A)

La prueba ELISA competitiva o de bloqueo deberá llevarse a cabo de conformidad con el protocolo siguiente: La prueba ELISA competitiva que utiliza el anticuerpo monoclonal 3-17-A3 permite identificar los anticuerpos de todos los serotipos conocidos del virus de la FCO. La prueba se basa en la interrupción de la reacción entre el antígeno del virus de la FCO y un anticuerpo monoclonal específico de grupo (3-17-A3) mediante la adición del suero para análisis. Los anticuerpos del virus de la FCO que se encuentran en el suero para análisis bloquean la reactividad del anticuerpo monoclonal (AM) y producen una reducción de la coloración prevista al añadir el anticuerpo anti-ratón marcado con enzima y el sustrato/cromógeno. Los sueros pueden analizarse empleando una dilución única de 1/5 (prueba de dilución única, véase el apéndice 1) o pueden titularse (titulación serológica, véase el apéndice 2) para que se obtenga la dilución máxima. Los valores de inhibición superiores al 50 % se consideran positivos. Materiales y reactivos: 1. Placas de microtitulación ELISA apropiadas. 2. Antígeno: suministrado como concentrado de extracto de células, preparado como se describe a continuación y almacenado a – 20 °C o – 70 °C. 3. Solución amortiguadora de bloqueo: solución salina amortiguadora de fosfatos (SAF) con un 0,3 % de suero de bovino adulto de resultado negativo frente al virus de la FCO y un 0,1 % (v/v) de Tween-20 (en forma de jarabe de monolaurato de polioxietilensorbitol) en SAF. 4. Anticuerpo monoclonal: 3-17-A3 (en forma de sobrenadante de cultivo tisular de hibridomas) dirigido contra el polipéptido vp7 específico de grupo y conservado a – 20 °C o liofilizado, diluido antes del uso al 1/100 con solución amortiguadora de bloqueo. 5. Conjugado: globulina de conejo anti-ratón (previamente sometida a adsorción y elución) conjugada con peroxidasa de rábano y conservada al abrigo de la luz a 4 °C. 6. Sustrato y cromógeno: orto-fenilendiamina (cromógeno OFD) a una concentración final de 0,4 mg/ml en agua destilada estéril. Peróxido de hidrógeno (30 % p/v sustrato), 0,05 % v/v añadido inmediatamente antes del uso (5 μl H2 O2 / 10 ml OFD). (Manejar la OFD con cuidado - usar guantes de goma - posible mutágeno). 7. Ácido sulfúrico 1 M: 26,6 ml de ácido añadido a 473,4 ml de agua destilada. (Atención: añadir siempre el ácido al agua, nunca el agua al ácido.) 8. Agitador orbital. 9. Lector de placas ELISA (la prueba puede leerse visualmente). Formato de la prueba Cc: control del conjugado (sin suero/sin anticuerpo monoclonal); C++: suero de control marcadamente positivo. C+: suero de control moderadamente positivo. C-: suero de control negativo. Cm: control del anticuerpo monoclonal (sin suero).



APÉNDICE 1 Formato para la prueba de dilución única (1/5) (40 sueros por placa) Controles Sueros para análisis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



APÉNDICE 2 Formato para la titulación del suero (10 sueros por placa) Controles Sueros para análisis 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1/5 1/5 B Cc C- 1/10 1/10 C C++ C++ 1/20 1/20 D C++ C++ 1/40 1/40 E C+ C+ 1/80 1/80 F C+ C+ 1/160 1/160 G Cm Cm 1/320 1/320 H Cm Cm 1/640 1/640 Protocolo de las pruebas: Control del conjugado (Cc) : los pocillos 1A y 1B corresponden a un ensayo en blanco, formado por el antígeno del virus de la FCO y el conjugado. Puede utilizarse para ajustar a cero el lector ELISA. Control del AM (Cm) : las columnas 1 y 2 de las hileras G y H corresponden al control del anticuerpo monoclonal (AM), formado por antígeno del virus de la FCO, el anticuerpo monoclonal y el conjugado. Estos pocillos representan el color máximo. La media de las lecturas de densidad óptica de este control representa el porcentaje nulo de inhibición. Control positivo (C++ y C+) : columnas 1 y 2 de las hileras C, D, E y F. Estos pocillos contienen antígeno del virus de la FCO, antisuero positivo marcado y moderado respectivamente, AM y conjugado. Control negativo (C-) : los pocillos 2A y 2B son los controles negativos, que contienen antígeno del virus de la FCO, antisuero de resultado negativo frente al virus de la FCO, AM y conjugado. Sueros para análisis : en estudios serológicos a gran escala para cribado rápido, los sueros pueden analizarse por dilución única de 1/5 (véase el apéndice 1). Otra posibilidad es analizar 10 sueros en una gama de dilución del 1/5 al 1/640 (véase el apéndice 2). De este modo puede conocerse de forma aproximada el título del anticuerpo en los sueros para análisis. Procedimiento: 1. Diluir el antígeno del virus de la FCO en una SAF hasta una concentración titulada previamente, tratar brevemente con ultrasonidos para dispersar el virus agregado (si no se dispone de baño de ultrasonidos, pipetear enérgicamente) y añadir 50 μl a todos los pocillos de la placa ELISA. Golpear los lados de la placa para dispersar el antígeno. 2. Incubar a 37 °C durante 60 minutos en un agitador orbital. Lavar las placas tres veces, llenando los pocillos de una SAF no estéril, vaciándolos y secándolos a continuación con papel secante. 3. Pocillos de control: añadir 100 μl de solución amortiguadora de bloqueo a los pocillos de control del conjugado. Añadir 50 μl de sueros de control positivo y negativo, a una dilución de 1/5 (10 μl de suero + 40 μl de solución amortiguadora de bloqueo), a los pocillos C-, C+ y C++ correspondientes. Añadir 50 μl de solución amortiguadora de bloqueo a los pocillos de control del AM. Método de titulación única: añadir una dilución de 1/5 de cada suero para análisis en una solución amortiguadora de bloqueo a los pocillos duplicados de las columnas 3 a 12 (10 μl suero + 40 μl de solución amortiguadora de bloqueo), o Método de titulación del suero: preparar una serie de diluciones al 1/2 de cada muestra de ensayo (de 1/5 a 1/640) en una solución amortiguadora de bloqueo, en los ocho pocillos de una de las columnas 3 a 12. 4. Inmediatamente después de la incorporación de los sueros para análisis, diluir el AM a 1/100 en una solución amortiguadora de bloqueo y añadir 50 μl a todos los pocillos de la placa, excepto a los del ensayo en blanco. 5. Incubar a 37 °C durante 60 minutos en un agitador orbital. Lavar tres veces con una SAF y secar con papel secante. 6. Diluir a 1/5 000 el concentrado de conejo anti-ratón en una solución amortiguadora de bloqueo y añadir 50 μl a todos los pocillos de la placa. 7. Incubar a 37 °C durante 60 minutos en un agitador orbital. Lavar tres veces con una SAF y secar con papel secante. 8. Descongelar el diclorhidrato de o-fenilendiamina (OFD) e, inmediatamente antes del uso, añadir 5 μl de peróxido de hidrógeno al 30 % a cada alícuota de 10 ml de OFD. Añadir 50 μl a todos los pocillos de la placa. Tras 10 minutos aproximadamente de coloración, interrumpir la reacción con ácido sulfúrico 1 Molar (50 μl por pocillo). Deberá observarse una coloración en los pocillos de control del AM y en los que contengan sueros sin anticuerpos frente al virus de la FCO. 9. Examinar y registrar las placas visualmente o mediante un lector espectrofotométrico. Análisis de los resultados: Imprimir mediante un programa informático los valores de densidad óptica (DO) y de porcentaje de inhibición (PI) de los sueros para análisis y de los sueros de control a partir del valor medio registrado en los pocillos de control del antígeno. Los datos expresados como valores de DO y PI se emplean para determinar si la prueba funciona dentro de unos límites aceptables. Los límites superiores y los límites inferiores para el control del AM (el antígeno junto con el AM sin sueros para análisis) deben situarse entre los valores de 0,4 y 1,4 de DO. Deberá rechazarse toda placa que no cumpla los criterios citados. Si no se dispone de ningún programa informático adecuado, imprimir los valores de DO utilizando la impresora ELISA. Calcular el valor medio de DO de los pocillos de control del antígeno, que es equivalente al valor 100 %. Determinar el valor de DO de un 50 % y calcular manualmente la positividad o negatividad de cada muestra. Valor del porcentaje de inhibición (PI) = 100 – (DO de cada control de prueba / promedio de DO del Cm) × 100. Los pocillos duplicados del suero de control negativo y los pocillos duplicados del blanco deberán registrar unos valores de PI comprendidos entre + 25 % y – 25 %, y entre + 95 % y + 105 %, respectivamente. Si los valores no están situados entre estos límites, la placa no queda invalidada, pero ello indica que se está desarrollando un color de fondo. Los sueros de control marcada y moderadamente positivos deberán registrar valores de PI comprendidos entre + 81 % y + 100 %, y entre + 51 % y + 80 %, respectivamente. El umbral de diagnóstico de los sueros para análisis es el 50 % (PI del 50 % o DO del 50 %). Las muestras que registren valores de PI > 50 % son negativas. Se consideran dudosas las muestras que registren valores del PI superiores o inferiores al umbral en el caso de los pocillos duplicados. Dichas muestras pueden volver a analizarse con la prueba de dilución única o titularse. Las muestras positivas pueden también titularse para conocer el grado de positividad. Lectura visual: las muestras positivas y negativas son fácilmente discernibles visualmente, pero las muestras marcadamente negativas y las muestras moderadamente positivas pueden resultar más difíciles de interpretar mediante un examen visual. Preparación del antígeno del virus de la FCO para la prueba ELISA: 1. Lavar tres veces con medio de cultivo Eagle exento de suero entre 40 y 60 frascos de Roux de células confluentes BHK-21 e inocular el virus de la FCO del serotipo 1 en dicho medio. 2. Incubar a 37 °C y comprobar diariamente si se produce el efecto citopático (ECP). 3. Cuando dicho ECP se ponga de manifiesto en la capa celular de cada frasco de Roux, entre el 90 % y el 100 %, recoger el virus desprendiendo por agitación las células que hayan quedado adheridas al cristal. 4. Centrifugar a una velocidad entre 2 000 y 3 000 rpm para que sedimenten las células. 5. Desechar el sobrenadante y efectuar una nueva suspensión celular en 30 ml aproximadamente de una SAF que contenga un 1 % de sarkosil y 2 ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (solución amortiguadora de lisis). Es posible que se gelifiquen las células, en cuyo caso podrá añadirse más solución amortiguadora de lisis para reducir el efecto. (Atención: el fluoruro de fenilmetilsulfonilo es nocivo, debe manipularse con sumo cuidado). 6. Romper las células aplicando una sonda ultrasónica de 30 micrones de amplitud durante 60 segundos. 7. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 minutos. 8. Guardar el sobrenadante a + 4 °C y efectuar una nueva suspensión del sedimento celular restante en 10-20 ml de solución amortiguadora de lisis. 9. Someter a ultrasonidos y clarificar tres veces en total, guardando el sobrenadante en cada fase. 10. Reunir los sobrenadantes y centrifugar durante 120 minutos a 24 000 rpm (100,000 g) y a una temperatura de + 4 °C sobre una almohadilla de 5 ml de sacarosa al 40 % (p/v en una SAF), utilizando tubos de centrifugado Beckmann de 30 ml y un rotor SW 28. 11. Desechar el sobrenadante, escurrir bien los tubos y efectuar una nueva suspensión del sedimento en una SAF mediante un baño de ultrasonidos. Guardar el antígeno en partes alícuotas a – 20 °C. Titulación del antígeno del virus de la FCO para la prueba ELISA: El antígeno de la FCO para la prueba ELISA se titula mediante el método ELISA indirecto. Se titulan las diluciones a 1/2 del antígeno ante una dilución constante (1/100) del anticuerpo monoclonal 3-17-A3. El protocolo es el siguiente: 1. Titular una dilución 1/20 del antígeno del virus de la FCO en una SAF en la placa de microtitulación en una serie de diluciones a 1/2 (50 μl por pocillo) empleando una pipeta multicanal. 2. Incubar durante 1 hora a 37 °C en un agitador orbital. 3. Lavar las placas tres veces con una SAF. 4. Añadir a cada pocillo de la placa de microtitulación 50 μl del anticuerpo monoclonal 3-17-A3 (diluido a 1/100). 5. Incubar durante 1 hora a 37 °C en un agitador orbital. 6. Lavar las placas tres veces con una SAF. 7. Añadir a cada pocillo de la placa de microtitulación 50 μl de globulina de conejo anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano, diluida a una concentración óptima previamente titulada. 8. Incubar durante 1 hora a 37 °C en un agitador orbital. 9. Añadir el sustrato y el cromógeno como se ha descrito anteriormente. Transcurridos 10 minutos, interrumpir la reacción añadiendo ácido sulfúrico 1 M (50 μl/pocillo). En el método competitivo, debe haber un exceso de anticuerpo monoclonal; por lo tanto se utilizará una dilución de antígeno comprendida dentro de la curva de titulación (no en la región plana) que dé un valor de DO de aproximadamente 0,8 después de 10 minutos.