++++

KOMMISSIONENS FORORDNING ( EOEF ) Nr . 72/77

af 13 . januar 1977

om aendring af forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 om udtagelse og reduktion af proever samt om bestemmelse af indholdet af olie , urenheder og fugtighed i olieholdige froe

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,

under henvisning til Raadets forordning nr . 136/66/EOEF af 22 . september 1966 om oprettelse af en faelles markedsordning for fedstoffer ( 1 ) , senest aendret ved forordning ( EOEF ) nr . 1707/73 ( 2 ) , saerlig artikel 26 , stk . 3 , og

ud fra foelgende betragtninger :

Der boer fastsaettes en egnet metode til at bestemme det noejagtige indhold af erucasyre i raps - og rybsfroe ; med henblik herpaa boer der foretages en aendring af Kommissionens forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 af 23 . september 1968 om udtagelse og reduktion af proever samt om bestemmelse af indholdet af olie , urenheder og fugtighed i olieholdige froe ( 3 ) , senest aendret ved forordning ( EOEF ) nr . 3025/75 ( 4 ) ;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomiteen for Fedstoffer -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING :

Artikel 1

Foelgende artikel 2b indsaettes i forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 :

" Den i artikel 4 i forordning nr . 282/67/EOEF omhandlede bestemmelse af indholdet af erucasyre foretages efter den i bilag VI til naervaerende forordning definerede metode .

Raps - og rybsfroe anses for at have det i artikel 3 , stk . 2 , foerste led , i forordning nr . 282/67/EOEF omhandlede maksimumsindhold af erucasyre , dersom den olie , der udvindes af froeene efter den i bilag VI , afsnit I , anfoerte metode , indeholder hoejst 15,0 % erucasyre ( C 22 ) beregnet efter den i bilag VI , afsnit II og III , anfoerte metode . "

Artikel 2

Forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 suppleres med bilag VI , hvis tekst er anfoert i bilaget til naervaerende forordning .

Artikel 3

Denne forordning traeder i kraft paa tredjedagen efter offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende .

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat .

Udfaerdiget i Bruxelles , den 13 . januar 1977 .

Paa Kommissionens vegne

Finn GUNDELACH

Naestformand

( 1 ) EFT nr . 172 af 30 . 9 . 1966 , s . 3025/66 .

( 2 ) EFT nr . L 175 af 29 . 6 . 1973 , s . 5 .

( 3 ) EFT nr . L 239 af 28 . 9 . 1968 , s . 2 .

( 4 ) EFT nr . L 300 af 20 . 11 . 1975 , s . 5 .

BILAG VI

FAELLESSKABSANALYSEMETODE TIL BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ERUCASYRE I FROE , DER ER OVERTAGET AF INTERVENTIONSORGANERNE

I . Forberedelse af proeven

II . Fremstilling af fedtsyremethylestere

III . Gasfasekromatografi af fedtsyremethylestere

I . FORBEREDELSE AF PROEVER

1 . Udtagelse af froeproever , meddelelse af laboratorieproever til analyseproever , bestemmelse af indholdet af olie i produkter , som det foreligger , foretages efter de metoder , der er beskrevet i henholdsvis bilag I , II og V til forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 .

2 . Tilberedelse af proeven af den olie , der er ekstraheret af froe fra proeveudtagningen .

2.1 . Proeven flydende og helt klar :

Som sikkerhedsforanstaltning rystes proeven foer proeveudtagningerne foretages .

2.2 . Proeven flydende men uklar eller danner bundfald :

Proeven anbringes i et toerreskab ved 50 * C . Naar proeven har naaet denne temperatur , rystes den kraftigt , hvorefter man lader den bundfaelde sig . Den filtreres paa papir i toerreskabet , idet temperaturen holdes paa 30 * C . Filtratet skal vaere klart .

2.3 . Proeven stoerknet :

Proeven anbringes i toerreskab ved en temperatur paa 10 * over den antagne smeltningszone . Samme fremgangsmaade som under 2.1 . ( hvis den smeltede proeve er klar ) eller under 2.2 ( hvis den smeltede proeve er uklar eller danner bundfald ) .

II . FREMSTILLING AF FEDTSYREMETHYLESTERE

1 . INDLEDNING

Disse metoder anvendes til omdannelse af fedtsyrer af animalsk eller vegetabilsk oprindelse samt fedtsyrer af enhver oprindelse til fedtsyremethylestere .

De saaledes fremkomme methylestere kan bestemmes ved forskellige metoder : gaskromatografi , tyndlagskromatografi , infraroed spektrofotometri osv . ...

2 . ANVENDELSESOMRAADE

De beskrevne metoder gaelder fedstoffer af animalsk og vegetabilsk oprindelse og fedtsyrer af enhver oprindelse . De i 3 . beskrevne metoder anvendes til fremstilling af fedtsyremethylestere med 6 eller flere kulstofatomer . Dersom der er fedtsyrer af C6 og C8 , og hvis der fremstilles estere til gaskromatografi , boer oploesningsmidlet til methylesteroploesningen ikke bortkastes .

Den generelle metode 3.1 kan give fejlagtige resultater i foelgende tilfaelde :

- sekundaere oxygenforbindelser ( hydroxy , hydroperoxy , keto , epoxy ) ,

- cyklopropan og cyklopropenforbindelser ,

- konjugerede polymaettede forbindelser og acetylenforbindelser ,

- voks

en af de metoder , der beskrives i 3.2 , boer i disse tilfaelde anvendes . De fedtstoffer , der indeholder disse grupper i meget smaa maengder ( f.eks . olie af bomuld ) , kan imidlertid analyseres ud fra 3.1 .

Phospholipider kan analyseres efter forsaebning af forestering af fedtsyrer .

Forsaebningsresten elimineres ikke og dersom den er tilstede i vaesentligt omfang kan den indvirke paa de senere analyser ( bem . 1 ) .

3 . METODER TIL FREMSTILLING AF FEDTSYREMETHYLESTERE MED 6 OG FLERE KULSTOFATOMER

3.1 gennemgaar en generel metode til fremstilling af methylestere ved anvendelse af bortrifluorid . Denne metode skal fortrinsvis anvendes . Hvis dette ikke er muligt er der beskrevet alternative metoder i 3.2 .

3.1 . Generel metode ved anvendelse af bortrifluorid

3.1.1 . Princip

Forsaebning af glycerider , derefter frigoerelse og forestring af fedtsyrerne under tilstedevaerelse af bortrifluorid .

3.1.2 . Udstyr

- Kolber paa 50 og 100 ml med slib ,

- svaler med slib , laengde 20 - 30 cm , der passer til kolben ,

- kogesten , fri for fedtstof ,

- studs til nitrogengennemblaesning ,

- maalepipette med en kapacitet paa mindst 10 ml og gummibold til pipetten , eller automatisk pipette ,

- reagensglas med slib og glasprop ,

- 250 ml skilletragte .

3.1.3 . Reagenser

- Cirka 0,5 N natriumhydroxidmethanoloploesning :

oploes 2 g natriumhydroxyd i 100 ml methanol , som ikke indeholder mere end 0,5 % ( m/m ) vand . Dersom oploesningen staar over et laengere tidsrum dannes en smule natriumcarbonat ( hvidt bundfald ) ; dette har ikke nogen indflydelse paa fremstillingen af methylesterene .

- Bortrifluoridmethanoloploesning med en styrke paa mellem 12 og 15 % ( m/m ) . ( Der findes oploesninger paa 14 og 50 % i handelen ) ( bem . 2 ) .

Advarsel : Bortrifluorid er en giftig forbindelse , hvorfor det ikke anbefales selv at tilberede oploesningen ud fra bortrifluorid og methanol ( bem 3 ) .

- Heptan til kromatografi ( bem . 2 , bem . 4 ) ,

- redestilleret petroleumether ( Kp 40 - 60 * C ) bromindeks mindre end 1 , fri for destillationsrest , eller hexan ( bem . 2 ) ,

- vandfrit natriumsulfat ,

- vandig maettet oploesning af natriumchlorid ,

- methylroedt , oploesning 0,1 % ( m/v ) i 60 % ( v/v ) ethanol ,

- nitrogen indeholdende mindre end 5 mg oxygen pr . kg .

3.1.4 . Fremgangsmaade

De foelgende operationer boer fortrinsvis foregaa i stinkskab paa grund af bortrifluoridets toksiske egenskaber . Alle glasting skal vaskes i vand umiddelbart efter anvendelse .

Ved tilstedevaerelsen af olier eller fedtsyrer , som indeholder syre med mere end 2 dobbeltbindinger , anbefales det at fjerne luften i methanolen og kolben ved en gennemblaesning med nitrogen i nogle minutter .

Proeven forberedes som beskrevet i afsnit I " forberedelse af proeven " .

En noejagtig afvejning er ikke noedvendig . Stoerrelsen af proeven skal kun kendes for at vaelge stoerrelsen af kolben og reagensmaengder ud fra foelgende tabel :

Proeve mg * Kolbe ml * NaOH 0,5 N ml * Methanoloploesning BF3 ml *

100 - 250 * 50 * 4 * 5 *

250 - 500 * 50 * 6 * 7 *

500 - 750 * 100 * 8 * 9 *

750 - 1000 * 100 * 10 * 12 *

Ved methylestere til gaskromatografisk analyse boer proeven fortrinsvis vaere omkring 350 mg . Hvis den er mindre , boer der tages forhaandsregler for at den udtagne proeve bliver repraesentativ ( bem . 5 ) .

3.1.4.1 . Olier og fedt

Den afvejede proeve kommes i kolben . Den angivne maengde natriumhydroxidmethanoloploesning tilsaettes sammen med en kogesten . Svaleren paasaettes kolben . Der koges med tilbagesvaling indtil de smaa draaber fedtstof oploeses ( dette kan vare 5 til 10 minutter , men kan i visse tilfaelde overstige 10 minutter ) .

Gennem svaleren tilsaettes med maalepipette med gummibold eller en automatisk pipette den angivne maengde bortrifluoridmethanoloploesning . Kogningen fortsaettes i 2 minutter .

Der tilsaettes 2 til 5 ml heptan til den kogende blanding ( bem . 4 ) gennem svaleren ( maengden af heptan er uden betydning for reaktionen ) , og der koges i 1 minut .

Opvarmningskilden og derefter svaleren fjernes . Der tilsaettes nogle ml af den maettede natriumchloridoploesning og kolben rystes svagt flere gange under rotation .

Tilsaetning med maettet natriumchloridoploesning fortsattes indtil vaeskeniveauet paar op i kolbens hals . Cirka 1 ml af det oeverste lag ( heptanoploesning ) overfoeres i et reagensglas med slib og glasprop , og der tilsaettes en noedvendig maengde vandfrit natriumsulfat til at fjerne spor af vand . Ved en proeve paa 350 mg vil den opnaaede oploesning indeholde 5 til 10 % methylestere , som kan indsproejtes direkte i gaskromatografens kolonne . I andre tilfaelde fortyndes heptanoploesningen , saaledes at der fremkommer en koncentration paa 5 til 10 % methylestere ( bem . 6 ) .

For at faa den totale maengde af estere i toer tilstand overfoeres saltoploesningen og heptanfasen i en 250 ml skilletragt . Der dekanteres . Saltoploesningen ekstraheres 2 gange med 50 ml petroleumether ( Kp 40 - 60 * C ) eller hexan . Heptanfasen og de to ekstrakter samles og vaskes med portioner a 20 ml vand indtil neutralreaktion ( indikator : methylroedt ) . Tilsaet vandfrit natriumsulfat og fjern oploesningsmidlet paa dampbad ved hjaelp af nitrogengennemblaesning ( bem . 6 , bem . 7 ) . Ved proever paa mindre end 500 mg boer rumfanget af oploesningsmidlet og vand reduceres proportionalt .

3.1.4.2 . Fedtsyrer

Dersom proeven udelukkende bestaar af fedtsyrer gennemfoeres forsaebningen ikke .

Den givne maengde fedtsyre kommes i kolben . Den forskrevne maengde methanoloploesning af bortrifluorid tilsaettes . Der koges i 2 minutter . Derefter fortsaettes som angivet i 3.1.4.1 fra " Der tilsaettes 2 til 5 ml heptan til ... " .

3.2 . Alternative metoder som ikke anvender bortrifluorid

3.2.1 . For neutrale fedstoffer ( syretal < 2 )

3.2.1.1 . Princip

Methanolyse af glycerider i alkalinsk oploesning .

3.2.1.2 . Udstyr

- Omroerer der muliggoer en hurtig omroering og et passende opvarmningsapparat ( f.eks . magnetomroerer med varmeplade ) ,

- erlenmeyerkolbe eller 100 ml kolbe med slebet hals ,

- studs til nitrogengennemblaesning ,

- svaler som passer til erlenmeyerkolben eller kolben med slib ,

- kogesten , fri for fedt ,

- 125 ml skilletragte

- 50 ml erlenmeyerkolbe .

3.2.1.3 . Reagenser

- Methanol , ikke indeholdende mere end 0,5 % ( m/m ) vand ,

- cirka 1 N kaliumhydroxidmethanoloploesning : oploes 5,6 g kaliumhydroxid i 100 ml methanol , som ikke indeholder mere end 0,5 % ( m/m ) vand ,

- heptan til kromatografi ( bem . 2 , bem . 4 ) ,

- vandfrit natriumsulfat ,

- nitrogen , indeholdende mindre end 5 mg oxygen pr . kg .

3.2.1.4 . Fremgangsmaade

Ved tilstedevaerelse af olie indeholdende syrer med mere end 2 dobbeltbindinger anbefales det at fjerne luften i ethanolen og kolben ved gennemblaesning med nitrogen i nogle minutter .

Proeven forberedes som beskrevet i I , " forberedelse af proeven " .

I en erlenmeyerkolbe eller en 100 ml kolbe med slib overfoeres ca . 4 g ( bem . 5 ) af det tilberedte fedtstof .

Der tilsaettes ca . 40 ml methanol , 0,5 ml af natriumhydroxideploesningen og kogesten . Der paasaettes svaler med tilbagesvaling , omroeres og bringes til kogning . Oploesningen skal forblive klar . Reaktionen er almindeligvis faerdig i loebet af 5 til 10 minutter . Ved olier af recinusolietypen er klarhed ikke et anvendeligt kriterium for reaktion .

Der afkoeles under rindende vand , og blandingen overfoeres til en 125 ml skilletragt . Kolben skylles med 20 ml heptan ( bem . 4 ) , og dette haeldes over i tragten . Der tilsaettes ca . 40 ml vand , og der omroeres . Esterne samler sig i den oeverste sammen med heptanfasen . Den vandige fase udtraekkes endnu en gang med 20 ml heptan . De to ekstrakter samles , og der vaskes to gange med 20 ml vand . Efter dekantering toerres esteroploesningen med vandfrit natriumsulfat , der filtreres paa bomuld , og endelig inddampes oploesningen paa et kogende vandbad indtil 20 ml ved hjaelp af gennemblaesning med nitrogen i en 50 ml erlenmeyerkolbe ( bem . 6 , bem . 7 ) .

3.2.2 . For fedtstoffer ( syretal > 2 ) og fedtsyrer

3.2.2.1 . Princip

Ved fedtstoffer foretages neutralisation af de frie fedtsyrer , alkalinsk methanolsyre af glyceriderne og derefter forestering af fedtsyrerne i sur oploesning .

Ved fedtsyrer foretages forestering i sur oploesning .

3.2.2.2 . Udstyr

- Omroerer der tillader en hurtig omroering og et passende opvarmningsapparat ( f.eks . magnetomroerer med varmeplade ) ,

- erlenmeyerkolbe eller 250 ml kolbe med slebet hals ,

- studs til nitrogengennemblaesning ,

- svaler , der passer til erlenmeyerkolben eller kolben ,

- kogesten , fri for fedt ,

- 250 ml skilletragte ,

- 100 ml erlenmeyerkolbe .

3.2.2.3 . Reagenser

- Natriumethylatoploesning opnaaet ved at oploese 1 g natrium i 100 ml methanol , der ikke indeholder mere end 0,5 % ( m/m ) vand ,

- cirka i N methanoloploesning af vandfri saltsyre ( se bemaerkningerne 3.2.2.6 a ) og b ) ,

- heptan til kromatografi ( bem . 2 , bem . 4 ) ,

- vandfrit natriumsulfat ,

- nitrogen indeholdende mindre end 5 mg oxygen pr . kg .

3.2.2.4 . Fremgngsmaade ved fedtstoffer

Ved tilstedevaerelse af olier indeholdende syrer med mere end 2 dobbelt bindinger anbefales det at fjerne luften i methanolen og kolben , gennemblaesning med nitrogen i nogle minutter .

Proeven forberedes som beskrevet i I " forberedelse af proeven " .

I en erlenmeyerkolbe eller en 250 ml kolbe med slib overfoeres ca . 4 g ( bem . 5 ) af det tilberedte fedstof .

Der tilsaettes 40 ml natriumethylatoploesning ( se bemaerkning 3.2.2.6 c ) ) . Der koges under tilbagesvaling og omroeres . Oploesningen skal blive klar , hvilket normalt finder sted i loebet af 10 minutter . Reaktionen er praktisk taget faerdig efter 15 minutter .

I kolben kommes derefter mindst 50 ml saltsyreoploesning , og der koges paa ny i 10 minutter ( se bem . 3.2.2.6 d ) ) .

Der afkoeles under rindende vand , og derefter tilsaettes til kolben 100 ml vand , hvorefter blandingen overfoeres til en 250 ml skilletragt , og der tilsaettes 30 ml heptan ( bem . 4 ) . Der omroeres kraftigt og dekanteres indtil komplet udskillelse af de to faser . Heptanfasen opsamles . Den vandige fase udtraekkes endnu en gang med 30 ml heptan . De to heptanekstrakter samles og vaskes flere gange med vand indtil neutral reaktion . Efter dekantering toerres med vandfrit natriumsulfat . Oploesningsmidlet filtreres paa bomuld og inddampes derefter indtil 20 ml paa kogende vandbad med gennemblaesning af nitrogen i en 100 ml erlenmeyerkolbe ( bem . 6 , bem . 7 ) .

3.2.2.5 . Fremgangsmaade for fedtsyrer

Ved fedtsyrer anvendes foelgende simplificerede fremgangsmaade .

Ved fedtsyrer , som indeholder syrer med mere end 2 dobbeltbindinger , anbefales det at fjerne luften i methanolen og kolben ved en gennemblaesning med nitrogen i nogle minutter .

Proeven forberedes som beskrevet i I " forberedelse af proeven " .

I en erlenmeyerkolbe eller en 250 ml kolbe overfoeres ca . 4 g ( ben . 5 ) af det tilberedte fedtstof .

Der ihaeldes 50 ml saltsyreoploesning og kogesten , derefter koges i 10 minutter .

Der afkoeles under rindende vand , derpaa tilsaettes kolben 100 ml vand , og blandingen overfoeres til en 250 ml skilletragt , og der tilsaettes 30 ml heptan ( note 4 ) . Der omrystes kraftigt og dekanteres indtil fuldstaendig udskillelse af de to faser . den vandige fase omahaeldes og udtraekkes endnu en gang med 30 ml heptan , De to heptanekstrakter samles og vaskes flere gange i vand indtil neutral reaktion . Efter dekantering toerres med vandfrit natriumsulfat . Oploesningsmidlet filtreres paa bomuld og inddampes til 20 ml paa kogende vandbad ved gennemblaesning med nitrogen i en 100 ml erlenmeyerkolbe ( bem . 6 , bem . 7 ) .

3.2.2.6 . Bemaerkninger

a ) I laboratoriet er det let at fremstille mindre maengder hydrogenchlorid gennem simpel perkolation af den kommercielle oploesning ( d = 1,18 ) , ved lidt efter lidt at tilsaette koncentreret svovlsyre ( d + 1,84 ) . Den gas som frigoeres toerres enkelt ved gennemblaesning i svovlsyre . Da methanol er meget reaktionsvilligt med hydrogenchlorid , boer man tage alle normale forholdsregler ved oploesningen f.eks . ved at foretage indfoeringen af gassen ved hjaelp af en lille omvendt tragt , som netop er i niveau med methanoloverfladen . Det er ioevrigt muligt i forvejen at fremstille betydelige maengder methanolsaltsyreoploesninger , som er i stand til at holde sig i flasker med slib og glasprop , som opbevares i moerke .

b ) Det er muligt at anvende ca . 1 N svovlsyremethanoloploesning i stedet for saltsyremethanoloploesningen , men foresteringstiden skal vaere mindst 20 minutter og bundfald af natriumsulfat vil genere kogningen og noedvendiggoere filtrering eller anvendelse af en magnetomroerer .

c ) Foer paasaetning af proeven er det ligeledes muligt at ihaelde 40 ml methanol og at tilsaette 0,4 g natrium , hvilket er det samme som at fremstille en natriummethylatoploesning til oejeblikkelig brug .

d ) Ved meget sure fedtstoffer fremkommer der paa grund af den relativt betydelige maengde natriumethylat et bundfald af natriumchlorid , som kan fremkalde stoedkogning . Det er muligt at bortfiltrere dette bundfald , men dette er almindeligvis ikke noedvendigt paa grund af den korte opvarmningstid .

4 . SAERLIGE METODER TIL FREMSTILLING AF FEDTSYREMETHYLESTERE MED 4 ELLER FAERRE KULSTOFATOMER

4.1 . Princip

Methylestere fremkommer gennem reaktion af fedtstoffer med en kaliumhydroxidmethanoloploesning paa et mellemstadium foer forsaebningen finder sted .

Ved dosering af fedtsyre med mindre end 4 og 6 carbonatomer til gaskromatografi tilsaettes en intern standard ( methylpentonoat ) til methylestere .

Ved en kvalitativ bestemmelse gennem gaskromatografi af sammensaetningen af fedtstoffet i fedtsyrer og ved andre fysiske bestemmelser er en intern standard ikke noedvendig .

4.2 . Anvendelsesomraade

Metoden er foerst og fremmest bestemt til fremstilling af methylestere , som skal analyseres ved gaskromatografi .

Metoden er ikke anvendelig for fedtsyrer ( syretal > 2 ) .

4.3 . Udstyr

- Cirka 20 ml reagensglas med slebet prop ,

- 50 og 100 ml maalekolber ,

- maalepipetter inddelt med 1 ml delstreger ( eller mere ) ,

- maaleglas inddelt til 10 ml .

4.4 . Reagenser

- Cirka 2 N kaliumhydroxidmethanoloploesning : oploes 11,2 g kaliumhydroxid i 100 ml methanol , som ikke indeholder mere end 0,5 % ( m/m ) vand ,

- heptan til kromatografi ( bem . 2 , bem . 4 ) ,

- referenceoploesning I : i en 50 ml maalekolbe afvejes med en noejagtighed paa 0,1 mg 1 g methylpentanoat , og der fyldes op til maalestreg med heptan ,

- referenceoploesning II : i en 100 ml maalekolbe afvejes med en noejagtighed paa 0,1 mg 200 mg methylpentanoat , og der fyldes op til maalestreg med heptan .

4.5 . Fremgangsmaade

Dersom en senere dosering af smoersyre til gaskromatografi kraeves , anvendes en referenceoploesning : referenceoploesning I , hvis det antagne indhold af smoersyre er stoerre end 1 % , og referenceoploesning II , hvis dette er mindre end 1 % .

Dersom en bestemmelse af sammensaetningen i fedtsyrer ved hjaelp af gaskromatografi kraeves anvendes ikke referenceoploesning .

Proeven forberedes som beskrevet i I " forberedelse af proeven " .

I et cirka 20 ml reagensglas med slib og glasprop afvejes med en noejagtighed paa 1 mg 1 g forberedt proeve . Der tilsaettes 10 ml heptan afmaalt i maaleglas . Med en maalepipette tilsaettes 1,0 ml af den givne referenceoploesning .

Bem . : Dersom der ikke kraeves dosering af smoersyrer , er det ikke noedvendigt at afveje proeven med en noejagtighed paa 1 mg ej heller at tilsaette referenceoploesningen .

Der tilsaettes 0,5 ml af den ca . 2 N kaliumhydroxidmethanoloploesning og indholdet i reagensglasset blandes ved omrystning , indtil det bliver klart . Dette sker i loebet af ca . 20 sekunder . Naesten umiddelbart efter denne klaring bliver oploesningen igen uklar som foelge af udskillelsen af glycerol .

Dekanteringen af glycerol skal ske hurtigt .

Det oeverste lag indeholdende methylesterne dekanteres .

Methylesterne kan opbevares i koeleskab nogle dage .

5 . BEMAERKNINGER

1 . Dersom forsaebningsresten generer , fortyndes den oploesning , som fremkommer efter forsaebningen , i vand , og forsaebingsresten elimineres ved ekstraktion med deethyloxid hexan eller petroleumether under de beskrevne betingelser . Den vandige oploesning goeres sur og fedtsyrerne udskilles . Disses methylestere fremstilles som beskrevet i 3.1.4.2 eller 3.2.2.5 .

2 . Ved gaskromatografi af methylesterne kan visse reagenser og isaer bortrifluoridmethanoloploesningen foere til fremkomsten af falske toppe ( i omraadet C20-C22 for bortrifluoridmethanoloploesningerne ) . Foelgelig skal hver ny portion af reagens undersoeges ved at tilberede methylestere af ren oliesyre og derefter gennemfoere kromatografi paa disse . Dersom der forekommer en falsk top , maa det anvendte reagens ikke benyttes .

3 . Dersom det er absolut noedvendigt at fremstille en bortrifluoridmethanoloploesning , skal det ske paa foelgende maade :

Tag en 2 liter kolbe indeholdende 1 liter methanol .

Afkoel i et bad med isvand . Kolben forbliver i isbadet under gennemblaesning med BF3 fra en gasflaske med BF3 ved hjaelp af et glasroer i methanolen , indtil der er absorberet 125 g ; dette foregaar i stinkskab . Begynd gennemblaesningen med BF3 i glasroeret foer dette nedsaenkes i methanolen og lige til dette er trukket tilbage derfra , for at undgaa enhver indsugning af vaeske i det system , som indeholder gassen . Gassen maa ikke ved at slippe for hurtigt ud af kolben afgive en hvid roeg . Reagenset er stabilt i to aar .

4 . Heptan kan erstattes af hexan i fravaer af fedtsyrer med 20 eller flere kulstofatomer .

5 . Dersom man ikke disponerer over den paaregnede proevemaengde , kan denne reduceres indtil 10 mg og endog derunder paa betingelse af , at reagensernes volumen og apparatkapaciteten formindskes proportionelt dermed .

6 . Methylesterne boer fortrinsvis analyseres saa hurtigt som muligt . Om noedvendigt kan heptanoploesningen indeholdende methylestere opbevares under inaktiv gas og i koeleskab . Ved en oplagring af laengere varighed er det oenskeligt at beskytte methylestrene mod autoxidation gennem tilsaetning af en antioxidant til oploesningen med en koncentration , der ikke forstyrrer de senere analyser f.eks . 0,005 % ( m/v ) af B.H.T . ( 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol ) . Om noedvendigt kan de inddampede methylestere opbevares 24 timer under inaktiv gas i koeleskab eller i laengere til i forseglet roer i vakuum i fryser .

7 . Man risikerer at tabe en del af de mest flygtige methylestere hvis fordampningen af oploesningsmidlet tager for lang tid eller hvis nitrogenstroemmen er for kraftig .

Med henblik paa infraroed spektrofotometri skal denne fordampning af oploesningsmidlet vaere saa fuldstaendig som muligt . Ved gaskromatografi et det ikke oenskeligt at fjerne oploesningsmidlet .

8 . For olier af recinusolie-typen er klarheden ikke et kriterium for reaktionen .

III . GASKROMATOGRAFI AF FEDTSYREMETHYLESTERE

1 . INDLEDNING

Denne beskrivelse har til formaal at give generelle retningslinjer for gaskromatografisk bestemmelse af den kvalitative og kvantitative sammensaetning af en blanding af fedtsyremethylestere fremstillet , som beskrevet i II . Polymeriserede fedtsyrer er ikke analyserbare ved denne metode .

Disse bestemmelser angaar apparatur til gaskromatografi med kolonne og flammeionisationsdetektor ( bem . 1 ) .

2 . APPARATUR

2.1 . Gaskromatograf

Ethvert udstyr , som kan give den praecision og oploesning , som er defineret i 4.1.2 , kan anvendes .

2.1.1 . Injektionsblok

Injektionsblokken skal have saa lille et dadsvolumen som muligt og boer kunne opvarmes til en temperatur , som er 25 * -50 * C hoejere end kolonnen .

2.1.2 . Ovn

Ovnen skal vaere i stand til at opvarme kolonnerne til en temperatur paa mindst 220 * C og opretholde den valgte temperatur inden for en margen paa 1 * C . Ved anvendelse af forudbestemte betingelser tilraades det at vaelge et apparat med to kolonner .

2.1.3 . Fyldt kolonne

2.1.3.1 . Kolonne

Kolonnen skal vaere af et materiale , som er inaktiv i forhold til de emner , der skal analyseres ; glas eller i mangel heraf rustfrit staal ( bem . 2 ) .

Laengde fra 1-3 cm . En relativ kort kolonne anvendes ved tilstedevaerelse af langkaedede fedtsyrer ( stoerre end C20 ) .

Indre diameter : 2-4 mm .

Ved bestemmelsen af syre bestaaende af C4 og C6 boer anvendes en kolonne paa 2 m .

2.1.3.2 . Fyld

Baeremateriale : kiselgur vasket i syre og silaniseret , eller ethvert andet inaktiv baeremateriale kan anvendes . Interval for kornstoerrelse 25 um mellem 125 og 200 um , idet middelvaerdien er en funktion af kolonnens indre diameter og laengde .

Stationaer fase : polaer fase f.eks . af polyestertype ( diethylenglycolpolysuccinat , butandiolpolysuccinat , ethylenglycolpolyadipat ) , cyanosilicon eller enhver anden fase , som opfylder de nedennaevnte krav . Belaegningen skal vaere mellem 5 og 20 % . Ved visse adskillelser vil de ikke-polaere faser kuane anvendes .

2.1.3.3 . Konditionering

Efter om muligt at have afmonteret detektoren fra kolonnen opvarmes gaskromatografens ovn til 10 * C o er arbejdstemperaturen . Igennem kolonnen ledes en gasatroem paa 20-60 ml pr . min . inaktiv i mindst 16 timer ved denne temperatur og derpaa i 2 timer ved 195 * C .

2.1.4 . Detektor

Detektoren skal helst opvarmes til en temperatur , som er hoejere end kolonnens .

De nedenfor angivne betingelser angaar anvendelsen af en flammeionisationsdetektor ( bem . 1 ) .

2.2 . Injektionssproejte

Injektionssproejte paa maksimalt 10 ul opdelt i 1/10 af ul .

2.3 . Registreringsinstrument

Naar den optegnede kurve anvendes til at beregne sammensaetningen af den analyserede blanding , skal skriveren vaere et elektronisk apparat af stor praecision .

Det registrerende instruments karakteristika skal vaere tilpasset det anvendte apparatur :

- Responshastighed mindre end 1,5 sek . ( responshastigheden er den tid , der forloeber indtil et udslag paa 90 % ved en momentan paatrykning af et signal paa 100 % ) ,

- papirbredde : minimum 25 cm ,

- papirhastighed : 25-150 cm/h .

2.4 . Integrator eller regnemaskine ( frivillig )

Anvendelse af en elektronisk integrator eller en regnemaskine giver en hurtig og praecis beregning . Denne skal give et liniaer udslag med en tilstraekkelig foelsomhed , og korrektionen for afvigelse fra grundlinen skal vaere tilfredsstillende .

3 . REAGENSER

- Baeregas : Inaktiv gas ( nitrogen , helium , argon ) vel toerret og indeholdende mindre end 10 ppm oxygen .

- Hjaelpegas : Hydrogen 99,9 % minimum , ikke indeholdende organiske produkter , luft eller oxygen ikke indeholdende organiske produkter .

- Standardproever : Methylesterblandinger eller methylestere af en olie af kendt sammensaetning om muligt naert beslaegtet med de fedtstoffer , som skal analyseres .

4 . FREMGANGSMAADE

4.1 . Justering af apparatur

4.1.1 . Bestemmelse af de optimale arbejdsbetingelser

Foelgende variable indgaar i valget af arbejdsbetingelser :

kolonnens laengde og diameter

den stationaere fases art og maengde

kolonnens temperatur

baeregassens stroemningshastighed

den oenskede oploesning

proevens stoerrelse

analysetid

Proevens stoerrelse vaelges saaledes at systemets detektor-elektrometer giver et liniaert udslag .

Almindeligvis vil foelgende vaerdier give de oenskede resultater , dvs . antal teoretiske bunde for methylstaerat mindst er lig med 2 000 ved en eleuringstid paa ca . 15 minutter .

Kolonnens indre diameter

2 mm

3 mm

4 mm

Den stationaere fases koncentration

5 %

10 %

15 %

20 %

Baeregassens hastighed

15-25 ml/min

20-40 ml/min

40-60 ml/min

Temperatur

175 * C

180 * C

185 * C

185 * C

Naar apparaturet goer det muligt , skal injektionsblokken have en temperatur i naerheden af 200 * C og detektoren en temperatur , som er lig med eller stoerre end kolonnens .

Flammeionisationsdetektorens hydrogenstroemningshastighed skal almindeligvis vaere ca . halvdelen af bearegassens og luftens stroemningshastighed ca . 5-10 gange stoerre end hydrogenens .

4.1.2 . Bestemmelse af ydeevne og oploesning

Gennemfoer analysen med en blanding af methylstearat og methyloleat i vaesentlig grad ekvivalente dele ( f.eks . methylestere af cacaosmoer ) . Proevens stoerrelse , kolonnens temperatur og baeregassens stroemningshastighed vaelges saaledes , at methylstearatroppens maksimum registreres ca . 15 min . efter oploesningstoppen , og saaledes at denne top svarer til ca . 3/4 af fuldt udslag .

Antallet af teoretiske bunde ( n ) ( ydeevne ) beregnes ud fra formelen :

n = 16 ( dR1/w1)2

og oploesningen ( R ) af formelen :

R = 2 D/o1 + o2

hvor

dR1 er retentionsafstanden i mm maalt fra start til det relative maksimum for methylstearattoppen ,

o1 og o2 er bredderne i mm af toppene af methylstearat og methyloleat maalt mellem skaeringspunkterne af grundlinjen og tangenterne i kurvens inflektionspunkter ,

D er afstanden mellem de respektive maxima for methylstearat og methyloleattoppene : JFR . EFT

De betingelser , der giver et antal teoretiske bunde for methylsteatet paa mindst 2 000 og en oploesning paa mindst 1,25 skal anvendes . Der skal yderligere sikres , at linolensyre ( C18:3 ) adskilles fra arachinsyre ( C20:0 ) og gadoleinsyre ( C20:1 ) .

4.2 . Analyse

Proeven skal udgoere 0,1-2 ul heptanoploesning af de methylestere , som er fremkommet ifoelge II . Ved estere uden oploesningsmiddel fremstilles en ca . 10 % heptanoploesning og 0,1-1 ul af denne indsproejtes .

Ved soegning efter bestanddele , som kun er til stede som spor , kan denne proeveudtagning foroeges ( op til 10 gange ) .

Normalt vil arbejdsbetingelserne vaere som bestemt i 4.1.1 . Det vil dog vaere muligt at arbejde med en lavere kolonnetemperatur , dersom det er noedvendigt at dosere fedtsyre , som er under C12 , eller med en hoejere temperatur , dersom det er noedvendigt at dosere fedtsyre , som er hoejere end C20 .

Om noedvendigt anbefales det at gennemfoere en analyse ved anvendelse af 2 immobile faser med forskellig polaritet for at kontrollere fravaeret af maskerede toppe f.eks . for fiskeolie , eller ved samtidig tilstedevaerelse af C18:3 og C20:0 eller C18:3 og C18:2 konjugeret .

Det vil eventuelt vaere muligt at operere med en forud fastsat temperatur i de to foregaaende tilfaelde . Hvis proeven f.eks . indeholder fedtsyremethylestere med mindst 12 kulstofatomer , indsproejtes proeven ved 100 * C ( eller ved 50-60 * C dersom der er smoersyre til stede ) , og der indstilles straks paa 4-8 * C/min . indtil optimal temperatur .

I visse tilfaelde kan de to fremgangsmaader kombineres : i perioden efter indstilling af temperaturen fortsaettes elueringen ved konstant temperatur indtil alle bestanddelene er eluerede . Dersom apparatet ikke kan arbejde ved den indstillede temperatur opereres der med to faste temperaturer mellem 100 * og 195 * C .

5 . FORMULERING AF RESULTATERNE

5.1 . Kvalitativ analyse

Ved undersoegelse af en standardproeve af kendt sammensaetning bestemmes retentionsafstandene ( eller retentionstiderne ) for de indgaaende fedtsyrer . Logaritmen af retentionsafstanden ( eller retentionstiden ) som funktion af antal kulstofatomer optegnes ; under isotermiske betingelser og for estere med hoejredrejede kraeder og en fast umaettethedsgrad skal disse kurver optegnet paa semi logaritmisk papir vaere rette linjer , som i det vaesentlige er parallelle .

Ved identifikationen af toppene anvendes disse rette linjer om noedvendig ved interpolation .

Arbejdsbetingelser , hvor maskerede toppe vil kunne eksistere , boer undgaas , dvs . at to bestanddele ikke kan skelnes som foelge af en utilstraekkelig oploesning .

5.2 . Kvantitativ analyse

5.2.1 . Bestemmelse af sammensaetningen

Anvend den interne normalisationsmetode ( der findes visse undtagelser ) , dvs . at det forudsaettes , at samtlige de tilstedevaerende bestanddele i proeven er repraesenteret paa kromatogrammet , dvs . at summen af arealerne udgoer 100 % af de indgaaende stoffer ( total eluering ) .

Dersom apparaturet omfatter en integrator , anvendes resultaterne fra denne .

I modsat fald bestemmes hver tops areal ved triangulering ved at gange dens hoejde med den bredde i halv hoejde , eventuelt under hensyntagen til forskellige aendringer under registreringen .

5.2.1.1 . Generelt

I fravaer af vaesentlige bestanddele mindre end C8 beregnes indholdet af bestanddelen udtrykt i procent methylester ved at bestemme den procentdel , som den tilsvarende top udgoer i forhold til summen af arealerne af alle toppene :

procent ( m/m ) af bestanddelen ( i ) udtrykt som methylestere = A1/SA i gange 100

A1 = areal af den top , som svarer til bestanddelen ( i ) ,

SAi = summen af arealerne for alle toppene .

5.2.1.2 . Anvendelse af korrektionsfaktorer

I visse tilfaelde , isaer ved tilstedevaerelse af syrer , som er mindre end C8 eller sekundaere syrer og ved anvendelse af varmeledningsevedetektorer anvendes korrektionsfaktorer for at omsaette procentdelene for arealerne af toppene til indholdet i procent af bestanddelene .

Korrektionsfaktorerne bestemmes ved hjaelp af et kromatogram fra en standardoploesning af methylestere med en sammensaetning , som er noejagtig kendt og ved en fremgangsmaade , som er identisk med arbejdsbetingelserne .

For standardoploesningen

Procent ( m/m ) af bestanddelen ( i ) = B1/SB i gange 100

B1 = massen af bestanddelen ( i ) i standardoploesningen ,

SB i = summen af indholdet af de forskellige bestanddele i standardoploesningen ,

Kromatogrammet for standardoploesningen goer det muligt at beregne :

procent ( areal/areal ) af bestanddelen ( i ) = C1/SC i gange 100

C1 = arealet af den top , som svarer til bestanddelen ( i ) ,

SC i = summen af arealerne af alle toppene ,

Heraf faas :

korrektionsfaktor K1 = B1 gange SC i/C1 gange SB i

Normalt gaelder det , at korrektionsfaktorer udregnes saaledes at K16 = 1 og de relative faktorer bliver saa :

K'1 = K1/K16

For proeven er maengden af hver bestanddel givet ved

procent ( m/m ) af bestanddelen ( i ) = K'1 gange A/S ( K'i gange A ) gange 100

udtrykt som methylestere

5.2.1.3 . Anvendelse af intern standard

I visse tilfaelde ( isaer i proever som indeholder syrer med C4 og C6 og hvor ikke alle fedtsyrerne er aluerede ) boer der anvendes en intern standard ( henholdsvis C5 og C15 eller C17 ) , og derefter bestemmes korrektionsfaktoren for den interne standard .

procent ( m/m ) af bestanddelen ( i ) = m s gange K'1 gange A1 / m gange K's gange A s gange 100

udtrykt som methylestere

m s = indholdet af den interne standard i mg ,

m = indholdet i proeven i mg ,

K's = korrektionsfaktor for den interne standard ,

A s = areal af den top , som svarer til den interne standard ,

A1 = arealet af den top , som svarer til bestanddelen ( i ) .

5.2.2 . Udformning af resultaterne

Resultaterne angives med :

3 betydende cifre for indhold over 10 % ,

2 betydende cifre for indhold mellem 1 og 10 % ,

1 betydende ciffer for indhold under 1 % ,

dvs . i hvert tilfaelde med i ciffer efter kommset .

5.2.3 . Gentagelighed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser udfoert samme dag med samme apparat af samme persom og paa de samme estere og for de bestanddele , som er til stede i stoerre maengde en 5 % , maa ikke overstige en relativ vaerdi paa 3 % af den bestemte vaerdi med et absolut maksimum paa 1 % . For bestanddele , som er til stede i mindre maengde end 5 % , bliver gentageligheden hurtigt mindre relativ god , naar indholdet falder .

5.2.4 . Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultater opnaaet i to forskellige laboratorier for bestanddele , som er til stede i stoerre maengde end 5 % , maa ikke overtige en relativ vaerdi paa 10 % af den bestemte vaerdi med et absolut maksimum paa 3 % . For bestanddele , som er til stede i mindre maengde end 5 % , bliver reproducerbarheden hurtigt mindre relativ god , naar indholdet falder .

6 . NOTER

1 . En gaskromatograf med varmeledningsdetektor ( katharometer ) kan anvendes . De beskrevne betingelser skal saa aendres som foelger :

Kolonne : laengde 2-4 m - indre diameter 4 mm .

Baeremateriale : kornstoerrelse mellem 160 og 200 um .

Belaegningsgrad : 15-25 % .

Baeregas : helium eller i mangel deraf hydrogen med et saa lille indhold af oxygen som muligt .

It en hjaelpegas .

Indsproejtningstemperatur : ca . 40-60 * C hoejere end kolonnens temperatur .

Kolonnens temperatur : 180-200 * C .

Baeregassens stroemningshastighed : almindeligvis mellem 60 og 80 ml/min .

Indsproejtede maengder : almindeligvis mellem 0,5 og 2 um .

Ved en kvantitativ analyse tages hensyn til de i 5.2.1.2 . definerede korrektionsfaktorer .

2 . Dersom der er polyumaettede bestanddele med mere end 3 dobbeltbindinger til stede , kan en kolonne af rustfrit staal foraarsage spaltning af disse .