1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceitesdeorujodeolivaysobresus
métodosdeanálisis
(DOL248de5.9.1991,p.1)
Modificadopor:
DiarioOficial
nopágina fecha
►M1Reglamento (CEE) no3682/91 de la Comisión de 17 de diciembre de
1991L349 36 18.12.1991
►M2Reglamento(CEE)no1429/92delaComisiónde26demayode1992 L150 17 2.6.1992
►M3Reglamento(CEE)no1683/92delaComisiónde29dejuniode1992 L176 27 30.6.1992
►M4Reglamento(CEE)no1996/92delaComisiónde15dejuliode1992 L199 18 18.7.1992
►M5Reglamento (CEE) no3288/92 de la Comisión de 12 de noviembre de
1992L327 28 13.11.1992
►M6Reglamento(CEE)no183/93delaComisiónde29deenerode1993 L22 58 30.1.1993
►M7modificado por el Reglamento (CEE) no826/93 de la Comisión de 6
deabrilde1993L87 6 7.4.1993
►M8Reglamento(CEE)no620/93delaComisiónde17demarzode1993 L66 29 18.3.1993
►M9Reglamento(CE)no177/94delaComisiónde28deenerode1994 L24 33 29.1.1994
►M10Reglamento(CE)no2632/94delaComisiónde28deoctubrede1994 L280 43 29.10.1994
►M11Reglamento(CE)no656/95delaComisiónde28demarzode1995 L69 1 29.3.1995
Rectificadopor:
►C1Rectificación,DOL347de28.11.1992,p.69(2568/91)
►C2Rectificación,DOL176de20.7.1993,p.30(183/93)
▼B
REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceites
deorujodeolivaysobresusmétodosdeanálisis
LACOMISIÓNDELASCOMUNIDADESEUROPEAS,
VistoelTratadoconstitutivodelaComunidadEconómicaEuropea,
VistoelReglamento no136/66/CEE delConsejo,de22deseptiembre
de1966,porelqueseestablecelaorganizacióncomúndemercadosenelsectordelasmateriasgrasas(
1),cuyaúltimamodificación laconsti-
tuye el Reglamento (CEE) no3577/90(2), y, en particular, su artículo
35bis,
ConsiderandoqueenelAnexodelReglamentono136/66/CEEseesta-
blecen las denominaciones y definiciones de los aceites de oliva y de
los aceites de orujo de oliva comercializados dentro de cada Estado
miembro, así como en los intercambios intracomunitarios y contercerospaíses;
Considerando que, para poder distinguir los diferentes tipos de aceite,
procede definir lascaracterísticas fisicoquímicas decada unodeellos,
asícomolascaracterísticasorganolépticasdelosaceitesvírgenes,afindegarantizarasílapurezaycalidaddeestosproductos,sinperjuiciodeotrasdisposicionesexistentesenlamateria;
Considerandoqueconviene determinar demanera uniformeentodala
Comunidadlapresenciadelascaracterísticasdelosdiferentestiposdeaceite; que, para ello, procede establecer los métodos comunitarios deanálisis químico y de valoración organoléptica; que conviene, sinembargo, permitir que durante un período transitorio se utilicen otros
métodosdeanálisisqueseanaplicadosenlosEstadosmiembros,esta-
bleciendo al mismo tiempo que en caso de presentarse resultadosdivergentesprevalezcanlosobtenidosatravésdelmétodocomún;
Considerandoqueladefinicióndelascaracterísticas fisicoquímicas de
los aceites de oliva y de sus métodos de análisis comporta la adapta-
ción de las notas complementarias del capítulo 15 de la nomenclaturacombinada;
Considerando que el método de valoración de las características orga-
nolépticas delosaceites vírgenesrequiere lacreacióndeunospaneles
de catadores seleccionados yespecialmente adiestrados; queconviene,porlotanto,preverelplazonecesario parainstaurarunaestructura deeste tipo; que, dadas las dificultades a las que se enfrentarán determi-nados Estados miembros para crear dichos paneles, procede autorizarqueserecurraapanelesexistentesenotrosEstadosmiembros;
Considerando que, para garantizar el correcto funcionamiento del
sistema de las exacciones reguladoras aplicables a la importación deorujodeoliva,esconvenientepreverunmétodoúnicoparaladetermi-nacióndelcontenidoenaceitedeestosproductos;
Considerando que, para no perjudicar el comercio, resulta oportuno
prever un período limitado para la salida al mercado del aceite quehaya sido envasado antes de la entrada en vigor del presente Regla-mento;
ConsiderandoqueprocedederogarelReglamento(CEE)n
o1058/77de
la Comisión(3), cuya última modificación la constituye el Reglamento
(CEE)no1858/88(4);
Considerando que el Comité de gestión de las materias grasas no ha
emitidodictamenalgunoenelplazoestablecidoporsupresidente,1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—2
(1)D Ono172de30.9.1966,p.3025/66.
(2)D OnoL353de17.12.1990,p.23.
(3)D OnoL128de24.5.1977,p.6.
(4)D OnoL166de1.7.1988,p.10.
▼B
HAADOPTADOELPRESENTEREGLAMENTO:
Artículo 1
1. Se considerarán aceites de oliva vírgenes, a que se refieren las
letras a), b), y c) del punto 1 del Anexo del Reglamento no136/66/
CEE,losaceitescuyascaracterísticasseajustenalasindicadas,respec-tivamente,enlospuntos1, 2y3delAnexoIdelpresenteReglamento.
2. Seconsideraráaceitedeolivavirgenlampante,aqueserefierela
letrad)delpunto1delAnexodelReglamenton
o136/66/CEE,elaceite
cuyascaracterísticasseajustenalasindicadasenelpunto4delAnexo
IdelpresenteReglamento.
3. Seconsideraráaceitedeolivarefinado,aqueserefiereelpunto2
del Anexo del Reglamento no136/66/CEE, el aceite cuyas caracterís-
ticasseajustenalasindicadasenelpunto5delAnexoIdelpresenteReglamento.
4. Se considerará aceite de oliva, a que se refiere el punto 3 del
Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas características
seajustenalasindicadasenelpunto6delAnexoIdelpresenteRegla-mento.
5. Seconsiderará aceite deorujodeolivacrudo,aqueserefiere el
punto 4 del Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas
características seajustenalasindicadasenelpunto7delAnexoIdel
presenteReglamento.
6. Seconsiderará aceite deorujodeolivarefinado,aqueserefiere
el punto 5 del Anexo del Reglamento no136/66/CEE, el aceite cuyas
características seajustenalasindicadasenelpunto8delAnexoIdelpresenteReglamento.
7. Seconsideraráaceitedeorujodeoliva,aqueserefiereelpunto6
del Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas caracterís-
ticasseajustenalasindicadasenelpunto9delAnexoIdelpresenteReglamento.
Artículo 2
1. Las características de los aceites, previstas en el Anexo I, se
determinaránempleandolosmétodosdeanálisissiguientes:
— para determinar los ácidos grasos libres, expresados en porcentaje
deácidooleico,elmétodorecogidoenelAnexoII,
— para determinar el índice de peróxidos, el método recogido en el
AnexoIII,
— para determinar los alcoholes alifáticos, el método recogido en el
AnexoIV,
— paradeterminarelcontenidodeesteroles,elmétodorecogidoenel
AnexoV,
— para determinar el eritrodiol + uvaol, el método recogido en el
AnexoVI,
— para determinar los ácidos grasos saturados en la posición 2 del
triglicérido,elmétodorecogidoenelAnexoVII,
— paradeterminar elcontenidodetrilinoleína, elmétodorecogidoen
elAnexoVIII,
— para el análisis espectrofotométrico, el método recogido en el
AnexoIX,
— para determinar la composición de ácidos grasos, el método reco-
gidoenlosAnexosX«A»yX«B»,
— paradeterminarlossolventeshalogenadosvolátiles,elmétodoreco-
gidoenelAnexoXI,
— paralavaloracióndelascaracterísticasorganolépticasdelosaceites
de oliva vírgenes, el método recogido en el Anexo XII, que seaplicarádeconformidadconelapartado2,
— para la prueba de la refinación, el método recogido en el Anexo
XIII,1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—3
▼M11
— para determinar los estigmastadienos, el método recogido en el
AnexoXVII.
2.►M3El analista experto en análisis sensoriales, asistido si es
precisoporexpertos ◄,llevaráacabolavaloracióndelascaracterís-
ticas organolépticas con arreglo al procedimiento descrito en la fichade degustación contemplada en el Anexo XII. En caso de que el
análisis determine características organolépticas distintas de las resul-
tantes de la denominación del producto, el analista someterá lamuestraalexamendeunpaneldecatadores,conarregloalasdisposi-cionesdelAnexoXII.
El análisis contradictorio será realizado por el panel de catadores de
conformidadconlasdisposicionescitadasanteriormente.
Para la valoración de las características organolépticas con ocasión de
operaciones relacionadas con el régimen de intervención, el panel de
catadoresprocederáaaquellaconarregloalasdisposicionesdelAnexo
XII.
Artículo 3
Hasta el ►
M628 de febrero de 1993 ◄, la introducción de los
métodos de análisis previstos en el artículo 2 no será óbice para que
los Estados miembros empleen otros métodos comprobados y científi-camente válidos, siempre que con ello no se obstaculice la librecirculación de los productos reconocidos conformes a la normativa enaplicación delosmétodoscomunitarios. LosEstadosmiembrosintere-
sados comunicarán a la Comisión dichos otros métodos antes de
utilizarlos.
Encasodequealgunodeestosotrosmétodosdéunresultadodiferente
delalcanzado porelmétodocomún,seconsideraráválidoelresultado
obtenidoenaplicacióndelmétodocomún.
Artículo 3bis
En caso de divergencia sobre las características organolépticas del
aceite que sea objeto de transacciones comerciales, las partes intere-sadaspodránrecurriraunpaneldecatadoresautorizadodesuelección.
Artículo 3ter
Encasodequesecompruebequelascaracterísticas organolépticas de
un aceite son distintas de las correspondientes a su denominación, elEstado miembro interesado aplicará sanciones económicas administra-tivas, cuyo importe se determinará en función de la gravedad de la
irregularidadcomprobada,sinperjuiciodeotrasposiblessanciones.
Paralaevaluacióndelasirregularidadessetendrásobretodoencuenta
la evolución natural de las características del aceite de oliva conser-vadoencondicionesnormales.
Al principio de cada semestre, los Estados miembros informarán a la
Comisióndelnúmeroylanaturalezadelasirregularidadesobservadas,asícomodelassancionesimpuestasduranteelsemestreanterior.
Artículo 4
1. Para la apreciación de las características organolépticas, los
Estados miembros crearán paneles de catadores que se encargarán delcontrol oficial de las características organolépticas. Dichos panelesdeberáncumplirlosrequisitossiguientes:
— estar constituidos por catadores seleccionados y formados con
arregloalasreglasdelmétodocontempladoenelAnexoXII,
— poseerlas instalaciones yelmaterial necesarios para laevaluación
organolépticadeconformidadconlasreglasdelcitadométodo,1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—4
▼B
▼M5
▼M5
— utilizarelvocabularioespecíficodelanálisissensorialdelaceitede
oliva, la hoja de perfil y la tabla de puntuación previstos en elcitadométodo,
— comprometerse a efectuar los análisis organolépticos previstos a
escala comunitaria o internacional con ocasión de los controles
periódicos y de las sesiones de armonización de los criterios depercepción,
— comprometerseainformaranualmentealaComisióndelasmodifi-
caciones que se produzcan en la composición del panel y delnúmerodeevaluacionesporélrealizadasencalidaddepanelauto-rizado.
CadaEstadomiembroprocederáalaautorizacióndelospanelesquese
constituyan en su territorio y reúnan las condiciones anteriormente
expuestas. Nombrarán entre ellos al panel o a los paneles encargadosdelosanálisisderevisión.
Los paneles creados por los Estados miembros antes del 1 de
noviembrede1992conarregloalasnormasestablecidasenelmétodocontempladoenelAnexoXIIseconsideraránautorizadosalosefectosdelpresenteartículo.
CadaEstadomiembrocomunicaráalaComisiónyalosdemásEstados
miembroslalistadepanelesautorizados.
2. En casodequeunEstado miembro tenga dificultades para crear
un panel de catadores en su territorio, podrá recurrir a un panel dedegustadoresautorizadodeotroEstadomiembro.
3. Cada Estado miembro elaborará la lista de los paneles de cata-
dores creados por organizaciones profesionales o interprofesionales en
las condiciones fijadas en el apartado 1 y velará por el cumplimiento
deesascondiciones.
Artículo 5
Lasnotascomplementarias2,3y4delcapítulo15delanomenclatura
combinadaquefiguraenelAnexoIdelReglamento(CEE)n
o2658/87
del Consejo(1) serán sustituidas por el texto que figura en el Anexo
XIVdelpresenteReglamento.
Artículo 6
1. El contenido en aceite de orujode aceituna ydemásresiduos de
laextraccióndelaceitedeoliva(códigosNC23069011y23069019)sedeterminaráconarregloalmétodorecogidoenelAnexoXV.
2. Elcontenidodeaceite mencionadoenelapartado1seexpresará
comoporcentajedelextractosecoenpeso.
Artículo 7
Serán aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de
sustanciasextrañasdistintasdelasmencionadasenelAnexoXI.
Artículo 8
1. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión las medidas
adoptadasenaplicacióndelpresenteReglamento.
2. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión, al inicio de
cadasemestreunarecapitulacióndelosdatosanalíticosdelasdetermi-nacionesefectuadasduranteelsemestreprecedente.
Estos resultados serán examinados por el Comité de gestión de las
materiasgrasasconarregloalprocedimiento previstoenelartículo39delReglamenton
o136/66/CEE.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—5
(1)D onoL256de7.9.1987,p.1.▼M6
▼B
▼B
Artículo 9
QuedaderogadoelReglamento(CEE)no1058/77.
Artículo 10
1. ElpresenteReglamentoentraráenvigoreltercerdíasiguienteal
desupublicaciónenel Diario Oficial de las Comunidades Europeas .
Noobstante,elmétodoquefiguraenelAnexoXIIseaplicaráapartir
del►M11denoviembre de1992 ◄,exceptoenloqueserefiere a
lasoperacionesrelacionadasconlaintervención.
Dichométodonoseaplicará alosaceitesdeolivavírgenesenvasados
antesdel1denoviembrede1992.
ElpresenteReglamentonoseaplicaráalosaceitesdeolivaydeorujo
de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presente
Reglamentoycomercializadoshastael31deoctubrede1992.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y
directamenteaplicableencadaEstadomiembro.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—6
▼M5
▼B
▼B
ANEXOS
Índice
AnexoI: Característicasdelosaceitesdeoliva…
AnexoII: Determinacióndelgradodeacidez…
AnexoIII: Determinacióndelíndicedeperóxidos…AnexoIV: ►
M6Determinacióndelcontenidodecerasmediantecrama-
tografíadegasesconcolumnacapilar ◄…
AnexoV: Determinacióndelacomposiciónydelcontenidodeesteroles
mediantecromatografíadegasesconcolumnacapilar…
AnexoVI: Determinacióndeleritrodiolyuvaol…AnexoVII: Determinacióndelosácidosgrasossaturadosenlaposición2
delostriglicéridosdeaceitesygrasas…
AnexoVIII: Determinacióndelporcentajedetrilinoleína…AnexoIX: Pruebaespectrofométricaenelultravioleta…
AnexoX«A»: Análisisdelosésteresmetílicosdelosácidosgrasosmediante
cromatografíadegases…
AnexoX«B»: Preparacióndelosésteresmetílicosdelosácidosgrasos…
AnexoXI: Determinacióndelcontenidoen ►
C1disolventes ◄haloge-
nadosvolátilesenelaceitedeoliva…
AnexoXII: Valoraciónorganolépticadelaceitedeolivavirgen…
AnexoXIII: ►M6Neutralización y decoloración del aceite de oliva en
laboratorio ◄…
AnexoXIV: Notascomplementarias2,3y4delcapítulo15delanomen-
claturacombinada…
AnexoXV: Contenidodeaceitedelosorujosdeaceituna…
AnexoXVI: Determinacióndelíndicedeyodo…
AnexoXVII: Método para la determinación de estigmastadienos en los
aceitesvegetales…1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—7
▼M11
ANEXO I
CARACTERÍSTICASDELOSACEITESDEOLIVA
Categoría Acidez%Índicede
peróxidos
meqO2/kgSolventes
halogena-
dosmg/
kg(1)Cerasmg/
kgÁcidos
grasos
saturados
en
posición2
delostrigl-
icéridos%Estigmas-
tadie-
nos(2)mg/
kgEritrodiol
+uvaal%Trilinolei-
na%Colestero-
l%Brassicas-
terol%Campeste-
rol%Estignast-
erol%Betasitos-
terol(3)%Delta-7-
Estigmast-
enol%Esteroles
totalesmg/
kg
1. Aceitedeoliva
virgenextra M1,0 M20 M0,20 M250 M1,3 M0,15 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1000
2. Aceitedeoliva
virgen M2,0 M20 M0,20 M250 M1,3 M0,15 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1000
3. Aceitedeoliva
virgencorriente M3,3 M20 M0,20 M250 M1,3 M0,15 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1000
4. Aceitedeoliva
virgenlampante m3,3 m20 m0,20 M350 M1,3 M0,50 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 — m93,0 M0,5 m1000
5. Aceitedeoliva
refinado M0,5 M5 M0,20 M350 M1,5 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1000
6. Aceitedeoliva M1,5 M15 M0,20 M350 M1,5 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m10007. Aceitedeorujode
olivacrudo m2,0 — — — M1,8 m12 M0,7 M0,5 M0,1 M4,0 — m93,0 M0,5 m2500
8. Aceitedeorujode
olivarefinado M0,5 M5 M0,20 — M2,0 m12 M0,6 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1800
9. Aceitedeorujode
oliva M1,5 M15 M0,20 >350 M2,0 >4,5 M0,6 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1600
M=máximo,m=mínimo.
(1) Contenidototaldecompuestosdetectadosmediantecapturadeelectrones.
Paracadaunodeloscomponentesellímitemáximoesde0,10mg/kg.
(2) Sumadeisómerosquepodrían(onopodrían)separarsemedianteunacolumnacapilar.
(3) Delta-5-23-Estigmastadienol+Clerosterol+Sitosterol+Sitostanol+delta-5-Avenasterol+delta-5-Avenasterol+delta-5-24-Estigmastadie nol.
Nota:
Paradescalificarunaceitebastaráconqueunasoladelascaracterísticasnoseajustealoslímitesfijados.▼M111991R2568—ES—28.05.1995—012.001—8
CategoríaContenidodeácidos
Sumas(de
los)
isómeros
transoleicosSuma(de
los)
isómeros
transolino-
leicosy
translinolén-
icos%K232K270K270después
depasarpor
alúminaDelta-K Paneltest
Mirístico%Linolénic-
o%Araquídic-
o%Icosanoic-
o%Behénico%Lignocéric-
o%
1. Aceitedeoliva
virgenextra M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,05 M0,05 M2,50 M0,20 M0,10 M0,01 m6,5
2. Aceitedeoliva
virgen M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,05 M0,05 M2,60 M0,25 M0,10 M0,01 m5,5
3. Aceitedeoliva
virgencorrente M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,05 M0,05 M2,60 M0,25 M0,10 M0,01 m3,5
4. Aceitedeoliva
virgenlampante M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,10 M0,10 M3,70 M0,25 M0,11 — <3,5
5. Aceitedeolivarefi-
nado M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,20 M0,30 M3,40 M1,20 — M0,16 —
6. Aceitedeoliva M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,20 M0,30 M3,30 M1,00 — M0,13 —7. Aceitedeorujode
olivacrudo M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,3 M0,2 M0,20 M0,10 —————
8. Aceitedeorujode
olivarefinado M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,3 M0,2 M0,40 M0,35 M5,50 M2,50 — M0,25 —
9. Aceitedeorujode
oliva M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,3 M0,2 M0,40 M0,35 M5,30 M2,00 — M0,20 —
M=máximo,m=mínimo
Nota
Paradescalificarunaceitebastaráconqueunasoladelascaracterísticasnoseajustealoslímitesfijados.
Paraladeterminacióndelapureza,encasodequeelk270sobrepaseellímiteestablecidoparalacategoríacorrespondiente,deberáefectuarseunanuevadeterminacióndelk270despuésdesertratadosconalúmina.▼M111991R2568—ES—28.05.1995—012.001—9
▼B
ANEXO II
DETERMINACIÓNDELGRADODEACIDEZ
1. OBJETO
Determinar los ácidos libres en los aceites de oliva. El contenido en
ácidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada según el
métodoconvencional.
1.1.Principio
Disolución de la muestra en una mezcla de disolventes y valoración de
los ácidos grasos libres mediante una solución etanólica de hidróxido
potásico.
1.2.Reactivos
Todos los reactivos deben ser de calidad analítica reconocida y el agua
utilizadadebeseraguadestiladaodeunapurezaequivalente.
1.2.1. Mezcla de éter dietílico y etanol de 95 % (V/V), en proporción de
volumen1:1.
Nota:El éter dietílico es muy inflamable y puede formar peróxidos
explosivos.Debeutilizarsetomandoespecialesprecauciones.
Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilización con la
solucióndehidróxidopotásico(1.2.2)enpresenciade0,3mldelasolu-
cióndefenolftaleína(1.2.3)porcada100mldemezcla.
Nota:Si no es posible utilizar éter dietílico, puede sustituirse por una
mezcladedisolventesformadaporetanolytolueno.Sifueranece-
sario,eletanolpodríasustituirse,asuvez,por2-propanol.
1.2.2. Solución etanólica valorada de hidróxido potásico, = 0,1 M o, en caso
necesario,=0,5M.Nota1.
Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilización,
la concentración exacta de la solución etanólica de hidróxido potásico.
Debeutilizarseunasoluciónquehayasidopreparadaporlomenoscinco
días antes y decantada en un frasco de vidrio marrón cerrado con tapón
degoma.Lasolucióndebeserincoloraodecoloramarillopaja.
Nota:Se puede preparar una solución incolora y estable de hidróxido
potásico de la manera siguiente: Llevar a ebullición, y mantener
ésta a reflujo durante una hora, 1000 ml de etanol con 8 g dehidróxido potásico y 0,5 g de virutas de aluminio. Destilar inme-
diatamente. Disolver en el destilado la cantidad requerida de
hidróxido potásico. Dejar reposar durante varios días y decantar
el líquido claro sobrenadante, separándolo del precipitado de
carbonatopotásico.
La solución también puede prepararse de la manera siguiente sin
efectuar la destilación: añadir 4 ml de butilato de aluminio a
1000 ml de etanol y dejar reposar la mezcla durante algunos
días.Decantarellíquidosobrenadanteydisolverenéllacantidad
necesaria de hidróxido potásico. La solución está lista para ser
utilizada.
1.2.3. Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol de 95-96 % (V/V) o solu-
ción de 20 g/l de azul alcalino (en caso de aceites de oliva muy
coloreados)enetanolde95-96%(V/V).
1.3.Material
Materialhabitualdelaboratorio,yenparticular:
1.3.1. Balanzaanalítica
1.3.2. Matrazerlenmeyerde250mldecapacidad
1.3.3. Buretade10mldecapacidad,congraduaciónde0,05ml
1.4.Procedimento
1.4.1. Preparacióndelamuestraparalaprueba1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—10
▼B
La determinación se efectuará en una muestra filtrada. Si el contenido
globaldehumedadeimpurezasesinferioral1%,seutilizarálamuestra
talcual.
1.4.2. Muestraparalaprueba
Tomar la muestra, según el grado de acidez previsto, de acuerdo con el
cuadrosiguiente:
GradodeacidezprevistoPesodelamuestra
(eng)Precisióndelapesadade
lamuestra
(eng)
<1 20 0,05
1a4 10 0,02
4a15 2,5 0,01
15a75 0,5 0,001
>75 0,1 0,0002
Pesarlamuestraenelmatrazerlenmeyer(1.3.2)
1.4.3 Determinación
Disolverlamuestra(1.4.2)en50a150mldelamezcladeéterdietílico
yetanol(1.2.1),previamenteneutralizada.
Valorar,agitando,conlasolucióndehidróxidopotásicode0,1M(1.2.2)
(véase nota 2) hasta el viraje del indicador (la coloración rosa de la
fenolftaleínadebepermaneceralmenosdurante10segundos).
Nota 1:La solución etanólica valorada de hidróxido potásico (1.2.2)
puede sustituirse por una solución acuosa de hidróxido potásico
o sódico siempre que el volumen de agua añadido no provoque
unaseparacióndelasfases.
Nota 2:Sila cantidad necesaria delasolucióndehidróxidopotásico de
0,1Msuperalos10ml,debeutilizarseunasoluciónde0,5M.
Nota 3:Si la solución se enturbia durante la valoración, añadir una
cantidad suficiente de la mezcla de disolventes (1.2.1) para que
lasoluciónseaclare.
1.5Expresióndelaacidezenporcentajedeácidooleico
Laacidez,expresadaenporcentajedeácidooleicoesiguala:
V/C2c/C2M
1000/C2100
P¼V/C2c/C2M
10/C2P
siendo:
V: volumen en ml de la solución valorada de hidróxido potásico utili-
zada.
c: concentraciónexacta,enmolesporlitro,delasolucióndehidróxido
potásicoutilizada.
M: peso molecular del ácido en que se expresa el resultado (ácido
oleico=282).
P: pesoengramosdelamuestrautilizada.
Se tomará como resultado la media aritmética ►M6de dos
determinaciones ◄.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—11
▼B
ANEXO III
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEPERÓXIDOS
1. OBJETO
Lapresentenormadescribeunmétodoparaladeterminacióndelíndicede
peróxidosdelosaceitesygrasas.
2. ÁMBITODEAPLICACIÓN
Lapresentenormaesaplicablealosaceitesygrasasanimalesyvegetales.
3. DEFINICIÓN
El índice de peróxidos es la cantidad (expresada en miliequivalentes de
oxígenoactivoporkgdegrasa)deperóxidosenlamuestraqueocasionan
laoxidacióndelyoduropotásicoenlascondicionesdetrabajodescritas.
4. PRINCIPIO
La muestra problema, disuelta en ácido acético y cloroformo, se trata con
solucióndeyoduropotásico.Elyodoliberadosevaloraconsoluciónvalo-
radadetiosulfatosódico.
5. APARATOS
Todo el material utilizado estará exento de sustancias reductoras u
oxidantes.
Nota:Noengrasarlassuperficiesesmeriladas.
5.1. Navecilladevidriode3ml5.2. Matraces con cuello y tapón esmerilados, de 250ml de capacidad aproxi-
madamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco
(nitrógenoo,preferiblemente,dióxidodecarbono).
5.3. Buretade25o50ml,graduadaen0,1ml.
6. REACTIVOS
6.1. Cloroformoparaanálisis,exentodeoxígenoporborboteodeunacorriente
degasinertepuroyseco.
6.2. Ácidoacéticoglacialparaanálisis,exentodeoxígenoporborboteodeuna
corrientedegasinertepuroyseco.
6.3. Solución acuosa saturada de yoduro potásico, recién preparada, exenta de
yodoyyodatos.
6.4. Solución acuosa de tiosulfato sódico 0,01 N o 0,002 N valorada exacta-
mente;lavaloraciónseefectuaráinmediatamenteantesdeluso.
6.5. Solución de almidón, en solución acuosa de 10 g/l, recién preparada con
almidónsoluble.
7. MUESTRA
La muestra se tomará y almacenará al abrigo de la luz, y se mantendrá
refrigeradadentrodeenvasesdevidriototalmentellenosyherméticamente
cerradoscontaponesdevidrioesmeriladoodecorcho.
8. PROCEDIMIENTO
Elensayoserealizaráconluznaturaldifusaoconluzartificial. Pesarcon
precisiónde0,001genunanavecilladevidrio(5.1)o,ensudefecto,enun
matraz (5.2) una cantidad de muestra en función del índice de peróxidos
quesepresuponga,conarregloalcuadrosiguiente:1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—12
▼B
Índicedeperóxidosquesesupone
(meqdeO2/kg)Pesodelamuestraproblema
(eng)
de0a12 de5,0a2,0
de12a20 de2,0a1,2de20a30 de1,2a0,8de30a50 de0,8a0,5
de50a90 de0,5a0,3
Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la
muestraproblema.Añadir10mldecloroformo(6.1).Disolverrápidamente
la muestra problema mediante agitación. Añadir 15 ml de ácido acético
(6.2) y, a continuación, 1 ml de solución de yoduro potásico (6.3). Cerrar
rápidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscu-
ridad durante 5 minutos exactamente, a una temperatura comprendida
entre15y25ºC.
Añadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al
mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solución de tiosul-
fato sódico (6.4) (solución 0,002 N si se presuponen valores inferiores a
12ysolución0,01Nsisepresuponenvaloressuperioresa12),utilizando
lasolucióndealmidón(6.5)comoindicador.
Efectuardosdeterminacionespormuestra.
Realizar simultáneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo
en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solución de tiosulfato sódico 0,01 N
(6.4),sustituirlosreactivos.
9. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
El índice de peróxidos (I.P.), expresado en miliequivalentes de oxígeno
activoporkgdegrasasecalculamediantelafórmulasiguiente:
IP¼
V/C2N/C21000
P
siendo:
V: ml de solución valorada de tiosulfato sódico (6.4) empleados en el
ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo
enblanco.
N: normalidadexactadelasolucióndetiosulfatosódico(6.4)empleada.
P: peso,engramosdelamuestraproblema.
Elresultadoserálamediaartiméticadelasdosdeterminacionesefectuadas.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—13
▼M6
ANEXO IV
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE
CROMATOGRAFÍADEGASESCONCOLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de ceras en determinados aceites y grasas en las condi-
cionesdeensayo.
Puede utilizarse, en particular, para distinguir el aceite de oliva obte-
nidomedianteextracción(aceitedeorujodeoliva).
2. PRINCIPIO
Fraccionamiento de la grasa o aceite, a los que se habrá añadido un
patróninternoadecuado,mediantecromatografíaencolumnadegelde
sílice hidratado. Recuperación de la fracción eluida en las condiciones
de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicéridos) y, a
continuación,análisisdirectomediantecromatografíadegasescolumna
capilar.
3. APARATOS
3.1. MatrazErlenmeyerde25ml.
3.2. Columnadevidrioparacromatografíade15mmdediámetrointeriory
30-40cmdelongitud.
3.3. Cromatógrafo de gases adecuado con columna capilar, dotado de un
sistema de introducción directa en la columna, que incluya los
siguienteselementos:
3.3.1. Hornotermostáticoparalascolumnas,quepuedamantenerlatempera-
turadeseadaconunaoscilaciónmáximade1ºC.
3.3.2. Inyectorenfríoparaintroduccióndirectaenlacolumna.3.3.3. Detectordeionizacióndellamayconvertidor-amplificador.3.3.4. Registrador-integrador quepueda funcionar con elconvertidor-amplifi-
cador(3.3.3),conuntiempoderespuestainferioroigualaunsegundo
yvelocidaddelpapelvariable.
3.3.5. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de ►
C210-15 m ◄de
longitud y 0,25-0,32 mm de diámetro interior, con un recubrimiento
interno de SE-52 o SE-54 líquido, o equivalente, de un espesor que
oscileentre0,10y0,30 µm.
3.4. Microjeringa para inyección en columna, de 10 µl de capacidad,
provistadeunaagujacementada.
4. REACTIVOS
4.1. Geldesílice70-230mesh,artículo7754Merck.
Mantenerelgelenelhornodurantecuatrohorasaunatemperaturade
500ºC.Dejarenfriaryañadirun2%deagua.Agitarbienparahomo-
geneizar la mezcla. Mantener al abrigo de la luz durante al menos 12
horasantesdesuuso.
4.2. n-Hexano,decalidadparacromatografía.4.3. Éteretílico,decalidadparacromatografía.4.4. n-Heptano,decalidadparacromatografía.
4.5. Solución patrón de laurilaraquidato al 0,1 % (m/v) en hexano (patrón
interno).
4.6. Gasportador:hidrógenopuro,decalidadparacromatografíadegases.4.7. Gasesauxiliares:
— hidrógenopuro,decalidadparacromatografíadegases,
— airepuro,decalidadparacromatografíadegases.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—14
▼M6
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Separacióndelafraccióndelasceras
5.1.1. Preparacióndelacolumnacromatográfica.
Suspenderenn-hexanoanhidro15gdegeldesílicehidratadoal2%e
introducirenlacolumna.
Dejar sedimentar espontáneamente. Completar la sedimentación con
ayudadeunvibradoreléctrico,afindeobtenerunabandacromatográ-
ficamáshomogénea.Hacerpasar30mlden-hexanoparaeliminar las
posiblesimpurezas.
5.1.2. Cromatografíaencolumna.
Pesar con exactitud 500 mg de la muestra en un matraz de 25 ml;
añadir unacantidad de patrón interno apropiada, enfuncióndel conte-
nido de ceras que se presuma; por ejemplo, añadir 0,1 mg de
laurilaraquidatosisetratadeaceitedeolivay0,25-0,50mgsisetrata
deaceitedeorujodeoliva.
Transferir la muestra preparada a la columna cromatográfica, que se
habrá acondicionado como se indica en el punto 5.1.1 con ayuda de
dosporcionesde2mlden-hexano.
Dejarfluireldisolventehastaquesesitúea1mmporencimadelnivel
superiordel absorbente. Acontinuación, iniciar laelución cromatográ-
fica; recoger 140 ml de la mezcla de n-hexano y éter etílico en la
proporciónde99:1aunritmode15gotasaproximadamente cadadiez
segundos(2,1ml/minuto).
Secar la fracción resultante en un evaporador rotatorio hasta que se
haya eliminado casi todo el disolvente. Eliminar los últimos 2 o 3 ml
mediante una corriente débil de nitrógeno y añadir a continuación 10
mlden-heptano.
5.2. Análisisporcromatografíadegases
5.2.1. Operacionespreliminaresyacondicionamientodelacolumna.
5.2.1.1. Instalarlacolumnaenelcromatógrafodegases,conectandoelterminal
deentradaalsistemaencolumnayelterminaldesalidaaldetector.
Comprobar el funcionamiento general del cromatógrafo de gases
(funcionamiento de los circuitos de gas, eficacia del detector y del
registrador,etc.).
5.2.1.2. Silacolumnaseutilizaporvezprimera,esconvenienteacondicionarla.
Hacer pasar a través de la columna una corriente ligera de gas y, a
continuación, encender el cromatógrafo de gases. Calentar gradual-
mente hasta alcanzar una temperatura de ensayo (véase la nota).
Mantener esta temperatura durante al menos dos horas y, a continua-
ción, ajustar el aparato a las condiciones de ensayo (regulación del
flujo del gas, encendido de la llama, conexión con el registrador elec-
trónico, regulación de la temperatura del horno para la columna,
regulacióndeldetector,etc.).Registrarlaseñalconunasensibilidadal
menosdosvecessuperioralaexigidaparaefectuarelanálisis.Lalínea
de base deberá ser lineal, sin picos de ningún tipo, y no deberá
presentarderiva.
Unaderivarectilíneanegativaindicaquelasconexionesdelacolumna
nosoncorrectas;unaderivapositivaindicaquelacolumnanohasido
acondicionadaadecuadamente.
Nota:La temperatura de acondicionamiento debrá ser en todo
momentoalmenos20ºCinferioralatemperaturamáximaespe-
cificadaparaeleluyentequeseutilice.
5.2.2. Eleccióndelascondicionesdeensayo
5.2.2.1. Lascondicionesdeensayosongeneralmentelassiguientes:
— temperatura de la columna: se parte de una temperatura inicial de
80ºCqueseincrementaarazónde30ºC/minutohastalos120ºC,
y que, a continuación, se programa para que aumente 5 ºC/minuto
hastaalcanzarlos340ºC;
— temperaturadeldetector:350ºC;
— velocidadlinealdelgasportador:hidrógeno,20-35cm/segundo,
— sensibilidadinstrumental:4-16veceslaatenuaciónmínima,— sensibilidaddelregistrador:1-2mVdesdeelfondodelaescala,— velocidaddelpapel:30cm/hora,— cantidadinyectada:0,5-1 µldesolución.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—15
▼M6
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna ydel cromatógrafo degases (afin de obtener cromato-
gramas que reúnan las siguientes condiciones: el tiempo de retención
delpatróninternoC32debeserde25±2minutosyelpicomásrepre-
sentativo de las ceras debe estar comprendido entre el 60 y el 100 %
desdeelfondodelaescala).
5.2.2.2. Determinarlosparámetrosdeintegracióndelospicosdemaneraquese
obtengaunaevaluacióncorrectadelasáreasdelospicosconsiderados.
5.2.3. Realizacióndelanálisis5.2.3.1. Tomar 1 µldesolucióncon lamicrojeringa de10 µl;sacar elémbolo
hastaquelaagujaestévacía.Introducirlaagujaenelsistemadeinyec-
ción e inyectar rápidamente después de 1 o 2 segundos.Despuésde 5
segundosaproximadamente,extraerlentamentelaaguja.
5.2.3.2. Llevaracaboelregistrohastaquelascerassehayaneluidocompleta-
mente.
La línea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas
(5.2.1.2).
5.2.4. Identificacióndelospicos
Identificar los picos sobre la base de los tiempos de retención,
comparándolos con mezclas de ceras analizadas en las mismas condi-
cionesycuyostiemposderetenciónseanconocidos.
Lafigura1presentauncromatogramadelascerasdeunaceitedeoliva
virgen.
5.2.5. Análisiscuantitativo
5.2.5.1. Determinar con ayuda del integrador las áreas de los picos correspon-
dientesalpatróninternoyalosésteresalifáticosdeC40aC46.
5.2.5.2. Determinarelcontenidodecadaunodelosésteresenmg/kgdemateria
grasa,aplicandolasiguientefórmula:
éster(mg/kg)=A
x·ms·►M91000◄
As·m
siendo:
Ax= áreadelpicodecadaunodelosésteres;
As= áreadelpicodellaurilaraquidato;
ms= peso,enmiligramos,dellaurilaraquidatoañadido;
m = peso,engramos,delamuestratomadaparaladeterminación.
6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Expresarloscontenidosdelasdistintascerasylasumadeesosconte-
nidosenmg/kgdemateriagrasa.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—16
▼M6
APÉNDICE
Determinación de la velocidad lineal del gas
Inyectarde1a3 µldemetano(propano)enelcromatógrafodegases,después
dehaberloajustadoalascondicionesdeensayonormales.Medireltiempoque
tardaelgasenrecorrerlacolumna,desdeelmomentodesuinyecciónhastala
aparicióndelpico(tM).
Lavelocidadlinealencm/segundovienedadaporlafórmulaL/tM,siendoLla
longituddelacolumnaexpresadaencmytMeltiempomedidoensegundos.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—17
▼M61991R2568—ES—28.05.1995—012.001—18
▼B
ANEXO V
DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DEL CONTENIDO DE
ESTEROLES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON
COLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de esteroles en las materias grasas, expresado como
contenido de cada uno de los esteroles analizados y como contenido
totaldeesteroles.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadio α-coles-
tanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
potásico;acontinuación,extraccióndelinsaponificableconéteretílico.
Separación de la fracción de esteroles del insaponificable extraído
mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los esteroles
recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se
analizanmediantecromatografíadegasesconcolumnacapilar.
3. MATERIAL
3.1. Matrazde250ml,provistoderefrigerante dereflujoconjuntasesme-
riladas.
3.2. Embudosdeseparaciónde500ml.
3.3. Matracesde250ml.
3.4. Equipo completo de cromatografía en capa fina, utilizando placas de
vidriode20×20cm.
3.5. Lámparaultravioletadeunalongituddeondade366o254nm.
3.6. Microjeringade100µly500µl.
3.7. EmbudocilíndricofiltranteconfiltroporosoG3(porosidad15-40µm),
de2cmdediámetroy5cmdealtura,aproximadamente,conundispo-
sitivo adecuado para la filtración en vacío y una junta esmerilada
macho12/21.
3.8. Matrazcónicoparavacíode50ml,conjuntaesmeriladahembra12/21
acoplablealembudofiltrante(3.7).
3.9. Probetade10mldefondocónicocontapónhermético.
3.10. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna
capilar,provistodeunsistemadedivisióndeflujoformadopor:
3.10.1. Hornoparalacolumna,quepuedamantenerlatemperaturadeseadacon
precisiónde±1ºC.
3.10.2. Inyectorconelementovaporizadordevidriotratadoconpersilano.
3.10.3. Detectordeionizacióndellamayconvertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integrador quepueda funcionar con elconvertidor-amplifi-
cador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y
convelocidaddepapelvariable.
3.11. Columnacapilardevidrioosílicefundida,de20a30mdelongitudy
de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interno, recubierta interiormente de
líquidoSE-52,SE-54oequivalente,conunespesoruniformequeoscile
entre0,10y0,30µm.
3.12. Microjeringa de 10 µl para cromatografía de gases, con aguja endure-
cida.
4. REACTIVOS
4.1. Hidróxido potásico, solución etanólica 2N aproximadamente: disolver,
enfriando al mismo tiempo, 130 g de hidróxido potásico (valoración
mínima del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un
litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio oscuro
biencerradas.
4.2. Éteretílicodecalidadparaanálisis.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—19
▼B
4.3. Sulfatosódicoanhidrodecalidadparaanálisis.
4.4. Placasdevidriorecubiertas congeldesílice, sinindicador defluores-
cencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya
preparadasparaeluso).
4.5. Hidróxidopotásico,soluciónetanólica0,2N:disolver13gdehidróxido
potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con
etanol.
4.6. Bencenoparacromatografía.
4.7. Acetonaparacromatografía.(Véase5.2.2).
4.8. Hexanoparacromatografía.(Véase5.2.2).4.9. Éteretílicoparacromatografía.(Véase5.2.2).4.10. Cloroformodecalidadparaanálisis.
4.11. Solución patrón para cromatografía en capa fina: colesterol o fitoste-
roles,soluciónal ►
M62%◄encloroformo.
4.12. Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol. Para hacerla
ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2N
dehidróxidopotásico.
4.13. Piridinaanhidraparacromatografía.
4.14. Hexametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Soluciónproblema de trimetilsililéteres delosesteroles: preparar enel
momento del usoa partir de esteroles puroso de mezclas de esteroles
obtenidosdeaceitesqueloscontengan.
4.17. α-colestanol,disoluciónal0,2%(m/V)encloroformo(patróninterno).
4.18. Gasportador:hidrógenooheliodecalidadparacromatografíadegases.4.19. Gasesauxiliares:
— hidrógenodecalidadparacromatografíadegases,
— airedecalidadparacromatografíadegases.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparacióndelinsaponificable.5.1.1. Con la microjeringa de 500 µl introducir en el matraz de 250 ml un
volumen de disolución de α-colestanol al 0,2 % en cloroformo (4.17)
que contenga una cantidad de α-colestanol correspondiente al 10 %
aproximadamente del contenido de esteroles en la alícuota de la
muestraparaladeterminación.Porejemplo,para5gdemuestraañadir
500µldelasoluciónde α-colestanol al0,2%,sisetrata deaceite de
oliva,y1500µl,sisetrata ►
M6 ◄deaceitedeorujo
deoliva.
Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación,
pesarconprecisión,enelmismomatraz,5gdemuestrasecayfiltrada.
Enelcasodeaceites ►M6 ◄conunaltocontenidode
colesterolpuedeproducirseönpicocuyotiempoderetenciónseaidén-
ticoaldelcolestanol.Entalcasoelanálisisdelafraccióndeesteroles
deberealizarsedosveces:conpatróninternoysinél ►M6ohayque
utilizarbetulinolenlugardecolestanol ◄.
5.1.2. Añadir50mldesoluciónetanólicadehidróxidopotásico2N,adaptarel
refrigerante de reflujo y calentar en baño María con ligera ebullición,
agitandoenérgicaeininterrumpidamentehastaqueseproduzcalasapo-
nificación(lasoluciónsevuelvelímpida).Calentardurante20minutos
másy,acontinuación,añadir50mldeaguadestiladaporlapartesupe-
riordelrefrigerante; separarelrefrigerante yenfriarelmatraz a30ºC
aproximadamente.
5.1.3. Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de
separaciónde500ml,mediantevarioslavadosconuntotalaproximado
de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éter
etílico, agitar enérgicamente durante unos30 segundosy dejar reposar
hastalaseparacióndelasfases(nota1).
Separar la fase acuosa inferior pasándola a un segundo embudo de
separación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el
mismoprocedimiento,utilizandocadavezde60a70mldeéteretílico.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—20
▼B
Nota 1:Lasposiblesemulsionespodráneliminarseañadiendopequeñas
cantidadesdealcoholetílicoometílicoconunpulverizador.
5.1.4. Reunir las fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y
lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de
lavadopresentereacciónneutra.
Unavezeliminada elaguadelavado,secarconsulfatosódicoanhidro
y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml previa-
mente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeñas cantidades
deéteretílico.
5.1.5. Destilar eléterhastaquequedenunospocosml; acontinuación, secar
con un vacío ligero o en una corriente de nitrógeno, completando el
secado en una estufa a 100 ºC durante 15 minutos aproximadamente;
dejarenfriarenundesecadorypesar.
5.2. Separacióndelafraccióndeesteroles.
5.2.1. Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas
con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2N de hidróxido
potásico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana
durante dos horas y, por último, mantenerlas en una estufa regulada a
100 ºC durante una hora. Sacarlas de la estufa y conservarlas en un
desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas
sometidas a este tratamiento deberán utilizarse en un plazo de quince
díascomomáximo).
Nota 2:Siseutilizanplacasbásicasdegeldesíliceparalaseparación
delafraccióndeesteroles,yanoesnecesariotratarelinsapo-
nificableconalúmina.Deestemodo,todosloscompuestosde
naturalezaácida(ácidosgrasosyotros)quedanretenidosenla
líneadeaplicación,ylabandadelosesterolesapareceperfec-
tamente diferenciada de la banda de los alcoholes alifáticos y
triterpénicos.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de
benceno-acetona95:5(v/v)hastaunaalturade1cmaproximadamente.
Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y éter etílico
65:35(v/v).Cerrarlacubetaconsucorrespondientetapaydejartrans-
currirmediahoracomomínimo, deformaquesealcance elequilibrio
líquido-vapor.Enlascarasinterioresdelacubetapuedencolocarsetiras
de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el
tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elución
másuniformeyregulardeloscomponentes.
Nota 3:Paraquelascondicionesdeelución seanperfectamente repro-
ducibles, la mezcla de desarrollo deberá cambiarse en cada
prueba.
5.2.3. Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 %
aproximadamente y, con la microjeringa de 100 µl, depositar 0,3 ml
de dicha solución en una placa cromatográfica (5.2.1) a unos2 cm de
unodelosbordes,formandounalínealomásfinayuniformeposible.
Alaalturadelalínea deaplicación sedepositan,enunextremodela
placa, de2a3µldelasolucióndereferencia deesteroles (4.11)para
poderidentificarlabandadeesterolesunavezefectuadoeldesarrollo.
5.2.4. Introducirlaplacaenlacubetadedesarrollo,preparadacomoseindica
en el punto 5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura ambiente entre
15 y 20 ºC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca
laeluciónhastaqueelfrentedeldisolvente sesitúea1cmaproxima-
damente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y
evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la
placabajounacampanaunosminutos.
5.2.5. Pulverizarlaplacaligerayuniformementeconlasoluciónde2,7-diclo-
rofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede
identificarse la banda de los esteroles mediante comparación con la
mancha obtenida a partir de la solución de referencia; marcar con
lápiznegroloslímitesdelabandaalolargodelosmárgenesdefluo-
rescencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área
delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el
embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclarcuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo
elfiltradoenelmatrazcónico(3.8)acopladoalembudofiltrante.
Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando
cada vez unos 10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mismo
matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—21
▼B
un volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al tubo de
ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suaveencorriente ligera denitrógeno,recoger
conalgunasgotasdeacetona,evaporardenuevohastasequedad,intro-
ducirenunaestufaa105ºCduranteunos10minutos,dejarenfriaren
eldesecadorypesar.
Elresiduoquequedaeneltubodeensayoestáformadoporlafracción
deesteroles.
5.3. Preparacióndelostrimetilsililéteres.
5.3.1. Agregaraltuboquecontienelafraccióndeesteroleselreactivodesila-
nización formado por una mezcla de piridina-hexametildisilazano-
trimetilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 4), a razón de 50 µl por mili-
gramodeesteroles,evitandotodaabsorcióndehumedad(nota5).
Nota 4:Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además,
también existen otros reactivos de silanización, como el bis-
trimetilsililacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que se
diluyeenelmismovolumendepiridinaanhidra.
5.3.2. Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la completa
disolución de los esteroles. Dejar reposar un cuarto de hora, como
mínimo,atemperaturaambienteycentrifugardurantealgunosminutos;
lasoluciónlímpida queda lista para elanálisis mediante cromatografía
degases.
Nota 5:La formación de una ligera opalescencia es normal y no
ocasiona ninguna interferencia. La formación de una flocula-
ciónblanca olaaparición deunacoloración rosasonindicios
de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este
casodeberárepetirselaprueba.
5.4. Cromatografíadegases.
5.4.1. Operacionespreliminares:acondicionamientodelacolumna.
5.4.1.1. Colocarlacolumnaenelcromatógrafouniendounodelosextremosde
lacolumnaalinyectoryelotroaldetector.
Efectuarloscontrolesgeneralesdelequipoparacromatografíadegases
(estanquidaddeloscricuitosdegases,eficaciadeldetector,eficaciadel
sistemadedivisióndeflujoydelsistemaderegistro,etc.).
5.4.1.2. Silacolumnaseutilizaporvezprimera,esconvenienteacondicionarla
previamente.Hacerpasarunligeroflujodegasatravésdelacolumna,
encenderelequipodecromatografíadegaseseiniciaruncalentamiento
gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 ºC superior a la
temperatura de trabajo (nota 6).Mantener dicha temperatura durante 2
horas como mínimo; a continuación, poner el equipo completo en
condiciones de funcionamiento (regulación del flujo de gases y de la
relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador
electrónico, regulación de la temperatura del horno del detector y del
inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos
veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de
base debe ser lineal, exento de picos de cualquier tipo y no debe
presentarderiva.
Unaderivarectilíneanegativaindicaquelasconexionesdelacolumna
nosontotalmenteestancas;unaderivapositivaindicaqueelacondicio-
namientodelacolumnaesinsuficiente.
Nota 6:La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre,
comomínimo20ºCinferioralatemperaturamáximaprevista
paralafaseestacionariautilizada.
5.4.2. Eleccióndelascondicionesdetrabajo.
5.4.2.1. Lascondicionesdetrabajoexigidassonlassiguientes:
— temperaturadelacolumna:260ºC±5ºC,
—►C1temperaturadelinyector ◄:280ºC,
— temperaturadeldetector:290ºC,— velocidadlinealdelgasportador:helio20a35cm/s,hidrógeno30
a50cm/s,
— relaciónde«split»de1/50a1/100,
— sensibilidaddelinstrumento:de4a16veceslaatenuaciónmínima,
— sensibilidadderegistro:1a2mVf.e.— velocidaddelpapel:30a60cm/hora,— cantidaddesustanciainyectada:0,5a1µldesolucióndeTMSE.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—22
▼B
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
delacolumna ydelcromatógrafo, demodoqueseobtengancromato-
gramasquecumplanlossiguientesrequisitos:
— eltiempoderetencióndel β-sitosteroldebeserde20±5minutos,
— elpicodelcampesteroldebeser:paraelaceite deoliva(contenido
mediodel3%),15±5%delfondodeescala;paraelaceitedesoja
(contenidomediodel20%),80±10%delfondodeescala,
— sedebenseparar todoslosesteroles presentes;esnecesario quelos
picos no sólo se separen sino que se resuelvan completamente, es
decir, que el trazo del pico llegue a la línea de base antes de que
seinicieelpicosiguiente.Noobstante,podráadmitirseunaresolu-
ción incompleta si el pico a TRR 1,02 puede cuantificarse
utilizandolaperpendicular.
5.4.3. Realizacióndelanálisis.
5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 µl tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µl de
airey,acontinuación,entre0,5y1µldelasoluciónproblema;elevar
elémbolodelajeringademodoquelaagujaquedevacía.Introducirla
agujaatravésdelseptumy,despuésde 1o2segundos,inyectarrápida-
mente;transcurridosunos5segundos,extraerlaagujalentamente.
5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los
esterolespresentes.
La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones
exigidas(5.4.1.2).
5.4.4. Identificacióndelospicos.
Paralaidentificación delosdiferentes picosseutilizan lostiempos de
retención y la comparación con mezclas de TMSE de los esteroles
analizadasenlasmismascondiciones.
Laelucióndelosesterolesseefectúa enelordensiguiente:colesterol,
brasicasterol,24-metilencolesterol, campesterol,campestanol,estigmas-
terol, ∆-7-campesterol, ∆-5,23-estigmastadienol, clerosterol, β-
sitosterol, sitostanol, ∆-5-avenasterol, ∆-5,24-estigmastadienol, ∆-7-
estigmastenol, ∆-7-avenasterol.
En el cuadro Ifiguran lostiempos de retención correspondientes al β-
sitosterolparalascolumnasSE52ySE54.
Lasfiguras1y2ilustranloscromatogramastípicosdealgunosaceites.
5.4.5. Determinacióncuantitativa.5.4.5.1. Calcularlasáreasdelospicosdel α-colestanolydelosesterolesutili-
zando el integrador. No se tomarán en cuenta los picos de aquellos
componentesquenofigurenenelcuadroI.Elfactorderespuestapara
elα-colestanoldebeconsiderarsecomo1.
5.4.5.2. Calculardelmodosiguienteelcontenido decadaunodelosesteroles,
expresadoenmg/100gdemateriagrasa:
esterolx=A
x·ms·100
As·m
siendo:
Ax: áreadelpicodelesterolx ►M6 ◄,
As: áreadelpicodel α-colestanol,
ms: pesode α-colestanolañadido,enmiligramos,
m: pesodelamuestratomadoparaladeterminación,engramos.
6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
6.1. ►C1Seexpresa ◄elcontenidodecadaunodelosesterolesenmg/
100gdemateriagrasay,como«esterolestotales»,susuma.
6.2. Elporcentaje decadaunodelosesteroles simpleseslarazónentreel
áreadelpicocorrespondienteylasumadelasáreasdelospicosdelos
esteroles.
%delesterolX=Ax
ΣA×1001991R2568—ES—28.05.1995—012.001—23
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siendo:
Ax: áreadelpicodex,
ΣA: sumadelasáreasdetodoslospicos.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—24
▼B
APÉNDICE
Determinación de la velocidad lineal del gas
Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condiciones normales,
de1a3µldemetano(opropano)ymedireltiempoquetardaelgasenrecorrer
lacolumna,desdeelmomentodelainyecciónhastaelmomentoenqueaparece
elpico(tM).
La velocidad lineal en cm/s viene dada por L/tM, siendo L la longitud de la
columnaencmytMeltiempo,expresadoensegundos.
CuadroI
Tiemposderetenciónrelativosdelosesteroles
Pi-
coIdentificaciónTiempoderetención
Columna
SE54Columna
SE52
1 colesterol ∆5-colesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 colestanol 5 α-colestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brasicasterol [24S]-24-metil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-metilencolesterol 24-metilen- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-metil- ∆5colesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-metil-colestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 estigmasterol [24S]-24-etil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆7-campesterol [24R]-24-metil- ∆7-colesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆ 5,23-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,23-colestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 clerosterol [24S]-24-etil- ∆ 5,25-colestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-etil- ∆5-colesten-3 β-ol 1 1
12 sitostanol 24-etil-colestan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆5-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆5-colesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆ 5,24-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆7-estigmastenol [24R,S]-24-etil- ∆ 7,24-colesten-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆7-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆7-3β-ol 1,16 1,161991R2568—ES—28.05.1995—012.001—25
▼B
Figura1
Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva bruto
1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—26
▼B
Figura2
Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva refinado
1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—27
▼B
ANEXO VI
DETERMINACIÓNDELCONTENIDOENERITRODIOLYUVAOL
INTRODUCCIÓN
El eritrodiol, entendido corrientemente como conjunto de los dioles
eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, característico
de algunos tipos de materias grasas. Su concentración es mucho más
elevadaenlosaceitesdeolivaobtenidosmedianteextracciónqueenlos
obtenidosmediantepresiónoenelaceitedepepitadeuvay,porlotanto,
sudeterminación puede servirpara comprobar la existencia de aceite de
olivaobtenidomedianteextracción.
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para determinar el eritro-
diolenlasmateriasgrasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se saponifica con una solución etanólica de hidróxido
potásico;acontinuaciónseextraeelinsaponificable conéteretílicoyse
purificapasándoloporunacolumnadealúmina.
Elfraccionamiento delinsaponificable serealiza mediante cromatografía
encapafinaenplacadegeldesíliceyseaíslanlabandadelafracción
esterólicayladeleritrodiol.
Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la placa se transforman en
trimetilsililéteres yseguidamenteseanalizalamezclamediantecromato-
grafíadegases.
El resultado seexpresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto
deeritrodiol+esteroles.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. El mismo material que el indicado para el método del Anexo V (Deter-
minacióndelcontenidodeesteroles).
4. REACTIVOS
4.1. Los mismos reactivos que los indicados para el método del Anexo V
(Determinacióndelcontenidodeesteroles).
4.2. Soluciónpatróndeeritrodiolal0,5%encloroformo.
5. PROCEDIMIENTO5.1.Preparacióndelinsaponificable
Serealizatalcomoseindicaenelapartado5.1.2delmétododelAnexo
V
5.2.Separacióndeleritrodiolylosesteroles
5.2.1. Véaseelapartado5.2.1delmétododelAnexoV.
5.2.2. Véaseelapartado5.2.2delmétodomencionado.5.2.3. Prepararunasolucióndelinsaponificableal5%encloroformo.
Conunamicrojeringade0,1mldepositar0,3mldeestasoluciónenuna
placa cromatográfica aaproximadamente 1,5cmdelbordeinferiordela
placa,formandounabandalomásfinayuniformeposible.Depositaren
unextremodelaplaca,comoreferencia,algunosmicrolitrosdelassolu-
cionesdecolesterolyeritrodiol.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el apartado 5.2.1. La temperatura ambiente debe ser de unos 20 ºC.
Taparinmediatamente lacubetaydejarqueseproduzcalaeluciónhasta
que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximadamente del borde
superior de la placa. Sacar ésta de la cubeta de desarrollo y evaporar el
disolventeenunacorrientedeairecaliente.
5.2.5. Pulverizar la placa uniformemente con la solución alcohólica de 2 ′,7′-
diclorofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta pueden1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—28
▼B
identificarselasbandasdelosesterolesydeleritrodiolmediantecompa-
raciónconlasreferencias;delimitarlasbandasconunapuntaligeramente
porelexteriordelosmárgenesdefluorescencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en las áreas
delimitadas. Reunir el material obtenido en un matraz cónico de 50 ml;
añadir 15 ml de cloroformo caliente, agitar bien y filtrar en el embudo
de filtro poroso vertiendo el gel de sílice sobre el propio filtro. Lavar
tres veces con 10 ml de cloroformo caliente cada vez, recogiendo el
filtrado en un matraz esférico de 100 ml. Evaporar hasta obtener un
volumende4a5ml,transvasaraltubodecentrifugadodefondocónico
de10mlpreviamente tarado,evaporarhastasequedadmediante calenta-
mientosuaveencorrientedenitrógenoypesar.
5.3.Preparacióndelostrimetilsililéteres
Serealizatalcomoseindicaenelapartado5.3delmétododelAnexoV.
5.4.Cromatografíadegases
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4 del método citado. Las
condiciones operativas de la cromatografía de gases deben cumplir los
requisitos necesarios para analizar los esteroles y, además, permitir la
separacióndelosTMSEdeleritrodiolydeluvaol.
Una vez inyectada la muestra, dejar que se desarrolle el proceso hasta
que se produzca la elución de los esteroles presentes, el eritrodiol y el
uvaol; identificar los picos (el eritrodiol y el uvaol tienen tiempos de
retención relativos, respecto al β-sitosterol, de alrededor de 1,45 y 1,55,
respectivamente) y calcular sus áreas de la misma forma que para los
esteroles.
6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Eritrodiol,%=A1+A2
A1+A2+ΣAesteroles×100
siendo:
A1: áreadelpicodeleritrodiol,
A2: áreadelpicodeluvaol ►M6 ◄,
ΣAesteroles: sumadelasáreasdelosesterolespresentes.
Losresultadosdebenexpresarseconunacifradecimal.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—29
▼B
ANEXO VII
DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS SITUADOS EN LA
POSICIÓN2DELOSTRIGLICÉRIDOSDEACEITESYGRASAS
1. OBJETO
La presente norma describe un método para la determinación de la
composición porcentual de ácidos grasos que se encuentran esterificados
enlaposición2 ►C1(oposicióninterna) ◄delostriglicéridos.
2. CAMPODEAPLICACIÓN
Lapresentenormaesaplicablealosaceitesygrasascuyopuntodefusión
sesitúapordebajodelos45ºC,debidoalascaracterísticasespecialesde
laaccióndelalipasapancreática.
No es aplicable sin reservas a los aceites y grasas que contengan canti-
dades importantes de ácidos grasos con 12 átomos de carbono o menos
(aceitesdecocoydepalmiste,materiasgrasasbutíricas),deácidosgrasos
altamente insaturados (con más de cuatro enlaces dobles) que tengan 20
átomosdecarbonoomás(aceitesdepescadoydemamíferosmarinos)o
deácidosgrasosquetengangruposconfuncionesoxigenadas,ademásdel
grupoácido.
3. PRINCIPIO
Neutralización de los aceites y grasas si fuera necesario. Purificación
mediante tratamiento en columna de alúmina. Hidrólisis parcial de los
triglicéridos bajo la acción de la lipasa pancreática durante un tiempo
determinado. Separación de los monoglicéridos resultantes mediante
cromatografíaencapafinaymetanólisisdeestosmonoglicéridos.Análisis
delosésteresmetílicosmediantecromatografíagas-líquido.
4. EQUIPO
4.1. Matrazdefondoredondode100ml.4.2. Matrazdefondoredondode25mlconbocaesmerilada.4.3. Refrigerantedeairede1mdelongitud,adaptablealmatraz4.2.
4.4. Matrazerlenmeyerde250ml.
4.5. Vasodeprecipitadosde50ml.4.6. Embudodeseparaciónde500ml.4.7. Columnaparacromatografía,devidrio,condiámetrointeriorde13mmy
longitudde400mm,provistadeundiscodevidrioporosoydeunallave.
4.8. Tubodecentrífugade10mlcontapóndevidrioesmerilado.4.9. Buretade5mlgraduadaen0,05ml.4.10. Jeringahipodérmicade1mlprovistadeunaagujafina.4.11. Microjeringaquepuedadispensargotasde3-4µl.
4.12. Aplicadorparacromatografíaencapafina.
4.13. Placasdevidriode20×20cmparacromatografíaencapafina.4.14. Cubeta de desarrollo para cromatografía en capa fina, de vidrio, provista
deunatapadevidrioesmerilado,adecuadaparalasplacasde20×20cm.
4.15. Pulverizadorparacromatografíaencapafina.
4.16. Estufareguladaa103±2ºC.4.17. Termostatoregulableaunatemperaturacomprendidaentre30y45ºCcon
precisiónde0,5ºC.
4.18. Evaporadorrotatorio.
4.19. Vibrador eléctrico, con el que pueda agitarse vigorosamente el tubo de
centrífuga.
4.20. Lámparaultravioletaparaexaminarlasplacasdecapafina.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—30
▼B
Para el control de la actividad lipásica:
4.21. pH-metro.
4.22. Agitadorespiral.4.23. Buretade5ml.4.24. Cronómetro.
Para la eventual preparación de la lipasa:
4.25. Agitador de laboratorio, adecuado para dispersar y mezclar materiales
heterogéneos.
5. REACTIVOS
5.1. n-Hexanoo,ensudefecto,éterdepetróleo(puntodeebullición30-50ºC),
decalidadparacromatografía.
5.2. 2-Propanol,oetanol,95%(v/v)decalidadparaanálisis.
5.3. 2-Propanol,oetanol,soluciónacuosa1/1.5.4. Éterdietílico,exentodeperóxidos.5.5. Acetona.5.6. Ácidofórmico,almenosde98%(p/p).5.7. Solventededesarrollo:unamezcladen-hexano(5.1),éterdietílico(5.4)y
ácidofórmico(5.6)enlasproporciones70/30/1(v/v/v).
5.8. Alúmina activada para cromatografía, neutra, actividad l según Brock-
mann.
5.9. Geldesíliceconaglutinante,decalidadparacromatografíaencapafina.5.10. Lipasapancreáticadecalidadadecuada(véanselasnotas1y2).5.11. Hidróxidosódicoensoluciónacuosade120g/l.5.12. Ácidoclorhídrico,soluciónacuosa6N.5.13. Soluciónacuosade220g/ldeclorurodecalcio(CaCl
2).
5.14. Soluciónacuosade1g/ldecolatosódico(decalidadenzimática).
5.15. Solucióntampón:soluciónacuosadetris-hidroximetil-aminometano 1M,
ajustadaapH=8conácidoclorhídrico(5.12)(controlarconunpotenció-
metro).
5.16. Soluciónde10g/ldefenolftaleínaenetanolal95%(v/v).5.17. Solución de 2 g/l de 2 ′,7′-diclorofluoresceína en etanol al 95 % (v/v);
alcalinizar ligeramente añadiendo 1gotadesolucióndehidróxidosódico
1Npor100ml.
Para el control de la actividad lipásica:
5.18. Aceiteneutralizado.5.19. Soluciónacuosadehidróxidosódico0,1N.
5.20. Soluciónacuosade200g/ldecolatosódico(decalidadenzimática).
5.21. Soluciónacuosade100g/ldegomaarábiga.
6. PREPARACIÓNDELAMUESTRA
Silaacidezdelamuestra,determinadaconarregloalmétododelAnexo
IIesinferioral3%,seefectuarádirectamentelapurificaciónencolumna
dealúminacomosedescribeenelpunto6.2.
Silaacidezdelamuestra,determinadaconarregloalmétododelAnexo
II,essuperioral3%,seefectuaráunaneutralizaciónalcalinaenpresencia
de un solvente, como se describe en el punto 6.1, y a continuación e
realizarálapurificaciónencolumnadealúminadescritaenelpunto6.2.
6.1. Neutralizaciónalcalinaenpresenciadeunsolvente.
Introducir en el embudo de separación (4.6) aproximadamente 10 g de
aceitecrudoyañadir100mldehexano(5.1),50mlde2-propanol(5.2),
algunasgotasdesolucióndefenolftaleína(5.16)yelvolumendesolución
dehidróxidosódico(5.11)correspondientealaacidezlibredelaceitemás1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—31
▼B
un0,3%deexceso.Agitarenérgicamentedurante1minuto,añadir50ml
deaguadestilada,agitardenuevoydejarreposar.
Unavezquesehayaproducidolaseparación,separarlacapainferiorque
contiene los jabones. Separar, asimismo, todas las capas intermedias
(mucílago, materias insolubles). Lavar la solución de hexano delaceite
neutralizado con porciones sucesivas de 25-30 ml de la solución de 2-
propanol(5.3),hastaquedesaparezcaelcolorrosadelafenolftaleína.
Eliminar la mayor parte del hexano mediante destilación en vacío en el
evaporador rotatorio (4.18); desecar el aceite en vacío a 30-40 ºC
mediante una corriente de nitrógeno puro hasta la completa eliminación
delhexano.
6.2. Purificaciónconalúmina.
Preparar una suspensión de 15 g de alúmina activada (5.8) en 50 ml de
hexano (5.1) y verterla en la columna cromatográfica (4.7), removiendo
al mismo tiempo. Dejar que la alúmina se asiente uniformemente y
esperar a que el nivel del solvente descienda a 1-2 mm por encima del
absorbente. Verter cuidadosamente en la columna 5 g de aceite disueltos
en 25 ml de hexano (5.1); recoger todo el eluyente de la columna en un
matrazdefondoredondo(4.1).
7. PREPARACIÓNDELASPLACASCROMATOGRÁFICAS
Limpiar perfectamente las placas de vidrio (4.13) con etanol, éter de
petróleoyacetonaparaeliminarcualquierrastrodemateriagrasa.
Introducir en un matraz erlenmeyer (4.4) 30 g de polvo de sílice (5.9).
Añadir 60 ml de agua destilada. Tapar y agitar enérgicamente durante 1
minuto. Transferir inmediatamente al aplicador la mezcla semifluida
(4.12)yrecubrirlasplacaslimpiasconunacapade0,25mmdeespesor.
Secar lasplacas alaire durante 15minutosyacontinuación enlaestufa
(4.16)a103±2ºCdurante1hora.Antesdeluso,enfriarlasplacasenun
desecador a temperatura ambiente. En el comercio pueden adquirirse
placaspreparadas.
8. PROCEDIMIENTO
8.1. Hidrólisisconlipasapancreática.
Pesareneltubodecentrífuga(4.8)0,1gaproximadamentedelamuestra
preparada; si la muestra es aceite líquido, proceder como se indica a
continuación; si es una grasa sólida, disolverla en 0,2 ml de hexano
(5.1),aplicando,siesnecesario,unligerocalentamiento.
Añadir 20 mg de lipasa (5.10) y 2 ml de solución tampón (5.15). Agitar
bien,peroconcuidado,yañadiracontinuación 0,5mldelasoluciónde
colato sódico (5.14) y 0,2 ml de la solución de cloruro de calcio (5.13).
Cerrar el tubo con el tapón esmerilado, agitar cuidadosamente (evitando
humedecereltapón)eintroducireltuboinmediatamente eneltermostato
(4.17)a40±0,5ºCyagitarmanualmentedurante1minutoexacto.
Sacareltubodeltermostato yagitarenérgicamente conelvibradoreléc-
trico(4.19)durante2minutosexactos.
Enfriar de inmediato en agua corriente; añadir 1 ml de ácido clorhídrico
(5.12)y1mldeéterdietílico(5.4).Taparymezclarenérgicamenteconel
vibrador eléctrico. Dejar en reposo y extraer la capa orgánica con la
jeringa(4.10),trascentrifugarsifuesenecesario.
8.2. Separacióndelosmonoglicéridosporcromatografíaencapafina.
Conayudadelamicrojeringa (4.11)colocarelextractoa1,5cmaproxi-
madamente del borde inferior de la placa cromatográfica, depositándolo
demaneraqueformeunalínea fina,uniformeylomásestrecha posible.
Introducir la placa en una cubeta de desarrollo (4.14) bien saturada y
desarrollar con el solvente de desarrollo (5.7) a unos 20 ºC hasta 1 cm
aproximadamentedelbordesuperiordelaplaca.
Secar la placa al aire a la temperatura de la cubeta y pulverizarla con la
solución de 2 ′,7′-diclorofluoresceína (5.17). Identificar la banda de los
monoglicéridos(Rfaproximadamente0,035)conluzultravioleta(4.20).
8.3. Análisisdelosmonoglicéridosporcromatografíagas-líquido.
Raspar con una espátula la banda citada en el punto 8.2 (procurando no
raspar los componentes que permanezcan en la línea de base) y pasarla
al matraz de metilación (4.2). Tratar directamente la sílice recogida
como se indica en el Anexo X-B, de modo que los monoglicéridos se1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—32
▼B
transformen en ésteres metílicos, y, a continuación, examinar los ésteres
mediante cromatografía en fase gaseosa, como se describe en el Anexo
X-A.
9. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Calcular la composición de los ácidos grasos situados en la posición y
expresarelresultadoconunacifradecimal(nota3).
10. NOTAS
Nota 1:Controldelaactividadlipásica
Prepararunaemulsiónoleosacomosigue:agitarenunmezclador
adecuadounamezclaconstituidapor165mldesolucióndegoma
arábiga (5.21), 15 g de hielo picado y 20 ml de aceite neutrali-
zado(5.18).
En un vaso de precipitados (4.5) introducir 10 ml de esta emul-
sión,0,3mldesolucióndecolatosódico(5.20)y20mldeagua
destilada.
Colocar el vaso en un termostato a 37 ºC ± 0,5 ºC (nota 4) e
introducirloselectrodosdelpH-metro(4.21)yunagitadorespiral
(4.22);después,añadirgotaagotaconunabureta(4.23)solución
dehidróxidosódico(5.19)hastaobtenerunpHde8,5.
Añadirunasuspensiónacuosadelalipasa(véaseacontinuación)
encantidadsuficiente.SemideelpHy,tanprontocomoalcance
el valor de 8,3, se pone en marcha un cronómetro y se va
añadiendo la disolución de hidróxido sódico (5.19) gota a gota,
con la velocidad necesaria para mantener constante el pH de
8,3; anotar cada minuto el volumen de solución alcalina consu-
mido.
Llevar los datos obtenidos a un sistema de ejes de coordenadas,
indicando en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros
de solución alcalina necesarios para mantener constante el pH.
Deberáobtenerseunagráficalineal.
Lasuspensióndelipasamencionadaesunasuspensiónenaguaal
1/1000 (p/p). Deberá emplearse en cada ensayo una cantidad
suficiente de esta suspensión, de modo que en 4 o 5 minutos se
consuma 1 ml de solución alcalina aproximadamente. Normal-
mentesenecesitande1a5mgdepolvo.
La unidad lipásica se define como la cantidad de enzima que
libera10µeqdeácidoporminuto.LaactividadAdelpolvoutili-
zado, medida en unidades lipásicas por mg, se calcula medianteestafórmula:
A¼V/C210
p
siendo:
V = volumen de solución de hidróxido sódico (5.19) consu-
midoporminuto(calculadoapartirdelagráfica),
p = peso,enmg,delamuestrasproblemadepolvo.
Nota 2:Preparacióndelalipasa
En el comercio pueden encontrarse lipasas de actividad lipásica
satisfactoria. También esposible prepararlas en laboratorio dela
manera siguiente: tomar 5kg de páncreas fresco de cerdo, refri-
geradoa0ºC;eliminarlagrasasólidayeltejidoconjuntivoque
lorodean,ytriturarenunmolinodecuchillashastaobteneruna
pastafluida.Conunagitador(4.25)agitarlapastajuntocon2,5l
de acetona anhidra, durante 4-6 horas y después centrifugar.
Efectuartresextraccionesmásdelresiduoconelmismovolumen
deacetonaanhidra,dosextraccionesconunamezcladeacetonay
éteretílico1:1(V/V),ydosextraccionesconéteretílico,eneste
orden.
Desecar el residuo al vado durante 48 horas para obtener un
polvoestable,quedebealmacenarseenunrefrigerador.
Nota 3:Es aconsejable en todos los casos determinar la composición de
losácidos grasostotales delamisma muestra,yaquelacompa-
raciónconladelosácidossituadosenlaposición2facilitará la
interpretacióndelascifrasobtenidas.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—33
▼B
Nota 4:Portratarsedeunaceitelíquido,lahidrólisisseefectúaa37ºC.
No obstante, en el caso de la muestra problema se efectuará a
40 ºC a fin de que puedan examinarse las grasas con puntos de
fusióndehasta45ºC.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—34
▼B
ANEXO VIII
DETERMINACIÓNDELPORCENTAJEDETRILINOLEÍNA
1. OBJETO
Determinación ►C1delporcentaje detrilinoleína delosaceites vegetales
mediantecromatografíalíquidadealtaresolución ◄.
Lapresentenormadescribeunmétodoparaefectuarlaseparaciónydeter-
minación de la composición de los triglicéridos de los aceites vegetales
según su peso molecular y grado de insaturación ►C1expresado por ◄
sunúmeroequivalentedecarbonos(véaselanota1).
2. CAMPODEAPLICACIÓN
Lapresentenormaesaplicableatodoslosaceitesvegetalesquecontengan
triglicéridos de ácidos grasos de cadena larga. Este método es especial-
mente adecuado para detectar la presencia de pequeñas cantidades de
aceites semisecantes (ricos en ácido linoleico) en aceites vegetales cuyo
principal ácido graso insaturado sea el ácido oleico, como es el caso de
losaceitesdeoliva.
3. PRINCIPIO
Separación de los triglicéridos en función de su número equivalente de
carbonos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase
inversaeinterpretacióndeloscromatogramas.
4. APARATOS
4.1. Cromatógrafodelíquidosdealtaresoluciónconcontroltermostáticodela
temperaturadelacolumna.
4.2. Sistemadeinyecciónconunvolumende10µl.4.3. Detector:refractómetrodiferencial.Lasensibilidadentodalaescaladeberá
sercomomínimode10
−4unidadesdeíndicederefracción.
4.4. Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de
diámetro interior, rellena de partículas de sílice de 5 µm de diámetro con
un22-23%decarbonoenformadeoctadecilsilano(nota2).
4.5. Registradory/ointegrador.
5. REACTIVOS
Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de
elución deberán desgasificarse y podrán reciclarse varias veces sin que
elloafectealasseparaciones.
5.1. Cloroformo.5.2. Acetona.5.3. Acetonitrilo.5.4. Fase móvil: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarán para
obtenerlaseparacióndeseada;comenzarconunamezcla50:50).
5.5. Disolventedesolubilización:acetonaomezcladeacetona-cloroformo1:1.5.6. Triglicéridos dereferencia: puedenutilizarse bientriglicéridos comerciales
(tripalmitina, trioleína, etc.), en cuyo caso se reflejarán en un gráfico los
tiemposderetenciónfrentealnúmeroequivalentedecarbonos,alternativa-
menteuncromatogramadereferenciadelaceitedesoja(véanselasnotas3
y4ylasfiguras1y2).
6. PREPARACIÓNDELASMUESTRAS
Preparardelsiguientemodounasoluciónal5%delasmuestrasquevayan
a analizarse: pesar 0,5 ± 0,001 g de la muestra en un matraz aforado de
10mlyenrasarhasta10mlconeldisolventedesolubilización(5.5).
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Instalar el sistema cromatográfico. Bombear fase móvil (5.4) a razón de
1,5ml/mm para purgarelsistema completo. Esperar hastaque seobtenga1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—35
▼B
unalínea debaseestable. Inyectar 10µldelamuestrapreparada comose
indicaenelpunto6.
8. CÁLCULOYEXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Utilícese el método de normalización interna, es decir, considérese que la
suma de las áreas de los picos de los diferentes triglicéridos es igual a
100 %. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicérido mediante esta
fórmula:
%deltriglicérido=áreadelpico
sumadelasáreasdelospicos×100
Elresultadoseexpresaconundecimal.
Nota 1:El orden de elución puede determinarse calculando el número
equivalentedecarbonos,queamenudovienedadoporlarelación
NEC=NC−2n,siendoNCelnúmerodecarbonosynelnúmero
de enlaces dobles; es posible calcularlo con una precisión mucho
mayor tomando en consideración el origen del enlace doble. Si
no,nlynlnsonelnúmerodeenlacesdoblesatribuiblealosácidos
oleico, linoleico y linolénico, respectivamente, el número equiva-
lentedecarbonospuedecalcularsemediantelarelaciónsiguiente:
NEC=NC−dono−dlnl−dlnnln
Loscoeficientesdo,dlydlnpuedencalcularsemediantelostriglicé-
ridosdereferencia.
En las condiciones que se especifican en el presente método, la
relaciónqueseobtengaserásimilaralasiguiente:
NEC=NC−[2,60no]−[2,35nl]−[2,17nln]
Nota 2:Ejemplos: Lichrosorb(Merck)RP18Art50333;
Lichrosphere(Merck)100CH18Art50377osimilares.
Nota 3:Algunos triglicéridos de referencia también permiten calcular la
resoluciónrespectoalatrioleínai:
α=TR′/TR′oleína
utilizandoeltiempoderetencióncorregidoTR ′=TR−TRdisol-
vente.
La representación gráfica del log αfrente a f (número de enlaces
dobles) permite determinar los valores de retención de todos los
triglicéridos de los ácidos grasos contenidos en los triglicéridos
dereferencia(véaselafigura2).
Nota 4:Laeficaciadelacolumnadebepermitirsepararclaramenteelpico
de la LLL (trilinoleína) de los triglicéridos con tiempo de reten-
ciónpróximo.
Nota 5:En el caso de los aceites vírgenes lampantes y de los aceites de
orujode oliva brutos,paraobtener una buena separación delpico
de la trilinoleína de los picos adyacentes o de posibles sustancias
interferentes, se debe purificar previamente el aceite según la
metodologíasiguiente:
Sellevaacabolaabsorciónde200 µldeaceite sindiluirenuna
columnita de sílice sólida para extracción de líquido (tipo SEP
PAKsilicacartridge-waterspart.no51900).
La elución de los triglicéridos se efectúa con 20 ml de hexano
anhidroparaHPLCenuntiempomáximode20segundos.
El producto eluido se seca en una corriente de nitrógeno y se
recoge con isopropanol o acetona (5 ml). Se inyectan entre 10 y
20µl en HPLC. Es necesario comprobar que la composición de
ácidosgrasosdelaceitesealamismaantesydespuésdelapurifi-
cación, dentro de los límites de error del método analítico
adoptado.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—36
▼M11
▼B
Figura1
Cromatograma de una muestra de aceite de soja
Nota:P: ácido palmítico; St: ácido esteárico; O: ácido oleico; L: ácido
linoleico;Ln:ácidolinolénico1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—37
▼B
Figura2
Representación gráfica del log alfa frente a f (número de enlaces dobles)
Nota:La:ácidolaúrico;My:ácidomirístico;P:ácidopalmítico;St:ácido
esterárico;O:ácidooleico;L:ácidolinoleico;Ln:ácidolinolénico.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—38
▼B
ANEXO IX
PRUEBAESPECTROFOTOMÉTRICAENELULTRAVIOLETA
INTRODUCCIÓN
Lapruebaespectrofotométricaenelultravioletapuedeproporcionarindica-
ciones sobre la calidad de una materia grasa, suestado de conservación y
lasmodificacionesinducidasporlosprocesostecnológicos.
Lasabsorcionesenlaslongitudesdeondaindicadasenelmétodosedeben
a la presencia de sistemas diénicos y triénicos ►C1conjugados ◄. Los
valores de estas absorciones se expresan en extinción específica E1cm1%
(extinción de una solución de la materia grasa al 1 % en el disolvente
determinado, enunespesorde 1cm) queseexpresará convencionalmente
comoK,tambiéndenominadocoeficientedeextinción.
1. OBJETO
Elmétododescribeelprocedimientodeejecucióndelapruebaespectrofo-
tométricaenelultravioletadelasmateriasgrasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la
extinción de la solución a las longitudes de onda prescritas, respecto al
disolvente puro. A partir de los valores espectrofotométricos se calculan
lasextincionesespecíficas.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. Espectrofotómetroparamedidasdeextinciónenelultravioletaentre220y
360nm,conposibilidaddelecturaparacadaunidadnanométrica.
3.2. Cubetas de cuarzo, con tapadera, con paso óptico de 1 cm. Las cubetas,
llenasdeaguaodeotrodisolventeadecuado,nodebenpresentarentreellas
diferenciassuperioresa0,01unidadesdeextinción.
3.3. Matracesaforadosde25ml.
3.4. Columnadecromatografíade270mmdelongitudy35mmdediámetroen
lapartesuperior:de270mmdelongitudy10mmdediámetroenlaparte
inferior.
4. REACTIVOS
4.1. Isooctano (2,2,4-trimetilpentano) de calidad para espectrofotometría: debe
tener,respectoalaguadestilada,unatransmitanciadel60%comomínimo
a220nmydel95%comomínimoa250nm;o
— ciclohexano decalidad paraespectrofotometría: debe tener, respectoal
agua destilada, una transmitancia del 40 % como mínimo a 220 nm y
del95%comomínimoa250nm.
4.2. Alúmina básica para cromatografía en columna, preparada y controlada
comosedescribeenelapéndiceI.
4.3. n-Hexanoparacromatografía.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Lamuestradebeserperfectamentehomogéneayestarexentadeimpurezas
en suspensión. Los aceites líquidos a temperatura ambiente se filtran con
papel de filtro a una temperatura aproximada de 30 ºC, las grasas sólidas
se homogeneizan y se filtran a una temperatura superior en 10 ºC como
máximoasutemperaturadefusión.
5.2. Sepesanconprecisión0,25gaproximadamentedelamuestrapreparaday
se colocan en un matraz aforado de 25 ml, se completa con el disolvente
adecuado y se homogeneiza. La solución resultante debe estar perfecta-
mente clara. Si presenta opalescencia o turbidez, se filtrará rápidamente
conpapeldefiltro.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—39
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3. Se llena una cubeta con la solución obtenida y se miden las extinciones,
usando como referencia el disolvente empleado, a las longitudes de onda
comprendidas entre 232 y 276 nm. Los valores de extinción obtenidos
debenestarcomprendidosenelintervaloentre0,1y0,8;encasocontrario
es necesario repetir la medida utilizando soluciones más concentradas o
másdiluidassegúnelcaso.
5.4. Cuandosequieradeterminarlaextinciónespecíficadespuésdeltratamiento
conalúminaseprocederádelsiguientemodo:enlacolumnaparacromato-
grafía se introducen 30 g de alúmina básica en suspensión en hexano;
después de asentarse el absorbente se elimina el exceso de hexano, hasta
1cmaproximadamentesobreelnivelsuperiordelaalúmina.
Sedisuelven10gdemateria grasa,homogeneizada yfiltrada tal como se
describeenelpunto5.1,en100mldehexanoysevierteestasoluciónen
la columna. Se recoge el líquido eluido y se evapora totalmente el disol-
venteenvacíoaunatemperaturainferiora25ºC.
Con la materia grasa así obtenida se procede inmediatamente tal como se
indicaenelpunto5.2.
6. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
6.1. Se expresan las extinciones específicas o coeficientes de extinción a las
diversaslongitudesdeonda,calculadascomosigue:
Kλ¼Eλ
c:e:
siendo:
Kλ= extinciónespecíficaalalongituddeondalambda,
Eλ= extinciónmedidaalalongituddeondalambda,
c = concentracióndeladisoluciónengpor100ml,
e = espesordelacubetaencm.
Losresultadosdebenexpresarsecondoscifrasdecimales.
6.2. La prueba espectrofotométrica del aceite de oliva según el método oficial
de los Reglamentos de la CEE requiere la determinación de la extinción
específica, en solución en isooctano, a las longitudes de onda de 232 y
270nm,yladeterminaciónde ∆Edefinidocomo:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
donde Kmes la extinción específica a la longitud de onda m, longitud de
ondademáximaabsorciónalrededorde270nm.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—40
▼B
APÉNDICE I
Preparación de la alúmina y control de su actividad
A.1.1. Preparación de la alúmina
En un recipiente quepueda cerrarse herméticamente se echa la alúmina
previamentedesecadaenhornoa380-400ºCdurantetreshoras,seañade
aguadestiladaenunaproporciónde5mlpor100gdealúmina,secierra
rápidamente el recipiente, se agita repetidas veces y se deja reposar
durante12horascomomínimoantesdeluso.
A.1.2. Control de la actividad de la alúmina
Se prepara una columna para cromatografía con 30 g de alúmina. Se
operatalcomosedescribeenelapartado5.4.Sehacepasaratravésde
lacolumnaunamezclaformadapor:
— 95 % de aceite de oliva virgen, con extinción específica a 268 nm
menorque0,18,
— 5 % de aceite de cacahuete tratado con tierras decolorantes en el
procesoderefinado,conunaextinciónespecíficaa268nmmayoro
igualque4.
Si, después del paso por la columna, la mezcla presenta una extinción
específica a 268 nm mayor que 0,11, la alúmina es aceptable; en otro
casosedebeaumentarelporcentajedehidratación.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—41
▼B
APÉNDICE II
Ajuste del espectrofotómetro
A.2. Elaparatodeberevisarseperiódicamente(porlomenoscadaseismeses)
tantoenloqueserefierealaconformidaddelalongituddeondacomoa
laexactituddelarespuesta.
A.2.1. Elcontroldelarespuestadelalongituddeondapuedehacersemediante
unalámparadevapordemercurioomediantefiltrosadecuados.
A.2.2. Para controlar la célula fotoeléctrica y el fotomultiplicador se procede
comosigue:sepesan0,2gdecromatopotásicodecalidadparaespectro-
fotometría, se disuelven, en un matraz aforado de 1000 ml, en una
solución de hidróxido potásico 0,05 N y se completa hasta el enrase.
De la solución obtenida se toman exactamente 25 ml, se transvasan a
unmatrazaforadode500mlysecompletahastaelenraseconlamisma
solucióndehidróxidopotásico.
Semidelaextincióna275nmdelasoluciónasíobtenida,utilizandola
solucióndehidróxidopotásicocomoreferencia.Laextinciónmedidaen
cubetade1cmdeberáserde0,200±0,005.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—42
▼B
ANEXO X «A»
ANÁLISISDELOSÉSTERESMETÍLICOSDELOSÁCIDOSGRASOS
MEDIANTECROMATOGRAFÍADEGASES
1. OBJETO
El presente ►C1método ◄proporciona orientaciones generales para
determinar, mediantecromatografía degasesconcolumnaderellenoo
capilar, la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de
ésteresmetílicosdeácidosgrasosobtenidosconarregloalAnexoXB.
Elmétodonoesaplicablealosácidosgrasospolimerizados.
2. REACTIVOS
2.1.Gasportador
Gas inerte (nitrógeno, helio, argón, hidrógeno, etc.), perfectamente
desecadoyquecontengamenosde10mg/kgdeoxígeno.
Nota 1:El hidrógeno, que sólo se emplea como gas portador en las
columnas capilares, puede duplicar la velocidad del análisis,
peroespeligroso.Existendispositivosdeseguridad.
2.2. Gasesauxiliares
2.2.1. Hidrógeno(pureza ≥99,9%)exentodeimpurezasorgánicas.
2.2.2. Aireuoxígeno,exentodeimpurezasorgánicas.
2.3.Patróndereferencia
Una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos puros, o los ésteres
metílicos de una grasa de composición conocida y, preferentemente,
similaraladelamateriagrasaobjetodeanálisis.
Deberáevitarselaoxidacióndelosácidosgrasospoliinsaturados.
3. APARATOS
Las normas que figuran a continuación se refieren al equipo ordinario
para cromatografía de gases, utilizando columnas de relleno y/o capi-
lares y un detector de ionización de llama. Podrá utilizarse cualquier
aparatocuyaeficaciayresoluciónseajustenalodispuestoenelpunto
4.1.2.
3.1.Cromatógrafodegases
Elcromatógrafodegasesconstarádelossiguienteselementos:
3.1.1. Sistema de inyección
Utilizarunsistemadeinyección:
a) con columnas de relleno, con un espacio muerto lo más pequeño
posible (en este caso, el sistema de inyección podrá calentarse a
una temperatura que sea entre 20 y 50 ºC superior a la de la
columna);o
b) concolumnascapilares;enestecaso,elsistemadeinyecciónestará
especialmente diseñado para poder operar con esa clase de
columnas; podrá utilizarse un inyector con división de flujo o un
inyector«oncolumn».
Nota 2:En ausencia de ácidos grasos con menos de 16 átomos de
carbono,podráutilizarseuninyectordeagujamóvil.
3.1.2. Horno
Elhornopodrácalentarlacolumnaa260ºCcomomínimoymantener
dichatemperaturaconunaoscilaciónmáximade1ºC,siseempleauna
columnaderelleno,yde0,1ºC,siseempleaunacolumnacapilar.Este
último requisito es especialmente importante si se utiliza una columna
desílicefundida.
Serecomiendaemplearentodosloscasosunsistemadecalentamiento
programado, sobre todo en el caso de ácidos grasos con menos de 16
átomosdecarbono.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—43
▼B
3.1.3. Columna de relleno
3.1.3.1. Columna de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(esdecir,vidriooaceroinoxidable)ydelasdimensionessiguientes:
a) Longitud: de 1 a 3 m. Con ácidos grasos de cadena larga (más de
C20) es conveniente utilizar una columna relativamente corta. Para
el análisis de ácidos con 4 o 6 átomos de carbono se recomienda
unacolumnade2m.
b) Diámetrointerior:de2a4mm.
Nota 3:Si hay componentes poliinsaturados con más de tres enlaces
dobles,puedendescomponerseenunacolumnadeaceroinoxi-
dable.
Nota 4:Puedeutilizarseunsistemacondoblecolumnaderelleno.
3.1.3.2. Relleno,queincluyalossiguienteselementos:
a)Soporte:tierra de diatomeas lavada con ácido y silanizada, u otro
soporte inerte adecuado, con un margen estrecho de tamaño de
grano (margen de 25 µm, entre 125 y 200 µm); el tamaño medio
degranoestaráenfuncióndeldiámetrointeriorydelalongitudde
lacolumna.
b)Fase estacionaria: líquidopolardetipopoliéster(porejemplo:poli-
succinato de dietilenglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato
de etilenglicol, etc.), cianosiliconas o cualquier otro líquido que
permita efectuar la separación cromatográfica exigida (véase el
punto 4). La fase estacionalia deberá constituir del 5 % (m/m) al
20 % (m/m) del relleno. Para algunas separaciones podrá utilizarse
unafasefijanopolar.
3.1.3.3. Acondicionamientodelacolumna
Estandolacolumnadesconectadadeldetector,siesposible,calentarel
hornogradualmentehasta185ºCyhacerpasaratravésdelacolumna
recién preparada una corriente de gas inerte a razón de 20-60 ml/min
durante 16 horas como mínimo a la temparatura citada y, a continua-
ción,alatemperaturade195ºCdurante2horasmás.
3.1.4. Columna capilar3.1.4.1. Tubo de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(generalmente, vidrio o sílice fundida). El diámetro interior estará
comprendido entre 0,2 y 0,8 mm. La superficie interior se someterá a
un tratamiento adecuado (por ejemplo, preparación de la superficie,
inactivación) antes de introducir el recubrimiento de fase fija. En la
mayoríadecasos,essuficienteunalongitudde ►
C125m◄.
3.1.4.2. Faseestacionaria detipopoliglicol [poli(etilenglicol) 20000],poliéster
(polisuccinato de butanodiol) o polisiloxano polar (cianosiliconas),generalmente. Son apropiadas las columnas de fase químicamente
ligada.
Nota 5:Existe el riesgo de que los polisiloxanos polares dificulten la
identificaciónyseparacióndelácidolinolénicoydelosácidos
C
20.
Elespesordelafaseestarácomprendidoentre0,1y0,2µm.
3.1.4.3. Montajeyacondicionamientodelacolumna.
Observar las precauciones normales de montaje de columnas capilares
(esdecir,instalacióndelacolumnaenelhorno,elecciónymontajede
las juntas (estanqueidad), conexión de los extremos de la columna al
inyector y al detector (reducción de los espacios muertos). Colocar la
columna bajo un flujo de gas portador [por ejemplo, 0,3 bar (30 kPa)
paraunacolumnade ►C125m◄delongitudy0,3mmdediámetro
interior].
Acondicionar la columna programando el gradiente detemperatura del
hornoa3ºC/minapartirdelatemperaturaambientehastaalcanzaruna
temperatura10ºCinferiorallímite dedescomposicióndelafaseesta-
cionaria.Mantenerelhornoaesatemperaturadurante1horahastaque
seestabilicelalíneadebase.Restablecerlatemperaturade180ºCpara
trabajarencondicionesisotérmicas.
Nota 6:En el comercio pueden obtenerse columnas adecuadas previa-
menteacondicionadas.
3.1.5. Detector que puede calentarse a una temperatura superior a la de la
columna.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—44
▼B
3.2.Jeringa
Tendráunacapacidadmáximade10µlyestarágraduadaen0,1µl.
3.3.Registrador
Siseemplealacurvadelregistradorparacalcularlacomposicióndela
mezcla analizada, se necesita un registrador electrónico de alta preci-
sióncompatible conlosaparatosutilizados.Elregistradordeberátener
lassiguientescaracterísticas:
a) tiempoderepuestainferiora1,5sy,preferiblemente,inferiora1s
(eltiempo derepuesta eseltiempo quetarda lapluma registradora
enpasarde0a90%despuésdelaintroduccióninstantáneadeuna
señaldel100%);
b) anchodelpapel:20cmcomomínimo;
c) velocidaddelpapel:ajustableavalorescomprendidosentre0,4cm/
miny2,5cm/min.
3.4.Integrador
La utilización de un integrador electrónico permite efectuar cálculos
rápidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibi-
lidad adecuada y la corrección de la desviación de la línea de base
debesersatisfactoria.
4. PROCEDIMIENTO
Lasoperacionesdescritasenlospuntos4.1a4.3sólosonválidassise
empleaundetectordeionizacióndellama.
Comoalternativa puede emplearse uncromatógrafo degasesconcata-
rómetro(cuyofuncionamientosebasaenelprincipiodeloscambiosde
conductividadtérmica).Enesecaso,lascondicionesdeensayodeberán
modificarsecomoseindicaenelpunto6.
4.1.Condicionesdeensayo
4.1.1. Determinacióndelascondicionesoperativasóptimas
4.1.1.1. Columnaderelleno
Al establecer las condiciones de ensayo deberán tenerse en cuenta las
variablessiguientes:
a) longitudydiámetrodelacolumna;
b) composiciónycantidaddelafaseestacionaria;
c) temperaturadelacolumna;
d) flujodelgasportador;
e) resoluciónexigida;
f) tamaño de la muestra problema, determinado de modo que el
conjuntodeldetectoryelelectrómetrodéunarespuestalineal;
g) duracióndelanálisis.
Como norma general, las cifras de las tablas 1 y 2 permitirán obtener
los resultados deseados, es decir, al menos 2000 platos teóricos por
metro de longitud de columna en el caso del estearato de metilo, y su
eluciónen15minutosaproximadamente.
Cuandoelaparatolopermita,latemperaturadelinyectordeberáserde
200ºCaproximadamenteyladeldetectordeberáserigualosuperiora
ladelacolumna.
Porlogeneral,larazónentrelavelocidaddeflujodelhidrógenosumi-
nistradoaldetectordeionización dellama yladelgasportadoroscila
entre 1:2 y 1:1, en función del diámetro de la columna. El flujo del
oxígenoesde5a10vecessuperioraldelhidrógeno.
Tabla 1
Diámetrointeriordelacolumna
mmFlujodelgasportador
ml/min
21 5 a 2 5
32 0 a 4 0
44 0 a 6 01991R2568—ES—28.05.1995—012.001—45
▼B
Tabla 2
Concentracióndelafasefija
%(m/m)Temperaturadelacolumna
ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Columnacapilar
Laspropiedadesdeeficacia ypermeabilidad delascolumnascapilares
implican que la separación de los constituyentes y la duración del
análisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la
columna. Por lo tanto, para optimizar las condiciones operativas será
necesario manipular este parámetro (o, lo que es más sencillo, la
presiónencabezadecolumna)segúnsedeseemejorarlasseparaciones
oefectuarunanálisisrápido.
4.1.2. Determinación del número de platos teóricos (eficacia) y de la resolu-
ción
(Véaselafigura1)Efectuarelanálisisdeunamezcladeestearatodemetiloydeoleatode
metilo(porejemplo,ésteresmetílicosdemantecadecacao)enpropor-
cionesaproximadamenteequivalentes.
Escoger la temperatura de la columna y el flujo del gas portador de
maneraqueelmáximodelpicodelestearatodemetiloseregistreapro-
ximadamente 15 minutos después del pico del disolvente. Utilizar una
cantidadsuficientedelamezcladeésteresmetílicos,demaneraqueel
picodelestearatodemetiloseeleveatrescuartosaproximadamentede
laescalacompleta.
Calcular el número «n» de platos teóricos (eficacia) mediante la
siguientefórmula:
n¼16
dr1
a1/C20/C21
2
ylaresolución«R»mediantelasiguientefórmula:
R¼2∆
a1þa2
siendo:
dr1= distanciaenmm,desdeeliniciodelcromatogramahastael
máximodelpicodelestearatodemetilo,
a1ya2= anchura,enmm,delospicosdelestearato demetiloydel
oleato de metilo, respectivamente, medida entre lospuntos
de intersección de las tangentes en los puntos de inflexión
delacurvaconlalíneadebase,
∆= distancia, en mm, entre los dos máximos de los picos del
estearatodemetiloydeloleatodemetilo,
yelíndicederesolución«lr»mediantelasiguientefórmula:
a
b
siendo:
a = alturadelpicomáspequeño,medidaapartirdelalíneadebase;
b = altura del punto más bajo del valle comprendido entre los dos
picosadyacentes,medidaapartirdelalíneadebase.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—46
▼M2
▼B
Figura1
Cromatogramaparadeterminarelnúmerodeplatosteóricos(eficacia)ylareso-
lución
Se establecerán unas condiciones de análisis que permitan obtener almenos2000platos teóricos pormetro de longitud decolumna para el
estearatodemetiloyunaresoluciónde1,25comomínimo.
4.2.Muestraproblema
Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 µl a 2 µl de la solución de ésteres
metílicos preparados con arreglo al Anexo X B e inyectarlos en la
columna.
Enelcasodeésteresnodisueltos,prepararunasoluciónde100mg/ml
aproximadamente en heptano de calidad para cromatografía e inyectar
de0,1µla1µldeestasolución.
Sisólosedeseandetectarloscomponentespresentesencantidadesmuy
pequeñas,sepodráaumentareltamañodelamuestra(hasta10veces).
4.3.Análisis
Comonormageneral,lascondicionesdeensayosonlasqueseespeci-
ficanenelpunto4.1.1.
Noobstante,cuandosedeterminanácidosconmenosde12átomosde
carbono es posible operar a menor temperatura de columna, mientras
que cuando se determinan ácidos grasos con más de 20 átomos de
carbono es posible operar a una temperatura mayor. Aveces se puede
utilizar en los dos casos anteriores un sistema de programación de
temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene ésteres metílicos de
ácidosgrasosconmenosde12átomosdecarbono,inyectarlamuestra
a 100 ºC (o a 50 — 60 ºC si hay ácido butírico) y elevar inmediata-
mentelatemperatura arazónde4—8ºC/min hastaalcanzar elnivel
deseado.Enalgunoscasosesposiblecombinarambosprocedimientos.
Traselcalentamientoprogramado,secontinúalaeluciónatemperatura
constantehastaquetodosloscomponentessehayeneluido.Sielinstru-
mentonopuedeefectuar uncalentamiento programado,seoperaados
temperaturasfijascomprendidasentre100y195ºC.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—47
▼B
Siesnecesario,serecomiendaqueseefectúeunanálisiscondosfases
fijas de diferente polaridad para comprobar la ausencia de picos
«ocultos»,porejemplo encasodepresencia simultánea deC18:3yC20:0oC18:3yC18:2conjugados.
4.4.Preparacióndelcromatogramaylasgráficasdereferencia
Analizar la mezcla patrón de referencia (2.3) aplicando las mismas
condiciones de ensayo que a la muestra y medir los tiempos o las
distancias de retención de los ácidos grasos que la componen. Repre-
sentar gráficamente en papel semilogarítmico, para cualquier grado de
insaturación, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retención en
funcióndelnúmerodeátomosdecarbono.Encondicionesisotérmicas,
lasgráficasdelosésteresdecadenalinealconelmismogradodeinsa-
turación deben formar líneas rectas. Dichas líneas rectas deben ser
aproximadamenteparalelas.
Deben evitarse las condiciones que propicien la existencia de «picos
ocultos»,esdecir,unaresolucióninsuficiente paraseparar doscompo-
nentes.
5. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
5.1.Análisiscualitativo
Identificarlospicosdelestearatodemetilodelamuestraapartirdelos
gráficoscitadosenelpunto4.4,siesnecesarioporinterpolación.
5.2.Análisiscuantitativo
5.2.1. Determinación de la composición
Salvo en casos excepcionales, utilizar el método de normalización
interna, es decir, partir del principio de que todos los componentes de
la muestra están representados en el cromatograma, de manera que eltotal delasáreas situadasdebajo decadopico representa el100%de
losconstituyentes(elucióntotal).
Si el equipo incluye un integrador, utilizar las cifras que éste propor-
cione. En caso contrario, determinar el área situada debajo de cada
picomultiplicandolaalturadelpicoporelanchoalamitaddelaaltura
y,cuandoseanecesario, tomar enconsideración lasatenuaciones utili-
zadasduranteelregistro.
5.2.2. Método de cálculo
5.2.2.1. Casogeneral
Calcular el contenido de un componente dado (i) (expresado como
porcentaje en masa de ésteres metílicos), mediante la determinación
del porcentaje que representa el área de su pico en relación con la
sumadelasáreasdetodoslospicos,aplicandolafórmulasiguiente:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: áreadelpicocorrespondientealcomponentei.
ΣA: sumadelasáreasdetodoslospicos.
Expresarelresultadoconunacifradecimal.
Nota 7:En este caso general se considera que el resultado del cálculo
basado en las áreas relativas representa el porcentaje en peso.
Paraloscasosenquenoesválidaestaconsideración,véaseel
punto5.2.2.2.
5.2.2.2. Utilizacióndefactoresdecorrección
Enalgunoscasos,porejemploenpresenciadeácidosgrasosconmenos
de 8 átomos de carbono o de ácidos con grupos secundarios, si se
utilizan detectores de conductividad térmica o si es necesario alcanzar
mayor nivel de exactitud, deben aplicarse factores de corrección para
convertir los porcentajes de las áreas de los picos en porcentajes en
pesodeloscomponentes.
Determinar los factores de corrección con un cromatograma obtenido
delanálisisdeunamezcladereferenciadeésteresmetílicosdecompo-1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—48
▼B
sición conocida en condiciones de ensayo idénticas a las empleadas
paraelanálisisdelamuestra.
La fórmula que se aplicará a la muestra de referencia para obtener el
porcentajeenpesodelcomponenteieslasiguiente:
mi
Σm/C2100
siendo:
mi= pesodelcomponenteidelamuestradereferencia,
Σm = sumadelospesosdelosdiversoscomponentesdelamuestra
dereferencia.
Apartirdelcromatogramadelamuestradereferencia(4.4)calcularel
porcentaje(área/área)delcomponenteidelsiguientemodo:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: áreadelpicocorrespondientealcomponentei,
ΣA: sumadelasáreasdetodoslospicos.
Elfactordecorrecciónsecalculadelsiguientemodo:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Por lo general, los factores de corrección se expresan con relación a
KC16,demodoquelosfactoresrelativosseconviertenenlosiguiente:
K0
i¼Ki
KC16
En la muestra, el contenido de cada componente i, expresado como
porcentajeenpesodelosésteresmetílicos,eselsiguiente:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Expresarlosresultadosconunacifradecimal.
5.2.2.3. Utilizacióndepatróninterno
En algunos análisis (por ejemplo, cuando no se cuantifican todos los
ácidos grasos por estar presentes simultáneamente ácidos de 4 y 6
átomos de carbono y ácidos de 16 y 18 átomos de carbono, o cuando
es necesario determinar la cantidad absoluta de un ácido graso en la
muestra) es preciso utilizar un patrón interno. Se emplean con
frecuenciaácidosgrasosde5,15o17átomosdecarbono.Debedeter-
minarse,siesnecesario,elfactordecorreccióndelpatróninterno.
El porcentaje en peso del componente i, expresado como ésteres
metílicos,secalculamedianteestafórmula:
mp/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
p/C2Ap/C2100
siendo:
Ai: áreadelpicocorrespondientealcomponentei.
Ap: áreadelpicocorrespondientealpatróninterno.
K′i: factordecorreccióndelcomponentei(conrelaciónaKC16).
K′p: factordecorreccióndelpatróninterno(conrelaciónaKC16).
m: peso,enmg,delamuestra.
mp: peso,enmg,delpatróninterno.
Expresarlosresultadosconunacifradecimal.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—49
▼M2
6. CASO ESPECIAL DE DETERMINACIÓN DE LOS ISÓMEROS
TRANS
Es posible determinar el contenido de isómeros trans de los ácidos
grasos con un número de átomos de carbono comprendido entre 10 y
24porseparación delosésteresmetílicos, utilizando columnascroma-
tográficascapilaresconunapolaridadespecial.
6.1. Columna capilar de silicio de un diámetro interno comprendido entre
0,25mmy0,32mmyde50mdelongitud,recubiertadeunacapade
cianopropisilicona deunespesorcomprendidoentre0,1y0,3µm(tipo
SP2340,tipoSP2380,C.P.sil88,Silor10osimilar).
6.2. LosésteresmetílicossepreparansegúnelprocedimientoBdescritoen
el Anexo X «B». Las materias grasas con una acidez libre superior al
3 % deben neutralizarse previamente con arreglo al punto 6.1 del
AnexoVII.
6.3. Las condiciones generales de trabajo para la cromatografía en fase
gaseosasonlassiguientes:
— temperatura de la columna programada de 150º a 230 ºC (por
ejemplo, 165 ºC durante 15 minutos y a continuación un aumento
de5ºCporminutohastaalcanzar200ºC),
— temperaturadelinyector:250ºCsiseutilizaelsistemadeinyector
divisor o la temperatura inicial de la columna si se emplea el
sistema«oncolumn»,
— temperaturadeldetector:260ºC,— flujodelgasvector(helioehidrógeno):1,2ml/minuto.
La cantidad inyectada debe ser tal que, en las condiciones de sensibi-
lidad empleadas, la altura del pico correspondiente al éster metílico
delácidoaraquídicoseaigualosuperioral20%delfondodeescala.
6.4. La identificación de los diversos ésteres metílicos se efectúa compa-
rando los tiempos de retención con los de las mezclas de referencia
(talycomoseindicaenelpunto2.3).
Los ésteres de los ácidos grasos trans son eluidos antes que los
isómeros cis correspondientes. En la figura 2 se presenta un ejemplo
decromatograma.
Figura2
Cromatogramadegasestiporelativoaladeterminacióndelosisómerostransde
losácidosgrasosconcolumnacapilar
6.5. La eficacia de la columna determinada con arreglo al punto 4.1.2
deberá permitir una separación, conuníndice deresolución superior a
2,dedeterminadasparejascríticas,comolaformadaporelgrupodelos
ácidostransisoleicosyelpicodelácidooleico(transC18:1/cisC18:1).1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—50
▼M2
6.6. La proporción de los diversos ácidos grasos trans se calcula estable-
ciendo la relación entre la superficie del pico correspondiente y la
sumadelassuperficiesdetodoslospicospresentes.
Setomanenconsideraciónlosporcentajesdelosácidos:
— trans octadecenoicos (T 18:1), que en el Anexo I del presente
Reglamentofigurancomotaldeisómerostransoleicos,
— cis-trans y trans-cis octadecadienoicos [(CT/TC) 8:2], que en el
Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de isómeros
translinoleicos,
— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis octadecatrie-
noicos[(TCT+CCT+CTC+TCC)18:3],queenelAnexoIdel
presente Reglamento figuran como total de isómeros translinolé-
nicos.
Nota 8:Teniendo en cuenta las características particulares de este
método,losresultadosdebendarsecondosdecimales.
►M27.◄CASOESPECIALDEUTILIZACIÓNDEUNCATARÓMETRO
(FUNCIONAMIENTO BASADO EN EL PRINCIPIO DE LOS
CAMBIOSDECONDUCTIVIDADTÉRMICA)
Para la determinación de la composición cualitativa y cuantitativa de
una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos también podrá utili-
zarse un cromatógrafo de gases provisto de un detector cuyo
funcionamientosebaseenelprincipiodeloscambiosdeconductividad
térmica (catarómetro). En esecaso, las condiciones establecidas en los
puntos3y4deberánmodificarsecomoseindicaenlatabla3.
Paraelanálisiscuantitativo,utilizarlosfactoresdecorreccióndefinidos
enelpunto5.2.2.2.
Tabla 3
Variable Valor/condición
Columna Longitud:2a4m
Diámetrointerior:4mm
Soporte Tamañodegranoentre160y
200µm
Concentracióndelafaseestacio-
nariaDe15%a25%(m/m)
Gasportador Helioo,ensudefecto,hidrógeno,
conelmenorcontenidode
oxígenoposible
Gasesauxiliares Ninguno
Temperaturadelinyector De40a60ºCmásqueladela
columna
Temperaturadelacolumna De180a200ºC
Flujodelgasportador Normalmenteentre60y80ml/
min
Tamañodelamuestraproblema
inyectadaNormalmenteentre0,5y2µl
►M28.◄INFORMEDELANÁLISIS
En el informe del análisis seexpondrán losmétodos utilizados para la
preparación de los ésteres metílicos y para la realización del análisis
mediante cromatografía de gases, así como los resultados obtenidos.
Semencionarán,asimismo,cualesquiera procedimientosdetrabajoque
no se especifiquen en la presente norma internacional o que se consi-
deren facultativos, así como toda circunstancia que pueda haber
influidoenlosresultados.
El informe del análisis incluirá todos los datos necesarios para la
completaidentificacióndelamuestra.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—51
▼B
▼B
ANEXO X «B»
PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS
GRASOSDECONFORMIDADCONLOSPUNTOSIYIIDELANEXO
VIDELREGLAMENTO(CEE)No72/77OSEGÚNELMÉTODOQUE
SEDESCRIBEACONTINUACIÓN
INTRODUCCIÓN
La elección del procedimiento a utilizar deberá hacerse en función de la
composición de los ácidos y de la acidez de la materia grasa que haya
que examinar y del análisis mediante cromatografía de gases que deba
efectuarse.
Enparticular:
— cuandosetratedemateriasgrasasquecontenganácidosgrasosinferior
aC12,sólopodránutilizarselosprocedimientosentubocerrado ►C1o
consulfatodimetílico ◄,
— cuandosetratedemateriasgrasasconunaacidezsuperioral3%,sólo
podrán utilizarse los procedimientos con mezcla de metanol y ácido
clorhídricooconsulfatodimetílico,
— en la determinación mediante cromatografía de gases de los isómeros
trans, sólo podrán utilizarse los procedimientos con metilato sódico o
consulfatodimetílico,
— el procedimiento con mezcla de metanol, hexano y ácido sulfúrico
deberáutilizarseenlapreparacióndelosésteresmetílicosdepequeñas
cantidadesdemateriasgrasasporseparaciónmediantecromatografíaen
capafina.
Nosetendráencuentaelinsaponificablecuandonosupereel3%;encaso
contrario, los ésteres metílicos deberán prepararse a partir de los ácidos
grasos.
1. OBJETO
A continuación se describen cinco procedimientos para la preparación de
losésteresmetílicosdelasmateriasgrasas:
a) conmetilatosódico;
b) conmetilatosódicoentubocerrado;
c) conmezclademetanolyácidoclorhídricoentubocerrado;
d) consulfatodimetílico;
e) conmezclademetanol,hexanoyácidosulfúrico.
ProcedimientoA
2. PRINCIPIODELMÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se calienta a reflujo con alcohol
metílicoymetilatosódico.Losésteresmetílicosqueseobtenganseextraen
conéteretílico.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. Matrazredondode100mlconrefrigerantedereflujo,provistoensuextre-
midadsuperiordeuntuboparacalsódica,conjuntaesmerilada.
3.2. Probetasde50ml.
3.3. Pipetade5mlgraduadaendivisionesde0,1ml.
3.4. Embudosdeseparaciónde250ml.3.5. Matrazredondode200ml.
4. REACTIVOS
4.1. Metanolanhidro.
4.2. Solución de metilato sódico en metanol al 1 % aproximadamente. Se
preparadisolviendo0,34gdesodiometalen100mldemetanolanhidro.
4.3. Éteretílico.4.4. Solucióndeclorurosódicoal10%.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—52
▼B
4.5. Éterdepetróleo40º—60ºC.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducirenelmatrazde100ml2gdegrasapreviamentedeshidratadaen
sulfatosódicoyfiltrada.Añadir35mldemetanol,acoplarelrefrigerantey
llevaraebulliciónmanteniéndolaareflujodurantealgunosminutos.
5.2. Interrumpir el calentamiento, separar el refrigerante y añadir rápidamente
3,5 ml de la solución de metilato sódico; acoplar nuevamente el refrige-
rante y hervir a reflujo durante 3 horas como mínimo. La metilación se
habrácompletadocuandotodalamateriagrasasehayadisueltoylamezcla
dereacciónestéperfectamentetransparenteatemperaturaambiente.
5.3. Enfriar y verter la mezcla de reacción en una ampolla de separación de
250 ml, añadir 35 o 40 ml de éter etílico, 100 ml de agua y 5 o 6 ml de
lasolucióndeclorurosódicoal10%.Agitaryesperaraqueseproduzcala
separacióndelascapas;transferirlafaseacuosaaunasegundaampollade
separaciónyextraerladenuevocon25mldeéteretílico.
Añadir a los extractos etéreos reunidos 50 ml de éter de petróleo
40º—60ºC,loqueprovocarálaseparacióndelaguaquedebeeliminarse.
Lavar la fase etérea tres veces con 10 o 15 ml de agua cada vez, desecar
sobresulfatosódicoypasarfiltrandoatravésdepapelaunmatrazredondo
de200ml.
Concentrar la solución al baño María hasta unos 20 ml mientras se hace
pasarunacorrientedenitrógenopuro.
ProcedimientoB
2. PRINCIPIODELMÉTODO
Lamateria grasaobjetodeanálisisestratada conmetilato sódicoensolu-
ciónmetanólica,enrecipientecerrado,a85º—90ºC.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. Tubo de vidrio de paredes gruesas, de unos 5 ml (altura: 40—45 mm,
diámetro:14—16mm).
3.2. Pipetade1mlgraduadaendivisionesde0,1ml.
4. REACTIVOS
4.1. Solución de metilato sódico en metanol al 1,5 % aproximadamente. Se
preparadisolviendo0,50gdesodiometalen100mldemetanolanhidro.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducireneltubodevidrio2gdemateriagrasapreviamentedeshidra-
tadaensulfatosódicoyfiltrada.Añadir0,3g(unos0,4ml)delasolución
demetilatosódicoycerrareltuboalallama.
5.2. MantenereltubodurantedoshorasalbañoMaríaaunatemperaturaentre
85ºy90ºCagitándolodevezencuando.Laesterificaciónsehabráconse-
guido cuando se vuelva transparente el contenido del frasco tras la
sedimentacióndelaglicerinaydelosresiduosdelosreactivos.
5.3. Enfriaratemperaturaambiente.Abrireltubocuandosevayanautilizarlos
ésteresmetílicos.Éstosnonecesitandeningunaotramanipulaciónantesde
seranalizados.
ProcedimientoC
2. PRINCIPIODELMÉTODO
Lamateriagrasaobjetodeanálisisestratadaconunamezclademetanoly
ácidoclorhídrico,entubocerrado,a100ºC.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. Tubo de vidrio de paredes gruesas, de unos 5 ml (altura: 40—45 mm,
diámetro:14—16mm).
3.2. Pipetasaforadasde1y2ml.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—53
▼B
4. REACTIVOS
4.1. Solución de ácido clorhídrico en metanol al 2 %. Se prepara con ácido
clorhídricogaseosoymetanolanhidro(nota1).
4.2. Hexanodecalidadadecuadaparacromatografía.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de vidrio 0,2 g de materia grasa, previamente deshi-
dratada en sulfato sódico y filtrada, y 2 ml de la solución de ácido
clorhídricoenmetanol.Cerrareltuboalallama.
5.2. Mantenereltubodurante40minutosalbañoMaríaa100ºC.
5.3. Enfriar el tuboen agua corriente, abrirlo, añadir 2 ml de agua destilada y
1 ml de hexano. Centrifugar y extraer la fase del hexano que estará lista
paraserutilizada.
ProcedimientoD
2. PRINCIPIODELMÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se saponifica con una solución en
alcohol metílico de hidróxido potásico, y después se trata con sulfato
dimetílico. Trasañadirácidoclorhídrico,losésteresmetílicos formadosse
separan espontáneamente. Mediante el tratamiento posterior con alúmina,
seobtienenésteresmetílicosdeelevadapureza.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. Tubo de ensayo de vidrio de paredes gruesas, de 20 ml aproximadamente
decapacidad,contapónesmerilado10/19yenganchesdeseguridad.
3.2. Refrigerantedereflujodecincoampollasconjuntaesmerilada10/19.
3.3. Filtrosdevidriodefondoporoso,degraduaciónG2ydiámetrode20mm.
3.4. Tubosdeensayodevidriodefondocónico,deunos10mldecapacidad.
3.5. Jeringasde 1y5ml.
4. REACTIVOS
4.1. Solución al 10 % de hidróxido potásico en alcohol metílico de calidad
adecuadaparacromatografía.
4.2. Soluciónal0,05%delindicadorverdedebromocresolenalcoholmetílico.
4.3. Sulfatodimetílico(d=1,335a15ºC).
4.4. Ácido clorhídrico concentrado (d = 1,19) diluido 1:1 con alcohol metílico
decalidadcromatográfica.
4.5. ÓxidodealuminionormalizadosegúnelmétodoBrockmannparacromato-
grafíadeadsorción.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de ensayo de 20 ml unos 2,2 ml de materia grasa
previamente deshidratada en sulfato sódico y filtrada; añadir 5 ml de la
solución de hidróxido potásico y algunos granos de piedra pómez para
regularlaebullición. Acoplarelrefrigerante dereflujoycalentar agitando
sobre llama pequeña durante 5 minutos. Para que la saponificación sea
completa, la solución deberá volverse transparente. Por último, enfriar en
aguacorrienteysepararelrefrigerante.
5.2. Añadirdosgotasdelindicadory,lentamente,conlaayudadeunajeringa,
1 ml de sulfato dimetílico. Cerrar herméticamente el tubo de ensayo y
agitar durante dos o tres minutos, introduciendo con frecuencia el fondo
deltuboenaguahirviendo: lareacción serácompleta cuandoelindicador
pasedelazulalamarillo.Alfinal,enfriareltuboenaguacorriente,abrirlo
yañadir5mldelasoluciónmetanólicadeácidoclorhídrico.
5.3. Trasagitarduranteunossegundos,inclinareltuboydarleligerassacudidas
quefacilitenlaaparicióndelosésteresmetílicosenformademasaoleosa
(notaA).
Retirar los ésteres metílicos con una jeringa, introducirlos en un tubo de
fondo cónico, añadir un volumen de alúmina equivalente a un cuarto del
volumendelosésteresmetílicos,agitaryfiltrarconpapeldefiltro.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—54
▼B
Nota A:Encasodequenoseproduzcaespontáneamente laseparaciónde
losésteresmetílicos,añadiraltubo5mldeaguayagitar.
ProcedimientoE
2. PRINCIPIODELMÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se calienta a reflujo con metanol,
hexano y ácido sulfúrico. Los ésteres metílicos que se obtengan seextraeránconéterdepetróleo.
3. MATERIALYAPARATOS
3.1. Tubodeensayodeunos20mldecapacidad,conrefrigerantedereflujode
aire,de1maproximadamentedelongitud,conjuntaesmerilada.
3.2. Pipetaaforada5ml.
3.3. Ampolladeseparaciónde50ml.3.4. Probetasde10y25ml.
3.5. Tubodefondocónicode15ml.
4. REACTIVOS
4.1. Reactivodemetilación:metanolanhidro,hexanoyácidosulfúricoconcen-
trado(d=1,84)enlaseguienteproporción:75:25:1(V/V/V).
4.2. Éterdepetróleo40—60ºC.4.3. Sulfatosódicoanhidro.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducireneltubode20mlelmaterial recuperado delaplaca yañadir
5mldereactivodemetilación.
5.2. Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar al baño María en ebullición
durante30minutos(nota2).
5.3. Transferir cuantitativamente la mezcla a una ampolla de separación de
50mlconlaayudade10mldeaguadestiladay10mldeéterdepetróleo.
Agitar enérgicamente y esperar a que se produzca la separación de las
fases, extraer la capa acuosa y lavar la capa etérea dos veces con 20 ml
deaguadestilada.Añadiralaampolladeseparaciónunapequeñacantidad
de sulfato sódico anhidro, agitar, dejar reposar unos minutos y pasar
filtrandoauntubodefondocónicode15ml.
EvaporareldisolventealbañoMaríahaciendopasarunacorrientedenitró-
geno.
Nota 1:En el laboratorio pueden prepararse fácilmente pequeñas canti-
dades de ácido clorhídrico gaseoso por simple desplazamiento de
la solución comercial ( ρ= 1,18), añadiendo algunas gotas de
ácido sulfúrico concentrado ( ρ= 1,84). El gas liberado se deseca
fácilmente por borboteo a través de ácido sulfúrico concentrado.
Dado que el ácido clorhídrico es absorbido por el metanol con
mucharapidez,seaconsejaqueseadoptenlasprecauciones nece-
sarias al disolverlo (es decir, introducir el gas a través de un
embudo pequeño invertido cuyo borde roce la superficie del
líquido). Pueden prepararse con antelación cantidades grandes de
solución metanólica de ácido clorhídrico, ya que se conserva en
perfectas condiciones en la oscuridad dentro de botellas con
taponesdevidrio.
Nota 2:Para controlar la ebullición, introducir una varita de vidrio en el
tuboylimitarlatemperaturadelbañoMaríaa90ºC.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—55
▼B
ANEXO XI
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ►C1 DISOLVENTES ◄
HALOGENADOSVOLÁTILESENELACEITEDEOLIVA
1. PRINCIPIODELMÉTODO
Análisisporcromatografíaenfasegaseosasegúnlatécnicadelespaciode
cabeza(head space).
2. EQUIPO
2.1. Cromatografíadegasescondetectordecapturadeelectrones(ECD).
2.2. Equipoparaespaciodecabeza (head space).
2.3. Columnadecromatografíaenfasegaseosadevidriode2metrosdelargoy
2mmdediámetro,faseestacionaria.
OV101al10%impregnadoencromosorbW-AW-DMCS(tierradediato-
meascalcinadalavadaconácidoysilanizado(80—100Mesh).
2.4. Gas portador y gas auxiliar: nitrógeno para cromatografía de gases de
purezaadecuadaparaladetecciónporcapturadeelectrones.
2.5. Frascosde cristal de 10 a 15 ml provistosde septum de teflón y con una
cápsuladealuminioconunorificioparatomademuestrasconjeringa.
2.6. Pinzascapsuladoraparacerrarherméticamente.2.7. Jeringaparagasesde0,5y2ml.
3. REACTIVOS
►
C1Disolventes ◄halogenados con una pureza apropiada para su uso
encromatografíaenlafasegaseosa.
4. PROCEDIMIENTODEANÁLISIS
4.1. Pesar con exactitud unos 3 g de aceite en un frasco de cristal (no reutili-
zable), tapar el frasco de manera que quede cerrado herméticamente.
Introducir el frasco en un baño con termostato a 70 ºC durante 1 hora.
Extraer con precisión, por medio de una jeringa, un volumen de 0,2 a
0,5 ml del espacio de cabeza. Inyectarlo en la columna del cromatógrafo
degasesconlassiguientescondiciones:
temperaturainyector:150ºC
temperaturacolumna:70—80ºC
temperaturadetector:200—250ºC
Podránutilizarseotrastemperaturassiemprequelosresultadosseanequiva-
lentes.
Lainyecciónsepuederealizarconelequipoparaespaciodecabeza.
4.2. Soluciones de referencia. Preparar soluciones patrón utilizando aceite de
oliva refinado sin trazas de ►C1disolventes ◄con concentraciones en
hidrocarburos halogenados de 0,05 a 1 ppm(m g/kg) según el contenido
supuestodelamuestra.Paraprepararlasolucióndereferencia,siesnece-
sariodiluirpreviamenteelhidrocarburohalogenadopatrón,puedeutilizarse
pentano.
4.3. Cuantificación. Se efectúa por cálculo mediante la relación de áreas o
alturas del pico de la muestra y de la solución patrón cuya concentración
sea la más próxima a la de la muestra. Si la desviación es superior al
10 %, será necesario volver a hacer el análisis, comparándolo con una
nueva solución patrón de concentración tal que se ajuste a la desviación
relativaantesmencionada.Elcontenidoseestableceráefectuandolamedia
devariasinyecciones.
4.4. Expresióndelosresultados.Losresultadosseexpresaránenppm(mg/kg).
Ellímitededeteccióndelmétodoesde0,01mg/kg.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—56
▼B
ANEXO XII
VALORACIÓNORGANOLÉPTICADELACEITEDEOLIVAVIRGEN
1. OBJETO
El presente método tiene porfinalidad establecer loscriterios necesarios
para valorar las características del flavor del aceite de oliva virgen y
desarrollarlasistemáticanecesaria.
2. CAMPODEAPLICACIÓN
El método que se describe sólo es aplicable a la valoración y clasifica-
ción organoléptica del aceite de oliva virgen utilizable para consumo
directo. Se limita a clasificar el aceite virgen en una escala numérica,
relacionada con la percepción de los estímulos de su flavor, según el
juiciodeungrupodecatadoresseleccionadosconstituidosenpanel.
3. ANÁLISISSENSORIAL:VOCABULARIOGENERALBÁSICO
Véaseelcapítulo«Análisissensorial:vocabulariogeneralbásico».
4. VOCABULARIOESPECÍFICODELACEITEDEOLIVA
4.1 Sensaciones agradables producidas por los atributos característicos de
calidaddelosaceitesdeolivavírgenes:
Frutado:flavor que recuerda el olor y el gusto del fruto sano, fresco y
recogidoenelpuntoóptimodesumaduración.
Frutado maduro: flavor del aceite de oliva obtenido de frutos maduros,
generalmentedeolorapagadoysabordulce.
Frutado verde: flavordelaceiteextraídodefrutosaúnverdes.
4.2. Sensacionesmásomenosagradablesenfuncióndesuintensidad,queno
debenconsiderarsedefectosaunqueinfluyenenlaarmoníadelfrutado.
Manzana:flavordelaceitedeolivaquerecuerdaadichofruto.
Dulce:sabor agradable del aceite, que, sin ser precisamente azucarado,
nopredominanenéllosatributosamargo,astringenteopicante.
Hierba:flavor característico de algunos aceites que recuerda a la hierba
reciéncortada.
Hojas verdes(amargo):flavordelaceite obtenidodeaceitunasexcesiva-
menteverdesoquesehanmolidomezcladasconhojasytallos.
Amargo:saborcaracterísticodelaceiteobtenidodeaceitunasverdesoen
envero.Puedesermásomenosagradablesegúnsuintensidad.
Aspero:sensacióncaracterística dealgunosaceitesquealserdegustados
producenunasensaciónbuco-táctildeastringencia.
Picante:sensación gustativa de picor, característica de los aceites obte-
nidos a comienzos de la campaña, principalmente de aceitunas todavías
verdes. Se debe a la acción de las sustancias fenólicas sobre los termi-
nalesdelnerviotrigéminoqueseextiendenportodalacavidadbucal.
Almendrado:este flavor puede darse en dos aspectos: el típico de la
almendra fresca o el propio de la almendra seca y sana, que puede
confundirseconunrancioincipiente.Seapreciacomounregustocuando
el aceite permanece en contacto con la lengua y el paladar; se asocia a
losaceitesdulcesydeolorapagado.
Apagado o plano: flavor del aceite de oliva cuyas características orga-
nolépticas son muy tenues debido a la pérdida de sus componentes
aromáticos.
Heno:flavor característico de algunos aceites que recuerda a la hierba
másomenosseca.
4.3 Sensaciones siempre desagradables, incluso cuando apenas son percepti-
bles,quedebenconsiderarsedefectosorganolépticos.
Esparto:flavor característico del aceite obtenido de aceitunas prensadas
en capachos nuevos de esparto. El flavor puede ser diferente si el
capachoestáfabricadoconespartoverdeosiloestáconespartoseco.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—57
▼M3
▼M3
Tierra:flavor característico del aceite obtenido de aceitunas recogidas
con tierra, embarradas y no lavadas. Este flavor puede ir unido al de
mohoohumedadenalgunasocasiones.
Viejo:flavor característico del aceite cuando permanece demasiado
tiempo en recipientes de almacenamiento. También puede darse en
aceitesenvasadosduranteunperíodoprolongado.
Gusano:flavorcaracterísticodelaceiteobtenidodeaceitunasfuertemente
atacadasporlarvasdemoscadelolivo (Dacus oleae).
Metálico:flavor que recuerda a los metales. Es característico del aceite
que ha permanecido en contacto, durante tiempo prolongado, con
alimentos o superficies metálicas en condiciones indebidas, durante los
procesosdemolienda,batido,prensadooalmacenamiento.
Moho-humedad: flavorcaracterístico delaceite obtenidodefrutosenlos
quesehandesarrolladoabundanteshongosylevadurasacausadehaber
permanecidoamontonadosyconhumedadvariosdías.
Rancio:flavorcaracterísticoycomúnatodoslosaceitesygrasasquehan
sufridounprocesoautoxidativo,acausadesuprolongadocontactoconel
aire.Esteflavoresdesagradableeirreversible.
Atrojado:flavor característico del aceite obtenido de aceitunas amonto-
nadasquehansufridounavanzadogradodefermentación.
Salmuera:flavor del aceite extraído de aceitunas conservadas en solu-
cionessalinas.
Orujo:flavorcaracterísticoquerecuerdaaldelorujodeaceituna.
Jabonoso:flavorconunasensaciónolfato-gustativaquerecuerdaaladel
jabónverde.
Alpechín:flavorcaracterísticoadquiridoporelaceiteacausadeunamala
decantaciónyprolongadocontactoconlasaguasdevegetación.
Avinado-avinagrado: flavor característico de algunos aceites que
recuerdanalvinoovinagre.Esdebidofundamentalmentealaformación
deácidoacético,acetatodeetioloyetanol,encantidadessuperioresolo
normalenelaromadelaceitedeoliva.
Pepino:flavor que se produce en el aceite sometido a un envasado
hermético y excesivamente prolongado, particularmente en hojalata, que
esatribuidoalaformaciónde2-6nonadienal.
Cocido o quemado: flavorcaracterísticodelaceiteoriginadoporunexce-
sivo o prolongado calentamiento durante su obtención, muy
particuarlmente durante el termo-batido de la pasta, si éste se realiza en
condicionesinadecuadas.
Borras:flavor característico del aceite recuperado de los lados decan-
tadosendepósitosytrujales.
Capacho:flavorcaracterísticodelaceiteobtenidodeaceitunasprensadas
encapachossuciosconresiduosfermentados.
Grasa de máquina: olordelaceitedeolivaobtenidoenunaalmarzarade
cuya maquinaria no han sido adecuadamente eliminados residuos de
petróleo,degrasaoaceitemineral.
Basto:percepcióncaracterísticadealgunosaceitesque,alserdegustados,
producenunasensaciónbuco-táctildensaypastosa.
5. COPAPARADEGUSTACIÓNDEACEITES
Véaseelcapítulo«Copaparaladegustacióndeaceites».
6. SALADECATA
Véaseelcapítulo«Guíaparalainstalacióndeunasaladecata».
7. UTENSILIOS
En cada cabina y a disposición del catador deben estar los utensilios
necesariosparaqueéstepuedaejerceradecuadamentesucometido.Estos
son:
— copas (normalizadas), conteniendo las muestras marcadas en clave
con un par de números dígitos tomados al azar, o con un par de1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—58
▼B
▼B
númerosyletras.Lasmarcassedebenhacerconunlápizindeleblee
inodoro,
— vidriosderelojconidénticasmarcas,paracubrirlascopas,— hojadepuntuación,véasefigura2,conteniendolasinstruccionespara
suutilización,
— lápizobolígrafo,— bandejitasconteniendorodajasdemanzanas,— vasodeaguaalatemperaturaambiente.
8. METODOLOGÍA
Enesteapartadoseestablecenlosconocimientospreviosnecesariospara
larealizacióndelanálisissensorialdelosaceitesdeolivavírgenesytrata
denormalizarelcomportamientoylaactuacióndeloscatadoresquehan
deintervenirenlaspruebas,loscualeshandetomarconcienciatantode
lasrecomendacionesdetipogeneralcomodelasespecíficasparalacata
delosaceitesdeoliva.
8.1.Actuacióndelorganizadorojefedelpanel (ogrupodecatadores)
Elorganizadordelpaneldeberáserunapersonasuficientementeformada,
conocedorayexpertaenlostiposdeaceitesqueencontraráensutrabajo.
Es la figura clave del panel y el responsable de la organización y del
funcionamiento del mismo. Convocará con tiempo suficiente a los cata-
dores y les aclarará cualquier duda en cuanto a la realización de los
ensayos, aunque se abstendrá de sugerirles ningún tipo de opinión sobre
lamuestra.
Será responsable del inventario de los utensilios, de su adecuada
limpieza, de la preparación y codificación de las muestras, así como de
su presentación a dos catadores según el diseño experimental adecuado;
de la recopilación de los datos y de su tratamiento estadístico, a fin de
obtenerlosmejoresresultadosconelmenoresfuerzo.
Eltrabajodeljefedelpanelrequierehabilidadsensorial,meticulosidaden
lapreparacióndelosensayos,rigurosoordenparasuejecución,asícomo
habilidadypacienciaparaplanificaryejecutarlaspruebas.Esmisióndel
jefe de panel estimular la moral de los componentes del grupo, fomen-
tando entre ellos el interés, curiosidad y espíritu competitivo. Debe
evitarquesuopiniónseaconocidaeimpedirqueloscriteriosdeposibles
líderes se impongan sobre los restantes catadores. También es de su
competencia el entrenamiento, selección y control sobre los mismos, a
findeconocersisemantienenconeladecuadoniveldeaptitud.
8.2.Condicionesdelensayo
8.2.1. Tamaño de la muestra
Lacantidaddeaceitecontenidoencadacopadebeserde15ml.
8.2.2. Temperatura de la prueba
Lasmuestrasdeaceiteacatarsemantendrándentrodelascopasa28ºC
±2ºC.Estatemperaturasehaelegidoporserenlaqueseobservancon
mayor facilidad diferencias organolépticas, dentro de la temperatura
normal, cuando los aceites se usan como condimento. Otro aspecto que
inclina a tomar este valor es que temperaturas más bajas o más altas
producen una escasa volatilización de los compuestos aromáticos o por
elcontrariovolátilesyapropiosdeaceitescalentados.
8.2.3. Horario del ensayo
Paralacatadeaceites,lashorasdetrabajoóptimassonlasdelamañana.
Estádemostradoqueduranteeldíaexistenperíodosdeóptimapercepción
paraelgustoyelolfato.
Las comidas son precedidas de un período de incremento de la sensibi-
lidadolfato-gustativa,seguidasdeundecrecimientodelamisma.
Sinembargo,estecriterionodebeserllevadoalextremo,hastaelpunto
de que el hambre pueda distraer a los catadores, haciendo descender en
ellos su capacidad de discriminación y, particularmente, sus criterios de
preferenciayaceptación.
9. CATADORES
Las personasque intervengan como catadores en losensayos organolép-
ticos de aceites de oliva comestibles deberán ser entrenados y
seleccionadosdeacuerdoconsuhabilidadparadistinguirentremuestras1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—59
▼B
similares,debiéndosetenerencuentaquelaprecisiónsemejoraráconel
entrenamiento(véaseapartadocorrespondiente).
Para la prueba se exige un número de 8 a 12 catadores siendo conve-
nientedisponerdealgunosmásenreserva,paracubrirposiblesausencias.
9.1.Normasgeneralesdecomportamientoparacandidatosycatadores
Las presentes recomendaciones se refieren al comportamiento de los
candidatosycatadoresdurantesutrabajo.
Alrecibirlacomunicacióndeljefedelpanelparaintervenirenunensayo
organoléptico, el catador deberá estar en condiciones de realizarlo a la
horapreviamenteseñalada,ateniéndosealassiguientesnormas:
9.1.1. Seabstendrádefumaralmenos30minutosantesdelahorafijada.
9.1.2. Noutilizará ningún perfume, cosmético o jabón cuyo olor persista enel
momento del ensayo. Para el lavado de las manos utilizará un jabón no
perfumado o poco perfumado, procediendo a enjuagarse las manos y a
secárselastantasvecescomoseannecesariasparaeliminarcualquierolor.
9.1.3. No deberá haber tomado ningún alimento al menos una hora antes de
realizarlacata.
9.1.4. Si se encontrase en condiciones de inferioridad fisiológica, particular-
mente si tiene afectado el sentido del olfato o del gusto, o bajo algún
efectopsicológicoqueleimpidaconcentrarseensutrabajo,deberácomu-
nicarloaljefedelpanelalobjetodequeloapartedeltrabajo,obienpara
quetomelasdecisionesoportunas,teniendoencuentasuposibledesvia-
cióndelosvaloresmediosdelrestodelpanel.
9.1.5. Elcatador,unavezcumplidaslasnormasprecedentes,procederáaocupar
sulugar en la cabina que le corresponda, con el mayor orden ysilencio
posibles.
9.1.6. Unavezsentado,procederáaexaminarsielmaterialquenecesitaestáen
ordenyeselcorrecto,comprobandosilaclavedelacopasecorresponde
conladelvidrioderelojquelacubre.
9.1.7. Leerá detenidamente las instrucciones contenidas en la hoja de puntua-
ción, no comenzando el examen de la muestra hasta estar totalmente
compenetrado con el trabajo que debe realizar. En caso de duda, debe
consultarprivadamentelasdificultadesencontradasconeljefedelpanel.
9.1.8. El catador procederá a tomar la copa, manteniéndola cubierta con su
vidrio de reloj, la inclinará ligeramente, y en esta posición le dará un
girototalafindemojarlomásposiblelasuperficieinterior.Hechaesta
operación, separará el vidrio de reloj y procederá a oler la muestra,
haciendo inspiraciones suaves, lentas e intensas, hasta formarse un
criteriosobreelaceite quedebejuzgar.Elperíododeolfacción nodebe
soprepasar 30 segundos. Si en este período no se ha llegado a ninguna
conclusión, debe tomarse un pequeño descanso, antes de un nuevo
intento.Unavezrealizado elensayoolfativo,seprocederá aenjuiciar el
flavor(sensaciónconjunta olfato-gustativa-táctil). Paraellosetomará un
pequeñosorbodeaceite,deunos3mlaproximadamente.Esmuyimpor-
tantedistribuirelaceiteportodalacavidadbucal,desdelaparteanterior
de la boca y la lengua, por los laterales y la parte posterior, hasta los
pilares del paladar; ya que, como se sabe, la percepción de los cuatro
sabores fundamentales, dulce, salado, ácido y amargo, se hace con
distintaintensidadsegúnlaszonasdelalenguayelpaladar.
Debe insistirse en la necesidad de que el aceite se extienda en cantidad
suficienteymuylentamente porlaparteposteriordelalenguahacialos
pilaresdelpaladarylagarganta,concentrandolaatenciónenelordende
aparición de los estímulos amargo y picante; si no se procede así, en
algunos aceites ambos estímulos pueden pasar inadvertidos o el amargo
quedarocultoporelpicante.
Aspiracionescortasysucesivas,introduciendoaireporlaboca,permiten,
ademásdeextenderlamuestraampliamenteporlacavidadbucal,percibir
porvíaretronasalloscomponentesvolátilesaromáticos.
La sensación táctil debe tomarse, también, en consideración: así, la
fluidez, pastosidad y picor o escozor deben ser anotados cuando se
detecteny,silapruebaasíloexige,cuantificarsuintensidad.
9.1.9. La valorazión organoléptica de un aceite virgen debe hacerse evaluando
unasolamuestraporsesión,paraevitarelefectodecontrastequepodría
producirladegustacióninmediatadeotras.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—60
▼B
Puesto que las catas sucesivas son afectadas por la fatiga, o pérdida de
sensibilidad,causadasporlasprecedentes,seimponeutilizarunproducto
capazdeeliminardelabocalosrestosdeaceitedelacataanterior.
Serecomiendaelusodeunpequeñotrozodemanzana,deunos15gr,el
cual, después de masticado, puede ser vertido al escupidor, procediendo
seguidamenteaenjuagarseconunpocodeaguaatemperaturaambiente.
Entre la cata finalizada y la siguiente deben transcurrir al menos 15
minutos.
9.2.Preseleccióndecandidatos
Estaetapadeberárealizarlaelorganizadordelpanelmedianteentrevistas
personalesytieneporobjetoconocerlapersonalidaddelcandidatoylas
característicasquelerodean.Lasexigenciaspreviasrespectoalascondi-
ciones fisiológicas y psicológicas no son muy rigurosas, ya que, en
principio, cualquier persona normal puede desarrollar esta actividad. La
importanciadelaedad,sexo,determinadoshábitos(fumar)etc.,seconsi-
deransecundariosfrenteaotrosaspectos,talescomo:lasalud,elinterés
personalydisponerdetiempoparaestetrabajo.
Durante la entrevista, el organizador del ensayo debe explicar al candi-
dato las características de la función que va a realizar e informarle del
tiempo aproximado que le va a ocupar. A continuación ha de recabar
datosquelepermitanvalorarelgradodeinterésymotivacióndelcandi-
dato,asícomodesudisponibilidadrealdetiempo.Laencuestasiguiente
deberáservirlecomoreferencia.
(1)
Conestainformaciónelorganizadorrealizarálapreselección,rechazando
a los candidatos con poco interés por este tipo de trabajo, poco tiempo
disponible,oincapacesparaconcretarsusideas.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—61
(1) Describaelinterésquepuedetenerlavaloraciónorganolépticadecualquieralimentoo
sileparecedelaceitedeoliva.
▼B
9.3.Determinacióndel«umbralmedio»delgrupopara«atributoscarac-
terísticos»
Se eligen cuidadosamente cuatro aceites, de tal forma que cada uno sea
consideradocomorepresentantetípicodelosatributos:atrojado,avinado,
rancioyamargo,conlamayorymásclaraintensidadposible.
Tomandounapartealícuotadecadaunodeellossepreparanmuestras,a
distintas concentraciones de razón 2, por sucesivas diluciones con el
soporte apropiado hasta que en las dos o tres diluciones últimas no sea
posibledetectardiferenciaconlacopaquecontienesóloelsoporte.Una
últimaparejalaformarándoscopasdesoporte.
Laseriesecompletaráconcopasdeconcentracionessuperiores,hastaun
totalde8.
Preparar suficiente cantidad de muestras de las distintas concentraciones
paraentregar seriescompletas decadaatributo acada unodeloscandi-
datos.
Paraestabelecerel«umbralmedio»deloscandidatos,paracadaatributo
se presentará a éstos una copa conteniendo 15 ml de una cualquiera de
las concentraciones preparadas, junto con otra copa que contenga sólo
15 ml del «soporte». El candidato, después de realizar el ensayo, debe
indicarsisonigualesodistintas.
Elmismoensayoserepiteparalasrestantesconcentracionesdelatributo
estudiado.
Se anota el número de contestaciones correctas obtenidas para cada
concentración del conjunto de candidatos, y se refiere como porcentaje
delnúmerodeensayosefectuados.
Se representa en orden creciente, en abscisas las concentraciones ensa-
yadas y en ordenadas el % de identificaciones correctas hechas para
cadaconcentración.
Lafigura1representaunejemploprácticodeloexpuestoanteriormente.
Elumbraldedetecciónsedefinesobreabscisasextrapolandodelacurva
elpuntodelaordenadaquecorrespondeaun75%deaciertos.
Esta concentración «umbral», que puede ser distinta para cada aceite de
partida, dependiendo de la intensidad del atributo en dicho aceite, debe
ser similar para los distintos grupos de candidatos de distintos paneles;
no está unida a ninguna costumbre, hábito o preferencia tendenciosa,
consiguientemente es un punto de referencia común a cualquier grupo
humano normal y puede servir para homogeneizar los distintos paneles
sóloporsusensibilidadolfato-gustativa.
A partir de la concentración umbral del grupo obtenida se procederá
comosigue:
Prepáreseunaseriedeconcentracionescrecientesydecrecientesdeforma
que esta «concentración umbral» corresponda al lugar 10 de esta escala.
Lógicamente las concentraciones 11 y 12 serán más diluidas y consi-
guientemente muy difíciles de detectar en ellas la presencia del aceite
conelatributoelegido.
ApartirdelaconcentraciónC10,lasrestantesmuestraspuedenprepararse
mediantelafórmula:
C10×an,donde«a»esunaconstantecorrespondientealfactordedilución
iguala1,5y«n»elexponentequevariarádesde9a−2.
Por ejemplo: supuesto el umbral obtenido para el aceite rancio = 0,32;
seráC10=0,32,apartirdeellacomoa=1,5laseriedemuestrastendría
lassiguientesconcentraciones.
Muestras 1 2 34567891 0 1 1 1 2
Concentración 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Siserepitetodoloanteriorparalostresrestantesatributos,partiendode
los umbrales respectivos calculados también como antes se indicó, se
obtendránasíescalasqueparatodosloslaboratoriostendránintensidades
aromáticas similares para cada estímulo, aunque se haya partido de
aceitesdeolivacuyosdefectossonperceptiblescondistintaintensidad.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—62
▼B
9.4.Seleccióndecatadoresporelmétodode«clasificacióndeintensidad»
Laseleccióndeberealizarsepartiendodeunnúmerodecandidatosdoso
tresvecessuperioralnecesarioparaformarelgrupo,conobjetodepoder
elegiralosmássensiblesydemayorcapacidaddiscriminatoria.Siempre
es aconsejable realizar las pruebas con el mismo producto que se va a
analizar posteriormente. (Consiguientemente nosotros utilizaremos aceite
deoliva.)
Figura1
Enlaeleccióndelmétodo,juntoasueficacianosepuedeolvidarquees
deinterésqueelprocedimientoaseguirsealomáseconómicoposibleen
cuantoacantidaddeaceite,númerodemuestrasautilizarytiempodedi-
cado a la selección. La eficacia de un procedimiento de selección se
caracteriza por la elección de los niveles óptimos de las tres variables
dependientes siguientes: a) «costo» determinado por el número de
ensayos, b) «proporción» de candidatos potencialmente aptos que por
azarpuedenserdesafortunadamenterechazadosenlacribayc)«propor-
ción» de candidatos no apropiados que por un azar favorable son
aceptadosenlaselecciónsindeberserlo.
Elprocedimientodeselecciónelegido:«pruebadeclasificacióndeinten-
sidad»(The intensity rating test) descritoenlasnormasASTM (American
Society for Testing and Materials) ySTP(Special Technical Publication)
440página53,modificadoencuatropuntos:
1) reduccióndelnúmerodemuestrasenlaserie;
2) ampliación de estímulos con objeto de aumentar el número de notas
olfato-gustativas sobre las que está basada la selección, a fin de
adecuarlas a los defectos más comunes perceptibles en el aceite de
oliva;
3) variacióndelarelacióndeconcentraciónenlaserie;
4) tratamientoestadísticodelosresultados.
Material necesario
— botellasomatracesde1500ml,
— copasdevidriooscuro,1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—63
▼B
— probetasde10ml,15ml,1000mly1500ml.
Productos necesarios
— Parafina Merck (referencia 7.160, DAB 8, USP XX) o soporte
oleoso inodoro e insípido (aceite de oliva u otro similar reciénrefinado),
— aceites:atrojado,avinado,rancioyamargo.
9.4.1. Procedimiento operatorio
Una vez preparadas las concentraciones se empezará la selección
partiendo de 25 candidatos, de acuerdo con la metodología que se
explicaráacontinuaciónparacadaestímulo:
1) Se preparan series de 12 copas, marcadas en clave (una serie por
candidato).Encadacopasevierten15mldecadaunadelasdistintas
concentraciones,preparadasdeacuerdoconlafórmulaC
10×an.
2) Unavezllenaslascopasconvienequepermanezcanenlasaladecata,
a20—22ºC,cubiertasconunvidrioderelojalmenosunahoraantes
decomenzarlosensayos,afindehomogeneizarsutemperaturaconla
ambiente.
3) Las 12 copas de una serie se colocan por el organizador del ensayo,
demayoramenorconcentración,enunafila.
Acontinuación seprocedeainvitaracadacandidato paraquerealice el
ensayoporseparado,dándolelassiguientesinstrucciones:
9.4.2. Instrucciones para el candidato
Las 12 copas alineadas frente al candidato contienen diluciones de cada
uno de los estímulos atrojado, avinado, rancio y amargo según sea el
caso.Lascopassediferencian unasdeotrasenlaintensidaddelolor,la
deolormásintensoseencuentraenelextremoizquierdo,laintensidadde
olordelasrestantesvadisminuyendogradualmente hacialaderecha.La
última copa de la derecha puede tener tan poco olor que podría no ser
detectable.
Procédase como sigue: familiarícese con los olores de las copas que
formanlaserie.Paraellocomience aolerporladeladerecha(no12)e
intenterecordarlaintensidaddelosolores.Procurenofatigarse.
Cuandoconsiderequesehahabituado alaescaladeconcentraciones de
olorpresentada,salgadelahabitación.
El organizador del ensayo procederá, mientras tanto, a entresacar una
copadelaseriequeemparejará conlaúltimadeladerechaprocediendo
a tapar el hueco aproximando entre sí las restantes. Vuelva entonces de
nuevoalahabitaciónparacontinuarelensayo.
Lapruebaconsisteenlosiguiente:
La copa separada debe ser restituida al lugar que le corresponde en la
serie. Para ello puede olerla y compararla con las restantes tantas veces
como se quiera, teniendo en cuenta que si la restituye correctamente al
lugar que le corresponde, debe oler más fuerte que su inmediata de la
derechaymásdébilqueladelainzquierda. Estapruebaserepetirá con
otrastrescopas.
Para facilitar el trabajo y la recogida de la respuesta emitida, a cada
candidato se le entregará junto con las instrucciones anteriormente
descritaselsiguienteestadillo.
9.4.3. Obtención de los resultados
Para facilitar la ordenación de datos de cada uno de los candidatos, el
organizadordelpanellosanotarádelaformasiguiente:1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—64
▼B
9.4.4. Procedimiento estadístico de puntuación
Enelcasoconcretodelaselecciónefectuada,lascopasareintegrarensu
lugar serán las mismas para todos y cada uno de los candidatos y de
acuerdoconloscálculosestadísticosrealizadosparaestecasoseránaque-
llascuyoordendeserieseindicaacontinuaciónparacadaatributo.
Atrojado(At) Avinado(Av) Rancio(Ra) Amargo(Am)
CopanoCopanoCopanoCopano
(10,5,7,2) (11,3,8,6) (7,4,10,2) (6,3,11,9)
Elnúmeroocupadoporlascopasenlaserienopuedeservariado,puesto
queloscálculosestadísticosparaesteensayosehanrealizadodeacuerdo
conlaprobabilidaddequelascopasindicadasseanrestituidasasulugar
porazar.
Ahorabien,conobjetodedificultar,cualquierpasodeinformacióndeun
candidato a otro el organizador del panel tendrá presente los siguientes
puntos:
1) Loscandidatosnopuedencomunicarseentresí.Lasclavesserándife-
rentesparacadacandidato.
2) Loscandidatosnopuedenenterarsequéposiciónocupanlascopasque
selehanretirado.
3) Aunque todos los candidatos deben recibir las copas reseñadas ante-
riormente, el organizador debe variar el orden en que las entrega a
cadacandidato.
A cada candidato se le asigna una puntuación en función de sus resul-
tados obtenidos; procediendo tal y como se pasa a describir a
continuación:
Seanei
1,ei
2,…e12ilas12copasconlasdoceconcentracionescorrespon-
dientes de un atributo i (i = cualquiera de los cuatro atributos atrojado,
avinado,rancioyamargo)ordenadasdemayoramenor.
SeaekiunadelascopasseleccionadasyseaK ′laposiciónqueasignael
candidatoadichacopaenlaserie.LosvaloresdeKyK ′son,porconsi-
guiente,númerosenteroscomprendidosentreel1yel12ambosinclusive
que corresponden a las posiciones real y asignada por el candidato,
respectivamente,delacopaseleccionada.
Sea T (máxima desviación admitida) un valor, fijado de antemano, en
nuestrocaso igual a3detal forma que si(K ′−K)>Tel candidato es
rechazadoautomáticamente(1).
Siporelcontrario(K ′−K)≤T,elcandidato,enprincipio,noesrecha-
zado y puede continuar la prueba, puesto que es capaz de situar el
estímulo problema en el lugar que le corresponde o cuando menos en
loslugarespróximosinmediatos.
En este caso, la puntuación asignada a un candidato cuando valora un
estímulo (concentración) de un determinado atributo, por ejemplo, de la
serieatrojado(At),seráigualalcuadradodeladiferenciaentreelnúmero
deordenquecorrespondealaposicióncorrectaqueocuparíaenlaserie
lacopaportadoradelestímuloylaposiciónaqueelcandidatolaharein-
tegrado,esdecir:
P(At)
h=(K′−K)21991R2568—ES—28.05.1995—012.001—65
(1) Es importante que el organizador insista sobre el candidato a fin de que el ensayo se
conduzca razonablemente sin que se produzca una pérdida de sensibilidad por
cansancioolfativo.
▼B
Puesto que esta operación será realizada por un mismo cadidato sobre
cuatro estímulos (concentraciones) de cada atributo, la puntación parcial
paradichoatributo(porejemploAt)sería:
ZAt=PAt
h+PAt
j+PAt
l+PAt
m
Parafacilidaddecomprensiónseexponenlossiguientesejemplos:
Ejemplo1:
SupongamosquelasrespuestasdelcandidatoAparaloscuatroestímulos
quesehanretiradodelaseriedelatributo(i)sonlassiguientes:
Posicióncorrectade
lacopaenlaserie
(K)Posiciónenquefue
colocada(K ′)Separacióndelaposición
correcta
(K′−K)
7 7 7−7=0
4 5 4−5=−1
10 6 10−6=4(1)
2 4 2−4=−2
(1) Estecandidatoesrechazado,yaquehaobtenidoenelensayounvalordeT>3.
Ejemplo2:
Supongamos que un candidato reordena las copas de un atributo como
sigue:
Posicióncorrectade
lacopaenlaserie
(K)Posiciónenquefue
colocada
(K′)Separacióndelaposición
correcta
(K′−K)
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10−7=3
2 3 2−3=−1
Estecandidatonoesrechazadoylapuntuaciónqueobtieneparaesteatri-
butoes:
Zi=02+02+32+(−1)2=10
La puntuación final del candidato que nos permitirá seleccionarlo o no
como catador en función de sus respuestas frente a los cuatro atributos
quehemostomadoparalaselecciónsería:
PhAt+PjAt+PlAt+PmAt=ZAt
PhAv+PjAv+PlAv+PmAv=ZAv
PhRa+PjRa+PlRa+PmRa=ZRa
PhAm+PjAm+PlAm+PmAm=ZAm
Zfinal=ZAt+…+ZAm
siendo:
At: atrojado.
Av: avinado.
Ra: rancio.Am: amargo.
El problema es ahora determinar hasta qué valor de Z es posible consi-
derar que el candidato posee buenos niveles de percepción, memoria
olfativa y organización mental para dar la adecuada respuesta para los
cuatro estímulos considerados. Naturalmente Z es siempre un valor no
negativo,yZ=0significaqueelcandidatohareconocidoycuantificado
correctamente todaslas16intensidades presentadas(cuatro decadaatri-
buto). Valores de Z distintos de cero indican que el candidato ha
reconocidolaszonasdelasescalasdondesesitúanlasintensidadesselec-
cionadas,perodentrodeellasnohapodidorealizarunacorrectasituación1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—66
▼B
asuposicióndebidoaquenoposeeunabuenacapacidaddiscriminatoria
asociada a la escala de intensidad que se le ha presentado para uno o
variosdelosestímulos.
Asípues,habráquedeterminarunvalorcríticoZ,talqueenelsupuesto
de que el candidato realice todas sus asignaciones de posición en la
escala al azar dentro de las zonas que previamente ha reconocido, la
probabilidaddeunapuntacióndefinitivaZ,inferioraZc,seaunacantidad
suficientementepequeña αquepreviamentesepuedefijar.Enotraspala-
bras,quelaprobabilidaddequeconesteprocedimientoseseleccioneun
catador para el panel que no posea suficiente capacidad discriminatoria
paralasintensidadesdeestosestímulosquesehanutilizadoparalaselec-
ción,seainferiora α.
Fijado α,en nuestro caso igual 0,05, la obtención de Zcdepende de la
distribución de probabilidad de la variable Z, que a su vez depende de
lasdistribucionesdeprobabilidaddelasvariablesp(K ′).
Realizados los cálculos estadísticos correspondientes, el valor obtenido
paraZcesiguala34.
Una vez obtenida la puntuación Z de todos los candidatos, serán recha-
zadosaquelloscuyapuntuaciónseasuperiora34.
Porejemplo,loscandidatosAyBobtienenlassiguientespuntuaciones:
Atributo CandidatoA CandidatoB
Atrojado ZAt=10 ZAt=12
Avinado ZAv=10 ZAv=11
Rancio ZRa=10 ZRa=15
Amargo ZAm=4 ZAm=0
Σ=34 Σ=38
LosvaloresdeZparaamboscandidatossonparaelA=34yparaelB
=38,luegoseráelegidoelcandidatoAyrechazadoelB.Eliminandolos
candidatos con puntuación superior a 34 los restantes se ordenarán por
susvaloresdeZ,eligiéndoseporordenhastacompletarelnúmerode12
quedeseamosreunir.
9.5.Entrenamiento
Elentrenamientotienecomoobjetivosprincipales:
a) familiarizar al catador con las numerosas variantes olfato-gustativo-
táctilesqueofrecenlosaceitesdeolivavírgenes;
b) familiarizaraloscatadoresconlametodologíasensorialespecífica;
c) incrementarlahabilidadindividualparareconocer,identificarycuan-
tificarlosatributossensoriales;
d) mejorar la sensibilidad y la memoria frente a los distintos atributos
paraconseguirjuiciosconsistentes.
El período de entrenamiento suele consistir en una serie de sesiones
según las posibilidades del grupo y del estudio, en las que después de
analizarindividualmentelosaceites,loscatadoresdiscutenconjuntamente
coneldirectorlasdificultadesencontradasycomentanlascalificaciones
paraaunarcriteriosyunificaropiniones.
El grado de entrenamiento conseguido después de un determinado
númerodesesionesseevalúaobservandoelincremento enelporcentaje
de juicios correctos si se utilizan pruebas discriminatorias o analizando
las variaciones de las calificaciones individuales medias del grupo,
cuandosetratadepruebasescalares.
La utilidad práctica de este período de entrenamiento ha sido amplia-
mente discutida, pero hoy se considera muy eficaz e incluso
imprescindible cuando se necesita disponer de datos sensoriales exactos
yprecisos.
9.6.Comprobación
Losgruposde catadores muyentrenados suelen realizar catas periódicas
y continuadas con pruebas sensoriales que requieren un gran esfuerzo.
Sobre su opinión se basan, en muchas ocasiones, decisiones de gran1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—67
▼B
importanciatecnológicaycomercial,yporello,despuésdeseleccionados
yentrenados, debenestar sometidosacomprobaciones quegaranticen la
fiabilidaddelosresultados.
Esevidentequeseríanecesario,unavezlospanelesconstituidosysome-
tidos a ensayos de rutina, proceder periódicamente a comprobar su
«performance»aintervalosadecuados.
10. PROCEDIMIENTOPARALAEVALUACIÓNORGANOLÉPTICADE
ACEITESDEOLIVAVÍRGENES
Reunidas las condiciones y medios necesarios indicados en las normas
anteriormente citadas y seleccionado elgrupode catadores, cada unode
ellosoleráydegustará(1)lacopaquecontienelamuestradeaceitesome-
tida a examen analizando en ella las percepciones olfativas, gustativas,
táctilesyquinestéticasconayudadelahojadelafigura2dondeanotará
supresenciayelvalordesuintensidad.Acontinuaciónpasaráapuntuar
lacalidaddelaceite.
10.1.Utilizacióndelahojadelafigura2 (descripción del flavor y puntua-
cióndecalidad)
Enlaparteizquierdadeestahojaseincluyenalgunasdelaspercepciones
sensoriales más características que suelen encontrarse con mayor
frecuencia en los aceites de oliva y que describen su flavor. En el caso
dequesepercibanotrosestímulosquenosecorrespondanconloscalifi-
cativos enumerados deberá anotarlos como «otros» empleando el
calificativo o calificativos que lo describa o describan con mayor
propiedad.
Losestímulosperceptiblesdeberánservaloradosproporcionalmente asu
intensidadindicandoéstaconunsigno(+)enelcasillerocorrespondiente,
deacuerdoconelcriteriosiguiente:
1: casiimperceptible.
2: ligera.
3: media.
4: grande.5: extrema.
En la parte derecha de esta hoja, se establece una escala de 9 puntos(9
calidadexcepcional, 1pésima)queseráutilizada porelcatadorparadar
una puntuación única, conjunta, de las características del aceite. Esta
puntuación debe ser consecuente con las virtudes, defectos encontrados
enelaceite,anotadosyaenlapartedelaizquierda.
La primera columna (defectos) de la tabla de puntuación comprende
cinco apartados, de esta forma la clasificación de los aceites se basará
fundamentalmente en la ausencia total o en la presencia de flavores
defectuosos así como en la mayor o menor gravedad o intensidad de
éstos;sinembargo,comolaescaladevaloraciónesde9puntos,deberán
considerarsealgunosmaticesoaspectosquecontribuyendeformadefini-
tiva a decidir la puntuación total de calidad, que se describen en la
segundacolumna(características).
10.2.Puntuaciónfinal
El jefe del panel recogerá las puntuaciones dadas por cada uno de los
catadores, comprobará que los atributos y las intensidades con que los
ha percibido y marcado en la tabla de perfil se corresponden aceptable-
mente con la valoración asignada al aceite en la «hoja de puntuación».
En caso de existir una diferencia apreciable, solicitará al catador que
revisesuhojadepuntuación.
Sifuesenecesario,elcatadorrepetiráelensayo.
Porúltimo,eljefedelpaneltabularálaspuntuacionesdetodoelgrupoy
calcularálamediaaritméticayelerrortípico(delamedia).
Sielerrortípicoessuperioralerrordemétodo,harárepetirelensayoa
todoelgrupo.
Elgruporepetirálosensayoshastaobtenerunaevaluaciónportriplicado
delamuestra, únicamente enelcasodeanálisis derevisión. Lapuntua-1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—68
(1) Podrá abstenerse cuando al olerla encuentre algún atributo extremada e intensamente
desagradableyanotaráestacircunstancia excepcionalenlahojadepuntuación.
▼B
ciónfinaldelamuestraserálamediadelastrespuntuacionesdadas,con
unacifradecimal.
Sielvalordeintensidad media deamargoy/opicanteessuperiora2,5,
al aceite se le dará la calificación correspondiente y sehará constar que
esespecialmenteamargoy/opicante.
Expresión de los resultados: el jefe del panel determinará, a partir de la
puntuaciónmedia,lacategoríaalaquecorrespondelamuestra,segúnlos
valores establecidos en el Anexo I. Con este objeto, si la puntuación
mediaesigualosuperiora5puntos,eljefedelpanelaplicará:
— durantelacampaña1992/93,unatoleranciade+1,5;
— durantelascampañasde1993/94y1994/95,unatoleranciade+1;— durantelacampaña1995/96,unatoleranciade+0,5.
Noobstante,enelcasodelasaceitesobjetodeoperacionesdeinterven-
ción,noseaplicaráningunatolerancia.
Ladiferenciaestadística,relativaalosvaloresderepetibilidadyreprodu-
cibilidad del método, entre el resultado del análisis y el límite
reglamentario estará comprendida dentro del margen de tolerancia
contempladoenlospárrafosanteriores.
Enelcasodeque,durantelascampañasantesmencionadas,elinteresado
proceda a la clasificación del aceite sin aplicar el margen de tolerancia
previsto, podrá indicar en el envase inmediato la puntuación organolép-
tica mínima del producto, comprobable durante el período de
comercialización.
Enelinforme delanálisis,eljefedelpanelindicará únicamente lacate-
goría en la que se clasifique la muestra. Cuando se trate de un examen
efectuadoporunanalistadeconformidadconelpárrafoprimerodelapar-
tado 2del artículo 2, dicho analista aplicará el mismo procedimiento de
determinacióndelacategoría.
Nota:Lasmuestrasdeberánconservarsecerradasyenfrigoríficohastasu
análisis,devolviéndolasaéstehastacompletareltriplicado.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—69
▼M10
▼M9
▼M5
▼B
▼M3
Figura2
Aceitedeolivavirgen
ANÁLISISSENSORIAL:VOCABULARIOGENERALBÁSICO
1. OBJETO
La presente norma tiene por objeto agrupar los términos generales utili-
zadosparaelanálisissensorialyproporcionarsudefinición.
2. VOCABULARIO
2.1.Terminologíageneral
Análisis sensorial (sustantivo):
examen de los caracteres organolépticos de un producto mediante los
sentidos.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—70
▼B
▼B
Percepción(sustantivo):
tomadeconcienciasensorialdeobjetosoacontecimientosexteriores.
Organoléptico (adjetivo)(carácteropropiedad):
califica toda propiedad de un producto susceptible de ser percibida por
losórganosdelossentidos.
Experto(sustantivo):
(enloqueconciernealexamendeloscaracteresorganolépticos)
catadorespecializadoenelanálisissensorialdeundeterminadoproducto
yqueposeeconocimientosbásicossobrelaelaboración delmismoylas
preferenciasdelmercado.
Catador(sustantivo):
personaperspicaz,sensible,seleccionadayentrenada,queestimaconlos
órganosdesussentidosloscaracteresorganolépticosdeunalimento.
Grupo de catadores:
conjunto de sujetos o jueces loscuales han sido especialmente seleccio-
nados y entrenados y que se reúnen para efectuar bajo condiciones
controladaselanálisissensorialdelproducto.
Sensación(sustantivo):
fenómeno subjetivo resultante del estímulo de un sistema sensorial. Este
fenómeno es subjetivamente discriminable y objetivamente definible a
través del órgano sensorial interesado, según la naturaleza o la cualidad
delestímulo,asícomoporsuintensidad.
Sensibilidad(sustantivo):
capacidaddelosórganossensorialesquelespermitepercibircualitativay
cuantitativamente unestímulo depocaintensidad odiferencias pequeñas
entreestímulos.
Cata(sustantivo):
operación queconsisteenpercibir, analizar yjuzgar loscaracteres orga-
nolépticos, y más particularmente los olfato-gustativos, táctiles y
quinestéticosdeunproductoalimenticio.
Aceptación(sustantivo):
actoqueconsisteenadmitircomofavorableunproductoporpartedeun
individuoounapoblación.
Armonía(sustantivo):
cualidaddeunproductoqueoriginaunasensacióndeconjuntoagradable.
Dichasensaciónesdebidaalapercepcióndesuscomponentes,aportados
como estímulos olfativos, gustativos, táctiles y quinestéticos porque se
encuentranenrelacionesdeconcentraciónadecuadas.
Aceptabilidad (sustantivo):
estadodeunproductorecibidofavorablementeporunindividuoopobla-
ciónenfuncióndesuspropiedadesorganolépticas.
Discriminación (sustantivo):
diferenciacióncualitativay/ocuantitativaentredosovariosestímulos.
Compensación (sustantivo):
resultado de la interacción debida a un conjunto de estímulos de modo
quecadaunosepercibeconmenorintensidadquesiactuarasolo.
Aspecto(sustantivo):
conjuntodecaracteresorganolépticospercibidosporelórganodelavista:
tamaño,forma,color,conformación,turbidez,limpieza,fluidez,espumay
efervescencia.
Estetérminoespreferiblealdeapariencia.
Atributo(sustantivo):
propiedadcarcterísticaperceptible.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—71
▼B
2.2.Terminologíarelativaalafisiología
Estímulo(sustantivo):
agente físico o químico que produce específicamente la respuesta de los
receptoressensorialesexternosointernos.
Gusto:(Sentidodelgusto)uno de los sentidos cuyos receptores están localizados en la boca, parti-
cularmentesobrelalenguayquesonactivadospordiferentescompuestos
ensolución.
Gustativo(adjetivo):
calificalapropiedaddeunproductocapazdeestimularelaparatogusta-
tivo despertando las sensaciones correspondientes a uno a varios de los
cuatrossaboreselementales:dulce,salado,ácidoyamargo.
Receptor(sustantivo):
estructuraespecializadadeunórganosensorialexcitable,capazderecibir
unestímuloyconvertirloeninflujonervioso.
Nota:Los receptores se clasifican según el tipo de energía asociada al
estímulo(luz,calor,sonido,etcétera).
Olfacción(sustantivo):
función del aparato olfativo con vistas a la percepción y discriminación
de las moléculas que acceden a él, en fase gaseosa desde un medio
externo,porvíanasaldirectaoindirecta.
Intensidad(sustantivo):
grado de energía de una cualidad medible según una escala cuantitativa
devaloressuperioresalumbral.
Adaptación(sustantivo):
modificación temporal de la sensibilidad para percibir estímulos senso-
riales como resultado de una contínua y repetida exposición a ese o
similarestímulo.
Inhibición(sustantivo):
falta de respuesta por parte de un órgano sensorial o de una parte del
mismo, a pesar de estar sometido a la acción de un estímulo adecuado
deintensidadsuperioralumbral.
Respuesta(sustantivo):
acciónconquelascélulassensorialescorrespondenaladeunoovarios
estímulosrelativosaunamodalidadsensorialdefinida.
Cuerpo(sustantivo):
sensacióntáctil percibida enlabocayqueotorgaungradodedensidad,
viscosidad,consistenciaocompacidadaunproducto.
Fragancia(sustantivo):
olorfresco,suaveydelicioso.Oler(verbo):
(sentidoactivoaplicadoalolfato)designalaaccióndepercibirunolor.
Objetivo(adjetivo):
a) califica a aquello que proporciona una representación real y compro-
bable del objeto, reduciendo al mínimo los factores humanos (por
ejemplo:preferencia,costumbre,afectividad);
b) califica a aquella técnica que, bien utilizando métodos sensoriales o
métodosinstrumentales,permitereduciralmínimoloserrorespropios.
Nota:Sedesaconsejaemplearcomosinónimoeltérminodeinstrumental.
Subjetivo(adjetivo):
califica a aquello que proporciona una percepción condicionada por
nuestromododepensarosentirynosóloporelestímulo.
Quinestesia:1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—72
▼B
conjunto desensaciones resultante deunapresión aplicable alamuestra
por un movimiento (por ejemplo, presión de los dedos en el caso de un
queso).
Umbral(sustantivo):
Umbral absoluto:
cantidadmínimadeunestímulosensorial,quedalugar:
— alaaparicióndeunasensación(umbraldeapariciónodedetección),
— oalreconocimientodedichasensación(umbraldeidentificación).
Umbral diferencial:
cantidad mínima de estímulo sensorial que da lugar a una diferencia
perceptibleenlaintensidaddelasensación.
Umbral final:
cantidadmáximadeunestímuloapartirdelacualunaumentodeinten-
sidadnosepercibe.
Umbral preferencial:
valorcuantitativo mínimodeunestímulo ovalorcrítico supraliminarde
este estímulo al que corresponde la aparición de una respuesta de atrac-
ción o repulsa en relación con un estímulo neutro, por ejemplo, en la
elecciónentreunasoluciónazucaradayelagua.
Nota:se debe distinguir entre umbral absoluto de preferencia y umbral
diferencialdepreferencia.
Subliminar(adjetivo):
pordebajodelumbralabsoluto.Supraliminar(adjetivo):
porencimadelumbralabsoluto.
Fatiga sensorial:
casoparticulardeadaptaciónsensorialenelqueseproduceunadisminu-
cióndelasensibilidad.
Compensación (sustantivo):
resultado de la interacción debida a un conjunto de estímulos de modo
quecadaunosepercibeconmenorintensidadquesiactuarasolo.
Sinérgico(adjetivo):
efecto o acción concertada de determinadas sustancias, de modo que la
intensidad de los caracteres organolépticos resultantes de la mezcla son
superioresalasumadelasintensidadesquecadaunodeellosmostraba
porseparado.
Efecto de contraste:
aumentodelarespuestaalasdiferenciasentrelosestímulossimultáneos
oconsecutivos.Contrariodelefectodeconvergencia.
Efecto de convergencia:
disminucióndelarespuestaalasdiferenciasentrelosestímulossimultá-
neosoconsecutivos.Contrariodelefectodecontraste.
2.3.Terminologíarelativaalaspropiedadesorganolépticas
Ácido(adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por soluciones acuosas diluidas
de la mayoría de los ácidos (por ejemplo, ácidos cítrico, láctico y
tartárico);
b) calificalapropiedaddeloscuerpospurosomezclasquealserdegus-
tadosproducenestesabor.
Elsustantivocorrespondienteesacidez.
Agrio(adjetivo):
califica la sensación olfato-gustativa con predominio de ácidos general-
mente de origen fermentativo, y a los alimentos que producen esta
sensación.Algunosfactoresquecontribuyenadichasensaciónestánrela-1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—73
▼B
cionados con el proceso de fermentación, por ejemplo acética, de un
productoalimenticio.
Amargo(adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por soluciones acuosas diluidas
de diversas sustancias tales como quinina, cafeína y determinados
heterósidos;
b) califica la propiedad de aquellos cuerpos puros o sus mezclas que al
serdegustadosproducenestesabor.
Elsustantivocorrespondienteesamargor.
Salado(adjetivo):
a) sensación característica quese percibe a través del sentido del gusto,
cuyoejemplo mástípico eselproducidoporunasolucióndecloruro
sódico;
b) califica la propiedad de las sustancias o mezclas que producen este
saborduranteladegustación.
Elsustantivocorrespondienteessalinidad.
Dulce(adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por las soluciones acuosas de
diversassustancias,porejemplo,lasacarosa;
b) califica la propiedad de las sustancias puras o mezclas, que al ser
degustadasproducenestesabor.
Elsustantivocorrespondienteesdulzor.
Astringente:
a) califica la sensación compleja producida en la boca poruna solución
acuosa diluida de productos como algunos taninos (por ejemplo, los
taninosdelcaquiydeendrina);
b) califica la propiedad de los cuerpos puros o mezclas que producen
estasensación.
Elsustantivocorrespondienteesastringencia.
Flavor(sustantivo):
seentiendeporflavorelconjuntodepercepcionesdeestímulosolfatogus-
tativos, táctiles y quinestéticos que permite a un sujeto identificar un
alimento y establecer un criterio, a distintos niveles, de agrado o desa-
grado.
Sabor(sustantivo):
a) sensacionespercibidascomoconsecuenciadelestímulodelaspapilas
gustativasporalgunassustanciassolubles,
b) cualidaddelasensaciónparticularproducidaportalessustancias.
Sabor elemental (sustantivo):
Cadaunodeloscuatrosaboresreconocidos:dulce,salado,ácido,amargo.
Olor(sustantivo):
a) conjunto de sensaciones percibidas por el órgano olfativo cuando se
inspirandeterminadassustanciasvolátiles;
b) cualidad de la sensación particular producida por cada una de las
sustanciasanteriores.
Aroma(sustantivo):
a) sensacionesagradablespercibidas porelórganoolfativoporvíaindi-
rectacuandoserealizaladegustacióndeunalimento;
b) enperfumería y en lenguaje no especializado seaplica también alas
mismassensacionesapreciadasporvíanasaldirecta.
Regusto(sustantivo):
Conjunto de sensaciones percibidas después de haber desaparecido el
estímulodelaboca,distintasalaspercibidaspreviamente.
Essinónimodedejo.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—74
▼B
Aromático(adjetivo):
a) calificalapropiedaddeloscuerpospurosomezclasque,alserdegus-
tados,producenlassensacionescalificadascomoaroma;
b) califica a aquellos productos que, examinados por vía nasal directa,
producensensacionesdefraganciayfrescor.
Textura(sustantivo):
características del estado sólido o reológico de un producto, cuyo
conjunto es capaz de estimular los receptores mecánicos, durante la
degustación,particularmentedelossituadosenlaregiónbucal.
Nota:Estetérminoserefiereúnicamentealaspropiedadesobjetivasyno
alassensacionesproducidasyquesedesignanportérminosgene-
rales,talescomoconsistencia,fibrosidad,untuosidad,etc.
Paladear:
accióndeconseguirqueunalimentosituadoenlabocaentreencontacto
con todas las zonas sensibles de la misma, con objeto de percibir las
sensacionesbucalesqueproduce.
Nota:Este vocabulario puede ampliarse consultando las Normas ISO
5492/I, II, III, IV, V y otras existentes, tales como el elaborado
por J.L. Magnen «Les cahiers techniques du Centre national de
coordinationdesetudesetrecherchessurlanutritionetl'alimenta-
tion»,etc.
COPAPARALADEGUSTACIÓNDEACEITES
1. OBJETO
Lapresentenormatieneporobjetodescribirlascaracterísticasdelacopa,
destinadaalanálisisorganolépticodelosaceitescomestibles(olor,sabor,
flavor).
Describe, además, el dispositivo de calentamiento adaptado, necesario
para la obtención y el mantenimiento de la temperatura adecuada para
esteanálisis.
2. DESCRIPCIÓN
Elesquemadiseñadodelafigura1pretendeoptimizarlascaracterísticas
deseablesenunutensiliodeestanaturaleza,yquepuedenconcretarseen
lospuntossiguientes:
a) máxima estabilidad, dificultando su inclinación y derramamiento del
aceitecontenido;
b) fondofácilmenteadaptablealoshuecosdelbloquedecalefacciónque
permiteelcalentamientohomogéneodelabasedelacopa;
c) estrechamiento de la boca que favorece la concentración de olores y
facilitasuidentificación;
d) devidriooscuroquenopermitaalcatadorpercibirelcolordelaceite,
impidiéndole cualquier prejuicio y la posible creación de sesgos o
tendenciasquepuedanafectaralaobjetividaddeladeterminación.
2.1.Dimensiones
Elesquemadelacopavarepresentadoenlafigura1,teniendolasdimen-
sionessiguientes:
— capacidadtotal….............................. 130ml±10ml,
— alturatotal….................................. 60mm±1mm,— diámetrodelaboca…......................... 50mm±1mm,— diámetrodelapartemásancha….............. 70mm±1mm,— diámetrodelabase…......................... 35mm±1mm,— espesordevidrioenlasparedeslaterales….... 1,5mm±0,2mm,— espesordevidrioenelfondo…................ 5mm±1mm.
Cada copa irá acompañada de un vidrio de reloj cuyo diámetro será de
unos10mmsuperioraldesuboca.Estevidrioservirádetapaparaevitar
lapérdidadearomaylaentradadepolvo.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—75
▼B
2.2.Característicasdefabricación
Lacopadeberáestarfabricadaconvidrioresistente;decoloroscuroque
impida apreciar la coloración de su contenido, exento de rayas o
burbujas.
Elbordedeberáserregular,lisoyrebordeado.La pieza deberá estar recocida, permitiéndole resistir las variaciones de
temperaturaquehadesufrirenlosensayos.
2.3.Normasparalautilización
La limpieza de las copas deberá realizarse utilizando jabón o detergente
no perfumados, enjuagándose a continuación repetidas veces hasta
eliminar totalmente el agente de limpieza. Se enjuaga finalmente con
aguadestilada,sedejaescurrirysesecaenunaestufadedesecación.
Nodebenutilizarseácidosconcentradosnimezclacrómica.Las copas deben mantenerse en la estufa hasta su utilización, o conser-
varse en un armario protegiéndolas de toda contaminación de olores
extraños.
Antes de cada utilización, deberá olerse cada copa, con el fin de
comprobar la ausencia de cualquier olor extraño. Al preparar el ensayo
setendrámuchocuidadodeanotarlaclavedecadacopayelaceiteque
le corresponde. Esta correspondencia clave/aceite sóloseráconocida por
elorganizadordelensayo.
3. DISPOSITIVODECALENTAMIENTODELASMUESTRAS
Elexamenorganolépticodelasmuestrasdeberáefectuarseaunatempe-
raturadeterminadaque,paralosaceitescomestibles,debeserde28±2ºC.
Para conseguir esto, deberá instalarse en el interior de cada cabina, al
alcance del catador, un dispositivo de calefacción como el representado
enlafigura2.Consisteenunbloquedealuminiosumergidoenunbaño
deaguareguladotermostáticamente,conelobjetodeobtenerunatempe-
ratura uniforme. Este bloque lleva una serie de oquedades a las que se
adaptan los fondos de las copas. La diferencia de temperatura entre el
dispositivo de calentamiento y el aceite de las copas colocadas en las
oquedadesdelosdistintosbloquesnodebesersuperiora±2ºC.
Figura1—Copadedegustación
Dimensiones(enmm)1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—76
▼B
Figura 2 — Dispositivo de calentamiento de las muestras (Dimen-
sionesenmilímetros)
GUÍAPARALAINSTALACIÓNDEUNASALADECATA
1. INTRODUCCIÓN
La sala de cata tiene por objeto proporcionar al grupo de catadores que
intervienen en los ensayos sensoriales un ambiente adecuado, cómodo y
normalizado que facilite el trabajo y tienda a mejorar la repetitividad y
reproducibilidaddelosresultados.
2. OBJETO
Lapresentenormatieneporobjetoprecisarlascondicionesbásicasaque
debeatenerselainstalacióndeunasaladecata.
3. ESPECIFICACIONESGENERALESDELAINSTALACIÓN
Unlocal,cualquieraqueseasusuperficie,deberáresponderalasespeci-
ficacionessiguientes:
El local deberá ser agradable y estar convenientemente iluminado, pero
conservando un carácter neutro. Con este fin, se recomienda un color1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—77
▼B
relajante, liso y claro en las paredes para que se cree una atmósfera de
distensión(1).
El local será de fácil limpieza y estará aislado de cualquier fuente de
ruido;portanto,preferentemente insonorizado.Estaráigualmenteaislado
deoloresextrañosporloque,aserposible,estaráprovistodeundispo-
sitivo eficaz de ventilación. Si las oscilaciones de la temperatura
ambiental loaconsejan, lasaladecata deberádotarsedeaire acondicio-
nadoquemantengaelambientepróximoa20-22ºC.
3.1.Dimensiones
Las dimensiones del local dependen frecuentemente de las disponibili-
dades de los laboratorios o de las empresas. En general, deberá ser lo
suficientemente espacioso para permitir la instalación de unas diez
cabinasytambiéndeunazonaparalapreparacióndelasmuestras.
Sinembargo,esevidentequecuantomayorseaelespaciodedicadoalas
instalaciones, mejor será, ya que así se podrán prever dependencias
anexas para, por ejemplo, limpieza del material, colocación de prepara-
cionesculinariasyreunionesde«panelesabiertos».
3.2.Iluminación
La iluminación general, ya provenga de la luz solar o de lámparas (por
ejemplo, lámparas de tubo tipo «luz de día») será uniforme, regulable y
conluzdifusa.
3.3.Temperaturayestadohigrométrico
Ellocalsemantendrácontinuamenteencondicionestérmicasehigromé-
tricas agradables. Salvo circunstancias especiales, se recomienda una
temperatura de 20-22 ºC y un estado higrométrico de 60 a 70 % de
humedadrelativa.
4. DESCRIPCIÓNDELASCABINAS
4.1.Característicasgenerales
Las cabinas se situarán en el local una al lado de otra, serán idénticas
entre sí y estarán separadas unas de otras por mamparas lo suficiente-
mente altas y anchas para aislar a los catadores entre sí, una vez
sentados.Se puedenconstruir de cualquier material apropiado yde fácil
limpieza y conservación (por ejemplo: madera, contra-chapado vitrifi-
cado, paneles laminados, etcétera). Siseutilizan pinturas, éstas deberán,
despuésdesecas,sertotalmenteinodoras.
Los asientos previstos en cada cabina serán cómodos y de altura regu-
lable.
Tambiénhayquepreverqueencadaunadeellaselalumbradoseaindi-
vidual,regulableendireccióneintensidad.
Es muy recomendable que las cabinas estén provistas de un pulsador
conectado a un dispositivo luminoso exterior que permita al catador
comunicar a la persona que lo atiende desde el exterior, sin distraer a
los demás, que ha terminado el ensayo, desea nuevas muestras, carece
de algún utensilio, ha observado alguna irregularidad, o desea alguna
información,etc.
4.2.Dimensiones
Lascabinasseránsuficientementeampliasyconfortables.Engeneral,semantendránlassiguientesdimensiones:
— ancho:
0,75m(sinpilaenlamesa),0,85m(conpilaenlamesa);
— fondo:
0,50m(lamesa),0,20mexcesodelamampara;
— alturadelasmamparas:1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—78
(1) Elcolordelahabitación ysuiluminaciónpuedeninfluirenlosresultadosdelanálisis
sensorial.
▼B
0,60mmínimoapartirdelamesa;
— alturadelamesa:
0,75metros.
4.3.Disposición
Lasuperficiedelamesaserádefácillimpieza.Unapartedeestasuperficiedebereservarseparaunapiladotadadeagua
corriente potable. Sin embargo, si esto no es factible, se reservará este
espacioparalacolocacióndeunacubeta,escupideraosimilar.
Cuando se deban mantener las muestras, mientras se realiza la prueba a
temperatura constante superior o inferior al ambiente, conviene disponer
deunequipoadecuadoparatalfin(bañoMaría,placacalefactora,etc.).
También sepuedeinstalarunarepisa,aunaalturaaproximada delsuelo
de1,10metros,paracolocarenelladiferentesaccesorios(vasos,material
menudo,etc.).
Si la disposición de las cabinas en la sala lo permite, es conveniente
instalarundispositivoparafacilitarlapresentacióndelasmuestras.Este
puede ser en forma de corredera (figura 1), de torno vertical (figura 2)
indicado para vasos o copas (recipientes altos), o de torno horizontal
cuando los recipientes en que se sirven las muestras tienen poca altura
(figura3).Sencillamente, queposeahuecosuficienteparaelpasodelas
bandejasycopasquecontenganlasmuestrasaexaminar.
5. LOCALESCOMPLEMENTARIOS
Sisedisponedeespaciosuficiente,convienecontarconlocalesseparados
para preparación de muestras (cocina experimental si se prevén ensayos
culinarios uotros),estanterías paralacolocación devasosoutensiliosy
salasdereuniónparalasdiscusionespreviasoposterioresalosensayos.
En estos casos dichos locales se mantendrán limpios y en ningún caso
podrán molestar el trabajo de los jueces, en la sala de cata, con sus
olores,ruidos,oconlaconversacióndelosreunidos.
Véaseenla figura 4unejemplo desala decata einstalaciones comple-
mentarias.
Nota:Lascondicionesdescritassonlasideales;perosinofueseposible
disponer de una instalación semejante reservada únicamente para
el análisis sensorial, los ensayos podrían realizarse en un local
que reúna las condiciones mínimas descritas (luz, temperatura,
ruido, olores), instalando cabinas móviles a partir de elementos
plegables de tal forma que permitan, como mínimo aislar entre sí
aloscatadores.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—79
▼B
DISPOSICIÓNDELACABINA
Figura1
1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—80
▼B
TORNODEPRESENTACIÓNDELASMUESTRAS
Figura2
1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—81
▼B
TRAMPILLADEPRESENTACIÓNDELASMUESTRAS
Figura3
1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—82
▼B
LABORATORIODEANÁLISISSENSORIAL
Figura4— Ejemplo de sala de cata
1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—83
▼B
ANEXO XIII
NEUTRALIZACIÓNYDECOLORACIÓNDELACEITEDEOLIVAEN
LABRATORIO
1. NEUTRALIZACIÓN Y DECOLORACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA
ENLABORATORIO
1.1.Neutralizacióndelaceite
1.1.1. Equipo
— vasode300mldeformaalta,
— centrífugacontubosde100ml,— vasode250ml,— matracesde100ml,— ampolladedecantaciónde1litro.
1.1.2. Reactivos
— soluciónacuosadehidróxidodesodioal12%,
— soluciónetanólicaal1%defenolftaleína,— hexanoparaanálisis,— alcoholisopropílicopuroparaanálisis.
1.1.3. Modo de operar
a)Aceites de acidez expresada en ácido oleico inferior al 30%
Introducirenunvasode300mldeformaalta,50gdeaceitebrutoy
calentar a 65 ºC al baño María. Agitar lentamente, y añadir una
cantidad de solución de hidróxido de sodio al 12 % que corresponda
alaacidezlibredelaceiteconunexcesodel5%.Continuaragitando
durantecincominutos,manteniendolatemperaturaa65ºC.
Trasladar el total a unos tubos de centrífuga de 100 ml, separar la
masa jabonosa por centrifugación. Verter el aceite decantado en un
vaso de 250 ml y lavar con 50-60 ml de agua destilada hirviendo
eliminando durante este proceso la capa acuosa con la ayuda de un
sifón.Repetir loslavados hasta eliminar completamente losrestos de
jabonresidual(desaparicióndelacoloraciónrosaenlafenolftaleína).
Centrifugar el aceite para eliminar las pequeñas cantidades de agua
residual.
b)Aceites de acidez expresada en ácido oleico superior al 30%
Introducir en una ampolla de decantación de un litro, 50 g de aceite
bruto, 200 ml de hexano, 100 ml de alcohol isopropílico y una
cantidad de solución de hidróxido de sodio al 12 % que corresponda
alaacidezlibredelaceite,conunexcesodel0,3%.Agitarenérgica-
menteduranteunminuto.Añadir100mldeaguadestilada, agitarde
nuevoydejarreposar.
Despuésdelaseparacióndelascapas,dejarsalirlacapainferiorque
contienelosjabones.Entreambascapas(aceitosaporencimayacuosa
pordebajo) se forma frecuentemente una capa intermedia constituida
por mucílagos y sustancias insolubles que deberá eliminarse igual-
mente
Proceder a continuación al lavado de la solución hexánica de aceite
neutroconporcionesde50-60mldeunasolucióndealcoholisopropí-
lico/agua destilada 1/1 (v/v) hasta la desaparición de la coloración
rosa en la fenolftaleína. Proceder a continuación a la eliminación
completadelhexanopordestilaciónenvacío(porejemplo,enelrota-
vapor).
1.2.Decoloracióndelaceiteneutro
1.2.1. Equipo
— matrazde250mlcon3bocasquepermitanlainserciónde:
a) un termómetro graduado en grados que permita hacer lecturas
hasta90ºC,1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—84
▼M6
▼B
▼B
b) unagitadormecánicoquegirea250-300vueltasporminutoequi-
padoparaelfuncionamientoenvacio,
c) unrácorhacialabombadevacío,
— bombadevacio,provistadeunmanómetro,capazdelograrpresiones
residualesde15-30milibares.
1.2.2. Modo de operar
Pesar en el matraz de 3 bocas cerca de 100 g del aceite neutralizado.
Insertar el termómetro y el agitador, volver a unir a la bomba de vacío
ycalentarhasta90ºCagitándolo.
Mantener dicha temperatura, siempre bajo agitación, hasta que el aceite
que deba analizarse esté completamente liberado de suhumedad (treinta
minutosaproximadamente).
Interrumpirentonceselvacíoyañadirle2a3gdetierraactivada.Resta-
blecer el vacío hasta obtener una presión residual de 15-30 milibares y,
siempre con una temperatura de 90 ºC, agitar durante 30 minutos a 250
vueltasporminutoaproximadamente.
Filtraracontinuaciónencalienteenunbañotermoestático(50-60ºC).1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—85
▼M6
ANEXO XIV
NOTAS COMPLEMENTARIAS 2, 3 Y 4 DEL CAPÍTULO 15 DE LA
NOMENCLATURACOMBINADA
2. A. SóloperteneceránaloscódigosNC1509y1510losaceitesqueprocedan
exclusivamente del tratamiento de las aceitunas y cuyas características
analíticas relativas al contenido de ácidos grasos y esteroles sean las
siguientes:
CuadroI:Contenidodeácidosgrasosenporcentaje
deltotaldeácidosgrasosCuadroII:Contenidodeesterolesenporcentajedel
totaldeesteroles
Ácidomirístico M0,1 Colesterol M0,5
Ácidolinolénico M0,9 Brasicasterol M0,2
Ácidoaraquídico M0,7 Campesterol M4,0
Ácidoeicosánico M0,5 Estigmasterol(1) <Campesterol
Ácidobehénico M0,3 Beta-sitosterol(2) m93,0
Ácidolignocérico M0,5 Delta-7-Estigmasterol M0,5
m = mínimo
M = máximo
(1) Condiciónnoválidaparaelaceitedeolivavirgenlampante(subpartida15091010)niparaelaceitede
orujodeolivaenbruto(subpartida15100010).
(2) Delta-5,23-Estigmastadienol+Clerosterol+Beta-Sitosterol+Sitostanol+Delta-5-Avenasterol+Delta-
5,24-Estigmastadienol.
No pertenecerán a las partidas 1509 y 1510 los aceites de oliva modifi-
cados químicamente (en particular, los aceites reesterificados) ni las
mezclasdeaceitedeolivaconaceitesdeotrotipo.Lapresenciadeaceite
deoliva reesterificado ode aceites deotro tipo sedeterminará mediante
losmétodosindicadosenlosAnexosV,VII,XAyXBdelReglamento
(CEE)no2568/91.
B. Sóloperteneceránalasubpartida150910losaceitesdeolivadefinidosen
los puntos I y II siguientes, obtenidos únicamente por procedimientos
mecánicos o por otros procedimientos físicos, en condiciones, especial-
mente térmicas, quenoalteren elaceite, yque nohayan sidosometidos
a más tratamiento que el lavado, la decantación, el centrifugado y la
filtración. Los aceites obtenidos a partir de la oliva mediante solventes
perteneceránalapartida1510.
I. Seconsiderará «aceite deoliva virgen lampante», tal como figura en
lasubpartida15091010ycualquieraqueseasuacidez,elaceiteque
presente:
a) uncontenidode ►M9ceras◄nosuperiora ►M9350◄mg/
kg;
b) uncontenidodeeritrodiolyuvaolnosuperioraun4,5%;
c) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de los
triglicéridosnosuperioraun1,3%;
d) lasumadeisómerostransoleicosinferioraun0,10%ylasumade
isomerostranslinoleicos+translinolénicosinferioraun0,10%;
e) yunaovariasdelassiguientescaracterísticas:
1) uníndicedeperióxidosuperiora20meqdeoxgenoactivo/kg;
2) uncontenidodesolventeshalogenadosvolátilestotalessuperior
a0,2mg/kgo,porlomenosunodeellos,superiora1mg/kg;
3) uncoeficiente deextinciónK270superiora0,25y,traseltrata-
miento del aceite con alúmina activada, nosuperiora0,11;en
efecto, algunos aceites con un contenido de ácidos grasos
libres, expresado en ácido oleico, superior a 3,3 g por 100 g
podrán tener, tras el paso por alúmina activada, con arreglo al
método indicado en el Anexo IX del Reglamento (CEE) no
2568/91, un coeficiente de extinción K270superior a 0,10; en
ese caso, tras la neutralización y decoloración efectuadas en
laboratorio con arreglo al método indicado en el Anexo XIII
delReglamento antesmencionado,deberántenerlassiguientes
características:
— uncoeficientedeextinciónK270nosuperiora1,20,1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—86
▼M6
— una variación (Delta K) del coeficiente de extinción alre-
dedorde270nmsuperiora0,01peronoa0,16,esdecir.:
DeltaK=Km−0,5(Km−4+Km+4)
Km= es el coeficiente de extinción a la
longitud de onda del vértico máximo
de la curva de absorción alrededor
de270nm,
Km−4yKm+4= sonloscoeficientesdeextinciónalas
longitudes de onda inferiores y supe-
rioresen4nmaladeKm;
4) características organolépticas que revelen defectos perceptibles
conunaintensidadsuperiorallímitedeaceptabilidad yconun
resultado de análisis sensorial inferior a 3,5 con arreglo a la
puntación contemplada en el Anexo XII del Reglamento
(CEE)no3568/91.
II. Se considerará «otro aceite de oliva virgen», tal como figura en la
subpartida 15091090, el aceite de oliva que presente las siguientes
características:
a) unaacidez,expresadaenácidooleico,nosuperiora3,3g/100g;
b) uníndicedeperióxidonosuperiora20meqdeoxígenoactivo/kg;
c) uncontenidode ►M9ceras◄nosuperiora ►M9250◄mg/
kg;
d) uncontenidodesolventeshalogenadosvolátilestotalesnosuperior
a0,2mg/kgycadaunodeellosconuncontenidonosuperiora0,1
mg/kg;
e) un coeficiente de extinción K270no superiora 0,25y,tras elpaso
delaceiteporalúminaactivadanosuperiora0,10;
f) unavariacióndelcoeficientedeextinción(DeltaK)enlazonade
270nmnosuperiora0,01;
g) característicasorganolépticasquerevelendefectosperceptiblescon
unaintensidadinferiorallímitedeaceptabilidad,conunresultado
deanálisissensorialigualosuperiora3,5,conarregloalodispu-
estoenelAnexoXIIdelReglamento(CEE)no2568/91;
h) uncontenidodeeritrodiol+uvaolnosuperiora4,5%;
i) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de los
triglicéridosnosuperioraun1,3%;
j) lasumadeisómerostransoleicosinferioraun0,03%ylasumade
isomerostranslinoleicos+translinolénicosinferioraun0,03%.
C. Pertenecerá a la subpartida 15099000 el aceite de oliva obtenido por
tratamiento de los aceites de las subpartidas 15091010 y/o 15091090,
inclusoconadicióndeaceitedeolivavirgen,quepresentelascaracterís-
ticassiguientes:
a) unaacidez,expresadaenácidooleico,nosuperiora3,3g/100g;
b) uncontenidode ►M9ceras◄nosuperiora350mg/kg;
c) uncoeficientedeextinciónK270nosuperiora1,20;
d) unavariacióndelcoeficientedeextinción( ∆K)enlazonade270nm
nosuperiora0,16;
e) uncontenidodeeritrodiolyuvaolnosuperioraun4,5%;
f) uncontenidodeácidosgrasossaturadosenlaposición2delostrigli-
céridosnosuperioraun1,5%;
g) lasumadelosisómerostransoleicosinferioraun0,20%ylasumade
isómerostranslinoleicos+translinolénicosinferioraun0,30%.
D. Se considerarán «aceites crudos» tal come figuran en la subpartida
15100010 los aceites, principalmente los aceites de orujo de oliva, que
presentanlassiguientescaracterísticas:
a) unaacidez,expresadaenácidooleico,igualosuperiora2g/100g;
b) uncontenidodeeritrodiolyuvaolsuperioraun12%;
c) uncontenidodeácidosgrasossaturadosenlaposición2delostrigli-
céridosnosuperioraun1,8%;
d) lasumadelosisómerostransoleicosinferioraun0,20%ylasumade
losisómerostranslinoleicos+translinolénicosinferioraun0,10%.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—87
▼M9
▼M6
▼M6
E. Pertenecerán a la subpartida 15100090 los aceites obtenidos por trata-
miento de los aceites de la subpartida 15100010, incluso con adición
de aceite de oliva virgen, y los que no presenten las características de
los aceites contemplados en las notas complementarias 2 B, 2 C y 2 D.
Losaceitesdelapresentesubpartidadebenteneruncontenidodeácidos
grasossaturadosenlaposición2delostriglicéridosnosuperioraun2%,
la suma de isómeros transoleicos inferior a un 0,40 % y la de los
isómerostranslinoleicos+translinolénicosinferioraun0,35%.
3. Seexcluirándelassubpartidas15220031y15220039:
a) los resíduos procedentes del tratamiento de grasas que contengan aceite
cuyoíndicedeyodo,determinadoporelmétodosquefiguraenelAnexo
XVIdelReglamento(CEE)no2568/91seainferiora70osuperiora100.
b) los residuos procedentes del tratamiento de grasas que contengan aceite
cuyo índice de yodo esté comprendido entre 70 y 100, pero en los que
la superficie del pico correspondiente al tiempo de retención del beta-
sitosterol(1), determinada con arreglo a lo dispuesto en el Anexo V del
Reglamento(CEE)no2568/91,presentamenosdel93%delasuperficie
totaldelospicosdelosesteroles.
4. Losmétodosquedeberánaplicarseparadeterminarlascaracterísticas delos
productosantesmencionadossonloscontempladosenlosAnexosdelRegla-
mento(CEE)no2568/91.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—88
(1) Delta-5, 23-estigmastadienol + clerosterol ►C2+ beta-sitosterol ◄+ sitostanol +
delta-5-avenasterol+delta-5,24-estigmastadienol.
▼B
ANEXO XV
1. CONTENIDOENACEITEDELOSORUJOSDEACEITUNA
1.1.Material
— aparato de extracción apropiado tipo ►C1soxhlet ◄, provisto de un
matrazde200a250ml,
— baño por calefacción eléctrica (baño de arena, baño de agua, etc.) o
placacalefactora,
— balanzaanalítica,— estufareguladaa80ºCcomomáximo,— estufadecalefaccióneléctricaprovistadeundispositivodetermorregu-
laciónreguladaa103ºC±2ºCyquepermitarealizarunainsuflación
deaireounapresiónreducida,
— trituradormecánicofácildelimpiaryquepermitaeltrituradodelorujo
sincalentamientoysindisminuciónsensibledesucontenidoenaguayenaceite,
— cartucho de extracción y algodón hidrófilo o papel filtro, exentos de
productosextraíblesporelhexano,
— desecador,— cribaconagujerosde1mmdediámetro,
— piedrapómezenpequeñosgranos,previamentesecada.
1.2.Reactivo
n-hexanotécnicocuyoresiduoenevaporacióncompletadeberáserinferior
a0,002gpara100ml.
2. MODODEOPERAR2.1.Preparacióndelamuestraparaensayo
Triturar la muestra para laboratorio, si fuera necesario, en el triturador
mecánico, previamente bienlimpio,parareducirlaapartículasquepuedan
atravesarcompletamentelacriba.
Utilizaraproximadamenteunavigésimapartedelamuestraparacompletar
la limpieza del triturador, tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo,
mezclarloconcuidadoyanalizarlosindemora.
2.2.Tomademuestra
Pesar inmediatamente después del triturado, alrededor de 10 g de la
muestraparaensayoconunaaproximaciónde0,01g.
2.3.Preparacióndelcartuchodeextracción
►
C1colocar la muestra en el cartucho y taparla con el tapón ◄de
algodón hidrófilo. En caso de haber utilizado papel de filtro, envolver la
muestramolidaendichopapel.
2.4.Presecado
Cuando el orujo esté muy húmedo (contenido en agua y en materias
volátiles superior al 10 %), efectuar un presecado colocando durante un
tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa
calentada a 80 ºC como máximo, para llevar el contenido en agua y en
materiasvolátilespordebajodel10%.
2.5.Preparacióndelmatraz
Pesar con aproximación de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de
piedrapómez,previamente secadoenlaestufaa103ºC±2ºCydespués
enfriadodurantealmenosunahoraeneldesecador.
2.6.Primeraextracción
Colocar en el aparato de extracción el cartucho (o el papel de filtro) que
contenga la muestra. Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano.
►C1Adaptar ◄elmatrazalaparatodeextracciónycolocarlotodosobre
la placa calefactora. Llevar la calefacción a tal estado que el caudal de
reflujo sea al menos de tres gotas por segundo (ebullición moderada, no
tumultuosa).1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—89
▼B
Despuésdecuatrohorasdeextracción,dejarenfriar.Quitarelcartuchodel
aparatodeextracciónycolocarloenunacorrientedeaireparaeliminar la
mayorpartedeldisolventequeloimpregna.
2.7.Segundaextracción
Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea
posible.Colocardenuevocuantitativamentelamezclaenelcartuchoyésta
enelaparatodeextracción.
Empezar de nuevo la extracción durante dos horas más, utilizando el
mismomatrazconteniendolaprimeraextracción.
Lasoluciónobtenida enelmatraz deextracción deberáserlímpida. Sino
fuere así, filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer
matraz yelpapel defiltroconhexano.Recoger elfiltrado yeldisolvente
en un segundo matraz previamente secado y tarado aproximadamente a
1mg.
2.8.Eliminacióndeldisolventeypesadadelextracto
Eliminarenelequipodeextracciónlamayorpartedeldisolvente.Eliminar
losúltimosrestosdeéstecalentandoelmatrazenlaestufaa103ºC±2ºC
durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminación, ya sea insuflando aire de
vezencuandoopreferiblementeungasinerte,oactuandobajounapresión
reducida.
Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora, y
pesarloconunaprecisiónde1mgaproximadamente.
Calentar denuevo10minutosenlasmismascondiciones, dejar enfriar en
eldesecadorypesar.
Ladiferenciaentrelosresultadosdeestasdospesadasdeberáserinferioro
igual a 10 mg, si no, calentar de nuevo durante períodos de diez minutos
seguidos de enfriamento y pesada, hasta que la diferencia de peso sea, a
losumo,de10mg.Seleccionarlaúltimapesadadelmatraz.
Efectuardosdeterminaciones.
3. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS3.1.Mododecálculoyfórmula
a) Elextractoexpresadoenpesodelproductotalcualseráiguala:
S=m
1×100
m0
donde: S eselporcentajeenpesodelextractodelproductotalcual,
m0eselpeso,engramos,delamuestra,
m1eselpeso,engramos,delextractoseco.
Tomar como resultado la media aritmética de las dos determinaciones,
silascondicionesderepetitividadsecumplen.
Expresarelresultadoconunsolodecimal.
b) El extracto se relacionará con la materia seca utilizando la siguiente
fórmula:
S×100
100−U=%grasasobreextractoseco
donde: S eselprocentajeenpesodeextractodelproductotalcualver
a),
U essucontenidoenaguayenmateriasvolátiles.
3.2.Repetitividad
La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones, efectuadas
simultáneamente o rápidamente la una a continuación de la otra mediante
elmismoanálisis,nodeberásersuperiora0,2gdeextractodehexanopor
cada100gdemuestra.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—90
▼B
Encasocontrario,repetirsobreotrasdostomasdemuestra.Siestavezla
diferenciaesdenuevosuperiora0,2gtomarcomoresultadolamediaarit-
méticadelascuatrodeterminacionesefectuadas.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—91
▼B
ANEXO XVI
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEYODO
1. OBJETO
La presente norma internacional especifica un método para la determina-
cióndelíndicedeyododelasgrasasyaceitesanimalesyvegetales,enlo
sucesivodenominadosgrasas.
2. DEFINICIÓN
A los fines de la presente norma internacional, se aplicará la definición
siguiente:
2.1.Índice de yodo: el peso de yodo absorbido por la muestra en las condi-
cionesdetrabajoqueseespecificanenlapresentenormainternacional.
Elíndicedeyodoseexpresaengramosdeyodopor100grdemuestra.
3. PRINCIPIO
DisolucióndelamuestraproblemayadicióndereactivodeWijs.Unavez
transcurrido el tiempo que se especifica, adición de solución acuosa de
yoduro potásico y valoración del yodo liberado con solución de tiosulfato
sódico.
4. REACTIVOS
Todoslosreactivosserándecalidadanalíticareconocida.
4.1. Yoduropotásico,soluciónde100g/l,exentodeyodatosodeyodolibre.
4.2. Engrudodealmidón.
Mezclar 5 g de almidón soluble con 30 ml de agua, añadir esta mezcla a
1000mldeaguaenebullición,hervirdurante3minutosydejarenfriar.
4.3. Soluciónvolumétricapatróndetiosulfatosódico.
c(Na2S2O3.5H2O)=0,1mol/l, valorada comomáximo 7díasantes desu
uso.
4.4. Disolvente, preparado mezclando volúmenes iguales de ciclohexano y
ácidoacético.
4.5. ReactivodeWijs,quecontengamonoclorurodeyodoenácidoacético.Se
utilizaráreactivodeWijscomercializado.
Nota:Elreactivocontiene9gdeICl3+9gdeIenácidoacético.
5. MATERIAL
Materialordinariodelaboratorioy,enparticular,losiguiente:
5.1. Navecillas de vidrio, apropiadas para la muestra problema y que puedan
introducirseenlosmatraces(5.2).
5.2. Matraces erlenmeyer de 500 ml de capacidad con boca esmerilada,
provistosdesuscorrespondientestaponesdevidrioyperfectamentesecos.
6. PREPARACIÓNDELAMUESTRA ►C1PROBLEMA ◄.
►C1La muestra homogeneizada, se seca sobre sulfato sódico y se
filtra◄.
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Tamañodelamuestra
Elpesodelamuestravaríaenfuncióndelíndicedeyodoprevisto,comose
indicaenelcuadro1.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—92
▼B
Cuadro 1
Índicedeyodoprevisto Pesodelamuestraproblema
menosde5 3,00g
5—20 1,00g
21—50 0,40g
51—100 0,20g
101—150 0,13g
151—200 0,10g
Pesar la muestra problema con precisión de 0,1 mg en una
►C1navecilla ◄devidrio5.1.
7.2. Determinación
Introducirlamuestraproblemaenunmatrazde500ml(5.2).Añadir20ml
deldisolvente(4.4)paradisolverlagrasa.Agregarexactamente 25mldel
reactivo de Wijs (4.5), tapar el matraz, agitar el contenido y colocar el
matraz al abrigo de la luz. No deberá utilizarse la boca para pipetear el
reactivodeWijs.
Preparardelmismomodounensayoenblancoconeldisolventeyelreac-
tivo,perosinlamuestraproblema.
Para las muestras con un índice de yodo inferior a 150, mantener los
matraces en la oscuridad durante 1 hora; para las muestras con un índice
deyodosuperiora150,asícomoenelcasodeproductospolimerizadoso
considerablementeoxidados,mantenerenlaoscuridaddurante2horas.
Unaveztranscurridoeltiempocorrespondiente,agregaracadaunodelos
matraces20mldesolucióndeyoduropotásico(4.1)y150mldeagua.
Valorarconladisoluciondetiosulfatosódico(4.3)hastaquehayadesapa-
recidocasitotalmenteelcoloramarilloproducidoporelyodo.Añadirunas
gotas de engrudo de almidón (4.2) y continuar la valoración hasta el
momentoprecisoenquedesaparezcaelcolorazuldespuésdeunaagitación
muyintensa.
Nota:Sepermiteladeterminaciónpotenciométricadelpuntofinal.
7.3. Númerodedeterminaciones
Efectuar2determinacionesdelamuestraproblema.
8. EXPRESIÓNDELOSRESULTADOS
Elíndicedeyodoseexpresadelsiguientemodo:
12;69c V1/C0V2 ðÞ
p
siendo:
c: valor numérico de la concentración exacta, expresada en moles por
litro, de la solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico (4.3)
utilizada;
V1: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
detiosulfatosódico(4.3)utilizadaparaelensayoenblanco;
V2: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
detiosulfatosódico(4.3)utilizadaparaladeterminación;
p: valor numérico del peso, expresado en gramos, de la muestra
problema(7.1).
Setomará como resultadolamedia aritmética delasdosdeterminaciones,
siempre que se cumpla el requisito establecido con respecto a la repetibi-
lidad.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—93
▼M11
ANEXO XVII
MÉTODOPARALADETERMINACIÓNDEESTIGMASTADIENOSEN
LOSACEITESVEGETALES
1. OBJETIVOS
Determinacióndeestigmastadienosenlosaceitesvegetalesquepresentan
bajas concentraciones de dichos hidrocarburos, particularmente en el
aceitedeolivavirgenyenelaceitedeorujodeolivasinrefinar.
2. APLICACIÓN
Se trata de una norma aplicable a cualquier aceite de origen vegetal,
teniendo encuentaqueúnicamente seobtendránmedidasfiables cuando
el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de
0,01a4,0mg/kg.Elmétodoresultaespecialmenteadecuadoparadetectar
la presencia de aceites vegetales refinados (aceites de oliva, orujo de
oliva, girasol, palma, etc.) en el aceite de oliva virgen, dado que los
aceitesrefinadoscontienenestigmastadienosylosaceitesvírgenesno.
3. FUNDAMENTO
Aislamiento de la materia insaponificable. Separación de la fracción de
hidrocarburos esteroideos mediante cromatografia en columna de gel de
síliceyanálisismediantecromatografíadegasesencolumnacapilar.
4. INSTRUMENTAL
4.1. Matracesde250mlaptosparacolocarlesunrefrigerantedereflujo.4.2. Embudosdedecantaciónconcapacidadpara500ml.4.3. Matracesdefondoredondode100ml.4.4. Rotavapor.4.5. Columna de vidrio para cromatografía (1,5-2,0 cm de diámetro interno
por50cmdelongitud)provistadeunallavedeteflónyconunatorunda
de lana de vidrio o un disco de vidrio unterizado en el fondo. Para
preparar la columna de gel de sílice se vierte hexano en la columna de
cromatografía hasta que alcance una altura de aproximadamente 5 cm,
llenándose a continuación con una papilla de gel de sílice en hexano
(15 g en 40 ml) mediante la ayuda de varias porciones de hexano. Se
deja sedimentar la mezcla en reposo, completándose la sedimentación
aplicando una ligera vibración. Añadir sulfato sódico anhidro hasta una
altura de aproximadamente 0,5 cm y finalmente eluir el exceso de
hexano.
4.6. Cromatógrafo de gases equipado con detector de ionización de llama,
inyectorcondivisióndeflujou«coldon-column»yhornoprogramable
conprecisiónde±1ºC.
4.7. Columna capilar de sílice fundida (0,25 o 0,32 mm de diámetro
interno × 25 mde longitud), recubierta con una película de 0,25 µmde
espesordelafase5%-fenilmetilsilicona.
Nota 1.
Puedenutilizarseotrascolumnasconpolaridadessimilaresoinferiores.
4.8. Integrador-registrador con capacidad para modo de integración valle-
valle.
4.9. Microjeringade5-10 µlparacromatografíadegasesconagujafija.
4.10. Calentadordetipomantaoplacaeléctrica.
5. REACTIVOS
Salvo indicación en sentido contrario, únicamente se utilizarán reactivos
de calidad para análisis. Debe emplearse agua destilada o de pureza al
menosequivalente.
5.1. Hexano o una mezcla de alcanos con un intervalo de ebullición de 65-
70ºC,destiladosencolumnarectificadora.
Nota 2.
Eldisolventedebedestilarseparaeliminarimpurezas.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—94
▼M11
5.2. Etanolde96v/v.
5.3. Sulfatosódicoanhidro.5.4. Soluciónalcohólicadehidróxidopotásicoal10%.Añadir10mldeagua
a 50 g de hidróxido potásico, agitar y diluir seguidamente la mezcla en
etanolhastaunvolumende500ml.
Nota 3.
La potasa alcohólica toma color marrón con el tiempo. Debe prepararse
diariamenteysealmacenaráenbotellasdevidriooscurocerradashermé-
ticamente.
5.5. Geldesílice60paracolumnadecromatografia, de70-230mallas(refe-
rencia7734deMerckosimilar).
Nota 4.
Porlo general, el gel de sílice puede utilizarse directamente a partir del
envasesinnecesidaddetratamiento.Sinembargo,algunoslotesdesílice
pueden presentar baja actividad produciendo separaciones cromatográ-
ficasinadecuadas.Cuandoelloocurradebetratarseelgeldesílicedela
siguientemanera:activarelgelcalentándoloa550ºCduranteunmínimo
decuatrohoras.Traselcalentamiento ponerelgeldesíliceaenfriaren
undesecadorytrasvasarloacontinuaciónaunmatrazconcierrehermé-
tico.Seañadeseguidamenteun2%deaguaagitandohastaquedejende
versegrumosyelpolvofluyalibremente.
Sialgúnlotedegeldesíliceoriginacromatogramasconpicosqueinter-
fieran,dichogelserásometidoaltratamientoanteriormentemencionado.
Puede considerarse como alternativa la utilización de gel de sílice 60
extrapuro(referencia7754deMerck).
5.6. Soluciónmadre(200ppm)decolesta-3,5-dieno(Sigma,99%depureza)
enhexano(10mgen50ml).
5.7. Soluciónpatróndecolesta-3,5-dienoenhexanoconunaconcentraciónde
20ppm,queseobtienediluyendolasoluciónanterior.
Nota 5.
Sisemantienelatemperaturapordebajode4ºC,lassoluciones5.6y5.7
permaneceráninalteradasduranteunmínimode4meses.
5.8. Solución den-nonacosanoen hexanocon unaconcentración aproximada
de100ppm.
5.9. Gas portador para cromatografia: helio o hidrógeno de 99,9990 % de
pureza.
5.10. Gasesauxiliaresparaeldetectordeionizacióndellama:airepurificadoe
hidrógenode99,9990%depureza.
6. METODOLOGÍA
6.1.Preparacióndelamateriainsaponificable:
6.1.1. Pesar20±0,1gdeaceiteenunmatrazde250ml(4.1),añadir1mlde
soluciónpatróndecolesta-3,5-dieno(20 µg)y75mldepotasaalcohólica
al 10 %, colocar un refrigerante de reflujo y calentar a ebullición suave
durante30minutos.Retirardelafuentedecalorelmatrazconlamuestra
ydejarenfriarligeramente lasolución(elenfriamiento nodebesertotal
paraevitarladecantacióndelamuestra).Añadir100mldeaguaypasar
la solución a un embudo de decantación (4.2) con ayuda de 100 ml de
hexano.Agitarenérgicamentedurante30segundosydejardecantar.
Nota 6.
Siseproduceemulsión,quenodesaparecerápidamente,añadirpequeñas
cantidadesdeetanol.
6.1.2. Pasar la fase acuosa inferior a un segundo embudo de decantación y
someterla nuevamente a extracción con 100 ml de hexano. Separar
nuevamentelafaseinferiorylavarlosextractosdehexano(mezclándolos
en otro embudo de decantación) con tres porciones de 100 ml cada una
deunamezcladeaguayetanol(1:1)hastaobtenerunpHneutro.
6.1.3. Pasar la solución de hexano a través de sulfato sódico anhidro (50 g),
lavarcon20mldehexanoyevaporara30ºCypresiónreducidaenun
rotavaporhastasequedad.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—95
▼M11
6.2.Separacióndelafraccióndehidrocarburosesteroideos:
6.2.1. Introducirelresiduoenlacolumnadefraccionamientoconayudadedos
porcionesde1mldehexano,distribuirlamuestraenlacolumnadejando
que el nivel de solución descienda hasta la parte superior del sulfato de
sodioycomenzarlaelucióncromatográfica conhexanoaunflujoapro-
ximadode1ml/min.Desecharlosprimeros25-30mldeeluidoyrecoger
lafracción siguiente de40ml.Después,pasar estafracción aunmatraz
defondoredondode100ml(4.3).
Nota 7.
Laprimerafraccióncontieneloshidrocarburossaturados(cf.Figura1a)y
lasegundafracciónlosesteroideos.Alproseguirconlaeluciónseobtiene
escualenoyotroscompuestosrelacionados.Parapoderobtenerunabuena
separación entre los hidrocarburos saturados y los esteroideos, es nece-
sario optimizar los volúmenes de las fracciones. A tal efecto se debe
ajustar el volumen de la primera fracción de tal manera que cuando se
analice la segunda, los picos correspondientes a los hidrocarburos satu-
rados sean bajos (cf. Figura 1c); cuando estos no aparezcan pero la
intensidad del pico correspondiente al patrón sea reducida, debe dismi-
nuirse el volumen. De todas formas, puesto que no se produce
solapamiento de los picos durante la cromatografía de gases, no es
precisa una separación completa entre los componentes de la primera y
segundafraccionessiemprequelascondicionesdelaCGesténajustadas
como se indica en 6.3.1. Por lo general no es necesario optimizar el
volumendelasegundafracción,puestoqueexisteunabuenaseparación
con los componentes que eluyen posteriormente. Sin embargo, la
presenciadeunpicoimportantea1,5min,aproximadamente,pordebajo
deltiempoderetencióndelpatrónsedebealescualenoyrevelaunamala
separación.
6.2.2. Evaporar la segunda fracción en rotavapor a 30 ºC y presión reducida
hastasequedad.Disolverinmediatamente elresiduoen0,2mldehexano
ymantenerlasoluciónenelrefrigeradorhastaelmomentodesuanálisis.
Nota 8.
Los residuos 6.1.3 y 6.2.2 no deben mantenerse en seco a temperatura
ambiente.Unavezobtenidos,esnecesarioañadirlesdisolventeyalmace-
narlosenunrefrigerador.
6.3.Cromatografíadegases
6.3.1. Condicionesdetrabajoparainyeccióncondivisióndeflujo.
— temperaturadelinyector:300ºC,
— temperaturadeldetector:320ºC.
— integrador-registrador:losparámetrosdeintegracióndebenserfijados
detalformaquelaevaluacióndelasáreasseacorrecta.Lamodalidad
deintegraciónvalle-valleeslamásrecomendable,
— sensibilidad:aproximadamente16veceslaatenuaciónmínima,
— cantidaddedisolucióninyectada:1 µl,
— programación de la temperatura del horno: temperatura inicial cons-
tante de 235 ºC durante 6 minutos, seguida de un aumento gradual
de2ºC/minhastaalcanzar285ºC,
— inyecciónconunadivisióndeflujode1:15,
— gasportador:helioohidrógenoa120kPadepresión.
Dichas condiciones pueden modificarse en función de las características
del cromatógrafo yde la columna con objeto de obtener cromatogramas
querespondanalossiguientesrequisitos:Picodelpatróninternosituado
conunaaproximaciónde5minutosentornoaltiempocitadoen6.3.2;el
pico del patrón interno alcanzará, como mínimo, un 80 % de la escala
total.
Elsistemadecromatografíadegasesdeberácomprobarseinyectandouna
mezcla de la solución madre de colestadieno (5.6) y de n-nonacosano(5.8). El pico del colesta-3,5-dieno deberá aparecer antes que el del n-
nonacosano (véase figura 1c); si esto no ocurre, pueden adoptarse dos
soluciones:reducirlatemperaturainicialdelhornoosustituirlacolumna
decromatografíadegasesporotradepolaridadinferior.
6.3.2. Identificacióndepicos
Elpicodelpatróninternoapareceauntiempoderetenciónde,aproxima-
damente, 19 minutos, y el del estigmasta-3,5-dieno lo hace a un tiempo
de retención relativo de aproximadamente 1,29 (véase figura 1b). El
estigmasta-3,5-dieno suele ir acompañado de pequeñas cantidades de un
isómero y, por lo general, ambos originan un solo pico cromatográfico.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—96
▼M11
Noobstante,silacolumnaesdemasiadopolar,otieneungranpoderde
resolución,elisómeropuedeaparecerenformadeunpequeñopicojusto
antesycercadelestigmasta-3,5-dieno(véasefigura2).Enestoscasos,es
preciso sumarlasáreas delosdospicos. Conel finde estar seguroque
losestigmastadienoseluyencomounsolopicoserecomiendainstituirla
columnaporotrademenorpolaridadodemayordiámetrointerior.
Nota 9.
Para obtener una referencia de los estigmastadienos puede utilizarse el
análisis de cualquier aceite vegetal refinado empleando menor cantidad
demuestra(de1a2g).Losestigmastadienosdanlugaraunpicoimpor-
tantedefácilidentificación.
6.3.3. Análisiscuantitativo
Elcontenidodelosestigmastadienossedeterminaaplicandolafórmula
mg=kgdeestigmastadienos ¼As/C2Mc
Ac/C2Mo
enlacual: Ab= área del pico de estigmastadienos (si el pico se
halla dividido en dospicos, súmeseel área de los
dospicos.).
Ac= áreadelpicodelpatróninterno(colestadieno).
Mc= pesodepatrónañadido,enmicrogramos.
Mo= pesodeaceiteempleado,engramos.
Límitededetección:aproximadamente0,01mg/kg.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—97
▼M11
Figura1
Cromatogramasprocedentesdelanálisisdemuestrasdeaceitedeolivaen
columnacapilardesílicefundida(0,25mmdediámetrointerno×25m)
recubierta con una película de 0,25 µmde grosor de 5 %-fenilm etilsili-
cona.
a) Primerafracción(30ml)deunaceitevirgenmarcadoconelpatrón.
b) Segundafracción(40ml)deunaceitedeolivaquecontiene0,10mg/
kgdeestigmastadienos.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—98
▼M11
c) Segunda fracción (40 ml) que incluye una pequeña proporción de la
primera.
Figura2
Cromatograma procedente delanálisisdeunamuestra deaceite deoliva
refinadoenunacolumnaDB-5,enelqueseapreciaelisómerodelestig-
masta-3,5-dieno.1991R2568—ES—28.05.1995—012.001—99