*****

ΟΔΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

της 20ής Δεκεμβρίου 1983

που τροποποιεί τις οδηγίες 71/393/ΕΟΚ, 72/199/ΕΟΚ και 78/633/ΕΟΚ περί καθορισμού κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών

(84/4/ΕΟΚ)

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας,

την οδηγία 70/373/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 20ής Ιουλίου 1970 περί εισαγωγής τρόπων λήψεως δειγμάτων και κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την πράξη προσχωρήσεως της Ελλάδας, και ιδίως το άρθρο 2,

Εκτιμώντας:

ότι οι οδηγίες 71/393/ΕΟΚ (2), 72/199/ΕΟΚ (3) και 78/633/ΕΟΚ (4) της Επιτροπής καθορίζουν, αντίστοιχα, τις μεθόδους προσδιορισμού των ακατέργαστων λιπαρών ουσιών, της νικοτιανομυκίνης και της ψευδαργυρικής βακιτρακίνης· ότι φαίνεται αναγκαίο να αντικατασταθούν οι μέθοδοι αυτές με μεθόδους προσαρμοσμένες στην εξέλιξη της επιστημονικής και τεχνικής γνώσης·

ότι τα μέτρα που προβλέπονται στην παρούσα οδηγία είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μόνιμης Επιτροπής Ζωοτροφών,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:

Άρθρο 1

Στο παράρτημα της οδηγίας 71/393/ΕΟΚ, το κείμενο του τμήματος 4 «Προσδιορισμός των ακατέργαστων λιπαρών ουσιών» αντικαθίσταται από το κείμενο που περιλαμβάνει το παράρτημα Ι της παρούσας οδηγίας.

Άρθρο 2

Στο παράρτημα ΙΙ της οδηγίας 72/199/ΕΟΚ, το κείμενο του τμήματος 5 «Προσδιορισμός της νικοτιανομυκίνης - δια διαχύσεως επί άγαρος» αντικαθίσταται από το κείμενο που περιλαμβάνει το παράρτημα ΙΙ της παρούσας οδηγίας.

Άρθρο 3

Στο παράρτημα της οδηγίας 78/633/ΕΟΚ, το κείμενο του τμήματος 1 «Προσδιορισμός της ψευδαργυρικής βακιτρακίνης - δια διαχύσεως σε μέσο που περιέχει άγαρ» αντικαθίσταται από το κείμενο που περιλαμβάνει το παράρτημα ΙΙΙ της παρούσας οδηγίας.

Άρθρο 4

Τα κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ τις αναγκαίες νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις για να συμμορφωθούν προς τις διατάξεις της παρούσας οδηγίας το αργότερο την 1η Ιουνίου 1984. Ενημερώνουν αμέσως την Επιτροπή.

Άρθρο 5

Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα κράτη μέλη.

Βρυξέλλες, 20 Δεκεμβρίου 1983.

Για την Επιτροπή

Poul DALSAGER

Μέλος της Επιτροπής

(1) ΕΕ αριθ. L 170 της 3. 8. 1970, σ. 2.

(2) ΕΕ αριθ. L 279 της 20. 12. 1971, σ. 7.

(3) ΕΕ αριθ. L 123 της 29. 5. 1972, σ. 6.

(4) ΕΕ αριθ. L 206 της 29. 7. 1978, σ. 43.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι

«4. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΚΑΤΕΡΓΑΣΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΥΣΙΩΝ

1. Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε ακατέργαστες λιπαρές ουσίες των ζωοτροφών. Η μέθοδος δεν αφορά την ανάλυση των ελαιούχων σπόρων και καρπών που καθορίζονται από τον κανονισμό του Συμβουλίου 136/66/ΕΟΚ της 22ας Σεπτεμβρίου 1966.

Ανάλογα με τη φύση της τροφής, πρέπει να εφαρμοστεί η μία ή η άλλη των μεθόδων που αναφέρονται κατωτέρω.

1.1. Μέθοδος Α

Εφαρμόζεται στις απλές τροφές φυτικής προελεύσεως, εξαιρέσει εκείνων των οποίων είναι γνωστό ότι περιέχουν έλαια και λιπαρές ουσίες που δεν είναι δυνατόν να εκχυλίζονται πλήρως δι' αιθέρος χωρίς προκαταρκτική υδρόλυση. Σ' αυτές τις εξαιρέσεις ανήκουν γλουτένες, ζύμη, πρωτεΐνες σόγιας και γεώμηλα. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται επίσης στις σύνθετες ζωοτροφές, εξαιρέσει εκείνων που περιέχουν σκόνη γάλακτος ή που οι λιπαρές ουσίες δεν εκχυλίζονται πλήρως δι' αιθέρος χωρίς προκαταρκτική υδρόλυση.

1.2. Μέθοδος Β

Εφαρμόζεται στις απλές ζωοτροφές ζωικής προελεύσεως, καθώς και στις τροφές που αναφέρονται υπό το σημείο 1.1 ως εξαιρέσεις της εφαρμογής της μεθόδου Α.

2. Αρχή

2.1. Μέθοδος Α

Το δείγμα υδρολύεται δι' αιθέρος. Το διαλυτικό μέσο απομακρύνεται με απόσταξη και το υπόλειμμα ξηραίνεται και ζυγίζεται.

2.2. Μέθοδος Β

Το δείγμα κατεργάζεται εν θερμώ δι' υδροχλωρικού οξέος. Το μείγμα ψύχεται και διηθείται. Το υπόλειμμα, αφού εκπλυθεί και ξηρανθεί, υπόκειται σε ανάλυση κατά τη μέθοδο Α.

3. Αντιδραστήρια

3.1. Αιθέρας, διάστημα αναβράσεως: 40 μέχρι 60 ° C. Ο δείκτης του βρωμίου πρέπει να είναι κατώτερος από 1 και το υπόλειμμα της εξατμίσεως κατώτερο από 2 mg/100 ml.

3.2. Άνυδρο θειικό νάτριο.

3.3. Υδροχλωρικό οξύ 3Ν.

3.4. Επιβοηθητικό διηθήσεως, πχ. γη διατόμων, Hyflo-supercel.

4. Συσκευές

4.1. Συσκευή εκχυλίσεως. Εάν η συσκευή είναι εφοδιασμένη με σιφώνιο (συσκευή Soxhlet), η παροχή αναρροής ρυθμίζεται προς επίτευξη 10 στροφών τουλάχιστον ανά ώρα. Εφόσον χρησιμοποιείται συσκευή άνευ σιφωνίων, η παροχή του αναρρεομένου υγρού πρέπει να είναι 10 ml περίπου ανά λεπτό.

4.2. Φυσίγγια εκχυλίσεως, ελεύθερα ουσιών διαλυτών στον αιθέρα, των οποίων το πορώδες ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις του σημείου 4.1.

4.3. Ξηραντήρας, είτε κενού σε 75 ± 3 ° C είτε με ατμοσφαιρική πίεση σε 100 ± 3 ° C.

5. Τρόπος εργασίας (μεθοδολογία)

5.1. Μέθοδος Α (βλέπε σημείο 8.1)

Ζυγίζονται 5 g δείγματος, με προσέγγιση 1 mg, εισάγονται εντός φυσιγγίου εκχυλίσεως (4.2) και καλύπτονται δια πώματος εκ βάμβακος απαλλαγμένου λιπαρών ουσιών.

Τοποθετείται το φυσίγγιον εντός συσκευής εκχυλίσεως (4.1) και εκχυλίζεται επί έξι ώρες με αιθέρα (3.1). Εκλέγεται το εκχύλισμα εντός ξηράς φιάλης, εφοδιασμένης μετά μερικών τεμαχίων κισσήρεως (1), της οποίας έχει ληφθεί το απόβαρο.

Απομακρύνεται το διαλυτικό μέσο δι' αποστάξεως. Ξηραίνεται το υπόλειμμα επί μία και ημίσεια ώρα τοποθετώντας τη φιάλη εντός ξηραντήρος (4.3). Ψύχεται εντός αποξηραντήρος και ζυγίζεται. Διενεργείται εκ νέου ξήρανση επί 30 λεπτά προς επιβεβαίωση ότι το βάρος της λιπαράς ύλης παραμένει σταθερό (η απώλεια του βάρους μεταξύ δύο διαδοχικών ζυγισμάτων πρέπει να είναι κατώτερη του 1 mg).

5.2. Μέθοδος Β

Ζυγίζονται 2,5 g δείγματος με προσέγγιση 1 ml (βλέπε παρατήρηση 8.2) και εισάγονται εντός υαλίνου ποτηρίου ζέσεως των 400 ml ή εντός κωνικής φιάλης των 300 ml και προστίθενται 100 ml υδροχλωρικού οξέος 3Ν (3.3) και μερικά τεμάχια κισσήρεως. Καλύπτεται το υάλινο ποτήριο ζέσεως μεθ' υάλου ωρολογίου ή εφοδιάζεται η κωνική φιάλη μετά καθέτου ψυκτήρος. Φέρεται το μείγμα σε ήπιο βρασμό με τη χρήση χαμηλής φλόγας ή θερμαντικής πλακός και διατηρείται εκεί για μία ώρα. Αποφεύγεται η προσκόλληση του προϊόντος επί των πλευρών του υποδοχέως.

Ψύχεται και προστίθεται ποσότητα επιβοηθητικού διηθήσεως (3.4), επαρκής προς αποφυγή κάθε απωλείας λιπαρής ύλης κατά τη διάρκεια της διηθήσεως. Διηθείται δια διπλού υγρανθέντος διηθητικού χάρτου ελεύθερου λιπαρών υλών. Εκπλύνεται το υπόλειμμα με ψυχρό ύδωρ μέχρις ουδετεροποιήσεως του διηθήματος. Ελέγχεται η απουσία λιπαρών υλών εκ του διηθήματος.

Η παρουσία αυτών δεικνύει ότι το δείγμα πρέπει να εκχυλιστεί δι' αιθέρος, κατά τη μέθοδο Α, προ της υδρολύσεως.

Τοποθετείται ο διπλός διηθητικός χάρτης ο οποίος περιέχει το υπόλειμμα επί υάλου ωρολογίου και ξηραίνεται επί μία και ημίσεια ώρα εντός του κλιβάνου αποξηράνσεων σε θερμοκρασία 100 ± 3 ° C.

Εισάγεται ο διπλός διηθητικός χάρτης και το ξηρό υπόλειμμα εντός φυσιγγίου εκχυλίσεως (4.2) και καλύπτεται δια κύματος εκ βάμβακος απαλλαγμένου λιπαρών ουσιών. Τοποθετείται το φυσίγγιον εντός συσκευής εκχυλίσεως και ακολουθείται ο τρόπος εργασίας όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1, δεύτερο και τρίτο εδάφιο.

6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Το αποτέλεσμα του γυρίσματος εκφράζεται επί τοις εκατό επί του δείγματος.

7. Επαναληπτικότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο παραλλήλων προσδιορισμών, διενεργουμένων επί του αυτού δείγματος, από τον ίδιο αναλυτή, δεν πρέπει να υπερβαίνει:

- το 0,2 % σε απόλυτη τιμή για περιεκτικότητες σε ακατέργαστες ύλες μικρότερες του 5 %,

- το 4 % του μεγαλύτερου αποτελέσματος για περιεκτικότητα από 5 έως 10 %,

- το 0,4 % σε απόλυτο τιμή για περιεκτικότητες υψηλότερες του 10 %.

8. Παρατηρήσεις

8.1. Για τα προϊόντα με υψηλή περιεκτικότητα λιπαρών ουσιών, δυσκόλως κονιοποιούμενα ή μη κατάλληλα για λήψη μειωμένης και ομοιογενούς ποσότητας δείγματος, διενεργούνται τα κάτωθι:

Ζυγίζονται 20 g δείγματος με προσέγγιση 1 mg και αναμειγνύονται μετά ποσότητος 10 g ή περισσοτέρων ανύδρου θειικού νατρίου (3.2). Διενεργείται εκχύλιση δι' αιθέρος (3.1) όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1. Συμπληρούται το επιτευχθέν εκχύλισμα έως 500 ml δι' αιθέρος (3.1) και ομοιογενοποιείται. Εισάγονται 50 ml του διαλύματος σε μικρή ξηρή φιάλη εφοδιασμένη με μερικά τεμάχια κισσήρεως (1) της οποίας έχει ληφθεί το απόβαρο. Απομακρύνεται το διαλυτικό μέσο δι' αποστάξεως, ξηραίνεται και ακολουθείται ο τρόπος εργασίας όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1, τελευταίο εδάφιο.

Απομακρύνεται το διαλυτικό μέσο του υπολείμματος της εκχυλίσεως, το οποίο ευρίσκεται εντός του φυσιγγίου, κονιοποιείται το υπόλοιπο σε κόκκους 1 χιλιοστομέτρου, τοποθετείται εκ νέου εντός του φυσιγγίου (άνευ προσθήκης θειικού νατρίου) και ακολουθείται ο τρόπος εργασίας όπως υποδεικνύεται στο σημείο 5.1, δεύτερο και τρίτο εδάφιο.

Η περιεκτικότης σε ακατέργαστες λιπαρές ύλες επί τοις εκατό του δείγματος εκφράζεται κατά τον τύπο:

(10α + β) x 5

όπου:

α = μάζα σε γραμμάρια του υπολείμματος της πρώτης εκχυλίσεως (χρησιμοποιηθέν μέρος του εκχυλίσματος),

β = μάζα σε γραμμάρια του υπολείμματος του δευτέρου εκχυλίσματος.

8.2. Η ποσότητα του δείγματος των πτυχών σε λιπαρές ύλες προϊόντων δύναται να ανέρχεται σε 5 g.».

(1) Όταν η λιπαρά ύλη πρέπει να αποτελέσει αντικείμενο μεταγενεστέρων ποιοτικών εξετάσεων, τα τεμάχια κισσήρεως αντικαθίστανται από υάλινες χάνδρες.

(1) Όταν η λιπαρά ύλη πρέπει να αποτελέσει αντικείμενο μεταγενέστερων ποιοτικών εξετάσεων, τα τεμάχια κισσήρεως αντικαθίστανται από υάλινες χάνδρες.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ

«5. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ VIRGINIAMYCIN

- δια διαχύσεως σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό -

1. Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της virginiamycin στις ζωοτροφές και τα προμείγματα. Το κατώτατο όριο προσδιορισμού είναι 2 mg/kg (2ppm) (1).

2. Αρχή

Το δείγμα εκχυλίζεται με μεθανολικό διάλυμα Tween 80. Το εκχύλισμα φέρεται σε διαχωριστική χοάνη ή φυγοκεντρείται και αραιώνεται. Η αντιβιοτική του δραστικότης προσδιορίζεται μετρώντας τη διάχυση της virginiamycin σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό που έχει ενοφθαλμισθεί με Micrococcus luteus. Η διάχυση διαπιστώνεται από το σχηματισμό ζωνών αναστολής της μικροβιακής ανάπτυξης. Η διάμετρος των ζωνών αυτών θεωρείται ευθέως ανάλογη προς το λογάριθμο της συγκεντρώσεως του αντιβιοτικού για τις διάφορες συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν.

3. Μικροοργανισμός: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Διατήρηση του στελέχους

Κεκλιμένοι σωλήνες που περιέχουν το θρεπτικό υλικό (4.1) ενοφθαλμίζονται με Micrococcus luteus και επωάζονται επί 24 ώρες στους 30 ° C. Η καλλιέργεια διατηρείται σε ψυγείο στους 4 ° C και ανανεώνεται κάθε δύο εβδομάδες.

3.2. Προετοιμασία του μικροβιακού εναιωρήματος (α)

Συλλέγονται τα σπόρια από ένα σωλήνα με αγαρούχο θρεπτικό υλικό (3.1) πρόσφατης παρασκευής με τη βοήθεια 2 έως 3 ml διαλύματος χλωριούχου νατρίου (4.3). Το εναιώρημα αυτό χρησιμοποιείται για τον ενοφθαλμισμό 250 ml θρεπτικού υλικού (4.1) μέσα σε φιάλη Roux. Επωάζεται επί 18 έως 20 ώρες στους 30 ° C. Τα σπόρια συλλέγονται με τη βοήθεια 25 ml διαλύματος χλωριούχου νατρίου (4.3). Το εναιώρημα αναδεύεται και ακολούθως αραιώνεται στο 1/10 με διάλυμα χλωριούχου νατρίου (4.3). Στιβάδα του εναιωρήματος πάχους 1 cm εξεταζόμενη στα 650 nm ως προς διάλυμα χλωριούχου νατρίου (4.3) πρέπει να επιτρέπει τη δίοδο σε 75 % περίπου του προσπίπτοντος φωτός. Το εναιώρημα αυτό μπορεί να διατηρηθεί μία εβδομάδα στους 4 ° C περίπου.

4. Θρεπτικά υλικά και αντιδραστήρια

4.1. Θρεπτικό υλικό για τη διατήρηση του στελέχους και για τον προσδιορισμό (β)

1.2 // Πεπτόνη κρέατος // 6,0 g // Τρυπτόνη // 4,0 g // Εκχύλισμα μαγιάς // 3,0 g // Εκχύλισμα κρέατος // 1,5 g // Γλυκόζη // 1,0 g // Άγαρ // 10,0 έως 20,0 g // Νερό // 1 000 ml // pH 6,5 (μετά από αποστείρωση)· //

4.2. Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 6

1.2 // Όξινο φωσφορικό γάλιο, K2HPO4 // 2,0 g // Δισόξινο φωσφορικό κάλιο, KH2PO4 // 8,0 g // Νερό έως // 1 000 ml

4.3. Διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,8 % (w/v): διαλύονται 8 g χλωριούχου νατρίου με νερό και αραιώνονται για να ληφθεί τελικός όγκος 1 000 ml. Το διάλυμα αποστειρώνεται.

4.4. Μεθανόλη.

4.5. Μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (4.2) και μεθανόλης (4.4): 80/20 (v/v).

4.6. Μεθανολικό διάλυμα Tween 80 0,5 % (w/v): διαλύονται 5 g Tween 80 μέσα σε μεθανόλη (4.4) και αραιώνονται με μεθανόλη ώστε να ληφθεί τελικός όγκος 1 000 ml.

4.7. Πρότυπη ουσία: Virginiamycin γνωστής δραστικότητος.

5. Πρότυπα διαλύματα

Διαλύεται μια ακριβώς ζυγισμένη ποσότητα πρότυπης ουσίας (4.7) μέσα σε μεθανόλη (4.4) και αραιώνεται με μεθανόλη (4.4) ώστε να προκύψει μητρικό διάλυμα που περιέχει 1 000 μg virginiamycin ανά ml.

Διατηρούμενο σε πωματισμένη φιάλη στους 4 ° C το διάλυμα αυτό παραμένει σταθερό επί πέντε ημέρες.

Από αυτό το μητρικό διάλυμα παρασκευάζονται μετά από διαδοχικές αραιώσεις με το μείγμα (4.5) τα ακόλουθα διαλύματα:

S8 1 μg/ml

S4 0,5 μg/ml

S2 0,25 μg/ml

S1 0,125 μg/ml

6. Παρασκευή του εκχυλίσματος και των διαλυμάτων

6.1. Εκχύλιση

6.1.1. Π ρ ο ϊ ό ν τ α μ ε π ε ρ ι ε κ τ ι κ ό τ η τ α σ ε v i r g i n i a m y c i n έ ω ς 1 0 0 m g / k g

Ζυγίζονται 50,0 g δείγματος. Προστίθενται 200 ml διαλύματος (4.6) και αναδεύονται επί 30 λεπτά. Αφήνεται να κατακαθίσει ή φυγοκεντρείται. Από το υπερκείμενο διάλυμα λαμβάνονται 20 ml και εξατμίζονται έως ότου απομείνουν 5 ml μέσα σε περιστρεφόμενη αντλία εξατμίσεως και σε θερμοκρασία όχι μεγαλύτερη από 40 ° C. Το υπόλειμμα αραιώνεται με το μείγμα (4.5) έτσι ώστε η αναμενόμενη περιεκτικότητα σε virginiamycin να είναι 1 μg/ml (=U8)

6.1.2. Π ρ ο ϊ ό ν τ α μ ε π ε ρ ι ε κ τ ι κ ό τ η τ α σ ε v i r g i n i a m y c i n μ ε γ α λ ύ τ ε ρ η α π ό 100 mg/kg

Ζυγίζονται έως 10,0 g δείγματος τα οποία περιέχουν από 1,0 έως 50,0 mg virginiamycin. Προστίθενται 100 ml διαλύματος (4.6) και αναδεύονται επί 30 λεπτά. Αφήνεται να κατακαθίσει ή φυγοκεντρείται. Το υπερκείμενο διάλυμα αραιώνεται με το μείγμα (4.5) έτσι ώστε η αναμενόμενη περιεκτικότητα σε virginiamycin να είναι 1 μg/ml (=U8).

6.2. Διαλύματα του εκχυλίσματος

Από το διάλυμα U8 παρασκευάζονται τα διαλύματα U4 (αναμενόμενη συγκέντρωση: 0,5 μg/ml), U2 (αναμενόμενη συγκέντρωση: 0,25 μg/ml) και U1 (αναμενόμενη συγκέντρωση: 0,125 μg/ml) μετά από διαδοχικές αραιώσεις (1 + 1) με το μείγμα (4.5).

7. Τρόπος προσδιορισμού

7.1. Ενοφθαλισμός του θρεπτικού υλικού

Το θρεπτικό υλικό (4.1) ενοφθαλμίζεται με το μικροβιακό εναιώρημα (3.2) στους 50 ° C περίπου. Από προκαταρκτικές δοκιμές σε τριβλία με θρεπτικό υλικό (4.1) προσδιορίζεται η ποσότητα του μικροβιακού εναιωρήματος που απαιτείται για να ληφθούν όσο το δυνατόν ευρύτερες και σαφέστερες ζώνες αναστολής με τις διάφορες συγκεντρώσεις της virginiamycin.

7.2. Προετοιμασία των τριβλίων

Η διάχυση πάνω σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό πραγματοποιείται μέσα σε τριβλία με τις τέσσερις συγκεντρώσεις του προτύπου διαλύματος (S8, S4, S2, S1) και τις τέσσερις συγκεντρώσεις του διαλύματος του εκχυλίσματος (U8, U4, U2, U1). Σε κάθε τριβλίο πρέπει να τοποθετηθούν απαραίτητα οι τέσσερις αυτές συγκεντρώσεις εκχυλίσματος και προτύπου. Για το λόγο αυτό το μέγεθος των τριβλίων πρέπει να είναι αρκετά μεγάλο ώστε να είναι δυνατόν να σχηματιστούν στο θρεπτικό υλικό τουλάχιστον οκτώ οπές διαμέτρου 10 έως 13 mm των οποίων τα κέντρα δεν απέχουν λιγότερο από 30 mm μεταξύ τους. Αντί των τριβλίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν γυάλινες πλάκες πάνω από τις οποίες τοποθετούνται δακτύλιοι από αλουμίνιο ή πλαστικό, διαμέτρου 200 mm και ύψους 20 mm.

Εισάγεται μέσα στα τριβλία ποσότητα θρεπτικού υλικού (4.1) η οποία έχει ενοφθαλμιστεί όπως περιγράφεται στο σημείο 7.1, έτσι ώστε να ληφθεί στιβάδα πάχους 2 mm περίπου (60 ml για τριβλίο διαμέτρου 200 mm). Αφήνεται να στερεοποιηθεί, ανοίγονται οι οπές και τοποθετούνται σ' αυτές επακριβώς μετρημένοι όγκοι διαλυμάτων του προτύπου και του εκχυλίσματος (0,10 έως 0,15 ml ανά οπή) ανάλογα με τη διάμετρο. Γίνονται τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις με κάθε συγκέντρωση έτσι ώστε σε κάθε προσδιορισμό να υπολογίζονται 32 ζώνες αναστολής.

7.3. Επώαση

Τα τριβλία επωάζονται επί 16 έως 18 ώρες στους 30 ± 2 ° C. 8. Υπολογισμός

Μετράται η διάμετρος των ζωνών αναστολής με ακρίβεια 0,1 mm. Για κάθε συγκέντρωση, οι μέσες τιμές των μετρήσεων καταγράφονται πάνω σε ημιλογαριθμικό χάρτη όπου παρίσταται η σχέση του λογαρίθμου των συγκεντρώσεων ως προς τις διαμέτρους των ζωνών αναστολής. Χαράσσονται οι πιο αντιπροσωπευτικές ευθείες για το πρότυπο διάλυμα και το εκχύλισμα ακολουθώντας τον τρόπο που περιγράφεται κατωτέρω:

Προσδιορίζεται το πιο αντιπροσωπευτικό σημείο για το μικρότερο διάλυμα του προτύπου (SL) βάσει του τύπου:

1.2 // (α) SL = // 7s1 + 4s2 + s4 - 2s8 10

Προσδιορίζεται το πιο αντιπροσωπευτικό σημείο για το μεγαλύτερο διάλυμα του προτύπου (SH) βάσει του τύπου:

1.2 // (β) SH = // 7s8 + 4s4 + s2 - 2s1 10

Κατά τον ίδιο τρόπο υπολογίζονται τα πιο αντιπροσωπευτικά σημεία για το μικρότερο διάλυμα του εκχυλίσματος (UL) και το μεγαλύτερο διάλυμα (UH), αντικαθιστώντας στους παραπάνω τύπους τα s1, s2, s4 και s8 με u1, u2, u4 και u8 αντιστοίχως.

Οι τιμές SL και SH καταγράφονται στο ίδιο διάγραμμα και συνδέοντας τα δύο σημεία λαμβάνεται η πιο αντιπροσωπευτική ευθεία για το πρότυπο διάλυμα. Ακολουθώντας τον ίδιο τρόπο για τις τιμές UL και UH λαμβάνεται η πιο αντιπροσωπευτική ευθεία για το εκχύλισμα.

Αν δεν υπάρχει παρεμβολή, οι ευθείες πρέπει να είναι παράλληλες. Για πρακτικούς λόγους οι ευθείες μπορούν να θεωρηθούν παράλληλες αν οι τιμές (SH - SL) και (UH - UL) δεν αποκλίνουν περισσότερο από 10 % από το μέσο όρο τους.

Αν οι ευθείες δεν είναι παράλληλες μπορούν να παραλειφθούν είτε τα u1 και s1 είτε τα u8 και s8. Στην περίπτωση αυτή τα SL, SH, UL και UH υπολογίζονται από τους ακόλουθους τύπους, προκειμένου να ληφθούν πιο αντιπροσωπευτικές ευθείες:

1.2.3.4 // (α' ) SL = // 5s1 + 2s2 - s4 6 // ή // 5s2 + 2s4 - s8 6 // (β' ) SH = // 5s4 + 2s2 - s1 6 // ή // 5s8 + 2s4 - s2 6

Κατά τον ίδιο τρόπο υπολογίζονται τα UL και UH. Τα ίδια κριτήρια παραλληλίας πρέπει να ισχύουν και στην εναλλακτική αυτή λύση. Στην τελική έκθεση θα πρέπει να αναφέρεται ότι για τον υπολογισμό του αποτελέσματος χρησιμοποιήθηκαν τρία επίπεδα.

Όταν οι ευθείες θεωρούνται παράλληλες, ο λογάριθμος της σχετικής δραστικότητας (log. A) υπολογίζεται από έναν από τους ακόλουθους τύπους, ανάλογα με το αν χρησιμοποιήθηκαν τρία ή τέσσερα διαλύματα για την εκτίμηση της παραλληλίας.

Για τέσσερα διαλύματα

1.2 // (γ) Log A = // (u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8) x 0,602 u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2

Για τρία διαλύματα

1.2 // (δ) Log A = // (u1 + u2 + u4 - s1 - s2 - s4) x 0,401 u4 + s4 - u1 - s1 // ή // // (δ' ) Log A = // (u2 + u4 + u8 - s2 - s4 - s8) x 0,401 u8 + s8 - u2 - s2 // //

Δραστικότητα του εκχυλίσματος του δείγματος = δραστικότητα του αντίστοιχου προτύπου x Α:

U8 = S8 x A

Αν η τιμή της σχετικής δραστικότητος βρίσκεται έξω από τη σειρά των τιμών που περιλαμβάνονται μεταξύ 0,5 και 2,0, ο προσδιορισμός επαναλαμβάνεται ρυθμίζοντας κατάλληλα τις συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος ή, ενδεχόμενα, τις συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυμάτων. Όταν δεν μπορεί να επιτευχθεί σχετική δραστικότης που να βρίσκεται μέσα στα όρια των απαιτουμένων τιμών, το λαμβανόμενο αποτέλεσμα πρέπει να θεωρείται κατά προσέγγιση και αυτό να αναφέρεται στην τελική έκθεση.

Όταν οι ευθείες δεν θεωρούνται παράλληλες, ο προσδιορισμός επαναλαμβάνεται: Αν ποτέ δεν επιτευχθεί παραλληλία ο προσδιορισμός θεωρείται μη ικανοποιητικός. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε χιλιοστόγραμμα virginiamycin ανά χιλιόγραμμο ζωοτροφής. 9. Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιήθηκαν στο ίδιο δείγμα, από τον ίδιο αναλυτή, δεν πρέπει να υπερβαίνει:

- τα 2 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες σε virginiamycin έως 10 mg/kg,

- το 20 % του υψηλοτέρου αποτελέσματος για περιεκτικότητες από 10 έως 25 mg/kg,

- τα 5 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες από 25 έως 50 mg/kg,

- το 10 % του υψηλοτέρου αποτελέσματος για περιεκτικότητες άνω των 50 mg/kg.»

(1) 1 mg virginiamycin ισοδυναμεί με 1 000 μονάδες UK.

(α) Άλλες μέθοδοι οι οποίες δίνουν, αποδεδειγμένα, ανάλογα μικροβιακά εναιωρήματα μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν.

(β) Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε θρεπτικό υλικό του εμπορίου το οποίο έχει ανάλογη σύσταση και δίνει τα ίδια αποτελέσματα.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙΙ

«1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ZING BACITRACIN

- δια διαχύσεως σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό -

1. Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της Zing bacitracin στις ζωοτροφές και τα προμείγματα. Το κατώτατο όριο προσδιορισμού είναι 5 mg/kg (5ppm) (1).

2. Αρχή

Το δείγμα εκχυλίζεται σε pH 2 με μείγμα μεθανόλης/νερού/υδροχλωρικού οξέος και διάλυμα θειούχου νατρίου. Το θειούχο νάτριο χρησιμοποιείται για την καθίζηση διαλυτών αλάτων του χαλκού που ενδέχεται να παρεμβληθούν στον προσδιορισμό. Το εκχύλισμα φέρεται σε pH 6,5 συμπυκνώνεται (αν είναι αναγκαίο) και αραιώνεται. Η αντιβιοτική του δραστικότης προσδιορίζεται μετρώντας τη διάχυση της Zing bacitracin σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό που έχει ενοφθαλμιστεί με Micrococcus luteus (flavus). Η διάχυση διαπιστώνεται από το σχηματισμό ζωνών αναστολής της μικροβιακής ανάπτυξης. Η διάμετρος των ζωνών αυτών θεωρείται ευθέως ανάλογη προς το λογάριθμο της συγκεντρώσεως του αντιβιοτικού για τις διάφορες συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν.

3. Μικροοργανισμός: Micrococcus luteus (flavus) ATCC 10240

3.1. Διατήρηση του στελέχους

Κεκλιμένοι σωλήνες που περιέχουν θρεπτικό υλικό (4.1) ενοφθαλμίζονται με Micrococcus luteus (flavus) και επωάζονται επί 24 ώρες στους 30 ° C. Η καλλιέργεια διατηρείται σε ψυγείο στους 4 ° C περίπου και ανανεώνεται κάθε δύο εβδομάδες.

3.2. Προετοιμασία του μικροβιακού εναιωρήματος (α)

Συλλέγονται τα σπόρια από ένα σωλήνα με αγαρούχο θρεπτικό υλικό (3.1) πρόσφατης παρασκευής με τη βοήθεια 2 έως 3 ml διαλύματος χλωριούχου νατρίου (4.3). Το εναιώρημα αυτό χρησιμοποιείται για τον ενοφθαλμισμό 250 ml θρεπτικού υλικού (4.1) μέσα σε φιάλη Roux. Επωάζεται επί 18 έως 20 ώρες στους 30 ° C. Τα σπόρια συλλέγονται με τη βοήθεια 25 ml διαλύματος χλωριούχου νατρίου (4.3).

Το εναιώρημα αναδεύεται και ακολούθως αραιώνεται στο 1/10 με διάλυμα χλωριούχου νατρίου (4.3). Στιβάδα του εναιωρήματος, πάχους 1 cm, εξεταζόμενη στα 650 nm ως προς διάλυμα χλωριούχου νατρίου (4.3) πρέπει να επιτρέπει τη δίοδο σε 75 % περίπου του προσπίπτοντος φωτός. Το εναιώρημα αυτό μπορεί να διατηρηθεί μία εβδομάδα στους 4 ° C περίπου.

4. Θρεπτικά υλικά και αντιδραστήρια

4.1. Θρεπτικό υλικό για τη διατήρηση του στελέχους (β)

1.2 // Πεπτόνη κρέατος // 6,0 g // Τρυπτόνη // 4,0 g // Εκχύλισμα μαγιάς // 3,0 g // Εκχύλισμα κρέατος // 1,5 g // Γλυκόζη // 1,0 g // Άγαρ // 10,0 έως 20,0 g // Νερό // 1 000 ml // pH 6,5 - 6,6 (μετά από αποστείρωση)· //

4.2. Θρεπτικό υλικό για τον προσδιορισμό (β)

1.2 // Τρυπτόνη // 10,0 g // Εκχύλισμα μαγιάς // 3,0 g // Εκχύλισμα κρέατος // 1,5 g // Γλυκόζη // 1,0 g // Άγαρ // 10,0 έως 20,0 g // Tween 80 // 1 ml // Νερό // 1 000 ml // pH 6,5 (μετά από αποστείρωση)· //

4.3. Διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,8 % (w/v): διαλύονται 8 g χλωριούχου νατρίου μέσα σε νερό και αραιώνονται για να ληφθεί τελικός όγκος 1 000 ml. Το διάλυμα αποστειρώνεται.

4.4. Μείγμα μεθανόλης/νερού/ υδροχλωρικού οξέος (4.6): 80/17,5/2,5 (v/v/v).

4.5. Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pH 6,5:

1.2 // Όξινο φωσφορικό κάλιο K2HPO4 // 22,15 g // Διόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4 // 27,85 g // Νερό έως // 1 000 ml

4.6. Υδροχλωρικό οξύ, d = 1,18 - 1,19

4.7. Υδροχλωρικό οξύ, 0,1 Μ

4.8. Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 1 Μ

4.9. Διάλυμα θειούχου νατρίου 0,5 M περίπου

4.10. Διάλυμα πορφυρού βρωμοκρεσόλης 0,04 % (w/v): διαλύεται 0,1 g πορφυρού βρωμοκρεσόλης μέσα σε 18,5 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 0,01 Μ. Προστίθεται νερό ώστε να ληφθεί τελικός όγκος 250 ml και αναδεύεται.

4.11. Πρότυπη ουσία: Zinc bacitracin γνωστής δραστικότητος (σε ΔΜ)

5. Πρότυπα διαλύματα

Ζυγίζεται ποσότητα πρότυπης Zing bacitracin (4.11) η οποία να αντιστοιχεί σε 1 050 ΔΜ (σύμφωνα με την αναφερόμενη ένδειξη. Προστίθενται 5 ml υδροχλωρικού οξέος 0,1 Μ (4.7) και αφήνεται σε ηρεμία επί 15 λεπτά. Προστίθενται 30 ml νερού και ρυθμίζεται το pH στα 4,5 με τη βοήθεια ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (4.5) (περίπου 4 ml). Προστίθεται νερό ώστε να ληφθεί τελικός όγκος 50 ml και αναδεύεται καλά (1 ml = 21 ΔΜ).

Από το διάλυμα αυτό παρασκευάζονται μετά από διαδοχικές αραιώσεις με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (4.5) τα ακόλουθα διαλύματα:

S8 0,42 ΔΜ/ml

S4 0,21 ΔΜ/ml

S2 0,105 ΔΜ/ml

S1 0,0525 ΔΜ/ml

6. Προετοιμασία του εκχυλίσματος και των διαλυμάτων

6.1. Εκχύλιση

6.1.1. Π ρ ο μ ε ί γ μ α τ α κ α ι α ν ό ρ γ α ν ε ς ζ ω ο τ ρ ο φ έ ς

Ζυγίζονται 2,0 έως 5,0 g δείγματος, προστίθενται 29,0 ml μείγματος (4.4) και 1,0 ml διαλύματος θειούχου νατρίου (4.9) και αναδεύεται λίγο. Ελέγχεται αν το pH είναι περίπου 2. Αναδεύεται επί 10 λεπτά, προστίθενται 30 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (4.5), αναδεύεται επί 15 λεπτά και φυγοκεντρείται. Από το υπερκείμενο διάλυμα λαμβάνεται κατάλληλη ποσότητα και ρυθμίζεται το pH στα 6,5 με τη βοήθεια διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 1 Μ (4.8) χρησιμοποιώντας pHμετρο ή διάλυμα πορφυρού βρωμοκρεσόλης (4.10) για δείκτη. Αραιώνεται με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (4.5) ώστε η αναμενόμενη περιεκτικότητα σε Zinc bacitracin να είναι 0,42 ΔΜ/ml (= U8).

6.1.2. Π ρ ω τ ε ϊ ν ι κ ά σ υ μ π υ κ ν ώ μ α τ α

Ζυγίζονται 10,0 g δείγματος, προστίθενται 49,0 ml μείγματος (4.4) και 1,0 ml διαλύματος θειούχου νατρίου (4.9) και αναδεύεται λίγο. Ελέγχεται αν το pH είναι περίπου 2. Αναδεύεται επί 10 λεπτά, προστίθενται 50 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (4.5), αναδεύεται επί 15 λεπτά και φυγοκεντρείται. Από το υπερκείμενο διάλυμα λαμβάνεται κατάλληλη ποσότητα και ρυθμίζεται το pH στα 6,5 με τη βοήθεια διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 1 Μ (4.8) χρησιμοποιώντας pHμετρο ή διάλυμα πορφυρού βρωμοκρεσόλης (4.10) για δείκτη. Εξατμίζεται σε περιστροφική αντλία εξατμίσεως και σε θερμοκρασία όχι μεγαλύτερη από 35 ° C έως ότου ληφθεί ο μισός του αρχικού όγκου. Αραιώνεται με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (4.5) έτσι ώστε η αναμενόμενη περιεκτικότητα σε Zinc bacitracin να είναι 0,42 ΔΜ/ml (= U8).

6.1.3. Ά λ λ ε ς ζ ω ο τ ρ ο φ έ ς

Ζυγίζονται 10,0 g δείγματος (20,0 g για αναμενόμενη περιεκτικότητα σε Zinc bacitracin 5 mg/kg). Προστίθενται 24 ml μείγματος (4.4) και 1,0 ml διαλύματος θειούχου νατρίου (4.9) και ομογενοποιούνται επί 10 λεπτά. Προστίθενται 25 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (4.5), αναδεύεται επί 15 λεπτά και φυγοκεντρείται. Από το υπερκείμενο διάλυμα λαμβάνονται 20 ml και ρυθμίζεται το pH στο 6,5 με τη βοήθεια διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 1 Μ (4.8), χρησιμοποιώντας pH μετρο ή διάλυμα πορφυρού βρωμοκρεσόλης (4.10) για δείκτη. Εξατμίζεται σε περιστροφική αντλία εξατμίσεως και σε θερμοκρασία όχι μεγαλύτερη από 35 ° C έως ότου απομείνουν 4 ml. Το υπόλειμμα αραιώνεται με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (4.5) έτσι ώστε η αναμενόμενη περιεκτικότητα σε Zing bacitracin να είναι 0,42 ΔΜ/ml (= U8).

6.2. Διαλύματα

Από το διάλυμα U8 παρασκευάζονται τα διαλύματα U4 (αναμενόμενη συγκέντρωση: 0,21 ΔΜ/ml), U2 (αναμενόμενη συγκέντρωση: 0,105 ΔΜ/ml) και U1 (αναμενόμενη συγκέντρωση: 0,0525 ΔΜ/ml) μετά από διαδοχικές αραιώσεις (1 + 1) με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (4.5). 7. Τρόπος προσδιορισμού

7.1. Ενοφθαλμισμός του θρεπτικού υλικού

Γίνεται ενοφθαλμισμός του θρεπτικού υλικού (4.2) με το μικροβιακό εναιώρημα (3.2) στους 50 ° C περίπου. Από προκαταρκτικές δοκιμές σε τριβλίο με θρεπτικό υλικό (4.2) προσδιορίζεται η ποσότητα του μικροβιακού εναιωρήματος που απαιτείται για να ληφθούν όσο το δυνατόν ευρύτερες και σαφέστερες ζώνες αναστολής με τις διάφορες συγκεντρώσεις της Zinc bacitracin.

7.2. Προετοιμασία των τριβλίων

Η διάχυση πάνω σε αγαρούχο θρεπτικό υλικό πραγματοποιείται μέσα σε τριβλία με τις τέσσερις συγκεντρώσεις του προτύπου διαλύματος (S8, S4, S2, S1) και τις τέσσερις συγκεντρώσεις του διαλύματος του εκχυλίσματος (U8, U4, U2, U1). Σε κάθε τριβλίο πρέπει να τοποθετηθούν απαραίτητα οι τέσσερις αυτές συγκεντρώσεις εκχυλίσματος και προτύπου. Για το λόγο αυτό το μέγεθος των τριβλίων πρέπει να είναι αρκετά μεγάλο ώστε να είναι δυνατόν να σχηματιστούν στο θρεπτικό υλικό τουλάχιστον οκτώ οπές διαμέτρου 10 έως 13 mm των οποίων τα κέντρα δεν απέχουν λιγότερο από 30 mm μεταξύ τους. Αντί των τριβλίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν γυάλινες πλάκες πάνω από τις οποίες τοποθετούνται δακτύλιοι από αλουμίνιο ή πλαστικό, διαμέτρου 200 mm και ύψους 20 mm. Εισάγεται μέσα στα τριβλία ποσότητα θρεπτικού υλικού (4.2) η οποία έχει ενοφθαλμιστεί όπως περιγράφεται στο σημείο 7.1, έτσι ώστε να ληφθεί στιβάδα πάχους 2 mm περίπου (60 ml για τριβλίο διαμέτρου 200 mm). Αφήνεται να στερεοποιηθεί, ανοίγονται οι οπές και τοποθετούνται σ' αυτές επακριβώς μετρημένοι όγκοι διαλυμάτων του προτύπου και του εκχυλίσματος (0,10 έως 0,15 ml ανά οπή) ανάλογα με τη διάμετρο. Γίνονται τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις με κάθε συγκέντρωση, έτσι ώστε σε κάθε προσδιορισμό να υπολογίζονται 32 ζώνες αναστολής.

7.3. Επώαση

Τα τριβλία επωάζονται επί 16 έως 18 ώρες στους 30 ± 2 ° C.

8. Υπολογισμός

Μετράται η διάμετρος των ζωνών αναστολής με ακρίβεια 0,1 mm. Για κάθε συγκέντρωση, οι μέσες τιμές των μετρήσεων καταγράφονται πάνω σε ημιλογαριθμικό χάρτη όπου παρίσταται η σχέση του λογαρίθμου των συγκεντρώσεων ως προς τις διαμέτρους των ζωνών αναστολής. Χαράσσονται οι πιο αντιπροσωπευτικές ευθείες για το πρότυπο διάλυμα και το εκχύλισμα ακολουθώντας τον τρόπο που περιγράφεται κατωτέρω:

Προσδιορίζεται το πιο αντιπροσωπευτικό σημείο για το μικρότερο διάλυμα του προτύπου (SL) βάσει του τύπου:

1.2 // (α) SL = // 7s1 + 4s2 + s4 - 2s8 10

Προσδιορίζεται το πιο αντιπροσωπευτικό σημείο για το μεγαλύτερο διάλυμα του προτύπου (SH) βάσει του τύπου:

1.2 // (β) SH = // 7s8 + 4s4 + s2 - 2s1 10

Κατά τον ίδιο τρόπο υπολογίζονται τα πιο αντιπροσωπευτικά σημεία για το μικρότερο διάλυμα του εκχυλίσματος (UL) και το μεγαλύτερο διάλυμα του εκχυλίσματος (UH), αντικαθιστώντας στους παραπάνω τύπους τα s1, s2, s4 και s8 με u1, u2, u4 και u8 αντιστοίχως.

Οι τιμές SL και SH καταγράφονται στο ίδιο διάγραμμα και, συνδέοντας τα δύο σημεία, λαμβάνεται η πιο αντιπροσωπευτική ευθεία για το πρότυπο διάλυμα. Ακολουθώντας τον ίδιο τρόπο για τις τιμές UL και UH λαμβάνεται η πιο αντιπροσωπευτική ευθεία για το εκχύλισμα.

Αν δεν υπάρχει παρεμβολή, οι ευθείες πρέπει να είναι παράλληλες. Για πρακτικούς λόγους οι ευθείες μπορούν να θεωρηθούν παράλληλες αν οι τιμές (SH - SL) και (UH - UL) δεν αποκλίνουν περισσότερο από 10 % από το μέσο όρο τους.

Αν οι ευθείες δεν είναι παράλληλες μπορούν να παραλειφθούν είτε τα u1 και s1 είτε τα u8 και s8. Στην περίπτωση αυτή τα SL, SH, UL και UH υπολογίζονται από τους ακόλουθους τύπους, προκειμένου να ληφθούν πιο αντιπροσωπευτικές ευθείες:

1.2.3.4 // (α' ) SL = // 5s1 + 2s2 - s4 6 // ή // 5s2 + 2s4 - s8 6 // (β' ) SH = // 5s4 + 2s2 - s1 6 // ή // 5s8 + 2s4 - s2 6

Κατά τον ίδιο τρόπο υπολογίζονται τα UL και UH. Τα ίδια κριτήρια παραλληλίας πρέπει να ισχύουν και στην εναλλακτική αυτή λύση. Στην τελική έκθεση θα πρέπει να αναφέρεται ότι για τον υπολογισμό του αποτελέσματος χρησιμοποιήθηκαν τρία διαλύματα. Όταν οι ευθείες θεωρούνται παράλληλες, ο λογάριθμος της σχετικής δραστικότητας (log Α) υπολογίζεται από έναν από τους ακόλουθους τύπους, ανάλογα με το αν χρησιμοποιήθηκαν τρία ή τέσσερα διαλύματα για την εκτίμηση της παραλληλίας.

Για τέσσερα διαλύματα

1.2 // (γ) Log A = // (u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8) x 0,602 u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2

Για τρία διαλύματα

1.2 // (δ) Log A = // (u1 + u2 + u4 - s1 - s2 - s4) x 0,401 u4 + s4 - u1 - s1 // ή // // (δ' ) Log Α = // (θ2 + θ4 + θ8 - σ2 - σ4 - σ8) x 0,401

θ8 + σ8 - θ2 - σ2

Δραστικότης του εκχυλίσματος του δείγματος = δραστικότης του αντίστοιχου προτύπου x Α:

U8 = S8 x A

Αν η τιμή της σχετικής δραστικότητος βρίσκεται έξω από τη σειρά των τιμών που περιλαμβάνονται μεταξύ 0,5 και 2,0, ο προσδιορισμός επαναλαμβάνεται ρυθμίζοντας κατάλληλα τις συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος ή, ενδεχόμενα, τις συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυμάτων. Όταν δεν μπορεί να επιτευχθεί σχετική δραστικότης που να βρίσκεται μέσα στα όρια των απαιτουμένων τιμών, το λαμβανόμενο αποτέλεσμα πρέπει να θεωρείται κατά προσέγγιση και αυτό να αναφέρεται στην τελική έκθεση.

Όταν οι ευθείες δεν θεωρούνται παράλληλες, ο προσδιορισμός επαναλαμβάνεται.

Αν ποτέ δεν επιτευχθεί παραλληλία ο προσδιορισμός θεωρείται μη ικανοποιητικός.

Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε mg Zinc bacitracin ανά kg ζωοτροφής.

9. Επαναληψιμότητα

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιήθηκαν στο ίδιο δείγμα, από τον ίδιο αναλυτή, δεν πρέπει να υπερβαίνει:

- τα 2 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες σε Zinc bacitracin έως 10 mg/kg,

- το 20 % του υψηλοτέρου αποτελέσματος για περιεκτικότητες από 10 έως 25 mg/kg,

- τα 5 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες από 25 έως 50 mg/kg,

- το 10 % του υψηλοτέρου αποτελέσματος για περιεκτικότητες άνω των 50 mg/kg.»

(1) 1 mg Zing bacitracin (ποιότητας για ζωοτροφές) ισοδυναμεί με 42 διεθνείς μονάδες (ΔΜ).

(α) Άλλες μέθοδοι, οι οποίες αποδεδειγμένα δίνουν ανάλογα μικροβιακά εναιωρήματα, μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν.

(β) Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε θρεπτικό υλικό του εμπορίου το οποίο έχει ανάλογη σύσταση και δίνει τα ίδια αποτελέσματα.