ΟΔΗΓΙΑ ΤΟΥ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟΥ

της 27ης Ιουνίου 1967

περί της χρήσεως ορισμένων συντηρητικών για την επεξεργασία της επιφανείας των εσπεριδοειδών καθώς και περί των μέτρων ελέγχου για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό των συντηρητικών μέσα και πάνω στα εσπεριδοειδή

( 67/427/ΕΟΚ )

ΤΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΗΣ ΚΟΙΝΟΤΗΤΟΣ ,

Έχοντας υπόψη :

τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινοτητος και ιδίως το άρθρο 100 ,

την πρόταση της Επιτροπής ,

τη γνώμη της Συνελεύσεως (1) ,

τη γνώμη της Οικονομικής και Κοινωνικής Επιτροπής (2) ,

Εκτιμώντας :

ότι σύμφωνα με το άρθρο 5 της οδηγίας του Συμβουλίου της 5ης Νοεμβρίου 1963 περί προσεγγίσεως των νομοθεσιών των Κρατών μελών σχετικά με τα συντηρητικά που επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται στα τρόφιμα (3) , όπως τροποποιήθηκε τελευταία από το άρθρο 1 της οδηγίας του Συμβουλίου της 14ης Δεκεμβρίου 1966 (4) , τα Κράτη μέλη μπορούν να διατηρήσουν μέχρι την 30η Ιουνίου 1967 τις διατάξεις των εθνικών νομοθεσιών τους περί της επεξεργασίας της επιφανείας των εσπεριδοειδών με διφαινύλιο , ορθοφαινυλοφαινόλη και ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο .

ότι η χρησιμοποίηση των ουσίων αυτών για την επεξεργασία της επιφανείας των εσπεριδοειδών δεν είναι επικίνδυνη για την υγεία , αν το ποσόν του υπολείμματος ανά χιλιόγραμμο ολοκλήρων φρούτων δεν υπερβαίνει τα 70 χιλιοστόγραμμα διφαινυλίου και 12 χιλιοστόγραμμα ορθοφαινυλοφαινόλης και ορθοφαινυλοφαινολικού νατρίου , εκφρασμένα σε ορθοφαινυλοφαινόλη .

ότι , εξ άλλου , πρέπει να δηλώνεται η επεξεργασία που έγινε , με κατάλληλο τρόπο , σε όλα τα στάδια του εμπορίου .

ότι η άδεια χρησιμοποιήσεως των τριών αυτών ουσίων σε κοινοτικό επίπεδο προϋποθέτει επίσης τον καθορισμό κοινών κανόνων για τον επίσημο έλεγχο των επεξεργασμένων εσπεριδοειδών .

ότι η εφαρμογή από τα Κράτη μέλη των διατάξεων της παρούσας οδηγίας είναι δυνατό να πραγματοποιηθεί μόνο μετά από μεταβατική περίοδο και ότι πρέπει , ως εκ τούτου , να διατηρηθούν μέχρι το τέλος της περιόδου αυτής οι διατάξεις των εθνικών νομοθεσιών περί της επεξεργασίας της επιφανείας των εσπεριδοειδών με τα τρία αυτά συντηρητικά .

ότι δεν πρέπει να επιβληθεί σε Κράτος μέλος η υποχρέωση να επιτρέπει τη χρησιμοποίηση συντηρητικού στα τρόφιμα που παράγονται και καταναλίσκονται στο έδαφός του , όταν δεν υπάρχει τεχνολογική ανάγκη που να δικαιολογεί τη χρησιμοποίηση αυτή ,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ :

Άρθρο 1

Η οδηγία του Συμβουλίου της 5ης Νοεμβρίου 1963 περί προσεγγίσεως των νομοθεσιών των Κρατών μελών σχετικά με τα συντηρητικά που επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται στα τρόφιμα , τροποποιείται ως εξής :

1 . Στο άρθρο 2 , παράγραφος 2 , η δεύτερη φράση αντικαθίσταται με το ακόλουθο κείμενο :

« Εν τούτοις , η νομοθεσία Κράτους μέλους μπορεί να αποκλείει εξ ολοκλήρου τη χρησιμοποίηση ενός από τα συντηρητικά που απαριθμούνται στο παράρτημα , μόνο στην περίπτωση που δεν υπάρχει τεχνολογική ανάγκη χρησιμοποιήσεως του στα τρόφιμα που παράγονται και καταναλίσκονται στο έδαφός του . »

2 . Τα ακόλουθα συντηρητικά προστίθενται σε αυτά που απαριθμούνται στο τμήμα I του παραρτήματος :

Αρίθμηση της ΕΟΚ * Ονομασία * Προϋποθέσεις χρήσεως *

Ε 230 * Διφαινύλιο * α ) Αποκλειστικά για την επεξεργασία της επιφανείας των εσπεριδοειδών *

* * β ) Κατά τη στιγμή της διαθέσεως των εσπεριδοειδών στο εμπόριο *

* * ι ) το ποσοστό υπολείμματος ανά χιλιόγραμμο εσπεριδοειδών ( ολόκληρα φρούτα ) δεν πρέπει να υπερβαίνει : *

* * για το διφαινύλιο : τα 70 χιλιοστόγραμμα και για την ορθοφαινυλοφαινόλη και το ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο , χωριστά ή τα δύο μαζί , εκφρασμένα σε ορθοφαινυλοφαινόλη : 12 χιλιοστόγραμμα . *

* * ιι ) η επεξεργασία πρέπει να αναφέρεται : *

* * - για το χονδρικό εμπόριο στα τιμολόγια και σε μία εξωτερική όψη των συσκευασιών με την ένδειξη : « Διατηρημένο με ... » ακολουθούμενη από το όνομά της ή των ουσίων που χρησιμοποιήθηκαν . *

* * - για το λιανικό εμπόριο με μια εμφανή ένδειξη που να εξασφαλίζει , χωρίς κίνδυνο παρανοήσεως , την ενημέρωση του καταναλωτή . *

Ε 231 * Ορθοφαινυλοφαινόλη * α ) Αποκλειστικά για την επεξεργασία της επιφανείας των εσπεριδοειδών *

* * β ) Κατά τη στιγμή της διαθέσεως των εσπεριδοειδών στο εμπόριο *

* * ι ) το ποσοστό υπολείμματος ανά χιλιόγραμμο εσπεριδοειδών ( ολόκληρα φρούτα ) δεν πρέπει να υπερβαίνει : *

* * για το διφαινύλιο : τα 70 χιλιοστόγραμμα και για την ορθοφαινυλοφαινόλη και το ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο , χωριστά ή τα δύο μαζί , εκφρασμένα σε ορθοφαινυλοφαινόλη : 12 χιλιοστόγραμμα . *

* * ιι ) η επεξεργασία πρέπει να αναφέρεται : *

* * - για το χονδρικό εμπόριο στα τιμολόγια και σε μία εξωτερική όψη των συσκευασιών με την ένδειξη : « Διατηρημένο με ... » ακολουθούμενη από το όνομα της ή των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν . *

* * - για το λιανικό εμπόριο με μια εμφανή ένδειξη που να εξασφαλίζει , χωρίς κίνδυνο παρανοήσεως , την ενημέρωση του καταναλωτή . *

Ε 232 * Ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο * α ) Αποκλειστικά για την επεξεργασία της επιφανείας των εσπεριδοειδών *

* * β ) Κατά τη στιγμή της διαθέσεως των εσπεριδοειδών στο εμπόριο *

* * ι ) το ποσοστό υπολείμματος ανά χιλιόγραμμο εσπεριδοειδών ( ολόκληρα φρούτα ) δεν πρέπει να υπερβαίνει : *

* * για το διφαινύλιο : τα 70 χιλιοστόγραμμα και για την ορθοφαινυλοφαινόλη και το ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο , χωριστά ή τα δύο μαζί , εκφρασμένα σε ορθοφαινυλοφαινόλη : 12 χιλιοστόγραμμα . *

* * ιι ) η επεξεργασία πρέπει να αναφέρεται : *

* * - για το χονδρικό εμπόριο στα τιμολόγια και σε μία εξωτερική όψη των συσκευασιών με την ένδειξη : « Διατηρημένο με ... » ακολουθούμενη από το όνομα της ή των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν . *

* * - για το λιανικό εμπόριο με μια εμφανή ένδειξη που να εξασφαλίζει , χωρίς κίνδυνο παρανοήσεως , την ενημέρωση του καταναλωτή . *

3 . Το εδάφιο β ) του άρθρου 5 καταργείται .

Άρθρο 2

Τα Κράτη μέλη λαμβάνουν όλα τα χρήσιμα μέτρα , ώστε η δειγματοληψία και οι αναλύσεις για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό του διφαινυλίου , της ορθοφαινυλοφαινόλης και του ορθοφαινυλοφαινολικού νατρίου μέσα και πάνω στα εσπεριδοειδή να πραγματοποιούνται σύμφωνα με τις διατάξεις των παραρτημάτων I , II , III και IV , της παρούσης οδηγίας .

Άρθρο 3

1 . Τα Κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ τα αναγκαία μέτρα , ώστε να συμμορφωθούν με την παρούσα οδηγία , το αργότερο μέχρι την 1η Ιουλίου 1968 , και πληροφορούν αμέσως περί τούτου την Επιτροπή .

2 . Μέχρι την ημερομηνία της 1ης Ιουλίου 1968 τα Κράτη μέλη μπορούν να διατηρήσουν τις διατάξεις των εθνικών νομοθεσιών περί της επεξεργασίας της επιφανείας των εσπεριδοειδών με διφαινύλιο , ορθοφαινυλοφαινόλη και ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο .

Άρθρο 4

Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη μέλη .

Έγινε στις Βρυξέλλες , στις 27 Ιουνίου 1967 .

Για το Συμβούλιο

Ο Πρόεδρος

R. VAN ELSLANDE

(1) ΕΕ αριθ. 63 της 3 . 4 . 1967 , σ. 990/67 .

(2) ΕΕ αριθ. 64 της 5 . 4 . 1967 , σ. 1005/67 .

(3) ΕΕ αριθ. 12 της 27 . 1 . 1964 , σ. 161/64 .

(4) ΕΕ αριθ. 233 της 20 . 12 . 1966 , σ. 3947/66 .

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

ΤΡΟΠΟΙ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΣΥΝΤΗΡΗΤΙΚΩΝ

Α . Δειγματοληψίες

I . Οι δειγματοληψίες πραγματοποιούνται σύμφωνα με τις επιστημονικές μεθόδους που επιτρέπουν να διασφαλισθεί η λήψη αντιπροσωπευτικών δειγμάτων της προς έλεγχο παρτίδας .

II . Τα δείγματα πρέπει να ανταποκρίνονται τουλάχιστον στις ακόλουθες απαιτήσεις :

1 . Συσκευασμένα εμπορεύματα ( ξύλινα κιβώτια , χαρτοκιβώτια και ανάλογες μονάδες συσκευασίας )

Αριθμός μονάδων συσκευασίας παρτίδας * Μέχρι 20 * Από 21 ως 500 * Από 501 ως 1000 * Άνω των 1000 *

Ελάχιστος αριθμός μονάδων συσκευασίας για ανάληψη * 1 * 2 * 3 * 4 *

Ποσότητα σε χιλιόγραμμα φρούτων για ανάληψη ανά μονάδα συσκευασίας * 2 * 2 * 2 * 2 *

2 . Εμπορεύματα χύδην

Ποσότητα παρτίδας σε χιλιόγραμμα * Μέχρι 20 * Από 21 ως 500 * Άνω των 500 *

Ποσότητα για άνάληψη σε χιλιόγραμμα * 2 * 4 * 8 *

III . Με τον όρο παρτίδα ( LOT ) νοείται ένα μέρος του φορτίου που παρουσιάζει τα ίδια χαρακτηριστικά , όπως ποικιλία , βαθμό ωριμότητας , τύπο συσκευασίας .

Β . Συσκευασία και διαβίβαση των δειγμάτων

1 . Τα δείγματα εισάγονται σε ερμητικά κλεισμένα δοχεία .

2 . Τα δοχεία σφραγίζονται .

3 . Τα ούτω συσκευασμένα δείγματα διαβιβάζονται το ταχύτερο δυνατό στα εργαστήρια ελέγχου .

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II

ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΔΙΦΑΙΝΥΛΙΟΥ , ΟΡΘΟΦΑΙΝΥΛΟΦΑΙΝΟΛΗΣ ΚΑΙ ΟΡΘΟΦΑΙΝΥΛΟΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΝΑΤΡΙΟΥ ΣΤΟ ΦΛΟΙΟ ΤΩΝ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΩΝ

1 . Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος που περιγράφεται κατωτέρω επιτρέπει την εξακρίβωση της παρουσίας υπολειμμάτων διφαινυλίου , ορθοφαινυλοφαινόλης ( OPP ) ή ορθοφαινυλοφαινολικού νατρίου στο φλοιό των εσπεριδοειδών . Το όριο ευαισθησίας είναι , κατ’ απόλυτη τιμή , της τάξεως των 5 μg για το διφαινύλιο και 1 mg για το OPP ή το ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο , τα οποία ισοδυναμούν αντίστοιχα με 5 μg διφαινυλίου ( 5 ppm ) και 1 mg OPP ( 1 ppm ) στο φλοιό 1 kg εσπεριδοειδών .

Η επεξεργασία των εσπεριδοειδών με τα προαναφερθέντα προϊόντα επιφέρει την παρουσία υπολειμμάτων , κατά κύριο λόγο , στο φλοιό των φρούτων . Ο προσδιορισμός αυτών των υπολειμμάτων μέσα σε ολόκληρα τα φρούτα δεν είναι ως εκ τούτου αναγκαίος , παρά μόνο στην περίπτωση που η παρουσία τους έχει πιστοποιηθεί στο φλοιό .

2 . Αρχή της μεθόδου

Οι φλοιοί εκχυλίζονται με διχλωρομεθάνιο σε όξινο περιβάλλον . Το εκχύλισμα συμπυκνώνεται και γίνεται χρωματογραφία λεπτής στιβάδας πάνω σε gel de silice . Η παρουσία διφαινυλίου , ορθοφαινυλοφαινόλης ή ορθοφαινυλοφαινολικού νατρίου γίνεται φανερή με φθορισμό και χρωστικές αντιδράσεις .

3 . Αντιδραστήρια

Κυκλοεξάνιο p.a.

Διχλωρομεθάνιο p.a.

Υδροχλωρικό οξύ 25 % ( p/v )

Gel de silice GF 254 Merck ή ισοδύναμο

Διάλυμα σε ακετόνη της 2,4,7-τρινιτροφλουορενόνης ( Fluka , B.D.H. ή ισοδύναμη ) 0,5 % ( TNF )

Αιθανολικό διάλυμα 2,6,-διβρωμοβενζοκινονο-4- χλωρο-ιμιδίου 0,1 % ( μεγίστη διάρκεια διατηρήσεως : μία εβδομάδα σε ψυγείο )

Συμπυκνωμένο διάλυμα αμμωνίας d : 0,9

Πρότυπο διάλυμα καθαρού διφαινυλίου 1 % μέσα σε κυκλοεξάνιο

Πρότυπο διάλυμα καθαρής ορθοφαινυλοφαινόλης 1 % μέσα σε κυκλοεξάνιο

4 . Όργανα

Αναμικτήρας ( μίξερ )

Σφαιρική φιάλη των 250 ml εσμυρισμένη στο λαιμό και με κάθετο ψυκτήρα

Συμπυκνωτήρας υπό ελαττωμένη πίεση

Μικροσιφώνια

Συσκευή χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας με πλάκες 20 X 20 cm

Λυχνία U.V. ( 254 nm ) : η ένταση πρέπει να είναι τέτοια , ώστε μια κηλίδα των 5 μg διφαινυλίου να μπορεί να διακρίνεται

Ψεκαστήρας αντιδραστηρίων

Πυριαντήριο

5 . Τρόπος εργασίας

α ) Προετοιμασία του δείγματος και εκχύλιση

Τα φρούτα που αποτελούν το σύνολο του δείγματος που ελήφθη για τον έλεγχο , κόπτονται στα δύο . Το ένα μισό κάθε φρούτου προορίζεται για τον προσδιορισμό των υπολειμμάτων διφαινυλίου και/ή ορθοφαινυλοφαινόλης . Λαμβάνομε από τα άλλα μισά τόσα μέρη φλοίου , ώστε να έχομε δείγμα 80 γραμμαρίων περίπου . Αυτά τα μέρη τεμαχίζονται , συνθλίβονται στο μίξερ και τοποθετούνται σε σφαιρική φιάλη των 250 ml . Προσθέτουμε 1 ml υδροχλωρικού οξέος 25 % και 100 ml διχλωρομεθανίου . Το μίγμα θερμαίνεται υπό κάθετο ψυκτήρα επί δέκα λεπτά . Αφού ψυχθεί και εκπλυθεί ο ψυκτήρας με 5 ml περίπου διχλωρομεθανίου , διηθούμε από πτυχωτό ηθμό , φέρομε το διάλυμα στον συμπυκνωτήρα και προσθέτουμε μερικές ελαφρόπετρες . Το διάλυμα συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση στη θερμοκρασία των 60 ° C μέχρι να πάρουμε έναν τελικό όγκο 10 ml περίπου . Αν χρησιμοποιούμε περιστροφικό συμπυκνωτήρα , η σφαιρική φιάλη πρέπει να συγκρατείται σε σταθερή θέση για ν’ αποφύγουμε τις απώλειες σε διφαινύλιο με το σχηματισμό ενός υμένα αυτού του προϊόντος στο άνω τοίχωμα σφαιρικής φιάλης .

β ) Χρωματογραφία

Τοποθετούμε σε αναμικτήρα 30 gr gel de silice και 60 ml ύδατος . Αναμιγνύουμε επί ένα λεπτό , στρώνουμε κατόπιν το μίγμα σε 5 χρωματογραφικές πλάκες και το απλώνουμε για να σχηματισθεί ένα στρώμα πάχους 0,250 χιλιοστών του μέτρου περίπου . Οι στρωμένες πλάκες υποβάλλονται επί 15 λεπτά σε ρεύμα θερμού αέρα στους 110 ° C .

Αφού ψυχθούν , κάθε πλάκα διαιρείται σε λωρίδες πλάτους 2 cm με παράλληλες γραμμές που εισχωρούν στην επίστρωση μέχρι της επιφανείας της πλάκας . Αποθέτουμε σε κάθε λωρίδα , περίπου 1,5 cm από την άκρη της και σε μία σειρά σταγόνων επαλλήλων 50 μl από το προς ανάλυση εκχύλισμα . Μία τουλάχιστον λωρίδα φυλάσσεται για τους μάρτυρες που αποτελούνται από μία απόθεση του 1 μl ( ήτοι 10 μg ) προτύπων διαλυμάτων διφαινυλίου και ορθοφαινυλοφαινόλης . Οι χρωματογραφικές πλάκες αναπτύσσονται με τη βοήθεια ενός μίγματος κυκλοεξανίου και διχλωρομεθανίου ( 25 : 95 ) σε θαλάμους που έχουν προηγουμένως επιστρωθεί εσωτερικά με διηθητικό χάρτη .

γ ) Ανίχνευση και πιστοποίηση

Η παρουσία διφαινυλίου και ορθοφαινυλοφαινόλης χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση κηλίδων στο υπεριώδες φως ( 254 nm ) . Επειδή το ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο έχει μετατραπεί σε ορθοφαινυλοφαινόλη κατά τη διάρκεια της εκχυλίσεως σε όξινο περιβάλλον , η παρουσία του δεν διαφοροποιείται από εκείνη της ορθοφαινυλοφαινόλης . Η πιστοποίηση των προϊόντων γίνεται με τον ακόλουθο τρόπο :

ι ) Το διφαινύλιο δίνει μία κίτρινη κηλίδα στο φως της ημέρας μετά από ψεκασμό με διάλυμα TNF .

ιι ) Η ορθοφαινυλοφαινόλη δίνει μία κυανή κηλίδα , μετά από ψεκασμό με διάλυμα 2,6- διβρωμο-βενζοκινονο-4-χλωρο-ιμιδίου , ακολουθούμενο από γρήγορο πέρασμα σε ρεύμα θερμού αέρα και στη συνέχεια έκθεση σε ατμόσφαιρα κορεσμένη με αμμωνία .

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΔΙΦΑΙΝΥΛΙΟΥ ΣΤΑ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΗ

1 . Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής .

Η μέθοδος που περιγράφεται κατωτέρω επιτρέπει να προσδιορίσουμε το υπόλειμμα του διφαινυλίου μέσα στα εσπεριδοειδή ( ολόκληρα φρούτα ) . Το περιθώριο λάθους των αποτελεσμάτων είναι ± 10 % για περιεκτικότητες σε διφαινύλιο μεγαλύτερες των 10 mg ανά χιλιόγραμμο φρούτων ( 10 ppm ) .

2 . Αρχή της μεθόδου

Ύστερα από απόσταξη σε όξινο περιβάλλον και εκχύλιση με κυκλοεξάνιο , το εκχύλισμα χρωματογραφείται σε λεπτή στιβάδα πάνω σε gel de silice . Το χρωματογράφημα αναπτύσσεται , το διφαινύλιο εκλούεται και προσδιορίζεται φασματοφωτομετρικώς σε 248 nm .

3 . Αντιδραστήρια

Πυκνό θειικό οξύ

Αντιαφριστικό γαλάκτωμα με βάση τη σιλικόνη

Κυκλοεξάνιο p.a.

Εξάνιο p.a.

Αιθανόλη p.a.

Άνυδρο θειικό νάτριο

Gel de silice GF 254 Merck ή ισοδύναμο

Πρότυπο διάλυμα διφαινυλίου καθαρού 1 % μέσα σε κυκλοεξάνιο : διαλύουμε με κυκλοεξάνιο , ώστε να πάρομε τα τρία ακόλουθα διαλύματα :

α ) 0,6 μg/μl

β ) 1 μg/μl

γ ) 1,4 μg/μl

4 . Όργανα

Αναμικτήρας ( μίξερ ) 1 λίτρου

Σφαιρική φιάλη αποστάξεως των 2 λίτρων με διαχωριστή τύπου Clevenger (1) τροποποιημένο και κάθετο ψυκτήρα

Φιάλη ογκομετρική των 10 ml

Μικροσιφώνια των 50 μl

Συσκευή χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας με πλάκες των 20 x 20 εκ.

Πυριαντήριο

Φυγόκεντρος με κωνικούς υποδοχείς των 15 ml

Φασματοφωτόμετρο U.V.

5 . Τρόπος εργασίας

α ) Προετοιμασία και εκχύλιση του δείγματος

Τα φρούτα που αποτελούν το σύνολο του προς έλεγχο δείγματος κόβονται στα δύο . Το ένα μισό κάθε φρούτου προορίζεται για την αναζήτηση υπολειμμάτων διφαινυλίου , OPP ή ορθοφαινυλοφαινολικού νατρίου . Τα άλλα μισά συγκεντρώνονται , αλέθονται σε μύλο ή συνθλίβονται μέχρι να ληφθεί ένα ομογενές μίγμα . Λαμβάνομε από το μίγμα αυτό δύο τουλάχιστον υπο-δείγματα των 200 γραμμαρίων , στα οποία εκτελούμε την ανάλυση σύμφωνα με τη μέθοδο που υποδεικνύεται κατωτέρω . Κάθε υπο-δείγμα τοποθετείται σε αναμικτήρα ( μίξερ ) με 100 ml νερού και συνθλίβεται σε χαμηλή ταχύτητα επί μερικά δευτερόλεπτα . Προσθέτουμε νερό σε ποσότητα τέτοια , ώστε ο όγκος του μίγματος να φθάσει τα 3/4 της χωρητικότητας του αναμικτήρα . Ανακατεύουμε στη συνέχεια με μεγάλη ταχύτητα περί τα 5 λεπτά . Ο πολτός που λαμβάνουμε κατ’ αυτό τον τρόπο μεταφέρεται στη φιάλη αποστάξεως των 2 λίτρων . Ξεπλένουμε τον αναμικτήρα με νερό και προσθέτουμε αυτό το νέρο εκπλύσεως στο περιεχόμενο της σφαιρικής φιάλης . ( Το σύνολο του νερού που χρησιμοποιείται για τη σύνθλιψη και το ξέπλυμα είναι 1 λίτρο ) . Στο μίγμα προσθέτουμε 2 ml θειικού οξέος , 1 ml αντιαφριστικό γαλάκτωμα και μερικές ελαφρόπετρες . Συνδέουμε το διαχωριστήρα και τον ψυκτήρα με τη σφαιρική φιάλη . Εισάγουμε στο διαχωριστήρα απεσταγμένο νερό , μέχρις ότου το επίπεδο του νερού ξεπεράσει καθαρά την κάτω σύνδεση του πλαγίου σωλήνα επιστροφής και στη συνέχεια 7 ml κυκλοεξάνιο . Αποστάζουμε επί δύο ώρες περίπου . Συλλέγουμε κατόπιν το περιεχόμενο του διαχωριστήρα στην ογκομετρική φιάλη των 10 ml , ξεπλένουμε το διαχωριστήρα με 1,5 ml περίπου κυκλοεξάνιο , προσθέτουμε το διάλυμα του εκπλύματος στο περιεχόμενο της φιάλης και συμπληρώνουμε τον όγκο με κυκλοεξάνιο . Προσθέτουμε τελικά λίγο άνυδρο θειικό νάτριο και αναταράσσουμε .

β ) Χρωματογραφία

Βάζουμε σε έναν αναμικτήρα ( μίξερ ) 30 g gel de silice και 60 ml νερό . Αναμιγνύουμε επί ένα λεπτό , χύνουμε στη συνέχεια το μίγμα σε 5 χρωματογραφικές πλάκες και το απλώνουμε για να σχηματισθεί ένα στρώμα πάχους 0,250 χιλιοστών του μέτρου περίπου . Οι κατ’ αυτόν τον τρόπο επικαλυμμένες πλάκες υποβάλλονται επί 15 λεπτά σε ρεύμα θερμού αέρα και τοποθετούνται σε πυριαντήριο , όπου διατηρούνται επί 30 λεπτά σε 110 ° C . Μετά την ψύξη , διαιρείται κάθε πλάκα σε 4 λωρίδες πλάτους 4,5 cm με παράλληλες γραμμές που εισχωρούν στην επικάλυψη μέχρι την επιφάνεια της πλάκας . Αποθέτουμε σε απόσταση 1,5 εκ. περίπου από την άκρη της πλάκας και σε σειρά επαλλήλων σταγόνων 50 μl του προς ανάλυση εκχυλίσματος σε μία από τις λωρίδες και σε κάθε μία από τις άλλες τρεις λωρίδες 50 μl από τα πρότυπα διαλύματα α ) , β ) και γ ) που αντιστοιχούν σε δόσεις διφαινυλίου των 30 , 50 και 70 μl .

Αν κάνουμε τις αναλύσεις στη σειρά , μπορούμε να παραλείψουμε να αποθέσουμε σε κάθε πλάκα τα πρότυπα διαλύματα και να αναφερθούμε , για την καμπύλη αναφοράς , στο μέσο όρο των τιμών που πήραμε από πέντε τουλάχιστον πλάκες με τις ίδιες δόσεις προτύπων διαλυμάτων .

γ ) Ανάπτυξη των χρωματογραφημάτων και έκλυση

Τα χρωματογραφήματα αναπτύσσονται σε ύψος 17 εκ. με εξάνιο , μέσα σε θαλάμους που έχουν προηγουμένως επιστρωθεί εσωτερικά με διηθητικό χάρτη . Οι πλάκες ξηραίνονται στον αέρα . Οι ζώνες στις οποίες υπάρχει διφαινύλιο εντοπίζονται σε φως U.V. στα 254 nm και περιγράφονται με τετράγωνα ίσης επιφανείας .

Οι επιφάνειες που περιορίσθηκαν έτσι ξύνονται αμέσως με μία σπάτουλα σε όλο το βάθος του υποστρώματος . Το διφαινύλιο εκχυλίζεται με 10 ml αιθανόλης επί 10 λεπτά , αναδεύοντας πολλές φορές . Μεταφέρουμε στους σωλήνες φυγοκεντρίσεως και φυγοκεντρούμε επί 5 λεπτά στις 2 500 στροφές ανά λεπτό .

Παίρνουμε κατά τον ίδιο τρόπο μία ζώνη μάρτυρα των ιδίων διαστάσεων . Σε περίπτωση που οι αναλύσεις γίνονται στη σειρά , παίρνουμε αυτή τη ζώνη σε μία παρθένα λωρίδα της πλάκας . Στην περίπτωση ανεξαρτήτων αναλύσεων , την παίρνουμε από μία λωρίδα κατειλημμένη από ένα πρότυπο κάτω από τη ζώνη που περιέχει το διφαινύλιο .

δ ) Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός

Μεταγγίζουμε το υγρό που επιπλέει μέσα στις κυψελίδες του φασματοφωτομέτρου και προσδιορίζουμε την απόσβεση στα 248 nm , συγκρίνοντας μ’ ένα πρότυπο εκχύλισμα που προέρχεται από μία χρωματογραφική ζώνη χωρίς διφαινύλιο .

6 . Υπολογισμός των αποτελεσμάτων

Σχεδιάζουμε μία καμπύλη αναφοράς , λαμβάνοντας αντιστοίχως ως συντεταγμένες τις δόσεις διφαινυλίου των 30 , 50 και 70 μg και τις αντίστοιχες τιμές αποσβέσεως που προσδιορίστηκαν στο φασματοφωτόμετρο . Η καμπύλη που λαμβάνουμε κατ’ αυτόν τον τρόπο είναι μία ευθεία που διέρχεται από την αρχή των αξόνων . Αυτή η γραφική παράσταση επιτρέπει την απ’ ευθείας ανάγνωση σε ppm των περιεκτικοτήτων των δειγμάτων σε διφαινύλιο , με βάση τις τιμές αποσβέσεως των εκχυλισμάτων τους .

(1) Βλέπε σχήμα .

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ ΟΡΘΟΦΑΙΝΥΛΟΦΑΙΝΟΛΗΣ ΚΑΙ ΟΡΘΟΦΑΙΝΥΛΟΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΝΑΤΡΙΟΥ ΜΕΣΑ ΣΤΑ ΕΣΠΕΡΙΔΟΕΙΔΗ

1 . Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογής

Η μέθοδος που περιγράφεται κατωτέρω επιτρέπει τον προσδιορισμό των υπολειμμάτων ορθοφαινυλοφαινόλης και ορθοφαινυλοφαινολικού νατρίου στα εσπεριδοειδή ( ολόκληρα φρούτα ) . Τα αποτελέσματα περιέχουν ένα σφάλμα του οποίου η μέση τιμή βρίσκεται μεταξύ 10 και 20 % , για μία περιεκτικότητα σε OPP ή ορθοφαινυλοφαινολικό νάτριο της τάξεως των 12 ppm .

2 . Αρχή της μεθόδου .

Ύστερα από απόσταξη σε όξινο περιβάλλον και εκχύλισμα με δι-ισοπενθυλικό αιθέρα , το εκχύλισμα καθαρίζεται και υποβάλλεται σε κατεργασία με διάλυμα 1-φαινυλο-2,3-διμεθυλο- 4-αμινο-πυραζολόνης ( = 4-αμινοαντιπυρίνης ) . Αναπτύσσεται ένας ερυθρός χρωματισμός , του οποίου η ένταση μετριέται με φασματοφωτομέτρηση στα 510 nm .

3 . Αντιδραστήρια

Φωσφορικό οξύ 70 %

Αντιαφριστικό γαλάκτωμα με βάση τη σιλικόνη

Δι-ισοπενθυλικός αιθέρας p.a.

Καθαρό κυκλοεξάνιο : αναδεύουμε τρεις φορές με διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 4 % , ξεπλένουμε τρεις φορές με απεσταγμένο νερό

Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 4 %

Διάλυμα ρυθμιστικό με pH 10,4 : τοποθετούμε σε μία ογκομετρική φιάλη των δύο λίτρων 6,64 g βορικό οξύ , 8,00 g χλωριούχο κάλιο και 93,1 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου IN . Αναδεύουμε και συμπληρώνουμε με απεσταγμένο νερό μέχρι την χαραγή

Αντιδραστήριο I : διαλύουμε 1,0 g 1-φαινυλο-2,3-διμεθυλο-4-αμινοπυραζολόνη ( 5 ) ( = 4-αμινοαντιπυρίνη ) σε 100 ml απεσταγμένο νερό

Αντιδραστήριο II : διαλύουμε 2 g σιδηροκυανιούχου καλίου σε 100 ml απεσταγμένο νερό . Τα αντιδραστήρια I και II πρέπει να διατηρούνται σε σκοτεινές γυάλινες φιάλες και δεν είναι σταθερά παρά μόνο για 14 ημέρες περίπου

Gel de silice

Πρότυπο διάλυμα : διαλύουμε 10 mg OPP καθαρό σε 1 ml NaOH 0,1 N , συμπληρώνουμε μέχρι τα 100 ml με διάλυμα βορικού νατρίου 0,2 m ( 1 ml = 100 μg ) . Για την καμπύλη αναφοράς διαλύουμε 1 : 10 με το ρυθμιστικό διάλυμα

4 . Όργανα

Μύλος αλέσεως ή συνθλίπτης

Αναμικτήρας ( μίξερ )

Φιάλη αποστάξεως 1 λίτρου με διαχωριστήρα τύπου Clevenger τροποποιημένο και με κάθετο ψυκτήρα ( νερού )

Λουτρό υπερύθρων

Χοάνη διαχωρισμού των 200 ml

Ογκομετρικοί κύλινδροι των 25 και 100 ml

Ογκομετρικές φιάλες των 25 και 100 ml

Σιφώνια του 1 ως 10 ml

Σιφώνια ογκομετρικά των 0,5 ml

Φασματοφωτόμετρο με κυβέτες ( κυψελίδες ) των 5 cm

5 . Τρόπος εργασίας

Τα φρούτα που αποτελούν το σύνολο του δείγματος που ελήφθη για έλεγχο , κόβονται στα δύο . Το ένα μισό κάθε φρούτου προορίζεται για την ανίχνευση υπολειμμάτων του διφαινυλίου , του OPP ή του ορθοφαινυλοφαινολικού νατρίου . Τα άλλα μισά συλλέγονται , αλέθονται σε μύλο ή συνθλίβονται , μέχρις ότου γίνουν ένα ομογενές μίγμα . Παίρνουμε από το μίγμα τουλάχιστον δύο υπο-δείγματα των 250 g , στο οποία πραγματοποιούμε την ανάλυση σύμφωνα με τη μέθοδο που υποδεικνύεται κατωτέρω .

Κάθε υπο-δείγμα τοποθετείται σε αναμικτήρα με 500 ml νερό και συνθλίβεται , μέχρις ότου γίνει ένας ρευστός ομογενής πολτός , στον οποίο τα ελαιώδη κύτταρα δεν είναι πλέον διακριτά . Παίρνουμε ανάλογα με την πιθαναλογούμενη περιεκτικότητα σε OPP 150 ως 300 g πολτού και τα βάζουμε στη φιάλη αποστάξεως του ενός λίτρου με τη βοήθεια ποσότητας νερού , ώστε το μίγμα να φθάσει στα 500 g μέσα στη φιάλη . Αφού προσθέσουμε 10 ml φωσφορικού οξέος 70 % , μερικές ελαφρόπετρες και 0,5 ml αντιαφριστικό γαλάκτωμα , συνδέομε το διαχωριστήρα και τον ψυκτήρα στη σφαιρική φιάλη . Εισάγομε στο διαχωριστήρα 10 ml δι-ισοπενθυλικό αιθέρα και θερμαίνουμε σιγά τη φιάλη μέσα στο λουτρό υπερύθρων αποφεύγοντας το ψήσιμο του πολτού ή το σχηματισμό αφρού . Αποστάζουμε επί 6 ώρες περίπου . Κατόπιν χύνουμε το περιεχόμενο του διαχωριστήρα στη χοάνη διαχωρισμού των 200 ml , ξεπλένουμε το διαχωριστήρα και τον ψυκτήρα με 60 ml κυκλοεξάνιο και μετά με 60 ml νερό . Προσθέτουμε τα υγρά εκπλύσεως στο περιεχόμενο της χοάνης διαχωρισμού . Αναταράζουμε δυνατά και αφού χωριστούν οι φάσεις διαχωρίζουμε και αφαιρούμε την υδατική φάση .

Για να εκχυλίσουμε το OPP , η οργανική φάση αναταράζεται δυνατά 5 φορές , κάθε φορά για 3 λεπτά με 10 ml υδροξειδίου του νατρίου 4 % . Τα αλκαλικά διαλύματα συγκεντρώνονται , εξουδετερώνονται σε pH 9-10 με φωσφορικό οξύ παρουσία χάρτου φαινολοφθαλεΐνης και συμπληρώνονται έως τα 100 ml με απεσταγμένο νερό . Προσθέτουμε μία μικρή ποσότητα gel de silice για να διαυγάσουμε το διάλυμα που παρουσιάζει ελαφρό θόλωμα , αναταράζουμε και διηθούμε από ξηρό φίλτρο με πολύ λεπτούς πόρους . Εφόσον είναι γνωστό ότι μεγαλύτερη ακρίβεια και πιστότητα στην ανάπτυξη του χρωματισμού επιτυγχάνεται με ποσότητες OPP που περιλαμβάνονται μεταξύ 10 και 70 μg , παίρνουμε με τη βοήθεια ενός σιφωνίου μία ανάλογη ποσότητα από 0,5 εώς 10 ml διαλύματος , έχοντας υπόψη τις ποσότητες OPP που περιμένουμε να βρούμε . Βάζουμε αυτό το διάλυμα μέσα σε μία ογκομετρική φιάλη των 25 ml , προσθέτουμε 0,5 ml από το αντιδραστήριο I , 10 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα και ακολούθως 0,5 ml από το αντιδραστήριο II . Συμπληρώνουμε μέχρι τη χαραγή με το ρυθμιστικό διάλυμα και αναταράζουμε δυνατά .

Υστερα από 5 λεπτά μετράμε στο φασματοφωτόμετρο την απόσβεση του ερυθρού χρωματισμού στα 510 nm συγκρίνοντας με ένα δείγμα που δεν περιέχει εκχύλισμα . Η ένταση του χρωματισμού δεν μεταβάλλεται επί 30 λεπτά . Η εκτίμηση γίνεται σε σχέση με τις τιμές της καμπύλης αναφοράς που έγινε υπό τις ίδιες συνθήκες με το πρότυπο διάλυμα OPP .

6 . Παρατηρήσεις

Για κάθε ανάλυση συνιστάται να γίνεται ο φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός εις διπλούν , με διαφορετικούς όγκους εξουδετερουμένου αλκαλικού εκχυλίσματος . Τα εσπεριδοειδή που δεν είναι επεξεργασμένα δίνουν με αυτή τη μέθοδο « λευκές τιμές » που μπορούν να φθάσουν τα 0,5 ppm για τα πορτοκάλια και 0,8 ppm για τα λεμόνια .

Συσκευή CLEVENGER

( Παράρτημα III , Κεφάλαιο 4 , Παράρτημα IV , Κεφάλαιο 4 ) : Βλέπε Ε.Ε.