ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

Μέθοδοι δοκιμών για την ανίχνευση και ταυτοποίηση του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού που αναφέρονται στο άρθρο 3 παράγραφος 2

1. Δοκιμή με σπόρια

Για την ανίχνευση και ταυτοποίηση χρησιμοποιούνται θερινά σποριάγγεια και διαχειμάζοντα σπόρια, τα οποία λαμβάνονται από το χώμα μετά από κοσκίνιση ή απευθείας από το φυτικό υλικό.

2. Μέθοδοι ανίχνευσης

Για την εξαγωγή σπορίων του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού από το χώμα, χρησιμοποιείται μία από τις ακόλουθες μεθόδους:

α) μέθοδος κοσκίνισης χώματος, όπως περιγράφεται από τον Pratt (1976) (1)·

β) μέθοδος κοσκίνισης χώματος, όπως περιγράφεται από τους van Leeuwen et al. (2005) (2)·

γ) τεχνική φυγοκέντρησης φυγοκέντρηση βαθμιδωτής πυκνότητας για επεξεργασία δειγμάτων υψηλής απόδοσης, όπως περιγράφεται από τους Wander et al. (2007) (3).

3. Μέθοδοι ταυτοποίησης

Μετά την εκχύλιση, τα σπόρια του συγκεκριμένου επιβλαβούς οργανισμού ταυτοποιούνται με μία από τις ακόλουθες μεθόδους:

α) μορφολογική ταυτοποίηση με οπτικό μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 100x – 400x·

β) συμβατική PCR με χρήση εκκινητών κατά Lévesque et al. (2001) (4) και van den Boogert et al. (2005) (5)·

γ) PCR πραγματικού χρόνου με χρήση εκκινητών και ανιχνευτών κατά van Gent-Pelzer et al. (2010) (6)·

δ) PCR πραγματικού χρόνου με χρήση εκκινητών και ανιχνευτών κατά Smith et al. (2014) (7).

4. Βιωσιμότητα των διαχειμαζόντων σπορίων

Ο προσδιορισμός της βιωσιμότητας των διαχειμαζόντων σπορίων μπορεί να επιτευχθεί με μικροσκοπική εξέταση ή βιοδοκιμή. Η βιωσιμότητα των σποριαγγείων μπορεί να προσδιοριστεί με μικροσκοπική εξέταση των σποριαγγείων μέσα σε λακτοφαινόλη ή σε νερό (Przetakiewicz 2015) (8). Τα σποριάγγεια με κοκκώδες περιεχόμενο ή με ελαφρώς στρογγυλεμένο πρωτόπλασμα μπορούν να θεωρηθούν βιώσιμα. Τα χωρίς εμφανές περιεχόμενο σποριάγγεια ή εκείνα που έχουν υποστεί μόνιμη πλασμόλυση θεωρούνται νεκρά.

Εναλλακτικά, ή σε περίπτωση αμφιβολίας, μπορεί να πραγματοποιηθεί βιοδοκιμή, όπως περιγράφεται στο σημείο 3 του παραρτήματος IV.

5. Προσδιορισμός παθοτύπων

Για τον προσδιορισμό των παθοτύπων θα χρειαστούν φρέσκοι όγκοι.

Το μόλυσμα για τη δοκιμή παράγεται με μία από τις ακόλουθες μεθόδους:

α) μέθοδος SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), η οποία περιλαμβάνει τα δύο ακόλουθα στάδια: i) παραγωγή του μολύσματος Ιστός παλαιού (καφέ χρώματος) καρκινώματος υποβάλλεται σε θραύση σε μικρότερα κομμάτια και σε ξήρανση σε θερμοκρασία δωματίου έως ότου σκληρύνει. Ο σκληρός πλέον ιστός κονιορτοποιείται, είτε χειρωνακτικά είτε με μηχανικά μέσα. Το κονιορτοποιημένο υλικό υποβάλλεται σε ξηρή κοσκίνιση, από την οποίο συλλέγεται το κλάσμα μεταξύ 25 και 75 μm, και ακολούθως υποβάλλεται σε εκχύλιση χρησιμοποιώντας τη μέθοδο με χρήση χλωροφορμίου του Pratt (1976)1· ii) παραγωγή φρέσκων όγκων Περίπου 10 mg εκχυλισμένων διαχειμαζόντων σπορίων εναποτίθενται στην επιφάνεια 10 ml αποστειρωμένου απεσταγμένου νερού σε μικρό πλαστικό τρυβλίο Petri και επωάζονται σε σκοτεινό περιβάλλον στους 20 °C έως ότου βλαστήσουν. Κόνδυλοι πατάτας με μικρά φύτρα μήκους 1 έως 2 mm τοποθετούνται σε διαφανή πλαστικά κουτιά, στρωμένα με υγρό λεπτό χαρτί και με τα σημαδεμένα φύτρα στραμμένα προς τα επάνω. Γύρω από τα φύτρα δημιουργείται δακτύλιος από λιωμένη βαζελίνη με χρήση σύριγγας. Ο δακτύλιος πρέπει να είναι αρραγής και αρκετά ψηλός ώστε να μπορεί να κρατήσει το αιώρημα των σπορίων χωρίς διαρροές. Τα 10 ml των βλαστανόντων διαχειμαζόντων σπορίων αραιώνονται περαιτέρω σε 20 ml με αποστειρωμένο νερό και τοποθετούνται εντός των δακτυλίων με σιφώνιο ή εύκαμπτο πλαστικό μπουκάλι έως ότου το φύτρο καλυφθεί πλήρως από το αιώρημα σπορίων. Τα πλαστικά κουτιά καλύπτονται με πώματα και αφήνονται προς επώαση για 4 ημέρες στους 10 °C· στη συνέχεια τα κουτιά ανοίγονται, αφαιρούνται το μόλυσμα και οι δακτύλιοι βαζελίνης και τα κουτιά μεταφέρονται σε θερμοκήπιο με υδρατμούς σε θερμοκρασία 15 έως 18 °C (16 ώρες έκθεσης στο φως)·

β) μέθοδος των Spiekermann & Kothoff (1924) (9)·

γ) μέθοδος των Potoček et al. (1991) (10)·

δ) μέθοδος των Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11)· Lemmerzahl 1930 (12)· Noble και Glynne 1970 (13)).

Για την ταυτοποίηση όλων των παθοτύπων που είναι γνωστό ότι αφορούν την Ένωση [1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) και 38(Nevşehir)], θα χρησιμοποιηθεί διαφορική δοκιμασία μόλυνσης με διάφορες ποικιλίες του συγκεκριμένου φυτού όπως περιγράφεται στον πίνακα. Η δοκιμασία προσβολής θα πραγματοποιηθεί σύμφωνα με το πρωτόκολλο που αναφέρεται στο στοιχείο δ) (μέθοδος Glynne-Lemmerzahl).

Επιλεκτική ευπάθεια καλλιεργητικών ποικιλιών πατάτας για τον προσδιορισμό των παθοτύπων του S. endobioticum

Καλλιεργητική ποικιλία Παθότυποι S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R «S»: ευπαθής «R»: ανθεκτική *: δηλώνει μικρή ευπάθεια της ποικιλίας στο S. endobioticum («παρουσία μη νεκρωτικών περιοχών σωρών χωρίς σχηματισμό όγκων»).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21 – 29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25 – 31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165 – 174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200–201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47 – 57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129 – 133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422 – 432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114 – 115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191 – 205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34 – 60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288 – 297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125 – 135.