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►B REGLAMENTO (CEE) No3942/92 DE LA COMISIÓN
de 22 de diciembre de 1992
por el que se establece un método de referencia para la determinación del contenido de sitosterol y
estigmasterol en el butteroil
(DO L 399 de 31.12.1992, p. 29)
Modificado por:
Diario Oficial
nopágina fecha
►M1Reglamento (CEE) no2539/93 de la Comisión de 15 de septiembre de
1993 L233 1 16.9.1993
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REGLAMENTO (CEE) No3942/92 DE LA COMISIÓN
de 22 de diciembre de 1992
por el que se establece un método de referencia para la determina-
ción del contenido de sitosterol y estigmasterol en el butteroil
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,
Visto el Reglamento (CEE) no804/68 del Consejo, de 27 de junio de
1968, por el que se establece la organización común de mercados en elsector de la leche y de los productos lácteos(
1), cuya última modifica-
ción la constituye el Reglamento (CEE) no2071/92(2) y, en particular,
su artículo 6,
Considerando que el butteroil debe marcarse y el butteroil marcado
debe controlarse de conformidad con el Reglamento (CEE) no3143/85
de la Comisión(3), cuya última modificación la constituye el Regla-
mento (CEE) no1264/92(4), y, en particular sus artículos 5 y 6;
Considerando que el butteroil puede marcarse y los productos marcados
deben controlarse con arreglo al Reglamento (CEE) no570/88 de la
Comisión(5), cuya última modificación la constituye el Reglamento
(CEE) no124/92(6), y, en particular, sus artículos 3 y 6;
Considerando que el butteroil debe marcarse y el butteroil marcado
debe controlarse de acuerdo con el Reglamento (CEE) no429/90 de la
Comisión(7), cuya última modificación la constituye el Reglamento
(CEE) no1264/92, y, en particular, sus artículos 10 y 11;
Considerando que, para prevenir el riesgo de uso indebido de mante-
quilla subvencionada, es necesario que se cumplan estrictamente lascondiciones de marcado del butteroil;
Considerando que, habida cuenta de la importancia del marcado para el
funcionamiento correcto del sistema es necesario establecer métodoscomunesdedeteccióndetodoslosmarcadoresqueésterequiera,aplica-bles por igual en toda la Comunidad; que, en particular, con ello sepretende garantizar un tratamiento equitativo a todos los agentes econó-micos que se acojan a estos sistemas y eliminar diferencias de lascondicionesdecompetenciaquepuedenexistiractualmentedebidoalosdiferentes métodos de análisis nacionales;
Considerando que es difícil establecer dichos métodos de referencia
simultáneamente para todos los marcadores; que el establecimiento deunmétododereferenciaparadeterminarelcontenidodeestigmasterolysitosterol en el butteroil constituye un primer paso en esta dirección;
Considerando que las medidas previstas en el presente Reglamento se
ajustanaldictamendelComitédegestióndelalecheydelosproductoslácteos,
HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:
(1)D OnoL 148 de 28. 6. 1968, p. 13.
(2)D OnoL 215 de 30. 7. 1992, p. 64.
(3)D OnoL 298 de 12. 11. 1985, p. 9.
(4)D OnoL 135 de 19. 5. 1992, p. 5.
(5)D OnoL 55 de 1. 3. 1988, p. 31.
(6)D OnoL 14 de 21. 1. 1992, p. 28.
(7)D OnoL 45 de 21. 2. 1990, p. 8.
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Artículo 1
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En el Anexo se expone el método de análisis de referencia para deter-minar el contenido de estigmasterol en el butteroil en virtud del artículo6 del Reglamento (CEE) n
o3143/85, del artículo 6 del Reglamento
(CEE) no570/88 o del artículo 11 del Reglamento (CEE) no429/90, así
como para determinar el contenido de β-sitosterol en el butteroil en
virtud del artículo 6 del Reglamento (CEE) no570/88.
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El butteroil habrá sido correctamente marcado cuando los resultadosobtenidos respondan a los requisitos enunciados en el apartado 8 delAnexo.
Artículo 2
El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su
publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas .
Será aplicable a partir del 1 de febrero de 1993.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y
directamente aplicable en cada Estado miembro.
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ANEXO
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE SITOSTEROL Y ESTIGMAS-
TEROL EN EL BUTTEROIL MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE
GASES EN COLUMNA CAPILAR
1. OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN
El presente método describe un procedimiento para la determinación del
contenido de sitosterol y estigmasterol en el butteroil. Se consideracitosterol la suma de β-sitosterol y 22-dihidro- β-sitosterol; los demás
sitosteroles se consideran sin importancia. Se utilizarán muestras reci-bidas de conformidad con los Reglamentos (CEE) n
os3143/85, 570/88 y
429/90.
2. PRINCIPIO
Saponificación del butteroil con una solución etanólica de hidróxido de
potasio y extracción de los insaponificables con éter dietílico.
Los esteroles se transforman en trimetilsililéteres y se analizan mediante
cromatografía de gases en columna capilar con referencia a un patróninterno de betulina.
3. MATERIAL
3.1. Matraz de saponificación de 150ml, provisto de refrigerante de reflujo
con juntas esmeriladas.
3.2. Ampollas de decantación de 500ml.3.3. Matraces de 250ml.3.4. Embudoscompensadoresdepresión,de250mlosimilares,pararecoger
el sobrante de éter dietílico.
3.5. Columna de vidrio de 350mm×20mm provista de un tapón de vidrio
sinterizado.
3.6. Baño maría u otro sistema termostatizado.3.7. Viales para reacción de 2ml.3.8. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna
capilar, provisto de un sistema de división de flujo y formado por:
3.8.1. Una cámara termostática para columnas, capaz de mantener la tempera-
tura deseada con una precisión de ±1 °C.
3.8.2. Una unidad de vaporización de temperatura ajustable.3.8.3. Un detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.3.8.4. Unintegrador-registradorquepuedafuncionarconelconvertidor-ampli-
ficador (3.8.3).
3.9. Columna capilar de sílice fundida, recubierta completamente de BP1 o
material equivalente, con un espesor uniforme de 0,25 µm; la columna
debe ser capaz de separar los trimetilsililderivados del lanosterol y delsitosterol; es adecuada una columna con BP1, de 12m de longitud y0,2mm de diámetro interior.
3.10. Microjeringa de 1 µl para cromatografía de gases, con aguja enderecida
(3.8.2).
4. REACTIVOS
Todos los reactivos deberán ser de grado analítico reconocido. El agua
utilizada deberá ser agua destilada o de pureza al menos equivalente.
4.1. Etanol de una pureza mínima del 95%.4.2. Solución de hidróxido de potasio al 60%: disolver 600g de hidróxido
de potasio (del 85% como mínimo) en agua y completar hasta un litrocon agua.
4.3. Betulina de una pureza mínima del 99%.4.3.1. Soluciones de patrón interno. Betulina en éter dietílico (4.4):4.3.1.1. La concentración de la solución de betulina usada para la determinación
del contenido de sitosterol será de 1,0mg/ml.
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4.3.1.2. La concentración de la solución de betulina usada para la determinación
del contenido de estigmasterol será de 0,4mg/ml.
4.4. Éter dietílico de calidad para análisis (sin peróxidos ni residuos).4.5. Sulfato sódico anhidro granulado, secado previamente a 102 °C durante
dos horas.
4.6. Reactivo de sililación, por ejemplo TRI-SIL (distribuido por Pierce
Chemical Co, número de catálogo 49001) o equivalente. (ATENCIÓN:el TRI-SIL es tóxico, inflamable, corrosivo y posiblemente cancerígeno.El personal de laboratorio deberá conocer bien las medidas de seguridadpara trabajar con TRI-SIL y adoptar las debidas precauciones.)
4.7. Lanosterol.4.8. Sitosterol de una pureza conocida del 90% como mínimo (P).
Nota 1:La pureza de los materiales patrón utilizados para el calibrado
deberá determinarse usando el método de normalización. Considéreseque todos los esteroles presentes en la muestra están representados en elcromatograma, que el área total de los picos representa el 100% de loscomponentes esterólicos y que los esteroles dan la misma respuesta a ladetección. La linealidad del sistema deberá ser validada en la zona deconcentraciones de interés.
4.8.1. Solución patrón de sitosterol: preparar una solución que contenga apro-
ximadamente 0,5mg/ml (W
1) de sitosterol (4.8) en éter dietílico (4.4),
con una precisión de 0,001mg/ml.
4.9. Estigmaterol, de una pureza conocida del 90% como mínimo (P).4.9.1. Solución patrón de estigmasterol: preparar una solución que contenga
aproximadamente0,2mg/ml(W
1)deestigmasterol(4.9)enéterdietílico
(4.4), con una precisión de 0,001mg/ml.
4.10. Mezcla para la prueba de resolución: preparar una solución que
contenga 0,05mg de lanosterol (4.7) y 0,5mg/ml de sitosterol en éterdietílico (4.4).
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparación de las soluciones patrón para cromatografía.
La solución de patrón interno (4.3.1) debe añadirse a la solución patrón
de esterol correspondiente a la vez que se añade a la muestra saponifi-cada (véase 5.2.2).
5.1.1. Solución cromatográfica patrón de sitosterol; pasar 1ml de solución
patrón de sitosterol (4.8.1 ) a 2 viales de reacción (3.7) y eliminar el éter
dietílico con una corriente de nitrógeno. Añadir 1ml de solución depatrón interno (4.3.1.1) y eliminar el éter dietílico con una corriente denitrógeno.
5.1.2. Solución cromatográfica patrón de estigmasterol; pasar 1ml de solución
patrón de estigmasterol (4.9.1) a 2 viales de reacción (3.7) y eliminar eléter dietílico con una corriente de nitrógeno. Añadir 1ml de solución depatrón interno (4.3.1.2) y eliminar el éter dietílico con una corriente denitrógeno.
5.2. Preparación de los insaponificables.5.2.1. Pesar en un matraz de 150ml (3.1) con precisión de 1mg alrededor de
1g de butteroil (W
2). Añadir 50ml de etanol (4.1) y 10ml de solución
de hidróxido de potasio (4.2). Colocar el refrigerante de reflujo ycalentar a unos 75 °C durante 30minutos. Desmontar el refrigerante y
enfriar el matraz hasta una temperatura próxima a la del ambiente.
5.2.2. Añadir 1,0ml de solución de patrón interno (4.3.1.1) al matraz si va a
determinarse el sitosterol, o bien (4.3.1.2) si se va a determinar elestigmasterol. Homogeneizar completamente. Pasar cuantitativamente elcontenido del matraz a una ampolla de decantación de 500ml (3.2) ylavar el matraz por orden con 50ml de agua y 250ml de éter dietílico(4.4).Agitarenérgicamentelaampolladedecantacióndurante2minutosy dejar que se separen las fases. Eliminar la capa acuosa inferior y lavarla capa etérea agitándola sucesivamente con 4 porciones de 100ml deagua.
Nota 2:Para evitar que se forme una emulsión, es fundamental que los
dos primeros lavados con agua se realicen suavemente (diez inver-siones). El tercer lavado puede hacerse agitando enérgicamente durante30 segundos. Si se forma una emulsión, puede deshacerse añadiendo de
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5 a 10ml de etanol. Si se añade etanol, es necesario realizar otros dos
lavados enérgicos con agua.
5.2.3. Pasar la capa etérea transparente y exenta de jabones a través de una
columna de vidrio (3.5) que contenga 30g de sulfato sódico anhidro(4.5).Recogereléterenunmatrazde250ml(3.3).Añadirmaterialpararegular la ebullición y evaporar casi hasta sequedad con baño maría uotro sistema termostatizado, recogiendo los disolventes residuales.
Nota 3:Si los extractos de la muestra se llevan a sequedad completa a
una temperatura demasiado elevada, pueden darse pérdidas de esteroles.
5.3. Preparación de los trimetilsililéteres.5.3.1. Pasar la solución etérea restante en el matraz a un vial de reacción de
2ml (3.7) con 2ml de éter dietílico y eliminar el éter con una corrientedenitrógeno.Lavarelmatrazdosvecesconsendasporcionesde2mldeéter dietílico, pasando el líquido al vial y eliminando el éter con nitró-geno cada vez.
5.3.2. Sililar la muestra añadiendo 1ml de TRI-SIL (4.6). Cerrar el vial y
agitar enérgicamente para disolver el contenido. Si la disolución no escompleta, calentar hasta 65-70 °C. Dejar en reposo durante al menos
5minutos antes de inyectar en el cromatógrafo de gases. Sililar lospatrones de la misma forma que las muestras. Sililar la mezcla para laprueba de resolución (4.10) de la misma forma que las muestras.
Nota 4:La sililación debe realizarse en ausencia de agua. Si la betulina
se silila de forma incompleta, aparece un segundo pico próximo al de labetulina.
Lapresenciadeetanolenlafasedesililacióninterfiereconesteproceso.
El etanol puede estar presente cuando el lavado en la fase de extracciónno es el adecuado. Si este problema persiste, puede realizarse un quintolavado,agitandoenérgicamentedurante30segundos,enlafasedeextra-cción.
5.4. Análisis por cromatografía de gases.5.4.1. Condiciones de funcionamiento:
Ajustar el cromatógrafo de gases con arreglo a las instrucciones del
fabricante.
Las condiciones de funcionamiento son las siguientes:
—temperaturadelacolumna: 265 °C
—temperaturadelinyector: 280 °C
—temperaturadeldetector: 300 °C
—velocidaddelgasportador: 0,6ml/minuto—presióndehidrógeno: 84kPa—presióndelaire: 155kPa—divisióndelamuestra10:1a50:1;laproporcióndedivisióndebe
optimizarseconarregloalasinstruccionesdelfabricante,ydespuésdebevalidarselalinealidaddelarespuestadeldetectorentodalazonadeconcentracionesdeinterés.
Nota 5:Es fundamental limpiar regularmente la camisa del inyector.
— cantidad de sustancia inyectada: 1 µl de solución de TMSE.
Hay que dejar que el sistema se equilibre hasta obtener una respuesta de
estabilidad satisfactoria antes de comenzar el análisis.
Estas condiciones pueden modificarse según las características de la
columna y del cromatógrafo de gases con el fin de obtener cromato-gramas que cumplan los siguientes requisitos:
— el pico de sitosterol debe estar suficientemente separado del de
lanosterol. La figura 1muestra un cromatograma típico como el quedebe obtenerse con una mezcla sililada para la prueba de resolución(4.10).
— los tiempos relativos de retención de los siguientes esteroles deben
aproximarse a los valores indicados a continuación:
Colesterol: 1,0
Estigmasterol: 1,3Sitosterol: 1,5
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Betulina: 2,5
— el tiempo de retención de la betulina debe ser 24minutos aproxima-
damente.
5.4.2. Procedimiento analítico:
Inyectar 1 µl de solución patrón sililada (estigmasterol o sitosterol) y
ajustar los parámetros de calibración del integrador.
Inyectar otra vez 1 µl de solución patrón sililada para determinar los
factores de respuesta en relación con la betulina.
Inyectar 1 µl de solución de muestra sililada y medir las áreas de los
picos. Cada tanda cromatográfica debe ir precedida y seguida por unainyección de patrones. Como orientación pueden incluirse seis inyec-ciones de muestra en cada tanda así controlada.
Nota 6:La integración del pico del estigmasterol debe incluir las posi-
bles colas según se define con los puntos 1 ,2y3d el a figura 2 b.
La integración del pico del sitosterol debe incluir el área del pico del
22-dihidro- β-sitosterol (estigmastanol) que eluye inmediatamente
despuésdelsitosterol(véaselafigura3b),cuandoseevalúeelsitosteroltotal.
6. CÁLCULO DELOS RE SULTADOS
6.1. Determinar el área de los picos de los esteroles y de la betulina en los
dos patrones que preceden y siguen a una tanda y calcular R
1:
R1=Área media del pico del esterol en el patrón
Área media del pico de la betulina en el patrón
Determinar el área del pico del esterol (estigmasterol o sitosterol) y del
pico de la betulina en la muestra y calcular R2:
R2=Área del pico del esterol en la muestra
Área del pico de la betulina en la muestra
W1= Contenidoenesteroldelpatrón(mg)incluidoen1mldesolución
patrón (4.8.1 o 4.9.1)
W2= peso de la muestra (g) (5.2.1).
P = pureza del esterol patrón (4.8 o 4.9)
Contenido en esterol de la muestra mg/kg =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. PRECISION DEL METODO
7.1. Repetibilidad7.1.1. Estigmasterol
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas
dentrodelperíododetiempomásbreveposible,porunmismooperador,utilizando el mismo equipo y con el mismo material problema, nodeberá exceder de 10,2mg/kg.
7.1.2. Sitosterol
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas en
el período de tiempo más breve posible, por un mismo operador, utili-zando el mismo equipo y con el mismo material problema, no excederádel 3,6% respecto a la media de las determinaciones.
7.2. Reproducibilidad7.2.1. Estigmasterol
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas por
operadores de diferentes laboratorios, utilizando equipos diferentes ycon el mismo material problema, no excederá de 25,3mg/kg.
7.2.2. Sitosterol
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas por
operadores de diferentes laboratorios, utilizando equipos diferentes ycon el mismo material problema, no excederá del 8,9% respecto a lamedia de las determinaciones.
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7.3. Fuente de los datos sobre la precisión
Los datos sobre la precisión proceden de un experimento realizado en
1991 en el que participaron nueve laboratorios y seis muestras (tresduplicados ciegos) para el estigmasterol y seis muestras (tres duplicadosciegos) para el sitosterol.
8. LÍMITES DE TOLERANCIA
8.1. Deben tomarse tres muestras del producto marcado para comprobar la
homogeneidad.
8.2. Estigmasterol8.2.1. La proporción de incorporación del estigmasterol es de 150gramos de
estigmasterol de una pureza mínima del 95% por tonelada de butteroil,esdecir,142,5mg/kg;obien170gramosdeestigmasteroldeunapurezamínima del 85% por tonelada de butteroil, es decir, 144,5mg/kg.
8.2.2. Teniendo en cuenta la diferencia crítica de un nivel de probabilidad del
95% (CrD
95), la media de los tres resultados no será inferior a:
128,3mg/kg en caso de que se incorpore estigmasterol de una pureza
mínima del 95%,
130,3mg/kg en caso de que se incorpore estigmasterol de una pureza
mínima del 85%.
8.2.3. Además de los criterios indicados en el punto 8.2.2, el resultado más
bajoobtenidoenlosanálisisdelproductoseemplearáparacomprobarlahomogeneidad de la distribución del indicador. Este proceso se realizarámediante comparación con los siguientes límites
— 120,4mg/kg (el 95% de la proporción de incorporación mínima
corresponde a estigmasterol de una pureza mínima del 95%, y sólose tiene en cuenta una única muestra de CrD
95);
— 122,3mg/kg (el 95% de la proporción de incorporación mínima
corresponde a estigmasterol de una pureza mínima del 85%, y sólose tiene en cuenta una única muestra de CrD
95);
— 99,0mg/kg (el 80% de la proporción de incorporación mínima
corresponde a estigmasterol de una pureza mínima del 95%, y sólose tiene en cuenta una única muestra de CrD
95);
— 100,6mg/kg (el 80% de la proporción de incorporación mínima
corresponde a estigmasterol de una pureza mínima del 85%, y sólose tiene en cuenta una única muestra de CrD
95).
La concentración de indicador en la muestra que proporcione el resul-
tado más bajo se obtiene interpolando 120,4mg/kg con 99,0mg/kg, o122,3mg/kg con 100,6mg/kg, respectivamente.
8.3. Sitosterol8.3.1. La proporción de incorporación de sitosterol es de 600gramos de sitos-
teroldeunapurezadel90%portoneladadebutteroil,esdecir,540mg/kg.
8.3.2. Si se tiene en cuenta el CrD
95, la media de los tres resultados no será
inferior a 513,0mg/kg.
8.3.3. Además del criterio indicado en el punto 8.3.2, el resultado más bajo
obtenido de los análisis del producto se emplea para comprobar lahomogeneidad de la distribución del indicador. Este proceso se realizamediante comparación con los siguientes límites:
— 484,4mg/kg (el 95% de la proporción de incorporación mínima
corresponde a sitosterol de una pureza mínima del 90%, y sólo setiene en cuenta una única muestra de CrD
95);
— 403,4mg/kg (el 80% de la proporción de incorporación mínima
corresponde a sitosterol de una pureza mínima del 90%, y sólo setiene en cuenta una única muestra de CrD
95).
La concentración de indicador en la muestra que proporcione el resul-
tado más bajo se obtiene interpolando 484,4mg/kg con 403,4mg/kg.
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Figura 1 Cromatograma de la mezcla para la prueba de resolución
Es preferible la resolución completa, es decir, la línea del pico del
lanosterol debe volver a la línea de base antes de volver a subir paraformarelpicodelsitosterol,peropuedeaceptarselaresoluciónincom-pleta.

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Figura 2a
Patrón de estigmasterol

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Figura 2b
Muestra de butteroil desnaturalizado con estigmasterol
Nota: La integración del pico del estigmasterol debe incluir las posibles colas,
según se define con los puntos 1 ,2y3 .
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Figura 3a
Patrón de B-sitosterol

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Figura 3b
Muestra de butteroil desnaturalizado con B-sitosterol
Nota: El B-sitosterol suele contener una impureza (identificada como estigmas-
tanol que eluye inmediatamente tras el B-sitosterol. Las áreas de estos dos picosdeben sumerse para evaluar el contenido total en B-sitosterol.