*****

KOMMISSIONENS FORORDNING (EOEF) Nr. 2426/90

af 21. august 1990

om aendring af forordning (EOEF) nr. 1725/79 om naermere regler for stoette til skummetmaelkspulver, der forarbejdes til foderblandinger, og til skummetmaelkspulver isaer til kalvefoder

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets forordning (EOEF) nr. 804/68 af 27. juni 1968 om den faelles markedsordning for maelk og mejeriprodukter (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 3879/89 (2), saerlig artikel 10, stk. 3, og

ud fra foelgende betragtninger:

Ifoelge artikel 1, stk. 2, litra a), i Kommissionens forordning (EOEF) nr. 1725/79 (3), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 3368/88 (4), skal skummetmaelkspulver, jf. artikel 1, stk. 1, opfylde definitionerne i artikel 1 i Raadets forordning (EOEF) nr. 986/68 (5), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 1115/89 (6), og produceres uden tilsaetning;

ulovlig tilsaetning af valletoerstof til skummetmaelk, der bruges til fremstilling af skummetmaelkspulver eller til pulveret selv, er i modstrid med ovennaevnte bestemmelser; da der ikke findes nogen officiel EF-metode til paavisning af vallepulver i skummetmaelkspulver, der kan indeholde kaernemaelkspulver, indeholder forordning (EOEF) nr. 1725/79 ikke specifikke regler for paavisning af valletoerstof; der er for nylig blevet udviklet en analysemetode til paavisning af loebevalle; det er hensigtsmaessigt at indfoere denne metode i ovennaevnte forordning;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomitéen for Maelk og Mejeriprodukter -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING:

Artikel 1

I forordning (EOEF) nr. 1725/79 foretages foelgende aendringer:

1) I artikel 10, stk. 3, foerste afsnit, tilfoejes:

»Naar denne kontrol vedroerer skummetmaelkspulver, der enten anvendes som saadant eller i form af en blanding, paavises fravaer fra loebevallepulver efter fremgangsmaaden i bilag IV.«

2) Bilag, I, afsnit A, stk. 2, litra j), affattes saaledes:

»j) andet, herunder isaer sur valle, saafremt det kraeves af de nationale myndigheder.«

3) Bilaget til naervaerende forordning indsaettes som bilag IV.

Artikel 2

Denne forordning traeder i kraft paa dagen for offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Den anvendes fra den 1. marts 1991.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 21. august 1990.

Paa Kommissionens vegne

Ray MAC SHARRY

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 148 af 28. 6. 1968, s. 13.

(2) EFT nr. L 378 af 27. 12. 1989, s. 1.

(3) EFT nr. L 199 af 7. 8. 1979, s. 1.

(4) EFT nr. L 296 af 29. 10. 1988, s. 50.

(5) EFT nr. L 169 af 18. 7. 1968, s. 4.

(6) EFT nr. L 118 af 29. 4. 1989, s. 7.

BILAG

»BILAG IV

BESTEMMELSE AF LOEBEVALLETOERSTOF I SKUMMETMAELKSPULVER OG BLANDINGER I HENHOLD TIL FORORDNING (EOEF) Nr. 1725/79

1.2 // 1. // Formaal: Paavisning af tilsaetning af loebevalletoerstof til: // // a) skummetmaelkspulver som defineret i artikel 1 i forordning (EOEF) nr. 986/68, og // // b) blandinger som defineret i artikel 1, stk. 3, i forordning (EOEF) nr. 1725/79. // 2. // Referencer: International standard ISO 707. // // Maelk og mejeriprodukter: Proeveudtagningsmetoder i overensstemmelse med retningslinierne i bilag I, nr. 2, litra c), til forordning (EOEF) nr. 625/78. // 3. // Definition // // Indholdet af loebevalletoerstof defineres som indholdet udtrykt i vaegtprocent som bestemt ved den beskrevne fremgangsmaade. // 4. // Princip // // Bestemmelse af maengden af glycomakropeptid A, jf. forordning (EOEF) nr. 625/78, bilag V. Proever, der giver et positivt resultat, analyseres for glycomakropeptid A ved hoejtryksvaeskekromatografi med omvendt fase (HPLC-metoden). Vurdering af resultatet i forhold til standardproever af skummetmaelkspulver med og uden et kendt procentvist indhold af vallepulver. Resultater over 1 % (m/m) er tegn paa, at der er loebevalletoerstof til stede. // 5. // Reagenser // // Alle reagenser skal vaere af analysekvalitet. Der anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed. Acetonitril skal vaere af spektroskopisk kvalitet eller HPLC-kvalitet. // // De reagenser, der er noedvendige til den i forordning (EOEF) nr. 625/78 beskrevne metode, er beskrevet i bilag V til den paagaeldende forordning. // // Reagenser til HPLC med omvendt fase. // 5.1. // Oploesning af trichloreddikesyre // // 240 g trichloreddikesyre (CCI3COOH) oploeses i vand og fortyndes til 1 000 ml. // 5.2. // Elueringsvaeske A og B // // Elueringsvaeske A: 150 ml acetonitril (CH3CN), 20 ml isopropanol (CH3CHOHCH3) og 1,00 ml trifluoreddikesyre (TFA, CF3COOH) blandes med vand, og der fyldes op til 1 000 ml. Elueringsvaeske B: 550 ml acetonitril, 20 ml isopropanol og 1,00 ml TFA blandes med vand, og der fyldes op til 1 000 ml. Foer brugen filtreres elueringsvaesken gennem et membranfilter med porestoerrelse 0,45 mm. // 5.3. // Opbevaring af kolonnen // // Efter analyserne skylles kolonnen med elueringsvaeske B (under anvendelse af en gradient), og derefter skylles den med acetonitril (under anvendelse af en gradient i 30 minutter). Kolonnen opbevares i acetonitril. // 5.4. // Standardproever // 5.4.1. // Skummetmaelkspulver, der opfylder kravene i forordning (EOEF) nr. 625/78, benaevnt [0]. // 5.4.2. // Samme pulver tilsat 5 % (m/m) loebevallepulver med normal sammensaetning benaevnt [5]. // 5.4.3. // Samme pulver tilsat 50 % (m/m) loebevallepulver med normal sammensaetning benaevnt [50] (*). // 6. // Apparatur // // Det apparatur, der er er noedvendigt til den i forordning (EOEF) nr. 625/78 beskrevne metode, er beskrevet i bilag V til den paagaeldende samme resultater som Nizo-pulveret, kan dog ogsaa bruges.

// 6.1. // Analysevaegt. // 6.2. // Centrifuge, der kan praestere en centrifugalkraft paa 2 200 g, med tilhoerende lukkede centrifugeglas paa ca. 50 ml. // 6.3. // Mekanisk omroerer, der er udrustet til omroering ved 50 °C. // 6.4. // Magnetomroerer. // 6.5. // Glastragte med diameter ca. 7 cm. // 6.6. // Filterpapir, middel filtrering, diameter paa ca. 12,5 cm. // 6.7. // Filtreringsudstyr af glas med tilhoerende membranfiltre med porestoerrelse 0,45 mm. // 6.8. // Maalepipette paa 10 ml, som opfylder kravene i ISO 648, klasse A, eller ISO/R 835 eller et system, som muliggoer gennemloeb af 10,0 ml paa 2 min. // 6.9. // Termostatstyret vandbad indstillet paa 25 ± 0,5 °C. // 6.10. // HPLC-udstyr bestaaende af: // 6.10.1. // Binaert gradientpumpesystem. // 6.10.2. // Manuel eller automatisk injektionsenhed paa 100 ml. // 6.10.3. // En Dupont Protein Plus kolonne (25 × 0,46 cm indvendig diameter) eller en tilsvarende bredporet siliciumbaseret kolonne med omvendt fase. // 6.10.4. // Termostatstyret kolonneovn indstillet paa 35 ± 1 °C. // 6.10.5. // UV-detektor med variabel boelgelaengde, hvormed der ved 210 nm kan maales med en foelsomhed paa 0,02 AA (om noedvendigt kan en stoerre boelgelaengde paa op til 220 nm benyttes). // 6.10.6. // Integrator, der kan maale hoejden af toppene. // // Bemaerkning: // // Der kan arbejdes med kolonnen ved stuetemperatur, forudsat at stuetemperaturen ikke svinger med mere end 1 °C. I modsat fald vil der vaere for stor variation i retentionstiden for GMPA. // 7. // Stikproeveudtagning // 7.1. // International standard ISO 707 - maelk og mejeriprodukter - proeveudtagningsmetoder i overensstemmelse med bestemmelserne i bilag I, nr. 2, litra c), i forordning (EOEF) nr. 625/78. // 7.2. // Stikproeven opbevares under saadanne forhold, at der hverken kan ske oedelaeggelse eller aendring af sammensaetningen. // 8. // Fremgangsmaade // 8.1. // Forberedelse af analyseproeven // // Pulveret overfoeres til en beholder, der er cirka dobbelt saa stor som pulverets volumen, og som har et lufttaet laag. Beholderen lukkes straks. Maelkepulveret blandes omhyggeligt ved flere gange at vende rundt paa beholderen. // 8.2. // Udtagning af analyseproeven // // I et centrifugeglas (6.2) eller en tilboerligt tilproppet kolbe (50 ml) afvejes 2,000 ± 0,001 g. // 8.3. // Fjernelse af fedtstoffer og proteiner // 8.3.1. // Der saettes 20,0 g 50 °C varmt vand til analyseproeven. Pulveret oploeses ved omroering med omroereren (6.3) i 5 minutter eller i 30 minutter, saafremt det drejer sig om kaernemaelk fra syrnet floede. Reagensglasset anbringes i vandbadet (6.9), og det afventes, at der indtraeder en ligevaegt ved 25 °C. // 8.3.2. // I loebet af 2 minutter tilsaettes med konstant hastighed 10 ml trichloreddikesyreoploesning paa 25 °C (5.1) under kraftig omroering med magnetomroereren (6.4). Glasset anbringes i vandbadet (6.9), hvori det henstaar i 60 minutter. // 8.3.3. // Der centrifugeres (6.2) ved 2 200 g i 10 minutter eller filtreres gennem papirfilter (6.6), idet de foerste 5 ml filtrat bortkastes. // 8.4. // Kromatografisk bestemmelse // 8.4.1. // HPLC-analysen gennemfoeres som beskrevet i forordning (EOEF) nr. 625/78, bilag V. Hvis der opnaas et negativt resultat, indeholder den analyserede proeve ikke loebevalletoerstof i paaviselige maengder. Hvis der opnaas positive resultater, maa den nedenfor beskrevne HPLC-metode med omvendt fase anvendes. Tilstedevaerelse af kaernemaelkspulveret fra syrnet floede kan give anledning til falske positive resultater. HPLC-metoden med omvendt fase udelukker denne mulighed. // 8.4.2. // Foer HPLC-analysen med omvendt fase gennemfoeres, maa gradientbetingelserne optimeres. En retentionstid paa 26 minutter ± 2 minutter for GMPA er optimal for gradientsystemer med et doedvolumen paa ca. 6 ml (volumenet fra det punkt, hvor oploesningerne blandes, til det punkt, hvor injektionssloejfen slutter). For gradientsystemer med et mindre doedvolumen (f.eks. 2 ml) bruges 22 minutter som optimal retentionstid. // // Der anvendes oploesninger af standardproeverne (5.4) uden og med 50 % loebevalle. // // Af centrifugatet eller filtratet (8.3.3) indsproejtes 100 ml i HPLC-apparatet under anvendelse af de kontrolgradientvilkaar, der fremgaar af tabel 1. 1.2.3.4.5 // // // // // // Tid (min.) // Gennemstroemn. (ml/min.) // % A // % B // Kurve // // // // // // Init // 1,0 // 90 // 10 // * // 27 // 1,0 // 60 // 40 // lin // 32 // 1,0 // 10 // 90 // lin // 37 // 1,0 // 10 // 90 // lin // 42 // 1,0 // 90 // 10 // lin // // // // // 1.2 // // Sammenligning af de to kromatogrammer vil vise beliggenheden af toppen af GMPA. // // Ved anvendelse af nedenstaaende formel kan den oprindelige sammensaetning af den oploesning, der skal bruges til den normale gradient (se 8.4.3), beregnes: // // % B = 10 - 2.5 + (13.5 + RTgmpA - 26)/6)*30/27 // // % B = 7.5 + (13.5 + RTgmpA - 26)/6)*1.11 // // hvor: 1.2.3 // // RTgmpA: // retentionstiden for GMPA ved anvendelse af kontrolgradienten // // 10: // den oprindelige % B af kontrolgradienten // // 2.5: // % B midtvejs minus % B ved begyndelsen ved anvendelse af den // // 13.5: // midtvejspunkt for kontrolgradienten // // 26: // den kraevede retentionstid for GMPA // // 6: // haeldningskoefficient for kontrolgradienten og den normale gradient // // 30: // % B paa begyndelsestidspunktet minus % B efter 27 minutter ved anvendelse af kontrolgradienten // // 27: // varighed for kontrolgradienten. 1.2 // 8.4.3. // Der udtages oploesninger af analyseproeverne. // // Af centrifugatet eller filtratet (8.3.3) indsproejtes en noejagtigt afmaalt maengde paa mellem 15 og 30 ml i HPLC-apparatet under en elueringshastighed paa 1,0 ml pr. minut. // // Sammensaetningen af elueringsvaesken ved analysens begyndelse opnaas fra 8.4.2. Den er normalt taet paa A : B = 76: 24 (5.2). Umiddelbart efter indsproejtningen startes en lineaer gradient, saaledes at B bliver 5 % hoejere efter 27 minutter. Derefter startes en lineaer gradient, hvorved elueringsvaeskens indhold af B kommer op paa 90 % i loebet af 5 minutter. Denne sammensaetning opretholdes i 5 minutter, hvorefter sammensaetningen i loebet af 5 minutter aendres ved hjaelp af en lineaer gradient til den oprindelige sammensaetning. Afhaengigt af pumpesystemets indre volumen kan den naeste indsproejtning foretages 15 minutter efter de oprindelige betingelser. // // Bemaerkninger: // // 1. Retentionstiden for glycomakropeptid boer vaere 26 minutter ± 2 minutter. Dette kan opnaas ved at aendre begyndelses- og slutbetingelserne for den foerste gradient. Imidlertid skal forskellen i % B for begyndelses- og slutbetingelserne for den foerste gradient fortsat vaere 5 % B. // // 2. Elueringsvaeskerne maa afgasses tilstraekkeligt og skal forblive afgassede. Dette er vigtigt for gradientpumpesystemets tilfredsstillende virkning. Standardafvigelsen for retentionstiden for GMP-toppen skal vaere paa under 0,1 min. (n=10). // // 3. Efter hver femte proeve skal referenceproeven [5] indsproejtes og benyttes til beregning af en ny kalibreringsfaktor R (9.1.1). // 8.4.4. // Resultaterne af kromatograferingen af analyseproeven [E] foreligger i form af et kromatogram, hvor GMP-toppen identificeres ved sin retentionstid paa ca. 26 minutter. // // Integratoren (6.10.6) maaler automatisk GMP-toppens hoejde H. Basislinjens beliggenhed skal kontrolleres for hvert kromatogram. Analysen eller integrationen skal gentages, hvis basislinjens beliggenhed ikke er korrekt. // // For at afsloere eventuelle afvigelser enten som foelge af, at apparaturet eller kolonnen ikke har fungeret tilfredsstillende, eller paa grund af den analyserede proeves oprindelse eller art, maa alle kromatogrammer bedoemmes visuelt foer en kvantitativ tolkning paabegyndes. I tvivlstilfaelde gentages analysen. // 8.5. // Kalibrering // 8.5.1. // Med standardproeverne (5.4.1 og 5.4.2) foelges den i punkt 8.2 til 8.4.4 beskrevne fremgangsmaade noeje. Der benyttes frisk fremstillede oploesninger, da GMP nedbrydes i 8 % trichloreddikesyreoploesning ved stuetemperatur. Ved 4 °C forbliver oploesningen stabil i 24 timer. Skal der foretages en lang raekke analyser, er det oenskeligt at anvende en koelet proevebakke i den automatiske injektor. // // Bemaerkning: // // 8.4.2 kan udelades, hvis % B paa begyndelsesbetingelserne er kendt fra tidligere analyser. // // Kromatogrammet for referenceproeven [5] skal svare til fig. 1. Paa denne figur er der inden GMPA-toppen to smaa toppe. Det er vigtigt at opnaa en lignende separation. // 8.5.2. // Foer den kromatografiske bestemmelse af proeverne indsproejtes 100 ml af standardproeven uden loebevalle [0] (5.4.1). // // Kromatogrammet maa ikke indeholde nogen top ved retentionstiden for GMPA-toppen. // 8.5.3. // Kalibreringsfaktorerne R bestemmes ved at indsproejte filtrat (8.5.1) i samme maengde som proeverne. // 9. // Angivelse af resultaterne // 9.1. // Formler og beregning // 9.1.1. // Beregning af kalibreringsfaktoren R: // // GMP-toppen: R = W/H // // hvor: 1.2.3 // // R // = kalibreringsfaktoren for GMP-toppen // // H // = hoejden af GMP-toppen // // W // = maengden af valle i standardproeven [5]. 1.2 // 9.2. // Beregning af det procentvise indhold af loebevallepulver i proeven: 1.2.3 // // W[E] // = indholdet af loebevalle i proeven [E], i % m/m // // R // = kalibreringsfaktoren for GMP-toppen (9.1.1) // // H[E] // = hoejden af GMP-toppen af proeven [E]. 1.2 // // Hvis W[E] er stoerre end 1 % og forskellen mellem retentionstiden og retentionstiden for standardproeven [5] er mindre end 0,2 min., er der loebevalletoerstof til stede. // 9.3. // Metodens noejagtighed // 9.3.1. // Repeterbarhed: // // Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, der er udfoert samtidig eller med kort tids mellemrum af samme person, med samme apparatur og paa samme stikproeve, maa ikke overstige 0,2 % m/m. // 9.3.2. // Reproducerbarhed: // // Endnu ikke fastlagt. // 9.3.3. // Linearitet // // For mellem 0 og 16 % loebevalle skal der opnaas en lineaer sammenhaeng med en korrelationskoefficient > 0,99. // 9.4. // Fortolkning // 9.4.1. // Proeven anses for at indeholde valle, hvis resultatet fra 9.2 ligger over 1 % m/m, og retentionstiden for GMP-toppen afviger mindre end 0,2 minutter fra retentionstiden for standardproeven [5]. Graensen paa 1 % er fastsat i overensstemmelse med bestemmelserne i forordning (EOEF) nr. 625/78, bilag V, punkt 9.2 og 9.4.1.

Absorbans (220 nm)

« forordning. // // Apparatur til HPLC med omvendt fase:

(*) Loebevallepulver med normal sammensaetning og skummetmaelkspulver med tilsaetning kan erhverves fra Nizo, Kernhemseweg 2, PO Box 20, NL-6710 BA Ede. Pulver, der giver

For mellem 0 og 16 % loebevalle skal der opnaas en lineaer sammenhaeng med en korrelationskoefficient > 0,99 .

9.4 .

Fortolkning

9.4.1 .

Proeven anses for at indeholde valle, hvis resultatet fra 9.2 ligger over 1 % m/m, og retentionstiden for GMP-toppen afviger mindre end 0,2 minutter fra retentionstiden for standardproeven ( 5 ). Graensen paa 1 % er fastsat i overensstemmelse med bestemmelserne i forordning ( EOEF ) nr . 625/78, bilag V, punkt 9.2 og 9.4.1 .

Absorbans ( 220 nm )

"

Apparatur til HPLC med omvendt fase :

(*) Loebevallepulver med normal sammensaetning og skummetmaelkspulver med tilsaetning kan erhverves fra Nizo, Kernhemseweg 2, PO Box 20, NL-6710 BA Ede . Pulver, der giver