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►B REGLAMENTO (CE) No86/94 DE LA DE LA COMMISIÓN
de 19 de enero de 1994
por el que se establece un método de referencia para la determinación del contenido de sitosterol y
estigmasterol en la mantequilla
(DO L 17 de 20.1.1994, p. 7)
Modificado por:
Diario Oficial
no página fecha
►M1 Reglamento (CE) no175/1999 de la Comisión de 26 de enero de 1999 L 20 22 27.1.1999
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REGLAMENTO (CE) No86/94 DE LA DE LA COMMISIÓN
de 19 de enero de 1994
por el que se establece un método de referencia para la determina-
ción del contenido de sitosterol y estigmasterol en la mantequilla
LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,
Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea,
Visto el Reglamento (CEE) no804/68 del Consejo, de 27 de junio de
1968, por el que se establece la organización común de mercados en elsector de la leche y de los productos lácteos (
1), cuya última modifica-
ción la constituye el Reglamento (CEE) no2071/92 (2), y, en particular,
el apartado 7 de su artículo 6,
Considerando que la mantequilla puede marcarse y que los productos
marcados deben controlarse con arreglo a los artículos 3 y 6 del Regla-
mento (CEE) no570/88 de la Comisión (3), cuya última modificación la
constituye el Reglamento (CE) no3049/93 (4);
Considerando que, para prevenir el riesgo de uso indebido de mante-
quilla subvencionada, es necesario que se cumplan estrictamente lascondiciones de marcado de la mantequilla;
Considerando que, habida cuenta de la importancia del marcado para el
correcto funcionamiento del sistema, es necesario establecer métodoscomunes para la detección de todos los marcadores que éste requiera,aplicables por igual en toda la Comunidad; que con ello se pretende, enparticular, garantizar un trato equitativo a todos los agentes económicosque se acojan a estos sistemas y eliminar las diferencias de las condi-ciones de competencia que pueden existir actualmente debido a losdiferentes métodos de análisis nacionales;
Considerando que el Reglamento (CEE) n
o3942/92 de la Comisión (5)
establece un método de referencia para la determinación del contenidode sitosterol y estigmasterol en el butteroil; que este método puedeaplicarse, con ligeras modificaciones, a la determinación de los marca-dores de esteroles en la mantequilla;
Considerando la necesidad de determinar la precisión del método y sus
límites de tolerancia;
Considerando que las medidas previstas en el presente Reglamento se
ajustan al dictamen del Comité de gestión de la leche y de los productoslácteos,
HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO:
Artículo 1
El método de análisis de referencia que se utilizará para determinar el
contenido de estigmasterol o de β-sitosterol en la mantequilla con
arreglo al artículo 6 del ►M1Reglamento (CE) no2571/97 ◄es el
que figura en el Anexo.
(1)D OnoL 148 de 28. 6. 1968, p. 13.
(2)D OnoL 215 de 30. 7. 1992, p. 64.
(3)D OnoL 55 de 1. 3. 1988, p. 31.
(4)D OnoL 273 de 5. 11. 1993, p. 7.
(5)D OnoL 399 de 31. 12. 1992, p. 29.
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La mantequilla habrá sido correctamente marcada cuando los resultadosobtenidos respondan a los requisitos enunciados en el apartado 8 delAnexo.
Artículo 2
El presente Reglamento entrará en vigor el tercer día siguiente al de su
publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas .
Será aplicable a partir del 1 de abril de 1994.
El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y
directamente aplicable en cada Estado miembro.
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ANEXO
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE SITOSTEROL Y ESTIGMAS-
TEROL EN LA MANTEQUILLA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE
GASES EN COLUMNA CAPILAR
1. OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN
El presente método describe un procedimiento para la determinación del
contenido de sitosterol y estigmasterol en la mantequilla. Se considerasitosterol la suma de β-sitosterol y 22-dihidro- β-sitosterol; los demás
sitosteroles se consideran sin importancia. Se utilizarán muestras reci-bidas de conformidad con el Reglamento (CEE) n
o570/88.
2. PRINCIPIO
Saponificación de la mantequilla con una solución etanólica de hidró-
xido de potasio y extracción de los insaponificables con éter dietílico.
Los esteroles se transforman en trimetilsililéteres y se analizan mediante
cromatografía de gases en columna capital con referencia a un patróninterno de betulina.
3. MATERIAL
3.1. Matraz de saponificación de 150 ml, provisto de refrigerante de reflujo
con juntas esmeriladas.
3.2. Ampollas de decantación de 500 ml.3.3. Matraces de 250 ml.3.4. Embudos compensadores de presión, de 250 ml o similares, para recoger
el sobrante de éter dietílico.
3.5. Columna de vidrio de 350 mm × 20 mm provista de un tapón de vidrio
sinterizado.
3.6. Baño maría u otro sistema termostatizado.3.7. Viales para reacción de 2 ml.3.8. Equipo de cromatografía de gases que pueda funcionar con columna
capilar, provisto de un sistema de división de flujo y formado por:
3.8.1. Una cámara termostática para columnas, capaz de mantener la tempera-
tura deseada con una precisión de ± 1 °C.
3.8.2. Una unidad de vaporización de temperatura ajustable.
3.8.3. Un detector de ionización de llama y convertidor-amplificador.3.8.4. Un integrador-registrador que pueda funcionar con el convertidor-ampli-
ficador (3.8.3).
3.9. Columna capilar de sílice fundida, recubierta completamente de BP1 o
material equivalente, con un espesor uniforme de 0,25 µm; la columnadebe ser capaz de separar los trimetilsililderivados del lanosterol y delsitosterol; es adecuada una columna con BP1, de 12 m de longitud y 0,2mm de diámetro interior.
3.10. Microjeringa de 1 µl para cromatografía de gases, con aguja endurecida
(3.8.2).
4. REACTIVOS
Todos los reactivos deberán ser de grado analítico reconocido. El agua
utilizada deberá ser agua destilada o de pureza al menos equivalente.
4.1. Etanol de una pureza mínima del 95 %.4.2. Solución de hidróxido de potasio al 60 %: disolver 600 g de hidróxido
de potasio (del 85 % como mínimo) en agua y completar hasta un litrocon agua.
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4.3. Betulina de una pureza mínima del 99 %.
4.3.1. Soluciones de patrón interno. Betulina en éter dietílico (4.4):
4.3.1.1. La concentración de la solución de betulina usada para la determinación
del contenido de sitosterol será de 1,0 mg/ml.
4.3.1.2. La concentración de la solución de betulina usada para la determinación
del contenido de estigmasterol será de 0,4 mg/ml.
4.4. Éter dietílico de calidad para análisis (sin peróxidos ni residuos).4.5. Sulfato sódico anhidro granulado, secado previamente a 102 °C durante
dos horas.
4.6. Reactivo de sililación, por ejemplo TRI-SIL (distribuido por Pierce
Chemical Co, número de catálogo 49001) o equivalente. (ATENCIÓN:el TRI-SIL es tóxico, inflamable, corrosivo y posiblemente cancerígeno.El personal de laboratorio deberá conocer bien las medidas de seguridadpara trabajar con TRI-SIL y adoptar las debidas precauciones.)
4.7. Lanosterol.4.8. Sitosterol de una pureza conocida del 90 % como mínimo (P).
Nota 1: La pureza de los materiales patrón utilizados para el calibrado
deberá determinarse usando el método de normalización. Considéreseque todos los esteroles presentes en la muestra están representados en elcromatograma, que el área total de los picos representa el 100 % de loscomponentes esterólicos y que los esteroles dan la misma respuesta a ladetección. La linealidad del sistema deberá ser validada en la zona deconcentraciones de interés.
4.8.1. Solución patrón de sitosterol: preparar una solución que contenga apro-
ximadamente 0,5 mg/ml (W
1) de sitosterol (4.8) en éter dietílico (4.4),
con una precisión de 0,001 mg/ml.
4.9. Estigmaterol, de una pureza conocida del 90 % como mínimo (P).4.9.1. Solución patrón de estigmasterol: preparar una solución que contenga
aproximadamente 0,2 mg/ml (W
1) de estigmasterol (4.9) en éter dietílico
(4.4), con una precisión de 0,001 mg/ml.
4.10. Mezcla para la prueba de resolución: preparar una solución que
contenga 0,05 mg/ml de lanosterol (4.7) y 0,5 mg/ml de sitosterol enéter dietílico (4.4).
5. PROCEDIMIENTO
5.1. Preparación de las soluciones patrón para cromatografía.
La solución de patrón interno (4.3.1) debe añadirse a la solución patrón
de esterol correspondiente a la vez que se añade a la muestra saponifi-cada (véase 5.2.2).
5.1.1. Solución cromatográfica patrón de sitosterol; pasar 1 ml de solución
patrón de sitosterol (4.8.1 ) a 2 viales de reacción (3.7) y eliminar el éter
dietílico con una corriente de nitrógeno. Añadir 1 ml de solución depatrón interno (4.3.1.1) y eliminar el éter dietílico con una corriente denitrógeno.
5.1.2. Solución cromatográfica patrón de estigmasterol; pasar 1 ml de solución
patrón de estigmasterol (4.9.1) a 2 viales de reacción (3.7) y eliminar eléter dietílico con una corriente de nitrógeno. Añadir 1 ml de solución depatrón interno (4.3.1.2) y eliminar el éter dietílico con una corriente denitrógeno.
5.2. Preparación de los insaponificables.
5.2.1. Fundir la muestra de mantequilla a una temperatura que no exceda 35
°C, mezclar perfectamente la muestra removiéndola. Pesar en un matraz
de 150 ml (3.1) con precisión de 1 mg alrededor d e1gd e mantequilla
(W
2). Añadir 50 ml de etanol (4.1) y 10 ml de solución de hidróxido de
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potasio (4.2). Colocar el refrigerante de reflujo y calentar a unos 75 °C
durante 30 minutos. Desmontar el refrigerante y enfriar el matraz hastauna temperatura próxima a la del ambiente.
5.2.2. Añadir 1,0 ml de solución de patrón interno (4.3.1.1) al matraz si va a
determinarse el sitosterol, o bien (4.3.1.2) si se va a determinar elestigmasterol. Homogeneizar completamente. Pasar cuantitativamente elcontenido del matraz a una ampolla de decantación de 500 ml (3.2) ylavar el matraz por orden con 50 ml de agua y 250 ml de éter dietílico(4.4). Agitar enérgicamente la ampolla de decantación durante 2 minutosy dejar que se separen las fases. Eliminar la capa acuosa inferior y lavarla capa etérea agitándola sucesivamente con 4 porciones de 100 ml deagua.
Nota 2: Para evitar que se forme una emulsión, es fundamental que los
dos primeros lavados con agua se realicen suavemente (diez inver-siones). El tercer lavado puede hacerse agitando enérgicamente durante30 segundos. Si se forma una emulsión, puede deshacerse añadiendo de5 a 10 ml de etanol. Si se añade etanol, es necesario realizar otros doslavados enérgicos con agua.
5.2.3. Pasar la capa etérea transparente y exenta de jabones a través de una
columna de vidrio (3.5) que contenga 30 g de sulfato sódico anhidro(4.5). Recoger el éter en un matraz de 250 ml (3.3). Añadir material pararegular la ebullición y evaporar casi hasta sequedad con baño maría uotro sistema termostatizado, recogiendo los disolventes residuales.
Nota 3: Si los extractos de la muestra se llevan a sequedad completa a
una temperatura demasiado elevada, pueden darse pérdidas de esteroles.
5.3. Preparación de los trimetilsililéteres.
5.3.1. Pasar la solución etérea restante en el matraz a un vial de reacción de 2
ml (3.7) con 2 ml de éter dietílico y eliminar el éter con una corriente denitrógeno. Lavar el matraz dos veces con sendas porciones de 2 ml deéter dietílico, pasando el líquido al vial y eliminando el éter con nitró-geno cada vez.
5.3.2. Sililar la muestra añadiendo 1 ml de TRI-SIL (4.6). Cerrar el vial y
agitar enérgicamente para disolver el contenido. Si la disolución no escompleta, calentar hasta 65-70 °C. Dejar en reposo durante al menos 5
minutos antes de inyectar en el cromatógrafo de gases. Sililar lospatrones de la misma forma que las muestras. Sililar la mezcla para laprueba de resolución (4.10) de la misma forma que las muestras.
Nota 4: La siliación debe realizarse en ausencia de agua. Si la betulina
se silila de forma incompleta, aparece un segundo pico próximo al de labetulina.
La presencia de etanol en la fase de sililación interfiere con este proceso.
El etanol puede estar presente cuando el lavado en la fase de extracciónno es el adecuado. Si este problema persiste, puede realizarse un quintolavado, agitando enérgicamente durante 30 segundos, en la fase deextracción.
5.4. Análisis por cromatografía de gases.
5.4.1. Condiciones de funcionamiento:
Ajustar el cromatógrafo de gases con arreglo a las instrucciones del
fabricante.
Las condiciones de funcionamiento son las siguientes:
— temperatura de la columna: 265 °C
— temperatura del inyector: 280 °C
— temperatura del detector: 300 °C
— velocidad del gas portador: 0,6 ml/minuto— presión de hidrógeno: 84 kPa— presión del aire: 155 kPa
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— división de la muestra 10 : 1 a 50: 1; la proporción de división debe
optimizarse con arreglo a las instrucciones del fabricante, y despuésdebe validarse la linealidad de la respuesta del detector en toda la zonade concentraciones de interés.
Nota 5: Es fundamental limpiar regularmente la camisa del inyector.
— cantidad de sustancia inyectada: 1 µl de solución de TMSE.
Hay que dejar que el sistema se equilibre hasta obtener una respuesta de
estabilidad satisfactoria antes de comenzar el análisis.
Estas condiciones pueden modificarse según las características de la
columna y del cromatógrafo de gases con el fin de obtener cromato-gramas que cumplan los siguientes requisitos:
— el pico de sitosterol debe estar suficientemente separado del de
lanosterol. La figura 1 muestra un cromatograma típico como el quedebe obtenerse con una mezcla sililada para la prueba de resolución(4.10),
— los tiempos relativos de retención de los siguientes esteroles deben
aproximarse a los valores indicados a continuación:
Colesterol: 1,0
Estigmasterol: 1,3Sitosterol: 1,5Betulina: 2,5,
— el tiempo de retención de la betulina debe ser 24 minutos aproxima-
damente.
5.4.2. Procedimiento analítico:
Inyectar 1 µl de solución patrón sililada (estigmasterol o sitosterol) y
ajustar los parámetros de calibración del integrador.
Inyectar otra vez 1 µl de solución patrón sililada para determinar los
factores de respuesta en relación con la betulina.
Inyectar 1 µl de solución de muestra sililada y medir las áreas de los
picos. Cada tanda cromatográfica debe ir precedida y seguida por unainyección de patrones. Como orientación pueden incluirse seis inyec-ciones de muestra en cada tanda así controlada.
Nota 6: La integración del pico del estigmasterol debe incluir las
posibles colas según se define con los puntos 1 ,2y3d el a figura 2 b.
La integración del pico del sitosterol debe incluir el área del pico del
22-dihidro- β-sitosterol (estigmastanol) que eluye inmediatamente
después del sitosterol (véase la figura 3 b), cuando se evalúe el sitosteroltotal.
6. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
6.1. Determinar el área de los picos de los esteroles y de la betulina en los
dos patrones que preceden y siguen a una tanda y calcular R
1:
R1=Área media del pico del esterol en el patrón
Área media del pico de la betulina en el patrón
Determinar el área del pico del esterol (estigmasterol o sitosterol) y del
pico de la betulina en la muestra y calcular R2:
R2=Área del pico del esterol en la muestra
Área del pico de la betulina en la muestra
W1= Contenido en esterol del patrón (mg) incluido en 1 ml de solu-
ción patrón (4.8.1 o 4.9.1)
W2= peso de la muestra (g) (5.2.1)
P = pureza del esterol patrón (4.8 o 4.9)
Contenido en esterol de la muestra (mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
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▼B
7. PRECISIÓN DEL MÉTODO
7.1. Repetibilidad
7.1.1. Estigmasterol
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas
dentro del período de tiempo más breve posible, por un mismo operador,utilizando el mismo equipo y con el mismo material problema, nodeberá exceder de 19,3 mg/kg.
7.1.2. Sitosterol
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas en
el período de tiempo más breve posible, por un mismo operador, utili-zando el mismo equipo y con el mismo material problema, no excederádel 23,0 mg/kg respecto a la media de las determinaciones.
7.2. Reproducibilidad
7.2.1. Estigmasterol
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas por
operadores de diferentes laboratorios, utilizando equipos diferentes ycon el mismo material problema, no excederá de 31,9 mg/kg.
7.2.2. Sitosterol
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas por
operadores de diferentes laboratorios, utilizando equipos diferentes ycon el mismo material problema, no excederá del 8,7 % respecto a lamedia de las determinaciones.
7.3. Fuente de los datos sobre la precisión
Los datos sobre la precisión proceden de un experimento realizado en
1992 en el que participaron ocho laboratorios y seis muestras (tresduplicados ciegos) para el estigmasterol y seis muestras (tres duplicadosciegos) para el sitosterol.
8. LÍMITES DE TOLERANCIA
▼
M1
8.1. Deben tomarse tres muestras del producto marcado para comprobar su
correcto marcado.
▼B
8.2. Estigmasterol
8.2.1. La proporción de incorporación del estigmasterol es de 150 gramos de
estigmasterol de una pureza mínima del 95 % por tonelada de mante-quilla, es decir, 142,5 mg/kg; o bien 170 gramos de estigmasterol de unapureza mínima del 85 % por tonelada de mantequilla, es decir, 144,5mg/kg.
▼
M1
8.2.2. Los resultados de las tres muestras obtenidos del análisis del producto
se utilizarán para comprobar la proporción y la homogeneidad de laincorporación del marcador y el resultado más bajo se comparará conlos límites siguientes [teniendo en cuenta la diferencia crítica de un nivelde probabilidad del 95 % (CrD95)]:
— 116,0 mg/kg (el 95 % de la proporción de incorporación mínima
corresponde a estigmasterol de una pureza mínima del 95 %),
— 118,0 mg/kg (el 95 % de la proporción de incorporación mínima
corresponde a estigmasterol de una pureza mínima del 85 %);
— 81,0 mg/kg (el 70 % de la proporción de incorporación mínima
corresponde a estigmasterol de una pureza mínima del 95 %),
— 82,0 mg/kg (el 70 % de la proporción de incorporación mínima
corresponde a estigmasterol de una pureza mínima del 85 %).
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▼M1
La concentración de marcador de la muestra que proporcione el resul-
tado más bajo se utilizará junto con la interpolación entre 116,0 mg/kg y81,0 mg/kg, o entre 118,0 mg/kg y 82,0 mg/kg, respectivamente.
▼
B
8.3. Sitosterol
8.3.1. La proporción de incorporación de sitosterol es de 600 gramos de
sitosterol de una pureza del 90 % por tonelada de mantequilla, es decir,540 mg/kg.
▼
M1
8.3.2. Los resultados de las tres muestras obtenidos del análisis del producto
se utilizarán para comprobar la proporción y la homogeneidad de laincorporación del marcador y el resultado más bajo se comparará conlos límites siguientes [teniendo en cuenta la diferencia crítica de un nivelde probabilidad del 95 % (CrD95)]:
— 486,0 mg/kg (el 95 % de la proporción de incorporación mínima
corresponde a sitosterol de una pureza mínima del 90 %),
— 358,0 mg/kg (el 70 % de la proporción de incorporación mínima
corresponde a sitosterol de una pureza mínima del 90 %).
La concentración de marcador de la muestra que proporcione el resul-
tado más bajo se utilizará junto con la interpolación entre 486,0 mg/kg y358,0 mg/kg.
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▼M1

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▼
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