ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VI

1. ΜΕΘΟΔΟΣ

Η παρούσα μέθοδος είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή TG 221 (2006) του ΟΟΣΑ (1). Οι αρχές της Ευρωπαϊκής Ένωσης (ΕΕ) συμφώνησαν γενικά ότι η δοκιμή σε Lemna αποτελεί κατάλληλη εναλλακτική επιλογή αντί της δοκιμής σε φύκη για τις ουσίες έντονου χρώματος (2)(3).

1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η παρούσα μέθοδος δοκιμών προορίζεται για την εκτίμηση της τοξικότητας ουσιών για τα υδρόβια φυτά των γλυκών υδάτων του γένους Lemna (κοινώς, λέμνα ή φακή του νερού). Η μέθοδος βασίζεται στις υφιστάμενες κατευθυντήριες γραμμές (4)(5)(6)(7)(8)(9), αλλά περιλαμβάνει τροποποιήσεις των αντίστοιχων μεθόδων, οι οποίες αποτυπώνουν τα αποτελέσματα πρόσφατων ερευνητικών εργασιών και διαβουλεύσεων για ορισμένα ζητήματα καίριας σημασίας. Η προτεινόμενη μέθοδος επικυρώθηκε με διεθνή κυκλική δοκιμή (ring-test) (10).

Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών περιγράφεται η διεξαγωγή δοκιμής τοξικότητας με χρήση των ειδών Lemna gibba και Lemna minor, που έχουν μελετηθεί εκτενώς και αποτελούν το αντικείμενο των προαναφερόμενων προτύπων. Η συστηματική κατάταξη του φυτού Lemna spp. είναι δύσκολη, διότι περιπλέκεται από την ύπαρξη πληθώρας φαινοτύπων. Παρόλο που μπορεί να παρουσιαστεί γενετική μεταβλητότητα της απόκρισης της λέμνας σε τοξικούς παράγοντες, τα σχετικά με αυτό το αίτιο μεταβλητότητας δεδομένα δεν επαρκούν, προς το παρόν, ώστε να υποδειχθεί η χρήση συγκεκριμένου κλώνου κατά την εφαρμογή της παρούσας μεθόδου. Σημειωτέον ότι η δοκιμή δεν διεξάγεται με αξενικές (χωρίς παρουσία ξένων οργανισμών) καλλιέργειες, λαμβάνονται όμως μέτρα σε διάφορα στάδια της διαδικασίας δοκιμής για την ελαχιστοποίηση της μόλυνσης από άλλους οργανισμούς.

Περιγράφεται λεπτομερώς η διεξαγωγή της δοκιμής με ανανέωση (ημιστατικό και συνεχές σύστημα) και χωρίς ανανέωση (στατικό σύστημα) του διαλύματος δοκιμής. Ανάλογα με τους στόχους της δοκιμής και τις απαιτήσεις των κανονιστικών ρυθμίσεων, συνιστάται να εξετάζεται το ενδεχόμενο εφαρμογής των ημιστατικών και των συνεχών τεχνικών, π.χ. στην περίπτωση των ουσιών που εξαφανίζονται ταχέως από το διάλυμα, λόγω εξάτμισης, φωτοαποικοδόμησης, καθίζησης ή βιοαποικοδόμησης. Περαιτέρω καθοδήγηση παρέχεται στη δημοσίευση (11).

1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ

Για τους σκοπούς της παρούσας μεθόδου δοκιμών, χρησιμοποιούνται οι ακόλουθοι ορισμοί και συντμήσεις:

Βιομάζα: το ξηρό βάρος της ζώσας ύλης την οποία περιέχει ένας πληθυσμός. Στην παρούσα δοκιμή, μετρώνται συνήθως υποκατάστατα της βιομάζας, όπως ο αριθμός θαλλών ή η θαλλική επιφάνεια. Ως εκ τούτου, ο όρος βιομάζα αναφέρεται και σε αυτά τα υποκατάστατα μέτρα.

Χλώρωση: ο κίτρινος χρωματισμός του θαλλικού ιστού.

Κλώνος: οργανισμός ή κύτταρο που δημιουργείται με αγενή πολλαπλασιασμό από ένα μόνο άτομο. Συνεπώς, τα μέλη του ίδιου κλώνου είναι γενετικώς πανομοιότυπα.

Αποικία: συσσωμάτωμα μητρικών και θυγατρικών θαλλών (συνήθως 2 έως 4), συνδεδεμένων μεταξύ τους. Μερικές φορές, αναφέρεται ως φυτό.

ECx : η συγκέντρωση της ελεγχόμενης ουσίας, διαλελυμένης στο υλικό δοκιμής, η οποία προκαλεί μείωση της ανάπτυξης της λέμνας κατά x % (π.χ. 50 %) εντός της δηλούμενης περιόδου έκθεσης (πρέπει να αναφέρεται επακριβώς, εάν διαφέρει από την πλήρη ή κανονική διάρκεια της δοκιμής). Για να δηλώνεται σαφώς αν η τιμή EC έχει προκύψει από τον ρυθμό ανάπτυξης ή από την απόδοση, χρησιμοποιούνται τα σύμβολα «ErC» και «EyC», αντίστοιχα, ακολουθούμενα από τη μεταβλητή που μετρήθηκε, π.χ. ErC (αριθμός θαλλών).

Συνεχής δοκιμή: η δοκιμή στην οποία τα διαλύματα δοκιμής αντικαθίστανται συνεχώς.

Θαλλός: ατομική/μεμονωμένη «φυλλοειδής» δομή του φυτού λέμνα. Πρόκειται για τη μικρότερη μονάδα, δηλαδή άτομο, με ικανότητα αναπαραγωγής.

Κυφότητα: οι θαλλοί που εμφανίζουν εξόγκωμα ή διόγκωση.

Ανάπτυξη: η αύξηση της μετρούμενης μεταβλητής — αριθμός θαλλών, ξηρό βάρος, υγρό (νωπό) βάρος ή θαλλική επιφάνεια— στη διάρκεια της δοκιμής.

Ρυθμός ανάπτυξης (μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης): η λογαριθμική αύξηση της βιομάζας κατά την περίοδο έκθεσης.

Κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης (LOEC, από τα αρχικά των αγγλικών λέξεων Lowest Observed Effect Concentration): η χαμηλότερη ελεγχθείσα συγκέντρωση, στην οποία παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης (με p < 0,05) υπό την επίδραση της ουσίας, σε σύγκριση με τον μάρτυρα, εντός δεδομένου χρόνου έκθεσης. Ωστόσο, όλες οι ελεγχόμενες συγκεντρώσεις που υπερβαίνουν τη LOEC πρέπει να έχουν βλαβερή επίδραση ίση ή μεγαλύτερη από εκείνη που παρατηρείται στη LOEC. Σε περίπτωση όπου δεν είναι δυνατόν να πληρούνται οι δύο αυτοί όροι, πρέπει να εξηγείται πλήρως ο τρόπος επιλογής της LOEC (και, κατ’ επέκταση, της NOEC).

Μετρούμενες μεταβλητές: κάθε είδους μεταβλητή που μετράται, προκειμένου να εκφραστεί το τελικό σημείο της δοκιμής με χρήση μίας ή περισσότερων διαφορετικών μεταβλητών απόκρισης. Στην παρούσα μέθοδο, μετρούμενες μεταβλητές είναι ο αριθμός θαλλών, η θαλλική επιφάνεια, το υγρό βάρος και το ξηρό βάρος.

Μονοκαλλιέργεια: καλλιέργεια με ένα μόνο είδος φυτού.

Νέκρωση: νεκρός (δηλαδή λευκός ή διαποτισμένος με νερό) θαλλικός ιστός.

Συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC από τα αρχικά των αγγλικών λέξεων No Observed Effect Concentration): η αμέσως μικρότερη από τη LOEC ελεγχόμενη συγκέντρωση.

Φαινότυπος: τα αντιληπτά χαρακτηριστικά ενός οργανισμού, τα οποία καθορίζονται από την αλληλεπίδραση των γονιδίων του με το περιβάλλον του.

Μεταβλητές απόκρισης: μεταβλητές για την εκτίμηση της τοξικότητας, οι οποίες προκύπτουν, με διάφορες μεθόδους υπολογισμού, από τις μετρούμενες μεταβλητές που περιγράφουν τη βιομάζα. Στην παρούσα μέθοδο, ο ρυθμός ανάπτυξης και η απόδοση είναι μεταβλητές απόκρισης που προκύπτουν από μετρούμενες μεταβλητές, όπως ο αριθμός θαλλών, η θαλλική επιφάνεια, το υγρό βάρος ή το ξηρό βάρος.

Ημιστατική δοκιμή (ανανέωσης): η δοκιμή στη διάρκεια της οποίας το διάλυμα δοκιμής αντικαθίσταται σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα.

Στατική δοκιμή: η δοκιμή στη διάρκεια της οποίας δεν ανανεώνεται το διάλυμα δοκιμής.

Τελικό σημείο της δοκιμής: περιγράφει, ως στόχο της δοκιμής, τον γενικό παράγοντα που θα μεταβληθεί υπό την επίδραση της ελεγχόμενης χημικής ουσίας σε σχέση με τον μάρτυρα. Στην παρούσα μέθοδο, τελικό σημείο της δοκιμής είναι η αναστολή (παρεμπόδιση) της ανάπτυξης, η οποία μπορεί να εκφραστεί με διάφορες μεταβλητές απόκρισης, βασιζόμενες σε μία ή περισσότερες μετρούμενες μεταβλητές.

Υλικό δοκιμής: το πλήρες συνθετικό θρεπτικό υλικό, στο οποίο αναπτύσσονται τα φυτά της δοκιμής, όταν εκτίθενται στην ελεγχόμενη ουσία. Η ελεγχόμενη ουσία είναι κατά κανόνα διαλελυμένη στο υλικό δοκιμής.

Απόδοση: ισούται με την τιμή της μετρούμενης μεταβλητής που εκφράζει τη βιομάζα, στο τέλος της περιόδου έκθεσης μείον την τιμή της ίδιας μεταβλητής στην αρχή της περιόδου έκθεσης.

1.3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ

Λογαριθμικές (εκθετικές) καλλιέργειες φυτών του γένους Lemna αφήνονται να αναπτυχθούν ως μονοκαλλιέργειες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας για περίοδο επτά ημερών. Σκοπός τη δοκιμής είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιδράσεων της ουσίας στη βλαστητική αύξηση κατά την ανωτέρω περίοδο, με βάση εκτιμήσεις των επιλεγμένων μετρούμενων μεταβλητών. Ο αριθμός θαλλών είναι η πρωταρχική μετρούμενη μεταβλητή. Μετράται επίσης τουλάχιστον μία ακόμη μεταβλητή (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος), επειδή ορισμένες ουσίες είναι δυνατόν να έχουν πολύ μεγαλύτερη επίδραση σε άλλες μετρούμενες μεταβλητές απ’ όση στον αριθμό θαλλών. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιδράσεων της ουσίας, συγκρίνεται η ανάπτυξη στα διαλύματα δοκιμής με εκείνη των μαρτύρων και προσδιορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης κατά συγκεκριμένο ποσοστό x % (π.χ. 50 %), η οποία εκφράζεται ως ECx (π.χ. EC50).

Το τελικό σημείο της δοκιμής είναι η αναστολή της ανάπτυξης, εκφραζόμενη ως λογαριθμική αύξηση της μετρούμενης μεταβλητής (μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης) στη διάρκεια της περιόδου έκθεσης. Από τους μέσους ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης που καταγράφονται για μια σειρά διαλυμάτων δοκιμής, προσδιορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης κατά συγκεκριμένο ποσοστό x % (π.χ. 50 %) και εκφράζεται ως ErCx (π.χ. ErC50).

Μία επιπλέον μεταβλητή απόκρισης που χρησιμοποιείται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών είναι η απόδοση, η οποία ενδέχεται να απαιτείται για τη συμμόρφωση με ειδικές κανονιστικές απαιτήσεις σε ορισμένες χώρες. Η απόδοση ορίζεται ως η διαφορά των μετρούμενων μεταβλητών στο τέλος της περιόδου έκθεσης μείον τις μετρούμενες μεταβλητές στην αρχή της περιόδου αυτής. Από την απόδοση που καταγράφεται για μια σειρά διαλυμάτων δοκιμής, προσδιορίζεται η συγκέντρωση που προκαλεί αναστολή της απόδοσης κατά συγκεκριμένο ποσοστό x % (π.χ. 50 %) και εκφράζεται ως EyCx (π.χ. EyC50).

Επιπροσθέτως, μπορούν να προσδιοριστούν στατιστικά η κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης (LOEC) και η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC).

1.4. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΟΥΣΙΑ

Θα πρέπει να υπάρχει αναλυτική μέθοδος επαρκούς ευαισθησίας για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ουσίας στο υλικό δοκιμής.

Στις σχετικές με την ελεγχόμενη ουσία πληροφορίες, που μπορεί να είναι χρήσιμες για τον καθορισμό των συνθηκών δοκιμής, περιλαμβάνονται ο συντακτικός τύπος, η καθαρότητα, η υδατοδιαλυτότητα, η σταθερότητα στο νερό και στο φως, οι σταθερές pKa και Pow, η τάση ατμών και η βιοαποικοδομησιμότητα. Η υδατοδιαλυτότητα και η τάση ατμών μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον υπολογισμό της σταθεράς του νόμου του Henry, η οποία δείχνει αν είναι πιθανόν να σημειωθούν σημαντικές απώλειες της ελεγχόμενης ουσίας στη διάρκεια της δοκιμής. Με τον τρόπο αυτό κρίνεται ευκολότερα αν πρέπει να ληφθούν ιδιαίτερα μέτρα για τον έλεγχο των εν λόγω απωλειών. Σε περίπτωση που τα στοιχεία για τη διαλυτότητα και τη σταθερότητα της ελεγχόμενης ουσίας είναι αβέβαια, συνιστάται να εκτιμώνται οι ιδιότητες αυτές στις συνθήκες της δοκιμής, δηλαδή θρεπτικό υλικό και συνθήκες θερμοκρασίας και φωτισμού που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν στη δοκιμή.

Όταν ο έλεγχος του pH του υλικού δοκιμής έχει ιδιαίτερη σημασία, π.χ. στις δοκιμές μετάλλων ή ασταθών στην υδρόλυση ουσιών, συνιστάται η προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος στο θρεπτικό υλικό (βλέπε σημείο 1.7.4, πρώτο εδάφιο). Περαιτέρω καθοδήγηση για τον έλεγχο ουσιών που οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες δυσχεραίνουν τη δοκιμή τους παρέχονται στη δημοσίευση (11).

1.5. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ

Είναι δυνατόν να υποβληθούν σε δοκιμή μία ή περισσότερες ουσίες αναφοράς, όπως η 3,5-διχλωρο-φαινόλη που χρησιμοποιήθηκε στη διεθνή κυκλική δοκιμή (10), προκειμένου να ελεγχθεί η διαδικασία δοκιμής. Είναι σκόπιμο να υποβάλλεται η ουσία αναφοράς σε δοκιμή τουλάχιστον ανά εξάμηνο ή, στην περίπτωση των δοκιμών που διεξάγονται με μικρότερη συχνότητα, παράλληλα με τον προσδιορισμό της τοξικότητας της ελεγχόμενης ουσίας.

1.6. ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ

Για να είναι έγκυρη η δοκιμή, ο χρόνος διπλασιασμού του αριθμού θαλλών στον μάρτυρα πρέπει να μην υπερβαίνει τις 2,5 ημέρες (60 ώρες), τιμή που αντιστοιχεί περίπου σε επταπλασιασμό σε επτά ημέρες και σε μέσο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης 0,275 ημέρα–1. Με τα υλικά και στις συνθήκες δοκιμής που περιγράφονται στη παρούσα μέθοδο, το κριτήριο αυτό είναι δυνατόν να πληρούται σε στατικό σύστημα δοκιμής (8). Προβλέπεται επίσης ότι θα πληρούται σε συνθήκες ημιστατικής και συνεχούς δοκιμής. Ο υπολογισμός του χρόνου διπλασιασμού παρατίθεται στο σημείο 2.1.

1.7. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ

1.7.1. Εργαστηριακά σκεύη και όργανα

Όλα τα τεμάχια εξοπλισμού που πρόκειται να έλθουν σε επαφή με τα υλικά δοκιμής πρέπει να είναι κατασκευασμένα από γυαλί ή άλλο χημικώς αδρανές υλικό. Τα γυάλινα σκεύη που χρησιμοποιούνται για καλλιέργεια και δοκιμές θα πρέπει να καθαρίζονται για την απομάκρυνση των ξένων χημικών ουσιών, οι οποίες θα μπορούσαν να διεισδύσουν στο υλικό δοκιμής, και να είναι στείρα. Τα δοκιμαστικά δοχεία θα πρέπει να έχουν ικανό πλάτος, ώστε οι θαλλοί των διαφόρων αποικιών στα δοχεία μάρτυρες να μπορούν να αναπτυχθούν χωρίς να αλληλεπικαλύπτονται στο τέλος της δοκιμής. Δεν έχει σημασία αν οι ρίζες αγγίζουν τον πυθμένα των δοκιμαστικών δοχείων, συνιστάται όμως να έχει κάθε δοκιμαστικό δοχείο ελάχιστο βάθος 20 mm και ελάχιστο όγκο 100 ml. Η επιλογή τύπου δοκιμαστικών δοχείων δεν έχει κρίσιμη σημασία, εφόσον πληρούνται οι απαιτήσεις αυτές. Τα γυάλινα ποτήρια ζέσεως, δοχεία κρυστάλλωσης και τριβλία petri με τις ενδεδειγμένες διαστάσεις έχουν αποδειχθεί όλα κατάλληλα. Τα δοκιμαστικά δοχεία πρέπει να καλύπτονται, ώστε να ελαχιστοποιούνται η εξάτμιση και η συμπτωματική μόλυνση, ταυτόχρονα δε, να είναι δυνατή η αναγκαία ανταλλαγή αέρα. Τα κατάλληλα δοκιμαστικά δοχεία και, ιδίως, τα καλύμματα πρέπει να αποτρέπουν τη σκίαση και τις αλλαγές στα φασματικά χαρακτηριστικά του φωτός.

Οι καλλιέργειες και τα δοκιμαστικά δοχεία δεν θα πρέπει να φυλάσσονται μαζί. Ο καλύτερος τρόπος για να επιτευχθεί αυτό είναι η χρήση χωριστών θαλάμων, επωαστήρων ή δωματίων ανάπτυξης σε συνθήκες περιβάλλοντος. Ο φωτισμός και η θερμοκρασία πρέπει να μπορούν να ρυθμίζονται και να διατηρούνται σταθερά (βλέπε σημείο 1.7.8).

1.7.2. Οργανισμός δοκιμής

Ο οργανισμός που χρησιμοποιείται στην παρούσα δοκιμή είναι είτε το είδος Lemna gibba ή το Lemna minor. Σύντομες περιγραφές των ειδών λέμνας που έχουν χρησιμοποιηθεί σε δοκιμές τοξικότητας παρέχονται στο προσάρτημα 1. Το φυτικό υλικό μπορεί να ληφθεί από συλλογή καλλιεργειών, άλλο εργαστήριο ή από το ύπαιθρο. Εάν τα φυτά έχουν συλλεχθεί από το ύπαιθρο, θα πρέπει να διατηρούνται σε καλλιέργεια στο ίδιο θρεπτικό υλικό με εκείνο που χρησιμοποιείται στη δοκιμή, τουλάχιστον για οκτώ εβδομάδες πριν από τη χρήση τους. Οι υπαίθριοι χώροι από τους οποίους συλλέγονται τα φυτά των αρχικών καλιεργειών πρέπει να είναι απαλλαγμένοι από εμφανείς πηγές μόλυνσης. Ομοίως, εάν τα φυτά έχουν ληφθεί από άλλο εργαστήριο ή από συλλογή καλλιεργειών, θα πρέπει να διατηρούνται για χρονικό διάστημα τουλάχιστον τριών εβδομάδων. Θα πρέπει πάντα να αναφέρονται η πηγή του φυτικού υλικού, καθώς και το είδος και ο κλώνος (εφόσον είναι γνωστός) που χρησιμοποιήθηκαν στη δοκιμή.

Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μονοκαλλιέργειες, εμφανώς απαλλαγμένες από μόλυνση από άλλους οργανισμούς, όπως φύκη (άλγες) και πρωτόζωα. Τα υγιή φυτά του είδους L. minor συνίστανται από αποικίες που περιλαμβάνουν δύο έως πέντε θαλλούς, ενώ οι υγιείς αποικίες του L. gibba είναι δυνατόν να περιλαμβάνουν έως επτά θαλλούς.

Η ποιότητα και η ομοιομορφία των φυτών που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή επηρεάζουν σημαντικά την έκβασή της και, συνεπώς, πρέπει να επιλέγονται επιμελώς. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται νεαρά, ταχέως αναπτυσσόμενα φυτά, χωρίς ορατές αλλοιώσεις ούτε αποχρωματισμό (χλώρωση). Οι καλλιέργειες καλής ποιότητας χαρακτηρίζονται από υψηλή συχνότητα εμφάνισης αποικιών με δύο τουλάχιστον θαλλούς. Ο μεγάλος αριθμός μεμονωμένων θαλλών αποτελεί ένδειξη περιβαλλοντικής πίεσης, π.χ. περιορισμός θρεπτικών στοιχείων, και δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται στη δοκιμή φυτικό υλικό από τέτοιες καλλιέργειες.

1.7.3. Καλλιέργεια

Για λιγότερο συχνή διατήρηση της καλλιέργειας (π.χ. όταν δεν έχουν προγραμματιστεί δοκιμές σε λέμνα για κάποιο διάστημα), οι καλλιέργειες μπορούν να διατηρούνται σε συνθήκες ελαττωμένου φωτισμού και ελαττωμένης θερμοκρασίας (4-10 °C). Λεπτομέρειες σχετικά με την καλλιέργεια παρέχονται στο προσάρτημα 2. Τα προφανή σημεία μόλυνσης από φύκη ή άλλους οργανισμούς επιβάλλουν την επιφανειακή αποστείρωση ενός μερικού δείγματος θαλλών λέμνας, ακολουθούμενη από μεταφορά σε πρόσφατα παρασκευασμένο θρεπτικό υλικό (βλέπε προσάρτημα 2). Στην περίπτωση αυτή, η υπόλοιπη μολυσμένη καλλιέργεια θα πρέπει να απορρίπτεται.

Τουλάχιστον επτά ημέρες πριν από τη διεξαγωγή της δοκιμής, επαρκής αριθμός αποικιών μεταφέρονται ασηπτικά σε στείρο θρεπτικό υλικό πρόσφατης παρασκευής και καλλιεργούνται για 7-10 ημέρες στις συνθήκες της δοκιμής.

1.7.4. Υλικό δοκιμής

Συνιστώνται διαφορετικά θρεπτικά υλικά για το Lemna minor και το Lemna gibba, τα οποία περιγράφονται κατωτέρω. Θα πρέπει να μελετάται με προσοχή η προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος στο υλικό δοκιμής (MOPS [4-μορφολινοπροπανοσουλφονικό οξύ, αριθ. CAS: 1132-61-2, αριθ. EINECS: 214-478-5] στο υλικό για το L. minor και NaHCO3 στο υλικό για το L. gibba), εάν υπάρχουν υπόνοιες ότι ενδέχεται να αντιδράσει με την ελεγχόμενη ουσία και να επηρεάσει την έκφραση της τοξικότητάς της. Αποδεκτό είναι, επίσης, το υλικό Steinberg (12), εφόσον πληρούνται τα κριτήρια εγκυρότητας.

Για την καλλιέργεια και τις δοκιμές σε L. minor συνιστάται, τροποποιημένο, το πρότυπο θρεπτικό υλικό για λέμνα του Σουηδικού Ινστιτούτου Προτύπων (SIS). Η σύσταση του υλικού αυτού παρατίθεται στο προσάρτημα 3.

Για την καλλιέργεια και τις δοκιμές σε L. gibba συνιστάται το θρεπτικό υλικό 20X — AAP που περιγράφεται στο προσάρτημα 3.

Κατάλληλο για το είδος L. minor είναι, επίσης, το περιγραφόμενο στο προσάρτημα 3 υλικό Steinberg, το οποίο, ωστόσο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για το L. gibba, εφόσον πληρούνται τα κριτήρια εγκυρότητας.

1.7.5. Διαλύματα δοκιμής

Τα διαλύματα δοκιμής παρασκευάζονται συνήθως με αραίωση μητρικών διαλυμάτων. Τα μητρικά διαλύματα της ελεγχόμενης ουσίας παρασκευάζονται, κατά κανόνα, με διάλυση της ουσίας στο θρεπτικό υλικό.

Η υψηλότερη συγκέντρωση δοκιμής της ελεγχόμενης ουσίας θα πρέπει κανονικά να υπερβαίνει την υδατοδιαλυτότητά της στις συνθήκες της δοκιμής. Σημειωτέον, όμως, ότι τα φυτά Lemna spp. επιπλέουν στην επιφάνεια και είναι δυνατόν να εκτεθούν σε ουσίες που συσσωρεύονται στην επιφάνεια επαφής νερού-αέρα (π.χ. δυσδιάλυτες στο νερό ή υδρόφοβες ή επιφανειοδραστικές ουσίες). Στις περιπτώσεις αυτές, η έκθεση οφείλεται σε άλλες ύλες πλην των διαλελυμένων, οι δε συγκεντρώσεις δοκιμής μπορούν να υπερβαίνουν την υδατοδιαλυτότητα της ελεγχόμενης ουσίας, ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της. Προκειμένου για ελεγχόμενες ουσίες με χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, ενδέχεται να είναι απαραίτητο να παρασκευαστεί πυκνό μητρικό ή κολλοειδές διάλυμα της ουσίας με τη βοήθεια οργανικού διαλύτη ή μέσου διασποράς, ώστε να διευκολυνθεί η προσθήκη ακριβών ποσοτήτων της ελεγχόμενης ουσίας στο υλικό δοκιμής και να υποβοηθηθούν διασπορά και η διάλυσή της. Θα πρέπει να καταβάλλεται κάθε δυνατή προσπάθεια για τη αποφυγή της χρήσης τέτοιων υλικών. Η χρήση βοηθητικών διαλυτών ή μέσων διασποράς δεν θα πρέπει να έχει ως αποτέλεσμα φυτοτοξικότητα. Για παράδειγμα, μεταξύ των διαλυτών ευρείας χρήσης που δεν προκαλούν φυτοτοξικότητα σε συγκεντρώσεις έως 100 μl·l–1 περιλαμβάνονται η ακετόνη και το διμεθυλοφορμαμίδιο. Σε περίπτωση χρήσης διαλύτη ή μέσου διασποράς, η τελική του συγκέντρωση θα πρέπει να αναφέρεται και να διατηρείται σε ελάχιστα επίπεδα (≤ 100 μl·l–1), να είναι δε η ίδια σε όλες τις ομάδες αγωγής και μάρτυρες. Περαιτέρω καθοδήγηση για τη χρήση μέσων διασποράς παρέχεται στη δημοσίευση (11).

1.7.6. Ομάδες δοκιμής και μάρτυρες

Η προηγούμενη γνώση της τοξικότητας της ελεγχόμενης ουσίας για τη λέμνα, π.χ. μέσω δοκιμής εύρεσης πεδίου τιμών, διευκολύνει την επιλογή των κατάλληλων συγκεντρώσεων δοκιμής. Στην οριστική δοκιμή τοξικότητας, θα πρέπει κανονικά να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον πέντε συγκεντρώσεις δοκιμής, διατεταγμένες σε γεωμετρική πρόοδο. Ο λόγος προόδου θα πρέπει, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 3,2, αλλά επιτρέπεται να χρησιμοποιείται υψηλότερη τιμή, εάν η καμπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης είναι επίπεδη. Εάν έχουν χρησιμοποιηθεί λιγότερες από πέντε συγκεντρώσεις, η επιλογή αυτή θα πρέπει να αιτιολογείται. Σε κάθε συγκέντρωση δοκιμής, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τρία πανομοιότυπα δοχεία (replicates).

Στον καθορισμό της σειράς των συγκεντρώσεων δοκιμής (για τη δοκιμή εύρεσης πεδίου τιμών ή/και τη οριστική δοκιμή τοξικότητας), θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη τα εξής:

Κάθε δοκιμή θα πρέπει να περιλαμβάνει μάρτυρες, που συνίστανται σε θρεπτικό υλικό, αριθμό θαλλών και αποικιών, συνθήκες περιβάλλοντος και διαδικασίες ίδια με εκείνα των δοχείων αγωγής, αλλά χωρίς την ελεγχόμενη ουσία. Εάν χρησιμοποιείται βοηθητικός διαλύτης ή μέσο διασποράς, θα πρέπει να συμπεριλαμβάνεται πρόσθετη αγωγή μάρτυρας με τον διαλύτη/μέσο διασποράς στην ίδια συγκέντρωση με τη χρησιμοποιούμενη στα δοχεία που περιέχουν την ελεγχόμενη ουσία. Το πλήθος των δοχείων μαρτύρων (και των δοχείων με διαλύτη, εάν έχει εφαρμογή) πρέπει να είναι τουλάχιστον ίσο και, στην ιδανική περίπτωση, διπλάσιο από το πλήθος των δοχείων που χρησιμοποιούνται για κάθε συγκέντρωση δοκιμής.

Εάν δεν απαιτείται προσδιορισμός της NOEC, ο σχεδιασμός της δοκιμής είναι δυνατόν να τροποποιηθεί, ώστε να αυξηθεί το πλήθος των συγκεντρώσεων και να μειωθεί το πλήθος των δοχείων ανά συγκέντρωση. Ωστόσο, τα δοχεία μάρτυρες πρέπει να είναι τουλάχιστον τρία.

1.7.7. Έκθεση

Αποικίες αποτελούμενες από 2 έως 4 ορατούς θαλλούς μεταφέρονται ασηπτικά από την καλλιέργεια εμβολιασμού (ενοφθαλμισμού) στα δοκιμαστικά δοχεία με τυχαιοποιημένη κατανομή μεταξύ των δοχείων. Κάθε δοκιμαστικό δοχείο θα πρέπει να περιέχει συνολικά 9 έως 12 fronds. Ο αριθμός των θαλλών και αποικιών θα πρέπει να είναι ο ίδιος σε όλα τα δοχεία. Η εμπειρία από την παρούσα μέθοδο, καθώς και τα δεδομένα κυκλικής δοκιμής δείχνουν ότι ο τριπλός προσδιορισμός ανά αγωγή, κατά τον οποίο κάθε δοχείο περιέχει αρχικά 9 έως 12 θαλλούς, αρκεί για την ανίχνευση διαφορών στην ανάπτυξη της τάξεως του 4 έως 7 %, όταν η αναστολή της υπολογίζεται με βάση τον ρυθμό ανάπτυξης (10 έως 15 %, όταν υπολογίζεται με βάση την απόδοση) μεταξύ των ομάδων αγωγής (10).

Απαιτείται τυχαιοποιημένος σχεδιασμός για τη θέση των δοκιμαστικών δοχείων στον επωαστήρα, ώστε να ελαχιστοποιείται η επιρροή των χωρικών διαφορών ως προς τη φωτεινή ένταση ή τη θερμοκρασία. Απαιτείται επίσης σχεδιασμός καθ’ ομάδες (blocked design) ή τυχαιοποιημένη επανατοποθέτηση των δοχείων μετά τις παρατηρήσεις (ή συχνότερη αλλαγή θέσης).

Εάν από προκαταρτική δοκιμή σταθερότητας έχει προκύψει ότι δεν είναι δυνατόν να διατηρηθεί η συγκέντρωση της ελεγχόμενης ουσίας (δηλαδή η μετρούμενη συγκέντρωση μειώνεται κάτω του 80 % της μετρηθείσας αρχικής συγκέντρωσης) σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής (7 ημέρες), συνιστάται ημιστατικό σύστημα δοκιμής. Στην περίπτωση αυτή, οι αποικίες θα πρέπει να εκτίθενται σε πρόσφατα παρασκευασμένα διαλύματα δοκιμής και μάρτυρα τουλάχιστον δύο φορές κατά τη δοκιμή (π.χ. την 3η και την 5η ημέρα). Η συχνότητα έκθεσης στο πρόσφατα παρασκευασμένο υλικό εξαρτάται από τη σταθερότητα της ελεγχόμενης ουσίας· ενδέχεται να χρειαστεί μεγαλύτερη συχνότητα για τη διατήρηση σχεδόν σταθερών συγκεντρώσεων εξαιρετικά ασταθών ή πτητικών ουσιών. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ενδέχεται να απαιτηθεί συνεχής διαδικασία (11)(13).

Το σενάριο έκθεσης μέσω εφαρμογής στο φύλλωμα (ψεκασμός) δεν καλύπτεται από την παρούσα μέθοδο δοκιμών, βλέπε αντ’ αυτής δημοσίευση (14).

1.7.8. Συνθήκες επώασης

Θα πρέπει να χρησιμοποιείται συνεχής φωτισμός με θερμό ή ψυχρό λευκό φως φθορισμού, ώστε να εξασφαλίζεται φωτεινή ένταση η οποία επιλέγεται από το πεδίο τιμών 85-135 μE·m–2·s–1 (ισοδύναμο με 6 500-10 000 lux), μετρούμενη σε φωτοσυνθετικά ενεργό μήκος κύματος της ακτινοβολίας (400-700 nm), σε σημεία που βρίσκονται στην ίδια απόσταση από τη φωτεινή πηγή όπως οι θαλλοί της λέμνας. Οι τυχόν διαφορές από την επιλεγμένη φωτεινή ένταση στην επιφάνεια όπου διεξάγεται η δοκιμή δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν το ± 15 %. Η μέθοδος ανίχνευσης και μέτρησης του φωτός, ιδίως δε ο τύπος του αισθητήρα, επηρεάζουν τη μετρούμενη τιμή. Οι σφαιρικοί αισθητήρες (που αποκρίνονται στο φως το οποίο εκπέμπεται από όλες τις γωνίες επάνω και κάτω από το επίπεδο μέτρησης) και οι αισθητήρες συνημιτόνου (που αποκρίνονται στο φως το οποίο εκπέμπεται από όλες τις γωνίες επάνω από το επίπεδο μέτρησης) προτιμώνται έναντι των αισθητήρων μονής κατεύθυνσης και παρέχουν μεγαλύτερες ενδείξεις για τις πολυσημειακές φωτεινές πηγές του είδους που περιγράφεται στην παρούσα μέθοδο.

Η θερμοκρασία στα δοκιμαστικά δοχεία θα πρέπει να είναι 24 ± 2 °C. Το pH του υλικού μάρτυρα δεν θα πρέπει να αυξάνεται κατά περισσότερο από 1,5 μονάδα στη διάρκεια της δοκιμής. Ωστόσο, οι αποκλίσεις πέραν της 1,5 μονάδας δεν ακυρώνουν τη δοκιμή, εφόσον είναι δυνατόν να αποδειχθεί ότι πληρούνται τα κριτήρια εγκυρότητάς της. Πρέπει να αποδίδεται μεγαλύτερη προσοχή στη μεταβολή του pH σε ειδικές περιπτώσεις, όπως κατά τη δοκιμή ασταθών ουσιών ή μετάλλων. Περαιτέρω καθοδήγηση παρέχεται στη δημοσίευση (11).

1.7.9. Διάρκεια

Η δοκιμή τερματίζεται 7 ημέρες μετά τη μεταφορά των φυτών στα δοκιμαστικά δοχεία.

1.7.10. Μετρήσεις και αναλυτικοί προσδιορισμοί

Στην αρχή της δοκιμής μετράται και καταγράφεται ο αριθμός θαλλών, με μέριμνα ώστε να καταμετρώνται οι προεξέχοντες ευδιάκριτοι θαλλοί. Οι αριθμοί θαλλών που φαίνονται φυσιολογικοί ή αφύσικοι πρέπει να προσδιορίζονται στην αρχή της δοκιμής, τουλάχιστον ανά τρεις ημέρες κατά την περίοδο έκθεσης (δηλαδή τουλάχιστον δύο φορές στη διάρκεια της επταήμερης περιόδου) και τουλάχιστον στο τέλος της δοκιμής. Οι αλλαγές στην ανάπτυξη των φυτών, π.χ. μεταβολή του μεγέθους και της εμφάνισης των θαλλών, ενδείξεις νέκρωσης, χλώρωσης ή κυφότητας, θραύση ή απώλεια πλευστότητας των αποικιών, καθώς και στο μήκος και στην όψη των ριζών πρέπει να σημειώνονται. Θα πρέπει επίσης να σημειώνονται τα σημαντικά χαρακτηριστικά του υλικού δοκιμής (π.χ. παρουσία αδιάλυτων υλικών, ανάπτυξη φυκών στο δοκιμαστικό δοχείο).

Επιπλέον της καταμέτρησης των θαλλών κατά τη δοκιμή, εκτιμώνται οι επιδράσεις της ελεγχόμενης ουσίας και σε μία (ή περισσότερες) από τις ακόλουθες μετρούμενες μεταβλητές:

Η συνολική θαλλική επιφάνεια παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι μπορεί να προσδιοριστεί σε κάθε δοχείο δοκιμής και μάρτυρα στην αρχή, στη διάρκεια και στο τέλος της δοκιμής. Το ξηρό ή το υγρό βάρος θα πρέπει να προσδιορίζεται στη αρχή της δοκιμής, σε δείγμα της καλλιέργειας εμβολιασμού το οποίο είναι αντιπροσωπευτικό του υλικού που χρησιμοποιήθηκε για την εκκίνηση της δοκιμής, καθώς και στο τέλος της δοκιμής στο φυτικό υλικό κάθε δοχείου δοκιμής και μάρτυρα. Εάν δεν μετράται η θαλλική επιφάνεια, προτιμάται το ξηρό βάρος έναντι του υγρού.

Η συνολική θαλλική επιφάνεια, το ξηρό βάρος και το υγρό βάρος μπορούν να προσδιοριστούν ως εξής:

1.7.10.1. Συχνότητα των μετρήσεων και αναλυτικών προσδιορισμών

Εάν εφαρμόζεται σχεδιασμός στατικής δοκιμής, θα πρέπει να μετράται το pH κάθε αγωγής στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής. Εάν εφαρμόζεται σχεδιασμός ημιστατικής δοκιμής, το pH θα πρέπει να μετράται σε κάθε παρτίδα «πρόσφατου» διαλύματος δοκιμής, πριν από κάθε ανανέωση, καθώς και στα αντίστοιχα «εξαντλημένα» διαλύματα.

Η φωτεινή ένταση θα πρέπει να μετράται στον θάλαμο, επωαστήρα ή δωμάτιο ανάπτυξης, σε σημεία που βρίσκονται στην ίδια απόσταση από τη φωτεινή πηγή όπως οι θαλλοί της λέμνας. Οι μετρήσεις θα πρέπει να εκτελούνται τουλάχιστον μία φορά στη διάρκεια της δοκιμής. Θα πρέπει να καταγράφεται, τουλάχιστον ημερησίως, η θερμοκρασία του θρεπτικού υλικού σε υποκατάστατο δοχείο, το οποίο διατηρείται στις ίδιες συνθήκες στον θάλαμο, επωαστήρα ή δωμάτιο ανάπτυξης.

Στη διάρκεια της δοκιμής, οι συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας προσδιορίζονται σε κατάλληλα διαστήματα. Η ελάχιστη απαίτηση για τις στατικές δοκιμές είναι ο προσδιορισμός των συγκεντρώσεων στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής.

Στις ημιστατικές δοκιμές, κατά τις οποίες η συγκέντρωση της ελεγχόμενης ουσίας αναμένεται να μην παραμείνει εντός των ορίων της ονομαστικής συγκέντρωσης ± 20 %, είναι απαραίτητο να υποβάλλονται σε ανάλυση όλα τα πρόσφατα παρασκευασμένα διαλύματα δοκιμής, καθώς και τα ίδια διαλύματα σε κάθε ανανέωση (βλέπε σημείο 1.7.7, τρίτο εδάφιο). Ωστόσο, στην περίπτωση των δοκιμών κατά τις οποίες η μετρηθείσα αρχική συγκέντρωση της ελεγχόμενης ουσίας διαφέρει περισσότερο από ± 20 % από την ονομαστική συγκέντρωση, αλλά μπορούν να προσκομιστούν επαρκή στοιχεία από τα οποία προκύπτει ότι οι αρχικές συγκεντρώσεις είναι επαναλήψιμες και σταθερές (δηλαδή κυμαίνονται μεταξύ 80 και 120 % της αρχικής συγκέντρωσης), είναι δυνατόν να εκτελείται χημικός προσδιορισμός μόνο για την υψηλότερη και τη χαμηλότερη συγκέντρωση δοκιμής. Σε κάθε περίπτωση, οι συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας πριν από την ανανέωση είναι αναγκαίο να προσδιορίζονται μόνο σε ένα από τα πολλαπλά δοχεία για κάθε συγκέντρωση δοκιμής (ή στο συνενωμένο περιεχόμενο των δοχείων ανά πολλαπλό προσδιορισμό).

Εάν χρησιμοποιείται συνεχής δοκιμή, ενδείκνυται σύστημα δειγματοληψίας ανάλογο με το περιγραφόμενο για τις ημιστατικές δοκιμές, το οποίο περιλαμβάνει ανάλυση στην αρχή, στη μέση και στο τέλος της δοκιμής, χωρίς όμως μετρήσεις στα «εξαντλημένα» διαλύματα, που δεν ενδείκνυνται εν προκειμένω. Στον συγκεκριμένο τύπο δοκιμής, θα πρέπει να ελέγχεται ημερησίως η ταχύτητα ροής του μέσου αραίωσης και της ελεγχόμενης ουσίας ή του μητρικού διαλύματος της ελεγχόμενης ουσίας.

Εάν υπάρχουν στοιχεία, από τα οποία προκύπτει ότι η συγκέντρωση της ελεγχόμενης ουσίας διατηρήθηκε ικανοποιητικά εντός των ορίων της ονομαστικής ή της μετρηθείσας αρχικής συγκέντρωσης ± 20 % σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής, η ανάλυση των αποτελεσμάτων μπορεί να βασιστεί στις ονομαστικές ή τις μετρηθείσες αρχικές τιμές. Εάν η απόκλιση από την ονομαστική ή τη μετρηθείσα αρχική συγκέντρωση υπερβαίνει το ± 20 %, η ανάλυση των αποτελεσμάτων θα πρέπει να βασίζεται στον γεωμετρικό μέσο όρο των συγκεντρώσεων κατά την έκθεση ή σε μοντέλα που περιγράφουν τη μείωση της συγκέντρωσης της ελεγχόμενης ουσίας (11).

1.7.11. Οριακή δοκιμή

Σε ορισμένες περιπτώσεις, π.χ. όταν από προκαταρτική δοκιμή έχει προκύψει ότι η ελεγχόμενη ουσία δεν έχει τοξικές επιδράσεις σε συγκεντρώσεις έως 100 mg·l–1 ή έως το όριο διαλυτότητάς της στο υλικό της δοκιμής (αναλόγως του ποια είναι μικρότερη), είναι δυνατόν να διεξαχθεί οριακή δοκιμή, η οποία συνίσταται σε σύγκριση των αποκρίσεων μίας ομάδας μάρτυρα και μίας ομάδας αγωγής (συγκέντρωση ίση με 100 mg·l–1 ή με το όριο διαλυτότητας). Συνιστάται ένθερμα να τεκμηριώνεται αυτό με ανάλυση της συγκέντρωσης έκθεσης. Η οριακή δοκιμή υπόκειται σε όλες τις συνθήκες δοκιμής και όλα τα κριτήρια εγκυρότητας που περιγράφονται ανωτέρω, εξαιρουμένου του πλήθους των δοχείων αγωγής, που θα πρέπει να είναι τουλάχιστον διπλάσιο. Η ανάπτυξη στην ομάδα μάρτυρα και στην ομάδα αγωγής είναι δυνατόν να υποβληθεί σε στατιστική ανάλυση με δοκιμή σύγκρισης μέσων όρων, π.χ. δοκιμή t του Student.

2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΕΩΝ

2.1. ΧΡΟΝΟΣ ΔΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ

Για τον προσδιορισμό του χρόνου διπλασιασμού (Td) του αριθμού θαλλών και την τήρηση αυτού του κριτηρίου εγκυρότητας στη μελέτη (σημείο 1.6), εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος στα δεδομένα που προκύπτουν από τα δοχεία μάρτυρες:

Td = ln 2/μ

όπου μ είναι ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, ο οποίος προσδιορίζεται όπως περιγράφεται στο σημείο 2.2.1, πρώτο και δεύτερο εδάφιο.

2.2. ΜΕΤΑΒΛΗΤΕΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ

Η δοκιμή αποσκοπεί στον προσδιορισμό των επιδράσεων της ελεγχόμενης ουσίας στη βλαστητική ανάπτυξη της λέμνας. Στην παρούσα μέθοδο δοκιμών περιγράφονται δύο μεταβλητές απόκρισης, δεδομένου ότι τα κράτη μέλη έχουν διαφορετικές προτιμήσεις και κανονιστικές ανάγκες. Για να είναι τα αποτελέσματα των δοκιμών αποδεκτά σε όλα τα κράτη μέλη, οι επιδράσεις θα πρέπει να αξιολογούνται με χρήση και των δύο μεταβλητών απόκρισης α) και β) που περιγράφονται κατωτέρω.

Σημειωτέον ότι οι τιμές τοξικότητας που υπολογίζονται με χρήση των ανωτέρω δύο μεταβλητών απόκρισης δεν είναι συγκρίσιμες και η διαφορά αυτή πρέπει να αναγνωρίζεται, όταν χρησιμοποιούνται τα αποτελέσματα της δοκιμής. Εφόσον τηρούνται οι συνθήκες δοκιμής που καθορίζονται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών, οι τιμές ECx που προκύπτουν από τον μέσο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (ErCx) είναι γενικά υψηλότερες από τα βασιζόμενα στην απόδοση αποτελέσματα (EyCx), λόγω της μαθηματικής βάσης της αντίστοιχης προσέγγισης. Αυτό δεν θα πρέπει να ερμηνεύεται ως διαφορά ευαισθησίας μεταξύ των δύο μεταβλητών απόκρισης· πρόκειται απλώς για μαθηματική διαφορά τιμών. Η έννοια του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης βασίζεται στον γενικό λογαριθμικό τύπο ανάπτυξης της λέμνας σε απεριόριστες καλλιέργειες, όπου η τοξικότητα εκτιμάται με βάση τις επιδράσεις στον ρυθμό ανάπτυξης, χωρίς να εξαρτάται από την απόλυτη τιμή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης του μάρτυρα ούτε από την κλίση της καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης ούτε από τη διάρκεια της δοκιμής. Αντίθετα, τα αποτελέσματα που βασίζονται στην απόδοση ως μεταβλητή απόκρισης εξαρτώνται από όλες τις προαναφερόμενες άλλες μεταβλητές. Η EyCx εξαρτάται από τον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης του είδους λέμνας που χρησιμοποιείται σε κάθε δοκιμή, καθώς και από τον μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης, ο οποίος μπορεί να διαφέρει μεταξύ των ειδών ή ακόμη και μεταξύ διαφορετικών κλώνων. Η συγκεκριμένη μεταβλητή απόκρισης δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τη σύγκριση της ευαισθησίας διαφορετικών ειδών ή κλώνων λέμνας σε τοξικούς παράγοντες. Μολονότι είναι προτιμότερο, από επιστημονική άποψη, να χρησιμοποιείται ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για την εκτίμηση της τοξικότητας, η παρούσα μέθοδος δοκιμών περιλαμβάνει και εκτιμήσεις της τοξικότητας με βάση την απόδοση, προκειμένου να καλυφθούν οι κανονιστικές απαιτήσεις που ισχύουν σήμερα σε ορισμένες χώρες.

Οι εκτιμήσεις της τοξικότητας θα πρέπει να βασίζονται στον αριθμό θαλλών και σε μία πρόσθετη μετρούμενη παράμετρο (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος), επειδή ορισμένες ουσίες ενδέχεται να έχουν πολύ μεγαλύτερη επίδραση σε άλλες μετρούμενες μεταβλητές απ’ όση στον αριθμό θαλλών. Η επίδραση αυτή δεν ανιχνεύεται με τον υπολογισμό μόνο του αριθμού θαλλών.

Ο αριθμός θαλλών και κάθε άλλη μετρούμενη μεταβλητή που έχει καταγραφεί, δηλαδή συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος, καταχωρίζονται σε πίνακα μαζί με τις συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας για κάθε χρόνο μέτρησης. Η μετέπειτα ανάλυση δεδομένων, π.χ. για την εκτίμηση της LOEC, NOEC ή ECx, θα πρέπει να βασίζεται στις τιμές που αντιστοιχούν σε καθένα από τα πολλαπλά δοχεία αγωγής και όχι σε μέσες τιμές που έχουν υπολογιστεί για κάθε ομάδα αγωγής.

2.2.1. Μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης

Ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για συγκεκριμένη χρονική περίοδο υπολογίζεται ως η λογαριθμική αύξηση των μεταβλητών ανάπτυξης — αριθμός θαλλών και μία ακόμη μετρούμενη μεταβλητή (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος) — από τον ακόλουθο τύπο, ο οποίος εφαρμόζεται σε καθένα από τα πολλαπλά δοχεία μάρτυρες και αγωγής:

όπου:

Για κάθε ομάδα αγωγής και ομάδα μάρτυρα, υπολογίζεται η μέση τιμή του ρυθμού ανάπτυξης, συνοδευόμενη από εκτίμηση της διακύμανσης.

Θα πρέπει να υπολογίζεται ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης για τη συνολική διάρκεια της δοκιμής (η χρονική στιγμή «i» στον ανωτέρω τύπο είναι η αρχή της δοκιμής και η χρονική στιγμή «j» το τέλος της). Για κάθε συγκέντρωση δοκιμής και κάθε μάρτυρα, υπολογίζεται η μέση τιμή του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης, συνοδευόμενη από εκτίμηση της διακύμανσης. Επιπλέον, θα πρέπει να υπολογίζεται ο τμηματικός ρυθμός ανάπτυξης με σκοπό την αξιολόγηση των επιδράσεων της ελεγχόμενης ουσίας στη διάρκεια της περιόδου έκθεσης (π.χ. με εξέταση των λογαριθμικά μετασχηματισμένων καμπυλών ανάπτυξης). Ουσιαστικές διαφορές μεταξύ του τμηματικού και του μέσου ρυθμού ανάπτυξης υποδηλώνουν απόκλιση από τη σταθερή εκθετική ανάπτυξη και δικαιολογούν την ενδελεχή εξέταση των καμπυλών ανάπτυξης. Μια συντηρητική προσέγγιση στην περίπτωση αυτή είναι η σύγκριση των ειδικών ρυθμών ανάπτυξης κατά το χρονικό διάστημα μέγιστης αναστολής μεταξύ των καλλιεργειών που έχουν υποβληθεί σε αγωγή και των μαρτύρων.

Στη συνέχεια, είναι δυνατόν να υπολογιστεί η εκατοστιαία αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης (Ir) για κάθε συγκέντρωση δοκιμής (ομάδα αγωγής) από τον ακόλουθο τύπο:

όπου:

2.2.2. Απόδοση

Οι επιδράσεις στην απόδοση προσδιορίζονται με βάση τις δύο μετρούμενες μεταβλητές — αριθμός θαλλών και μία ακόμη μετρούμενη μεταβλητή (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος) — των οποίων η παρουσία διαπιστώνεται σε κάθε δοκιμαστικό δοχείο στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής. Στην περίπτωση του ξηρού ή υγρού βάρους, η αρχική βιομάζα προσδιορίζεται σε δείγμα θαλλών λαμβανόμενο από την παρτίδα που χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό των δοκιμαστικών δοχείων (βλέπε σημείο 1.7.3, δεύτερο εδάφιο). Για κάθε ελεγχόμενη συγκέντρωση και κάθε μάρτυρα, υπολογίζεται η μέση τιμή της απόδοσης, συνοδευόμενη από εκτίμηση της διακύμανσης. Η εκατοστιαία αναστολή της απόδοσης (%Iy) μπορεί να υπολογιστεί για κάθε ομάδα αγωγής με τον ακόλουθο τύπο:

όπου:

2.2.3. Χάραξη των καμπυλών συγκέντρωσης-απόκρισης

Θα πρέπει να χαράσσονται καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης, που συνδέουν τη μέση τιμή της εκατοστιαίας αναστολής της μεταβλητής απόκρισης (Ir ή Iy, υπολογιζόμενη όπως υποδεικνύεται στο τελευταίο εδάφιο του σημείου 2.2.1 ή 2.2.2, αντίστοιχα) με τον λογάριθμο της συγκέντρωσης της ελεγχόμενης ουσίας.

2.2.4. Εκτίμηση της ECx

Οι εκτιμήσεις της ECx (π.χ. EC50) θα πρέπει να βασίζονται τόσο στον μέσο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (ErCx), όσο και στην απόδοση (EyCx). Καθεμία από τις μεταβλητές αυτές θα πρέπει να βασίζεται στον αριθμό θαλλών και σε μία πρόσθετη μετρούμενη μεταβλητή (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος), επειδή υπάρχουν ελεγχόμενες ουσίες με διαφορετική επίδραση στον αριθμό θαλλών απ’ ότι σε άλλες μετρούμενες μεταβλητές. Επομένως, οι επιθυμητές παράμετροι τοξικότητας είναι τέσσερις τιμές ECx για κάθε βαθμό αναστολής x που έχει υπολογιστεί: ErCx (αριθμός θαλλών), ErCx (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος), EyCx (αριθμός θαλλών) και EyCx (συνολική θαλλική επιφάνεια, ξηρό βάρος ή υγρό βάρος).

2.3. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΕΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ

Το ζητούμενο είναι να ληφθεί ποσοτική σχέση συγκέντρωσης-επίδοσης με ανάλυση παλινδρόμησης. Είναι δυνατόν να εφαρμοστεί σταθμισμένη γραμμική παλινδρόμηση, μετά από γραμμικό μετασχηματισμό των δεδομένων απόκρισης, λόγου χάριν, σε μονάδες probit ή logit ή Weibull (16), αλλά προτιμώνται οι τεχνικές μη γραμμικής παλινδρόμησης, με τις οποίες αντιμετωπίζονται καλύτερα οι αναπόφευκτες ανωμαλίες των δεδομένων και οι αποκλίσεις τους από τις ομαλές κατανομές. Στις περιοχές είτε της μηδενικής είτε της πλήρους αναστολής, οι ανωμαλίες αυτές ενδέχεται να μεγεθυνθούν από τον μετασχηματισμό και να παρεμποδίσουν την ανάλυση (16). Σημειωτέον ότι οι συνήθεις μέθοδοι ανάλυσης με χρήση αποτελεσμάτων μετασχηματισμού probit, logit ή Weibull προορίζονται για δεδομένα που δέχονται μόνο δύο τιμές (π.χ. θνησιμότητα ή επιβίωση) και πρέπει να τροποποιούνται για να καλύψουν δεδομένα ανάπτυξης ή βιομάζας. Ειδικές διαδικασίες για τον προσδιορισμό τιμών ECx από συνεχή δεδομένα παρατίθενται στις δημοσιεύσεις (17) (18) και (19).

Για κάθε μεταβλητή απόκρισης που πρόκειται να αναλυθεί, χρησιμοποιείται η σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης για την εκτίμηση των σημείων των τιμών ECx. Όπου είναι δυνατόν, θα πρέπει να προσδιορίζονται, για κάθε εκτίμηση, τα όρια εμπιστοσύνης 95 %. Η καλή προσαρμογή των δεδομένων απόκρισης στο μοντέλο παλινδρόμησης θα πρέπει να αξιολογείται με γραφική ή στατιστική μέθοδο. Η ανάλυση παλινδρόμησης θα πρέπει να εκτελείται με χρήση των αποκρίσεων στα επιμέρους δοχεία και όχι των μέσων όρων των ομάδων αγωγής.

Εάν τα διαθέσιμα μοντέλα/μέθοδοι παλινδρόμησης είναι ακατάλληλα για τα δεδομένα, μπορούν επίσης να ληφθούν εκτιμήσεις και όρια εμπιστοσύνης για την EC50 με γραμμική παρεμβολή με τεχνική εύρεσης εκτιμητριών bootstrap (20).

Για την εκτίμηση της LOEC και, κατ’ επέκταση, της NOEC, είναι αναγκαία η σύγκριση των μέσων όρων των ομάδων αγωγής με τεχνικές ανάλυσης της διακύμανσης (ANOVA). Στη συνέχεια, ο μέσος όρος για κάθε συγκέντρωση πρέπει να συγκρίνεται με τον μέσο όρο του μάρτυρα με κατάλληλη μέθοδο πολλαπλής σύγκρισης ή δοκιμής τάσης. Χρήσιμη για τον σκοπό αυτό μπορεί να είναι η δοκιμή του Dunnett ή του Williams (21) (22) (23) (24). Είναι απαραίτητο να κρίνεται αν ευσταθεί η παραδοχή της ANOVA για ομοιογενή διακύμανση. Η αξιολόγηση αυτή μπορεί να διενεργηθεί γραφικά ή με επίσημη δοκιμή (25). Κατάλληλες σχετικές δοκιμές είναι εκείνες του Levene και του Bartlett. Εάν δεν ισχύει η παραδοχή της ομοιογένειας της διακύμανσης, αυτό είναι μερικές φορές δυνατόν να διορθωθεί με λογαριθμικό μετασχηματισμό των δεδομένων. Στις περιπτώσεις ακραίας ετερογένειας της διακύμανσης, η οποία δεν είναι δυνατόν να διορθωθεί με μετασχηματισμό, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο ανάλυσης με μεθόδους όπως οι μειωτικές δοκιμές τάσης Jonkheere. Πρόσθετη καθοδήγηση σχετικά με τον προσδιορισμό της NOEC παρέχεται στη δημοσίευση (19).

Οι πρόσφατες επιστημονικές εξελίξεις υπαγόρευσαν τη σύσταση να εγκαταλειφθεί η έννοια της NOEC και να αντικατασταθεί από εκτιμήσεις των σημείων των τιμών ECx βάσει παλινδρόμησης. Δεν έχει καθοριστεί κατάλληλη τιμή του x για την παρούσα δοκιμή σε λέμνα. Φαίνεται, ωστόσο, να ενδείκνυται ένα εύρος 10 έως 20 % (ανάλογα με την επιλεγμένη μεταβλητή απόκρισης), κατά προτίμηση μάλιστα, θα πρέπει να αναφέρονται τόσο η EC10, όσο και η EC20.

3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΕΩΝ

3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ

Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:

Ελεγχόμενη ουσία:

Είδος οργανισμού δοκιμής:

Συνθήκες δοκιμής:

Αποτελέσματα:

4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Guidance on information requirements and chemical safety assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, διαθέσιμο στην ιστοσελίδα

ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742. In, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.

Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37-120 pp

Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.

Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.

OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23.

ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) — Duckweed Growth Inhibition Test.

Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.

Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353-359.

Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.

Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167.

Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.

OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of Ecotoxicity Data.

Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.

Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.

Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.

Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.

Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.

Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.

Προσάρτημα 1

Περιγραφή του φυτού Lemna SPP.

Το υδρόβιο φυτό Lemna spp., κοινώς λέμνα ή φακή του νερού, ανήκει στην οικογένεια λεμνίδες (Lemnaceae), που περιλαμβάνει ορισμένα κοσμοπολίτικα είδη, ταξινομημένα σε τέσσερα γένη. Οι διαφορές τους ως προς την εμφάνιση και τη συστηματική κατάταξη έχουν περιγραφεί εκτενώς (1)(2). Τα είδη Lemna gibba και L. minor είναι αντιπροσωπευτικά των εύκρατων περιοχών και χρησιμοποιούνται ευρέως σε δοκιμές τοξικότητας. Και τα δύο αυτά είδη έχουν έναν επιπλέοντα ή βυθισμένο δισκοειδή βλαστό (θαλλό), ενώ από το κέντρο της κάτω επιφάνειας κάθε θαλλού εξέρχεται μία λεπτότατη ρίζα. Η λέμνα σπάνια παράγει άνθη και τα φυτά πολλαπλασιάζονται με βλαστητική αναπαραγωγή, παράγοντας νέους θαλλούς (3). Σε σύγκριση με τα φυτά μεγαλύτερης ηλικίας, τα νεαρότερα έχουν ασθενέστερο χρώμα και βραχύτερες ρίζες και αποτελούνται από δύο έως τρεις θαλλούς διαφορετικών μεγεθών. Το μικρό μέγεθος της λέμνας, η απλή δομή της, η αγενής αναπαραγωγή της και ο μικρός χρόνος γενεάς καθιστούν τα φυτά του γένους αυτού ιδιαίτερα κατάλληλα για εργαστηριακές δοκιμές (4) (5).

Λόγω πιθανών διειδικών διαφορών στην ευαισθησία, μόνο οι συγκρίσεις ευαισθησίας εντός του ίδιου είδους είναι έγκυρες.

Παραδείγματα ειδών λέμνας που έχουν χρησιμοποιηθεί σε δοκιμές: αναφορά των ειδών στη βιβλιογραφία

Lemna aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoctialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.

Lemna major: Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.

Lemna minor: United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., «Public draft». EPA 712-C-96-156. 8pp.

Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10pp.

Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15pp (στη σουηδική γλώσσα).

Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). pp. 733-742.

United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., «Public draft». EPA 712-C-96-156. 8pp.

Lemna paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.

Lemna perpusilla: Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.

Lemna trisulca: Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.

Lemna valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.

Πηγές ειδών λέμνας

University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria Department of Botany, University of Toronto M5S 3 B2 Toronto, Ontario Καναδάς Tηλ.: +1-416-978-3641 Φαξ: +1-416-978-5878 Ηλεκτρονικό ταχυδρομείο: jacreman@botany.utoronto.ca Διαδίκτυο: http://www.botany.utoronto.ca/utcc

North Carolina State University Forestry Dept Duckweed Culture Collection Campus Box 8002 Raleigh, NC 27695-8002 ΗΠΑ Τηλ.: +1 (919) 515-7572 Ηλεκτρονικό ταχυδρομείο: astomp@unity.ncsu.edu

Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University SE-106 91 Stockholm Σουηδία Tηλ.: +46 8 674 7240 Φαξ: +46 8 674 7636

Federal Environmental Agency (UBA) FG III 3.4 Schichauweg 58 12307 Berlin Γερμανία Ηλεκτρονικό ταχυδρομείο: lemna@uba.de Διαδίκτυο: http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm

Βιβλιογραφία

(1) Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.

(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, Switzerland.

(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, University of Oslo.

(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.