ΟΔΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 18ης Νοεμβρίου 1987 που προσαρμόζει για ένατη φορά στην τεχνική πρόοδο την οδηγία 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου περί προσεγγίσεως των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων περί ταξινομήσεως, συσκευασίας και επισημάνσεως των επικινδύνων ουσιών (88/302/EOK)

H EPITROPH TVN EZRVPAIKVN KOINOTHTVN,

iExontaw zpσch:

th sznu´hkh gia thn νdrzsh thw Ezrvpaοk´hw Oikonomik´hw Koinσthtaw,

thn odhgνa 67/548/EOK toz Szmbozlνoz thw 27hw Ioznνoz 1967 perν proseggνsevw tvn nomouetik´vn, kanonistik´vn kai dioikhtik´vn diatαjevn perν tajinom´hsevw, szskezasνaw kai epishmαnsevw tvn epikind´znvn ozsi´vn (1), σpvw tropopoi´huhke gia ιkth forα apσ thn odhgνa 79/831/EOK (2), kai idνvw to αruro 19,

Ektim´vntaw:

σti to αruro 3 parαgrafow 1 thw odhgνaw 67/548/EOK problιpei σti o prosdiorismσw tvn fzsikoxhmik´vn idiot´htvn, thw tojikσthtaw kai thw oikotojikσthtaw tvn ozsi´vn kai paraskezasmαtvn dienergeνtai s´zmfvna me tiw meuσdozw poz problιpontai sto parαrthma Vφ

σti to αruro 3 parαgrafow 2 thw odhgνaw 67/548/EOK problιpei σti h ajiolσghsh toz pragmatiko´z ´h dznhtiko´z kind´znoz gia to peribαllon gνnetai s´zmfvna me ta xarakthristikα poz apariumo´zntai sta parart´hmata VII kai VIIIφ

σti to parαrthma V poz prostιuhke me thn odhgνa 84/449/EOK thw Epitrop´hw (3) perilambαnei prow to parσn mσno tiw meuσdozw dokimasνaw poz antapokrνnontai sta xarakthristikα poz anafιrontai leptomer´vw sto parαrthma VII, kai σti eνnai anagkaνo epνshw na zpαrxei h dznatσthta prσsbashw stiw meuσdozw dokimasi´vn poz antistoixo´zn sta xarakthristikα poz apariumo´zntai sto parαrthma VIIIφ

σti oi diatαjeiw thw paro´zsaw odhgνaw eνnai s´zmfvnew me th gn´vmh thw epitrop´hw gia thn prosarmog´h sthn texnik´h

prσodo tvn odhgi´vn poz apoblιpozn sthn ejαleich tvn texnik´vn empodνvn stiw sznallagιw ston tomιa tvn epikνndznvn ozsi´vn kai paraskezasmαtvn,

EJEDVSE THN PAROZSA ODHGIA:

νAruro 1

Sto parαrthma V thw odhgνaw 67/548/EOK prostνuetai to keνmeno toz parart´hmatow thw paro´zsaw odhgνaw.

νAruro 2

Ta krαth mιlh egkrνnozn kai dhmosie´zozn, prin apσ thn 1h Dekembrνoz 1988, tiw anagkaνew diatαjeiw gia na szmmorfvuo´zn me thn paro´zsa odhgνa kai enhmer´vnozn amιsvw thn Epitrop´h sxetikα. Ta krαth mιlh efarmσyozn tiw en lσgv diatαjeiw, to argσtero stiw 30 Ioznνoz 1989.

νAruro 3

H paro´zsa odhgνa apezu´znetai sta krαth mιlh.

Brzjιllew, 18 Noembrνoz 1987.

Για την Επιτροπή

Stanley CLINTON DAVIS

Μέλος της Επιτροπής

(1) ΕΕ αριθ. 196 της 16. 8. 1967, σ. 1/67.

(2) ΕΕ αριθ. L 259 της 15. 10. 1979, σ. 10.

(3) ΕΕ αριθ. L 251 της 19. 9. 1984, σ. 1.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

Σελίδα

ΜΕΡΟΣ Β: Τοξικολογικές μέθοδοι ... 4

Γενική εισαγωγή: μέρος Β ... 4

Μελέτη υποχρόνιας τοξικότητας ουσιών που λαμβάνονται από το στόμα: Μελέτη 90 ημερών με επαναλαμβανόμενη δόση από το στόμα σε τρωκτικά ... 8

Μελέτη υποχρόνιας τοξικότητας ουσιών που λαμβάνονται από το στόμα: Επαναλαμβανόμενη δόση 90 ημερών από το στόμα με τη χρήση μη τρωκτικών ειδών ...12

Μελέτη υποχρόνιας δερματικής τοξικότητας ουσιών: Επαναλαμβανόμενη δόση 90 ημερών στο δέρμα με τη χρήση τρωκτικών ειδών ...16

Μελέτη υποχρόνιας τοξικότητας ουσιών που λαμβάνονται με την εισπνοή: Επαναλαμβανόμενη δόση εισπνοής, 90 ημερών, με τη χρήση τρωκτικών ειδών ...20

Μελέτη τερατογενετικότητας σε τρωκτικά και μη τρωκτικά ...24

Δοκιμασία χρόνιας τοξικότητας ...27

Δοκιμασία καρκινογενετικότητας ...32

Συνδυασμένη δοκιμασία καρκινογενετικότητας και χρόνιας τοξικότητας ...37

Τοξικολογική δοκιμασία αναπαραγωγής μιας γενεάς ...43

Τοξικολογική δοκιμασία αναπαραγωγής δύο γενεών ...47

Τοξικοκινητική ...51

ιΕλεγχος μεταλλαξιογενετικότητας και έρευνα για καρκινογενετικότητα:

- Μετάλλαξη γονιδίων - Saccharomyces cerevisiζ ...55

- Μιτωτικός ανασυνδυασμός, Saccharomyces cerevisiζ ...58

- Κύτταρο θηλαστικού in vitro - Δοκιμασία μετάλλαξης γονιδίου ...61

- Βλάβη και επιδιόρθωση DNA - απρογραμμάτιστη σύνθεση DNA - κύτταρα θηλαστικών - in vitro ...64

- Μέθοδος ανταλλαγής αδελφών χρωματίδων in vitro ...68

- Δοκιμασία θανατηφόρου φυλοσυνδέτου υπολειπομένου χαρακτήρος σε Drosophila melanogaster ...71

- Δοκιμασίες μετασχηματισμού κυττάρων θηλαστικών in vitro ...73

- Δοκιμασία θανατηφόρου επικρατούντος χαρακτήρος σε τρωκτικά ...76

- Κυτταρογενετική γεννητικών κυττάρων θηλαστικού ...79

- Δοκιμασία κηλίδας σε ποντικό ...82

- Κληρονομήσιμη μετατόπιση γονιδίων σε ποντικούς ...85

ΜΕΡΟΣ Γ: Μέθοδος ελέγχου της οικοτοξικότητας ...88

Γενική εισαγωγή: μέρος Γ ...88

Δοκιμασία αναστολής αλγών ...89

Τοξικότητα για τους γαιοσκώληκες: Δοκιμασία τεχνητού εδάφους ...95

Βιοαποικοδόμηση: Δοκιμασία Zahn-Wellens ...99

Βιοαποικοδόμηση: Δοκιμασίες προσομοίωσης ενεργοποιημένης ιλύος ...106

Βιοαποικοδόμηση: Ενεργοποιημένη ιλύς: έλεγχος αναστολής της αναπνοής ...118

Βιοαποικοδόμηση: Τροποποιημένη δοκιμασία SCAS ...123

ΜΕΡΟΣ Β: ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ

ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ: ΜΕΡΟΣ Β

ΜΑΚΡΟΠΡΟΘΕΣΜΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ

Υποχρόνιες-χρόνιες μελέτες και μελέτες καρκινογενετικότητας

Χαρακτηρισμός της δοκιμαζόμενης ουσίας και του μείγματος αγωγής

Η σύνθεση της δοκιμαζόμενης ουσίας, συμπεριλαμβανομένων των κυριότερων προσμείξεων και οι σχετικές φυσικοχημικές ιδιότητές της, συμπεριλαμβανομένης της σταθερότητας, πρέπει να είναι γνωστές πριν την έναρξη οποιασδήποτε μελέτης τοξικότητας.

Οι φυσικοχημικές ιδιότητες της δοκιμαζόμενης ουσίας παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για την επιλογή της οδού χορήγησης, τη σχεδίαση υποχρόνιων και χρόνιων μελετών ή μελετών καρκινογενετικότητας και τη διαχείριση και φύλαξη της δοκιμαζόμενης ουσίας.

Οι πληροφορίες για τη χημική δομή και τις φυσικοχημικές ιδιότητες μπορούν επίσης να παράσχουν μια ένδειξη των χαρακτηριστικών απορρόφησης από την οδό χορήγησης που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί, καθώς επίσης και των δυνατοτήτων μεταβολικής και ιστολογικής κατανομής. Μπορούν επίσης να υπάρξουν πληροφορίες για τοξικοκινητικές παραμέτρους από προηγούμενες μελέτες τοξικότητας και τοξικοκινητικότητας.

Η ανάπτυξη μιας αναλυτικής μεθόδου για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό της δοκιμαζόμενης ουσίας (συμπεριλαμβανομένων των κυριότερων προσμείξεων, εάν είναι δυνατόν) στο μέσο χορήγησης των δόσεων, καθώς επίσης και στο βιολογικό υλικό, θα πρέπει να προηγείται από την έναρξη της μελέτης.

Πειραματόζωα: επιλογή του είδους και της ποικιλίας

Επειδή είναι ανάγκη να επιβάλλεται αγωγή στα ζώα για το μεγαλύτερο μέρος της διάρκειας της ζωής τους, οι μελέτες τείνουν να περιορισθούν στη χρήση ευκολοσυντήρητων και σχετικά βραχύβιων πειραματικών ειδών ζώων. Είναι εξαιρετικά επιθυμητό να είναι γνωστή η εμφάνιση αυτογενών ασθενειών και όγκων στο στέλεχος του χρησιμοποιούμενου ζώου, όταν διατηρείται κάτω από παρόμοιες συνθήκες.

Οι ποικιλίες των ζώων πρέπει να χαρακτηρίζονται με σαφήνεια και να μην παρουσιάζουν συγγενή ελαττώματα. Η χρήση ποικιλιών ζώων που προήλθαν από αιμομεικτική αναπαραγωγή ή από F.1 υβρίδια παρουσιάζει μερικά πλεονεκτήματα από της απόψεως αυτής, αλλά, στην περίπτωση που διατίθενται επαρκή στοιχεία ιστορικού για ποικιλίες που προήλθαν από αναπαραγωγή μη αιμομεικτικών στελεχών ζώων, με τη χρήση ζώων που προήλθαν από περιορισμένο αρχικό αριθμό ζώων, τα ζώα αυτά είναι αποδεκτά.

Φροντίδα για τα ζώα, δίαιτα και χορήγηση νερού

Τα πειράματα και οι μελέτες με τα ζώα θα διεξάγονται σύμφωνα με τους εθνικούς κανονισμούς και πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι ανθρωπιστικές αρχές και οι διεθνείς εξελίξεις στον τομέα της πρόνοιας για τα ζώα.

Ο αυστηρός έλεγχος των συνθηκών του περιβάλλοντος και των κατάλληλων τεχνικών μεθόδων για τη φροντίδα των ζώων είναι επιτακτικός για να υπάρξουν ουσιαστικά αποτελέσματα. Παράγοντες όπως είναι οι συνθήκες κατοικίας, οι παρεμπίπτουσες νόσοι, η φαρμακοθεραπεία, οι προσμείξεις στη δίαιτα, στον αέρα, στο νερό και οι ευκολίες στρωμνής και γενικής ζωικής φροντίδας μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά τα αποτελέσματα των μελετών με τη χορήγηση επαναλαμβανόμενων δόσεων. Γενικά, πρέπει να είναι γνωστό το αποτέλεσμα των χημικών αποστειρωτικών πάνω στη μελέτη.

Η δίαιτα πρέπει να ικανοποιεί όλες τις απαιτήσεις διατροφής του χρησιμοποιούμενου είδους και να μην περιέχει προσμείξεις που θα μπορούσαν να επηρεάσουν το αποτέλεσμα του πειράματος. Τα τρωκτικά πρέπει να λαμβάνουν τροφή και νερό κατά βούληση και η τροφή τους να αντικαθίσταται τουλάχιστον κάθε εβδομάδα. Σήμερα χρησιμοποιούνται τρεις τύποι δίαιτας, η συμβατική, η συνθετική και διάφορες δίαιτες μη καθορισμένης μορφής.

Οποιαδήποτε δίαιτα και αν επιλεγεί, οι προμηθευτές πρέπει να εξακριβώνουν με περιοδικό έλεγχο τη θρεπτική αξία και το επίπεδο των ρυπαντικών ουσιών στη βασική δίαιτα και να παρέχουν τις πληροφορίες αυτές στο εργαστήριο για κάθε παρτίδα τροφών. Είναι επίσης εξαιρετικά επιθυμητό να είναι γνωστές οι επιδράσεις της διαιτητικής αγωγής πάνω στο μεταβολισμό καθώς επίσης και στην ανάπτυξη όγκων και στη μακροβιότητα των ζώων.

Εκτός αυτών, μπορούν να διενεργηθούν δοκιμαστικές αναλύσεις της βασικής δίαιτας από το εργαστήριο δοκιμασιών τόσο για τα συστατικά των τροφών όσο και για τις τυχαίες ρυπαντικές ουσίες, συμπεριλαμβανομένων και των καρκινογόνων ουσιών. Εάν γίνει αυτό, τα αποτελέσματα των αναλύσεων πρέπει να διατηρηθούν και να συμπεριληφθούν στην τελική έκθεση που θα συνταχθεί για κάθε δοκιμαζόμενη ουσία.

Κοινά διαιτητικά συστατικά που είναι γνωστό ότι επιδρούν στην καρκινογένεση (π.χ. αντιοξειδωτικά, μη κεκορεσμένα λιπαρά οξέα, σελήνιο), δεν πρέπει να υπάρχουν σε ενοχλητικές συγκεντρώσεις. Η ενδεχόμενη επίδραση διαφόρων κοινών διαιτητικών ρυπαντικών ουσιών στην εκτίμηση της καρκινογενετικότητας απαιτεί να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στην ύπαρξη καταλοίπων εντομοκτόνων, οργανοχλωριωμένων ενώσεων, πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων, οιστρογόνων, βαρέων μετάλλων, νιτροζαμινών και μυκοτοξινών μέσα στη δίαιτα.

Στην περίπτωση που η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται μέσα στο νερό ή στην τροφή, χρήσιμες είναι οι δοκιμασίες σταθερότητας. Για να καθορισθεί η απαιτούμενη συχνότητα προπαρασκευής της δίαιτας και παρακολούθησης, πρέπει να χρησιμοποιηθούν δοκιμασίες σταθερότητας και ομοιογένειας που έχουν κατάλληλα εκτελεσθεί πριν από τις μελέτες επαναλαμβανόμενων δόσεων.

ιΟταν οι τροφές είναι αποστειρωμένες, πρέπει να είναι γνωστές οι επιδράσεις των διαδικασιών αυτών στη δοκιμαζόμενη ουσία και στα διαιτητικά συστατικά. Πρέπει να γίνουν οποιεσδήποτε κατάλληλες προσαρμογές.

Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων καρκινογένεσης, οι ερευνητές πρέπει να είναι ενήμεροι για την ύπαρξη ενδεχόμενα επιμολυντικών ουσιών στο χρησιμοποιούμενο νερό. Το νερό που είναι εγκεκριμένο για ανθρώπινη κατανάλωση είναι γενικά ικανοποιητικό, και πρέπει να υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με τη σύστασή του.

Η συγκέντρωση μιας δοκιμαζόμενης ουσίας μέσα στη δίαιτα μπορεί να χρειάζεται προσαρμογή ανάλογα με την ανάπτυξη των ζώων, έτσι ώστε να διατηρείται μια λογικά σταθερή λήψη ουσίας σε σχέση με το βάρος του σώματος.

Η θρεπτική αξία της δίαιτας μάρτυρος και της δίαιτας πειράματος πρέπει να καταστεί όσο το δυνατόν πιο όμοια. Γι' αυτό το λόγο θα πρέπει να εξεταστεί η θρεπτική αξία της δοκιμαζόμενης ουσίας που έχει αναμειχθεί μέσα στη δίαιτα. Η πείρα διδάσκει ότι ένα ποσοστό των μη θρεπτικών δοκιμαζόμενων ουσιών μέσα στη δίαιτα, που ανέρχεται μέχρι και στο 5 % της ποσότητάς τους, είναι απίθανο να επηρεάσει σε σημαντικό βαθμό τη θρεπτική αξία της δίαιτας.

1. Μελέτες τοξικότητας ουσιών που λαμβάνονται με εισπνοή

Δεν προσδιορίζεται κανένα οριακό πείραμα, γιατί δεν έγινε δυνατό να ορισθεί μία και μόνο οριακή τιμή έκθεσης εισπνοής.

2. Μελέτη τερατογενετικότητας

Η μέθοδος του πειράματος κατευθύνεται αρχικά στη χορήγηση της ουσίας μέσω του στόματος. Εναλλακτικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες οδοί χορήγησης ανάλογα με τις φυσικές ιδιότητες της δοκιμαζόμενης ουσίας ή της πιθανής οδού της ανθρώπινης έκθεσης. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η μέθοδος του πειράματος πρέπει να προσαρμοσθεί κατάλληλα λαμβάνοντας υπόψη τα προσφυή στοιχεία των δοκιμασιών πειραμάτων 28 ημερών.

3. Τοξικοκινητική

Οι τοξικοκινητικές μελέτες βοηθούν στην ερμηνεία και αξιολόγηση των δεδομένων τοξικότητας. Οι μελέτες αυτές αποβλέπουν στο να διευκρινήσουν ιδιαίτερες απόψεις της τοξικότητας της υπό δοκιμασία χημικής ουσίας, τα δε αποτελέσματά τους μπορούν να βοηθήσουν στο σχεδιασμό των περαιτέρω μελετών τοξικότητας. Δεν χρειάζεται να προσδιορίζονται όλες οι παράμετροι σε κάθε περίπτωση. Μόνο σε σπάνιες περιπτώσεις είναι απαραίτητη όλη η σειρά των τοξικοκινητικών μελετών (απορρόφηση, έκκριση, κατανομή και μεταβολισμός). Για ορισμένες ενώσεις ενδείκνυνται αλλαγές στη σειρά αυτή ή μπορεί να είναι αρκετή και μελέτη με μια μόνο δόση.

Ορισμοί

Τοξικοκινητικότητα:

η μελέτη της απορρόφησης, κατανομής, μεταβολισμού και έκκρισης των ουσιών του πειράματος.

Απορρόφηση:

η διαδικασία ή οι διαδικασίες με τις οποίες η χορηγούμενη ουσία εισέρχεται στο σώμα.

ιΕκκριση:

η διαδικασία ή οι διαδικασίες με τις οποίες η χορηγούμενη ουσία ή/και τα προϊόντα του μεταβολισμού της αποβάλλονται από το σώμα.

Κατανομή:

η διαδικασία ή οι διαδικασίες με τις οποίες η απορροφηθείσα ουσία ή/και τα προϊόντα του μεταβολισμού της κατανέμονται στο σώμα.

Μεταβολισμός:

η διαδικασία ή οι διαδικασίες με τις οποίες η δομή της χορηγούμενης ουσίας μεταβάλλεται μέσα στο σώμα με ενζυματικές ή μη ενζυματικές αντιδράσεις.

4. Οξεία και υποξεία μελέτη σε δεύτερο είδος

Ο σκοπός μιας μελέτης σε δεύτερο είδος είναι να συμπληρώσει τα συμπεράσματα που βγήκαν από το πρώτο.

Σε περίπτωση μελέτης σε δεύτερο είδος, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ή να προσαρμοσθεί για μικρότερο αριθμό ζώων η μέθοδος δοκιμασίας που έχει ήδη περιγραφεί.

5. Μελέτες γονιμότητας

ιΟταν απαιτείται δοκιμασία για αναπαραγωγή επί τρεις γενεές, η περιγραφείσα μέθοδος για την αναπαραγωγή επί δύο γενεές μπορεί να επεκταθεί ώστε να καλύψει την τρίτη γενεά.

6. Μελέτες μεταλλαξιογένεσης

Πρόσθετα πειράματα μεταλλαξιογένεσης που περιλαμβάνουν πειράματα «SCREENING» για καρκινογένεση

Στο παράρτημα VΙΙΙ της οδηγίας αναφέρονται πρόσθετες μελέτες για την περαιτέρω έρευνα της μεταλλαξιογένεσης ή την προληπτική εξέταση για καρκινογένεση. Οι μελέτες που περιγράφονται στο τμήμα αυτό μπορούν γενικά να χρησιμοποιηθούν για την έρευνα και στους δύο αυτούς τομείς.

Εισαγωγή

Η αρχική εκτίμηση της μεταλλαξιογενούς δραστηριότητας μιας ουσίας συνίσταται σε δοκιμασίες για (εστιακές) μεταλλάξεις γονιδίων σε βακτήρια και για κυτταρογενετική βλάβη σε κύτταρα θηλαστικών (in vitro ή in vivo). Κατάλληλοι μέθοδοι για τις βασικές αυτές μελέτες περιγράφηκαν προηγουμένως. Το τμήμα αυτό ασχολείται με συμπληρωματικές μελέτες οι οποίες είναι κατάλληλες για την επαλήθευση ή/και επέκταση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται στις βασικές μελέτες και οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ορισμένους σκοπούς όπως είναι:

1. ^η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από της βασικές μελέτες

2. ^η έρευνα των τελικών σημείων που δεν μελετώνται στη βασική μελέτη

3. ^η προώθηση ή η επέκταση μελετών in vivo.

Για τους σκοπούς αυτούς η σειρά των δοκιμασιών που περιγράφονται περιλαμβάνουν, τόσο in vitro όσο και in vivo, ευκαρυωτικά συστήματα και μια εκτεταμένη σειρά βιολογικών τελικών σημείων. Οι δοκιμασίες παρέχουν πληροφορίες για εστιακές μεταλλάξεις σε οργανισμούς περισσότερο σύνθετους απ' ό,τι τα χρησιμοποιούμενα βακτηρίδια στη βασική μελέτη και επεκτείνουν τις πληροφορίες στην ικανότητα μιας ουσίας να προκαλέσει χρωμοσωμική απόκλιση.

Περιγράφονται επίσης δοκιμασίες για τελικά σημεία διαφορετικά από τις εστιακές μεταλλάξεις και τη χρωμοσωμική απόκλιση. Οι δοκιμασίες αυτές παρέχουν συμπληρωματικές πληροφορίες και μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε δοκιμαστικά προγράμματα.

Σαν γενική αρχή, κατά την εξέταση ενός προγράμματος περαιτέρω μελετών μεταλλαξιογένεσης, η σχεδίαση θα πρέπει να γίνεται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να παρέχει σχετικές πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με το μεταλλαξιογενετικό ή/και καρκινογενετικό δυναμικό της εν λόγω ουσίας.

Οι πραγματικές μελέτες που μπορεί να είναι κατάλληλες σε μια ιδιαίτερη περίπτωση, θα εξαρτηθούν από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των χημικών και των φυσικών χαρακτηριστικών της ουσίας, των αποτελεσμάτων των αρχικών βακτηριολογικών και κυτταρογενετικών δοκιμασιών, του μεταβολικού χαρακτήρα της ουσίας, των αποτελεσμάτων άλλων τοξικολογικών μελετών και των γνωστών χρήσεων της ουσίας. ιΕνα αυστηρό πρόγραμμα επιλογής δοκιμασιών είναι ως εκ τούτου ακατάλληλο εν όψει της ποικιλίας των παραγόντων οι οποίοι πιθανόν να απαιτούν εξέταση. Ωστόσο, μερικές γενικές αρχές μπορούν να είναι χρήσιμες. Εάν μια δοκιμασία ήταν θετική στις βασικές μελέτες, οι συμπληρωματικές μελέτες μπορούν να περιλαμβάνουν τουλάχιστον μία δοκιμασία η οποία να μπορεί να ανιχνεύει το ίδιο γενετικό τελικό σημείο. Εάν και οι δύο δοκιμασίες στις βασικές μελέτες ήταν αρνητικές, θα πρέπει κανονικά να εκτελεσθούν δοκιμασία για τις μεταλλάξεις γονιδίων καθώς και δοκιμασία για χρωμοσωμικές αποκλίσεις, υπό τη μορφή συμπληρωματικών μελετών. ιΙσως επίσης να είναι κατάλληλη η απόκτηση πρόσθετων στοιχείων από ενδεικτικές δοκιμασίες (που περιγράφονται κατωτέρω). Οι μέθοδοι για τέτοιες έρευνες ταξινομούνται κατωτέρω με βάση το κύριο γενετικό τελικό τους σημείο.

Μελέτες για την έρευνα (εστιακών) μεταλλάξεων γονιδίων

Για την περαιτέρω έρευνα της δυνατότητας μιας ουσίας να παράγει (εστιακές) μεταλλάξεις γονιδίων, μία από τις παρακάτω δοκιμασίες μπορεί να είναι κατάλληλη:

α) ^μελέτες πρόσω ή αντίστροφης μετάλλαξης με τη χρήση ευκαρυωτικών μικροοργανισμών [σακχαρομύκης μπίρας (Saccharomyces cerevisiae)]

β) ^μελέτες in vitro για την έρευνα της πρόσω μετάλλαξης σε κύτταρα θηλαστικών

γ) ^δοκιμασία θανατηφόρου φυλοσυνδέτου υπολειπομένου χαρακτήρος σε Drosophilia melanogaster

δ) ^δοκιμασία σωματικής κυτταρικής μετάλλαξης in vivo: δοκιμασία κηλίδας σε ποντικό.

Μελέτες για την έρευνα χρωμοσωμικών αποκλίσεων

ιΟταν υπάρχει ανάγκη για περαιτέρω έρευνα της δυνατότητας μιας ουσίας να παράγει χρωμοσωμικές αποκλίσεις, μία από τις παρακάτω δοκιμασίες μπορεί να είναι κατάλληλη:

α) ^κυτταρογενετικές μελέτες in vivo σε θηλαστικά.

Η μεταφασική ανάλυση in vivo κυττάρων μυελού οστών θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη εάν δεν περιλήφθηκε στην αρχική εκτίμηση (βασικές μελέτες). Εκτός αυτού, μπορεί να γίνει έρευνα in vivo στην κυτταρογενετική των γαμετογόνων κυττάρων

β) ^κυτταρογενετικές μελέτες in vitro σε κύτταρα θηλαστικών, εάν δεν περιλήφθηκαν στην αρχική εκτίμηση

γ) ^δοκιμασία θανατηφόρου επικρατούντος χαρακτήρος σε τρωκτικά

δ) ^δοκιμασία κληρονομήσιμης μετατόπισης (γονιδίων) ποντικών.

Ενδεικτικές δοκιμασίες για την επίδραση στο DNA

Υπάρχουν μέθοδοι οι οποίες παρέχουν μια ένδειξη ορισμένων επιδράσεων πάνω στο DNA, αλλά δεν έχουν μεταλλαξιγενές αποτέλεσμα, όπως το «τελικό σημείο». Οι μελέτες αυτές μπορούν να παρέχουν πληροφορίες οι οποίες συμπληρώνουν εκείνες που λαμβάνονται από μελέτες μεταλλαξιγένεσης και οι οποίες μπορεί να είναι χρήσιμες στην ερμηνεία των εν λόγω μελετών. ιΟταν υπάρχει ανάγκη για τη διενέργεια των ερευνών αυτών, μπορεί να είναι κατάλληλη μία από τις παρακάτω μεθόδους με τη χρήση ευκαρυωτικών μικροοργανισμών ή κυττάρων θηλαστικών:

α) ^μιτωτικός ανασυνδυασμός σε σακχαρομύκητα της μπίρας (Saccharomyces cerevisiae)

β) ^βλάβη και επανόρθωση DNA -απρογραμμάτιστη σύνθεση DNA- σε κύτταρα θηλαστικών (in vitro)

γ) ^ανταλλαγή αδελφών χρωματιδίων σε κύτταρα θηλαστικών (in vitro).

Άλλες ενδεικτικές δοκιμασίες για δυνητική καρκινόγενεση

Υπάρχουν δοκιμές μετασχηματισμού κυττάρων θηλαστικών οι οποίες μετράνε την ικανότητα μιας ουσίας να προκαλεί μορφολογικές μεταβολές και μεταβολές ως προς τη συμπεριφορά σε καλλιέργεια κυττάρων, οι οποίες πιστεύεται ότι συνδέονται με κακοήθη μετασχηματισμό in vivo. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί αριθμός διαφορετικών κυτταρικών τύπων και κριτηρίων μετασχηματισμού.

Εκτίμηση του κινδύνου για κληρονομήσιμες επιδράσεις σε θηλαστικά

Υπάρχουν μέθοδοι για τη μέτρηση των κληρονομήσιμων επιδράσεων σε ολόκληρα θηλαστικά, που παρήχθησαν από (εστιακές) μεταλλάξεις γονιδίων, όπως είναι η ειδική δοκιμασία θέσης επί χρωματιδίου ποντικού^(;), ή για χρωμοσωμικές αποκλίσεις, όπως είναι το πείραμα κληρονομήσιμης μετατόπισης γονιδίων ποντικού. Οι μέθοδοι αυτοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την εκτίμηση του πιθανού κίνδυνου μιας ουσίας για τον άνθρωπο. Ωστόσο, εν όψει του περίπλοκου χαρακτήρα την δοκιμασιών αυτών και του πολύ μεγάλου αριθμού ζώων που χρειάζονται, ιδιαίτερα για τη δοκιμασία ειδικής θέσης, απαιτείται τεκμηριωμένη αιτιολόγηση πριν την ανάληψη των μελετών αυτών.

(;) Η ειδική δοκιμασία θέσης επί χρωματιδίου ποντικού (η οποία δεν περιγράφεται στο έγγραφο αυτό) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της μετάλλαξης των γαμετογόνων κυττάρων στην πρώτη γενεά μετά την έκθεση σε μία μεταλλαξιγόνο ουσία. Γενετικές μεταβολές που οδηγούν σε αλλαγές στα προϊόντα γονιδίων με ορατά φαινότυπα, μπορούν να ανιχνευθούν και να προσδιορισθεί η ποσότητά τους.

ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΧΡΟΝΙΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΟΥΣΙΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ

ΜΕΛΕΤΗ 90 ΗΜΕΡΩΝ ΜΕ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗ ΔΟΣΗ ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ ΣΕ ΤΡΩΚΤΙΚΑ

1.

ΜΕΘΟΔΟΣ

1.1.

Εισαγωγή

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.2.

Ορισμοί

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.3.

Ουσίες αναφοράς

Καμία.

1.4.

Αρχή της μεθόδου δοκιμασίας

Η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται καθημερινά από το στόμα σε προοδευτικά αυξανόμενες δόσεις σε αρκετές ομάδες πειραματόζωων, μία δόση ανά ομάδα για περίοδο 90 ημερών. Κατά την περίοδο της αγωγής, τα ζώα παρατηρούνται καθημερινά για την ανίχνευση σημείων τοξικότητας. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, καθώς επίσης και τα επιζήσαντα ζώα στο τέλος της δοκιμασίας, υφίστανται νεκροψία.

1.5.

Κριτήρια ποιότητας

Κανένα.

1.6.

Περιγραφή της μεθόδου δοκιμασίας

Προπαρασκευή

Τα ζώα διατηρούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες κατοικίας και διατροφής επί πέντε τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία, υγιή νεαρά πειραματόζωα ξεχωρίζονται με τυχαία επιλογή και κατανέμονται σε ομάδες αγωγής και ομάδες μάρτυρες.

Η δοκιμαζόμενη ουσία μπορεί να χορηγείται μέσα στη δίαιτα, με καθετήρα στομάχου, με κάψουλες ή μέσα στο πόσιμο νερό. Οι δόσεις για όλα τα ζώα πρέπει να χορηγούνται με την ίδια μέθοδο κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου δοκιμασίας. Εάν χρησιμοποιηθεί έκδοχο ή άλλα προσθετικά για τη διευκόλυνση της χορήγησης των δόσεων, θα πρέπει να είναι γνωστό ότι δεν προκαλούν τοξικές επιδράσεις. Εάν χρειασθεί, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ιστορικά στοιχεία.

Συνθήκες δοκιμασίας

Πειραματόζωα

Εφόσον δεν υπάρχουν αντενδείξεις, το προτιμώμενο είδος είναι ο αρουραίος. Πρέπει να χρησιμοποιούνται ποικιλίες νέων υγιών ζώων που χρησιμοποιούνται συνήθως σε εργαστήρια και η χορήγηση δόσεων πρέπει να αρχίζει κατά προτίμηση πριν οι αρουραίοι φθάσουν σε ηλικία έξι έως οκτώ εβδομάδων. Στην αρχή της μελέτης, η διαφορά βάρους ανάμεσα στα ζώα που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να υπερβαίνει το π 20 % του μέσου βάρους. Στην περίπτωση που διεξάγεται υποχρόνια μελέτη τοξικότητας ουσιών που λαμβάνονται από το στόμα για να χρησιμεύσει σαν προκαταρκτική για μια μακροπρόθεσμη μελέτη, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και στις δύο μελέτες τα ίδια είδη και ποικιλίες.

Αριθμός και φύλο

Τουλάχιστον 20 ζώα (10 θηλυκά και 10 αρσενικά) πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε κάθε επίπεδο δόσης. Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και όχι έγκυα. Εάν σχεδιάζονται θανατώσεις κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, ο αριθμός θα πρέπει να αυξηθεί ανάλογα με τον αριθμό των ζώων που πρόκειται να θανατωθούν πριν την ολοκλήρωση της μελέτης. Εκτός αυτού, μία δορυφορική ομάδα 20 ζώων (10 ζώα ανά φύλο) μπορεί να υποβληθεί σε αγωγή με το υψηλό επίπεδο δόσης επί 90 ημέρες και να παρατηρείται για αναστρεψιμότητα, εμμονή ή καθυστερημένη εμφάνιση των τοξικών επιδράσεων για μεταγενέστερη αγωγή 28 ημερών.

Επίπεδα δόσεων

Πρέπει να χρησιμοποιούνται τρία τουλάχιστον επίπεδα δόσεων και μία δόση μάρτυρος. Εξαιρουμένης της αγωγής με τη δοκιμαζόμενη ουσία, τα ζώα στην ομάδα μάρτυρα πρέπει να έχουν κατά τα άλλα την ίδια μεταχείριση με εκείνα της ομάδας της δοκιμασίας. Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται έκδοχο για να διευκολύνει τη χορήγηση των δόσεων, οι μάρτυρες πρέπει να λαμβάνουν δόσεις με το έκδοχο κατά τον ίδιο τρόπο όπως οι ομάδες που υφίστανται την αγωγή, και να λαμβάνουν την ίδια ποσότητα εκδόχου με αυτή που λαμβάνεται από την ομάδα του υψηλότερου επίπεδου δόσης. Το υψηλότερο επίπεδο δόσης πρέπει να προκαλέσει τοξικές επιδράσεις όχι όμως και θανάτους, ή τουλάχιστον πολύ λίγους. Το χαμηλότερο επίπεδο δόσης δεν πρέπει να προκαλεί οποιοδήποτε ίχνος τοξικότητας. Στην περίπτωση που υπάρχει χρησιμοποιήσιμη εκτίμηση ανθρώπινης έκθεσης, το χαμηλότερο επίπεδο πρέπει να την υπερβεί. Η ιδανική περίπτωση είναι το μέσο επίπεδο δόσης να προκαλεί ελάχιστες παρατηρήσιμες τοξικές επιδράσεις. Εάν χρησιμοποιηθούν περισσότερες από μία ενδιάμεσες δόσεις, τα επίπεδα δόσεων πρέπει να απέχουν μεταξύ τους έτσι ώστε να προκαλούν μια κλιμάκωση τοξικών επιδράσεων.

Στις χαμηλές και στις ενδιάμεσες ομάδες, καθώς και στις ομάδες μάρτυρες, η επέλευση οποιωνδήποτε θανάτων πρέπει να είναι χαμηλή έτσι ώστε να επιτρέπει μια ουσιαστική εκτίμηση των αποτελεσμάτων.

ιΟταν η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται μέσα στη δίαιτα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε μια σταθερή διαιτητική συγκέντρωση (ppm ή mg/kg τροφής) είτε ένα σταθερό επίπεδο δόσης ανάλογα με το βάρος του σώματος των ζώων. Πρέπει να προσδιορισθεί η εναλλακτική μέθοδος που χρησιμοποιείται. Για ουσίες που χορηγούνται με καθετήρα στομάχου, η δόση πρέπει να χορηγείται σε παραπλήσιες χρονικές στιγμές κάθε ημέρα. Τα επίπεδα δόσης πρέπει να ρυθμίζονται κατά διαστήματα (εβδομαδιαία ή δισεβδομαδιαία) έτσι ώστε να διατηρείται ένα σταθερό επίπεδο δόσης ανάλογα με το βάρος του σώματος του ζώου.

Οριακή δοκιμασία

Εάν μια μελέτη 90 ημερών, που διεξάγεται σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται με λεπτομέρεια παρακάτω, με επίπεδο δόσης 1^000 mg/kg βάρους σώματος ανά ημέρα, ή με υψηλότερο επίπεδο δόσης αναφορικά με ενδεχόμενη ανθρώπινη έκθεση, όπου αυτό είναι γνωστό, δεν παρέχει ενδείξεις τοξικών επιδράσεων, η συνέχιση του πειράματος μπορεί να μη θεωρηθεί αναγκαία. Για ουσίες χαμηλής τοξικότητας είναι σημαντικό να ληφθούν μέτρα ώστε οι ποσότητες και άλλες ιδιότητες της υπόψη δοκιμαζόμενης ουσίας, όταν χορηγούνται μέσα στη δίαιτα, να μην επηρεάζουν τις κανονικές απαιτήσεις διατροφής.

Περίοδος παρατήρησης

ιΟλα τα ζώα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά και να καταγράφονται οι ενδείξεις τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου εμφάνισης, του βαθμού και της διάρκειάς τους. Πρέπει επίσης να καταγράφεται ο χρόνος θανάτου και ο χρόνος εμφάνισης και εξαφάνισης των σημείων τοξικότητας.

Διαδικασία

Το ιδανικό είναι να λαμβάνουν τα ζώα δόσεις της δοκιμαζόμενης ουσίας επτά ημέρες την εβδομάδα για μια περίοδο 90 ημερών. Τα ζώα σε οποιαδήποτε δορυφορική ομάδα, που έχει προγραμματισθεί για παραπέρα παρατηρήσεις, πρέπει να διατηρούνται για 28 ημέρες ακόμα χωρίς αγωγή για τη διάγνωση της θεραπείας ή της εμμονής των τοξικών επιδράσεων.

Οι παρατηρήσεις «κλωβού» πρέπει να περιλαμβάνουν τις μεταβολές στο δέρμα και στο τρίχωμα, στους οφθαλμούς και στους βλεννογόνους υμένες καθώς επίσης και στο αναπνευστικό, κυκλοφορικό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στο πρότυπο συμπεριφοράς. Πρέπει να διενεργούνται μετρήσεις για την κατανάλωση τροφής (καθώς επίσης και για την κατανάλωση νερού, όταν η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται μέσα στο πόσιμο νερό), καθώς και ζύγιση των ζώων κάθε εβδομάδα.

Η τακτική παρατήρηση των ζώων είναι αναγκαία για την το κατά μέγιστο δυνατόν εξασφάλιση της μη απωλείας ζώων από τη δοκιμασία, οφειλομένη σε αιτίες όπως ο κανιβαλισμός, η αυτόλυση των ιστών ή η εσφαλμένη τοποθέτηση. Στο τέλος της περιόδου της μελέτης όλα τα επιζώντα ζώα στις μη δορυφορικές ομάδες αγωγής υφίστανται νεκροψία. ιΟταν παρατηρούνται ετοιμοθάνατα ζώα, πρέπει να απομακρύνονται και να υφίστανται νεκροψία.

Οι παρακάτω εξετάσεις γίνονται συνήθως για όλα τα ζώα, συμπεριλαμβανομένων των μαρτύρων:

α) ^οφθαλμολογική εξέταση, με τη χρήση οφθαλμοσκοπίου ή ισοδύναμου κατάλληλου εξοπλισμού, πρέπει να διενεργείται πριν από τη χορήγηση της δοκιμαζόμενης ουσίας και κατά το τέλος της μελέτης, κατά προτίμηση σε όλα τα ζώα, τουλάχιστον όμως στις ομάδες υψηλής δόσης και στις ομάδες μάρτυρες. Εάν διαπιστωθούν μεταβολές στους οφθαλμούς, πρέπει να εξετασθούν όλα τα ζώα

β) ^αιματολογική εξέταση, που συμπεριλαμβάνει εξέταση του αιματοκρίτη, της συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης, του ερυθροκυτταρικού τύπου, του συνολικού και διαφορικού λευκοκυτταρικού τύπου, καθώς επίσης και μέτρηση της πηκτικής ικανότητας, όπως είναι ο χρόνος πήξης, ο χρόνος προθρομβίνης, ο χρόνος θρομβοπλαστίνης ή ο αριθμός των αιματοπεταλίων, πρέπει να διενεργείται στο τέλος της περιόδου δοκιμασίας

γ) ^κλινικός βιοχημικός προσδιορισμός του αίματος πρέπει να διενεργείται στο τέλος της περιόδου δοκιμασίας. Οι περιοχές της δοκιμασίας που θεωρούνται κατάλληλες για όλες τις μελέτες είναι η ηλεκτρολυτική ισορροπία, ο μεταβολισμός των υδατανθράκων και η λειτουργία του ήπατος και του νεφρού. Η επιλογή ιδιαίτερων δοκιμασιών θα επηρεασθεί από τις παρατηρήσεις για τον τρόπο δράσεως της ουσίας. Προτείνονται

προσδιορισμοί του ασβεστίου, του φωσφόρου, των χλωριούχων, του νατρίου, του καλίου, της γλυκόζης νηστείας (με περίοδο νηστείας ανάλογα με το είδος του ζώου), της τρανσαμινάσης του γλουταμινικού και πυροσταφυλικού οξέος του ορού^(;), της τρανσαμινάσης του γλουταμινικού και οξαλοξεικού οξέως του ορού^($), της αποκαρβοξυλάσης της ορνιθίνης, της γ-γλουταμυλοτρανσπεπτιδάσης, του αζώτου ουρίας, του λευκώματος, της κρεατινίνης του αίματος, της συνολικής χολερυθρίνης και της συνολικής πρωτεΐνης του ορού. ιΑλλοι προσδιορισμοί που μπορεί να είναι αναγκαίοι για μια επαρκή τοξικολογική εκτίμηση περιλαμβάνουν αναλύσεις των λιπιδίων, των ορμονών, της ισορροπίας οξέος/βάσης, της μεθαιμοσφαιρίνης και της δράσης της χολινεστεράσης. Πρόσθετη κλινική βιοχημική εξέταση μπορεί να διενεργηθεί, όπου είναι αναγκαίο, για την επέκταση της έρευνας των παρατηρούμενων αποτελεσμάτων

δ) ^η ανάλυση των ούρων δεν απαιτείται επί τακτικής βάσεως αλλά μόνον όταν υπάρξει ένδειξη που θα βασίζεται σε αναμενόμενη ή παρατηρούμενη τοξικότητα.

Εάν τα βασικά ιστορικά στοιχεία είναι ανεπαρκή, πρέπει να εξετασθεί αν χρειάζεται προσδιορισμός των αιματολογικών και κλινικών βιοχημικών παραμέτρων πριν την έναρξη της χορήγησης των δόσεων.

Μακροσκοπική νεκροψία

ιΟλα τα ζώα πρέπει να υποστούν πλήρη μακροσκοπική νεκροψία που θα περιλαμβάνει εξέταση της εξωτερικής επιφάνειας του σώματος, όλων των στομίων, καθώς επίσης και της κρανιακής, θωρακικής και κοιλιακής κοιλότητας και του περιεχομένου τους. Το ήπαρ, οι νεφροί, τα επινεφρίδια και οι όρχεις πρέπει να ζυγισθούν υγρά το συντομότερο δυνατόν μετά την ανατομή έτσι ώστε να αποφευχθεί η ξήρανση. Τα παρακάτω όργανα και ιστοί πρέπει να διατηρηθούν σε κατάλληλο μέσο για ενδεχόμενη μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση: όλες οι μακροσκοπικές βλάβες, ο εγκέφαλος -συμπεριλαμβανομένων τμημάτων μυελού/γέφυρας εγκέφαλου, παρεγκεφαλικού και εγκεφαλικού φλοιού-, η υπόφυση, ο θυρεοειδής/παραθυρεοειδής, όλοι οι θυμικοί ιστοί, η τραχεία και οι πνεύμονες, η καρδιά, η αορτή, (οι σιελογόνοι αδένες), το ήπαρ, η σπλήνα, οι νεφροί, τα επινεφρίδια, το πάγκρεας, οι γεννητικοί αδένες, η μήτρα (τα βοηθητικά γεννητικά όργανα), (το δέρμα), ο οισοφάγος, το στομάχι, το δωδεκαδάκτυλο, η νήστις, ο ειλεός, το τυφλό έντερο, το κόλον, το ορθό έντερο, η ουροδόχος κύστη, ο αντιπροσωπευτικός λεμφαδένας, (ο μαστικός αδένας θήλεος), (το μυϊκό σύστημα μηρών), το περιφερικό νεύρο, το στέρνο με μυελό των οστών, (οι οφθαλμοί), (το μηριαίον οστούν, συμπεριλαμβανομένης της αρθρικής επιφάνειας), (ο νωτιαίος μυελός σε τρία επίπεδα -αυχενικός, μεσοθωρακικός και οσφυϊκός) και (οι εξώφθαλμοι δακρυϊκοί αδένες). Οι ιστοί που αναφέρονται μεταξύ παρενθέσεων χρειάζονται εξέταση μόνο εάν υπάρχουν ενδείξεις τοξικότητας ή επιπλοκής οργάνων που αποτελούν αντικείμενο της μελέτης.

Ιστοπαθολογική εξέταση

α) ^Πλήρης ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να διεξαχθεί στα όργανα και στους ιστούς των ζώων που ανήκουν στις ομάδες μάρτυρα και υψηλής δόσης.

β) ^ιΟλες οι μακροσκοπικές βλάβες πρέπει να εξετασθούν.

γ) ^Τα όργανα που αποτελούν αντικείμενο της μελέτης σε άλλες ομάδες δόσεων πρέπει να εξετασθούν.

δ) ^Οι πνεύμονες των ζώων στις ομάδες χαμηλής και ενδιάμεσης δόσης πρέπει να υποβληθούν σε ιστοπαθολογική εξέταση για τη διαπίστωση λοίμωξης, γιατί μ' αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται εύκολη εκτίμηση της κατάστασης της υγείας των ζώων. Πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη η ιστοπαθολογική εξέταση του ήπατος και των νεφρών στις ομάδες αυτές. Μπορεί συνήθως να μην απαιτείται πρόσθετη ιστοπαθολογική εξέταση των ζώων των ομάδων αυτών αλλά θα πρέπει πάντοτε να διενεργείται σε όργανα τα οποία παρουσίασαν ίχνη βλάβης στην ομάδα υψηλής δόσης.

ε) ^ιΟταν χρησιμοποιείται δορυφορική ομάδα, η ιστοπαθολογική εξέταση θα πρέπει να διενεργείται σε ιστούς και όργανα τα οποία έχει εξακριβωθεί ότι παρουσιάζουν επιδράσεις στις ομάδες που υφίστανται την αγωγή.

2.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ

Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται με τη μορφή πίνακα, που θα παρουσιάζει για κάθε ομάδα δοκιμασίας τον αριθμό των ζώων κατά την αρχή της δοκιμασίας, τον αριθμό των ζώων που παρουσίασαν βλάβες και το ποσοστό των ζώων ανά τύπο βλάβης. ιΟλα τα παρατηρούμενα αποτελέσματα πρέπει να εκτιμούνται με κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.

3.

ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ

3.1.

ιΕκθεση της δοκιμασίας

Η έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνει τις παρακάτω πληροφορίες:

- είδος ζώου, ποικιλία ζώου, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, δίαιτα κλπ.,

- συνθήκες δοκιμασίας,

- επίπεδα δόσεων (συμπεριλαμβανομένου του εκδόχου, αν χρησιμοποιήθηκε) και συγκεντρώσεις,

- στοιχεία τοξικής αντίδρασης ανά φύλο και δόση,

(;) Γνωστή τώρα σαν αμινοτρανσφεράση της αλανίνης του ορού.

($) Γνωστή τώρα σαν αμινοτρανσφεράση του ασπαρτικού οξέος του ορού.

- επίπεδο στο οποίο δεν προκαλείται καμία επίδραση, εφόσον είναι δυνατόν,

- χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια της μελέτης ή, εάν τα ζώα επέζησαν, χρόνο λήξης της μελέτης,

- περιγραφή τοξικών ή άλλων επιδράσεων,

- χρόνο παρατήρησης κάθε ανωμαλίας και μετέπειτα πορεία της,

- στοιχεία για την τροφή και το βάρος του σώματος,

- οφθαλμολογικά ευρήματα,

- αιματολογικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν και όλα τα αποτελέσματά τους,

- κλινικές βιοχημικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν και όλα τα αποτελέσματά τους (συμπεριλαμβανομένων των αποτελεσμάτων τυχόν ανάλυσης ούρων),

- ευρήματα νεκροψίας,

- λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών ευρημάτων,

- στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, όπου είναι δυνατόν,

- συζήτηση των αποτελεσμάτων,

- ερμηνεία των αποτελεσμάτων.

3.2.

Αξιολόγηση και ερμηνεία

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

4.

ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΧΡΟΝΙΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΟΥΣΙΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ

ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗ ΔΟΣΗ 90 ΗΜΕΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΗ ΤΡΩΚΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ

1.

ΜΕΘΟΔΟΣ

1.1.

Εισαγωγή

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.1.2.

Ορισμοί

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.3.

Ουσίες αναφοράς

Καμία.

1.4.

Αρχή της μεθόδου δοκιμασίας

Η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται καθημερινά από το στόμα σε προοδευτικά αυζανόμενες δόσεις σε αρκετές ομάδες πειραματοζώων (μη τρωκτικών), (μία δόση ανά ομάδα για περίοδο 90 ημερών). Κατά την περίοδο της χορηγήσεως της ουσίας τα ζώα παρατηρούνται καθημερινά για την ανίχνευση σημείων τοξικότητας. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, καθώς επίσης και τα επιζήσαντα ζώα στο τέλος της δοκιμασίας, υφίστανται νεκροψία.

1.5.

Κριτήρια ποιότητας

Κανένα.

1.6.

Περιγραφή της μεθόδου δοκιμασίας

Προπαρασκευή

Τα ζώα διατηρούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες κατοικίας και διατροφής επί πέντε τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία, υγιή νεαρά ζώα ξεχωρίζονται με τυχαία επιλογή και κατανέμονται σε ομάδες αγωγής και ομάδες μάρτυρες.

Η δοκιμαζόμενη ουσία μπορεί να χορηγείται μέσα στη δίαιτα ή σε κάψουλες, που η χρησιμοποίησή τους μπορεί να θεωρηθεί προσφορότερη. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν άλλοι τρόποι χορήγησης από το στόμα. Οι δόσεις σε όλα τα ζώα πρέπει να χορηγούνται με την ίδια μέθοδο κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου δοκιμασίας. Εάν χρησιμοποιηθεί έκδοχο ή άλλα προσθετικά για τη διευκόλυνση της χορήγησης των δόσεων, πρέπει να είναι γνωστό ότι δεν προκαλούν τοξικές επιδράσεις. Εάν χρειασθεί, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ιστορικά στοιχεία.

Συνθήκες δοκιμασίας

Πειραματόζωα

Το χρησιμοποιούμενο συνήθως είδος ζώου μη τρωκτικού είναι ο σκύλος, καθορισμένης κατά προτίμηση φυλής. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν άλλα μη τρωκτικά είδη. Πρέπει να χρησιμοποιούνται νέα υγιή ζώα και, στην περίπτωση του σκύλου, η χορήγηση δόσεων πρέπει να αρχίζει κατά προτίμηση σε ηλικία τεσσάρων έως έξι και μέχρι το πολύ εννέα μηνών. Στην περίπτωση που διεξάγεται υποχρόνια μελέτη τοξικότητας ουσιών που λαμβάνονται από το στόμα για να χρησιμεύσει σαν προκαταρκτική για μία μακροπρόθεσμη μελέτη, πρέπει να χρησιμοποιηθεί και στις δύο μελέτες το ίδιο είδος/φυλή.

Αριθμός και φύλο

Τουλάχιστον οκτώ ζώα (τέσσερα θηλυκά και τέσσερα αρσενικά) πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε κάθε επίπεδο δόσης. Ο αριθμός των ζώων στο τέλος της μελέτης πρέπει να είναι επαρκής για μία ουσιαστική εκτίμηση των τοξικών επιδράσεων.

Επίπεδα δόσεων

Πρέπει να χρησιμοποιούνται τρία τουλάχιστον επίπεδα δόσεων και μία δόση μάρτυρος. Εκτός της αγωγής με τη δοκιμαζόμενη ουσία, τα ζώα στην ομάδα μάρτυρα πρέπει να έχουν κατά τα άλλα την ίδια μεταχείριση με εκείνα της ομάδας της δοκιμασίας. Το υψηλότερο επίπεδο δόσης πρέπει να προκαλέσει τοξικές επιδράσεις αλλά όχι θανάτους.

Το χαμηλότερο επίπεδο δόσης δεν πρέπει να προκαλέσει οποιοδήποτε ίχνος τοξικότητας. Στην περίπτωση που υπάρχει χρησιμοποιήσιμη εκτίμηση ανθρώπινης έκθεσης, το χαμηλότερο επίπεδο πρέπει να την υπερβεί. Η ιδανική περίπτωση είναι το μέσο επίπεδο δόσης να προκαλεί ελάχιστες παρατηρήσιμες τοξικές επιδράσεις. Εάν χρησιμοποιηθούν περισσότερες από μία ενδιάμεση δόση, τα επίπεδα δόσεων θα πρέπει να απέχουν μεταξύ τους έτσι ώστε να προκαλούν μια κλιμάκωση τοξικών επιδράσεων.

Δεν θα πρέπει επίσης να επέλθουν καθόλου θάνατοι στις ομάδες χαμηλής και ενδιάμεσης δόσης καθώς επίσης στους μάρτυρες.

Για ουσίες χαμηλής τοξικότητας είναι σημαντικό να ληφθούν μέτρα ώστε, όταν χορηγούνται μέσα στη δίαιτα, οι ποσότητες της δοκιμαζόμενης ουσίας να μην επηρεάζουν τις κανονικές απαιτήσεις διατροφής.

ιΟταν η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται στη δίαιτα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε μία σταθερή διαιτητική συγκέντρωση (ppm ή mg/kg τροφής) είτε ένα σταθερό επίπεδο δόσης ανάλογα με το βάρος του σώματος των ζώων. Πρέπει να προσδιορισθεί η εναλλακτική μέθοδος που χρησιμοποιείται. ιΟταν η δόση χορηγείται απευθείας, π.χ. με κάψουλα, η δόση πρέπει να χορηγείται σε παραπλήσιες χρονικές στιγμές κάθε ημέρα και να προσαρμόζεται, ανάλογα με τις ανάγκες, κάθε εβδομάδα, έτσι ώστε να διατηρείται ένα σταθερό επίπεδο δόσης ανάλογα με το βάρος του σώματος του ζώου. Στην περίπτωση που διεξάγεται υποχρόνια μελέτη τοξικότητας ουσίας για να χρησιμεύσει σαν προκαταρκτική για μια μακροπρόθεσμη μελέτη, πρέπει να χρησιμοποιείται συνήθως και στις δύο μελέτες μία παρόμοια δίαιτα.

Οριακή δοκιμασία

Εάν μια μελέτη 90 ημερών, που διεξάγεται σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται με λεπτομέρεια παρακάτω, με επίπεδο δόσης 1^000 mg/kg βάρους σώματος ανά ημέρα, ή με υψηλότερο επίπεδο δόσης αναφορικά με ενδεχόμενη ανθρώπινη έκθεση, όπου αυτό είναι γνωστό, δεν παρέχει ενδείξεις τοξικών επιδράσεων, η συνέχιση του πειράματος μπορεί να θεωρηθεί αναγκαία. Για ουσίες χαμηλής τοξικότητας είναι σημαντικό να ληφθούν μέτρα ώστε, όταν χορηγούνται στη δίαιτα οι ποσότητες και οι άλλες ιδιότητες της δοκιμαζόμενης ουσίας, να μην επηρεάζουν τις κανονικές απαιτήσεις διατροφής.

Περίοδος παρατήρησης

ιΟλα τα ζώα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά και να καταγράφονται οι ενδείξεις τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου εμφάνισης, του βαθμού και της διάρκειάς τους. Πρέπει επίσης να καταγράφεται ο χρόνος θανάτου και ο χρόνος εμφάνισης και εξαφάνισης των σημείων τοξικότητας.

Διαδικασία

Το ιδανικό είναι να λαμβάνουν τα ζώα δόσεις της δοκιμαζόμενης ουσίας επτά ημέρες την εβδομάδα για μια περίοδο 90 ημερών. Ωστόσο, θεωρείται αποδεκτή, από πρακτική άποψη, η χορήγηση δόσεων επί πέντε ημέρες την εβδομάδα, όταν η ουσία χορηγείται με άλλο τρόπο εκτός από τη δίαιτα.

Οι παρατηρήσεις πρέπει να περιλαμβάνουν τις μεταβολές στο δέρμα και στο τρίχωμα, στους οφθαλμούς και στους βλεννογόνους υμένες καθώς επίσης και στο αναπνευστικό, κυκλοφορικό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στο πρότυπο συμπεριφοράς, χωρίς να περιορίζονται μόνο σ' αυτά. Πρέπει να διενεργούνται μετρήσεις για την κατανάλωση τροφής (καθώς επίσης και για την κατανάλωση νερού, όταν η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται στο πόσιμο νερό) κάθε εβδομάδα καθώς και ζύγιση των ζώων επίσης κάθε εβδομάδα.

Προσεκτική κλινική εξέταση των ζώων πρέπει να διενεργείται καθημερινά και να λαμβάνονται κατάλληλα μέτρα για την ελαχιστοποίηση της απώλειας ζώων από τη δοκιμασία. Στο τέλος της περιόδου της έκθεσης όλα τα επιζώντα ζώα υφίστανται νεκροψία. ιΟταν παρατηρούνται ετοιμοθάνατα ζώα, πρέπει να απομακρύνονται και να υφίστανται νεκροψία.

Οι παρακάτω εξετάσεις γίνονται συνήθως σε όλα τα ζώα, συμπεριλαμβανομένων των μαρτύρων:

α) ^οφθαλμολογική εξέταση, με τη χρήση οφθαλμοσκοπίου ή ισοδύναμου κατάλληλου εξοπλισμού, πρέπει να διενεργείται πριν από τη χορήγηση της δοκιμαζόμενης ουσίας και κατά το τέλος της μελέτης, κατά προτίμηση σε όλα τα ζώα, τουλάχιστον όμως στις ομάδες υψηλής δόσης και στις ομάδες πάρτυρες. Εάν διαπιστωθούν μεταβολές στους οφθαλμούς, πρέπει να εξετασθούν όλα τα ζώα

β) ^αιματολογική εξέταση, που συμπεριλαμβάνει εξέταση του αιματοκρίτη, της συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης, του ερυθροκυτταρικού τύπου, του συνολικού και διαφορικού λευκοκυτταρικού τύπου, καθώς επίσης και μέτρηση της πηκτικής ικανότητας, όπως είναι ο χρόνος πήξης, ο χρόνος προθρομβίνης, ο χρόνος θρομβοπλαστίνης ή ο αριθμός των αιματοπεταλίων, πρέπει να διενεργείται στην αρχή της δοκιμασίας κατόπιν είτε κάθε μήνα είτε στο μέσο της περιόδου δοκιμασίας, και τελικά στο τέλος της περιόδου δοκιμασίας

γ) ^κλινικός βιοχημικός προσδιορισμός του αίματος πρέπει να διενεργείται στην αρχή της δοκιμασίας, κατόπιν είτε κάθε μήνα είτε στο μέσο της περιόδου δοκιμασίας, και τελικά στο τέλος της περιόδου δοκιμασίας. Οι περιοχές της δοκιμασίας που θεωρούνται κατάλληλες για όλες τις μελέτες είναι η ηλεκτρολυτική ισορροπία, ο μεταβολισμός των υδατανθράκων και η λειτουργία του ήπατος και του νεφρού. Η επιλογή ιδιαίτερων δοκιμασιών θα επηρεασθεί από τις παρατηρήσεις για τον τρόπο επενέργειας της ουσίας. Προτείνονται προσδιορισμοί του αβεστίου, του φωσφόρου, των χλωριούχων, του νατρίου, του καλίου, της γλυκόζης νηστείας (με περίοδο νηστείας ανάλογα με το είδος/φύλο του ζώου), της τρανσαμινάσης, του γλουταμινικού και πυροσταφυλικού οξέος του ορού^(;), της τρανσαμινάσης του γλουταμινικού και οξαλοξεικού οξέος του ορού^($),

της αποκαρβοξυλάσης της ορνιθίνης, της γ-γλουταμυλοτρανσπεπτιδάσης, του αζώτου ουρίας, του λευκώματος,

(;) Γνωστή τώρα σαν αμινοτρανσφεράση της αλανίνης του ορού.

($) Γνωστή τώρα σαν αμινοτρανσφεράση του ασπαρτικού οξέος του ορού.

της κρεατινίνης του αίματος, της συνολικής χολερυθρίνης και της συνολικής πρωτεΐνης του ορού. ιΑλλοι προσδιορισμοί που μπορεί να είναι αναγκαίοι για μία επαρκή τοξικολογική εκτίμηση περιλαμβάνουν αναλύσεις των λιπιδίων, των ορμονών, του ισορροπίας οξέος/βάσης, της μεθαιμοσφαιρίνης και της δράσης της χολινεστεράσης. Πρόσθετη κλινική βιοχημική εξέταση μπορεί να διενεργηθεί, όπου είναι αναγκαίο, για την επέκταση της έρευνας των παρατηρούμενων αποτελεσμάτων. Τα μη τρωκτικά πρέπει να παραμείνουν νηστικά για ένα χρονικό διάστημα (μέχρι 24 ώρες) πριν ληφθούν δείγματα αίματος

δ) ^η ανάλυση των ούρων δεν απαιτείται επί τακτικής βάσεως αλλά μόνον όταν υπάρξει ένδειξη που θα βασίζεται σε αναμενόμενη ή παρατηρούμενη τοξικότητα.

Μακροσκοπική νεκροψία

ιΟλα τα ζώα πρέπει να υποστούν πλήρη μακροσκοπική νεκροψία που θα περιλαμβάνει εξέταση της εξωτερικής επιφάνειας του σώματος, όλων των στομίων, και της κρανιακής, θωρακικής και κοιλιακής κοιλότητας και του περιεχομένου τους. Το ήπαρ, οι νεφροί, τα επινεφρίδια, ο θυρεοειδής (με τους παραθυρεοειδείς) και οι όρχεις πρέπει να ζυγισθούν υγρά το συντομότερο δυνατόν μετά την ανατομή ώστε να αποφευχθεί η ξήρανση. Τα παρακάτω όργανα και ιστοί πρέπει να διατηρηθούν σε κατάλληλο μέσο για ενδεχόμενη μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση: όλες οι μακροσκοπικές βλάβες, ο εγκέφαλος -συμπεριλαμβανομένων τμημάτων μυελού/γέφυρας του εγκεφάλου, παρεγκεφαλικού και εγκεφαλικού φλοιού-, η υπόφυση, ο θυρεοειδής/παραθυρεοειδής, όλοι οι θυμικοί ιστοί, (η τραχεία), οι πνεύμονες, η καρδιά, η αορτή, οι σιελογόνοι αδένες, το ήπαρ, η σπλήνα, οι νεφροί, τα επινεφρίδια, το πάγκρεας, οι γεννητικοί αδένες, η μήτρα (τα βοηθητικά γεννητικά όργανα), το δέρμα, η χοληδόχος κύστη, ο οισοφάγος, το στομάχι, το δωδεκαδάκτυλο, η νήστις, το τυφλό έντερο, το κόλον, το ορθό έντερο, η ουροδόχος κύστη, ο αντιπροσωπευτικός λεμφαδένας, (ο μαστικός αδένας θήλεος), (το μυϊκό σύστημα μηρών), το περιφερικό νεύρο, (οι οφθαλμοί), το στέρνο με μυελό οστών, (το μηριαίο οστούν, συμπεριλαμβανομένης της αρθρικής επιφάνειας) και (ο νωτιαίος μυελός σε τρία επίπεδα -αυχενικός, μεσοθωρακικός και οσφυϊκός). Οι ιστοί που αναφέρονται μεταξύ παρενθέσεων χρειάζονται εξέταση μόνο εάν υπάρξουν ενδείξεις τοξικότητας ή επιπλοκής οργάνων που αποτελούν αντικείμενο της μελέτης.

Ιστοπαθολογική εξέταση

Πλήρης ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να διεξαχθεί στα όργανα και στους ιστούς των ζώων που ανήκουν στις ομάδες μάρτυρα και υψηλής δόσης. Πρόσθετη ιστοπαθολογική εξέταση στις άλλες ομάδες δόσεων πρέπει να διενεργείται σε όργανα που παρουσιάζουν βλάβες στην ομάδα υψηλής δόσης ή για τα οποία οι κλινικές παρατηρήσεις υπαγορεύουν αυτή την ανάγκη.

2.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ

Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται με τη μορφή πίνακα, που θα παρουσιάζει για κάθε ομάδα δοκιμασίας τον αριθμό των ζώων κατά την αρχή της δοκιμασίας, τον αριθμό των ζώων που παρουσίασαν βλάβες, τον τύπο των βλαβών και το ποσοστό των ζώων ανά τύπο βλάβης. ιΟλα τα αποτελέσματα που πρόκυψαν πρέπει να εκτιμούνται με κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.

3.

ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ

3.1.

ιΕκθεση της δοκιμασίας

Η έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνει τις παρακάτω πληροφορίες:

- είδος, φυλή ή ποικιλία ζώου, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, δίαιτα κλπ.,

- συνθήκες δοκιμασίας,

- επίπεδα δόσεων (συμπεριλαμβανομένου του εκδόχου, αν χρησιμοποιήθηκε) και συγκεντρώσεις,

- στοιχεία τοξικής αντίδρασης ανά φύλο και δόση,

- επίπεδο στο οποίο δεν παρατηρούνται επιδράσεις, εφόσον είναι δυνατόν,

- χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια της μελέτης ή, εάν τα ζώα επέζησαν, χρόνο λήξης της μελέτης,

- περιγραφή τοξικών ή άλλων επιδράσεων (με ιδιαίτερη έμφαση στα κλινικά ευρήματα),

- χρόνο παρατήρησης κάθε ανωμαλίας και μετέπειτα πορεία της,

- στοιχεία για την τροφή και το βάρος του σώματος,

- οφθαλμολογικά ευρήματα,

- αιματολογικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν και όλα τα αποτελέσματά τους,

- κλινικές βιοχημικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν και όλα τα αποτελέσματά τους (συμπεριλαμβανομένων των αποτελεσμάτων τυχόν ανάλυσης των ούρων),

- ευρήματα νεκροψίας,

- λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών ευρημάτων,

- στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, όπου είναι δυνατόν,

- συζήτηση των αποτελεσμάτων,

- ερμηνεία των αποτελεσμάτων.

3.2.

Αξιολόγηση και ερμηνεία

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

4.

ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΧΡΟΝΙΑΣ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΟΥΣΙΩΝ

ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗ ΔΟΣΗ 90 ΗΜΕΡΩΝ ΣΤΟ ΔΕΡΜΑ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΡΩΚΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ

1.

ΜΕΘΟΔΟΣ

1.1.

Εισαγωγή

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.2.

Ορισμοί

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.3.

Ουσίες αναφοράς

Καμία.

1.4.

Αρχή της μεθόδου του πειράματος

Η δοκιμαζόμενη ουσία τίθεται καθημερινά πάνω στο δέρμα σε προοδευτικά αυξανόμενες δόσεις σε αρκετές ομάδες πειραματόζωων, μία δόση ανά ομάδα για περίοδο 90 ημερών. Κατά την περίοδο της αγωγής τα ζώα παρατηρούνται καθημερινά για την ανίχνευση σημείων τοξικότητας. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια του πειράματος, καθώς επίσης και τα επιζήσαντα ζώα στο τέλος του πειράματος, υφίστανται νεκροψία.

1.5.

Κριτήρια ποιότητας

Κανένα.

1.6.

Περιγραφή της μεθόδου του πειράματος

Προπαρασκευή

Τα ζώα διατηρούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες κατοικίας και διατροφής επί πέντε τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία, υγιή νεαρά ζώα ξεχωρίζονται με τυχαία επιλογή και κατανέμονται σε ομάδες αγωγής και ομάδες μάρτυρες. Λίγο πριν από τη δοκιμασία το τρίχωμα απομακρύνεται με κούρεμα από τη νωτιαία περιοχή του κορμού των πειραματόζωων. Μπορεί επίσης να απομακρυνθεί με ξύρισμα, που πρέπει όμως να γίνει 24 ώρες περίπου πριν από τη δοκιμασία. Επανάληψη του κουρέματος ή ξυρίσματος απαιτείται συνήθως κάθε εβδομάδα περίπου. Κατά το κούρεμα ή το ξύρισμα του τριχώματος πρέπει να καταβληθεί προσοχή ώστε να αποφευχθεί ή εκδορά του δέρματος. Δέκα τοις εκατό τουλάχιστον της επιφάνειας του δέρματος πρέπει να είναι γυμνή για την επίθεση της δοκιμαζόμενης ουσίας. Το βάρος του ζώου πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά τη λήψη της απόφασης σχετικά με την περιοχή που θα πρέπει να απογυμνωθεί και για τις διαστάσεις της επικάλυψης. Κατά τη δοκιμασία στερεών ουσιών, που μπορούν, εφόσον είναι δυνατό, να κονιοποιηθούν, η δοκιμαζόμενη ουσία πρέπει να υγρανθεί επαρκώς με νερό ή, εφόσον χρειάζεται, με κατάλληλο έκδοχο για να εξασφαλισθεί καλή επαφή με το δέρμα. Οι υγρές δοκιμαζόμενες ουσίες χρησιμοποιούνται συνήθως χωρίς αραίωση. Εφαρμόζεται καθημερινή επίθεση της ουσίας επί πέντε ή επτά ημέρες την εβδομάδα.

Συνθήκες δοκιμασίας

Πειραματόζωα

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο αρουραίος, το κουνέλι ή το ινδικό χοιρίδιο, πλήρους ανάπτυξης. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν και άλλα είδη, αλλά η χρήση τους θα απαιτούσε αιτιολόγηση. Στην αρχή του πειράματος, η διαφορά βάρους δεν πρέπει να υπερβαίνει το π 20 % του μέσου βάρους. Στην περίπτωση που διεξάγεται υποχρόνια μελέτη δερματικής τοξικότητας, για να χρησιμεύσει σαν προκαταρκτική για μια μακροπρόθεσμη μελέτη, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και στις δύο μελέτες τα ίδια είδη και στελέχη.

Αριθμός και φύλο

Τουλάχιστον 20 ζώα (10 θηλυκά και 10 αρσενικά) με υγιές δέρμα πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε κάθε επίπεδο δόσης. Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και όχι έγκυα. Εάν σχεδιάζονται ενδιάμεσες θανατώσεις, ο αριθμός θα πρέπει να αυξηθεί ανάλογα με τον αριθμό των ζώων που πρόκειται να θανατωθούν πριν από την ολοκλήρωση της μελέτης. Εκτός αυτού, μία δορυφορική ομάδα 20 ζώων (10 ζώα ανά φύλο) μπορεί να υποβληθεί σε αγωγή με το υψηλό επίπεδο δόσης επί 90 ημέρες και να παρατηρείται για αναστρεψιμότητα, εμμονή ή καθυστερημένη εμφάνιση των τοξικών επιδράσεων για μεταγενέστερη αγωγή 28 ημερών.

Επίπεδα δόσεων

Απαιτούνται τρία τουλάχιστον επίπεδα δόσεων και ένας μάρτυρας ή έκδοχο μάρτυρας εάν χρησιμοποιηθεί έκδοχο. Η περίοδος έκθεσης θα πρέπει να ανέρχεται σε έξι ώρες τουλάχιστον την ημέρα. Η επίθεση της δοκιμαζόμενης ουσίας πρέπει να γίνεται σε παραπλήσιες χρονικές στιγμές κάθε ημέρα, και η ποσότητα της επιτιθέμενης ουσίας να προσαρμόζεται κατά διαστήματα (κάθε μία ή δύο εβδομάδες) για τη διατήρηση ενός σταθερού επιπέδου δόσης, με βάση το βάρος του σώματος του ζώου. Εκτός από την αγωγή με τη δοκιμαζόμενη ουσία τα ζώα στην ομάδα μάρτυρα πρέπει κατά τα άλλα να έχουν την ίδια μεταχείριση με εκείνα της ομάδας. Σε περίπτωση που χρησιμοποιείται έκδοχο για να διευκολύνει τη χορήγηση των δόσεων, τα ζώα της ομάδας ελέγχου εκδόχου λαμβάνουν δόσεις κατά τον ίδιο τρόπο όπως οι ομάδες που υφίστανται την αγωγή και λαμβάνουν την ίδια ποσότητα μ' εκείνη που λαμβάνεται από την ομάδα υψηλότερου επιπέδου δόσης. Το υψηλότερο επίπεδο δόσης πρέπει να προκαλέσει τοξικές επιδράσεις όχι όμως και θανάτους ή τουλάχιστον πολύ λίγους. Το χαμηλότερο επίπεδο δόσης δεν πρέπει να προκαλεί οποιοδήποτε ίχνος τοξικότητας. Στην περίπτωση που υπάρχει χρησιμοποιήσιμη εκτίμηση ανθρώπινης έκθεσης, το χαμηλότερο επίπεδο θα πρέπει να την υπερβεί. Στην ιδανική περίπτωση το ενδιάμεσο επίπεδο δόσης πρέπει να προκαλεί ελάχιστες παρατηρήσιμες τοξικές επιδράσεις. Εάν χρησιμοποιηθούν περισσότερες από μία ενδιάμεσες δόσεις, τα επίπεδα δόσεων θα πρέπει να απέχουν μεταξύ τους έτσι ώστε να προκαλούν μια κλιμάκωση τοξικών επιδράσεων.

Στη χαμηλή και στην ενδιάμεση ομάδα, καθώς και στην ομάδα μάρτυρα, η επέλευση οποιωνδήποτε θανάτων πρέπει να είναι χαμηλή έτσι ώστε να επιτρέπει μια ουσιαστική εκτίμηση αποτελεσμάτων.

Εάν η επίθεση της δοκιμαζόμενης ουσίας δημιουργήσει σοβαρό ερεθισμό του δέρματος, οι συγκεντρώσεις πρέπει να ελαττωθούν, και αυτό ίσως να έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση ή την απουσία άλλων τοξικών επιδράσεων στο υψηλό επίπεδο δόσης. Εάν το δέρμα έχει υποστεί σοβαρή βλάβη, πιθανόν να χρειαστεί να τερματιστεί η μελέτη και να επαναληφθεί με χαμηλότερες συγκεντρώσεις.

Οριακή δοκιμασία

Εάν μια προκαταρκτική μελέτη σε επίπεδο δόσης 1 000 mg/kg ή σε υψηλότερο επίπεδο δόσης αναφορικά με ενδεχόμενη ανθρώπινη έκθεση, όπου αυτό είναι γνωστό, δεν προκαλεί τοξικές επιδράσεις, η συνέχιση του πειράματος μπορεί να μη θεωρηθεί αναγκαία.

Περίοδος παρατήρησης

Τα πειραματόζωα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά για ενδείξεις τοξικότητας. Πρέπει να καταγράφεται ο χρόνος θανάτου και ο χρόνος εμφάνισης και εξαφάνισης των σημείων τοξικότητας.

Διαδικασία

Τα ζώα πρέπει να παραμένουν σε χωριστά κλουβιά και το ιδανικό είναι να υποβάλλονται σε αγωγή με τη δοκιμαζόμενη ουσία επτά ημέρες την εβδομάδα για περίοδο 90 ημερών. Τα ζώα σε οποιαδήποτε δορυφορική ομάδα, που έχει προγραμματισθεί για παραπέρα παρατηρήσεις, πρέπει να διατηρούνται για 28 ημέρες ακόμα χωρίς αγωγή για τη διάγνωση της θεραπείας ή της εμμονής των τοξικών επιδράσεων. Ο χρόνος έκθεσης πρέπει να ανέρχεται σε έξι ώρες την ημέρα.

Η δοκιμαζόμενη ουσία πρέπει να επιτίθεται ομοιόμορφα σε έκταση ίση με το 10 % περίπου της συνολικής επιφάνειας του σώματος. Στην περίπτωση ουσιών υψηλής τοξικότητας, η καλυπτόμενη επιφάνεια μπορεί να είναι μικρότερη, αλλά θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε όσο το δυνατόν περισσότερη επιφάνεια να καλύπτεται με όσο το δυνατόν λεπτό και ομοιόμορφο στρώμα.

Κατά τη διάρκεια της έκθεσης η δοκιμαζόμενη ουσία διατηρείται σε επαφή με το δέρμα με τη χρήση πορώδους επίδεσμου και λευκοπλάστη που δεν προκαλεί ερεθισμό. Η περιοχή της έκθεσης πρέπει να καλύπτεται ακόμη με κατάλληλο τρόπο για τη συγκράτηση του επιδέσμου και της δοκιμαζόμενης ουσίας και για την εξασφάλιση της μη κατάποσης της δοκιμαζόμενης ουσίας από τα ζώα. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν συστήματα συγκράτησης για την πρόληψη της κατάποσης της δοκιμαζόμενης ουσίας, αλλά δεν συνιστάται η πλήρης ακινητοποίηση. Στο τέλος της περιόδου έκθεσης τα κατάλοιπα της δοκιμαζόμενης ουσίας θα πρέπει να απομακρυνθούν, εφόσον είναι δυνατό με τη χρήση νερού ή κάποιας άλλης κατάλληλης μεθόδου καθαρισμού του δέρματος. ιΟλα τα ζώα θα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά και να καταγράφονται οι ενδείξεις τοξικότητας, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου εμφάνισης, του βαθμού και της διάρκειάς τους.

Οι παρατηρήσεις «κλωβού» πρέπει να περιλαμβάνουν τις μεταβολές στο δέρμα και στο τρίχωμα, στους οφθαλμούς και στους βλεννογόνους υμένες καθώς επίσης και στο αναπευστικό, κυκλοφορικό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στο πρότυπο συμπεριφοράς. Πρέπει να διενεργούνται μετρήσεις για την κατανάλωση τροφής, καθώς και ζύγιση των ζώων κάθε εβδομάδα.

Η τακτική παρατήρηση των ζώων είναι αναγκαία για την το κατά μέγιστο δυνατόν εξασφάλιση της μη απωλείας ζώων από τη δοκιμασία, οφειλομένη σε αιτίες όπως είναι ο κανιβαλισμός, η αυτόλυση των ιστών ή η εσφαλμένη τοποθέτηση. Στο τέλος της περιόδου της μελέτης όλα τα επιζώντα ζώα στις μη δορυφορικές ομάδες αγωγής υφίστανται νεκροψία. ιΟταν παρατηρούνται ετοιμοθάνατα ζώα, πρέπει να απομακρύνονται και να υφίστανται νεκροψία.

Οι παρακάτω εξετάσεις γίνονται συνήθως σε όλα τα ζώα, συμπεριλαμβανομένων των μαρτύρων:

α) ^οφθαλμολογική εξέταση, με τη χρήση οφθαλμοσκοπίου ή ισοδύναμου κατάλληλου εξοπλισμού, πρέπει να διενεργείται πριν από την έκθεση στη δοκιμαζόμενη ουσία και κατά το τέλος της μελέτης, κατά προτίμηση σε όλα τα ζώα, τουλάχιστον όμως στις ομάδες υψηλής δόσης και στις ομόδες μάρτυρες. Εάν διαπιστωθούν μεταβολές στους οφθαλμούς, πρέπει να εξετασθούν όλα τα ζώα

β) ^αιματολογική εξέταση, που περιλαμβάνει εξέταση του αιματοκρίτη, της συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης, του ερυθροκυτταρικού τύπου, του συνολικού και διαφορικού λευκοκυτταρικού τύπου, καθώς επίσης και μέτρηση της πηκτικής ικανότητας, όπως είναι ο χρόνος πήξης, ο χρόνος προθρομβίνης, ο χρόνος θρομβοπλαστίνης ή ο αριθμός των αιματοπεταλίων, πρέπει να διενεργείται στο τέλος της περιόδου δοκιμασίας

γ) ^κλινικός βιοχημικός προσδιορισμός του αίματος πρέπει να διενεργείται στο τέλος της περιόδου δοκιμασίας. Οι περιοχές της δοκιμασίας που θεωρούνται κατάλληλες για όλες τις μελέτες είναι η ηλεκτρολυτική ισορροπία ο μεταβολισμός των υδατανθράκων και η λειτουργία του ήπατος και νεφρού. Η επιλογή ιδιαίτερων πειραμάτων θα επηρεασθεί από τις παρατηρήσεις για τον τρόπο επενέργειας της ουσίας. Προτείνονται προσδιορισμοί του αβεστίου, του φωσφόρου, των χλωριούχων, του νατρίου, του καλίου, της γλυκόζης νηστείας (με περίοδο νηστείας ανάλογα με το είδος του ζώου), της τρανσαμινάσης του γλουταμινικού και πυροσταφυλικού οξέος του ορού, της τρανσαμινάσης του γλουταμινικού και οξαλοξεικού οξέος του ορού^($), της αποκαρβοξυλάσης της ορνιθίνης, της γ-γλουταμυλοτρανσπεπτιδάσης, του αζώτου ουρίας, του λευκώματος, της κρεατινίνης του αίματος, της συνολικής χολερυθρίνης και της συνολικής πρωτεΐνης του ορού. ιΑλλοι προσδιορισμοί που μπορεί να είναι αναγκαίοι για μία επαρκή τοξικολογική εκτίμηση περιλαμβάνουν αναλύσεις των λιπιδίων, των ορμονών, της ισορροπίας οξέος/βάσης, της μεθαιμοσφαιρίνης και της δραστικότητας της χολινεστεράσης. Πρόσθετη κλινική βιοχημική εξέταση μπορεί να διενεργηθεί, όπου είναι αναγκαίο, για την επέκταση της έρευνας των παρατηρούμενων αποτελεσμάτων

δ) ^η ανάλυση των ούρων δεν απαιτείται επί τακτικής βάσεως αλλά μόνον όταν υπάρξει ένδειξη που θα βασίζεται σε αναμενόμενη ή παρατηρούμενη τοξικότητα.

Εάν τα βασικά ιστορικά στοιχεία είναι ανεπαρκή, πρέπει να εξετασθεί αν χρειάζεται ο προσδιορισμός των αιματολογικών και κλινικών βιοχημικών παραμέτρων πριν την έναρξη της χορήγησης των δόσεων.

Μακροσκοπική νεκροψία

ιΟλα τα ζώα πρέπει να υποστούν πλήρη μακροσκοπική νεκροψία που περιλαμβάνει εξέταση της εξωτερικής επιφάνειας του σώματος, όλων των στομίων, καθώς επίσης και της κρανιακής, θωρακικής και κοιλιακής κοιλότητας και του περιεχομένου τους. Το ήπαρ, οι νεφροί, τα επινεφρίδια και οι όρχεις πρέπει να ζυγισθούν υγρά το συντομότερο δυνατόν μετά την ανατομή έτσι ώστε να αποφευχθεί η ξήρανση. Τα παρακάτω όργανα και ιστοί θα πρέπει να διατηρηθούν σε κατάλληλο μέσο για ενδεχόμενη μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση: όλες οι μακροσκοπικές βλάβες, ο εγκέφαλος -συμπεριλαμβανομένων τμημάτων μυελού/γέφυρας του εγκεφάλου, παρεγκεφαλικού και εγκεφαλικού φλοιού-, η υπόφυση, ο θυρεοειδής/παραθυρεοειδής, όλοι οι θυμικοί ιστοί (η τραχεία), οι πνεύμονες, η καρδιά, η αορτή, οι σιελογόνοι αδένες, το ήπαρ, η σπλήνα, οι νεφροί, τα επινεφρίδια, το πάγκρεας, οι γεννητικοί αδένες, η μήτρα, τα βοηθητικά γεννητικά όργανα, η χοληδόχος κύστη (εάν υπάρχει), ο οισοφάγος, το στομάχι, το δωδεκαδάκτυλο, η νήστις, ο ειλεός, το τυφλό έντερο, το κόλον, το ορθό έντερο, η ουροδόχος κύστη, ο αντιπροσωπευτικός λεμφαδένας (ο μαστικός αδένας θήλεος), (το μυϊκό σύστημα μηρών), το περιφερικό νεύρο (οι οφθαλμοί), (το στέρνο με μυελό των οστών), (το μηριαίον οστούν, συμπεριλαμβανομένης της αρθρικής επιφάνειας), (ο νωτιαίος μυελός σε τρία επίπεδα -αυχενικός, μεσοθωρακικός και οσφυϊκός), και (οι εξώφθαλμοι δακρυϊκοί αδένες). Οι ιστοί που αναφέρονται μεταξύ παρενθέσεων χρειάζονται εξέταση μόνον εάν υπάρχουν ενδείξεις τοξικότητας ή επιπλοκής οργάνων που αποτελούν αντικείμενο μελέτης.

Ιστοπαθολογική εξέταση

α) ^Πλήρης ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να διεξαχθεί στο μη θιγέν δέρμα και στο δέρμα που υπέστη αγωγή, καθώς επίσης και στα όργανα και στους ιστούς όλων των ζώων που ανήκουν στις ομάδες μάρτυρα και υψηλής δόσης.

β) ^ιΟλες οι μακροσκοπικές βλάβες πρέπει να εξετασθούν.

γ) ^Τα όργανα που αποτελούν αντικείμενο της μελέτης σε άλλες ομάδες δόσης πρέπει να εξετασθούν.

δ) ^Στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται αρουραίοι, οι πνεύμονες των ζώων στις ομάδες χαμηλής και ενδιάμεσης δόσης πρέπει να υποστούν ιστοπαθολογική εξέταση για τη διαπίστωση λοίμωξης, γιατί έτσι επιτυγχάνεται μια εύκολη εκτίμηση της κατάστασης της υγείας των ζώων. Μπορεί να μην απαιτείται τακτικά πρόσθετη ιστοπαθολογική εξέταση των ζώων των ομάδων αυτών, αλλά θα πρέπει πάντοτε να διενεργείται σε όργανα τα οποία παρουσίασαν ίχνη βλάβης στην ομάδα υψηλής δόσης.

ε) ^ιΟταν χρησιμοποιείται δορυφορική ομάδα, η ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να διενεργείται σε ιστούς και όργανα τα οποία έχει εξακριβωθεί ότι παρουσιάζουν επιδράσεις στις άλλες ομάδες που υφίστανται την αγωγή.

2.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ

Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται με τη μορφή πίνακα, που θα παρουσιάζει για κάθε ομάδα δοκιμασίας τον αριθμό των ζώων κατά την αρχή της δοκιμασίας, τον αριθμό των ζώων που παρουσίασαν βλάβες τον τύπο των βλαβών και το ποσοστό των ζώων ανά τύπο βλάβης. ιΟλα τα παρατηρούμενα αποτελέσματα πρέπει να εκτιμούνται με κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.

(;) Γνωστή τώρα σαν αμινοτρανσφεράση της αλανίνης του ορού.

($) Γνωστή τώρα σαν αμινοτρανσφεράση του ασπαρτικού οξέος του ορού.

3.

ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ

3.1.

ιΕκθεση της δοκιμασίας

Η έκθεση της δοκιμασίας θα πρέπει να περιλαμβάνει τις παρακάτω πληροφορίες:

- είδος ζώου, ποικιλία ζώου, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, δίαιτα κλπ.,

- συνθήκες δοκιμασίας,

- επίπεδα δόσεων (συμπεριλαμβανομένου του εκδόχου, αν χρησιμοποιήθηκε) και συγκεντρώσεις,

- στοιχεία τοξικής αντίδρασης ανά φύλο και δόση,

- επίπεδο στο οποίο η ουσία δεν παρουσίασε επιδράσεις, εφόσον είναι δυνατόν,

- χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια της μελέτης ή, εάν τα ζώα επέζησαν, χρόνο λήξης της μελέτης,

- περιγραφή τοξικών ή άλλων επιδράσεων,

- χρόνο παρατήρησης κάθε ανωμαλίας και μετέπειτα πορεία της,

- στοιχεία για την τροφή και το βάρος του σώματος,

- οφθαλμολογικά ευρήματα,

- αιματολογικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν και όλα τα αποτελέσματά τους,

- κλινικές βιοχημικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν και αποτελέσματα (συμπεριλαμβανομένων των αποτελεσμάτων τυχόν ανάλυσης ούρων),

- ευρήματα νεκροψίας,

- λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών ευρημάτων,

- στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, όπου είναι δυνατόν,

- συζήτηση των αποτελεσμάτων,

- ερμηνεία των αποτελεσμάτων.

3.2.

Αξιολόγηση και ερμηνεία

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

4.

ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΧΡΟΝΙΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΟΥΣΙΩΝ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΕΙΣΠΝΟΗ

ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗ ΔΟΣΗ ΕΙΣΠΝΟΗΣ, 90 ΗΜΕΡΩΝ, ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΡΩΚΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ

1.

ΜΕΘΟΔΟΣ

1.1.

Εισαγωγή

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.2.

Ορισμοί

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.3.

Ουσίες αναφοράς

Καμία.

1.4.

Αρχή της μεθόδου δοκιμασίας

Αρκετές ομάδες πειραματοζώων εκτίθενται καθημερινά επί ένα ορισμένο χρονικό διάστημα στη δοκιμαζόμενη ουσία σε προοδευτικά αυξανόμενες συγκεντρώσεις (μία συγκέντρωση ανά ομάδα για περίοδο 90 ημερών). Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται έκδοχο για να βοηθήσει στην παραγωγή μιας κατάλληλης συγκέντρωσης της δοκιμαζόμενης ουσίας στην ατμόσφαιρα, πρέπει να χρησιμοποιηθεί μια ομάδα εκδόχου, μάρτυρας. Κατά την περίοδο της αγωγής τα ζώα παρατηρούνται καθημερινά για την ανίχνευση σημείων τοξικότητας. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, καθώς επίσης και τα επιζήσαντα ζώα στο τέλος της δοκιμασίας, υφίστανται νεκροψία.

1.5.

Κριτήρια ποιοτήτας

Κανένα.

1.6.

Περιγραφή της μεθόδου δοκιμασίας

Προπαρασκευή

Τα ζώα διατηρούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες κατοικίας και διατροφής επί πέντε τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία, νεαρά υγιή ζώα ξεχωρίζονται με τυχαία επιλογή και κατανέμονται στις απαιτούμενες ομάδες. Εάν υπάρχει ανάγκη, μπορεί να προστεθεί στη δοκιμαζόμενη ουσία κατάλληλο έκδοχο για να βοηθήσει στην παραγωγή κατάλληλης συγκέντρωσης της ουσίας στην ατμόσφαιρα. Εάν χρησιμοποιηθεί έκδοχο ή άλλα προσθετικά για τη διευκόλυνση της χορήγησης των δόσεων, πρέπει να είναι γνωστό ότι δεν προκαλούν τοξικές επιδράσεις. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν ιστορικά στοιχεία εάν χρειασθεί.

Συνθήκες δοκιμασίας

Πειραματόζωα

Εφόσον δεν υπάρχουν αντενδείξεις, το προτιμούμενο είδος είναι ο αρουραίος. Πρέπει να χρησιμοποιούνται ποικιλίες νέων υγιών ζώων που χρησιμοποιούνται συνήθως σε εργαστήριο. Στην αρχή της μελέτης, η διαφορά βάρους ανάμεσα στα ζώα που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να υπερβαίνει το p20 % της μέσης τιμής. Στην περίπτωση που διεξάγεται υποχρόνια μελέτη τοξικότητας ουσιών που λαμβάνονται διά της εισπνοής για να χρησιμεύσει σαν προκαταρκτική μελέτη, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και στις δύο μελέτες τα ίδια είδη και ποικιλίες.

Αριθμός και φύλο

Τουλάχιστον 20 ζώα (10 θηλυκά και 10 αρσενικά) πρέπει να χρησιμοποιηθούν για κάθε ομάδα του πειράματος. Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και όχι έγκυα. Εάν σχεδιάζονται ενδιάμεσες θανατώσεις, ο αριθμός θα πρέπει να αυξηθεί ανάλογα με τον αριθμό των ζώων που πρόκειται να θανατωθούν πριν από την ολοκλήρωση της μελέτης. Εκτός αυτού, μία δορυφορική ομάδα 20 ζώων (10 ζώα ανά φύλο) μπορεί να υποβληθεί σε αγωγή με το υψηλό επίπεδο συγκέντρωσης επί 90 ημέρες και να παραρτηρείται για αναστρεψιμότητα, εμμονή ή καθυστερημένη εμφάνιση των τοξικών αποτελεσμάτων για μετεγενέστερη αγωγή 28 ημερών.

Συγκέντρωση έκθεσης

Απαιτούνται τρεις τουλάχιστον συγκεντρώσεις, με μάρτυρα ή μάρτυρα έκδοχο (που να αντιστοιχεί στη συγκέντρωση του εκδόχου στο υψηλότερο επίπεδο), στην περίπτωση χρησιμοποίησης εκδόχου. Εκτός από την αγωγή με τη δοκιμαζόμενη ουσία, τα ζώα στην ομάδα μάρτυρα πρέπει κατά τα άλλα να έχουν την ίδια μεταχείριση με εκείνα της ομάδας του πειράματος. Το υψηλότερο επίπεδο συγκέντρωσης πρέπει να έχει σαν αποτέλεσμα τοξικές επιδράσεις όχι όμως και θανάτους, ή τουλάχιστον πολύ λίγους. ιΟπου υπάρχει χρησιμοποιήσιμη εκτίμηση ανθρώπινης έκθεσης, το χαμηλότερο επίπεδο συγκέντρωσης θα πρέπει να την υπερβεί. Στην ιδανική περίπτωση το ενδιάμεσο επίπεδο συγκέντρωσης πρέπει να προκαλεί πολύ μικρές παρατηρήσιμες τοξικές επιδράσεις. Εάν χρησιμοποιηθούν περισσότερες από μία ενδιάμεσες συγκεντρώσεις, οι συγκεντρώσεις πρέπει να απέχουν μεταξύ τους έτσι ώστε να προκαλούν μια κλιμάκωση τοξικών επιδράσεων.

Στη χαμηλή και στην ενδιάμεση ομάδα, καθώς και στους μάρτυρες, η συχνότητα οποιουδήποτε θανάτου πρέπει να είναι χαμηλή έτσι ώστε να επιτρέπει μια ουσιαστική εκτίμηση των αποτελεσμάτων.

Χρόνος έκθεσης

Η διάρκεια της καθημερινής έκθεσης πρέπει να ανέρχεται σε έξι ώρες μετά από εξισορρόπηση των συγκεντρώσεων του θαλάμου. ιΑλλοι χρόνοι διάρκειας μπορούν να εφαρμοσθούν για την ικανοποίηση ιδιαίτερων απαιτήσεων.

Εξοπλισμός

Τα πειράματα πάνω στα ζώα πρέπει να διενεργούνται μέσα σε συσκευές εισπνοής ικανές να διατηρούν μια δυναμική ροή αέρα δώδεκα τουλάχιστων αλλαγών αέρα ανά ώρα, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται επαρκής περιεκτικότητα σε οξυγόνο και ομοιόμορφα κατανεμημένη ατμόσφαιρα έκθεσης. Στην περίπτωση που χρησιμοποιείται θάλαμος, η σχεδίασή του πρέπει να είναι τέτοια ώστε να ελαχιστοποιεί το συνωστισμό των ζώων δοκιμασίας και να μεγιστοποιεί την έκθεσή τους στην εισπνοή της δοκιμαζόμενης ουσίας. Σαν γενικός κανόνας για την εξασφάλιση της σταθερότητας της ατμόσφαιρας ενός θαλάμου πρέπει να ορισθεί ότι ο συνολικός «όγκος» των πειραματόζωων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 % του όγκου του δοκιμαστικού θαλάμου. Μπορεί να εφαρμοσθεί η στοματορινική έκθεση, η έκθεση μόνο της κεφαλής ή η έκθεση ολόκληρου του σώματος σε ατομικούς θαλάμους. Στις δύο πρώτες περιπτώσεις ελαχιστοποιείται η λήψη από άλλες οδούς.

Περίοδος παρατήρησης

Τα πειραματόζωα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά για ενδείξεις τοξικότητας καθ' όλη την περίοδο αγωγής και ανάληψης. Πρέπει να καταγράφεται ο χρόνος θανάτου και ο χρόνος εμφάνισης και εξαφάνισης των σημείων τοξικότητας.

Διαδικασία

Τα ζώα εκτίθενται στη δοκιμαζόμενη ουσία καθημερινά, πέντε έως επτά ημέρες την εβδομάδα, για περίοδο 90 ημερών. Τα ζώα σε οποιαδήποτε δορυφορική ομάδα, που έχει προγραμματισθεί για παραπέρα παρατηρήσεις, πρέπει να διατηρούνται για 28 ημέρες ακόμα χωρίς αγωγή για τη διάγνωση της θεραπείας ή της εμμονής των τοξικών επιδράσεων.

Η θερμοκρασία κατά την εκτέλεση της δοκιμασίας πρέπει να διατηρείται στους 22 p 3 °C. Στην ιδανική περίπτωση η σχετική υγρασία θα πρέπει να διατηρείται μεταξύ 30 και 70 %, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις (π.χ. πειράματα αεροζόλ) τα επίπεδα αυτά μπορεί να μην είναι εφαρμόσιμα. Η τροφή και το νερό θα πρέπει να απομακρύνονται κατά τη διάρκεια της έκθεσης. Πρέπει να χρησιμοποιείται ένα δυναμικό σύστημα εισπνοής με κατάλληλο σύστημα αναλυτικού ελέγχου της συγκέντρωσης. Για τη δημιουργία κατάλληλων συγκεντρώσεων έκθεσης συνιστάται δοκιμαστικό πείραμα. Η ροή του αέρα πρέπει να διευθετείται για να εξασφαλιστεί η ομοιογένεια των συνθηκών σε όλο το θάλαμο έκθεσης. Το σύστημα πρέπει να εξασφαλίζει την όσο το δυνατόν ταχύτερη επείτευξη σταθερών συνθηκών έκθεσης.

Πρέπει να διενεργούνται μετρήσεις ή έλεγχοι για τα ακόλουθα:

α) ^ταχύτητα της ροής του αέρα (συνεχώς)

β) ^πραγματική συγκέντρωση της δοκιμαζόμενης ουσίας με τη διενέργεια μέτρησης στη ζώνη αναπνοής. Κατά τη διάρκεια της καθημερινής περιόδου έκθεσης η συγκέντρωση δεν θα πρέπει να αποκλίνει περισσότερο από p 15 % της μέσης τιμής. Παρ' όλα αυτά όμως, στην περίπτωση σκονών και αεροζόλ, το επίπεδο αυτό ελέγχου μπορεί να μην είναι επιτευκτό, και τότε θα πρέπει να γίνει αποδεκτή μία ευρύτερη διακύμανση. Καθ' όλη τη διάρκεια της μελέτης οι καθημερινές συγκεντρώσεις πρέπει να διατηρούνται όσο το δυνατό σταθερές. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του συστήματος παραγωγής πρέπει να διενεργείται ανάλυση μεγέθους σωματιδίων για την παρακολούθηση της σταθερότητας των συγκεντρώσεων αεροζόλ. Κατά τη διάρκεια της έκθεσης η ανάλυση πρέπει να διεξάγεται κάθε φορά που είναι απαραίτητο για τον προσδιορισμό της ομοιομορφίας στην κατανομή των αιωρουμένων σωματιδίων

γ) ^θερμοκρασία και υγρασία

δ) ^κατά τη διάρκεια της έκθεσης και μετά από αυτή διενεργούνται παρατηρήσεις και καταγράφονται συστηματικά, ενώ τηρούνται ατομικοί φάκελοι για κάθε ζώο. ιΟλα τα ζώα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά και να καταγράφονται οι ενδείξεις τοξικότητας συμπεριλαμβανομένου του χρόνου εμφάνισης, του βαθμού και της διάρκειάς τους. Οι παρατηρήσεις «κλωβού» πρέπει να περιλαμβάνουν τις μεταβολές στο δέρμα και στο τρίχωμα, στους οφθαλμούς και στους βλεννογόνους υμένες καθώς επίσης και στο αναπνευστικό, κυκλοφορικό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στο πρότυπο συμπεριφοράς. Πρέπει να διενεργούνται μετρήσεις για την κατανάλωση τροφής (καθώς επίσης και για την κατανάλωση νερού, όταν η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται στο πόσιμο νερό), καθώς και ζύγιση των ζώων κάθε εβδομάδα. Η

τακτική παρατήρηση των ζώων είναι αναγκαία για την κατά το μέγιστο δυνατόν εξασφάλιση της μη απωλείας ζώων από τη δοκιμασία, οφειλομένη σε αιτίες όπως είναι ο κανιβαλισμός, η αυτόλυση των ιστών ή η εσφαλμένη τοποθέτηση. Στο τέλος της περιόδου της έκθεσης, όλα τα επιζήσαντα ζώα αγωγής υφίστανται νεκροψία. ιΟταν παρατηρούνται ετοιμοθάνατα ζώα, πρέπει να απομακρύνονται και να υφίστανται νεκροψία.

Οι παρακάτω εξετάσεις γίνονται συνήθως για όλα τα ζώα, συμπεριλαμβανομένων των μαρτύρων:

α) ^οφθαλμολογική εξέταση, με τη χρήση οφθαλμοσκοπίου ή ισοδύναμου κατάλληλου εξοπλισμού, πρέπει να διενεργείται πριν από την έκθεση στη δοκιμαζόμενη ουσία και κατά το τέλος της μελέτης, κατά προτίμηση σε όλα τα ζώα, τουλάχιστον όμως στις ομάδες υψηλής δόσης και στις ομάδες μάρτυρες. Εάν διαπιστωθούν μεταβολές στους οφθαλμούς, πρέπει να εξετασθούν όλα τα ζώα

β) ^αιματολογική εξέταση, που συμπεριλαμβάνει εξέταση του αιματοκρίτη, της συγκέντρωσης αιμοσφαιρίνης, του ερυθροκυτταρικού τύπου, του συνολικού και διαφορικού λευκοκυτταρικού τύπου, καθώς επίσης και μέτρηση της πηκτικής ικανότητας, όπως είναι ο χρόνος θρομβοπλαστίνης ή ο αριθμός των αιματοπεταλίων, πρέπει να διενεργείται στο τέλος περιόδου δοκιμασίας

γ) ^κλινικός βιοχημικός προσδιορισμός του αίματος πρέπει να διενεργείται στο τέλος της περιόδου δοκιμασίας. Οι περιοχές δοκιμασίας που θεωρούνται κατάλληλες για όλες τις μελέτες είναι η ηλεκτρολυτική ισορροπία, ο μεταβολισμός των υδατανθράκων και η λειτουργία του ήπατος και του νεφρού. Η επιλογή ιδιαίτερων δοκιμασιών θα επηρεασθεί από τις παρατηρήσεις για τον τρόπο επενέργειας την ουσίας. Προτείνονται προσδιορισμοί του ασβεστίου, του φωσφόρου, των χλωριούχων, του νατρίου, του καλίου, της γλυκόζης νηστείας (με περίοδο νηστείας ανάλογα με το είδος του ζώου), της τρανσαμινάσης του γλουταμινικού και πυροσταφυλικού οξέος του ορού^(;), της τρανσαμινάσης του γλουταμινικού και οξαλοξεικού οξέος του ορού^($), της αποκαρβοξυλάσης της ορνιθίνης, της γ-γλουταμυλοτρανσπεπτιδάσης, του αζώτου ουρίας, του λευκώματος, της κρεατινίνης του αίματος, της συνολικής χολερυθρίνης και της συνολικής πρωτεΐνης του ορού. ιΑλλοι προσδιορισμοί που μπορεί να είναι αναγκαίοι για μια επαρκή τοξικολογική εκτίμηση περιλαμβάνουν αναλύσεις των λιπιδίων, των ορμονών, της ισορροπίας οξέος/βάσης, της μεθαμοσφαιρίνης και της δραστικότητας της χολινεστεράσης. Πρόσθετη κλινική βιοχημική εξέταση μπορεί να διενεργηθεί, όπου είναι αναγκαίο, για την επέκταση της έρευνας των παρατηρούμενων αποτελεσμάτων

δ) ^η ανάλυση των ούρων δεν απαιτείται επί τακτικής βάσης, αλλά μόνο όταν υπάρξει ένδειξη που θα βασίζεται σε αναμενόμενη ή παρατηρούμενη τοξικότητα.

Εάν τα βασικά ιστορικά στοιχεία είναι ανεπαρκή, πρέπει να εξετασθεί αν χρειάζεται να ληφθεί υπόψη ο προσδιορισμός των αιματολογικών και κλινικών βιοχημικών παραμέτρων πριν από την έναρξη της χορήγησης των δόσεων.

Μακροσκοπική νεκροψία

ιΟλα τα ζώα πρέπει να υποστούν πλήρη μακροσκοπική νεκροψία που θα περιλαμβάνει εξέταση της εξωτερικής επιφάνειας του σώματος, όλων των στομίων, καθώς επίσης και της κρανιακής, θωρακικής και κοιλιακής κοιλότητας και του περιεχομένου τους. Το ήπαρ, οι νεφροί, τα επινεφρίδια και οι όρχεις πρέπει να ζυγισθούν υγρά το συντομότερο δυνατόν μετά την ανατομή έτσι ώστε να αποφευχθεί η ξήρανση. Τα παρακάτω όργανα και ιστοί πρέπει να διατηρηθούν σε κατάλληλο μέσο για ενδεχόμενη μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση: όλες οι μακροσκοπικές βλάβες, οι πνεύμονες -που πρέπει να αφαιρεθούν ανέπαφοι, να ζυγισθούν και να τύχουν επεξεργασίας με κατάλληλο στερεωτικό, έτσι ώστε να εξασφαλισθεί η διατήρηση της δομής του πνεύμονα (η έκχυση με στερεωτικό θεωρείται σαν αποτελεσματική διαδικασία)-, οι ρινοφαρυγγικοί ιστοί, ο εγκέφαλος -συμπεριλαμβανομένων τμημάτων μυελού/γέφυρας εγκεφάλου, παρεγκεφαλικού και εγκεφαλικού φλοιού-, η υπόφυση, ο θυρεοειδής/παραθυρεοειδής, όλοι οι θυμικοί ιστοί, η τραχεία, οι πνεύμονες, η καρδιά, η αορτή, οι σιελογόνοι αδένες, το ήπαρ, η σπλήνα, οι νεφροί, τα επινεφρίδια, το πάγκρεας, οι γεννητικοί αδένες, η μήτρα (τα βοηθητικά γεννητικά όργανα), (το δέρμα), η χοληδόχος κύστη (εάν υπάρχει), ο οισοφάγος, το στομάχι, το δωδεκαδάκτυλο, η νήστις, ο ειλεός, το τυφλό έντερο, το κόλον, το ορθό έντερο, η ουροδόχος κύστη, ο αντιπροσωπευτικός λεμφαδένας (ο μαστικός αδένας θήλεος), (το μυϊκό σύστημα μηρών), το περιφερικό νεύρο (οι οφθαλμοί), το στέρνο με μυελό των οστών (το μηριαίο οστούν, συμπεριλαμβανομένης της αρθρικής επιφάνειας), ο νωτιαίος μυελός σε τρία επίπεδα -αυχενικό, μεσοθωρακικό και οσφυικό). Οι ιστοί που αναφέρονται μεταξύ παρενθέσεων χρειάζονται εξέταση μόνο εάν υπάρχουν ενδείξεις τοξικότητας ή επιπλοκής οργάνων που αποτελούν αντικείμενο της μελέτης.

Ιστοπαθολογική εξέταση

α) ^Πλήρης ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να διεξαχθεί στην αναπνευστική οδό και στα άλλα όργανα και στους ιστούς όλων των ζώων που ανήκουν στις ομάδες μάρτυρες και υψηλής δόσης.

β) ^ιΟλες οι μακροσκοπικές βλάβες πρέπει να εξετασθούν.

γ) ^Τα όργανα, που αποτελούν αντικείμενο της μελέτης σε άλλες ομάδες δόσης πρέπει να εξετασθούν.

δ) ^Οι πνεύμονες των ζώων στις ομάδες χαμηλής και ενδιάμεσης δόσης πρέπει να υποστούν ιστοπαθολογική εξέταση, γιατί μ' αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται εύκολη εκτίμηση της κατάστασης της υγείας των ζώων. Μπορεί να μην απαιτείται πρόσθετη ιστοπαθολογική εξέταση στα ζώα των ομάδων επί τακτικής βάσης αλλά πρέπει πάντοτε να διενεργείται σε όργανα τα οποία παρουσίασαν ίχνη βλάβης στην ομάδα υψηλής δόσης.

ε) ^ιΟταν χρησιμοποιείται δορυφορική ομάδα, η ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να διενεργείται σε ιστούς και όργανα τα οποία έχει εξακριβωθεί ότι παρουσιάζουν επιδράσεις σε άλλες ομάδες που υφίστανται την αγωγή.

(;) Γνωστή τώρα σαν αμινοτρανσφεράση της αλανίνης του ορού.

($) Γνωστή τώρα σαν αμινοτρανσφεράση του ασπαρτικού οξέος του ορού.

2.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ

Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται με τη μορφή πίνακα, που θα παρουσιάζει για κάθε ομάδα δοκιμασίας τον αριθμό των ζώων κατά την αρχή της δοκιμασίας, τον αριθμό των ζώων που παρουσίασαν βλάβες, τον τύπο των βλαβών και το ποσοστό των ζώων ανά τύπο βλάβης. ιΟλα τα παρατηρούμενα αποτελέσματα πρέπει να εκτιμού-νται με κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.

3.

ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ

3.1.

ιΕκθεση της δοκιμασίας

Η έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνει τις παρακάτω πληροφορίες:

- είδος ζώου, ποικιλία ζώου, πηγή, συνθήκες του περιβάλλοντος, δίαιτα, κλπ.,

- συνθήκες δοκιμασίας:

Περιγραφή της συσκευής έκθεσης: περιλαμβάνει το σχέδιο, τον τύπο, τις διαστάσεις, την πηγή του αέρα, το σύστημα παραγωγής σωματιδίων και αεροζόλ, τη μέθοδο κλιματισμού, την επεξεργασία του εξερχόμενου αέρα και τη μέθοδο στέγασης των ζώων σε πειραματικό θάλαμο, σε περίπτωση χρησιμοποίησής του. Πρέπει να γίνει περιγραφή του εξοπλισμού για τη μέτρηση της θερμοκρασίας, της υγρασίας και, εφόσον είναι δυνατό, της σταθερότητας των συγκεντρώσεων αεροζόλ ή του μεγέθους σωματιδίων.

Δεδομένα της έκθεσης στη δοκιμαζόμενη ουσία: τα δεδομένα αυτά πρέπει να εμφανίζονται σε μορφή πίνακα και να παρουσιάζονται με μέσες τιμές και ένα μέτρο διακύμανσης (π.χ. σταθερή απόκλιση), και πρέπει να περιλαμβάνουν:

α)

ταχύτητα ροής του αέρα μέσα από τον εξοπλισμό εισπνοής

β)

θερμοκρασία και υγρασία του αέρα

γ)

ονομαστικές συγκεντρώσεις (συνολική ποσότητα δοκιμαζόμενης ουσίας που εισάγεται στον εξοπλισμό εισπνοής διαιρούμενη με τον όγκο του αέρα)

δ)

φύση του εκδόχου, εάν χρησιμοποιήθηκε

ε)

πραγματικές συγκεντρώσεις μέσα στη ζώνη αναπνοής του πειράματος

ζ)

μέσα μεγέθη σωματιδίων (εφόσον χρειάζεται),

- στοιχεία τοξικής αντίδρασης ανά φύλο και συγκέντρωση,

- επίπεδο στο οποίο η ουσία δεν επέφερε κανένα αποτέλεσμα, εφόσον είναι δυνατόν,

- χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια της μελέτης ή, εάν τα ζώα επέζησαν, χρόνο λήξης της μελέτης,

- περιγραφή τοξικών ή άλλων επιδράσεων,

- χρόνο παρατήρησης κάθε ανωμαλίας και μετέπειτα πορεία της,

- στοιχεία για την τροφή και το βάρος του σώματος,

- οφθαλμολογικά ευρήματα,

- αιματολογικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν και αποτελέσματα,

- κλινικές βιοχημικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν και αποτελέσματα (συμπεριλαμβανομένων των αποτελεσμάτων τυχόν ανάλυσης ούρων),

- ευρήματα νεκροψίας,

- λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών ευρημάτων,

- στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, όπου είναι δυνατόν,

- συζήτηση των αποτελεσμάτων,

- ερμηνεία των αποτελεσμάτων.

3.2.

Αξιολόγηση και ερμηνεία

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

4.

ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

ΜΕΛΕΤΗ ΤΕΡΑΤΟΓΕΝΕΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΤΡΩΚΤΙΚΑ ΚΑΙ ΜΗ ΤΡΩΚΤΙΚΑ

1.

ΜΕΘΟΔΟΣ

1.1.

Εισαγωγή

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.2.

Ορισμοί

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.3.

Ουσίες αναφοράς

Καμία.

1.4.

Αρχή της μεθόδου δοκιμασίας

Η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται σε προοδευτικά αυξανόμενες δόσεις ή συγκεντρώσεις, τουλάχιστον κατά τη διάρκεια του τμήματος εκείνου της εγκυμοσύνης που καλύπτει την περίοδο της οργανογένεσης, σε διάφορες ομάδες εγκύων πειραματοζώων (μία δόση ανά ομάδα). Λίγο πριν από την αναμενόμενη ημερομηνία του τοκετού, θανατώνεται η μητέρα, αφαρείται η μήτρα και εξετάζεται το περιεχόμενο. Η μέθοδος αυτή καλύπτει την εμβρυοτοξικότητα και την εμβρυονική (ή νεογνική) τοξικότητα.

1.5.

Κριτήρια ποιότητας

Κανένα.

1.6.

Περιγραφή της μεθόδου δοκιμασίας

Προπαρασκευή

Υγιή νεαρά, ενήλικα, παρθένα θηλυκά ζώα ανάλογης ηλικίας και μεγέθους εγκλιματίζονται προς τις εργαστηριακές συνθήκες επί πέντε τουλάχιστον ημέρες πριν από το πείραμα και κατόπιν ζευγαρώνονται με αρσενικά αποδειγμένης γονιμότητας. Τα γονιμοποιημένα θηλυκά ζώα ξεχωρίζονται και κατανέμονται σε ομάδες αγωγής.

Το ζευγάρωμα μπορεί να επιτευχθεί κατά φυσικό τρόπο ή με τεχνητή γονιμοποίηση. Η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται καθημερινά στα θηλυκά ζώα αρχίζοντας αμέσως μετά την εμφύτευση και συνεχίζοντας σε όλη τη διάρκεια της περιόδου οργανογένεσης. Μία ημέρα πριν από το τέλος, τα έμβρυα αποσπώνται με υστερεκτομή και εξετάζονται για ανωμαλίες των σπλάχνων ή του σκελετού, συμπεριλαμβανομένης της καθυστέρησης της ανάπτυξης, της καθυστερημένης οστεοποίησης και των εντερικών αιμορραγιών.

Συνθήκες δοκιμασίας

Πειραματόζωα

Τα είδη που συνήθως χρησιμοποιούνται είναι ο αρουραίος, ο ποντικός, ο κρικητός ο γνήσιος (χάμστερ) και το κουνέλι. Τα προτιμούμενα είδη είναι ο αρουραίος και το κουνέλι. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ποικιλίες ζώων που χρησιμοποιούνται συνήθως σε εργαστήριο. Η ποικιλία του ζώου δεν πρέπει να παρουσιάζει χαμηλή γονιμότητα και πρέπει να χαρακτηρίζεται για την αντίδρασή της στα τερατογόνα. Τα ζώα πρέπει να διαμένουν σε χωριστά κλουβιά.

Αριθμός και φύλο

Για κάθε επίπεδο δόσης απαιτούνται τουλάχιστον είκοσι έγκυοι αρουραίοι, ποντικοί ή κρικητοί (χάμστερ) ή δώδεκα έγκυα κουνέλια. Αυτό έχει σαν σκοπό την εξασφάλιση παραγωγής επαρκών νεογνών που να επιτρέπουν μια εκτίμηση της τερατογενετικής ικανότητας της ουσίας.

Επίπεδα δόσεων

Πρέπει να χρησιμοποιούνται τρεις τουλάχιστον ομάδες δόσεων και μια ομάδα μάρτυρας. Πρέπει επίσης να χρησιμοποιείται μία ομάδα μάρτυρας για το έκδοχο, όταν η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται με έκδοχο. Στην περίπτωση χρησιμοποίησης εκδόχου, πρέπει να είναι γνωστές οι τοξικολογικές ιδιότητές του, που δεν πρέπει να είναι τερατογενετικές ή να παρουσιάζουν επιδράσεις στην αναπαραγωγή. Εκτός από την αγωγή με τη δοκιμαζόμενη

ουσία, τα ζώα στις ομάδες μάρτυρες πρέπει κατά τα άλλα να έχουν την ίδια μεταχείριση με εκείνη της ομάδας δοκιμασίας. Εκτός έαν περιοριστεί από το φυσικό/χημικό χαρακτήρα ή τις βιολογικές ιδιότητες της ουσίας, το υψηλότερο επίπεδο δόσης πρέπει θεωρητικά να προκαλεί κάποια έκδηλη μητρική τοξικότητα, όπως είναι η ελαφρή απώλεια βάρους, αλλά όχι περισσότερο από 10 % μητρικούς θανάτους. Το χαμηλό επίπεδο δόσης δεν θα πρέπει να προκαλεί παρατηρήσιμες επιδράσεις που να μπορούν να αποδοθούν στη δοκιμαζόμενη ουσία. Η ενδιάμεση δόση ή δόσεις πρέπει να ορισθούν κατά γεωμετρική πρόοδο μεταξύ των επιπέδων υψηλής και χαμηλής δόσης.

Οριακή δοκιμασία

Στην περίπτωση ουσίων χαμηλής τοξικότητας, εάν ένα επίπεδο δόσης 1^000^mg/kg τουλάχιστον δεν παράγει ίχνη εμβρυοτοξικότητας ή τερατογενετικότητας, οι μελέτες σε άλλα επίπεδα δόσεων μπορούν να μη θεωρηθούν απαραίτητες.

Χρόνος έκθεσης

Η ημέρα 0 στη δοκιμασία είναι η ημέρα κατά την οποία παρατηρείται το κολπικό βύσμα ή/και το σπέρμα (στην περίπτωση που είναι εφικτό). Η περίοδος χορήγησης δόσεων πρέπει να καλύπτει την περίοδο της βασικής οργανογένεσης. Η περίοδος αυτή μπορεί να ορισθεί ανάμεσα στην έκτη και στη δέκατη πέμπτη ημέρα για τον αρουραίο και τον ποντικό, στην έκτη και στη δέκατη τέταρτη ημέρα για τον κρικητό ή στην έκτη και στη δέκατη όγδοη ημέρα για το κουνέλι. Εάν η ημέρα 0 βασίζεται στην παρατήρηση του ζευγαρώματος ή της τεχνητής γονιμοποίησης, οι παραπάνω χρόνοι πρέπει να διορθωθούν με την προσθήκη μιας ημέρας. Εναλλακτικά, η περίοδος χορήγησης δόσεων μπορεί να επεκταθεί μέχρι μία ημέρα περίπου πριν από την αναμενόμενη ημερομηνία τοκετού.

Περίοδος παρατήρησης

Προσεκτική κλινική εξέταση πρέπει να διενεργείται μία φορά τουλάχιστον κάθε ημέρα. Πρόσθετες παρατηρήσεις πρέπει να διενεργούνται καθημερινά με τη λήψη κατάλληλων μέτρων για την ελαχιστοποίηση της απώλειας ζώων από τη μελέτη.

Διαδικασία

Η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται από το στόμα με καθετήρα στομάχου την ίδια ώρα κατά προσέγγιση κάθε ημέρα.

Τα θηλυκά πειραματόζωα λαμβάνουν τη δοκιμαζόμενη ουσία καθημερινά καθ' όλη τη διάρκεια της σχετικής περιόδου αγωγής. Η δόση μπορεί να βασίζεται στο βάρος των θηλυκών κατά την έναρξη της αγωγής ή, εναλλακτικά, εν όψει της ταχείας απόκτησης βάρους κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, τα ζώα μπορούν να ζυγίζονται περιοδικά και οι δόσεις να βασίζονται στη πλέον πρόσφατη μέτρηση βάρους. Οι ενδείξεις τοξικότητας πρέπει να καταγράφονται μόλις παρατηρούνται, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου εμφάνισης, του βαθμού και της διάρκειάς τους. Τα θηλυκά που παρουσιάζουν σημεία αποβολής ή πρόωρου τοκετού πρέπει να θανατώνονται και να υφίστανται προσεκτική μακροσκοπική εξέταση. Η περίοδος παρατήρησης μετά την αγωγή πρέπει να συνεχιστεί μέχρι την προηγούμενη ημέρα περίπου πριν από τον τοκετό. Αυτό έχει σαν σκοπό να καλύπτει το μεγαλύτερο μέρος της περιόδου εγκυμοσύνης αλλά να αποφευχθούν επιπλοκές στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων, τα οποία θα μπορούσαν να προκύψουν μετά από φυσικό τοκετό.

Οι παρατηρήσεις «κλωβού» πρέπει να περιλαμβάνουν τις μεταβολές στο δέρμα και στο τρίχωμα, στους οφθαλμούς και στους βλεννογόνους υμένες, καθώς επίσης και στο αναπνευστικό, κυκλοφορικό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στο πρότυπο συμπεριφοράς, αλλά να μην περιορίζονται μόνο σ' αυτά. Πρέπει να διενεργούνται μετρήσεις για την κατανάλωση της τροφής καθώς επίσης και ζύγιση των ζώων κάθε εβδομάδα.

Νεκροψία

Εφόσον επέλθει θάνατος κατά τη διάρκεια της μελέτης ή κατά το τέλος αυτής, οι μητέρες πρέπει να εξετάζονται μακροσκοπικά για οποιεσδήποτε δομικές ανωμαλίες ή παθολογικές μεταβολές που δυνατόν να επηρέασαν την εγκυμοσύνη. Αμέσως μετά το θάνατο πρέπει να αφαιρεθεί η μήτρα και να εξεταστεί το περιεχόμενό της για εμβρυϊκούς θανάτους και για τον αριθμό των ζωντανών εμβρύων. Είναι συνήθως δυνατό να εκτιμηθεί ο χρόνος θανάτου μέσα στη μήτρα, όπου αυτός έχει επέλθει. Στους ποντικούς και τα κουνέλια, ο αριθμός των ωχρών σωματίων της ωοθήκης μπορεί να προσδιοριστεί. Πρέπει να προσδιοριστεί το φύλο των εμβρύων και να γίνει ζύγισή τους χωριστά για το καθένα, να καταγραφεί το βάρος τους καθώς επίσης και το προκύπτον μέσο εμβρυϊκό βάρος. Μετά την αφαίρεση, κάθε έμβρυο πρέπει να εξεταστεί εξωτερικά. Για τους αρουραίους, τα ποντίκια και τους κρικητούς, το ένα τρίτο μέχρι και το ήμισυ του αριθμού των νεογνών κάθε μητέρας πρέπει να εξεταστεί για ανωμαλίες του σκελετού, ενώ το υπόλοιπο μέρος πρέπει να προετοιμαστεί και να εξεταστεί για ανωμαλίες μαλακού ιστού με τη χρήση κατάλληλων μεθόδων. Για τα κουνέλια, κάθε έμβρυο πρέπει να εξεταστεί με προσεκτική ανατομή για σπλαγχνικές ανωμαλίες και έπειτα για ανωμαλίες του σκελετού.

2.

ΔΕΔΟΜΕΝΑ

Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται με μορφή πίνακα, που να παρουσιάζει για κάθε ομάδα δοκιμασίας τον αριθμό των ζώων κατά την αρχή της δοκιμασίας, τον αριθμό των ζώων που κατέστησαν έγκυα, τον αριθμό και τα ποσοστά των ζωντανών εμβρύων με οποιεσδήποτε ανωμαλίες μαλακού ιστού ή σκελετού, και τέλος της σχέση τους προς ιδιαίτερες ομάδες νεογνών. ιΟλα τα παρατηρούμενα αποτελέσματα πρέπει να εκτιμούνται με κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.

3.

ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ

3.1.

ιΕκθεση της δοκιμασίας

Η έκθεση της δοκιμασίας πρέπει να περιλαμβάνει τις παρακάτω πληροφορίες:

- είδος ζώου, ποικιλία ζώου, πηγή, συνθήκες του περιβάλλοντος, δίαιτα κλπ.,

- συνθήκες δοκιμασίας,

- επίπεδα δόσεων (συμπεριλαμβανομένου του εκδόχου, εάν χρησιμοποιήθηκε) και συγκεντρώσεις,

- δεδομένα τοξικής αντίδρασης ανά δόση,

- επίπεδο στο οποίο η ουσία δεν παρουσίασε επιδράσεις (εφόσον είναι δυνατόν),

- χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια της μελέτης ή, εάν τα ζώα επέζησαν, χρόνο λήξης της μελέτης,

- περιγραφή τοξικών ή άλλων επιδράσεων,

- χρόνο παρατήρησης κάθε ανώμαλίας και μετέπειτα πορεία της,

- στοιχεία για την τροφή και το βάρος του σώματος,

- διάρκεια της εγκυμοσύνης και στοιχεία για τα νεογνά που γεννήθηκαν από κάθε μητέρα (συμπεριλαμβανομένων ιστορικών στοιχείων),

- στοιχεία εμβρύων (ζωντανά/νεκρά, φύλο, βλάβες μαλακού ιστού και σκελετού),

- στοιχεία νεογνών (ζωντανά/νεκρά, φύλο, βλάβες μαλακού ιστού και σκελετού για κάθε νεογνό),

- στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων,

- συζήτηση των αποτελεσμάτων,

- ερμηνεία των αποτελεσμάτων.

3.2.

Αξιολόγηση και ερμηνεία

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

4.

ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΧΡΟΝΙΑΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ

1.

ΜΕΘΟΔΟΣ

1.1.

Εισαγωγή

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.2.

Ορισμοί

Βλέπε γενική εισαγωγή, μέρος Β.

1.3.

Ουσίες αναφοράς

Καμία.

1.4.

Αρχή της μεθόδου δοκιμασίας

Η δοκιμαζόμενη ουσία χορηγείται κανονικά επτά ημέρες την εβδομάδα, από κατάλληλη οδό, σε διάφορες ομάδες πειραματοζώων (μία δόση ανά ομάδα), για ένα σημαντικό μέρος της ζωής τους. Κατά τη διάρκεια και μετά την έκθεσή τους στη δοκιμαζόμενη ουσία, τα πειραματόζωα παρατηρούνται καθημερινά για την ανίχνευση ενδείξεων τοξικότητας.

1.5.

Κριτήρια ποιότητας

Κανένα.

1.6.

Περιγραφή της μεθόδου δοκιμασίας

Προπαρασκευή

Τα ζώα διατηρούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες κατοικίας και διατροφής επί πέντε τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία, υγιή νεαρά ζώα ξεχωρίζονται με τυχαία επιλογή και κατανέμονται σε ομάδες αγωγής και ομάδες μάρτυρες.

Συνθήκες δοκιμασίας

Πειραματόζωα

Το προτιμούμενο είδος είναι ο αρουραίος. Με βάση τα αποτελέσματα μελετών που έχουν διεξαχθεί στο παρελθόν, μπορούν να χρησιμοποιούν άλλα είδη ζώων (τρωκτικά ή μη τρωκτικά). Πρέπει να χρησιμοποιούνται ποικιλίες νέων υγιών ζώων που χρησιμοποιούνται συνήθως στα εργαστήρια, και η χορήγηση δόσεων πρέπει να αρχίζει το συντομότερο δυνατό μετά τον απογαλακτισμό.

Στην αρχή της μελέτης, η διαφορά βάρους ανάμεσα στα ζώα που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να υπερβαίνει το π 20 % της μέσης τιμής. Στην περίπτωση που έχει διεξαχθεί υποχρόνια μελέτη τοξικότητας με λήψη της ουσίας από το στόμα για να χρησιμεύσει σαν προκαταρκτική για μία μακροπρόθεσμη μελέτη, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και στις δύο μελέτες τα ίδια είδη και ποικιλίες.

Αριθμός και φύλο

Στην περίπτωση των τρωκτικών, πρέπει να χρησιμοποιηθούν 40 τουλάχιστον ζώα (20 θηλυκά και 20 αρσενικά) σε κάθε επίπεδο δόσης και συμπράττουσα ομάδα μάρτυρα. Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και όχι έγκυα. Εάν έχουν προγραμματιστεί θανατώσεις κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, ο αριθμός πρέπει να αυξηθεί ανάλογα με τον αριθμό των ζώων που πρόκειται να θανατωθούν πριν από το τέλος της μελέτης.

Στην περίπτωση των μη τρωκτικών, είναι αποδεκτός μικρότερος αριθμός ζώων, τουλάχιστον όμως τέσσερα ζώα ανά φύλο ανά ομάδα.

Επίπεδα δόσεων και συχνότητα έκθεσης

Εκτός από τη συμπράττουσα ομάδα μάρτυρα πρέπει να χρησιμοποιηθούν τρία τουλάχιστον επίπεδα δόσεων. Το υψηλότερο επίπεδο δόσης πρέπει να είναι αρκετά υψηλό για να προκαλέσει σαφή σημεία τοξικότητας, χωρίς να προκαλέσει όμως υπερβολική θνησιμότητα. Το χαμηλότερο επίπεδο δόσης δεν θα πρέπει να προκαλέσει οποιαδήποτε τοξικότητα. Η ενδιάμεση δόση ή δόσεις πρέπει να κυμαίνονται σε ένα μέσο επίπεδο μεταξύ της υψηλής και χαμηλής δόσης. Για την επιλογή των επιπέδων δόσεων θα πρέπει να ληφθούν υπόψη στοιχεία από προηγούμενες δοκιμασίες και μελέτες τοξικότητας.

Η συχνότητα έκθεσης είναι κανονικά καθημερινή. Η χημική ουσία πρέπει να είναι συνεχώς διαθέσιμη, εφόσον χορηγείται με το πόσιμο νερό ή αναμειγνύεται στη δίαιτα.

Ομάδες μάρτυρες

Πρέπει να χρησιμοποιείται συγχρόνως ομάδα μάρτυρας όμοια από κάθε άποψη με τις ομάδες που υποβάλλονται σε έκθεση, εκτός ως προς την έκθεση στη δοκιμαζόμενη ουσία.

Σε ειδικές περιστάσεις, όπως σε μελέτες στις οποίες η λήψη της ουσίας γίνεται με εισπνοή, σε μελέτες που αφορούν αεροζόλ ή τη χρήση ενός γαλακτοματοποιητικού μέσου μη χαρακτηρισμένης βιολογικής δράσης, σε μελέτες στις οποίες η ουσία λαμβάνεται από το στόμα, πρέπει να χρησιμοποιηθεί παράλληλα αρνητική ομάδα μάρτυρας. Τα ζώα της ομάδας αρνητικού ελέγχου έχουν την ίδια μετεχείριση όπως όλα τα άλλα πειραματόζωα, με την εξαίρεση ότι η ομάδα αυτή ελέγχου δεν θα πρέπει να εκτεθεί στη δοκιμαζόμενη ουσία ή σε οποιοδήποτε έκδοχο.

Οδός λήψης

Οι δύο κύριες οδοί λήψης είναι από το στόμα και με την εισπνοή. Η επιλογή τη οδού λήψης εξαρτάται από τα φυσικά και χημικά χαρακτηριστικά της δοκιμαζόμενης ουσίας και από την πιθανή οδό έκθεσης για τους ανθρώπους.

Η χρήση της δερματικής οδού παρουσιάζει σημαντικά πρακτικά προβλήματα. Η χρόνια συστηματική τοξικότητα που προκύπτει από διαδερμική απορρόφηση μπορεί κανονικά να συναχθεί από τα αποτελέσματα της μελέτης με λήψη της ουσίας από το στόμα και η γνώση της έκτασης της διαδερμικής απορρόφησης να προκύψει από προηγούμενα πειράματα διαδερμικής τοξικότητας.

Μελέτες στις οποίες η ουσία λαμβάνεται από το στόμα

ιΟταν η δοκιμαζόμενη ουσία απορροφάται από τη γαστρεντερική οδό, και εάν η οδός εισαγωγής αποτελεί μια οδό από την οποία μπορούν να εκτεθούν οι άνθρωποι, προτιμάται η λήψη από το στόμα εφόσον δεν υπάρχουν αντενδείξεις.

Τα ζώα μπορούν να λαμβάνουν τη δοκιμαζόμενη ουσία στη δίαιτά τους, διαλυμένη σε πόσιμο νερό, ή σε κάψουλες.

Το ιδανικότερο είναι να εφαρμόζεται καθημερινή χορήγηση δόσεων επί επτά ημέρες την εβδομάδα, γιατί η χορήγηση δόσεων επί πέντε ημέρες την εβδομάδα πιθανόν να επιτρέψει ανάληψη ή την υποχώρηση της τοξικότητας κατά την περίοδο που δεν χορηγούνται δόσεις, και έτσι να επηρεάσει το αποτέλεσμα και τη μετέπειτα εκτίμηση. Ωστόσο, από πρακτική άποψη, η χορήγηση δόσεων επί πέντε ημέρες την εβδομάδα θεωρείται σαν αποδεκτή.

Μελέτες με λήψη της ουσίας με εισπνοή

Επειδή οι μελέτες με λήψη της ουσίας με εισπνοή παρουσιάζουν πιο περίπλοκα τεχνικά προβλήματα απ' ό,τι οι άλλες οδοί λήψης, παρέχονται εδώ λεπτομερέστερες οδηγίες γι' αυτόν τον τρόπο λήψης. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι η ενδοτραχειακή ενστάλαξη μπορεί να αποτελέσει μια αποδεκτή εναλλακτική λύση σε ιδιαίτερες περιπτώσεις.

Οι μακροπρόθεσμες εκθέσεις σχεδιάζονται συνήθως με βάση την υφιστάμενη προοπτική για ανθρώπινη έκθεση, εκθέτοντας τα ζώα καθημερινά επί έξι ώρες μετά από την εξισορρόπηση των συγκεντρώσεων του θαλάμου, επί πέντε ημέρες την εβδομάδα (διαλείπουσα έκθεση), ή, σε ενδεχόμενη έκθεση περιβάλλοντος, 22 έως 24 ώρες έκθεσης ανά ημέρα επί επτά ημέρες την εβδομάδα (συνεχής έκθεση), με μία ώρα περίπου την ημέρα για διατροφή των ζώων σε παραπλήσια ώρα και για συντήρηση του θαλάμου. Και στις δύο περιπτώσεις, τα ζώα εκτίθενται συνήθως με μια καθορισμένη συγκέντρωση δοκιμαζόμενης ουσίας. Μία βασική διαφορά που πρέπει να ληφθεί υπόψη μεταξύ διαλείπουσας και συνεχούς έκθεσης είναι ότι στην πρώτη υπάρχει μία δεκαεπτάωρη μέχρι δεκαοκτάωρη περίοδος κατά την οποία τα ζώα μπορούν να αναλάβουν από τις επιδράσεις της κάθε καθημερινής έκθεσης, καθώς επίσης και μία ακόμη μεγαλύτερη περίοδος ανάληψης κατά τα σαββατοκύριακα.

Η επιλογή της διαλείπουσας ή συνεχούς έκθεσης εξαρτάται από τους στόχους της μελέτης και από τις συνθήκες της ανθρώπινης έκθεσης στην ουσία τις οποίες πρέπει να απομιμηθεί. Παρ' όλα αυτά όμως, πρέπει να ληφθούν υπόψη ορισμένες τεχνικές δυσκολίες. Επί παραδείγματι, τα πλεονεκτήματα της συνεχούς έκθεσης για την απομίμηση συνθηκών περιβάλλοντος μπορεί να αντισταθμιστούν από την ανάγκη χορήγησης νερού και τροφής κατά τη διάρκεια της έκθεσης και από την ανάγκη περισσότερο περίπλοκων (και αξιόπιστων) τεχνικών παραγωγής και παρακολούθησης αεροζόλ και ατμών.

Θάλαμοι έκθεσης

Τα ζώα πρέπει να δοκιμάζονται σε θαλάμους εισπνοής που είναι σχεδιασμένοι να υφίστανται μία δυναμική ροή δώδεκα τουλάχιστον αλλαγών αέρα ανά ώρα, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται επαρκής περιεκτικότητα σε οξυγόνο και ομοιόμορφα κατανεμημένη ατμόσφαιρα έκθεσης στην ουσία. Οι θάλαμοι μάρτυρες και θάλαμοι έκθεσης πρέπει να είναι τελείως όμοιοι στην κατασκευή και στη σχεδίαση έτσι ώστε να εξασφαλίζουν συγκρίσιμες συνθήκες έκθεσης από όλες τις απόψεις, με την εξαίρεση της έκθεσης στη δοκιμαζόμενη ουσία. Μία ελαφρή αρνητική πίεση μέσα στο θάλαμο διατηρείται συνήθως για την πρόληψη διαρροής της δοκιμαζόμενης ουσίας στο γύρω χώρο. Οι θάλαμοι πρέπει να ελαχιστοποιούν το συνωστισμό των πειραματόζωων. Σαν γενικός κανόνας για την εξασφάλιση της σταθερότητας της ατμόσφαιρας του θαλάμου πρέπει να οριστεί ότι ο συνολικός όγκος των πειραματόζωων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 % του όγκου του θαλάμου.

Πρέπει να διενεργηθούν οι παρακάτω μετρήσεις ή έλεγχοι:

iii)

Ροή αέρα: η ταχύτητα ροής του αέρα διά μέσου του θαλάμου πρέπει κατά προτίμηση να παρακολουθείται συνεχώς.

iii)

Συγκέντρωση: κατά τη διάρκεια της περιόδου καθημερινής έκθεσης η συγκέντρωση της δοκιμαζόμενης ουσίας δεν θα πρέπει να αποκλίνει περισσότερο από π 15 % της μέσης τιμής.

iii)

Θερμοκρασία και υγρασία: για τα τρωκτικά, η θερμοκρασία πρέπει να διατηρείται στους 22^ π 2 γC και η υγρασία μέσα στο θάλαμο σε 30 έως 70 %, εκτός από τις περιπτώσεις που χρησιμοποιείται νερό για την εναιώρηση της δοκιμαζόμενης ουσίας στην ατμόσφαιρα του θαλάμου. Κατά προτίμηση, τόσο η θερμοκρασία όσο και η υγρασία θα πρέπει να παρακολουθούνται συνεχώς.

iv)

Μετρήσεις μεγέθους σωματιδίων: στην ατμόσφαιρα του θαλάμου πρέπει να γίνεται προσδιορισμός της κατανομής μεγέθους σωματιδίων στα υγρά ή στερεά αεροζόλ. Τα σωματίδια αεροζόλ πρέπει να είναι αναπνεύσιμου μεγέθους για το χρησιμοποιούμενο πειραματόζωο. Δείγματα ατμόσφαιρας θαλάμου πρέπει να λαμβάνονται στην περιοχή αναπνοής των ζώων. Το δείγμα αέρα πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικό της κατανομής των σωματιδίων στα οποία εκτίθενται τα ζώα και πρέπει να αντιπροσωπεύει, επί σταθμικής βάσης, όλο το εναιωρούμενο αεροζόλ, ακόμη και όταν μεγάλη ποσότητα από το αεροζόλ δεν είναι αναπνεύσιμη. Οι αναλύσεις μεγέθους πρέπει να διενεργούνται συχνά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του συστήματος παραγωγής ώστε να εξασφαλιστεί η σταθερότητα του αεροζόλ, και μετέπειτα, κατά τη διάρκεια των εκθέσεων, μόνον εφόσον παρίσταται ανάγκη, για τον προσδιορισμό της ομοιομορφίας στην κατανομή σωματιδίων στα οποία εκτέθηκαν τα ζώα.

Διάρκεια της μελέτης

Η διάρκεια της περιόδου χορήγησης πρέπει να είναι τουλάχιστον δώδεκα μήνες.

Διαδικασία

Παρατηρήσεις

Μια φορά τουλάχιστον κάθε μέρα πρέπει να διεξάγεται προσεκτική κλινική εξέταση. Πρόσθετες παρατηρήσεις πρέπει να διενεργούνται καθημερινά με λήψη κατάλληλων μέτρων για την ελαχιστοποίηση της απώλειας ζώων από τη μελέτη, π.χ. νεκροψία ή κατάψυξη των ζώων εκείνων που βρέθηκαν νεκρά και απομόνωση ή θανάτωση των ασθενών ή των ετοιμοθάνατων ζώων. Πρέπει να διενεργούνται προσεκτικές παρατηρήσεις για την ανίχνευση της εμφάνισης και της πορείας όλων των τοξικών επιδράσεων καθώς επίσης και για την ελαχιστοποίηση των απωλειών λόγω ασθενειών, αυτόλυσης των ιστών ή κανιβαλισμού.

Πρέπει να καταγράφονται για όλα τα ζώα κλινικές ενδείξεις, που περιλαμβάνουν νευρολογικές και οφθαλμολογικές μεταβολές, καθώς επίσης και οι θάνατοι. Πρέπει να καταγράφεται ο χρόνος της εμφάνισης και εξέλιξης των τοξικών συνθηκών, συμπεριλαμβανομένων των ύποπτων όγκων.

Το βάρος του σώματος πρέπει να καταγράφεται ατομικά για όλα τα ζώα μια φορά την εβδομάδα κατά τη διάρκεια των 13 πρώτων εβδομάδων της περιόδου της μελέτης, και μετέπειτα μια φορά τουλάχιστον κάθε τέσσερις εβδομάδες. Η λήψη τροφής πρέπει να καθορίζεται κάθε εβδομάδα κατά τη διάρκεια των 13 πρώτων εβδομάδων της μελέτης, και μετέπειτα κατά τρίμηνα περίπου διαστήματα, εκτός εάν οι μεταβολές στην κατάσταση της υγείας ή στο βάρος του σώματος υπαγορεύουν τη λήψη άλλων μέτρων.

Αιματολογική εξέταση

Αιματολογική εξέταση (π.χ. περιεχόμενο αιμοσφαιρίνης, όγκος συσσωρευμένων κυττάρων, συνολικός αριθμός ερυθρών κυττάρων αίματος, συνολικός αριθμός λευκών κυττάρων αίματος και αιματοπεταλίων, ή άλλες μετρήσεις της πηκτικής ικανότητας του αίματος) πρέπει να διενεργείται στους τρεις μήνες, έξι μήνες, και μετέπειτα κατά διαστήματα έξι περίπου μηνών, καθώς επίσης και κατά το τέλος του πειράματος, σε δείγματα αίματος που λήφθηκαν από όλα τα μη τρωκτικά και από δέκα αρουραίους ανά φύλο από όλες τις ομάδες. Εάν είναι δυνατόν, οι αιμοληψίες πρέπει να γίνουν από τους ίδιους αρουραίους σε κάθε ένα από τα παραπάνω ανεφερθέντα χρονικά διαστήματα. Επίσης, πρέπει να ληφθεί ένα προπειραματικό δείγμα από μη τρωκτικά.

Εάν οι κλινικές παρατηρήσεις δείχνουν μια επιδείνωση της υγείας των ζώων κατά τη διάρκεια της μελέτης, θα πρέπει να διενεργηθεί μια μέτρηση του διαφορικού τύπου των λευκών αιμοσφαιρίων του αίματος των προσβληθέντων ζώων.

Διαφορική μέτρηση του αίματος διενεργείται στα δείγματα εκείνων των