ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΟΚ) αριθ. 690/92 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 19ης Μαρτίου 1992 περί θεσπίσεως μεθόδου αναφοράς για την ανίχνευση της καζεΐνης αγελαδινού γάλακτος σε τυριά από πρόβειο γάλα

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας,

την πράξη προσχώρησης της Ισπανίας και της Πορτογαλίας, και ιδίως το άρθρο 67 παράγραφοι 1 και 2, το άρθρο 98, το άρθρο 234 παράγραφος 2 και το άρθρο 310,

τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 1677/85 του Συμβουλίου της 11ης Ιουνίου 1985 σχετικά με τα νομισματικά εξισωτικά ποσά στο γεωργικό τομέα (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 2205/90 (2), και ιδίως το άρθρο 1 παράγραφος 1,

τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 804/68 του Συμβουλίου της 27ης Ιουνίου 1968 περί κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων (3), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 374/92 της Επιτροπής (4), και ιδίως το άρθρο 9 παράγραφος 3, το άρθρο 14 παράγραφος 7 και το άρθρο 17 παράγραφος 4,

τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 876/68 του Συμβουλίου της 28ης Ιουνίου 1968 περί καθορισμού στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων των γενικών κανόνων για τη χορήγηση επιστροφών κατά την εξαγωγή και των κριτηρίων καθορισμού του ύψους τους (5), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 1344/86 (6), και ιδίως το άρθρο 6 παράγραφος 3,

Εκτιμώντας:

ότι τα τυριά που προέρχονται αποκλειστικά από πρόβειο γάλα υπόκεινται σε ορισμένους συγκεκριμένους κανόνες βάσει των κοινοτικών κανονισμών στο γεωργικό τομέα- ότι, πριν από την εφαρμογή αυτών των κανόνων, είναι σκόπιμο να διασφαλίζεται ότι το υπό εξέταση προϊόν δεν περιέχει αγελαδινό γάλα-

ότι μπορεί να χορηγηθεί ενίσχυση για ιδιωτική αποθεματοποίηση τυριών από πρόβειο γάλα βάσει του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 508/71 του Συμβουλίου της 8ης Μαρτίου 1971 περί καθορισμού των γενικών κανόνων που διέπουν τη χορήγηση ενισχύσεων για την ιδιωτική αποθεματοποίηση του τυριού διατηρήσεως (7)- ότι μια ειδική επιστροφή για τα ίδια αυτά προϊόντα μπορεί να χορηγηθεί σύμφωνα με τους όρους του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 876/68- ότι κανένα νομισματικό εξισωτικό ποσό δεν επιβάλλεται για το εμπόριο προϊόντων πρόβειου γάλακτος βάσει του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 1677/85- ότι αποκλείεται η εφαρμογή των εξισωτικών ποσών προσχώρησης για τις συναλλαγές τυριών από πρόβειο γάλα προς και από την Ισπανία σύμφωνα με τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 466/86 του Συμβουλίου της 25ης Φεβρουαρίου 1986 για τον καθορισμό των γενικών κανόνων του καθεστώτος των εξισωτικών ποσών προσχώρησης στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων, λόγω της προσχώρησης της Ισπανίας (8) και τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 3640/90 του Συμβουλίου της 11ης Δεκεμβρίου 1990 περί καθορισμού των γενικών κανόνων του καθεστώτος εξισωτικών ποσών προσχώρησης στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων κατά το δεύτερο στάδιο προσχώρησης της Πορτογαλίας (9)-

ότι επί του παρόντος, δεδομένου ότι η Επιτροπή έχει θεσπίσει τις προαναφερθείσες διατάξεις όσον αφορά τυριά που έχουν παρασκευασθεί από πρόβειο γάλα, είναι απαραίτητο να επαληθεύεται με κατάλληλο έλεγχο ότι δεν έχει ενσωματωθεί καθόλου αγελαδινό γάλα στα υπό εξέταση προϊόντα- ότι κρίνεται αναγκαίο, σε επίπεδο ελέγχου, να καθιερωθεί μια κοινοτική μέθοδος αναφοράς για την ανίχνευση του αγελαδινού γάλακτος, με την επιφύλαξη της εφαρμογής των συνηθισμένων μεθόδων, εφόσον συμφωνούν με ορισμένα κριτήρια-

ότι η Επιτροπή Διαχείρισης Γάλακτος και Γαλακτοκομικών Προϊόντων δεν διατύπωσε γνώμη στην προθεσμία που όρισε ο πρόεδρός της,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:

Άρθρο 1

Η μέθοδος αναφοράς που παρατίθεται στο παράρτημα εφαρμόζεται προκειμένου να διαπιστωθεί ότι το τυρί που παρασκευάζεται αποκλειστικά από πρόβειο γάλα δεν περιέχει καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος.

θεωρείται ότι υπάρχει καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος όταν το ανιχνεύσιμο περιεχόμενο του προς ανάλυση δείγματος σε καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος είναι ίσο ή μεγαλύτερο από το περιεχόμενο του πρότυπου δείγματος που περιγράφεται στο παράρτημα.

Άρθρο 2

Οι συνηθισμένες μέθοδοι ανίχνευσης της καζεΐνης αγελαδινού γάλακτος σε τυριά από πρόβειο γάλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν με τους ακόλουθους όρους:

- το όριο ανίχνευσης πρέπει να είναι 0,5 % ή μικρότερο,

- δεν πρέπει να εμφανίζονται εσφαλμένως θετικά αποτελέσματα. Εάν αυτό δεν μπορεί να αποκλειστεί, κάθε δείγμα που δίνει θετικό αποτέλεσμα πρέπει να εξετάζεται με τη μέθοδο αναφοράς,

- η καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος πρέπει να είναι ανιχνεύσιμη με την απαιτούμενη ευαισθησία, ακόμα και μετά από μακρές περιόδους ωρίμανσης, όπως μπορεί να συμβεί υπό τις συνήθεις εμπορικές συνθήκες. Εάν δεν πληρούται η απαίτηση αυτή για ορισμένο τύπο τυριού από πρόβειο γάλα, το τυρί αυτό πρέπει να εξετάζεται με τη μέθοδο αναφοράς.

Άρθρο 3

Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.

Εφαρμόζεται από τις 16 Σεπτεμβρίου 1992. Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.

Βρυξέλλες, 19 Μαρτίου 1992. Για την Επιτροπή

Ray MAC SHARRY

Μέλος της Επιτροπής

(1) ΕΕ αριθ. L 164 της 24. 6. 1985, σ. 6. (2) ΕΕ αριθ. L 201 της 31. 7. 1990, σ. 9. (3) ΕΕ αριθ. L 148 της 28. 6. 1968, σ. 13. (4) ΕΕ αριθ. L 41 της 18. 2. 1992, σ. 9. (5) ΕΕ αριθ. L 155 της 3. 7. 1968, σ. 1. (6) ΕΕ αριθ. L 119 της 8. 5. 1986, σ. 36. (7) ΕΕ αριθ. L 58 της 11. 3. 1971, σ. 1. (8) ΕΕ αριθ. L 53 της 1. 3. 1986, σ. 23. (9) ΕΕ αριθ. L 362 της 27. 12. 1990, σ. 3.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

Μέθοδος αναφοράς για την ανίχνευση καζεΐνης αγελαδινού γάλακτος σε τυριά που παρασκευάζονται από πρόβειο γάλα

1. Αντικείμενο Ανίχνευση καζεΐνης αγελαδινού γάλακτος σε τυριά από πρόβειο γάλα με ισοηλεκτρική εστίαση γ-καζεϊνών μετά από πλασμινόλυση. 2. Πεδίο εφαρμογής Η μέθοδος είναι κατάλληλη για ευαίσθητη και συγκεκριμένη ανίχνευση καζεΐνης αγελαδινού γάλακτος σε νωπά και ώριμα τυριά πρόβειου γάλακτος. 3. Αρχή της μεθόδου 3.1. Απομόνωση καζεϊνών από το τυρί. 3.2. Διάλυση των καζεϊνών που έχουν απομονωθεί και υποβολή σε πλασμινόλυση (EC.3.4.21.7). 3.3. Ισοηλεκτρική εστίαση των καζεϊνών οι οποίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πλασμίνη παρουσία ουρίας και χρώση πρωτεϊνών με Coomassie brilliant blue G 250. 3.4. Αξιολόγηση μορφών απεικόνισης βαμένων γ2-καζεϊνών (αποδεικτικό αγελαδινού γάλακτος) διά συγκρίσεως της μορφής που προέκυψε από το δείγμα με εκείνες που προέκυψαν στην ίδια πηκτή από πρότυπα περιεκτικότητας 0 % και 1 % σε αγελαδινό γάλα. 4. Αντιδραστήρια Πρέπει να χρησιμοποιούνται αντιδραστήρια αναλυτικής καθαρότητας, εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά. Το νερό θα πρέπει να είναι δισαπεσταγμένο ή ισοδύναμης καθαρότητας. Σημείωση: Οι αναλογίες που ακολουθούν αφορούν πηκτές πολυακρυλαμιδίων με ουρία, διαστάσεων 265 x 125 x 0,25 mm, που έχουν παρασκευαστεί εργαστηριακά. Όπου χρησιμοποιούνται πηκτές άλλων διαστάσεων και τύπων, χρειάζεται ίσως προσαρμογή των συνθηκών διαχωρισμού. Ισοηλεκτρική εστίαση 4.1. Αντιδραστήρια παρασκευής πηκτών πολυακριλαμιδίου, που περιέχουν ουρία. 4.1.1. Μητρικό διάλυμα πηκτής Διαλύονται σε νερό: 4,85 g ακρυλαμιδίου 0,15 g Ν,Ν -μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου (BIS) 48,05 g ουρίας 12,22 g γλυκερίνης (87 % m/m), συμπλήρωνεται ο όγκος μέχρι 100 ml και το διάλυμα διατηρείται στο ψυγείο μέσα σε σκοτεινόχρωμη φιάλη. Σημείωση: Αντί των νευροτοξικών ακρυλαμιδίων (στις ανωτέρω ποσότητες), προτιμότερο είναι να χρησιμοποιείται προαναμειχθέν διάλυμα ακρυλαμιδίου/BIS, το οποίο διατίθεται στο εμπόριο. Αντί των ως άνω ποσοτήτων, χρειάζονται 12,6 ml ενός τέτοιου προαναμειχθέντος διαλύματος, εφόσον η περιεκτικότητά του σε ακρυλαμίδιο είναι 30 % m/v και η περιεκτικότητα του σε BIS είναι 0,8 % mv. Ο μέγιστος χρόνος διατηρησιμότητας του μητρικού διαλύματος είναι δέκα ημέρες- εάν η αγωγιμότητά του είναι μεγαλύτερη των 5 μS, απιονίζεται υπό ανάδευση για 30 λεπτά με 2 g Amberlite MB-3 και στη συνέχεια διηθείται από μεμβράνη 0,45 μm. 4.1.2. Διάλυμα πηκτής Παρασκευάζεται το διάλυμα πηκτής με ανάμειξη προσθέτων και αμφολυτών με το μητρικό διάλυμα πηκτής (βλέπε 4.1.1). 9,0 ml μητρικού διαλύματος 24 mg β-αλανίνης 500 μl αμφολύτου με pH 3,5-9,5 (1) 500 μl αμφολύτου με pH 6-7 (1). Το διάλυμα πηκτής αναμειγνύεται και απαερώνεται επί 2 έως 3 λεπτά σε λουτρό υπερήχων ή σε κενό. Σημείωση: Το διάλυμα πηκτής παρασκευάζεται αμέσως πριν μεταφερθεί πάνω στην πλάκα (βλέπε 6.2). 4.1.3. Διαλύματα καταλυτών Διάλυμα υπερθειικού αμμωνίου (PER) 40 % m/v: Διαλύονται σε νερό 800 mg PER και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 2 ml. Ν,Ν,Ν,Ν-τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (TEMED). Σημείωση: Να χρησιμοποιείται πάντοτε πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα PER. 4.2. Υγρό επαφής Κηροζίνη ή υγρή παραφίνη. 4.3. Ανοδικό διάλυμα Παρασκευάζεται διάλυμα 5,77 g φωσφορικού οξέως (85 % m/m) σε 100 ml νερού. 4.4 Καθοδικό διάλυμα Διαλύονται σε νερό 2,00 g υδροξειδίου του νατρίου και το διάλυμα αραιώνεται με νερό μέχρις όγκου 100 ml. Παρασκευή του δείγματος 4.5. Αντιδραστήρια απομόνωσης πρωτεϊνών Διχλωρομεθάνιο. Αραιό οξικό οξύ (25,0 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος αραιώνονται με νερό μέχρις όγκου 100 ml). Ακετόνη. 4.6. Ρυθμιστικό διάλυμα για τη διάλυση πρωτεϊνών Διαλύονται σε νερό 5,75 g γλυκερίνης (87 % m/m) 24,03 g ουρίας 250 mg διθειοθρεϊτόλης και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι όγκου 50 ml. Σημείωση: Φυλάσσεται στο ψυγείο- μέγιστος χρόνος διατήρησης μία εβδομάδα. 4.7. Αντιδραστήρια πλασμινόλυσης καζεΐνης 4.7.1. Ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου Τιτλοδοτείται διάλυμα όξινου ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml νερού) με διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml νερού) έως pH 8. 4.7.2. Πλασμίνη βοοειδούς (EC.3.4.21.7), ενεργότητας τουλάχιστον 5 U/ml. 4.7.3. Διάλυμα αναστολής ενζύμου Διαλύονται 2,624 g ε-αμινοκαπρονικού οξέος (6-άμινο-n-εξανικό οξύ) σε 100 ml αιθανόλης 40 % v/v. 4.8. Παρασκευή προτύπων πηγμένου αποκορυφωμένου πρόβειου γάλακτος που περιέχουν 0 % και 1 % αγελαδινού γάλακτος Αποκορυφωμένο γάλα λαμβάνεται με φυγοκέντρηση αγελαδινού ή πρόβειου μη κατεργασμένου ασυσκεύαστου γάλακτος στους 37o C για 20 λεπτά στα 2 500 g. Αφού ο σωλήνας και το περιεχόμενο ψυχθούν ταχέως μέχρι θερμοκρασίας 6-8oC, αφαιρείται εντελώς το ανώτερο στρώμα λίπους. Για την παρασκευή του προτύπου 1 %, προστίθενται 5,00 ml αποκορυφωμένου αγελαδινού γάλακτος σε 495 ml αποκορυφωμένου πρόβειου γάλακτος μέσα σε ποτήριο ζέσεως 1 λίτρου και, με την προσθήκη αραιού γαλακτικού οξέος (10 % v/v), ρυθμίζεται το pH σε 6,4. Ρυθμίζεται η θερμοκρασία στους 35o C και προστίθενται 100 μl πιτιάς μόσχου (ενεργότης πυτιάς 1 : 10 000, περίπου 3 000 U/ml), γίνεται ανάδευση για 1 λεπτό και εν συνεχεία το ποτήριο ζέσεως, σκεπασμένο με φύλλο αλουμινίου, αφήνεται στους 35o C επί μία ώρα για να σχηματισθεί το τυρόπηγμα. Αφού σχηματισθεί το τυρόπηγμα, το πηγμένο γάλα υφίσταται λυοφιλίωση χωρίς προηγούμενη ομοιογενοποίηση ή αποστράγγιση του ορού. Μετά τη λυοφιλίωση, κονιοποιείται προς σχηματισμό ομοιογενούς σκόνης. Για την παρασκευή του προτύπου 0 %, ακολουθείται η ίδια διαδικασία με 500 ml αμιγούς αποκορυφωμένου πρόβειου γάλακτος. Σημείωση: Πριν από την παρασκευή των προτύπων, συνιστάται ο έλεγχος του βαθμού καθαρότητας του πρόβειου γάλακτος με ισοηλεκτρική εστίαση των καζεϊνών οι οποίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πλασμίνη. Αντιδραστήρια χρώσης πρωτεϊνών 4.9. Σταθεροποιητής Διαλύονται σε νερό 150 g τριχλωροοξικού οξέος και το διάλυμα αραιώνεται μέχρις όγκου 1 000 ml. 4.10. Διάλυμα αποχρωματισμού Αραιώνονται με απεσταγμένο νερό 500 ml μεθανόλης και 200 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος μέχρις όγκου 2 000 ml. Σημείωση: Το διάλυμα αποχρωματισμού παρασκευάζεται σε ημερήσια βάση- Μπορεί να παρασκευαστεί με ανάμειξη ίσων όγκων μητρικών διαλυμάτων μεθανόλης (50 % v/v) και κρυσταλλικού οξικού οξέος (20 % v/v). 4.11. Διαλύματα βαφής 4.11.1. Διαλύματα βαφής (μητρικό διάλυμα 1) Διαλύονται 3,0 g Coomassie brilliant bleu G 250 (Color Index 42655) σε 100 ml μεθανόλης, 90 % v/v με τη χρησιμοποίηση μαγνητικού αναδευτήρα (45 λεπτά περίπου) και ακολουθεί διήθηση από δύο πτυχωτούς ηθμούς μέσης ταχύτητας. 4.11.2 Διάλυμα βαφής (μητρικό διάλυμα 2) Διαλύονται 5,0 g ένυδρου θειικού χαλκού (CuSO4 x 5H20) σε 1 000 ml οξικού οξέος 20 % (v/v). 4.11.3. Διάλυμα βαφής (διάλυμα εργασίας) Αναμειγνύονται 125 ml από κάθε μητρικό διάλυμα (4.11.1, 4.11.2) αμέσως πριν από τη βαφή. Σημείωση: Το διάλυμα βαφής πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο την ημέρα παρασκευής του. 5. Εξοπλισμός 5.1. Γυάλινες πλάκες διαστάσεων 265 x 125 x 4 mm- ελαστικός κύλινδρος (πλάτος 15 cm)- τραπέζι οριζοντίωσης. 5.2. Φύλλο συγκράτησης πηκτής διαστάσεων 265 x 125 mm. 5.3. Φύλλο κάλυψης διαστάσεων 280 x 125 mm. Επικολλάται λωρίδα αυτοκόλλητης ταινίας διαστάσεων 280 x 6 x 0,25 mm σε κάθε μεγάλη πλευρά (βλέπε σχήμα 1). 5.4. Θάλαμος ηλεκτροεστίασης με πλάκα ψύξης (π.χ. 265 x 125 mm) με κατάλληλη πηγή τάσης μεγαλύτερη ή ίση από 2,5 kv ή αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 5.5. Κρυοστάτης κυκλοφορίας ρυθμισμένος στους 12 +-0,5oC. 5.6. Συσκευή φυγοκέντρησης προσαρμοσμένη στα 3 000 g. 5.7. Ταινίες ηλεκτροδίου (μήκους μεγαλύτερου ή ίσου προς 265 mm). 5.8. Πλαστικές σταγονομετρικές φιάλες για το ανοδικό και το καθοδικό διάλυμα. 5.9. Φορείς δείγματος (10 x 5 mm, διηθητικός χάρτης από βισκόζη ή χαμηλής προσροφητικότητας σε πρωτεΐνες). 5.10. Ψαλίδια, νυστέρια και λαβίδες από ανοξείδωτο χάλυβα. 5.11. Δοχεία βαφής και αποχρωματισμού από ανοξείδωτο χάλυβα ή από γυαλί (π.χ. δίσκοι οργάνων 265 x 150 mm). 5.12. Ομοιογενοποιητής με ράβδο διαμέτρου 10 mm, 8 000 έως 20 000 στροφές ανά λεπτό (rpm). 5.13. Μαγνητικός αναδευτήρας. 5.14. Λουτρό υπερήχων. 5.15. Συγκολλητής ταινίας. 5.16. Μικροσιφώνια των 5 25 μl. 5.17. Συμπυκνωτής κενού ή συσκευή λυοφιλίωσης. 5.18. Θερμοστατούμενο υδρόλουτρο στους 35 και 40 +- 1o C, με τάρακτρο. 5.19. Πυκνόμετρο για μήκος κύματος λ = 634 nm. 6. Πορεία εργασίας 6.1. Παρασκευή δείγματος 6.1.1. Απομόνωση καζεϊνών Ζυγίζεται ποσότητα ισοδύναμη με 5 g ξερής μάζας τυριού ή προτύπων - για λευκά τυριά μούχλας χρησιμοποιείται, όπου αυτό είναι δυνατόν, το ανώριμο κέντρο - σε σωλήνα φυγοκέντρησης των 100 ml, προστίθενται 60 ml απεσταγμένου νερού και γίνεται ομοιογενοποίηση με ομοιογενοποιητή με ράβδο (8 000 10 000 rpm). Ρυθμίζεται το pH σε 4,6 με αραιό οξικό οξύ (4.5), γίνεται φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3 000 g), το λίπος και ο ορός απορρίπτονται, το υπόλειμμα ομοιογενοποιείται σ 20 000 rpm με 40 ml απεσταγμένου νερού προσαρμοσμένου σε pH 4 5 με αραιό οξικό οξύ (βλέπε 4.5), προστίθενται 20 ml διχλωρομεθανίου (βλέπε 4.5) και γίνεται εκ νέου ομοιογενοποίηση και φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3 000 g). Το στρώμα της καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ της υδατικής και της οργανικής φάσης (βλέπε σχήμα 2) αφαιρείται με μια σπάτουλα και απορρίπτονται και οι δύο φάσεις. Η καζεΐνη ομοιογενοποιείται εκ νέου με 40 ml απεσταγμένου νερού (βλέπε ανωτέρω) και 20 ml διχλωρομεθανίου και υποβάλλεταισε φυγοκέντρηση. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου και οι δύο φάσεις εκχύλισης γίνουν άχρωμες (2 έως 3 φορές). Το πρωτεϊνικό υπόλειμμα ομοιογενοποιείται με 50 ml άνυδρης ακετόνης (βλέπε 4.5) και διηθείται από πτυχωτό διηθητικό ηθμό μέσης ταχύτητας. Το υπόλειμμα εκπλύνεται πάνω στο διηθητικό ηθμό δύο φορές με 25 ml ακετόνης κάθε φορά και αφήνεται να ξεραθεί στον αέρα ή σε ρεύμα αζώτου, και στη συνέχεια κονιοποιείται σε γουδί.

Σημείωση: Οι απομονωμένες ξερές πρωτεΐνες μπορούν να διατηρηθούν επ' αόριστον σε θερμοκρασία δωματίου. Για ταχεία απομόνωση πρωτεϊνών, ομοιογενοποιείται ποσότητα ισοδύναμη με 5 g ξερής μάζας τυριού δύο φορές, κάθε φορά με 100 ml ακετόνης (βλέπε 4.5) σε 20 000 rpm, αφήνεται να ηρεμήσει επί 5 λεπτά και εν συνέχεια διηθείται από πτυχωτό ηθμό. Το πρωτεϊνικό υπόλειμμα ξηραίνεται με ακετόνη όπως περιγράφεται παραπάνω για να προκύψει τελικά η με ακετόνη ξηρανθείσα σκόνη. Η ταχεία μέθοδος δεν είναι εφαρμόσιμη σε τυριά τύπου ροκφόρ. 6.1.2. Πλασμινόλυση β-καζεϊνών προς ενίσχυση γ-καζεϊνών Ετοιμάζεται αιώρημα 25 mg απομονωθείσας καζεΐνης ή 50 mg των λυοφιλιωμένων προτύπων (βλέπε 4.8) ή η με ακετόνη ξηρανθείσα σκόνη από την ταχεία απομόνωση πρωτεϊνών σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού αμμωνίου (βλέπε 4.7.1) και ομοιογενοποιούνται επί 20 λεπτά, με υπέρηχους για παράδειγμα. Θερμαίνονται στους 40oC και προστίθενται 10 μl πλασμίνης (βλέπε 4.7.2), αναμειγνύονται και επωάζονται επί μία ώρα στους 40oC με συνεχή ανάδευση. Για αναστολή του ενζύμου προστίθενται 20 μl διαλύματος ε-αμινοκαπρονικού οξέος (βλέπε 4.7.3), και εν συνεχεία, προστίθενται 200 mg στερεάς ουρίας και 2 mg διθειοθρεϊτόλης. Σημείωση: Για να προκύψει μεγαλύτερη συμμετρία στις εστιασθείσες ταινίες καζεΐνης, συνιστάται λυοφιλίωση του διαλύματος μετά την προσθήκη του ε-αμινοκαπρονικού οξέος και εν συνεχεία διάλυση των υπολειμμάτων σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ουρίας (βλέπε 4.6). 6.2. Παρασκευή πηκτών ακρυλαμιδίου περιεχόντων ουρία Το φύλλο συγκράτησης πήγματος (βλέπε 5.2) κυλίεται με τη βοήθεια μερικών σταγόνων νερού πάνω σε γυάλινη πλάκα (βλέπε 5.1 και απομακρύνεται το επιπλέον νερό με χαρτοπετσέτα. Το φύλλο κάλυψης (βλέπε 5.3) κυλίεται με διαχωριστήρες (0,25 ml) πάνω σε άλλη γυάλινη πλάκα κατά τον ίδιο τρόπο. Η πλάκα τοποθετείται οριζοντίως σε τραπέζι οριζοντίωσης. Προστίθενται 10 μl καθενός από τα διαλύματα καταλυτών TEMED και PER (βλέπε 4.1.3) στο παρασκευασθέν και απαερωθέν διάλυμα πηκτής (βλέπε 4.1.2), αναμειγνύονται επ' ολίγον και μεταφέρονται ομοιόμορφα πάνω στο κέντρο του φύλλου κάλυψης. Τοποθετείται μια πλευρά της πλάκας συγκράτησης πήγματος (η πλευρά με το φύλλο προς τα κάτω) πάνω στην πλάκα με το φύλλο κάλυψης και χαμηλώνεται αργά, έτσι ώστε να σχηματίζεται μεταξύ των φύλλων ένα λεπτό στρώμα πήγματος που να απλώνεται κανονικά και να μην περιέχει φυσαλλίδες (βλέπε σχήμα 3). Η πλάκα συγκράτησης πηκτής χαμηλώνεται προσεκτικά και τελείως με τη βοήθεια μιας λεπτής σπάτουλας και τοποθετούνται από πάνω τρεις ακόμη γυάλινες πλάκες σαν βάρος. Αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός (60 λεπτά περίπου), απομακρύνεται το φύλλο υποστήριξης πηκτής μαζί με το φύλλο κάλυψης δι' ελαφρών κτυπημάτων των γυάλινων πλακών. Η ανάστροφη πλευρά του φύλλου συγκράτησης καθαρίζεται προσεκτικά για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα πηκτής και ουρίας. Το "sandwich" της πηκτής φέρεται σε κατάλληλο σωλήνα και αποθηκεύεται σε ψυγείο (επί έξι εβδομάδες το πολύ). Σημείωση: Το φύλλο κάλυψης με τους διαχωριστήρες μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου. Η πηκτή πολυακριλαμιδίου μπορεί να κοπεί σε μικρότερα μεγέθη, πράγμα το οποίο συνιστάται όταν υπάρχουν λίγα δείγματα ή όταν χρησιμοποιείται αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2 πηκτές διαστάσεων 4,5 x 5 cm). 6.3. Ισοηλεκτρική εστίαση Ο θερμοστάτης ψύξης ρυθμίζεται στους 12oC. Η ανάστροφη πλευρά του φύλλου συγκράτησης επαλείφεται με κηροζίνη και εν συνεχεία σταλάζονται μερικές σταγόνες κηροζίνης (βλέπε 4.2) στο κέντρο του ψυγόμενου τμήματος. Κυλίεται κατόπιν επ' αυτού το "sandwich" της πηκτής με το φύλλο συγκράτησης προς τα κάτω, με προσοχή ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία φυσαλλίων. Καθαρίζεται το τυχόν περίσσευμα κηροζίνης και αφαιρείται το φύλο κάλυψης. Διαβρέχονται οι ταινίες των ηλεκτροδίων με τα διαλύματα ανόδου και καθόδου (βλέπε 4.3, 4.4), κόβονται στο μήκος της πηκτής και τοποθετούνται στις προβλεπόμενες θέσεις (απόσταση ηεκτροδίων 9,5 cm). Συνθήκες για την ισοηλεκτρική εστίαση: 6.3.1. Διαστάσεις πήγματος 265 x 125 x 0,25 mm Φάση Χρόνος (λεπτά) Τάση (V) Ένταση ρεύματος (mA) Ισχύς (W) Βόλτ-ώρες (Vh) 1. Προεστίαση 30 μέγιστη 2 500 μέγιστη 15 σταθερή 4 περίπου 300 2. Εστίαση δείγματος (*) 60 μέγιστη 2 500 μέγιστη 15 σταθερή 4 περίπου 1 000 3. Τελική εστίαση 60 μέγιστη 2 500 μέγιστη 5 μέγιστη 20 περίπου 3 000 40 μέγιστη 2 500 μέγιστη 6 μέγιστη 20 περίπου 3 000 30 μέγιστη 2 500 μέγιστη 7 μέγιστη 25 περίπου 2 500 (*) Μεταφορά δείγματος: Μετά την προεστίαση (φάση 1), μεταφέρονται με σιφώνιο 18 μl από κάθε διάλυμα δείγματος στους φορείς δείγματος (βλέπε 5.9), που τοποθετούνται επάνω στην πηκτή σε απόσταση 1 mm το ένα από το άλλο και σε απόσταση 5 mm από την επιμήκη πλευρά της ανόδου και εφαρμόζεται ελαφρά πίεση. Η εστίαση πραγματοποιείται υπό τις ανωτέρω συνθήκες και οι φορείς δείγματος αφαιρούνται προσεκτικά μετά από 60 λεπτά εστίασης του δείγματος. Σημείωση: Εάν μεταβληθεί το πάχος ή το πλάτος των πηκτών, θα πρέπει να προσαρμοσθούν κατάλληλα οι τιμές της εντάσεως του ρεύματος και της ισχύος (π.χ. οι τιμές της εντάσεως του ρεύματος και της ισχύος διπλασιάζονται εάν χρησιμοποιηθεί πήγμα διαστάσεων 265 x 125 x 0,5 mm). 6.3.2. Παράδειγμα προγράμματος τάσης για αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2 πηκτές διαστάσεων 5,0 x 4,5 cm), με ηλεκτρόδια που εφαρμόζονται απευθείας στην πηκτή, χωρίς ταινίες ηλεκτροδίων Φάση Τάση Ένταση ρεύματος Ισχύς Θερμοκρασία Βόλτ-ώρες 1. Προεστίαση 1 000 V 10,0 μΑ 3,5 W 8o C 85 Vh 2. Εστίαση δείγματος 250 V 5,0 mA 2,5 W 8o C 30 Vh 3. Εστίαση 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8o C 80 Vh 4. Εστίαση 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8o C 570 Vh Κατά τη φάση 2, ο φορέας δείγματος τοποθετείται στις 0 Vh. Κατά τη φάση 2 ο φορέας δείγματος απομακρύνεται στις 30 Vh. 6.4. Βαφή πρωτεϊνών 6.4.1. Σταθεροποίηση πρωτεϊνών Απομακρύνονται οι ταινίες των ηλεκτροδίων αμέσως μετά τη διακοπή του ρεύματος και η πηκτή τοποθετείται αμέσως σε ένα δοχείο βαφής/αποχρωματισμού που είναι γεμάτος με 200 ml σταθεροποιητή (βλέπε 4.9)- αφήνεται επί 15 λεπτά αναδευόμενο κατά διαστήματα. 6.4.2. Έκπλυση και βαφή της πλάκας της πηκτής Ο σταθεροποιητής αποστραγγίζεται εντελώς και η πλάκα της πηκτής εκπλύνεται δύο φορές για 30 δευτερόλεπτα, κάθε φορά με 100 ml διαλύματος αποχρωματισμού (βλέπε 4.10). Το διάλυμα αποχρωματισμού αποχύνεται και πληρούται στο δοχείο με 250 ml διαλύματος βαφής (βλέπε 4.11.3), το οποίο και αφήνεται να ενεργήσει για 45 λεπτά υπό ελαφρή ανάδευση. 6.4.3. Αποχρωματισμός της πλάκας της πηκτής Αποχύνεται το διάλυμα βαφής, εκπλύνεται η πλάκα της πηκτής δύο φορές με 100 ml διαλύματος αποχρωματισμού κάθε φορά και εν συνεχεία αναδεύεται δύο φορές τουλάχιστον με 200 ml διαλύματος αποχρωματισμού επί 15 τουλάχιστον λεπτά κάθε φορά μέχρις ότου το υπόβαθρο γίνει εντελώς καθαρό και άχρωμο. Εκπλύνεται εν συνεχεία η πλάκα της πηκτής με απεσταγμένο νερό (2 φορές x 2 λεπτά κάθε φορά) και αφήνεται να στεγνώσει στον αέρα (2 έως 3 ώρες) ή στεγνώνεται με ηλεκτρικό στεγνωτήρα (10 έως 15 λεπτά). Σημείωση: Η σταθεροποίηση, η έκπλυση, η χρώση και ο αποχρωματισμός γίνονται στους 20o C. Οι υψηλές θερμοκρασίες να αποφεύγονται. 7. Αξιολόγηση Η αξιολόγηση γίνεται με σύγκριση των πρωτεϊνικών ταινιών του δείγματος με εκείνες δειγμάτων αναφοράς πάνω στην ίδια πηκτή. Η ανίχνευση αγελαδινού γάλακτος σε πρόβειο γάλα ή σε προϊόντα γάλακτος γίνεται μέσω των γ2- και γ3-καζεϊνών, οι οποίες έχουν ενισχυθεί κατόπιν επεξεργασίας με πλασμίνη (βλέπε 6.1.2), και των οποίων τα ισοηλεκτρικά σημεία ευρίσκονται στην περιοχή τιμών pH μεταξύ 6,5 και 7,5 (σχήματα 4 και 5). Το όριο ανίχνευσης είναι χαμηλότερο από 0,5 %. Για οπτική αξιολόγηση της ποσότητας αγελαδινού γάλακτος συνιστάται η προσαρμογή των συγκεντρώσεων δειγμάτων και προτύπων ώστε να προκύψει το ίδιο επίπεδο έντασης των γ2-καζεϊνών πρόβειου γάλακτος (βλέπε "γ2 Π" στα σχήματα 4 και 5). Κατόπιν αυτού, η ποσότητα αγελαδινού γάλακτος (μικρότερη, ίση ή μεγαλύτερη από 1 %) στο άγνωστο δείγμα μπορεί να εκτιμηθεί απευθείας διά συγκρίσεως της εντάσεως των γ2-καζεϊνών του αγελαδινού γάλακτος (βλέπε "γ2 Α" στα σχήματα 4 και 5). Εφόσον υπάρχει δυνατότητα, χρησιμοποιείται πυκνότερο (βλέπε 5.19) για τον προσδιορισμό του λόγου των εμβαδών των καμπύλων γ2-καζεϊνών βοοειδών και προβατοειδών (βλέπε σχήμα 5). Η τιμή αυτή συγκρίνεται με το λόγο των γ2-καζεϊνών στο πρότυπο 1 % που αναλύθηκε επάνω στην ίδια πηκτή. Σημείωση: Η μέθοδος δίδει ικανοποιητικά αποτελέσματα εφόσον υπάρξει σαφής θετική ένδειξη γ2καζεΐνης βοοειδούς στο πρότυπο 1 %, όχι όμως και στο πρότυπο 0 %. Εάν όχι, η διαδικασία βελτιστοποιείται με επακριβή εφαρμογή των λεπτομερειών της μεθόδου. 8. Βιβλιογραφία Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of γ2-caseins using plasmin as signal amplifier. Στο: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.) σσ. 389-393, Bode-Verlag, Munich (1989). Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -kaese durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Z. Lebensm. Unters. Forsch (σε προετοιμασία). Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Σχήμα 1. Σχηματική αναπαράσταση του φύλλου κάλυψης

Λωρίδα διαχωριστήρα

Φύλλο πολυεστέρα

Σχήμα 2. Στρώμα καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ υδατικής και οργανικής φάσης μετά από φυγοκέντρηση

Φάση H2O

Καζεΐνη

Φάση CH2Cl2

Σχήμα 3. Τεχνική επικάλυψης για στρώση υπερλέπτων πηκτών πολυακρυλαμιδίου

α = λωρίδα διαχωριστήρα (0,25 mm)- β = φύλλο κάλυψης (5.3)- γ,ε. = γυάλινες πλάκες (5.1)- δ = διάλυμα πηκτής (4.1.2)- στ = φύλλο συγκράτησης πηκτής (5.2)

Σχήμα 4. Ισοηλεκτρική εστίαση καζεϊνών επεξεργασμένων με πλασμίνη, από τυρί τύπου Pecorino με διαφορετικές ποσότητες αγελαδινού γάλακτος. % ΓΑ = ποσοστό αγελαδινού γάλακτος, Α = αγελάδα, Π = πρόβατο

Τυρί τύπου Pecorino που περιέχει:

Σχήμα 5. Πυκνογραφήματα δείγματος τυριού τύπου Pecorino με 0, 1, 2, 3 και 7 % αγελαδινό γάλα μετά από ισοηλεκτρική εστίαση. Το άνω ήμισυ της πηκτής σαρώθηκε σε λ = 634 nm. STD = πρότυπα περιέχοντα 0 και 1 % αγελαδινό γάλα.

(1) Τα προϊόντα Ampholine με pH 3,5-9,5 (Pharmacia-LKB) και Servalyte με pH 6-7 (Serva) έχουν αποδειχθεί ιδιαιτέρως κατάλληλα προκειμένου για την επίτευξη του ζητούμενου διαχωρισμού γ-καζεϊνών.