1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 1
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►B DECISIÓN DE LA COMISIÓN
de 15 de julio de 1994
relativa a las condiciones sanitarias y a la certificación veterinaria para la importación de esperma
de animales de la especie bovina procedente de terceros países
(94/577/CE)
(DO L 221 de 26.8.1994, p. 26)
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Diario Oficial
nopágina fecha
►M1Decisión 1999/495/CE de la Comisión de 1 de julio de 1999 L 192 56 24.7.1999
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DECISIÓN DE LA COMISIÓN
de 15 de julio de 1994
relativa a las condiciones sanitarias y a la certificación veterinaria
para la importación de esperma de animales de la especie bovina
procedente de terceros países
(94/577/CE)
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea,
Vista la Directiva 88/407/CEE del Consejo, de 14 de junio de 1988, por
la que se fijan las exigencias de policía sanitaria aplicables a losintercambios intracomunitarios y a las importaciones de esperma deanimales de la especie bovina (
1), cuya última modificación la consti-
tuye la Directiva 93/60/CEE (2), y, en particular, sus artículos 10 y 11,
Considerando que la Decisión 90/14/CEE de la Comisión (3), cuya
última modificación la constituye la Decisión 91/276/CEE (4), establece
la lista de terceros países de los que los Estados miembros autorizan laimportación de esperma de animales de la especie bovina, en adelante,lista de terceros países;
Considerando que, dada la situación sanitaria de Israel, se han tenido
que prohibir, por la Decisión 91/277/CEE de la Comisión (
5) las impor-
taciones procedentes de este país;
Considerando que las Decisiones 91/479/CEE (6), 91/549/CEE (7), 92/
123/CEE (8), 92/124/CEE (9), 92/125/CEE (10), 92/126/CEE (11), 92/
127/CEE (12), 92/128/CEE (13), 92/386/CEE (14), 92/387/CEE (15)y 92/
445/CEE (16)de la Comisión establecen las condiciones sanitarias y la
certificación veterinaria para la importación de esperma de animales dela especie bovina procedente de los Estados Unidos de América,Canadá, Polonia, Finlandia, Nueva Zelanda, Austria, Suiza, Suecia,Hungría, Noruega y Checoslovaquia, respectivamente;
Considerando que la Directiva 93/60/CEE del Consejo, que tiene que
aplicarse en los Estados miembros antes del 1 de julio de 1994, modi-fica la Directiva 88/407/CEE, por lo que es necesario modificar lasDecisiones relativas a los terceros países arriba mencionados; que, parasimplificar y precisar la normativa comunitaria aplicable en este sector,es necesario agrupar las Decisiones antes mencionadas y derogar lasque se refieran a los países individualmente;
Considerando que, dadas las disposiciones del Acuerdo sobre el Espacio
Económico Europeo, no es necesario mantener los certificados veterina-rios para las importaciones de esperma de ganado bovino procedente deAustria, Finlandia, Noruega y Suecia;
Considerando que, de conformidad con el dictamen del Comité cientí-
fico veterinario, es necesario introducir una prueba suplementaria parala detección de la enfermedad enzoótica hemorrágica;
(1)D OnoL 194 de 22. 7. 1988, p. 10.
(2)D OnoL 186 de 28. 7. 1993, p. 28.
(3)D OnoL 8 de 11. 1. 1990, p. 71.
(4)D OnoL 135 de 30. 5. 1991, p. 58.
(5)D OnoL 135 de 30. 5. 1991, p. 60.
(6)D OnoL 258 de 16. 9. 1991, p. 1.
(7)D OnoL 298 de 29. 10. 1991, p. 6.
(8)D OnoL 48 de 22. 2. 1992, p. 1.
(9)D OnoL 48 de 22. 2. 1992, p. 10.
(10)D OnoL 48 de 22. 2. 1992, p. 19.
(11)D OnoL 48 de 22. 2. 1992, p. 28.
(12)D OnoL 48 de 22. 2. 1992, p. 37.
(13)D OnoL 48 de 22. 2. 1992, p. 46.
(14)D OnoL 204 de 21. 7. 1992, p. 13.
(15)D OnoL 204 de 21. 7. 1992, p. 22.
(16)D OnoL 247 de 27. 8. 1992, p. 1.
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Considerando que únicamente en el caso de Canadáse efectuá n antes de
la recolección del esperma pruebas de rutina para la detección de esaenfermedad a intervalos de seis meses; que, por consiguiente, es nece-sario establecer un período transitorio para la aplicación de la presenteDecisión con respecto a Canadáa fin de que las autoridades zoosanita-rias canadienses dispongan de tiempo suficiente para introducir la nuevaprueba en su programa de rutina;
Considerando, además, que a raíz de los avances que se han producido
recientemente en el conocimiento de la epidemiología de la fiebrecatarral, en la actualidad puede permitirse la importación de esperma deanimales de la especie bovina procedente de Australia;
Considerando que la situación zoosanitaria en los terceros países que
figuran en la lista de terceros países es buena y es controlada porservicios veterinarios organizados y bien estructurados en lo querespecta a las enfermedades transmisibles por el esperma;
Considerando que las autoridades zoosanitarias competentes de los
terceros países que figuran en la lista de terceros países se han compro-metido a confirmar a la Comisión y a los Estados miembros por télex otelefax y en el plazo de 24 horas, la aparición de cualesquiera de lasenfermedades que figuran en la lista A de la Oficina Internacional deEpizootias (OIE), así como de cualquier modificación que se produzcaen la política de vacunaciones en relación con alguna de ellas o, en unplazo de tiempo adecuado, de la aparición de alguna de las enferme-dades que figuran en la lista B de la OIE, así como cualquier propuestade modificación de las normas de importación aplicables a los animalesdomésticos o al esperma y los embriones de éstos;
Considerando que las autoridades zoosanitarias competentes de los
terceros países que figuran en la lista de terceros países se han compro-metido a supervisar oficialmente la expedición de certificados en aplica-ción de la presente Decisión, y a garantizar que todos los certificados,excepciones y resultados de laboratorio en los que se hayan podidobasar estos certificados se conserven en un archivo oficial durante 12meses, como mínimo, después del envío del esperma al que se refieran;
Considerando que las autoridades zoosanitarias competentes de los
terceros países que figuran en la lista de terceros países se han compro-metido a autorizar oficialmente centros de recolección de esperma parala exportación de esperma bovino a la Comunidad, de conformidad conel artículo 9 de la Directiva 88/407/CEE;
Considerando que las condiciones sanitarias y la certificación veteri-
naria deben adaptarse a la situación zoosanitaria del tercer país de quese trate;
Considerando que las medidas previstas en la presente Decisión se
ajustan al dictamen del Comité veterinario permanente,
HA ADOPTADO LA PRESENTE DECISIÓN:
Artículo 1
Los Estados miembros autorizarán la importación de esperma de
animales de la especie bovina que cumpla las condiciones indicadas enlos certificados contenidos en la primera parte de los Anexos A, B, C yD y que procedan únicamente de los terceros países que figuran en lasegunda parte de dichos Anexos.
No obstante, los Estados miembros autorizarán, hasta el 31 de
diciembre de 1994, las importaciones procedentes de Canadádeesperma de animales de la especie bovina recolectado y transformadode conformidad con la Decisión 91/549/CEE.
Artículo 2
Quedan derogadas la Decisiones 91/479/CEE, 92/123/CEE, 92/
124/CEE, 92/125/CEE, 92/126/CEE, 92/127/CEE, 92/128/CEE, 92/386/CEE, 92/387/CEE y 92/445/CEE.
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Queda derogada, con efectos a partir del 1 de enero de 1995, laDecisión 91/549/CEE.
Artículo 3
Las disposiciones del párrafo primero del artículo 1 serán aplicables con
respecto a Canadáa partir del 1 de enero de 1995.
Artículo 4
Los destinatarios de la presente Decisión serán los Estados miembros.
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ANEXO A
PRIMERA PARTE
CERTIFICADO ZOOSANITARIO
para la importación de esperma de animales de la especie bovina

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▼B
13. El veterinario oficial abajo firmante conoce las disposiciones de la Directiva 88/407/CEE del Consej o
modificada y certifica que:
a) ............................................................................................ ha estado libre de peste bovin a
(nombre del país exportador)
y fiebre aftosa durante los doce meses inmediatamente anteriores a la recolección del esperma destinado a
la exportación y hasta la fecha del envío de éste y que no se ha llevado a cabo ninguna vacunación contr a
estas enfermedades durante ese mismo período;
b) el centro de recolección de esperma en el que se recogió el esperma destinado a la exportación:
i) ha sido autorizado con arreglo a las condiciones establecidas en el capítulo I del Anexo A de l a
Directiva 88/407/CEE;
ii) ha sido administrado y supervisado con arreglo a las condiciones establecidas en el capítulo II de l
Anexo A de la Directiva 88/407/CEE;
iii) ha estado libre de rabia, tuberculosis, brucelosis, ántrax y perineumonía contagiosa bovina desde 3 0
días antes de la fecha de recolección del esperma hasta 30 días después de haberse efectuado ésta (en e l
caso de esperma fresco, hasta el día del envío);
c) los animales de la especie bovina presentes en el centro de recolección de esperma:
i) proceden de rebaños o han nacido de hembras que cumplen las condiciones establecidas en el capítulo I
del Anexo B de la Directiva 88/407/CEE;
ii) han sido sometidos, antes de su aislamiento, a las pruebas exigidas en el capítulo I del Anexo B de l a
Directiva 88/407/CEE;
iii) han cumplido, antes del período de aislamiento, los requisitos que se establecen en el capítulo I de l
Anexo B de la Directiva 88/407/CEE y han sido sometidos a las pruebas que se indican en él;
iv) en caso de haber permanecido en dicho centro durante al menos un año, han sido sometidos a la s
pruebas de rutina con arreglo a lo dispuesto en el capítulo II del Anexo B de la Directiva 88/407/ CEE;
d) el esperma destinado a la exportación:
i) procede de donantes que han permanecido en
.............................................................................................................................
(nombre del país exportador)
durante los seis meses inmediatamente anteriores a la recogida del esperma destinado a la exportació n
y cumplen las condiciones establecidas en el Anexo C de la Directiva 88/407/CEE;
ii) procede de donantes que:
— han permanecido en un centro de recolección de esperma en el que, en los 12 meses anteriores a l a
recogida del esperma destinado a la exportación, todos los animales de la especie bovina han sid o
sometidos, con resultados negativos, a una prueba de seroneutralización o una prueba ELISA par a
la detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina y la vulvovaginitis pustulosa infecciosa (1),
o
— han sido sometidos, con resultados negativos, a una prueba de seroneutralización o a una prueb a
ELISA para la detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina y la vulvovaginitis pustulos a
infecciosa efectuada en los 12 meses anteriores a la recogida del esperma destinado a la expor -
tación (1),
o
— son seropositivos tras haber sido vacunados de conformidad con lo dispuesto en el capítulo II de l
Anexo B de la Directiva 88/407/CEE y haber sido sometidos, con resultados negativos, a un a
prueba de seroneutralización o a una prueba ELISA efectuada en el centro de recolección d e
esperma autorizado antes de la vacunación (1);
(1) Táchese lo que no proceda.
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▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) ha sido transformado, almacenado y transportado en condiciones que se ajustan a lo dispuesto en l a
Directiva 88/407/CEE.
En ................................................................,
(lugar)a .................................................................
(fecha)
/SS74(Sello) (2)Firma (2): .............................................................................
Nombre y apellidos en letras mayúsculas: . .....................................
Cargo oficial: . .......................................................................
►(2)◄
(2) La firma y el sello deberán estamparse en un color que no sea el del texto impreso.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 8
▼B
SEGUNDA PARTE
Lista de países autorizados para utilizar el modelo de certificado zoosani-
tario de la primera parte del Anexo A
REPÚBLICA CHECAHUNGRÍANUEVA ZELANDAPOLONIARUMANÍASUIZAREPÚBLICA ESLOVACA
1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 9
▼B
ANEXO B
PRIMERA PARTE
CERTIFICADO ZOOSANITARIO
para la importación de los Estados Unidos de América de esperma de animales de la especie bovina

1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 10
▼B
13. El veterinario oficial abajo firmante conoce las disposiciones de la Directiva 88/407/CEE modificada y
certifica que:
a) ............................................................................................ ha estado libre de peste bovin a
(nombre del país exportador)
y fiebre aftosa durante los doce meses inmediatamente anteriores a la recolección del esperma destinado a
la exportación y hasta la fecha del envío de éste y que no se ha llevado a cabo ninguna vacunación contr a
estas enfermedades durante ese mismo período;
b) el centro de recolección de esperma en el que se recogió el esperma destinado a la exportación:
i) ha sido autorizado con arreglo a las condiciones establecidas en el capítulo I del Anexo A de l a
Directiva 88/407/CEE;
ii) ha sido administrado y supervisado con arreglo a las condiciones establecidas en el capítulo II de l
Anexo A de la Directiva 88/407/CEE;
iii) ha estado libre de rabia, tuberculosis, brucelosis, ántrax y perineumonía contagiosa bovina desde 3 0
días antes de la fecha de recolección del esperma hasta 30 días después de haberse efectuado ésta (en e l
caso de esperma fresco, hasta el día del envío);
c) los animales de la especie bovina presentes en el centro de recolección de esperma:
i) proceden de rebaños o han nacido de hembras que cumplen las condiciones establecidas en el capítulo I
del Anexo B de la Directiva 88/407/CEE;
ii) han sido sometidos, antes de su aislamiento, a las pruebas exigidas en el capítulo I del Anexo B de l a
Directiva 88/407/CEE;
iii) han cumplido, antes del período de aislamiento, los requisitos que se establecen en el capítulo I de l
Anexo B de la Directiva 88/407/CEE y han sido sometidos a las pruebas que se indican en él;
iv) en caso de haber permanecido en dicho centro durante al menos un año, han sido sometidos a la s
pruebas de rutina con arreglo a lo dispuesto en el capítulo II del Anexo B de la Directiva 88/407/ CEE;
d) el esperma destinado a la exportación:
i) procede de donantes que han permanecido en
.............................................................................................................................
(nombre del país exportador)
durante los seis meses inmediatamente anteriores a la recogida del esperma destinado a la exportació n
y cumplen las condiciones establecidas en el Anexo C de la Directiva 88/407/CEE;
ii) procede de donantes que:
— han permanecido en un centro de recolección de esperma en el que, en los 12 meses anteriores a l a
recogida del esperma destinado a la exportación, todos los animales de la especie bovina han sid o
sometidos, con resultados negativos, a una prueba de seroneutralización o una prueba ELISA par a
la detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina y la vulvovaginitis pustulosa infecciosa (1),
o
— han sido sometidos, con resultados negativos, a una prueba de seroneutralización o a una prueb a
ELISA para la detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina y la vulvovaginitis pustulos a
infecciosa efectuada en los doce meses anteriores a la recogida del esperma destinado a l a
exportación (1),
o
— son seropositivos tras haber sido vacunados de conformidad con 1o dispuesto en el capítulo II de l
Anexo B de la Directiva 88/407/CEE y haber sido sometidos, con resultados negativos, a un a
prueba de seroneutralización o a una prueba ELISA efectuada en el centro de recolección d e
esperma autorizado antes de la vacunación (1);
(1) Táchese lo que no proceda.
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▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) ha sido transformado, almacenado y transportado en condiciones que se ajustan a lo dispuesto en l a
Directiva 88/407/CEE;
iv) procede de donantes machos que han sido sometidos con resultados negativos, en dos ocasiones y co n
un intervalo máximo de 12 meses, a las pruebas siguientes realizadas en un laboratorio autorizado ante s
y después de la recolección del esperma (la prueba que se realice después de la recolección deb e
llevarse a cabo con una muestra de sangre que haya sido tomada como mínimo 21 días después d e
recolectado el esperma destinado a la exportación):
— prueba de bloqueo ELISA para la detección de la fiebre catarral realizada de acuerdo con el Anex o
E;
— prueba de inmunodifusión en agar realizada con arreglo al Anexo E y prueba de neutralización de l
virus para la detección de todos los serotipos de la enfermedad enzoótica hemorrágica que existe n
en el país exportador.
En ................................................................,
(lugar)a .................................................................
(fecha)
/SS74(Sello) (2)Firma (2): .............................................................................
Nombre y apellidos en letras mayúsculas: . .....................................
Cargo oficial: . .......................................................................
►(3)◄
(2) La firma y el sello deberán estamparse en un color que no sea el del texto impreso.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 12
▼B
SEGUNDA PARTE
Lista de países autorizados para utilizar el modelo de certificado zoosani-
tario de la primera parte del Anexo B
ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA
1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 13
▼B
ANEXO C
PRIMERA PARTE
CERTIFICADO ZOOSANITARIO
para la importación de esperma de animales de la especie bovina

1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 14
▼B
13. El veterinario oficial abajo firmante conoce las disposiciones de la Directiva 88/407/CEE modificada y
certifica que:
a) ............................................................................................ ha estado libre de peste bovin a
(nombre del país exportador)
y fiebre aftosa durante los doce meses inmediatamente anteriores a la recolección del esperma destinado a
la exportación y hasta la fecha del envío de éste y que no se ha llevado a cabo ninguna vacunación contr a
estas enfermedades durante ese mismo período;
b) el centro de recolección de esperma en el que se recogió el esperma destinado a la exportación:
i) ha sido autorizado con arreglo a las condiciones establecidas en el capítulo I del Anexo A de l a
Directiva 88/407/CEE;
ii) ha sido administrado y supervisado con arreglo a las condiciones establecidas en el capítulo II de l
Anexo A de la Directiva 88/407/CEE;
iii) ha estado libre de rabia, tuberculosis, brucelosis, ántrax y perineumonía contagiosa bovina desde 3 0
días antes de la fecha de recolección del esperma hasta 30 días después de haberse efectuado ésta (en e l
caso de esperma fresco, hasta el día del envío);
c) los animales de la especie bovina presentes en el centro de recolección de esperma:
i) proceden de rebaños o han nacido de hembras que cumplen las condiciones establecidas en el capítulo I
del Anexo B de la Directiva 88/407/CEE;
ii) han sido sometidos, antes de su aislamiento, a las pruebas exigidas en el capítulo I del Anexo B de l a
Directiva 88/407/CEE;
iii) han cumplido, antes del período de aislamiento, los requisitos que se establecen en el capítulo I de l
Anexo B de la Directiva 88/407/CEE y han sido sometidos a las pruebas que se indican en él;
iv) en caso de haber permanecido en dicho centro durante al menos un año, han sido sometidos a la s
pruebas de rutina con arreglo a lo dispuesto en el capítulo II del Anexo B de la Directiva 88/407/ CEE;
d) el esperma destinado a la exportación:
i) procede de donantes que han permanecido en
.............................................................................................................................
(nombre del país exportador)
durante los seis meses inmediatamente anteriores a la recogida del esperma destinado a la exportació n
y cumplen las condiciones establecidas en el Anexo C de la Directiva 88/407/CEE;
ii) procede de donantes que:
— han permanecido en un centro de recolección de esperma en el que, en los doce meses anteriores a
la recogida del esperma destinado a la exportación, todos los animales de la especie bovina han sid o
sometidos, con resultados negativos, a una prueba de seroneutralización o una prueba ELISA par a
la detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina y la vulvovaginitis pustulosa infecciosa (1),
o
— han sido sometidos, con resultados negativos, a una prueba de seroneutralización o a una prueb a
ELISA para la detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina y la vulvovaginitis pustulos a
infecciosa efectuada en los doce meses anteriores a la recogida del esperma destinado a l a
exportación (1),
— son seropositivos tras haber sido vacunados de conformidad con lo dispuesto en el capítulo II de l
Anexo B de la Directiva 88/407/CEE y haber sido sometidos, con resultados negativos, a un a
prueba de seroneutralización o a una prueba ELISA efectuada en el centro de recolección d e
esperma autorizado antes de la vacunación (1);
(1) Táchese lo que no proceda.
1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 15
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) ha sido transformado, almacenado y transportado en condiciones que se ajustan a lo dispuesto en l a
Directiva 88/407/CEE;
iv) procede de donantes machos que:
— se encontraban en el centro autorizado el 1 de julio de 1994,— llegaron al centro autorizado después del l de julio de 1994 tras haber sido sometidos antes de s
u
Ilegada, con resultados negativos, a las siguientes pruebas para la detección de la fiebre catarral y
de la enfermedad enzoótica hemorrágica realizadas en un laboratorio autorizado y, en ambos casos,
fueron sometidos cada seis meses, con resultados negativos, a las pruebas siguientes realizadas e n
un laboratorio autorizado:
— prueba de bloqueo ELISA para la detección de la fiebre catarral realizada de acuerdo con e l
Anexo E;
— prueba de inmunodifusión en agar realizada con arreglo al Anexo E y prueba de neutralizació n
del virus para la detección de todos los serotipos de la enfermedad enzoótica hemorrágica qu e
existen en el país exportador.
En ................................................................,
(lugar)a .................................................................
(fecha)
/SS74(Sello) (2)Firma (2): .............................................................................
Nombre y apellidos en letras mayúsculas: . .....................................
Cargo oficial: . .......................................................................
►(2)◄
(2) La firma y el sello deberán estamparse en un color que no sea el del texto impreso.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 16
▼B
SEGUNDA PARTE
Lista de países autorizados para utilizar el modelo de certificado zoosani-
tario de la primera parte del Anexo C
CANADÁ: Con exclusión de la región del Valle de Okanagan (Columbia Britá-
nica), que es la zona delimitada por una línea que une los siguientespuntos: un punto de la frontera entre Canadáy los Estados Unidos a120 °15 /prime1de longitud y 49 °de latitud, un punto situado al norte a
119 °35 /prime1de longitud y 50 °30 /prime1de latitud, un punto situado al
nordeste a 119 °de longitud y 50 °45 /prime1de latitud, y un punto situado
al sur en la frontera entre Canadáy los Estados Unidos a 118 °15 /prime1
de longitud y 49 °de latitud.
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▼B
ANEXO D
PRIMERA PARTE
CERTIFICADO ZOOSANITARIO
para la importación de esperma de animales de la especie bovina

1994D0577 — ES — 05.07.1999 — 001.001 — 18
▼B
13. El veterinario oficial abajo firmante conoce las disposiciones de la Directiva 88/407/CEE modificada y
certifica que:
a) ............................................................................................ ha estado libre de peste bovin a
(nombre del país exportador)
y fiebre aftosa durante los doce meses inmediatamente anteriores a la recolección del esperma destinado a
la exportación y hasta la fecha del envío de éste y que no se ha Ilevado a cabo ninguna vacunación contr a
estas enfermedades durante ese mismo período;
b) el centro de recolección de esperma en el que se recogió el esperma destinado a la exportación:
i) ha sido autorizado con arreglo a las condiciones establecidas en el capítulo I del Anexo A de l a
Directiva 88/407/CEE;
ii) ha sido administrado y supervisado con arreglo a las condiciones establecidas en el capítulo II de l
Anexo A de la Directiva 88/407/CEE;
iii) ha estado libre de rabia, tuberculosis, brucelosis, ántrax y perineumonía contagiosa bovina desde 3 0
días antes de la fecha de recolección del esperma hasta 30 días después de haberse efectuado ésta (en e l
caso de esperma fresco, hasta el día del envío);
c) los animales de la especie bovina presentes en el centro de recolección de esperma:
i) proceden de rebaños o han nacido de hembras que cumplen las condiciones establecidas en el capítulo I
del Anexo B de la Directiva 88/407/CEE;
ii) han sido sometidos, antes de su aislamiento, a las pruebas exigidas en el capítulo I del Anexo B de l a
Directiva 88/407/CEE;
iii) han cumplido, antes del período de aislamiento, los requisitos que se establecen en el capítulo I de l
Anexo B de la Directiva 88/407/CEE y han sido sometidos a las pruebas que se indican en él;
iv) en caso de haber permanecido en dicho centro durante al menos un año, han sido sometidos a la s
pruebas de rutina con arreglo a lo dispuesto en el capítulo II del Anexo B de la Directiva 88/407/ CEE;
d) el esperma destinado a la exportación:
i) procede de donantes que han permanecido en
.............................................................................................................................
(nombre del país exportador)
durante los seis meses inmediatamente anteriores a la recogida del esperma destinado a la exportació n
y cumplen las condiciones establecidas en el Anexo C de 1a Directiva 88/407/CEE;
ii) procede de donantes que:
— han permanecido en un centro de recolección de esperma en el que, en los doce meses anteriores a
la recogida del esperma destinado a la exportación, todos los animales de la especie bovina han sid o
sometidos, con resultados negativos, a una prueba de seroneutralización o una prueba ELISA par a
la detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina y la vulvovaginitis pustulosa infecciosa (1),
o
— han sido sometidos, con resultados negativos, a una prueba de seroneutralización o a una prueb a
ELISA para la detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina y la vulvovaginitis pustulos a
infecciosa efectuada en los doce meses anteriores a la recogida del esperma destinado a l a
exportación (1),
o
— son seropositivos tras haber sido vacunados de conformidad con lo dispuesto en el capítulo II de l
Anexo B de la Directiva 88/407/CEE y haber sido sometidos, con resultados negativos, a un a
prueba de seroneutralización o a una prueba ELISA efectuada en el centro de reco1ección d e
esperma autorizado antes de la vacunación (1);
(1) Táchese lo que no proceda.
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▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) ha sido transformado, almacenado y transportado en condiciones que se ajustan a lo dispuesto en l a
Directiva 88/407/CEE;
iv) procede de donantes machos que han sido sometidos con resultados negativos, en dos ocasiones y co n
un intervalo máximo de doce meses, a las pruebas siguientes rea1izadas en un laboratorio autorizad o
antes y después de la recolección del esperma (la prueba que se realice después de la recolección deb e
llevarse a cabo con una muestra de sangre que haya sido tomada como mínimo 21 días después d e
recolectado el esperma destinado a la exportación):
— prueba de bloqueo ELISA para la detección de la fiebre catarral realizada de acuerdo con el Anex o
E,
— prueba de inmunodifusión en agar realizada con arreglo al Anexo E y prueba de neutralización de l
virus para la detección de todos los serotipos de la enfermedad enzoótica hemorrágica que existe n
en el país exportador,
— prueba de seroneutralización para la detección del virus de Akabane.
En ................................................................,
(lugar)a .................................................................
(fecha)
/SS74(Sello) (2)Firma (2): .............................................................................
Nombre y apellidos en letras mayúsculas: . .....................................
Cargo oficial: . .......................................................................
►(2)◄
(2) La firma y el sello deberán estamparse en un color que no sea el del texto impreso.
►(1)M1
►(2)M1
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▼B
SEGUNDA PARTE
Lista de terceros países autorizados para utilizar el modelo de certificado
zoosanitario de la primera parte del Anexo D
AUSTRALIA
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▼B
ANEXO E
Normas para la prueba de inmunoabsorción enzimática de bloqueo o
competitiva mediante un anticuerpo monoclonal específico de grupo para la
detección de los anticuerpos del virus de la fiebre catarral ovina
PRUEBA ELISA COMPETITIVA DE LA FIEBRE CATARRAL OVINA
MEDIANTE EL ANTICUERPO MONOCLONAL 3-17-A3
Mediante esta prueba se pueden detectar los anticuerpos de todos los serotipos
conocidos del virus de la fiebre catarral ovina (BTV).
La prueba se basa en la interrupción de la reacción entre el antígeno BTV y un
anticuerpo monoclonal específico de grupo (3-17-A3) mediante la adición dediluciones de suero problema. Los anticuerpos del BTV presentes en el sueroproblema bloquean la reactividad del anticuerpo monoclonal (Mab), dando lugara una reducción en el color esperado al añadirse el sustrato enzimático.
MATERIALES Y REACTIVOS
1. Microplacas de fondo plano.
2. Antígeno: preparado según se describe a continuación.3. Amortiguador de bloqueo: 5 % (p/v) de leche en polvo desecada «Marvel»,
0,1 % (v/v) de Tween-20 (suministrado en forma de jarabe de monolaurato depolioxietilensorbitol) en PBS (solución amortiguadora de fosfatos).
4. Anticuerpo monoclonal: 3-17-A3 (suministrado como sobrenadante del
cultivo-tejido de hibridoma) almacenado a una temperatura de − 20 °Co
liofilizado, diluido al 1/50 con amortiguador de bloqueo antes de su empleo,dirigido contra el polipéptido específico de grupo p7.
5. Conjugado: anticuerpo de conejo antiglobulina de ratón (adsorbido y eluido)
conjugado con peroxidasa de rábano y guardado en la oscuridad a unatemperatura de 4 °C.
6. Sustrato y cromógeno: 0,2 g de ortofenilendiamina (OPD) disuelta en una
solución amortiguadora consistente en 2,553 g de ácido cítrico, 4,574 g deortofosfato ácido disódico y agua destilada hasta 500 ml, se divide en partesalícuotas de 25 ml y se conserva en la oscuridad a una temperatura de − 20°C, con 12 µl/25 ml de peróxido de hidrógeno (30 % p/v) añadido inmediata-
mente antes de su empleo.
TRATAR LA OPD CON CUIDADO — USAR GUANTES DE GOMA —
POSIBLE MUTÁGENO.
7. Ácido sulfúrico molar: 26,6 ml de ácido añadido a 473,4 ml de agua desti-
lada.
RECUÉRDESE QUE SIEMPRE HAY QUE AÑADIR ÁCIDO AL AGUA,
NUNCA AGUA AL ÁCIDO.
8. Agitador orbital.9. Lector de placa ELISA (la prueba puede leerse visualmente).
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▼B
FORMATO DE LA PRUEBA
NORMAS DE LA PRUEBA
Control en blanco
La fila 1 A- H es un control en blanco consistente en antígeno de BTV y
conjugado. Puede utilizarse para ajustar el lector ELISA.
Control Mab
L af i l a2A-He se l control del anticuerpo monoclonal y se compone de
antígeno de BTV, anticuerpo monoclonal y conjugado. Se trata de un controlnegativo. El promedio de las lecturas de densidad óptica de esta fila de controlrepresenta el valo r0%d e inhibición.
Control positivo
L af i l a3A-He se l control positivo. Se compone de antígeno de BTV,
diluciones de antisuero positivo de BTV, Mab y conjugado. Se incluye comoindicador de que la prueba funciona adecuadamente, debiéndose obtener nivelessimilares de inhibición de una prueba a otra.
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▼B
Sueros problema
En el formato de la prueba arriba indicado, pueden probarse 18 sueros en una
serie de diluciones de 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16. Esto servirápara obtener unaindicación del título del anticuerpo de los sueros problema. El margen dedilución puede ampliarse hasta obtener los títulos de punto final de la dilucióndel suero. De forma alternativa y en estudios serológicos de mayor envergadura,los sueros podrán probarse en una sola dilución (1/4) o en dos diluciones (1/2 y1/4) a modo de prueba de detección rápida.
PROCEDIMIENTO
1. Diluir el antígeno del BTV en una concentración pretitulada en PBS, someter
la dilución brevemente a ultrasonidos para dispersar el virus agregado (si nose dispone del instrumento, pipetear enérgicamente) y poner 50 µl en todos
los pocillos de la placa ELISA. Golpear los lados de la placa para dispersar elantígeno.
2. Incubar durante 60 minutos a 37 °C en un agitador orbital. Lavar las placas
tres veces llenando y vaciando los pocillos con PBS no estéril y secar en unpapel absorbente.
3. Añadir 50 µl de amortiguador de bloqueo por pocillo. Añadir los sueros
problema y el suero positivo a los pocillos adecuados y diluir en la placamediante una pipeta multicanal. No añadir sueros al control en blanco ni alcontrol Mab.
4. Inmediatamente después de haber añadido los sueros problema, diluir el Mab
en el amortiguador de bloqueo (para la dilución pretitulada) y añadir 50 µla
todos los pocillos de la placa excepto los de control de blanco.
5. Incubar durante 60 minutos a 37 °C en un agitador orbital. Lavar tres veces
con PBS y secar con un papel absorbente.
6. Diluir el conjugado de anticuerpo de conejo de antiglobulina de ratón al
1/5 000 en el amortiguador de bloqueo y añadir 50 µl a todos los pocillos de
la placa.
7. Incubar durante 60 minutos a 37 °C en un agitador orbital. Lavar tres veces
con PBS y secar con un agente absorbente.
8. Descongelar la OPD y, justo antes de utilizarla, añadir 12 µl de peróxido de
hidrógeno al 3 0 % a cada fracción de 25 ml de OPD. Añadir 50 µl a todos los
pocillos de la placa. Dejar que el color se desarrolle durante 10 minutosaproximadamente y detener la reacción con ácido sulfúric o1M( 5 0 µl por
pocillo). El color deberádesarrollarse en los pocillos de control Mab y en lospocillos que contengan sueros sin ningún anticuerpo del BTV.
9. Examinar y marcar las placas visualmente o bien mediante un lector espectro-
fotométrico.
ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
Calcular la lectura media de DO de los controles Mab. Este resultado represen-
taráel valor de inhibición del 0 %. Las lecturas de densidad óptica de los suerosproblema se expresarán como valores de porcentaje de inhibición mediante lasiguiente fórmula:
Valor del porcentaje de inhibición = 100 − DO en presencia del suero proble-
maDO en ausencia del suero problema × 100
Los valores de inhibición superiores al 40 % en una dilución de suero al 1/4 se
considerarán positivos. Será posible la lectura visual, dado que el 40 % deinhibición es el valor mínimo discernible fácilmente a la vista.
PREPARACIÓN DEL ANTÍGENO DEL VIRUS DE LA FIEBRE CATA-
RRAL OVINA (BTV) PARA LA PRUEBA ELISA
1. Lavar 10 frascos de Roux de cultivos celulares confluentes de BHK-21 tres
veces con medio de Eagle sin suero e inocular el virus de la fiebre catarralovina del serotipo 1 en medio de Eagle sin suero.
2. Incubar a 37 °C y examinar diariamente el efecto citopático (cpe).
3. Cuando se vea el efecto citopático en un 80-90 % de la capa celular de cada
frasco de Roux, recoger el virus desprendiendo por agitación todas lascélulas del cristal.
4. Centrifugar a 2 000-3 000 rpm para que sedimenten las células.5. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 30 ml aproxi-
madamente de PBS con u n1%d e «Sarkosyl »y2m ld e fluoruro de
fenolmetilsulfonilo (amortiguador de lisis). Esto puede provocar que lascélulas formen un gel, efecto que podráreducirse añadiendo má s amorti-
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guador de lisis. Adviértase que el fluoruro de fenilmetilsulfonilo es nocivo y
debe manejarse con mucho cuidado.
6. Romper las células durante 60 segundos mediante una sonda ultrasónica con
una amplitud de 30 micras.
7. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 minutos.8. Almacenar el sobrenadant ea+4 °C y volver a suspender el sedimento
celular restante en 10-20 ml de amortiguador de lisis.
9. Someter a ultrasonidos y clarificar tres veces, almacenando el sobrenadante
de cada fase.
10. Juntar los sobrenadantes y centrifugar a 24 000 rpm durante 120 minutos a +
4°C encima de una almohadilla de 5 ml de sacarosa al 40 % (p/v en PBS)
utilizando tubos de centrifugado Beckmann de 30 ml y un rotor 28 SW.
11. Eliminar el sobrenadante, escurrir bien los tubos y volver a suspender el
sedimento en PBS mediante un baño de ultrasonidos. Almacenar el antígenoen partes alícuotas a − 70 °C.
TITULACIÓN DEL ANTÍGENO DEL VIRUS DE LA FIEBRE CATA-
RRAL OVINA PARA LA PRUEBA ELISA
El antígeno de la fiebre catarral ovina para la prueba ELISA se titula mediante el
método ELISA indirecto. Se titulan diluciones al 1/2 de antígeno ante unadilución constante (1/50) del anticuerpo monoclonal 3-17-A3. El proceso es elsiguiente:
PROCEDIMIENTO
1. Diluir el antígeno del virus de la fiebre catarral ovina en PBS en la placa de
microtitulación en una serie de diluciones al 1/2 (50 µl/pocillo) mediante una
pipeta multicanal.
2. Incubar durante 1 hora a 37 °C en un agitador orbital.
3. Lavar las placas tres veces con PBS.4. Añadir 50 µl de anticuerpo monoclonal 3-17-A3 (diluido al 1/50) en cada
pocillo de la placa de microtitulación.
5. Incubar durante 1 hora a 37 °C en un agitador orbital.
6. Lavar las placas tres veces con PBS.7. Añadir 50 µl de anticuerpo de conejo antiglobulina de ratón conjugado con
peroxidasa de rábano, diluido a una concentración óptima pretitulada, en cadapocillo de la placa de microtitulación.
8. Incubar durante 1 hora a 37 °C en un agitador orbital.
9. Añadir el substrato y el cromógeno del modo expuesto anteriormente. Detener
la reacción después de 10 minutos mediante la adición de ácido sulfúricomolar (50 µl/pocillo).
En el método competitivo, el anticuerpo monoclonal debe hallarse en exceso;
para ello se escoge una dilución de antígeno incluida en la curva de titulación (noen la región plana) que al cabo de 10 minutos dé aproximadamente 0,8 DO.
Normas para la prueba de inmunodifusión en gel de agar para la detección
de los anticuerpos de la enfermedad enzoótica hemorrágica
La prueba de inmunodifusión en gel de agar deberáefectuarse de conformidad
con el siguiente procedimiento:
MATERIALES Y REACTIVOS
1. Antígeno
El antígeno precipitante deberáprepararse en un cultivo celular que favorezca
la multiplicación rápida del serotipo (o serotipos) adecuado(s) de la enfer-medad enzoótica hemorrágica. Se recomienda la utilización de células BHK oVero. Al finalizar el crecimiento del virus, el antígeno se encontraráen ellíquido sobrenadante, pero para ser activo deberátener una concentración de50 a 100 veces, lo que se podráobtener aplicando un procedimiento normali-zado de concentración de las proteínas. El virus existente en el antígeno podráinactivarse con la adición de 0,3 % (v/v) de betapropiolactona.
2. Suero de control positivo conocido
Con el suero y el antígeno de referencia internacionales, preparar un suero
patrón nacional normalizado con relación al suero de referencia internacionalpara obtener una proporción óptima, liofilizarlo y emplearlo como suero decontrol positivo conocido en cada prueba.
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▼B
3. Suero problema
PROCEDIMIENTO
1. Preparar una solución de agarosa a l1%e nu n tampón de borato o de barbitol
sódico con un pH de 8,5 a 9,0, y verter en una placa Petri hasta una alturamínima de 3 mm.
2. Perforar en el agar siete pocillos libres de humedad de 5 mm de diámetro
cada uno, dispuestos del siguiente modo: un pocillo central, rodeado de losotros seis pocillos, formando un círculo de 3 mm de radio.
3. Llenar el pocillo central con el antígeno estándar, los pocillos periféricos 2, 4
y 6 con el suero positivo conocido, y los pocillos 1 ,3y5c o ne l suero
problema.
4. Incubar durante 72 horas como máximo a temperatura ambiente en una
cámara cerrada y húmeda.
INTERPRETACIÓN
El suero problema es positivo si forma una línea de precipitina específica con el
antígeno y una línea completa de identidad con el suero de control. El sueroproblema es negativo si no forma una línea específica con el antígeno y nodesvía la línea del suero de control. Las placas Petri deberán examinarse sobrefondo oscuro con iluminación indirecta.