*****

KOMMISSIONENS DIREKTIV

af 20. december 1983

om aendring af direktiv 71/393/EOEF, 72/199/EOEF og 78/633/EOEF om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer

(84/4/EOEF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 70/373/EOEF af 20. juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder for saa vidt angaar den officielle kontrol med foderstoffer (1), senest aendret ved akten vedroerende Graekenlands tiltraedelse, saerlig artikel 2, og

ud fra foelgende betragtninger:

I Kommissionens direktiv 71/393/EOEF (2), 72/199/EOEF (3) og 78/633/EOEF (4) fastsaettes metoder til bestemmelse af henholdsvis raafedt, virginiamycin og zink-bacitracin; disse metoder maa erstattes med metoder, der tilpasset den videnskabelige og tekniske udvikling;

de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den staaende Foderstofkomité -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV:

Artikel 1

I bilaget til direktiv 71/393/EOEF erstattes del 4 »Bestemmelse af raafedt « med teksten i bilag I til naervaerende direktiv.

Artikel 2

I bilag II til direktiv 72/199/EOEF erstattes del 5 »Bestemmelse af virginiamycin - ved diffusion i agarnaeringssubstrat« med teksten i bilag II til naervaerende direktiv.

Artikel 3

I bilaget til direktiv 78/633/EOEF erstattes del 1 »Bestemmelse af zinkbacitracin - ved diffusion i agarnaeringssubstrat« med teksten i bilag III til naervaerende direktiv.

Artikel 4

Medlemsstaterne saetter de fornoedne love og administrative bestemmelser i kraft for at efterkomme dette direktiv senest den 1. juni 1984. De underretter straks Kommissionen herom.

Artikel 5

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 20. december 1983.

Paa Kommissionens vegne

Poul DALSAGER

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 170 af 3. 8. 1970, s. 2.

(2) EFT nr. L 279 af 20. 12. 1971, s. 7.

(3) EFT nr. L 123 af 29. 5. 1972, s. 6.

(4) EFT nr. L 206 af 29. 7. 1978, s. 43.

BILAG I

»4. BESTEMMELSE AF RAAFEDT

1. Formaal og anvendelse

Metoden anvendes til bestemmelse af raafedtindholdet i foderstoffer. Den er ikke beregnet til analyse af olieholdige froe og olieholdige frugter som defineret i Raadets forordning 136/66/EOEF af 22. september 1966.

Alt efter foderstoffets art anvendes en af de to beskrevne metoder.

1.1. Metode A

Skal anvendes til ublandede foderstoffer af vegetabilsk oprindelse med undtagelse af saadanne, som er kendt som foderstoffer, hvorfra fedt ikke kan ekstraheres fuldstaendigt med petroleumsether uden forudgaaende hydrolyse. Blandt disse kan naevnes gluten, gaer, soja- og kartoffelproteiner. Metoden anvendes endvidere til foderblandinger med undtagelse af saadanne, som indeholder maelkepulver, eller hvis fedtindhold ikke kan ekstraheres fuldstaendigt med petroleumsether uden forudgaaende hydrolyse.

1.2. Metode B

Skal anvendes til ublandede foderstoffer af animalsk oprindelse samt til de foderstoffer, der er naevnt under punkt 1.1 som undtagelser fra metode A.

2. Princip

2.1. Metode A

Proeven ekstraheres med petroleumsether. Oploesningsmidlet afdampes og det ekstraherede fedt toerres og vejes.

2.2. Metode B

Proeven hydrolyseres med saltsyre under kogning. Oploesningen afkoeles og filtreres. Den vaskede og toerrede rest behandles herefter som beskrevet under metode A.

3. Reagenser

3.1. Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40-60 °C. Bromtallet skal vaere under 1, og inddampningsresten under 2 mg/100 ml.

3.2. Natriumsulfat, vandfrit

3.3. Saltsyre, 3M.

3.4. Filtreringsmiddel, f.eks. kiselgur, Hyflo-supercel.

4. Apparatur

4.1. Ekstraktionsapparat. Dersom apparatet er udstyret med et haevertroer (Soxhlet apparat), boer varmekilden indstilles, saa der sker ca. 10 toemninger i timen; dersom apparatet ikke er udstyret med haevertroer, boer varmekilden vaere ca. 10 ml i minuttet.

4.2. Ekstraktionshaetter skal vaere frit for stof, der er oploeseligt i petroleumsether, og skal have en poroesitet i overensstemmelse med kravene under 4.1.

4.3. Toerreskab, enten et vakuumtoerreskab indstillet til 75° C ± 3° C eller et toerreskab med luftcirkulation instillet til 100° C ± 3° C.

5. Fremgangsmaade

5.1. Metode A (jf. 8.1)

5 g af proeven afvejes med en noejagtighed paa 1 mg, fyldes i en ekstrationshaette (4.2) og tildaekkes med en affedtet vatprop.

Haetten anbringes i et ekstraktionsapparat (4.1), og der ekstraheres i seks timer med petroleumsether (3.1). Petroleumsetherekstraktet opsamles i en toer, tareret kolbe indeholdende nogle stykker pimpsten (1).

Oploesningsmidlet afdestilleres. Destillationsresten toerres derpaa i halvanden time i toerreskabet (4.3). Efter afkoeling ekssikkator vejes resten. Ved yderligere toerring paa 30 minutter kontrolleres, om fedtets vaegt forbliver konstant (vaegttabet mellem to paa hinanden foelgende vejninger skal ligge under 1 mg).

5.2. Metode B

2,5 g af proeven afvejes med en noejagtighed paa 1 mg (se bemaerkninger 8.2), haeldes i et 400 ml baegerglas eller en 300 ml konisk kolbe, hvorefter der tilsaettes 100 ml 3M saltsyre (3.3) og nogle stykker pimpsten. Baegerglasset tildaekkes med et urglas, eller hvis der anvendes konisk kolbe, forsynes denne med en tilbageloebskoeler Blandingen bringes til let kogning over en svag flamme eller paa en varmeplade i ca. 1 time. Materialet skal forhindres i at saette sig fast paa glassets vaeg.

Beholderen afkoeles, og der tilsaettes saa meget filtreringsmiddel (3.4), at der ikke opstaar noget fedttab ved filtreringen. Der filtreres gennem et fugtigt, fedtfri dobbelt papirfilter. Remanensen udvaskes med koldt vand, indtil filtratet er neutralt. Derefter kontrolleres, at filtratet ikke har fedtperler paa overfladen. Tilstedevaerelse af fedt viser, at der inden hydrolysen skal foretages en ekstraktion af proeven med petroleumsether ved anvendelse af metode A.

Det dobbelte papirfilter med filterresten laegges paa et urglas og toerres i toerreskab ved 100° C ± 3° C i halvanden time.

Det dobbelte papirfilter med den toerre filterrest anbringes i en ekstraktionshaette (4.2) og tildaekkes med en affedtet vatprop. Haetten anbringes i et ekstraktionsapparat (4.1), hvorefter der fortsaettes som beskrevet under 5.1, andet og tredje afsnit.

6. Beregning af resultaterne

Vaegten af afdampningsresten udtrykkes i % af proeven.

7. Reproducerbarhed

Forskellen mellem to parallelbestemmelser udfoert paa samme proeve af samme analytiker boer ikke overstige:

- 0,2 % i absolut vaerdi, for raafedtindhold under 5 %,

- 4,0 % af det hoejeste resultat, for indhold paa 5 til 10 %,

- 0,4 % i absolut vaerdi, for indhold over 10 %.

8. Bemaerkninger

8.1. Til proever med hoejt fedtindhold, som er vanskelige at findele, eller som ikke egner sig til udtagning af en reduceret homogen proeve, anvendes foelgende fremgangsmaade.

20 g af proeven afvejes med en noejagtighed paa 1 mg og blandes med 10 g eller mere af vandfrit natriumsulfat (3.2). Derpaa ekstraheres med petroleumsether (3.1) som angivet under 5.1. Den herved opsamlede ekstrakt tilsaettes petroleumsether (3.1) ad 500 ml og blandingen rystes. Af oploesningen udtages 50 ml, som haeldes i en lille, toer, tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten (1). Oploesningsmidlet afdampes; derpaa toerres og fortsaettes som beskrevet under 5.1, sidste afsnit.

Ekstraktionsresten i haetten befries for oploesningsmidlet og findeles til en kornstoerrelse paa 1 mm, hvorefter den haeldes tilbage i ekstraktionshaetten (der tilsaettes ikke natriumsulfat); derpaa fortsaettes som beskrevet under 5.1, andet og tredje afsnit.

Fedtindholdet beregnes som en procentdel af proeven ved anvendelse af nedenstaaende formel:

(10 a + b) × 5

hvor:

a = vaegt i gram af remanensen efter den foerste ekstraktion (den alikvote del af ekstraktet)

b = vaegt i gram af remanensen efter den anden ekstraktion.

8.2. Ved proever med lavt fedtindhold kan der anvendes en afvejning paa 5 g (se 5.1).«

(1) Saafremt fedtet senere skal undersoeges kvalitativt, erstattes pimpstenstykkerne af glaskugler.

(1) Saafremt fedtet senere skal undersoeges kvantitativt, erstattes pimpstentykkerne af glaskugler.

BILAG II

»5. BESTEMMELSE AF VIRGINIAMYCIN

- ved diffusion paa agarplader -

1. Formaal og anvendelsesomraade

Metoden anvendes til bestemmelse af virginiamycin i foderstoffer og forblandinger. Undergraensen for bestemmelsen er 2 mg/kg (2 ppm) (1).

2. Princip

Proeven ekstraheres med en oploesning af Tween 80 i methanol. Ekstraktet dekanteres eller centrifugeres og fortyndes. Dets antibiotiske styrke bestemmes ved at maale diffusionen af virginiamycin i et agarsubstrat podet med Micrococcus luteus. Diffusionen viser sig ved dannelsen af zoner, hvori mikroorganismens vaekst er haemmet. Diameteren af disse zoner anses for at vaere direkte proportional med logaritmen til den antibiotiske styrke inden for de anvendte koncentrationer af antibiotikum.

3. Testorganisme: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC) 8340, NCIB 8553)

3.1. Opbevaring af stamkulturen

Micrococcus luteus podes paa skraaagar med naeringssubstrat (4.1) og inkuberes i 24 timer ved 30° C. Kulturen opbevares i koeleskab ved ca. 4° C. Den ompodes hver anden uge.

3.2. Fremstilling af bakteriesuspension (a)

Vaeksten fra et skraaagarglas (3.1) opslemmes med 2 til 3 ml natrium-chloridoploesning (4.3). Denne opslaemning anvendes til podning af 250 ml naeringssubstrat (4.1) i en Roux-kolbe, og der inkuberes i 18 til 20 timer ved 30° C. Vaeksten opslaemmes i 25 ml natriumchloridoploesning (4.3) og fortyndes 10 gange med samme oploesning. Opslaemningens lystransmission skal vaere ca. 75 pct., maalt ved 650 nm mod natriumchloridoploesning (4.3) i en 1 cm celle. Opslaemningen kan opbevares ved ca. 4° C i en uge.

4. Naeringssubstrater og reagenser

4.1. Naerings- og testsubstrat (b)

1.2 // Koedpepton // 6,0 g // Trypton // 4,0 g // Gaerekstrakt // 3,0 g // Koeekstrakt // 1,5 g // Glucose // 1,0 g // Agar // 10,0 til 20,0 g // Vand // 1 000 ml // pH 6,5 (efter sterilisering). //

4.2. Phosphatbuffer, pH 6

1.2 // Kaliumhydrogenphosphat, K2HPO4 // 2,0 g // Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4 // 8,0 g // Vand til // 1 000 ml.

4.3. Natriumchloridoploesning, 0,8 %: 8 g natriumchlorid oploeses i vand, fortyndes til 1 000 ml og steriliseres.

4.4. Methanol.

4.5. Blanding af phosphatbuffer (4.2) og methanol (4.4): 80/20 (v/v).

4.6. Oploesning af Tween 80 i methanol, 0,5 % (w/v): 5 g Tween 80 oploeses i methanol (4.4) og fortyndes til 1 000 ml.

4.7. Standardpraeparat: virginiamycin af kendt styrke.

5. Standardoploesninger

En noejagtigt afvejet maengde standardpraeparat (4.7) oploeses i methanol (4.4) og fortyndes med methanol (4.4), saaledes at der fremkommer en stamoploesning indeholdende 1 000 mg virginiamycin pr. ml. Opbevaret i tilproppede flasker ved 4° c vil denne oploesning vaere holdbar i indtil 5 dage.

Af denne stamoploesning fremstilles ved successiv fortynding med blandingen (4.5) foelgende oploesninger:

S8 1 mg/ml,

S4 0,5 mg/ml,

S2 0,25 mg/ml,

S1 0,125 mg/ml.

6. Fremstilling af ekstrakt og testoploesninger

6.1. Ekstraktion

6.1.1. Produkter med et virginiamycinindhold paa til og med 100 mg/kg

50,0 g af proeven afvejes. Der tilsaettes 200 ml af oploesningen (4.6) og rystes i 30 minutter. Efter bundfaeldning eller centrifugering udtages 20 ml af supernatanten, som inddampes til ca. 5 ml i en rotationsfordamper ved hoejst 40° C. Remanensen fortyndes med blandingen (4.5) indtil et forventet virginiamycinindhold paa 1 mg/ml (= U8).

6.1.2. Produkter med et virginiamycinindhold paa over 100 mg/kg

Der afvejes en maengde af proeven paa hoejst 10,0 g, der indeholder mellem 1 og 50 mg virginiamycin. Der tilsaettes 100 ml af oploesningen (4.6) og rystes i 30 minutter. Efter bundfaeldning eller centrifugering fortyndes supernatanten med blandingen (4.5) indtil et forventet virginiamycinindhold paa 1 m g/ml (= U8).

6.2. Testoploesninger

Oploesningerne U4 (forventet indhold: 0,5 mg/ml), U2 (forventet indhold: 0,25 mg/ml) og U1 (forventet indhold: 0,125 mg/ml) fremstilles af oploesning U8 ved successiv fortynding (1: 1) med blandingen (4.5).

7. Testmetode

7.1. Podning af testsubstratet

Testsubstratet (4.1) podes med bakteriesuspensionen (3.2) ved ca. 50° C . Paa plader med testsubstrat (4.1) bestemmes forud den maengden bakteriesuspension, der giver de stoerste og tydeligste haemningszoner med de forskellige koncentrationer af virginiamycin.

7.2. Forberedelse af pladerne

Diffusionen i agar udfoeres paa plader med de fire koncentrationer af standardoploesningen (S8, S4, S2, S1) og de fire koncentrationer af testoploesningen (U8, U4, U2 og U1). Disse fire koncentrationer af ekstrakt og standard skal noedvendigvis alle findes paa hver plade. Der boer derfor vaelges plader, der er store nok til at rumme mindst otte huller i agarsubstratet med en diameter paa 10 til 13 mm og mindst 30 mm mellem hullernes centrum. Testen kan udfoeres paa plader, der bestaar af en glasplade med en aluminium- eller plastring ovenpaa, 200 mm i diameter og 20 mm hoej.

Pladerne paahaeldes substrat (4.1), der er podet som angivet i 7.1, saa der opnaas et ca. 2 mm tykt lag (60 ml til en plade paa 200 mm i diameter). Pladerne anbringes vandret til stoerkning, hullerne udstanses, og noejagtigt afmaalte maengder af test- og standardoploesning anbringes i hullerne (mellem 0,10 og 0,15 ml pr. hul, afhaengig af diameteren), Hver koncentration skal anbringes mindst fire gange, saaledes at hver bestemmelse er baseret paa en aflaesning af 32 haemningszoner.

7.3. Inkubation

Pladerne inkuberes i 16 til 18 timer ved 30° C ± 2° C.

8. Bedoemmelse

Haemningszonernes diameter maales med 0,1 mm noejagtighed. Middeldiameteren for hver koncentration afsaettes paa semilogaritmisk papir, saaledes at de viser logaritmen til koncentrationen i forhold til haemningszonernes diameter. Der indtegnes den »bedst tilpassede« rette linje for henholdsvis standardoploesningen og ekstratet, f.eks. som vist nedenfor. Det »bedst tilpassede punkt« for den laveste vaerdi for standardoploesningen (SL) bestemmes ved hjaelp af formlen:

1.2 // (a) SL = // 7s1 + 4s2 + s4 - 2s8 10

Det »bedst tilpassede punkt« for den hoejeste vaerdi for standardoploesningen (SH) bestemmes ved hjaelp af formlen:

1.2 // (b) SH = // 7s8 + 4s4 + s2 - 2s1 10

Paa tilsvarende maade beregnes det »bedst tilpassede punkt« for den laveste vaerdi for ekstratet (UL) og den hoejeste vaerdi for ekstratet (UH) ved at erstatte s1, s2, s4 og s8 med u1, u2, u4 og u8 i ovennaevnte formler.

De beregnede SL- og SH-vaerdier indtegnes paa samme millimeterpapir og forbindes til den »bedst tilpassede linje« for standardoploesningen. UL- og UH-vaerdierne indtegnes paa tilsvarende maade og forbindes til den »bedst tilpassede linje« for ekstraktet.

Hvis der ikke er stoffer til stede, som forstyrrer analysen, vil linjerne vaere parallelle. Til praktiske formaal kan linjerne betragtes som vaerende parallelle, hvis vaerdierne (SH-SL) og (UH-UL) ikke afgiver mere end 10 % fra middelvaerdien.

Saafremt linjerne viser sig ikke at vaere parallelle. kan enten u1 og s1 eller u8 og s8 udelades, og SL, SH, UL og UH beregnes ved hjaelp af de alternative formler, for at opnaa de alternative »bedst tilpassede linjer«:

1.2.3.4 // (a' ) SL = // 5s1 + 2s2 - s4 6 // eller // 5s2 + 2s4 - s8 6 // (b' ) SH = // 5s4 + 2s2 - s1 6 // eller // 5s8 + 2s4 - s2 6

og tilsvarende for UL og UH. De samme kriterier for parallelisme skal vaere opfyldt. Det noteres i den endelige rapport, at resultatet er beregnet ud fra tre koncentrationer.

Hvis linjerne kan betragtes som vaerende parallelle, beregnes logaritmen til den relative styrke (log A) ved hjaelp af én af foelgende formler alt efter om der er anvendt 3 eller 4 koncentrationer til at bestemme parallelismen.

For fire koncentrationer

1.2 // (c) Log A = // (u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8) × 0,602 u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2

For tre koncentrationer

1.2 // (d) Log A = // (u1 + u2 + u4 - s1 - s2 - s4) × 0,401 u4 + s4 - u1 - s1 // eller // // (d' ) Log A = // (u2 + u4 + u8 - s2 - s4 - s8) × 0,401 u8 + s8 - u2 - s2

Proeveekstraktets styrke = den paagaeldende standards styrke A:

(U8 = S8 × A)

Hvis den relative styrke ligger uden for omraadet 0,5 til 2,0, gentages analysen med den fornoedne tilpasning af virginiamycinkoncentrationen i ekstrakterne eller, hvis dette ikke er muligt, i standardoploesningerne. Hvis den relative styrke ikke kan bringes inden for det kraevede interval, maa de resultater, der opnaas, betragtes som tilnaermede og dette boer anfoeres i den endelige rapport.

Hvis linjerne ikke kan betragtes som vaerende parallelle, gentages bestemmelsen. Hvis der stadig ikke opnaas parallelisme, maa bestemmelsen betragtes som utilfredsstillende.

Resultatet udtrykkes i milligram virginiamycin pr. kilogram foderstof. 9. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, udfoert paa samme proeve af samme person, boer ikke overstige:

- 2 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold af virginiamycin paa til og med 10 mg/kg;

- 20 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa over 10 og til og med 25 mg/kg;

- 5 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold paa over 25 til og med 50 mg/kg;

- 10 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa over 50 mg/kg.«

(1) 1 mg virginiamycinbase svarer til 1 000 »UK« enheder.

(a) Andre metoder kan anvendes, forudsat at det er bevist, at de giver tilsvarende bakteriesuspensioner.

(b) Ethvert naeringssubstrat af tilsvarende sammensaetning, som er i handelen, og som giver de samme resultater, kan anvendes.

BILAG III

»1. BESTEMMELSE AF ZINKBACITRACIN

- ved diffusion paa agarplader -

1. Formaal og anvendelsesomraade

Metoden anvendes til bestemmelse af zinkbacitracin i foderstoffer og forblandinger. Undergraensen for bestemmelsen er 5 mg/kg (5 ppm) (1).

2. Princip

Proeven ekstraheres ved pH 2 med en blanding af methanol, vand, saltsyre og natriumsulfidoploesning. Natriumsulfidet tilsaettes for at udfaelde oploeselige kobbersalte, der kan paavirke bestemmelsen. Ekstratets pH indstilles til 6,5, og der inddampes (om noedvendigt) og fortyndes. Ekstraktets antibiotiske styrke bestemmes ved at maale diffusionen af zinkbacitracin i et agarsubstrat podet med Micrococcus luteus (flavus). Diffusionen viser sig ved dannelse af zoner, hvori mikroorganismens vaekst er haemmet. Diameteren af disse zoner anses for at vaere direkte proportional med logaritmen til den antibiotiske styrke inden for de anvendte koncentrationer af antibiotikum.

3. Testorganisme: Micrococcus luteus (flavus) ATCC 10240

3.1. Opbevaring af stamkulturen

Micrococcus luteus (flavus) podes paa skraaagar med naeringssubstrat (4.1) og inkuberes i 24 timer ved 30° C. Kulturen opbevares i koeleskab ved ca. 4° C . Den ompodes hver anden uge.

3.2. Fremstilling af bakteriesuspension (a)

Vaeksten fra et skraaagarglas (3.1) opslaemmes med 2 til 3 ml natriumchloridoploesning (4.3). Denne opslaemning anvendes til podning af 250 ml naeringssubstrat (4.1) i en Roux-kolbe, og der inkuberes i 18 til 20 timer ved 30° C. Vaeksten opslaemmes i 25 ml natriumchloridoploesning (4.3) og fortyndes 10 gange med samme oploesning. Opslaemningens lystransmission skal vaere ca. 75 % maalt ved 650 nm mod natriumchloridoploesning (4.3) i en 1 cm celle. Opslaemningen kan opbevares ved ca. 4° C i en uge.

4. Naeringssubstrater og reagenser

4.1. Naeringssubstrat (b)

1.2 // Koedpepton // 6,0 g, // Trypton // 4,0 g, // Gaerekstrakt // 3,0 g, // Koedekstrakt // 1,5 g, // Glucose // 1,0 g, // Agar // 10,0 til 20,0 g, // Vand // 1 000 ml, // pH 6,5 til 6,6 (efter sterilisering). //

4.2. Testsubstrat (b)

1.2 // Trypton // 10,0 g, // Gaerekstrakt // 3,0 g, // Koedekstrakt // 1,5 g, // Glucose // 1,0 g, // Agar // 10,0 til 20,0 g, // Tween 80 // 1 ml, // Vand // 1 000 ml, // pH 6,5 (efter sterilisering). //

4.3. Natriumchloridoploesning, 0,8 % (w/v): 8 g natriumchlorid oploeses i vand, fortyndes til 1 000 ml og steriliseres.

4.4. Blanding af methanol, vand og saltsyre (4.6): 80 : 17,5 : 2,5 (v/v/v).

4.5. Phosphatbuffer, pH 6,5

1.2 // Kaliumhydrogenphosphat, K2HPO4 // 22,15 g, // Kaliumhydrogenphosphat, KH2PO4 // 27,85 g, // Vand til // 1 000 ml.

4.6. Saltsyre, d: 1,18-1,19

4.7. Saltsyre, 0,1 M.

4.8. Natriumhydroxid, 1 M.

4.9. Natriumsulfidoploesning, ca. 0,5 M.

4.10. Bromkresolpurpur, 0,04 % (w/v) oploesning: 0,1 g bromkresolpurpur oploeses i 18,5 ml 0,01 M natriumhydroxid. Der fyldes op til 250 ml med vand og blandes.

4.11 Standardpraeparat: zinkbacitracin af kendt styrke (i IE).

5. Standardoploesninger

Der afvejes en maengde zinkbacitracin (4.11) svarende til 1 050 IE (ifoelge den opgivne styrke). Der tilsaettes 5 ml 0,1 M saltsyre (4.7), og efter 15 minutters henstand tilsaettes 30 ml vand. pH indstilles til 4,5 med phosphatbufferen (4.5) (ca. 4 ml), hvorefter der fyldes op til 50 ml med vand og blandes omhyggeligt (1 ml = 21 IE).

Af denne stamoploesning fremstilles ved successiv fortynding med phosphatbufferen (4.5) foelgende oploesninger:

S8 0,42 IE/ml,

S4 0,21 IE/ml,

S2 0,105 IE/ml,

S1 0,0525 IE/ml.

6. Fremstilling af ekstrakt og testoploesninger

6.1. Ekstraktion

6.1.1. Forblandinger og mineralske foderstoffer

2,0 til 5,0 g af proeven afvejes, og efter tilsaetning af 29,0 ml af blandingen (4.4) og 1,0 ml natriumsulfidoploesning (4.9) rystes kortvarigt. Det kontrolleres, at pH er ca. 2. Der rystes i 10 min., tilsaettes 30 ml phosphatbuffer (4.5), rystes i 15 minutter og centrifugeres. Der udtages en passende maengde af supernatanten, og pH indstilles til 6,5 med 1 M natriumhydroxid (4.8) enten ved hjaelp af et pH-meter eller med bromkresolpurpuroploesningen (4.10) som indikator. Der fortyndes med phosphatbuffer (4.5) indtil et forventet zinkbacitracinindhold paa 0,42 IE/ml (= U8).

6.1.2. Proteinkoncentrater

10,0 g af proeven afvejes, og efter tilsaetning af 49,0 ml af blandingen (4.4) og 1,0 ml natriumsulfidoploesning (4.9) rystes kortvarigt. Det kontrolleres, at pH er ca. 2. Der rystes i 10 minutter, tilsaettes 50 ml phosphatbuffer (4.5), rystes i 15 minutter og centrifugeres. Der udtages en passende maengde af supernatanten, og pH indstilles til 6,5 med 1 M natriumhydroxidoploesning (4.8) enten ved hjaelp af et pH-meter eller med bromkresolpurpuroploesningen (4.10) som indikator . Der inddampes til ca. halvt volumen paa rotationsfordamper ved hoejst 35° C.

Der fortyndes med phosphatbuffer (4.5) indtil et forventet zinkbacitracinindhold paa 0,42 IE/ml (= U8).

6.1.3. Andre foderstoffer

10,0 g af proeven afvejes (20,0 g ved et forventet zinkbacitracinindhold paa 5 mg/kg). Der tilsaettes 24 ml af blandingen (4.4) og 1,0 ml natriumsulfidoploesning (4.9), hvorefter der homogeniseres i 10 minutter. Der tilsaettes 25 ml phosphatbuffer (4.5), rystes i 15 minutter og centrifugeres. Der udtages 20 ml af supernatanten, og pH indstilles til 6,5 med 1 M natriumhydroxid (4.8) enten ved hjaelp af et pH-meter eller med bromkresolpurpuroploesningen (4.10) som indikator. Der inddampes til ca. 4 ml paa rotationsfordamper ved hoejst 35° C. Remanensen fortyndes med phosphatbuffer (4.5) indtil et forventet zinkbacitracinindhold paa 0,42 IE/ml (= U8).

6.2. Testoploesninger

Oploesningerne U4 (forventet indhold: 0,21 IE/ml), U2 (forventet indhold 0,105 IE/ml) og U1 (forventet indhold: 0,0525 IE/ml) fremstilles af oploesning U8 ved successiv fortynding (1: 1) med phosphatbuffer (4.5). 7. Testmetode

7.1. Podning af testsubstratet

Testsubstratet (4.2) podes med bakteriesuspensionen (3.2) ved ca. 50° C. Paa plader med testsubstrat (4.2) bestemmes forud den maengde bakteriesuspension, der giver de stoerste og tydeligste haemningszoner med de forskellige koncentrationer af zinkbacitracin.

7.2. Forberedelse af pladerne

Diffusionen i agar udfoeres paa plader med de fire koncentrationer af standardoploesningen (S8, S4, S2, S1) og de fire koncentrationer af testoploesningen (U8, U4, U2 og U1). Disse fire koncentrationer af ekstrakt og standard skal noedvendigvis alle findes paa hver plade. Der boer derfor vaelges plader, der er store nok til at rumme mindst otte huller i agarsubstratet med en diameter paa 10 til 13 mm og mindst 30 mm mellem hullernes centrum. Testen kan udfoeres paa plader, der bestaar af en glasplade med en aluminium- eller plastring ovenpaa, 200 mm i diameter og 20 mm hoej.

Pladerne paahaeldes substrat (4.1), der er podet som angivet i 7.1, saa der opnaas et ca. 2 mm tykt lag (60 ml til en plade paa 200 mm i diameter). Pladerne anbringes vandret til stoerkning, hullerne udstanses, og noejagtigt afmaalte maengder af test- og standardoploesning anbringes i hullerne (mellem 0,10 og 0,15 ml pr. hul, afhaengig af diameteren), Hver koncentration skal anbringes mindst fire gange, saaledes at hver bestemmelse er baseret paa en aflaesning af 32 haemningszoner.

7.3. Inkubation

Pladerne inkuberes i 16 til 18 timer ved 30° C ± 2° C.

8. Bedoemmelse

Haemningszonernes diameter maales med 0,1 mm noejagtighed. Middeldiameteren for hver koncentration afsaettes paa semilogaritmisk papir, saaledes at de viser logaritmen til koncentrationen i forhold til haemningszonernes diameter. Der indtegnes den »bedst tilpassede« rette linje for henholdsvis standardoploesningen og ekstratet, f.eks. som vist nedenfor.

Det »bedst tilpassede punkt« for den laveste vaerdi for standardoploesningen (SL) bestemmes ved hjaelp af formlen:

1.2 // (a) SL= // 7s1 + 4s2 + s4 - 2s8 10

Det »bedst tilpassede punkt« for den hoejeste vaerdi for standardoploesningen (SH) bestemmes ved hjaelp af formlen:

1.2 // (b) SH = // 7s8 + 4s4 + s2 - 2s1 10

Paa tilsvarende maade beregnes det »bedst tilpassede punkt« for den laveste vaerdi for ekstratet (UL) og den hoejeste vaerdi for ekstratet (UH) ved at erstatte s1, s2, s4 og s8 med u1, u2, u4 og u8 i ovennaevnte formler.

De beregnede SL- og SH-vaerdier indtegnes paa samme millimeterpapir og forbindes til den »bedst tilpassede linje« for standardoploesningen. UL- og UH-vaerdierne indtegnes paa tilsvarende maade og forbindes til den »bedst tilpassede linje« for ekstratet.

Hvis der ikke er stoffer til stede, som forstyrrer analysen, vil linjerne vaere parallelle. Til praktiske formaal kan linjerne betragtes som vaerende parallelle, hvis vaerdierne (SH-SL) og (UH-UL) ikke afgiver mere end 10 % fra middelvaerdien.

Saafremt linjerne viser sig ikke at vaere parallelle. kan enten u1 og s1 eller u8 og s8 udelades, og SL, SH, UL og UH beregnes ved hjaelp af de alternative formler, for at opnaa de alternative »bedst tilpassede linjer«:

1.2.3.4 // (a' ) SL = // 5s1 + 2s2 - s4 6 // eller // 5s2 + 2s4 - s8 6 // (b' ) SH = // 5s4 + 2s2 - s1 6 // eller // 5s8 + 2s4 - s2 6

og tilsvarende for UL og UH. De samme kriterier for parallelisme skal vaere opfyldt. Det noteres i den endelige rapport, at resultatet er beregnet ud fra tre koncentrationer. Hvis linjerne kan betragtes som vaerende parallelle, beregnes logaritmen til den relative styrke (log A) ved hjaelp af én af foelgende formler alt efter om der er anvendt 3 eller 4 koncentrationer til at bestemme parallelismen.

For fire koncentrationer

1.2 // (c) log A = // (u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8) × 0,602 u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2

For tre koncentrationer

1.2 // (d) log A = // (u1 + u2 + u4 - s1 - s2 - s4) × 0,401 u4 + s4 - u1 - s1 // eller // // (d' ) log A = // (u2 + u4 + u8 - s2 - s4 - s8) × 0,401 u8 + s8 - u2 - s2

Proeveekstraktets styrke = den paagaeldende standards styrke × A:

(U8 = S8 × A)

Hvis den relative styrke ligger uden for omraadet 0,5 til 2,0, gentages analysen med den fornoedne tilpasning af zinkbacitracin i ekstrakterne eller, hvis dette ikke er muligt, i standardoploesningerne. Hvis den relative styrke ikke kan bringes inden for det kraevede interval, maa de resultater, der opnaas, betragtes som tilnaermede og dette boer anfoeres i den endelige rapport.

Hvis linjerne ikke kan betragtes som vaerende parallelle, gentages bestemmelsen. Hvis der stadig ikke opnaas parallelisme, maa bestemmelsen betragtes som utilfredsstillende.

Resultatet udtrykkes i milligram zinkbacitracin pr. kilogram foderstof.

9. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, udfoert paa samme proeve af samme person, boer ikke overstige:

- 2 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold af zinkbacitracin paa til og med 10 mg/kg;

- 20 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa over 10 og til og med 25 mg/kg;

- 5 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold paa over 25 til og med 50 mg/kg;

- 10 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa over 50 mg/kg.«

(1) 1 mg zinkbacitracin af foderstofkvalitet svarer til 42 internationale enheder (IE).

(a) Andre metoder kan anvendes, forudsat at det er bevist, at de giver tilsvarende bakteriesuspensioner.

(b) Ethvert naeringssubstrat af tilsvarende sammensaetning, som er i handelen, og som giver de samme resultater, kan anvendes.

Hvis linjerne kan betragtes som vaerende parallelle , beregnes logaritmen til den relative styrke ( log A ) ved hjaelp af én af foelgende formler alt efter om der er anvendt 3 eller 4 koncentrationer til at bestemme parallelismen .

For fire koncentrationer

( c ) log A = ( u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 - s8 ) gange 0,602 / ( u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 - s1 - s2 )

For tre koncentrationer

( d ) log A = ( u1 + u2 + u4 - s1 - s2 - s4 ) gange 0,401 / ( u4 + s4 - u1 - s1 )

eller

( d' ) log A = ( u2 + u4 + u8 - s2 - s4 - s8 ) gange 0,401 / ( u8 + s8 - u2 - s2 )

Proeveekstraktets styrke = den paagaeldende standards styrke gange A :

( U8 = S8 gange A )

Hvis den relative styrke ligger uden for omraadet 0,5 til 2,0 , gentages analysen med den fornoedne tilpasning af zinkbacitracin i ekstrakterne eller , hvis dette ikke er muligt , i standardoploesningerne . Hvis den relative styrke ikke kan bringes inden for det kraevede interval , maa de resultater , der opnaas , betragtes som tilnaermede og dette boer anfoeres i den endelige rapport .

Hvis linjerne ikke kan betragtes som vaerende parallelle , gentages bestemmelsen . Hvis der stadig ikke opnaas parallelisme , maa bestemmelsen betragtes som utilfredsstillende .

Resultatet udtrykkes i milligram zinkbacitracin pr . kilogram foderstof .

9 . Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser , udfoert paa samme proeve af samme person , boer ikke overstige :

- 2 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold af zinkbacitracin paa til og med 10 mg/kg ;

- 20 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa over 10 og til og med 25 mg/kg ;

- 5 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold paa over 25 til og med 50 mg/kg ;

- 10 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa over 50 mg/kg . "

( 1 ) 1 mg zinkbacitracin af foderstofkvalitet svarer til 42 internationale enheder ( IE ) .

( a ) Andre metoder kan anvendes , forudsat at det er bevist , at de giver tilsvarend bakteriesuspensioner .

( b ) Ethvert naeringssubstrat af tilsvarende sammensaetning , som er i handelen , og som giver de samme resultater , kan anvendes .