1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceitesdeorujodeolivaysobresus
métodosdeanálisis
(DO L 248 de 5.9.1991, p. 1)
Modificado por:
Diario Oficial
nopágina fecha
►M1Reglamento (CEE) no3682/91 de la Comisión de 17 de diciembre de
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Reglamento (CEE) no1429/92 de la Comisión de 26 de mayo de 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Reglamento (CEE) no1683/92 de la Comisión de 29 de junio de 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Reglamento (CEE) no1996/92 de la Comisión de 15 de julio de 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Reglamento (CEE) no3288/92 de la Comisión de 12 de noviembre de
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Reglamento (CEE) no183/93 de la Comisión de 29 de enero de 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 modificado por el Reglamento (CEE) no826/93 de la Comisión de 6
de abril de 1993L 87 6 7.4.1993
►M8Reglamento (CEE) no620/93 de la Comisión de 17 de marzo de 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Reglamento (CE) no177/94 de la Comisión de 28 de enero de 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Reglamento (CE) no2632/94 de la Comisión de 28 de octubre de 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Reglamento (CE) no656/95 de la Comisión de 28 de marzo de 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Reglamento (CE) no2527/95 de la Comisión de 27 de octubre de 1995 L 258 49 28.10.1995
Rectificado por:
►C1Rectificación, DO L 347 de 28.11.1992, p. 69 (2568/91)
►C2Rectificación, DO L 176 de 20.7.1993, p. 30 (183/93)
▼B
REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceites
deorujodeolivaysobresusmétodosdeanálisis
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,
Visto el Reglamento no136/66/CEE del Consejo, de 22 de septiembre
de 1966, por el que se establece la organización común de mercados enel sector de las materias grasas(
1), cuya última modificación la consti-
tuye el Reglamento (CEE) no3577/90(2), y, en particular, su artículo
35bis,
Considerando que en el Anexo del Reglamento no136/66/CEE se esta-
blecen lasdenominacionesy definicionesde losaceitesde oliva y de
losaceitesde orujo de oliva comercializadosdentro de cada Es tado
miembro, así como en los intercambios intracomunitarios y conterceros países;
Considerando que, para poder distinguir los diferentes tipos de aceite,
procede definir las características fisicoquímicas de cada uno de ellos,
así como las características organolépticas de los aceites vírgenes, a finde garantizar así la pureza y calidad de estos productos, sin perjuicio deotras disposiciones existentes en la materia;
Considerando que conviene determinar de manera uniforme en toda la
Comunidad la presencia de las características de los diferentes tipos deaceite; que, para ello, procede establecer los métodos comunitarios deanálisis químico y de valoración organoléptica; que conviene, sinembargo, permitir que durante un período transitorio se utilicen otros
métodos de análisis que sean aplicados en los Estados miembros, esta-
bleciendo al mismo tiempo que en caso de presentarse resultadosdivergentesprevalezcan losobtenidosa travésdel método común;
Considerando que la definición de las características fisicoquímicas de
los aceites de oliva y de sus métodos de análisis comporta la adapta-
ción de lasnotascomplementariasdel capítulo 15 de la nomenclaturacombinada;
Considerando que el método de valoración de las características orga-
nolépticasde losaceitesvírgenesrequiere la creación de unospaneles
de catadores seleccionados y especialmente adiestrados; que conviene,por lo tanto, prever el plazo necesario para instaurar una estructura dees te tipo; que, dadaslasdificultadesa lasque s e enfrentarán determi-nados Estados miembros para crear dichos paneles, procede autorizarque se recurra a paneles existentes en otros Estados miembros;
Considerando que, para garantizar el correcto funcionamiento del
sistema de las exacciones reguladoras aplicables a la importación deorujo de oliva, esconveniente prever un método único para la determi-nación del contenido en aceite de estos productos;
Considerando que, para no perjudicar el comercio, resulta oportuno
prever un período limitado para la salida al mercado del aceite quehaya sido envasado antes de la entrada en vigor del presente Regla-mento;
Considerando que procede derogar el Reglamento (CEE) n
o1058/77 de
la Comisión(3), cuya última modificación la constituye el Reglamento
(CEE) no1858/88(4);
Considerando que el Comité de gestión de las materias grasas no ha
emitido dictamen alguno en el plazo establecido por su presidente,1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 2
(1)D O no172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.
(2)D O noL 353 de 17. 12. 1990, p. 23.
(3)D O noL 128 de 24. 5. 1977, p. 6.
(4)D O noL 166 de 1. 7. 1988, p. 10.
▼B
HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:
Artículo 1
1. Se considerarán aceites de oliva vírgenes, a que se refieren las
letrasa), b), y c) del punto 1 del Anexo del Reglamento no136/66/
CEE, los aceites cuyas características se ajusten a las indicadas, respec-tivamente, en lospuntos1, 2 y 3 del Anexo I del presente Reglamento.
2. Se considerará aceite de oliva virgen lampante, a que se refiere la
letra d) del punto 1 del Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite
cuyas características se ajusten a las indicadas en el punto 4 del Anexo
I del presente Reglamento.
3. Se considerará aceite de oliva refinado, a que se refiere el punto 2
del Anexo del Reglamento no136/66/CEE, el aceite cuyascaracterís -
ticas se ajusten a las indicadas en el punto 5 del Anexo I del presenteReglamento.
4. Se considerará aceite de oliva, a que se refiere el punto 3 del
Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyascaracterís ticas
se ajusten a las indicadas en el punto 6 del Anexo I del presente Regla-mento.
5. Se considerará aceite de orujo de oliva crudo, a que se refiere el
punto 4 del Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas
características se ajusten a las indicadas en el punto 7 del Anexo I del
presente Reglamento.
6. Se considerará aceite de orujo de oliva refinado, a que se refiere
el punto 5 del Anexo del Reglamento no136/66/CEE, el aceite cuyas
características se ajusten a las indicadas en el punto 8 del Anexo I delpresente Reglamento.
7. Se considerará aceite de orujo de oliva, a que se refiere el punto 6
del Anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyascaracterís -
ticas se ajusten a las indicadas en el punto 9 del Anexo I del presenteReglamento.
Artículo 2
1. Las características de los aceites, previstas en el Anexo I, se
determinarán empleando los métodos de análisis siguientes:
— para determinar los ácidos grasos libres, expresados en porcentaje
de ácido oleico, el método recogido en el Anexo II,
— para determinar el índice de peróxidos, el método recogido en el
Anexo III,
— para determinar losalcoholesalifáticos , el método recogido en el
Anexo IV,
— para determinar el contenido de esteroles, el método recogido en el
Anexo V,
— para determinar el eritrodiol + uvaol, el método recogido en el
Anexo VI,
— para determinar los ácidos grasos saturados en la posición 2 del
triglicérido, el método recogido en el Anexo VII,
— para determinar el contenido de trilinoleína, el método recogido en
el Anexo VIII,
— para el análisis espectrofotométrico, el método recogido en el
Anexo IX,
— para determinar la composición de ácidos grasos, el método reco-
gido en losAnexosX «A» y X «B»,
— para determinar los solventes halogenados volátiles, el método reco-
gido en el Anexo XI,
— para la valoración de lascaracterís ticasorganolépticasde losaceites
de oliva vírgenes, el método recogido en el Anexo XII, que seaplicará de conformidad con el apartado 2,
— para la prueba de la refinación, el método recogido en el Anexo
XIII,1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 3
▼M11
— para determinar los estigmastadienos, el método recogido en el
Anexo XVII.
2.►M3El analista experto en análisis sensoriales, asistido si es
preciso por expertos ◄, llevará a cabo la valoración de lascaracterís -
ticasorganolépticascon arreglo al procedimiento des crito en la fichade degustación contemplada en el Anexo XII. En caso de que el
análisis determine características organolépticas distintas de las resul-
tantes de la denominación del producto, el analista someterá lamuestra al examen de un panel de catadores, con arreglo a las disposi-cionesdel Anexo XII.
El análisis contradictorio será realizado por el panel de catadores de
conformidad con las disposiciones citadas anteriormente.
Para la valoración de las características organolépticas con ocasión de
operacionesrelacionadascon el régimen de intervención, el panel de
catadores procederá a aquella con arreglo a las disposiciones del Anexo
XII.
Artículo 3
Hasta el ►
M628 de febrero de 1993 ◄, la introducción de los
métodos de análisis previstos en el artículo 2 no será óbice para que
losEs tadosmiembrosempleen otrosmétodoscomprobadosy científi-camente válidos, siempre que con ello no se obstaculice la librecirculación de losproductosreconocidosconformesa la normativa enaplicación de los métodos comunitarios. Los Estados miembros intere-
sados comunicarán a la Comisión dichos otros métodos antes de
utilizarlos.
En caso de que alguno de estos otros métodos dé un resultado diferente
del alcanzado por el método común, se considerará válido el resultado
obtenido en aplicación del método común.
Artículo 3 bis
En caso de divergencia sobre las características organolépticas del
aceite que sea objeto de transacciones comerciales, las partes intere-sadas podrán recurrir a un panel de catadores autorizado de su elección.
Artículo 3 ter
En caso de que se compruebe que las características organolépticas de
un aceite son distintas de las correspondientes a su denominación, elEstado miembro interesado aplicará sanciones económicas administra-tivas, cuyo importe se determinará en función de la gravedad de la
irregularidad comprobada, sin perjuicio de otras posibles sanciones.
Para la evaluación de las irregularidades se tendrá sobre todo en cuenta
la evolución natural de las características del aceite de oliva conser-vado en condicionesnormales .
Al principio de cada semestre, los Estados miembros informarán a la
Comisión del número y la naturaleza de las irregularidades observadas,así como de las sanciones impuestas durante el semestre anterior.
Artículo 4
1. Para la apreciación de las características organolépticas, los
Estados miembros crearán paneles de catadores que se encargarán delcontrol oficial de las características organolépticas. Dichos panelesdeberán cumplir los requisitos siguientes:
— estar constituidos por catadores seleccionados y formados con
arreglo a lasreglasdel método contemplado en el Anexo XII,
— poseer las instalaciones y el material necesarios para la evaluación
organoléptica de conformidad con lasreglasdel citado método,1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 4
▼B
▼M5
▼M5
— utilizar el vocabulario específico del análisis sensorial del aceite de
oliva, la hoja de perfil y la tabla de puntuación previstos en elcitado método,
— comprometerse a efectuar los análisis organolépticos previstos a
escala comunitaria o internacional con ocasión de los controles
periódicos y de las sesiones de armonización de los criterios depercepción,
— comprometerse a informar anualmente a la Comisión de las modifi-
caciones que se produzcan en la composición del panel y delnúmero de evaluacionespor él realizadasen calidad de panel auto-rizado.
Cada Estado miembro procederá a la autorización de los paneles que se
constituyan en su territorio y reúnan las condiciones anteriormente
expuestas. Nombrarán entre ellos al panel o a los paneles encargadosde los análisis de revisión.
Lospanelescreadospor losEs tadosmiembrosantesdel 1 de
noviembre de 1992 con arreglo a lasnormases tablecidasen el métodocontemplado en el Anexo XII se considerarán autorizados a los efectosdel presente artículo.
Cada Estado miembro comunicará a la Comisión y a los demás Estados
miembros la lista de paneles autorizados.
2. En caso de que un Estado miembro tenga dificultades para crear
un panel de catadoresen s u territorio, podrá recurrir a un panel dedegustadores autorizado de otro Estado miembro.
3. Cada Estado miembro elaborará la lista de los paneles de cata-
dores creados por organizaciones profesionales o interprofesionales en
lascondicionesfijadasen el apartado 1 y velará por el cumplimiento
de esas condiciones.
Artículo 5
Lasnotascomplementarias2, 3 y 4 del capítulo 15 de la nomenclatura
combinada que figura en el Anexo I del Reglamento (CEE) n
o2658/87
del Consejo(1) serán sustituidas por el texto que figura en el Anexo
XIV del presente Reglamento.
Artículo 6
1. El contenido en aceite de orujo de aceituna y demásres iduosde
la extracción del aceite de oliva (códigosNC 2306 90 11 y 2306 90 19)se determinará con arreglo al método recogido en el Anexo XV.
2. El contenido de aceite mencionado en el apartado 1 se expresará
como porcentaje del extracto seco en peso.
Artículo 7
Serán aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de
sustancias extrañas distintas de las mencionadas en el Anexo XI.
Artículo 8
1. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión las medidas
adoptadasen aplicación del pres ente Reglamento.
2. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión, al inicio de
cada semestre una recapitulación de los datos analíticos de las determi-naciones efectuadas durante el semestre precedente.
Estos resultados serán examinados por el Comité de gestión de las
materias grasas con arreglo al procedimiento previsto en el artículo 39del Reglamento n
o136/66/CEE.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 5
(1)D o noL 256 de 7. 9. 1987, p. 1.▼M6
▼B
▼B
Artículo 9
Queda derogado el Reglamento (CEE) no1058/77.
Artículo 10
1. El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al
de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas .
No obstante, el método que figura en el Anexo XII se aplicará a partir
del►M11 de noviembre de 1992 ◄, excepto en lo que se refiere a
lasoperacionesrelacionadascon la intervención.
Dicho método no se aplicará a los aceites de oliva vírgenes envasados
antesdel 1 de noviembre de 1992.
El presente Reglamento no se aplicará a los aceites de oliva y de orujo
de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presente
Reglamento y comercializadoshas ta el 31 de octubre de 1992.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y
directamente aplicable en cada Estado miembro.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 6
▼M5
▼B
▼B
ANEXOS
Índice
Anexo I: Características de los aceites de oliva …
Anexo II: Determinación del grado de acidez …
Anexo III: Determinación del índice de peróxidos…Anexo IV: ►
M6Determinación del contenido de cerasmediante crama-
tografía de gases con columna capilar ◄…
Anexo V: Determinación de la composición y del contenido de esteroles
mediante cromatografía de gases con columna capilar …
Anexo VI: Determinación del eritrodiol y uvaol …Anexo VII: Determinación de los ácidos grasos saturados en la posición 2
de lostriglicéridosde aceitesy gras as…
Anexo VIII: Determinación del porcentaje de trilinoleína …Anexo IX: Prueba espectrofométrica en el ultravioleta …
Anexo X «A»: Análisis de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante
cromatografía de gases …
Anexo X «B»: Preparación de losés teresmetílicosde losácidosgras os…
Anexo XI: Determinación del contenido en ►
C1disolventes ◄haloge-
nadosvolátilesen el aceite de oliva …
Anexo XII: Valoración organoléptica del aceite de oliva virgen …
Anexo XIII: ►M6Neutralización y decoloración del aceite de oliva en
laboratorio ◄…
Anexo XIV: Notascomplementarias2, 3 y 4 del capítulo 15 de la nomen-
clatura combinada …
Anexo XV: Contenido de aceite de losorujosde aceituna …
Anexo XVI: Determinación del índice de yodo …
Anexo XVII: Método para la determinación de estigmastadienos en los
aceitesvegetales…1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 7
▼M11
ANEXO I
CARACTERÍSTICASDELOSACEITESDEOLIVA
Categoría Acidez %Índice de
peróxidos
meq O2/kgSolventes
halogena-
dosmg/
kg (1)Cerasmg/
kgÁcidos
grasos
saturados
en
posición 2
delostrigl-
icéridos%Estigmas-
tadie-
nos(2)mg/
kgEritrodiol
+ uvaal %Trilinolei-
na %Colestero-
l%Brassicas-
terol %Campeste-
rol %Estignast-
erol %Betasitos-
terol (3)%Delta-7-
Estigmast-
enol %Esteroles
totalesmg/
kg
1. Aceite de oliva
virgen extra M 1,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
2. Aceite de oliva
virgen M 2,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
3. Aceite de oliva
virgen corriente M 3,3 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
4. Aceite de oliva
virgen lampante m 3,3 m 20 m 0,20 M 350 M 1,3 M 0,50 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1000
5. Aceite de oliva
refinado M 0,5 M 5 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
6. Aceite de oliva M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 10007. Aceite de orujo de
oliva crudo m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,7 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2500
8. Aceite de orujo de
oliva refinado M 0,5 M 5 M 0,20 — M 2,0 m 12 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1800
9. Aceite de orujo de
oliva M 1,5 M 15 M 0,20 > 350 M 2,0 > 4,5 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1600
M = máximo, m = mínimo.
(1) Contenido total de compuestos detectados mediante captura de electrones.
Para cada uno de loscomponentesel límite máximo esde 0,10 mg/kg.
(2) Suma de isómeros que podrían (o no podrían) separarse mediante una columna capilar.
(3) Delta-5-23-Estigmastadienol + Clerosterol + Sitosterol + Sitostanol + delta-5-Avenasterol + delta-5-Avenasterol + delta-5-24-Estigmastadie nol.
Nota:
Para descalificar un aceite bastará con que una sola de las características no se ajuste a los límites fijados.▼M111991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 8
CategoríaContenido de ácidos
Sumas(de
los)
isómeros
transoleicosSuma (de
los)
isómeros
transolino-
leicosy
translinolén-
icos%K232K270K270después
de pasar por
alúminaDelta-K Panel test
Mirístico %Linolénic-
o%Araquídic-
o%Icosanoic-
o%Behénico %Lignocéric-
o%
1. Aceite de oliva
virgen extra M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,50 M 0,20 M 0,10 M 0,01 m 6,5
2. Aceite de oliva
virgen M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 5,5
3. Aceite de oliva
virgen corrente M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 3,5
4. Aceite de oliva
virgen lampante M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,10 M 0,10 M 3,70 M 0,25 M 0,11 — < 3,5
5. Aceite de oliva refi-
nado M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —
6. Aceite de oliva M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —7. Aceite de orujo de
oliva crudo M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,20 M 0,10 —————
8. Aceite de orujo de
oliva refinado M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Aceite de orujo de
oliva M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —
M = máximo, m = mínimo
Nota
Para descalificar un aceite bastará con que una sola de las características no se ajuste a los límites fijados.
Para la determinación de la pureza, en caso de que el k270sobrepase el límite establecido para la categoría correspondiente, deberá efectuarse una nueva determinación del k270después de ser tratados con alúmina.▼M111991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 9
▼B
ANEXO II
DETERMINACIÓNDELGRADODEACIDEZ
1. OBJETO
Determinar losácidoslibresen losaceitesde oliva. El contenido en
ácidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada según el
método convencional.
1.1.Principio
Disolución de la muestra en una mezcla de disolventes y valoración de
los ácidos grasos libres mediante una solución etanólica de hidróxido
potásico.
1.2.Reactivos
Todoslosreactivosdeben s er de calidad analítica reconocida y el agua
utilizada debe ser agua destilada o de una pureza equivalente.
1.2.1. Mezcla de éter dietílico y etanol de 95 % (V/V), en proporción de
volumen 1:1.
Nota:El éter dietílico esmuy inflamable y puede formar peróxidos
explosivos. Debe utilizarse tomando especiales precauciones.
Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilización con la
solución de hidróxido potásico (1.2.2) en presencia de 0,3 ml de la solu-
ción de fenolftaleína (1.2.3) por cada 100 ml de mezcla.
Nota:Si no es posible utilizar éter dietílico, puede sustituirse por una
mezcla de disolventes formada por etanol y tolueno. Si fuera nece-
sario, el etanol podría sustituirse, a su vez, por 2-propanol.
1.2.2. Solución etanólica valorada de hidróxido potásico, = 0,1 M o, en caso
necesario, = 0,5 M. Nota 1.
Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilización,
la concentración exacta de la solución etanólica de hidróxido potásico.
Debe utilizarse una solución que haya sido preparada por lo menos cinco
díasantesy decantada en un fras co de vidrio marrón cerrado con tapón
de goma. La solución debe ser incolora o de color amarillo paja.
Nota:Se puede preparar una solución incolora y estable de hidróxido
potásico de la manera siguiente: Llevar a ebullición, y mantener
ésta a reflujo durante una hora, 1 000 ml de etanol con 8 g dehidróxido potásico y 0,5 g de virutas de aluminio. Destilar inme-
diatamente. Disolver en el destilado la cantidad requerida de
hidróxido potásico. Dejar reposar durante varios días y decantar
el líquido claro sobrenadante, separándolo del precipitado de
carbonato potásico.
La solución también puede prepararse de la manera siguiente sin
efectuar la destilación: añadir 4 ml de butilato de aluminio a
1 000 ml de etanol y dejar reposar la mezcla durante algunos
días. Decantar el líquido sobrenadante y disolver en él la cantidad
necesaria de hidróxido potásico. La solución está lista para ser
utilizada.
1.2.3. Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol de 95-96 % (V/V) o solu-
ción de 20 g/l de azul alcalino (en caso de aceites de oliva muy
coloreados) en etanol de 95-96 % (V/V).
1.3.Material
Material habitual de laboratorio, y en particular:
1.3.1. Balanza analítica
1.3.2. Matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad
1.3.3. Bureta de 10 ml de capacidad, con graduación de 0,05 ml
1.4.Procedimento
1.4.1. Preparación de la muestra para la prueba1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 10
▼B
La determinación se efectuará en una muestra filtrada. Si el contenido
global de humedad e impurezas es inferior al 1 %, se utilizará la muestra
tal cual.
1.4.2. Muestra para la prueba
Tomar la muestra, según el grado de acidez previsto, de acuerdo con el
cuadro siguiente:
Grado de acidez previstoPeso de la muestra
(en g)Precisión de la pesada de
la muestra
(en g)
< 1 20 0,05
1 a 4 10 0,02
4 a 15 2,5 0,01
15 a 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Pesar la muestra en el matraz erlenmeyer (1.3.2)
1.4.3 Determinación
Disolver la muestra (1.4.2) en 50 a 150 ml de la mezcla de éter dietílico
y etanol (1.2.1), previamente neutralizada.
Valorar, agitando, con la solución de hidróxido potásico de 0,1 M (1.2.2)
(véase nota 2) hasta el viraje del indicador (la coloración rosa de la
fenolftaleína debe permanecer al menos durante 10 segundos).
Nota 1: La solución etanólica valorada de hidróxido potásico (1.2.2)
puede sustituirse por una solución acuosa de hidróxido potásico
o sódico siempre que el volumen de agua añadido no provoque
una separación de las fases.
Nota 2: Si la cantidad necesaria de la solución de hidróxido potásico de
0,1 M supera los 10 ml, debe utilizarse una solución de 0,5 M.
Nota 3: Si la solución se enturbia durante la valoración, añadir una
cantidad suficiente de la mezcla de disolventes (1.2.1) para que
la solución se aclare.
1.5Expresióndelaacidezenporcentajedeácidooleico
La acidez, expresada en porcentaje de ácido oleico es igual a:
V/C2c/C2M
1000/C2100
P¼V/C2c/C2M
10/C2P
siendo:
V: volumen en ml de la solución valorada de hidróxido potásico utili-
zada.
c: concentración exacta, en molespor litro, de la s olución de hidróxido
potásico utilizada.
M: peso molecular del ácido en que se expresa el resultado (ácido
oleico = 282).
P: peso en gramos de la muestra utilizada.
Se tomará como resultado la media aritmética ►M6de dos
determinaciones ◄.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 11
▼B
ANEXO III
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEPERÓXIDOS
1. OBJETO
La presente norma describe un método para la determinación del índice de
peróxidos de los aceites y grasas.
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
La presente norma es aplicable a los aceites y grasas animales y vegetales.
3. DEFINICIÓN
El índice de peróxidosesla cantidad (expres ada en miliequivalentesde
oxígeno activo por kg de grasa) de peróxidos en la muestra que ocasionan
la oxidación del yoduro potásico en las condiciones de trabajo descritas.
4. PRINCIPIO
La muestra problema, disuelta en ácido acético y cloroformo, se trata con
solución de yoduro potásico. El yodo liberado se valora con solución valo-
rada de tiosulfato sódico.
5. APARATOS
Todo el material utilizado estará exento de sustancias reductoras u
oxidantes.
Nota:No engrasar las superficies esmeriladas.
5.1. Navecilla de vidrio de 3 ml5.2. Matraces con cuello y tapón esmerilados, de 250 ml de capacidad aproxi-
madamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco
(nitrógeno o, preferiblemente, dióxido de carbono).
5.3. Bureta de 25 o 50 ml, graduada en 0,1 ml.
6. REACTIVOS
6.1. Cloroformo para análisis, exento de oxígeno por borboteo de una corriente
de gasinerte puro y s eco.
6.2. Ácido acético glacial para análisis, exento de oxígeno por borboteo de una
corriente de gasinerte puro y s eco.
6.3. Solución acuosa saturada de yoduro potásico, recién preparada, exenta de
yodo y yodatos.
6.4. Solución acuosa de tiosulfato sódico 0,01 N o 0,002 N valorada exacta-
mente; la valoración se efectuará inmediatamente antes del uso.
6.5. Solución de almidón, en solución acuosa de 10 g/l, recién preparada con
almidón soluble.
7. MUESTRA
La muestra se tomará y almacenará al abrigo de la luz, y se mantendrá
refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y herméticamente
cerradoscon taponesde vidrio es merilado o de corcho.
8. PROCEDIMIENTO
El ensayo se realizará con luz natural difusa o con luz artificial. Pesar con
precisión de 0,001 g en una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un
matraz (5.2) una cantidad de muestra en función del índice de peróxidos
que se presuponga, con arreglo al cuadro siguiente:1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 12
▼B
Índice de peróxidos que se supone
(meq de O2/kg)Peso de la muestra problema
(en g)
de 0 a 12 de 5,0 a 2,0
de 12 a 20 de 2,0 a 1,2de 20 a 30 de 1,2 a 0,8de 30 a 50 de 0,8 a 0,5
de 50 a 90 de 0,5 a 0,3
Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la
muestra problema. Añadir 10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rápidamente
la muestra problema mediante agitación. Añadir 15 ml de ácido acético
(6.2) y, a continuación, 1 ml de solución de yoduro potásico (6.3). Cerrar
rápidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscu-
ridad durante 5 minutosexactamente, a una temperatura comprendida
entre 15 y 25 ºC.
Añadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al
mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solución de tiosul-
fato sódico (6.4) (solución 0,002 N si se presuponen valores inferiores a
12 y solución 0,01 N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando
la solución de almidón (6.5) como indicador.
Efectuar dosdeterminacionespor mues tra.
Realizar simultáneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo
en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solución de tiosulfato sódico 0,01 N
(6.4), sustituir los reactivos.
9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
El índice de peróxidos(I.P.), expres ado en miliequivalentesde oxígeno
activo por kg de grasa se calcula mediante la fórmula siguiente:
IP¼
V/C2N/C21000
P
siendo:
V: ml de solución valorada de tiosulfato sódico (6.4) empleados en el
ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo
en blanco.
N: normalidad exacta de la solución de tiosulfato sódico (6.4) empleada.
P: peso, en gramos de la muestra problema.
El resultado será la media artimética de las dos determinaciones efectuadas.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 13
▼M6
ANEXO IV
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE
CROMATOGRAFÍADEGASESCONCOLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de cerasen determinadosaceitesy gras asen lascondi-
cionesde ens ayo.
Puede utilizarse, en particular, para distinguir el aceite de oliva obte-
nido mediante extracción (aceite de orujo de oliva).
2. PRINCIPIO
Fraccionamiento de la grasa o aceite, a los que se habrá añadido un
patrón interno adecuado, mediante cromatografía en columna de gel de
sílice hidratado. Recuperación de la fracción eluida en las condiciones
de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicéridos) y, a
continuación, análisis directo mediante cromatografía de gases columna
capilar.
3. APARATOS
3.1. Matraz Erlenmeyer de 25 ml.
3.2. Columna de vidrio para cromatografía de 15 mm de diámetro interior y
30-40 cm de longitud.
3.3. Cromatógrafo de gases adecuado con columna capilar, dotado de un
sistema de introducción directa en la columna, que incluya los
siguientes elementos:
3.3.1. Horno termostático para las columnas, que pueda mantener la tempera-
tura deseada con una oscilación máxima de 1 ºC.
3.3.2. Inyector en frío para introducción directa en la columna.3.3.3. Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.3.3.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplifi-
cador (3.3.3), con un tiempo de respuesta inferior o igual a un segundo
y velocidad del papel variable.
3.3.5. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de ►
C210-15 m ◄de
longitud y 0,25-0,32 mm de diámetro interior, con un recubrimiento
interno de SE-52 o SE-54 líquido, o equivalente, de un espesor que
oscile entre 0,10 y 0,30 µm.
3.4. Microjeringa para inyección en columna, de 10 µl de capacidad,
provista de una aguja cementada.
4. REACTIVOS
4.1. Gel de sílice 70-230 mesh, artículo 7754 Merck.
Mantener el gel en el horno durante cuatro horasa una temperatura de
500 ºC. Dejar enfriar y añadir un 2 % de agua. Agitar bien para homo-
geneizar la mezcla. Mantener al abrigo de la luz durante al menos12
horas antes de su uso.
4.2. n-Hexano, de calidad para cromatografía.4.3. Éter etílico, de calidad para cromatografía.4.4. n-Heptano, de calidad para cromatografía.
4.5. Solución patrón de laurilaraquidato al 0,1 % (m/v) en hexano (patrón
interno).
4.6. Gas portador: hidrógeno puro, de calidad para cromatografía de gases.4.7. Gases auxiliares:
— hidrógeno puro, de calidad para cromatografía de gases,
— aire puro, de calidad para cromatografía de gases.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 14
▼M6
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Separación de la fracción de lasceras
5.1.1. Preparación de la columna cromatográfica.
Suspender en n-hexano anhidro 15 g de gel de sílice hidratado al 2 % e
introducir en la columna.
Dejar sedimentar espontáneamente. Completar la sedimentación con
ayuda de un vibrador eléctrico, a fin de obtener una banda cromatográ-
fica máshomogénea. Hacer pas ar 30 ml de n-hexano para eliminar las
posibles impurezas.
5.1.2. Cromatografía en columna.
Pesar con exactitud 500 mg de la muestra en un matraz de 25 ml;
añadir una cantidad de patrón interno apropiada, en función del conte-
nido de ceras que se presuma; por ejemplo, añadir 0,1 mg de
laurilaraquidato si se trata de aceite de oliva y 0,25-0,50 mg si se trata
de aceite de orujo de oliva.
Transferir la muestra preparada a la columna cromatográfica, que se
habrá acondicionado como se indica en el punto 5.1.1 con ayuda de
dosporcionesde 2 ml de n-hexano.
Dejar fluir el disolvente hasta que se sitúe a 1 mm por encima del nivel
superior del absorbente. A continuación, iniciar la elución cromatográ-
fica; recoger 140 ml de la mezcla de n-hexano y éter etílico en la
proporción de 99:1 a un ritmo de 15 gotasaproximadamente cada diez
segundos (2,1 ml/minuto).
Secar la fracción resultante en un evaporador rotatorio hasta que se
haya eliminado casi todo el disolvente. Eliminar los últimos 2 o 3 ml
mediante una corriente débil de nitrógeno y añadir a continuación 10
ml de n-heptano.
5.2. Análisis por cromatografía de gases
5.2.1. Operacionespreliminaresy acondicionamiento de la columna.
5.2.1.1. Instalar la columna en el cromatógrafo de gases, conectando el terminal
de entrada al sistema en columna y el terminal de salida al detector.
Comprobar el funcionamiento general del cromatógrafo de gases
(funcionamiento de loscircuitosde gas , eficacia del detector y del
registrador, etc.).
5.2.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla.
Hacer pasar a través de la columna una corriente ligera de gas y, a
continuación, encender el cromatógrafo de gases. Calentar gradual-
mente hasta alcanzar una temperatura de ensayo (véase la nota).
Mantener esta temperatura durante al menos dos horas y, a continua-
ción, ajustar el aparato a las condiciones de ensayo (regulación del
flujo del gas, encendido de la llama, conexión con el registrador elec-
trónico, regulación de la temperatura del horno para la columna,
regulación del detector, etc.). Registrar la señal con una sensibilidad al
menos dos veces superior a la exigida para efectuar el análisis. La línea
de base deberá ser lineal, sin picos de ningún tipo, y no deberá
presentar deriva.
Una deriva rectilínea negativa indica que lasconexionesde la columna
no son correctas; una deriva positiva indica que la columna no ha sido
acondicionada adecuadamente.
Nota:La temperatura de acondicionamiento debrá ser en todo
momento al menos20 ºC inferior a la temperatura máxima es pe-
cificada para el eluyente que se utilice.
5.2.2. Elección de lascondicionesde ens ayo
5.2.2.1. Las condiciones de ensayo son generalmente las siguientes:
— temperatura de la columna: se parte de una temperatura inicial de
80 ºC que se incrementa a razón de 30 ºC/minuto hasta los 120 ºC,
y que, a continuación, se programa para que aumente 5 ºC/minuto
hasta alcanzar los 340 ºC;
— temperatura del detector: 350 ºC;
— velocidad lineal del gasportador: hidrógeno, 20-35 cm/s egundo,
— sensibilidad instrumental: 4-16 veces la atenuación mínima,— sensibilidad del registrador: 1-2 mV desde el fondo de la escala,— velocidad del papel: 30 cm/hora,— cantidad inyectada: 0,5-1 µl de solución.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 15
▼M6
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna y del cromatógrafo de gases (a fin de obtener cromato-
gramas que reúnan las siguientes condiciones: el tiempo de retención
del patrón interno C32 debe ser de 25 ± 2 minutos y el pico más repre-
sentativo de las ceras debe estar comprendido entre el 60 y el 100 %
desde el fondo de la escala).
5.2.2.2. Determinar losparámetrosde integración de lospicosde manera que s e
obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos considerados.
5.2.3. Realización del análisis5.2.3.1. Tomar 1 µl de solución con la microjeringa de 10 µl; sacar el émbolo
hasta que la aguja esté vacía. Introducir la aguja en el sistema de inyec-
ción e inyectar rápidamente después de 1o2s egundos. Después de 5
segundos aproximadamente, extraer lentamente la aguja.
5.2.3.2. Llevar a cabo el registro hasta que las ceras se hayan eluido completa-
mente.
La línea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas
(5.2.1.2).
5.2.4. Identificación de lospicos
Identificar los picos sobre la base de los tiempos de retención,
comparándoloscon mezclasde cerasanalizadasen lasmis mascondi-
ciones y cuyos tiempos de retención sean conocidos.
La figura 1 presenta un cromatograma de las ceras de un aceite de oliva
virgen.
5.2.5. Análisis cuantitativo
5.2.5.1. Determinar con ayuda del integrador lasáreasde lospicoscorres pon-
dientesal patrón interno y a losés teresalifáticosde C40 a C46.
5.2.5.2. Determinar el contenido de cada uno de losés teresen mg/kg de materia
grasa, aplicando la siguiente fórmula:
éster (mg/kg) =A
x·ms·►M91 000◄
As·m
siendo:
Ax= área del pico de cada uno de los ésteres;
As= área del pico del laurilaraquidato;
ms= peso, en miligramos, del laurilaraquidato añadido;
m = peso, en gramos, de la muestra tomada para la determinación.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Expresar los contenidos de las distintas ceras y la suma de esos conte-
nidosen mg/kg de materia gras a.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 16
▼M6
APÉNDICE
Determinación de la velocidad lineal del gas
Inyectar de 1 a 3 µl de metano (propano) en el cromatógrafo de gases, después
de haberlo ajustado a las condiciones de ensayo normales. Medir el tiempo que
tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de su inyección hasta la
aparición del pico (tM).
La velocidad lineal en cm/segundo viene dada por la fórmula L/tM, siendo L la
longitud de la columna expresada en cm y tMel tiempo medido en segundos.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 17
▼M61991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 18
▼B
ANEXO V
DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DEL CONTENIDO DE
ESTEROLES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON
COLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de esteroles en las materias grasas, expresado como
contenido de cada uno de loses terolesanalizadosy como contenido
total de esteroles.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadio α-coles-
tanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
potásico; a continuación, extracción del insaponificable con éter etílico.
Separación de la fracción de esteroles del insaponificable extraído
mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los esteroles
recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se
analizan mediante cromatografía de gases con columna capilar.
3. MATERIAL
3.1. Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo con juntas esme-
riladas.
3.2. Embudosde s eparación de 500 ml.
3.3. Matracesde 250 ml.
3.4. Equipo completo de cromatografía en capa fina, utilizando placasde
vidrio de 20 × 20 cm.
3.5. Lámpara ultravioleta de una longitud de onda de 366 o 254 nm.
3.6. Microjeringa de 100 µl y 500 µl.
3.7. Embudo cilíndrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 µm),
de 2 cm de diámetro y 5 cm de altura, aproximadamente, con un dispo-
sitivo adecuado para la filtración en vacío y una junta esmerilada
macho 12/21.
3.8. Matraz cónico para vacío de 50 ml, con junta esmerilada hembra 12/21
acoplable al embudo filtrante (3.7).
3.9. Probeta de 10 ml de fondo cónico con tapón hermético.
3.10. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna
capilar, provisto de un sistema de división de flujo formado por:
3.10.1. Horno para la columna, que pueda mantener la temperatura deseada con
precisión de ± 1 ºC.
3.10.2. Inyector con elemento vaporizador de vidrio tratado con persilano.
3.10.3. Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplifi-
cador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y
con velocidad de papel variable.
3.11. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de 20 a 30 m de longitud y
de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interno, recubierta interiormente de
líquido SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile
entre 0,10 y 0,30 µm.
3.12. Microjeringa de 10 µl para cromatografía de gases, con aguja endure-
cida.
4. REACTIVOS
4.1. Hidróxido potásico, solución etanólica 2N aproximadamente: disolver,
enfriando al mismo tiempo, 130 g de hidróxido potásico (valoración
mínima del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un
litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio oscuro
bien cerradas.
4.2. Éter etílico de calidad para análisis.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 19
▼B
4.3. Sulfato sódico anhidro de calidad para análisis.
4.4. Placas de vidrio recubiertas con gel de sílice, sin indicador de fluores-
cencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya
preparadaspara el us o).
4.5. Hidróxido potásico, solución etanólica 0,2N: disolver 13 g de hidróxido
potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con
etanol.
4.6. Benceno para cromatografía.
4.7. Acetona para cromatografía. (Véase 5.2.2).
4.8. Hexano para cromatografía. (Véase 5.2.2).4.9. Éter etílico para cromatografía. (Véase 5.2.2).4.10. Cloroformo de calidad para análisis.
4.11. Solución patrón para cromatografía en capa fina: colesterol o fitoste-
roles, solución al ►
M62%◄en cloroformo.
4.12. Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol. Para hacerla
ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2N
de hidróxido potásico.
4.13. Piridina anhidra para cromatografía.
4.14. Hexametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Solución problema de trimetilsililéteres de los esteroles: preparar en el
momento del uso a partir de esteroles puros o de mezclas de esteroles
obtenidosde aceitesque loscontengan.
4.17. α-colestanol, disolución al 0,2 % (m/V) en cloroformo (patrón interno).
4.18. Gas portador: hidrógeno o helio de calidad para cromatografía de gases.4.19. Gases auxiliares:
— hidrógeno de calidad para cromatografía de gases,
— aire de calidad para cromatografía de gases.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparación del insaponificable.5.1.1. Con la microjeringa de 500 µl introducir en el matraz de 250 ml un
volumen de disolución de α-colestanol al 0,2 % en cloroformo (4.17)
que contenga una cantidad de α-colestanol correspondiente al 10 %
aproximadamente del contenido de esteroles en la alícuota de la
muestra para la determinación. Por ejemplo, para 5 g de muestra añadir
500 µl de la solución de α-colestanol al 0,2 %, si se trata de aceite de
oliva, y 1 500 µl, si se trata ►
M6 ◄de aceite de orujo
de oliva.
Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación,
pesar con precisión, en el mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada.
En el caso de aceites ►M6 ◄con un alto contenido de
colesterol puede producirse ön pico cuyo tiempo de retención sea idén-
tico al del colestanol. En tal caso el análisis de la fracción de esteroles
debe realizarse dos veces: con patrón interno y sin él ►M6o hay que
utilizar betulinol en lugar de colestanol ◄.
5.1.2. Añadir 50 ml de solución etanólica de hidróxido potásico 2N, adaptar el
refrigerante de reflujo y calentar en baño María con ligera ebullición,
agitando enérgica e ininterrumpidamente hasta que se produzca la sapo-
nificación (la solución se vuelve límpida). Calentar durante 20 minutos
más y, a continuación, añadir 50 ml de agua destilada por la parte supe-
rior del refrigerante; separar el refrigerante y enfriar el matraz a 30 ºC
aproximadamente.
5.1.3. Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de
separación de 500 ml, mediante varios lavados con un total aproximado
de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éter
etílico, agitar enérgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar
hasta la separación de las fases (nota 1).
Separar la fase acuosa inferior pasándola a un segundo embudo de
separación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el
mismo procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de éter etílico.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 20
▼B
Nota 1: Las posibles emulsiones podrán eliminarse añadiendo pequeñas
cantidadesde alcohol etílico o metílico con un pulverizador.
5.1.4. Reunir las fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y
lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de
lavado presente reacción neutra.
Una vez eliminada el agua de lavado, secar con sulfato sódico anhidro
y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml previa-
mente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeñas cantidades
de éter etílico.
5.1.5. Destilar el éter hasta que queden unos pocos ml; a continuación, secar
con un vacío ligero o en una corriente de nitrógeno, completando el
secado en una estufa a 100 ºC durante 15 minutos aproximadamente;
dejar enfriar en un desecador y pesar.
5.2. Separación de la fracción de esteroles.
5.2.1. Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas
con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2N de hidróxido
potásico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana
durante doshorasy, por último, mantenerlasen una es tufa regulada a
100 ºC durante una hora. Sacarlas de la estufa y conservarlas en un
desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas
sometidas a este tratamiento deberán utilizarse en un plazo de quince
díascomo máximo).
Nota 2: Si se utilizan placas básicas de gel de sílice para la separación
de la fracción de esteroles, ya no es necesario tratar el insapo-
nificable con alúmina. De este modo, todos los compuestos de
naturaleza ácida (ácidos grasos y otros) quedan retenidos en la
línea de aplicación, y la banda de loses terolesaparece perfec-
tamente diferenciada de la banda de losalcoholesalifáticosy
triterpénicos.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de
benceno-acetona 95:5 (v/v) hasta una altura de 1 cm aproximadamente.
Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y éter etílico
65:35 (v/v). Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y dejar trans-
currir media hora como mínimo, de forma que se alcance el equilibrio
líquido-vapor. En lascarasinterioresde la cubeta pueden colocars e tiras
de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el
tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elución
másuniforme y regular de loscomponentes .
Nota 3: Para que lascondicionesde elución s ean perfectamente repro-
ducibles, la mezcla de desarrollo deberá cambiarse en cada
prueba.
5.2.3. Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 %
aproximadamente y, con la microjeringa de 100 µl, depositar 0,3 ml
de dicha solución en una placa cromatográfica (5.2.1) a unos 2 cm de
uno de los bordes, formando una línea lo más fina y uniforme posible.
A la altura de la línea de aplicación se depositan, en un extremo de la
placa, de 2 a 3 µl de la solución de referencia de esteroles (4.11) para
poder identificar la banda de esteroles una vez efectuado el desarrollo.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el punto 5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura ambiente entre
15 y 20 ºC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca
la elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproxima-
damente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y
evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la
placa bajo una campana unosminutos .
5.2.5. Pulverizar la placa ligera y uniformemente con la solución de 2,7-diclo-
rofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede
identificarse la banda de los esteroles mediante comparación con la
mancha obtenida a partir de la solución de referencia; marcar con
lápiz negro loslímitesde la banda a lo largo de losmárgenesde fluo-
rescencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área
delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el
embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclarcuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo
el filtrado en el matraz cónico (3.8) acoplado al embudo filtrante.
Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando
cada vez unos10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mis mo
matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 21
▼B
un volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al tubo de
ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitrógeno, recoger
con algunas gotas de acetona, evaporar de nuevo hasta sequedad, intro-
ducir en una estufa a 105 ºC durante unos 10 minutos, dejar enfriar en
el desecador y pesar.
El residuo que queda en el tubo de ensayo está formado por la fracción
de esteroles.
5.3. Preparación de los trimetilsililéteres.
5.3.1. Agregar al tubo que contiene la fracción de esteroles el reactivo de sila-
nización formado por una mezcla de piridina-hexametildisilazano-
trimetilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 4), a razón de 50 µl por mili-
gramo de esteroles, evitando toda absorción de humedad (nota 5).
Nota 4: Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además,
también existen otros reactivos de silanización, como el bis-
trimetilsililacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que se
diluye en el mismo volumen de piridina anhidra.
5.3.2. Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la completa
disolución de los esteroles. Dejar reposar un cuarto de hora, como
mínimo, a temperatura ambiente y centrifugar durante algunosminutos ;
la solución límpida queda lista para el análisis mediante cromatografía
de gases.
Nota 5: La formación de una ligera opalescencia es normal y no
ocasiona ninguna interferencia. La formación de una flocula-
ción blanca o la aparición de una coloración rosa son indicios
de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este
caso deberá repetirse la prueba.
5.4. Cromatografía de gases.
5.4.1. Operacionespreliminares : acondicionamiento de la columna.
5.4.1.1. Colocar la columna en el cromatógrafo uniendo uno de losextremosde
la columna al inyector y el otro al detector.
Efectuar loscontrolesgeneralesdel equipo para cromatografía de gas es
(estanquidad de los cricuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del
sistema de división de flujo y del sistema de registro, etc.).
5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla
previamente. Hacer pasar un ligero flujo de gas a través de la columna,
encender el equipo de cromatografía de gases e iniciar un calentamiento
gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 ºC superior a la
temperatura de trabajo (nota 6). Mantener dicha temperatura durante 2
horascomo mínimo; a continuación, poner el equipo completo en
condicionesde funcionamiento (regulación del flujo de gas esy de la
relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador
electrónico, regulación de la temperatura del horno del detector y del
inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos
veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de
base debe ser lineal, exento de picos de cualquier tipo y no debe
presentar deriva.
Una deriva rectilínea negativa indica que lasconexionesde la columna
no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicio-
namiento de la columna esins uficiente.
Nota 6: La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre,
como mínimo 20 ºC inferior a la temperatura máxima prevista
para la fase estacionaria utilizada.
5.4.2. Elección de lascondicionesde trabajo.
5.4.2.1. Las condiciones de trabajo exigidas son las siguientes:
— temperatura de la columna: 260 ºC ± 5 ºC,
—►C1temperatura del inyector ◄: 280 ºC,
— temperatura del detector: 290 ºC,— velocidad lineal del gasportador: helio 20 a 35 cm/s , hidrógeno 30
a 50 cm/s,
— relación de «split» de 1/50 a 1/100,
— sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima,
— sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e.— velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,— cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 µl de solución de TMSE.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 22
▼B
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna y del cromatógrafo, de modo que se obtengan cromato-
gramas que cumplan los siguientes requisitos:
— el tiempo de retención del β-sitosterol debe ser de 20 ± 5 minutos,
— el pico del campesterol debe ser: para el aceite de oliva (contenido
medio del 3 %), 15 ± 5 % del fondo de escala; para el aceite de soja
(contenido medio del 20 %), 80 ± 10 % del fondo de escala,
— se deben separar todos los esteroles presentes; es necesario que los
picos no sólo se separen sino que se resuelvan completamente, es
decir, que el trazo del pico llegue a la línea de base antes de que
se inicie el pico siguiente. No obstante, podrá admitirse una resolu-
ción incompleta si el pico a TRR 1,02 puede cuantificarse
utilizando la perpendicular.
5.4.3. Realización del análisis.
5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 µl tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µl de
aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 µl de la solución problema; elevar
el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la
aguja a través del septum y, después de 1o2segundos, inyectar rápida-
mente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente.
5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los
esteroles presentes.
La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones
exigidas(5.4.1.2).
5.4.4. Identificación de lospicos .
Para la identificación de losdiferentespicoss e utilizan lostiemposde
retención y la comparación con mezclasde TMSE de loses teroles
analizadas en las mismas condiciones.
La elución de los esteroles se efectúa en el orden siguiente: colesterol,
brasicasterol, 24-metilencolesterol, campesterol, campestanol, estigmas-
terol, ∆-7-campesterol, ∆-5,23-estigmastadienol, clerosterol, β-
sitosterol, sitostanol, ∆-5-avenasterol, ∆-5,24-estigmastadienol, ∆-7-
estigmastenol, ∆-7-avenasterol.
En el cuadro I figuran lostiemposde retención corres pondientesal β-
sitosterol para las columnas SE 52 y SE 54.
Las figuras 1 y 2 ilustran los cromatogramas típicos de algunos aceites.
5.4.5. Determinación cuantitativa.5.4.5.1. Calcular lasáreasde lospicosdel α-colestanol y de los esteroles utili-
zando el integrador. No se tomarán en cuenta los picos de aquellos
componentes que no figuren en el cuadro I. El factor de respuesta para
elα-colestanol debe considerarse como 1.
5.4.5.2. Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los esteroles,
expresado en mg/100 g de materia grasa:
esterol x =A
x·ms· 100
As·m
siendo:
Ax: área del pico del esterol x ►M6 ◄,
As: área del pico del α-colestanol,
ms: peso de α-colestanol añadido, en miligramos,
m: peso de la muestra tomado para la determinación, en gramos.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
6.1. ►C1Se expresa ◄el contenido de cada uno de loses terolesen mg/
100 g de materia grasa y, como «esteroles totales», su suma.
6.2. El porcentaje de cada uno de los esteroles simples es la razón entre el
área del pico correspondiente y la suma de las áreas de los picos de los
esteroles.
% del esterol X =Ax
ΣA× 1001991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 23
▼B
siendo:
Ax: área del pico de x,
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 24
▼B
APÉNDICE
Determinación de la velocidad lineal del gas
Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condicionesnormales ,
de 1 a 3 µl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gasen recorrer
la columna, desde el momento de la inyección hasta el momento en que aparece
el pico (tM).
La velocidad lineal en cm/sviene dada por L/tM, s iendo L la longitud de la
columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.
CuadroI
Tiemposde retención relativosde loses teroles
Pi-
coIdentificaciónTiempo de retención
Columna
SE 54Columna
SE 52
1 colesterol ∆5-colesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 colestanol 5 α-colestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brasicasterol [24S]-24-metil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-metilencolesterol 24-metilen- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-metil- ∆5colesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-metil-colestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 estigmasterol [24S]-24-etil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆7-campesterol [24R]-24-metil- ∆7-colesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆ 5,23-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,23-colestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 clerosterol [24S]-24-etil- ∆ 5,25-colestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-etil- ∆5-colesten-3 β-ol 1 1
12 sitostanol 24-etil-colestan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆5-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆5-colesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆ 5,24-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆7-estigmastenol [24R,S]-24-etil- ∆ 7,24-colesten-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆7-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆7-3β-ol 1,16 1,161991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 25
▼B
Figura1
Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva bruto
1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 26
▼B
Figura2
Cromatograma de la fracción de esteroles de un aceite de oliva refinado
1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 27
▼B
ANEXO VI
DETERMINACIÓNDELCONTENIDOENERITRODIOLYUVAOL
INTRODUCCIÓN
El eritrodiol, entendido corrientemente como conjunto de losdioles
eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, característico
de algunos tipos de materias grasas. Su concentración es mucho más
elevada en losaceitesde oliva obtenidosmediante extracción que en los
obtenidosmediante pres ión o en el aceite de pepita de uva y, por lo tanto,
su determinación puede servir para comprobar la existencia de aceite de
oliva obtenido mediante extracción.
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para determinar el eritro-
diol en las materias grasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se saponifica con una solución etanólica de hidróxido
potásico; a continuación se extrae el insaponificable con éter etílico y se
purifica pasándolo por una columna de alúmina.
El fraccionamiento del insaponificable se realiza mediante cromatografía
en capa fina en placa de gel de sílice y se aíslan la banda de la fracción
esterólica y la del eritrodiol.
Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la placa se transforman en
trimetilsililéteres y seguidamente se analiza la mezcla mediante cromato-
grafía de gases.
El resultado se expresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto
de eritrodiol + esteroles.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. El mismo material que el indicado para el método del Anexo V (Deter-
minación del contenido de esteroles).
4. REACTIVOS
4.1. Losmis mosreactivosque losindicadospara el método del Anexo V
(Determinación del contenido de esteroles).
4.2. Solución patrón de eritrodiol al 0,5 % en cloroformo.
5. PROCEDIMIENTO5.1.Preparacióndelinsaponificable
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.1.2 del método del Anexo
V
5.2.Separacióndeleritrodiolylosesteroles
5.2.1. Véase el apartado 5.2.1 del método del Anexo V.
5.2.2. Véase el apartado 5.2.2 del método mencionado.5.2.3. Preparar una solución del insaponificable al 5 % en cloroformo.
Con una microjeringa de 0,1 ml depositar 0,3 ml de esta solución en una
placa cromatográfica a aproximadamente 1,5 cm del borde inferior de la
placa, formando una banda lo más fina y uniforme posible. Depositar en
un extremo de la placa, como referencia, algunosmicrolitrosde lass olu-
cionesde coles terol y eritrodiol.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el apartado 5.2.1. La temperatura ambiente debe ser de unos 20 ºC.
Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la elución hasta
que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximadamente del borde
superior de la placa. Sacar ésta de la cubeta de desarrollo y evaporar el
disolvente en una corriente de aire caliente.
5.2.5. Pulverizar la placa uniformemente con la solución alcohólica de 2 ′,7′-
diclorofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta pueden1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 28
▼B
identificarse las bandas de los esteroles y del eritrodiol mediante compa-
ración con lasreferencias ; delimitar lasbandascon una punta ligeramente
por el exterior de losmárgenesde fluores cencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en las áreas
delimitadas. Reunir el material obtenido en un matraz cónico de 50 ml;
añadir 15 ml de cloroformo caliente, agitar bien y filtrar en el embudo
de filtro poroso vertiendo el gel de sílice sobre el propio filtro. Lavar
tresvecescon 10 ml de cloroformo caliente cada vez, recogiendo el
filtrado en un matraz esférico de 100 ml. Evaporar hasta obtener un
volumen de 4 a 5 ml, transvasar al tubo de centrifugado de fondo cónico
de 10 ml previamente tarado, evaporar hasta sequedad mediante calenta-
miento suave en corriente de nitrógeno y pesar.
5.3.Preparacióndelostrimetilsililéteres
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.3 del método del Anexo V.
5.4.Cromatografíadegases
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4 del método citado. Las
condicionesoperativasde la cromatografía de gas esdeben cumplir los
requisitos necesarios para analizar los esteroles y, además, permitir la
separación de los TMSE del eritrodiol y del uvaol.
Una vez inyectada la muestra, dejar que se desarrolle el proceso hasta
que se produzca la elución de los esteroles presentes, el eritrodiol y el
uvaol; identificar lospicos(el eritrodiol y el uvaol tienen tiemposde
retención relativos, respecto al β-sitosterol, de alrededor de 1,45 y 1,55,
respectivamente) y calcular sus áreas de la misma forma que para los
esteroles.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Eritrodiol, % =A1+A2
A1+A2+ΣAesteroles× 100
siendo:
A1: área del pico del eritrodiol,
A2: área del pico del uvaol ►M6 ◄,
ΣAesteroles: suma de las áreas de los esteroles presentes.
Los resultados deben expresarse con una cifra decimal.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 29
▼B
ANEXO VII
DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS SITUADOS EN LA
POSICIÓN2DELOSTRIGLICÉRIDOSDEACEITESYGRASAS
1. OBJETO
La presente norma describe un método para la determinación de la
composición porcentual de ácidos grasos que se encuentran esterificados
en la posición 2 ►C1(o posición interna) ◄de lostriglicéridos .
2. CAMPO DE APLICACIÓN
La presente norma es aplicable a los aceites y grasas cuyo punto de fusión
se sitúa por debajo de los 45 ºC, debido a las características especiales de
la acción de la lipasa pancreática.
No es aplicable sin reservas a los aceites y grasas que contengan canti-
dadesimportantesde ácidosgras oscon 12 átomosde carbono o menos
(aceites de coco y de palmiste, materias grasas butíricas), de ácidos grasos
altamente insaturados (con más de cuatro enlaces dobles) que tengan 20
átomosde carbono o más(aceitesde pes cado y de mamíferosmarinos ) o
de ácidos grasos que tengan grupos con funciones oxigenadas, además del
grupo ácido.
3. PRINCIPIO
Neutralización de los aceites y grasas si fuera necesario. Purificación
mediante tratamiento en columna de alúmina. Hidrólisis parcial de los
triglicéridosbajo la acción de la lipas a pancreática durante un tiempo
determinado. Separación de losmonoglicéridosres ultantesmediante
cromatografía en capa fina y metanólisis de estos monoglicéridos. Análisis
de los ésteres metílicos mediante cromatografía gas-líquido.
4. EQUIPO
4.1. Matraz de fondo redondo de 100 ml.4.2. Matraz de fondo redondo de 25 ml con boca esmerilada.4.3. Refrigerante de aire de 1 m de longitud, adaptable al matraz 4.2.
4.4. Matraz erlenmeyer de 250 ml.
4.5. Vaso de precipitados de 50 ml.4.6. Embudo de separación de 500 ml.4.7. Columna para cromatografía, de vidrio, con diámetro interior de 13 mm y
longitud de 400 mm, provista de un disco de vidrio poroso y de una llave.
4.8. Tubo de centrífuga de 10 ml con tapón de vidrio esmerilado.4.9. Bureta de 5 ml graduada en 0,05 ml.4.10. Jeringa hipodérmica de 1 ml provista de una aguja fina.4.11. Microjeringa que pueda dispensar gotas de 3-4 µl.
4.12. Aplicador para cromatografía en capa fina.
4.13. Placasde vidrio de 20 × 20 cm para cromatografía en capa fina.4.14. Cubeta de desarrollo para cromatografía en capa fina, de vidrio, provista
de una tapa de vidrio esmerilado, adecuada para las placas de 20 × 20 cm.
4.15. Pulverizador para cromatografía en capa fina.
4.16. Estufa regulada a 103 ± 2 ºC.4.17. Termostato regulable a una temperatura comprendida entre 30 y 45 ºC con
precisión de 0,5 ºC.
4.18. Evaporador rotatorio.
4.19. Vibrador eléctrico, con el que pueda agitarse vigorosamente el tubo de
centrífuga.
4.20. Lámpara ultravioleta para examinar lasplacasde capa fina.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 30
▼B
Para el control de la actividad lipásica:
4.21. pH-metro.
4.22. Agitador espiral.4.23. Bureta de 5 ml.4.24. Cronómetro.
Para la eventual preparación de la lipasa:
4.25. Agitador de laboratorio, adecuado para dispersar y mezclar materiales
heterogéneos.
5. REACTIVOS
5.1. n-Hexano o, en su defecto, éter de petróleo (punto de ebullición 30-50 ºC),
de calidad para cromatografía.
5.2. 2-Propanol, o etanol, 95 % (v/v) de calidad para análisis.
5.3. 2-Propanol, o etanol, solución acuosa 1/1.5.4. Éter dietílico, exento de peróxidos.5.5. Acetona.5.6. Ácido fórmico, al menosde 98 % (p/p).5.7. Solvente de desarrollo: una mezcla de n-hexano (5.1), éter dietílico (5.4) y
ácido fórmico (5.6) en lasproporciones70/30/1 (v/v/v).
5.8. Alúmina activada para cromatografía, neutra, actividad l según Brock-
mann.
5.9. Gel de sílice con aglutinante, de calidad para cromatografía en capa fina.5.10. Lipasa pancreática de calidad adecuada (véanse las notas 1 y 2).5.11. Hidróxido sódico en solución acuosa de 120 g/l.5.12. Ácido clorhídrico, solución acuosa 6 N.5.13. Solución acuosa de 220 g/l de cloruro de calcio (CaCl
2).
5.14. Solución acuosa de 1 g/l de colato sódico (de calidad enzimática).
5.15. Solución tampón: solución acuosa de tris-hidroximetil-aminometano 1 M,
ajustada a pH = 8 con ácido clorhídrico (5.12) (controlar con un potenció-
metro).
5.16. Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol al 95 % (v/v).5.17. Solución de 2 g/l de 2 ′,7′-diclorofluoresceína en etanol al 95 % (v/v);
alcalinizar ligeramente añadiendo 1 gota de solución de hidróxido sódico
1 N por 100 ml.
Para el control de la actividad lipásica:
5.18. Aceite neutralizado.5.19. Solución acuosa de hidróxido sódico 0,1 N.
5.20. Solución acuosa de 200 g/l de colato sódico (de calidad enzimática).
5.21. Solución acuosa de 100 g/l de goma arábiga.
6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al método del Anexo
II esinferior al 3 %, s e efectuará directamente la purificación en columna
de alúmina como se describe en el punto 6.2.
Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al método del Anexo
II, es superior al 3 %, se efectuará una neutralización alcalina en presencia
de un solvente, como se describe en el punto 6.1, y a continuación e
realizará la purificación en columna de alúmina descrita en el punto 6.2.
6.1. Neutralización alcalina en presencia de un solvente.
Introducir en el embudo de separación (4.6) aproximadamente 10 g de
aceite crudo y añadir 100 ml de hexano (5.1), 50 ml de 2-propanol (5.2),
algunas gotas de solución de fenolftaleína (5.16) y el volumen de solución
de hidróxido sódico (5.11) correspondiente a la acidez libre del aceite más1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 31
▼B
un 0,3 % de exceso. Agitar enérgicamente durante 1 minuto, añadir 50 ml
de agua destilada, agitar de nuevo y dejar reposar.
Una vez que se haya producido la separación, separar la capa inferior que
contiene los jabones. Separar, asimismo, todas las capas intermedias
(mucílago, materias insolubles). Lavar la solución de hexano delaceite
neutralizado con porciones sucesivas de 25-30 ml de la solución de 2-
propanol (5.3), hasta que desaparezca el color rosa de la fenolftaleína.
Eliminar la mayor parte del hexano mediante destilación en vacío en el
evaporador rotatorio (4.18); desecar el aceite en vacío a 30-40 ºC
mediante una corriente de nitrógeno puro hasta la completa eliminación
del hexano.
6.2. Purificación con alúmina.
Preparar una suspensión de 15 g de alúmina activada (5.8) en 50 ml de
hexano (5.1) y verterla en la columna cromatográfica (4.7), removiendo
al mismo tiempo. Dejar que la alúmina se asiente uniformemente y
esperar a que el nivel del solvente descienda a 1-2 mm por encima del
absorbente. Verter cuidadosamente en la columna 5 g de aceite disueltos
en 25 ml de hexano (5.1); recoger todo el eluyente de la columna en un
matraz de fondo redondo (4.1).
7. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS
Limpiar perfectamente lasplacasde vidrio (4.13) con etanol, éter de
petróleo y acetona para eliminar cualquier rastro de materia grasa.
Introducir en un matraz erlenmeyer (4.4) 30 g de polvo de sílice (5.9).
Añadir 60 ml de agua destilada. Tapar y agitar enérgicamente durante 1
minuto. Transferir inmediatamente al aplicador la mezcla semifluida
(4.12) y recubrir las placas limpias con una capa de 0,25 mm de espesor.
Secar lasplacasal aire durante 15 minutosy a continuación en la es tufa
(4.16) a 103 ± 2 ºC durante 1 hora. Antesdel us o, enfriar lasplacasen un
desecador a temperatura ambiente. En el comercio pueden adquirirse
placaspreparadas .
8. PROCEDIMIENTO
8.1. Hidrólisis con lipasa pancreática.
Pesar en el tubo de centrífuga (4.8) 0,1 g aproximadamente de la muestra
preparada; si la muestra es aceite líquido, proceder como se indica a
continuación; si es una grasa sólida, disolverla en 0,2 ml de hexano
(5.1), aplicando, si es necesario, un ligero calentamiento.
Añadir 20 mg de lipasa (5.10) y 2 ml de solución tampón (5.15). Agitar
bien, pero con cuidado, y añadir a continuación 0,5 ml de la solución de
colato sódico (5.14) y 0,2 ml de la solución de cloruro de calcio (5.13).
Cerrar el tubo con el tapón esmerilado, agitar cuidadosamente (evitando
humedecer el tapón) e introducir el tubo inmediatamente en el termostato
(4.17) a 40 ± 0,5 ºC y agitar manualmente durante 1 minuto exacto.
Sacar el tubo del termostato y agitar enérgicamente con el vibrador eléc-
trico (4.19) durante 2 minutosexactos .
Enfriar de inmediato en agua corriente; añadir 1 ml de ácido clorhídrico
(5.12) y 1 ml de éter dietílico (5.4). Tapar y mezclar enérgicamente con el
vibrador eléctrico. Dejar en reposo y extraer la capa orgánica con la
jeringa (4.10), tras centrifugar si fuese necesario.
8.2. Separación de losmonoglicéridospor cromatografía en capa fina.
Con ayuda de la microjeringa (4.11) colocar el extracto a 1,5 cm aproxi-
madamente del borde inferior de la placa cromatográfica, depositándolo
de manera que forme una línea fina, uniforme y lo más estrecha posible.
Introducir la placa en una cubeta de desarrollo (4.14) bien saturada y
desarrollar con el solvente de desarrollo (5.7) a unos 20 ºC hasta 1 cm
aproximadamente del borde superior de la placa.
Secar la placa al aire a la temperatura de la cubeta y pulverizarla con la
solución de 2 ′,7′-diclorofluoresceína (5.17). Identificar la banda de los
monoglicéridos(Rfaproximadamente 0,035) con luz ultravioleta (4.20).
8.3. Análisis de los monoglicéridos por cromatografía gas-líquido.
Raspar con una espátula la banda citada en el punto 8.2 (procurando no
raspar los componentes que permanezcan en la línea de base) y pasarla
al matraz de metilación (4.2). Tratar directamente la sílice recogida
como se indica en el Anexo X-B, de modo que los monoglicéridos se1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 32
▼B
transformen en ésteres metílicos, y, a continuación, examinar los ésteres
mediante cromatografía en fase gaseosa, como se describe en el Anexo
X-A.
9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Calcular la composición de los ácidos grasos situados en la posición y
expresar el resultado con una cifra decimal (nota 3).
10. NOTAS
Nota 1: Control de la actividad lipásica
Preparar una emulsión oleosa como sigue: agitar en un mezclador
adecuado una mezcla constituida por 165 ml de solución de goma
arábiga (5.21), 15 g de hielo picado y 20 ml de aceite neutrali-
zado (5.18).
En un vaso de precipitados (4.5) introducir 10 ml de esta emul-
sión, 0,3 ml de solución de colato sódico (5.20) y 20 ml de agua
destilada.
Colocar el vaso en un termostato a 37 ºC ± 0,5 ºC (nota 4) e
introducir loselectrodosdel pH-metro (4.21) y un agitador es piral
(4.22); después, añadir gota a gota con una bureta (4.23) solución
de hidróxido sódico (5.19) hasta obtener un pH de 8,5.
Añadir una suspensión acuosa de la lipasa (véase a continuación)
en cantidad suficiente. Se mide el pH y, tan pronto como alcance
el valor de 8,3, se pone en marcha un cronómetro y se va
añadiendo la disolución de hidróxido sódico (5.19) gota a gota,
con la velocidad necesaria para mantener constante el pH de
8,3; anotar cada minuto el volumen de solución alcalina consu-
mido.
Llevar los datos obtenidos a un sistema de ejes de coordenadas,
indicando en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros
de solución alcalina necesarios para mantener constante el pH.
Deberá obtenerse una gráfica lineal.
La suspensión de lipasa mencionada es una suspensión en agua al
1/1 000 (p/p). Deberá emplearse en cada ensayo una cantidad
suficiente de esta suspensión, de modo que en 4 o 5 minutos se
consuma 1 ml de solución alcalina aproximadamente. Normal-
mente se necesitan de 1 a 5 mg de polvo.
La unidad lipásica se define como la cantidad de enzima que
libera 10 µeq de ácido por minuto. La actividad A del polvo utili-
zado, medida en unidades lipásicas por mg, se calcula medianteesta fórmula:
A¼V/C210
p
siendo:
V = volumen de solución de hidróxido sódico (5.19) consu-
mido por minuto (calculado a partir de la gráfica),
p = peso, en mg, de la muestras problema de polvo.
Nota 2: Preparación de la lipasa
En el comercio pueden encontrarse lipasas de actividad lipásica
satisfactoria. También es posible prepararlas en laboratorio de la
manera siguiente: tomar 5 kg de páncreas fresco de cerdo, refri-
gerado a 0 ºC; eliminar la grasa sólida y el tejido conjuntivo que
lo rodean, y triturar en un molino de cuchillashas ta obtener una
pasta fluida. Con un agitador (4.25) agitarla pasta junto con 2,5 l
de acetona anhidra, durante 4-6 horasy des puéscentrifugar.
Efectuar tres extracciones más del residuo con el mismo volumen
de acetona anhidra, dosextraccionescon una mezcla de acetona y
éter etílico 1: 1 (V/V), y dosextraccionescon éter etílico, en es te
orden.
Desecar el residuo al vado durante 48 horas para obtener un
polvo estable, que debe almacenarse en un refrigerador.
Nota 3: Es aconsejable en todos los casos determinar la composición de
los ácidos grasos totales de la misma muestra, ya que la compa-
ración con la de los ácidos situados en la posición 2 facilitará la
interpretación de lascifrasobtenidas .1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 33
▼B
Nota 4: Por tratarse de un aceite líquido, la hidrólisis se efectúa a 37 ºC.
No obstante, en el caso de la muestra problema se efectuará a
40 ºC a fin de que puedan examinarse las grasas con puntos de
fusión de hasta 45 ºC.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 34
▼B
ANEXO VIII
DETERMINACIÓNDELPORCENTAJEDETRILINOLEÍNA
1. OBJETO
Determinación ►C1del porcentaje de trilinoleína de losaceitesvegetales
mediante cromatografía líquida de alta resolución ◄.
La presente norma describe un método para efectuar la separación y deter-
minación de la composición de los triglicéridos de los aceites vegetales
según su peso molecular y grado de insaturación ►C1expresado por ◄
su número equivalente de carbonos (véase la nota 1).
2. CAMPO DE APLICACIÓN
La presente norma es aplicable a todos los aceites vegetales que contengan
triglicéridos de ácidos grasos de cadena larga. Este método es especial-
mente adecuado para detectar la presencia de pequeñas cantidades de
aceites semisecantes (ricos en ácido linoleico) en aceites vegetales cuyo
principal ácido graso insaturado sea el ácido oleico, como es el caso de
losaceitesde oliva.
3. PRINCIPIO
Separación de lostriglicéridosen función de s u número equivalente de
carbonos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase
inversa e interpretación de los cromatogramas.
4. APARATOS
4.1. Cromatógrafo de líquidos de alta resolución con control termostático de la
temperatura de la columna.
4.2. Sistema de inyección con un volumen de 10 µl.4.3. Detector: refractómetro diferencial. La sensibilidad en toda la escala deberá
ser como mínimo de 10
−4unidadesde índice de refracción.
4.4. Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de
diámetro interior, rellena de partículasde s ílice de 5 µm de diámetro con
un 22-23 % de carbono en forma de octadecilsilano (nota 2).
4.5. Registrador y/o integrador.
5. REACTIVOS
Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de
elución deberán desgasificarse y podrán reciclarse varias veces sin que
ello afecte a las separaciones.
5.1. Cloroformo.5.2. Acetona.5.3. Acetonitrilo.5.4. Fase móvil: acetonitrilo + acetona (las proporciones se ajustarán para
obtener la separación deseada; comenzar con una mezcla 50:50).
5.5. Disolvente de solubilización: acetona o mezcla de acetona-cloroformo 1:1.5.6. Triglicéridosde referencia: pueden utilizars e bien triglicéridoscomerciales
(tripalmitina, trioleína, etc.), en cuyo caso se reflejarán en un gráfico los
tiemposde retención frente al número equivalente de carbonos , alternativa-
mente un cromatograma de referencia del aceite de soja (véanse las notas 3
y 4 y lasfiguras1 y 2).
6. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Preparar del siguiente modo una solución al 5 % de las muestras que vayan
a analizarse: pesar 0,5 ± 0,001 g de la muestra en un matraz aforado de
10 ml y enrasar hasta 10 ml con el disolvente de solubilización (5.5).
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Instalar el sistema cromatográfico. Bombear fase móvil (5.4) a razón de
1,5 ml/mm para purgar el sistema completo. Esperar hasta que se obtenga1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 35
▼B
una línea de base estable. Inyectar 10 µl de la muestra preparada como se
indica en el punto 6.
8. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Utilícese el método de normalización interna, es decir, considérese que la
suma de las áreas de los picos de los diferentes triglicéridos es igual a
100 %. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicérido mediante esta
fórmula:
% del triglicérido =área del pico
suma de las áreas de los picos× 100
El resultado se expresa con un decimal.
Nota 1: El orden de elución puede determinarse calculando el número
equivalente de carbonos, que a menudo viene dado por la relación
NEC = NC − 2n, siendo NC el número de carbonos y n el número
de enlaces dobles; es posible calcularlo con una precisión mucho
mayor tomando en consideración el origen del enlace doble. Si
no,nlynlnson el número de enlaces dobles atribuible a los ácidos
oleico, linoleico y linolénico, respectivamente, el número equiva-
lente de carbonos puede calcularse mediante la relación siguiente:
NEC = NC − dono−dlnl−dlnnln
Loscoeficientesdo,dlydlnpueden calcularse mediante los triglicé-
ridosde referencia.
En las condiciones que se especifican en el presente método, la
relación que se obtenga será similar a la siguiente:
NEC = NC − [2,60 no] − [2,35 nl] − [2,17 nln]
Nota 2: Ejemplos: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333;
Lichrosphere (Merck) 100 CH 18 Art 50377 o similares.
Nota 3: Algunostriglicéridosde referencia también permiten calcular la
resolución respecto a la trioleínai:
α=T R′/TR′oleína
utilizando el tiempo de retención corregido TR ′= TR − TR disol-
vente.
La representación gráfica del log αfrente a f (número de enlaces
dobles) permite determinar los valores de retención de todos los
triglicéridosde losácidosgras oscontenidosen lostriglicéridos
de referencia (véase la figura 2).
Nota 4: La eficacia de la columna debe permitir separar claramente el pico
de la LLL (trilinoleína) de lostriglicéridoscon tiempo de reten-
ción próximo.
Nota 5: En el cas o de losaceitesvírgeneslampantesy de losaceitesde
orujo de oliva brutos, para obtener una buena separación del pico
de la trilinoleína de los picos adyacentes o de posibles sustancias
interferentes, se debe purificar previamente el aceite según la
metodología siguiente:
Se lleva a cabo la absorción de 200 µl de aceite sin diluir en una
columnita de sílice sólida para extracción de líquido (tipo SEP
PAK silica cartridge-waters part. no51900).
La elución de lostriglicéridoss e efectúa con 20 ml de hexano
anhidro para HPLC en un tiempo máximo de 20 segundos.
El producto eluido se seca en una corriente de nitrógeno y se
recoge con isopropanol o acetona (5 ml). Se inyectan entre 10 y
20µl en HPLC. Es necesario comprobar que la composición de
ácidos grasos del aceite sea la misma antes y después de la purifi-
cación, dentro de loslímitesde error del método analítico
adoptado.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 36
▼M11
▼B
Figura1
Cromatograma de una muestra de aceite de soja
Nota:P: ácido palmítico; St: ácido esteárico; O: ácido oleico; L: ácido
linoleico; Ln: ácido linolénico1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 37
▼B
Figura2
Representación gráfica del log alfa frente a f (número de enlaces dobles)
Nota:La: ácido laúrico; My: ácido mirístico; P: ácido palmítico; St: ácido
esterárico; O: ácido oleico; L: ácido linoleico; Ln: ácido linolénico.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 38
▼B
ANEXO IX
PRUEBAESPECTROFOTOMÉTRICAENELULTRAVIOLETA
INTRODUCCIÓN
La prueba espectrofotométrica en el ultravioleta puede proporcionar indica-
ciones sobre la calidad de una materia grasa, su estado de conservación y
las modificaciones inducidas por los procesos tecnológicos.
Lasabs orcionesen laslongitudesde onda indicadasen el método s e deben
a la presencia de sistemas diénicos y triénicos ►C1conjugados ◄. Los
valores de estas absorciones se expresan en extinción específica E1cm1%
(extinción de una solución de la materia grasa al 1 % en el disolvente
determinado, en un espesor de 1 cm) que se expresará convencionalmente
como K, también denominado coeficiente de extinción.
1. OBJETO
El método describe el procedimiento de ejecución de la prueba espectrofo-
tométrica en el ultravioleta de las materias grasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la
extinción de la solución a las longitudes de onda prescritas, respecto al
disolvente puro. A partir de los valores espectrofotométricos se calculan
las extinciones específicas.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Espectrofotómetro para medidas de extinción en el ultravioleta entre 220 y
360 nm, con posibilidad de lectura para cada unidad nanométrica.
3.2. Cubetas de cuarzo, con tapadera, con paso óptico de 1 cm. Las cubetas,
llenas de agua o de otro disolvente adecuado, no deben presentar entre ellas
diferenciass uperioresa 0,01 unidadesde extinción.
3.3. Matracesaforadosde 25 ml.
3.4. Columna de cromatografía de 270 mm de longitud y 35 mm de diámetro en
la parte superior: de 270 mm de longitud y 10 mm de diámetro en la parte
inferior.
4. REACTIVOS
4.1. Isooctano (2,2,4-trimetilpentano) de calidad para espectrofotometría: debe
tener, respecto al agua destilada, una transmitancia del 60 % como mínimo
a 220 nm y del 95 % como mínimo a 250 nm; o
— ciclohexano de calidad para espectrofotometría: debe tener, respecto al
agua destilada, una transmitancia del 40 % como mínimo a 220 nm y
del 95 % como mínimo a 250 nm.
4.2. Alúmina básica para cromatografía en columna, preparada y controlada
como se describe en el apéndice I.
4.3. n-Hexano para cromatografía.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. La muestra debe ser perfectamente homogénea y estar exenta de impurezas
en suspensión. Los aceites líquidos a temperatura ambiente se filtran con
papel de filtro a una temperatura aproximada de 30 ºC, las grasas sólidas
se homogeneizan y se filtran a una temperatura superior en 10 ºC como
máximo a su temperatura de fusión.
5.2. Se pesan con precisión 0,25 g aproximadamente de la muestra preparada y
se colocan en un matraz aforado de 25 ml, se completa con el disolvente
adecuado y se homogeneiza. La solución resultante debe estar perfecta-
mente clara. Si presenta opalescencia o turbidez, se filtrará rápidamente
con papel de filtro.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 39
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3. Se llena una cubeta con la solución obtenida y se miden las extinciones,
usando como referencia el disolvente empleado, a las longitudes de onda
comprendidasentre 232 y 276 nm. Losvaloresde extinción obtenidos
deben estar comprendidos en el intervalo entre 0,1 y 0,8; en caso contrario
es necesario repetir la medida utilizando soluciones más concentradas o
más diluidas según el caso.
5.4. Cuando se quiera determinar la extinción específica después del tratamiento
con alúmina se procederá del siguiente modo: en la columna para cromato-
grafía se introducen 30 g de alúmina básica en suspensión en hexano;
después de asentarse el absorbente se elimina el exceso de hexano, hasta
1 cm aproximadamente sobre el nivel superior de la alúmina.
Se disuelven 10 g de materia grasa, homogeneizada y filtrada tal como se
describe en el punto 5.1, en 100 ml de hexano y se vierte esta solución en
la columna. Se recoge el líquido eluido y se evapora totalmente el disol-
vente en vacío a una temperatura inferior a 25 ºC.
Con la materia grasa así obtenida se procede inmediatamente tal como se
indica en el punto 5.2.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
6.1. Se expresan las extinciones específicas o coeficientes de extinción a las
diversas longitudes de onda, calculadas como sigue:
Kλ¼Eλ
c:e:
siendo:
Kλ= extinción específica a la longitud de onda lambda,
Eλ= extinción medida a la longitud de onda lambda,
c = concentración de la disolución en g por 100 ml,
e = espesor de la cubeta en cm.
Los resultados deben expresarse con dos cifras decimales.
6.2. La prueba espectrofotométrica del aceite de oliva según el método oficial
de losReglamentosde la CEE requiere la determinación de la extinción
específica, en solución en isooctano, a las longitudes de onda de 232 y
270 nm, y la determinación de ∆E definido como:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
donde Kmesla extinción es pecífica a la longitud de onda m, longitud de
onda de máxima absorción alrededor de 270 nm.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 40
▼B
APÉNDICE I
Preparación de la alúmina y control de su actividad
A.1.1. Preparación de la alúmina
En un recipiente que pueda cerrarse herméticamente se echa la alúmina
previamente desecada en horno a 380-400 ºC durante tres horas, se añade
agua destilada en una proporción de 5 ml por 100 g de alúmina, se cierra
rápidamente el recipiente, se agita repetidas veces y se deja reposar
durante 12 horascomo mínimo antesdel us o.
A.1.2. Control de la actividad de la alúmina
Se prepara una columna para cromatografía con 30 g de alúmina. Se
opera tal como se describe en el apartado 5.4. Se hace pasar a través de
la columna una mezcla formada por:
— 95 % de aceite de oliva virgen, con extinción específica a 268 nm
menor que 0,18,
— 5 % de aceite de cacahuete tratado con tierrasdecolorantesen el
proceso de refinado, con una extinción específica a 268 nm mayor o
igual que 4.
Si, después del paso por la columna, la mezcla presenta una extinción
específica a 268 nm mayor que 0,11, la alúmina es aceptable; en otro
caso se debe aumentar el porcentaje de hidratación.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 41
▼B
APÉNDICE II
Ajuste del espectrofotómetro
A.2. El aparato debe revisarse periódicamente (por lo menos cada seis meses)
tanto en lo que se refiere a la conformidad de la longitud de onda como a
la exactitud de la respuesta.
A.2.1. El control de la respuesta de la longitud de onda puede hacerse mediante
una lámpara de vapor de mercurio o mediante filtrosadecuados .
A.2.2. Para controlar la célula fotoeléctrica y el fotomultiplicador se procede
como sigue: se pesan 0,2 g de cromato potásico de calidad para espectro-
fotometría, se disuelven, en un matraz aforado de 1 000 ml, en una
solución de hidróxido potásico 0,05 N y se completa hasta el enrase.
De la solución obtenida se toman exactamente 25 ml, se transvasan a
un matraz aforado de 500 ml y se completa hasta el enrase con la misma
solución de hidróxido potásico.
Se mide la extinción a 275 nm de la solución así obtenida, utilizando la
solución de hidróxido potásico como referencia. La extinción medida en
cubeta de 1 cm deberá ser de 0,200 ± 0,005.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 42
▼B
ANEXO X «A»
ANÁLISISDELOSÉSTERESMETÍLICOSDELOSÁCIDOSGRASOS
MEDIANTECROMATOGRAFÍADEGASES
1. OBJETO
El presente ►C1método ◄proporciona orientacionesgeneralespara
determinar, mediante cromatografía de gases con columna de relleno o
capilar, la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de
ésteres metílicos de ácidos grasos obtenidos con arreglo al Anexo X B.
El método no es aplicable a los ácidos grasos polimerizados.
2. REACTIVOS
2.1.Gasportador
Gasinerte (nitrógeno, helio, argón, hidrógeno, etc.), perfectamente
desecado y que contenga menos de 10 mg/kg de oxígeno.
Nota 1: El hidrógeno, que sólo se emplea como gas portador en las
columnas capilares, puede duplicar la velocidad del análisis,
pero es peligroso. Existen dispositivos de seguridad.
2.2. Gases auxiliares
2.2.1. Hidrógeno (pureza ≥99,9 %) exento de impurezasorgánicas .
2.2.2. Aire u oxígeno, exento de impurezasorgánicas .
2.3.Patróndereferencia
Una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos puros, o los ésteres
metílicos de una grasa de composición conocida y, preferentemente,
similar a la de la materia grasa objeto de análisis.
Deberá evitarse la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.
3. APARATOS
Lasnormasque figuran a continuación s e refieren al equipo ordinario
para cromatografía de gases, utilizando columnas de relleno y/o capi-
laresy un detector de ionización de llama. Podrá utilizars e cualquier
aparato cuya eficacia y resolución se ajusten a lo dispuesto en el punto
4.1.2.
3.1.Cromatógrafodegases
El cromatógrafo de gases constará de los siguientes elementos:
3.1.1. Sistema de inyección
Utilizar un sistema de inyección:
a) con columnasde relleno, con un es pacio muerto lo máspequeño
posible (en este caso, el sistema de inyección podrá calentarse a
una temperatura que sea entre 20 y 50 ºC superior a la de la
columna); o
b) con columnas capilares; en este caso, el sistema de inyección estará
especialmente diseñado para poder operar con esa clase de
columnas; podrá utilizarse un inyector con división de flujo o un
inyector «on column».
Nota 2: En ausencia de ácidos grasos con menos de 16 átomos de
carbono, podrá utilizarse un inyector de aguja móvil.
3.1.2. Horno
El horno podrá calentar la columna a 260 ºC como mínimo y mantener
dicha temperatura con una oscilación máxima de 1 ºC, si se emplea una
columna de relleno, y de 0,1 ºC, si se emplea una columna capilar. Este
último requisito es especialmente importante si se utiliza una columna
de sílice fundida.
Se recomienda emplear en todos los casos un sistema de calentamiento
programado, sobre todo en el caso de ácidos grasos con menos de 16
átomosde carbono.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 43
▼B
3.1.3. Columna de relleno
3.1.3.1. Columna de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(es decir, vidrio o acero inoxidable) y de las dimensiones siguientes:
a) Longitud: de 1 a 3 m. Con ácidosgras osde cadena larga (másde
C20) esconveniente utilizar una columna relativamente corta. Para
el análisis de ácidos con 4 o 6 átomos de carbono se recomienda
una columna de 2 m.
b) Diámetro interior: de 2 a 4 mm.
Nota 3: Si hay componentespoliins aturadoscon másde tresenlaces
dobles, pueden descomponerse en una columna de acero inoxi-
dable.
Nota 4: Puede utilizarse un sistema con doble columna de relleno.
3.1.3.2. Relleno, que incluya los siguientes elementos:
a)Soporte: tierra de diatomeaslavada con ácido y s ilanizada, u otro
soporte inerte adecuado, con un margen estrecho de tamaño de
grano (margen de 25 µm, entre 125 y 200 µm); el tamaño medio
de grano estará en función del diámetro interior y de la longitud de
la columna.
b)Fase estacionaria: líquido polar de tipo poliéster (por ejemplo: poli-
succinato de dietilenglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato
de etilenglicol, etc.), cianosiliconas o cualquier otro líquido que
permita efectuar la separación cromatográfica exigida (véase el
punto 4). La fase estacionalia deberá constituir del 5 % (m/m) al
20 % (m/m) del relleno. Para algunas separaciones podrá utilizarse
una fase fija no polar.
3.1.3.3. Acondicionamiento de la columna
Estando la columna desconectada del detector, si es posible, calentar el
horno gradualmente hasta 185 ºC y hacer pasar a través de la columna
recién preparada una corriente de gasinerte a razón de 20-60 ml/min
durante 16 horascomo mínimo a la temparatura citada y, a continua-
ción, a la temperatura de 195 ºC durante 2 horasmás .
3.1.4. Columna capilar3.1.4.1. Tubo de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(generalmente, vidrio o sílice fundida). El diámetro interior estará
comprendido entre 0,2 y 0,8 mm. La superficie interior se someterá a
un tratamiento adecuado (por ejemplo, preparación de la superficie,
inactivación) antesde introducir el recubrimiento de fas e fija. En la
mayoría de casos, es suficiente una longitud de ►
C125 m◄.
3.1.4.2. Fase estacionaria de tipo poliglicol [poli(etilenglicol) 20 000], poliéster
(polisuccinato de butanodiol) o polisiloxano polar (cianosiliconas),generalmente. Son apropiadaslascolumnasde fas e químicamente
ligada.
Nota 5: Existe el riesgo de que los polisiloxanos polares dificulten la
identificación y separación del ácido linolénico y de los ácidos
C
20.
El espesor de la fase estará comprendido entre 0,1 y 0,2 µm.
3.1.4.3. Montaje y acondicionamiento de la columna.
Observar las precauciones normales de montaje de columnas capilares
(esdecir, ins talación de la columna en el horno, elección y montaje de
lasjuntas(es tanqueidad), conexión de losextremosde la columna al
inyector y al detector (reducción de los espacios muertos). Colocar la
columna bajo un flujo de gasportador [por ejemplo, 0,3 bar (30 kPa)
para una columna de ►C125 m◄de longitud y 0,3 mm de diámetro
interior].
Acondicionar la columna programando el gradiente de temperatura del
horno a 3 ºC/min a partir de la temperatura ambiente hasta alcanzar una
temperatura 10 ºC inferior al límite de descomposición de la fase esta-
cionaria. Mantener el horno a esa temperatura durante 1 hora hasta que
se estabilice la línea de base. Restablecer la temperatura de 180 ºC para
trabajar en condiciones isotérmicas.
Nota 6: En el comercio pueden obtenerse columnas adecuadas previa-
mente acondicionadas.
3.1.5. Detector que puede calentarse a una temperatura superior a la de la
columna.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 44
▼B
3.2.Jeringa
Tendrá una capacidad máxima de 10 µl y estará graduada en 0,1 µl.
3.3.Registrador
Si se emplea la curva del registrador para calcular la composición de la
mezcla analizada, se necesita un registrador electrónico de alta preci-
sión compatible con los aparatos utilizados. El registrador deberá tener
las siguientes características:
a) tiempo de repuesta inferior a 1,5 s y, preferiblemente, inferior a 1 s
(el tiempo de repuesta es el tiempo que tarda la pluma registradora
en pasar de 0 a 90 % después de la introducción instantánea de una
señal del 100 %);
b) ancho del papel: 20 cm como mínimo;
c) velocidad del papel: ajustable a valores comprendidos entre 0,4 cm/
min y 2,5 cm/min.
3.4.Integrador
La utilización de un integrador electrónico permite efectuar cálculos
rápidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibi-
lidad adecuada y la corrección de la desviación de la línea de base
debe ser satisfactoria.
4. PROCEDIMIENTO
Las operaciones descritas en los puntos 4.1 a 4.3 sólo son válidas si se
emplea un detector de ionización de llama.
Como alternativa puede emplearse un cromatógrafo de gases con cata-
rómetro (cuyo funcionamiento se basa en el principio de los cambios de
conductividad térmica). En ese caso, las condiciones de ensayo deberán
modificarse como se indica en el punto 6.
4.1.Condicionesdeensayo
4.1.1. Determinación de lascondicionesoperativasóptimas
4.1.1.1. Columna de relleno
Al establecer las condiciones de ensayo deberán tenerse en cuenta las
variables siguientes:
a) longitud y diámetro de la columna;
b) composición y cantidad de la fase estacionaria;
c) temperatura de la columna;
d) flujo del gasportador;
e) resolución exigida;
f) tamaño de la muestra problema, determinado de modo que el
conjunto del detector y el electrómetro dé una respuesta lineal;
g) duración del análisis.
Como norma general, lascifrasde lastablas 1 y 2 permitirán obtener
los resultados deseados, es decir, al menos 2 000 platos teóricos por
metro de longitud de columna en el caso del estearato de metilo, y su
elución en 15 minutosaproximadamente.
Cuando el aparato lo permita, la temperatura del inyector deberá ser de
200 ºC aproximadamente y la del detector deberá ser igual o superior a
la de la columna.
Por lo general, la razón entre la velocidad de flujo del hidrógeno sumi-
nistrado al detector de ionización de llama y la del gas portador oscila
entre 1:2 y 1:1, en función del diámetro de la columna. El flujo del
oxígeno esde 5 a 10 vecess uperior al del hidrógeno.
Tabla 1
Diámetro interior de la columna
mmFlujo del gasportador
ml/min
21 5 a 2 5
32 0 a 4 0
44 0 a 6 01991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 45
▼B
Tabla 2
Concentración de la fase fija
% (m/m)Temperatura de la columna
ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Columna capilar
Laspropiedadesde eficacia y permeabilidad de lascolumnascapilares
implican que la separación de los constituyentes y la duración del
análisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la
columna. Por lo tanto, para optimizar lascondicionesoperativass erá
necesario manipular este parámetro (o, lo que es más sencillo, la
presión en cabeza de columna) según se desee mejorar las separaciones
o efectuar un análisis rápido.
4.1.2. Determinación del número de platosteóricos(eficacia) y de la res olu-
ción
(Véase la figura 1)Efectuar el análisis de una mezcla de estearato de metilo y de oleato de
metilo (por ejemplo, ésteres metílicos de manteca de cacao) en propor-
cionesaproximadamente equivalentes .
Escoger la temperatura de la columna y el flujo del gas portador de
manera que el máximo del pico del estearato de metilo se registre apro-
ximadamente 15 minutos después del pico del disolvente. Utilizar una
cantidad suficiente de la mezcla de ésteres metílicos, de manera que el
pico del estearato de metilo se eleve a tres cuartos aproximadamente de
la escala completa.
Calcular el número «n» de platosteóricos(eficacia) mediante la
siguiente fórmula:
n¼16
dr1
a1/C20/C21
2
y la resolución «R» mediante la siguiente fórmula:
R¼2∆
a1þa2
siendo:
dr1= distancia en mm, desde el inicio del cromatograma hasta el
máximo del pico del estearato de metilo,
a1ya2= anchura, en mm, de lospicosdel es tearato de metilo y del
oleato de metilo, respectivamente, medida entre los puntos
de intersección de las tangentes en los puntos de inflexión
de la curva con la línea de base,
∆ = dis tancia, en mm, entre losdosmáximosde lospicosdel
estearato de metilo y del oleato de metilo,
y el índice de resolución «lr» mediante la siguiente fórmula:
a
b
siendo:
a = altura del pico máspequeño, medida a partir de la línea de bas e;
b = altura del punto másbajo del valle comprendido entre losdos
picos adyacentes, medida a partir de la línea de base.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 46
▼M2
▼B
Figura1
Cromatograma para determinar el número de platosteóricos(eficacia) y la res o-
lución
Se establecerán unas condiciones de análisis que permitan obtener almenos2 000 platosteóricospor metro de longitud de columna para el
estearato de metilo y una resolución de 1,25 como mínimo.
4.2.Muestraproblema
Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 µl a 2 µl de la solución de ésteres
metílicospreparadoscon arreglo al Anexo X B e inyectarlosen la
columna.
En el caso de ésteres no disueltos, preparar una solución de 100 mg/ml
aproximadamente en heptano de calidad para cromatografía e inyectar
de 0,1 µl a 1 µl de esta solución.
Si sólo se desean detectar los componentes presentes en cantidades muy
pequeñas, se podrá aumentar el tamaño de la muestra (hasta 10 veces).
4.3.Análisis
Como norma general, las condiciones de ensayo son las que se especi-
fican en el punto 4.1.1.
No obstante, cuando se determinan ácidos con menos de 12 átomos de
carbono espos ible operar a menor temperatura de columna, mientras
que cuando se determinan ácidos grasos con más de 20 átomos de
carbono es posible operar a una temperatura mayor. A veces se puede
utilizar en los dos casos anteriores un sistema de programación de
temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene ésteres metílicos de
ácidos grasos con menos de 12 átomos de carbono, inyectar la muestra
a 100 ºC (o a 50 — 60 ºC si hay ácido butírico) y elevar inmediata-
mente la temperatura a razón de 4 — 8 ºC/min hasta alcanzar el nivel
deseado. En algunos casos es posible combinar ambos procedimientos.
Trasel calentamiento programado, s e continúa la elución a temperatura
constante hasta que todos los componentes se hayen eluido. Si el instru-
mento no puede efectuar un calentamiento programado, se opera a dos
temperaturasfijascomprendidasentre 100 y 195 ºC.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 47
▼B
Si es necesario, se recomienda que se efectúe un análisis con dos fases
fijasde diferente polaridad para comprobar la aus encia de picos
«ocultos», por ejemplo en caso de presencia simultánea de C18:3yC20:0oC18:3yC18:2conjugados.
4.4.Preparacióndelcromatogramaylasgráficasdereferencia
Analizar la mezcla patrón de referencia (2.3) aplicando lasmis mas
condiciones de ensayo que a la muestra y medir los tiempos o las
distancias de retención de los ácidos grasos que la componen. Repre-
sentar gráficamente en papel semilogarítmico, para cualquier grado de
insaturación, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retención en
función del número de átomos de carbono. En condiciones isotérmicas,
las gráficas de los ésteres de cadena lineal con el mismo grado de insa-
turación deben formar líneas rectas. Dichas líneas rectas deben ser
aproximadamente paralelas.
Deben evitarse las condiciones que propicien la existencia de «picos
ocultos», es decir, una resolución insuficiente para separar dos compo-
nentes.
5. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
5.1.Análisiscualitativo
Identificar los picos del estearato de metilo de la muestra a partir de los
gráficos citados en el punto 4.4, si es necesario por interpolación.
5.2.Análisiscuantitativo
5.2.1. Determinación de la composición
Salvo en casos excepcionales, utilizar el método de normalización
interna, esdecir, partir del principio de que todosloscomponentesde
la muestra están representados en el cromatograma, de manera que eltotal de las áreas situadas debajo de cado pico representa el 100 % de
loscons tituyentes(elución total).
Si el equipo incluye un integrador, utilizar lascifrasque és te propor-
cione. En caso contrario, determinar el área situada debajo de cada
pico multiplicando la altura del pico por el ancho a la mitad de la altura
y, cuando sea necesario, tomar en consideración las atenuaciones utili-
zadasdurante el regis tro.
5.2.2. Método de cálculo
5.2.2.1. Caso general
Calcular el contenido de un componente dado (i) (expresado como
porcentaje en masa de ésteres metílicos), mediante la determinación
del porcentaje que representa el área de su pico en relación con la
suma de las áreas de todos los picos, aplicando la fórmula siguiente:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i.
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.
Expresar el resultado con una cifra decimal.
Nota 7: En este caso general se considera que el resultado del cálculo
basado en las áreas relativas representa el porcentaje en peso.
Para los casos en que no es válida esta consideración, véase el
punto 5.2.2.2.
5.2.2.2. Utilización de factoresde corrección
En algunos casos, por ejemplo en presencia de ácidos grasos con menos
de 8 átomos de carbono o de ácidos con grupos secundarios, si se
utilizan detectores de conductividad térmica o si es necesario alcanzar
mayor nivel de exactitud, deben aplicarse factores de corrección para
convertir losporcentajesde lasáreasde lospicosen porcentajesen
peso de los componentes.
Determinar losfactoresde corrección con un cromatograma obtenido
del análisis de una mezcla de referencia de ésteres metílicos de compo-1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 48
▼B
sición conocida en condiciones de ensayo idénticas a las empleadas
para el análisis de la muestra.
La fórmula que se aplicará a la muestra de referencia para obtener el
porcentaje en peso del componente i es la siguiente:
mi
Σm/C2100
siendo:
mi= peso del componente i de la muestra de referencia,
Σm = suma de los pesos de los diversos componentes de la muestra
de referencia.
A partir del cromatograma de la muestra de referencia (4.4) calcular el
porcentaje (área/área) del componente i del siguiente modo:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i,
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.
El factor de corrección se calcula del siguiente modo:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Por lo general, los factores de corrección se expresan con relación a
KC16, de modo que los factores relativos se convierten en lo siguiente:
K0
i¼Ki
KC16
En la muestra, el contenido de cada componente i, expresado como
porcentaje en peso de los ésteres metílicos, es el siguiente:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Expresar los resultados con una cifra decimal.
5.2.2.3. Utilización de patrón interno
En algunos análisis (por ejemplo, cuando no se cuantifican todos los
ácidos grasos por estar presentes simultáneamente ácidos de 4 y 6
átomosde carbono y ácidosde 16 y 18 átomosde carbono, o cuando
es necesario determinar la cantidad absoluta de un ácido graso en la
muestra) es preciso utilizar un patrón interno. Se emplean con
frecuencia ácidosgras osde 5, 15 o 17 átomosde carbono. Debe deter-
minarse, si es necesario, el factor de corrección del patrón interno.
El porcentaje en peso del componente i, expresado como ésteres
metílicos, se calcula mediante esta fórmula:
mp/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
p/C2Ap/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i.
Ap: área del pico correspondiente al patrón interno.
K′i: factor de corrección del componente i (con relación a KC16).
K′p: factor de corrección del patrón interno (con relación a KC16).
m: peso, en mg, de la muestra.
mp: peso, en mg, del patrón interno.
Expresar los resultados con una cifra decimal.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 49
▼M2
6. CASO ESPECIAL DE DETERMINACIÓN DE LOS ISÓMEROS
TRANS
Es posible determinar el contenido de isómeros trans de los ácidos
grasos con un número de átomos de carbono comprendido entre 10 y
24 por separación de los ésteres metílicos, utilizando columnas croma-
tográficascapilarescon una polaridad es pecial.
6.1. Columna capilar de silicio de un diámetro interno comprendido entre
0,25 mm y 0,32 mm y de 50 m de longitud, recubierta de una capa de
cianopropisilicona de un espesor comprendido entre 0,1 y 0,3 µm (tipo
SP 2340, tipo SP 2380, C.P. sil 88, Silor 10 o similar).
6.2. Los ésteres metílicos se preparan según el procedimiento B descrito en
el Anexo X «B». Las materias grasas con una acidez libre superior al
3 % deben neutralizarse previamente con arreglo al punto 6.1 del
Anexo VII.
6.3. Lascondicionesgeneralesde trabajo para la cromatografía en fas e
gaseosa son las siguientes:
— temperatura de la columna programada de 150º a 230 ºC (por
ejemplo, 165 ºC durante 15 minutosy a continuación un aumento
de 5 ºC por minuto hasta alcanzar 200 ºC),
— temperatura del inyector: 250 ºC si se utiliza el sistema de inyector
divisor o la temperatura inicial de la columna si se emplea el
sistema «on column»,
— temperatura del detector: 260 ºC,— flujo del gasvector (helio e hidrógeno): 1,2 ml/minuto.
La cantidad inyectada debe ser tal que, en las condiciones de sensibi-
lidad empleadas, la altura del pico correspondiente al éster metílico
del ácido araquídico sea igual o superior al 20 % del fondo de escala.
6.4. La identificación de los diversos ésteres metílicos se efectúa compa-
rando lostiemposde retención con losde lasmezclasde referencia
(tal y como se indica en el punto 2.3).
Los ésteres de los ácidos grasos trans son eluidos antes que los
isómeros cis correspondientes. En la figura 2 se presenta un ejemplo
de cromatograma.
Figura2
Cromatograma de gases tipo relativo a la determinación de los isómeros trans de
losácidosgras oscon columna capilar
6.5. La eficacia de la columna determinada con arreglo al punto 4.1.2
deberá permitir una separación, con un índice de resolución superior a
2, de determinadasparejascríticas , como la formada por el grupo de los
ácidos transisoleicos y el pico del ácido oleico (trans C18:1/cis C18:1).1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 50
▼M2
6.6. La proporción de los diversos ácidos grasos trans se calcula estable-
ciendo la relación entre la superficie del pico correspondiente y la
suma de las superficies de todos los picos presentes.
Se toman en cons ideración losporcentajesde losácidos :
— transoctadecenoicos(T 18:1), que en el Anexo I del pres ente
Reglamento figuran como tal de isómeros transoleicos,
— cis-trans y trans-cis octadecadienoicos [(CT/TC) 8:2], que en el
Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de isómeros
translinoleicos,
— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis octadecatrie-
noicos[(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], que en el Anexo I del
presente Reglamento figuran como total de isómeros translinolé-
nicos.
Nota 8: Teniendo en cuenta las características particulares de este
método, los resultados deben darse con dos decimales.
►M27.◄CASO ESPECIAL DE UTILIZACIÓN DE UN CATARÓMETRO
(FUNCIONAMIENTO BASADO EN EL PRINCIPIO DE LOS
CAMBIOS DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA)
Para la determinación de la composición cualitativa y cuantitativa de
una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos también podrá utili-
zarse un cromatógrafo de gases provisto de un detector cuyo
funcionamiento se base en el principio de los cambios de conductividad
térmica (catarómetro). En ese caso, las condiciones establecidas en los
puntos 3 y 4 deberán modificarse como se indica en la tabla 3.
Para el análisis cuantitativo, utilizar los factores de corrección definidos
en el punto 5.2.2.2.
Tabla 3
Variable Valor/condición
Columna Longitud: 2 a 4 m
Diámetro interior: 4 mm
Soporte Tamaño de grano entre 160 y
200 µm
Concentración de la fase estacio-
nariaDe 15 % a 25 % (m/m)
Gasportador Helio o, en s u defecto, hidrógeno,
con el menor contenido de
oxígeno posible
Gases auxiliares Ninguno
Temperatura del inyector De 40 a 60 ºC másque la de la
columna
Temperatura de la columna De 180 a 200 ºC
Flujo del gasportador Normalmente entre 60 y 80 ml/
min
Tamaño de la muestra problema
inyectadaNormalmente entre 0,5 y 2 µl
►M28.◄INFORME DEL ANÁLISIS
En el informe del análisis se expondrán los métodos utilizados para la
preparación de los ésteres metílicos y para la realización del análisis
mediante cromatografía de gases, así como los resultados obtenidos.
Se mencionarán, asimismo, cualesquiera procedimientos de trabajo que
no se especifiquen en la presente norma internacional o que se consi-
deren facultativos, así como toda circunstancia que pueda haber
influido en los resultados.
El informe del análisis incluirá todos los datos necesarios para la
completa identificación de la muestra.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 51
▼B
▼B
ANEXO X «B»
PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS
GRASOSDECONFORMIDADCONLOSPUNTOSIYIIDELANEXO
VIDELREGLAMENTO(CEE)No72/77OSEGÚNELMÉTODOQUE
SEDESCRIBEACONTINUACIÓN
INTRODUCCIÓN
La elección del procedimiento a utilizar deberá hacerse en función de la
composición de los ácidos y de la acidez de la materia grasa que haya
que examinar y del análisis mediante cromatografía de gases que deba
efectuarse.
En particular:
— cuando se trate de materias grasas que contengan ácidos grasos inferior
aC12, sólo podrán utilizarse los procedimientos en tubo cerrado ►C1o
con sulfato dimetílico ◄,
— cuando se trate de materias grasas con una acidez superior al 3 %, sólo
podrán utilizarse los procedimientos con mezcla de metanol y ácido
clorhídrico o con sulfato dimetílico,
— en la determinación mediante cromatografía de gases de los isómeros
trans, sólo podrán utilizarse los procedimientos con metilato sódico o
con sulfato dimetílico,
— el procedimiento con mezcla de metanol, hexano y ácido sulfúrico
deberá utilizarse en la preparación de los ésteres metílicos de pequeñas
cantidades de materias grasas por separación mediante cromatografía en
capa fina.
No se tendrá en cuenta el insaponificable cuando no supere el 3 %; en caso
contrario, los ésteres metílicos deberán prepararse a partir de los ácidos
grasos.
1. OBJETO
A continuación se describen cinco procedimientos para la preparación de
los ésteres metílicos de las materias grasas:
a) con metilato sódico;
b) con metilato sódico en tubo cerrado;
c) con mezcla de metanol y ácido clorhídrico en tubo cerrado;
d) con sulfato dimetílico;
e) con mezcla de metanol, hexano y ácido sulfúrico.
ProcedimientoA
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se calienta a reflujo con alcohol
metílico y metilato sódico. Los ésteres metílicos que se obtengan se extraen
con éter etílico.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Matraz redondo de 100 ml con refrigerante de reflujo, provisto en su extre-
midad superior de un tubo para cal sódica, con junta esmerilada.
3.2. Probetasde 50 ml.
3.3. Pipeta de 5 ml graduada en divisiones de 0,1 ml.
3.4. Embudosde s eparación de 250 ml.3.5. Matraz redondo de 200 ml.
4. REACTIVOS
4.1. Metanol anhidro.
4.2. Solución de metilato sódico en metanol al 1 % aproximadamente. Se
prepara disolviendo 0,34 g de sodio metal en 100 ml de metanol anhidro.
4.3. Éter etílico.4.4. Solución de cloruro sódico al 10 %.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 52
▼B
4.5. Éter de petróleo 40 º—60 ºC.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el matraz de 100 ml 2 g de grasa previamente deshidratada en
sulfato sódico y filtrada. Añadir 35 ml de metanol, acoplar el refrigerante y
llevar a ebullición manteniéndola a reflujo durante algunosminutos .
5.2. Interrumpir el calentamiento, separar el refrigerante y añadir rápidamente
3,5 ml de la solución de metilato sódico; acoplar nuevamente el refrige-
rante y hervir a reflujo durante 3 horascomo mínimo. La metilación s e
habrá completado cuando toda la materia grasa se haya disuelto y la mezcla
de reacción esté perfectamente transparente a temperatura ambiente.
5.3. Enfriar y verter la mezcla de reacción en una ampolla de separación de
250 ml, añadir 35 o 40 ml de éter etílico, 100 ml de agua y 5 o 6 ml de
la solución de cloruro sódico al 10 %. Agitar y esperar a que se produzca la
separación de las capas; transferir la fase acuosa a una segunda ampolla de
separación y extraerla de nuevo con 25 ml de éter etílico.
Añadir a losextractosetéreosreunidos50 ml de éter de petróleo
40 º—60 ºC, lo que provocará la separación del agua que debe eliminarse.
Lavar la fase etérea tres veces con 10 o 15 ml de agua cada vez, desecar
sobre sulfato sódico y pasar filtrando a través de papel a un matraz redondo
de 200 ml.
Concentrar la solución al baño María hasta unos 20 ml mientras se hace
pasar una corriente de nitrógeno puro.
ProcedimientoB
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis es tratada con metilato sódico en solu-
ción metanólica, en recipiente cerrado, a 85 º—90 ºC.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Tubo de vidrio de paredes gruesas, de unos 5 ml (altura: 40—45 mm,
diámetro: 14—16 mm).
3.2. Pipeta de 1 ml graduada en divisiones de 0,1 ml.
4. REACTIVOS
4.1. Solución de metilato sódico en metanol al 1,5 % aproximadamente. Se
prepara disolviendo 0,50 g de sodio metal en 100 ml de metanol anhidro.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de vidrio 2 g de materia grasa previamente deshidra-
tada en sulfato sódico y filtrada. Añadir 0,3 g (unos 0,4 ml) de la solución
de metilato sódico y cerrar el tubo a la llama.
5.2. Mantener el tubo durante doshorasal baño María a una temperatura entre
85 º y 90 ºC agitándolo de vez en cuando. La esterificación se habrá conse-
guido cuando se vuelva transparente el contenido del frasco tras la
sedimentación de la glicerina y de los residuos de los reactivos.
5.3. Enfriar a temperatura ambiente. Abrir el tubo cuando se vayan a utilizar los
ésteres metílicos. Éstos no necesitan de ninguna otra manipulación antes de
ser analizados.
ProcedimientoC
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis es tratada con una mezcla de metanol y
ácido clorhídrico, en tubo cerrado, a 100 ºC.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Tubo de vidrio de paredes gruesas, de unos 5 ml (altura: 40—45 mm,
diámetro: 14—16 mm).
3.2. Pipetasaforadasde 1 y 2 ml.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 53
▼B
4. REACTIVOS
4.1. Solución de ácido clorhídrico en metanol al 2 %. Se prepara con ácido
clorhídrico gaseoso y metanol anhidro (nota 1).
4.2. Hexano de calidad adecuada para cromatografía.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de vidrio 0,2 g de materia grasa, previamente deshi-
dratada en sulfato sódico y filtrada, y 2 ml de la solución de ácido
clorhídrico en metanol. Cerrar el tubo a la llama.
5.2. Mantener el tubo durante 40 minutosal baño María a 100 ºC.
5.3. Enfriar el tubo en agua corriente, abrirlo, añadir 2 ml de agua destilada y
1 ml de hexano. Centrifugar y extraer la fase del hexano que estará lista
para ser utilizada.
ProcedimientoD
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se saponifica con una solución en
alcohol metílico de hidróxido potásico, y después se trata con sulfato
dimetílico. Tras añadir ácido clorhídrico, los ésteres metílicos formados se
separan espontáneamente. Mediante el tratamiento posterior con alúmina,
se obtienen ésteres metílicos de elevada pureza.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Tubo de ensayo de vidrio de paredes gruesas, de 20 ml aproximadamente
de capacidad, con tapón esmerilado 10/19 y enganches de seguridad.
3.2. Refrigerante de reflujo de cinco ampollascon junta es merilada 10/19.
3.3. Filtrosde vidrio de fondo poros o, de graduación G 2 y diámetro de 20 mm.
3.4. Tubosde ens ayo de vidrio de fondo cónico, de unos10 ml de capacidad.
3.5. Jeringasde 1y5m l .
4. REACTIVOS
4.1. Solución al 10 % de hidróxido potásico en alcohol metílico de calidad
adecuada para cromatografía.
4.2. Solución al 0,05 % del indicador verde de bromocresol en alcohol metílico.
4.3. Sulfato dimetílico (d = 1,335 a 15 ºC).
4.4. Ácido clorhídrico concentrado (d = 1,19) diluido 1:1 con alcohol metílico
de calidad cromatográfica.
4.5. Óxido de aluminio normalizado según el método Brockmann para cromato-
grafía de adsorción.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de ensayo de 20 ml unos 2,2 ml de materia grasa
previamente deshidratada en sulfato sódico y filtrada; añadir 5 ml de la
solución de hidróxido potásico y algunos granos de piedra pómez para
regular la ebullición. Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar agitando
sobre llama pequeña durante 5 minutos. Para que la saponificación sea
completa, la solución deberá volverse transparente. Por último, enfriar en
agua corriente y separar el refrigerante.
5.2. Añadir dosgotasdel indicador y, lentamente, con la ayuda de una jeringa,
1 ml de sulfato dimetílico. Cerrar herméticamente el tubo de ensayo y
agitar durante doso tresminutos , introduciendo con frecuencia el fondo
del tubo en agua hirviendo: la reacción será completa cuando el indicador
pase del azul al amarillo. Al final, enfriar el tubo en agua corriente, abrirlo
y añadir 5 ml de la solución metanólica de ácido clorhídrico.
5.3. Tras agitar durante unos segundos, inclinar el tubo y darle ligeras sacudidas
que faciliten la aparición de los ésteres metílicos en forma de masa oleosa
(nota A).
Retirar losés teresmetílicoscon una jeringa, introducirlosen un tubo de
fondo cónico, añadir un volumen de alúmina equivalente a un cuarto del
volumen de los ésteres metílicos, agitar y filtrar con papel de filtro.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 54
▼B
Nota A: En caso de que no se produzca espontáneamente la separación de
los ésteres metílicos, añadir al tubo 5 ml de agua y agitar.
ProcedimientoE
2. PRINCIPIO DEL MÉTODO
La materia grasa objeto de análisis se calienta a reflujo con metanol,
hexano y ácido sulfúrico. Los ésteres metílicos que se obtengan seextraerán con éter de petróleo.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Tubo de ensayo de unos 20 ml de capacidad, con refrigerante de reflujo de
aire, de 1 m aproximadamente de longitud, con junta esmerilada.
3.2. Pipeta aforada 5 ml.
3.3. Ampolla de separación de 50 ml.3.4. Probetasde 10 y 25 ml.
3.5. Tubo de fondo cónico de 15 ml.
4. REACTIVOS
4.1. Reactivo de metilación: metanol anhidro, hexano y ácido sulfúrico concen-
trado (d = 1,84) en la seguiente proporción: 75:25:1 (V/V/V).
4.2. Éter de petróleo 40—60 ºC.4.3. Sulfato sódico anhidro.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Introducir en el tubo de 20 ml el material recuperado de la placa y añadir
5 ml de reactivo de metilación.
5.2. Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar al baño María en ebullición
durante 30 minutos(nota 2).
5.3. Transferir cuantitativamente la mezcla a una ampolla de separación de
50 ml con la ayuda de 10 ml de agua destilada y 10 ml de éter de petróleo.
Agitar enérgicamente y esperar a que se produzca la separación de las
fases, extraer la capa acuosa y lavar la capa etérea dos veces con 20 ml
de agua destilada. Añadir a la ampolla de separación una pequeña cantidad
de sulfato sódico anhidro, agitar, dejar reposar unos minutos y pasar
filtrando a un tubo de fondo cónico de 15 ml.
Evaporar el disolvente al baño María haciendo pasar una corriente de nitró-
geno.
Nota 1: En el laboratorio pueden prepararse fácilmente pequeñas canti-
dades de ácido clorhídrico gaseoso por simple desplazamiento de
la solución comercial ( ρ= 1,18), añadiendo algunasgotasde
ácido sulfúrico concentrado ( ρ= 1,84). El gas liberado se deseca
fácilmente por borboteo a travésde ácido s ulfúrico concentrado.
Dado que el ácido clorhídrico esabs orbido por el metanol con
mucha rapidez, se aconseja que se adopten las precauciones nece-
sarias al disolverlo (es decir, introducir el gas a través de un
embudo pequeño invertido cuyo borde roce la superficie del
líquido). Pueden prepararse con antelación cantidades grandes de
solución metanólica de ácido clorhídrico, ya que se conserva en
perfectascondicionesen la os curidad dentro de botellascon
taponesde vidrio.
Nota 2: Para controlar la ebullición, introducir una varita de vidrio en el
tubo y limitar la temperatura del baño María a 90 ºC.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 55
▼B
ANEXO XI
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ►C1 DISOLVENTES ◄
HALOGENADOSVOLÁTILESENELACEITEDEOLIVA
1. PRINCIPIO DEL MÉTODO
Análisis por cromatografía en fase gaseosa según la técnica del espacio de
cabeza(head space) .
2. EQUIPO
2.1. Cromatografía de gases con detector de captura de electrones (ECD).
2.2. Equipo para espacio de cabeza (head space) .
2.3. Columna de cromatografía en fase gaseosa de vidrio de 2 metros de largo y
2 mm de diámetro, fase estacionaria.
OV 101 al 10 % impregnado en cromosorb W-AW-DMCS (tierra de diato-
meas calcinada lavada con ácido y silanizado (80—100 Mesh).
2.4. Gasportador y gasauxiliar: nitrógeno para cromatografía de gas esde
pureza adecuada para la detección por captura de electrones.
2.5. Frascos de cristal de 10 a 15 ml provistos de septum de teflón y con una
cápsula de aluminio con un orificio para toma de muestras con jeringa.
2.6. Pinzascaps uladora para cerrar herméticamente.2.7. Jeringa para gases de 0,5 y 2 ml.
3. REACTIVOS
►
C1Disolventes ◄halogenados con una pureza apropiada para su uso
en cromatografía en la fase gaseosa.
4. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
4.1. Pesar con exactitud unos 3 g de aceite en un frasco de cristal (no reutili-
zable), tapar el frasco de manera que quede cerrado herméticamente.
Introducir el frasco en un baño con termostato a 70 ºC durante 1 hora.
Extraer con precisión, por medio de una jeringa, un volumen de 0,2 a
0,5 ml del espacio de cabeza. Inyectarlo en la columna del cromatógrafo
de gases con las siguientes condiciones:
temperatura inyector: 150 ºC
temperatura columna: 70—80 ºC
temperatura detector: 200—250 ºC
Podrán utilizarse otras temperaturas siempre que los resultados sean equiva-
lentes.
La inyección se puede realizar con el equipo para espacio de cabeza.
4.2. Solucionesde referencia. Preparar s olucionespatrón utilizando aceite de
oliva refinado sin trazas de ►C1disolventes ◄con concentracionesen
hidrocarburoshalogenadosde 0,05 a 1 ppm (mg/kg) s egún el contenido
supuesto de la muestra. Para preparar la solución de referencia, si es nece-
sario diluir previamente el hidrocarburo halogenado patrón, puede utilizarse
pentano.
4.3. Cuantificación. Se efectúa por cálculo mediante la relación de áreaso
alturas del pico de la muestra y de la solución patrón cuya concentración
sea la más próxima a la de la muestra. Si la desviación es superior al
10 %, será necesario volver a hacer el análisis, comparándolo con una
nueva solución patrón de concentración tal que se ajuste a la desviación
relativa antes mencionada. El contenido se establecerá efectuando la media
de variasinyecciones .
4.4. Expresión de los resultados. Los resultados se expresarán en ppm (mg/kg).
El límite de detección del método esde 0,01 mg/kg.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 56
▼B
ANEXO XII
VALORACIÓNORGANOLÉPTICADELACEITEDEOLIVAVIRGEN
1. OBJETO
El presente método tiene por finalidad establecer los criterios necesarios
para valorar lascaracterís ticasdel flavor del aceite de oliva virgen y
desarrollar la sistemática necesaria.
2. CAMPO DE APLICACIÓN
El método que se describe sólo es aplicable a la valoración y clasifica-
ción organoléptica del aceite de oliva virgen utilizable para consumo
directo. Se limita a clasificar el aceite virgen en una escala numérica,
relacionada con la percepción de los estímulos de su flavor, según el
juicio de un grupo de catadores seleccionados constituidos en panel.
3. ANÁLISIS SENSORIAL: VOCABULARIO GENERAL BÁSICO
Véase el capítulo «Análisis sensorial: vocabulario general básico».
4. VOCABULARIO ESPECÍFICO DEL ACEITE DE OLIVA
4.1 Sensaciones agradables producidas por los atributos característicos de
calidad de losaceitesde oliva vírgenes :
Frutado: flavor que recuerda el olor y el gusto del fruto sano, fresco y
recogido en el punto óptimo de su maduración.
Frutado maduro: flavor del aceite de oliva obtenido de frutosmaduros ,
generalmente de olor apagado y sabor dulce.
Frutado verde: flavor del aceite extraído de frutosaún verdes .
4.2. Sensaciones más o menos agradables en función de su intensidad, que no
deben considerarse defectos aunque influyen en la armonía del frutado.
Manzana: flavor del aceite de oliva que recuerda a dicho fruto.
Dulce: sabor agradable del aceite, que, sin ser precisamente azucarado,
no predominan en él losatributosamargo, as tringente o picante.
Hierba: flavor característico de algunos aceites que recuerda a la hierba
recién cortada.
Hojas verdes (amargo): flavor del aceite obtenido de aceitunasexces iva-
mente verdes o que se han molido mezcladas con hojas y tallos.
Amargo: sabor característico del aceite obtenido de aceitunas verdes o en
envero. Puede ser más o menos agradable según su intensidad.
Aspero: sensación característica de algunos aceites que al ser degustados
producen una sensación buco-táctil de astringencia.
Picante: sensación gustativa de picor, característica de los aceites obte-
nidosa comienzosde la campaña, principalmente de aceitunastodavías
verdes. Se debe a la acción de las sustancias fenólicas sobre los termi-
nalesdel nervio trigémino que s e extienden por toda la cavidad bucal.
Almendrado: este flavor puede darse en dos aspectos: el típico de la
almendra fresca o el propio de la almendra seca y sana, que puede
confundirse con un rancio incipiente. Se aprecia como un regusto cuando
el aceite permanece en contacto con la lengua y el paladar; se asocia a
losaceitesdulcesy de olor apagado.
Apagado o plano: flavor del aceite de oliva cuyascaracterís ticasorga-
nolépticas son muy tenues debido a la pérdida de sus componentes
aromáticos.
Heno: flavor característico de algunos aceites que recuerda a la hierba
máso menoss eca.
4.3 Sensaciones siempre desagradables, incluso cuando apenas son percepti-
bles, que deben considerarse defectos organolépticos.
Esparto: flavor característico del aceite obtenido de aceitunas prensadas
en capachos nuevos de esparto. El flavor puede ser diferente si el
capacho está fabricado con esparto verde o si lo está con esparto seco.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 57
▼M3
▼M3
Tierra: flavor característico del aceite obtenido de aceitunas recogidas
con tierra, embarradas y no lavadas. Este flavor puede ir unido al de
moho o humedad en algunas ocasiones.
Viejo: flavor característico del aceite cuando permanece demasiado
tiempo en recipientesde almacenamiento. También puede dars e en
aceitesenvas adosdurante un período prolongado.
Gusano: flavor característico del aceite obtenido de aceitunas fuertemente
atacadaspor larvasde mos ca del olivo (Dacus oleae) .
Metálico: flavor que recuerda a los metales. Es característico del aceite
que ha permanecido en contacto, durante tiempo prolongado, con
alimentos o superficies metálicas en condiciones indebidas, durante los
procesos de molienda, batido, prensado o almacenamiento.
Moho-humedad: flavor característico del aceite obtenido de frutos en los
que se han desarrollado abundantes hongos y levaduras a causa de haber
permanecido amontonadosy con humedad variosdías .
Rancio: flavor característico y común a todos los aceites y grasas que han
sufrido un proceso autoxidativo, a causa de su prolongado contacto con el
aire. Este flavor es desagradable e irreversible.
Atrojado: flavor característico del aceite obtenido de aceitunas amonto-
nadasque han s ufrido un avanzado grado de fermentación.
Salmuera: flavor del aceite extraído de aceitunas conservadas en solu-
ciones salinas.
Orujo: flavor característico que recuerda al del orujo de aceituna.
Jabonoso: flavor con una sensación olfato-gustativa que recuerda a la del
jabón verde.
Alpechín: flavor característico adquirido por el aceite a causa de una mala
decantación y prolongado contacto con lasaguasde vegetación.
Avinado-avinagrado: flavor característico de algunos aceites que
recuerdan al vino o vinagre. Esdebido fundamentalmente a la formación
de ácido acético, acetato de etiolo y etanol, en cantidadess uperioreso lo
normal en el aroma del aceite de oliva.
Pepino: flavor que se produce en el aceite sometido a un envasado
hermético y excesivamente prolongado, particularmente en hojalata, que
esatribuido a la formación de 2-6 nonadienal.
Cocido o quemado: flavor característico del aceite originado por un exce-
sivo o prolongado calentamiento durante su obtención, muy
particuarlmente durante el termo-batido de la pasta, si éste se realiza en
condicionesinadecuadas .
Borras: flavor característico del aceite recuperado de los lados decan-
tados en depósitos y trujales.
Capacho: flavor característico del aceite obtenido de aceitunas prensadas
en capachos sucios con residuos fermentados.
Grasa de máquina: olor del aceite de oliva obtenido en una almarzara de
cuya maquinaria no han sido adecuadamente eliminados residuos de
petróleo, de grasa o aceite mineral.
Basto: percepción característica de algunos aceites que, al ser degustados,
producen una sensación buco-táctil densa y pastosa.
5. COPA PARA DEGUSTACIÓN DE ACEITES
Véase el capítulo «Copa para la degustación de aceites».
6. SALA DE CATA
Véase el capítulo «Guía para la instalación de una sala de cata».
7. UTENSILIOS
En cada cabina y a disposición del catador deben estar los utensilios
necesarios para que éste pueda ejercer adecuadamente su cometido. Estos
son:
— copas (normalizadas), conteniendo las muestras marcadas en clave
con un par de númerosdígitostomadosal azar, o con un par de1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 58
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números y letras. Las marcas se deben hacer con un lápiz indeleble e
inodoro,
— vidrios de reloj con idénticas marcas, para cubrir las copas,— hoja de puntuación, véase figura 2, conteniendo las instrucciones para
su utilización,
— lápiz o bolígrafo,— bandejitasconteniendo rodajasde manzanas ,— vaso de agua a la temperatura ambiente.
8. METODOLOGÍA
En este apartado se establecen los conocimientos previos necesarios para
la realización del análisis sensorial de los aceites de oliva vírgenes y trata
de normalizar el comportamiento y la actuación de loscatadoresque han
de intervenir en laspruebas , loscualeshan de tomar conciencia tanto de
lasrecomendacionesde tipo general como de lases pecíficaspara la cata
de losaceitesde oliva.
8.1.Actuacióndelorganizadorojefedelpanel (o grupo de catadores)
El organizador del panel deberá ser una persona suficientemente formada,
conocedora y experta en lostiposde aceitesque encontrará en s u trabajo.
Es la figura clave del panel y el responsable de la organización y del
funcionamiento del mismo. Convocará con tiempo suficiente a los cata-
doresy lesaclarará cualquier duda en cuanto a la realización de los
ensayos, aunque se abstendrá de sugerirles ningún tipo de opinión sobre
la muestra.
Será responsable del inventario de los utensilios, de su adecuada
limpieza, de la preparación y codificación de las muestras, así como de
su presentación a dos catadores según el diseño experimental adecuado;
de la recopilación de los datos y de su tratamiento estadístico, a fin de
obtener los mejores resultados con el menor esfuerzo.
El trabajo del jefe del panel requiere habilidad sensorial, meticulosidad en
la preparación de los ensayos, riguroso orden para su ejecución, así como
habilidad y paciencia para planificar y ejecutar las pruebas. Es misión del
jefe de panel estimular la moral de los componentes del grupo, fomen-
tando entre ellos el interés, curiosidad y espíritu competitivo. Debe
evitar que su opinión sea conocida e impedir que los criterios de posibles
líderes se impongan sobre los restantes catadores. También es de su
competencia el entrenamiento, selección y control sobre los mismos, a
fin de conocer si se mantienen con el adecuado nivel de aptitud.
8.2.Condicionesdelensayo
8.2.1. Tamaño de la muestra
La cantidad de aceite contenido en cada copa debe ser de 15 ml.
8.2.2. Temperatura de la prueba
Las muestras de aceite a catar se mantendrán dentro de las copas a 28 ºC
± 2 ºC. Esta temperatura se ha elegido por ser en la que se observan con
mayor facilidad diferenciasorganolépticas , dentro de la temperatura
normal, cuando los aceites se usan como condimento. Otro aspecto que
inclina a tomar es te valor esque temperaturasmásbajaso másaltas
producen una escasa volatilización de los compuestos aromáticos o por
el contrario volátilesya propiosde aceitescalentados .
8.2.3. Horario del ensayo
Para la cata de aceites, las horas de trabajo óptimas son las de la mañana.
Está demostrado que durante el día existen períodos de óptima percepción
para el gusto y el olfato.
Las comidas son precedidas de un período de incremento de la sensibi-
lidad olfato-gustativa, seguidas de un decrecimiento de la misma.
Sin embargo, este criterio no debe ser llevado al extremo, hasta el punto
de que el hambre pueda distraer a los catadores, haciendo descender en
ellos su capacidad de discriminación y, particularmente, sus criterios de
preferencia y aceptación.
9. CATADORES
Las personas que intervengan como catadores en los ensayos organolép-
ticos de aceites de oliva comestibles deberán ser entrenados y
seleccionados de acuerdo con su habilidad para distinguir entre muestras1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 59
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similares, debiéndose tener en cuenta que la precisión se mejorará con el
entrenamiento (véase apartado correspondiente).
Para la prueba se exige un número de 8 a 12 catadores siendo conve-
niente disponer de algunos más en reserva, para cubrir posibles ausencias.
9.1.Normasgeneralesdecomportamientoparacandidatosycatadores
Las presentes recomendaciones se refieren al comportamiento de los
candidatosy catadoresdurante s u trabajo.
Al recibir la comunicación del jefe del panel para intervenir en un ensayo
organoléptico, el catador deberá estar en condiciones de realizarlo a la
hora previamente señalada, ateniéndose a las siguientes normas:
9.1.1. Se abstendrá de fumar al menos 30 minutos antes de la hora fijada.
9.1.2. No utilizará ningún perfume, cosmético o jabón cuyo olor persista en el
momento del ensayo. Para el lavado de las manos utilizará un jabón no
perfumado o poco perfumado, procediendo a enjuagarse las manos y a
secárselas tantas veces como sean necesarias para eliminar cualquier olor.
9.1.3. No deberá haber tomado ningún alimento al menosuna hora antesde
realizar la cata.
9.1.4. Si se encontrase en condiciones de inferioridad fisiológica, particular-
mente si tiene afectado el sentido del olfato o del gusto, o bajo algún
efecto psicológico que le impida concentrarse en su trabajo, deberá comu-
nicarlo al jefe del panel al objeto de que lo aparte del trabajo, o bien para
que tome las decisiones oportunas, teniendo en cuenta su posible desvia-
ción de losvaloresmediosdel res to del panel.
9.1.5. El catador, una vez cumplidaslasnormasprecedentes , procederá a ocupar
su lugar en la cabina que le corresponda, con el mayor orden y silencio
posibles.
9.1.6. Una vez sentado, procederá a examinar si el material que necesita está en
orden y es el correcto, comprobando si la clave de la copa se corresponde
con la del vidrio de reloj que la cubre.
9.1.7. Leerá detenidamente lasins truccionescontenidasen la hoja de puntua-
ción, no comenzando el examen de la muestra hasta estar totalmente
compenetrado con el trabajo que debe realizar. En caso de duda, debe
consultar privadamente las dificultades encontradas con el jefe del panel.
9.1.8. El catador procederá a tomar la copa, manteniéndola cubierta con su
vidrio de reloj, la inclinará ligeramente, y en esta posición le dará un
giro total a fin de mojar lo más posible la superficie interior. Hecha esta
operación, separará el vidrio de reloj y procederá a oler la muestra,
haciendo inspiraciones suaves, lentas e intensas, hasta formarse un
criterio sobre el aceite que debe juzgar. El período de olfacción no debe
soprepasar 30 segundos. Si en este período no se ha llegado a ninguna
conclusión, debe tomarse un pequeño descanso, antes de un nuevo
intento. Una vez realizado el ensayo olfativo, se procederá a enjuiciar el
flavor (sensación conjunta olfato-gustativa-táctil). Para ello se tomará un
pequeño sorbo de aceite, de unos 3 ml aproximadamente. Es muy impor-
tante distribuir el aceite por toda la cavidad bucal, desde la parte anterior
de la boca y la lengua, por los laterales y la parte posterior, hasta los
pilares del paladar; ya que, como se sabe, la percepción de los cuatro
sabores fundamentales, dulce, salado, ácido y amargo, se hace con
distinta intensidad según las zonas de la lengua y el paladar.
Debe insistirse en la necesidad de que el aceite se extienda en cantidad
suficiente y muy lentamente por la parte posterior de la lengua hacia los
pilaresdel paladar y la garganta, concentrando la atención en el orden de
aparición de los estímulos amargo y picante; si no se procede así, en
algunos aceites ambos estímulos pueden pasar inadvertidos o el amargo
quedar oculto por el picante.
Aspiraciones cortas y sucesivas, introduciendo aire por la boca, permiten,
ademásde extender la mues tra ampliamente por la cavidad bucal, percibir
por vía retronasal los componentes volátiles aromáticos.
La sensación táctil debe tomarse, también, en consideración: así, la
fluidez, pastosidad y picor o escozor deben ser anotados cuando se
detecten y, si la prueba así lo exige, cuantificar su intensidad.
9.1.9. La valorazión organoléptica de un aceite virgen debe hacerse evaluando
una sola muestra por sesión, para evitar el efecto de contraste que podría
producir la degustación inmediata de otras.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 60
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Puesto que las catas sucesivas son afectadas por la fatiga, o pérdida de
sensibilidad, causadas por las precedentes, se impone utilizar un producto
capaz de eliminar de la boca losres tosde aceite de la cata anterior.
Se recomienda el uso de un pequeño trozo de manzana, de unos 15 gr, el
cual, después de masticado, puede ser vertido al escupidor, procediendo
seguidamente a enjuagarse con un poco de agua a temperatura ambiente.
Entre la cata finalizada y la siguiente deben transcurrir al menos 15
minutos.
9.2.Preseleccióndecandidatos
Esta etapa deberá realizarla el organizador del panel mediante entrevistas
personales y tiene por objeto conocer la personalidad del candidato y las
características que le rodean. Las exigencias previas respecto a las condi-
ciones fisiológicas y psicológicas no son muy rigurosas, ya que, en
principio, cualquier persona normal puede desarrollar esta actividad. La
importancia de la edad, sexo, determinados hábitos (fumar) etc., se consi-
deran secundarios frente a otros aspectos, tales como: la salud, el interés
personal y disponer de tiempo para este trabajo.
Durante la entrevista, el organizador del ensayo debe explicar al candi-
dato lascaracterís ticasde la función que va a realizar e informarle del
tiempo aproximado que le va a ocupar. A continuación ha de recabar
datosque le permitan valorar el grado de interésy motivación del candi-
dato, así como de su disponibilidad real de tiempo. La encuesta siguiente
deberá servirle como referencia.
(1)
Con esta información el organizador realizará la preselección, rechazando
a loscandidatoscon poco interéspor es te tipo de trabajo, poco tiempo
disponible, o incapaces para concretar sus ideas.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 61
(1) Describa el interés que puede tener la valoración organoléptica de cualquier alimento o
si le parece del aceite de oliva.
▼B
9.3.Determinacióndel«umbralmedio»delgrupopara«atributoscarac-
terísticos»
Se eligen cuidadosamente cuatro aceites, de tal forma que cada uno sea
considerado como representante típico de los atributos: atrojado, avinado,
rancio y amargo, con la mayor y más clara intensidad posible.
Tomando una parte alícuota de cada uno de ellos se preparan muestras, a
distintas concentraciones de razón 2, por sucesivas diluciones con el
soporte apropiado hasta que en las dos o tres diluciones últimas no sea
posible detectar diferencia con la copa que contiene sólo el soporte. Una
última pareja la formarán doscopasde s oporte.
La serie se completará con copas de concentraciones superiores, hasta un
total de 8.
Preparar suficiente cantidad de muestras de las distintas concentraciones
para entregar series completas de cada atributo a cada uno de los candi-
datos.
Para estabelecer el «umbral medio» de los candidatos, para cada atributo
se presentará a éstos una copa conteniendo 15 ml de una cualquiera de
las concentraciones preparadas, junto con otra copa que contenga sólo
15 ml del «soporte». El candidato, después de realizar el ensayo, debe
indicar si son iguales o distintas.
El mismo ensayo se repite para las restantes concentraciones del atributo
estudiado.
Se anota el número de contestaciones correctas obtenidas para cada
concentración del conjunto de candidatos, y se refiere como porcentaje
del número de ensayos efectuados.
Se representa en orden creciente, en abscisas las concentraciones ensa-
yadasy en ordenadasel % de identificacionescorrectashechaspara
cada concentración.
La figura 1 representa un ejemplo práctico de lo expuesto anteriormente.
El umbral de detección se define sobre abscisas extrapolando de la curva
el punto de la ordenada que corresponde a un 75 % de aciertos.
Esta concentración «umbral», que puede ser distinta para cada aceite de
partida, dependiendo de la intensidad del atributo en dicho aceite, debe
ser similar para los distintos grupos de candidatos de distintos paneles;
no está unida a ninguna costumbre, hábito o preferencia tendenciosa,
consiguientemente es un punto de referencia común a cualquier grupo
humano normal y puede servir para homogeneizar los distintos paneles
sólo por su sensibilidad olfato-gustativa.
A partir de la concentración umbral del grupo obtenida se procederá
como sigue:
Prepárese una serie de concentraciones crecientes y decrecientes de forma
que esta «concentración umbral» corresponda al lugar 10 de esta escala.
Lógicamente las concentraciones 11 y 12 serán más diluidas y consi-
guientemente muy difícilesde detectar en ellasla pres encia del aceite
con el atributo elegido.
A partir de la concentración C10, las restantes muestras pueden prepararse
mediante la fórmula:
C10×an, donde «a» es una constante correspondiente al factor de dilución
igual a 1,5 y «n» el exponente que variará desde 9 a − 2.
Por ejemplo: supuesto el umbral obtenido para el aceite rancio = 0,32;
será C10= 0,32, a partir de ella como a = 1,5 la serie de muestras tendría
las siguientes concentraciones.
Muestras 1 2 3456789 1 0 1 1 1 2
Concentración 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Si se repite todo lo anterior para los tres restantes atributos, partiendo de
los umbrales respectivos calculados también como antes se indicó, se
obtendrán así escalas que para todos los laboratorios tendrán intensidades
aromáticas similares para cada estímulo, aunque se haya partido de
aceites de oliva cuyos defectos son perceptibles con distinta intensidad.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 62
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9.4.Seleccióndecatadoresporelmétodode«clasificacióndeintensidad»
La selección debe realizarse partiendo de un número de candidatos dos o
tres veces superior al necesario para formar el grupo, con objeto de poder
elegir a los más sensibles y de mayor capacidad discriminatoria. Siempre
es aconsejable realizar las pruebas con el mismo producto que se va a
analizar posteriormente. (Consiguientemente nosotros utilizaremos aceite
de oliva.)
Figura1
En la elección del método, junto a su eficacia no se puede olvidar que es
de interés que el procedimiento a seguir sea lo más económico posible en
cuanto a cantidad de aceite, número de muestras a utilizar y tiempo dedi-
cado a la selección. La eficacia de un procedimiento de selección se
caracteriza por la elección de losnivelesóptimosde lastresvariables
dependientes siguientes: a) «costo» determinado por el número de
ensayos, b) «proporción» de candidatos potencialmente aptos que por
azar pueden ser desafortunadamente rechazados en la criba y c) «propor-
ción» de candidatosno apropiadosque por un azar favorable s on
aceptados en la selección sin deber serlo.
El procedimiento de selección elegido: «prueba de clasificación de inten-
sidad»(The intensity rating test) descrito en las normas ASTM (American
Society for Testing and Materials) y STP(Special Technical Publication)
440 página 53, modificado en cuatro puntos:
1) reducción del número de muestras en la serie;
2) ampliación de estímulos con objeto de aumentar el número de notas
olfato-gustativas sobre las que está basada la selección, a fin de
adecuarlasa losdefectosmáscomunesperceptiblesen el aceite de
oliva;
3) variación de la relación de concentración en la serie;
4) tratamiento estadístico de los resultados.
Material necesario
— botellaso matracesde 1 500 ml,
— copasde vidrio os curo,1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 63
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— probetasde 10 ml, 15 ml, 1 000 ml y 1 500 ml.
Productos necesarios
— Parafina Merck (referencia 7.160, DAB 8, USP XX) o soporte
oleoso inodoro e insípido (aceite de oliva u otro similar reciénrefinado),
— aceites: atrojado, avinado, rancio y amargo.
9.4.1. Procedimiento operatorio
Una vez preparadas las concentraciones se empezará la selección
partiendo de 25 candidatos, de acuerdo con la metodología que se
explicará a continuación para cada estímulo:
1) Se preparan series de 12 copas, marcadas en clave (una serie por
candidato). En cada copa se vierten 15 ml de cada una de las distintas
concentraciones, preparadas de acuerdo con la fórmula C
10×an.
2) Una vez llenaslascopasconviene que permanezcan en la s ala de cata,
a 20—22 ºC, cubiertascon un vidrio de reloj al menosuna hora antes
de comenzar los ensayos, a fin de homogeneizar su temperatura con la
ambiente.
3) Las 12 copas de una serie se colocan por el organizador del ensayo,
de mayor a menor concentración, en una fila.
A continuación se procede a invitar a cada candidato para que realice el
ensayo por separado, dándole las siguientes instrucciones:
9.4.2. Instrucciones para el candidato
Las12 copasalineadasfrente al candidato contienen dilucionesde cada
uno de los estímulos atrojado, avinado, rancio y amargo según sea el
caso. Las copas se diferencian unas de otras en la intensidad del olor, la
de olor más intenso se encuentra en el extremo izquierdo, la intensidad de
olor de las restantes va disminuyendo gradualmente hacia la derecha. La
última copa de la derecha puede tener tan poco olor que podría no ser
detectable.
Procédase como sigue: familiarícese con los olores de las copas que
forman la serie. Para ello comience a oler por la de la derecha (no12) e
intente recordar la intensidad de los olores. Procure no fatigarse.
Cuando considere que se ha habituado a la escala de concentraciones de
olor presentada, salga de la habitación.
El organizador del ensayo procederá, mientras tanto, a entresacar una
copa de la serie que emparejará con la última de la derecha procediendo
a tapar el hueco aproximando entre sí las restantes. Vuelva entonces de
nuevo a la habitación para continuar el ensayo.
La prueba consiste en lo siguiente:
La copa separada debe ser restituida al lugar que le corresponde en la
serie. Para ello puede olerla y compararla con las restantes tantas veces
como se quiera, teniendo en cuenta que si la restituye correctamente al
lugar que le corresponde, debe oler más fuerte que su inmediata de la
derecha y más débil que la de la inzquierda. Esta prueba se repetirá con
otrastrescopas .
Para facilitar el trabajo y la recogida de la respuesta emitida, a cada
candidato se le entregará junto con las instrucciones anteriormente
descritas el siguiente estadillo.
9.4.3. Obtención de losres ultados
Para facilitar la ordenación de datosde cada uno de loscandidatos , el
organizador del panel losanotará de la forma s iguiente:1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 64
▼B
9.4.4. Procedimiento estadístico de puntuación
En el caso concreto de la selección efectuada, las copas a reintegrar en su
lugar serán las mismas para todos y cada uno de los candidatos y de
acuerdo con los cálculos estadísticos realizados para este caso serán aque-
llas cuyo orden de serie se indica a continuación para cada atributo.
Atrojado (At) Avinado (Av) Rancio (Ra) Amargo (Am)
Copa noCopa noCopa noCopa no
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
El número ocupado por las copas en la serie no puede ser variado, puesto
que los cálculos estadísticos para este ensayo se han realizado de acuerdo
con la probabilidad de que las copas indicadas sean restituidas a su lugar
por azar.
Ahora bien, con objeto de dificultar, cualquier paso de información de un
candidato a otro el organizador del panel tendrá presente los siguientes
puntos:
1) Los candidatos no pueden comunicarse entre sí. Las claves serán dife-
rentespara cada candidato.
2) Los candidatos no pueden enterarse qué posición ocupan las copas que
se le han retirado.
3) Aunque todosloscandidatosdeben recibir lascopasres eñadasante-
riormente, el organizador debe variar el orden en que lasentrega a
cada candidato.
A cada candidato se le asigna una puntuación en función de sus resul-
tados obtenidos; procediendo tal y como se pasa a describir a
continuación:
Sean ei
1,ei
2,…e12ilas12 copascon lasdoce concentracionescorres pon-
dientesde un atributo i (i = cualquiera de loscuatro atributosatrojado,
avinado, rancio y amargo) ordenadasde mayor a menor.
Sea ekiuna de las copas seleccionadas y sea K ′la posición que asigna el
candidato a dicha copa en la serie. Los valores de K y K ′son, por consi-
guiente, númerosenteroscomprendidosentre el 1 y el 12 ambosinclus ive
que corresponden a las posiciones real y asignada por el candidato,
respectivamente, de la copa seleccionada.
Sea T (máxima desviación admitida) un valor, fijado de antemano, en
nuestro caso igual a 3 de tal forma que si (K ′− K) > T el candidato es
rechazado automáticamente (1).
Si por el contrario (K ′−K )≤T, el candidato, en principio, no esrecha-
zado y puede continuar la prueba, puesto que es capaz de situar el
estímulo problema en el lugar que le corresponde o cuando menos en
loslugarespróximosinmediatos .
En este caso, la puntuación asignada a un candidato cuando valora un
estímulo (concentración) de un determinado atributo, por ejemplo, de la
serie atrojado (At), será igual al cuadrado de la diferencia entre el número
de orden que corresponde a la posición correcta que ocuparía en la serie
la copa portadora del estímulo y la posición a que el candidato la ha rein-
tegrado, esdecir:
P(At)
h=( K′−K )21991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 65
(1) Es importante que el organizador insista sobre el candidato a fin de que el ensayo se
conduzca razonablemente sin que se produzca una pérdida de sensibilidad por
cansancio olfativo.
▼B
Puesto que esta operación será realizada por un mismo cadidato sobre
cuatro estímulos (concentraciones) de cada atributo, la puntación parcial
para dicho atributo (por ejemplo At) sería:
ZAt=PAt
h+PAt
j+PAt
l+PAt
m
Para facilidad de comprensión se exponen los siguientes ejemplos:
Ejemplo 1:
Supongamos que las respuestas del candidato A para los cuatro estímulos
que se han retirado de la serie del atributo (i) son las siguientes:
Posición correcta de
la copa en la serie
(K)Posición en que fue
colocada (K ′)Separación de la posición
correcta
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 5 4−5=−1
10 6 10 − 6 = 4 (1)
2 4 2−4=−2
(1) Este candidato es rechazado, ya que ha obtenido en el ensayo un valor de T > 3.
Ejemplo 2:
Supongamosque un candidato reordena lascopasde un atributo como
sigue:
Posición correcta de
la copa en la serie
(K)Posición en que fue
colocada
(K′)Separación de la posición
correcta
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10 − 7 = 3
2 3 2−3=−1
Este candidato no es rechazado y la puntuación que obtiene para este atri-
buto es:
Zi=02+02+32+( −1 )2=1 0
La puntuación final del candidato que nospermitirá s eleccionarlo o no
como catador en función de sus respuestas frente a los cuatro atributos
que hemos tomado para la selección sería:
PhAt+PjAt+PlAt+PmAt=ZAt
PhAv+PjAv+PlAv+PmAv=ZAv
PhRa+PjRa+PlRa+PmRa=ZRa
PhAm+PjAm+PlAm+PmAm=ZAm
Z final = ZAt+…+ZAm
siendo:
At: atrojado.
Av: avinado.
Ra: rancio.Am: amargo.
El problema es ahora determinar hasta qué valor de Z es posible consi-
derar que el candidato pos ee buenosnivelesde percepción, memoria
olfativa y organización mental para dar la adecuada respuesta para los
cuatro estímulos considerados. Naturalmente Z es siempre un valor no
negativo, y Z = 0 significa que el candidato ha reconocido y cuantificado
correctamente todas las 16 intensidades presentadas (cuatro de cada atri-
buto). Valoresde Z dis tintosde cero indican que el candidato ha
reconocido las zonas de las escalas donde se sitúan las intensidades selec-
cionadas, pero dentro de ellas no ha podido realizar una correcta situación1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 66
▼B
a su posición debido a que no posee una buena capacidad discriminatoria
asociada a la escala de intensidad que se le ha presentado para uno o
varios de los estímulos.
Así pues, habrá que determinar un valor crítico Z, tal que en el supuesto
de que el candidato realice todas sus asignaciones de posición en la
escala al azar dentro de las zonas que previamente ha reconocido, la
probabilidad de una puntación definitiva Z, inferior a Zc, sea una cantidad
suficientemente pequeña αque previamente se puede fijar. En otras pala-
bras, que la probabilidad de que con este procedimiento se seleccione un
catador para el panel que no posea suficiente capacidad discriminatoria
para las intensidades de estos estímulos que se han utilizado para la selec-
ción, sea inferior a α.
Fijado α,en nuestro caso igual 0,05, la obtención de Zcdepende de la
distribución de probabilidad de la variable Z, que a su vez depende de
lasdis tribucionesde probabilidad de lasvariablesp (K ′).
Realizados los cálculos estadísticos correspondientes, el valor obtenido
para Zcesigual a 34.
Una vez obtenida la puntuación Z de todos los candidatos, serán recha-
zados aquellos cuya puntuación sea superior a 34.
Por ejemplo, los candidatos A y B obtienen las siguientes puntuaciones:
Atributo Candidato A Candidato B
Atrojado ZAt=1 0 ZAt=1 2
Avinado ZAv=1 0 ZAv=1 1
Rancio ZRa=1 0 ZRa=1 5
Amargo ZAm=4 ZAm=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Losvaloresde Z para amboscandidatoss on para el A = 34 y para el B
= 38, luego será elegido el candidato A y rechazado el B. Eliminando los
candidatos con puntuación superior a 34 los restantes se ordenarán por
sus valores de Z, eligiéndose por orden hasta completar el número de 12
que deseamos reunir.
9.5.Entrenamiento
El entrenamiento tiene como objetivosprincipales :
a) familiarizar al catador con las numerosas variantes olfato-gustativo-
táctilesque ofrecen losaceitesde oliva vírgenes ;
b) familiarizar a los catadores con la metodología sensorial específica;
c) incrementar la habilidad individual para reconocer, identificar y cuan-
tificar los atributos sensoriales;
d) mejorar la sensibilidad y la memoria frente a los distintos atributos
para conseguir juicios consistentes.
El período de entrenamiento suele consistir en una serie de sesiones
según las posibilidades del grupo y del estudio, en las que después de
analizar individualmente losaceites , loscatadoresdis cuten conjuntamente
con el director lasdificultadesencontradasy comentan lascalificaciones
para aunar criteriosy unificar opiniones .
El grado de entrenamiento conseguido después de un determinado
número de sesiones se evalúa observando el incremento en el porcentaje
de juicios correctos si se utilizan pruebas discriminatorias o analizando
lasvariacionesde lascalificacionesindividualesmediasdel grupo,
cuando se trata de pruebas escalares.
La utilidad práctica de este período de entrenamiento ha sido amplia-
mente discutida, pero hoy se considera muy eficaz e incluso
imprescindible cuando se necesita disponer de datos sensoriales exactos
y precisos.
9.6.Comprobación
Losgruposde catadoresmuy entrenadoss uelen realizar catasperiódicas
y continuadas con pruebas sensoriales que requieren un gran esfuerzo.
Sobre su opinión se basan, en muchas ocasiones, decisiones de gran1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 67
▼B
importancia tecnológica y comercial, y por ello, después de seleccionados
y entrenados, deben estar sometidos a comprobaciones que garanticen la
fiabilidad de los resultados.
Es evidente que sería necesario, una vez los paneles constituidos y some-
tidos a ensayos de rutina, proceder periódicamente a comprobar su
«performance» a intervalosadecuados .
10. PROCEDIMIENTO PARA LA EVALUACIÓN ORGANOLÉPTICA DE
ACEITES DE OLIVA VÍRGENES
Reunidaslascondicionesy mediosneces ariosindicadosen lasnormas
anteriormente citadas y seleccionado el grupo de catadores, cada uno de
ellosolerá y degus tará(1) la copa que contiene la muestra de aceite some-
tida a examen analizando en ella las percepciones olfativas, gustativas,
táctilesy quines téticascon ayuda de la hoja de la figura 2 donde anotará
su presencia y el valor de su intensidad. A continuación pasará a puntuar
la calidad del aceite.
10.1.Utilizacióndelahojadelafigura2 (descripción del flavor y puntua-
ción de calidad)
En la parte izquierda de esta hoja se incluyen algunas de las percepciones
sensoriales más características que suelen encontrarse con mayor
frecuencia en los aceites de oliva y que describen su flavor. En el caso
de que se perciban otros estímulos que no se correspondan con los califi-
cativosenumeradosdeberá anotarloscomo «otros » empleando el
calificativo o calificativos que lo describa o describan con mayor
propiedad.
Los estímulos perceptibles deberán ser valorados proporcionalmente a su
intensidad indicando ésta con un signo (+) en el casillero correspondiente,
de acuerdo con el criterio siguiente:
1: casi imperceptible.
2: ligera.
3: media.
4: grande.5: extrema.
En la parte derecha de esta hoja, se establece una escala de 9 puntos (9
calidad excepcional, 1 pésima) que será utilizada por el catador para dar
una puntuación única, conjunta, de las características del aceite. Esta
puntuación debe ser consecuente con las virtudes, defectos encontrados
en el aceite, anotadosya en la parte de la izquierda.
La primera columna (defectos) de la tabla de puntuación comprende
cinco apartados, de esta forma la clasificación de los aceites se basará
fundamentalmente en la ausencia total o en la presencia de flavores
defectuosos así como en la mayor o menor gravedad o intensidad de
éstos; sin embargo, como la escala de valoración es de 9 puntos, deberán
considerarse algunos matices o aspectos que contribuyen de forma defini-
tiva a decidir la puntuación total de calidad, que se describen en la
segunda columna (características).
10.2.Puntuaciónfinal
El jefe del panel recogerá laspuntuacionesdadaspor cada uno de los
catadores, comprobará que los atributos y las intensidades con que los
ha percibido y marcado en la tabla de perfil se corresponden aceptable-
mente con la valoración asignada al aceite en la «hoja de puntuación».
En caso de existir una diferencia apreciable, solicitará al catador que
revise su hoja de puntuación.
Si fuese necesario, el catador repetirá el ensayo.
Por último, el jefe del panel tabulará laspuntuacionesde todo el grupo y
calculará la media aritmética y el error típico (de la media).
Si el error típico es superior al error de método, hará repetir el ensayo a
todo el grupo.
El grupo repetirá los ensayos hasta obtener una evaluación por triplicado
de la muestra, únicamente en el caso de análisis de revisión. La puntua-1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 68
(1) Podrá abstenerse cuando al olerla encuentre algún atributo extremada e intensamente
desagradable y anotará esta circunstancia excepcional en la hoja de puntuación.
▼B
ción final de la muestra será la media de las tres puntuaciones dadas, con
una cifra decimal.
Si el valor de intensidad media de amargo y/o picante es superior a 2,5,
al aceite se le dará la calificación correspondiente y se hará constar que
eses pecialmente amargo y/o picante.
Expresión de los resultados: el jefe del panel determinará, a partir de la
puntuación media, la categoría a la que corresponde la muestra, según los
valores establecidos en el Anexo I. Con este objeto, si la puntuación
media es igual o superior a 5 puntos, el jefe del panel aplicará:
— durante la campaña 1992/93, una tolerancia de + 1,5;
— a partir de la campaña 1993/94, una tolerancia de + 1.
No obstante, en el caso de las aceites objeto de operaciones de interven-
ción, no se aplicará ninguna tolerancia.
La diferencia estadística, relativa a los valores de repetibilidad y reprodu-
cibilidad del método, entre el resultado del análisis y el límite
reglamentario estará comprendida dentro del margen de tolerancia
contemplado en lospárrafosanteriores .
En el caso de que, durante las campañas antes mencionadas, el interesado
proceda a la clasificación del aceite sin aplicar el margen de tolerancia
previsto, podrá indicar en el envase inmediato la puntuación organolép-
tica mínima del producto, comprobable durante el período de
comercialización.
En el informe del análisis, el jefe del panel indicará únicamente la cate-
goría en la que se clasifique la muestra. Cuando se trate de un examen
efectuado por un analista de conformidad con el párrafo primero del apar-
tado 2 del artículo 2, dicho analista aplicará el mismo procedimiento de
determinación de la categoría.
Nota:Las muestras deberán conservarse cerradas y en frigorífico hasta su
análisis, devolviéndolas a éste hasta completar el triplicado.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 69
▼M12
▼M9
▼M5
▼B
▼M3
Figura2
Aceitedeolivavirgen
ANÁLISISSENSORIAL:VOCABULARIOGENERALBÁSICO
1. OBJETO
La presente norma tiene por objeto agrupar los términos generales utili-
zados para el análisis sensorial y proporcionar su definición.
2. VOCABULARIO
2.1.Terminologíageneral
Análisis sensorial (sustantivo):
examen de loscaracteresorganolépticosde un producto mediante los
sentidos.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 70
▼B
▼B
Percepción (sustantivo):
toma de conciencia sensorial de objetos o acontecimientos exteriores.
Organoléptico (adjetivo) (carácter o propiedad):
califica toda propiedad de un producto susceptible de ser percibida por
losórganosde loss entidos .
Experto (sustantivo):
(en lo que concierne al examen de loscaracteresorganolépticos )
catador especializado en el análisis sensorial de un determinado producto
y que posee conocimientos básicos sobre la elaboración del mismo y las
preferenciasdel mercado.
Catador (sustantivo):
persona perspicaz, sensible, seleccionada y entrenada, que estima con los
órganos de sus sentidos los caracteres organolépticos de un alimento.
Grupo de catadores:
conjunto de sujetos o jueces los cuales han sido especialmente seleccio-
nadosy entrenadosy que s e reúnen para efectuar bajo condiciones
controladas el análisis sensorial del producto.
Sensación (sustantivo):
fenómeno subjetivo resultante del estímulo de un sistema sensorial. Este
fenómeno es subjetivamente discriminable y objetivamente definible a
través del órgano sensorial interesado, según la naturaleza o la cualidad
del estímulo, así como por su intensidad.
Sensibilidad (sustantivo):
capacidad de los órganos sensoriales que les permite percibir cualitativa y
cuantitativamente un estímulo de poca intensidad o diferencias pequeñas
entre estímulos.
Cata(sustantivo):
operación que consiste en percibir, analizar y juzgar los caracteres orga-
nolépticos, y más particularmente los olfato-gustativos, táctiles y
quinestéticos de un producto alimenticio.
Aceptación (sustantivo):
acto que consiste en admitir como favorable un producto por parte de un
individuo o una población.
Armonía (sustantivo):
cualidad de un producto que origina una sensación de conjunto agradable.
Dicha sensación es debida a la percepción de sus componentes, aportados
como estímulos olfativos, gustativos, táctiles y quinestéticos porque se
encuentran en relacionesde concentración adecuadas .
Aceptabilidad (sustantivo):
estado de un producto recibido favorablemente por un individuo o pobla-
ción en función de sus propiedades organolépticas.
Discriminación (sustantivo):
diferenciación cualitativa y/o cuantitativa entre dos o varios estímulos.
Compensación (sustantivo):
resultado de la interacción debida a un conjunto de estímulos de modo
que cada uno se percibe con menor intensidad que si actuara solo.
Aspecto (sustantivo):
conjunto de caracteresorganolépticospercibidospor el órgano de la vis ta:
tamaño, forma, color, conformación, turbidez, limpieza, fluidez, espuma y
efervescencia.
Este término es preferible al de apariencia.
Atributo (sustantivo):
propiedad carcterística perceptible.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 71
▼B
2.2.Terminologíarelativaalafisiología
Estímulo (sustantivo):
agente físico o químico que produce específicamente la respuesta de los
receptores sensoriales externos o internos.
Gusto:(Sentido del gusto)uno de los sentidos cuyos receptores están localizados en la boca, parti-
cularmente sobre la lengua y que son activados por diferentes compuestos
en solución.
Gustativo (adjetivo):
califica la propiedad de un producto capaz de estimular el aparato gusta-
tivo despertando las sensaciones correspondientes a uno a varios de los
cuatros sabores elementales: dulce, salado, ácido y amargo.
Receptor (sustantivo):
estructura especializada de un órgano sensorial excitable, capaz de recibir
un estímulo y convertirlo en influjo nervioso.
Nota:Los receptores se clasifican según el tipo de energía asociada al
estímulo (luz, calor, sonido, etcétera).
Olfacción (sustantivo):
función del aparato olfativo con vistas a la percepción y discriminación
de las moléculas que acceden a él, en fase gaseosa desde un medio
externo, por vía nasal directa o indirecta.
Intensidad (sustantivo):
grado de energía de una cualidad medible según una escala cuantitativa
de valoress uperioresal umbral.
Adaptación (sustantivo):
modificación temporal de la sensibilidad para percibir estímulos senso-
riales como resultado de una contínua y repetida exposición a ese o
similar estímulo.
Inhibición (sustantivo):
falta de respuesta por parte de un órgano sensorial o de una parte del
mismo, a pesar de estar sometido a la acción de un estímulo adecuado
de intensidad superior al umbral.
Respuesta (sustantivo):
acción con que las células sensoriales corresponden a la de uno o varios
estímulos relativos a una modalidad sensorial definida.
Cuerpo (sustantivo):
sensación táctil percibida en la boca y que otorga un grado de densidad,
viscosidad, consistencia o compacidad a un producto.
Fragancia (sustantivo):
olor fresco, suave y delicioso.Oler(verbo):
(sentido activo aplicado al olfato)designa la acción de percibir un olor.
Objetivo (adjetivo):
a) califica a aquello que proporciona una representación real y compro-
bable del objeto, reduciendo al mínimo losfactoreshumanos(por
ejemplo: preferencia, costumbre, afectividad);
b) califica a aquella técnica que, bien utilizando métodos sensoriales o
métodos instrumentales, permite reducir al mínimo los errores propios.
Nota:Se desaconseja emplear como sinónimo el término de instrumental.
Subjetivo (adjetivo):
califica a aquello que proporciona una percepción condicionada por
nuestro modo de pensar o sentir y no sólo por el estímulo.
Quinestesia:1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 72
▼B
conjunto de sensaciones resultante de una presión aplicable a la muestra
por un movimiento (por ejemplo, presión de los dedos en el caso de un
queso).
Umbral (sustantivo):
Umbral absoluto:
cantidad mínima de un estímulo sensorial, que da lugar:
— a la aparición de una sensación (umbral de aparición o de detección),
— o al reconocimiento de dicha sensación (umbral de identificación).
Umbral diferencial:
cantidad mínima de estímulo sensorial que da lugar a una diferencia
perceptible en la intensidad de la sensación.
Umbral final:
cantidad máxima de un estímulo a partir de la cual un aumento de inten-
sidad no se percibe.
Umbral preferencial:
valor cuantitativo mínimo de un estímulo o valor crítico supraliminar de
este estímulo al que corresponde la aparición de una respuesta de atrac-
ción o repulsa en relación con un estímulo neutro, por ejemplo, en la
elección entre una solución azucarada y el agua.
Nota:se debe distinguir entre umbral absoluto de preferencia y umbral
diferencial de preferencia.
Subliminar (adjetivo):
por debajo del umbral absoluto.Supraliminar (adjetivo):
por encima del umbral absoluto.
Fatiga sensorial:
caso particular de adaptación sensorial en el que se produce una disminu-
ción de la sensibilidad.
Compensación (sustantivo):
resultado de la interacción debida a un conjunto de estímulos de modo
que cada uno se percibe con menor intensidad que si actuara solo.
Sinérgico (adjetivo):
efecto o acción concertada de determinadas sustancias, de modo que la
intensidad de los caracteres organolépticos resultantes de la mezcla son
superiores a la suma de las intensidades que cada uno de ellos mostraba
por separado.
Efecto de contraste:
aumento de la respuesta a las diferencias entre los estímulos simultáneos
o consecutivos. Contrario del efecto de convergencia.
Efecto de convergencia:
disminución de la respuesta a las diferencias entre los estímulos simultá-
neos o consecutivos. Contrario del efecto de contraste.
2.3.Terminologíarelativaalaspropiedadesorganolépticas
Ácido(adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por soluciones acuosas diluidas
de la mayoría de losácidos(por ejemplo, ácidoscítrico, láctico y
tartárico);
b) califica la propiedad de los cuerpos puros o mezclas que al ser degus-
tados producen este sabor.
El sustantivo correspondiente es acidez.
Agrio(adjetivo):
califica la sensación olfato-gustativa con predominio de ácidos general-
mente de origen fermentativo, y a losalimentosque producen es ta
sensación. Algunos factores que contribuyen a dicha sensación están rela-1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 73
▼B
cionadoscon el proces o de fermentación, por ejemplo acética, de un
producto alimenticio.
Amargo (adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por soluciones acuosas diluidas
de diversas sustancias tales como quinina, cafeína y determinados
heterósidos;
b) califica la propiedad de aquelloscuerpospuroso s usmezclasque al
ser degustados producen este sabor.
El sustantivo correspondiente es amargor.
Salado (adjetivo):
a) sensación característica que se percibe a través del sentido del gusto,
cuyo ejemplo mástípico esel producido por una s olución de cloruro
sódico;
b) califica la propiedad de las sustancias o mezclas que producen este
sabor durante la degustación.
El sustantivo correspondiente es salinidad.
Dulce(adjetivo):
a) califica el sabor elemental producido por las soluciones acuosas de
diversas sustancias, por ejemplo, la sacarosa;
b) califica la propiedad de las sustancias puras o mezclas, que al ser
degustadas producen este sabor.
El sustantivo correspondiente es dulzor.
Astringente:
a) califica la sensación compleja producida en la boca por una solución
acuosa diluida de productos como algunos taninos (por ejemplo, los
taninosdel caqui y de endrina);
b) califica la propiedad de loscuerpospuroso mezclasque producen
esta sensación.
El sustantivo correspondiente es astringencia.
Flavor (sustantivo):
se entiende por flavor el conjunto de percepciones de estímulos olfatogus-
tativos, táctiles y quinestéticos que permite a un sujeto identificar un
alimento y establecer un criterio, a distintos niveles, de agrado o desa-
grado.
Sabor(sustantivo):
a) sensaciones percibidas como consecuencia del estímulo de las papilas
gustativas por algunas sustancias solubles,
b) cualidad de la sensación particular producida por tales sustancias.
Sabor elemental (sustantivo):
Cada uno de los cuatro sabores reconocidos: dulce, salado, ácido, amargo.
Olor(sustantivo):
a) conjunto de sensaciones percibidas por el órgano olfativo cuando se
inspiran determinadas sustancias volátiles;
b) cualidad de la sensación particular producida por cada una de las
sustancias anteriores.
Aroma (sustantivo):
a) sensaciones agradables percibidas por el órgano olfativo por vía indi-
recta cuando se realiza la degustación de un alimento;
b) en perfumería y en lenguaje no especializado se aplica también a las
mismas sensaciones apreciadas por vía nasal directa.
Regusto (sustantivo):
Conjunto de sensaciones percibidas después de haber desaparecido el
estímulo de la boca, distintas a las percibidas previamente.
Ess inónimo de dejo.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 74
▼B
Aromático (adjetivo):
a) califica la propiedad de los cuerpos puros o mezclas que, al ser degus-
tados, producen las sensaciones calificadas como aroma;
b) califica a aquellosproductosque, examinadospor vía nas al directa,
producen sensaciones de fragancia y frescor.
Textura (sustantivo):
características del estado sólido o reológico de un producto, cuyo
conjunto es capaz de estimular los receptores mecánicos, durante la
degustación, particularmente de los situados en la región bucal.
Nota:Este término se refiere únicamente a las propiedades objetivas y no
a las sensaciones producidas y que se designan por términos gene-
rales, tales como consistencia, fibrosidad, untuosidad, etc.
Paladear:
acción de conseguir que un alimento situado en la boca entre en contacto
con todas las zonas sensibles de la misma, con objeto de percibir las
sensaciones bucales que produce.
Nota:Este vocabulario puede ampliarse consultando las Normas ISO
5492/I, II, III, IV, V y otras existentes, tales como el elaborado
por J.L. Magnen «Lescahierstechniquesdu Centre national de
coordination desetudeset recherchess ur la nutrition et l'alimenta-
tion», etc.
COPAPARALADEGUSTACIÓNDEACEITES
1. OBJETO
La presente norma tiene por objeto describir las características de la copa,
destinada al análisis organoléptico de los aceites comestibles (olor, sabor,
flavor).
Describe, además, el dispositivo de calentamiento adaptado, necesario
para la obtención y el mantenimiento de la temperatura adecuada para
este análisis.
2. DESCRIPCIÓN
El esquema diseñado de la figura 1 pretende optimizar las características
deseables en un utensilio de esta naturaleza, y que pueden concretarse en
los puntos siguientes:
a) máxima estabilidad, dificultando su inclinación y derramamiento del
aceite contenido;
b) fondo fácilmente adaptable a loshuecosdel bloque de calefacción que
permite el calentamiento homogéneo de la base de la copa;
c) estrechamiento de la boca que favorece la concentración de olores y
facilita su identificación;
d) de vidrio oscuro que no permita al catador percibir el color del aceite,
impidiéndole cualquier prejuicio y la posible creación de sesgos o
tendenciasque puedan afectar a la objetividad de la determinación.
2.1.Dimensiones
El esquema de la copa va representado en la figura 1, teniendo las dimen-
siones siguientes:
— capacidad total ….............................. 130 ml ± 10 ml,
— altura total ….................................. 60 mm ± 1 mm,— diámetro de la boca …......................... 50 mm ± 1 mm,— diámetro de la parte másancha … .............. 70 mm ± 1 mm,— diámetro de la base …......................... 35 mm ± 1 mm,— espesor de vidrio en las paredes laterales ….... 1,5 mm ± 0,2 mm,— espesor de vidrio en el fondo … ................ 5 mm ± 1 mm.
Cada copa irá acompañada de un vidrio de reloj cuyo diámetro será de
unos 10 mm superior al de su boca. Este vidrio servirá de tapa para evitar
la pérdida de aroma y la entrada de polvo.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 75
▼B
2.2.Característicasdefabricación
La copa deberá estar fabricada con vidrio resistente; de color oscuro que
impida apreciar la coloración de su contenido, exento de rayas o
burbujas.
El borde deberá ser regular, liso y rebordeado.La pieza deberá estar recocida, permitiéndole resistir las variaciones de
temperatura que ha de sufrir en los ensayos.
2.3.Normasparalautilización
La limpieza de lascopasdeberá realizars e utilizando jabón o detergente
no perfumados, enjuagándose a continuación repetidas veces hasta
eliminar totalmente el agente de limpieza. Se enjuaga finalmente con
agua destilada, se deja escurrir y se seca en una estufa de desecación.
No deben utilizarse ácidos concentrados ni mezcla crómica.Las copas deben mantenerse en la estufa hasta su utilización, o conser-
varse en un armario protegiéndolas de toda contaminación de olores
extraños.
Antesde cada utilización, deberá olers e cada copa, con el fin de
comprobar la ausencia de cualquier olor extraño. Al preparar el ensayo
se tendrá mucho cuidado de anotar la clave de cada copa y el aceite que
le corresponde. Esta correspondencia clave/aceite sólo será conocida por
el organizador del ensayo.
3. DISPOSITIVO DE CALENTAMIENTO DE LAS MUESTRAS
El examen organoléptico de las muestras deberá efectuarse a una tempe-
ratura determinada que, para los aceites comestibles, debe ser de 28 ± 2 ºC.
Para conseguir esto, deberá instalarse en el interior de cada cabina, al
alcance del catador, un dispositivo de calefacción como el representado
en la figura 2. Consiste en un bloque de aluminio sumergido en un baño
de agua regulado termostáticamente, con el objeto de obtener una tempe-
ratura uniforme. Este bloque lleva una serie de oquedades a las que se
adaptan losfondosde lascopas . La diferencia de temperatura entre el
dispositivo de calentamiento y el aceite de las copas colocadas en las
oquedades de los distintos bloques no debe ser superior a ± 2 ºC.
Figura1—Copadedegustación
Dimensiones (en mm)1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 76
▼B
Figura 2 — Dispositivo de calentamiento de las muestras (Dimen-
sionesenmilímetros)
GUÍAPARALAINSTALACIÓNDEUNASALADECATA
1. INTRODUCCIÓN
La sala de cata tiene por objeto proporcionar al grupo de catadores que
intervienen en los ensayos sensoriales un ambiente adecuado, cómodo y
normalizado que facilite el trabajo y tienda a mejorar la repetitividad y
reproducibilidad de los resultados.
2. OBJETO
La presente norma tiene por objeto precisar las condiciones básicas a que
debe atenerse la instalación de una sala de cata.
3. ESPECIFICACIONES GENERALES DE LA INSTALACIÓN
Un local, cualquiera que sea su superficie, deberá responder a las especi-
ficaciones siguientes:
El local deberá ser agradable y estar convenientemente iluminado, pero
conservando un carácter neutro. Con este fin, se recomienda un color1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 77
▼B
relajante, liso y claro en las paredes para que se cree una atmósfera de
distensión(1).
El local será de fácil limpieza y estará aislado de cualquier fuente de
ruido; por tanto, preferentemente insonorizado. Estará igualmente aislado
de olores extraños por lo que, a ser posible, estará provisto de un dispo-
sitivo eficaz de ventilación. Si las oscilaciones de la temperatura
ambiental lo aconsejan, la sala de cata deberá dotarse de aire acondicio-
nado que mantenga el ambiente próximo a 20-22 ºC.
3.1.Dimensiones
Las dimensiones del local dependen frecuentemente de las disponibili-
dades de los laboratorios o de las empresas. En general, deberá ser lo
suficientemente espacioso para permitir la instalación de unas diez
cabinas y también de una zona para la preparación de las muestras.
Sin embargo, es evidente que cuanto mayor sea el espacio dedicado a las
instalaciones, mejor será, ya que así se podrán prever dependencias
anexaspara, por ejemplo, limpieza del material, colocación de prepara-
cionesculinariasy reunionesde «panelesabiertos ».
3.2.Iluminación
La iluminación general, ya provenga de la luz solar o de lámparas (por
ejemplo, lámparasde tubo tipo «luz de día») s erá uniforme, regulable y
con luz difusa.
3.3.Temperaturayestadohigrométrico
El local se mantendrá continuamente en condiciones térmicas e higromé-
tricas agradables. Salvo circunstancias especiales, se recomienda una
temperatura de 20-22 ºC y un estado higrométrico de 60 a 70 % de
humedad relativa.
4. DESCRIPCIÓN DE LAS CABINAS
4.1.Característicasgenerales
Las cabinas se situarán en el local una al lado de otra, serán idénticas
entre sí y estarán separadas unas de otras por mamparas lo suficiente-
mente altas y anchas para aislar a los catadores entre sí, una vez
sentados. Se pueden construir de cualquier material apropiado y de fácil
limpieza y conservación (por ejemplo: madera, contra-chapado vitrifi-
cado, paneles laminados, etcétera). Si se utilizan pinturas, éstas deberán,
después de secas, ser totalmente inodoras.
Los asientos previstos en cada cabina serán cómodos y de altura regu-
lable.
También hay que prever que en cada una de ellasel alumbrado s ea indi-
vidual, regulable en dirección e intensidad.
Es muy recomendable que las cabinas estén provistas de un pulsador
conectado a un dispositivo luminoso exterior que permita al catador
comunicar a la persona que lo atiende desde el exterior, sin distraer a
los demás, que ha terminado el ensayo, desea nuevas muestras, carece
de algún utensilio, ha observado alguna irregularidad, o desea alguna
información, etc.
4.2.Dimensiones
Las cabinas serán suficientemente amplias y confortables.En general, se mantendrán las siguientes dimensiones:
— ancho:
0,75 m (sin pila en la mesa),0,85 m (con pila en la mesa);
— fondo:
0,50 m (la mesa),0,20 m exceso de la mampara;
— altura de lasmamparas :1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 78
(1) El color de la habitación y su iluminación pueden influir en los resultados del análisis
sensorial.
▼B
0,60 m mínimo a partir de la mesa;
— altura de la mesa:
0,75 metros.
4.3.Disposición
La superficie de la mesa será de fácil limpieza.Una parte de esta superficie debe reservarse para una pila dotada de agua
corriente potable. Sin embargo, si esto no es factible, se reservará este
espacio para la colocación de una cubeta, escupidera o similar.
Cuando se deban mantener las muestras, mientras se realiza la prueba a
temperatura constante superior o inferior al ambiente, conviene disponer
de un equipo adecuado para tal fin (baño María, placa calefactora, etc.).
También se puede instalar una repisa, a una altura aproximada del suelo
de 1,10 metros, para colocar en ella diferentes accesorios (vasos, material
menudo, etc.).
Si la disposición de las cabinas en la sala lo permite, es conveniente
instalar un dispositivo para facilitar la presentación de las muestras. Este
puede ser en forma de corredera (figura 1), de torno vertical (figura 2)
indicado para vasos o copas (recipientes altos), o de torno horizontal
cuando los recipientes en que se sirven las muestras tienen poca altura
(figura 3). Sencillamente, que posea hueco suficiente para el paso de las
bandejasy copasque contengan lasmues trasa examinar.
5. LOCALES COMPLEMENTARIOS
Si se dispone de espacio suficiente, conviene contar con locales separados
para preparación de muestras (cocina experimental si se prevén ensayos
culinarios u otros), estanterías para la colocación de vasos o utensilios y
salas de reunión para las discusiones previas o posteriores a los ensayos.
En estos casos dichos locales se mantendrán limpios y en ningún caso
podrán molestar el trabajo de los jueces, en la sala de cata, con sus
olores, ruidos, o con la conversación de los reunidos.
Véase en la figura 4 un ejemplo de sala de cata e instalaciones comple-
mentarias.
Nota:Las condiciones descritas son las ideales; pero si no fuese posible
disponer de una instalación semejante reservada únicamente para
el análisis sensorial, los ensayos podrían realizarse en un local
que reúna lascondicionesmínimasdes critas(luz, temperatura,
ruido, olores), instalando cabinas móviles a partir de elementos
plegables de tal forma que permitan, como mínimo aislar entre sí
a loscatadores .1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 79
▼B
DISPOSICIÓN DE LA CABINA
Figura1
1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 80
▼B
TORNO DE PRESENTACIÓN DE LAS MUESTRAS
Figura2
1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 81
▼B
TRAMPILLA DE PRESENTACIÓN DE LAS MUESTRAS
Figura3
1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 82
▼B
LABORATORIO DE ANÁLISIS SENSORIAL
Figura4— Ejemplo de sala de cata
1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 83
▼B
ANEXO XIII
NEUTRALIZACIÓNYDECOLORACIÓNDELACEITEDEOLIVAEN
LABRATORIO
1. NEUTRALIZACIÓN Y DECOLORACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA
EN LABORATORIO
1.1.Neutralizacióndelaceite
1.1.1. Equipo
— vaso de 300 ml de forma alta,
— centrífuga con tubosde 100 ml,— vaso de 250 ml,— matracesde 100 ml,— ampolla de decantación de 1 litro.
1.1.2. Reactivos
— solución acuosa de hidróxido de sodio al 12 %,
— solución etanólica al 1 % de fenolftaleína,— hexano para análisis,— alcohol isopropílico puro para análisis.
1.1.3. Modo de operar
a)Aceites de acidez expresada en ácido oleico inferior al 30%
Introducir en un vaso de 300 ml de forma alta, 50 g de aceite bruto y
calentar a 65 ºC al baño María. Agitar lentamente, y añadir una
cantidad de solución de hidróxido de sodio al 12 % que corresponda
a la acidez libre del aceite con un exceso del 5 %. Continuar agitando
durante cinco minutos, manteniendo la temperatura a 65 ºC.
Trasladar el total a unos tubos de centrífuga de 100 ml, separar la
masa jabonosa por centrifugación. Verter el aceite decantado en un
vaso de 250 ml y lavar con 50-60 ml de agua destilada hirviendo
eliminando durante este proceso la capa acuosa con la ayuda de un
sifón. Repetir los lavados hasta eliminar completamente los restos de
jabon residual (desaparición de la coloración rosa en la fenolftaleína).
Centrifugar el aceite para eliminar laspequeñascantidadesde agua
residual.
b)Aceites de acidez expresada en ácido oleico superior al 30%
Introducir en una ampolla de decantación de un litro, 50 g de aceite
bruto, 200 ml de hexano, 100 ml de alcohol isopropílico y una
cantidad de solución de hidróxido de sodio al 12 % que corresponda
a la acidez libre del aceite, con un exceso del 0,3 %. Agitar enérgica-
mente durante un minuto. Añadir 100 ml de agua destilada, agitar de
nuevo y dejar reposar.
Después de la separación de las capas, dejar salir la capa inferior que
contiene los jabones. Entre ambas capas (aceitosa por encima y acuosa
por debajo) se forma frecuentemente una capa intermedia constituida
por mucílagos y sustancias insolubles que deberá eliminarse igual-
mente
Proceder a continuación al lavado de la solución hexánica de aceite
neutro con porciones de 50-60 ml de una solución de alcohol isopropí-
lico/agua destilada 1/1 (v/v) hasta la desaparición de la coloración
rosa en la fenolftaleína. Proceder a continuación a la eliminación
completa del hexano por destilación en vacío (por ejemplo, en el rota-
vapor).
1.2.Decoloracióndelaceiteneutro
1.2.1. Equipo
— matraz de 250 ml con 3 bocasque permitan la ins erción de:
a) un termómetro graduado en gradosque permita hacer lecturas
hasta 90 ºC,1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 84
▼M6
▼B
▼B
b) un agitador mecánico que gire a 250-300 vueltaspor minuto equi-
pado para el funcionamiento en vacio,
c) un rácor hacia la bomba de vacío,
— bomba de vacio, provista de un manómetro, capaz de lograr presiones
residuales de 15-30 milibares.
1.2.2. Modo de operar
Pesar en el matraz de 3 bocas cerca de 100 g del aceite neutralizado.
Insertar el termómetro y el agitador, volver a unir a la bomba de vacío
y calentar hasta 90 ºC agitándolo.
Mantener dicha temperatura, siempre bajo agitación, hasta que el aceite
que deba analizarse esté completamente liberado de su humedad (treinta
minutosaproximadamente).
Interrumpir entoncesel vacío y añadirle 2 a 3 g de tierra activada. Res ta-
blecer el vacío hasta obtener una presión residual de 15-30 milibares y,
siempre con una temperatura de 90 ºC, agitar durante 30 minutos a 250
vueltaspor minuto aproximadamente.
Filtrar a continuación en caliente en un baño termoestático (50-60 ºC).1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 85
▼M6
ANEXO XIV
NOTAS COMPLEMENTARIAS 2, 3 Y 4 DEL CAPÍTULO 15 DE LA
NOMENCLATURACOMBINADA
2. A. Sólo pertenecerán a loscódigosNC 1509 y 1510 losaceitesque procedan
exclusivamente del tratamiento de las aceitunas y cuyas características
analíticas relativas al contenido de ácidos grasos y esteroles sean las
siguientes:
Cuadro I: Contenido de ácidosgras osen porcentaje
del total de ácidosgras osCuadro II: Contenido de esteroles en porcentaje del
total de esteroles
Ácido mirístico M 0,1 Colesterol M 0,5
Ácido linolénico M 0,9 Brasicasterol M 0,2
Ácido araquídico M 0,7 Campesterol M 4,0
Ácido eicosánico M 0,5 Estigmasterol (1) < Campesterol
Ácido behénico M 0,3 Beta-sitosterol (2) m 93,0
Ácido lignocérico M 0,5 Delta-7-Estigmasterol M 0,5
m = mínimo
M = máximo
(1) Condición no válida para el aceite de oliva virgen lampante (subpartida 1509 10 10) ni para el aceite de
orujo de oliva en bruto (subpartida 1510 00 10).
(2) Delta-5, 23-Estigmastadienol + Clerosterol + Beta-Sitosterol + Sitostanol + Delta-5-Avenasterol + Delta-
5, 24-Estigmastadienol.
No pertenecerán a laspartidas1509 y 1510 losaceitesde oliva modifi-
cados químicamente (en particular, los aceites reesterificados) ni las
mezclasde aceite de oliva con aceitesde otro tipo. La pres encia de aceite
de oliva reesterificado o de aceites de otro tipo se determinará mediante
losmétodosindicadosen losAnexosV, VII, X A y X B del Reglamento
(CEE) no2568/91.
B. Sólo pertenecerán a la subpartida 1509 10los aceites de oliva definidos en
los puntos I y II siguientes, obtenidos únicamente por procedimientos
mecánicos o por otros procedimientos físicos, en condiciones, especial-
mente térmicas, que no alteren el aceite, y que no hayan sido sometidos
a mástratamiento que el lavado, la decantación, el centrifugado y la
filtración. Losaceitesobtenidosa partir de la oliva mediante s olventes
pertenecerán a la partida 1510.
I. Se considerará «aceite de oliva virgen lampante», tal como figura en
la subpartida 1509 10 10 y cualquiera que sea su acidez, el aceite que
presente:
a) un contenido de ►M9ceras◄no superior a ►M9350◄mg/
kg;
b) un contenido de eritrodiol y uvaol no superior a un 4,5 %;
c) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de los
triglicéridosno s uperior a un 1,3 %;
d) la suma de isómeros transoleicos inferior a un 0,10 % y la suma de
isomeros translinoleicos + translinolénicos inferior a un 0,10 %;
e) y una o varias de las siguientes características:
1) un índice de perióxido superior a 20 meq de oxgeno activo/kg;
2) un contenido de solventes halogenados volátiles totales superior
a 0,2 mg/kg o, por lo menos uno de ellos, superior a 1 mg/kg;
3) un coeficiente de extinción K270superior a 0,25 y, tras el trata-
miento del aceite con alúmina activada, no superior a 0,11; en
efecto, algunosaceitescon un contenido de ácidosgras os
libres, expresado en ácido oleico, superior a 3,3 g por 100 g
podrán tener, trasel pas o por alúmina activada, con arreglo al
método indicado en el Anexo IX del Reglamento (CEE) no
2568/91, un coeficiente de extinción K270superior a 0,10; en
ese caso, tras la neutralización y decoloración efectuadas en
laboratorio con arreglo al método indicado en el Anexo XIII
del Reglamento antesmencionado, deberán tener lass iguientes
características:
— un coeficiente de extinción K270no superior a 1,20,1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 86
▼M6
— una variación (Delta K) del coeficiente de extinción alre-
dedor de 270 nm superior a 0,01 pero no a 0,16, es decir.:
Delta K = Km− 0,5 (Km−4+Km+4)
Km= esel coeficiente de extinción a la
longitud de onda del vértico máximo
de la curva de absorción alrededor
de 270 nm,
Km−4yKm+4= son los coeficientes de extinción a las
longitudesde onda inferioresy s upe-
rioresen 4 nm a la de Km;
4) características organolépticas que revelen defectos perceptibles
con una intensidad superior al límite de aceptabilidad y con un
resultado de análisis sensorial inferior a 3,5 con arreglo a la
puntación contemplada en el Anexo XII del Reglamento
(CEE) no3568/91.
II. Se considerará «otro aceite de oliva virgen», tal como figura en la
subpartida 1509 10 90, el aceite de oliva que presente las siguientes
características:
a) una acidez, expresada en ácido oleico, no superior a 3,3 g/100 g;
b) un índice de perióxido no superior a 20 meq de oxígeno activo/kg;
c) un contenido de ►M9ceras◄no superior a ►M9250◄mg/
kg;
d) un contenido de solventes halogenados volátiles totales no superior
a 0,2 mg/kg y cada uno de elloscon un contenido no s uperior a 0,1
mg/kg;
e) un coeficiente de extinción K270no superior a 0,25 y, tras el paso
del aceite por alúmina activada no superior a 0,10;
f) una variación del coeficiente de extinción (Delta K) en la zona de
270 nm no superior a 0,01;
g) características organolépticas que revelen defectos perceptibles con
una intensidad inferior al límite de aceptabilidad, con un resultado
de análisis sensorial igual o superior a 3,5, con arreglo a lo dispu-
esto en el Anexo XII del Reglamento (CEE) no2568/91;
h) un contenido de eritrodiol + uvaol no superior a 4,5 %;
i) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de los
triglicéridosno s uperior a un 1,3 %;
j) la suma de isómeros transoleicos inferior a un 0,03 % y la suma de
isomeros translinoleicos + translinolénicos inferior a un 0,03 %.
C. Pertenecerá a la subpartida 1509 90 00 el aceite de oliva obtenido por
tratamiento de losaceitesde lass ubpartidas1509 10 10 y/o 1509 10 90,
incluso con adición de aceite de oliva virgen, que presente las caracterís-
ticas siguientes:
a) una acidez, expresada en ácido oleico, no superior a 3,3 g/100 g;
b) un contenido de ►M9ceras◄no superior a 350 mg/kg;
c) un coeficiente de extinción K270no superior a 1,20;
d) una variación del coeficiente de extinción ( ∆K) en la zona de 270 nm
no superior a 0,16;
e) un contenido de eritrodiol y uvaol no superior a un 4,5 %;
f) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de los trigli-
céridosno s uperior a un 1,5 %;
g) la suma de los isómeros transoleicos inferior a un 0,20 % y la suma de
isómeros translinoleicos + translinolénicos inferior a un 0,30 %.
D. Se considerarán «aceites crudos» tal come figuran en la subpartida
1510 00 10 losaceites , principalmente losaceitesde orujo de oliva, que
presentan las siguientes características:
a) una acidez, expresada en ácido oleico, igual o superior a 2 g/100 g;
b) un contenido de eritrodiol y uvaol superior a un 12 %;
c) un contenido de ácidos grasos saturados en la posición 2 de los trigli-
céridosno s uperior a un 1,8 %;
d) la suma de los isómeros transoleicos inferior a un 0,20 % y la suma de
los isómeros translinoleicos + translinolénicos inferior a un 0,10 %.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 87
▼M9
▼M6
▼M6
E. Pertenecerán a la subpartida 1510 00 90 los aceites obtenidos por trata-
miento de los aceites de la subpartida 1510 00 10, incluso con adición
de aceite de oliva virgen, y los que no presenten las características de
losaceitescontempladosen lasnotascomplementarias2 B, 2 C y 2 D.
Los aceites de la presente subpartida deben tener un contenido de ácidos
grasos saturados en la posición 2 de los triglicéridos no superior a un 2 %,
la suma de isómeros transoleicos inferior a un 0,40 % y la de los
isómeros translinoleicos + translinolénicos inferior a un 0,35 %.
3. Se excluirán de lass ubpartidas1522 00 31y 1522 00 39:
a) los resíduos procedentes del tratamiento de grasas que contengan aceite
cuyo índice de yodo, determinado por el métodosque figura en el Anexo
XVI del Reglamento (CEE) no2568/91 sea inferior a 70 o superior a 100.
b) los residuos procedentes del tratamiento de grasas que contengan aceite
cuyo índice de yodo esté comprendido entre 70 y 100, pero en los que
la superficie del pico correspondiente al tiempo de retención del beta-
sitosterol(1), determinada con arreglo a lo dispuesto en el Anexo V del
Reglamento (CEE) no2568/91, presenta menos del 93 % de la superficie
total de lospicosde loses teroles .
4. Los métodos que deberán aplicarse para determinar las características de los
productosantesmencionadoss on loscontempladosen losAnexosdel Regla-
mento (CEE) no2568/91.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 88
(1) Delta-5, 23-estigmastadienol + clerosterol ►C2+ beta-sitosterol ◄+ sitostanol +
delta-5-avenasterol + delta-5, 24-estigmastadienol.
▼B
ANEXO XV
1. CONTENIDO EN ACEITE DE LOS ORUJOS DE ACEITUNA
1.1.Material
— aparato de extracción apropiado tipo ►C1soxhlet ◄, provisto de un
matraz de 200 a 250 ml,
— baño por calefacción eléctrica (baño de arena, baño de agua, etc.) o
placa calefactora,
— balanza analítica,— estufa regulada a 80 ºC como máximo,— estufa de calefacción eléctrica provista de un dispositivo de termorregu-
lación regulada a 103 ºC ± 2 ºC y que permita realizar una insuflación
de aire o una presión reducida,
— triturador mecánico fácil de limpiar y que permita el triturado del orujo
sin calentamiento y sin disminución sensible de su contenido en agua yen aceite,
— cartucho de extracción y algodón hidrófilo o papel filtro, exentosde
productosextraíblespor el hexano,
— desecador,— criba con agujerosde 1 mm de diámetro,
— piedra pómez en pequeños granos, previamente secada.
1.2.Reactivo
n-hexano técnico cuyo residuo en evaporación completa deberá ser inferior
a 0,002 g para 100 ml.
2. MODO DE OPERAR2.1.Preparacióndelamuestraparaensayo
Triturar la muestra para laboratorio, si fuera necesario, en el triturador
mecánico, previamente bien limpio, para reducirla a partículasque puedan
atravesar completamente la criba.
Utilizar aproximadamente una vigésima parte de la muestra para completar
la limpieza del triturador, tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo,
mezclarlo con cuidado y analizarlo sin demora.
2.2.Tomademuestra
Pesar inmediatamente después del triturado, alrededor de 10 g de la
muestra para ensayo con una aproximación de 0,01 g.
2.3.Preparacióndelcartuchodeextracción
►
C1colocar la muestra en el cartucho y taparla con el tapón ◄de
algodón hidrófilo. En caso de haber utilizado papel de filtro, envolver la
muestra molida en dicho papel.
2.4.Presecado
Cuando el orujo esté muy húmedo (contenido en agua y en materias
volátiles superior al 10 %), efectuar un presecado colocando durante un
tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa
calentada a 80 ºC como máximo, para llevar el contenido en agua y en
materiasvolátilespor debajo del 10 %.
2.5.Preparacióndelmatraz
Pesar con aproximación de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de
piedra pómez, previamente secado en la estufa a 103 ºC ± 2 ºC y después
enfriado durante al menosuna hora en el des ecador.
2.6.Primeraextracción
Colocar en el aparato de extracción el cartucho (o el papel de filtro) que
contenga la muestra. Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano.
►C1Adaptar ◄el matraz al aparato de extracción y colocarlo todo sobre
la placa calefactora. Llevar la calefacción a tal estado que el caudal de
reflujo sea al menos de tres gotas por segundo (ebullición moderada, no
tumultuosa).1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 89
▼B
Después de cuatro horas de extracción, dejar enfriar. Quitar el cartucho del
aparato de extracción y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la
mayor parte del disolvente que lo impregna.
2.7.Segundaextracción
Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea
posible. Colocar de nuevo cuantitativamente la mezcla en el cartucho y ésta
en el aparato de extracción.
Empezar de nuevo la extracción durante doshorasmás , utilizando el
mismo matraz conteniendo la primera extracción.
La solución obtenida en el matraz de extracción deberá ser límpida. Si no
fuere así, filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer
matraz y el papel de filtro con hexano. Recoger el filtrado y el disolvente
en un segundo matraz previamente secado y tarado aproximadamente a
1 mg.
2.8.Eliminacióndeldisolventeypesadadelextracto
Eliminar en el equipo de extracción la mayor parte del disolvente. Eliminar
los últimos restos de éste calentando el matraz en la estufa a 103 ºC ± 2 ºC
durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminación, ya sea insuflando aire de
vez en cuando o preferiblemente un gasinerte, o actuando bajo una pres ión
reducida.
Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora, y
pesarlo con una precisión de 1 mg aproximadamente.
Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas condiciones, dejar enfriar en
el desecador y pesar.
La diferencia entre los resultados de estas dos pesadas deberá ser inferior o
igual a 10 mg, si no, calentar de nuevo durante períodos de diez minutos
seguidos de enfriamento y pesada, hasta que la diferencia de peso sea, a
lo sumo, de 10 mg. Seleccionar la última pesada del matraz.
Efectuar dosdeterminaciones .
3. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS3.1.Mododecálculoyfórmula
a) El extracto expresado en peso del producto tal cual será igual a:
S=m
1×100
m0
donde: S esel porcentaje en pes o del extracto del producto tal cual,
m0es el peso, en gramos, de la muestra,
m1es el peso, en gramos, del extracto seco.
Tomar como resultado la media aritmética de las dos determinaciones,
si las condiciones de repetitividad se cumplen.
Expresar el resultado con un solo decimal.
b) El extracto se relacionará con la materia seca utilizando la siguiente
fórmula:
S×100
100 − U= % grasa sobre extracto seco
donde: S esel procentaje en pes o de extracto del producto tal cual ver
a),
U es su contenido en agua y en materias volátiles.
3.2.Repetitividad
La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones, efectuadas
simultáneamente o rápidamente la una a continuación de la otra mediante
el mismo análisis, no deberá ser superior a 0,2 g de extracto de hexano por
cada 100 g de muestra.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 90
▼B
En caso contrario, repetir sobre otras dos tomas de muestra. Si esta vez la
diferencia es de nuevo superior a 0,2 g tomar como resultado la media arit-
mética de lascuatro determinacionesefectuadas .1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 91
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ANEXO XVI
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEYODO
1. OBJETO
La presente norma internacional especifica un método para la determina-
ción del índice de yodo de las grasas y aceites animales y vegetales, en lo
sucesivo denominados grasas.
2. DEFINICIÓN
A los fines de la presente norma internacional, se aplicará la definición
siguiente:
2.1.Índice de yodo: el peso de yodo absorbido por la muestra en las condi-
ciones de trabajo que se especifican en la presente norma internacional.
El índice de yodo se expresa en gramos de yodo por 100 gr de muestra.
3. PRINCIPIO
Disolución de la muestra problema y adición de reactivo de Wijs. Una vez
transcurrido el tiempo que se especifica, adición de solución acuosa de
yoduro potásico y valoración del yodo liberado con solución de tiosulfato
sódico.
4. REACTIVOS
Todoslosreactivoss erán de calidad analítica reconocida.
4.1. Yoduro potásico, solución de 100 g/l, exento de yodatos o de yodo libre.
4.2. Engrudo de almidón.
Mezclar 5 g de almidón soluble con 30 ml de agua, añadir esta mezcla a
1 000 ml de agua en ebullición, hervir durante 3 minutosy dejar enfriar.
4.3. Solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico.
c (Na2S2O3.5 H2O) = 0,1 mol/l, valorada como máximo 7 díasantesde s u
uso.
4.4. Disolvente, preparado mezclando volúmenes iguales de ciclohexano y
ácido acético.
4.5. Reactivo de Wijs, que contenga monocloruro de yodo en ácido acético. Se
utilizará reactivo de Wijscomercializado.
Nota:El reactivo contiene 9 g de ICl3+ 9 g de I en ácido acético.
5. MATERIAL
Material ordinario de laboratorio y, en particular, lo siguiente:
5.1. Navecillasde vidrio, apropiadaspara la mues tra problema y que puedan
introducirse en los matraces (5.2).
5.2. Matraceserlenmeyer de 500 ml de capacidad con boca es merilada,
provistos de sus correspondientes tapones de vidrio y perfectamente secos.
6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ►C1PROBLEMA ◄.
►C1La muestra homogeneizada, se seca sobre sulfato sódico y se
filtra◄.
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Tamaño de la muestra
El peso de la muestra varía en función del índice de yodo previsto, como se
indica en el cuadro 1.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 92
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Cuadro 1
Índice de yodo previsto Peso de la muestra problema
menosde 5 3,00 g
5—20 1,00 g
21—50 0,40 g
51—100 0,20 g
101—150 0,13 g
151—200 0,10 g
Pesar la muestra problema con precisión de 0,1 mg en una
►C1navecilla ◄de vidrio 5.1.
7.2. Determinación
Introducir la muestra problema en un matraz de 500 ml (5.2). Añadir 20 ml
del disolvente (4.4) para disolver la grasa. Agregar exactamente 25 ml del
reactivo de Wijs(4.5), tapar el matraz, agitar el contenido y colocar el
matraz al abrigo de la luz. No deberá utilizarse la boca para pipetear el
reactivo de Wijs.
Preparar del mismo modo un ensayo en blanco con el disolvente y el reac-
tivo, pero sin la muestra problema.
Para lasmues trascon un índice de yodo inferior a 150, mantener los
matraces en la oscuridad durante 1 hora; para las muestras con un índice
de yodo superior a 150, así como en el caso de productos polimerizados o
considerablemente oxidados, mantener en la oscuridad durante 2 horas.
Una vez transcurrido el tiempo correspondiente, agregar a cada uno de los
matraces 20 ml de solución de yoduro potásico (4.1) y 150 ml de agua.
Valorar con la disolucion de tiosulfato sódico (4.3) hasta que haya desapa-
recido casi totalmente el color amarillo producido por el yodo. Añadir unas
gotasde engrudo de almidón (4.2) y continuar la valoración has ta el
momento preciso en que desaparezca el color azul después de una agitación
muy intensa.
Nota:Se permite la determinación potenciométrica del punto final.
7.3. Número de determinaciones
Efectuar 2 determinacionesde la mues tra problema.
8. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
El índice de yodo se expresa del siguiente modo:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
p
siendo:
c: valor numérico de la concentración exacta, expresada en moles por
litro, de la solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico (4.3)
utilizada;
V1: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para el ensayo en blanco;
V2: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para la determinación;
p: valor numérico del peso, expresado en gramos, de la muestra
problema (7.1).
Se tomará como resultado la media aritmética de las dos determinaciones,
siempre que se cumpla el requisito establecido con respecto a la repetibi-
lidad.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 93
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ANEXO XVII
MÉTODOPARALADETERMINACIÓNDEESTIGMASTADIENOSEN
LOSACEITESVEGETALES
1. OBJETIVOS
Determinación de estigmastadienos en los aceites vegetales que presentan
bajasconcentracionesde dichoshidrocarburos , particularmente en el
aceite de oliva virgen y en el aceite de orujo de oliva sin refinar.
2. APLICACIÓN
Se trata de una norma aplicable a cualquier aceite de origen vegetal,
teniendo en cuenta que únicamente se obtendrán medidas fiables cuando
el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de
0,01 a 4,0 mg/kg. El método resulta especialmente adecuado para detectar
la presencia de aceites vegetales refinados (aceites de oliva, orujo de
oliva, girasol, palma, etc.) en el aceite de oliva virgen, dado que los
aceites refinados contienen estigmastadienos y los aceites vírgenes no.
3. FUNDAMENTO
Aislamiento de la materia insaponificable. Separación de la fracción de
hidrocarburoses teroideosmediante cromatografia en columna de gel de
sílice y análisis mediante cromatografía de gases en columna capilar.
4. INSTRUMENTAL
4.1. Matracesde 250 ml aptospara colocarlesun refrigerante de reflujo.4.2. Embudosde decantación con capacidad para 500 ml.4.3. Matracesde fondo redondo de 100 ml.4.4. Rotavapor.4.5. Columna de vidrio para cromatografía (1,5-2,0 cm de diámetro interno
por 50 cm de longitud) provista de una llave de teflón y con una torunda
de lana de vidrio o un disco de vidrio unterizado en el fondo. Para
preparar la columna de gel de sílice se vierte hexano en la columna de
cromatografía hasta que alcance una altura de aproximadamente 5 cm,
llenándose a continuación con una papilla de gel de sílice en hexano
(15 g en 40 ml) mediante la ayuda de variasporcionesde hexano. Se
deja sedimentar la mezcla en reposo, completándose la sedimentación
aplicando una ligera vibración. Añadir sulfato sódico anhidro hasta una
altura de aproximadamente 0,5 cm y finalmente eluir el exceso de
hexano.
4.6. Cromatógrafo de gases equipado con detector de ionización de llama,
inyector con división de flujo u «cold on -column» y horno programable
con precisión de ± 1 ºC.
4.7. Columna capilar de sílice fundida (0,25 o 0,32 mm de diámetro
interno × 25 m de longitud), recubierta con una película de 0,25 µmd e
espesor de la fase 5 %-fenilmetilsilicona.
Nota 1.
Pueden utilizarse otras columnas con polaridades similares o inferiores.
4.8. Integrador-registrador con capacidad para modo de integración valle-
valle.
4.9. Microjeringa de 5-10 µl para cromatografía de gases con aguja fija.
4.10. Calentador de tipo manta o placa eléctrica.
5. REACTIVOS
Salvo indicación en sentido contrario, únicamente se utilizarán reactivos
de calidad para análisis. Debe emplearse agua destilada o de pureza al
menosequivalente.
5.1. Hexano o una mezcla de alcanoscon un intervalo de ebullición de 65-
70 ºC, destilados en columna rectificadora.
Nota 2.
El disolvente debe destilarse para eliminar impurezas.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 94
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5.2. Etanol de 96 v/v.
5.3. Sulfato sódico anhidro.5.4. Solución alcohólica de hidróxido potásico al 10 %. Añadir 10 ml de agua
a 50 g de hidróxido potásico, agitar y diluir seguidamente la mezcla en
etanol hasta un volumen de 500 ml.
Nota 3.
La potasa alcohólica toma color marrón con el tiempo. Debe prepararse
diariamente y se almacenará en botellas de vidrio oscuro cerradas hermé-
ticamente.
5.5. Gel de sílice 60 para columna de cromatografia, de 70-230 mallas (refe-
rencia 7734 de Merck o similar).
Nota 4.
Por lo general, el gel de sílice puede utilizarse directamente a partir del
envase sin necesidad de tratamiento. Sin embargo, algunos lotes de sílice
pueden presentar baja actividad produciendo separaciones cromatográ-
ficas inadecuadas. Cuando ello ocurra debe tratarse el gel de sílice de la
siguiente manera: activar el gel calentándolo a 550 ºC durante un mínimo
de cuatro horas. Tras el calentamiento poner el gel de sílice a enfriar en
un desecador y trasvasarlo a continuación a un matraz con cierre hermé-
tico. Se añade seguidamente un 2 % de agua agitando hasta que dejen de
verse grumos y el polvo fluya libremente.
Si algún lote de gel de sílice origina cromatogramas con picos que inter-
fieran, dicho gel será sometido al tratamiento anteriormente mencionado.
Puede considerarse como alternativa la utilización de gel de sílice 60
extrapuro (referencia 7754 de Merck).
5.6. Solución madre (200 ppm) de colesta-3,5-dieno (Sigma, 99 % de pureza)
en hexano (10 mg en 50 ml).
5.7. Solución patrón de colesta-3,5-dieno en hexano con una concentración de
20 ppm, que se obtiene diluyendo la solución anterior.
Nota 5.
Si se mantiene la temperatura por debajo de 4 ºC, las soluciones 5.6 y 5.7
permanecerán inalteradas durante un mínimo de 4 meses.
5.8. Solución de n-nonacosano en hexano con una concentración aproximada
de 100 ppm.
5.9. Gasportador para cromatografia: helio o hidrógeno de 99,9990 % de
pureza.
5.10. Gases auxiliares para el detector de ionización de llama: aire purificado e
hidrógeno de 99,9990 % de pureza.
6. METODOLOGÍA
6.1.Preparacióndelamateriainsaponificable:
6.1.1. Pesar 20 ± 0,1 g de aceite en un matraz de 250 ml (4.1), añadir 1 ml de
solución patrón de colesta-3,5-dieno (20 µg) y 75 ml de potasa alcohólica
al 10 %, colocar un refrigerante de reflujo y calentar a ebullición suave
durante 30 minutos. Retirar de la fuente de calor el matraz con la muestra
y dejar enfriar ligeramente la solución (el enfriamiento no debe ser total
para evitar la decantación de la muestra). Añadir 100 ml de agua y pasar
la solución a un embudo de decantación (4.2) con ayuda de 100 ml de
hexano. Agitar enérgicamente durante 30 segundos y dejar decantar.
Nota 6.
Si se produce emulsión, que no desaparece rápidamente, añadir pequeñas
cantidadesde etanol.
6.1.2. Pasar la fase acuosa inferior a un segundo embudo de decantación y
someterla nuevamente a extracción con 100 ml de hexano. Separar
nuevamente la fase inferior y lavar los extractos de hexano (mezclándolos
en otro embudo de decantación) con tresporcionesde 100 ml cada una
de una mezcla de agua y etanol (1: 1) hasta obtener un pH neutro.
6.1.3. Pasar la solución de hexano a través de sulfato sódico anhidro (50 g),
lavar con 20 ml de hexano y evaporar a 30 ºC y presión reducida en un
rotavapor hasta sequedad.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 95
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6.2.Separacióndelafraccióndehidrocarburosesteroideos:
6.2.1. Introducir el residuo en la columna de fraccionamiento con ayuda de dos
porciones de 1 ml de hexano, distribuir la muestra en la columna dejando
que el nivel de solución descienda hasta la parte superior del sulfato de
sodio y comenzar la elución cromatográfica con hexano a un flujo apro-
ximado de 1 ml/min. Desechar los primeros 25-30 ml de eluido y recoger
la fracción siguiente de 40 ml. Después, pasar esta fracción a un matraz
de fondo redondo de 100 ml (4.3).
Nota 7.
La primera fracción contiene loshidrocarbuross aturados(cf. Figura 1a) y
la segunda fracción los esteroideos. Al proseguir con la elución se obtiene
escualeno y otros compuestos relacionados. Para poder obtener una buena
separación entre los hidrocarburos saturados y los esteroideos, es nece-
sario optimizar los volúmenes de las fracciones. A tal efecto se debe
ajustar el volumen de la primera fracción de tal manera que cuando se
analice la segunda, los picos correspondientes a los hidrocarburos satu-
rados sean bajos (cf. Figura 1c); cuando estos no aparezcan pero la
intensidad del pico correspondiente al patrón sea reducida, debe dismi-
nuirse el volumen. De todas formas, puesto que no se produce
solapamiento de los picos durante la cromatografía de gases, no es
precisa una separación completa entre los componentes de la primera y
segunda fracciones siempre que las condiciones de la CG estén ajustadas
como se indica en 6.3.1. Por lo general no es necesario optimizar el
volumen de la segunda fracción, puesto que existe una buena separación
con loscomponentesque eluyen pos teriormente. Sin embargo, la
presencia de un pico importante a 1,5 min, aproximadamente, por debajo
del tiempo de retención del patrón se debe al escualeno y revela una mala
separación.
6.2.2. Evaporar la segunda fracción en rotavapor a 30 ºC y presión reducida
hasta sequedad. Disolver inmediatamente el residuo en 0,2 ml de hexano
y mantener la solución en el refrigerador hasta el momento de su análisis.
Nota 8.
Los residuos 6.1.3 y 6.2.2 no deben mantenerse en seco a temperatura
ambiente. Una vez obtenidos, es necesario añadirles disolvente y almace-
narlosen un refrigerador.
6.3.Cromatografíadegases
6.3.1. Condicionesde trabajo para inyección con divis ión de flujo.
— temperatura del inyector: 300 ºC,
— temperatura del detector: 320 ºC.
— integrador-registrador: los parámetros de integración deben ser fijados
de tal forma que la evaluación de lasáreass ea correcta. La modalidad
de integración valle-valle esla másrecomendable,
— sensibilidad: aproximadamente 16 veces la atenuación mínima,
— cantidad de disolución inyectada: 1 µl,
— programación de la temperatura del horno: temperatura inicial cons-
tante de 235 ºC durante 6 minutos, seguida de un aumento gradual
de 2 ºC/min hasta alcanzar 285 ºC,
— inyección con una división de flujo de 1: 15,
— gasportador: helio o hidrógeno a 120 kPa de pres ión.
Dichas condiciones pueden modificarse en función de las características
del cromatógrafo y de la columna con objeto de obtener cromatogramas
que respondan a los siguientes requisitos: Pico del patrón interno situado
con una aproximación de 5 minutosen torno al tiempo citado en 6.3.2; el
pico del patrón interno alcanzará, como mínimo, un 80 % de la escala
total.
El sistema de cromatografía de gases deberá comprobarse inyectando una
mezcla de la solución madre de colestadieno (5.6) y de n-nonacosano(5.8). El pico del colesta-3,5-dieno deberá aparecer antes que el del n-
nonacosano (véase figura 1c); si esto no ocurre, pueden adoptarse dos
soluciones: reducir la temperatura inicial del horno o sustituir la columna
de cromatografía de gases por otra de polaridad inferior.
6.3.2. Identificación de picos
El pico del patrón interno aparece a un tiempo de retención de, aproxima-
damente, 19 minutos, y el del estigmasta-3,5-dieno lo hace a un tiempo
de retención relativo de aproximadamente 1,29 (véase figura 1b). El
estigmasta-3,5-dieno suele ir acompañado de pequeñas cantidades de un
isómero y, por lo general, ambos originan un solo pico cromatográfico.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 96
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No obstante, si la columna es demasiado polar, o tiene un gran poder de
resolución, el isómero puede aparecer en forma de un pequeño pico justo
antes y cerca del estigmasta-3,5-dieno (véase figura 2). En estos casos, es
preciso sumar las áreas de los dos picos. Con el fin de estar seguro que
los estigmastadienos eluyen como un solo pico se recomienda instituir la
columna por otra de menor polaridad o de mayor diámetro interior.
Nota 9.
Para obtener una referencia de los estigmastadienos puede utilizarse el
análisis de cualquier aceite vegetal refinado empleando menor cantidad
de muestra (de 1 a 2 g). Los estigmastadienos dan lugar a un pico impor-
tante de fácil identificación.
6.3.3. Análisis cuantitativo
El contenido de los estigmastadienos se determina aplicando la fórmula
mg=kg de estigmastadienos ¼As/C2Mc
Ac/C2Mo
en la cual: Ab= área del pico de estigmastadienos (si el pico se
halla dividido en dos picos, súmese el área de los
dospicos .).
Ac= área del pico del patrón interno (colestadieno).
Mc= peso de patrón añadido, en microgramos.
Mo= peso de aceite empleado, en gramos.
Límite de detección: aproximadamente 0,01 mg/kg.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 97
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Figura1
Cromatogramas procedentes del análisis de muestras de aceite de oliva en
columna capilar de sílice fundida (0,25 mm de diámetro interno × 25 m)
recubierta con una película de 0,25 µm de grosor de 5 %-fenilmetilsili-
cona.
a) Primera fracción (30 ml) de un aceite virgen marcado con el patrón.
b) Segunda fracción (40 ml) de un aceite de oliva que contiene 0,10 mg/
kg de estigmastadienos.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 98
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c) Segunda fracción (40 ml) que incluye una pequeña proporción de la
primera.
Figura2
Cromatograma procedente del análisis de una muestra de aceite de oliva
refinado en una columna DB-5, en el que se aprecia el isómero del estig-
masta-3,5-dieno.1991R2568 — ES — 31.10.1995 — 013.001 — 99