ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

Σχήμα δοκιμών που πρέπει να διενεργούνται σύμφωνα με τα άρθρα 3, 4, 5 και 7

1. ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΤΟΥ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΟΥ ΕΠΙΒΛΑΒΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ

1.1. Υπάρχει υπόνοια παρουσίας του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού, εάν λαμβάνεται θετικό αποτέλεσμα στην πρώτη δοκιμή ανίχνευσης που διενεργείται στο συγκεκριμένο φυτό ή στα δείγματα νερού.

1.2. Η παρουσία του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού επιβεβαιώνεται στις ακόλουθες περιπτώσεις: α) σε περίπτωση που η πρώτη ή η δεύτερη δοκιμή ανίχνευσης είναι δοκιμή εκλεκτικής απομόνωσης από την οποία προκύπτουν αποικίες με τυπική μορφολογία και λαμβάνονται θετικά αποτελέσματα σε δύο δοκιμές ταυτοποίησης που διενεργούνται στις αποικίες· β) σε περίπτωση που η πρώτη και η δεύτερη δοκιμή δεν είναι δοκιμές εκλεκτικής απομόνωσης και λαμβάνονται θετικά αποτελέσματα σε δύο δοκιμές ταυτοποίησης αφότου το δείγμα υποβλήθηκε σε εκλεκτική απομόνωση από την οποία προκύπτουν αποικίες με τυπική μορφολογία. Μία από τις δύο αυτές δοκιμές ταυτοποίησης είναι δοκιμή που αναφέρεται στο σημείο 2.2 στοιχεία ε), στ) και ζ).

2. ΔΟΚΙΜΕΣ

2.1. Δοκιμές ανίχνευσης

Οι δοκιμές ανίχνευσης είναι δοκιμές που ανιχνεύουν με συνέπεια τουλάχιστον 104 κύτταρα/ml αιωρήματος ιζήματος που λαμβάνεται από ασυμπτωματικά δείγματα.

Η δεύτερη δοκιμή ανίχνευσης βασίζεται σε διαφορετικές βιολογικές αρχές ή διαφορετικές νουκλεοτιδικές περιοχές σε σχέση με την πρώτη δοκιμή ανίχνευσης.

Οι δοκιμές ανίχνευσης είναι οι εξής:

α) δοκιμές ανοσοφθορισμού όπως περιγράφονται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

β) απομόνωση του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού στο ημιεκλεκτικό θρεπτικό μέσο mSMSA, όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

γ) δοκιμασία συμβατικής PCR με χρήση εκκινητών κατά Pastrik et al., (2002) (1), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

δ) δοκιμασίες PCR πραγματικού χρόνου TaqMan® με χρήση εκκινητών και ανιχνευτών κατά: i) Weller et al. (2000) (2), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα· ii) Vreeburg et al. (2016) (3) [με χρήση ανιχνευτή TaqMan® ο οποίος τροποποιήθηκε από τον αρχικό ανιχνευτή που περιγράφεται από τους Weller et al. (2000)], όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα· iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (η αποκαλούμενη δοκιμή NYtor), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα· iv) Massart et al. (2014) (5), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

ε) δοκιμή LAMP (ισοθερμική ενίσχυση μέσω βρόχου) με χρήση εκκινητών κατά Lenarčič et al. (2014) (6) (μόνο για το συμπτωματικό φυτικό υλικό), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα.

2.2. Δοκιμές ταυτοποίησης

Οι δοκιμές ταυτοποίησης είναι οι εξής:

α) δοκιμές ανοσοφθορισμού όπως περιγράφονται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

β) δοκιμασίες συμβατικής PCR με χρήση εκκινητών κατά Pastrik et al. (2002), όπως περιγράφονται λεπτομερώς στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

γ) δοκιμασίες PCR πραγματικού χρόνου TaqMan® με χρήση εκκινητών και ανιχνευτών κατά: i) Weller et al. (2000), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα· ii) Vreeburg et al. (2016) [με χρήση ανιχνευτή TaqMan® ο οποίος τροποποιήθηκε από τον αρχικό ανιχνευτή που περιγράφεται από τους Weller et al. (2000)], όπως περιγράφεται λεπτομερώς στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα· iii) Vreeburg et al. (2018) (η αποκαλούμενη δοκιμή NYtor), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα· iv) Massart et al. (2014), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

δ) δοκιμή LAMP (ισοθερμική ενίσχυση μέσω βρόχου) με χρήση εκκινητών κατά Lenarčič et al. (2014), όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

ε) ειδική για τον φυλότυπο δοκιμασία πολλαπλής συμβατικής PCR [Opina et al. (1997) (7)· Fegan & Prior (2005) (8)], όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

στ) γραμμωτός κώδικας DNA [Wicker et al. (2007) (9)], όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα·

ζ) φασματομετρία μάζας MALDI-TOF [van de Bilt et al. (2018) (10)], όπως περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα.

3. ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΑ ΡΟΗΣ ΤΩΝ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΩΝ

Διάγραμμα ροής αριθ. 1: Διαγνωστική διαδικασία για την παρουσία του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού σε δείγματα του συγκεκριμένου φυτού.

α Η απομόνωση μπορεί να χρησιμοποιείται ως πρώτη ή δεύτερη δοκιμή ανίχνευσης. Εάν υπάρχει υπόνοια παρουσίας του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού στο θρεπτικό μέσο, οι αποικίες καθαρίζονται ώστε να προκύψουν καθαρές καλλιέργειες στις οποίες διενεργούνται δύο δοκιμές ταυτοποίησης.

β Μία από αυτές τις δύο δοκιμές ταυτοποίησης είναι δοκιμή που αναφέρεται στο σημείο 2.2 στοιχεία ε), στ) και ζ). Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του επιβλαβούς οργανισμού απαιτούνται θετικά αποτελέσματα στις δύο δοκιμές ταυτοποίησης.

γ Η τρίτη δοκιμή ανίχνευσης βασίζεται σε διαφορετικές βιολογικές αρχές ή διαφορετικές νουκλεοτιδικές περιοχές.

Διάγραμμα ροής αριθ. 2: Διαγνωστική διαδικασία για τον συγκεκριμένο επιβλαβή οργανισμό σε δείγματα νερού.

α Μία από αυτές τις δύο δοκιμές ταυτοποίησης είναι δοκιμή που αναφέρεται στο σημείο 2.2 στοιχεία ε), στ) και ζ). Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του επιβλαβούς οργανισμού απαιτούνται θετικά αποτελέσματα στις δύο δοκιμές ταυτοποίησης.

4. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

4.1. Δείγματα από ασυμπτωματικούς κονδύλους

Το τυπικό μέγεθος δείγματος είναι 200 κόνδυλοι ανά δοκιμή. Η κατάλληλη εργαστηριακή διαδικασία για την κατεργασία των κώνων από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου ώστε να παρασκευασθεί το εκχύλισμα για την ανίχνευση του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα.

4.2. Δείγματα από ασυμπτωματικά συγκεκριμένα φυτά

Η ανίχνευση των λανθανουσών μολύνσεων διενεργείται σε σύνθετα δείγματα τμημάτων στελεχών ή μίσχων φύλλων. Η διαδικασία είναι δυνατόν να εφαρμόζεται για έως και 200 τμήματα στελεχών ή 200 μίσχους φύλλων από διαφορετικά φυτά σε ένα δείγμα. Η κατάλληλη εργαστηριακή διαδικασία για την απολύμανση και την κατεργασία των τμημάτων στελεχών ή μίσχων φύλλων ώστε να παρασκευασθεί το εκχύλισμα για την ανίχνευση του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα.

4.3. Δείγματα από συμπτωματικό υλικό των συγκεκριμένων φυτών

Τμήματα ιστού αφαιρούνται ασηπτικώς από τον αγγειώδη δακτύλιο του κονδύλου πατάτας ή από τις αγγειώδεις δέσμες των στελεχών των συγκεκριμένων φυτών που εμφανίζουν συμπτώματα μαρασμού. Η κατάλληλη εργαστηριακή διαδικασία για την κατεργασία αυτών των ιστών ώστε να παρασκευαστεί το εκχύλισμα για την ανίχνευση του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού περιγράφεται λεπτομερώς στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα.

4.4. Δείγματα από επιφανειακό ή ανακυκλωμένο νερό (συμπεριλαμβανομένων των λυμάτων κατεργασίας πατάτας ή των ακάθαρτων υδάτων)

Η κύρια δοκιμή για την ανίχνευση του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού σε δείγματα επιφανειακού νερού, νερού από συστήματα ανακύκλωσης καθώς και σε δείγματα λυμάτων (βιομηχανία μεταποίησης πατάτας) είναι η εκλεκτική απομόνωση. Η κατάλληλη εργαστηριακή διαδικασία για την επεξεργασία των δειγμάτων νερού περιγράφεται στα διεθνή διαγνωστικά πρότυπα.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002) Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex”. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds Allen C, Hayward AC & Prior P), pp. 449–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.