ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΚ) αριθ. 1459/98 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 8ης Ιουλίου 1998 σχετικά με τη θέσπιση μεθόδου αναφοράς για τον προσδιορισμό της βανιλίνης στο συμπυκνωμένο βούτυρο, στο βούτυρο ή στην κρέμα γάλακτος

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,

τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 804/68 του Συμβουλίου, της 27ης Ιουνίου 1968, περί κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1587/96 (2), και ιδίως το άρθρο 6 και το άρθρο 12 παράγραφος 3,

Εκτιμώντας:

ότι στον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 2571/97 της Επιτροπής, της 15ης Δεκεμβρίου 1997, σχετικά με την πώληση σε μειωμένη τιμή βουτύρου και τη χορήγηση ενισχύσεως στην κρέμα γάλακτος, στο βούτυρο και στο συμπυκνωμένο βούτυρο που προορίζονται για την παρασκευή προϊόντων ζαχαροπλαστικής, παγωτών και άλλων προϊόντων διατροφής (3), προβλέπεται ιχνηθέτηση, σε ορισμένες περιπτώσεις, της κρέμας γάλακτος, του βουτύρου και του συμπυκνωμένου βουτύρου ώστε να διασφαλίζεται η σωστή τελική χρήση των εν λόγω προϊόντων 7

ότι, λόγω της σημασίας της ιχνηθέτησης για την ορθή λειτουργία του καθεστώτος και προκειμένου να εξασφαλιστεί ίση μεταχείριση των επιχειρηματιών που συμμετέχουν σ' αυτό, είναι σκόπιμο να θεσπιστούν κοινές μέθοδοι προσδιορισμού των ιχνηθετών που αναφέρονται στον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 2571/97 7

ότι είναι δύσκολο να θεσπιστούν μέθοδοι αναφοράς για όλους τους ιχνηθέτες ταυτόχρονα 7 ότι η θέσπιση μεθόδου αναφοράς για τον προσδιορισμό της βανιλίνης στο συμπυκνωμένο βούτυρο, στο βούτυρο ή στην κρέμα γάλακτος συνιστά ένα ακόμη βήμα προς την κατεύθυνση αυτή 7

ότι τα μέτρα που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό είναι σύμφωνα με τη γνώμη της επιτροπής διαχείρισης γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:

Άρθρο 1

Η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στο παράρτημα εφαρμόζεται ως μέθοδος αναφοράς για τον προσδιορισμό της βανιλίνης στο συμπυκνωμένο βούτυρο, στο βούτυρο ή στην κρέμα γάλακτος δυνάμει του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 2571/97.

Το συμπυκνωμένο βούτυρο, το βούτυρο ή η κρέμα γάλακτος έχουν ιχνηθετηθεί σύμφωνα με το άρθρο 6 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 2571/97 όταν τα λαμβανόμενα αποτελέσματα ανταποκρίνονται στις προδιαγραφές της παραγράφου 8 του παραρτήματος.

Άρθρο 2

Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.

Εφαρμόζεται από την 1η Σεπτεμβρίου 1998.

Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.

Βρυξέλλες, 8 Ιουλίου 1998.

Για την Επιτροπή

Franz FISCHLER

Μέλος της Επιτροπής

(1) ΕΕ L 148 της 28. 6. 1968, σ. 13.

(2) ΕΕ L 206 της 16. 8. 1996, σ. 21.

(3) ΕΕ L 350 της 20. 12. 1997, σ. 3.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

Προσδιορισμός της περιεκτικότητας του συμπυκνωμένου βουτύρου, του βουτύρου ή της κρέμας γάλακτος σε βανιλίνη με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης

1. Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Στη μέθοδο αυτή περιγράφεται διαδικασία ποσοτικού προσδιορισμού της βανιλίνης στο συμπυκνωμένο βούτυρο, το βούτυρο ή την κρέμα γάλακτος.

Η μέθοδος εφαρμόζεται σε δείγματα που έχουν ληφθεί δυνάμει του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 2571/97.

2. Αρχή

Εκχύλιση γνωστής ποσότητας δείγματος με μείγμα ισοπροπανόλης/αιθανόλης/ακετονιτριλίου (1:1:2). Καταβύθιση του μεγαλυτέρου μέρους των λιπαρών υλών με ψύξη σε θερμοκρασία -15 °C έως -20 °C, και στη συνέχεια φυγοκέντρηση.

Αραίωση με νερό και προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε βανιλίνη με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC).

3. Εργαστηριακά σκεύη και όργανα

Συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός και ειδικότερα:

3.1. καταψύκτης με πεδίο τιμών θερμοκρασίας λειτουργίας -15 °C έως -20°C 7

3.2. σύριγγες μίας χρήσεως χωρητικότητας 2 ml.

3.3. μικροδιηθητικές μεμβράνες μεγέθους πόρων 0,45 μm, ανθεκτικές σε διάλυμα περιεκτικότητας 5 % στο διάλυμα εκχύλισης (4.4) 7

3.4. σύστημα υγρής χρωματογραφίας αποτελούμενο από αντλία (παροχή 0,1 ml/min), διάταξη έγχυσης εγχυόμενη ποσότητα 20 μl, αυτόματη ή χειροκίνητη, ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας (λειτουργία σε μήκος κύματος 306 nm, 0,01 AU πλήρους κλίμακας) καταγραφέα ή ολοκληρωτή και θερμοστάτη στήλης που λειτουργεί στους 25 °C.

3.5. Αναλυτική στήλη (μήκος 250 mm και εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm), η οποία έχει πληρωθεί με LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) ή ισοδύναμο υλικό 7

3.6. Στήλη ασφαλείας (μήκους 20 mm και εσωτερικής διαμέτρου 3 mm περίπου), η οποία έχει πληρωθεί σε ξηρά κατάσταση με Perisorb RP 18 (30-40 μm) ή ισοδύναμο υλικό.

4. Αντιδραστήρια

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναγνωρισμένης αναλυτικής καθαρότητας.

4.1. Ισοπροπανόλη

4.2. Αιθανόλη 96 % (v/v)

4.3. Ακετονιτρίλιο

4.4. Διάλυμα εκχύλισης

Μείγμα ισοπροπανόλης (4.1), αιθανόλης (4.2) και ακετονιτριλίου (4.3) σε αναλογία 1:1:2 (ν/ν)

4.5. Βανιλίνη (4-υδροξυ-3-μεθοξυβενζαλδεΰδη)

4.5.1. Μητρικό διάλυμα βανιλίνης (=500 μg/ml)

Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται με ακρίβεια 0,1 mg περίπου 50 mg (CM mg) βανιλίνης (4.5). Προστίθενται 25 ml διαλύματος εκχύλισης (4.4) και ο όγκος συμπληρώνεται με νερό μέχρι τη χαραγή.

4.5.2. Πρότυπο διάλυμα βανιλίνης (=10 μg/ml).

Αναρροφώνται με σιφώνιο 5,00 ml μητρικού διαλύματος βανιλίνης (4.5.1) και φέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml. Ο όγκος συμπληρώνεται με νερό μέχρι τη χαραγή.

4.6. Μεθανόλη, καθαρότητας για HPLC

4.7. Παγόμορφο οξικό οξύ

4.8. Νερό, καθαρότητας για HPLC

4.9. Κινητή φάση HPLC

Σε ογκομετρική φιάλη των 1 000 ml αναμειγνύονται 300 ml μεθανόλης (4.6), περίπου 500 ml νερού (4.8) και 20,0 ml οξικού οξέος (4.7) και ο όγκος συμπληρώνεται με νερό (4.8) μέχρι τη χαραγή. Ακολουθεί διήθηση με ηθμό 0,45 μm.

5. Εκτέλεση

5.1. Προετοιμασία του δείγματος δοκιμής

5.1.1. Βούτυρο

Το δείγμα θερμαίνεται έως ότου αρχίσει να τήκεται. Πρέπει να αποφεύγεται τοπική υπερθέρμανση άνω των 40 °C. Όταν το δείγμα μαλακώσει αρκετά ομογενοποιείται με ανακίνηση. Το βούτυρο αναδεύεται επί 15 s πριν από τη δειγματοληψία. Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg, περίπου 5 g (SM g) βουτύρου.

5.1.2. Συμπυκνωμένο Βούτυρο

Ο περιέκτης με το συμπυκνωμένο βούτυρο τοποθετείται αμέσως πριν από τη δειγματοληψία σε πυραντήριο στους 40-50 °C μέχρις πλήρους τήξεως. Το δείγμα αναμιγνύεται με περιστροφικές κινήσεις ή ανάδευση και αποφεύγεται ο σχηματισμός φυσαλίδων αέρα λόγω υπερβολικής ζωηρής ανάδευσης. Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg, περίπου 4 g (SM σε g) συμπυκνωμένου βουτύρου.

5.1.3. Κρέμα γάλακτος

Το δείγμα θερμαίνεται σε υδατόλουτρο ή επωαστήρα στους 35-40 °C. Η λιπαρή ύλη κατανέμεται ομοιογενώς με περιστροφικές κινήσεις και, εάν είναι αναγκαίο, με ανάδευση. Το δείγμα ψύχεται ταχέως στους 20 ± 2 °C. Πρέπει να εμφανίζει ομοιογένεια. Σε αντίθετη περίπτωση η διαδικασία επαναλαμβάνεται. Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg περίπου 10 g (SM g) κρέμας γάλακτος.

5.2. Παρασκευή του διαλύματος δοκιμής

Στη ζυγισμένη ποσότητα δείγματος (5.1.1, 5.1.2 ή 5.1.3). προστίθενται περίπου 75 ml διαλύματος εκχύλισης (4.4). Η φιάλη αναδεύεται ή ανακινείται ζωηρά επί 15 min περίπου και ο όγκος συμπληρώνεται με διάλυμα εκχύλισης (4.4) μέχρι τη χαραγή. Από το εκχύλισμα αυτό μεταγγίζονται 10 ml περίπου σε δοκιμαστικό σωλήνα εφοδιασμένο με πώμα. Ο δοκιμαστικός σωλήνας τοποθετείται στον καταψύκτη (3.1) και αφήνεται σε ηρεμία επί 30 min περίπου. Το ψυχρό εκχύλισμα φυγοκεντρείται επί 5 min στις 2 000 rpm περίπου και ακολουθεί αμέσως απόχυση.

5.3. Βαθμονόμηση

Αναρροφώνται με σιφώνιο 5,00 ml προτύπου διαλύματος βανιλίνης (4.5.2) και φέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml. Προστίθενται 5,0 ml διαλύματος εκχύλισης (4.4) και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με νερό. Η περιεκτικότητα του διαλύματος αυτού σε βανιλίνη είναι 0,5 μg/ml.

5.4. Προσδιορισμός με HPLC

Το χρωματογραφικό σύστημα αφήνεται να σταθεροποιηθεί επί 30 min περίπου. Εγχέεται το πρότυπο διάλυμα (5.3). Η εργασία επαναλαμβάνεται έως ότου η διαφορά ως προς το εμβαδόν ή το ύψος των κορυφών μεταξύ δύο διαδοχικών εγχύσεων είναι μικρότερη από 2 %. Στις συγκεκριμένες συνθήκες ο χρόνος κατακράτησης της βανιλίνης είναι 9 min περίπου. Το πρότυπο διάλυμα (5.3) υποβάλλεται σε ανάλυση εις διπλούν με έγχυση 20 μl. Εγχέονται 20 μl των διαλυμάτων δοκιμής (5.2). Προσδιορίζεται το εμβαδόν ή το ύψος της λαμβανόμενης κορυφής της βανιλίνης. Η ανάλυση του προτύπου διαλύματος (5.3) επαναλαμβάνεται εις διπλούν μετά από 10 εγχύσεις δειγμάτων δοκιμής (5.2).

6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Υπολογίζεται ο μέσος όρος των εμβαδών (ή υψών) (AC) των κορυφών της βανιλίνης που αντιστοιχούν στις διπλές εγχύσεις προτύπου διαλύματος για κάθε παρτίδα διαλυμάτων δοκιμής (τέσσερις περιοχές συνολικά).

Υπολογίζεται ο συντελεστής απόκρισης (R):

R = >NUM>AC/

>DEN>CM

όπου CM είναι η μάζα της βανιλίνης σε mg (4.5.1).

Η περιεκτικότητα (C) του δείγματος δοκιμής σε βανιλίνη (mg/kg) δίδεται από τον τύπο:

C = >NUM>AS Χ 20 Χ 0,96

>DEN>SM Χ R

όπου:

AS = το εμβαδόν της κορυφής της βανιλίνης του δείγματος δοκιμής

SM = η μάζα του δείγματος δοκιμής σε g (5.1.1, 5.1.2 ή 5.1.3)

20 = ο συντελεστής αραίωσης του προτύπου δείγματος και του δείγματος δοκιμής

0,96 = ο διοθρωτικός συντελεστής για την περιεκτικότητα της πρώην αραίωσης του δείγματος δοκιμής σε λιπαρές ύλες

Σημείωση:

Αντί των εμβαδών, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν τα ύψη των κορυφών (βλέπε σημείο 8.3).

7. Ακρίβεια της μεθόδου

7.1. Ενδοεργαστηριακή επαναληπτικότητα (r)

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που εκτελούνται με τη μικρότερη εφικτή χρονική διαφορά σε πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό, από τον ίδιο τεχνικό που χρησιμοποιεί τον ίδιο εξοπλισμό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 16 mg/kg.

7.2. Διεργαστηριακή επαναληπτικότητα (R)

Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που εκτελούνται σε πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό από τους τεχνικούς διαφορετικών εργαστηρίων που χρησιμοποιούν διαφορετικό εξοπλισμό, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 27 mg/kg.

8. Όρια ανοχής

8.1. Από το ιχνηθετημένο προϊόν λαμβάνονται τρία δείγματα για τον έλεγχο της ομοιογένειας.

8.2. Όταν ο ιχνηθέτης έχει ληφθεί είτε από φυσική είται από συνθετική βανίλια:

8.2.1. Ο βαθμός ενσωμάτωσης της 4-υδροξυ-3-μεθοξυβενζαλδεΰδης είναι 250 g ανά τόνο 7

8.2.2. Λαμβανομένης υπόψη της κρίσης διαφοράς για πιθανότητα 95 % (CrD95), μέσος όρος των αποτελεσμάτων των μεμονωμένων αναλύσεων στις οποίες έχει υποβληθεί καθένα από τα τρία δείγματα για τον έλεγχο της ομοιογένειας είναι τουλάχιστον 236,0 mg/kg.

8.2.3 Πέραν του κριτηρίου του σημείου 8.2.2 για τον έλεγχο της ομοιογένειας της κατανομής του ιχνηθέτη χρησιμοποιώντας το χαμηλότερο αποτέλεσμα της ανάλυσης του προϊόντος. Αυτό επιτυγχάνεται με παραβολή με τα ακόλουθα όρια:

- 221,5 mg/kg (95 % του ελάχιστου βαθμού ενσωμάτωσης, λαμβανομένης υπόψη της CrD95, των μεμονωμένων δειγμάτων),

- 159,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου βαθμού ενσωμάτωσης, λαμβανομένης υπόψη της CrD95 των μεμονωμένων δειγμάτων).

Χρησιμοποιείται η συγκέντρωση των ιχνηθέτη στο δείγμα η οποία δίδει τα χαμηλότερα αποτελέσματα σε συνδυασμό με παρεμβολή μεταξύ 221,5 mg/kg και 159,0 mg/kg.

8.3. Όταν ο ιχνηθέτης έχει ληφθεί αποκλειστικά από καρπούς βανίλιας ή από πλήρη εκχυλίσματα αυτών:

8.3.1. Ο βαθμός ενσωμάτωσης της 4-υδροξυ-3-μεθοξυβενζαλδεΰδης είναι 100 g ανά τόνο.

8.3.2. Λαμβανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς για πιθανότητα 95 % (CrD95), μέσος όρος των αποτελεσμάτων των μενονωμένων αναλύσεων στις οποίες έχει υποβληθεί καθένα από τα τρία δείγματα για τον έλεγχο της ομοιογένειας είναι τουλάχιστον 86,0 mg/kg.

8.3.3. Πέραν του ανωτέρω κριτηρίου, για τον έλεγχο της ομοιογένειας της κατανομής του ιχνηθέτη χρησιμοποιώντας το χαμηλότερο αποτέλεσμα της ανάλυσης του προϊόντος. Αυτό επιτυχάνεται με παραβολή με τα ακόλουθα όρια:

- 79,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου βαθμού ενσωμάτωσης, λαμβανομένης υπόψη της CrD95, των μεμονωμένων δειγμάτων),

- 54,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου βαθμού ενσωμάτωσης, λαμβανομένης υπόψη της CrD95 των μεμονωμένων δειγμάτων).

Χρησιμοποιείται η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα η οποία δίδει τα χαμηλότερα αποτελέσματα σε συνδυασμό με παρεμβολή μεταξύ 79,0 mg/kg και 54,0 mg/kg.

9. Σημειώσεις

9.1. Η ενδοεργαστηριακή επαναληπτικότητα r είναι η τιμή κάτω από την οποία η διαφορά, σε απόλυτες τιμές, μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων δοκιμών που έχουν εκτελεστεί με πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό, με την ίδια μέθοδο και τις ίδιες συνθήκες (ίδιος εξοπλισμός, ίδιο εργαστήριο, μικρή χρονική διαφορά) αναμένεται να προκύψει με δεδομένη πιθανότητα. Εκτός αντίθετων υποδείξεων, η πιθανότητα είναι 95 %.

9.2. Η ενδοεργαστηριακή επαναληπτικότητα R είναι η τιμή κάτω από την οποία η διαφορά σε απόλυτες τιμές μεταξύ αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων δοκιμών που έχουν εκτελεστεί με πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό, με την ίδια μέθοδο αλλά με διαφορετικές συνθήκες (διαφορετικοί τεχνικοί, διαφορετικός εξοπλισμός, διαφορετικά εργαστήρια ή/και διαφορετικός χρόνος) αναμένεται να προκύψει με δεδομένη πιθανότητα. Εκτός αντίθετων υποδείξεων, η πιθανότητα είναι 95 %.

9.3. Η ανάκτηση της βανιλίνης που έχει προστεθεί στο επίπεδο των 250 mg/kg βουτυρελαίου κυμαίνεται από 97,0 έως 103,8. Διαπιστώθηκε ότι η μέση περιεκτικότητα ήταν 99,9 % με τυπική απόκλιση 2,7 %.

9.4. Το πρότυπο διάλυμα περιέχει διάλυμα εκχύλισης σε αναλογία 5 % για την αντιστάθμιση της διεύρυνσης της κορυφής που οφείλεται στην παρουσία του διαλύματος εκχύλισης 5 % των δειγμάτων δοκιμής. Αυτό επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό με μέτρηση του ύψους της κορυφής.

9.5. Η ανάλυση βασίζεται σε καμπύλη βαθμονόμησης που είναι ευθεία γραμμή διερχόμενη από το μηδέν. Πριν από την πρώτη ανάλυση θα πρέπει να ελέγχεται η γραμμικότητα της καμπύλης χρησιμοποιώντας κατάλληλες αραιώσεις του προτύπου διαλύματος (4.5.2). Ο έλεγχος αυτός θα πρέπει να επαναλαμβάνεται σε τακτά χρονικά διαστήματα καθώς και μετά από οποιαδήποτε μετατροπή ή επισκευή του εξοπλισμού HPLC.