KOMMISSIONENS BESLUTNING af 16. maj 1994 om proeveudtagningsplaner og diagnosticeringsmetoder til paavisning og bekraeftelse af visse sygdomme hos bloeddyr (Tekst af betydning for EOES) (94/306/EF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europaeiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 91/67/EOEF af 28. januar 1991 om dyresundhedsmaessige betingelser for afsaetning af akvakulturdyr og -produkter (1), aendret ved direktiv 93/54/EOEF (2), saerlig artikel 15, og

ud fra foelgende betragtninger:

Det er med henblik paa ensartet anvendelse af procedurerne i direktiv 91/67/EOEF noedvendigt at fastlaegge proeveudtagningsplaner og diagnosticeringsmetoder, der skal anvendes for at erklaere en kystzone eller en farm fri for sygdomme, som rammer bloeddyr, og for undersoegelse af bestande med abnorm doedelighed;

Den Videnskabelige Veterinaerkomité, der blev nedsat ved Kommissionens afgoerelse 81/651/EOEF (3), er blevet hoert;

de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Veterinaerkomité -

VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

Proeveudtagnings- og diagnosticeringsmetoderne til paavisning og bekraeftelse af bonamiose (Bonamia ostraea) og marteiliose (Marteilia refringens) er fastlagt i bilaget.

Artikel 2

Denne beslutning anvendes fra den 1. juni 1994.

Artikel 3

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 16. maj 1994.

Paa Kommissionens vegne

René STEICHEN

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 46 af 19. 2. 1991, s. 1.

(2) EFT nr. L 175 af 19. 7. 1993, s. 34.

(3) EFT nr. L 233 af 19. 8. 1981, s. 32.

BILAG

I. PROEVEUDTAGNINGS- OG TESTMETODER TIL OVERVAAGNING AF BONAMIA OSTRAEA OG MARTEILIA REFRINGENS I OSTREA EDULIS

1. Proeveudtagning

1.1. Proeveudtagningssteder

Der udvaelges for hver af de zoner, der omhandles i bilag B, punkt III, til direktiv 91/67/EOEF, et antal proeveudtagningssteder, der vil give stoerst mulighed for at opdage eventuel tildstedevaerelse af Bonamia ostreae og/eller Marteilia refringens. Med henblik herpaa benyttes parametre, som har indflydelse paa udviklingen af sygdomssagen, f.eks. populationstaethed, vandstroemme og bloeddyrets udviklingscyklus.

Der udvaelges for en given zone mindst tre proeveudtagningssteder. Antallet af proeveudtagningssteder oeges for omfattende zoner med flere, adskilte omraader, hvor der opdraettes modtagelige arter.

Hvis det er muligt, udtages der mindst en proeve fra naturlige banker. Valget skal falde paa bloeddyr, der visser abnormiteter (unormal vaekst, aabne skaller).

1.2. Proeveudtagningstidspunkt og -hyppighed

Hyppigheden af den kontrol, der omhandles i bilag B, punkt II A 2, til direktiv 91/67/EOEF, afhaenger af den periode, hvori sygdommen har manifesteret sig eller kan paavises, og kontrollen maa finde sted derefter. Ved tilrettelaeggelsen af kontrollen tages der ogsaa hensyn til omflytningen af bloeddyrene, som normalt finder sted i foraaret og efteraaret. Foelgelig boer der udtages proever

- en gang om aaret efter sommerperioden for Marteilia refringens

- to gange om aaret (foraar/efteraar) for Bonamia ostreae.

1.3. Proevestoerrelse

I den indledende toaarige kontrolperiode, som gaar forud for opnaaelse af status som godkendt, er proevestoerrelsen for hvert proeveudtagningssted 150 for at sikre paavisning med en konfidens paa 95 % for smittebaererne ved en almindelig sygdomsforekomst paa 2 %.

I de efterfoelgende aar (bevarelse af status som godkendt) kan proevestoerrelsen nedsaettes til 30 til at sikre paavisning med en konfidens paa 95 % for smittebaererne ved en almindelig sygdomsforekomst paa 10 %.

2. Indsendelse af proever

Alle udtagne bloeddyr skal ankomme til det godkendte laboratorium inden 24 timer efter proeveudtagningen. De skal indpakkes efter almindelige normer for at holde dem i god stand. En etiket med angivelse af proeveudtagningsstedet, proeveudtagningsdatoen og eventuelle bemaerkninger paasaettes proeven.

3. Makroskopisk undersoegelse

Bloeddyrene skal aabnes forsigtigt, saa vaevene ikke beskadiges, navnlig ikke kappen, gaellerne, hjertet og fordoejelseskirtlen. Abnormiteter og vaevslaesioner noteres.

4. Tilberedning og undersoegelse af proever for bonamiose

4.1. Immunofluorescens

4.1.1. Immunofluorescens kan foretages paa larver, smaa oesters og voksne oesters. Efter toerring af proeven moses larverne, eller hjertevaevet udstryges paa et objektglas. Objektglasset lufttoerres og fikseres ved neddypning i acetone 5 til 10 min. Saadanne tilberedninger kan bruges direkte eller nedfryses til 20 °C.

Der tilberedes en oploesning af monoklonale antistoffer i bufferoploesning (NaC1 8 g/1, KH2 PO4 0,2 g/l, Na2 HpO4 12H2O 2,9 g/l, KC1 0,2 g/l, Azide Na 0,2 g/l, Tween pH 7,4) fortyndet i henhold til leverandoerens anvisninger.

50 ml af oploesningen pipetteres i hvert hul eller paa objektglas, saa udstyringerne daekkes. Efter inkubering i fugtkammer i 15 min., ved 20 °C vaskes objektglassene med ovennaevnte bufferoploesning og daekkes herefter med en oploesning af gedeantistoffer mod mus og G antistof (50 ml pr. hul) konjugeret med fluorescerende istothiocyanat. Antistofoploesningen fortyndes i henhold til leverandoerens anvisninger, og der tilsaettes Evans-blaat (1 %) til den buffer, som er anvendt til fortynding.

Efter inkubering i fugtkammer i 15 min. ved 20 °C anbringes tilberedningerne i en glycerinbuffer og undersoeges ved U/V-mikroskopi.

Tilstedevaerelse af kuglerunde celler, der er fluorescerende groenne, bekraefter infektion med Bonamia ostreae.

Andre proever, som forskellige laboratorier har udviklet, og som giver sammenlignelige resultater, kan ogsaa benyttes.

4.2. Udstrygningspraeparater af blod

For larver og oesters: efter lufttoerring af proeverne moses larverne, eller hjertevaevet udstryges paa et histologisk objektglas. Objektglassene lufttoerres og fikseres derefter i metanol.

De tilberedte larver og oesters farves efter de standardmetoder, der normalt benyttes i forbindelse med den paagaeldende farve. Efter farvningen skylles glassene med ledningsvand og henstaar til fuldstaendig toerring i kold eller varm luft, hvorefter de monteres ved hjaelp af kunstharpiks.

Parasitten (stoerrelse: 2 mikrometer) identificeres ved det blaa cytoplasma og den roede kerne. Den kan iagttages i haematocytterne eller uden for disse. En observationstid paa 5 min. pr. objektglas er tilstraekkelig.

4.3. Histologi

Til den histologiske undersoegelse tages en sektion (»boef«) af oestersen ved snit gennem hjerte, fordoejelseskirtel og gaeller, og proeven anbringes i fikservaeske som Davidson's, Bouin's eller Carson's; sidstnaevnte goer det muligt at genbruge proeverne senere til elektromikroskopi, hvis paakraevet. Forholdet paa 1: 10 mellem proevens volumen og fiskervaeskens volumen skal overholdes.

Flere uspecifikke farvemetoder som f.eks. Haematoxylin-Eosin eller Masson's trikromasi goer det muligt at visualisere Bonamia ostreae. Disse eksempler er ikke udtoemmende, og der kan benyttes andre farvningsmetoder. Det anbefales at undersoege to sektioner pr. oesters.

Parasitten (stoerrelse: 2 mikrometer) visualiseres tydeligt i bindevaevet eller i haematocytterne.

5. Tilberedning og undersoegelse af proever for marteiliose

5.1. Cytologisk undersoegelse

Til udstrygninger tages en sektion ved snit gennem fordoejelseskirtlen og gaellerne. Det overskydende vand fjernes ved, at proeven anbringes paa traekpapir, hvorefter den sektion, der passerer gennem fordoejelseskanalen, udstryges paa objektglasset. Efter lufttoering fikseres objektglassene i metanol (2-3 min.).

De tilberedte proever farves efter de standardmetoder, der normalt benyttes i forbindelse med den paagaeldende farve. Efter farvningen skylles objektglassene med ledningsvand og henstaar til fuldstaendig toerring i kold eller varm luft, hvorefter de monteres ved hjaelp af kunstharpiks.

Parasitten, der er 5 til 8 mikrometer stor i de foerste udviklingsstadier, kan komme op paa 40 mikrometer under sporedannelsen. Cellernes cytoplasma bliver mere eller mindre straekt blaat, og kernen bliver kraftigt roed. De sekundaere celler eller sporoblasterne er omkranset af en opklaring. En observationstid paa 5 min. pr. objektglas er tilstraekkelig.

5.2. Histologisk undersoegelse

Til den histologiske undersoegelse tages en sektion ved snit gennem fordoejelseskirtlen ved brug af en lille saks, og proeven anbringes i fikservaeske som f.eks. Davidson's, Bouin's eller Carson's; i sidstnaevnte tilfaelde kan proeverne genbruges senere til elektronmikroskopi, hvis paakraevet. Forholdet mellem vaevets volumen og fikservaeskens volumen maa ikke vaere over 1: 10.

Proeverne haandteres derpaa efter klassiske, histologiske metoder. Flere farvemetoder goer det muligt at iagttage Marteilia refringens som f.eks. Haematoxylin-Eosin eller Masson's trikromasi. Disse eksempler er ikke udtoemmende, og der kan benyttes andre farvningsmetoder. Det anbefales at undersoege to sektioner pr. oesters.

De tidlige stadier af Marteilia er til stede i mavens epitel, mens de senere udviklingsstadier kan findes i tarmdivertiklens epitel. Frie sporehuse kan ogsaa iagttages i tarmens lumen.

II. UNDERSOEGELSE AF BESTANDE AF OSTREA EDULIS MED ABNORM DOEDELIGHED

Hvis der forekommer abnorm doedelighed i bestande af Ostrea edulis, skal der straks foretages undersoegelse for at bestemme aetiologien.

Den proeve, der tages, skal bestaa af 100 oestersindivider. Proeven haandteres efter den metode, der er fastlagt for histologisk undersoegelse i afsnit I. Denne metode skal bruges i foerste raekke, inden der benyttes nogen anden form for undersoegelse.

Proeverne fikseres - helst i Carson's fikservaeske, som goer det muligt at genbruge proeven til elektronmikroskopi.