BILAG XX

Metode til bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere ved gaskromatografi på kapillarkolonne

1. FORMÅL

Metodens formål er bestemmelse af indholdet af voks, fedtsyremethylestere og fedtsyreethylestere i olivenolie. De enkelte vokser og alkylestere adskilles efter antallet af kulstofatomer. Metoden anbefales som værktøj til at skelne mellem olivenolie og olie af olivenpresserester og som kvalitetsparameter for ekstra jomfruolie og dermed påvisning af ulovlig blanding af ekstra jomfruolie med olie af ringere kvalitet, uanset om det er jomfruolie, bomolie eller desodoriseret olie.

2. PRINCIP

Tilsætning af egnede interne standarder til olien og adskillelse ved kromatografi på silicagelkolonne. Opsamling af den fraktion, der elueres under prøvebetingelserne (og som har lavere polaritet end triacylglycerolerne), og direkte analyse ved gaskromatografi på kapillarkolonne.

3. APPARATUR

3.1. Erlenmeyerkolbe, 25 ml

3.2. Glaskolonne til væskekromatografi, indvendig diameter 15 mm, længde 30-40 cm, med hane

3.3. Gaskromatograf til brug med kapillarkolonne og med et system til direkte indsprøjtning i kolonnen, bestående af følgende:

3.3.1. Termostatstyret kolonneovn med temperaturprogrammering

3.3.2. Kold injektor til direkte indsprøjtning i kolonnen

3.3.3. En flammeioniseringsdetektor og en konverter-forstærker

3.3.4. Skriver/integrator (anm. 1), der passer til konverter-forstærkeren (3.3.3), med responstid højst 1 sekund og variabel papirhastighed

Anmærkning 1: Der kan også benyttes computersystemer med direkte overførsel af data fra gaskromatografen til en pc.

3.3.5. Kapillarkolonne af sintret kvarts (til analyse af vokser og methyl- og ethylestere), længde 8-12 m, indvendig diameter 0,25-0,32 mm, coatet indvendigt med væskefase (anm. 2) i en ensartet lagtykkelse på 0,10-0,30 μm

Anmærkning 2: Der er egnede væskefaser i handelen til dette formål, fx SE52 og SE54.

3.4. Mikroinjektionssprøjte på 10 μl, med hærdet kanyle, til direkte indsprøjtning i kolonnen

3.5. Elektrisk vibrator

3.6. Rotationsfordamper

3.7. Muffelovn

3.8. Analysevægt med en nøjagtighed på ± 0,1 mg

3.9. Sædvanligt laboratorieglasudstyr

4. REAGENSER

4.1. Silicagel med kornstørrelse 60-200 μm. Silicagelen anbringes i ovnen ved 500 °C i mindst fire timer. Efter afkøling tilsættes der 2 % vand beregnet på silicagelmængden. Pulveret rystes omhyggeligt, til det er ensartet, og opbevares i ekssikkator i mindst tolv timer inden brug.

4.2. n-hexan af kvalitet til kromatografering eller bestemmelse af restkoncentrationer (renheden kontrolleres)

ADVARSEL – Dampe kan antændes. Holdes væk fra varme, gnister og åben ild. Sørg for, at flasker altid er rigtigt lukket. Sørg for god udluftning under brugen. Undgå akkumulering af dampe, og fjern alle antændelseskilder såsom elvarmeapparater og elektrisk udstyr, der ikke er lavet af ikke brændbare materialer. Farligt ved indånding, da det kan forårsage skader på nerveceller. Undgå indånding af dampe. Brug om nødvendigt egnet åndedrætsværn. Undgå kontakt med øjne og hud.

4.3. Ethylether, til kromatografering

ADVARSEL – Meget brandfarligt og moderat giftigt. Hudirriterende. Farligt ved indånding. Kan forårsage øjenskader. Virkningerne kan indtræde med forsinkelse. Kan danne eksplosive peroxider. Dampe kan antændes. Holdes væk fra varme, gnister og åben ild. Sørg for, at flasker altid er rigtigt lukket. Sørg for god udluftning under brugen. Undgå akkumulering af dampe, og fjern alle antændelseskilder såsom elvarmeapparater og elektrisk udstyr, der ikke er lavet af ikkebrændbare materialer. Bør ikke inddampes til tørhed eller næsten tørhed. Dannelse af peroxider kan mindskes ved tilsætning af vand eller et passende reduktionsmiddel. Må ikke drikkes. Undgå indånding af dampe. Undgå længerevarende eller gentagen hudkontakt.

4.4. n-heptan, til kromatografering, eller isooctan

ADVARSEL – Brandfarligt. Farligt ved indånding. Holdes væk fra varme, gnister og åben ild. Sørg for, at flasker altid er rigtigt lukket. Sørg for god udluftning under brugen. Undgå indånding af dampe. Undgå længerevarende eller gentagen hudkontakt.

4.5. Standardopløsning af laurylarachidat (anm. 3), 0,05 % (m/v) i heptan (intern standard for voks).

Anmærkning 3: Der kan også bruges palmitylpalmitat, myristylstearat eller arachidyllaurat.

4.6. Standardopløsning af methylheptadecanoat, 0,02 % (m/v) i heptan (intern standard for methyl- og ethylestere)

4.7. Sudan 1 (1-phenylazo-2-naphthol)

4.8. Bæregas: hydrogen eller helium, ren, til gaskromatografi

ADVARSEL

Hydrogen. Meget brandfarligt, under tryk. Holdes væk fra varme, gnister, åben ild og elektrisk udstyr, der ikke er lavet af ikkebrændbare materialer. Sørg for, at flaskens ventil er lukket, når den ikke er i brug. Benyt altid reduktionsventil. Reduktionsventilens fjeder skal udløses helt, inden ventilen på flasken åbnes. Stå ikke foran flaskens åbning, når ventilen åbnes. Sørg for god udluftning under brugen. Overfør ikke hydrogen fra en flaske til en anden. Bland ikke gasser i flasken. Sørg for, at flaskerne ikke kan vælte. Hold flasker afskærmet mod sollys og varme. Opbevares i ikkekorrosionsfremmende omgivelser. Brug ikke flasker, der er beskadiget eller mangler etiket.

Helium. Komprimeret gas under højt tryk. Gassen mindsker den mængde oxygen, der er til rådighed til vejrtrækning. Hold flasken lukket. Sørg for god udluftning under brugen. Gå ikke ind i lagerrum, hvis de ikke har tilstrækkelig udluftning. Benyt altid reduktionsventil. Reduktionsventilens fjeder skal udløses helt, inden ventilen på flasken åbnes. Overfør ikke gas fra en flaske til en anden. Sørg for, at flaskerne ikke kan vælte. Stå ikke foran flaskens åbning, når ventilen åbnes. Hold flasker afskærmet mod sollys og varme. Opbevares i ikkekorrosionsfremmende omgivelser. Brug ikke flasker, der er beskadiget eller mangler etiket. Må ikke indåndes. Kun til teknisk brug.

4.9. Hjælpegasser:

— hydrogen, ren, til gaskromatografi

— luft, ren, til gaskromatografi.

ADVARSEL

Luft. Komprimeret gas under højt tryk. Bruges med forsigtighed, når der er brændbare stoffer til stede, da de fleste organiske forbindelser har en betydeligt lavere selvantændelsestemperatur i luft under højt tryk. Sørg for, at flaskens ventil er lukket, når den ikke er i brug. Benyt altid reduktionsventil. Reduktionsventilens fjeder skal udløses helt, inden ventilen på flasken åbnes. Stå ikke foran flaskens åbning, når ventilen åbnes. Overfør ikke gas fra en flaske til en anden. Bland ikke gasser i flasken. Sørg for, at flaskerne ikke kan vælte. Hold flasker afskærmet mod sollys og varme. Opbevares i ikkekorrosionsfremmende omgivelser. Brug ikke flasker, der er beskadiget eller mangler etiket. Luft til teknisk brug må ikke anvendes til inhalations- og respirationsapparater.

5. FREMGANGSMÅDE

5.1. Fremstilling af kromatografikolonnen

15 g silicagel (4.1) opslæmmes i n-hexan (4.2) og hældes i kolonnen (3.2). Når kolonnematerialet har sat sig ved henstand, pakkes det yderligere ved hjælp af en el-vibrator (3.5) for at opnå større homogenitet. Der elueres med 30 ml n-hexan for at fjerne eventuelle urenheder. På analysevægten (3.8) afvejes ca. 500 mg af prøven nøjagtigt i en 25 ml kolbe (3.1), og der tilsættes en mængde intern standard (4.5) svarende til det formodede voksindhold, eksempelvis 0,1 mg laurylarachidat til olivenolie og 0,25-0,50 mg til olie af olivenpresserester og 0,05 mg methylheptadecanoat til olivenolier (4.6).

Den tilberedte prøve overføres til kromatografikolonnen ved hjælp af to portioner n-hexan (4.2) a 2 ml.

Der aftappes opløsningsmiddel, indtil væskeoverfladen står 1 mm over kolonnematerialet. Der elueres yderligere med n-hexan/ethylether (99:1) og opsamles 220 ml eluat med en hastighed på ca. 15 dråber pr. 10 sekunder. (Denne fraktion indeholder methyl- og ethylestrene og vokserne). (Anm. 4) (Anm. 5).

Anmærkning 4: n-hexan/ethylether-blandingen (99:1) skal friskfremstilles hver dag.

Anmærkning 5: Korrekt eluering af vokserne kan kontrolleres visuelt ved, at der til prøveopløsningen tilsættes 100 μl 1 % Sudan 1 i elueringsvæske. Farvestoffet har en retentionstid mellem vokser og triglycerider, så når farven har nået bunden af kolonnen, skal elueringen standses, eftersom al voks da er elueret.

Den derved fremkomne fraktion inddampes i en rotationsfordamper, indtil opløsningsmidlet næsten helt er forsvundet. De sidste 2 ml fjernes ved hjælp af en svag nitrogenstrøm. Den opsamlede fraktion, der indeholder methyl- og ethylestrene, fortyndes med 2-4 ml n-heptan eller isooctan.

5.2. Gaskromatografisk analyse

5.2.1. Indledende procedure

Kolonnen påmonteres gaskromatografen (3.3), idet den ene ende forbindes med injektionssystemet og den anden ende med detektoren. Gaskromatografen kontrolleres (gasledningerne, detektors og skrivers ydeevne, m.v.).

Hvis kolonnen ikke har været benyttet før, kan det anbefales at konditionere den. En svag gasstrøm ledes gennem kolonnen, hvorefter gaskromatografen sættes i gang. Der opvarmes gradvis til 350 °C over en periode på ca. fire timer.

Denne temperatur holdes i mindst to timer, hvorefter apparaturet indstilles til arbejdsbetingelserne (gasstrømmen indstilles, der tændes for flammen, den elektroniske skriver (3.3.4) tilsluttes, kolonneovnens temperatur indstilles, detektoren indstilles osv.). Signalet registreres med en følsomhed på mindst det dobbelte af den, der kræves ved analysen. Basislinjen bør være lineær uden nogen form for toppe og må ikke drive.

Negativ lineær drift tyder på utætheder i kolonneforbindelserne, mens positiv drift er tegn på utilstrækkelig konditionering af kolonnen.

5.2.2. Valg af arbejdsbetingelser for vokser og methyl- og ethylestere (Anm. 6)

Arbejdsbetingelserne er normalt som følger:

— Kolonnetemperatur: 20 °C/min 5 °C/min

fra 80 °C (1’) 140 °C 335 °C (20)

— Detektortemperatur: 350 °C

— Indsprøjtet mængde: 1 μl af opløsningen i (2-4 ml) n-heptan

— Bæregas: helium eller hydrogen med den for den valgte gas optimale lineære hastighed (se tillæg A)

— Instrumentfølsomhed: passende til opfyldelse af ovenstående krav.

Anmærkning 6: På grund af den høje sluttemperatur, tillades der en positiv drift på op til 10 % af fuldt udslag.

Disse betingelser kan ændres alt efter kolonnens og gaskromatografens karakteristika, så man opnår adskillelse af alle vokser og methyl- og ethylestere af fedtsyrer, en tilfredsstillende opløsning af toppene (se figur 2, 3 og 4) og en retentionstid for den interne standard laurylarachidat på 18 ± 3 minutter. Voksernes mest repræsentative top skal måle mindst 60 % af fuldt udslag, mens den interne standard for methyl- og ethylestrene, methylheptadecanoat, skal give fuldt udslag.

Parametrene for toppenes integration fastlægges på en sådan måde, at de relevante toppes arealer vurderes korrekt.

5.3. Udførelse af analysen

Der suges 10 μl af opløsningen op i 10 μl-mikrosprøjten, og stemplet trækkes tilbage, indtil kanylen er tom. Kanylen stikkes ind i injektionssystemet, og der indsprøjtes hurtigt efter 1-2 sekunder. Efter ca. 5 sekunder trækkes kanylen forsigtigt ud.

Registreringen fortsættes, indtil alle vokser eller stigmastadiener er helt elueret, afhængigt af, hvilken fraktion der analyseres.

Basislinjen skal hele tiden opfylde de fastsatte betingelser.

5.4. Identifikation af toppene

Toppene identificeres ud fra retentionstiderne, idet de sammenlignes med blandinger af vokser med kendte retentionstider, der er analyseret under samme betingelser. Alkylestrene identificeres ud fra blandinger af methyl- og ethylestre af de vigtigste fedtsyrer i olivenolie (palmitinsyre og oliesyre).

Figur 1 viser et kromatogram af vokser fra jomfruolie. Figur 2 og 3 viser kromatogrammer af to ekstra jomfruolier fra detailhandelen, den ene indeholdende methyl- og ethylestre, den anden ikke. Figur 4 viser kromatogrammerne af en ekstra jomfruolie af bedste kvalitet og af samme olie, hvortil der er tilsat 20 % desodoriseret olie.

5.5. Kvantitativ analyse af vokserne

Arealerne af toppene for den interne standard laurylarachidat og for de alifatiske C40- til C46- estere bestemmes ved hjælp af integratoren.

Det samlede voksindhold bestemmes som summen af de enkelte vokser i mg/kg fedtstof efter formlen:

hvor:

Ax = arealet af toppen for den enkelte ester i computerenheder As = arealet af toppen for den interne standard laurylarachidat i computerenheder ms = massen af tilsat intern standard laurylarachidat i milligram m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.

5.5.1. Kvantitativ analyse af methyl- og ethylestere

Arealerne af toppene for den interne standard methylheptadecanoat, methylestrene af C16- og C18-fedtsyrerne og ethylestrene af C16- og C18-fedtsyrerne bestemmes ved hjælp af integratoren.

Indholdet af den enkelte alkylester bestemmes i mg/kg fedtstof efter formlen:

hvor:

Ax = arealet af toppen for den enkelte C16- og C18-ester i computerenheder As = arealet af toppen for den interne standard methylheptadecanoat i computerenheder ms = massen af tilsat intern standard methylheptadecanoat i milligram m = massen af den prøve, der bruges til bestemmelsen, i gram.

6. ANGIVELSE AF RESULTATER

Summen af indholdet af de forskellige C40- til C46-vokser (Anm. 7) angives i mg pr. kg fedtstof (ppm).

Summen af indholdet af henholdsvis C16- til C18-methylestere og -ethylestere angives samt de to summer tilsammen.

Resultaterne angives i nærmeste hele mg/kg.

Anmærkning 7: De bestanddele, der skal bestemmes kvantitativt, er dem med et lige antal kulstofatomer blandt C40- til C46-estrene, jf. eksemplet på et kromatogram af vokser i olivenolie i nedenstående figur. Hvis C46-esteren giver en dobbelt top, tilrådes det med henblik på identifikation at analysere voksfraktionen fra en olie af olivenpresserester, hvor C46-toppen tydeligt kan skelnes, da den er langt den største.

Forholdet mellem ethylestere og methylestere angives.

Figur 1

Eksempel på et gaskromatogram af voksfraktionen fra en olivenolie (1)

Figur 2

Methylestere, ethylestere og vokser i en jomfruolie

Figur 3

Methylestere, ethylestere og vokser i en ekstra jomfruolie

Figur 4

Udsnit af kromatogrammer af en ekstra jomfruolie og af samme olie, hvortil der er tilsat desodoriseret olie