3.

Προστίθενται τα ακόλουθα κεφάλαια: «Β.49. ΔΟΚΙΜΗ ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ IN VITRO ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η δοκιμασία μικροπυρήνων in vitro (MNvit) αποτελεί δοκιμή γονιδιοτοξικότητας για την ανίχνευση μικροπυρήνων στο κυτταρόπλασμα των μεσοφασικών κυττάρων. Οι μικροπυρήνες μπορεί να προέρχονται από άκεντρα (δηλαδή χωρίς κεντρομερίδιο) τμήματα χρωμοσώματος ή από ολόκληρα χρωμοσώματα που δεν είναι ικανά να μετακινηθούν προς τους πόλους κατά το στάδιο ανάφασης της κυτταρικής διαίρεσης. Με τη δοκιμασία ανιχνεύεται η δράση κλαστογόνων και ανευπλοειδογόνων χημικών προϊόντων (ουσιών και μειγμάτων) (1) (2) σε κύτταρα που διαιρέθηκαν κατά τη διάρκεια της έκθεσης στην ελεγχόμενη ουσία ή μετά από αυτή. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών παρέχει τη δυνατότητα χρήσης πρωτοκόλλου με ή χωρίς τον αναστολέα πολυμερισμού της ακτίνης κυτταροχαλασίνη (κυτοχαλασίνη) Β (cytoB). Η προσθήκη cytoB πριν από τη στοχευόμενη μίτωση επιτρέπει τον προσδιορισμό και την επιλεκτική ανάλυση της συχνότητας σχηματισμού μικροπυρήνων σε κύτταρα που έχουν ολοκληρώσει μία μίτωση, καθώς τα κύτταρα αυτά είναι διπύρηνα (3) (4). Η παρούσα μέθοδος παρέχει επίσης τη δυνατότητα χρήσης πρωτοκόλλων χωρίς αναστολή της κυτταροκίνησης, με την προϋπόθεση ότι υπάρχουν στοιχεία από τα οποία προκύπτει ότι ο αναλυόμενος κυτταρικός πληθυσμός έχει υποστεί μίτωση. 2. Εκτός από τη χρήση της δοκιμασίας MNvit για την αναγνώριση χημικών προϊόντων (ουσιών και μειγμάτων) που επάγουν μικροπυρήνες, πληροφορίες σχετικά με τους μηχανισμούς πρόκλησης χρωμοσωματικών βλαβών και σχηματισμού μικροπυρήνων είναι επίσης δυνατόν να συγκεντρωθούν με αναστολή της κυτταροκίνησης, ανοσοχημική σήμανση κινητοχώρου ή με υβριδισμό με ανιχνευτές κεντρομεριδίου/τελομεριδίου (FISH, από τα αρχικά των λέξεων fluorescence in situ hybridisation/υβριδισμός in situ με φθορισμό) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Οι διαδικασίες σήμανσης και υβριδισμού μπορούν να χρησιμοποιούνται όταν αυξάνεται ο σχηματισμός μικροπυρήνων και ο ερευνητής επιθυμεί να διαπιστώσει αν η αύξηση οφείλεται σε κλαστογόνα και/ή ανευπλοειδογόνα συμβάντα. 3. Οι μικροπυρήνες αποτελούν βλάβη που μεταβιβάζεται στα θυγατρικά κύτταρα, ενώ οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες που καταγράφονται σε μεταφασικά κύτταρα είναι δυνατόν να μη μεταβιβάζονται. Λόγω της δυνατότητας σχετικά αντικειμενικής εκτίμησης των μικροπυρήνων σε μεσοφασικά κύτταρα, το εργαστηριακό προσωπικό πρέπει μόνο να διαπιστώνει αν τα κύτταρα έχουν ή όχι διαιρεθεί και πόσα κύτταρα περιέχουν μικροπυρήνα. Συνεπώς, είναι δυνατή η σχετικά ταχεία καταμέτρηση των παρασκευασμάτων και η αυτοματοποίηση της ανάλυσης. Αυτό καθιστά πρακτικά εφικτή την καταμέτρηση χιλιάδων αντί εκατοντάδων κυττάρων ανά αγωγή, με αποτέλεσμα να αυξάνεται η ισχύς της δοκιμασίας. Τέλος, επειδή μικροπυρήνες μπορούν να προκύψουν από καθυστερούντα χρωμοσώματα, παρέχεται η δυνατότητα ανίχνευσης παραγόντων που επάγουν ανευπλοειδία και οι οποίοι είναι δύσκολο να μελετηθούν με συμβατικές δοκιμές χρωμοσωματικών ανωμαλιών, π.χ. με την κατευθυντήρια γραμμή OECD Test Guideline 473 (κεφάλαιο Β.10 του παρόντος παραρτήματος) (17). Ωστόσο, με τη δοκιμασία MNvit δεν είναι δυνατή η διάκριση μεταξύ των χημικών ουσιών που επάγουν πολυπλοειδία και των κλαστογόνων ουσιών, χωρίς τη χρήση ειδικών τεχνικών, όπως η FISH που περιγράφεται στην παράγραφο 2. 4. Η δοκιμασία MNvit είναι μέθοδος in vitro, στην οποία χρησιμοποιούνται συνήθως καλλιεργημένα κύτταρα ανθρώπου ή τρωκτικών. Παρέχει εκτεταμένη βάση για την in vitro διερεύνηση του δυναμικού πρόκλησης χρωμοσωματικών βλαβών, χάρη στη δυνατότητα ανίχνευσης τόσο των ανευπλοειδογόνων όσο και των κλαστογόνων ουσιών. 5. Η δοκιμασία MNvit είναι αυτοδύναμη και αποτελεσματική σε διάφορους κυτταρικούς τύπους, παρουσία ή μη cytoB. Εκτενή δεδομένα υποστηρίζουν την εγκυρότητα της δοκιμασίας MNvit με τη χρήση διαφόρων κυτταρικών σειρών τρωκτικών (CHO, V79, CHL/IU και L5178Y) και ανθρώπινων λεμφοκυττάρων (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Μεταξύ αυτών συγκαταλέγονται, ειδικότερα, οι διεθνείς μελέτες επικύρωσης που συντόνισε η γαλλική επιστημονική εταιρεία Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) και οι εκθέσεις του International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Τα διαθέσιμα δεδομένα επαναξιολογήθηκαν επίσης στο πλαίσιο μελέτης αναδρομικής επικύρωσης με ανάλυση βάρους της μαρτυρίας, η οποία διεξήχθη από το Ευρωπαϊκό Κέντρο Επικύρωσης Εναλλακτικών Μεθόδων (ECVAM) της Ευρωπαϊκής Επιτροπής, και η μέθοδος δοκιμών κρίθηκε επιστημονικά έγκυρη από την επιστημονική συμβουλευτική επιτροπή (ESAC) του ECVAM (32) (33) (34). Έχει επίσης περιγραφεί η χρήση της σειράς ανθρώπινων λεμφοβλαστοειδών κυττάρων TK6 (35), των κυττάρων HepG2 (36) (37) και πρωτογενών εμβρυϊκών κυττάρων του είδους χάμστερ Mesocricetus auratuscells (38), τα οποία όμως δεν έχουν χρησιμοποιηθεί σε μελέτες επικύρωσης. ΟΡΙΣΜΟΙ 6. Οι χρησιμοποιούμενοι ορισμοί παρατίθενται στο προσάρτημα 1. ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ 7. Οι δοκιμές που διεξάγονται in vitro απαιτούν κατά κανόνα τη χρήση εξωγενούς πηγής μεταβολικής ενεργοποίησης, εκτός εάν τα κύτταρα διαθέτουν ικανότητα μεταβολισμού των ελεγχόμενων ουσιών. Τα εξωγενή συστήματα μεταβολικής ενεργοποίησης δεν μιμούνται απόλυτα τις συνθήκες in vivo. Πρέπει επίσης να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφεύγεται η χρήση συνθηκών που μπορεί να οδηγήσουν σε τεχνητά θετικά αποτελέσματα, τα οποία μπορεί να μην οφείλονται σε εγγενή μεταλλαξιγένεση αλλά σε παράγοντες όπως η σημαντική αλλαγή του pH ή της ωσμωτικότητας ή τα υψηλά επίπεδα κυτταροτοξικότητας (39) (40) (41). Εάν η ελεγχόμενη χημική ουσία μεταβάλλει το pH του θρεπτικού υλικού όταν προστίθεται σε αυτό, το pH πρέπει να ρυθμίζεται, κατά προτίμηση με την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος στο διάλυμα παρακαταθήκης κατά τρόπο ώστε όλοι οι όγκοι να παραμένουν αμετάβλητοι σε όλες τις συγκεντρώσεις δοκιμής και για όλους τους μάρτυρες. 8. Βασικής σημασίας για την ανάλυση της επαγωγής μικροπυρήνων είναι να συντελείται μίτωση τόσο στις καλλιέργειες που υποβάλλονται σε αγωγή, όσο και σε εκείνες που δεν υποβάλλονται. Το πιο διαφωτιστικό στάδιο για την καταμέτρηση των μικροπυρήνων είναι η ολοκλήρωση μιας μίτωσης των κυττάρων κατά τη διάρκεια της αγωγής με την ελεγχόμενη ουσία ή μετά από αυτή. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ 9. Καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων ή κυττάρων θηλαστικών εκτίθενται στην ελεγχόμενη χημική ουσία, με και χωρίς εξωγενή πηγή μεταβολικής ενεργοποίησης, εκτός εάν χρησιμοποιούνται κύτταρα με επαρκή μεταβολική ικανότητα. Σε όλες τις δοκιμές συμπεριλαμβάνονται χημικές ουσίες ως παράλληλοι μάρτυρες φορέα/διαλύτη και θετικοί μάρτυρες. 10. Κατά τη διάρκεια της έκθεσης στην ελεγχόμενη ουσία ή μετά από αυτή, τα κύτταρα καλλιεργούνται για επαρκές χρονικό διάστημα ώστε η βλάβη του χρωμοσώματος ή της ατράκτου να προκαλέσει τον σχηματισμό μικροπυρήνων σε μεσοφασικά κύτταρα. Για την επαγωγή ανευπλοειδίας χρειάζεται συνήθως η παρουσία της ελεγχόμενης ουσίας κατά τη μίτωση. Τα μεσοφασικά κύτταρα συλλέγονται και, ύστερα από χρώση, αναλύονται για να διαπιστωθεί η παρουσία μικροπυρήνων. Στην ιδανική περίπτωση, θα πρέπει να καταμετρώνται μόνο μικροπυρήνες κυττάρων τα οποία ολοκλήρωσαν μια μίτωση κατά τη διάρκεια της έκθεσης στην ελεγχόμενη ουσία ή της περιόδου μετά την έκθεση, εάν προβλέπεται. Στις καλλιέργειες που υποβάλλονται σε αγωγή με αναστολέα κυτταροκίνησης, αυτό επιτυγχάνεται με την καταμέτρηση μόνο των διπύρηνων κυττάρων. Εάν δεν χρησιμοποιείται αναστολέας κυτταροκίνησης, έχει σημασία να καταδεικνύεται ότι τα αναλυόμενα κύτταρα πιθανώς διαιρέθηκαν κατά τη διάρκεια της έκθεσης στην ελεγχόμενη ουσία ή μετά από αυτή. Για όλα τα πρωτόκολλα, έχει σημασία να καταδεικνύεται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων τόσο στις καλλιέργειες-μάρτυρες όσο και σε εκείνες που υποβάλλονται σε αγωγή, στις δε καλλιέργειες στις οποίες καταμετρώνται οι μικροπυρήνες (ή σε παράλληλες καλλιέργειες) πρέπει να εκτιμάται ο βαθμός κυτταροτοξικότητας ή κυτταρόστασης που επάγει η ελεγχόμενη ουσία. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Προετοιμασία 11. Μπορούν να χρησιμοποιούνται καλλιεργημένα πρωτογενή ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερειακού αίματος (5) (19) (42) (43) και ορισμένες κυτταρικές σειρές τρωκτικών, όπως οι CHO, V79, CHL/IU και L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Η χρήση άλλων κυτταρικών σειρών και τύπων πρέπει να αιτιολογείται με βάση τις αποδεδειγμένες επιδόσεις τους στη δοκιμασία, όπως περιγράφεται στην ενότητα “Κριτήρια αποδοχής”. Δεδομένου ότι η συχνότητα υποβάθρου του σχηματισμού μικροπυρήνων επηρεάζει την ευαισθησία της δοκιμασίας, συνιστάται η χρήση κυτταρικών τύπων με χαμηλή και σταθερή συχνότητα υποβάθρου όσον αφορά τον σχηματισμό μικροπυρήνων. 12. Τα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερειακού αίματος πρέπει να λαμβάνονται από νέα (ηλικίας 18-35 ετών περίπου) και υγιή άτομα που δεν καπνίζουν και δεν έχουν γνωστό ιστορικό πρόσφατης έκθεσης σε γονιδιοτοξικές χημικές ουσίες ή σε ακτινοβολία. Σε περίπτωση συνένωσης για χρήση κυττάρων από περισσότερους του ενός δότες, πρέπει να προσδιορίζεται ο αριθμός των δοτών. Η συχνότητα σχηματισμού μικροπυρήνων αυξάνεται με την ηλικία, περισσότερο στις γυναίκες απ’ ό,τι στους άνδρες (44), γεγονός που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στην επιλογή δοτών κυττάρων για συνένωση. Θρεπτικά υλικά και συνθήκες καλλιέργειας 13. Για τις καλλιέργειες πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλο θρεπτικό υλικό και κατάλληλες συνθήκες επώασης (δοχεία καλλιέργειας, συγκέντρωση CO2, θερμοκρασία και υγρασία). Οι καθιερωμένες κυτταρικές σειρές και στελέχη πρέπει να ελέγχονται τακτικά ως προς τη σταθερότητα του τυπικού αριθμού χρωμοσωμάτων και την απουσία μόλυνσης από μυκόπλασμα και να μην χρησιμοποιούνται εάν έχει μεταβληθεί ο τυπικός αριθμός χρωμοσωμάτων. Πρέπει να είναι γνωστή η κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου στις συνθήκες καλλιέργειας που χρησιμοποιεί το εργαστήριο δοκιμών. Εάν εφαρμόζεται η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης, η συγκέντρωση του αναστολέα κυτταροκίνησης πρέπει να βελτιστοποιείται για τον συγκεκριμένο τύπο κυττάρων και να έχει αποδεδειγμένα ικανοποιητική απόδοση σε διπύρηνα κύτταρα για καταμέτρηση. Παρασκευή των καλλιεργειών 14. Καθιερωμένες κυτταρικές σειρές και στελέχη: τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται από μητρικές καλλιέργειες, ανακαλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό, σε πυκνότητα τέτοια ώστε οι καλλιέργειες να μη γίνονται συρρέουσες σε μονοστιβάδα και οι καλλιέργειες σε εναιώρημα να μην φθάνουν σε κατάσταση υπέρμετρης πυκνότητας πριν από τον χρόνο συλλογής, και επωάζονται στους 37 °C. 15. Λεμφοκύτταρα: ολικό (πλήρες) αίμα κατεργασμένο με αντιθρομβωτικό (π.χ. ηπαρίνη) ή διαχωρισμένα λεμφοκύτταρα καλλιεργούνται παρουσία μιτωγόνου (π.χ. φυτοαιμοσυγκολλητίνη/PHA) πριν εκτεθούν στην ελεγχόμενη ουσία και στην cytoB. Μεταβολική ενεργοποίηση 16. Όταν χρησιμοποιούνται κύτταρα με ανεπαρκή ενδογενή μεταβολική ικανότητα, πρέπει να χρησιμοποιούνται εξωγενή συστήματα μεταβολικής ενεργοποίησης. Το συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι ένα μεταμιτοχονδριακό κλάσμα εμπλουτισμένο με συμπαράγοντα (S9), το οποίο παρασκευάζεται από το ήπαρ τρωκτικών που έχει υποβληθεί σε κατεργασία με ενζυμοεπαγωγικούς παράγοντες, όπως το Aroclor 1254 (45) (46) ή ο συνδυασμός φαινοβαρβιτόνης και β-ναφθοφλαβόνης (46) (47) (48) (49). Ο συνδυασμός αυτός δεν αντιβαίνει στη σύμβαση της Στοκχόλμης για τους έμμονους οργανικούς ρύπους (50) και στον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 850/2004 για τους έμμονους οργανικούς ρύπους (66), ενώ έχει αποδειχθεί εξίσου αποτελεσματικός με το Aroclor 1254 στην επαγωγή οξειδασών μεικτής λειτουργίας (46) (47) (48) (49). Το κλάσμα S9 χρησιμοποιείται συνήθως σε συγκεντρώσεις 1-10 % ν/ν στο τελικό μέσο θρεπτικό υλικό δοκιμής. Ο όρος που αφορά το σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης ενδέχεται να εξαρτάται από την τάξη της ελεγχόμενης χημικής ουσίας και, σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί να ενδείκνυται η χρήση περισσότερων της μιας συγκεντρώσεων του S9. 17. Οι κυτταρικές σειρές που είναι προϊόν γενετικής μηχανικής και εκφράζουν συγκεκριμένα ενεργοποιητικά ένζυμα του ανθρώπου ή των τρωκτικών μπορούν να καταργήσουν την ανάγκη για εξωγενές σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης και να χρησιμοποιηθούν ως κύτταρα δοκιμής. Στην περίπτωση αυτή, η επιλογή των χρησιμοποιούμενων κυτταρικών σειρών πρέπει να αιτιολογείται επιστημονικά, π.χ. με βάση την καταλληλότητα των οξειδασών μεικτής λειτουργίας για τον μεταβολισμό της ελεγχόμενης ουσίας (51) και τον βαθμό απόκρισής τους σε γνωστές κλαστογόνες και ανευπλοειδογόνες ουσίες (βλέπε χωριστή ενότητα για τα κριτήρια αποδοχής). Επισημαίνεται ότι η ελεγχόμενη ουσία μπορεί να μη μεταβολίζεται από την ή τις εκφραζόμενες οξειδάσες μεικτής λειτουργίας. Στην περίπτωση αυτή, τα αρνητικά αποτελέσματα δεν υποδηλώνουν ότι η ελεγχόμενη ουσία δεν μπορεί να επάγει τον σχηματισμό μικροπυρήνων. Παρασκεύασμα της ελεγχόμενης ουσίας 18. Πριν από την αγωγή των κυττάρων, οι στερεές χημικές ουσίες πρέπει να διαλύονται σε κατάλληλους διαλύτες ή φορείς και να αραιώνονται, εφόσον ενδείκνυται. Οι υγρές ουσίες μπορούν να προστίθενται κατευθείαν στα συστήματα δοκιμής και/ή να αραιώνονται πριν από την αγωγή. Οι αέριες ή πτητικές ουσίες πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή με κατάλληλες τροποποιήσεις των τυπικών πρωτοκόλλων, π.χ. αγωγή σε σφραγισμένα δοχεία (52) (53). Πρέπει να χρησιμοποιούνται πρόσφατα παρασκευάσματα της ελεγχόμενης ουσίας, εκτός εάν η φύλαξή τους είναι αποδεκτή βάσει των σχετικών με τη σταθερότητα στοιχείων. Συνθήκες δοκιμής Διαλύτες/φορείς 19. Ο διαλύτης/φορέας δεν πρέπει να αντιδρά με την ελεγχόμενη ουσία ούτε να είναι ασύμβατος με την επιβίωση των κυττάρων ή τη διατήρηση της δραστικότητας του S9 στη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση. Η χρήση άλλων διαλυτών/φορέων εκτός από τους καθιερωμένους (π.χ. νερό, θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιέργειας, διμεθυλοσουλφοξείδιο) πρέπει να υποστηρίζεται από δεδομένα από τα οποία προκύπτει ότι είναι συμβατοί με την ελεγχόμενη ουσία και δεν είναι γονιδιοτοξικοί. Συνιστάται, εφόσον είναι δυνατόν, να εξετάζεται πρώτα η δυνατότητα χρήσης υδατικού διαλύτη/φορέα. Χρήση cytoB ως αναστολέα κυτταροκίνησης 20. Μια από τις σημαντικότερες παραμέτρους κατά την εκτέλεση της δοκιμασίας MNvit είναι να εξασφαλίζεται ότι τα καταμετρούμενα κύτταρα ολοκλήρωσαν μια μίτωση κατά τη διάρκεια της αγωγής με την ελεγχόμενη ουσία ή της περιόδου επώασης μετά την αγωγή, εάν προβλέπεται. Η CytoB είναι ο ευρύτερα χρησιμοποιούμενος παράγοντας για την αναστολή της κυτταροκίνησης, καθώς αναστέλλει τη συγκρότηση της ακτίνης και, κατ’ επέκταση, εμποδίζει τον αποχωρισμό των θυγατρικών κυττάρων μετά τη μίτωση, προκαλώντας τον σχηματισμό διπύρηνων κυττάρων (5) (54) (55). Ως εκ τούτου η καταμέτρηση των μικροπυρήνων μπορεί να περιοριστεί μόνο στα κύτταρα που υπέστησαν μίτωση κατά τη διάρκεια της αγωγής ή μετά από αυτή. Είναι δυνατόν να μετρηθεί ταυτόχρονα η επίδραση της ελεγχόμενης ουσίας στην κινητική του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Όταν χρησιμοποιούνται ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, πρέπει να χρησιμοποιείται CytoB ως αναστολέας κυτταροκίνησης, λόγω της μεταβλητότητας της διάρκειας του κυτταρικού κύκλου εντός των καλλιεργειών και μεταξύ των δοτών, καθώς και του γεγονότος ότι δεν αντιδρούν όλα τα λεμφοκύτταρα στην PHA. Στις δοκιμές με κυτταρικές σειρές έχουν χρησιμοποιηθεί και άλλες μέθοδοι για τη διαπίστωση της διαίρεσης των καταμετρούμενων κυττάρων, οι οποίες εξετάζονται κατωτέρω (βλέπε παράγραφο 26). 21. Το εργαστήριο πρέπει να καθορίζει, για κάθε τύπο κυττάρων, την κατάλληλη συγκέντρωση cytoB για την επίτευξη της βέλτιστης συχνότητας διπύρηνων κυττάρων στις καλλιέργειες-μάρτυρες με φορέα/διαλύτη. Η κατάλληλη συγκέντρωση cytoB κυμαίνεται συνήθως μεταξύ 3 and 6 μg/ml. Μέτρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταροτοξικότητας και επιλογή των συγκεντρώσεων έκθεσης 22. Κατά τον καθορισμό της υψηλότερης συγκέντρωσης δοκιμής της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να αποφεύγονται οι συγκεντρώσεις που μπορούν να οδηγήσουν σε τεχνητά θετικές αποκρίσεις, όπως εκείνες που προκαλούν υπέρμετρη κυτταροτοξικότητα, καθίζηση στο θρεπτικό υλικό και σημαντική αλλαγή του pH ή της ωσμωτικότητας (39) (40) (41). 23. Μετράται ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός για να εξασφαλίζεται ότι τα υποβαλλόμενα σε αγωγή κύτταρα υφίστανται μίτωση κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας και ότι η αγωγή διεξάγεται σε κατάλληλα επίπεδα κυτταροτοξικότητας (βλέπε παράγραφο 29). Στα κύτταρα που χρειάζονται μεταβολική ενεργοποίηση, η κυτταροτοξικότητα πρέπει να προσδιορίζεται με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση, μέσω της σχετικής αύξησης του καταμετρούμενου αριθμού κυττάρων (RICC) ή του σχετικού διπλασιασμού του πληθυσμού (RPD) (βλέπε μαθηματικούς τύπους στο προσάρτημα 2), εκτός εάν χρησιμοποιείται cytoB. Εφόσον χρησιμοποιείται cytoB, η κυτταροτοξικότητα μπορεί να προσδιορίζεται μέσω του δείκτη αναδιπλασιασμού (RI) (βλέπε μαθηματικό τύπο στο προσάρτημα 2). 24. Η κατεργασία των καλλιεργειών με cytoB και η μέτρηση της σχετικής συχνότητας των μονοπύρηνων, διπύρηνων και πολυπύρηνων κυττάρων στην καλλιέργεια παρέχουν μια ορθή μέθοδο ποσοτικού προσδιορισμού της επίδρασης της αγωγής στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και της κυτταροτοξικής ή κυτταροστατικής δράσης της (5) και εξασφαλίζουν την καταμέτρηση μόνο των κυττάρων εκείνων που διαιρέθηκαν κατά τη διάρκεια της αγωγής ή μετά από αυτή. 25. Στις μελέτες με cytoB, η κυτταρόσταση/κυτταροτοξικότητα είναι δυνατόν να προσδιοριστεί ποσοτικά μέσω του δείκτη πολλαπλασιασμού με αναστολή κυτταροκίνησης (CBPI) (5), (26), (56) ή να συναχθεί από τον δείκτη RI, από 500 τουλάχιστον κύτταρα ανά καλλιέργεια (βλέπε μαθηματικούς τύπους στο προσάρτημα 2). Όταν χρησιμοποιείται cytoB για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ο δείκτης CBPI ή RI πρέπει να προσδιορίζεται από 500 τουλάχιστον κύτταρα ανά καλλιέργεια. Οι μετρήσεις αυτές, μεταξύ άλλων, μπορούν να χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας με τη σύγκριση των τιμών που αντιστοιχούν στις καλλιέργειες αγωγής και στις καλλιέργειες-μάρτυρες. Η αξιολόγηση άλλων δεικτών κυτταροτοξικότητας (π.χ. συρρέουσα καλλιέργεια, κυτταρικός αριθμός, απόπτωση, νέκρωση, καταμέτρηση μετάφασης) μπορεί να παράσχει χρήσιμες πληροφορίες. 26. Στις μελέτες χωρίς cytoB, είναι αναγκαίο να καταδεικνύεται ότι τα καταμετρούμενα κύτταρα της καλλιέργειας διαιρέθηκαν κατά τη διάρκεια της αγωγής με την ελεγχόμενη ουσία ή μετά από αυτή. Σε αντίθετη περίπτωση, υπάρχει το ενδεχόμενο ψευδαρνητικών αποκρίσεων. Μεταξύ των μεθόδων που έχουν χρησιμοποιηθεί για την εξασφάλιση της καταμέτρησης διαιρεθέντων κυττάρων συγκαταλέγονται η ενσωμάτωση και, στη συνέχεια, η ανίχνευση βρωμοδεσοξυουριδίνης (BrdU) με σκοπό την αναγνώριση των κυττάρων που έχουν αναδιπλασιαστεί (57), η κλωνοποίηση στις περιπτώσεις αγωγής και καταμέτρησης in situ, σε αντικειμενοφόρο πλάκα, κυττάρων από μόνιμες κυτταρικές σειρές [δείκτης πολλαπλασιασμού (PI)] (25) (26) (27) (28), η μέτρηση του σχετικού διπλασιασμού του πληθυσμού (RPD) ή της σχετικής αύξησης του καταμετρούμενου αριθμού κυττάρων (RICC) και άλλες αποδεδειγμένες μέθοδοι (16) (56) (58) (59) (βλέπε μαθηματικούς τύπους στο προσάρτημα 2). Η αξιολόγηση άλλων δεικτών κυτταροτοξικότητας ή κυταρόστασης (π.χ. συρρέουσα καλλιέργεια, κυτταρικός αριθμός, απόπτωση, νέκρωση, καταμέτρηση μετάφασης) μπορεί να παράσχει χρήσιμες πληροφορίες. 27. Θα πρέπει να αξιολογούνται τρεις τουλάχιστον συγκεντρώσεις δοκιμής που επιδέχονται ανάλυση. Για να επιτευχθεί αυτό, μπορεί να είναι απαραίτητη η εκτέλεση του πειράματος με μεγαλύτερο πλήθος συγκεντρώσεων που δεν απέχουν πολύ μεταξύ τους και η ανάλυση του σχηματισμού μικροπυρήνων στις συγκεντρώσεις που παρέχουν το κατάλληλο φάσμα κυτταροτοξικότητας. Εναλλακτική στρατηγική είναι η διεξαγωγή προκαταρτικής δοκιμής κυτταροτοξικότητας για τον περιορισμό του εύρους συγκεντρώσεων της τελικής δοκιμής. 28. Με την υψηλότερη συγκέντρωση πρέπει να επιδιώκεται κυτταροτοξικότητα 55 ± 5 %. Σε υψηλότερα επίπεδα, η κυτταροτοξικότητα ενδέχεται να έχει ως δευτερογενές αποτέλεσμα χρωμοσωματικές βλάβες (60). Σε περίπτωση κυτταροτοξικότητας, οι επιλεγόμενες συγκεντρώσεις δοκιμής πρέπει να εκτείνονται από τη συγκέντρωση που προκαλεί κυτταροτοξικότητα 55 ± 5 % μέχρι εκείνη που προκαλεί ελάχιστη ή μηδενική κυτταροτοξικότητα. 29. Εάν δεν παρατηρηθεί κυτταροτοξικότητα ή ίζημα, η υψηλότερη συγκέντρωση δοκιμής πρέπει να αντιστοιχεί στη μικρότερη από τις τιμές 0,01 M, 5 mg/mL ή 5 μl/mL. Κατά κανόνα, η απόσταση μεταξύ των επιλεγόμενων για ανάλυση συγκεντρώσεων πρέπει να μην υπερβαίνει τον παράγοντα 10. Προκειμένου για ουσίες με μεγάλη κλίση καμπύλης συγκέντρωσης-απόκρισης, μπορεί να είναι απαραίτητη η ελάττωση της απόστασης μεταξύ των συγκεντρώσεων της ελεγχόμενης ουσίας, ώστε να γίνεται καταμέτρηση και στις καλλιέργειες των κλιμάκων μεσαίας και χαμηλής τοξικότητας. 30. Όταν η διαλυτότητα αποτελεί περιοριστικό παράγοντα, η υψηλότερη συγκέντρωση, εφόσον δεν περιορίζεται από την κυτταροτοξικότητα, πρέπει να είναι η μικρότερη συγκέντρωση στην οποία οι καλλιέργειες παρουσιάζουν το ελάχιστο ορατό ίζημα, με την προϋπόθεση να μην παρεμποδίζεται η καταμέτρηση. Η καθίζηση πρέπει να αξιολογείται με μεθόδους όπως η οπτική μικροσκοπία, ενώ πρέπει να καταγράφεται το ίζημα που εμμένει ή εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας (το αργότερο στο τέλος της αγωγής). Μάρτυρες 31. Σε κάθε πείραμα πρέπει να περιλαμβάνονται παράλληλοι θετικοί μάρτυρες και μάρτυρες διαλύτη/φορέα, με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. 32. Οι θετικοί μάρτυρες χρειάζονται για να καταδεικνύεται η ικανότητα αναγνώρισης των κλαστογόνων και των ανευπλοειδογόνων ουσιών από τα χρησιμοποιούμενα κύτταρα και από το πρωτόκολλο δοκιμής και για να επιβεβαιώνεται η μεταβολική ικανότητα του παρασκευάσματος S9. Οι θετικοί μάρτυρες πρέπει, αφενός, να είναι ουσίες που είναι γνωστό ότι επάγουν τον σχηματισμό μικροπυρήνων σε συγκεντρώσεις οι οποίες αναμένεται να οδηγήσουν σε μικρές αλλά αναπαραγώγιμες αυξήσεις έναντι της τιμής υποβάθρου και, αφετέρου, να καταδεικνύουν την ευαισθησία του συστήματος δοκιμής. Οι συγκεντρώσεις των θετικών μαρτύρων πρέπει να επιλέγονται κατά τρόπο ώστε τα αποτελέσματα να είναι σαφή, αλλά να μην αποκαλύπτουν αμέσως την ταυτότητα των κωδικοποιημένων αντικειμενοφόρων πλακών στον παρατηρητή. 33. Για να καταδειχθεί τόσο η μεταβολική ικανότητα όσο και η ικανότητα του συστήματος δοκιμής να ανιχνεύει τις κλαστογόνες χημικές ουσίες, πρέπει να χρησιμοποιείται κλαστογόνος ουσία που απαιτεί μεταβολική ενεργοποίηση (π.χ. κυκλοφωσφαμίδιο, βενζο[a]πυρένιο). Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλοι θετικοί μάρτυρες, αυτό όμως πρέπει να αιτιολογείται. Δεδομένου ότι ορισμένοι θετικοί μάρτυρες που χρειάζονται μεταβολική ενεργοποίηση ενδέχεται να είναι ενεργοί, χωρίς εξωγενή μεταβολική ενεργοποίηση, σε ορισμένες συνθήκες αγωγής ή για ορισμένες κυτταρικές σειρές, η ανάγκη μεταβολικής ενεργοποίησης και η δραστικότητα του παρασκευάσματος S9 πρέπει να ελέγχονται με την κυτταρική σειρά και στις συγκεντρώσεις που έχουν επιλεγεί. 34. Μέχρι στιγμής, δεν υπάρχουν ανευπλοειδογόνες ουσίες για τις οποίες να είναι γνωστό ότι απαιτείται μεταβολική ενεργοποίηση προκειμένου να έχουν γονιδιοτοξική δράση (16). Παραδείγματα αποδεκτών, επί του παρόντος, θετικών μαρτύρων ανευπλοειδογόνου δράσης είναι η κολχικίνη και η βινβλαστίνη. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλοι θετικοί μάρτυρες, εφόσον επάγουν τον σχηματισμό μικροπυρήνων αποκλειστικά ή πρωτίστως με ανευπλοειδογόνο δράση. Για να μην χρειάζονται δύο θετικοί μάρτυρες χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση (ένας για την κλαστογένεση και ένας για την ανευπλοειδογένεση), ο μάρτυρας ανευπλοειδογένεσης μπορεί να λειτουργήσει ως θετικός μάρτυρας χωρίς S9, ενώ ο μάρτυρας κλαστογένεσης μπορεί να χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της επάρκειας του συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Στην περίπτωση των κυττάρων που δεν απαιτούν S9 πρέπει να χρησιμοποιούνται θετικοί μάρτυρες, τόσο για την κλαστογένεση όσο και για την ανευπλοειδογένεση. Οι συνιστώμενοι θετικοί μάρτυρες περιλαμβάνονται στο προσάρτημα 3. 35. Μπορεί να εξετάζεται η χρήση θετικών μαρτύρων παρόμοιας χημικής τάξης, εφόσον υπάρχουν κατάλληλες ουσίες. Όλοι οι χρησιμοποιούμενοι θετικοί μάρτυρες πρέπει να είναι οι ενδεδειγμένοι για τον τύπο των κυττάρων και τις συνθήκες ενεργοποίησης. 36. Για κάθε χρόνο συλλογής πρέπει να συμπεριλαμβάνονται μάρτυρες διαλύτη/φορέα. Επιπλέον, πρέπει να χρησιμοποιούνται και αρνητικοί μάρτυρες (χωρίς διαλύτη/φορέα) που δεν υποβάλλονται σε αγωγή, εκτός εάν υπάρχουν δημοσιευμένα δεδομένα ή ιστορικά δεδομένα του εργαστηρίου που καταδεικνύουν ότι ο επιλεγμένος διαλύτης δεν έχει γονιδιοτοξικές ή άλλες επιβλαβείς επιδράσεις στις χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ Πρόγραμμα αγωγής 37. Για τη μεγιστοποίηση της πιθανότητας ανίχνευσης μιας ανευπλοειδογόνου ή κλαστογόνου ουσίας που δρα σε συγκεκριμένο στάδιο του κυτταρικού κύκλου, έχει μεγάλη σημασία η αγωγή επαρκών αριθμών κυττάρων με την ελεγχόμενη ουσία σε όλα τα στάδια του κύκλου τους. Συνεπώς, το πρόγραμμα αγωγής των κυτταρικών σειρών και των καλλιεργειών πρωτογενών κυττάρων μπορεί να διαφέρει ως έναν βαθμό από εκείνο των λεμφοκυττάρων, τα οποία χρειάζονται μιτωγόνο διέγερση για να αρχίσουν τον κύκλο τους. Το θέμα αυτό εξετάζεται στις παραγράφους 41 έως 43 (16). 38. Θεωρητικές εκτιμήσεις, σε συνδυασμό με δημοσιευμένα δεδομένα (18), παρέχουν ενδείξεις σύμφωνα με τις οποίες οι περισσότερες ανευπλοειδογόνες και κλαστογόνες ουσίες ανιχνεύονται με βραχύχρονη αγωγή 3 έως 6 ωρών, με και χωρίς S9, ακολουθούμενη από απομάκρυνση της ελεγχόμενης ουσίας και φάση ανάπτυξης 1,5-2,0 κυτταρικών κύκλων (6). Λαμβάνονται δείγματα κυττάρων σε χρόνο 1,5 έως 2,0 φορές μεγαλύτερο από την κανονική διάρκεια (δηλαδή χωρίς αγωγή) του κυτταρικού κύκλου, είτε μετά την έναρξη της αγωγής είτε στο τέλος της (βλέπε πίνακα 1). Οι χρόνοι δειγματοληψίας ή αποκατάστασης είναι δυνατόν να παραταθούν, εάν είναι γνωστό ή υπάρχουν υπόνοιες ότι η ελεγχόμενη ουσία επηρεάζει τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (π.χ. στις δοκιμές ουσιών ανάλογων με νουκλεοζίτες). 39. Λόγω της δυνητικής τοξικότητας των παρασκευασμάτων S9 για τα καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών, η αγωγή με παρατεταμένη έκθεση επί 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου εφαρμόζεται μόνο χωρίς S9. Στην παρατεταμένη αγωγή παρέχεται η δυνατότητα επιλογής μεταξύ της αγωγής των κυττάρων με την ελεγχόμενη χημική ουσία με ή χωρίς cytoB. Με αυτή τη δυνατότητα επιλογής αντιμετωπίζονται οι περιπτώσεις προβληματισμού σχετικά με τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της ελεγχόμενης ουσίας και της cytoB. 40. Τα συνιστώμενα προγράμματα αγωγής κυττάρων εμφαίνονται στον πίνακα 1. Τα γενικά αυτά προγράμματα αγωγής μπορούν να τροποποιούνται ανάλογα με τη σταθερότητα και τη δραστικότητα της ελεγχόμενης ουσίας ή με τα ιδιαίτερα αυξητικά χαρακτηριστικά των χρησιμοποιούμενων κυττάρων. Κάθε αγωγή πρέπει να αρχίζει και να τελειώνει όταν τα κύτταρα βρίσκονται στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Τα εν λόγω προγράμματα αναλύονται στις επόμενες παραγράφους 41-47. Πίνακας 1 Χρόνοι αγωγής και συλλογής κυττάρων για τη δοκιμασία MNvit Λεμφοκύτταρα, πρωτογενή κύτταρα και κυτταρικές σειρές που υποβάλλονται σε αγωγή με cytoB + S9 Αγωγή επί 3-6 ώρες παρουσία S9, απομάκρυνση του S9 και του θρεπτικού υλικού αγωγής, προσθήκη νέου θρεπτικού υλικού και cytoB, συλλογή μετά παρέλευση χρόνου ίσου με 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου – S9 Σύντομη έκθεση Αγωγή επί 3-6 ώρες, απομάκρυνση του θρεπτικού υλικού αγωγής, προσθήκη νέου θρεπτικού υλικού και cytoB, συλλογή μετά παρέλευση χρόνου ίσου με 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου – S9 Παρατεταμένη έκθεση Επιλογή A: Αγωγή επί 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου παρουσία cytoB, συλλογή στο τέλος της περιόδου έκθεσης Επιλογή Β: Αγωγή επί 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, απομάκρυνση της ελεγχόμενης ουσίας, προσθήκη νέου θρεπτικού υλικού και cytoB, συλλογή μετά παρέλευση χρόνου ίσου με 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Κυτταρικές σειρές που υποβάλλονται σε αγωγή χωρίς cytoB (Τα προγράμματα αγωγής που παρατίθενται ανωτέρω, με τη διαφορά ότι δεν προστίθεται cytoB.) Λεμφοκύτταρα, πρωτογενή κύτταρα και κυτταρικές σειρές με cytoB 41. Η αποτελεσματικότερη προσέγγιση για τα λεμφοκύτταρα συνίσταται στην έναρξη της έκθεσης στην ελεγχόμενη ουσία 44-48 ώρες μετά τη διέγερση με PHA, όταν έχει παύσει ο συγχρονισμός του κύκλου (5). Στην αρχική δοκιμή, τα κύτταρα υποβάλλονται σε αγωγή με την ελεγχόμενη ουσία επί 3-6 ώρες, με και χωρίς S9. Το θρεπτικό υλικό αγωγής απομακρύνεται και αντικαθίσταται από νέο υλικό που περιέχει cytoB και τα κύτταρα συλλέγονται μετά παρέλευση χρόνου ίσου με 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. 42. Εάν τα αποτελέσματα και των δύο αρχικών δοκιμών με σύντομη έκθεση (3-6 ώρες) είναι αρνητικά ή αμφίβολα, ακολουθεί αγωγή παρατεταμένης έκθεσης χωρίς S9. Παρέχονται δύο εναλλακτικές δυνατότητες αγωγής, οι οποίες είναι εξίσου αποδεκτές. Ωστόσο, για τα διεγερμένα λεμφοκύτταρα, η λογαριθμική ανάπτυξη των οποίων ενδέχεται να είναι μειωμένη μετά την πάροδο 96 ωρών από τη διέγερση, μπορεί να ενδείκνυται περισσότερο η επιλογή Α. Επίσης, στην επιλογή Β, οι κυτταροκαλλιέργειες δεν πρέπει να είναι συρρέουσες κατά τον χρόνο της τελικής δειγματοληψίας. — Επιλογή A: Τα κύτταρα υποβάλλονται σε αγωγή με την ελεγχόμενη ουσία επί 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και συλλέγονται στο τέλος της περιόδου αγωγής. — Επιλογή Β: Τα κύτταρα υποβάλλονται σε αγωγή με την ελεγχόμενη ουσία επί 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Το θρεπτικό υλικό αγωγής απομακρύνεται και αντικαθίσταται από νέο υλικό και τα κύτταρα συλλέγονται μετά από επιπλέον χρόνο ίσο με 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. 43. Τα πρωτογενή κύτταρα και οι κυτταρικές σειρές πρέπει να υποβάλλονται σε αγωγή με τρόπο παρόμοιο με των λεμφοκυττάρων, με τη διαφορά ότι δεν είναι απαραίτητη η διέγερσή τους με PHA επί 44-48 ώρες. Τα άλλα κύτταρα πλην των λεμφοκυττάρων πρέπει να εκτίθενται κατά τρόπο ώστε να βρίσκονται ακόμη στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης κατά τον χρόνο τερματισμού της μελέτης. Κυτταρικές σειρές χωρίς cytoB 44. Τα κύτταρα πρέπει να υποβάλλονται σε αγωγή επί 3-6 ώρες, με και χωρίς S9. Το θρεπτικό υλικό αγωγής απομακρύνεται και αντικαθίσταται από νέο υλικό και τα κύτταρα συλλέγονται μετά παρέλευση χρόνου ίσου με 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. 45. Εάν τα αποτελέσματα και των δύο αρχικών δοκιμών με σύντομη έκθεση (3-6 ώρες) είναι αρνητικά ή αμφίβολα, ακολουθεί αγωγή παρατεταμένης έκθεσης (χωρίς S9). Παρέχονται δύο εναλλακτικές δυνατότητες αγωγής, οι οποίες είναι εξίσου αποδεκτές. — Επιλογή A: Τα κύτταρα υποβάλλονται σε αγωγή με την ελεγχόμενη ουσία επί 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και συλλέγονται στο τέλος της περιόδου αγωγής. — Επιλογή Β: Τα κύτταρα υποβάλλονται σε αγωγή με την ελεγχόμενη ουσία επί 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Το θρεπτικό υλικό αγωγής απομακρύνεται και αντικαθίσταται από νέο υλικό και τα κύτταρα συλλέγονται μετά από επιπλέον χρόνο ίσο με 1,5-2,0 φορές την κανονική διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. 46. Στο τέλος της περιόδου αγωγής των 3-6 ωρών είναι πιθανή η παρουσία μιτωτικών κυττάρων (αναγνωρίζονται από το στρογγυλό σχήμα τους και από την απόσπασή τους από την επιφάνεια) στις μονοστιβάδες. Επειδή τα εν λόγω μιτωτικά κύτταρα αποσπώνται εύκολα, είναι πιθανή η απώλειά τους κατά την απομάκρυνση του θρεπτικού υλικού που περιέχει την ελεγχόμενη ουσία. Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για τη συλλογή τους κατά την έκπλυση των καλλιεργειών και την επαναφορά τους σε αυτές, ώστε να αποφεύγεται η απώλεια κυττάρων που υφίστανται μίτωση κατά τον χρόνο της συλλογής και διατρέχουν κίνδυνο σχηματισμού μικροπυρήνων. Αριθμός καλλιεργειών 47. Πρέπει να χρησιμοποιείται διπλή καλλιέργεια για κάθε συγκέντρωση ελεγχόμενης ουσίας, καθώς και για τους μάρτυρες φορέα/διαλύτη και τους αρνητικούς. Εφόσον είναι δυνατόν να αποδειχθεί, με βάση ιστορικά δεδομένα του εργαστηρίου, ότι η μεταβλητότητα μεταξύ των δύο καλλιεργειών είναι ελάχιστη, μπορεί να γίνει δεκτή η χρήση μιας μόνο καλλιέργειας. Σε περίπτωση χρήσης μιας μόνο καλλιέργειας, συνιστάται να αυξάνεται το πλήθος των συγκεντρώσεων της ανάλυσης. Συλλογή των κυττάρων και ετοιμασία των αντικειμενοφόρων πλακών 48. Η συλλογή και η επεξεργασία των κυττάρων πραγματοποιούνται σε κάθε καλλιέργεια χωριστά. Η ετοιμασία των κυτταρικών παρασκευασμάτων μπορεί να περιλαμβάνει κατεργασία με υπότονο διάλυμα. Ωστόσο, το στάδιο αυτό δεν είναι απαραίτητο, εάν επιτυγχάνεται κατάλληλη επίστρωση των κυττάρων με άλλον τρόπο. Μπορούν να χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές ετοιμασίας αντικειμενοφόρων πλακών, με την προϋπόθεση ότι προκύπτουν υψηλής ποιότητας κυτταρικά παρασκευάσματα για καταμέτρηση. Το κυτταρόπλασμα πρέπει να διατηρείται ώστε να είναι δυνατή η ανίχνευση των μικροπυρήνων και (στη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης) η αξιόπιστη αναγνώριση των διπύρηνων κυττάρων. 49. Για τη χρώση των αντικειμενοφόρων πλακών μπορούν να χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι, όπως η χρωστική Giemsa ή ειδικά για το DNA φθοριοχρώματα (59). Με τη χρήση ειδικής για το DNA χρώσης [π.χ. πορτοκαλί της ακριδίνης (61) ή Hoechst 33258 και πυρονίνη-Y (62)] είναι δυνατόν να εξαλειφθούν ορισμένα από τα τεχνητά αποτελέσματα που οφείλονται στη χρήση μη ειδικών για το DNA χρώσεων. Εάν ενδιαφέρει να συγκεντρωθούν στοιχεία σχετικά με τον μηχανισμό του σχηματισμού μικροπυρήνων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντισώματα κινητοχώρου, η μέθοδος FISH με παγκεντρομερικούς ανιχνευτές DNA ή η σήμανση in situ (PRINS) με παγκεντρομερικούς εκκινητές, σε συνδυασμό με κατάλληλη για DNA χρώση αντίθεσης, για την αναγνώριση του περιεχομένου των μικροπυρήνων (ακέραιο χρωμόσωμα/τμήμα χρωμοσώματος) (15) (16). Μπορούν να χρησιμοποιούνται και άλλες μέθοδοι διάκρισης μεταξύ κλαστογόνων και ανευπλοειδογόνων ουσιών, εάν έχει αποδειχθεί η αποτελεσματικότητά τους. Ανάλυση 50. Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που αντιστοιχούν στον φορέα/διαλύτη και στους μάρτυρες, πρέπει να λαμβάνουν ανεξάρτητο κωδικό πριν από τη μικροσκοπική εξέταση. Εναλλακτικά, είναι δυνατή η ανάλυση των κωδικοποιημένων δειγμάτων με αυτόματο σύστημα κυτταρομετρίας ροής ή ανάλυσης εικόνων. 51. Στις κατεργασμένες με cytoB καλλιέργειες, η συχνότητα σχηματισμού μικροπυρήνων πρέπει να εξετάζεται τουλάχιστον σε 2 000 διπύρηνα κύτταρα ανά συγκέντρωση (τουλάχιστον 1 000 διπύρηνα κύτταρα ανά καλλιέργεια, δύο καλλιέργειες ανά συγκέντρωση). Εάν χρησιμοποιείται μόνο μία καλλιέργεια, πρέπει να καταμετρώνται από αυτή τουλάχιστον 2 000 διπύρηνα κύτταρα ανά συγκέντρωση. Εάν σε κάθε συγκέντρωση είναι διαθέσιμα για καταμέτρηση σημαντικά λιγότερα από 1 000 διπύρηνα κύτταρα ανά καλλιέργεια (ή 2 000, σε περίπτωση χρήσης μόνο μιας καλλιέργειας) και δεν διαπιστωθεί σημαντική αύξηση των μικροπυρήνων, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί με περισσότερα κύτταρα ή με λιγότερο τοξικές συγκεντρώσεις, αναλόγως του ποιο από τα δύο ενδείκνυται. Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να μην καταμετρώνται διπύρηνα κύτταρα που έχουν ανώμαλο σχήμα ή των οποίων οι δύο πυρήνες παρουσιάζουν μεγάλη διαφορά μεγέθους. Επίσης, δεν πρέπει να συγχέονται τα διπύρηνα κύτταρα με ελλιπώς επιστρωμένα πολυπύρηνα. Τα κύτταρα που περιέχουν περισσότερους από δύο κύριους πυρήνες δεν πρέπει να εξετάζονται για την παρουσία μικροπυρήνων, δεδομένου ότι η βασική συχνότητα σχηματισμού μικροπυρήνων μπορεί να είναι υψηλότερη σε αυτά (63) (64). Η καταμέτρηση μονοπύρηνων κυττάρων είναι αποδεκτή, εάν έχει αποδειχθεί ότι η ελεγχόμενη ουσία δεν παρεμποδίζει τη δράση της cytoB. 52. Στις κυτταρικές σειρές που υποβάλλονται στη δοκιμασία χωρίς κατεργασία με cytoB, πρέπει να καταμετρώνται οι μικροπυρήνες τουλάχιστον σε 2 000 διπύρηνα κύτταρα ανά συγκέντρωση (τουλάχιστον 1 000 κύτταρα ανά καλλιέργεια, δύο καλλιέργειες ανά συγκέντρωση). Σε περίπτωση χρήσης μόνο μιας καλλιέργειας ανά συγκέντρωση, πρέπει να καταμετρώνται από αυτή τουλάχιστον 2 000 κύτταρα. 53. Όταν χρησιμοποιείται cytoB, πρέπει να προσδιορίζεται ο δείκτης CBPI ή RI, τουλάχιστον από 500 κύτταρα ανά καλλιέργεια, για την εκτίμηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (βλέπε προσάρτημα 2). Στις περιπτώσεις αγωγής χωρίς cytoB, είναι θεμελιώδους σημασίας η παροχή στοιχείων από τα οποία προκύπτει ο πολλαπλασιασμός των καταμετρούμενων κυττάρων, όπως εξηγείται στις παραγράφους 24-27. Κριτήρια αποδοχής 54. Το εργαστήριο που προτείνει τη χρήση της δοκιμασίας MNvit η οποία περιγράφεται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών πρέπει να αποδεικνύει την ικανότητά του να ανιχνεύει, με αξιοπιστία και ορθότητα, χημικές ουσίες γνωστής ανευπλοειδογόνου και κλαστογόνου δράσης, με και χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση, καθώς και γνωστές αρνητικές χημικές ουσίες, χρησιμοποιώντας τις χημικές ουσίες αναφοράς που παρατίθενται στο προσάρτημα 3. Προκειμένου να αποδείξει την οικεία ικανότητα ορθής εφαρμογής της παρούσας μεθόδου δοκιμών, το εργαστήριο πρέπει να παρέχει στοιχεία από τα οποία προκύπτει ότι, εάν η δοκιμή διεξάγεται χωρίς τη χρήση cytoB, τα κύτταρα που καταμετρώνται για σχηματισμό μικροπυρήνων έχουν ολοκληρώσει μία πυρηνική διαίρεση. 55. Συνιστάται η χρήση των χημικών ουσιών του προσαρτήματος 3 ως ουσιών αναφοράς. Μπορούν να συμπεριλαμβάνονται υποκατάστατα αυτών ή συμπληρωματικές χημικές ουσίες, εάν η δραστικότητά τους είναι γνωστή, εάν επάγουν μικροπυρήνες με τους ίδιους μηχανισμούς δράσης και εάν είναι αποδεδειγμένα συναφείς με τις χημικές ουσίες που θα υποβάλλονται σε δοκιμή με τη διαδικασία MNvit Η σχετική αιτιολόγηση μπορεί να περιλαμβάνει μελέτη επικύρωσης στην οποία χρησιμοποιήθηκε ευρύ φάσμα ουσιών ή η οποία επικεντρώθηκε σε στενότερο φάσμα, με βάση τη χημική τάξη της ελεγχόμενης ουσίας ή τον μελετώμενο μηχανισμό πρόκλησης βλάβης. 56. Για τους μάρτυρες φορέα/διαλύτη και τις καλλιέργειες που δεν υποβάλλονται σε αγωγή πρέπει να προκύπτουν αναπαραγώγιμες χαμηλές και σταθερές συχνότητες σχηματισμού μικροπυρήνων (συνήθως 5-25 μικροπυρήνες ανά 1 000 κύτταρα για τους τύπους κυττάρων που προσδιορίζονται στην παράγραφο 11). Άλλοι τύποι κυττάρων ενδέχεται να εμφανίζουν διαφορετικά φάσματα αποκρίσεων, τα οποία πρέπει να προσδιορίζονται κατά την επικύρωση της χρήσης των εν λόγω τύπων στη δοκιμασία MNvit. Τα δεδομένα από τους αρνητικούς και τους θετικούς μάρτυρες, καθώς και από τους μάρτυρες διαλύτη πρέπει να χρησιμοποιούνται για τον καθορισμό ιστορικών πεδίων τιμών για τους μάρτυρες. Η απόφαση σχετικά με τη σκοπιμότητα της χρήσης παράλληλου θετικού/αρνητικού μάρτυρα σε ένα πείραμα πρέπει να βασίζεται στις τιμές αυτές. 57. Εάν προτείνονται μικρές τροποποιήσεις του πρωτοκόλλου της δοκιμασίας (π.χ. χρήση αυτόματων τεχνικών καταμέτρησης αντί των μη αυτόματων, χρήση νέου τύπου κυττάρων), πρέπει να καταδεικνύεται η αποτελεσματικότητα της μεταβολής για να μπορεί να θεωρηθεί αποδεκτή η χρήση του τροποποιημένου πρωτοκόλλου. Η αποτελεσματικότητα καταδεικνύεται, μεταξύ άλλων, με επίδειξη της δυνατότητας να ανιχνεύονται οι κύριοι μηχανισμοί θραύσης και προσθήκης ή απώλειας χρωμοσώματος και να επιτυγχάνονται τα ενδεδειγμένα θετικά και αρνητικά αποτελέσματα για την τάξη της μεμονωμένης ουσίας ή του ευρέος φάσματος ουσιών που θα υποβάλλεται στη δοκιμή. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΕΩΝ Επεξεργασία των αποτελεσμάτων 58. Εάν εφαρμόζεται η τεχνική της αναστολής της κυτταροκίνησης, μόνο οι συχνότητες διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες (ανεξαρτήτως του αριθμού μικροπυρήνων ανά κύτταρο) χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της επαγωγής μικροπυρήνων. Η καταγραφή του αριθμού κυττάρων με έναν, δύο ή περισσότερους μικροπυρήνες μπορεί να παράσχει χρήσιμες πληροφορίες, αλλά δεν είναι υποχρεωτική. 59. Πρέπει να προσδιορίζονται παράλληλα μέτρα κυτταροτοξικότητας και/ή κυτταρόστασης για όλες τις καλλιέργειες που υποβάλλονται σε αγωγή και τις καλλιέργειες-μάρτυρες φορέα/διαλύτη (58). Όταν εφαρμόζεται η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης, πρέπει να υπολογίζεται ο δείκτης CBPI ή RI ως μέτρο της καθυστέρησης του κυτταρικού κύκλου, για όλες τις καλλιέργειες που υποβάλλονται σε αγωγή και τις καλλιέργειες-μάρτυρες. Εάν δεν χρησιμοποιείται cytoB, πρέπει να υπολογίζεται ο δείκτης RPD ή RICC ή PI (βλέπε προσάρτημα 2). 60. Πρέπει να παρέχονται δεδομένα για κάθε καλλιέργεια. Επιπλέον, όλα τα δεδομένα πρέπει να συγκεφαλαιώνονται με τη μορφή πίνακα. 61. Η επαγωγή μικροπυρήνων από χημικές ουσίες στη δοκιμασία MNvit ενδέχεται να οφείλεται σε θραύση ή απώλεια χρωμοσώματος ή στον συνδυασμό τους. Για να προσδιοριστεί αν ο μηχανισμός επαγωγής μικροπυρήνων συνδέεται με κλαστογόνο ή ανευπλοειδογόνο δράση, είναι δυνατόν να διεξαχθεί περαιτέρω ανάλυση με αντισώματα κινητοχώρου, κεντρομερικούς ανιχνευτές in situ ή με άλλες μεθόδους. Αξιολόγηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων 62. Δεν απαιτείται επαλήθευση των σαφών θετικών ή αρνητικών αποκρίσεων με πρόσθετες δοκιμές. Τα αμφίβολα αποτελέσματα μπορούν να αποσαφηνίζονται με την εξέταση 1 000 επιπλέον κυττάρων, λαμβανόμενων από όλες τις καλλιέργειες, ώστε να τηρείται η τυφλότητα. Εάν το πρόβλημα δεν επιλύεται με την προσέγγιση αυτή, πρέπει να διεξάγονται περαιτέρω δοκιμές. Στα επαναληπτικά πειράματα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο τροποποίησης των παραμέτρων της μελέτης ώστε να καλύπτουν ένα διευρυμένο ή στενότερο πεδίο συνθηκών. Στις παραμέτρους που μπορούν να τροποποιούνται περιλαμβάνονται το εύρος των συγκεντρώσεων δοκιμής, οι χρόνοι αγωγής και συλλογής κυττάρων και/ή οι συνθήκες μεταβολικής ενεργοποίησης. 63. Για να θεωρηθεί ένα αποτέλεσμα θετικό υπάρχουν διάφορα κριτήρια, όπως η σχετιζόμενη με τη συγκέντρωση ή στατιστικά σημαντική αύξηση του αριθμού των κυττάρων που περιέχουν μικροπυρήνες. Πρέπει να εξετάζεται πρώτα η βιολογική συνάφεια των αποτελεσμάτων. Αν εξεταστεί το κατά πόσον οι παρατηρούμενες τιμές περικλείονται στο ιστορικό πεδίο τιμών για τους μάρτυρες, είναι δυνατόν να προκύψουν κατευθύνσεις για την αξιολόγηση της βιολογικής σημαντικότητας της απόκρισης. Μπορούν να χρησιμοποιούνται κατάλληλες στατιστικές μέθοδοι ως βοήθημα κατά την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των δοκιμών (65). Ωστόσο τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης πρέπει να αντιπαραβάλλονται με τη σχέση δόσης-απόκρισης. Πρέπει επίσης να λαμβάνονται υπόψη τα δεδομένα αναπαραγωγιμότητας και τα ιστορικά δεδομένα. 64. Αν και από τα περισσότερα πειράματα προκύπτουν σαφώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα, σε ορισμένες περιπτώσεις η σειρά δεδομένων δεν επιτρέπει τη συναγωγή οριστικού συμπεράσματος σχετικά με τη δραστικότητα της ελεγχόμενης ουσίας. Οι αποκρίσεις μπορεί να παραμένουν αμφίβολες ή αμφισβητήσιμες, ανεξάρτητα από το πόσες φορές θα επαναληφθεί το πείραμα. 65. Τα θετικά αποτελέσματα της δοκιμασίας MNvit υποδηλώνουν ότι η ελεγχόμενη ουσία επάγει θραύση ή απώλεια χρωμοσώματος σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών. Τα αρνητικά αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι, στις συνθήκες της δοκιμής, η ελεγχόμενη ουσία δεν επάγει θραύση και/ή προσθήκη ή απώλεια χρωμοσώματος σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών. Έκθεση δοκιμής 66. Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον τα ακόλουθα στοιχεία, εφόσον αυτά έχουν σημασία για τη διεξαγωγή της μελέτης: Ελεγχόμενη χημική ουσία — στοιχεία ταυτότητας και αριθμοί CAS και EC, — φυσική μορφή και καθαρότητα, — φυσικοχημικές ιδιότητες που έχουν σημασία για τη διεξαγωγή της μελέτης, — ικανότητα αντίδρασης της ελεγχόμενης ουσίας με τον διαλύτη/φορέα ή τα θρεπτικά υλικά κυτταροκαλλιέργειας. Διαλύτης/φορέας — αιτιολόγηση της επιλογής του διαλύτη/φορέα, — διαλυτότητα και σταθερότητα της ελεγχόμενης ουσίας στον διαλύτη/φορέα. Κύτταρα — τύπος και προέλευση των χρησιμοποιούμενων κυττάρων, — καταλληλότητα του χρησιμοποιούμενου τύπου κυττάρων, — απουσία μυκοπλάσματος, εφόσον συντρέχει περίπτωση, — στοιχεία σχετικά με τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, τον χρόνο διπλασιασμού ή τον δείκτη πολλαπλασιασμού, — σε περίπτωση χρήσης λεμφοκυττάρων, φύλο, ηλικία και αριθμός των δοτών αίματος, εφόσον συντρέχει περίπτωση, — σε περίπτωση χρήσης λεμφοκυττάρων, προσδιορίζεται αν εκτέθηκαν στην ουσία ολικό αίμα ή διαχωρισμένα λεμφοκύτταρα, — αριθμός ανακαλλιεργειών, εφόσον συντρέχει περίπτωση, — μέθοδοι συντήρησης των κυτταροκαλλιεργειών, εφόσον συντρέχει περίπτωση, — τυπικός αριθμός χρωμοσωμάτων, — κανονική διάρκεια (αρνητικός μάρτυρας) του κυτταρικού κύκλου. Συνθήκες δοκιμής — ταυτότητα του αναστολέα κυτταροκίνησης (π.χ. cytoB), εάν χρησιμοποιείται, συγκέντρωση της ουσίας αυτής και διάρκεια έκθεσης των κυττάρων, — αιτιολόγηση της επιλογής των συγκεντρώσεων και του αριθμού καλλιεργειών, συμπεριλαμβανομένων δεδομένων για την κυτταροτοξικότητα και των περιορισμών από πλευράς διαλυτότητας, εάν υπάρχουν, — σύνθεση των θρεπτικών υλικών και συγκέντρωση CO2, εφόσον συντρέχει περίπτωση, — συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας, — συγκέντρωση (και/ή όγκος) του φορέα και της ελεγχόμενης ουσίας που προστίθεται, — θερμοκρασία και χρόνος επώασης, — διάρκεια της αγωγής, — χρόνος συλλογής μετά την αγωγή, — πυκνότητα των κυττάρων στην ανακαλλιέργεια, εφόσον συντρέχει περίπτωση, — τύπος και σύσταση του συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης, συμπεριλαμβανομένων κριτηρίων αποδοχής, — θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες, — χρησιμοποιούμενες μέθοδοι ετοιμασίας και τεχνική χρώσης αντικειμενοφόρων πλακών, — κριτήρια αναγνώρισης μικροπυρήνων, — αριθμοί εξετασθέντων κυττάρων, — μέθοδοι μέτρησης της κυτταροτοξικότητας, — τυχόν συμπληρωματικές πληροφορίες που αφορούν την κυτταροτοξικότητα, — κριτήρια χαρακτηρισμού των μελετών ως θετικών, αρνητικών ή αμφίβολων, — χρησιμοποιούμενες μέθοδοι στατιστικής ανάλυσης, — μέθοδοι, π.χ. χρήση αντισωμάτων κινητοχώρου, που χρησιμοποιούνται για να διαπιστωθεί αν οι μικροπυρήνες περιέχουν ολόκληρα χρωμοσώματα ή τμήματα χρωμοσωμάτων, εφόσον συντρέχει περίπτωση. Αποτελέσματα — χρησιμοποιούμενο μέτρο κυτταροτοξικότητας, π.χ. δείκτης CBPI ή RI, στην περίπτωση της μεθόδου αναστολής κυτταροκίνησης, δείκτης RICC, RPD ή PI, όταν δεν χρησιμοποιούνται μέθοδοι αναστολής κυτταροκίνησης· άλλες παρατηρήσεις, εφόσον συντρέχει περίπτωση, π.χ. συρρέουσα καλλιέργεια, απόπτωση, νέκρωση, καταμέτρηση μετάφασης, συχνότητα διπύρηνων κυττάρων, — σημεία καθίζησης, — δεδομένα για το pΗ και την οσμωτικότητα του θρεπτικού υλικού αγωγής, εφόσον προσδιορίστηκαν, — ορισμός των αποδεκτών για εξέταση κυττάρων, — κατανομή των μονοπύρηνων, διπύρηνων και πολυπύρηνων κυττάρων, εάν χρησιμοποιείται μέθοδος αναστολής κυτταροκίνησης, — αριθμός κυττάρων με μικροπυρήνες ανά καλλιέργεια που υποβλήθηκε σε αγωγή και ανά καλλιέργεια-μάρτυρα, με τη διευκρίνιση αν πρόκειται για διπύρηνα ή μονοπύρηνα κύτταρα, εφόσον ενδείκνυται, — σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης, όπου είναι δυνατόν, — δεδομένα για τους παράλληλους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) και θετικούς μάρτυρες (συγκεντρώσεις και διαλύτες)· — ιστορικά δεδομένα για τους αρνητικούς (διαλύτης/φορέας) και θετικούς μάρτυρες, με πεδία τιμών, μέσες τιμές, τυπικές αποκλίσεις και διάστημα εμπιστοσύνης (π.χ. 95 %), — στατιστική ανάλυση, τιμές p, εάν υπάρχουν. Συζήτηση των αποτελεσμάτων Συμπεράσματα ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4. (2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15. (3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246. (4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172. (5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104. (6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198. (7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43. (8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20. (9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302. (10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334. (11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213. (12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525. (13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20. (14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245. (15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219. (16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163. (17) OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Διατίθεται στον ιστότοπο: [www.oecd.org/env/testguidelines] (18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36. (19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60. (20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87. (21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124. (22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152. (23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208. (24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59. (25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116. (26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190. (27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71. (28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163. (29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134. (30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580. (31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152. (32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. 25η συνεδρίαση της ESAC, 16-17 Νοεμβρίου 2006, Διατίθεται στον ιστότοπο: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] (33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Διατίθεται στον ιστότοπο: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] (34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283. (35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115. (36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260. (37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328. (38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70. (39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205. (40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305. (41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886. (42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36. (43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18. (44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31-45. (45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215. (46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65. (47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177. (48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. (49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59. (50) UNEP (2001), σύμβαση της Στοκχόλμης για τους έμμονους οργανικούς ρύπους, Πρόγραμμα των Ηνωμένων Εθνών για το Περιβάλλον (UNEP). Διατίθεται στον ιστότοπο: [http://www.pops.int/] (51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274. (52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. (53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801. (54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44. (55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112. (56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”, Mutation Res., 564, 97-100. (57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65. (58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3. (59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184. (60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201. (61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247. (62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275. (63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247. (64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75. (65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467. (66) Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 850/2004 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 29ης Απριλίου 2004, για τους έμμονους οργανικούς ρύπους και την τροποποίηση της οδηγίας 79/117/ΕΟΚ (ΕΕ L 229 της 30.4.2004, σ. 5). Προσάρτημα 1 Ορισμοί Ανευπλοειδογόνος παράγοντας: κάθε ουσία ή διεργασία που προκαλεί ανευπλοειδία σε κύτταρα ή οργανισμούς, μέσω της αντίδρασής της με τα συστατικά του κυτταρικού κύκλου μιτωτικής και μειωτικής διαίρεσης. Ανευπλοειδία: κάθε απόκλιση από τον φυσιολογικό διπλοειδή (ή απλοειδή) χρωμοσωματικό αριθμό που εμφανίζεται σε ένα ή περισσότερα χρωμοσώματα, όχι όμως σε πλήρεις σειρές χρωμοσωμάτων (πολυπλοειδία). Απόπτωση: προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, ο οποίος χαρακτηρίζεται από μια σειρά σταδίων που οδηγούν στη διάσπαση των κυττάρων προς συνδεδεμένα με την κυτταρική μεμβράνη σωματίδια τα οποία, στη συνέχεια, απομακρύνονται με φαγοκυττάρωση ή αποβολή. Κυτταρικός πολλαπλασιασμός: αύξηση του αριθμού των κυττάρων η οποία είναι αποτέλεσμα της μιτωτικής τους διαίρεσης. Κεντρομερίδιο (ή κεντρομερές): περιοχή DNA του χρωμοσώματος στην οποία συγκρατούνται μεταξύ τους οι δύο χρωματίδες και είναι προσδεδεμένοι εκτέρωθεν οι δύο κινητοχώροι. Κλαστογόνος παράγοντας: κάθε ουσία ή διεργασία που προκαλεί δομικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες σε πληθυσμούς κυττάρων ή οργανισμούς. Κυτταροκίνηση: η διαδικασία κυτταρικής διαίρεσης αμέσως μετά τη μίτωση για τον σχηματισμό δύο θυγατρικών κυττάρων, το καθένα από τα οποία περιέχει έναν μόνο πυρήνα. Δείκτης πολλαπλασιασμού με αναστολή κυτταροκίνησης (CBPI): το ποσοστό κυττάρων από δεύτερη διαίρεση στον υποβαλλόμενο σε αγωγή πληθυσμό σε σχέση με τον μάρτυρα που δεν υποβάλλεται σε αγωγή (βλέπε μαθηματικό τύπο στο προσάρτημα 2). Κυτταρόσταση: αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων (βλέπε μαθηματικό τύπο στο προσάρτημα 2) Κυτταροτοξικότητα: επιβλαβείς επιδράσεις στη δομή ή τη λειτουργία του κυττάρου, με τελικό αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο. Γονιδιοτοξική δράση: γενικός όρος που καλύπτει όλα τα είδη βλαβών του DNA ή του χρωμοσώματος, στις οποίες συγκαταλέγονται η θραύση, η προσθήκη, η αναδιάταξη, η μετάλλαξη, οι χρωμοσωματικές ανωμαλίες και η ανευπλοειδία. Δεν προκαλούν όλες οι γονιδιοτοξικές επιδράσεις μεταλλάξεις ή σταθερές βλάβες του χρωμοσώματος. Μεσοφασικά κύτταρα: κύτταρα που δεν βρίσκονται στο μιτωτικό στάδιο. Κινητοχώρος: πρωτεϊνική δομή που συναρμολογείται στο κεντρομερίδιο του χρωμοσώματος και με την οποία ενώνονται οι μικροσωληνίσκοι της ατράκτου κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, κατευθύνοντας την τακτική κίνηση των θυγατρικών χρωμοσωμάτων προς τους πόλους των θυγατρικών κυττάρων. Μικροπυρήνες: μικροί πυρήνες, διακριτοί από τους κύριους πυρήνες των κυττάρων και επιπρόσθετοι, οι οποίοι παράγονται κατά τη διάρκεια της τελόφασης της μίτωσης (μείωση) από καθυστερούντα τμήματα χρωμοσώματος ή ολόκληρα χρωμοσώματα. Μίτωση: διαίρεση του κυτταρικού πυρήνα, η οποία συνήθως χωρίζεται σε πρόφαση, προμετάφαση, μετάφαση, ανάφαση και τελόφαση. Μιτωτικός δείκτης: ο λόγος των κυττάρων που βρίσκονται σε μετάφαση διά του συνολικού αριθμού των κυττάρων που παρατηρούνται σε έναν κυτταρικό πληθυσμό· αποτελεί ένδειξη του βαθμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού του συγκεκριμένου πληθυσμού. Μεταλλαξιογόνος παράγοντας: παράγοντας που προκαλεί κληρονομήσιμη μεταβολή είτε μιας ή περισσότερων ακολουθιών ζευγών βάσεων του DNA στα γονίδια είτε της δομής των χρωμοσωμάτων (χρωμοσωματικές ανωμαλίες). Μη αποχωρισμός: αδυναμία των ζευγών χρωματίδων να αποχωριστούν και να διαχωριστούν σωστά στα αναπτυσσόμενα θυγατρικά κύτταρα, με αποτέλεσμα τα θυγατρικά κύτταρα να μην έχουν κανονικό αριθμό χρωμοσωμάτων. Πολυπλοειδία: αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες κυττάρων ή οργανισμών, οι οποίες αφορούν πλήρεις σειρές χρωμοσωμάτων, σε αντίθεση με εκείνες που αφορούν ένα ή περισσότερα μεμονωμένα χρωμοσώματα (ανευπλοειδία). Δείκτης πολλαπλασιασμού (PI): μέθοδος μέτρησης της κυτταροτοξικότητας, όταν δεν χρησιμοποιείται κυτταροχαλασίνη Β (βλέπε μαθηματικό τύπο στο προσάρτημα 2). Σχετική αύξηση του καταμετρούμενου αριθμού κυττάρων (RICC): μέθοδος μέτρησης της κυτταροτοξικότητας, όταν δεν χρησιμοποιείται κυτταροχαλασίνη Β (βλέπε μαθηματικό τύπο στο προσάρτημα 2). Σχετικός διπλασιασμός του πληθυσμού (RPD): μέθοδος μέτρησης της κυτταροτοξικότητας, όταν δεν χρησιμοποιείται κυτταροχαλασίνη Β (βλέπε μαθηματικό τύπο στο προσάρτημα 2). Δείκτης αναδιπλασιασμού (RI): το ποσοστό κυτταρικών κύκλων διαίρεσης που ολοκληρώνονται σε υποβαλλόμενη σε αγωγή καλλιέργεια, σε σχέση με τον μάρτυρα που δεν υποβάλλεται σε αγωγή, κατά τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης και της αποκατάστασης (βλέπε μαθηματικό τύπο στο προσάρτημα 2). Ελεγχόμενη χημική ουσία (καλούμενη επίσης “ελεγχόμενη ουσία”): κάθε ουσία ή μείγμα που υποβάλλεται σε δοκιμή με την παρούσα μέθοδο δοκιμών. Προσάρτημα 2 Μαθηματικοί τύποι για την εκτίμηση της κυταροτοξικότητας 1. Όταν χρησιμοποιείται cytoB, η κυτταροτοξικότητα πρέπει να εκτιμάται με βάση τον δείκτη πολλαπλασιασμού με αναστολή κυτταροκίνησης (CBPI) ή τον δείκτη αναδιπλασιασμού (RI) (16) (58). Ο CBPI δείχνει τον μέσο αριθμό κυτταρικών κύκλων ανά κύτταρο κατά τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης στην cytoB και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ο RI δείχνει τον σχετικό αριθμό πυρήνων στις υποβαλλόμενες σε αγωγή καλλιέργειες σε σχέση με τις καλλιέργειες-μάρτυρες και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό του επί τοις εκατό ποσοστού κυτταρόστασης. Κυτταρόσταση % = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} και T = καλλιέργεια που υποβάλλεται σε αγωγή με την ελεγχόμενη ουσία C = καλλιέργεια-μάρτυρας με φορέα όπου: Συνεπώς, μια τιμή CBPI ίση με 1 (όλα τα κύτταρα είναι μονοπύρηνα) ισοδυναμεί με κυτταρόσταση 100 %. Κυτταρόσταση = 100 – RI T = υποβαλλόμενες σε αγωγή καλλιέργειες C = καλλιέργειες-μάρτυρες 2. Συνεπώς, μια τιμή RI ίση με 53 % σημαίνει ότι στην υποβληθείσα σε αγωγή καλλιέργεια διαιρέθηκε μόνο το 53 % του αριθμού των κυττάρων που διαιρέθηκαν στην καλλιέργεια-μάρτυρα προς σχηματισμό διπύρηνων και πολυπύρηνων κυττάρων, δηλαδή κυτταρόσταση 47 %. 3. Όταν δεν χρησιμοποιείται cytoB, συνιστάται η εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας με βάση τη σχετική αύξηση του καταμετρούμενου αριθμού κυττάρων (RICC) ή τον σχετικό διπλασιασμό του πληθυσμού (RPD) (58), δεδομένου ότι και στις δύο αυτές παραμέτρους λαμβάνεται υπόψη το διαιρεθέν ποσοστό του κυτταρικού πληθυσμού. όπου: Διπλασιασμός πληθυσμού = [log (αριθ. κυττάρων μετά την αγωγή ÷ αρχικός αριθ. κυττάρων)] ÷ log 2 4. Συνεπώς μια τιμή RICC ή RPD ίση με 53 % δείχνει κυτταροτοξικότητα/κυτταρόσταση 47 %. 5. Η κυτταροτοξικότητα είναι δυνατόν να εκτιμηθεί μέσω της καταμέτρησης των κλώνων που αποτελούνται από 1 (cl1), 2 (cl2), 3 έως 4 (cl4) και 5 έως 8 (cl8) κύτταρα, με τη βοήθεια δείκτη πολλαπλασιασμού (PI). 6. Ο PI έχει χρησιμοποιηθεί ως χρήσιμη και αξιόπιστη παράμετρος κυτταροτοξικότητας και στην περίπτωση των κυτταρικών σειρών που καλλιεργούνται in situ χωρίς cytoB (25) (26) (27) (28). Προσάρτημα 3 Συνιστώμενες χημικές ουσίες αναφοράς για την αξιολόγηση των επιδόσεων (16) Κατηγορία Χημική ουσία Αριθ. CAS Αριθ. EC 1. Κλαστογόνες ουσίες που δρουν χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση Αραβινοζίτης κυτοσίνης 147-94-4 205-705-9 Μιτομυκίνη C 50-07-7 200-008-6 2. Κλαστογόνες ουσίες που απαιτούν μεταβολική ενεργοποίηση Βενζο[a]πυρένιο 50-32-8 200-028-5 Κυκλοφωσφαμίδιο 50-18-0 200-015-4 3. Ανευπλοειδογόνες ουσίες Κολχικίνη 64-86-8 200-598-5 Βινβλαστίνη 143-67-9 205-606-0 4. Ουσίες αρνητικού αποτελέσματος Φθαλικό δι(2-αιθυλεξύλιο) 117-81-7 204-211-0 Ναλιδιξικό οξύ 389-08-2 206-864-7 Πυρένιο 129-00-0 204-927-3 Χλωριούχο νάτριο 7647-14-5 231-598-3 Β.50. ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΕΡΜΑΤΟΣ: ΤΟΠΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΛΕΜΦΑΔΕΝΩΝ: DA ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Οι κατευθυντήριες γραμμές του ΟΟΣΑ για τη διεξαγωγή δοκιμών με χημικές ουσίες και οι μέθοδοι δοκιμών της ΕΕ επανεξετάζονται κατά περιόδους με βάση την επιστημονική πρόοδο, τις μεταβαλλόμενες ανάγκες κανονιστικής ρύθμισης και τον προβληματισμό όσον αφορά την καλή μεταχείριση των ζώων. Η πρώτη μέθοδος δοκιμών (B.42) για τον προσδιορισμό της ευαισθητοποίησης του δέρματος σε ποντικούς, δηλαδή η τοπική δοκιμασία λεμφαδένων (LLNA – κατευθυντήρια γραμμή OECD Test Guideline 429) αναθεωρήθηκε (1). Έχουν δημοσιευθεί λεπτομερείς περιγραφές της επικύρωσης της LLNA, καθώς και επισκόπηση των σχετικών εργασιών (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Στην LLNA χρησιμοποιείται ραδιενεργός θυμιδίνη ή ραδιενεργό ιώδιο για τη μέτρηση του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων, με αποτέλεσμα να περιορίζεται η χρήση της δοκιμασίας όταν υπάρχουν προβλήματα προμήθειας, χρήσης ή τελικής διάθεσης ραδιοϊσοτόπων. Η μέθοδος δοκιμών LLNA: DA (αναπτύχθηκε από την εταιρεία Daicel Chemical Industries, Ltd.) αποτελεί τροποποίηση της LLNA που δεν απαιτεί ραδιενέργεια και στην οποία προσδιορίζεται, μέσω της βιοφωταύγειας, η περιεκτικότητα σε τριφωσφορική αδενοσίνη (αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ, ATP) ως δείκτης πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων. Η LLNA: DA επικυρώθηκε, επανεξετάστηκε και συνιστάται από διεθνή επιτροπή αξιολόγησης από ομότιμους κριτές, καθώς θεωρείται χρήσιμη για την αναγνώριση των ευαισθητοποιητικών και μη ευαισθητοποιητικών για το δέρμα χημικών ουσιών, με ορισμένους περιορισμούς (10) (11) (12) (13). Η παρούσα μέθοδος δοκιμών σχεδιάστηκε για την εκτίμηση του δερματικού ευαισθητοποιητικού δυναμικού των χημικών προϊόντων (ουσιών και μειγμάτων) στα ζώα. Το κεφάλαιο Β.6 του παρόντος παραρτήματος και η κατευθυντήρια γραμμή OECD Test Guideline 406 συνίστανται σε δοκιμές σε ινδικά χοιρίδια, συγκεκριμένα στη δοκιμή μεγιστοποίησης σε ινδικά χοιρίδια και τη δοκιμή Buehler (14). Τόσο η LLNA (κεφάλαιο Β.42 του παρόντος παραρτήματος, OECD Test Guideline 429), όσο και οι δύο τροποποιήσεις της που δεν απαιτούν ραδιενέργεια – LLNA: DA (κεφάλαιο Β.50 του παρόντος παραρτήματος, OECD Test Guideline 442 A) και LLNA: BrdU-ELISA (κεφάλαιο Β.51 του παρόντος παραρτήματος, OECD Test Guideline 442 B) – προσφέρουν πλεονέκτημα έναντι των δοκιμών σε ινδικά χοιρίδια που περιγράφονται στο κεφάλαιο Β.6 και στην κατευθυντήρια γραμμή OECD Test Guideline 406 (14), όσον αφορά τον περιορισμό και τη βελτίωση της χρήσης ζώων. 2. Η LLNA: DA, όπως και η LLNA, μελετά την επαγωγική φάση της δερματικής ευαισθητοποίησης και παρέχει κατάλληλα ποσοτικά δεδομένα για την εκτίμηση της σχέσης δόσης-απόκρισης. Επιπλέον, η ικανότητα ανίχνευσης των ευαισθητοποιητικών για το δέρμα ουσιών χωρίς να χρειάζεται ραδιοσήμανση για το DNA αποκλείει το ενδεχόμενο επαγγελματικής έκθεσης σε ραδιενέργεια και αίρει τα προβλήματα διάθεσης των αποβλήτων. Αυτό παρέχει τη δυνατότητα αύξησης της χρήσης ποντικών για την ανίχνευση των ευαισθητοποιητικών για το δέρμα ουσιών, χάρη στην οποία θα μπορούσε να περιοριστεί περαιτέρω η χρήση ινδικών χοιριδίων σε δοκιμές για τη διαπίστωση του δυναμικού δερματικής ευαισθητοποίησης (κεφάλαιο B.6, OECD Test Guideline 406) (14). ΟΡΙΣΜΟΙ 3. Οι χρησιμοποιούμενοι ορισμοί παρατίθενται στο προσάρτημα 1. ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ 4. Η δοκιμασία LLNA: DA αποτελεί τροποποιημένη μέθοδο LLNA για την αναγνώριση χημικών ουσιών που πιθανώς προκαλούν δερματική ευαισθητοποίηση, με συγκεκριμένους περιορισμούς. Αυτό δεν σημαίνει κατ’ ανάγκη ότι η LLNA: DA πρέπει να χρησιμοποιείται σε κάθε περίπτωση αντί της LLNA ή των δοκιμών σε ινδικά χοιρίδια (κεφάλαιο Β.6, OECD Test Guideline 406) (14), αλλά μάλλον ότι είναι εφάμιλλη των τελευταίων και μπορεί να χρησιμοποιείται ως εναλλακτική λύση, η οποία κατά κανόνα δεν απαιτεί περαιτέρω επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων, θετικών και αρνητικών (10) (11). Πριν από τη διεξαγωγή της μελέτης, το εργαστήριο δοκιμών πρέπει να λαμβάνει υπόψη όλα τα διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με την ελεγχόμενη ουσία, μεταξύ των οποίων την ταυτότητα και τη χημική δομή της, τις φυσικές και χημικές ιδιότητές της, τα αποτελέσματα τυχόν άλλων δοκιμών τοξικότητας της ουσίας, in vitro ή in vivo, και τα τοξικολογικά δεδομένα του αφορούν χημικά προϊόντα ανάλογης δομής. Τα στοιχεία αυτά θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη προκειμένου να κριθεί αν η LLNA: DA είναι κατάλληλη για την ελεγχόμενη ουσία (με δεδομένη την ασυμβατότητα περιορισμένου αριθμού ειδών χημικών προϊόντων με την LLNA: DA —βλέπε παράγραφο 5) και ως βοήθημα κατά την επιλογή δόσεων. 5. Η LLNA: DA είναι μέθοδος in vivo και, επομένως, δεν καταργεί τη χρήση ζώων στην εκτίμηση της δραστικότητας αλλεργικής ευαισθητοποίησης εξ επαφής. Είναι ωστόσο ικανή να περιορίσει τη χρήση ζώων για τον σκοπό αυτό, σε σύγκριση με τις δοκιμές σε ινδικά χοιρίδια (κεφάλαιο Β.6, OECD Test Guideline 406) (14). Επιπλέον, η LLNA: DA βελτιώνει ουσιαστικά (ελάττωση του πόνου και της δυσφορίας) τον τρόπο με τον οποίο χρησιμοποιούνται τα ζώα στις δοκιμές αλλεργικής ευαισθητοποίησης εξ επαφής, δεδομένου ότι, σε αντίθεση με τη μέθοδο δοκιμών Β.6 και την κατευθυντήρια γραμμή OECD Test Guideline 406, δεν απαιτεί την εκδήλωση των επαγόμενων από το ερέθισμα αντιδράσεων δερματικής υπερευαισθησίας. Παρά τα πλεονεκτήματα της LLNA: BrdU-DA έναντι των μεθόδων B.6 και OECD Test Guideline 406 (14), υπάρχουν ορισμένοι περιοριστικοί παράγοντες που ενδέχεται να επιβάλλουν τη χρήση των B.6 και OECD Test Guideline 406 (π.χ. δοκιμές με ορισμένα μέταλλα, ψευδοθετικά ευρήματα με ορισμένες ερεθιστικές για το δέρμα ουσίες [όπως ορισμένα επιφανειοδραστικά χημικά προϊόντα] (6) (1 και κεφάλαιο B.42 του παρόντος παραρτήματος), η διαλυτότητα της ελεγχόμενης ουσίας). Επιπροσθέτως, η χρήση των δοκιμών σε ινδικά χοιρίδια [μέθοδοι B.6, OECD Test Guideline 406 (14)] ενδέχεται να καταστεί αναγκαία στην περίπτωση χημικών ουσιών ή τάξεων χημικών ουσιών που περιέχουν δραστικές ομάδες οι οποίες έχει αποδειχθεί ότι μπορούν να αποτελέσουν συγχυτικούς παράγοντες (16).Οι περιορισμοί που έχουν προσδιοριστεί για την LLNA (1 και κεφάλαιο B.42 του παρόντος παραρτήματος) συνιστάται να ισχύουν και για την LLNA: BrdU-DA (10). Επιπλέον, η χρήση της LLNA: DA πιθανώς να μην ενδείκνυται για τις δοκιμές με ουσίες που επηρεάζουν τα επίπεδα ATP (π.χ. ουσίες που δρουν ως αναστολείς της ATP) ή την ακριβή μέτρηση της ενδοκυττάριας ATP (π.χ. παρουσία ενζύμων που διασπούν την ATP, παρουσία εξωκυττάριας ATP στον λεμφαδένα). Εκτός αυτών των εντοπισθέντων περιορισμών, θεωρείται ότι η LLNA: DA μπορεί να εφαρμοστεί στις δοκιμές οποιασδήποτε ουσίας, εκτός εάν αυτή έχει ιδιότητες που ενδέχεται να επηρεάσουν την ορθότητα της μεθόδου. Επιπροσθέτως, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η πιθανότητα οριακών θετικών αποτελεσμάτων όταν οι τιμές του δείκτη διέγερσης (SI) κυμαίνονται από 1,8 έως 2,5 (βλέπε παραγράφους 31-32). Αυτό στηρίζεται στη βάση δεδομένων επικύρωσης για 44 ουσίες με τη χρήση SI ≥ 1,8 (βλέπε παράγραφο 6), από τις οποίες αναγνωρίστηκαν σωστά με την LLNA: DA και οι 32 ευαισθητοποιητικές βάσει της LLNA, αλλά δεν αναγνωρίστηκαν σωστά 3 από τις 12 μη ευαισθητοποιητικές βάσει της LLNA ουσίες με τιμές SI μεταξύ 1,8 και 2,5 (δηλαδή οριακό θετικό αποτέλεσμα) (10). Επειδή, ωστόσο, χρησιμοποιήθηκε η ίδια σειρά δεδομένων για τον καθορισμό των τιμών του SI και για τον υπολογισμό των προγνωστικών ιδιοτήτων της δοκιμής, τα αναφερόμενα αποτελέσματα μπορεί να συνιστούν υπερεκτίμηση των πραγματικών προγνωστικών ιδιοτήτων. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΩΝ 6. Η βασική αρχή στην οποία στηρίζεται η LLNA: DA είναι ότι οι ευαισθητοποιητικές ουσίες επάγουν πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων των λεμφαδένων που αποχετεύουν το σημείο εφαρμογής της ελεγχόμενης ουσίας. Ο πολλαπλασιασμός αυτός είναι ανάλογος με τη δόση και με την ισχύ του εφαρμοζόμενου αλλεργιογόνου και αποτελεί ένα απλό μέσο αντικειμενικής, ποσοτικής μέτρησης της ευαισθητοποίησης. Μετράται με σύγκριση του αριθμητικού μέσου του πολλαπλασιασμού σε κάθε ομάδα δοκιμής προς τον αριθμητικό μέσο του πολλαπλασιασμού στην ομάδα-μάρτυρα που έχει υποβληθεί σε αγωγή με τον φορέα (VC). Προσδιορίζεται ο λόγος του αριθμητικού μέσου του πολλαπλασιασμού σε κάθε ομάδα που υποβάλλεται σε αγωγή προς την αντίστοιχη τιμή για την παράλληλη ομάδα VC, ο οποίος καλείται δείκτης διέγερσης (SI) και πρέπει να είναι ≥ 1,8 ώστε να δικαιολογείται η περαιτέρω αξιολόγηση μιας ελεγχόμενης ουσίας ως δυνητικά ευαισθητοποιητικής για το δέρμα. Οι διαδικασίες που περιγράφονται στο παρόν κεφάλαιο βασίζονται στη μέτρηση της περιεκτικότητας σε ATP μέσω της βιοφωταύγειας (που είναι γνωστό ότι συσχετίζεται με τον αριθμό ζωντανών κυττάρων) (17) ως ένδειξης αυξημένου αριθμού πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων στους αποχετευτικούς ωτικούς λεμφαδένες (18) (19). Στη μέθοδο βιοφωταύγειας χρησιμοποιείται το ένζυμο λουσιφεράση για να καταλύσει την εκπομπή φωτός κατά την ακόλουθη αντίδραση ATP με λουσιφερίνη: ATP + Luciferin + O 2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + Light Η ένταση του εκπεμπόμενου φωτός συνδέεται με γραμμική σχέση με τη συγκέντρωση ATP και μετράται με ειδικό φωτόμετρο φωταυγειομετρίας (λουμινόμετρο). Η δοκιμασία λουσιφερίνης-λουσιφεράσης αποτελεί ευαίσθητη μέθοδο ποσοτικού προσδιορισμού της ATP με ευρύ φάσμα εφαρμογών (20). ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Επιλογή ζωικού είδους 7. Το είδος που έχει επιλεγεί για τη συγκεκριμένη δοκιμή είναι ο ποντικός. Οι μελέτες επικύρωσης της LLNA: DA διεξήχθησαν αποκλειστικά σε ποντικούς της φυλής CBA/J, η οποία κατά συνέπεια θεωρείται προτιμώμενη (12) (13). Χρησιμοποιούνται νεαροί ενήλικες θηλυκοί ποντικοί που δεν έχουν ποτέ γεννήσει ούτε εγκυμονούν. Κατά την έναρξη της μελέτης, η ηλικία των ζώων πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 8 και 12 εβδομάδων και οι διαφορές βάρους μεταξύ τους πρέπει να είναι ελάχιστες και να μην υπερβαίνουν το 20 % της μέσης τιμής. Εναλλακτικά, είναι δυνατή η χρήση άλλων φυλών, καθώς και αρσενικών ζώων, εφόσον έχουν συγκεντρωθεί επαρκή δεδομένα από τα οποία προκύπτει ότι δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές απόκρισης κατά την LLNA: DA, οφειλόμενες ειδικά στη φυλή και/ή το φύλο. Συνθήκες στέγασης και διατροφής 8. Οι ποντικοί πρέπει να στεγάζονται σε ομάδες (21), εκτός εάν η ατομική στέγασή τους δικαιολογείται με επαρκή επιστημονική αιτιολόγηση. Η θερμοκρασία του θαλάμου πειραματόζωων πρέπει να είναι 22 ± 3 °C. Αν και η σχετική υγρασία πρέπει να είναι τουλάχιστον 30 % και, κατά προτίμηση, να μην υπερβαίνει το 70 %, εκτός από τις περιόδους καθαρισμού του θαλάμου, εντούτοις ο στόχος θα πρέπει να είναι μια τιμή 50-60 %. Ο φωτισμός πρέπει να είναι τεχνητός, με φωτοπερίοδο 12ώρου. Για τη διατροφή επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται συνήθη εργαστηριακά σιτηρέσια με απεριόριστη παροχή πόσιμου νερού. Προετοιμασία των ζώων 9. Τα ζώα επιλέγονται τυχαία, σημαίνονται με τρόπο που επιτρέπει την αναγνώριση του καθενός (αλλά όχι με αναγνωριστικό ενώτιο οποιασδήποτε μορφής) και παραμένουν στους κλωβούς τους τουλάχιστον για πέντε ημέρες πριν από την έναρξη της χορήγησης των δόσεων, ώστε να εγκλιματιστούν στις εργαστηριακές συνθήκες. Πριν από την έναρξη της αγωγής, εξετάζονται όλα τα ζώα για να είναι βέβαιο ότι δεν παρουσιάζουν εμφανείς βλάβες του δέρματος. Παρασκευή των διαλυμάτων δοσολογίας 10. Πριν από την εφαρμογή στο αυτί ποντικού, τα στερεά χημικά προϊόντα πρέπει να διαλύονται, ή να σχηματίζεται εναιώρημά τους, σε κατάλληλους διαλύτες/φορείς και να αραιώνονται, εφόσον ενδείκνυται. Τα υγρά χημικά προϊόντα μπορούν να εφαρμόζονται ως έχουν ή να αραιώνονται πριν από τη χορήγηση. Τα αδιάλυτα χημικά προϊόντα, όπως αυτά που συναντώνται συνήθως στα ιατροτεχνολογικά είδη, πρέπει να υποβάλλονται σε εξαντλητική εκχύλιση με κατάλληλο διαλύτη, ώστε να παραλαμβάνονται όλα τα εκχυλίσιμα συστατικά για δοκιμή, πριν από την εφαρμογή στο αυτί ποντικού. Τα παρασκευάσματα της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να ανανεώνονται καθημερινά, εκτός εάν η φύλαξή τους είναι αποδεκτή βάσει των σχετικών με τη σταθερότητα στοιχείων. Έλεγχος αξιοπιστίας 11. Χρησιμοποιούνται χημικά προϊόντα ως θετικοί μάρτυρες για να καταδειχθεί η ορθή εκτέλεση της δοκιμασίας με την απόκριση, με επαρκή και αναπαραγώγιμη ευαισθησία, σε ευαισθητοποιητική ελεγχόμενη ουσία για την οποία έχει χαρακτηριστεί επακριβώς το μέγεθος της απόκρισης. Συνιστάται η συμπερίληψη παράλληλου θετικού μάρτυρα επειδή καταδεικνύει την ικανότητα του εργαστηρίου να εκτελεί με επιτυχία κάθε δοκιμασία και καθιστά δυνατή την εκτίμηση της ενδοεργαστηριακής και διεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας και συγκρισιμότητας. Επίσης, καθώς ορισμένες ρυθμιστικές Αρχές απαιτούν τη χρήση θετικού μάρτυρα σε κάθε μελέτη, συνιστάται στους χρήστες να ζητούν τη γνώμη των αρμόδιων αρχών πριν από τη διεξαγωγή της LLNA: DA. Συνιστάται, επομένως, η χρήση παράλληλου θετικού μάρτυρα ως συνήθης πρακτική, ώστε να μην χρειάζονται πρόσθετες δοκιμές σε ζώα για την κάλυψη των αναγκών που μπορεί να δημιουργήσει η περιοδική χρήση θετικών μαρτύρων (βλέπε παράγραφο 12). Ένας θετικός μάρτυρας θα πρέπει να δίδει θετική απόκριση κατά την LLNA: DA σε επίπεδα έκθεσης τα οποία αναμένεται να προκαλέσουν αύξηση του SI σε τιμή ≥ 1,8 σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού μάρτυρα. Η δόση για τον θετικό μάρτυρα πρέπει να επιλέγεται κατά τρόπο ώστε να μην προκαλεί υπέρμετρο ερεθισμό του δέρματος ή συστημική τοξικότητα και η επαγωγή να είναι αναπαραγώγιμη αλλά όχι υπερβολική (δηλαδή οι τιμές SI > 10 θεωρούνται υπέρμετρες). Οι προτιμώμενοι θετικοί μάρτυρες είναι το διάλυμα εξυλοκινναμωμικής αλδεΰδης (αριθ. Chemical Abstracts Service [CAS] 101-86-0) 25 % και το διάλυμα ευγενόλης (αριθ. CAS 97-53-0) 25 % σε μείγμα ακετόνης-ελαιολάδου (4:1, v/v). Σε ορισμένες, δεόντως αιτιολογημένες, περιπτώσεις μπορούν να χρησιμοποιούνται άλλοι θετικοί μάρτυρες που πληρούν τα προαναφερόμενα κριτήρια. 12. Παρά τη σύσταση για συμπερίληψη παράλληλης ομάδας θετικού μάρτυρα, σε ορισμένες περιπτώσεις ενδέχεται να αρκεί η περιοδική δοκιμή του θετικού μάρτυρα (δηλαδή ανά διαστήματα που δεν υπερβαίνουν το εξάμηνο) για εργαστήρια που εκτελούν τακτικά LLNA: DA (δηλαδή με συχνότητα τουλάχιστον μηνιαία) και διαθέτουν εδραιωμένη ιστορική βάση δεδομένων για τον θετικό μάρτυρα, η οποία καταδεικνύει την ικανότητα του εργαστηρίου να επιτυγχάνει αναπαραγώγιμα και ορθά αποτελέσματα με τους θετικούς μάρτυρες. Η επαρκής τεχνική ικανότητα ως προς την LLNA: DA μπορεί να αποδειχθεί με την επίτευξη σταθερών θετικών αποτελεσμάτων με τον θετικό μάρτυρα σε 10 τουλάχιστον ανεξάρτητες δοκιμές που έχουν διεξαχθεί εντός εύλογου χρονικού διαστήματος, δηλαδή μικρότερου από ένα έτος. 13. Πρέπει να συμπεριλαμβάνεται πάντοτε παράλληλη ομάδα θετικού μάρτυρα όταν επέρχονται διαδικαστικές αλλαγές στην LLNA: DA (π.χ. αλλαγή ειδικευμένου προσωπικού, αλλαγή υλικών και/ή αντιδραστηρίων της μεθόδου δοκιμών ή του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται σε αυτή, αλλαγή της προέλευσης των πειραματόζωων), οι οποίες πρέπει να τεκμηριώνονται στις εκθέσεις του εργαστηρίου. Πρέπει να εξετάζονται οι επιπτώσεις των αλλαγών αυτών στην επάρκεια της ήδη συγκροτημένης ιστορικής βάσης δεδομένων, προκειμένου να κριθεί αν είναι απαραίτητη η δημιουργία νέας ιστορικής βάσης δεδομένων για την τεκμηρίωση της σταθερότητας των αποτελεσμάτων που προκύπτουν με τους θετικούς μάρτυρες. 14. Οι ερευνητές θα πρέπει να γνωρίζουν ότι η απόφαση για διεξαγωγή περιοδικής και όχι ταυτόχρονης μελέτης με θετικό μάρτυρα επηρεάζει έμμεσα την επάρκεια και τη δυνατότητα αποδοχής των αρνητικών αποτελεσμάτων που προκύπτουν χωρίς παράλληλο θετικό μάρτυρα κατά το μεσοδιάστημα μεταξύ των περιοδικών μελετών με θετικό μάρτυρα. Για παράδειγμα, σε περίπτωση ψευδαρνητικού αποτελέσματος της περιοδικής μελέτης με θετικό μάρτυρα, μπορεί να αμφισβητηθούν τα αρνητικά αποτελέσματα που προέκυψαν για την ελεγχόμενη ουσία κατά το μεσοδιάστημα μεταξύ της τελευταίας αποδεκτής περιοδικής μελέτης με θετικό μάρτυρα και της μη αποδεκτής. Οι συνέπειες αυτές πρέπει να λαμβάνονται επιμελώς υπόψη όταν κρίνεται αν θα συμπεριλαμβάνονται παράλληλοι θετικοί μάρτυρες ή θα διεξάγονται απλώς περιοδικές μελέτες με θετικούς μάρτυρες. Πρέπει επίσης να εξετάζεται το ενδεχόμενο χρήσης μικρότερου αριθμού ζώων στην παράλληλη ομάδα θετικού μάρτυρα, εφόσον δικαιολογείται από επιστημονική άποψη και το εργαστήριο καταδεικνύει τη δυνατότητα χρήσης μικρότερου αριθμού ποντικών με βάση ειδικά για το ίδιο ιστορικά δεδομένα (22). 15. Παρόλο που ο θετικός μάρτυρας πρέπει να ελέγχεται στον φορέα που είναι γνωστό ότι αποσπά σταθερή απόκριση (π.χ. μείγμα ακετόνης-ελαιολάδου σε αναλογία 4:1, v/v), ενδέχεται να υπάρχουν περιπτώσεις όπου οι νομοθετικές ρυθμίσεις επιβάλλουν τη διεξαγωγή δοκιμών και σε μη τυποποιημένο φορέα (κλινικώς/χημικώς συναφές σκεύασμα) (23). Σε περίπτωση δοκιμής του παράλληλου θετικού μάρτυρα και της ελεγχόμενης ουσίας σε διαφορετικούς φορείς, θα πρέπει να συμπεριλαμβάνεται χωριστός μάρτυρας VC για τον παράλληλο θετικό μάρτυρα. 16. Όταν αξιολογούνται ουσίες που ανήκουν σε συγκεκριμένη τάξη χημικών ουσιών ή προκαλούν συγκεκριμένο φάσμα αποκρίσεων, είναι ενδεχομένως χρήσιμες και οι ουσίες συγκριτικής αξιολόγησης για να καταδειχθεί η ορθή λειτουργία της μεθόδου δοκιμών ως προς την ανίχνευση του δερματικού ευαισθητοποιητικού δυναμικού των συγκεκριμένων ειδών ουσιών. Οι κατάλληλες ουσίες συγκριτικής αξιολόγησης πρέπει να διαθέτουν τις ακόλουθες ιδιότητες: — δομική και λειτουργική αναλογία προς την τάξη της ελεγχόμενης ουσίας, — γνωστά φυσικά και χημικά χαρακτηριστικά, — δεδομένα τεκμηρίωσης που προέρχονται από την LLNA: DA, — δεδομένα τεκμηρίωσης που αφορούν άλλα ζωικά μοντέλα και/ή τον άνθρωπο. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ Αριθμός ζώων και επίπεδα δόσεων 17. Χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τέσσερα ζώα ανά δοσολογική ομάδα, με τρεις τουλάχιστον συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας, συν μια παράλληλη ομάδα αρνητικού μάρτυρα, που υποβάλλεται σε αγωγή μόνο με τον φορέα της ελεγχόμενης ουσίας, και έναν θετικό μάρτυρα (παράλληλο ή πρόσφατο, ανάλογα με την πολιτική που εφαρμόζει το εργαστήριο λαμβάνοντας υπόψη τις παραγράφους 11-15). Θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο δοκιμής με πολλαπλές δόσεις της ουσίας που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας, κυρίως στις περιπτώσεις διαλειπουσών δοκιμών με θετικό μάρτυρα. Η μεταχείριση και η αγωγή των ζώων των ομάδων-μαρτύρων, εκτός του ότι αυτά δεν υποβάλλονται σε αγωγή με την ελεγχόμενη ουσία, πρέπει κατά τα άλλα να είναι πανομοιότυπες με των ζώων των ομάδων αγωγής. 18. Η επιλογή των δόσεων και του φορέα πρέπει να βασίζεται στις συστάσεις των βιβλιογραφικών πηγών (2) και (24). Επιλέγονται κατά κανόνα διαδοχικές δόσεις από κατάλληλη σειρά συγκεντρώσεων, όπως 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % κ.λπ. Η επιλογή της χρησιμοποιούμενης σειράς συγκεντρώσεων πρέπει να συνοδεύεται από επαρκή επιστημονική αιτιολόγηση. Κατά την επιλογή των τριών διαδοχικών συγκεντρώσεων, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όλα τα υπάρχοντα τοξικολογικά στοιχεία (π.χ. οξεία τοξικότητα και δερματικός ερεθισμός) και στοιχεία για τη δομή και τις φυσικοχημικές ιδιότητες της ελεγχόμενης ουσίας (και/ή ουσιών ανάλογης δομής) που ενδιαφέρουν, έτσι ώστε η υψηλότερη συγκέντρωση να μεγιστοποιεί την έκθεση, χωρίς να προκαλεί συστημική τοξικότητα και/ή υπέρμετρο τοπικό ερεθισμό του δέρματος (24) (25). Εάν δεν υπάρχουν τέτοια στοιχεία, μπορεί να χρειάζεται δοκιμή προδιαλογής (βλέπε παραγράφους 21-24). 19. Ο φορέας πρέπει να μην προκαλεί συστηματικά και άλλα σφάλματα στα αποτελέσματα των δοκιμών και να επιλέγεται με γνώμονα τη μεγιστοποίηση της διαλυτότητας, ώστε να προκύπτει η μέγιστη εφικτή συγκέντρωση και, ταυτόχρονα, να σχηματίζεται κατάλληλο διάλυμα/εναιώρημα για την εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας. Συνιστώνται οι ακόλουθοι φορείς: μείγμα ακετόνης-ελαιολάδου (4:1, v/v), N,N-διμεθυλοφορμαμίδιο, μεθυλαιθυλκετόνη, προπυλενογλυκόλη και διμεθυλοσουλφοξείδιο (6), χωρίς να αποκλείεται η χρήση άλλων, εφόσον παρέχεται επαρκής επιστημονική αιτιολόγηση. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ενδέχεται να απαιτείται η χρήση, ως πρόσθετου μάρτυρα, ενός κλινικώς συναφούς διαλύτη ή του σκευάσματος του εμπορίου με τη μορφή του οποίου διατίθεται στην αγορά η ελεγχόμενη ουσία. Θα πρέπει να λαμβάνεται ιδιαίτερη μέριμνα για την ενσωμάτωση των υδρόφιλων ουσιών σε ένα σύστημα φορέα το οποίο διαβρέχει το δέρμα και δεν απορρέει αμέσως, με την προσθήκη κατάλληλων διαλυτοποιητών (π.χ. 1 % Pluronic® L92). Κατά συνέπεια, θα πρέπει να αποφεύγονται οι εξ ολοκλήρου υδατικοί φορείς. 20. Η επεξεργασία λεμφαδένων μεμονωμένων ποντικών επιτρέπει την εκτίμηση της μεταβλητότητας μεταξύ των ζώων και τη στατιστική ανάλυση της διαφοράς μεταξύ των μετρήσεων της ελεγχόμενης ουσίας και των μετρήσεων της ομάδας VC (βλέπε παράγραφο 33) Επιπλέον, η αξιολόγηση της δυνατότητας μείωσης του αριθμού ποντικών της ομάδας θετικού μάρτυρα είναι εφικτή μόνο εφόσον συλλέγονται δεδομένα για μεμονωμένα ζώα (22). Επίσης, ορισμένες ρυθμιστικές Αρχές απαιτούν τη συλλογή δεδομένων για μεμονωμένα ζώα. Η τακτική συλλογή δεδομένων για μεμονωμένα ζώα προσφέρει ένα πλεονέκτημα από πλευράς καλής μεταχείρισης των ζώων, καθώς αποτρέπει την επανάληψη δοκιμών που θα ήταν αναγκαία σε περίπτωση μεταγενέστερης εξέτασης των αποτελεσμάτων τα οποία έχουν προκύψει για την ελεγχόμενη ουσία με έναν τρόπο (π.χ. από συγχωνευμένα δεδομένα για τα ζώα) από ρυθμιστικές αρχές που έχουν άλλες απαιτήσεις (π.χ. δεδομένα για μεμονωμένα ζώα). Δοκιμή προδιαλογής 21. Όταν δεν υπάρχουν στοιχεία για τον προσδιορισμό της μέγιστης δόσης προς δοκιμή (βλέπε παράγραφο 18), θα πρέπει να εκτελείται δοκιμή προδιαλογής, προκειμένου να καθοριστεί το κατάλληλο επίπεδο δόσης για τη δοκιμή με LLNA: DA. Η δοκιμή προδιαλογής αποσκοπεί στην καθοδήγηση κατά την επιλογή του ανώτατου επιπέδου δόσης το οποίο θα χρησιμοποιηθεί για την κυρίως μελέτη LLNA: BrdU-DA, στις περιπτώσεις που δεν υπάρχουν στοιχεία σχετικά με τη συγκέντρωση η οποία επάγει συστημική τοξικότητα (βλέπε παράγραφο 24) και/ή υπέρμετρο τοπικό ερεθισμό του δέρματος (βλέπε παράγραφο 23). Το ανώτατο επίπεδο δόσης που χρησιμοποιείται στη δοκιμή πρέπει να είναι το 100 % της ελεγχόμενης ουσίας, εάν αυτή είναι υγρή, ή η μέγιστη δυνατή συγκέντρωση, προκειμένου για στερεά ή εναιωρήματα. 22. Η δοκιμή προδιαλογής διεξάγεται στις ίδιες συνθήκες όπως η κυρίως μελέτη LLNA: DA, εκτός από την εκτίμηση του πολλαπλασιασμού στους λεμφαδένες, η οποία παραλείπεται, και τη δυνατότητα μείωσης του αριθμού των ζώων που χρησιμοποιούνται σε κάθε δοσολογική ομάδα. Προτείνεται η χρήση ενός ή δύο ζώων ανά δοσολογική ομάδα. Όλοι οι ποντικοί εξετάζονται καθημερινά για την ανίχνευση κλινικών σημείων συστημικής τοξικότητας ή τοπικού ερεθισμού στο σημείο εφαρμογής της ελεγχόμενης ουσίας. Καταγράφεται το βάρος σώματος πριν από την έναρξη και πριν από τον τερματισμό της δοκιμής (8η ημέρα). Εξετάζονται και τα δύο αυτιά κάθε ποντικού για την ανίχνευση ερυθήματος, το οποίο βαθμολογείται με τη βοήθεια του πίνακα 1 (25). Μετράται το πάχος των αυτιών με παχύμετρο (π.χ. ψηφιακό μικρόμετρο ή παχύμετρο Peacock Dial) την 1η ημέρα (πριν από τη χορήγηση της δόσης), την 3η ημέρα (περίπου 48 ώρες μετά την πρώτη δόση), την 7η ημέρα (24 ώρες πριν από τον τερματισμό) και την 8η ημέρα. Επιπλέον, το πάχος των αυτιών είναι δυνατόν να προσδιοριστεί την 8η ημέρα με προσδιορισμούς βάρους δείγματος αυτιού λαμβανόμενου με λαβίδα βιοψίας, οι οποίοι πρέπει να εκτελούνται μετά τη θανάτωση των ζώων με ευθανασία. Μια βαθμολογία ερυθήματος ≥ 3 και/ή η αύξηση του πάχους των αυτιών κατά ≥ 25 %, σε οποιαδήποτε ημέρα μέτρησης, αποτελούν ενδείξεις υπέρμετρου τοπικού ερεθισμού (26) (27). Ως μέγιστη δόση για την κυρίως μελέτη LLNA: DA επιλέγεται η αμέσως χαμηλότερη δόση στη σειρά συγκεντρώσεων της προδιαλογής (βλέπε παράγραφο 18) η οποία δεν επάγει συστημική τοξικότητα και/ή υπέρμετρο τοπικό ερεθισμό του δέρματος. Πίνακας 1 Βαθμολογία ερυθήματος Παρατήρηση Βαθμολογία Απουσία ερυθήματος 0 Πολύ ελαφρό ερύθημα (μόλις αντιληπτό) 1 Περιγεγραμμένο ερύθημα 2 Μέτριο έως σοβαρό ερύθημα 3 Σοβαρό ερύθημα (ερυθρότητα τεύτλων) έως σχηματισμός εσχάρας που εμποδίζει τη διαβάθμιση του ερυθήματος 4 23. Εκτός από την αύξηση του πάχους των αυτιών κατά 25 % (26) (27), έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για την αναγνώριση των ερεθιστικών ουσιών κατά την LLNA η στατιστικά σημαντική αύξηση του πάχους των αυτιών των ποντικών που υποβάλλονται σε αγωγή σε σύγκριση με τους ποντικούς-μάρτυρες (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Ωστόσο, η αύξηση του πάχους των αυτιών κατά λιγότερο από 25 %, έστω και αν είναι στατιστικά σημαντική, δεν έχει συσχετιστεί ειδικά με υπέρμετρο ερεθισμό (30) (31) (32) (33) (34). 24. Οι ακόλουθες κλινικές παρατηρήσεις, εντασσόμενες σε ολοκληρωμένη εκτίμηση, είναι δυνατόν να αποτελούν ένδειξη συστημικής τοξικότητας (35) και, κατ’ επέκταση, να υποδεικνύουν το ανώτατο επίπεδο δόσης προς χρήση στην κυρίως μελέτη LLNA: DA: αλλαγές στη λειτουργία του νευρικού συστήματος (π.χ. ανόρθωση τριχών, αταξία, τρόμοι, σπασμοί), στη συμπεριφορά (π.χ. επιθετικότητα, αλλαγή όσον αφορά την περιποίηση του σώματος, έντονη μεταβολή της κινητικότητας), στον αναπνευστικό ρυθμό (δηλαδή μεταβολές της συχνότητας και της έντασης των αναπνοών, όπως δύσπνοια, ασθμαίνουσα αναπνοή και ρόγχος), καθώς και στην κατανάλωση τροφής και νερού. Επιπλέον, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη στην αξιολόγηση τα σημεία λήθαργου και/ή απουσίας αντίδρασης σε ερεθίσματα και κάθε κλινικό σημείο που υπερβαίνει τον ελαφρό ή στιγμιαίο πόνο και δυσφορία, η μείωση του βάρους σώματος κατά > 5 % μεταξύ 1ης και 8ης ημέρας και η θνησιμότητα. Τα ετοιμοθάνατα ζώα, καθώς και όσα παρουσιάζουν σημεία έντονου πόνου και δυσφορίας, πρέπει να θανατώνονται με ευθανασία (36). Πρόγραμμα πειραμάτων της κυρίως μελέτης 25. Το πρόγραμμα πειραμάτων της δοκιμασίας έχει ως εξής: — 1η ημέρα: Κάθε ζώο ζυγίζεται χωριστά και καταγράφονται το βάρος του και οι ενδεχόμενες κλινικές παρατηρήσεις. Η ραχιαία επιφάνεια κάθε αυτιού επιχρίεται με υδατικό διάλυμα λαυρυλοθειικού νατρίου (SLS) 1 % με τη βοήθεια ψήκτρας εμβαπτιζόμενης στο διάλυμα αυτό, έτσι ώστε να καλύπτεται ολόκληρη η ραχιαία επιφάνεια κάθε αυτιού με 4-5 κινήσεις. Μία ώρα μετά την αγωγή με SLS, τοποθετούνται στη ραχιαία επιφάνεια κάθε αυτιού 25 μL κατάλληλης αραίωσης της ελεγχόμενης ουσίας, του φορέα μόνου ή του θετικού μάρτυρα (παράλληλου ή πρόσφατου, ανάλογα με την πολιτική που εφαρμόζει το εργαστήριο λαμβάνοντας υπόψη τις παραγράφους 11-15). — 2η, 3η και 7η ημέρα: Επαναλαμβάνεται η διαδικασία προκατεργασίας με υδατικό διάλυμα SLS 1 % και εφαρμογής της ελεγχόμενης ουσίας όπως την 1η ημέρα. — 4η, 5η και 6η ημέρα: Καμία αγωγή. — 8η ημέρα: Καταγράφονται το βάρος κάθε ζώου και οι ενδεχόμενες κλινικές παρατηρήσεις. Περίπου 24 έως 30 ώρες μετά την έναρξη της εφαρμογής κατά την 7η ημέρα, τα ζώα θανατώνονται με ευθανασία. Εκτέμνονται οι αποχετευτικοί ωτικοί λεμφαδένες από κάθε αυτί ποντικού και υποβάλλονται χωριστά σε επεξεργασία με φυσιολογικό ορό στον οποίο έχει προστεθεί ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS) ανά ζώο. Λεπτομέρειες και διαγράμματα για την αναγνώριση και την εκτομή των λεμφαδένων παρέχονται στη βιβλιογραφική πηγή (22). Για την περαιτέρω παρακολούθηση της τοπικής απόκρισης του δέρματος κατά την κυρίως μελέτη, το πρωτόκολλό της μπορεί να περιλαμβάνει πρόσθετες παραμέτρους, όπως βαθμολογία του ωτικού ερυθήματος ή μετρήσεις του πάχους των αυτιών (με τη βοήθεια παχυμέτρου ή με προσδιορισμούς βάρους δείγματος αυτιού λαμβανόμενου με λαβίδα βιοψίας κατά τη νεκροψία). Παρασκευή κυτταρικών εναιωρημάτων 26. Παρασκευάζεται εναιώρημα μεμονωμένων λεμφοκυττάρων από τους λεμφαδένες που έχουν ληφθεί με αμφοτερόπλευρη εκτομή από κάθε ποντικό, με την τοποθέτηση των λεμφαδένων μεταξύ δύο γυάλινων πλακιδίων και την άσκηση ελαφράς πίεσης ώστε να συνθλιβούν οι αδένες. Αφού επιβεβαιωθεί ο σχηματισμός λεπτού ομοιόμορφου στρώματος του ιστού, διαχωρίζονται τα δύο πλακίδια. Σχηματίζεται εναιώρημα του ιστού και των δύο πλακιδίων σε PBS ως εξής: κάθε πλακίδιο κρατείται υπό κλίση πάνω από το τρυβλίο Petri και εκπλύνεται με PBS, ενώ ταυτόχρονα αφαιρείται ο ιστός από το πλακίδιο με ξέστρο κυττάρων. Εξάλλου, επειδή οι λεμφαδένες των ζώων της ομάδας αρνητικού μάρτυρα είναι μικροί, είναι σημαντικό να εκτελείται η εργασία αυτή με προσοχή ώστε να αποφεύγονται οι τεχνητές επιδράσεις στις τιμές του SI. Για την έκπλυση των δύο πλακιδίων πρέπει να χρησιμοποιείται συνολικός όγκος 1 mL PBS. Το εναιώρημα λεμφοκυττάρων στο τρυβλίο Petri πρέπει να ομοιογενοποιείται ελαφρά με το ξέστρο κυττάρων. Στη συνέχεια, λαμβάνεται με μικροσιφώνιο ποσότητα 20 μL του εναιωρήματος λεμφοκυττάρων —με προσοχή ώστε να μην αναρροφηθεί η ορατή μεμβράνη— και αναμειγνύεται με 1,98 mL PBS για να προκύψει δείγμα όγκου 2 mL. Παρασκευάζεται έπειτα ένα δεύτερο δείγμα 2 mL με την ίδια διαδικασία, ώστε να αντιστοιχούν δύο δείγματα σε κάθε ζώο. Προσδιορισμός του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (μέτρηση της περιεκτικότητας των λεμφοκυττάρων σε ATP) 27. Η αύξηση της περιεκτικότητας των λεμφοκυττάρων σε ATP μετράται με τη μέθοδο της λουσιφερίνης/λουσιφεράσης με τη βοήθεια συνόλου αντιδραστηρίων (kit) για τη μέτρηση ATP, το οποίο προσδιορίζει τη βιοφωταύγεια σε σχετικές μονάδες φωταύγειας (RLU). Η διάρκεια της δοκιμασίας, από τον χρόνο θανάτωσης των ζώων μέχρι τη μέτρηση της περιεκτικότητας σε ATP για το καθένα, πρέπει να διατηρείται σταθερή και να μην υπερβαίνει τα 30 λεπτά περίπου, καθώς θεωρείται ότι η περιεκτικότητα σε ATP μειώνεται σταδιακά με την πάροδο του χρόνου μετά τη θανάτωση των ζώων (12). Συνεπώς, η σειρά διαδικασιών που αρχίζει με την εκτομή των ωτικών λεμφαδένων και τελειώνει με τη μέτρηση της ATP πρέπει να ολοκληρώνεται εντός 20 λεπτών σύμφωνα με το προκαθορισμένο χρονοδιάγραμμα, που είναι το ίδιο για όλα τα ζώα. Μετράται η φωταύγεια ATP καθενός από τα δείγματα των 2 mL ώστε να λαμβάνονται συνολικά δύο μετρούμενες τιμές ATP για κάθε ζώο. Στη συνέχεια προσδιορίζεται η μέση τιμή φωταύγειας λόγω ATP, η οποία χρησιμοποιείται στους μετέπειτα υπολογισμούς (βλέπε παράγραφο 30). ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Κλινικές παρατηρήσεις 28. Κάθε ποντικός πρέπει να εξετάζεται με προσοχή, τουλάχιστον μία φορά ημερησίως, για την ανίχνευση κλινικών σημείων είτε τοπικού ερεθισμού στο σημείο εφαρμογής της ελεγχόμενης ουσίας είτε συστημικής τοξικότητας. Όλες οι παρατηρήσεις καταγράφονται συστηματικά σε χωριστό αρχείο για κάθε ποντικό. Τα σχέδια παρακολούθησης πρέπει να περιλαμβάνουν κριτήρια για τον ταχύ εντοπισμό, με σκοπό την ευθανασία, των ποντικών που εμφανίζουν συστημική τοξικότητα ή υπέρμετρο τοπικό ερεθισμό ή διάβρωση του δέρματος (36). Βάρος σώματος 29. Όπως αναφέρεται στην παράγραφο 25, το βάρος κάθε ζώου πρέπει να μετράται κατά την έναρξη της δοκιμής και κατά τον προγραμματισμένο χρόνο ευθανασίας. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 30. Τα αποτελέσματα για κάθε ομάδα αγωγής εκφράζονται σε μέση τιμή SI. Ο SI προκύπτει με διαίρεση της μέσης τιμής RLU/ποντικό κάθε ομάδα