1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—1
Estedocumentoesuninstrumentodedocumentaciónynocomprometelaresponsabilidaddelasinstituciones
►B OCTAVADIRECTIVADELACOMISIÓN
de15dejuniode1978
porlaquesefijanlosmétodosdeanálisiscomunitarioparaelcontroloficialdelosalimentospara
animales
(78/633/CEE)
(DOL206de29.7.1978,p.43)
Modificadapor:
DiarioOficial
nopágina fecha
►M1Directiva81/680/CEEdelaComisiónde30dejuliode1981 L246 32 29.8.1981
►M2Directiva84/4/CEEdelaComisiónde20dediciembrede1983 L15 28 18.1.1984
▼B
OCTAVADIRECTIVADELACOMISIÓN
de15dejuniode1978
por la que se fijan los métodos de análisis comunitario para el
controloficial delosalimentosparaanimales
(78/633/CEE)
LACOMISIÓNDELASCOMUNIDADESEUROPEAS,
VistoelTratadoconstitutivodelaComunidadEconómicaEuropea,
Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo, de 20 de julio de 1970,
referente a la introducción de modos de toma de muestras y demétodos de análisis comunitarios para el control oficial de losalimentosparaanimales(
1),modificadoenúltimolugarporelActade
adhesión,yenparticularsuartículo2,
Considerando que la Directiva anteriormente contemplada prevé que
los controles oficiales de los alimentos para animales dirigidos a
comprobarquelascondicionesprescritasenvirtuddelasdisposicioneslegales, reglamentarias o administrativas referentes a la calidad y a lacomposicióndelosanimalesserespetanyserealizansegúnmodosdetomademuestrasydemétodosdeanálisiscomunitarios;
ConsiderandoquelasDirectivasdelaComisión71/250/CEE,de15de
juniode1971(
2),71/393/CEEde18denoviembrede1971(3),72/199/
CEE de 27 de abril de 1972(4), 73/46/CEE de 5 de diciembre de
1972(5),74/203/CEEde25demarzode1974(6),75/84/CEEde20de
diciembre de 1974(7) y 76/372/CEE de 1 de marzo de 1976(8) han
fijadoyaundeterminadonúmerodemétodosdeanálisiscomunitarios;que, teniendo en cuenta el grado de desarrollo de los trabajos reali-zadosdesdeentonces,procedeestablecerunaoctavaseriedemétodos;
Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva
concuerdan con el dictamen del Comité permanente de alimentación
animal,
HAADOPTADOLAPRESENTEDIRECTIVA:
Artículo 1
1. Los Estados miembros prescribirán que los análisis para los
controlesoficialesdelosalimentosparaanimales,enloreferenteasucontenidoenbacitracina-cinc,flavofosfolipol,hierro,cobre,manganeso
y cinc, se realizarán según los métodos descritos en el anexo de la
presenteDirectiva.
Artículo 2
Los Estados miembros aplicarán, el 1 de enero de 1979, las disposi-
ciones legales, reglamentarias y administrativas necesarias para
cumplirlasdisposicionesdelapresenteDirectivaeinformarándeelloinmediatamente alaComisión.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—2
(1)D OnoL170de3.8.1970,p.2.
(2)D OnoL155de12.7.1971,p.13.
(3)D OnoL279de20.12.1971,p.7.
(4)D OnoL123de29.5.1972,p.6.
(5)D OnoL83de30.3.1973,p.21.
(6)D OnoL108de22.4.1974,p.7.
(7)D OnoL32de5.2.1975,p.26.
(8)D OnoL102de15.4.1976,p.8.▼M1
▼B
▼B
Artículo 3
LosdestinatariosdelapresenteDirectivaseránlosEstadosmiembros.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—3
▼B
ANEXO
1.DETERMINACIÓNDELABACITRACINA-CINC
—pordifusiónengelosa—
1. OBJETOYÁMBITODEAPLICACIÓN
El método permite determinar la bacitracina-cinc en los alimentos las
premezclas. El límite inferior de la determinación es de 5 mg/kg
(5ppm)(1).
2. PRINCIPIO
Se extrae la muestra a pH 2 mediante una mezcla de etanol, agua y
ácido clorhídrico y una solución de sulfuro sódico. El sulfuro sódico
permiteprecipitarlassalesdecobresolublesquepudieranobstaculizar
la determinación. El extracto, llevado a pH 6,5, se concentra (en caso
necesario)ydiluye.Suactividadantibióticasedeterminapormedición
de la difusión de la bacitracina-cinc en un medio de gelosa, sembrado
conMicrococcus luteus (flavus) .Ladifusiónsemanifiesta mediante la
formación de zonas de inhibición del microorganismo. El diámetro de
dichaszonassoconsideradirectamente proporcionalallogaritmodela
concentracióndeantibióticoparalagamadeconcentracionesutilizadas.
3. MICROORGANISMO: «MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS)»
ATCC10240
3.1.Mantenimientodelacepa
Sembrar el medio de cultivo (4.1), en tubos inclinados, con Micro-
coccus luteus (flavus) . Incubar durante veinticuatro horas a 30 ºC,
conservar en frigorífico a unos 4 ºC y renovar la siembra cada quince
días.
3.2.Preparacióndelasuspensiónbacteriana (a)
Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa (3.1), de preparación
reciente,conlaayudade2a3mldesolucióndeclorurosódico(4.3).
Sembrar con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo (4.1) en un
matraz de Roux e incubar durante dieciocho a veinte horas a 30 ºC.
Recoger los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro sódico (4.3) y
homogeneizar.
Diluirlasuspensióna1/10conayudadelasolucióndeclorurosódico
(4.3). La transmisión luminosa de la solución, medida a 650 mm bajo
unespesorde1cmporcomparaciónconlasolucióndeclorurosódico
(4.3), debe ser de alrededor del 75 %. Esta suspensión puede conser-
varseunasemanaaunos4ºC.
4. MEDIOSDECULTIVOYREACTIVOS
4.1.Mediodemantenimientodelacepa (b)
Peptonadecarne 6,0g
Triptona 4,0g
Extractodelevadura 3,0g
Extractodecarne 1,5g
Glucosa 1,0g
Gelosa 10,0a20,0g
Agua 1000ml
pH6,5—6,6(trasesterilización)
4.2.Mediodebasedeladeterminación (b)
Triptona 10,0g
Extractodelevadura 3,0g
Extractodecarne 1,5g
Glucosa 1,0g
Gelosa 10,0a20,0g1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—4
(1) 1mgdebacitracina-cinc(calidadparaalimentosparaanimales)equivalea42unidades
internacionales(UI).
(a) Pueden utilizarse otros métodos, siempre que esté demostrado que producen suspen-
sionesbacterianasanálogas.
(b) Puedeutilizarsecualquiermediodecultivocomercialdecomposiciónanálogayquedé
losmismosresultados.▼M2
▼M2
Tween80 1ml
Agua 1000ml
pH6,5(trasesterilización)
4.3. Solución al 0,8 % (p/v) de cloruro sódico: disolver en agua 8 g de
clorurosódico,diluira1000mlyesterilizar.
4.4. Mezclademetanol/agua/ácido clorhídrico(4.6):80/17,5/2,5(v/v/v).4.5.Tampónfasfato,pH6,5
FosfatobipotásicoK
2HPO422,15g
FosfatomonopotásicoKH2PO427,85g
Aguahasta 1000ml
4.6. Ácidoclorhídrico,d:1,18-1,194.7. Ácidoclorhídrico,0,1M4.8. Solución1Mdehidróxidosódico4.9. Solución0,5M,aproximadamente,desulfurosódico4.10. Soluciónal0,04%(p/v)depúrpuradebromocresol:
disolver0,1gdepúrpuradebromocresolen18,5mldesolución0,01M
dehidróxidosódico.Completarhasta250mlconaguayhomogeneizar.
4.11. Sustanciadereferencia:bacitracina-cincdeactividadconocida(enUI).
5. SOLUCIONESDEREFERENCIA
Pesar una cantidad de sustancia de referencia (4.11) correspondiente a
1050 UI (según el título indicado). Añadir 5 ml de ácido clorhídrico
0,1 M (4,7) y dejar reposar quince minutos. Añadir 30 ml de agua,
ajustarelpHa4,5conlaayudadeltampón fosfato(4.5)(unos4ml),
completarhasta50mlconaguayhomogeneizar(1ml=21UI).
Preparar,apartirdeestasoluciónymediante diluciones sucesivascon
ayudadeltampónfosfatopH6,5(4.5),lassolucionessiguientes:
S
80,42 UI/ml
S40,21 UI/ml
S20,105 UI/ml
S10,0525 UI/ml
6. PREPARACIÓNDELEXTRACTO
6.1.Extracción
6.1.1. Premezclas y alimentos minerales
Pesar una cantidad de mazcla de 2,0 a 5,0 g, añadir 29,0 ml de la
mezcla(4.4)y1,0mldesolucióndesulfurosódico(4.9);agitarbreve-
mente. Comprobar que el pH es de alrededor de 2. Agitar durante 10
minutos, añadir 30 ml de tampón fosfato (4.5), agitar durante 15
minutosycentrifugar.Tomarunapartealícuotadelasoluciónsobrena-
danteyajustarelpHa6,5conayudadelasolución1Mdehidróxido
sódico(4,8)utilizandounphmetroolasolucióndepúrpuradebromo-
cresolcomoindicador.
Diluir con ayuda del tampón fosfato (4.5) para obtener una concentra-
ciónsupuestaenbacitracina-cincde0,42UI/ml(=U8).
6.1.2. Concentrados proteínicos
Pesaruna cantidad de muestra de 10,0 g,añadir 49,0 ml de la mezcla
(4.4)y1,0mldelasolucióndesulfurosódico(4.9);agitarbrevemente.
ComprobarqueelpHesdealrededorde2.Agitardurante10minutos,
añadir 50 ml de tampón fosfato (4.5), agitar durante 15 minutos y
centrifugar. Tomar una parte alícuota de la solución sobrenadante y
ajustar el pHa 6,5con ayuda de la solución 1Mde hidróxido sódico
(4,8) utilizando un pHmetro o la solución de púrpura de bromocresol
(4.10)comoindicador.
Evaporar aproximadamente la mitad del volumen en un evaporador
rotatorio a una temperatura que no exceda de 35 ºC. Diluir con ayuda
del tampón fosfato (4.5) para obtener una concentración supuesta en
bacitracina-cincde0,42UI/ml(=U8).
6.1.3. Otros alimentos
Pesarunacantidad demuestrade10g(20,0gparaunaconcentración
supuesta de bacitracina-cinc de 5 mg/kg). Añadir 24,0 ml de mezcla1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—5
▼M2
(4.4) y 1,0 ml de solución de sulfuro sódico (4.9); homogeneizar
durante 10 minutos. Añadir 25 ml de tampón fosfato (4.5), agitar
durante15minutosycentrifugar.Tomar20mldelasoluciónsobrena-
danteyajustarelpHa6,5conayudadelasolución1Mdehidróxido
sódico(4.8)utilizandounpHmetroolasolucióndepúrpuradebromo-
cresol(4.10)comoindicador.Evaporarhasta4mlaproximadamenteen
un evaporador rotatorio a una temperatura que no exceda de 35 ºC.
Diluir el residuo con ayuda del tampón fosfato (4.5) para obtener una
concentraciónsupuestadebacitracine-cincde0,42UI/ml(=U8).
6.2.Solucionesdelextracto
Preparar, a partir de la solución U8y por diluciones sucesivas (1 + 1)
conlaayudadeltampónfosfato(4.5),lassolucionesU4(concentración
supuesta: 0,21 UI/ml), U2(concentración supuesta: 0,105 UI/ml) y U1(concentraciónsupuesta:0,0525UI/ml).
7. MODALIDADESDEDETERMINACIÓN
7.1.Inoculacióndelmediodecultivo
Sembraraunos50ºCelmediodebasedeladeterminación(4.2)conla
suspensión bacteriana (3.2) mediante ensayos preliminares en placas
con el medio (4.2), determinar la cantidad de suspensión bacteriana
quepermite obtenerparalasdiferentes concentraciones debacitracina-
cinc zonas de inhibición lo más amplias posibles sin dejar de ser
nítidas.
7.2.Preparacióndelascajas
Ladifusiónengelosaseefectúaencajasconlascuatroconcentraciones
delasolucióndereferencia(S8,S4,S2,S1)ylascuatroconcentraciones
delextracto(U8,U4,U2,U1).Cadacajadeberecibirnecesariamentelas
cuatro concentraciones de referencia y del extracto. A tal fin, hay que
elegirladimensióndelascajasdeformaquesepuedanexcaver enel
mediodegelosaporlomenos8cavidadesde10a13mmdediámetro,
cuyos centros no disten menos de 30 mm. Pueden emplearse como
cajas placas de vidrio planas, coronadas por un anillo de aluminio o
demateriaplásticade200mmdediámetroy20mmdealtura.
Introducirenlascajasunacantidaddelmedio(4.2),sembradotalcomo
seindicaen7.1,quepermitaobtenerunacapadeunos2mmdegrosor
(60 ml para una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar,
excavar las cavidades y depositar en ellas volúmenes exactamente
medidosdelassolucionesdereferencia ydelextracto (0,10a0,15ml
porcavidadsegúneldiámetro).Repetirporlomenoscuatrovecescada
concentración, de forma que cada determinación comprenda la valora-
ciónde32zonasdeinhibición.
7.3.Incubación
Incubarlascajasdurantedieciséisadieciochohorasa30ºC±2ºC.
8. VALORACIÓN
Medireldiámetrodelaszonasdeinhibiciónconunerrornosuperiora
0,1mm.Paracadaconcentración,registrarlasmedidasmediasenpapel
semilogarítmico, trasladando el logaritmo de las concentraciones en
relaciónconlosdiámetrosdelaszonasdeinhibición.Trazarlasrectas
más ajustadas para la solución de referencia y para el extracto, por
ejemplo,medianteelprocedimientosiguiente:
Determinarelpuntomásapropiadodelnivelmásbajodelasoluciónde
referencia(SL)canayudadelafórmula:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Determinarelpuntomásapropiadodelnivelmásaltodelasoluciónde
referencia(H)conayudadelafórmula:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto
para el nivel más bajo (UL)y el nivel más alto (UH)sustituyendo S1,
S2,S4yS8enlasfórmulasanterioresporU1,U2,U4yU8.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—6
▼M2
Consignar los valores SL y SH en la misma gráfica. Al unir los dos
puntos se obtiene la recta más ajustada para la solución de referencia.
Si se sigue el mismo mótodo para UL y UH se obtiene la recta más
ajustadaparaelextracto.
Si no hubiere ninguna interferencia, las rectas serían paralelas. En la
práctica,seconsideranparalelascuando(SH—SL)y(UH—UL)no
difierenenmásdeun10%desumedia.
Silasrectasnosonparalelas,puedeneliminarseU1yS1,oU8yS8.Los
valoresSL,SH,ULyUHquepermitenobtenerlasrectasmásajustadas
secalculanentoncesconayudadelasfórmulassiguientes:
(a′)SL=5s1þ2s2/C0s4
6ó5s2/C02s4/C0s8
6
(b′)SH=5s4/C02s2/C0s1
6ó5s8þ2s4/C0s2
6
ydefórmulasanálogasparaULyUH.Lautilizacióndeestaalternativa
obliga a respetar los mismos criterios de paralelismo. En el boletín de
análisis debe mencionarse la obtención de un resultado procedente de
tresniveles.
Cuandolasrectasseconsiderenparalelas,hayquecalcularellogaritmo
delaactividadrelativa(logA)medianteunadelasfórmulassiguientes,
según el número de niveles (4 o 3) utilizados para la valoración del
paralelismo.
Para4niveles:
(c) logA ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Para3niveles:
(d) logA ¼u1/C0u2/C0u4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4/C0s4/C0u1/C0s1
(d′)logA ¼u2/C0u4/C0u8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8/C0s8/C0u2/C0s2
Actividaddelextractodelamuestra=actividaddelareferenciacorres-
pondiente×A:
(U8=S8×A)
Silaactividadrelativanoseencuentraenlagamadevalorescompren-
didosentre0,5y2,0,haderepetirseladeterminaciónprocediendoalos
ajustesapropiadosdelasconcentracionesdelextractoo,ensucaso,de
las soluciones de referencia. Cuando esta actividad no pueda encua-
drarse en la gema de los valores exigidos, el resultado se considerará
aproximadoyasíseharáconstarenelboletíndeanálisis.
Cuandolasrectasnoseconsiderenparalelas,serepetriráladetermina-
ción. Si tampoco ahora se lograre el paralelismo, la determinación se
consideraráinsatisfactoria.
Expresar el resultado en miligramos de bacitracinacinc por kilogramo
dealimento.
9. REPRODUCIBILIDAD
Ladiferenciaentrelosresultadosdedosdeterminacionesefectuadasen
lamismamuestraporelmismoanalistanodebeexcederde:
2mg/kg,envalorabsoluto,paraloscontenidosdebacitracina-cincinfe-
rioresa19mg/kg,
20%delresultadomásalto,paraloscontenidosde10a25mg/kg,5mg/kg,envalorabsoluto,paraloscontenidosde25a50mg/kg,
10%delresultadomásalto,paraloscontenidossuperioresa50mg/kg.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—7
▼B
2.DOSIFICACIÓN DEL FLAVOFOSFOLIPOL POR DIFUSIÓN EN
GELOSA
1. OBJETOYDOMINIODEAPLICACIÓN
El método permitirá dosificar el flavofosfolipol en los alimentos, los
concentrados y las premezclas. El límite inferior de dosificación será
de1mg/kg(1ppm).
2. PRINCIPIO
Sesometerá lamuestra aunaextracción pormetanol diluido mediante
calentamiento por reflujo. El extracto será centrifugado, purificado si
fuerenecesarioenresinasintercambiadorasdeionesydiluido.Sedeter-
minará su actividad antibiótica por medida de la difusión del
flavofosfolipol en un medio de gelosa, sembrado con Staphylococcus
aureus.Eldiámetrodedichaszonasseconsiderarácomosifueradirec-
tamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibiótico
paralagamadelasconcentracionesutilizadas.
3. MICROORGANISMO:STAPHYLOCOCCUSAUREUSATCC6538P
3.1.Mantenimientodelextractobase
Sembrar el medio de cultivo (4.1), en tubos inclinados, con Staphylo-
coccus aureus. Incubar 24 horas a 37 ºC, conservar en refrigerador a
4ºCaproximadamenteyrenovarlasiembracadames.
3.2.Preparacióndelasuspensiónbacteriana (a)
Extraer dos tubos que contengan el cultivo-madre (3.1) y renovar la
siembracadasemana.Incubar24horasa37ºCyconservarenrefrige-
radora4ºCaproximadamente.
24horasantesdeladosificación,sembrarmediantedichoscultivosdos
acuatrotubosinclinadosquecontenganelmediodecultivo(4.1).
Incubarde16a18horasa37ºC.Ponerluegolosgérmenesensuspen-
siónen lasolución decloruro desodio(4.3).La transmisión luminosa
delasuspensión,medidaa578nmbajounespesorde1cmporcompa-
ración con la solución de cloruro de sodio, deberá ser de 40 %
aproximadamente.
4. MEDIOSDECULTIVOYREACTIVOS
4.1.Mediodemantenimientodelextracto base (b)
Peptonadecarne 6,0g
Triptona 4,0gExtractodelevadura 3,0g
Extractodecarne 1,5g
Glucosa 1,0gGelosa 15,0g
Agua 1000ml
pH6,5(despuésesterilización)
4.2.Mediodebasedeladosificación
4.2.1. Capa inferior(
c)
Peptonadecarne 6,0g
Extractodelevadura 3,0g
Extractodecarne 1,5g
Gelosa 10,0gAgua 1000mlpH6,5(despuésesterilización)
4.2.2. Capa por sembrar
Medio(4.1)sumadoa2gdeemulsiónantiespumantedesilicona(
d)1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—8
(a) Sepodránutilizarotrosmétodosenlamedidaenquequededemostradoqueproducirán
unasuspensiónbacterianaanáloga.
(b) Se podrá utilizar cualquiermedio de cultivo comercial de composición análoga yque
délosmismosresultados, porejemplo OxoidAntibiotic Medium (CM327)sumado a
gelosaOxoidno3(L13).
(c) Se podrá utilizar cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que
dé los mismos resultados, por ej. Oxoid Antibiotic Medium 2 (CM 335) sumada agelosaOxoidn
o3(L13).
(d) PorejemploSE2deWackerChemieGmbH,Munich.
▼B
4.3. Solución a 0,4 % (p/v) de cloruro de sodio: disolver en agua 4 g de
clorurodesodiop.a.,diluirhasta1000mlyesterilizar.
4.4. Metanolpuro.4.5. Metanola50%(v/v):diluir500mldemetanolpor500mldeagua.
4.6. Metanol a 80 % (v/v): diluir 800 ml de metanol (4.4) por 200 ml de
agua.
4.7. Tris(hidroximetil)aminometanop.a.
4.8. Soluciónmetanólicaa1,5%(p/v)declorurodepotasio:disolver1,5g
de cloruro de potasio p.a. en 20 ml de agua, completar hasta 100 ml
conmetanol(4.4).
4.9. Intercambiador de cationes: Dowex 50 WX8, 20-50 mesh, forma Na
(cat.Servan
o41600)oequivalente.
4.10. Intercambiador de aniones: Dowex 1X2, 50-100 mesh, forma Cl (cat.
Servano41010)oequivalente.Antesdeutilizarlo,mantenerelproducto
durante12a14horasenmetanola80%(4.6).
4.11. Lanadevidrio.4.12. PapelindicadordepH(pH6,6-8,1)4.13. Ácidoascórbico.
4.14. Sustanciapatrón:flavofosfolipoldeactividadconocida.
5. EQUIPO
5.1. Tubopara cromatografía, devidrio, diámetro interior: 9mm,longitud:
150a200mm,provistodeungrifoenlaparteafiladadelaextremidad
inferiorydeunesmeriladonormalizado(paraempalmedelembudo)en
lapartesuperior.
5.2. Embudocondepósitode250ml,congrifoyesmeriladonormalizado.
5.3. Frascocónicode250ml,deesmeriladonormalizado.5.4. Refrigerantedereflujo,deesmeriladonormalizado.
6. SOLUCIONESPATRÓN
Disolverunacantidadexactamentepesadadesustanciapatrón(4.14)en
metanola50%(4.5)ydiluirparaobtenerunasoluciónmadredeflavo-
fosfolipol a 100 µg/ml. Conservada en frasco tapado a 4º C, dicha
soluciónseráestabledurantedosmeses.
Prepararapartirdedichasoluciónypordilucionessucesivasmediante
metanola50%(4.5)lassolucionessiguientes:
S
80,2 µg/ml
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025µg/ml
7. PREPARACIÓNDELEXTRACTO
7.1.Extracción
7.1.1. Concentrados, premezclas y alimentos minerales
Pesar una cantidad de muestra de 2 a 5 g y añadirle unos 150 mg de
ácido ascórbico(4.13).Mezclar a150mgdemetanol a50%(4.5)en
unfrasco(5.3)yajustarelpHa8,1-8,2medianteunos400mgdetris
(hidroximetil)aminometano(4.7).ControlarelpHmediantepapelindi-
cador (4.12).Dejar macerar 15minutos,ajustar denuevoel pHa8,1-
8,2mediantetris(hidroximetil)aminometano(4.7)yluegohacerhervir
durante10minutosconrefrigerantedereflujo(5.4)agitandoconstante-mente.Dejarenfriar,luegocentrifugarydecantarelextracto.
7.1.2. Otros alimentos
Pesarunacantidaddemuestrade5a30gquecontengaalmenos30µg
de flavofosfolipol. Mezclar a 150 ml de metanol a 50 % (4.5) en un
frasco (5.3) y ajustar el pH a 8,1-8,2 mediante unos 400 mg de tris
(hidroximetil) aminometano (4.7). Controlar el pH mediante el papel
indicador (4.12). Dejar macerar 15 minutos, ajustar de nuevo el pH a
8,1-8,2 mediante tris(hidroximetil) aminometano (4.7) y luego hacer
hervir durante 10 minutos con refrigerante de reflujo (5.4) agitando
constantemente.Dejarenfriar,luegocentrifugarydecantarelextracto.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—9
▼B
7.2.Purificación (se podrá omitir dicha modalidad para los concen-
trados,laspremezclas ylosalimentosminerales)
Mezclar110mldelextractoa11gdeintercambiadordecationes(4.9),
hacer hervir durante un minuto con refrigerante de reflujo (5.4)
agitando constantemente. Separar el intercambiador de cationes por
centrifugación o filtración. Mezclar 100 ml del extracto a 150 ml de
metanol (4.4) y dejar reposar la solución de 12 a 15 horas a 4 ºC.
Eliminarlamateriafloculanteporfiltraciónenfrío.
Ponerenelextremoinferiordeuntubo(5.1)untapóndelanadevidrio
(4.11), verter en el tubo 5 ml de intercambiador de aniones (4.10) y
lavarlacolumnacon100mldemetanola80%(4.6).Luegotrasvasar
en la columna mediante el embudo (5.2) un volumen de filtrado de
100 ml que se supondrá contiene al menos 16 µg de flavofosfolipol
(200mlparaunamuestrade30gdealimentoa1ppm).Sifuerenece-
sario, diluir el filtrado antes de trasvasarlo en la columna mediante
metanola80%(4.6)paraobtenerunapresuntaconcentraciónenflavo-
fosfolipolde16µgpor100ml.Regularelcaudaldesalidadellíquido
a2mlaproximadamente porminuto.Eliminarlatotalidaddelfiltrado.
Lavar luego la columna mediante 50 ml de metanol a 80 % (4.6) y
eliminarelfiltrado.
Diluirelflavofosfolipol mediante lasoluciónmetanólica declorurode
potasio (4.8) manteniendo el caudal de goteo alrededor de 2 ml por
minuto. Recoger 50 ml de la disolución en un matraz aforado, añadir
30mldeaguayhomogeneizar.Estadisolucióndeberíatenerunconte-
nidoenflavofosfolipolde0,2µg/ml(=U8).
7.3.Solucionesdelextracto
Sifuerenecesario(enparticularenloscasosenquesehubiereomitido
lapurificación),diluirelextractoobtenidoen7.1.1conmetanola50%
(4.5) para obtener una presunta concentración en flavofosfolipol de
0,2µg/ml(=U8).
Preparar a partir de la solución U8por diluciones sucesivas (1 + 1)
mediante metanol a 50 % (4.5) las soluciones U4(presunta concentra-
ción): 0,1 µg/ml), U2(presunta concentración: 0,05 µg/ml) y U1(presuntaconcentración:0,025µg/ml).
8. MODALIDADESDELADOSIFICACIÓN
8.1.Inoculacióndelmediodecultivo
Sembrara50ºCaproximadamenteelmediodebasedeladosificación
(4.2.2) a través de la suspensión bacteriana (3.2). Gracias a ensayos
preliminares en placas con el medio (4.2.2), determinar la cantidad de
suspensiónbacteriana quepermita obtener paralasdistintasconcentra-
ciones en flavofosfolipol zonas de inhibición tan extensas como sea
posibleyquepermanezcanaúnnítidas(unos30mlporlitro).
8.2.Preparacióndelascajas
La difusión en gelosa se realizará en cajas con las cuatro concentra-
ciones de la solución patrón (S8,S4,S2,S1) y las cuatro
concentraciones del extracto (U8,U4,U2,U1). Cada caja deberánecesa-
riamenterecibirlascuatroconcentracionesdelpatrónydelextracto.A
tal fin, escoger la dimensión de las cajas de forma tal que se pueda
ahuecar en el medio de gelosa al menos ocho cavidades de 10 a
13 mm de diámetro, cuyos centros no estén separados por menos de
30mm.Sepodráutilizarcomocajasplacasdevidrioplanas,coronadas
porunanillodealuminioodemateriaplásticade200mmdediámetro
y20mmdealtura.
Introducir en las cajas una cantidad del medio (4.2.1) que permita
obtener unacapade1,5mmaproximadamente deespesor(45mlpara
una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar y añadir una
cantidad del medio (4.2.2), sembrado como indicado en el punto 8.1,
que permita obtener una capa de 1 mm de espesor (30 ml para una
caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, ahuecar las cavidades
ydepositarenlasmismasvolúmenesexactamentemedidosdelassolu-
ciones del patrón y del extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad, segúnel
diámetro).
Haceralmenoscuatrorepeticionesdecadaconcentracióndemodoque
cadadeterminaciónseaobjetodeunaevaluaciónde32zonasdeinhibi-
ción.
8.3.Incubación
Incubarlascajasde16a18horasa28-30ºC.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—10
▼B
9. EVALUACIÓN
Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una tolerancia de
0,1mm.Paracadaconcentración,registrarlasmedidasmediasenpapel
semi-logarítmico anotandoellogaritmo delasconcentraciones frentea
los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas mejor ajus-
tadas para la solución patrón y para el extracto procediendo, por
ejemplo,delasiguientemanera.
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución
patrón(SL)mediantelafórmula:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más elevado de la solu-
ciónpatrón(SH)mediantelafórmula:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto
paraelnivelmásbajo(UL)yelnivelmáselevado (UH)sustituyendo
S1,S2,S4yS8enlasfórmulasarribamencionadasporU1,U2,U4yU8.
Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico. Uniendo los dos
puntos, se obtendrá la recta mejor ajustada para la solución patrón.
Procediendo del mismo modo para UL y UH, se conseguirá la recta
mejorajustadaparaelextracto.
Enausenciadecualquierinterferencia,lasrectasdeberíanserparalelas.
Enlapráctica,selasconsiderarácomosifuerenparalelascuando(SH-
SL)y(UH-UL)nodiferierendemásdel10%desumedia.
Silasrectasnofuerenparalelas,sepodráeliminarobienU1yS1obien
U8yS8.LosvaloresSL,SH,ULyUHquepermitanobtenerlasrectas
mejor ajustadas se calcularán entonces mediante las fórmulas
siguientes:
(a′)SL¼5S1þ2S2/C0S4
6o5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)SH¼5S4þ2S2/C0S1
6o5S8þ2S4/C0S2
6
yfórmulasanálogasparaULyUH.Lautilización dedichaalternativa
deberá igualmente ser objeto de una verificación en cuanto al parale-
lismodelasrectascomoindicado másarriba.Sedeberámencionar en
el boletín de análisis la obtención de un resultado procedente de tres
niveles.
Cuando se consideren las rectas como paralelas, se calculará el loga-
ritmodelaactividadrelativa (log.A)mediantealgunadelasfórmulas
siguientes.
Para 4 niveles
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Para 3 niveles
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′)log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C20;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Actividadreal=actividadpresunta×actividadrelativa.
Cuando las rectas se consideren como no paralelas, repetirladetermi-
nación. Si la misma continuara sin permitir alcanzar el paralelismo,
calcular el logaritmo de la actividad relativa (log. A) mediante la
fórmula (c). Sin embargo, se deberá considerar el resultado obtenido
como aproximativo y será procedente mencionarlo en el boletín de
análisis.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—11
▼B
10. REPETIBILIDAD
Ladiferencia entrelosresultadosdedosdeterminaciones realizadasen
lamismamuestraporelmismoanalistanodeberíasobrepasar:
0,5mg/kg,envalorabsoluto,paraloscontenidosenflavofosfolipolde
1a2mg/kg,
25%delresultadomáselevadoparaloscontenidossuperioresa2mg/
kgyhasta10mg/kg,
20%delresultadomáselevadoparaloscontenidossuperioresa10mg/
kgyhasta25mg/kg,
5mg/kg,envalorabsoluto,paraloscontenidossuperioresa25mg/kgy
hasta50mg/kg,
10%delresultadomáselevadoparaloscontenidossuperioresa50mg/
kg.
3.DOSIFICACIÓN DE LOS OLIGOELEMENTOS HIERRO, COBRE,
MANGANESOYCINC
1. OBJETOYÁMBITODEAPLICACIÓN
Elmétodopermitirádosificarlosoligoelementos hierro,cobre,manga-
nesoycincenlosalimentos delosanimales. Loslímites inferioresde
determinaciónseránlossiguientes:
Hierro(Fe) 20mg/kg,
Cobre(Cu) 10mg/kgManganeso(Mn) 20mg/kg
Cinc(Zn) 20mg/kg
2. PRINCIPIO
Semeteráensoluciónlamuestraenelácidoclorhídricodespuésdela
eventual destrucción de las materias orgánicas. Se determinarán los
elementos hierro, cobre, manganeso y cinc, después de dilución apro-
piada,porespectrometríadeabsorciónatómica.
3. REACTIVOS
Observacionespreliminares
El agua utilizada para la preparación de los reactivos y de las solu-
cionesrequeridaseneltranscursodelanálisisdeberánestarexentosde
los cationes por determinar. Se obtendrá bien por doble destilación en
unaparato deborosilicato odecuarzo, bien pordoble permutación en
resinaintercambiadoradeiones.
Losreactivosdeberánseralmenosdelacalidad«paraanálisis»(p.a.).
La ausencia del elemento por determinar deberá ser controlada por un
ensayoen blanco. Si fuere necesario, sesometerán losreactivos auna
purificaciónmásprofunda.
Se podrán sustituir las soluciones patrón descritas a continuación por
solucionespatróncomercialescontalquelasmismasseangarantizadas
ycontroladasantesdesuempleo.
3.1. Ácidoclorhídricop.a.,d:1,19.
3.2. Ácidoclorhídricop.a.,6N.3.3. Ácidoclorhídricop.a.,0,5N.3.4. Ácidofluorhídricoa38-40%(v/v),conuncontenidodehierroinferior
a 1 mg/l y cuyo residuo de evaporación sea inferior a 10 mg (expre-
sadosensulfatos)/l.
3.5. Ácidosulfúricop.a.,d:1,84.3.6. Aguaoxigenadap.a.,a100vol.aproximadamentedeoxígeno(30%en
peso).
3.7. Solución patrón de hierro (1000 µg Fe/ml): disolver 1 g de hierro de
hilo p.a. en 200 ml de ácido clorhídrico 6 N (3,2), añadir 16 ml de
aguaoxigenada(3.6)ycompletarconaguahasta1l.
3.7.1. Solución patrón de trabajo (100 µg Fe/ml): diluir la solución patrón
(3.7)conaguaa1+9.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—12
▼B
3.8. Solución patrón de cobre (100 µg Cu/ml): disolver 1 g de cobre en
polvopaen25mldeácidoclorhídrico6N(3.2),añadir5mldeagua
oxigenada(3.6)ycompletarconaguahasta1l.
3.8.1. Soluciónpatróndetrabajo(10µgCu/ml):diluirlasoluciónpatrón(3.8)
a1+9conagua;diluirluegoconagualasoluciónobtenidaa1+9.
3.9. Solución patrón de manganeso (1000 µg Mn/ml): disolver 1 g de
manganeso en polvo p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2) y
completarconaguahasta1l.
3.9.1. Solución patrón de trabajo (10 µg Mn/ml): diluir la solución patrón
(3.9) con agua a 1 + 9; diluir luego con agua la solución obtenida a
1+9.
3.10. Soluciónpatróndecinc(1000µgZn/ml):disolver1gdecincencinta
oenplacap.a.en25mldeácidoclorhídrico6N(3.2)ycompletarcon
aguahasta1l.
3.10.1. Solución patrón de trabajo (10 µg Zn/ml): diluir la solución patrón
(3.10) con agua a 1 + 9; diluir luego la solución obtenida con agua a
1+9.
3.11. Solución de cloruro de lantano: disolver 12 g de óxido de lantano en
150 ml de agua, añadir 100 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2) y
completarconaguahasta1l.
4. EQUIPO
4.1. Hornodemufla,determperaturaregulableycontrolada.4.2. Materialdevidriodeborosilicato,resistente.Serecomendaráutilizarun
materialquesirvaexclusivamenteparalasdosificacionesdelosoligoe-
lementos.
4.3. Cápsulasdeplatinoy,eventualmente,decuarzo.
4.4. Espectrofotómetrodeabsorciónatómico,querespondaalasexigencias
del método en cuanto a la sensibilidad y a la precisión en la gama de
lasmedidasútiles.
5. MODOOPERATIVO
5.1.Muestraquecontengacompuestosorgánicos
5.1.1. Incineración y preparación de la solución por analizar (*)
i) Colocar de 5 a 10 g de la muestra, pesados don 0,2 mg de tole-
rancia, en una cápsula de cuarzo o de platino (4.3) (ver nota b),
secar en la estufa a 105 ºC e introducir la cápsula en el horno de
mufla (4.1) frío. Cerrar el horno (ver nota c) y elevar progresiva-
mentesutemperaturaparaalcanzarde450a475ºCen90minutos
aproximadamente.Mantenerdichatemperaturadurante4a16horas
(por ejemplo, durante la noche) de forma a eliminar la materia
carbonosa,abrirluegoelhornoydejarenfriar(vernotad).
Humectarlascenizasconagua,luegotrasvasarlasaunvasoprecipi-
tado de 250 ml. Enjuagar la cápsula con 5 ml de ácido clorhídrico
(3.1) y trasvasar lentamente y con precaución la solución de
enjuague en el vaso precipitado (se podrá producir una reacción
violenta por formación deCO
2. Añadir luego gota a gota ácido
clorhídrico (3.1), agitando al mismo tiempo el contenido del vaso
precipitado, hasta el cese de la efervescencia. Evaporar en seco
agitandoperiódicamenteconunavarilladevidrio.
Añadiralresiduo15mldeácidoclorhídrico6N(3.2)yluegounos
120mldeagua.Mezclarconlaayudadeunavarilladevidrio,dejar1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—13
(*) Los forrajes verdes (frescos o deshidratados) podrán contener grandes cantidades de
sílice vegetal que puedan retener oligoelementos y que se deberán eliminar. Sedeberán someter las muestras de dichos alimentos al siguiente tratamiento. Efectuarlaoperación(5.1.1i)hastalafasedelafiltración. Lavarelpapelfiltroquecontenga
el residuo insoluble por dos veces con agua hirviente y colocarlo en una cápsula de
platino(4.3).Incinerarenelhornodemufla(4.1)aunatemperaturainferiora550ºChastaquetodalamateriacarbonosahubieredesaparecidoporcompleto.Dejarenfriar,añadir algunas gotas de agua, luego de 10 a 15 ml de ácido fluorhídrico (3.4) yevaporar en seco a 150 ºC aproximadamente. Si el residuo conteniere aún sílice,
disolver la misma en algunos ml de ácido fluorhídrico (3.4) y evaporar en seco.
Añadir 5 gotas de ácido sulfúrico (3.5) y calentar hasta desaparición de los humosblancos. Anãdir 5 ml de ácido clorhídrico 6 N (3.2) y 30 ml aproximadamente deagua, calentar, filtrar la solución en un matraz aforado de 250 ml y completar hastasuvolumenconagua(laconcentracióndehlseráde0,5Naproximadamente).Prose-
guirelprocedimientoapartirdelpunto5.1.3.
▼B
la misma en el vaso precipitado y recubrir con un vidrio de reloj.
Poner el líquido en ebullición suave y mantener la ebullición hasta
que aparentemente ya no se disuelvan las cenizas. Filtrar en un
papel filtro sin cenizas y recoger el filtrado en un matraz aforado
de 250 ml. Lavar el vaso precipitado y el filtro con 5 ml de ácido
clorhídrico 6 N (3.2) caliente y por dos veces con agua hirviente.
Completar con agua hasta su volumen (la concentración en hl será
de0,5Naproximadamente).
ii) Si el residuo que se encuentre en el filtro apareciere negro (carbo-
noso), colocarlo de nuevo en el horno e incinerar a 450-475 ºC.Dicha incineración, que requerirá únicamente algunas horas (3 a 5
horasaproximadamente)secompletarácuandolascenizasaparezcan
blancas o casi blancas. Disolver el residuo en unos 2 ml de ácido
clorhídrico (3.1), evaporar en seco y añadir 5 ml de ácido clorhí-
drico 6N(3.2).Calentar, filtrar la soluciónen elmatraz aforado y
completarconaguahastasuvolumen(laconcentraciónenhlseráde
0,5Naproximadamente).
Observaciones:
a) Aldosificarlosoligoelementos,seráoportunollamarlaatenciónen
cuanto a los riesgos de contaminación, en particular por el cinc, el
cobreyelhierro.Porellolosinstrumentosutilizadosparalaprepa-
racióndelasmuestrasdeberánserexentosdedichosmetales.
Para reducir los riesgos de contaminación, convendrá trabajar en
atmósfera exenta de polvo, con un material rigurosamente limpio y
aparatosdevidriocuidadosamentelavados.Ladosificacióndelcinc
será especialmente sensible a las contaminaciones procedentes en
particulardelosaparatosdevidrio,delosreactivos,delpolvo,etc.
b) Calcular el peso de la muestra por incinerar en función del conte-
nido aproximativo del alimento en oligoelementos por dosificar y
delasensibilidaddelespectrofotómetroutilizado.Paradeterminados
alimentospobresenoligoelementos,podrásernecesarioextraeruna
muestrade10a20gydelimitarelvolumendelasoluciónfinala
100ml.
c) Incinerarenunhornocerradosininyeccióndeaireodeoxígeno.
d) La temperatura indicada por el pirómetro no deberá sobrepasar los
475ºC.
5.1.2. Determinación espectrofotométrica
5.1.2.1. Preparacióndelassolucionespatrón
Prepararparacadaoligoelementopordosificarunagamadesoluciones
patrón a partir de las soluciones patrón de trabajo 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 y
3.10.1,deformaquecadasoluciónpatróntuviereunaconcentraciónen
HClde0,5Naproximadamentey,enelcasodelhierro,delmanganeso
ydel cinc, una concentración en clorurodelantano que corresponda a
0,1 % de lantano (p/v). Las concentraciones escogidas en oligoele-
mentos deberán encontrarse en la zona de sensibilidad del
espectrofotómetro utilizado. Los cuadros siguientes darán, a título de
ejemplo, tipos de composición de solución patrón; según el tipo y la
sensibilidaddelespectrofotómetroutilizado,podrásernecesarioescoger
otrasconcentraciones.
Hierro
µgFe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
mldesolución
patróndetrabajo
(3.7.1)
(1ml=100µgFe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+mlhl6N(3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (3.11); completar con agua
hasta100ml.
Cobre
µgCu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
mldesolución
patróndetrabajo
(3.8.1)1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—14
▼B
µgCu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
(1ml=10µgCU) 0 1 2 4 6 8 10
+mlhl6N(3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Completarconaguahasta100ml.
Manganeso
gMn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
mldesolución
patróndetrabajo
(3.9.1)
(1ml=10µgMn) 0 1 2 4 6 8 10
+mlhl6N(3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (3.11); completar con agua
hasta100ml.
Cinc
gZn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
mldesolución
patróndetrabajo
(3.10.1)
(1ml=10µgZn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+mlhl6N(3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (3.11); completar con agua
hasta100ml
5.1.2.2. Preparacióndelasoluciónporanalizar
Paraladosificacióndelcobre,lasoluciónpreparadasegún5.1.1podrá,
comoreglageneral,utilizarsedirectamente.Sifuerenecesariollevarsu
concentración a la gama de las concentraciones de las soluciones
patrón, se podrá introducir con una pipeta una parte alícuota en un
matraz aforado de 100 ml y completar con ácido clorhídrico 0,5 N
(3.3)hastasuvolumen.
Paraladosificacióndelhierro,delmanganesoydelcinc,introducircon
la pipeta una porción alícuota de la solución preparada según 5.1.1 en
un matraz aforado de 100 ml; añadir 10 ml de solución de cloruro de
lantano (3.11) y completar con ácido clorhídrico 0,5 N (3.3) (ver
tambiénpunto8«Observación»)hastasuvolumen.
5.1.2.3. Pruebaenblanco
Realizar una prueba en blanco que comprenda todas las etapas pres-
critasdelmodooperatorio,conexclusióndelapresenciadelamuestra.
Nosedeberáutilizarlasoluciónpatrón«O»paralapruebaenblanco.
5.1.2.4. Medidadelaabsorciónatómica
Medir la absorción de las soluciones patrón y de la solución por
analizar,utilizandounallamaoxidanteaire-acetileno,conlassiguientes
longitudesdeonda:
Fe 248,3nm
Cu 324,8nm
Mn 279,5nm
Zn 213,8nm.
Realizarcuatrovecescadamedida.
5.2. Compuestosminerales
En ausencia de materia orgánica, será inútil la incineración previa.
Aplicarelmodooperatorioapartirdelpunto5.5.1i)delsegundoapar-
tado.Sepodráomitirlaevaporaciónenpresenciadeácidofluorhídrico.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—15
▼B
6. CÁLCULODELOSRESULTADOS
Calcularlaconcentraciónenoligoelementosenlasoluciónporanalizar
mediante una curva de contraste y expresar el resultado en mg de
oligoelementoporkgdemuestra(ppm).
7. REPETIBILIDAD
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas
efectuadas sobre la misma muestra por el mismo analista no debiere
sobrepasar:
— 5 mg/kg en valor absoluto, para los contenidos respectivos en
oligoelementoshasta50mg/kg,
— 10%delresultadomáselevadoparaloscontenidossuperioresa50
yhasta100mg/kg,
— 10mg/kg,envalorabsoluto,paraloscontenidossuperioresa100y
hasta200mg/kg,
— 5 % del resultado más elevado para los contenidos superiores a
200mg/kg.
8. OBSERVACIÓN
La presencia de grandes cantidades de fosfatos podrá interferir en la
dosificación del hierro, del manganeso y del cinc. Se deberá corregir
dicha interferencia por adición de solución de cloruro de lantano
(3.11). Sin embargo, si la muestra tuviere una relación ponderal
CaþMg
p>2 se podrá omitir la adición de solución de cloruro de
lantano(3.11)alasoluciónporanalizaryalassolucionespatrón.1978L0633—ES—20.12.1983—002.001—16