*****

ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΟΚ) αριθ. 1864/90 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

της 29ης Ιουνίου 1990

για την τροποποίηση του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 περί της λήψεως και αναγωγής δειγμάτων καθώς και των μεθόδων αναλύσεως των ελαιούχων σπόρων

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας,

τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 136/66/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 22ας Σεπτεμβρίου 1966 περί κοινής οργανώσεως της αγοράς στον τομέα των λιπαρών ουσιών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 2902/89 (2), και ιδίως το άρθρο 24α,

Εκτιμώντας:

ότι η ονομασία «διπλό μηδέν» για τους κραμβόσπορους και τους γογγυλόσπορους εξαρτάται από την περιεκτικότητα σε γλυκοζινικές ουσίες· ότι για να καθοριστεί η περιεκτικότητα αυτή πρέπει να προβλεφθεί καταλληλότερη μέθοδος·

ότι ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 της Επιτροπής (3), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 2435/86 (4), καθόρισε την κοινή μέθοδο για την Κοινότητα για τον καθορισμό της περιεκτικότητας σε γλυκοζινικές ενώσεις των κραμβόσπορων· ότι, έκτοτε, τελειοποιήθηκε και δοκιμάσθηκε καλύτερη μέθοδος αναλύσεως και πρέπει, συνεπώς, να τροποποιηθεί η κοινή μέθοδος για την Κοινότητα καθορισμού της περιεκτικότητας σε γλυκοζινικές ενώσεις·

ότι τα μέτρα που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Επιτροπής Διαχείρισης Λιπαρών Ουσιών,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:

Άρθρο 1

Το παράρτημα VIII του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 αντικαθίσταται από το παράρτημα του παρόντος κανονισμού.

Άρθρο 2

Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την ημέρα της δημοσίευσής του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.

Εφαρμόζεται από την 1η Ιουλίου 1990.

Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.

Βρυξέλλες, 29 Ιουνίου 1990.

Για την Επιτροπή

Ray MAC SHARRY

Μέλος της Επιτροπής

(1) ΕΕ αριθ. 172 της 30. 9. 1966, σ. 3025/66.

(2) ΕΕ αριθ. L 280 της 29. 9. 1989, σ. 2.

(3) ΕΕ αριθ. L 239 της 28. 9. 1968, σ. 2.

(4) ΕΕ αριθ. L 210 της 1. 8. 1986, σ. 55.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

«ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VIII

ΕΛΑΙΟΥΧΟΙ ΣΠΟΡΟΙ - ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΥΚΟΖΙΝΟΛΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC)

1.2 // // // 1. // ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ // // Το παρόν παραρτημα καθορίζει μια μέθοδο προσδιορισμού διαφόρων γλυκοζινολικών ενώσεων σε ελαιούχους σπόρους ειδών Brassica, ειδικότερα στον κραμβόσπορο, με χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης. Η μέθοδος αυτή δεν προσδιορίζει γλυκοζινολικές ενώσεις υποκατεστημένες στο μόριο της γλυκόζης, αλλά οι ουσίες αυτές έχουν μικρή σημασία για την ελαιοκράμβη του εμπορίου. // 2. // ΑΝΑΦΟΡΕΣ // // Η προπαρασκευή των δειγμάτων για ανάλυση πρέπει να γίνει σύμφωνα με τα σχετικά παραρτήματα του παρόντος κανονισμού. Ειδικότερα, τα εξής παραρτήματα είναι σημαντικά: // // Παράρτημα ΙΙ - Αναγωγή των λαμβανόμενων δειγμάτων σε δείγματα για ανάλυση. // // Παράρτημα ΙΙΙ - Προσδιορισμός περιεκτικότητας σε υγρασία και πτητικές ουσίες. // 3. // ΑΡΧΗ // // Οι γλυκοζινολικές ενώσεις εκχυλίζονται σε διάλυμα μεθανόλης, καθαρίζονται και αποθειώνονται ενζυματικά με τη βοήθεια στήλης ιοντοανταλλακτικών ρητινών. Προσδιορίζονται με χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης - ανάστροφης φάσης με διαβάθμιση διαλυτών και ανίχνευση υπεριώδους ακτινοβολίας (UV). // 4. // ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ // // Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικού βαθμού και το χρησιμοποιούμενο νερό πρέπει να είναι αποσταγμένο ή τουλάχιστον ισοδύναμης καθαρότητας. // 4.1. // Μεθανόλη, διάλυμα 70 % (V/V) σε νερό. // 4.2. // Οξικό νάτριο, διάλυμα 0,02 mol/l σε pH 4,0. // 4.3. // Οξικό νάτριο, διάλυμα 0,2 mol/l. // 4.4. // Μυρμηγκικό ιμιδαζόλιο, διάλυμα 6 mol/l. Διαλύονται 204 g ιμιδαζόλιο με 113 ml μυρμηγκικού οξέος σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml. Αραίωση με νερό μέχρη όγκου 500 ml. // 4.5. // Εσωτερικό πρότυπο. // // Χρησιμοποιείται σινιγκρίνη (μονοένυδρο αλλυλγλυκοζινολικό κάλιο, ΜΒ=415,49) της οποίας η καθαρότητα πρέπει να έχει ελεγχθεί σύμφωνα με τους όρους του σημείου 4.5.3. // 4.5.1. // Διάλυμα σινιγκρίνης 5 mmol/l // // Διαλύονται 207,7 mg μονοένυδρου αλλυλγλυκοζινολικού καλίου σε νερό σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι το μηνίσκο. // 4.5.2. // Διάλυμα σινιγκρίνης 20 mmol/l // // Διαλύονται 831,0 mg μονοένυδρου αλλυλγλυκοζινολικού καλίου σε νερό σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι το μηνίσκο. // // Τα διαλύματα αυτά διατηρούνται σε ψυγείο, στους 4° C περίπου, εάν η διατήρηση διαρκεί μια σύντομη περίοδο (π.χ. μια εβδομάδα) ή σε κατάψυκτη στους - 18° C για μεγαλύτερες περιόδους. // 4.5.3. // Έλεγχος καθαρότητας συνιγκρίνης. // // Χρησιμοποιείται ένα ή περισσότερα από τα ακόλουθα είδη δοκιμών: // // - ανάλυση με HPLC, χρησιμοποιώντας την παρούσα μέθοδο πρέπει να εμφανίσει μόνο μία κύρια κορυφή, // // - ανάλυση με ανέπαφης σινιγκρίνης με HPLC (τεχνική ζεύγους ιόντων) πρέπει να εμφανίσει μόνο μία κύρια κορυφή, // // - ανάλυση του αποθειωμένου και σιλυλιωμένου παραγώγου της σινιγκρίνης με αέρια χρωματογραφία πρέπει να εμφανίσει μόνο μία κύρια κορυφή, // // // Κατά τις ανωτέρω δοκιμές, η κύρια κορυφή πρέπει να αντιπροσωπεύει τουλάχιστον το 98 % του συνολικού εμβαδού των κορυφών. // // Η επιβεβαίωση γίνεται με τον προσδιορισμό της ποσότητας της γλυκόζης που παράγεται από υδρόλυση με μυροσινάση (θειογλυκοζιδοκουδρολάση EC 3.2.3.1). Η γλυκόζη πρέπει να προσδιοριστεί με ενζυματικά μέσα, χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό πακέτο ανάλυσης. Είναι απαραίτητο να υπολογιστεί η πιθανή παρουσία ελεύθερης γλυκόζης η οποία πρέπει να προσδιοριστεί χωρίς προσθήκη μυροσινάσης. Η μοριακή συγκέντρωση της προσδιοριζόμενης γλυκόζης πρέπει να αντιστοιχεί τουλάχιστον στο 98 % της μοριακής συγκέντρωσης του ελεγχόμενου διαλύματος σινιγκρίνης. // 4.5.4. // Εναλλακτικό εσωτερικό πρότυπο: γλυκοτροπεολίνη. // // Σε ορισμένους σπόρους των ειδών Brassica ή σε σπόρους παρόμοιων ειδών (καλλιεργούμενων ή αυτοφυών) η σινιγκρίνη μπορεί να απαντάται φυσικά. Όταν η σινιγκρίνη απαντάται φυσικά, πρέπει να χρησιμοποιηθεί ένα άλλο εσωτερικό πρότυπο, η γλυκοτροπεολίνη (βενζολγλυκοζινολικό άλας καλίου, MB = 447,52), αλλά είναι μερικές φορές δύσκολο να διαχωριστεί από άλλες φυσικές δευτερεύουσες γλυκοζινολικές ενώσεις. // // Η γλυκοτροπεολίνη χρησιμοποιείται κατά τον ίδιο τρόπο (διαλύματα των 5 και 20 mmol/l) με τη σινιγκρίνη, μετά από έλεγχο της καθαρότητάς της σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο σημείο 4.5.3 και πιστοποίηση ότι ο συντελεστής σχετικής απόκρισής της, συγκριτικά με τη σινιγκρίνη, αντιστοιχεί στον αναφερόμενο στο σημείο 7.2. // 4.6. // Κινητές φάσεις. // 4.6.1. // Εκλουστικό (διαλύτης Α): νερό (ποιότητα HPLC). // 4.6.2. // Εκλουστικό (διαλύτης Β): ακετονιτρίλιο (ποιότητα HPLC), διάλυμα 20 % (V/V) σε καθαρισμένο νερό (ποιότητα HPLC). Η συγκέντρωση μπορεί να τροποποιηθεί σε σχέση με τις χρησιμοποιούμενες στήλες. // 4.7. // Ιοντοανταλλακτική ρητίνη. // 4.7.1. // DEAE Sepharose CI-6B σε αιώρημα και προσφερόμενη στο εμπόριο έτοιμη για χρήση. // 4.7.2. // DEAE Sephadex A25 αιώρημα παρασκευαζόμενο ως εξής: // // Αναδεύονται 10 g ρητίνης σε περίσσεια οξικού οξέος 2 mol/l. Αφήνονται να κατακαθίσουν. Προστίθεται οξικό οξύ 2 mol/l έως ότου ο όγκος του αιωρήματος εξισωθεί με το διπλάσιο του όγκου του κατακαθισμένου υλικού. // 4.8. // Σουλφατάση, Helix promatia τύπος H1 (EC 3.1.6.1), προηγούμενα καθαρισμένη και ελεγμένη όπως αναφέρεται κατωτέρω, μετά σε αραίωση. // 4.8.1. // Προπαρασκευή των ιοντοεναλλακτικών ρητινών. // // Πέντε σιφώνια Paster (5.9) τέμνονται 7 cm πάνω από το σημείο στένωσης, όπου τοποθετείται πώμα από υαλοβάμβακα (5.8). Τα σιφώνια τοποθετούνται κάθερα σε υποστήριγμα και προστίθεται σε καθένα από αυτά αιώρημα ιοντοανταλλακτικής ρητίνης DEAE Sepharose C1-6B (4.7.1) έτσι ώστε, όταν το νερό αποστραγγιστεί, να απομείνει όγκος 500 μl ρητίνης. // // Σε κάθε σιφώνιο προστίθεται 1 ml διαλύματος μυρμηγκικού ιμιδαζόλιου (6 mol/l) (4.4) και εκπλύεται δύο φορές με 1 ml νερό. // 4.8.2. // Καθαρισμός της σουλφατάσης. // // Ζυγίζονται, με ακρίβεια 0,1 mg, 25 mg Helix pomatia τύπου H1, διαλύονται σε 2,5 ml νερού και 500 μl του διαλύματος αυτού προστίθενται σε καθεμία από τις αναγεννημένες στήλες (4.8.1). Κάθε στήλη εκπλύεται με 1,5 ml νερό, απομακρύνοντας το έκλουσμα. Μετά προστίθενται 1,5 ml διαλύματος 0,2 mol/l οξικού νατρίου (4.3), τα εκλούσματα από τις πέντε στήλες ανακτούνται και συλλέγονται. // // Τα εκλούσματα συμπυκνώνονται με διήθηση μέσα από φίλτρο millipore PTGC 11K25 έως ότου ένα υπόλειμμα περίπου 100 μl παραληφθεί (σουλφατάση μοριακής μάζας μεγαλύτερης από 5 000 δεν απομακρύνεται). Προστίθενται 2,5 ml νερού και ακολουθεί για άλλη μια φορά συμπύκνωση με διήθηση έως ότου ένα υπόλειμμα περίπου 100 μl παραληφθεί. Αραιώνεται στα 2,5 ml με νερό και η καθαρισμένη σουλφατάση διατηρείται σε καταψυκτή στους - 18° C (σε μικρές ποσότητες ώστε να είναι δυνατή η απόψυξη της απαραίτητης ποσότητας για άμεση χρήση). // 4.8.3. // Μέτρηση της δραστικότητας της σουλφατάσης. // 4.8.3.1. // Παρασκευή διαλύματος σινιγκρίνης 0,5 mmol/l, ρυθμισμένου σε pH 5,8.

// // Παρασκευάζονται, διαδοχικά, τα ακόλουθα διαλύματα: // // α) προστίθεται 1 ml οξικού οξέος σε φιάλη των 500 ml και ο όγκος συμπληρώνεται με νερό μέχρι το μηνίσκο· // // β) προστίθεται 1 ml αιθυλενοδιαμίνης σε φιάλη 500 ml και όγκος συμπληρώνεται με νερό μέχρι το μηνίσκο· // // // γ) αναμειγνύονται 73 ml διαλύματος του στοιχείου α) και 400 ml διαλύματος του στοιχείου β)· // // δ) προσαρμογή σε pH 5,8 με διάλυμα του στοιχείου α) ή β). // // Προστίθενται 3 ml του διαλύματος σινιγκρίνης 5 mmol/l (4.5.1) σε φιάλη των 100 ml και ο όγκος συμπληρώνεται με διάλυμα του στοιχείου γ) μέχρι το μηνίσκο. // 4.8.3.2. // Μέτρηση δραστικότητας.

// // Μία μονάδα δραστικότητας ορίζεται η παραγωγή 1 micromole (μικρογραμμομόριου) αποθειωμένης σινιγκρίνης ανά λεπτό στους 30° C και pH 5,8. // // Για τη μέτρηση, προστίθενται 2 ml του ρυθμισμένου διαλύματος σινιγκρίνης (4.8.3.1) στις κυψελίδες αναφοράς και μέτρησης του φασματοφωτομέτρου (5.3), ρυθμισμένου σε μήκος κύματος 228 nm και θερμοκρασία κυψελίδας 30° C. Σε χρόνο t = 0, προστίθενται 50 μl καθαρισμένης σουλφατάσης (4.8.2) στην κυψελίδα μέτρησης και τίθεται σε λειτουργία ο καταγραφέας. Η λειτουργία του καταγραφέα τερματίζεται όταν η απορρόφηση δεν καταβάλλεται πλέον (Ae), φέρεται η εφαπτομένη σε σημείο t = 0 και υπολογίζεται η κλίση Δ A Δ t . // // Η δραστικότητα της σουλφατάσης, εκφρασμένη σε μονάδες δραστικότητας ανά χιλιοστόλιτρο (ml) διαλύματος σουλφατάσης, είναι ίση με: 1.2.3.4.5.6.7 // // Δ A Δ t // x // V Δ E // x // 1 000 50 // x 106 1.2 // // όπου: 1.2.3 // // Δ A Δ t // είναι η κλίση της εφαπτομένης στο σημείο t = 0,σε μονάδες απορρόφησης ανά λεπτό // // V // είναι ο όγκος σε λίτρα του αντιδρώντος μέσο (π.χ. 2,0510 x 10-31). // // Δ E // είναι η διαφορά μεταξύ των συντελεστών μοριακής απόσβεσης της σινιγκρίνης και της αποθειωμένης σινιγκρίνης στα 228 nm. 1.2.3.4 // // // Δ E = // Δ Ae e x c 1.2.3 // // // όπου: 1.2.3.4 // // // Δ Ae // είναι η διαφορά μεταξύ της απορρόφησης σε ισοροπία της αποθειωμένης σινιγκρίνης και απορρόφησης σε χρόνο t = 0. // // // e // είναι το μήκος της κυψελίδας, σε εκατοστόμετρα (cm), (π.χ. 1 cm). // // // c // είναι η συγκέντρωση της αποθειωμένης σινιγκρίνης σε ισορροπία, σε γραμμομόρια ανά λίτρο moles/l) 1.2.3.4.5.6 // // // // c = // 0,15 x 10-3 x 0,95 x 2 2,05 // = 1,39 x 10-4 mol/l 1.2 // // Η απόδοση σε ισορροπία της αποθείωσης της σινιγκρίνης είναι 0,95. // // Το υπολογιζόμενο ΔE, πρέπει να είναι της τάξης των 1 500 l.mol-1. cm-1. // // Η δραστικότητα της σουλφατάσης μπορεί επίσης να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την εξής απλοποιημένη εξίσωση: 1.2.3 // // Δραστικότητα = // Δ A x 5,7 Δ t x Δ Ae 1.2 // // Η ευρισκόμενη δραστικότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 0,5 μmol/min.ml, από διάλυμα καθαρής σουλφατάσης. // 4.8.4. // Αραίωση. // // Χρησιμοποιώντας ένα σιφώνιο, προστίθεται 1 ml καθαρής σουλφατάσης (4.8.2) σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml, ο όγκος συμπληρώνεται με νερό μέχρι το μηνίσκο και αναδεύεται. // // Το διάλυμα διαιρείται σε μικρές ποσότητες και διατηρείται στους - 18° C. // 5. // ΟΡΓΑΝΑ // // Βασικός εργαστηριακός εξοπλισμός, και ειδικότερα: // 5.1. // Διάταξη υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, με δυνατότητα διαβάθμισης διαλυτών και ρύθμισης της θερμοκρασίας της στήλης στους 30° C, συνδεδεμένη με ανιχνευτή ακτινοβολίας UV, επιτρέποντας μετρήσεις στα 229 nm. // 5.2. // Χρωματογραφική στήλη για HPLC, τύπου C18 ή C8 για μέγεθος σωματιδίων 5 μm, ή για παράδειγμα: 1.2.3 // // στήλη Lichrosorb RP 18 5 μm // (150 mm x 4,6 mm), // // στήλη Spherisorb OD 52 5 μm // (250 mm x 4-5 mm), // // στήλη Novapak C 18 4 μm // (150 mm x 4 mm), // // στήλη Lichrospher RP8 5 μm // (125 mm x 4 mm), // // στήλη Nuleosil C18 5 μm // (200 mm x 4 mm). 1.2 // 1.2 // // Η απόδοση της επιλεχθείσας στήλης πρέπει να ελέγχεται τακτικά, κατά προτίμηση χρησιμοποιώντας ένα δείγμα αναφοράς ελαιοκράμβης. Συνίσταται δείγμα αποθεωμένων γλυκοζινολικών ενώσεων, κατά προτίμηση από το γραφείο αναφορών της Κοινότητας. Ειδικότερα, η στήλη δεν πρέπει να αποδομεί την 4-υδροξυγλυκομπρασσικίνη, μια σημαντική αλλά σχετικά ασταθή γλυκοζινολική ένωση. // // Οι νέες στήλες πρέπει να υποβάλλονται σε προκαταρκτική λειτουργία έτσι ώστε να λαμβάνονται αναπαραγώγιμα αποτελέσματα. // 5.3. // Φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης, ικανό να λειτουργεί στο υπεριώδες και, εάν είναι δυνατό, σε ρυθμισμένη θερμοκρασία 30° C , εξοπλισμένο με κυψελίδες χαλαζία και, εάν είναι δυνατό, ένα σύστημα καταγραφής. // 5.4. // Μικρομύλος, για παράδειγμα ένας μύλος καφέ. // 5.5. // Φυγόκεντρος, για σωλήνες των 6 ml, ικανή για φυγόκεντρη επιτάχυνση των 5 000 g. // 5.6. // Υδρόλουτρο θερμού νερού ή με διάταξη θέρμανσης, ρυθμισμένης στους 75° C. // 5.7. // Σωλήνες πολυπροπενίου, χωρητικότητας 6 ml. // 5.8. // Υαλοβάμβακας. // 5.9. // Σιφώνια Pasteur, μήκους 150 mm. // 6. // ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ // 6.1. // Παρασκευή του δείγματος για ανάλυση. // // Το εργαστηριακό δείγμα ανάγεται σύμφωνα με το παράρτημα ΙΙ και αλέθεται σε μικρομύλο (5.4) επί 20 δευτερόλεπτα. Το άλεσμα αναμειγνύεται και αλέθεται επί άλλα 5 δευτερόλεπτα. // // Εάν οι σπόροι περιέχουν υγρασία πάνω από 10 % (m/m), αρχικά ξηραίνονται σε ρεύμα αέρα στους 45° C περίπου. // // Σημείωση: Όταν αναλύονται επεξεργασμένοι σπόροι, πριν αλεσθούν, καθαρίζονται με διχλωρομεθάνιο. // 6.2. // Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε υγρασία και πτητικές ουσίες. // // Προσδιορίζεται η περιεκτικότητα σε υγρασία και πτητικές ουσίες αναλυτικού δείγματος σύμφωνα με το παράρτημα ΙΙΙ. // 6.3. // Μέγεθος δείγματος (δοσολογία). // // Προετοιμάζονται 2 σωλήνες (5.7) και προστίθενται 200 mg δείγματος ελαιούχων σπόρων για ανάλυση ζυγισμένου με ακρίβεια 0,1 mg στο καθένα. // 6.4. // Εκχύλιση γλυκοζινολικών ενώσεων. // // Οι σωλήνες τοποθετούνται στο υδρόλουτρο με θερμό νερό ή διάταξη θέρμανσης (5.6) ρυθμισμένη στους 75° C και παραμένουν εκεί επί 1 λεπτό. Προστίθενται 2 ml θερμού διαλύματος μεθανόλης (70 %) (4.1) και αμέσως μετά προστίθενται: // // - στον πρώτο σωλήνα Α, 200 μl διαλύματος σινιγκρίνης 5 mmol/l (4.5.1), // // - στο δεύτερο σωλήνα Β, 200 μl διαλύματος σινιγκρίνης 20 mmol/l (4.5.2). // // Η θέρμανση στο υδρόλουτρο στους 75° C συνεχίζεται επί 10 λεπτά, με τακτική ανάδευση. Το περιεχόμενο κάθε σωλήνα αναδεύεται και φυγοκεντρείται με επιτάχυνση 5 000 g επί 3 λεπτά. Το υπερκείμενο κάθε διαλύματος μεταγγίζεται σε άλλο σωλήνα (5.7). // // Προστίθενται 2 ml θερμού διαλύματος μεθανόλης 70 % (4.1) σε κάθε ίζημα και επαναθερμαίνεται στο υδρόλουτρο στους 75° C επί 10 λεπτά, με τακτική ανάδευση. Φυγοκεντρείται επί 3 λεπτά και προστίθεται το υπερκείμενο στο αρχικό εκχύλισμα. Ο όγκος προσαρμόζεται στα 5 ml περίπου με νερό και το διάλυμα αναδεύεται. // // Το διάλυμα αυτό μπορεί να διατηρηθεί για 2 εβδομάδες, σε σκοτεινές συνθήκες, σε κατάψυξη στους - 18° C. // 6.5. // Προπαρασκευή των ιοντοανταλλακτικών ρητινών // // Ο απαιτούμενος αριθμός σιφωνίων Pasteur (5.9), π.χ. ένα σιφώνιο ανά δείγμα, τέμνεται έτσι ώστε να παραμένει όγκος 1,2 ml πάνω από το σημείο στένωσης και τοποθετείται πώμα από υαλοβάμβακα (5.8) στο σημείο αυτό. Τα σιφώνια τοποθετούνται κάθετα σε ένα υποστήριγμα. // // Αποτίθενται 0,5 ml από το καλά αναμεμειγμένο αιώρημα DEAE Sephadex A25 (4.7.2) σε κάθε στήλη και αφήνονται να κατακαθίσουν. // // Οι στήλες εκπλύονται με 2 ml μυρμηγκικού ιμιδαζόλιου 6 mol/l (4.4) και μετά δύο φορές με 1 ml νερό. //

// // // 6.6. // Καθαρισμός και αποθείωση. // // Στην προπαρασκευασμένη στήλη αποτίθεται 1 ml εκχυλίσματος (6.4) χωρίς να διαταραχθεί η επιφάνεια της ρητίνης και αφήνεται να στραγγίσει. Προστίθεται δύο φορές 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικού νατρίου των 0,02 mol/l σε pH 4,0 (4.2) αφήνοντας κάθε φορά να στραγγίσει. // // Αποτίθενται 75 μl αραιωμένου διαλύματος καθαρρισμένης σουλφατάσης (4.8.4). Αφήνεται να δράσει όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι παραγόμενες αποθειωμένες γλυκοζινολικές ενώσεις εκλούονται δύο φορές με νερό (ποιότητα HPLC) που αφήνεται να στραγγίσει πριν από κάθε προσθήκη. Το έκλουσμα συλλέγεται σε σωλήνα. Το έκλουσμα αναδεύεται καλά και διατηρείται, στο σκοτάδι, σε καταψύκτη στους - 18ο C εάν δεν πρόκειται να υποβληθεί αμέσως σε χρωματογραφία. // 6.7. // Δοκιμή αναφοράς. // // Εάν κριθεί απαραίτητο (βλέπε σημείο 7.3), εκτελείται μία δοκιμή αναφοράς κάτω από τις ίδιες συνθήκες σε ταυτόσημη δοσολογία δείγματος, αλλά παραλείποντας το διάλυμα εσωτερικού πρότυπου σινιγκρίνης, ώστε να ανιχνευθεί ποιοτικά και ποσοτικά κάθε πιθανή παρουσία σινιγκρίνης στο δείγμα. // 6.8. // Χρωματογραφία. // 6.8.1. // Ρύθμιση του οργάνου. // // Ταχύτητα ροής της κινητής φάσης: εξαρτάται από τη φύση της στήλης (βλέπε σημείο 6.8.2). // // Θερμοκρασία στήλης: 30ο C. // // Μήκος κύματος ανίχνευσης: 229 nm. // 6.8.2. // Κλίση (διαβάθμιση) δοκιμής και έκλουσης. // // Ακολουθώντας τις οδηγίες λειτουργίας του οργάνου ενίονται όχι περισσότερο από 50 μl διαλύματος αποθειωμένων γλυκοζινολικών παραληφθέντων από τη δοκιμή του σημείου 6.6. // // Ανάλογα με τη χρησιμοποιούμενη στήλη, ένας αριθμός κλίσεων διαλυτών μπορεί να είναι κατάλληλος. // // - Στήλη Spherisorb RP18 5 μm (150 mm x 4,6 mm): // // - 100 % διαλύτη Α (4.6.1) + 0 % διαλύτη Β (4.6.2) επί 1 λεπτό, // // - μία γραμμική κλίση έκλουσης επί 20 λεπτά μέχρις ότου 0 % διαλύτη Α και 100 % διαλύτη Β παραληφθούν, // // - μία γραμμική κλίση έκλουσης επί 5 λεπτά μέχρις ότου 100 % διαλύτη Α και 0 % διαλύτη Β παραληφθούν, // // - 100 % διαλύτη Α και 0 % διαλύτη Β επί 5 λεπτά προς εξισορρόπηση. // // - Στήλη Lichrosper RP8 5 μm (125 mm x 4,0 mm): // // - 100 % διαλύτη Α επί 2 λεπτά 30 δευτερόλεπτα, // // - μία γραμμική κλίση έκλουσης επί 18 λεπτά μέχρις ότου 0 % διαλύτη Α και 100 % διαλύτη Β παραληφθούν, // // - 100 % διαλύτη Β επί 5 λεπτά, // // - μία γραμμική κλίση έκλουσης επί 2 λεπτά 0 % διαλύτη Α + 100 % διαλύτη Β μέχρις ότου 100 % διαλύτη Α και 0 % διαλύτη Β παραληφθούν. // // - εξισορρόπηση επί 5 λεπτά. // // Σημείωση: Η κατανομή των κλίσεων μπορεί να τροποποιηθεί ώστε να δώσει βέλτιστους διαχωρισμούς ανάλογα με τις χρησιμοποιούμενες στήλες.

// 6.8.3. // Εξέταση των χρωματογραφημάτων. // // Υπολογίζονται μόνον οι κορυφές των γλυκοζινολικών με εμβαδόν μεγαλύτερο από 1 % του συνολικού αθροίσματος των εμβαδών των κορυφών. // // Η σειρά έκλουσης των κορυφών με στήλη τύπου C 18 και κλισή έκλουσης όπως στο σημείο 6.8.2, είναι, γενικά, η εξής: // // 1. Αποθειωμένη γλυκοϊμπερίνη // // 2. Αποθειωμένη προγοϊτρίνη // // 3. Αποθειωμένη επι-προγοϊτρίνη // // 4. Αποθειωμένη σινιγκρίνη // // 5. Αποθειωμένη γλυκοραφανίνη // // 6. Αποθειωμένη γλυκοαναπολειφερίνη // // 7. Αποθειωμένη γλυκοαλλυσίνη // // 8. Αποθειωμένη γλυκοαπίνη // // 9. Αποθειωμένη 4-υδροξυ-γλυκομπρασσικίνη // // 10. Αποθειωμένη γλυκομπρασσικαναπίνη // // 11. Αποθειωμένη γλυκοτροπεολίνη // // 12. Αποθειωμένη γλυκομπρασσικίνη // // 13. Αποθειωμένη γλυκοναστουρτιίνη // // 14. Αποθειωμένη 4-μεθοξυ-γλυκομπορασσικίνη // // 15. Αποθειωμένη νεογλυκομπρασσικίνη // // 7. // ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ // 7.1. // Υπολογισμός της περιεκτικότητας σε κάθε γλυκοζινολική ένωση. // // Η περιεκτικότητα σε κάθε γλυκοζινολική ένωση, εκφρασμένη σε μικρογραμμάρια ανά γραμμάριο (micromoles/gram) ολόκληρων ξηρών σπόρων, ισούτε με:

1.2.3.4 // // εμβαδόν κορυφής αποθειωμένης γλυκοζινολικής ένωσης

εμβαδόν κορυφής αποθειωμένης σινιγκρίνης

// x // ποσότητα εσωτερικού προτύπου προστεθείσα στο σωληνάριο κατά την 6.4 (μmol)

βάρος εκχυλισθέντων σπόρων στο δείγμα

1.2.3.4 // // x σχετικός συντελεστής απόκρισης της αποθειωμένης γλυκοζινολικής ένωσης (7.2) // x // 100

100 - Η 1.2 // όπου: // // // Η είναι η περιεκτικότητα σε υγρασία και πτητικές ουσίες, εκφρασμένη σαν ποσοστό επί της μάζας, του αναλυτικού δείγματος (6.2). // // Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα αποτελέσματα πρέπει να εκφραστούν σε βάσει ορισμένου ποσοστού (προς το παρόν 9 %). Στις περιπτώσεις αυτές τοι αποτέλεσμα που υπολογίστηκε για την ξηρή ουσία πολλαπλασιάζεται με // // (100 - υγρασία)

100

// 7.2. // Σχετικοί συντελεστές απόκρισης. // // Οι τιμές των σχετικών συντελεστών απόκρισης έχουν προσδιοριστεί πειραματικά· έχουν ληφθεί σαν σταθερές μετά από συμφωνία ανάμεσα στα διαφορετικά εργαστήρια που έλαβαν μέρος και μπορεί να πρέπει να αναθεωρηθον κατά τη συνέχεια. // // Αποθειωμένη γλυκοϊμπερίνη 1,07 // // Αποθειωμένη γλυκομπρασσικαπίνη 1,15 // // Αποθειωμένη γλυκοραφανίνη 1,07 // // Αποθειωμένη 4-υδφροξυ-γλυκοραφανίνη 0,28 // // Αποθειωμένη γλυκοαλλυσίνη 1,07 // // Αποθειωμένη γλυκομπρασσικίνη 0,29 // // Αποθειωμένη προγοϊτρίνη 1,09 // // Αποθειωμένη νεογλυκομπρασσικίνη 0,20 // // Αποθειωμένη επι-προγοϊτρίνη 1,09 // // Αποθειωμένη γλυκοτροπεολίνη 0,95 // // Αποθειωμένη σινιγκρίνη 1,00 // // Αποθειωμένη γλυκοναστουρτιίνη 0,95 // // Αποθειωμένη γλυκοναπίνη 1,11 // // Αποθειωμένη γλυκοαναπολειφερίνη 1,00 // // Αποθειωμένη 4-μεθόξυ-γλυκομπρασσικίνη 0,25 // // Άλλε αποθειωμένες γλυκοζινολικές ενώσεις 1,00 // 7.3. // Ολική περιεκτικότητα γλυκοζινολικών ενώσεων. // // Η ολική περιεκτικότητα γλυκοζινολικών, εκφρασμένη σε μικρογραμμομόρια ανά γραμμάριο ( micromoles/gramm) ξηρής ένωσης, για την οποία το εμβαδόν της αντίστοιχης κορυφής είναι μεγαλύτερο από 1 % του συνολικού αθροίσματος εμβαδών των κορυφών. // // Η χρήση των εσωτερικών προτύπων αναφοράς σε δύο συγκεντρώσεις (4.5.1 και 4.5.2) επιτρέπει την παρουσία σινιγκρίνης στο δείγμα ή την παρουσία ενός αγνώστου συστατικού που εκλούεται μαζί με τη σινιγκρίνη. // // - Εάν η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων της ολικής περιεκτικότητας σε γλυκοζινολικά των δύο επαλήψεων βρίσκεται εκτός των ορίων επαναληψιμότητας (8.2) δεν υπάρχει μόλυνση εσωτερικού προτύπου. Το αποτέλεσμα είναι ο εσωτερικός μέσος των δύο προσδιορισμένων τιμών. // // - Εάν η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων βρίσκεται εκτός των ορίων επαναληψιμότητας (8.2), επαναλαμβάνεται ο προσδιορισμός σε δύο άλλα αναλυτικά δείγματα και εκτελείται μια δοκιμή αναφοράς (6.7), παραλείποντας το διάλυμα εσωτερικού πρότυπου. Το εμβαδόν της μόλυνσης αφαιρείται από το εμβαδόν του εσωτερικού πρότυπου για να δώσει το πραγματικό εμβαδόν του εσωτερικού πρότυπου αναφοράς που χρησιμοποιείται στην εξίσωση 7.1. Το αποτέλεσμα είναι ο αριθμητικός μέσος των αποτελεσμάτων των δύο νέων προσδιορισμών. // 8. // ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΟΡΓΑΝΩΝ ΚΑΙ ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΜΕΘΟΔΟΥ // 8.1. // Ακρίβεια οργάνων (επαναληπτικότητα και αναπαραγωγιμότητα). // // Μια διεθνής διεργαστηριακή μελέτη που οργανώθηκε το 1988, με τη συμμετοχή 12 εργαστηρίων, έκαστο των οποίων είχε πραγματοποιήσει δύο προσδιορισμούς επί 4 δειγμάτων αγριοκράμβης, δίνει τις τιμές επαναληπτικότητας και αναπαραγωγιμότητας που αναφέρονται στον πίνακα 1. // // Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν σύμφωνα με το πρότυπο ISO 5725. (Στατιστική εφαρμογή - ακρίβεια των δοκιμαστικών μεθόδων - προσδιορισμός μιας δοκιμαστικής μεθόδου ρυθμισμένης με διεργαστηριακές δοκιμές). // // // Πίνακας 1: Τιμές της επαναληπτικότητας και της αναπαραγωγιμότητας που ελήφθησαν με διεργαστηρική μελέτη (1988). 1.2.3.4.5 // // // // // // Δείγματα

// Ελαιοκράμβη Α // Ελαιοκράμβη Β // Ελαιοκράμβη Γ // Ελαιοκράμβη Δ // // // // // // Αριθμός εργαστηρίων μετά από απαλειφή ακραίων // 11 // 1 // 11 // 11 // // // // // // Μέσος // 20,6 // 14,1 // 4,9 // 25,9 // // // // // // Τυπικές διαφορές επαναληπτικότητας // 1,7 // 0,6 // 0,3 // 0,8 // Συντελεστής διακύμανσης επαναληπτικότητας // 8,5 % // 4,4 % // 6,7 % // 3,3 % // Επαναληπτικότητα // 4,9 // 1,7 // 0,9 // 2,4 // // // // // // Τυπικές διαφορές αναπαραγωγιμότητας // 3,4 // 2,5 // 1,5 // 2,4 // Συντελεστής διακύμανσης αναπαραγωγιμότητας // 17 % // 18 % // 31 % // 9,4 % // Αναπαραγωγιμότητα // 9,6 // 7,1 // 1,4 // 6,8 // // // // // 1.2 // 8.1.1. // Επαναληπτικότητα // // Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που περιλαμβάνονται ανωτέρω (8.1), η διαφορά μεταξύ των τιμών των δύο προσδιορισμών που εκτελέσθησαν αμέσως ο ένας μετά τον άλλον από τον ίδιο αναλυτή χρησιμοποιώντας την ίδια συσκευή στο ίδιο δείγμα, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 2 micromoles/g για περιεκτικότητες μικρότερες από 20 micromoles/g και 4 micromoles/g για περιεκτικότητες μεταξύ 20 και 35 micromoles/g. // 8.1.2. // Αναπαραγωγιμότητα // // Εφαρμόζοντας τα ανωτέρω αποτελέσματα (8.1), η διαφορά μεταξύ των τιμών του τελικού αποτελέσματος δύο εργαστηρίων, χρησιμοποιώντας την παρούσα μέθοδο προς ανάλυση του ίδιου εργαστηριακού δείγματος, δεν ήταν μεγαλύτερη από 4 micromoles/g για περιεκτικότητες μικρότερες από 20 micromoles/g και 8 micromoles/g για περιεκτικότητες μεταξύ 20 και 35 micromoles/g. // 8.2. // Ακρίβεια μεθόδου. // // Η ορθή χρησιμοποίηση της μεθόδου θα εξακριβωθεί πραγματοποιώντας επαναληπτικές μετρήσεις επί των υλικών αναφοράς σε πιστοποιημένη περιεκτικότητα σε ολικές γλυκοζινολικές ενώσεις που θα καλύπτουν όλη την κλίμακα της εν λόγω συγκέντρωσης. // // Τα κατάλληλα υλικά αναφοράς πιστοποιημένης περιεκτικότητας μπορούν να ληφθούν στο κοινοτικό γραφείο αναφοράς (BCR) της Επιτροπής των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων. // // Το πρωτόκολλο για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται εργαστηριακά με τα υλικά αναφοράς πιστοποιημένης περιεκτικότητας περιγράφεται στην παράγραφο ''instruction for use'' της συνοδευτικής έκθεσης των υλικών αναφοράς. // 9. // ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ // // Η αναφορά ανάλυσης πρέπει να δηλώνει τη μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε και το υπολογιζόμενο αποτέλεσμα. Πρέπει επίσης να αναφέρει κάθε λεπτομέρεια σχετική με την εκτέλεση που δεν έχει καθοριστεί στα διεθνή πρότυπα ή θεωρείται προαιρετική, μαζί με κάθε γεγονός που μπορεί να έχει επηρεάσει το αποτέλεσμα. // // Η αναφορά ανάλυσης πρέπει να δίνει όλες τις απαραίτητες πληροφορίες για μια πλήρη αναγνώριση του δείγματος.»