BILAG

I bilaget til forordning (EF) nr. 440/2008 foretages følgende ændringer:

Som kapitel B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 og B.58 tilføjes:

»B.53. UNDERSØGELSE AF NEUROTOKSICITET UNDER UDVIKLINGEN

INDLEDNING

1. Denne testmetode svarer til OECD-testvejledningen (TG) 426 (2007). På et møde i København i juni 1995 drøftede en OECD-arbejdsgruppe om reproduktion og udviklingstoksicitet behovet for at ajourføre den eksisterende OECD-testvejledning for reproduktion og udviklingstoksicitet og for at udforme nye retningslinjer for de endepunkter, som endnu ikke er dækket (1). Arbejdsgruppen anbefalede, at der blev skrevet en testvejledning for udviklingsneurotoksicitet på grundlag af en vejledning fra den amerikanske miljøstyrelse (EPA-vejledning), som siden er blevet revideret (2). I juni 1996 blev der afholdt et andet møde i København for at hjælpe sekretariatet med at skitsere rammerne for en ny testvejledning vedrørende udviklingsneurotoksicitet, bl.a. de vigtigste elementer som f.eks. oplysninger om valg af dyrearter, doseringsperiode, testperiode, endepunkter, der skal vurderes, og kriterier for vurdering af resultater. Der blev udgivet en amerikansk vejledning i vurdering af neurotoksicitetsrisici i 1998 (3). Et OECD-konsultationsmøde med eksperter og en ILSI Risk Science Institute-workshop blev afholdt umiddelbart efter hinanden i oktober 2000, og i 2005 blev der afholdt et konsultationsmøde med eksperter i Tokyo. Disse møder blev holdt for at drøfte de videnskabelige og tekniske spørgsmål vedrørende den nuværende testvejledning, og der blev taget hensyn til anbefalingerne fra møderne (4)(5)(6)(7) i forbindelse med udviklingen af denne testmetode. Supplerende information om, hvilken adfærd, fortolkning og terminologi der skal anvendes til denne testmetode, kan ses i OECD's vejledning nr. 43 om reproduktiv toksicitetsundersøgelse og -vurdering (8) og nr. 20 om neurotoksicitetstest (9).

INDLEDENDE OVERVEJELSER

2. Det er kendt, at en række kemikalier forårsager en neurotoksisk påvirkning af udviklingen hos mennesker og andre arter (10)(11)(12)(13). En bestemmelse af potentialet for udviklingsneurotoksicitet kan være nødvendig for at vurdere og evaluere et kemikalies toksiske egenskaber. Udviklingsneurotoksicitetsundersøgelser skal resultere i data, bl.a. karakteriseringer af dosisrespons og om de potentielle funktionelle og morfologiske virkninger, der kan opstå på afkommets ikkefærdigudviklede nervesystem ved eksponering in utero og i den første levetid.

3. En udviklingsneurotoksicitetsundersøgelse kan gennemføres som en særskilt undersøgelse, som en del af en reproduktionstoksicitetsundersøgelse og/eller en neurotoksicitetsundersøgelse af voksne (f.eks. testmetode B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) eller som tillæg til en prænatal udviklingstoksicitetsundersøgelse (f.eks. testmetode B.31 (17)). Når udviklingsneurotoksicitetsundersøgelsen indgår i eller knyttes til en anden undersøgelse, er det afgørende at bevare begge undersøgelsestypers integritet. Alle test skal overholde gældende lovgivning eller statslige og institutionelle retningslinjer for anvendelsen af forsøgsdyr i forskning (f.eks. 18).

4. Testlaboratoriet bør inden testens udførelse gennemgå alle tilgængelige oplysninger om testkemikaliet. Disse oplysninger skal omfatte kemikaliets identitet og struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af andre in vitro- eller in vivo-toksicitetstest af kemikaliet, toksikologiske data om strukturelt beslægtede stoffer, samt stoffets forventede anvendelse(r). Disse oplysninger er nødvendige for til alle parters tilfredshed at godtgøre, at testen har afgørende betydning for beskyttelsen af menneskers sundhed, og vil desuden være nyttige ved valg af passende startdosis.

PRINCIP FOR TESTEN

5. Testkemikaliet indgives til dyr under drægtighed og laktation. Moderdyr testes for at vurdere virkningerne hos drægtige og diegivende hunner og kan også give komparativ information (moderdyr kontra afkom). Afkom udvælges vilkårligt fra kuld med henblik på en vurdering af neurotoksiciteten. Vurderingen består af observationer for at afsløre større neurologiske og adfærdsmæssige abnormiteter, bl.a. vurdering af fysisk udvikling, adfærdsudvikling, motorisk aktivitet, motoriske og sensoriske funktioner samt indlæring og hukommelse og vurdering af hjernevægt og neuropatologi under postnatal udvikling og voksenliv.

6. Når testmetoden gennemføres som en særskilt undersøgelse, kan der anvendes yderligere tilgængelige dyr i hver gruppe til særlige neuroadfærdsmæssige, neuropatologiske, neurokemiske eller elektrofysiologiske procedurer, der kan supplere de data, der fås fra undersøgelser, som anbefales for denne testmetode (16)(19)(20)(21). De supplerende procedurer kan være særligt nyttige, når empiriske observationer, forventede virkninger eller virkningsmekanisme/virkemåde peger på neurotoksicitet af en bestemt art. Disse supplerende procedurer kan anvendes hos både moderdyr og unger. Endvidere kan ex vivo- eller in vitro-procedurer også følges, så længe disse procedurer ikke ændrer in vivo-procedurernes integritet.

FORBEREDELSER TIL TESTEN

Valg af dyreart

7. Den foretrukne dyreart er rotten, men andre arter kan bruges, når det er hensigtsmæssigt. Det skal dog bemærkes, at det antal drægtighedsdage og dage efter fødslen, der er anført i denne testmetode, gælder specifikt for de hyppigst anvendte rottestammer, og der bør vælges sammenlignelige dage, hvis der bruges en anden art eller en usædvanlig stamme. Anvendes der en anden art, skal dette begrundes med toksikologiske, farmakokinetiske og/eller andre data. I begrundelsen anføres, om der findes artsspecifikke postnatale neuroadfærdsmæssige og neuropatologiske vurderinger. Hvis en tidligere test har givet anledning til bekymringer, bør den art/stamme, som blev anvendt, gennemgås. På grund af forskellige rottestammers forskellige ydeevneegenskaber skal der foreligge dokumentation for, at den valgte stamme har tilstrækkelig fertilitet og modtagelighed. Andre arters pålidelighed og følsomhed i forbindelse med detektion af udviklingsneurotoksicitet dokumenteres.

Miljøbetingelser og fodring

8. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke. Det er også muligt at vende lyscyklussen forud for parring og i undersøgelsens løbetid for at foretage vurderinger af funktionelle og adfærdsmæssige endepunkter i mørke perioder (under rødt lys), dvs. i den tid dyrene er normalt aktive (22). Alle ændringer i lys-mørkecyklussen bør omfatte tilstrækkelig tid til akklimatisering, så dyrene kan tilpasse sig den nye cyklus. Der kan anvendes normalt laboratoriefoder med ubegrænset forsyning af drikkevand. Arten af foder og vand rapporteres, og begge dele analyseres for forurenende stoffer.

9. Dyrene kan anbringes individuelt eller i bure i små grupper af samme køn. Parring bør finde sted i bure, der er egnede til formålet. Efter tegn på kopulation eller senest på drægtighedsperiodens dag 15 anbringes parrede hunner hver for sig i fødebure eller yngelbure. Burene skal anbringes således, at mulige virkninger som følge af burenes placering minimeres. Parrede hunner skal forsynes med egnet og nærmere bestemt redemateriale, når fødselstidspunktet nærmer sig. Det er velkendt, at uhensigtsmæssig behandling eller stress i drægtighedsperioden kan medføre negative resultater, herunder prænatalt tab og forandringer i prænatal og postnatal udvikling. For at sikre mod prænatalt tab som følge af ikkebehandlingsrelaterede faktorer skal drægtige dyr håndteres med omhu, og stress forårsaget af ydre faktorer som støj skal undgås.

Forberedelse af dyrene

10. Der anvendes sunde dyr, som er tilvænnet laboratorieforholdene, og som ikke tidligere har været anvendt til eksperimenter, medmindre undersøgelsen indgår i en anden undersøgelse (se pkt. 3). Dyrene beskrives med hensyn til stamme, kilde, køn, vægt og alder. Hvert dyr tildeles og mærkes med sit eget identifikationsnummer. Dyrene i alle testgrupper skal så vidt muligt være af ensartet vægt og alder og skal ligge inden for normalområdet for den art eller stamme, der undersøges. På hvert dosisniveau anvendes unge voksne hundyr, som ikke tidligere har født. Det bør sikres, at søskendedyr ikke parres. Dag 0 i drægtighedsperioden (GD 0) er den dag, hvor der observeres en vaginal prop og/eller sperma. Der bør gives tilstrækkelig tid til akklimatisering (f.eks. 2-3 dage) ved køb af drægtige dyr fra en leverandør. Parrede hunner fordeles uden skævhed mellem kontrol- og behandlingsgrupperne og fordeles så vidt muligt ligeligt mellem grupperne (f.eks. anbefales en stratificeret vilkårlig procedure for at sikre en jævn fordeling mellem alle grupper f.eks. baseret på kropsvægt). Hunner, som insemineres af samme han, fordeles jævnt mellem grupperne.

FREMGANGSMÅDE

Dyrenes antal og køn

11. I hver test- og kontrolgruppe skal der være et tilstrækkeligt antal drægtige hunner, som kan eksponeres for testkemikaliet, for at sikre, at der produceres et passende antal unger med henblik på vurdering af neurotoksiciteten. I alt 20 kuld anbefales på hvert dosisniveau. Doseringsdesign med gentagne eller forskudte grupper er tilladt, hvis det samlede antal kuld pr. gruppe opnås, og der anvendes passende statistiske modeller til forklaring af gentagelser.

12. På eller før dag 4 efter fødslen (PND 4) (dagen for fødslen er PND 0) skal størrelsen på hvert kuld tilpasses ved at fjerne ekstra unger ved vilkårlig udvælgelse for at få en ensartet kuldstørrelse for alle kuld (23). Kuldstørrelsen bør ikke overstige den gennemsnitlige kuldstørrelse for den anvendte stamme af gnavere (8-12). Kuldet skal så vidt muligt have lige mange han- og hununger. Selektiv fjernelse af unger, f.eks. baseret på kropsvægt, er ikke hensigtsmæssigt. Efter standardiseringen af kuld (aflivning) og før den videre test af funktionelle endepunkter skal de enkelte unger, der skal testes før og efter fravænning, mærkes individuelt efter en egnet human metode til identificering af unger (f.eks. 24).

Fordeling af dyr til funktionelle og adfærdsmæssige test, hjernevejning og neuropatologiske vurderinger

13. Testmetoden giver mulighed for forskellige tilgange til fordeling af dyr eksponeret in utero og gennem laktation til funktionelle og adfærdsmæssige test, kønsmodning, bestemmelse af hjernevægt og neuropatologisk vurdering (25). Andre test af neuroadfærdsfunktion (f.eks. social adfærd), neurokemiske eller neuropatologiske undersøgelser kan tilføjes i det enkelte tilfælde, så længe integriteten af de oprindelige nødvendige test ikke skades.

14. Ungerne udvælges fra hver dosisgruppe og fordeles til endepunktsvurderinger på eller efter PND 4. Ungerne bør udvælges, således at begge køn fra hvert kuld i hver dosisgruppe så vidt muligt bliver ligeligt repræsenteret i alle test. Til test af motorisk aktivitet bør det samme par han- og hununger testes i alle aldersklasser før fravænning (se pkt. 35). Til alle andre test kan de samme eller særskilte par han- og hundyr fordeles til forskellige adfærdstest. Det kan være nødvendigt at fordele forskellige unger til kognitive funktionstest for fravænnede i modsætning til testen for voksne for at undgå, at disse målinger påvirkes af virkningerne af alder og forudgående træning (26)(27). Ved fravænning (PND 21) kan unger, der ikke udvælges til test, aflives humant. Evt. ændringer i fordelingerne af unger rapporteres. Den statistiske måleenhed er kuldet (eller moderdyret) og ikke ungen.

15. Der er forskellige måder at fordele unger på til eksperimenter før og efter fravænning, kognitive test, patologiske undersøgelser osv. (se figur 1 vedrørende generelt design og tillæg 1 for eksempler på fordeling). Det anbefalede minimumsantal dyr i hver dosisgruppe for undersøgelser før og efter fravænning er følgende:

Kliniske observationer og kropsvægt Alle dyr Detaljerede kliniske observationer 20/køn (1/køn/kuld) Hjernevægt (efter fiksering) PND 11-22 10/køn (1/kuld) Hjernevægt (ufikseret) ~ PND 70 10/køn (1/kuld) Neuropatologi (immersions- eller perfusionsfiksering) PND 11-22 10/køn (1/kuld) Neuropatologi (perfusionsfiksering) PND ~70 10/køn (1/kuld) Kønsmodning 20/køn (1/køn/kuld) Øvrige udviklingsmæssige kendetegn (valgfrit) Alle dyr Adfærdsudvikling 20/køn (1/køn/kuld) Motorisk aktivitet 20/køn (1/køn/kuld) Motorisk og sensorisk funktion 20/køn (1/køn/kuld) Indlæring og hukommelse 10/køn (1) (1/kuld)

Dosering

16. Der anvendes mindst tre dosisstørrelser og en sideløbende kontrol. Dosisstørrelserne vælges med sådanne intervaller, at der opnås en gradueret toksisk effekt. Medmindre kemikaliets fysisk-kemiske eller biologiske egenskaber sætter grænser for doseringen, vælges det højeste doseringsniveau således, at det har en vis toksisk effekt på moderdyret (f.eks. kliniske tegn, vægttab (højst 10 %) og/eller evidens for en dosisbegrænsende toksicitet i et målorgan). Den høje dosis kan begrænses til 1 000 mg/kg/dag kropsvægt med visse undtagelser. F.eks. kan den forventede humane eksponering foranledige, at der benyttes en højere dosis. Alternativt foretages pilotundersøgelser eller foreløbige »range-finding«-undersøgelser for at bestemme de højeste doser, der skal anvendes for at give en minimal grad af toksicitet hos moderdyret. Hvis testkemikaliet har vist sig at være udviklingstoksisk enten i en standardudviklingstoksicitetsundersøgelse eller i en pilotundersøgelse, bør den højeste dosisstørrelse være den maksimale dosis, der ikke påfører for stærk toksicitet hos afkommet eller in utero- eller neonatal død eller deformationer, der er tilstrækkeligt alvorlige til at udelukke en meningsfuld vurdering af neurotoksiciteten. Den laveste dosering må hverken medføre tegn på maternel toksicitet eller udviklingstoksicitet, herunder neurotoksicitet. Der vælges faldende dosisstørrelse med henblik på at påvise en evt. dosisrelateret respons, og det niveau, som ikke medfører observeret skadelig virkning (NOAEL), eller doser nær detektionsgrænsen, således at der kan bestemmes en benchmarkdosis. For at fastlægge den aftagende række dosisstørrelser svarer de optimale intervaller ofte til en faktor to til fire, og i mange tilfælde må tilføjelse af en fjerde behandlingsgruppe ofte foretrækkes frem for meget store intervaller (f.eks. større end en faktor 10) mellem dosisstørrelserne.

17. Doseringen vælges under hensyntagen til alle foreliggende toksicitetsdata samt supplerende oplysninger om metabolisme og toksikokinetik af testkemikalie eller beslægtede stoffer. Sådanne oplysninger kan desuden være med til at godtgøre, at den valgte dosering er hensigtsmæssig. Direkte dosering til unger bør overvejes på grundlag af eksponering og farmakokinetiske oplysninger (28)(29). Fordele og ulemper overvejes omhyggeligt, før der foretages direkte doseringsundersøgelser (30).

18. Den sideløbende kontrolgruppe skal være ubehandlet eller behandles med vehikel, hvis et sådant anvendes til indgift af testkemikaliet. Alle dyr skal normalt have samme mængde af enten testkemikalie eller vehikel på grundlag af kropsvægt. Anvendes et vehikel eller andet tilsætningsstof for at lette doseringen, tages følgende egenskaber i betragtning: indvirkningen på testkemikaliets absorption, distribution, metabolisme og retention af testkemikaliet; evt. indvirkning på testkemikaliets kemiske egenskaber, som kan ændre dets toksiske egenskaber, samt indvirkningen på dyrenes foder- og vandindtagelse eller ernæringstilstand. Vehiklet må ikke skabe virkninger, der vanskeliggør fortolkningen af undersøgelsen, og det må heller ikke være neuroadfærdsmæssigt toksisk eller påvirke reproduktion eller udvikling. For nye vehikler skal der inkluderes en ubehandlet kontrolgruppe ud over vehikelkontrolgruppen. Dyrene i kontrolgruppen/-grupperne behandles nøjagtigt som dyrene i testgruppen/-grupperne.

Indgift af doser

19. Testkemikalie eller vehikel indgives ad den vej, som er mest relevant i forhold til human eksponering, og på grundlag af de foreliggende oplysninger om metabolisme og fordeling i forsøgsdyrene. Indgiftsvejen er normalt oral (f.eks. gennem sonde, i føden eller i drikkevandet), men andre veje (f.eks. gennem huden eller ved inhalation) kan benyttes alt efter kendetegn og forventede eller kendte eksponeringsveje for mennesker (OECD's vejledning 43 (8) indeholder yderligere oplysninger). Den valgte indgiftsvej skal begrundes. Testkemikaliet indgives på omtrent samme tidspunkt hver dag.

20. Dosis til det enkelte dyr baseres normalt på den seneste bestemmelse af dyrets kropsvægt. I den sidste tredjedel af drægtighedsperioden må justering af doseringen dog ske med varsomhed. Konstateres der kraftig toksisk effekt hos de behandlede moderdyr, skal disse aflives på en human måde.

21. Testkemikaliet eller -vehiklet indgives som minimum dagligt til parrede hunner fra implantationstidspunktet (GD 6) og i hele laktationsperioden (PND 21), så ungerne eksponeres for testkemikaliet under den præ- og postnatale neurologiske udvikling. Den alder, hvor doseringen starter, og doseringens varighed og frekvens kan justeres, hvis der er dokumentation for et forsøgsdesign, som er mere relevant i forhold til menneskers eksponering. Doseringsvarigheden justeres til andre arter for at sikre eksponering i alle tidlige perioder af hjerneudviklingen (dvs. svarende til prænatal og tidlig postnatal hjernevækst hos mennesker). Dosering kan begynde fra drægtighedsperiodens begyndelse (GD 0), om end man skal være opmærksom på risikoen for, at testkemikaliet forårsager letal virkning før implantation. Ved at indgive kemikaliet på GD 6 kan denne risiko undgås, men udviklingsstadierne mellem GD 0 og 6 vil så ikke blive behandlet. Køber et laboratorium tidsparrede dyr, er det upraktisk at begynde doseringen på GD 0, og i så fald vil GD 6 være en god begyndelsesdag. Testlaboratoriet fastsætter doseringen efter relevant information om testkemikaliets virkninger, tidligere erfaringer og logistiske hensyn. Dette kan betyde, at doseringen udvides ud over fravænningen. Dosering bør ikke forekomme på dagen for fødslen, hvis dyret ikke er helt færdig med at føde sit afkom. Normalt antages det, at ungernes eksponering sker gennem modermælken. Dog bør direkte dosering af unger overvejes i tilfælde, hvor der ikke er tegn på, at ungerne eksponeres kontinuerligt. Tegn på kontinuerlig eksponering kan hentes fra f.eks. farmakokinetiske oplysninger, toksicitet hos afkommet eller ændringer i biomarkører (28).

OBSERVATIONER

Observationer på moderdyr

22. Alle moderdyr observeres nøje mindst én gang dagligt med hensyn til deres almindelige helbredstilstand, herunder morbiditet og mortalitet

23. I behandlings- og observationsperioder foretages detaljerede kliniske observationer jævnligt (mindst to gange ved dosering i drægtighedsperioden og to gange ved dosering i laktationsperioden), idet der anvendes mindst 10 moderdyr pr. dosisniveau. Dyrene observeres uden for deres eget bur af uddannede teknikere, der ikke kender til dyrenes behandling, og efter standardiserede procedurer for at minimere dyrenes stress og forudindtagethed hos observatøren og maksimere pålideligheden mellem observatører. Hvor det er muligt, anbefales det, at observationerne i en given undersøgelse foretages af den samme tekniker.

24. Tilstedeværelsen af observerede tegn registreres. Også størrelsesordenen af de observerede tegn registreres, når det er muligt. De kliniske observationer omfatter, men er ikke begrænset til, ændringer i hud, pels, øjne, slimhinder, forekomst af sekretion og autonom aktivitet (f.eks. tåreflåd, piloerektion, pupilstørrelse, usædvanligt respirationsmønster og/eller mundrespiration og evt. symptomer vedrørende vandladning eller defækation).

25. Evt. usædvanlig respons med hensyn til kropsstilling, aktivitetsniveau (f.eks. nedsat eller øget udforskning af »open field«) og koordinering af bevægelser registreres ligeledes. Ændringer i gangen (f.eks. vralten, ataksi), kropsstilling (f.eks. pukkelrygget) og reaktion på håndtering samt optræden af kloniske eller toniske bevægelser, kramper eller tremor, stereotypier (f.eks. overdreven pleje af pels, usædvanlige bevægelser med hovedet, gentagne cirkelbevægelser) eller bizar adfærd (bidning eller overdreven slikning, selvmutilering, baglæns gang, vokalisation) eller aggression protokolleres.

26. Alle tegn på toksicitet registreres, herunder dato og klokkeslæt for indtræden af unormal adfærd samt grad og varighed.

27. Dyrene vejes på doseringstidspunktet mindst én gang om ugen under hele undersøgelsen, på eller tæt på fødselstidspunktet og på PND 21 (fravænning). I forsøg med indgift gennem sonde vejes moderdyr mindst to gange om ugen. Doser justeres på tidspunktet for bestemmelse af hver kropsvægt, som det er hensigtsmæssigt. Fødeindtagelse måles én gang om ugen som minimum under drægtighed og laktation. Vandindtagelse måles mindst én gang om ugen, hvis eksponering sker gennem vandforsyningen.

Observationer af afkom

28. Alt afkom observeres nøje mindst én gang dagligt for tegn på toksicitet samt for morbiditet og mortalitet.

29. I behandlings- og observationsperioder foretages mere detaljerede kliniske observationer af afkommet. Afkommet (mindst én unge/køn/kuld) observeres af uddannede teknikere, der ikke kender til dyrenes behandling, og efter standardiserede procedurer for at minimere forudindtagethed hos observatøren og maksimere pålideligheden mellem observatører. Hvor det er muligt, anbefales det, at observationerne foretages af den samme tekniker. Som minimum overvåges endepunkterne, jf. pkt. 24 og 25, med hensyn til det udviklingstrin, som observeres, hvis det er relevant.

30. Alle tegn på toksicitet hos afkommet registreres, herunder dato og klokkeslæt for indtræden af unormal adfærd samt grad og varighed.

Fysiske og udviklingsmæssige kendetegn

31. Ændringer i udviklingskendetegn før fravænningen (f.eks. åbning af ydre ører og øjne, frembrud af fortand) hænger tæt sammen med kropsvægt (30)(31). Kropsvægt kan være den bedste indikator for fysisk udvikling. Måling af udviklingsmæssige kendetegn anbefales derfor kun, når der på forhånd er tegn på, at disse endepunkter vil give ekstra oplysninger. Tidspunkter for vurdering af disse parametre er anført i tabel 1. Alt efter de forventede virkninger og resultaterne af de indledende målinger kan det være tilrådeligt at tilføje ekstra tidspunkter eller foretage målingerne på andre udviklingstrin.

32. Det anbefales at benytte postkoital alder i stedet for postnatal alder ved vurdering af fysisk udvikling (33). Hvis unger testes på fravænningsdagen, anbefales det, at denne test udføres før den faktiske fravænning for at undgå en forvirrende effekt fremkaldt af stress i forbindelse med fravænningen. Endvidere bør test af unger efter fravænning ikke ske i de første to dage efter fravænningen.

Tabel 1

Tidsplan for vurdering af fysiske og udviklingsmæssige kendetegn samt funktionelle/adfærdsmæssige endepunkter (2)

Aldersperioder Endepunkter Før fravænning (3) Unge (3) Unge voksne (3) Fysiske og udviklingsmæssige kendetegn Kropsvægt og kliniske observationer én gang om ugen (4) mindst hver anden uge mindst hver anden uge Hjernevægt PND 22 (5) ved afslutning Neuropatologi PND 22 (5) ved afslutning Kønsmodning — hvis det er relevant — Øvrige udviklingsmæssige kendetegn (6) hvis det er relevant — — Funktionelle/adfærdsmæssige kendetegn Adfærdsudvikling Mindst to målinger Motorisk aktivitet (herunder tilvænning) 1-3 gange (7) — én gang Motorisk og sensorisk funktion — én gang én gang Indlæring og hukommelse — én gang én gang

33. Levende unger tælles og kønsbestemmes, f.eks. ved visuel kontrol eller måling af den anogenitale afstand (34)(35), og hver unge i et kuld vejes individuelt ved fødslen eller snarest efter, mindst én gang om ugen under laktation og herefter mindst én gang hver anden uge. Når kønsmodningen er vurderet, bestemmes dyrets alder og kropsvægt på tidspunktet for åbning af vagina (36) og separation af præputium (37) for mindst én han og en hun pr. kuld.

Adfærdsudvikling

34. Udvikling af udvalgte adfærdsformer måles hos mindst én unge/køn/kuld i den relevante aldersperiode, idet de samme unger anvendes på alle testdage til alle vurderede adfærdsformer. Målingsdagene fordeles jævnt over perioden for at definere enten den normale eller behandlingsrelaterede ændring i udviklingen af den pågældende adfærd (38). Følgende er eksempler på adfærdsformer, hvis ontogenese kan vurderes: opretningsrefleks, negativ geotaxis og motorisk aktivitet (38)(39)(40).

Motorisk aktivitet

35. Motorisk aktivitet overvåges (41)(42)(43)(44)(45) inden fravænningen og i den voksne periode. Med hensyn til test på fravænningstidspunktet henvises til pkt. 32. Testsessionen skal være lang nok til at påvise ubehandlede kontroldyrs tilvænning i løbet af sessionen. Anvendelse af motorisk aktivitet til at vurdere individets adfærdsudvikling anbefales kraftigt. Hvis testen bruges som en test af adfærdsudvikling, anvendes de samme dyr til alle testsessioner før afvænning. Testen skal ske tilstrækkeligt hyppigt til at vurdere udviklingen i tilvænningen i løbet af sessionen (44). Dette kan kræve tre eller flere tidsperioder forud for og inklusive fravænningsdagen (f.eks. PND 13, 17, 21). Test af de samme dyr eller dyr fra samme kuld skal også ske i voksenalderen, tæt på undersøgelsens afslutning (f.eks. PND 60-70). Der kan om nødvendigt foretages test på supplerende dage. Motorisk aktivitet overvåges af et automatisk aktivitetsregistrerende apparat, som skal kunne afsløre både stigninger og fald i aktiviteten (dvs. at referenceaktiviteten som målt af apparatet ikke må være så lav, at fald ikke afsløres, og heller ikke så høj, at aktivitetsstigninger ikke registreres). Hvert apparat testes efter standardprocedurer for så vidt muligt at sikre operationens pålidelighed på tværs af apparater og dage. Så vidt muligt skal behandlingsgrupperne være ligeligt fordelt på tværs af apparaterne. Hvert dyr testes individuelt. Behandlingsgrupper udlignes på tværs af testgange for at undgå sammenblanding af cirkadiske aktivitetsrytmer. Man skal bestræbe sig på at sikre, at variationer i testbetingelserne er minimale og ikke systematisk relateres til behandlingen. Blandt de variabler, der kan påvirke mange adfærdsmålinger, bl.a. motorisk aktivitet, er lydniveau, testburets størrelse og form, temperatur, relativ luftfugtighed, lysforhold, lugte, brug af eget bur eller nyt testbur og forstyrrelser fra omgivelserne.

Motorisk og sensorisk funktion

36. Motorisk og sensorisk funktion undersøges i detaljer mindst én gang for modningsperioden og én gang i den unge voksenperiode (f.eks. PND 60-70). Med hensyn til test på fravænningstidspunktet henvises til pkt. 32. Der skal foretages tilstrækkeligt mange forsøg til at sikre en passende kvantitativ prøvetagning af sensoriske modaliteter (f.eks. somatosensoriske, vestibulære) og motoriske funktioner (f.eks. styrke, koordination). Nogle få eksempler på test for motorisk og sensorisk funktion er træk/tryk-respons (46), opretningsrefleks (47)(48), auditiv startle tilvænning (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) og evokerede potentialer (55).

Indlærings- og hukommelsesforsøg

37. En associativ indlærings- og hukommelsestest gennemføres efter fravænning (f.eks. 25 ± 2 dage) og for unge voksne (PND 60 og derover). Med hensyn til forsøg på fravænningstidspunktet henvises til pkt. 32. Den samme eller (en) særskilt(e) test kan benyttes på disse to udviklingstrin. Der er mulighed for en vis fleksibilitet i valget af test for indlæring og hukommelse hos fravænnede og voksne rotter. Testen/-ene designes dog således, at de opfylder to kriterier. For det første vurderes indlæringen enten som en ændring på tværs af flere gentagne indlæringstest eller -sessioner eller i test, der omfatter et enkelt forsøg, med henvisning til en betingelse, som sikrer kontrol med ikkeassociative virkninger af træningseksperimentet. For det andet skal testen/-ene omfatte en vis måling af hukommelsen (kort- eller langtids-) ud over oprindelig indlæring (færdighed), men denne hukommelsesmåling kan ikke rapporteres, da der mangler en færdighedsmåling, der fås fra samme test. Hvis indlærings- og hukommelsestesten/-ene viser en virkning af testkemikaliet, kan det overvejes at foretage supplerende test for at udelukke alternative fortolkninger baseret på ændringer i sensorisk, motivationsmæssig og/eller motorisk kapacitet. Ud over ovenstående to kriterier anbefales det, at indlærings- og hukommelsestesten vælges på grundlag af sin påviste følsomhed over for den undersøgte kemikalieklasse, hvis disse oplysninger er tilgængelige i litteraturen. I mangel af sådanne oplysninger omfatter eksempler på test, der kan foretages for at opfylde ovenstående kriterier: passiv undgåelse (43)(56)(57), delayed-matching-to-position for den voksne rotte (58) og for den spæde rotte (59), olfaktorisk konditionering (43)(60), Morris' vandlabyrint (61)(62)(63), Biel- eller Cincinnati-labyrinten (64)(65), radialarmslabyrint (66), T-labyrint (43) og tilegnelse og fastholdelse af »schedule-controlled« adfærd (26)(67)(68). Supplerende test beskrives i litteraturen for fravænnede (26)(27) og voksne rotter (19)(20).

Obduktion

38. Moderdyr kan aflives efter fravænning af afkommet.

39. Den neuropatologiske vurdering af afkommet sker ved hjælp af væv fra dyr, der er aflivet på en human måde på PND 22 eller på et tidligere tidspunkt mellem PND 11 og PND 22 samt ved testens afslutning. For afkom aflivet efter PND 22 vurderes hjernevæv. For dyr aflivet ved testens afslutning vurderes væv fra både centralnervesystemet (CNS) og det perifere nervesystem (PNS). Dyr aflivet på PND 22 eller tidligere kan fikseres ved enten immersion eller perfusion. Dyr aflivet ved testens afslutning fikseres ved perfusion. I forbindelse med alle aspekter af præpareringen af vævsprøver, fra perfusion af dyrene over dissektion af vævsprøver, vævsbehandling og farvning på objektglas følges et afbalanceret design, således at hver batch indeholder repræsentative prøver fra hver dosisgruppe. OECD's vejledning nr. 20 (9) indeholder supplerende vejledning om neuropatologiske undersøgelser. Se endvidere (103).

Behandling af vævsprøver

40. Alle større abnormiteter, der er synlige på obduktionstidspunktet noteres. Udtagne vævsprøver skal repræsentere alle større dele af nervesystemet. Vævsprøverne præserveres i et egnet fiksativ og behandles ifølge standardiserede offentliggjorte histologiske protokoller (69)(70)(71) (103). Paraffinfiksering er acceptabelt for væv fra CNS og PNS, men osmium ved postfiksering sammen med epoxyfiksering kan være hensigtsmæssigt, når der kræves en højere adskillelsesgrad (f.eks. for perifere nerver ved mistanke om perifer neuropati og/eller til morfometrisk analyse af perifere nerver). Hjernevæv udtaget til morfometrisk analyse fikseres i egnede medier ved alle dosisniveauer samtidig for at undgå skrumpning, der kan optræde i forbindelse med langvarig opbevaring i fiksativ (6).

Neuropatologisk undersøgelse

41. Formålet med den kvalitative undersøgelse er:

i) at identificere områder i nervesystemet, der viser tegn på neuropatologiske forandringer

ii) at identificere typer af neuropatologiske forandringer, der følger af eksponering for testkemikaliet

iii) at bestemme de neuropatologiske forandringers sværhedsgrader.

Repræsentative histologiske snit af vævsprøver undersøges i mikroskop af en uddannet patolog for tegn på neuropatologiske forandringer. Alle neuropatologiske forandringer tildeles en subjektiv sværhedsgrad. En hematoxylin-eosin-farvning kan være tilstrækkelig til at vurdere hjernesnit af dyr, der er aflivet humant på PND 22 eller tidligere. En myelinfarvning (f.eks. luxol fast blue/cresyl violet) og en sølvfarvning (f.eks. Bielschowskys eller Bodians farvestoffer) anbefales til snit af CNS- og PNS-væv fra dyr aflivet ved testens afslutning. Med forbehold for patologens faglige vurdering og typen af observerede forandringer kan andre farver findes egnede til at identificere og karakterisere særlige typer af forandringer (f.eks. gliafibrillært surt protein (GFAP) eller lektin histokemi til at vurdere glia- og mikrogliaforandringer (72), fluoro-jade til at afsløre nekrose (73)(74) eller sølvfarve specifikt til neural degeneration (75)).

42. En morfometrisk (kvantitativ) vurdering udføres, da disse data kan bidrage til at detektere en behandlingsrelateret virkning og er værdifulde i fortolkningen af behandlingsrelaterede forskelle i hjernevægt eller morfologi (76)(77). Nervevæv udtages og præpareres med henblik på morfometrisk vurdering. Morfometriske vurderinger kan omfatte f.eks. lineære målinger eller arealmålinger af særlige hjerneområder (78). Lineære målinger eller arealmålinger kræver brug af homologe snit, der er omhyggeligt udvalgt på grundlag af pålidelige mikroskopiske kendetegn (6). Stereologi kan anvendes til at identificere behandlingsrelaterede virkninger på parametre såsom volumen eller celleantal til bestemte neuroanatomiske områder (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. Hjernerne undersøges for evt. tegn på behandlingsrelaterede neuropatologiske forandringer, og der udtages passende prøver fra alle større dele af hjernen (f.eks. bulbus olfactorius, cortex cerebralis, hippocampus, basalganglier, thalamus, hypothalamus, midterhjernen (tectum, tegmentum og pedunculus cerebri), pons, medulla oblongata, cerebellum) for at sikre en grundig undersøgelse. Det er vigtigt, at snit for alle dyr tages i samme plan. Hos voksne, der er humant aflivet ved undersøgelsens afslutning, udtages repræsentative snitprøver af rygmarven og PNS. De undersøgte områder skal omfatte øjet med nervus opticus og retina, rygmarven med intumescentia cervicalis og lumbalis, fibre fra de dorsale og ventrale rødder, den proksimale del af nervus sciaticus, den proksimale del af nervus tibialis (ved knæet) og lægmuskelgrenene af nervus tibialis. Der skal være både tværsnit og længdesnit af rygmarv og perifere nerver.

44. Den neuropatologiske evaluering skal omfatte en undersøgelse for tegn på udviklingsskader på nervesystemet (6)(85)(86)(87)(88)(89) ud over celleforandringer (f.eks. neuronal vakuolation, degeneration, nekrose) og vævsforandringer (f.eks. gliosis, leukocytinfiltration, cystedannelse). I den forbindelse er det vigtigt at skelne behandlingsrelaterede virkninger fra normale udviklingshændelser, som man ved, opstår på et udviklingstrin svarende til aflivningstidspunktet (90). Eksempler på væsentlige forandringer, der peger på udviklingsskade, omfatter, men er ikke begrænset til:

— forandringer i den makroskopisk synlige størrelse eller form af bulbus olfactorius, cerebrum eller cerebellum

— forandringer i forskellige hjerneområders relative størrelse, bl.a. fald eller stigninger i områdestørrelse som følge af tab eller persistens af normalt transiente cellepopulationer eller axonale projektioner (f.eks. eksternt germinallag på cerebellum, corpus callosum)

— forandringer i proliferation, migration og differentiation, som viser sig ved områder med stærk apoptose eller nekrose, klynger eller spredte populationer af ektopiske, desorienterede eller misdannede neuroner eller forandringer i forskellige cortikale strukturlags relative størrelse

— forandringer i myeliniseringsmønstre, herunder en samlet størrelsesreduktion eller ændret farvning af myelinerede strukturer

— tegn på hydrocephalus, især udvidelse af ventrikler, stenosis af aqueductus cerebri og tyndere cerebralhemisfærer.

Analyse af neuropatologiske forandringers dosis-responssammenhæng

45. Følgende trinvise procedure anbefales til kvalitative og kvantitative neuropatologiske analyser. Først sammenlignes snit fra højdosisgrupper med snit fra kontrolgruppen. Hvis der ikke findes tegn på neuropatologiske forandringer i dyrene fra højdosisgruppen, kræves der ingen yderligere analyse. Findes der tegn på neuropatologiske forandringer i højdosisgruppen, undersøges dyr fra mellem- og lavdosisgrupperne. Hvis højdosisgruppen afsluttes på grund af død eller anden konfunderet toksicitet, analyseres høj- og mellemdosisgrupperne for neuropatologiske forandringer. Er der tegn på neurotoksicitet i lavere dosisgrupper, udføres en neuropatologisk analyse i de pågældende grupper. Såfremt der findes behandlingsrelaterede neuropatologiske forandringer ved den kvalitative og kvantitative undersøgelse, bestemmes dosisafhængigheden for forekomst, frekvens og læsionernes eller de morfometriske forandringers sværhedsgrad på grundlag af en vurdering af alle dyr fra alle dosisgrupper. Alle hjerneområder, der udviser tegn på neuropatologisk forandring medtages i denne vurdering. For hver læsionstype beskrives de kendetegn, som anvendes til at definere hver sværhedsgrad, med angivelse af de symptomer, der er benyttet til at differentiere hver grad. Frekvensen af hver læsionstype og sværhedsgraden heraf registreres, og der udføres en statistisk analyse for at evaluere arten af en dosis-responssammenhæng. Det anbefales at anvende kodede objektglas (91).

DATA OG RAPPORTERING

Data

46. Data rapporteres individuelt og opsummeres i tabelform, der for hver testgruppe viser typer af forandringer og antal moderdyr, afkom efter køn samt kuld og med angivelse af hver type forandring. Er der foretaget direkte postnatal eksponering af afkom, rapporteres eksponeringsvej, -varighed og -periode.

Evaluering og fortolkning af resultater

47. En udviklingsneurotoksicitetsundersøgelse skal indeholde oplysninger om virkningerne af gentagen eksponering for et kemikalie i in utero- og den tidlige postnatale udvikling. Da vægten ligger på endepunkter for både generel toksicitet og udviklingsneurotoksicitet, vil resultaterne af undersøgelsen gøre det muligt at skelne mellem neuroudviklingsmæssige virkninger, som opstår uden generel maternel toksicitet, og dem, der kun kommer til udtryk på niveauer, som også er toksiske for moderdyret. På grund af det komplekse samspil mellem undersøgelsesdesign, statistisk analyse og dataenes biologiske signifikans, kræver en adækvat fortolkning af udviklingsneurotoksicitetsdata en ekspertvurdering (107)(109). Ved fortolkning af testresultater følges en »weight-of-evidence«-tilgang (20)(92)(93)(94). Evt. mønstre i adfærdsmæssige eller morfologiske resultater samt tegn på dosisrespons diskuteres. Data fra alle undersøgelser af relevans for evalueringen af udviklingsneurotoksicitet, bl.a. humanepidemiologiske undersøgelser eller caserapporter og eksperimentelle dyreunderstudier (f.eks. toksikokinetiske data, oplysninger om struktur/aktivitet, data fra andre toksicitetsundersøgelser) medtages i denne karakterisering. Dette omfatter forholdet mellem doser af testkemikaliet og tilstedeværelse eller mangel, incidens og omfang af en evt. neurotoksisk virkning for hvert køn (20)(95).

48. Evalueringen af data skal indeholde en diskussion af både biologisk og statistisk signifikans. Statistisk analyse skal ses som et værktøj, der guider snarere end bestemmer fortolkningen af data. Manglende statistisk signifikans må ikke være det eneste rationale for at konkludere, at der mangler en behandlingsrelateret virkning, ligesom statistisk signifikans ikke må være den eneste begrundelse for at konkludere, at der foreligger en behandlingsrelateret virkning. For at sikre mod mulige falsk negative fund og de iboende vanskeligheder med at »bevise et negativt fund« skal tilgængelige positive og tidligere kontroldata diskuteres, især når der ikke er nogen behandlingsrelaterede virkninger (102)(106). Sandsynligheden for falsk positive fund diskuteres i lyset af den samlede statistiske evaluering af dataene (96). Evalueringen skal indeholde en evt. sammenhæng mellem observerede neuropatologiske og adfærdsmæssige forandringer.

49. Alle resultater analyseres ved hjælp af statistiske modeller, som egner sig til testens design (108). Valget af en parametrisk eller ikkeparametrisk analyse begrundes ved inddragelse af faktorer såsom dataenes art (transformerede eller ej) og fordelingen heraf samt den valgte statistiske analyses relative robusthed. Undersøgelsens formål og design skal være styrende for valget af statistiske analyser for at minimere type I-fejl (falsk positive) og type II-fejl (falsk negative) (96)(97)(104)(105). Udviklingsundersøgelser med arter, som føder flere unger på én gang, og hvor der testes mange unger pr. kuld, skal inkludere kuldet i den statistiske model for at sikre mod en oppustet type I-fejlhyppighed (98)(99)(100)(101). Den statistiske måleenhed er kuldet og ikke ungen. Forsøgene designes, så dyr fra samme kuld ikke behandles som uafhængige observationer. Et evt. endepunkt, som gentagne gange måles hos det samme individ, analyseres under anvendelse af statistiske modeller, der tager højde for, at målingerne ikke er uafhængige.

Testrapport

50. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

Testkemikaliet

— fysisk form og, når det er relevant, fysisk-kemiske egenskaber

— identifikationsdata, herunder kilde

— præparatets renhed og kendte og/eller forventede urenheder

Evt. vehikel

— begrundelse for valg af vehikel, hvis dette ikke er vand eller fysiologisk saltvand.

Forsøgsdyr

— den anvendte art og stamme samt begrundelse for anvendelse af andet end rotter

— leverandør af forsøgsdyr

— antal dyr samt deres køn og alder ved testens begyndelse

— oprindelse, miljøbetingelser, kost, vand osv.

— de enkelte dyrs vægt ved testens begyndelse.

Testbetingelser

— rationale for valg af dosisniveau

— rationale for doseringsvej og tidsperiode

— specifikationer af indgivne doser, herunder oplysninger om vehikel og det indgivne stofs volumen og fysiske form

— oplysninger om formuleringen af testkemikalie/fodertilberedning, opnået koncentration, tilberedningens stabilitet og homogenitet

— anvendt metode til entydig identifikation af moderdyr og afkom

— en detaljeret beskrivelse af de(n) randomiseringsprocedure(r), der er fulgt ved fordeling af moderdyr på behandlingsgrupper, udvælgelse af unger til aflivning og fordeling af unger til testgrupper

— oplysninger om indgift af testkemikaliet

— evt. omregning fra testkemikaliekoncentration (ppm) i foder/drikkevand eller inhalation til opnået dosis (mg/kg kropsvægt/dag)

— miljøbetingelser

— oplysninger om kvaliteten af foder og vand (f.eks. fra vandhanen, destilleret)

— datoer for undersøgelsens begyndelse og afslutning.

Observationer og testprocedurer

— en detaljeret beskrivelse af procedurer anvendt til at standardisere observationer og procedurer samt operationelle definitioner for bedømmelse af observationer

— en liste over alle anvendte testprocedurer og begrundelse for anvendelsen heraf

— oplysninger om de anvendte adfærdsmæssige/funktionelle, patologiske, neurokemiske eller elektrofysiologiske procedurer, herunder oplysninger og detaljer om automatiserede anordninger

— procedurer til kalibrering og sikring af anordningernes ækvivalens og afbalancering af behandlingsgrupper i testprocedurer

— en kort begrundelse for evt. beslutninger baseret på faglig vurdering.

Resultater (individuelle og resumé, herunder middeltal og varians, når det er relevant)

— antal dyr ved undersøgelsens begyndelse og antal ved undersøgelsens afslutning

— antal dyr og kuld anvendt til hver testmetode

— identifikationsnummer for hvert dyr og hvert kuld, det kom fra

— kuldstørrelse og gennemsnitsvægt ved fødslen fordelt på køn

— data om kropsvægt og kropsvægtændringer, herunder slutvægt, for moderdyr og afkom

— evt. data om føde- og vandindtagelse (f.eks. hvis testkemikaliet indgives i vand)

— data for toksiske reaktioner efter køn og dosisniveau, herunder tegn på toksicitet eller mortalitet, bl.a. evt. tidspunkt og dødsårsag

— de detaljerede kliniske observationers art, grad, varighed, startdato og klokkeslæt samt efterfølgende forløb

— scoreværdi for hvert udviklingskendetegn (vægt, kønsmodning og adfærdsudvikling) på hvert observationstidspunkt

— en detaljeret beskrivelse af alle adfærdsmæssige, funktionelle, neuropatologiske, neurokemiske og elektrofysiologiske fund efter køn, herunder både stigninger og fald i forhold til kontrolgrupper

— obduktionsfund

— hjernevægt

— evt. diagnoser udledt af neurologiske tegn og læsioner, herunder naturligt forekommende sygdomme eller tilstande

— billeder af eksemplariske fund

— »low-power«-billeder til at vurdere homologien af snit anvendt til morfometri

— data om absorption and metabolisme, herunder evt. supplerende data fra en separat toksikokinetisk undersøgelse

— statistisk behandling af resultater, herunder statistiske modeller anvendt til analyse af data og resultater, uanset om de var signifikante eller ej

— liste over forsøgsmedarbejdere, bl.a. uddannelse.

Diskussion af resultater

— oplysninger om dosisrespons fordelt på køn og gruppe

— evt. andre toksiske virkningers sammenhæng med en konklusion vedrørende testkemikaliets neurotoksiske potentiale fordelt på køn og gruppe

— evt. toksikokinetiske oplysningers indvirkninger på konklusionerne

— virkningernes ligheder med kendte neurotoksiske stoffer

— data, der støtter testmetodens pålidelighed og følsomhed (dvs. positive og tidligere kontroldata)

— evt. sammenhæng mellem neuropatologiske og funktionelle virkninger

— NOAEL eller benchmarkdosis for moderdyr og afkom fordelt på køn og gruppe.

Konklusioner

— en diskussion af den samlede fortolkning af data baseret på resultater, herunder en konklusion om, hvorvidt testkemikaliet forårsagede udviklingsneurotoksicitet og NOAEL.

LITTERATUR

1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. København, Danmark, 13.-14. juni 1995.

2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Tilgængelig på: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Tilgængelig på: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001) Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., USA, 23.-25. oktober 2000.

8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris, juli 2008. Tilgængelig på: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, september 2003. Tilgængelig på: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990). Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000). Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002). Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998). Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

14) Kapitel B.34 i dette bilag, Reproduktionstoksicitetsundersøgelse i én generation.

15) Kapitel B.35 i dette bilag, Reproduktionstoksicitetsundersøgelse i to generationer.

16) Kapitel B.43 i dette bilag, Neurotoksicitetsundersøgelse i gnavere.

17) Kapitel B.31 i dette bilag, Prænatal udviklingstoksicitetsundersøgelse.

18) Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. EUT L 276 af 20.10.2010, s. 33.

19) WHO (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Tilgængelig på: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

20) WHO (2001). Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Genève. Tilgængelig på: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995). Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997). Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997). The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977). Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989). Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979). Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987). Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

28) Zoetis, T., Walls, I. (2003). Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005). Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999). Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

31) ICH (1993). ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

32) Lochry, E.A. (1987). Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998). Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999). Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000). Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985). Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977). Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

38) Spear, L.P. (1990). Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975). Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

40) Adams, J. (1986). Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, s. 67-100.

41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979). Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

42) Robbins, T.W. (1977). A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, s. 37-82.

43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993). Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3′-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985). Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991). Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997). Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998). A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals. Physiol. Behav., 64:661-669.

48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977). A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

49) Davis, M. (1984). The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, s. 287-351

50) Koch, M. (1999). The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

51) Crofton, K.M. (1992). Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In TARGET Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, s. 181-211.

52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989). Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994). Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25-30.

54) Ison, J.R. (1984). Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437-445.

55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992). Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: TARGET Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. s. 125-145.

56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990). Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3′-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

57) Bammer, G. (1982). Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

58) Bushnell, P.J. (1988). Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989). Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984). Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

61) Morris, R. (1984). Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989). The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001). Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

64) Vorhees, C.V. (1987). Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

65) Vorhees, C.V. (1997). Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988). Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983). Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981). Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000). Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994). Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, s. 84-107.

71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002). Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996). Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000). Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001). Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994). Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Vralten-Besrenden, I.D.H., Ligander, M.M., Gundersen, H.J. (2005a). Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Vralten-Besrenden, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b). 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979). Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129-135.

79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998). Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998). Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993). Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

82) Schmitz, C. (1997). Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

83) West, M.J. (1999). Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005). Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813-831.

85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994). Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995). Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

87) Jensen KF, Catalano SM. (1998). Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3-41.

88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999). Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000). Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056-1060.

90) Friede, R. L. (1989). Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992). Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996). Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

93) US EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

94) US EPA (1996). Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

95) Miljøstyrelsen (1995). Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

97) Gad, S.C. (1989). Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 08:21-27.

98) Abby, H., Howard, E. (1973). Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975). Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992). Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985). Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004). A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006). A »best practices« approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992). The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985). Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008). Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008). Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008). Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008). Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

Figur 1

Generel forsøgsplan for funktionelle/adfærdsmæssige test, neuropatologisk evaluering og hjernevægt. Dette diagram er baseret på beskrivelsen i pkt. 13-15 (PND = postnatal day, dag 0 efter fødslen). Eksempler på fordeling af dyr er anført i tillæg 1.

Tillæg 1 1. Eksempler på mulige fordelinger er beskrevet og opstillet i tabelform nedenfor. Disse eksempler er anført for at illustrere, at fordelingen af forsøgsdyr til forskellige forsøgsparadigmer kan foretages på flere forskellige måder. Eksempel 1 2. En gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) bruges til test vedrørende adfærdsudvikling før fravænning. Af disse dyr aflives 10 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) humant på PND 22. Hjernerne fjernes, vejes og præpareres til histopatologisk undersøgelse. Endvidere indsamles data om hjernevægt under anvendelse af ufikserede hjerner fra de resterende 10 hanner og 10 hunner pr. dosisniveau. 3. En anden gruppe på 20 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) bruges til funktionelle/adfærdsmæssige test efter fravænning (detaljerede kliniske observationer, motorisk aktivitet, auditiv startle og kognitive funktionsforsøg hos unge voksne) og vurdering af alder ved kønsmodning. Af disse dyr bedøves 10 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) og fikseres via perfusion ved undersøgelsens afslutning (ca. PND 70). Efter supplerende fiksering in situ fjernes hjernen og præpareres til neuropatologisk undersøgelse. 4. Til kognitive funktionstest med unge voksne (f.eks. PND 60-70) anvendes en tredje gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld). Af disse dyr aflives 10 dyr/køn/gruppe (én han eller én hun pr. kuld) ved undersøgelsens afslutning, og hjernen fjernes og vejes. 5. De resterende 20 dyr/køn/gruppe udtages til evt. supplerende test. Tabel 1 Unge nr. (8) Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test m f 1 5 20 m + 20 f Adfærdsudvikling 10 m + 10 f PND 22 hjernevægt/neuropatologi/morfometri 10 m + 10 f PND 22 hjernevægt 2 6 20 m + 20 f Detaljerede kliniske observationer 20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Kønsmodning 20 m + 20 f Motorisk og sensorisk funktion 20 m + 20 f Indlæring og hukommelse (PND 25) 10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt/neuropatologi/morfometri ~ PND 70 3 7 20 m + 20 f Indlæring og hukommelse (unge voksne) 10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt ~ PND 70 4 8 — Reservedyr til udskiftninger eller supplerende test Eksempel 2 6. En gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) bruges til test vedrørende adfærdsudvikling før fravænning. Af disse dyr aflives 10 unger/køn/dosisniveau (én han eller én hun pr. kuld) humant på PND 11. Hjernerne fjernes, vejes og præpareres til histopatologisk undersøgelse. 7. En anden gruppe på 20 dyr/køn/dosisniveau (én han og én hun pr. kuld) bruges til undersøgelser efter fravænning (detaljerede kliniske observationer, motorisk aktivitet, vurdering af alder ved kønsmodning samt motorisk og sensorisk funktion). Af disse dyr bedøves 10 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) og fikseres via perfusion ved undersøgelsens afslutning (ca. PND 70). Efter supplerende fiksering in situ fjernes hjernen, vejes og præpareres til neuropatologisk undersøgelse. 8. Til kognitive funktionstest med unge og unge voksne anvendes 10 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld). Der anvendes forskellige dyr til forsøg med kognitive funktionstest på PND 23 og unge voksne. Ved afslutningen aflives de 10 dyr/køn/gruppe, der er testet som voksne, hjernen fjernes og vejes. 9. De resterende 20 dyr/køn/gruppe, der ikke er udvalgt til forsøg, aflives og kasseres ved fravænning. Tabel 2. Unge nr. (9) Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test m f 1 5 20 m + 20 f Adfærdsontogenese 10 m + 10 f PND 11 hjernevægt/neuropatologi/morfometri 2 6 20 m + 20 f Detaljerede kliniske observationer 20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Kønsmodning 20 m + 20 f Motorisk og sensorisk funktion 10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt/neuropatologi/morfometri ~ PND 70 3 7 10 m + 10 f (10) Indlæring og hukommelse (PND 23) 3 7 10 m + 10 f (10) Indlæring og hukommelse (unge voksne) Ung voksen hjernevægt 4 8 — Dyr aflives og kasseres PND 21. Eksempel 3 10. En gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) bruges til hjernevejning og neuropatologisk undersøgelse på PND 11. Af disse dyr aflives 10 unger/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) humant på PND 11, og hjerner fjernes, vejes og præpareres til histopatologisk undersøgelse. Endvidere indsamles data om hjernevægt under anvendelse af ufikserede hjerner fra de resterende 10 hanner og 10 hunner pr. dosisniveau. 11. En anden gruppe på 20 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) bruges til adfærdsontogenese (motorisk aktivitet) undersøgelser efter fravænning (motorisk aktivitet og vurdering af alder ved kønsmodning) samt kognitive funktionstest med unge 12. Endnu en gruppe på 20 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han og én hun pr. kuld) bruges til motoriske og sensoriske funktionstest (auditiv startle) og detaljerede kliniske observationer. Af disse dyr bedøves 10 dyr/køn/dosisniveau (dvs. én han eller én hun pr. kuld) og fikseres via perfusion ved undersøgelsens afslutning (ca. PND 70). Efter supplerende fiksering in situ fjernes hjernen, vejes og præpareres til neuropatologisk undersøgelse. 13. En anden gruppe på 20 unger/køn/dosisniveau anvendes til kognitive funktionstest med unge voksne (dvs. én han og én hun pr. kuld). Af disse dyr aflives 10 dyr/køn/gruppe (dvs. én han eller én hun pr. kuld) ved undersøgelsens afslutning, og hjernen fjernes og vejes. Tabel 3 Unge nr. (11) Antal unger fordelt til test Undersøgelse/Test m f 1 5 10 m + 10 f PND 11 hjernevægt/neuropatologi/morfometri 10 m + 10 f PND 11 hjernevægt 2 6 20 m + 20 f Adfærdsontogenese (motorisk aktivitet) 20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Kønsmodning 20 m + 20 f Indlæring og hukommelse (PND 27) 3 7 20 m + 20 f Auditiv startle (unge og unge voksne) 20 m + 20 f Detaljerede kliniske observationer 10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt/neuropatologi/morfometri ~ PND 70 4 8 20 m + 20 f Indlæring og hukommelse (unge voksne) 10 m + 10 f Ung voksen hjernevægt

Tillæg 2 Definitioner Kemikalie: et stof eller en blanding. Testkemikalie: et stof eller en blanding, som testes ved hjælp af denne testmetode.

B.54. UTERUSTESTEN I GNAVERE: EN KORTTIDSSCREENINGTEST FOR ØSTROGENECITET

INDLEDNING

1. Denne testmetode svarer til OECD-testvejledningen (TG) 440 (2007). OECD indledte en højt prioriteret aktivitet i 1998 med at revidere eksisterende vejledninger og udvikle nye vejledninger for screening og test af potentielt hormonforstyrrende stoffer (1). Ét element i denne aktivitet var at udvikle en testvejledning for det uterotrofiske bioassay med gnavere. Det uterotrofiske bioassay med gnavere blev herefter underkastet et omfattende valideringsprogram, herunder udarbejdelse af et detaljeret background document (2)(3) og gennemførelse af omfattende intra- og interlaboratorieundersøgelser for at vise bioassayets relevans og reproducerbarhed med et potent referenceøstrogen, en stærk østrogenreceptoragonist og et negativt referencekemikalie (4)(5)(6)(7)(8)(9). Denne testmetode B.54 bygger på erfaringerne fra valideringstestprogrammet og de derved opnåede resultater med østrogenagonister.

2. Det uterotrofiske bioassay er en korttidsscreeningtest, der havde sin oprindelse i 1930'erne (27)(28) og først blev standardiseret til screening af et ekspertudvalg i 1962 (32)(35). Det er baseret på forøgelsen af uterusvægt eller uterotrofisk respons (se gennemgang i 29). Det evaluerer et kemikalies evne til at fremkalde biologiske aktiviteter i overensstemmelse med agonister eller antagonister i naturlige østrogener (f.eks. 17ß-estradiol). Det bruges dog langt mindre til påvisning af antagonister end af agonister. Uterus reagerer på østrogener på to måder. En første reaktion er en vægtforøgelse på grund af vandimbibition. Denne reaktion efterfølges af vægtforøgelse på grund af vævsvækst (30). Uterusreaktioner hos rotter og mus er kvalitativt sammenlignelige.

3. Dette bioassay tjener som et in vivo-screeningassay, og anvendelsen heraf skal ses i forbindelse med »OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals« (tillæg 2). I denne konceptramme ligger det uterotrofiske bioassay på niveau 3 som et in vivo-assay, der giver data om en enkelt endokrin mekanisme, nemlig østrogenicitet.

4. Det uterotrofiske bioassay er beregnet til at blive inkluderet i en række in vitro- og in vivo-test med henblik på at afdække kemikalier med potentiale til at interagere med det endokrine system, så man i sidste ende kan foretage vurderinger af risici for menneskers sundhed og miljøet. OECD's valideringsprogram anvendte både stærke og svage østrogenagonister til at vurdere, hvor effektivt assayet kan identificere østrogene kemikalier (4)(5)(6)(7)(8). Derved blev testprocedurens følsomhed over for østrogenagonister påvist ud over en god reproducerbarhed i og mellem laboratorier.

5. Med hensyn til negative kemikalier blev der kun medtaget ét »negativt« referencekemikalie, der allerede var rapporteret negativt ved uterotrofisk assay samt in vitro-receptorbinding og receptorassays i valideringsprogrammet, men supplerende testdata, som ikke vedrørte OECD-valideringsprogrammet, er blevet evalueret og har yderligere underbygget specificiteten af det uterotrofiske bioassay til screening for østrogenagonister (16).

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

6. Østrogenagonister og -antagonister fungerer som ligander for østrogenreceptorer a og b og kan henholdsvis aktivere eller hæmme receptorernes transkriptionsaktivitet. Dette kan potentielt føre til sundhedsrisici, herunder skadevirkninger for reproduktion og udvikling. Derfor er der behov for hurtigt at kunne vurdere og evaluere et kemikalie som en mulig østrogenagonist eller -antagonist. Selv om en ligands affinitet for en østrogenreceptor eller transkriptionsaktivering af reportergener in vitro er informativ, er det kun en af flere determinanter for mulig fare. Andre determinanter kan omfatte metabolisk aktivering og deaktivering ved optagelse i kroppen, fordeling til målvæv og clearance fra kroppen, i hvert fald delvis afhængigt af indgiftsvejen og det kemikalie, der testes. Dette medfører behov for at screene et kemikalies mulige aktivitet in vivo under relevante betingelser, medmindre kemikaliets kendetegn vedrørende Absorption — Distribution — Metabolisme — Eliminering (ADME) allerede giver tilstrækkelig information. Uterusvæv reagerer med hurtig og kraftig vækst på stimulering med østrogener, især hos forsøgsgnavere, hvor brunstcyklussen varer ca. fire dage. Gnaverarter, navnlig rotten, anvendes også bredt i toksicitetsundersøgelser til risikobeskrivelse. Derfor er gnaverens uterus et egnet målorgan for in vivo-screening af østrogenagonister og -antagonister.

7. Denne testmetode er baseret på de protokoller, der blev anvendt i OECD's valideringsundersøgelse, og som har vist sig at være pålidelige og repeterbare i intra- og interlaboratorieundersøgelser (5)(7). I øjeblikket findes der to metoder, nemlig den ovariektomiserede metode for voksne hunner (OVX-voksen-metode) og den ikkekønsmodne ikkeovariektomiserede metode (den ikkekønsmodne metode). Det blev påvist i OECD-valideringstestprogrammet, at begge metoder har sammenlignelig følsomhed og reproducerbarhed. Da den ikkekønsmodne metode har en intakt HPG-akse (hypotalamus-hypofyse-gonade) er den dog noget mindre specifik, men dækker et bredere undersøgelsesområde end det ovariektomiserede dyr, fordi den kan reagere på kemikalier, der interagerer med HPG-aksen i stedet for blot østrogenreceptoren. Rottens HGP-akse er funktionel omkring 15-dages alderen. Før kan puberteten ikke fremskyndes med behandlinger som GnRH. Da hunner begynder at komme i puberteten før åbningen af vagina, vil hunnen have flere stille cyklusser, der ikke fører til vaginalåbning eller ovulation, men der er visse hormonale svingninger. Hvis et kemikalie stimulerer HPG-aksen direkte eller indirekte, medfører det for tidligt indtrædende pubertet, tidlig ovulation og fremskyndet vaginalåbning. Det er ikke kun kemikalier, der påvirker HPG-aksen, som gør dette, men nogle former for foder med højere niveauer af omsættelig energi end andre vil stimulere vækst og fremskynde vaginalåbning uden at være østrogene. Sådanne kemikalier vil ikke fremkalde en uterotrofisk reaktion ved OVX på voksne dyr, da deres HPG-akse ikke fungerer.

8. Af hensyn til dyrevelfærden foretrækkes metoden med ikkekønsmodne rotter, da man undgår kirurgisk forbehandling af dyrene og også undgår, at dyr, som ser ud til at være ved at gå i brunst, evt. ikke anvendes (se pkt. 30).

9. Den uterotrofiske respons har ikke udelukkende østrogen oprindelse, dvs. at andre kemikalier end østrogenagonister og -antagonister også kan give en reaktion. F.eks. kan relativt høje doser af progesteron, testosteron eller forskellige syntetiske progestiner alle føre til en stimulerende reaktion (30). En evt. reaktion kan analyseres histologisk for keratinisering og forhorning af vagina (30). Uanset reaktionens mulige oprindelse bør et positivt udfald af et uterotrofisk bioassay normalt give anledning til handling med henblik på yderligere afklaring. Supplerende tegn på østrogenicitet kan komme fra in vitro-assays såsom assays om ER-binding og transkriptionsaktivering eller fra andre in vivo-assays såsom assayet om kvindelig pubertet.

10. Under hensyntagen til, at det uterotrofiske bioassay fungerer som et in vivo-screeningassay, tjente den anvendte valideringstilgang både dyrevelfærdshensyn og en trinvis teststrategi. Med henblik herpå bestræbte man sig på at foretage en streng validering af reproducerbarhed og følsomhed for østrogenicitet — den vigtigste bekymring i forbindelse med mange kemikalier — mens antiøstrogenecitetselementet i assayet ikke fik megen opmærksomhed. Kun ét antiøstrogen med stærk aktivitet blev testet, eftersom antallet af kemikalier med en klar antiøstrogen profil (ikke tilsløret af en vis østrogenaktivitet) er meget begrænset. Således er denne testmetode dedikeret til den østrogene protokol, mens protokollen med beskrivelse af assayets antagonistform er indeholdt i en vejledning (37). Assayets reproducerbarhed og følsomhed for kemikalier med rent antiøstrogen aktivitet vil blive tydeligere defineret senere, når testproceduren har været anvendt rutinemæssigt i nogen tid, og flere kemikalier med denne virkningsmodalitet er blevet identificeret.

11. Det er anerkendt, at alle dyrebaserede procedurer skal overholde lokale standarder for pasning af dyr. Nedenstående beskrivelser af pleje og behandling er minimumsstandarder og vil blive erstattet af lokale forskrifter såsom Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (38). OECD har udarbejdet yderligere vejledning om human behandling af dyr (25).

12. Som med alle assays, der anvender levende dyr, er det væsentligt at sikre, at dataene virkelig er nødvendige, før assayet påbegyndes. Eksempler på to forhold, hvor data kan være påkrævet:

— højt eksponeringspotentiale (niveau 1 i konceptrammen, tillæg 2) eller tegn på østrogenicitet (niveau 2) for at undersøge, hvorvidt sådanne virkninger kan optræde in vivo

— virkninger, der indikerer østrogenicitet i in vivo-test på niveau 4 eller 5, for at underbygge, at virkningerne var knyttet til en østrogen mekanisme, som ikke kan klarlægges ved hjælp af in vitro-test.

13. Definitioner anvendt i denne testmetode er anført i tillæg 1.

PRINCIP FOR TESTEN

14. Af hensyn til følsomheden bygger det uterotrofiske bioassay på et dyreforsøgssystem, hvor hypotalamus-hypofyse-ovarieaksen ikke er funktionel, hvilket fører til lave endogene niveauer af cirkulerende østrogen. Det vil sikre, at uterus har en lav udgangsvægt, og at der bliver en maksimal spredning af reaktioner på indgivne østrogener. To østrogenfølsomme tilstande hos hungnavere opfylder dette krav:

i) ikkekønsmodne hunner efter fravænning og før pubertet

ii) unge voksne hunner efter ovariektomi med tilstrækkelig tid til regression af uterusvævet.

15. Testkemikaliet indgives dagligt ved oral sonde eller subkutan injektion. Graduerede testkemikaliedoser indgives til mindst to behandlingsgrupper (se vejledning i pkt. 33) af forsøgsdyr med ét dosisniveau pr. gruppe og en indgiftsperiode på tre på hinanden følgende dage for den ikkekønsmodne metode og en indgiftsperiode på mindst tre på hinanden følgende dage for OVX-voksen-metoden. Dyrene obduceres ca. 24 timer efter den sidste dosis. For østrogenagonister undersøges behandlede dyregruppers gennemsnitlige uterusvægt i forhold til vehikelgruppen for en statistisk signifikant forøgelse. En statistisk signifikant forøgelse i gennemsnitlig uterusvægt for en testgruppe viser en positiv respons i dette bioassay.

BESKRIVELSE AF METODEN

Valg af dyreart

16. Der kan bruges almindeligt anvendte gnaverstammer. Som eksempel blev Sprague-Dawley og Wistar-stammer af rotter anvendt under valideringen. Stammer med uteri, som man ved eller har mistanke om, er mindre responsive, bruges ikke. Laboratoriet skal påvise den anvendte stammes følsomhed som foreskrevet i pkt. 26 og 27.

17. Rotter og mus er rutinemæssigt blevet anvendt i det uterotrofiske bioassay siden 1930'erne. OECD's valideringsundersøgelser blev kun udført med rotter baseret på en forståelse af, at begge arter forventes at være ækvivalente, og derfor burde én art være nok til den globale validering med henblik på at spare ressourcer og dyr. Rotten er den foretrukne art i de fleste reproduktions- og udviklingstoksicitetsundersøgelser. Eftersom der findes en omfattende historisk database for mus og for derfor at udvide anvendelsesområdet for den uterotrofiske bioassay-testmetode med gnavere til anvendelsen af mus som forsøgsarter, blev der udført en begrænset opfølgende valideringsundersøgelse med mus (16). En »bridging«-metode med et begrænset antal testkemikalier og deltagende laboratorier og uden kodet stikprøvetest blev valgt i overensstemmelse med det oprindelige ønske om at spare ressourcer og dyr. Denne »bridging«-valideringsundersøgelse viser for det uterotrofiske bioassay med unge vokse ovariektomiserede mus, at data opnået med rotter og mus kvalitativt og kvantitativt stemmer udmærket overens. Selv om resultatet af det uterotrofiske bioassay måske er foreløbigt i forhold til en langtidsundersøgelse, giver det mulighed for, at dyr fra den samme stamme og kilde kan anvendes i begge undersøgelser. »Bridging«-metoden blev begrænset til OVX-mus, og rapporten giver ikke et robust datasæt, der kan validere den ikkekønsmodne model. Den ikkekønsmodne model for mus kommer således ikke i betragtning under den nuværende testmetodes anvendelsesområde.

18. I nogle tilfælde kan mus derfor anvendes i stedet for rotter. Denne art skal begrundes i toksikologiske, farmakokinetiske og/eller andre kriterier. Ændringer i protokollen kan være nødvendige for mus. F.eks. er mus' fødeindtagelse målt på kropsvægt højere end rotters, og derfor skal det fytoøstrogene indhold i foderet være lavere for mus end for rotter(9)(20)(22).

Miljøbetingelser og fodring

19. Alle procedurer skal overholde lokale standarder for pasning af forsøgsdyr. Disse beskrivelser af pasning og behandling er minimumsstandarder og vil blive erstattet af lokale forskrifter såsom Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (38). Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 °C (± 3 °C). Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af rummet, men 50-60 % bør tilstræbes. Belysningen skal være kunstig bestående af 12 timers lys og 12 timers mørke.

20. Laboratoriefoder og drikkevand gives ad libitum. Unge voksne dyr kan opbevares i bure hver for sig eller i grupper på op til tre dyr. På grund af de ikkekønsmodne dyrs unge alder anbefales social gruppeanbringelse

21. Et højt fytoøstrogenniveau i laboratoriefoder er kendt for at øge uterusvægten hos gnavere i tilstrækkelig grad til at påvirke det uterotrofiske bioassay (13)(14)(15). Et højt niveau af fytoøstrogener og omsættelig energi i laboratoriefoder kan også føre til tidlig pubertet, hvis der anvendes ikkekønsmodne dyr. Tilstedeværelsen af fytoøstrogener stammer primært fra tilsætningen af soja- og lucerneprodukter i laboratoriefoderet, og koncentrationer af fytoøstrogener i standardlaboratoriefoder har vist sig at variere fra batch til batch (23). Kropsvægt er en vigtig variabel, da den hænger sammen med mængden af indtaget foder. Derfor varierer den faktisk indtagne dosis fytoøstrogen fra samme foder mellem arter og efter alder (9). For ikkekønsmodne hunrotter kan fødeindtagelsen målt efter kropsvægt være ca. det dobbelte af indtagelsen for ovariektomiserede unge voksne hunner. For unge voksne mus kan fødeindtagelsen målt efter kropsvægt være næsten det firedobbelte af indtagelsen for ovariektomiserede unge voksne hunrotter.

22. Resultater af det uterotrofiske bioassay (9)(17)(18)(19) viser imidlertid, at begrænsede mængder af fytoøstrogener i foderet er acceptabelt og ikke reducerer bioassayets følsomhed. Vejledende bør fytoøstrogenniveauerne i foder ikke overstige 350 μg genistein-ækvivalenter/gram laboratoriefoder til ikkekønsmodne Sprague Dawley- og Wistar-hunrotter (6)(9). Et sådant foder bør også være passende ved test på unge voksne ovariektomiserede rotter, fordi fødeindtagelsen målt efter kropsvægt er mindre hos unge voksne sammenlignet med ikkekønsmodne dyr. Hvis voksne ovariektomiserede mus eller mere fytoøstrogenfølsomme rotter anvendes, skal man overveje en forholdsmæssig reduktion i fytoøstrogenniveauet i foderet (20). Endvidere kan forskelle i tilgængelig metabolisk energi fra forskelligt foder føre til tidsforskydninger i pubertetens start (21)(22).

23. Forud for undersøgelsen kræves en omhyggelig udvælgelse af foder uden et højt fytoøstrogenniveau (se vejledning (6)(9)) eller metabolisk energi, der kan forstyrre resultaterne (15)(17)(19)(22)(36). Det er en vigtig kontrol af begge disse faktorer at sikre, at laboratoriets testsystem fungerer korrekt som fastsat i pkt. 26 og 27. Som en beskyttelsesforanstaltning i overensstemmelse med god laboratoriepraksis (GLP) udtages der repræsentative prøver af hver batch foder, som indgives i løbet af undersøgelsen, med henblik på mulig analyse af fytoøstrogenindholdet (f.eks. i tilfælde af høj uteruskontrolvægt i forhold til tidligere kontroller eller en uhensigtsmæssig respons på referenceøstrogenet, 17-alfa-ethinylestradiol). Alikvoter analyseres som led i undersøgelsen eller fryses ved – 20 °C eller på en sådan måde, at prøven ikke nedbrydes før analyse.

24. Nogle former for strøelse kan indeholde naturligt forekommende østrogene eller antiøstrogene kemikalier (f.eks. er det kendt, at majskolber påvirker rotters cyklus og ser ud til at være antiøstrogene). Det valgte strøelsesmateriale skal indeholde så lidt østrogen som muligt.

Forberedelse af dyr

25. Forsøgsdyr uden tegn på sygdom eller fysiske abnormiteter tilordnes vilkårligt til kontrol- og behandlingsgrupper. Burene anbringes således, at mulige virkninger som følge af burenes placering minimeres. Dyrene mærkes individuelt. Ikkekønsmodne dyr opbevares helst i bur med moderdyr eller plejemoderdyr indtil fravænning under akklimatisering. Akklimatiseringsperioden forud for undersøgelsens start skal være omkring fem dage for unge voksne dyr og for ikkekønsmodne dyr leveret med moderdyr eller plejemoderdyr. Såfremt der fås fravænnede ikkekønsmodne dyr uden moderdyr, kan en kortere akklimatiseringsperiode blive nødvendig, da dosering skal starte umiddelbart efter fravænning (se pkt. 29).

FREMGANGSMÅDE

Kontrol af laboratoriets kompetence

26. Der er to forskellige muligheder for at kontrollere laboratoriets kompetence:

— periodisk kontrol i forhold til en indledende positiv grundkontrolundersøgelse (se pkt. 27). Mindst hver sjette måned og hver gang der sker en ændring, som kan påvirke assayets resultater (f.eks. en ny foderformulering, ændringer i dissektionspersonale, ændring af dyrestamme eller -leverandør osv.), skal testsystemets (dyremodellens) responsivitet kontrolleres ved hjælp af en passende dosis (baseret på den positive grundkontrol, jf. pkt. 27) af et referenceøstrogen: 17a-ethinylestradiol (CAS-nr. 57-63-6) (EE)

— brug af sideløbende kontroller ved at inkludere en gruppe, som får en passende dosis referenceøstrogen, i hvert assay.

Reagerer systemet ikke som forventet, skal testbetingelserne undersøges og ændres i overensstemmelse hermed. Det anbefales, at den dosis referenceøstrogen, der skal anvendes ved hver tilgang, er ca. ED70-80.

27. Positiv grundkontrolundersøgelse — Før et laboratorium første gang gennemfører en undersøgelse i henhold til denne testmetode,påvises laboratoriets kompetence gennem en test af dyremodellens responsivitet ved at fastlægge et referenceøstrogens dosisrespons: 17a-ethinylestradiol (CAS-nr. 57-63-6) (EE) med minimum fire doser. Uterusvægtrespons sammenlignes med etablerede tidligere data (se reference (5)). Hvis denne positive grundkontrol ikke giver de forventede resultater, undersøges testbetingelserne og ændres.

Dyrenes antal og vilkår

28. Hver behandlings- og kontrolgruppe skal omfatte mindst seks dyr (gælder protokoller for både den ikkekønsmodne og OVX-voksen-metoden).

Ikkekønsmodne dyrs alder

29. Til det uterotrofiske bioassay med ikkekønsmodne dyr skal fødselsdatoen anføres. Doseringen skal begynde tidligt nok til at sikre, at den fysiologiske forøgelse af endogene østrogener i forbindelse med puberteten endnu ikke har fundet sted, når indgiften af testkemikaliet afsluttes. På den anden side er der tegn på, at meget unge dyr kan være mindre følsomme. Ved definering af den optimale alder skal hvert laboratorium tage udgangspunkt i sine egne baggrundsdata om kønsmodning.

Som generel vejledning kan dosering af rotter begynde straks efter en tidlig fravænning på PND 18 (idet dagen for fødslen er PND 0). Dosering af rotter skal helst fuldføres på PND 21, men under alle omstændigheder før PND 25, for efter den alder bliver hypothalamus-hypofyse-ovarie-aksen funktionel, og det endogene østrogenniveau kan begynde at stige med en samtidig stigning i uterus' gennemsnitlige basislinjevægt og en stigning i gruppens standardafvigelser (2)(3)(10)(11)(12).

Procedure for ovariektomi

30. For ovariektomiserede hunrotter og -mus (behandlings- og kontrolgrupper) foretages ovariektomi i 6-8-ugersalderen. For rotter skal der gå mindst 14 dage mellem ovariektomi og den første dags indgift for at give uterus mulighed for at trække sig sammen til en minimal stabil basislinje. For mus skal der gå mindst syv dage mellem ovariektomi og den første dags indgift. Da små mængder ovarievæv er tilstrækkelige til at producere betydelige mængder af cirkulerende østrogen (3), skal dyrene testes før brug ved at observere epithelceller skrabet fra vagina i mindst fem på hinanden følgende dage (f.eks. dag 10-14 efter ovariektomi for rotters vedkommende). Hvis dyrene viser tegn på, at de er ved at gå i brunst, skal de ikke bruges. Ved obduktion skal ovariestilkene undersøges for tegn på evt. tilstedeværelse af ovarievæv. I givet fald skal dyret ikke anvendes i beregningerne (3).

31. Ovariektomiproceduren begynder med, at dyret bedøves korrekt og lægges på maven. Incisionen til åbning af den dorsolaterale abdominalvæg skal være ca. 1 cm på langs ved midtpunktet mellem ribbenenes margo inferior og crista iliaca og nogle få millimeter lateralt i forhold til lændemusklens laterale kant. Ovariet fjernes fra bughulen til et aseptisk felt. Ovariet skæres fra ved overgangen mellem æggeleder og corpus uteri. Efter bekræftelse af, at der ikke forekommer massiv blødning, lukkes abdominalvæggen med sutur, og huden lukkes med autoclips eller egnet sutur. Ligaturpunkterne vises skematisk i figur 1. Passende postoperativ analgesi bruges som anbefalet af en dyrlæge med erfaring i pleje af gnavere.

Kropsvægt

32. I OVX-voksen-metoden hænger kropsvægt og uterusvægt ikke sammen, fordi uterusvægten påvirkes af hormoner såsom østrogener, men ikke af vækstfaktorer, der regulerer kropsstørrelsen. Derimod hænger kropsvægten sammen med uterusvægten i den ikkekønsmodne model under kønsmodning (34). Ved påbegyndelse af undersøgelsen skal vægtvariationen for de anvendte dyr i den ikkekønsmodne model derfor være minimal og må ikke overstige ± 20 % af middelvægten. Det betyder, at kuldstørrelsen skal være standardiseret af producenten for at sikre, at afkom fra andre moderdyr bliver fodret med det samme. Dyr tilordnes til grupper (kontrol- og behandlingsgrupper) ved randomiseret vægtfordeling, således at hver gruppes gennemsnitlige kropsvægt ikke er statistisk anderledes end en anden gruppes. Man skal, så vidt det er praktisk muligt, være opmærksom på ikke at tilordne dyr fra samme kuld til samme behandlingsgruppe uden at øge antallet af kuld, der anvendes til undersøgelsen.

Dosering

33. For at fastslå, om et testkemikalie kan have østrogen virkning in vivo, er to dosisgrupper og en kontrolgruppe normalt tilstrækkeligt, og dette design foretrækkes derfor af hensyn til dyrevelfærden. Hvis formålet er enten at opnå en dosisrepræsentativ kurve eller at ekstrapolere til lavere doser, er der behov for mindst tre dosisgrupper. Hvis der kræves information ud over identificeringen af østrogen aktivitet (såsom et skøn over styrke), må man overveje et andet dosisregime. Med undtagelse af behandling med testkemikaliet behandles dyr i kontrolgruppen på samme måde som testgruppens dyr. Hvis der bruges et vehikel til indgift af testkemikaliet, skal kontrolgruppen modtage den samme mængde vehikel, som bruges til den behandlede gruppe (eller den største mængde, der bruges til testgrupperne, hvis der er forskel grupperne imellem).

34. Formålet i tilfælde af det uterotrofiske bioassay er at vælge doser, der sikrer dyrenes overlevelse, og som er uden væsentlig toksicitet eller lidelse for dyrene efter tre på hinanden følgende dages indgift af kemikaliet indtil en maksimal dosis på 1 000 mg/kg/dag. Alle dosisniveauer foreslås og vælges under hensyntagen til evt. eksisterende toksicitets- og (toksiko-)kinetiske data om testkemikaliet eller materiale i den forbindelse. Med hensyn til det højeste dosisniveau skal der først tages hensyn til LD50 og/eller information om akut toksicitet for at undgå død eller alvorlig lidelse for dyrene (24)(25)(26). Den højeste dosis repræsenterer den maksimalt tolererede dosis (MTD). En undersøgelse foretaget med et dosisniveau, som skabte en positiv uterotrofisk respons, ville også blive godkendt. Til screening er store intervaller (f.eks. enheder a en halv logaritme svarende til en dosisprogression på 3,2 eller op til enheder a en logaritme) mellem doseringerne normalt acceptable. Foreligger der ikke passende data, kan der udføres en range-finding-undersøgelse til bestemmelse af de doser, der skal anvendes.

35. Hvis den østrogene styrke for en agonist kan anslås ved in vitro- (eller in silico-) data, kan disse alternativt inddrages med henblik på valg af dosis. F.eks. anslås den mængde af testkemikaliet, som vil fremkalde uterotrofisk respons svarende til referenceagonisten (ethinylestradiol), efter sine relative in vitro-styrker i forhold til ethinylestradiol. Man vil få den højeste testdosis ved at gange denne ækvivalente dosis med en passende faktor, f.eks. 10 eller 100.

Overvejelser over »range-finding«

36. Om nødvendigt kan der udføres en range-finding-undersøgelse med nogle få dyr. I den forbindelse kan OECD's vejledning nr. 19 (25) bruges til at definere kliniske tegn på toksicitet eller lidelse for dyrene. Såfremt det er muligt inden for denne range-finding-undersøgelse, kan uteri efter tre dages indgift eksciseres og vejes ca. 24 timer efter den sidste dosis. Disse data kan herefter bruges som input til design af hovedundersøgelsen (vælg en acceptabel maksimumsdosis og lavere doser, og anbefal antallet af dosisgrupper).

Indgift af doser

37. Testkemikaliet indgives ved oral sonde eller subkutan injektion. Dyrevelfærdshensyn og toksikologiske aspekter såsom relevansen for den måde, hvorpå mennesker eksponeres for kemikaliet (f.eks. oral sonde til modelindtagelse, subkutan injektion til modelinhalation eller dermal absorption), testkemikaliets fysisk-kemiske egenskaber og især eksisterende toksikologisk information og data om metabolisme og kinetik (f.eks. behov for at undgå førstepassage-metabolisme, bedre effektivitet ad en særlig vej) skal tages i betragtning ved valg af indgiftsvej.

38. Det anbefales først at overveje en vandig opløsning/suspension, hvor det er muligt. Men da de fleste østrogene ligander eller deres metaboliske prækursorer normalt er hydrofobe, er den mest almindelige fremgangsmåde at anvende en opløsning/suspension i olie (f.eks. majs-, jordnødde-, sesam- eller olivenolie). Disse olier har imidlertid forskelligt kalorie- og fedtindhold, og vehiklet kan derfor påvirke det samlede indtag af omsættelig energi og derved potentielt ændre de målte endepunkter såsom uterusvægt, især ved den ikkekønsmodne metode (33). Forud for undersøgelsen testes derfor ethvert vehikel, der skal anvendes, i forhold til kontrolgrupper uden vehikel. Testkemikalier kan opløses i en minimal mængde på 95 % ethanol eller andre egnede opløsningsmidler og fortyndes til endelige arbejdskoncentrationer i testvehiklet. Opløsningsmidlets toksiske karakteristika skal være kendt og testes i en særskilt kontrolgruppe, som kun får opløsning