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►B REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceitesdeorujodeolivaysobresus
métodosdeanálisis
(DO L 248 de 5.9.1991, p. 1)
Modificado por:
Diario Oficial
nopágina fecha
►M1Reglamento (CEE) no3682/91 de la Comisión de 17 de diciembre de
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Reglamento (CEE) no1429/92 de la Comisión de 26 de mayo de 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Reglamento (CEE) no1683/92 de la Comisión de 29 de junio de 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Reglamento (CEE) no1996/92 de la Comisión de 15 de julio de 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Reglamento (CEE) no3288/92 de la Comisión de 12 de noviembre de
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Reglamento (CEE) no183/93 de la Comisión de 29 de enero de 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 modificado por el Reglamento (CEE) no826/93 de la Comisión de 6
de abril de 1993L 87 6 7.4.1993
►M8Reglamento (CEE) no620/93 de la Comisión de 17 de marzo de 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Reglamento (CE) no177/94 de la Comisión de 28 de enero de 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Reglamento (CE) no2632/94 de la Comisión de 28 de octubre de 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Reglamento (CE) no656/95 de la Comisión de 28 de marzo de 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Reglamento (CE) no2527/95 de la Comisión de 27 de octubre de 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13Reglamento (CE) no2472/97 de la Comisión de 11 de diciembre de 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14Reglamento (CE) no282/98 de la Comisión de 3 de febrero de 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15Reglamento (CE) no2248/98 de la Comisión de 19 de octubre de 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16Reglamento (CE) no379/1999 de la Comisión de 19 de febrero de 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17Reglamento (CE) no455/2001 de la Comisión de 6 de marzo de 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18Reglamento (CE) no2042/2001 de la Comisión de 18 de octubre de 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19Reglamento (CE) no796/2002 de la Comisión de 6 de mayo de 2002 L 128 8 15.5.2002
►M20Reglamento (CE) no1989/2003 de la Comisión de 6 de noviembre de
2003L 295 57 13.11.2003
Rectificado por:
►C1Rectificación, DO L 347 de 28.11.1992, p. 69 (2568/91)
►C2Rectificación, DO L 176 de 20.7.1993, p. 30 (183/93)
►C3Rectificación, DO L 63 de 4.3.1998, p. 34 (2472/97)
►C4Rectificación, DO L 67 de 5.3.2004, p. 34 (1989/2003)1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 1
▼B
REGLAMENTO(CEE)No2568/91DELACOMISIÓN
de11dejuliode1991
relativoalascaracterísticasdelosaceitesdeolivaydelosaceites
deorujodeolivaysobresusmétodosdeanálisis
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,
Visto el Reglamento no136/66/CEE del Consejo, de 22 de septiembre
de 1966, por el que se establece la organización común de mercados enel sector de las materias grasas (
1), cuya última modificación la consti-
tuye el Reglamento (CEE) no3577/90 (2), y, en particular, su artículo
35bis,
Considerando que en el Anexo del Reglamento no136/66/CEE se esta-
blecen lasdenominacionesy definicionesde losaceitesde oliva y de
losaceitesde orujo de oliva comercializadosdentro de cada Es tado
miembro, así como en los intercambios intracomunitarios y conterceros países;
Considerando que, para poder distinguir los diferentes tipos de aceite,
procede definir las características fisicoquímicas de cada uno de ellos,
así como las características organolépticas de los aceites vírgenes, a finde garantizar así la pureza y calidad de estos productos, sin perjuicio deotras disposiciones existentes en la materia;
Considerando que conviene determinar de manera uniforme en toda la
Comunidad la presencia de las características de los diferentes tipos deaceite; que, para ello, procede establecer los métodos comunitarios deanálisis químico y de valoración organoléptica; que conviene, sinembargo, permitir que durante un período transitorio se utilicen otros
métodos de análisis que sean aplicados en los Estados miembros, esta-
bleciendo al mismo tiempo que en caso de presentarse resultadosdivergentesprevalezcan losobtenidosa travésdel método común;
Considerando que la definición de las características fisicoquímicas de
los aceites de oliva y de sus métodos de análisis comporta la adapta-
ción de lasnotascomplementariasdel capítulo 15 de la nomenclaturacombinada;
Considerando que el método de valoración de las características orga-
nolépticasde losaceitesvírgenesrequiere la creación de unospaneles
de catadores seleccionados y especialmente adiestrados; que conviene,por lo tanto, prever el plazo necesario para instaurar una estructura dees te tipo; que, dadaslasdificultadesa lasque s e enfrentarán determi-nados Estados miembros para crear dichos paneles, procede autorizarque se recurra a paneles existentes en otros Estados miembros;
Considerando que, para garantizar el correcto funcionamiento del
sistema de las exacciones reguladoras aplicables a la importación deorujo de oliva, esconveniente prever un método único para la determi-nación del contenido en aceite de estos productos;
Considerando que, para no perjudicar el comercio, resulta oportuno
prever un período limitado para la salida al mercado del aceite quehaya sido envasado antes de la entrada en vigor del presente Regla-mento;
Considerando que procede derogar el Reglamento (CEE) n
o1058/77 de
la Comisión (3), cuya última modificación la constituye el Reglamento
(CEE) no1858/88 (4);
Considerando que el Comité de gestión de las materias grasas no ha
emitido dictamen alguno en el plazo establecido por su presidente,1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 2
(1)D O no172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.
(2)D O noL 353 de 17. 12. 1990, p. 23.
(3)D O noL 128 de 24. 5. 1977, p. 6.
(4)D O noL 166 de 1. 7. 1988, p. 10.
▼B
HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:
Artículo 1
1. Se considerarán aceites de oliva vírgenes, con arreglo a las letras
a) y b) del punto 1 del anexo del Reglamento no136/66/CEE, los
aceites cuyas características se ajusten a las indicadas, respectivamente,en lospuntos 1 y 2 del anexo I del presente Reglamento.
2. Se considerará aceite de oliva lampante, con arreglo a la letra c)
del punto 1 del anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas
características se ajusten a las indicadas en el punto 3 del anexo I delpresente Reglamento.
3. Se considerará aceite de oliva refinado, con arreglo al punto 2 del
anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas características se
ajusten a las indicadas en el punto 4 del anexo I del presente Regla-
mento.
4. Se considerará aceite de oliva que contiene exclusivamente
aceitesde oliva refinadosy aceitesde oliva vírgenes , con arreglo al
punto 3 del anexo del Reglamento no136/66/CEE, el aceite cuyas
características se ajusten a las indicadas en el punto 5 del anexo I delpresente Reglamento.
5. Se considerará aceite de orujo de oliva crudo, con arreglo al
punto 4 del anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas
características se ajusten a las indicadas en el punto 6 del anexo I delpresente Reglamento.
6. Se considerará aceite de orujo de oliva refinado, con arreglo al
punto 5 del anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas
características se ajusten a las indicadas en el punto 7 del anexo I delpresente Reglamento.
7. Se considerará aceite de orujo de oliva, con arreglo al punto 6 del
anexo del Reglamento n
o136/66/CEE, el aceite cuyas características se
ajusten a las indicadas en el punto 8 del anexo I del presente Regla-
mento.
Artículo 2
1. Las características de los aceites, previstas en el Anexo I, se
determinarán empleando los métodos de análisis siguientes:
— para determinar los ácidos grasos libres, expresados en porcentaje
de ácido oleico, el método recogido en el Anexo II,
— para determinar el índice de peróxidos, el método recogido en el
Anexo III,
— para determinar el contenido de ceras, el método recogido en el
anexo IV,
— para determinar el contenido de esteroles, el método recogido en el
Anexo V,
— para determinar el eritrodiol + uvaol, el método recogido en el
Anexo VI,
— para determinar los ácidos grasos saturados en la posición 2 del
triglicérido, el método recogido en el Anexo VII,
— para el análisis espectrofotométrico, el método recogido en el
Anexo IX,
— para determinar la composición de ácidos grasos, el método reco-
gido en losAnexosX «A» y X «B»,1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 3
▼M20
▼C4
▼M20
▼B
▼M19
▼B
▼M20
▼B
▼B
— para determinar los solventes halogenados volátiles, el método reco-
gido en el Anexo XI,
— para la valoración de lascaracterís ticasorganolépticasde losaceites
de oliva vírgenes, el método recogido en el Anexo XII, que seaplicará de conformidad con el apartado 2,
— para determinar los estigmastadienos, el método recogido en el
Anexo XVII,
— para determinar la composición de los triglicéridos de ECN42, el
método que figura en el Anexo XVIII,
— para determinar el contenido de alcoholesalifáticos , el método
recogido en el anexo XIX.
2. La comprobación de lascaracterís ticasorganolépticasde los
aceitesde oliva vírgenespor parte de lasautoridadesnacionaleso s us
representantes correrá a cargo de paneles de catadores autorizados por
losEs tadosmiembros .
Lascaracterís ticasorganolépticasdel aceite de oliva mencionado en el
apartado 1 se considerarán conformes a la categoría declarada si un
panel de catadores autorizado por el Estado miembro interesado
confirma dicha clasificación.
En caso de que el panel autorizado no confirme tal declaración en lo
que respecta a las características organolépticas de la categoría de
aceite de oliva declarada, las autoridades nacionales o sus represen-
tantes ordenarán que se proceda, a petición del interesado, a dosanálisis contradictorios por otros paneles autorizados; al menos uno deellos deberá ser realizado por un panel de cata autorizado por el Estadomiembro productor. Las características en cuestión se considerarán
conformes a las declaradas si ambos análisis contradictorios confirman
la clasificación declarada. En caso contrario, los gastos generados porlos análisis contradictorios, sin perjuicio de otras posibles sanciones,correrán por cuenta del interesado.
3. En lo tocante a la comprobación por lasautoridadesnacionaleso
sus representantes de las características de los aceites previstas en elapartado 1, la toma de muestras se efectuará de acuerdo con las normas
internacionalesEN ISO 661 y EN ISO 5555 relativasa la preparación
de las muestras y al muestreo. Ahora bien, no obstante lo dispuesto enel punto 6.8 de la norma EN ISO 5555, respecto de los lotescompuestos por esos aceites, presentados en envases inmediatos deuna capacidad igual o inferior a 100 litros, la toma de muestras se
realizará de acuerdo con el anexo I bisdel presente Reglamento.
Sin perjuicio de lo dispuesto en la norma EN ISO 5555 y en el capítulo
6 de la norma EN ISO 661, las muestras deberán guardarse lo antesposible en un lugar protegido de la luz y de las elevadas temperaturasy enviarse al laboratorio para la realización de los análisis a más tardar:
— el décimo día hábil siguiente al de la toma de la muestra, durante
losmes esde octubre a mayo, y
— el quinto día hábil siguiente al de la toma la muestra, durante los
meses de junio a septiembre.
4.►
M20Para la comprobación prevista en el apartado 3, los
análisis a que se refieren los anexos II, III, IX, X y XII, así como, ensu caso, los segundos análisis previstos por las legislaciones nacionales,se efectuarán antes de la fecha de caducidad mínima. En caso de que latoma de la muestra se efectúe más de cuatro meses antes de la fecha decaducidad mínima, dichos análisis se realizarán a más tardar el cuarto1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 4
▼M20
▼M11
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▼M19
▼M17
▼M19
▼M17
▼M17
mes siguiente al de la toma de la muestra. No se aplicará ningún plazo
a los demás análisis previstos por el citado Reglamento. ◄
Excepto si la toma de muestras se ha efectuado menos de un mes antes
de la fecha de caducidad mínima, en caso de que los resultados de los
análisis no se ajusten a las características de la categoría de aceite de
oliva o de orujo de oliva declarada, se notificará este extremo al inte-resado como muy tarde un mes antes de que finalice el plazomencionado en el párrafo primero.
5. Con vistas a la determinación de las características de los aceites
de oliva efectuada con arreglo a losmétodoscontempladosen el apar-
tado 1, los resultados de los análisis se compararán directamente con
loslímitesfijadosen el pres ente Reglamento.
Artículo 2 bis
La comprobación por las autoridades nacionales o sus representantes de
la conformidad de una mues tra de losaceitesde oliva y de losaceitesde orujo de oliva con la categoría declarada podrá efectuarse:
a) mediante la realización, en cualquier orden, de losanális iscontem-
pladosen el anexo I, o bien
b) según el orden establecido en el anexo I terdel esquema de deci-
siones, hasta la adopción de una de las decisiones mencionadas endicho esquema.
Artículo ►M193◄
En caso de que se compruebe que las características organolépticas de
un aceite son distintas de las correspondientes a su denominación, elEstado miembro interesado aplicará sanciones económicas administra-
tivas, cuyo importe se determinará en función de la gravedad de la
irregularidad comprobada, sin perjuicio de otras posibles sanciones.
Para la evaluación de las irregularidades se tendrá sobre todo en cuenta
la evolución natural de las características del aceite de oliva conser-vado en condicionesnormales .
Al principio de cada semestre, los Estados miembros informarán a la
Comisión del número y la naturaleza de las irregularidades observadas,así como de las sanciones impuestas durante el semestre anterior.
Artículo 4
1. Para la apreciación y el control de lascaracterís ticasorganolép-
ticas por parte de las autoridades nacionales o sus representantes, los
Estados miembros podrán constituir paneles de catadores autorizados.
Las condiciones de autorización serán establecidas por los Estados
miembros con los objetivos siguientes:
— cumplir lascondicionesdel punto 4 del anexo XII,
— asegurar que la formación del jefe del panel de catadores se efectúa
en un establecimiento y en condiciones reconocidos a tal efecto porel Estado miembro,
— someter la validez de la autorización a los resultados obtenidos en
el sistema de control anual implantado por el Estado miembro.
Todos los Estados miembros comunicarán a la Comisión la lista de los
paneles de catadores autorizados, así como las demás medidas adop-tadasde conformidad con el pres ente apartado.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 5
▼M19
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▼M5
2. En caso de que un Estado miembro tenga dificultades para crear
un panel de catadoresen s u territorio, podrá recurrir a un panel dedegustadores autorizado de otro Estado miembro.
3. Cada Estado miembro elaborará la lista de los paneles de cata-
dores creados por organizaciones profesionales o interprofesionales enlascondicionesfijadasen el apartado 1 y velará por el cumplimientode esas condiciones.
Artículo 6
1. El contenido en aceite de orujo de aceituna y demásres iduosde
la extracción del aceite de oliva (códigosNC 2306 90 11 y 2306 90 19)
se determinará con arreglo al método recogido en el Anexo XV.
2. El contenido de aceite mencionado en el apartado 1 se expresará
como porcentaje del extracto seco en peso.
Artículo 7
Serán aplicables las disposiciones comunitarias sobre la presencia de
contaminantes.
En lo que respecta al contenido de disolventes halogenados, los límites
para todas las categorías de aceites de oliva son los siguientes:
— Contenido máximo de cada disolvente halogenado detectado:
0,1 mg/kg
— Contenido máximo de la suma de los disolventes halogenados
detectados: 0,2 mg/kg.
Artículo 8
1. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión las medidas
adoptadasen aplicación del pres ente Reglamento.
2. Cada Estado miembro comunicará a la Comisión, al inicio de
cada semestre una recapitulación de los datos analíticos de las determi-
naciones efectuadas durante el semestre precedente.
Estos resultados serán examinados por el Comité de gestión de las
materias grasas con arreglo al procedimiento previsto en el artículo 39del Reglamento n
o136/66/CEE.
Artículo 9
Queda derogado el Reglamento (CEE) no1058/77.
Artículo 10
1. El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al
de su publicación en el DiarioOficial delasComunidadesEuropeas .
No obstante, el método que figura en el Anexo XII se aplicará a partir
del►M11 de noviembre de 1992 ◄, excepto en lo que se refiere a
lasoperacionesrelacionadascon la intervención.
Dicho método no se aplicará a los aceites de oliva vírgenes envasados
antesdel 1 de noviembre de 1992.
El presente Reglamento no se aplicará a los aceites de oliva y de orujo
de oliva envasados antes de la fecha de entrada en vigor del presenteReglamento y comercializadoshas ta el 31 de octubre de 1992.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y
directamente aplicable en cada Estado miembro.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 6
▼M19
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▼B
▼B
ANEXOS
Índice
Anexo I: Características de los aceites de oliva
Anexo Ibis: Muestreo de lotes de aceite de oliva o aceite de orujo de oliva
presentado en envases inmediatos de 100 litros como máximo
Anexo Iter: Esquema de decisiones
Anexo II: Determinación del grado de acidez
Anexo III: Determinación del índice de peróxidos
Anexo IV: ►M6Determinación del contenido de cerasmediante crama-
tografía de gases con columna capilar ◄
Anexo V: Determinación de la composición y del contenido de esteroles
mediante cromatografía de gases con columna capilar
Anexo VI: Determinación del eritrodiol y uvaol
Anexo VII: Determinación de los ácidos grasos saturados en la posición 2
de lostriglicéridosde aceitesy gras as
Anexo IX: Prueba espectrofométrica en el ultravioleta
Anexo X «A»: Análisis de los ésteres metílicos de los ácidos grasos mediante
cromatografía de gases
Anexo X «B»: Preparación de losés teresmetílicosde losácidosgras os
Anexo XI: Determinación del contenido en ►C1disolventes ◄haloge-
nadosvolátilesen el aceite de oliva
Anexo XII: Valoración organoléptica del aceite de oliva virgen
Anexo XV: Contenido de aceite de losorujosde aceitunaAnexo XVI: Determinación del índice de yodo
Anexo XVII: Método para la determinación de estigmastadienos en los
aceitesvegetales
Anexo XVIII: Método para la determinación de la composición de los trigli-
céridosde ECN42
Anexo XIX: Método de determinación del contenido de alcoholesalifá-
ticos1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 7
▼M17
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▼B
▼M20
▼B
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ANEXOI
CARACTERÍSTICASDELOSACEITESDEOLIVA
CategoríaAcidez
(%)
(*)Índice de
peróxidos
mEq 02/kg
(*)Cerasmg/kg
(**)Ácidoss atu-
radosen pos i-
ción 2 de los
triglicéridos
(%)Estigmasta-
dieno mg/
kg (1)Diferencia
entre ECN42
HPLC y
ECN42
(cálculo
teórico)K232(*) K270(*) Delta-K (*)Evaluación
organoléptica
Mediana del
defecto
(Md) (*)Evaluación
organoléptica
Mediana del
atributo
frutado
(Mf) (*)
1. Aceite de oliva virgen
extra ≤0,8 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,22 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Aceite de oliva virgen ≤2,0 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Aceite de oliva lampante > 2,0 — ≤300 (3) ≤1,5 ≤0,50 ≤0,3 — — — Md > 2,5 (2)—
4. Aceite de oliva refinado ≤0,3 ≤5 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤1,10 ≤0,16 — —
►C45. Aceite de oliva —
contiene exclusivamente
aceitesde oliva refinados
y aceitesde oliva
vírgenes ◄≤ 1,0 ≤15 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤0,90 ≤0,15 — —
6. Aceite de orujo de oliva
crudo — — > 350 (4) ≤2,2 — ≤0,6 — — — — —
7. Aceite de orujo de oliva
refinado ≤0,3 ≤5 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤2,00 ≤0,20 — —
8. Aceite de orujo de oliva ≤1,0 ≤15 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤1,70 ≤0,18 — —
(1) Suma de isómeros que podrían separarse (o no) mediante columna capilar.
(2) O cuando la mediana de losdefectosesinferior o igual a 2,5 y la mediana del atributo frutado esigual a 0.
(3) Los aceites con un contenido de ceras comprendido entre 300 y 350 mg/kg se consideran aceite de oliva lampante si el contenido de alcoholes alifáticos totalesesinferior o igual a 350 mg/kg o s i el porcentaje de eritrodiol y
uvaol esinferior o igual a 3,5.
(4) Los aceites con un contenido de ceras comprendido entre 300 y 350 mg/kg se consideran aceite de orujo de oliva crudo si el contenido de alcoholes alifát icos totales es superior à 350 mg/kg y si el porcentaje de eritrodiol y
uvaol ess uperior a 3,5.▼M201991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 8
CategoríaContenido de ácidosgras os(1)
Sumasde
los
isómeros
trans-
oleicos
(%)Sumasde
los
isómeros
trans-
lino-
leicos+
trans-
lino-
lénicos
(%)Composición de esteroles
Esteroles
totales
(mg/kg)Eritrodiol
y uvaol
(%) (**)Mirís-
tico
(%)Lino-
lénico
(%)Araquí-
dico
(%)Eico-
senoico
(%)Behénico
(%)Ligno-
cérico
(%)Coles-
terol
(%)Brasi-
casterol
(%)Cam-
pesterol
(%)Estigmas-
terol
(%)Beta-
sitosterol
(%) (2)Delta-7-
estigmas-
tenol
(%)
1. Aceite de oliva
virgen extra ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Aceite de oliva
virgen ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Aceite de oliva
lampante ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (3)
4. Aceite de oliva
refinado ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
►C45. Aceite de
oliva — contiene
exclusivamente
aceitesde oliva
refinadosy
aceitesde olivavírgenes ◄≤ 0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Aceite de orujo
de oliva crudo ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5 (
4)
7. Aceite de orujo
de oliva refinado ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
8. Aceite de orujo
de oliva ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Contenido de otrosácidosgras os(%): palmítico 7,5-20,0; palmitoleico 0,3-3,5; heptadecanoico ≤; heptadecenoico ≤0,3; esteárico 0,5-5,0; oleico 55,0-83,0; linoleico 3,5-21,0.
(2) Suma de: Delta-5-23-estigmastadienol + clerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5-24-estigmastadienol.
(3) Los aceites con un contenido de ceras comprendido entre 300 y 350 mg/kg se consideran aceite de oliva lampante si el contenido de alcoholes alifáticos totalesesinferior o igual a 350 mg/kg o s i el porcentaje de eritrodiol y
uvaol esinferior o igual a 3,5.
(4) Los aceites con un contenido de ceras comprendido entre 300 y 350 mg/kg se consideran aceite de orujo de oliva crudo si el contenido de alcoholes alifát icos totales es superior a 350 mg/kg y si el porcentaje de eritrodiol y
uvaol ess uperior a 3,5.
Notas:
a) Los resultados de los análisis deberán expresarse con el mismo número de decimales que el previsto para cada característica. La última cifra expres ada deberá redondearse hacia arriba si la cifra siguiente es superior a 4.
b) Para cambiar de categoría un aceite o declararlo no conforme en cuanto a su pureza, basta con que una sola de las características no se ajuste a los lími tesfijados .
c) Las características indicadas con asterisco (*), relativas a la calidad del aceite, implican lo siguiente:
— en el caso del aceite de oliva lampante, los límites correspondientes pueden no respetarse simultáneamente,
— en el caso de los aceites de oliva vírgenes, el incumplimiento de uno de los límites supondrá un cambio de categoría, aunque seguirán clasificados den tro de una de lascategoríasde losaceitesde oliva vírgenes .
d) Las características indicadas con dos asteriscos (**) implican que, en el caso de todos los aceites de orujo de oliva, los límites correspondientes pueden no respetarse simultáneamente.▼M201991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 9
▼M20
ANEXOI bis
Muestreodeaceitedeolivaoaceitedeorujodeolivaentregadoenenvases
inmediatosde100litroscomomáximo
El presente método de muestreo se aplicará a las entregas de aceite de oliva o de
orujo de oliva de 125 000 litros como máximo, presentados en envases inme-
diatosde 100 litroscomo máximo.
Cuando la entrega consista en más de 125 000 litros, se dividirá en lotes de
cantidades iguales o inferiores a 125 000 litros. Cuando la entrega sea inferior
a 125 000 litros, ésta constituirá un lote. El presente método se aplicará entonces
a cada lote.
En función del tamaño del lote se determinará el número mínimo de muestras
elementales, con arreglo al cuadro que figura en el punto 1.
El volumen de la muestra elemental se establecerá en función de la capacidad
de los envases inmediatos, de acuerdo con el cuadro que figura en el punto 2.1.
Lasdefinicionescontempladasen la norma EN ISO 5555 s e aplicarán a
«entrega», «muestra elemental» y «muestra de laboratorio».
Se entenderá por «lote» un conjunto de unidadesde venta que s e hayan produ-
cido, fabricado y envasado en circunstancias tales que el aceite contenido en
cada una de dichas unidades de venta se considere homogéneo en lo que se
refiere a sus características analíticas.
1. NÚMERO DE MUESTRAS ELEMENTALES
El número mínimo de muestras elementales se determinará en función del
tamaño del lote, con arreglo al cuadro siguiente:
Tamaño del lote (litros) inferior aNúmero mínimo de muestras elemen-
tales
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Los envases inmediatos de una misma muestra elemental deberán escogerse
entre envases contiguos del lote.
En caso de duda, el Estado miembro aumentará el número de muestras
elementalesque deban tomars e.
2. CONTENIDO DE UNA MUESTRA ELEMENTAL
2.1Cadamuestraelementalconsistiráenlosiguiente:
En caso de que los envases inmediatos
tengan una capacidad:La muestra elemental se extraerá del
aceite de:
a) superior o igual a 5 litros a) tres envases inmediatos
b) superior o igual a 3 litros e infe-
rior a 5 litrosb) tresenvas esinmediatos
c) superior o igual a 2 litros e infe-
rior a 3 litrosc) tresenvas esinmediatos
d) superior o igual a 1 litro e infe-
rior a 2 litrosd) seis envases inmediatos
e) superior o igual a 0,75 litros e
inferior a 1 litroe) seis envases inmediatos
f) inferior a 0,75 litrosf) tres veces el aceite del número
mínimo de envases cuya capa-
cidad total supere 1,5 litros1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 10
▼M20
2.2Las muestras elementales se mantendrán en los envases inmediatos
hastaelmomentodelosanálisis.Acontinuación,elaceitedelasmues-
tras elementales se subdividirá, en su caso, en tres muestras de
laboratorioconelfindeefectuar:
a) losanális ismencionadosen losanexosII, III, IX y X;
b) el análisis mencionado en el anexo XII;
c) los demás análisis.
2.3Losenvasesqueconstituyanunamuestraelementalsesubdividiránde
acuerdoconlosprocedimientosdecontrolprevistosporlaslegislaciones
nacionales.
3. ANÁLISIS Y RESULTADOS
a) Cada una de las muestras elementales contempladas en el punto 1 se
subdividirá en muestras de laboratorio con arreglo al punto 2.5 de la
norma EN ISO 5555, para someterlas a los análisis siguientes:
— determinación de ácidos grasos libres, como se contempla en el
primer guión del apartado 1 del artículo 2,
— determinación del índice de peróxidos, como se contempla en el
segundo guión del apartado 1 del artículo 2,
— análisis espectrofotométrico, como se contempla en el octavo guión
del apartado 1 del artículo 2,
— composición de ácidos grasos, como se contempla en el noveno
guión del apartado 1 del artículo 2.
b) En caso de que los resultados de los análisis mencionados en la letra a)
de al menos una de las muestras elementales tomadas del mismo lote no
se ajusten a las características de la categoría de aceite declarada, el
conjunto del lote de que se trate se declarará no conforme.
En caso de que no sean homogéneos todos los resultados de los análisis
mencionadosen la letra a) de cada una de lasmues traselementales
tomadas del mismo lote, habida cuenta de las características de repetibi-
lidad de los métodos de que se trate, el conjunto del lote se declarará no
homogéneo y cada muestra elemental deberá someterse a los demás
análisis exigidos. En caso contrario, sólo una de las muestras elementales
de dicho lote se someterá a los demás análisis exigidos.
c) En caso de que uno de los resultados de los análisis mencionados en el
segundo párrafo de la letra b) no se ajuste a las características de la cate-
goría de aceite declarada, el conjunto del lote de que se trate se declarará
no conforme.
En caso de que todos los resultados de los análisis mencionados en el
segundo párrafo de la letra b) se ajusten a las características de la cate-
goría de aceite declarada, todo el lote se declarará conforme.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 11
▼M20
ANEXOI ter
ESQUEMA DE DECISIONES PARA LA COMPROBACIÓN DE LA
CONFORMIDADDEUNAMUESTRADEACEITEDEOLIVACONLA
CATEGORÍADECLARADA
El análisis de la conformidad de un aceite de oliva o de orujo de oliva con la
categoría declarada podrá efectuarse:
a) mediante la realización, en cualquier orden, de los análisis previstos para
comprobar que se reúnen las características mencionadas en el anexo I, obien
b) mediante la realización, según el orden indicado en el esquema de deci-
siones, de los análisis previstos en el mismo, hasta la adopción de una de
las decisiones mencionadas en dicho esquema.
Los análisis relativos a los contaminantes, necesarios para comprobar la confor-
midad con las normas de la Comunidad Europea, se realizarán por separado.
El esquema de decisiones se aplicará a todas las categorías de aceite de oliva y
de orujo de oliva. Se compone de cuadrosnumeradosdel 1 al 11, que deberán
seguirse en el orden indicado en el cuadro general en función de la categoría de
aceite declarada.
Para la lectura de loscuadrosgeneral a 11:
— la línea doble (=) indica el camino que debe seguirse en caso de confor-
midad (respuesta positiva) con las condiciones previstas en la casilla
anterior; la línea de puntos(…) indica, por el contrario, el camino que
debe seguirse en caso de no conformidad,
— lostítulosde lascas illasque figuran en loscuadros1 a 11 s e refieren a los
análisis previstos en el presente Reglamento, según las correspondencias
mencionadasen el apéndice 1 del pres ente anexo,
— lasletrasque figuran en loscírculosde decis ión negativa de loscuadros1 a
11 remiten a datosindicativosmencionadosen el apéndice 2 del pres ente
anexo y no implican por sí mismas ninguna obligación de continuar los
análisis o la certeza de la mencionada presunción.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 12
▼M20
Cuadrogeneral
►(1)C41991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 13
▼M20
Cuadro1
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 14
▼M20
Cuadro2
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 15
▼M20
Cuadro3
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 16
▼M20
Cuadro4
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 17
▼M20
Cuadro5
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 18
▼M20
Cuadro6
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 19
▼M20
Cuadro7
►(1)C41991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 20
▼M20
Cuadro8
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 21
▼M20
Cuadro9
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 22
▼M20
Cuadro10
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 23
▼M20
Cuadro11
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 24
▼M20
Apéndice 1
CorrespondenciaentrelosanexosdelpresenteReglamentoylosanálisisprevistosenelprocedi-
mientodecisorio
— Grado de acidez Anexo II Determinación de losácidosgras os
libres
— Índice de peróxidosAnexo III Determinación del índice de peró-
xidos
— Espectrofotometría en el ultravio-
letaAnexo IX Prueba espectrofotométrica
— Valoración organoléptica Anexo XII Valoración organoléptica de los
aceitesde oliva vírgenes
— Estigmasta-3,5-dieno en mg/kg Anexo XVII Método para la determinación de los
estigmastadienos en los aceites vege-
tales
— Isómeros trans de ácidos grasos Anexo X a y Análisis de los ésteres metílicos de
losácidosgras osmediante cromato-
grafía de gases
Anexo X b Preparación de losés teresmetílicos
de losácidosgras os
— Composición de ácidos grasos Anexo X a y Análisis de los ésteres metílicos de
losácidosgras osmediante cromato-
grafía de gases
Anexo X b Preparación de losés teresmetílicos
de losácidosgras os
—∆ECN42 Anexo XVIII Determinación del contenido de
triglicéridoscon ECN42 (diferencia
entre composición real y composi-
ción teórica)
— Composición esterólica y este-
rolestotalesAnexo V Determinación de la composición y
del contenido de esteroles mediante
cromatografía de gases con columna
capilar
— Eritrodiol y Uvaol (%) Anexo VI Determinación del Eritrodiol y Uvaol
— Cerasmg/kg Anexo IV Determinación del contenido de ceras
mediante cromatografía de gases con
columna capilar
— AlcoholesAnexo XIX Determinación del contenido de
alcoholesalifáticosmediante croma-
tografía de gases con columna
capilar
— Ácidos grasos saturados en la
posición 2Anexo VII Determinación de losácidosgras os
saturados en la posición 2 de los
triglicéridos1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 25
▼M20
Apéndice 2
Cuadro1
a) Véase el aceite de oliva virgen o lampante (criterios de calidad del cuadro2
o criteriosde calidad y pureza del cuadro4 )
b) Véase el aceite de oliva lampante (criterios de calidad y pureza del cuadro4 )
Cuadro2
a) Véase el aceite de oliva lampante (criterios de calidad y pureza del cuadro4 )
b) Véase el aceite de oliva virgen extra (criterios de calidad del cuadro1 )
Cuadro3
a) Presencia de aceite refinado (de oliva u otros)
b) Presencia de aceite de orujo de oliva
Cuadro4
a) Véase el aceite de oliva virgen extra y el aceite de oliva virgen (criterios de
calidad delcuadro1 y delcuadro2 )
b) Presencia de aceite refinado (de oliva u otros)
c) Presencia de aceite de orujo de oliva
d) Presencia de aceites esterificados
Cuadro7
a) Presencia de aceite de orujo de oliva
b) Presencia de aceites esterificados
Cuadro8
a) Presencia de aceite refinado (de oliva u otros)
b) Véase el aceite de oliva lampante (criterios de calidad y pureza del cuadro4 )
c) Presencia de aceites esterificados
Cuadro11
a) Presencia de aceites esterificados1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 26
▼B
ANEXOII
DETERMINACIÓNDELGRADODEACIDEZ
1. OBJETO
Determinar losácidoslibresen losaceitesde oliva. El contenido en
ácidos grasos libres se expresa mediante la acidez calculada según el
método convencional.
1.1.Principio
Disolución de la muestra en una mezcla de disolventes y valoración de
los ácidos grasos libres mediante una solución etanólica de hidróxido
potásico.
1.2.Reactivos
Todoslosreactivosdeben s er de calidad analítica reconocida y el agua
utilizada debe ser agua destilada o de una pureza equivalente.
1.2.1. Mezcla de éter dietílico y etanol de 95 % (V/V), en proporción de
volumen 1:1.
Nota:El éter dietílico esmuy inflamable y puede formar peróxidos
explosivos. Debe utilizarse tomando especiales precauciones.
Debe neutralizarse exactamente en el momento de su utilización con la
solución de hidróxido potásico (1.2.2) en presencia de 0,3 ml de la solu-
ción de fenolftaleína (1.2.3) por cada 100 ml de mezcla.
Nota:Si no es posible utilizar éter dietílico, puede sustituirse por una
mezcla de disolventes formada por etanol y tolueno. Si fuera nece-
sario, el etanol podría sustituirse, a su vez, por 2-propanol.
1.2.2. Solución etanólica valorada de hidróxido potásico, = 0,1 M o, en caso
necesario, = 0,5 M. Nota 1.
Debe conocerse, y comprobarse inmediatamente antes de su utilización,
la concentración exacta de la solución etanólica de hidróxido potásico.
Debe utilizarse una solución que haya sido preparada por lo menos cinco
díasantesy decantada en un fras co de vidrio marrón cerrado con tapón
de goma. La solución debe ser incolora o de color amarillo paja.
Nota:Se puede preparar una solución incolora y estable de hidróxido
potásico de la manera siguiente: Llevar a ebullición, y mantener
ésta a reflujo durante una hora, 1 000 ml de etanol con 8 g dehidróxido potásico y 0,5 g de virutas de aluminio. Destilar inme-
diatamente. Disolver en el destilado la cantidad requerida de
hidróxido potásico. Dejar reposar durante varios días y decantar
el líquido claro sobrenadante, separándolo del precipitado de
carbonato potásico.
La solución también puede prepararse de la manera siguiente sin
efectuar la destilación: añadir 4 ml de butilato de aluminio a
1 000 ml de etanol y dejar reposar la mezcla durante algunos
días. Decantar el líquido sobrenadante y disolver en él la cantidad
necesaria de hidróxido potásico. La solución está lista para ser
utilizada.
1.2.3. Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol de 95-96 % (V/V) o solu-
ción de 20 g/l de azul alcalino (en caso de aceites de oliva muy
coloreados) en etanol de 95-96 % (V/V).
1.3.Material
Material habitual de laboratorio, y en particular:
1.3.1. Balanza analítica
1.3.2. Matraz erlenmeyer de 250 ml de capacidad
1.3.3. Bureta de 10 ml de capacidad, con graduación de 0,05 ml
1.4.Procedimento
1.4.1. Preparación de la muestra para la prueba1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 27
▼B
La determinación se efectuará en una muestra filtrada. Si el contenido
global de humedad e impurezas es inferior al 1 %, se utilizará la muestra
tal cual.
1.4.2. Muestra para la prueba
Tomar la muestra, según el grado de acidez previsto, de acuerdo con el
cuadro siguiente:
Grado de acidez previstoPeso de la muestra
(en g)Precisión de la pesada de
la muestra
(en g)
< 1 20 0,05
1 a 4 10 0,02
4 a 15 2,5 0,01
15 a 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Pesar la muestra en el matraz erlenmeyer (1.3.2)
1.4.3 Determinación
Disolver la muestra (1.4.2) en 50 a 150 ml de la mezcla de éter dietílico
y etanol (1.2.1), previamente neutralizada.
Valorar, agitando, con la solución de hidróxido potásico de 0,1 M (1.2.2)
(véase nota 2) hasta el viraje del indicador (la coloración rosa de la
fenolftaleína debe permanecer al menos durante 10 segundos).
Nota1: La solución etanólica valorada de hidróxido potásico (1.2.2)
puede sustituirse por una solución acuosa de hidróxido potásico
o sódico siempre que el volumen de agua añadido no provoque
una separación de las fases.
Nota2: Si la cantidad necesaria de la solución de hidróxido potásico de
0,1 M supera los 10 ml, debe utilizarse una solución de 0,5 M.
Nota3: Si la solución se enturbia durante la valoración, añadir una
cantidad suficiente de la mezcla de disolventes (1.2.1) para que
la solución se aclare.
1.5Expresióndelaacidezenporcentajedeácidooleico
La acidez, expresada en porcentaje de ácido oleico es igual a:
V/C2c/C2M
1000/C2100
P¼V/C2c/C2M
10/C2P
siendo:
V: volumen en ml de la solución valorada de hidróxido potásico utili-
zada.
c: concentración exacta, en molespor litro, de la s olución de hidróxido
potásico utilizada.
M: peso molecular del ácido en que se expresa el resultado (ácido
oleico = 282).
P: peso en gramos de la muestra utilizada.
Se tomará como resultado la media aritmética ►M6de dos
determinaciones ◄.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 28
▼B
ANEXOIII
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEPERÓXIDOS
1. OBJETO
La presente norma describe un método para la determinación del índice de
peróxidos de los aceites y grasas.
2. ÁMBITO DE APLICACIÓN
La presente norma es aplicable a los aceites y grasas animales y vegetales.
3. DEFINICIÓN
El índice de peróxidosesla cantidad (expres ada en miliequivalentesde
oxígeno activo por kg de grasa) de peróxidos en la muestra que ocasionan
la oxidación del yoduro potásico en las condiciones de trabajo descritas.
4. PRINCIPIO
La muestra problema, disuelta en ácido acético y cloroformo, se trata con
solución de yoduro potásico. El yodo liberado se valora con solución valo-
rada de tiosulfato sódico.
5. APARATOS
Todo el material utilizado estará exento de sustancias reductoras u
oxidantes.
Nota:No engrasar las superficies esmeriladas.
5.1. Navecilla de vidrio de 3 ml5.2. Matraces con cuello y tapón esmerilados, de 250 ml de capacidad aproxi-
madamente, previamente secados y llenos de gas inerte puro y seco
(nitrógeno o, preferiblemente, dióxido de carbono).
5.3. Bureta de 25 o 50 ml, graduada en 0,1 ml.
6. REACTIVOS
6.1. Cloroformo para análisis, exento de oxígeno por borboteo de una corriente
de gasinerte puro y s eco.
6.2. Ácido acético glacial para análisis, exento de oxígeno por borboteo de una
corriente de gasinerte puro y s eco.
6.3. Solución acuosa saturada de yoduro potásico, recién preparada, exenta de
yodo y yodatos.
6.4. Solución acuosa de tiosulfato sódico 0,01 N o 0,002 N valorada exacta-
mente; la valoración se efectuará inmediatamente antes del uso.
6.5. Solución de almidón, en solución acuosa de 10 g/l, recién preparada con
almidón soluble.
7. MUESTRA
La muestra se tomará y almacenará al abrigo de la luz, y se mantendrá
refrigerada dentro de envases de vidrio totalmente llenos y herméticamente
cerradoscon taponesde vidrio es merilado o de corcho.
8. PROCEDIMIENTO
El ensayo se realizará con luz natural difusa o con luz artificial. Pesar con
precisión de 0,001 g en una navecilla de vidrio (5.1) o, en su defecto, en un
matraz (5.2) una cantidad de muestra en función del índice de peróxidos
que se presuponga, con arreglo al cuadro siguiente:1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 29
▼B
Índice de peróxidos que se supone
(meq de O2/kg)Peso de la muestra problema
(en g)
de 0 a 12 de 5,0 a 2,0
de 12 a 20 de 2,0 a 1,2
de 20 a 30 de 1,2 a 0,8
de 30 a 50 de 0,8 a 0,5
de 50 a 90 de 0,5 a 0,3
Abrir un matraz (5.2) e introducir la navecilla de vidrio que contenga la
muestra problema. Añadir 10 ml de cloroformo (6.1). Disolver rápidamente
la muestra problema mediante agitación. Añadir 15 ml de ácido acético
(6.2) y, a continuación, 1 ml de solución de yoduro potásico (6.3). Cerrar
rápidamente el matraz, agitar durante 1 minuto y mantenerlo en la oscu-
ridad durante 5 minutosexactamente, a una temperatura comprendida
entre 15 y 25 ºC.
Añadir 75 ml aproximadamente de agua destilada. Valorar (agitando al
mismo tiempo vigorosamente) el yodo liberado con la solución de tiosul-
fato sódico (6.4) (solución 0,002 N si se presuponen valores inferiores a
12 y solución 0,01 N si se presuponen valores superiores a 12), utilizando
la solución de almidón (6.5) como indicador.
Efectuar dosdeterminacionespor mues tra.
Realizar simultáneamente un ensayo en blanco. Si el resultado del ensayo
en blanco sobrepasa 0,05 ml de la solución de tiosulfato sódico 0,01 N
(6.4), sustituir los reactivos.
9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
El índice de peróxidos(I.P.), expres ado en miliequivalentesde oxígeno
activo por kg de grasa se calcula mediante la fórmula siguiente:
IP¼V/C2N/C21000
P
siendo:
V: ml de solución valorada de tiosulfato sódico (6.4) empleados en el
ensayo, convenientemente corregidos para tener en cuenta el ensayo
en blanco.
N: normalidad exacta de la solución de tiosulfato sódico (6.4) empleada.
P: peso, en gramos de la muestra problema.
El resultado será la media artimética de las dos determinaciones efectuadas.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 30
▼M6
ANEXOIV
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CERAS MEDIANTE
CROMATOGRAFÍADEGASESCONCOLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de cerasen determinadosaceitesy gras asen lascondi-
cionesde ens ayo.
Puede utilizarse, en particular, para distinguir el aceite de oliva obte-
nido mediante extracción (aceite de orujo de oliva).
2. PRINCIPIO
Fraccionamiento de la grasa o aceite, a los que se habrá añadido un
patrón interno adecuado, mediante cromatografía en columna de gel de
sílice hidratado. Recuperación de la fracción eluida en las condiciones
de ensayo (cuya polaridad es inferior a la de los triglicéridos) y, a
continuación, análisis directo mediante cromatografía de gases columna
capilar.
3. APARATOS
3.1. Matraz Erlenmeyer de 25 ml.
3.2. Columna de vidrio para cromatografía de 15 mm de diámetro interior y
30-40 cm de longitud.
3.3. Cromatógrafo de gases adecuado con columna capilar, dotado de un
sistema de introducción directa en la columna, que incluya los
siguientes elementos:
3.3.1. Horno termostático para las columnas, que pueda mantener la tempera-
tura deseada con una oscilación máxima de 1 ºC.
3.3.2. Inyector en frío para introducción directa en la columna.3.3.3. Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.3.3.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplifi-
cador (3.3.3), con un tiempo de respuesta inferior o igual a un segundo
y velocidad del papel variable.
3.3.5. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de ►
C210-15 m ◄de
longitud y 0,25-0,32 mm de diámetro interior, con un recubrimiento
interno de SE-52 o SE-54 líquido, o equivalente, de un espesor que
oscile entre 0,10 y 0,30 µm.
3.4. Microjeringa para inyección en columna, de 10 µl de capacidad,
provista de una aguja cementada.
4. REACTIVOS
4.1. Gel de sílice 70-230 mesh, artículo 7754 Merck.
Mantener el gel en el horno durante cuatro horasa una temperatura de
500 ºC. Dejar enfriar y añadir un 2 % de agua. Agitar bien para homo-
geneizar la mezcla. Mantener al abrigo de la luz durante al menos12
horas antes de su uso.
4.2. n-Hexano, de calidad para cromatografía.4.3. Éter etílico, de calidad para cromatografía.4.4. n-Heptano, de calidad para cromatografía.
4.5. Solución patrón de laurilaraquidato al 0,1 % (m/v) en hexano (patrón
interno).
4.6. Gas portador: hidrógeno puro, de calidad para cromatografía de gases.4.7. Gases auxiliares:
— hidrógeno puro, de calidad para cromatografía de gases,
— aire puro, de calidad para cromatografía de gases.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 31
▼M6
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Separación de la fracción de lasceras
5.1.1. Preparación de la columna cromatográfica.
Suspender en n-hexano anhidro 15 g de gel de sílice hidratado al 2 % e
introducir en la columna.
Dejar sedimentar espontáneamente. Completar la sedimentación con
ayuda de un vibrador eléctrico, a fin de obtener una banda cromatográ-
fica máshomogénea. Hacer pas ar 30 ml de n-hexano para eliminar las
posibles impurezas.
5.1.2. Cromatografía en columna.
Pesar con exactitud 500 mg de la muestra en un matraz de 25 ml;
añadir una cantidad de patrón interno apropiada, en función del conte-
nido de ceras que se presuma; por ejemplo, añadir 0,1 mg de
laurilaraquidato si se trata de aceite de oliva y 0,25-0,50 mg si se trata
de aceite de orujo de oliva.
Transferir la muestra preparada a la columna cromatográfica, que se
habrá acondicionado como se indica en el punto 5.1.1 con ayuda de
dosporcionesde 2 ml de n-hexano.
Dejar fluir el disolvente hasta que se sitúe a 1 mm por encima del nivel
superior del absorbente. A continuación, iniciar la elución cromatográ-
fica; recoger 140 ml de la mezcla de n-hexano y éter etílico en la
proporción de 99:1 a un ritmo de 15 gotasaproximadamente cada diez
segundos (2,1 ml/minuto).
Secar la fracción resultante en un evaporador rotatorio hasta que se
haya eliminado casi todo el disolvente. Eliminar los últimos 2 o 3 ml
mediante una corriente débil de nitrógeno y añadir a continuación 10
ml de n-heptano.
5.2. Análisis por cromatografía de gases
5.2.1. Operacionespreliminaresy acondicionamiento de la columna.
5.2.1.1. Instalar la columna en el cromatógrafo de gases, conectando el terminal
de entrada al sistema en columna y el terminal de salida al detector.
Comprobar el funcionamiento general del cromatógrafo de gases
(funcionamiento de loscircuitosde gas , eficacia del detector y del
registrador, etc.).
5.2.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla.
Hacer pasar a través de la columna una corriente ligera de gas y, a
continuación, encender el cromatógrafo de gases. Calentar gradual-
mente hasta alcanzar una temperatura de ensayo (véase la nota).
Mantener esta temperatura durante al menos dos horas y, a continua-
ción, ajustar el aparato a las condiciones de ensayo (regulación del
flujo del gas, encendido de la llama, conexión con el registrador elec-
trónico, regulación de la temperatura del horno para la columna,
regulación del detector, etc.). Registrar la señal con una sensibilidad al
menos dos veces superior a la exigida para efectuar el análisis. La línea
de base deberá ser lineal, sin picos de ningún tipo, y no deberá
presentar deriva.
Una deriva rectilínea negativa indica que lasconexionesde la columna
no son correctas; una deriva positiva indica que la columna no ha sido
acondicionada adecuadamente.
Nota:La temperatura de acondicionamiento debrá ser en todo
momento al menos20 ºC inferior a la temperatura máxima es pe-
cificada para el eluyente que se utilice.
5.2.2. Elección de lascondicionesde ens ayo
5.2.2.1. Las condiciones de ensayo son generalmente las siguientes:
— temperatura de la columna: se parte de una temperatura inicial de
80 ºC que se incrementa a razón de 30 ºC/minuto hasta los 120 ºC,
y que, a continuación, se programa para que aumente 5 ºC/minuto
hasta alcanzar los 340 ºC;
— temperatura del detector: 350 ºC;
— velocidad lineal del gasportador: hidrógeno, 20-35 cm/s egundo,
— sensibilidad instrumental: 4-16 veces la atenuación mínima,— sensibilidad del registrador: 1-2 mV desde el fondo de la escala,— velocidad del papel: 30 cm/hora,— cantidad inyectada: 0,5-1 µl de solución.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 32
▼M6
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna y del cromatógrafo de gases (a fin de obtener cromato-
gramas que reúnan las siguientes condiciones: el tiempo de retención
del patrón interno C32 debe ser de 25 ± 2 minutos y el pico más repre-
sentativo de las ceras debe estar comprendido entre el 60 y el 100 %
desde el fondo de la escala).
5.2.2.2. Determinar losparámetrosde integración de lospicosde manera que s e
obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos considerados.
5.2.3. Realización del análisis5.2.3.1. Tomar 1 µl de solución con la microjeringa de 10 µl; sacar el émbolo
hasta que la aguja esté vacía. Introducir la aguja en el sistema de inyec-
ción e inyectar rápidamente después de 1o2s egundos. Después de 5
segundos aproximadamente, extraer lentamente la aguja.
5.2.3.2. Llevar a cabo el registro hasta que las ceras se hayan eluido completa-
mente.
La línea de base debe satisfacer siempre las condiciones exigidas
(5.2.1.2).
5.2.4. Identificación de lospicos
Identificar los picos sobre la base de los tiempos de retención,
comparándoloscon mezclasde cerasanalizadasen lasmis mascondi-
ciones y cuyos tiempos de retención sean conocidos.
La figura 1 presenta un cromatograma de las ceras de un aceite de oliva
virgen.
5.2.5. Análisis cuantitativo
5.2.5.1. Determinar con ayuda del integrador lasáreasde lospicoscorres pon-
dientesal patrón interno y a losés teresalifáticosde C40 a C46.
5.2.5.2. Determinar el contenido de cada uno de losés teresen mg/kg de materia
grasa, aplicando la siguiente fórmula:
éster (mg/kg) =A
x·ms·►M91 000◄
As·m
siendo:
Ax= área del pico de cada uno de los ésteres;
As= área del pico del laurilaraquidato;
ms= peso, en miligramos, del laurilaraquidato añadido;
m = peso, en gramos, de la muestra tomada para la determinación.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Expresar los contenidos de las distintas ceras y la suma de esos conte-
nidosen mg/kg de materia gras a.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 33
▼M6
APÉNDICE
Determinación delavelocidad linealdelgas
Inyectar de 1 a 3 µl de metano (propano) en el cromatógrafo de gases, después
de haberlo ajustado a las condiciones de ensayo normales. Medir el tiempo que
tarda el gas en recorrer la columna, desde el momento de su inyección hasta la
aparición del pico (tM).
La velocidad lineal en cm/segundo viene dada por la fórmula L/tM, siendo L la
longitud de la columna expresada en cm y tMel tiempo medido en segundos.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 34
▼M61991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 35
▼B
ANEXOV
DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN Y DEL CONTENIDO DE
ESTEROLES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON
COLUMNACAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de esteroles en las materias grasas, expresado como
contenido de cada uno de loses terolesanalizadosy como contenido
total de esteroles.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadio α-coles-
tanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
potásico; a continuación, extracción del insaponificable con éter etílico.
Separación de la fracción de esteroles del insaponificable extraído
mediante cromatografía en placa de gel de sílice básica; los esteroles
recuperados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se
analizan mediante cromatografía de gases con columna capilar.
3. MATERIAL
3.1. Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo con juntas esme-
riladas.
3.2. Embudosde s eparación de 500 ml.
3.3. Matracesde 250 ml.
3.4. Equipo completo de cromatografía en capa fina, utilizando placasde
vidrio de 20 × 20 cm.
3.5. Lámpara ultravioleta de una longitud de onda de 366 o 254 nm.
3.6. Microjeringa de 100 µl y 500 µl.
3.7. Embudo cilíndrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 µm),
de 2 cm de diámetro y 5 cm de altura, aproximadamente, con un dispo-
sitivo adecuado para la filtración en vacío y una junta esmerilada
macho 12/21.
3.8. Matraz cónico para vacío de 50 ml, con junta esmerilada hembra 12/21
acoplable al embudo filtrante (3.7).
3.9. Probeta de 10 ml de fondo cónico con tapón hermético.
3.10. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna
capilar, provisto de un sistema de división de flujo formado por:
3.10.1. Horno para la columna, que pueda mantener la temperatura deseada con
precisión de ± 1 ºC.
3.10.2. Inyector con elemento vaporizador de vidrio tratado con persilano.
3.10.3. Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con el convertidor-amplifi-
cador (3.10.3), con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y
con velocidad de papel variable.
3.11. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de 20 a 30 m de longitud y
de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interno, recubierta interiormente de
líquido SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile
entre 0,10 y 0,30 µm.
3.12. Microjeringa de 10 µl para cromatografía de gases, con aguja endure-
cida.
4. REACTIVOS
4.1. Hidróxido potásico, solución etanólica 2N aproximadamente: disolver,
enfriando al mismo tiempo, 130 g de hidróxido potásico (valoración
mínima del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un
litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio oscuro
bien cerradas.
4.2. Éter etílico de calidad para análisis.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 36
▼B
4.3. Sulfato sódico anhidro de calidad para análisis.
4.4. Placas de vidrio recubiertas con gel de sílice, sin indicador de fluores-
cencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya
preparadaspara el us o).
4.5. Hidróxido potásico, solución etanólica 0,2N: disolver 13 g de hidróxido
potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con
etanol.
4.6. Benceno para cromatografía.
4.7. Acetona para cromatografía. (Véase 5.2.2).
4.8. Hexano para cromatografía. (Véase 5.2.2).4.9. Éter etílico para cromatografía. (Véase 5.2.2).4.10. Cloroformo de calidad para análisis.
4.11. Solución patrón para cromatografía en capa fina: colesterol o fitoste-
roles, solución al ►
M62%◄en cloroformo.
4.12. Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol. Para hacerla
ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2N
de hidróxido potásico.
4.13. Piridina anhidra para cromatografía.
4.14. Hexametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.4.16. Solución problema de trimetilsililéteres de los esteroles: preparar en el
momento del uso a partir de esteroles puros o de mezclas de esteroles
obtenidosde aceitesque loscontengan.
4.17. α-colestanol, disolución al 0,2 % (m/V) en cloroformo (patrón interno).
4.18. Gas portador: hidrógeno o helio de calidad para cromatografía de gases.4.19. Gases auxiliares:
— hidrógeno de calidad para cromatografía de gases,
— aire de calidad para cromatografía de gases.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparación del insaponificable.5.1.1. Con la microjeringa de 500 µl introducir en el matraz de 250 ml un
volumen de disolución de α-colestanol al 0,2 % en cloroformo (4.17)
que contenga una cantidad de α-colestanol correspondiente al 10 %
aproximadamente del contenido de esteroles en la alícuota de la
muestra para la determinación. Por ejemplo, para 5 g de muestra añadir
500 µl de la solución de α-colestanol al 0,2 %, si se trata de aceite de
oliva, y 1 500 µl, si se trata ►
M6 ◄de aceite de orujo
de oliva.
Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación,
pesar con precisión, en el mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada.
En el caso de aceites ►M6 ◄con un alto contenido de
colesterol puede producirse ön pico cuyo tiempo de retención sea idén-
tico al del colestanol. En tal caso el análisis de la fracción de esteroles
debe realizarse dos veces: con patrón interno y sin él ►M6o hay que
utilizar betulinol en lugar de colestanol ◄.
5.1.2. Añadir 50 ml de solución etanólica de hidróxido potásico 2N, adaptar el
refrigerante de reflujo y calentar en baño María con ligera ebullición,
agitando enérgica e ininterrumpidamente hasta que se produzca la sapo-
nificación (la solución se vuelve límpida). Calentar durante 20 minutos
más y, a continuación, añadir 50 ml de agua destilada por la parte supe-
rior del refrigerante; separar el refrigerante y enfriar el matraz a 30 ºC
aproximadamente.
5.1.3. Transvasar cuantitativamente el contenido del matraz a un embudo de
separación de 500 ml, mediante varios lavados con un total aproximado
de 50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éter
etílico, agitar enérgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar
hasta la separación de las fases (nota 1).
Separar la fase acuosa inferior pasándola a un segundo embudo de
separación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el
mismo procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de éter etílico.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 37
▼B
Nota1: Las posibles emulsiones podrán eliminarse añadiendo pequeñas
cantidadesde alcohol etílico o metílico con un pulverizador.
5.1.4. Reunir las fracciones etéreas en un mismo embudo de separación y
lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de
lavado presente reacción neutra.
Una vez eliminada el agua de lavado, secar con sulfato sódico anhidro
y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml previa-
mente pesado, lavando el embudo y el filtro con pequeñas cantidades
de éter etílico.
5.1.5. Destilar el éter hasta que queden unos pocos ml; a continuación, secar
con un vacío ligero o en una corriente de nitrógeno, completando el
secado en una estufa a 100 ºC durante 15 minutos aproximadamente;
dejar enfriar en un desecador y pesar.
5.2. Separación de la fracción de esteroles.
5.2.1. Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas
con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2N de hidróxido
potásico (4.5) durante 10 segundos; dejar secar las placas en campana
durante doshorasy, por último, mantenerlasen una es tufa regulada a
100 ºC durante una hora. Sacarlas de la estufa y conservarlas en un
desecador de cloruro de calcio hasta el momento del uso (las placas
sometidas a este tratamiento deberán utilizarse en un plazo de quince
díascomo máximo).
Nota2: Si se utilizan placas básicas de gel de sílice para la separación
de la fracción de esteroles, ya no es necesario tratar el insapo-
nificable con alúmina. De este modo, todos los compuestos de
naturaleza ácida (ácidos grasos y otros) quedan retenidos en la
línea de aplicación, y la banda de loses terolesaparece perfec-
tamente diferenciada de la banda de losalcoholesalifáticosy
triterpénicos.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de
benceno-acetona 95:5 (v/v) hasta una altura de 1 cm aproximadamente.
Puede utilizarse como alternativa una mezcla de hexano y éter etílico
65:35 (v/v). Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y dejar trans-
currir media hora como mínimo, de forma que se alcance el equilibrio
líquido-vapor. En lascarasinterioresde la cubeta pueden colocars e tiras
de papel de filtro que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el
tiempo de desarrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elución
másuniforme y regular de loscomponentes .
Nota3: Para que lascondicionesde elución s ean perfectamente repro-
ducibles, la mezcla de desarrollo deberá cambiarse en cada
prueba.
5.2.3. Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 %
aproximadamente y, con la microjeringa de 100 µl, depositar 0,3 ml
de dicha solución en una placa cromatográfica (5.2.1) a unos 2 cm de
uno de los bordes, formando una línea lo más fina y uniforme posible.
A la altura de la línea de aplicación se depositan, en un extremo de la
placa, de 2 a 3 µl de la solución de referencia de esteroles (4.11) para
poder identificar la banda de esteroles una vez efectuado el desarrollo.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el punto 5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura ambiente entre
15 y 20 ºC. Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca
la elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproxima-
damente del borde superior de la placa. Sacar la placa de la cubeta y
evaporar el disolvente en una corriente de aire caliente o dejando la
placa bajo una campana unosminutos .
5.2.5. Pulverizar la placa ligera y uniformemente con la solución de 2,7-diclo-
rofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta puede
identificarse la banda de los esteroles mediante comparación con la
mancha obtenida a partir de la solución de referencia; marcar con
lápiz negro loslímitesde la banda a lo largo de losmárgenesde fluo-
rescencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área
delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el
embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclarcuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo
el filtrado en el matraz cónico (3.8) acoplado al embudo filtrante.
Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando
cada vez unos10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mis mo
matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 38
▼B
un volumen de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al tubo de
ensayo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitrógeno, recoger
con algunas gotas de acetona, evaporar de nuevo hasta sequedad, intro-
ducir en una estufa a 105 ºC durante unos 10 minutos, dejar enfriar en
el desecador y pesar.
El residuo que queda en el tubo de ensayo está formado por la fracción
de esteroles.
5.3. Preparación de los trimetilsililéteres.
5.3.1. Agregar al tubo que contiene la fracción de esteroles el reactivo de sila-
nización formado por una mezcla de piridina-hexametildisilazano-
trimetilclorosilano 9:3:1 (v/v/v) (nota 4), a razón de 50 µl por mili-
gramo de esteroles, evitando toda absorción de humedad (nota 5).
Nota4: Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además,
también existen otros reactivos de silanización, como el bis-
trimetilsililacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que se
diluye en el mismo volumen de piridina anhidra.
5.3.2. Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la completa
disolución de los esteroles. Dejar reposar un cuarto de hora, como
mínimo, a temperatura ambiente y centrifugar durante algunosminutos ;
la solución límpida queda lista para el análisis mediante cromatografía
de gases.
Nota5: La formación de una ligera opalescencia es normal y no
ocasiona ninguna interferencia. La formación de una flocula-
ción blanca o la aparición de una coloración rosa son indicios
de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este
caso deberá repetirse la prueba.
5.4. Cromatografía de gases.
5.4.1. Operacionespreliminares : acondicionamiento de la columna.
5.4.1.1. Colocar la columna en el cromatógrafo uniendo uno de losextremosde
la columna al inyector y el otro al detector.
Efectuar loscontrolesgeneralesdel equipo para cromatografía de gas es
(estanquidad de los cricuitos de gases, eficacia del detector, eficacia del
sistema de división de flujo y del sistema de registro, etc.).
5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla
previamente. Hacer pasar un ligero flujo de gas a través de la columna,
encender el equipo de cromatografía de gases e iniciar un calentamiento
gradual hasta alcanzar una temperatura al menos 20 ºC superior a la
temperatura de trabajo (nota 6). Mantener dicha temperatura durante 2
horascomo mínimo; a continuación, poner el equipo completo en
condicionesde funcionamiento (regulación del flujo de gas esy de la
relación de «split», ignición de la llama, conexión con el registrador
electrónico, regulación de la temperatura del horno del detector y del
inyector, etc.) y registrar la señal con una sensibilidad al menos dos
veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de la línea de
base debe ser lineal, exento de picos de cualquier tipo y no debe
presentar deriva.
Una deriva rectilínea negativa indica que lasconexionesde la columna
no son totalmente estancas; una deriva positiva indica que el acondicio-
namiento de la columna esins uficiente.
Nota6: La temperatura de acondicionamiento deberá ser siempre,
como mínimo 20 ºC inferior a la temperatura máxima prevista
para la fase estacionaria utilizada.
5.4.2. Elección de lascondicionesde trabajo.
5.4.2.1. Las condiciones de trabajo exigidas son las siguientes:
— temperatura de la columna: 260 ºC ± 5 ºC,
—►C1temperatura del inyector ◄: 280 ºC,
— temperatura del detector: 290 ºC,— velocidad lineal del gasportador: helio 20 a 35 cm/s , hidrógeno 30
a 50 cm/s,
— relación de «split» de 1/50 a 1/100,
— sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima,
— sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e.— velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,— cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 µl de solución de TMSE.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 39
▼B
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna y del cromatógrafo, de modo que se obtengan cromato-
gramas que cumplan los siguientes requisitos:
— el tiempo de retención del β-sitosterol debe ser de 20 ± 5 minutos,
— el pico del campesterol debe ser: para el aceite de oliva (contenido
medio del 3 %), 15 ± 5 % del fondo de escala; para el aceite de soja
(contenido medio del 20 %), 80 ± 10 % del fondo de escala,
— se deben separar todos los esteroles presentes; es necesario que los
picos no sólo se separen sino que se resuelvan completamente, es
decir, que el trazo del pico llegue a la línea de base antes de que
se inicie el pico siguiente. No obstante, podrá admitirse una resolu-
ción incompleta si el pico a TRR 1,02 puede cuantificarse
utilizando la perpendicular.
5.4.3. Realización del análisis.5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 µl tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µl de
aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 µl de la solución problema; elevar
el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la
aguja a través del septum y, después de 1o2segundos, inyectar rápida-
mente; transcurridos unos 5 segundos, extraer la aguja lentamente.
5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los
esteroles presentes.
La línea de base debe ajustarse en todo momento a las condiciones
exigidas(5.4.1.2).
5.4.4. Identificación de lospicos .
Para la identificación de losdiferentespicoss e utilizan lostiemposde
retención y la comparación con mezclasde TMSE de loses teroles
analizadas en las mismas condiciones.
La elución de los esteroles se efectúa en el orden siguiente: colesterol,
brasicasterol, 24-metilencolesterol, campesterol, campestanol, estigmas-
terol, ∆-7-campesterol, ∆-5,23-estigmastadienol, clerosterol, β-
sitosterol, sitostanol, ∆-5-avenasterol, ∆-5,24-estigmastadienol, ∆-7-
estigmastenol, ∆-7-avenasterol.
En el cuadro I figuran lostiemposde retención corres pondientesal β-
sitosterol para las columnas SE 52 y SE 54.
Las figuras 1 y 2 ilustran los cromatogramas típicos de algunos aceites.
5.4.5. Determinación cuantitativa.
5.4.5.1. Calcular lasáreasde lospicosdel α-colestanol y de los esteroles utili-
zando el integrador. No se tomarán en cuenta los picos de aquellos
componentes que no figuren en el cuadro I. El factor de respuesta para
elα-colestanol debe considerarse como 1.
5.4.5.2. Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los esteroles,
expresado en mg/100 g de materia grasa:
esterol x =A
x·ms· 100
As·m
siendo:
Ax: área del pico del esterol x ►M6 ◄,
As: área del pico del α-colestanol,
ms: peso de α-colestanol añadido, en miligramos,
m: peso de la muestra tomado para la determinación, en gramos.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
6.1. ►C1Se expresa ◄el contenido de cada uno de loses terolesen mg/
100 g de materia grasa y, como «esteroles totales», su suma.
6.2. El porcentaje de cada uno de los esteroles simples es la razón entre el
área del pico correspondiente y la suma de las áreas de los picos de los
esteroles.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 40
▼B
% del esterol X =Ax
ΣA× 100
siendo:
Ax: área del pico de x,
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 41
▼B
APÉNDICE
Determinación delavelocidad linealdelgas
Inyectar en el cromatógrafo, preparado para trabajar en condicionesnormales ,
de 1 a 3 µl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el gasen recorrer
la columna, desde el momento de la inyección hasta el momento en que aparece
el pico (tM).
La velocidad lineal en cm/sviene dada por L/tM, s iendo L la longitud de la
columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.
CuadroI
Tiemposde retención relativosde loses teroles
Pico IdentificaciónTiempo de retención
Columna
SE 54Columna
SE 52
1 colesterol ∆5-colesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 colestanol 5 α-colestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brasicasterol [24S]-24-metil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-metilencolesterol 24-metilen- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-metil- ∆5colesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-metil-colestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 estigmasterol [24S]-24-etil- ∆ 5,22-colestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆7-campesterol [24R]-24-metil- ∆7-colesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆ 5,23-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,23-colestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 clerosterol [24S]-24-etil- ∆ 5,25-colestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-etil- ∆5-colesten-3 β-ol 1 1
12 sitostanol 24-etil-colestan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆5-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆5-colesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆ 5,24-estigmastadienol [24R,S]-24-etil- ∆ 5,24-colestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆7-estigmastenol [24R,S]-24-etil- ∆ 7,24-colesten-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆7-avenasterol [24Z]-24-etiliden- ∆7-3β-ol 1,16 1,161991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 42
▼B
Figura1
Cromatogramadelafraccióndeesterolesdeunaceite deolivabruto
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 43
▼B
Figura2
Cromatogramadelafracción deesterolesdeunaceite deolivarefinado
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 44
▼B
ANEXOVI
DETERMINACIÓNDELCONTENIDOENERITRODIOLYUVAOL
INTRODUCCIÓN
El eritrodiol, entendido corrientemente como conjunto de losdioles
eritrodiol y uvaol, es un componente del insaponificable, característico
de algunos tipos de materias grasas. Su concentración es mucho más
elevada en losaceitesde oliva obtenidosmediante extracción que en los
obtenidosmediante pres ión o en el aceite de pepita de uva y, por lo tanto,
su determinación puede servir para comprobar la existencia de aceite de
oliva obtenido mediante extracción.
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para determinar el eritro-
diol en las materias grasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se saponifica con una solución etanólica de hidróxido
potásico; a continuación se extrae el insaponificable con éter etílico y se
purifica pasándolo por una columna de alúmina.
El fraccionamiento del insaponificable se realiza mediante cromatografía
en capa fina en placa de gel de sílice y se aíslan la banda de la fracción
esterólica y la del eritrodiol.
Los esteroles y el eritrodiol recuperados de la placa se transforman en
trimetilsililéteres y seguidamente se analiza la mezcla mediante cromato-
grafía de gases.
El resultado se expresa en porcentaje de eritrodiol respecto del conjunto
de eritrodiol + esteroles.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. El mismo material que el indicado para el método del Anexo V (Deter-
minación del contenido de esteroles).
4. REACTIVOS
4.1. Losmis mosreactivosque losindicadospara el método del Anexo V
(Determinación del contenido de esteroles).
4.2. Solución patrón de eritrodiol al 0,5 % en cloroformo.
5. PROCEDIMIENTO5.1.Preparacióndelinsaponificable
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.1.2 del método del Anexo
V
5.2.Separacióndeleritrodiolylosesteroles
5.2.1. Véase el apartado 5.2.1 del método del Anexo V.
5.2.2. Véase el apartado 5.2.2 del método mencionado.5.2.3. Preparar una solución del insaponificable al 5 % en cloroformo.
Con una microjeringa de 0,1 ml depositar 0,3 ml de esta solución en una
placa cromatográfica a aproximadamente 1,5 cm del borde inferior de la
placa, formando una banda lo más fina y uniforme posible. Depositar en
un extremo de la placa, como referencia, algunosmicrolitrosde lass olu-
cionesde coles terol y eritrodiol.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el apartado 5.2.1. La temperatura ambiente debe ser de unos 20 ºC.
Tapar inmediatamente la cubeta y dejar que se produzca la elución hasta
que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm aproximadamente del borde
superior de la placa. Sacar ésta de la cubeta de desarrollo y evaporar el
disolvente en una corriente de aire caliente.
5.2.5. Pulverizar la placa uniformemente con la solución alcohólica de 2 ′,7′-
diclorofluoresceína. Al examinar la placa a la luz ultravioleta pueden1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 45
▼B
identificarse las bandas de los esteroles y del eritrodiol mediante compa-
ración con lasreferencias ; delimitar lasbandascon una punta ligeramente
por el exterior de losmárgenesde fluores cencia.
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en las áreas
delimitadas. Reunir el material obtenido en un matraz cónico de 50 ml;
añadir 15 ml de cloroformo caliente, agitar bien y filtrar en el embudo
de filtro poroso vertiendo el gel de sílice sobre el propio filtro. Lavar
tresvecescon 10 ml de cloroformo caliente cada vez, recogiendo el
filtrado en un matraz esférico de 100 ml. Evaporar hasta obtener un
volumen de 4 a 5 ml, transvasar al tubo de centrifugado de fondo cónico
de 10 ml previamente tarado, evaporar hasta sequedad mediante calenta-
miento suave en corriente de nitrógeno y pesar.
5.3.Preparacióndelostrimetilsililéteres
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.3 del método del Anexo V.
5.4.Cromatografíadegases
Se realiza tal como se indica en el apartado 5.4 del método citado. Las
condicionesoperativasde la cromatografía de gas esdeben cumplir los
requisitos necesarios para analizar los esteroles y, además, permitir la
separación de los TMSE del eritrodiol y del uvaol.
Una vez inyectada la muestra, dejar que se desarrolle el proceso hasta
que se produzca la elución de los esteroles presentes, el eritrodiol y el
uvaol; identificar lospicos(el eritrodiol y el uvaol tienen tiemposde
retención relativos, respecto al β-sitosterol, de alrededor de 1,45 y 1,55,
respectivamente) y calcular sus áreas de la misma forma que para los
esteroles.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Eritrodiol, % =A1+A2
A1+A2+ΣAesteroles× 100
siendo:
A1: área del pico del eritrodiol,
A2: área del pico del uvaol ►M6 ◄,
ΣAesteroles: suma de las áreas de los esteroles presentes.
Los resultados deben expresarse con una cifra decimal.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 46
▼B
ANEXOVII
DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS SITUADOS EN LA
POSICIÓN2DELOSTRIGLICÉRIDOSDEACEITESYGRASAS
1. OBJETO
La presente norma describe un método para la determinación de la
composición porcentual de ácidos grasos que se encuentran esterificados
en la posición 2 ►C1(o posición interna) ◄de lostriglicéridos .
2. CAMPO DE APLICACIÓN
La presente norma es aplicable a los aceites y grasas cuyo punto de fusión
se sitúa por debajo de los 45 ºC, debido a las características especiales de
la acción de la lipasa pancreática.
No es aplicable sin reservas a los aceites y grasas que contengan canti-
dadesimportantesde ácidosgras oscon 12 átomosde carbono o menos
(aceites de coco y de palmiste, materias grasas butíricas), de ácidos grasos
altamente insaturados (con más de cuatro enlaces dobles) que tengan 20
átomosde carbono o más(aceitesde pes cado y de mamíferosmarinos ) o
de ácidos grasos que tengan grupos con funciones oxigenadas, además del
grupo ácido.
3. PRINCIPIO
Neutralización de los aceites y grasas si fuera necesario. Purificación
mediante tratamiento en columna de alúmina. Hidrólisis parcial de los
triglicéridosbajo la acción de la lipas a pancreática durante un tiempo
determinado. Separación de losmonoglicéridosres ultantesmediante
cromatografía en capa fina y metanólisis de estos monoglicéridos. Análisis
de los ésteres metílicos mediante cromatografía gas-líquido.
4. EQUIPO
4.1. Matraz de fondo redondo de 100 ml.4.2. Matraz de fondo redondo de 25 ml con boca esmerilada.4.3. Refrigerante de aire de 1 m de longitud, adaptable al matraz 4.2.
4.4. Matraz erlenmeyer de 250 ml.
4.5. Vaso de precipitados de 50 ml.4.6. Embudo de separación de 500 ml.4.7. Columna para cromatografía, de vidrio, con diámetro interior de 13 mm y
longitud de 400 mm, provista de un disco de vidrio poroso y de una llave.
4.8. Tubo de centrífuga de 10 ml con tapón de vidrio esmerilado.4.9. Bureta de 5 ml graduada en 0,05 ml.4.10. Jeringa hipodérmica de 1 ml provista de una aguja fina.4.11. Microjeringa que pueda dispensar gotas de 3-4 µl.
4.12. Aplicador para cromatografía en capa fina.
4.13. Placasde vidrio de 20 × 20 cm para cromatografía en capa fina.4.14. Cubeta de desarrollo para cromatografía en capa fina, de vidrio, provista
de una tapa de vidrio esmerilado, adecuada para las placas de 20 × 20 cm.
4.15. Pulverizador para cromatografía en capa fina.
4.16. Estufa regulada a 103 ± 2 ºC.4.17. Termostato regulable a una temperatura comprendida entre 30 y 45 ºC con
precisión de 0,5 ºC.
4.18. Evaporador rotatorio.
4.19. Vibrador eléctrico, con el que pueda agitarse vigorosamente el tubo de
centrífuga.
4.20. Lámpara ultravioleta para examinar lasplacasde capa fina.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 47
▼B
Paraelcontroldelaactividad lipásica:
4.21. pH-metro.
4.22. Agitador espiral.4.23. Bureta de 5 ml.4.24. Cronómetro.
Paralaeventual preparacióndelalipasa:
4.25. Agitador de laboratorio, adecuado para dispersar y mezclar materiales
heterogéneos.
5. REACTIVOS
5.1. n-Hexano o, en su defecto, éter de petróleo (punto de ebullición 30-50 ºC),
de calidad para cromatografía.
5.2. 2-Propanol, o etanol, 95 % (v/v) de calidad para análisis.
5.3. 2-Propanol, o etanol, solución acuosa 1/1.5.4. Éter dietílico, exento de peróxidos.5.5. Acetona.5.6. Ácido fórmico, al menosde 98 % (p/p).5.7. Solvente de desarrollo: una mezcla de n-hexano (5.1), éter dietílico (5.4) y
ácido fórmico (5.6) en lasproporciones70/30/1 (v/v/v).
5.8. Alúmina activada para cromatografía, neutra, actividad l según Brock-
mann.
5.9. Gel de sílice con aglutinante, de calidad para cromatografía en capa fina.5.10. Lipasa pancreática de calidad adecuada (véanse las notas 1 y 2).5.11. Hidróxido sódico en solución acuosa de 120 g/l.5.12. Ácido clorhídrico, solución acuosa 6 N.5.13. Solución acuosa de 220 g/l de cloruro de calcio (CaCl
2).
5.14. Solución acuosa de 1 g/l de colato sódico (de calidad enzimática).
5.15. Solución tampón: solución acuosa de tris-hidroximetil-aminometano 1 M,
ajustada a pH = 8 con ácido clorhídrico (5.12) (controlar con un potenció-
metro).
5.16. Solución de 10 g/l de fenolftaleína en etanol al 95 % (v/v).5.17. Solución de 2 g/l de 2 ′,7′-diclorofluoresceína en etanol al 95 % (v/v);
alcalinizar ligeramente añadiendo 1 gota de solución de hidróxido sódico
1 N por 100 ml.
Paraelcontroldelaactividad lipásica:
5.18. Aceite neutralizado.5.19. Solución acuosa de hidróxido sódico 0,1 N.
5.20. Solución acuosa de 200 g/l de colato sódico (de calidad enzimática).
5.21. Solución acuosa de 100 g/l de goma arábiga.
6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al método del Anexo
II esinferior al 3 %, s e efectuará directamente la purificación en columna
de alúmina como se describe en el punto 6.2.
Si la acidez de la muestra, determinada con arreglo al método del Anexo
II, es superior al 3 %, se efectuará una neutralización alcalina en presencia
de un solvente, como se describe en el punto 6.1, y a continuación e
realizará la purificación en columna de alúmina descrita en el punto 6.2.
6.1. Neutralización alcalina en presencia de un solvente.
Introducir en el embudo de separación (4.6) aproximadamente 10 g de
aceite crudo y añadir 100 ml de hexano (5.1), 50 ml de 2-propanol (5.2),
algunas gotas de solución de fenolftaleína (5.16) y el volumen de solución
de hidróxido sódico (5.11) correspondiente a la acidez libre del aceite más1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 48
▼B
un 0,3 % de exceso. Agitar enérgicamente durante 1 minuto, añadir 50 ml
de agua destilada, agitar de nuevo y dejar reposar.
Una vez que se haya producido la separación, separar la capa inferior que
contiene los jabones. Separar, asimismo, todas las capas intermedias
(mucílago, materias insolubles). Lavar la solución de hexano del aceite
neutralizado con porciones sucesivas de 25-30 ml de la solución de 2-
propanol (5.3), hasta que desaparezca el color rosa de la fenolftaleína.
Eliminar la mayor parte del hexano mediante destilación en vacío en el
evaporador rotatorio (4.18); desecar el aceite en vacío a 30-40 ºC
mediante una corriente de nitrógeno puro hasta la completa eliminación
del hexano.
6.2. Purificación con alúmina.
Preparar una suspensión de 15 g de alúmina activada (5.8) en 50 ml de
hexano (5.1) y verterla en la columna cromatográfica (4.7), removiendo
al mismo tiempo. Dejar que la alúmina se asiente uniformemente y
esperar a que el nivel del solvente descienda a 1-2 mm por encima del
absorbente. Verter cuidadosamente en la columna 5 g de aceite disueltos
en 25 ml de hexano (5.1); recoger todo el eluyente de la columna en un
matraz de fondo redondo (4.1).
7. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS
Limpiar perfectamente lasplacasde vidrio (4.13) con etanol, éter de
petróleo y acetona para eliminar cualquier rastro de materia grasa.
Introducir en un matraz erlenmeyer (4.4) 30 g de polvo de sílice (5.9).
Añadir 60 ml de agua destilada. Tapar y agitar enérgicamente durante 1
minuto. Transferir inmediatamente al aplicador la mezcla semifluida
(4.12) y recubrir las placas limpias con una capa de 0,25 mm de espesor.
Secar lasplacasal aire durante 15 minutosy a continuación en la es tufa
(4.16) a 103 ± 2 ºC durante 1 hora. Antesdel us o, enfriar lasplacasen un
desecador a temperatura ambiente. En el comercio pueden adquirirse
placaspreparadas .
8. PROCEDIMIENTO
8.1. Hidrólisis con lipasa pancreática.
Pesar en el tubo de centrífuga (4.8) 0,1 g aproximadamente de la muestra
preparada; si la muestra es aceite líquido, proceder como se indica a
continuación; si es una grasa sólida, disolverla en 0,2 ml de hexano
(5.1), aplicando, si es necesario, un ligero calentamiento.
Añadir 20 mg de lipasa (5.10) y 2 ml de solución tampón (5.15). Agitar
bien, pero con cuidado, y añadir a continuación 0,5 ml de la solución de
colato sódico (5.14) y 0,2 ml de la solución de cloruro de calcio (5.13).
Cerrar el tubo con el tapón esmerilado, agitar cuidadosamente (evitando
humedecer el tapón) e introducir el tubo inmediatamente en el termostato
(4.17) a 40 ± 0,5 ºC y agitar manualmente durante 1 minuto exacto.
Sacar el tubo del termostato y agitar enérgicamente con el vibrador eléc-
trico (4.19) durante 2 minutosexactos .
Enfriar de inmediato en agua corriente; añadir 1 ml de ácido clorhídrico
(5.12) y 1 ml de éter dietílico (5.4). Tapar y mezclar enérgicamente con el
vibrador eléctrico. Dejar en reposo y extraer la capa orgánica con la
jeringa (4.10), tras centrifugar si fuese necesario.
8.2. Separación de losmonoglicéridospor cromatografía en capa fina.
Con ayuda de la microjeringa (4.11) colocar el extracto a 1,5 cm aproxi-
madamente del borde inferior de la placa cromatográfica, depositándolo
de manera que forme una línea fina, uniforme y lo más estrecha posible.
Introducir la placa en una cubeta de desarrollo (4.14) bien saturada y
desarrollar con el solvente de desarrollo (5.7) a unos 20 ºC hasta 1 cm
aproximadamente del borde superior de la placa.
Secar la placa al aire a la temperatura de la cubeta y pulverizarla con la
solución de 2 ′,7′-diclorofluoresceína (5.17). Identificar la banda de los
monoglicéridos(Rfaproximadamente 0,035) con luz ultravioleta (4.20).
8.3. Análisis de los monoglicéridos por cromatografía gas-líquido.
Raspar con una espátula la banda citada en el punto 8.2 (procurando no
raspar los componentes que permanezcan en la línea de base) y pasarla
al matraz de metilación (4.2). Tratar directamente la sílice recogida
como se indica en el Anexo X-B, de modo que los monoglicéridos se1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 49
▼B
transformen en ésteres metílicos, y, a continuación, examinar los ésteres
mediante cromatografía en fase gaseosa, como se describe en el Anexo
X-A.
9. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Calcular la composición de los ácidos grasos situados en la posición y
expresar el resultado con una cifra decimal (nota 3).
10. NOTAS
Nota1: Control de la actividad lipásica
Preparar una emulsión oleosa como sigue: agitar en un mezclador
adecuado una mezcla constituida por 165 ml de solución de goma
arábiga (5.21), 15 g de hielo picado y 20 ml de aceite neutrali-zado (5.18).
En un vaso de precipitados (4.5) introducir 10 ml de esta emul-
sión, 0,3 ml de solución de colato sódico (5.20) y 20 ml de agua
destilada.
Colocar el vaso en un termostato a 37 ºC ± 0,5 ºC (nota 4) e
introducir loselectrodosdel pH-metro (4.21) y un agitador es piral
(4.22); después, añadir gota a gota con una bureta (4.23) solución
de hidróxido sódico (5.19) hasta obtener un pH de 8,5.
Añadir una suspensión acuosa de la lipasa (véase a continuación)
en cantidad suficiente. Se mide el pH y, tan pronto como alcance
el valor de 8,3, se pone en marcha un cronómetro y se va
añadiendo la disolución de hidróxido sódico (5.19) gota a gota,
con la velocidad necesaria para mantener constante el pH de
8,3; anotar cada minuto el volumen de solución alcalina consu-
mido.
Llevar los datos obtenidos a un sistema de ejes de coordenadas,
indicando en abscisas los tiempos y en ordenadas los mililitros
de solución alcalina necesarios para mantener constante el pH.
Deberá obtenerse una gráfica lineal.
La suspensión de lipasa mencionada es una suspensión en agua al
1/1 000 (p/p). Deberá emplearse en cada ensayo una cantidad
suficiente de esta suspensión, de modo que en 4 o 5 minutos se
consuma 1 ml de solución alcalina aproximadamente. Normal-
mente se necesitan de 1 a 5 mg de polvo.
La unidad lipásica se define como la cantidad de enzima que
libera 10 µeq de ácido por minuto. La actividad A del polvo utili-
zado, medida en unidades lipásicas por mg, se calcula mediante
esta fórmula:
A¼V/C210
p
siendo:
V = volumen de solución de hidróxido sódico (5.19) consu-
mido por minuto (calculado a partir de la gráfica),
p = peso, en mg, de la muestras problema de polvo.
Nota2: Preparación de la lipasa
En el comercio pueden encontrarse lipasas de actividad lipásica
satisfactoria. También es posible prepararlas en laboratorio de la
manera siguiente: tomar 5 kg de páncreas fresco de cerdo, refri-
gerado a 0 ºC; eliminar la grasa sólida y el tejido conjuntivo que
lo rodean, y triturar en un molino de cuchillashas ta obtener una
pasta fluida. Con un agitador (4.25) agitar la pasta junto con 2,5 l
de acetona anhidra, durante 4-6 horasy des puéscentrifugar.
Efectuar tres extracciones más del residuo con el mismo volumen
de acetona anhidra, dosextraccionescon una mezcla de acetona y
éter etílico 1: 1 (V/V), y dosextraccionescon éter etílico, en es te
orden.
Desecar el residuo al vado durante 48 horas para obtener un
polvo estable, que debe almacenarse en un refrigerador.
Nota3: Es aconsejable en todos los casos determinar la composición de
los ácidos grasos totales de la misma muestra, ya que la compa-1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 50
▼B
ración con la de los ácidos situados en la posición 2 facilitará la
interpretación de lascifrasobtenidas .
Nota4: Por tratarse de un aceite líquido, la hidrólisis se efectúa a 37 ºC.
No obstante, en el caso de la muestra problema se efectuará a
40 ºC a fin de que puedan examinarse las grasas con puntos de
fusión de hasta 45 ºC.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 51
▼M20
▼B
ANEXOIX
PRUEBAESPECTROFOTOMÉTRICAENELULTRAVIOLETA
INTRODUCCIÓN
La prueba espectrofotométrica en el ultravioleta puede proporcionar indica-
ciones sobre la calidad de una materia grasa, su estado de conservación y
las modificaciones inducidas por los procesos tecnológicos.
Lasabs orcionesen laslongitudesde onda indicadasen el método s e deben
a la presencia de sistemas diénicos y triénicos ►C1conjugados ◄. Los
valores de estas absorciones se expresan en extinción específica E1cm1%
(extinción de una solución de la materia grasa al 1 % en el disolvente
determinado, en un espesor de 1 cm) que se expresará convencionalmente
como K, también denominado coeficiente de extinción.
1. OBJETO
El método describe el procedimiento de ejecución de la prueba espectrofo-
tométrica en el ultravioleta de las materias grasas.
2. PRINCIPIO
La materia grasa se disuelve en el disolvente requerido y se determina la
extinción de la solución a las longitudes de onda prescritas, respecto al
disolvente puro. A partir de los valores espectrofotométricos se calculan
las extinciones específicas.
3. MATERIAL Y APARATOS
3.1. Espectrofotómetro para medidas de extinción en el ultravioleta entre 220 y
360 nm, con posibilidad de lectura para cada unidad nanométrica.
3.2. Cubetas de cuarzo, con tapadera, con paso óptico de 1 cm. Las cubetas,
llenas de agua o de otro disolvente adecuado, no deben presentar entre ellas
diferenciass uperioresa 0,01 unidadesde extinción.
3.3. Matracesaforadosde 25 ml.
3.4. Columna de cromatografía de 270 mm de longitud y 35 mm de diámetro en
la parte superior: de 270 mm de longitud y 10 mm de diámetro en la parte
inferior.
4. REACTIVOS
4.1. Isooctano (2,2,4-trimetilpentano) de calidad para espectrofotometría: debe
tener, respecto al agua destilada, una transmitancia del 60 % como mínimo
a 220 nm y del 95 % como mínimo a 250 nm; o
— ciclohexano de calidad para espectrofotometría: debe tener, respecto al
agua destilada, una transmitancia del 40 % como mínimo a 220 nm y
del 95 % como mínimo a 250 nm.
4.2. Alúmina básica para cromatografía en columna, preparada y controlada
como se describe en el apéndice I.
4.3. n-Hexano para cromatografía.
5. PROCEDIMIENTO
5.1. La muestra debe ser perfectamente homogénea y estar exenta de impurezas
en suspensión. Los aceites líquidos a temperatura ambiente se filtran con
papel de filtro a una temperatura aproximada de 30 ºC, las grasas sólidas
se homogeneizan y se filtran a una temperatura superior en 10 ºC como
máximo a su temperatura de fusión.
5.2. Se pesan con precisión 0,25 g aproximadamente de la muestra preparada y
se colocan en un matraz aforado de 25 ml, se completa con el disolvente
adecuado y se homogeneiza. La solución resultante debe estar perfecta-
mente clara. Si presenta opalescencia o turbidez, se filtrará rápidamente
con papel de filtro.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 52
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3. Se llena una cubeta con la solución obtenida y se miden las extinciones,
usando como referencia el disolvente empleado, a las longitudes de onda
comprendidasentre 232 y 276 nm. Losvaloresde extinción obtenidos
deben estar comprendidos en el intervalo entre 0,1 y 0,8; en caso contrario
es necesario repetir la medida utilizando soluciones más concentradas o
más diluidas según el caso.
5.4. Cuando se quiera determinar la extinción específica después del tratamiento
con alúmina se procederá del siguiente modo: en la columna para cromato-
grafía se introducen 30 g de alúmina básica en suspensión en hexano;
después de asentarse el absorbente se elimina el exceso de hexano, hasta
1 cm aproximadamente sobre el nivel superior de la alúmina.
Se disuelven 10 g de materia grasa, homogeneizada y filtrada tal como se
describe en el punto 5.1, en 100 ml de hexano y se vierte esta solución en
la columna. Se recoge el líquido eluido y se evapora totalmente el disol-
vente en vacío a una temperatura inferior a 25 ºC.
Con la materia grasa así obtenida se procede inmediatamente tal como se
indica en el punto 5.2.
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
6.1. Se expresan las extinciones específicas o coeficientes de extinción a las
diversas longitudes de onda, calculadas como sigue:
Kλ¼Eλ
c:e:
siendo:
Kλ= extinción específica a la longitud de onda lambda,
Eλ= extinción medida a la longitud de onda lambda,
c = concentración de la disolución en g por 100 ml,
e = espesor de la cubeta en cm.
Los resultados deben expresarse con dos cifras decimales.
6.2. La prueba espectrofotométrica del aceite de oliva según el método oficial
de losReglamentosde la CEE requiere la determinación de la extinción
específica, en solución en isooctano, a las longitudes de onda de 232 y
270 nm, y la determinación de ∆E definido como:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
donde Kmesla extinción es pecífica a la longitud de onda m, longitud de
onda de máxima absorción alrededor de 270 nm.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 53
▼B
APÉNDICEI
Preparacióndelaalúminaycontroldesuactividad
A.1.1. Preparación de la alúmina
En un recipiente que pueda cerrarse herméticamente se echa la alúmina
previamente desecada en horno a 380-400 ºC durante tres horas, se añade
agua destilada en una proporción de 5 ml por 100 g de alúmina, se cierra
rápidamente el recipiente, se agita repetidas veces y se deja reposar
durante 12 horascomo mínimo antesdel us o.
A.1.2. Control de la actividad de la alúmina
Se prepara una columna para cromatografía con 30 g de alúmina. Se
opera tal como se describe en el apartado 5.4. Se hace pasar a través de
la columna una mezcla formada por:
— 95 % de aceite de oliva virgen, con extinción específica a 268 nm
menor que 0,18,
— 5 % de aceite de cacahuete tratado con tierrasdecolorantesen el
proceso de refinado, con una extinción específica a 268 nm mayor o
igual que 4.
Si, después del paso por la columna, la mezcla presenta una extinción
específica a 268 nm mayor que 0,11, la alúmina es aceptable; en otro
caso se debe aumentar el porcentaje de hidratación.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 54
▼B
APÉNDICEII
Ajustedelespectrofotómetro
A.2. El aparato debe revisarse periódicamente (por lo menos cada seis meses)
tanto en lo que se refiere a la conformidad de la longitud de onda como a
la exactitud de la respuesta.
A.2.1. El control de la respuesta de la longitud de onda puede hacerse mediante
una lámpara de vapor de mercurio o mediante filtrosadecuados .
A.2.2. Para controlar la célula fotoeléctrica y el fotomultiplicador se procede
como sigue: se pesan 0,2 g de cromato potásico de calidad para espectro-
fotometría, se disuelven, en un matraz aforado de 1 000 ml, en una
solución de hidróxido potásico 0,05 N y se completa hasta el enrase.
De la solución obtenida se toman exactamente 25 ml, se transvasan a
un matraz aforado de 500 ml y se completa hasta el enrase con la misma
solución de hidróxido potásico.
Se mide la extinción a 275 nm de la solución así obtenida, utilizando la
solución de hidróxido potásico como referencia. La extinción medida en
cubeta de 1 cm deberá ser de 0,200 ± 0,005.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 55
▼B
ANEXOX«A»
ANÁLISISDELOSÉSTERESMETÍLICOSDELOSÁCIDOSGRASOS
MEDIANTECROMATOGRAFÍADEGASES
1. OBJETO
El presente ►C1método ◄proporciona orientacionesgeneralespara
determinar, mediante cromatografía de gases con columna de relleno o
capilar, la composición cualitativa y cuantitativa de una mezcla de
ésteres metílicos de ácidos grasos obtenidos con arreglo al Anexo X B.
El método no es aplicable a los ácidos grasos polimerizados.
2. REACTIVOS
2.1.Gasportador
Gasinerte (nitrógeno, helio, argón, hidrógeno, etc.), perfectamente
desecado y que contenga menos de 10 mg/kg de oxígeno.
Nota1: El hidrógeno, que sólo se emplea como gas portador en las
columnas capilares, puede duplicar la velocidad del análisis,
pero es peligroso. Existen dispositivos de seguridad.
2.2. Gases auxiliares
2.2.1. Hidrógeno (pureza ≥99,9 %) exento de impurezasorgánicas .
2.2.2. Aire u oxígeno, exento de impurezasorgánicas .
2.3.Patróndereferencia
Una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos puros, o los ésteres
metílicos de una grasa de composición conocida y, preferentemente,
similar a la de la materia grasa objeto de análisis.
Deberá evitarse la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.
3. APARATOS
Lasnormasque figuran a continuación s e refieren al equipo ordinario
para cromatografía de gases, utilizando columnas de relleno y/o capi-
laresy un detector de ionización de llama. Podrá utilizars e cualquier
aparato cuya eficacia y resolución se ajusten a lo dispuesto en el punto
4.1.2.
3.1.Cromatógrafodegases
El cromatógrafo de gases constará de los siguientes elementos:
3.1.1. Sistema de inyección
Utilizar un sistema de inyección:
a) con columnasde relleno, con un es pacio muerto lo máspequeño
posible (en este caso, el sistema de inyección podrá calentarse a
una temperatura que sea entre 20 y 50 ºC superior a la de la
columna); o
b) con columnas capilares; en este caso, el sistema de inyección estará
especialmente diseñado para poder operar con esa clase de
columnas; podrá utilizarse un inyector con división de flujo o un
inyector «on column».
Nota2: En ausencia de ácidos grasos con menos de 16 átomos de
carbono, podrá utilizarse un inyector de aguja móvil.
3.1.2. Horno
El horno podrá calentar la columna a 260 ºC como mínimo y mantener
dicha temperatura con una oscilación máxima de 1 ºC, si se emplea una
columna de relleno, y de 0,1 ºC, si se emplea una columna capilar. Este
último requisito es especialmente importante si se utiliza una columna
de sílice fundida.
Se recomienda emplear en todos los casos un sistema de calentamiento
programado, sobre todo en el caso de ácidos grasos con menos de 16
átomosde carbono.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 56
▼B
3.1.3. Columna de relleno
3.1.3.1. Columna de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(es decir, vidrio o acero inoxidable) y de las dimensiones siguientes:
a) Longitud: de 1 a 3 m. Con ácidosgras osde cadena larga (másde
C20) esconveniente utilizar una columna relativamente corta. Para
el análisis de ácidos con 4 o 6 átomos de carbono se recomienda
una columna de 2 m.
b) Diámetro interior: de 2 a 4 mm.
Nota3: Si hay componentespoliins aturadoscon másde tresenlaces
dobles, pueden descomponerse en una columna de acero inoxi-
dable.
Nota4: Puede utilizarse un sistema con doble columna de relleno.
3.1.3.2. Relleno, que incluya los siguientes elementos:
a)Soporte: tierra de diatomeaslavada con ácido y s ilanizada, u otro
soporte inerte adecuado, con un margen estrecho de tamaño de
grano (margen de 25 µm, entre 125 y 200 µm); el tamaño medio
de grano estará en función del diámetro interior y de la longitud de
la columna.
b)Faseestacionaria: líquido polar de tipo poliéster (por ejemplo: poli-
succinato de dietilenglicol, polisuccinato de butanodiol, poliadipato
de etilenglicol, etc.), cianosiliconas o cualquier otro líquido que
permita efectuar la separación cromatográfica exigida (véase el
punto 4). La fase estacionalia deberá constituir del 5 % (m/m) al
20 % (m/m) del relleno. Para algunas separaciones podrá utilizarse
una fase fija no polar.
3.1.3.3. Acondicionamiento de la columna
Estando la columna desconectada del detector, si es posible, calentar el
horno gradualmente hasta 185 ºC y hacer pasar a través de la columna
recién preparada una corriente de gasinerte a razón de 20-60 ml/min
durante 16 horascomo mínimo a la temparatura citada y, a continua-
ción, a la temperatura de 195 ºC durante 2 horasmás .
3.1.4. Columna capilar3.1.4.1. Tubo de un material inerte a las sustancias que vayan a analizarse
(generalmente, vidrio o sílice fundida). El diámetro interior estará
comprendido entre 0,2 y 0,8 mm. La superficie interior se someterá a
un tratamiento adecuado (por ejemplo, preparación de la superficie,
inactivación) antesde introducir el recubrimiento de fas e fija. En la
mayoría de casos, es suficiente una longitud de ►
C125 m◄.
3.1.4.2. Fase estacionaria de tipo poliglicol [poli(etilenglicol) 20 000], poliéster
(polisuccinato de butanodiol) o polisiloxano polar (cianosiliconas),generalmente. Son apropiadaslascolumnasde fas e químicamente
ligada.
Nota5: Existe el riesgo de que los polisiloxanos polares dificulten la
identificación y separación del ácido linolénico y de los ácidos
C
20.
El espesor de la fase estará comprendido entre 0,1 y 0,2 µm.
3.1.4.3. Montaje y acondicionamiento de la columna.
Observar las precauciones normales de montaje de columnas capilares
(esdecir, ins talación de la columna en el horno, elección y montaje de
lasjuntas(es tanqueidad), conexión de losextremosde la columna al
inyector y al detector (reducción de los espacios muertos). Colocar la
columna bajo un flujo de gasportador [por ejemplo, 0,3 bar (30 kPa)
para una columna de ►C125 m◄de longitud y 0,3 mm de diámetro
interior].
Acondicionar la columna programando el gradiente de temperatura del
horno a 3 ºC/min a partir de la temperatura ambiente hasta alcanzar una
temperatura 10 ºC inferior al límite de descomposición de la fase esta-
cionaria. Mantener el horno a esa temperatura durante 1 hora hasta que
se estabilice la línea de base. Restablecer la temperatura de 180 ºC para
trabajar en condiciones isotérmicas.
Nota6: En el comercio pueden obtenerse columnas adecuadas previa-
mente acondicionadas.
3.1.5. Detector que puede calentarse a una temperatura superior a la de la
columna.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 57
▼B
3.2.Jeringa
Tendrá una capacidad máxima de 10 µl y estará graduada en 0,1 µl.
3.3.Registrador
Si se emplea la curva del registrador para calcular la composición de la
mezcla analizada, se necesita un registrador electrónico de alta preci-
sión compatible con los aparatos utilizados. El registrador deberá tener
las siguientes características:
a) tiempo de repuesta inferior a 1,5 s y, preferiblemente, inferior a 1 s
(el tiempo de repuesta es el tiempo que tarda la pluma registradora
en pasar de 0 a 90 % después de la introducción instantánea de una
señal del 100 %);
b) ancho del papel: 20 cm como mínimo;
c) velocidad del papel: ajustable a valores comprendidos entre 0,4 cm/
min y 2,5 cm/min.
3.4.Integrador
La utilización de un integrador electrónico permite efectuar cálculos
rápidos y precisos. Debe proporcionar una respuesta lineal de sensibi-
lidad adecuada y la corrección de la desviación de la línea de base
debe ser satisfactoria.
4. PROCEDIMIENTO
Las operaciones descritas en los puntos 4.1 a 4.3 sólo son válidas si se
emplea un detector de ionización de llama.
Como alternativa puede emplearse un cromatógrafo de gases con cata-
rómetro (cuyo funcionamiento se basa en el principio de los cambios de
conductividad térmica). En ese caso, las condiciones de ensayo deberán
modificarse como se indica en el punto 6.
4.1.Condicionesdeensayo
4.1.1. Determinación de lascondicionesoperativasóptimas
4.1.1.1. Columna de relleno
Al establecer las condiciones de ensayo deberán tenerse en cuenta las
variables siguientes:
a) longitud y diámetro de la columna;
b) composición y cantidad de la fase estacionaria;
c) temperatura de la columna;
d) flujo del gasportador;
e) resolución exigida;
f) tamaño de la muestra problema, determinado de modo que el
conjunto del detector y el electrómetro dé una respuesta lineal;
g) duración del análisis.
Como norma general, lascifrasde lastablas 1 y 2 permitirán obtener
los resultados deseados, es decir, al menos 2 000 platos teóricos por
metro de longitud de columna en el caso del estearato de metilo, y su
elución en 15 minutosaproximadamente.
Cuando el aparato lo permita, la temperatura del inyector deberá ser de
200 ºC aproximadamente y la del detector deberá ser igual o superior a
la de la columna.
Por lo general, la razón entre la velocidad de flujo del hidrógeno sumi-
nistrado al detector de ionización de llama y la del gas portador oscila
entre 1:2 y 1:1, en función del diámetro de la columna. El flujo del
oxígeno esde 5 a 10 vecess uperior al del hidrógeno.
Tabla1
Diámetro interior de la columna
mmFlujo del gasportador
ml/min
21 5 a 2 5
32 0 a 4 0
44 0 a 6 01991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 58
▼B
Tabla2
Concentración de la fase fija
% (m/m)Temperatura de la columna
ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Columna capilar
Laspropiedadesde eficacia y permeabilidad de lascolumnascapilares
implican que la separación de los constituyentes y la duración del
análisis dependen considerablemente del flujo del gas portador en la
columna. Por lo tanto, para optimizar lascondicionesoperativass erá
necesario manipular este parámetro (o, lo que es más sencillo, la
presión en cabeza de columna) según se desee mejorar las separaciones
o efectuar un análisis rápido.
4.1.2. Determinación del número de platosteóricos(eficacia) y de la res olu-
ción
(Véase la figura 1)
Efectuar el análisis de una mezcla de estearato de metilo y de oleato de
metilo (por ejemplo, ésteres metílicos de manteca de cacao) en propor-
cionesaproximadamente equivalentes .
Escoger la temperatura de la columna y el flujo del gas portador de
manera que el máximo del pico del estearato de metilo se registre apro-
ximadamente 15 minutos después del pico del disolvente. Utilizar una
cantidad suficiente de la mezcla de ésteres metílicos, de manera que el
pico del estearato de metilo se eleve a tres cuartos aproximadamente de
la escala completa.
Calcular el número «n» de platosteóricos(eficacia) mediante la
siguiente fórmula:
n¼16dr1
a1/C20/C21
2
y la resolución «R» mediante la siguiente fórmula:
R¼2∆
a1þa2
siendo:
dr1= distancia en mm, desde el inicio del cromatograma hasta el
máximo del pico del estearato de metilo,
a1ya2= anchura, en mm, de lospicosdel es tearato de metilo y del
oleato de metilo, respectivamente, medida entre los puntos
de intersección de las tangentes en los puntos de inflexión
de la curva con la línea de base,
∆ = dis tancia, en mm, entre losdosmáximosde lospicosdel
estearato de metilo y del oleato de metilo,
y el índice de resolución «lr» mediante la siguiente fórmula:
a
b
siendo:
a = altura del pico máspequeño, medida a partir de la línea de bas e;
b = altura del punto másbajo del valle comprendido entre losdos
picos adyacentes, medida a partir de la línea de base.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 59
▼M2
▼B
Figura1
Cromatograma para determinar el número de platos teóricos (eficacia) y la
resolución
Se establecerán unas condiciones de análisis que permitan obtener almenos2 000 platosteóricospor metro de longitud de columna para el
estearato de metilo y una resolución de 1,25 como mínimo.
4.2.Muestraproblema
Tomar con la jeringa (3.2) de 0,1 µl a 2 µl de la solución de ésteres
metílicospreparadoscon arreglo al Anexo X B e inyectarlosen la
columna.
En el caso de ésteres no disueltos, preparar una solución de 100 mg/ml
aproximadamente en heptano de calidad para cromatografía e inyectar
de 0,1 µl a 1 µl de esta solución.
Si sólo se desean detectar los componentes presentes en cantidades muy
pequeñas, se podrá aumentar el tamaño de la muestra (hasta 10 veces).
4.3.Análisis
Como norma general, las condiciones de ensayo son las que se especi-
fican en el punto 4.1.1.
No obstante, cuando se determinan ácidos con menos de 12 átomos de
carbono espos ible operar a menor temperatura de columna, mientras
que cuando se determinan ácidos grasos con más de 20 átomos de
carbono es posible operar a una temperatura mayor. A veces se puede
utilizar en los dos casos anteriores un sistema de programación de
temperatura. Por ejemplo, si la muestra contiene ésteres metílicos de
ácidos grasos con menos de 12 átomos de carbono, inyectar la muestra
a 100 ºC (o a 50 — 60 ºC si hay ácido butírico) y elevar inmediata-
mente la temperatura a razón de 4 — 8 ºC/min hasta alcanzar el nivel
deseado. En algunos casos es posible combinar ambos procedimientos.
Trasel calentamiento programado, s e continúa la elución a temperatura
constante hasta que todos los componentes se hayen eluido. Si el instru-
mento no puede efectuar un calentamiento programado, se opera a dos
temperaturasfijascomprendidasentre 100 y 195 ºC.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 60
▼B
Si es necesario, se recomienda que se efectúe un análisis con dos fases
fijasde diferente polaridad para comprobar la aus encia de picos
«ocultos», por ejemplo en caso de presencia simultánea de C18:3yC20:0oC18:3yC18:2conjugados.
4.4.Preparacióndelcromatogramaylasgráficasdereferencia
Analizar la mezcla patrón de referencia (2.3) aplicando lasmis mas
condiciones de ensayo que a la muestra y medir los tiempos o las
distancias de retención de los ácidos grasos que la componen. Repre-
sentar gráficamente en papel semilogarítmico, para cualquier grado de
insaturación, el logaritmo del tiempo o de la distancia de retención en
función del número de átomos de carbono. En condiciones isotérmicas,
las gráficas de los ésteres de cadena lineal con el mismo grado de insa-
turación deben formar líneas rectas. Dichas líneas rectas deben ser
aproximadamente paralelas.
Deben evitarse las condiciones que propicien la existencia de «picos
ocultos», es decir, una resolución insuficiente para separar dos compo-
nentes.
5. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS5.1.Análisiscualitativo
Identificar los picos del estearato de metilo de la muestra a partir de los
gráficos citados en el punto 4.4, si es necesario por interpolación.
5.2.Análisiscuantitativo
5.2.1. Determinación de la composición
Salvo en casos excepcionales, utilizar el método de normalización
interna, esdecir, partir del principio de que todosloscomponentesde
la muestra están representados en el cromatograma, de manera que el
total de las áreas situadas debajo de cado pico representa el 100 % de
loscons tituyentes(elución total).
Si el equipo incluye un integrador, utilizar lascifrasque és te propor-
cione. En caso contrario, determinar el área situada debajo de cadapico multiplicando la altura del pico por el ancho a la mitad de la altura
y, cuando sea necesario, tomar en consideración las atenuaciones utili-
zadasdurante el regis tro.
5.2.2. Método de cálculo
5.2.2.1. Caso general
Calcular el contenido de un componente dado (i) (expresado como
porcentaje en masa de ésteres metílicos), mediante la determinación
del porcentaje que representa el área de su pico en relación con la
suma de las áreas de todos los picos, aplicando la fórmula siguiente:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i.
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.
Expresar el resultado con una cifra decimal.
Nota7: En este caso general se considera que el resultado del cálculo
basado en las áreas relativas representa el porcentaje en peso.
Para los casos en que no es válida esta consideración, véase el
punto 5.2.2.2.
5.2.2.2. Utilización de factoresde corrección
En algunos casos, por ejemplo en presencia de ácidos grasos con menos
de 8 átomos de carbono o de ácidos con grupos secundarios, si se
utilizan detectores de conductividad térmica o si es necesario alcanzar
mayor nivel de exactitud, deben aplicarse factores de corrección para
convertir losporcentajesde lasáreasde lospicosen porcentajesen
peso de los componentes.
Determinar losfactoresde corrección con un cromatograma obtenido
del análisis de una mezcla de referencia de ésteres metílicos de compo-1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 61
▼B
sición conocida en condiciones de ensayo idénticas a las empleadas
para el análisis de la muestra.
La fórmula que se aplicará a la muestra de referencia para obtener el
porcentaje en peso del componente i es la siguiente:
mi
Σm/C2100
siendo:
mi= peso del componente i de la muestra de referencia,
Σm = suma de los pesos de los diversos componentes de la muestra
de referencia.
A partir del cromatograma de la muestra de referencia (4.4) calcular el
porcentaje (área/área) del componente i del siguiente modo:
Ai
ΣA/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i,
ΣA: suma de las áreas de todos los picos.
El factor de corrección se calcula del siguiente modo:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Por lo general, los factores de corrección se expresan con relación a
KC16, de modo que los factores relativos se convierten en lo siguiente:
K0
i¼Ki
KC16
En la muestra, el contenido de cada componente i, expresado como
porcentaje en peso de los ésteres metílicos, es el siguiente:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Expresar los resultados con una cifra decimal.
5.2.2.3. Utilización de patrón interno
En algunos análisis (por ejemplo, cuando no se cuantifican todos los
ácidos grasos por estar presentes simultáneamente ácidos de 4 y 6
átomosde carbono y ácidosde 16 y 18 átomosde carbono, o cuando
es necesario determinar la cantidad absoluta de un ácido graso en la
muestra) es preciso utilizar un patrón interno. Se emplean con
frecuencia ácidosgras osde 5, 15 o 17 átomosde carbono. Debe deter-
minarse, si es necesario, el factor de corrección del patrón interno.
El porcentaje en peso del componente i, expresado como ésteres
metílicos, se calcula mediante esta fórmula:
mp/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
p/C2Ap/C2100
siendo:
Ai: área del pico correspondiente al componente i.
Ap: área del pico correspondiente al patrón interno.
K′i: factor de corrección del componente i (con relación a KC16).
K′p: factor de corrección del patrón interno (con relación a KC16).
m: peso, en mg, de la muestra.m
p: peso, en mg, del patrón interno.
Expresar los resultados con una cifra decimal.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 62
▼M2
6. CASO ESPECIAL DE DETERMINACIÓN DE LOS ISÓMEROS
TRANS
Es posible determinar el contenido de isómeros trans de los ácidos
grasos con un número de átomos de carbono comprendido entre 10 y
24 por separación de los ésteres metílicos, utilizando columnas croma-
tográficascapilarescon una polaridad es pecial.
6.1. Columna capilar de silicio de un diámetro interno comprendido entre
0,25 mm y 0,32 mm y de 50 m de longitud, recubierta de una capa de
cianopropisilicona de un espesor comprendido entre 0,1 y 0,3 µm (tipo
SP 2340, tipo SP 2380, C.P. sil 88, Silor 10 o similar).
6.2. Los ésteres metílicos se preparan según el procedimiento B descrito en
el Anexo X «B». Las materias grasas con una acidez libre superior al
3 % deben neutralizarse previamente con arreglo al punto 6.1 del
Anexo VII.
6.3. Lascondicionesgeneralesde trabajo para la cromatografía en fas e
gaseosa son las siguientes:
— temperatura de la columna programada de 150º a 230 ºC (por
ejemplo, 165 ºC durante 15 minutosy a continuación un aumento
de 5 ºC por minuto hasta alcanzar 200 ºC),
— temperatura del inyector: 250 ºC si se utiliza el sistema de inyector
divisor o la temperatura inicial de la columna si se emplea el
sistema «on column»,
— temperatura del detector: 260 ºC,
— flujo del gasvector (helio e hidrógeno): 1,2 ml/minuto.
La cantidad inyectada debe ser tal que, en las condiciones de sensibi-
lidad empleadas, la altura del pico correspondiente al éster metílico
del ácido araquídico sea igual o superior al 20 % del fondo de escala.
6.4. La identificación de los diversos ésteres metílicos se efectúa compa-
rando lostiemposde retención con losde lasmezclasde referencia
(tal y como se indica en el punto 2.3).
Los ésteres de los ácidos grasos trans son eluidos antes que los
isómeros cis correspondientes. En la figura 2 se presenta un ejemplo
de cromatograma.
Figura2
Cromatograma de gases tipo relativo a la determinación de los isómeros trans
delosácidosgrasosconcolumnacapilar
6.5. La eficacia de la columna determinada con arreglo al punto 4.1.2
deberá permitir una separación, con un índice de resolución superior a1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 63
▼M2
2, de determinadasparejascríticas , como la formada por el grupo de los
ácidos transisoleicos y el pico del ácido oleico (trans C18:1/cis C18:1).
6.6. La proporción de los diversos ácidos grasos trans se calcula estable-
ciendo la relación entre la superficie del pico correspondiente y la
suma de las superficies de todos los picos presentes.
Se toman en cons ideración losporcentajesde losácidos :
— transoctadecenoicos(T 18:1), que en el Anexo I del pres ente
Reglamento figuran como tal de isómeros transoleicos,
— cis-trans y trans-cis octadecadienoicos [(CT/TC) 8:2], que en el
Anexo I del presente Reglamento figuran como tal de isómeros
translinoleicos,
— trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis octadecatrie-
noicos[(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], que en el Anexo I del
presente Reglamento figuran como total de isómeros translinolé-
nicos.
Nota8: Teniendo en cuenta las características particulares de este
método, los resultados deben darse con dos decimales.
►M27.◄CASO ESPECIAL DE UTILIZACIÓN DE UN CATARÓMETRO
(FUNCIONAMIENTO BASADO EN EL PRINCIPIO DE LOS
CAMBIOS DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA)
Para la determinación de la composición cualitativa y cuantitativa de
una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos también podrá utili-
zarse un cromatógrafo de gases provisto de un detector cuyo
funcionamiento se base en el principio de los cambios de conductividad
térmica (catarómetro). En ese caso, las condiciones establecidas en los
puntos 3 y 4 deberán modificarse como se indica en la tabla 3.
Para el análisis cuantitativo, utilizar los factores de corrección definidos
en el punto 5.2.2.2.
Tabla3
Variable Valor/condición
Columna Longitud: 2 a 4 m
Diámetro interior: 4 mm
Soporte Tamaño de grano entre 160 y
200 µm
Concentración de la fase estacio-
nariaDe 15 % a 25 % (m/m)
Gasportador Helio o, en s u defecto, hidrógeno,
con el menor contenido de
oxígeno posible
Gases auxiliares Ninguno
Temperatura del inyector De 40 a 60 ºC másque la de la
columna
Temperatura de la columna De 180 a 200 ºC
Flujo del gasportador Normalmente entre 60 y 80 ml/
min
Tamaño de la muestra problema
inyectadaNormalmente entre 0,5 y 2 µl
►M28.◄INFORME DEL ANÁLISIS
En el informe del análisis se expondrán los métodos utilizados para la
preparación de los ésteres metílicos y para la realización del análisis
mediante cromatografía de gases, así como los resultados obtenidos.
Se mencionarán, asimismo, cualesquiera procedimientos de trabajo que
no se especifiquen en la presente norma internacional o que se consi-
deren facultativos, así como toda circunstancia que pueda haber
influido en los resultados.
El informe del análisis incluirá todos los datos necesarios para la
completa identificación de la muestra.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 64
▼B
▼M19
ANEXOX«B»
PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS
GRASOS DEL ACEITE DE OLIVA Y DEL ACEITE DE ORUJO DE
OLIVA
Se recomiendan losdosmétodoss iguientespara la preparación de losés teres
metílicosde losácidosgras osde losaceitesde oliva y de losaceitesde orujo
de oliva.
Método A: Transesterificación en frío con una solución metanólica de hidró-
xido potásico.
Método B: Metilación en caliente con una solución metanólica de metilato de
sodio, seguida de esterificación en medio ácido.
Se aplicará uno u otro método según el parámetro analítico que se vaya a deter-
minar y dependiendo de la categoría de aceite, tal como se indica a
continuación:
a) Determinación del ∆ECN42 (diferencia entre el contenido real y el contenido
teórico en triglicéridoscon ECN42):
— El método A se aplicará a las muestras de aceites de todas las categorías
traspurificación del aceite pas ándolo a travésde una columna de gel de
sílice.
b) Determinación de la composición de ácidos grasos
— El método A se aplicará directamente a las muestras de aceites de las
siguientes categorías:
— aceitesde oliva vírgenescon una acidez libre inferior al 3,3 %,
— aceite de oliva refinado,— aceite de oliva (mezcla de aceitesde oliva vírgenesy de aceite de
oliva refinado),
— aceite de orujo de oliva refinado,— aceite de orujo de oliva (mezcla de aceitesde oliva vírgenesy de
aceite de orujo de oliva refinado).
— El método B se aplicará directamente a las muestras de aceites de las
siguientes categorías:
— aceite de oliva virgen con una acidez libre superior al 3,3 %,
— aceite de orujo de oliva crudo.
c) Determinación de losis ómeros transde losácidosgras os
— El método A se aplicará directamente a las muestras de aceites de las
siguientes categorías:
— aceitesde oliva vírgenescon una acidez libre inferior al 3,3 %,
— aceite de oliva refinado,— aceite de oliva (mezcla de aceitesde oliva vírgenesy de aceite de
oliva refinado),
— aceite de orujo de oliva refinado,
— aceite de orujo de oliva (mezcla de aceitesde oliva vírgenesy de
aceite de orujo de oliva refinado).
— El método A se aplicará a las muestras de aceite de las categorías
siguientes tras purificación del aceite pasándolo a través de una columna
de gel de sílice:
— aceite de oliva virgen con una acidez libre superior al 3,3 %,
— aceite de orujo de oliva crudo.
PURIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS DE ACEITE
Cuando proceda, las muestras se purificarán pasando el aceite a través de una
columna de gel de sílice, utilizando como disolvente de elución hexano/éter
dietílico (87: 13, v/v) tal como se describe en el método IUPAC 2.507.
Como procedimiento alternativo puede recurrirse a la extracción en fase sólida
utilizando cartuchos de gel de sílice. Se coloca un cartucho de gel de sílice (1 g,
6 ml) en un aparato de elución en vacío, se lava con 6 ml de hexano y se deja
de aplicar el vacío para evitar que se seque la columna. A continuación se intro-
duce en la columna una solución de aceite (0,12 g aproximadamente) en 0,5 ml
de hexano y se aplica el vacío para que la solución se introduzca en la sílice;
después se eluye con 10 ml de hexano/éter dietílico (87: 13 v/v) en vacío. Se
homogeneiza la totalidad de los eluidos y se divide en dos alícuotas similares.
Una alícuota se evapora hasta sequedad en un evaporador rotatorio a presión
reducida y a temperatura ambiente. El residuo se disuelve en 1 ml de heptano1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 65
▼M19
y la solución queda lista para el análisis de ácidos grasos por CG. La segunda
alícuota se evapora y el residuo se disuelve en 1 ml de acetona para el análisis
de los triglicéridos mediante HPLC si es necesario.
MÉTODOS PARA LA PREPARACIÓN DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE
LOS ÁCIDOS GRASOS
1. Método A: Transesterificación en frío con una solución metanólica de
hidróxido potásico
1.1.Ámbitodeaplicación
Es te método rápido esaplicable a losaceitesde oliva y a losaceitesde
orujo de oliva con un contenido en ácidosgras oslibresinferior al 3,3 %.
El hidróxido potásico no produce la esterificación de los ácidos grasos
libres. Los ésteres etílicos de los ácidos grasos se transesterifican más
lentamente que los glicéridos y puede que sólo se metilen parcialmente.
1.2.Principio
Los ésteres metílicos se forman por transesterificación con una solución
metanólica de hidróxido potásico como fase intermedia antes de que se
produzca la saponificación (punto 5 del método ISO 5509: 2000, punto
5 del método IUPAC 2.301).
1.3.Reactivos
Metanol con un contenido en agua igual o inferior al 0,5 % (m/m).Heptano para cromatografía.Hidróxido potásico, solución metanólica 2 N aproximadamente:
disolver 11,2 g de hidróxido potásico en 100 ml de metanol.
1.4.Material
Tubos de rosca (5 ml de volumen) con tapón provisto de junta de PTFEPipetasaforadaso automáticasde 2 ml y 0,2 ml.
1.5.Procedimiento
En un tubo de rosca de 5 ml pesar aproximadamente 0,1 g de la
muestra de aceite. Añadir 2 ml de heptano y agitar. Añadir 0,2 ml de
la solución metanólica 2 N de hidróxido potásico, poner el tapón
provisto de junta de PTFE, cerrar bien y agitar enérgicamente durante
30 segundos. Dejar reposar hasta que la parte superior de la solución
quede clara. Decantar la capa superior, que es la que contiene los
ésteres metílicos. La solución de heptano está lista para inyectarse en
el cromatógrafo. Es aconsejable mantener la solución en el frigorífico
hasta el momento de realizar el análisis cromatográfico. No se reco-
mienda guardar la solución durante más de 12 horas.
2. Método B: Metilación en caliente con una solución metanólica de
metilato de sodio, seguida de esterificación en medio ácido
2.1.Ámbitodeaplicación
Es te método esaplicable a losaceitesde oliva y a losaceitesde orujo
de oliva con un contenido en ácidos grasos libres superior al 3,3 %.
2.2.Principio
Neutralización de losácidosgras oslibresy metanólis isalcalina de los
glicéridos, seguida de esterificación de los ácidos grasos en medio ácido
(punto 4.2 del método IUPAC n
o2.301).
2.3.Reactivos
— Heptano para cromatografía,
— Metanol con un contenido en agua igual o inferior al 0,05 % (m/m),— Metilato de sodio, solución metanólica 0,2 N: disolver 5 g de sodio
en 1 000 ml de metanol (puede prepararse a partir de soluciones
comerciales),
— Fenolftaleína, 0,2 % solución metanólica,1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 66
▼M19
— Ácido sulfúrico, en solución metanólica 1 N: añadir 3 ml de ácido
sulfúrico al 96 % a 100 ml de metanol,
— Solución saturada de cloruro sódico en agua.
2.4.Material
— Matraz aforado de 50 ml, con fondo plano y cuello esmerilado largo
y estrecho,
— Refrigerante de reflujo: refrigerante de aire (de 1 m de longitud) con
junta esmerilada,
— Perlaspara regular la ebullición,
— Embudo de cristal.
2.5.Procedimiento
Poner 0,25 g de la muestra de aceite en un matraz aforado de 50 ml,
con cuello esmerilado. Con ayuda del embudo, añadir 10 ml de la solu-
ción metanólica de metilato de sodio 0,2 N y las perlas para regular la
ebullición. Acoplar el refrigerante de reflujo, agitar y llevar a ebulli-
ción. La solución debería quedar límpida al cabo de unos 10 minutos.
La reacción está terminada prácticamente a los 15 minutos. Retirar elmatraz de la fuente de calor, esperar hasta que pare el reflujo, quitar
el refrigerante y añadir dosgotasde la s olución de fenolftaleína. Añadir
unos mililitros de ácido sulfúrico en solución metanólica 1 N hasta que
la solución quede incolora y, a continuación, añadir un exceso de 1 ml.
Colocar el refrigerante y volver a llevar a ebullición durante unos20
minutos. Retirar el matraz de la fuente de calor y enfriarlo en chorro
de agua. Quitar el refrigerante, añadir 20 ml de la solución saturada de
cloruro sódico y agitar. Añadir 5 ml de heptano, tapar el matraz y agitar
enérgicamente durante 15 segundos.
Dejar reposar hasta que las dos fases se separen completamente. Añadir
de nuevo solución saturada de cloruro sódico hasta que la fase acuosa
alcance la parte inferior del cuello del matraz. La capa superior, que se
encuentra en el cuello del matraz, esla que contiene losés teres
metílicos. Esta solución está lista para inyectarse en el cromatógrafo
de gases.
Precaución: La metilación con el método B debe realizarse en campana
extractora.
2.6.AlternativasalametilaciónsegúnelMétodoB
2.6.1.MétodoC
2.6.1.1. Principio
La materia grasa analizada se trata con solución metanólica de ácido
clorhídrico, en una ampolla cerrada, a 100 ºC.
2.6.1.2. Material
— Ampolla de cristal grueso con una capacidad de unos 5 ml (altura
de 40 a 45 mm, diámetro de 14 a 16 mm).
— Pipetasaforadasde 1y2m l .
2.6.1.3. Reactivos
Solución de ácido clorhídrico en 2 % de metanol, preparada a partir de
ácido clorhídrico gaseoso y metanol anhidro (nota 1).
Hexano para cromatografía.
Nota1: Pueden emplearse soluciones comerciales de cloruro de hidró-
geno en metanol. En el laboratorio pueden prepararse
fácilmente pequeñas cantidades de ácido clorhídrico gaseoso
por simple desplazamiento de la solución comercial (p = 1,18),
añadiendo algunasgotasde ácido s ulfúrico concentrado. Comoel metanol muestra mucha avidez por el ácido clorhídrico, se
aconseja tomar las precauciones necesarias para la disolución
(por ejemplo, introducir el gasa travésde un pequeño embudo
invertido cuyo borde roce la superficie del metanol). Pueden
prepararse con antelación grandes cantidades de solución meta-
nólica de ácido clorhídrico, ya que se conserva en perfectas
condiciones en la oscuridad dentro de frascos con tapones de
vidrio. Este reactivo puede asimismo prepararse disolviendo
cloruro de acetilo en metanol anhidro.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 67
▼M19
2.6.1.4. Procedimiento
— Colocar en la ampolla de cristal 0,2 g de la materia grasa, previa-
mente desecada en sulfato de sodio y filtrada, y 2 ml de la
solución metanólica de ácido clorhídrico. Cerrar la ampolla.
— Sumergir la ampolla a 100 ºC durante 40 minutos.— Enfriar la ampolla en chorro de agua, abrirla y añadir 2 ml de agua
destilada y 1 ml de hexano.
— Centrifugar y extraer la fase del hexano, que estará lista para ser
utilizada.
2.6.2.MétodoD
2.6.2.1. Principio
La materia grasa analizada se calienta a reflujo con metanol, hexano y
ácido sulfúrico. Los ésteres metílicos obtenidos se extraen con éter de
petróleo.
2.6.2.2. Material
— Tubo de ensayo de unos 20 ml de capacidad, con refrigerante de
reflujo de aire de aproximadamente 1 m de longitud, con junta
esmerilada.
— Pipeta aforada de 5 ml.
— Ampolla de decantación de 50 ml.— Probetasde 10 ml y 25 ml.— Tubo de ensayo de fondo cónico de 15 ml.
2.6.2.3. Reactivos
— Reactivo de metilación: metanol anhidro, hexano y ácido sulfúrico
concentrado (p = 1,84) en la siguiente proporción: 75:25:1 (v/v/v).
— Éter de petróleo 40-60 ºC.— Sulfato sódico anhidro.
2.6.2.4. Procedimiento
Introducir 0,1 g de aceite en el tubo de 20 ml y añadir 5 ml del reactivo
de metilación.
Acoplar el refrigerante de reflujo y calentar al baño María en ebullición
durante 30 minutos(nota 2).
Pasar cuantitativamente la mezcla a una ampolla de decantación de
50 ml con 10 ml de agua destilada y 10 ml de éter de petróleo. Agitar
enérgicamente y esperar a que se produzca la separación de las fases.
Separar la fase acuosa y lavar dos veces la capa etérea con 20 ml de
agua destilada. Añadir a la ampolla de decantación una pequeña
cantidad de sulfato sódico anhidro, agitar, dejar reposar unos minutos
y filtrar, recogiendo el filtrado en un tubo de fondo cónico de 15 ml.
Evaporar el disolvente al baño María haciendo pasar una corriente de
nitrógeno.
Nota2: Para controlar la ebullición, introducir una varita de vidrio en
el tubo y limitar la temperatura del baño María a 90 ºC.
3. Parámetros de precisión
La evaluación estadística de la precisión de los métodos A y B ha sido
publicada por el Consejo Oleícola Internacional en su método COI/
T.20/Doc. n
o24.
RECOMENDACIONES PARA EL ANÁLISIS MEDIANTE CROMATO-
GRAFÍA DE GASES DE LOS ÉSTERES DE LOS ÁCIDOS GRASOS DEL
ACEITE DE OLIVA Y DEL ACEITE DE ORUJO DE OLIVA
1. Procedimiento
El análisis mediante cromatografía de gases de soluciones de ésteres
grasos en hexano se realizará según la norma ISO 5508, utilizando una
columna capilar (50 m de longitud × 0,25 o 0,32 mm de diámetro inte-
rior) impregnada con cianopropilsilicona, tal como se indica para la
determinación de losis ómeros transde losácidosgras os(COI/T.20/
Doc. no17).
En la figura 1 se presenta el perfil cromatográfico típico de un aceite de
orujo de oliva que contiene ésteres metílicos y etílicos de ácidos grasos
e isómerostransde ésteres metílicos.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 68
▼M19
2. Cálculos
2.1. Para calcular la composición en ácidos grasos y el ∆ECN42, se han de
tener en cuenta los siguientes ácidos grasos:
Mirístico (C14:0).
Palmítico (C16:0). Suma de lasáreasde lospicoscorres pondientesa
los ésteres metílicos y etílicos.
Palmitoleico (C16:1). Suma de lasáreasde lospicoscorres pondientesa
losis ómeros ω9yω7del éster metílico.
Heptadecanoico (C17:0).
Heptadecenoico (C17:1).
Esteárico (C18:0).Oleico (C18:1). Suma de lasáreasde lospicoscorres pondientesa los
isómeros ω9yω7del éster metílico, del éster etílico y de los isómeros
transdel éster metílico.
Linoleico (C18:2). Suma de lasáreasde lospicoscorres pondientesa
losés teresmetílicosy etílicosy a losis ómeros transdel éster metílico.
Araquídico (C20:0).
Linolénico (C18:3). Suma de lasáreasdel és ter metílico y de los
isómerostransdel éster metílico.
Eicosenoico (C20:1).
Behénico (C22:0).
Lignocérico (C24:0).El escualeno no se tiene en cuenta para calcular el área total.
2.2. Para calcular el porcentaje de trans-C18:1 se utilizará el pico corres-
pondiente a los ésteres metílicos de este ácido graso. Para la suma
[trans-C18:2 +trans-C18:3], se sumarán todos los picos correspon-
dientesa losis ómeros transde estos dos ácidos grasos. Para calcular
el área total se tendrán en cuenta todos los picos mencionados en 2.1
(véase COI/T.20/Doc. n
o17).
El cálculo del porcentaje de cada ácido graso se efectuará según la
siguiente fórmula:
% X = (Área X × 100)/(área total)1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 69
▼M19
Figura 1: Perfil cromatográfico de un aceite de orujo de oliva, obtenido con el
método de metilación en frío. Lospicoscromatográficoscorres ponden a los
ésteres metílicos, excepto aquellos en que se indica otra cosa.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 70
▼B
ANEXOXI
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN ►C1 DISOLVENTES ◄
HALOGENADOSVOLÁTILESENELACEITEDEOLIVA
1. PRINCIPIO DEL MÉTODO
Análisis por cromatografía en fase gaseosa según la técnica del espacio de
cabeza(headspace) .
2. EQUIPO
2.1. Cromatografía de gases con detector de captura de electrones (ECD).
2.2. Equipo para espacio de cabeza (headspace) .
2.3. Columna de cromatografía en fase gaseosa de vidrio de 2 metros de largo y
2 mm de diámetro, fase estacionaria.
OV 101 al 10 % impregnado en cromosorb W-AW-DMCS (tierra de diato-
meas calcinada lavada con ácido y silanizado (80—100 Mesh).
2.4. Gasportador y gasauxiliar: nitrógeno para cromatografía de gas esde
pureza adecuada para la detección por captura de electrones.
2.5. Frascos de cristal de 10 a 15 ml provistos de septum de teflón y con una
cápsula de aluminio con un orificio para toma de muestras con jeringa.
2.6. Pinzascaps uladora para cerrar herméticamente.2.7. Jeringa para gases de 0,5 y 2 ml.
3. REACTIVOS
►
C1Disolventes ◄halogenados con una pureza apropiada para su uso
en cromatografía en la fase gaseosa.
4. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
4.1. Pesar con exactitud unos 3 g de aceite en un frasco de cristal (no reutili-
zable), tapar el frasco de manera que quede cerrado herméticamente.
Introducir el frasco en un baño con termostato a 70 ºC durante 1 hora.
Extraer con precisión, por medio de una jeringa, un volumen de 0,2 a
0,5 ml del espacio de cabeza. Inyectarlo en la columna del cromatógrafo
de gases con las siguientes condiciones:
temperatura inyector: 150 ºC
temperatura columna: 70—80 ºC
temperatura detector: 200—250 ºC
Podrán utilizarse otras temperaturas siempre que los resultados sean equiva-
lentes.
La inyección se puede realizar con el equipo para espacio de cabeza.
4.2. Solucionesde referencia. Preparar s olucionespatrón utilizando aceite de
oliva refinado sin trazas de ►C1disolventes ◄con concentracionesen
hidrocarburoshalogenadosde 0,05 a 1 ppm (mg/kg) s egún el contenido
supuesto de la muestra. Para preparar la solución de referencia, si es nece-
sario diluir previamente el hidrocarburo halogenado patrón, puede utilizarse
pentano.
4.3. Cuantificación. Se efectúa por cálculo mediante la relación de áreaso
alturas del pico de la muestra y de la solución patrón cuya concentración
sea la más próxima a la de la muestra. Si la desviación es superior al
10 %, será necesario volver a hacer el análisis, comparándolo con una
nueva solución patrón de concentración tal que se ajuste a la desviación
relativa antes mencionada. El contenido se establecerá efectuando la media
de variasinyecciones .
4.4. Expresión de los resultados. Los resultados se expresarán en ppm (mg/kg).
El límite de detección del método esde 0,01 mg/kg.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 71
▼M19
ANEXOXII
VALORACIÓN ORGANOLÉPTICA DE LOS ACEITES DE OLIVA
VÍRGENES
1. OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN
El presente método tiene por finalidad establecer los criterios necesarios
para la valoración de lascaracterís ticasorganolépticasdel aceite de oliva
virgen según se define en el punto 1 del anexo del Reglamento no136/66/
CEE, y describir las normas para su clasificación en ese sentido.
El método descrito sólo es aplicable a la clasificación de los aceites de
oliva vírgenes, en función de la existencia del atributo «frutado» y de la
intensidad de los defectos, determinados por un grupo de catadores selec-
cionados y entrenados, constituido en panel de conformidad con el punto 4.
2. ASPECTOS GENERALES
Para el vocabulario general de base, la sala de degustación, la metodología
general y la copa de cata de los aceites, se recomienda ajustarse a las pres-
cripcionesdel Cons ejo Oleícola Internacional.
3. VOCABULARIO ESPECÍFICO3.1.Atributospositivos
Frutado : conjunto de sensaciones olfativas, dependientes de la variedad de
oliva y características del aceite procedente de frutos sanos y frescos,
verdes o maduros, percibido por vía directa o retronasal.
Amargo : gusto característico del aceite obtenido a partir de las aceitunas
verdeso en envero.
Picante : sensación táctil de picor, característica de los aceites producidos
en inicio de campaña, principalmente de aceitunastodavía verdes .
3.2.Atributosnegativos
Atrojado : flavor característico del aceite obtenido a partir de aceitunas
amontonadasen avanzado grado de fermentación anaerobia.
Moho-humedad : flavor característico del aceite obtenido a partir de acei-
tunas en las que se han desarrollado abundantes hongos y levaduras por
haber permanecido almacenadascon humedad durante variosdías .
Borras: flavor característico del aceite que ha permanecido en contacto con
los lodos de decantación en trujales y depósitos.
Avinado-avinagrado : flavor característico de determinados aceites que
recuerda al vino o el vinagre. Se debe fundamentalmente a un proceso de
fermentación de lasaceitunasque da lugar a la formación de ácido acético,
acetato de etilo y etanol.
Metálico : flavor que recuerda a los metales, característica del aceite que ha
permanecido mucho tiempo en contacto con superficies metálicas durante
los procesos de molienda, batido, prensado o almacenamiento.
Rancio: flavor de los aceites que han sufrido un proceso de oxidación.
Cocido o quemado : flavor característico de los aceites, originada por un
calentamiento excesivo y/o prolongado durante su obtención, especialmente
durante el termobatido de la pasta, si éste se ha realizado en condiciones
térmicasinadecuadas .
Heno-madera : flavor característico de determinados aceites procedentes de
aceitunas secas.
Basto: sensación buco-táctil densa y pastosa producida por algunos aceites.
Lubricante : flavor que recuerda al del gasóleo, la grasa o el aceite mineral.
Alpechín : flavor adquirido por el aceite como consecuencia de un contacto
prolongado con lasaguasde vegetación.
Salmuera : flavor del aceite obtenido a partir de aceitunascons ervadasen
salmuera.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 72
▼M19
Esparto : flavor característico del aceite obtenido a partir de aceitunas pren-
sadas en capachos nuevos de esparto. Puede ser diferente según se trate de
capachos fabricados con esparto verde o con esparto seco.
Tierra: flavor del aceite obtenido a partir de aceitunasrecogidascon tierra,
embarradasy no lavadas .
Gusano : flavor del aceite obtenido a partir de aceitunasfuertemente
atacadaspor larvasde la mos ca del olivo ( BactroceraOleae ).
Pepino: flavor del aceite característico de un envasado hermético excesiva-
mente prolongado, especialmente en recipientes de hojalata, que se atribuye
a la formación de 2-6 nonadienal.
4. PANEL DE CATADORES
El panel deberá ser nombrado por el Estado miembro y componerse de un
jefe de panel y un número de catadorescomprendido entre ocho y doce. No
obstante, el número de catadores para la campaña 2001/02 podrá ser infe-
rior a ocho.
El jefe del panel deberá haber recibido una sólida formación y ser un
avezado experto en los diferentes tipos de aceite de oliva. Será responsable
del panel, de su organización y funcionamiento y de la preparación, codifi-
cación y presentación de las muestras a los catadores, así como de la
compilación de los datos y su tratamiento estadístico.
El jefe del panel seleccionará a los catadores y supervisará su entrena-
miento y actuación profesional para garantizar que se mantienen en un
nivel de aptitud adecuado.
Loscatadoresde loscontrolesorganolépticosdel aceite de oliva deberán
ser seleccionados y entrenados en función de su habilidad para distinguir
entre muestras similares, conforme a lo establecido en la guía del Consejo
Oleícola Internacional para la selección, entrenamiento y control de los
catadorescualificadosde aceite de oliva virgen.
Lospanelesdeberán comprometers e a participar en lasvaloracionesorga-
nolépticasque s e programen en el ámbito nacional, comunitario o
internacional para el control periódico y la armonización de loscriterios
de percepción. Además, deberán presentar anualmente al Estado miembro
interesado toda la información que éste solicite sobre la composición del
panel e indicarle el número de valoracionesque hayan realizado en calidad
de panel autorizado.
5. PROCEDIMIENTO DE VALORACIÓN ORGANOLÉPTICA Y CLASIFI-
CACIÓN
5.1.Utilizacióndelafichadecataporelcatador
En el apéndice A del presente método figura el modelo de ficha de cata
que deben emplear loscatadores .
Cada uno de loscatadoresintegrantesdel panel deberá oler y, acto s eguido,
degustar (1) el aceite sometido a valoración, contenido en la copa de cata,
con el fin de analizar las percepciones olfativas, gustativas, táctiles y
quinestésicas. A continuación, deberá consignar en la ficha de cata que se
pondrá a su disposición la intensidad con la que percibe cada uno de los
atributos negativos y positivos.
En caso de que se perciban atributos negativos no indicados en la ficha de
cata, deberán consignar en el apartado «Otros», empleando los términos
que los describan con mayor precisión de entre los definidos en el punto
3.2 del presente método.
5.2.Utilizacióndelosdatosporeljefedepanel
El jefe de panel deberá recoger lasfichasde cata cumplimentadaspor cada
uno de los catadores, controlar las intensidades atribuidas, y, si comprueba
alguna anomalía, solicitar al catador que revise su ficha de cata y, en caso
necesario, que repita la prueba.
El jefe de panel puede introducir losdatosde cada catador en un programa
informático conforme al método de cálculo estadístico de la mediana indi-
cado en el apéndice B. La introducción de datospara cada mues tra deberá
realizarse mediante una matriz compuesta de diez columnas correspon-1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 73
(1) Podrá abstenerse de la degustación cuando aprecie algunos atributos negativos suma-
mente intensos, circunstancia excepcional que deberá indicar en la ficha de cata.
▼M19
dientes a los diez atributos sensoriales y de n líneas correspondientes a los
n miembrosdel panel de cata.
Cuando al menosel 50 % del panel ins criba un atributo negativo en el
apartado «Otros», el jefe de panel deberá proceder al cálculo de la mediana
de este atributo y a la clasificación correspondiente.
En el caso de los análisis efectuados a propósito de los controles de confor-
midad con las normas o de los análisis contradictorios, el jefe de panel
deberá ordenar que se proceda a la valoración organoléptica del aceite por
triplicado, con al menosun día de intervalo entre cada prueba; la mediana
de losatributoss e calculará a partir del conjunto de datosde lasfichasde
cata de lastrespruebas .
5.3.Clasificacióndelosaceites
El aceite se clasifica bajo las denominaciones que se indican más adelante,
en función de la mediana de losdefectosy de la mediana del atributo
«frutado». Por mediana de losdefectoss e entiende la mediana del atributo
negativo percibido con mayor intensidad. El valor del coeficiente de varia-
ción sólido para ese atributo negativo debe ser inferior o igual al 20 %.
a)Aceitedeolivavirgenextra : la mediana de losdefectosesigual a 0 y la
del atributo «frutado» superior a 0.
b)Aceitedeolivavirgen : la mediana de losdefectosess uperior a 0 e infe-
rior a igual a 2,5 y la del atributo «frutado» superior a 0.
c)Aceite de oliva virgen corriente : la mediana de losdefectosess uperior
a 2,5 e inferior o igual a 6,0, o bien, la mediana de losdefectosesinfe-
rior o igual a 2,5 y la del atributo «frutado» igual a 0.
d)Aceite de olivavirgen lampante : la mediana de losdefectosess uperior
a 6,0.
No obstante, a partir del 1 de noviembre de 2003, las categorías c) y d)
quedan sustituidas por la siguiente categoría única:
c)Aceitedeolivalampante : la mediana de losdefectosess uperior a 2,5, o
bien, la mediana de losdefectosesinferior o igual a 2,5 y la del atributo
«frutado» esigual a 0.
5.4.Casosparticulares
Cuando la mediana de los atributos positivos distintos de «frutado» sea
superior a 5,0, el jefe de panel consignará tal extremo en el certificado de
análisis del aceite.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 74
▼M19
APÉNDICEA
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 75
▼M19
APÉNDICEB
MÉTODO DE CÁLCULO DE LA MEDIANA Y DE LOS INTERVALOS DE
CONFIANZA
Mediana
La mediana esla cifra real Xm caracterizada por el hecho de que la probabi-
lidad (P) de que los valores de la distribución (X) sean inferiores a esa cifra
(Xm) esinferior o igual a 0,5, y de que, s imultáneamente, la probabilidad (P)
de que los valores de la distribución (X) sean inferiores o iguales a Xm es supe-
rior o igual a 0,5. Otra definición considera la mediana como el percentil 50 de
una distribución de cifras ordenadas de forma creciente. En otros términos, la
mediana representa el valor central de una serie ordenada de cifras impares, o
bien la media de los dos valores centrales de una serie ordenada de cifras pares.
Desviacióntípicasólida
Para obtener una estimación fiable de la variabilidad que se produce en torno a
la mediana, es preciso referirse a la estimación de la desviación típica sólida de
Stuart y Kendall. La fórmula de la desviación típica asintótica depende de N e
IQR. N esel número de obs ervacionese IQR el rango intercuartílico, esdecir,
la estimación sólida de la variabilidad de los datos considerados (el rango inter-
cuartílico encierra exactamente el 50 % de los casos de una distribución
cualquiera de probabilidad). Para determinar el rango intercuartílico se calcula
la dimensión de la desviación entre los percentiles 75 y 25.
IQR = percentil 75 - percentil 25
El percentil esel valor Xpc caracterizado por el hecho de que la probabilidad
(P) de que los valores de la distribución sean inferiores a Xpc es inferior o igual
a una centésima determinada, y de que, simultáneamente, la probabilidad (P) de
que los valores de la distribución sean inferiores o iguales a Xpc es superior o
igual a dicha centésima. La centésima indica la fracción de distribución esco-
gida. En el caso de la mediana, ésta es igual a 50/100.
En otras palabras, el percentil es el valor de distribución que corresponde a un
área determinada, trazada a partir de la curva de distribución o de densidad. Por
ejemplo, el percentil 25 representa el valor de distribución correspondiente a un
área igual a 0,25 o 25/100.
Coeficientedevariaciónsólidoen%
El CVR esuna cifra pura, esdecir, carente de dimens ión, que indica el porcen-
taje de variabilidad de la serie de cifras analizadas en relación con el valor Me
de la mediana; por ese motivo, este coeficiente resulta muy útil a la hora de
comprobar la fiabilidad de losmiembrosdel panel de cata.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 76
▼M19
Intervalosdeconfianzaal95%sobrelamediana
Losintervalosde confianza (IC) al 95 % (valor del error de primera es pecie
igual a 0,05, o 5 %) constituyen el intervalo dentro del que podría variar el valor
de la mediana en la hipótesis de que fuera posible repetir la experiencia un
número infinito de veces. En la práctica, este intervalo indica el intervalo de
variabilidad de la prueba en las condiciones fijadas, en la hipótesis de que el
ensayo pueda repetirse varias veces. Al igual que el CVR, el intervalo contri-
buye a evaluar la fiabilidad de la prueba.
I C. Superior = Me + (c.S)
I. C. Inferior = Me - (c.S)
Donde c, en el caso del intervalo de confianza a 0,95, es igual a 1,96.
La clasificación se efectúa mediante la comparación de los valores de la
mediana con losintervalosde referencia es tablecidosen el punto 5.3 del
método. El programa informático permite visualizar la clasificación en un
cuadro de datos estadísticos o en un gráfico.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 77
▼M20
▼M19
▼B
ANEXOXV
1. CONTENIDO EN ACEITE DE LOS ORUJOS DE ACEITUNA
1.1.Material
— aparato de extracción apropiado tipo ►C1soxhlet ◄, provisto de un
matraz de 200 a 250 ml,
— baño por calefacción eléctrica (baño de arena, baño de agua, etc.) o
placa calefactora,
— balanza analítica,— estufa regulada a 80 ºC como máximo,— estufa de calefacción eléctrica provista de un dispositivo de termorregu-
lación regulada a 103 ºC ± 2 ºC y que permita realizar una insuflación
de aire o una presión reducida,
— triturador mecánico fácil de limpiar y que permita el triturado del orujo
sin calentamiento y sin disminución sensible de su contenido en agua yen aceite,
— cartucho de extracción y algodón hidrófilo o papel filtro, exentosde
productosextraíblespor el hexano,
— desecador,— criba con agujerosde 1 mm de diámetro,
— piedra pómez en pequeños granos, previamente secada.
1.2.Reactivo
n-hexano técnico cuyo residuo en evaporación completa deberá ser inferior
a 0,002 g para 100 ml.
2. MODO DE OPERAR2.1.Preparacióndelamuestraparaensayo
Triturar la muestra para laboratorio, si fuera necesario, en el triturador
mecánico, previamente bien limpio, para reducirla a partículasque puedan
atravesar completamente la criba.
Utilizar aproximadamente una vigésima parte de la muestra para completar
la limpieza del triturador, tirar dicha mezcla, triturar el resto, recogerlo,
mezclarlo con cuidado y analizarlo sin demora.
2.2.Tomademuestra
Pesar inmediatamente después del triturado, alrededor de 10 g de la
muestra para ensayo con una aproximación de 0,01 g.
2.3.Preparacióndelcartuchodeextracción
►
C1colocar la muestra en el cartucho y taparla con el tapón ◄de
algodón hidrófilo. En caso de haber utilizado papel de filtro, envolver la
muestra molida en dicho papel.
2.4.Presecado
Cuando el orujo esté muy húmedo (contenido en agua y en materias
volátiles superior al 10 %), efectuar un presecado colocando durante un
tiempo conveniente el cartucho lleno (o el papel de filtro) en la estufa
calentada a 80 ºC como máximo, para llevar el contenido en agua y en
materiasvolátilespor debajo del 10 %.
2.5.Preparacióndelmatraz
Pesar con aproximación de 1 g el matraz que contenga 1 a 2 granos de
piedra pómez, previamente secado en la estufa a 103 ºC ± 2 ºC y después
enfriado durante al menosuna hora en el des ecador.
2.6.Primeraextracción
Colocar en el aparato de extracción el cartucho (o el papel de filtro) que
contenga la muestra. Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano.
►C1Adaptar ◄el matraz al aparato de extracción y colocarlo todo sobre
la placa calefactora. Llevar la calefacción a tal estado que el caudal de
reflujo sea al menos de tres gotas por segundo (ebullición moderada, no
tumultuosa).1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 78
▼B
Después de cuatro horas de extracción, dejar enfriar. Quitar el cartucho del
aparato de extracción y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la
mayor parte del disolvente que lo impregna.
2.7.Segundaextracción
Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar tan finamente como sea
posible. Colocar de nuevo cuantitativamente la mezcla en el cartucho y ésta
en el aparato de extracción.
Empezar de nuevo la extracción durante doshorasmás , utilizando el
mismo matraz conteniendo la primera extracción.
La solución obtenida en el matraz de extracción deberá ser límpida. Si no
fuere así, filtrarla sobre un papel de filtro lavando varias veces el primer
matraz y el papel de filtro con hexano. Recoger el filtrado y el disolvente
en un segundo matraz previamente secado y tarado aproximadamente a
1 mg.
2.8.Eliminacióndeldisolventeypesadadelextracto
Eliminar en el equipo de extracción la mayor parte del disolvente. Eliminar
los últimos restos de éste calentando el matraz en la estufa a 103 ºC ± 2 ºC
durante 20 minutos. Facilitar dicha eliminación, ya sea insuflando aire de
vez en cuando o preferiblemente un gasinerte, o actuando bajo una pres ión
reducida.
Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al menos una hora, y
pesarlo con una precisión de 1 mg aproximadamente.
Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas condiciones, dejar enfriar en
el desecador y pesar.
La diferencia entre los resultados de estas dos pesadas deberá ser inferior o
igual a 10 mg, si no, calentar de nuevo durante períodos de diez minutos
seguidos de enfriamento y pesada, hasta que la diferencia de peso sea, a
lo sumo, de 10 mg. Seleccionar la última pesada del matraz.
Efectuar dosdeterminaciones .
3. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
3.1.Mododecálculoyfórmula
a) El extracto expresado en peso del producto tal cual será igual a:
S=m1×100
m0
donde:S esel porcentaje en pes o del extracto del producto tal
cual,
m0es el peso, en gramos, de la muestra,
m1es el peso, en gramos, del extracto seco.
Tomar como resultado la media aritmética de las dos determinaciones,
si las condiciones de repetitividad se cumplen.
Expresar el resultado con un solo decimal.
b) El extracto se relacionará con la materia seca utilizando la siguiente
fórmula:
S×100
100 − U= % grasa sobre extracto seco
donde: S esel procentaje en pes o de extracto del producto tal cual
ver a),
U es su contenido en agua y en materias volátiles.
3.2.Repetitividad
La diferencia entre los resultados de las dos determinaciones, efectuadas
simultáneamente o rápidamente la una a continuación de la otra mediante
el mismo análisis, no deberá ser superior a 0,2 g de extracto de hexano por
cada 100 g de muestra.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 79
▼B
En caso contrario, repetir sobre otras dos tomas de muestra. Si esta vez la
diferencia es de nuevo superior a 0,2 g tomar como resultado la media arit-
mética de lascuatro determinacionesefectuadas .1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 80
▼B
ANEXOXVI
DETERMINACIÓNDELÍNDICEDEYODO
1. OBJETO
La presente norma internacional especifica un método para la determina-
ción del índice de yodo de las grasas y aceites animales y vegetales, en lo
sucesivo denominados grasas.
2. DEFINICIÓN
A los fines de la presente norma internacional, se aplicará la definición
siguiente:
2.1.Índice de yodo: el peso de yodo absorbido por la muestra en las condi-
ciones de trabajo que se especifican en la presente norma internacional.
El índice de yodo se expresa en gramos de yodo por 100 gr de muestra.
3. PRINCIPIO
Disolución de la muestra problema y adición de reactivo de Wijs. Una vez
transcurrido el tiempo que se especifica, adición de solución acuosa de
yoduro potásico y valoración del yodo liberado con solución de tiosulfato
sódico.
4. REACTIVOS
Todoslosreactivoss erán de calidad analítica reconocida.
4.1. Yoduro potásico, solución de 100 g/l, exento de yodatos o de yodo libre.
4.2. Engrudo de almidón.
Mezclar 5 g de almidón soluble con 30 ml de agua, añadir esta mezcla a
1 000 ml de agua en ebullición, hervir durante 3 minutosy dejar enfriar.
4.3. Solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico.
c (Na2S2O3.5 H2O) = 0,1 mol/l, valorada como máximo 7 díasantesde s u
uso.
4.4. Disolvente, preparado mezclando volúmenes iguales de ciclohexano y
ácido acético.
4.5. Reactivo de Wijs, que contenga monocloruro de yodo en ácido acético. Se
utilizará reactivo de Wijscomercializado.
Nota:El reactivo contiene 9 g de ICl3+ 9 g de I en ácido acético.
5. MATERIAL
Material ordinario de laboratorio y, en particular, lo siguiente:
5.1. Navecillasde vidrio, apropiadaspara la mues tra problema y que puedan
introducirse en los matraces (5.2).
5.2. Matraceserlenmeyer de 500 ml de capacidad con boca es merilada,
provistos de sus correspondientes tapones de vidrio y perfectamente secos.
6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ►C1PROBLEMA ◄.
►C1La muestra homogeneizada, se seca sobre sulfato sódico y se
filtra◄.
7. PROCEDIMIENTO
7.1. Tamaño de la muestra
El peso de la muestra varía en función del índice de yodo previsto, como se
indica en el cuadro 1.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 81
▼B
Cuadro1
Índice de yodo previsto Peso de la muestra problema
menosde 5 3,00 g
5— 20 1,00 g
21— 50 0,40 g
51—100 0,20 g
101—150 0,13 g
151—200 0,10 g
Pesar la muestra problema con precisión de 0,1 mg en una
►C1navecilla ◄de vidrio 5.1.
7.2. Determinación
Introducir la muestra problema en un matraz de 500 ml (5.2). Añadir 20 ml
del disolvente (4.4) para disolver la grasa. Agregar exactamente 25 ml del
reactivo de Wijs(4.5), tapar el matraz, agitar el contenido y colocar el
matraz al abrigo de la luz. No deberá utilizarse la boca para pipetear el
reactivo de Wijs.
Preparar del mismo modo un ensayo en blanco con el disolvente y el reac-
tivo, pero sin la muestra problema.
Para lasmues trascon un índice de yodo inferior a 150, mantener los
matraces en la oscuridad durante 1 hora; para las muestras con un índice
de yodo superior a 150, así como en el caso de productos polimerizados o
considerablemente oxidados, mantener en la oscuridad durante 2 horas.
Una vez transcurrido el tiempo correspondiente, agregar a cada uno de los
matraces 20 ml de solución de yoduro potásico (4.1) y 150 ml de agua.
Valorar con la disolucion de tiosulfato sódico (4.3) hasta que haya desapa-
recido casi totalmente el color amarillo producido por el yodo. Añadir unas
gotasde engrudo de almidón (4.2) y continuar la valoración has ta el
momento preciso en que desaparezca el color azul después de una agitación
muy intensa.
Nota:Se permite la determinación potenciométrica del punto final.
7.3. Número de determinaciones
Efectuar 2 determinacionesde la mues tra problema.
8. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
El índice de yodo se expresa del siguiente modo:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
p
siendo:
c: valor numérico de la concentración exacta, expresada en moles por
litro, de la solución volumétrica patrón de tiosulfato sódico (4.3)
utilizada;
V1: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para el ensayo en blanco;
V2: valor numérico del volumen, expresado en mililitros, de la solución
de tiosulfato sódico (4.3) utilizada para la determinación;
p: valor numérico del peso, expresado en gramos, de la muestra
problema (7.1).
Se tomará como resultado la media aritmética de las dos determinaciones,
siempre que se cumpla el requisito establecido con respecto a la repetibi-
lidad.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 82
▼M11
ANEXOXVII
MÉTODOPARALADETERMINACIÓNDEESTIGMASTADIENOSEN
LOSACEITESVEGETALES
1. OBJETIVOS
Determinación de estigmastadienos en los aceites vegetales que presentan
bajasconcentracionesde dichoshidrocarburos , particularmente en el
aceite de oliva virgen y en el aceite de orujo de oliva sin refinar.
2. APLICACIÓN
Se trata de una norma aplicable a cualquier aceite de origen vegetal,
teniendo en cuenta que únicamente se obtendrán medidas fiables cuando
el contenido de estos hidrocarburos se halle incluido en un margen de
0,01 a 4,0 mg/kg. El método resulta especialmente adecuado para detectar
la presencia de aceites vegetales refinados (aceites de oliva, orujo de
oliva, girasol, palma, etc.) en el aceite de oliva virgen, dado que los
aceites refinados contienen estigmastadienos y los aceites vírgenes no.
3. FUNDAMENTO
Aislamiento de la materia insaponificable. Separación de la fracción de
hidrocarburoses teroideosmediante cromatografia en columna de gel de
sílice y análisis mediante cromatografía de gases en columna capilar.
4. INSTRUMENTAL
4.1. Matracesde 250 ml aptospara colocarlesun refrigerante de reflujo.4.2. Embudosde decantación con capacidad para 500 ml.4.3. Matracesde fondo redondo de 100 ml.4.4. Rotavapor.4.5. Columna de vidrio para cromatografía (1,5-2,0 cm de diámetro interno
por 50 cm de longitud) provista de una llave de teflón y con una torunda
de lana de vidrio o un disco de vidrio unterizado en el fondo. Para
preparar la columna de gel de sílice se vierte hexano en la columna de
cromatografía hasta que alcance una altura de aproximadamente 5 cm,
llenándose a continuación con una papilla de gel de sílice en hexano
(15 g en 40 ml) mediante la ayuda de variasporcionesde hexano. Se
deja sedimentar la mezcla en reposo, completándose la sedimentación
aplicando una ligera vibración. Añadir sulfato sódico anhidro hasta una
altura de aproximadamente 0,5 cm y finalmente eluir el exceso de
hexano.
4.6. Cromatógrafo de gases equipado con detector de ionización de llama,
inyector con división de flujo u «cold on -column» y horno programable
con precisión de ± 1 ºC.
4.7. Columna capilar de sílice fundida (0,25 o 0,32 mm de diámetro
interno × 25 m de longitud), recubierta con una película de 0,25 µmd e
espesor de la fase 5 %-fenilmetilsilicona.
Nota1.
Pueden utilizarse otras columnas con polaridades similares o inferiores.
4.8. Integrador-registrador con capacidad para modo de integración valle-
valle.
4.9. Microjeringa de 5-10 µl para cromatografía de gases con aguja fija.
4.10. Calentador de tipo manta o placa eléctrica.
5. REACTIVOS
Salvo indicación en sentido contrario, únicamente se utilizarán reactivos
de calidad para análisis. Debe emplearse agua destilada o de pureza al
menosequivalente.
5.1. Hexano o una mezcla de alcanoscon un intervalo de ebullición de 65-
70 ºC, destilados en columna rectificadora.
Nota2.
El disolvente debe destilarse para eliminar impurezas.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 83
▼M11
5.2. Etanol de 96 v/v.
5.3. Sulfato sódico anhidro.5.4. Solución alcohólica de hidróxido potásico al 10 %. Añadir 10 ml de agua
a 50 g de hidróxido potásico, agitar y diluir seguidamente la mezcla en
etanol hasta un volumen de 500 ml.
Nota3.
La potasa alcohólica toma color marrón con el tiempo. Debe prepararse
diariamente y se almacenará en botellas de vidrio oscuro cerradas hermé-
ticamente.
5.5. Gel de sílice 60 para columna de cromatografia, de 70-230 mallas (refe-
rencia 7734 de Merck o similar).
Nota4.
Por lo general, el gel de sílice puede utilizarse directamente a partir del
envase sin necesidad de tratamiento. Sin embargo, algunos lotes de sílice
pueden presentar baja actividad produciendo separaciones cromatográ-
ficas inadecuadas. Cuando ello ocurra debe tratarse el gel de sílice de la
siguiente manera: activar el gel calentándolo a 550 ºC durante un mínimo
de cuatro horas. Tras el calentamiento poner el gel de sílice a enfriar en
un desecador y trasvasarlo a continuación a un matraz con cierre hermé-
tico. Se añade seguidamente un 2 % de agua agitando hasta que dejen de
verse grumos y el polvo fluya libremente.
Si algún lote de gel de sílice origina cromatogramas con picos que inter-
fieran, dicho gel será sometido al tratamiento anteriormente mencionado.
Puede considerarse como alternativa la utilización de gel de sílice 60
extrapuro (referencia 7754 de Merck).
5.6. Solución madre (200 ppm) de colesta-3,5-dieno (Sigma, 99 % de pureza)
en hexano (10 mg en 50 ml).
5.7. Solución patrón de colesta-3,5-dieno en hexano con una concentración de
20 ppm, que se obtiene diluyendo la solución anterior.
Nota5.
Si se mantiene la temperatura por debajo de 4 ºC, las soluciones 5.6 y 5.7
permanecerán inalteradas durante un mínimo de 4 meses.
5.8. Solución de n-nonacosano en hexano con una concentración aproximada
de 100 ppm.
5.9. Gasportador para cromatografia: helio o hidrógeno de 99,9990 % de
pureza.
5.10. Gases auxiliares para el detector de ionización de llama: aire purificado e
hidrógeno de 99,9990 % de pureza.
6. METODOLOGÍA
6.1.Preparacióndelamateriainsaponificable:
6.1.1. Pesar 20 ± 0,1 g de aceite en un matraz de 250 ml (4.1), añadir 1 ml de
solución patrón de colesta-3,5-dieno (20 µg) y 75 ml de potasa alcohólica
al 10 %, colocar un refrigerante de reflujo y calentar a ebullición suave
durante 30 minutos. Retirar de la fuente de calor el matraz con la muestra
y dejar enfriar ligeramente la solución (el enfriamiento no debe ser total
para evitar la decantación de la muestra). Añadir 100 ml de agua y pasar
la solución a un embudo de decantación (4.2) con ayuda de 100 ml de
hexano. Agitar enérgicamente durante 30 segundos y dejar decantar.
Nota6.
Si se produce emulsión, que no desaparece rápidamente, añadir pequeñas
cantidadesde etanol.
6.1.2. Pasar la fase acuosa inferior a un segundo embudo de decantación y
someterla nuevamente a extracción con 100 ml de hexano. Separar
nuevamente la fase inferior y lavar los extractos de hexano (mezclándolos
en otro embudo de decantación) con tresporcionesde 100 ml cada una
de una mezcla de agua y etanol (1: 1) hasta obtener un pH neutro.
6.1.3. Pasar la solución de hexano a través de sulfato sódico anhidro (50 g),
lavar con 20 ml de hexano y evaporar a 30 ºC y presión reducida en un
rotavapor hasta sequedad.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 84
▼M11
6.2.Separacióndelafraccióndehidrocarburosesteroideos:
6.2.1. Introducir el residuo en la columna de fraccionamiento con ayuda de dos
porciones de 1 ml de hexano, distribuir la muestra en la columna dejando
que el nivel de solución descienda hasta la parte superior del sulfato de
sodio y comenzar la elución cromatográfica con hexano a un flujo apro-
ximado de 1 ml/min. Desechar los primeros 25-30 ml de eluido y recoger
la fracción siguiente de 40 ml. Después, pasar esta fracción a un matraz
de fondo redondo de 100 ml (4.3).
Nota7.
La primera fracción contiene loshidrocarbuross aturados(cf. Figura 1a) y
la segunda fracción los esteroideos. Al proseguir con la elución se obtiene
escualeno y otros compuestos relacionados. Para poder obtener una buena
separación entre los hidrocarburos saturados y los esteroideos, es nece-
sario optimizar los volúmenes de las fracciones. A tal efecto se debe
ajustar el volumen de la primera fracción de tal manera que cuando se
analice la segunda, los picos correspondientes a los hidrocarburos satu-
rados sean bajos (cf. Figura 1c); cuando estos no aparezcan pero la
intensidad del pico correspondiente al patrón sea reducida, debe dismi-
nuirse el volumen. De todas formas, puesto que no se produce
solapamiento de los picos durante la cromatografía de gases, no es
precisa una separación completa entre los componentes de la primera y
segunda fracciones siempre que las condiciones de la CG estén ajustadas
como se indica en 6.3.1. Por lo general no es necesario optimizar el
volumen de la segunda fracción, puesto que existe una buena separación
con loscomponentesque eluyen pos teriormente. Sin embargo, la
presencia de un pico importante a 1,5 min, aproximadamente, por debajo
del tiempo de retención del patrón se debe al escualeno y revela una mala
separación.
6.2.2. Evaporar la segunda fracción en rotavapor a 30 ºC y presión reducida
hasta sequedad. Disolver inmediatamente el residuo en 0,2 ml de hexano
y mantener la solución en el refrigerador hasta el momento de su análisis.
Nota8.
Los residuos 6.1.3 y 6.2.2 no deben mantenerse en seco a temperatura
ambiente. Una vez obtenidos, es necesario añadirles disolvente y almace-
narlosen un refrigerador.
6.3.Cromatografíadegases
6.3.1. Condicionesde trabajo para inyección con divis ión de flujo.
— temperatura del inyector: 300 ºC,
— temperatura del detector: 320 ºC.
— integrador-registrador: los parámetros de integración deben ser fijados
de tal forma que la evaluación de lasáreass ea correcta. La modalidad
de integración valle-valle esla másrecomendable,
— sensibilidad: aproximadamente 16 veces la atenuación mínima,
— cantidad de disolución inyectada: 1 µl,
— programación de la temperatura del horno: temperatura inicial cons-
tante de 235 ºC durante 6 minutos, seguida de un aumento gradual
de 2 ºC/min hasta alcanzar 285 ºC,
— inyección con una división de flujo de 1: 15,
— gasportador: helio o hidrógeno a 120 kPa de pres ión.
Dichas condiciones pueden modificarse en función de las características
del cromatógrafo y de la columna con objeto de obtener cromatogramas
que respondan a los siguientes requisitos: Pico del patrón interno situado
con una aproximación de 5 minutosen torno al tiempo citado en 6.3.2; el
pico del patrón interno alcanzará, como mínimo, un 80 % de la escala
total.
El sistema de cromatografía de gases deberá comprobarse inyectando una
mezcla de la solución madre de colestadieno (5.6) y de n-nonacosano(5.8). El pico del colesta-3,5-dieno deberá aparecer antes que el del n-
nonacosano (véase figura 1c); si esto no ocurre, pueden adoptarse dos
soluciones: reducir la temperatura inicial del horno o sustituir la columna
de cromatografía de gases por otra de polaridad inferior.
6.3.2. Identificación de picos
El pico del patrón interno aparece a un tiempo de retención de, aproxima-
damente, 19 minutos, y el del estigmasta-3,5-dieno lo hace a un tiempo
de retención relativo de aproximadamente 1,29 (véase figura 1b). El
estigmasta-3,5-dieno suele ir acompañado de pequeñas cantidades de un
isómero y, por lo general, ambos originan un solo pico cromatográfico.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 85
▼M11
No obstante, si la columna es demasiado polar, o tiene un gran poder de
resolución, el isómero puede aparecer en forma de un pequeño pico justo
antes y cerca del estigmasta-3,5-dieno (véase figura 2). En estos casos, es
preciso sumar las áreas de los dos picos. Con el fin de estar seguro que
los estigmastadienos eluyen como un solo pico se recomienda instituir la
columna por otra de menor polaridad o de mayor diámetro interior.
Nota9.
Para obtener una referencia de los estigmastadienos puede utilizarse el
análisis de cualquier aceite vegetal refinado empleando menor cantidad
de muestra (de 1 a 2 g). Los estigmastadienos dan lugar a un pico impor-
tante de fácil identificación.
6.3.3. Análisis cuantitativo
El contenido de los estigmastadienos se determina aplicando la fórmulamg=kg de estigmastadienos ¼
As/C2Mc
Ac/C2Mo
en la cual:Ab= área del pico de estigmastadienos (si el pico se
halla dividido en dos picos, súmese el área de los
dospicos .).
Ac= área del pico del patrón interno (colestadieno).
Mc= peso de patrón añadido, en microgramos.
Mo= peso de aceite empleado, en gramos.
Límite de detección: aproximadamente 0,01 mg/kg.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 86
▼M11
Figura1
Cromatogramas procedentes del análisis de muestras de aceite de oliva en
columna capilar de sílice fundida (0,25 mm de diámetro interno × 25 m)
recubierta con una película de 0,25 µm de grosor de 5 %-fenilmetilsili-
cona.
a) Primera fracción (30 ml) de un aceite virgen marcado con el patrón.
b) Segunda fracción (40 ml) de un aceite de oliva que contiene 0,10 mg/
kg de estigmastadienos.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 87
▼M11
c) Segunda fracción (40 ml) que incluye una pequeña proporción de la
primera.
Figura2
Cromatograma procedente del análisis de una muestra de aceite de oliva
refinado en una columna DB-5, en el que se aprecia el isómero del estig-
masta-3,5-dieno.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 88
▼M13
ANEXOXVIII
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE TRIGLICÉRIDOS CON
ECN42 (DIFERENCIA ENTRE EL CONTENIDO TEÓRICO Y LOS
DATOSOBTENIDOSPORHPLC)
1.Objeto
Determinación de la composición de triglicéridos (TG) de los aceites de
oliva, expresados en su número equivalente de carbonos (ECN) en
función de lasdiferenciasexis tentesentre el contenido teórico, calcu-
lado a partir de la composición de ácidos grasos, y los resultados
analíticosobtenidosmediante cromatografía de líquidosde alta res olu-
ción (HPLC).
2.Campodeaplicación
La presente norma es aplicable a los aceites de oliva. El método puede
utilizarse para detectar la presencia de pequeñas cantidades de aceites
de semillas (ricos en ácido linoleico) en todos los tipos de aceites de
oliva.
3.Principio
El contenido teórico de triglicéridoscon ECN42 (calculado s obre la
base de la determinación de la composición de ácidos grasos mediante
GLC) y el contenido de triglicéridoscon ECN42 determinado mediante
HPLC se corresponden dentro de unos límites en el caso de los aceites
puros. Las diferencias superiores a los valores establecidos en el Regla-
mento respecto a cada tipo de aceite indican que el aceite contiene
aceites de semillas.
4.Método
El método para calcular el contenido teórico de triglicéridoscon
ECN42 y su diferencia respecto a los datos obtenidos mediante HPLC
consiste esencialmente en coordinar los datos analíticos obtenidos por
otros métodos. Pueden distinguirse tres fases: determinación de la
composición de ácidos grasos mediante cromatografía de gases en
columna capilar, cálculo de la composición teórica de triglicéridos con
ECN42, y determinación de lostriglicéridoscon ECN42 mediante
HPLC.
4.1.Aparatos
4.1.1. Matracesredondosde 250 y 500 ml.
4.1.2. Vasos de precipitados de 100 ml.
4.1.3. Columna de cromatografía de vidrio, de 21 mm de diámetro interior y
450 mm de longitud, con grifo y cono (hembra) normalizado en el
extremo superior.
4.1.4. Embudosde decantación de 250 ml, con cono (macho) normalizado en
el extremo inferior, para conexión con el extremo superior de la
columna.
4.1.5. Varilla de vidrio de 600 mm de longitud.
4.1.6. Embudo de vidrio de 80 mm de diámetro.
4.1.7. Matracesaforadosde 50 ml.
4.1.8. Matracesaforadosde 20 ml.
4.1.9. Evaporador de rotación.
4.1.10. Cromatografía de líquidos de alta resolución, con control termostático
de la temperatura de la columna.
4.1.11. Sistema de inyección de volúmenes de 10 µl.
4.1.12. Detector: refractómetro diferencial. La sensibilidad de toda la escala
deberá ser como mínimo de 10−4unidadesde índice de refracción.
4.1.13. Columna de acero inoxidable de 250 mm de longitud y 4,5 mm de
diámetro interior, rellena de partículasde s ílice de 5 µm de diámetro
con un 22-23 % de carbono en forma de octadecilsilano (nota 2).
4.1.14. Registrador o integrador.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 89
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4.2.Reactivos
Los reactivos deberán ser de calidad para análisis. Los disolventes de
elución deberán desgasificarse y podrán reciclarse varias veces sin que
ello afecte a las separaciones.
4.2.1. Éter de petróleo, 40-60 ºC, grado cromatográfico.
4.2.2. Éter etílico, libre de peróxidos, recién destilado.
4.2.3. Disolvente de elución para la purificación del aceite por cromatográfica
en columna: mezcla de éter de petróleo/éter etílico 87/13 (v/v).
4.2.4. Gel de sílice, 70-230 mallas, tipo Merck 7734, con contenido de agua
normalizado al 5 % (p/p).
4.2.5. Lana de vidrio.4.2.6. Acetona.4.2.7. Acetonitrilo.4.2.8. Disolvente de elución para HPLC: acetonitrilo + acetona (las propor-
ciones se ajustarán para obtener la separación deseada; comenzar con
una mezcla de 50:50).
4.2.9. Disolvente de solubilización: acetona.4.2.10. Triglicéridosde referencia: pueden utilizars e triglicéridoscomerciales
(tripalmitina, trioleína, etc.), en cuyo caso se reflejarán en un gráfico
lostiemposde retención frente al número equivalente de carbonos , o
bien cromatogramas de referencia correspondientes a aceite de soja, a
una mezcla de aceite de soja y aceite de oliva 30:70 y a aceite puro
de oliva (véanse las notas 3 y 4 y las figuras 1, 2, 3 y 4).
4.3.Preparacióndelamuestra
Como pueden obtenerse falsos resultados positivos debido a la
presencia de diversas sustancias que interfieren, la muestra debe some-
terse siempre a un proceso de purificación según el método IUPAC
2.507, relativo a la determinación de las sustancias polares en los
aceitesoxidados .
4.3.1. Preparación de la columna cromatográfica
Llenar la columna (4.1.3) con aproximadamente 30 ml de disolvente de
elución (4.2.3); introducir un poco de lana de vidrio (4.2.5), empuján-
dolo hasta el fondo de la columna con la varilla de vidrio (4.1.5).
Preparar en un vaso de precipitados de 100 ml una suspensión con 25 g
de gel de sílice (4.2.4) en 80 ml de la mezcla de elución (4.2.3) y trans-
ferirla a la columna con ayuda de un embudo de vidrio (4.1.6).
Para realizar la transferencia total del gel de sílice a la columna, lavar
el vaso de precipitados con la mezcla de elución y pasar también los
líquidosde lavado a la columna.
Abrir el grifo de la columna y dejar que salga el disolvente de ella
hasta que su nivel se sitúe aproximadamente 1 cm por encima del gel
de sílice.
4.3.2. Cromatografía en columna
Pesar, con la precisión de 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g de aceite previamente
filtrado, homogeneizado y, en caso necesario, deshidratado, en un
matraz aforado de 50 ml (4.1.7). Disolver en 20 ml aproximadamente
de disolvente de elución (4.2.3). Si es necesario, calentar ligeramente
para facilitar la disolución. Enfriar a temperatura ambiente y enrasar
con el disolvente de elución.
Introducir con una pipeta aforada 20 ml de solución en la columna
preparada como se indica en 4.3.1, abrir el grifo y hacer eluir el disol-
vente hasta el nivel de la capa de gel de sílice.
Eluir con 150 ml de disolvente de elución (4.2.3), regulando el flujo de
disolvente a 2 ml por minuto aproximadamente (de modo que pasen a
travésde la columna 150 ml en 60-70 minutos ).
Recoger el eluido en un matraz redondo de 250 ml (4.1.1) previamente
tarado y pesado exactamente. Eliminar el disolvente a presión reducida
(Rotavapor) y pesar el residuo que se utilizará en la preparación de la
solución para el análisis por HPLC y en la preparación de los ésteres
metílicos.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 90
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Tras pasar por la columna, debe recuperarse como mínimo un 90 % de
la muestra en el caso de aceite de oliva de las categorías extravirgen,
virgen y refinado ordinario, mientrasque en el de losaceiteslampantes
y de orujo losporcentajesde recuperación no pueden s er inferioresal
80 %.
4.4.AnálisisporHPLC
4.4.1. Preparación de las muestras para el análisis cromatográfico
Preparar del siguiente modo una solución al 5 % de la muestra que
vaya a analizarse: pesar 0,5 ± 0,001 g de la muestra en un matraz
aforado de 10 ml y enrasar con el disolvente de solubilización (4.2.9).
4.4.2. Procedimiento
Instalar el sistema cromatográfico. Bombear el disolvente de elución
(4.2.8) a un ritmo de 1,5 ml/mn para purgar todo el sistema. Esperar
hasta que se obtenga una línea de base estable. Inyectar 10 µld el a
muestra preparada como se indica en el punto 4.3.
4.4.3. Cálculo y expresión de los resultados
Utilizar el método de normalización interna, esdecir, cons iderar que la
suma de las superficies de los picos correspondientes a los distintos
triglicéridosde ECN entre 42 y 52 esigual al 100 %. Calcular el
porcentaje relativo de cada triglicérido mediante la fórmula siguiente:
% de triglicérido = superficie del pico × 100 / suma de la superficies de
lospicos .
El resultado se expresa con, como mínimo, dos decimales.
Nota 1: El orden de elución puede determinarse mediante el cálculo
del número equivalente de carbonos, que con frecuencia viene dado
por la fórmula ECN = CN−2n, siendo CN el número de carbonos y n
el número de enlaces dobles; puede calcularse con mayor precisión
teniendo en cuenta el origen del enlace doble. Si no,nlynlnson los
númerosde enlacesdoblesde losácidosoleico, linoleico y linolénico,
respectivamente, el número equivalente de carbonos puede calcularse
mediante la fórmula siguiente:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln,
siendo do,dlydlncoeficientesque pueden calculars e mediante lostrigli-
céridos de referencia. En las condiciones que se especifican en el
presente método la fórmula obtenida será similar a la siguiente:
ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln)
Nota2: Ejemplos: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 o equi-
valente.
Nota 3: Con variostriglicéridosde referencia también espos ible
calcular la resolución con respecto a la trioleína:
α= TR' / TR trioleína
utilizando el tiempo de retención reducido TR' = TR − TR disolvente.
La representación gráfica del log αfrente a f (número de enlaces
dobles) permite determinar los valores de retención de todos los trigli-
céridosde losácidosgras oscontenidosen lostriglicéridosde referencia
(véase la figura 2).
Nota 4: La resolución de la columna debe permitir separar claramente
el pico de la trilinoleína de lospicosde lostriglicéridoscon un tiempo
de retención próximo. La elución se prosigue hasta el pico de ECN52.
Nota 5: Para obtener un cromatograma que permita la medición
correcta de las superficies de todos los picos de interés en la presente
determinación, es necesario que el segundo pico correspondiente a
ECN50 tenga una altura igual al 50 % de la escala completa del regis-
trador.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 91
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4.5.Cálculodelacomposicióndetriglicéridos(%moles)apartirdelos
datosdeGLCdeácidosgrasos(%superficie)
4.5.1. Determinación de la composición de ácidos grasos
La composición de ácidos grasos se determina con arreglo al método de
cromatografía de gases de la CEE que figura en el Anexo X A del
Reglamento (CEE) no2568/91, utilizando columna capilar. La prepara-
ción de los ésteres metílicos se realiza según el Anexo X B (solución
alcohólica de metilato sódico).
4.5.2. Ácidos grasos considerados para el cálculo
Los glicéridos se agrupan en función de su número equivalente de
carbonos(ECN), teniendo en cuenta lasequivalenciasque figuran a
continuación entre ECN y ácidos grasos. Sólo se han considerado los
ácidos grasos con 16 y 18 átomos de carbono, ya que son los únicos
importantespara el aceite de oliva.
Ácido graso (AG) AbreviaturaPeso mole-
cular (PM)ECN
Ácido palmítico P 256,4 16
Ácido palmitoleico Po 254,4 14Ácido esteárico S 284,5 18
Ácido oleico O 282,5 16
Ácido linoleico L 280,4 14Ácido linolénico Ln 278,4 12
4.5.3. Transformación del % superficie en moles para todos los
ácidosgras os
molesP ¼
%su p :P
PM PmolesS ¼%su p :S
PM SmolesPo ¼%su p :Po
PM Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
molesO ¼
%su p :O
PM OmolesL ¼%su p :L
PM LmolesLn ¼%su p :Ln
PM Ln
4.5.4. Normalización al 100 % de losácidosgras os
% molesP 1 ;2;3 ðÞ ¼molesP /C3100
molesP þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)% molesS 1 ;2;3 ðÞ ¼
molesS /C3100
molesP þSþPoþOþLþLn ðÞ
% molesPo 1 ;2;3 ðÞ ¼molesPo /C3100
molesP þSþPoþOþLþLn ðÞ
% molesO 1 ;2;3 ðÞ ¼molesO /C3100
molesP þSþPoþOþLþLn ðÞ
% molesL 1 ;2;3 ðÞ ¼molesL /C3100
molesP þSþPoþOþLþLn ðÞ
% molesLn 1 ;2;3 ðÞ ¼molesLn /C3100
molesP þSþPoþOþLþLn ðÞ
El resultado proporciona el porcentaje de cada ácido graso en % moles
en todaslaspos iciones(1, 2 y 3) de losTG.
A continuación se calculan las sumas de los ácidos grasos saturados
(AGS) P y S y de los ácidos grasos insaturados (AGI) Po, O, L y Ln:
% molesAGS = % molesP + % molesS/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)% molesAGI = 100 - % molesAGS.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 92
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4.5.5. Cálculo de la composición de los ácidos grasos en las posi-
ciones2 y 1-3 de losTG
Los ácidos grasos se distribuyen en tres grupos del siguiente modo: dos
idénticospara laspos iciones 1y3yu n o para la posición 2, con coefi-
cientesdiferentespara losácidoss aturados(P y S) y losins aturados
(Po, O, L y Ln).
4.5.5.1. Ácidos grasos saturados en la posición 2 [P(2) y S(2)]
% molesP(2) = % molesP (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)% molesS(2) = % molesS (1,2,3) * 0,06
4.5.5.2. Ácidos grasos insaturados en la posición 2 [Po(2), O(2), L(2) y Ln(2)]
% molesPo 2 ðÞ ¼% molesPo 1 ;2;3 ðÞ
% molesAGI/C3100 - % molesP 2 ðÞ- % molesS 2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)% molesO 2 ðÞ ¼
% molesO 1 ;2;3 ðÞ
% molesAGI/C3100 - % molesP 2 ðÞ- % molesS 2 ðÞ ½/C138
% molesL 2 ðÞ ¼% molesL 1 ;2;3 ðÞ
% molesAGI/C3100 - % molesP 2 ðÞ- % molesS 2 ðÞ ½/C138
% molesLn 2 ðÞ ¼% molesLn 1 ;2;3 ðÞ
% molesAGI/C3100 - % molesP 2 ðÞ- % molesS 2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3. Ácidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3),
L(1,3) y Ln(1,3)]
% molesP 1 ;3ðÞ ¼% molesP 1 ;2;3 ðÞ - % molesP 2 ðÞ
2þ% molesP 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)% molesS 1 ;3ðÞ ¼
% molesS 1 ;2;3 ðÞ - % molesS 2 ðÞ
2þ% molesS 1 ;2;3 ðÞ
% molesPo 1 ;3ðÞ ¼% molesPo 1 ;2;3 ðÞ - % molesPo 2 ðÞ
2þ% molesPo 1 ;2;3 ðÞ
% molesO 1 ;3ðÞ ¼% molesO 1 ;2;3 ðÞ - % molesO 2 ðÞ
2þ% molesO 1 ;2;3 ðÞ
% molesL 1 ;3ðÞ ¼% molesL 1 ;2;3 ðÞ - % molesL 2 ðÞ
2þ% molesL 1 ;2;3 ðÞ
% molesLn 1 ;3ðÞ ¼% molesLn 1 ;2;3 ðÞ - % molesLn 2 ðÞ
2þ% molesLn 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Cálculo de lostriglicéridos
4.5.6.1. TG con un ácido graso (AAA; en este caso, LLL, PoPoPo)
% molesAAA ¼% molesA 1 ;3ðÞ /C3 % molesA 2 ðÞ/C3% molesA 1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TG con dos ácidos grasos (AAB; en este caso, PoPoL, PoLL)
% molesAAB ¼% molesA 1 ;3ðÞ /C3 % molesA 2 ðÞ/C3% molesB 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
% molesABA ¼
% molesA 1 ;3ðÞ /C3 % molesB 2 ðÞ/C3% molesA 1 ;3ðÞ
100001991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 93
▼M13
4.5.6.3. TG con tres ácidos grasos diferentes (ABC; en este caso, OLLn, PLLn,
PoOLn, PPoLn)
% molesABC ¼% molesA 1 ;3ðÞ /C3 % molesB 2 ðÞ/C3% molesC 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) % molesBCA ¼
% molesB 1 ;3ðÞ /C3 % molesC 2 ðÞ/C3% molesA 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
% molesCAB ¼% molesC 1 ;3ðÞ /C3 % molesA 2 ðÞ/C3% molesB 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
4.5.6.4. Triglicéridoscon ECN42
Los triglicéridos siguientes con ECN42 se calculan según las ecua-
ciones7, 8 y 9, por orden previs to de elución en HPLC (normalmente
sólo tres picos).
LLL
PoLL e isómero de posición LPoLOLLn e isómeros de posición OLnL y LnOL
PoPoL e isómero de posición PoLPo
PoOLn e isómeros de posición OPoLn y OLnPoPLLn e isómeros de posición LLnP y LnPL
PoPoPo
SLnLn e isómero de posición LnSLnPPoLn e isómeros de posición PLnPo y PoPLn
Los triglicéridos con ECN42 se obtienen mediante la suma de los nueve
triglicéridos, incluidos sus isómeros de posición. El resultado se expresa
con, como mínimo, dosdecimales .
5.Evaluacióndelosresultados
Se comparan el contenido teórico calculado y el determinado por
HPLC. Si la diferencia entre losdatosde HPLC y losdatosteóricos
es superior al valor establecido para la categoría correspondiente de
aceite en el Reglamento, la muestra contiene aceite de semillas.
Nota:Los resultados se expresan con una cifra decimal.
6.Ejemplo (losnúmeroshacen referencia a lass eccionesdel texto del
método)
4.5.1. Cálculo del porcentaje de molesde losácidosgras osa
partir de losdatosobtenidosmediante GLC (% s uperficie)
Los datos siguientes de la composición de ácidos grasos se obtienen
mediante GLC:
AG
PMP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
% sup. 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Transformación del % superficie en moles para todos los
ácidosgras os
molesP ¼10
256 ;4¼0;03900 molesP Véas e fórmula (1)
molesS ¼3
284 ;5¼0;01054 molesS Véas e fórmula (1)
molesPo ¼1
254 ;4¼0;00393 molesPo Véas e fórmula (1)1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 94
▼M13
molesO ¼75
282 ;5¼0;26549 molesO Véas e fórmula (1)
molesL ¼10
280 ;4¼0;03566 molesL Véas e fórmula (1)
molesLn ¼1
278 ;4¼0;003594 molesLn Véas e fórmula (1)
Total = 0,35822 molesTG
4.5.4. Normalización al 100 % de losácidosgras os
% molesP 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 molesP /C3100
0;35822 moles¼10;888 % Véase fórmula (2)
% molesS 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 molesS /C3100
0;35822 moles¼2;944 % Véase fórmula (2)
% molesPo 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 molesPo /C3100
0;35822 moles¼1;097 % Véase fórmula (2)
% molesO 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 molesO /C3100
0;35822 moles¼74;113 % Véase fórmula (2)
% molesL 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 molesL /C3100
0;35822 moles¼9;956 % Véase fórmula (2)
% molesLn 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 molesLn /C3100
0;35822 moles¼1;003 % Véase fórmula (2)
Total % moles= 100,0 %
Suma de los ácidos grasos saturados e insaturados en las posiciones 1, 2
y 3 de losTG:
% molesAGS = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Véas e fórmula (3)
% molesAGI = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Véas e fórmula (3)
4.5.5. Cálculo de la compos ición de ácidosgras osen laspos i-
ciones2 y 1-3 de losTG
4.5.5.1. Ácidos grasos saturados en la posición 2 [P(2) y S(2)]
% molesP(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 % moles Véas e fórmula (4)
% molesS(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 % moles Véas e fórmula (4)
4.5.5.2. Ácidos grasos insaturados en la posiciones 1 y 3 [Po(1,3), O(1,3),
L(1,3) y Ln(1,3)]
% molesPo 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 % molesVéas e fórmula (5)
% molesO 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 % molesVéas e fórmula (5)
% molesL 2 ðÞ ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458 % molesVéas e fórmula (5)
% molesLn 2 ðÞ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼1;154 % molesVéas e fórmula (5)
4.5.5.3. Ácidos grasos en las posiciones 1 y 3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3),
L(1,3) y Ln(1,3)]
% molesP 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 % molesVéas e fórmula (6)
% molesS 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 % molesVéas e fórmula (6)1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 95
▼M13
% molesPo 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 % molesVéas e fórmula (6)
% molesO 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 % molesVéas e fórmula (6)
% molesL 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 % molesVéas e fórmula (6)
% molesLn 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927 % molesVéas e fórmula (6)
4.5.6. Cálculo de triglicéridos
A partir de la composición calculada de los ácidos grasos en las posi-
ciones sn-2 y sn-1,3 (véase el siguiente cuadro):
AG en Posición 1 y 3 Posición 2
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %
Suma 100,0 % 100,0 %
Se calculan los triglicéridos siguientes:
LLL
PoPoPo
PoLL con un isómero de posiciónSLnLn con un isómero de posiciónPoPoL con un isómero de posición
PPoLn con dos isómeros de posición
OLLn con dos isómeros de posiciónPLLn con dos isómeros de posición
PoOLn con dos isómeros de posición
4.5.6.1. TG con un ácido graso (LLL, PoPoPo) Véase fórmula (7)
% molesLLL ¼
9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10000= 0,09708 mol LLL
% molesPoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10000= 0,00013 mol PoPoPo
4.5.6.2. TG con dos ácidos grasos (PoLL, SLnLn, PoPoL) Véase fórmula (8)
% molesPoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10000= 0,02141
% molesLPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10000= 0,01070
0,03211 mol PoLL
% molesSLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00093
% molesLnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10000= 0,000021991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 96
▼M13
0,00095 mol SLnLn
% molesPoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00236
% molesPoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10000= 0,00118
0,00354 mol PoPoL
4.5.6.3. TG con tresácidosgras osdiferentes(PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
Véase fórmula (9)
% molesPPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00375
% molesLnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10000= 0,00012
% molesPoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,00375
0,00762 mol PPoLn
% molesOLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,14577
% molesLnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10000= 0,14577
% molesLLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10000= 0,14577
0,43671 mol OLLn
% molesPLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,03400
% molesLnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00111
% molesLLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,03400
0,06911 mol PLLn
% molesPoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10000=
0,01605
% molesLnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10000= 0,01605
% molesOLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10000= 0,01605
0,04815 mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 mol TG1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 97
▼M14
Figura1:Representación gráfica del log alfa frente a f (número de
enlacesdobles)
Nota:La: ácido laúrico; My: ácido mirístico; P: ácido palmítico; St:
ácido esterárico; O: ácido oleico; L: ácido linoleico; Ln: ácido
linolénico.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 98
▼M14
Figura2:aceite desoja
Figura3:aceite desoja/aceite deoliva30/70
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 99
▼M14
Figura4:aceite deoliva
1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 100
▼M19
ANEXOXIX
DETERMINACIÓNDELCONTENIDODEALCOHOLESALIFÁTICOS
MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES CON COLUMNA
CAPILAR
1. OBJETO
El presente método describe un procedimiento para la determinación
del contenido de alcoholes alifáticos en las materias grasas, expresado
como contenido de cada uno de losalcoholesalifáticosanalizadosy
como contenido total.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la materia grasa, a la que se habrá añadido 1-eico-
sanol como patrón interno, con una solución etanólica de hidróxido
potásico; a continuación, extracción del insaponificable con éter etílico.
Separación de la fracción alcohólica del insaponificable mediante
cromatografía en placa de gel de sílice básica; los alcoholes recupe-
rados del gel de sílice se transforman en trimetilsililéteres y se
analizan mediante cromatografía de gases con columna capilar.
3. EQUIPO
3.1. Matraz de 250 ml, provisto de refrigerante de reflujo con juntas esme-
riladas.
3.2. Embudosde decantación de 500 ml.3.3. Matracesde 250 ml.3.4. Equipo completo de cromatografía en capa fina (fase sólida), con placas
de vidrio de 20 × 20 cm.
3.5. Lámpara ultravioleta de una longitud de onda de 366 o 254 nm.3.6. Microjeringasde 100 y 500 µl.
3.7. Embudo cilíndrico filtrante con filtro poroso G3 (porosidad 15-40 µm),
de 2 cm de diámetro y 5 cm de altura, aproximadamente, con un dispo-
sitivo adecuado para la filtración en vacío y una junta esmerilada
macho 12/21.
3.8. Matraz cónico para vacío de 50 ml, con junta esmerilada hembra 12/21
acoplable al embudo filtrante (3.7).
3.9. Tubo de 10 ml de fondo cónico con tapón hermético.3.10. Cromatógrafo de gases que pueda funcionar con columna capilar,
provisto de un sistema de fraccionamiento, formado por:
3.10.1. Horno termostático para la columna, que pueda mantener la temperatura
deseada con precisión aproximada de 1 ºC.
3.10.2. Inyector termorregulable con elemento vaporizador de vidrio persilani-
zado.
3.10.3. Detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.
3.10.4. Registrador-integrador que pueda funcionar con un convertidor-amplifi-
cador, con un tiempo de respuesta no superior a 1 segundo y con
velocidad de papel variable.
3.11. Columna capilar de vidrio o sílice fundida, de 20 a 30 m de longitud y
de 0,25 a 0,32 mm de diámetro interior, recubierta interiormente de
líquido SE-52, SE-54 o equivalente, con un espesor uniforme que oscile
entre 0,10 y 0,30 µm.
3.12. Microjeringa de 10 µl para cromatografia de gases, con aguja endure-
cida.
3.13. Balanza de precisión con sensibilidad de 1 mg e indicación de 0,1 mg.
4. REACTIVOS
4.1. Hidróxido potásico en solución etanólica aproximadamente 2 N:
disolver, enfriando al mismo tiempo, 130 g de hidróxido potásico (título
mínimo del 85 %) en 200 ml de agua destilada y completar hasta un
litro con etanol. Conservar la solución en botellas de vidrio opaco bien
cerradas.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 101
▼M19
4.2. Éter etílico de calidad para análisis.
4.3. Sulfato sódico anhidro de calidad para análisis.
4.4. Placas de vidrio recubiertas con gel de sílice, sin indicador de fluores-
cencia, de 0,25 mm de espesor (disponibles en el comercio ya
preparadaspara el us o).
4.5. Hidróxido potásico en solución etanólica 0,2 N: disolver 13 g de hidró-
xido potásico en 20 ml de agua destilada y completar hasta un litro con
etanol.
4.6. Benceno para cromatografía (5.2.2).4.7. Acetona para cromatografía (5.2.2).
4.8. Hexano para cromatografía (5.2.2).
4.9. Éter etílico para cromatografía (5.2.2).4.10. Cloroformo de calidad para análisis.4.11. Solución de referencia para cromatografía en capa fina: colesterol o
fitosterol, solución al 0,5 % en cloroformo.
4.12. Solución de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2 % en etanol; para hacerla
ligeramente básica se añaden algunas gotas de solución alcohólica 2 N
de hidróxido potásico.
4.13. Piridina anhidra para cromatografía.4.14. Hexametildisilazano.4.15. Trimetilclorosilano.
4.16. Solución patrón de trimetilsililéteres de los alcoholes alifáticos de C
20a
C28; debe prepararse en el momento de utilización a partir de mezclas
de alcoholespuros .
4.17. 1-eicosanol, solución al 0,1 % (m/v) en cloroformo (patrón interno).4.18. Gasportador: hidrógeno o helio puro, de calidad para cromatografía de
gases.
4.19. Gas auxiliar: nitrógeno puro, de calidad para cromatografía de gases.
5. PROCEDIMIENTO5.1.Preparacióndelinsaponificable
5.1.1. Con la microjeringa de 500 µl, introducir en el matraz de 250 ml un
volumen de solucion de 1-eicosanol al 0,1 % en cloroformo (4.17) que
contenga una cantidad de 1-eicosanol correspondiente al 10 % aproxi-
madamente del contenido de alcoholesalifáticosen la alícuota de la
muestra para la determinación. Por ejemplo, para 5 g de muestra, añadir
250µl de la solución de 1-eicosanol al 0,1 %, si se trata de aceite de
oliva, y 1 500 µl si se trata de aceite de orujo de oliva.
Evaporar en corriente de nitrógeno hasta sequedad y, a continuación,
pesar con precisión, en el mismo matraz, 5 g de muestra seca y filtrada.
5.1.2. Añadir 50 ml de solución etanólica de hidróxido potásico 2 N, poner en
funcionamiento el refrigerante de reflujo y calentar al baño María con
ligera ebullición, agitando enérgica e ininterrumpidamente hasta que se
produzca la saponificación (la solución se vuelve límpida). Calentar
durante 20 minutosmásy, a continuación, añadir 50 ml de agua des ti-
lada por la parte superior del refrigerante; separar éste y enfriar el
matraz a 30 ºC aproximadamente.
5.1.3. Pasar cuantitativamente el contenido del matraz a una ampolla de
decantación de 500 ml, mediante varioslavadoscon un total de unos
50 ml de agua destilada. Agregar 80 ml aproximadamente de éteretílico, agitar enérgicamente durante unos 30 segundos y dejar reposar
hasta la completa separación de las fases (nota 1).
Separar la fase acuosa inferior pasándola a una segunda ampolla de
decantación. Efectuar otras dos extracciones de la fase acuosa por el
mismo procedimiento, utilizando cada vez de 60 a 70 ml de éter etílico.
Nota1: Las posibles emulsiones pueden eliminarse añadiendo una
pequeña cantidad de alcohol etílico o metílico con un pulveri-
zador.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 102
▼M19
5.1.4. Reunir lasfraccionesetéreasen una mis ma ampolla de decantación y
lavarlas con agua destilada (50 ml cada vez) hasta que el agua de
lavado presente reacción neutra.
Una vez eliminada el agua de lavado, desecar con sulfato sódico
anhidro y filtrar sobre sulfato sódico anhidro a un matraz de 250 ml
previamente pesado, lavando la ampolla y el filtro con pequeñas canti-
dadesde éter etílico.
5.1.5. Destilar el éter hasta que quede una pequeña cantidad; a continuación,
secar en vacío ligero o en corriente de nitrógeno y completar el secado
en estufa a 100 ºC durante 15 minutos aproximadamente; dejar enfriar
en un desecador y pesar.
5.2.Separacióndelafracciónalcohólica
5.2.1. Preparación de las placas básicas: sumergir completamente las placas
con gel de sílice (4.4) en la solución etanólica 0,2 N de hidróxido
potásico (4.5) durante 10 segundos; dejarlas en reposo; secarlas bien
bajo campana de aspiración durante dos horas y, por último, ponerlas
en estufa a 100 ºC durante una hora.
Sacarlas de la estufa y conservarlas en un desecador de cloruro de
calcio hasta el momento del uso (las placas sometidas a este tratamiento
deben utilizarse en el plazo de quince días como máximo).
Nota2: Si se utilizan placas básicas de gel de sílice para la separación
de la fracción alcohólica, ya no es necesario tratar el insaponi-
ficable con alúmina. De esta manera, se retienen en la línea de
aplicación todosloscomponentesde naturaleza ácida (ácidos
grasos y otros). Así se obtiene la banda de alcoholes alifáticos
y terpénicos netamente separada de la banda de esteroles.
5.2.2. Introducir en la cubeta de desarrollo de las placas una mezcla de
hexano-éter etílico 65:35 (v/v) hasta una altura de 1 cm aproximada-
mente (*).
Cerrar la cubeta con su correspondiente tapa y dejar transcurrir media
hora como mínimo, de forma que se alcance el equilibrio líquido-vapor.
En lascarasinterioresde la cubeta pueden colocars e tirasde papel de
filtro que se sumerjan en el eluyente: de esta manera el tiempo de desa-
rrollo se reduce casi un tercio y se obtiene una elución más uniforme y
regular de loscomponentes .
Nota3: A fin de que lascondicionesde elución s ean perfectamente
reproducibles, la mezcla debe cambiarse para cada prueba.
5.2.3. Preparar una solución de insaponificable (5.1.5) en cloroformo al 5 %
aproximadamente y, con la microjeringa de 100 µl, depositar 0,3 ml
de dicha solucion en la placa cromatográfica (5.2.1) a unos 2 cm de
uno de losbordes , formando una línea continua lo másfina y uniforme
posible. A la altura de la línea de aplicación se depositan, en un
extremo de la placa, de 2 a 3 µl de la solucion de referencia de
alcoholesalifáticos(4.11) para poder identificar la banda de alcoholes
alifáticosen el revelado.
5.2.4. Introducir la placa en la cubeta de desarrollo, preparada como se indica
en el punto 5.2.2. Deberá mantenerse una temperatura de entre 15 y
20 ºC. Tapar inmediatamente la cubeta con su tapa y dejar que se
produzca la elución hasta que el frente del disolvente se sitúe a 1 cm
aproximadamente del borde superior de la placa.
Sacar la placa de la cubeta y evaporar el disolvente en una corriente de
aire caliente o bien dejando la placa bajo campana de aspiración un
breve momento.
5.2.5. Pulverizar la placa ligera y uniformemente con la solución de 2,7-diclo-
rofluoresceína. Identificar la banda de alcoholes alifáticos mediante
comparación con la mancha obtenida con la solución de referencia;
marcar con lápiz negro el conjunto de la banda de alcoholesalifáticos
y de la banda inmediatamente superior correspondiente a los alcoholes
triterpénicos.
Nota4: La prescripción de recoger el conjunto de la banda de
alcoholesalifáticosy de la banda de alcoholesterpénicos
responde al hecho de que ésta, en las condiciones del método,
incluye cantidades significativas de alcoholes alifáticos.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 103
(*) En ciertos casos particulares, para obtener una buena separación de las bandas es
necesario emplear como eluyente la mezcla benceno-acetona 95/5 (v/v).
▼M19
5.2.6. Rascar con una espátula metálica el gel de sílice contenido en el área
delimitada. Introducir el material obtenido, finamente triturado, en el
embudo filtrante (3.7); añadir 10 ml de cloroformo caliente, mezclar
cuidadosamente con la espátula metálica y filtrar en vacío, recogiendo
el filtrado en el matraz cónico (3.8) acoplado al embudo filtrante.
Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter etílico (empleando
cada vez unos10 ml), recogiendo cada vez el filtrado en el mis mo
matraz cónico acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta obtener
un volumen aproximado de 4 a 5 ml, transvasar la solución residual al
tubo de 10 ml (3.9) previamente pesado, evaporar hasta sequedad
mediante calentamiento suave en corriente ligera de nitrógeno, recoger
con algunas gotas de acetona, evaporar de nuevo hasta sequedad, intro-
ducir en estufa a 105 ºC durante unos 10 minutos, dejar enfriar en el
desecador y pesar.
El residuo que queda en el tubo de ensayo está formado por la fracción
alcohólica.
5.3.Preparacióndelostrimetilsililéteres
5.3.1. Agregar al tubo que contiene la fracción de alcoholesel reactivo de
silanización formado por una mezcla de piridina, hexametildisilazano y
trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 5), a razón de 50 µl por mili-
gramo de alcoholesevitando toda abs orción de humedad (nota 6).
Nota5: Existen soluciones comerciales listas para el uso. Además,
también existen otros reactivos de silanización, como la bis-
trimetilsililtrifluoroacetamida + 1 % de trimetilclorosilano, que
se diluye en el mismo volumen de piridina anhidra.
Nota6: La eventual formación de una ligera opalescencia es normal y
no ocasiona ninguna interferencia. La formación de una flocu-
lación blanca o la aparición de una coloración rosa son indicios
de presencia de humedad o de deterioro del reactivo. En este
caso deberá repetirse la prueba.
5.3.2. Tapar el tubo y agitar cuidadosamente (sin invertir) hasta la total diso-
lución de los alcoholes. Dejar reposar al menos un cuarto de hora a
temperatura ambiente y centrifugar durante algunos minutos; la solu-
ción límpida queda lista para el análisis mediante cromatografía de
gases.
5.4.Cromatografíadegases
5.4.1. Operacionespreliminares : acondicionamiento de la columna
5.4.1.1. Colocar la columna en el cromatógrafo de gases, uniendo el extremo de
entrada al inyector conectado al sistema de fraccionamiento y el
extremo de salida al detector. Efectuar los controles generales del
equipo de cromatografía de gases (estanqueidad de los circuitos de
gases, eficacia del detector, eficacia del sistema de fraccionamiento y
del sistema de registro, etc.).
5.4.1.2. Si la columna se utiliza por vez primera, es conveniente acondicionarla
previamente. Hacer pasar un ligero flujo de gas a través de la columna,
encender después el equipo de cromatografía de gases e iniciar un
calentamiento gradual hasta alcanzar una temperatura superior al menos
en 20 ºC a la temperatura de trabajo (nota 7). Mantener dicha tempera-
tura durante 2 horascomo mínimo; a continuación, poner el equipo
completo en condicionesde funcionamiento [regulación del flujo de
gases y del fraccionamiento ( split), encendido de la llama, conexión
con el registrador electrónico, regulación de la temperatura del horno,
del detector y del inyector, etc.] y registrar la señal con una sensibilidad
al menos dos veces superior a la prevista para el análisis. El trazado de
la línea de base debe ser lineal, estar exento de picos de cualquier tipo
y no debe presentar deriva. Una deriva rectilínea negativa indica que las
conexiones de la columna no son totalmente estancas; una deriva posi-
tiva indica que el acondicionamiento de la columna esins uficiente.
Nota7: La temperatura de acondicionamiento debe ser siempre inferior
en, como mínimo, 20 ºC a la temperatura máxima prevista para
la fase estacionaria utilizada.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 104
▼M19
5.4.2. Elección de lascondicionesde trabajo
5.4.2.1. Las condiciones de trabajo sugeridas son las siguientes:
— temperatura de la columna: inicialmente isoterma durante 8 minutos
a 180 ºC; a continuación, programar un incremento de 5 ºC/minuto
hasta alcanzar los 260 ºC y mantener después 15 minutos a 260 ºC,
— temperatura del evaporador (inyector): 280 ºC,
— temperatura del detector: 290 ºC,— velocidad lineal del gasportador: helio 20 a 35 cm/s , hidrógeno 30
a 50 cm/s,
— relación de fraccionamiento ( split): de 1/50 a 1/100,
— sensibilidad del instrumento: de 4 a 16 veces la atenuación mínima,
— sensibilidad de registro: 1 a 2 mV f.e.,
— velocidad del papel: 30 a 60 cm/hora,
— cantidad de sustancia inyectada: 0,5 a 1 µl de solución de TMSE.
Estas condiciones pueden modificarse en función de las características
de la columna y del cromatógrafo, de modo que se obtengan cromato-
gramas que cumplan los siguientes requisitos:
— el tiempo de retención del alcohol C
26debe ser de 18 ± 5 minutos,
— el pico del alcohol C22debe ser el 80 ± 20 % de la escala de fondo
en el caso del aceite de oliva y el 40 ± 20 % de la escala de fondo
en el caso del aceite de semillas.
5.4.2.2. Para comprobar los requisitos citados, efectuar varias inyecciones de
mezclasproblema de TMSE de alcoholesy ajus tar lascondicionesde
trabajo para obtener los mejores resultados.
5.4.2.3. Los parámetros de integración de los picos deben establecerse de modo
que se obtenga una evaluación correcta de las áreas de los picos
tomadosen cons ideración.
5.4.3. Realización del análisis
5.4.3.1. Con la microjeringa de 10 µl tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µld e
aire y, a continuación, entre 0,5 y 1 µl de la solución problema; elevar
el émbolo de la jeringa de modo que la aguja quede vacía. Introducir la
aguja a travésde la membrana del complejo de inyección y, des puésde
1 o 2 segundos, inyectar rápidamente; transcurridos unos 5 segundos,
extraer la aguja lentamente.
5.4.3.2. Continuar el registro hasta la completa elución de los TMSE de los
alcoholes presentes. La línea de base debe ajustarse en todo momento
a lascondicionesexigidas(5.4.1.2).
5.4.4. Identificación de lospicos
Para la identificación de losdiferentespicoss e utilizan lostiemposde
retención y la comparación con la mezcla de TMSE de losalcoholes
alifáticos, analizada en las mismas condiciones.
La figura 1 muestra un cromatograma de la fracción alcohólica de un
aceite de oliva virgen.
5.4.5. Determinación cuantitativa
5.4.5.1. Calcular lasáreasde lospicosdel 1-eicos anol y de losalcoholesalifá-
ticosC22,C24,C26yC28utilizando el integrador.
5.4.5.2. Calcular del modo siguiente el contenido de cada uno de los alcoholes
alifáticos, expresado en miligramos por 1 000 gramos de materia grasa:
donde:
Ax= área del pico del alcohol x
As= área del pico del 1-eicosanol
ms= peso de 1-eicosanol añadido, en miligramos
m = peso de la muestra tomada para la determinación, en gramos.1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 105
▼M19
6. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Se expresa el contenido de cada uno de los alcoholes alifáticos en mili-
gramos por 1 000 gramos de materia grasa y su suma como «alcoholes
alifáticostotales .».1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 106
▼M19
APÉNDICE
Determinación delavelocidad linealdelgas
Inyectar en el cromatógrafo de gases, preparado para trabajar en condiciones
normales, de 1 a 3 µl de metano (o propano) y medir el tiempo que tarda el
gas en recorrer la columna, desde el momento de la inyección hasta el momento
en que aparece el pico (tM).
La velocidad lineal en cm/sviene dada por L/tM, s iendo L la longitud de la
columna en cm y tM el tiempo, expresado en segundos.
Figura 1 — Cromatograma de la fracción alcohólica de un aceite virgen
1 = Eicosanol
2 = Docosanol
3 = Tricosanol4 = Tetracosanol
5 = Pentacosanol
6 = Hexacosanol7 = Heptacosanol8 = Octacosanol1991R2568 — ES — 01.11.2003 — 020.002 — 107