ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΔΟΣΕΩΝ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΙΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ

1.1. Απαιτήσεις για τις μεθόδους διαλογής

1.1.1. Κατηγορίες κατάλληλων μεθόδων διαλογής

Ως κατάλληλες μέθοδοι διαλογής χρησιμοποιούνται ποιοτικές, ημιποσοτικές ή ποσοτικές μέθοδοι.

1.1.2. Απαιτήσεις για τις βιολογικές, βιοχημικές ή φυσικοχημικές μεθόδους διαλογής

Για τις απαγορευμένες ή τις μη εγκεκριμένες ουσίες, η τιμή CCβ είναι η χαμηλότερη ευλόγως εφικτή και σε κάθε περίπτωση χαμηλότερη από το σημείο αναφοράς για τη λήψη μέτρων (RPA) για τις ουσίες για τις οποίες έχουν θεσπιστεί RPA βάσει του κανονισμού (ΕΕ) 2019/1871.

Για τις εγκεκριμένες φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες, η τιμή CCβ είναι χαμηλότερη από το ΑΟΚ ή το ΑΕ.

Μόνον οι τεχνικές ανάλυσης για τις οποίες μπορεί να αποδειχθεί με τεκμηριωμένο και επαληθεύσιμο τρόπο ότι είναι επικυρωμένες και δίνουν ψευδώς συμμορφούμενο αποτέλεσμα σε ποσοστό μικρότερο ή ίσο του 5 % (σφάλμα τύπου β) μπορούν να χρησιμοποιούνται για σκοπούς διαλογής. Στην περίπτωση που υπάρχουν υποψίες για μη συμμορφούμενο αποτέλεσμα, το εν λόγω αποτέλεσμα πρέπει να επιβεβαιώνεται με μέθοδο επιβεβαίωσης.

Οι ποσοτικές μέθοδοι διαλογής που χρησιμοποιούνται τόσο για τη διαλογή όσο και για την επιβεβαίωση πρέπει να πληρούν τις ίδιες απαιτήσεις ορθότητας, εύρους και ακρίβειας που περιγράφονται στα σημεία 1.2.2.1 και 1.2.2.2.

1.2. Απαιτήσεις για τις μεθόδους επιβεβαίωσης

1.2.1. Γενικές απαιτήσεις για τις μεθόδους επιβεβαίωσης

Για τις απαγορευμένες ή τις μη επιτρεπόμενες ουσίες, η τιμή CCα είναι η χαμηλότερη ευλόγως εφικτή. Για τις απαγορευμένες ή τις μη εγκεκριμένες ουσίες για τις οποίες έχουν θεσπιστεί RPA βάσει του κανονισμού (ΕΕ) 2019/1871, η τιμή CCα είναι μικρότερη ή ίση με το σημείο αναφοράς για τη λήψη μέτρων.

Για τις εγκεκριμένες ουσίες, η τιμή CCα είναι υψηλότερη αλλά όσο το δυνατόν πλησιέστερη προς το ΑΟΚ ή το ΑΕ.

Για σκοπούς επιβεβαίωσης, χρησιμοποιούνται μόνο αναλυτικές μέθοδοι για τις οποίες μπορεί να αποδειχθεί με τεκμηριωμένο και επαληθεύσιμο τρόπο ότι είναι επικυρωμένες και δίνουν ψευδώς μη συμμορφούμενο αποτέλεσμα (σφάλμα τύπου α) σε ποσοστό μικρότερο ή ίσο του 1 % για τις απαγορευμένες ή τις μη εγκεκριμένες ουσίες, ή μικρότερο ή ίσο του 5 % για τις εγκεκριμένες ουσίες.

Οι μέθοδοι επιβεβαίωσης πρέπει να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη δομική χημική σύνθεση της αναλυτέας ουσίας. Συνεπώς, οι μέθοδοι επιβεβαίωσης που βασίζονται μόνο στη χρωματογραφική ανάλυση χωρίς να χρησιμοποιούν ανίχνευση με φασματομετρία μάζας δεν είναι κατάλληλες για να χρησιμοποιούνται μόνες τους ως επιβεβαιωτικές μέθοδοι για απαγορευμένες ή μη εγκεκριμένες φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες. Στην περίπτωση που η φασματομετρία μάζας δεν είναι κατάλληλη για εγκεκριμένες ουσίες, μπορούν να χρησιμοποιούνται άλλες μέθοδοι, όπως η HPLC-DAD και η HPLC-FLD, ή συνδυασμός αυτών.

Όταν απαιτείται σύμφωνα με τη μέθοδο επιβεβαίωσης, στην αρχή της διαδικασίας εκχύλισης προστίθεται κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο στο δοκιμαζόμενο κλάσμα. Ανάλογα με τη διαθεσιμότητα, χρησιμοποιούνται είτε σταθερές ραδιοσημασμένες μορφές της αναλυτέας ουσίας, που είναι ιδιαιτέρως κατάλληλες για ανίχνευση με φασματομετρία μάζας, είτε ανάλογες ενώσεις που έχουν παρόμοια δομή με την αναλυτέα ουσία. Όταν δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο, η ταυτοποίηση της αναλυτέας ουσίας επιβεβαιώνεται κατά προτίμηση με συγχρωματογραφία (1). Στην περίπτωση αυτή λαμβάνεται μία μόνο κορυφή, με ύψος (ή το εμβαδόν) αυξημένο κατά ποσότητα ισοδύναμη με την προστιθέμενη αναλυτέα ουσία. Εάν αυτό δεν είναι εφικτό, χρησιμοποιούνται πρότυπα αντίστοιχης ή εμβολιασμένης μήτρας.

1.2.2. Γενικά κριτήρια επιδόσεων για τις μεθόδους επιβεβαίωσης

1.2.2.1. Αληθότητα με ανάκτηση

Για επαναλαμβανόμενες αναλύσεις πιστοποιημένου υλικού αναφοράς, η απόκλιση του πειραματικώς προσδιοριζόμενου μέσου κλάσματος μάζας με διόρθωση ανάκτησης από την πιστοποιημένη τιμή συμμορφώνεται με τα ελάχιστα εύρη αληθότητας που παρατίθενται στον πίνακα 1.

Πίνακας 1

Ελάχιστη αληθότητα των ποσοτικών μεθόδων

Κλάσμα μάζας Εύρος ≤ 1 μg/kg -50 % έως +20 % > 1 μg/kg έως 10 μg/kg -30 % έως +20 % ≥ 10 μg/kg -20 % έως +20 %

Όταν δεν υπάρχουν διαθέσιμα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς, γίνεται δεκτό να αξιολογείται η αληθότητα των μετρήσεων με άλλους τρόπους, όπως η χρήση υλικών με εκχωρημένες τιμές από διεργαστηριακές μελέτες ή μέσω προσθήκης γνωστών ποσοτήτων της ή των αναλυτέων ουσιών σε τυφλό μήτρας.

1.2.2.2. Ακρίβεια

Ο συντελεστής μεταβλητότητας (CV) για την επαναλαμβανόμενη ανάλυση ενός υλικού αναφοράς ή εμβολιασμένου υλικού, υπό συνθήκες ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας, δεν πρέπει να υπερβαίνει το επίπεδο που υπολογίζεται με την εξίσωση Horwitz. Η εξίσωση αυτή είναι η εξής:

CV = 2(1 – 0,5 log C)

όπου C το κλάσμα μάζας εκφραζόμενο ως δύναμη του 10 (π.χ. 1 mg/g = 10-3). Για κλάσματα μάζας κάτω των 120 μg/kg, η εφαρμογή της εξίσωσης Horwitz δίνει απαράδεκτα υψηλές τιμές. Ως εκ τούτου, ο επιτρεπόμενος μέγιστος συντελεστής μεταβλητότητας δεν πρέπει να υπερβαίνει τις τιμές που παρουσιάζονται στον πίνακα 2.

Πίνακας 2

Αποδεκτός συντελεστής μεταβλητότητας

Κλάσμα μάζας CV αναπαραγωγιμότητας (%) > 1 000 μg/kg 16 (προσαρμογή από την εξίσωση Horwitz) > 120 μg/kg – 1 000 μg/kg 22 (προσαρμογή από την εξίσωση Horwitz) 10 – 120 μg/kg 25 (*) < 10 μg/kg 30 (*)

Για τις αναλύσεις που διεξάγονται υπό συνθήκες επαναληψιμότητας, ο συντελεστής μεταβλητότητας υπό συνθήκες επαναληψιμότητας είναι ίσος ή μικρότερος από τα δύο τρίτα των τιμών που παρατίθενται στον πίνακα 2.

1.2.3. Απαιτήσεις για τον χρωματογραφικό διαχωρισμό

Για υγροχρωματογραφία (LC) ή αεριοχρωματογραφία (GC), ο ελάχιστος αποδεκτός χρόνος κατακράτησης για την εξεταζόμενη αναλυτέα ουσία είναι διπλάσιος του χρόνου κατακράτησης που αντιστοιχεί στον κενό όγκο της στήλης. Ο χρόνος κατακράτησης της αναλυτέας ουσίας στο εκχύλισμα αντιστοιχεί σ’ εκείνον του προτύπου βαθμονόμησης, προτύπου αντίστοιχης μήτρας ή προτύπου εμβολιασμένης μήτρας με ανοχή ± 0,1 λεπτό. Για την ταχεία χρωματογραφία, όταν ο χρόνος κατακράτησης είναι μικρότερος από 2 λεπτά, γίνεται δεκτή απόκλιση μικρότερη από το 5 % του χρόνου κατακράτησης. Σε περίπτωση που χρησιμοποιείται εσωτερικό πρότυπο, ο λόγος του χρωματογραφικού χρόνου κατακράτησης της αναλυτέας ουσίας προς τον αντίστοιχο του εσωτερικού προτύπου, δηλαδή ο σχετικός χρόνος κατακράτησης της αναλυτέας ουσίας, αντιστοιχεί σε αυτόν του προτύπου βαθμονόμησης, του προτύπου αντίστοιχης μήτρας ή του προτύπου εμβολιασμένης μήτρας, με μέγιστη απόκλιση 0,5 % για αεριοχρωματογραφία και 1 % για υγροχρωματογραφία για τις μεθόδους που επικυρώνονται μετά την ημερομηνία έναρξης ισχύος του παρόντος κανονισμού.

1.2.4. Ειδικά κριτήρια επιδόσεων για τη φασματομετρία μάζας

1.2.4.1. Ανίχνευση με φασματομετρία μάζας

Η ανίχνευση με φασματομετρία μάζας πραγματοποιείται με χρήση ορισμένων από τις ακόλουθες επιλογές:

1. καταγραφή φασμάτων μάζας πλήρους σάρωσης (FS)·

2. παρακολούθηση επιλεγμένων ιόντων (SIM)·

3. τεχνικές διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (MSn) όπως η παρακολούθηση επιλεγμένων αντιδράσεων (SRM)·

4. συνδυασμός τεχνικών φασματομετρίας μάζας (MS) ή διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (MSn) με κατάλληλους τρόπους ιοντισμού.

Τόσο η φασματομετρία μάζας χαμηλής διακριτικής ικανότητας (LRMS, στη διακριτική ικανότητα μοναδιαίας μάζας) όσο και η φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRMS), η οποία περιλαμβάνει π.χ. τομείς διπλής εστίασης, χρόνο πτήσης (TOF) και όργανα Orbitrap, θεωρούνται κατάλληλες.

Για την επιβεβαίωση της ταυτότητας μιας αναλυτέας ουσίας με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRMS), η απόκλιση μάζας όλων των διαγνωστικών ιόντων είναι μικρότερη από 5 ppm (ή, σε περίπτωση που m/z < 200, κάτω από 1 mDa). Στη βάση αυτή θα πρέπει να επιλέγεται ωφέλιμη διακριτική ικανότητα κατάλληλη για τον επιδιωκόμενο σκοπό. Η διακριτική ικανότητα πρέπει κατά κανόνα να είναι μεγαλύτερη από 10 000 για ολόκληρο το εύρος τιμών μάζας σε κοιλάδα 10 % ή 20 000 για το ολικό εύρος στο ημιμέγιστο ύψος (FWHM).

Όταν ο φασματομετρικός προσδιορισμός μάζας πραγματοποιείται με την καταγραφή φασμάτων πλήρους σάρωσης (τόσο LRMS όσο και HRMS), είναι κατάλληλα μόνο διαγνωστικά ιόντα με σχετική ένταση άνω του 10 % στο φάσμα αναφοράς του προτύπου βαθμονόμησης, του προτύπου αντίστοιχης μήτρας ή του προτύπου εμβολιασμένης μήτρας. Στα διαγνωστικά ιόντα περιλαμβάνεται το μοριακό ιόν, εάν υπάρχει σε ένταση ≥ 10 % της βασικής κορυφής, και τα χαρακτηριστικά ιοντικά θραύσματα ή ιοντικά προϊόντα.

Επιλογή πρόδρομου ιόντος: Όταν ο φασματομετρικός προσδιορισμός μάζας πραγματοποιείται με θραυσματοποίηση μετά την επιλογή του πρόδρομου ιόντος, η επιλογή αυτή πραγματοποιείται στη διακριτική ικανότητα μοναδιαίας μάζας ή ανώτερη. Το επιλεγμένο πρόδρομο ιόν είναι το μοριακό ιόν, οι χαρακτηριστικές ενώσεις προσθήκης του μοριακού ιόντος, τα χαρακτηριστικά ιοντικά προϊόντα ή κάποιο από τα ισότοπα ιόντα αυτών. Σε περίπτωση που η επιλογή πρόδρομου ιόντος έχει παράθυρο επιλογής μάζας άνω του ενός Dalton [π.χ. σε περίπτωση λήψης ανεξάρτητης από δεδομένα (Data Independent Acquisition ή DIA)], η τεχνική θεωρείται ανάλυση επιβεβαίωσης πλήρους σάρωσης.

Ιοντικά θραύσματα και προϊόντα: Τα επιλεγμένα ιοντικά προϊόντα ή ιοντικά θραύσματα είναι διαγνωστικά θραύσματα για τη μετρούμενη αναλυτέα ουσία/το μετρούμενο προϊόν. Οι μη επιλεκτικές μεταπτώσεις (π.χ. κατιόν τροπυλίου ή απώλεια νερού) παραλείπονται όποτε είναι δυνατόν. Η αφθονία διαγνωστικών ιόντων προσδιορίζεται από το εμβαδόν ή το ύψος κορυφής των ενσωματωμένων χρωματογραφημάτων ιόντων που προκύπτουν από την εκχύλιση. Αυτό ισχύει επίσης όταν για την ταυτοποίηση χρησιμοποιούνται μετρήσεις πλήρους σάρωσης. Ο λόγος σήματος προς θόρυβο (S/N) όλων των διαγνωστικών ιόντων είναι ίσος ή μεγαλύτερος από τρία προς ένα (3:1).

Σχετικές εντάσεις: Οι σχετικές εντάσεις των διαγνωστικών ιόντων (λόγος ιόντων) εκφράζονται ως ποσοστό της έντασης του πλέον άφθονου ιόντος ή της πλέον άφθονης μετάπτωσης. Ο λόγος ιόντων πρέπει να προσδιορίζεται με σύγκριση φασμάτων ή με ενσωμάτωση των σημάτων των ιχνών μάζας των ιόντων που προκύπτουν από την εκχύλιση. Ο λόγος ιόντων της προς επιβεβαίωση αναλυτέας ουσίας αντιστοιχεί στους λόγους των προτύπων αντίστοιχης μήτρας, των προτύπων εμβολιασμένης μήτρας ή των πρότυπων διαλυμάτων σε συγκρίσιμες συγκεντρώσεις, μετρούμενες υπό τις ίδιες συνθήκες, εντός σχετικής απόκλισης ± 40 %.

Για όλες τις αναλύσεις φασματομετρίας μάζας, προσδιορίζεται τουλάχιστον ένας λόγος ιόντων. Αυτά είναι κατά προτίμηση ιόντα που λαμβάνονται μέσα σε μία μόνο σάρωση, αλλά μπορούν να προέρχονται και από διαφορετικές σαρώσεις στην ίδια έγχυση (δηλαδή πλήρης σάρωση και σάρωση θραυσματοποίησης).

1.2.4.2. Ταυτοποίηση

Χρησιμοποιείται σύστημα σημείων ταυτοποίησης για την επιλογή κατάλληλων τρόπων λήψης και κριτηρίων αξιολόγησης. Για την επιβεβαίωση της ταυτότητας των ουσιών σε μήτρα για την οποία έχει καθοριστεί ΑΟΚ (εγκεκριμένη χρήση), απαιτούνται τουλάχιστον 4 σημεία ταυτοποίησης. Για τις μη εγκεκριμένες ή τις απαγορευμένες ουσίες απαιτούνται 5 σημεία ταυτοποίησης. Ένα σημείο μπορεί να προέρχεται από τον χρωματογραφικό διαχωρισμό. Στον πίνακα 3 ορίζεται ο αριθμός των σημείων ταυτοποίησης που δίνει κάθε τεχνική. Προκειμένου να ικανοποιούνται οι απαιτήσεις σημείων ταυτοποίησης για την επιβεβαίωση, μπορούν να προστίθενται σημεία ταυτοποίησης που λαμβάνονται από διαφορετικές τεχνικές.

1. Όλες οι αναλύσεις φασματομετρίας μάζας συνδυάζονται με τεχνική διαχωρισμού που δείχνει επαρκή διαχωριστική ικανότητα και επιλεκτικότητα για τη συγκεκριμένη εφαρμογή. Κατάλληλες τεχνικές διαχωρισμού είναι, μεταξύ άλλων, η υγροχρωματογραφία και η αεριοχρωματογραφία, η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (CE) και η χρωματογραφία υπερκρίσιμου ρευστού (SFC). Στην περίπτωση αναλυτέας ουσίας που εμφανίζει ισοβαρή ή ισομερή ένωση, απαιτείται αποδεκτός χρόνος κατακράτησης (δηλαδή ± 0,5 % σε GC και ± 1 % σε LC και SFC) για την επιβεβαίωση της ταυτότητάς της.

2. Για να επιτευχθεί ο ελάχιστος αριθμός σημείων ταυτοποίησης, μπορούν να συνδυαστούν έως τρεις διαφορετικές τεχνικές.

3. Οι διάφοροι τρόποι ιοντισμού (π.χ. ιοντισμός ηλεκτρονίων και χημικός ιοντισμός) θεωρούνται διαφορετικές τεχνικές. Πίνακας 3 Σημεία ταυτοποίησης ανά τεχνική Τεχνική Σημεία ταυτοποίησης Διαχωρισμός (GC, LC, SFC, CE) 1 LR-MS, ιόν 1 Επιλογή πρόδρομου ιόντος σε εύρος μαζών < ± 0,5 Da 1 (έμμεσο) LR-MSn, ιοντικό προϊόν 1,5 HR-MS, ιόν 1,5 HR-MSn, ιοντικό προϊόν 2,5 Πίνακας 4 Παραδείγματα του αριθμού σημείων ταυτοποίησης για συγκεκριμένες τεχνικές και συνδυασμούς τεχνικών (n = ακέραιος) Τεχνική/-ές Διαχωρισμός Αριθμός ιόντων Σημεία ταυτοποίησης GC-MS (EI ή CI) GC n 1 + n GC-MS (EI και CI) GC 2 (EI) + 2 (CI) 1 + 4 = 5 GC-MS (EI ή CI) 2 παράγωγα GC 2 (παράγωγο A) + 2 (παράγωγο B) 1 + 4 = 5 LC-MS LC n (MS) 1 + n GC- ή LC-MS/MS GC ή LC 1 πρόδρομο + 2 προϊόντα 1 + 1 + 2 × 1,5 = 5 GC- ή LC-MS/MS GC ή LC 2 πρόδρομο + 2 προϊόντα 1 + 2 + 2 × 1,5 = 6 GC- ή LC-MS3 GC ή LC 1 πρόδρομο + 1 προϊόν MS2 + 1 προϊόν MS3 1 + 1 + 1,5 + 1,5 = 5 GC- ή LC-HRMS GC ή LC n 1 + n × 1,5 GC- ή LC-HRMS/MS GC ή LC 1 πρόδρομο (εύρος μαζών < ± 0,5 Da) + 1 προϊόν 1 + 1 + 2,5 = 4,5 GC- ή LC-HRMS και HRMS/MS GC ή LC 1 ιόν πλήρους σάρωσης + 1 ιοντικό προϊόν HRMS (a) 1 + 1,5 + 2,5 = 5 GC- και LC-MS GC και LC 2 ιόντα (GCMS) + 1 ιόν (LCMS) 1 + 1 + 2 + 1 + 1 = 6

1.2.5. Ειδικά κριτήρια επιδόσεων για τον προσδιορισμό αναλυτέας ουσίας με χρήση υγροχρωματογραφίας με τεχνικές ανίχνευσης διαφορετικές από τη φασματομετρία μάζας

Μόνο για τις εγκεκριμένες ουσίες, ως εναλλακτική επιλογή έναντι των μεθόδων που βασίζονται στη φασματομετρία μάζας μπορούν να χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες τεχνικές, υπό τον όρο ότι πληρούνται τα σχετικά κριτήρια για τις τεχνικές αυτές:

1. φασματοφωτομετρία πλήρους σάρωσης με συστοιχία διόδων ανίχνευσης (diode array detection – DAD) σε περίπτωση που χρησιμοποιείται με HPLC·

2. φασματοφωτομετρία με ανίχνευση φθορισμού σε περίπτωση που χρησιμοποιείται με HPLC.

Η υγροχρωματογραφία μαζί με την ανίχνευση UV/VIS (ενός μήκους κύματος) δεν είναι κατάλληλη για να χρησιμοποιείται μόνη της ως μέθοδος επιβεβαίωσης.

1.2.5.1. Κριτήρια επιδόσεων για φασματοφωτομετρία πλήρους σάρωσης με συστοιχία διόδων

Πληρούνται τα κριτήρια επιδόσεων για τον χρωματογραφικό διαχωρισμό τα οποία περιλαμβάνονται στο σημείο 1.2.3.

Τα μέγιστα απορρόφησης στο φάσμα UV της αναλυτέας ουσίας βρίσκονται στα ίδια μήκη κύματος με εκείνα του προτύπου βαθμονόμησης σε μήτρα εντός μέγιστου περιθωρίου, το οποίο καθορίζεται από τη διακριτική ικανότητα του συστήματος ανίχνευσης. Για την ανίχνευση με συστοιχία διόδων, το εν λόγω μέγιστο περιθώριο είναι κατά κανόνα ± 2 nm. Το φάσμα της αναλυτέας ουσίας σε μήκη κύματος άνω των 220 nm, για τα τμήματα των δύο φασμάτων όπου η σχετική απορρόφηση είναι ίση ή μεγαλύτερη από 10 %, δεν πρέπει να διαφέρει εμφανώς από το φάσμα του προτύπου βαθμονόμησης. Το κριτήριο αυτό πληρούται όταν, πρώτον, υπάρχουν τα ίδια μέγιστα και, δεύτερον, η διαφορά μεταξύ των δύο φασμάτων δεν υπερβαίνει σε κανένα σημείο το 10 % της απορρόφησης του προτύπου βαθμονόμησης. Εάν χρησιμοποιείται ηλεκτρονική αναζήτηση σε βιβλιοθήκη και αντιστοίχιση, η σύγκριση των φασματικών δεδομένων των επίσημων δειγμάτων με τα δεδομένα του διαλύματος βαθμονόμησης πρέπει να υπερβαίνει έναν ορισμένο κρίσιμο συντελεστή αντιστοίχισης. Ο συντελεστής αυτός προσδιορίζεται κατά τη διαδικασία επικύρωσης για κάθε αναλυτέα ουσία βάσει των φασμάτων για τα οποία πληρούνται τα ανωτέρω κριτήρια. Ελέγχεται η μεταβλητότητα στα φάσματα που οφείλεται στη μήτρα του δείγματος και τις επιδόσεις του ανιχνευτή.

1.2.5.2. Κριτήρια επιδόσεων για τη φασματοφωτομετρία με ανίχνευση φθορισμού

Πληρούνται τα κριτήρια επιδόσεων για τον χρωματογραφικό διαχωρισμό τα οποία περιλαμβάνονται στο σημείο 1.2.3.

Η επιλογή των μηκών κύματος διέγερσης και εκπομπής σε συνδυασμό με τις χρωματογραφικές συνθήκες γίνεται κατά τρόπο ώστε να ελαχιστοποιείται η εμφάνιση παρεμποδίσεων σε εκχυλίσματα τυφλού δείγματος. Η διαφορά μεταξύ των μηκών κύματος διέγερσης και εκπομπής θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 50 νανόμετρα.

Το πλησιέστερο μέγιστο κορυφής στο χρωματογράφημα απέχει από την καθορισμένη κορυφή αναλυτέας ουσίας τουλάχιστον κατά ένα πλήρες πλάτος κορυφής στο 10 % του μέγιστου ύψους της κορυφής αναλυτέας ουσίας.

Αυτό ισχύει για τα μόρια που εμφανίζουν φυσικό φθορισμό, καθώς και για τα μόρια που εμφανίζουν φθορισμό μετά από μετασχηματισμό ή παραγωγοποίηση.

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ

2.1. Χαρακτηριστικά επιδόσεων που πρέπει να προσδιορίζονται για τις αναλυτικές μεθόδους

Μέσω της επικύρωσης της μεθόδου, αποδεικνύεται ότι η αναλυτική μέθοδος συμμορφώνονται με τα κριτήρια που ισχύουν για τα σχετικά χαρακτηριστικά επιδόσεων. Για διαφορετικούς σκοπούς ελέγχου απαιτούνται διαφορετικές κατηγορίες μεθόδων. Στον πίνακα 5 προσδιορίζεται ποια χαρακτηριστικά επιδόσεων πρέπει να επαληθεύονται για κάθε τύπο μεθόδου. Περαιτέρω επεξηγήσεις για κάθε παράμετρο παρέχονται στο παρόν κεφάλαιο.

Πίνακας 5

Ταξινόμηση των αναλυτικών μεθόδων ανάλογα με τα χαρακτηριστικά επιδόσεων που πρέπει να προσδιορίζονται

Μέθοδος Επιβεβαίωση Διαλογή Ποιοτική Ποσοτική Ποιοτική Ημιποσοτική Ποσοτική Ουσίες A A, B A, B A, B A, B Ταυτοποίηση σύμφωνα με το τμήμα 1.2 x x CCα x x CCβ - x x x Αληθότητα x x Ακρίβεια x (x) x Σχετική επίδραση μήτρας/απόλυτη ανάκτηση (*) x x Επιλεκτικότητα/Ειδικότητα x x x x Σταθερότητα (#) x x x x Ανθεκτικότητα x x x x x: Απαιτείται να αποδεικνύεται μέσω της επικύρωσης ότι πληρούνται οι απαιτήσεις για το χαρακτηριστικό επίδοσης. (x) Για τις ημιποσοτικές μεθόδους διαλογής δεν χρειάζεται να πληρούνται οι απαιτήσεις ακρίβειας του σημείου 1.2.2.2. Ωστόσο, προσδιορίζεται η ακρίβεια ώστε να αποδεικνύεται ότι η μέθοδος είναι κατάλληλη για να αποφεύγονται ψευδώς συμμορφούμενα αναλυτικά αποτελέσματα. A: απαγορευμένες ή μη εγκεκριμένες ουσίες B: εγκεκριμένες ουσίες

2.2. Αληθότητα, επαναληψιμότητα και ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα

Στο παρόν κεφάλαιο δίνονται παραδείγματα και στοιχεία αναφοράς για τις διαδικασίες επικύρωσης. Μπορούν να χρησιμοποιούνται και άλλες προσεγγίσεις ώστε να αποδεικνύεται ότι η μέθοδος συμμορφώνεται με τα κριτήρια επιδόσεων, υπό την προϋπόθεση ότι οι προσεγγίσεις αυτές επιτυγχάνουν το ίδιο επίπεδο και την ίδια ποιότητα πληροφοριών.

2.2.1. Συμβατική επικύρωση

Ο υπολογισμός των παραμέτρων σύμφωνα με τις συμβατικές μεθόδους απαιτεί τη διεξαγωγή αρκετών επιμέρους πειραμάτων. Για κάθε σημαντική μεταβολή πρέπει να προσδιορίζεται κάθε χαρακτηριστικό επίδοσης (βλέπε τμήμα 2.4). Για τις μεθόδους πολλαπλών αναλυτέων ουσιών, μπορούν να αναλυθούν ταυτόχρονα παραπάνω από μία αναλυτέες ουσίες, εφόσον έχει αποκλειστεί το ενδεχόμενο σημαντικής παρεμπόδισης. Με παρόμοιο τρόπο μπορούν να προσδιοριστούν αρκετά χαρακτηριστικά επιδόσεων. Ως εκ τούτου, για να ελαχιστοποιείται ο φόρτος εργασίας, συνιστάται να γίνεται όσο το δυνατόν περισσότερο συνδυασμός των πειραμάτων (π.χ. επαναληψιμότητα και ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα μαζί με ειδικότητα, ανάλυση τυφλών δειγμάτων για τον προσδιορισμό του ορίου απόφασης για επιβεβαίωση και δοκιμές για ειδικότητα).

2.2.1.1. Αληθότητα βάσει πιστοποιημένου υλικού αναφοράς

Ο προσδιορισμός της αληθότητας μιας αναλυτικής μεθόδου γίνεται κατά προτίμηση μέσω πιστοποιημένου υλικού αναφοράς (CRM). Η σχετική διαδικασία περιγράφεται στο πρότυπο ISO 5725-4:1994 (2).

Παρακάτω δίνεται ένα παράδειγμα:

1. Αναλύονται έξι πανομοιότυπα δείγματα του πιστοποιημένου υλικού αναφοράς σύμφωνα με τις οδηγίες δοκιμών για τη μέθοδο·

2. Προσδιορίζεται η συγκέντρωση της αναλυτέας ουσίας σε καθένα από τα πανομοιότυπα δείγματα·

3. Υπολογίζονται η μέση συγκέντρωση, η τυπική απόκλιση και ο συντελεστής μεταβλητότητας (%) γι’ αυτά τα έξι πανομοιότυπα δείγματα·

4. Υπολογίζεται η αληθότητα με διαίρεση της ανιχνευθείσας μέσης συγκέντρωσης με την πιστοποιημένη τιμή (που μετράται ως συγκέντρωση) και πολλαπλασιασμό με το 100, ώστε το αποτέλεσμα να εκφραστεί ως ποσοστό.

Αληθότητα (%) = (μέση ανιχνευθείσα συγκέντρωση διορθωμένη ως προς την ανάκτηση) × 100/πιστοποιημένη τιμή

2.2.1.2. Αληθότητα βάσει εμβολιασμένων δειγμάτων

Εάν δεν διατίθεται πιστοποιημένο υλικό αναφοράς, η αληθότητα της μεθόδου προσδιορίζεται πειραματικά με χρήση εμβολιασμένου τυφλού μήτρας, τουλάχιστον σύμφωνα με την ακόλουθη διαδικασία:

1. Για τις μεθόδους που επικυρώνονται μετά την ημερομηνία έναρξης ισχύος του παρόντος κανονισμού, επιλέγεται τυφλό υλικό το οποίο εμβολιάζεται σε συγκέντρωση: (a) ίση με την τιμή RPA επί 0,5 (3), 1,0 και 1,5· ή (b) ίση με 0,1 (4), 1,0 και 1,5 φορές το ΑΟΚ ή το ΑΕ για τις εγκεκριμένες ουσίες· ή (c) ίσης με την τιμή LCL επί 1,0, 2,0 και 3,0 για τις μη εγκεκριμένες ουσίες (για τις οποίες δεν έχει καθοριστεί RPA).

2. Σε κάθε επίπεδο η ανάλυση διενεργείται με έξι πανομοιότυπα δείγματα.

3. Αναλύονται τα δείγματα.

4. Υπολογίζεται η ανιχνευθείσα συγκέντρωση σε κάθε δείγμα.

5. Υπολογίζεται η αληθότητα για κάθε δείγμα μέσω της παρακάτω εξίσωσης και, στη συνέχεια, υπολογίζονται η μέση αληθότητα και ο συντελεστής μεταβλητότητας για τα έξι αποτελέσματα σε κάθε επίπεδο συγκέντρωσης.

Αληθότητα (%) = (μέση ανιχνευθείσα συγκέντρωση διορθωμένη ως προς την ανάκτηση) × 100/επίπεδο εμβολιασμού

Για τις μεθόδους για εγκεκριμένες ουσίες που έχουν επικυρωθεί πριν από την ημερομηνία εφαρμογής του παρόντος κανονισμού, αρκεί ο προσδιορισμός της αληθότητας της μεθόδου με τη χρήση 6 κλασμάτων εμβολιασμένων σε επίπεδα που αντιστοιχούν σε 0,5, 1,0 και 1,5 φορές το ΑΟΚ ή το ΑΕ.

2.2.1.3. Επαναληψιμότητα

1. Για τις μεθόδους που επικυρώνονται μετά την ημερομηνία έναρξης ισχύος του παρόντος κανονισμού, ετοιμάζεται σύνολο από δείγματα πανομοιότυπων τυφλών μητρών του ίδιου είδους. Τα δείγματα αυτά εμβολιάζονται με την αναλυτέα ουσία ώστε να προκύψουν συγκεντρώσεις ισοδύναμες με: α) την τιμή RPA επί 0,5 (5), 1,0 και 1,5, ή β) 0,1 (6), 1,0 και 1,5 φορές το ΑΟΚ ή το ΑΕ για τις εγκεκριμένες ουσίες, ή γ) την τιμή LCL επί 1,0, 2,0 και 3,0 για τις μη εγκεκριμένες ή τις απαγορευμένες ουσίες, σε περίπτωση που δεν εφαρμόζεται RPA.

2. Σε κάθε επίπεδο η ανάλυση διενεργείται με έξι τουλάχιστον πανομοιότυπα δείγματα.

3. Αναλύονται τα δείγματα.

4. Υπολογίζεται η ανιχνευθείσα συγκέντρωση σε κάθε δείγμα.

5. Υπολογίζονται η μέση συγκέντρωση, η τυπική απόκλιση και ο συντελεστής μεταβλητότητας (%) των εμβολιασμένων δειγμάτων.

6. Τα βήματα αυτά επαναλαμβάνονται τουλάχιστον άλλες δύο φορές.

7. Υπολογίζονται οι συνολικές μέσες συγκεντρώσεις, οι τυπικές αποκλίσεις (υπολογίζεται ο μέσος όρος των τετραγώνων των τυπικών αποκλίσεων των επιμέρους περιπτώσεων και λαμβάνεται η τετραγωνική ρίζα αυτού) και των συντελεστών μεταβλητότητας για τα εμβολιασμένα δείγματα. Για τις μεθόδους για εγκεκριμένες ουσίες που έχουν επικυρωθεί πριν από την ημερομηνία εφαρμογής του παρόντος κανονισμού, αρκεί ο προσδιορισμός της επαναληψιμότητας με εμβολιασμένες μήτρες σε συγκεντρώσεις ίσες με το ΑΟΚ ή το ΑΕ επί 0,5, 1,0 και 1,5. Εναλλακτικά, ο υπολογισμός της επαναληψιμότητας μπορεί να πραγματοποιηθεί σύμφωνα με το πρότυπο ISO 5725-2:2019 (7).

2.2.1.4. Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα

1. Για επικυρώσεις που πραγματοποιούνται μετά την ημερομηνία έναρξης ισχύος του παρόντος κανονισμού, ετοιμάζεται σύνολο από δείγματα καθορισμένου υλικού δοκιμής (πανομοιότυπες ή διαφορετικές μήτρες), εμβολιασμένα με την ή τις αναλυτέες ουσίες ώστε να προκύψουν συγκεντρώσεις ισοδύναμες με: α) την τιμή RPA επί 0,5(5), 1,0 και 1,5, ή β) 0,1(6), 1,0 και 1,5 φορές το ΑΟΚ ή το ΑΕ για τις εγκεκριμένες ουσίες, ή γ) την τιμή LCL επί 1,0, 2,0 και 3,0 για τις μη εγκεκριμένες ή τις απαγορευμένες ουσίες, σε περίπτωση που δεν εφαρμόζεται RPA.

2. Διενεργείται η ανάλυση σε κάθε επίπεδο συγκέντρωσης με τουλάχιστον έξι πανομοιότυπα δείγματα τυφλού υλικού.

3. Αναλύονται τα δείγματα.

4. Υπολογίζεται η ανιχνευθείσα συγκέντρωση σε κάθε δείγμα.

5. Τα βήματα αυτά επαναλαμβάνονται τουλάχιστον άλλες δύο φορές με διαφορετικές παρτίδες τυφλού υλικού, από διαφορετικούς τεχνικούς και υπό όσο το δυνατόν περισσότερες διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες, π.χ. διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίων και διαλυτών, διαφορετικές θερμοκρασίες δωματίου, διαφορετικά όργανα, ή μια ποικιλία άλλων παραμέτρων.

6. Καθορίζονται η μέση συγκέντρωση, η τυπική απόκλιση και ο συντελεστής μεταβλητότητας (%) των εμβολιασμένων δειγμάτων. Για τις μεθόδους για εγκεκριμένες ουσίες που έχουν επικυρωθεί πριν από την ημερομηνία έναρξης ισχύος του παρόντος κανονισμού, αρκεί ο προσδιορισμός της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας με εμβολιασμένες μήτρες σε συγκεντρώσεις ίσες με 0,5, 1,0 και 1,5 φορές το ΑΟΚ ή το ΑΕ. Εναλλακτικά, ο υπολογισμός της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας/ενδιάμεσης ακρίβειας μπορεί επίσης να διενεργηθεί σύμφωνα με τα πρότυπα ISO 5725-2:2019 ή ISO 11843-1:1997 (8) ή τον Codex CAC/GL 59-2006 (9).

2.2.2. Επικύρωση σύμφωνα με εναλλακτικά μοντέλα

Ο υπολογισμός των παραμέτρων σύμφωνα με εναλλακτικά μοντέλα απαιτεί την εφαρμογή πειραματικού σχεδίου. Το πειραματικό σχέδιο καταρτίζεται ανάλογα με τον αριθμό των διαφορετικών ειδών και των διαφορετικών παραγόντων που εξετάζονται. Επομένως, το πρώτο βήμα της όλης διαδικασίας επικύρωσης είναι η εξέταση του πληθυσμού των δειγμάτων που θα αναλύονται εφεξής στο εργαστήριο, προκειμένου να προσδιοριστούν τα πιο σημαντικά είδη και οι παράγοντες που μπορεί να επηρεάσουν τα αποτελέσματα των μετρήσεων. Η παραγοντική προσέγγιση επιτρέπει την εκτίμηση της αβεβαιότητας μέτρησης των αποτελεσμάτων της δοκιμής, τα οποία λαμβάνονται υπό διάφορες συνθήκες δοκιμής σε δεδομένο εργαστήριο, π.χ. διαφορετικούς τεχνικούς, διαφορετικά όργανα, διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίων, διαφορετικές μήτρες, διαφορετικούς χρόνους δοκιμασίας και διαφορετικές θερμοκρασίες δοκιμασίας. Στη συνέχεια, η κλίμακα συγκεντρώσεων πρέπει να επιλέγεται με τρόπο προσαρμοσμένο στον επιδιωκόμενο σκοπό σύμφωνα με το ΑΟΚ ή το ΑΕ για τις εγκεκριμένες ουσίες, ή την τιμή RPA ή LCL για τις απαγορευμένες ή τις μη εγκεκριμένες ουσίες.

Η παραγοντική προσέγγιση αποσκοπεί στον καθορισμό αξιόπιστων δεδομένων ακρίβειας και δεδομένων μέτρησης μέσω ταυτόχρονης ελεγχόμενης μεταβλητότητας των επιλεγμένων παραγόντων. Επιτρέπει την αξιολόγηση του συνδυασμένου αντικτύπου των παραγοντικών και των τυχαίων επιδράσεων. Ο πειραματικός σχεδιασμός επιτρέπει επίσης τη διερεύνηση της ανθεκτικότητας (10) της αναλυτικής μεθόδου και τον προσδιορισμό της τυπικής απόκλισης της εσωτερικής αναπαραγωγιμότητας μεταξύ των μητρών.

Στη συνέχεια δίνεται ένα παράδειγμα εναλλακτικής προσέγγισης με χρήση ορθογώνιου πειραματικού σχεδίου.

Μπορούν να εξεταστούν έως και επτά παράγοντες (παράγοντες θορύβου). Η μελέτη έχει σχεδιαστεί κατά τρόπο ώστε, μέσω της εφαρμογής του πειραματικού σχεδίου, να μπορούν να προσδιοριστούν ταυτόχρονα η ακρίβεια, η αληθότητα (βάσει εμβολιασμένων δειγμάτων), η ευαισθησία, η αβεβαιότητα μέτρησης και οι κρίσιμες συγκεντρώσεις.

Πίνακας 6

Παράδειγμα ορθογώνιου πειραματικού σχεδίου με 7 παράγοντες (I-VII) που κυμαίνονται σε δύο επίπεδα (A/B) σε μελέτη επικύρωσης με οκτώ σειρές δοκιμών (συνδυασμός επιπέδων παραγόντων)

Παράγοντας I II III IV V VI VII Σειρά 01 A A A A A A A Σειρά 02 A A B A B B B Σειρά 03 A B A B A B B Σειρά 04 A B B B B A A Σειρά 05 B A A B B A B Σειρά 06 B A B B A B A Σειρά 07 B B A A B B A Σειρά 08 B B B A A A B

Ο υπολογισμός των χαρακτηριστικών της μεθόδου πραγματοποιείται όπως περιγράφεται από Jülicher et al. (11).

2.2.3. Άλλες προσεγγίσεις ως προς την επικύρωση

Μπορούν να χρησιμοποιούνται και άλλες προσεγγίσεις ώστε να αποδεικνύεται ότι η αναλυτική μέθοδος συμμορφώνεται με τα κριτήρια για τα χαρακτηριστικά επιδόσεων, υπό την προϋπόθεση ότι οι προσεγγίσεις αυτές επιτυγχάνουν το ίδιο επίπεδο και την ίδια ποιότητα πληροφοριών. Η επικύρωση μπορεί επίσης να πραγματοποιείται με τη διεξαγωγή διεργαστηριακής μελέτης όπως καθορίζεται από τον Codex Alimentarius, τα πρότυπα ISO ή την IUPAC (12), ή σύμφωνα με εναλλακτικές μεθόδους, όπως μονοεργαστηριακές μελέτες ή εσωτερική επικύρωση (13). Όταν εφαρμόζονται εναλλακτικές διαδικασίες επικύρωσης, στο πρωτόκολλο επικύρωσης καθορίζονται το υποκείμενο μοντέλο και η υποκείμενη στρατηγική με τις αντίστοιχες προϋποθέσεις, παραδοχές και μαθηματικούς τύπους, ή τουλάχιστον περιλαμβάνονται σχετικές παραπομπές.

2.3. Επιλεκτικότητα/Ειδικότητα

Προσδιορίζεται στον μέγιστο δυνατό βαθμό η ικανότητα διάκρισης ανάμεσα στην αναλυτέα ουσία και σε συγγενείς ουσίες. Προσδιορίζεται η παρεμπόδιση από ομόλογες ουσίες, ισομερή, προϊόντα αποδόμησης, ενδογενείς ουσίες, ανάλογες ουσίες, μεταβολικά προϊόντα του καταλοίπου που ενδιαφέρει, ενώσεις της μήτρας ή κάθε άλλη πιθανώς παρεμποδίζουσα ουσία και, εάν χρειάζεται, τροποποιείται η μέθοδος ώστε να αποφεύγονται οι προσδιορισθείσες παρεμποδίσεις. Για τον προσδιορισμό της ειδικότητας της μεθόδου χρησιμοποιείται η ακόλουθη προσέγγιση:

1. Επιλέγεται μια σειρά από χημικά συγγενείς ενώσεις ή άλλες ουσίες που ενδέχεται να περιέχονται στα δείγματα μαζί με την ένωση που ενδιαφέρει και επαληθεύεται κατά πόσον αυτές θα μπορούσαν να παρεμποδίσουν την ανάλυση της ή των αναλυτέων ουσιών-στόχων.

2. Αναλύεται κατάλληλος αριθμός αντιπροσωπευτικών τυφλών δειγμάτων, π.χ. διαφορετικές παρτίδες ή παρτίδες από διαφορετικά ζωικά είδη (n ≥ 20) και πραγματοποιείται έλεγχος για τυχόν παρεμποδίσεις από σήματα, κορυφές ή ίχνη ιόντων στην περιοχή που ενδιαφέρει και όπου αναμένεται να εκλουστεί η αναλυτέα ουσία.

3. Αντιπροσωπευτικά τυφλά δείγματα εμβολιάζονται, σε κατάλληλες συγκεντρώσεις, με ουσίες που θα μπορούσαν ενδεχομένως να επηρεάσουν την ταυτοποίηση και/ή την ποσοτικοποίηση της αναλυτέας ουσίας και ερευνάται κατά πόσον η προστιθέμενη ουσία: α) μπορεί να οδηγήσει σε ψευδή ταυτοποίηση· β) εμποδίζει την ταυτοποίηση της αναλυτέας ουσίας-στόχου· γ) επηρεάζει σημαντικά την ποσοτικοποίηση.

2.4. Ανθεκτικότητα

Η αναλυτική μέθοδος υποβάλλεται σε δοκιμή για να διαπιστωθεί κατά πόσον οι επιδόσεις της παραμένουν σταθερές υπό διαφορετικές πειραματικές συνθήκες, στις οποίες περιλαμβάνονται π.χ. διαφορετικές συνθήκες δειγματοληψίας και μεταβολές ήσσονος σημασίας που μπορούν να επέλθουν στις δοκιμές ρουτίνας. Για να δοκιμαστεί η ανθεκτικότητα της μεθόδου, οι μεταβολές που εισάγονται στις πειραματικές συνθήκες θα πρέπει να είναι ήσσονος σημασίας. Η σημασία αυτών των μεταβολών υποβάλλεται σε αξιολόγηση. Προσδιορίζεται κάθε χαρακτηριστικό επιδόσεων για όλες τις μεταβολές ήσσονος σημασίας για τις οποίες διαπιστώνεται ότι έχουν σημαντική επίδραση στις επιδόσεις της δοκιμασίας.

2.5. Σταθερότητα

Πρέπει να προσδιορίζεται η σταθερότητα του προτύπου βαθμονόμησης, του προτύπου αντίστοιχης μήτρας και/ή του προτύπου εμβολιασμένης μήτρας, καθώς και των συστατικών της αναλυτέας ουσίας ή της μήτρας στο δείγμα κατά την αποθήκευση ή την ανάλυση, καθώς τυχόν αστάθειες ενδέχεται να επηρεάσουν τα αποτελέσματα των δοκιμών.

Συνήθως η σταθερότητα της αναλυτέας ουσίας είναι καλά χαρακτηρισμένη υπό διάφορες συνθήκες αποθήκευσης. Τα πειράματα που διεξάγονται για την παρακολούθηση των συνθηκών αποθήκευσης των προτύπων και των δειγμάτων, τα οποία πραγματοποιούνται στο πλαίσιο του συνήθους συστήματος διαπίστευσης εργαστηρίων και ελέγχου ποιότητας, μπορούν να παρέχουν τις απαιτούμενες πληροφορίες. Εάν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα σταθερότητας για τις αναλυτέες ουσίες στη μήτρα (π.χ. βάσει πληροφοριών από τα εργαστήρια αναφοράς της ΕΕ, δημοσιευμένων δεδομένων κ.λπ.), τα δεδομένα αυτά δεν χρειάζεται να προσδιορίζονται από κάθε εργαστήριο. Ωστόσο, η αναφορά στα διαθέσιμα δεδομένα σταθερότητας των αναλυτέων ουσιών σε διάλυμα και σε μήτρα είναι αποδεκτή μόνο εάν εφαρμόζονται ταυτόσημες συνθήκες.

Σε περίπτωση που τα απαιτούμενα δεδομένα σταθερότητας δεν είναι διαθέσιμα, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες προσεγγίσεις.

2.5.1. Προσδιορισμός της σταθερότητας της αναλυτέας ουσίας σε διάλυμα

1. Παρασκευάζονται νέα αποθεματικά διαλύματα της ή των αναλυτέων ουσιών, τα οποία αραιώνονται όπως ορίζεται στις οδηγίες δοκιμών ώστε να παραχθεί επαρκής αριθμός κλασμάτων (π.χ. 40) από κάθε επιλεγμένη συγκέντρωση. Ετοιμάζονται δείγματα από: α) διαλύματα της αναλυτέας ουσίας τα οποία χρησιμοποιούνται για εμβολιασμό· β) διαλύματα της αναλυτέας ουσίας τα οποία χρησιμοποιούνται για την τελική ανάλυση· γ) κάθε άλλο διάλυμα που ενδιαφέρει (π.χ. παράγωγα πρότυπα).

2. Μετριέται η περιεκτικότητα του πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος σε αναλυτέα ουσία σύμφωνα με τις οδηγίες δοκιμών.

3. Μεταγγίζονται κατάλληλοι όγκοι σε κατάλληλους περιέκτες, οι οποίοι επισημαίνονται και αποθηκεύονται σύμφωνα με τις συνθήκες φωτισμού και θερμοκρασίας της διαδικασίας που περιλαμβάνεται στον πίνακα 7. Ο χρόνος αποθήκευσης επιλέγεται λαμβανομένης υπόψη της εφαρμοζόμενης αναλυτικής πρακτικής, ιδανικά έως ότου παρατηρηθούν τα πρώτα φαινόμενα αποδόμησης κατά την ταυτοποίηση και/ή την ποσοτικοποίηση. Εάν δεν παρατηρηθεί αποδόμηση κατά τη μελέτη σταθερότητας, η διάρκεια αποθήκευσης της μελέτης σταθερότητας λαμβάνεται ίση με τη διάρκεια της μέγιστης περιόδου αποθήκευσης του διαλύματος.

4. Υπολογίζεται η συγκέντρωση της ή των αναλυτέων ουσιών σε κάθε κλάσμα σε σύγκριση με τη συγκέντρωση της αναλυτέας ουσίας στο πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα, σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: Απομένουσα αναλυτέα ουσία (%) = Ci × 100/Cfresh Ci = συγκέντρωση τη χρονική στιγμή i Cfresh = συγκέντρωση πρόσφατου διαλύματος Η μέση τιμή πέντε πανομοιότυπων διαλυμάτων που διατηρήθηκαν αποθηκευμένα δεν πρέπει να διαφέρει κατά περισσότερο από 15 % από τη μέση τιμή πέντε προσφάτως παρασκευασμένων πανομοιότυπων διαλυμάτων. Η μέση τιμή των πέντε πρόσφατα παρασκευασμένων διαλυμάτων χρησιμοποιείται ως βάση για τον υπολογισμό της ποσοστιαίας διαφοράς. Πίνακας 7 Διαδικασία για τον προσδιορισμό της σταθερότητας της αναλυτέας ουσίας σε διάλυμα – 20 °C + 4 °C + 20 °C Σκουρόχρωμο 10 κλάσματα 10 κλάσματα 10 κλάσματα Ανοιχτόχρωμο 10 κλάσματα

2.5.2. Προσδιορισμός της σταθερότητας της ή των αναλυτέων ουσιών σε μήτρα

1. Όπου είναι δυνατόν, χρησιμοποιούνται πραγματικά δείγματα. Εάν δεν υπάρχει διαθέσιμη μήτρα πραγματικού δείγματος, χρησιμοποιείται τυφλό μήτρας εμβολιασμένο με την αναλυτέα ουσία.

2. Όταν υπάρχει διαθέσιμη μήτρα πραγματικού δείγματος, προσδιορίζεται η συγκέντρωση στη μήτρα, όσο η μήτρα είναι ακόμη πρόσφατη. Αποθηκεύονται επιπλέον κλάσματα της ομογενοποιημένης μήτρας πραγματικού δείγματος σε θερμοκρασία -20 °C ή χαμηλότερη, εάν απαιτείται, και προσδιορίζονται οι συγκεντρώσεις της αναλυτέας ουσίας για όσο διάστημα διατηρείται το δείγμα στο εργαστήριο.

3. Εάν δεν υπάρχει διαθέσιμη μήτρα πραγματικού δείγματος, λαμβάνεται και ομογενοποιείται τυφλό μήτρας. Η μήτρα μοιράζεται σε πέντε κλάσματα. Κάθε κλάσμα εμβολιάζεται με την αναλυτέα ουσία, η οποία θα πρέπει κατά προτίμηση να παρασκευάζεται σε μικρή ποσότητα υδατικού διαλύματος. Το ένα κλάσμα αναλύεται αμέσως, ενώ τα υπόλοιπα αποθηκεύονται σε θερμοκρασία -20 °C ή χαμηλότερη, εάν απαιτείται, και αναλύονται μετά από βραχυπρόθεσμη, μεσοπρόθεσμη και μακροπρόθεσμη αποθήκευση, λαμβανομένων υπόψη των εφαρμοζόμενων αναλυτικών μεθόδων.

4. Καταγράφονται ο μέγιστος αποδεκτός χρόνος αποθήκευσης και οι βέλτιστες συνθήκες αποθήκευσης. Η μέση τιμή πέντε πανομοιότυπων διαλυμάτων που διατηρήθηκαν αποθηκευμένα δεν πρέπει να διαφέρει από τη μέση τιμή πέντε προσφάτως παρασκευασμένων πανομοιότυπων διαλυμάτων κατά περισσότερο από την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου. Η μέση τιμή των πέντε πρόσφατα παρασκευασμένων διαλυμάτων χρησιμοποιείται ως βάση για τον υπολογισμό της ποσοστιαίας διαφοράς.

2.6. Όριο απόφασης για επιβεβαίωση (CCα)

Για τις μεθόδους επιβεβαίωσης προσδιορίζεται το CCα, το οποίο καθορίζεται υπό συνθήκες που συμμορφώνονται με τις απαιτήσεις για την ταυτοποίηση ή για την ταυτοποίηση σε συνδυασμό με ποσοτικοποίηση, όπως αυτές ορίζονται στα «Κριτήρια επιδόσεων και άλλες απαιτήσεις για τις αναλυτικές μεθόδους» (κεφάλαιο 1).

Για τον έλεγχο της συμμόρφωσης των δειγμάτων, η συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα μέτρησης έχει ήδη ληφθεί υπόψη στην τιμή CCα (όριο απόφασης για επιβεβαίωση).

1. Για τις μη εγκεκριμένες ή τις απαγορευμένες φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες, το CCα υπολογίζεται ως εξής: α) Μέθοδος 1: με τη διαδικασία της καμπύλης βαθμονόμησης σύμφωνα με το πρότυπο ISO 11843-1:1997 (14) (όπου αναφέρεται ως κρίσιμη τιμή της μεταβλητής καθαρής κατάστασης). Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται τυφλό υλικό, εμβολιασμένο στην τιμή RPA ή LCL και πάνω από αυτήν σε ισαπέχοντα βήματα. Αναλύονται τα δείγματα. Μετά την ταυτοποίηση, σχεδιάζεται η καμπύλη του σήματος, όπου είναι δυνατόν, ή η εκ νέου υπολογισθείσα συγκέντρωση σε σχέση με την προστεθείσα συγκέντρωση. Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στο σημείο τομής του άξονα y συν 2,33 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας στο σημείο τομής ισούται με το όριο απόφασης. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται μόνο σε ποσοτικές δοκιμασίες. Τα όρια απόφασης που λαμβάνονται με την προσέγγιση αυτή επαληθεύονται με ανάλυση τυφλού μήτρας εμβολιασμένου στο υπολογιζόμενο όριο απόφασης. β) Μέθοδος 2: με ανάλυση τουλάχιστον 20 αντιπροσωπευτικών τυφλών υλικών ανά μήτρα, ώστε να είναι δυνατός ο υπολογισμός του λόγου σήματος προς θόρυβο στο χρονικό διάστημα στο οποίο αναμένεται να εμφανιστεί η αναλυτέα ουσία. Ως όριο απόφασης μπορεί να χρησιμοποιηθεί τιμή ίση με το τριπλάσιο του λόγου σήματος προς θόρυβο. Αυτό ισχύει τόσο για ποσοτικές όσο και για ποιοτικές δοκιμασίες. Τα όρια απόφασης που λαμβάνονται με την προσέγγιση αυτή επαληθεύονται με ανάλυση τυφλού μήτρας εμβολιασμένου στο υπολογιζόμενο όριο απόφασης. γ) Μέθοδος 3: CCα = LCL + k(μονόπλευρη δοκιμή, 99 %) × (συνδυασμένη) τυπική αβεβαιότητα μέτρησης στο LCL Για τις μη εγκεκριμένες ή τις απαγορευμένες φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες, ανάλογα με το πείραμα επικύρωσης (και τους αντίστοιχους βαθμούς ελευθερίας), μπορεί εύλογα να εφαρμοστεί κατανομή t ή —εάν ληφθεί ως βάση η κατανομή Gauss (μονόπλευρη δοκιμή, n=∞)— χρησιμοποιείται συντελεστής k ίσος με 2,33. Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα και η αληθότητα είναι κατάλληλες για τον καθορισμό της (συνδυασμένης) τυπικής αβεβαιότητας μέτρησης, εάν για τον προσδιορισμό τους λαμβάνονται υπόψη όλοι οι συναφείς επιδρώντες παράγοντες. Στην περίπτωση μεθόδων που έχουν επικυρωθεί πριν από την ημερομηνία έναρξης ισχύος του παρόντος κανονισμού, η μέθοδος 2 για τον υπολογισμό του CCα μπορεί να χρησιμοποιείται μόνο έως την 1η Ιανουαρίου 2026. Για τις μεθόδους που επικυρώνονται μετά την έναρξη ισχύος του παρόντος κανονισμού, χρησιμοποιούνται μόνο οι μέθοδοι 1 ή 3.

2. Για τις εγκεκριμένες ουσίες, το CCα υπολογίζεται ως εξής: α) Για τις εγκεκριμένες ουσίες σε συνδυασμούς μητρών/ειδών για τους οποίους έχει καθοριστεί ΑΟΚ ή ΑΕ: i) Μέθοδος 1: με τη διαδικασία της καμπύλης βαθμονόμησης σύμφωνα με το πρότυπο ISO 11843-1:1997 (όπου αναφέρεται ως κρίσιμη τιμή της μεταβλητής καθαρής κατάστασης). Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται τυφλό υλικό, εμβολιασμένο στην τιμή του ΑΟΚ ή του ΑΕ και πάνω από αυτήν σε ισαπέχοντα βήματα. Αναλύονται τα δείγματα. Μετά την ταυτοποίηση, σχεδιάζεται η καμπύλη του σήματος, όπου είναι δυνατόν, ή η εκ νέου υπολογισθείσα συγκέντρωση σε σχέση με την προστεθείσα συγκέντρωση. Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στο ΑΟΚ ή το ΑΕ συν 1,64 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας στο επιτρεπόμενο όριο ισούται με το όριο απόφασης (α = 5 %). ii) Μέθοδος 2: CCα = ΑΟΚ (ή ΑΕ) + k(μονόπλευρη δοκιμή, 95 %) × (συνδυασμένη) τυπική αβεβαιότητα μέτρησης στο ΑΟΚ ή το ΑΕ Για τις εγκεκριμένες ουσίες, ανάλογα με το πείραμα επικύρωσης (και τους αντίστοιχους βαθμούς ελευθερίας), μπορεί εύλογα να εφαρμοστεί κατανομή t ή —εάν ληφθεί ως βάση η κατανομή Gauss (μονόπλευρη δοκιμή, n=∞)— χρησιμοποιείται συντελεστής k ίσος με 1,64. Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα και η αληθότητα είναι κατάλληλες για τον καθορισμό της (συνδυασμένης) τυπικής αβεβαιότητας μέτρησης, εάν για τον προσδιορισμό τους λαμβάνονται υπόψη όλοι οι συναφείς επιδρώντες παράγοντες. Για τις φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες για τις οποίες έχει καθοριστεί ΑΟΚ για το άθροισμα των διαφόρων ουσιών, ως CCα για την εκτίμηση του αθροίσματος των ουσιών στο μετρούμενο δείγμα χρησιμοποιείται το CCα της ουσίας με την υψηλότερη συγκέντρωση στο δείγμα. β) Για τις εγκεκριμένες ουσίες σε συνδυασμούς μητρών/ειδών για τους οποίους δεν έχει καθοριστεί ΑΟΚ, δεν πρέπει να υπάρχουν κατάλοιπα εκτός εάν έχει χορηγηθεί εγκεκριμένη θεραπευτική αγωγή σύμφωνα με το άρθρο 11 της οδηγίας 2001/82/ΕΚ. Για τις επιτρεπόμενες ουσίες για τις οποίες δεν έχει καθοριστεί ΑΟΚ, για τον υπολογισμό του CCα χρησιμοποιείται το ΑΟΚ που προκύπτει από τη διαδοχική διαδικασία που καθορίζεται στον εκτελεστικό κανονισμό (ΕΕ) 2018/470 της Επιτροπής (15). Εφαρμόζεται η μέθοδος 1 ή 2 της ανωτέρω παραγράφου, αλλά το «ΑΟΚ» αναφέρεται στο «ΑΟΚ εκ διαδοχής επί 0,5, με στόχο ΑΟΚ εκ διαδοχής επί 0,1, όταν αυτό είναι ευλόγως εφικτό».

2.7. Ικανότητα ανίχνευσης διαλογής (CCβ)

Για τις μεθόδους διαλογής προσδιορίζεται η CCβ, η οποία καθορίζεται όπως ορίζεται στα «Κριτήρια επιδόσεων και άλλες απαιτήσεις για τις αναλυτικές μεθόδους» (κεφάλαιο 1 του παρόντος παραρτήματος) και σύμφωνα με τις απαιτήσεις που παρατίθενται στον πίνακα 5. Ωστόσο, για τις μεθόδους διαλογής δεν χρειάζεται να εφαρμόζονται πλήρως οι απαιτήσεις για την ταυτοποίηση (βλέπε σημεία 1.2.3, 1.2.4, 1.2.5).

1. Για τις μη εγκεκριμένες ή τις απαγορευμένες φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες, εξασφαλίζεται μέγιστο σφάλμα τύπου β 5 %. Η CCβ υπολογίζεται ως εξής: α) Μέθοδος 1: διαδικασία καμπύλης βαθμονόμησης σύμφωνα με το πρότυπο ISO 11843-1:1997 (όπου αναφέρεται ως ελάχιστη ανιχνεύσιμη τιμή της μεταβλητής καθαρής κατάστασης). Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται αντιπροσωπευτικό τυφλό υλικό, το οποίο είναι εμβολιασμένο στην τιμή RPA και κάτω από αυτήν ή, αν δεν έχει καθοριστεί RPA, γύρω από την STC σε ισαπέχοντα βήματα. Αναλύονται τα δείγματα. Σχεδιάζεται η καμπύλη του σήματος έναντι της προστεθείσας συγκέντρωσης. Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στην STC συν 1,64 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας της μέσης μετρηθείσας περιεκτικότητας στην STC ισούται με την ικανότητα ανίχνευσης. Η παρέκταση πολύ κάτω από το χαμηλότερο επίπεδο εμβολιασμού (< 50 % του χαμηλότερου επιπέδου εμβολιασμού) επιβεβαιώνεται από τα πειραματικά δεδομένα στο στάδιο της επικύρωσης. β) Μέθοδος 2: διερεύνηση εμβολιασμένου τυφλού υλικού σε επίπεδα συγκέντρωσης στην τιμή STC και πάνω από αυτήν. Για κάθε συγκέντρωση αναλύονται 20 εμβολιασμένα τυφλά ώστε να εξασφαλίζεται αξιόπιστη βάση για τον προσδιορισμό αυτό. Το επίπεδο συγκέντρωσης στο οποίο το ποσοστό των ψευδώς συμμορφούμενων αποτελεσμάτων περιορίζεται σε ≤ 5 % ισούται με την ικανότητα ανίχνευσης της μεθόδου. γ) Μέθοδος 3: CCβ = STC + k(μονόπλευρη δοκιμή, 95 %) × (συνδυασμένη) τυπική αβεβαιότητα μέτρησης στην STC ή πάνω από αυτήν. Για τις μη εγκεκριμένες ή τις απαγορευμένες φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες, ανάλογα με το πείραμα επικύρωσης (και τους αντίστοιχους βαθμούς ελευθερίας), μπορεί εύλογα να εφαρμοστεί κατανομή t ή, εάν ληφθεί ως βάση η κατανομή Gauss (μονόπλευρη δοκιμή, n=∞), χρησιμοποιείται συντελεστής k ίσος με 1,64. Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα και η αληθότητα είναι κατάλληλες για τον καθορισμό της (συνδυασμένης) τυπικής αβεβαιότητας μέτρησης, εάν για τον προσδιορισμό τους λαμβάνονται υπόψη όλοι οι συναφείς επιδρώντες παράγοντες.

2. Για τις εγκεκριμένες ουσίες, εξασφαλίζεται μέγιστο σφάλμα τύπου β 5 %. Η CCβ υπολογίζεται ως εξής: α) Μέθοδος 1: με τη διαδικασία της καμπύλης βαθμονόμησης σύμφωνα με το πρότυπο ISO 11843-1:1997 (όπου αναφέρεται ως ελάχιστη ανιχνεύσιμη τιμή της μεταβλητής καθαρής κατάστασης). Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται αντιπροσωπευτικό τυφλό υλικό, το οποίο είναι εμβολιασμένο στο επιτρεπόμενο επίπεδο και κάτω από αυτό, σε ισαπέχοντα βήματα ξεκινώντας από την STC. Αναλύονται τα δείγματα και γίνεται ταυτοποίηση της ή των αναλυτέων ουσιών. Υπολογίζεται η τυπική απόκλιση της μέσης μετρηθείσας περιεκτικότητας στην STC. Η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στην STC συν 1,64 φορές την τυπική απόκλιση της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας της μέσης μετρηθείσας περιεκτικότητας στην STC ισούται με την ικανότητα ανίχνευσης. β) Μέθοδος 2: με διερεύνηση εμβολιασμένου τυφλού υλικού σε επίπεδα συγκέντρωσης κάτω από το επιτρεπόμενο όριο. Για κάθε συγκέντρωση αναλύονται 20 εμβολιασμένα τυφλά ώστε να εξασφαλίζεται αξιόπιστη βάση για τον προσδιορισμό αυτό. Το επίπεδο συγκέντρωσης στο οποίο το ποσοστό των ψευδώς συμμορφούμενων αποτελεσμάτων περιορίζεται σε ≤ 5 % ισούται με την ικανότητα ανίχνευσης της μεθόδου. γ) Μέθοδος 3: CCβ = STC + k(μονόπλευρη δοκιμή, 95 %) × (συνδυασμένη) τυπική αβεβαιότητα μέτρησης στην STC ή πάνω από αυτήν. Για τις εγκεκριμένες ουσίες, ανάλογα με το πείραμα επικύρωσης (και τους αντίστοιχους βαθμούς ελευθερίας), μπορεί εύλογα να εφαρμοστεί κατανομή t ή, εάν ληφθεί ως βάση η κατανομή Gauss (μονόπλευρη δοκιμή, n=∞), χρησιμοποιείται συντελεστής k ίσος με 1,64 (είτε χρησιμοποιείται ΑΟΚ εκ διαδοχής είτε κανονικό ΑΟΚ). Η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα και η αληθότητα είναι κατάλληλες για τον καθορισμό της (συνδυασμένης) τυπικής αβεβαιότητας μέτρησης, εάν για τον προσδιορισμό τους λαμβάνονται υπόψη όλοι οι συναφείς επιδρώντες παράγοντες. Για τις φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες για τις οποίες έχει καθοριστεί ΑΟΚ για το άθροισμα διαφόρων ουσιών, ως CCβ για την αξιολόγηση του αθροίσματος των ουσιών στο μετρούμενο δείγμα χρησιμοποιείται η CCβ της ουσίας με την υψηλότερη συγκέντρωση στο δείγμα.

2.8. Καμπύλες βαθμονόμησης

Όταν χρησιμοποιούνται καμπύλες βαθμονόμησης για την ποσοτικοποίηση:

(1) στη χάραξη της καμπύλης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον πέντε ισαπέχοντα επίπεδα (συμπεριλαμβανομένου του μηδενικού επιπέδου)·

(2) περιγράφεται το εύρος εργασίας της καμπύλης·

(3) περιγράφονται ο μαθηματικός τύπος της καμπύλης και ο έλεγχος καλής προσαρμογής των δεδομένων (συντελεστής προσδιορισμού R2) στην καμπύλη·

(4) περιγράφονται τα πεδία τιμών αποδοχής για τις παραμέτρους της καμπύλης.

Για τις καμπύλες βαθμονόμησης που βασίζονται σε πρότυπο διάλυμα, πρότυπα αντίστοιχης μήτρας ή πρότυπα εμβολιασμένης μήτρας, αναφέρονται τα αποδεκτά πεδία τιμών για τις παραμέτρους της καμπύλης βαθμονόμησης, που μπορεί να ποικίλλουν από σειρά σε σειρά.

2.9. Απόλυτη ανάκτηση

Η απόλυτη ανάκτηση της μεθόδου προσδιορίζεται όταν δεν χρησιμοποιείται εσωτερικό πρότυπο ή βαθμονόμηση διενεργούμενη με πρότυπο εμβολιασμένης μήτρας.

Όταν πληρούνται οι απαιτήσεις αληθότητας, όπως ορίζονται στον πίνακα 1, μπορεί να χρησιμοποιείται σταθερός διορθωτικός συντελεστής. Σε αντίθετη περίπτωση, χρησιμοποιείται ο συντελεστής ανάκτησης που προκύπτει για τη συγκεκριμένη παρτίδα. Εναλλακτικά, αντί για συντελεστή διόρθωσης ανάκτησης, χρησιμοποιείται η διαδικασία σταθερής προσθήκης (16) ή εσωτερικό πρότυπο.

Η απόλυτη ανάκτηση υπολογίζεται για τουλάχιστον έξι αντιπροσωπευτικές παρτίδες μήτρας.

Πριν από την εκχύλιση εμβολιάζεται κλάσμα τυφλού μήτρας με την αναλυτέα ουσία, ενώ μετά την προετοιμασία του δείγματος εμβολιάζεται δεύτερο κλάσμα τυφλού μήτρας σε κατάλληλο επίπεδο συγκέντρωσης και προσδιορίζεται η συγκέντρωση της αναλυτέας ουσίας.

Η ανάκτηση υπολογίζεται ως εξής:

Ανάκτηση (αναλυτέα ουσία) = (εμβαδόν κορυφής, πρότυπο εμβολιασμένης μήτρας)/(εμβαδόν κορυφής, πρότυπο αντίστοιχης μήτρας) × 100

2.10. Σχετική επίδραση μήτρας

Η σχετική επίδραση μήτρας προσδιορίζεται σε όλες τις περιπτώσεις. Αυτό μπορεί να γίνει είτε στο πλαίσιο της επικύρωσης είτε σε χωριστά πειράματα. Ο υπολογισμός της σχετικής επίδρασης μήτρας πραγματοποιείται για τουλάχιστον 20 διαφορετικές παρτίδες τυφλών (μήτρα/είδος), ανάλογα με το πεδίο εφαρμογής της μεθόδου, π.χ. τα διαφορετικά είδη που πρέπει να καλυφθούν.

Το τυφλό μήτρας θα πρέπει να εμβολιάζεται μετά την εκχύλιση με την αναλυτέα ουσία στην τιμή RPA, στο ΑΟΚ ή στο ΑΕ και θα πρέπει να αναλύεται μαζί με καθαρό διάλυμα της αναλυτέας ουσίας.

Η σχετική επίδραση μήτρας ή συντελεστής μήτρας (ΣΜ) υπολογίζεται ως εξής:

IS: εσωτερικό πρότυπο

ΠΑΜ: πρότυπο αντίστοιχης μήτρας

Ο συντελεστής μεταβλητότητας δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20 % για τον ΣΜ (πρότυπο κανονικοποιημένο για IS).

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΡΟΥΤΙΝΑΣ — ΔΙΑΡΚΗΣ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΔΟΣΕΩΝ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ

Πρέπει να πληρούνται οι απαιτήσεις που ορίζονται στο κεφάλαιο 7.7 του προτύπου ISO/IEC 17025:2017 (17) σχετικά με τη διασφάλιση της ποιότητας των αναλυτικών αποτελεσμάτων.

Κατά την ανάλυση ρουτίνας, η ανάλυση πιστοποιημένων υλικών αναφοράς είναι η προτιμότερη επιλογή για την τεκμηρίωση των επιδόσεων της μεθόδου. Δεδομένου ότι σπάνια υπάρχουν διαθέσιμα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς που να περιέχουν τις σχετικές αναλυτέες ουσίες στα απαιτούμενα επίπεδα συγκέντρωσης, μπορούν εναλλακτικά να χρησιμοποιούνται και υλικά αναφοράς τα οποία παρέχονται και χαρακτηρίζονται από τα εργαστήρια αναφοράς της ΕΕ ή εργαστήρια που διαθέτουν διαπίστευση ISO/IEC 17043:2010 (18). Ως άλλη εναλλακτική δυνατότητα μπορούν να χρησιμοποιούνται εσωτερικά υλικά αναφοράς, τα οποία ελέγχονται τακτικά.

Η διαρκής επαλήθευση των επιδόσεων της μεθόδου κατά τη διάρκεια ανάλυσης ρουτίνας θα πρέπει να διενεργείται στο στάδιο της διαλογής και στο στάδιο της επιβεβαίωσης.

1. Για το στάδιο της διαλογής: Για κάθε σειρά (παρτίδα) αναλύσεων που διενεργούνται, αναλύεται ταυτόχρονα σύνολο από τα ακόλουθα δείγματα ελέγχου ποιότητας: α) δείγμα ελέγχου για την καταλληλότητα του οργάνου ως σύστημα, το οποίο, ιδανικά, είναι ειδικό για τη συγκεκριμένη μέθοδο· β) δείγματα ελέγχου ποιότητας τα οποία εμβολιάζονται σε συγκέντρωση κοντά στην STC και, ιδανικά, στη CCβ της διαλογής για εγκεκριμένες φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες, καθώς και για απαγορευμένες ή μη εγκεκριμένες ουσίες· γ) συμμορφούμενο δείγμα ελέγχου (τυφλά δείγματα) και, κατά περίπτωση, τυφλά αντιδραστηρίου.

2. Για το στάδιο της επιβεβαίωσης: Για κάθε σειρά (παρτίδα) αναλύσεων που διενεργούνται, αναλύεται ταυτόχρονα σύνολο από τα ακόλουθα δείγματα ελέγχου ποιότητας: α) δείγμα ελέγχου για την καταλληλότητα του οργάνου ως σύστημα, το οποίο, ιδανικά, είναι ειδικό για τη συγκεκριμένη μέθοδο· β) δείγματα ελέγχου ποιότητας τα οποία εμβολιάζονται σε συγκέντρωση κοντά στο ΑΟΚ ή το ΑΕ για εγκεκριμένες φαρμακολογικώς δραστικές ουσίες ή κοντά στο RPA ή το LCL για απαγορευμένες ή μη εγκεκριμένες ουσίες (μη συμμορφούμενα δείγματα ελέγχου)· γ) συμμορφούμενο δείγμα ελέγχου (τυφλά δείγματα) και, κατά περίπτωση, τυφλά αντιδραστηρίου.

Για τα δείγματα ελέγχου ποιότητας συνιστάται η ακόλουθη σειρά: δείγμα ελέγχου για την καταλληλότητα του οργάνου, συμμορφούμενο δείγμα ελέγχου, δείγμα/-τα προς επιβεβαίωση, ξανά συμμορφούμενο δείγμα ελέγχου και εμβολιασμένο δείγμα ελέγχου ποιότητας (μη συμμορφούμενα δείγματα ελέγχου).

Για τις ποσοτικές μεθόδους, με κάθε παρτίδα επίσημων δειγμάτων, αναλύεται και μετράται καμπύλη βαθμονόμησης πριν ή μετά τα προαναφερθέντα δείγματα.

Όταν είναι εφικτό, αξιολογείται η αληθότητα (με βάση εμπλουτισμένα δείγματα) όλων των αναλυτέων ουσιών-στόχων στα μη συμμορφούμενα δείγματα ελέγχου μέσω διαγραμμάτων ελέγχου ποιότητας, σύμφωνα με το κεφάλαιο 7.7 του προτύπου ISO/IEC 17025:2017. Εάν αυτό απαιτεί δυσανάλογα μεγάλο αριθμό προσδιορισμών αληθότητας, ο αριθμός των αναλυτέων ουσιών μπορεί να μειωθεί σε έναν περιορισμένο αριθμό αντιπροσωπευτικών αναλυτέων ουσιών.

ΚΕΦΆΛΑΙΟ 4

ΕΠΈΚΤΑΣΗ ΤΟΥ ΕΠΙΚΥΡΩΜΈΝΟΥ ΠΕΔΊΟΥ ΕΦΑΡΜΟΓΉΣ ΜΙΑΣ ΉΔΗ ΕΠΙΚΥΡΩΜΈΝΗΣ ΜΕΘΌΔΟΥ

Μερικές φορές είναι αναγκαίο να επεκταθεί το πεδίο εφαρμογής μιας μεθόδου που έχει ήδη επικυρωθεί πλήρως. Στις περιπτώσεις αυτές, η επέκταση του πεδίου εφαρμογής θα πρέπει να πραγματοποιείται με τρόπο αποδοτικό και ενδεδειγμένο από αναλυτικής άποψης τρόπο. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με τη διενέργεια επικύρωσης σε μειωμένο αριθμό δειγμάτων (π.χ. τα μισά δείγματα) σε σύγκριση με μια πλήρη επικύρωση.

Ωστόσο, ο τύπος και ο αριθμός των τροποποιήσεων που μπορούν να επικυρωθούν σε μία μοναδική διαδικασία επικύρωσης με μειωμένο αριθμό δειγμάτων πρέπει πάντα να βασίζεται σε εμπειρογνωσία και προηγούμενες εμπειρίες. Για παράδειγμα, μια μεταβολή στην τεχνική ανίχνευσης θα απαιτούσε πλήρη επικύρωση σε κάθε περίπτωση.

Γενικά, για να διασφαλίζεται ότι η μέθοδος παραμένει έγκυρη, οι επιδόσεις της παρακολουθούνται συνεχώς και συγκρίνονται με τις παραμέτρους επικύρωσης που είχαν ληφθεί αρχικά. Ιδανικά, αυτός ο διαρκής έλεγχος επιδόσεων της μεθόδου είναι σχεδιασμένος κατά τρόπο ώστε τα δεδομένα που λείπουν για πλήρη επικύρωση να μπορούν να συλλέγονται με την πάροδο του χρόνου (π.χ. με λίγα σημεία δεδομένων από δείγματα ελέγχου ποιότητας σε κάθε αναλυτική σειρά).

4.1. Επέκταση μεθόδων όσον αφορά την κλίμακα συγκεντρώσεων

Λόγω μεταβολών στα ΑΟΚ, τα ΑΕ και τα RPA μπορεί να καταστεί αναγκαία η προσαρμογή της κλίμακας συγκεντρώσεων για την οποία έχει επικυρωθεί μια μέθοδος. Στην περίπτωση αυτή, γίνεται δεκτή η εφαρμογή διαδικασίας μειωμένης επικύρωσης.

Οι καμπύλες βαθμονόμησης για την τροποποιημένη κλίμακα θα πρέπει να σχεδιάζονται σύμφωνα με την επικυρωμένη διαδικασία. Θα πρέπει να αναλύονται διάφορες παρτίδες εμβολιασμένες σε διαφορετικά επίπεδα συγκέντρωσης (βλέπε σημεία 2.2.1, 2.2.2). Η αληθότητα, η επαναληψιμότητα και η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα/ενδιάμεση ακρίβεια θα πρέπει να βρίσκονται εντός αποδεκτού εύρους σε σύγκριση με εκείνες της αρχικά επικυρωμένης μεθόδου. Κατά περίπτωση, θα πρέπει να πραγματοποιείται εκ νέου υπολογισμός της CCβ (μέθοδοι διαλογής) και του CCα (μέθοδοι επιβεβαίωσης).

4.2. Επέκταση μεθόδων όσον αφορά πρόσθετες ουσίες

Σε γενικές γραμμές, επέκταση της μεθόδου σε πρόσθετες ενώσεις μπορεί να γίνει μόνο για αναλυτέες ουσίες οι οποίες είναι παρόμοιες ως προς τη δομή και τα χαρακτηριστικά σε σύγκριση μ’ εκείνες που περιλαμβάνονται ήδη στην αναλυτική μέθοδο. Στην περίπτωση αυτή, γίνεται δεκτή η εφαρμογή διαδικασίας μειωμένης επικύρωσης. Ομοίως, δεν επιτρέπεται καμία απόκλιση από την περιγραφή της μεθόδου.

Οι καμπύλες βαθμονόμησης για τις πρόσθετες ουσίες θα πρέπει να σχεδιάζονται σύμφωνα με την επικυρωμένη διαδικασία. Θα πρέπει να αναλύονται διάφορες παρτίδες υλικών μήτρας εμβολιασμένες σε διαφορετικά επίπεδα συγκέντρωσης (βλέπε σημεία 2.2.1, 2.2.2). Η αληθότητα, η επαναληψιμότητα και η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα/ενδιάμεση ακρίβεια θα πρέπει να βρίσκονται εντός συγκρίσιμου εύρους μ’ εκείνες για τις άλλες αναλυτέες ουσίες της αρχικά επικυρωμένης μεθόδου και να είναι σύμφωνες με τις απαιτήσεις του σημείου 1.2.2. Πρέπει να πραγματοποιείται υπολογισμός της CCβ (μέθοδοι διαλογής) και του CCα (μέθοδοι επιβεβαίωσης) για τις νέες αναλυτέες ουσίες.

4.3. Επέκταση μεθόδων όσον αφορά νέες μήτρες/είδη

Η συμπερίληψη νέων μητρών ή ειδών σε μια ήδη επικυρωμένη αναλυτική μέθοδο αποφασίζεται πάντοτε κατά περίπτωση, με βάση τις γνώσεις και τις εμπειρίες που έχουν αποκτηθεί μέχρι στιγμής με τη μέθοδο και τα προκαταρκτικά πειράματα με τα οποία αξιολογούνται πιθανές επιδράσεις της μήτρας και παρεμποδίσεις. Γενικά, αυτό θα είναι δυνατό μόνο για μήτρες που παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες και για μη κρίσιμες αναλυτέες ουσίες (σταθερότητα, ανιχνευσιμότητα).

Οι καμπύλες βαθμονόμησης (πρότυπο ή μήτρα) θα πρέπει να σχεδιάζονται σύμφωνα με την επικυρωμένη διαδικασία. Θα πρέπει να αναλύονται διάφορες παρτίδες υλικού μήτρας εμβολιασμένες σε διαφορετικά επίπεδα συγκέντρωσης (βλέπε σημεία 2.2.1, 2.2.2). Η αληθότητα, η επαναληψιμότητα και η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα/ενδιάμεση ακρίβεια θα πρέπει να βρίσκονται εντός αποδεκτού εύρους σε σχέση μ’ εκείνες της αρχικά επικυρωμένης μεθόδου και να είναι σύμφωνες με τις απαιτήσεις του σημείου 1.2.2. Ανάλογα με την προσέγγιση ως προς την επικύρωση, ενδέχεται να χρειαστεί εκ νέου υπολογισμός της CCβ (μέθοδοι διαλογής) ή του CCα (μέθοδοι επιβεβαίωσης).

Εάν τα αποτελέσματα δεν βρίσκονται εντός αποδεκτού εύρους σε σύγκριση με τις τιμές για την αρχική μήτρα, θα χρειαστεί πρόσθετη πλήρης επικύρωση, προκειμένου να προσδιοριστούν οι ειδικές παράμετροι επιδόσεων μήτρας/είδους.

Στις περιπτώσεις όπου τα ΑΟΚ για μια συγκεκριμένη ουσία διαφέρουν για ορισμένες μήτρες, θα είναι πιθανότατα δύσκολο να προσαρμοστεί το πεδίο εφαρμογής της μεθόδου στην πρόσθετη μήτρα/είδος και συγκέντρωση, δεδομένου ότι στην περίπτωση αυτή πρέπει να εξεταστούν δύο τροποποιήσεις. Στις περιπτώσεις αυτές συνιστάται πλήρης επικύρωση.

(1) Η συγχρωματογραφία είναι διαδικασία κατά την οποία το εκχύλισμα του δείγματος μοιράζεται σε δύο μέρη πριν από τη χρωματογραφία. Ένα μέρος υποβάλλεται σε χρωματογραφία ως έχει. Το δεύτερο μέρος αναμειγνύεται με την πρότυπη αναλυτέα ουσία που πρόκειται να μετρηθεί. Στη συνέχεια, το μείγμα αυτό υποβάλλεται επίσης σε χρωματογραφία. Η ποσότητα της προστιθέμενης πρότυπης αναλυτέας ουσίας πρέπει να είναι όμοια με την εκτιμώμενη ποσότητα της αναλυτέας ουσίας στο εκχύλισμα. Η συγχρωματογραφία έχει σχεδιαστεί για τη βελτίωση της ταυτοποίησης της αναλυτέας ουσίας όταν χρησιμοποιούνται χρωματογραφικές μέθοδοι, ιδίως όταν δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατάλληλο εσωτερικό πρότυπο.

(*) Ο αναγραφόμενος CV (%) συνιστά κατευθυντήρια γραμμή και θα πρέπει να είναι ο χαμηλότερος ευλόγως εφικτός.

(a) α Δεν λαμβάνεται πρόσθετο σημείο ταυτοποίησης για την επιλογή του πρόδρομου ιόντος, εάν το εν λόγω πρόδρομο ιόν είναι το ίδιο ιόν (ή ένωση προσθήκης ή ισότοπο) με το ιόν HRMS που παρακολουθείται σε πλήρη σάρωση.

(#) Εάν τα δεδομένα σταθερότητας για τις αναλυτέες ουσίες σε μια μήτρα είναι διαθέσιμα από την επιστημονική βιβλιογραφία ή από άλλο εργαστήριο, τα δεδομένα αυτά δεν χρειάζεται να προσδιοριστούν εκ νέου από το οικείο εργαστήριο. Ωστόσο, η αναφορά στα διαθέσιμα δεδομένα σταθερότητας των αναλυτέων ουσιών σε διάλυμα είναι αποδεκτή μόνο εάν εφαρμόζονται ταυτόσημες συνθήκες.

(*) Αφορά μεθόδους MS, ώστε να αποδεικνύεται μέσω της επικύρωσης ότι πληρούνται οι απαιτήσεις για τα χαρακτηριστικά επιδόσεων. Η σχετική επίδραση μήτρας της μεθόδου προσδιορίζεται όταν η επίδραση αυτή δεν αξιολογήθηκε κατά τη διάρκεια της διαδικασίας επικύρωσης. Η απόλυτη ανάκτηση της μεθόδου προσδιορίζεται όταν δεν χρησιμοποιείται εσωτερικό πρότυπο ή βαθμονόμηση διενεργούμενη με πρότυπο εμβολιασμένης μήτρας.

(2) ISO 5725-4:2020 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method (Clause 3) [Ορθότητα αποτελεσμάτων και μεθόδων μέτρησης (αληθότητα και ακρίβεια) - Μέρος 4: Βασικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό της αληθότητας πρότυπης μεθόδου μέτρησης (ρήτρα 3)].

(3) Όταν, για μη επιτρεπόμενη φαρμακολογικώς δραστική ουσία, δεν είναι ευλόγως εφικτή η επικύρωση συγκέντρωσης ίσης με την τιμή RPA επί 0,5, η συγκέντρωση RPA επί 0,5 μπορεί να αντικατασταθεί από τη χαμηλότερη συγκέντρωση μεταξύ RPA επί 0,5 και RPA επί 1,0 η οποία είναι ευλόγως εφικτή.

(4) Όταν, για συγκεκριμένη φαρμακολογικώς δραστική ουσία, δεν είναι ευλόγως εφικτή η επικύρωση συγκέντρωσης ίσης με το ΑΟΚ επί 0,1, η συγκέντρωση ΑΟΚ επί 0,1 μπορεί να αντικατασταθεί από τη χαμηλότερη συγκέντρωση μεταξύ ΑΟΚ επί 0,1 και ΑΟΚ επί 0,5 η οποία είναι ευλόγως εφικτή.

(5) Όταν, για μη επιτρεπόμενη φαρμακολογικώς δραστική ουσία, δεν είναι ευλόγως εφικτή η επικύρωση συγκέντρωσης ίσης με την τιμή RPA επί 0,5, η συγκέντρωση RPA επί 0,5 μπορεί να αντικατασταθεί από τη χαμηλότερη συγκέντρωση μεταξύ RPA επί 0,5 και RPA επί 1,0 η οποία είναι ευλόγως εφικτή.

(6) Όταν, για συγκεκριμένη φαρμακολογικώς δραστική ουσία, δεν είναι ευλόγως εφικτή η επικύρωση συγκέντρωσης ίσης με το ΑΟΚ επί 0,1, η συγκέντρωση ΑΟΚ επί 0,1 μπορεί να αντικατασταθεί από τη χαμηλότερη συγκέντρωση μεταξύ ΑΟΚ επί 0,1 και ΑΟΚ επί 0,5 η οποία είναι ευλόγως εφικτή.

(7) ISO 5725-2:2019 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method (Clause 3) [Ορθότητα αποτελεσμάτων και μεθόδων μέτρησης (αληθότητα και ακρίβεια) - Μέρος 4: Βασική μέθοδος για τον προσδιορισμό της επαναληψιμότητας και της αναπαραγωγιμότητας πρότυπης μεθόδου μέτρησης (ρήτρα 3)].

(8) ISO 11843-1:1997 Capability of detection – Part 1: Terms and definitions (Ικανότητα ανίχνευσης – Μέρος 1: Όροι και ορισμοί).

(9) Επιτροπή του Codex Alimentarius, Οργανισμός Τροφίμων και Γεωργίας των Ηνωμένων Εθνών/Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας, Guidelines on estimation of uncertainty of results (Κατευθυντήριες γραμμές σχετικά με την εκτίμηση της αβεβαιότητας των αποτελεσμάτων) (CAC/GL 59-2006).

(10) Οι μεταβολές στις πειραματικές συνθήκες που αναφέρονται εδώ μπορούν να αφορούν τα υλικά των δειγμάτων, τις αναλυτέες ουσίες, τις συνθήκες αποθήκευσης, τις περιβαλλοντικές συνθήκες και/ή τις συνθήκες προετοιμασίας των δειγμάτων. Για όλες τις πειραματικές συνθήκες οι οποίες μπορεί στην πράξη να υπόκεινται σε διακυμάνσεις (π.χ. σταθερότητα των αντιδραστηρίων, σύνθεση του δείγματος, pH, θερμοκρασία), αναφέρεται κάθε μεταβολή που θα μπορούσε να επηρεάσει το αναλυτικό αποτέλεσμα.

(11) Jülicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 120, 173.

(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.

(13) Gowik, P., Jülicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221.

(14) ISO 11843-1:1997 Capability of detection – Part 1: Terms and definitions (Ικανότητα ανίχνευσης – Μέρος 1: Όροι και ορισμοί).

(15) Εκτελεστικός κανονισμός (ΕΕ) 2018/470 της Επιτροπής, της 21ης Μαρτίου 2018, για λεπτομερείς κανόνες σχετικά με το ανώτατο όριο καταλοίπων που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη για τον έλεγχο τροφίμων που παράγονται από ζώα τα οποία έχουν λάβει θεραπευτική αγωγή στην ΕΕ σύμφωνα με το άρθρο 11 της οδηγίας 2001/82/ΕΚ (ΕΕ L 79 της 22.3.2018, σ. 16).

(16) Η ποσότητα της πρότυπης αναλυτέας ουσίας που προστίθεται μπορεί να είναι, για παράδειγμα, διπλάσια έως πενταπλάσια από την εκτιμώμενη ποσότητα της αναλυτέας ουσίας στο δείγμα. Η διαδικασία αυτή έχει σχεδιαστεί για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας μιας αναλυτέας ουσίας σε ένα δείγμα, λαμβανομένης υπόψη της ανάκτησης της αναλυτικής διαδικασίας.

(17) ISO/IEC 17025:2017 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories (Chapter 7.7) [Γενικές απαιτήσεις για την ικανότητα των εργαστηρίων δοκιμών και διακριβώσεων (κεφάλαιο 7.7)].

(18) ISO/IEC 17043:2010 Conformity assessment – General requirements for proficiency testing (Αξιολόγηση συμμόρφωσης – Γενικές απαιτήσεις για δοκιμές ικανότητας).