(19)

Στο μέρος Γ προστίθενται τα ακόλουθα κεφάλαια: «Γ.47 Δοκιμή τοξικότητας στα αρχικά στάδια ζωής των ψαριών ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 210 του ΟΟΣΑ (2013). Σκοπός των δοκιμών στα αρχικά στάδια ζωής των ψαριών είναι να καθοριστούν οι θανατηφόρες και οι υποθανατηφόρες επιδράσεις των χημικών ουσιών στα υπό δοκιμή στάδια ζωής και είδη. Οι δοκιμές αυτές παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για την εκτίμηση των χρόνιων θανατηφόρων και υποθανατηφόρων επιδράσεων των χημικών ουσιών σε άλλα είδη ψαριών. 2. Η κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών 210 βασίζεται σε πρόταση του Ηνωμένου Βασιλείου, η οποία συζητήθηκε σε συνεδρίαση εμπειρογνωμόνων του ΟΟΣΑ που πραγματοποιήθηκε στο Medmenham (Ηνωμένο Βασίλειο) τον Νοέμβριο του 1988 και επικαιροποιήθηκε περαιτέρω το 2013 για να αποτυπωθούν η εμπειρία από τη χρήση της δοκιμής και οι συστάσεις που διατυπώθηκαν στην ημερίδα του ΟΟΣΑ για τις δοκιμές ιχθυοτοξικότητας, του Σεπτεμβρίου του 2010 (1). ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 3. Τα ψάρια εκτίθενται κατά τα αρχικά στάδια της ζωής τους σε ένα εύρος συγκεντρώσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που έχει διαλυθεί σε νερό. Προτιμώνται οι συνθήκες συνεχούς ροής· εάν, ωστόσο, αυτό δεν είναι εφικτό, είναι αποδεκτές οι ημιστατικές συνθήκες. Περισσότερες λεπτομέρειες θα πρέπει να αναζητηθούν στο έγγραφο καθοδήγησης του ΟΟΣΑ σχετικά με τις δοκιμές υδατικής τοξικότητας δύσκολων ουσιών και μειγμάτων (2). Η δοκιμή αρχίζει με την τοποθέτηση γονιμοποιημένων αυγών σε δοκιμαστικούς θαλάμους και συνεχίζεται για την ειδική ανά είδος χρονική περίοδο που απαιτείται για να φθάσουν τα ψάρια-μάρτυρες σε νεαρή ηλικία. Οι θανατηφόρες και υποθανατηφόρες επιδράσεις αξιολογούνται και συγκρίνονται με τις τιμές των μαρτύρων για να προσδιοριστεί η κατώτατη συγκέντρωση στην οποία παρατηρούνται επιπτώσεις (LOEC) με σκοπό να προσδιοριστούν i) η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC) και/ή ii) η ECx (π.χ. EC10, EC50) με τη χρήση μοντέλου παλινδρόμησης ώστε να εκτιμηθεί η συγκέντρωση που θα προκαλούσε μεταβολή x % στη μετρούμενη επίδραση. Η αναφορά των σχετικών συγκεντρώσεων και παραμέτρων με επίδραση μπορεί να εξαρτάται από το κανονιστικό πλαίσιο. Οι συγκεντρώσεις της δοκιμής θα πρέπει να περικλείουν την ECx, έτσι ώστε αυτή να προκύπτει από παρεμβολή και όχι από προεκβολή (βλ. προσάρτημα 1 για ορισμούς). ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟ ΔΟΚΙΜΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ 4. Με τον όρο υπό δοκιμή χημική ουσία νοείται το δοκίμιο. Θα πρέπει να είναι γνωστές η υδατοδιαλυτότητα (βλ. κεφάλαιο Α.6 του παρόντος παραρτήματος) και η τάση ατμών (βλ. κεφάλαιο Α.4 του παρόντος παραρτήματος) της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και να υπάρχει αξιόπιστη αναλυτική μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού της χημικής ουσίας στα διαλύματα της δοκιμής, της οποίας η ακρίβεια και τo όριo ποσοτικού προσδιορισμού να είναι γνωστά και δημοσιευμένα. Αν και δεν είναι απαραίτητα για τη διεξαγωγή της δοκιμής, τα αποτελέσματα δοκιμής οξείας τοξικότητας (βλ. κεφάλαιo Γ.1 ή Γ.49 του παρόντος παραρτήματος), κατά προτίμηση στα ίδια είδη με αυτά που έχουν επιλεγεί για την παρούσα δοκιμή, μπορούν να παράσχουν χρήσιμες πληροφορίες. 5. Εάν η μέθοδος δοκιμής χρησιμοποιείται για τη δοκιμή μείγματος, θα πρέπει να περιγράφεται, στο μέτρο του δυνατού, η σύνθεσή του, π.χ. μέσω της χημικής ταυτότητας των συστατικών του, των ποσοτήτων στις οποίες απαντούν, καθώς και των ειδικών ανά ουσία ιδιοτήτων τους (όπως εκείνες που αναφέρονται ανωτέρω). Πριν από τη χρήση της μεθόδου δοκιμών για δοκιμές μείγματος στο πλαίσιο κανονιστικών ρυθμίσεων, θα πρέπει να εξετάζεται κατά πόσον οι εν λόγω δοκιμές θα παράσχουν αποδεκτά αποτελέσματα για τον επιδιωκόμενο από τις κανονιστικές ρυθμίσεις σκοπό. 6. Στις χρήσιμες πληροφορίες περιλαμβάνονται ο συντακτικός τύπος, η καθαρότητα της ουσίας, η υδατοδιαλυτότητα, η σταθερότητα στο νερό και το φως, οι τιμές pKa, Pow, καθώς και αποτελέσματα δοκιμής άμεσης βιοαποικοδομησιμότητας (π.χ. κεφάλαιο Γ.4 ή Γ.9 του παρόντος παραρτήματος). ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 7. Οι προϋποθέσεις εγκυρότητας της δοκιμής είναι οι ακόλουθες: — η συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου θα πρέπει να είναι > 60 % της τιμής κορεσμού με αέρα σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής· — η θερμοκρασία του νερού θα πρέπει να μη διαφέρει περισσότερο από ± 1,5 °C μεταξύ δοκιμαστικών θαλάμων ή μεταξύ διαδοχικών ημερών οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια της δοκιμής και να περικλείεται στο εύρος θερμοκρασιών που ορίζεται για το εκάστοτε είδος ψαριού (προσάρτημα 2). — η αναλυτική μέτρηση των συγκεντρώσεων της δοκιμής είναι υποχρεωτική. — η συνολική επιβίωση των γονιμοποιημένων αυγών και η επιτυχία μετά την εκκόλαψη στους μάρτυρες και, κατά περίπτωση, στους μάρτυρες με διαλύτη θα πρέπει να είναι ανώτερες ή ίσες με τις οριακές τιμές που καθορίζονται στο προσάρτημα 2. 8. Εάν παρατηρηθεί ήσσονος σημασίας απόκλιση από τα κριτήρια εγκυρότητας, οι συνέπειες θα πρέπει να εκτιμώνται σε σχέση με την αξιοπιστία των δεδομένων της δοκιμής και οι εκτιμήσεις αυτές θα πρέπει να περιλαμβάνονται στην έκθεση. Οι επιδράσεις στην επιβίωση, την εκκόλαψη ή την ανάπτυξη που εμφανίζονται στους μάρτυρες με διαλύτη, σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα, θα πρέπει να αναφέρονται και να συζητούνται στο πλαίσιο της αξιοπιστίας των δεδομένων της δοκιμής. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Δοκιμαστικοί θάλαμοι 9. Μπορεί να χρησιμοποιείται οποιοδήποτε δοχείο από γυαλί, ανοξείδωτο χάλυβα ή άλλο χημικώς αδρανές υλικό. Επειδή είναι γνωστό ότι η σιλικόνη έχει μεγάλη ικανότητα απορρόφησης λιπόφιλων ουσιών, η χρήση σωλήνων από σιλικόνη σε μελέτες συνεχούς ροής και παρεμβυσμάτων σιλικόνης που έρχονται σε επαφή με το νερό θα πρέπει να ελαχιστοποιείται με τη χρησιμοποίηση π.χ. ολόσωμων ενυδρείων από γυαλί. Οι διαστάσεις των δοχείων θα πρέπει να είναι αρκετά μεγάλες ώστε να είναι δυνατή η σωστή ανάπτυξη στους μάρτυρες, η διατήρηση της συγκέντρωσης διαλυμένου οξυγόνου (π.χ. για τα είδη μικρών ψαριών, αυτό επιτυγχάνεται με δεξαμενή χωρητικότητας 7 L) και η συμμόρφωση με τα κριτήρια πληθυσμιακού φόρτου που ορίζονται στην παράγραφο 19. Είναι σκόπιμο να τοποθετούνται οι δοκιμαστικοί θάλαμοι με τυχαίο τρόπο στον χώρο εκτέλεσης των δοκιμών. Είναι προτιμότερος ο τυχαιοποιημένος σχεδιασμός κατά ομάδες (randomised block design), όπου κάθε ομάδα περιλαμβάνει όλες τις μεταχειρίσεις, αντί του πλήρως τυχαιοποιημένου σχεδιασμού (completely randomised design). Οι δοκιμαστικοί θάλαμοι θα πρέπει να προστατεύονται από ανεπιθύμητη διατάραξη. Το σύστημα της δοκιμής θα πρέπει κατά προτίμηση να εγκλιματίζεται με συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας για επαρκές χρονικό διάστημα προκειμένου να καταδεικνύονται σταθερές συγκεντρώσεις έκθεσης πριν από την εισαγωγή των υπό δοκιμή οργανισμών. Επιλογή είδους 10. Τα είδη ψαριών που συνιστώνται για τη δοκιμή παρατίθενται στον πίνακα 1. Η σύσταση αυτή δεν αποκλείει τη χρήση άλλων ειδών, αρκεί η διαδικασία δοκιμής να προσαρμοστεί με τρόπο ώστε να επιτευχθούν οι κατάλληλες συνθήκες δοκιμής. Στην περίπτωση αυτή θα πρέπει να αναφέρεται η αιτιολογία της επιλογής του είδους και της πειραματικής μεθόδου. Διατήρηση των γεννητόρων 11. Λεπτομέρειες σχετικά με τη διατήρηση των γεννητόρων υπό ικανοποιητικές συνθήκες μπορούν να αναζητηθούν στο προσάρτημα 3 και στις βιβλιογραφικές παραπομπές (3), (4) και (5). Χειρισμός των γονιμοποιημένων αυγών, των εμβρύων και προνυμφών 12. Αρχικά, τα γονιμοποιημένα αυγά, τα έμβρυα και οι προνύμφες μπορούν να εκτεθούν στο εσωτερικό του βασικού δοχείου τοποθετημένα σε μικρότερα δοχεία από γυαλί ή ανοξείδωτο χάλυβα, εξοπλισμένα με πλευρές ή απολήξεις από πλέγμα, ώστε να είναι δυνατή η ροή του διαλύματος της δοκιμής μέσω του δοχείου. Είναι δυνατόν να προκληθεί συνεχής μη τυρβώδης ροή στα μικρά αυτά δοχεία, εάν αναρτηθούν από βραχίονα ο οποίος τα ανεβοκατεβάζει κατά τρόπο ώστε οι οργανισμοί να παραμένουν συνεχώς μέσα στο νερό. Τα γονιμοποιημένα αυγά σολομονιδών μπορούν να τοποθετηθούν σε σχάρες ή πλέγματα με ανοίγματα αρκετά μεγάλα ώστε οι προνύμφες να μπορούν να διέλθουν από αυτά μετά την εκκόλαψη. 13. Όταν χρησιμοποιούνται δοχεία, σχάρες ή πλέγματα για τη συγκράτηση των αυγών εντός του βασικού δοκιμαστικού δοχείου, πρέπει να αφαιρούνται μετά την εκκόλαψη των προνυμφών, σύμφωνα με τις οδηγίες του προσαρτήματος 3, εκτός από τα πλέγματα που χρειάζονται για να μη διαφεύγουν οι προνύμφες. Εάν είναι αναγκαίο να μεταφερθούν οι προνύμφες, θα πρέπει να μην εκτίθενται στον αέρα και να μη χρησιμοποιούνται δίχτυα για την ελευθέρωση των προνυμφών από τα δοχεία που περιέχουν τα αυγά. Η χρονική στιγμή της μεταφοράς εξαρτάται από το είδος και θα πρέπει να τεκμηριώνεται στην έκθεση. Ωστόσο, δεν είναι πάντοτε αναγκαία η μεταφορά. Νερό 14. Ως νερό δοκιμής μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάθε νερό στο οποίο το υπό δοκιμή είδος εμφανίζει την ενδεδειγμένη μακρόχρονη επιβίωση και ανάπτυξη (βλ. προσάρτημα 4). Κατά τη διάρκεια της δοκιμής το νερό θα πρέπει να είναι σταθερής ποιότητας. Για να είναι βέβαιο ότι το νερό αραίωσης δεν θα επηρεάσει δυσμενώς το αποτέλεσμα της δοκιμής (π.χ. σχηματίζοντας σύμπλοκα με την υπό δοκιμή χημική ουσία) ούτε τις επιδόσεις των γεννητόρων, θα πρέπει κατά διαστήματα να λαμβάνονται δείγματα για ανάλυση. Όταν είναι γνωστό ότι η ποιότητα του νερού αραίωσης είναι σχετικά σταθερή, θα πρέπει, π.χ. κάθε έξι μήνες, να γίνονται μετρήσεις βαρέων μετάλλων (π.χ. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), βασικών ανιόντων και κατιόντων (π.χ. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO4 2-), αμμωνίας, ολικών υπολειμμάτων χλωριούχων γεωργικών φαρμάκων, ολικού οργανικού άνθρακα και αιωρούμενων στερεών. Εάν είναι γνωστό ότι η ποιότητα του νερού είναι μεταβλητή, οι μετρήσεις πρέπει να διεξάγονται συχνότερα· η συχνότητα των μετρήσεων εξαρτάται από τη μεταβλητότητα της ποιότητας. Ορισμένα χημικά χαρακτηριστικά αποδεκτού νερού αραίωσης απαριθμούνται στο προσάρτημα 4. Διαλύματα της δοκιμής 15. Στις δοκιμές συνεχούς ροής, για την παροχή σειράς συγκεντρώσεων στους δοκιμαστικούς θαλάμους απαιτείται σύστημα το οποίο να διανέμει και να αραιώνει συνεχώς ένα διάλυμα παρακαταθήκης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (π.χ. δοσιμετρική αντλία, αναλογικός αραιωτής, σύστημα κορεσμού). Οι ρυθμοί παροχής των διαλυμάτων παρακαταθήκης και του νερού αραίωσης θα πρέπει να ελέγχονται κατά διαστήματα κατά τη διάρκεια της δοκιμής και να μη μεταβάλλονται κατά περισσότερο από 10 % καθ' όλη τη διάρκειά της. Θεωρείται κατάλληλη μια τιμή παροχής ισοδύναμη με τουλάχιστον πέντε όγκους δοκιμαστικού θαλάμου ανά 24ωρο (3). Ωστόσο, εάν τηρείται ο πληθυσμιακός φόρτος που ορίζεται στην παράγραφο 19, χαμηλότερη παροχή, π.χ. 2-3 όγκοι δοκιμαστικών θαλάμων, μπορεί να αποτρέψει την ταχεία απομάκρυνση της τροφής. 16. Τα διαλύματα της δοκιμής με τις επιλεγμένες συγκεντρώσεις παρασκευάζονται με αραίωση διαλύματος παρακαταθήκης. Το διάλυμα παρακαταθήκης θα πρέπει, κατά προτίμηση, να παρασκευάζεται με απλή ανάμειξη ή ανακίνηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε νερό αραίωσης, με μηχανικά μέσα (π.χ. ανάδευση και/ή υπερήχους). Για να επιτευχθεί κατάλληλο πυκνό διάλυμα παρακαταθήκης, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν στήλες κορεσμού (στήλες διαλυτότητας) ή παθητικές δοσιμετρικές μέθοδοι (6). Δεν συνιστάται η χρήση φορέα διαλύτη. Ωστόσο, σε περίπτωση που απαιτείται διαλύτης, θα πρέπει να υποβάλλεται παράλληλα στη διαδικασία ένας μάρτυρας με διαλύτη, στην ίδια συγκέντρωση διαλύτη όπως στις ομάδες μεταχείρισης με τη χημική ουσία· δηλ. το επίπεδο του διαλύτη θα πρέπει, κατά προτίμηση, να είναι ίσο σε όλες τις συγκεντρώσεις, καθώς και στον μάρτυρα με διαλύτη. Για ορισμένα συστήματα αραιωτή, αυτό μπορεί να είναι δύσκολο από τεχνική άποψη· στην προκειμένη περίπτωση, η συγκέντρωση του διαλύτη στον μάρτυρα με διαλύτη θα πρέπει να ισούται με τη μέγιστη συγκέντρωση του διαλύτη στην ομάδα μεταχείρισης. Για ουσίες που είναι δύσκολο να υποβληθούν σε δοκιμή, οι ενδιαφερόμενοι θα πρέπει να ανατρέξουν στο έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 23 του ΟΟΣΑ σχετικά με τις δοκιμές υδατικής τοξικότητας δύσκολων ουσιών και μειγμάτων (2). Εάν χρησιμοποιείται διαλύτης, η επιλογή του καθορίζεται με βάση τις χημικές ιδιότητες της χημικής ουσίας. Το έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 23 του ΟΟΣΑ συνιστά μέγιστη συγκέντρωση 100 μl/l. Για να αποφευχθεί πιθανή επίδραση του διαλύτη στα μετρούμενα τελικά σημεία (7), συνιστάται η διατήρηση της συγκέντρωσης του διαλύτη στο χαμηλότερο δυνατό επίπεδο. 17. Για ημιστατική δοκιμή, είναι δυνατόν να εφαρμοστούν δύο διαφορετικές διαδικασίες ανανέωσης. Είτε παρασκευάζονται νέα διαλύματα της δοκιμής σε καθαρά δοχεία και τα αυγά και οι προνύμφες που έχουν επιβιώσει μεταφέρονται με ήπιο τρόπο στα νέα δοχεία είτε οι υπό δοκιμή οργανισμοί διατηρούνται στα δοκιμαστικά δοχεία ενώ αντικαθίσταται μέρος μόνο (τουλάχιστον τα δύο τρίτα) του όγκου του διαλύματος δοκιμής / μάρτυρα. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Συνθήκες έκθεσης Διάρκεια 18. Η δοκιμή θα πρέπει να αρχίζει το ταχύτερο δυνατόν μετά τη γονιμοποίηση των αυγών και, κατά προτίμηση, την εμβάπτισή τους στα διαλύματα της δοκιμής πριν αρχίσει το στάδιο της κυτταρικής αυλάκωσης των βλαστοδίσκων ή όσο το δυνατόν συντομότερα μετά το στάδιο αυτό. Η διάρκεια της δοκιμής εξαρτάται από το χρησιμοποιούμενο είδος. Ορισμένες συνιστώμενες διάρκειες παρέχονται στο προσάρτημα 2. Φόρτωση 19. Ο αριθμός γονιμοποιημένων αυγών στην αρχή της δοκιμής θα πρέπει να είναι στατιστικώς επαρκής. Τα αυγά θα πρέπει να κατανέμονται στις διάφορες ομάδες μεταχείρισης με τυχαίο τρόπο, και θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ανά συγκέντρωση τουλάχιστον 80 αυγά, ισοκατανεμημένα σε τέσσερις τουλάχιστον όμοιους δοκιμαστικούς θαλάμους. Ο πληθυσμιακός φόρτος (βιομάζα ανά όγκο διαλύματος της δοκιμής) θα πρέπει να είναι επαρκώς χαμηλός, ώστε να διατηρείται η συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου τουλάχιστον στο 60 % της τιμής κορεσμού με αέρα χωρίς αερισμό κατά το στάδιο των αυγών και των προνυμφών. Για τις δοκιμές συνεχούς ροής συνιστάται να μην υπερβαίνει ο πληθυσμιακός φόρτος τα 0,5 g/l νωπού βάρους ανά 24ωρο και τα 5 g/l διαλύματος σε καμία στιγμή (3). Φως και θερμοκρασία 20. Η φωτοπερίοδος και η θερμοκρασία του νερού θα πρέπει να είναι κατάλληλες για τα υπό δοκιμή είδη (βλ. προσάρτημα 2). Σίτιση 21. Η τροφή και η σίτιση έχουν καθοριστική σημασία και πρέπει απαραιτήτως να παρέχεται η σωστή τροφή για κάθε στάδιο ζωής, στον σωστό χρόνο και σε επαρκή ποσότητα για τη στήριξη της φυσιολογικής ανάπτυξης. Η σίτιση θα πρέπει να είναι περίπου ίση μεταξύ των επαναλήψεων, εκτός εάν προσαρμοστεί σε συνάρτηση με τη θνησιμότητα. Η πλεονάζουσα τροφή και τα περιττώματα θα πρέπει να απομακρύνονται, στο μέτρο του αναγκαίου, για την αποφυγή της συσσώρευσης αποβλήτων. Αναλυτικά προγράμματα σίτισης παρατίθενται στο προσάρτημα 3 αλλά, με τη συσσώρευση εμπειρίας, η τροφή και τα προγράμματα σίτισης τελειοποιούνται διαρκώς με σκοπό τη βελτίωση της επιβίωσης και τη βελτιστοποίηση της ανάπτυξης. Η ζωντανή τροφή αποτελεί πηγή εμπλουτισμού του περιβάλλοντος και, ως εκ τούτου, θα πρέπει να χρησιμοποιείται αντί ή επιπλέον της ξηράς ή κατεψυγμένης τροφής, όποτε αυτό ενδείκνυται για το είδος και το στάδιο του κύκλου ζωής. Συγκεντρώσεις της δοκιμής 22. Απαιτούνται συνήθως πέντε συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, με τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις ανά συγκέντρωση, οι οποίες να απέχουν μεταξύ τους κατά σταθερό παράγοντα που δεν υπερβαίνει το 3,2. Κατά την επιλογή του εύρους των συγκεντρώσεων της δοκιμής, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη, εάν είναι διαθέσιμα, στοιχεία σχετικά με τις δοκιμές οξείας τοξικότητας, κατά προτίμηση με το ίδιο είδος ψαριού, και/ή δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών (1). Ωστόσο, όλες οι πηγές πληροφόρησης θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή του εύρους των συγκεντρώσεων της δοκιμής, συμπεριλαμβανομένων πηγών όπως π.χ. δεδομένα συγκριτικής προσέγγισης και δεδομένα δοκιμών οξείας τοξικότητας σε έμβρυα ψαριών. Οριακή δοκιμή ή διευρυμένη οριακή δοκιμή, με λιγότερες από πέντε συγκεντρώσεις ως η οριστική δοκιμή, μπορεί να είναι αποδεκτή, εφόσον πρόκειται να προσδιοριστούν μόνο εμπειρικές NOEC. Η χρήση λιγότερων από πέντε συγκεντρώσεις θα πρέπει να αιτιολογείται. Δεν χρειάζεται να δοκιμάζονται συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας μεγαλύτερες από την LC50 96 ωρών ή τα 10 mg/l (όποια από τις δύο είναι χαμηλότερη). Μάρτυρες 23. Επιπλέον της σειράς συγκεντρώσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, θα πρέπει να υποβάλλεται στη διαδικασία ένας μάρτυρας με νερό αραίωσης και, εάν είναι απαραίτητο, ένας μάρτυρας με διαλύτη που περιέχει μόνο τον φορέα διαλύτη (βλ. παράγραφο 16). Συχνότητα αναλυτικών προσδιορισμών και μετρήσεων 24. Πριν από την έναρξη της περιόδου έκθεσης, θα πρέπει να διασφαλίζεται η ορθή λειτουργία του συστήματος παροχής της χημικής ουσίας για όλες τις επαναλήψεις (π.χ. με τη μέτρηση των συγκεντρώσεων της δοκιμής). Θα πρέπει να καθορίζονται οι αναγκαίες αναλυτικές μέθοδοι, μεταξύ άλλων ένα κατάλληλο όριο ποσοτικού προσδιορισμού (LOQ) και επαρκείς γνώσεις σχετικά με τη σταθερότητα της ουσίας στο σύστημα της δοκιμής. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, οι συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας προσδιορίζονται σε τακτά διαστήματα για τον χαρακτηρισμό της έκθεσης. Απαιτούνται τουλάχιστον πέντε προσδιορισμοί. Στα συστήματα συνεχούς ροής, θα πρέπει να διενεργούνται αναλυτικές μετρήσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε μία επανάληψη ανά συγκέντρωση, τουλάχιστον μια φορά την εβδομάδα, με συστηματική εναλλαγή των επαναλήψεων. Οι επιπλέον αναλυτικοί προσδιορισμοί συχνά βελτιώνουν την ποιότητα των αποτελεσμάτων της δοκιμής. Τα δείγματα θα πρέπει ενδεχομένως να διηθούνται για την απομάκρυνση τυχόν σωματιδίων (π.χ. με χρήση πόρων μεγέθους 0,45 μm) ή να φυγοκεντρούνται για να διασφαλίζεται ότι οι προσδιορισμοί εκτελούνται στην υπό δοκιμή χημική ουσία σε αληθές διάλυμα. Για να μειώνεται η προσρόφηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, οι ηθμοί θα πρέπει να έχουν κορεσθεί πριν από τη χρήση. Όταν οι μετρούμενες συγκεντρώσεις δεν παραμένουν εντός εύρους 80-120 % της ονομαστικής συγκέντρωσης, οι συγκεντρώσεις επίδρασης θα πρέπει να προσδιορίζονται και να εκφράζονται σε σχέση με τον αριθμητικό μέσο όρο των συγκεντρώσεων για τις δοκιμές συνεχούς ροής (βλ. προσάρτημα 6 της μεθόδου δοκιμών Γ.20 για τον υπολογισμό του αριθμητικού μέσου όρου (8)) και να εκφράζονται σε σχέση με τον γεωμετρικό μέσο όρο των μετρούμενων συγκεντρώσεων για τις ημιστατικές δοκιμές (βλ. κεφάλαιο 5 του εγγράφου καθοδήγησης του ΟΟΣΑ σχετικά με τις δοκιμές υδατικής τοξικότητας δύσκολων ουσιών και μειγμάτων) (2). 25. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, θα πρέπει να μετρώνται το διαλυμένο οξυγόνο, το pH και η θερμοκρασία σε όλα τα δοκιμαστικά δοχεία, τουλάχιστον μία φορά την εβδομάδα, καθώς και η αλατότητα και η σκληρότητα, εάν συντρέχουν λόγοι, στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής. Η θερμοκρασία θα πρέπει, κατά προτίμηση, να παρακολουθείται συνεχώς σε ένα τουλάχιστον δοκιμαστικό δοχείο. Παρατηρήσεις 26. Στάδιο εμβρυϊκής ανάπτυξης : Το εμβρυϊκό στάδιο κατά την έναρξη της έκθεσης στην υπό δοκιμή χημική ουσία θα πρέπει να επαληθεύεται με όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ακρίβεια. Η επαλήθευση μπορεί να γίνει σε αντιπροσωπευτικό δείγμα αυγών τα οποία έχουν διατηρηθεί και καθαριστεί καταλλήλως. 27. Εκκόλαψη και επιβίωση : η εκκόλαψη και η επιβίωση θα πρέπει να παρατηρούνται τουλάχιστον μία φορά ημερησίως και να καταγράφονται τα αριθμητικά δεδομένα. Εάν παρατηρηθούν μύκητες στα αυγά στα αρχικά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης (π.χ. κατά την πρώτη ή τη δεύτερη ημέρα της δοκιμής), αυτά τα αυγά θα πρέπει να καταμετρούνται και να αφαιρούνται. Τα νεκρά έμβρυα, προνύμφες και νεαρά ψάρια θα πρέπει να απομακρύνονται αμέσως μόλις γίνονται αντιληπτά, καθώς μπορεί να αποσυντεθούν ταχέως και να διαλυθούν από τις ενέργειες των άλλων ψαριών. Η απομάκρυνση των νεκρών ατόμων πρέπει να γίνεται με σχολαστική προσοχή για να μην υποστούν φυσική βλάβη τα παρακείμενα αυγά/προνύμφες. Οι ενδείξεις θανάτου διαφέρουν ανάλογα με το είδος και στάδιο του κύκλου ζωής. Για παράδειγμα: — για τα γονιμοποιημένα αυγά: ιδιαίτερα στα αρχικά στάδια, αισθητή μείωση της διαφάνειας και αλλαγή χρώματος, λόγω πήξης και/ή καταβύθισης των πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα λευκή θαμπή όψη, — για τα έμβρυα, τις προνύμφες και τα νεαρά ψάρια: ακινησία και/ή απώλεια αναπνευστικής κίνησης και/ή απουσία καρδιακού παλμού και/ή έλλειψη αντίδρασης σε μηχανικά ερεθίσματα. 28. Μη φυσιολογική εμφάνιση : ο αριθμός των προνυμφών ή νεαρών ψαριών που εμφανίζουν αφύσικο σχήμα σώματος θα πρέπει να καταγράφεται σε κατάλληλα χρονικά διαστήματα ανάλογα με τη διάρκεια της δοκιμής και το είδος της παρατηρούμενης ανωμαλίας. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι είναι φυσικό να εμφανίζονται ανώμαλες προνύμφες και νεαρά ψάρια, που μπορεί να αντιπροσωπεύουν σημαντικό ποσοστό των μαρτύρων σε ορισμένα είδη. Όταν οι δυσμορφίες και η συνακόλουθη μη φυσιολογική συμπεριφορά θεωρείται ότι είναι τόσο σοβαρά ώστε να προκαλείται σημαντική ταλαιπωρία στον οργανισμό, ο οποίος έχει φθάσει σε σημείο πέραν του οποίου δεν υπάρχει δυνατότητα ανάρρωσης, ο οργανισμός επιτρέπεται να αφαιρείται από τη δοκιμή. Τα ζώα αυτά θα πρέπει να υποβάλλονται σε ευθανασία και να συνυπολογίζονται στη θνησιμότητα στη μετέπειτα ανάλυση των δεδομένων. Έχει τεκμηριωθεί φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη για τα περισσότερα από τα είδη που συνιστώνται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών (9) (10) (11) (12). 29. Αφύσικη συμπεριφορά : ανωμαλίες όπως ο υπεραερισμός, η μη συντονισμένη κολύμβηση, η άτυπη ηρεμία και η άτυπη συμπεριφορά σίτισης θα πρέπει να καταγράφονται σε κατάλληλα χρονικά διαστήματα ανάλογα με τη διάρκεια της δοκιμής (π.χ. μία φορά ημερησίως για τα είδη θερμών υδάτων). Αυτές οι επιδράσεις, αν και είναι δύσκολο να προσδιοριστούν ποσοτικά, μπορούν, όταν παρατηρούνται, να βοηθήσουν στην ερμηνεία των δεδομένων θνησιμότητας. 30. Βάρος : στο τέλος της δοκιμής ζυγίζονται όλα τα επιζώντα ψάρια τουλάχιστον σε μία από τις επαναλήψεις (αναφορά του αριθμού των ζώων στην επανάληψη και του μέσου βάρους ανά ζώο): αν και προτιμάται το νωπό βάρος (στέγνωμα με απορροφητικό χαρτί), μπορεί επίσης να αναφέρονται δεδομένα για το ξηρό βάρος (13). 31. Μήκος : στο τέλος της δοκιμής, μετράται το μήκος κάθε ψαριού. Συνιστάται το ολικό μήκος, αλλά αν παρουσιαστεί αποσύνθεση του ουραίου πτερυγίου ή διάβρωση πτερυγίου, μπορεί να χρησιμοποιηθεί το κανονικό μήκος. Η ίδια μέθοδος θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε όλα τα ψάρια δεδομένης δοκιμής. Το ατομικό μήκος μπορεί να μετρηθεί με παχύμετρο, ψηφιακή φωτογραφική μηχανή ή βαθμονομημένο οπτικό μικρόμετρο. Τα συνήθη ελάχιστα μήκη καθορίζονται στο προσάρτημα 2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Επεξεργασία των αποτελεσμάτων 32. Συνιστάται ο σχεδιασμός του πειράματος και η επιλογή στατιστικού ελέγχου να παρέχουν επαρκή ισχύ (80 % ή μεγαλύτερη) για την ανίχνευση μεταβολών βιολογικής σημασίας σε τελικά σημεία, όταν πρόκειται να αναφερθεί η NOEC. Η αναφορά των σχετικών συγκεντρώσεων και παραμέτρων με επίδραση μπορεί να εξαρτάται από το κανονιστικό πλαίσιο. Εάν πρόκειται να αναφερθεί η ECx, ο σχεδιασμός του πειράματος και η επιλογή μοντέλου παλινδρόμησης θα πρέπει να επιτρέπουν την εκτίμηση της ECx, έτσι ώστε i) το διάστημα εμπιστοσύνης 95 % που αναφέρεται για την ECx να μην περιέχει το μηδέν και να μην είναι υπερβολικά ευρύ, (ii) το διάστημα εμπιστοσύνης 95 % για την προβλεπόμενη μέση τιμή της ECx να μην περιέχει τη μέση τιμή των μαρτύρων, iii) να μην υπάρχει σημαντική έλλειψη προσαρμογής του μοντέλου παλινδρόμησης στα δεδομένα. Και οι δύο προσεγγίσεις απαιτούν να υποδειχθεί εκείνη η ποσοστιαία μεταβολή σε κάθε τελικό σημείο, η οποία είναι σημαντικό να ανιχνευτεί ή να εκτιμηθεί. Ο πειραματικός σχεδιασμός θα πρέπει να είναι ειδικά προσαρμοσμένος έτσι ώστε να παρέχει αυτή τη δυνατότητα. Όταν δεν πληρούνται οι ανωτέρω προϋποθέσεις για τον καθορισμό της ECx, θα πρέπει να χρησιμοποιείται η προσέγγιση της NOEC. Είναι απίθανο να ισχύει η ίδια ποσοστιαία μεταβολή για όλα τα τελικά σημεία, ούτε είναι εφικτό να σχεδιαστεί ένα πείραμα που θα πληροί αυτά τα κριτήρια για όλα τα τελικά σημεία και, ως εκ τούτου, έχει σημασία για τον κατάλληλο σχεδιασμό του πειράματος η εστίαση στα τελικά σημεία που είναι σημαντικά για το αντίστοιχο πείραμα. Στατιστικά διαγράμματα ροής και οδηγίες για κάθε προσέγγιση είναι διαθέσιμα στα προσαρτήματα 5 και 6 για την καθοδήγηση της επεξεργασίας των δεδομένων και της επιλογής του καταλληλότερου στατιστικού ελέγχου ή του καταλληλότερου στατιστικού μοντέλου προς χρήση. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες στατιστικές προσεγγίσεις, εφόσον αυτό δικαιολογείται επιστημονικά. 33. Είναι απαραίτητο να αναλύονται οι μεταβολές σε κάθε σειρά επαναλήψεων με διαδικασίες ανάλυσης διασποράς ή πίνακα συνάφειας και να χρησιμοποιούνται κατάλληλες μέθοδοι στατιστικής ανάλυσης με βάση αυτή την ανάλυση. Για την πολλαπλή σύγκριση των αποτελεσμάτων στις επιμέρους συγκεντρώσεις με τα αποτελέσματα από τους μάρτυρες, συνιστάται ο έλεγχος Jonckheere-Terpstra με αποκλιμάκωση (step-down) ή ο έλεγχος Williams, για συνεχείς αποκρίσεις, και ο έλεγχος Cochran-Armitage με αποκλιμάκωση για ασυνεχείς αποκρίσεις συμβατές με μονοτονική σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης και χωρίς ενδείξεις εξωδιωνυμικής διασποράς (14). Όταν υπάρχουν ενδείξεις εξωδιωνυμικής διασποράς, συνιστάται η τροποποίηση κατά Rao-Scott του ελέγχου Cochran-Armitage (15) (16) ή εφαρμόζεται ο έλεγχος Williams ή Dunnett (μετά από μετασχηματισμό τετραγωνικής ρίζας του τόξου ημιτόνου) ή ο έλεγχος Jonckheere-Terpstra στις αναλογίες των επαναλήψεων. Όταν τα δεδομένα δεν είναι συμβατά με μονοτονική σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης, μπορεί να είναι χρήσιμη η μέθοδος του Dunnett ή του Dunn ή η μέθοδος Mann-Whitney για συνεχείς αποκρίσεις, καθώς και ο ακριβής έλεγχος του Fisher για δυαδικές αποκρίσεις (14) (17) (18). Θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε, κατά την εφαρμογή κάθε στατιστικής μεθόδου ή στατιστικού μοντέλου, να εξασφαλίζεται ότι πληρούνται οι απαιτήσεις της μεθόδου ή του μοντέλου (π.χ. η μεταβλητότητα μεταξύ των θαλάμων εκτιμάται και λαμβάνεται υπόψη κατά τον πειραματικό σχεδιασμό, καθώς και στη μέθοδο ή το μοντέλο που χρησιμοποιείται). Τα δεδομένα πρέπει να αξιολογούνται ως προς την κανονικότητα και στο προσάρτημα 5 περιγράφεται ο τρόπος χειρισμού των υπολοίπων της ανάλυσης ANOVA. Στο προσάρτημα 6 αναλύονται πρόσθετα ζητήματα για την προσέγγιση της παλινδρόμησης. Θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο μετασχηματισμών για την εκπλήρωση των απαιτήσεων ενός στατιστικού ελέγχου. Ωστόσο, οι μετασχηματισμοί με σκοπό να καταστεί δυνατή η προσαρμογή ενός μοντέλου παλινδρόμησης απαιτούν ιδιαίτερη προσοχή, διότι, για παράδειγμα, μια μεταβολή κατά 25 % της μη μετασχηματισμένης απόκρισης δεν αντιστοιχεί σε μεταβολή κατά 25 % της μετασχηματισμένης. Σε όλες τις αναλύσεις, η μονάδα ανάλυσης και η πειραματική μονάδα είναι ο δοκιμαστικός θάλαμος και όχι τα μεμονωμένα ψάρια, γεγονός που θα πρέπει να αντικατοπτρίζεται τόσο στους ελέγχους υποθέσεων όσο και στην παλινδρόμηση (3) (14) (19) (20). Έκθεση δοκιμής 34. Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία: Υπό δοκιμή χημική ουσία: Μονοσυστατική ουσία — φυσική εμφάνιση, υδατοδιαλυτότητα και πρόσθετες σχετικές φυσικοχημικές ιδιότητες· — στοιχεία ταυτοποίησης χημικής ουσίας, όπως ονομασία IUPAC ή CAS, αριθμός CAS, κωδικός SMILES ή InChI, συντακτικός τύπος, καθαρότητα, χημική ταυτότητα προσμίξεων, κατά περίπτωση και στο μέτρο του δυνατού, κ.λπ. (συμπεριλαμβανομένης της περιεκτικότητας σε οργανικό άνθρακα, κατά περίπτωση). Πολυσυστατική ουσία, UVCB και μείγματα: — χαρακτηρίζονται, στο μέτρο του δυνατού, π.χ. με τη χημική ταυτότητα των συστατικών (βλ. ανωτέρω), την ποσότητα στην οποία απαντούν και τις σχετικές φυσικοχημικές τους ιδιότητες Υπό δοκιμή είδος: — επιστημονική ονομασία, στέλεχος, πηγή και μέθοδος συλλογής των γονιμοποιημένων αυγών και μετέπειτα χειρισμός. Συνθήκες δοκιμής: — εφαρμοζόμενη διαδικασία δοκιμής (π.χ. ημιστατική ή συνεχούς ροής, φόρτωση)· — φωτοπερίοδος(-οι)· — σχεδιασμός της δοκιμής [π.χ. αριθμός δοκιμαστικών θαλάμων και επαναλήψεων, αριθμός αυγών ανά επανάληψη, υλικό και μέγεθος του δοκιμαστικού θαλάμου (ύψος, πλάτος, όγκος), όγκος νερού ανά δοκιμαστικό θάλαμο]· — μέθοδος παρασκευής των διαλυμάτων παρακαταθήκης και συχνότητα ανανέωσης (θα πρέπει να αναφέρονται το μέσο διαλυτοποίησης και η συγκέντρωσή του, εφόσον χρησιμοποιείται)· — μέθοδος χορήγησης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (π.χ. αντλίες, συστήματα αραίωσης)· — η απόδοση ανάκτησης της μεθόδου και οι ονομαστικές συγκεντρώσεις της δοκιμής, το όριο ποσοτικού προσδιορισμού, ο μέσος όρος των μετρούμενων τιμών και οι τυπικές αποκλίσεις τους στα δοκιμαστικά δοχεία και η μέθοδος με την οποία επιτεύχθηκαν, καθώς και στοιχεία που αποδεικνύουν ότι οι μετρήσεις αναφέρονται στις συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε αληθές διάλυμα· — χαρακτηριστικά του νερού αραίωσης: pΗ, σκληρότητα, θερμοκρασία, συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου, επίπεδα υπολειμματικού χλωρίου (εφόσον μετρούνται), ολικός οργανικός άνθρακας (εφόσον μετριέται), αιωρούμενα στερεά (εφόσον μετρούνται), αλατότητα του δοκιμαστικού μέσου (εφόσον μετριέται) και τυχόν άλλες μετρήσεις· — ποιότητα του νερού μέσα στα δοκιμαστικά δοχεία, pΗ, σκληρότητα, θερμοκρασία και συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου· — λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τη σίτιση (π.χ. είδος τροφής, πηγή, ποσότητα και συχνότητα χορήγησης). Αποτελέσματα, αναφερόμενα χωριστά (ή ανά επανάληψη) και ως μέση τιμή και συντελεστής μεταβλητότητας, κατά περίπτωση, για τα ακόλουθα τελικά σημεία: — στοιχεία που αποδεικνύουν ότι οι μάρτυρες πληρούν το πρότυπο αποδεκτής συνολικής επιβίωσης για το είδος ψαριού που χρησιμοποιείται στη δοκιμή (προσάρτημα 2)· — δεδομένα για τη θνησιμότητα σε κάθε στάδιο (εμβρύου, προνύμφης και νεαρών ψαριών) και σωρευτική (αθροιστική) θνησιμότητα· — ημέρες εκκόλαψης, αριθμός προνυμφών που εκκολάφθηκαν κάθε ημέρα και λήξη της εκκόλαψης· — αριθμός υγιών ψαριών στο τέλος της δοκιμής· — δεδομένα σχετικά με το μήκος (διευκρινίζεται αν πρόκειται για το κανονικό ή το ολικό μήκος) και το βάρος των ζώων που επιβίωσαν· — επίπτωση, περιγραφή και αριθμός μορφολογικών ανωμαλιών, εάν υπάρχουν· — επίπτωση, περιγραφή και αριθμός επιδράσεων στη συμπεριφορά, εάν υπάρχουν· — προσέγγιση για τη στατιστική ανάλυση (ανάλυση παλινδρόμησης ή ανάλυση διασποράς) και την επεξεργασία των δεδομένων (στατιστικός έλεγχος ή στατιστικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε)· — συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης για κάθε απόκριση που αξιολογήθηκε (NOEC)· — κατώτατη συγκέντρωση στην οποία παρατηρείται επίπτωση (LOEC) (σε p = 0,05) για κάθε απόκριση που αξιολογήθηκε· — ECx για κάθε απόκριση που αξιολογήθηκε, κατά περίπτωση, και διαστήματα εμπιστοσύνης (π.χ. 90 % ή 95 %), καθώς και γραφική παράσταση του προσαρμοσμένου μοντέλου που χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της, κλίση της καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης, μαθηματικός τύπος του μοντέλου παλινδρόμησης, εκτιμώμενες παράμετροι του μοντέλου και τα τυπικά σφάλματά τους. Κάθε απόκλιση από τη μέθοδο δοκιμών. Συζήτηση των αποτελεσμάτων, που περιλαμβάνει τυχόν επίδραση των αποκλίσεων από τη μέθοδο δοκιμών στην έκβαση της δοκιμής. Πίνακας 1 Είδη ψαριών που συνιστώνται για τη δοκιμή ΓΛΥΚΟΥ ΝΕΡΟΥ ΥΔΑΤΩΝ ΕΚΒΟΛΩΝ ΠΟΤΑΜΩΝ ΚΑΙ ΘΑΛΑΣΣΙΩΝ ΥΔΑΤΩΝ Oncorhynchus mykiss Ιριδίζουσα πέστροφα Cyprinodon variegatus Κυπρινόδοντας Pimephales promelas Χοντροκέφαλος φοξίνος Menidia sp. Πλευρασημόψαρο Danio rerio Ζεβρόψαρο Oryzias latipes Ρυζόψαρο ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Κεφάλαιο Γ. 20 του παρόντος παραρτήματος, Δοκιμή αναπαραγωγής σε Daphnia magna. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 - 376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. (15) Rao, J.N.K. και A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. και A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. (17) Dunnett C. W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. (18) Dunnett C. W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Προσάρτημα 1 ΟΡΙΣΜΟΙ Κανονικό μήκος (SL): αναφέρεται στο μήκος ψαριού που μετράται από την άκρη του ρύγχους έως το οπίσθιο άκρο του τελευταίου σπονδύλου ή το οπίσθιο άκρο του μεσοπλάγιου τμήματος της υπουραίας πλάκας. Με απλά λόγια, η μέτρηση αυτή δεν περιλαμβάνει το μήκος του ουραίου πτερυγίου. (www.fishbase.org) Μεσουραίο μήκος (FL): αναφέρεται στο μήκος από την άκρη του ρύγχους έως το άκρο των μεσαίων ακτίνων του ουραίου πτερυγίου και χρησιμοποιείται σε ψάρια για τα οποία είναι δύσκολο να οριοθετηθεί η κατάληξη της σπονδυλικής στήλης (www.fishbase.org) Ολικό μήκος (TL): αναφέρεται στο μήκος από την άκρη του ρύγχους έως την άκρη του μακρύτερου λοβού του ουραίου πτερυγίου, που συνήθως μετράται με τους λοβούς συμπιεσμένους κατά μήκος του άξονα συμμετρίας. Πρόκειται για μέτρηση ευθείας γραμμής που δεν ακολουθεί την καμπύλη του σώματος (www.fishbase.org) Εικόνα 1 Περιγραφή των χρησιμοποιούμενων διαφορετικών μηκών Χημική ουσία: μια ουσία ή ένα μείγμα. ECx: (Συγκέντρωση επίδρασης για επίδραση x %): η συγκέντρωση που προκαλεί x % επίδρασης σε υπό δοκιμή οργανισμούς εντός συγκεκριμένης περιόδου έκθεσης σε σύγκριση με μάρτυρα. Για παράδειγμα, η EC50 είναι η συγκέντρωση που εκτιμάται ότι προκαλεί επίδραση σε τελικό σημείο δοκιμής σε ποσοστό 50 % του εκτιθέμενου πληθυσμού επί καθορισμένη περίοδο έκθεσης. Κατώτατη συγκέντρωση στην οποία παρατηρούνται επιπτώσεις (LOEC) είναι η χαμηλότερη συγκέντρωση μιας υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην οποία παρατηρείται ότι η εν λόγω ουσία έχει στατιστικά σημαντική επίδραση (με p < 0,05), συγκριτικά με τον μάρτυρα. Ωστόσο, όλες οι συγκεντρώσεις της δοκιμής που υπερβαίνουν τη LOEC θα πρέπει να έχουν βλαβερή επίδραση ίση ή μεγαλύτερη από εκείνη που παρατηρείται στη LOEC. Σε περίπτωση που δεν πληρούνται οι δύο αυτοί όροι, θα πρέπει να εξηγείται πλήρως ο τρόπος επιλογής της LOEC (και, κατ' επέκταση, της NOEC). Τα προσαρτήματα 5 και 6 παρέχουν οδηγίες. Συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC) είναι η αμέσως χαμηλότερη της LOEC συγκέντρωση της δοκιμής, η οποία, συγκριτικά με τον μάρτυρα, δεν έχει στατιστικά σημαντική επίδραση (με ρ < 0,05) εντός συγκεκριμένης περιόδου έκθεσης. Υπο δοκιμή χημική ουσία: κάθε ουσία ή μείγμα που υποβάλλεται σε δοκιμή με τη χρήση της παρούσας μεθόδου δοκιμών. UVCB: ουσίες άγνωστης ή μεταβλητής σύνθεσης, σύμπλοκα προϊόντα αντίδρασης ή βιολογικά υλικά. IUPAC: Διεθνής Ένωση Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας. SMILES: Simplified Molecular Input Line Entry Specification (Προδιαγραφή Απλοποιημένης Μοριακής Γραμμικής Γραφής). Προσάρτημα 2 ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΔΟΚΙΜΗΣ, ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΚΑΙ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΒΙΩΣΗΣ ΓΙΑ ΤΑ ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΑ ΕΙΔΗ ΕΙΔΟΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΔΟΚΙΜΗΣ ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ Σύνηθες ελάχιστο μέσο ολικό μήκος των ψαριών-μαρτύρων στο τέλος της μελέτης (mm) (98) ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΜΑΡΤΥΡΩΝ (ελάχιστη) Θερμοκρασία (°C) Αλατότητα (0/00) Φωτοπερίοδος (ώρες) Επιτυχία της εκκόλαψης Επιτυχία μετά την εκκόλαψη Γλυκού νερού: Oncorhynchus mykiss Ιριδίζουσα πέστροφα 10 ± 1,5 (99) 12 - 16 (100) 2 εβδομάδες μετά την ελεύθερη σίτιση μαρτύρων (ή 60 ημέρες μετά την εκκόλαψη) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Χοντροκέφαλος φοξίνος 25 ± 1,5 16 32 ημέρες από την έναρξη της δοκιμής (ή 28 ημέρες μετά την εκκόλαψη) 18 70 % 75 % Danio rerio Ζεβρόψαρο 26 ± 1,5 12 - 16 (101) 30 ημέρες μετά την εκκόλαψη 11 70 % 75 % Oryzias latipes Ρυζόψαρο 25 ± 2 12 - 16 (101) 30 ημέρες μετά την εκκόλαψη 17 80 % 80 % Υδάτων εκβολών ποταμών και θαλάσσιων υδάτων: Cyprinodon variegatus Κυπρινόδοντας 25 ± 1,5 15-35 (102) 12 - 16 (101) 32 ημέρες από την έναρξη της δοκιμής (ή 28 ημέρες μετά την εκκόλαψη) 17 75 % 80 % Menidia sp. Πλευρασημόψαρο 22 - 25 15-35 (102) 13 28 ημέρες 20 80 % 60 % Προσάρτημα 3 ΟΔΗΓΙΕΣ ΣΙΤΙΣΗΣ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΓΕΝΝΗΤΟΡΩΝ ΚΑΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΩΝ ΤΩΝ ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΩΝ ΕΙΔΩΝ ΕΙΔΟΣ ΤΡΟΦΗ (*9) ΧΡΟΝΟΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΚΚΟΛΑΨΗ ΧΡΟΝΟΣ ΠΡΩΤΗΣ ΣΙΤΙΣΗΣ Γεννήτορες Νεοεκκολαφθείσες προνύμφες Νεαρά ψάρια Τύπος Συχνότητα Γλυκού νερού: Oncorhynchus mykiss Ιριδίζουσα πέστροφα τροφή για πέστροφες Καμία (1) αρχική τροφή για πέστροφες BSN 2-4 σιτηρέσια ημερησίως 14-16 ημέρες μετά την εκκόλαψη ή κατά την ανάπλευση (δεν είναι ουσιαστικής σημασίας) 19 ημέρες μετά την εκκόλαψη ή κατά την ανάπλευση Pimephales promelas Χοντροκέφαλος, φοξίνος BSN, νιφάδες τροφής, FBS BSN BSN48, νιφάδες τροφής 2-3 φορές την ημέρα όταν η εκκόλαψη είναι 90 % 2 φορές ημερησίως μετά την εκκόλαψη Danio rerio Ζεβρόψαρο BSN, νιφάδες τροφής Τροφή του εμπορίου για προνύμφες, πρωτόζωα (2), πρωτεΐνες (3) BSN48, νιφάδες τροφής, Η BSN μία φορά ημερησίως· νιφάδες τροφής δύο φορές ημερησίως όταν η εκκόλαψη είναι 90 % 2 ημέρες μετά την εκκόλαψη Oryzias latipes Ρυζόψαρο νιφάδες τροφής BSN, νιφάδες τροφής (ή πρωτόζωα ή τροχόζωα) BSN48, νιφάδες τροφής (ή τροχόζωα) Η BSN μία φορά ημερησίως· νιφάδες τροφής δύο φορές ημερησίως ή νιφάδες τροφής και τροχόζωα μία φορά ημερησίως ανεφάρμοστο 6-7 ημέρες μετά την ωοτοκία Υδάτων εκβολών ποταμών και θαλάσσιων υδάτων: Cyprinodon varieqatus Κυπρινόδοντας BSN, τροφή σε νιφάδες FBS BSN BSN48 2-3 σιτηρέσια ημερησίως ανεφάρμοστο 1 ημέρα μετά την εκκόλαψη/ανάπλευση Menidia sp. Πλευρασημόψαρο BSN48, νιφάδες τροφής BSN BSN48 2-3 σιτηρέσια ημερησίως ανεφάρμοστο 1 ημέρα μετά την εκκόλαψη/ανάπλευση Προσάρτημα 4 ΟΡΙΣΜΕΝΑ ΧΗΜΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΕΚΤΟΥ ΝΕΡΟΥ ΑΡΑΙΩΣΗΣ Συστατικό Οριακή συγκέντρωση Σωματίδια 5 mg/l Ολικός οργανικός άνθρακας 2 mg/l Μη ιονισμένη αμμωνία 1 μg/l Υπολείμματα χλωρίου 10 μg/l Ολικά οργανοφωσφορικά γεωργικά φάρμακα 50 ng/l Ολικά οργανοχλωριούχα γεωργικά φάρμακα συν πολυχλωριωμένα διφαινύλια 50 ng/l Ολικό οργανικό χλώριο 25 ng/l Αργίλιο 1 μg/l Αρσενικό 1 μg/l Χρώμιο 1 μg/l Κοβάλτιο 1 μg/l Χαλκός 1 μg/l Σίδηρος 1 μg/l Μόλυβδος 1 μg/l Νικέλιο 1 μg/l Ψευδάργυρος 1 μg/l Κάδμιο 100 ng/l Υδράργυρος 100 ng/l Άργυρος 100 ng/l Προσάρτημα 5 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΚΑΘΟΔΗΓΗΣΗ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ NOEC Γενικές παρατηρήσεις Η δεξαμενή επανάληψης είναι η μονάδα ανάλυσης. Συνεπώς, για συνεχείς παραμέτρους, όπως το μέγεθος, θα πρέπει να υπολογίζεται η μέση ή διάμεση τιμή των επαναλήψεων και οι εν λόγω τιμές επαναλήψεων είναι τα δεδομένα για ανάλυση. Θα πρέπει να καταδεικνύεται η ισχύς των δοκιμών που χρησιμοποιούνται, κατά προτίμηση βάσει επαρκών ιστορικών δεδομένων για κάθε εργαστήριο. Για κάθε τελικό σημείο θα πρέπει να παρέχεται, μαζί με τον στατιστικό έλεγχο που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί, η επίδραση μεγέθους που μπορεί να ανιχνευθεί με ισχύ 75-80 %. Οι βάσεις δεδομένων που ήταν διαθέσιμες κατά την εκπόνηση της παρούσας μεθόδου δοκιμών καθορίζουν την ισχύ που επιτυγχάνουν οι συνιστώμενες στατιστικές διαδικασίες. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να αποδεικνύει την ικανότητά του να ανταποκρίνεται στην εν λόγω απαίτηση ισχύος, είτε διεξάγοντας ανάλυση ισχύος είτε καταδεικνύοντας ότι ο συντελεστής μεταβλητότητας (CV) για κάθε απόκριση δεν υπερβαίνει το 90ό εκατοστημόριο των CV που χρησιμοποιήθηκαν στην εκπόνηση της κατευθυντήριας γραμμής. Οι σχετικοί CV παρατίθενται στον πίνακα 1. Εάν είναι διαθέσιμες μόνο μέσες ή διάμεσες τιμές των επαναλήψεων, ο CV εντός κάθε επανάληψης μπορεί να αγνοηθεί. Πίνακας 1 CV 90ού εκατοστημορίου για επιλεγμένα είδη γλυκού νερού Είδος Απόκριση CV μεταξύ επαναλήψεων CV εντός κάθε επανάληψης Ιριδίζουσα πέστροφα Μήκος 17,4 9,8 Βάρος 10,1 28 Χοντροκέφαλος φοξίνος Μήκος 16,9 13,5 Βάρος 11,7 38,7 Ζεβρόψαρο Μήκος 43,7 11,7 Βάρος 11,9 32,8 Για όλες σχεδόν τις στατιστικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση εργαστηριακών τοξικολογικών μελετών, οι συγκρίσεις που ενδιαφέρουν είναι εκείνες που γίνονται μεταξύ των ομάδων μεταχείρισης και των μαρτύρων. Για τον λόγο αυτό, δεν ενδείκνυται να απαιτείται έλεγχος F ANOVA με σημαντικό αποτέλεσμα πριν από τη χρήση του ελέγχου Dunnett ή Williams ούτε έλεγχος Kruskal-Wallis με σημαντικό αποτέλεσμα πριν από τη χρήση του ελέγχου Jonckheere-Terpstra, Mann-Whitney ή Dunn (Hochberg και Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson και συν. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). Καθώς ο έλεγχος Dunnett διαθέτει ενσωματωμένη διόρθωση ως προς την πολλαπλότητα, τα ψευδοθετικά και ψευδοαρνητικά ποσοστά του επηρεάζονται δυσμενώς από τη χρησιμοποίηση του ελέγχου F ως θυροφύλακα (gatekeeper). Ομοίως, οι εφαρμοζόμενοι με αποκλιμάκωση έλεγχοι Williams και Jonckheere-Terpstra με τη χρήση επιπέδου σημαντικότητας 0,05 σε κάθε στάδιο διατηρούν συνολικό ψευδοθετικό ποσοστό 5 %, τόσο δε το ποσοστό αυτό όσο και η ισχύς των ελέγχων επηρεάζονται δυσμενώς από τη χρησιμοποίηση του ελέγχου F ή Kruskal-Wallis ως θυροφύλακα. Οι έλεγχοι Mann-Whitney και Dunn πρέπει να διορθώνονται ως προς την πολλαπλότητα, συνιστάται δε η διόρθωση κατά Bonferroni-Holm. Διεξοδική ανάλυση των περισσότερων συστάσεων για τους ελέγχους υποθέσεων και την επαλήθευση των παραδοχών στις οποίες βασίζονται οι εν λόγω έλεγχοι παρέχεται σε έγγραφο του ΟΟΣΑ (2006), το οποίο περιλαμβάνει επίσης εκτενή βιβλιογραφία. Αντιμετώπιση των μαρτύρων όταν χρησιμοποιείται διαλύτης Εάν χρησιμοποιείται διαλύτης, θα πρέπει να περιλαμβάνονται δύο μάρτυρες: ένας με νερό αραίωσης και ένας με διαλύτη. Οι δύο μάρτυρες θα πρέπει να συγκρίνονται για κάθε απόκριση και να συνδυάζονται για στατιστική ανάλυση, εάν δεν διαπιστωθεί σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Διαφορετικά, ο μάρτυρας με διαλύτη θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της NOEC ή την εκτίμηση της ECx, ενώ ο μάρτυρας με νερό δεν χρησιμοποιείται. Βλ. περιορισμό στα κριτήρια εγκυρότητας (παράγραφος 7). Για το μήκος, το βάρος, την αναλογία εκκολαπτόμενων αυγών ή θνησιμότητας των προνυμφών ή μη φυσιολογικών προνυμφών, καθώς και για την πρώτη ή την τελευταία ημέρα επώασης ή ανάπλευσης, θα πρέπει να χρησιμοποιείται έλεγχος T ή Mann-Whitney για τη σύγκριση μεταξύ μάρτυρα με νερό αραίωσης και μάρτυρα με διαλύτη σε επίπεδο σημαντικότητας 0,05, κατά την οποία αγνοούνται όλες οι ομάδες μεταχείρισης. Τα αποτελέσματα αυτών των ελέγχων θα πρέπει να αναφέρονται. Μετρήσεις μεγέθους (μήκους και βάρους) Οι τιμές μήκους και βάρους κάθε ψαριού μπορούν να είναι κανονικά ή λογαριθμοκανονικά κατανεμημένες. Σε κάθε περίπτωση, οι μέσες τιμές των επαναλήψεων τείνουν να είναι κανονικά κατανεμημένες βάσει του κεντρικού οριακού θεωρήματος και να επιβεβαιώνονται από τα δεδομένα περισσότερων από 100 μελετών αρχικών σταδίων της ζωής με τρία ζωικά είδη του γλυκού νερού. Εναλλακτικά, όταν τα δεδομένα ή οι ιστορικές βάσεις δεδομένων υποδηλώνουν λογαριθμοκανονική κατανομή των μεμονωμένων τιμών μεγέθους των ψαριών, μπορεί να υπολογιστεί ο λογάριθμος των μέσων τιμών μεγέθους ανά επανάληψη, οπότε τα δεδομένα για ανάλυση θα είναι οι αντιλογάριθμοι των εν λόγω λογαρίθμων των μέσων τιμών των επαναλήψεων. Θα πρέπει να αξιολογείται η συμφωνία των δεδομένων με την κανονική κατανομή και την ομοιογένεια της διασποράς. Για τον σκοπό αυτό, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τα υπόλοιπα από μοντέλο ANOVA, με τη συγκέντρωση ως μόνη ερμηνευτική μεταβλητή ανά κατηγορία. Επιτρέπεται ο οπτικός προσδιορισμός από διαγράμματα διασποράς και ιστογράμματα ή διαγράμματα μίσχου-φύλλου. Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάποιος επίσημος έλεγχος, όπως οι Shapiro-Wilk ή Anderson-Darling. Η συνέπεια με την ομοιογένεια της διασποράς μπορεί να αξιολογηθεί με οπτική εξέταση του ίδιου διαγράμματος διασποράς ή επίσημα με τον έλεγχο Levene. Η αξιολόγηση της κανονικότητας και της ομοιογένειας της διασποράς είναι αναγκαία μόνο στην περίπτωση των παραμετρικών ελέγχων (π.χ. έλεγχοι Williams, Dunnett). Πρέπει να δίνεται προσοχή στις πιθανές έκτοπες τιμές και την επίδρασή τους στην ανάλυση. Μπορεί να χρησιμοποιείται ο έλεγχος έκτοπων τιμών Tukey και ο οπτικός έλεγχος των διαγραμμάτων υπολοίπων που περιγράφονται ανωτέρω. Υπενθυμίζεται ότι οι παρατηρήσεις είναι πλήρεις επαναλήψεις και, ως εκ τούτου, οι έκτοπες τιμές θα πρέπει να παραλείπονται από την ανάλυση μόνο μετά από προσεκτική εξέταση. Οι στατιστικοί έλεγχοι που αξιοποιούν τα χαρακτηριστικά του πειραματικού σχεδιασμού και της βιολογικής προσδοκίας είναι έλεγχοι τάσης με διαδικασία αποκλιμάκωσης, όπως οι έλεγχοι Williams και Jonckheere-Terpstra. Οι έλεγχοι αυτοί λαμβάνουν ως παραδοχή μονοτονική σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης και θα πρέπει να αξιολογείται η συμφωνία των δεδομένων με την παραδοχή αυτή. Η αξιολόγηση μπορεί να είναι οπτική από το διάγραμμα διασποράς των μέσων τιμών των επαναλήψεων συναρτήσει της συγκέντρωσης της δοκιμής. Είναι χρήσιμη η υπέρθεση του εν λόγω διαγράμματος διασποράς με μια τμηματικά γραμμική καμπύλη που συνδέει τις μέσες τιμές συγκέντρωσης, σταθμισμένες κατά το μέγεθος του δείγματος επανάληψης. Μια μεγάλη απόκλιση της τμηματικά γραμμικής καμπύλης από τη μονοτονικότητα θα αποτελούσε ένδειξη πιθανής ανάγκης να χρησιμοποιηθούν άλλοι έλεγχοι πλην των ελέγχων τάσης. Εναλλακτικά, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν επίσημοι έλεγχοι. Ένας απλός επίσημος έλεγχος συνίσταται στον υπολογισμό των γραμμικών και τετραγωνικών αντιθέσεων των μέσων τιμών συγκέντρωσης. Εάν η τετραγωνική αντίθεση είναι σημαντική, ενώ η γραμμική δεν είναι, αυτό αποτελεί ένδειξη πιθανού προβλήματος μονοτονικότητας, το οποίο θα πρέπει να αξιολογείται περαιτέρω από τα διαγράμματα. Όταν τίθεται ζήτημα κανονικότητας ή ομοιογένειας της διασποράς, οι αντιθέσεις αυτές μπορούν να υπολογιστούν από δεδομένα που έχουν μετασχηματιστεί με βάση τη σειρά κατάταξης. Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικές διαδικασίες, όπως ο έλεγχος Bartholomew για τη μονοτονικότητα, αλλά περιπλέκουν την εργασία. Εικόνα 2 Διάγραμμα ροής NOEC για τις μετρήσεις μεγέθους (μήκους και βάρους). Εάν τα δεδομένα δεν είναι σύμφωνα με τις απαιτήσεις αυτών των ελέγχων, η NOEC προσδιορίζεται με αποκλιμακωμένη εφαρμογή του ελέγχου Williams ή Jonckheere-Terpstra. Το έγγραφο του ΟΟΣΑ (2006) παρέχει λεπτομερείς πληροφορίες για τις διαδικασίες αυτές. Για τα δεδομένα που δεν είναι σύμφωνα με τις απαιτήσεις για τους ελέγχους τάσης με αποκλιμάκωση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο έλεγχος Dunnett ή Tamhane-Dunnett (T3), οι οποίοι διαθέτουν ενσωματωμένες διορθώσεις ως προς την πολλαπλότητα. Οι έλεγχοι λαμβάνουν ως παραδοχή την κανονικότητα και, στην περίπτωση του ελέγχου Dunnett, την ομοιογένεια της διασποράς. Εάν δεν πληρούνται οι προϋποθέσεις αυτές, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο μη παραμετρικός έλεγχος Dunn. Το έγγραφο του ΟΟΣΑ (2006) παρέχει λεπτομερείς πληροφορίες για όλες αυτές τις μεθόδους. Η εικόνα 2 παρέχει μια επισκόπηση για την εξεύρεση της προτιμητέας μεθόδου. Εκκόλαψη αυγών και επιβίωση προνυμφών Τα δεδομένα είναι οι αναλογίες εκκολαπτόμενων αυγών ή προνυμφών που επιβιώνουν στην κάθε επανάληψη. Θα πρέπει να αξιολογείται η εξωδιωνυμική διασπορά αυτών των αναλογιών, η οποία είναι συνήθης αλλά όχι καθολική σε τέτοιες μετρήσεις. Το διάγραμμα ροής στην εικόνα 3 καθοδηγεί την αναζήτηση της προτιμητέας μεθόδου· βλ. κείμενο για αναλυτικές περιγραφές. Χρησιμοποιούνται συνήθως δύο έλεγχοι. Πρόκειται για τον έλεγχο C(α) του Tarone (Tarone, 1979) και τον έλεγχο «χι τετράγωνο» (χ2), καθένας από τους οποίους εφαρμόζεται χωριστά σε κάθε συγκέντρωση της δοκιμής. Εάν διαπιστωθεί εξωδιωνυμική διασπορά έστω και σε μία συγκέντρωση της δοκιμής, θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν υποστηρικτικές (accommodating) μέθοδοι. Τύπος 1. Έλεγχος C(α) κατά Tarone (Tarone 1979) όπου ̂ είναι η μέση αναλογία για δεδομένη συγκέντρωση, m ο αριθμός δεξαμενών επανάληψης, nj ο αριθμός των υποκειμένων της επανάληψης j και xj ο αριθμός υποκειμένων της εν λόγω επανάληψης που αποκρίθηκαν, π.χ. δεν εκκολάφθηκαν ή ήταν νεκρά. Ο έλεγχος αυτός εφαρμόζεται σε κάθε συγκέντρωση χωριστά. Μολονότι μπορεί να θεωρηθεί ένα είδος τροποποιημένου ελέγχου χ2, οι περιορισμένες προσομοιώσεις ισχύος του Tarone έδειξαν ότι είναι ισχυρότερος από τους ελέγχους χ2. Εικόνα 3 Διάγραμμα ροής NOEC για την εκκόλαψη αυγών και τη θνησιμότητα προνυμφών Όταν δεν υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις εξωδιωνυμικής διασποράς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο έλεγχος Cochran-Armitage με αποκλιμάκωση. Καθώς ο έλεγχος αυτός αγνοεί τις επαναλήψεις, όταν υπάρχουν τέτοιες ενδείξεις, η διόρθωση κατά Rao-Scott του ελέγχου Cochran-Armitage (RSCA) λαμβάνει υπόψη τις επαναλήψεις, τα μεγέθη των επαναλήψεων και την εξωδιωνυμική διασπορά και συνιστάται. Εναλλακτικοί έλεγχοι είναι, μεταξύ άλλων, οι έλεγχοι Williams και Jonckheere-Terpstra με αποκλιμάκωση, καθώς και ο έλεγχος Dunnett, όπως περιγράφεται για τις μετρήσεις μεγέθους. Οι έλεγχοι αυτοί εφαρμόζονται ανεξάρτητα από την ύπαρξη εξωδιωνυμικής διασποράς, η ισχύς τους όμως είναι σχετικά μικρότερη (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao και Scott 1992, 1999, Fung και συν. 1994, 1996). Πρώτη ή τελευταία ημέρα επώασης ή ανάπλευσης Η απόκριση είναι ακέραιος αριθμός που δηλώνει την ημέρα της δοκιμής κατά την οποία έγινε η αναφερόμενη παρατήρηση για δεδομένη δεξαμενή επανάληψης. Το εύρος τιμών είναι γενικά πολύ περιορισμένο και υπάρχει συχνά υψηλό ποσοστό όμοιων τιμών, π.χ. η ίδια πρώτη ημέρα εκκόλαψης παρατηρείται σε όλες τις επαναλήψεις των μαρτύρων και, ίσως, σε μία ή δύο χαμηλές συγκεντρώσεις της δοκιμής. Οι παραμετρικοί έλεγχοι, όπως των Williams και Dunnett, δεν είναι κατάλληλοι για τα εν λόγω δεδομένα. Ο έλεγχος Jonckheere-Terpstra με αποκλιμάκωση είναι πολύ ισχυρός για την ανίχνευση των επιδράσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, εφόσον δεν υπάρχουν στοιχεία σοβαρής έλλειψης μονοτονικότητας. Διαφορετικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο έλεγχος Dunn. Ανωμαλίες προνυμφών Η απόκριση είναι ο αριθμός των προνυμφών που διαπιστώνεται ότι για κάποιο λόγο δεν είναι φυσιολογικές. Η απόκριση αυτή είναι συνήθως χαμηλής επίπτωσης και παρουσιάζει ορισμένα από τα ίδια προβλήματα όπως η πρώτη ημέρα εκκόλαψης, επιπλέον δε, σε ορισμένες περιπτώσεις, ακανόνιστη σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης. Εάν τα δεδομένα ακολουθούν τουλάχιστον σε γενικές γραμμές ένα μονοτονικό σχήμα συγκέντρωσης, ο έλεγχος Jonckheere-Terpstra με αποκλιμάκωση είναι ισχυρός για την ανίχνευση των επιδράσεων. Διαφορετικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο έλεγχος Dunn. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere, A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, Αρ. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) — A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) — A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. Προσάρτημα 6 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΚΑΘΟΔΗΓΗΣΗ ΓΙΑ ΤΙΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ ΠΑΛΙΝΔΡΟΜΗΣΗΣ Γενικές παρατηρήσεις Οι παρατηρήσεις που χρησιμοποιούνται για την προσαρμογή μοντέλων είναι οι μέσες τιμές των επαναλήψεων (μήκους και βάρους) ή οι αναλογίες των επαναλήψεων (εκκόλαψης αυγών και θνησιμότητας προνυμφών) (ΟΟΣΑ 2006). Συνιστάται γενικά η σταθμισμένη παλινδρόμηση με τη χρήση του μεγέθους δείγματος επανάληψης ως συντελεστή στάθμισης. Μπορεί να χρησιμοποιηθούν και άλλα συστήματα στάθμισης, όπως η στάθμιση με την προβλεπόμενη μέση απόκριση ή ένας συνδυασμός αυτής και του μεγέθους δείγματος επανάληψης. Δεν συνιστάται στάθμιση με την αντίστροφη δειγματική διασπορά εντός συγκέντρωσης (Bunke και συν. 1999, Seber και Wild, 2003, Motulsky και Christopoulos 2004, Huet και συν. 2003). Κάθε μετασχηματισμός αποκρίσεων πριν από την ανάλυση θα πρέπει να διατηρεί την ανεξαρτησία των παρατηρήσεων, η δε ECx και τα όρια εμπιστοσύνης θα πρέπει να εκφράζονται στις αρχικές μονάδες μέτρησης και όχι σε μετασχηματισμένες μονάδες. Για παράδειγμα, μια μεταβολή κατά 20 % στον λογάριθμο του μήκους δεν ισοδυναμεί με μεταβολή του μήκους κατά 20 % (Lyles και συν. 2008, Draper και Smith 1999). Το διάγραμμα ροής στην εικόνα 4 παρέχει μια επισκόπηση των εκτιμήσεων της ECx. Οι λεπτομέρειες περιγράφονται στο κείμενο που ακολουθεί. Εικόνα 4: Διάγραμμα ροής για την εκτίμηση της ECx βάσει του μέσου μήκους ή βάρους των επαναλήψεων ή της αναλογίας εκκολαπτόμενων αυγών ή θνησιμότητας προνυμφών των επαναλήψεων· για περισσότερες λεπτομέρειες, βλ. κείμενο Εκτιμήσεις για την εκκόλαψη αυγών και τη θνησιμότητα προνυμφών Όσον αφορά την εκκόλαψη αυγών και τη θνησιμότητα προνυμφών, κατά κανόνα το καλύτερο είναι να προσαρμόζεται ένα φθίνον μοντέλο, εκτός αν προσαρμόζεται μοντέλο probit, όπως περιγράφεται κατωτέρω. Δηλαδή, πρέπει να μοντελοποιείται η αναλογία μη εκκολαπτόμενων αυγών ή νεκρών προνυμφών. Αυτό οφείλεται στο ότι η ECx αναφέρεται σε μια συγκέντρωση στην οποία επέρχεται μεταβολή ίση με x % της μέσης απόκρισης των μαρτύρων. Για παράδειγμα, αν το ποσοστό της αποτυχίας εκκόλαψης στον μάρτυρα είναι 5 % και μοντελοποιηθεί η αποτυχία εκκόλαψης, η τιμή EC20 αναφέρεται στη συγκέντρωση στην οποία επέρχεται μεταβολή ίση με 20 % του ποσοστού αποτυχίας εκκόλαψης 5 %, το οποίο σημαίνει μεταβολή 0,2 * 0,05 = 0,01 ή κατά 1 ποσοστιαία μονάδα, με αποτέλεσμα ποσοστό αποτυχίας εκκόλαψης 6 %. Μια τόσο μικρή μεταβολή δεν είναι δυνατόν να εκτιμηθεί από τα διαθέσιμα δεδομένα κατά τρόπο που να έχει σημασία και δεν είναι σημαντική από βιολογική άποψη. Εάν όμως μοντελοποιηθεί η αναλογία εκκολαπτόμενων αυγών, η αναλογία στους μάρτυρες θα είναι 95 % στο παράδειγμα αυτό και μια μείωση της μέσης τιμής των μαρτύρων κατά 20 % θα ισοδυναμεί με μεταβολή 0,95 * 0,2 = 0,18, δηλ. ποσοστό επιτυχίας εκκόλαψης από 95 % σε 77 % (= 95 – 18) και αυτή η συγκέντρωση επίδρασης μπορεί να εκτιμηθεί και είναι κατά τεκμήριο σημαντικότερη. Δεν τίθεται τέτοιο ζήτημα με τις μετρήσεις μεγέθους, αν και δυσμενείς επιδράσεις στο μέγεθος συνεπάγονται κατά κανόνα μείωση μεγέθους. Μοντέλα για το μέγεθος (μήκος ή βάρος) και την επιτυχία εκκόλαψης αυγών ή την επιβίωση προνυμφών Εκτός από το μοντέλο Brain-Cousens με όρμηση, όλα αυτά τα μοντέλα περιγράφονται και συνιστώνται στο έγγραφο του ΟΟΣΑ (2006). Τα επονομαζόμενα μοντέλα ΟΟΣΑ 2-5 εξετάζονται επίσης για πειράματα οικοτοξικότητας στη δημοσίευση Slob (2002). Πολλά άλλα διαθέσιμα μοντέλα θα ήταν, ασφαλώς, χρήσιμα. Οι Bunke και συν. (1999) παραθέτουν πολυάριθμα μοντέλα που δεν περιλαμβάνονται στο παρόν προσάρτημα, ενώ υπάρχουν πολλές βιβλιογραφικές παραπομπές σε άλλα μοντέλα. Αυτά που απαριθμούνται στη συνέχεια προτείνονται ως κατ' εξοχήν κατάλληλα για πειράματα οικοτοξικότητας και χρησιμοποιούνται ευρέως. Με 5 συγκεντρώσεις δοκιμής συν μάρτυρα — Bruce-Versteeg — Απλή εκθετική (ΟΟΣΑ 2) — Εκθετική με παράμετρο μορφής (ΟΟΣΑ 3) — Απλή εκθετική με κατώτατο όριο (ΟΟΣΑ 4) Με 6 ή περισσότερες συγκεντρώσεις δοκιμής συν μάρτυρα — Εκθετική με παράμετρο μορφής και κατώτατο όριο (ΟΟΣΑ 5) — Michaelis-Menten — Hill Όταν υπάρχουν οπτικές ενδείξεις όρμησης (απίθανο στην περίπτωση της επιτυχίας εκκόλαψης αυγών ή της επιβίωσης προνυμφών, αλλά ενίοτε διακρίνονται στις παρατηρήσεις μεγέθους) — Brain-Cousens Hormetic· Brain και Cousens (1989) Εναλλακτικά μοντέλα για την αποτυχία εκκόλαψης αυγών και τη θνησιμότητα προνυμφών — Είναι δυνατή η προσαρμογή αυξόντων μοντέλων για τις εν λόγω αποκρίσεις με μοντέλα probit (ή λογιστικά), εάν δεν υπάρχουν στοιχεία εξωδιωνυμικής διασποράς και η επίπτωση (incidence) στους μάρτυρες εκτιμάται στην προσαρμογή του μοντέλου. Αυτή δεν είναι η προτιμώμενη μέθοδος, διότι λαμβάνει ως μονάδα ανάλυσης το άτομο και όχι τις επαναλήψεις (Morgan 1992, O'Hara Hines και Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Ποιότητα προσαρμογής μεμονωμένου μοντέλου — Συγκρίνονται οπτικά το παρατηρούμενο με το προβλεπόμενο ποσοστό μείωσης σε κάθε συγκέντρωση της δοκιμής (Motulsky και Christopoulos 2004, Draper και Smith 1999). — Συγκρίνεται το μέσο τετραγωνικό σφάλμα παλινδρόμησης με το μέσο τετραγωνικό καθαρό σφάλμα με έλεγχο F (Draper και Smith 1999). — Επαληθεύεται ότι κάθε όρος του μοντέλου διαφέρει σημαντικά από το μηδέν (δηλ. διαπιστώνεται αν όλοι οι όροι του μοντέλου είναι σημαντικοί), (Motulsky και Christopoulos 2004). — Σχεδιάζεται η καμπύλη των υπολοίπων της παλινδρόμησης συναρτήσει των συγκεντρώσεων της δοκιμής, ενδεχομένως σε λογαριθμική κλίμακα log(συγκέντρωση). Δεν θα πρέπει να υπάρχει μοτίβο στην εν λόγω καμπύλη. Τα σημεία θα πρέπει να είναι τυχαίως διασκορπισμένα γύρω από μια οριζόντια γραμμή στο ύψος του μηδέν. — Τα δεδομένα θα πρέπει να αξιολογούνται ως προς την κανονικότητα και την ομοιογένεια της διασποράς, με τον τρόπο που υποδεικνύεται στο προσάρτημα 5. — Επιπλέον, θα πρέπει να αξιολογείται η κανονικότητα των υπολοίπων γύρω από το μοντέλο παλινδρόμησης με τη χρήση των μεθόδων που υποδεικνύονται στο προσάρτημα 5 για τα υπόλοιπα της ανάλυσης ANOVA. Σύγκριση μοντέλων — Χρησιμοποιούνται τα κριτήρια AICc του Akaike. Μικρότερες τιμές AICc υποδηλώνουν καλύτερες προσαρμογές και εάν AICc(B)-AICc(A) ≥ 10, το μοντέλο Α είναι κατά πάσα πιθανότητα καλύτερο από το μοντέλο Β (Motulsky και Christopoulos (2004). — Συγκρίνονται οπτικά τα δύο μοντέλα με βάση το κατά πόσο πληρούν τα ανωτέρω κριτήρια για μεμονωμένο μοντέλο. — Συνιστάται η αρχή της φειδούς, σύμφωνα με την οποία χρησιμοποιείται το απλούστερο μοντέλο που προσαρμόζεται στα δεδομένα με εύλογα καλή ποιότητα (Ratkowsky 1993, Lyles και συν. 2008). Ποιότητα της εκτίμησης της ECx Το διάστημα εμπιστοσύνης (CI) για την ECx δεν θα πρέπει να είναι υπερβολικά ευρύ. Απαιτείται στατιστική κρίση για τον καθορισμό του εύρους του διαστήματος εμπιστοσύνης που εξακολουθεί να δίνει χρήσιμη ECx. Οι προσομοιώσεις της προσαρμογής μοντέλων παλινδρόμησης σε δεδομένα για την εκκόλαψη αυγών και για το μέγεθος δείχνουν ότι περίπου το 75 % των διαστημάτων εμπιστοσύνης για την ECx (x = 10, 20 ή 30) καλύπτουν το πολύ δύο συγκεντρώσεις δοκιμής. Αυτό παρέχει μια γενική κατεύθυνση για το τι είναι αποδεκτό και αποτελεί πρακτικό οδηγό για το τι είναι εφικτό. Πολλοί συγγραφείς υποστηρίζουν ότι είναι αναγκαία η αναφορά των διαστημάτων εμπιστοσύνης για όλες τις παραμέτρους τoυ μοντέλου και ότι διαστήματα εμπιστοσύνης με μεγάλο εύρος δηλώνουν μη αποδεκτά μοντέλα (Ott και Longnecker 2008, Alvord και Rossio 1993, Motulsky και Christopoulos 2004, Lyles και συν. 2008, Seber και Wild 2003, Bunke και συν 1999, Environment Canada 2005). Το διάστημα εμπιστοσύνης (CI) για την ECx (ή οποιαδήποτε άλλη παράμετρο του μοντέλου) δεν θα πρέπει να περιέχει το μηδέν (Motulsky και Christopoulos 2004). Είναι η παλινδρόμηση που ισοδυναμεί με την ελάχιστη σημαντική διαφορά η οποία αναφέρεται συχνά στις προσεγγίσεις ελέγχου υποθέσεων (π.χ. Wang και συν. 2000). Επίσης, αντιστοιχεί στο διάστημα εμπιστοσύνης ώστε οι μέσες αποκρίσεις στη LOEC να μην περιέχουν τη μέση τιμή των μαρτύρων. Θα πρέπει να τίθεται το ερώτημα αν οι εκτιμήσεις των παραμέτρων είναι επιστημονικά ευλογοφανείς. Για παράδειγμα, εάν το διάστημα εμπιστοσύνης για τη μεταβλητή y0 είναι ± 20 %, καμία εκτίμηση της EC10 δεν είναι ευλογοφανής. Εάν το μοντέλο προβλέπει επίδραση 20 % σε μια συγκέντρωση C και η μέγιστη παρατηρούμενη επίδραση στη C και στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις είναι 10 %, η EC20 δεν είναι ευλογοφανής (Motulsky και Christopoulos 2004, Wang και συν. 2000, Environment Canada 2005). Για την ECx δεν θα πρέπει να χρειάζεται παρέκταση εκτός του εύρους των θετικών συγκεντρώσεων (Draper και Smith 1999, ΟΟΣΑ 2006). Για παράδειγμα, μια πιθανή γενική κατεύθυνση θα μπορούσε να ορίζει ότι η ECx δεν πρέπει να είναι χαμηλότερη από την κατώτατη συγκέντρωση της δοκιμής ή υψηλότερη από την ανώτατη κατά περισσότερο από 25 % περίπου. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878-886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. Γ.48 Βραχυπρόθεσμη δοκιμή αναπαραγωγής σε ψάρια ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 229 του ΟΟΣΑ (2012). Η ανάγκη ανάπτυξης κι επικύρωσης δοκιμών σε ψάρια για την ανίχνευση ενδοκρινικά δραστικών χημικών ουσιών πηγάζει από τις ανησυχίες ότι τα επίπεδα των χημικών ουσιών στο περιβάλλον ενδέχεται να έχουν δυσμενείς επιδράσεις τόσο στους ανθρώπους όσο και στην άγρια πανίδα, λόγω της αλληλεπίδρασης των εν λόγω ουσιών με το ενδοκρινικό σύστημα. Το 1998 ο ΟΟΣΑ δρομολόγησε μια δραστηριότητα πρώτης προτεραιότητας με σκοπό την αναθεώρηση των υφιστάμενων κατευθυντήριων γραμμών και την ανάπτυξη νέων για τη διαλογή (screening) και τη δοκιμή δυνητικών ενδοκρινικών διαταρακτών. Ένα στοιχείο της δραστηριότητας ήταν η εκπόνηση κατευθυντήριας γραμμής δοκιμών για τη διαλογή των χημικών ουσιών που δρουν στο ενδοκρινικό σύστημα διαφόρων ειδών ψαριών. Η βραχυπρόθεσμη δοκιμή αναπαραγωγής σε ψάρια υποβλήθηκε σε εκτενές πρόγραμμα επικύρωσης, αποτελούμενο από διεργαστηριακές μελέτες με επιλεγμένες χημικές ουσίες, ώστε να καταδειχθούν η συνάφεια και η αξιοπιστία της δοκιμής για την ανίχνευση χημικών ουσιών που επηρεάζουν την αναπαραγωγή των ψαριών με διάφορους μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένων των ενδοκρινικών τρόπων δράσης (1, 2, 3, 4, 5). Όλα τα τελικά σημεία της κατευθυντήριας γραμμής δοκιμών του ΟΟΣΑ έχουν επικυρωθεί στον χοντροκέφαλο φοξίνο, ενώ ένα υποσύνολο των τελικών σημείων έχει επικυρωθεί στο ρυζόψαρο (η βιτελογενίνη και τα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου) και στο ζεβρόψαρο (η βιτελογενίνη). Η εργασία επικύρωσης υποβλήθηκε σε αξιολόγηση από ομότιμους κριτές, μια ομάδα εμπειρογνωμόνων που ορίστηκαν από τους εθνικούς συντονιστές του προγράμματος κατευθυντήριων γραμμών δοκιμών του ΟΟΣΑ (6), εν μέρει, και από ανεξάρτητη ομάδα εμπειρογνωμόνων κατόπιν ανάθεσης από την Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος των Ηνωμένων Πολιτειών (29). Η δοκιμή δεν έχει σχεδιαστεί για τον εντοπισμό συγκεκριμένων μηχανισμών ορμονικής διατάραξης, λόγω του ότι τα πειραματόζωα διαθέτουν άθικτο άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-γονάδων (HPG), ο οποίος μπορεί να αποκριθεί σε χημικές ουσίες που τον επηρεάζουν σε διάφορα επίπεδα. 2. Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών περιγράφεται μια δοκιμή διαλογής in vivo, κατά την οποία γεννητικά ώριμα αρσενικά και θηλυκά ψάρια διατηρούνται μαζί και εκτίθενται σε μία χημική ουσία για ένα μικρό μέρος του κύκλου ζωής τους (21 ημέρες). Κατά τη λήξη της περιόδου έκθεσης των 21 ημερών, μετρούνται δύο τελικά σημεία βιοδεικτών σε αρσενικά και θηλυκά άτομα ως δείκτες ενδοκρινικής δραστικότητας της υπό δοκιμή χημικής ουσίας· τα τελικά αυτά σημεία είναι η βιτελογενίνη και τα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου. Η βιτελογενίνη μετράται στον χοντροκέφαλο φοξίνο, στο ρυζόψαρο και στο ζεβρόψαρο, ενώ τα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου μετρούνται στον χοντροκέφαλο φοξίνο και το ρυζόψαρο. Επιπλέον, παρακολουθείται καθημερινά η ποσοτική γονιμότητα σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Διατηρούνται επίσης οι γονάδες και είναι δυνατόν να αξιολογηθεί η ιστοπαθολογική εικόνα με σκοπό την εκτίμηση της αναπαραγωγικής υγείας των πειραματόζωων και την ενίσχυση του βάρους της απόδειξης άλλων τελικών σημείων. 3. Ο παρών βιοπροσδιορισμός λειτουργεί ως δοκιμή αναπαραγωγής in vivo για διαλογή και η εφαρμογή του θα πρέπει να εντάσσεται στο «Εννοιολογικό πλαίσιο του ΟΟΣΑ για τις δοκιμές και την αξιολόγηση χημικών ενδοκρινικών διαταρακτών» (30). Στο εν λόγω εννοιολογικό πλαίσιο, η βραχυπρόθεσμη δοκιμή αναπαραγωγής σε ψάρια προτείνεται στο επίπεδο 3 ως δοκιμή in vivo που παρέχει δεδομένα σχετικά με επιλεγμένους(-ες) ενδοκρινικούς(-ές) μηχανισμούς/οδούς. ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ 4. Η βιτελογενίνη (VTG) παράγεται κανονικά από το ήπαρ των θηλυκών ωοτόκων σπονδυλωτών ως απόκριση στα κυκλοφορούντα ενδογενή οιστρογόνα. Είναι πρόδρομος των πρωτεϊνών της λεκίθου του αυγού και, αφού παραχθεί στο ήπαρ, φθάνει μέσω της κυκλοφορίας του αίματος στην ωοθήκη, όπου απορροφάται και τροποποιείται από τα αναπτυσσόμενα αυγά. Η βιτελογενίνη είναι σχεδόν μη ανιχνεύσιμη στο πλάσμα των ανώριμων θηλυκών και των αρσενικών ψαριών, επειδή αυτά δεν διαθέτουν επαρκή κυκλοφορούντα οιστρογόνα· ωστόσο, το ήπαρ είναι ικανό να συνθέτει και να εκκρίνει βιτελογενίνη ως απόκριση σε εξωγενή διέγερση από οιστρογόνα. 5. Η μέτρηση της βιτελογενίνης χρησιμεύει στην ανίχνευση χημικών ουσιών με διάφορους τρόπους οιστρογόνου δράσης. Η ανίχνευση χημικών ουσιών με οιστρογόνο δράση είναι εφικτή μέσω της μέτρησης της επαγωγής βιτελογενίνης σε αρσενικά ψάρια και έχει τεκμηριωθεί σε πληθώρα επιστημονικών δημοσιεύσεων αξιολογημένων από ομότιμους κριτές (π.χ. (7)). Η επαγωγή βιτελογενίνης έχει επίσης καταδειχτεί μετά από έκθεση σε αρωματοποιήσιμα ανδρογόνα (8, 9). Μείωση των κυκλοφορούντων επιπέδων οιστρογόνων σε θηλυκά άτομα, για παράδειγμα μέσω αναστολής της αρωματάσης που μετατρέπει τα ενδογενή ανδρογόνα στο φυσικό οιστρογόνο 17β-οιστραδιόλη, προκαλεί μείωση των επιπέδων VTG, η οποία χρησιμοποιείται για την ανίχνευση χημικών ουσιών με ιδιότητες αναστολής της αρωματάσης (10, 11). Η βιολογική σημασία της απόκρισης της βιτελογενίνης μετά από αναστολή των οιστρογόνων / της αρωματάσης έχει αποδειχθεί και τεκμηριωθεί ευρέως. Ωστόσο, η παραγωγή VTG στα θηλυκά άτομα μπορεί επίσης να επηρεαστεί από γενική τοξικότητα και μη ενδοκρινικούς τοξικούς τρόπους δράσης, π.χ. ηπατοτοξικότητα. 6. Διάφορες μέθοδοι μέτρησης έχουν αναπτυχθεί με επιτυχία και έχουν τυποποιηθεί για συστηματική χρήση. Αυτό ισχύει για τις ειδικές ανά ζωικό είδος μεθόδους ενζυμικού ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού (ELISA) με τη χρήση ανοσοχημείας για τον ποσοτικό προσδιορισμό της παραγόμενης VTG σε μικρά δείγματα αίματος ή ήπατος που συλλέγονται από μεμονωμένα ψάρια (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Λαμβάνονται δείγματα αίματος από χοντροκέφαλο φοξίνο, αίματος ή ομογενοποιήματος κεφαλής/ουράς από ζεβρόψαρο και ήπατος από ρυζόψαρο για μέτρηση της VTG. Στο ρυζόψαρο υπάρχει ικανοποιητική συσχέτιση μεταξύ της VTG που μετράται στο αίμα και εκείνης που μετράται στο ήπαρ (19). Στο προσάρτημα 6 παρέχονται οι συνιστώμενες διαδικασίες συλλογής δειγμάτων για την ανάλυση VTG. Προπαρασκευασμένα αντιδραστήρια (κιτ) για τη μέτρηση της VTG είναι ευρέως διαθέσιμα· τα εν λόγω κιτ θα πρέπει να βασίζονται σε επικυρωμένη ειδική ανά ζωικό είδος μέθοδο ELISA. 7. Τα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου στα αρσενικά ψάρια ορισμένων ειδών είναι εξωτερικά ορατά, ποσοτικοποιήσιμα και αποκρίνονται στα κυκλοφορούντα επίπεδα ενδογενών ανδρογόνων· αυτό ισχύει για τον χοντροκέφαλο φοξίνο και το ρυζόψαρο, όχι όμως για το ζεβρόψαρο, που δεν διαθέτει ποσοτικοποιήσιμα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου. Τα θηλυκά άτομα διατηρούν την ικανότητα ανάπτυξης αρσενικών δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου, όταν εκτεθούν σε ανδρογόνες χημικές ουσίες στο νερό. Στην επιστημονική βιβλιογραφία είναι διαθέσιμες διάφορες μελέτες που τεκμηριώνουν αυτό το είδος απόκρισης στον χοντροκέφαλο φοξίνο (20) και στο ρυζόψαρο (21). Η μείωση των δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου σε αρσενικά άτομα θα πρέπει να ερμηνεύεται με προσοχή, λόγω της χαμηλής στατιστικής ισχύος, και να βασίζεται στην κρίση εμπειρογνωμόνων και στο βάρος της απόδειξης. Υπάρχουν περιορισμοί στη χρήση ζεβρόψαρου στην παρούσα δοκιμή, λόγω της απουσίας ποσοτικοποιήσιμων δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου που να αποκρίνονται σε χημικές ουσίες με ανδρογόνο δράση. 8. Στον χοντροκέφαλο φοξίνο, ο κύριος δείκτης εξωγενούς έκθεσης σε ανδρογόνα είναι ο αριθμός των γαμήλιων φυματίων που βρίσκονται στο ρύγχος των θηλυκών ψαριών. Στο ρυζόψαρο, ο αριθμός των θηλοειδών αποφύσεων αποτελεί τον κύριο δείκτη εξωγενούς έκθεσης θηλυκών ψαριών σε ανδρογόνες χημικές ουσίες. Στα προσαρτήματα 5A και 5B αναφέρονται οι συνιστώμενες διαδικασίες που πρέπει να ακολουθούνται για την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών του φύλου στον χοντροκέφαλο φοξίνο και το ρυζόψαρο αντίστοιχα. 9. Η δοκιμή 21 ημερών σε ψάρια περιλαμβάνει αξιολόγηση της ποσοτικής παραγωγής αυγών και τη διατήρηση των γονάδων για προαιρετική ιστοπαθολογική εξέταση. Ορισμένες ρυθμιστικές αρχές ενδέχεται να απαιτούν αυτό το πρόσθετο τελικό σημείο για μια πιο ολοκληρωμένη αξιολόγηση της αναπαραγωγικής υγείας των πειραματόζωων ή σε περιπτώσεις που η βιτελογενίνη και τα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου δεν αποκρίνονται στην έκθεση στη χημική ουσία. Αν και ορισμένα τελικά σημεία μπορεί να έχουν υψηλή διαγνωστική αξία (π.χ. η επαγωγή VTG σε αρσενικά άτομα και ο σχηματισμός φυματίων σε θηλυκά), δεν προορίζονται όλα τα τελικά σημεία της δοκιμής (π.χ. γονιμότητα και ιστοπαθολογική εξέταση γονάδων) για τον αδιαμφισβήτητο εντοπισμό ειδικών κυτταρικών μηχανισμών δράσης. Αντίθετα, το σύνολο των τελικών σημείων επιτρέπει συλλογικά την εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με τις πιθανές ενδοκρινικές διαταράξεις και, ως εκ τούτου, παρέχει καθοδήγηση για περαιτέρω δοκιμές. Μολονότι δεν συνδέεται ειδικά με το ενδοκρινικό σύστημα, η γονιμότητα, λόγω της αποδεδειγμένης ευαισθησίας της σε γνωστές ενδοκρινικά δραστικές χημικές ουσίες (5), αποτελεί σημαντικό τελικό σημείο που πρέπει να συμπεριλαμβάνεται, διότι, όταν αυτή και άλλα τελικά σημεία δεν επηρεάζονται, αυξάνεται η πεποίθηση ότι μια ένωση είναι απίθανο να είναι ενδοκρινικά δραστική. Όταν, όμως, υπάρχει επίδραση στη γονιμότητα, αυτή συνεισφέρει σε μεγάλο βαθμό στην εξαγωγή συμπερασμάτων βάσει του βάρους της απόδειξης. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών παρέχει περαιτέρω καθοδήγηση για την ερμηνεία των δεδομένων και την αποδοχή των αποτελεσμάτων των δοκιμών. 10. Οι ορισμοί που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών παρατίθενται στο προσάρτημα 1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 11. Στη δοκιμή, αρσενικά και θηλυκά ψάρια σε αναπαραγωγική κατάσταση εκτίθενται μαζί μέσα σε δοκιμαστικά δοχεία. Η ενήλικη και αναπαραγωγική τους κατάσταση επιτρέπει σαφή διαφοροποίηση του κάθε φύλου και, ως εκ τούτου, τη φυλοσύνδετη ανάλυση κάθε τελικού σημείου και εξασφαλίζει την ευαισθησία τους έναντι εξωγενών χημικών ουσιών. Στο τέλος της δοκιμής, το φύλο επιβεβαιώνεται με μακροσκοπική εξέταση των γονάδων έπειτα από διάνοιξη της κοιλιακής πλευράς της κοιλίας με ψαλίδι. Το προσάρτημα 2 παρέχει επισκόπηση των σημαντικών συνθηκών βιοπροσδιορισμού. Η δοκιμή αρχίζει συνήθως με δείγματα ψαριών από πληθυσμό που βρίσκεται σε ωοτοκία· δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται υπερήλικα ζώα. Οδηγίες για την ηλικία των ψαριών και την αναπαραγωγική κατάσταση περιλαμβάνονται στην ενότητα για την επιλογή των ψαριών. Η δοκιμή διεξάγεται με τη χρήση τριών συγκεντρώσεων έκθεσης στη χημική ουσία και ενός μάρτυρα με νερό, καθώς και ενός μάρτυρα με διαλύτη, εάν είναι απαραίτητο. Για τα ζεβρόψαρα χρησιμοποιούνται δύο δοχεία ή επαναλήψεις ανά μεταχείριση (κάθε δοχείο περιέχει 5 αρσενικά και 5 θηλυκά άτομα). Για τους χοντροκέφαλους φοξίνους χρησιμοποιούνται τέσσερα δοχεία ή επαναλήψεις ανά μεταχείριση (κάθε δοχείο περιέχει 2 αρσενικά και 4 θηλυκά άτομα). Αυτό γίνεται για να εξυπηρετείται η χωροκρατική συμπεριφορά του αρσενικού χοντροκέφαλου φοξίνου και, παράλληλα, να διατηρεί η δοκιμή επαρκή ισχύ. Για τα ρυζόψαρα χρησιμοποιούνται τέσσερα δοχεία ή επαναλήψεις ανά μεταχείριση (κάθε δοχείο περιέχει 3 αρσενικά και 3 θηλυκά άτομα). Η έκθεση διαρκεί 21 ημέρες και η δειγματοληψία ψαριών διενεργείται την 21η ημέρα της έκθεσης. Η ποσοτική γονιμότητα παρακολουθείται σε καθημερινή βάση. 12. Για τη δειγματοληψία κατά την 21η ημέρα, τα ζώα θανατώνονται με τρόπο ανώδυνο. Τα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου μετρούνται σε χοντροκέφαλους φοξίνους και ρυζόψαρα (βλ. προσαρτήματα 5Α και 5Β)· για τον προσδιορισμό της VTG σε ζεβρόψαρα και χοντροκέφαλους φοξίνους συλλέγονται δείγματα αίματος· εναλλακτικά μπορούν να συλλεχθούν κεφαλή/ουρά για τον προσδιορισμό της VTG στα ζεβρόψαρα (προσάρτημα 6)· για την ανάλυση VTG στα ρυζόψαρα συλλέγεται το ήπαρ (προσάρτημα 6)· οι γονάδες μονιμοποιούνται είτε ολόκληρες είτε ανατετμημένες για ενδεχόμενη ιστοπαθολογική αξιολόγηση (22). ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΠΟΔΟΧΗΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 13. Για να είναι αποδεκτά τα αποτελέσματα της δοκιμής, πρέπει να πληρούνται οι ακόλουθες προϋποθέσεις: — η θνησιμότητα μαρτύρων σε νερό (ή διαλύτη) δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 10 % στο τέλος της περιόδου έκθεσης· — η συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 60 % της τιμής κορεσμού με αέρα (ASV) καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης· — η θερμοκρασία του νερού θα πρέπει να μη διαφέρει μεταξύ των δοκιμαστικών δοχείων κατά περισσότερο από ± 1,5 °C οποιαδήποτε χρονική στιγμή κατά τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης και να διατηρείται με απόκλιση 2 °C εντός του εύρους θερμοκρασιών που ορίζεται για το υπό δοκιμή είδος (προσάρτημα 2)· — θα πρέπει να υπάρχουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι οι συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο διάλυμα διατηρήθηκαν ικανοποιητικά στα όρια του ± 20 % των μέσων τιμών που μετρήθηκαν· — πρέπει να υπάρχουν στοιχεία που να αποδεικνύουν ενεργό ωοτοκία των ψαριών σε όλες τις επαναλήψεις πριν από την έναρξη της έκθεσης στη χημική ουσία και στις επαναλήψεις με μάρτυρες κατά τη διάρκεια της δοκιμής. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Εργαστηριακός εξοπλισμός 14. Συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός και, ειδικότερα, τα ακόλουθα: α. οξυγονόμετρα και πεχάμετρα· β. εξοπλισμός για τον προσδιορισμό της σκληρότητας και αλκαλικότητας του νερού· γ. κατάλληλη συσκευή για τον έλεγχο και, κατά προτίμηση, τη συνεχή παρακολούθηση της θερμοκρασίας· δ. δεξαμενές κατασκευασμένες από χημικώς αδρανές υλικό και κατάλληλης χωρητικότητας ανάλογα με τον συνιστώμενο πληθυσμιακό φόρτο και την πληθυσμιακή πυκνότητα (βλ. προσάρτημα 2)· ε. υπόστρωμα ωοτοκίας για χοντροκέφαλους φοξίνους και ζεβρόψαρα — το παράρτημα 4 παρέχει τις απαραίτητες λεπτομέρειες· στ. ζυγός κατάλληλης ακρίβειας (δηλαδή ακρίβεια έως ± 0,5mg). Νερό 15. Ως νερό δοκιμής μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάθε νερό στο οποίο το υπό δοκιμή είδος εμφανίζει την ενδεδειγμένη μακροπρόθεσμη επιβίωση και ανάπτυξη. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής το νερό θα πρέπει να είναι σταθερής ποιότητας. Το pΗ του νερού θα πρέπει να κυμαίνεται από 6,5 έως 8,5, κατά τη διάρκεια όμως μιας δεδομένης δοκιμής δεν θα πρέπει να αποκλίνει πέραν των ± 0,5 μονάδων pΗ. Για να διασφαλίζεται ότι το νερό αραίωσης δεν πρόκειται να επηρεάσει αδικαιολόγητα το αποτέλεσμα της δοκιμής (π.χ. μέσω του σχηματισμού συμπλόκων με την υπό δοκιμή χημική ουσία)· θα πρέπει κατά διαστήματα να λαμβάνονται δείγματα για ανάλυση. Όταν είναι γνωστό ότι η ποιότητα του νερού αραίωσης είναι σχετικά σταθερή, θα πρέπει, π.χ. κάθε τρεις μήνες, να γίνονται μετρήσεις βαρέων μετάλλων (π.χ. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd και Ni), βασικών ανιόντων και κατιόντων (π.χ. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl- και SO4 2-), γεωργικών φαρμάκων (π.χ. ολικών οργανοφωσφορικών και ολικών οργανοχλωριούχων γεωργικών φαρμάκων), ολικού οργανικού άνθρακα και αιωρούμενων στερεών. Εάν η ποιότητα του νερού έχει αποδειχθεί ότι είναι σταθερή για ένα τουλάχιστον έτος, η συχνότητα των προσδιορισμών μπορεί να περιοριστεί και τα διαστήματα να αυξηθούν (π.χ. κάθε έξι μήνες). Μερικά χημικά χαρακτηριστικά αποδεκτού νερού αραίωσης καταγράφονται στο παράρτημα 3. Διαλύματα της δοκιμής 16. Τα διαλύματα της δοκιμής με τις επιλεγμένες συγκεντρώσεις παρασκευάζονται με αραίωση διαλύματος παρακαταθήκης. Το διάλυμα παρακαταθήκης θα πρέπει, κατά προτίμηση, να παρασκευάζεται με απλή ανάμειξη ή ανακίνηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε νερό αραίωσης, με τη χρήση μηχανικών μέσων (π.χ. ανάδευση ή υπερήχους). Για να επιτευχθεί το κατάλληλο πυκνό διάλυμα παρακαταθήκης είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν στήλες κορεσμού (στήλες διαλυτότητας). Δεν συνιστάται η χρήση φορέα διαλύτη. Ωστόσο, σε περίπτωση που απαιτείται διαλύτης, θα πρέπει να υποβάλλεται παράλληλα στη διαδικασία ένας μάρτυρας με διαλύτη, στην ίδια συγκέντρωση διαλύτη όπως στις ομάδες μεταχείρισης με τη χημική ουσία. Για χημικές ουσίες που είναι δύσκολο να υποβληθούν σε δοκιμή, ο διαλύτης μπορεί να είναι, από τεχνική άποψη, η βέλτιστη λύση· οι ενδιαφερόμενοι θα πρέπει να ανατρέξουν στο έγγραφο καθοδήγησης του ΟΟΣΑ σχετικά με τις δοκιμές υδατικής τοξικότητας δύσκολων ουσιών και μειγμάτων (23). Η επιλογή του διαλύτη καθορίζεται από τις χημικές ιδιότητες της χημικής ουσίας ή του μείγματος. Το έγγραφο καθοδήγησης του ΟΟΣΑ συνιστά μέγιστη συγκέντρωση 100μl/l, όριο που θα πρέπει να τηρείται. Ωστόσο, μια πρόσφατη ανασκόπηση (24) ανέδειξε πρόσθετες ανησυχίες όταν χρησιμοποιούνται διαλύτες για δοκιμές ενδοκρινικής δραστικότητας. Ως εκ τούτου, συνιστάται η συγκέντρωση του διαλύτη, εφόσον χρειάζεται, να ελαχιστοποιείται όποτε αυτό είναι τεχνικά εφικτό (εξαρτάται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες της υπό δοκιμή χημικής ουσίας). 17. Χρησιμοποιείται σύστημα δοκιμής συνεχούς ροής. Ένα τέτοιο σύστημα διανέμει και αραιώνει συνεχώς ένα διάλυμα παρακαταθήκης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (π.χ. δοσιμετρική αντλία, αναλογικός αραιωτής, σύστημα κορεσμού) για την παροχή σειράς συγκεντρώσεων στους δοκιμαστικούς θαλάμους. Οι ταχύτητες ροής των διαλυμάτων παρακαταθήκης και του νερού αραίωσης θα πρέπει να ελέγχονται κατά διαστήματα, κατά προτίμηση καθημερινά, κατά τη διάρκεια της δοκιμής και να μη μεταβάλλονται κατά περισσότερο από 10 % σε όλη τη διάρκειά της. Θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η χρήση χαμηλής ποιότητας πλαστικών σωληνώσεων ή άλλων υλικών που ενδέχεται να περιέχουν βιολογικά δραστικές χημικές ουσίες. Κατά την επιλογή του υλικού για το σύστημα συνεχούς ροής, θα πρέπει να συνυπολογίζεται η πιθανή προσρόφηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο υλικό αυτό. Διατήρηση των ψαριών 18. Τα υπό δοκιμή ψάρια θα πρέπει να επιλέγονται από εργαστηριακό πληθυσμό, κατά προτίμηση από ένα και μόνο απόθεμα, που έχει εγκλιματιστεί για δύο εβδομάδες τουλάχιστον πριν από τη δοκιμή, υπό συνθήκες ποιότητας νερού και φωτισμού παρόμοιες με εκείνες που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή. Είναι σημαντικό, ο φόρτος και η πυκνότητα του πληθυσμού (για ορισμούς βλ. προσάρτημα 1) να είναι κατάλληλα για το χρησιμοποιούμενο υπό δοκιμή είδος ψαριών (βλέπε προσάρτημα 2). 19. Έπειτα από ένα 48ωρο εγκατάστασης, καταγράφονται οι θνησιμότητες και εφαρμόζονται τα ακόλουθα κριτήρια: — ποσοστά θνησιμότητας άνω του 10 % του πληθυσμού σε επτά ημέρες: απορρίπτεται ολόκληρη η παρτίδα· — ποσοστά θνησιμότητας μεταξύ 5 % και 10 % του πληθυσμού: εγκλιματισμός για επτά ακόμη ημέρες. Εάν, κατά τη διάρκεια του δεύτερου επταημέρου, καταγραφεί ποσοστό θνησιμότητας άνω του 5 %, απορρίπτεται ολόκληρη η παρτίδα· — ποσοστά θνησιμότητας κάτω του 5 % του πληθυσμού σε επτά ημέρες: η παρτίδα γίνεται αποδεκτή. 20. Τα ψάρια δεν θα πρέπει να λαμβάνουν αγωγή για ασθένεια κατά τη διάρκεια της περιόδου εγκλιματισμού, της περιόδου προέκθεσης και της περιόδου έκθεσης. Προέκθεση και επιλογή των ψαριών 21. Συνιστάται περίοδος προέκθεσης μίας ή δύο εβδομάδων, με τα ζώα τοποθετημένα σε δοχεία παρόμοια με εκείνα της πραγματικής δοκιμής. Τα ψάρια θα πρέπει να σιτίζονται κατά βούληση (ad libitum), καθ' όλη την περίοδο διατήρησης και κατά τη διάρκεια της φάσης έκθεσης. Το στάδιο της έκθεσης αρχίζει με ενήλικα ψάρια με φυλετικό διμορφισμό, προερχόμενα από εργαστηριακή πηγή αναπαραγωγικά ώριμων ζώων (π.χ. με σαφή δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου, ορατά στην περίπτωση του χοντροκέφαλου φοξίνου και του ρυζόψαρου), που βρίσκονται σε ενεργό ωοτοκία. Ως γενική κατεύθυνση και μόνο (και να μην ληφθεί υπόψη ανεξάρτητα από την παρατήρηση της πραγματικής αναπαραγωγικής κατάστασης δεδομένης παρτίδας ψαριών), οι χοντροκέφαλοι φοξίνοι θα πρέπει να είναι ηλικίας περίπου 20 (± 2) εβδομάδων, εφόσον έχουν καλλιεργηθεί στους 25 ± 2 °C κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Τα ρυζόψαρα θα πρέπει να είναι ηλικίας περίπου 16 (± 2) εβδομάδων, εφόσον έχουν καλλιεργηθεί στους 25 ± 2 °C κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Τα ζεβρόψαρα θα πρέπει να είναι ηλικίας περίπου 16 (± 2) εβδομάδων, εφόσον έχουν καλλιεργηθεί στους 26 ± 2 °C κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Η παραγωγή αυγών πρέπει να αξιολογείται καθημερινά κατά το στάδιο της προέκθεσης. Συνιστάται να παρατηρείται η ωοτοκία σε όλες τις δεξαμενές επανάληψης, πριν από την ενσωμάτωσή τους στο στάδιο της έκθεσης της δοκιμής. Ποσοτικές κατευθύνσεις σχετικά με την επιθυμητή ημερήσια παραγωγή αυγών δεν μπορούν να παρασχεθούν επί του παρόντος, αλλά είναι σχετικά σύνηθες να παρατηρείται μέση εναπόθεση > 10 αυγών/θηλυκό άτομο/ημέρα για κάθε είδος. Για την κατανομή των επαναλήψεων στα διάφορα πειραματικά επίπεδα θα πρέπει να χρησιμοποιείται τυχαιοποιημένος σχεδιασμός κατά ομάδες με βάση την παραγωγή αυγών, ώστε να εξασφαλίζεται ισόρροπη κατανομή των επαναλήψεων. ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 22. Χρησιμοποιούνται τρεις συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, ένας μάρτυρας (νερό) και, εφόσον χρειαστεί, ένας μάρτυρας με διαλύτη. Τα δεδομένα μπορούν να αναλυθούν για να προσδιοριστούν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των αποκρίσεων μεταχείρισης και των αποκρίσεων μαρτύρων. Από τις αναλύσεις αυτές θα προκύψουν στοιχεία σχετικά με το κατά πόσον απαιτείται περαιτέρω μακροπρόθεσμη δοκιμή για δυσμενείς επιδράσεις της χημικής ουσίας (δηλ. στην επιβίωση, την ανάπτυξη, την αύξηση και την αναπαραγωγή) και όχι για χρήση στην εκτίμηση κινδύνου (25). 23. Για τα ζεβρόψαρα, την 21η ημέρα του πειράματος, αρσενικά και θηλυκά άτομα από κάθε επίπεδο μεταχείρισης (5 αρσενικά και 5 θηλυκά καθεμίας από τις δύο επαναλήψεις) και από τον(τους) μάρτυρα(ες) υποβάλλονται σε δειγματοληψία για τη μέτρηση της βιτελογενίνης. Για τα ρυζόψαρα, την 21η ημέρα του πειράματος, αρσενικά και θηλυκά άτομα από κάθε επίπεδο μεταχείρισης (3 αρσενικά και 3 θηλυκά καθεμίας από τις τέσσερις επαναλήψεις) και από τον(τους) μάρτυρα(ες) υποβάλλονται σε δειγματοληψία για τη μέτρηση της βιτελογενίνης και των δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου. Για τους χοντροκέφαλους φοξίνους, την 21η ημέρα της έκθεσης, αρσενικά και θηλυκά άτομα (2 αρσενικά και 4 θηλυκά καθεμίας από τις τέσσερις επαναλήψεις) και από τον(τους) μάρτυρα(ες) υποβάλλονται σε δειγματοληψία για τη μέτρηση της βιτελογενίνης και των δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου. Απαιτείται ποσοτική εκτίμηση της γονιμότητας και οι ιστοί των γονάδων θα πρέπει να μονιμοποιούνται ολόκληροι ή να ανατέμνονται για πιθανή ιστοπαθολογική αξιολόγηση, εάν χρειαστεί. Επιλογή των συγκεντρώσεων δοκιμής 24. Για τους σκοπούς της παρούσας δοκιμής, η υψηλότερη συγκέντρωση δοκιμής θα πρέπει να καθορίζεται από τη μέγιστη ανεκτή συγκέντρωση (ΜΑΣ), η οποία έχει προσδιοριστεί με δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών ή με βάση άλλα δεδομένα τοξικότητας, ή τα 10 mg/l ή τη μέγιστη υδατοδιαλυτότητα, αναλόγως του ποια από τις τιμές αυτές είναι χαμηλότερη. Η ΜΑΣ ορίζεται ως η υψηλότερη συγκέντρωση της χημικής ουσίας στη δοκιμή που έχει ως αποτέλεσμα θνησιμότητα μικρότερη από 10 %. Η χρήση αυτής της προσέγγισης προϋποθέτει την ύπαρξη εμπειρικών δεδομένων οξείας τοξικότητας ή άλλων δεδομένων τοξικότητας από τα οποία μπορεί να γίνει εκτίμηση της ΜΑΣ. Η εκτίμηση της ΜΑΣ μπορεί να μην είναι ακριβής και συνήθως απαιτεί τη γνώμη ενός ειδικού. 25. Απαιτούνται τρεις συγκεντρώσεις δοκιμής, οι οποίες να απέχουν μεταξύ τους κατά σταθερό παράγοντα που δεν υπερβαίνει το 10, και ένας μάρτυρα με νερό αραίωσης (και μάρτυρας με διαλύτη, εάν χρειάζεται). Συνιστάται εύρος παραγόντων απόστασης μεταξύ 3,2 και 10. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Επιλογή και ζύγιση των υπό δοκιμή ψαριών 26. Είναι σημαντικό να ελαχιστοποιείται η διακύμανση του βάρους των ψαριών στην αρχή της δοκιμής. Κατάλληλες περιοχές μεγεθών για τα διάφορα είδη που συνιστώνται για χρήση στην παρούσα δοκιμή παρέχονται στο προσάρτημα 2. Για το σύνολο της παρτίδας ψαριών που χρησιμοποιείται στη δοκιμή, το εύρος βάρους σώματος ανά άτομο για αρσενικά και θηλυκά ψάρια στην έναρξη της δοκιμής θα πρέπει, εάν είναι δυνατόν, να διατηρείται εντός του ± 20 % του αριθμητικού μέσου βάρους του ιδίου φύλου. Πριν από τη δοκιμή συνιστάται να ζυγίζεται ένα μερικό δείγμα του αποθέματος ψαριών, για να εκτιμάται το μέσο βάρος. Συνθήκες έκθεσης Διάρκεια 27. Η διάρκεια της δοκιμής είναι 21 ημέρες, μετά από μια περίοδο προέκθεσης. Η συνιστώμενη περίοδος προέκθεσης είναι μία έως δύο εβδομάδες. Σίτιση 28. Τα ψάρια θα πρέπει να σιτίζονται κατά βούληση με κατάλληλη τροφή (προσάρτημα 2) και σε επίπεδα επαρκή για να διατηρηθεί η φυσική κατάσταση. Θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η ανάπτυξη μικροβίων και η θολερότητα του νερού. Ως γενική κατεύθυνση, το ημερήσιο σιτηρέσιο μπορεί να διαιρείται σε δύο ή τρεις ίσες μερίδες για πολλαπλές σιτίσεις την ημέρα, διαχωριζόμενες από διαστήματα τουλάχιστον τριών ωρών. Ένα μόνο μεγαλύτερο σιτηρέσιο είναι αποδεκτό, ιδίως για τα σαββατοκύριακα. Η σίτιση των ψαριών θα πρέπει να διακόπτεται 12 ώρες πριν από τη δειγματοληψία/νεκροψία. 29. Η τροφή των ψαριών θα πρέπει να αξιολογείται για την παρουσία προσμείξεων, όπως τα οργανοχλωριούχα γεωργικά φάρμακα, οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAH), τα πολυχλωριωμένα διφαινύλια (PCB). Θα πρέπει να αποφεύγονται τροφές με υψηλό επίπεδο φυτοοιστρογόνων που μπορούν να διακυβεύσουν την απόκριση της δοκιμής σε γνωστό αγωνιστή οιστρογόνων (π.χ. 17b-οιστραδιόλη). 30. Τα υπολείμματα των τροφών και τα περιττώματα θα πρέπει να απομακρύνονται από τα δοκιμαστικά δοχεία τουλάχιστον δύο φορές την εβδομάδα, π.χ. με προσεκτικό καθαρισμό του πυθμένα κάθε δεξαμενής με σίφωνα. Φως και θερμοκρασία 31. Η φωτοπερίοδος και η θερμοκρασία του νερού θα πρέπει να είναι κατάλληλες για τα υπό δοκιμή είδη (βλ. προσάρτημα 2). Συχνότητα αναλυτικών προσδιορισμών και μετρήσεων 32. Πριν από την έναρξη της περιόδου έκθεσης, θα πρέπει να διασφαλίζεται η ορθή λειτουργία του συστήματος παροχής της χημικής ουσίας. Όλες οι αναλυτικές μέθοδοι που απαιτούνται θα πρέπει να είναι καθιερωμένες, συμπεριλαμβανομένων επαρκών γνώσεων σχετικά με τη χημική σταθερότητα στο σύστημα δοκιμής. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, οι συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας προσδιορίζονται σε τακτά διαστήματα, ως εξής: οι ταχύτητες ροής του μέσου αραίωσης και του διαλύματος παρακαταθήκης του τοξικού παράγοντα θα πρέπει να ελέγχονται κατά προτίμηση καθημερινά ή τουλάχιστον δύο φορές την εβδομάδα και να μη διαφέρουν περισσότερο από 10 % καθ' όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Συνιστάται να μετρώνται οι πραγματικές συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε όλα τα δοχεία κατά την έναρξη της δοκιμής και, κατόπιν, ανά εβδομάδα. 33. Συνιστάται να βασίζονται τα αποτελέσματα σε μετρηθείσες συγκεντρώσεις. Ωστόσο, εάν η συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο διάλυμα έχει διατηρηθεί ικανοποιητικά εντός του ± 20 % της ονομαστικής συγκέντρωσης καθ' όλη τη διάρκεια της δοκιμής, τα αποτελέσματα μπορούν να βασίζονται στις ονομαστικές ή στις μετρηθείσες τιμές. 34. Τα δείγματα μπορεί να χρειάζεται να διηθηθούν (π.χ. με τη χρήση διηθητικού μέσου με πόρους διαμέτρου 0,45 μm) ή να φυγοκεντρηθούν. Εάν χρειάζεται, η συνιστώμενη διαδικασία είναι η φυγοκέντρηση. Πάντως, εφόσον η υπό δοκιμή ύλη δεν προσροφάται στους ηθμούς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η διήθηση. 35. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, το διαλυμένο οξυγόνο, η θερμοκρασία και το pH θα πρέπει να μετρώνται σε όλα τα δοκιμαστικά δοχεία τουλάχιστον μία φορά την εβδομάδα. Η ολική σκληρότητα και αλκαλικότητα θα πρέπει να μετρώνται στους μάρτυρες και σε ένα δοχείο με την υψηλότερη συγκέντρωση τουλάχιστον μία φορά την εβδομάδα. Η θερμοκρασία θα πρέπει, κατά προτίμηση, να παρακολουθείται συνεχώς σε ένα τουλάχιστον δοκιμαστικό δοχείο. Παρατηρήσεις 36. Ορισμένες γενικές (π.χ. επιβίωση) και βιολογικές αποκρίσεις (π.χ. τα επίπεδα VTG) αξιολογούνται κατά τη διάρκεια της δοκιμής ή στο τέλος της. Απαιτείται καθημερινή ποσοτική παρακολούθηση της γονιμότητας. Η μέτρηση και αξιολόγηση αυτών των τελικών σημείων, καθώς και η χρησιμότητά τους, περιγράφονται κατωτέρω. Επιβίωση 37. Τα ψάρια θα πρέπει να εξετάζονται καθημερινά κατά τη διάρκεια της περιόδου δοκιμής, τυχόν θνησιμότητα να καταγράφεται και τα νεκρά ψάρια να απομακρύνονται το ταχύτερο δυνατό. Τα νεκρά ψάρια δεν θα πρέπει να αντικαθίσταται ούτε στα δοχεία του μάρτυρα ούτε στα δοχεία αγωγής. Το φύλο των ψαριών που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμής θα πρέπει να προσδιορίζεται με μακροσκοπική αξιολόγηση των γονάδων. Συμπεριφορά και εμφάνιση 38. Κάθε μη φυσιολογική συμπεριφορά (σε σχέση με τους μάρτυρες) θα πρέπει να σημειώνεται· αυτό μπορεί να περιλαμβάνει σημεία γενικής τοξικότητας, μεταξύ των οποίων υπεραερισμό, ασυντόνιστες κολυμβητικές κινήσεις, απώλεια ισορροπίας και άτυπη ηρεμία ή συμπεριφορά σίτισης. Επίσης, θα πρέπει να σημειώνονται τυχόν εξωτερικές ανωμαλίες (όπως π.χ. αιμορραγία, αποχρωματισμός). Τα εν λόγω σημεία τοξικότητας θα πρέπει να εξετάζονται με προσοχή κατά την ερμηνεία των δεδομένων, δεδομένου ότι μπορεί να υποδηλώνουν συγκεντρώσεις στις οποίες οι βιοδείκτες ενδοκρινικής δραστικότητας δεν είναι αξιόπιστοι. Τέτοιες παρατηρήσεις σχετικά με τη συμπεριφορά ενδέχεται επίσης να παράσχουν χρήσιμες ποιοτικές πληροφορίες για τη διατύπωση πιθανών μελλοντικών απαιτήσεων για δοκιμές σε ψάρια. Για παράδειγμα, έχει παρατηρηθεί χωροκρατική επιθετικότητα σε κανονικούς αρσενικούς ή αρρενοποιημένους θηλυκούς χοντροκέφαλους φοξίνους όταν εκτίθενται σε ανδρογόνα· στα ζεβρόψαρα, η χαρακτηριστική συμπεριφορά ζευγαρώματος και ωοτοκίας με το πρώτο φως της αυγής ελαττώνεται ή παρεμποδίζεται από την έκθεση σε οιστρογόνα ή αντιανδρογόνα. 39. Επειδή ορισμένες πτυχές της εμφάνισης (κυρίως το χρώμα) μπορούν να αλλάξουν γρήγορα λόγω των χειρισμών, είναι σημαντικό οι ποιοτικές παρατηρήσεις να πραγματοποιούνται πριν από την απομάκρυνση των ζώων από το σύστημα δοκιμής. Η μέχρι σήμερα εμπειρία με τον χοντροκέφαλο φοξίνο δείχνει ότι μερικές ενδοκρινικά δραστικές χημικές ουσίες ενδέχεται αρχικά να επιφέρουν αλλαγές στα ακόλουθα εξωτερικά χαρακτηριστικά: χρώμα σώματος (ανοιχτό ή σκούρο), μοτίβα χρωματισμού (παρουσία κάθετων λωρίδων) και σχήμα σώματος (κεφαλή και θωρακική περιοχή). Ως εκ τούτου, οι παρατηρήσεις της φυσικής εμφάνισης των ψαριών θα πρέπει να πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια της δοκιμής και όταν ολοκληρώνεται η μελέτη. Γονιμότητα 40. Οι καθημερινές ποσοτικές παρατηρήσεις της ωοτοκίας θα πρέπει να καταγράφονται ανά επανάληψη. Η παραγωγή αυγών θα πρέπει να καταγράφεται ανά επανάληψη ως αριθμός αυγών/επιζών θηλυκό άτομο/ημέρα. Τα αυγά θα πρέπει να απομακρύνονται καθημερινά από τους δοκιμαστικούς θαλάμους Για τον χοντροκέφαλο φοξίνο και το ζεβρόψαρο θα πρέπει να τοποθετούνται στον δοκιμαστικό θάλαμο υποστρώματα ωοτοκίας, ώστε να μπορούν τα ψάρια να εναποθέτουν τα αυγά τους υπό κανονικές συνθήκες. Το προσάρτημα 4 παρέχει περαιτέρω λεπτομέρειες των συνιστώμενων υποστρωμάτων ωοτοκίας για το ζεβρόψαρο (προσάρτημα 4α) και τον χοντροκέφαλο φοξίνο (προσάρτημα 4Β). Δεν θεωρείται αναγκαίο για το ρυζόψαρο το υπόστρωμα ωοτοκίας. Ανώδυνη θανάτωση των ψαριών 41. Την 21η ημέρα, δηλ. κατά τον τερματισμό της έκθεσης, τα ψάρια θα πρέπει να υποβάλλονται σε ευθανασία με κατάλληλες ποσότητες τρικαΐνης [μεθανοσουλφονική τρικαΐνη, μετακαΐνη, MS-222 (αριθ. CAS 886-86-2)], διάλυμα 100-500 mg/l, στο οποίο έχει προστεθεί ρυθμιστικό διάλυμα NaHCO3 (διττανθρακικό νάτριο, αριθ. CAS.144-55-8) 300 mg/l για τον περιορισμό του ερεθισμού του βλεννογόνου· στη συνέχεια λαμβάνονται δείγματα αίματος ή ιστών για τον προσδιορισμό της VTG, όπως εξηγείται στην ενότητα για τη βιτελογενίνη. Παρατήρηση των δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου 42. Μερικές ενδοκρινικά δραστικές χημικές ουσίες μπορεί να επιφέρουν αλλαγές σε εξειδικευμένα δευτερογενή χαρακτηριστικά του φύλου (αριθμός γαμήλιων φυματίων σε αρσενικούς χοντροκέφαλους φοξίνους, θηλοειδών αποφύσεων σε αρσενικά ρυζόψαρα). Ειδικότερα, χημικές ουσίες με ορισμένους τρόπους δράσης μπορεί να προκαλέσουν μη φυσιολογική εμφάνιση δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου σε ζώα του αντίθετου φύλου· για παράδειγμα, αγωνιστές των υποδοχέων ανδρογόνων, όπως η τρενβολόνη, η μεθυλοτεστοστερόνη και η διυδροτεστοστερόνη, μπορούν να προκαλέσουν την ανάπτυξη εμφανών γαμήλιων φυματίων στους θηλυκούς χοντροκέφαλους φοξίνους ή θηλοειδών αποφύσεων στα θηλυκά ρυζόψαρα (11, 20, 21). Έχει επίσης αναφερθεί ότι οι αγωνιστές των υποδοχέων οιστρογόνων μπορούν να μειώσουν τον αριθμό των γαμήλιων φυματίων και το μέγεθος του ραχιαίου αυχενικού σπογγώδους εξογκώματος στους ενήλικες αρσενικούς χοντροκέφαλους φοξίνους (26, 27). Τέτοιες μακροσκοπικές μορφολογικές παρατηρήσεις ενδέχεται να παράσχουν χρήσιμες ποιοτικές και ποσοτικές πληροφορίες για τη διατύπωση πιθανών μελλοντικών απαιτήσεων για δοκιμές σε ψάρια. Ο αριθμός και το μέγεθος των γαμήλιων φυματίων στους χοντροκέφαλους φοξίνους και των θηλοειδών αποφύσεων στα ρυζόψαρα μπορούν να προσδιοριστούν ποσοτικά απευθείας ή, πιο πρακτικά, σε διατηρημένα δείγματα. Οι συνιστώμενες διαδικασίες για την αξιολόγηση των δευτερογενών χαρακτηριστικών του φύλου στους χοντροκέφαλους φοξίνους και στα ρυζόψαρα είναι διαθέσιμες στα προσαρτήματα 5α και 5β αντίστοιχα. Βιτελογενίνη (VTG) 43. Συλλέγεται αίμα από την ουραία αρτηρία/φλέβα με ηπαρινισμένο τριχοειδές σωληνάριο μικροαιματοκρίτη ή, εναλλακτικά, με καρδιακή παρακέντηση με σύριγγα. Ανάλογα με το μέγεθος των ψαριών, οι ποσότητες αίματος που μπορούν να συλλεχθούν κυμαίνονται γενικά από 5 έως 60 μl ανά άτομο για τους χοντροκέφαλους φοξίνους και 5-15 μl ανά άτομο για τα ζεβρόψαρα. Το πλάσμα διαχωρίζεται από το αίμα με φυγοκέντρηση και φυλάσσεται με αναστολείς πρωτεάσης στους – 80 °C, μέχρι να αναλυθεί για VTG. Εναλλακτικά, στα ρυζόψαρα χρησιμοποιείται το ήπαρ, ενώ στα ζεβρόψαρα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ομογενοποίημα κεφαλής/ουράς ως πηγή ιστών για τον προσδιορισμό της VTG (προσάρτημα 6). Η μέτρηση της VTG θα πρέπει να βασίζεται σε επικυρωμένη ομόλογη μέθοδο ELISA, με χρήση ομόλογου προτύπου VTG και ομόλογων αντισωμάτων. Συνιστάται η χρήση μεθόδου που να επιτρέπει την ανίχνευση επιπέδων VTG λίγων μόλις ng/ml πλάσματος (ή ng/mg ιστού), που αποτελούν το επίπεδο υποβάθρου σε μη εκτεθειμένα αρσενικά ψάρια. 44. Ο ποιοτικός έλεγχος της ανάλυσης VTG διεξάγεται με τη χρήση προτύπων, τυφλών δειγμάτων και τουλάχιστον διπλών αναλύσεων. Για κάθε μέθοδο ELISA θα πρέπει να διεξάγεται δοκιμή για την επίδραση της μήτρας (επίδραση της αραίωσης του δείγματος) με σκοπό τον προσδιορισμό του ελάχιστου παράγοντα αραίωσης του δείγματος. Κάθε πλάκα ELISA που χρησιμοποιείται για δοκιμές VTG θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα δείγματα ποιοτικού ελέγχου: τουλάχιστον 6 πρότυπα βαθμονόμησης που καλύπτουν το εύρος των αναμενόμενων συγκεντρώσεων VTG και τουλάχιστον μία τυφλή δοκιμή μη ειδικής δέσμευσης (ανάλυση εις διπλούν). Η απορρόφηση των εν λόγω τυφλών δειγμάτων θα πρέπει να είναι μικρότερη από 5 % της μέγιστης απορρόφησης του προτύπου βαθμονόμησης. Αναλύονται τουλάχιστον δύο κλάσματα (σε διπλές μικροκοιλότητες) από κάθε αραίωση του δείγματος. Οι διπλές μικροκοιλότητες που διαφέρουν κατά περισσότερο από 20 % θα πρέπει να υποβάλλονται σε νέα ανάλυση. 45. Ο συντελεστής συσχέτισης (R2) για τις καμπύλες βαθμονόμησης θα πρέπει να είναι μεγαλύτερος του 0,99. Ωστόσο, η υψηλή συσχέτιση δεν αρκεί για να διασφαλιστεί επαρκής πρόβλεψη της συγκέντρωσης σε όλο το εύρος τιμών. Πέρα από την ύπαρξη αρκούντως υψηλή