ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΟΚ) αριθ. 2188/81 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 28ης Ιουλίου 1981 περί τροποποιήσεως του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 625/78 "περί των λεπτομερειών εφαρμογής της κρατικής αποθεματοποιήσεως του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη"

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος,

τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 804/68 του Συμβουλίου της 27ης Ιουνίου 1968 περί κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων(1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την πράξη προσχωρήσεως της Ελλάδος, και ιδίως το άρθρο 7 παράγραφος 5,

Εκτιμώντας:

ότι στο παράρτημα I του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 625/78 της Επιτροπής(2), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 2937/80(3), όπου καθορίζονται οι όροι ποιότητας στους οποίους πρέπει να ανταποκρίνεται το αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη προκειμένου να προσφερθεί στην παρέμβαση, αναγράφονται ορισμένες προδιαγραφές σχετικά με τις μεθόδους αναλύσεως για την ανίχνευση του ορρού γάλακτος με ποσοτικό προσδιορισμό ορισμένων συστατικών του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη- ότι στην παραπομπή(2) του προαναφερθέντος παραρτήματος προβλέπεται να γίνει καθορισμός κοινοτικών οριακών τιμών για τα εν λόγω συστατικά, μετά τη διεξαγωγή πειραμάτων για ορισμένη περίοδο στα Κράτη μέλη-

ότι είναι δυνατόν να καθιερωθεί τώρα σε κοινοτικό επίπεδο μια μέθοδος αναλύσεως για τον προσδιορισμό, στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη, του ορρού γάλακτος που λαμβάνεται με την επίδραση πυτίας, με ποσοτικό προσδιορισμό του ελεύθερου σιαλικού οξέος- ότι εν τούτοις η μέθοδος αυτή δεν πρέπει να καταστεί υποχρεωτική πριν παρέλθει μια ορισμένη περίοδος, αναγκαία για την εξοικείωση των οργανισμών ελέγχου καθώς και των ατόμων που θα εκτελέσουν τον έλεγχο με την αναλυτική αυτή μέθοδο-

ότι τα μέτρα που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Επιτροπής Διαχειρίσεως Γάλακτος και Γαλακτοκομικών Προϊόντων,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:

Άρθρο 1

1. Το παράρτημα I του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 625/78 τροποποιείται ως εξής:

α) στο σημείο 2 υπό β, το κείμενο της δεύτερης περιπτώσεως αντικαθίσταται από το ακόλουθο κείμενο:

"- του ορρού γάλακτος:

ποσοτικός προσδιορισμός του ελεύθερου σιαλικού οξέος(2) και/ή του συμπλέγματος κυστεΐνη-κυστίνη, εφ' όσον μία τουλάχιστον από τις τρεις υποχρεωτικές δοκιμασίες, δηλαδή των γλυκομακροπεπτιδίων του ορρού του γάλακτος (προσδιοριζόμενα με μια απλοποιημένη δοκιμασία), των αλάτων του γαλακτικού οξέος ή της τέφρας, δίδει τιμή ανώτερη απο 3 %, 150 mg/100 g και 8 % αντιστοίχως-"-

β) το κείμενο της παραπομπής(2) αντικαθίσταται από το ακόλουθο κείμενο:

"(2) Όσον αφορά την με ποσοτικό προσδιορισμό του ελεύθερου σιαλικού οξέος ανίχνευση του ορρού γάλατος που λαμβάνεται με την επίδραση πυτίας, η μέθοδος αναλύσεως που θα εφαρμόζεται από την 1η Ιανουαρίου 1982 είναι αυτή που περιγράφεται στο παράρτημα IV του παρόντος κανονισμού.".

2. Το παράρτημα του παρόντος κανονισμού προστίθεται στον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 625/78 ως παράρτημα IV.

Άρθρο 2

Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη μέρα από τη δημοσίευση του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.

Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε Κράτος μέλος.

Έγινε στις Βρυξέλλες, στις 28 Ιουλίου 1981.

Για την Επιτροπή

Ο Πρόεδρος

Gaston THORN

(1) ΕΕ αριθ. L 148 της 28. 6. 1968, σ. 13.

(2) ΕΕ αριθ. L 84 της 31. 3. 1978, σ. 19.

(3) ΕΕ αριθ. L 305 της 14. 11. 1980, σ. 13.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

"ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ, ΜΕ ΠΟΣΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΟΥ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΣΙΑΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ, ΤΟΥ ΟΡΡΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΕΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΥΤΙΑΣ, ΣΤΟ ΑΠΟΚΟΡΥΦΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗ ΠΟΥ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ ΓΙΑ ΔΗΜΟΣΙΑ ΑΠΟΘΕΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗ

1. Αντικείμενο και τομέας εφαρμογής

Με τη μεθόδο αυτή επιτυγχάνεται ο προσδιορισμός, στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη που προορίζεται για δημόσια αποθεματοποίηση, του ορρού γάλακτος ο οποίος λαμβάνεται με την επίδραση πυτίας.

2. Αρχή της μεθόδου

Κατά την πήξη του γάλακτος υπό την επίδραση πυτίας ελευθερώνονται γλυκομακροπεπτίδια της καζεΐνης, των οποίων η περιεκτικότητα σε σιαλικό οξύ είναι υψηλή. Με προσδιορισμό του σιαλικού οξέος (Ν-ακετυλονευραμινικό οξύ) διαπιστώνεται η ενδεχόμενη παρουσία ορρού γάλακτος εκ πυτίας στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη. Μετά την ανασύσταση του γάλακτος, τα γλυκομακροπεπτίδια στα οποία περιέχεται το σιαλικό οξύ καθιζάνουν από διήθημα τριχλωροξικού οξέος 12 % δι' επιδράσεως φωσφοροβολφραμικού οξέος.

Το σιαλικό οξύ που ελευθερώνεται δια οξικής υδρολύσεως σχηματίζει με τη ρεσορκινόλη ένα χρωματιστό σύμπλοκο, του οποίου η οπτική πυκνότητα μετράται με φασματοφωτόμετρο στα 580 nm.

3. Αντιδραστήρια

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι καθαρότητας κατάλληλης για ανάλυση. Το νερό πρέπει να είναι απεσταγμένο ή απιονισμένο.

3.1. Διάλυμα τριχλωροξικού οξέος

Διαλύονται 240 g τριχλωροξικού οξέος σε νερό, και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 1 000 ml.

3.2. Διάλυμα φωσφοροβολφραμικού οξέος

Διαλύονται 20 g φωσφοροβολφαρμικού οξέος σε νερό, και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 100 ml.

3.3. Αιθανόλη 95 % (v/v)

3.4. Διάλυμα θειικού οξέος 0,1 N περίπου

Διαλύονται 28,1 ml πυκνού θειικού οξέος (95 % H2SO4) σε νερό, και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 1 000 ml, για να ληφθεί διάλυμα θειικού οξέος 1 N. Διαλύονται 100 ml θειικού οξέος 1 N σε νερό, και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 1 000 ml, για να ληφθεί διάλυμα θειικού οξέος 0,1 N.

3.5. Ρυθμιστικό διάλυμα οξικών, pH = 4,8

Διαλύονται 19,7 g άνυδρου οξικού νατρίου σε νερό, προστίθενται 9 ml παγόμορφου οξικού οξέος (glacial), και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 1 000 ml με νερό.

Γίνεται επαλήθευση και ενδεχομένως ρύθμιση του pH.

3.6. Διάλυμα θειικού χαλκού, 0,1 M

Διαλύονται 2,497 g (CuSO4-5H2O) σε νερό, και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 100 ml.

3.7. Διάλυμα ρεσορκίνης 2 %

Διαλύονται 2 g ρεσορκίνης σε νερό, και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 100 ml.

Το διάλυμα αυτό μπορεί να διατηρηθεί 4 μήνες σε θερμοκρασία 5o- 8o C.

3.8. Αντιδραστήριο ρεσορκινόλης

Αναμιγνύονται 10 ml διαλύματος ρεσορκίνης (3.7), 80 ml πυκνού υδροχλωρικού οξέος (d 20o C = 1,19 g/l) και 0,25 ml διαλύματος θειικού χαλκού (3.6), και το διάλυμα αραιώνεται με νερό μέχρι τελικού όγκου 100 ml.

Το διάλυμα παρασκευάζεται την ημέρα της χρησιμοποιήσεώς του.

3.9. Ισοαμυλική αλκοόλη

3.10. Διάλυμα N-ακετυλονευραμινικού οξέος (σιαλικού οξέος)

Διαλύονται 20 mg Ν ακετυλονευραμινικού οξέος σε νερό. Το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Δεν πρέπει να διατηρηθεί περισσότερο απο μία εβδομάδα στους + 4o C.

4. Εργαστηριακός εξοπλισμός

4.1. Αναλυτικός ζυγός.

4.2. Μαγνητικός αναδευτήρας, μαγνητικές ράβδοι μήκους 2 cm επικαλυμμένες με teflon.

4.3. Πεχάμετρο.

4.4. Φυγόκεντρος με φυγοκεντρική δύναμη 3 000 g.

4.5. Σωλήνες φυγοκεντρήσεως χωρητικότητος 75 ml περίπου.

4.6. Υδατόλουτρο με θερμοστάτη ρυθμιζόμενο στους 80o C.

4.7. Ζέον υδατόλουτρο.

4.8. Ηθμοί χάρτινοι διαμέτρου 125 mm (Schleicher και Schuell αριθ. 589 2, τύπος "Weissband", ή αντίστοιχης ποιότητας).

4.9. Γυάλινα χωνιά διαμέτρου 7 cm περίπου.

4.10. Ποτήρια ζέσεως των 100 και 150 ml:

4.11. Ογκομετρικές φιάλες των 50, 100 και 1 000 ml.

4.12. Δοκιμαστικοί σωλήνες χωρητικότητας 10 ml, με βιδωτά πώματα.

4.13. Φασματοφωτόμετρο.

4.14. Γυάλινες κυψελίδες, πάχους 10 mm, για φασματοφωτόμετρο (4.13).

4.15. Βαθμολογημένα σιφώνια 1, 2, 5, 10, 20, 25, και 50 ml.

4.16. Γυάλινες ράβδοι.

4.17. Κλίβανος ξηράνσεως με θερμοστάτη στους 35o C.

5. Προετοιμασία του δείγματος

Το δείγμα, αφού ομογενοποιηθεί, εξετάζεται όπως υποδεικνύεται στην παράγραφο 6 και στις επόμενες.

6. Μέθοδος εργασίας

6.1. Απομόνωση του ελεύθερου σιαλικού οξέος.

6.1.1. Ζυγίζονται 5 +- 0,005 g αποκορυφωμένου γάλακτος σκόνη μέσα σε ποτήρι ζέσεως των 150 ml. Προστίθενται 50 ml νερού. Αναδεύονται καλά με τον μαγνητικό αναδευτήρα (4.2) έως ότου διαλυθούν εντελώς.

Προστίθενται αργά, με ταυτόχρονη ανάδευση, 50 ml διαλύματος τριχλωροξικού οξέος (3.1). Αφήνεται σε ηρεμία στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος για 30 λεπτά.

6.1.2. Αναδεύεται και διηθείται αμέσως (4.8).

6.1.3. Σε σωλήνα φυγοκεντρήσεως (4.5) φέρονται 50 ml από το διήθημα το οποίο ελήφθη μέσα στο διάστημα των 60 λεπτών που μεσολάβησε από την αρχή της διηθήσεως.

Προστίθεται 1 ml διαλύματος φωσφοροβολφραμικού οξέος (3.2).

Το διάλυμα ομογενοποιείται με ανάδευση και αφήνεται σε ηρεμία στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος για 10 λεπτά. Το ίζημα διαχωρίζεται, με φυγοκέντριση σε 3 000 g,για 10 λεπτά.

6.1.4. Η υπερκείμενη στοιβάδα απορρίπτεται. Το ίζημα εκπλένεται 2 φορές με 5 ml αιθανόλης (3.3). Λαμβάνεται φροντίδα ώστε να αναδευτεί καλά με μαγνητικό αναδευτήρα ή γυάλινη ράβδο (4.16). (Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται γυάλινη ράβδος, προστίθενται 2 ml αιθανόλης για διασπορά του ιζήματος, και η ράβδος εκπλένεται με τα υπόλοιπα 3 ml αιθανόλης).

Μετά από κάθε έκπλυση φυγοκεντρείται για 10 λεπτά σε 3 000 g.

Το ίζημα ξηραίνεται είτε για μία νύκτα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος είτε για 90 λεπτά στους 35o.

6.1.5. Στο ξηρό ίζημα προστίθενται 4 ml θειικού οξέος 0,1 N (3.4), και αναδεύεται καλά για να σχηματιστεί εναιώρημα.

Οι σωλήνες φυγοκεντρίσεως πωματίζονται και τοποθετούνται σε υδατόλουτρο 80o C για 40 λεπτά. Ανακινούνται κατά διαστήματα, προκειμένου να εξασφαλιστεί καλή διασπορά.

Ψύχεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, και κατόπιν προστίθενται 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικών (3.5). Οι σωλήνες ανακινούνται προσεκτικά.

6.1.6. Φυγοκεντρούνται για 10 λεπτά σε 3 000 g. Προσδιορίζεται το σιαλικό οξύ ή το N-ακετυλονευραμινικό οξύ στην υπερκείμενη στοιβάδα.

6.2. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός του ελεύθερου σιαλικού οξέος

6.2.1. Από την υπερκείμενη στοιβάδα λαμβάνονται 2 ml και φέρονται σε δοκιμαστικό σωλήνα (4.12), και προστίθενται 2 ml αντιδραστηρίου ρεσορκινόλης (3.8).

6.2.2. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες πωματίζονται, το περιεχόμενο αναμιγνύται προσεκτικά, και τοποθετούνται σε υδατόλουτρο 100o C (4.7) για 15 λεπτά ακριβώς. Ψύχονται με τρεχούμενο νερό στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος.

6.2.3. Προστίθενται 5 ml ισοαμυλικής αλκοόλης (3.9), οι δοκιμαστικοί σωλήνες πωματίζονται, το περιεχόμενο αναμιγνύεται με ισχυρή ανακίνηση των σωλήνων, οι οποίοι τοποθετούνται κατόπιν σε παγόλουτρο για 15 λεπτά.

6.2.4. Φυγοκεντρούνται σε 1 000 g για 2 λεπτά, προκειμένου να γίνει καλός διαχωρισμός των δύο φάσεων.

6.2.5. Λαμβάνονται 3 ml περίπου από την υπερκείμενη στοιβάδα (αλκοολική φάση) και εισάγονται σε γυάλινη κυψελίδα. Μετράται η οπτική πυκνότητα στα 580 nm σε σχέση με το λευκό δείγμα, όχι αργότερα από 30 λεπτά μετά την εξαγωγή των δοκιμαστικών σωλήνων από το παγόλουτρο.

6.3 Λευκή δοκιμή

Προετοιμάζεται λευκή δοκιμή σύμφωνα με τα σημεία 6.2.1 έως 6.2.5 και με χρησιμοποίηση 1 ml διαλύματος θειικού οξέος 0,1 Ν (3.4) και 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικών (3.5), αντί των 2 ml διηθήματος, όπως περιγράφεται στο σημείο 6.2.1.

6.4. Γραμμή αναφοράς

6.4.1. Μέσα σε ογκομετρικές φιάλες των 50 ml φέρονται 0-2-5-10-20 και 30 ml, ακριβώς από το διάλυμα (3.10), τα οποία αντιστοιχούν σε 0-0, 4-1-2-4-6 mg σιαλικού οξέος. Συμπληρώνεται η κάθε φιάλη μέχρι τελικού όγκου 50 ml με διάλυμα θειικού οξέος 0,1 N (3.4), και το περιεχόμενο αναμιγνύεται καλά.

6.4.2. Φέρεται 1 ml από το περιεχόμενο κάθε ογκομετρικής φιάλης σε δοκιμαστικό σωλήνα (4.12). Προστίθεται 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικών (3,5), προκειμένου να ληφθεί μια σειρά διαλυμάτων αναφοράς περιέχοντα 0 (μηδενική τιμή) 8, 20, 40, 80, 120 μικρογραμμάρια σιαλικού οξέος. Αναμιγνύονται καλά, και εκτελείται ο προσδιορισμός σύμφωνα με τα σημεία 6.2.2 έως 6.2.5.

6.4.3. Για τη χάραξη της γραμμής αναφοράς, φέρονται στο ζεύγος των συντεταγμένων αφ' ενός οι τιμές της οπτικής πυκνότητας που ελήφθησαν στο σημείο 6.4.2 και αφ' ετέρου οι αντίστοιχες ποσότητες του σιαλικού οξέος σε μικρογραμμάρια όπως αναφέρονται στο σημείο 6.4.2.

7. Έκφραση των αποτελεσμάτων

7.1. Τρόπος υπολογισμού

Η περιεκτικότητα σε σιαλικό οξύ, εκφραζόμενη σε μικρογραμμάρια ανά γραμμάριο, υπολογίζεται από τον ακόλουθο τύπο:

όπου:

C η μάζα του σιαλικού οξέος σε μικρογραμμάρια, όπως προκύπτει από τη γραμμή αναφοράς, η οποία αντιστοιχεί στην τιμή της οπτικής πυκνότητας που ελήφθη στο σημείο 6.2.5,

E η μάζα του δείγματος (6.1.1) σε γραμμάρια.

Το αποτέλεσμα εκφράζεται με προσέγγιση ενός μικρογραμμαρίου.

7.2. Επαναληπτικότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα ή με μικρή διαφορά χρόνου από τον ίδιο αναλυτή δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 % του αριθμητικού μέσου όρου των αποτελεσμάτων.

8. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων

Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό του ορρού γάλακτος που ενδεχομένως περιέχεται στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη.

8.1. Υπολογισμός της μέσης τιμής ελεύθερου σιαλικού οξέος σε μικρογραμμάρια ανά γραμμάριο δείγματος, σε σχέση με την περιεκτικότητά του σε πρωτεΐνη εκφραζόμενη σε ποσοστό επί τοις εκατόν (m/m):

Y = 40 + 3 (X-34)2

όπου:

40 η μέση περιεκτικότητα σε σιαλικό οξύ, εκφραζόμενη σε μικρογραμμάρια ανά γραμμάριο για αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη του οποίου η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη είναι τουλάχιστον 34 %,

X η περιεκτικότητα (%) σε ολική πρωτεΐνη, η οποία προσδιορίζεται σύμφωνα με τη μέθοδο Kjeldahl FIL:IDF 20:1962

8.2. Υπολογισμός του ποσοστού (%) του ορρού γάλακτος σε σκόνη που ενδεχομένως περιέχεται:

όπου:

Z η περιεκτικότητα του δείγματος σε σιαλικό οξύ, η οποία προσδιορίστηκε στην παράγραφο 7.1, εκφραζόμενη σε μικρογραμμάρια ανά γραμμάριο,

Υ η μέση περιεκτικότητα του δείγματος σε ελεύθερο σιαλικό οξύ, η οποία υπολογίστηκε στην παράγραφο 8.1,

10 η συμβατική περιεκτικότητα σε ελεύθερο σιαλικό οξύ, εκφραζόμενη σε μικρογραμμάρια ενός γραμμαρίου ορρού γάλακτος σε σκόνη ο οποίος έχει ληφθεί με την επίδραση πυτίας.

8.3. Λαμβάνοντας υπόψη τα σφάλματα που οφείλονται στην ίδια τη μέθοδο και στις φυσικές διακυμάνσεις της συστάσεως του δείγματος, μπορούμε να συμπεράνουμε οριστικά την απουσία ορρού γάλακτος όταν η τιμή που λαμβάνεται στην παράγραφο 8.2 είναι κατώτερη ή ίση του 2,0.

Μια μεγαλύτερη τιμή συνεπάγεται την παρουσία ορρού γάλακτος. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του γίνεται με βάση τον τύπο της παραγράφου 8.2.".