6)

Προστίθενται τα ακόλουθα κεφάλαια Γ.31 έως Γ.46: « Γ.31. ΔΟΚΙΜΗ ΣΕ ΧΕΡΣΑΙΑ ΦΥΤΑ: ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΔΥΣΗΣ ΣΠΟΡΟΦΥΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΠΟΡΟΦΥΤΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η παρούσα μέθοδος δοκιμής είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 208 του ΟΟΣΑ (2006). Οι μέθοδοι δοκιμών επανεξετάζονται περιοδικά με βάση την επιστημονική πρόοδο και την εφαρμοσιμότητά τους στην κανονιστική χρήση. Η παρούσα επικαιροποιημένη μέθοδος δοκιμών έχει σχεδιαστεί με σκοπό να εκτιμηθούν οι δυνητικές επιδράσεις των χημικών ουσιών στην ανάδυση και την ανάπτυξη σποροφύτων. Ως τέτοια, δεν καλύπτει τις χρόνιες επιδράσεις ή τις επιδράσεις στην αναπαραγωγή (δηλ. σπορόδεση, σχηματισμός ανθέων, ωρίμανση καρπών). Πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι συνθήκες έκθεσης και οι ιδιότητες της χημικής ουσίας που πρόκειται να υποβληθεί σε δοκιμή, ώστε να εξασφαλίζεται ότι χρησιμοποιούνται οι ενδεικνυόμενες μέθοδοι δοκιμών (π.χ. κατά τη δοκιμή μετάλλων / μεταλλικών ενώσεων θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι επιδράσεις του pH και των αντίστοιχων αντισταθμιστικών ιόντων) (1). Η παρούσα μέθοδος δοκιμών δεν αφορά τα φυτά που εκτίθενται σε ατμούς χημικών ουσιών. Η μέθοδος εφαρμόζεται στις δοκιμές χημικών ουσιών εν γένει, βιοκτόνων και προϊόντων προστασίας των καλλιεργειών (γνωστών και ως φυτοπροστατευτικών προϊόντων ή παρασιτοκτόνων). Έχει αναπτυχθεί με βάση υφιστάμενες μεθόδους (2) (3) (4) (5) (6) (7). Ελήφθησαν επίσης υπόψη άλλες παραπομπές που αφορούν τις δοκιμές σε φυτά (8) (9) (10). Οι ορισμοί που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στο προσάρτημα 1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 2. Η δοκιμή εκτιμά τις επιδράσεις στην ανάδυση σποροφύτων και την αρχική ανάπτυξη ανώτερων φυτών έπειτα από έκθεση στην υπό δοκιμή χημική ουσία στο έδαφος (ή σε άλλη κατάλληλη μήτρα εδάφους). Οι σπόροι τοποθετούνται σε έδαφος που έχει υποστεί αγωγή με την υπό δοκιμή χημική ουσία, και εκτιμώνται οι επιδράσεις μετά την πάροδο συνήθως 14 έως 21 ημερών έπειτα από ανάδυση του 50 % των σποροφύτων στην ομάδα ελέγχου. Τα μετρούμενα τελικά σημεία είναι η οπτική εκτίμηση της ανάδυσης σποροφύτων, το ξηρό βάρος των βλαστών (εναλλακτικά, το υγρό βάρος των βλαστών) και, σε ορισμένες περιπτώσεις, το ύψος των βλαστών, καθώς και η εκτίμηση των εμφανών βλαβερών επιδράσεων σε διάφορα μέρη του φυτού. Αυτές οι μετρήσεις και οι παρατηρήσεις συγκρίνονται με τις αντίστοιχες για τα φυτά ελέγχου που δεν έχουν υποβληθεί σε αγωγή. 3. Ανάλογα με την αναμενόμενη οδό έκθεσης, η υπό δοκιμή χημική ουσία είτε ενσωματώνεται στο έδαφος (ή, ενδεχομένως, σε τεχνητή μήτρα εδάφους) είτε εφαρμόζεται στην επιφάνεια του εδάφους, κάτι που αντιπροσωπεύει ακριβώς την πιθανή οδό έκθεσης στη χημική ουσία. Η ενσωμάτωση στο έδαφος πραγματοποιείται με αγωγή του χύδην εδάφους. Μετά την εφαρμογή, το έδαφος μεταφέρεται σε δοχεία και, στη συνέχεια, οι σπόροι του συγκεκριμένου είδους φυτού φυτεύονται στο έδαφος. Οι επιφανειακές εφαρμογές πραγματοποιούνται σε έδαφος μέσα σε δοχείο στο οποίο έχουν ήδη φυτευθεί οι σπόροι. Στη συνέχεια, οι μονάδες δοκιμής (μάρτυρες και εδάφη που έχουν υποστεί αγωγή συν σπόροι) τοποθετούνται σε κατάλληλες συνθήκες που ευνοούν την εκβλάστηση/ανάπτυξη των φυτών. 4. Ανάλογα με τον επιδιωκόμενο σκοπό, η δοκιμή μπορεί να διεξάγεται για τον προσδιορισμό της καμπύλης δόσης-απόκρισης, ή σε μία συγκέντρωση/ποσότητα ως οριακή δοκιμή. Εάν τα αποτελέσματα από τη δοκιμή σε μία συγκέντρωση/ποσότητα υπερβαίνουν ένα συγκεκριμένο όριο τοξικότητας (π.χ. εάν διαπιστώνονται επιδράσεις που υπερβαίνουν το x %), διενεργείται δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών με σκοπό να προσδιοριστεί το ανώτερο και το κατώτερο όριο τοξικότητας και, στη συνέχεια, δοκιμή σε πολλαπλές συγκεντρώσεις/ποσότητες, με σκοπό τη χάραξη καμπύλης δόσης-απόκρισης. Εφαρμόζεται κατάλληλη στατιστική ανάλυση, για να ληφθεί η αποτελεσματική συγκέντρωση ECx ή η αποτελεσματική ποσότητα εφαρμογής ERx (π.χ. EC25, ER25, EC50, ER50) για την(τις) πιο ευαίσθητη(-ες) ενδεικνυόμενη(-ες) παράμετρο(-τρους). Με αυτή τη δοκιμή μπορούν επίσης να υπολογιστούν η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC) και η κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης (LOEC). ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟ ΔΟΚΙΜΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ 5. Οι ακόλουθες πληροφορίες είναι χρήσιμες για τον καθορισμό της αναμενόμενης οδού έκθεσης στη χημική ουσία και για τον σχεδιασμό της δοκιμής: ο συντακτικός τύπος, η καθαρότητα, η υδατοδιαλυτότητα, η διαλυτότητα σε οργανικούς διαλύτες, ο συντελεστής κατανομής σε 1-οκτανόλη/νερό, η προσροφητική συμπεριφορά του εδάφους, η τάση ατμών, η χημική σταθερότητα στο νερό και στο φως, και η βιοαποικοδομησιμότητα. ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 6. Η δοκιμή θεωρείται έγκυρη, εάν διαπιστώνεται κατόπιν ελέγχων ότι ικανοποιούνται τα ακόλουθα κριτήρια επιδόσεων: — η ανάδυση σποροφύτων είναι τουλάχιστον 70 %· — τα σπορόφυτα δεν παρουσιάζουν εμφανείς φυτοτοξικές επιδράσεις (π.χ. χλώρωση, νέκρωση, μάρανση, παραμόρφωση των φύλλων και των μίσχων) και τα φυτά παρουσιάζουν μόνο τη συνηθισμένη, για το συγκεκριμένο είδος, διακύμανση ως προς την ανάπτυξη και τη μορφολογία· — η μέση επιβίωση των σποροφύτων ελέγχου που έχουν αναδυθεί είναι τουλάχιστον 90 % κατά τη διάρκεια της δοκιμής· — οι περιβαλλοντικές συνθήκες για ένα συγκεκριμένο είδος είναι ταυτόσημες και τα θρεπτικά μέσα περιέχουν την ίδια ποσότητα μήτρας εδάφους, υποστηρικτικών θρεπτικών μέσων, ή υποστρώματος από την ίδια πηγή. ΧΗΜΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ 7. Η χημική ουσία αναφοράς μπορεί να υποβάλλεται σε δοκιμή ανά τακτά χρονικά διαστήματα, για να επαληθευτεί ότι η εκτέλεση της δοκιμής και η απόκριση των συγκεκριμένων φυτών της δοκιμής, καθώς και οι συνθήκες της δοκιμής δεν έχουν μεταβληθεί σημαντικά με την πάροδο του χρόνου. Εναλλακτικά, θα μπορούσαν να χρησιμοποιούνται οι παλαιότερες μετρήσεις της βιομάζας ή της ανάπτυξης των μαρτύρων, ώστε να αξιολογούνται οι επιδόσεις του συστήματος δοκιμής σε συγκεκριμένα εργαστήρια, και να λειτουργούν ως μέτρα ελέγχου της ενδοεργαστηριακής ποιότητας. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Φυσικό έδαφος — Τεχνητό υπόστρωμα 8. Τα φυτά μπορούν να αναπτύσσονται σε δοχεία με αμμώδη πηλό, πηλώδη άμμο ή αμμοαργιλώδη πηλό, που να περιέχει έως 1,5 τοις εκατό οργανικό άνθρακα (περίπου 3 τοις εκατό οργανική ύλη). Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί χώμα εμπορίου για γλάστρες ή μείγμα συνθετικού εδάφους που να περιέχει έως 1,5 τοις εκατό οργανικό άνθρακα. Τα αργιλώδη εδάφη δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται, εάν είναι γνωστό ότι η υπό δοκιμή χημική ουσία έχει υψηλή συγγένεια με την άργιλο. Το έδαφος αγρού θα πρέπει να διέρχεται από κόσκινο με οπές μεγέθους 2 mm, ώστε να ομογενοποιείται και να απομακρύνονται τα χονδρόκοκκα σωματίδια. Θα πρέπει να δηλώνονται ο τύπος και η υφή, το ποσοστό (%) οργανικού άνθρακα, το pH και η περιεκτικότητα σε άλατα, καθώς και η ηλεκτρονική αγωγιμότητα του τελικού προετοιμασμένου εδάφους. Το έδαφος θα πρέπει να ταξινομείται σύμφωνα με τυποποιημένο σύστημα ταξινόμησης (11). Το έδαφος θα μπορούσε να υποβάλλεται σε παστερίωση ή σε θερμική επεξεργασία, ώστε να μειώνεται η επίδραση των παθογόνων του εδάφους. 9. Το φυσικό έδαφος μπορεί να περιπλέξει την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και να αυξήσει τη μεταβλητότητα, λόγω των διαφορετικών φυσικών/χημικών ιδιοτήτων και μικροβιακών πληθυσμών. Με τη σειρά τους, αυτές οι μεταβλητές μεταβάλλουν την ικανότητα κατακράτησης υγρασίας, την ικανότητα δημιουργίας χημικών δεσμών, τον αερισμό και την περιεκτικότητα σε θρεπτικά στοιχεία και ιχνοστοιχεία. Εκτός από τη μεταβλητότητα των συγκεκριμένων φυσικών παραγόντων, θα υπάρξει μεταβλητότητα και στις χημικές ιδιότητες, όπως στο pH και στο οξειδοαναγωγικό δυναμικό, οι οποίες ενδέχεται να επηρεάσουν τη βιοδιαθεσιμότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (12) (13) (14). 10. Κατά κανόνα, τα τεχνητά υποστρώματα δεν χρησιμοποιούνται για τη διεξαγωγή δοκιμών σε φυτοπροστατευτικά προϊόντα, αλλά μπορεί να χρησιμοποιούνται για τη διεξαγωγή δοκιμών σε χημικές ουσίες εν γένει ή όταν είναι επιθυμητό να ελαχιστοποιηθεί η μεταβλητότητα των φυσικών εδαφών και να αυξηθεί η συγκρισιμότητα των αποτελεσμάτων των δοκιμών. Τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται θα πρέπει να αποτελούνται από αδρανή υλικά που ελαχιστοποιούν την αλληλεπίδραση με την υπό δοκιμή χημική ουσία, τον φορέα διαλύτη, ή και τα δύο. Έχει διαπιστωθεί ότι η εκπλυμένη με οξύ χαλαζιακή άμμος, ο ορυκτοβάμβακας και τα γυάλινα σφαιρίδια (π.χ. με διάμετρο 0,35 έως 0,85 mm) συνιστούν κατάλληλα αδρανή υλικά που απορροφούν ελάχιστα την υπό δοκιμή χημική ουσία (15), εξασφαλίζοντας έτσι τη μέγιστη διαθεσιμότητα της χημικής ουσίας στο σπορόφυτο μέσω πρόσληψης από τις ρίζες. Ορισμένα από τα ακατάλληλα υποστρώματα είναι ο βερμικουλίτης, ο περλίτης και άλλα εξαιρετικά απορροφητικά υλικά. Θα πρέπει να παρέχονται τα θρεπτικά στοιχεία για την ανάπτυξη των φυτών, ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα φυτά δεν υφίστανται καταπόνηση λόγω ανεπάρκειας θρεπτικών στοιχείων, κάτι που θα πρέπει να εκτιμάται, όταν είναι εφικτό, μέσω χημικής ανάλυσης ή με οπτική αξιολόγηση των φυτών ελέγχου. Κριτήρια για την επιλογή των υπό δοκιμή ειδών 11. Τα είδη που επιλέγονται θα πρέπει να ανήκουν σε ικανοποιητικά εκτενές φάσμα –π.χ. όσον αφορά την ταξινομική πολυμορφία τους στο φυτικό βασίλειο, την κατανομή τους, την αφθονία τους, τα χαρακτηριστικά του κύκλου ζωής τους και την περιοχή της φυσικής παρουσίας τους–, ώστε να αναπτύσσεται ένα εύρος αποκρίσεων (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Για την επιλογή θα πρέπει να εξετάζονται τα ακόλουθα χαρακτηριστικά των πιθανών υπό δοκιμή ειδών: — τα είδη έχουν ομοιόμορφους σπόρους οι οποίοι είναι άμεσα διαθέσιμοι από αξιόπιστες τυποποιημένες πηγές και παράγουν σταθερή, αξιόπιστη και ομοιόμορφη εκβλάστηση, καθώς και ομοιόμορφη ανάπτυξη των σποροφύτων· — τα φυτά μπορούν να υποβάλλονται σε δοκιμές στο εργαστήριο και μπορούν να παράγουν αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα εντός της ίδιας εγκατάστασης δοκιμών ή μεταξύ διαφορετικών εγκαταστάσεων δοκιμών· — η ευαισθησία των υπό δοκιμή ειδών θα πρέπει να αντιστοιχεί στις αποκρίσεις των φυτών τα οποία βρίσκονται στο περιβάλλον που εκτίθεται στη χημική ουσία· — έχουν χρησιμοποιηθεί, ως έναν βαθμό, σε προηγούμενες δοκιμές τοξικότητας και η χρήση τους –π.χ. σε βιοδοκιμασίες ζιζανιοκτόνων, στο κοσκίνισμα βαρέων μετάλλων, σε δοκιμές αντοχής στην αλατότητα ή σε ανόργανες ουσίες, ή σε μελέτες αλληλοπάθειας– παρουσιάζει ευαισθησία σε μεγάλο φάσμα παραγόντων καταπόνησης· — είναι συμβατά με τις συνθήκες ανάπτυξης της μεθόδου δοκιμών· — πληρούν τα κριτήρια εγκυρότητας της δοκιμής. Ορισμένα από τα είδη που έχουν χρησιμοποιηθεί συχνότερα σε δοκιμές κατά το παρελθόν παρατίθενται στο προσάρτημα 2, και τα πιθανά μη καλλιεργούμενα είδη παρατίθενται στο προσάρτημα 3. 12. Ο αριθμός των ειδών που θα υποβληθούν σε δοκιμές εξαρτάται από τις σχετικές κανονιστικές απαιτήσεις και, ως εκ τούτου, δεν προσδιορίζεται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών. Εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας 13. Η χημική ουσία θα πρέπει να εφαρμόζεται σε κατάλληλο φορέα (π.χ. νερό, ακετόνη, αιθανόλη, αιθυλενογλυκόλη, αραβικό κόμμι, άμμος). Μπορούν επίσης να υποβληθούν σε δοκιμή τα μείγματα (παρασκευασμένα προϊόντα ή παρασκευάσματα) που περιέχουν ενεργά συστατικά και διάφορες βοηθητικές ουσίες. Ενσωμάτωση στο έδαφος ή σε τεχνητό υπόστρωμα 14. Οι χημικές ουσίες που είναι υδατοδιαλυτές ή αιωρούνται στο νερό μπορούν να προστίθενται σε νερό και, στη συνέχεια, το διάλυμα αναμειγνύεται με έδαφος με τη βοήθεια κατάλληλης διάταξης ανάδευσης. Αυτός ο τύπος δοκιμής μπορεί να ενδείκνυται σε περίπτωση που η έκθεση στη χημική ουσία πραγματοποιείται μέσω του εδάφους ή του ενδοπορικού νερού του εδάφους, και εάν υπάρχει κίνδυνος πρόσληψης από τις ρίζες. Η προσθήκη της υπό δοκιμή χημικής ουσίας δεν θα πρέπει να υπερβαίνει την υδατοχωρητικότητα του εδάφους. Ο όγκος του προστιθέμενου νερού θα πρέπει να είναι ίδιος για κάθε συγκέντρωση δοκιμής, αλλά θα πρέπει να είναι περιορισμένος ώστε να αποφεύγεται ο σχηματισμός συσσωματωμάτων εδάφους. 15. Οι χημικές ουσίες με χαμηλή υδατοδιαλυτότητα θα πρέπει να διαλύονται σε κατάλληλο πτητικό διαλύτη (π.χ. ακετόνη, αιθανόλη) και να αναμειγνύονται με άμμο. Στη συνέχεια, ο διαλύτης μπορεί να απομακρύνεται από την άμμο με τη βοήθεια ενός ρεύματος αέρα, με συνεχή ανάμειξη της άμμου. Η άμμος που έχει υποστεί αγωγή αναμειγνύεται με το πειραματικό έδαφος. Παρασκευάζεται δεύτερος μάρτυρας, ο οποίος αποτελείται μόνο από άμμο και διαλύτη. Σε κάθε επίπεδο της αγωγής και στον δεύτερο μάρτυρα προστίθενται ίσες ποσότητες άμμου, της οποίας ο διαλύτης αναμειγνύεται και απομακρύνεται. Όταν πρόκειται για στερεές και αδιάλυτες υπό δοκιμή χημικές ουσίες, το ξηρό έδαφος και η χημική ουσία αναμειγνύονται σε κατάλληλη διάταξη ανάμειξης. Ακολούθως, το έδαφος προστίθεται στα δοχεία και οι σπόροι φυτεύονται αμέσως. 16. Σε περίπτωση που, αντί εδάφους, χρησιμοποιείται τεχνητό υπόστρωμα, οι χημικές ουσίες που είναι υδατοδιαλυτές μπορούν να διαλύονται σε θρεπτικό διάλυμα ακριβώς πριν από την έναρξη της δοκιμής. Οι χημικές ουσίες που είναι αδιάλυτες στο νερό, αλλά μπορούν να αιωρούνται στο νερό με τη βοήθεια φορέα διαλύτη, θα πρέπει να προστίθενται μαζί με τον φορέα στο θρεπτικό διάλυμα. Οι μη υδατοδιαλυτές χημικές ουσίες, για τις οποίες δεν υπάρχει διαθέσιμος μη τοξικός υδατοδιαλυτός φορέας, θα πρέπει να διαλύονται σε κατάλληλο πτητικό διαλύτη. Το διάλυμα αναμειγνύεται με άμμο ή γυάλινα σφαιρίδια, τοποθετείται σε περιστροφική συσκευή κενού και εξατμίζεται, σχηματίζοντας ενιαία επικάλυψη της χημικής ουσίας στην άμμο ή στα σφαιρίδια. Ένα ζυγισμένο τμήμα των σφαιριδίων θα πρέπει να εξάγεται με τον ίδιο οργανικό διαλύτη και τη χημική ουσία της δοκιμής πριν από την πλήρωση των δοχείων. Επιφανειακή εφαρμογή 17. Στην περίπτωση φυτοπροστατευτικών προϊόντων, για την εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας χρησιμοποιείται συχνά ψεκασμός της επιφάνειας του εδάφους με το διάλυμα δοκιμής. Ο σχεδιασμός και η χωρητικότητα όλου του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση των δοκιμών, συμπεριλαμβανομένου του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται για την παρασκευή και τη χορήγηση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, θα πρέπει να εξασφαλίζουν ότι οι δοκιμές στις οποίες αυτός χρησιμοποιείται μπορούν να διεξάγονται με ακρίβεια και να παρέχουν αναπαραγώγιμη κάλυψη. Η κάλυψη θα πρέπει να είναι ομοιόμορφη σε όλες τις επιφάνειες του εδάφους. Θα πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα ώστε να απομακρύνεται η πιθανότητα προσρόφησης των χημικών ουσιών από τον εξοπλισμό ή αντίδρασής τους με αυτόν (π.χ. πλαστικές σωληνώσεις και λιπόφιλες χημικές ουσίες ή εξαρτήματα και στοιχεία από χάλυβα). Η υπό δοκιμή χημική ουσία ψεκάζεται πάνω στην επιφάνεια του εδάφους, κατά προσομοίωση των συνήθων εφαρμογών με δεξαμενή ψεκασμού. Γενικά, ο όγκος των ψεκασμών θα πρέπει να βρίσκεται εντός του εύρους που χρησιμοποιείται στη συνήθη γεωργική πρακτική και θα πρέπει να δηλώνεται (ποσότητα νερού κ.λπ.). Ο τύπος του ακροφυσίου που επιλέγεται θα πρέπει να εξασφαλίζει την ομοιόμορφη κάλυψη της επιφάνειας του εδάφους. Σε περίπτωση που εφαρμόζονται διαλύτες και φορείς, θα πρέπει να δημιουργείται δεύτερη ομάδα φυτών ελέγχου, η οποία να λαμβάνει μόνο τον διαλύτη/φορέα. Αυτό δεν είναι απαραίτητο για τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα τα οποία υποβάλλονται σε δοκιμή με τη μορφή παρασκευασμάτων. Επαλήθευση της συγκέντρωσης/ποσότητας της υπό δοκιμή χημικής ουσίας 18. Οι συγκεντρώσεις/ποσότητες εφαρμογής πρέπει να επιβεβαιώνονται με κατάλληλη αναλυτική επαλήθευση. Εάν πρόκειται για διαλυτές χημικές ουσίες, η επαλήθευση όλων των συγκεντρώσεων/ποσοτήτων δοκιμής μπορεί να επιβεβαιώνεται με ανάλυση της υψηλότερης συγκέντρωσης του διαλύματος δοκιμής, συνοδευόμενη από στοιχεία τεκμηρίωσης σχετικά με την επακόλουθη διάλυση και χρήση του βαθμονομημένου εξοπλισμού εφαρμογής (π.χ. βαθμονομημένα αναλυτικά γυάλινα σκεύη και όργανα, βαθμονόμηση του ψεκαστικού εξοπλισμού). Εάν πρόκειται για αδιάλυτες χημικές ουσίες, η επαλήθευση του σύνθετου υλικού πρέπει να παρέχεται με τη ζύγιση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που προστίθεται στο έδαφος. Εάν απαιτείται απόδειξη της ομοιογένειας, μπορεί να κρίνεται αναγκαία η ανάλυση του εδάφους. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Σχεδιασμός της δοκιμής 19. Οι σπόροι του ίδιου είδους φυτεύονται σε δοχεία. Ο αριθμός των σπόρων που φυτεύονται σε κάθε δοχείο εξαρτάται από το είδος, το μέγεθος του δοχείου και τη διάρκεια της δοκιμής. Ο αριθμός των φυτών ανά δοχείο θα πρέπει να παρέχει κατάλληλες συνθήκες ανάπτυξης και να αποτρέπει τον υπερπληθυσμό κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Η μέγιστη πυκνότητα των φυτών θα πρέπει να είναι μεταξύ 3 — 10 σπόροι ανά 100 cm2, ανάλογα με το μέγεθος των σπόρων. Για παράδειγμα, συνιστώνται ένα ή δύο φυτά αραβοσίτου, σόγιας, τομάτας, αγγουριού ή ζαχαρότευτλων ανά περιέκτη 15 cm· τρία φυτά κράμβης ή αρακά ανά περιέκτη 15 cm· και 5 έως 10 σπόροι κρεμμυδιού, σιταριού ή άλλοι μικροί σπόροι ανά περιέκτη 15 cm. Ο αριθμός των σπόρων και των δοχείων επανάληψης (ως επανάληψη ορίζεται το δοχείο και, γι' αυτό, τα φυτά του ίδιου δοχείου δεν αποτελούν επαναλήψεις) θα πρέπει να είναι επαρκής ώστε να επιτυγχάνεται η βέλτιστη στατιστική ανάλυση (21). Θα πρέπει να επισημανθεί ότι η μεταβλητότητα θα είναι μεγαλύτερη για υπό δοκιμή είδη για τα οποία χρησιμοποιείται μικρότερος αριθμός μεγάλων σπόρων ανά δοχείο (επανάληψη), σε σύγκριση με υπό δοκιμή είδη για τα οποία είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί μεγαλύτερος αριθμός μικρών σπόρων ανά δοχείο. Η φύτευση ίσου αριθμού σπόρων σε κάθε δοχείο μπορεί να ελαχιστοποιήσει αυτή τη μεταβλητότητα. 20. Η χρήση των ομάδων ελέγχου εξασφαλίζει ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις συνδέονται μόνο με την έκθεση στην υπό δοκιμή χημική ουσία ή αποδίδονται μόνο στην εν λόγω έκθεση. Η κατάλληλη ομάδα ελέγχου θα πρέπει να είναι πανομοιότυπη από κάθε άποψη με την ομάδα δοκιμής, με εξαίρεση την έκθεση στην υπό δοκιμή χημική ουσία. Στο πλαίσιο συγκεκριμένης δοκιμής, όλα τα φυτά δοκιμής –συμπεριλαμβανομένων των μαρτύρων– θα πρέπει να προέρχονται από την ίδια πηγή. Για να αποφεύγεται η μεροληψία, απαιτείται η τυχαία κατανομή των δοχείων δοκιμής και ελέγχου. 21. Οι σπόροι που είναι επικαλυμμένοι με εντομοκτόνο ή μυκητοκτόνο (δηλ. οι επενδυμένοι σπόροι) θα πρέπει να αποφεύγονται. Ωστόσο, η χρήση ορισμένων μη συστημικών μυκητοκτόνων επαφής (π.χ. Captan, Thiram) επιτρέπεται από ορισμένες κανονιστικές αρχές (22). Εάν υπάρχει κίνδυνος παρουσίας παθογόνων που μεταφέρονται με τον σπόρο, οι σπόροι μπορεί να εμποτίζονται για σύντομο χρονικό διάστημα σε ασθενές διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 5 % και, στη συνέχεια, να εκπλύνονται διεξοδικά με τρεχούμενο νερό και να ξηραίνονται. Δεν επιτρέπεται η θεραπευτική αγωγή με άλλο φυτοπροστατευτικό προϊόν. Συνθήκες δοκιμής 22. Οι συνθήκες δοκιμής θα πρέπει να προσεγγίζουν τις συνθήκες που είναι αναγκαίες για την κανονική ανάπτυξη των υπό δοκιμή ειδών και ποικιλιών (στο προσάρτημα 4 παρατίθενται παραδείγματα συνθηκών δοκιμής). Τα αναδυόμενα φυτά θα πρέπει να διατηρούνται υπό ορθές φυτοκομικές πρακτικές σε θαλάμους ελεγχόμενου περιβάλλοντος, φύτοτρα ή θερμοκήπια. Όταν χρησιμοποιούνται εγκαταστάσεις καλλιέργειας, αυτές οι πρακτικές περιλαμβάνουν συνήθως τον έλεγχο και την επαρκώς συχνή (π.χ. ημερήσια) καταγραφή της θερμοκρασίας, της υγρασίας, της συγκέντρωσης διοξειδίου του άνθρακα, του φωτός (φωτεινή ένταση, μήκος κύματος, φωτοσυνθετικά ενεργός ακτινοβολία) και της φωτοπεριόδου, των ποτιστικών μέσων κ.λπ., ώστε να εξασφαλίζεται ικανοποιητική ανάπτυξη του φυτού, όπως εκτιμάται από τα φυτά ελέγχου του επιλεγμένου είδους. Οι θερμοκρασίες στα θερμοκήπια θα πρέπει να ελέγχονται μέσω συστημάτων αερισμού, θέρμανσης και/ή ψύξης. Κατά κανόνα, για την εκτέλεση δοκιμών σε θερμοκήπια συνιστώνται οι ακόλουθες συνθήκες: — θερμοκρασία: 22 °C ± 10 °C· — υγρασία: 70 % ± 25 %· — φωτοπερίοδος: τουλάχιστον 16 ώρες φωτός· — φωτεινή ένταση: 350 ± 50 μE/m2/s. Μπορεί να κρίνεται αναγκαίο να υπάρξει επιπλέον φωτισμός, εάν η ένταση μειώνεται σε λιγότερο από 200 μE/m2/s, μήκος κύματος 400 - 700 nm, εκτός εάν πρόκειται για είδη με χαμηλότερες απαιτήσεις φωτός. Οι περιβαλλοντικές συνθήκες θα πρέπει να παρακολουθούνται και να δηλώνονται κατά τη διάρκεια της μελέτης. Τα φυτά θα πρέπει να καλλιεργούνται σε μη πορώδη πλαστικά ή στιλβωμένα δοχεία τοποθετημένα επάνω σε δίσκο ή πιάτο. Η θέση των δοχείων μπορεί να αλλάζει κατά διαστήματα, ώστε να ελαχιστοποιείται η μεταβλητότητα ως προς την ανάπτυξη των φυτών (λόγω των διαφορετικών συνθηκών δοκιμής στις εγκαταστάσεις καλλιέργειας). Τα δοχεία πρέπει να είναι αρκετά μεγάλα ώστε να επιτρέπουν την κανονική ανάπτυξη. 23. Τα θρεπτικά στοιχεία του εδάφους μπορούν να συμπληρώνονται εάν κρίνεται αναγκαίο, ώστε να διατηρείται ικανοποιητική ευρωστία του φυτού. Η αναγκαιότητα και το χρονοδιάγραμμα χορήγησης επιπλέον θρεπτικών στοιχείων μπορούν να αξιολογούνται με παρατήρηση των φυτών ελέγχου. Συνιστάται το πότισμα από το κάτω μέρος των δοχείων (π.χ. με τη χρήση φυτιλιών από υαλόνημα). Ωστόσο, το πότισμα από το επάνω μέρος μπορεί να χρησιμοποιείται στην αρχή για να διεγείρεται η εκβλάστηση των σπόρων και, σε περίπτωση εφαρμογής στην επιφάνεια του εδάφους, να διευκολύνεται η εισαγωγή της χημικής ουσίας στο έδαφος. 24. Οι συγκεκριμένες συνθήκες ανάπτυξης θα πρέπει να είναι κατάλληλες για το υπό δοκιμή είδος και την υπό δοκιμή χημική ουσία που εξετάζονται. Τα φυτά ελέγχου και τα φυτά που έχουν υποβληθεί σε αγωγή πρέπει να διατηρούνται στις ίδιες περιβαλλοντικές συνθήκες. Ωστόσο, θα πρέπει να λαμβάνονται κατάλληλα μέτρα ώστε να αποφεύγεται η διασταυρούμενη έκθεση (π.χ. πτητικών χημικών ουσιών) μεταξύ διαφορετικών αγωγών, καθώς και η έκθεση των μαρτύρων στην υπό δοκιμή χημική ουσία. Δοκιμές σε μία συγκέντρωση/ποσότητα 25. Για να προσδιοριστεί η κατάλληλη συγκέντρωση/ποσότητα μιας χημικής ουσίας με σκοπό την εκτέλεση δοκιμής σε μία μόνο συγκέντρωση ή ποσότητα (πρόκληση/όριο), πρέπει να εξετάζεται μια σειρά παραγόντων. Για τις χημικές ουσίες εν γένει, αυτοί οι παράγοντες περιλαμβάνουν τις φυσικές/χημικές ιδιότητες της χημικής ουσίας. Για τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα, πρέπει να εξετάζονται οι φυσικές/χημικές ιδιότητες και ο τρόπος χρήσης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, η μέγιστη συγκέντρωση ή ποσότητα εφαρμογής της, ο αριθμός εφαρμογών ανά περίοδο και/ή η παραμονή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας. Για να προσδιοριστεί κατά πόσον μια γενική χημική ουσία διαθέτει φυτοτοξικές ιδιότητες, μπορεί να κρίνεται σκόπιμο να εκτελεστεί η δοκιμή σε μέγιστο επίπεδο 1 000 mg/kg ξηρού εδάφους. Δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών 26. Εάν κρίνεται αναγκαίο, η δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών θα μπορούσε να εκτελείται ώστε να λαμβάνονται πληροφορίες σχετικά με τις συγκεντρώσεις/ποσότητες προς δοκιμή στο πλαίσιο οριστικής μελέτης δόσης-απόκρισης. Στη δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών, οι συγκεντρώσεις/ποσότητες δοκιμής θα πρέπει να απέχουν πολύ μεταξύ τους (π.χ. 0,1, 1,0, 10, 100 και 1 000 mg/kg ξηρού εδάφους). Στην περίπτωση φυτοπροστατευτικών προϊόντων, οι συγκεντρώσεις/ποσότητες θα μπορούσαν να βασίζονται στη συνιστώμενη ή μέγιστη συγκέντρωση/ποσότητα εφαρμογής, π.χ. 1/100, 1/10, 1/1 της συνιστώμενης ή μέγιστης συγκέντρωσης/ποσότητας εφαρμογής. Δοκιμές σε πολλαπλές συγκεντρώσεις/ποσότητες 27. Ο στόχος της δοκιμής σε πολλαπλές συγκεντρώσεις/ποσότητες είναι να καθορίζεται η σχέση δόσης-απόκρισης και να προσδιορίζεται η τιμή της ECx ή της ERx σε σχέση με την ανάδυση, τη βιομάζα και/ή τις εμφανείς επιδράσεις σε σύγκριση με τους μάρτυρες που δεν έχουν εκτεθεί στην ουσία, όπως απαιτείται από τις κανονιστικές αρχές. 28. Ο αριθμός των συγκεντρώσεων/ποσοτήτων και η μεταξύ τους απόσταση θα πρέπει να είναι ικανά ώστε να προσδιορίζονται αξιόπιστα η σχέση δόσης-απόκρισης και η εξίσωση παλινδρόμησης, και να παρέχεται εκτίμηση της ECx ή της ERx. Οι επιλεγμένες συγκεντρώσεις/ποσότητες θα πρέπει να περιλαμβάνουν τις τιμές της ECx ή της ERx οι οποίες πρέπει να προσδιοριστούν. Για παράδειγμα, εάν απαιτείται τιμή της EC50, θα ήταν επιθυμητό να εκτελείται η δοκιμή σε ποσότητες που προκαλούν επίδραση 20 έως 80 %. Ο συνιστώμενος αριθμός των συγκεντρώσεων/ποσοτήτων δοκιμής για την επίτευξη αυτής της επίδρασης πρέπει να είναι τουλάχιστον πέντε σε γεωμετρική πρόοδο συν ένας μάρτυρας που δεν έχει υποβληθεί σε αγωγή, και ο παράγοντας της μεταξύ τους απόστασης δεν πρέπει να υπερβαίνει το τρία. Για κάθε ομάδα αγωγής και ελέγχου, ο αριθμός των επαναλήψεων θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 4 και ο συνολικός αριθμός των σπόρων θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 20. Για να αυξηθεί η στατιστική ισχύς της δοκιμής, ενδέχεται να χρειαστούν περισσότερες επαναλήψεις εάν πρόκειται για φυτά με χαμηλό ρυθμό εκβλάστησης ή ποικίλη αυξητική συμπεριφορά. Εάν χρησιμοποιείται μεγαλύτερος αριθμός συγκεντρώσεων/ποσοτήτων δοκιμής, ο αριθμός των επαναλήψεων μπορεί να μειωθεί. Εάν πρέπει να εκτιμηθεί η NOEC, μπορεί να χρειαστούν περισσότερες επαναλήψεις ώστε να εξασφαλιστεί η επιθυμητή στατιστική ισχύς (23). Παρατηρήσεις 29. Κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης, δηλ. από 14 έως 21 ημέρες μετά την ανάδυση του 50 % των φυτών ελέγχου (και των μαρτύρων με τον διαλύτη, κατά περίπτωση), τα φυτά εξετάζονται συχνά (τουλάχιστον σε εβδομαδιαία και, εάν είναι δυνατόν, σε ημερήσια βάση), ώστε να παρακολουθούνται η ανάδυση, η ορατή φυτοτοξικότητα και η θνησιμότητα. Στο τέλος της δοκιμής, θα πρέπει να καταγράφεται η μέτρηση της ποσοστιαίας ανάδυσης και της βιομάζας των φυτών που επιζούν, καθώς και οι εμφανείς βλαβερές επιδράσεις σε διάφορα μέρη του φυτού. Οι επιδράσεις αυτές περιλαμβάνουν ανωμαλίες στην εμφάνιση των αναδυόμενων σποροφύτων, καθυστερημένη ανάπτυξη, χλώρωση, αποχρωματισμό, θνησιμότητα και επιδράσεις στην ανάπτυξη του φυτού. Η τελική βιομάζα μπορεί να μετράται με βάση το τελικό μέσο ξηρό βάρος των βλαστών των φυτών που επιζούν, με συλλογή των βλαστών στην επιφάνεια του εδάφους και με ξήρανσή τους μέχρι σταθερού βάρους στους 60 °C. Εναλλακτικά, η τελική βιομάζα μπορεί να μετράται με βάση το υγρό βάρος των βλαστών. Το ύψος των βλαστών μπορεί να είναι ένα άλλο τελικό σημείο, εάν απαιτείται από τις κανονιστικές αρχές. Θα πρέπει να χρησιμοποιείται ενιαίο σύστημα βαθμολόγησης για εμφανείς κακώσεις, ώστε να αξιολογούνται οι παρατηρήσιμες τοξικές αποκρίσεις. Παραδείγματα εκτέλεσης ποιοτικών και ποσοτικών οπτικών εκτιμήσεων παρέχονται στις βιβλιογραφικές παραπομπές (23) και (24). ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΕΚΘΕΣΕΙΣ Στατιστική ανάλυση Δοκιμή σε μία συγκέντρωση/ποσότητα 30. Τα δεδομένα για κάθε είδος φυτού θα πρέπει να αναλύονται με τη βοήθεια κατάλληλης στατιστικής μεθόδου (21). Θα πρέπει να δηλώνεται το επίπεδο της επίδρασης στη συγκέντρωση/ποσότητα δοκιμής, ή η αδυναμία επίτευξης συγκεκριμένης επίδρασης στη συγκέντρωση/ποσότητα δοκιμής (π.χ., < x % της παρατηρούμενης επίδρασης σε συγκέντρωση ή ποσότητα y). Δοκιμή σε πολλαπλές συγκεντρώσεις/ποσότητες 31. Η σχέση δόσης-απόκρισης καθορίζεται με εξίσωση παλινδρόμησης. Μπορούν να χρησιμοποιούνται διάφορα μοντέλα: π.χ. για την εκτίμηση της ECx ή της ERx (π.χ. EC25, ER25, EC50, ER50) και των ορίων εμπιστοσύνης τους όσον αφορά την ανάδυση θα μπορούσαν να είναι κατάλληλες η μέθοδος δεδομένων που δέχονται μόνο δύο τιμές, η μέθοδος μονάδων logit, probit ή Weibull, η μέθοδος Spearman-Karber, η απλοποιημένη μέθοδος Spearman-Karber κ.ά. Για να εκτιμηθεί η ανάπτυξη των σποροφύτων (βάρος και ύψος) με τη μορφή συνεχών τελικών σημείων, η ECx ή η ERx και τα όρια εμπιστοσύνης τους μπορούν να εκτιμηθούν με τη βοήθεια κατάλληλης ανάλυσης παλινδρόμησης [π.χ. η ανάλυση με μη γραμμική παλινδρόμηση Bruce-Versteeg (25)]. Στο μέτρο του δυνατού, η R2 θα πρέπει να είναι ίση με 0,7 ή υψηλότερη για τα πιο ευαίσθητα είδη και οι συγκεντρώσεις/ποσότητες δοκιμής που χρησιμοποιούνται να περιλαμβάνουν επιδράσεις 20 % έως 80 %. Εάν πρέπει να εκτιμηθεί η NOEC, θα πρέπει να προτιμάται η διενέργεια ισχυρών στατιστικών δοκιμών, οι οποίες θα πρέπει να επιλέγονται με βάση την κατανομή δεδομένων (21) (26). Έκθεση δοκιμής 32. Η έκθεση δοκιμής θα πρέπει να παρουσιάζει τα αποτελέσματα των μελετών, λεπτομερή περιγραφή των συνθηκών δοκιμής, διεξοδική εξέταση των αποτελεσμάτων, ανάλυση των δεδομένων, καθώς και τα συμπεράσματα που προκύπτουν από την ανάλυση. Θα πρέπει να παρέχονται περίληψη σε μορφή πίνακα και σύνοψη των αποτελεσμάτων. Η έκθεση πρέπει να περιλαμβάνει τα ακόλουθα: Υπό δοκιμή χημική ουσία: — δεδομένα χημικής ταυτοποίησης, σχετικές ιδιότητες της υπό δοκιμή χημικής ουσίας (π.χ. log Pow, υδατοδιαλυτότητα, τάση ατμών και πληροφορίες σχετικά με την πορεία της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και τη συμπεριφορά της στο περιβάλλον, εάν είναι διαθέσιμες)· — λεπτομέρειες σχετικά με την παρασκευή του διαλύματος δοκιμής και επαλήθευση των συγκεντρώσεων δοκιμής, όπως προσδιορίζονται στο σημείο 18. Ελεγχόμενο είδος: — λεπτομέρειες σχετικά με τον οργανισμό δοκιμής: είδος/ποικιλία, οικογένειες φυτών, επιστημονικές και κοινές ονομασίες, πηγή και ιστορικό του σπόρου με όσο το δυνατόν περισσότερες λεπτομέρειες (δηλ. όνομα του προμηθευτή, ποσοστό εκβλάστησης, τάξη μεγέθους του σπόρου, αριθμός παρτίδας, έτος σποράς ή καλλιεργητική περίοδος συλλογής, ημερομηνία αξιολόγησης της εκβλάστησης), βιωσιμότητα κ.λπ.· — αριθμός των μονοκοτυλήδονων και δικοτυλήδονων ειδών που υποβλήθηκαν στη δοκιμή· — σκεπτικό για την επιλογή των ειδών· — περιγραφή της αποθήκευσης, της επεξεργασίας και της διατήρησης των σπόρων. Συνθήκες δοκιμής: — εγκαταστάσεις δοκιμών (π.χ. θάλαμος ανάπτυξης, φύτοτρο και θερμοκήπιο)· — περιγραφή του συστήματος της δοκιμής (π.χ. διαστάσεις των δοχείων, υλικό των δοχείων και ποσότητες εδάφους)· — χαρακτηριστικά του εδάφους [υφή ή τύπος του εδάφους: κατανομή και ταξινόμηση των σωματιδίων του εδάφους, φυσικές και χημικές ιδιότητες, όπως το ποσοστό (%) οργανικής ύλης, το ποσοστό (%) οργανικού άνθρακα και το pH]· — παρασκευή εδάφους/υποστρώματος (π.χ. έδαφος, τεχνητό έδαφος, άμμος και άλλα) πριν από τη δοκιμή· — περιγραφή του θρεπτικού μέσου, εάν χρησιμοποιείται· — εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας: περιγραφή της μεθόδου εφαρμογής, περιγραφή του εξοπλισμού, βαθμός έκθεσης και όγκος, συμπεριλαμβανομένης της χημικής επαλήθευσης, περιγραφή της μεθόδου βαθμονόμησης και περιγραφή των περιβαλλοντικών συνθηκών κατά την εφαρμογή· — συνθήκες ανάπτυξης: φωτεινή ένταση (π.χ. PAR, φωτοσυνθετικά ενεργός ακτινοβολία), φωτοπερίοδος, μέγιστες/ελάχιστες θερμοκρασίες, χρονοδιάγραμμα και μέθοδος ποτίσματος, γονιμοποίηση· — αριθμός σπόρων ανά δοχείο, αριθμός φυτών ανά δόση, αριθμός επαναλήψεων (δοχείων) ανά βαθμό έκθεσης· — είδος και αριθμός μαρτύρων (αρνητικοί και/ή θετικοί μάρτυρες, τυχόν μάρτυρας με τον διαλύτη)· — διάρκεια της δοκιμής. Αποτελέσματα: — πίνακας όλων των τελικών σημείων για κάθε επανάληψη, συγκέντρωση/ποσότητα δοκιμής και είδος· — αριθμός και ποσοστό ανάδυσης σε σύγκριση με τους μάρτυρες· — μετρήσεις βιομάζας (ξηρό ή υγρό βάρος των βλαστών) των φυτών ως ποσοστό των μαρτύρων· — ύψος των βλαστών των φυτών ως ποσοστό των μαρτύρων, εάν μετρώνται· — ποσοστό εμφανών κακώσεων και ποιοτική και ποσοτική περιγραφή των εμφανών κακώσεων (χλώρωση, νέκρωση, μάρανση, παραμόρφωση των φύλλων και των μίσχων, καθώς και τυχόν απουσία επιδράσεων) που προκαλούνται από την υπό δοκιμή χημική ουσία σε σύγκριση με τα φυτά ελέγχου· — περιγραφή της κλίμακας αξιολόγησης που χρησιμοποιείται για την εκτίμηση των εμφανών κακώσεων, εάν παρέχεται οπτική εκτίμηση· — για μελέτες σε μία ποσότητα, θα πρέπει να δηλώνεται το ποσοστό των κακώσεων· — οι τιμές της ECx ή της ERx (π.χ. EC50, ER50, EC25, ER25) και τα σχετικά όρια εμπιστοσύνης. Όταν διενεργείται ανάλυση παλινδρόμησης, θα πρέπει να παρέχεται το τυπικό σφάλμα για την εξίσωση παλινδρόμησης και το τυπικό σφάλμα για την εκτίμηση μεμονωμένων παραμέτρων (π.χ. κλίση, σημείο τομής)· — οι τιμές NOEC (και LOEC), εάν υπολογίζονται· — περιγραφή των στατιστικών διαδικασιών και παραδοχών που χρησιμοποιούνται· — γραφική απεικόνιση αυτών των δεδομένων και σχέση δόσης-απόκρισης του είδους που υποβάλλεται σε δοκιμή. Αποκλίσεις από τις διαδικασίες που περιγράφονται στην παρούσα μέθοδο δοκιμών και τυχόν ασυνήθιστα συμβάντα κατά τη δοκιμή. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background — Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Κεμπέκ, Καναδάς. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms — A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Οντάριο, Καναδάς. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, σ. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 σ., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) ΟΟΣΑ (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Οργανισμός Οικονομικής Συνεργασίας και Ανάπτυξης, Παρίσι. (22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Κεφάλαιο Γ.33 του παρόντος παραρτήματος: Δοκιμασία αναπαραγωγής γαιοσκωλήκων (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Προσάρτημα 1 Ορισμοί Δραστικό συστατικό (δ.σ.) [ή δραστική ουσία (δ.ο.)] : το υλικό που έχει σχεδιαστεί ώστε να επιφέρει συγκεκριμένη βιολογική επίδραση (π.χ. καταπολέμηση των εντόμων, καταπολέμηση των ασθενειών των φυτών, καταπολέμηση των ζιζανίων στην περιοχή αγωγής), γνωστό και ως δραστικό συστατικό / δραστική ουσία τεχνικής καθαρότητας. Χημική ουσία : μια ουσία ή ένα μείγμα. Προϊόντα προστασίας των καλλιεργειών ή φυτοπροστατευτικά προϊόντα ή παρασιτοκτόνα : υλικά με συγκεκριμένη βιολογική δράση, τα οποία χρησιμοποιούνται σκόπιμα για να προστατεύσουν τις καλλιέργειες από τα παράσιτα (π.χ. μυκητιάσεις, έντομα και ανταγωνιστικά φυτά). ECx, x % συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδρασης, ή ERx, x % ποσότητα παρατηρούμενης επίδρασης : η συγκέντρωση ή η ποσότητα η οποία επιφέρει ανεπιθύμητη μεταβολή ή αλλοίωση x % στο τελικό σημείο δοκιμής που μετράται σε σχέση με τον μάρτυρα (π.χ. η μείωση κατά 25 % ή 50 % στην ανάδυση σποροφύτων, στο ύψος των βλαστών, στον τελικό αριθμό των φυτών που είναι παρόντα, ή η ανάλογη αύξηση των εμφανών κακώσεων θα συνιστούσε, αντίστοιχα, EC25/ER25 ή EC50/ER50). Ανάδυση : η εμφάνιση του κολεοπτίλου ή του κοτυληδόνου επάνω από την επιφάνεια του εδάφους. Σκεύασμα : το εμπορικό παρασκευασμένο προϊόν που περιέχει τη δραστική ουσία (το δραστικό συστατικό), γνωστό και ως τελικό σκεύασμα (8) ή τυπικό τελικό προϊόν. LOEC (κατώτατη συγκέντρωση παρατηρούμενης επίδραση) : η ελάχιστη συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην οποία παρατηρείται επίδραση. Στην παρούσα δοκιμή, η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στη LOEC έχει στατιστικώς σημαντική επίδραση (p < 0,05) εντός δεδομένης περιόδου έκθεσης σε σύγκριση με τον μάρτυρα, και υπερβαίνει την τιμή της NOEC. Μη στοχευόμενα φυτά : τα φυτά που βρίσκονται εκτός της περιοχής των στοχοθετημένων φυτών. Για τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα, ο όρος αυτός αφορά συνήθως τα φυτά που βρίσκονται εκτός της περιοχής αγωγής. NOEC (συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης) : η υψηλότερη συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στην οποία δεν παρατηρείται επίδραση. Στην παρούσα δοκιμή, η συγκέντρωση που αντιστοιχεί στη NOEC δεν έχει στατιστικώς σημαντική επίδραση (p < 0,05) εντός δεδομένης περιόδου έκθεσης σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Φυτοτοξικότητα : επιβλαβείς αποκλίσεις (σύμφωνα με μετρήσεις και οπτικές εκτιμήσεις) από τη συνήθη εμφάνιση και πορεία ανάπτυξης των φυτών ως αντίδραση σε συγκεκριμένη χημική ουσία. Επανάληψη : η πειραματική μονάδα που αντιπροσωπεύει την ομάδα ελέγχου και/ή την ομάδα αγωγής. Στις εν λόγω μελέτες, ως επανάληψη ορίζεται το δοχείο. Οπτική εκτίμηση : αξιολόγηση της ορατής βλάβης έπειτα από παρατηρήσεις ως προς τη στήριξη, την ευρωστία, τη δυσμορφία, τη χλώρωση και τη νέκρωση του φυτού, καθώς και τη συνολική εμφάνισή του σε σύγκριση με μάρτυρα. Υπό δοκιμή χημική ουσία : κάθε ουσία ή μείγμα που υποβάλλεται σε δοκιμή με τη χρήση της παρούσας μεθόδου δοκιμών. Προσάρτημα 2 Κατάλογος ειδών που χρησιμοποιούνται συνήθως στίσε δοκιμές σε φυτά Οικογένεια Είδος Κοινή ονομασία DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Καρότο Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Ηλίανθος Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Μαρούλι Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Σινάπι άσπρο Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Κινέζικο λάχανο Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Ελαιοκράμβη Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Λάχανο Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Γογγύλι (ρέβα) Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Κάρδαμο το εδώδιμο Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Ραπάνι Chenopodiaceae Beta vulgaris Ζαχαρότευτλο Cucurbitaceae Cucumis sativus Αγγούρι Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Σόγια Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Φασόλι μούνγκο Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Φασίολος ο νάνος και φασίολος ο κοινός Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Μπιζέλι Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Τριγωνέλλα ή μοσχοσίταρο Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Λωτός ο κερατιοφόρος Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Τριφύλλι το λειμώνιο Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Βίκος ο κοινός Linaceae Linum usitatissimum Λινάρι Polygonaceae Fagopyrum esculentum Φαγόπυρο το εδώδιμο ή μαύρο σιτάρι Solanaceae Solanum lycopersicon Τομάτα MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Κρεμμύδι Poaceae (Gramineae) Avena sativa Βρώμη Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Κριθάρι Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Λόλιο το πολυετές Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Ρύζι Poaceae (Gramineae) Secale cereale Σίκαλη Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Σόργο Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Σιτάρι Poaceae (Gramineae) Zea mays Αραβόσιτος Προσάρτημα 3 Κατάλογος πιθανών μη καλλιεργούμενων ειδών Πιθανά είδη σύμφωνα με τον ΟΟΣΑ για τις δοκιμές τοξικότητας σε φυτά Σημείωση: Ο ακόλουθος πίνακας παρέχει πληροφορίες για 52 μη καλλιεργούμενα είδη (οι παραπομπές για κάθε εγγραφή δίνονται εντός παρενθέσεων). Οι αναφερόμενοι ρυθμοί ανάδυσης προέρχονται από δημοσιευμένη βιβλιογραφία και παρέχονται μόνο ως γενική κατεύθυνση. Η προσωπική πείρα μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με την πηγή του σπόρου και άλλους παράγοντες. ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ Βοτανική ονομασία του είδους (κοινή ονομασία στα ελληνικά) Διάρκεια ζωής (9) και ενδιαίτημα Βάρος σπόρου (mg) Φωτοπερίοδος για την εκβλάστηση ή την ανάπτυξη (10) Βάθος φύτευσης (mm) (11) Χρόνος εκβλάστησης (ημέρες) (12) Ειδικές αγωγές (13) Δοκιμή τοξικότητας (14) Προμηθευτές σπόρων (15) Άλλες παραπομπές (16) APIACEAE Torilis japonica (Τοριλίδα της Ιαπωνίας) А, В διαταραγμένες περιοχές, θαμνοστοιχίες, βοσκότοποι (16, 19) 1,7 — 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) ψυχρή στρωμάτωση (7, 14, 18, 19) η ωρίμανση μπορεί να κρίνεται απαραίτητη (19) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1, 19) καμία ειδική αγωγή (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (Μαργαρίτα) Ρ χορτολιβαδικές εκτάσεις, αρόσιμες εκτάσεις, χλοοτάπητες (16, 19) 0,09 — 0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (18, 19) καμία ειδική αγωγή (4, 14) POST (4) Α, Δ, ΣΤ 7 Centaurea cyanus (Κύανος ή κενταύρια) Α αγροί, παρυφές δρόμων, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 4,1 — 4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) καμία ειδική αγωγή (2, 4) POST (2,4) Α, Δ, Ε, ΣΤ 7 Centaurea nigra (Κενταύρια η μελανή) Ρ αγροί, παρυφές δρόμων, ανοικτά ενδιαιτήματα (16, 19) 2,4 — 2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) η ωρίμανση μπορεί να κρίνεται απαραίτητη (18, 19) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (19) καμία ειδική αγωγή (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (Ίνουλα ή ελένιο) Ρ υγρά, διαταραγμένα μέρη (16) 1 — 1,3 (14, 29) 0 (4, 29) καμία ειδική αγωγή (4) POST (4) Α, ΣΤ Leontodon hispidus (Λεοντόδους) Ρ αγροί, παρυφές δρόμων, διαταραγμένες περιοχές (16, 19) 0,85 — 1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (17, 18, 19) καμία ειδική αγωγή (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (Ρουντμπέκια) Β, Ρ διαταραγμένες περιοχές (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) καμία ειδική αγωγή (4, 14, 33) POST (4, 33) Γ, Δ, Ε, ΣΤ Solidago canadensis (Σολιντάγκο του Καναδά ή καναδική χρυσόβεργα) Ρ βοσκότοποι, ανοικτές περιοχές (16) 0,06 — 0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) ανάμειξη με ίση ποσότητα άμμου και εμποτισμός σε 500 ppm GA για 24 ώρες (11) καμία ειδική αγωγή (4) POST (4) Ε, ΣΤ Xanthium pensylvanicum (Ξάνθιο) Α αγροί, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 25 — 61 (14, 29) 0 (1) 5 (29) πιθανή αναστολή της εκβλάστησης λόγω σκότους (1) εμποτισμός σε θερμό νερό για 12 ώρες (29) PRE & POST (31) A Xanthium spinosum (Ξάνθιο το αγκαθωτό) Α ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) τραυματισμός (14) καμία ειδική αγωγή (6) PRE & POST (6) A Xanthium strumarium (Ξάνθιο το χειράδιο) Α αγροί, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 67,4 (14) L = D (14) 10 — 20 (6, 21) καμία ειδική αγωγή (6, 14, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (Καρδαμίνη η λιβαδική ή Καρδαμίνη των αγρών) Ρ αγροί, παρυφές δρόμων, χλοοτάπητες (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (18, 19) καμία ειδική αγωγή (5, 14, 22) POST (5, 22) ΣΤ CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (Λυχνίς ή το άνθος του κούκου) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) η ωρίμανση μπορεί να κρίνεται απαραίτητη (18) καμία ειδική αγωγή (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) ΣΤ CHENOPODIACEAE Chenopodium album (Χηνοπόδιο το λευκό ή λουβουδιά) Α παρυφές αγρών, διαταραγμένες περιοχές (16, 19) 0,7 — 1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) η αγωγή διαφέρει ανάλογα με το χρώμα των σπόρων (19) λήθαργος σε εν ξηρώ αποθήκευση (19) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1, 18, 19) ψυχρή στρωμάτωση (18) καμία ειδική αγωγή (14, 34) PRE & POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (Υπερικόν το διάτρητον, κοινώς βάλσαμο, βαλσαμόχορτο ή σπαθίδα) Ρ αγροί, αρόσιμες εκτάσεις, ανοικτά ενδιαιτήματα (16, 19) 0,1 — 0,23 (14, 19) L= D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1, 18, 19) καμία ειδική αγωγή (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) Α, Ε, ΣΤ CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (Αγριοφασουλιά) Α παρυφές δρόμων, ανοικτά ενδιαιτήματα, σιταγροί (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10 — 20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (1) καμία ειδική αγωγή (6, 21) PRE & POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (Κύπειρος ο στρογγυλός) Ρ αρόσιμες εκτάσεις, βοσκότοποι, παρυφές δρόμων (16, 30) 0,2 (14) L= D (14) 0 (1) 10 — 20 (6, 10) 12 (91 %) (10) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1) καμία ειδική αγωγή (6, 10, 14) PRE & POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (Λωτός ο κερατιοφόρος ή αγριοτριφύλλι) Ρ λειμώνες, παρυφές δρόμων, ανοικτά ενδιαιτήματα (16, 19) 1 — 1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) τραυματισμός (14, 19) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (18, 19) καμία ειδική αγωγή (23, 25) POST (5, 23, 25) Α, Δ, Ε, ΣΤ Senna obtusifolia (Κασσία) Α υγρά δάση (16) 23 — 28 (9) L = D (14) L > D (9) 10 — 20 (6, 9) εμποτισμός σπόρων σε νερό για 24 ώρες (9) τραυματισμός (14) η βιωσιμότητα των σπόρων διαφέρει ανάλογα με το χρώμα (1) καμία ειδική αγωγή (6) POST (6, 9) A Sesbania exaltata (Κάνναβη) Α προσχωσιγενή εδάφη (16) 11 — 13 (9, 14) L > D (9) 10 — 20 (9, 21) εμποτισμός σπόρων σε νερό για 24 ώρες (9) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (1) καμία ειδική αγωγή (21) PRE & POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense Τριφύλλι το λειμώνιο Ρ αγροί, παρυφές δρόμων, αρόσιμες εκτάσεις (16, 19) 1,4 — 1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) τραυματισμός (14, 18) η ωρίμανση μπορεί να κρίνεται απαραίτητη (19) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (1, 19) καμία ειδική αγωγή (5) POST (5) Α, Ε, ΣΤ LAMIACEAE Leonurus cardiaca (Λεόνουρος ή μανοβότανο) Ρ ανοικτές περιοχές (16) 0,75 — 1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) καμία ειδική αγωγή (4, 14) POST (4) ΣΤ Mentha spicata (Μίνθη η σταχυώδης ή Δυόσμος) Ρ υγρές περιοχές (16) 2,21 (4) 0 (4) καμία ειδική αγωγή (4) POST (4) ΣΤ Nepeta cataria (Γλήχωμα το γαλεόφιλον ή νεπέτα ή γατόχορτο) Ρ διαταραγμένες περιοχές (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) καμία ειδική αγωγή (2, 4, 14) POST (2,4) ΣΤ Prunella vulgaris (Προυνέλλα η κοινή ή βουτυρόχορτο) Ρ αρόσιμες εκτάσεις, λειμώνες, διαταραγμένες περιοχές (16, 19) 0,58 — 1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (18, 19) καλύτερη εκβλάστηση με μεγαλύτερους σπόρους (1) καμία ειδική αγωγή (4, 14, 22) POST (4, 22) Α, ΣΤ Stachys officinalis (Στάχυς ο φαρμακευτικός) Ρ χορτολιβαδικές εκτάσεις, παρυφές αγρών (19) 14 — 18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) καμία ειδική αγωγή (5, 14, 22) POST (5, 22) ΣΤ MALVACEAE Abutilón theophrasti (Αγριοβαμβακιά ή καμπανάκια) Α αγροί, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 8,8 (14) L = D (14) 10 — 20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) τραυματισμός (14) καμία ειδική αγωγή (5, 10, 21) PRE & POST (6, 22, 28, 31) Α, ΣΤ Sida spinosa (Σίδη η ακανθώδης) Α αγροί, παρυφές δρόμων (16) 3,8 (14) L = D (14) 10 — 20 (6, 21) τραυματισμός (14) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (1) καμία ειδική αγωγή (6, 21) PRE & POST (6, 21, 28, 31) Α, ΣΤ PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (Παπάβερ η ροϊάς ή παπαρούνα) Α αγροί, αρόσιμες εκτάσεις, διαταραγμένες περιοχές (16, 19) 0,1 — 0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) ψυχρή στρωμάτωση και τραυματισμός (1, 19, 32) καμία ειδική αγωγή (4, 14, 29) POST (4) Α, Δ, Ε, ΣΤ, Ζ POACEAE Agrostis tenuis (Αγρώστις η λεπτή) χλοοτάπητες, βοσκότοποι (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1, 17-19) καμία ειδική αγωγή (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (Αλεποουρά) Α αγροί, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 0,9 — 1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) τραυματισμός (14) αγωγή με 101 mg/l KNO3 (14) θερμή στρωμάτωση (1) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1) καμία ειδική αγωγή (34) PRE & POST (28, 34) A 32 Avena fatua (Αγριοβρώμη) Α καλλιεργούμενες εκτάσεις, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 7 — 37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10 — 20 (6, 10) 3 (70 %) (18) τραυματισμός (7, 32) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1) ψυχρή στρωμάτωση (1, 18) καμία ειδική αγωγή (6, 10, 14) PRE & POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (Βρώμος ο στεγοφυής) Α αγροί, παρυφές δρόμων, αρόσιμες εκτάσεις (16) 0,45 — 2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) περίοδος ωρίμανσης (1, 7, 32) αναστολή εκβλάστησης λόγω φωτός (1) καμία ειδική αγωγή (14) PRE & POST (28, 31) Α Cynosurus cristatus (Κυνόσουρα η λοφωτή) P αγροί, παρυφές δρόμων, ανοικτά ενδιαιτήματα (16, 19) 0,5 — 0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (19) καμία ειδική αγωγή (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (Αιματόχορτο) Α αγροί, χλοοτάπητες, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 0,52 — 0,6 (14, 30) L = D (14) 10-20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) τραυματισμός, ψυχρή στρωμάτωση και ωρίμανση (1, 7, 14, 32) αγωγή με 101 mg/l KNO3 (14) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1) καμία ειδική αγωγή (21) PRE & POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (Μουχρίτσα) Α (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10 — 20 (7, 21) τραυματισμός (7, 32) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (1) καμία ειδική αγωγή (3, 14, 21) PRE & POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (Έλυμος ή άγρια σίκαλη του Καναδά) P παραποτάμιες περιοχές, διαταραγμένες περιοχές (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14 — 28 (11) καμία ειδική αγωγή (2, 11) POST (2) Γ, Δ, Ε Festuca pratensis (Φεστούκα η λειμώνιος) P αγροί, υγρές περιοχές (16, 19) 1,53 — 2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) καμία ειδική αγωγή (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (Κριθάρι νάνος) Α βοσκότοποι, παρυφές δρόμων, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 3,28 (14) θερμή στρωμάτωση (1) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (1) PRE (31) 7 Phleum pratense (Φλέως ο λειμώνιος) P βοσκότοποι, αρόσιμες εκτάσεις, διαταραγμένες περιοχές (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (19) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (17) καμία ειδική αγωγή (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (Αναρριχώμενο πολύγωνο) Α ανοικτά ενδιαιτήματα, παρυφές δρόμων (16) 5 — 8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) ψυχρή στρωμάτωση για 4 — 8 εβδομάδες (1, 2, 4, 20, 29) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (1) PRE & POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (Λαπάτσα) Α υγρά εδάφη (16) 1,8 — 2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (1) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (18) ψυχρή στρωμάτωση (1) καμία ειδική αγωγή (5) PRE & POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (Πολύγωνο της Πενσυλβανίας) Α αγροί, ανοικτά ενδιαιτήματα (16) 3,6 — 7 (14, 29) 2 (29) ψυχρή στρωμάτωση για 4 εβδομάδες σε 0 — 5 °C (1, 29) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (Αγριοπιπεριά) Α διαταραγμένες περιοχές, αρόσιμες εκτάσεις (16, 19) 2,1 — 2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) τραυματισμός, ψυχρή στρωμάτωση, αγωγή με GA (14) ψυχρή στρωμάτωση, ωρίμανση (17-19) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (19) καμία ειδική αγωγή (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (Λάπαθο) P αρόσιμες εκτάσεις, παρυφές δρόμων, ανοικτά ενδιαιτήματα (16, 19) 1,3 — 1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (18, 19) η ωρίμανση μπορεί να κρίνεται απαραίτητη (18) καμία ειδική αγωγή (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (Αναγαλλίς η αρουραία) Α αρόσιμες εκτάσεις, ανοικτά ενδιαιτήματα, διαταραγμένες περιοχές (16, 19) 0,4 — 1,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) ψυχρή στρωμάτωση, αγωγή με GA (1, 14, 18, 19, 32) απαιτείται φως για την εκβλάστηση (1) καμία ειδική αγωγή (2, 4) POST (2,4) Α, ΣΤ RANUNCULACEAE Ranunculus acris (Βατράχιο το κοινό) Ρ αρόσιμες εκτάσεις, παρυφές δρόμων, ανοικτά ενδιαιτήματα (16, 19) 1,5 — 8 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41-56 (19, 29) καμία ειδική αγωγή (5, 14, 22, 24 -26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (Γέο το αστικό) Ρ θαμνοστοιχίες, υγρές περιοχές (16, 19) 0,8 — 1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (18, 19) θερμή στρωμάτωση (1) καμία ειδική αγωγή (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (Γάλιο ή κολλητσίδα) Α αρόσιμες εκτάσεις, υγρές περιοχές, διαταραγμένες περιοχές (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) ψυχρή στρωμάτωση (1, 18, 19) η εκβλάστηση δεν επηρεάζεται από την ένταση της ακτινοβολίας (18, 19) αναστολή εκβλάστησης λόγω φωτός (1) καμία ειδική αγωγή (6, 14) PRE & POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (Γάλιο το μόλλουγο) Ρ θαμνοστοιχίες, ανοικτές περιοχές (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) καμία ειδική αγωγή (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (Διγιταλίς η Πορφυρά) Β, Ρ θαμνοστοιχίες, ανοικτές περιοχές (16, 19) 0,1 — 0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (1, 17-19) καμία ειδική αγωγή (4, 22-26) POST (4, 22 — 26) Δ, Ζ, ΣΤ Veronica persica (Βερόνικα η περσική) Α αρόσιμες εκτάσεις, ανοικτά ενδιαιτήματα, διαταραγμένες περιοχές (16, 19) 0,5 — 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18) αναστολή εκβλάστησης λόγω σκότους (18, 19) ψυχρή στρωμάτωση (18) καμία ειδική αγωγή (14) PRE & POST (28) A 32 Αναφερόμενοι προμηθευτές σπόρων Αναγνωριστικό προμηθευτή Στοιχεία προμηθευτή Α Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ΗΝΩΜΕΝΟ ΒΑΣΙΛΕΙΟ +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 ΗΠΑ (727) 344 — 4050 www.tropilab.com Γ Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 ΚΑΝΑΔΑΣ (519) 586 — 3985 Δ Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 ΗΠΑ (303) 431 — 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 ΗΠΑ (800) 873 — 3321 www.ernstseed.com ΣΤ Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ΗΝΩΜΕΝΟ ΒΑΣΙΛΕΙΟ +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk Ζ Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 ΚΑΝΑΔΑΣ (800) 274 — 7333 www.thompson-morgan.com ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-UpÒ). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. σ. 197-208. (7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. (10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC — Weeds. σ. 151-156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Προσωπική ανακοίνωση. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. (16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., Λονδίνο (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. (21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. (22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. (23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. (24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. (25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC — Weeds. σ. 1021-1028. (28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Προσωπική ανακοίνωση. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Προσωπική ανακοίνωση. (34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Προσάρτημα 4 Παραδείγματά κατάλληλων συνθηκών ανάπτυξής για ορισμένα είδη καλλιεργειών Οι ακόλουθες συνθήκες διαπιστώθηκε ότι είναι κατάλληλες για 10 είδη καλλιεργειών και μπορούν να χρησιμοποιούνται ως κατεύθυνση για τις δοκιμές σε θαλάμους ανάπτυξης μαζί με ορισμένα άλλα είδη: Συγκέντρωση διοξειδίου του άνθρακα: 350 ± 50 ppm· Σχετική υγρασία: 70 ± 5 % κατά τις περιόδους φωτισμού και 90 ± 5 % κατά τις περιόδους σκότους· Θερμοκρασία: 25 ± 3 °C κατά την ημέρα, 20 ± 3 °C κατά τη νύκτα· Φωτοπερίοδος: 16 ώρες φωτός / 8 ώρες σκότους, με την παραδοχή μέσου μήκους κύματος 400 έως 700 nm· Φως: φωτεινότητα 350 ± 50 μE/m2/s, μετρούμενη στην κορυφή του φυλλώματος. Τα είδη καλλιεργειών είναι τα εξής: — τομάτα (Solanum lycopersicon)· — αγγούρι (Cucumis sativus)· — μαρούλι (Lactuca sativa)· — σόγια (Glycine max)· — λάχανο (Brassica oleracea var. capitata)· — καρότο (Daucus carota)· — βρώμη (Avena sativa)· — λόλιο το πολυετές (Lolium perenne)· — αραβόσιτος (Zea mays)· — κρεμμύδι (Allium cepa). Γ.32. ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΣΕ ENCHYTRAEIDAE ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών είναι ισοδύναμη με την κατευθυντήρια γραμμή δοκιμών (TG) 220 του ΟΟΣΑ (2004). Έχει σχεδιαστεί με σκοπό να εκτιμηθούν οι επιδράσεις των χημικών ουσιών στις αναπαραγωγικές επιδόσεις του λευκού σκώληκα, Enchytraeus albidus Henle 1873, στο έδαφος. Η δοκιμή βασίζεται, κατά κύριο λόγο, σε μέθοδο που έχει αναπτυχθεί από την Ομοσπονδιακή Υπηρεσία Περιβάλλοντος (Umweltbundesamt) της Γερμανίας (1) και έχει υποβληθεί σε δοκιμή δακτυλίου (ring test) (2). Εξετάστηκαν και άλλες μέθοδοι για την εκτίμηση της τοξικότητας των χημικών ουσιών στα Enchytraeidae και στους γαιοσκώληκες (3)(4)(5)(6)(7)(8). ΑΡΧΙΚΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΕΙΣ 2. Οι αννελίδες που διαβιούν στο έδαφος και ανήκουν στο γένος Enchytraeus είναι οικολογικά σημαντικά είδη για τις δοκιμές οικοτοξικότητας. Αν και τα Enchytraeidae απαντούν συχνά σε εδάφη που περιέχουν γαιοσκώληκες, είναι εξίσου αληθές ότι συχνά αφθονούν σε πολλά εδάφη από τα οποία απουσιάζουν οι γαιοσκώληκες. Τα Enchytraeidae μπορούν να χρησιμοποιούνται σε εργαστηριακές δοκιμές, καθώς και σε μελέτες σε συνθήκες προσομοίωσης αγρού και σε συνθήκες αγρού. Από πρακτική άποψη, πολλά είδη Enchytraeus είναι εύκολα στον χειρισμό και την εκτροφή, και ο χρόνος γενεάς είναι σημαντικά μικρότερος από τον αντίστοιχο για τους γαιοσκώληκες. Για τον λόγο αυτό, η διάρκεια μιας δοκιμής αναπαραγωγής με Enchytraeidae είναι μόνο 4-6 εβδομάδες, ενώ για τους γαιοσκώληκες (Eisenia fetida) είναι 8 εβδομάδες. 3. Βασικές πληροφορίες σχετικά με την οικολογία και την οικοτοξικολογία των Enchytraeidae στο χερσαίο περιβάλλον περιλαμβάνονται στις παραπομπές (9)(10)(11)(12). ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 4. Οι ενήλικοι σκώληκες Enchytraeidae εκτίθενται σε ένα εύρος συγκεντρώσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που έχει αναμειχθεί σε τεχνητό έδαφος. Η δοκιμή μπορεί να διαιρεθεί σε δύο στάδια: α) σε περίπτωση που δεν είναι διαθέσιμες επαρκείς πληροφορίες, μια δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών, κατά την οποία η θνησιμότητα είναι το βασικό τελικό σημείο που εκτιμάται έπειτα από έκθεση δύο εβδομάδων, και β) μια οριστική δοκιμή αναπαραγωγής, κατά την οποία εκτιμώνται ο συνολικός αριθμός νεαρών σκωλήκων ανά γεννήτορα και η επιβίωση των γεννητόρων. Η οριστική δοκιμή διαρκεί έξι εβδομάδες. Μετά τις πρώτες τρεις εβδομάδες, οι ενήλικοι σκώληκες απομακρύνονται και καταγράφονται οι μορφολογικές μεταβολές. Μετά την πάροδο ακόμα τριών εβδομάδων, υπολογίζεται ο αριθμός απογόνων που έχουν εκκολαφθεί από τα κουκούλια τα οποία παρήγαγαν οι ενήλικοι σκώληκες. Οι αναπαραγωγικές επιδόσεις των ζώων που έχουν εκτεθεί στην υπό δοκιμή χημική ουσία συγκρίνονται με τις αντίστοιχες επιδόσεις του(των) μάρτυρα(-ων), ώστε να προσδιοριστούν (i) η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης (NOEC) και/ή (ii) η ECx (π.χ. EC10, EC50) με τη βοήθεια ενός μοντέλου παλινδρόμησης για να εκτιμηθεί η συγκέντρωση που θα προκαλούσε μείωση των αναπαραγωγικών επιδόσεων κατά x %. Οι συγκεντρώσεις δοκιμής θα πρέπει να περικλείουν την ECx (π.χ. EC10, EC50), ώστε η ECx να προκύπτει από παρεμβολή παρά από προεκβολή. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΠΟ ΔΟΚΙΜΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ 5. Η υδατοδιαλυτότητα, ο log Kow, ο συντελεστής κατανομής εδάφους/νερού (π.χ. κεφάλαιο Γ.18 ή Γ.19 του παρόντος παραρτήματος) και η τάση ατμών της υπό δοκιμή χημικής ουσίας θα πρέπει, κατά προτίμηση, να είναι γνωστά. Θα ήταν επιθυμητό να υπάρχουν επιπλέον πληροφορίες σχετικά με την πορεία της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο έδαφος, όπως η ταχύτητα φωτόλυσης και η ταχύτητα υδρόλυσης. 6. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών μπορεί να χρησιμοποιείται για υδατοδιαλυτές ή μη υδατοδιαλυτές χημικές ουσίες. Ωστόσο, ο τρόπος εφαρμογής της υπό δοκιμή χημικής ουσίας θα διαφέρει ανάλογα. Η παρούσα μέθοδος δοκιμών δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε πτητικές χημικές ουσίες, δηλ. σε χημικές ουσίες για τις οποίες η σταθερά του Henry ή ο συντελεστής κατανομής αέρα/νερού είναι μεγαλύτερα από τη μονάδα, ή σε χημικές ουσίες για τις οποίες η τάση ατμών υπερβαίνει τα 0,0133 Pa στους 25 °C. ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 7. Η δοκιμή θεωρείται έγκυρη, εάν διαπιστώνεται κατόπιν ελέγχων ότι ικανοποιούνται τα ακόλουθα κριτήρια επιδόσεων: — η θνησιμότητα στον ενήλικο πληθυσμό δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 20 % στο τέλος της δοκιμής προσδιορισμού του εύρους τιμών και μετά τις πρώτες τρεις εβδομάδες της δοκιμής αναπαραγωγής· — με την παραδοχή ότι χρησιμοποιήθηκαν 10 ενήλικοι σκώληκες ανά δοχείο κατά την έναρξη της δοκιμής, θα πρέπει να έχουν παραχθεί, κατά μέσο όρο, τουλάχιστον 25 νεαροί σκώληκες ανά δοχείο στο τέλος της δοκιμής· — ο συντελεστής μεταβολής που προσεγγίζει τον μέσο αριθμό νεαρών σκωλήκων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 50 % στο τέλος της δοκιμής αναπαραγωγής. Εάν η δοκιμή δεν ικανοποιεί τα ανωτέρω κριτήρια εγκυρότητας, θα πρέπει να τερματίζεται, εκτός εάν μπορεί να δικαιολογηθεί η συνέχισή της. Η αιτιολογία θα πρέπει να περιλαμβάνεται στην έκθεση δοκιμής. ΧΗΜΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ 8. Για να επαληθευτεί ότι η απόκριση των οργανισμών δοκιμής δεν έχει μεταβληθεί σημαντικά με την πάροδο του χρόνου, η χημική ουσία αναφοράς θα πρέπει είτε να υποβάλλεται σε δοκιμή σε τακτά χρονικά διαστήματα είτε να περιλαμβάνεται σε κάθε δοκιμή. Κατάλληλη χημική ουσία αναφοράς είναι η καρβενδαζίμη, η οποία έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει την επιβίωση και την αναπαραγωγή των Enchytraeidae (13)(14)· θα μπορούσαν επίσης να χρησιμοποιούνται άλλες χημικές ουσίες για τις οποίες υπάρχουν γνωστά τοξικολογικά δεδομένα. Σε δοκιμή δακτυλίου χρησιμοποιήθηκε σκεύασμα καρβενδαζίμης, γνωστό με την εμπορική ονομασία Derosal ™, το οποίο διατίθεται από την εταιρεία AgrEvo (Φρανκφούρτη, Γερμανία) και περιέχει 360 g/l (32,18 %) δραστικής ουσίας (2). Η τιμή της EC50 για την αναπαραγωγή που προσδιορίστηκε στη δοκιμή δακτυλίου κυμάνθηκε μεταξύ 1,2 ± 0,8 mg δραστικού συστατικού ανά κιλό ξηρής μάζας (2). Εάν στη σειρά δοκιμών συμπεριλαμβάνεται μια θετική πρότυπη τοξική ουσία, χρησιμοποιείται μόνο μία συγκέντρωση και ο αριθμός επαναλήψεων θα πρέπει να είναι ίδιος με τον αριθμό των μαρτύρων. Για την καρβενδαζίμη, συνιστάται η δοκιμή 1,2 mg δραστικού συστατικού ανά κιλό ξηρού βάρους (υποβλήθηκε στη δοκιμή με τη μορφή υγρού σκευάσματος). ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ Εξοπλισμός 9. Τα δοχεία δοκιμής θα πρέπει να είναι κατασκευασμένα από γυαλί ή άλλο χημικώς αδρανές υλικό. Οι γυάλινοι κώδωνες (π.χ. με όγκο 0,20 - 0,25 λίτρα και διάμετρο ≈ 6 cm) είναι κατάλληλοι. Τα δοχεία θα πρέπει να έχουν διαφανή καλύμματα (π.χ. από γυαλί ή πολυαιθυλένιο), τα οποία να είναι σχεδιασμένα ώστε να μειώνουν την εξάτμιση του νερού, επιτρέποντας την ανταλλαγή αερίων μεταξύ του εδάφους και της ατμόσφαιρας. Τα καλύμματα θα πρέπει να είναι διαφανή, ώστε να επιτρέπουν τη μετάδοση του φωτός. 10. Απαιτείται συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός, και ειδικότερα: — θάλαμος ξήρανσης· — στερεοσκοπικό μικροσκόπιο· — πεχάμετρο και φωτόμετρο· — κατάλληλοι ζυγοί ακριβείας· — κατάλληλος εξοπλισμός για τη ρύθμιση της θερμοκρασίας· — κατάλληλος εξοπλισμός για τη ρύθμιση της υγρασίας (δεν είναι σημαντικός, εάν τα δοχεία έκθεσης έχουν καλύμματα)· — επωαστήρας ή μικρό δωμάτιο με κλιματισμό· — λαβίδες, άγκιστρα ή βρόχοι· — λεκάνη εμφάνισης φωτογραφιών. Παρασκευή του τεχνητού εδάφους 11. Στην παρούσα δοκιμή χρησιμοποιείται τεχνητό έδαφος (5)(7) με την ακόλουθη σύνθεση (με βάση το ξηρό βάρος, που έχει ξηρανθεί μέχρι σταθερού βάρους στους 105 °C): — 10 % τύρφη σφάγνων, αερόξηρη και λεπτοαλεσμένη (είναι αποδεκτό το μέγεθος σωματιδίων 2 ± 1 mm)· συνιστάται να ελέγχεται ότι το έδαφος που έχει παρασκευαστεί με πρόσφατη παρτίδα τύρφης είναι κατάλληλο για την καλλιέργεια των σκωλήκων προτού χρησιμοποιηθεί στη δοκιμή· — 20 % καολινιτική άργιλος (περιεκτικότητα σε καολινίτη κατά προτίμηση άνω του 30 %)· — περίπου 0,3 έως 1,0 % ανθρακικό ασβέστιο (CaCO3, κονιοποιημένο, αναλυτικής καθαρότητας), για να επιτευχθεί pH 6,0 ± 0,5· η ποσότητα ανθρακικού ασβεστίου που πρέπει να προστίθεται μπορεί να εξαρτάται, κατά κύριο λόγο, από την ποιότητα/φύση της τύρφης· — περίπου 70 % αερόξηρη χαλαζιακή άμμος (ανάλογα με την απαιτούμενη ποσότητα CaCO3), πρωτίστως λεπτή άμμος (το μέγεθος του 50 % και άνω των σωματιδίων θα πρέπει να είναι μεταξύ 50 και 200 μm). Συνιστάται να αποδεικνύεται η καταλληλότητα του τεχνητού εδάφους για την καλλιέργεια των σκωλήκων και για την εκπλήρωση των κριτηρίων εγκυρότητας της δοκιμής πριν από τη χρήση του εδάφους σε οριστική δοκιμή. Συνιστάται ιδίως ο έλεγχος αυτός να διασφαλίζει ότι οι επιδόσεις της δοκιμής δεν αλλοιώνονται σε περίπτωση που η περιεκτικότητα του τεχνητού εδάφους σε οργανικό άνθρακα μειώνεται, π.χ. με μείωση της περιεκτικότητας σε τύρφη στο 4-5 % και με αντίστοιχη αύξηση της περιεκτικότητας σε άμμο. Με αυτή τη μείωση της περιεκτικότητας σε οργανικό άνθρακα είναι δυνατόν να μειωθούν οι δυνατότητες προσρόφησης της υπό δοκιμή χημικής ουσίας στο έδαφος (οργανικός άνθρακας) και να αυξηθεί η διαθεσιμότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας για τους σκώληκες. Έχει αποδειχτεί ότι ο Enchytraeus albidus μπορεί να ικανοποιεί τα κριτήρια εγκυρότητας σχετικά με την αναπαραγωγή, όταν υποβάλλεται σε δοκιμές με γεωργικά εδάφη χαμηλότερης περιεκτικότητας σε οργανικό άνθρακα απ' ό,τι προαναφέρεται (π.χ. 2,7 %) (15)· η –περιορισμένη– πείρα δείχνει ότι αυτό μπορεί να επιτευχθεί και σε τεχνητό έδαφος με 5 % τύρφη. Σημείωση: Όταν χρησιμοποιείται φυσικό έδαφος σε επιπλέον δοκιμές (π.χ. ανώτερης βαθμίδας), η καταλληλότητα του εδάφους και η ικανοποίηση των κριτηρίων εγκυρότητας της δοκιμής θα πρέπει επίσης να αποδεικνύονται. 12. Τα ξηρά συστατικά του εδάφους αναμειγνύονται πλήρως (π.χ. σε εργαστηριακό αναμείκτη μεγάλης κλίμακας). Αυτό θα πρέπει να γίνεται τουλάχιστον μία εβδομάδα πριν από την έναρξη της δοκιμής. Το αναμειγμένο έδαφος θα πρέπει να φυλάσσεται για δύο ημέρες, για την εξισορρόπηση/σταθεροποίηση της οξύτητας. Για τον προσδιορισμό του pH χρησιμοποιείται μείγμα εδάφους και διάλυμα 1 M χλωριούχου καλίου (KCl) ή 0,01 M χλωριούχου ασβεστίου (CaCl2) σε αναλογία 1:5 [βλ. (16) και προσάρτημα 3]. Εάν η οξύτητα του εδάφους υπερβαίνει το απαιτούμενο εύρος τιμών (βλ. σημείο 11), μπορεί να προσαρμόζεται με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας CaCO3. Εάν το έδαφος είναι υπερβολικά αλκαλικό, μπορεί να προσαρμόζεται με την προσθήκη μεγαλύτερης ποσότητας του μείγματος που αναφέρεται στο σημείο 11, αλλά χωρίς CaCO3. 13. Η μέγιστη υδατοχωρητικότητα του τεχνητού εδάφους προσδιορίζεται σύμφωνα με τις διεργασίες που περιγράφονται στο προσάρτημα 2. Μία ή δύο ημέρες πριν από την έναρξη της δοκιμής, το ξηρό τεχνητό έδαφος προϋγραίνεται με την προσθήκη επαρκούς ποσότητας απιονισμένου νερού, ώστε να επιτευχθεί περίπου το ήμισυ της τελικής περιεκτικότητας σε υγρασία, η οποία θα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 40 % και 60 % της μέγιστης υδατοχωρητικότητας. Κατά την έναρξη της δοκιμής, το προϋγραθέν έδαφος διαρείται σε δόσεις οι οποίες αντιστοιχούν στον αριθμό των συγκεντρώσεων δοκιμής (και, κατά περίπτωση, των χημικών ουσιών αναφοράς) και των μαρτύρων που χρησιμοποιούνται για τη δοκιμή. Η περιεκτικότητα σε υγρασία προσαρμόζεται στο 40-60 % της μέγιστης υδατοχωρητικότητας με την προσθήκη του διαλύματος της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και/ή με την προσθήκη απεσταγμένου ή απιονισμένου νερoύ (βλ. σημεία 19-21). Η περιεκτικότητα σε υγρασία προσδιορίζεται στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής (με ξήρανση μέχρι σταθερού βάρους στους 105 °C) και θα πρέπει να κυμαίνεται εντός του βέλτιστου εύρους για την επιβίωση των σκωλήκων. Η περιεκτικότητα του εδάφους σε υγρασία μπορεί να εκτιμηθεί κατά προσέγγιση με την ήπια συμπίεση του εδάφους με το χέρι: εάν η περιεκτικότητα σε υγρασία είναι σωστή, θα πρέπει να εμφανίζονται μικρές σταγόνες νερού μεταξύ των δακτύλων. Επιλογή και προετοιμασία των ζώων δοκιμής 14. Το συνιστώμενο για τη δοκιμή είδος είναι το Enchytraeus albidus Henle 1837 (λευκός σκώληκας), μέλος της οικογένειας των Enchytraeidae (τάξη Ολιγόχαιτων, συνομοταξία Αννελιδών). Το είδος E. albidus είναι ένα από τα μεγαλύτερα είδη Enchytraeidae· έχουν καταγραφεί δείγματα μήκους έως 35 mm (17)(18). Το E. albidus εμφανίζει παγκόσμια κατανομή και εντοπίζεται σε θαλάσσια, λιμναία και χερσαία ενδιαιτήματα, κυρίως σε αποσυντιθέμενη οργανική ύλη (φύκη, κομπόστ) και σπανίως σε λειμώνες (9). Η ευρεία οικολογική ανοχή του και ορισμένες μορφολογικές παραλλαγές μπορεί να αποτελούν ένδειξη ότι υπάρχουν διαφορετικές φυλές. 15. Το E. albidus διατίθεται στο εμπόριο ως ιχθυοτροφή. Θα πρέπει να ελέγχεται αν η καλλιέργεια είναι μολυσμένη από άλλα, συνήθως μικρότερα, είδη (1)(19). Σε περίπτωση μόλυνσης, όλοι οι σκώληκες θα πρέπει να εκπλύνονται με νερό σε τρυβλίο Petri. Στη συνέχεια, θα πρέπει να επιλέγονται μεγάλα δείγματα ενηλίκων E. albidus (με τη βοήθεια στερεοσκοπικού μικροσκοπίου) για την έναρξη νέας καλλιέργειας και όλοι οι άλλοι σκώληκες να απορρίπτονται. Το E. albidus μπορεί να αναπαράγεται εύκολα σε μεγάλο εύρος οργανικών υλών (βλ. προσάρτημα 4). Ο κύκλος ζωής του E. albidus είναι σύντομος, καθώς φθάνει σε ωρίμανση εντός διαστήματος από 33 ημέρες (στους 18 °C) έως 74 ημέρες (στους 12 °C) (1). Για τη δοκιμή θα χρησιμοποιούνται μόνο καλλιέργειες που έχουν παραμείνει στο εργαστήριο για τουλάχιστον 5 εβδομάδες (μία γενεά), χωρίς να έχουν παρουσιαστεί προβλήματα. 16. Κατάλληλα είναι και άλλα είδη του γένους Enchytraeus, όπως το E. buchholzi Vejdovsky 1879 ή το E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (βλ. προσάρτημα 5). Εάν χρησιμοποιούνται άλλα είδη Enchytraeus, πρέπει να προσδιορίζονται σαφώς και να αιτιολογείται το σκεπτικό της επιλογής τους. 17. Τα ζώα που χρησιμοποιούνται στις δοκιμές είναι ενήλικοι σκώληκες. Θα πρέπει να έχουν αυγά (με κηλίδες) στον δακτυλιοειδή ωοφόρο σάκο και να έχουν περίπου το ίδιο μέγεθος (μήκος περίπου 1 cm). Ο συγχρονισμός της καλλιέργειας αναπαραγωγής δεν είναι απαραίτητος. 18. Εάν τα Enchytraeidae δεν αναπαράγονται στον ίδιο τύπο εδάφους και υπό τις συνθήκες που χρησιμοποιούνται για την τελική δοκιμή (συμπεριλαμβανομένων των συνθηκών σίτισης), πρέπει να εγκλιματίζονται για τουλάχιστον 24 ώρες και έως τρεις ημέρες. Αρχικά, θα πρέπει να εγκλιματίζεται μεγαλύτερος αριθμός ενήλικων σκωλήκων από εκείνον που απαιτείται για την εκτέλεση της δοκιμής, ώστε να υπάρχει το περιθώριο απόρριψης των δειγμάτων που έχουν υποστεί βλάβη ή έχουν καταστεί ακατάλληλα με άλλον τρόπο. Στο τέλος της περιόδου εγκλιματισμού, επιλέγονται για τη δοκιμή μόνο οι σκώληκες που περιέχουν αυγά και δεν εμφανίζουν ανωμαλίες στη συμπεριφορά τους (π.χ. επιχειρούν να αποδράσουν από το έδαφος). Οι σκώληκες απομακρύνονται προσεκτικά με τη χρήση λαβίδων εργαστηρίου, αγκίστρων ή βρόχων και τοποθετούνται σε τρυβλίο Petri που περιέχει μικρή ποσότητα γλυκού νερού. Για τον συγκεκριμένο σκοπό προτιμάται ανασυσταθέν γλυκό νερό, όπως προτείνεται στο κεφάλαιο Γ.20 του παρόντος παραρτήματος (Δοκιμασία αναπαραγωγής Daphnia magna), αφού το απιονισμένο νερό, το απομεταλλοποιημένο νερό ή το νερό βρύσης θα μπορούσε να είναι επιβλαβές για τους σκώληκες. Οι σκώληκες επιθεωρούνται στο στερεοσκοπικό μικροσκόπιο και απομακρύνονται όσοι δεν περιέχουν αυγά. Λαμβάνεται μέριμνα ώστε να απομακρύνονται και να απορρίπτονται τυχόν ακάρεα ή κολλέμβολα που ενδέχεται να έχουν μολύνει τις καλλιέργειες. Οι υγιείς σκώληκες που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί στη δοκιμή επιστρέφουν στη μητρική καλλιέργεια. Παρασκευή των συγκεντρώσεων δοκιμής Υδατοδιαλυτή υπό δοκιμή χημική ουσία 19. Παρασκευάζεται διάλυμα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σε απιονισμένο νερό σε ποσότητα επαρκή για όλες τις επαναλήψεις μίας συγκέντρωσης δοκιμής. Συνιστάται να χρησιμοποιείται κατάλληλη ποσότητα νερού ώστε να επιτυγχάνεται η απαιτούμενη περιεκτικότητα σε υγρασία, δηλ. 40 έως 60 % της μέγιστης υδατοχωρητικότητας (βλ. σημείο 13). Κάθε διάλυμα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας αναμειγνύεται πλήρως με μία παρτίδα του προϋγραθέντος εδάφους πριν από την εισαγωγή του στο δοχείο δοκιμής. Υπό δοκιμή χημική ουσία αδιάλυτη στο νερό 20. Όταν πρόκειται για χημικές ουσίες αδιάλυτες στο νερό αλλά διαλυτές σε οργανικούς διαλύτες, η υπό δοκιμή χημική ουσία μπορεί να διαλύεται στον μικρότερο δυνατό όγκο κατάλληλου φορέα (π.χ. ακετόνης). Μόνο πτητικοί διαλύτες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται. Ο φορέας ψεκάζεται ή αναμειγνύεται με μικρή ποσότητα, π.χ. 2,5 g, λεπτής χαλαζιακής άμμου. Ο φορέας απομακρύνεται με εξάτμιση κάτω από απαγωγό επί τουλάχιστον μία ώρα. Αυτό το μείγμα χαλαζιακής άμμου και υπό δοκιμή χημικής ουσίας προστίθεται στο προϋγραθέν έδαφος και αναμειγνύεται πλήρως μετά την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας απιονισμένου νερού για να επιτευχθεί η απαιτούμενη περιεκτικότητα σε υγρασία. Το τελικό μείγμα εισάγεται στα δοχεία δοκιμής. 21. Εάν πρόκειται για χημικές ουσίες που είναι δυσδιάλυτες στο νερό και σε οργανικούς διαλύτες, αναμειγνύεται το ισοδύναμο 2,5 g λεπτοαλεσμένης χαλαζιακής άμμου ανά δοχείο δοκιμής με την ποσότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, για να ληφθεί η επιθυμητή συγκέντρωση δοκιμής. Αυτό το μείγμα χαλαζιακής άμμου και υπό δοκιμή χημικής ουσίας προστίθεται στο προϋγραθέν έδαφος και αναμειγνύεται πλήρως μετά την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας απιονισμένου νερού για να επιτευχθεί η απαιτούμενη περιεκτικότητα σε υγρασία. Το τελικό μείγμα κατανέμεται στα δοχεία δοκιμής. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται για κάθε συγκέντρωση δοκιμής και παρασκευάζεται επίσης κατάλληλος μάρτυρας. 22. Κατά κανόνα, οι χημικές ουσίες δεν θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμές σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 1 000 mg/kg ξηρής μάζας εδάφους. Ωστόσο, οι δοκιμές σε υψηλότερες συγκεντρώσεις μπορεί να απαιτούνται ανάλογα με τους στόχους της εκάστοτε δοκιμής. ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΩΝ ΔΟΚΙΜΩΝ Ομάδες δοκιμής και ελέγχου 23. Για κάθε συγκέντρωση δοκιμής, εισάγεται στο δοχείο δοκιμής ποσότητα του εδάφους δοκιμής η οποία αντιστοιχεί σε 20 g ξηρού βάρους (βλ. σημεία 19-21). Παρασκευάζονται επίσης μάρτυρες, χωρίς την υπό δοκιμή χημική ουσία. Σε κάθε δοχείο δοκιμής τοποθετείται τροφή σύμφωνα με τις διεργασίες που περιγράφονται στο σημείο 29. Δέκα σκώληκες κατανέμονται τυχαία σε κάθε δοχείο δοκιμής. Οι σκώληκες μεταφέρονται προσεκτικά σε κάθε δοχείο δοκιμής και τοποθετούνται στην επιφάνεια του εδάφους με τη χρήση, π.χ., λαβίδων εργαστηρίου, αγκίστρων ή βρόχων. Ο αριθμός επαναλήψεων για τις συγκεντρώσεις δοκιμής και για τους μάρτυρες εξαρτάται από τον σχεδιασμό της δοκιμής που εκτελείται (βλ. σημείο 34). Τα δοχεία δοκιμής τοποθετούνται τυχαία στον επωαστήρα δοκιμής, και αυτές οι θέσεις αλλάζουν τυχαία σε εβδομαδιαία βάση. 24. Εάν χρησιμοποιείται φορέας για την εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας, θα πρέπει να υποβάλλεται σε δοκιμή, εκτός από τη σειρά με την υπό δοκιμή ουσία, και μία σειρά μαρτύρων που περιέχουν χαλαζιακή άμμο ψεκασμένη ή αναμειγμένη με διαλύτη. Η συγκέντρωση του διαλύτη ή του μέσου διασποράς πρέπει να είναι η ίδια με εκείνη που χρησιμοποιείται στα δοχεία δοκιμής που περιέχουν την υπό δοκιμή χημική ουσία. Σε δοκιμή θα πρέπει επίσης να υποβάλλεται μια σειρά μαρτύρων που περιέχουν επιπλέον χαλαζιακή άμμο (2,5 g ανά δοχείο) για τις ουσίες που απαιτούν χορήγηση σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφονται στο σημείο 21. Συνθήκες δοκιμής 25. Η θερμοκρασία δοκιμής είναι 20 ± 2 °C. Για να αποτρέπεται η διαφυγή σκωλήκων από το έδαφος, η δοκιμή διενεργείται σε ελεγχόμενους κύκλους φωτός-σκότους (κατά προτίμηση, 16 ώρες φωτός και 8 ώρες σκότους) με φωτισμό έντασης 400 έως 800 lux στην περιοχή των δοχείων δοκιμής. 26. Για τον έλεγχο της υγρασίας τους εδάφους, τα δοχεία ζυγίζονται στην αρχή της δοκιμής και, στη συνέχεια, μία φορά την εβδομάδα. Η απώλεια βάρους αποκαθίσταται με την προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας απιονισμένου νερού. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η απώλεια νερού μπορεί να μειωθεί με τη διατήρηση υψηλής υγρασίας του αέρα (> 80 %) στον επωαστήρα δοκιμής. 27. Η περιεκτικότητα σε υγρασία και το pH θα πρέπει να μετρώνται στην αρχή και στο τέλος τόσο της δοκιμής προσδιορισμού του εύρους τιμών όσο και της οριστικής δοκιμής. Οι μετρήσεις θα πρέπει να διενεργούνται τόσο σε δείγματα εδάφους που έχουν υποβληθεί σε αγωγή (όλες οι συγκεντρώσεις) όσο και σε δείγματα εδάφους ελέγχου, τα οποία έχουν παρασκευαστεί και φυλάσσονται με τον ίδιο τρόπο όπως οι καλλιέργειες δοκιμής, αλλά δεν περιέχουν σκώληκες. Η τροφή θα πρέπει να προστίθεται μόνο σε αυτά τα δείγματα εδάφους στην αρχή της δοκιμής, ώστε να διευκολύνεται η μικροβιακή δραστηριότητα. Η ποσότητα προστιθέμενης τροφής θα πρέπει να είναι ίδια με εκείνη που προστίθεται στις καλλιέργειες δοκιμής. Δεν είναι αναγκαίο να προστίθεται επιπλέον τροφή σε αυτά τα δοχεία κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Σίτιση 28. Μπορεί να χρησιμοποιείται τροφή ικανή να διατηρεί τον πληθυσμό των Enchytraeidae. Έχει διαπιστωθεί ότι οι νιφάδες βρώμης –κατά προτίμηση, θερμασμένες σε αυτόκαυστο πριν από τη χρήση, ώστε να προλαμβάνεται η μικροβιακή επιμόλυνση (ενδείκνυται επίσης η θέρμανση)– αποτελούν κατάλληλο υλικό σίτισης. 29. Αρχικά, η τροφή χορηγείται με την ανάμειξη 50 mg αλεσμένων νιφάδων βρώμης με το έδαφος σε κάθε δοχείο πριν από την εισαγωγή των σκωλήκων. Στη συνέχεια, η τροφή χορηγείται σε εβδομαδιαία βάση έως την 21η ημέρα. Η σίτιση δεν πραγματοποιείται την 28η ημέρα, αφού οι ενήλικοι σκώληκες έχουν απομακρυνθεί σε αυτό το στάδιο και οι νεαροί σκώληκες χρειάζονται σχετικά μικρή ποσότητα επιπλέον τροφής από το στάδιο αυτό και μετά. Η σίτιση κατά τη διάρκεια της δοκιμής περιλαμβάνει 25 mg αλεσμένων νιφάδων βρώμης ανά δοχείο, που τοποθετούνται προσεκτικά στην επιφάνεια του εδάφους, ώστε να αποφεύγεται η πρόκληση βλάβης στους σκώληκες. Για να μειωθεί η ανάπτυξη μυκήτων, οι νιφάδες βρώμης θα πρέπει να θάβονται στο έδαφος, δηλ. να καλύπτονται με μικρές ποσότητες εδάφους. Εάν παραμένουν υπολείμματα τροφής, θα πρέπει να μειώνεται το σιτηρέσιο. Σχεδιασμός της δοκιμής προσδιορισμού του εύρους τιμών 30. Όταν κρίνεται αναγκαίο, διενεργείται η δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών, π.χ. με πέντε συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή χημικής ουσίας των 0,1, 1,0, 10, 100 και 1 000 mg/kg (ξερό βάρος εδάφους). Μία επανάληψη για κάθε αγωγή και μάρτυρα είναι αρκετή. 31. Η δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών διαρκεί δύο εβδομάδες. Στο τέλος της δοκιμής, αξιολογείται η θνησιμότητα των σκωλήκων. Ένας σκώληκας θεωρείται νεκρός, εάν δεν αντιδρά σε μηχανικό ερέθισμα στο πρόσθιο άκρο. Επιπλέον πληροφορίες σχετικά με τη θνησιμότητα μπορεί να είναι χρήσιμες και για να καθοριστεί το εύρος των συγκεντρώσεων που θα χρησιμοποιηθούν στην οριστική δοκιμή. Κατά συνέπεια, οι μεταβολές στη συμπεριφορά των ενηλίκων (π.χ. εάν δεν είναι σε θέση να σκάπτουν το έδαφος ή εάν μένουν ακίνητοι στο γυάλινο τοίχωμα του δοχείου δοκιμής) και στη μορφολογία τους (π.χ. η ύπαρξη ανοικτών πληγών) θα πρέπει επίσης να καταγράφονται, παράλληλα με την παρουσία τυχόν νεαρών σκωλήκων. Η παρουσία αυτή μπορεί να προσδιορίζεται με την εφαρμογή της μεθόδου χρωματισμού που περιγράφεται στο προσάρτημα 6. 32. Η LC50 μπορεί να προσδιοριστεί κατά προσέγγιση με τον υπολογισμό του γεωμετρικού μέσου των δεδομένων θνησιμότητας. Κατά τον προσδιορισμό του εύρους συγκεντρώσεων για την οριστική δοκιμή, λαμβάνεται η παραδοχή ότι οι επιδράσεις στην αναπαραγωγή είναι χαμηλότερες από την LC50 κατά έναν παράγοντα έως 10. Ωστόσο, πρόκειται για εμπειρική συσχέτιση, η οποία σε οποιαδήποτε συγκεκριμένη περίπτωση ενδέχεται να είναι διαφορετική. Οι επιπλέον παρατηρήσεις που διατυπώνονται στο πλαίσιο της δοκιμής προσδιορισμού του εύρους τιμών, όπως η παρουσία νεαρών σκωλήκων, μπορεί να συμβάλουν στον λεπτομερέστερο προσδιορισμό του εύρους συγκεντρώσεων της υπό δοκιμή χημικής ουσίας που θα χρησιμοποιηθούν στην οριστική δοκιμή. 33. Για τον ακριβή προσδιορισμό της LC50, συνιστάται να εκτελείται η δοκιμή με τη χρήση τουλάχιστον τεσσάρων επαναλήψεων ανά συγκέντρωση της υπό δοκιμή χημικής ουσίας και επαρκούς αριθμού συγκεντρώσεων, ώστε να προκαλούνται τουλάχιστον τέσσερις διαφορετικές στατιστικώς σημαντικές μέσες αποκρίσεις σε αυτές τις συγκεντρώσεις. Κατά περίπτωση, χρησιμοποιείται ανάλογος αριθμός συγκεντρώσεων και επαναλήψεων για τους μάρτυρες. Σχεδιασμός της οριστικής δοκιμής αναπαραγωγής 34. Προτείνονται τρεις σχεδιασμοί με βάση τις συστάσεις που προκύπτουν από μια δοκιμή δακτυλίου (2): — Για τον προσδιορισμό της NOEC, θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή τουλάχιστον πέντε συγκεντρώσεις σε γεωμετρική πρόοδο. Συνιστώνται τέσσερις επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση δοκιμής συν οκτώ μάρτυρες. Οι συγκεντρώσεις θα πρέπει να απέχουν μεταξύ τους κατά έναν παράγοντα που να μην υπερβαίνει το 1,8. — Για τον προσδιορισμό της ECx (π.χ. EC10, EC50), θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή τουλάχιστον πέντε συγκεντρώσεις και οι συγκεντρώσεις θα πρέπει να περικλείουν την ECx, ώστε η ECx να προκύπτει από παρεμβολή παρά από προεκβολή. Συνιστώνται τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση δοκιμής και τέσσερις επαναλήψεις ελέγχου. Ο παράγοντας διαστήματος μπορεί να ποικίλλει, δηλ. να είναι μικρότερος ή ίσος με 1,8 στο εύρος των αναμενόμενων επιδράσεων, και άνω του 1,8 στις υψηλότερες και χαμηλότερες συγκεντρώσεις. — Η συνδυασμένη προσέγγιση καθιστά εφικτό τον προσδιορισμό τόσο της NOEC όσο και της ECx. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οκτώ συγκεντρώσεις αγωγής σε γεωμετρική πρόοδο. Συνιστώνται τέσσερις επαναλήψεις για κάθε αγωγή συν οκτώ μάρτυρες. Οι συγκεντρώσεις θα πρέπει να απέχουν μεταξύ τους κατά έναν παράγοντα που να μην υπερβαίνει το 1,8. 35. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται δέκα ενήλικοι σκώληκες ανά δοχείο δοκιμής (βλ. σημείο 23). Στα δοχεία δοκιμής προστίθεται τροφή στην αρχή της δοκιμής και, στη συνέχεια, μία φορά την εβδομάδα (βλ. σημείο 29) έως και την 21η ημέρα. Την 21η ημέρα τα δείγματα εδάφους αναμοχλεύονται προσεκτικά με το χέρι, οι ζώντες ενήλικοι σκώληκες εξετάζονται και μετρώνται, και καταγράφονται οι μεταβολές στη συμπεριφορά τους (π.χ. εάν δεν είναι σε θέση να σκάπτουν το έδαφος ή εάν μένουν ακίνητοι στο γυάλινο τοίχωμα του δοχείου δοκιμής) και στη μορφολογία τους (π.χ. ανοικτές πληγές). Στη συνέχεια, όλοι οι ενήλικοι σκώληκες απομακρύνονται από τα δοχεία δοκιμής και το έδαφος δοκιμής. Το έδαφος δοκιμής που περιέχει τυχόν κουκούλια τα οποία είχαν παραχθεί εκκολάπτεται για τρεις επιπλέον εβδομάδες υπό τις ίδιες συνθήκες δοκιμής, με τη διαφορά ότι η σίτιση πραγματοποιείται μόνο κατά την 35η ημέρα (δηλ. 25 mg αλεσμένες νιφάδες βρώμης ανά δοχείο). 36. Έπειτα από έξι εβδομάδες, γίνεται η μέτρηση των νεοεκκολαφθέντων σκωλήκων. Συνιστάται η μέθοδος χρωματισμού με κόκκινο της Βεγγάλης (βλ. προσάρτημα 6), αν και έχουν αποδειχθεί κατάλληλες και άλλες τεχνικές υγρής (αλλά όχι θερμής) εκχύλισης και επίπλευσης (βλ. προσάρτημα 6) (4)(10)(11)(20). Η μέθοδος χρωματισμού με κόκκινο της Βεγγάλης συνιστάται επειδή η υγρή εκχύλιση από το έδαφος μπορεί να παρεμποδίζεται από τη θολερότητα που οφείλεται στα αιωρούμενα σωματίδια αργίλου. Οριακή δοκιμή 37. Εάν δεν παρατηρούνται επιδράσεις στην υψηλότερη συγκέντρωση κατά τη δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών (δηλ. 1 000 mg/kg), η δοκιμή αναπαραγωγής μπορεί να διενεργείται ως οριακή δοκιμή με τη χρήση 1 000 mg/kg, ώστε να αποδεικνύεται ότι η NOEC για την αναπαραγωγή είναι μεγαλύτερη από τη συγκεκριμένη τιμή. Περίληψη και χρονοδιάγραμμα της δοκιμής 38. Τα βήματα της δοκιμής συνοψίζονται ως εξής: Χρόνος Δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών Οριστική δοκιμή Ημέρα –7 ή προγενέστερη — Προετοιμασία τεχνητού εδάφους (ανάμειξη ξηρών συστατικών) — Προετοιμασία τεχνητού εδάφους (ανάμειξη ξηρών συστατικών) Ημέρα –5 — Έλεγχος του pH του τεχνητού εδάφους — Μέτρηση της μέγιστης υδατοχωρητικότητας του εδάφους — Έλεγχος του pH του τεχνητού εδάφους — Μέτρηση της μέγιστης υδατοχωρητικότητας του εδάφους Ημέρα –5 έως –3 — Διαλογή σκωλήκων για εγκλιματισμό — Διαλογή σκωλήκων για εγκλιματισμό Ημέρα — 3 έως 0 — Εγκλιματισμός σκωλήκων για τουλάχιστον 24 ώρες — Εγκλιματισμός σκωλήκων για τουλάχιστον 24 ώρες Ημέρα –1 — Προΰγρανση του τεχνητού εδάφους και κατανομή σε παρτίδες — Προΰγρανση του τεχνητού εδάφους και κατανομή σε παρτίδες Ημέρα 0 — Παρασκευή διαλυμάτων παρακαταθήκης — Εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας — Ζύγιση του υποστρώματος δοκιμής στα δοχεία δοκιμής — Ανάμειξη στην τροφή — Εισαγωγή των σκωλήκων — Μέτρηση του pH του εδάφους και της περιεκτικότητας σε υγρασία — Παρασκευή διαλυμάτων παρακαταθήκης — Εφαρμογή της υπό δοκιμή χημικής ουσίας — Ζύγιση του υποστρώματος δοκιμής στα δοχεία δοκιμής — Ανάμειξη στην τροφή — Εισαγωγή των σκωλήκων — Μέτρηση του pH του εδάφους και της περιεκτικότητας σε υγρασία Ημέρα 7 — Έλεγχος της περιεκτικότητας του εδάφους σε υγρασία — Έλεγχος της περιεκτικότητας του εδάφους σε υγρασία — Σίτιση Ημέρα 14 — Προσδιορισμός της θνησιμότητας στον ενήλικο πληθυσμό — Εκτίμηση του αριθμού των νεαρών σκωλήκων — Μέτρηση του pH του εδάφους και της περιεκτικότητας σε υγρασία — Έλεγχος της περιεκτικότητας του εδάφους σε υγρασία — Σίτιση Ημέρα 21 — Παρατήρηση της συμπεριφοράς των ενηλίκων — Απομάκρυνση των ενηλίκων — Προσδιορισμός της θνησιμότητας στον ενήλικο πληθυσμό — Έλεγχος της περιεκτικότητας του εδάφους σε υγρασία — Σίτιση Ημέρα 28 — Έλεγχος της περιεκτικότητας του εδάφους σε υγρασία — Διακοπή σίτισης Ημέρα 35 — Έλεγχος της περιεκτικότητας του εδάφους σε υγρασία — Σίτιση Ημέρα 42 — Μέτρηση των νεαρών σκωλήκων — Μέτρηση του pH του εδάφους και της περιεκτικότητας σε υγρασία ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΕΚΘΕΣΕΙΣ Επεξεργασία των αποτελεσμάτων 39. Επισκόπηση των αποτελεσμάτων παρέχεται στο προσάρτημα 7. Ωστόσο, στην παρούσα μέθοδο δοκιμών δεν δίνεται καμία οριστική στατιστική κατεύθυνση όσον αφορά την ανάλυση των αποτελεσμάτων της δοκιμής. 40. Στη δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών, το βασικό τελικό σημείο είναι η θνησιμότητα. Ωστόσο, οι μεταβολές στη συμπεριφορά των ενήλικων σκωλήκων (π.χ. εάν δεν είναι σε θέση να σκάπτουν το έδαφος ή εάν μένουν ακίνητοι στο γυάλινο τοίχωμα του δοχείου δοκιμής) και στη μορφολογία τους (π.χ. η ύπαρξη ανοικτών πληγών) θα πρέπει επίσης να καταγράφονται, παράλληλα με την παρουσία τυχόν νεαρών σκωλήκων. Η ανάλυση Probit (21) ή η λογιστική παλινδρόμηση θα πρέπει, κατά κανόνα, να εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό της LC50. Ωστόσο, σε περιπτώσεις που η συγκεκριμένη μέθοδος ανάλυσης είναι ακατάλληλη (π.χ. εάν είναι διαθέσιμες λιγότερες από τρεις συγκεντρώσεις με μερική θνησιμότητα), μπορούν να χρησιμοποιούνται εναλλακτικές μέθοδοι. Αυτές οι μέθοδοι θα μπορούσαν να περιλαμβάνουν κινητούς μέσους όρους (22), την απλοποιημένη μέθοδο Spearman-Karber (23) ή την απλή παρεμβολή (π.χ. γεωμετρικός μέσος της LC0 και της LC100, όπως υπολογίζεται με την τετραγωνική ρίζα της LC0 πολλαπλασιαζόμενη με την LC100). 41. Στην οριστική δοκιμή, το τελικό σημείο είναι η γονιμότητα (δηλ. ο αριθμός των νεαρών σκωλήκων που παράγονται). Ωστόσο, όπως και στη δοκιμή προσδιορισμού του εύρους τιμών, όλα τα άλλα σημεία νοσηρότητας θα πρέπει να καταγράφονται στην τελική έκθεση. Η στατιστική ανάλυση απαιτεί να υπολογίζονται η αριθμητική μέση τιμή και η τυπική απόκλιση ανά αγωγή και ανά μάρτυρα για την αναπαραγωγή. 42. Εάν έχει διενεργηθεί ανάλυση διασποράς, η τυπική απόκλιση, s, και οι βαθμοί ελευθερίας, df, μπορούν να αντικατασταθούν από τη συνολική εκτίμηση της διασποράς που λαμβάνεται από την ANOVA και από τους βαθμούς ελευθερίας της, αντίστοιχα — με τον όρο ότι η διασπορά δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση. Σ' αυτή την περίπτωση, χρησιμοποιούνται οι χωριστές διασπορές των μαρτύρων και των δειγμάτων που έχουν υποβληθεί σε αγωγή. Κατά κανόνα, οι τιμές αυτές υπολογίζονται με τη βοήθεια εμπορικού λογισμικού στατιστικής ανάλυσης που χρησιμοποιεί τα ανά δοχείο αποτελέσματα ως επαναλήψεις. Εάν η συνένωση δεδομένων για τον αρνητικό μάρτυρα και τον μάρτυρα με τον διαλύτη εμφανίζεται καταλληλότερη από τη διενέργεια των δοκιμών σε σύγκριση με έναν από αυτούς τους μάρτυρες, θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή για να διαπιστώνεται ότι δεν διαφέρουν σημαντικά (για κατάλληλες δοκιμές, βλ. σημείο 45 και προσάρτημα 7). 43. Η διεξαγωγή περαιτέρω στατιστικών δοκιμών και συναγωγών εξαρτάται από το κατά πόσον οι επαναληπτικές τιμές κατανέμονται κανονικά και παρουσιάζουν ομοιογένεια ως προς τη διασπορά τους. Εκτίμηση NOEC 44. Θα πρέπει να προτιμάται η εφαρμογή ισχυρών δοκιμών. Για να διαπιστωθεί κατά πόσον η κατανομή των δεδομένων είναι κανονική, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται στοιχεία, π.χ., από προηγούμενες εμπειρίες με δοκιμές δακτυλίου ή άλλα ιστορικά δεδομένα. Η ομοιογένεια ως προς τη διασπορά (ομοσκεδαστικότητα) είναι κρισιμότερο στοιχείο. Έχει διαπιστωθεί εμπειρικά ότι η διασπορά συχνά αυξάνεται όταν αυξάνεται ο μέσος όρος. Σ' αυτές τις περιπτώσεις, ο μετασχηματισμός των δεδομένων θα μπορούσε να έχει ως αποτέλεσμα την ομοσκεδαστικότητα. Ωστόσο, αυτός ο μετασχηματισμός θα πρέπει να βασίζεται στην πείρα με ιστορικά δεδομένα παρά με τα υπό εξέταση δεδομένα. Εάν υπάρχουν ομοιογενή δεδομένα, θα πρέπει να διενεργούνται πολλές δοκιμασίες t, όπως η δοκιμασία Williams (α = 0,05, μονόπλευρη δοκιμή) (24)(25) ή, σε ορισμένες περιπτώσεις, η δοκιμασία Dunnett (26)(27). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, στην περίπτωση άνισης αναπαραγωγής, οι τιμές t του πίνακα πρέπει να διορθώνονται όπως υποδεικνύεται από τους Dunnett και Williams. Μερικές φορές, λόγω μεγάλης μεταβολής, οι αποκρίσεις δεν αυξάνονται/μειώνονται με κανονικούς ρυθμούς. Σ' αυτή την περίπτωση αισθητής απόκλισης από την μονοτονικότητα, η δοκιμασία Dunnett είναι καταλληλότερη. Εάν παρατηρούνται αποκλίσεις από την ομοσκεδαστικότητα, μπορεί να είναι εύλογο να διερευνηθούν προσεκτικότερα πιθανές επιδράσεις στις διασπορές, ώστε να αποφασιστεί εάν οι δοκιμασίες t μπορούν να εφαρμοστούν χωρίς να αλλοιωθεί σημαντικά η ισχύς τους (28). Εναλλακτικά, μια δοκιμασία U πολλαπλής σύγκρισης, π.χ. η δοκιμασία U Bonferroni κατά Holm (29), ή όταν αυτά τα δεδομένα παρουσιάζουν ετεροσκεδαστικότητα αλλά συμφωνούν, κατά τα άλλα, με μια υποκείμενη μονότονη σχέση δόσης-απόκρισης, μπορεί να εφαρμοστεί μια άλλη μη παραμετρική δοκιμασία [π.χ. Jonckheere-Terpstra (30) (31) ή Shirley (32) (33)], η οποία θα ήταν, κατά κανόνα, προτιμότερη από τις δοκιμασίες t άνισης διασποράς (βλ. επίσης το σχήμα στο προσάρτημα 7). 45. Εάν έχει διενεργηθεί οριακή δοκιμή και εάν πληρούνται οι προϋποθέσεις των διαδικασιών για τις παραμετρικές δοκιμασίες (κανονικότητα, ομοιογένεια), μπορεί να χρησιμοποιηθεί η δοκιμασία t του Student κατά ζεύγη ή, διαφορετικά, η δοκιμασία U των Mann-Whitney (29). Εκτίμηση της ECx 46. Για τον υπολογισμό οποιασδήποτε τιμής ECx, οι μέσοι όροι για κάθε αγωγή χρησιμοποιούνται για την ανάλυση (γραμμικής ή μη γραμμικής) παλινδρόμησης, αφού έχει αποκτηθεί κατάλληλη συνάρτηση δόσης-απόκρισης. Όσον αφορά την ανάπτυξη των σκωλήκων ως συνεχή απόκριση, οι τιμές ECx– μπορούν να υπολογιστούν κατ' εκτίμηση με τη βοήθεια της κατάλληλης ανάλυσης παλινδρόμησης (35). Μεταξύ των κατάλληλων συναρτήσεων για τα δεδομένα που δέχονται μόνο δύο τιμές (θνησιμότητα/επιβίωση) και αριθμός παραγόμενων απογόνων είναι οι κανονικές σιγμοειδείς συναρτήσεις, οι λογιστικές συναρτήσεις ή οι συναρτήσεις Weibull, που περιέχουν δύο έως τέσσερις παραμέτρους, ορισμένες από τις οποίες μπορούν επίσης να μοντελοποιήσουν αποκρίσεις όρμησης. Εάν η συνάρτηση δόσης-απόκρισης προσαρμόστηκε μέσω ανάλυσης γραμμικής παλινδρόμησης, θα πρέπει να βρεθούν ένας σημαντικός r2 (συντελεστής προσδιορισμού) και/ή μια κλίση με την ανάλυση παλινδρόμησης πριν από την εκτίμηση της ECx με την εισαγωγή μιας τιμής που αντιστοιχεί στο x % του μέσου όρου του μάρτυρα στην εξίσωση που λαμβάνεται με την ανάλυση παλινδρόμησης. Τα όρια εμπιστοσύνης 95 % υπολογίζονται σύμφωνα με τη μέθοδο Fieller [όπως αναφέρεται στον Finney (21)] ή άλλες σύγχρονες κατάλληλες μεθόδους. 47. Εναλλακτικά, η απόκριση μοντελοποιείται ως ποσοστό ή αναλογία της παραμέτρου του μοντέλου που ερμηνεύεται ως η μέση απόκριση του μάρτυρα. Σ' αυτές τις περιπτώσεις, η κανονική σιγμοειδής καμπύλη (λογιστική, Weibull) μπορεί συχνά να προσαρμόζεται άνετα στα αποτελέσματα με την εφαρμογή της μεθόδου παλινδρόμησης probit (21). Σ' αυτές τις περιπτώσεις, η συνάρτηση στάθμισης πρέπει να προσαρμόζεται για τις μετρικές αποκρίσεις κατά Christensen (36). Ωστόσο, εάν έχει διαπιστωθεί όρμηση, η ανάλυση probit θα πρέπει να αντικαθίσταται από λογιστική συνάρτηση ή συνάρτηση Weibull τεσσάρων παραμέτρων, προσαρμοσμένη από μια μέθοδο μη γραμμικής παλινδρόμησης (36). Εάν μια κατάλληλη συνάρτηση δόσης-απόκρισης δεν μπορεί να προσαρμόζεται στα δεδομένα, είναι δυνατόν να χρησιμοποιούνται εναλλακτικές μέθοδοι για την εκτίμηση της ECx και των ορίων εμπιστοσύνης της, όπως η μέθοδος των κινητών μέσων όρων κατά Thompson (22) και η απλοποιημένη μέθοδος Spearman-Karber (23). ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ 48. Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: Υπό δοκιμή χημική ουσία: — φυσικές ιδιότητες και, κατά περίπτωση, φυσικοχημικές ιδιότητες (π.χ. υδατοδιαλυτότητα, τάση ατμών)· — χημική ταυτότητα της υπό δοκιμή χημικής ουσίας σύμφωνα με την ονοματολογία IUPAC, τον αριθμό CAS, την παρτίδα, τον συντακτικό τύπο και την καθαρότητα· — ημερομηνία λήξης του δείγματος. Ζωικό είδος δοκιμής: — ζώα που χρησιμοποιήθηκαν στη δοκιμή: είδος, επιστημονική ονομασία, πηγή των οργανισμών και συνθήκες αναπαραγωγής. Συνθήκες δοκιμής: — συστατικά και παρασκευή του τεχνητού εδάφους· — μέθοδος εφαρμογής της υπό δοκιμή χημικής ουσίας· — περιγραφή των συνθηκών δοκιμής, όπως θερμοκρασία, περιεκτικότητα σε υγρασία, pH κ.λπ.· — πλήρης περιγραφή του σχεδιασμού και των διαδικασιών της δοκιμής. Αποτελέσματα της δοκιμής: — θνησιμότητα των ενήλικων σκωλήκων έπειτα από δύο εβδομάδες, και αριθμός των νεαρών σκωλήκων στο τέλος της δοκιμής προσδιορισμού του εύρους τιμών· — θνησιμότητα των ενήλικων σκωλήκων έπειτα από τρεις εβδομάδες και πλήρης καταγραφή των νεαρών σκωλήκων σ