5.4.

Cromatografía de gases. 5.4.1. Operaciones preliminares: acondicionamiento de la columna capilar. 5.4.1.1. Colocar la columna (punto 3.11) en el cromatógrafo de gases conectando el extremo de entrada al inyector de fraccionamiento y el extremo de salida al detector. Efectuar los controles generales del equipo para cromatografía de gases (estanquidad de los circuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del sistema de división de flujo y del sistema de registro, etc.). 5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla previamente. Hacer pasar un ligero flujo de gas a través de la columna, encender el equipo de cromatografía de gases e iniciar un calentamiento gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 °C superior a la temperatura de trabajo (nota 8). Mantener dicha temperatura durante 2 horas como mínimo; a continuación, poner el equipo completo en condiciones de funcionamiento (regulación del flujo de gases y del fraccionamiento (split), ignición de la llama, conexión con el sistema informático, regulación de la temperatura de la columna, del detector y del inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de base debe ser lineal, exento de picos de cualquier tipo y no debe presentar deriva. Una deriva rectilínea negativa indica que las conexiones de la columna no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicionamiento de la columna es insuficiente. Nota 8: La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre, como mínimo 20 °C inferior a la temperatura máxima especificada para la fase estacionaria utilizada. 5.4.2. Condiciones de funcionamiento: 5.4.2.1. Las condiciones de trabajo son las siguientes: — temperatura de la columna: 260 ± 5 °C; — temperatura del inyector: 280-300 °C; — temperatura del detector: 280-300 °C; — velocidad lineal del gas portador: helio 20 a 35 cm/s, hidrógeno 30 a 50 cm/s, — relación de fraccionamiento (split) de 1/50 a 1/100; — sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima, — sensibilidad de registro: 1 a 2 mV de fondo de escala; — cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 μl de solución de TMSE. Estas condiciones pueden modificarse en función de las características de la columna y del cromatógrafo de gases, de modo que se obtengan cromatogramas que cumplan los siguientes requisitos: — el tiempo de retención del pico del ß-sitosterol debe ser de 20 ± 5 min; — el pico del campesterol debe ser: para el aceite de oliva (contenido medio del 3 %), 20 ± 5 % del fondo de escala; para el aceite de soja (contenido medio del 20 %), 80 ± 10 % del fondo de escala; — se deben separar todos los esteroles presentes; es necesario que los picos no solo se separen sino que se resuelvan completamente, es decir, que el trazo del pico llegue a la línea de base antes de que se inicie el pico siguiente. No obstante, podrá admitirse una resolución incompleta si el pico a TRR 1,02 (sitostanol) puede cuantificarse utilizando la perpendicular. 5.4.3. Realización del análisis 5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 μl tomar 1 μl de hexano, aspirar 0,5 μl de aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 μl de la solución problema; elevar el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la aguja a través de la membrana del inyector y, después de 1 o 2 segundos, inyectar rápidamente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente. También puede emplearse un inyector automático. 5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los dialcoholes triperpénicos presentes. La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones exigidas (punto 5.4.1.2). 5.4.4. Identificación de los picos Para la identificación de los diferentes picos se utilizan los tiempos de retención y la comparación con la mezcla de TMSE de los esteroles y dialcoholes triperpénicos analizada en las mismas condiciones (véase apéndice). La elución de los esteroles y dialcoholes triperpénicos se efectúa en el orden siguiente: colesterol, brasicasterol, ergosterol, 24-metilencolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, Δ-7-campesterol, Δ-5,23-estigmastadienol, clerosterol, ß-sitosterol, sitostanol, Δ-5-avenasterol, Δ-5,24-estigmastadienol, Δ-7-estigmastenol, Δ-7-avenasterol, eritrodiol y uvaol. En el cuadro 1 figuran los tiempos de retención correspondientes al ß-sitosterol para las columnas SE 52 y SE 54. Las figuras 1 y 2 recogen los cromatogramas típicos de algunos aceites. 5.4.5. Determinación cuantitativa. 5.4.5.1. Calcular las áreas de los picos del α-colestanol y de los esteroles y dialcoholes triperpénicos utilizando el sistema informático. No se tomarán en cuenta los picos de aquellos componentes que no figuren en el cuadro 1 (el ergosterol no debe calcularse). El factor de respuesta para el α-colestanol debe considerarse como 1. 5.4.5.2. Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los esteroles, expresado en mg/kg de materia grasa: donde: Ax = área del pico del esterol x, en unidades de cuenta del sistema informático; As = área del pico del α-colestanol, en unidades de cuenta del sistema informático; ms = peso de α-colestanol añadido, en miligramos; m = peso de la muestra tomada para la determinación, en gramos.