10)

Følgende tilføjes som kapitel C.27, C.28, C.29 og C.30: »C.27. TOKSICITETSTEST SEDIMENT/VAND PÅ CHIRONOMIDER MED FORURENET SEDIMENT INDLEDNING 1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 218 (2004). Formålet med denne test er at vurdere virkningerne på larver af ferskvandsdipteraen Chironomus sp., der lever i sediment, af forlænget eksponering for kemikalier. Den er baseret på de eksisterende toksicitetstestprotokoller for Chironomus riparius og Chironomus tentans, der er blevet udviklet i Europa (1) (2) (3) og Nordamerika (4) (5) (6) (7) (8) og ringtestet (1) (6) (9). Andre veldokumenterede chironomidarter kan også benyttes, f.eks. Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Eksponeringsscenariet i denne testmetode er spiking (forurening) af sediment med teststoffet. Valget af det mest velegnede eksponeringsscenario afhænger af, hvad testen skal anvendes til. Scenariet med sedimentspiking har til formål at simulere akkumulerede niveauer af kemikalier i sedimentet. Dette eksponeringssystem omfatter spiking af sediment i et sediment/vand-testsystem. 3. Stoffer, der skal testes i forbindelse med organismer, der lever i sediment, forefindes normalt i dette rum over længere tid. Organismer, der lever i sediment, kan eksponeres ad forskellige veje. Den relative vigtighed af den enkelte eksponeringsvej og den tid, der tager for hver enkelt at bidrage til de generelle toksiske virkninger, afhænger af de fysisk-kemiske egenskaber af det pågældende kemikalie. Ved stærkt adsorberende stoffer (f.eks. med log Kow > 5) eller ved stoffer, der kovalent bindes til sediment, kan indtagelse af kontamineret føde være en væsentlig eksponeringsvej. For ikke at undervurdere toksiciteten af højt lipofile stoffer kan det overvejes at tilsætte foder til sedimentet før tilsætning af teststoffet. For at tage alle potentielle eksponeringsveje i betragtning fokuserer denne testmetode på langtidseksponering. Testens varighed er 20-28 dage for C. riparius og C. yoshimatsui og 28-65 dage for C. tentans. Hvis der kræves korttidsdata til særlige formål, f.eks. for at undersøge virkningerne af et ustabilt kemikalie, kan yderligere replikater fjernes efter en periode på 10 dage. 4. De målte effektparametre er det samlede antal voksne, der har udviklet sig, og tiden, der er gået med udvikling. Det anbefales, at målinger af larvers overlevelse og vækst kun udføres efter en periode på 10 dage, hvis der kræves yderligere korttidsdata, ved hjælp af eventuelle yderligere replikater. 5. Det anbefales at anvende formuleret sediment. Der er flere fordele ved formuleret sediment i forhold til naturlige sedimenter: — udsvingene i forsøgene reduceres, idet der dannes en reproducerbar »standardiseret matrix«, og der er ikke brug for at finde ikke-kontaminerede og rene sedimentkilder — testene kan indledes på ethvert tidspunkt, uden at der opstår sæsonbetingede udsving i testsedimentet, og der er ikke behov for at forbehandle sedimentet med henblik på at fjerne hjemmehørende fauna; brugen af formuleret sediment reducerer også omkostningerne i forbindelse med opsamling af tilstrækkelige mængder sediment i felten til rutinetest — anvendelsen af formuleret sediment gør det muligt at sammenligne toksicitet og rangordne stoffer i overensstemmelse hermed. 6. De anvendte definitioner er anført i tillæg 1. TESTENS PRINCIP 7. Æglarver af chironomider eksponeres for et koncentrationsinterval af testkemikaliet i sediment/vand-systemer. Teststoffet tilsættes sedimentet, og æglarverne overføres derefter til bægerglas, hvor sediment- og vandkoncentrationerne er blevet stabiliseret. Emergens- og udviklingstiden for chironomider måles ved afslutningen af testen. Larvernes overlevelse og vægt kan om nødvendigt også måles efter 10 dage (ved brug af yderligere replikater). Disse data analyseres ved hjælp af en regressionsmodel for at anslå den koncentration, der vil forårsage en reduktion på × % i emergens, larveoverlevelse eller larvevækst (f.eks. EC15, EC50 osv.), eller ved hjælp af statistisk hypotesetest med henblik på at bestemme en NOEC/LOEC. Sidstnævnte kræver sammenligning af effektværdier med kontrolværdier ved hjælp af statistiske test. OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET 8. Teststoffets vandopløselighed, damptryk, målt eller beregnet, fordeling i sediment samt stabilitet i vand og sediment bør kendes. En pålidelig analysemetode til kvantificering af teststoffet i overliggende vand, porevand og sediment med kendt og publiceret nøjagtighed og nedre målegrænse bør foreligge. Nyttige oplysninger omfatter teststoffets strukturformel og renhed. Teststoffets kemiske skæbne (f.eks. spredning, abiotisk og biotisk nedbrydning osv.) er også nyttige oplysninger. For stoffer, der er vanskelige at teste som følge af deres fysisk-kemiske egenskaber, findes der yderligere vejledning i (12). REFERENCEKEMIKALIER 9. Referencekemikalier kan testes periodisk for at sikre, at testprotokollen og -betingelserne er pålidelige. Eksempler på referencetoksikanter, der er anvendt med godt resultat i ringtest og valideringsforsøg, omfatter lindan, trifluralin, pentachlorphenol, cadmiumchlorid og kaliumchlorid (1) (2) (5) (6) (13). TESTENS VALIDITET 10. Testens validitet forudsætter følgende: — emergensen i kontrolbeholderne skal være mindst 70 % ved testens afslutning (1) (6) — emergensen af C. riparius og C. yoshimatsui til voksne fra kontrolglassene skal ske mellem 12 og 23 dage efter deres overførsel til testglassene; for C. tentans kræves der en periode på 20-65 dage — ved testens afslutning måles pH og koncentrationen af opløst ilt i hvert bægerglas. Koncentrationen af opløst ilt skal være mindst 60 % af værdien for mætning med luft (ASV) ved den anvendte temperatur, og pH i det overliggende vand skal være i intervallet 6-9 i alle bægerglas — vandtemperaturen må højst variere med ± 1,0 °C. Vandtemperatur kan styres ved at anvende et isotermisk rum, og i det tilfælde bekræftes rumtemperaturen med passende tidsintervaller. BESKRIVELSE AF METODEN Testglas 11. Forsøget udføres i 600 ml bægerglas med en diameter på 8 cm. Andre beholdere kan anvendes, men de skal kunne sikre en passende dybde for det overliggende vand og sediment. Sedimentoverfladen skal være tilstrækkelig (2 til 3 cm2 pr. larve). Forholdet mellem dybden af sedimentlaget og dybden af det overliggende vand skal være 1:4. Testglas og andet udstyr, der kommer i berøring med testsystemet, skal være udført helt i glas eller andet kemisk inaktivt materiale (f.eks. Teflon). Valg af fiskeart 12. Den art, der skal benyttes i testen, er fortrinsvis Chironomus riparius. Chironomus tentans kan også anvendes, men er vanskeligere at håndtere og kræver en længere testperiode. Chironomus yohimatsui kan også anvendes. Detaljer om dyrkningsmetoder findes i tillæg 2 vedrørende Chironomus riparius. Oplysninger om dyrkningsbetingelser findes også for andre arter, dvs. Chironomus tentans (4) og Chironomus yoshimatsui (11). Identifikation af arten skal bekræftes inden testning, men kræves ikke før hver test, hvis organismer kommer fra en intern bestand. Sediment 13. Formuleret sediment (også kaldet rekonstitueret, kunstigt eller syntetisk sediment) bør fortrinsvis anvendes. Hvis naturligt sediment anvendes, skal det karakteriseres (som minimum ved hjælp af pH og organisk kulstofindhold, men andre parametre anbefales også, f.eks. C/N-forhold og kornstørrelse), og det bør være uden forurening og andre organismer, der kan konkurrere med eller æde chironomiderne. Inden naturligt sediment anvendes i en toksicitetstest på chironomider, bør det desuden konditioneres i syv dage under de betingelser, der anvendes i den efterfølgende test. Det anbefales at bruge følgende formulerede sediment, som er baseret på den syntetiske jord, der anvendes i testmetode C.8 (14), i denne test (1) (15) (16): a) 4-5 % (tørvægt) tørv: så tæt på pH 5,5 til 6,0 som muligt; det er vigtigt at bruge pulveriseret tørv, findelt (partikelstørrelse ≤ 1 mm) og kun lufttørret b) 20 % (tørvægt) kaolinholdigt ler, helst med over 30 % kaolinit c) 75-76 % (tørvægt) kvartssand (overvejende finsand med over 50 % af en partikelstørrelse på 50 til 200 μm) d) deioniseret vand tilsættes for at få et fugtindhold i den færdige blanding på 30-50 % e) kemisk rent calciumcarbonat (CaCO3) tilsættes for at få en pH-værdi i den færdige sedimentblanding på 7,0 ± 0,5. Det organiske kulstofindhold i den færdige blanding skal være 2 % (± 0,5 %), og det justeres ved brug af passende mængder tørv og sand som anført i litra a) og c). 14. Oprindelsen af tørv, kaolinler og sand skal være kendt. Det kontrolleres, at sedimentkomponenterne ikke indeholder kemisk forurening (f.eks. tungmetaller, organiske chlorforbindelser, organiske phosphorforbindelser osv.). Et eksempel på fremstilling af formuleret sediment er beskrevet i tillæg 3. Blanding af tørre bestanddele accepteres også, hvis det påvises, at der ikke sker en separation af sedimentets bestanddele efter tilsætning af overliggende vand (f.eks. at tørvepartikler flyder ovenpå), og at tørven eller sedimentet er tilstrækkeligt konditioneret. Vand 15. Til brug i testen kan anvendes vand, der er i overensstemmelse med de kemiske karakteristika for acceptabelt fortyndingsvand, som beskrevet i tillæg 2 og 4. Som dyrknings- og fortyndingsvand kan accepteres råvand (overflade- eller grundvand), rekonstitueret vand (se tillæg 2) eller afkloret ledningsvand, såfremt chironomider kan overleve i vandet i et tidsrum svarende til dyrknings- og testperioden uden at vise tegn på stress. Ved testens begyndelse skal testvandet have en pH-værdi på 6-9 og en hårdhedsgrad på højst 400 mg/l som CaCO3. Hvis der er formodning om en interaktion mellem hårdhedsioner og teststoffet, anvendes vand med lavere hårdhed (og dermed må Elendt-medium M4 ikke anvendes i denne situation). Den samme type vand skal anvendes i hele forsøget. De karakteristika for vandkvalitet, der er anført i tillæg 4, måles to gange årligt, samt hver gang der er formodning om, at de kan have ændret sig væsentligt. Stamopløsninger — forurenet sediment 16. Forurenet sediment af den valgte koncentration fremstilles sædvanligvis ved, at en stamopløsning af teststoffet tilsættes sedimentet direkte. En stamopløsning af teststoffet opløst i deioniseret vand blandes med det formulerede sediment ved brug af valsning, en foderblander eller manuel blanding. Hvis teststoffet er tungtopløseligt i vand, kan det opløses i den mindst mulige mængde af et passende organisk opløsningsmiddel (f.eks. hexan, acetone eller chloroform). Denne opløsning blandes derefter med 10 g fint kvartssand til et testglas. Vent, indtil opløsningsmidlet er fordampet, og fjern det helt fra sandet. Derefter blandes sandet med den passende mængde sediment pr. testglas. Kun midler, der let fordamper, kan bruges til at opløse, dispergere eller emulgere teststoffet. Det sand, der findes i teststoffet og sandblandingen, skal tages i betragtning, når sedimentet fremstilles (dvs. sediment skal således fremstilles med mindre sand). Det skal sikres, at det teststof, der tilsættes sediment, fordeles grundigt og jævnt i sedimentet. Om nødvendigt kan delprøver analyseres for at bestemme homogeniteten. TESTDESIGN 17. Testdesignet vedrører valget af testkoncentrationernes antal og intervaller, antal testglas med hvert koncentrationsniveau samt antal larver pr. testglas. Design til beregning af EC-punkter, beregning af NOEC og gennemførelse af en grænsetest beskrives. Design til regressionsanalyse 18. Testen skal omfatte et interval af koncentrationer, der ligger omkring den virksomme koncentration (f.eks. EC15, EC50) og det koncentrationsområde, hvor man er interesseret i testkemikaliets virkning. Beregningen af de virksomme koncentrationer (ECx) vil være mest nøjagtig og gyldig, når den virksomme koncentration befinder sig midt i testkoncentrationsområdet. Ekstrapolering langt under den laveste positive koncentration eller over den højeste koncentration bør undgås. En præliminær test til bestemmelse af koncentrationsområdet kan være nyttig, når det skal afgøres, hvilke testkoncentrationer der er passende (se afsnit 27). 19. Hvis ECx skal bestemmes, skal der testes mindst fem koncentrationer og tre replikater for hver koncentration. Under alle omstændigheder bør der anvendes et tilstrækkeligt antal testkoncentrationer til at sikre god modelestimering. Faktoren mellem koncentrationer bør ikke overstige to (medmindre dosiskurven har en lav hældning). Antallet af replikater i hver behandling kan reduceres, hvis antallet af testkoncentrationer med forskellige reaktioner forøges. Hvis antallet af replikater forøges, eller størrelsen af testkoncentrationsintervallerne reduceres, opnås der ofte snævrere konfidensintervaller for testen. Der kræves yderligere replikater, hvis larveoverlevelse og -vækst skal anslås for en periode på 10 dage. Design til beregning af NOEC/LOEC 20. Hvis LOEC eller NOEC skal beregnes, anvendes fem testkoncentrationer med mindst fire replikater, og faktoren mellem koncentrationerne bør højst være to. Antallet af replikater bør være højt nok til at sikre en tilstrækkelig statistisk styrke til at detektere en forskel på 20 % i forhold til kontrollen på signifikansniveauet 5 % (p = 0,05). I forbindelse med udviklingshastigheden er en ANOVA-analyse normalt velegnet, f.eks. Dunnett-testen eller Williams-testen (17) (18) (19) (20). I forbindelse med emergensforholdet kan Cochran-Armitage-testen, Fishers eksakte test (med Bonferroni-korrektion) eller Mantel-Haenszel-testen anvendes. Grænsetest 21. En grænsetest kan udføres (med en testkoncentration og kontrol), hvis der ikke blev observeret virkninger i den præliminære test til bestemmelse af koncentrationsområdet. Formålet med grænsetesten er at udføre en test ved en koncentration, der er høj nok til, at beslutningstagere kan udelukke mulige toksiske virkninger af teststoffet, og grænsen fastsættes til en koncentration, der ikke forventes at forekomme under nogen omstændigheder. 1 000 mg/kg (tørvægt) anbefales. Der anbefales normalt seks replikater for både behandlings- og kontrolgruppen. Statistisk styrke til at detektere en forskel på 20 % i forhold til kontrollen på signifikansniveauet 5 % (p = 0,05) skal påvises. Med hensyn til metrisk respons (udviklingshastighed og vægt) er t-testen en egnet statistisk metode, hvis dataene opfylder kravene i forbindelse med denne test (normalitet og homogen varians). T-testen justeret for forskel i varians eller en ikke-parametrisk test, f.eks. Wilcoxon-Mann-Whithey-testen, kan bruges, hvis disse krav ikke opfyldes. Med hensyn til emergensforholdet kan Fishers eksakte test anvendes. FREMGANGSMÅDE Eksponeringsbetingelser Klargøring af forurenet sediment/vand-system 22. Den spiking-metode, der er beskrevet i testmetode C.8, Toksicitet for regnorme, anbefales til tilsætning af teststoffet (14). De »spikede« (forurenede) sedimenter anbringes i bægerglas, og overliggende vand tilsættes for at frembringe et volumenforhold mellem sediment og vand på 1:4 (se afsnit 11 og 15). Sedimentlaget skal have en dybde på 1,5-3 cm. For at undgå separering af sedimentets bestanddele og resuspension af fint materiale under tilsætningen af testvand i vandsøjlen, kan sedimentet overdækkes med en plastplade, mens vandet hældes i. Plastpladen fjernes derefter straks. Der kan også anvendes andre løsninger. 23. Testglassene skal være overdækket (f.eks. af glasplader). I løbet af forsøget påfyldes der yderligere vand for at bevare det oprindelige volumen og kompensere for vandfordampning. Dette vand skal være destilleret eller deioniseret vand for at forhindre opbygning af salte. Stabilisering 24. Når det forurenede sediment med overliggende vand er blevet fremstillet, afventes det, at teststoffet fordeler sig fra den vandige fase til sedimentet (3) (4) (6) (13). Dette bør ske under de temperatur- og beluftningsforhold, der anvendes i testen. Tiden til opnåelse af ligevægt (ækvilibrering) afhænger af det pågældende sediment og kemikalie og kan være fra timer til dage og i sjældne tilfælde flere uger (4-5 uger). Da mange kemikalier i dette tidsrum ville blive nedbrudt, afventes ligevægt ikke, men en ækvilibreringstid på 48 timer anbefales. Efter denne yderligere ækvilibreringstid måles koncentrationen af teststoffet i det overliggende vand, porevandet og sedimentet, som minimum ved den højeste koncentration og en lavere (se afsnit 38). Disse analyser af teststoffet gør det muligt at beregne massebalance og angive resultater baseret på målte koncentrationer. Tilsætning af testorganismer 25. Fire til fem dage inden tilsætningen af testorganismer til testglassene udtages ægmasse fra bestandene og anbringes i små glas i dyrkningsmedium. Ældet dyrkningsmedium fra stamkulturen eller frisk medium kan anvendes. Hvis sidstnævnte anvendes, tilsættes dyrkningsmediet en lille mængde foder, f.eks. grønalger og/eller et par dråber filtrat fra en fintmalet suspension af fiskefoder i flager (se tillæg 2). Kun frisklagte ægmasser bør anvendes. Normalt begynder larverne at blive udklækket et par dage efter æglægningen (2-3 dage for Chironomus riparius ved 20 °C og 1-4 dage for Chironomus tentans ved 23 °C og Chironomus yoshimatui ved 25 °C), og larvevækst sker i fire stadier, som hver er af 4-8 dages varighed. Larver i første stadium (2-3 eller 1-4 dage efter udklækning) bør anvendes i testen. Larver af dansemyg kan muligvis kontrolleres ved hjælp af hovedkapselbredde (6). 26. 20 æglarver fordeles vilkårligt til hvert testglas med forurenet sediment og vand ved hjælp af en stump pipette. Beluftningen af vandet skal standses, mens larverne overføres til testglassene, og den skal være standset i endnu 24 timer efter tilsætningen af larver (se afsnit 25 og 32). Afhængigt af det anvendte testdesign (se afsnit 19 og 20) anvendes der mindst 60 larver pr. koncentration i forbindelse med bestemmelse af EC-punkter og 80 til bestemmelse af NOEC. Testkoncentrationer 27. En test til bestemmelse af koncentrationsområde kan være nyttig, når koncentrationsområdet skal vælges til den endelige test. Til det formål anvendes en række spredte koncentrationer af teststoffet. For at opnå den overfladedensitet pr. chironomide, der anvendes i den endelige test, eksponeres chironomider for hver koncentration af teststoffet i en periode, der gør det muligt at anslå de omtrentlige testkoncentrationer, og der kræves ingen replikater. 28. Testkoncentrationerne i den endelige test fastlægges ud fra testen til bestemmelse af koncentrationsområde. Mindst fem koncentrationer anvendes og vælges som beskrevet i afsnit 18-20. Kontroller 29. Kontrolglas uden teststof, men med sediment, inkluderes i testen med et hensigtsmæssigt antal replikater (se afsnit 19-20). Hvis der er anvendt et opløsningsmiddel til tilsætning af teststoffet (se afsnit 16), anvendes også en opløsningsmiddelkontrol. Testsystem 30. Der anvendes statiske systemer. Semistatiske systemer eller gennemstrømningssystemer med intermitterende eller kontinuerlig udskiftning af overliggende vand kan undtagelsesvis bruges, hvis specifikationerne for vandkvalitet bliver uhensigtsmæssige for testorganismen eller påvirker den kemiske ligevægt (hvis f.eks. koncentrationen af opløst ilt bliver for lav, koncentrationen af ekskretionsprodukter bliver for høj, eller mineraler udvaskes fra sedimentet og påvirker pH og/eller vandets hårdhed). Andre metoder til forbedring af det overliggende vands kvalitet, f.eks. beluftning, er normalt tilstrækkelige og bør foretrækkes. Foder 31. Larverne skal fodres, helst dagligt eller mindst tre gange om ugen. Fiskefoder (en suspension i vand eller fintmalet foder, f.eks. Tetra-Min eller Tetra-Phyll; se detaljer i tillæg 2) i en mængde på 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg for C. yoshimatui) pr. larve pr. dag er tilstrækkelig til unge larver i de første 10 dage. Ældre larver skal have lidt mere foder: 0,5-1 mg pr. larve pr. dag er passende i resten af testen. Foderrationen skal reduceres i alle behandlingsprøver og reguleres, hvis der konstateres svampevækst, eller hvis mortalitet observeres i kontrolglassene. Hvis svampevæksten ikke kan stoppes, gentages testen. Ved test af stærkt adsorberende stoffer (f.eks. med log Kow > 5) eller ved stoffer, der kovalent bindes til sediment, skal den mængde foder, der er nødvendig for at sikre organismernes overlevelse og naturlige vækst, muligvis tilsættes det formulerede sediment inden stabiliseringsperioden. Til det formål anvendes der plantemateriale i stedet for fiskefoder, f.eks. tilsætning af 0,5 % (tørvægt) fintmalede blade af brændenælde (Urtica dioica), morbærtræ (Morus alba), hvidkløver (Trifolium repens) eller spinat (Spinacia oleracea). Andet plantemateriale (Cerophyl eller alfa-cellulose) kan også anvendes. Inkubationsbetingelser 32. Forsigtig beluftning af det overliggende vand i testglassene foretages helst 24 timer efter tilsætningen af larver og foretages gennem hele testen. Det skal sikres, at koncentrationen af opløst ilt ikke falder til mindre end 60 % af ASV. Beluftning sker gennem en Pasteur-glaspipette, der er fastgjort 2-3 cm over sedimentlaget (dvs. en eller få bobler pr. sekund). Ved test af flygtige kemikalier kan det overvejes ikke at belufte sediment/vand-systemet. 33. Testen udføres ved en konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). For C. tentans og C. yoshimatui anbefales en temperatur på henholdsvis 23 °C og 25 °C (± 2 °C). Der anvendes en lysperiode på 16 timer, og lysintensiteten skal være 500-1 000 lux. Eksponeringsvarighed 34. Eksponeringen begynder, når larver tilsættes de forurenede bægerglas og kontrolglassene. Den maksimale eksponeringsvarighed er 28 dage for C. riparius og C. yoshimatsui og 65 dage for C. tentans. Hvis dansemyg udvikles tidligere, kan testen afsluttes, når der er gået mindst fem dage efter emergensen af den sidste voksne i kontrolglasset. Observationer Emergens 35. Udviklingstiden og det samlede antal fuldt udviklede han- og hunindivider bestemmes. Hanner kan nemt identificeres ved deres fjerbuskede antenner. 36. Testglassene observeres mindst tre gange ugentligt med henblik på visuelt at vurdere abnorm opførsel (hvis individer f.eks. forlader sediment eller svømmer på en usædvanlig måde) sammenlignet med kontrollen. I løbet af perioden for forventet emergens foretages en daglig tælling af de udviklede individer. Kønnet og antallet af fuldt udviklede individer registreres dagligt. Efter identifikation fjernes individerne fra bægerglassene. Ægmasse, der er afsat før afslutningen af testen, registreres og fjernes derefter for at forhindre gentaget tilførsel af larver til sedimentet. Antallet af synlige pupper, der ikke har udviklet sig, registreres også. Vejledning i måling af emergens findes i tillæg 5. Vækst og overlevelse 37. Hvis der skal fremlægges data om larveoverlevelse og -vækst efter 10 dage, skal yderligere testglas medtages fra begyndelsen, så de kan anvendes efterfølgende. Sedimentet fra disse yderligere glas sigtes gennem en 250 μm sigte for at tilbageholde larverne. Kriterier for død er immobilitet eller manglende reaktion på mekaniske stimuli. Larver, der ikke genfindes, registreres også som døde (larver, der er døde ved begyndelsen af testen, kan være blevet nedbrudt af mikrober). Tørvægten (askefri) af de overlevende larver pr. testglas bestemmes, og den individuelle gennemsnitlige tørvægt pr. glas beregnes. Det er nyttigt at bestemme det stadium, som de overlevende larver befinder sig på. Til det formål anvendes en måling af bredden på hvert individs hovedkapsel. Analysemålinger Teststofkoncentration 38. Inden testen påbegyndes (dvs. inden larver tilsættes), udtages prøver af bulksediment fra mindst ét glas pr. behandling til analytisk bestemmelse af teststofkoncentrationen i sedimentet. Det anbefales, at prøver af som minimum det overliggende vand, porevandet og sedimentet analyseres ved begyndelsen (se afsnit 24) og slutningen af testen ved den højeste koncentration og en lavere. Disse bestemmelser af teststofkoncentrationen giver oplysninger om teststoffets opførsel/fordeling i vand- og sedimentsystemet. 39. Når der foretages mellemliggende målinger (f.eks. på dag 7), og hvis der i analysen skal bruges større prøver, der ikke kan udtages fra testglas uden at påvirke testsystemet, udføres de analytiske bestemmelser på prøver fra yderligere testglas, der er behandlet på samme måde (herunder tilstedeværelse af testorganismer), men som ikke anvendes til biologiske observationer. 40. Centrifugering ved f.eks. 10 000 g og 4 °C i 30 minutter er den anbefalede fremgangsmåde til isolering af interstitielt vand. Hvis det påvises, at teststoffet ikke adsorberer til filtre, kan filtrering dog accepteres. I nogle tilfælde er det ikke muligt at analysere koncentrationer i porevandet, da prøvestørrelsen er for lille. Fysisk-kemiske parametre 41. Testglassenes pH og temperatur måles på en hensigtsmæssig måde (se afsnit 10). Hårdhed og ammoniak måles i kontrolglassene og et testglas ved den højeste koncentration ved begyndelsen og afslutningen af testen. DATA OG RAPPORTERING Behandling af resultater 42. Formålet med denne test er at bestemme virkningen af teststoffet på udviklingshastigheden og det samlede antal fuldt udviklede han- og hunindivider eller virkningen på larvernes overlevelse og vægt, hvis en 10-dages test udføres. Hvis der ikke er indikationer på statistisk forskellige sensitiviteter mellem kønnene, kan resultaterne for hanner og hunner samles med henblik på statistisk analyse. Kønsbetingede sensitivitetsforskelle kan vurderes statistisk ved hjælp af f.eks. en χ2-r × 2-test. Larvernes overlevelse og den individuelle gennemsnitlige tørvægt pr. glas bestemmes om nødvendigt efter 10 dage. 43. Effektkoncentrationer udtrykt og baseret på tørvægt beregnes fortrinsvis ud fra målte sedimentkoncentrationer ved begyndelsen af testen (se afsnit 38). 44. For at beregne et punktestimat for EC50 eller en anden ECx-værdi bruges data pr. glas som ægte replikater. Når et konfidensinterval for en ECx-værdi beregnes, skal variabiliteten mellem glassene tages i betragtning, eller det skal påvises, at denne variabilitet er så lille, at den kan ignoreres. Når modellen tilpasses ved hjælp af Least Squares, foretages en transformation af dataene pr. glas for at forbedre varianshomogeniteten. ECx-værdier beregnes dog, når resultatet er transformeret tilbage til den oprindelige værdi. 45. Når den statistiske analyse har til formål at bestemme NOEC/LOEC ved hjælp af hypotesetest, skal variabiliteten mellem glassene tages i betragtning, f.eks. ved hjælp af nested ANOVA. Alternativt kan mere robuste test (21) bruges i situationer, hvor de sædvanlige ANOVA-antagelser ikke kan anvendes. Emergensforhold 46. Emergensforhold er kvantale data og kan analyseres ved at anvende Cochran-Armitage-testen på en nedadgående måde, hvor et monotont dosisrespons forventes, og disse data er i overensstemmelse med denne forventning. Hvis det ikke er tilfældet, kan Fishers eksakte test eller Mantel-Haenszel-testen med Bonferroni-Holm-korrigerede p-værdier anvendes. Hvis der er bevis for større variabilitet mellem replikater inden for samme koncentration, end en binominal fordeling indicerer (ofte betegnet som »ekstra-binominal« variation), anvendes en robust Cochran-Armitage-test eller Fishers eksakte test som foreslået i (21). Summen af individer, der har udviklet sig pr. glas, ne, bestemmes og divideres med antallet af tilførte larver, na: hvor: ER = emergensforhold ne = antal udviklede individer pr. glas na = antal tilførte larver pr. glas 47. Ved store prøvestørrelser, hvor der er ekstra-binominal varians, kan emergensforholdet behandles som et kontinuerligt respons, og der kan bruges fremgangsmåder, som f.eks. Williams test, når et monotont dosisrespons forventes og er i overensstemmelse med disse ER-data. Dunnetts test kan anvendes, hvis der ikke kan påvises monotoni. Et stor prøvestørrelse defineres her som prøver, hvor både antallet af udviklede individer og antallet af ikke-udviklede individer overstiger fem målt pr. replikat (glas). 48. Hvis ANOVA-metoder anvendes, skal ER-værdier først transformeres ved hjælp af arcsin-sqrt-transformation eller Freeman-Tukey-transformation for at få en omtrentlig normalfordeling og udligne varians. Cochran-Armitage-testen, Fishers eksakte test (med Bonferroni-korrektion) eller Mantel-Haenszel-testen kan anvendes, hvis absolutte hyppigheder anvendes. Arcsin-sqrt-transformation anvendes ved at tage invers sinus (sin–1) af kvadratroden af ER. 49. I forbindelse med emergensforhold beregnes ECx-værdier ved hjælp af regressionsanalyse (eller f.eks. probit (22), logit, Weibull, relevant software i handelen osv.). Hvis regressionsanalyse mislykkes (hvis der f.eks. er mindre end to delsvar), anvendes andre ikke-parametriske metoder, som f.eks. glidende gennemsnit eller simpel interpolation. Udviklingshastighed 50. Den gennemsnitlige udviklingstid repræsenterer det gennemsnitlige tidsrum mellem tilsætningen af larver (testens dag 0) og emergensen af testkohorten af dansemyg. (Ved beregning af den sande udviklingstid tages larvernes alder på tilsætningstidspunktet i betragtning). Udviklingshastigheden er det reciprokke tal til udviklingstiden (enhed: 1/dag) og angiver den del af larveudviklingen, der finder sted pr. dag. Udviklingshastigheden foretrækkes til evaluering af disse sedimenttoksicitetsforsøg, da dens varians er lavere, og da den er mere homogen og ligger tættere på normalfordelingen end udviklingstid. Testfremgangsmåder baseret på anvendelige parametre kan derfor bruges med udviklingshastighed i stedet for udviklingstid. For udviklingshastighed som et kontinuerligt respons kan ECx-værdier estimeres ved hjælp af regressionsanalyse (f.eks. (23) (24)). 51. I forbindelse med følgende statistiske test antages det antal individer, der er observeret på kontroldagen, at være udviklet ved gennemsnittet af tidsintervallet mellem dag × og dag x-l (l = længde af inspektionsinterval, normalt 1 dag). Den gennemsnitlige udviklingshastighed pr. glas (x) beregnes ved hjælp af følgende ligning: hvor: : gennemsnitlig udviklingshastighed pr. glas i : indeks for inspektionsinterval m : maksimalt antal inspektionsintervaller : antal individer, der er udviklet i inspektionsintervallet i ne : det samlede antal individer, der er udviklet ved slutningen af forsøget (= ) xi : udviklingshastighed for individer, der er udviklet i intervallet i hvor: dayi : inspektionsdag (siden behandling) li : længde af inspektionsintervallet i (dage, normalt 1 dag) Testrapport 52. Testrapporten skal mindst indeholde følgende oplysninger: Teststof: — fysiske egenskaber og relevante fysisk-kemiske egenskaber (vandopløselighed, damptryk, fordelingskoefficient i jord (eller sediment, hvis tilgængelig), stabilitet i vand osv.) — kemisk identifikation (generisk navn, kemisk navn, CAS-nummer, strukturformel osv.), herunder renhed og analysemetode til kvantificering af teststof. Testart: — anvendte testorganismer: art, videnskabeligt navn, herkomst af organismer og dyrkningsbetingelser — information om håndtering af ægmasser og larver — testorganismernes alder ved tilsætning til testglas. Testbetingelser: — anvendt sediment, dvs. naturligt eller formuleret sediment — for naturligt sediment: beliggenhed og beskrivelse af prøvetagningsstedet for sediment, herunder så vidt muligt oplysninger om tidligere forurening; karakteristika: pH, organisk kulstofindhold, C/N-forhold og kornstørrelse (hvis relevant) — fremstilling af formuleret sediment: ingredienser og karakteristika (organisk kulstofindhold, pH, fugt osv. ved begyndelsen af testen) — fremstilling af testvand (hvis rekonstitueret vand anvendes) og dets karakteristika (iltkoncentration, pH, ledningsevne, hårdhed osv. ved begyndelsen af testen) — dybde af sediment og overliggende vand — volumen af overliggende vand og porevand; vægt af vådt sediment med og uden porevand — testglas (materiale og størrelse) — metode til sedimentspiking: anvendte testkoncentrationer, antal replikater og brug af evt. opløsningsmiddel — stabiliserende ligevægtsfase for det spikede sediment/vand-system: varighed og betingelser — inkubationsbetingelser: temperatur, lysintensitet og -periodicitet, beluftning (hyppighed og intensitet) — detaljerede oplysninger om fodring, herunder fodertype, tilberedning, mængde og fodringshyppighed. Resultater: — nominelle testkoncentrationer, målte testkoncentrationer og resultater af alle analyser med henblik på at bestemme teststofkoncentrationen i testglasset — kvaliteten af vandet i testglassene, dvs. pH, temperatur, opløst ilt, hårdhed og ammoniak — evt. udskiftning af fordampet vand — antal udviklede han- og hunindivider pr. glas og pr. dag — antal larver, der ikke udviklede sig til dansemyg, pr. glas — individuel gennemsnitlige tørvægt af larver pr. glas og pr. stadium, hvis relevant — procentvis emergens pr. replikat og testkoncentration (samlet for han- og hunindivider) — gennemsnitlig udviklingshastighed for fuldt udviklede individer pr. replikat og behandlingshastighed (samlet for han- og hunindivider) — estimater for toksicitetseffektparametre, f.eks. ECx (og tilhørende konfidensintervaller), NOEC og/eller LOEC og de statistiske metoder, der anvendt til at beregne dem — diskussion af resultaterne, herunder den eventuelle betydning af fravigelser fra denne testmetode. LITTERATUR: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Redigeret af M. Streloke og H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Endelig rapport til Europa-Kommissionen. Rapport nr. EC 3738. August 1994. WRc, Det Forenede Kongerige. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Fra WOSTA-workshop afholdt i Nederlandene. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. s. 1125-1241. I ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ og Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Kapitel C.8 i dette bilag, Toksicitet for regnorme. (15) Suedel BC og JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C og C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. (21) Rao JNK og Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce og Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Tillæg 1 DEFINITIONER I forbindelse med denne testmetode anvendes følgende definitioner: Formuleret sediment eller rekonstitueret, kunstigt eller syntetisk sediment: en blanding af materialer, der bruges til at efterligne de fysiske bestanddele i naturligt sediment. Overliggende vand: det vand, der tilsættes over sedimentet i testglasset. Interstitielt vand eller porevand: det vand, der optager pladsen mellem sediment og jordpartikler. Spiked sediment eller forurenet sediment: sediment, som teststoffet er tilsat. Testkemikalie: ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne testmetode. Tillæg 2 Anbefalinger vedrørende dyrkning af Chironomus riparius 1. Chironomus-larver kan holdes i krystallisationsskåle eller større beholdere. Fint kvartssand spredes i et tyndt lag på ca. 5-10 mm på bunden af skålen. Kiselgur (f.eks. Merck, Art 8117) er også et egnet substrat (et tyndere lag på få mm er nok). En passende mængde vand tilsættes, så der fås en dybde på flere cm. Vandet fyldes op efter behov for at erstatte tab som følge af fordampning og undgå udtørring. Vandet kan udskiftes, hvis det er nødvendigt. Forsigtig beluftning skal foretages. Larvebeholderne opbevares i et bur, der er egnet til formålet, og som forhindrer udviklede voksne i at forsvinde. Buret skal være så stort, at udviklede voksne kan danne sværme. Ellers vil kopulation muligvis ikke forekomme (minimum er ca. 30 × 30 × 30 cm). 2. Burene opbevares ved rumtemperatur eller i rum med konstant temperatur ved 20 ± 2 °C med belysning, der består af 16 timers lys (intensitet ca. 1 000 lux) og 8 timers mørke. Det er rapporteret, at en luftfugtighed på mindre end 60 % RH kan hæmme reproduktionen. Fortyndingsvand 3. Der kan anvendes egnet naturligt eller syntetisk vand. Brøndvand, afkloret ledningsvand eller kunstige medier (f.eks. Elendt M4 eller M7, se nedenfor) anvendes ofte. Vandet skal beluftes inden brug. Om nødvendigt kan vandet i beholderne udskiftes ved forsigtigt at hælde eller suge det brugte vand fra dyrkingsbeholderne uden at ødelægge larverørene. Fodring af larver 4. Chironomus-larver fodres med fiskefoder i flager (Tetra Min®, Tetra Phyll® eller et tilsvarende mærke af særligt fiskefoder) med ca. 250 mg pr. beholder pr. dag. Foderet kan gives som tørt malet pulver eller som en suspension i vand: 1,0 g foder i flager tilsættes 20 ml fortyndet vand og blandes for at få en homogen blanding. Denne præparat kan tilsættes med ca. 5 ml pr. beholder pr. dag (rystes inden brug). Ældre larver kan gives mere foder. 5. Fodringen tilpasses vandkvaliteten. Hvis dyrkningsmediet bliver uklart, reduceres fodermængden. Tilsætningen af foder overvåges nøje. For lidt foder vil få larverne til at vandre til vandsøjlen, og for meget foder vil forårsage øget mikrobiel aktivitet og lavere iltkoncentrationer. Begge forhold kan medføre lavere vækstrater. 6. Nogle grønalger (f.eks. Scenedesmus subspicatus og Chlorella vulgaris) kan også tilsættes ved etableringen af nye dyrkningsbeholdere. Fodring af udviklede voksne 7. Nogle forskere har foreslået, at vat, der er opblødt i mættet rørsukkeropløsning, kan bruges som foder til udviklede voksne. Emergens 8. Efter ca. 13-15 dage ved 20 ± 2 °C begynder voksne at udvikle sig fra larvebeholderne. Hanner kan nemt identificeres ved deres fjerbuskede antenner. Ægmasser 9. Når der findes voksne i buret, skal alle larvebeholdere kontrolleres tre gange om ugen for afsætning af geleagtige ægmasser. Evt. ægmasser skal fjernes forsigtigt. De overføres til en lille plade med en prøve af dyrkningsvandet. Ægmasser bruges til at starte et nyt dyrkningsglas (f.eks. 2-4 ægmasser pr. glas) eller til toksicitetstest. 10. Æglarver udklækkes efter 2-3 dage. Etablering af nye dyrkningsglas 11. Når vækstbetingelser er etableret, kan et nyt larvedyrkningsglas etableres hver uge eller mindre hyppigt afhængigt af testkravene, således at de ældste glas kan fjernes, når voksne individer har udviklet sig. Ved hjælp af dette system fås der en regelmæssig forsyning af voksne med minimal håndtering. Fremstilling af testopløsninger M4 og M7 12. Elendt (1990) har beskrevet M4-mediet. M7-mediet fremstilles på samme måde som M4-mediet bortset fra de stoffer, der er anført i tabel 1, for hvilke koncentrationerne er fire gange lavere i M7 end i M4. En artikel om M7-mediet er under forberedelse (Elendt, personlig meddelelse). I henhold til Elendt og Bias (1990) bør testopløsningen ikke fremstilles for de nævnte koncentrationer af NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 og K2HPO4, idet oplysningerne om fremstillingen af stamopløsninger ikke er fyldestgørende. Fremstilling af M7-mediet 13. Hver stamopløsning (I) fremstilles individuelt, og en kombineret stamopløsning (II) fremstilles ud fra disse stamopløsninger (I) (se tabel 1). M7-mediet fremstilles ved at fortynde 50 ml af den kombinerede stamopløsning (II) og de mængder af hver stamopløsning med makro-næringsstoffer, der er anført i tabel 2, med 1 liter deioniseret vand. En vitaminopløsning fremstilles ved at tilsætte tre vitaminer til deioniseret vand som anført i tabel 3, og 0,1 ml af den kombinerede vitaminopløsning tilsættes det færdige M7-medium umiddelbart inden brug. Vitaminopløsningen opbevares i små aliquoter i frossen tilstand. Mediet beluftes og stabiliseres. LITTERATUR BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Redigeret af M. Streloke og H. Köpp. Berlin 1995. Tabel 1 Stamopløsninger af sporstoffer til M4- og M7-medierne Stamopløsninger (I) Mængde (mg), der fortyndes med 1 l deioniseret vand Fremstilling af den kombinerede stamopløsning (II): Bland følgende mængder (ml) af stamopløsninger (I), og fortynd med 1 l deioniseret vand Endelige koncentrationer i testopløsninger (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 Kl 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Tabel 2 Stamopløsninger med makro-næringsstoffer til M4- og M7-medierne Mængde, der fortyndes med 1 l deioniseret vand (mg) Mængde af stamopløsninger med makro-næringsstoffer, der tilsættes for at fremstille M4- og M7-medierne (ml/l) Endelige koncentrationer i testopløsninger M4 og M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Tabel 3 Vitaminopløsninger til M4- og M7-medierne. Alle tre vitaminopløsninger samles for at fremstille én vitaminopløsning. Mængde, der fortyndes med 1 l deioniseret vand (mg) Mængde af vitaminopløsning, der tilsættes for at fremstille M4- og M7-medierne (ml/l) Endelige koncentrationer i testopløsninger M4 og M7 (mg/l) Thiaminhydrochlorid 750 0,1 0,075 Cyanocobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 LITTERATUR Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Tillæg 3 FREMSTILLING AF FORMULERET SEDIMENT Sammensætning af sediment Det formulerede sediment skal have følgende sammensætning: Bestanddel Karakteristika % af sediment (tørvægt) Tørv Sphagnum så nær pH 5,5-6,0 som muligt uden synlige planterester og findelt (partikelstørrelse ≤ 1 mm) og lufttørret 4-5 Kvartssand Kornstørrelse: > 50 % af partiklerne skal være fra 50-200 μm 75-76 Kaolinholdigt ler Kaolinindhold ≥ 30 % 20 Organisk kulstof Justeres ved tilsætning af tørv og sand 2 (± 0,5) Calciumcarbonat CaCO3, pulveriseret, kemisk rent 0,05-0,1 Vand Ledeevne ≤ 10 μS/cm 30-50 Fremstilling Tørven lufttørres og males til fint pulver. En suspension af den krævede mængde tørvepulver i ioniseret vand fremstilles ved brug af et højtydende homogeniseringsapparat. pH-værdien af denne suspension justeres til 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneres i mindst to dage med forsigtig omrøring ved 20 ± 2 °C for at stabilisere pH og opnå en stabil mikrobiel komponent. pH måles igen og skal være 6,0 ± 0,5. Derefter blandes tørvesuspensionen med de andre bestanddele (sand og kaolinholdigt ler) og deioniseret vand for at få et homogent sediment med et vandindhold på 30-50 % af sedimentets tørvægt. Den færdige blandings pH måles igen og justeres om nødvendigt til 6,5 til 7,5 med CaCO3. Der udtages prøver af sedimentet for at bestemme tørvægten og det organiske kulstofindhold. Inden det formulerede sediment anvendes i en toksicitetstest på chironomider, bør det konditioneres i syv dage under de betingelser, der anvendes i den efterfølgende test. Opbevaring De tørre bestanddele til fremstilling af kunstigt sediment lagres tørt og køligt ved rumtemperatur. Det formulerede (våde) sediment må ikke opbevares inden brug. Det skal bruges umiddelbart efter konditioneringsperioden på de syv dage, som afslutter dets fremstilling. LITTERATUR Kapitel C.8 i dette bilag. Toksicitet for regnorme. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Tillæg 4 Kemiske egenskaber af acceptabelt vand til fortynding Stof Koncentrationer Faste stoffer < 20 mg/l Totalt organisk kulstof < 2 mg/l Ikke-ioniseret ammoniak < 1 μg/l Hårdhed som CaCO3 < 400 mg/l (17) Residualt chlor < 10 μg/l Total organiske phosphorpesticider < 50 ng/l Total chlorerede organiske pesticider + polychlorbiphenyler < 50 ng/l Total organisk chlor < 25 ng/l Tillæg 5 Vejledning i overvågning af emergens af chironomidlarver Emergensfiltre anbringes på testbægerglassene. Disse filtre skal bruges fra dag 20 til slutningen af testen. Et eksempel på et filter vises nedenfor: A: Nylonvæv B: Omvendte plastbægre C: Eksponeringsbæger uden flange D: Åbninger med væv til vandudskiftning E: Vand F: Sediment C. 28. TOKSICITETSTEST SEDIMENT/VAND PÅ CHIRONOMIDER MED FORURENET VAND INDLEDNING 1. Denne testmetode svarer til OECD TG 219 (2004). Formålet med denne test er at vurdere virkningerne på larver af ferskvandsdipteraen Chironomus sp., der lever i sediment, af forlænget eksponering for kemikalier. Den er primært baseret på BBA-vejledningen, der anvender et sediment- og vandtestsystem med syntetisk jord, og et vandsøjleeksponeringsscenario (1). Den inddrager også de eksisterende toksicitetstestprotokoller for Chironomus riparius og Chironomus tentans, der er blevet udviklet i Europa og Nordamerika (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) og ringtestet (1) (6) (9). Andre veldokumenterede chironomidarter kan også benyttes, f.eks. Chironomus yoshimatsui (10) (11). 2. Eksponeringsscenariet i denne testmetode er spiking (forurening) af vand. Valget af det mest velegnede eksponeringsscenario afhænger af, hvad testen skal anvendes til. Vandeksponeringsscenariet, hvor vandsøjlen spikes, har til formål at simulere et tilfælde af aerosolspredning af pesticider og dækker den første koncentrationstop i porevand. Det kan også anvendes i forbindelse med andre typer eksponering (herunder kemiske udslip) med undtagelse af akkumuleringsprocesser, der varer længere end testperioden. 3. Stoffer, der skal testes i forbindelse med organismer, der lever i sediment, forefindes normalt i dette rum over længere tid. Organismer, der lever i sediment, kan eksponeres ad forskellige veje. Den relative vigtighed af den enkelte eksponeringsvej og den tid, der tager for hver enkelt at bidrage til de generelle toksiske virkninger, afhænger af de fysisk-kemiske egenskaber af det pågældende kemikalie. Ved stærkt adsorberende stoffer (f.eks. med log Kow > 5) eller ved stoffer, der kovalent bindes til sediment, kan indtagelse af kontamineret føde være en væsentlig eksponeringsvej. For ikke at undervurdere toksiciteten af højt lipofile stoffer kan det overvejes at tilsætte foder til sedimentet før tilsætning af teststoffet. For at tage alle potentielle eksponeringsveje i betragtning fokuserer denne testmetode på langtidseksponering. Testens varighed er 20-28 dage for C. riparius og C. yoshimatsui og 28-65 dage for C. tentans. Hvis der kræves korttidsdata til særlige formål, f.eks. for at undersøge virkningerne af et ustabilt kemikalie, kan yderligere replikater fjernes efter en periode på 10 dage. 4. De målte effektparametre er det samlede antal voksne, der har udviklet sig, og tiden, der er gået med udvikling. Det anbefales, at målinger af larvers overlevelse og vækst kun udføres efter en periode på 10 dage, hvis der kræves yderligere korttidsdata, ved hjælp af eventuelle yderligere replikater. 5. Det anbefales at anvende formuleret sediment. Der er flere fordele ved formuleret sediment i forhold til naturlige sedimenter: — udsvingene i forsøgene reduceres, idet der dannes en reproducerbar »standardiseret matrix«, og der er ikke brug for at finde ikke-kontaminerede og rene sedimentkilder — testene kan indledes på ethvert tidspunkt, uden at der opstår sæsonbetingede udsving i testsedimentet, og der er ikke behov for at forbehandle sedimentet med henblik på at fjerne hjemmehørende fauna; brugen af formuleret sediment reducerer også omkostningerne i forbindelse med opsamling af tilstrækkelige mængder sediment i felten til rutinetest — anvendelsen af formuleret sediment gør det muligt at sammenligne toksicitet og rangordne stoffer i overensstemmelse hermed toksicitetsdata fra test med naturlige og kunstige sedimenter var sammenlignelige for flere kemikalier (2). 6. De anvendte definitioner er anført i tillæg 1. TESTENS PRINCIP 7. Æglarver af chironomider eksponeres for et koncentrationsinterval af teststoffet i sediment/vand-systemer. Testen indledes med, at æglarver anbringes i testbægerglas, som indeholder sediment/vand-systemet, og derefter tilsættes teststoffet vandet. Emergens- og udviklingstiden for chironomider måles ved afslutningen af testen. Larvernes overlevelse og vægt kan om nødvendigt også måles efter 10 dage (ved brug af yderligere replikater). Disse data analyseres ved hjælp af en regressionsmodel for at anslå den koncentration, der vil forårsage en reduktion på × % i emergens, larveoverlevelse eller larvevækst (f.eks. EC15, EC50 osv.), eller ved hjælp af statistisk hypotesetest med henblik på at bestemme en NOEC/LOEC. Sidstnævnte kræver sammenligning af effektværdier med kontrolværdier ved hjælp af statistiske test. OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET 8. Teststoffets vandopløselighed, damptryk, målt eller beregnet, fordeling i sediment og stabilitet i vand og sediment bør kendes. En pålidelig analysemetode til kvantificering af teststoffet i overliggende vand, porevand og sediment med kendt og publiceret nøjagtighed og nedre målegrænse bør foreligge. Nyttige oplysninger omfatter teststoffets strukturformel og renhed. Teststoffets kemiske skæbne (f.eks. spredning, abiotisk og biotisk nedbrydning osv.) er også nyttige oplysninger. For stoffer, der er vanskelige at teste som følge af deres fysisk-kemiske egenskaber, findes der yderligere vejledning i (12). REFERENCEKEMIKALIER 9. Referencekemikalier kan testes periodisk for at sikre, at testprotokollen og -betingelserne er pålidelige. Eksempler på referencetoksikanter, der er anvendt med godt resultat i ringtest og valideringsforsøg, omfatter lindan, trifluralin, pentachlorphenol, cadmiumchlorid og kaliumchlorid (1) (2) (5) (6) (13). TESTENS VALIDITET 10. Testens validitet forudsætter følgende: — emergensen i kontrolbeholderne skal være mindst 70 % ved testens afslutning (1) (6) — emergensen af C. riparius og C. yoshimatsui til voksne fra kontrolglassene skal ske mellem 12 og 23 dage efter deres overførsel til testglassene; for C. tentans kræves der en periode på 20-65 dage — ved testens afslutning måles pH og koncentrationen af opløst ilt i hvert bægerglas. Koncentrationen af opløst ilt skal være mindst 60 % af værdien for mætning med luft (ASV) ved den anvendte temperatur, og pH i det overliggende vand skal være i intervallet 6-9 i alle bægerglas — vandtemperaturen må højst variere med ± 1,0 °C. Vandtemperatur kan styres ved at anvende et isotermisk rum, og i det tilfælde bekræftes rumtemperaturen med passende tidsintervaller. BESKRIVELSE AF METODEN Testglas 11. Forsøget udføres i 600 ml bægerglas med en diameter på 8 cm. Andre beholdere kan anvendes, men de skal kunne sikre en passende dybde for det overliggende vand og sediment. Sedimentoverfladen skal være tilstrækkelig (2 til 3 cm2 pr. larve). Forholdet mellem dybden af sedimentlaget og dybden af det overliggende vand skal være 1:4. Testglas og andet udstyr, der kommer i berøring med testsystemet, skal være udført helt i glas eller andet kemisk inaktivt materiale (f.eks. Teflon). Valg af fiskeart 12. Den art, der skal benyttes i testen, er fortrinsvis Chironomus riparius. Chironomus tentans kan også anvendes, men er vanskeligere at håndtere og kræver en længere testperiode. Chironomus yohimatsui kan også anvendes. Detaljer om dyrkningsmetoder findes i tillæg 2 vedrørende Chironomus riparius. Oplysninger om dyrkningsbetingelser findes også for andre arter, dvs. Chironomus tentans (4) og Chironomus yoshimatsui (11). Identifikation af arten skal bekræftes inden testning, men kræves ikke før hver test, hvis organismer kommer fra en intern bestand. Sediment 13. Formuleret sediment (også kaldet rekonstitueret, kunstigt eller syntetisk sediment) bør fortrinsvis anvendes. Hvis naturligt sediment anvendes, skal det karakteriseres (som minimum ved hjælp af pH og organisk kulstofindhold, men andre parametre anbefales også, f.eks. C/N-forhold og kornstørrelse), og det bør være uden forurening og andre organismer, der kan konkurrere med eller æde chironomiderne. Inden naturligt sediment anvendes i en toksicitetstest på chironomider, bør det desuden konditioneres i syv dage under de betingelser, der anvendes i den efterfølgende test. Det anbefales at bruge følgende formulerede sediment, som er baseret på den syntetiske jord, der anvendes i testmetode C.8 (14), i denne test (1) (15) (16): a) 4-5 % (tørvægt) tørv: så tæt på pH 5,5 til 6,0 som muligt; det er vigtigt at bruge pulveriseret tørv, findelt (partikelstørrelse ≤ 1 mm) og kun lufttørret b) 20 % (tørvægt) kaolinholdigt ler, helst med over 30 % kaolinit c) 75-76 % (tørvægt) kvartssand (overvejende finsand med over 50 % af en partikelstørrelse på 50 til 200 μm) d) deioniseret vand tilsættes for at få et fugtindhold i den færdige blanding på 30-50 % e) kemisk rent calciumcarbonat (CaCO3) tilsættes for at få en pH-værdi i den færdige sedimentblanding på 7,0 ± 0,5 f) det organiske kulstofindhold i den færdige blanding skal være 2 % (± 0,5 %), og det justeres ved brug af passende mængder tørv og sand som anført i litra a) og c). 14. Oprindelsen af tørv, kaolinler og sand skal være kendt. Det kontrolleres, at sedimentkomponenterne ikke indeholder kemisk forurening (f.eks. tungmetaller, organiske chlorforbindelser, organiske phosphorforbindelser osv.). Et eksempel på fremstilling af formuleret sediment er beskrevet i tillæg 3. Blanding af tørre bestanddele accepteres også, hvis det påvises, at der ikke sker en separation af sedimentets bestanddele efter tilsætning af overliggende vand (f.eks. at tørvepartikler flyder ovenpå), og at tørven eller sedimentet er tilstrækkeligt konditioneret. Vand 15. Til brug i testen kan anvendes vand, der er i overensstemmelse med de kemiske karakteristika for acceptabelt fortyndingsvand, som beskrevet i tillæg 2 og 4. Som dyrknings- og fortyndingsvand kan accepteres råvand (overflade- eller grundvand), rekonstitueret vand (se tillæg 2) eller afkloret ledningsvand, såfremt chironomider kan overleve i vandet i et tidsrum svarende til dyrknings- og testperioden uden at vise tegn på stress. Ved testens begyndelse skal testvandet have en pH-værdi på 6-9 og en hårdhedsgrad på højst 400 mg/l som CaCO3. Hvis der er formodning om en interaktion mellem hårdhedsioner og teststoffet, anvendes vand med lavere hårdhed (og dermed må Elendt-medium M4 ikke anvendes i denne situation). Den samme type vand skal anvendes i hele forsøget. De karakteristika for vandkvalitet, der er anført i tillæg 4, måles to gange årligt, samt hver gang der er formodning om, at de kan have ændret sig væsentligt. Stamopløsninger — forurenet vand 16. Testkoncentrationer beregnes på grundlag af vandsøjlekoncentrationer, dvs. vandet over sedimentet. Testopløsninger med de valgte koncentrationer fremstilles almindeligvis ved fortynding af en stamopløsning. Stamopløsninger fremstilles fortrinsvis ved at opløse teststoffet i testmediet. Anvendelse af opløsningsmidler eller dispergeringsmidler kan i nogle tilfælde være nødvendig for at fremstille en stamopløsning med en passende koncentration. Som opløsningsmiddel kan der benyttes acetone, ethanol, methanol, ethylenglycolmonomethylether, ethylenglycoldimethylether, dimethylformamid eller triethylenglycol. Som dispergeringsmiddel kan benyttes Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcellulose eller HCO-40. Koncentrationen af opløselighedsfremmere i det færdige testmedium skal være så lille som muligt (dvs. ≤ 0,1 ml/l) og bør være den samme i alle behandlingsprøver. Når der anvendes en opløselighedsfremmer, må den ikke have nogen signifikant virkning på overlevelsen eller synlig negativ virkning på chironomidlarven, hvilket kan afsløres ved en kontroltest, hvor kun opløsningsmidlet anvendes. Der skal ydes enhver indsats for at undgå brugen af sådanne materialer. TESTDESIGN 17. Testdesignet vedrører valget af testkoncentrationernes antal og intervaller, antal testglas med hvert koncentrationsniveau samt antal larver pr. testglas. Design til beregning af EC-punkter, beregning af NOEC og gennemførelse af en grænsetest beskrives. Regressionsanalyse foretrækkes frem for hypotesetest. Design til regressionsanalyse 18. Testen skal omfatte et interval af koncentrationer, der ligger omkring den virksomme koncentration (f.eks. EC15, EC50) og det koncentrationsområde, hvor man er interesseret i testkemikaliets virkning. Beregningen af de virksomme koncentrationer (ECx) vil være mest nøjagtig og gyldig, når den virksomme koncentration befinder sig midt i testkoncentrationsområdet. Ekstrapolering langt under den laveste positive koncentration eller over den højeste koncentration bør undgås. En præliminær test til bestemmelse af koncentrationsområdet kan være nyttig, når det skal afgøres, hvilke testkoncentrationer der er passende (se afsnit 27). 19. Hvis ECx skal bestemmes, skal der testes mindst fem koncentrationer og tre replikater for hver koncentration. Under alle omstændigheder bør der anvendes et tilstrækkeligt antal testkoncentrationer til at sikre god modelestimering. Faktoren mellem koncentrationer bør ikke overstige to (medmindre dosiskurven har en lav hældning). Antallet af replikater i hver behandling kan reduceres, hvis antallet af testkoncentrationer med forskellige reaktioner forøges. Hvis antallet af replikater forøges, eller størrelsen af testkoncentrationsintervallerne reduceres, opnås der ofte snævrere konfidensintervaller for testen. Der kræves yderligere replikater, hvis larveoverlevelse og -vækst skal anslås for en periode på 10 dage. Design til beregning af NOEC/LOEC 20. Hvis LOEC eller NOEC skal beregnes, anvendes fem testkoncentrationer med mindst fire replikater, og faktoren mellem koncentrationerne bør højst være to. Antallet af replikater bør være højt nok til at sikre en tilstrækkelig statistisk styrke til at detektere en forskel på 20 % i forhold til kontrollen på signifikansniveauet 5 % (p = 0,05). I forbindelse med udviklingshastigheden er en ANOVA-analyse normalt velegnet, f.eks. Dunnett-testen eller Williams-testen (17) (18) (19) (20). I forbindelse med emergensforholdet kan Cochran-Armitage-testen, Fishers eksakte test (med Bonferroni-korrektion) eller Mantel-Haenszel-testen anvendes. Grænsetest 21. En grænsetest kan udføres (med en testkoncentration og kontrol), hvis der ikke blev observeret virkninger i den præliminære test til bestemmelse af koncentrationsområdet. Formålet med grænsetesten er at indicere, at teststoffets toksiske værdi er større end den testede grænsekoncentration. En anbefalet koncentration kan ikke foreslås i forbindelse med denne testmetode. Det overlades til myndighedernes vurdering. Der anbefales normalt seks replikater for både behandlings- og kontrolgruppen. Statistisk styrke til at detektere en forskel på 20 % i forhold til kontrollen på signifikansniveauet 5 % (p = 0,05) skal påvises. Med hensyn til metrisk respons (udviklingshastighed og vægt) er t-testen en egnet statistisk metode, hvis dataene opfylder kravene i forbindelse med denne test (normalitet og homogen varians). T-testen justeret for forskel i varians eller en ikke-parametrisk test, f.eks. Wilcoxon-Mann-Whithey-testen, kan bruges, hvis disse krav ikke opfyldes. Med hensyn til emergensforholdet kan Fishers eksakte test anvendes. FREMGANGSMÅDE Eksponeringsbetingelser Klargøring af forurenet vand- og sedimentsystem 22. Passende mængder formuleret sediment (se afsnit 13-14 og tillæg 3) tilsættes testglasset, så der dannes et lag på mindst 1,5 cm. Vand tilsættes, så der fås en dybde på 6 cm (se afsnit 15). Forholdet mellem dybden af sedimentlaget og dybden af vandet må ikke overstige 1:4, og sedimentlaget må ikke være dybere end 3 cm. Sediment/vand-systemet hensættes til forsigtig beluftning i syv dage inden testorganismer tilsættes (se afsnit 14 og tillæg 3). For at undgå separering af sedimentets bestanddele og resuspension af fint materiale under tilsætningen af testvand i vandsøjlen, kan sedimentet overdækkes med en plastplade, mens vandet hældes i. Plastpladen fjernes derefter straks. Der kan også anvendes andre løsninger. 23. Testglassene skal være overdækket (f.eks. af glasplader). I løbet af forsøget påfyldes der yderligere vand for at bevare det oprindelige volumen og kompensere for vandfordampning. Dette vand skal være destilleret eller deioniseret vand for at forhindre opbygning af salte. Tilsætning af testorganismer 24. Fire til fem dage inden tilsætningen af testorganismer til testglassene udtages ægmasse fra bestandene og anbringes i små glas i dyrkningsmedium. Ældet dyrkningsmedium fra stamkulturen eller frisk medium kan anvendes. Hvis sidstnævnte anvendes, tilsættes dyrkningsmediet en lille mængde foder, f.eks. grønalger og/eller et par dråber filtrat fra en fintmalet suspension af fiskefoder i flager (se tillæg 2). Kun frisklagte ægmasser bør anvendes. Normalt begynder larverne at blive udklækket et par dage efter æglægningen (2-3 dage for Chironomus riparius ved 20 °C og 1-4 dage for Chironomus tentans ved 23 °C og Chironomus yoshimatui ved 25 °C), og larvevækst sker i fire stadier, som hver er af 4-8 dages varighed. Larver i første stadium (2-3 eller 1-4 dage efter udklækning) bør anvendes i testen. Larver af dansemyg kan muligvis kontrolleres ved hjælp af hovedkapselbredde (6). 25. 20 æglarver fordeles vilkårligt til hvert testglas med forurenet sediment og vand ved hjælp af en stump pipette. Beluftningen af vandet skal standses, mens larverne overføres til testglassene, og den skal være standset i endnu 24 timer efter tilsætningen af larver (se afsnit 24 og 32). Afhængigt af det anvendte testdesign (se afsnit 19 og 20) anvendes der mindst 60 larver pr. koncentration i forbindelse med bestemmelse af EC-punkter og 80 til bestemmelse af NOEC. 26. 24 timer efter tilsætning af larverne tilsættes teststoffet i den overliggende vandsøjle, og let beluftning tilføres igen. Små mængder af teststofopløsninger tilsættes under vandoverfladen ved hjælp af en pipette. Det overliggende vand blandes derefter forsigtigt, idet det undgås at forstyrre sedimentet. Testkoncentrationer 27. En test til bestemmelse af koncentrationsområde kan være nyttig, når koncentrationsområdet skal vælges til den endelige test. Til det formål anvendes en række spredte koncentrationer af teststoffet. For at opnå den overfladedensitet pr. chironomide, der anvendes i den endelige test, eksponeres chironomider for hver koncentration af teststoffet i en periode, der gør det muligt at anslå de omtrentlige testkoncentrationer, og der kræves ingen replikater. 28. Testkoncentrationerne i den endelige test fastlægges ud fra testen til bestemmelse af koncentrationsområde. Mindst fem koncentrationer anvendes og vælges som beskrevet i afsnit 18-20. Kontroller 29. Kontrolglas uden teststof, men med sediment, inkluderes i testen med et hensigtsmæssigt antal replikater (se afsnit 19-20). Hvis der er anvendt et opløsningsmiddel til tilsætning af teststoffet (se afsnit 16), anvendes også en opløsningsmiddelkontrol. Testsystem 30. Der anvendes statiske systemer. Semistatiske systemer eller gennemstrømningssystemer med intermitterende eller kontinuerlig udskiftning af overliggende vand kan undtagelsesvis bruges, hvis specifikationerne for vandkvalitet bliver uhensigtsmæssige for testorganismen eller påvirker den kemiske ligevægt (hvis f.eks. koncentrationen af opløst ilt bliver for lav, koncentrationen af ekskretionsprodukter bliver for høj, eller mineraler udvaskes fra sedimentet og påvirker pH og/eller vandets hårdhed). Andre metoder til forbedring af det overliggende vands kvalitet, f.eks. beluftning, er normalt tilstrækkelige og bør foretrækkes. Foder 31. Larverne skal fodres, helst dagligt eller mindst tre gange om ugen. Fiskefoder (en suspension i vand eller fintmalet foder, f.eks. Tetra-Min eller Tetra-Phyll; se detaljer i tillæg 2) i en mængde på 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg for C. yoshimatui) pr. larve pr. dag er tilstrækkelig til unge larver i de første 10 dage. Ældre larver skal have lidt mere foder: 0,5-1 mg pr. larve pr. dag er passende i resten af testen. Foderrationen skal reduceres i alle behandlingsprøver og reguleres, hvis der konstateres svampevækst, eller hvis mortalitet observeres i kontrolglassene. Hvis svampevæksten ikke kan stoppes, gentages testen. Ved test af stærkt adsorberende stoffer (f.eks. med log Kow > 5) eller ved stoffer, der kovalent bindes til sediment, skal den mængde foder, der er nødvendig for at sikre organismernes overlevelse og naturlige vækst, muligvis tilsættes det formulerede sediment inden stabiliseringsperioden. Til det formål anvendes der plantemateriale i stedet for fiskefoder, f.eks. tilsætning af 0,5 % (tørvægt) fintmalede blade af brændenælde (Urtica dioica), morbærtræ (Morus alba), hvidkløver (Trifolium repens) eller spinat (Spinacia oleracea). Andet plantemateriale (Cerophyl eller alfa-cellulose) kan også anvendes. Inkubationsbetingelser 32. Forsigtig beluftning af det overliggende vand i testglassene foretages helst 24 timer efter tilsætningen af larver og foretages gennem hele testen. Det skal sikres, at koncentrationen af opløst ilt ikke falder til mindre end 60 % af ASV. Beluftning sker gennem en Pasteur-glaspipette, der er fastgjort 2-3 cm over sedimentlaget (dvs. en eller få bobler pr. sekund). Ved test af flygtige kemikalier kan det overvejes ikke at belufte sediment/vand-systemet. 33. Testen udføres ved en konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). For C. tentans og C. yoshimatui anbefales en temperatur på henholdsvis 23 °C og 25 °C (± 2 °C). Der anvendes en lysperiode på 16 timer, og lysintensiteten skal være 500-1 000 lux. Eksponeringsvarighed 34. Eksponeringen begynder, når larver tilsættes de forurenede bægerglas og kontrolglassene. Den maksimale eksponeringsvarighed er 28 dage for C. riparius og C. yoshimatsui og 65 dage for C. tentans. Hvis dansemyg udvikles tidligere, kan testen afsluttes, når der er gået mindst fem dage efter emergensen af den sidste voksne i kontrolglasset. OBSERVATIONER Emergens 35. Udviklingstiden og det samlede antal fuldt udviklede han- og hunindivider bestemmes. Hanner kan nemt identificeres ved deres fjerbuskede antenner. 36. Testglassene observeres mindst tre gange ugentligt med henblik på visuelt at vurdere abnorm opførsel (hvis individer f.eks. forlader sediment eller svømmer på en usædvanlig måde) sammenlignet med kontrollen. I løbet af perioden for forventet emergens foretages en daglig tælling af de udviklede individer. Kønnet og antallet af fuldt udviklede individer registreres dagligt. Efter identifikation fjernes individerne fra bægerglassene. Ægmasse, der er afsat før afslutningen af testen, registreres og fjernes derefter for at forhindre gentaget tilførsel af larver til sedimentet. Antallet af synlige pupper, der ikke har udviklet sig, registreres også. Vejledning i måling af emergens findes i tillæg 5. Vækst og overlevelse 37. Hvis der skal fremlægges data om larveoverlevelse og -vækst efter 10 dage, skal yderligere testglas medtages fra begyndelsen, så de kan anvendes efterfølgende. Sedimentet fra disse yderligere glas sigtes gennem en 250 μm sigte for at tilbageholde larverne. Kriterier for død er immobilitet eller manglende reaktion på mekaniske stimuli. Larver, der ikke genfindes, registreres også som døde (larver, der er døde ved begyndelsen af testen, kan være blevet nedbrudt af mikrober). Tørvægten (askefri) af de overlevende larver pr. testglas bestemmes, og den individuelle gennemsnitlige tørvægt pr. glas beregnes. Det er nyttigt at bestemme det stadium, som de overlevende larver befinder sig på. Til det formål anvendes en måling af bredden på hvert individs hovedkapsel. Analysemålinger Teststofkoncentration 38. Som minimum analyseres prøver af det overliggende vand, porevandet og sedimentet ved begyndelsen (helst en time efter tilsætning af teststoffet) og slutningen af testen ved den højeste koncentration og en lavere. Disse bestemmelser af teststofkoncentrationen giver oplysninger om teststoffets opførsel/fordeling i vand- og sedimentsystemet. Prøvetagning af sediment ved begyndelsen af testen kan påvirke testsystemet (f.eks. fjerne testlarver), og derfor bør der anvendes yderligere testglas til udførelsen af analysebestemmelser ved begyndelsen af og i løbet af testen, hvis det er hensigtsmæssigt (se afsnit 39). Målinger i sediment er muligvis ikke nødvendige, hvis fordelingen af teststoffet mellem vand og sediment er blevet tydeligt bestemt i et vand- og sedimentforsøg under lignende betingelser (f.eks. forhold mellem vand og sediment, anvendelsestype og organisk kulstofindhold i sediment). 39. Når der foretages mellemliggende målinger (f.eks. på dag 7), og hvis der i analysen skal bruges større prøver, der ikke kan udtages fra testglas uden at påvirke testsystemet, udføres de analytiske bestemmelser på prøver fra yderligere testglas, der er behandlet på samme måde (herunder tilstedeværelse af testorganismer), men som ikke anvendes til biologiske observationer. 40. Centrifugering ved f.eks. 10 000 g og 4 °C i 30 minutter er den anbefalede fremgangsmåde til isolering af interstitielt vand. Hvis det påvises, at teststoffet ikke adsorberer til filtre, kan filtrering dog accepteres. I nogle tilfælde er det ikke muligt at analysere koncentrationer i porevandet, da prøvestørrelsen er for lille. Fysisk-kemiske parametre 41. Testglassenes pH og temperatur samt opløst ilt i vandet måles på en hensigtsmæssig måde (se afsnit 10). Hårdhed og ammoniak måles i kontrolglassene og et testglas ved den højeste koncentration ved begyndelsen og afslutningen af testen. DATA OG RAPPORTERING Behandling af resultater 42. Formålet med denne test er at bestemme virkningen af teststoffet på udviklingshastigheden og det samlede antal fuldt udviklede han- og hunindivider eller virkningen på larvernes overlevelse og vægt, hvis en 10-dages test udføres. Hvis der ikke er indikationer på statistisk forskellige sensitiviteter mellem kønnene, kan resultaterne for hanner og hunner samles med henblik på statistisk analyse. Kønsbetingede sensitivitetsforskelle kan vurderes statistisk ved hjælp af f.eks. en χ2-r × 2-test. Larvernes overlevelse og den individuelle gennemsnitlige tørvægt pr. glas bestemmes om nødvendigt efter 10 dage. 43. Effektkoncentrationer udtrykt som koncentrationer i det overliggende vand beregnes fortrinsvis ud fra målte sedimentkoncentrationer ved begyndelsen af testen (se afsnit 38). 44. For at beregne et punktestimat for EC50 eller en anden ECx-værdi bruges data pr. glas som ægte replikater. Når et konfidensinterval for en ECx-værdi beregnes, skal variabiliteten mellem glassene tages i betragtning, eller det skal påvises, at denne variabilitet er så lille, at den kan ignoreres. Når modellen tilpasses ved hjælp af Least Squares, foretages en transformation af dataene pr. glas for at forbedre varianshomogeniteten. ECx-værdier beregnes dog, når resultatet er transformeret tilbage til den oprindelige værdi. 45. Når den statistiske analyse har til formål at bestemme NOEC/LOEC ved hjælp af hypotesetest, skal variabiliteten mellem glassene tages i betragtning, f.eks. ved hjælp af nested ANOVA. Alternativt kan mere robuste test (21) bruges i situationer, hvor de sædvanlige ANOVA-antagelser ikke kan anvendes. Emergensforhold 46. Emergensforhold er kvantale data og kan analyseres ved at anvende Cochran-Armitage-testen på en nedadgående måde, hvor et monotont dosisrespons forventes, og disse data er i overensstemmelse med denne forventning. Hvis det ikke er tilfældet, kan Fishers eksakte test eller Mantel-Haenszel-testen med Bonferroni-Holm-korrigerede p-værdier anvendes. Hvis der er bevis for større variabilitet mellem replikater inden for samme koncentration, end en binominal fordeling indicerer (ofte betegnet som »ekstra-binominal« variation), anvendes en robust Cochran-Armitage-test eller Fishers eksakte test som foreslået i (21). 47. Summen af individer, der har udviklet sig pr. glas, ne, bestemmes og divideres med antallet af tilførte larver, na: hvor: ER = emergensforhold ne = antal udviklede individer pr. glas na = antal tilførte larver pr. glas 48. Ved store prøvestørrelser, hvor der er ekstra-binominal varians, kan emergensforholdet behandles som et kontinuerligt respons, og der kan bruges fremgangsmåder, som f.eks. Williams test, når et monotont dosisrespons forventes og er i overensstemmelse med disse ER-data. Dunnetts test kan anvendes, hvis der ikke kan påvises monotoni. Et stor prøvestørrelse defineres her som prøver, hvor både antallet af udviklede individer og antallet af ikke-udviklede individer overstiger fem målt pr. replikat (glas). 49. Hvis ANOVA-metoder anvendes, skal ER-værdier først transformeres ved hjælp af arcsin-sqrt-transformation eller Freeman-Tukey-transformation for at få en omtrentlig normalfordeling og udligne varians. Cochran-Armitage-testen, Fishers eksakte test (med Bonferroni-korrektion) eller Mantel-Haenszel-testen kan anvendes, hvis absolutte hyppigheder anvendes. Arcsin-sqrt-transformation anvendes ved at tage invers sinus (sin–1) af kvadratroden af ER. 50. I forbindelse med emergensforhold beregnes ECx-værdier ved hjælp af regressionsanalyse (eller f.eks. probit (22), logit, Weibull, relevant software i handelen osv.). Hvis regressionsanalyse mislykkes (hvis der f.eks. er mindre end to delsvar), anvendes andre ikke-parametriske metoder, som f.eks. glidende gennemsnit eller simpel interpolation. Udviklingshastighed 51. Den gennemsnitlige udviklingstid repræsenterer det gennemsnitlige tidsrum mellem tilsætningen af larver (testens dag 0) og emergensen af testkohorten af dansemyg. (Ved beregning af den sande udviklingstid tages larvernes alder på tilsætningstidspunktet i betragtning.) Udviklingshastigheden er det reciprokke tal til udviklingstiden (enhed: 1/dag) og angiver den del af larveudviklingen, der finder sted pr. dag. Udviklingshastigheden foretrækkes til evaluering af disse sedimenttoksicitetsforsøg, da dens varians er lavere, og da den er mere homogen og ligger tættere på normalfordelingen end udviklingstid. Testfremgangsmåder baseret på anvendelige parametre kan derfor bruges med udviklingshastighed i stedet for udviklingstid. For udviklingshastighed som et kontinuerligt respons kan ECx-værdier estimeres ved hjælp af regressionsanalyse (f.eks. (23) (24)). 52. I forbindelse med følgende statistiske test antages det antal individer, der er observeret på kontroldagen, at være udviklet ved gennemsnittet af tidsintervallet mellem dag × og dag x-l (l = længde af inspektionsinterval, normalt 1 dag). Den gennemsnitlige udviklingshastighed pr. glas (x) beregnes ved hjælp af følgende ligning: hvor: : gennemsnitlig udviklingshastighed pr. glas i : indeks for inspektionsinterval m : maksimalt antal inspektionsintervaller : antal individer, der er udviklet i inspektionsintervallet i ne : det samlede antal individer, der er udviklet ved slutningen af forsøget (= ) xi : udviklingshastighed for individer, der er udviklet i intervallet i hvor: dayi : inspektionsdag (siden behandling) li : længde af inspektionsintervallet i (dage, normalt 1 dag) Testrapport 53. Testrapporten skal mindst indeholde følgende oplysninger: Teststof: — fysiske egenskaber og relevante fysisk-kemiske egenskaber (vandopløselighed, damptryk, fordelingskoefficient i jord (eller sediment, hvis tilgængelig), stabilitet i vand osv.) — kemisk identifikation (generisk navn, kemisk navn, CAS-nummer, strukturformel osv.), herunder renhed og analysemetode til kvantificering af teststof. Testart: — anvendte forsøgsdyr: art, videnskabeligt navn, herkomst af organismer og dyrkningsbetingelser — information om håndtering af ægmasser og larver — forsøgsdyrenes alder ved tilsætning til testglas. Testbetingelser: — anvendt sediment, dvs. naturligt eller formuleret sediment — for naturligt sediment: beliggenhed og beskrivelse af prøvetagningsstedet for sediment, herunder så vidt muligt oplysninger om tidligere forurening; karakteristika: pH, organisk kulstofindhold, C/N-forhold og kornstørrelse (hvis relevant) — fremstilling af formuleret sediment: ingredienser og karakteristika (organisk kulstofindhold, pH, fugt osv. ved begyndelsen af testen) — fremstilling af testvand (hvis rekonstitueret vand anvendes) og dets karakteristika (iltkoncentration, pH, ledningsevne, hårdhed osv. ved begyndelsen af testen) — dybde af sediment og overliggende vand — volumen af overliggende vand og porevand; vægt af vådt sediment med og uden porevand — testglas (materiale og størrelse) — metode til fremstilling af stamopløsninger og testkoncentrationer — anvendelse af teststof: anvendte testkoncentrationer, antal replikater og brug af evt. opløsningsmiddel — inkubationsbetingelser: temperatur, lysintensitet og -periodicitet, beluftning (hyppighed og intensitet) — detaljerede oplysninger om fodring, herunder fodertype, tilberedning, mængde og fodringshyppighed. Resultater: — nominelle testkoncentrationer, målte testkoncentrationer og resultater af alle analyser med henblik på at bestemme teststofkoncentrationen i testglasset — kvaliteten af vandet i testglassene, dvs. pH, temperatur, opløst ilt, hårdhed og ammoniak — evt. udskiftning af fordampet vand — antal udviklede han- og hunindivider pr. glas og pr. dag — antal larver, der ikke udviklede sig til dansemyg, pr. glas — individuel gennemsnitlige tørvægt af larver pr. glas og pr. stadium, hvis relevant — procentvis emergens pr. replikat og testkoncentration (samlet for han- og hunindivider) — gennemsnitlig udviklingshastighed for fuldt udviklede individer pr. replikat og behandlingshastighed (samlet for han- og hunindivider) — estimater for toksicitetseffektparametre, f.eks. ECx (og tilhørende konfidensintervaller), NOEC og/eller LOEC og de statistiske metoder, der anvendt til at beregne dem — diskussion af resultaterne, herunder den eventuelle betydning af fravigelser fra denne testmetode. LITTERATUR: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Redigeret af M. Streloke og H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Endelig rapport til Europa-Kommissionen. Rapport nr. EC 3738. August 1994. WRc, Det Forenede Kongerige. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Fra WOSTA-workshop afholdt i Nederlandene. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. s. 1125-1241. I ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850,1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ og Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Kapitel C.8 i dette bilag, Toksicitet for regnorme. (15) Suedel BC og Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C og Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. (21) Rao JNK og Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce og Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Tillæg 1 DEFINITIONER I forbindelse med denne testmetode anvendes følgende definitioner: Formuleret sediment eller rekonstitueret, kunstigt eller syntetisk sediment: en blanding af materialer, der bruges til at efterligne de fysiske bestanddele i naturligt sediment. Overliggende vand: det vand, der tilsættes over sedimentet i testglasset. Interstitielt vand eller porevand: det vand, der optager pladsen mellem sediment og jordpartikler. Spiked vand eller forurenet vand: vand, som teststoffet er tilsat. Testkemikalie: ethvert stof eller enhver blanding, der testes ved hjælp af denne testmetode. Tillæg 2 Anbefalinger vedrørende dyrkning af Chironomus riparius 1. Chironomus-larver kan holdes i krystallisationsskåle eller større beholdere. Fint kvartssand spredes i et tyndt lag på ca. 5-10 mm på bunden af skålen. Kiselgur (f.eks. Merck, Art 8117) er også et egnet substrat (et tyndere lag på få mm er nok). En passende mængde vand tilsættes, så der fås en dybde på flere cm. Vandet fyldes op efter behov for at erstatte tab som følge af fordampning og undgå udtørring. Vandet kan udskiftes, hvis det er nødvendigt. Forsigtig beluftning skal foretages. Larvebeholderne opbevares i et bur, der er egnet til formålet, og som forhindrer udviklede voksne i at forsvinde. Buret skal være så stort, at udviklede voksne kan danne sværme. Ellers vil kopulation muligvis ikke forekomme (minimum er ca. 30 × 30 × 30 cm). 2. Burene opbevares ved rumtemperatur eller i rum med konstant temperatur ved 20 ± 2 °C med belysning, der består af 16 timers lys (intensitet ca. 1 000 lux) og 8 timers mørke. Det er rapporteret, at en luftfugtighed på mindre end 60 % RH kan hæmme reproduktionen. Fortyndingsvand 3. Der kan anvendes egnet naturligt eller syntetisk vand. Brøndvand, afkloret ledningsvand eller kunstige medier (f.eks. Elendt M4 eller M7, se nedenfor) anvendes ofte. Vandet skal beluftes inden brug. Om nødvendigt kan vandet i beholderne udskiftes ved forsigtigt at hælde eller suge det brugte vand fra dyrkingsbeholderne uden at ødelægge larverørene. Fodring af larver 4. Chironomus-larver fodres med fiskefoder i flager (Tetra Min®, Tetra Phyll® eller et tilsvarende mærke af særligt fiskefoder) med ca. 250 mg pr. beholder pr. dag. Foderet kan gives som tørt malet pulver eller som en suspension i vand: 1,0 g foder i flager tilsættes 20 ml fortyndet vand og blandes for at få en homogen blanding. Denne præparat kan tilsættes med ca. 5 ml pr. beholder pr. dag (rystes inden brug). Ældre larver kan gives mere foder. 5. Fodringen tilpasses vandkvaliteten. Hvis dyrkningsmediet bliver uklart, reduceres fodermængden. Tilsætningen af foder overvåges nøje. For lidt foder vil få larverne til at vandre til vandsøjlen, og for meget foder vil forårsage øget mikrobiel aktivitet og lavere iltkoncentrationer. Begge forhold kan medføre lavere vækstrater. 6. Nogle grønalger (f.eks. Scenedesmus subspicatus og Chlorella vulgaris) kan også tilsættes ved etableringen af nye dyrkningsbeholdere. Fodring af udviklede voksne 7. Nogle forskere har foreslået, at vat, der er opblødt i mættet rørsukkeropløsning, kan bruges som foder til udviklede voksne. Emergens 8. Efter ca. 13-15 dage ved 20 ± 2 °C begynder voksne at udvikle sig fra larvebeholderne. Hanner kan nemt identificeres ved deres fjerbuskede antenner. Ægmasser 9. Når der findes voksne i buret, skal alle larvebeholdere kontrolleres tre gange om ugen for afsætning af geleagtige ægmasser. Evt. ægmasser skal fjernes forsigtigt. De overføres til en lille plade med en prøve af dyrkningsvandet. Ægmasser bruges til at starte et nyt dyrkningsglas (f.eks. 2-4 ægmasser pr. glas) eller til toksicitetstest. 10. Æglarver udklækkes efter 2-3 dage. Etablering af nye dyrkningsglas 11. Når vækstbetingelser er etableret, kan et nyt larvedyrkningsglas etableres hver uge eller mindre hyppigt afhængigt af testkravene, således at de ældste glas kan fjernes, når voksne individer har udviklet sig. Ved hjælp af dette system fås der er en regelmæssig forsyning af voksne med minimal håndtering. Fremstilling af testopløsninger M4 og M7 12. Elendt (1990) har beskrevet M4-mediet. M7-mediet fremstilles på samme måde som M4-mediet bortset fra de stoffer, der er anført i tabel 1, for hvilke koncentrationerne er fire gange lavere i M7 end i M4. En artikel om M7-mediet er under forberedelse (Elendt, personlig meddelelse). I henhold til Elendt og Bias (1990) bør testopløsningen ikke fremstilles for de nævnte koncentrationer af NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 og K2HPO4, idet oplysningerne om fremstillingen af stamopløsninger ikke er fyldestgørende. Fremstilling af M7-mediet 13. Hver stamopløsning (I) fremstilles individuelt, og en kombineret stamopløsning (II) fremstilles ud fra disse stamopløsninger (I) (se tabel 1). M7-mediet fremstilles ved at fortynde 50 ml af den kombinerede stamopløsning (II) og de mængder af hver stamopløsning med makro-næringsstoffer, der er anført i tabel 2, med 1 liter deioniseret vand. En vitaminopløsning fremstilles ved at tilsætte tre vitaminer til deioniseret vand som anført i tabel 3, og 0,1 ml af den kombinerede vitaminopløsning tilsættes det færdige M7-medium umiddelbart inden brug. Vitaminopløsningen opbevares i små aliquoter i frossen tilstand. Mediet beluftes og stabiliseres. Tabel 1 Stamopløsninger af sporstoffer til M4- og M7-medierne Stamopløsninger (I) Mængde (mg), der fortyndes med 1 l deioniseret vand Fremstilling af den kombinerede stamopløsning (II): Bland følgende mængder (ml) af stamopløsninger (I), og fortynd med 1 l deioniseret vand Endelige koncentrationer i testopløsninger (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (18) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (18) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 Kl 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (18) (19) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (18) (19) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249 Tabel 2 Stamopløsninger med makro-næringsstoffer til M4- og M7-medierne Mængde, der fortyndes med 1 l deioniseret vand (mg) Mængde af stamopløsninger med makro-næringsstoffer, der tilsættes for at fremstille M4- og M7-medierne (ml/l) Endelige koncentrationer i testopløsninger M4 og M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184 Tabel 3 Vitaminopløsninger til M4- og M7-medierne Alle tre vitaminopløsninger samles for at fremstille én vitaminopløsning.

Mængde, der fortyndes med 1 l deioniseret vand (mg) Mængde af vitaminopløsning, der tilsættes for at fremstille M4- og M7-medierne (ml/l) Endelige koncentrationer i testopløsninger M4 og M7 (mg/l) Thiaminhydrochlorid 750 0,1 0,075 Cyanocobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075 LITTERATUR BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Redigeret af M. Streloke og H. Köpp. Berlin 1995. Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt BP og Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Tillæg 3 FREMSTILLING AF FORMULERET SEDIMENT Sammensætning af sediment Det formulerede sediment skal have følgende sammensætning: Bestanddel Karakteristika % af sediment (tørvægt) Tørv Sphagnum så nær pH 5,5-6,0 som muligt uden synlige planterester og findelt (partikelstørrelse ≤ 1 mm) og lufttørret 4-5 Kvartssand Kornstørrelse: > 50 % af partiklerne skal være fra 50-200 μm 75-76 Kaolinholdigt ler Kaolinindhold ≥ 30 % 20 Organisk kulstof Justeres ved tilsætning af tørv og sand 2 (± 0,5) Calciumcarbonat CaCO3, pulveriseret, kemisk rent 0,05-0,1 Vand Ledeevne ≤ 10 μS/cm 30-50 Fremstilling Tørven lufttørres og males til fint pulver. En suspension af den krævede mængde tørvepulver i ioniseret vand fremstilles ved brug af et højtydende homogeniseringsapparat. pH-værdien af denne suspension justeres til 5,5 ± 0,5 med CaCO3. Suspensionen konditioneres i mindst to dage med forsigtig omrøring ved 20 ± 2 °C for at stabilisere pH og opnå en stabil mikrobiel komponent. pH måles igen og skal være 6,0 ± 0,5. Derefter blandes tørvesuspensionen med de andre bestanddele (sand og kaolinholdigt ler) og deioniseret vand for at få et homogent sediment med et vandindhold på 30-50 % af sedimentets tørvægt. Den færdige blandings pH måles igen og justeres om nødvendigt til 6,5 til 7,5 med CaCO3. Der udtages prøver af sedimentet for at bestemme tørvægten og det organiske kulstofindhold. Inden det formulerede sediment anvendes i en toksicitetstest på chironomider, bør det konditioneres i syv dage under de betingelser, der anvendes i den efterfølgende test. Opbevaring De tørre bestanddele til fremstilling af kunstigt sediment lagres tørt og køligt ved rumtemperatur. Det formulerede (våde) sediment må ikke opbevares inden brug. Det skal bruges umiddelbart efter konditioneringsperioden på de syv dage, som afslutter dets fremstilling. LITTERATUR: Kapitel C.8 i dette bilag. Toksicitet for regnorme. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Tillæg 4 Kemiske egenskaber af acceptabelt vand til fortynding Stof Koncentrationer Faste stoffer < 20 mg/l Totalt organisk kulstof < 2 mg/l Ikke-ioniseret ammoniak < 1 μg/l Hårdhed som CaCO3 < 400 mg/l (20) Residualt chlor < 10 μg/l Total organiske phosphorpesticider < 50 ng/l Total chlorerede organiske pesticider + polychlorbiphenyler < 50 ng/l Total organisk chlor < 25 ng/l Tillæg 5 Vejledning i overvågning af emergens af chironomidlarver Emergensfiltre anbringes på testbægerglassene. Disse filtre skal bruges fra dag 20 til slutningen af testen. Et eksempel på et filter vises nedenfor: A : Nylonvæv B : Omvendte plastbægre C : Eksponeringsbæger uden flange D : Åbninger med væv til vandudskiftning E : Vand F : Sediment C.29. LET BIONEDBRYDELIGHED — CO2 I LUKKEDE BEHOLDERE (HEADSPACE-TEST) INDLEDNING 1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 310 (2006). Denne testmetode er en screeningsmetode til evaluering af kemikaliers lette bionedbrydelighed og giver oplysninger, der svarer de oplysninger, der fås med de seks testmetoder, som er beskrevet i kapitel C.4 (A-F) i dette bilag. Et kemikalie, der giver positive resultater i forbindelse med denne testmetode, kan derfor betragtes som let bionedbrydeligt og derfor hurtigt nedbrydeligt i miljøet. 2. Den veletablerede kuldioxidmetode (CO2) (1), der er baseret på Sturms originale test (2) til vurdering af organiske kemikaliers bionedbrydelighed, som måler den kuldioxid, der produceres ved mikrobiel aktivitet, har normalt været den foretrukne metode i forbindelse med test af tungtopløselige kemikalier og stærkt adsorberende kemikalier. Den er også blevet anvendt i forbindelse med opløselige (men ikke flygtige) kemikalier, da udviklingen af kuldioxid af mange betragtes som det eneste klare bevis for mikrobiel aktivitet. Eliminering af opløst organisk kulstof kan opnås ved hjælp af fysisk-kemiske processer — adsorption, fordampning, udfældning, hydrolyse — og ved hjælp af mikrobiel aktivitet, og mange ikke-biologiske reaktioner forbruger ilt. CO2 produceres i sjældne tilfælde abiotisk fra organiske kemikalier. I den originale og tilpassede Sturm-test (1) (2) elimineres CO2 fra væskefasen til de absorberende kar som følge »sparging« (dvs. luftbobler, der er behandlet til at eliminere CO2 via det flydende substrat), mens CO2 i Larsons version (3) (4) overføres fra reaktionsbeholderen til absorberne ved at lade CO2-fri luft passere gennem headspace og ved også kontinuerligt at ryste testbeholderen. Kun i Larsons version rystes reaktionsbeholderen. Omrystning foreskrives kun for uopløselige stoffer i ISO 9439 (5) og i den originale amerikanske version (6), som begge foreskriver sparging i stedet for headspace-udskiftning. I en anden officiel amerikansk EPA-metode (7), som er baseret på Gledhills metode (8), er den omrystede reaktionsbeholder lukket for atmosfæren, og det producerede CO2 opsamles i et indbygget alkalisk filter direkte fra gasfasen som i klassiske Warburg/Barcroft-respirometerkolber. 3. Det er påvist, at uorganisk kulstof akkumuleres i mediet ved anvendelse af den traditionelle tilpassede Sturm-test på en række kemikalier (9). En koncentration af uorganisk kulstof på så meget som 8 mg/l blev fundet under nedbrydningen af 20 mg C/l anilin. Opsamling af CO2 i alkalifiltre gav derfor ikke et sandt billede af den mængde CO2, der produceres mikrobiologisk på forskellige tidspunkter i løbet af nedbrydningen. Som følge deraf opfyldes forskriften om, at en teoretisk maksimal CO2-produktion > 60 % skal opsamles inden for et »10-dages-vindue« (de 10 dage umiddelbart efter opnåelsen af 10 % bionedbrydning), for at et testkemikalie kan klassificeres som let bionedbrydeligt, ikke for visse kemikalier, der klassificeres som sådan ved hjælp af eliminering af opløst organisk kulstof (DOC). 4. Når den procentvise nedbrydning er en lavere værdi end forventet, akkumuleres uorganisk kulstof muligvis i testopløsningen. Bionedbrydelighed kan derefter vurderes med andre test for let bionedbrydelighed. 5. På grund af andre ulemper ved Sturm-metoden (besværlig, tidskrævende, mere udsat for forsøgsfejl og ikke-anvendelig i forbindelse med flygtige kemikalier) har man tidligere forsøgt at finde en teknik med en lukket beholder — ud over Gledhills — i stedet for gasgennemstrømning (10) (11). Boatman et al. (12) gennemgik de tidligere metoder og anvendte et indesluttet headspace-system, hvor CO2 blev frigivet til headspace ved slutningen af inkubationen gennem forsuring af mediet. CO2 blev målt ved hjælp af gaskromatografi (GC)/analyse af uorganisk kulstof i automatisk udtagne prøver fra headspace, men opløst uorganisk kulstof (DIC) i væskefasen blev ikke taget i betragtning. De anvendte beholdere var desuden meget små (20 ml) og indeholdt kun 10 ml medium, hvilket gav problemer f.eks. ved tilsætning af de nødvendigvis meget små mængder uopløselige testkemikalier. Der kunne også være for få eller ingen mikroorganismer til stede i det inokulerede medium, som kan nedbryde testkemikalierne. 6. Disse vanske