KOMMISSIONENS BESLUTNING af 9. september 1997 om et foreløbigt testprogram for diagnosticering, påvisning og identifikation af Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith i kartofler (97/647/EF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets direktiv 77/93/EØF af 21. december 1976 om foranstaltninger mod indslæbning i Fællesskabet af skadegørere på planter eller planteprodukter og mod deres spredning inden for Fællesskabet (1), senest ændret ved direktiv 97/14/EF (2), særlig artikel 15, stk. 3, og

ud fra følgende betragtninger:

Ifølge Kommissionens beslutning 95/506/EF af 24. november 1995 om bemyndigelse af medlemsstaterne til midlertidigt af træffe supplerende foranstaltninger mod spredning af Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, for så vidt angår Kongeriget Nederlandene (3), senest ændret ved beslutning 96/599/EF (4), særlig artikel 1, stk. 2, litra a), underlitra bb), skal medlemsstaterne, når de gennemfører officielle eller officielt overvågede undersøgelser af kartofler, anvende karantæneprocedure nr. 26 for Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith som fastlagt af Plantebeskyttelsesorganisationen for Europa og Middelhavsområderne (EPPO) (5) eller en anden procedure, der er godkendt efter proceduren i artikel 16a i direktiv 77/93/EØF;

ad hoc-ekspertkomitéen »bakteriesygdomme hos planter«, som er oprettet af Europa-Kommissionens tjenestegrene under Den Stående Komité for Plantesundhed, har nærmere fastlagt et foreløbigt testprogram, hvori der tages hensyn til de bedre procedurer for påvisning og undersøgelse, der er udviklet siden offentliggørelsen af EPPO's karantæneprocedure nr. 26; dette testprogram er foreløbigt, da der forudses yderligere forskning, især i de enkelte tests følsomhed og specificitet, med henblik på udvælgelse og standardisering af de optimale foreliggende test til brug i en ajourført testmetode;

det i denne beslutning fastsatte foreløbige testprogram er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Stående Komité for Plantesundhed -

VEDTAGET FØLGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

Med henblik på gennemførelsen af bestemmelsen i artikel 1, stk. 2, litra a), underlitra bb), i beslutning 95/506/EF, som senest ændret, erstattes karantæneprocedure nr. 26 for Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith som fastlagt af Plantebeskyttelsesorganisationen for Europa og Middelhavsområderne (EPPO) af det foreløbige testprogram for diagnosticering, påvisning og identifikation af Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith i bilaget til nærværende beslutning.

Artikel 2

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.

Udfærdiget i Bruxelles, den 9. september 1997.

På Kommissionens vegne

Franz FISCHLER

Medlem af Kommissionen

(1) EFT L 26 af 31. 1. 1977, s. 20.

(2) EFT L 87 af 2. 4. 1997, s. 17.

(3) EFT L 291 af 6. 12. 1995, s. 48.

(4) EFT L 265 af 18. 10. 1996, s. 18.

(5) Bulletin EPPO/OEPP 20, s. 255-262 (1990).

BILAG

FORELØBIGT TESTPROGRAM FOR DIAGNOSTICERING, PÅVISNING OG IDENTIFIKATION AF PSEUDOMONAS SOLANACEARUM (SMITH) SMITH

OMRÅDE

Det forelagte program beskriver de forskellige procedurer, der indgår i:

i) diagnosticering af brunbakteriose i kartoffelplanter og -knolde

ii) påvisning af Pseudomonas solanacearum i prøver af kartoffelknolde

iii) identifikation af Pseudomonas solanacearum.

Der er i tillæggene givet detaljer om tilberedning af testmateriale, f.eks. dyrkningsmedier, buffere, opløsninger og reagenser.

INDHOLD

Afsnit I. Anvendelse af testprogrammet . 4

1. Diagnosticering af brunbakteriose i kartoffelplanter og -knolde . 4

2. Påvisning og identifikation af Pseudomonas solanacearum i prøver af kartoffelknolde 6

Afsnit II. Diagnosticering af brunbakteriose i kartoffelplanter og -knolde . 8

1. Symptomer på brunbakteriose . 8

2. Screeningstest . 8

3. Isolering . 9

4. Konfirmative test . 9

Afsnit III. Påvisning og identifikation af Pseudomonas solanacearum i prøver af kartoffelknolde . 12

1. Tilberedelse af prøven til test . 12

2. Immunofluorescenstest (IF-test) . 13

3. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) test . 15

4. Polymerase Chain Reaction (PCRTM) test . 15

5. Dyrkning på selektivt medie . 17

6. Biotest . 18

7. Berigningstest . 18

8. Patogenitetstest . 18

Tillæg 1. Næringsmedier til isolering og dyrkning af Pseudomonas solanacearum . 19

Tillæg 2. Materiale til prøvetilberedelse . 20

Tillæg 3. Materiale til IF-test . 21

Tillæg 4. Bestemmelse af celleantal i IF-testen . 22

Tillæg 5. Materiale til ELISA-test . 23

Tillæg 6. Materiale til PCR-test . 24

Tillæg 7. Materiale til dyrkning på selektivt medie- og berigningstest . 24

Litteraturhenvisninger . 25

AFSNIT I

ANVENDELSE AF TESTMETODEN

1. Diagnosticering af brunbakteriose i kartoffelplanter og -knolde

Testmetoden er beregnet til planter og knolde med symptomer, der er typiske for eller giver mistanke om brunbakteriose. Den omfatter en hurtigscreeningtest, isolering af patogenet fra inficeret karvæv på diagnostiske substrater og i tilfælde af positivt resultat identifikation af kulturen som Pseudomonas solanacearum.

Flowdiagram

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Bemærkninger til flowdiagrammet:

>START GRAFIK>

(1) Symptomerne er beskrevet i afsnit II, punkt 1.

(2) En screeningtest til en foreløbig diagnose.

Egnede test er:

- Karstrømningstest af karvæv fra stængler (afsnit II, punkt 2)

- Test for poly-ß-hydroxybutyratkorn (afsnit II, punkt 2)

- IF-test (afsnit III, punkt 2)

- ELISA-test (afsnit III, punkt 3)

- PCR-test (afsnit III, punkt 4)

(3) Skønt isolering af patogenet fra plantemateriale med typiske symptomer ved pladespredning af forskellige fortyndinger er ligetil, kan dyrkningen dog slå fejl på fremskredne infektionsstadier. Saprofytiske bakterier, der vokser på sygt væv, kan vokse stærkere end eller hæmme patogenet på isoleringsmediet. Hvis isoleringstesten er negativ, men sygdomssymptomerne typiske, skal isoleringen gentages, helst ved dyrkning på et selektivt medie.

(4) Pålidelig identifikation af en renkultur af Pseudomonas solanacearum kan opnås ved mindst en af de i afsnit II, punkt 4.1., omhandlede test kombineret med en patogenitetstest (afsnit II, punkt 4.3.). Bestemmelse af linjen er ikke krævet, men anbefales i hvert nyt tilfælde.

>SLUT GRAFIK>

2. Påvisning og identifikation af Pseudomonas solanacearum i prøver af kartoffelknolde

Metoden er bestemt til påvisning af latente infektioner i kartoffelknolde ved en eller helst flere screeningtest, som, hvis resultatet er positivt, bekræftes ved isolering af patogenet. Ved isolering af typiske kolonier efterfølges dette af identifikation af en renkultur som Pseudomonas solanacearum.

Flowdiagram

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Bemærkninger til flowdiagrammet:

>START GRAFIK>

(1) Prøvestørrelse

Standardprøvestørrelse er 200 knolde, dog kan metoden tillige anvendes for prøver med færre end 200 knolde.

(2) Screeningstest

En enkelt test er måske ikke tilstrækkeligt følsom eller pålidelig til at påvise Pseudomonas solanacearum i en prøve. Der anbefales derfor mere end en test. Om muligt bør disse test baseres på forskellige biologiske principper.

(3) Immunofluorescenstest (IF-test)

IF-testen (indirekte metode) er en veletableret screeningtest. Det er en fordel frem for andre test, som endnu ikke er fuldt udviklet eller valideret. Testen bruges for mange andre bakterier, f.eks. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Med de aflæsningsparametre, der er bestemt i denne metode, er det en følsom test (grænseværdien for følsomheden på 103-104 celler/ml kartoffelekstraktpellet).

Den kritiske faktor for testresultatets pålidelighed er antiserumets kvalitet. Kun et antiserum med høj titer (mindst 2000 for det ubehandlede antiserum) er acceptabelt, og alle test skal foretages ved antiserumtiteren eller en fortynding under titeren. Den indirekte metode foretrækkes. Den direkte metode kan benyttes, hvis testens følsomhed og specificitet svarer til den indirekte metodes.

IF-testen har den fordel at give subjektiv fortolkning af cellefarvningsmorfologi og fluorescensintensitet, som giver oplysninger om reaktionsspecificitet. Krydsreaktioner med serologisk beslægtede bakterier fra jord eller kartoffelvæv med lignende cellemorfologi som Pseudomonas solanacearum forekommer hyppigt. IF-testen kan benyttes som eneste screeningtest, men i tilfælde, hvor der er mistanke om krydsreaktioner, bør der foretages yderligere screeningstest baseret på et andet biologisk princip. I sådan et tilfælde er selektiv udstrygning at foretrække.

(4) Dyrkning på selektivt substrat

Med det modificerede SMSA-medie og den testmetodik, der er beskrevet i denne metode, er dette en følsom og selektiv test for Pseudomonas solanacearum. Resultatet foreligger 3-6 døgn efter tilberedelse af prøven. Patogenet fås som renkultur og kan let identificeres. For at testens potentiel kan udnyttes fuldt ud, kræves omhyggelig tilberedelse af navleender for at eliminere sekundære bakterier forbundet med kartoffelknolde, som er konkurrenter til Pseudomonas solanacearum på substratet og kan hæmme patogenets udvikling. Nogle stammer kan have ringe vækst, da substratets bestanddele må have indflydelse på målorganismen. Der kræves desuden omhu for at differentiere Pseudomonas solanacearum fra andre bakterier, som måtte udvikle sig på mediet.

Dyrkning på selektivt medie kan benyttes som eneste screeningtest, men hvis testresultatet er negativt, og der foreligger mistanke om hæmning af Pseudomonas solanacearum på grund af andre bakterier på substratet, bør der foretages endnu en screeningtest. I sådanne tilfælde er IF-testen den mest velegnede.

(5) ELISA-test

ELISA-testen er generelt mindre følsom end IF-testen (grænseværdien for følsomheden på 104-105 celler/ml kartoffelekstraktpellet). Testen er billig og hurtig, men generelt mere tilbøjelig til at give falsk positive (krydsreaktioner) og falsk negative (hæmning ved fenolmolekyler i kartoffelekstraktet) resultater. Kravene til antiserumsspecificitet er overordentligt strenge. ELISA kan ikke benyttes som eneste screeningtest.

(6) PCR-test

PCR-testen har potentiale til meget følsom påvisning, skønt testen meget let bliver hæmmet af plante- eller knoldekstraktbestanddele og giver falsk negative resultater. Nogle kartoffelsorter indeholder flere inhibitorer end andre. Det er derfor nødvendigt at fjerne disse inhibitorer. Inhibitorerne kan reduceres ved fortynding, men derved bliver populationerne af Pseudomonas solanacearum også fortyndet. Der må udvises stor forsigtighed på alle trin i tilberedelsen af prøve og test for at hindre kontamination, som kunne give falsk positive resultater. Falsk positive kan også hidrøre fra andre organismers sekvenshomologi. Af disse årsager kan direkte PCR ikke benyttes som eneste screeningtest.

(7) Berigningstest

Inkubering af prøver af kartoffelekstraktpellet i et semiselektiv flydende næringsmedie, f.eks. modificeret SMSA-bouillon, gør opformering af Pseudomonas solanacearum mulig. Vigtigere er det måske, at derved fortyndes også potentielle inhibitorer for ELISA- eller PCR-test. Pseudomonas solanacearum i berigningsbouillon kan således påvises ved IF, ELISA og PCR. Det kan ikke anbefales at foretage direkte pladespredning fra beriget flydende næringsmedie. Disse berigningsmetoder er ikke grundigt gennemprøvet og testet. De er medtaget her, fordi de har et godt potentiale. Men på grund af den relative mangel på erfaring med dem kan de ikke benyttes som eneste påvisningsmetoder.

(8) Biotest

Biotesten bruges til isolering af Pseudomonas solanacearum fra kartoffelekstrakt ved selektiv berigelse i en værtsplante og kan foretages på kartoffelplanter eller ægplante. Testen kræver optimale inkuberingsbetingelser som beskrevet i denne metode. Bakterier, der er inhibitorer for Pseudomonas solanacearum på SMSA-substratet, vil sandsynligvis ikke virke forstyrrende i denne test.

(9) Konfirmative test

Pålidelig identifikation af en renkultur af Pseudomonas solanacearum opnås ved mindst en af de test, der er angivet i afsnit II, punkt 4.1., i kombination med en patogenitetstest (afsnit II, punkt 4.3.). Bestemmelse af linjen er ikke krævet, men anbefales i hvert nyt tilfælde.

>SLUT GRAFIK>

AFSNIT II

DIAGNOSTICERING AF BRUNBAKTERIOSE I KARTOFFELPLANTER OG -KNOLDE

1. Symptomer på brunbakteriose

Kartoffelplanten

De tidlige symptomer er, når bladene visner i plantens top ved høje temperatur om dagen for derefter at komme sig om natten. Denne visnen bliver hurtigt irreversibel og medfører, at planten dør. Karvævet i stængler fra visne planter, der er skåret tværs over, kan blive brunt, og et mælkeagtigt sekret siver ud fra sårfladen eller kan let trykkes ud, ved at man kniber stænglen. Hvis en overskåren stængel anbringes vertikalt i vand, vil slimtråde strømme fra karbundterne.

Kartoffelknolden

Kartoffelknolde skal skæres tværs over nær ved navleenden (= stolon). Det tidlige infektionsstadium er en glasagtig gullig til lysebrun misfarvning af karringen, hvorfra der spontant kommer et blegt sekret efter et par minutter, eller hvis man trykker let med tommelfingrene på huden nær ved sårfladen. Senere bliver karmisfarvningen mere tydeligt brun, og vævsdøden kan brede sig til parenkymvævet. På mere fremskredne stadier bryder infektionen ud fra endeskorpen og øjnene, hvilket medfører rødbrune, let indsunkne læsioner på huden, hvorfra bakterier siver ud og får jordpartikler til at hænge ved.

2. Screeningstest

Screeningstest kan medføre en foreløbig diagnose. Brug en eller flere af de følgende test:

Karstrømningstest

Tilstedeværelsen af Pseudomonas solanacearum i visnende kartoffelstilke kan påvises ved nedenstående enkle test.

Stilken overskæres lige over jorden. Den overskårne stilk stilles i et bæger med vand. Kort efter vil tråde af bakterieslim spontant strømme ud af karstrengene. Eventuelle andre bakterier, der forårsager karvævsinfektion i kartoffelplanter, vil ikke vise dette fænomen.

Påvisning af korn af poly-â-hydroxybutyrat (PHB)

PHB-kornene i cellerne i Pseudomonas solanacearum gøres synlige ved farvning med Nile blue A eller Sudan black B.

Der laves et udstrygningspræparat af bakterieslimen eller det opslæmmede væv på et objektglas, eller der tilberedes et udstrygningspræparat af en 48 timers kultur på YPGA eller SPA (bilag 1). Som kontrol laves positive udstrygningspræparater af en biovar 2/race 3-stamme, og hvis nødvendig, et negativt udstrygningspræparat af en heterolog stamme. Glasset tørres. Dets underside føres gentagne gange hurtigt gennem flammen, indtil præparatet er fikseret.

Nile blue-test

1. Det fikserede udstrygningspræparat overhældes med en 1 % vandig opløsning af Nile blue A. Inkuberes i 10 min. ved 55 °C.

2. Farvningsopløsningen afdrænes. Prøven vaskes kort i langsomt rindende ledningsvand. Overskydende vand fjernes med filtrerpapir.

3. Udstrygningspræparatet overhældes med 8 % vandig eddikesyre. Inkuberes i 1 min. ved laboratorietemperatur.

4. Prøven vaskes i langsomt rindende ledningsvand. Den tørres med filtrerpapir.

5. Prøven genbefugtes med en dråbe vand. Der sættes et dækglas på.

6. Det farvede udstrygningspræparat undersøges under et epifluorescensmikroskop ved 450 nm i immersionsolie ved 1 000 ganges forstørrelse.

Der observeres for klart orange fluorescens fra PHB-korn. Desuden foretages observation i normalt lys for at sikre, at kornene er intracellulære, og at cellemorfologien er typisk for Pseudomonas solanacearum.

Sudan black-test

1. Det fikserede udstrygningspræparat overhældes med 0,3 % Sudan black B-opløsning i 70 % ethanol. Prøven inkuberes i 10 min. ved laboratorietemperatur.

2. Farvningsopløsningen afdrænes. Prøven vaskes hurtigt i ledningsvand. Overskydende vand fjernes med filtrerpapir.

3. Udstrygningspræparatet neddyppes kort i xylen. Glasset duppes tørt med filtrerpapir.

NB: Xylen er et farligt stof. Arbejdet skal foregå i et stinkskab.

4. Udstrygningspræparatet overhældes med 0,5 % (w/v) vandig safranin og henstår 10 sek. ved laboratorietemperatur.

NB: Safranin er et farligt stof. Arbejdet skal foregå i et stinkskab.

5. Prøven vaskes i langsomt rindende vand. Den tørres med filtrerpapir. Der sættes dækglas på.

6. Det farvede udstrygningspræparat undersøges under et lysmikroskop med gennemfaldende lys i immersionsolie ved 1 000 ganges forstørrelse.

PHB-korn i celler af Pseudomonas solanacearum bliver blåsorte. Cellevæggen bliver lyserød.

Andre test

Andre anbefalelsesværdige test er IF-testen (afsnit III, punkt 2), ELISA-testen (afsnit III, punkt 3) og PCR-testen (afsnit III, punkt 4).

3. Isolering

3.1. En lille mængde af bakterieslimen eller partier af misfarvet væv fra karringen i knolden eller fra karstrengene i stilken opslæmmes i sterilt, destilleret vand eller 50 mM fosfatbuffer. Prøven henstår på testbordet i 5-10 min.

3.2. Der laves en serie tifoldsfortyndinger af suspensionen - 1:10 og 1:100 eller flere, hvis det skønnes nødvendigt.

3.3. En standardmængde af suspensionen overføres til et standardnæringsmedie (NA, YPGA og SPA (tillæg 1)), og/eller Kelman's tetrazolium-medium (tillæg 1), og/eller et selektivt SMSA-substrat (tillæg 7). Spred og udstryg med en formålstjenlig fortyndingsteknik. Hvis nødvendigt skal der tilberedes et sæt særskilte plader med en fortyndet cellesuspensionskultur af en biovar 2/race 3-stamme af Pseudomonas solanacearum som positiv kontrol.

3.4. Pladerne inkuberes i 3 døgn ved 28 °C. Inkubationen kan forlænges indtil 6 dage, hvis væksten er langsom, men kolonier på SMSA-plader bliver ofte atypiske og dør.

På standardnæringsmediet udvikler virulente isolater af Pseudomonas solanacearum perlehvide, flade, uregelmæssige og udflydende kolonier, der ofte har karakteristiske hvirvler.

På Kelman's tetrazolium-mediet er typiske kolonier af virulente isolater af Pseudomonas solanacearum cremefarvede, flade, uregelmæssige og udflydende, med blodrøde hvirvler i centrum. Avirulente former af Pseudomonas solanacearum udvikler smørlignende, dybrøde kolonier.

På SMSA-mediet udvikler virulente isolater af Pseudomonas solanacearum mælkehvide, flade, uregelmæssige og udflydende kolonier, der har tydelige, blodrøde centre.

Avirulente former af Pseudomonas solanacearum udvikler mindre udflydende kolonier, som er fuldstændigt lyserøde til røde på SMSA-mediet.

3.5. Kolonier med karakteristisk morfologi rendyrkes ved subkultur på et generelt næringssubstrat. Regelmæssig subkultur bør undgås, da det kan medføre tab af virulens.

4. Konfirmative test

4.1. Identifikation af Pseudomonas solanacearum

Identificere renkulturer af Pseudomonas solanacearum ved mindst en af de følgende procedurer:

Nærings- og enzymtest

Bemærk: inkluder en kontrolkultur ved hver test.

Følgende fænotypiske egenskaber hos Pseudomonas solanacearum forekommer enten universelt eller slet ikke:

>TABELPOSITION>

Medier og metoder: se Lelliott og Stead (1987).

IF-test

Der laves en opslæmning af 106 celler/ml fra kulturen og en positiv kontrolstamme. Der laves en række tofoldsopløsninger af antiserum. IF-metoden benyttes (afsnit III, punkt 2). Kulturens IF-titer skal svare til den positive kontrols titer.

ELISA-test

Der laves en opslæmning af > 106 celler/ml fra kulturen og en positiv kontrolstamme. ELISA-metoden benyttes (afsnit III, punkt 3). Kulturens ELISA-værdi skal svare til den positive kontrols værdi.

PCR-test

Der laves en opslæmning af 106 celler/ml fra kulturen og en positiv kontrolstamme. PCR-metoden benyttes (afsnit III, punkt 4). Kulturens PCR-produkt skal være af samme størrelse og have samme restriktionsenzymanalysemønster (REA) som den positive kontrol.

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH)

Der laves en opslæmning af 106 celler/ml fra kulturen og en positiv kontrolstamme. FISH-metoden benyttes (van Beuningen et al, 1995) med OLI-1 PCR-primer (Seal et al., 1993). Kulturen skal vise samme reaktion som den positive kontrol.

Proteinprofilering

Denaturerede helcelleproteiner separeres ved polyacrylamidgelektroforese - PAGE (Stead, 1992a).

Fedtsyreprofilering (FAP)

Kulturen og en positiv kontrolstamme dyrkes i 48 timer ved 28 °C på trypticasesojaagar. FAP-metoden benyttes (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead 1992b). Kulturens profil skal være identisk med den positive kontrols profil. Under de beskrevne betingelser er karakteristiske fedtsyrer 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH og 18:1 2OH.

4.2. Karakterisering af stammen

Linjekarakterisering er ikke krævet, men anbefales for hvert nyt tilfælde ved mindst en af følgende metoder:

Biovarbestemmelse

Pseudomonas solanacearum opdeles i biovarer ud fra deres evne til at udnytte og/eller oxidere tre hexosealkoholer og tre sukkerarter (Hayward, 1964 & 1994):

>TABELPOSITION>

Supplerende test differentierer biovar 2 i underfænotyper (Hayward, 1994):

>TABELPOSITION>

Racebestemmelse

Racen (Buddenhagen et al., 1962) bestemmes på grundlag af en patogenitetstest i tomatplanter eller ægplanter og i tobaksplanter og ved hjælp af en hypersensitivitetsreaktion (HR) i tobaksblade (Lozano & Sequeira, 1970):

>TABELPOSITION>

Racen karakteriseres ved hjælp af en patogenitetstest eller en hypersensitivitetsreaktion i tobak, er ikke helt troværdig, og kan i stedet bedømmes ud fra biovar og den naturlige værtsplante.

Kulturen kan yderligere beskrives ved:

»Fingeraftryk« af genomet

Molekylær differentiering af stammer i Pseudomonas solanacearum-komplekset kan foretages ved:

RFLP-analyse (Cook et al., 1989)

Gentagen sekvens PCR (REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995))

4.3. Patogenitetstest

Testen er beregnet til konfirmering af diagnosen for Pseudomonas solanacearum og for at bekræfte virulensen af kulturer identificeret som Pseudomonas solanacearum.

Der laves et inokulum på 106 celler/ml fra kulturen og en positiv kontrolstamme. 5-10 tomatplanter eller ægplanter indpodes helst på bladstadium 3 eller ældre (afsnit III, punkt 6). Planterne inkuberes i indtil to uger ved 22 °C-28 °C og høj relativ fugtighed og vandes hver dag. Der observeres for visnesymptomer, epinasti, klorose eller hæmning.

Isoler fra symptomatiske planter på følgende måde:

- fjern en del af vævet fra stænglen 2 cm over inokuleringspunktet

- opslem i lille mængde sterilt destilleret vand eller 50 mM PBS-buffer, og udstryg, inkuber og check for typiske kolonier af Pseudomonas solanacearum.

AFSNIT III

PÅVISNING OG IDENTIFIKATION AF PSEUDOMONAS SOLANACEARUM I PRØVER AF KARTOFFELKNOLDE

NB: Standardprøvestørrelse er 200 knolde, dog kan metoden tillige anvendes for prøver med færre end 200 knolde.

1. Tilberedelse af prøven til test

NB: Den kartoffelekstraktpellet, der fremkommer ved denne metode, kan tillige bruges til påvisning af Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Metoder, der kan benyttes til foreløbig test, hvis det findes nyttigt:

i) Prøven inkuberes ved 25-30 °C i indtil 2 uger for at fremme formeringen af latente populationer af Pseudomonas solanacearum

ii) Knoldene vaskes i rindende vand med passende desinfektions- og opløsningsmidler. Knoldene lufttørres.

1.1. Med en ren, desinficeret skalpel eller grøntsagskniv fjernes huden fra knoldens navleende, således at karvævene lige netop bliver synlige. En lille konisk kerne (3-5 mm diam.) karvæv fra hver knolds navleende udskæres. Mængden af ikke-karvæv skal være mindst mulig. Første trin gentages for hver knold i prøven.

NB: Der kan foretages visuel undersøgelse af knoldene (afsnit II, punkt 1) på dette stadium. Eventuelle knolde med symptomer eller forrådnelse anbringes for sig og underkastes særskilt test (afsnit II).

1.2. Navleenderne anbringes i en lukket beholder. Navleenderne skal helst behandles straks. Hvis dette ikke er muligt, bør de ikke opbevares i over 24 timer - eller ved 4 °C ikke længere end 72 timer.

1.3. Navleenderne behandles på en af nedenstående måder:

i) Navleenderne overføres til en egnet beholder.

Der tilsættes nok udblødningsbuffer (tillæg 2) til at dække kernerne.

Navleenderne findeles i en Waring Blender eller ved Ultra Thurrax, indtil de lige netop er homogeniseret. Overdreven homogenisering skal undgås.

Prøven henstår til udblødning i 15-30 min.

ii) Navleenderne overføres til en egnet beholder.

Der tilsættes nok udblødningsbuffer til at dække navleenderne.

Beholderen anbringes på en rotationsryster.

Prøven inkuberes ved 50-100 rpm i 4 timer ved 20-22 °C eller 16-24 timer ved 4 °C.

iii) Navleenderne overføres til en kraftig engangspose til udblødning (fx Stomacherpose på 105 mm × 150 mm, steriliseret ved betråling).

Vævskernerne knuses omhyggeligt med et egnet værktøj, fx en hammer, indtil de lige netop er homogeniseret.

Der tilsættes nok udblødningsbuffer til at dække de knuste kerner.

Prøven henstår til bundfældning i 15-30 min.

1.4. Bakterierne ekstraheres fra de behandlede endeskorper på en af nedenstående måder:

i) Den macererede prøve dekanteres forsigtigt til et centrifugeglas, således at bundfaldet forbliver i beholderen eller posen. Hvis det dekanterede, udblødte præparat er uklart, centrifugeres ved højst 180 g i 10 min. ved under 10 °C.

Det udblødte præparat eller supernatanten fra første centrifugeringstrin centrifugeres ved 7 000 g i 15 min. eller ved 10 000 g i 10 min. ved en temperatur på under 10 °C.

Supernatanten kasseres, uden at pelleten forstyrres.

ii) Det udblødte præparat filtreres gennem et filterssystem med en porestørrelse på 40-100 µm.

Filteringen fremskyndes ved brug af en vakuumpumpe.

Filtratet opsamles i en centrifugeglas.

Filtret vaskes med udblødningsbuffer.

Filtratet centrifugeres ved 7 000 g i 15 min. eller ved 10 000 g i 10 min. ved en temperatur på under 10 °C.

Supernatanten kasseres, uden at pelleten forstyrres.

1.5. Pelleten genopslæmmes i 1 ml pelletbuffer (tillæg 2).

Det deles i to lige store portioner, og hver portion overføres til et eppendorfrør.

Det ene eppendorfrør benyttes til test. Resten af dette ekstrakt opbevares ved 4 °C under testen.

Der tilsættes 10-25 % (v/v) steril glycerin til det andet eppendorfrør. Glasset rystes. Opbevares ved - 18 °C (uger) eller - 70 °C (måneder).

2. IF-test

Der benyttes antiserum mod Pseudomonas solanacearum, helst mod race 3/biovar 2. Titeren bestemmes på en suspension af 106 celler/ml fra den homologe stamme af Pseudomonas solanacearum. Der benyttes en passende fortynding af fluoresceinisothiocyanatkonjugatet (FITC-konjugatet) ifølge producentens anbefalinger. Det ubehandlede antiserum bør have en IF-titer på mindst 1:2 000.

Der benyttes mangehullede objektglas med helst 10 felter med mindst 6 mm diam.

Der skal for hvert objektglas indgå en FITC-konjugatkontrol. Testen gentages med en PBS-kontrol indbefattet, hvis der observeres positive celler ved FITC-kontrollen.

Der tilberedes særskilte, positive kontrolglas med en opslæmning af 106 celler/ml fra den korrekte race/biovar-stamme af Pseudomonas solanacearum. Der indgår et objektglas i hvert testsæt.

2.1. Testglassene tilberedes på en af nedenstående måder:

i) For pellets med forholdsvis lidt stivelse:

En afmålt standardmængde (15 µl er passende for 6 mm vinduesdiam. - mængden øges forholdsmæssigt for større vinduer) af den genopslæmmede pellet afpipetteres på en række vinduer. Den resterende række kan anvendes som duplikat eller til en anden prøve som beskrevet i figur 1.

ii) For andre pellets:

Der laves tifoldsfortyndinger, dvs. 1:10, 1:100 og 1:1 000, af den genopslæmmede pellet i pelletbuffer. En afmålt standardmængde (15 µl er passende for 6 mm vinduesdiam. - mængden øges forholdsmæssigt for større vinduer) af den genopslæmmede pellet og hver fortynding afpipetteres på en række vinduer. Den resterende række kan anvendes som duplikat eller til en anden prøve som beskrevet i figur 2.

2.2. Man lader dråberne tørre. Bakteriecellerne fikseres på glasset ved opvarmning, ved flambering eller med 95 % ethanol.

2.3. IF-metode

i) Ved tilberedelse af objektglas som beskrevet ovenfor i underpunkt 2.1, nr. i):

Der laves en række tofoldsfortyndinger af antiserum i IF-buffer (tillæg 3):

¼ af titeren (>NUM>T/>DEN>4), ½ af titeren (>NUM>T/>DEN>2), titeren (T) og det dobbelte af titeren (2T).

ii) Ved tilberedelse af objektglas som beskrevet ovenfor i underpunkt 2.1, nr. ii):

Der laves en arbejdsfortynding (WD) af antiserum i IF-buffer. Arbejdsfortyndingen er den fortynding af antiserum, som har optimal specificitet, og den har normalt det halve af titeren.

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

2.3.1. Objektglassene placeres på fugtigt filtrerpapir.

Testvinduerne dækkes med antiserumfortyndingen/erne. Der pådryppes PBS på FITC-vinduerne. Den mængde antiserum, der anbringes på vinduerne, skal svare til den tilsatte mængde ekstrakt.

2.3.2. Glassene inkuberes tildækket i 30 min. ved rumtemperatur.

2.3.3. Antiserumdråberne rystes af glasset, og glassene skylles omhyggeligt med IF-buffer.

De vaskes 5 min. i IF-buffer-Tween og efterfølgende i 5 min. i IF-buffer (tillæg 3).

Overskydende væske fjernes omhyggeligt.

2.3.4. Objektglassene placeres på fugtigt filtrerpapir.

Testvinduerne og FITC-vinduet dækkes med den fortynding af FITC-konjugatet, der er brugt til at bestemme titeren. Den mængde konjugat, der anbringes på vinduerne, skal svare til den tilsatte mængde antiserum.

2.3.5. Glassene inkuberes tildækket i 30 min. ved rumtemperatur.

2.3.6. Konjugatdråberne rystes af glasset. Glassene skylles og vaskes som ovenfor (2.3.3).

Overskydende fugt fjernes omhyggeligt.

2.3.7. 5-10 µl af 0,1 M fosfatbufferet glycerin (tillæg 3) eller en tilsvarende indlejringsolie afpipetteres på hvert vindue, og der sættes dækglas på.

2.4. Aflæsning af IF-testen

Testglassene undersøges i et mikroskop med en epifluorescerende lyskilde og filtre, som er egnet til arbejdet med FITC, i immersionsolie ved 500-1 000 ganges forstørrelse. Vinduerne gennemsøges langs to diametre vinkelret på hinanden og langs omkredsen.

Det positive kontrolvindue undersøges først. Cellerne skal være lyse, fluorescerende og fuldstændig farvede. NB: Testen må gentages om farvningen er unormal.

Det konstateres derefter, at der ikke er fluorescerende celler i FITC-kontrolvinduerne. Fluorescerende celler i FITC-kontrollen viser uspecifik binding af konjugatet, autofluorescens eller kontaminering.

NB: Hvis sådanne celler observeres, gentages testen.

Dernæst observeres, om der er lyse, fluorescerende celler med den karakteristiske morfologi for Pseudomonas solanacearum i testvinduerne. Fluorescensens intensitet skal svare til den positive kontrolstammes ved samme antiserumfortynding. Celler med ufuldstændig farvning eller med svag fluorescens ses der bort fra, undtagen hvis de forekommer i stort antal (se fortolkning af IF-testresultatet).

Fortolkning af IF-testresultatet

i) En IF-test er negativ, hvis der ikke er fundet lyse, fluorescerende celler med karakteristisk morfologi i en prøve.

ii) Hvis der er fundet lyse, fluorescerende celler med karakteristisk morfologi i en prøve, bestemmes gennemsnitsantallet af celler pr. mikroskopfelt og antal celler (N) pr. ml. genopslæmmet pellet beregnes (tillæg 4).

En population på omkring 10³ celler/ml af det opsamlede bundfald er grænseværdien for IF-testen.

- for prøver med N > 10³ celler/ml er IF-testen positiv

- for prøver med N < 10³ celler/ml kan IF-testen betragtes som positiv.

iii) Hvis et stort antal (>105 celler/ml) af ufuldstændige eller svage fluoricerende celler ses ved antiserummets titer, skal en anden test gennemføres:

- Denne skal enten baseres på et anderledes serologisk princip, eller

- være en gentagelse af IF-testen, med en anden antiserum eller en tigangs fortynding af bundfaldet.

3. ELISA-test

Robinson-Smith et al. 1995

Der benyttes antiserum mod Pseudomonas solanacearum, helst mod race 3/biovar 2. Titeren bestemmes på en opslæmning af 106 celler/ml fra den homologe stamme af Pseudomonas solanacearum.

Det anbefales at bruge NUNC Polysorb mikrotiterplader.

Der skal indgå en negativ kartoffelekstraktkontrol og en fosfatbufferet saltkontrol (PBS).

Der anvendes en opslæmning af > 106 celler/ml fra en korrekt race/biovar stamme af Pseudomonas solanacearum som positiv kontrol. Test af kontrollerne foretages som for prøvernes vedkommende, men de skal holdes godt adskilt fra prøverne på mikrotiterpladen.

3.1. 100-200 µl af den genopslæmmede pellet afpipetteres i et eppendorfrør.

Glasset opvarmes i 4 min. ved 100 °C. Glasset afkøles på is.

3.2. Der tilsættes en lige så stor mængde karbonatcoatingbuffer af dobbelt styrke (tillæg 5). Eppendørfrøret rystes.

3.3. 100 µl portioner af prøven anbringes på hver af mindst to brønde i mikrotiterpladen. Pladen inkuberes i en time ved 37 °C eller natten over ved 4 °C.

3.4. Ekstrakterne hældes ud af brøndene. Brøndene vaskes tre gange med PBS-Tween (tillæg 5). Det sidste hold vaskeopløsning skal henstå i brøndene mindst 5 min.

3.5. Der laves en passende fortynding af Pseudomonas solanacearum-antiserum i blokeringsbuffer (tillæg 5). 100 µl antiserumfortynding overføres til brøndene. Pladen inkuberes i en time ved 37 °C.

3.6. Antiseraet hældes ud af brøndene. Brøndenen vaskes som ovenfor (nr. 3.4).

3.7. Man laver en passende fortynding af alkalisk fosfatasekonjugat i blokeringsbuffer. 100 µl af konjugatfortyndingen overføres til brøndene.

Pladen inkuberes i en time ved 37 °C.

3.8. Konjugatet slåes ud af brøndene. Brøndene vaskes som ovenfor (nr. 3.4 og 3.6).

3.9. Man laver den alkaliske fosfatasesubstratopløsning (tillæg 5). 100 µl overføres til hullerne. Pladen inkuberes i 30-60 minutter i mørke ved laboratorietemperatur.

3.10. Absorbansen aflæses ved 409 nm.

Fortolkning af ELISA-test

ELISA-testen er negativ, hvis prøvens absorbans er < 2 × den negative kontrols absorbans.

ELISA-testen er positiv, hvis prøvens absorbans er > 2 × den negative kontrols absorbans.

4. PCR-test

Seal et al., 1993

NB: Der skal på alle trin i tilberedelsen af prøven og andre manipulationer med PCR benyttes pipettespidser med filterprop.

Der laves en opslæmning af 106 celler/ml fra en race 3/biovar 2-stamme af Pseudomonas solanacearum som positiv kontrol. Test af kontrollen foretages som for prøvernes vedkommende.

4.1. 100 µl af den genopslæmmede pellet afpipetteres i et eppendorfrøret.

Som alternativ kan 90 µl af den genopslæmmede pellet overføres til et eppendorfrør med 10 µl 0,5 M NaOH. Prøven blandes ved, at eppendorfrøret vendes gentagne gange.

4.2. Prøven opvarmes i 4 min. ved 100 °C. Eppendorfrøret afkøles straks på is.

4.3. Der laves tifoldsfortyndinger, fx 1:10 og 1:100, i sterilt destilleret eller ultrarent vand (UPW).

4.4. PCR-reaktionsvolumen (tillæg 6) laves i et sterilt glas ved tilsætning af følgende bestanddele i nedenstående rækkefølge:

>TABELPOSITION>

Til flere reaktioner

Mængden af hver bestanddel til det krævede antal reaktioner beregnes. Bestanddelene blandes, og 45-48 µl af blandingen overføres til sterile PCR-rør. Rørene med PCR-reaktionsvolumet opbevares på is.

Til en reaktionsvolumen på 25 µl

Mængderne af bestanddele reduceres proportionalt.

4.5. PCR-forstærkning

4.5.1. Valgmulighed: Pulscentrifugering af glassene med den kogte prøve og den positive kontrol.

Der tilsættes i denne rækkefølge 2-5 µl prøve(r), vandkontrol og positiv kontrol til glassene med PCR-reaktionsblandingen. Glassene anbringes i PCR-apparatets varmeblok.

4.5.2. Følgende program køres:

1 cyklus på

i) 2 min. ved 96 °C: denaturering af DNA

50 cykler på

ii) 20 sek. ved 94 °C: denaturering

iii) 20 sek. ved 68 °C: påhæftning af primere

iv) 30 sek. ved 72 °C: forlængelse af kopi

1 cyklus på

v) 10 min ved 72 °C: yderligere forlængelse

1 cyklus på

vi) henstand ved 4 °C.

NB: Disse parametre gælder for en Perkin Elmer 9600. Andre PCR-apparater kræver måske et øvre lag af mineralolie i PCR-reaktionsglassene og/eller modifikation af varigheden af trin ii), iii) og iv) i forstærkningsprofilen.

4.5.3. Glassene tages ud af PCR-apparatet. PCR-produktet analyseres. Hvis dette ikke straks finder sted, opbevares glassene ved 4 °C for brug samme dag eller ved -18 °C for senere brug.

4.6. Analyse af PCR-produktet

PCR-fragmenterne påvises ved agarosegelelektroforese og farvning med ethidiumbromid.

4.6.1. Der laves en agarosegel ved langsomt at bringe agarose i kog i trisacetatelektroforese (TAE)-buffer.

4.6.2. Den smeltede agarose afkøles til 50-60 °C og hældes i elektroforeseenhedens form, hvorefter kammen indsættes. Man lader gelen størkne.

4.6.3. Kammen tages ud. Gelen nedsænkes i TAE, således at den lige netop er dækket (2-3 mm) af bufferen.

4.6.4. 3 µl dråber buffer anbringes på parafilm. Der tilsættes 12 µl af PCR-produktet fra prøverne, den positive kontrol eller vandkontrollen, og der blandes ved at suge let i pipettespidsen inden påfyldning. De givne mængder kan ændres, således at de passer til kapaciteten af brøndene i agarosegelen.

4.6.5. Gelens brønde flydes forsigtigt. Som reference anbringes en egnet DNA-markør i mindst en brønd.

4.6.6. Ledningerne mellem strømforsyningen og elektroforeseapparatet forbindes. Man lader gelen løbe ved 5-8 V/cm, indtil frontindikatoren er 1 cm fra enden af gelen.

4.6.7. Strømforsyningen afbrydes. Ledningerne tages af elektroforeseapparatet. Gelen fjernes forsigtigt. Den nedsænkes i ethidiumbromidopløsning i 30-45 min.

NB: Man skal altid bære engangshandsker, når man håndterer ethidiumbromid, som er et kraftigt mutagent stof.

4.6.8. Prøven affarves i destilleret vand i 10-15 min.

4.6.9. De forstærkede DNA-fragmenter visualiseres ved UV-gennemlysning. PCR-produktet af Pseudomonas solanacearum ved primer OLI-1 og Y-2 er 288 bp i længde. Dette kontrolleres i forhold til DNA-markøren og den positive kontrol.

NB: Vandkontrollen skal under alle omstændigheder være negativ. Hvis den er positiv, gentages testen.

4.6.10. Gelen fotograferes, hvis der er brug for at bevare resultatet.

4.6.11. Det forstærkede fragtments ægthed bekræftes ved restriktionsenzymanalyse (REA).

4.7. Restriktionsenzymanalyse (REA)

4.7.1. 8,5 µl af PCR-produktet (4.5.3) overføres til et nyt mikroglas. Der tilsættes 1 µl 10 × enzymbuffer og 0,5 µl restriktionsenzym Avall.

4.7.2. Blandingen foretages ved at suge forsigtigt i pipettespidsen. Hvis der stadig er dråber på glassets vægge, pulscentrifugeres i en mikrocentrifuge. Glasset inkuberes i en time ved 37 °C.

4.7.3. Det destruerede PCR-fragment analyseres ved agarosegelelektroforese som ovenfor (punkt 4.6).

Fortolkning af PCR-testresultatet

PCR-testen er negativ, hvis det karakteristiske 288 bp-fragment ikke påvises, samtidig med at fragmentet påvises for den positive kontrolstamme af Pseudomonas solanacearum.

PCR-testen er positiv, hvis 288 bp-fragmentet påvises, samtidig med at REA-analysen af det forstærkede fragment er identisk med den positive kontrolstamme af Pseudomonas solanacearum.

5. Dyrkning på selektivt medie

Elphinstone et al., 1996

5.1. Testen foretages ved en passende fortyndingsudstrygningsmetode, f.eks.:

i) Der laves mindst to tifoldsfortyndninger, dvs. 1:10 og 1:100, af den genopslæmmede pellet i pelletbuffer. En afmålt standardmængde (50-100 µl) af den genopslæmmede pellet og hver fortynding afpipetteres på et modificeret, selektivt SMSA-substrat (tillæg 7) og stryges med en glasstav ud over hele substratets overflade.

Hvis man finder det nyttigt, kan der også foretages en fortynding ved hjælp af en podenål fyldt med 10 µl af den genopslæmmede pellet. Øskenen skal flamberes mellem strøgene.

ii) En afmålt standardmængde (50-100 µl) af den genopslæmmede pellet overføres til et modificeret, selektivt SMSA-medie og stryges med en glasstav ud over hele substratets overflade. Der stryges med staven uden flambering på endnu to modificerede SMSA-plader.

5.2. Efter samme fortyndingsudstrygningsmetode udstryges en opslæmning af 106 celler/ml fra en race 3/biovar 2-stamme af Pseudomonas solanacearum som positiv kontrol på en række særskilte, modificerede SMSA-plader.

5.3. Pladerne inkuberes ved 28 °C. Man begynder at aflæse pladerne efter tre døgn. Hvis de er negative, inkuberes de yderligere i indtil seks døgn. Virulente isolater af Pseudomonas solanacearum udvikler mælkehvide, flade, uregelmæssige og udflydende kolonier med tydelige røde til violette centre, der viser indre striber eller hvirvler.

5.4. Kolonier med karakteristisk morfologi rendyrkes ved subkultur på et generelt næringssubstrat (tillæg 1).

5.5. Renkulturer (afsnit II, punkt 4.1) identificeres, og Pseudomonas solanacearum-kulturer bekræftes ved en patogenitetstest (afsnit II, punkt 4.3)

Fortolkning af resultatet af selektiv udstrygning

Selektiv udstrygning er negativ, hvis der ikke er isoleret nogen kolonier efter seks døgn, eller hvis der ikke er isoleret nogen karakteristiske kolonier af Pseudomonas solanacearum, forudsat at der ikke foreligger mistanke om hæmning ved kolonier af andre bakterier, og at karakteristiske kolonier af Pseudomonas solanacearum er fundet i den positive kontrol.

Selektiv udstrygning er positiv, hvis der isoleres karakteristiske kolonier af Pseudomonas solanacearum.

6. Biotest

Janse, 1988

6.1. Der benyttes 10 testplanter af modtagelige tomat- eller ægplanter bladstadium 3 til hver prøve. Planterne må ikke vandes de sidste 24 timer før indpodningen.

6.2. 100 µl genopslæmmet pellet fordeles mellem testplanterne. Der indpodes i stænglen mellem kimbladene på et eller flere steder.

6.3. Efter samme metode indpodes 10 frøplanter med en opslæmning af 106 celler/ml fra en race 3/biovar 2-stamme af Pseudomonas solanacearum som positiv kontrol og med pelletbuffer som negativ kontrol. De positive kontrolplanter holdes adskilt fra de øvrige planter for at undgå kontamination.

6.4. Småplanterne videredyrkes ved en temperatur på 22 °C-28 °C, med høj relativ fugtighed og daglig vanding, i op til 4 uger. Der observeres for udvikling af visnesymptomer, epinasti, klorose og/eller nedsat vækst.

6.5. Der isoleres fra inficerede planter (afsnit II). Renkulturer med karakteristisk morfologi (afsnit II, punkt 4.1) identificeres, og Pseudomonas solanacearum-kulturer bekræftes ved en patogenitetstest (afsnit II, punkt 4.3).

6.6. Det kontrolleres, at der ikke findes infektion i hold af testplanter, der ikke viser tegn på infektion. 2 cm over indpodningsstedet på hver testplante fjernes et stykke stilk på 1 cm. Vævene homogeniseres i udblødningsbuffer. Der foretages fortyndingsudstrygning (afsnit III, punkt 5.1). Hvis resultatet er positivt, identificeres renkulturer med karakteristisk morfologi (afsnit II, punkt 4.1), og Pseudomonas solanacearum-kulturer bekræftes ved en patogenitetstest (afsnit II, punkt 4.3).

Fortolkning af resultatet af biotesten

Biotesten er negativ, hvis testplanterne ikke er inficeret med Pseudomonas solanacearum, og forudsat at Pseudomonas solanacearum er påvist i de positive kontrolplanter.

Biotesten er positiv, hvis testplanterne er inficeret med Pseudomonas solanacearum.

7. Berigningstest

J. G. Elphinstone et al., 1996

7.1. 100 µl genopslæmmet pellet overføres til 3 ml modificeret SMSA-bouillon (tillæg 7).

7.2. Der inkuberes i 48 timer (men højst 72 timer) ved 28 °C med glassets prop sat løst på af hensyn til beluftning.

7.3. Proppen sættes fast, og prøven omrystes. Der tages portioner fra til IF-testen (dette afsnit, punkt 2), ELISA-testen (dette afsnit, punkt 3) og/eller PCR-testen (dette afsnit, punkt 4).

8. Patogenitetstest

Se afsnit II, 4.3.

Tillæg 1

Medier til isolering og dyrkning af Pseudomonas solanacearum

Næringsagar (NA)

>TABELPOSITION>

Der tilberedes medium i kolber på 1 l med ½ l medium i hver.

Ingredienserne opløses.

Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Der afkøles til 50 °C. Ophældning på petriskåle.

Gær-pepton-glucoseagar (YPGA)

>TABELPOSITION>

Der tilberedes medium i kolber på 1 l med ½ l medium i hver.

Ingredienserne opløses.

Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Der afkøles til 50 °C. Ophældning på petriskåle.

Saccharose-peptonagar (SPA)

>TABELPOSITION>

Der tilberedes medium i kolber på 1 l med ½ l medium i hver.

Ingredienserne opløses. Om nødvendigt justeres pH til 7,2-7,4.

Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Der afkøles til 50 °C. Ophældning på petriskåle.

Kelman's tetrazolium-medium

>TABELPOSITION>

Der tilberedes medium i kolber på 1 l med ½ l medium i hver.

Ingredienserne opløses. Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Der afkøles til 50 °C.

Der tilsættes en filtersteriliseret vandig opløsning af triphenyltetrazoliumchlorid (Sigma), så der opnås en slutkoncentration på 50 mg/l.

Ophældning på petriskåle.

Tillæg 2

Materiale til tilberedning af prøver

Udblødningsbuffer: 50 mM phosphatbuffer, pH 7,0

Denne buffer benyttes til udblødning af væv.

>TABELPOSITION>

Ingredienserne opløses, og pH kontrolleres. Der fremstilles opløsninger efter behov. Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Det anbefales, at der tilsættes 5 % Poly Vinyl Pyrolidon-40 000 MWT (PVP-40) ved udførelsen af den direkte PCR-test for at mindske sandsynligheden for, at aromatiske molekuler i ekstraktet hæmmer forstærkningen.

Det anbefales, at det tilsættes et antiflokkuleringsmiddel, et antiskummiddel eller en antioxidant, når der bruges en Waring Blender- eller Ultra Turrax-homogeniseringsprocedure for udblødning af kartoffelvæv.

>TABELPOSITION>

Der autoklaveres særskilt. Der tilsættes, til den ønskede koncentration opnås.

Pelletbuffer: 10 mM phosphatpuffer pH 7,2

Denne buffer benyttes til genopslæmning og fortynding af pellets af kartoffelendeskorper.

>TABELPOSITION>

Ingredienserne opløses, og pH kontrolleres. Der fremstilles opløsninger efter behov.

Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Tillæg 3

Materiale til IF-testen

IF-buffer: 10 mM saltvand med phosphatbuffer (PBS), pH 7,2

Denne buffer benyttes til fortynding af antisera.

>TABELPOSITION>

Ingredienserne opløses, og pH kontrolleres. Der fremstilles opløsninger efter behov.

Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

IF-buffer - Tween

Denne buffer benyttes til skylning af objektglas. Der tilsættes 0,1 % Tween 20 til IF-bufferen.

0,1 M Glycerol med phosphatbuffer pH 7,6

Denne buffer benyttes som indlejringsmiddel på vinduerne i IF-objektglasset for at intensivere fluorescensen.

>TABELPOSITION>

Tillæg 4

Bestemmelse af kontaminationen i IF-testen

Overflademål (S) af vindue eller multispot-objektglas

= >NUM>ð D²>DEN>4

>TABELPOSITION> (1)

Synsfeltets (s) overflademål

= >NUM>ð d²>DEN>4

>TABELPOSITION> (2)

d bestemmes enten ved direkte måling eller på grund af følgende formel:

s = >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4 (3)

>TABELPOSITION>

Af (2)

d = √>NUM>4 s>DEN>ð (4)

Fås (3)

d = √>NUM>4 × >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4>DEN>ð = >NUM>i>DEN>GK

Optælling: antal typisk fluorescerende celler pr. synsfelt (c).

Beregning: antal typisk fluorescerende celler pr. vindue (C).

C = c >NUM>S>DEN>s

Beregning: antal typisk fluorescerende celler pr. ml tørstofenhed (N).

N = C × >NUM>1 000>DEN>y× F

>TABELPOSITION>

Tillæg 5

Materiale til ELISA-testen

Coating buffer, pH 9,6

>TABELPOSITION>

Ingredienserne opløses, og pH kontrolleres. Der fremstilles opløsninger efter behov.

Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Der kan tilsættes natriumsulfit til en slutkoncentration på 0,2 % som antioxidant, hvis ekstraktet har et stort indhold af aromatiske molekyler.

10 × saltvand med phosphatbuffer (PBS), pH 7,4

>TABELPOSITION>

Ingredienserne opløses, og pH kontrolleres. Der fremstilles opløsninger efter behov.

Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Saltvand med phosphatbuffer-Tween (PBS-T)

>TABELPOSITION>

Blokerende (antistof) buffer (skal være frisklavet)

>TABELPOSITION>

Alkalisk phosphatasesubstratopløsning pH 9,8

>TABELPOSITION>

Der blandes og justeres til pH 9,8 med koncentreret HCI.

Der fyldes op til 1 l med destilleret vand.

Der tilsættes 0,2 g MgCl2.

2 phosphatasesubstrattabletter (5 mg) (Sigma) opløses pr. 15 ml opløsning.

Tillæg 6

Materiale til PCR-testen

Oligonucleotid primersekvens:

>TABELPOSITION>

Materialer: se Seal et al. 1993

Tillæg 7

Materiale til dyrkning på selektivt substrat og berigningstest

SMSA selektivt medium (Engelbrecht, 1994 som ændret ved Elphinstone et al., 1996)

Grundmedium

>TABELPOSITION>

Der tilberedes medium i kolber på 1 l med ½ l medium i hver.

Ingredienserne opløses, og pH kontrolleres. Om nødvendigt justeres pH til 6,5 inden autoklavering. Pseudomonas solanacearum gror dårligt på mediet ved pH > 7,0.

Der steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 15 minutter.

Der nedkøles til 50 °C.

Følgende ingredienser tilsættes (alle fra Sigma), så de angivne slutkoncentrationer opnås:

>TABELPOSITION>

Ingredienserne opløses i 70 % ethanol til de koncentrationer, der følger af den tilberedte mediemængde. Nogle ingredienser, fx polymixin B og chloramphenicol kræver en let opvarmning og skal omrystes.

SMSA-bouillon (Elphinstone et al., 1996)

Tilberedningen foregår som for det selektive SMSA-medium, men agaren udelades.

Hældes i 30 ml Universal-glas til engangsbrug i 3 ml aliquoter.

Litteraturhenvisninger

Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726.

Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121.

Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142.

Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith)Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.

Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5.

Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277.

Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127-135.

Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351.

Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345.

Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293-695.

Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp.

Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536.

Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838.

Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029-1034.

Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594.

Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268.

Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111.

Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295.

Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266-269.