5.4.

Cromatografía de gases. 5.4.1. Operaciones preliminares: acondicionamiento de la columna. 5.4.1.1. Colocar la columna en el cromatógrafo uniendo uno de los extremos de la columna al inyector y el otro al detector. Efectuar los controles generales del equipo para cromatografía de gases (estanquidad de los cricuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del sistema de división de flujo y del sistema de registro, etc.). 5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla previamente. Hacer pasar un ligero flujo de gas a través de la columna, encender el equipo de cromatografía de gases e iniciar un calentamiento gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 °C superior a la temperatura de trabajo (nota 6). Mantener dicha temperatura durante 2 horas como mínimo; a continuación, poner el equipo completo en condiciones de funcionamiento (regulación del flujo de gases y de la relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador electrónico, regulación de la temperatura del horno del detector y del inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de base debe ser lineal, exento de picos de cualquier tipo y no debe presentar deriva. Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicionamiento de la columna es insuficiente. Nota 6: La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre, como mínimo 20 °C inferior a la temperatura máxima prevista para la fase estacionaria utilizada. 5.4.2. Elección de las condiciones de trabajo. 5.4.2.1. Las condiciones de trabajo exigidas son las siguientes: — temperatura de la columna: 260 °C ± 5 °C, — ►C1 temperatura del inyector ◄ : 280 °C, — temperatura del detector: 290 °C, — velocidad lineal del gas portador: helio 20 a 35 cm/s, hidrógeno 30 a 50 cm/s, — relación de «split» de 1/50 a 1/100, — sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima, — sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e. — velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora, — cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 μl de solución de TMSE. Estas condiciones pueden modificarse en función de las características de la columna y del cromatógrafo, de modo que se obtengan cromatogramas que cumplan los siguientes requisitos: — el tiempo de retención del β-sitosterol debe ser de 20 ± 5 minutos, — el pico del campesterol debe ser: para el aceite de oliva (contenido medio del 3 %), 15 ± 5 % del fondo de escala; para el aceite de soja (contenido medio del 20 %), 80 ± 10 % del fondo de escala, — se deben separar todos los esteroles presentes; es necesario que los picos no sólo se separen sino que se resuelvan completamente, es decir, que el trazo del pico llegue a la línea de base antes de que se inicie el pico siguiente. No obstante, podrá admitirse una resolución incompleta si el pico a TRR 1,02 puede cuantificarse utilizando la perpendicular. 5.4.3. Realización del análisis. 5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 μl tomar 1 μl de hexano, aspirar 0,5 μl de aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 μl de la solución problema; elevar el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la aguja a través del septum y, después de 1 o 2 segundos, inyectar rápidamente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente. 5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los esteroles presentes. La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones exigidas (5.4.1.2). 5.4.4. Identificación de los picos. Para la identificación de los diferentes picos se utilizan los tiempos de retención y la comparación con mezclas de TMSE de los esteroles analizadas en las mismas condiciones. La elución de los esteroles se efectúa en el orden siguiente: colesterol, brasicasterol, 24-metilencolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, Δ-7-campesterol, Δ-5,23-estigmastadienol, clerosterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ-5-avenasterol, Δ-5,24-estigmastadienol, Δ-7-estigmastenol, Δ-7-avenasterol. En el cuadro I figuran los tiempos de retención correspondientes al β-sitosterol para las columnas SE 52 y SE 54. Las figuras 1 y 2 ilustran los cromatogramas típicos de algunos aceites. 5.4.5. Determinación cuantitativa. 5.4.5.1. Calcular las áreas de los picos del α-colestanol y de los esteroles utilizando el integrador. No se tomarán en cuenta los picos de aquellos componentes que no figuren en el cuadro I. El factor de respuesta para el α-colestanol debe considerarse como 1. 5.4.5.2. Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los esteroles, expresado en mg/100 g de materia grasa: siendo: Ax : área del pico del esterol x ►M6 ————— ◄ , As : área del pico del α-colestanol, ms : peso de α-colestanol añadido, en miligramos, m : peso de la muestra tomado para la determinación, en gramos.