( 91/189/EOEF )

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 72/462/EOEF af 12 . december 1972 om sundhedsmaessige og veterinaerpolitimaessige problemer i forbindelse med indfoersel af kvaeg og svin samt fersk koed fra tredjelande(1 ), senest aendret ved direktiv 91/69/EOEF(2 ), saerlig artikel 8, stk . 1, og

ud fra foelgende betragtninger :

Ifoelge direktiv 72/462/EOEF tillades indfoersel af kvaeg og svin fra tredjelande, der er optaget paa listen i bilaget til Raadets beslutning 79/542/EOEF(3 ), senest aendret ved beslutning 90/485/EOEF(4 );

der maa fastlaegges dyresundhedsbetingelser, som skal gaelde for indfoerslen af levende dyr fra et tredjeland, alt efter dyresundhedssituationen i det paagaeldende land;

skoent dyresundhedsbetingelserne kan vaere forskellige fra land til land, gaelder protokollerne for veterinaerundersoegelser og betingelserne for godkendelse af markeder i tredjelande til at handle med dyr beregnet til udfoersel til Faellesskabet for alle tredjelande;

for at forenkle beslutningerne med hensyn til de dyresundhedsbetingelser, der skal gaelde for indfoerslen af kvaeg og svin fra tredjelande, vil det vaere hensigtsmaessigt at have en enkelt, faelles beslutning, som indeholder protokollerne for veterinaerundersoegelser og betingelserne for godkendelse af markeder;

en beslutning vedroerende protokollerne for veterinaerundersoegelser og betingelser for godkendelse af markeder i tredjelande skal kun gaelde for et tredjeland, for hvilket der er blevet vedtaget en beslutning, som specielt vedroerer dyresundhedsbetingelserne i det paagaeldende land;

de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Veterinaerkomité -

VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING :

Artikel 1 1 . Ved denne beslutning indfoeres der protokoller for veterinaerundersoegelser og betingelser for godkendelse af

markeder i tredjelande til handel med dyr beregnet til udfoersel til Faellesskabet i forbindelse med indfoerslen af levende kvaeg og svin fra de tredjelande, der er optaget paa listen i bilaget til beslutning 79/542/EOEF .

2 . Kravene i bilag I og II til naervaerende beslutning gaelder kun for tredjelande, for hvilke der er blevet vedtaget en beslutning, som fastlaegger dyresundhedskravene i det enkelte tilfaelde efter artikel 8 i direktiv 72/462/EOEF .

Artikel 2 Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne .

Udfaerdiget i Bruxelles, den 25 . februar 1991.

Paa Kommissionens vegne Ray MAC SHARRY Medlem af Kommissionen

( 1 ) EFT nr . L 302 af 31 . 12 . 1972, s . 28 .

( 2 ) EFT nr . L 46 af 19 . 2 . 1991, s . 37 .

( 3)EFT nr . L 146 af 14 . 6 . 1979, s . 15 .

( 4 ) EFT nr . L 276 af 27 . 9 . 1990, s . 46 .

BILAG I

PROTOKOLLER FOR STANDARDISERING AF MATERIALER OG PROEVEPROCEDURER KAPITEL I Kvaeg

1.Tuberkulose

Den enkelte intradermaltuberkulinproeve med kvaegtuberkulin foretages i overensstemmelse med bilag B til Raadets direktiv 64/432/EOEF af 26 . juni 1964 om veterinaerpolitimaessige problemer ved handel inden for Faellesskabet med kvaeg og svin(1 ).

2.Brucellose

Serumagglutinationsproeven og komplementbindingsproeven foretages i overensstemmelse med bilag C, afsnit A og B, til direktiv 64/432/EOEF .

3.Enzootisk kvaegleukose

Agar-gel-immunodiffusionsproeven foretages i overensstemmelse med bilag G til direktiv 64/432/EOEF .

4.Bluetongue

A.Den blokerende eller kompetitive ELISA foretages efter foelgende protokol :

Den kompetitive ELISA med anvendelse af monoklonalt antistof 3-17-A3 kan paavise antistoffer mod alle kendte serotyper af bluetongue-virus ( BTV ).

Proeveprincippet er, at reaktionen mellem BTV-antigen og et gruppespecifikt monoklonalt antistof ( 3-17-A3 ) afbrydes ved tilsaetning af fortyndinger af proeveserum . Tilstedevaerende antistoffer mod BTV i proeveserumet blokerer reaktionsevnen hos det monoklonale antistof ( Mas ) og resulterer i en formindskelse af den forventede farveudvikling ved tilsaetning af enzymsubstrat .

Materialer og reagenser :

1.Fladbundede mikrotiterplader .

2.Antigen : tilberedes som beskrevet nedenfor .

3.Blokerende buffer : 5 % ( w/v ) »Marvel« toerret maelkepulver, 0,1 % ( v/v ) Tween-20 ( leveres som polyoxyethylensorbitanmonolauratsirup ) i PBS .

4.Monoklonalt antistof : 3-17-A3 ( leveres som hybridom cellekultur supernatant ), opbevaret ved -20 °C eller frysetoerret, fortyndet i forholdet 1:50 med blokerende buffer inden brug, rettet mod det gruppespecifikke polypeptid p7 .

5.Konjugat : kanin-antimuseglobulin ( adsorberet og elueret ), konjugeret med peberrodsperoxidase og opbevaret i moerke ved 4 °C .

6.Substrat og kromogen : 0,2 g ortophenylendiamin ( OPD ) oploest i en buffer bestaaende af 2,553 g citronsyre og 4,574 g dinatriumhydrogenortophosphat tilsat destilleret vand op til 500 ml, opdelt i 25 ml alikvoter og opbevaret i moerke ved -20 °C med tilsaetning af 12ìl/ml hydrogenperoxid (3 % w/v ) umiddelbart inden brug .

OPD omgaas med forsigtighed - Brug gummihandsker - Mistanke om mutagen .

7.1 Molar svovlsyre : 26,6 ml syre blandet i 473,4 ml destilleret vand .

Husk - bland altid syre i vand, aldrig vand i syre .

8.Orbitalryster .

9.ELISA-pladelaeser ( proeven kan aflaeses visuelt ).

Proeveformat

HGFEDCBABlind -

proeve

Antigen + konjugat

1

Mas -

kontrol

Antigen + Mas + konjugat

2

Positiv

kontrol

Antigen + positivt serum + Mas + konjugat

1/21/41/81/161/321/641/1281 /256

3

Proevesera

1/21/41/81/161/21/41/81/16

4

5

6

Proeve -

sera

7

8

9

10

11

12

Proevekontrol

Blankproevekontrol

Raekke 1 A-H er en blankproevekontrol bestaaende af BTV-antigen og konjugat . Den kan anvendes som blindproeve for ELISA-laeseren .

Mas-kontrol

Raekke 2 A-H er den monoklonale antistofkontrol og bestaar af BTV-antigen, monoklonalt antistof og konjugat . Den udgoer en negativ kontrol . Middelvaerdien af absorbansaflaesningerne af denne kontrolraekke repraesenterer 0 % haemning .

Positiv kontrol

Raekke 3 A-H er den positive kontrol . Den bestaar af BTV-antigen, BTV-positive antiserumfortyndinger, Mas og konjugat . Den tjener som indikator for, at proeven fungerer ordentligt, og der boer opnaas samstemmende haemningsniveauer fra proeve til proeve .

Proevesera

I ovenstaaende proeveformat kan der afproeves 18 sera fortyndet i forholdet 1:2, 1:4, 1:8 og 1:16 . Dette vil vise noget om antistoftiteret i proeveserumet . Fortyndingsraekken kan gaa laengere, saaledes at titrene for serumfortynding naar slutpunktet . Som et alternativ kan sera, naar det gaelder serologiske undersoegelser i stor skala, proeves i en enkelt fortynding ( 1:4 ) eller to fortyndinger ( 1:2 og 1:4 ) som en hurtig screeningtest .

Procedure

1.BTV-antigen fortyndes til praetitreret fortynding i PBS, der sonikeres et oejeblik for at sprede akkumuleret virus ( hvis der ikke findes nogen sonikator, pippeteres der kraftigt ), og der tilfoeres 50 ìl til alle huller i ELISA-pladen . Der bankes paa pladens sider for at sprede antigenet .

2.Der inkuberes ved 37 °C i 60 minutter i en orbitalryster . Pladerne vaskes tre gange ved overskylning og toemning af hullerne med usterilt PBS, og de trykkes af med klatpapir .

3.Der tilsaettes 50 ìl blokerende buffer pr . hul . Proevesera og positivt serum haeldes i de relevante huller, og der fortyndes hen over pladen ved hjaelp af en multikanalpipette . Sera maa ikke tilsaettes blankproevekontrollen eller Mas-kontrollen .

4.Straks efter tilsaetningen af proeveseraene fortyndes Mas i blokerende buffer ( for at praetitrere fortyndingen ), og der haeldes 50 ìl i alle pladens huller, undtagen naar det gaelder blindproevekontrollen .

5.Der inkuberes ved 37 °C i 60 minutter i en orbitalryster . Der vaskes tre gange med PBS og trykkes af med klatpapir .

6.Kanin-antimusekoncentrat fortyndes til 1:5 000 i blokerende buffer, og der haeldes 50 ìl i alle pladens huller .

7.Der inkuberes ved 37 °C i 60 minutter i en orbitalryster . Der vaskes tre gange med PBS og trykkes af med klatpapir .

8.OPD optoes, og umiddelbart inden brug tilsaettes hver 25 ml OPD 12 ìl 30 % hydrogenperoxid . 50 ìl haeldes i alle pladens huller . Man lader farven udvikle sig i ca . 10 minutter og standser reaktionen med 1 M svovlsyre ( 50 ìl pr . hul .). Farven skal udvikle sig i Mas-kontrolhullerne og i de huller, der ikke indeholder sera med antistof mod BTV .

9.Hullerne undersoeges og registreres enten visuelt eller ved hjaelp af en spektrofotometrisk laeser .

Analyse af resultater

Middel-OD-aflaesningen beregnes ud fra MAS-kontrollerne . Dette repraesenterer haemningsvaerdien paa 0 %. Absorbansaflaesninger af proeveseraene udtrykkes i procent haemningsvaerdier ved hjaelp af foelgende formel :

Procent haemningsvaerdi = 100 - OD ved tilstedevaerelse af proeveserumOD ved fravaer af proeveserum × 100 .

Haemningsvaerdier paa over 40 % ved en serumfortynding paa 1:4 betragtes som positive . Visuel aflaesning er mulig, da 40 % haemning er den laveste vaerdi, der let kan ses med det blotte oeje .

Tilberedning af BTV ELISA-antigen

1.10 roux sammenflydende BHK-21 celler vaskes tre gange med serumfrit Eagle's medium, og der inficeres med bluetongue-virus serotype 1 i serumfrit Eagle's medium .

2.Der inkuberes ved 37 °C og undersoeges daglig for cytopatisk effekt ( cpe ).

3.Naar der kan konstateres cpe i 80-90 % af cellelaget i hver roux, indsamles viruset ved, at eventuelle celler, der stadig sidder paa glasset, rystes af .

4.Der centrifugeres ved 2 000-3 000 rpm for at sammenpresse cellerne .

5.Supernatanten fjernes, og cellerne genopslaemmes i ca . 30 ml PBS, som indeholder 1 % »Sarkosyl« og 2 ml phenolmetylsulfonylfluorid lysisbuffer ). Dette kan bevirke, at cellerne danner en gel, og der kan tilsaettes mere lysisbuffer for at reducere denne effekt .

Anmaerkning : Phenylmetylsulfonylfluorid er skadeligt - behandles med stoerste forsigtighed .

6.Cellerne spraenges i 60 sekunder ved hjaelp af en ultralydsonde med en amplitude paa 30 micron .

7.Der centrifugeres ved 10 000 rpm i 10 minutter .

8.Supernatanten opbevares ved +4 °C, og den resterende cellemasse genopslaemmes i 10-20 ml lysisbuffer .

9.Der sonikeres og foretages en klaring, idet supernatanten opbevares paa hvert stadium, i alt tre gange .

10.Supernatanterne samles og centrifugeres ved 24 000 rpm i 120 minutter ved +4 °C paa en 5 ml pude bestaaende af 40 % sakkarose ( w/v i PBS ) ved hjaelp af 30 ml Beckman centrifugeglas og en SW 28 rotor .

11.Supernatanten fjernes, glassene toemmes helt, og massen genopslaemmes i PBS ved hjaelp af sonikering . Antigenet opbevares i alikvoter ved -70 °C .

Titrering af BTV ELISA-antigen

Bluetongue ELISA-antigen titreres ved hjaelp af den indirekte ELISA . Tofoldfortyndinger af antigen titreres over for en konstant fortynding ( 1:50 ) af monoklonalt antistof 3-17-A3 . Protokollen er som foelger :

Procedure :

1.BTV antigen fortyndes i PBS over mikrotiterpladen i en todobbelt fortyndingsraekke ( 50 ìl/hul ) ved hjaelp af en multikanalpipette .

2.Der inkuberes 1 time ved 37 °C i en orbitalryster .

3.Pladerne vaskes tre gange med PBS .

4.Der tilsaettes hvert hul i mikrotiterpladen 50 ìl monoklonalt antistof 3-17-A3 ( fortyndet 1:50 ).

5.Der inkuberes 1 time ved 37 °C i en orbitalryster .

6.Pladerne vaskes tre gange med PBS .

7.Der tilsaettes hvert hul i mikrotiterpladen 50 ìl kanin-antimuseglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase fortyndet til en praetitreret optimal koncentration .

8.Der inkuberes 1 time ved 37 °C i en orbitalryster .

9.Der tilsaettes substrat og kromogen som tidligere beskrevet . Reaktionen standses efter 10 minutter ved tilsaetning af 1 Molar svovlsyre ( 50 ìl/hul ).

I den kompetitive proeve skal det monoklonale antistof vaere i overskud, og der vaelges derfor en fortynding af antigen, som ligger paa titreringskurven ( ikke paa den flade del ), hvilket giver ca . 0,8 OD efter 10 minutter .

B.Agar-gel-immunodiffusionsproeven foretages efter foelgende protokol :

Materialer og reagenser

Antigen :

Antigen, der bundfaeldes, tilberedes i et cellekultursystem, der taaler den hurtige formering af en referencestamme af bluetongue-virus . BHK eller Vero-celler anbefales . Antigen forekommer i supernatantvaesken, naar virusets vaekst er ophoert, men kraever en koncentration paa 50 til 100 gange for at vaere effektivt . Dette kan opnaas ved hjaelp af enhver standardprocedure for proteinkoncentrering . Virus i antigenet kan inaktiveres ved tilsaetning af 0,3 % ( v/v ) betapropiolaktion .

Kendt positivt kontrolserum :

Ved hjaelp af det internationale referenceserum og antigen fremstilles et nationalt standardserum, der standardiseres i det optimale forhold som for det internationale referenceserum, frysetoerres og anvendes som det kendte kontrolserum i hver enkelt proeve .

Proeveserum

Procedure :

1 % agarose tilberedt i borat eller natriumbarbitolbuffer, pH 8,5 til 9,0 haeldes i en petriskaal op til mindst 3,0 mm .

Der skaeres et proevemoenster paa syv fugtfri huller paa hver 5,0 mm diameter i agaren . Moenstret bestaar af et centerhul og seks huller, der er anbragt rundt om det i en cirkel med en radius paa 3 mm .

Centerhullet fyldes med standardantigenet . De ydre huller 2, 4 og 6 fyldes med kendt positivt serum og hul 1, 3 og 5 fyldes med proevesera .

Systemet inkuberes i indtil 72 timer ved stuetemperatur i et lukket fugtigt kammer .

Fortolkning :

Et proeveserum er positivt, hvis det danner en specifik bundfaeldninglinje med antigenet og danner en ubrudt identitetslinje med kontrolserumet . Et proeveserum er negativt, hvis det ikke danner en specifik linje med antigenet og det ikke krummer kontrolserumets linje . Petriskaale boer undersoeges mod en moerk baggrund ved indirekte belysning .

5.Epizootisk haemoragisk sygdom

Agar-gel-immunodiffusionsproeven foretages efter foelgende protokol :

Materialer og reagenser

Antigen :

Antigen, der bundfaeldes, tilberedes i et cellekultursystem, der taaler den hurtige formering af den/de paagaeldende serotype/r epizootisk haemoragisk sygdomsvirus . BHK eller Vero-celler anbefales . Antigen forekommer i supernatantvaesken, naar virusets vaekst er ophoert, men kraever en koncentration paa 50 til 100 gange for at vaere effektivt. Dette kan opnaas ved hjaelp af enhver standardprocedure for proteinkoncentrering . Virus i antigenet kan inaktiveres ved tilsaetning af 0,3 % ( v/v ) betapropiolaktion .

Kendt positivt kontrolserum :

Ved hjaelp af det internationale referenceserum og antigen fremstilles et nationalt standardserum, der standardiseres i det optimale forhold som for det internationale referenceserum, frysetoerres og anvendes som det kendte kontrolserum i hver enkelt proeve .

Proeveserum

Procedure :

1 % agarose tilberedt i borat eller natriumbarbitolbuffer, pH 8,5 til 9,0 haeldes i en petriskaal op til mindst 3,0 mm .

Der skaeres et proevemoenster paa syv fugtfri huller paa hver 5,0 mm diameter i agaren . Moenstret bestaar af et centerhul og seks huller, der er anbragt rundt om det i en cirkel med en radius paa 3 mm .

Centerhullet fyldes med standardantigenet . De ydre huller 2, 4 og 6 fyldes med kendt positivt serum og hul 1, 3 og 5 fyldes med proevesera .

Systemet inkuberes i indtil 72 timer ved stuetemperatur i et lukket fugtigt kammer .

Fortolkning :

Et proeveserum er positivt, hvis det danner en specifik bundfaeldninglinje med antigenet og danner en ubrudt identitetslinje med kontrolserumet . Et proeveserum er negativt, hvis det ikke danner en specifik linje med antigenet og det ikke krummer kontrolserumets linje . Petriskaale boer undersoeges mod en moerk baggrund ved indirekte belysning .

6.Leptospirose

Den mikroskopiske agglutinationsproeve foretages efter foelgende protokol :

Kulturer :

Dyrkes i Korthofs eller EMJH-substrat ved 30 °C .

Antigen :

Indeholder 2 × 108 organismer pr . ml kultursubstrat .

Procedure :

Lige dele antigen og serum blandes i fladbundede mikrotiterplader og inkuberes ved 30 °C i to timer eller 37 °C i 1 - 1 1/2 time . Proeven aflaeses ved laveffekt moerkefeltbelysning med en forstoerrelse paa mellem

60 og 100 .

Fortolkning :

Et negativt resultat er under 50 % agglutination ved en oploesning paa 1:50 .

7.Smitsom bovin rhinotracheitis/infektioes pustular vilvovaginitis

Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve udfoeres i mikrotiterplader under anvendelse af MDBK eller andre foelsomme celler . Colorado, Oxford eller en anden referencestamme af viruset benyttes ved 100 TCID50 pr . 0,025 ml; inaktiverede, ufortyndede serumproever blandes med en tilsvarende maengde ( 0,025 ml ) virussuspension . Virus/serumblandingerne inkuberes to timer ved 37 °C i mikrotiterpladerne, foer MDBK-cellerne tilsaettes . Der benyttes celler i en koncentration, som danner et fuldstaendigt éncellelag efter 24 timer .

Kontrol :

- Virusinfektivitetsproeve

- Serumtoksicitetskontrol

- Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

- Referenceantisera .

Fortolkning :

Resultaterne af neutralisationsproeven og titeret for det virus, som benyttes ved proeven, aflaeses efter 3-6 dages inkubation ved 37 °C . Serumtitere regnes for negative, hvis der ikke sker nogen neutralisering ved en oploesning paa 1:2 (ufortyndet serum ).

8.Bovin virusdiarré ( BVD )

A.Virusisolationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Proevemateriale og paavisningsmetoder :

Der anvendes serum, suspensioner af crusta phlogistica eller blodkoagel fra nyindsamlede, ikke varmeinaktiverede blodproever af mindst seks maaneder gammelt kvaeg . Der benyttes en immunologisk farvningsprocedure saasom den fluorescerende antistofmetode ( FA ) eller en enzym-kaede-immunitet-maaling, f . eks . immunoperoxidase ( IPX ), til paavisning af BVD-virus i podede kulturer .

Proevereagens :

Til FA-proeven kraeves et FITC-konjugeret specifikt BVD-antiserum . Til IPX-proeven kraeves et ukonjugeret anti-BVD-serum af kvaeg, et peroxidasekonjugeret antibovint antiserum og passende enzymsubstrat ( f.eks . 3-amino-9-ethylkarbazol ). Et anti-BVD-serum fra andre arter end kvaeg kan anvendes, forudsat at peroxidasekonjugatet er rettet imod serumglobuliner af den paagaeldende art . Alle antivirale sera skal have kendt specificitet og et bredt reaktionsomraade .

Procedure :

Til proeven anvendes foelsomme celler saasom bovint turbinat, kalvenyre eller kalvetestis, der er frie for endogent BVD -virus .

Serumproever - proeveserum og vaevsdyrkningsceller anbringes i daekglaskulturer eller i huller i mikrotiterplader eller andre beholdere, saa serumslutfortyndingen er paa 10 %.

Crusta phlogistica og blodkoagel - proeverne tilsaettes til sammenflydende éncellelagskulturer i 1 time ved 37 °C, hvorefter kulturerne vaskes og paahaeldes kulturmedium med 10 % BVD-frit foetalt kalveserum .

Kulturerne inkuberes derefter ved 37 °C og fikseres og farves efter FA - eller IPX-metoden .

Kontrol :

- Positiv BVD-viruskontrol,

- Negativ kontrol uden tilsat virus .

Fortolkning :

FA-proeven farves efter 4-6 doegns inkubation og aflaeses i ultraviolet lys . Fluorescens i celler, der er inkuberet med proeven, fortolkes som et positivt resultat .

IPX-proeven farves efter 4 doegns inkubation og aflaeses ved lysmikroskopi . Moerkebrun farvning af nogle af cellernes cytoplasma fortolkes som et positivt resultat .

B.Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve i mikrotiterplader foretages ved hjaelp af egnede, seriopformerede foelsomme bovine celler ( f . eks . bovine turbinatceller som beskrevet af McClurkin m.fl ., 1974, Arch . Ges . Virusforsch ., 45, 285-289 ).

Det er vigtigt, at alle reagenser og celler er fri for kontaminerende, tilfaeldigt forekommende ikke-cytopatiske BVD/MD-virus .

Proevevirus, som kan vaere enhver egnet cytopatisk referencestamme ( f.eks . NADL-stammen ), anvendes i en koncentration paa i gennemsnit 100 infektive cellekulturdoser pr . 0,025 ml . Fortyndinger af inaktiverede sera blandes med tilsvarende maengder virussuspension ( 0,025 ml ), og virus/serumblandingerne inkuberes i 1 time ved 37 °C, foer der tilsaettes tilsvarende maengder cellesuspension . Der benyttes celler i en koncentration, som danner et fuldstaendigt éncellelag inden for 2 doegn .

Kontrol :

- Virusinfektivitetsproeve

- Serumtoksicitetskontrol

- Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

- Referenceantisera .

Fortolkning :

Med NADL-virusstammen er det optimale tidspunkt for aflaesning efter 5 doegns inkubation ved 37 °C .

Et gennemsnitligt neutralisationstiter paa 1:10 anses for at indicere en immunreaktion paa en tidligere akut infektion .

9.Maelkeanalyse til paavisning af mastitis

Maelkeanalysen foretages i overensstemmelse med bilag D til direktiv 64/432/EOEF .

10.Mund - og klovesyge ( M & K )

A.Indsamling og proevning af proever af oesofagus/farynks foretages efter foelgende protokol :

Reagenser :

Inden proeven tages, tilberedes et transportmedium . Der fordeles 2 ml i lige saa mange beholdere som det antal dyr, der skal proeves . Beholderne boer vaere frysefaste i toeris eller flydende nitrogen .

Der indsamles proever ved hjaelp af en specialkonstrueret spytkollektor eller »probang «.

Proeven indsamles ved, at probangskaalen foeres gennem munden over tungens dorsum og ned i den oevre del af oesofagus . Der goeres forsoeg paa at bortskrabe overfladeepitelet fra oevre oesofagus og farynks ved bevaegelser lateralt og dorsalt . Derefter fjernes probang, helst efter, at dyret har svaelget. Skaalen boer vaere fuld og indeholde en blanding af slim, spyt, oesofagusvaeske og celleaffald . Man maa soerge for, at hver proeve indeholder noget synligt cellemateriale . Haardhaendet behandling, der foraarsager bloedninger, skal undgaas .

Proever fra nogle dyr kan vaere staerkt forurenet med vomindhold . Saadanne proever kasseres, og dyrets mund skylles med vand eller helst fysiologisk saltvand, inden proevningen gentages .

Behandling af proever :

Hver proeve i probangskaalen kvalitetsundersoeges, og der tilsaettes 2 ml til en tilsvarende maengde transportmedium i en frysefast beholder . Beholderne lukkes taet, forsegles, desinficeres og maerkes . Proeverne opbevares koeligt (+ 4 °C ) og undersoeges inden for 3-4 timer eller anbringes paa toeris (- 69 °C ) eller i flydende nitrogen og holdes nedfrosne indtil undersoegelsestidspunktet .

For hvert dyr desinficeres probang og vaskes i tre hold rent vand .

Proevning for M & K-virus :

Proeverne podes i kulturer af primaere bovine thyreoidcellekulturer med brug af mindst tre reagensglas pr . proeve . Andre foelsomme celler, f.eks . primaere bovine eller porcine nyreceller, kan bruges, men man boer huske, at de er mindre foelsomme over for nogle stammer af M & K-virus . Reagensglassene inkuberes ved 37 °C i en tromble og undersoeges daglig i 48 timer for cytoplastisk effekt ( cpe ). Hvis resultatet er negativt, overfoeres kulturerne blindt til nye kulturer og undersoeges igen i 48 timer . Eventuel cpe's specificitet skal bekraeftes .

Anbefalet transportmedium :

1.0,08 M phosphatbuffer pH 7,2 med 0,01 % bovint serumalbumin, 0,002 % phenolroedt og antibiotika .

2.Vaevsdyrkningsmedium ( f.eks . Eagle's MEM ) med 0,04 M HEPES-buffer, 0,01 % bovint serumalbumin og antibiotika, pH 7,2 .

Antibiotika ( pr . ml slutprodukt ) boer tilsaettes transportmediet f.eks .

penicillin1 000 IU

neomycinsulfat100 IU

polymyxin-B-sulfat50 IU

mycostatin100 IU .

B.Virusneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Reagenser :

Stam-M & KV-antigen tilberedes i cellekulturer eller paa kalvetunger og opbevares ved -70 °C eller derunder eller ved -20 °C, efter at der er tilsat 50 % glycerol . Dette er stamantigenet . M & KV er stabilt under disse forhold, og titrene varierer meget lidt i en periode paa flere maaneder .

Procedure :

Proeven foretages i fladbundede mikrotiterplader af vaevskulturgrad med brug af foelsomme celler saasom IB-RS-2, BHK-21 eller kalvenyreceller .

Sera til proeven fortyndes 1:4 i serumfrit cellekulturmedium med tilsaetning af 100 IU/ml meomycin eller andre egnede antibiotika . Sera inaktiveres ved 56 °C i 30 minutter, og der anvendes maengder paa 0,05 ml til tilberedning af en dobbeltserie i mikrotiterplader med brug af 0,05 ml fortyndingsoeser . Praetitreret virus, der ogsaa er fortyndet i serumfrit kulturmedium og indeholder 100 TCID50/0,05 ml tilsaettes derefter til hvert hul . Efter inkubation ved 37 °C i 1 time, saa neutralisering kan finde sted, tilsaettes 0,05 ml suspensionsceller med 0,5 - 1,0 × 106 celler pr . 1 ml i cellekulturmedium indeholdende serumfrit M & K-antistof til hvert hul, og pladerne forsegles .

Pladerne inkuberes ved 37 °C . Encellelag er normalt sammenflydende inden for 24 timer . Cpe er normalt tilstraekkeligt fremskredet efter 48 timer til, at der kan foretages en mikroskopisk aflaesning af proeven . Paa dette tidspunkt kan der foretages en endelig mikroskopisk aflaesning, eller pladerne kan fikseres og farves med henblik paa en makroskopisk aflaesning, f.eks . ved hjaelp af 10 % formaldehyd og 0,05 % metylenblaat .

Kontrol :

Kontrollen af hver proeve omfatter homologt antiserum med kendt titer, en cellekontrol, en serumtoksicitetskontrol, en mediekontrol og en virustitrering, som danner grundlag for beregningen af den faktiske maengde virus i proeven .

Fortolkning :

Huller, der viser tegn paa cpe, betragtes som inficeret, og neutralisationstitrene udtrykkes som den reciprokke af den endelige fortynding af serum, der er til stede i serum/virusblandingerne ved 50 %-slutpunkterne, der bestemmes efter Spearmen-Karber-metoden ( Karber, G ., 1931, Archiv fuer Experimentelle Pathologie und Pharmakologie, 162, 480 ).

Proever betragtes som paalidelige, naar den faktisk anvendte virusmaengde pr . hul i proeven er paa mellem 101,5 og 102,5 TCID50, og naar referenceserumtiteret ligger inden for det todobbelte af det forventede titer vurderet ud fra tidligere titreringers modus . Naar kontrolresultaterne overskrider disse graenser, gentages proeverne .

Et slutpunkttiter paa 1:11 eller derunder betragtes som negativt .

C.Paavisningen og kvantificeringen af antistof ved hjaelp af ELISA foretages efter foelgende protokol :

Reagenser :

Kaninantiserum mod 146S -antigen af syv typer mund og klovesygevirus ( M & KV ) benyttet i en forud fastlagt optimal koncentration i karbonat/bikarbonatbuffer, pH 9,6 .

Antigener fremstilles af udvalgte virusstammer, der er dyrket paa BHK-21 énlagsceller . Der benyttes urensede supernatanter, som praetitreres efter protokollen, men uden serum, saaledes at der fremkommer en fortynding, som efter tilsaetning af en tilsvarende maengde PBST ( phosphatbufferet salt med 0,05 % Tween-20 og phenolroed indikator ) giver en absorbansaflaesning paa mellem 1,2 og 1,5 . Viraene kan anvendes inaktiveret . Der benyttes PBST som fortyndingsmiddel . Der tilberedes marsvineantisera ved indpodning af marsvin med 146S-antigen af hver serotype . Der fremstilles en forud fastlagt optimal koncentration iPBST med 10 % normalt bovint serum og 5 % normalt kaninserum .

Kanin-antimarsvineimmunuglobulin, der er konjugeret med peberrodsperoxidase, anvendes i en forud fastlagt optimal koncentration i PBST med 10 % normalt bovint serum og 5 % normalt kaninserum .

Proevesera fortyndes i PBST .

Procedure :

1.ELISA-plader belaegges med 50 ìl antivirale kaninsera natten over i et fugtigt kammer ved stuetemperatur .

2.50 ìl af en ekstra dobbeltserie af hvert proeveserum begyndende med 1:4 tilberedes i rundbundede flerhulsplader ( baereplader ). 50 ìl af en konstant dosis antigen tilsaettes til hvert hul, og blandingerne henstaar natten over ved 4 °C . Tilsaetningen af antigenet nedsaetter startserumfortyndingen til 1:8 .

3.ELISA-pladerne vaskes 5 gange med PBST .

4.50 ìl serum/antigenblandinger overfoeres derefter fra baerepladerne til de kaninserumbelagte ELISA-plader og inkuberes ved 37 °C i 1 time i en orbitalryster :

5.Efter vaskning tilstaettes 50 ìl marsvineantiserum mod det i punkt 4 anvendte antigen til hvert hul . Pladerne inkuberes ved 37 °C i 1 time i en orbitalryster .

6.Pladerne vaskes, og 50 ìl kanin-antimarsvineimmunoglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase tilsaettes til hvert hul . Pladerne inkuberes ved 37 °C i 1 time i en orbitalryster .

7.Pladerne vaskes, og 50 ìl ortofenylendiamin med 0,05 % H2O2 ( 30 %) w/v tilsaettes til hvert hul .

8.Reaktionen standses efter 15 minutter med 1,25 M H2SO4 .

Pladerne aflaeses spektrofometrisk ved 492 nm paa en ELISA-laeser, der er forbundet med en mikrodatamat .

Kontrol :

- For hvert anvendt antigen indeholder 40 huller intet serum, men indeholder antigen fortyndet i PBST .

- En ekstra dobbelt fortyndingsserie af homologt bovint referenceantiserum .

- En ekstra dobbelt fortyndingsserie af negativt bovint serum .

Fortolkning :

Antistoftitere udtrykkes som den endelige fortynding af proeveserum, der giver 50 % af den middel-OD-vaerdi, der registreres i viruskontrolhullerne uden tilstedevaerelse af proeveserum . Titere ud over 1:40 betragtes som positive .

Referencer :

Hamblin C . Barnett ITR and Hedger RS ( 1986 ) - A new enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus . I . Development and method of ELISA . Journal of Immunological Methods, 93, 115-121.11 .

KAPITEL II Svin

1.Tuberkulose

Den enkelte intradermaltuberkulinproeve med fjerkraetuberkulin foretages i overensstemmelse med bilag B til Raadets direktiv 64/432/EOEF , dog skal injektionsstedet vaere den slappe hud ved oereroden .

2.Brucellose

Serumagglutinationsproeven og komplementbindingsproeven foretages i overensstemmelse med bilag C, afsnit A og B, til Raadets direktiv 64/432/EOEF .

3.Aujeszky's sygdom

Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve udfoeres i mikrotiterplader under anvendelse af Vero eller andre foelsomme cellekulturer . Aujeszky's sygdomsvirus benyttes ved 100 TCID50 pr . 0,025 ml; inaktiverede, ufortyndede serumproever blandes med en tilsvarende maengde ( 0,025 ml ) virussuspension . Virus/serumblandingerne inkuberes i 2 timer ved 37 °C i mikrotiterpladerne, foer de til formaalet kraevede celler tilsaettes . Der benyttes celler i en koncentration, som danner et fuldstaendigt éncellelag efter 24 timer .

Kontrol :

-Virusinfektivitetsproeve

-Serumtoksicitetskontrol

-Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

-Referenceantisera.

Fortolkning :

Resultaterne af neutralisationsproeven og titeret for det virus, som benyttes ved proeven aflaeses efter 3-7 dages inkubation ved 37 °C . Serumtitere under 1:2 ( ufortyndet serum ) regnes for negative .

4.Overfoerbar gastroenteritis

Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve udfoeres i mikrotiterplader under anvendelse af A72 ( hundetumor ) celler eller andre foelsomme cellekultuer . TGE-virus benyttes ved 100 TCID50 pr . 0,025 ml; inaktiverede ufortyndede serumproever blandes med en tilsvarnede maengde ( 0,025 ml ) virussuspension . Virus/serumblandingerne inkuberes i 30-60 minutter ved 37 °C i mikrotiterpladerne, inden de til formaalet kraevede celler tilsaettes . Der benyttes celler i en koncentration, der danner et komplet éncellelag efter 24 timer . Der tilsaettes 0,1 ml cellesuspension til hver celle .

Kontrol :

-Virusinfektivitetsproeve

-Serumtoksicitetskontrol

- Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

- Referenceantisera .

Fortolkning :

Resultaterne af neutralisationsproeven og titeret for det i proeven benyttede virus aflaeses efter 3-5 dages inkubation ved 37 °C . Serumtitere under 1:2 ( endelig fortynding ) betragtes som negative . Hvis ufortyndede serumproever er toksiske over for vaevskulturerne, kan disse sera fortyndes 1:2, inden de benyttes til proeven . Dette svarer til 1:4 endelig serumfortynding . Serumtitere under 1:4 ( endelig fortynding ) betragtes som negative i disse tilfaelde .

5.Svineinfluenza

Agglutinationshaemningsproeven foretages efter foelgende protokol :

Procedure :

Proeverne udfoeres efter standardmetoder ( US Department of Health, Education and Welfare, Immunology series No 6 ).

For at nedbryde uspecifikke haemmende stoffer boer svineserum behandles med enten receptornedbrydende enzym ( Vibrio cholerae-filtrat ) natten over ved 37 °C efterfulgt at opvarmning ved 56 °C i 30 minutter for at standse yderligere enzymaktivitet eller ved behandling med 25 % kaolin natten over ved 4 °C ( Clark and Casals, 1958, American Journal of Tropical Medecine and Hygiene, 7, 561 ).

Efter absorbering med en 10 % suspension af kyllingeerythrocyter i 1 time ved 37 °C afproeves seraene paa 4 haemningsagglutionsenheder af det relevante virus under anvendelse af 1 % kyllingeerythrocyter . Virus og serum holdes i kontakt i 60 minutter ved stuetemperatur, foer erythrocyterne tilsaettes .

Fortolkning :

Titere paa 1:10 eller derover betragtes som positive :

6.Mund - og klovesyge

Proever for mund - og klovesyge hos svin foretages efter protokollerne i kapitel I, punkt 10 .

7.Smitsom blaereudslet hos svin

Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve foretages i mikrotiterplader under anvendelse af IB-RS-2-celler eller andre foelsomme cellekulturer . Der benyttes UKG 27/72 eller enhver anden virusreferencestamme ved 100 TCID50 pr . 0,025 ml . Sera til proeven fortyndes 1:4 og inaktiveres, og der tilberedes en dobbelt fortyndingsserie . Serumproeverne blandes med en tilsvarende maengde virussuspension og inkuberes i 1 time ved 37 °C i mikrotiterpladerne, inden der tilsaettes 0,025 ml cellesuspension indeholdende 3 × 106 celler/ml .

Kontrol :

- Virusinfektivitetsproeve

- Serumtoksicitetskontrol

- Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

- Referenceantisera .

Fortolkning :

Resultaterne af neutralisationsproeven og titeret for det til proeven benyttede virus aflaeses efter 3 dages inkubation ved 37 °C . Serumtitere betragtes som negative, hvis der ikke sker en neutralisering med en fortynding paa 1:11 .

8.Klassisk svinepest

Proever for klassisk svinepest foretages efter bilag I til Raadets direktiv 80/217/EOEF(2 ).

9.Leptospirose

Proever for leptospirose hos svin foretages efter kapitel I, punkt 6, i dette bilag .

( 1 ) EFT nr . 121 af 29 . 7 . 1964, s . 1977/64 .

( 2 ) EFT nr . L 47 af 21 . 2 . 1980, s . 11 .

BILAG II

MINDSTEKRAV FOR GODKENDELSE AF MARKEDER TIL HANDEL MED KVAEG OG SVIN BEREGNET TIL UDFOERSEL TIL DET EUROPAEISKE FAELLESSKAB 1.Markederne er under tilsyn af en embedsdyrlaege .

2.Markederne ligger centralt i et omraade med en diameter paa 20 km, hvori der ifoelge officielle fund i mindst 30 dage forud for deres brug som godkendte markeder ikke er forekommet noget tilfaelde af mund - og klovesyge og - hvis markederne er godkendt for svin - ikke noget tilfaelde af svinepest, blaeresyge hos svin eller porcin enteroviral encephalomyelitis ( Teschenersyge ).

3.Inden markederne godkendes til brug som godkendte markeder, rengoeres og desinficeres de med et desinficeringsmiddel, der er officielt godkendt i udfoerselslandet som vaerende effektivt i bekaempelsen af de i krav nr . 2 omhandlede sygdomme .

4.Samlepladser, indladningspladser eller andre steder, som kvaeg eller svin beregnet til udfoersel til Det Europaeiske Faellesskab eventuelt kan passere, skal opfylde krav nr . 1, 2 og 3 i dette bilag .

5.At kvaeg og alle svin, der passerer godkendte markeder, skal opfylde de sundhedskrav, der er stillet for indfoersel af den paagaeldende dyrekategori til Det Europaeiske Faellesskab .

6.Dyr, der skal udfoeres til Det Europaeiske Faellesskab, og som passerer godkendte markeder, skal inden seks dage derefter indlades og direkte forsendes til udfoerselslandets graense

a)uden at komme i beroering med andre klovdyr end kvaeg og svin, der opfylder de sundhedskrav, der er stillet for indfoersel af den paagaeldende dyrekategori til Det Europaeiske Faellesskab

b)opdelt i forsendelser, saaledes at ingen forsendelse indeholder baade avls - og brugsdyr og dyr til oejeblikkelig slagtning

c)transporteret i transportkoeretoejer eller containere, som forinden er blevet rengjort og desinficeret med et desinficeringsmiddel, der er officielt godkendt i udfoerselslandet som vaerende effektivt i bekaempelsen af de i krav nr . 2 omhandlede sygdomme, og vaere saaledes konstrueret, at ekskrementer, urin, stroeelse eller foder ikke kan flyde eller falde ud af koeretoejet under transporten .

7.Hvis betingelserne for udfoersel af dyr til Faellesskabet kraever, at der foretages en undersoegelse inden for en fastlagt periode inden indladning, omfatter denne periode enhver periode for samling - indtil seks dage - efter at dyrene har passeret godkendte markeder .

8.Udfoerselslandet udpeger de markeder, der godkendes for avls - og brugsdyr, og de markeder, der godkendes for slagtedyr, og meddeler Kommissionen og medlemsstaternes kompetente centrale myndigheder saadanne markeders navn og adresse .

9.Udfoerselslandet fastsaetter proceduren for officielt tilsyn med markeder, samlepladser og indladningspladser og soerger for, at et saadant tilsyn bliver foretaget .

10.Udfoerselslandet soerger for, at detaljer vedroerende markeder og samlepladser bliver givet i det relevante afsnit i sundhedscertifikatet, der ledsager dyr, som udfoeres til Det Europaeiske Faellesskab .

KOMMISSIONENS BESLUTNING af 25 . februar 1991 om protokollerne for standardisering af materialer og procedurer for veterinaerproever og betingelser for godkendelse af markeder i forbindelse med indfoersel af kvaeg og svin fra tredjelande ( 91/189/EOEF )

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 72/462/EOEF af 12 . december 1972 om sundhedsmaessige og veterinaerpolitimaessige problemer i forbindelse med indfoersel af kvaeg og svin samt fersk koed fra tredjelande(1 ), senest aendret ved direktiv 91/69/EOEF(2 ), saerlig artikel 8, stk . 1, og

ud fra foelgende betragtninger :

Ifoelge direktiv 72/462/EOEF tillades indfoersel af kvaeg og svin fra tredjelande, der er optaget paa listen i bilaget til Raadets beslutning 79/542/EOEF(3 ), senest aendret ved beslutning 90/485/EOEF(4 );

der maa fastlaegges dyresundhedsbetingelser, som skal gaelde for indfoerslen af levende dyr fra et tredjeland, alt efter dyresundhedssituationen i det paagaeldende land;

skoent dyresundhedsbetingelserne kan vaere forskellige fra land til land, gaelder protokollerne for veterinaerundersoegelser og betingelserne for godkendelse af markeder i tredjelande til at handle med dyr beregnet til udfoersel til Faellesskabet for alle tredjelande;

for at forenkle beslutningerne med hensyn til de dyresundhedsbetingelser, der skal gaelde for indfoerslen af kvaeg og svin fra tredjelande, vil det vaere hensigtsmaessigt at have en enkelt, faelles beslutning, som indeholder protokollerne for veterinaerundersoegelser og betingelserne for godkendelse af markeder;

en beslutning vedroerende protokollerne for veterinaerundersoegelser og betingelser for godkendelse af markeder i tredjelande skal kun gaelde for et tredjeland, for hvilket der er blevet vedtaget en beslutning, som specielt vedroerer dyresundhedsbetingelserne i det paagaeldende land;

de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Veterinaerkomité -

VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING :

Artikel 1 1 . Ved denne beslutning indfoeres der protokoller for veterinaerundersoegelser og betingelser for godkendelse af

markeder i tredjelande til handel med dyr beregnet til udfoersel til Faellesskabet i forbindelse med indfoerslen af levende kvaeg og svin fra de tredjelande, der er optaget paa listen i bilaget til beslutning 79/542/EOEF .

2 . Kravene i bilag I og II til naervaerende beslutning gaelder kun for tredjelande, for hvilke der er blevet vedtaget en beslutning, som fastlaegger dyresundhedskravene i det enkelte tilfaelde efter artikel 8 i direktiv 72/462/EOEF .

Artikel 2 Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne .

Udfaerdiget i Bruxelles, den 25 . februar 1991 .

Paa Kommissionens vegne Ray MAC SHARRY Medlem af Kommissionen

( 1 ) EFT nr . L 302 af 31 . 12 . 1972, s . 28 .

( 2 ) EFT nr . L 46 af 19 . 2 . 1991, s . 37 .

( 3)EFT nr . L 146 af 14 . 6 . 1979, s . 15 .

( 4 ) EFT nr . L 276 af 27 . 9 . 1990, s . 46 .

BILAG I

PROTOKOLLER FOR STANDARDISERING AF MATERIALER OG PROEVEPROCEDURER KAPITEL I Kvaeg

1.Tuberkulose

Den enkelte intradermaltuberkulinproeve med kvaegtuberkulin foretages i overensstemmelse med bilag B til Raadets direktiv 64/432/EOEF af 26 . juni 1964 om veterinaerpolitimaessige problemer ved handel inden for Faellesskabet med kvaeg og svin( 1 ).

2.Brucellose

Serumagglutinationsproeven og komplementbindingsproeven foretages i overensstemmelse med bilag C, afsnit A og B, til direktiv 64/432/EOEF .

3.Enzootisk kvaegleukose

Agar-gel-immunodiffusionsproeven foretages i overensstemmelse med bilag G til direktiv 64/432/EOEF .

4.Bluetongue

A.Den blokerende eller kompetitive ELISA foretages efter foelgende protokol :

Den kompetitive ELISA med anvendelse af monoklonalt antistof 3-17-A3 kan paavise antistoffer mod alle kendte serotyper af bluetongue-virus ( BTV ).

Proeveprincippet er, at reaktionen mellem BTV-antigen og et gruppespecifikt monoklonalt antistof ( 3-17-A3 ) afbrydes ved tilsaetning af fortyndinger af proeveserum. Tilstedevaerende antistoffer mod BTV i proeveserumet blokerer reaktionsevnen hos det monoklonale antistof ( Mas ) og resulterer i en formindskelse af den forventede farveudvikling ved tilsaetning af enzymsubstrat .

Materialer og reagenser :

1.Fladbundede mikrotiterplader .

2.Antigen : tilberedes som beskrevet nedenfor .

3.Blokerende buffer : 5 % ( w/v ) »Marvel« toerret maelkepulver, 0,1 % ( v/v ) Tween-20 ( leveres som polyoxyethylensorbitanmonolauratsirup ) i PBS .

4.Monoklonalt antistof : 3-17-A3 ( leveres som hybridom cellekultur supernatant ), opbevaret ved -20 °C eller frysetoerret, fortyndet i forholdet 1:50 med blokerende buffer inden brug, rettet mod det gruppespecifikke polypeptid p7 .

5.Konjugat : kanin-antimuseglobulin ( adsorberet og elueret ), konjugeret med peberrodsperoxidase og opbevaret i moerke ved 4 °C .

6.Substrat og kromogen : 0,2 g ortophenylendiamin ( OPD ) oploest i en buffer bestaaende af 2,553 g citronsyre og 4,574 g dinatriumhydrogenortophosphat tilsat destilleret vand op til 500 ml, opdelt i 25 ml alikvoter og opbevaret i moerke ved -20 °C med tilsaetning af 12ìl/ml hydrogenperoxid ( 3 % w/v ) umiddelbart inden brug .

OPD omgaas med forsigtighed - Brug gummihandsker - Mistanke om mutagen .

7.1 Molar svovlsyre : 26,6 ml syre blandet i 473,4 ml destilleret vand .

Husk - bland altid syre i vand, aldrig vand i syre .

8.Orbitalryster .

9.ELISA-pladelaeser ( proeven kan aflaeses visuelt ).

Proeveformat

HGFEDCBABlind -

proeve

Antigen + konjugat

1

Mas -

kontrol

Antigen + Mas + konjugat

2

Positiv

kontrol

Antigen + positivt serum + Mas + konjugat

1/21/41/81/161/321/641/1281/256

3

Proevesera

1/21/41/81/161/21/41/81/16

4

5

6

Proeve -

sera

7

8

9

10

11

12

Proevekontrol

Blankproevekontrol

Raekke 1 A-H er en blankproevekontrol bestaaende af BTV-antigen og konjugat. Den kan anvendes som blindproeve for ELISA-laeseren .

Mas-kontrol

Raekke 2 A-H er den monoklonale antistofkontrol og bestaar af BTV-antigen, monoklonalt antistof og konjugat . Den udgoer en negativ kontrol . Middelvaerdien af absorbansaflaesningerne af denne kontrolraekke repraesenterer 0 % haemning .

Positiv kontrol

Raekke 3 A-H er den positive kontrol . Den bestaar af BTV-antigen, BTV-positive antiserumfortyndinger, Mas og konjugat . Den tjener som indikator for, at proeven fungerer ordentligt, og der boer opnaas samstemmende haemningsniveauer fra proeve til proeve .

Proevesera

I ovenstaaende proeveformat kan der afproeves 18 sera fortyndet i forholdet 1:2, 1:4, 1:8 og 1:16 . Dette vil vise noget om antistoftiteret i proeveserumet . Fortyndingsraekken kan gaa laengere, saaledes at titrene for serumfortynding naar slutpunktet . Som et alternativ kan sera, naar det gaelder serologiske undersoegelser i stor skala, proeves i en enkelt fortynding ( 1:4 ) eller to fortyndinger ( 1:2 og 1:4 ) som en hurtig screeningtest .

Procedure

1.BTV-antigen fortyndes til praetitreret fortynding i PBS, der sonikeres et oejeblik for at sprede akkumuleret virus ( hvis der ikke findes nogen sonikator, pippeteres der kraftigt ), og der tilfoeres 50 ìl til alle huller i ELISA-pladen . Der bankes paa pladens sider for at sprede antigenet .

2.Der inkuberes ved 37 °C i 60 minutter i en orbitalryster . Pladerne vaskes tre gange ved overskylning og toemning af hullerne med usterilt PBS, og de trykkes af med klatpapir .

3.Der tilsaettes 50 ìl blokerende buffer pr . hul . Proevesera og positivt serum haeldes i de relevante huller, og der fortyndes hen over pladen ved hjaelp af en multikanalpipette . Sera maa ikke tilsaettes blankproevekontrollen eller Mas-kontrollen .

4.Straks efter tilsaetningen af proeveseraene fortyndes Mas i blokerende buffer ( for at praetitrere fortyndingen ), og der haeldes 50 ìl i alle pladens huller, undtagen naar det gaelder blindproevekontrollen .

5.Der inkuberes ved 37 °C i 60 minutter i en orbitalryster . Der vaskes tre gange med PBS og trykkes af med klatpapir .

6.Kanin-antimusekoncentrat fortyndes til 1:5 000 i blokerende buffer, og der haeldes 50 ìl i alle pladens huller .

7.Der inkuberes ved 37 °C i 60 minutter i en orbitalryster . Der vaskes tre gange med PBS og trykkes af med klatpapir .

8.OPD optoes, og umiddelbart inden brug tilsaettes hver 25 ml OPD 12 ìl 30 % hydrogenperoxid . 50 ìl haeldes i alle pladens huller . Man lader farven udvikle sig i ca. 10 minutter og standser reaktionen med 1 M svovlsyre ( 50 ìl pr . hul .). Farven skal udvikle sig i Mas-kontrolhullerne og i de huller, der ikke indeholder sera med antistof mod BTV .

9.Hullerne undersoeges og registreres enten visuelt eller ved hjaelp af en spektrofotometrisk laeser .

Analyse af resultater

Middel-OD-aflaesningen beregnes ud fra MAS-kontrollerne . Dette repraesenterer haemningsvaerdien paa 0 %. Absorbansaflaesninger af proeveseraene udtrykkes i procent haemningsvaerdier ved hjaelp af foelgende formel :

Procent haemningsvaerdi = 100 - OD ved tilstedevaerelse af proeveserumOD ved fravaer af proeveserum × 100 .

Haemningsvaerdier paa over 40 % ved en serumfortynding paa 1:4 betragtes som positive . Visuel aflaesning er mulig, da 40 % haemning er den laveste vaerdi, der let kan ses med det blotte oeje .

Tilberedning af BTV ELISA-antigen

1.10 roux sammenflydende BHK-21 celler vaskes tre gange med serumfrit Eagle's medium, og der inficeres med bluetongue-virus serotype 1 i serumfrit Eagle's medium .

2.Der inkuberes ved 37 °C og undersoeges daglig for cytopatisk effekt ( cpe ).

3.Naar der kan konstateres cpe i 80-90 % af cellelaget i hver roux, indsamles viruset ved, at eventuelle celler, der stadig sidder paa glasset, rystes af .

4.Der centrifugeres ved 2 000-3 000 rpm for at sammenpresse cellerne .

5.Supernatanten fjernes, og cellerne genopslaemmes i ca . 30 ml PBS, som indeholder 1 % »Sarkosyl« og 2 ml phenolmetylsulfonylfluorid lysisbuffer ). Dette kan bevirke, at cellerne danner en gel, og der kan tilsaettes mere lysisbuffer for at reducere denne effekt .

Anmaerkning : Phenylmetylsulfonylfluorid er skadeligt - behandles med stoerste forsigtighed .

6.Cellerne spraenges i 60 sekunder ved hjaelp af en ultralydsonde med en amplitude paa 30 micron .

7.Der centrifugeres ved 10 000 rpm i 10 minutter .

8.Supernatanten opbevares ved +4 °C, og den resterende cellemasse genopslaemmes i 10-20 ml lysisbuffer .

9.Der sonikeres og foretages en klaring, idet supernatanten opbevares paa hvert stadium, i alt tre gange .

10.Supernatanterne samles og centrifugeres ved 24 000 rpm i 120 minutter ved +4 °C paa en 5 ml pude bestaaende af 40 % sakkarose ( w/v i PBS ) ved hjaelp af 30 ml Beckman centrifugeglas og en SW 28 rotor .

11.Supernatanten fjernes, glassene toemmes helt, og massen genopslaemmes i PBS ved hjaelp af sonikering . Antigenet opbevares i alikvoter ved -70 °C .

Titrering af BTV ELISA-antigen

Bluetongue ELISA-antigen titreres ved hjaelp af den indirekte ELISA . Tofoldfortyndinger af antigen titreres over for en konstant fortynding ( 1:50 ) af monoklonalt antistof 3-17-A3 . Protokollen er som foelger:

Procedure :

1.BTV antigen fortyndes i PBS over mikrotiterpladen i en todobbelt fortyndingsraekke ( 50 ìl/hul ) ved hjaelp af en multikanalpipette .

2.Der inkuberes 1 time ved 37 °C i en orbitalryster .

3.Pladerne vaskes tre gange med PBS .

4.Der tilsaettes hvert hul i mikrotiterpladen 50 ìl monoklonalt antistof 3-17-A3 ( fortyndet 1:50 ).

5.Der inkuberes 1 time ved 37 °C i en orbitalryster .

6.Pladerne vaskes tre gange med PBS.

7.Der tilsaettes hvert hul i mikrotiterpladen 50 ìl kanin-antimuseglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase fortyndet til en praetitreret optimal koncentration .

8.Der inkuberes 1 time ved 37 °C i en orbitalryster .

9.Der tilsaettes substrat og kromogen som tidligere beskrevet . Reaktionen standses efter 10 minutter ved tilsaetning af 1 Molar svovlsyre ( 50 ìl/hul ).

I den kompetitive proeve skal det monoklonale antistof vaere i overskud, og der vaelges derfor en fortynding af antigen, som ligger paa titreringskurven ( ikke paa den flade del ), hvilket giver ca. 0,8 OD efter 10 minutter .

B.Agar-gel-immunodiffusionsproeven foretages efter foelgende protokol :

Materialer og reagenser

Antigen :

Antigen, der bundfaeldes, tilberedes i et cellekultursystem, der taaler den hurtige formering af en referencestamme af bluetongue-virus . BHK eller Vero-celler anbefales . Antigen forekommer i supernatantvaesken, naar virusets vaekst er ophoert, men kraever en koncentration paa 50 til 100 gange for at vaere effektivt . Dette kan opnaas ved hjaelp af enhver standardprocedure for proteinkoncentrering . Virus i antigenet kan inaktiveres ved tilsaetning af 0,3 % ( v/v ) betapropiolaktion .

Kendt positivt kontrolserum :

Ved hjaelp af det internationale referenceserum og antigen fremstilles et nationalt standardserum, der standardiseres i det optimale forhold som for det internationale referenceserum, frysetoerres og anvendes som det kendte kontrolserum i hver enkelt proeve .

Proeveserum

Procedure :

1 % agarose tilberedt i borat eller natriumbarbitolbuffer, pH 8,5 til 9,0 haeldes i en petriskaal op til mindst 3,0 mm .

Der skaeres et proevemoenster paa syv fugtfri huller paa hver 5,0 mm diameter i agaren . Moenstret bestaar af et centerhul og seks huller, der er anbragt rundt om det i en cirkel med en radius paa 3 mm .

Centerhullet fyldes med standardantigenet . De ydre huller 2, 4 og 6 fyldes med kendt positivt serum og hul 1, 3 og 5 fyldes med proevesera .

Systemet inkuberes i indtil 72 timer ved stuetemperatur i et lukket fugtigt kammer .

Fortolkning :

Et proeveserum er positivt, hvis det danner en specifik bundfaeldninglinje med antigenet og danner en ubrudt identitetslinje med kontrolserumet . Et proeveserum er negativt, hvis det ikke danner en specifik linje med antigenet og det ikke krummer kontrolserumets linje. Petriskaale boer undersoeges mod en moerk baggrund ved indirekte belysning .

5.Epizootisk haemoragisk sygdom

Agar-gel-immunodiffusionsproeven foretages efter foelgende protokol :

Materialer og reagenser

Antigen :

Antigen, der bundfaeldes, tilberedes i et cellekultursystem, der taaler den hurtige formering af den/de paagaeldende serotype/r epizootisk haemoragisk sygdomsvirus . BHK eller Vero-celler anbefales . Antigen forekommer i supernatantvaesken, naar virusets vaekst er ophoert, men kraever en koncentration paa 50 til 100 gange for at vaere effektivt . Dette kan opnaas ved hjaelp af enhver standardprocedure for proteinkoncentrering. Virus i antigenet kan inaktiveres ved tilsaetning af 0,3 % ( v /v ) betapropiolaktion .

Kendt positivt kontrolserum :

Ved hjaelp af det internationale referenceserum og antigen fremstilles et nationalt standardserum, der standardiseres i det optimale forhold som for det internationale referenceserum, frysetoerres og anvendes som det kendte kontrolserum i hver enkelt proeve .

Proeveserum

Procedure :

1 % agarose tilberedt i borat eller natriumbarbitolbuffer, pH 8,5 til 9,0 haeldes i en petriskaal op til mindst 3,0 mm .

Der skaeres et proevemoenster paa syv fugtfri huller paa hver 5,0 mm diameter i agaren . Moenstret bestaar af et centerhul og seks huller, der er anbragt rundt om det i en cirkel med en radius paa 3 mm .

Centerhullet fyldes med standardantigenet . De ydre huller 2, 4 og 6 fyldes med kendt positivt serum og hul 1, 3 og 5 fyldes med proevesera .

Systemet inkuberes i indtil 72 timer ved stuetemperatur i et lukket fugtigt kammer .

Fortolkning :

Et proeveserum er positivt, hvis det danner en specifik bundfaeldninglinje med antigenet og danner en ubrudt identitetslinje med kontrolserumet . Et proeveserum er negativt, hvis det ikke danner en specifik linje med antigenet og det ikke krummer kontrolserumets linje . Petriskaale boer undersoeges mod en moerk baggrund ved indirekte belysning .

6.Leptospirose

Den mikroskopiske agglutinationsproeve foretages efter foelgende protokol :

Kulturer :

Dyrkes i Korthofs eller EMJH-substrat ved 30 °C .

Antigen :

Indeholder 2 × 108 organismer pr . ml kultursubstrat .

Procedure :

Lige dele antigen og serum blandes i fladbundede mikrotiterplader og inkuberes ved 30 °C i to timer eller 37 °C i 1 - 1 1/2 time . Proeven aflaeses ved laveffekt moerkefeltbelysning med en forstoerrelse paa mellem

60 og 100 .

Fortolkning :

Et negativt resultat er under 50 % agglutination ved en oploesning paa 1:50 .

7.Smitsom bovin rhinotracheitis/infektioes pustular vilvovaginitis

Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve udfoeres i mikrotiterplader under anvendelse af MDBK eller andre foelsomme celler . Colorado, Oxford eller en anden referencestamme af viruset benyttes ved 100 TCID50 pr . 0,025 ml; inaktiverede, ufortyndede serumproever blandes med en tilsvarende maengde ( 0,025 ml ) virussuspension . Virus/serumblandingerne inkuberes to timer ved 37 °C i mikrotiterpladerne, foer MDBK-cellerne tilsaettes . Der benyttes celler i en koncentration, som danner et fuldstaendigt éncellelag efter 24 timer .

Kontrol :

- Virusinfektivitetsproeve

- Serumtoksicitetskontrol

- Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

- Referenceantisera .

Fortolkning :

Resultaterne af neutralisationsproeven og titeret for det virus, som benyttes ved proeven, aflaeses efter 3-6 dages inkubation ved 37 °C . Serumtitere regnes for negative, hvis der ikke sker nogen neutralisering ved en oploesning paa 1:2 ( ufortyndet serum ).

8.Bovin virusdiarré ( BVD )

A.Virusisolationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Proevemateriale og paavisningsmetoder :

Der anvendes serum, suspensioner af crusta phlogistica eller blodkoagel fra nyindsamlede, ikke varmeinaktiverede blodproever af mindst seks maaneder gammelt kvaeg . Der benyttes en immunologisk farvningsprocedure saasom den fluorescerende antistofmetode ( FA ) eller en enzym-kaede-immunitet-maaling, f . eks . immunoperoxidase ( IPX ), til paavisning af BVD-virus i podede kulturer .

Proevereagens :

Til FA-proeven kraeves et FITC-konjugeret specifikt BVD-antiserum . Til IPX-proeven kraeves et ukonjugeret anti-BVD-serum af kvaeg, et peroxidasekonjugeret antibovint antiserum og passende enzymsubstrat ( f.eks . 3-amino-9-ethylkarbazol). Et anti-BVD-serum fra andre arter end kvaeg kan anvendes, forudsat at peroxidasekonjugatet er rettet imod serumglobuliner af den paagaeldende art . Alle antivirale sera skal have kendt specificitet og et bredt reaktionsomraade .

Procedure :

Til proeven anvendes foelsomme celler saasom bovint turbinat, kalvenyre eller kalvetestis, der er frie for endogent BVD-virus .

Serumproever - proeveserum og vaevsdyrkningsceller anbringes i daekglaskulturer eller i huller i mikrotiterplader eller andre beholdere, saa serumslutfortyndingen er paa 10 %.

Crusta phlogistica og blodkoagel - proeverne tilsaettes til sammenflydende éncellelagskulturer i 1 time ved 37 °C, hvorefter kulturerne vaskes og paahaeldes kulturmedium med 10 % BVD-frit foetalt kalveserum .

Kulturerne inkuberes derefter ved 37 °C og fikseres og farves efter FA - eller IPX-metoden .

Kontrol :

- Positiv BVD-viruskontrol,

- Negativ kontrol uden tilsat virus .

Fortolkning :

FA-proeven farves efter 4-6 doegns inkubation og aflaeses i ultraviolet lys . Fluorescens i celler, der er inkuberet med proeven, fortolkes som et positivt resultat .

IPX-proeven farves efter 4 doegns inkubation og aflaeses ved lysmikroskopi . Moerkebrun farvning af nogle af cellernes cytoplasma fortolkes som et positivt resultat .

B.Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve i mikrotiterplader foretages ved hjaelp af egnede, seriopformerede foelsomme bovine celler ( f . eks . bovine turbinatceller som beskrevet af McClurkin m.fl ., 1974, Arch . Ges . Virusforsch ., 45, 285-289 ).

Det er vigtigt, at alle reagenser og celler er fri for kontaminerende, tilfaeldigt forekommende ikke-cytopatiske BVD/MD-virus .

Proevevirus, som kan vaere enhver egnet cytopatisk referencestamme ( f.eks . NADL -stammen ), anvendes i en koncentration paa i gennemsnit 100 infektive cellekulturdoser pr . 0,025 ml . Fortyndinger af inaktiverede sera blandes med tilsvarende maengder virussuspension ( 0,025 ml ), og virus/serumblandingerne inkuberes i 1 time ved 37 °C, foer der tilsaettes tilsvarende maengder cellesuspension . Der benyttes celler i en koncentration, som danner et fuldstaendigt éncellelag inden for 2 doegn .

Kontrol :

- Virusinfektivitetsproeve

- Serumtoksicitetskontrol

- Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

- Referenceantisera .

Fortolkning :

Med NADL-virusstammen er det optimale tidspunkt for aflaesning efter 5 doegns inkubation ved 37 °C .

Et gennemsnitligt neutralisationstiter paa 1:10 anses for at indicere en immunreaktion paa en tidligere akut infektion .

9.Maelkeanalyse til paavisning af mastitis

Maelkeanalysen foretages i overensstemmelse med bilag D til direktiv 64/432/EOEF .

10.Mund - og klovesyge ( M & K )

A.Indsamling og proevning af proever af oesofagus/farynks foretages efter foelgende protokol :

Reagenser :

Inden proeven tages, tilberedes et transportmedium . Der fordeles 2 ml i lige saa mange beholdere som det antal dyr, der skal proeves . Beholderne boer vaere frysefaste i toeris eller flydende nitrogen .

Der indsamles proever ved hjaelp af en specialkonstrueret spytkollektor eller »probang «.

Proeven indsamles ved, at probangskaalen foeres gennem munden over tungens dorsum og ned i den oevre del af oesofagus . Der goeres forsoeg paa at bortskrabe overfladeepitelet fra oevre oesofagus og farynks ved bevaegelser lateralt og dorsalt . Derefter fjernes probang, helst efter, at dyret har svaelget . Skaalen boer vaere fuld og indeholde en blanding af slim, spyt, oesofagusvaeske og celleaffald . Man maa soerge for, at hver proeve indeholder noget synligt cellemateriale . Haardhaendet behandling, der foraarsager bloedninger, skal undgaas .

Proever fra nogle dyr kan vaere staerkt forurenet med vomindhold . Saadanne proever kasseres, og dyrets mund skylles med vand eller helst fysiologisk saltvand, inden proevningen gentages .

Behandling af proever :

Hver proeve i probangskaalen kvalitetsundersoeges, og der tilsaettes 2 ml til en tilsvarende maengde transportmedium i en frysefast beholder . Beholderne lukkes taet, forsegles, desinficeres og maerkes . Proeverne opbevares koeligt (+ 4 °C ) og undersoeges inden for 3-4 timer eller anbringes paa toeris (- 69 °C ) eller i flydende nitrogen og holdes nedfrosne indtil undersoegelsestidspunktet .

For hvert dyr desinficeres probang og vaskes i tre hold rent vand .

Proevning for M & K-virus :

Proeverne podes i kulturer af primaere bovine thyreoidcellekulturer med brug af mindst tre reagensglas pr. proeve . Andre foelsomme celler, f.eks . primaere bovine eller porcine nyreceller, kan bruges, men man boer huske, at de er mindre foelsomme over for nogle stammer af M & K-virus . Reagensglassene inkuberes ved 37 °C i en tromble og undersoeges daglig i 48 timer for cytoplastisk effekt ( cpe ). Hvis resultatet er negativt, overfoeres kulturerne blindt til nye kulturer og undersoeges igen i 48 timer . Eventuel cpe's specificitet skal bekraeftes .

Anbefalet transportmedium :

1.0,08 M phosphatbuffer pH 7,2 med 0,01 % bovint serumalbumin, 0,002 % phenolroedt og antibiotika .

2.Vaevsdyrkningsmedium ( f.eks . Eagle's MEM ) med 0,04 M HEPES-buffer, 0,01 % bovint serumalbumin og antibiotika, pH 7,2 .

Antibiotika ( pr . ml slutprodukt ) boer tilsaettes transportmediet f.eks .

penicillin1 000 IU

neomycinsulfat100 IU

polymyxin-B-sulfat50 IU

mycostatin100 IU .

B.Virusneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Reagenser :

Stam-M & KV-antigen tilberedes i cellekulturer eller paa kalvetunger og opbevares ved -70 °C eller derunder eller ved -20 °C, efter at der er tilsat 50 % glycerol . Dette er stamantigenet . M & KV er stabilt under disse forhold, og titrene varierer meget lidt i en periode paa flere maaneder .

Procedure :

Proeven foretages i fladbundede mikrotiterplader af vaevskulturgrad med brug af foelsomme celler saasom IB-RS-2, BHK-21 eller kalvenyreceller .

Sera til proeven fortyndes 1:4 i serumfrit cellekulturmedium med tilsaetning af 100 IU/ml meomycin eller andre egnede antibiotika . Sera inaktiveres ved 56 °C i 30 minutter, og der anvendes maengder paa 0,05 ml til tilberedning af en dobbeltserie i mikrotiterplader med brug af 0,05 ml fortyndingsoeser . Praetitreret virus, der ogsaa er fortyndet i serumfrit kulturmedium og indeholder 100 TCID50/0,05 ml tilsaettes derefter til hvert hul . Efter inkubation ved 37 °C i 1 time, saa neutralisering kan finde sted, tilsaettes 0,05 ml suspensionsceller med 0,5 - 1,0 × 106 celler pr . 1 ml i cellekulturmedium indeholdende serumfrit M & K-antistof til hvert hul, og pladerne forsegles .

Pladerne inkuberes ved 37 °C . Encellelag er normalt sammenflydende inden for 24 timer . Cpe er normalt tilstraekkeligt fremskredet efter 48 timer til, at der kan foretages en mikroskopisk aflaesning af proeven . Paa dette tidspunkt kan der foretages en endelig mikroskopisk aflaesning, eller pladerne kan fikseres og farves med henblik paa en makroskopisk aflaesning, f.eks . ved hjaelp af 10 % formaldehyd og 0,05 % metylenblaat .

Kontrol :

Kontrollen af hver proeve omfatter homologt antiserum med kendt titer, en cellekontrol, en serumtoksicitetskontrol, en mediekontrol og en virustitrering, som danner grundlag for beregningen af den faktiske maengde virus i proeven .

Fortolkning :

Huller, der viser tegn paa cpe, betragtes som inficeret, og neutralisationstitrene udtrykkes som den reciprokke af den endelige fortynding af serum, der er til stede i serum/virusblandingerne ved 50 %-slutpunkterne, der bestemmes efter Spearmen-Karber-metoden ( Karber, G ., 1931, Archiv fuer Experimentelle Pathologie und Pharmakologie, 162, 480 ).

Proever betragtes som paalidelige, naar den faktisk anvendte virusmaengde pr . hul i proeven er paa mellem 101,5 og 102,5 TCID50, og naar referenceserumtiteret ligger inden for det todobbelte af det forventede titer vurderet ud fra tidligere titreringers modus . Naar kontrolresultaterne overskrider disse graenser, gentages proeverne .

Et slutpunkttiter paa 1:11 eller derunder betragtes som negativt .

C.Paavisningen og kvantificeringen af antistof ved hjaelp af ELISA foretages efter foelgende protokol :

Reagenser :

Kaninantiserum mod 146S-antigen af syv typer mund og klovesygevirus ( M & KV ) benyttet i en forud fastlagt optimal koncentration i karbonat/bikarbonatbuffer, pH 9,6 .

Antigener fremstilles af udvalgte virusstammer, der er dyrket paa BHK-21 énlagsceller . Der benyttes urensede supernatanter, som praetitreres efter protokollen, men uden serum, saaledes at der fremkommer en fortynding, som efter tilsaetning af en tilsvarende maengde PBST ( phosphatbufferet salt med 0,05 % Tween-20 og phenolroed indikator ) giver en absorbansaflaesning paa mellem 1,2 og 1,5 . Viraene kan anvendes inaktiveret . Der benyttes PBST som fortyndingsmiddel . Der tilberedes marsvineantisera ved indpodning af marsvin med 146S-antigen af hver serotype . Der fremstilles en forud fastlagt optimal koncentration i PBST med 10 % normalt bovint serum og 5 % normalt kaninserum .

Kanin-antimarsvineimmunuglobulin, der er konjugeret med peberrodsperoxidase, anvendes i en forud fastlagt optimal koncentration i PBST med 10 % normalt bovint serum og 5 % normalt kaninserum .

Proevesera fortyndes i PBST .

Procedure :

1.ELISA-plader belaegges med 50 ìl antivirale kaninsera natten over i et fugtigt kammer ved stuetemperatur .

2.50 ìl af en ekstra dobbeltserie af hvert proeveserum begyndende med 1:4 tilberedes i rundbundede flerhulsplader ( baereplader ). 50 ìl af en konstant dosis antigen tilsaettes til hvert hul, og blandingerne henstaar natten over ved 4 °C . Tilsaetningen af antigenet nedsaetter startserumfortyndingen til 1:8 .

3.ELISA-pladerne vaskes 5 gange med PBST .

4.50 ìl serum/antigenblandinger overfoeres derefter fra baerepladerne til de kaninserumbelagte ELISA-plader og inkuberes ved 37 °C i 1 time i en orbitalryster :

5.Efter vaskning tilstaettes 50 ìl marsvineantiserum mod det i punkt 4 anvendte antigen til hvert hul. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 1 time i en orbitalryster .

6.Pladerne vaskes, og 50 ìl kanin-antimarsvineimmunoglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase tilsaettes til hvert hul . Pladerne inkuberes ved 37 °C i 1 time i en orbitalryster .

7.Pladerne vaskes, og 50 ìl ortofenylendiamin med 0,05 % H2O2 ( 30 %) w/v tilsaettes til hvert hul .

8.Reaktionen standses efter 15 minutter med 1,25 M H2SO4 .

Pladerne aflaeses spektrofometrisk ved 492 nm paa en ELISA-laeser, der er forbundet med en mikrodatamat .

Kontrol :

- For hvert anvendt antigen indeholder 40 huller intet serum, men indeholder antigen fortyndet i PBST .

- En ekstra dobbelt fortyndingsserie af homologt bovint referenceantiserum .

- En ekstra dobbelt fortyndingsserie af negativt bovint serum .

Fortolkning :

Antistoftitere udtrykkes som den endelige fortynding af proeveserum, der giver 50 % af den middel-OD-vaerdi, der registreres i viruskontrolhullerne uden tilstedevaerelse af proeveserum . Titere ud over 1:40 betragtes som positive .

Referencer :

Hamblin C . Barnett ITR and Hedger RS ( 1986 ) - A new enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus . I. Development and method of ELISA . Journal of Immunological Methods, 93, 115-121.11 .

KAPITEL II Svin

1.Tuberkulose

Den enkelte intradermaltuberkulinproeve med fjerkraetuberkulin foretages i overensstemmelse med bilag B til Raadets direktiv 64/432/EOEF , dog skal injektionsstedet vaere den slappe hud ved oereroden.

2.Brucellose

Serumagglutinationsproeven og komplementbindingsproeven foretages i overensstemmelse med bilag C, afsnit A og B, til Raadets direktiv 64/432/EOEF .

3.Aujeszky's sygdom

Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve udfoeres i mikrotiterplader under anvendelse af Vero eller andre foelsomme cellekulturer . Aujeszky's sygdomsvirus benyttes ved 100 TCID50 pr . 0,025 ml; inaktiverede, ufortyndede serumproever blandes med en tilsvarende maengde ( 0,025 ml ) virussuspension . Virus/serumblandingerne inkuberes i 2 timer ved 37 °C i mikrotiterpladerne, foer de til formaalet kraevede celler tilsaettes . Der benyttes celler i en koncentration, som danner et fuldstaendigt éncellelag efter 24 timer .

Kontrol :

-Virusinfektivitetsproeve

-Serumtoksicitetskontrol

-Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

-Referenceantisera .

Fortolkning :

Resultaterne af neutralisationsproeven og titeret for det virus, som benyttes ved proeven aflaeses efter 3-7 dages inkubation ved 37 °C . Serumtitere under 1:2 ( ufortyndet serum ) regnes for negative .

4.Overfoerbar gastroenteritis

Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve udfoeres i mikrotiterplader under anvendelse af A72 ( hundetumor ) celler eller andre foelsomme cellekultuer . TGE-virus benyttes ved 100 TCID50 pr . 0,025 ml; inaktiverede ufortyndede serumproever blandes med en tilsvarnede maengde ( 0,025 ml ) virussuspension . Virus/serumblandingerne inkuberes i 30-60 minutter ved 37 °C i mikrotiterpladerne, inden de til formaalet kraevede celler tilsaettes . Der benyttes celler i en koncentration, der danner et komplet éncellelag efter 24 timer . Der tilsaettes 0,1 ml cellesuspension til hver celle .

Kontrol :

-Virusinfektivitetsproeve

-Serumtoksicitetskontrol

- Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

- Referenceantisera .

Fortolkning :

Resultaterne af neutralisationsproeven og titeret for det i proeven benyttede virus aflaeses efter 3-5 dages inkubation ved 37 °C . Serumtitere under 1:2 ( endelig fortynding ) betragtes som negative . Hvis ufortyndede serumproever er toksiske over for vaevskulturerne, kan disse sera fortyndes 1:2, inden de benyttes til proeven . Dette svarer til 1:4 endelig serumfortynding . Serumtitere under 1:4 ( endelig fortynding ) betragtes som negative i disse tilfaelde .

5.Svineinfluenza

Agglutinationshaemningsproeven foretages efter foelgende protokol :

Procedure :

Proeverne udfoeres efter standardmetoder ( US Department of Health, Education and Welfare, Immunology series No 6 ).

For at nedbryde uspecifikke haemmende stoffer boer svineserum behandles med enten receptornedbrydende enzym ( Vibrio cholerae-filtrat ) natten over ved 37 °C efterfulgt at opvarmning ved 56 °C i 30 minutter for at standse yderligere enzymaktivitet eller ved behandling med 25 % kaolin natten over ved 4 °C ( Clark and Casals, 1958, American Journal of Tropical Medecine and Hygiene, 7, 561 ).

Efter absorbering med en 10 % suspension af kyllingeerythrocyter i 1 time ved 37 °C afproeves seraene paa 4 haemningsagglutionsenheder af det relevante virus under anvendelse af 1 % kyllingeerythrocyter . Virus og serum holdes i kontakt i 60 minutter ved stuetemperatur, foer erythrocyterne tilsaettes .

Fortolkning :

Titere paa 1:10 eller derover betragtes som positive :

6.Mund - og klovesyge

Proever for mund - og klovesyge hos svin foretages efter protokollerne i kapitel I, punkt 10 .

7.Smitsom blaereudslet hos svin

Serumneutralisationsproeven foretages efter foelgende protokol :

Serum :

Alle sera varmeinaktiveres ved 56 °C i 30 minutter foer brugen .

Procedure :

Den konstante virusvariable serumneutralisationsproeve foretages i mikrotiterplader under anvendelse af IB-RS-2-celler eller andre foelsomme cellekulturer . Der benyttes UKG 27/72 eller enhver anden virusreferencestamme ved 100 TCID50 pr . 0,025 ml . Sera til proeven fortyndes 1:4 og inaktiveres, og der tilberedes en dobbelt fortyndingsserie . Serumproeverne blandes med en tilsvarende maengde virussuspension og inkuberes i 1 time ved 37 °C i mikrotiterpladerne, inden der tilsaettes 0,025 ml cellesuspension indeholdende 3 × 106 celler/ml .

Kontrol :

- Virusinfektivitetsproeve

- Serumtoksicitetskontrol

- Kontrol af endnu ikke podet cellekultur

- Referenceantisera .

Fortolkning :

Resultaterne af neutralisationsproeven og titeret for det til proeven benyttede virus aflaeses efter 3 dages inkubation ved 37 °C . Serumtitere betragtes som negative, hvis der ikke sker en neutralisering med en fortynding paa 1:11 .

8.Klassisk svinepest

Proever for klassisk svinepest foretages efter bilag I til Raadets direktiv 80/217/EOEF(2 ).

9.Leptospirose

Proever for leptospirose hos svin foretages efter kapitel I, punkt 6, i dette bilag .

( 1 ) EFT nr . 121 af 29 . 7 . 1964, s . 1977/64 .

( 2 ) EFT nr . L 47 af 21 . 2 . 1980, s . 11 .

BILAG II

MINDSTEKRAV FOR GODKENDELSE AF MARKEDER TIL HANDEL MED KVAEG OG SVIN BEREGNET TIL UDFOERSEL TIL DET EUROPAEISKE FAELLESSKAB 1.Markederne er under tilsyn af en embedsdyrlaege .

2.Markederne ligger centralt i et omraade med en diameter paa 20 km, hvori der ifoelge officielle fund i mindst 30 dage forud for deres brug som godkendte markeder ikke er forekommet noget tilfaelde af mund - og klovesyge og - hvis markederne er godkendt for svin - ikke noget tilfaelde af svinepest, blaeresyge hos svin eller porcin enteroviral encephalomyelitis ( Teschenersyge ).

3.Inden markederne godkendes til brug som godkendte markeder, rengoeres og desinficeres de med et desinficeringsmiddel, der er officielt godkendt i udfoerselslandet som vaerende effektivt i bekaempelsen af de i krav nr . 2 omhandlede sygdomme .

4.Samlepladser, indladningspladser eller andre steder, som kvaeg eller svin beregnet til udfoersel til Det Europaeiske Faellesskab eventuelt kan passere, skal opfylde krav nr . 1, 2 og 3 i dette bilag .

5.At kvaeg og alle svin, der passerer godkendte markeder, skal opfylde de sundhedskrav, der er stillet for indfoersel af den paagaeldende dyrekategori til Det Europaeiske Faellesskab .

6.Dyr, der skal udfoeres til Det Europaeiske Faellesskab, og som passerer godkendte markeder, skal inden seks dage derefter indlades og direkte forsendes til udfoerselslandets graense

a)uden at komme i beroering med andre klovdyr end kvaeg og svin, der opfylder de sundhedskrav, der er stillet for indfoersel af den paagaeldende dyrekategori til Det Europaeiske Faellesskab

b)opdelt i forsendelser, saaledes at ingen forsendelse indeholder baade avls - og brugsdyr og dyr til oejeblikkelig slagtning

c)transporteret i transportkoeretoejer eller containere, som forinden er blevet rengjort og desinficeret med et desinficeringsmiddel, der er officielt godkendt i udfoerselslandet som vaerende effektivt i bekaempelsen af de i krav nr . 2 omhandlede sygdomme, og vaere saaledes konstrueret, at ekskrementer, urin, stroeelse eller foder ikke kan flyde eller falde ud af koeretoejet under transporten .

7.Hvis betingelserne for udfoersel af dyr til Faellesskabet kraever, at der foretages en undersoegelse inden for en fastlagt periode inden indladning, omfatter denne periode enhver periode for samling - indtil seks dage - efter at dyrene har passeret godkendte markeder .

8.Udfoerselslandet udpeger de markeder, der godkendes for avls - og brugsdyr, og de markeder, der godkendes for slagtedyr, og meddeler Kommissionen og medlemsstaternes kompetente centrale myndigheder saadanne markeders navn og adresse .

9.Udfoerselslandet fastsaetter proceduren for officielt tilsyn med markeder, samlepladser og indladningspladser og soerger for, at et saadant tilsyn bliver foretaget .

10.Udfoerselslandet soerger for, at detaljer vedroerende markeder og samlepladser bliver givet i det relevante afsnit i sundhedscertifikatet, der ledsager dyr, som udfoeres til Det Europaeiske Faellesskab .