ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΚ) αριθ. 1081/96 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 14ης Ιουνίου 1996 περί θεσπίσεως μεθόδου αναφοράς για την ανίχνευση αγελαδινού γάλακτος και, καζεϊνικών αλάτων σε τυριά από πρόβειο, κατσικίσιο ή βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος και περί καταργήσεως του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 690/92

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,

τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 804/68 του Συμβουλίου, της 27ης Ιουνίου 1968, περί κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 2931/95 της Επιτροπής (2), και ιδίως το άρθρο 9 παράγραφος 3, το άρθρο 16 παράγραφοι 1 και 4 και το άρθρο 17 παράγραφος 14,

Εκτιμώντας:

ότι οι ενισχύσεις για την ιδιωτική αποθεματοποίηση τυριών από πρόβειο γάλα μπορούν να χορηγηθούν βάσει του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 508/71 του Συμβουλίου, της 8ης Μαρτίου 1971, περί καθορισμού των γενικών κανόνων που διέπουν τη χορήγηση ενισχύσεων για την ιδιωτική αποθεματοποίηση του τυριού διατηρήσεως (3) 7 ότι μια ειδική επιστροφή για τα ίδια αυτά προϊόντα μπορεί να χορηγηθεί βάσει του άρθρου 17 του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 804/68 7 ότι προβλέπεται η εισαγωγή τυριών από πρόβειο, κατσικίσιο ή βουβαλίσιο γάλα, ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος στην Κοινότητα βάσει προτιμησιακών ρυθμίσεων 7

ότι, δεδομένης της ύπαρξης των προαναφερθέντων διατάξεων όσον αφορά τυριά που έχουν παρασκευαστεί από πρόβειο γάλα, κατσικίσιο γάλα ή βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος, είναι απαραίτητο να επαληθεύεται με κατάλληλο έλεγχο ότι δεν έχει ενσωματωθεί καθόλου αγελαδινό γάλα στα υπό εξέταση προϊόντα 7 ότι είναι αναγκαίο να καθιερωθεί μια κοινοτική μέθοδος αναφοράς για την ανίχνευση του αγελαδινού γάλακτος, με την επιφύλαξη της εφαρμογής των συνηθισμένων μεθόδων, εφόσον συμφωνούν με ορισμένα κριτήρια 7

ότι η μέθοδος αναφοράς που εφαρμόζεται σε τυριά που έχουν παρασκευαστεί από πρόβειο, κατσικίσιο ή βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος αντικαθιστά τη μέθοδο αναφοράς που περιγράφεται στον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 690/92 της Επιτροπής (4), η οποία μπορεί, επομένως, να καταργηθεί 7

ότι τα μέτρα που προβλέπονται στον παρόντα κανονισμό είναι σύμφωνα με τη γνώμη της επιτροπής διαχείρισης γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:

Άρθρο 1

Η μέθοδος αναφοράς που παρατίθεται στο παράρτημα εφαρμόζεται προκειμένου να διαπιστωθεί ότι το τυρί που παρασκευάζεται αποκλειστικά από πρόβειο, κατσικίσιο ή βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος δεν περιέχει καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος.

Θεωρείται ότι υπάρχει καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος όταν το ανιχνεύσιμο περιεχόμενο του προς ανάλυση δείγματος σε καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος είναι ίσο ή μεγαλύτερο από το περιεχόμενο του πρώτου δείγματος που περιέχει 1 % αγελαδινού γάλακτος που περιγράφεται στο παράρτημα.

Άρθρο 2

Οι συνηθισμένες μέθοδοι ανίχνευσης της καζεΐνης αγελαδινού γάλακτος σε τυριά που αναφέρονται στο άρθρο 1 μπορούν να χρησιμοποιηθούν με τους ακόλουθους όρους:

- το όριο ανίχνευσης πρέπει να είναι 0,5 % ή μικρότερο,

- δεν πρέπει να εμφανίζονται εσφαλμένως θετικά αποτελέσματα. Αν αυτό δεν μπορεί να αποκλειστεί, κάθε δείγμα που δίνει θετικό αποτέλεσμα πρέπει να εξετάζεται με τη μέθοδο αναφοράς,

- η καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος πρέπει να είναι ανιχνεύσιμη με την απαιτούμενη ευαισθησία ακόμη και μετά από μακρές περιόδους ωρίμανσης, όπως πρέπει να συμβεί υπό τις συνήθεις εμπορικές συνθήκες. Εάν δεν πληρούται η απαίτηση αυτή για ορισμένο τύπο τυριού που αναφέρεται στο άρθρο 1, το τυρί αυτό πρέπει να εξετάζεται με τη μέθοδο αναφοράς.

Άρθρο 3

Καταργείται ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 690/92. Οι παραπομπές στον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 690/92 πρέπει να θεωρούνται ως παραπομπές στον παρόντα κανονισμό.

Άρθρο 4

Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.

Εφαρμόζεται από την 1η Οκτωβρίου 1996.

Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.

Βρυξέλλες, 14 Ιουνίου 1996.

Για την Επιτροπή

Franz FISCHLER

Μέλος της Επιτροπής

(1) ΕΕ αριθ. L 148 της 28. 6. 1968, σ. 13.

(2) ΕΕ αριθ. L 307 της 20. 12. 1995, σ. 10.

(3) ΕΕ αριθ. L 58 της 11. 3. 1971, σ. 1.

(4) ΕΕ αριθ. L 74 της 20. 3. 1992, σ. 23.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΓΕΛΑΔΙΝΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΚΑΙ ΚΑΖΕΪΝΙΚΩΝ ΑΛΑΤΩΝ ΣΕ ΤΥΡΙΑ ΠΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΠΡΟΒΕΙΟ, ΚΑΤΣΙΚΙΣΙΟ Ή ΒΟΥΒΑΛΙΣΙΟ ΓΑΛΑ Ή ΑΠΟ ΜΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΟΒΕΙΟΥ, ΚΑΤΣΙΚΙΣΙΟΥ Ή ΒΟΥΒΑΛΙΣΙΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ

1. Αντικείμενο

Ανίχνευση αγελαδινού γάλακτος και καζεϊνικών αλάτων σε τυριά από πρόβειο κατσικίσιο ή βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου ή βουβαλίσιου γάλακτος με ισοηλεκτρική εστίαση γ-καζεϊνών μετά από πλασμινόλυση.

2. Πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος είναι κατάλληλη για ευαίσθητη και συγκεκριμένη ανίχνευση αγελαδινού γάλακτος και καζεϊνικών αλάτων αυτούσιων που έχουν υποστεί θερμική επεξεργασία σε νωπά και ώριμα τυριά από πρόβειο, κατσικίσιο, βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος. Η μέθοδος αυτή δεν είναι κατάλληλη για την ανίχνευση της νόθευσης του γάλακτος και του τυριού, με συμπυκνώματα πρωτεϊνών ορού γάλακτος βοοειδών που έχουν υποστεί θερμική κατεργασία.

3. Αρχή της μεθόδου

3.1. Απομόνωση καζεϊνών από το τυρί και των πρότυπων αναφοράς

3.2. Διάλυση των καζεϊνών που έχουν απομονωθεί και υποβολή σε πλασμινόλυση (EC.3.4.21.7)

3.3. Ισοηλεκτρική εστίαση των καζεϊνών οι οποίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πλασμίνη παρουσία ουρίας και χρώση πρωτεϊνών.

3.4. Αξιολόγηση μορφών απεικόνισης βαμένων γ3 και γ2-καζεϊνών (αποδεικτικό αγελαδινού γάλακτος) δια συγκρίσεως της μορφής που προέκυψε από το δείγμα με εκείνες που προέκυψαν στην ίδια πηκτή από πρότυπα περιεκτικότητας 0 % και 1 % σε αγελαδινό γάλα.

4. Αντιδραστήρια

Πρέπει να χρησιμοποιούνται αντιδραστήρια αναλυτικής καθαρότητας, εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά. Το νερό θα πρέπει να είναι δισαπεσταγμένο ή ισοδύναμης καθαρότητας.

Σημείωση: Οι αναλογίες που ακολουθούν αφορούν πηκτές πολυακρυλαμιδίων με ουρία, διαστάσεων 265 Χ 125 Χ 0,25 mm, που έχουν παρασκευαστεί εργαστηριακά. Όπου χρησιμοποιούνται πηκτές άλλων διαστάσεων και τύπων, χρειάζεται ίσως προσαρμογή των συνθηκών διαχωρισμού.

Ισοηλεκτρική εστίαση

4.1. Αντιδραστήρια παρασκευής πηκτών πολυακριλαμιδίου, που περιέχουν ουρία.

4.1.1. Μητρικό διάλυμα πηκτής

Διαλύονται σε νερό:

4,85 g ακρυλαμιδίου

0,15 g N, N'-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου (BIS)

48,05 g ουρίας

15,00 g γλυκερίνης (87 % m/m),

συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι 100 ml και το διάλυμα διατηρείται στο ψυγείο μέσα σε σκοτεινόχρωμη φιάλη.

Σημείωση: Αντί των νευροτοξικών ακρυλαμιδίων (στις ανωτέρω ποσότητες), προτιμότερο είναι να χρησιμοποιείται προαναμειχθέν διάλυμα ακρυλαμιδίου/BIS, το οποίο διατίθεται στο εμπόριο. Αντί των ως άνω ποσοτήτων, χρειάζονται 16,2 ml ενός τέτοιου προαναμειχθέντος διαλύματος, εφόσον η περιεκτικότητά του σε ακρυλαμίδιο είναι 30 % m/v και η περιεκτικότητά του σε BIS είναι 0,8 % m/v. Ο μέγιστος χρόνος διατηρησιμότητας του μητρικού διαλύματος είναι δέκα ημέρες. Εάν η αγωγιμότητά του είναι μεγαλύτερη των 5μS, απιονίζεται υπό ανάδευση για 30 λεπτά με 2 g Amberlite MB-3 και στη συνέχεια διηθείται από μεμβράνη 0,45 μm.

4.1.2. Διάλυμα πηκτής

Παρασκευάζεται το διάλυμα πηκτής με ανάμειξη προσθέτων και αμφολυτών με το μητρικό διάλυμα πηκτής (βλέπε 4.1.1.).

9,0 ml μητρικού διαλύματος

24 mg -αλανίνης

500 μl αμφολύτου με pH 3,5-9,5 (1)

250 μl αμφολύτου με pH 5-7 (2)

250 μl αμφολύτου με pH 6-8 (3).

Το διάλυμα πηκτής αναμειγνύεται και απαερώνεται επί 2 έως 3 λεπτά σε λουτρό υπερήχων ή σε κενό.

Σημείωση: Το διάλυμα πηκτής παρασκευάζεται αμέσως πριν μεταφερθεί πάνω στην πλάκα (βλέπε 6.2).

4.1.3. Διαλύματα καταλυτών

4.1.3.1. N, N, N' N'- τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (TEMED)

4.1.3.2. Διάλυμα υπερθειικού αμμωνίου (PER) 40 % m/v: Διαλύονται σε νερό 800 mg PER και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 2 ml.

Σημείωση: Να χρησιμοποιείται πάντοτε πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα PER.

4.2. Υγρό επαφής

Κηροζίνη ή υγρή παραφίνη

4.3. Ανοδικό διάλυμα

Παρασκευάζεται διάλυμα 5,77 g φωσφορικού οξέως (85 % m/m) σε 100 ml νερού.

4.4. Καθοδικό διάλυμα

Διαλύονται σε νερό 2,00 g υδροξειδίου του νατρίου και το διάλυμα αραιώνεται με νερό μέχρις όγκου 100 ml.

Παρασκευή του δείγματος

4.5. Αντιδραστήρια απομόνωσης πρωτεϊνών

4.5.1. Αραιό οξικό οξύ (25,0 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος αραιώνονται με νερό μέχρις όγκου 100 ml)

4.5.2. Διχλωρομεθάνιο

4.5.3. Ακετόνη

4.6. Ρυθμιστικό διάλυμα για τη διάλυση πρωτεϊνών

Διαλύονται σε νερό

5,75 g γλυκερίνης (87 % m/m)

24,03 g ουρίας

250 mg διθειοθρεϊτόλης

και το διάλυμα αραιώνεται μέχρις όγκου 50 ml.

Σημείωση: Φυλάσσεται στο ψυγείο - μέγιστος χρόνος διατήρησης μία εβδομάδα.

4.7. Αντιδραστήρια πλασμινόλυσης καζεΐνης

4.7.1. Ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου

Τιτλοδοτείται διάλυμα όξινου ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml νερού) με διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml νερού) έως pH 8.

4.7.2. Πλασμίνη βοοειδούς (E.C. 3.4.21.7), ενεργότητας τουλάχιστον 5 U/ml.

4.7.3. Διάλυμα αναστολής ενζύμου

Διαλύονται 2,624 g ε-αμινοκαπρονικού οξέος (6-αμινο-n-εξανικό οξύ) σε 100 ml αιθανόλης 40 % v/v.

4.8. Πρότυπα

4.8.1. Πιστοποιημένα πρότυπα αναφοράς από μείγμα αποκορυφωμένου πρόβειου και κατσικίσιου γάλακτος που περιέχουν 0 % και 1 % αγελαδινού γάλακτος, είναι διαθέσιμα στο Commission's Institute for Reference Materials and Measurements B 2440 Geel, Βέλγιο.

4.8.2. Παρασκευή προσωρινών προτύπων πηγμένου αποκορυφωμένου βουβαλίσιου γάλακτος που περιέχουν 0 % και 1 % αγελαδινού γάλακτος.

Αποκορυφωμένο γάλα λαμβάνεται με φυγοκέντρηση βουβαλίσιου ή πρόβειου μη κατεργασμένου ασυσκεύαστου γάλακτος στους 37 °C για 20 λεπτά, 2 500 g. Αφού ο σωλήνας και το περιεχόμενο ψυχθούν ταχέως μέχρι θερμοκρασίας 6-8 °C, αφαιρείται εντελώς το ανώτερο στρώμα λίπους. Για την παρασκευή του προτύπου 1 %, προστίθενται 5,00 ml αποκορυφωμένου αγελαδινού γάλακτος σε 495 ml αποκορυφωμένου βουβαλίσιου γάλακτος μέσα σε ποτήριο ζέσεως 1 λίτρου και, με την προσθήκη αραιού γαλακτικού οξέος (10 % v/v), ρυθμίζεται το pH σε 6,4. Ρυθμίζεται η θερμοκρασία στους 35 °C και προστίθενται 100 μl πιτιάς μόσχου (ενεργότης πυτιάς 1: 10 000, περίπου 3 000 U/ml), γίνεται ανάδευση για 1 λεπτό και εν συνεχεία το ποτήριο ζέσεως, σκεπασμένο με φύλλο αλουμινίου, αφήνεται στους 35 °C επί μία ώρα για να σχηματισθεί το τυρόπηγμα. Αφού σχηματισθεί το τυρόπηγμα, το πηγμένο γάλα υφίσταται λυοφιλίωση χωρίς προηγούμενη ομοιογενοποίηση ή αποστράγγιση του ορού. Μετά τη λυοφιλίωση, κονιοποιείται προς σχηματισμό ομοιογενούς σκόνης. Για την παρασκευή του προτύπου 0 % ακολουθείται η ίδια διαδικασία με 500 ml αμιγούς αποκορυφωμένου βουβαλίσιου γάλακτος. Τα πρότυπα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία - 20 °C.

Σημείωση: Πριν από την παρασκευή των προτύπων, συνίσταται ο έλεγχος του βαθμού καθαρότητας του προβείου γάλακτος με ισοηλεκτρική εστίαση των καζεϊνών οι οποίες υποβλήθηκαν σε συνεργασία με πλασμίνη.

Αντιδραστήρια χρέωσης πρωτεϊνών

4.9. Σταθεροποιητής

Διαλύονται σε νερό 150 g τριχλωροοξικού οξέος και το διάλυμα αραιώνεται μέχρις όγκου 1 000 ml.

4.10. Διάλυμα αποχρωματισμού

Αραιώνονται με απεσταγμένο νερό 500 ml μεθανόλης και 200 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος μέχρις όγκου 2 000 ml.

Σημείωση: Το διάλυμα αποχρωματισμού παρασκευάζεται σε ημερήσια βάση. Μπορεί να παρασκευαστεί με ανάμειξη ίσων όγκων μητρικών διαλυμάτων μεθανόλης (50 % v/v) και κρυσταλλικού οξικού οξέος (20 % v/v).

4.11. Διαλύματα βαφής

4.11.1 Διαλύματα βαφής (μητρικό διάλυμα 1)

Διαλύονται 3,0 g Coomassie brilliant bleu G 250 (Color Index 42655) σε 1 000 ml μεθανόλης, 90 % v/v με τη χρησιμοποίηση μαγνητικού αναδευτήρα (45 λεπτά περίπου) και ακολουθεί διήθηση από δύο πτυχωτούς ηθμούς μέσης ταχύτητας.

4.11.2. Διάλυμα βαφής (μητρικό διάλυμα 2)

Διαλύονται 5,0 g ένυδρου θειικού χαλκού (CuSO4 Χ 5H20) σε 1 000 ml οξικού οξέος 20 % (v/v).

4.11.3 Διάλυμα βαφής (διάλυμα εργασίας)

Αναμειγνύονται 125 ml από κάθε μητρικό διάλυμα (4.11.1, 4.11.2) αμέσως πριν από τη βαφή.

Σημείωση: Το διάλυμα βαφής πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο την ημέρα παρασκευής του.

5. Εξοπλισμός

5.1. Γυάλινες πλάκες διαστάσεων 265 Χ 125 Χ 4 mm - ελαστικός κύλινδρος (πλάτος 15 cm) - τραπέζι οριζοντίωσης

5.2. Φύλλο συγκράτησης πηκτής διαστάσεων 265 Χ 125 mm

5.3. Φύλλο κάλυψης διαστάσεων 280 Χ 125 mm. Επικολλάται λωρίδα αυτοκόλλητης ταινίας διαστάσεων 280 Χ 6 Χ 0,25 mm σε κάθε μεγάλη πλευρά (βλέπε σχήμα 1).

5.4. Θάλαμος ηλεκτροεστίασης με πλάκα ψύξης (π.χ. 265 Χ 125 mm) με κατάλληλη πηγή τάσης μεγαλύτερη ή ίση από 2,5 kv ή αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης.

5.5. Κρυοστάτης κυκλοφορίας ρυθμισμένος στους 12 ± 0,5 °C

5.6. Συσκευή φυγοκέντρησης προσαρμοσμένη στα 3 000 g

5.7. Ταινίες ηλεκτροδίου (μήκους μεγαλύτερου ή ίσου προς 265 mm)

5.8. Πλαστικές σταγονομετρικές φιάλες για το ανοδικό και το καθοδικό διάλυμα

5.9. Φορείς δείγματος (10 Χ 5 mm, διηθητικός χάρτης από βισκόζη ή χαμηλής προσροφητικότητας σε πρωτεΐνες)

5.10. Ψαλίδια, νυστέρια και λαβίδες από ανοξείδωτο χάλυβα

5.11. Δοχεία βαφής και αποχρωματισμού από ανοξείδωτο χάλυβα ή από γυαλί (π.χ. δίσκοι οργάνων 280 Χ 150 mm)

5.12. Ομοιογενοποιητής με ράβδο διαμέτρου 10 mm, 8 000 έως 20 000 στροφές ανά λεπτό (rpm)

5.13. Μαγνητικός αναδευτήρας

5.14. Λουτρό υπερήχων

5.15. Συγκολλητής ταινίας

5.16. Μικροσιφώνια των 5 - 25 μl

5.17. Συμπυκνωτής κενού ή συσκευή λυοφιλίωσης

5.18. Θερμοστατούμενο υδρόλουτρο στους 35 και 40 ± 1 °C με τάρακτρο

5.19. Πυκνόμετρο για μήκος κύματος λ =634 nm

6. Πορεία εργασίας

6.1. Παρασκευή δείγματος

6.1.1. Απομόνωση καζεϊνών

Ζυγίζεται ποσότητα ισοδύναμη με 5 g ξερής μάζας τυριού ή προτύπων - για λευκά τυριά μούχλας χρησιμοποιείται, όπου αυτό είναι δυνατόν, το ανώριμο κέντρο - σε σωλήνα φυγοκέντρησης των 100 ml, προστίθενται 60 ml απεσταγμένου νερού και γίνεται ομοιογενοποίηση με ομοιογενοποιητή με ράβδο (8 000 έως 10 000 rpm). Ρυθμίζεται το pH σε 4,6 με αραιό οξικό οξύ (4.5.1), γίνεται φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3 000 g), το λίπος και ο ορός απορρίπτονται, το υπόλειμμα ομοιογενοποιείται σε 20 000 rpm με 40 ml απεσταγμένου νερού προσαρμοσμένου σε pH 4 - 5 με αραιό οξικό οξύ (βλέπε 4.5.1), προστίθενται 20 ml διχλωρομεθανίου (βλέπε 4.5.2) και γίνεται εκ νέου ομοιογενοποίηση και φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3 000 g). Το στρώμα της καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ της υδατικής και της οργανικής φάσης (βλέπε σχήμα 2) αφαιρείται με μια σπάτουλα και απορρίπτονται και οι δύο φάσεις. Η καζεΐνη ομοιογενοποιείται εκ νέου με 40 ml απεσταγμένου νερού (βλέπε ανωτέρω) και 20 ml διχλωρομεθανίου και υποβάλλεται σε φυγοκέντρηση. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου και οι δύο φάσεις εκχύλισης γίνουν άχρωμες (2 έως 3 φορές). Το πρωτεϊνικό υπόλειμμα ομοιογενοποιείται με 50 ml άνυδρης ακετόνης (βλέπε 4.5.3) και διηθείται από πτυχωτό διηθητικό ηθμό μέσης ταχύτητας. Το υπόλειμμα εκπλύνεται πάνω στο διηθητικό ηθμό δύο φορές με 25 ml ακετόνης κάθε φορά και αφήνεται να ξεραθεί στον αέρα ή σε ρεύμα αζώτου, και στη συνέχεια κονιοποιείται σε γουδί.

Σημείωση: Οι απομονωμένες ξερές πρωτεΐνες πρέπει να διατηρηθούν σε θερμοκρασία -20 °C.

6.1.2. Πλασμινόλυση ί-καζεϊνών προς ενίσχυση γ-καζεϊνών

Ετοιμάζεται αιώρημα 25 mg απομονωθείσας καζεΐνης ή 0,5 ml των λυοφιλιωμένων προτύπων (βλέπε 4.7.1) ή η με ακετόνη ξηρανθείσα σκόνη από την ταχεία απομόνωση πρωτεϊνών σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού αμμωνίου (βλέπε 4.7.2) και ομοιογενοποιούνται επί 20 λεπτά, με υπέρηχους για παράδειγμα. Θερμαίνονται στους 40 °C και προστίθενται 10μl πλασμίνης (βλέπε 4.7.2), αναμειγνύονται και επωάζονται επί μία ώρα στους 40 °C με συνεχή ανάδευση. Για αναστολή του ενζύμου προστίθενται 20 μl διαλύματος ε-αμινοκαπρονικού οξέος (βλέπε 4.7.3), και εν συνεχεία, προστίθενται 200 mg στερεάς ουρίας και 2 mg διθειοθρεϊτόλης.

Σημείωση: Για να προκύψει μεγαλύτερη συμμετρία στις εστιασθείσες ταινίες καζεΐνης, συνιστάται λυοφιλίωση του διαλύματος μετά την προσθήκη του ε-αμινοκαπρονικού οξέος και εν συνεχεία διάλυση των υπολειμμάτων σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ουρίας (βλέπε 4.6).

6.2. Παρασκευή πηκτών ακρυλαμιδίου περιεχόντων ουρία

Το φύλλο συγκράτησης πήγματος (βλέπε 5.2) κυλίεται με τη βοήθεια μερικών σταγόνων νερού πάνω σε γυάλινη πλάκα (βλέπε 5.1) και απομακρύνεται το επιπλέον νερό με χαρτοπετσέτα. Το φύλλο κάλυψης (βλέπε 5.3) κυλίεται με διαχωριστήρες (0,25 mm) πάνω σε άλλη γυάλινη πλάκα κατά τον ίδιο τρόπο. Η πλάκα τοποθετείται οριζοντίως σε τραπέζι οριζοντίωσης.

Προστίθενται 10 μl καθενός από τα διαλύματα καταλυτών TEMED και PER (βλέπε 4.1.3.1) στο παρασκευασθέν και απαερωθέν διάλυμα πηκτής (βλέπε 4.1.2), αναμειγνύονται επ' ολίγον και μεταφέρονται ομοιόμορφα πάνω στο κέντρο του φύλλου κάλυψης. Τοποθετείται μια πλευρά της πλάκας συγκράτησης πήγματος (η πλευρά με το φύλλο προς τα κάτω) πάνω στην πλάκα με το φύλλο κάλυψης και χαμηλώνεται αργά, έτσι ώστε να σχηματίζεται μεταξύ των φύλλων ένα λεπτό στρώμα πήγματος που να απλώνεται κανονικά και να μην περιέχει φυσαλλίδες (βλέπε σχήμα 3). Η πλάκα συγκράτησης πηκτής χαμηλώνεται προσεκτικά και τελείως με τη βοήθεια μιας λεπτής σπάτουλας και τοποθετούνται από πάνω τρεις ακόμη γυάλινες πλάκες σαν βάρος. Αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός (60 λεπτά περίπου), απομακρύνεται το φύλλο υποστήριξης πηκτής μαζί με το φύλλο κάλυψης δι' ελαφρών κτυπημάτων των γυάλινων πλακών. Η ανάστροφη πλευρά του φύλλου συγκράτησης καθαρίζεται προσεκτικά για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα πηκτής και ουρίας. Το «sandwich» της πηκτής φέρεται σε κατάλληλο σωλήνα και αποθηκεύεται σε ψυγείο (επί έξι εβδομάδες το πολύ).

Σημείωση: Το φύλλο κάλυψης με τους διαχωριστήρες μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου. Η πηκτή πολυακριλαμιδίου μπορεί να κοπεί σε μικρότερα μεγέθη, πράγμα το οποίο συνιστάται όταν υπάρχουν λίγα δείγματα ή όταν χρησιμοποιείται αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (δύο πηκτές διαστάσεων 4,5 Χ 5 cm).

6.3. Ισοηλεκτρική εστίαση

Ο θερμοστάτης ψύξης ρυθμίζεται στους 12 °C. Η ανάστροφη πλευρά του φύλλου συγκράτησης επαλείφεται με κηροζίνη και εν συνεχεία σταλάζονται μερικές σταγόνες κηροζίνης (βλέπε 4.2) στο κέντρο του ψυγόμενου τμήματος. Κυλίεται κατόπιν επ' αυτού το «sandwich» της πηκτής με το φύλλο συγκράτησης προς τα κάτω, με προσοχή ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία φυσαλλίων. Καθαρίζεται το τυχόν περίσσευμα κηροζίνης και αφαιρείται το φύλλο κάλυψης. Διαβρέχονται οι ταινίες των ηλεκτροδίων με τα διαλύματα ανόδου και καθόδου (βλέπε 4.3, και 4.4), κόβονται στο μήκος της πηκτής και τοποθετούνται στις προβλεπόμενες θέσεις (απόσταση ηλεκτροδίων 9,5 cm).

Συνθήκες για την ισοηλεκτρική εστίαση:

6.3.1. Διαστάσεις πήγματος 265 Χ 125 Χ 0,25 mm

>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>

Σημείωση: Εάν μεταβληθεί το πάχος ή το πλάτος των πηκτών, θα πρέπει να προσαρμοσθούν κατάλληλα οι τιμές της εντάσεως του ρεύματος και της ισχύος (π.χ. οι τιμές της εντάσεως του ρεύματος και της ισχύος διπλασιάζονται εάν χρησιμοποιηθεί πήγμα διαστάσεων 265 Χ 125 Χ 0,5 mm).

6.3.2. Παράδειγμα προγράμματος τάσης για αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2 πηκτές διαστάσεων 5,0 Χ 4,5 cm), με ηλεκτρόδια που εφαρμόζονται απευθείας στην πηκτή, χωρίς ταινίες ηλεκτροδίων

>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>

Κατά τη φάση 2, ο φορέας δείγματος τοποθετείται στις 0 Vh.

Κατά τη φάση 2, ο φορέας δείγματος απομακρύνεται στις 30 Vh.

6.4. Βαφή πρωτεϊνών

6.4.1. Σταθεροποίηση πρωτεϊνών

Απομακρύνονται οι ταινίες των ηλεκτροδίων αμέσως μετά τη διακοπή του ρεύματος και η πηκτή τοποθετείται αμέσως σε ένα δοχείο βαφής/αποχρωματισμού που είναι γεμάτος με 200 ml σταθεροποιητή (βλέπε 4.9) - αφήνεται επί 15 λεπτά αναδευόμενο κατά διαστήματα.

6.4.2. Έκπλυση και βαφή της πλάκας της πηκτής

Ο σταθεροποιητής αποστραγγίζεται εντελώς και η πλάκα της πηκτής εκπλύνεται δύο φορές για 30 δευτερόλεπτα, κάθε φορά με 100 ml διαλύματος αποχρωματισμού (βλέπε 4.10). Το διάλυμα αποχρωματισμού αποχύνεται και πληρούται στο δοχείο με 250 ml διαλύματος βαφής (βλέπε 4.11.3), το οποίο και αφήνεται να ενεργήσει για 45 λεπτά υπό ελαφρή ανάδευση.

6.4.3. Αποχρωματισμός της πλάκας της πηκτής

Αποχύνεται το διάλυμα βαφής, εκπλύνεται η πλάκα της πηκτής δύο φορές με 100 ml διαλύματος αποχρωματισμού κάθε φορά και εν συνεχεία αναδεύεται δύο φορές τουλάχιστον με 200 ml διαλύματος αποχρωματισμού επί 15 τουλάχιστον λεπτά κάθε φορά μέχρις ότου το υπόβαθρο γίνει εντελώς καθαρό και άχρωμο. Εκπλύνεται εν συνεχεία η πλάκα της πηκτής με απεσταγμένο νερό (δύο φορές Χ 2 λεπτά κάθε φορά) και αφήνεται να στεγνώσει στον αέρα (2 έως 3 φορές) ή στεγνώνεται με ηλεκτρικό στεγνωτήρα (10 έως 15 λεπτά).

Σημείωση 1: Η σταθεροποίηση, η έκπλυση, η χρώση και ο αποχρωματισμός γίνονται στους 20 °C. Οι υψηλές θερμοκρασίες να αποφεύγονται.

Σημείωση 2: Εάν επιλεγεί πιο ευαίσθητη μέθοδος χρώσης με άργυρο (π.χ. αντιδραστήριο Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, (κωδικός αριθ. 17-1150-01), οι καζεΐνες που έχουν υποστεί επεξεργασία με πλασμίνη πρέπει να αραιώνονται στα 5 mg/ml.

7. Αξιολόγηση

Η αξιολόγηση γίνεται με σύγκριση των πρωτεϊνικών ταινιών του δείγματος με εκείνες δειγμάτων αναφοράς πάνω στην ίδια πηκτή. Η ανίχνευση αγελαδινού γάλακτος σε τυριά από πρόβειο, κατσικίσιο, βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος γίνεται μέσω των γ2 και γ3-καζεϊνών των οποίων τα ισοηλεκτρικά σημεία βρίσκονται στην περιοχή τιμών μεταξύ 6,5 και 7,5 (σχήματα 4α, 4β και 5). Το όριο ανίχνευσης είναι χαμηλότερο από 0,5 %.

7.1. Οπτική εξέταση

Για οπτική εξέταση της ποσότητας αγελαδινού γάλακτος συνίσταται η προσαρμογή των συγκεκριμένων δειγμάτων και προτύπων ώστε να προκύψει το ίδιο επίπεδο έντασης των γ2- και γ3-καζεϊνών αιγοπροβάτων ή/και βουβαλιών (βλέπε «γ2 E,G,B» και «γ3 E, G, B» στα σχήματα 4α, 4β και 5). Κατόπιν αυτού, η ποσότητα αγελαδικού γάλακτος (μικρότερη, ίση ή μεγαλύτερη από 1 %) στο άγνωστο δείγμα μπορεί να εκτιμηθεί απευθείας με σύγκριση της εντάσεως των γ2- και γ3- καζεϊνών βοοειδών (βλέπε «γ3 C» και «γ2 C» στα σχήματα 4α, 4β και 5) με εκείνες των προτύπων αναφοράς 0 και 1 % (προβατίνα, αίγα) ή των προσωρινών εργαστηριακών προτύπων (βουβάλι).

7.2. Πυκνομετρική εξέταση

Εφόσον υπάρχει δυνατότητα, χρησιμοποιείται πυκνομετρία (βλέπε 5.19) για τον προσδιορισμό του λόγου των εμβαδών των κορυφών γ2- και γ3- καζεϊνών βοοειδών, αιγοπροβάτων ή/και βουβαλιών (βλέπε σχήμα 5). Η τιμή αυτή συγκρίνεται με το λόγο των γ2- και γ3- καζεϊνών στο πρότυπο 1 % (αίγα, προβατίνα) ή στο εργαστηριακό προσωρινό πρότυπο (βουβάλι) που αναλύθηκε επάνω στην ίδια πηκτή.

Σημείωση: Η μέθοδος δίνει ικανοποιητικά αποτελέσματα εφόσον υπάρξει σαφής θετική ένδειξη γ2- και γ3- καζεΐνης βοοειδών στο πρότυπο 1 %, όχι όμως και στο πρότυπο 0 %. Εάν όχι, η διαδικασία βελτιστοποιείται με επακριβή εφαρμογή των λεπτομερειών της μεθόδου.

Ένα δείγμα θεωρείται θετικό, εάν οι γ2- και γ3- καζεΐνες βοοειδών ή οι αντίστοιχοι λόγοι των εμβαδών των κορυφών είναι ίσοι ή μεγαλύτεροι από το επίπεδο του δείγματος αναφοράς 1 %.

8. Βιβλιογραφία

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffallo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilised pH gradient - isoelectric focusing of γ2-caseins using plasmin as signal amplifier. Στο: Electrophoresis-Forum '89 (B. J. Radola, ed.) σσ. 389-393, Bode-Verlag, Mόnchen (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -kaese durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΗΛΜ>

Σχήμα 1: Σχηματική αναπαράσταση του φύλλου κάλυψης

>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΗΛΜ>

Σχήμα 2: Στρώμα καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ υδατικής και οργανικής φάσης μετά από φυγοκέντρηση

>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΗΛΜ>

Σχήμα 3: Τεχνική επικάλυψης για στρώση υπερλέπτων πηκτών πολυακρυλαμιδίου

α = λωρίδα διαχωριστήρα (0,25 mm) 7 b = φύλλο κάλυψης (5.3) 7 c, e = γυάλινες πλάκες (5.1) 7 d = διάλυμα πηκτής (4.1.2) 7 f = φύλλο συγκράτησης πηκτής (5.2)

>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΗΛΜ>

Σχήμα 4α: Ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) καζεϊνών επεξεργασμένων με πλασμίνη από τυρί που προέρχεται από πρόβειο και κατσικίσιο γάλα με διαφορετικές ποσότητες αγελαδινού γάλακτος.

% CM = ποσοστό αγελαδινού γάλακτος 7 C = αγελάδα 7 Ε = πρόβατο 7 G = κατσίκι.

Αναφέρεται η συνολική απόσταση διαχωρισμού της πηκτής της IEF.

>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΗΛΜ>

Σχήμα 4β: Ισοηλεκτρική εστίαση καζεϊνών επεξεργασμένων με πλασμίνη, από τυρί που προέρχεται από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος, με διαφορετικές ποσότητες αγελαδινού γάλακτος.

% CM = ποσοστό αγελαδινού γάλακτος 7 1+ = δείγμα που περιέχει 1 % αγελαδινού γάλακτος και το οποίο έχει εμπλουτισθεί με καθαρή καζεΐνη βοοειδών στη μέση της διαδρομής 7 C = αγελάδα 7 Ε = πρόβατο 7 G = κατσίκι 7 B = βουβάλι.

Αναφέρεται η συνολική απόσταση διαχωρισμού της πηκτής της IEF.

>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΗΛΜ>

Σχήμα 5: Τοποθέτηση των πυκνογραφημάτων των προτύπων (STD) και των δειγμάτων τυριού από μείγματα πρόβειου και κατσικίσιου γάλακτος μετά την ισοηλεκτρική εστίαση

α,b = πρότυπα που περιέχουν 0 και 1 % αγελαδινού γάλακτος αγελάδας 7 c-g = δείγματα τυριού που περιέχουν 0, 1, 2, 3 και 7 % αγελαδινού γάλακτος 7 C = αγελάδα 7 E = πρόβατο 7 G = κατσίκι.

Το ανώτερο ήμιση της πηκτής της IEF υποβλήθηκε σε σάρωση σε μήκος κύματος λ = 634 nm.

(1) Προϊόντα Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia) και Resolyte pH 5-7 και pH 6-8 (BDH, Merck) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικά για την επίτευξη του απαιτούμενου διαχωρισμού των γ-καζεϊνών.