de en ­
sayo/ha corresponde a 5 μg/cm  2 
Total μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Ajuste de la cantidad en relación con una altura de 
100 cm. 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Volumen de la columna de agua: 50,3 × 12 = 603 ml Concentración en el agua: 30,18 ÷ 603 = 0,050 | μg/ml o 50 μg/1
 ▼B 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  MINERALIZACIÓN AEROBIA EN AGUAS SUPERFICIALES. 
ENSAYO DE SIMULACIÓN DE LA BIODEGRADACIÓN  
1. MÉTODO  
El presente método es equivalente a las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 309 (2004) (1).  
1.1. INTRODUCCIÓN 
El objeto de este ensayo es medir la evolución temporal de la biode ­
gradación de una sustancia problema a baja concentración en agua 
natural aerobia y cuantificar las observaciones en forma de expre ­
siones cinéticas de velocidad. Este ensayo de simulación consiste en un ensayo discontinuo en matraces agitados en el laboratorio para 
determinar velocidades de biodegradación aerobia de sustancias or ­
gánicas en muestras de aguas superficiales naturales (agua dulce, salobre o salada). Se basa en la norma ISO/DIS 14592-1 (2) e incluye también elementos de los métodos de ensayo C.23 
y C.24 (3) (4). Cuando la duración del ensayo es larga, se puede 
optar por un procedimiento semicontinuo en lugar del discontinuo, con el fin de evitar el deterioro del microcosmos de ensayo. El objetivo principal del ensayo de simulación es determinar la mine ­
ralización de la sustancia problema en las aguas superficiales, y la 
mineralización constituye la base para expresar la cinética de degradación. Sin embargo, un posible objetivo secundario del ensayo es obtener información sobre la degradación primaria y la 
formación de los productos de transformación importantes. La iden ­
tificación de los productos de transformación y, a ser posible, la cuantificación de sus concentraciones son especialmente importantes en el caso de las sustancias que se mineralizan muy despacio (por 
ejemplo, con vidas medias del
 14 C total residual superiores 
a 60 días). Normalmente deben utilizarse concentraciones más ele ­
vadas de sustancia problema (por ejemplo, > 100 μg/l) para la iden ­
tificación y cuantificación de los productos de transformación impor ­
tantes, debido a las limitaciones analíticas. 
Una baja concentración en este ensayo significa una concentración 
(por ejemplo, de menos de 1 μg/l a 100 μg/l) lo suficientemente baja 
para garantizar que la cinética de biodegradación obtenida en el 
ensayo refleja la cinética prevista en el medio ambiente. Comparada con la masa total de sustratos carbonados biodegradables presentes en el agua natural utilizada en el ensayo, la sustancia problema 
presente a concentración baja servirá de sustrato secundario. Esto 
significa que la cinética de biodegradación prevista es de primer orden (cinética independiente del «crecimiento») y que la sustancia problema puede degradarse por «cometabolismo». Una cinética de 
primer orden significa que la velocidad de degradación (mg/l/día) es 
proporcional a la concentración de sustrato, que se va reduciendo a lo largo del tiempo. Con una cinética realmente de primer orden, la constante específica de velocidad de degradación, k, es indepen ­
diente del tiempo y de la concentración; es decir, k no varía aprecia ­
blemente a lo largo de la duración de un experimento y no cambia con la concentración añadida entre experimentos. Por definición, la constante específica de velocidad de degradación es igual al cambio 
relativo de concentración por unidad de tiempo: k = (1/C) · (dC/dt). 
Aunque en las condiciones establecidas lo previsible normalmente es una cinética de primer orden, puede haber circunstancias en que sea más adecuada otra cinética. Por ejemplo, pueden observarse desvia ­
ciones de la cinética de primer orden si la velocidad de biotrans ­
formación está limitada por fenómenos de transferencia de masas, como la velocidad de difusión, más que por la velocidad de reacción biológica. Sin embargo, los datos pueden describirse casi siempre 
con una cinética de pseudoprimer orden si se acepta una constante de 
velocidad dependiente de la concentración.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Para facilitar el establecimiento del diseño experimental e interpretar 
los resultados, antes del ensayo debe disponerse de información 
sobre la biodegradabilidad de la sustancia problema a concentracio ­
nes más elevadas (por ejemplo, datos procedentes de ensayos preli ­
minares) y de información sobre la degradabilidad abiótica, los pro ­
ductos de transformación y las propiedades fisicoquímicas pertinen ­
tes. El uso de sustancias problema marcadas con  14 C y la determi ­
nación de la distribución de fases del  14 C al final del ensayo permi ­
ten la determinación de la biodegradabilidad final. Cuando se utilice 
una sustancia problema no marcada, la biodegradación final solo se 
podrá estimar si se estudia una concentración superior y se conocen todos los productos de transformación mayoritarios.
 
1.2. DEFINICIONES 
Se entenderá por:  
Biodegradación primaria : el cambio estructural (transformación) de 
una sustancia química por microorganismos con el resultado de pér ­
dida de la identidad química.  
Biodegradación funcional : el cambio estructural (transformación) 
de una sustancia química por microorganismos con el resultado de pérdida de una propiedad específica.  
Biodegradación aerobia final : la descomposición de una sustancia 
química por microorganismos en presencia de oxígeno hasta dar dióxido de carbono, agua y sales minerales de cualquier otro ele ­
mento presente (mineralización) y la producción de nueva biomasa y 
productos orgánicos de biosíntesis microbiana.  
Mineralización : la descomposición de una sustancia química o ma ­
teria orgánica por microorganismos en presencia de oxígeno hasta 
dar dióxido de carbono, agua y sales minerales de cualquier otro 
elemento presente.  
Tiempo de latencia : el tiempo comprendido desde el inicio de un 
ensayo hasta que se consigue la adaptación de los microorganismos 
de degradación y aumenta hasta un nivel detectable el grado de biodegradación de una sustancia química o materia orgánica (por ejemplo, hasta el 10 % de la biodegradación teórica máxima, o 
menos, en función de la exactitud de la técnica de medición).  
Nivel máximo de biodegradación : el grado de biodegradación de 
una sustancia química o materia orgánica presente en un ensayo, 
expresado en porcentaje, por encima del cual no se produce más 
biodegradación durante el ensayo.  
Sustrato primario : el conjunto de fuentes naturales de carbono y 
energía que permiten el crecimiento y mantenimiento de la biomasa 
microbiana.  
Sustrato secundario : un componente del sustrato presente en una 
concentración tan baja que mediante su degradación solo se propor ­
cionan a los microorganismos competentes cantidades insignificantes de carbono y energía, en comparación con el carbono y la energía suministrados por la degradación de los componentes del sustrato 
principal (sustratos primarios).  
Constante de velocidad de degradación : una constante cinética de 
velocidad de primer orden o pseudoprimer orden, k (d
 –1 ), que indica 
la velocidad de los procesos de degradación. En caso de experimento 
discontinuo, k se estima basándose en la parte inicial de la curva 
de degradación obtenida tras el final del tiempo de latencia.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Vida media, t  1/2 (d): el término utilizado para caracterizar la velo ­
cidad de una reacción de primer orden, consistente en el intervalo de 
tiempo que corresponde a una reducción de la concentración a la mitad. La vida media y la constante de velocidad de degradación están relacionadas por la ecuación t
 1/2 = ln2/k.  
Vida media de degradación, DT  50 (d): el término utilizado para 
cuantificar el resultado de los ensayos de biodegradación, consistente en el intervalo de tiempo, incluido el de latencia, necesario para 
alcanzar el 50 % de biodegradación.  
Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOC) : el 
límite de detección (LOD) es la concentración de una sustancia por 
debajo de la cual no se puede distinguir la identidad de la sustancia 
de la de artefactos analíticos; el límite de cuantificación (LOC) es la concentración de una sustancia por debajo de la cual no puede determinarse dicha concentración con una exactitud aceptable.  
Carbono orgánico disuelto (COD) : la parte del carbono orgánico 
presente en una muestra de agua que no puede eliminarse por una separación de fases especificada como, por ejemplo, mediante cen ­
trifugación a 40 000 ms
 –2 durante 15 min o mediante filtración por 
membrana con poros de 0,2 μm a 0,45 μm de diámetro.  
Actividad del  14 C orgánico total (AOT) : la actividad total del  14 C 
relacionada con el carbono orgánico.  
Actividad del  14 C orgánico disuelto (AOD) : la actividad total del  
14 C relacionada con el carbono orgánico disuelto.  
Actividad del  14 C orgánico particulado (AOP) : la actividad total 
del 14 C relacionada con el carbono orgánico particulado.  
1.3. APLICABILIDAD DEL ENSAYO 
El ensayo de simulación es aplicable a sustancias orgánicas no vo ­
látiles o débilmente volátiles estudiadas a bajas concentraciones. En 
la práctica, si se utilizan matraces abiertos a la atmósfera (por ejem ­
plo, con tapón de algodón), puede considerarse que no son volátiles las sustancias que tienen constantes de la ley de Henry inferiores a 
aproximadamente 1 Pa·m
 3 /mol (unas 10  –5 atm·m  3 /mol). Si se utili ­
zan matraces cerrados con cámara de aire, es posible estudiar sus ­
tancias ligeramente volátiles (con constantes de la ley de Henry < 100 Pa·m
 3 /mol o < 10  –3 atm·m  3 /mol) sin pérdidas del sistema 
de ensayo. Puede haber pérdidas de sustancias marcadas con  14 C, 
si no se toman las debidas precauciones, cuando se elimina el CO  2 . 
En tales situaciones, puede ser necesario atrapar el CO  2 en un ab ­
sorbente interno con álcali o utilizar un sistema externo de absorción 
de CO  2 (determinación directa de  14 CO 2 ; véase el apéndice 3). Para 
determinar la cinética de la biodegradación, la concentración de la sustancia problema debe ser inferior a su hidrosolubilidad. Sin em ­
bargo, ha de señalarse que los valores de hidrosolubilidad que se 
encuentran en la bibliografía pueden ser bastante más elevados que 
la solubilidad de la sustancia problema en aguas naturales. También es posible establecer la solubilidad de sustancias problema especial ­
mente poco hidrosolubles utilizando las aguas naturales que son 
objeto del estudio. 
El método puede utilizarse para simular la biodegradación en aguas 
superficiales libres de partículas gruesas (ensayo pelágico) o en 
aguas superficiales turbias que puede haber, por ejemplo, cerca de 
la interfaz agua/sedimento (ensayo con sedimento en suspensión).
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. PRINCIPIO DEL ENSAYO 
El ensayo se efectúa de forma discontinua incubando la sustancia 
problema solo con agua superficial (ensayo pelágico) o con agua superficial a la que se ha añadido sedimento/sólidos en suspensión 
a la concentración de 0,01 a 1 g/l en peso seco (ensayo con sedi ­
mento en suspensión) para simular una masa de agua con sólidos en suspensión o con sedimento resuspendido. La concentración de se ­
dimento/sólidos en suspensión en la parte inferior de este intervalo es 
representativa de la mayoría de las aguas superficiales. Los matraces 
de ensayo se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente, en condiciones aerobias y con agitación. Para determinar la cinética 
de degradación deben utilizarse al menos dos concentraciones dife ­
rentes de sustancia problema. Las concentraciones deben estar sepa ­
radas por un factor de entre 5 y 10, y representar el intervalo de concentraciones previsto en el medio ambiente. La concentración 
máxima de la sustancia problema no debe superar los 100 μg/l, 
pero es preferible utilizar una concentración máxima en el ensayo por debajo de 10 μg/l o menos, para tener la certeza de que la 
biodegradación sigue una cinética de primer orden. La concentración 
mínima no debe superar los 10 μg/l, pero es preferible que sea del 
orden de 1 a 2 μg/l o incluso inferior a 1 μg/l. Normalmente puede 
efectuarse un análisis adecuado de concentraciones tan bajas utili ­
zando sustancias marcadas con
 14 C disponibles en el mercado. De ­
bido a las limitaciones analíticas, con frecuencia resulta imposible 
medir la concentración de la sustancia problema con la exactitud exigida si dicha concentración es ≤ 100 μg/l (véase el párrafo se ­
gundo del punto 1.7.2). Pueden emplearse concentraciones superiores 
de sustancia problema (> 100 μg/l y a veces > 1 mg/l) para la 
identificación y cuantificación de los productos de transformación mayoritarios o si no se dispone de un método específico de análisis con un límite de detección bajo. Si se estudian concentraciones 
elevadas de sustancia problema, quizás sea imposible utilizar los 
resultados para estimar la constante de degradación de primer orden y la vida media, ya que probablemente la degradación no va a seguir una cinética de primer orden. 
La degradación se va estudiando a intervalos adecuados, midiendo el
 
14 C residual o la concentración residual de sustancia problema si se 
utiliza un análisis químico específico. El marcado con  14 C de la parte 
más estable de la molécula permite la determinación de la minerali ­
zación total, mientras que el marcado con  14 C de una parte menos 
estable de la molécula, así como el uso de análisis específicos, permite la evaluación de solo la biodegradación primaria. Sin em ­
bargo, la parte más estable no incluye necesariamente la fracción 
funcional pertinente de la molécula (que puede relacionarse con 
una propiedad específica, como toxicidad, bioacumulación, etc.). En tal caso, puede ser apropiado utilizar una sustancia problema marcada con
 14 C en la parte funcional para estudiar la eliminación 
de la propiedad específica.  
1.5. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
En este ensayo pueden utilizarse sustancias problema tanto radiomar ­
cadas como sin marcar. Se recomienda la técnica del marcado con  
14 C, normalmente en la parte o partes más estables de la molécula 
(véase también el punto 1.4). En el caso de sustancias que contienen 
más de un anillo aromático, es preferible que estén marcados con  
14 C uno o más carbonos de cada anillo. Por otra parte, es aconsejable 
que estén marcados con  14 C uno o varios carbonos a cada lado de 
los enlaces fácilmente degradables. La pureza química y/o radioquí ­
mica de la sustancia problema debe ser > 95 %. En caso de sustan ­
cias radiomarcadas, se recomienda una actividad específica de unos 50 μCi/mg (1,85 MBq) o más, a fin de facilitar las mediciones de
 
14 C en ensayos efectuados con bajas concentraciones iniciales. Debe 
disponerse de la siguiente información sobre la sustancia problema:  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— hidrosolubilidad [Método A.6], 
— solubilidad en disolventes orgánicos (sustancias aplicadas con 
disolventes o con baja hidrosolubilidad), 
— constante de disociación (pKa) si es fácil que la sustancia tome o 
pierda protones [OCDE TG 112] (5), 
— presión de vapor [Método A.4] y constante de la ley de Henry, 
— estabilidad química en el agua y en la oscuridad (hidrólisis) 
[Método C.7]. 
Cuando se estudian en agua de mar sustancias poco hidrosolubles, 
puede ser útil conocer también el parámetro del efecto salino (o «constante de Setschenow») K
 s , definida por la expresión siguien ­
te: log (S/S’) = K  s C m , donde S y S’ son la solubilidad de la 
sustancia en agua dulce y agua de mar, respectivamente, y C  m es 
la concentración molar de sales. 
Si el ensayo se realiza como «ensayo con sedimento en suspensión», 
debe disponerse asimismo de la información siguiente: 
— coeficiente de reparto n-octanol/agua [Método A.8], — coeficiente de adsorción [Método C.18]. 
Los siguientes datos también pueden ser útiles: 
— concentración en el medio ambiente (valor conocido o estima ­
ción), 
— toxicidad de la sustancia problema para los microorganismos 
[Método C.11], 
— biodegradabilidad fácil o inherente [Métodos C.4 A-F, C.12, C.9, 
OCDE TG 302 (5)], 
— estudios de biodegradabilidad aerobia o anaerobia en el suelo y 
transformación en sedimentos/agua [Métodos C.23, C.24].
 
1.6. SUSTANCIA DE REFERENCIA 
Debe utilizarse como sustancia de referencia una sustancia que nor ­
malmente se degrade con facilidad en condiciones aerobias (por 
ejemplo, anilina o benzoato de sodio). Normalmente, el tiempo pre ­
visto de degradación de la anilina y del benzoato de sodio es inferior a 2 semanas. El objeto de las sustancias de referencia es garantizar que la actividad microbiana del agua estudiada esté dentro de ciertos 
límites; es decir, que el agua contenga una población microbiana 
activa.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. CRITERIOS DE CALIDAD  
1.7.1.  Recuperación  
Inmediatamente tras la adición de la sustancia problema, debe veri ­
ficarse cada concentración inicial de ensayo midiendo la actividad de  
14 C, o efectuando análisis químicos en caso de sustancias sin marcar, 
en muestras al menos duplicadas. Así se obtiene información sobre la aplicabilidad y repetibilidad del método analítico y sobre la ho ­
mogeneidad de la distribución de la sustancia problema. Normalmen ­
te, el valor de actividad de
 14 C o de concentración de sustancia 
problema medido al principio se utiliza en los análisis posteriores de los datos en vez de la concentración nominal, ya que así se 
compensan las pérdidas debidas a la adsorción y los errores de 
dosificación. En caso de sustancia problema marcada con
 14 C, el 
nivel de recuperación al final del experimento viene dado por el balance de masas (véase el último párrafo del punto 1.8.9.4). Lo 
ideal es que el balance de masa con marcado radiactivo esté entre 
el 90 y el 110 %, mientras que la exactitud analítica debe llevar a una recuperación inicial de entre el 70 y el 110 % con sustancias problema sin marcar. Estos intervalos deben interpretarse como ob ­
jetivos y no utilizarse como criterios de aceptación del ensayo. Tam ­
bién se puede determinar la exactitud analítica con la sustancia pro ­
blema a una concentración inferior a la inicial y con los productos de transformación mayoritarios.
 
1.7.2.  Repetibilidad y sensibilidad del método analítico  
La repetibilidad del método analítico (incluida la eficiencia de la 
extracción inicial) para cuantificar la sustancia problema y, en su caso, los productos de transformación debe comprobarse analizando 
cinco réplicas de los distintos extractos del agua superficial. 
Siempre que sea posible, el límite de detección (LOD) del método 
analítico con la sustancia problema y con los productos de trans ­
formación debe ser el 1 % o menos de la cantidad inicial utilizada en 
el sistema de ensayo. El límite de cuantificación (LOC) debe ser igual o inferior al 10 % de la concentración utilizada. Los análisis químicos de muchas sustancias orgánicas y de sus productos de 
transformación exigen con frecuencia que la sustancia problema se 
aplique en concentraciones relativamente elevadas, es decir, > 100 μg/l.
 
1.8. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO  
1.8.1.  Equipo  
El ensayo puede realizarse en matraces Erlenmeyer o en vasos cilín ­
dricos de la capacidad adecuada (por ejemplo, 0,5 o 1,0 litros) ce ­
rrados con tapones de silicona o caucho, o en matraces de suero con 
tapas herméticas al CO  2 como, por ejemplo, diafragmas de caucho 
butílico. Otra posibilidad es efectuar el ensayo utilizando varios matraces y recoger matraces enteros, al menos por duplicado, en 
cada intervalo de muestreo (véase el último párrafo del 
punto 1.8.9.1). Si las sustancias problema no son volátiles ni están radiomarcadas, no será necesario utilizar tapones ni tapas herméticos a los gases, y será suficiente con tapones de algodón flojos que 
impidan la entrada de contaminación desde el aire (véase el párrafo 
segundo del punto 1.8.9.1). Las sustancias químicas ligeramente volátiles deben ensayarse en un sistema biométrico con agitación suave de la superficie del agua. Para asegurarse de que no se pro ­
duce contaminación bacteriana, se puede optar por esterilizar los 
recipientes calentándolos o pasándolos por autoclave antes de utili ­
zarlos. Además se utilizará el siguiente equipo normal de laboratorio: 
— plataforma de agitación o agitadores magnéticos para la agitación 
continua de los matraces de ensayo,
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— centrifugadora, 
— pH metro, — turbidímetro para mediciones de turbidez nefelométrica, — estufa u horno microondas para determinaciones del peso seco, — equipo de filtración por membrana, — autoclave o estufa para esterilización de material de vidrio por 
calor, 
— instalaciones para la manipulación de sustancias marcadas 
con
 14 C, 
— equipo para cuantificar la actividad de  14 C en muestras de solu ­
ciones de captura de CO  2 y, en caso necesario, en muestras de 
sedimento, 
— equipo analítico para la determinación de la sustancia problema 
(y de referencia) si se utiliza un análisis químico específico (por 
ejemplo, cromatógrafo de gases, cromatógrafo de líquidos de alta presión).
 
1.8.2.  Soluciones madre de sustancia problema  
Se utiliza agua desionizada para preparar las soluciones madre de las 
sustancias problema y de referencia (véase el párrafo primero del 
punto 1.8.7). El agua desionizada estará libre de sustancias que 
puedan ser tóxicas para los microorganismos, y la concentración de carbono orgánico disuelto (COD) no será mayor de 1 mg/l (6).
 
1.8.3.  Recogida y transporte del agua superficial  
El lugar de muestreo para la recogida del agua superficial se selec ­
cionará de acuerdo con el objetivo del ensayo en cada caso. Al seleccionar los lugares de muestreo se atenderá a los antecedentes 
de posibles aportes de material agrícola, industrial o doméstico. Si se 
sabe que un entorno acuático ha sido contaminado con la sustancia problema o sus análogos estructurales en los cuatro años anteriores, no se utilizará para la recogida de agua para el ensayo, salvo que lo 
que se pretenda sea precisamente investigar las velocidades 
de degradación en lugares previamente expuestos. Se medirán en el lugar de recogida tanto el pH como la temperatura del agua. Por otra parte, se anotarán la profundidad del muestreo y el aspecto 
de la muestra de agua (por ejemplo, color y turbidez) (véase el 
punto 3). Deben medirse la concentración de oxígeno y el potencial redox del agua y de la capa superficial de los sedimentos, a fin de demostrar la presencia de condiciones aerobias, salvo que sea evi ­
dente a partir del aspecto y de los datos anteriores sobre el mismo 
lugar. El agua superficial debe transportarse en un recipiente lim ­
piado a fondo. Durante el transporte, la temperatura de la muestra no deberá superar significativamente la temperatura que se vaya a uti ­
lizar en el ensayo. Se recomienda refrigerar a 4 °C si el transporte va 
a durar más de 2 o 3 horas. No debe congelarse la muestra de agua.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Conservación y preparación del agua superficial  
El ensayo debe iniciarse preferentemente en el plazo de un día desde 
la recogida de la muestra. En caso necesario, el agua puede conser ­
varse durante un tiempo que debe reducirse al mínimo, sin superar 
en ningún caso las 4 semanas. La muestra de agua se mantendrá 
a 4 °C con aireación hasta su utilización. Antes de utilizarse, se retirarán las partículas gruesas, por ejemplo mediante paso por filtro de nailon con una luz de malla aproximada de 100 μm o por papel 
de filtro grueso, o mediante sedimentación.
 
1.8.5.  Preparación del agua con adición de sedimento (opcional)  
Para el ensayo con sedimento en suspensión, se añade sedimento 
superficial a los matraces que contienen agua natural (filtrada para 
retirar las partículas gruesas como se describe en el punto 1.8.4) a fin de obtener una suspensión; la concentración de sólidos en suspensión debe estar entre 0,01 y 1 g/l. El sedimento superficial debe proceder 
del mismo lugar del que se haya tomado la muestra de agua. En 
función del entorno acuático de que se trate, el sedimento superficial puede caracterizarse por un elevado contenido de carbono orgánico (2,5 a 7,5 %) y una textura fina o bien por un bajo contenido de 
carbono orgánico (0,5 a 2,5 %) y una textura gruesa (3). El sedi ­
mento superficial puede prepararse de la forma siguiente: se extraen varias calas de sedimento utilizando un tubo de plástico transparente, se separan las capas aerobias superiores (desde la superficie hasta 
una profundidad máxima de 5 mm) inmediatamente después de la 
extracción y se juntan todas. La muestra de sedimento así obtenida se transporta en un recipiente con una gran cámara de aire para mantener el sedimento en condiciones aerobias (y refrigerado 
a 4 °C si la duración del transporte supera las 2 o 3 horas). La 
muestra de sedimento debe suspenderse en el agua del ensayo en la proporción de 1:10 y mantenerse a 4 °C con aireación hasta su utilización. En caso necesario, el sedimento puede conservarse du ­
rante un tiempo que debe reducirse al mínimo, sin superar en ningún 
caso las 4 semanas.
 
1.8.6.  Procedimiento semicontinuo (facultativo)  
Puede ser necesaria una incubación prolongada (varios meses) si hay 
un largo tiempo de latencia antes de que se pueda medir una degradación significativa de la sustancia problema. Si esto se sabe por ensayos anteriores efectuados con la sustancia, el ensayo 
puede iniciarse con un procedimiento semicontinuo que permita la 
renovación periódica de una parte del agua o suspensión de ensayo (véase el apéndice 2). Otra posibilidad es pasar el ensayo discontinuo normal a ensayo semicontinuo si al cabo de unos 60 días de seguir el 
procedimiento discontinuo no se aprecia ninguna degradación de la 
sustancia problema (véase el párrafo segundo del punto 1.8.8.3).
 
1.8.7.  Adición de la sustancia problema (o de referencia)  
En el caso de sustancias con elevada hidrosolubilidad (> 1 mg/l) y 
baja volatilidad (constantes de la ley de Henry < 1 Pa·m  3 /mol o 
< 10  –5 atm·m  3 /mol), puede prepararse una solución madre en agua 
desionizada (véase el punto 1.8.2); después se añade el volumen adecuado de la solución madre a los recipientes de ensayo para 
conseguir la concentración deseada. El volumen de las eventuales 
soluciones madre añadidas debe mantenerse en el mínimo posible (< 10 % del volumen final de líquido, a ser posible). Otro procedi ­
miento es disolver la sustancia problema en un volumen mayor de 
agua de ensayo, lo que puede considerarse como un alternativa al 
uso de disolventes orgánicos.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Si no hay otra posibilidad, se prepararán soluciones madre de las 
sustancias no volátiles con escasa hidrosolubilidad utilizando un di ­
solvente orgánico volátil, pero la cantidad de disolvente añadido al sistema de ensayo no debe superar el 1 % v/v ni tener efectos adversos sobre la actividad microbiana. El disolvente no debe afectar 
a la estabilidad de la sustancia problema en el agua. El disolvente 
debe eliminarse para que no quede más que una pequeñísima canti ­
dad, a fin de que no aumente significativamente la concentración de COD en el agua o suspensión de ensayo. Esto debe comprobarse 
realizando un análisis específico de la sustancia o, a ser posible, un 
análisis de COD (6). Ha de tenerse cuidado para limitar la cantidad de disolvente transferido al mínimo absolutamente necesario, y velar por que toda la cantidad de sustancia problema pueda disolverse en 
el volumen final de agua de ensayo. Pueden utilizarse otras técnicas 
para introducir la sustancia problema en los recipientes de ensayo, como se describe en las referencias (7) y (8). Cuando se utilice un disolvente orgánico para introducir la sustancia problema, habrá unos 
controles de disolvente, que contendrán agua de ensayo 
(sin añadidos) y agua de ensayo con la sustancia de referencia aña ­
dida y se tratarán de forma similar a los recipientes de ensayo activo en los que se introduce la sustancia problema disuelta en el disol ­
vente. El objeto de los controles de disolvente consiste en examinar 
los posibles efectos negativos causados por el disolvente en la po ­
blación microbiana, siguiendo la degradación de la sustancia de referencia.
 
1.8.8.  Condiciones de ensayo  
1.8.8.1.  Temperatura del ensayo  
La incubación debe efectuarse en un lugar de preferencia oscuro, o 
bien con luz difusa, y a temperatura controlada (± 2 °C), que puede ser la temperatura de campo o una temperatura normal de 20 
a 25 °C. La temperatura de campo puede ser la temperatura real 
de la muestra en el momento del muestreo o la temperatura de campo media del lugar de muestreo.
 
1.8.8.2.  Agitación  
Debe efectuarse una agitación continua para mantener en suspensión 
las partículas y microorganismos. La agitación también facilita la 
transferencia de oxígeno desde la cámara de aire hacia el líquido 
para mantener unas condiciones aerobias adecuadas. Los matraces se ponen en una plataforma de agitación (de unas 100 rpm) o se utilizan 
agitadores magnéticos. La agitación debe ser continua. Sin embargo, 
también debe ser lo más suave posible, siempre que se mantenga una suspensión homogénea.
 
1.8.8.3.  Duración del ensayo  
La duración del ensayo no debe superar en principio los 60 días, 
salvo que se siga un procedimiento semicontinuo con renovación 
periódica de la suspensión de ensayo (véanse el punto1.8.6 y el 
apéndice 2). Sin embargo, si en los primeros 60 días se ha iniciado la degradación de la sustancia problema, puede ampliarse hasta un máximo de 90 días la duración del ensayo con un procedimiento 
discontinuo. Se va siguiendo la evolución de la degradación a inter ­
valos adecuados, determinando la actividad del
 14 C residual o del  
14 CO 2 formado (véase el punto 1.8.9.4) o realizando análisis quími ­
cos (véase el punto 1.8.9.5). El período de incubación debe tener la 
duración suficiente para que se pueda evaluar el proceso 
de degradación. La amplitud de la degradación debe superar prefe ­
rentemente el 50 %; en caso de sustancias lentamente degradables, la amplitud de la degradación debe ser suficiente (en principio, más del 
20 %) para permitir la estimación de la constante de velocidad 
de degradación cinética.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Deben medirse periódicamente el pH y la concentración de oxígeno 
en el sistema de ensayo, salvo que la experiencia anterior con ensa ­
yos similares de muestras de agua y sedimento tomados del mismo lugar haga innecesarias tales mediciones. En ciertas circunstancias, el metabolismo de sustratos primarios en concentraciones mucho más 
elevadas en el agua o sedimento podría provocar la formación de 
CO
 2 y el agotamiento del oxígeno en una proporción suficiente para 
alterar significativamente las condiciones experimentales durante el ensayo.
 
1.8.9.  Procedimiento  
1.8.9.1.  Preparación de matraces para el ensayo pelágico  
Se pasa un volumen adecuado de agua de ensayo a los matraces, 
hasta un tercio aproximadamente del volumen de estos, sin bajar de unos 100 ml. Si se utilizan varios matraces (para que se puedan 
recoger matraces enteros en cada tiempo de muestreo), el volumen 
adecuado de agua de ensayo será también de unos 100 ml, ya que unos volúmenes pequeños de muestra pueden influir en la duración del tiempo de latencia. La sustancia problema se añade a partir de 
una solución madre como se describe en los puntos 1.8.2 
y 1.8.7. Deben utilizarse al menos dos concentraciones diferentes de sustancia problema, relacionadas por una razón de entre 5 y 10, a fin de determinar la cinética de degradación y calcular la constante 
de velocidad de degradación cinética. Las dos concentraciones selec ­
cionadas deben estar por debajo de 100 μg/l y lo mejor es que se 
encuentren en el intervalo de < 1-10 μg/l. 
Los matraces se cierran con tapones o tapas impermeables al aire y 
al CO
 2 . En caso de sustancias problema no volátiles y no marcadas 
con  14 C, es adecuado utilizar tapones de algodón flojos que impidan 
la contaminación por el aire (véase el punto 1.8.1), siempre que se sepa que los productos de degradación importantes no son volátiles y 
si se efectúa una determinación indirecta de CO
 2 (véase el 
apéndice 3). 
Los matraces se incuban a la temperatura seleccionada (véase el 
punto 1.8.8.1). Se toman muestras para el análisis químico o la 
medición del  14 C al inicio del ensayo (es decir, antes de que empiece 
la degradación; véase el punto 1.7.1) y después a intervalos adecua ­
dos a lo largo de la duración del ensayo. El muestreo puede efec ­
tuarse retirando submuestras (por ejemplo, alícuotas de 5 ml) de cada 
réplica o recogiendo matraces enteros en cada tiempo de muestreo. La mineralización de la sustancia problema puede determinarse di ­
recta o indirectamente (véase el apéndice 3). Normalmente hace falta 
un mínimo de cinco puntos de muestreo a lo largo de la fase 
de degradación (es decir, después del final del tiempo de latencia) para establecer una constante de velocidad fiable, salvo que pueda justificarse que tres puntos de muestreo son suficientes con sustan ­
cias rápidamente degradables. En caso de sustancias que no 
se degradan rápidamente pueden hacerse con facilidad más medicio ­
nes durante la fase de degradación y, por tanto, deben utilizarse más puntos para la estimación de k. No puede indicarse un programa fijo 
de muestreo, ya que la velocidad de biodegradación varía; sin em ­
bargo, se recomienda tomar una muestra cada semana si la degradación es lenta. Si la sustancia es rápidamente degradable, el muestreo debe hacerse una vez al día durante los tres primeros 
días y después cada dos o tres días. En ciertas circunstancias, como 
cuando las sustancias se hidrolizan muy rápidamente, puede ser necesario tomar muestras cada hora. Se recomienda efectuar un es ­
tudio preliminar antes del ensayo para determinar los intervalos de 
muestreo adecuados. Si hacen falta muestras para otros análisis es ­
pecíficos, se recomienda tomar más muestras y seleccionar después las que vayan a analizarse al final del experimento siguiendo una estrategia hacia atrás, es decir, analizando primero las últimas mues ­
tras (véase en el párrafo segundo del punto 1.8.9.5 información sobre 
la estabilidad de las muestras durante su conservación).
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Número de matraces y muestras  
Se reserva un número suficiente de matraces de ensayo para los 
siguientes usos: 
— matraces de ensayo; matraces al menos duplicados de cada concen ­
tración de sustancia problema (es preferible un mínimo de 3) o 
varios matraces de ensayo para cada concentración si se van a tomar matraces enteros en cada tiempo de muestreo (símbolo: F
 T ), 
— matraces de ensayo para el cálculo del balance de masas; ma ­
traces al menos duplicados de cada concentración de ensayo 
(símbolo: F  M ), 
— ensayo en blanco, sin sustancia problema; al menos un matraz 
para el ensayo en blanco, solo con agua de ensayo (símbolo: F  B ), 
— control de referencia; matraces duplicados con sustancia de refe ­
rencia (por ejemplo, anilina o benzoato de sodio, a 10 μg/l) 
(símbolo: F  C ). El objeto del control de referencia es confirmar 
la presencia de un mínimo de actividad microbiana. Si resulta 
procedente, puede utilizarse una sustancia de referencia radiomar ­
cada, incluso aunque la degradación de la sustancia problema se vaya siguiendo mediante análisis químicos, 
— control estéril; uno o dos matraces con agua de ensayo esterili ­
zada para examinar la posible degradación abiótica u otro tipo de 
eliminación no biológica de la sustancia problema (símbolo: F
 S ). 
La actividad biológica puede interrumpirse pasando por autoclave (121 °C; 20 min) el agua de ensayo o añadiendo un tóxico (por 
ejemplo, azida de sodio (NaN
 3 ) a la concentración de 10-20 g/l, 
cloruro mercúrico (HgCl  2 ) a la de 100 mg/l o formol a la de 
100 mg/l) o con rayos gamma. Si se utiliza HgCl  2 , debe elimi ­
narse luego como residuo tóxico. Si se han añadido al agua 
grandes cantidades de sedimento, no es fácil conseguir condicio ­
nes estériles; en tal caso, se recomienda repetir el tratamiento en autoclave (por ejemplo, tres veces). Debe tenerse en cuenta que el tratamiento en autoclave puede alterar las características de 
adsorción del sedimento, 
— controles de disolventes, con agua de ensayo más sustancia de 
referencia y con agua de ensayo sin esta sustancia; matraces duplicados con la misma cantidad de disolvente y sometidos al 
mismo procedimiento que para la aplicación de la sustancia pro ­
blema. Lo que se pretende es examinar los posibles efectos ad ­
versos del disolvente determinando la degradación de la sustancia de referencia. 
Al diseñar el ensayo, el investigador ha de considerar la importancia 
relativa del aumento de la replicación experimental frente al aumento del número de tiempos de muestreo. El número exacto de matraces necesarios depende del método utilizado para medir la degradación 
(véase el párrafo tercero del punto 1.8.9.1, el punto 1.8.9.4 y el 
apéndice 3).
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
A cada tiempo de muestreo se toman dos submuestras (por ejemplo, 
alícuotas de 5 ml) de cada matraz de ensayo. Si se utilizan varios 
matraces para permitir recoger matraces enteros, debe tomarse un mínimo de dos matraces a cada tiempo de muestreo (véase el párrafo primero del punto 1.8.9.1).
 
1.8.9.3.  Preparación de matraces para el ensayo con sedimento en 
suspensión (opcional)  
Se añaden a los recipientes de ensayo los volúmenes necesarios de agua 
de ensayo y sedimento, en su caso (véase el punto 1.8.5). La prepara ­
ción de los matraces para el ensayo con sedimento en suspensión es 
igual que para el ensayo pelágico (véanse los puntos 1.8.9.1 y 1.8.9.2). 
Es mejor utilizar botellas de suero o matraces de forma similar. Los matraces cerrados se colocan horizontalmente en un agitador. Eviden ­
temente, los matraces abiertos con sustancias no volátiles y no marca ­
das con
 14 C deben colocarse de pie; en tal caso se recomienda la 
agitación magnética con varillas magnéticas recubiertas de cristal. Cuando sea necesario habrá que airear las botellas para mantener unas condiciones aerobias adecuadas.
 
1.8.9.4.  Determinaciones radioquímicas  
La cantidad de  14 CO 2 producida se mide directa e indirectamente 
(véase el apéndice 3). La cantidad de  14 CO 2 se determina indirecta ­
mente por la diferencia entre la actividad inicial de  14 C en el agua o 
suspensión de ensayo y la actividad total residual al tiempo del 
muestreo medida tras acidificar la muestra hasta un pH de 2-3 y 
eliminar el CO  2 . El carbono inorgánico queda así eliminado y la 
actividad residual medida corresponderá al material orgánico. No debe efectuarse la determinación indirecta del
 14 CO 2 si de la 
transformación de la sustancia problema se forman productos volá ­
tiles principalmente (véase el apéndice 3). A ser posible, la evolución del
 14 CO 2 debe medirse directamente (véase el apéndice 3) a cada 
tiempo de muestreo en al menos un matraz de ensayo; este proce ­
dimiento permite que se comprueben tanto el balance de masa como 
el proceso de biodegradación, pero está limitado a los ensayos efec ­
tuados con recipientes cerrados. 
Si el  14 CO 2 formado se mide directamente durante el ensayo, deben 
reservarse más matraces a este efecto al inicio del ensayo. Se reco ­
mienda la determinación directa del  14 CO 2 si de la transformación de 
la sustancia problema se forman productos volátiles importantes. A cada tiempo de medición, los matraces de ensayo adicionales se 
acidifican hasta obtener un pH de 2-3 y el
 14 CO 2 se recoge en un 
absorbente interno o externo (véase el apéndice 3). 
Se puede optar por determinar las concentraciones de sustancias 
problema y productos de transformación mayoritarios marcados 
con  14 C, mediante radiocromatografía (por ejemplo, cromatografía 
de capa fina, RAD-TLC) o HPLC con detección radioquímica. 
También se puede determinar la distribución en fases de la radiacti ­
vidad restante (véase el apéndice 1), así como la sustancia problema 
residual y los productos de transformación.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Al final del ensayo ha de determinarse el balance de masa mediante 
medición directa del  14 CO 2 utilizando matraces de ensayo aparte, de 
los que no se haya tomado ninguna muestra durante el desarrollo del ensayo (véase el apéndice 3).
 
1.8.9.5.  Análisis químico específico  
Si se dispone de un método de análisis específico y sensible, la 
biodegradación primaria puede evaluarse midiendo la concentración residual total de sustancia problema en lugar de aplicar técnicas de 
radiomarcado. Si se utiliza una sustancia problema radiomarcada 
(para medir la mineralización total), pueden hacerse en paralelo aná ­
lisis químicos específicos para conseguir información adicional útil y comprobar el procedimiento. Los análisis químicos específicos tam ­
bién pueden utilizarse para medir los productos de transformación 
formados durante la degradación de la sustancia problema, lo que se recomienda en caso de sustancias cuya vida media de mineralización sea superior a 60 días. Se mide y se registra la concentración de la 
sustancia problema y de los productos de transformación en cada 
tiempo de muestreo (como concentración y como porcentaje de la sustancia aplicada). En general, deben identificarse los productos de transformación detectados en cualquier tiempo de muestreo, a con ­
centraciones ≥ 10 % de la concentración aplicada, salvo que se 
justifique otra opción. Habrá de tomarse también en consideración la identificación de los productos de transformación cuyas concen ­
traciones aumenten continuamente durante el estudio, aunque tales 
concentraciones no superen los límites indicados anteriormente, ya 
que este aumento puede indicar persistencia. Debe considerarse la realización de análisis de los productos de transformación en los controles estériles si se piensa que es posible una transformación 
abiótica rápida de la sustancia problema (por ejemplo, hidrólisis). 
Debe sopesarse en cada caso la necesidad de cuantificar e identificar los productos de transformación, indicando en el informe las justifi ­
caciones pertinentes. Las técnicas de extracción con disolventes or ­
gánicos deben aplicarse según las instrucciones del procedimiento 
analítico correspondiente. 
Todas las muestras se conservarán a una temperatura de 2 a 4 °C en 
recipientes herméticos al aire si el análisis se realiza en el plazo de 24 horas (método preferible). Para una conservación más prolongada, 
las muestras deben congelarse por debajo de –18 °C o tratarse quí ­
micamente. No se recomienda la acidificación para conservar las muestras, ya que las muestras acidificadas pueden ser inestables. Si las muestras no se analizan en el plazo de 24 horas y se conservan 
durante más tiempo, debe efectuarse un estudio de la estabilidad ante 
la conservación a fin de demostrar la estabilidad de las sustancias de interés cuando se congelan por debajo de –18 °C o se conservan químicamente. Si el método analítico implica la extracción bien con 
disolventes o bien en fase sólida, la extracción se efectuará inmedia ­
tamente tras el muestreo o tras conservar la muestra refrigerada durante un máximo de 24 horas. 
En función de la sensibilidad del método analítico, puede ser nece ­
sario disponer de volúmenes de muestra mayores que los indicados en el punto 1.8.1. El ensayo puede realizarse fácilmente con volú ­
menes de ensayo de un litro en matraces de 2-3 litros, lo que permite 
recoger muestras de unos 100 ml.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. DATOS E INFORME  
2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS  
2.1.1.  Representación gráfica de los datos  
Los tiempos de muestreo se redondean a horas enteras (salvo si la 
sustancia se degrada significativamente en cuestión de minutos u 
horas) pero no a días enteros. Se representan frente al tiempo las estimaciones de la actividad residual de la sustancia problema (en caso de sustancias marcadas con
 14 C) o de la concentración residual 
(en caso de sustancias no marcadas), tanto de forma lineal como 
semilogarítmica (véanse las figuras 1a y 1b). Si ha habido degradación, se comparan los resultados de los matraces F
 T 
con los de los matraces F  S . Si las medias de los resultados de los 
matraces con sustancia problema (F  T ) y los matraces estériles (F  S ) se 
desvían en menos del 10 %, puede aceptarse que la degradación observada es predominantemente abiótica. Si la degradación en los 
matraces F
 S es menor, las cifras pueden utilizarse para corregir las 
obtenidas con los matraces F  T (por sustracción) a fin de estimar la 
amplitud de la biodegradación. Cuando se efectúan análisis opciona ­
les de productos de transformación mayoritarios, deben hacerse grá ­
ficas de su formación y desaparición, además de la gráfica de desa ­
parición de la sustancia problema. 
La duración del tiempo de latencia t  L se estima a partir de la curva 
de degradación (representación semilogarítmica) extrapolando su 
parte lineal a la degradación nula, o bien determinando el tiempo correspondiente a una degradación aproximada del 10 % (véanse las figuras 1a y 1b). A partir de la representación semilogarítmica se 
estiman la constante de velocidad de primer orden, k, y su error 
estándar mediante regresión lineal de la gráfica ln (actividad residual de
 14 C o concentración de sustancia problema) frente al tiempo. Con 
las mediciones de  14 C en particular, debe recurrirse solo a datos 
pertenecientes a la parte lineal inicial de la curva tras el final del 
tiempo de latencia, y darse preferencia a la selección de unos pocos datos representativos, en vez de a un número mayor de datos más inciertos. La incertidumbre incluye aquí errores inherentes al uso 
directo recomendado de mediciones de la actividad residual de
 14 C 
(véase más abajo). A veces puede ser pertinente calcular dos cons ­
tantes de velocidad diferentes, si la degradación sigue un modelo bifásico. Con este objeto se definen dos fases diferentes de la curva 
de degradación. Deben calcularse la constante de velocidad, k, y la 
vida media, t
 ½ = ln2/k, correspondientes a cada uno de los matraces 
replicados si se toman submuestras del mismo matraz, o utilizando los valores medios si se toman matraces enteros a cada tiempo de 
muestreo (véase el último párrafo del punto 1.8.9.2). Cuando se 
utilice el procedimiento mencionado en primer lugar, deben indicarse la constante de velocidad y la vida media correspondientes a cada uno de los distintos matraces replicados, así como un valor medio 
con su error estándar. Si se han utilizado concentraciones elevadas 
de sustancia problema, la curva de degradación puede desviarse considerablemente de una recta (representación semilogarítmica), con lo que no sería válida la cinética de primer orden. Por tanto, 
no tendría sentido definir una vida media. Sin embargo, con un 
intervalo limitado de datos, puede aplicarse una cinética de pseudo ­
primer orden y estimarse el semiperíodo de degradación, DT
 50 
(tiempo trascurrido hasta alcanzar una degradación del 50 %). 
No obstante, ha de recordarse que la evolución temporal de 
la degradación más allá del intervalo seleccionado de datos no puede predecirse utilizando el DT
 50 , que es simplemente un descriptor de 
un conjunto determinado de datos. Se dispone de herramientas ana ­
líticas para facilitar los cálculos estadísticos y el ajuste de la curva, y 
se recomienda el uso de este tipo de programas informáticos.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Si se realizan análisis químicos específicos, se estiman las constantes 
de velocidad y las vidas medias de la degradación primaria de la 
misma forma que se indicaba antes para la mineralización total. Si la degradación primaria es el proceso limitante, a veces es posible utilizar puntos de datos de todo el proceso de degradación. Esto es 
así porque las mediciones son directas, a diferencia de las medicio ­
nes de la actividad de
 14 C. 
Si se utilizan sustancias marcadas con  14 C, hay que expresar un 
balance de masas en porcentaje de la concentración inicial aplicada, 
al menos al final del ensayo.  
2.1.2.  Actividad residual  
Cuando se biodegrada la parte marcada con  14 C de una sustancia 
orgánica, la mayor parte del  14 C se convierte en  14 CO 2 , mientras que 
otra parte se destina al crecimiento de la biomasa o a la síntesis de 
metabolitos extracelulares. Por tanto, la biodegradación «final» com ­
pleta de una sustancia no produce la conversión del 100 % de su carbono en
 14 CO 2 . El  14 C integrado en productos formados por 
biosíntesis se libera después lentamente como  14 CO 2 , debido a una 
«mineralización secundaria». Por este motivo, la representación grá ­
fica de la actividad de  14 C orgánico residual (medida tras la elimi ­
nación del CO  2 ) o del  14 CO 2 producido frente al tiempo mostrará 
una «cola» después de que haya terminado la degradación. Esto 
complica la interpretación cinética de los datos, y, con este propó ­
sito, solo debe utilizarse normalmente la parte inicial de la curva (después de que haya terminado el tiempo de latencia y antes de 
que se alcance aproximadamente el 50 % de degradación) para la 
estimación de la constante de velocidad de degradación. Si se degrada la sustancia problema, la actividad residual total de
 14 C 
orgánico siempre será mayor que la actividad de  14 C relacionada con 
la sustancia problema que quede intacta. Si la sustancia problema 
se degrada según una reacción de primer orden y una fracción cons ­
tante α se mineraliza pasando a CO  2 , la pendiente inicial de la curva 
de desaparición del  14 C ( 14 C orgánico total frente al tiempo) será el 
resultado de multiplicar por α la pendiente de la curva correspon ­
diente a la concentración de la sustancia problema (o, para mayor precisión, de la parte de la sustancia problema marcada con
 14 C). Al 
utilizarse mediciones de la actividad total de  14 C orgánico sin co ­
rregir, la constante de velocidad de degradación calculada será, por tanto, de tipo conservador. En la bibliografía (2) (9) (10) (11) se describen procedimientos para estimar las concentraciones de la sus ­
tancia problema a partir de las actividades radioquímicas medidas, 
aplicando distintas hipótesis simplificadoras. Tales procedimientos son sobre todo aplicables a las sustancias rápidamente degradables.
 
2.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 
Si se ve que k es independiente de la concentración añadida (es 
decir, si la k calculada es aproximadamente igual a las distintas 
concentraciones de la sustancia problema), puede aceptarse que la constante de velocidad de primer orden es representativa de las condiciones de ensayo aplicadas: la sustancia problema, la muestra 
de agua y la temperatura de ensayo. Un juicio experto debe evaluar 
en qué medida los resultados pueden generalizarse o extrapolarse a otros sistemas. Si se utiliza una elevada concentración de sustancia problema, y por tanto la degradación no sigue una cinética de primer 
orden, los datos no podrán utilizarse para la estimación directa de 
una constante de velocidad de primer orden o una vida media co ­
rrespondiente. Sin embargo, los datos procedentes de un ensayo en el que se utilice una elevada concentración de sustancia problema po ­
drán ser útiles al menos para estimar el grado de mineralización total 
o para detectar y cuantificar los productos de transformación.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Si se conocen las velocidades de otros procesos de pérdida distintos 
de la biodegradación (por ejemplo, hidrólisis o volatilización), po ­
drán sustraerse de la velocidad de pérdida neta observada durante el ensayo para dar una estimación aproximada de la velocidad de bio ­
degradación. Por ejemplo, pueden obtenerse datos sobre la hidrólisis 
con los controles estériles o con ensayos paralelos en los que se 
utilicen concentraciones superiores de la sustancia problema. 
La determinación indirecta y directa del
 14 CO 2 (punto 1.8.9.4 y 
apéndice 3) solo puede utilizarse para medir el alcance de la mine ­
ralización de la sustancia problema hasta convertirse en CO  2 . La 
radiocromatografía (RAD-TLC) o la HPLC pueden utilizarse para analizar las concentraciones de las sustancias problema marcadas con
 14 C y la formación de los productos de transformación mayori ­
tarios (párrafo tercero del punto 1.8.9.4). Para que se pueda efectuar 
una estimación directa de la vida media, es necesaria la ausencia de productos de transformación mayoritarios (definidos como aquellos que representan individualmente una concentración ≥ 10 % de la 
cantidad aplicada de sustancia problema). En caso de presencia de 
productos de transformación mayoritarios, según se acaban de defi ­
nir, es necesario proceder a una evaluación detallada de los datos. Aquí puede incluirse la repetición del ensayo o la identificación de 
los productos de transformación (véase el párrafo primero del 
punto 1.8.9.5) salvo que el destino de los productos de transforma ­
ción pueda evaluarse razonablemente según la experiencia (por ejem ­
plo, con información sobre la ruta de degradación). Como varía la 
proporción de carbono de la sustancia problema que se ha convertido 
en CO
 2 (dependiendo en gran medida de la concentración de sus ­
tancia problema y de otros sustratos disponibles, de las condiciones del ensayo y de la comunidad microbiana), este ensayo no permite 
una estimación directa de la biodegradación final como en un ensayo 
de desaparición del COD, pero el resultado es similar al obtenido con un ensayo respirométrico. El grado de mineralización será así más o menos igual al nivel mínimo de biodegradación final. Para 
obtener una imagen más completa de la biodegradación final (mine ­
ralización e incorporación a la biomasa), debe realizarse al final del ensayo el análisis de la distribución en fases del
 14 C (véase el 
apéndice 1). El  14 C presente en el conjunto de partículas consistirá 
en el  14 C incorporado a la biomasa bacteriana y en el  14 C adsorbido 
a partículas orgánicas.  
2.3. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Si la sustancia de referencia no se degrada dentro del intervalo de 
tiempo previsto (en el caso de la anilina y del benzoato de sodio, 
normalmente menos de dos semanas), la validez del ensayo queda 
bajo sospecha y debe comprobarse posteriormente, o bien ha de repetirse el ensayo con otra muestra de agua. En un ensayo de intercalibración del método, organizado por la ISO y en el que 
participaron siete laboratorios situados en distintos puntos de Europa, 
las constantes de velocidad de degradación adaptadas de la anilina variaron entre 0,3 y 1,7 días
 –1 con una media de 0,8 d  -1 a 20 o  C y un 
error estándar de ± 0,4 d  –1 (t ½ = 0,9 días). Los tiempos de latencia 
típicos estaban entre 1 y 7 días. Se informó de que las aguas exa ­
minadas tenían una biomasa bacteriana correspondiente a 10  3 a 10  4 
unidades formadoras de colonias por ml. Las velocidades 
de degradación en las aguas ricas en nutrientes de Europa central 
eran mayores que en las aguas oligotróficas de los países nórdicos, lo 
que puede deberse a la diferente situación trófica o a alguna expo ­
sición previa a las sustancias. 
La recuperación total (balance de masas) al final de experimento 
debe situarse entre el 90 y el 110 % en caso de sustancias radio ­
marcadas, mientras que la recuperación inicial al principio del expe ­
rimento debe estar entre el 70 y el 110 % en caso de sustancias no marcadas. Sin embargo, estos intervalos deben interpretarse solo 
como objetivos y no utilizarse como criterios de aceptación del 
ensayo.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. INFORME DEL ENSAYO  
El tipo de estudio, es decir, si es pelágico o con sedimento en 
suspensión, debe figurar claramente en el informe del ensayo, que también incluirá como mínimo la información siguiente: 
Sustancias problema y de referencia: — denominaciones comunes, nombres químicos (recomendados por 
la IUPAC o nombres CAS), números CAS, fórmulas estructura ­
les (con indicación de la posición del
 14 C si se utilizan sustancias 
radiomarcadas) y propiedades fisicoquímicas pertinentes de las 
sustancias problema y de referencia (véanse los puntos 1.5 y 1.6), 
— nombres químicos, números CAS, fórmulas estructurales (con 
indicación de la posición del  14 C si se utilizan sustancias radio ­
marcadas) y propiedades fisicoquímicas pertinentes de las sustan ­
cias utilizadas como patrones para la identificación y cuantifica ­
ción de los productos de transformación, 
— pureza (impurezas) de las sustancias problema y de referencia, 
— pureza radioquímica de la sustancia química marcada y actividad 
específica (si procede). 
Aguas superficiales: 
Debe aportarse como mínimo la siguiente información sobre la 
muestra de agua tomada: 
— ubicación y descripción del lugar de muestreo, incluyendo, si se 
puede, un historial de la contaminación, 
— fecha y hora de la toma de muestras, — nutrientes (N total, amonio, nitritos, nitratos, P total, ortofosfato 
disuelto), 
— profundidad a la que se ha tomado la muestra, — aspecto de la muestra (por ejemplo, color y turbidez), 
— COD y COT, 
— DBO, — temperatura y pH en el lugar y a la hora de la recogida, — potencial de oxígeno o redox (obligatorio si no es evidente el 
carácter aerobio de las condiciones), 
— salinidad o conductividad (en caso de agua salina o salobre), 
— sólidos en suspensión (en caso de muestra turbia), 
— otra información que pueda ser de interés sobre el lugar de 
muestreo en el momento del mismo (por ejemplo, datos históri ­
cos o actuales sobre el caudal del río o corriente marítima, pro ­
ximidad a vertidos importantes y tipo de vertidos, condiciones meteorológicas antes del momento del muestreo), 
y, opcionalmente, — biomasa microbiana (por ejemplo, recuento directo con naranja 
de acridina o unidades formadoras de colonias),
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— carbono inorgánico, 
— concentración de clorofila a como estimación específica de la 
biomasa de algas. 
Por otra parte, debe proporcionarse la información siguiente sobre el 
sedimento cuando se realice un ensayo con sedimento en suspensión: 
— profundidad a la que se ha tomado el sedimento, 
— aspecto del sedimento (por ejemplo, coloreado, fangoso, limoso o 
arenoso), 
— textura (por ejemplo, porcentaje de arena gruesa, arena fina, limo 
y arcilla), 
— peso seco en g/l de los sólidos en suspensión, concentración de 
COT o pérdida de peso por calcinación como medida del con ­
tenido de materia orgánica, 
— pH, 
— potencial de oxígeno o redox (obligatorio si no es evidente el 
carácter aerobio de las condiciones). 
Condiciones de ensayo: 
— tiempo transcurrido entre la recogida y la utilización en el ensayo 
de laboratorio, conservación y tratamiento previo de la muestra, 
fechas de realización de los estudios, 
— cantidad de sustancia problema aplicada, concentración de en ­
sayo y sustancia de referencia, 
— método de aplicación de la sustancia problema, incluido el even ­
tual uso de disolventes, 
— volumen de agua superficial utilizada y de sedimento (en su 
caso), y volumen de las muestras tomadas para su análisis en 
cada intervalo, 
— descripción del sistema de ensayo utilizado. 
Si no debe mantenerse la oscuridad, información sobre las condicio ­
nes de «luz difusa»; 
— información sobre los métodos utilizados para establecer los con ­
troles de esterilidad (por ejemplo, temperatura, tiempo y número de tratamientos en autoclave), 
— temperatura de incubación, 
— información sobre técnicas analíticas y métodos utilizados para 
mediciones radioquímicas y supervisión del balance de masas, así 
como mediciones de la distribución en fases (en su caso), 
— número de réplicas. 
Resultados: 
— porcentajes de recuperación (véase el punto 1.7.1), 
— repetibilidad y sensibilidad de los métodos de análisis utilizados, 
incluido el límite de detección (LOD) y el límite de 
cuantificación (LOC) (véase el punto 1.7.2),
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— todos los datos medidos (incluidos los tiempos de muestreo) y 
los valores calculados en forma tabular, así como las curvas 
de degradación; respecto a cada concentración de ensayo y cada uno de los matraces replicados, debe indicarse el coeficiente de correlación lineal de la pendiente de la representación loga ­
rítmica, el tiempo de latencia estimado y la constante de veloci ­
dad de primer o de pseudoprimer orden (a ser posible), así como la vida media de degradación correspondiente (o el período de vida media, t
 50 ), 
— valores importantes como medias de los resultados observados en 
las distintas réplicas, por ejemplo, la duración del tiempo de 
latencia, la constante de velocidad de degradación y la vida 
media de degradación (o el t  50 ), 
— categorización del sistema como adaptado o no adaptado, según 
el aspecto de la curva de degradación y la posible influencia de la concentración de ensayo, 
— resultados de la supervisión del balance de masa final y resulta ­
dos de las mediciones de la distribución en fases (en su caso), 
— fracción de
 14 C mineralizado y, si se hacen análisis específicos, 
nivel final de la degradación primaria, 
— identificación, concentración molar y porcentaje de los productos 
aplicados y de los de transformación mayoritarios (véase el pá ­
rrafo primero del punto 1.8.9.5), cuando proceda, 
— vía de transformación propuesta, si procede, 
— discusión de los resultados.  
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OECD TG 309 (2004). Aerobic Mineralisation in surface water 
— Simulation Biodegradation Test. 
(2) ISO/DIS 14592-1 (1999). Water quality — Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations — Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions. 
(3) Método de ensayo C.23. Transformación aerobia y anaerobia en 
el suelo. 
(4) Método de ensayo C.24. Transformación aerobia y anaerobia en 
sistemas de sedimentos acuáticos. 
(5) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
París. 
(6) ISO 8245 (1999). Water quality — Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC). 
(7) ISO 10634 (1995). Water quality — Guidance for the prepara ­
tion and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an 
aqueous medium. 
(8) OECD (2000). Guidance Document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures. Environmental Health and 
Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 22.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
(9) Simkins, S., y Alexander, M. (1984). Models for mineralization 
kinetics with the variables of substrate concentration and popu ­
lation density. Appl. Environ. Microbiol. 47, 394-401. 
(10) Ingerslev, F., y N. Nyholm (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at 
low concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Envi ­
ron. Saf. 45, 274-283. 
(11) ISO/CD 14592-1 (1999). Ring test report: Water Quality — 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic com ­
pounds at low concentrations part 1 — Report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface 
water/sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Apéndice 1  
Distribución en fases del  14 C 
Para supervisar el procedimiento, las mediciones normales de la actividad de  14 C 
orgánico total residual (AOT) deben complementarse con mediciones del balance de masa mediante determinación directa del
 14 CO 2 formado previa retención en 
un absorbente (véase el apéndice 3). El mero hecho de que se forme  14 CO 2 es en 
sí una prueba directa de biodegradación, frente a la degradación abiótica u otros mecanismos de pérdida, como la volatilización y la adsorción. Es posible obtener información adicional útil sobre las características de biodegradabilidad a partir 
de mediciones de la distribución de la AOT entre el estado disuelto (actividad de
 
14 C orgánico disuelto, AOD) y en partículas (actividad de  14 C orgánico en 
partículas, AOP) previa separación de las partículas mediante filtración por mem ­
brana o centrifugación. La AOP se refiere a la sustancia problema adsorbida en la 
biomasa microbiana o en otras partículas, además del carbono de la sustancia 
problema que se haya utilizado en la síntesis de nuevo material celular y, por tanto, se haya incorporado a la fracción particulada de la biomasa. La formación de material orgánico con
 14 C disuelto puede estimarse como la AOD al final de 
la biodegradación (meseta en la curva degradación-tiempo). 
La distribución en fases del  14 C residual en muestras elegidas se estima pasando 
las muestras por un filtro de membrana de 0,22 μm o 0,45 μm, procurando que el 
filtro sea de un material que no adsorba cantidades significativas de sustancia problema (pueden ser adecuados los filtros de policarbonato). Si la sorción de 
sustancia problema en el filtro es demasiado importante como para despreciarla 
(este extremo se ha de comprobar antes de que se efectúe el experimento), puede sustituirse la filtración por centrifugación a elevada velocidad (2 000 g; 10 min). 
El filtrado o centrifugado se trata como se describe en el apéndice 3 respecto a 
las muestras sin filtrar. Los filtros de membrana se disuelven en un líquido de 
centelleo adecuado y se hace el recuento normalmente, en principio utilizando solo el método de la proporción con el patrón externo para corregir la atenuación, o bien se utiliza un oxidante de la muestra. Si se ha recurrido a la centrifugación, 
el precipitado de las partículas se vuelve a suspender en 1-2 ml de agua destilada 
y se pasa a un frasco de centelleo. Después se lava dos veces con 1 ml de agua destilada y el agua utilizada se pasa al frasco. En caso necesario, la suspensión puede incorporarse a un gel para recuento de centelleo líquido.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Apéndice 2  
Procedimiento semicontinuo  
Puede ser necesario prolongar la incubación hasta varios meses para conseguir 
una degradación suficiente de sustancias persistentes. La duración del ensayo no debe pasar en principio de 60 días, salvo que se mantengan las características de 
la muestra original de agua mediante la renovación de la suspensión de ensayo. 
Sin embargo, si en los primeros 60 días se ha iniciado la degradación de la sustancia problema, la duración del ensayo puede ampliarse hasta un máximo de 90 días sin renovación de la suspensión de ensayo. 
Si la incubación dura mucho tiempo, la diversidad de la comunidad microbiana 
puede verse reducida por diversos mecanismos de pérdida y por el posible 
agotamiento de nutrientes esenciales y sustratos primarios de carbono en la muestra de agua. Por tanto, se recomienda efectuar un ensayo semicontinuo para determinar adecuadamente la velocidad de degradación de las sustancias 
que se degradan lentamente. El ensayo debe iniciarse con un procedimiento 
semicontinuo si, en función de la experiencia previa, se espera que sea necesario un período de incubación de tres meses para lograr una degradación del 20 % de la sustancia. Otra posibilidad es pasar el ensayo discontinuo normal a ensayo 
semicontinuo si al cabo de unos 60 días de seguir el procedimiento discontinuo 
no se aprecia ninguna degradación de la sustancia problema. Puede pararse el procedimiento semicontinuo y seguir el experimento como experimento disconti ­
nuo cuando se haya registrado una degradación sustancial (por ejemplo, > 20 %). 
En el ensayo semicontinuo, cada dos semanas se sustituye un tercio aproxima ­
damente del volumen de la suspensión de ensayo por agua recién recogida con la sustancia problema añadida a la concentración inicial. Análogamente, si se efec ­
túa el ensayo opcional con sedimento en suspensión, al agua de sustitución se le 
añade sedimento a la concentración inicial (entre 0,01 y 1 g/l). Cuando se realiza 
el ensayo con sedimento sólido en suspensión, es importante que se mantenga el sistema totalmente en suspensión también durante la renovación del agua, y que el tiempo de residencia sea el mismo para los sólidos y para el agua, ya que en 
caso contrario podría perderse la deseada similitud con un sistema acuoso ho ­
mogéneo sin fases fijas. Por estos motivos, se prefiere que, cuando se utilice un procedimiento semicontinuo, la concentración inicial de sedimentos en suspen ­
sión se sitúe en la banda baja del intervalo especificado. 
La adición prescrita de sustancia problema implica que la concentración inicial de 
sustancia problema no se vea superada por la renovación parcial de la suspensión 
de ensayo y, por tanto, se evite la adaptación que se encuentra frecuentemente con concentraciones elevadas de sustancia problema. Como el procedimiento incluye tanto una reinoculación como una compensación de los nutrientes y 
sustratos primarios agotados, se restablece la diversidad microbiana original y 
la duración del ensayo puede prolongarse, en principio indefinidamente. Cuando se utiliza el procedimiento semicontinuo, es importante observar que la concen ­
tración residual de la sustancia problema debe corregirse para tener en cuenta las 
cantidades de sustancia problema añadidas y eliminadas en cada operación de 
renovación. Si el compuesto se adsorbe, las concentraciones de sustancia pro ­
blema total y disuelta serán intercambiables. La sorción es despreciable (< 5 %) en las condiciones especificadas (0,1 a 1 g sólidos/l) en caso de sustancias de 
log K
 ow < 3 (válido para compuestos neutros y lipófilos). Esto queda ilustrado 
con el siguiente ejemplo de cálculo. 0,1 g/l de sólidos corresponden aproxima ­
damente a 10 mg de carbono por litro (fracción de carbono, f  C = 0,01). Si se 
acepta que: 
log K  ow (de la sustancia problema) = 3 
K oc = 0,42 × K  ow 
coeficiente de reparto, K  d = f C × K  oc , 
entonces, la fracción disuelta de la concentración total [C-agua (C  w )/C-total (C  t )] es: 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 
× 0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Apéndice 3  
Determinación del  14 CO  2 
Determinación indirecta del  14 CO  2 
Para las mediciones normales, el método indirecto suele ser el que menos tiempo 
exige y el más preciso, si la sustancia problema no es volátil ni se transforma en 
productos volátiles. Se transfieren simplemente muestras sin filtrar de, por ejem ­
plo, 5 ml a frascos de centelleo. Es adecuada una actividad inicial en las muestras de 5 000 dpm a 10 000 dpm (80 a 170 Bq), y la actividad inicial mínima es de unas 1 000 dpm. El CO
 2 debe eliminarse tras acidificar hasta un pH de 2-3 con 1 
a 2 gotas de H  3 PO 4 o HCl concentrado. La eliminación del CO  2 puede efectuarse 
burbujeando aire durante aproximadamente 30 min o 1 hora. Otra posibilidad consiste en agitar enérgicamente los frascos durante 1 a 2 horas (por ejemplo, en un agitador de microplacas), o bien agitarlos más suavemente hasta el día si ­
guiente. Debe comprobarse la eficacia del procedimiento de eliminación del CO
 2 , 
prolongando el período de aireación o de agitación. A continuación se añade un líquido de centelleo adecuado para el recuento de muestras acuosas, se homoge ­
neiza la muestra con un mezclador de torbellino y se determina la radiactividad 
mediante recuento de centelleo líquido, restando la actividad de fondo observada 
en los ensayos en blanco (F
 B ). Salvo que el agua de ensayo sea muy coloreada o 
contenga una elevada concentración de partículas, las muestras exhibirán normal ­
mente una atenuación uniforme y será suficiente efectuar una corrección de la 
atenuación utilizando un patrón externo. Si el agua de ensayo está muy colorea ­
da, puede ser necesario corregir la atenuación mediante la adición de un patrón interno. Si la concentración de partículas es elevada, puede que no sea viable obtener una solución o un gel homogéneos, o que la variación de la atenuación 
entre las muestras sea grande. En tal caso, podrá utilizarse el método de recuento 
descrito más abajo para el ensayo de lodos. Si el ensayo se realiza como ensayo de sedimento en suspensión, la medición del
 14 CO 2 podría hacerse indirecta ­
mente tomando una muestra homogénea de 10 ml de la suspensión o agua de 
ensayo y separando las fases mediante centrifugación a una velocidad adecuada 
(por ejemplo, a 40 000 m/s  2 durante 15 min). La fase acuosa se trataría a 
continuación como se describe más arriba. La actividad de  14 C en la fase parti ­
culada (AOP) debe determinarse volviendo a suspender el sedimento en un 
pequeño volumen de agua destilada, transfiriendo esta suspensión a frascos de 
centelleo y añadiendo líquido de centelleo para formar un gel (se encuentran líquidos de centelleo especiales para este fin). Según la naturaleza de las partí ­
culas (por ejemplo, su contenido en materia orgánica), puede ser factible digerir 
la muestra hasta el día siguiente con un solubilizador de tejidos y homogeneizar 
después con un mezclador de torbellino antes de añadirle líquido de centelleo. Otra posibilidad consiste en determinar la AOP mediante combustión en exceso de oxígeno utilizando un oxidante de la muestra. Para hacer el recuento, deben 
incluirse siempre patrones internos, y puede ser necesario efectuar correcciones 
de la atenuación añadiendo patrones internos a cada una de las muestras.
 
Determinación directa del  14 CO  2 
Si se mide directamente el  14 CO 2 formado, debe hacerse poniendo más matraces 
al inicio del ensayo; los matraces de ensayo se recogen a cada tiempo de medi ­
ción, se acidifican hasta un pH de 2-3 y se recoge el  14 CO 2 con un absorbente 
interno (colocado en cada matraz al principio del ensayo) o externo. Como medio absorbente puede utilizarse un álcali (por ejemplo, solución de NaOH 1 N, o una 
lenteja de NaOH), etanolamina o un absorbente a base de etanolamina, o algún 
absorbente disponible en el comercio. Si se recurre a la medición directa del
 
14 CO 2 , los matraces deben estar cerrados con, por ejemplo, diafragmas de caucho 
butílico.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Figura 1a  
Ejemplo de representación aritmética de los datos (actividad residual frente al tiempo)
  
Figura 1b  
Ejemplo de representación semilogarítmica de los datos (ln de la actividad residual frente al tiempo)
  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  PRUEBA DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE  LEMNA  
SPP.  
1. MÉTODO  
El presente método es equivalente a las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 221 (2006) (1). Se ha llegado a un amplio acuerdo entre las autoridades de la UE en el sentido de que el ensayo con  Lemna  
consituye una alternativa adecuada a un ensayo con algas en caso de 
sustancias fuertemente coloreadas (2) (3).
 
1.1. INTRODUCCIÓN 
El objetivo del presente método de ensayo es evaluar la toxicidad de 
las sustancias para las plantas de agua dulce del género  Lemna  
(lenteja de agua). Se basa en directrices anteriores (4) (5) (6) (7) (8) (9), pero incluye modificaciones encaminadas a 
tener en cuenta los resultados de recientes investigaciones y consul ­
tas sobre diversos aspectos fundamentales. El método propuesto se ha validado mediante un ensayo de intercalibración internacional (10). 
El presente método describe el ensayo de toxicidad con  Lemna gibba  
y Lemna minor , dos especies que han sido estudiadas ampliamente y 
son objeto de las normas arriba citadas. La taxonomía de  Lemna  spp. 
es difícil y se ve complicada por la existencia de una amplia gama de 
fenotipos. Aunque puede aparecer variabilidad genética en la res ­
puesta de  Lemna  a los agentes tóxicos, actualmente no se tienen 
datos suficientes sobre esta fuente de variabilidad como para reco ­
mendar el uso de un clon determinado en el presente método. Ha de 
señalarse que el ensayo no se realiza en condiciones axénicas, pero 
se toman medidas en distintas fases del ensayo para reducir al mí ­
nimo la contaminación por otros organismos. 
Se incluyen pormenores sobre los ensayos con renovación (semiestá ­
ticos y dinámicos) y sin renovación (estáticos) de la solución de 
ensayo. En función de los objetivos del ensayo y de las imposiciones 
normativas, se recomienda considerar la aplicación de métodos semi ­
estáticos y dinámicos, por ejemplo en caso de sustancias que despa ­
rezcan rápidamente de la solución por volatilización, fotodegrada ­
ción, precipitación o biodegradación. En la referencia (11) se dan 
más orientaciones.
 
1.2. DEFINICIONES 
En relación con el presente método de ensayo se entenderá por:  
Biomasa : el peso seco de materia viva presente en una población. 
En este ensayo, lo que se mide normalmente son indicadores de la biomasa, como el número de frondas o la superficie de las frondas, 
por lo que el término de «biomasa» se refiere también a estos indi ­
cadores.  
Clorosis : el amarilleamiento del tejido de la fronda.  
Clon : el conjunto de organismos o células procedentes de un solo 
individuo por reproducción asexual. Los individuos del mismo clon 
son, por tanto, genéticamente idénticos.  
Colonia : el conjunto de frondas madre e hijas (generalmente de 2 
a 4) unidas entre sí. A veces se le da el nombre de planta.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : la concentración de la sustancia problema disuelta en el medio 
de ensayo que produce una reducción del x % (por ejemplo, del 
50 %) en el crecimiento de  Lemna  dentro de un plazo de exposición 
definido (que debe indicarse explícitamente si es distinto de la du ­
ración completa o normal del ensayo). Para expresar de forma ine ­
quívoca el valor de EC obtenido a partir de la tasa de crecimiento o 
del rendimiento, se usan respectivamente los símbolos «EC  t » y 
«EC  r », seguidos de la variable de medición que se ha utilizado, 
por ejemplo EC  t (número de frondas).  
Ensayo dinámico : el ensayo en que las soluciones de ensayo se 
renuevan continuamente.  
Fronda : cada una de las estructuras «foliáceas» simples de una 
planta de lenteja de agua. Es la unidad mínima, es decir, individuo, 
capaz de reproducirse.  
Deformación : la presencia de frondas con protuberancias o aspecto 
hinchado.  
Crecimiento : el aumento de la variable de medición, por ejemplo el 
número de frondas, el peso seco, el peso húmedo o la superficie de 
las frondas, a lo largo de la duración del ensayo.  
Tasa de crecimiento (tasa media de crecimiento específico) : el 
aumento logarítmico de la biomasa durante el período de exposición.  
Concentración mínima con efecto observado (LOEC) : la concen ­
tración estudiada mínima a la que se observa que la sustancia ejerce un efecto estadísticamente significativo de reducción del crecimiento (con p < 0,05) cuando se compara con el control, dentro de un 
tiempo de exposición dado. Sin embargo, es necesario también que 
todas las concentraciones de ensayo superiores a la LOEC ejerzan un efecto nocivo superior o igual al que se observa con dicha concen ­
tración. Si no se cumplen estas dos condiciones, es preciso dar una 
explicación completa sobre cómo se ha elegido la LOEC (y, por 
tanto, la NOEC).  
Variables de medición : las variables de cualquier tipo que se miden 
para expresar el criterio del ensayo utilizando una o más variables de 
respuesta diferentes. En este método se consideran variables de me ­
dición el número de frondas, la superficie de las frondas, el peso fresco y el peso seco.  
Monocultivo : el cultivo con una sola especie vegetal.  
Necrosis : el tejido de fronda muerto (es decir, blanco o saturado de 
agua).  
Concentración sin efecto observado (NOEC) : la concentración es ­
tudiada que se encuentra inmediatamente por debajo de la LOEC.  
Fenotipo : las características observables de un organismo determi ­
nadas por la interacción de sus genes con su entorno.  
Variables de respuesta : las variables para la estimación de la toxi ­
cidad derivadas de cualquier variable de medición que describa la 
biomasa por distintos métodos de cálculo. A efectos del presente método, las tasas de crecimiento y el rendimiento son variables de respuesta derivadas de variables de medición como el número de 
frondas, la superficie de las frondas, el peso fresco y el peso seco.  
Ensayo semiestático (de renovación) : el ensayo en que, a lo largo 
de su duración, la solución de ensayo se sustituye periódicamente, a intervalos específicos.  
Ensayo estático : el ensayo en que, a lo largo de su duración, no hay 
renovación de la solución de ensayo.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Criterio del ensayo : el factor general que, como objetivo del ensa ­
yo, es modificado por la sustancia problema respecto al control. En 
este método el criterio del ensayo es la inhibición del crecimiento, que se puede expresar mediante diferentes variables de respuesta, basadas en una o más variables de medición.  
Medio de ensayo : el medio de cultivo sintético y completo en que 
crecen las plantas del ensayo cuando se exponen a la sustancia 
problema. Esta se disuelve en principio en el medio de ensayo.  
Rendimiento : el valor de una variable de medición para expresar la 
biomasa al final del período de exposición menos el valor de la variable de medición al inicio del período de exposición.
 
1.3. PRINCIPIO DEL ENSAYO 
Se cultivan plantas del género  Lemna  en fase de crecimiento expo ­
nencial como monocultivos expuestos a diferentes concentraciones 
de la sustancia problema durante un plazo de siete días. El objetivo 
del ensayo es cuantificar el efecto producido por la sustancia sobre el crecimiento vegetativo a lo largo de este plazo, a partir de la eva ­
luación de unas variables de medición seleccionadas. La variable de 
medición primaria es el número de frondas. Se mide también al 
menos otra variable de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco), ya que algunas sustancias pueden afectar a otras variables de medición mucho más que al número de frondas. 
Para cuantificar los efectos debidos a la sustancia, se compara el 
crecimiento en las soluciones de ensayo con el de los controles y se determina la concentración que ocasiona una inhibición del cre ­
cimiento de un porcentaje especificado (por ejemplo, 50 %), la cual 
se expresa como EC
 x (por ejemplo, EC  50 ). 
El criterio final es la inhibición del crecimiento, expresado como 
incremento logarítmico de la variable de medición (tasa media de crecimiento específico) durante el tiempo de exposición. A partir de 
las tasas medias de crecimiento específico registradas en una serie de 
soluciones de ensayo, se determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % de la tasa de crecimiento (por ejem ­
plo, del 50 %) y se expresa como EC
 tx (por ejemplo, EC  t50 ). 
Otra variable de respuesta utilizada en este método de ensayo es el 
rendimiento, lo que puede ser necesario en algunos países para cum ­
plir obligaciones específicas derivadas de la normativa. Se define como las variables de medición al final del tiempo de exposición menos las variables de medición al inicio de este tiempo. A partir del 
rendimiento registrado en una serie de soluciones de ensayo, se 
determina la concentración que produce una inhibición especificada del x % del rendimiento (por ejemplo, del 50 %) y se expresa como EC
 rx (por ejemplo, EC  r50 ). 
Además, pueden determinarse estadísticamente la concentración mí ­
nima con efecto observado (LOEC) y la concentración sin efecto 
observado (NOEC).  
1.4. INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
Debe contarse con un método analítico que tenga la sensibilidad 
adecuada para cuantificar la sustancia en el medio de ensayo.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Entre la información sobre la sustancia problema que puede ser útil 
para establecer las condiciones del ensayo está lo siguiente: fórmula 
estructural, pureza, hidrosolubilidad, estabilidad en el agua, pK  a , 
K ow , presión de vapor y biodegradabilidad. La hidrosolubilidad y 
la presión de vapor pueden utilizarse para calcular la constante de 
la ley de Henry, que indicará la probabilidad de la pérdida de can ­
tidades significativas de sustancia problema durante el tiempo del ensayo. Esto contribuirá a indicar si deben tomarse medidas particu ­
lares para limitar tal pérdida. Cuando sea incierta la información 
sobre la solubilidad y estabilidad de la sustancia problema, se reco ­
mienda que se evalúen dichos aspectos en las condiciones del ensa ­
yo, es decir, con el medio de cultivo, la temperatura y el régimen de iluminación que se vayan a utilizar en el ensayo. 
Cuando sea particularmente importante el control del pH del medio 
de ensayo, por ejemplo cuando se estudien metales o sustancias hidrolíticamente inestables, se recomienda añadir un tampón al me ­
dio de cultivo (véase el párrafo primero del punto 1.7.4). En la 
referencia (11) se ofrece más orientación sobre los ensayos de sus ­
tancias con propiedades fisicoquímicas que dificultan estos ensayos.
 
1.5. SUSTANCIA DE REFERENCIA 
Para comprobar el procedimiento del ensayo pueden someterse al 
mismo sustancias de referencia, como el 3,5-diclorofenol utilizado 
en el ensayo de intercalibración internacional (10). Se recomienda efectuar un ensayo con una sustancia de referencia al menos dos veces al año o, si la frecuencia de los ensayos es menor, en paralelo 
con la determinación de la toxicidad de una sustancia problema.
 
1.6. VALIDEZ DEL ENSAYO 
Para que el ensayo sea válido, el tiempo de duplicación del número 
de frondas en el control debe ser inferior a 2,5 días (60 h), lo que 
corresponde a una multiplicación por siete en el plazo de siete días y 
a una tasa media de crecimiento específico de 0,275 d  –1 . Con los 
medios y condiciones de ensayo descritos en el presente método, este criterio puede cumplirse utilizando un régimen estático (8). También 
se prevé que este criterio se pueda cumplir en condiciones semiestá ­
ticas y dinámicas. En el punto 2.1 se muestra cómo calcular el tiempo de duplicación.
 
1.7. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
1.7.1.  Equipo  
Todo el equipo que entre en contacto con los medios de ensayo será 
de vidrio o de otro material químicamente inerte. El material de vidrio utilizado para el cultivo y el ensayo estará limpio de conta ­
minantes químicos que puedan pasar al medio de ensayo y además 
será estéril. Los recipientes de ensayo tendrán la anchura suficiente 
para que las frondas de las diferentes colonias de los recipientes de control puedan crecer sin solaparse al final del ensayo. No importa si las raíces tocan el fondo de los recipientes de ensayo, pero se reco ­
mienda una profundidad mínima de 20 mm y un volumen mínimo de 
100 ml en cada recipiente de ensayo. Siempre que se respeten estas normas, no es fundamental el tipo de recipiente de ensayo: se ha visto que son adecuados tanto los vasos de precipitados como los 
cristalizadores o las placas Petri de vidrio de dimensiones adecuadas. 
Los recipientes de ensayo estarán cubiertos para minimizar la eva ­
poración y la contaminación accidental, pero sin impedir el necesario intercambio de gases. Los recipientes de ensayo y, en particular, las 
tapas serán tales que eviten la formación de sombras o la modifica ­
ción de las características espectrales de la luz.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
No se tendrán juntos los cultivos y los recipientes de ensayo, y la 
mejor forma de conseguirlo es utilizar distintas cámaras, incubadoras 
o recintos de cultivo ambientales. Debe ser posible regular la ilumi ­
nación y la temperatura, y mantenerlas a nivel constante (véase el punto 1.7.8).
 
1.7.2.  Organismo de ensayo  
El organismo utilizado para este ensayo es  L. gibba  o L. minor . En 
el apéndice 1 se recogen breves descripciones de especies de lenteja 
de agua que se han utilizado en ensayos de toxicidad. El material 
vegetal puede obtenerse de una colección de cultivos, de otro labo ­
ratorio o del campo. Si se recogen del campo, las plantas deben mantenerse cultivadas en el mismo medio que se vaya a utilizar 
para el ensayo al menos en las ocho semanas anteriores a esta 
utilización. Los lugares del campo utilizados para recoger los culti ­
vos iniciales deben estar libres de fuentes de contaminación eviden ­
tes. Si se obtienen de otro laboratorio o de una colección de cultivos, 
deben mantenerse similarmente durante un mínimo de tres semanas. 
En el informe han de indicarse siempre el origen, la especie y el clon (si se conoce) del material vegetal utilizado para el ensayo. 
Deben utilizarse monocultivos que estén claramente exentos de con ­
taminación con otros organismos, como algas o protozoos. Las plan ­
tas sanas de  L. minor  consisten en colonias formadas por entre dos y 
cinco frondas, mientras que las colonias sanas de  L. gibba  pueden 
tener hasta siete frondas. 
La calidad y la uniformidad de las plantas empleadas en el ensayo 
tendrán una influencia significativa sobre el resultado del mismo, por lo que deben seleccionarse con cuidado. Han de utilizarse plantas 
jóvenes, en fase de crecimiento rápido, que no presenten lesiones 
visibles ni cambios de color (clorosis). La buena calidad de un cultivo viene indicada por una elevada frecuencia de colonias con un mínimo de dos frondas. Un gran número de frondas aisladas 
indica problema ambiental, por ejemplo por limitación de nutrientes, 
y el material de estos cultivos no debe utilizarse en los ensayos.
 
1.7.3.  Cultivo  
Para reducir la frecuencia del mantenimiento del cultivo (por ejem ­
plo, cuando no esté previsto efectuar ensayos con  Lemna  durante 
cierto tiempo), es posible mantener los cultivos en condiciones de iluminación y temperatura reducidas (4 a 10 °C). En el apéndice 2 se 
recoge información sobre el mantenimiento de los cultivos. Si se 
observan signos evidentes de contaminación por algas u otros orga ­
nismos, habrá que proceder a la esterilización superficial de una submuestra de frondas de  Lemna , seguida por su transferencia a 
medio fresco (véase el apéndice 2). En tal caso, se desechará el resto 
del cultivo contaminado. 
Al menos siete días antes del ensayo, debe transferirse asépticamente 
a medio estéril fresco un número suficiente de colonias, que se cultivarán durante 7 a 10 días en las condiciones del ensayo.
 
1.7.4.  Medio de ensayo  
Se recomienda el uso de diferentes medios para  L. minor  y L. gibba , 
como se describe más abajo. Debe estudiarse cuidadosamente la inclusión de un tampón de pH en el medio de ensayo [ácido 4- 
morfolinopropano-sulfónico (MOPS), n
 o CAS: 1132-61-2; 
n o EINECS: 214-478-5) en medio de  L. minor , y NaHCO  3 en medio 
de L. gibba ] si se sospecha que puede reaccionar con la sustancia 
problema e influir en la expresión de su toxicidad. También es 
aceptable el medio de Steinberg (12), siempre que se cumplan los 
criterios de validez.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Para el cultivo de  L. minor  y los ensayos con ella, se recomienda una 
modificación del medio de cultivo normal de Suecia (SIS) para  
Lemna , cuya composición figura en el apéndice 3. 
Para el cultivo de  L. gibba  y los ensayos con ella, se recomienda el 
medio de cultivo 20X-AAP, tal como se describe en el apéndice 3. 
El medio de Steinberg, como se describe en el apéndice 3, es tam ­
bién adecuado para  L. minor , aunque puede utilizarse asimismo con  
L. gibba  siempre que se cumplan los criterios de validez.  
1.7.5.  Soluciones de ensayo  
Las soluciones de ensayo se preparan normalmente diluyendo una 
solución madre. En principio, las soluciones madre de la sustancia problema se preparan disolviendo la sustancia en medio de cultivo. 
La mayor concentración estudiada de la sustancia problema no debe 
superar como norma su hidrosolubilidad en las condiciones de en ­
sayo. No obstante, ha de señalarse que  Lemna  spp. flotan en la 
superficie y pueden exponerse a sustancias que se acumulan en la interfase agua-aire (por ejemplo, sustancias hidrofóbicas o poco hi ­
drosolubles, o sustancias tensoactivas). En tales circunstancias, la 
exposición se deberá a material que no está disuelto y las concen ­
traciones de ensayo podrán superar la hidrosolubilidad, según las características de la sustancia problema. En caso de sustancias pro ­
blema de escasa hidrosolubilidad, puede ser necesario preparar una 
dispersión o solución madre concentrada de la sustancia con un 
dispersante o disolvente orgánico para facilitar la adición de canti ­
dades exactas de la sustancia problema al medio de ensayo y ayudar a su dispersión y disolución. No obstante, debe evitarse en la mayor 
medida posible el empleo de tales materiales. El uso de disolventes o 
dispersantes auxiliares no debe provocar fitotoxicidad. Por ejemplo, entre los disolventes utilizados frecuentemente que no causan fitoto ­
xicidad a concentraciones de hasta 100 μl·l
 –1 figuran la acetona y la 
dimetilformamida. Si se utiliza un disolvente o dispersante, su con ­
centración final se indicará en el informe y se mantendrá a un nivel mínimo ( ≤ 100 μl·l
 –1 ), y todos los recipientes de tratamiento y de 
control contendrán la misma concentración de disolvente o disper ­
sante. En la referencia (11) se da más información sobre el uso de 
dispersantes.  
1.7.6.  Grupos de ensayo y controles  
Para seleccionar las concentraciones de ensayo adecuadas es útil 
disponer de datos anteriores sobre la toxicidad de la sustancia pro ­
blema para  Lemna , como, por ejemplo, datos procedentes de un 
ensayo preliminar. En el ensayo definitivo de toxicidad, deben em ­
plearse al menos cinco concentraciones de ensayo dispuestas en progresión geométrica. Lo mejor es que la razón entre las concen ­
traciones de ensayo no sea superior a 3,2, pero puede utilizarse un 
valor superior si la curva concentración-respuesta es plana. Si se 
usan menos de cinco concentraciones, hay que justificarlo. De cada concentración de ensayo se utilizarán al menos tres réplicas en paralelo. 
Al fijar el abanico de concentraciones de ensayo (para el ensayo de 
tanteo o para el ensayo definitivo de toxicidad), debe tenerse en 
cuenta lo siguiente:
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Para determinar una EC  x , es necesario que las concentraciones de 
ensayo abarquen el valor de EC  x a fin de asegurar un nivel 
adecuado de confianza. Por ejemplo, si se estima la EC  50 , la 
mayor concentración de ensayo debe ser superior al valor de EC
 50 . Si el valor de EC  50 se encuentra fuera del abanico de 
las concentraciones de ensayo, los intervalos de confianza aso ­
ciados serán amplios y quizá no sea posible efectuar una evalua ­
ción adecuada del ajuste estadístico del modelo. 
— Si el objetivo es estimar la LOEC/NOEC, la menor concentración 
de ensayo debe ser tan baja que el crecimiento correspondiente 
no sea significativamente inferior al del control. Por otra parte, la 
mayor concentración de ensayo debe ser tan alta que el creci ­
miento correspondiente sea significativamente inferior al del con ­
trol. Si no es así, habrá que repetir el ensayo utilizando un 
abanico diferente de concentraciones (salvo que la mayor concen ­
tración sea el límite de solubilidad o la concentración límite requerida máxima, por ejemplo 100 mg·l
 –1 ). 
Cada ensayo debe incluir controles con un medio nutritivo, número 
de frondas y colonias, condiciones ambientales y procedimientos 
iguales que los recipientes de ensayo, pero sin la sustancia problema. 
Si se utiliza un disolvente o dispersante auxiliar, se incluirá un con ­
trol adicional con el disolvente o dispersante presente en la misma concentración que en los recipientes con la sustancia problema. El 
número de réplicas de los recipientes de control (y recipientes de 
disolventes, en su caso) será al menos igual al número de recipientes utilizados con cada concentración de ensayo, y preferentemente el doble de este número. 
Si no es necesario determinar la NOEC, el diseño de la prueba puede 
modificarse para aumentar el número de concentraciones y reducir el 
número de réplicas por concentración. Sin embargo, el número de réplicas de los controles será al menos de tres.
 
1.7.7.  Exposición  
Se transfieren desde el cultivo de inóculo colonias formadas por 
entre 2 y 4 frondas visibles, repartiéndose aleatoriamente entre los 
recipientes de ensayo en condiciones asépticas. Cada recipiente de 
ensayo debe contar con un total de 9 a 12 frondas. En cada uno de ellos habrá el mismo número de frondas y colonias. La experiencia obtenida con este método y los datos del ensayo de intercalibración 
indican que el uso de tres réplicas por tratamiento, contando cada 
una de ellas inicialmente con entre 9 y 12 frondas, es suficiente para detectar diferencias en el crecimiento del orden del 4 al 7 % de la inhibición calculada en tasa de crecimiento (del 10 al 15 % calculada 
en rendimiento) entre tratamientos (10). 
Es necesario un diseño aleatorio de la distribución de los recipientes 
de ensayo en la incubadora para minimizar la influencia de las diferencias espaciales de intensidad luminosa o temperatura. Tam ­
bién es necesario un diseño por bloq ues o una redistribución alea ­
toria de los recipientes cuando se hacen observaciones (o una redis ­
tribución más frecuente).
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Si un ensayo previo de estabilidad indica que la concentración de 
sustancia problema no puede mantenerse (es decir, que la concen ­
tración medida cae por debajo del 80 % de la concentración medida inicialmente) a lo largo de la duración del ensayo (7 días), se reco ­
mienda un régimen de ensayo semiestático. En tal caso, las colonias 
deben exponerse a soluciones de ensayo y control recién preparadas 
en al menos dos ocasiones durante el ensayo (por ejemplo, en los días 3 y 5). La frecuencia de la exposición al medio fresco dependerá de la estabilidad de la sustancia problema; puede ser necesaria una 
frecuencia mayor para mantener concentraciones cuasi constantes de 
sustancias muy inestables o volátiles. En ciertas circunstancias puede hacer falta un procedimiento dinámico (11) (13). 
La posibilidad de exposición mediante aplicación foliar (aerosol) no 
se contempla en el presente método de ensayo; véase en cambio la 
referencia (14).
 
1.7.8.  Condiciones de incubación  
Debe utilizarse continuamente una luz fluorescente blanca fría o 
cálida que dé una intensidad luminosa seleccionada en el intervalo de 85 a 135 μE·m
 –2 ·s –1 cuando se mide en una radiación activa para 
la fotosíntesis (400 a 700 nm) en puntos situados a la misma dis ­
tancia de la fuente luminosa que las frondas de  Lemna  (equivalente 
a 6 500 a 10 000 lux). Las diferencias respecto a la intensidad lumi ­
nosa seleccionada no deben superar el ± 15 % en toda la superficie de ensayo. El método de detección y medición de la luz, en parti ­
cular el tipo de sensor, influye en el valor medido. La utilización de 
sensores esféricos (que responden a la luz desde todos los ángulos por encima y por debajo del plano de medición) y de sensores de «coseno» (que responden a la luz desde todos los ángulos por en ­
cima del plano de medición) es mejor que la de sensores unidirec ­
cionales, y proporciona lecturas más elevadas con una fuente lumi ­
nosa multipuntual del tipo que se describe aquí. 
La temperatura de los recipientes de ensayo debe ser de 24 ± 2 °C. 
El pH del medio de control no debe subir más de 1,5 unidades 
durante el ensayo. Sin embargo, una desviación superior a 1,5 uni ­
dades no invalidaría el ensayo si puede demostrarse que se cumplen los criterios de validez. Es necesario prestar especial atención a la 
deriva del pH en casos especiales, como cuando se estudian metales 
o sustancias inestables. En la referencia (11) puede encontrarse más información al respecto.
 
1.7.9.  Duración  
El ensayo termina a los siete días de la transferencia de las plantas a 
los recipientes de ensayo.  
1.7.10.  Mediciones y determinaciones analíticas  
Al inicio del ensayo, se cuenta y registra el número de frondas de los 
recipientes de ensayo, velando por tener en cuenta las frondas pro ­
minentes y claramente visibles. Es necesario determinar el número 
de frondas de aspecto normal o anormal al inicio del ensayo, al 
menos una vez cada tres días durante el plazo de exposición (es decir, al menos dos veces durante el período de 7 días) y al final del ensayo. Deben anotarse los cambios observados en el desarrollo 
de las plantas como, por ejemplo, en el tamaño, aspecto, indicación 
de necrosis, clorosis o protuberancias, rotura de colonias o pérdida de flotabilidad de las frondas, así como en la longitud y aspecto de las raíces. Deben registrarse también las características significativas 
del medio de ensayo (por ejemplo, presencia de material sin disolver 
o crecimiento de algas en el recipiente de ensayo).
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Además del recuento del número de frondas durante el ensayo, hay 
que evaluar los efectos de la sustancia problema sobre una o más de 
las siguientes variables de medición: 
i) superficie total de las frondas, 
ii) peso seco, 
iii) peso fresco. La superficie total de las frondas tiene la ventaja de que puede 
determinarse en cada recipiente de ensayo y de control al principio 
y al final del ensayo, así como durante el mismo. El peso seco o 
fresco debe determinarse al principio del ensayo a partir de una muestra de cultivo del inóculo representativa del utilizado para em ­
pezar el ensayo, y al final de este con el material vegetal de cada 
recipiente de ensayo y de control. Si no se mide la superficie de las 
frondas, es mejor determinar el peso seco que el peso fresco. 
La superficie total de las frondas, el peso seco y el peso fresco 
pueden determinarse de la forma siguiente: 
i) Superficie total de las frondas : La superficie total de las frondas 
de todas las colonias puede determinarse por análisis de imáge ­
nes. Puede captarse el contorno del recipiente de ensayo y de las plantas mediante una cámara de vídeo (es decir, poniendo el recipiente en una caja de luz), y después se digitaliza la imagen 
resultante. A continuación puede determinarse la superficie total 
de las frondas de un recipiente de ensayo calibrando con planti ­
llas de superficie conocida. Debe procurarse evitar las interferen ­
cias debidas al borde del recipiente de ensayo. Otra posibilidad, 
pero más laboriosa, consiste en fotografiar los recipientes de 
ensayo y las plantas, recortar el contorno obtenido de las colo ­
nias y determinar su superficie mediante un analizador de super ­
ficie de hojas o papel milimetrado. También pueden ser adecua ­
das otras técnicas (por ejemplo, el cociente entre el peso del 
papel correspondiente a la superficie del contorno de las colonias y el de la superficie unitaria). 
ii) Peso seco : Se recogen todas las colonias de cada uno de los 
recipientes de ensayo y se lavan con agua destilada o desioni ­
zada. Se secan con material absorbente para eliminar el exceso 
de agua y después se calientan a 60 °C hasta llegar a peso constante. Deben incluirse los eventuales fragmentos de raíces. El peso seco se expresará con una precisión mínima de 0,1 mg. 
iii) Peso fresco : Todas las colonias se transfieren a tubos de polies ­
tireno (u otro material inerte), pesados previamente, con peque ­
ños agujeros (de 1 mm) en los fondos redondeados. A continua ­
ción se centrifugan los tubos a 3 000 rpm durante 10 minutos a 
temperatura ambiente. Después se vuelven a pesar los tubos, que 
contienen las colonias ahora secadas, y el peso fresco se calcula restando el peso del tubo vacío.
 
1.7.10.1.  Frecuencia de las mediciones y determinaciones analíticas  
Si se utiliza un ensayo estático, debe medirse el pH de cada trata ­
miento al inicio y al final del ensayo. Si el ensayo es semiestático, el pH debe medirse en cada lote de solución de ensayo «fresca» antes 
de cada renovación y también en las correspondientes soluciones 
«viejas».
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Debe medirse la intensidad luminosa en la cámara de crecimiento, 
incubadora o recinto de cultivo, en puntos situados a la misma 
distancia de la fuente luminosa que las frondas de  Lemna . Esta 
medición debe efectuarse al menos una vez durante el ensayo. Debe registrarse al menos una vez al día la temperatura del medio 
en un recipiente indicador mantenido en las mismas condiciones en 
la cámara, incubadora o recinto de cultivo. 
Las concentraciones de la sustancia problema se determinarán du ­
rante el ensayo a intervalos adecuados. Con ensayos estáticos, el 
requisito mínimo es determinar las concentraciones al inicio y al 
final del ensayo. 
Con ensayos semiestáticos en que no se prevea que la concentración de 
sustancia problema permanezca en el intervalo del ± 20 % de la con ­
centración nominal, habrá que analizar todas las soluciones de ensayo 
recién preparadas y las mismas soluciones en cada renovación (véase el párrafo tercero del punto 1.7.7). No obstante, en los ensayos en los que la concentración inicial medida de la sustancia problema no esté dentro 
del intervalo del ± 20 % de la concentración nominal, pero en los que 
puedan aportarse pruebas suficientes de que las concentraciones inicia ­
les son repetibles y estables (es decir, que están dentro del intervalo del 80 a 120 % de la concentración inicial), las determinaciones químicas 
podrían limitarse a las concentraciones de ensayo máxima y mínima. 
En todos los casos, la determinación de las concentraciones de la sus ­
tancia problema antes de la renovación solo tendrá que efectuarse en uno de los recipientes replicados de cada concentración de ensayo (o en 
los contenidos reunidos de los recipientes replicados). 
Si se utiliza un ensayo dinámico, será adecuado un régimen de 
muestreo similar al descrito para los ensayos semiestáticos, incluido el análisis al inicio, a la mitad y al final del ensayo, pero en este caso 
no será apropiado efectuar mediciones de las soluciones «gastadas». 
En este tipo de ensayo habrá que comprobar diariamente el caudal de solución madre de sustancia problema o de diluyente y sustancia problema. 
Si está demostrado que la concentración de la sustancia problema se 
ha mantenido satisfactoriamente a lo largo de todo el ensayo dentro del intervalo del ± 20 % de la concentración nominal o medida inicialmente, el análisis de los resultados puede basarse en los valo ­
res nominales o medidos inicialmente. Si la desviación respecto a la 
concentración nominal o medida inicialmente es superior al ± 20 %, el análisis de los resultados deberá basarse en la media geométrica de la concentración durante la exposición o en modelos que describan el 
descenso de la concentración de la sustancia problema (11).
 
1.7.11.  Ensayo límite  
Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando un ensayo preliminar 
indica que la sustancia problema no tiene efectos tóxicos a concen ­
traciones de hasta 100 mg·l  –1 , o hasta su límite de solubilidad en el 
medio de ensayo si este valor es más bajo, puede efectuarse un 
ensayo límite comparando las respuestas de un grupo de control y 
de un único grupo de tratamiento (100 mg·l  –1 o una concentración 
igual al límite de solubilidad). Se recomienda vivamente que esto se apoye en un análisis de la concentración de exposición. Todas las 
condiciones de ensayo y criterios de validez antes descritos son 
aplicables al ensayo límite, con la excepción de que el número de réplicas de tratamiento ha de duplicarse. El crecimiento en el grupo de control y en el de tratamiento pueden analizarse mediante un 
método estadístico para comparar las medias como, por ejemplo, 
una prueba t de Student.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. DATOS E INFORME  
2.1. TIEMPO DE DUPLICACIÓN 
Para determinar el tiempo de duplicación (T  d ) del número de frondas 
y el cumplimiento de este criterio de validez por el estudio 
(punto 1.6), se aplicará la fórmula siguiente con datos obtenidos 
de los recipientes de control: 
T d = ln 2/μ 
donde μ es la tasa media de crecimiento específico determinada 
como se describe en los párrafos primero y segundo del punto 2.2.1.  
2.2. VARIABLES DE RESPUESTA 
El objetivo del ensayo es determinar los efectos de la sustancia 
problema sobre el crecimiento vegetativo de  Lemna . El presente 
método de ensayo describe dos variables de respuesta, ya que los 
Estados miembros tienen distintas preferencias y necesidades norma ­
tivas. Para que los resultados del ensayo sean aceptables en todos los Estados miembros, los efectos deben evaluarse utilizando las dos variables de respuesta a) y b) que se describen a continuación: 
a) Tasa media de crecimiento específico: Esta variable de respuesta 
se calcula a partir del cambio del logaritmo del número de fron ­
das y, además, a partir del cambio del logaritmo de otro paráme ­
tro de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso 
fresco) a lo largo del tiempo (expresado en días) en los controles y en cada grupo de tratamiento. A veces se denomina tasa de crecimiento relativa (15). 
b) Rendimiento: Esta variable de respuesta se calcula a partir del 
cambio del número de frondas y, además, a partir del cambio de otro parámetro de medición (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) en los controles y en cada grupo de trata ­
miento hasta el final del ensayo. 
Ha de señalarse que los valores de toxicidad calculados a partir de 
estas dos variables de respuesta no son comparables y es necesario 
tener en cuenta esta diferencia cuando se utilicen los resultados del 
ensayo. Los valores de EC
 x basados en la tasa media de crecimiento 
específico (EC  tx ) son normalmente más elevados que los basados en 
el rendimiento (EC  rx ) si se respetan las condiciones del presente 
método de ensayo, debido al fundamento matemático de los plantea ­
mientos respectivos. Esto no debe interpretarse como una diferencia en la sensibilidad de las dos variables de respuesta, sino como una diferencia puramente matemática entre los valores. El concepto de 
tasa media de crecimiento específico se basa en el modelo general de 
crecimiento exponencial de la lenteja de agua en cultivos no limita ­
dos, en que la toxicidad se estima en función de los efectos sobre la tasa de crecimiento, sin depender del nivel absoluto de la tasa de 
crecimiento específico del control, de la pendiente de la curva con ­
centración-respuesta ni de la duración del ensayo. Por el contrario, los resultados basados en la variable de respuesta «rendimiento» dependen de todas estas otras variables. La EC
 rx depende de la 
tasa de crecimiento específico de la especie de lenteja de agua uti ­
lizada en cada ensayo y de la tasa máxima de crecimiento específico, que puede variar de una especie a otra e incluso de un clon a otro. Esta variable de respuesta no debe utilizarse para comparar la sen ­
sibilidad de distintas especies, o incluso distintos clones, de lenteja 
de agua ante un agente tóxico. Aunque científicamente se prefiere el uso de la tasa media de crecimiento específico para estimar la toxi ­
cidad, en el presente método de ensayo se incluye también la esti ­
mación a partir del rendimiento para cumplir los requisitos normati ­
vos vigentes en ciertos países.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Las estimaciones de la toxicidad deben basarse en el número de 
frondas y en otra variable de medición más (superficie total de las 
frondas, peso seco o peso fresco), porque ciertas sustancias pueden afectar a otras variables de medición mucho más que al número de frondas. Este efecto no se detectaría si solo se calculará el número de 
frondas. 
El número de frondas y las otras variables de medición registradas 
(es decir, la superficie total de las frondas, el peso seco o el peso 
fresco), se tabulan junto con las concentraciones de esa sustancia 
problema correspondientes a cada punto de medición. Todo análisis posterior de los datos, por ejemplo para estimar la LOEC, NOEC o EC
 x , se basará en los valores de las distintas réplicas y no en los 
promedios calculados de cada grupo de tratamiento.  
2.2.1.  Tasa media de crecimiento específico  
La tasa media de crecimiento específico correspondiente a un pe ­
ríodo específico se calcula como el incremento logarítmico de las variables de crecimiento, es decir, número de frondas y otra variable 
de medición (área total de las frondas, peso seco o peso fresco), 
aplicando la fórmula siguiente a cada réplica de control y de trata ­
miento:
 
μ iÄj ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
donde:  
— μ i-j es la tasa media de crecimiento específico entre el tiempo  
i y el  j 
— N  i es la variable de medición del recipiente de ensayo o de 
control en el tiempo  i 
— N  j es la variable de medición del recipiente de ensayo o de 
control en el tiempo  j 
— t es el tiempo transcurrido entre  i y j. 
Respecto a cada grupo de tratamiento y de control ha de calcularse 
un valor promedio de la tasa de crecimiento con una estimación de la 
varianza. 
Debe calcularse la tasa media de crecimiento específico correspon ­
diente a toda la duración del ensayo (el tiempo  i en la fórmula 
anterior es el principio del ensayo y el tiempo  j es el final del 
mismo). Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio de la tasa media de crecimiento espe ­
cífico con una estimación de la varianza. Por otra parte, debe con ­
siderarse la tasa de crecimiento de cada sección para evaluar el 
efecto de la sustancia problema presente durante el período de ex ­
posición (por ejemplo, examinando curvas logarítmicas de crecimien ­
to). Una diferencia importante entre la tasa de crecimiento de cada 
sección y la tasa media de crecimiento indica una desviación res ­
pecto al crecimiento exponencial constante e impone el examen en detalle de las curvas de crecimiento. En este caso, un enfoque pru ­
dente sería comparar las tasas de crecimiento específico de cultivos 
tratados durante el tiempo de inhibición máxima con las correspon ­
dientes a los controles durante el mismo tiempo.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Después puede calcularse el porcentaje de inhibición en tasa de 
crecimiento (I  t ) correspondiente a cada concentración de ensayo 
(grupo de tratamiento) aplicando la fórmula siguiente:  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
donde: 
— % I  t es el porcentaje de inhibición en tasa media de creci ­
miento específico 
— μ C es el valor promedio de μ en el grupo de control 
— μ T es el valor promedio de μ en el grupo de tratamiento.  
2.2.2.  Rendimiento  
Los efectos sobre el rendimiento se determinan a partir de dos varia ­
bles de medición, el número de frondas y otra variable de medición 
(superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco) observadas 
en cada recipiente de ensayo al inicio y al final del ensayo. En el caso del peso seco o del peso fresco, la biomasa inicial se determina a partir una muestra de frondas tomada del mismo lote utilizado para 
inocular los recipientes de ensayo (véase el párrafo segundo del 
punto 1.7.3). Respecto a cada concentración de ensayo y control ha de calcularse un valor promedio del rendimiento con una estima ­
ción de la varianza. El porcentaje promedio de inhibición en rendi ­
miento (% I
 y ) puede calcularse de la manera siguiente con cada 
grupo de tratamiento:  
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
donde: 
— % I  y es el porcentaje de reducción en rendimiento 
— b  C es la biomasa final menos la biomasa inicial correspon ­
diente al grupo de control 
— b  T es la biomasa final menos la biomasa inicial correspon ­
diente al grupo de tratamiento.  
2.2.3.  Trazado de las curvas concentración-respuesta  
Se trazarán las curvas concentración-respuesta que relacionan el por ­
centaje promedio de inhibición de la variable de respuesta (I  r o I y , 
calculado como se indica en el último párrafo del punto 2.2.1 o en el punto 2.2.2) con el logaritmo de la concentración de la sustancia 
problema
 
2.2.4.  Estimación de ECx  
Las estimaciones de EC  x (por ejemplo, EC  50 ) deben basarse tanto en 
la tasa media de crecimiento específico (EC  tx ) como en el rendi ­
miento (EC  rx ), cada uno de los cuales debe basarse, a su vez, en 
el número de frondas y en una variable de medición más (superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco). El motivo es que ciertas sustancias problema influyen de forma diferente en el número 
de frondas y en otras variables de medición. Por tanto, los paráme ­
tros buscados de la toxicidad son cuatro valores de EC
 x por cada 
nivel de inhibición x calculado: EC  tx (número de frondas); EC  tx 
(superficie total de las frondas, peso seco o peso fresco); EC  rx (nú­
mero de frondas); y EC  rx (superficie total de las frondas, peso seco o 
peso fresco).  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. PROCEDIMIENTOS ESTADÍSTICOS 
El objetivo es obtener una relación cuantitativa concentración-res ­
puesta mediante análisis de regresión. Es posible utilizar una regre ­
sión lineal ponderada después de haber efectuado una linealización 
de los datos de respuesta como, por ejemplo, en probit o logit o 
unidades Weibull (16), pero son preferibles los procedimientos de regresión no lineal porque con ellos se tratan mejor las inevitables irregularidades de los datos y las desviaciones respecto a distribu ­
ciones suaves. Si la inhibición está próxima al 0 o al 100 %, la 
transformación puede magnificar tales irregularidades, interfiriendo así con el análisis (16). Debe señalarse que los métodos normales 
de análisis que utilizan las transformaciones en probit, logit o de 
Weibull están previstos para aplicarse a datos cuantales (por ejemplo, mortalidad o supervivencia), y que es necesario modificarlos para aplicarlos a datos de tasas de crecimiento o rendimiento. En las 
referencias (17), (18) y (19) pueden encontrarse métodos específicos 
de determinación de los valores de EC
 x a partir de datos continuos. 
Respecto a cada variable de respuesta que haya de analizarse, se 
utilizará la relación concentración-respuesta para calcular estimacio ­
nes puntuales de los valores de EC  x . Cuando sea posible, se deter ­
minarán los límites de confianza del 95 % de cada estimación. La 
bondad del ajuste de los datos de respuesta al modelo de regresión se 
evaluará de forma gráfica o estadística. El análisis de regresión se efectuará utilizando las respuestas de las distintas réplicas y no los promedios de los grupos de tratamiento. 
Las estimaciones de la EC
 50 y los límites de confianza pueden 
obtenerse también utilizando la interpolación lineal con remuestreo 
(bootstrapping ) (20) si los métodos o modelos de regresión disponi ­
bles no son adecuados para los datos. 
Para la estimación de los valores de LOEC y, por tanto, de NOEC, 
es necesario comparar los promedios de tratamiento utilizando téc ­
nicas de análisis de la varianza (ANOVA). A continuación se ha de 
comparar el promedio obtenido a cada concentración con el del control, aplicando un método apropiado de comparación múltiple o de prueba de tendencia. Las pruebas de Dunnett o Williams pueden 
ser útiles (21) (22) (23) (24). Hay que comprobar si se sostiene la 
hipótesis del ANOVA de homogeneidad de la varianza. Esta com ­
probación puede realizarse gráficamente o mediante una prueba en regla (25). Son adecuadas las pruebas de Levene o Bartlett. El in ­
cumplimiento de la hipótesis de homogeneidad de las varianzas 
puede corregirse a veces mediante la transformación logarítmica de los datos. Si la heterogeneidad de la varianza es extrema y no puede corregirse mediante transformación, ha de considerarse la posibilidad 
de efectuar un análisis por métodos como las pruebas de tendencia 
de Jonkheere de ajuste secuencial de residuos. En la referencia (19) puede encontrarse más información sobre la determinación de la NOEC. 
Los recientes avances científicos han llevado a recomendar el aban ­
dono del concepto de NOEC para sustituirlo por el de estimaciones 
puntuales de EC
 x basadas en la regresión. Aún no se ha determinado 
un valor adecuado de  x para esta prueba con  Lemna . Sin embargo, 
parece que es apropiado el intervalo del 10 al 20 % (según la 
variable de respuesta elegida) y lo mejor es indicar tanto la EC  10 
como la EC  20 . 
3. INFORMES  
3.1. INFORME DEL ENSAYO 
El informe del ensayo debe incluir la información siguiente: 
Sustancia problema: — naturaleza física y propiedades fisicoquímicas, incluido el límite 
de hidrosolubilidad,
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— datos de identificación química (por ejemplo, número CAS), in ­
cluida la pureza. 
Especie de ensayo: 
— nombre científico, clon (si se conoce) y procedencia. 
Condiciones de ensayo: 
— procedimiento de ensayo aplicado (estático, semiestático o 
dinámico), 
— fecha de inicio y duración del ensayo, 
— medio de ensayo, 
— descripción del diseño experimental: recipientes de ensayo y sus 
tapas, volúmenes de solución, número de colonias y de frondas por recipiente de ensayo al inicio del ensayo, 
— concentraciones de ensayo (nominales y medidas, según proceda) 
y número de réplicas por concentración, 
— métodos de preparación de las soluciones madre y problema, 
incluido el eventual uso de disolventes o dispersantes, 
— temperatura durante el ensayo, 
— fuente, intensidad y homogeneidad de la luz, 
— valores de pH de los medios de ensayo y de control, 
— concentraciones de la sustancia problema y método de análisis 
con datos adecuados de evaluación de la calidad (estudios de 
validación, desviaciones típicas o límites de confianza de los análisis), 
— métodos de determinación del número de frondas y otras varia ­
bles de medición como, por ejemplo, el peso seco, el peso fresco o la superficie de las frondas, 
— todas las desviaciones respecto al presente método de ensayo. 
Resultados: 
— datos en bruto: número de frondas y otras variables de medición 
en cada recipiente de ensayo y de control en cada observación y momento de análisis, 
— medias y desviaciones típicas de cada variable de medición, — curvas de crecimiento de cada concentración (se recomienda con 
transformación logarítmica de la variable de medición, véase el párrafo segundo del punto 2.2.1), 
— tiempo de duplicación/tasa de crecimiento en el control según el 
número de frondas, 
— variables de respuesta calculadas de cada réplica de tratamiento, 
con valores medios y coeficiente de variación de las réplicas, 
— representación gráfica de la relación concentración-efecto, 
— estimaciones de parámetros de la toxicidad correspondientes a 
variables de respuesta, por ejemplo, EC
 50 , EC  10 , EC  20 , e inter­
valos de confianza asociados. En caso de que se calculen la 
LOEC o la NOEC, se indicarán sus valores y los métodos esta ­
dísticos utilizados en su determinación,  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— si se ha utilizado el ANOVA, el tamaño del efecto que puede 
observarse (por ejemplo, la diferencia significativa mínima), 
— la eventual estimulación del crecimiento que se haya observado 
en cualquier recipiente de tratamiento, 
— los eventuales signos visuales de fitotoxicidad así como observa ­
ciones de las soluciones de ensayo, 
— discusión de los resultados, incluida la eventual influencia que 
tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método 
de ensayo.  
4. BIBLIOGRAFÍA  
(1) OECD TG 221 (2006).  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test. 
(2) El uso de estudios con  Lemna  sobre sustancias coloreadas se 
detalla en la sección 13.5.3 del Manual de Decisiones de la UE de julio de 2006, en http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals (solo en inglés). 
(3) Guidance on information requirements and chemical safety asses ­
sment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3, Summary of difficult substance testing issues, disponible en: 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/infor ­
mation_requirements_en.htm?time=1234958685#A. 
(4) ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reap ­
proved 1998), pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA. 
(5) USEPA — United States Environmental Protection Agency 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using 
Lemna spp., «Public draft». EPA 712-C-96-156. 8 pp. 
(6) AFNOR — Association Française de Normalisation (1996). XP 
T 90-337. Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor , 10 pp. 
(7) SSI — Swedish Standards Institute (1995). Water quality — 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duck­
weed. SS 02 82 13, 15 pp. (en sueco). 
(8) Environment Canada (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Ma ­
crophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37, 120 pp. 
(9) Environment Canada (1993). Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Eva ­
luation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145. 
(10) Sims, I., Whitehouse, P., y Lacey, R. (1999). The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft 
OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc 
plc — Environment Agency. 
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Tes ­
ting of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmen ­
tal Health and Safety Publications, Series on Testing and As ­
sessment No. 23. 
(12) ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) — Duckweed Growth Inhibition Test.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge, C.T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3-77 108. September 1977. 
(14) Lockhart, W.L., Billeck, B.N., y Baron, C.L. (1989). Bioassays 
with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed and 
dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353-359. 
(15) Huebert, D.B., y Shay, J.M. (1993). Considerations in the as ­
sessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, 481-483. 
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713-718. 
(17) Nyholm, N., Sørensen, P.S., Kusk, K.O., y Christensen, E.R. 
(1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167. 
(18) Bruce, R.D., y Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494. 
(19) OECD (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
(20) Norberg-King, T.J. (1988). An interpolation estimate for chro ­
nic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity As ­
sessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN. 
(21) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096-1121. 
(22) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482-491. 
(23) Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103-117. 
(24) Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. 
(25) Brain, P., y Cousens, R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Apéndice 1  
Descripción de  Lemna  spp.  
La planta acuática denominada vulgarmente lenteja de agua,  Lemna  spp., perte ­
nece a la familia  Lemnaceae , que tiene varias especies de distribución mundial 
recogidas en cuatro géneros. Se han descrito exhaustivamente sus diferencias de 
aspecto y taxonomía (1) (2).  L. gibba  y L. minor  son especies representativas de 
las zonas templadas y se utilizan frecuentemente en estudios de toxicidad. Ambas especies tienen un tallo discoidal (fronda) flotante o sumergido y una raíz muy fina que sale del centro de la superficie inferior de cada fronda. Las especies de  
Lemna  no suelen echar flores, y las plantas se reproducen vegetativamente ha ­
ciendo nuevas frondas (3). En comparación con las plantas viejas, las jóvenes tienden a ser más pálidas, tener raíces más cortas y consistir en dos o tres frondas de distintos tamaños. El pequeño tamaño, la sencillez de la estructura, la repro ­
ducción asexual y el breve tiempo de generación de  Lemna  son características 
que convierten a las plantas de este género en idóneas para los ensayos de laboratorio (4) (5). 
Debido a la probabilidad de que haya diferencias de sensibilidad entre las espe ­
cies, solo son válidas las comparaciones de sensibilidad dentro de una misma especie.
 
Ejemplos de especies de  Lemna  que se utilizan en los ensayos: Referencias 
sobre las especies  
L. aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium strictum  
and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological bioassays. 
Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.  
L. major : Clark, N.A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
L. minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA) (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., «Public draft». 
EPA 712-C-96-156, 8 pp. 
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor , 10 pp. 
Swedish Standards Institute (SIS) (1995). Water quality — Determination of 
growth inhibition (7-d)  L. minor , duckweed. SS 02 82 13, 15 pp. (en sueco).  
L. gibba : ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  L. gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998), pp. 733-742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA) (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., «Public draft». 
EPA 712-C-96-156, 8 pp.  
L. paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an in ­
dicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
L. perpusilla : Clark, J.R., et al. (1981). Accumulation and depuration of metals 
by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
L. trisulca : Huebert, D.B., Shay, J.M. (1993). Considerations in the assessment 
of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
L. valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and 
synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Fuentes de especies de Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria 
Department of Botany, University of Toronto, Toronto, Ontario 
CANADÁ, M5S 3 B2 Tel. (1-416) 978 36 41 Fax (1-416) 978 58 78 Dirección electrónica: jacreman@botany.utoronto.ca http://www.botany.utoronto.ca/utcc 
North Carolina State University 
Forestry Dept 
Duckweed Culture Collection 
Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695-8002 ESTADOS UNIDOS Tel. (001-919) 515 75 72 
Dirección electrónica: astomp@unity.ncsu.edu 
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University 
SE-106 91 
Estocolmo SUECIA Tel. (46-8) 674 72 40 Fax (46-8) 674 76 36 
Umweltbundesamt (UBA) 
FG III 3.4 
Schichauweg 58 
12307 Berlín ALEMANIA Dirección electrónica: lemna@uba.de http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm
 
Bibliografía  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287. 
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ), vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zúrich, 
Suiza. 
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human uti ­
lization of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo. 
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14. 
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Apéndice 2  
Mantenimiento de cultivos de inóculo  
Los cultivos de inóculo pueden mantenerse a temperaturas bajas (4 a 10 °C) 
durante tiempos prolongados sin tener que volver a obtenerlos. El medio de cultivo de  Lemna  puede ser el mismo que se utilice en los ensayos, pero también 
pueden utilizarse otros medios ricos en nutrientes para los cultivos de inóculo. 
Periódicamente se pasan varias plantas jóvenes, de color verde claro, a nuevos 
recipientes de cultivo con medio fresco, aplicando una técnica aséptica. En las condiciones de baja temperatura que se indican, pueden hacerse subcultivos a intervalos de hasta tres meses. 
Para los cultivos deben utilizarse recipientes estériles de vidrio, químicamente 
limpios (lavados con ácido); su manipulación se hará asépticamente. En caso de 
contaminación del cultivo de inóculo, por ejemplo con algas u hongos, se toma ­
rán medidas para eliminar los organismos contaminantes. En relación con las algas y la mayoría de otros organismos contaminantes, esto puede efectuarse 
mediante esterilización superficial. Se toma una muestra del material vegetal 
contaminado y se cortan las raíces. A continuación se agita enérgicamente el material en agua limpia, y después se sumerge en solución de hipoclorito sódico 
al 0,5 % (v/v) durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 5 minutos. 
Seguidamente se enjuaga el material vegetal con agua estéril y se transfiere, en una serie de lotes, a recipientes de cultivo con medio de cultivo fresco. Aunque este tratamiento puede ocasionar la muerte de muchas frondas, especialmente con 
tiempos largos de exposición, algunas de las frondas supervivientes estarán nor ­
malmente libres de contaminación y podrán utilizarse para reinocular nuevos cultivos.
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Apéndice 3  
Medios  
Se recomiendan medios de cultivo distintos para  L. minor  y L. gibba . Para  L. 
minor  se recomienda una modificación del medio de cultivo normal de Suecia 
(SIS), y para  L. gibba , el medio 20X-AAP. A continuación se indican las com ­
posiciones de ambos medios. Para prepararlos deben utilizarse sustancias de 
grado analítico o reactivo y agua desionizada.  
Medio de cultivo normal de Suecia (SIS) para  Lemna  
— Las soluciones madre I a V se esterilizan en autoclave (120 °C, 15 minutos) o 
mediante filtración por membrana (de unos 0,2 μm de diámetro de poro). 
— Las soluciones VI y, en su caso, VII se esterilizan solo mediante filtración 
por membrana; no deben tratarse en autoclave. 
— Las soluciones madre estériles deben conservarse en lugar fresco y oscuro. Las 
soluciones madre I a V pueden conservarse hasta seis meses, mientras que la soluciones VI y, en su caso, VII deben desecharse al cabo de un solo mes.
 
Solución madre 
n o Sustancia Concentración en 
la solución madre 
(g· l  –1 ) Concentración en 
el medio prepa ­
rado (g·l  –1 ) Medio preparado 
Elemento Concentración 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 0,050 0,0050 
0,010 1,00 
0,20 
0,010 0,050 0,0050 
0,010 B 
Mn 
Mo Zn Cu 
Co 0,17 
0,056 
0,0040 0,011 0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA · 2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (tampón) 490 490 — — 
— Para preparar un litro de medio SIS, se añaden los volúmenes siguientes 
a 900 ml de agua desionizada: 
— 10 ml de solución madre I — 5 ml de solución madre II — 5 ml de solución madre III — 5 ml de solución madre IV
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml de solución madre V 
— 5 ml de solución madre VI 
— 1 ml de solución madre VII (opcional).  
Nota:  Con ciertas sustancias problema (véase el último párrafo del punto 1.4) puede ser 
necesaria además la solución madre VII [tampón de ácido 3-(N-morfolino)-pro ­
panosulfónico (MOPS)].  
— El pH se ajusta a 6,5 ± 0,2 con HCl o NaOH 0,1 o 1 M, y el volumen se 
lleva a un litro con agua desionizada.  
Medio de cultivo 20X-AAP  
Las soluciones madre se preparan con agua destilada o desionizada estéril. 
Las soluciones madre estériles deben conservarse en lugar fresco y oscuro. En 
estas condiciones pueden mantenerse durante al menos 6 u 8 semanas. 
Para obtener este medio 20X-AAP se necesitan cinco soluciones madre de nu ­
trientes (A1, A2, A3, B y C), preparadas con sustancias de grado reactivo. A unos 850 ml de agua desionizada se añaden 20 ml de cada solución madre de nutrientes para obtener el medio de cultivo. El pH se ajusta a 7,5 ± 0,1 con HCl 
o NaOH 0,1 o 1 M, y el volumen se lleva a un litro con agua desionizada. 
Después se pasa el medio a un recipiente estéril a través de un filtro de mem ­
brana de unos 0,2 μm. 
El medio de cultivo debe prepararse uno o dos días antes de su utilización en los 
ensayos, a fin de que el pH pueda estabilizarse. Antes de utilizar el medio de 
cultivo, se comprobará su pH y, en caso necesario, se ajustará añadiendo NaOH o HCl 0,1 o 1 M, como se describe más arriba.
 
Solución madre 
n o Sustancia Concentración en 
la solución madre 
(g·l –1 ) (*) Concentración en 
el medio preparado 
(g·l –1 ) (*) Medio preparado 
Elemento Concentración 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 · 6H  2 O 
CaCl  2 · 2H  2 O 26 
12 
4,4 510 
240 
90 Na; N 
Mg 
Ca 190; 84 
58,08 
24,04 
A2 MgSO  4 · 7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 · 3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4; 3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
FeCl  3 · 6H  2 O 
Na 2 EDTA · 2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 · 6H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
CuCl  2 · 2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn 
Co 
Mo Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Salvo que se indique otra cosa.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Nota:  La concentración final teóricamente adecuada de bicarbonato (para evitar un ajuste 
apreciable del pH) es de 15 mg/l, y no de 300 mg/l. Sin embargo, la experiencia con 
el medio 20X-AAP, incluido el ensayo de intercalibración relativo al presente método, se basa en 300 mg/l (I. Sims, P. Whitehouse y R. Lacey (1999). The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. 
R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency).
 
Medio de Steinberg (según ISO 20079)  
Concentraciones y soluciones madre  
— El medio modificado de Steinberg se utiliza según la norma ISO 20079 con  L. 
minor  solo (ya que en esa norma solo se contempla  L. minor ), pero los ensayos 
muestran que pueden obtenerse buenos resultados también con  L. gibba . 
— Para preparar el medio deben utilizarse sustancias de grado analítico o re ­
activo y agua desionizada. 
— A partir de soluciones madre se prepara el medio nutritivo o el medio diez 
veces más concentrado que permite una concentración máxima del medio sin precipitación.
 
Cuadro 1  
Medio de Steinberg con pH estabilizado (modificado según Altenburger)  
Sustancia Medio nutritivo  
Macroelementos  Peso molecular mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Microelementos  Peso molecular μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA disódico · 2H  2 O 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Cuadro 2  
Soluciones madre (macroelementos)  
1. Macroelementos (concentración 50 veces mayor)  g/l  
Solución madre 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Solución madre 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Solución madre 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Cuadro 3  
Soluciones madre (microelementos)  
2. Microelementos (concentración 1 000 veces mayor)  mg/l  
Solución madre 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Solución madre 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Solución madre 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Solución madre 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Solución madre 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA disódico · 2H  2 O 1 500,00 
— Pueden reunirse las soluciones madre 2 y 3 por un lado y, aparte, de la 4 a la 
7 (teniendo en cuenta las concentraciones establecidas). 
— Para poder conservarlas más tiempo, hay que tratar las soluciones madre en 
autoclave a 121 °C durante 20 min o bien someterlas a esterilización por filtración (0,2 μm). Se recomienda vivamente someter la solución madre n
 o 8 
a esterilización por filtración (0,2 μm). 
Preparación de la concentración final de medio de Steinberg (modificado)  
— Se añaden 20 ml de las soluciones madre 1, 2 y 3 (véase el cuadro 2) a unos 
900 ml de agua desionizada para evitar la precipitación. 
— Se añade 1,0 ml de las soluciones madre 4, 5, 6, 7 y 8 (véase el cuadro 3). — El pH debe ser de 5,5 ± 0,2 (se ajusta añadiendo un volumen mínimo de 
solución de NaOH o HCl).
 ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Se completa con agua hasta 1 000 ml. 
— Si las soluciones madres están esterilizadas y se utiliza agua adecuada, no es 
necesario proceder a otra esterilización. Si se efectúa la esterilización del 
medio final, la solución madre n  o 8 se añadirá después del pase por autoclave 
(a 121 °C durante 20 min).  
Preparación del medio de Steinberg (modificado) de concentración 10 veces 
mayor para su conservación intermedia  
— Se añaden 20 ml de las soluciones madre 1, 2 y 3 (véase el cuadro 2) a unos 
30 ml de agua para evitar la precipitación. 
— Se añade 1,0 ml de las soluciones madre 4, 5, 6, 7 y 8 (véase el cuadro 3). Se 
completa con agua hasta 100 ml. 
— Si las soluciones madres están esterilizadas y se utiliza agua adecuada, no es 
necesario proceder a otra esterilización. Si se efectúa la esterilización del medio final, la solución madre n
 o 8 se añadirá después del pase por autoclave 
(a 121 °C durante 20 min). 
— El pH del medio (concentración final) debe ser de 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27.  ENSAYO DE TOXICIDAD PARA QUIRONÓMIDOS EN 
SISTEMAS SEDIMENTO-AGUA CON SEDIMENTO ENRIQUECIDO  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 218 (2004). Está diseñado para evaluar los efectos de la expo ­
sición prolongada de sustancias sobre las larvas del díptero de agua dulce  
Chironomus  sp., que viven en los sedimentos. Se basa en los actuales 
protocolos de ensayo de toxicidad para  Chironomus riparius  y Chironomus 
tentans  que se han elaborado en Europa (1) (2) (3) y en América del Norte 
(4) (5) (6) (7) (8) y se han sometido a ensayos interlaboratorios (1) (6) (9). 
Pueden utilizarse asimismo otras especies de quironómidos bien documen ­
tadas como, por ejemplo,  Chironomus yoshimatsui  (10) (11). 
2. La situación de exposición aplicada en el presente método de ensayo es el 
enriquecimiento del sedimento con la sustancia problema. La selección de la 
situación de exposición adecuada depende de la aplicación que se prevea para el ensayo. La situación de enriquecimiento del sedimento tiene el objetivo de simular niveles acumulados de sustancias que permanecen en 
el sedimento. Este sistema de exposición implica el enriquecimiento del 
sedimento de un sistema de ensayo sedimento-agua. 
3. Las sustancias que tienen que someterse a ensayo respecto a organismos que 
viven en los sedimentos suelen permanecer en este compartimento durante 
largos períodos. Los organismos que viven en los sedimentos pueden estar 
expuestos a través de varias vías de exposición. La importancia relativa de cada vía de exposición, y el tiempo que tarda cada una de ellas en contribuir a los efectos tóxicos generales, dependen de las propiedades fisicoquímicas 
de la sustancia correspondiente. En el caso de las sustancias que se adsorben 
fuertemente (por ejemplo, con log K
 ow > 5) o en el de las sustancias que se 
unen covalentemente con el sedimento, la ingestión de alimentos contami ­
nados puede constituir una vía de exposición significativa. A fin de no 
subestimar la toxicidad de sustancias muy lipofílicas, puede considerarse la adición de alimentos al sedimento antes de aplicar la sustancia problema. Para tener en cuenta todas las vías potenciales de exposición, el presente 
método de ensayo insiste en la exposición a largo plazo. La duración del 
ensayo está en la banda de 20 a 28 días en el caso de  C. riparius  y C. 
yoshimatsui,  y de 28 a 65 días en el de  C. tentans.  Si se necesitan datos a 
un plazo más corto con algún fin específico como, por ejemplo, investigar 
los efectos de una sustancia inestable, es posible retirar réplicas adicionales 
tras un plazo de diez días. 
4. Los parámetros medidos son el número total de adultos que aparecen y el 
tiempo transcurrido hasta su aparición. Se recomienda que las mediciones de 
supervivencia y crecimiento de las larvas no se hagan hasta que hayan 
pasado diez días si se necesitan datos adicionales a corto plazo, utilizando réplicas adicionales cuando convenga. 
5. Se recomienda el uso de sedimentos artificiales, que presentan diversas 
ventajas sobre los sedimentos naturales: 
— se reduce la variabilidad experimental porque se constituye una "matriz 
normalizada" reproducible y desaparece la necesidad de conseguir fuen ­
tes de sedimentos limpios y no contaminados, 
— pueden iniciarse los ensayos en cualquier momento sin problemas de 
variabilidad estacional del sedimento en cuestión, y no es necesario aplicar ningún tratamiento previo al sedimento para eliminar la fauna 
endógena; el uso de un sedimento artificial reduce también el coste 
asociado con la recogida de campo de cantidades suficientes de sedi ­
mentos para los ensayos sistemáticos, 
— el uso de sedimento artificial permite comparar la toxicidad de las sus ­
tancias y clasificarlas en consecuencia. 
6. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
7. Se exponen quironómidos de primer estadio larvario a una serie de concen ­
traciones de la sustancia problema en sistemas sedimento-agua. La sustancia problema se introduce en el sedimento y a continuación se toman larvas del 
primer estadio y se ponen en vasos donde se han estabilizado diferentes 
concentraciones de sedimento y agua. Al final del ensayo se mide la tasa de aparición de adultos y de desarrollo de quironómidos. También es posible medir la supervivencia y el peso de las larvas a los 10 días en caso nece ­
sario, utilizando réplicas adicionales cuando proceda. Estos datos se analizan 
o bien usando un modelo de regresión para estimar la concentración que provocaría una reducción del x % en la aparición de adultos o en la super ­
vivencia o el crecimiento de las larvas (por ejemplo, EC
 15 , EC  50 , etc.), o 
bien realizando contrastes estadísticos de hipótesis para determinar la NOEC/LOEC. Esta última posibilidad exige la comparación de valores de efectos con valores que tienen control, utilizando pruebas estadísticas.
 
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
8. Deben conocerse la hidrosolubilidad de la sustancia problema, su presión de 
vapor, su reparto medido o calculado en el sedimento y su estabilidad en el 
agua y en el sedimento. Para cuantificar la sustancia problema presente en el 
agua sobrenadante, en el agua intersticial y en el sedimento, debe disponerse de un método analítico fiable, cuya precisión y límite de detección sean conocidos y se indiquen. Entre la información útil se incluyen la fórmula 
estructural y la pureza de la sustancia problema. También es útil la infor ­
mación sobre el destino químico de la sustancia problema (por ejemplo, disipación, degradación abiótica y biótica, etc.). En la referencia 12 se ofrece más orientación sobre los ensayos de sustancias con propiedades 
fisicoquímicas que dificultan la realización del ensayo.
 
SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
9. Puede realizarse periódicamente un ensayo con sustancias de referencia, para 
asegurarse de la fiabilidad del protocolo y de las condiciones del ensayo. 
Las siguientes sustancias son ejemplos de tóxicos de referencia utilizados con éxito en estudios interlaboratorios y de validación: lindano, trifluralina, pentaclorofenol, cloruro de cadmio y cloruro de potasio (1) (2) (5) (6) (13).
 
VALIDEZ DEL ENSAYO 
10. Para que el ensayo sea válido deben darse las condiciones siguientes: 
— la aparición de adultos en los controles no ha de ser inferior al 70 % al 
final del ensayo (1) (6), 
— la aparición de adultos de  C. riparius  y C. yoshimatsui  en los recipientes 
de control debe producirse cuando hayan transcurrido entre 12 y 23 días 
desde su introducción en los recipientes; en el caso de  C. tentans  es 
necesario un plazo de entre 20 y 65 días, 
— al final del ensayo deben medirse en cada recipiente el pH y la concen ­
tración de oxígeno disuelto; la concentración de oxígeno debe ser al 
menos el 60 % del valor de saturación en el aire a la temperatura 
aplicada, y el pH del agua sobrenadante debe estar en el rango de 6 a 9 en todos los recipientes de ensayo, 
— la temperatura del agua no debe variar en más de ± 1,0 °C; la tempe ­
ratura del agua podría controlarse mediante un espacio isotérmico y, en 
tal caso, debería confirmarse la temperatura ambiente de ese espacio a 
intervalos apropiados.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Recipientes de ensayo  
11. El estudio se lleva a cabo en vasos de vidrio de 600 ml de capacidad y 8 cm 
de diámetro. Pueden utilizarse otros recipientes que garanticen una altura adecuada de sedimento y de agua sobrenadante. La superficie del sedimento debe ser suficiente para que correspondan de 2 a 3 cm
 2 por larva. La 
proporción de la altura de la capa de sedimento respecto a la altura del 
agua sobrenadante debe ser de 1:4. Los recipientes de ensayo y demás instrumentos que hayan de entrar en contacto con el sistema de ensayo serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte como, 
por ejemplo, teflón.
 
Selección de la especie  
12. La especie que debe usarse preferentemente en el ensayo es  Chironomus 
riparius.  También es adecuada la especie  Chironomus tentans,  pero resulta 
más difícil de manejar y requiere un período de ensayo más largo. Asi ­
mismo es posible utilizar  Chironomus yoshimatsui.  En el apéndice 2 se da 
información sobre los métodos de cultivo de  Chironomus riparius.  También 
se dispone de información sobre las condiciones de cultivo de otras espe ­
cies, como  Chironomus tentans  (4) y  Chironomus yoshimatsui  (11). Hay 
que confirmar la identificación de la especie antes de realizar los ensayos, 
pero no es necesario hacerlo antes de cada ensayo si los organismos pro ­
ceden de un cultivo del propio laboratorio.  
Sedimento  
13. Es preferible utilizar un sedimento artificial (también denominado formula ­
do, reconstituido o sintético). Sin embargo, si se utiliza sedimento natural, 
deben determinarse sus características (al menos, el pH y el contenido de carbono, pero es recomendable incluir otros parámetros, como la relación C/N y la granulometría), y debe estar exento de toda contaminación y de 
otros organismos que pudieran competir con los quironómidos o consumir ­
los. También se recomienda que el sedimento natural, antes de emplearse en un ensayo de toxicidad para quironómidos, se someta durante siete días a las mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo. Se 
recomienda utilizar en este ensayo (1) (15) (16) el siguiente sedimento 
artificial, basado en el suelo artificial empleado en el método de ensayo C.8 (14): 
a) 4-5 % de turba (peso seco), de pH lo más próximo posible a la banda 
5,5-6,0; es importante utilizar turba en forma de polvo, finamente molida (tamaño de partícula ≤ 1 mm) y secada solo al aire; 
b) 20 % de caolín (peso seco), con un contenido de caolinita preferente ­
mente superior al 30 %; 
c) 75-76 % de arena de cuarzo (peso seco); debe predominar la arena fina, 
con más del 50 % de las partículas de un tamaño entre 50 y 200 μm; 
d) agua desionizada añadida para obtener un contenido de humedad en la 
mezcla final el rango de 30 a 50 %; 
e) carbonato de calcio de calidad químicamente pura (CaCO
 3 ) añadido para 
ajustar el pH de la mezcla final del sedimento a 7,0 ± 0,5; el contenido de carbono orgánico de la mezcla final debe ser del 2 % (± 0,5 %), ajustado mediante el empleo de cantidades adecuadas de turba y arena, 
según las letras a) y c). 
14. Debe conocerse el origen de la turba, del caolín y de la arena. Hay que 
comprobar que los componentes del sedimento no presentan contaminación química (por ejemplo, con metales pesados, compuestos organoclorados, 
compuestos organofosforados, etc.). En el apéndice 3 se describe un ejemplo 
de preparación del sedimento artificial. Puede aceptarse también la mezcla de componentes secos si se demuestra que, tras la adición de agua sobre ­
nadante, no se produce separación de los componentes del sedimento (por 
ejemplo, flotación de partículas de turba), y que la turba o el sedimento 
están suficientemente acondicionados.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Agua  
15. Es adecuada como agua de ensayo cualquier agua que se ajuste a las 
características químicas de un agua de dilución aceptable según se indica en los apéndices 2 y 4. Puede utilizarse como agua de cultivo y agua de 
ensayo cualquier agua adecuada, agua natural (superficial o subterránea), 
agua reconstituida (véase el apéndice 2) o agua del grifo desclorada, siempre que los quironómidos sobrevivan en ella durante las fases de cultivo y ensayo sin mostrar signos de presión. Al inicio del ensayo, el pH del 
agua de ensayo debe estar entre 6 y 9 y la dureza total no debe superar 
el valor de 400 mg/l en CaCO
 3 . Sin embargo, si se sospecha interacción 
entre los iones responsables de la dureza y la sustancia problema, debe 
utilizarse agua menos dura (por tanto, en esta situación no debe emplearse 
el medio M4 de Elendt). Debe usarse el mismo tipo de agua a lo largo de todo el estudio. Las características de calidad del agua recogidas en el apéndice 4 deben medirse al menos dos veces al año o cuando se sospeche 
que pueden haber cambiado de forma significativa.
 
Soluciones madre — sedimentos enriquecidos  
16. Los sedimentos enriquecidos a la concentración elegida se preparan por lo 
general añadiendo una solución de la sustancia problema directamente al 
sedimento. La solución madre de la sustancia problema preparada con agua desionizada se mezcla con el sedimento artificial mediante molino de rodi ­
llos, mezcladora de piensos o a mano. Si la sustancia problema es poco 
soluble en agua, puede disolverse en el mínimo volumen posible de un 
disolvente orgánico apropiado (por ejemplo, hexano, acetona o cloroformo). Esta solución se mezcla a continuación con 10 g de arena de cuarzo fina para un solo recipiente de ensayo. Se deja que se evapore el disolvente, que 
tiene que desaparecer totalmente de la arena; después se mezcla la arena con 
la cantidad adecuada de sedimento para un vaso de ensayo. Para solubilizar, dispersar o emulsionar la sustancia problema solo pueden utilizarse agentes que se volatilicen rápidamente. No ha de olvidarse que la arena aportada por 
la mezcla de sustancia problema y arena tiene que tenerse en cuenta a la 
hora de preparar el sedimento (es decir, el sedimento debe prepararse en ­
tonces con menos arena). Debe velarse por que la sustancia problema aña ­
dida al sedimento se distribuya de forma total y homogénea por el sedimen ­
to. En caso necesario, deben analizarse submuestras para determinar el grado 
de homogeneidad.
 
DISEÑO DEL ENSAYO 
17. El diseño del ensayo se refiere a la selección del número de concentraciones 
de ensayo y al intervalo entre las mismas, al número de recipientes por concentración y al número de larvas por recipiente. Se describen los diseños 
para la estimación puntual de la EC y de la NOEC, así como para realizar 
un ensayo límite.
 
Diseño para análisis de regresión  
18. La concentración con efecto (por ejemplo, EC  15 , EC  50 ) y el rango de con ­
centraciones en la que resulta interesante el efecto de la sustancia problema, tienen que estar abarcadas entre las concentraciones incluidas en el ensayo. En general, la exactitud y, sobre todo, la validez con la que pueden hacerse 
las estimaciones de las concentraciones con efecto (EC
 x ) mejoran cuando la 
concentración con efecto se encuentra dentro del rango de concentraciones ensayadas. Debe evitarse extrapolar muy por debajo de la menor concen ­
tración positiva o por encima de la concentración máxima. Es conveniente 
efectuar previamente un ensayo para seleccionar el rango de concentraciones 
que se deba utilizar (véase el punto 27).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Si ha de estimarse la EC  x , deben someterse a ensayo al menos cinco con ­
centraciones y tres réplicas por cada concentración. En cualquier caso, es 
recomendable utilizar suficientes concentraciones de ensayo para poder ha ­
cer una buena estimación del modelo. El factor entre concentraciones no sebe ser mayor que dos (puede permitirse una excepción en los casos en que 
la pendiente de la curva dosis-respuesta sea poco pronunciada). El número 
de réplicas de cada tratamiento puede reducirse si aumenta el número de concentraciones de ensayo con diferentes respuestas. El aumento del número de réplicas o la reducción del tamaño del intervalo entre concentraciones de 
ensayo tiende a estrechar los intervalos de confianza del ensayo. Si se han 
de estimar la supervivencia y el crecimiento de las larvas a los 10 días, es necesario emplear réplicas adicionales.
 
Diseño para estimar una NOEC/LOEC  
20. Si hay que estimar la LOEC y/o la NOEC, se deben emplear cinco concen ­
traciones de ensayo con un mínimo de cuatro réplicas y el factor entre concentraciones no debe exceder de dos. El número de réplicas debe ser 
suficiente para garantizar una potencia estadística adecuada que permita 
detectar una diferencia del 20 % respecto al control con un nivel de signi ­
ficación del 5 % (p = 0,05). Respecto a la tasa de desarrollo, suele ser adecuado un análisis de la varianza (ANOVA), como el ensayo de Dunnett 
o el de Williams (17) (18) (19) (20). Para la tasa de aparición, pueden 
emplearse el método de Cochran-Armitage, la prueba exacta de Fisher (con la corrección de Bonferroni), o el método de Mantel-Haenszel.
 
Ensayo límite  
21. Puede llevarse a cabo un ensayo límite (una sola concentración de ensayo y 
un control) si no se han observado efectos en el ensayo previamente efec ­
tuado para seleccionar el rango de concentraciones. La finalidad del ensayo 
límite es someter a ensayo una concentración suficientemente elevada como 
para permitir a los responsables excluir cualquier efecto tóxico de la sus ­
tancia problema, y el límite se establece a una concentración que no se espera encontrar en la realidad en ninguna situación. Se recomienda la 
concentración de 1 000 mg/kg (peso seco). Generalmente hacen falta al 
menos seis réplicas tanto de las unidades de tratamiento como de las de control. Debe demostrarse una potencia estadística adecuada que permita detectar una diferencia del 20 % respecto al control con un nivel de signi ­
ficación del 5 % (p = 0,05). Con una respuesta métrica (tasa de desarrollo y 
peso), la prueba t es un método estadístico adecuado si los datos cumplen los requisitos de esta prueba (normalidad, varianzas homogéneas). Si estos requisitos no se satisfacen, puede utilizarse la prueba t de varianzas desi ­
guales o una prueba no paramétrica, tal como la de Wilcoxon-Mann-Whit ­
hey. En relación con la tasa de aparición de adultos es adecuada la prueba exacta de Fisher.
 
PROCEDIMIENTO  
Condiciones de exposición  
Preparación del sistema sedimento enriquecido-agua  
22. El procedimiento de enriquecimiento descrito en el método de ensayo C.8. 
Toxicidad para gusanos de tierra es el recomendado para su aplicación a la 
sustancia problema (14). Los sedimentos enriquecidos se colocan en los recipientes y se añade agua sobrenadante para conseguir una relación de volumen sedimento-agua de 1:4 (véanse los puntos 11 y 15). La altura de la 
capa de sedimento debe estar entre 1,5 y 3 cm. Para evitar que se separen 
los ingredientes del sedimento y se resuspendan las partículas finas durante la adición del agua de ensayo a la columna de agua, puede cubrirse el sedimento con un disco de plástico mientras se vierte el agua encima, y 
retirar el disco inmediatamente a continuación. Puede ser adecuado también 
utilizar otros dispositivos. 
23. Los recipientes de ensayo tienen que estar cubiertos (por ejemplo, con 
placas de vidrio). Cuando sea necesario, manténgase durante el estudio el volumen de agua inicial añadiendo agua para compensar la evaporación de 
esta. Para esta operación debe utilizarse agua destilada o desionizada a fin 
de evitar la formación de sales.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Estabilización  
24. Una vez preparado el sedimento enriquecido con el agua sobrenadante, es 
conveniente dejar que la sustancia problema se reparta pasando de la fase acuosa al sedimento (3) (4) (6) (13). Esto debe efectuarse de preferencia en 
las mismas condiciones de temperatura y aireación que el ensayo. El tiempo 
adecuado para el equilibrado depende de la sustancia y del sedimento, y puede ser del orden de horas o de días, aunque en ciertos casos raros puede llegar a ser de varias semanas (4 o 5 semanas). Como esto daría ocasión 
para la degradación de muchas sustancias, no se espera hasta alcanzar el 
equilibrio completo, sino que se recomienda un período de equilibrado de 48 h. Al final de este período de equilibrado, debe medirse la concentración 
de la sustancia problema en el agua sobrenadante, en el agua intersticial y en 
el sedimento, al menos a la concentración más elevada y a una inferior (véase el punto 38). Estas determinaciones analíticas de la sustancia pro ­
blema permiten el cálculo del balance de masas y la expresión de los 
resultados sobre la base de las concentraciones medidas.
 
Adición de los organismos de ensayo  
25. Cuatro o cinco días antes de añadir los organismos de ensayo a los reci ­
pientes de ensayo, deben tomarse de los cultivos masas de huevos y poner ­
las en recipientes pequeños con medio de cultivo. Puede utilizarse medio 
viejo del cultivo madre o medio recién preparado. Si se utiliza este último, debe añadírsele una pequeña cantidad de alimento como, por ejemplo, algas verdes o unas gotitas de filtrado de una suspensión finamente molida de 
alimento para peces en copos (véase el apéndice 2). Solo deben utilizarse 
masas de huevos recién puestas. Normalmente, las larvas empiezan a salir de los huevos un par de días después de la puesta (de 2 a 3 días en el caso de Chironomus riparius  a 20 °C y de 1 a 4 días en el de  Chironomus 
tentans  a 23 °C y en el de  Chironomus yoshimatsui  a 25 °C) y el creci ­
miento de las larvas tiene lugar en cuatro fases, cada una de entre 4 y 8 días de duración. En el ensayo deben utilizarse larvas de primera fase (2-3 o 1-4 días tras la eclosión). La fase de los animales puede comprobarse midiendo 
la anchura de la cápsula cefálica (6). 
26. Se asignan aleatoriamente veinte larvas de primera fase a cada recipiente de 
ensayo que contenga el sedimento enriquecido y el agua, utilizando una 
pipeta de punta roma. Es necesario detener la aireación del agua mientras se ponen las larvas en los recipientes de ensayo y mantener la situación durante otras 24 horas tras la adición de las larvas (véanse los puntos 25 y 
32). Según el diseño de ensayo empleado (véanse los puntos 19 y 20), el 
número de larvas utilizadas por concentración es de al menos 60 para la estimación puntual de la ECx y de 80 para la determinación de la NOEC.
 
Concentraciones de ensayo  
27. Puede ser útil efectuar un ensayo preliminar para determinar el rango de 
concentraciones adecuadas para el ensayo definitivo. Con este fin se utiliza una serie de concentraciones de la sustancia problema, muy diferentes entre sí. A fin de proporcionar la misma densidad superficial por quironómido que 
se vaya a emplear para el ensayo definitivo, se exponen los quironómidos a 
cada concentración de la sustancia problema durante un plazo que permita la estimación de las concentraciones de ensayo adecuadas, y no hace falta utilizar réplicas. 
28. Las concentraciones de ensayo para el ensayo definitivo se deciden sobre la 
base del resultado del ensayo de determinación del rango de concentracio ­
nes. Deben utilizarse al menos cinco concentraciones y seleccionarse como 
se describe en los puntos 18 a 20.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Controles  
29. Deben incluirse en el ensayo, con el número adecuado de réplicas, recipien ­
tes de control sin sustancia problema pero con sedimento (véanse los puntos 19-20). Si se ha utilizado algún disolvente para aplicar la sustancia problema 
(véase el punto 16), debe añadirse un control del disolvente en el sedimento.
 
Sistema de ensayo  
30. Se emplean sistemas estáticos. Pueden utilizarse en casos excepcionales 
sistemas semiestáticos o dinámicos con renovación intermitente o continua del agua sobrenadante, como, por ejemplo, si las especificaciones de calidad del agua se hacen inadecuadas para el organismo de ensayo o afectan al 
equilibrio químico (por ejemplo, cuando los niveles de oxígeno disuelto 
caen demasiado, la concentración de excrementos se eleva demasiado, o se lixivian minerales del sedimento con modificación del pH y/o de la dureza del agua). Sin embargo, normalmente será suficiente y preferible 
emplear otros métodos de mejora de la calidad del agua sobrenadante, 
como la aireación.
 
Alimentación  
31. Es necesario alimentar a las larvas, de preferencia una vez al día o, al 
menos, tres veces por semana. Parece adecuada una ración diaria de comida para peces (suspensión en agua o comida finamente molida como, por ejemplo, Tetra-Min o Tetra-Phyll; véanse detalles en el apéndice 2), de 
0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg para  C. yoshimatsui ) por larva durante los 10 
primeros días. Las larvas de más edad pueden necesitar algo más de comida: entre 0,5 y 1 mg por larva al día debería ser suficiente durante el resto del ensayo. La ración alimentaria debe reducirse en todos los tratamientos y 
controles si se observa crecimiento de hongos o si se aprecia mortalidad en 
los controles. Si no puede detenerse el desarrollo fúngico, hay que repetir el ensayo. Cuando se someten a ensayo sustancias muy adsorbentes (por ejem ­
plo, con log K
 ow > 5), o hay sustancias que se unen covalentemente al 
sedimento, es posible añadir al sedimento artificial, antes del período de 
estabilización, la cantidad de comida necesaria para garantizar la supervi ­
vencia y el crecimiento natural de los organismos. Con este objetivo, debe utilizarse material vegetal en lugar de la comida para peces, por ejemplo, 
adición de 0,5 % (peso seco) de hojas finamente molidas de ortiga mayor 
(Urtica dioica ), morera ( Morus alba ), trébol blanco ( Trifolium repens ), 
espinaca ( Spinacia oleracea ) u otro material vegetal ( Cerophyl  o 
alfa-celulosa).
 
Condiciones de incubación  
32. Se aporta aireación suave al agua sobrenadante de los recipientes de ensayo, 
preferentemente a las 24 h de la adición de las larvas, y se continúa a lo 
largo de todo el ensayo (debe tenerse cuidado para que la concentración de oxígeno disuelto no caiga por debajo del 60 % del valor de saturación en el aire). La aireación se aporta mediante una pipeta Pasteur de vidrio fijada a 
2-3 cm por encima del nivel del sedimento, con el ritmo de una o unas 
pocas burbujas por segundo. Cuando se sometan a ensayo sustancias volá ­
tiles, debe considerarse el no airear el sistema sedimento-agua. 
33. El ensayo se efectúa a la temperatura constante de 20 °C (± 2 °C). En el 
caso de  C. tentans  y de  C. yoshimastsui,  las temperaturas recomendadas son 
de 23 °C y 25 °C (± 2 °C), respectivamente. Se usa un fotoperíodo de 16 h, 
con una intensidad luminosa de 500 a 1 000 lux.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Duración de la exposición  
34. La exposición comienza con la adición de larvas a los recipientes con 
sedimento enriquecido y a los de control. La duración máxima del ensayo es de 28 días en el caso de  C. riparius  y C. yoshimatsui,  y de 65 días en el 
de C. tentans.  Si los dípteros aparecen antes, es posible terminar el ensayo 
tras un mínimo de cinco días desde la aparición del último adulto en los recipientes de control.
 
Observaciones  
Aparición de adultos  
35. Se determinan el tiempo de desarrollo y el número total de dípteros machos 
y hembras que aparecen completamente. Los machos se identifican fácil ­
mente por sus antenas plumosas. 
36. Hay que observar los recipientes de ensayo al menos tres veces por semana 
para hacer una evaluación visual de los eventuales comportamientos anor ­
males (por ejemplo, dejar el sedimento, nadar de forma inusual) respecto al 
control. Durante el tiempo en que se prevea que ha de ocurrir la aparición es 
necesario efectuar un recuento diario de los dípteros aparecidos. Se registran cada día el sexo y el número de los dípteros aparecidos completamente. Tras 
su identificación, se sacan los dípteros de los recipientes. Las eventuales 
masas de huevos puestas antes de la terminación del ensayo deben anotarse y después retirarse para evitar la reintroducción de larvas en el sedimento. También debe registrarse el número de pupas visibles de las que no han 
llegado a aparecer adultos. En el apéndice 5 se dan orientaciones sobre la 
medición de la aparición de los dípteros.
 
Crecimiento y supervivencia  
37. Si han de proporcionarse datos sobre la supervivencia y el crecimiento de 
larvas a los 10 días, deben incluirse desde el principio recipientes de ensayo 
adicionales, de forma que puedan utilizarse después. El sedimento de estos recipientes adicionales se filtra a través de un tamiz de 250 μm para retener 
las larvas. Los criterios para determinar la muerte son la inmovilidad o la 
ausencia de reacción ante un estímulo mecánico. Las larvas no recuperadas 
deben contarse asimismo como muertas (las larvas que hayan muerto al inicio del ensayo pueden haber sido degradadas por los microbios). Se determina el peso seco (libre de cenizas) de las larvas supervivientes por 
recipiente de ensayo y se calcula el peso seco individual medio por reci ­
piente. Es útil determinar a qué fase pertenecen las larvas supervivientes; para obtener este dato puede utilizarse la medición de la anchura de la cápsula cefálica de cada individuo.
 
Mediciones analíticas  
Concentración de la sustancia problema  
38. Antes de iniciar el ensayo (es decir, la adición de las larvas), se toman 
muestras de sedimento de al menos un recipiente por tratamiento para la determinación analítica de la concentración de la sustancia problema en el 
sedimento. Se recomienda que, como mínimo, se analicen muestras del agua 
sobrenadante, del agua intersticial y del sedimento al inicio (véase el punto 24) y al final del ensayo, a la concentración máxima y a una inferior. Estas determinaciones de la concentración de la sustancia problema infor ­
man sobre el comportamiento y el reparto de la sustancia problema en el 
sistema agua-sedimento. 
39. Cuando se hagan mediciones intermedias (por ejemplo, el día n
 o 7) y si los 
análisis necesitan grandes muestras que no puedan tomarse de los recipien ­
tes de ensayo sin influir en el sistema de ensayo, las determinaciones ana ­
líticas deben llevarse a cabo con muestras de recipientes de ensayo adicio ­
nales tratados de la misma manera (incluida la presencia de los organismos 
de ensayo) pero que no se utilizan para las observaciones biológicas.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. El procedimiento recomendado para aislar el agua intersticial es la centrifu ­
gación, por ejemplo a 10 000 g y 4 °C durante 30 min. Sin embargo, si se 
demuestra que la sustancia problema no se adsorbe a los filtros, también puede aceptarse la filtración. En algunos casos puede resultar imposible analizar las concentraciones en el agua intersticial debido a que el tamaño 
de la muestra es demasiado pequeño.
 
Parámetros fisicoquímicos  
41. Deben medirse de la manera adecuada el pH y la temperatura de los reci ­
pientes de ensayo (véase el punto 10). Hay que medir la dureza y el amoníaco en los controles y en un recipiente de ensayo a la concentración máxima, al inicio y al final del ensayo.
 
DATOS E INFORME  
Tratamiento de los resultados  
42. El objetivo de este ensayo es determinar el efecto de la sustancia comple ­
tamente sobre la tasa de desarrollo y el número total de dípteros machos y 
hembras totalmente aparecidos o, en el caso de los efectos del ensayo de 10 
días, sobre la supervivencia y el peso de las larvas. Si no hay ninguna señal de sensibilidades estadísticamente diferentes según los sexos, a efectos de 
análisis estadísticos pueden agruparse los resultados de machos y de hem ­
bras. Las diferencias de sensibilidad entre los sexos pueden evaluarse esta ­
dísticamente mediante, por ejemplo, una prueba de tabla de contingencia de χ
 2 -r × 2. Cuando así se requiera, habrá que determinar la supervivencia de 
las larvas y su peso seco individual medio por recipiente al cabo de 10 días. 
43. Las concentraciones que tienen efecto, expresadas en peso seco y sobre la 
base de este, se calculan preferentemente a partir de las concentraciones medidas en el sedimento al inicio del ensayo (véase el punto 38). 
44. A efectos de computar una estimación puntual para la EC
 50 o cualquier otra 
EC x , las estadísticas por recipiente pueden utilizarse como réplicas verda ­
deras. Al calcular el intervalo de confianza para cualquier EC  x , debe tenerse 
en cuenta la variabilidad entre recipientes, o bien hay que mostrar que esta 
variabilidad es tan pequeña que puede despreciarse. Cuando el modelo sigue el método de los mínimos cuadrados, debe aplicarse una transformación estadística por cada recipiente a fin de mejorar la homogeneidad de la 
varianza. Sin embargo, los valores de EC
 x deben calcularse después de 
haber vuelto a transformar la respuesta al valor original. 
45. Cuando el análisis estadístico se dirige a determinar la NOEC/LOEC me ­
diante contrastes de hipótesis, es necesario tener en cuenta la variabilidad 
entre recipientes, por ejemplo mediante un análisis de varianza anidado. También puede ser adecuado realizar ensayos más robustos (21) en situa ­
ciones en que no se cumplen las hipótesis de los análisis de varianza 
usuales.
 
Tasa de aparición  
46. Las tasas de aparición son datos cuantales y pueden ser analizados por el 
método de Cochran-Armitage aplicado con ajuste secuencial de residuos cuando se prevé una relación dosis-respuesta monótona y estos datos son coherentes con dicha previsión. En caso contrario, puede utilizarse una 
prueba exacta de Fisher o el método de Mantel-Haenszel con los valores 
p ajustados según Bonferroni-Holm. Si hay pruebas de que la variabilidad entre réplicas dentro de la misma concentración es mayor de lo que indicaría una distribución binomial (lo que se señala generalmente como variación 
"extrabinomial"), hay que utilizar un método de Cochran-Armitage o una 
prueba exacta de Fisher robustos (como se propone en el punto 21).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Se determina la suma de dípteros aparecidos por recipiente, n  e , y se divide 
por el número de larvas introducidas, n  a : 
ER ¼ n e 
n a 
donde:  
ER = tasa de aparición  
n e = número de dípteros aparecidos por recipiente  
n a = número de larvas introducidas por recipiente 
47. Otra posibilidad más adecuada para las muestras de gran tamaño, cuando 
hay variación extrabinomial, consiste en tratar la tasa de aparición como una respuesta continua y emplear procedimientos tales como la prueba de Wi ­
lliams cuando se prevé una relación dosis-respuesta monótona y es cohe ­
rente con estos datos de tasa de aparición. La prueba de Dunnett sería apropiada si no se mantuviera la monotonía. Se define aquí como muestra 
de gran tamaño la que corresponde a la situación en que tanto el número de 
dípteros emergidos como el número de no emergidos es superior a cinco, por réplica (recipiente). 
48. Para aplicar los métodos de análisis de la varianza, hay que transformar 
primero los valores de tasa de aparición mediante la transformación arco ­
seno de la raíz cuadrada o la transformación de Freeman-Tukey para obtener una distribución normal aproximada y uniformizar las varianzas. Cuando se 
usan las frecuencias absolutas es posible aplicar el método de 
Cochran-Armitage, la prueba exacta de Fisher (Bonferroni), o el método de Mantel-Haenszel. La transformación arcoseno de la raíz cuadrada se aplica tomando el arcoseno (sen
 -1 ) de la raíz cuadrada de la tasa de apari ­
ción. 
49. Respecto a las tasas de aparición, los valores de EC  x se calculan mediante 
análisis de regresión [o, por ejemplo, probit (22), logit, Weibull, programas 
comerciales apropiados, etc.]. Si no sirve el análisis de regresión (por ejem ­
plo, cuando hay menos de dos respuestas parciales), se utilizan otros méto ­
dos no paramétricos, tales como la media móvil o la interpolación simple).  
Tasa de desarrollo  
50. El tiempo de desarrollo medio corresponde al intervalo medio de tiempo 
entre la introducción de las larvas (día 0 del ensayo) y la aparición de la cohorte experimental de dípteros (para el cálculo del tiempo de desarrollo verdadero debe tenerse en cuenta la edad de las larvas en el momento de su 
introducción). La tasa de desarrollo es la inversa del tiempo de desarrollo 
(unidades: 1/día) y corresponde a la porción de desarrollo larvario que se produce en un día. Es preferible utilizar la tasa de desarrollo para evaluar estos estudios de toxicidad en los sedimentos, ya que su varianza es menor y 
es más homogénea y próxima a la distribución normal que el tiempo de 
desarrollo. Por tanto, pueden usarse procedimientos de ensayos paramétricos más potentes con la tasa de desarrollo que con el tiempo de desarrollo. 
Considerando a la tasa de desarrollo como respuesta continua, es possible 
estimar valores de EC
 x mediante análisis de regresión [por ejemplo, (23), 
(24)]. 
51. En relación con las siguientes pruebas estadísticas, se supone que el número 
de dípteros observados en el día de inspección x ha aparecido a la media del intervalo de tiempo entre el día x y el día x - l (l = longitud del intervalo de inspección, que es normalmente de 1 día). La tasa de desarrollo media por 
recipiente ( x) se calcula con ayuda de la siguiente fórmula:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
donde:  
x: tasa de desarrollo media por recipiente, 
i: índice del intervalo de inspección, 
m: número máximo de intervalos de inspección,  
ƒ i : número de dípteros aparecidos en el intervalo de inspección i, 
n e : número total de dípteros aparecidos al final del experimento (=  P ƒ i ), 
x i : tasa de desarrollo de los dípteros aparecidos en el intervalo i, 
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
donde: 
day  i : día de inspección (días desde la aplicación), 
l i : longitud del intervalo de inspección i (en días, generalmente 1 día).  
Informe del ensayo  
52. El informe del ensayo debe dar, como mínimo, la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (hidrosolu ­
bilidad, presión de vapor, coeficiente de reparto en el suelo (o en el sedimento, si se conoce), estabilidad en el agua, etc.). 
— Datos de identificación química (nombre común, nombre químico, fór ­
mula estructural, número CAS, etc.), incluida la pureza y el método de análisis cuantitativo de la sustancia problema.  
Especie de ensayo:  
— Animales utilizados en el ensayo: especie, nombre científico, origen de 
los organismos y condiciones de cría. 
— Información sobre la manipulación de las masas de huevos y de las 
larvas. 
— Edad de los animales de ensayo cuando se introducen en los recipientes 
de ensayo.  
Condiciones de ensayo:  
— Sedimento utilizado, es decir, si es natural o artificial. 
— En el caso del sedimento natural, ubicación y descripción del lugar de 
muestreo del sedimento, incluyendo, si se puede, un historial de la contaminación; características: pH, contenido de carbono orgánico, rela ­
ción C/N y granulometría (cuando sea apropiado). 
— Preparación del sedimento artificial: ingredientes y características (con ­
tenido de carbono orgánico, pH, humedad, etc., al inicio del ensayo). 
— Preparación del agua de ensayo (si se utiliza agua reconstituida) y ca ­
racterísticas (concentración de oxígeno, pH, conductividad, dureza, etc., al inicio del ensayo). 
— Altura del sedimento y del agua sobrenadante. 
— Volumen del agua sobrenadante y del agua intersticial, peso del sedi ­
mento húmedo con y sin agua intersticial.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— Recipientes de ensayo (material y tamaño). 
— Método para enriquecer el sedimento: concentraciones de ensayo utili ­
zadas, número de réplicas y empleo eventual de disolvente. 
— Fase de estabilización (equilibrado) del sistema sedimento enriquecido – 
agua: duración y condiciones. 
— Condiciones de incubación: temperatura, intensidad y ciclo de luz, ai ­
reación (frecuencia e intensidad). 
— Información detallada sobre la alimentación de los animales, incluidos el 
tipo de alimento, la preparación, la cantidad y el régimen alimentario.  
Resultados:  
— Concentraciones de ensayo nominales, concentraciones de ensayo medi ­
das y resultados de todos los análisis efectuados para determinar la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo. 
— Calidad del agua de los recipientes de ensayo, es decir, pH, temperatura, 
oxígeno disuelto, dureza y amoníaco. 
— Sustitución del agua de ensayo evaporada, en su caso. 
— Número de dípteros machos y hembras aparecidos por recipiente y por 
día. 
— Número de larvas que no han aparecido como dípteros por recipiente. 
— Peso seco individual medio de las larvas por recipiente, y por fase, en 
caso apropiado. 
— Porcentaje de apariciones por réplica y concentración de ensayo (sin 
distinguir entre dípteros machos y hembras). 
— Tasa de desarrollo media de los dípteros aparecidos completamente por 
réplica y tasa de tratamiento (sin distinguir entre dípteros machos y hembras). 
— Estimación de los parámetros de toxicidad como, por ejemplo, EC
 x (con 
intervalos de confianza asociados), NOEC y/o LOEC, y métodos esta ­
dísticos empleados para su determinación. 
— Discusión de los resultados del ensayo, incluida la eventual influencia 
que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de ensayo.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. 
(2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. 
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Works ­
hop held in the Netherlands. 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the To ­
xicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp. 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; 
Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. 
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus 
riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Se ­
cond edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates. 
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae 
(Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. 
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57. 
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of To ­
xicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference 
Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 
(14) Método de ensayo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de 
tierra. 
(15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175. 
(16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 
3291-3303. 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. 
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482-491. 
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103-117. 
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510-531. 
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48: 577-585. 
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. 
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling conti ­
nuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485- 1494. 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES 
A efectos del presente método de ensayo, aplicarán las siguientes definiciones:  
Sedimento artificial  (o sedimento reconstituido, formulado o sintético): una 
mezcla de materiales empleada para imitar los componentes físicos de un sedi ­
mento natural.  
Agua sobrenadante:  el agua situada sobre el sedimento en el recipiente de 
ensayo.  
Agua intersticial:  el agua que ocupa el espacio entre el sedimento y las partí ­
culas del suelo.  
Sedimento enriquecido:  el sedimento al que se ha añadido sustancia problema.  
Sustancia problema:  toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este mé ­
todo de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Apéndice 2  
Recomendaciones para el cultivo de  Chironomus riparius  
1. Las larvas de  Chironomus  pueden criarse en cristalizadores o en recipientes 
más grandes. Sobre el fondo del recipiente se extiende arena de cuarzo fina, en una capa delgada de unos 5 a 10 mm de espesor. Se ha comprobado que la tierra de diatomeas (por ejemplo, Merck, Art 8117) también constituye un 
sustrato adecuado (es suficiente una capa más fina, de muy pocos milíme ­
tros). A continuación se añade agua adecuada hasta una altura de varios centímetros. Los niveles deben mantenerse rellenando con agua en la me ­
dida necesaria para compensar las pérdidas por evaporación y evitar la 
desecación. En caso necesario, es posible sustituir el agua. Debe aportarse 
una aireación suave. Los recipientes de cría de las larvas deben mantenerse en una jaula adecuada para evitar que se escapen los adultos que aparezcan. La jaula debe ser lo suficientemente grande como para permitir el enjam ­
brado de los adultos aparecidos, ya que en caso contrario puede que no haya 
copulación (las dimensiones mínimas son de unos 30 × 30 × 30 cm). 
2. Las jaulas deben mantenerse a temperatura ambiente o en una zona de 
ambiente constante a 20 ± 2 °C con un fotoperíodo de 16 horas de luz (de intensidad alrededor de 1 000 lux) y 8 horas de oscuridad. Se ha co ­
municado que una humedad relativa del aire de menos del 60 % puede 
impedir la reproducción.
 
Agua de dilución  
3. Puede emplearse cualquier agua natural o sintética que sea adecuada. Se 
suelen utilizar agua de pozo, agua del grifo desclorada y medios artificiales (como, por ejemplo, medio M4 o M7 de Elendt, véase más abajo). Es 
necesario airear el agua antes de emplearla. En caso necesario, el agua de 
cultivo puede renovarse sacando cuidadosamente, por vertido o con sifón, el agua usada de los recipientes de cultivo, sin destruir los tubos de las larvas.
 
Alimentación de las larvas  
4. Las larvas de  Chironomus  deben alimentarse con comida para peces en 
copos (Tetra Min  ® , Tetra Phyll  ® u otra marca similar de comida comercial 
para peces), al ritmo de aproximadamente 250 mg por recipiente al día. Puede administrarse como polvo molido seco o como suspensión en agua: se añade 1,0 g de comida en copos a 20 ml de agua de dilución y se mezcla 
para obtener un resultado homogéneo. Esta preparación puede administrarse 
al ritmo de unos 5 ml por recipiente al día y ha de agitarse antes de usarse. Las larvas más viejas pueden recibir más cantidad. 
5. La alimentación se ajusta según la calidad del agua. Si el medio de cultivo 
se pone turbio, hay que reducir la alimentación. Es necesario supervisar cuidadosamente la adición de comida. Si la comida es demasiado escasa, se provocará la emigración de las larvas hacia la columna de agua, mientras 
que si es excesiva aumentará la actividad microbiana y se reducirá la con ­
centración de oxígeno. Ambas situaciones pueden producir un descenso de la tasa de crecimiento. 
6. Es posible añadir también algunas células de algas verdes (como, por ejem ­
plo, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris ) cuando se establecen 
recipientes de cultivo nuevos.
 
Alimentación de los adultos aparecidos  
7. Algunos experimentadores han sugerido que un disco de algodón empapado 
en una solución saturada de sacarosa puede servir de alimento para los 
adultos aparecidos.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Aparición de adultos  
8. A 20 ± 2 °C, los adultos empiezan a aparecer en los recipientes de cría de 
larvas a los 13-15 días aproximadamente. Los machos se distinguen fácil ­
mente porque tienen antenas plumosas.  
Masas de huevos  
9. Una vez haya adultos en la jaula de cría, deben supervisarse todos los 
recipientes de cría de larvas tres veces por semana para observar la puesta 
de masas gelatinosas de huevos. Cuando se encuentren, las masas de huevos deben retirarse cuidadosamente y transferirse a una pequeña placa que con ­
tenga una muestra del agua de cría. Las masas de huevos se emplean para 
iniciar un nuevo recipiente de cultivo (por ejemplo, 2-4 masas de huevos 
por recipiente) o para los ensayos de toxicidad. 
10. Las larvas en primer estadio deben salir de los huevos al cabo de 2 – 3 días.
 
Establecimiento de nuevos recipientes de cultivo  
11. Cuando se hayan establecido los cultivos, debe ser posible establecer un 
nuevo recipiente de cultivo de larvas cada semana o con menos frecuencia, según los requisitos de cultivo, eliminando los recipientes más viejos una 
vez han aparecido los dípteros adultos. Con este sistema, se obtendrá un 
suministro regular de adultos, con una gestión mínima.
 
Preparación de las soluciones de ensayo M4 y M7  
12. Elendt (1990) describió el medio M4. El M7 se prepara como el medio M4, 
salvo en lo relativo a las sustancias indicadas en el cuadro 1, cuyas concen ­
traciones son cuatro veces más bajas en el medio M7 que en el M4. Se está preparando una publicación sobre el medio M7 (Elendt, comunicación per ­
sonal). La solución de ensayo no debe prepararse siguiendo a Elendt y Bias 
(1990), ya que no son adecuadas las concentraciones de NaSiO
 3 5 H  2 O, 
NaNO  3 , KH  2 PO 4 y K  2 HPO  4 dadas para la preparación de las soluciones 
madre.  
Preparación del medio M7  
13. Las soluciones madre (I) se preparan por separado cada una y a partir de 
ellas se prepara una solución madre combinada (II) (véase el cuadro 1). Se 
toman 50 ml de la solución madre combinada (II) junto con las cantidades de solución madre de cada macronutriente que se dan en el cuadro 2 y se llevan a 1 litro con agua desionizada para preparar el medio M7. Se prepara 
una solución madre de vitaminas añadiendo tres vitaminas a agua desioni ­
zada como se indica en el cuadro 3, y se añaden al medio M7 final 0,1 ml de la solución madre de vitaminas combinadas, poco antes de su empleo (la solución madre de vitaminas se conserva congelada en pequeñas partes 
alícuotas). El medio se airea y se estabiliza.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius:  Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Cuadro 1  
Soluciones madre de oligoelementos para los medios M4 y M7  
Soluciones madre (I) Cantidad (mg) 
enrasada a 1 litro 
con agua desio ­
nizada Para preparar la solución madre 
combinada (II): mezclar las siguien ­
tes cantidades (ml) de soluciones 
madre (I) y enrasar a 1 litro con 
agua desionizada Concentraciones finales en las 
soluciones de ensayo (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Estas sustancias difieren en M4 y M7, como se indica más arriba. 
( 2 ) Estas soluciones se preparan por separado y después se juntan y se pasan por el autoclave inmediatamente.  
Cuadro 2  
Soluciones madre de macronutrientes para los medios M4 y M7  
Cantidad enrasada a 1 
litro con agua desioni ­
zada 
(mg) Cantidad de soluciones 
madre de macronutrientes 
añadida para preparar los 
medios M4 y M7 
(ml/l) Concentraciones fina ­
les en las soluciones 
de ensayo de M4 y 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Cuadro 3  
Solución madre de vitaminas para los medios M4 y M7. Las tres soluciones de vitaminas se 
combinan para formar una única solución madre de vitaminas  
Cantidad enrasada a 1 
litro con agua desioni ­
zada 
(mg) Cantidad de solución madre 
de vitaminas añadida para 
preparar los medios M4 y M7 
(ml/l) Concentraciones finales 
en las soluciones de en ­
sayo de M4 y M7 
(mg/l)  
Clorhidrato de tiamina 750 0,1 0,075 
Cianocobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 Biotina 7,5 0,1 0,00075
 
BIBLIOGRAFÍA:  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25- 
33. 
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna. Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Apéndice 3  
PREPARACIÓN DEL SEDIMENTO ARTIFICIAL  
Composición del sedimento  
La composición del sedimento artificial debe ser la siguiente:  
Componente Características % de sedimento 
en peso seco  
Turba Turba esfágnea, de pH lo 
más próximo posible a 5,5- 
6,0, sin restos vegetales visi ­
bles, finamente molida (ta ­
maño de partícula ≤ 1 mm) 
y secada al aire 4 - 5 
Arena de cuarzo Granulometría: > 50 % de las 
partículas deben encontrarse 
en la banda de 50-200 μm 75 - 76 
Caolín Contenido en caolinita ≥ 
30 % 20 
Carbono orgánico Ajustado mediante adición de 
turba y arena 2 (± 0,5) 
Carbonato de calcio CaCO  3 , pulverizado, quími ­
camente puro 0,05 - 0,1 
Agua Conductividad ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Preparación  
La turba se seca al aire y se tritura hasta convertirse en un polvo fino. Se prepara 
en agua desionizada una suspensión de la cantidad necesaria de polvo de turba, utilizando un dispositivo de homogeneización de prestaciones elevadas. El pH de esta suspensión se ajusta a 5,5 ± 0,5 con CaCO
 3 . La suspensión se deja durante 
al menos dos días con agitación suave a 20 ± 2 °C, para estabilizar el pH e 
implantar un componente microbiano estable. Se vuelve a medir el pH, que debe quedar a 6,0 ± 0,5. A continuación se mezcla la suspensión de turba con los demás componentes (arena y caolín) y con agua desionizada para obtener un 
sedimento homogéneo con un contenido de agua del 30-50 % del peso seco del 
sedimento. Se vuelve a medir el pH de la mezcla final y se ajusta a 6,5-7,5 con CaCO
 3 en caso necesario. Se toman muestras del sedimento para determinar el 
peso seco y el contenido en carbono orgánico. Se recomienda a continuación que 
el sedimento artificial, antes de emplearse en el ensayo de toxicidad para quiro ­
nómidos, se someta durante siete días a las mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo.
 
Almacenamiento  
Los componentes secos utilizados para preparar el sedimento artificial pueden 
almacenarse en un lugar fresco y seco, a temperatura ambiente. El sedimento 
(húmedo) ya preparado no debe almacenarse antes de su empleo en el ensayo. 
Debe utilizarse inmediatamente tras el tiempo de acondicionamiento de 7 días con que termina su preparación.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra. 
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Apéndice 4  
Características químicas aceptables del agua de dilución  
Sustancia Concentraciones  
Materia en partículas < 20 mg/l 
Carbono orgánico total < 2 mg/l Amoníaco no ionizado < 1 μg/l 
Dureza expresada en CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Cloro residual < 10 μg/l 
Plaguicidas organofosforados totales < 50 ng/l Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlo ­
rados < 50 ng/l 
Cloro orgánico total < 25 ng/l
 
(*) Sin embargo, si se sospecha interacción entre los iones responsables de la dureza y la 
sustancia problema, debe utilizarse agua menos dura (por tanto, en esta situación no 
debe emplearse el medio M4 de Elendt).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Apéndice 5  
Orientaciones para el seguimiento de la aparición de las larvas de 
quironómidos  
Se ponen trampas de aparición en los vasos del ensayo. Estas trampas tienen que 
mantenerse desde el día 20 hasta el final del ensayo. A continuación figura el esquema de un ejemplo de trampa:
 
A: tamiz de nailon 
B: tazas de plástico invertidas 
C: vaso de exposición sin pico D: accesos con tamiz para intercambio de agua 
E: agua 
F: sedimento  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C. 28.  ENSAYO DE TOXICIDAD PARA QUIRONÓMIDOS EN 
SISTEMAS SEDIMENTOS-AGUA CON AGUA ENRIQUECIDA  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 
TG 219 (2004). El presente método de ensayo está diseñado para evaluar los 
efectos de la exposición prolongada de sustancias sobre las larvas del díp ­
tero de agua dulce  Chironomus  sp., que viven en los sedimentos. Se basa 
principalmente en las directrices del BBA, que utiliza un sistema de ensayo 
sedimento-agua con suelo artificial, y una situación de exposición en la 
columna de agua (1). También tiene en cuenta los actuales protocolos de ensayo de toxicidad para  Chironomus riparius  y Chironomus tentans  que se 
han elaborado en Europa y en América del Norte (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) y 
se han sometido a ensayos interlaboratorios (1) (6) (9). Pueden utilizarse 
asimismo otras especies de quironómidos bien decumentadas como, por ejemplo,  Chironomus yoshimatsui  (10) (11). 
2. La situación de exposición empleada en el presente método de ensayo es el 
enriquecimiento del agua. La selección de la situación de exposición ade ­
cuada depende de la aplicación que se prevea para el ensayo. La situación de exposición en agua, que implica el enriquecimiento de la columna de agua, pretende simular un caso de aerosol errático de un plaguicida y 
comprende el pico inicial de concentraciones en el agua intersticial. Tam ­
bién es útil para otros tipos de exposición (incluidos los vertidos de sustan ­
cias), salvo los procesos de acumulación que duren más que el período de 
ensayo. 
3. Las sustancias que tienen que someterse a ensayo respecto a organismos que 
viven en los sedimentos suelen permanecer en este compartimento durante largos plazos. Los organismos que viven en los sedimentos pueden estar 
expuestos a través de varias vías de exposición. La importancia relativa de 
cada vía de exposición, y el tiempo que tarda cada una de ellas en contribuir a los efectos tóxicos generales, dependen de las propiedades fisicoquímicas de la sustancia correspondiente. En el caso de las sustancias que se adsorben 
fuertemente (por ejemplo, con log K
 ow > 5) o en el de las sustancias que se 
unen covalentemente con el sedimento, la ingestión de alimentos contami ­
nados puede constituir una vía de exposición significativa. A fin de no subestimar la toxicidad de sustancias muy lipofílicas, puede considerarse 
la adición de alimentos al sedimento antes de aplicar la sustancia problema. 
Para tener en cuenta todas las vías potenciales de exposición, el presente método de ensayo insiste en la exposición a largo plazo. La duración del ensayo está en la banda de 20 a 28 días en el caso de  C. riparius  y C. 
yoshimatsui,  y de 28 a 65 días en el de  C. tentans.  Si se necesitan datos a 
un plazo más corto con algún fin específico como, por ejemplo, para in ­
vestigar los efectos de sustancias inestables, es posible retirar réplicas para ­
lelas adicionales tras un plazo de diez días. 
4. Los parámetros medidos son el número total de adultos que aparecen y el 
tiempo transcurrido hasta la aparición. Se recomienda que las mediciones de supervivencia y crecimiento de las larvas no se hagan hasta que hayan 
pasado diez días si se necesitan datos adicionales a corto plazo, utilizando 
réplicas adicionales cuando convenga. 
5. Se recomienda el uso de sedimentos artificiales, que presentan diversas 
ventajas sobre los sedimentos naturales: 
— se reduce la variabilidad experimental porque se constituye una "matriz 
normalizada" reproducible y desaparece la necesidad de conseguir fuen ­
tes de sedimentos limpios y no contaminados, 
— pueden iniciarse los ensayos en cualquier momento sin problemas de 
variabilidad estacional del sedimento en cuestión, y no es necesario aplicar ningún tratamiento previo al sedimento para eliminar la fauna endógena; el uso de un sedimento artificial reduce también el coste 
asociado con la recogida de campo de cantidades suficientes de sedi ­
mentos para los ensayos sistemáticos,
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— el uso de sedimento artificial permite comparar la toxicidad de las sus ­
tancias y clasificarlas en consecuencia: son comparables los datos de 
toxicidad obtenidos de ensayos realizados con sedimentos naturales y artificiales en relación con diversas sustancias (2). 
6. En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
7. Se exponen quironómidos de la primera fase del estado larvario a una serie 
de concentraciones de la sustancia problema en sistemas sedimento-agua. El ensayo se inicia poniendo larvas de primer estadio en vasos de ensayo que 
contienen el sistema sedimento-agua y a continuación se añade al agua la 
sustancia problema. Al final del ensayo se mide la tasa de aparición y de desarrollo de quironómidos. También es posible medir la supervivencia y el peso de las larvas a los 10 días en caso necesario, utilizando réplicas 
adicionales cuando proceda. Estos datos se analizan o bien usando un mo ­
delo de regresión para estimar la concentración que provocaría una reduc ­
ción del x % en la aparición o en la supervivencia o el crecimiento de las larvas (por ejemplo, EC
 15 , EC  50 , etc.), o bien realizando contrastes estadís ­
ticos de hipótesis para determinar la NOEC/LOEC. Esta última posibilidad 
exige la comparación de valores que tienen efectos con valores de control, utilizando pruebas estadísticas.
 
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
8. Deben conocerse la hidrosolubilidad de la sustancia problema, su presión de 
vapor, su reparto medido o calculado en el sedimento y su estabilidad en el 
agua y en el sedimento. Para cuantificar la sustancia problema presente en el agua sobrenadante, en el agua intersticial y en el sedimento, debe disponerse de un método analítico fiable, cuya precisión y límite de detección sean 
conocidos y se indiquen. Entre la información útil se incluyen la fórmula 
estructural y la pureza de la sustancia problema. También es útil la infor ­
mación sobre el destino químico de la sustancia problema (por ejemplo, disipación, degradación abiótica y biótica, etc.). En la referencia 12 se 
ofrece más orientación sobre los ensayos de sustancias con propiedades 
fisicoquímicas que dificultan la realización del ensayo.
 
SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
9. Puede realizarse periódicamente un ensayo con sustancias de referencia, para 
asegurarse de la fiabilidad del protocolo y de las condiciones del ensayo. 
Las siguientes sustancias son ejemplos de tóxicos de referencia utilizados 
con éxito en estudios interlaboratorios y de validación: lindano, trifluralina, pentaclorofenol, cloruro de cadmio y cloruro de potasio (1) (2) (5) (6) (13).
 
VALIDEZ DEL ENSAYO 
10. Para que el ensayo sea válido deben darse las condiciones siguientes: 
— la aparición de adultos en los controles no ha de ser inferior al 70 % al 
final del ensayo (1) (6), 
— la aparición de adultos de  C. riparius  y C. yoshimatsui  en los recipientes 
de control debe producirse cuando hayan transcurrido entre 12 y 23 días desde su introducción en los recipientes; en el caso de  C. tentans  es 
necesario un plazo de entre 20 y 65 días, 
— al final del ensayo deben medirse en cada recipiente el pH y la concen ­
tración de oxígeno disuelto; la concentración de oxígeno debe ser al menos el 60 % del valor de saturación en el aire a la temperatura 
aplicada, y el pH del agua sobrenadante debe estar en el rango de 6 a 
9 en todos los recipientes de ensayo,
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— la temperatura del agua no debe variar en más de ± 1,0 °C; la tempe ­
ratura del agua podría controlarse mediante un espacio isotérmico y, en 
tal caso, debería confirmarse la temperatura ambiente de ese espacio a intervalos apropiados.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Recipientes de ensayo  
11. El estudio se lleva a cabo en vasos de vidrio de 600 ml de capacidad y 8 cm 
de diámetro. Pueden utilizarse otros recipientes que garanticen una altura adecuada de sedimento y de agua sobrenadante. La superficie del sedimento 
debe ser suficiente para que correspondan de 2 a 3 cm
 2 por larva. La 
proporción de la altura de la capa de sedimento respecto a la altura del agua sobrenadante debe ser de 1:4. Los recipientes de ensayo y demás 
instrumentos que hayan de entrar en contacto con el sistema de ensayo 
serán íntegramente de vidrio o de otro material químicamente inerte como, por ejemplo, teflón.
 
Selección de las especies  
12. La especie que debe usarse preferentemente en el ensayo es  Chironomus 
riparius.  También es adecuada la especie  Chironomus tentans,  pero resulta 
más difícil de manejar y requiere un período de ensayo más largo. Asi ­
mismo es posible utilizar  Chironomus yohimatsui.  En el apéndice 2 se da 
información sobre los métodos de cultivo de  Chironomus riparius.  También 
se dispone de información sobre las condiciones de cultivo de otras espe ­
cies, como  Chironomus tentans  (4) y  Chironomus yoshimatsui  (11). Hay 
que confirmar la identificación de la especie antes de realizar los ensayos, pero no es necesario hacerlo antes de cada ensayo si los organismos pro ­
ceden de un cultivo del propio laboratorio.
 
Sedimento  
13. Es preferible utilizar un sedimento artificial (también denominado formula ­
do, reconstituido o sintético). Sin embargo, si se utiliza sedimento natural, deben determinarse sus características (al menos, el pH y el contenido de 
carbono, pero es recomendable incluir otros parámetros, como la relación 
C/N y la granulometría), y debe estar exento de toda contaminación y de otros organismos que pudieran competir con los quironómidos o consumir ­
los. También se recomienda que el sedimento natural, antes de emplearse en 
un ensayo de toxicidad para quironómidos, se someta durante siete días a las 
mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo. Se recomienda utilizar en este ensayo (1) (15) (16) el siguiente sedimento artificial, basado en el suelo artificial empleado en el método de ensayo 
C.8 (14): 
a) 4-5 % de turba (peso seco): de pH lo más próximo posible a la banda 
5,5-6,0; es importante utilizar turba en forma de polvo, finamente molida 
(tamaño de partícula ≤ 1 mm) y secada solo al aire; 
b) 20 % de caolín (peso seco), con un contenido de caolinita preferente ­
mente superior al 30 %; 
c) 75-76 % de arena de cuarzo (peso seco); debe predominar la arena fina, 
con más del 50 % de las partículas de un tamaño entre 50 y 200 μm; 
d) agua desionizada para obtener un contenido de humedad en la mezcla 
final en el rango de 30 a 50 %; 
e) carbonato de calcio de calidad químicamente pura (CaCO
 3 ) añadido para 
ajustar el pH de la mezcla final del sedimento a 7,0 ± 0,5; 
f) el contenido de carbono orgánico de la mezcla final debe ser del 2 % (± 
0,5 %), ajustado mediante el empleo de cantidades adecuadas de turba y 
arena, según las letras a) y c).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Debe conocerse el origen de la turba, del caolín y de la arena. Hay que 
comprobar que los componentes del sedimento no presentan contaminación 
química (por ejemplo, con metales pesados, compuestos organoclorados, compuestos organofosforados, etc.). En el apéndice 3 se describe un ejemplo de preparación del sedimento artificial. Puede aceptarse también la mezcla 
de componentes secos si se demuestra que, tras la adición de agua sobre ­
nadante, no se produce separación de los componentes del sedimento (por ejemplo, flotación de partículas de turba), y que la turba o el sedimento están suficientemente acondicionados.
 
Agua  
15. Es adecuada como agua para el ensayo cualquier agua que se ajuste a las 
características químicas de un agua de dilución aceptable según se indica en los apéndices 2 y 4. Puede utilizarse como agua de cultivo y agua de ensayo 
cualquier agua adecuada, agua natural (superficial o subterránea), agua re ­
constituida (véase el apéndice 2) o agua del grifo desclorada, siempre que los quironómidos sobrevivan en ella durante las fases de cultivo y ensayo sin mostrar signos de presión. Al inicio del ensayo, el pH del agua de 
ensayo debe estar entre 6 y 9 y la dureza total no debe superar el valor 
de 400 mg/l en CaCO
 3 . Sin embargo, si se sospecha interacción entre los 
iones responsables de la dureza y la sustancia problema, debe utilizarse agua menos dura (por tanto, en esta situación no debe emplearse el medio M4 de 
Elendt). Debe usarse el mismo tipo de agua a lo largo de todo el estudio. 
Las características de calidad del agua recogidas en el apéndice 4 deben medirse al menos dos veces al año o cuando se sospeche que pueden haber cambiado de forma significativa.
 
Soluciones madre — agua enriquecida  
16. Las concentraciones de ensayo se calculan a partir de las concentraciones en 
la columna de agua, es decir, en el agua sobrenadante, que recubre al 
sedimento. Las soluciones de ensayo de las concentraciones elegidas se 
preparan por dilución de una solución madre. A ser posible, estas soluciones madre deben prepararse disolviendo la sustancia en medio de ensayo. En algunos casos puede ser necesario utilizar disolventes o dispersantes para 
obtener una solución madre a la concentración deseada. Como ejemplos de 
disolventes adecuados pueden darse los siguientes: etanol, metanol, éter monometílico de etilenglicol, éter dimetílico de etilenglicol, dimetilforma ­
mida y trietilenglicol. Los dispersantes utilizables son Cremaphor RH40, 
Tween 80, metilcelulosa al 0,01 % y HCO-40. La concentración del agente 
solubilizante en el medio de ensayo final debe ser mínima (es decir, ≤ 0,1 
ml/l) y la misma en todos los tratamientos. Si se emplea un agente solubi ­
lizante, no debe actuar de forma significativa sobre la supervivencia ni 
producir efectos nocivos visibles sobre las larvas de quironómidos, lo cual 
ha de demostrarse en un lote de control que solo lleve disolvente. No obstante, debe hacerse todo lo posible por evitar el uso de dichas sustancias.
 
DISEÑO DEL ENSAYO 
17. El diseño del ensayo se refiere a la selección del número de concentraciones 
de ensayo y al intervalo entre las mismas, al número de recipientes por 
concentración y al número de larvas por recipiente. Se describen los diseños 
para la estimación puntual de la EC y de la NOEC, así como para realizar un ensayo límite. Es preferible el análisis de regresión antes que el plantea ­
miento de contrastes de hipótesis.
 
Diseño para análisis de regresión  
18. La concentración con efecto (por ejemplo, EC  15 , EC  50 ) y el rango de con ­
centraciones en la que resulta interesante el efecto de la sustancia problema, tienen que estar abarcadas entre las concentraciones incluidas en el ensayo. 
En general, la exactitud y, sobre todo, la validez con la que pueden hacerse 
las estimaciones de las concentraciones con efecto (EC
 x ) mejoran cuando la  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
concentración con efecto se encuentra dentro del rango de concentraciones 
ensayadas. Debe evitarse extrapolar muy por debajo de la menor concen ­
tración positiva o por encima de la concentración máxima. Es conveniente efectuar previamente un ensayo para seleccionar el rango de concentraciones que se deba utilizar (véase el punto 27). 
19. Si ha de estimarse la EC
 x , deben someterse a ensayo al menos cinco con ­
centraciones y tres réplicas por cada concentración. En cualquier caso, es 
recomendable utilizar suficientes concentraciones de ensayo para poder ha ­
cer una buena estimación del modelo. El factor entre concentraciones no sebe ser mayor que dos (puede permitirse una excepción en los casos en que 
la pendiente de la curva dosis-respuesta sea poco pronunciada). El número 
de réplicas de cada tratamiento puede reducirse si aumenta el número de concentraciones de ensayo con diferentes respuestas. El aumento del número de réplicas o la reducción del tamaño del intervalo entre concentraciones de 
ensayo tiende a estrechar los intervalos de confianza del ensayo. Si se han 
de estimar la supervivencia y el crecimiento de las larvas a los 10 días, es necesario emplear réplicas adicionales.
 
Diseño para estimar una NOEC/LOEC  
20. Si hay que estimar la LOEC y/o la NOEC, se deben emplear cinco concen ­
traciones de ensayo con un mínimo de cuatro réplicas y el factor entre concentraciones no debe exceder de dos. El número de réplicas debe ser 
suficiente para garantizar una potencia estadística adecuada que permita 
detectar una diferencia del 20 % respecto al control con un nivel de signi ­
ficación del 5 % (p = 0,05). Respecto a la tasa de desarrollo, suele ser adecuado un análisis de la varianza (ANOVA), como el ensayo de Dunnett 
o el de Williams (17) (18) (19) (20). Para la tasa de aparición, pueden 
emplearse el método de Cochran-Armitage, la prueba exacta de Fisher (con la corrección de Bonferroni), o el método de Mantel-Haenszel.
 
Ensayo límite  
21. Puede llevarse a cabo un ensayo límite (una sola concentración de ensayo y 
un control) si no se han observado efectos en el ensayo previamente efec ­
tuado para seleccionar la banda de concentraciones. El objetivo del ensayo 
límite es indicar que el valor tóxico de la sustancia problema es superior a la 
concentración límite estudiada. No es posible formular en el presente mé ­
todo de ensayo ninguna sugerencia de concentración recomendada; queda al criterio de las autoridades reguladoras. Generalmente hacen falta al menos 
seis réplicas tanto de las unidades de tratamiento como de las de control. 
Debe demostrarse una potencia estadística adecuada que permita detectar una diferencia del 20 % respecto al control con un nivel de significación del 5 % (p = 0,05). Con una respuesta métrica (tasa de desarrollo y peso), la 
prueba t es un método estadístico adecuado si los datos cumplen los requi ­
sitos de esta prueba (normalidad, varianzas homogéneas). Si estos requisitos no se satisfacen, puede utilizarse la prueba t de varianzas desiguales o una 
prueba no paramétrica, tal como la de Wilcoxon-Mann-Whithey. En relación 
con la tasa de aparición de adultos es adecuada la prueba exacta de Fisher.
 
PROCEDIMIENTO  
Condiciones de exposición  
Preparación del sistema agua enriquecida-sedimento  
22. Se añaden a los recipientes de ensayo cantidades adecuadas del sedimento 
artificial (véanse los puntos 13-14 y el apéndice 3) para formar una capa de al menos 1,5 cm. Se añade agua hasta una altura de 6 cm (véase el 
punto 15). La proporción de la altura de la capa de sedimento respecto a 
la altura del agua no debe ser mayor que 1:4, y la capa de sedimento no debe tener una altura mayor que 3 cm. El sistema sedimento-agua debe dejarse con aireación suave durante siete días antes de que se añadan los 
organismos de ensayo (véanse el punto 14 y el apéndice 3). Para evitar que 
se separen los ingredientes del sedimento y se resuspendan las partículas finas durante la adición del agua de ensayo a la columna de agua, puede cubrirse el sedimento con un disco de plástico mientras se vierte el agua 
encima, y retirar el disco inmediatamente a continuación. Puede ser ade ­
cuado también utilizar otros dispositivos.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Los recipientes de ensayo tienen que estar cubiertos (por ejemplo, con 
placas de vidrio). Cuando sea necesario, manténgase durante el estudio el 
volumen de agua inicial añadiendo agua para compensar la evaporación de esta. Para esta operación debe utilizarse agua destilada o desionizada para evitar la formación de sales.
 
Adición de los organismos de ensayo  
24. Cuatro o cinco días antes de añadir los organismos de ensayo a los reci ­
pientes de ensayo, deben tomarse de los cultivos masas de huevos y poner ­
las en recipientes pequeños con medio de cultivo. Puede utilizarse medio viejo del cultivo madre o medio recién preparado. Si se utiliza este último, debe añadírsele una pequeña cantidad de alimento como, por ejemplo, algas 
verdes o unas gotitas de filtrado de una suspensión finamente molida de 
alimento para peces en copos (véase el apéndice 2). Solo deben utilizarse masas de huevos recién puestas. Normalmente, las larvas empiezan a salir de los huevos un par de días después de la puesta (de 2 a 3 días en el caso 
de Chironomus riparius  a 20 °C y de 1 a 4 días en el de  Chironomus 
tentans  a 23 °C y en el de  Chironomus yoshimatsui  a 25 °C) y el creci ­
miento de las larvas tiene lugar en cuatro fases, cada una de entre 4 y 8 días de duración. En el ensayo deben utilizarse larvas de la primera fase (2-3 o 
1-4 días tras la eclosión). La fase de los animales puede comprobarse 
midiendo la anchura de la cápsula cefálica (6). 
25. Se asignan aleatoriamente veinte larvas de primera fase a cada recipiente de 
ensayo que contenga el sedimento enriquecido y el agua, utilizando una 
pipeta de punta roma. Es necesario detener la aireación del agua mientras 
se ponen las larvas en los recipientes de ensayo y mantener la situación durante otras 24 horas tras la adición de las larvas (véanse los puntos 24 y 32). Según el diseño de ensayo empleado (véanse los puntos 19 y 20), el 
número de larvas utilizadas por concentración es de al menos 60 para la 
estimación puntual de la EC y de 80 para la determinación de la NOEC. 
26. A las veinticuatro horas de haber añadido las larvas, se pone la sustancia 
problema en la columna de agua sobrenadante, y se vuelve a aportar airea ­
ción leve. Utilizando una pipeta, se aplican pequeños volúmenes de las 
soluciones de la sustancia problema por debajo de la superficie del agua. A continuación debe mezclarse el agua sobrenadante, con cuidado de no alterar el sedimento.
 
Concentraciones de ensayo  
27. Puede ser útil efectuar un ensayo preliminar para determinar el rango de 
concentraciones adecuadas para el ensayo definitivo. Con este fin se utiliza 
una serie de concentraciones de la sustancia problema, muy diferentes entre sí. A fin de proporcionar la misma densidad superficial por quironómido que se vaya a emplear para el ensayo definitivo, se exponen los quironómidos a 
cada concentración de la sustancia problema durante un plazo que permita la 
estimación de las concentraciones de ensayo adecuadas, y no hace falta utilizar réplicas. 
28. Las concentraciones de ensayo para el ensayo definitivo se deciden sobre la 
base del resultado del ensayo de determinación del rango de concentracio ­
nes. Deben utilizarse al menos cinco concentraciones y seleccionarse como se describe en los puntos 18 a 20.
 
Controles  
29. Deben incluirse en el ensayo, con el número adecuado de réplicas, recipien ­
tes de control sin sustancia problema pero con sedimento (véanse los puntos 
19-20). Si se ha utilizado algún disolvente para aplicar la sustancia problema 
(véase el punto 16), debe añadirse un control del disolvente en el sedimento.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Sistema de ensayo  
30. Se emplean sistemas estáticos. Pueden utilizarse en casos excepcionales 
sistemas semiestáticos o dinámicos con renovación intermitente o continua del agua sobrenadante, como, por ejemplo, si las especificaciones de calidad 
del agua se hacen inadecuadas para el organismo de ensayo o afectan al 
equilibrio químico (por ejemplo, cuando los niveles de oxígeno disuelto caen demasiado, la concentración de excrementos se eleva demasiado, o se lixivian minerales del sedimento con modificación del pH y/o de la 
dureza del agua). Sin embargo, normalmente será suficiente y preferible 
emplear otros métodos de mejora de la calidad del agua sobrenadante, como la aireación.
 
Alimentación  
31. Es necesario alimentar a las larvas, de preferencia una vez al día o, al 
menos, tres veces por semana. Parece adecuada una ración diaria de comida 
para peces (suspensión en agua o comida finamente molida como, por 
ejemplo, Tetra-Min o Tetra-Phyll; véanse detalles en el apéndice 2), de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg para  C. yoshimatsui ) por larva durante los 10 
primeros días. Las larvas de más edad pueden necesitar algo más de comida: 
entre 0,5 y 1 mg por larva al día debería ser suficiente durante el resto del 
ensayo. La ración alimentaria debe reducirse en todos los tratamientos y controlarse si se observa crecimiento de hongos o si se aprecia mortalidad en los controles. Si no puede detenerse el desarrollo fúngico, hay que repetir 
el ensayo. Cuando se someten a ensayo sustancias muy adsorbentes (por 
ejemplo, con log K
 ow > 5), o hay sustancias que se unen covalentemente al 
sedimento, es posible añadir al sedimento artificial, antes del período de estabilización, la cantidad de comida necesaria para garantizar la supervi ­
vencia y el crecimiento natural de los organismos. Con este objetivo, debe 
utilizarse material vegetal en lugar de la comida para peces, por ejemplo, adición de 0,5 % (peso seco) de hojas finamente molidas de ortiga mayor (Urtica dioica ), morera ( Morus alba ), trébol blanco ( Trifolium repens ), 
espinaca ( Spinacia oleracea ) u otro material vegetal ( Cerophyl  o 
alfa-celulosa).
 
Condiciones de incubación  
32. Se aporta aireación suave al agua sobrenadante de los recipientes de ensayo, 
preferentemente a las 24 h de la adición de las larvas, y se continúa a lo largo de todo el ensayo (debe tenerse cuidado para que la concentración de oxígeno disuelto no caiga por debajo del 60 % del valor de saturación en el 
aire). La aireación se aporta mediante una pipeta Pasteur de vidrio fijada a 
2-3 cm por encima del nivel del sedimento, con el ritmo de una o unas pocas burbujas por segundo. Cuando se sometan a ensayo sustancias volá ­
tiles, debe considerarse el no airear el sistema sedimento-agua. 
33. El ensayo se efectúa a la temperatura constante de 20 °C (± 2 °C). En el 
caso de  C. tentans  y de  C. yoshimatsui,  las temperaturas recomendadas son 
de 23 °C y 25 °C (± 2 °C), respectivamente. Se usa un fotoperíodo de 16 h, con una intensidad luminosa de 500 a 1 000 lux.
 
Duración de la exposición  
34. La exposición comienza con la adición de larvas a los recipientes enrique ­
cidos y a los de control. La duración máxima del ensayo es de 28 días en el caso de  C. riparius  y C. yoshimatsui,  y de 65 días en el de  C. tentans.  Si los 
dípteros aparecen antes, es posible terminar el ensayo tras un mínimo de 
cinco días desde la aparición del último adulto en los recipientes de control.
 
OBSERVACIONES  
Aparición de adultos  
35. Se determinan el tiempo de desarrollo y el número total de dípteros machos 
y hembras que aparecen completamente. Los machos se identifican fácil ­
mente por sus antenas plumosas.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Hay que observar los recipientes de ensayo al menos tres veces por semana 
para hacer una evaluación visual de los eventuales comportamientos anor ­
males (por ejemplo, dejar el sedimento, nadar de forma inusual) respecto al control. Durante el tiempo en que se prevea que ha de ocurrir la aparición es necesario efectuar un recuento diario de los dípteros aparecidos. Se registran 
cada día el sexo y el número de los dípteros aparecidos completamente. Tras 
su identificación, se sacan los dípteros de los recipientes. Las eventuales masas de huevos puestas antes de la terminación del ensayo deben anotarse y después retirarse para evitar la reintroducción de larvas en el sedimento. 
También debe registrarse el número de pupas visibles de las que no han 
llegado a aparecer adultos. En el apéndice 5 se dan orientaciones sobre la medición de la aparición de los dípteros.
 
Crecimiento y supervivencia  
37. Si han de proporcionarse datos sobre la supervivencia y el crecimiento de 
larvas a los 10 días, deben incluirse desde el principio recipientes de ensayo adicionales, de forma que puedan utilizarse después. El sedimento de estos 
recipientes adicionales se filtra a través de un tamiz de 250 μm para retener 
las larvas. Los criterios para determinar la muerte son la inmovilidad o la ausencia de reacción ante un estímulo mecánico. Las larvas no recuperadas deben contarse asimismo como muertas (las larvas que hayan muerto al 
inicio del ensayo pueden haber sido degradadas por los microbios). Se 
determina el peso seco (libre de cenizas) de las larvas supervivientes por recipiente de ensayo y se calcula el peso seco individual medio por reci ­
piente. Es útil determinar a qué fase pertenecen las larvas supervivientes; 
para obtener este dato puede utilizarse la medición de la anchura de la 
cápsula cefálica de cada individuo.
 
Mediciones analíticas  
Concentración de la sustancia problema  
38. Como mínimo, deben analizarse muestras del agua sobrenadante, del agua 
intersticial y del sedimento al inicio (preferentemente una hora tras la apli ­
cación de la sustancia problema) y al final del ensayo, a la concentración máxima y a una inferior. Estas determinaciones de la concentración de la 
sustancia problema informan sobre el comportamiento y el reparto de la 
sustancia problema en el sistema agua-sedimento. La toma de muestras del sedimento al inicio del ensayo puede influir en el sistema de ensayo (por ejemplo, eliminando larvas del ensayo), por lo que deberían emplearse 
recipientes de ensayo adicionales para realizar las determinaciones analíticas 
al inicio y durante el ensayo cuando sea apropiado (véase el punto 39). Puede no ser necesario efectuar mediciones en el sedimento si se ha deter ­
minado claramente el reparto de la sustancia problema entre el agua y el 
sedimento en un estudio agua/sedimento en condiciones comparables (por 
ejemplo, proporción entre sedimento y agua, tipo de aplicación, contenido en carbono orgánico del sedimento). 
39. Cuando se hagan mediciones intermedias (por ejemplo, el día n
 o 7) y si los 
análisis necesitan grandes muestras que no puedan tomarse de los recipien ­
tes de ensayo sin influir en el sistema de ensayo, las determinaciones ana ­
líticas deben llevarse a cabo con muestras de recipientes de ensayo adicio ­
nales tratados de la misma manera (incluida la presencia de los organismos 
de ensayo) pero que no se utilizan para las observaciones biológicas. 
40. El procedimiento recomendado para aislar el agua intersticial es la centrifu ­
gación, por ejemplo a 10 000 g y 4 °C durante 30 min. Sin embargo, si se demuestra que la sustancia problema no se adsorbe a los filtros, también puede aceptarse la filtración. En algunos casos puede resultar imposible 
analizar las concentraciones en el agua intersticial debido a que el tamaño 
de la muestra es demasiado pequeño.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Parámetros fisicoquímicos  
41. Deben medirse de la manera adecuada el pH, el oxígeno disuelto en el agua 
de ensayo y la temperatura de los recipientes de ensayo (véase el punto 10). Hay que medir la dureza y el amoníaco en los controles y en un recipiente 
de ensayo a la concentración máxima, al inicio y al final del ensayo.
 
DATOS E INFORME  
Tratamiento de los resultados  
42. El objetivo de este ensayo es determinar el efecto de la sustancia problema 
sobre la tasa de desarrollo y el número total de dípteros machos y hembras completamente aparecidos o, en el caso de los efectos del ensayo de 10 días, sobre la supervivencia y el peso de las larvas. Si no hay ninguna señal de 
sensibilidades estadísticamente diferentes según los sexos, pueden agruparse 
los resultados de machos y de hembras a efectos de análisis estadísticos. Las diferencias de sensibilidad entre los sexos pueden evaluarse estadísticamente mediante, por ejemplo, una prueba de tabla de contingencia de χ
 2 -r × 2 
cuadro. Cuando así se requiera, habrá que determinar la supervivencia de las 
larvas y su peso seco individual medio por recipiente al cabo de 10 días. 
43. Las concentraciones que tienen efecto, expresadas como concentraciones en 
el agua sobrenadante, se calculan preferentemente a partir de las concen ­
traciones medidas al inicio del ensayo (véase el punto 38). 
44. A efectos de computar una estimación puntual para la EC  50 o cualquier otra 
EC x , las estadísticas por recipiente pueden utilizarse como réplicas verda ­
deras. Al calcular el intervalo de confianza para cualquier EC  x , debe tenerse 
en cuenta la variabilidad entre recipientes, o bien hay que mostrar que esta variabilidad es tan pequeña que puede despreciarse. Cuando el modelo sigue el método de los mínimos cuadrados, debe aplicarse una transformación 
estádistica por cada recipiente a fin de mejorar la homogeneidad de la 
varianza. Sin embargo, los valores de EC
 x deben calcularse después de 
haber vuelto a transformar la respuesta al valor original. 
45. Cuando el análisis estadístico se dirige a determinar la NOEC/LOEC me ­
diante contrastes de hipótesis, es necesario tener en cuenta la variabilidad 
entre recipientes, por ejemplo mediante un análisis de varianza anidado. También puede ser adecuado realizar ensayos más robustos (21) en situa ­
ciones en que no se cumplen las hipótesis de los análisis de varianza 
usuales.
 
Tasa de aparición  
46. Las tasas de aparición son datos cuantales y pueden ser analizados por el 
método de Cochran-Armitage aplicado con ajuste secuencial de residuos cuando se prevé una relación dosis-respuesta monótona y estos datos son 
coherentes con dicha previsión. En caso contrario, puede utilizarse una 
prueba exacta de Fisher o el método de Mantel-Haenszel con los valores p ajustados según Bonferroni-Holm. Si hay pruebas de que la variabilidad entre réplicas dentro de la misma concentración es mayor de lo que indicaría 
una distribución binomial (lo que se señala generalmente como variación 
"extrabinomial"), hay que utilizar un método de Cochran-Armitage o una prueba exacta de Fisher robustos (como se propone en el punto 21). 
47. Se determina la suma de dípteros aparecidos por recipiente, n
 e , y se divide 
por el número de larvas introducidas, n  a : 
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
donde:  
ER = tasa de aparición  
n e = número de dípteros aparecidos por recipiente  
n a = número de larvas introducidas por recipiente 
48. Otra posibilidad más adecuada para las muestras de gran tamaño, cuando 
hay variación extrabinomial, consiste en tratar la tasa de aparición como una 
respuesta continua y emplear procedimientos tales como la prueba de Wi ­
lliams cuando se prevé una relación dosis-respuesta monótona y es cohe ­
rente con estos datos de tasa de aparición. La prueba de Dunnett sería apropiada si no se mantuviera la monotonía. Se define aquí como muestra 
de gran tamaño la que corresponde a la situación en que tanto el número de 
dípteros emergidos como el número de no emergidos es superior a cinco, por réplica (recipiente). 
49. Para aplicar los métodos de análisis de la varianza, hay que transformar 
primero los valores de la tasa de aparición mediante la transformación 
arcoseno de la raíz cuadrada o la transformación de Freeman-Tukey para 
obtener una distribución normal aproximada y uniformizar las varianzas. Cuando se usan las frecuencias absolutas es posible aplicar el método de Cochran-Armitage, la prueba exacta de Fisher (Bonferroni) o el método de 
Mantel-Haenszel. La transformación arcoseno de la raíz cuadrada se aplica 
tomando el arcoseno (sen
 –1 ) de la raíz cuadrada de la tasa de aparición. 
50. Respecto a las tasas de aparición, los valores de EC  x se calculan mediante 
análisis de regresión (o, por ejemplo, probit (22), logit, Weibull, programas comerciales apropiados, etc.). Si no sirve el análisis de regresión (por ejem ­
plo, cuando hay menos de dos respuestas parciales), se utilizan otros méto ­
dos no paramétricos, tales como la media móvil o la interpolación simple).
 
Tasa de desarrollo  
51. El tiempo medio de desarrollo corresponde al intervalo medio de tiempo 
entre la introducción de las larvas (día 0 del ensayo) y la aparición de la 
cohorte experimental de dípteros (para el cálculo del tiempo de desarrollo verdadero debe tenerse en cuenta la edad de las larvas en el momento de su 
introducción). La tasa de desarrollo es la inversa del tiempo de desarrollo 
(unidades: 1/día) y corresponde a la porción de desarrollo larvario que se produce en un día. Es preferible utilizar la tasa de desarrollo para evaluar estos estudios de toxicidad en los sedimentos, ya que su varianza es menor y 
es más homogénea y próxima a la distribución normal que el tiempo de 
desarrollo. Por tanto, pueden usarse procedimientos de ensayos paramétricos potentes más con la tasa de desarrollo que con el tiempo de desarrollo. Considerando la tasa de desarrollo como respuesta continua, es posible 
estimar valores de EC
 x mediante análisis de regresión [por ejemplo, (23) 
(24)]. 
52. En relación con las siguientes pruebas estadísticas, se supone que el número 
de dipteros observados en el día de inspección x ha aparecido a la media del intervalo de tiempo entre el día x y el día x - l (l = longitud del intervalo de 
inspección, que es normalmente de 1 día). La tasa de desarrollo media por 
recipiente ( x) se calcula con ayuda de la siguiente fórmula:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
donde:  
x: tasa de desarrollo media por recipiente, 
i: índice del intervalo de inspección, m: número máximo de intervalos de inspección,
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : número de dípteros aparecidos en el intervalo de inspección i, 
n e : número total de dípteros aparecidos al final del experimento (=  P ƒ i ), 
x i : tasa de desarrollo de los dípteros aparecidos en el intervalo i, 
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
donde: 
day  i : día de inspección (días desde la aplicación), 
l i : longitud del intervalo de inspección i (en días, generalmente 1 día).  
Informe del ensayo  
53. El informe del ensayo debe dar, como mínimo, la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Naturaleza física y, en su caso, propiedades fisicoquímicas (hidrosolu ­
bilidad, presión de vapor, coeficiente de reparto en el suelo (o en el 
sedimento, si se conoce), estabilidad en el agua, etc.). 
— Datos de identificación química (nombre común, nombre químico, fór ­
mula estructural, número CAS, etc.), incluida la pureza y el método de análisis cuantitativo de la sustancia problema.  
Especie de ensayo:  
— Animales utilizados en el ensayo: especie, nombre científico, origen de 
los organismos y condiciones de cría. 
— Información sobre la manipulación de las masas de huevos y de las 
larvas. 
— Edad de los animales de ensayo cuando se introducen en los recipientes 
de ensayo.  
Condiciones de ensayo:  
— Sedimento utilizado, es decir, si es natural o artificial. — En el caso del sedimento natural, ubicación y descripción del lugar de 
muestreo del sedimento, incluyendo, si se puede, un historial de la 
contaminación; características: pH, contenido de carbono orgánico, rela ­
ción C/N y granulometría (cuando sea apropiado). 
— Preparación del sedimento artificial: ingredientes y características (con ­
tenido de carbono orgánico, pH, humedad, etc., al inicio del ensayo. 
— Preparación del agua de ensayo (si se utiliza agua reconstituida) y ca ­
racterísticas (concentración de oxígeno, pH, conductividad, dureza, etc., 
al inicio del ensayo). 
— Altura del sedimento y del agua sobrenadante. — Volumen del agua sobrenadante y del agua intersticial, peso del sedi ­
mento húmedo con y sin agua intersticial. 
— Recipientes de ensayo (material y tamaño). — Método de preparación de soluciones madre y concentraciones de ensayo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— Aplicación de la sustancia problema: concentraciones de ensayo utiliza ­
das, número de réplicas y empleo eventual de disolvente. 
— Condiciones de incubación: temperatura, intensidad y ciclo de luz, ai ­
reación (frecuencia e intensidad). 
— Información detallada sobre la alimentación de los animales, incluidos el 
tipo de alimento, la preparación, la cantidad y el régimen alimentario.  
Resultados:  
— Concentraciones de ensayo nominales, concentraciones de ensayo medi ­
das y resultados de todos los análisis efectuados para determinar la concentración de la sustancia problema en los recipientes de ensayo. 
— Calidad del agua de los recipientes de ensayo, es decir, pH, temperatura, 
oxígeno disuelto, dureza y amoníaco. 
— Sustitución del agua de ensayo evaporada, en su caso. — Número de dípteros machos y hembras aparecidos por recipiente y por 
día. 
— Número de larvas que no han aparecido como dípteros por recipiente. — Peso seco individual medio de las larvas por recipiente, y por fase, en 
caso apropiado. 
— Porcentaje de apariciones por réplica y concentración de ensayo (sin 
distinguir entre dípteros machos y hembras). 
— Tasa de desarrollo media de los dípteros aparecidos completamente por 
réplica y tasa de tratamiento (sin distinguir entre dípteros machos y hembras). 
— Estimación de los parámetros de toxicidad como, por ejemplo, EC
 x (con 
intervalos de confianza asociados), NOEC y/o LOEC, y métodos esta ­
dísticos empleados para su determinación. 
— Discusión de los resultados del ensayo, incluida la eventual influencia 
que tengan sobre ellos las desviaciones respecto al presente método de 
ensayo.  
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. 
(2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK. 
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Works ­
hop held in the Netherlands. 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the To ­
xicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp. 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; 
Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. 
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Se ­
cond edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition 
dated June 1994.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates. 
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae 
(Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. 
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57. 
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety 
Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of To ­
xicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 
(14) Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra. (15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175. 
(16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. 
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482-491. 
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103-117. 
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510-531. 
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48:577-585. 
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. 
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling conti ­
nuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485- 1494. 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES 
A efectos del presente método, se aplicarán las siguientes definiciones por:  
Sedimento artificial  (o sedimento reconstituido, formulado o sintético): mezcla 
de materiales empleada para imitar los componentes físicos de un sedimento natural.  
Agua sobrenadante : el agua situada sobre el sedimento en el recipiente de 
ensayo.  
Agua intersticial : el agua que ocupa el espacio entre el sedimento y las partí ­
culas del suelo.  
Agua enriquecida : el agua a la que se ha añadido sustancia problema.  
Sustancia problema:  toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este mé ­
todo de ensayo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Apéndice 2  
Recomendaciones para el cultivo de  Chironomus riparius  
1. Las larvas de  Chironomus  pueden criarse en cristalizadores o en recipientes 
más grandes. Sobre el fondo del recipiente se extiende arena de cuarzo fina, en una capa delgada de unos 5 a 10 mm de espesor. Se ha comprobado que la tierra de diatomeas (por ejemplo, Merck, Art 8117) también constituye un 
sustrato adecuado (es suficiente una capa más fina, de muy pocos milíme ­
tros). A continuación se añade agua adecuada hasta una altura de varios centímetros. Los niveles deben mantenerse rellenando con agua en la me ­
dida necesaria para compensar las pérdidas por evaporación y evitar la 
desecación. En caso necesario, es posible sustituir el agua. Debe aportarse 
una aireación suave. Los recipientes de cría de las larvas deben mantenerse en una jaula adecuada para evitar que se escapen los adultos. La jaula debe ser lo suficientemente grande como para permitir el enjambrado de los 
adultos aparecidos, ya que en caso contrario puede que no haya copulación 
(las dimensiones mínimas son de unos 30 × 30 × 30 cm). 
2. Las jaulas deben mantenerse a temperatura ambiente o en una zona de 
ambiente constante a 20 ± 2 °C con un fotoperíodo de 16 horas de luz (de intensidad alrededor de 1 000 lux) y 8 horas de oscuridad. Se ha co ­
municado que una humedad relativa del aire de menos del 60 % puede 
impedir la reproducción.
 
Agua de dilución  
3. Puede emplearse cualquier agua natural o sintética que sea adecuada. Se 
suelen utilizar agua de pozo, agua del grifo desclorada y medios artificiales (como, por ejemplo, medio M4 o M7 de Elendt, véase más abajo). Es 
necesario airear el agua antes de emplearla. En caso necesario, el agua de 
cultivo puede renovarse sacando cuidadosamente, por vertido o con sifón, el agua usada de los recipientes de cultivo, sin destruir los tubos de las larvas.
 
Alimentación de las larvas  
4. Las larvas de  Chironomus  deben alimentarse con comida para peces en 
copos (Tetra Min  ® , Tetra Phyll  ® u otra marca similar de comida comercial 
para peces), al ritmo de aproximadamente 250 mg por recipiente al día. Puede administrarse como polvo molido seco o como suspensión en agua: se añade 1,0 g de comida en copos a 20 ml de agua de dilución y se mezcla 
para obtener un resultado homogéneo. Esta preparación puede administrarse 
al ritmo de unos 5 ml por recipiente al día y ha de agitarse antes de usarse. Las larvas más viejas pueden recibir más cantidad. 
5. La alimentación se ajusta según la calidad del agua. Si el medio de cultivo 
se pone turbio, hay que reducir la alimentación. Es necesario supervisar cuidadosamente la adición de comida. Si la comida es demasiado escasa, se provocará la emigración de las larvas hacia la columna de agua, mientras 
que si es excesiva aumentará la actividad microbiana y se reducirá la con ­
centración de oxígeno. Ambas situaciones pueden producir un descenso de la tasa de crecimiento. 
6. Es posible añadir también algunas células de algas verdes (como, por ejem ­
plo, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris ) cuando se establecen 
recipientes de cultivo nuevos.
 
Alimentación de los adultos aparecidos  
7. Algunos experimentadores han sugerido que un disco de algodón empapado 
en una solución saturada de sacarosa puede servir de alimento para los 
adultos aparecidos.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Aparición de adultos  
8. A 20 ± 2 °C, los adultos empiezan a aparecer en los recipientes de cría de 
larvas a los 13-15 días aproximadamente. Los machos se distinguen fácil ­
mente porque tienen antenas plumosas.  
Masas de huevos  
9. Una vez haya adultos en la jaula de cría, deben supervisarse todos los 
recipientes de cría de larvas tres veces por semana para observar la puesta 
de masas gelatinosas de huevos. Cuando se encuentren, las masas de huevos deben retirarse cuidadosamente y transferirse a una pequeña placa que con ­
tenga una muestra del agua de cría. Las masas de huevos se emplean para 
iniciar un nuevo recipiente de cultivo (por ejemplo, 2-4 masas de huevos 
por recipiente) o para los ensayos de toxicidad. 
10. Las larvas en primer estadio deben salir de los huevos al cabo de 2 – 3 días.
 
Establecimiento de nuevos recipientes de cultivo  
11. Cuando se hayan establecido los cultivos, debe ser posible establecer un 
nuevo recipiente de cultivo de larvas cada semana o con menos frecuencia, 
según los requisitos de cultivo, eliminando los recipientes más viejos una 
vez han aparecido los dípteros adultos. Con este sistema, se obtendrá un suministro regular de adultos, con una gestión mínima.
 
Preparación de las soluciones de ensayo M4 y M7  
12. Elendt (1990) describió el medio M4. El M7 se prepara como el medio M4, 
salvo en lo relativo a las sustancias indicadas en el cuadro 1, cuyas concen ­
traciones son cuatro veces más bajas en el medio M7 que en el M4. Se está 
preparando una publicación sobre el medio M7 (Elendt, comunicación per ­
sonal). La solución de ensayo no debe prepararse siguiendo a Elendt y Bias (1990), ya que no son adecuadas las concentraciones de NaSiO
 3 5 H  2 O, 
NaNO  3 , KH  2 PO 4 y K  2 HPO  4 dadas para la preparación de las soluciones 
madre.  
Preparación del medio M7  
13. Las soluciones madre (I) se preparan por separado cada una y a partir de 
ellas se prepara una solución madre combinada (II) (véase el cuadro 1). Se toman 50 ml de la solución madre combinada (II) junto con las cantidades 
de solución madre de cada macronutriente que se dan en el cuadro 2 y se 
enrasa a 1 litro con agua desionizada para preparar el medio M7. Se prepara una solución madre de vitaminas añadiendo tres vitaminas a agua desioni ­
zada como se indica en el cuadro 3, y se añaden al medio M7 final 0,1 ml 
de la solución madre de vitaminas combinadas, poco antes de su empleo (la 
solución madre de vitaminas se conserva congelada en pequeñas partes alícuotas). El medio se airea y se estabiliza.
 
Cuadro 1  
Soluciones madre de oligoelementos para los medios M4 y M7  
Soluciones madre (I) Cantidad (mg) 
enrasada a 1 litro 
con agua desio ­
nizada Para preparar la solución madre 
combinada (II): mezclar las siguien ­
tes cantidades (ml) de soluciones 
madre (I) y enrasar a 1 litro con 
agua desionizada Concentraciones finales en las 
soluciones de ensayo (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Soluciones madre (I) Cantidad (mg) 
enrasada a 1 litro 
con agua desio ­
nizada Para preparar la solución madre 
combinada (II): mezclar las siguien ­
tes cantidades (ml) de soluciones 
madre (I) y enrasar a 1 litro con 
agua desionizada Concentraciones finales en las 
soluciones de ensayo (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Estas sustancias difieren en M4 y M7, como se indica más arriba. 
( 2 ) Estas soluciones se preparan por separado y después se juntan y se pasan por el autoclave inmediatamente.  
Cuadro 2  
Soluciones madre de macronutrientes para los medios M4 y M7  
Cantidad enrasada a 1 
litro con agua desioni ­
zada 
(mg) Cantidad de soluciones 
madre de macronutrientes 
añadida para preparar los 
medios M4 y M7 
(ml/l) Concentraciones fina ­
les en las soluciones 
de ensayo de M4 y 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Cuadro 3  
Solución madre de vitaminas para los medios M4 y M7  
Las tres soluciones de vitaminas se combinan para formar una única solución madre de vitaminas.  
Cantidad enrasada a 1 
litro con agua desioni ­
zada 
(mg) Cantidad de solución madre 
de vitaminas añadida para 
preparar los medios M4 y M7 
(ml/l) Concentraciones finales 
en las soluciones de en ­
sayo de M4 y M7 
(mg/l)  
Clorhidrato de tiamina 750 0,1 0,075 
Cianocobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotina 7,5 0,1 0,00075  
BIBLIOGRAFÍA:  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. 
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33. 
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna. Water Research  
24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Apéndice 3  
PREPARACIÓN DEL SEDIMENTO ARTIFICIAL  
Composición del sedimento  
La composición del sedimento artificial debe ser la siguiente:  
Componente Características % de sedimento 
en peso seco  
Turba Turba esfágnea, de pH lo 
más próximo posible a 5,5- 
6,0, sin restos vegetales visi ­
bles, finamente molida (ta ­
maño de partícula ≤ 1 mm) 
y secada al aire 4-5 
Arena de cuarzo Granulometría: > 50 % de las 
partículas deben encontrarse 
en la banda de 50-200 μm 75-76 
Caolín Contenido en caolinita ≥ 
30 % 20 
Carbono orgánico Ajustado mediante adición de 
turba y arena 2 (± 0,5) 
Carbonato de calcio CaCO  3 , pulverizado, quími ­
camente puro 0,05 - 0,1 
Agua Conductividad ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Preparación  
La turba se seca al aire y se tritura hasta convertirse en un polvo fino. Se prepara 
en agua desionizada una suspensión de la cantidad necesaria de polvo de turba, utilizando un dispositivo de homogeneización de prestaciones elevadas. El pH de esta suspensión se ajusta a 5,5 ± 0,5 con CaCO
 3 . La suspensión se deja durante 
al menos dos días con agitación suave a 20 ± 2 °C, para estabilizar el pH e 
implantar un componente microbiano estable. Se vuelve a medir el pH, que debe quedar a 6,0 ± 0,5. A continuación se mezcla la suspensión de turba con los demás componentes (arena y caolín) y con agua desionizada para obtener un 
sedimento homogéneo con un contenido de agua del 30-50 % del peso seco del 
sedimento. Se vuelve a medir el pH de la mezcla final y se ajusta a 6,5-7,5 con CaCO
 3 en caso necesario. Se toman muestras del sedimento para determinar el 
peso seco y el contenido en carbono orgánico. Se recomienda a continuación que 
el sedimento artificial, antes de emplearse en el ensayo de toxicidad para quiro ­
nómidos, se someta durante siete días a las mismas condiciones que vayan a reinar posteriormente en el ensayo.
 
Almacenamiento  
Los componentes secos utilizados para preparar el sedimento artificial pueden 
almacenarse en un lugar fresco y seco, a temperatura ambiente. El sedimento 
(húmedo) ya preparado no debe almacenarse antes de su empleo en el ensayo. 
Debe utilizarse inmediatamente tras el tiempo de acondicionamiento de 7 días con que termina su preparación.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra. 
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Apéndice 4  
Características químicas aceptables del agua de dilución  
Sustancia Concentraciones  
Materia en partículas < 20 mg/l 
Carbono orgánico total < 2 mg/l Amoníaco no ionizado < 1 μg/l 
Dureza expresada en CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Cloro residual < 10 μg/l 
Plaguicidas organofosforados totales < 50 ng/l Plaguicidas organoclorados totales y bifenilos policlo ­
rados < 50 ng/l 
Cloro orgánico total < 25 ng/l
 
(*) Sin embargo, si se sospecha interacción entre los iones responsables de la dureza y la 
sustancia problema, debe utilizarse agua menos dura (por tanto, en esta situación no 
debe emplearse el medio M4 de Elendt).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Apéndice 5  
Orientaciones para el seguimiento de la aparición de las larvas de 
quironómidos  
Se ponen trampas de aparición en los vasos del ensayo. Estas trampas tienen que 
mantenerse desde el día 20 hasta el final del ensayo. A continuación figura el esquema de un ejemplo de trampa:
 
A: tamiz de nailon 
B: tazas de plástico invertidas 
C: vaso de exposición sin pico D: mirilla de tamiz para intercambio de agua 
E: agua 
F: sedimento  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  BIODEGRADABILIDAD FÁCIL—CO  2 EN RECIPIENTES 
SELLADOS (ENSAYO DEL ESPACIO DE CABEZA)  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 310 (2006). El presente método de ensayo es un método explo ­
ratorio para la evaluación de la biodegradabilidad fácil de las sustancias y aporta información similar a los seis métodos de ensayo descritos en el capítulo C.4-A a F del presente anexo. Por tanto, una sustancia que tenga 
resultados positivos con el presente método de ensayo puede considerarse 
fácilmente biodegradable y, en consecuencia, rápidamente degradable en el medio ambiente. 
2. Normalmente, la primera opción para someter a ensayo las sustancias poco 
solubles y las que se adsorben mucho ha sido el reconocido método del dióxido de carbono (CO
 2 ) (1), basado en el ensayo original de Sturm (2) 
para evaluar la biodegradabilidad de las sustancias orgánicas, mediante la 
medición del dióxido de carbono producido por la acción microbiana. Tam ­
bién se ha elegido para sustancias solubles (pero no volátiles), ya que el desprendimiento de dióxido de carbono es ampliamente considerado como 
la única prueba inequívoca de actividad microbiana. La eliminación del 
carbono orgánico disuelto puede verse afectada por procesos fisicoquímicos, como la adsorción, la volatilización, la precipitación o la hidrólisis, así como por la actividad microbiana, y son muchas las reacciones no biológicas que 
consumen oxígeno, mientras que es raro que se produzca CO
 2 a partir de 
sustancias orgánicas de forma abiótica. En el ensayo de Sturm, tanto original como modificado (1) (2), el CO
 2 pasa de la fase líquida a los recipientes 
absorbentes por arrastre (es decir, burbujeando aire tratado a través del 
medio líquido para eliminar el CO  2 ), mientras que en la versión de Larson 
(3) (4) el CO  2 se transfiere desde el recipiente de reacción a los absorbentes 
pasando aire exento de CO  2 a través del espacio de cabeza y, de forma 
adicional, sacudiendo continuamente el recipiente de ensayo. El recipiente 
de reacción se sacude solo en la modificación de Larson; la agitación se 
especifica solo para sustancias insolubles en la norma ISO 9439 (5) y en la versión original de EE. UU. (6), y en estas dos normas se especifica el arrastre en lugar de la sustitución del espacio de cabeza. En otro método 
oficial de la EPA norteamericana (7), basado en el método de Gledhill (8), 
el recipiente de reacción sacudido está cerrado a la atmósfera y el CO
 2 
producido se recoge en una trampa alcalina interna directamente desde la 
fase gaseosa, como en los frascos del respirómetro clásico de Warburg/Bar ­
croft. 
3. Sin embargo, se ha demostrado que se acumula carbono inorgánico (CI) en 
el medio durante la aplicación del ensayo de Sturm normal y modificado a 
una serie de sustancias (9). Durante la degradación de 20 mg C/l de anilina se encontró una concentración de CI de hasta 8 mg/l. Así pues, la recogida de CO
 2 en las trampas alcalinas no refleja fielmente la cantidad de CO  2 
producida por los microorganismos en fases intermedias de la degradación. 
Como resultado, la especificación de que > 60 % de la producción maxima teórica de CO
 2 (CO  2 T) debe recogerse dentro de un período de observación 
de 10 días (los 10 días inmediatamente siguientes a la consecución del 10 % 
de la biodegradación) para que una sustancia problema se clasifique como 
fácilmente biodegradable, no se cumplirá en el caso de ciertas sustancias que sí se clasificarían en esa categoría si se utilizara el método de la eliminación del carbono orgánico disuelto (COD). 
4. Cuando el porcentaje de degradación es menor que el valor previsto, es 
posible que se acumule CI en la solución de ensayo. En tales casos, la 
degradabilidad puede evaluarse con los otros ensayos de biodegrabilidad 
fácil.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Otros inconvenientes de la metodología de Sturm (que es engorrosa, exige 
mucho tiempo, se presta más al error experimental y no es aplicable a las 
sustancias volátiles) ya antes habían incitado a buscar una técnica de reci ­
piente cerrado, distinta de la Geldhill, en lugar del burbujeo de gas (10) (11). Boatman  et al  (12) revisaron los métodos anteriores y adoptaron un 
sistema de espacio de cabeza cerrado en el que se desprendía el CO
 2 a ese 
espacio al final de la incubación, al acidificar el medio. El CO  2 se midió 
analizando el carbono inorgánico mediante cromatografía de gases (GC) en muestras tomadas de forma automática en el espacio de cabeza, pero sin 
tener en cuenta el carbono inorgánico disuelto (CID) en la fase líquida. 
Además, los recipientes empleados eran muy pequeños (20 ml), con tan solo 10 ml de medio, lo que provocaba problemas, por ejemplo cuando se añadían las cantidades necesariamente muy pequeñas de sustancias pro ­
blema insolubles, o en el medio inoculado podía no haber microorganismos 
competentes (o no haberlos en número suficiente) para degradar las sustan ­
cias problema. 
6. Estas dificultades se han vencido mediante los estudios independientes de 
Struijs y Stoltenkamp (13) y de Birch y Fletcher (14), el último de los 
cuales se inspiró en su experiencia con los aparatos utilizados en el ensayo 
de degradación anaeróbica (15). En el primer método (13) se mide el CO
 2 
en el espacio de cabeza tras acidificación y equilibrado, mientras que en el 
segundo (14) el CID se mide tanto en la fase gaseosa como en la líquida, sin 
tratamiento; más del 90 % del CI formado se encontraba en la fase líquida. 
Ambos métodos aventajan al ensayo de Sturm en el sentido de que su sistema de ensayo es más compacto y manejable, es posible utilizarlos 
con sustancias químicas y evitan la posibilidad de retrasos en la medición 
del CO
 2 producido. 
7. Los dos enfoques se combinaron en la norma ISO sobre el CO  2 en el 
espacio de cabeza (16), que se sometió a un estudio interlaboratorios (17), y es esta norma la que forma la base del presente método de ensayo. De 
forma similar, los dos enfoques se han utilizado en el método de la EPA de 
EE. UU. (18). Se han recomendado dos métodos de medición del CO
 2 , a 
saber, el CO  2 en el espacio de cabeza previa acidificación (13) y el CI en la 
fase líquida tras la adición de un exceso de álcali. Este último método fue 
introducido por Peterson durante el ensayo interlaboratorios CONCAWE 
(19) de este método de espacio de cabeza modificado para medir la biode ­
gradabilidad intrínseca. Los cambios efectuados en la revisión de 1992 (20) de los métodos del capítulo C.4 del presente anexo para estudiar la biode ­
gradabilidad fácil se han incorporado al presente método de ensayo, de 
forma que, por lo demás, las condiciones (medio, duración, etc.) son las mismas que en el ensayo revisado de Sturm (20). Birch y Fletcher (14) han señalado que con este ensayo de espacio de cabeza se obtenían resultados 
muy similares a los obtenidos con las mismas sustancias en el ensayo 
interlaboratorios de la OCDE (21) de los métodos de ensayo revisados.
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
8. La sustancia problema, normalmente a la concentración de 20 mg C/l, como 
única fuente presente de carbono y de energía, se incuba en un medio amortiguador de sales minerales que se ha inoculado con una población 
mixta de microorganismos. El ensayo se lleva a cabo en frascos cerrados 
con un espacio de cabeza lleno de aire, que aporta una reserva de oxígeno para la biodegradación aerobia. El desprendimiento de CO
 2 derivado de 
la degradación aerobia final de la sustancia problema se determina midiendo 
el CI producido en los frascos de ensayo en exceso respecto al producido en 
los recipientes en blanco que contienen solamente medio inoculado. El grado de biodegradación se expresa en porcentaje de la producción máxima teórica de CI (CITe), sobre la base de la cantidad de sustancia problema (en 
carbono orgánico) añadida inicialmente. 
9. También puede medirse la eliminación del COD y/o el grado de biodegra ­
dación primaria de la sustancia problema (20).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMACIÓN SOBRE LA SUSTANCIA PROBLEMA 
10. Es preciso conocer el contenido de carbono orgánico (% p/p) de la sustancia 
problema, bien por su estructura química o bien por medición, de forma que sea posible calcular el porcentaje de degradación. En el caso de las sustan ­
cias problema volátiles, es útil disponer de la constante de la ley de Henry, 
medida o calculada, para determinar una relación adecuada entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido. También es conveniente disponer de información sobre la toxicidad de la sustancia problema para los microor ­
ganismos a la hora de seleccionar una concentración de ensayo adecuada y 
para interpretar los resultados que indiquen escasa biodegradabilidad: se recomienda incluir un control de la inhibición salvo que se sepa que la 
sustancia problema no es inhibidora de la actividad microbiana (véase el 
punto 24).
 
APLICABILIDAD DEL MÉTODO 
11. El ensayo es aplicable a las sustancias problema hidrosolubles e insolubles, 
aunque debe velarse por conseguir una buena dispersión de la sustancia 
problema. Utilizando la relación recomendada entre volumen del espacio de cabeza y volumen del líquido de 1:2, las sustancias volátiles con una constante de la ley de Henry de hasta 50 Pa.m
 3 .mol  –1 pueden someterse a 
ensayo, ya que la proporción de la sustancia problema en el espacio de 
cabeza no superará el valor del 1 % (13). Puede utilizarse un volumen menor del espacio de cabeza cuando se estudien sustancias que sean más volátiles pero cuya biodisponibilidad pueda ser limitante, en particular si son 
poco solubles en agua. Sin embargo, los usuarios deben velar por que la 
relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido y la concentración de la sustancia problema sean tales que se disponga de sufi ­
ciente oxígeno para que pueda darse una biodegradación aerobia completa 
(es decir, evitar el uso de una concentración elevada de sustrato y un 
pequeño volumen del espacio de cabeza). Pueden encontrarse orientaciones sobre esta cuestión en las referencias 13 y 23.
 
SUSTANCIAS DE REFERENCIA 
12. Para comprobar el procedimiento del ensayo, debe someterse al mismo, en 
paralelo, una sustancia de referencia de biodegradabilidad conocida. A estos efectos, pueden utilizarse anilina, benzoato de sodio o etilenglicol para el 
ensayo de sustancias problema hidrosolubles, y 1-octanol para el de sustan ­
cias problema poco solubles (13). La biodegradación de estas sustancias debe llegar a > 60 % del CITe en el plazo de 14 días.
 
REPRODUCIBILIDAD 
13. En el ensayo interlaboratorios del método (17), se obtuvieron los siguientes 
resultados aplicando las condiciones recomendadas, incluida la concentra ­
ción de 20 mg C de sustancia problema por litro.  
Sustancia problema Porcentaje medio de 
biodegradación 
(28 d) Coeficiente de va ­
riación 
(%) Número de labora ­
torios  
Anilina 90 16 17 
1-Octanol 85 12 14 
La variabilidad dentro del ensayo (reproducibilidad), utilizando anilina, era 
baja, con coeficientes de variabilidad no superiores al 5 % en casi todas las tandas de ensayos. En los dos casos en que la reproducibilidad era peor, la 
mayor variabilidad se debía probablemente a la alta producción de CI en las 
pruebas en blanco. La reproducibilidad era peor con el 1-octanol, pero aún así era menor del 10 % en el 79 % de las tandas de ensayos. Esta mayor variabilidad dentro del ensayo puede haberse debido a errores en la dosifi ­
cación, ya que es necesario inyectar pequeños volúmenes (de 3 a 4 μl) de 1- 
octanol en frascos de ensayo sellados. Se encuentran mayores coeficientes de variación cuando se emplean concentraciones menores de sustancia pro ­
blema, especialmente concentraciones inferiores a 10 mg C/l. Esto puede 
superarse parcialmente reduciendo la concentración de carbono inorgánico 
total (CIT) en el inóculo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. En un ensayo interlaboratorios de la UE (24) de cinco agentes tensioactivos 
a la concentración de 10 mg de C/l se obtuvieron los siguientes resultados:  
Sustancia problema Porcentaje medio de 
biodegradación 
(28 d) Coeficiente de 
variación 
(%) Número de 
laboratorios  
Tetrapropileno- 
benceno-sulfonato 17 45 10 
Di-iso-octilsulfo-succi ­
nato 
(aniónico) 72 22 9 
Cloruro de hexadecil- 
trimetilamonio (*) 
(catiónico) 75 13 10 
Iso-nonilfenol -(etoxi ­
lato)  9 
(no iónico) 41 32 10 
Coco-amida-propil 
dimetilhidroxi 
sulfobetaína (anfótera) 60 23 11
 
(*) Se añade SiO  2 para neutralizar la toxicidad.  
Los resultados indican que, en general, la variabilidad era mayor con los 
agentes tensioactivos menos degradados. La variabilidad dentro del ensayo era inferior al 15 % en más del 90 % de los casos, y los valores máximos llegaban al 30-40 %. 
NOTA: La mayoría de los agentes tensioactivos no son especies molecu ­
lares únicas sino mezclas de isómeros, homólogos, etc., que se 
degradan tras períodos de latencia característicos diferentes y con tasas cinéticas diferentes, lo que se plasma en curvas atenuadas, "borrosas", de forma que el valor de corte del 60 % puede no ser 
alcanzado dentro del período de observación de 10 días, incluso 
aunque cada especie molecular individual superara ese valor en el plazo de 10 días si se ensayara sola. Esto puede observarse tam ­
bién con otras mezclas complejas.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Equipo  
15. Equipo normal de laboratorio, además de lo siguiente: 
a) Frascos de suero de vidrio, cerrados con tapones de caucho butílico y 
cápsulas de aluminio. El tamaño recomendado es de "125 ml", con un volumentotal de unos 160 ml (en este caso, es necesario saber que el 
volumen de cada frasco es de 160 ± 1 ml). Puede emplearse un tamaño 
menor de recipiente cuando los resultados cumplen las condiciones des ­
critas en los puntos 66 y 67. 
b) Analizador de carbono u otro instrumento (por ejemplo, cromatógrafo de 
gases) para medir el carbono inorgánico.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) Jeringas de alta precisión para tomar muestras gaseosas y líquidas. 
d) Agitador orbital en un ambiente de temperatura controlada. 
e) Aporte de aire exento de CO  2 ; puede prepararse haciendo pasar aire a 
través de gránulos de cal sodada o utilizando una mezcla gaseosa con 80 % N
 2 /20 % O  2 (opcional) (véase el punto 28). 
f) Dispositivo de filtración por membrana de 0,20-0,45 μm de porosidad 
(opcional). 
g) Analizador de carbono orgánico (opcional).  
Reactivos  
16. Deben utilizarse siempre reactivos de pureza analítica.  
Agua  
17. Debe utilizarse agua destilada o desionizada, con ≤ 1 mg/l de carbono 
orgánico total. Esto corresponde a ≤ 5 % del contenido de carbono orgánico 
inicial introducido por la dosis recomendada de la sustancia problema.  
Soluciones madre para el medio de sales minerales  
18. Las soluciones madre y el medio de sales minerales son similares a los de 
los ensayos de la norma ISO 14593 (16) y del capítulo C.4 "biodegradabi ­
lidad fácil" (20). El uso de una concentración superior de cloruro de amonio 
(2,0 g/l en lugar de 0,5 g/l) debe ser necesario solo en casos muy excep ­
cionales como, por ejemplo, cuando la concentración de la sustancia pro ­
blema es > 40 mg C/l. Las soluciones madre deben conservarse refrigeradas 
y se eliminarán al cabo de seis meses, o antes si aparecen signos de preci ­
pitación o de crecimiento microbiano. Deben prepararse los seis frascos siguientes: 
a) Fosfato de dihidrógeno y potasio (KH
 2 PO 4 ) 8,50 g 
Fosfato de hidrógeno y dipotasio (K  2 HPO  4 ) 21,75 g 
Fosfato de hidrógeno y disodio dihidratado (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g 
Cloruro de amonio (NH  4 Cl) 0,50 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro. El pH de esta solución debe ser 7,4 
(± 0,2). Si no es así, debe prepararse una solución nueva. 
b) Cloruro de calcio dihidratado (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro. 
c) Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro. 
d) Cloruro de hierro (III) hexahidratado (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g 
Disolver en agua y enrasar a 1 litro; añadir una gota de HCl concentrado.  
Preparación del medio mineral  
19. Se mezclan 10 ml de la solución a) con unos 800 ml de agua (véase el 
punto 17), se añade a continuación 1 ml de las soluciones b), c) y d) y se enrasa a 1 litro con agua (punto 17).
 
Otros reactivos  
20. Ácido ortofosfórico concentrado (H  3 PO 4 ) (> 85 %, peso en volumen).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Solución de hidróxido de sodio 7M  
21. Se disuelven 280 g de hidróxido de sodio (NaOH) en 1 litro de agua (punto 
17). Se determina la concentración de CID de esta solución y se tiene en cuenta este valor cuando se calcule el resultado del ensayo (véanse los 
puntos 55 y 61), especialmente en función del criterio de validez del 
punto 66 b). Si la concentración de CID es demasiado elevada, debe pre ­
pararse una solución nueva.
 
Sustancia problema  
22. Preparar una solución madre de una sustancia problema suficientemente 
hidrosoluble, en agua (punto 17) o en el medio de ensayo (punto 19), a una concentración preferiblemente 100 veces mayor que la concentración final que se vaya a emplear en el ensayo; puede ser necesario ajustar el pH 
de la solución madre. La solución madre debe añadirse al medio mineral 
para conseguir una concentración final de carbono orgánico entre 2 y 40 mg C/l, preferiblemente 20 mg C/l. Si se utilizan concentraciones menores que estas, la precisión obtenida puede verse afectada. Las sustancias líquidas 
solubles e insolubles pueden añadirse a los recipientes directamente me ­
diante jeringas de precisión. Puede ser necesario aplicar un tratamiento especial a las sustancias problema poco solubles o insolubles (25). Las opciones son las siguientes: 
a) adición directa de cantidades pesadas conocidas; 
b) dispersión con ultrasonidos antes de la adición; 
c) dispersión con ayuda de agentes emulgentes, de los que se determinará si 
tienen algún efecto inhibidor o estimulante de la actividad microbiana antes de añadir la sustancia problema; 
d) adsorción de sustancias problema líquidas, o de una solución en un 
disolvente volátil adecuado, a un medio o soporte inerte (por ejemplo, filtro de fibras de vidrio), seguida de evaporación del disolvente even ­
tualmente empleado, y adición directa de cantidades conocidas; 
e) adición de un volumen conocido de una solución de la sustancia pro ­
blema en un disolvente muy volátil a un recipiente de ensayo vacío, 
seguido de evaporación del disolvente. 
Hay que someter a ensayo los agentes o disolventes utilizados en las letras 
c), d) y e) para comprobar si tienen efecto estimulante o inhibidor sobre la actividad microbiana [véase el punto 42 b)].
 
Sustancia de referencia  
23. Preparar una solución madre de la sustancia de referencia (soluble) en agua 
(punto 17), a una concentración de preferencia 100 veces mayor que la concentración final que se vaya a emplear en el ensayo (20 mg C/l).
 
Comprobación de la inhibición  
24. Es frecuente que las sustancias problema no muestren degradación signifi ­
cativa en las condiciones aplicadas en las evaluaciones de la biodegradación fácil. Una de las posibles causas es que la sustancia problema sea inhibidora para el inóculo a la concentración a la que se aplica en el ensayo. Puede 
incluirse en el diseño del ensayo una comprobación de la inhibición para 
facilitar la identificación ( a posteriori ) de la inhibición como posible causa o 
factor contribuyente. Por el contrario, la comprobación de la inhibición puede excluir tales interferencias y mostrar que la degradación nula o escasa 
debe atribuirse solo a que los microorganismos no son capaces de atacar la 
sustancia en la condiciones del ensayo. A fin de obtener información sobre la toxicidad de la sustancia problema para los microorganismos (aerobios), preparar una solución del medio de ensayo con la sustancia problema y la 
sustancia de referencia (punto 19), cada una a las mismas concentraciones 
que se añaden en el ensayo en sí (véanse los puntos 22 y 23).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inóculo  
25. El inóculo puede obtenerse de diversas fuentes: lodo activado, efluente de 
aguas residuales (no cloradas), aguas superficiales y suelos, o de una mezcla de estas (20). La actividad biodegradante de la fuente debe comprobarse 
utilizando una sustancia de referencia. Independientemente de la fuente, no 
deben utilizarse microorganismos que se hayan expuesto anteriormente a la sustancia problema, si se quiere emplear el procedimiento como ensayo de la biodegradabilidad fácil.
 
Advertencia: Hay que manejar con cuidado el lodo activado, las aguas 
residuales y los efluentes de aguas residuales, debido a su contenido en organismos patógenos. 
26. Según la experiencia, el volumen óptimo del inóculo es aquel que: 
— resulta suficiente para dar una actividad de biodegradación adecuada, 
— degrada la sustancia de referencia en el porcentaje estipulado (véase el 
punto 66), 
— da entre 10
 2 y 10  5 unidades formadoras de colonias por mililitro en la 
mezcla final, 
— da normalmente una concentración de 4 mg/l de sólidos en suspensión 
en la mezcla final cuando se utiliza lodo activado; es posible emplear 
concentraciones de hasta 30 mg/l, pero pueden aumentar significativa ­
mente la producción de CO  2 de los blancos (26), 
— contribuye con menos del 10 % de la concentración inicial de carbono 
orgánico introducido por la sustancia problema, 
— se encuentra generalmente en la banda de 1 a 10 ml de inóculo por litro 
de solución de ensayo.  
Lodo activado  
27. Se recoge, justo antes del proceso, lodo activado del depósito de aireación 
de una depuradora de aguas residuales o de una instalación de laboratorio 
que trate predominantemente aguas residuales domésticas. En caso necesa ­
rio, deben retirarse las partículas gruesas por tamizado (por ejemplo, con un tamiz de 1 mm
 2 de malla) y el lodo ha de mantenerse en condiciones 
aerobias hasta el momento de su utilización. 
28. También, después de eliminar las eventuales partículas gruesas, puede de ­
jarse sedimentar o centrifugarse (por ejemplo, 1 100 × g durante 10 min). Se 
desecha el sobrenadante. El lodo puede lavarse en la solución de minerales. Se suspende el lodo concentrado en medio mineral para obtener una con ­
centración de 3 a 5 g de sólidos en suspensión/1 y después se somete a 
aireación hasta que se utilice. 
29. El lodo debería obtenerse de una depuradora convencional que trabaje ade ­
cuadamente. Si el lodo tiene que obtenerse de una depuradora de elevado 
rendimiento o se piensa que contiene inhibidores, debería lavarse. El lodo resuspendido se mezcla bien y a continuación se deja sedimentar o se centrifuga, se desecha el sobrenadante y se vuelve a suspender el lodo 
lavado en otro volumen de medio mineral. Este procedimiento se repite 
hasta que se considere que el lodo queda exento de un exceso de sustrato o de inhibidor. 
30. Después de conseguir la resuspensión completa, o con el lodo sin tratar, se 
toma una muestra justo antes de su utilización para determinar el peso seco de los sólidos en suspensión. 
31. Otra posibilidad diferente es homogeneizar lodo activado (de 3 a 5 g de 
sólidos suspendidos/1). Se trata el lodo en un mezclador Waring durante 2 minutos a velocidad media. El lodo mezclado se deja sedimentar durante 30 
minutos, o más en caso necesario, y se decanta el líquido para utilizarlo 
como inóculo en la proporción de unos 10 mg/l de medio mineral.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Puede conseguirse una reducción aún mayor del desprendimiento de CO  2 en 
el blanco aireando el lodo hasta el día siguiente con aire exento de CO  2 . 
Utilizar como concentración del inóculo en este ensayo 4 mg/l de sólidos del lodo activado (13).
 
Efluente secundario de aguas residuales  
33. El inóculo puede obtenerse también a partir del efluente secundario de una 
depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba predominante ­
mente aguas residuales domésticas. Mantener la muestra en condiciones aerobias y utilizarla el día de la toma, o acondicionarla previamente en 
caso necesario. El efluente debe filtrarse por un filtro grueso para eliminar 
las partículas gruesas y se mide el valor del pH. 
34. Para reducir su contenido de CI, se hace pasar por el filtrado aire exento de 
CO
 2 (punto 15, letra e) durante 1 h, manteniendo el pH a 6,5 mediante el 
uso de ácido ortofosfórico (punto 20). El valor del pH se restaura a su valor 
original con hidróxio de sodio (punto 21) y, después de dejar sedimentar 
durante 1 h aproximadamente, se toma un volumen adecuado del sobrena ­
dante para la inoculación. Este procedimiento de arrastre reduce el contenido de CI del inóculo. Por ejemplo, cuando se utilizaba como inóculo el volu ­
men recomendado máximo de efluente sometido al arrastre y filtrado (100 
ml) por litro, la cantidad de CI presente en los recipientes de control en blanco estaba en la banda de 0,4-1,3 mg/l (14), lo que correspondía a entre el 2 y el 6,5 % del C de la sustancia problema a 20 mg C/l y entre el 4 y el 
13 % a 10 mg C/l.
 
Aguas superficiales  
35. Se toma una muestra de un agua superficial adecuada. Debe mantenerse en 
condiciones aerobias y utilizarse el mismo día de la toma. En caso necesa ­
rio, la muestra debe concentrarse por filtración o centrifugación. El volumen de inóculo que se vaya a utilizar en cada recipiente de ensayo debe cumplir los criterios del punto 26.
 
Suelos  
36. Se toma una muestra de un suelo adecuado, recogida a una profundidad de 
hasta 20 cm por debajo de la superficie del suelo. Hay que retirar las 
piedras, restos vegetales e invertebrados de la muestra de suelo antes de 
pasarla por un tamiz de 2 mm de malla (si la muestra está demasiado húmeda para tamizarla inmediatamente, se deja secar parcialmente al aire para facilitar el tamizado). Debe mantenerse en condiciones aerobias y 
utilizarse el mismo día de la toma; si la muestra se transporta en una bolsa 
de polietileno negra sin cerrar completamente, puede conservarse en la bolsa hasta un mes a una temperatura de entre 2 y 4 °C.
 
Preacondicionamiento del inóculo  
37. Los inóculos pueden estar preacondicionados a las condiciones experimen ­
tales, pero no preadaptados a la sustancia problema. El preacondiciona ­
miento puede reducir el desprendimiento de CO  2 del blanco. El preacondi ­
cionamiento consiste en airear el lodo activado, tras diluirlo en el medio de 
ensayo hasta una concentración de 30 mg/l, con aire húmedo exento de CO  2 
durante un máximo de 5 o 7 días a la temperatura del ensayo.  
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO  
Número de frascos  
38. El número de frascos [punto 15, letra a)] necesarios para un ensayo depen ­
derá de la frecuencia de los análisis y de la duración del ensayo. 
39. Se recomienda analizar frascos por triplicado tras un número suficiente de 
intervalos de tiempo, de forma que pueda señalarse el período de observa ­
ción de 10 días. También se analizan al final del ensayo al menos cinco frascos de ensayo [punto 15, letra a)] de los conjuntos a), b) y c) (véase el 
punto 42), para permitir el cálculo de los intervalos de confianza del 95 % 
del valor medio del porcentaje de biodegradación.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Medio inoculado  
40. El inóculo se emplea a la concentración de 4 mg/l de sólidos secos del lodo 
activado. Preparar inmediatamente antes del uso una cantidad suficiente de medio inoculado añadiendo, por ejemplo, 2 ml de lodo activado tratado de 
forma adecuada (puntos 27 a 32) a la concentración de 2 000 mg/l a 1 litro 
de medio de sales minerales (punto 19). Cuando deba utilizarse efluente secundario de aguas residuales, añadir hasta 100 ml de efluente (punto 33) a 900 ml de medio de sales minerales (punto 19) y enrasar a 1 litro con 
medio.
 
Preparación de los frascos  
41. Se ponen en frascos replicados alícuotas de medio inoculado para obtener 
una relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido de 1:2 
(por ejemplo, añadir 107 ml a frascos de 160 ml de capacidad). Es posible utilizar otras proporciones, pero téngase en cuenta la advertencia del punto 11. Independientemente del tipo de inóculo utilizado, ha de ponerse 
atención para que el medio inoculado se mezcle adecuadamente a fin de 
garantizar que se distribuye de manera uniforme en los frascos de ensayo. 
42. Se preparan conjuntos de frascos [punto 15, letra a)] que contengan lo 
siguiente: 
a) recipientes de ensayo (denominados F
 T ) que contengan la sustancia pro ­
blema; 
b) controles en blanco (denominados F  B ) que contengan el medio de ensayo 
más el inóculo; deben añadirse también las eventuales sustancias, disol ­
ventes, agentes o filtros de fibra de vidrio que se utilicen para introducir la sustancia problema en los recipientes de ensayo; 
c) recipientes (denominados F
 C ) para comprobar el procedimiento que con ­
tengan la sustancia de referencia; 
d) en caso necesario, recipientes (denominados F  I ) para comprobar un posi ­
ble efecto inhibidor de la sustancia problema que contengan tanto la 
sustancia problema como la sustancia de referencia a las mismas concen ­
traciones (punto 24) que se encuentran en los frascos F  T y F  C , respec­
tivamente; 
e) recipientes (denominados F  S ) para comprobar una possible degradación 
abiótica como en la letra a) más 50 mg/l HgCl  2 o esterilizados de alguna 
otra manera (por ejemplo, mediante autoclavado). 
43. Las sustancias problema y sustancias de referencia hidrosolubles se añaden 
como soluciones madre acuosas (puntos 22, 23 y 24) para dar una concen ­
tración de entre 10 y 20 mg C/l. 
44. Las sustancias problema y sustancias de referencia insolubles se añaden a 
los frascos de diversas formas [véase el punto 22, letras a) a e)] según la 
naturaleza de la sustancia problema, bien antes o bien después de la adición del medio inoculado, en función del método de tratamiento de la sustancia problema. Si se aplica uno de los procedimientos indicados en el punto 22, 
letras a) a e), los frascos en blanco F
 B [punto 42, letra b)] deben tratarse de 
forma similar, pero excluyendo la sustancia problema o la sustancia de referencia. 
45. Las sustancias problema volátiles deben inyectarse en frascos sellados 
(punto 47) mediante una microjeringa. La dosis se calcula a partir del 
volumen inyectado y de la densidad de la sustancia problema. 
46. En caso necesario, se añade agua a los recipientes para obtener el mismo 
volumen de líquido en cada uno de ellos. Ha de velarse por que la relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido (normalmente, 1:2) y la concentración de la sustancia problema sean tales que se disponga de 
suficiente oxígeno en el espacio de cabeza para permitir una biodegradación 
completa.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. A continuación se sellan todos los frascos, por ejemplo con diafragmas de 
caucho butílico y cápsulas de aluminio. Las sustancias problema volátiles 
deben añadirse en esta fase (punto 45). Si ha de seguirse el descenso de la concentración de COD de la solución de ensayo y han de realizarse análisis a tiempo cero para determinar la concentración de CI inicial [controles 
estériles, punto 42, letra e)] u otros parámetros, tomar una muestra apropiada 
del recipiente de ensayo. Este recipiente y su contenido se desechan a continuación. 
48. Los frascos sellados se colocan en un agitador rotatorio [punto 15, letra d)], 
con una velocidad de agitación suficiente para mantener el contenido de los 
frascos bien mezclado y en suspensión (por ejemplo, de 150 a 200 rpm), y se incuban a oscuras y a 20 °C, con una precisión de ± 1 °C.
 
Muestreo  
49. El patrón de muestreo dependerá del período de latencia y de la tasa cinética 
de biodegradación de la sustancia problema. Se toman frascos para anali ­
zarlos el mismo día del muestreo, que debe hacerse al menos una vez por 
semana o con más frecuencia (por ejemplo, dos veces por semana) si hace falta obtener la curva de degradación completa. Se toma del agitador el número necesario de frascos replicados, que correspondan a F
 T , F B y F  C 
y, cuando se utilicen, F  I y F  S (véase el punto 42). El ensayo dura normal ­
mente 28 días. Si la curva de biodegradación indica que se alcanza una meseta antes del día 28, el ensayo puede darse por concluido sin llegar al día 28. Tomar muestras de los cinco frascos reservados para el día 28 del 
ensayo a fin de analizarlas y utilizar los resultados para calcular los límites 
de confianza o el coeficiente de variación del porcentaje de degradación. No es necesario tomar con tanta frecuencia como de los demás frascos muestras de los que correspondan a las comprobaciones de la inhibición y 
de la degradación abiótica; es suficiente con los días 1 y 28.
 
Análisis de carbono inorgánico (CI)  
50. La producción de CO  2 en los frascos se determina midiendo el aumento de 
la concentración de carbono inorgánico (CI) durante la incubación. Se dis ­
pone de dos métodos recomendados para medir la cantidad de CI producida 
en el ensayo, y se describen inmediatamente a continuación. Dado que los 
métodos pueden dar resultados ligeramente diferentes, en cada tanda de ensayos hay que utilizar uno solo. 
51. Se recomienda el método a) si resulta probable que el medio contenga restos 
de, por ejemplo, un papel de filtro de vidrio o sustancia problema insoluble. 
Este análisis puede realizarse utilizando un cromatógrafo de gases si no se dispone de analizador de carbono. Es importante que los frascos estén a la temperatura del ensayo (o cerca de esta) cuando se analice el gas del espacio 
de cabeza. El método b) puede ser más fácil para los laboratorios que 
utilicen analizadores de carbono para medir el CI. Es importante que la solución de hidróxido de sodio (punto 21) utilizada para convertir el CO
 2 
en carbonato sea recién preparada o bien que se conozca su contenido en CI, 
de forma que este pueda tenerse en cuenta a la hora de calcular los resul ­
tados del ensayo [véase el punto 66, letra b)].  
Método a): acidificación a pH < 3  
52. Antes de cada lote de análisis, se calibra el analizador de CI utilizando un 
patrón adecuado de CI (por ejemplo, CO  2 al 1 % p/p en N  2 ). Se inyecta 
ácido ortofosfórico concentrado (punto 20) a través del diafragma de cada 
frasco de la muestra para reducir el pH del medio a<3 (por ejemplo, añadir 
1 ml a 107 ml de medio de ensayo). Los frascos se vuelven a colocar en el agitador. Tras agitar durante una hora a la temperatura de ensayo, se sacan los frascos del agitador, se retiran alícuotas (por ejemplo, de 1 ml) de gas 
del espacio de cabeza de cada frasco y se inyectan en el analizador de CI. 
Las concentraciones medidas de CI se registran en mg C/l.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. El principio del presente método consiste en que, tras la acidificación hasta 
un pH<3 y la estabilización a 20 °C, la constante de equilibrio para la 
distribución del CO  2 entre las fases líquida y gaseosa de los frascos de 
ensayo es de 1,0 cuando se mide en concentraciones (13). Es necesario demostrar al menos una vez que esto es así con el sistema de ensayo, de 
la manera siguiente: 
Preparar frascos con 5 y 10 mg/l de CI utilizando una solución de carbonato 
de sodio anhidro (Na
 2 CO 3 ) en agua exenta de CO  2 , obtenida acidificando 
agua hasta llegar a un pH de 6,5 con ácido ortofosfórico concentrado (punto 
20), burbujeando hasta el día siguiente aire exento de CO  2 y elevando el pH 
con álcali hasta llegar a la neutralidad. Asegurarse de que la relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido es la misma que en los 
ensayos (por ejemplo, de 1:2). Acidificar y equilibrar como se describe en el 
punto 52, y medir las concentraciones de CI tanto en la fase del espacio de cabeza como en la del líquido. Comprobar que las dos concentraciones son la misma, teniendo en cuenta el error experimental. En caso contrario, el 
operario debe revisar los procedimientos. No es necesario efectuar esta 
verificación de la distribución del CI entre las fases líquida y gaseosa cada vez que se realiza el ensayo; en principio puede hacerse durante la calibración. 
54. Si se quiere medir la eliminación del COD (solo con sustancias problema 
hidrosolubles), hay que tomar muestras de la fase líquida de distintos frascos (no acidificados), filtrarlas por membrana e inyectarlas en el analizador de 
COD. Estos frascos pueden utilizarse en otros análisis en caso necesario, 
para medir la biodegradación primaria.
 
Método b): conversión del CO  2 en carbonato  
55. Antes de cada lote de análisis, calibrar el analizador de CI utilizando un 
patrón adecuado como, por ejemplo, una solución de bicarbonato sódico 
(NaHCO  3 ) en agua exenta de CO  2 (véase el punto 53) en la banda de 0 
a 20 mg/l de CI. Inyectar solución de hidróxido de sodio (7 M, punto 21) (por ejemplo, 1 ml en 107 ml de medio) a través del diafragma de cada frasco muestreado; agitar los frascos durante 1 h a la temperatura de ensayo. 
Usar la misma solución de NaOH en todos los frascos apartados un día 
determinado, pero no necesariamente en todos los muestreos efectuados a lo largo de un ensayo. Si se necesita conocer los valores absolutos de CI de los blancos en todos los muestreos, será necesario determinar el CI de la solu ­
ción de NaOH cada vez que se utilice. Sacar los frascos del agitador y dejar 
reposar. Se retiran con jeringa volúmenes adecuados (por ejemplo, de 50 a 1 000 μl) de la fase líquida de cada recipiente. Las muestras se inyectan en 
el analizador de CI y se registran las concentraciones de CI. Hay que velar 
por que el analizador empleado esté equipado de forma adecuada para tratar 
las muestras alcalinas preparadas según este método. 
56. El principio del presente método consiste en que, tras la adición de álcali y 
la agitación, se hace despreciable la concentración de CI en el espacio de 
cabeza. Es necesario demostrar al menos una vez que esto es así con el sistema de ensayo, utilizando patrones de CI, añadiendo álcali y dejando equilibrar, para medir a continuación la concentración de CI tanto en la fase 
del espacio de cabeza como en la líquida (véase el punto 53). La concen ­
tración en el espacio de cabeza debe aproximarse a cero. Esta comprobación de que la absorción de CO
 2 es prácticamente total no resulta necesario 
hacerla cada vez que se realiza el ensayo. 
57. Si se quiere medir la eliminación del COD (solo con sustancias problema 
hidrosolubles), hay que tomar muestras de la fase líquida de distintos frascos (a los que no se ha añadido álcali), filtrarlas por membrana e inyectarlas en 
el analizador de COD. Estos frascos pueden utilizarse en otros análisis en 
caso necesario, para medir la biodegradabilidad primaria.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
DATOS E INFORME  
Cálculo de los resultados  
58. Suponiendo una mineralización del 100 % de la sustancia problema en CO  2 , 
el CITe que supere el producido en los controles en blanco equivale al COT añadido a cada frasco de ensayo al inicio del ensayo; es decir: 
CITe ¼ COT 
La masa total (mg) del carbono inorgánico (CIT) de cada frasco es: 
CIT ¼ ðmg C en el líquido  þ mg C en el espacio de cabeza Þ 
¼ ðV
 L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Ecuación [1] 
donde: 
V L = volumen de líquido en el frasco (litros); 
C L = concentración de CI en el líquido (mg/l en carbono); 
V H = volumen del espacio de cabeza (litros); 
C H = concentración de CI en el espacio de cabeza (mg/l en carbono). 
Los cálculos del CIT de los dos métodos analíticos utilizados para medir el 
CI en este ensayo se describen más adelante, en los puntos 60 y 61. El 
porcentaje de biodegradación (% D) en cada caso viene dado por la fórmula siguiente: 
%D ¼
 ðCIT  t Ä CIT  b Þ 
COT Ü 100 Ecuación [2] 
donde: 
CIT  t = mg CIT en el frasco de ensayo en el tiempo t; 
CIT  b = mg CIT medio en los frascos en blanco en el tiempo t; 
COT = mg COT añadidos inicialmente al recipiente de ensayo. 
El porcentaje de biodegradación (% D) se calcula para los frascos de ensayo 
(F T ), de referencia (F  C ) y, cuando se incluyan, de control del seguimiento de 
la inhibición (F  I ) a partir de las respectivas cantidades de CIT producidas 
hasta cada tiempo de muestreo. 
59. Si se observa un aumento significativo del contenido de CIT de los con ­
troles estériles (F  S ) a lo largo del período de ensayo, puede concluirse que 
ha habido degradación abiótica de la sustancia problema, y hay que tener esto en cuenta al calcular el valor de D en la ecuación [2].
 
Acidificación a pH < 3  
60. Dado que la acidificación a pH < 3 y el equilibrado resulta en la igualación 
de la concentración de CIT en las fases líquida y gaseosa, solo debe medirse 
la concentración de CI en la fase gaseosa. Así pues, de la ecuación [1] se desprende que
 CIT ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , donde V  B = volumen 
del frasco de suero.  
Conversión del CO  2 en carbonato  
61. En este método se realizan los cálculos como en la ecuación [1], pero se 
ignora la cantidad despreciable de CI presente en la fase gaseosa, es decir,  
V H Ü C H ¼ 0, y  CIT ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Expresión de los resultados  
62. Se obtiene una curva de biodegradación representando el porcentaje de 
biodegradación, D, frente al tiempo de incubación y, si es posible, se indi ­
can las fases de latencia y de biodegradación y el período de observación de 
10 días, así como la fase de meseta, es decir, la fase en que se ha alcanzado 
la degradación máxima y se ha aplanado la curva de biodegradación. Si se obtienen resultados comparables con los recipientes de ensayo paralelos F
 T 
(< 20 % de diferencia), se representa una curva media (véase el apéndice 2, 
fig.1); en caso contrario, se representan las curvas de cada recipiente. Se 
determina el valor medio del porcentaje de biodegradación en la fase de meseta o se evalúa el valor máximo (por ejemplo, cuando la curva decrece 
en la fase de meseta), pero es importante evaluar que en este último caso el 
valor no es anómalo. Hay que indicar este nivel máximo de biodegradación en el informe de ensayo como "grado de biodegradación de la sustancia problema". Si el número de recipientes de ensayo es insuficiente para indi ­
car la fase de meseta, se utilizan los valores medidos el último día del 
ensayo para calcular el valor medio. Este último valor, la media de cinco réplicas, sirve para indicar la precisión con que se ha determinado el por ­
centaje de biodegradación. Indíquese también el valor obtenido al final del 
período de observación de 10 días. 
63. De la misma manera, se representa la curva para la sustancia de referencia, 
F
 C , y, si están incluidos, para la comprobación de la eliminación abiótica, F  S 
y el control de la inhibición, F  I . 
64. Se registran las cantidades de CIT presentes en los controles en blanco (F  B ), 
así como las de los frascos F  S (comprobación abiótica), si se han incuido en 
el ensayo los recipientes correspondientes. 
65. Calcular el valor de D correspondiente a los recipientes F  I , sobre la base del 
rendimiento de CI teórico previsto a partir de únicamente el componente de referencia de la mezcla. Si, al día 28, [(D
 FC ( 1 )– D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, 
puede aceptarse que la sustancia problema ha inhibido la actividad del 
inóculo, y esto puede explicar la obtención de bajos valores de D  FT en 
las condiciones del ensayo. En este caso, el ensayo puede repetirse utili ­
zando una concentración de ensayo menor y, de preferencia, reduciendo el CID en el inóculo y el CIT formado en los controles en blanco, ya que, si 
no, la menor concentración reduciría la precisión del método. También 
puede utilizarse otro inóculo. Si en el frasco F
 S (abiótico) se observa un 
aumento significativo (> 10 %) en la cantidad de CIT, es posible que se hayan dado procesos de degradación abiótica.
 
Validez de los resultados  
66. Se considera que un ensayo es válido si: 
a) el valor medio del porcentaje de degradación en los recipientes F  C que 
contienen la sustancia de referencia es > 60 % para el 14  o día de incu ­
bación, y 
b) el valor medio del CIT presente en los controles en blanco F  B al final del 
ensayo es > 3 mg C/l. 
Si no se respetan estos límites, hay que repetir el ensayo con un inóculo 
procedente de otra fuente o revisar los procedimientos aplicados. Por ejem ­
plo, si la obtención de un contenido elevado de CI en los blancos es un 
problema, debe seguirse el procedimiento contemplado en los puntos 27 a 32.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Porcentaje de degradación en los recipientes F  C que contienen la sustancia de referencia. 
( 2 ) Porcentaje de degradación en los recipientes F  I .
 67. Si la sustancia problema no alcanza el 60 % del CITe y se ha visto que no 
es inhibidora (punto 65), podría repetirse el ensayo con una concentración 
superior del inóculo (hasta 30 mg/l de lodo activado y 100 ml de efluente/l) o inóculo de otras fuentes, sobre todo si la degradación estaba en la banda del 20 al 60 %.
 
Interpretación de los resultados  
68. Una biodegradación > 60 % del CITe en el plazo de observación de 10 días 
en este ensayo demuestra que la sustancia problema es fácilmente biode ­
gradable en condiciones aerobias. 
69. Si no se alcanza el umbral del 60 % del CITe, determinar el valor de pH en 
los medios de los frascos que no se han acidificado ni alcalinizado; un valor inferior a 6,5 podría indicar que se ha producido nitrificación. En tal caso, repítase el ensayo con una solución amortiguadora de mayor concentración.
 
Informe del ensayo  
70. Elaborar una tabla con los valores del % D de cada uno de los frascos de 
ensayo (F  T ), de referencia (F  C ) y, si se han incluido, de control de la 
inhibición (F  I ) correspondientes a cada día muestreado. Si se obtienen re ­
sultados comparables con los frascos replicados, trazar la curva del valor 
medio del % D frente al tiempo. Registrar la cantidad de CIT en los blancos 
(F B ) y en los controles estériles (F  S ), así como el COD y otros parámetros, y 
su porcentaje de eliminación. 
71. Determinar el valor medio del % D en la fase de meseta, o utilizar el valor 
máximo si la curva de biodegradación decrece en la fase de meseta, y comunicarlo como "grado de biodegradación de la sustancia problema". Es importante asegurarse de que en este último caso el valor máximo no 
es anómalo. 
72. El informe del ensayo deberá incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Nombre común, nombre químico, número CAS, fórmula estructural, y 
propiedades fisicoquímicas pertinentes. 
— Pureza (impurezas) de la sustancia problema.  
Condiciones de ensayo:  
— Referencia al presente método de ensayo. 
— Descripción del sistema de ensayo utilizado (por ejemplo, volumen del 
recipiente, relación entre el volumen del espacio de cabeza y el del líquido, método de agitación, etc.). 
— Aplicación de la sustancia problema y de la sustancia de referencia al 
sistema de ensayo: concentración de ensayo utilizada y cantidad de carbono añadida a cada frasco de ensayo, eventual uso de disolventes. 
— Datos del inóculo empleado, eventual tratamiento y acondicionamiento 
previos. 
— Temperatura de incubación. 
— Validación del principio del análisis del CI. 
— Características principales del analizador de IC empleado (y de otros 
eventuales métodos analíticos aplicados). 
— Número de réplicas.  
Resultados:  
— Datos en bruto y valores calculados de biodegradabilidad en forma 
tabular.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— Gráficas del porcentaje de degradación frente al tiempo correspondientes 
a la sustancia problema y a la sustancia de referencia, fase de latencia, 
fase de degradación, período de observación de 10 días y pendiente. 
— Porcentaje de eliminación en la meseta, al final del ensayo y tras el 
período de observación de 10 días. 
— Motivos del eventual rechazo de los resultados del ensayo. 
— Cualquier otro dato que pueda ser pertinente sobre el procedimiento 
seguido. 
— Discusión de los resultados.  
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Capítulo C.4 del presente anexo. Determinación de la biodegradabilidad 
"fácil". Ensayo de desprendimiento de CO  2 (método C.4-C) 
(2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 
159-167. 
(3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161. 
(4) Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide 
recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic cons ­
tants, Chemosphere 33: 1195-1210. 
(5) ISO 9439 (1990; revisada en 1999). Calidad del agua. Evaluación de la 
biodegradabilidad aerobia final de los compuestos orgánicos en medio acuoso. Método por valoración del dióxido de carbono producido (Sturm). 
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and To ­
xic Substances Washington, DC. 
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. 
(8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929. 
(9) Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812. 
(10) Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing bio ­
degradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185. 
(11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53. 
(12) Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for mea ­
suring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 
233-243. 
(13) Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211. 
(14) Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemos ­
phere 23: 507-524. 
(15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust 
H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biode ­
gradation. Chemosphere 19: 1527-1550.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593 (1999). Calidad del agua. Evaluación de la biodegradabilidad 
aerobia final de los compuestos orgánicos en medio acuoso. Método de 
análisis del carbono inorgánico en recipientes cerrados (ensayo del CO  2 en 
el espacio de cabeza). 
(17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Che ­
mosphere 34: 1813-1822. 
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance, Washington, DC. 
(19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An "inherent" biodegradability test for oil products: 
description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219- 
3235. 
(20) Capítulo C.4 del presente anexo: Determinación de la biodegradabilidad 
"fácil". 
(21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. 
Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris. 
(22) Capítulo C.11 del presente anexo. Lodo activado: Prueba de inhibición de 
la respiración. 
(23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. 
Biodegradation 6: 319-327. 
(24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Cen ­
tre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK. 
(25) ISO 10634 (1996) Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación 
y tratamiento de los compuestos orgánicos poco solubles en agua para la 
subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Apéndice 1  
ABREVIATURAS Y DEFINICIONES  
CI: Carbono inorgánico.  
CO  2 Te: Dióxido de carbono teórico (mg); es la cantidad de dióxido de carbono 
que se calcula que va a producirse a partir del contenido en carbono, conocido o medido, de la sustancia problema cuando se mineraliza completamente; se ex ­
presa también como mg de dióxido de carbono producido por mg de sustancia 
problema.  
COD:  Carbono orgánico disuelto; es el carbono orgánico presente en solución o 
el que pasa a través de un filtro de 0,45 micrómetros o permanece en el sobre ­
nadante tras centrifugación a aproximadamente 4 000 g (± 40 000 m sec
 -2 ) du­
rante 15 minutos.  
CID:  Carbono inorgánico disuelto.  
CITe:  Carbono inorgánico teórico.  
CIT:  Carbono inorgánico total.  
Fácilmente biodegradable:  Categoría arbitraria de sustancias químicas que han 
pasado determinados ensayos exploratorios específicos en cuanto a la biodegra ­
dabilidad última; estos ensayos son tan estrictos que se acepta que estos com ­
puestos se degradan rápida y completamente en los medios ambientes acuáticos en condiciones aerobias.  
Período de observación de 10 días:  Son los 10 días que siguen inmediatamente 
al momento en que se alcanza el 10 % de degradación.  
Biodegradabilidad intrínseca:  Categoría de sustancias químicas que presentan 
signos inequívocos de biodegradación (primaria o final) en algún ensayo de 
biodegradabilidad.  
Biodegradación aerobia final:  Es el nivel de degradación al que llega la sus ­
tancia problema cuando es totalmente utilizada por microorganismos dando lugar 
a la producción de dióxido de carbono, agua, sales minerales y nuevos cons ­
tituyentes celulares microbianos (biomasa).  
Mineralización:  Degradación completa de una sustancia orgánica a CO
 2 y H  2 O 
en condiciones aerobias y a CH  4 , CO  2 y H  2 O en condiciones anaerobias.  
Fase de latencia:  Tiempo comprendido desde el inicio de un ensayo hasta que se 
consigue la aclimatación o adaptación de los microorganismos de degradación y 
llega a un nivel detectable el grado de biodegradación de una sustancia o materia orgánica problema (por ejemplo, hasta el 10 % de la biodegradación teórica máxima, o menos, en función de la exactitud de la técnica de medición).  
Fase de degradación:  Tiempo transcurrido desde el final de la fase de latencia 
hasta el momento en que se alcanza el 90 % del nivel máximo de degradación.  
Fase de meseta:  Fase en la que se ha alcanzado la degradación máxima y se ha 
aplanado la curva de biodegradación.  
Sustancia problema:  Toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este 
método de ensayo.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Apéndice 2  
Ejemplo de curva de biodegradación  
Figura 1  
Biodegradación del 1-octanol en el ensayo del espacio de cabeza de CO  2
 
Glosario:  
Biodegradación Fase de degradación Nivel máximo de biodegradación Fase de meseta 
Período de observación de 10 días 
Tiempo de ensayo (días)
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30.  BIOACUMULACIÓN EN OLIGOQUETOS TERRESTRES  
INTRODUCCIÓN 
1. El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo de la 
OCDE TG 317 (2010). Entre los métodos de ensayo relativos al destino 
en el medio ambiente, los denominados Bioconcentración — Ensayo diná ­
mico con peces [capítulo C.13 del presente anexo (49)] y Bioacumulación en oligoquetos bentónicos que viven en los sedimentos (53) se publicaron respectivamente en 1996 y 2008, respectivamente. Extrapolar datos de bioa ­
cumulación acuática a los organismos terrestres, como los gusanos de tierra, 
resulta difícil, si no imposible. Actualmente se utilizan modelos de cálculo basados en la lipofilia de la sustancia problema [por ejemplo, (14) (37)] para la evaluación de la bioacumulación de sustancias en el suelo como, por 
ejemplo, en el documento de orientación técnica de la UE (19). Ya se ha 
establecido la necesidad de disponer de un método específico del compar ­
timento [por ejemplo, (55)]. Esto es especialmente importante para la eva ­
luación del envenenamiento secundario en cadenas alimentarias terrestres 
(4). Varios métodos de ensayo nacionales se refieren a la cuestión de la 
bioacumulación en organismos diferentes de los peces, como, por ejemplo, (2) y (72). La American Society for Testing and Materials ha elaborado un método para medir la bioacumulación en gusanos de tierra ( Eisenia fetida,  
Savigny) y gusanos terrestres del género  Enchytraeus  (3). Un método reco ­
nocido internacionalmente para la determinación de la bioacumulación en suelo enriquecido mejorará la evaluación del riesgo que plantean las sustan ­
cias para los ecosistemas terrestres [por ejemplo, (25) (29)]. 
2. Los invertebrados que ingieren suelo están expuestos a las sustancias unidas 
a este. Entre dichos animales, los oligoquetos terrestres desempeñan una papel importante para la estructura y la función de los suelos (15) (20). 
Los oligoquetos terrestres viven en el interior del suelo y parcialmente en su 
superficie (especialmente en la capa de materia orgánica en descomposi ­
ción); suelen representar las especies más abundantes en términos de bio ­
masa (54). Al remover la tierra y servir de presa estos animales pueden 
influir mucho en la biodisponibilidad de las sustancias para otros organis ­
mos, como predadores invertebrados [por ejemplo, ácaros y escarabajos predadores (64)] o vertebrados [por ejemplo, zorros y gaviotas (18) (62)]. En el apéndice 5 se describen algunas especies de oligoquetos terrestres que 
se utilizan actualmente en ensayos ecotoxicológicos. 
3. La guía ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or 
Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm  Eisenia fetida  and the 
Enchytraeid Potworm  Enchytraeus albidus  (3) proporciona muchos datos 
fundamentales y útiles para la realización del presente método de ensayo sobre bioacumulación en el suelo. También se hace referencia en el presente método de ensayo al capítulo C.13 del presente anexo (Bioconcentración — 
Ensayo dinámico con peces) (49) y a las directrices TG 315 de la OCDE 
(Bioacumulación en oligoquetos bentónicos que viven en los sedimentos) (53). Asimismo, constituyen fuentes principales de información para el pre ­
sente método de ensayo la experiencia práctica con estudios de bioacumu ­
lación en el suelo y las publicaciones de la bibliografía, como, por ejemplo, 
(1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79). 
4. El método de ensayo es sobre todo aplicable a las sustancias orgánicas 
neutras y estables, que tienden a adsorberse al suelo. Es posible que este 
método de ensayo pueda aplicarse en los ensayos de bioacumulación de compuestos organometálicos estables que se asocian al suelo. También es aplicable a los metales y otros oligoelementos.
 
REQUISITO PREVIO 
5. Se han realizado ensayos para medir la bioacumulación en los oligoquetos 
terrestres en relación con metales pesados [véase por ejemplo (63)] y de sustancias orgánicas persistentes con un valor de log K
 ow entre 3,0 y 6,0 
[véase por ejemplo (40)]. Estos ensayos también son aplicables a: 
— las sustancias con un valor de log K  ow superior a 6,0 (sustancias super ­
hidrofóbicas),  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— las sustancias que pertenecen a una clase de sustancias orgánicas de las 
que se sepa que tienen potencial para bioacumularse en organismos 
vivos como, por ejemplo, las sustancias tensioactivas o muy adsorbentes, 
— las sustancias cuyas características estructurales indican potencial de 
bioacumulación como, por ejemplo, los análogos de sustancias con po ­
tencial de bioacumulación conocido, y 
— los metales. 
6. Antes de empezar el estudio ha de obtenerse información sobre la sustancia 
problema, como el nombre común, el nombre químico (de preferencia la denominación IUPAC), la fórmula estructural, el número de registro CAS, la pureza, las precauciones de seguridad, las condiciones adecuadas de conser ­
vación y los métodos analíticos. Además, deben conocerse los datos siguien ­
tes: 
a) hidrosolubilidad; 
b) coeficiente de reparto octanol/agua K
 ow ; 
c) coeficiente de reparto suelo/agua K  oc ; 
d) presión de vapor; 
e) degradabilidad (por ejemplo, en el suelo, en agua); 
f) metabolitos conocidos. 
7. Pueden utilizarse sustancias problema tanto con marcado radiactivo como 
sin él. Sin embargo, para facilitar el análisis se recomienda emplear sustan ­
cias problema con marcado radiactivo. La decisión dependerá de los límites de detección o de la necesidad de medir la sustancia problema inicial y sus 
metabolitos Si se utiliza una sustancia problema con marcado radiactivo y se 
miden los residuos radiactivos totales, es importante caracterizar estos resi ­
duos tanto en el suelo como en los organismos de ensayo en cuanto a los porcentajes de sustancia problema inicial y de otras sustancias marcadas, por 
ejemplo en muestras tomadas en el estado de equilibrio o al final de la fase 
de absorción, para poder calcular un factor de bioacumulación (BAF) de la sustancia problema inicial y de sus metabolitos importantes presentes en el 
suelo (véase el punto 50). Es posible que se tenga que modificar el método 
aquí descrito como, por ejemplo, para conseguir biomasa suficiente o para medir sustancias problema orgánicas no marcadas radiactivamente o meta ­
les. Cuando se miden los residuos radiactivos totales (por recuento de cen ­
telleo líquido tras la extracción, combustión o disolución de los tejidos), el 
factor de bioacumulación se basará en la sustancia problema inicial y en sus metabolitos. El cálculo del BAF se basará preferentemente en la concen ­
tración de la sustancia problema inicial en los organismos y en los residuos 
radiactivos totales. Posteriormente, debe calcularse el factor de acumulación 
biota-suelo (BSAF), normalizado teniendo en cuenta el contenido de lípidos de los gusanos y el contenido de carbono orgánico (CO) del suelo, a partir del BAF, para permitir comparar los resultados obtenidos con diferentes 
ensayos de bioacumulación. 
8. Debe conocerse la toxicidad de la sustancia problema para la especie utili ­
zada en el ensayo, por ejemplo en forma de concentración con efecto (ECx) o de concentración letal (LCx) por la fase de absorción [por ejemplo, (19)]. Normalmente, la concentración seleccionada de la sustancia problema será 
aproximadamente del 1 % de su LC
 50 aguda asintótica, y al menos diez 
veces superior a su límite de detección en el suelo por el método de análisis elegido. Cuando sea posible, se dará prioridad a los valores de toxicidad derivados de estudios a largo plazo con parámetros subletales (51) (52). Si 
no se dispone de tales datos, un ensayo de toxicidad aguda aportará infor ­
mación útil [véase, por ejemplo, (23)].
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Debe disponerse de un método analítico adecuado, de exactitud, precisión y 
sensibilidad conocidas para la cuantificación de la sustancia en las solucio ­
nes de ensayo, en el suelo y en el material biológico, así como de datos sobre la preparación y la conservación de las muestras, junto con las fichas de datos de seguridad de los materiales. Es necesario también conocer el 
límite de detección analítica de la sustancia problema tanto en el suelo como 
en los tejidos de los gusanos. Si se utiliza una sustancia problema con marcado radiactivo, debe conocerse la radiactividad específica (es decir, en Bq mol
 -1 ) y el porcentaje de radiactividad asociada con las impurezas. 
La radiactividad específica de la sustancia problema debe ser suficentemente 
elevada para facilitar el análisis, y las concentraciones de ensayo utilizadas no deben provocar efectos tóxicos. 
10. El ensayo puede efectuarse con suelo artificial o con suelos naturales. Antes 
del inicio del ensayo debe disponerse de información sobre las característi ­
cas del suelo natural empleado como, por ejemplo, origen del suelo o sus 
componentes, pH, contenido de carbono orgánico, granulometría (porcentaje de arena, limo y arcilla), y capacidad de retención de agua (WHC) (3) (48).
 
PRINCIPIO DEL ENSAYO 
11. Entre los parámetros que caracterizan la bioacumulación de una sustancia 
problema se cuentan el factor de bioacumulación (BAF), la constante de la 
velocidad de absorción (k  s ) y la constante de la velocidad de eliminación 
(k e ). En el apéndice 1 se dan las definiciones pertinentes. 
12. El ensayo se divide en dos fases: la de absorción (exposición) y la de 
eliminación (post-exposición). Durante la fase de absorción, se exponen al suelo, que se ha enriquecido con la sustancia problema, grupos de gusanos 
en paralelo (réplicas). Además de los animales de ensayo, se someten a las 
mismas condiciones pero sin la sustancia problema grupos de gusanos de control. Se miden el peso seco y el contenido de lípidos de los organismos de ensayo. Esto puede hacerse con gusanos del grupo de control. Pueden 
obtenerse valores analíticos de referencia (blanco) analizando muestras del 
suelo y de los gusanos de control. Para la fase de eliminación, los gusanos se pasan a un suelo libre de la sustancia problema. Siempre hay que hacer una fase de eliminación, salvo que la absorción de la sustancia problema 
durante la fase de exposición haya sido insignificante. La fase de elimina ­
ción aporta información sobre la velocidad a la que los organismos de ensayo excretan la sustancia problema [por ejemplo, (27)]. Si durante la fase de absorción no se ha llegado a un estado de equilibrio, es preferible 
que la determinación de los parámetros cinéticos (factor de bioacumulación 
cinético, BAFk) y las constantes de velocidad de absorción y de eliminación se base en el ajuste simultáneo de los resultados de las fases de absorción y de eliminación. La concentración de la sustancia problema en el interior o 
en la superficie de los gusanos es objeto de seguimiento a lo largo de ambas 
fases del ensayo. 
13. Durante la fase de absorción, se efectúan mediciones a los tiempos de 
muestreo hasta 14 días (enquitreidos) o 21 días (gusanos de tierra) hasta 
que se alcance el estado de equilibrio (11) (12) (67). El estado de equilibrio 
se alcanza cuando una representación de la concentración en los gusanos frente al tiempo es paralela al eje del tiempo, y tres análisis sucesivos de la concentración efectuados con muestras tomadas a intervalos de al menos dos 
días no muestran una diferencias entre sí superiores al ± 20 % sobre la base 
de comparaciones estadísticas (por ejemplo, análisis de varianza, análisis de regresión). 
14. La fase de eliminación consiste en transferir los organismos de ensayo a 
recipientes que contienen el mismo sustrato pero sin la sustancia problema. 
Durante la fase de eliminación, se llevan a cabo mediciones a los tiempos de 
muestreo durante 14 días (enquitreidos) o 21 días (gusanos de tierra) salvo que en alguna determinación analítica se ponga antes de manifiesto que se ha llegado a una reducción del 90 % de los residuos de la sustancia pro ­
blema en los gusanos. La concentración de la sustancia problema en los 
gusanos al final de la fase de eliminación se registra como residuos no
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
eliminados. El factor de bioacumulación en el estado de equilibrio (BAFss) 
se calcula de preferencia como la proporción de la concentración en gusanos 
(Ca) y en el suelo (Cs) en el estado de equilibrio aparente, y también como factor de bioacumulación cinético (BAFk) que es la proporción entre la constante de la velocidad de absorción desde el suelo (k
 s ) y la constante 
de la velocidad de eliminación (k  e ) (véanse las definiciones en el apéndice 
1), aceptando que la cinética es de orden 1 (véanse los cálculos en el apéndice 2). En caso de que claramente no pueda aplicarse la cinética de primer orden, será necesario emplear otros modelos. 
15. La constante de la velocidad de absorción, la constante de la velocidad de 
eliminación (o constantes, cuando participen otros modelos), el factor de bioacumulación cinético (BAFk) y, cuando sea posible, los límites de con ­
fianza de cada uno de estos parámetros, se calculan a partir de ecuaciones 
modelo con ayuda de ordenador (véanse orientaciones en el apéndice 2). La 
adecuación del ajuste de cualquier modelo puede determinarse a partir de, por ejemplo, el coeficiente de correlación o del coeficiente de determinación (si los coeficientes están próximos a la unidad, es que la adecuación es 
buena) o con la prueba de ji cuadrado. También puede ser indicativo de 
la calidad del ajuste del modelo el orden del error típico o el límite de confianza alrededor de los parámetros estimados. 
16. Para reducir la variabilidad de los resultados de los ensayos de sustancias 
problema con elevada lipofilia, los factores de bioacumulación deben ex ­
presarse en relación con el contenido de lípidos y el contenido de carbono orgánico (kg de carbono orgánico en el suelo/kg de contenido de lípidos en los gusanos). Este enfoque se basa en el hecho de que, con algunos tipos de 
sustancias químicas, hay una clara relación entre el potencial de bioacumu ­
lación y la lipofilia; esto está bien demostrado en peces (47). Hay una relación entre el contenido en lípidos de los peces y la bioacumulación de tales sustancias. Se han encontrado correlaciones similares en los organis ­
mos bentónicos [véanse, por ejemplo, (30) (44)]. Análogamente se ha de ­
mostrado esta correlación en el caso de los oligoquetos terrestres [véanse por ejemplo (5) (6) (7) (14)]. Si se dispone de suficiente tejido de gusanos, puede determinarse el contenido en lípidos de los animales de ensayo con el 
mismo material biológico que se utilice para determinar la concentración de 
la sustancia problema. Otra posibilidad es utilizar los animales de control para medir el contenido en lípidos.
 
VALIDEZ DEL ENSAYO 
17. Para que un ensayo sea válido, deben cumplir los siguientes criterios tanto 
los grupos de control como los de tratamiento: 
— Al final del ensayo, la mortalidad general durante las fases de absorción 
y de eliminación no debe superar el 10 % (gusanos de tierra) o el 20 % (enquitreidos) del número total de gusanos introducidos. 
— Respecto a  Eisenia fetida  y Eisenia andrei , la pérdida media de masa 
medida al final de la fase de absorción y al final de la fase de elimina ­
ción no debe superar el 20 % respecto al peso fresco (pf) al inicio de cada fase.
 
DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO  
Especies de ensayo  
18. Para el ensayo de bioacumulación se recomienda emplear varias especies de 
oligoquetos terrestres. Las especies  Eisenia fetida  o Eisenia andrei  (Lum­
bricidae), o  Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus,  o Enchytraeus lu ­
xuriosus  (Enchytraeidae), que son las más frecuentemente utilizadas, se 
describen en el apéndice 5.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Equipo  
19. Se tendrá cuidado de no utilizar, con ninguna parte del equipo, materiales 
que puedan disolver o adsorber la sustancia problema o lixiviar otras sus ­
tancias, o tener algún efecto adverso sobre los animales de ensayo. Pueden 
utilizarse recipientes normales rectangulares o cilíndricos, de materiales quí ­
micamente inertes y de una capacidad adecuada para la tasa de carga, es decir, para el número de gusanos de ensayo. Para los equipos que estén en contacto con los medios de ensayo pueden utilizarse acero inoxidable, plás ­
tico o vidrio. Los recipientes de ensayo deben estar cubiertos de forma 
adecuada para evitar que se escapen los gusanos, pero permitiendo que entre suficiente aire. En el caso de sustancias con elevados coeficientes de adsor ­
ción, como los piretroides sintéticos, puede ser necesario emplear vidrio 
silanizado. Será necesario, en estos casos, deshacerse de los equipos una vez usados (49). Debe evitarse que se escapen las sustancias problema con marcado radiactivo y también las sustancias volátiles. Deben emplearse 
trampas (por ejemplo, frascos lavadores de gas, de vidrio) con absorbentes 
adecuados para retener los eventuales residuos que se evaporen de los recipientes de ensayo.
 
Suelo  
20. El suelo de ensayo debe ser tal que permita la supervivencia y, preferente ­
mente, la reproducción de los organismos de ensayo durante los períodos de aclimatación y de ensayo, sin que aparezcan comportamientos ni aspectos anormales en los animales. Los gusanos deben enterrarse en el suelo. 
21. Se recomienda para usarlo como sustrato de los ensayos el suelo artificial 
descrito en el capítulo C.8 del presente anexo (48). En el apéndice 4 se 
explica la preparación del suelo artificial para emplearlo en los ensayos de 
acumulación, y se dan recomendaciones para su almacenamiento. El suelo artificial secado al aire puede conservarse a temperatura ambiente hasta el momento de su utilización. 
22. Sin embargo, como suelo para el ensayo o para el cultivo de los gusanos 
pueden emplearse suelos naturales procedentes de lugares exentos de con ­
taminación. Los suelos naturales deben caracterizarse al menos por su origen (lugar de recogida), pH, contenido de carbono orgánico, granulometría (por ­
centaje de arena, limo y arcilla), capacidad de retención de agua máxima del 
suelo (WHCmax), y contenido porcentual de agua (3). El análisis del suelo 
o de sus componentes para detectar microcontaminantes antes de la utiliza ­
ción debe aportar información útil. Si se utiliza suelo de campo de tierras agrícolas, no debe haberse tratado con productos fitosanitarios ni haberse 
fertilizado con estiércol de animales tratados durante al menos un año ni con 
fertilizantes orgánicos durante al menos seis meses antes del muestreo (50). En la referencia 3 se describen los procedimientos de manipulación de los suelos naturales antes de su empleo en los ensayo de ecotoxicología con 
oligoquetos en laboratorio. El período de almacenamiento de los suelos 
naturales en el laboratorio debe ser lo más breve posible.
 
Aplicación de la sustancia problema  
23. La sustancia problema se incorpora al suelo. Hay que tener en cuenta las 
propiedades fisicoquímicas de la sustancia problema. Las sustancias pro ­
blema hidrosolubles deben disolverse completamente en agua antes de mez ­
clarse con el suelo. El procedimiento de enriquecimiento del suelo con sustancias problema poco hidrosolubles implica el recubrimiento de uno o 
varios de los componentes del suelo (artificial) con la sustancia problema. 
Por ejemplo, la arena de cuarzo, o una porción de la misma, puede sumer ­
girse en una solución de la sustancia problema en un disolvente orgánico adecuado, que se evapora lentamente después hasta sequedad. La fracción 
recubierta puede mezclarse a continuación con el suelo húmedo. La ventaja 
principal de este procedimiento es que no se introduce ningún disolvente en
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
el suelo. Cuando se utiliza suelo natural, la sustancia problema puede aña ­
dirse introduciéndola en una porción de suelo secada al aire como se des ­
cribe más arriba respecto al suelo artificial, o agitando la sustancia problema en el suelo húmedo, con una fase posterior de evaporación si se utiliza agente solubilizante. En general, debe evitarse el contacto del suelo húmedo 
con los disolventes, en la medida de lo posible. Deben considerarse los 
elementos siguientes (3): 
— Si se utiliza un disolvente distinto del agua, debe ser uno miscible con 
esta y/o que pueda extraerse (por ejemplo, mediante evaporación), para 
dejar en el suelo solamente la sustancia problema. 
— Si se utiliza un control del disolvente, no es necesario emplear un con ­
trol negativo. El control del disolvente debe contener la máxima concen ­
tración de disolvente que se haya añadido al suelo y hay que utilizar disolvente del mismo lote empleado para hacer la solución madre. Los 
principales criterios para la selección de un agente solubilizante ade ­
cuado deben ser la toxicidad y la volatilidad del disolvente, y la solu ­
bilidad de la sustancia problema en el disolvente elegido. 
24. En el caso de sustancias poco solubles en agua y en disolventes orgánicos, 
es posible mezclar (por ejemplo, utilizando un mortero) entre 2,0 y 2,5 g de arena de cuarzo finamente molida por recipiente de ensayo con la cantidad 
de sustancia problema necesaria para obtener la concentración de ensayo 
deseada. Esta mezcla de arena de cuarzo y sustancia problema se añade al suelo previamente humedecido y se mezcla completamente con la cantidad adecuada de agua desionizada para obtener el contenido necesario de hu ­
medad. La mezcla final se reparte en los recipientes de ensayo. Se repite el 
procedimiento con cada concentración de ensayo, y se prepara asimismo un control adecuado con 2,0 – 2,5 g de arena de cuarzo finamente molida por recipiente de ensayo. 
25. Debe determinarse la concentración de la sustancia problema en el suelo tras 
su adición a este. Ha de verificarse que la sustancia problema está distri ­
buida de forma homogénea en el suelo antes de introducir los organismos de 
ensayo. Hay que indicar el método utilizado para añadir la sustancia pro ­
blema y los motivos de la elección del procedimiento concreto (24). 
26. Lo ideal es que se establezca el equilibrio entre el suelo y la fase de agua 
intersticial antes de añadir los organismos; se recomienda dejar un tiempo de cuatro días a 20 °C. Con muchas sustancias orgánicas poco hidrosolubles, el 
plazo necesario para alcanzar un equilibrio verdadero entre las fracciones 
adsorbidas y las disueltas puede ser del orden de días o de meses. En función del objeto del estudio, por ejemplo cuando se pretende simular las condiciones ambientales, el suelo al que se ha añadido la sustancia puede 
"envejecerse" durante un plazo mayor como por ejemplo, en el caso de los 
metales, de tres semanas a 20 °C (22).
 
Cultivo de los organismos de ensayo  
27. Es preferible mantener los gusanos en cultivos de laboratorio permanentes. 
En el apéndice 5 se dan orientaciones sobre los métodos de cultivo en 
laboratorio de  Eisenia fetida  y Eisenia andrei,  así como de especies de 
enquitreidos [véanse también (48) (51) (52)]. 
28. Los gusanos utilizados en los ensayos deben estar libres de enfermedades, 
anomalías y parásitos observables.  
REALIZACIÓN DEL ENSAYO 
29. Los organismos de ensayo se exponen a la sustancia problema durante la 
fase de absorción, la cual debe durar 14 días (con los enquitreidos) o 21 días 
(con los gusanos de tierra), salvo que se demuestre que se ha alcanzado el 
estado de equilibrio.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Para la fase de eliminación, los gusanos se pasan a un suelo libre de la 
sustancia problema. La primera muestra debe tomarse a las 4 – 24 h tras el 
inicio de la fase de eliminación. En el apéndice 3 se dan ejemplos de planes de muestreo con una fase de absorción de 21 días y una fase de eliminación también de 21 días.
 
Organismos de ensayo  
31. En muchas especies de enquitreidos terrestres, el peso de cada individuo es 
muy bajo (por ejemplo, de 5-10 mg de peso húmedo por individuo de  
Enchytraeus albidus  y aún menos en el caso de  Enchytraeus crypticus  o 
de Enchytraeus luxuriosus ); a fin de efectuar las mediciones del peso y el 
análisis químico, puede ser necesario agrupar los gusanos de los recipientes de ensayo replicados (es decir, todos los gusanos de un recipiente replicado se utilizarán para obtener un solo resultado de los tejidos analizados). A 
cada recipiente replicado se añaden 20 individuos de enquitreidos, y se 
utilizan al menos tres réplicas. Si el límite de detección analítica de la sustancia problema es elevado, puede ser necesario emplear más gusanos. Cuando se trate de especies de ensayo con mayor peso individual ( Eisenia 
fetida  y Eisenia andrei ), pueden emplearse recipientes replicados con un 
solo individuo. 
32. Los gusanos de tierra empleados en un ensayo deben tener pesos similares 
(por ejemplo, los individuos de  Eisenia fetida  y de  Eisenia andrei  deben 
tener un peso de 250 – 600 mg). Los enquitreidos (por ejemplo,  En­
chytraeus albidus ) deben tener una longitud aproximada de 1 cm. Todos 
los gusanos utilizados en un ensayo concreto deben proceder de la misma fuente, y ser adultos con clitelo (véase el apéndice 5). Ya que el peso y la edad de un animal pueden afectar a los valores del BAF (por ejemplo, 
debido a las variaciones en el contenido de lípidos o a la presencia de 
huevos), estos parámetros deben registrarse con exactitud y tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados. Además, pueden depositarse 
capullos durante el período de exposición, lo que también afecta a los 
valores del BAF. Se recomienda pesar una submuestra de la población de gusanos de ensayo antes del ensayo, para calcular el peso medio, tanto seco como húmedo. 
33. Debe ser elevada la proporción de suelo respecto a los gusanos, para mini ­
mizar la disminución de la concentración de la sustancia problema en el 
suelo durante la fase de absorción. Con  Eisenia fetida  y Eisenia andrei  se 
recomienda una cantidad mínima de 50 g de peso seco (p.s.) de suelo por gusano; con enquitreidos, la recomendación es de un mínimo de 10-20 g p.s. de suelo por recipiente de ensayo. Los recipientes deben contener una 
capa de suelo de 2-3 cm (enquitreidos) o 4-5 cm (gusanos de tierra). 
34. Los gusanos empleados en un ensayo se toman del cultivo (por ejemplo, en 
el caso de los entriqueidos utilizando unas pinzas de joyero). Se transfieren animales adultos a un suelo de ensayo no tratado para su aclimatación, y se les da comida (véase el punto 36). Si las condiciones de ensayo son dife ­
rentes de las condiciones de cultivo, debe ser suficiente una fase de acli ­
matación de 24 – 72 h para que los gusanos se adapten a las condiciones de ensayo. Tras su aclimatación, los gusanos de tierra se lavan transfiriéndolos a placas de vidrio (por ejemplo, placas Petri) que contengan agua limpia, y 
después se pesan antes de añadirlos al suelo de ensayo. Antes de hacer la 
pesada, debe retirarse el exceso de agua de los gusanos, poniéndolos sua ­
vemente contra el borde de la placa o secándolos con precaución con una 
servilleta de papel humedecida ligeramente. 
35. Debe observarse y registrarse la conducta de enterramiento de los organis ­
mos de ensayo. En los ensayos con gusanos de tierra, los animales (de 
control y de tratamiento) se entierran normalmente en el suelo en el plazo de unas pocas horas; ha de comprobarse que esto es así en el plazo máximo de 24 h tras la adición de los gusanos a los recipientes de ensayo. Si los 
gusanos no se entierran en el suelo (por ejemplo, hay más del 10 % de 
gusanos que no se entierran a lo largo de más de la mitad de la fase de
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
absorción), puede ser que las condiciones de ensayo no sean adecuadas o 
bien que los organismos de ensayo no estén sanos. En tal caso, es necesario 
parar el ensayo y repetirlo. Los enquitreidos viven principalmente en los poros intersticiales del suelo, y con frecuencia su tegumento puede estar en contacto tan solo parcial con el sustrato que lo rodea; se acepta que la 
exposición de los enquitreidos enterrados y no enterrados es equivalente, 
y el que estos animales no se entierren no implica necesariamente que deba repetirse el ensayo.
 
Alimentación  
36. Debe preverse dar alimento a los animales cuando se utilice un suelo con bajo 
contenido de carbono orgánico total. Si se utiliza suelo artificial, se reco ­
mienda una tasa de alimentación semanal (es decir, los gusanos se alimentan una vez por semana) de 7 mg de estiércol seco por gramo de suelo en peso 
seco para los gusanos de tierra, y una tasa semanal de 2 – 2,5 mg de copos de 
avena molidos por gramo de suelo en peso seco para los enquitreidos (11). La primera ración de alimento debe mezclarse con el suelo justo antes de que se añadan los organismos de ensayo. Es preferible utilizar el mismo de tipo de 
alimento que en los cultivos (véase el apéndice 5).
 
Luz y temperatura  
37. Los ensayos deben efectuarse con un ciclo controlado de 16/8 horas de 
luz/oscuridad, con un nivel de iluminación preferentemente de 400 a 800 
lx en la zona de los recipientes de ensayo (3). La temperatura de ensayo debe ser de 20 ± 2 °C en toda la duración.
 
Concentraciones de ensayo  
38. Se utiliza una única concentración. Deben justificarse las situaciones en que 
sea necesario añadir una o varias concentraciones más. Si la toxicidad (EC  x ) 
de la sustancia problema está próxima al límite de detección analítica, se 
recomienda utilizar sustancias problema con marcado radiactivo de elevada 
radiactividad específica. En el caso de los metales, la concentración debe ser superior al nivel de fondo de los tejidos y del suelo.
 
Réplicas  
39. Para las mediciones cinéticas (fases de absorción y de eliminación), el 
número mínimo de réplicas de recipientes tratados debe ser de tres por punto de muestreo. El número total de réplicas preparadas debe ser sufi ­
ciente para todos los puntos de muestreo previstos de las fases de absorción 
y de eliminación. 
40. Para las observaciones y mediciones biológicas (por ejemplo, relación entre 
peso seco y peso húmedo, contenido de lípidos) y para el análisis de las concentraciones de fondo en los gusanos y el suelo, deben preverse al menos 12 recipientes replicados de un control negativo (cuatro muestreados 
al inicio, cuatro al final de la fase de absorción y cuatro al final de la fase de 
eliminación) si no se utiliza ningún disolvente distinto del agua. Si se emplea algún agente solubilizante para la aplicación de la sustancia proble ­
ma, debe utilizarse, además de las réplicas tratadas, un control del disolvente 
(cuatro recipientes de ensayo muestreados al inicio, cuatro al final de la fase 
de absorción y cuatro al final de la fase de eliminación) con todos los componentes salvo la sustancia problema. En este caso, pueden prepararse otros cuatro recipientes adicionales de un control negativo (sin disolvente) 
para permitir un muestreo opcional al final de la fase de absorción. Estas 
réplicas pueden compararse biológicamente con el control de disolvente para obtener información en cuanto a la posible influencia del disolvente sobre los organismos de ensayo. Se recomienda preparar un número suficiente de 
recipientes adicionales de reserva (por ejemplo, ocho) añadidos a los de 
tratamiento y de control.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Frecuencia de las mediciones de la calidad del suelo  
41. Al inicio y al final de las fases de absorción y de eliminación deben medirse 
el pH del suelo, el contenido de humedad del suelo y (continuamente) la temperatura de la sala del ensayo. Una vez por semana debe controlarse el 
contenido de humedad del suelo pesando los recipientes de ensayo y com ­
parando los pesos medidos en cada momento con los pesos iniciales del comienzo del ensayo. Las pérdidas de agua deben compensarse añadiendo agua desionizada.
 
Muestreo y análisis de los gusanos y del suelo  
42. En el apéndice 3 se encuentra un ejemplo de plan para las fases de absor ­
ción y de eliminación de los ensayos de bioacumulación en gusanos de tierra y en enquitreidos. 
43. Se toman muestras del suelo de los recipientes de ensayo para la determi ­
nación de la concentración de la sustancia problema antes de introducir los gusanos, y durante las fases de absorción y de eliminación. Durante el ensayo se determinan las concentraciones de la sustancia problema en los 
gusanos y en el suelo. En general, se miden las concentraciones totales en el 
suelo. Como opción pueden medirse las concentraciones en el agua inters ­
ticial; en tal caso, hay que aportar la justificación e indicar los métodos adecuados, antes del inicio del estudio, e incluir estos datos en el informe. 
44. Se toman muestras de los gusanos y del suelo al menos en seis ocasiones 
durante las fases de absorción y de eliminación. Si se demuestra la estabi ­
lidad de la sustancia problema, puede reducirse el número de análisis del 
suelo. Se recomienda analizar al menos tres réplicas al inicio y al final de la 
fase de absorción. Si la concentración en el suelo medida al final de la fase de absorción se desvía de la concentración inicial en más del 30 %, será necesario analizar también las muestras de suelo en otras fechas. 
45. En cada punto de muestreo se extraen los gusanos del suelo de una réplica 
dada (por ejemplo, después de extender el suelo de la réplica en una bandeja poco profunda, utilizando pinzas de joyero blandas) y se lavan rápidamente 
con agua en una bandeja poco profunda de vidrio o de acero. Se retira el 
exceso de agua (véase el punto 34). Se transfieren los gusanos con cuidado a un recipiente tarado y se pesan inmediatamente, incluido el contenido intestinal. 
46. A continuación hay que dejar que los gusanos de tierra ( Eisenia  sp.) se 
purguen del contenido intestinal durante una noche, por ejemplo, en un papel de filtro húmedo puesto en una placa Petri cerrada (véase el 
punto 34). Tras la purga, debe determinarse el peso de los gusanos para 
evaluar una posible disminución de la biomasa durante el ensayo (véanse los criterios de validez en el punto 17). La pesada y el análisis tisular de los enquitreidos se efectúan sin purgar, ya que tales operaciones resultan difí ­
ciles técnicamente debido al pequeño tamaño de estos gusanos. Tras la 
determinación final del peso, los gusanos se matan inmediatamente, utili ­
zando el método más adecuado (por ejemplo, con nitrógeno líquido, o congelando por debajo de – 18 °C). 
47. Durante la fase de eliminación, los gusanos van sustituyendo por suelo 
limpio el contenido intestinal contaminado. Esto significa que las medicio ­
nes de gusanos sin purgar (enquitreidos en este contexto) muestreados justo 
antes de la fase de eliminación incluyen el suelo contaminado presente en el 
intestino. Respecto a los oligoquetos acuáticos se acepta que, tras las pri ­
meras 4-24 h de la fase de eliminación, la mayor parte del contenido intestinal contaminado ha sido sustituido por sedimento limpio [véase, por 
ejemplo, (46)]. Se han comunicado observaciones similares en relación con 
los gusanos de tierra en estudios sobre la acumulación de cadmio y zinc radiomarcados (78). En los enquitreidos no purgados, la concentración de esta primera muestra de la fase de eliminación puede considerarse como la 
concentración tisular tras la purga intestinal. Para tener en cuenta la dilución 
de la concentración de la sustancia problema por el suelo no contaminado durante la fase de eliminación, es posible estimar el peso del contenido intestinal a partir de la relación entre el peso húmedo de los gusanos y el 
peso de las cenizas de los gusanos, o de la relación entre el peso seco de los 
gusanos y el peso de las cenizas de los gusanos.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Es preferible analizar las muestras de suelo y de gusanos inmediatamente 
después de haberlas tomado (es decir, en el plazo de 1 o 2 días) para evitar 
la degradación y otras pérdidas, y se recomienda calcular las velocidades aproximadas de absorción y de eliminación según se va llevando a cabo el ensayo. Si se retrasa el análisis, las muestras deben conservarse siguiendo un 
método adecuado como, por ejemplo, mediante congelación ( ≤ –18 °C). 
49. Hay que comprobar que la precisión y la reproducibilidad del análisis quí ­
mico, así como la recuperación de la sustancia problema de las muestras de 
suelo y de gusanos, son satisfactorias para el método considerado; deben 
indicarse la eficiencia de la extracción, el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ). Análogamente hay que comprobar que la sustancia problema no es detectable en los recipientes de control a concen ­
traciones superiores a la de fondo. Cuando la concentración de la sustancia 
problema en el organismo de ensayo Ca es > 0 en los gusanos de control, debe incluirse en el cálculo de los parámetros cinéticos (véase el apéndice 2). Todas las muestras deben manipularse a lo largo de todo el 
ensayo de manera que se minimicen la contaminación y las pérdidas (por 
ejemplo, derivadas de la adsorción de la sustancia problema al dispositivo de muestreo). 
50. Cuando se trabaja con sustancias problema radiomarcadas, es posible ana ­
lizar la sustancia original y sus metabolitos. La cuantificación de la sustancia problema original y de sus metabolitos en el estado de equilibrio o al final 
de la fase de absorción proporciona importante información. Las muestras 
deben "limpiarse" después, de manera que pueda cuantificarse aparte la sustancia problema original. Si alguno de los distintos metabolitos supera el 10 % de la radiactividad total de la muestra o muestras analizadas, se 
recomienda identificarlo. 
51. Hay que registrar y comunicar la recuperación total y la recuperación de la 
sustancia problema en gusanos, suelo y, si se utilizan, trampas que conten ­
gan absorbentes para retener la sustancia problema evaporada. 
52. Es aceptable mezclar los individuos muestreados de un recipiente de ensayo 
dado en el caso de los enquitreidos, que son más pequeños que los gusanos 
de tierra. Si esa mezcla implica reducir el número de réplicas, quedan limitados los procedimientos estadísticos que pueden aplicarse a los datos. Si se necesitan un procedimiento y una potencia estadística específica, con ­
vendrá entonces utilizar en el ensayo un número adecuado de recipientes de 
ensayo replicados, para conciliar la mezcla con el procedimiento y la po ­
tencia deseados. 
53. Se recomienda expresar el BAF tanto en función del peso seco total como, 
cuando se requiera (es decir, en el caso de las sustancias muy hidrofóbicas), en función del contenido lipídico. Deben aplicarse métodos adecuados para la determinación del contenido lipídico; a este propósito deben adaptarse 
algunos métodos existentes, véase por ejemplo (31) (58). Estos métodos 
aplican una técnica de extracción con cloroformo/metanol. Sin embargo, para evitar el uso de disolventes clorados debe utilizarse una modificación del método de Bligh y Dyer (9), como se describe en (17). Los diversos 
métodos pueden no dar valores idénticos, por lo que es importante precisar 
bien el método utilizado. Lo ideal es hacer el análisis de los lípidos, cuando sea posible (es decir, si se dispone de suficiente tejido de gusanos), con la misma muestra o extracto que se haya utilizado para el análisis de la 
sustancia problema, puesto que los lípidos deben a menudo retirarse del 
extracto antes de que este se pueda analizar por cromatografía (49). Otra posibilidad es utilizar animales del control para medir el contenido lipídico, el cual puede servir para normalizar los valores del BAF. Este último 
planteamiento reduce la contaminación del equipo con la sustancia 
problema.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
DATOS E INFORME  
Tratamiento de los resultados  
54. La curva de absorción de la sustancia problema se obtiene representando 
gráficamente su concentración en la superficie o el interior de los gusanos durante la fase de absorción en función del tiempo, con una escala aritmé ­
tica. Cuando la curva ha alcanzado la fase de meseta, o un estado de 
equilibrio (véanse las definiciones en el apéndice 1), el factor de bioacumu ­
lación en el estado de equilibrio (BAFss) se calcula con ayuda de la fórmula siguiente;
 
C a en el estado de equilibrio o al final de la fase de absorciún  ðmediaÞ 
C s en el estado de equilibrio o al final de la fase de absorciún  ðmediaÞ 
C a es la concentración de la sustancia problema en el organismo de ensayo 
C s es la concentración de la sustancia problema en el suelo 
55. Si no se alcanza el estado de equilibrio, debe determinarse el BAFk, a partir 
de las constantes de velocidad, en lugar del BAFss, como se describe a 
continuación: 
— Determinar el factor de acumulación (BAFK) como la relación ks/ke. — Es preferible calcular simultáneamente las constantes de absorción y de 
eliminación (véase la ecuación 11 del apéndice 2). 
— La constante de la velocidad de eliminación (k
 e ) se calcula normalmente 
a partir de la curva de eliminación (es decir, la gráfica de la concen ­
tración de la sustancia problema en los gusanos durante la fase de eliminación). A continuación se calcula la constante de la velocidad 
de absorción k
 s a partir de k  e y del valor de C  a derivado de la curva 
de absorción; véase en el apéndice 2 una descripción de estos métodos. Para obtener el factor de bioconcentración BAFK y las constantes de velocidad k
 s y k e se utilizarán preferiblemente métodos informáticos de 
estimación de parámetros no lineales. En caso de que la eliminación 
claramente no siga una cinética de primer orden, será necesario emplear otros modelos más complejos.
 
Informe del ensayo  
56. El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:  
Sustancia problema:  
— Toda la información disponible sobre la toxicidad aguda o a largo plazo 
(por ejemplo EC  x , LC  x , NOEC) de la sustancia problema respecto a los 
oligoquetos que viven en el suelo. 
— Pureza, naturaleza física y propiedades fisicoquímicas como, por ejem ­
plo, log K  ow , hidrosolubilidad. 
— Datos de identificación química, fuente de la sustancia problema, iden ­
tidad y concentración de los eventuales disolventes utilizados. 
— Si se utilizan sustancias problema radiomarcadas, la posición precisa 
de los átomos marcados, la radiactividad específica y la pureza radioquímica.  
Especie de ensayo:  
— Denominación científica, cepa, fuente, eventuales tratamientos previos, 
aclimatación, edad, rango de tamaños, etc.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Condiciones de ensayo:  
— Procedimiento de ensayo seguido. — Tipo y características del alumbrado y del fotoperíodo o fotoperíodos 
utilizados. 
— Diseño del ensayo (por ejemplo, número y tamaño de los recipientes de 
ensayo, masa de suelo y altura de la capa de suelo, número de réplicas, número de gusanos por réplica, número de concentraciones de ensayo, 
duración de las fases de absorción y eliminación, frecuencia del mues ­
treo). 
— Justificación de la elección del material de los recipientes de ensayo. — Método de preparación y aplicación de la sustancia problema, así como 
motivos para elegir un método específico. 
— Concentraciones de ensayo nominales, medias de los valores medidos y 
sus desviaciones típicas en los recipientes de ensayo, y método de 
obtención de estos valores. 
— Fuente de los componentes del suelo artificial o, si se utilizan medios 
naturales, origen del suelo, descripción de los eventuales tratamientos 
previos, resultados de los controles (supervivencia, desarrollo de la bio ­
masa, reproducción), características del suelo (pH, contenido de carbono orgánico total, granulometría (porcentaje de arena, limo y arcilla), WHCmax, contenido porcentual de agua al inicio y al final del ensayo, 
y otras mediciones realizadas eventualmente). 
— Información pormenorizada sobre el tratamiento de las muestras de suelo 
y de gusanos, incluidos datos de preparación, almacenamiento, adición de la sustancia problema, extracción y procedimientos (y precisión) del análisis de la sustancia problema en los gusanos y en el suelo y 
del contenido lipídico (si se mide), y recuperaciones de la sustancia 
problema.  
Resultados:  
— Mortalidad de los gusanos de control y de los gusanos de cada recipiente 
de ensayo, y eventuales comportamientos anormales observados (por 
ejemplo, evitación del suelo, ausencia de reproducción en un ensayo 
de bioacumulación con enquitreidos). 
— Relación de peso seco a peso húmedo del suelo y de los organismos del 
ensayo (útil a efectos de normalización). 
— Pesos húmedos de los gusanos a cada punto temporal de muestreo; en el 
caso de los gusanos de tierra, los pesos húmedos al inicio del ensayo y a 
cada punto temporal de muestreo antes y después de la purga intestinal. 
— El contenido lipídico de los organismos de ensayo (si se determina). — Curvas que indiquen las cinéticas de absorción y de eliminación de la 
sustancia problema en los gusanos y el tiempo hasta alcanzar el estado 
de equilibrio. 
— C
 a y C  s (con desviación típica y bandas, en caso adecuado) a todos los 
puntos temporales de muestreo (C  a expresada g kg  -1 de peso húmedo y 
seco de cuerpo completo, C  s expresada en g kg  -1 de peso húmedo y seco 
de suelo); si se necesita conocer el factor de acumulación 
biota-suelo (BSAF) (por ejemplo, a efectos de comparación de los re ­
sultados de dos o más ensayos realizados con animales de diferente contenido lipídico), C
 a puede expresarse además en g kg  -1 de contenido 
lipídico del organismo, y C  s puede expresarse en g kg  -1 de carbono 
orgánico del suelo. 
— BAF (expresado en kg de suelo ·kg -1 de gusanos), constante de la velo ­
cidad de absorción del suelo k  s (expresada en g de suelo kg  -1 de gusanos 
día -1 ), y constante de la velocidad de eliminación k  e (expresada en día  -1 ); 
también puede indicarse adicionalmente el BSAF (expresado en kg de 
CO del suelo kg  -1 de contenido lipídico de los gusanos).  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— Los siguientes parámetros, si se miden: porcentajes de sustancia original, 
metabolitos, y residuos ligados (es decir, porcentaje de sustancia pro ­
blema que no puede extraerse con métodos comunes de extracción) detectados en el suelo y en los animales de ensayo. 
— Métodos utilizados para los análisis estadísticos de los datos.  
Evaluación de los resultados:  
— Cumplimiento de los resultados con los criterios de validez recogidos en 
el punto 17, 
— resultados imprevistos o poco usuales como, por ejemplo, eliminación 
incompleta de la sustancia problema de los animales de ensayo.
 
BIBLIOGRAFÍA:  
(1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane 
(γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University 
Coimbra. 
(2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a. 
(3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia 
fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM Interna ­
tional, E1676-04: 26 pp. 
(4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The 
Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. 
Beek): Bioaccumulation-New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276. 
(5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99. 
(6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Her ­
mens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earth ­
worms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 
25: 154-165. 
(7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191. 
(8) Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the 
species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13. 
(9) Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917. 
(10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p. 
(11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P 
(2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmen ­
tal Agency (Umweltbundesamt Berlin), R & D No.: 298 64 416. 
(12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioac ­
cumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes En ­
chytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196. 
(13) Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia 
fetida. J. Soils Sediments 3: 13-20.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100. 
(15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2-29. 
(16) Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The 
Netherlands, pp. 555-576. 
(17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and she ­
llfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and 
Testing Programme. 
(18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Ba ­
chmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey follo ­
wing field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Envi ­
ron. Contam. Toxicol. 29: 140-145. 
(19) Reglamento (CE) n  o 1907/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 
18 de diciembre de 2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Preparados Químicos, se 
modifica la Directiva 1999/45/CE y se derogan el Reglamento (CEE) 
n
 o 793/93 del Consejo y el Reglamento (CE) n  o 1488/94 de la Comisión, 
así como la Directiva 76/769/CEE del Consejo y las Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la Comisión (DO 
L 396 de 30.12.2006, p. 1). 
(20) Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp. 
(21) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris 
(22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes 
by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardi ­
sierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Re ­
port to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R & D No.: 204 67 458: 149 pp. Puede descargarse en 
la dirección: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf 
(23) Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI 
Technical Report 325: 57 pp. 
(24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. 
(25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection 
Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208. 
(26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897-1905. 
(27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501-1514. 
(28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von g-1,2,3,4,5,6-Hexa ­
chlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Di ­
chlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbrici ­
dae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF-Z. Umweltchem, Ökotox. 
15: 78-84. 
(30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcen ­
tration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231. 
(31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods 
for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099- 1105. 
(32) Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 
701-707. 
(33) Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for 
soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20. 
(34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxi ­
kologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81. 
(35) ISO 11268-2 (1998) Calidad del suelo: Efectos de los contaminantes en 
lombrices ( Eisenia fetida ). Parte 2: Determinación de los efectos en la 
reproducción. 
(36) Jaenike J (1982). " Eisenia foetida " is two biological species. Megadrilogica 
4: 6-8. 
(37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 
17: 2080-2090. 
(38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oli ­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961. 
(39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, De ­
Jong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of 
polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligo ­
chaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775. 
(40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei 
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404. 
(41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Com ­
parison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312. 
(42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232. 
(43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von
 14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, 137 pp. 
(44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aro ­
matic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595. 
(45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accu ­
mulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26. 
(46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with 
Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim. 
(48) Capítulo C.8 del presente anexo. Toxicidad para gusanos de tierra. (49) Capítulo C.13 del presente anexo. Bioconcentración: Ensayo dinámico con 
peces. 
(50) Capítulo C.21 del presente anexo. Microorganismos del suelo: Ensayo de 
transformación del nitrógeno. 
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris. 
(52) OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia An ­
drei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris. 
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris 
(54) Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388. 
(55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology 
Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396. 
(56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81. 
(57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia 
fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven. 
(58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436. 
(59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S. 
(60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an 
international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp. 
(61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, 
In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129. 
(62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Se ­
condary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 
2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127. 
(63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120. 
(64) Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 
413-433. 
(65) Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Caroli ­
nea 57: 93–100.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys. 
(67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563. 
(68) Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320. 
(69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scrog ­
gins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxico ­
logy. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac 
Press, Pensacola, 67-81. 
(70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxi ­
col. Chemistry 22: 1167-1171. 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation-Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin. 
(72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Du ­
luth, MN, March 2000. 
(73) Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285. 
(74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earth ­
worms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB). 
(75) Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Che ­
mosphere 21: 1023-1033. 
(76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409-417. 
(77) Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm 
Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165. 
(78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated flood ­
plain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851. 
(79) Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Apéndice 1  
DEFINICIONES  
Bioacumulación  es el aumento de la concentración de la sustancia problema en 
el interior o en la superficie de un organismo respecto a la concentración de esta sustancia en el medio ambiente. La bioacumulación es el resultado de procesos tanto de bioconcentración como de biomagnificación (véase más abajo).  
Bioconcentración  es el aumento de la concentración de la sustancia problema en 
el interior o en la superficie de un organismo derivado de la absorción de la sustancia solo a partir del medio circundante (es decir, a través de la superficie 
corporal y del suelo ingerido), respecto a la concentración de esta sustancia en el 
medio circundante.  
Biomagnificación  es el aumento de la concentración de la sustancia problema en 
el interior o en la superficie de un organismo derivado de la absorción a través de 
comida o presas contaminadas, respecto a la concentración de esta sustancia en la comida o en la presa. La biomagnificación puede provocar la transferencia o la acumulación de la sustancia dentro de redes alimentarias. 
La eliminación  de una sustancia problema es la pérdida de esta sustancia por 
parte del tejido del organismo de ensayo por procesos activos o pasivos que se producen independientemente de la presencia o ausencia de la sustancia en el medio circundante. 
El factor de bioacumulación  (BAF) en cualquier momento de la fase de absor ­
ción de este ensayo de bioacumulación es la concentración de la sustancia pro ­
blema en la superficie o en el interior del organismo de ensayo (C
 a en g·kg -1 de 
peso seco de gusanos) dividida por la concentración de la sustancia en el medio 
circundante (C  s en g·kg -1 de peso seco de suelo); la unidad del BAF es el kg de 
suelo·kg -1 de gusanos. 
El factor de bioacumulación en el estado de equilibrio  (BAF  ss ) es el BAF en 
dicho estado y no cambia significativamente a lo largo de un período prolongado de tiempo, durante el cual se mantiene constante la concentración de la sustancia problema en el medio circundante (C
 s en g.kg  -1 de peso seco de suelo). 
Los factores de bioacumulación  calculados directamente a partir de la relación 
entre la constante de la velocidad de absorción del suelo y la constante de la velocidad de eliminación (k
 s y k e , véase más adelante) se denominan factores de 
bioacumulación cinéticos (BAF  K ). 
El factor de acumulación biota-suelo  (BSAF) es la concentración (normalizada 
teniendo en cuenta el contenido lipídico) de la sustancia problema en la super ­
ficie o en el interior del organismo de ensayo, dividida entre la concentración 
(normalizada teniendo en cuenta el contenido de carbono orgánico) de la sustan ­
cia problema en el suelo en el estado de equilibrio. C  a se expresa entonces en 
g·kg -1 de contenido lipídico del organismo, y C  s en g·kg -1 de carbono orgánico 
del suelo; la unidad del BSAF es el kg de carbono orgánico ·kg -1 de lípidos. 
La meseta  o el  estado de equilibrio  se define como el equilibrio entre los 
procesos de absorción y de eliminación que se dan simultáneamente durante la fase de exposición. La fase de equilibrio se alcanza en la representación gráfica 
del BAF frente al tiempo cuando la curva se hace paralela al eje del tiempo y tres 
análisis sucesivos del BAF realizados con muestras tomadas a intervalos de, al menos, dos días presentan una diferencia máxima del ± 20 % entre sí, y no hay diferencias estadísticamente significativas entre los tres puntos temporales de 
muestreo. Si las sustancias problema se absorben con lentitud, es más apropiado 
que los intervalos sean semanales (49). 
El coeficiente de reparto carbono orgánico-agua  (K
 oc ) es la relación de la 
concentración de una sustancia en la fracción de carbono orgánico de un suelo 
respecto a su concentración en el agua, en equilibrio. 
El coeficiente de reparto octanol-agua  (K  ow ) es la relación entre la solubilidad 
de una sustancia en n-octanol y en agua, en equilibrio; también se denomina P  ow . 
El logaritmo de K  ow (log K  ow ) se utiliza como indicación del potencial de 
bioacumulación de una sustancia por los organismos acuáticos.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
La fase de absorción o de exposición  es el tiempo durante el cual los organis ­
mos de ensayo se exponen a la sustancia problema. 
La constante de la velocidad de absorción del suelo  (k s ) es el valor numérico 
que define la velocidad del aumento de la concentración de la sustancia problema en el organismo de ensayo debido a la absorción desde la fase del suelo. k
 s se 
expresa en g de suelo kg  -1 de gusanos d  -1 . 
La fase de eliminación  es el tiempo, tras la transferencia de los organismos de 
ensayo desde un medio contaminado a un medio exento de la sustancia proble ­
ma, durante el cual se estudia la eliminación (o la pérdida neta) de la sustancia por los organismos de ensayo. 
La constante de la velocidad de eliminación  (k
 e ) es el valor numérico que 
define la velocidad de reducción de la concentración de la sustancia problema 
en el organismo de ensayo, tras la transferencia de los organismos de ensayo desde un medio que contiene la sustancia problema hacia un medio exento de ella; k
 e se expresa en d  -1 . 
Sustancia problema:  Toda sustancia o mezcla sometida a ensayo con este 
método de ensayo.  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Apéndice 2  
Cálculo de los parámetros de absorción y de eliminación  
El parámetro principal del ensayo de bioacumulación es el factor de bioacumu ­
lación, el BAF. El BAF medido puede calcularse dividiendo la concentración en el organismo de ensayo, C
 a , por la concentración en el suelo, C  s , en el estado de 
equilibrio. Si no se alcanza el estado de equilibrio durante la fase de absorción, 
en lugar del BAFss se calcula el BAF  K a partir de las constantes de velocidad. 
Sin embargo, ha de señalarse si el BAF se refiere o no a las concentraciones en el estado de equilibrio. 
El medio usual de obtener el factor de bioacumulación cinético (BAF
 K ), la 
constante de la velocidad de absorción del suelo (k  s ) y la constante de la velo ­
cidad de eliminación (k  e ) es emplear métodos informáticos de estimación de 
parámetros no lineales, por ejemplo siguiendo los modelos descritos en (68). 
Dado un conjunto de datos secuenciales de concentración en el tiempo y las 
ecuaciones del modelo: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ecuación 1] 
o 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [ecuación 2] 
donde: 
C a = concentración de sustancia en los gusanos [g kg  -1 de peso húmedo o seco] 
k s = constante de la velocidad de absorción en los tejidos [g de suelo kg  -1 de 
gusanos d  -1 ] 
C a = concentración de sustancia en el suelo [g kg  -1 de peso húmedo o seco] 
k e = constante de la velocidad de eliminación [d  -1 ] 
t c = tiempo al final de la fase de absorción; 
estos programas informáticos calculan los valores de BAF  K , k s y k  e . 
Cuando la concentración de fondo en los gusanos no expuestos, por ejemplo en 
el día 0, se aparta significativamente de cero (como puede suceder, por ejemplo, con los metales), es necesario incluir la concentración de fondo (C
 a,0 ) en estas 
ecuaciones, que así se convierten en las siguientes: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ecuación 3] 
y 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [ecuación 4] 
En los casos en que se observe un descenso significativo de la concentración de 
la sustancia problema en el suelo a lo largo del tiempo durante la fase de 
absorción, pueden utilizarse los modelos siguientes, por ejemplo (67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 
0 t Þ [ecuación 5]  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
donde: 
C s = concentración de sustancia en el suelo [g kg  -1 de peso húmedo o seco] 
k 0 = constante de la velocidad de degradación en el suelo [d  -1 ] 
C 0 = concentración inicial de sustancia en el suelo [g kg  -1 de peso húmedo o 
seco] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ecuación 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [ecuación 7] 
donde: 
C a = concentración de sustancia en los gusanos [g kg  -1 de peso húmedo o seco] 
k s = constante de la velocidad de absorción en los tejidos [g de suelo kg  -1 de 
gusanos d  -1 ] 
k 0 = constante de la velocidad de degradación en el suelo [d  -1 ] 
k e = constante de la velocidad de eliminación [d  -1 ] 
t c = tiempo al final de la fase de absorción. 
Cuando se alcanza el estado de equilibrio durante la fase de absorción (es decir, t 
= ∞), la ecuación 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [ecuación 1] 
puede reducirse a: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
o 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [ecuación 8] 
Entonces, k  s /k e x C  s es una aproximación de la concentración de la sustancia 
problema en el tejido de los gusanos en el estado de equilibrio (C  a,ss ). 
El factor de acumulación biota-suelo (BSAF) puede calcularse de la forma si ­
guiente: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [ecuación 9] 
donde f  oc es la fracción de carbono orgánico del suelo, y f  lip es la fracción de 
lípidos de los gusanos, habiéndose determinado ambos valores preferentemente en muestras tomadas del ensayo, y referidos al peso seco o al peso húmedo. 
La cinética de eliminación puede modelizarse utilizando los datos de la fase de 
eliminación y aplicando la siguiente ecuación modelo y un método informático 
de estimación de parámetros no lineales. Si la representación de los datos frente al tiempo indica un declive exponencial constante de la concentración de la sustancia problema en los animales, puede utilizarse un modelo monocomparti ­
mental (ecuación 9) para describir la evolución temporal de la eliminación. 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [ecuación 10]  ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Los procesos de eliminación a veces resultan bifásicos, con un rápido declive de 
C a durante las primeras etapas, que luego se convierte en una pérdida más lenta 
de sustancia problema en las fases posteriores de la eliminación [véanse, por ejemplo, (27) (68)]. Las dos fases pueden interpretarse aceptando que hay dos compartimentos diferentes en el organismo, y la sustancia problema sale de cada 
uno de ellos a diferentes velocidades. En estos casos hay que consultar la bi ­
bliografía específica, como (38) (39) (40) (78). 
Utilizando las ecuaciones modelo anteriores, es posible calcular también los 
parámetros cinéticos (k
 s y k  e ) de una sola vez aplicando el modelo de cinética 
de primer orden a todos los datos de las fases tanto de absorción como de 
eliminación, simultáneamente. Para encontrar una descripción de un método 
que permita este cálculo combinado de las constantes de velocidad de absorción y de eliminación, pueden consultarse las referencias (41) (73) y (70). 
C
 a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[ecuación 11]  
Nota:  Cuando los parámetros de absorción y de eliminación se estiman simul ­
táneamente a partir de los datos combinados de absorción y de elimina ­
ción, el símbolo "m" de la ecuación 11 es un descriptor que permite al 
programa informático asignar los subtérminos de la ecuación a los con ­
juntos de datos de la fase respectiva y llevar a cabo la evaluación co ­
rrectamente (m = 1 para la fase de absorción; m = 2 para la fase de 
eliminación). 
No obstante, estas ecuaciones modelo deben emplearse con precaución, especial ­
mente cuando durante el ensayo se producen cambios en la (bio)degradación o en la biodisponibilidad de la sustancia problema [véase, por ejemplo, (79)].
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Apéndice 3  
EJEMPLOS DE CALENDARIOS DE ENSAYOS DE BIOACUMULACIÓN 
EN EL SUELO  
Ensayo con gusanos de tierra  
a) Fase de absorción con ocho fechas de muestreo para el cálculo de la cinética  
Día Actividad  
– 6 Acondicionamiento durante 48 h del suelo preparado. 
– 4 Adición de la solución de la sustancia problema a la fracción del 
suelo; evaporación de los eventuales disolventes; mezcla de los 
componentes del suelo; distribución del suelo en los recipientes 
de ensayo; equilibrado a las condiciones de ensayo durante 4 días (3 semanas en caso de adición de metales al suelo). 
– 3 a – 1 Separación de los organismos de ensayo del cultivo de aclimata ­
ción; preparación y humidificación de los componentes del suelo. 
0 Medición de la temperatura y del pH del suelo; toma de muestras 
del suelo de los recipientes de tratamiento y de los controles de 
disolvente para determinar la concentración de la sustancia pro ­
blema; adición de la ración alimentaria; pesada y distribución aleatorizada de los gusanos en los recipientes de ensayo; conser ­
vación de suficientes submuestras de gusanos para la determina ­
ción de los valores analíticos de fondo, peso húmedo y seco, y 
contenido lipídico; pesada de todos los recipientes de ensayo para controlar la humedad del suelo; control del aporte de aire, si se 
utiliza un sistema de ensayo cerrado. 
1 Control del aporte de aire, registro del comportamiento de los 
gusanos y de la temperatura; toma de muestras de suelo y de gusanos para determinar la concentración de la sustancia proble ­
ma. 
2 Como el día 1. 
3 Control del aporte de aire, del comportamiento de los gusanos y 
de la temperatura. 
4 Como el día 1. 
5-6 Como el día 3. 
7 Como el día 1; adición de la ración alimentaria; control de la 
humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y 
compensación del agua evaporada. 
8-9 Como el día 3. 
10 Como el día 1. 
11-13 Como el día 3. 
14 Como el día 1; adición de la ración alimentaria; control de la 
humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y 
compensación del agua evaporada. 
15-16 Como el día 3. 
17 Como el día 1. 
18-20 Como el día 3.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Día Actividad  
21 Como el día 1; medición de la temperatura y del pH del suelo; 
control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes 
de ensayo; final de la fase de absorción; transferencia de los gusanos de las réplicas expuestas restantes a recipientes que con ­
tienen suelo limpio, para la fase de eliminación (sin purga intes ­
tinal); toma de muestras de suelo y de gusanos para los controles 
de los disolventes. 
Las actividades previas a la exposición (fase de equilibrado) 
deben programarse teniendo en cuenta las propiedades de la sus ­
tancia problema. 
Las actividades descritas para el día 3 deben realizarse diaria ­
mente (al menos en los días laborables). 
b) Fase de eliminación
 
Día Actividad  
– 6 Preparación y humidificación de los componentes del suelo; 
acondicionamiento durante 48 h del suelo preparado. 
– 4 Mezcla de los componentes del suelo; distribución del suelo en 
los recipientes de ensayo; incubación a las condiciones de ensayo 
durante 4 días. 
0 (final de la fase 
de absorción) Medición de la temperatura y del pH del suelo; pesada y dis ­
tribución aleatorizada de los gusanos en los recipientes de ensa ­
yo; adición de la ración alimentaria; transferencia de los gusanos de las réplicas expuestas restantes a recipientes que contienen 
suelo limpio; toma de muestras de suelo y de gusanos al cabo 
de 4 – 6 horas para determinar la concentración de la sustancia problema. 
1 Control del aporte de aire, registro del comportamiento de los 
gusanos y de la temperatura; toma de muestras de suelo y de gusanos para determinar la concentración de la sustancia proble ­
ma. 
2 Como el día 1. 
3 Control del aporte de aire, del comportamiento de los gusanos y 
de la temperatura. 
4 Como el día 1. 
5-6 Como el día 3. 
7 Como el día 1; adición de la ración alimentaria; control de la 
humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y 
compensación del agua evaporada. 
8-9 Como el día 3. 
10 Como el día 1. 
11-13 Como el día 3. 
14 Como el día 1; adición de la ración alimentaria; control de la 
humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y compensación del agua evaporada. 
15-16 Como el día 3. 
17 Como el día 1.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Día Actividad  
18-20 Como el día 3. 
21 Como el día 1; medición de la temperatura y del pH del suelo; 
control de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes 
de ensayo; toma de muestras de suelo y de gusanos para los controles de los disolventes. 
La preparación del suelo antes del inicio de la fase de elimina ­
ción debe hacerse de la misma forma que antes de la fase de absorción. 
Las actividades descritas para el día 3 deben realizarse diaria ­
mente (al menos en los días laborables).
 
Ensayo con enquitreidos  
a) Fase de absorción con ocho fechas de muestreo para el cálculo de la cinética  
Día Actividad  
– 6 Acondicionamiento durante 48 h del suelo preparado. 
– 4 Adición de la solución de la sustancia problema a la fracción del 
suelo; evaporación de los eventuales disolventes; mezcla de los componentes del suelo; distribución del suelo en los recipientes 
de ensayo; equilibrado a las condiciones de ensayo durante 4 días 
(3 semanas en caso de adición de metales al suelo). 
-3 a -1 Separación de los organismos de ensayo del cultivo de aclimata ­
ción; preparación y humidificación de los componentes del suelo. 
0 Medición de la temperatura y del pH del suelo; toma de muestras 
del suelo de los recipientes de tratamiento y de los controles de disolvente para determinar la concentración de la sustancia pro ­
blema; adición de la ración alimentaria al suelo; pesada y dis ­
tribución aleatorizada de los gusanos en los recipientes de ensa ­
yo; conservación de suficientes submuestras de gusanos para la determinación de los valores analíticos de fondo, peso húmedo y 
seco, y contenido lipídico; pesada de todos los recipientes de 
ensayo para controlar la humedad del suelo; control del aporte de aire, si se utiliza un sistema de ensayo cerrado. 
1 Control del aporte de aire, registro del comportamiento de los 
gusanos y de la temperatura; toma de muestras de suelo y de gusanos para determinar la concentración de la sustancia proble ­
ma. 
2 Como el día 1. 
3 Control del aporte de aire, del comportamiento de los gusanos y 
de la temperatura. 
4 Como el día 1. 
5-6 Como el día 3. 
7 Como el día 1; adición de la ración alimentaria al suelo; control 
de la humedad del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo y compensación del agua evaporada. 
9 Como el día 1. 
10 Como el día 3.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Día Actividad  
11 Como el día 1. 
12-13 Como el día 3. 
14 Como el día 1; adición de la ración alimentaria al suelo; medi ­
ción de la temperatura y del pH del suelo; control de la humedad 
del suelo volviendo a pesar los recipientes de ensayo; final de la 
fase de absorción; transferencia de los gusanos de las réplicas expuestas restantes a recipientes que contienen suelo limpio, para la fase de eliminación (sin purga intestinal); toma de muestras de 
suelo y de gusanos para los controles de los disolventes. 
Las actividades previas a la exposición (fase de equilibrado) 
deben programarse teniendo en cuenta las propiedades de la sus ­
tancia problema. 
Las actividades descritas para el día 3 deben realizarse diaria ­
mente (al menos en los días laborables).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Apéndice 4  
Suelo artificial — recomendaciones de preparación y conservación  
Dado que es posible que no se disponga durante todo el año de suelos naturales 
de una fuente particular, y que la presencia de organismos endógenos y de 
microcontaminantes puede influir en el ensayo, se recomienda emplear en este ensayo el suelo artificial indicado en el capítulo C.8 del presente anexo, Toxi ­
cidad para gusanos de tierra (48). Son varias las especies de ensayo que pueden 
sobrevivir, crecer y reproducirse en este suelo, y se facilita con él una normali ­
zación máxima, así como la comparabilidad intra e interlaboratorios de las con ­
diciones de ensayo y de cultivo. 
Componentes del suelo: 
Turba: 10 % Turba esfágnea, de acuerdo con las directri ­
ces 207 de la OCDE (48), 
Arena de cuarzo: 70 % Arena de cuarzo industrial (secada al aire); 
granulometría: más del 50 % de las partícu ­
las debe estar en la banda de 50-200 μm, 
pero todas las partículas deben tener ≤ 2 
mm, 
Caolín: 20 % Contenido en caolinita ≥ 30 %, 
Carbonato de cal ­
cio: ≤ 1 % CaCO
 3 , pulverizado, químicamente puro. 
Como opción, puede reducirse el contenido de carbono orgánico del suelo arti ­
ficial como, por ejemplo, rebajando el contenido de turba al 4-5 % de suelo seco 
y aumentando análogamente el contenido de arena. Con esta reducción del con ­
tenido de carbono orgánico, es posible que disminuyan las posibilidades de adsorción de la sustancia problema al suelo (carbono orgánico) y que aumente 
la disponibilidad de la sustancia problema para los gusanos (74). Se ha demos ­
trado que  Enchytraeus albidus  y Eisenia fetida  pueden ajustarse a los criterios de 
validez sobre la reproducción cuando se someten a ensayo en suelos de campo con un contenido menor de carbono orgánico como, por ejemplo, del 2,7 % (33) 
(61), y la experiencia demuestra que esto también puede conseguirse en suelo 
artificial con un 5 % de turba.
 
Preparación  
Los componentes secos del suelo se mezclan a fondo (por ejemplo, en un mez ­
clador de laboratorio de gran escala). Esta operación debe efectuarse alrededor de 
una semana antes de que se inicie el ensayo. La mezcla de componentes secos del suelo debe humedecerse con agua desionizada, al menos 48 h antes de que se añada la sustancia problema a fin de equilibrar o estabilizar la acidez. Para la 
determinación del pH se utiliza una mezcla de suelo y solución 1 M de KCl en la 
proporción de 1:5. Si el pH no se encuentra en la banda necesaria (6,0 ± 0,5), se añade al suelo una cantidad suficiente de CaCO
 3 o se prepara un nuevo lote de 
suelo. 
Se determina de acuerdo con la norma ISO 11268-2 (35) la capacidad de reten ­
ción de agua (WHC) máxima del suelo artificial. Al menos dos días antes del inicio del ensayo, el suelo artificial seco se humedece añadiéndole una cantidad suficiente de agua desionizada o reconstituida para obtener aproximadamente la 
mitad del contenido final de agua. El contenido final de agua debe estar entre el 
40 y el 60 % del WHC máximo. Al inicio del ensayo, el suelo previamente humedecido se divide en tantos lotes como concentraciones de ensayo y con ­
troles se vayan a emplear en el ensayo, y el contenido de humedad se ajusta al 40 
– 60 % del WHC
 max utilizando la solución de la sustancia problema o añadiendo 
agua desionizada o reconstituida. Se determina el contenido de humedad al inicio y al final del ensayo (a 105 °C). El resultado debe ser óptimo para los requisitos de la especie utilizada (también es posible comprobar el contenido de humedad 
de la manera siguiente: cuando el suelo se aprieta suavemente con la mano, 
deben aparecer gotitas de agua entre los dedos).
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Almacenamiento  
Los componentes secos del suelo artificial pueden conservarse a temperatura 
ambiente hasta el momento de su utilización. El suelo preparado, humedecido 
previamente, puede conservarse en un lugar fresco hasta tres días antes de que se le añada la sustancia problema; debe velarse por reducir al mínimo la evapora ­
ción de agua. Una vez se le haya añadido la sustancia problema, el suelo debe 
utilizarse inmediatamente, salvo que se disponga de información en el sentido de 
que ese suelo concreto puede conservarse sin que se vea afectada la toxicidad ni la biodisponibilidad de la sustancia problema. En tal caso, es posible conservar, en las condiciones recomendadas para el ensayo concreto, las muestras de suelo 
con la sustancia problema añadida hasta el momento de su análisis.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Apéndice 5  
Especies de oligoquetos recomendadas para el ensayo de bioacumulación a 
partir del suelo  
Gusanos de tierra  
La especie recomendada para el ensayo es  Eisenia fetida  (Savigny 1826), que 
pertenece a la familia Lumbricidae. Desde 1972 está dividida en dos subespecies [Eisenia fetida  y Eisenia andrei  (10)]. Según Jaenike (36), se trata de verdaderas 
especies aparte.  Eisenia fetida  se reconoce fácilmente por sus rayas intersegmen ­
tales de color amarillo claro, mientras que  Eisenia andrei  tiene color rojo oscuro 
uniforme. Proceden probablemente de la region del mar Negro, y actualmente tienen una distribución universal, especialmente en hábitats modificados antro ­
pogénicamente, como las pilas de compost. Las dos especies pueden utilizarse en 
ensayos tanto ecotoxicológicos como de bioacumulación.  
Eisenia fetida  y Eisenia andrei  están disponibles en el comercio, por ejemplo 
como cebos de pesca. En comparación con otros gusanos de tierra lumbrícidos, tienen un ciclo de vida breve y alcanzan la madurez en el plazo de unos 2 o 3 
meses (a temperatura ambiente). Su temperatura óptima es de unos 20 – 24 °C; 
prefieren sustratos relativamente húmedos, con un pH casi neutro y un elevado contenido de materia orgánica. Como estas especies llevan unos 25 años utili ­
zándose ampliamente en ensayos ecotoxicológicos normalizados, su cultivo se 
conoce muy bien (48) (77). 
Ambas especies pueden cultivarse en una amplia gama de residuos animales. El 
medio de cría recomendado por la ISO (35) es una mezcla al 50 % de estiércol de caballo o de vaca y de turba. Este medio debe tener un valor aproximado de pH entre 6 y 7 (regulado con carbonato de calcio) y una conductividad iónica 
baja (menos de 6 mS/cm o menos del 0,5 % de concentración salina), y no debe 
presentar una contaminación excesiva de amoníaco ni de orina animal. También puede utilizarse un suelo comercial de jardinería exento de aditivos, o un suelo artificial de acuerdo con la OCDE (48), o una mezcla de ambos al 50 %. El 
sustrato debe estar húmedo, pero no demasiado mojado. Son adecuados los 
incubadores de un volumen entre 10 y 50 litros. 
Para obtener gusanos de edad y masa normalizadas, lo mejor es iniciar el cultivo 
con capullos. Por tanto, se añaden gusanos adultos a un incubador que contenga 
sustrato fresco para producir capullos. La experiencia práctica indica que se 
obtienen buenas tasas de reproducción con una densidad de población de unos 100 gusanos adultos por kg de sustrato (peso húmedo). Tras 28 días se extraen los gusanos adultos. Los gusanos de tierra que salen de los capullos se utilizan 
para los ensayos una vez hayan madurado, al cabo de un mínimo de 2 meses y 
un máximo de 12 meses. 
Los gusanos de las especies antes descritas pueden considerarse sanos si se 
mueven a través del sustrato, no intentan abandonarlo y se reproducen continua ­
mente. Un movimiento muy lento o un color amarillo en el extremo posterior (en 
el caso de  Eisenia fetida ) son indicativos de agotamiento del sustrato. En este 
caso, se recomienda añadir sustrato fresco o rebajar el número de animales por incubador.
 
Bibliografía adicional seleccionada  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58. 
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1-81. 
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S. 
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55. 
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1-171. 
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology-from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp.
 
Enquitreidos  
La especie recomendada es  Enchytraeus albidus,  Henle 1837 (gusano blanco). 
Esta especie es una de las más grandes (hasta 15 mm) de la familia Enchytraei ­
dae de los anélidos oligoquetos y presenta una distribución universal [véase, por 
ejemplo, (8)].  Enchytraeus albidus  se encuentra en hábitats marinos, lacustres y 
terrestres, sobre todo en materia orgánica en descomposición (algas, compost) y raramente en praderas (42). Esta amplia tolerancia ecológica y algunas variacio ­
nes morfológicas indican que la especie podría tener diferentes razas.  
Enchytraeus albidus  se encuentra en el comercio, vendida como alimento para 
peces. Ha de comprobarse si el cultivo está contaminado con otras especies, generalmente más pequeñas (60). Si se da la contaminación, hay que lavar todos los gusanos con agua en una placa Petri. Después se seleccionan ejemplares 
adultos grandes de  Enchytraeus albidus  (empleando un microscopio estereoscó ­
pico) para iniciar un nuevo cultivo. Se desechan todos los demás gusanos. Tienen un breve ciclo de vida, ya que alcanzan la madurez entre los 33 días (a 18 °C) y los 74 días (a 12 °C). Solo deben utilizarse para los ensayos los cultivos que 
hayan estado en el laboratorio al menos 5 semanas (una generación) sin proble ­
mas. 
También son adecuadas otras especies del género  Enchytraeus,  en particular  
Enchytraeus luxuriosus.  Esta especie es un verdadero habitante del suelo, que 
se ha descrito recientemente en (65). Si se utilizan otras especies de  Enchytraeus,  
deben identificarse claramente y hay que indicar los motivos por los que se han seleccionado.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) es una especie que pertenece 
al mismo grupo que  Enchytraeus luxuriosus.  No se ha determinado con certeza si 
existe en el campo, ya que solo se ha descrito a partir de cultivos de gusanos de 
tierra y de pilas de compost (Römbke 2003). Por tanto, no se conocen sus requisitos ecológicos originales. Sin embargo, en estudios de laboratorio recientes en varios suelos de campo se ha confirmado que esta especie muestra una amplia 
tolerancia respecto a propiedades del suelo como el pH y la textura (Jänsch  et al.  
2005). En los últimos años se está utilizando esta especie con frecuencia en estudios ecotoxicológicos debido a la simplicidad de su cultivo y de sus ensayos, por ejemplo según Kuperman  et al.  2003). Sin embargo, es pequeña (3 – 12 mm; 
7 mm de media (Westheide & Müller 1996), lo que hace que sea más difícil de 
manejar que  Enchytraeus albidus.  Cuando se utiliza esta especie en lugar de  
Enchytraeus albidus,  es posible reducir el tamaño del recipiente de ensayo, 
aunque no es necesario. Por otra parte, ha de tenerse en cuenta que esta especie 
se reproduce muy rápidamente, con un tiempo de generación inferior a 20 días a 
20 ± 2 °C (Achazi  et al.  1999) e incluso más deprisa a temperaturas más altas. 
Los enquitreidos de la especie  Enchytraeus albidus  (así como otras especies del 
género  Enchytraeus ) pueden criarse en grandes cajas de plástico (por ejemplo, de 
30 × 60 × 10 cm o 20 × 12 × 8 cm, que es adecuado para el cultivo de gusanos 
de pequeño tamaño) llenas de una mezcla de suelo artificial y de suelo de jardín 
comercial, sin contaminar y exento de aditivos. Debe evitarse material de com ­
post, ya que podría contener sustancias tóxicas, como metales pesados. Antes de utilizar el suelo de cultivo hay que eliminar la fauna, congelándolo tres veces. 
También puede utilizarse suelo artificial puro, pero la tasa de reproducción podría 
ser menor que la obtenida con sustratos mixtos. El sustrato debe tener un pH de 6,0 ± 0,5. El cultivo se mantiene en un incubador a la temperatura de 15 ± 2 °C a oscuras. En cualquier caso, ha de evitarse una temperatura superior a 23 °C. El 
suelo artificial/natural debe estar húmedo, pero no demasiado mojado. Cuando se 
aprieta el suelo suavemente con la mano, solo deben aparecer gotitas de agua. En todo caso hay que evitar las condiciones anóxicas (es decir, si se utiliza tapa, el número de agujeros de esta debe bastar para que sea suficiente la renovación del 
aire). El suelo del cultivo debe airearse removiéndolo cuidadosamente una vez 
por semana.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Debe darse alimento a los gusanos  ad libitum  al menos una vez por semana con 
granos aplastados de avena que se introducen en una cavidad de la superficie del 
suelo y se recubren con suelo. Si queda comida en el recipiente desde la última vez que se les haya dado, será necesario ajustar en consecuencia la cantidad de alimento dado. Si se aprecia crecimiento fúngico en la comida restante, será 
necesario sustituir esta por una nueva cantidad de granos aplastados de avena. 
Para estimular la reproducción, es posible complementar cada dos semanas los granos aplastados de avena utilizando proteínas en polvo con vitaminas añadidas, disponibles en el comercio. Al cabo de tres meses, los animales se transfieren a 
un sustrato de cría o cultivo recién preparado. Los granos aplastados de avena, 
que deben conservarse en recipientes herméticamente cerrados, tienen que pa ­
sarse por el autoclave o calentarse antes de su utilización para evitar infecciones por ácaros de la harina (por ejemplo,  Glyzyphagus  sp., Astigmata, Acarina) o 
ácaros depredadores [por ejemplo,  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles,  Gamasida, 
Acarina]. Tras su desinfección, el alimento se muele de forma que sea fácil de espolvorear sobre la superficie del suelo. Otra posible fuente de alimento es la levadura de panadería o la comida para peces TetraMin
 ® . 
En general, las condiciones de cultivo son suficientes si los gusanos no intentan 
abandonar el sustrato, se mueven rápidamente por el suelo, presentan una super ­
ficie externa brillante sin que se les adhieran partículas del suelo, presentan un color más o menos blanquecino, y se observan gusanos de diferentes edades. En realidad, puede considerarse que los gusanos están sanos si se reproducen con ­
tinuamente.
 
Bibliografía adicional seleccionada  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126. 
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological re ­
quirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Re ­
views 13: 51-83. 
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656. 
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607-616. 
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488. 
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of en ­
chytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.
 ▼M4 2008R0440 — ES — 24.08.2014 — 005.001 — 1467