8)

Στο μέρος Β προστίθενται τα ακόλουθα κεφάλαια: «B.63 ΔΟΚΙΜΗ ΔΙΑΛΟΓΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ/ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 421 του ΟΟΣΑ (2016). Οι κατευθυντήριες γραμμές του ΟΟΣΑ για τον έλεγχο χημικών ουσιών αναθεωρούνται ανά διαστήματα ώστε να λαμβάνονται υπόψη οι εξελίξεις στον επιστημονικό τομέα. Η αρχική κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών διαλογής 421 εγκρίθηκε το 1995, βάσει ενός πρωτοκόλλου για την προκαταρκτική δοκιμή διαλογής τοξικότητας στην αναπαραγωγή που συζητήθηκε σε δύο συναντήσεις εμπειρογνωμόνων, στο Λονδίνο το 1990 (1) και στο Τόκυο το 1992 (2). 2. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών έχει επικαιροποιηθεί με παραμέτρους που αφορούν τους ενδοκρινικούς διαταράκτες, στο πλαίσιο της δράσης πρώτης προτεραιότητας που ξεκίνησε ο ΟΟΣΑ το 1998 με σκοπό την αναθεώρηση των υφιστάμενων κατευθυντήριων γραμμών δοκιμών και την ανάπτυξη νέων κατευθυντήριων γραμμών δοκιμών για τη διαλογή και τη διεξαγωγή δοκιμών σε δυνητικούς ενδοκρινικούς διαταράκτες (3). Για παράδειγμα, η TG 407 (μελέτη τοξικότητας από το στόμα, 28 ημερών, με επαναλαμβανόμενη δόση σε τρωκτικά, κεφάλαιο B.7 του παρόντος παραρτήματος) του ΟΟΣΑ, ενισχύθηκε το 2008 με παραμέτρους κατάλληλες για την ανίχνευση ενδοκρινικής δραστηριότητας υπό δοκιμή χημικών ουσιών. Ο στόχος της επικαιροποίησης της TG 421 ήταν η συμπερίληψη ορισμένων παραμέτρων σχετικά με τους ενδοκρινικούς διαταράκτες σε TG διαλογής στις οποίες οι περίοδοι έκθεσης καλύπτουν ορισμένες από τις ευαίσθητες περιόδους κατά την ανάπτυξη (προγεννητική ή πρώτη μεταγεννητική περίοδος). 3. Οι επιλεχθείσες πρόσθετες παράμετροι σχετικά με τους ενδοκρινικούς διαταράκτες, που αποτελούν επίσης μέρος της TG 443 (εκτεταμένη μελέτη τοξικότητας στην αναπαραγωγή μίας γενεάς, κεφάλαιο B.56 του παρόντος παραρτήματος), περιλήφθηκαν στην TG 421 βάσει μελέτης σκοπιμότητας στην οποία θίγονται επιστημονικά και τεχνικά θέματα που σχετίζονται με τη συμπερίληψή τους, καθώς και πιθανές προσαρμογές του σχεδιασμού δοκιμής που χρειάζονται για τη συμπερίληψή τους (4). 4. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών έχει σχεδιαστεί για να παρέχει πληροφορίες σχετικά με τις επιδράσεις μιας υπό δοκιμή χημικής ουσίας στις αναπαραγωγικές επιδόσεις αρσενικών και θηλυκών ατόμων, όπως η λειτουργία των γονάδων, η συμπεριφορά ζευγαρώματος, η σύλληψη, η ανάπτυξη του κυήματος και ο τοκετός. Δεν αποτελεί εναλλακτική μέθοδο ούτε αντικαθιστά τις υφιστάμενες μεθόδους δοκιμών B.31, B.34, B.35 ή B.56. ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ 5. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών διαλογής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παροχή αρχικών πληροφοριών σχετικά με τις πιθανές επιδράσεις στην αναπαραγωγή και/ή την ανάπτυξη, είτε σε πρώιμο στάδιο της αξιολόγησης των τοξικολογικών ιδιοτήτων χημικών ουσιών είτε σχετικά με χημικές ουσίες που προκαλούν ανησυχία. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως μέρος ενός συνόλου αρχικών δοκιμών διαλογής για υπάρχουσες χημικές ουσίες για τις οποίες οι διαθέσιμες τοξικολογικές πληροφορίες είναι ελάχιστες ή ανύπαρκτες, ως μελέτη προσδιορισμού εύρους δόσεων με σκοπό τη διεξαγωγή πιο εκτεταμένων μελετών της αναπαραγωγής/ανάπτυξης, ή όταν θεωρηθεί για άλλους λόγους κατάλληλη. Κατά τη διεξαγωγή της μελέτης θα πρέπει να εφαρμόζονται οι γενικές αρχές και τα κριτήρια που περιγράφονται στο έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 19 του ΟΟΣΑ σχετικά με την αναγνώριση, την αξιολόγηση και τη χρήση κλινικών σημείων ως ανώδυνων παραμέτρων για τα πειραματόζωα που χρησιμοποιούνται σε αξιολογήσεις ασφάλειας (5). 6. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών δεν παρέχει ολοκληρωμένες πληροφορίες για όλες τις πτυχές της αναπαραγωγής και της ανάπτυξης. Πιο συγκεκριμένα, παρέχει περιορισμένα μόνο μέσα ανίχνευσης των μεταγεννητικών εκδηλώσεων της προγεννητικής έκθεσης, ή των επαγόμενων κατά τη μεταγεννητική έκθεση πιθανών επιδράσεων. Λόγω (μεταξύ άλλων) των σχετικά μικρών αριθμών ζώων που περιλαμβάνονται στις ομάδες δόσεων, της επιλεκτικότητας των παραμέτρων και της μικρής διάρκειας της μελέτης, η παρούσα μέθοδος δεν θα παρέχει αποδεικτικά στοιχεία που να στηρίζουν οριστικούς ισχυρισμούς περί ανυπαρξίας επιδράσεων. Επιπλέον, σε περίπτωση απουσίας δεδομένων από άλλες δοκιμές τοξικότητας στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη, τα θετικά αποτελέσματα είναι χρήσιμα για την αρχική αξιολόγηση της επικινδυνότητας και συμβάλλουν στη διαδικασία λήψης αποφάσεων όσον αφορά την αναγκαιότητα και το χρονοδιάγραμμα διεξαγωγής πρόσθετων δοκιμών. 7. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τις σχετικές με το ενδοκρινικό σύστημα παραμέτρους θα πρέπει να μελετώνται στο πλαίσιο του εννοιολογικού πλαισίου για τον έλεγχο και την αξιολόγηση χημικών ενδοκρινικών διαταρακτών (Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) του ΟΟΣΑ (6). Σε αυτό το εννοιολογικό πλαίσιο, η ενισχυμένη TG 421 του ΟΟΣΑ περιλαμβάνεται στο επίπεδο 4 ως in vivo δοκιμασία που παρέχει δεδομένα για τις δυσμενείς επιδράσεις των παραμέτρων που σχετίζονται με το ενδοκρινικό σύστημα. Εντούτοις, ένα ενδοκρινικό σήμα μπορεί να μη θεωρηθεί επαρκώς ισχυρό στοιχείο ώστε μια χημική ουσία να χαρακτηριστεί ενδοκρινικός διαταράκτης. 8. Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών θεωρείται ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται από το στόμα. Εάν χρησιμοποιηθούν άλλες οδοί έκθεσης, ενδέχεται να χρειαστούν τροποποιήσεις. 9. Πριν από τη χρήση της μεθόδου δοκιμών σε μείγμα για την παραγωγή δεδομένων για συγκεκριμένο κανονιστικό σκοπό, θα πρέπει να εξετάζεται αν –και, εάν ναι, για ποιον λόγο– μπορεί να αποδώσει αποτελέσματα κατάλληλα για τον επιδιωκόμενο σκοπό. Τέτοια εξέταση δεν χρειάζεται όταν οι κανονιστικές ρυθμίσεις επιβάλλουν τον έλεγχο του μείγματος. 10. Οι ορισμοί που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στο προσάρτημα 1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 11. Η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται σε διαβαθμισμένες δόσεις σε αρκετές ομάδες αρσενικών και θηλυκών ατόμων. Η χορήγηση των δόσεων στα αρσενικά θα πρέπει να διαρκεί τουλάχιστον τέσσερις εβδομάδες και να φθάνει μέχρι και την ημέρα πριν από την προγραμματισμένη θανάτωση (σε αυτό το χρονοδιάγραμμα περιλαμβάνονται τουλάχιστον δύο εβδομάδες πριν το ζευγάρωμα, η περίοδος του ζευγαρώματος και περίπου δύο εβδομάδες μετά το ζευγάρωμα). Δεδομένης της περιορισμένης περιόδου χορήγησης των δόσεων στα αρσενικά πριν από το ζευγάρωμα, η γονιμότητα ενδέχεται να μην αποτελεί ιδιαίτερα ευαίσθητο δείκτη της τοξικότητας στους όρχεις. Ως εκ τούτου, είναι ιδιαίτερα σημαντική η διεξαγωγή αναλυτικής ιστολογικής εξέτασης. Ο συνδυασμός περιόδου χορήγησης πριν από το ζευγάρωμα διάρκειας δύο εβδομάδων και επακόλουθων παρατηρήσεων όσον αφορά το ζευγάρωμα/γονιμότητα με συνολική περίοδο χορήγησης τουλάχιστον τεσσάρων εβδομάδων, ακολουθούμενων από αναλυτική ιστοπαθολογική εξέταση των γονάδων των αρσενικών, θεωρείται επαρκής για την ανίχνευση της πλειονότητας των επιδράσεων στη γονιμότητα των αρσενικών και τη σπερματογένεση. 12. Η χορήγηση δόσεων στα θηλυκά θα πρέπει να διαρκεί καθ’ όλο το διάστημα διεξαγωγής της μελέτης. Η εν λόγω χορήγηση περιλαμβάνει δύο εβδομάδες πριν από το ζευγάρωμα (με στόχο να καλυφθούν τουλάχιστον δύο πλήρεις κύκλοι οίστρου), το μεταβλητό χρονικό διάστημα μέχρι τη σύλληψη, τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και τουλάχιστον δεκατρείς ημέρες μετά τη γέννηση, έως και την ημέρα πριν από την προγραμματισμένη θανάτωση. 13. Η διάρκεια της μελέτης, μετά τον εγκλιματισμό και την αξιολόγηση του κύκλου οίστρου πριν από τη χορήγηση των δόσεων, εξαρτάται από τις επιδόσεις των θηλυκών και είναι κατά προσέγγιση 63 ημέρες [τουλάχιστον 14 ημέρες πριν από το ζευγάρωμα, (έως) 14 ημέρες ζευγαρώματος, 22 ημέρες κύησης, 13 ημέρες γαλουχίας]. 14. Τα ζώα εξετάζονται με προσοχή καθημερινά κατά τη διάρκεια της περιόδου χορήγησης για τυχόν συμπτώματα τοξικότητας. Τα ζώα που πεθαίνουν ή θανατώνονται κατά τη διάρκεια της περιόδου δοκιμής νεκροτομούνται και, στο τέλος της δοκιμής, αυτά που έχουν επιζήσει θανατώνονται και νεκροτομούνται επίσης. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Επιλογή ζωικού είδους 15. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών έχει σχεδιαστεί για χρήση με επίμυ. Η διερεύνηση των παραμέτρων που προσδιορίζονται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών σε άλλα είδη τρωκτικών πρέπει να αιτιολογείται αναλυτικά. Στο διεθνές πρόγραμμα επικύρωσης για την ανίχνευση ενδοκρινικών διαταρακτών της TG 407 του ΟΟΣΑ (που αντιστοιχεί στο κεφάλαιο B.7 του παρόντος παραρτήματος), ο επίμυς ήταν το μόνο είδος που χρησιμοποιήθηκε. Δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται φυλές με χαμηλή γονιμότητα ή γνωστή υψηλή συχνότητα εμφάνισης αναπτυξιακών ελαττωμάτων. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται υγιή παρθένα ζώα, που δεν έχουν υποβληθεί προηγουμένως σε πειράματα. Τα πειραματόζωα θα πρέπει να χαρακτηρίζονται ως προς το είδος, τη φυλή, το φύλο, το βάρος και την ηλικία. Στην αρχή της μελέτης, η διακύμανση των βαρών των χρησιμοποιούμενων ζώων θα πρέπει να είναι ελάχιστη και να μην υπερβαίνει το 20 % της μέσης τιμής για κάθε φύλο. Σε περίπτωση που η μελέτη διεξάγεται ως προκαταρκτικό στάδιο μακροχρόνιας μελέτης ή μελέτης πλήρους γενεάς, συνιστάται να χρησιμοποιούνται και στις δύο μελέτες ζώα της ίδιας φυλής και προέλευσης. Στέγαση και διατροφή 16. Σε όλες οι διαδικασίες πρέπει να τηρούνται τα τοπικά πρότυπα φροντίδας των πειραματόζωων. H θερμοκρασία του θαλάμου πειραματόζωων πρέπει να είναι 22 °C (± 3 °). Αν και η σχετική υγρασία θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 30 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού του θαλάμου, εν τούτοις θα πρέπει να επιδιώκεται μια τιμή 50-60 %. Ο φωτισμός πρέπει να είναι τεχνητός και η φωτοπερίοδος 12ωρη. Για τη διατροφή μπορούν να χρησιμοποιούνται συνήθη εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται μέσω της παρούσας μεθόδου, η επιλογή σιτηρεσίου ενδέχεται να επηρεάζεται από την ανάγκη κατάλληλης ανάμειξης της ουσίας. 17. Τα ζώα θα πρέπει να στεγάζονται σε μικρές ομάδες του ίδιου φύλου. Επιτρέπεται η ατομική στέγαση, εάν αιτιολογείται επιστημονικά. Σε περίπτωση ομαδικής στέγασης, κάθε κλωβός δεν πρέπει να περιέχει περισσότερα από πέντε ζώα. Οι διαδικασίες ζευγαρώματος θα πρέπει να εκτελούνται σε κλωβούς κατάλληλους για τον σκοπό αυτό. Τα έγκυα θηλυκά θα πρέπει να στεγάζονται σε ατομικούς κλωβούς και θα πρέπει να τους παρέχονται υλικά φωλιάσματος. Τα θηλυκά κατά τη γαλουχία τοποθετούνται σε ατομικούς κλωβούς μαζί με τα νεογνά τους. 18. Η τροφή πρέπει να υποβάλλεται τακτικά σε ανάλυση ώστε να εντοπίζονται τυχόν ξένες προσμείξεις. Ένα δείγμα του σιτηρεσίου θα πρέπει να διατηρείται έως την οριστικοποίηση της έκθεσης. Προετοιμασία των ζώων 19. Υγιή νεαρά ενήλικα ζώα κατανέμονται τυχαία στις ομάδες μαρτύρων και αγωγής. Οι κλωβοί θα πρέπει να διατάσσονται με τρόπο ώστε να ελαχιστοποιούνται οι πιθανές επιδράσεις της θέσης τους. Τα ζώα ταυτοποιούνται με αποκλειστικό αναγνωριστικό και παραμένουν στα κλουβιά τους τουλάχιστον πέντε ημέρες πριν από την έναρξη της μελέτης για να μπορέσουν να εγκλιματιστούν στις εργαστηριακές συνθήκες. Παρασκευή των δόσεων 20. Συνιστάται η χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας από το στόμα, εκτός εάν θεωρούνται καταλληλότερες άλλες οδοί χορήγησης. Όταν επιλέγεται η οδός από το στόμα, η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται συνήθως με στομαχικό καθετήρα· εντούτοις, οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες μπορούν εναλλακτικά να χορηγούνται μέσω του σιτηρεσίου ή του πόσιμου νερού. 21. Εφόσον είναι αναγκαίο, παρασκευάζεται διάλυμα ή εναιώρημα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε κατάλληλο φορέα. Συνιστάται, οσάκις είναι δυνατό, να εξετάζεται πρώτα η δυνατότητα χρήσης υδατικού διαλύματος/εναιωρήματος, κατόπιν το ενδεχόμενο διαλύματος/γαλακτώματος σε λάδι (π.χ. αραβοσιτέλαιο) και, τέλος, η χρήση διαλύματος σε άλλους φορείς. Σε περίπτωση που ο φορέας δεν είναι το νερό, θα πρέπει να είναι γνωστά τα τοξικά χαρακτηριστικά του. Θα πρέπει να προσδιορίζεται η σταθερότητα και η ομοιογένεια της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στον φορέα. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Αριθμός και φύλο των ζώων 22. Συνιστάται κάθε ομάδα να περιλαμβάνει αρχικά τουλάχιστον 10 αρσενικά και 12-13 θηλυκά. Πριν από την έκθεση, θα αξιολογείται η κυκλικότητα του οίστρου των θηλυκών και τα ζώα που δεν παρουσιάζουν τυπικούς κύκλους 4-5 ημερών δεν θα περιλαμβάνονται στη μελέτη· ως εκ τούτου, συνιστάται η προσθήκη επιπλέον θηλυκών στις ομάδες ώστε αυτές να αποτελούνται από 10 θηλυκά έκαστη. Εκτός της περίπτωσης έντονων τοξικών επιδράσεων, αναμένεται ότι κατ’ αυτόν τον τρόπο θα εξασφαλίζονται τουλάχιστον 8 έγκυα θηλυκά ανά ομάδα, που είναι συνήθως ο ελάχιστος αποδεκτός αριθμός έγκυων θηλυκών ανά ομάδα. Στόχος είναι να προκαλούνται επαρκείς κυοφορίες και απόγονοι για να εξασφαλίζεται η ουσιαστική αξιολόγηση της ικανότητας της υπό δοκιμή χημικής ουσίας να επιδρά στη γονιμότητα, στην κύηση, στη μητρική συμπεριφορά και στη συμπεριφορά θηλασμού των ζώων, καθώς και στην αύξηση και την ανάπτυξη των απογόνων της F 1 από τη σύλληψη ως τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό. Δοσολογία 23. Κατά κανόνα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τρεις ομάδες δοκιμής και μία ομάδα μαρτύρων. Τα επίπεδα των δόσεων μπορούν να καθορίζονται βάσει πληροφοριών από δοκιμές οξείας τοξικότητας ή αποτελέσματα από μελέτες επαναλαμβανόμενης δόσης. Εκτός από τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, τα ζώα της ομάδας μαρτύρων θα πρέπει να υφίστανται την ίδια ακριβώς μεταχείριση όπως τα υποκείμενα των ομάδων δοκιμής. Εάν χρησιμοποιείται φορέας για τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, η ομάδα μαρτύρων πρέπει να λαμβάνει τον φορέα στον μέγιστο χρησιμοποιούμενο όγκο. 24. Τα επίπεδα των δόσεων θα πρέπει να επιλέγονται λαμβανομένων υπόψη τυχόν υφιστάμενων δεδομένων για την τοξικότητα και την (τοξικο-)κινητική. Επίσης, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι ενδέχεται να υπάρχουν διαφορές στην ευαισθησία μεταξύ έγκυων και μη έγκυων ζώων. Το υψηλότερο επίπεδο δόσης πρέπει να επιλέγεται με σκοπό να προκαλέσει τοξικές εκδηλώσεις, όχι όμως τον θάνατο ή έντονη οδύνη. Στη συνέχεια επιλέγεται φθίνουσα σειρά δοσολογικών επιπέδων με σκοπό τον εντοπισμό απόκρισης συνδεόμενης με τη δόση και του χαμηλότερου επιπέδου δόσης στο οποίο δεν παρατηρούνται δυσμενείς επιδράσεις (ΝΟΑΕL). Για τον καθορισμό της φθίνουσας σειράς δοσολογικών επιπέδων η βέλτιστη επιλογή είναι συνήθως ο υποδιπλασιασμός ή υποτετραπλασιασμός, ενώ η προσθήκη μιας τέταρτης ομάδας δοκιμής είναι συχνά προτιμότερη από τη χρησιμοποίηση πολύ μεγάλων συντελεστών (π.χ. άνω του 10) μεταξύ των δόσεων. 25. Όταν παρατηρείται γενική τοξικότητα (π.χ. μειωμένο βάρος σώματος, επιδράσεις στο ήπαρ, την καρδιά, τους πνεύμονες, τους νεφρούς κ.λπ.) ή άλλη αλλαγή που μπορεί να μην είναι τοξική αντίδραση (π.χ. μειωμένη πρόσληψη τροφής, διόγκωση του ήπατος), οι παρατηρούμενες επιδράσεις στις παραμέτρους που συνδέονται με ευαισθησία του ενδοκρινικού συστήματος θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Οριακή δοκιμή 26. Εάν μια δοκιμή από το στόμα σύμφωνα με τις περιγραφόμενες για την παρούσα μελέτη διαδικασίες, με επίπεδο δόσης τουλάχιστον 1 000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα ή, εφόσον πρόκειται για χορήγηση μέσω του σιτηρεσίου ή του πόσιμου νερού, με αντίστοιχη εκατοστιαία αναλογία στο σιτηρέσιο ή στο πόσιμο νερό, δεν έχει ως αποτέλεσμα παρατηρήσιμες τοξικές επιδράσεις και εάν, βάσει των διαθέσιμων δεδομένων για χημικές ουσίες ανάλογης δομής, δεν αναμένεται τοξικότητα, η πλήρης μελέτη με αρκετά επίπεδα δόσης μπορεί να μην είναι απαραίτητη. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οριακή δοκιμή, εκτός εάν, με βάση την έκθεση του ανθρώπου, διαφαίνεται η ανάγκη χρησιμοποίησης υψηλότερου επιπέδου δόσης από το στόμα. Σε περίπτωση χορήγησης από άλλη οδό, όπως εισπνοή ή εφαρμογή στο δέρμα, η μέγιστη εφικτή συγκέντρωση μπορεί να εξαρτάται συχνά από τις φυσικές και χημικές ιδιότητες των υπό δοκιμή ουσιών. Χορήγηση των δόσεων 27. Η δόση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στα ζώα χορηγείται καθημερινά επί 7 ημέρες την εβδομάδα. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται με καθετήρα, η χορήγηση πρέπει να γίνεται εφάπαξ με τη βοήθεια στομαχικού καθετήρα ή κατάλληλης διασωλήνωσης. Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί εφάπαξ εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Ο όγκος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 1 ml/100 g βάρους σώματος, εκτός της περίπτωσης υδατικών διαλυμάτων όπου μπορούν να χρησιμοποιούνται 2 ml/100 g βάρους σώματος. Εκτός από την περίπτωση των ερεθιστικών ή διαβρωτικών υπό δοκιμή χημικών ουσιών, οι οποίες σε υψηλότερες συγκεντρώσεις συνήθως προκαλούν εντονότερες επιδράσεις, η μεταβλητότητα των όγκων δοκιμής πρέπει να ελαχιστοποιείται με ρύθμιση της συγκέντρωσης, ώστε να εξασφαλίζεται σταθερός όγκος σε όλα τα επίπεδα δόσης. 28. Για τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες που χορηγούνται με την τροφή ή το πόσιμο νερό, πρέπει να εξασφαλίζεται ότι οι χορηγούμενες ποσότητες υπό δοκιμή χημικής ουσίας δεν επηρεάζουν το κανονικό διατροφικό ισοζύγιο ή ισοζύγιο νερού. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται μέσω του σιτηρεσίου, μπορεί να χρησιμοποιείται είτε σταθερή συγκέντρωση στο σιτηρέσιο (ppm) είτε σταθερό επίπεδο δόσης, εκφρασμένο επί του βάρους σώματος του ζώου. Η χρησιμοποιούμενη εναλλακτική επιλογή πρέπει να διευκρινίζεται. Για υπό δοκιμή χημικές ουσίες που χορηγούνται με καθετήρα, η δόση θα πρέπει να χορηγείται την ίδια περίπου ώρα κάθε μέρα και να ρυθμίζεται τουλάχιστον κάθε εβδομάδα ώστε να διατηρείται σταθερό επίπεδο δόσης ως προς το βάρος του σώματος. Χρονοδιάγραμμα πειράματος 29. Η χορήγηση δόσεων και στα δύο φύλα θα πρέπει να ξεκινά τουλάχιστον δύο εβδομάδες πριν από το ζευγάρωμα, αφού έχουν εγκλιματιστεί για τουλάχιστον πέντε ημέρες και τα θηλυκά έχουν υποβληθεί σε διαδικασία διαλογής ως προς την κανονικότητα των κύκλων οίστρου (στη διάρκεια περιόδου δύο εβδομάδων πριν από την αγωγή). Η μελέτη θα πρέπει να προγραμματίζεται κατά τρόπον ώστε η αξιολόγηση των κύκλων οίστρου να ξεκινά σε σύντομο χρονικό διάστημα αφότου τα ζώα έχουν φθάσει σε πλήρη σεξουαλική ωρίμανση. Το εν λόγω διάστημα μπορεί να διαφέρει ελαφρώς για διαφορετικές φυλές επιμύων σε διαφορετικά εργαστήρια, π.χ. επίμυες Sprague Dawley ηλικίας 10 εβδομάδων, επίμυες Wistar ηλικίας περίπου 12 εβδομάδων. Οι μητέρες με απογόνους πρέπει να θανατώνονται τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό, ή σύντομα μετά από αυτό. Η ημέρα γέννησης (όταν έχει ολοκληρωθεί ο τοκετός) ορίζεται ως η ημέρα 0 μετά τον τοκετό. Τα θηλυκά που δεν εμφανίζουν ενδείξεις συνουσίας θανατώνονται 24-26 ημέρες μετά την τελευταία ημέρα της περιόδου ζευγαρώματος. Η χορήγηση συνεχίζεται και στα δύο φύλα κατά τη διάρκεια της περιόδου ζευγαρώματος. Στα αρσενικά η χορήγηση θα πρέπει να συνεχίζεται και μετά την περίοδο ζευγαρώματος, τουλάχιστον έως ότου ολοκληρωθεί η ελάχιστη συνολική περίοδος χορήγησης των 28 ημερών. Στη συνέχεια θανατώνονται ή, εναλλακτικά, διατηρούνται και συνεχίζουν να λαμβάνουν δόσεις με σκοπό την πιθανή πραγματοποίηση δεύτερου ζευγαρώματος, εάν χρειαστεί. 30. Η καθημερινή χορήγηση στα γονικά θηλυκά θα πρέπει να συνεχίζεται καθ’ όλη τη διάρκεια της κύησης και τουλάχιστον μέχρι και τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό ή την ημέρα πριν τη θανάτωση. Για μελέτες όπου η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται μέσω εισπνοής ή διά του δέρματος, η χορήγηση θα πρέπει να συνεχίζεται τουλάχιστον μέχρι και τη 19η ημέρα της κύησης, και θα πρέπει να ξεκινά εκ νέου το συντομότερο δυνατό, το αργότερο μέχρι την 4η ημέρα μετά τη γέννηση. 31. Στο παράρτημα 2 παρατίθεται χρονοδιάγραμμα διεξαγωγής των πειραμάτων. Διαδικασία ζευγαρώματος 32. Κανονικά, στην παρούσα μελέτη θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ζευγαρώματα 1:1 (ένα αρσενικό προς ένα θηλυκό). Μπορεί να υπάρξουν εξαιρέσεις, στην περίπτωση περιστασιακών θανάτων αρσενικών. Το θηλυκό θα πρέπει να τοποθετείται μαζί με το ίδιο αρσενικό μέχρις ότου παρατηρηθούν ενδείξεις συνουσίας ή μέχρι να παρέλθει διάστημα δύο εβδομάδων. Κάθε πρωί, τα θηλυκά πρέπει να εξετάζονται για την παρουσία σπέρματος ή κολπικού βύσματος. Ως ημέρα 0 της κύησης ορίζεται η ημέρα κατά την οποία επιβεβαιώνονται οι ενδείξεις ζευγαρώματος (ανιχνεύεται κολπικό βύσμα ή σπέρμα). Σε περίπτωση που το ζευγάρωμα αποδειχθεί ανεπιτυχές, πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο νέου ζευγαρώματος των θηλυκών με ελεγμένα αρσενικά της ίδιας ομάδας. Μέγεθος γέννας 33. Την 4η ημέρα μετά τη γέννηση, το μέγεθος κάθε γέννας μπορεί να ρυθμίζεται διά της απομάκρυνσης των πλεοναζόντων νεογνών με τυχαία επιλογή, ούτως ώστε να παραμένουν, όπου είναι εφικτό, τέσσερα ή πέντε νεογνά ανά φύλο ανά γέννα, ανάλογα με το σύνηθες μέγεθος γέννας στη φυλή των επιμύων που χρησιμοποιείται. Από δυο από τα πλεονάζοντα νεογνά θα πρέπει να συλλέγονται δείγματα αίματος, τα οποία θα συγκεντρώνονται και θα χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των επιπέδων Τ4 στον ορό. Δεν ενδείκνυται η επιλεκτική απομάκρυνση νεογνών, π.χ. βάσει του σωματικού βάρους ή της πρωκτογεννητικής απόστασης (AGD). Όταν ο αριθμός των αρσενικών ή θηλυκών νεογνών δεν φθάνει τα τέσσερα ή πέντε νεογνά ανά φύλο ανά γέννα, είναι αποδεκτή η μερική ρύθμιση (π.χ. έξι αρσενικά και τέσσερα θηλυκά). Δεν απομακρύνεται κανένα νεογνό όταν το μέγεθος της γέννας είναι χαμηλότερο του στόχου (8 ή 10 νεογνά/γέννα). Εάν υπάρχει ένα μόνο νεογνό πάνω από τον στόχο απομάκρυνσης, θα απομακρύνεται μόνο ένα νεογνό, το οποίο θα χρησιμοποιείται για συλλογή αίματος με σκοπό την πιθανή διενέργεια αξιολογήσεων της T4. 34. Εάν δεν ρυθμιστεί το μέγεθος της γέννας, την 4η ημέρα μετά τη γέννηση θανατώνονται δύο νεογνά ανά γέννα και λαμβάνονται δείγματα αίματος για μέτρηση των συγκεντρώσεων θυρεοειδικών ορμονών στον ορό. Ει δυνατόν, τα δύο νεογνά ανά γέννα θα πρέπει να είναι θηλυκά προκειμένου να διατηρηθούν τα αρσενικά νεογνά για αξιολογήσεις διατηρούμενων θηλών, εκτός εάν η απομάκρυνση των δύο νεογνών θα είχε ως αποτέλεσμα να μην υπάρχουν άλλα θηλυκά προς αξιολόγηση κατά τη λήξη της μελέτης. Δεν απομακρύνεται κανένα νεογνό εάν έτσι το μέγεθος της γέννας θα μειωνόταν κάτω από τα 8 έως 10 νεογνά/γέννα (ανάλογα με το κανονικό μέγεθος γέννας στη χρησιμοποιούμενη φυλή επιμύων). Εάν υπάρχει ένα μόνο νεογνό πάνω από το κανονικό μέγεθος γέννας, θα απομακρύνεται μόνο ένα νεογνό, το οποίο θα χρησιμοποιείται για συλλογή αίματος με σκοπό την πιθανή διενέργεια αξιολογήσεων της T4. Παρατηρήσεις εν ζωή Κλινικές παρατηρήσεις 35. Καθ’ όλη τη διάρκεια της περιόδου δοκιμής θα πρέπει να διεξάγονται γενικές κλινικές παρατηρήσεις τουλάχιστον μία φορά τη μέρα, και συχνότερα σε περίπτωση που παρατηρηθούν τοξικά συμπτώματα. Αυτές οι παρατηρήσεις θα πρέπει να διεξάγονται κατά προτίμηση τις ίδιες ώρες κάθε ημέρα, λαμβανομένου υπόψη του χρόνου κορύφωσης των αναμενόμενων επιδράσεων μετά τη χορήγηση της δόσης. Σχετικές μεταβολές στη συμπεριφορά, σημεία δύσκολου ή παρατεταμένου τοκετού και όλα τα σημεία τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένης της θνησιμότητας, πρέπει να καταγράφονται. Οι εν λόγω καταγραφές θα πρέπει να περιλαμβάνουν τη χρονική στιγμή εμφάνισης, τη σοβαρότητα και τη διάρκεια των τοξικών συμπτωμάτων. Σωματικό βάρος και κατανάλωση τροφής/νερού 36. Τα αρσενικά και τα θηλυκά θα πρέπει να ζυγίζονται κατά την πρώτη ημέρα της χορήγησης και, στη συνέχεια, τουλάχιστον μία φορά την εβδομάδα, καθώς και κατά τη λήξη της μελέτης. Στη διάρκεια της κύησης, τα θηλυκά πρέπει να ζυγίζονται τις ημέρες 0, 7, 14 και 20, και εντός 24 ωρών από τον τοκετό (ημέρα 0 ή 1η ημέρα μετά τον τοκετό) και τουλάχιστον την 4η και 13η ημέρα μετά τον τοκετό. Οι παρατηρήσεις αυτές θα πρέπει να αναφέρονται ξεχωριστά για κάθε ενήλικο ζώο. 37. Στη διάρκεια της περιόδου πριν από το ζευγάρωμα, της εγκυμοσύνης και της γαλουχίας, η κατανάλωση τροφής πρέπει να μετράται τουλάχιστον μια φορά την εβδομάδα. Η μέτρηση της κατανάλωσης τροφής κατά το ζευγάρωμα είναι προαιρετική. Η κατανάλωση νερού στη διάρκεια των εν λόγω περιόδων θα πρέπει επίσης να μετράται, όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται μέσω πόσιμου νερού. Οιστρικοί κύκλοι 38. Οι οιστρικοί κύκλοι θα πρέπει να παρακολουθούνται πριν από την έναρξη της αγωγής προκειμένου να επιλέγονται για τη δοκιμή θηλυκά με κανονική κυκλικότητα (βλ. παράγραφο 22). Επίσης, θα πρέπει να παρακολουθούνται καθημερινά κολπικά επιχρίσματα, από την έναρξη της περιόδου αγωγής μέχρις ότου διαπιστωθούν ενδείξεις ζευγαρώματος. Εάν υπάρχει ανησυχία για οξείες αγχογόνες επιδράσεις που μπορεί να μεταβάλλουν τους οιστρικούς κύκλους με την έναρξη της χορήγησης, τα εργαστήρια μπορούν να υποβάλλουν τα ζώα σε έκθεση 2 εβδομάδων και, στη συνέχεια, να συλλέγουν καθημερινά κολπικά επιχρίσματα προκειμένου να παρακολουθούν τον οιστρικό κύκλο για τουλάχιστον δύο εβδομάδες κατά την περίοδο πριν από το ζευγάρωμα, και να συνεχίζουν την παρακολούθηση καθ’ όλη τη διάρκεια της περιόδου ζευγαρώματος μέχρι να ανιχνευθούν ενδείξεις ζευγαρώματος. Κατά τη λήψη κολπικών/τραχηλικών κυττάρων, θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η διαταραχή των βλεννογόνων που μπορεί να επαγάγει ψευδοκύηση (7) (8). Παράμετροι σχετικές με τους απογόνους 39. Η διάρκεια της κύησης πρέπει να καταγράφεται και υπολογίζεται από την ημέρα 0 της εγκυμοσύνης. Κάθε γέννα πρέπει να εξετάζεται το συντομότερο δυνατό μετά τον τοκετό για να προσδιορίζεται ο αριθμός και το φύλο των νεογνών, τα θνησιγενή νεογνά, τα ζώντα νεογνά, τα καχεκτικά νεογνά (νεογνά μεγέθους αρκετά μικρότερου από τα αντίστοιχα νεογνά μάρτυρες) και η παρουσία μακροσκοπικώς ορατών ανωμαλιών. 40. Τα ζώντα νεογνά πρέπει να καταμετρώνται και να προσδιορίζεται το φύλο τους, ενώ οι ομάδες των νεογνών που γεννήθηκαν από την ίδια μητέρα πρέπει να ζυγίζονται εντός 24 ωρών από τον τοκετό (ημέρα 0 ή 1 μετά τον τοκετό) και τουλάχιστον την 4η και τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό. Πέραν των παρατηρήσεων που περιγράφονται στην παράγραφο 35, θα πρέπει να καταγράφεται τυχόν μη φυσιολογική συμπεριφορά των απογόνων. 41. Η πρωκτογεννητική απόσταση κάθε νεογνού θα πρέπει να μετράται την ίδια ημέρα μεταγεννητικά, μεταξύ της μεταγεννητικής ημέρας (ΜΓΗ) 0 και 4. Θα πρέπει να προσδιορίζεται το σωματικό βάρος του νεογνού την ημέρα μέτρησης της πρωκτογεννητικής απόστασης, η οποία θα πρέπει να κανονικοποιείται σε ένα μέτρο του μεγέθους του νεογνού, κατά προτίμηση στην κυβική ρίζα του σωματικού βάρους (9). Θα πρέπει να καταμετράται ο αριθμός των θηλών/άλων στα αρσενικά νεογνά τη 12η ή 13η ΜΓΗ, όπως συνιστάται στο έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 151 του ΟΟΣΑ (10). Εξετάσεις κλινικής βιοχημείας 42. Λαμβάνονται δείγματα αίματος από καθορισμένο σημείο με βάση το ακόλουθο χρονοδιάγραμμα: — από τουλάχιστον δύο νεογνά ανά γέννα την 4η ημέρα μετά τη γέννηση, εάν το επιτρέπει ο αριθμός των νεογνών (βλ. παραγράφους 33-34) — από όλες τις μητέρες και από τουλάχιστον δύο νεογνά ανά γέννα κατά τη λήξη της μελέτης τη 13η ημέρα, και — από όλα τα ενήλικα αρσενικά κατά τη λήξη της μελέτης. Όλα τα δείγματα αίματος αποθηκεύονται υπό κατάλληλες συνθήκες. Δείγματα αίματος νεογνών 13ης ΜΓΗ και των ενήλικων αρσενικών αξιολογούνται ως προς τα επίπεδα θυρεοειδικών ορμονών (T4). Ανάλογα με την περίπτωση, διενεργείται περαιτέρω αξιολόγηση της T4 σε δείγματα αίματος από τις μητέρες και νεογνά 4ης ΜΓΗ. Ανάλογα με την περίπτωση, μπορούν να μετρηθούν προαιρετικά και άλλες ορμόνες. Το αίμα νεογνών μπορεί να συγκεντρώνεται ανά γέννα για τη διενέργεια αναλύσεων θυρεοειδικών ορμονών. Οι θυρεοειδικές ορμόνες (T4 και TSH) θα πρέπει, κατά προτίμηση να μετρώνται ως «σύνολο». 43. Οι ακόλουθοι παράγοντες ενδέχεται να επηρεάζουν τη μεταβλητότητα και τις απόλυτες τιμές συγκέντρωσης των προσδιοριζόμενων ορμονών: — ο χρόνος θανάτωσης, λόγω της ημερήσιας διακύμανσης των συγκεντρώσεων ορμονών, — η μέθοδος θανάτωσης, και ως εκ τούτου πρέπει να αποφεύγεται η περιττή καταπόνηση των ζώων, που μπορεί να επηρεάσει τις συγκεντρώσεις των ορμονών, — οι σειρές αντιδραστηρίων (κιτ) ορμονικού προσδιορισμού που ενδέχεται να διαφέρουν ως προς τις πρότυπες καμπύλες τους. 44. Τα δείγματα πλάσματος που προορίζονται ειδικά για ορμονικό προσδιορισμό θα πρέπει να λαμβάνονται σε παραπλήσια ώρα της ημέρας. Οι αριθμητικές τιμές που προκύπτουν από ανάλυση των συγκεντρώσεων ορμονών διαφέρουν ανάλογα με τα διάφορα κιτ δοκιμασιών που είναι διαθέσιμα στο εμπόριο. Παθολογοανατομία Νεκροψία-νεκροτομή 45. Σε περίπτωση θανάτωσης ή θανάτου κατά τη διάρκεια της μελέτης, τα ενήλικα αρσενικά θα πρέπει να εξετάζονται μακροσκοπικά για τυχόν ανωμαλίες ή παθολογικές αλλοιώσεις. Ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δίδεται στα όργανα του αναπαραγωγικού συστήματος. Ο αριθμός των σημείων εμφύτευσης θα πρέπει να καταγράφεται. Θα πρέπει να εξετάζονται κολπικά επιχρίσματα το πρωί της ημέρας της νεκροψίας για να προσδιοριστεί το στάδιο του οιστρικού κύκλου και να καταστεί εφικτή η συσχέτιση με την ιστοπαθολογία των ωοθηκών. 46. Οι όρχεις και επιδιδυμίδες, ο προστάτης και οι σπερματοδόχοι κύστεις με τους πηκτοειδείς αδένες στο σύνολό τους, όλων των αρσενικών ενήλικων ζώων θα πρέπει να απαλλάσσονται από τυχόν προσφυόμενους ιστούς, ανάλογα με την περίπτωση, και να ζυγίζονται νωπά όσο το δυνατόν συντομότερα μετά την ανατομή ώστε να αποφεύγεται η ξήρανσή τους. Επιπλέον, μπορούν να μετρώνται προαιρετικά τα βάρη οργάνων όπως το σύμπλεγμα ανελκτήρων του πρωκτού και βολβοσηραγγωδών μυών, οι βολβοουρηθραίοι αδένες (αδένες του Cowper) και η βάλανος του πέους στα αρσενικά και ωοθήκες σε ζεύγη (βάρος σε νωπή κατάσταση) και η μήτρα (περιλαμβανομένου του τραχήλου) στα θηλυκά· σε περίπτωση που περιλαμβάνονται, τα εν λόγω βάρη θα πρέπει να μετρώνται το συντομότερο δυνατό μετά την ανατομή. 47. Τα νεκρά νεογνά και τα νεογνά που θανατώνονται τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό, ή σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά από αυτήν, θα πρέπει, τουλάχιστον, να εξετάζονται προσεκτικά εξωτερικά για μακροσκοπικές ανωμαλίες. Ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δίνεται στα εξωτερικά όργανα του γεννητικού συστήματος, τα οποία θα πρέπει να εξετάζονται για τυχόν ύπαρξη σημείων ανώμαλης ανάπτυξης. Τη 13η ΜΓΗ θα πρέπει να λαμβάνεται και να φυλάσσεται ο θυρεοειδής από 1 αρσενικό και 1 θηλυκό νεογνό ανά γέννα. 48. Οι ωοθήκες, οι όρχεις, άλλα όργανα του γεννητικού συστήματος (μήτρα και τράχηλος, επιδιδυμίδες, προστάτης, σπερματοδόχοι κύστεις και πηκτοειδείς αδένες), ο θυρεοειδής και όλα τα όργανα που παρουσιάζουν μακροσκοπικές βλάβες, από όλα τα ενήλικα ζώα, πρέπει να διατηρούνται. Η μονιμοποίηση σε φορμόλη δεν συνιστάται για τη συνήθη εξέταση των όρχεων και των επιδιδυμίδων. Μια αποδεκτή μέθοδος είναι η χρήση μονιμοποιητικού Bouin ή τροποποιημένου μονιμοποιητικού Davidson (11). Ο ινώδης χιτώνας (tunica albuginea) μπορεί να διατρυπάται με βελόνα, με ήπιες κινήσεις, σε μικρό βάθος και στα δύο άκρα ώστε να διευκολύνεται η διείσδυση του μονιμοποιητικού υλικού. Ιστοπαθολογία 49. Θα πρέπει να διενεργούνται αναλυτικές ιστολογικές εξετάσεις των ωοθηκών, των όρχεων και των επιδιδυμίδων (με ιδιαίτερη έμφαση στα στάδια της σπερματογένεσης και την ιστοπαθολογία της δομής των διάμεσων κυττάρων των όρχεων) των ζώων της ομάδας στην οποία χορηγείται η υψηλότερη δόση και της ομάδας μαρτύρων. Εφόσον απαιτείται, μπορεί να εξετάζονται και τα άλλα διατηρούμενα όργανα, περιλαμβανομένου του θυρεοειδούς νεογνών και ενήλικων ζώων. Μετά τη μονιμοποίηση μπορεί να προσδιορίζεται το βάρος του θυρεοειδούς. Ο καθαρισμός θα πρέπει και στην περίπτωση αυτή να πραγματοποιείται με μεγάλη προσοχή και μόνο μετά τη μονιμοποίηση, ώστε να μην προκαλείται βλάβη στους ιστούς. Οι βλάβες των ιστών μπορούν να βλάψουν την εγκυρότητα της ιστοπαθολογικής ανάλυσης. Οι εξετάσεις επεκτείνονται στα ζώα των ομάδων άλλων δόσεων εάν στην ομάδα της υψηλότερης δόσης έχουν παρατηρηθεί αλλοιώσεις. Το έγγραφο καθοδήγησης σχετικά με την ιστοπαθολογία (11) παρέχει επιπρόσθετες πληροφορίες για την ανατομή, τη μονιμοποίηση, την τομή και την ιστολογική ανάλυση των ενδοκρινικών ιστών. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Δεδομένα 50. Πρέπει να παρέχονται δεδομένα για κάθε ζώο ξεχωριστά. Επιπλέον, όλα τα δεδομένα θα πρέπει να συνοψίζονται σε μορφή πινάκων, όπου θα δίνεται για κάθε ομάδα δοκιμής ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμής, ο αριθμός των ζώων που βρέθηκαν νεκρά κατά τη διάρκεια της δοκιμής ή θανατώθηκαν με ευθανασία, η χρονική στιγμή κάθε θανάτου ή θανάτωσης, ο αριθμός των γόνιμων ζώων, ο αριθμός των έγκυων θηλυκών, ο αριθμός των ζώων που εμφάνισαν σημεία τοξικότητας, μια περιγραφή των παρατηρηθέντων σημείων τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένης της χρονικής στιγμής εμφάνισης, της διάρκειας και της σοβαρότητας κάθε τοξικής δράσης, οι τύποι των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων και κάθε σχετικό στοιχείο για τις γέννες. Στο προσάρτημα 3 παρέχεται ένας μορφότυπος συνοπτικής αναφοράς σε μορφή πίνακα που έχει αποδεχθεί ιδιαίτερα χρήσιμος για την αξιολόγηση των επιδράσεων στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη. 51. Λόγω του περιορισμένου μεγέθους της μελέτης, οι στατιστικές αναλύσεις υπό μορφή ελέγχων σημαντικότητας είναι περιορισμένης αξίας για πολλές παραμέτρους, ιδίως τις παραμέτρους σχετικά με την αναπαραγωγή. Σε περίπτωση χρήσης στατιστικών αναλύσεων, η επιλεγόμενη μέθοδος θα πρέπει να είναι κατάλληλη για την κατανομή της υπό εξέταση μεταβλητής, και να επιλέγεται πριν από την έναρξη της μελέτης. Η στατιστική ανάλυση πρωκτογεννητικής απόστασης και διατηρούμενων θηλών θα πρέπει να βασίζεται σε ατομικά στοιχεία για κάθε νεογνό, και θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι επιδράσεις στη γέννα. Όπου αρμόζει, μονάδα της ανάλυσης θα πρέπει να είναι η γέννα από την ίδια μητέρα. Η στατιστική ανάλυση σωματικού βάρους των νεογνών θα πρέπει να βασίζεται σε ατομικά στοιχεία για κάθε νεογνό, και θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη το πλήθος νεογνών της γέννας. Λόγω του μικρού μεγέθους της ομάδας, μπορεί να είναι χρήσιμη η χρήση ιστορικών δεδομένων μαρτύρων (π.χ. σχετικά με το μέγεθος της γέννας), εάν υπάρχουν, ως βοήθημα στην ερμηνεία της μελέτης. Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων 52. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης τοξικότητας θα πρέπει να αξιολογούνται ως προς τις παρατηρούμενες επιδράσεις, τα ευρήματα της νεκροψίας και τα μικροσκοπικά ευρήματα. Στην αξιολόγηση περιλαμβάνεται η σχέση μεταξύ της δόσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και της παρουσίας ή απουσίας, της συχνότητας εμφάνισης και της σοβαρότητας των ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων των μακροσκοπικών αλλοιώσεων, των ταυτοποιημένων οργάνων στόχων, της στειρότητας, των κλινικών ανωμαλιών, των επιδράσεων στις επιδόσεις στην αναπαραγωγή και στις γέννες, των μεταβολών στα σωματικά βάρη, των επιδράσεων στη θνησιμότητα και κάθε άλλου τοξικού φαινομένου. 53. Λόγω της σύντομης περιόδου αγωγής των αρσενικών, κατά την αξιολόγηση των επιδράσεων στην αναπαραγωγή των αρσενικών, μαζί με τα δεδομένα για τη γονιμότητα θα πρέπει να εξετάζεται και η ιστοπαθολογία των όρχεων και των επιδιδυμίδων. Επικουρικά, χρήσιμη στην ερμηνεία της μελέτης μπορεί να είναι και η χρήση ιστορικών δεδομένων μαρτύρων (π.χ. σχετικά με το μέγεθος της γέννας, την πρωκτογεννητική απόσταση, τις διατηρούμενες θηλές, τα επίπεδα T4 στον ορό), εάν υπάρχουν. 54. Για τον ποιοτικό έλεγχο προτείνεται η συλλογή ιστορικών δεδομένων μαρτύρων και ο υπολογισμός συντελεστών μεταβλητότητας για τα αριθμητικά δεδομένα, ιδίως όσον αφορά τις παραμέτρους που συνδέονται με την ανίχνευση ενδοκρινικών διαταρακτών. Τα δεδομένα αυτά μπορούν να χρησιμοποιούνται για συγκρίσεις κατά την αξιολόγηση πραγματικών μελετών. Έκθεση δοκιμής 55. Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία: Υπό δοκιμή χημική ουσία: — πηγή, αριθμός παρτίδας, καταληκτική ημερομηνία χρήσης, αν υπάρχει, — σταθερότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, εάν είναι γνωστή, Μονοσυστατική ουσία: — φυσική εμφάνιση, υδατοδιαλυτότητα και πρόσθετες σχετικές φυσικοχημικές ιδιότητες, — ταυτοποίηση της χημικής ουσίας, όπως ονομασία IUPAC ή CAS, αριθμός CAS, κωδικός SMILES ή InChI, συντακτικός τύπος, καθαρότητα, χημική ταυτότητα προσμίξεων, κατά περίπτωση και στο μέτρο του δυνατού, κ.λπ., Πολυσυστατική ουσία, UVCB και μείγματα: — περιγράφονται, στο μέτρο του δυνατού, με τη χημική ταυτότητα των συστατικών (βλ. ανωτέρω), την ποσότητα στην οποία απαντούν και τις σχετικές φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Φορέας (εάν χρησιμοποιείται): — αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα, εάν δεν είναι το νερό. Πειραματόζωα: — είδος/φυλή χρησιμοποιηθέντων ζώων, — αριθμός, ηλικία και φύλο των ζώων, — προέλευση των ζώων, συνθήκες στέγασης, σιτηρέσιο κ.λπ., — βάρος κάθε ζώου κατά την έναρξη της δοκιμής. — αιτιολόγηση της επιλογής άλλου είδους εκτός από τον επίμυ. Συνθήκες δοκιμής: — αιτιολόγηση της επιλογής των επιπέδων δόσης, — λεπτομέρειες σχετικά με το παρασκεύασμα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας/τροφής και τις επιτευχθείσες συγκεντρώσεις, σταθερότητα και ομοιογένεια του παρασκευάσματος, — λεπτομέρειες σχετικά με τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, — κατά περίπτωση, μετατροπή της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο σιτηρέσιο ή το πόσιμο νερό (ppm) σε πραγματική δόση (mg/kg βάρους σώματος/ημέρα), — λεπτομέρειες σχετικά με την ποιότητα της τροφής και του νερού, — αναλυτική περιγραφή της διαδικασίας τυχαιοποίησης για την επιλογή των νεογνών προς απομάκρυνση, εφόσον απαιτείται. Αποτελέσματα: — βάρος του σώματος/μεταβολές βάρους σώματος, — κατανάλωση τροφής και νερού, εφόσον είναι διαθέσιμα, — δεδομένα τοξικής αντίδρασης ανά φύλο και δόση, περιλαμβανομένης της γονιμότητας, της κύησης, καθώς και όποιων άλλων σημείων τοξικότητας, — διάρκεια κύησης, — τοξικές ή άλλες επιδράσεις στην αναπαραγωγή, στα νεογνά, στη μεταγεννητική ανάπτυξη κ.λπ., — φύση, σοβαρότητα και διάρκεια των κλινικών παρατηρήσεων (αναστρέψιμων και μη), — αριθμός ενήλικων θηλυκών με κανονικό ή μη κανονικό οιστρικό κύκλο και διάρκεια του κύκλου, — αριθμός ζώντων νεογνών και απώλειες μετά την εμφύτευση, — δεδομένα για το βάρος του σώματος των νεογνών, — πρωκτογεννητική απόσταση για όλα τα νεογνά (και βάρος σώματος την ημέρα της μέτρησης της πρωκτογεννητικής απόστασης) — διατηρούμενες θηλές σε αρσενικά νεογνά, — επίπεδα θυρεοειδικών ορμονών, σε νεογνά 13ης ΜΓΗ και σε ενήλικα αρσενικά (και σε μητέρες και νεογνά 4ης ΜΓΗ, εφόσον μετρώνται) — αριθμός νεογνών με μακροσκοπικά ορατές ανωμαλίες, μακροσκοπική αξιολόγηση των εξωτερικών γεννητικών οργάνων, αριθμός καχεκτικών νεογνών, — χρόνος θανάτου των ζώων κατά τη διάρκεια της μελέτης ή επιβίωση έως το τέλος, — αριθμός εμφυτευμένων νεογνών, μέγεθος γέννας και βάρη νεογνών γέννας κατά τη χρονική στιγμή της καταγραφής, — βάρος σώματος κατά τη θανάτωση και δεδομένα βάρους οργάνων για τα γονικά ζώα, — ευρήματα νεκροψίας, — λεπτομερής περιγραφή των ιστοπαθολογικών ευρημάτων, — δεδομένα για την απορρόφηση (εάν υπάρχουν διαθέσιμα), — στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, κατά περίπτωση. Εξέταση των αποτελεσμάτων Συμπεράσματα Ερμηνεία των αποτελεσμάτων 56. Η μελέτη θα παράσχει αξιολογήσεις της τοξικότητας στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη που συνδέεται με τη χορήγηση επαναλαμβανόμενων δόσεων (βλ. παραγράφους 5 και 6). Μπορεί να περιλαμβάνει υπόδειξη της ανάγκης διενέργειας περαιτέρω ερευνών και παρέχει καθοδήγηση όσον αφορά τον σχεδιασμό επακόλουθων μελετών. Για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων που αφορούν την αναπαραγωγή και την ανάπτυξη θα πρέπει να χρησιμοποιείται ως βοήθημα το έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 43 του ΟΟΣΑ (12). Στο έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 106 του ΟΟΣΑ για την ιστολογική αξιολόγηση των ενδοκρινικών και αναπαραγωγικών δοκιμών σε τρωκτικά (11) παρέχονται πληροφορίες σχετικά με την προετοιμασία και την αξιολόγηση των (ενδοκρινικών) οργάνων και των κολπικών επιχρισμάτων που μπορεί να είναι χρήσιμα για την παρούσα TG. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Διατίθεται κατόπιν αιτήματος από τον Οργανισμό για την Οικονομική Συνεργασία και την Ανάπτυξη, Παρίσι. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Διατίθεται κατόπιν αιτήματος από τον Οργανισμό για την Οικονομική Συνεργασία και την Ανάπτυξη, Παρίσι. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Διατίθεται κατόπιν αιτήματος από τον Οργανισμό για την Οικονομική Συνεργασία και την Ανάπτυξη, Παρίσι. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development,.Paris. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Προσάρτημα 1 ΟΡΙΣΜΟΙ [ΒΛ. ΕΠΙΣΗΣ ΤΟ ΕΓΓΡΑΦΟ ΚΑΘΟΔΗΓΗΣΗΣ ΑΡΙΘ. 150 ΤΟΥ ΟΟΣΑ (6)] Ανδρογονικότητα: η ικανότητα μιας χημικής ουσίας να δρα όπως μια φυσική ανδρογόνος ορμόνη (π.χ. τεστοστερόνη) στον οργανισμό θηλαστικού. Αντιανδρογονικότητα: η ικανότητα μιας χημικής ουσίας να καταστέλλει τη δράση μιας φυσικής ανδρογόνου ορμόνης (π.χ. τεστοστερόνη) στον οργανισμό θηλαστικού. Αντιοιστρογονικότητα: η ικανότητα μιας χημικής ουσίας να καταστέλλει τη δράση μιας φυσικής οιστρογόνου ορμόνης (π.χ. 17β-οιστραδιόλη) στον οργανισμό θηλαστικού. Αντιθυρεοειδική δραστηριότητα: η ικανότητα μιας χημικής ουσίας να καταστέλλει τη δράση μιας φυσικής θυρεοειδικής ορμόνης (π.χ. T3) στον οργανισμό θηλαστικού. Χημικό προϊόν: μια ουσία ή ένα μείγμα. Τοξικότητα στην ανάπτυξη: η εκδήλωση τοξικότητας στην αναπαραγωγή, η οποία περιλαμβάνει προγεννητικές, περιγεννητικές και μεταγεννητικές δομικές ή λειτουργικές διαταραχές των απογόνων. Δοσολογία: γενικός όρος που περιλαμβάνει τη δόση, τη συχνότητα και τη διάρκεια χορήγησης. Δόση: η χορηγούμενη ποσότητα υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Η δόση εκφράζεται σε βάρος υπό δοκιμή χημικής ουσίας ανά μονάδα βάρους πειραματόζωου ανά ημέρα (π.χ. mg/kg βάρους σώματος/ημέρα) ή σε σταθερή συγκέντρωση στην τροφή. Έκδηλη τοξικότητα: γενικός όρος που δηλώνει σαφή σημεία τοξικότητας μετά από χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Αυτά πρέπει να επαρκούν για την εκτίμηση της επικινδυνότητας και να είναι τέτοια ώστε η αύξηση της χορηγούμενης δόσης να αναμένεται ότι θα προκαλέσει σοβαρές τοξικές εκδηλώσεις και πιθανώς θνησιμότητα. Εξασθένιση της γονιμότητας: αντιπροσωπεύει διαταραχές των αναπαραγωγικών λειτουργιών ή της ικανότητας αρσενικών ή θηλυκών. Τοξικότητα στη μητέρα: δυσμενείς επιδράσεις σε κυοφορούντα θηλυκά, είτε ειδικής εκδήλωσης (άμεση επίδραση) είτε μη ειδικής εκδήλωσης (έμμεση επίδραση). NOAEL (no-observed-adverse effect level): πρόκειται για το υψηλότερο επίπεδο δόσης στο οποίο δεν παρατηρούνται δυσμενείς επιδράσεις λόγω της αγωγής. Οιστρογονικότητα: η ικανότητα μιας χημικής ουσίας να δρα όπως μια φυσική οιστρογόνος ορμόνη (π.χ. 17β-οιστραδιόλη) στον οργανισμό θηλαστικού. Τοξικότητα στην αναπαραγωγή: αντιπροσωπεύει τις επιβλαβείς επιδράσεις στους απογόνους και/ή την εξασθένιση των αναπαραγωγικών λειτουργιών ή ικανότητας αρσενικών και θηλυκών. Υπό δοκιμή χημική ουσία: κάθε ουσία ή μείγμα που υποβάλλεται σε δοκιμή με τη χρήση της παρούσας μεθόδου δοκιμών. Θυρεοειδική δραστηριότητα: η ικανότητα μιας χημικής ουσίας να δρα όπως μια φυσική θυρεοειδική ορμόνη (π.χ. T3) στον οργανισμό θηλαστικού. Επικύρωση: επιστημονική διαδικασία που αποσκοπεί στον χαρακτηρισμό των λειτουργικών απαιτήσεων και περιορισμών μιας μεθόδου δοκιμών και στην απόδειξη της αξιοπιστίας της και της καταλληλότητάς της για συγκεκριμένο σκοπό. Προσάρτημα 2 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΤΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΓΙΣΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ, ΒΑΣΕΙ ΠΛΗΡΟΥΣ ΠΕΡΙΟΔΟΥ ΖΕΥΓΑΡΩΜΑΤΟΣ 14 ΗΜΕΡΩΝ ﻿Προσάρτημα 3 ΣΥΝΟΠΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΤΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ/ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ ΤΙΜΕΣ Δοσολογία (μονάδες) 0 (μάρτυρας) … … … … Ζεύγη κατά την έναρξη (N) Οιστρικός κύκλος (τουλάχιστον μέση διάρκεια και συχνότητα μη κανονικών κύκλων) Θηλυκά που παρουσιάζουν ενδείξεις συνουσίας (N) Θηλυκά που καθίστανται έγκυα (N) Ημέρες σύλληψης 1 - 5 (N) Ημέρες σύλληψης 6 -… (21) (N) Εγκυμοσύνη ≤ 21 ημέρες (N) Εγκυμοσύνη = 22 ημέρες (N) Εγκυμοσύνη ≥ 23 ημέρες (N) Μητέρες με ζώντα νεογνά (N) Μητέρες με ζώντα νεογνά την 4η ημέρα (N) Εμφυτευμένα έμβρυα/μητέρα (μέσος όρος) Ζώντα νεογνά/μητέρα κατά τη γέννα (μέσος όρος) Ζώντα νεογνά/μητέρα κατά την 4η ημέρα (μέσος όρος) Αναλογία φύλων (α/θ) κατά τη γέννα (μέσος όρος) Αναλογία φύλων (α/θ) κατά την 4η ημέρα (μέσος όρος) Βάρος γέννας κατά τη γέννηση (μέσος όρος) Βάρος γέννας κατά την 4η ημέρα (μέσος όρος) Βάρος νεογνών κατά τη γέννηση (μέσος όρος) Βάρος νεογνών κατά τη μέτρηση της πρωκτογεννητικής απόστασης (μέσος όρος αρσενικών, μέσος όρος θηλυκών) Πρωκτογεννητική απόσταση νεογνών κατά την ίδια μεταγεννητική ημέρα, τη γέννηση – την 4η ημέρα (μέσος όρος αρσενικών, μέσος όρος θηλυκών, καταγραφή της ΜΓΗ) Βάρος νεογνών κατά την 4η ημέρα (μέσος όρος) Διατηρούμενες θηλές αρσενικών νεογνών τη 13η ημέρα (μέσος όρος) Βάρος νεογνών κατά τη 13η ημέρα (μέσος όρος) ΜΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΑ ΝΕΟΓΝΑ Μητέρες με 0 Μητέρες με 1 Μητέρες με ≥ 2 ΑΠΩΛΕΙΑ ΑΠΟΓΟΝΩΝ Προγεννητική/μετά την εμφύτευση (εμφυτευμένα έμβρυα μείον ζώντα νεογνά) Θηλυκά με 0 Θηλυκά με 1 Θηλυκά με 2 Θηλυκά με ≥ 3 Μεταγεννητική (ζώντα κατά τη γέννα μείον ζώντα κατά τη 13η ΜΓΗ) Θηλυκά με 0 Θηλυκά με 1 Θηλυκά με 2 Θηλυκά με ≥ 3 B.64 ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗΣ ΔΟΣΗΣ ΜΕ ΤΗ ΔΟΚΙΜΗ ΔΙΑΛΟΓΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ/ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 422 του ΟΟΣΑ (2016). Οι κατευθυντήριες γραμμές του ΟΟΣΑ για τον έλεγχο χημικών ουσιών αναθεωρούνται ανά διαστήματα ώστε να λαμβάνονται υπόψη οι επιστημονικές εξελίξεις. Η αρχική κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών διαλογής 422 εγκρίθηκε το 1996, βάσει ενός πρωτοκόλλου για συνδυασμένη δοκιμή επαναλαμβανόμενης δόσης και διαλογής αναπαραγωγής/ανάπτυξης που συζητήθηκε σε δύο συναντήσεις εμπειρογνωμόνων, στο Λονδίνο το 1990 (1) και στο Τόκυο το 1992 (2). 2. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών συνδυάζει ένα μέρος που συνίσταται στη διαλογή ως προς την τοξικότητα στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη, το οποίο βασίζεται στην εμπειρία που απέκτησαν τα κράτη μέλη από τη χρήση της αρχικής μεθόδου σε υφιστάμενες χημικές ουσίες υψηλού όγκου παραγωγής και σε διερευνητικές μελέτες με ουσίες που χρησιμεύουν ως θετικοί μάρτυρες (3) (4), και ένα άλλο μέρος σχετικό με την τοξικότητα επαναλαμβανόμενης δόσης σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή 407 του ΟΟΣΑ (μελέτη τοξικότητας από το στόμα, 28 ημερών, με επαναλαμβανόμενη δόση σε τρωκτικά, που αντιστοιχεί στο κεφάλαιο B.7 του παρόντος παραρτήματος). 3. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών έχει επικαιροποιηθεί με παραμέτρους που αφορούν τους ενδοκρινικούς διαταράκτες, στο πλαίσιο της δράσης πρώτης προτεραιότητας που ξεκίνησε ο ΟΟΣΑ το 1998 με σκοπό την αναθεώρηση των υφιστάμενων κατευθυντήριων γραμμών δοκιμών και την ανάπτυξη νέων κατευθυντήριων γραμμών δοκιμών για τη διαλογή και τη διεξαγωγή δοκιμών σε δυνητικούς ενδοκρινικούς διαταράκτες (5). Σε αυτό το πλαίσιο, η TG 407 (που αντιστοιχεί στο κεφάλαιο B.7 του παρόντος παραρτήματος) ενισχύθηκε το 2008 με παραμέτρους κατάλληλες για την ανίχνευση ενδοκρινικής δραστηριότητας υπό δοκιμή χημικών ουσιών. Ο στόχος της επικαιροποίησης της TG 422 ήταν η συμπερίληψη ορισμένων παραμέτρων σχετικά με τους ενδοκρινικούς διαταράκτες σε TG διαλογής στις οποίες οι περίοδοι έκθεσης καλύπτουν ορισμένες από τις ευαίσθητες περιόδους κατά την ανάπτυξη (προγεννητική ή πρώτη μεταγεννητική περίοδος). 4. Οι επιλεχθείσες πρόσθετες παράμετροι σχετικά με τους ενδοκρινικούς διαταράκτες, που αποτελούν επίσης μέρος της TG 443 (εκτεταμένη μελέτη τοξικότητας στην αναπαραγωγή μίας γενεάς, που αντιστοιχεί στο κεφάλαιο B.56 του παρόντος παραρτήματος), περιλήφθηκαν στην TG 422 βάσει μελέτης σκοπιμότητας στην οποία θίγονται επιστημονικά και τεχνικά θέματα που σχετίζονται με τη συμπερίληψή τους, καθώς και πιθανές προσαρμογές του σχεδιασμού δοκιμής που χρειάζονται για τη συμπερίληψή τους (6). 5. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών έχει σχεδιαστεί για να παρέχει πληροφορίες σχετικά με τις επιδράσεις μιας υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην αναπαραγωγική συμπεριφορά αρσενικών και θηλυκών ατόμων, όπως η λειτουργία των γονάδων, η συμπεριφορά ζευγαρώματος, η σύλληψη, η ανάπτυξη του κυήματος και ο τοκετός. Δεν αποτελεί εναλλακτική μέθοδο ούτε αντικαθιστά τις υφιστάμενες μεθόδους δοκιμών B.31, B.34, B.35 ή B.56. ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ 6. Κατά την εκτίμηση και αξιολόγηση των τοξικών χαρακτηριστικών μιας υπό δοκιμή χημικής ουσίας, μπορεί να προσδιοριστεί η τοξικότητά της από το στόμα με τη χρήση επαναλαμβανόμενης δόσης μετά τη λήψη αρχικών πληροφοριών για την τοξικότητα μέσω δοκιμών οξείας τοξικότητας. Η παρούσα μελέτη παρέχει πληροφορίες σχετικά με τους κινδύνους για την υγεία που είναι πιθανό να προκύψουν από την επαναλαμβανόμενη έκθεση για σχετικά περιορισμένη χρονική περίοδο. Η μέθοδος περιλαμβάνει τη βασική μελέτη τοξικότητας με επαναλαμβανόμενη δόση, που μπορεί να χρησιμοποιείται για χημικές ουσίες για τις οποίες δεν δικαιολογείται η διεξαγωγή μελέτης 90 ημερών (π.χ. όταν ο όγκος παραγωγής δεν υπερβαίνει συγκεκριμένα όρια) ή ως προκαταρκτικό στάδιο μιας μακροχρόνιας μελέτης. Κατά τη διεξαγωγή της μελέτης θα πρέπει να εφαρμόζονται οι γενικές αρχές και τα κριτήρια που περιγράφονται στο έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 19 του ΟΟΣΑ σχετικά με την αναγνώριση, την αξιολόγηση και τη χρήση κλινικών σημείων ως ανώδυνων παραμέτρων για τα πειραματόζωα που χρησιμοποιούνται σε αξιολογήσεις ασφάλειας (7). 7. Επίσης, περιλαμβάνει δοκιμή διαλογής ως προς την τοξικότητα στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη και, ως εκ τούτου, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για την παροχή αρχικών πληροφοριών σχετικά με τις δυνητικές επιδράσεις στις αναπαραγωγικές επιδόσεις αρσενικών και θηλυκών όπως η λειτουργία των γονάδων, η συμπεριφορά ζευγαρώματος, η σύλληψη, η ανάπτυξη του κυήματος και ο τοκετός, είτε σε πρώιμο στάδιο της αξιολόγησης των τοξικολογικών ιδιοτήτων υπό δοκιμή χημικών ουσιών είτε για χημικές ουσίες που προκαλούν ανησυχία. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών δεν παρέχει ολοκληρωμένες πληροφορίες για όλες τις πτυχές της αναπαραγωγής και της ανάπτυξης. Πιο συγκεκριμένα, παρέχει περιορισμένα μόνο μέσα ανίχνευσης των μεταγεννητικών εκδηλώσεων της προγεννητικής έκθεσης, ή των επαγόμενων κατά τη μεταγεννητική έκθεση πιθανών επιδράσεων. Λόγω (μεταξύ άλλων) της επιλεκτικότητας των παραμέτρων και της μικρής διάρκειας της μελέτης, η παρούσα μέθοδος δεν θα παρέχει αποδεικτικά στοιχεία που να στηρίζουν οριστικούς ισχυρισμούς περί ανυπαρξίας επιδράσεων στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη. Επιπλέον, σε περίπτωση απουσίας δεδομένων από άλλες δοκιμές τοξικότητας στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη, τα θετικά αποτελέσματα είναι χρήσιμα για την αρχική αξιολόγηση της επικινδυνότητας και συμβάλλουν στη διαδικασία λήψης αποφάσεων όσον αφορά την αναγκαιότητα και το χρονοδιάγραμμα διεξαγωγής πρόσθετων δοκιμών. 8. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τις σχετικές με το ενδοκρινικό σύστημα παραμέτρους θα πρέπει να μελετώνται στο πλαίσιο του εννοιολογικού πλαισίου για τον έλεγχο και την αξιολόγηση χημικών ενδοκρινικών διαταρακτών (Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) του ΟΟΣΑ (8). Σε αυτό το εννοιολογικό πλαίσιο, η ενισχυμένη TG 422 του ΟΟΣΑ περιλαμβάνεται στο επίπεδο 4 ως in vivo δοκιμασία που παρέχει δεδομένα για τις δυσμενείς επιδράσεις των παραμέτρων που σχετίζονται με το ενδοκρινικό σύστημα. Εντούτοις, ένα ενδοκρινικό σήμα μπορεί να μη θεωρηθεί επαρκώς ισχυρό στοιχείο ώστε μια χημική ουσία να χαρακτηριστεί ενδοκρινικός διαταράκτης. 9. Η μέθοδος δοκιμών δίδει μεγαλύτερη έμφαση στις νευρολογικές επιδράσεις ως ειδική παράμετρο καθώς και στην ανάγκη προσεκτικής κλινικής παρατήρησης των ζώων με σκοπό τη συγκέντρωση όσο το δυνατόν περισσοτέρων πληροφοριών. Επιδιώκεται η αναγνώριση χημικών ουσιών με νευροτοξικό δυναμικό, για τις οποίες ενδέχεται να χρειάζεται περαιτέρω εις βάθος διερεύνηση. Επιπλέον, η μέθοδος μπορεί επίσης να παράσχει βασικές ενδείξεις επιδράσεων στο ανοσοποιητικό σύστημα. 10. Σε περίπτωση απουσίας δεδομένων από άλλες μελέτες συστηματικής τοξικότητας, τοξικότητας στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη, νευροτοξικότητας και/ή ανοσοτοξικότητας, τα θετικά αποτελέσματα είναι χρήσιμα για την αρχική αξιολόγηση της επικινδυνότητας και συμβάλλουν στη διαδικασία λήψης αποφάσεων όσον αφορά την αναγκαιότητα και το χρονοδιάγραμμα διεξαγωγής πρόσθετων δοκιμών. Η δοκιμή μπορεί να είναι ιδιαίτερα χρήσιμη ως μέρος του συνόλου εξέτασης δεδομένων πληροφοριών (SIDS) του ΟΟΣΑ για την αξιολόγηση υφιστάμενων χημικών ουσιών για τις οποίες οι διαθέσιμες τοξικολογικές πληροφορίες είναι περιορισμένες ή ανύπαρκτες, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτική λύση αντί της διεξαγωγής δύο χωριστών δοκιμών για την τοξικότητα επαναλαμβανόμενης δόσης (TG 407 του ΟΟΣΑ, που αντιστοιχεί στο κεφάλαιο B.7 του παρόντος παραρτήματος) και την τοξικότητα στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη (TG 421 του ΟΟΣΑ, που αντιστοιχεί στο κεφάλαιο B.63 του παρόντος παραρτήματος) αντίστοιχα. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως μελέτη προσδιορισμού εύρους δόσεων για πιο εκτεταμένες μελέτες της αναπαραγωγής/ανάπτυξης, ή όταν θεωρηθεί για άλλους λόγους κατάλληλη. 11. Γενικά, σε ό,τι αφορά την ευαισθησία, θεωρείται ότι υπάρχουν διαφορές μεταξύ των έγκυων και των μη έγκυων ζώων. Κατά συνέπεια, ο προσδιορισμός των επιπέδων δόσεων που είναι επαρκή για την αξιολόγηση της γενικής συστηματικής τοξικότητας και της ειδικής τοξικότητας στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη με την παρούσα συνδυαστική δοκιμή μπορεί να είναι πιο περίπλοκος απ’ ό,τι όταν οι μεμονωμένες δοκιμές διεξάγονται χωριστά. Επιπλέον, η ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής όσον αφορά τη γενική συστηματική τοξικότητα μπορεί να είναι πιο δύσκολη απ’ ό,τι όταν διεξάγεται χωριστή μελέτη επαναλαμβανόμενης δόσης, ιδίως όταν οι ορολογικές και οι ιστοπαθολογικές παράμετροι δεν αξιολογούνται κατά την ίδια χρονική στιγμή στη μελέτη. Εξαιτίας αυτών των πολύπλοκων τεχνικών πτυχών, για τη διεξαγωγή της παρούσας συνδυαστικής δοκιμής διαλογής απαιτείται σημαντική εμπειρία στη διεξαγωγή δοκιμών τοξικότητας. Από την άλλη πλευρά, πέραν του μικρότερου πλήθους χρησιμοποιούμενων ζώων, η συνδυαστική μελέτη μπορεί να προσφέρει έναν καλύτερο τρόπο διάκρισης των άμεσων επιδράσεων στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη από τις επιδράσεις που θεωρούνται δευτερογενείς προς άλλες (συστηματικές) επιδράσεις. 12. Στην παρούσα δοκιμή, η διάρκεια της περιόδου χορήγησης είναι μεγαλύτερη απ’ ό,τι στην κλασική μελέτη επαναλαμβανόμενης δόσης 28 ημερών. Ωστόσο, στην παρούσα δοκιμή χρησιμοποιείται μικρότερο πλήθος ζώων από κάθε φύλο ανά ομάδα σε σύγκριση με τη διεξαγωγή κλασικής μελέτης επαναλαμβανόμενης δόσης 28 ημερών συν μια δοκιμή διαλογής ως προς την τοξικότητα στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη. 13. Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών θεωρείται ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται από το στόμα. Εάν χρησιμοποιηθούν άλλες οδοί έκθεσης, ενδέχεται να χρειαστούν τροποποιήσεις. 14. Πριν από τη χρήση της μεθόδου δοκιμών σε μείγμα για την παραγωγή δεδομένων για συγκεκριμένο κανονιστικό σκοπό, θα πρέπει να εξετάζεται αν –και, εάν ναι, για ποιον λόγο– μπορεί να αποδώσει αποτελέσματα κατάλληλα για τον επιδιωκόμενο σκοπό. Τέτοια εξέταση δεν χρειάζεται όταν οι κανονιστικές ρυθμίσεις επιβάλλουν τον έλεγχο του μείγματος. 15. Οι ορισμοί που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στο προσάρτημα 1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 16. Η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται σε διαβαθμισμένες δόσεις σε αρκετές ομάδες αρσενικών και θηλυκών ατόμων. Η χορήγηση των δόσεων στα αρσενικά θα πρέπει να διαρκεί τουλάχιστον τέσσερις εβδομάδες και να φθάνει μέχρι και την ημέρα πριν από την προγραμματισμένη θανάτωση (σε αυτό το χρονοδιάγραμμα περιλαμβάνονται τουλάχιστον δύο εβδομάδες πριν το ζευγάρωμα, η περίοδος του ζευγαρώματος και περίπου δύο εβδομάδες μετά το ζευγάρωμα). Λόγω της περιορισμένης περιόδου χορήγησης των δόσεων στα αρσενικά πριν από το ζευγάρωμα, η γονιμότητα ενδέχεται να μην αποτελεί ιδιαίτερα ευαίσθητο δείκτη της τοξικότητας στους όρχεις. Ως εκ τούτου, είναι ιδιαίτερα σημαντική ηδιεξαγωγή αναλυτικής ιστολογικής εξέτασης. Ο συνδυασμός μιας περιόδου χορήγησης διάρκειας δύο εβδομάδων πριν από το ζευγάρωμα και επακόλουθων παρατηρήσεων όσον αφορά το ζευγάρωμα/γονιμότητα με συνολική περίοδο χορήγησης τουλάχιστον τεσσάρων εβδομάδων, ακολουθούμενων από αναλυτική ιστοπαθολογική εξέταση των γονάδων των αρσενικών, θεωρείται επαρκής για την ανίχνευση της πλειονότητας των επιδράσεων στη γονιμότητα των αρσενικών και τη σπερματογένεση. 17. Η χορήγηση δόσεων στα θηλυκά θα πρέπει να διαρκεί καθ’ όλο το διάστημα διεξαγωγής της μελέτης. Η εν λόγω χορήγηση περιλαμβάνει δύο εβδομάδες πριν από το ζευγάρωμα (με στόχο να καλυφθούν τουλάχιστον δύο πλήρεις κύκλοι οίστρου), το μεταβλητό χρονικό διάστημα μέχρι τη σύλληψη, τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και τουλάχιστον δεκατρείς ημέρες μετά τη γέννηση, έως και την ημέρα πριν από την προγραμματισμένη θανάτωση. 18. Η διάρκεια της μελέτης, μετά τον εγκλιματισμό και την αξιολόγηση του κύκλου οίστρου πριν από τη χορήγηση των δόσεων, εξαρτάται από τις επιδόσεις των θηλυκών και είναι κατά προσέγγιση 63 ημέρες [τουλάχιστον 14 ημέρες πριν από το ζευγάρωμα, (έως) 14 ημέρες ζευγαρώματος, 22 ημέρες κύησης, 13 ημέρες γαλουχίας]. 19. Τα ζώα εξετάζονται με προσοχή καθημερινά κατά τη διάρκεια της περιόδου χορήγησης για τυχόν συμπτώματα τοξικότητας. Τα ζώα που πεθαίνουν ή θανατώνονται κατά τη διάρκεια της δοκιμής νεκροτομούνται και, στο τέλος της δοκιμής, αυτά που έχουν επιζήσει θανατώνονται και νεκροτομούνται επίσης. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Επιλογή ζωικού είδους 20. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών έχει σχεδιαστεί για χρήση με επίμυ. Η διερεύνηση των παραμέτρων που προσδιορίζονται στην παρούσα TG 422 σε άλλα είδη τρωκτικών πρέπει να αιτιολογείται αναλυτικά. Στο διεθνές πρόγραμμα επικύρωσης για την ανίχνευση ενδοκρινικών διαταρακτών της TG 407, ο επίμυς ήταν το μόνο είδος που χρησιμοποιήθηκε. Δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται φυλές με χαμηλή γονιμότητα ή γνωστή υψηλή συχνότητα εμφάνισης αναπτυξιακών ελαττωμάτων. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται υγιή παρθένα ζώα, που δεν έχουν υποβληθεί προηγουμένως σε πειράματα. Τα πειραματόζωα θα πρέπει να χαρακτηρίζονται ως προς το είδος, τη φυλή, το φύλο, το βάρος και την ηλικία. Στην αρχή της μελέτης, η διακύμανση των βαρών των χρησιμοποιούμενων ζώων θα πρέπει να είναι ελάχιστη και να μην υπερβαίνει το ± 20 % της μέσης τιμής για κάθε φύλο. Σε περίπτωση που η μελέτη διεξάγεται ως προκαταρκτικό στάδιο μακροχρόνιας μελέτης ή μελέτης πλήρους γενεάς, συνιστάται να χρησιμοποιούνται και στις δύο μελέτες ζώα της ίδιας φυλής και προέλευσης. Στέγαση και διατροφή 21. Σε όλες οι διαδικασίες πρέπει να τηρούνται τα τοπικά πρότυπα φροντίδας των πειραματόζωων. Η θερμοκρασία του θαλάμου πειραματόζωων θα πρέπει να είναι 22 °C (± 3 °C). Η σχετική υγρασία θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 30 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού του θαλάμου. Ο φωτισμός πρέπει να είναι τεχνητός και η φωτοπερίοδος 12ωρη. Για τη διατροφή μπορούν να χρησιμοποιούνται συνήθη εργαστηριακά σιτηρέσια, με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται μέσω της παρούσας μεθόδου, η επιλογή σιτηρεσίου ενδέχεται να επηρεάζεται από την ανάγκη κατάλληλης ανάμειξης της ουσίας. 22. Τα ζώα θα πρέπει να στεγάζονται σε μικρές ομάδες του ίδιου φύλου. Επιτρέπεται η ατομική στέγαση, εάν αιτιολογείται επιστημονικά. Σε περίπτωση ομαδικής στέγασης, κάθε κλωβός δεν πρέπει να περιέχει περισσότερα από πέντε ζώα. Οι διαδικασίες ζευγαρώματος θα πρέπει να εκτελούνται σε κλωβούς κατάλληλους για τον σκοπό αυτό. Τα έγκυα θηλυκά θα πρέπει να στεγάζονται σε ατομικούς κλωβούς και θα πρέπει να τους παρέχονται υλικά φωλιάσματος. Τα θηλυκά κατά τη γαλουχία τοποθετούνται σε ατομικούς κλωβούς μαζί με τα νεογνά τους. 23. Η τροφή πρέπει να υποβάλλεται τακτικά σε ανάλυση ώστε να εντοπίζονται τυχόν ξένες προσμείξεις. Ένα δείγμα του σιτηρεσίου θα πρέπει να διατηρείται έως την οριστικοποίηση της έκθεσης. Προετοιμασία των ζώων 24. Λαμβάνονται τυχαία υγιή, νεαρά, ενήλικα ζώα και κατανέμονται στις ομάδες και τους κλωβούς του πειράματος. Οι κλωβοί θα πρέπει να διατάσσονται με τρόπο ώστε να ελαχιστοποιούνται οι πιθανές επιδράσεις της θέσης τους. Τα ζώα ταυτοποιούνται με αποκλειστικό αναγνωριστικό και παραμένουν στα κλουβιά τους τουλάχιστον πέντε ημέρες πριν από την έναρξη της μελέτης προκειμένου να εγκλιματιστούν στις εργαστηριακές συνθήκες. Παρασκευή των δόσεων 25. Συνιστάται η χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας από το στόμα, εκτός εάν θεωρούνται καταλληλότερες άλλες οδοί χορήγησης. Όταν επιλέγεται η οδός από το στόμα, η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται συνήθως με στομαχικό καθετήρα· εντούτοις, οι υπό δοκιμή χημικές ουσίες μπορούν εναλλακτικά να χορηγούνται μέσω του σιτηρεσίου ή του πόσιμου νερού. 26. Εφόσον είναι αναγκαίο, παρασκευάζεται διάλυμα ή εναιώρημα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε κατάλληλο φορέα. Συνιστάται να εξετάζεται ως πρώτη επιλογή, εφόσον είναι δυνατόν, η χρήση υδατικού διαλύματος/εναιωρήματος, έπειτα η χρήση διαλύματος/εναιωρήματος σε έλαιο (π.χ. αραβοσιτέλαιο) και, ως τελευταία επιλογή, η χρήση διαλύματος σε άλλο φορέα. Σε περίπτωση που ο φορέας δεν είναι το νερό, θα πρέπει να είναι γνωστά τα τοξικά χαρακτηριστικά του. Θα πρέπει να προσδιορίζεται η σταθερότητα και η ομοιογένεια της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στον φορέα. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Αριθμός και φύλο των ζώων 27. Συνιστάται κάθε ομάδα να περιλαμβάνει αρχικά τουλάχιστον 10 αρσενικά και 12-13 θηλυκά. Πριν από την έκθεση, θα αξιολογείται η κυκλικότητα του οίστρου των θηλυκών και τα ζώα που δεν παρουσιάζουν τυπικούς κύκλους 4-5 ημερών δεν θα περιλαμβάνονται στη μελέτη· ως εκ τούτου, συνιστάται η προσθήκη επιπλέον θηλυκών στις ομάδες ώστε αυτές να αποτελούνται από 10 θηλυκά έκαστη. Εκτός της περίπτωσης έντονων τοξικών επιδράσεων, αναμένεται ότι κατ’ αυτόν τον τρόπο θα εξασφαλίζονται τουλάχιστον 8 έγκυα θηλυκά ανά ομάδα, που είναι συνήθως ο ελάχιστος αποδεκτός αριθμός έγκυων θηλυκών ανά ομάδα. Στόχος είναι να προκαλούνται επαρκείς κυοφορίες και απόγονοι για να εξασφαλίζεται η ουσιαστική αξιολόγηση της ικανότητας της υπό δοκιμή χημικής ουσίας να επιδρά στη γονιμότητα, στην κύηση, στη μητρική συμπεριφορά και στη συμπεριφορά θηλασμού των ζώων, καθώς και στην αύξηση και την ανάπτυξη των απογόνων της F 1 από τη σύλληψη ως τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό. Εάν προβλέπονται θανατώσεις κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, ο αριθμός αυξάνεται ανάλογα κατά τον αριθμό των ζώων που πρόκειται να θανατωθούν πριν την ολοκλήρωση της μελέτης. Θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο χρήσης επιπρόσθετης δορυφορικής ομάδας πέντε ζώων ανά φύλο στην ομάδα μαρτύρων και στην ομάδα μέγιστης δόσης, με σκοπό την παρατήρηση της αναστρεψιμότητας, της εμμονής ή της καθυστερημένης εμφάνισης συστηματικών τοξικών επιδράσεων επί 14 ημέρες τουλάχιστον μετά την αγωγή. Τα ζώα της δορυφορικής ομάδας δεν θα ζευγαρώνουν και, κατά συνέπεια, δεν χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της τοξικότητας στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη. Δοσολογία 28. Κατά κανόνα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τρεις ομάδες δοκιμής και μία ομάδα μαρτύρων. Εάν δεν διατίθενται κατάλληλα δεδομένα γενικής τοξικότητας, είναι δυνατόν να εκπονηθεί μελέτη προσδιορισμού του εύρους (ζώα της ίδιας φυλής και προέλευσης) για να διευκολύνει τον καθορισμό των δόσεων που θα χρησιμοποιηθούν. Εκτός από τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, τα ζώα της ομάδας μαρτύρων θα πρέπει να υφίστανται την ίδια ακριβώς μεταχείριση όπως τα υποκείμενα των ομάδων δοκιμής. Εάν χρησιμοποιείται φορέας για τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, η ομάδα μαρτύρων πρέπει να λαμβάνει τον φορέα στον μέγιστο χρησιμοποιούμενο όγκο. 29. Τα επίπεδα των δόσεων θα πρέπει να επιλέγονται λαμβανομένων υπόψη τυχόν υφιστάμενων δεδομένων για την τοξικότητα και την (τοξικο-)κινητική. Επίσης, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι ενδέχεται να υπάρχουν διαφορές στην ευαισθησία μεταξύ έγκυων και μη έγκυων ζώων. Το υψηλότερο επίπεδο δόσης πρέπει να επιλέγεται με σκοπό να προκαλέσει τοξικές εκδηλώσεις, όχι όμως τον θάνατο ούτε έντονη οδύνη. Στη συνέχεια επιλέγεται φθίνουσα σειρά δοσολογικών επιπέδων με σκοπό τον εντοπισμό απόκρισης συνδεόμενης με τη δόση και του χαμηλότερου επιπέδου δόσης στο οποίο δεν παρατηρούνται δυσμενείς επιδράσεις. Η βέλτιστη επιλογή είναι συνήθως ο υποδιπλασιασμός ή υποτετραπλασιασμός, ενώ η προσθήκη μιας τέταρτης ομάδας δοκιμής είναι συχνά προτιμότερη από τη χρησιμοποίηση πολύ μεγάλων συντελεστών (π.χ. άνω του 10) μεταξύ των δόσεων. 30. Όταν παρατηρείται γενική τοξικότητα (π.χ. μειωμένο βάρος σώματος, επιδράσεις στο ήπαρ, την καρδιά, τους πνεύμονες, τους νεφρούς κ.λπ.) ή άλλη αλλαγή που μπορεί να μην είναι τοξική αντίδραση (π.χ. μειωμένη πρόσληψη τροφής, διόγκωση του ήπατος), οι παρατηρούμενες επιδράσεις στις παραμέτρους που συνδέονται με ευαισθησία του ενδοκρινικού συστήματος θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Οριακή δοκιμή 31. Εάν μια δοκιμή από το στόμα σύμφωνα με τις περιγραφόμενες για την παρούσα μελέτη διαδικασίες, με επίπεδο δόσης τουλάχιστον 1 000 mg/kg βάρους σώματος/ημέρα ή, εφόσον πρόκειται για χορήγηση μέσω του σιτηρεσίου, με αντίστοιχη εκατοστιαία αναλογία στο σιτηρέσιο ή στο πόσιμο νερό (βάσει μετρήσεων του βάρους σώματος), δεν έχει ως αποτέλεσμα παρατηρήσιμες τοξικές επιδράσεις και εάν, βάσει των διαθέσιμων δεδομένων για χημικές ουσίες ανάλογης δομής, δεν αναμένεται τοξικότητα, είναι δυνατόν να μην απαιτείται διεξαγωγή πλήρους μελέτης με πολλά επίπεδα δόσεων. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οριακή δοκιμή, εκτός εάν, με βάση την έκθεση του ανθρώπου, διαφαίνεται η ανάγκη χρησιμοποίησης υψηλότερου επιπέδου δόσης. Σε περίπτωση χορήγησης από άλλη οδό, όπως εισπνοή ή εφαρμογή στο δέρμα, η μέγιστη εφικτή έκθεση μπορεί να εξαρτάται συχνά από τις φυσικές και χημικές ιδιότητες των υπό δοκιμή ουσιών. Χορήγηση των δόσεων 32. Η δόση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας χορηγείται στα ζώα καθημερινά επί 7 ημέρες την εβδομάδα. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται με καθετήρα, η χορήγηση πρέπει να γίνεται εφάπαξ με τη βοήθεια στομαχικού καθετήρα ή κατάλληλης διασωλήνωσης. Ο μέγιστος όγκος υγρού που μπορεί να χορηγηθεί εφάπαξ εξαρτάται από το μέγεθος του πειραματόζωου. Ο όγκος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 1 ml/100 g βάρους σώματος, εκτός της περίπτωσης υδατικών διαλυμάτων όπου μπορούν να χρησιμοποιούνται 2 ml/100 g βάρους σώματος. Εκτός από την περίπτωση των ερεθιστικώνή διαβρωτικών υπό δοκιμή χημικών ουσιών, οι οποίες σε υψηλότερες συγκεντρώσεις συνήθως προκαλούν εντονότερες επιδράσεις, η μεταβλητότητα των όγκων δοκιμής πρέπει να ελαχιστοποιείται με ρύθμιση της συγκέντρωσης, ώστε να εξασφαλίζεται σταθερός όγκος σε όλα τα επίπεδα δόσης. 33. Για τις υπό δοκιμή χημικές ουσίες που χορηγούνται με την τροφή ή το πόσιμο νερό, πρέπει να εξασφαλίζεται ότι οι χορηγούμενες ποσότητες υπό δοκιμή χημικής ουσίας δεν επηρεάζουν το κανονικό διατροφικό ισοζύγιο ή ισοζύγιο νερού. Όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται μέσω του σιτηρεσίου, μπορεί να χρησιμοποιείται είτε σταθερή συγκέντρωση στο σιτηρέσιο (ppm) είτε σταθερό επίπεδο δόσης, εκφρασμένο επί του βάρους σώματος του ζώου. Η χρησιμοποιούμενη εναλλακτική επιλογή πρέπει να διευκρινίζεται. Για υπό δοκιμή χημικές ουσίες που χορηγούνται με καθετήρα, η δόση θα πρέπει να χορηγείται την ίδια περίπου ώρα κάθε μέρα και να ρυθμίζεται τουλάχιστον κάθε εβδομάδα ώστε να διατηρείται σταθερό επίπεδο δόσης ως προς το βάρος του σώματος. Όταν η συνδυαστική μελέτη χρησιμοποιείται ως προκαταρκτικό στάδιο μακροχρόνιας μελέτης ή πλήρους μελέτης τοξικότητας στην αναπαραγωγή, θα πρέπει να χρησιμοποιείται παρόμοιο σιτηρέσιο και στις δύο μελέτες. Χρονοδιάγραμμα πειράματος 34. Η χορήγηση δόσεων και στα δύο φύλα θα πρέπει να ξεκινά δύο εβδομάδες πριν από το ζευγάρωμα, αφού έχουν εγκλιματιστεί για τουλάχιστον πέντε ημέρες και τα θηλυκά έχουν υποβληθεί σε διαδικασία διαλογής ως προς την κανονικότητα των κύκλων οίστρου (στη διάρκεια περιόδου δύο εβδομάδων πριν από την αγωγή). Η μελέτη θα πρέπει να προγραμματίζεται κατά τρόπον ώστε η αξιολόγηση των κύκλων οίστρου να ξεκινά σε σύντομο χρονικό διάστημα αφότου τα ζώα έχουν φθάσει σε πλήρη σεξουαλική ωρίμανση. Το εν λόγω διάστημα μπορεί να διαφέρει ελαφρώς για διαφορετικές φυλές επιμύων σε διαφορετικά εργαστήρια, π.χ. επίμυες Sprague Dawley ηλικίας 10 εβδομάδων, επίμυες Wistar ηλικίας περίπου 12 εβδομάδων. Οι μητέρες με απογόνους πρέπει να θανατώνονται τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό, ή σύντομα μετά από αυτό. Για να αφεθούν οι μητέρες σε ολονύκτια νηστεία πριν από την αιμοληψία (εφόσον προτιμηθεί αυτή η επιλογή), δεν χρειάζεται να θανατωθούν οι μητέρες και τα νεογνά την ίδια ημέρα. Η ημέρα γέννησης (όταν έχει ολοκληρωθεί ο τοκετός) ορίζεται ως η ημέρα 0 μετά τον τοκετό. Τα θηλυκά που δεν εμφανίζουν ενδείξεις συνουσίας θανατώνονται 24-26 ημέρες μετά την τελευταία ημέρα της περιόδου ζευγαρώματος. Η χορήγηση συνεχίζεται και στα δύο φύλα κατά τη διάρκεια της περιόδου ζευγαρώματος. Στα αρσενικά η χορήγηση θα πρέπει να συνεχίζεται και μετά την περίοδο ζευγαρώματος, τουλάχιστον έως ότου ολοκληρωθεί η ελάχιστη συνολική περίοδος χορήγησης των 28 ημερών. Στη συνέχεια θανατώνονται ή, εναλλακτικά, διατηρούνται και συνεχίζουν να λαμβάνουν δόσεις με σκοπό την πιθανή πραγματοποίηση δεύτερου ζευγαρώματος, εάν χρειαστεί. 35. Η καθημερινή χορήγηση στα γονικά θηλυκά θα πρέπει να συνεχίζεται καθ’ όλη τη διάρκεια της κύησης και τουλάχιστον μέχρι και τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό ή την ημέρα πριν τη θανάτωση. Για μελέτες όπου η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται μέσω εισπνοής ή διά του δέρματος, η χορήγηση θα πρέπει να συνεχίζεται τουλάχιστον μέχρι και τη 19η ημέρα της κύησης, και θα πρέπει να ξεκινά εκ νέου το συντομότερο δυνατό, το αργότερο μέχρι την 4η ημέρα μετά τη γέννηση (ΜΓΗ). 36. Τα ζώα που ανήκουν σε δορυφορική ομάδα για την οποία έχουν προγραμματιστεί επακόλουθες παρατηρήσεις, εφόσον προβλέπονται, δεν ζευγαρώνονται. Θα πρέπει να διατηρούνται για τουλάχιστον 14 ακόμη ημέρες μετά την πρώτη προγραμματισμένη θανάτωση των μητέρων, χωρίς αγωγή, προκειμένου να διαπιστωθεί τυχόν καθυστερημένη εκδήλωση, ή εμμονή, ή ανάρρωση από τοξικές επιδράσεις. 37. Στο παράρτημα 2 παρατίθεται διάγραμμα του χρονοδιαγράμματος διεξαγωγής των πειραμάτων. Οιστρικοί κύκλοι 38. Οι οιστρικοί κύκλοι θα πρέπει να παρακολουθούνται πριν από την έναρξη της αγωγής προκειμένου να επιλέγονται για τη δοκιμή θηλυκά με κανονική κυκλικότητα (βλ. παράγραφο 27). Επίσης, θα πρέπει να παρακολουθούνται καθημερινά κολπικά επιχρίσματα, από την έναρξη της περιόδου αγωγής μέχρις ότου διαπιστωθούν ενδείξεις ζευγαρώματος. Εάν υπάρχει ανησυχία για οξείες αγχογόνες επιδράσεις που μπορεί να μεταβάλλουν τους οιστρικούς κύκλους με την έναρξη της χορήγησης, τα εργαστήρια μπορούν να υποβάλλουν τα ζώα σε έκθεση 2 εβδομάδων και, στη συνέχεια, να συλλέγουν καθημερινά κολπικά επιχρίσματα προκειμένου να παρακολουθούν τον οιστρικό κύκλο για τουλάχιστον δύο εβδομάδες κατά την περίοδο πριν από το ζευγάρωμα, και να συνεχίζουν την παρακολούθηση καθ’ όλη τη διάρκεια της περιόδου ζευγαρώματος μέχρι να ανιχνευθούν ενδείξεις ζευγαρώματος. Κατά τη λήψη κολπικών/τραχηλικών κυττάρων, θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η διαταραχή των βλεννογόνων που μπορεί να επαγάγει ψευδοκύηση (8) (9). Διαδικασία ζευγαρώματος 39. Κανονικά, στην παρούσα μελέτη θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ζευγαρώματα 1:1 (ένα αρσενικό προς ένα θηλυκό). Μπορεί να υπάρξουν εξαιρέσεις, στην περίπτωση περιστασιακών θανάτων αρσενικών. Το θηλυκό θα πρέπει να τοποθετείται μαζί με το ίδιο αρσενικό μέχρις ότου παρατηρηθούν ενδείξεις συνουσίας ή μέχρι να παρέλθει διάστημα δύο εβδομάδων. Κάθε πρωί, τα θηλυκά πρέπει να εξετάζονται για την παρουσία σπέρματος ή κολπικού βύσματος. Ως ημέρα 0 της κύησης ορίζεται η ημέρα κατά την οποία επιβεβαιώνονται οι ενδείξεις ζευγαρώματος (ανιχνεύεται κολπικό βύσμα ή σπέρμα). Σε περίπτωση που το ζευγάρωμα αποδειχθεί ανεπιτυχές, πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο νέου ζευγαρώματος των θηλυκών με ελεγμένα αρσενικά της ίδιας ομάδας. Μέγεθος γέννας 40. Την 4η ημέρα μετά τη γέννηση, το μέγεθος κάθε γέννας μπορεί να ρυθμίζεται διά της απομάκρυνσης των πλεοναζόντων νεογνών με τυχαία επιλογή, ούτως ώστε να παραμένουν, όπου είναι εφικτό, τέσσερα ή πέντε νεογνά ανά φύλο ανά γέννα, ανάλογα με το σύνηθες μέγεθος γέννας στη φυλή των επιμύων που χρησιμοποιείται. Από δύο από τα πλεονάζοντα νεογνά θα πρέπει να συλλέγονται δείγματα αίματος, να συγκεντρώνονται και να χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των επιπέδων της T4 στον ορό. Δεν ενδείκνυται η επιλεκτική απομάκρυνση νεογνών, π.χ. βάσει του σωματικού βάρους ή της πρωκτογεννητικής απόστασης (AGD). Όταν ο αριθμός των αρσενικών ή θηλυκών νεογνών δεν φθάνει τα τέσσερα ή πέντε νεογνά ανά φύλο ανά γέννα, είναι αποδεκτή η μερική ρύθμιση (π.χ. έξι αρσενικά και τέσσερα θηλυκά). Δεν απομακρύνεται κανένα νεογνό όταν το μέγεθος της γέννας είναι χαμηλότερο του στόχου (8 ή 10 νεογνά/γέννα). Εάν υπάρχει ένα μόνο νεογνό πάνω από τον στόχο απομάκρυνσης, θα απομακρύνεται μόνο ένα νεογνό, το οποίο θα χρησιμοποιείται για συλλογή αίματος με σκοπό την πιθανή διενέργεια αξιολογήσεων της T4. 41. Εάν δεν ρυθμιστεί το μέγεθος της γέννας, την 4η ημέρα μετά τη γέννηση θανατώνονται δύο νεογνά ανά γέννα και λαμβάνονται δείγματα αίματος για μέτρηση των συγκεντρώσεων θυρεοειδικών ορμονών στον ορό. Ει δυνατόν, τα δύο νεογνά ανά γέννα θα πρέπει να είναι θηλυκά προκειμένου να διατηρηθούν τα αρσενικά νεογνά για αξιολογήσεις διατηρούμενων θηλών, εκτός εάν η απομάκρυνση των δύο νεογνών θα είχε ως αποτέλεσμα να μην υπάρχουν άλλα θηλυκά προς αξιολόγηση κατά τη λήξη της μελέτης. Δεν απομακρύνεται κανένα νεογνό εάν έτσι το μέγεθος της γέννας θα μειωνόταν κάτω από τα 8 έως 10 νεογνά/γέννα (ανάλογα με το κανονικό μέγεθος γέννας στη χρησιμοποιούμενη φυλή επιμύων). Εάν υπάρχει ένα μόνο νεογνό πάνω από το κανονικό μέγεθος γέννας, θα απομακρύνεται μόνο ένα νεογνό, το οποίο θα χρησιμοποιείται για συλλογή αίματος με σκοπό την πιθανή διενέργεια αξιολογήσεων της T4. Παρατηρήσεις 42. Θα πρέπει να διεξάγονται γενικές κλινικές παρατηρήσεις τουλάχιστον μια φορά ημερησίως, κατά προτίμηση την ίδια ώρα κάθε ημέρα και λαμβανομένου υπόψη του χρόνου κορύφωσης των αναμενόμενων επιδράσεων μετά τη χορήγηση της δόσης. Η κατάσταση της υγείας των ζώων θα πρέπει να καταγράφεται. Όλα τα ζώα εξετάζονται τουλάχιστον δύο φορές την ημέρα για τη διαπίστωση νοσηρότητας και θνησιμότητας. 43. Όλα τα γονικά ζώα πρέπει να υποβάλλονται σε λεπτομερή κλινική παρατήρηση μία φορά πριν από την πρώτη έκθεση (προκειμένου να γίνουν συγκρίσεις της κατάστασης κάθε ζώου) και στη συνέχεια τουλάχιστον μια φορά την εβδομάδα. Οι παρατηρήσεις αυτές πρέπει να διενεργούνται κατά προτίμηση την ίδια ώρα κάθε ημέρα, έξω από τους κλωβούς σε έναν τυποποιημένο χώρο. Οι παρατηρήσεις πρέπει να καταγράφονται επιμελώς, κατά προτίμηση με χρήση συστημάτων βαθμολόγησης, τα οποία προσδιορίζονται διεξοδικά από το εργαστήριο που διεξάγει τις δοκιμές. Καταβάλλεται προσπάθεια ώστε οι συνθήκες της δοκιμής να παρουσιάζουν τις ελάχιστες δυνατές διακυμάνσεις και οι παρατηρήσεις να διεξάγονται κατά προτίμηση από άτομα που δεν γνωρίζουν την αγωγή. Σημεία που θα πρέπει να καταγράφονται είναι, μεταξύ άλλων, μεταβολές στο δέρμα, το τρίχωμα, τους οφθαλμούς και τους βλεννογόνους, εκκρίσεις και απεκκρίσεις, καθώς και δραστηριότητα του αυτόνομου νευρικού συστήματος (π.χ. δακρύρροια, ανόρθωση τριχών, μεταβολή του μεγέθους της κόρης του οφθαλμού, ασυνήθης ρυθμός αναπνοής). Καταγράφονται επίσης μεταβολές στο βάδισμα, στη στάση και στην αντίδραση κατά τη μεταχείριση, καθώς και η εμφάνιση κλονικών ή τονικών κινήσεων, στερεότυπων κινήσεων (όπως υπερβολική περιποίηση του τριχώματος, συνεχές κυκλικό βάδισμα), δυσχερούς ή παρατεταμένου τοκετού ή περίεργης συμπεριφοράς (όπως αυτοτραυματισμός, βάδισμα προς τα πίσω) (10). 44. Μία φορά στη διάρκεια της μελέτης θα πρέπει να αξιολογείται η αισθητηριακή ανταπόκριση σε διαφορετικών ειδών ερεθίσματα (π.χ. ακουστικά, οπτικά και ιδιοδεκτικά ερεθίσματα) (8) (9) (11), η δύναμη λαβής (12) και η κινητικότητα (13) σε πέντε αρσενικά και πέντε θηλυκά που επιλέγονται τυχαία από κάθε ομάδα. Λεπτομερέστερη περιγραφή των διαδικασιών που μπορούν να ακολουθηθούν δίνονται στις αντίστοιχες βιβλιογραφικές παραπομπές. Εναλλακτικές διαδικασίες, διαφορετικές από τις περιγραφόμενες στις βιβλιογραφικές παραπομπές, μπορούν να χρησιμοποιηθούν επίσης. Στα αρσενικά, οι εν λόγω παρατηρήσεις των λειτουργιών θα πρέπει να γίνονται προς το τέλος της περιόδου χορήγησης των δόσεών τους, λίγο πριν την προγραμματισμένη θανάτωση αλλά πριν από τη δειγματοληψία αίματος για αιματολογικές εξετάσεις ή αναλύσεις κλινικής χημείας (βλ. παραγράφους 53-56, περιλαμβανομένης της υποσημείωσης 1). Στη διάρκεια αυτών των δοκιμών, τα θηλυκά θα πρέπει να βρίσκονται σε κατάσταση ανάλογη από άποψη φυσιολογίας και θα πρέπει, κατά προτίμηση, να υποβάλλονται σε δοκιμή τουλάχιστον εφάπαξ την τελευταία εβδομάδα της γαλουχίας (π.χ. LD 6-13), λίγο πριν από την προγραμματισμένη θανάτωση. Στον βαθμό που είναι εφικτό, θα πρέπει να ελαχιστοποιείται το χρονικό διάστημα χωρισμού των νεογνών από τις μητέρες. 45. Οι παρατηρήσεις των λειτουργιών που γίνονται εφάπαξ προς το τέλος της μελέτης μπορούν να παραλειφθούν όταν η μελέτη διεξάγεται ως προκαταρκτικό στάδιο επακόλουθης υποχρόνιας (90 ημερών) ή μακροχρόνιας μελέτης. Στην περίπτωση αυτή, οι παρατηρήσεις των λειτουργιών θα πρέπει να περιλαμβάνονται στην επακόλουθη αυτή μελέτη. Από την άλλη πλευρά όμως, η ύπαρξη δεδομένων για τις λειτουργίες από την παρούσα μελέτη επαναλαμβανόμενης δόσης είναι δυνατόν να διευκολύνει την επιλογή επίπεδων δόσεων για μια επακόλουθη υποχρόνια ή μακροχρόνια μελέτη. 46. Κατ’ εξαίρεση, οι παρατηρήσεις των λειτουργιών μπορούν επίσης να παραλείπονται όταν οι ομάδες εμφανίζουν εκδηλώσεις τοξικότητας σε βαθμό που παρεμποδίζει σημαντικά την εκτέλεση της δοκιμής λειτουργιών. 47. Η διάρκεια της κύησης πρέπει να καταγράφεται και υπολογίζεται από την ημέρα 0 της εγκυμοσύνης. Κάθε γέννα πρέπει να εξετάζεται το συντομότερο δυνατό μετά τον τοκετό για να προσδιορίζεται ο αριθμός και το φύλο των νεογνών, τα θνησιγενή νεογνά, τα ζώντα νεογνά, τα καχεκτικά νεογνά (νεογνά αρκετά μικρότερου μεγέθους από τα αντίστοιχα νεογνά μάρτυρες) και η παρουσία μακροσκοπικώς ορατών ανωμαλιών. 48. Τα ζώντα νεογνά πρέπει να καταμετρώνται και να προσδιορίζεται το φύλο τους, ενώ οι ομάδες των νεογνών που γεννήθηκαν από την ίδια μητέρα πρέπει να ζυγίζονται εντός 24 ωρών από τον τοκετό (ημέρα 0 ή 1 μετά τον τοκετό) και τουλάχιστον την 4η και τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό. Πέραν των παρατηρήσεων επί των γονικών ζώων (βλ. παραγράφους 43 και 44), θα πρέπει να καταγράφεται τυχόν μη φυσιολογική συμπεριφορά των απογόνων. 49. Η πρωκτογεννητική απόσταση κάθε νεογνού θα πρέπει να μετράται την ίδια ημέρα μεταγεννητικά, μεταξύ της μεταγεννητικής ημέρας (ΜΓΗ) 0 και 4. Θα πρέπει να προσδιορίζεται το σωματικό βάρος του νεογνού την ημέρα μέτρησης της πρωκτογεννητικής απόστασης, η οποία θα πρέπει να κανονικοποιείται σε ένα μέτρο του μεγέθους του νεογνού, κατά προτίμηση στην κυβική ρίζα του σωματικού βάρους (14). Θα πρέπει να καταμετράται ο αριθμός των θηλών/άλων στα αρσενικά νεογνά τη 12η ή 13η ΜΓΗ, όπως συνιστάται στο έγγραφο καθοδήγησης αριθ. 151 του ΟΟΣΑ (15). Σωματικό βάρος και κατανάλωση τροφής/νερού 50. Τα αρσενικά και τα θηλυκά θα πρέπει να ζυγίζονται κατά την πρώτη ημέρα της χορήγησης και, στη συνέχεια, τουλάχιστον μία φορά την εβδομάδα, καθώς και κατά τη λήξη της μελέτης. Στη διάρκεια της κύησης, τα θηλυκά πρέπει να ζυγίζονται τις ημέρες 0, 7, 14 και 20, και εντός 24 ωρών από τον τοκετό (ημέρα 0 ή 1η ημέρα μετά τον τοκετό) και τουλάχιστον την 4η και 13η ημέρα μετά τον τοκετό. Οι παρατηρήσεις αυτές θα πρέπει να αναφέρονται ξεχωριστά για κάθε ενήλικο ζώο. 51. Στη διάρκεια της περιόδου πριν από το ζευγάρωμα, της εγκυμοσύνης και της γαλουχίας, η κατανάλωση τροφής πρέπει να μετράται τουλάχιστον μια φορά την εβδομάδα. Η μέτρηση της κατανάλωσης τροφής κατά το ζευγάρωμα είναι προαιρετική. Η κατανάλωση νερού στη διάρκεια των εν λόγω περιόδων θα πρέπει επίσης να μετράται, όταν η υπό δοκιμή χημική ουσία χορηγείται μέσω του νερού. Αιματολογικές εξετάσεις 52. Μια φορά στη διάρκεια της μελέτης, θα πρέπει να πραγματοποιούνται οι ακόλουθες αιματολογικές εξετάσεις σε πέντε αρσενικά και πέντε θηλυκά που επιλέγονται τυχαία από κάθε ομάδα: προσδιορισμός αιματοκρίτη, συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης, αριθμού ερυθρών αιμοσφαιρίων, δικτυοερυθροκυττάρων, αριθμού λευκών αιμοσφαιρίων και λευκοκυτταρικού τύπου, αριθμού αιμοπεταλίων, χρόνου πήξεως και πηκτικότητας του αίματος. Εάν υπάρχουν υπόνοιες ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία ή οι θεωρητικοί μεταβολίτες της έχουν οξειδωτικές ιδιότητες, θα πρέπει να προσδιορίζονται επίσης, μεταξύ άλλων, η συγκέντρωση μεθαιμοσφαιρίνης και τα σωμάτια Heinz. 53. Τα δείγματα αίματος θα πρέπει να λαμβάνονται από καθορισμένο σημείο. Κατά τη δειγματοληψία, τα θηλυκά θα πρέπει να βρίσκονται σε ανάλογη από φυσιολογικής απόψεως κατάσταση. Για την αποφυγή των πρακτικών δυσκολιών που συνδέονται με τη μεταβλητότητα της χρονικής στιγμής έναρξης της κύησης, η αιμοληψία από τα θηλυκά μπορεί να πραγματοποιείται στο τέλος της περιόδου πριν από το ζευγάρωμα ως εναλλακτική λύση αντί της αιμοληψίας αμέσως πριν ή κατά την ευθανασία των ζώων. Τα δείγματα αίματος των αρσενικών θα πρέπει, κατά προτίμηση, να λαμβάνονται αμέσως πριν ή κατά την ευθανασία των ζώων. Εναλλακτικά, η αιμοληψία στα αρσενικά μπορεί να πραγματοποιείται στο τέλος της περιόδου πριν από το ζευγάρωμα, όταν έχει επιλεγεί το συγκεκριμένο χρονικό σημείο για τα θηλυκά. 54. Τα δείγματα αίματος θα πρέπει να αποθηκεύονται υπό κατάλληλες συνθήκες. Εξετάσεις κλινικής βιοχημείας 55. Θα πρέπει να διενεργούνται εξετάσεις κλινικής βιοχημείας για τη διερεύνηση σοβαρών τοξικών επιδράσεων στους ιστούς και, ειδικότερα, επιδράσεων στους νεφρούς και το ήπαρ, σε δείγματα αίματος που λαμβάνονται από τα επιλεγμένα πέντε αρσενικά και πέντε θηλυκά κάθε ομάδας. Συνιστάται να παραμένουν νηστικά τα ζώα τη νύχτα που προηγείται της αιμοληψίας ( 22 ) . Οι εξετάσεις στο πλάσμα ή στον ορό του αίματος θα πρέπει να περιλαμβάνουν προσδιορισμό νατρίου, καλίου, γλυκόζης, ολικής χοληστερόλης, ουρίας, κρεατινίνης, ολικής πρωτεΐνης και αλβουμίνης, δύο τουλάχιστον ενζύμων ενδεικτικών ηπατοκυτταρικής επίδρασης (όπως της αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης, της αμινοτρασφεράσης του ασπαρτικού και της αφυδρογονάσης της σορβιτόλης) και των χολικών οξέων. Η μέτρηση και άλλων ενζύμων (ηπατικής ή άλλης προέλευσης) και της χολερυθρίνης είναι δυνατόν να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες σε ορισμένες περιπτώσεις. 56. Λαμβάνονται δείγματα αίματος από καθορισμένο σημείο με βάση το ακόλουθο χρονοδιάγραμμα: — από τουλάχιστον δύο νεογνά ανά γέννα την 4η ημέρα μετά τη γέννηση, εάν το επιτρέπει ο αριθμός των νεογνών (βλ. παραγράφους 40-41) — από όλες τις μητέρες και από τουλάχιστον δύο νεογνά ανά γέννα κατά τη λήξη της μελέτης τη 13η ημέρα, και — από όλα τα ενήλικα αρσενικά κατά τη λήξη της μελέτης. Όλα τα δείγματα αίματος αποθηκεύονται υπό κατάλληλες συνθήκες. Δείγματα αίματος νεογνών 13ης ΜΓΗ και των ενήλικων αρσενικών αξιολογούνται ως προς τα επίπεδα θυρεοειδικών ορμονών (T4). Ανάλογα με την περίπτωση, διενεργείται περαιτέρω αξιολόγηση της T4 σε δείγματα αίματος από τις μητέρες και νεογνά 4ης ΜΓΗ. Ανάλογα με την περίπτωση, μπορούν να μετρηθούν προαιρετικά και άλλες ορμόνες. Το αίμα νεογνών μπορεί να συγκεντρώνεται ανά γέννα για τη διενέργεια αναλύσεων θυρεοειδικών ορμονών. Οι θυρεοειδικές ορμόνες (T4 και TSH) θα πρέπει, κατά προτίμηση να μετρώνται ως «σύνολο». 57. Προαιρετικά, κατά την τελευταία εβδομάδα της μελέτης μπορούν να διεξαχθούν οι ακόλουθες αναλύσεις ούρων σε πέντε τυχαία επιλεγμένα αρσενικά κάθε ομάδας χρησιμοποιώντας ούρα συλλεχθέντα σε καθορισμένο χρόνο: προσδιορισμός όψης, όγκου, ωσμωτικότητας ή ειδικού βάρους, pH, πρωτεϊνών, γλυκόζης και αίματος/αιμοκυττάρων. 58. Επιπλέον, εξετάζεται κατά πόσο είναι σκόπιμο να μελετηθούν δείκτες του ορού για τυχόν γενικές ιστικές βλάβες. Άλλοι προσδιορισμοί που απαιτούνται όταν οι γνωστές ιδιότητες της υπό δοκιμή χημικής ουσίας ενδέχεται ή αναμένεται να επηρεάσουν τα σχετικά μεταβολικά χαρακτηριστικά αφορούν το ασβέστιο, τα φωσφορικά, τα τριγλυκερίδια και τη γλυκόζη μετά από νηστεία, ειδικές ορμόνες, τη μεθαιμοσφαιρίνη και τη χολινεστεράση. Τα εν λόγω χαρακτηριστικά πρέπει να προσδιορίζονται κατά περίπτωση. 59. Οι ακόλουθοι παράγοντες ενδέχεται να επηρεάζουν τη μεταβλητότητα και τις απόλυτες τιμές συγκέντρωσης των προσδιοριζόμενων ορμονών: — ο χρόνος θανάτωσης, λόγω της ημερήσιας διακύμανσης των συγκεντρώσεων ορμονών, — η μέθοδος θανάτωσης, και ως εκ τούτου πρέπει να αποφεύγεται η περιττή καταπόνηση των ζώων, που μπορεί να επηρεάσει τις συγκεντρώσεις των ορμονών, — οι σειρές αντιδραστηρίων (κιτ) ορμονικού προσδιορισμού που ενδέχεται να διαφέρουν ως προς τις πρότυπες καμπύλες τους. 60. Τα δείγματα πλάσματος που προορίζονται ειδικά για ορμονικό προσδιορισμό θα πρέπει να λαμβάνονται σε παραπλήσια ώρα της ημέρας. Οι αριθμητικές τιμές που προκύπτουν από ανάλυση των συγκεντρώσεων ορμονών διαφέρουν ανάλογα με τα διάφορα κιτ δοκιμασιών που είναι διαθέσιμα στο εμπόριο. 61. Εάν τα ιστορικά δεδομένα αναφοράς είναι ανεπαρκή, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο προσδιορισμού των μεταβλητών αιματολογίας και κλινικής βιοχημείας πριν από την έναρξη της χορήγησης των δόσεων ή, κατά προτίμηση, σε μια ομάδα ζώων που δεν περιλαμβάνεται στις πειραματικές ομάδες. Για τα θηλυκά, τα δεδομένα πρέπει να αφορούν γαλουχούντα ζώα. ΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΙΑ Νεκροψία-νεκροτομή 62. Όλα τα ενήλικα ζώα της μελέτης πρέπει να υποβάλλονται σε πλήρη, λεπτομερή νεκροψία-νεκροτομή η οποία περιλαμβάνει προσεκτική εξέταση της εξωτερικής επιφάνειας του σώματος, όλων των στομίων, της κρανιακής, θωρακικής και περιτοναϊκής κοιλότητας και του περιεχομένου τους. Ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δίδεται στα όργανα του αναπαραγωγικού συστήματος. Ο αριθμός των σημείων εμφύτευσης θα πρέπει να καταγράφεται. Θα πρέπει να εξετάζονται κολπικά επιχρίσματα την ημέρα της νεκροψίας για να προσδιοριστεί το στάδιο του οιστρικού κύκλου και να καταστεί εφικτή η συσχέτιση με την ιστοπαθολογία των αναπαραγωγικών οργάνων των θηλυκών. 63. Οι όρχεις και επιδιδυμίδες, ο προστάτης και οι σπερματοδόχοι κύστεις με τους πηκτοειδείς αδένες στο σύνολό τους, όλων των αρσενικών ενήλικων ζώων θα πρέπει να απαλλάσσονται από τυχόν προσφυόμενους ιστούς, ανάλογα με την περίπτωση, και να ζυγίζονται νωπά όσο το δυνατόν συντομότερα μετά την ανατομή ώστε να αποφεύγεται η ξήρανσή τους. Επιπλέον, μπορούν να μετρώνται προαιρετικά τα βάρη οργάνων όπως το σύμπλεγμα ανελκτήρων του πρωκτού και βολβοσηραγγωδών μυών, οι βολβοουρηθραίοι αδένες (αδένες του Cowper) και η βάλανος του πέους στα αρσενικά και ωοθήκες σε ζεύγη (βάρος σε νωπή κατάσταση) και η μήτρα (περιλαμβανομένου του τραχήλου) στα θηλυκά· σε περίπτωση που περιλαμβάνονται, τα εν λόγω βάρη θα πρέπει να μετρώνται το συντομότερο δυνατό μετά την ανατομή. Οι ωοθήκες, οι όρχεις, οι επιδιδυμίδες, άλλα όργανα του αναπαραγωγικού συστήματος, και όλα τα όργανα που εμφανίζουν μακροσκοπικές αλλοιώσεις, από όλα τα ενήλικα ζώα, θα πρέπει να διατηρούνται. 64. Οι θυρεοειδείς αδένες από όλα τα ενήλικα αρσενικά και θηλυκά και από ένα αρσενικό και θηλυκό νεογνό 13ης ΜΓΗ από κάθε γέννα θα πρέπει να διατηρούνται σε μέσο μονιμοποίησης κατάλληλο για το είδος ιστοπαθολογικής εξέτασης στο οποίο ενδεχομένως να υποβληθούν στο μέλλον. Μετά τη μονιμοποίηση μπορεί να προσδιορίζεται το βάρος του θυρεοειδούς. Ο καθαρισμός θα πρέπει και στην περίπτωση αυτή να πραγματοποιείται με μεγάλη προσοχή και μόνο μετά τη μονιμοποίηση, ώστε να μην προκαλείται βλάβη στους ιστούς. Οι βλάβες των ιστών μπορούν να βλάψουν την εγκυρότητα της ιστοπαθολογικής ανάλυσης. Τα δείγματα αίματος πρέπει να λαμβάνονται από καθορισμένο σημείο ακριβώς πριν από τη θανάτωση των ζώων ή κατά τη διάρκειά της και να διατηρούνται υπό κατάλληλες συνθήκες (βλ. παράγραφο 56). 65. Επιπλέον, για τουλάχιστον πέντε ενήλικα αρσενικά και θηλυκά, τυχαία επιλεγμένα από κάθε ομάδα (εκτός όσων είναι ετοιμοθάνατα και/ή θανατώνονται με ευθανασία πριν από τη λήξη της μελέτης), το ήπαρ, οι νεφροί, τα επινεφρίδια, ο θύμος αδένας, ο σπλήνας, ο εγκέφαλος και η καρδιά θα πρέπει να απαλλάσσονται από τυχόν προσφυόμενους ιστούς, ανάλογα με την περίπτωση, και να ζυγίζονται νωπά όσο το δυνατόν συντομότερα μετά την ανατομή ώστε να αποφευχθεί η ξήρανσή τους. Οι ακόλουθοι ιστοί θα πρέπει να διατηρούνται σε μονιμοποιητικό μέσο κατάλληλο και για τον τύπο ιστού και για το είδος ιστοπαθολογικής εξέτασης στο οποίο προβλέπεται να υποβληθούν: κάθε ιστός που εμφανίζει μακροσκοπικές αλλοιώσεις, εγκέφαλος (αντιπροσωπευτικές περιοχές του κυρίου τμήματος, της παρεγκεφαλίδας και της γέφυρας), νωτιαίος μυελός, οφθαλμοί, στόμαχος, λεπτό και παχύ έντερο (συμπεριλαμβανομένων παϋέριων πλακών), ήπαρ, νεφροί,επινεφρίδια, σπλήνας, καρδιά, θύμος αδένας, τραχεία και πνεύμονες (διατηρημένοι με εμφύσηση μονιμοποιητικού υλικού, ακολουθούμενη από εμβάπτιση), γεννητικοί αδένες (όρχεις και ωοθήκες), άλλα όργανα του γεννητικού συστήματος (μήτρα και τράχηλος της μήτρας, επιδιδυμίδες, προστάτης και σπερματοδόχοι κύστεις με τους πηκτοειδείς αδένες), κολπική κοιλότητα, ουροδόχος κύστη, λεμφαδένες [πέραν του εγγύτερου παροχετεύοντα αδένα, θα πρέπει να λαμβάνεται και άλλος ένας λεμφαδένας ανάλογα με την πείρα του εργαστηρίου (16)], περιφερειακό νεύρο (ισχιακό ή κνημιαίο) κατά προτίμηση από θέση πολύ κοντά στον μυ, σκελετικός μυς και οστό με μυελό των οστών (τομή ή, εναλλακτικά, πρόσφατο παρασκεύασμα αναρροφηθέντος μυελού). Συνιστάται να μονιμοποιούνται οι όρχεις με εμβάπτιση σε μονιμοποιητικό υλικό Bouin ή τροποποιημένο μονιμοποιητικό υλικό Davidson (16) (17) (18)· για τους συγκεκριμένους ιστούς δεν συνιστάται μονιμοποίηση σε φορμόλη. Ο ινώδης χιτώνας (tunica albuginea) μπορεί να διατρυπάται με βελόνα, με ήπιες κινήσεις, σε μικρό βάθος και στα δύο άκρα ώστε να διευκολύνεται η διείσδυση του μονιμοποιητικού υλικού. Κλινικά και άλλα ευρήματα ενδεχομένως υποδεικνύουν ότι θα πρέπει να εξεταστούν και άλλοι πρόσθετοι ιστοί. Κάθε όργανο που, λόγω των γνωστών ιδιοτήτων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, θεωρείται πιθανό να αποτελεί όργανο-στόχο, πρέπει επίσης να διατηρείται. 66. Από τους ακόλουθους ιστούς είναι δυνατόν να ληφθούν πολύτιμες ενδείξεις για ενδοκρινικές επιδράσεις: γεννητικοί αδένες (όρχεις και ωοθήκες), άλλα όργανα του γεννητικού συστήματος (μήτρα και τράχηλος της μήτρας, επιδιδυμίδες, σπερματοδόχοι κύστεις με τους πηκτοειδείς αδένες, ραχιαιοπλάγιος και κοιλιακός λοβός προστάτη), κολπική κοιλότητα, υπόφυση, αρσενικός μαστικός αδένας και επινεφρίδιος αδένας. Δεν έχουν τεκμηριωθεί επαρκώς οι μεταβολές στους αρσενικούς μαστικούς αδένες, αλλά η παράμετρος αυτή ενδέχεται να είναι πολύ ευαίσθητη σε ουσίες με οιστρογόνο δράση. Η παρατήρηση οργάνων/ιστών που δεν απαριθμούνται στην παράγραφο 65 είναι προαιρετική. 67. Τα νεκρά νεογνά και τα νεογνά που θανατώνονται τη 13η ημέρα μετά τον τοκετό, ή σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά από αυτήν, θα πρέπει, τουλάχιστον, να εξετάζονται προσεκτικά εξωτερικά για μακροσκοπικές ανωμαλίες. Ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δίνεται στα εξωτερικά όργανα του αναπαραγωγικού συστήματος, τα οποία θα πρέπει να εξετάζονται για τυχόν ύπαρξη σημείων ανώμαλης ανάπτυξης. Ιστοπαθολογία 68. Θα πρέπει να διεξάγονται πλήρεις ιστοπαθολογικές εξετάσεις στα διατηρημένα όργανα και ιστούς των επιλεγμένων ζώων στις ομάδες μαρτύρων και υψηλής δόσης (με ιδιαίτερη έμφαση στα στάδια της σπερματογένεσης στους γεννητικούς αδένες των αρσενικών και στην ιστοπαθολογία της δομής των διάμεσων κυττάρων των όρχεων). Εφόσον απαιτείται, μπορεί να εξετάζεται και ο θυρεοειδής αδένας νεογνών και των υπόλοιπων ενήλικων ζώων. Οι εξετάσεις θα πρέπει να γίνονται και στα ζώα των ομάδων άλλων δόσεων εάν στην ομάδα υψηλής δόσης παρατηρηθούν μεταβολές σχετιζόμενες με την αγωγή. Το έγγραφο καθοδήγησης σχετικά με την ιστοπαθολογία (10) παρέχει επιπρόσθετες πληροφορίες για την ανατομή, τη μονιμοποίηση, την τομή και την ιστολογική ανάλυση των ενδοκρινικών ιστών. 69. Θα πρέπει να εξετάζονται όλες οι μακροσκοπικές βλάβες. Για λόγους συμβολής στην αποσαφήνιση των NOAEL, θα πρέπει να εξετάζονται όργανα-στόχοι σε άλλες ομάδες δόσης, ιδίως σε ομάδες που θεωρείται ότι παρουσιάζουν NOAEL. 70. Όταν χρησιμοποιείται δορυφορική ομάδα, εκτελείται ιστοπαθολογική εξέταση στους ιστούς και στα όργανα τα οποία έχει διαπιστωθεί ότι εμφανίζουν επιδράσεις στις ομάδες που υποβάλλονται σε αγωγή. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Δεδομένα 71. Πρέπει να παρέχονται δεδομένα για κάθε ζώο ξεχωριστά. Επιπλέον, όλα τα δεδομένα θα συνοψίζονται σε μορφή πινάκων, όπου θα δίνεται για κάθε ομάδα δοκιμής ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμής, ο αριθμός των ζώων που βρέθηκαν νεκρά κατά τη διάρκεια της δοκιμής ή θανατώθηκαν με ευθανασία, η χρονική στιγμή κάθε θανάτου ή θανάτωσης, ο αριθμός των γόνιμων ζώων, ο αριθμός των έγκυων θηλυκών, ο αριθμός των ζώων που εμφάνισαν σημεία τοξικότητας, μια περιγραφή των παρατηρηθέντων σημείων τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένης της χρονικής στιγμής εμφάνισης, της διάρκειας και της σοβαρότητας κάθε τοξικής δράσης, οι τύποι των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων και κάθε σχετικό στοιχείο για τις γέννες. Στο προσάρτημα 3 παρέχεται ένας μορφότυπος συνοπτικής αναφοράς σε μορφή πίνακα που έχει αποδεχθεί ιδιαίτερα χρήσιμος για την αξιολόγηση των επιδράσεων στην αναπαραγωγή/ανάπτυξη. 72. Όταν είναι δυνατόν, τα αριθμητικά αποτελέσματα αξιολογούνται με τη βοήθεια κατάλληλης στατιστικής μεθόδου γενικής αποδοχής. Με τη σύγκριση των επιδράσεων σε ένα εύρος δόσεων αποφεύγεται η χρήση πολλών ελέγχων t. Οι στατιστικές μέθοδοι πρέπει να επιλέγονται κατά τον σχεδιασμό της μελέτης. Η στατιστική ανάλυση πρωκτογεννητικής απόστασης και διατηρούμενων θηλών θα πρέπει να βασίζεται σε ατομικά στοιχεία για κάθε νεογνό, και θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι επιδράσεις στη γέννα. Όπου αρμόζει, μονάδα της ανάλυσης θα πρέπει να είναι η γέννα από την ίδια μητέρα. Η στατιστική ανάλυση σωματικού βάρους των νεογνών θα πρέπει να βασίζεται σε ατομικά στοιχεία για κάθε νεογνό, και θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη το πλήθος νεογνών της γέννας. Λόγω του περιορισμένου μεγέθους της μελέτης, οι στατιστικές αναλύσεις υπό μορφή ελέγχων σημαντικότητας είναι περιορισμένης αξίας για πολλές παραμέτρους, ιδίως τις παραμέτρους σχετικά με την αναπαραγωγή. Ορισμένες από τις πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενες μεθόδους, ιδίως παραμετρικοί έλεγχοι για μέτρα κεντρικής τάσης, είναι ακατάλληλες. Σε περίπτωση χρήσης στατιστικών αναλύσεων, η επιλεγόμενη μέθοδος θα πρέπει να είναι κατάλληλη για την κατανομή της υπό εξέταση μεταβλητής, και να επιλέγεται πριν από την έναρξη της μελέτης. Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων 73. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης τοξικότητας θα πρέπει να αξιολογούνται ως προς τις παρατηρούμενες επιδράσεις, τα ευρήματα της νεκροψίας-νεκροτομής και τα μικροσκοπικά ευρήματα. Στην αξιολόγηση περιλαμβάνεται η σχέση μεταξύ της δόσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και της παρουσίας ή απουσίας, της συχνότητας εμφάνισης και της σοβαρότητας των ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων των μακροσκοπικών αλλοιώσεων, των ταυτοποιημένων οργάνων στόχων, της στειρότητας, των κλινικών ανωμαλιών, των επιδράσεων στις επιδόσεις στην αναπαραγωγή και στις γέννες, των μεταβολών στα σωματικά βάρη, των επιδράσεων στη θνησιμότητα και κάθε άλλου τοξικού φαινομένου. 74. Λόγω της σύντομης περιόδου αγωγής των αρσενικών, κατά την αξιολόγηση των επιδράσεων στην αναπαραγωγή των αρσενικών, μαζί με τα δεδομένα για τη γονιμότητα θα πρέπει να εξετάζεται και η ιστοπαθολογία των όρχεων και των επιδιδυμίδων. Επικουρικά, χρήσιμη στην ερμηνεία της μελέτης μπορεί να είναι και η χρήση ιστορικών δεδομένων μαρτύρων (π.χ. σχετικά με το μέγεθος της γέννας, την πρωκτογεννητική απόσταση, τις διατηρούμενες θηλές, τα επίπεδα T4 στον ορό), εάν υπάρχουν. 75. Για τον ποιοτικό έλεγχο προτείνεται η συλλογή ιστορικών δεδομένων ως μάρτυρα και ο υπολογισμός συντελεστών μεταβλητότητας για τα αριθμητικά δεδομένα, ιδίως όσον αφορά τις παραμέτρους που συνδέονται με την ανίχνευση ενδοκρινικών διαταρακτών. Τα δεδομένα αυτά μπορούν να χρησιμοποιούνται για συγκρίσεις κατά την αξιολόγηση πραγματικών μελετών. Έκθεση δοκιμής 76. Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία: Υπό δοκιμή χημική ουσία: — πηγή, αριθμός παρτίδας, καταληκτική ημερομηνία χρήσης, αν υπάρχει, — σταθερότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, εάν είναι γνωστή, Μονοσυστατική ουσία: — φυσική εμφάνιση, υδατοδιαλυτότητα και πρόσθετες σχετικές φυσικοχημικές ιδιότητες, — ταυτοποίηση της χημικής ουσίας, όπως ονομασία IUPAC ή CAS, αριθμός CAS, κωδικός SMILES ή InChI, συντακτικός τύπος, καθαρότητα, χημική ταυτότητα προσμίξεων, κατά περίπτωση και στο μέτρο του δυνατού, κ.λπ., Πολυσυστατική ουσία, UVCB και μείγματα: — περιγράφονται, στο μέτρο του δυνατού, με τη χημική ταυτότητα των συστατικών (βλ. ανωτέρω), την ποσότητα στην οποία απαντούν και τις σχετικές φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Φορέας (εάν χρησιμοποιείται): — αιτιολόγηση της επιλογής του φορέα, εάν δεν είναι το νερό. Πειραματόζωα: — είδος/φυλή χρησιμοποιηθέντων ζώων, — αριθμός, ηλικία και φύλο των ζώων, — προέλευση των ζώων, συνθήκες στέγασης, σιτηρέσιο κ.λπ., — βάρος κάθε ζώου κατά την έναρξη της δοκιμής, — αιτιολόγηση της επιλογής άλλου είδους εκτός από τον επίμυ. Συνθήκες δοκιμής: — αιτιολόγηση της επιλογής των επιπέδων δόσης, — λεπτομέρειες σχετικά με το παρασκεύασμα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας/τροφής και τις επιτευχθείσες συγκεντρώσεις, σταθερότητα και ομοιογένεια του παρασκευάσματος, — λεπτομέρειες σχετικά με τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, — κατά περίπτωση, μετατροπή της συγκέντρωσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο σιτηρέσιο ή το πόσιμο νερό (ppm) σε πραγματική δόση (mg/kg βάρους σώματος/ημέρα), — λεπτομέρειες σχετικά με την ποιότητα της τροφής και του νερού, — αναλυτική περιγραφή της διαδικασίας τυχαιοποίησης για την επιλογή των νεογνών προς απομάκρυνση, εφόσον απαιτείται. Αποτελέσματα: — βάρος του σώματος/μεταβολές βάρους σώματος, — κατά περίπτωση, κατανάλωση τροφής και νερού, — δεδομένα τοξικής αντίδρασης ανά φύλο και δόση, περιλαμβανομένης της γονιμότητας, της κύησης, καθώς και όποιων άλλων σημείων τοξικότητας, — διάρκεια κύησης, — τοξικές ή άλλες επιδράσεις στην αναπαραγωγή, στους απογόνους, στη μεταγεννητική ανάπτυξη κ.λπ., — φύση, σοβαρότητα και διάρκεια των κλινικών παρατηρήσεων (αναστρέψιμων και μη), — αξιολόγηση των αισθητήριων λειτουργιών, της δύναμης της λαβής και της κινητικότητας, — αιματολογικές εξετάσεις με τις αντίστοιχες τιμές αναφοράς, — εξετάσεις κλινικής βιοχημείας με τις αντίστοιχες τιμές αναφοράς, — αριθμός ενήλικων θηλυκών με κανονικό ή μη κανονικό οιστρικό κύκλο και διάρκεια του κύκλου, — αριθμός ζώντων νεογνών και απώλειες μετά την εμφύτευση, — αριθμός νεογνών με μακροσκοπικά ορατές ανωμαλίες, μακροσκοπική εξέταση των εξωτερικών γεννητικών οργάνων, αριθμός καχεκτικών νεογνών, — χρόνος θανάτου κατά τη διάρκεια της μελέτης ή επιβίωση έως τη λήξη της, — αριθμός εμφυτευμένων νεογνών, μέγεθος γέννας και βάρη νεογνών γέννας κατά τη χρονική στιγμή της καταγραφής, — δεδομένα για το βάρος του σώματος των νεογνών, — πρωκτογεννητική απόσταση για όλα τα νεογνά (και βάρος σώματος την ημέρα της μέτρησης της πρωκτογεννητικής απόστασης) — διατηρούμενες θηλές σε αρσενικά νεογνά, — επίπεδα θυρεοειδικών ορμονών, σε νεογνά 13ης ΜΓΗ και σε ενήλικα αρσενικά (και σε μητέρες και νεογνά 4ης ΜΓΗ, εφόσον μετρώνται), — βάρος σώματος κατά τη θανάτωση και δεδομένα βάρους οργάνων για τα γονικά ζώα, — ευρήματα νεκροψίας-νεκροτομής, — λεπτομερής περιγραφή των ιστοπαθολογικών ευρημάτων, — δεδομένα για την απορρόφηση (εάν υπάρχουν διαθέσιμα), — στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, κατά περίπτωση. Εξέταση των αποτελεσμάτων Συμπεράσματα Ερμηνεία των απ