»BILAG XVIII

BESTEMMELSE AF FORSKELLEN MELLEM DET FAKTISKE OG DET TEORETISKE INDHOLD AF ECN 42-TRIACYLGLYCEROLER

1. FORMÅL

Bestemmelse af den absolutte forskel mellem den værdi for triacylglyceroler (TAG) med et ækvivalent kulstofantal på 42 (ECN 42HPLC), der bestemmes eksperimentelt ved HPLC-kromtografi af olien, og den teoretiske værdi for TAG med et ækvivalent kulstofantal på 42 (ECN 42theoretical), der beregnes ud fra fedtsyresammensætningen.

2. ANVENDELSESOMRÅDE

Metoden gælder for olivenolier. Den kan anvendes til at påvise tilstedeværelsen af små mængder frøolie (der har et højt indhold af linolsyre) i alle kategorier af olivenolie.

3. PRINCIP

Indholdet af ECN 42-triacylglyceroler bestemt ved HPLC-analyse og det teoretiske indhold af ECN 42-triacylglyceroler (beregnet på grundlag af GLC-bestemmelse af fedtsyresammensætningen) stemmer inden for visse grænser overens for ægte olivenolier. En større forskel end de værdier, der er fastsat for hver type olie, viser, at olien indeholder frøolier.

4. METODE

Metoden til beregning af det teoretiske indhold af ECN 42-triacylglyceroler og af forskellen mellem denne værdi og HPLC-data består hovedsagelig i samordning af analysedata, der er fremkommet ved andre metoder. Den kan opdeles i tre trin: bestemmelse af fedtsyresammensætningen ved hjælp af gaskromatografi på kapillarkolonne, beregning af den teoretiske sammensætning af ECN 42-triacylglyceroler og HPLC-bestemmelse af ECN 42-triacylglyceroler.

4.1. Apparatur

4.1.1. Rundkolber, 250 og 500 ml.

4.1.2. Bægerglas, 100 ml.

4.1.3. Glaskromatografikolonne, indvendig diameter 21 mm, længde 450 mm, med hane og standardslib (indvendigt) foroven.

4.1.4. Skilletragte, 250 ml, med standardslib (udvendigt) forneden, som passer øverst på kolonnen.

4.1.5. Glasstav, længde 600 mm.

4.1.6. Glastragt, diameter 80 mm.

4.1.7. Målekolber, 50 ml.

4.1.8. Målekolber, 20 ml.

4.1.9. Rotationsfordamper.

4.1.10. HPLC med mulighed for termostatstyring af kolonnetemperaturen.

4.1.11. Injektionsenheder à 10 μl.

4.1.12. Detektor: differentialrefraktometer. Følsomheden ved fuldt udslag bør være mindst 10–4 enheder.

4.1.13. Kolonne: rustfrit stålrør, længde 250 mm og indvendig diameter 4,5 mm, fyldt med silicapartikler med diameter 5 μm med 22-23 % kulstof i form af octadecylsilan.

4.1.14. Databehandlingssoftware.

4.1.15. Glas med rummål ca. 2 ml, septum med teflonlag og skruelåg.

4.2. Reagenser

Reagenserne skal være af analysekvalitet. Elueringsvæskerne bør være afgasset og kan recirkuleres adskillige gange uden indflydelse på adskillelsen.

4.2.1. Petroleumsether 40-60 °C, kromatografikvalitet, eller hexan.

4.2.2. Ethylether, peroxidfri, frisk destilleret.

4.2.3. Elueringsvæske til rensning af olien ved søjlekromatografi, blanding af petroleumsether/ethylether 87:13 (v/v).

4.2.4. Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, med standardiseret vandindhold på 5 % (w/w).

4.2.5. Glasuld.

4.2.6. Acetone til HPLC.

4.2.7. Acetonitril eller propionitril til HPLC.

4.2.8. Elueringsvæske til HPLC: acetonitril + acetone (i det indbyrdes forhold, der giver den ønskede adskillelse; der begyndes med en blanding i forholdet 50:50) eller propionitril.

4.2.9. Opløsningsmiddel: acetone.

4.2.10. Referencetriacylglyceroler: enten anvendes triacylglyceroler, som fås i handelen (tripalmitin, triolein osv.), hvis retentionstider plottes mod det ækvivalente kulstofantal, eller der anvendes referencekromatogrammer af sojaolie, en blanding af sojaolie og olivenolie i forholdet 30:70 og ren olivenolie (se anmærkning 1 og 2 og figur 1, 2, 3 og 4).

4.2.11. Fastfaseekstraktionskolonne med 1 g silica-fase, 6 ml.

4.3. Prøveforberedelse

Da interfererende stoffer kan give falsk positive resultater, skal prøven altid oprenses ifølge IUPAC-metode 2.507, der anvendes til bestemmelse af polære forbindelser i friturefedt og -olier.

4.3.1. Forberedelse af kromatografikolonne

Kolonnen (4.1.3) fyldes med ca. 30 ml elueringsvæske (4.2.3), derefter indsættes lidt glasuld (4.2.5) i kolonnen, og ved hjælp af glasstaven (4.1.5) skubbes glasulden ned i bunden af kolonnen.

I et 100 ml bægerglas opslæmmes 25 g silicagel (4.2.4) i 80 ml elueringsvæske (4.2.3), som derefter overføres til kolonnen ved hjælp af en glastragt (4.1.6).

For at sikre sig, at al silicagelen er overført til kolonnen, skylles bægerglasset med elueringsvæsken, og skyllevæsken hældes ligeledes ned i kolonnen.

Der åbnes for hanen, så væsken kan løbe ud af kolonnen, indtil væskeoverfladen står ca. 1 cm over silicagelen.

4.3.2. Kolonnekromatografi

2,5 ± 0,1 g olie, der om nødvendigt er filtreret, homogeniseret og tørret i forvejen, afvejes med 0,001 g nøjagtighed i en 50 ml målekolbe (4.1.7).

Olien opløses i ca. 20 ml elueringsvæske (4.2.3). Der kan om nødvendigt opvarmes svagt for at lette opløsningsprocessen. Der afkøles til stuetemperatur, og volumenet justeres med elueringsvæske.

Ved hjælp af en fuldpipette overføres der 20 ml opløsning til kolonnen, der er forberedt som beskrevet i 4.3.1, der åbnes for hanen, og væsken tappes af, indtil overfladen er på højde med silicagelen.

Der elueres dernæst med 150 ml elueringsvæske (4.2.3) med en hastighed på ca. 2 ml/min (det tager ca. 60-70 minutter at lade 150 ml løbe gennem kolonnen).

Eluatet opsamles i en 250 ml rundkolbe (4.1.1), der i forvejen er tareret og vejet nøjagtigt. Efter at væsken er inddampet på rotationsfordamper (4.1.9), vejes remanensen, som skal anvendes til fremstilling af opløsningen til HPLC-analyse og til fremstilling af methylester.

Udbyttet af prøven fra kolonnen skal være mindst 90 % for kategorierne ekstra jomfruolie, jomfruolie og raffineret olivenolie, og mindst 80 % for bomolie og olivenolie af presserester.

4.3.3. Oprensning ved fastfaseekstraktion

Fastfasekstraktionskolonnen (SPE-kolonnen) aktiveres ved eluering med 6 ml hexan (4.2.3) under vakuum (undgå tørhed).

Der afvejes 0,12 g prøve i et 2 ml glas (4.1.5) med en nøjagtighed på 0,001 g, og den opløses i 0,5 ml hexan (4.2.3).

Opløsningen sættes på SPE-kolonnen, og der elueres med 10 ml hexan/diethylether (87:13, v/v) (4.2.3) under vakuum.

Den opsamlede fraktion inddampes til tørhed på rotationsfordamper (4.1.9) under reduceret tryk og ved stuetemperatur. Remanensen opløses i 2 ml acetone (4.2.6) til analyse af triacylglyceroler (TAG).

4.4. HPLC-analyse

4.4.1. Prøveforberedelse til kromatografianalyse

Der fremstilles en 5 % opløsning af den prøve, der skal analyseres, ved, at der afvejes 0,5 ± 0,001 g af prøven i en 10 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til 10 ml med opløsningsmiddel (4.2.9).

4.4.2. Fremgangsmåde

Kromatografisystemet gøres klar. Der pumpes elueringsvæske (4.2.8) igennem med en hastighed af 1,5 ml/min. til rensning af hele systemet. Der ventes, indtil basislinjen er blevet stabil.

Derefter indsprøjtes 10 μl af prøven, der er forberedt som under 4.3.

4.4.3. Beregning og angivelse af resultaterne

Der anvendes arealnormalisering, dvs. at summen af de toparealer, der svarer til triacylglycerolerne med ECN 42 op til ECN 52, sættes til 100 %.

Den procentvise andel af hver triacylglycerol beregnes efter formlen:

Resultaterne angives med mindst to decimaler.

Se anm. 1-4.

4.5. Beregning af triacylglycerolsammensætningen (molprocent) ud fra data om fedtsyresammensætningen (arealprocent)

4.5.1. Bestemmelse af fedtsyresammensætningen

Fedtsyresammensætningen bestemmes ifølge ISO 5508 på kapillarkolonne. Methylestrene fremstilles ifølge COI/T.20/dok. nr. 24.

4.5.2. Fedtsyrer, der indgår i beregningen

Glyceriderne grupperes på grundlag af deres ækvivalente kulstofantal (Equivalent Carbon Number — ECN) som anført i tabellen nedenfor. Der er kun medtaget fedtsyrer med 16 eller 18 kulstofatomer, fordi kun disse er af betydning for olivenolie. Fedtsyrerne bør normaliseres til 100 %.

Fedtsyre (FA) Forkortelse Molekylvægt (MW) ECN Palmitinsyre P 256,4 16 Palmitolsyre Po 254,4 14 Stearinsyre S 284,5 18 Oliesyre O 282,5 16 Linolsyre L 280,4 14 Linolensyre Ln 278,4 12

4.5.3. Omregning af arealprocent til mol for alle fedtsyrer (1)

4.5.4. Normalisering af fedtsyrer (mol) til 100 % (2)

Resultaterne giver den procentvise andel af hver fedtsyre i molprocent i samtlige stillinger (1, 2 og 3) i triacylglycerolerne.

Derefter beregnes summen af de mættede fedtsyrer P og S (SFA) og de umættede fedtsyrer Po, O, L og Ln (UFA) (3):

4.5.5. Beregning af fedtsyresammensætningen i triacylglycerolernes 2- og 1,3-stilling

Fedtsyrerne fordeles i tre grupper som følger: én for 2-stillingen og to identiske for 1- og 3-stillingen med forskellige koefficienter for de mættede syrer (P og S) og de umættede syrer (Po, O, L og Ln).

4.5.5.1. Mættede fedtsyrer i 2-stillingen [P(2) og S(2)] (4)

4.5.5.2. Umættede fedtsyrer i 2-stillingen [Po(2), O(2), L(2) og Ln(2)] (5)

4.5.5.3. Fedtsyrer i 1,3-stillingen [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og Ln(1,3)] (6)

4.5.6. Beregning af triacylglyceroler

4.5.6.1. TAG'er med én fedtsyre (AAA, her LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2. TAG'er med to fedtsyrer (AAB, her PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3. TAG'er med tre forskellige fedtsyrer (ABC, her OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4. ECN 42-triacylglyceroler

ECN 42-triacylglycerolerne beregnes i overensstemmelse med ligning 7, 8 og 9 og opstilles i rækkefølge efter den forventede eluering i HPLC (normalt kun tre toppe).

LLL

PoLL og stillingsisomeren LPoL

OLLn og stillingsisomererne OLnL og LnOL

PoPoL og stillingsisomeren PoLPo

PoOLn og stillingsisomererne OPoLn og OLnPo

PLLn og stillingsisomererne LLnP og LnPL

PoPoPo

SLnLn og stillingsisomeren LnSLn

PPoLn og stillingsisomererne PLnPo og PoPLn.

ECN 42-triacylglycerolerne er givet ved summen af de ni triacylglyceroler og deres stillingsisomerer. Resultaterne angives med mindst to decimaler.

5. EVALUERING AF RESULTATERNE

Den beregnede teoretiske sammensætning og den sammensætning, der er bestemt ved HPLC-analysen, sammenlignes. Hvis den absolutte forskel mellem HPLC-dataene og de teoretiske data er større end de værdier, der er anført i handelsnormen for den pågældende oliekategori, indeholder prøven frøolie.

Resultaterne angives med én decimal.

6. EKSEMPEL (TALLENE HENVISER TIL AFSNITTENE I BESKRIVELSEN AF METODEN)

— 4.5.1. Beregning af molprocent fedtsyrer på grundlag af GLC-data (normaliserede arealprocenter)

Der fremkommer følgende data for fedtsyresammensætningen ved GLC:

FA P S Po O L Ln MW 256,4 284,5 254,4 282,5 280,4 278,4 Arealprocent 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0

— 4.5.3 Omregning af arealprocent til mol for alle fedtsyrer (se formel (1))

mol P = mol S = mol Po = mol O = mol L = mol Ln = I alt = 0,35821 mol TAG

— 4.5.4. Normalisering af fedtsyrer (mol) til 100 % (se formel (2))

molprocent P(1,2,3) = molprocent S(1,2,3) = molprocent Po(1,2,3) = molprocent O(1,2,3) = molprocent L(1,2,3) = molprocent Ln(1,2,3) = Molprocent i alt = 100 %

Sum af mættede og umættede fedtsyrer i 1-, 2- og 3-stillingen i TAG'erne (se formel (3)):

— 4.5.5. Beregning af fedtsyresammensætningen i triacylglycerolernes 2- og 1,3-stilling

— 4.5.5.1 Mættede fedtsyrer i 2-stillingen [P(2) og S(2)] (se formel (4))

— 4.5.5.2 Umættede fedtsyrer i 2-stillingen [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og Ln(1,3)] (se formel (5))

— 4.5.5.3 Fedtsyrer i 1,3-stillingen [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) og Ln(1,3)] (se formel (6))

— 4.5.6. Beregning af triacylglyceroler

På grundlag af den beregnede fedtsyresammensætning i 2- og 1,3-stillingen:

FA i 1,3-stillingen 2-stillingen P 16,004 % 0,653 % S 4,325 % 0,177 % Po 1,015 % 1,262 % O 68,526 % 85,296 % L 9,204 % 11,457 % Ln 0,927 % 1,153 % I alt 100,0 % 100,0 %

beregnes følgende triglycerider:

LLL

PoPoPo

PoLL med en stillingsisomer

SLnLn med en stillingsisomer

PoPoL med en stillingsisomer

PPoLn med to stillingsisomerer

OLLn med to stillingsisomerer

PLLn med to stillingsisomerer

PoOLn med to stillingsisomerer

— 4.5.6.1. TAG'er med én fedtsyre (LLL, PoPoPo) (se formel (7))

— 4.5.6.2 TAG'er med to fedtyrer (PoLL, SLnLn, PoPoL) (se formel (8))

0,03210 mol PoLL

0,00094 mol SLnLn

0,00354 mol PoPoL

— 4.5.6.3 TAG'er med tre forskellige fedtsyrer (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) (se formel (9))

0,00761 mol PPoLn

0,43655 mol OLLn

0,06907 mol PLLn

0,04812 mol PoOLn

ECN42 = 0,69512 mol TAG'er

Anmærkning 1: Elueringsrækkefølgen kan bestemmes ved beregning af det ækvivalente kulstofantal, ofte defineret ved udtrykket , hvor CN er kulstofantallet, og n er antallet af dobbeltbindinger; den kan beregnes mere nøjagtigt, hvis dobbeltbindingens placering tages i betragtning. Hvis no, nl og nln er antallet af dobbeltbindinger i henholdsvis olie-, linol- og linolensyre, kan det ækvivalente kulstofantal beregnes efter formlen:

hvor koefficienterne do, dl og dln kan beregnes ved hjælp af referencetriglyceriderne. Under de betingelser, der er specificeret ved denne metode, vil resultatet ligge tæt ved:

Anmærkning 2: Med flere referencetriglycerider er det også muligt at beregne opløsningsevnen med hensyn til triolein:

triolein

ved hjælp af den reducerede retentionstid opløsningsmiddel.

Ud fra en afbildning af log α mod f (antal dobbeltbindinger) kan retentionstiderne for alle de triglycerider af fedtsyrer, som findes i referencetriglyceriderne, bestemmes (se figur 1).

Anmærkning 3: Kolonnen skal være så effektiv, at toppene af LLL (trilinolein) adskilles tydeligt fra toppene af de triglycerider, der har næsten samme retentionstid. Elueringen fortsættes, indtil ECN 52-toppen.

Anmærkning 4: Der sikres en præcis måling af alle relevante toparealer for denne bestemmelse, hvis den anden top svarende til ECN 50 giver 50 % af fuldt udslag på skriveren.

Figur 1

Afbildning af log α mod f (antal dobbeltbindinger)

Figur 2

Olivenolie med lavt indhold af linolsyre

a

b

Figur 3

Olivenolie med højt indhold af linolsyre

a

b