KOMMISSIONENS BESLUTNING

af 14. februar 1991

om visse analyse- og proevemetoder for raa maelk og varmebehandlet maelk

(91/180/EOEF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 85/397/EOEF af 5. august 1985 om sundhedsmaessige og dyresundhedsmaessige problemer i forbindelse med handelen inden for Faellesskabet med varmebehandlet maelk (1), senest aendret ved direktiv 89/662/EOEF (2), saerlig artikel 10, stk. 2, og

ud fra foelgende betragtninger:

Ifoelge artikel 10, stk. 2, i direktiv 85/397/EOEF fastsaetter Kommissionen de analyse- og proevemetoder, der skal benyttes til at kontrollere, om normerne for raa maelk og varmebehandlet maelk overholdes;

for raa maelk boer der fastsaettes metoder, hvorved kimtal, celletal, frysepunkt og tilstedevaerelse af antibiotika kan bestemmes;

for pasteuriseret maelk boer der fastsaettes metoder, hvorved fravaer af patogene kim, antal koliforme bakterier, kimtal, fravaer af fosfatase, tilstedevaerelse af peroxidase, fravaer af antibiotika og frysepunkt kan bestemmes;

for steriliseret maelk og UHT-maelk boer der fastsaettes metoder, hvorved kimtal og fravaer af antibiotika kan bestemmes;

af tekniske aarsager boer der i foerste omfang fastsaettes referenceanalyse- og -proevemetoder med henblik paa at sikre overholdelse af visse normer; det er isaer vigtigt at fortsaette med at undersoege betingelserne for at bruge rutineanalyse- og -proevemetoder; indtil resultatet af denne undersoegelse foreligger, paahviler det de kompetente myndigheder at drage omsorg for, at der bruges passende rutinemetoder med henblik paa at sikre, at normerne i direktiv 85/397/EOEF overholdes;

bestemmelsen af referenceanalyse- og -proevemetoder omfatter bestemmelse af analysemetoder og fastsaettelse af paalidelighedskriterier for at sikre ensartet fortolkning af resultaterne;

de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Veterinaerkomité -

VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

Referencemetoderne for analyse og proevning af raa maelk er foelgende:

- bestemmelse af frysepunkt

- taelling af mirkoorganismer - kimtal ved 30 oC

- taelling af somatiske celler

- paavisning af antibiotika og sulfamider.

Artikel 2

Referencemetoder for analyse og proevning af pasteuriseret maelk er foelgende:

- bestemmelse af frysepunkt

- bestemmelse af fosfataseaktivitet

- bestemmelse af peroxidaseaktivitet

- taelling af mikroorganismer - kimtal ved 30 oC

- taelling af mikroorganismer - kimtal ved 21 oC

- taelling af koliforme bakterier - antal kolonier ved 30 oC

- paavisning af antibiotika og sulfamider

- paavisning af patogene mikroorganismer.

Artikel 3

Referencemetoderne for analyse og proevning af UHT-maelk og steriliseret maelk er foelgende:

- bestemmelse af frysepunkt

- taelling af mikroorganismer - kimtal ved 30 oC

- paavisning af antibiotika og sulfamider.

Artikel 4

Ivaerksaettelsen af referenceanalyse- og -proevemetoderne, paalidelighedskriterierne og indsamlingen af proever foretages i henhold til bilag I.

Artikel 5

De i artikel 1, 2 og 3 omhandlede referenceanalyse- og -proevemetoder er beskrevet i bilag II.

Artikel 6

Denne beslutning tages op til fornyet overvejelse inden den 31. december 1992 for at tage hensyn til udviklingen i den videnskabelige og tekniske viden.

Artikel 7

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 14. februar 1991.

Paa Kommissionens vegne

Ray MAC SHARRY

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 226 af 24. 8. 1985, s. 13.

(2) EFT nr. L 395 af 30. 12. 1989, s. 13.

BILAG I

INDHOLDSFORTEGNELSE

Side

II. Generelle bestemmelser .

4

II.

Proeveudtagning af raa og varmebehandlet maelk .

6

I. GENERELLE BESTEMMELSER

1.

Indledning

De generelle bestemmelser gaelder for reagenser, udstyr, angivelse af resultater, noejagtighed og proeverapport. Medlemsstaternes kompetente myndigheder og de kontrollaboratorier, der staar for proeveudtagning og kontrol af maelk, skal overholde de generelle bestemmelser.

2.

Reagenser

2.1.

Vand

2.1.1.

Vand til oploesning, fortynding eller skylning skal, medmindre andet er angivet, vaere destilleret vand, ionbyttet vand eller demineraliseret vand af mindst tilsvarende renhed. Til mikrobiologiske formaal skal det vaere fri for stoffer, som kan paavirke vaeksten af mirkoorganismer ved proevens udfoerelse.

2.1.2.

Ved »oploesning« eller »fortynding« uden yderligere angivelse forstaas »oploesning i vand« eller »fortynding med vand«.

2.2.

Kemikalier

Alle anvendte kemikalier skal, medmindre andet er angivet, vaere af anerkendt analysekvalitet for reagenser.

3.

Udstyr

3.1.

Lister over udstyr

Listerne over udstyr i de forskellige referencemetoder indeholder kun elementer med en saerlig anvendelse og elementer med bestemte specifikationer.

3.2.

Analysevaegt

En analysevaegt er en vaegt, der kan veje med en praecision paa 0,1 mg.

4.

Angivelse af resultater

4.1.

Resultater

Det i analyserapporten angivne resultat skal, medmindre andet er angivet, vaere den aritmetriske middelvaerdi af to proever, som opfylder det angivne repeterbarhedskriterium (5.1) for den paagaeldende metode. Hvis repeterbarhedskriteriet ikke opfyldes, skal den paagaeldende proeve gentages eller resultatet erklaeres ugyldigt.

4.2.

Procentberegning

Resultatet skal, medmindre andet er angivet, beregnes som en vaegtprocent af proeven.

5.

Noejagtighedskriterier: Repeterbarhed og reproducerbarhed

5.1.

Noejagtighedskriterierne for hver metode defineres som foelger:

5.1.1.

Repeterbarhed (r) er den vaerdi, der ligger under den absolute forskel mellem to enkelte proeveresultater, som er opnaaet ved samme metode paa identisk proevemateriale under samme betingelser (samme operatoer, samme apparatur, samme laboratorium og med et kort tidsinterval).

5.1.2.

Reproducerbarhed (R) er den vaerdi, der ligger under den absolutte forskel mellem to enkelte proeveresultater, som er opnaaet ved samme metode paa identisk proevemateriale under forskellige betingelser (forskellige operatoerer, forskelligt apparatur, forskellige laboratorier og/eller forskelligt tidsinterval).

5.1.3.

Vaerdierne for repeterbarheds- og reproducerbarhedskriterier anfoert i de relevante punkter for hver metode udgoer de konfidensniveauintervaller paa 95 %, som er defineret i ISO 5725: 2. udgave 1986, medmindre andet er angivet. De beregnes paa grundlag af resultaterne af anerkendte sammenlignende proever, som er benyttet til at evaluere metoderne. Der er dog ikke gennemfoert sammenlignende proever for visse af metoderne. I disse tilfaelde er repeterbarheds- og reproducerbarhedsvaerdierne anslaaet.

5.1.4.

De sammenlignende proever og undersoegelser, der omhandles i punkt 5.1.3, skal planlaegges og udfoeres i overensstemmelse med de internationale retningslinjer.

6.

Proeverapport

Proeverapporten skal specificere den anvendte analysemetode samt de opnaaede resultater. Den skal desuden oplyse eventuelle enkeltheder om anvendt metodik, som ikke er specificeret i analysemetoden, eller som ikke er obligatoprisk, samt eventuelle andre omstaendigheder, som kan have paavirket de opnaaede resultater. Proeverapporten skal indeholde alle noedvendige oplysninger til fuldstaendig identifikation af proeven.

II. PROEVEUDTAGNING AF RAA OG VARMEBEHANDLET MAELK

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til udtagning af proever af raa og varmebehandlet maelk. Denne metode til udtagning, transport og opbevaring af proever gaelder for raa maelk fra producentens maelkerum samt for raa og varmebehandlet maelk i lager- og transporttanke.

De i punkt 2, 4.4, 5 og 6 anfoerte metoder gaelder for proeveudtagning af varmebehandlet maelk til direkte konsum.

2.

Generelt

Proeveudtagning af raa og varmebehandlet maelk i junger, tanke m.v. skal foretages af en medarbejder, der er passende oplaert inden proeveudtagningen.

Hvis det anses for noedvendigt, skal proeveudtagningspersonalet af de kompetente myndigheder eller kontrollaboratoriet instrueres om proeveudtagningsteknik med henblik paa at sikre, at proeven er repraesentativ for og i overensstemmelse med hele partiet.

Hvis det anses for noedvendigt, skal proeveudtagningspersonalet af de kompetente myndigheder eller kontrollaboratoriet instrueres om maerkning af proeven med henblik paa sikker identifikation af den.

3.

Proeveudtagningsudstyr

3.1.

Generelt

Proeveudtagningsudstyret skal vaere af rustfrit staal eller andet egnet materiale af passende styrke og med en til formaalet (blanding, proeveudtagning m.v.) egnet konstruktion. Roerestaenger eller roerevaerker til blanding af vaesker i beholdere skal have et tilstraekkeligt omfang til at blande produktet passende, uden at der udvikles harsk smag. OEser skal have et solidt haandtag, som er langt nok til at muliggoere proeveudtagning paa en hvilken som helst dybde i beholderen. OEsens kapacitet skal vaere mindst 50 ml.

Proevebeholdere og lukkeanordninger skal vaere af glas, egnet metal eller plastik.

Proeveudtagningsudstyrets (herunder beholdere og lukkeanordninger) konstruktionsmateriale maa ikke foraarsage aendringer i proeven, som kan indvirke paa resultatet af undersoegelserne. Alle overflader paa proeveudtagningsudstyr og -beholdere skal vaere rene, toerre, glatte og fri for spraekker; hjoerner skal vaere afrundede.

3.2.

Proeveudtagningsudstyr til mikrobiologisk undersoegelse

Proeveudtagningsudstyr, herunder beholdere, skal ud over bestemmelserne i punkt 3.1 vaere sterile.

Hvis det samme proeveudtagningsudstyr anvendes til flere proeveudtagninger, skal det efter hver proeveudtagning rengoeres og steriliseres ifoelge de af kontrollaboratoriet eller den kompetente myndighed givne anvisninger eller krav paa en saadan maade, at ingen proever forurenes af en forudgaaende proeve.

4.

Proeveudtagningsteknik

4.1.

Generelt

Uanset hvilken undersoegelse, der skal udfoeres, skal maelken enten manuelt eller mekanisk blandes grundigt foer proeveudtagningen.

Proeven udtages umiddelbart efter blandingen, mens maelken stadig er i bevaegelse.

Naar der samtidig udtages flere proever af maelk i tanke til forskellige undersoegelser, skal proeven til den mikrobiologiske undersoegelse udtages foerst.

Proevens volumen skal vaere i overensstemmelse med kravene. De anvendte proevebeholdere skal have en saadan kapacitet, at de naesten fyldes helt af proeven, saaledes at indholdet kan blandes ordentligt inden undersoegelsen, samtidig med at der undgaas kaerning under transporten.

4.2.

Manuel proeveudtagning

4.2.1.

Proeveudtagning fra maelkespande og- junger

For at opnaa blanding bevaeges en roerestang hurtigt op og ned i spanden eller jungen, saa det sikres, at maelken blandes ordentligt, og at der ikke haenger floede fast ved jungens hals. Der skal udtages en repraesentativ proeve for hele partiet i overensstemmelse med punkt 4.2.4.

4.2.2.

Proeveudtagning fra gaardtanke

Maelken omroeres mekanisk eller manuelt, indtil der opnaas tilstraekkelig homogenitet.

Hvis maelkemaengden er for lille til, at den mekaniske omroerer kan blande maelken, skal omroeringen ske manuelt.

4.2.3.

Proeveudtagning fra vejebeholder

Det er vigtigt, at maelken er tilstraekkeligt blandet, naar den haeldes over i en vejebeholder. Det kan vaere noedvendigt at omroere maelken yderligere enten manuelt eller mekanisk for at sikre en jaevn fedtfordeling. Naar maelkemaengder, hvoraf der skal tages proeve, overstiger vejebeholderens kapacitet, udtages en proeve, der er repraesentativ for hele partiet i overensstemmelse med punkt 4.2.4.

4.2.4.

Proeveudtagning af maelk, der er fordelt paa flere beholdere

Naar der skal udtages proeve af maelk, der er fordelt paa mere end én beholder, tages en repraesentativ maengde fra hver beholder, og det noteres, hvor meget maelk de respektive proever er udtaget af. Medmindre proeverne fra hver beholder skal undersoeges enkeltvis, blandes portioner af disse repraesentative maengder i forhold til maengden i beholderen, hvorfra hver proeve er taget. Der udtages proeve(r) fra disse samlede forholdsmaessige maengder efter blanding.

4.2.5.

Proeveudtagning fra store beholdere, opbevarings-, jernbane- og lastvognstanke

4.2.5.1.

Maelken blandes efter en egnet metode foer proeveudtagningen

Det anbefales at omroere maelken mekanisk for at blande indholdet i store beholdere eller opbevarings-, jernbane- eller lastvognstanke (4.2.5.2).

Blandingstidens laengde skal vaere afpasset efter, hvor laenge maelken har vaeret i ro. Den blandingsmetode, der anvendes under givne omstaendigheder, skal paavises at vaere egnet til den planlagte analyse. Kriteriet for blandingseffektiviteten har saerlig betydning for ligheden mellem analyseresultater fra proever, der er udtaget fra enten forskellige dele af partiet eller med mellemrum fra tankens aabning under udstroemningen. En metode til blanding af maelk anses for at vaere effektiv, hvis forskellen i fedtindholdet mellem to proever, der er udtaget under disse betingelser, er under 0,1 %.

I en stor beholder med aabning i bunden kan der ved aabningsstudsen vaere en lille maengde maelk, som ikke er repraesentativ for hele indholdet, selv efter blanding. Proever skal derfor helst tages gennem et mandehul. Hvis der tages proever fra aabningen, skal der udledes en tilstraekkelig maengde maelk til at sikre, at proeverne er repraesentative for helheden.

4.2.5.2.

Blanding af indholdet i store beholdere eller opbevarings-, jernbane- eller lastvognstanke kan udfoeres:

- af en mekanisk omroerer, som er indbygget i tanken og drevet af en elektromotor

- af en propel eller omroerer drevet af en elektromotor og placeret paa mandehullet med omroereren nede i maelken

- i jernbane- eller lastvognstanke ved recirkulation af maelken gennem overfoerselsslangen, der er fastgjort til laensepumperne og indfoert gennem mandehullet

- af ren filtreret trykluft. I dette tilfaelde skal der benyttes mindst muligt lufttryk for at forhindre udvikling af en harsk smag.

4.3.

Automatisk eller halvautomatisk proeveudtagning

Automatiske eller halvautomatiske proeveudtagningsinstrumenter til proeveudtagning af raa maelk fra leverandoeren kan benyttes i henhold til kontrollaboratoriets eller anden kompetent myndigheds anvisninger.

Saadant udstyr skal, inden det benyttes og regelmaessigt under brugen, gennemgaa relevante proever som foreskrevet af den ansvarlige myndighed. Proeveudtagningsmetodernes egnethed skal bekraeftes med henblik paa at fastlaegge:

- minimumsvolumen af indsamlet maelk, hvoraf der maa udtages proever

- eventuelt overslaeb (som er afhaengigt af proevens minimumsvolumen)

- muligheden for at opnaa en repraesentativ proeve af maelken efter korrekt omroering.

Til anvendelse af automatisk eller halvautomatisk proeveudtagningsudstyr kan den ansvarlige kompetente nationale myndighed foreskrive:

- minimumsvolumen af maelk, hvoraf der maa udtages proever

- minimumsvolumen af proeven

- maksimalt overslaeb

- hvilke analyser der kan udfoeres, og hvilke sikkerhedsforanstaltninger der skal traeffes.

4.4.

Proeveudtagning af varmebehandlet maelk til direkte konsum i forbrugerpakninger

Proever af varmebehandlet maelk til direkte konsum i forbrugerpakninger skal udtages af den komplette, ubrudte pakning. Hvis det er muligt, udtages proeverne fra paafyldningsmaskinen i forarbejdningsvirksomheden saa hurtigt som muligt efter fremstillingen. Med hensyn til pasteuriseret maelk skal udtagningen ske paa fremstillingsdagen.

Proeverne udtages fra hver type varmebehandlet maelk (pasteuriseret, UHT og steriliseret) i et antal, som svarer til de undersoegelser, der skal foretages, og i overensstemmelse med kontrollaboratoriets eller anden kompetent myndigheds anvisninger.

5.

Identifikation af proeven

Proeven (se 2) skal maerkes med en identifikationskode, saaledes at den nemt kan identificeres ved hjaelp af kontrollaboratoriets eller den kompetente myndigheds anvisninger.

6.

Transport og opbevaring af proever

Anvisninger vedroerende transport, opbevaring og tidsinterval mellem proeveudtagning og analyse af maelken udarbejdes af kontrollaboratoriet alt efter maelketype og den analysemetode, der vil blive anvendt. Anvisningerne fastlaegges i forstaaelse med den kompetente nationale myndighed.

Anvisningerne omfatter foelgende punkter:

- Under transport og opbevaring skal der traeffes sikkerhedsforanstaltninger for at hindre, at maelken udsaettes for forurenende lugte og direkte sollys. Hvis der anvendes en gennemsigtig beholder til proeverne, skal denne opbevares moerkt.

- Proever af raa maelk, der er udtaget med henblik paa mikrobiologisk analyse, skal transporteres og opbevares mellem 0 og 4 oC. Tidsintervallet mellem proeveudtagning og analyse skal vaere saa kort som muligt og under alle omstaendigheder hoejst 36 timer. Den kompetente myndighed kan acceptere en opbevaringstemperatur mellem 0 og 6 oC, hvis tidsintervallet mellem proeveudtagning og analyse hoejst er 24 timer.

- Proever af pasteuriseret maelk, der er udtaget med henblik paa mikrobiologisk analyse, skal transporteres og opbevares mellem 0 og 4 oC. Tidsintervallet mellem proeveudtagning og analyse skal vaere saa kort som muligt og under alle omstaendigheder hoejst 24 timer.

- Proever af anden maelk end raa maelk og pasteuriseret maelk, der udtages med henblik paa mikrobiologisk analyse, skal opbevares nedkoelet i laboratoriet, og tidsintervallet mellem proeveudtagning og analyse skal vaere saa kort som muligt.

Saerlige sikkerhedsforanstaltninger, der skal traeffes i forbindelse med visse former for analyse, er angivet under de forskellige metoder.

BILAG II

INDHOLDSFORTEGNELSE

Side

I.

Bestemmelse af frysepunkt .

10

II.

Bestemmelse af fosfataseaktivitet .

16

III.

Bestemmelse af peroxidaseaktivitet .

19

IV.

Taelling af mikroorganismer - Kimtal ved 30 oC .

20

V.

Taelling af mikroorganismer - Kimtal ved 21 oC .

25

VI.

Taelling af coliforme bakterier - Kolonier ved 30o C .

29

VII.

Taelling af somatiske celler .

33

VIII.

Paavisning af antibiotika og sulfonamider .

39

IX.

Paavisning af patogene mikroorganismer .

48

I. BESTEMMELSE AF FRYSEPUNKT

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til bestemmelse af frysepunktet for raa, pasteuriseret, UHT-behandlet og steriliseret soedmaelk, delvis skummetmaelk og skummetmaelk ved hjaelp af et apparat (termistorkryoskop), hvori termostatvandbadet afkoeles elektrisk, og hvor en termistorsonde erstatter kviksoelvtermometeret.

Der findes to typer instrumenter. Det foerste er et instrument, som soeger det hoejeste frysepunkt paa frysekurvens »plateau«, mens det andet instrument af kommercielle aarsager er indstillet til at aflaese paa et bestemt punkt, efter at frysningen er begyndt. Da frysekurverne kan vaere forskellige for forskellige typer maelk samt for maelk og standardoploesninger, som benyttes til kalibreringen, kraever denne referencemetode brug af en plateausoeger. Fasttidsinstrumenter kan benyttes til rutinemaalinger.

Frysepunktet benyttes til at bestemme maengden af fremmed vand i maelken, forudsat at proevens surhedsgrad ikke overstiger 0,18 g maelkesyre pr. 100 ml (jf. 7.4).

2.

Definition

Maelks frysepunkt: Vaerdien opnaas ved maaling i overensstemmelse med den beskrevne metodik og udtrykkes i grader celcius (oC).

3.

Princip

En analyseproeve af maelk underafkoeles til den rette temperatur afhaengigt af instrumentet, og krystalliseringen saettes i gang ved mekanisk vibration, som faar temperaturen til at stige hurtigt til et plateau, som svarer til proevens frysepunkt.

Instrumentet kalibreres ved justering til at vise korrekte aflaesninger for to standardoploesninger ved samme metode som for maelkeproever. Under disse omstaendigheder viser plateauet maelkens frysepunkt i grader celcius.

4.

Apparatur og glasvarer

Saedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed:

4.1.

Kryoskop

Kryoskopet bestaar af et termostatstyret koelebad, termistorsonde (et halvleder-modstandstermometer) med tilknyttet kredsloeb og et galvanometer eller et display, proeveomroerer og en indretning til at starte frysningen samt proeveglas.

4.1.1.

Koelebad

Der kan benyttes to typer koelebad.

4.1.1.1.

Neddypningstypen

Et velisoleret bad, der indeholder en egnet koelevaeske, som omroeres, saaledes at temperaturforskellen mellem to vilkaarlige punkter i vaesken ikke overstiger 0,2 oC. Vaeskens temperatur maa ikke svinge med mere end p 0,5 oC i forhold til den nominelle vaerdi, som er angivet af fabrikanten.

Det er vigtigt, at vaesken i koelebadet holdes paa et konstant niveau. Hele proeveglassets overflade under volumenmaerket skal vaere daekket af koelevaeske.

4.1.1.2.

Cirkulationstypen

En stadig stroem af egnet koelevaeske cirkuleres i proeveglasset. Vaeskens temperatur maa ikke svinge med mere end p 0,5 oC i forhold til den nominelle vaerdi, som er angivet af fabrikanten.

En egnet koelevaeske er en 33 % (v/v) vandig oploesning af etan 1,2 diol (etylenglykol).

4.1.2.

Termistor og tilhoerende kredsloeb

Termistoren skal vaere af glassondetypen med en diameter paa hoejst 1,80 p 0,2 mm og med en kuglediameter paa hoejst 0,31 mm. Termistorens tidskonstant skal vaere paa under to sekunder, og vaerdien af â (se NB) skal vaere hoej. Driftsspaendingen, stroem- og stroemtabskonstanten skal sikre, at termistortemperaturen ikke haeves med mere end 0,0005 oC over omgivelserne ved 0,512 oC. Maksimal tolerance paa modstanden skal vaere p 5 %.

Naar sonden er i arbejdsstilling i kryptoskopet, skal spidsen af glasperlen ligge i proeveglassets akse i et punkt, der er 44,6 p 0,1 mm under glassets kant (se figuren paa side 15). Brugeren skal have en skabelon, saaledes at sonden kan placeres i denne position.

NB:

â definerer termistorens modstandstemperaturkarakteristik ved formlen:

d R × R = T 2 ,

d R

d T

×

1

R

=

â

T²

hvor:

T er temperaturen i kelvin

R

er modstanden i ohm ved temperaturen T

d R × R = er temperaturkoefficienten

d R

d T

×

1

R

=

er temperaturkoefficienten

â er en konstant, som afhaenger af det materiale, termistoren er lavet af. Der anbefales en vaerdi paa over 3 000.

4.1.3.

Maale- og aflaesningsinstrument

4.1.3.1.

Maalingsprincip

Det anvendte instrument skal fungere efter princippet for soegning af det foerste »plateau« paa frysepunktskurven. Plateauet er den del af kurven, hvor temperaturen er konstant inden for p 0,002 oC i mindst 20 sekunder.

4.1.3.2.

Manuel betjening

Termistorens modstand afbalanceres ved hjaelp af en wheatstonebro eller et lignende instrument, hvor der benyttes stabile modstande af hoejeste kvalitet, hvis tolerance ikke er stoerre end p 10 %, og hvis temperaturkoefficient ikke overstiger 2 × 10 & pr. grad celsius.

Den variable (balance) modstand maa ikke afvige fra lineariteten i hele sin udstraekning med mere end 0,3 % af maksimumsvaerdien.

Det skal vaere muligt at justere modstandene i kalibreringsoejemed.

Maaleskalaen skal gradueres i intervaller paa ikke over 0,001 oC.

4.1.3.3.

Automatisk betjening

Maaleinstrumentet skal have en aflaesningsnoejagtighed paa mindst 0,001 oC paa skalaen 0 til 1 oC.

Maaleinstrumentets og det tilhoerende kredsloebs stabilitet skal vaere af en saadan art, at paa hinanden foelgende indikationer af den samme temperatur ikke svinger med mere end 0,001 oC.

Kredsloebets linearitet skal vaere af en saadan art, at der ikke opstaar en fejl paa mere end p 0,001 oC paa noget punkt inden for skalaen 0,400 oC til 0,600 oC, naar instrumentet betjenes korrekt.

4.1.4.

Roeretraad

Der benyttes en roeretraad af metal med en diameter paa 1-1,5 mm, som er inert over for maelk, til at roere i analyseproeven.

Roeretraadens amplitude skal kunne justeres, og den monteres vertikalt med den nederste ende paa niveau med termistorsondens spids. En tolerance paa ca. 1,5 mm over eller under denne position er tilladt.

Roeretraaden skal vibrere lateralt med en tilstraekkelig amplitude angivet af fabrikanten (ikke under p 1,5 mm) for at sikre, at temperaturen i analyseproeven forbliver ensartet under bestemmelsen. Paa intet tidspunkt under den normale omroering maa roeretraaden ramme termistorsonden eller glassets vaeg.

4.1.5.

Instrument til start af frysning

Dette kan vaere en vilkaarlig indretning, som straks, naar den betjenes, starter frysning af proeven, saaledes at analyseproevens temperatur stiger mod frysepunktet. Roeretraaden kan benyttes til dette formaal. En metode er at oege svingningsbredden i 1-2 sekunder, saaledes at roeretraaden rammer proeveglassets vaeg.

4.1.6.

Proeveglas

Proeveglassene (se fig. 1) skal vaere af glas og 50,8 p 0,1 mm lange, 16,0 p 0,1 mm i udvendig diameter og 13,5 p 0,1 mm i indvendig diameter. Vaegtykkelsen i hele glasset maa ikke afvige med mere end 0,1 mm.

Glassene skal have et volumenmaerke 29,8 mm fra den oeverste kant (21 mm over glassets bund) for at angive et proevevolumen paa 2,5 p 0,1 ml.

4.1.7.

Elektricitetsforsyning

Spaendingen skal stabiliseres enten i apparatet eller eksternt, saaledes at svingningen ikke overstiger p 1 % af den nominelle vaerdi, naar forsyningen fra lysnettet svinger med p 6 %.

4.2.

Analysevaegt

4.3.

Maaleflasker med ét maerke, kapacitet 1 000 ml, klasse A.

4.4.

Toerreovn, velventileret, som kan holde en temperatur paa 130 p 1 oC

eller

elektrisk ovn, ventileret, som kan holde en temperatur paa 300 p 25 oC.

4.5.

Ekssikkator

5.

Reagenser

5.1.

Borsilikatglasdestilleret vand, kogt og afkoelet til 20 p 2 oC i en kolbe med kuldioxidabsorptionsroer.

5.2.

Natriumklorid, analysereagenskvalitet, fintmalet, toerret i fem timer ved 300 p 25 oC i en ovn eller alternativt toerret i en ovn ved 130 p 1 oC i mindst 24 timer og afkoelet til stuetemperatur i en effektiv ekssikkator.

5.3.

Fremstilling af standardoploesninger

Et passende kvantum (se tabel 1) toer natriumklorid (5.2) afvejes i en vejeflaske. Det oploeses i destilleret vand (5.1), overfoeres kvantitativt til en 1 000 ml maaleflaske med ét maerke og fortyndes til maerket med vand ved 20 p 2 oC.

Opbevares ved ca. 5 oC i polyetylenflasker med taetsluttende laag med en kapacitet, der ikke overstiger 250 ml, i hoejst to maaneder.>TABELPOSITION>

Inden en standardoploesning benyttes, vendes og drejes flasken forsigtigt flere gange, saa indholdet blandes grundigt. En standardoploesning maa paa intet tidspunkt bevaeges saa kraftigt, at der kommer luft ind.

Der udtages proever af en standardoploesning fra flasken ved overhaeldning af oploesning i et rent, toert baegerglas, dvs. der maa aldrig benyttes pipetter til dette formaal.

Der maa ikke bruges oploesninger fra flasker, der er mindre end kvart fyldte, og hvis de ikke er konserveret med et fungicid (f.eks. tiomersaloploesning 10 g/l), maa de ikke benyttes, hvis de er over to maaneder gamle.

6.

Kalibrering af termistorkryoskop

Kryoskopet skal etableres saaledes, at temperaturen i den omgivende luft ikke afviger mere end 1 oC fra den temperatur, hvor kalibreringen foretages. Kryoskopet maa ikke udsaettes for sollys, traek eller temperaturer over 26-27 oC.

Det maa kontrolleres, at kryoskopet fungerer tilfredsstillende ifoelge brugsanvisningen, og at der taendes for det mindst 12 timer foer kalibreringen. Sondens position, roeretraadens amplitude samt koelevaeskernes temperatur kontrolleres.

Der vaelges to standardoploesninger (se tabel 1), som ligger taet op ad den forventede vaerdi af frysepunktet for de maelkeproever, der skal kontrolleres. Forskellen mellem de to oploesningers frysepunkt maa helst ikke vaere mindre end 0,100 oC.

(I visse udformninger af de kryoskoper, der faas i handelen, er kredsloebet, som er forbundet med termistoren, konstrueret, saa det balancerer ved et bestemt frysepunkt paa instrumentets maaleskala. I saadanne tilfaelde lettes kalibreringen ved brug af en standardoploesning med dette frysepunkt som en af kalibreringsoploesningerne, og fabrikanten skal angive denne vaerdi).

2,5 p 0,1 ml af én standard pipetteres i et rent, toert proeveglas, og kryoskopet betjenes.

NB:

Proeveglassene, der benyttes under kalibreringen, skal vaere af samme type glas og vaskes og skylles med demineraliseret vand paa samme tid som de glas, der benyttes til kontrol af maelkeproeverne. Standardoploesningernes temperaturer skal svare til maelkeproevernes temperaturer.

Kalibreringskontrollerne justeres ifoelge brugsanvisningen, indtil kryoskopmaalingen svarer til standardoploesningens frysepunkt. Dette gentages med den anden standardoploesning, og der fortsaettes med skiftevis den ene og den anden oploesning, indtil flere paa hinanden foelgende maalinger for hver oploesning uden yderligere justering af kalibreringskontrollerne viser den korrekte vaerdi af hver oploesnings frysepunkt. Kryoskopet er nu klar til brug og vil direkte uden nogen korrektion angive maelkeproevens frysepunkt.

7.

Forbehandling af proeven

7.1.

Om noedvendigt opbevares proever ved en temperatur paa 0-5 oC.

7.2.

Synlige fremmedlegemer eller fast maelkefedt fra proeven fjernes eventuelt ved filtrering over i en ren, toer beholder, og proeven blandes forsigtigt. Hvis der benyttes filter, skal det vaere inert over for maelk, og det skal vaere effektivt, naar det benyttes ved laboratorietemperatur.

7.3.

Maelken kan kontrolleres ved opbevaringstemperatur (0-5 oC) eller ved laboratorietemperatur straks foer proevens paabegyndelse. Det er dog noedvendigt, at standardoploesningerne og maelkeproeverne har samme temperatur ved brug.

7.4.

Maelkens titrerbare surhedsgrad bestemmes saa sent som muligt foer frysepunktundersoegelsen. Proever med en surhedsgrad paa over 0,18 g maelkesyre pr. 100 ml maelk kan ikke undersoeges.

7.5.

UHT-behandlet og steriliseret maelk skal henstaa i mindst 20 minutter i en aaben beholder foer undersoegelse.

8.

Metodik

8.1.

Indledende kontrol

Det kontrolleres, at koelevaeskens niveau og temperatur er i overensstemmelse med brugsanvisningen, og om noedvendigt, at termistorsonden er i et tomt proeveglas i proevebroenden. Der taendes for kryoskopet, og det kontrolleres, at koelevaesken omroeres eller cirkuleres korrekt. Naar kryoskopet har vaeret taendt i mindst 12 timer, kontrolleres koelevaeskens temperatur og roeretraadens position og amplitude.

8.2.

Rutinekalibreringskontrol

Foer hver proeveraekke maales en standardnatriumkloridoploesnings frysepunkt (f.eks. en oploesning med frysepunkt paa 0,512 oC), indtil to paa hinanden foelgende bestemmelser ikke afviger med mere end 0,001 oC. Hvis middelvaerdien afviger med mere end 0,002 oC fra standardoploesningens frysepunkt, rekalibreres kryoskopet som beskrevet i punkt 6.

Hvis kryoskopet benyttes loebende, foretages rutinekalibreringskontrollen mindst én gang i timen ved at foelge brugsanvisningen.

8.3.

Bestemmelse af maelkens frysepunkt

Maelkeproeveflasken vendes og drejes forsigtigt flere gange for at blande indholdet. En proeve maa paa intet tidspunkt bevaeges saa kraftigt, at der kommer luft ind.

2,5 p 0,1 ml af maelken pipetteres i et rent, toert proeveglas, og eventuelt overskud fjernes med en pipette. Det kontrolleres, at sonden og roeretraaden er rene og toerre, eventuelt ved omhyggelig aftoerring med en bloed, ren, fnugfri klud nedefra og opefter.

Proeveglasset indsaettes i det kalibrerede kryoskop ifoelge brugsanvisningen. Maelken afkoeles, og frysningen startes ved en af fabrikanten angivet temperatur p 0,1 oC.

(Paa visse automatiske instrumenter kan denne temperatur iagttages paa den digitale display. Paa manuelle instrumenter opnaas den noedvendige praecision ved at sikre, at frysningen starter, naar galvanometret viser den rigtige temperatur).

Hvis frysning af en eller anden grund startes foer eller efter den angivne temperatur, opgives proeven, og der gentages med en anden maelkeportion. Hvis ogsaa den gentagne proeve fryser foer den angivne temperatur, opvarmes endnu en proeveportion til 45 oC og holdes der i fem minutter, saa krystallinsk fedt kan smelte.

Den nedkoeles derefter til proevetemperaturen og undersoeges straks. Maelkens temperatur stiger hurtigt, efter at frysningen starter, til en vaerdi, som forbliver praktisk taget konstant i nogen tid, foer den falder igen. Frysepunktet svarer til den hoejeste temperatur, der er naaet i denne periode, og denne vaerdi registreres.

NB:

Den tid, hvori temperaturen er konstant, og tidsintervallet mellem frysningens start og opnaaelse af den hoejeste temperatur, varierer fra proeve til proeve og vil vaere betydeligt kortere for vand og standardnatriumkloridoploesninger end for maelk. Det er vigtigt, at det er den hoejeste temperatur, der registreres.

Naar maalingen er afsluttet tilfredsstillende, fjernes glasset og skylles med vand, hvorefter termistorsonden og roeretraaden aftoerres med en bloed, ren, fnugfri klud nedefra og opefter, og der foretages en tilsvarende bestemmelse af en anden portion af maelkeproeven.

Hvis forskellen mellem de konstaterede frysepunkter er stoerre end vaerdien af repeterbarheden (0,004 oC), foretages en dobbeltbestemmelse af en anden portion af proeven. Stemmer de to bestemmelser overens ved naer 0,004 oC, registreres vaerdierne og benyttes til beregning af det endelige resultat.

8.4.

Afkoeling af sonde

Efter brug af instrumentet placeres et tomt proeveglas i proevebroenden, og betjeningshovedet nedsaenkes, saa sonden holdes afkoelet. (I visse udformninger af kryoskoper er dette maaske ikke muligt. I saa fald er det vigtigt at kontrollere, at sonden er tilstraekkelig afkoelet, foer der tages maalinger, f.eks. ved at foretage flere forsoegsbestemmelser, indtil der opnaas konsistente maalinger).

9.

Angivelse af resultater

9.1.

Beregning

Hvis kalibreringen bekraeftes efter rutinekalibreringskontrollen, beregnes middelvaerdierne af de acceptable dobbeltfrysepunktsbestemmelser afrundet til tre decimaler.

Hvis summen af to acceptable dobbeltbestemmelser er et ulige tal, afrundes middelvaerdien til det naermeste lige tal som vist i foelgende eksempel:>TABELPOSITION>

9.2.

Noejagighed

9.2.1.

Repeterbarhed (r): 0,004o C.

9.2.2.

Reproducerbarhed (R): 0,006o C.>START GRAFIK>

Detailtegning af termistorkryoskop 4.1 (placering af proeveglas i forhold til termistorkugle og roeretraad)

<?aa1V><?aeRV3><?aeFN32,"SLUT GRAFIK>

II. BESTEMMELSE AF FOSFATASEAKTIVITET

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til bestemmelse af fosfataseaktiviteten i pasteuriseret maelk.

2.

Definition

2.1.

Fosfataseaktiviteten er et maal for maengden af aktiv, alkalisk fosfatase i produktet udtrykt som maengden af fenol i mikrogram, der frigoeres af 1 ml af den pasteuriserede maelk under betingelser, der er naevnt i metoden.

2.2.

Maelk, hvis fosfataseaktivitet er under 4 ìg/ml, anses for at vaere fosfatasenegativ.

3.

Princip

Fosfataseaktiviteten bestemmes paa grundlag af maengden af fenol, der frigoeres fra det dinatriumfenylfosfat, som tilsaettes proeven. Den frigjorte fenol reagerer med dibromkinonklorimid og danner dibromindofenol (blaalig), som maales kolorimetrisk ved 610 nm. Der foretages en samenligning med en proeve, hvor fosfataseenzymet er oedelagt.

4.

Reagenser

4.1.

Bariumborathydroxid-buffer

4.1.1.

50,0 g bariumhydroxid (Ba(OH)2 78H2O) oploeses i vand til hoejst 1 000 ml.

4.1.2.

22,0 g borsyre (H3BO3) oploeses i vand til hoejst 1 000 ml.

4.1.3.

500 ml af hver oploesning opvarmes til 50 oC, oploesningerne blandes, omroeres, afkoeles hurtigt til ca. 20 oC, og om noedvendigt justeres pH-vaerdien til 10,6 p 0,1 ved tilsaetning af oploesning 4.1.1 eller 4.1.2. Oploesningen filtreres. Oploesningen opbevares i en beholder med taetsluttende laag.

4.1.4.

Oploesningen fortyndes inden brug med en tilsvarende maengde vand.

4.2.

Farveudviklingsbuffer

6,0 g natriummetaborat (NaBO2) eller 12,6 g NaBO2 74H2O samt 20,0 g natriumklorid (NaCl) oploeses i vand til hoejst 1 000 ml.

4.3.

Farvefortyndingsbuffer

10 ml af farveudviklings-bufferen (4.2) fortyndes med vand til 100 ml.

4.4.

Buffersubstrat

0,1 g fenolfrit dinatriumfenylfosfatdehydrat oploeses i 100 ml buffer (4.1.3) eller 0,5 g dinatriumfenylfosfat oploeses i 4,5 ml farveudviklings-buffer (4.2), to draaber BKK-oploesning (4.6) tilsaettes, og oploesningen henstaar ved stuetemperatur i 30 minutter. Den saaledes dannede farve ekstraheres med 2,5 ml butan-1-ol og henstaar, indtil butan-1-ol udskilles. Butan-1-ol fjernes og kasseres. Denne ekstraktion gentages eventuelt.

Oploesningen kan opbevares i koeleskab i et par doegn. Farven udvikles og reekstraheres foer brug. Buffer-substratet fremstilles umiddelbart foer brug ved fortynding af 1 ml af denne oploesning til 100 ml med bariumborathydroxid-buffer (4.1.3).

4.5.

Zink-kobber faeldningsmiddel

3.0 g zinksulfat (ZnSO4,7H2O) og 0,6 g kobber (II) sulfat (CuSO4,5H2O) oploeses i vand til 100 ml.

4.6.

2,6-dibromkinonklorimidoploesning (BKK-oploesning)

40 p 1 mg 2,6-dibromkinonklorimidoploesning (BKK) (C6H2Br2ClNO6) oploeses i 10 ml 96 % (v/v) ethanol.

Oploesningen opbevares i en brun flaske i koeleskab. Den kasseres, hvis den misfarves eller er over en maaned gammel.

4.7.

Kobber (II) sulfatoploesning

0,05 g kobber (II) sulfat (CuSO4 75H2O) oploeses i vand til 100 ml.

4.8.

Standardfenoloploesninger

4.8.1.

200 mg p 2 mg ren, vandfri fenol vejes og overfoeres til en 100 ml maaleflaske; der tilsaettes vand, blandes og fyldes op til maerket. Denne stamoploesning forbliver stabil i flere maaneder, naar den opbevares i koeleskab.

4.8.2.

10 ml stamoploesning fortyndes til 100 ml med vand og blandes. 1 ml indeholder 200ìg fenol.

5.

Apparatur og glasvarer

NB:

a) Alle glasvarer, propper og proeveudtagningsredskaber skal rengoeres omhyggeligt. Det anbefales at skylle dem med nykogt, destilleret vand eller at dampe dem.

b) Visse typer plastikpropper kan give fenolforurening, og saadanne maa ikke benyttes.

Saedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed:

5.1.

Analysevaegt

5.2.

Vandbad, som kan holdes paa 37 p 1 oC.

5.3.

Spektrofotometer, egnet til maalinger ved en boelgelaengde paa 610 nm.

5.4.

Reagensglas, 16 eller 18 mm × 150 mm, helst gradueret ved 5 og 10 ml.

5.5.

Pipetter

5.6.

Glastragte i passende stoerrelse, f.eks. med 5 cm diameter.

5.7.

Foldefiltre paa mindst 9 cm i diameter til middel filtreringshastighed.

5.8.

Maalekolber til fremstilling af standardoploesninger.

6.

Metodik

NB:

a) Man skal undgaa sollys under bestemmelsen.

b) Forurening med spor af spyt eller sved kan give falske positive resultater og skal undgaas. I den forbindelse skal man vaere saerlig opmaerksom paa pipetteringer.

6.1.

Forbehandling af proeven

6.1.1.

Analysen foretages umiddelbart efter proeveudtagning. Ellers opbevares proeven i koeleskab, dog hoejst i to doegn.

6.2.

Analyseproeve

1 ml af proeven pipetteres over i hvert af to reagensglas (5.4). Et glas benyttes til kontrol- eller blindproeve.

6.3.

Bestemmelse

6.3.1.

Blindproeven opvarmes i to minutter i kogende vand. Reagensglasset og baegerglasset med kogende vand tildaekkes med aluminiumsfolie for at sikre, at hele glasset opvarmes. Der afkoeles hurtigt til stuetemperatur.

6.3.2.

Blindproeven og proeven behandles paa samme maade i resten af processen. 10 ml buffersubstrat (4.4) tilsaettes og der blandes.

6.3.3.

Proeverne inkuberes straks i vandbadet (5.2) i 60 minutter, idet indholdet af og til blandes (mindst fire gange).

6.3.4.

Proeverne opvarmes i kogende vand i to minutter paa samme maade som anfoert under 6.3.1. De afkoeles hurtigt til stuetemperatur.

6.3.5.

1 ml zink-kobber faeldningsmiddel (4.5) tilsaettes til hvert glas, og der blandes grundigt.

6.3.6.

Proeverne filtreres gennem toert filtrerpapir. De foerste 2 ml kasseres. Eventuelt filtreres igen, indtil filtratet er helt klart, og der opsamles 5 ml i et reagensglas.

6.3.7.

5 ml farveudviklingsbuffer (4.2) tilsaettes.

6.3.8.

0,1 ml BKK-oploesning (4.6) tilsaettes, der blandes, og man lader farven udvikle sig i 30 minutter ved stuetemperatur.

6.3.9

Absorbansen i forhold til kontrol- eller blindproeven maales i spektrofotometret (5.3) ved en boelgelaengde paa 610 nm.

6.3.10.

Bestemmelsen gentages med en passende fortynding af proeven, hvis absorbansen som maalt under 6.3.9 overstiger absorbansen af standardoploesningen, som indeholder 20 ìg fenol pr. glas som maalt i 6.4.4. Denne fortynding tilberedes ved blanding af et volumen af proeven med et passende volumen af en del af den samme proeve forsigtigt opvarmet til kogepunktet for at inaktivere fosfatasen.

6.4.

Udarbejdelse af kalibreringskurven

6.4.1.

Der laves en passende skala af fortyndede standarder med udgangspunkt i standardfenol (4.8.2) indeholdende 0 (kontrol- eller blindproeve), 2, 5, 10 og 20 ìg fenol pr. milliliter, og der pipetteres henholdsvis 1 ml vand og 1 ml af de fire standardfenoloploesninger over i hvert af de fem reagensglas.

6.4.2.

Til hvert reagensglas tilsaettes 1 ml kobber(II)sulfatoploesning (4,7), 5 ml farvefortyndingsbuffer (4.3), 3 ml vand og 0,1 ml BKK-oploesning (4.6). Der blandes.

6.4.3.

Man lader farven udvikle sig i 30 minutter ved stuetemperatur.

6.4.4.

Absorbansen maales i forhold til kontrol- eller blindproeven i spektrofotometeret ved en boelgelaengde paa 610 nm.

6.4.5.

Paa grundlag af absorbansvaerdierne (6.4.4), som er opnaaet for hver maengde tilsat fenol (6.4.1), beregnes regressionslinjen efter de mindste kvadraters metode.

7.

Angivelse af resultater

7.1.

Beregning og formel

7.1.1.

Paa grundlag af absorbansmaalingen (6.3.9) beregnes maengden af fenol ved hjaelp af den opnaaede regressionslinje (6.4.5).

7.1.2.

Fosfataseaktiviteten beregnes som mikrogram fenol pr. milliliter af den pasteuriserede maelk ved foelgende formel:

Fosfataseaktivitet = 2,4 × A × D

hvor

A

er maengden af fenol i mikrogram opnaaet under 7.1.1

D

er fortyndingsfaktoren for fortyndingen i henhold til 6.3.10 (hvor der ikke sker fortynding, er D = 1).

Faktoren 2,4 er fortyndningsfaktoren (¹/12 af 1 ml proeve) - se 6.2 i forbindelse med 6.3.2, 6.3.5 og 6.3.6.

7.2.

Noejagtighed

7.2.1.

Repeterbarhed (r): 2ìg fenol/ml.

7.2.2.

Reproducerbarhed (R): 3 ìg (foreloebig) fenol/ml.

7.2.3.

Hvis en fortynding anvendes ifoelge 6.3.10, henviser den i 7.2.1 og 7.2.2 naevnte graense til de resultater, der er opnaaet med den fortyndede proeve.

III. BESTEMMELSE AF PEROXIDASEAKTIVITET

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til bestemmelse af tilstedevaerelse eller fravaer af peroxidaseenzym i maelk til kontrol med pasteuriseringen.

2.

Definition

Peroxidase-positiv reaktion

Hvis maelken er korrekt pasteuriseret, farves den blaa senest 30 sekunder efter iblandingen.

Peroxidase-negativ reaktion

Der sker ikke nogen blaafarvning inden for 30 sekunder efter blandingen.

3.

Princip

Peroxidaseenzymet nedbryder brintoverilte. Den frigjorte atomare ilt oxiderer det farveloese 1,4-fenylendiamin til det violette indofenol (Storchs proeve). Farveintensiteten er proportional med enzymets koncentration.

4.

Reagenser

4.1.

Oploesning af 1,4-fenylendiamin

2 g 1,4-fenylendiamin (C6H8N2) oploeses i varmt vand (50 oC) til et volumen paa 100 ml. Oploesningen opbevares koeligt og moerkt i en moerkebrun flaske med glasprop. En 1,4-fenylendiaminoploesning danner bundfald i loebet af et til to doegn. Den skal saa kasseres.

4.2.

Brintoverilteoploesning

9 ml brintoverilte 30 % fortyndes i vand til et volumen paa 100 ml. 1 ml koncentreret svovlsyre pr. liter oploesning tilsaettes til stabilisering.

Brintoverilteoploesningen er stabil i en maaned, hvis den opbevares koeligt og moerkt i en flaske med glasprop, saa den ikke kommer i kontakt med organiske forbindelser.

5.

Metodik

5.1.

5 ml af maelkeproeven overfoeres til et rent reagensglas med passende lukning.

5.2.

5 ml 1,4-fenylendiaminoploesning (4.1) tilsaettes.

5.3.

To draaber brintoverilteoploesning (4.2) tilsaettes.

5.4.

Man maa holde oeje med farvereaktionen inden for 30 sekunder efter blanding. Hvis den blaa farve fremkommer over 30 sekunder efter tilsaetning af reagenserne, er reaktionen uspecifik.

IV. TAELLING AF MIKROORGANISMER - KIMTAL VED 30 oC

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til taelling af mikroorganismer ved hjaelp af en kolonitaellingsteknik ved 30 oC.

Denne metode er anvendelig for raa og pasteuriseret maelk samt for UHT-behandlet og steriliseret maelk, der er forinkubereret ved 30 oC i 15 doegn.

2.

Definition

Ved »mikroorganismer« forstaas organismer, som danner taellelige kolonier, naar de inkuberes aerobt under de beskrevne betingelser.

3.

Princip

En defineret maengde af maelkeproeven blandes med naeringssubstratet i petriskaale og inkuberes ved 30 oC i 72 timer. Kolonierne taelles, og antallet af mikroorganismer pr. 1 ml raa eller pasteuriseret maelk eller pr. 0,1 ml forinkubereret UHT-behandlet eller steriliseret maelk beregnes.

4.

Apparatur og glasvarer

Saedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed:

4.1.

Apparater

4.1.1.

Varmluftsovn, der kan fungere ved 170-175 oC.

4.1.2.

Autoklave, der kan fungere ved 121 p 1 oC.

4.1.3.

Varmeskab, der overalt kan holde en temperatur paa 30 p 1 oC.

4.1.4.

pH-meter med en noejagtighed paa p 0,1 pH-enhed med temperaturkompensation.

4.1.5.

Vandbad, der kan holde en temperatur paa 45 p 1 oC.

4.1.6.

Lup, 2-4 gange forstoerrelse.

4.1.7.

Lup, 8-10 gange forstoerrelse.

4.1.8.

Taelleinstrument

4.1.9.

Mixer, der kan blande 1 ml maelkeproeve eller tifoldsfortynding med 9 ml fortyndingsvaeske, og som fungerer efter princippet for excentrisk rotation af indholdet i reagensglasset.

4.2.

Glasvarer

4.2.1.

Reagensglas med passende lukkeanordninger og tilstraekkelig kapacitet til at indeholde 10 ml af den primaere fortynding eller af yderligere tifoldsfortyndinger, idet der samtidig skal vaere plads nok til at blande.

4.2.2.

Flasker med en kapacitet paa 150-250 ml eller glas med en kapacitet paa ca. 20 ml til opbevaring af naeringssubstratet.

4.2.3.

Pipetter (med vatprop) af glas eller sterilt, syntetisk materiale med ubeskadiget spids og en nominel kapacitet paa 1 ml samt en aabning med en diameter paa 1,75-3 mm.

4.2.4.

Petriskaale af klart, ufarvet glas eller sterilt, syntetisk materiale. Den nederste skaal med en indvendig diameter paa ca. 90-100 mm. Den indvendige dybde skal vaere mindst 10 mm. Bunden skal vaere uden ujaevnheder, som forstyrrer taellingen af kolonier.

4.2.5.

Sterilisation af glasvarer

Glasvarer steriliseres ved en af foelgende metoder:

a) henstand ved 170-175 oC i mindst en time i varmluftsovn (4.1.1)

b) henstand ved 121 p 1 oC i mindst 20 minutter i autoklave (4.1.2).

Det skal sikres, at der sker tilstraekkelig gennemtraengning af damp i autoklaven; hvis udstyret f.eks. steriliseres i beholdere, skal disse ikke lukkes taet, og flasker skal have loestsiddende laag.

Glasvarer, som steriliseres i autoklaven, toerres ved dampventilation.

Pipetter steriliseres i en varmluftsovn (4.1.1).

5.

Dyrkningssubstrat - Milk plate count agar

5.1.

Sammensaetning

Gaerekstrakt

2,5 g

Trypton

5,0 g

Glukose D(+) eller dextrose

1,0 g

Skummetmaelkspulver

1,0 g

Agar

10-15 g (afhaengigt af den anvendte agars gelatineringsevne)

Vand

1 000 ml.

Skummetmaelkspulveret skal vaere frit for haemmende stoffer. Dette skal sikres ved sammenlignende undersoegelser, hvor der anvendes skummetmaelkspulver, som ikke indeholder haemmende stoffer.

Fremstilling:

Bestanddelene opslaemmes og oploeses i vand i foelgende raekkefoelge: gaerekstrakt, trypton, glukose og endelig skummetmaelkspulver. Opvarmning af opslaemningen fremmer denne proces. Agaren tilsaettes, og der opvarmes til kogepunktet under stadig omroering, eller i stroemmende vanddamp i ca. 30 minutter indtil agaren er fuldstaendig oploest.

Eventuelt filtreres gennem filtrerpapir.

pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter sterilisation er 6,9 p 0,1 ved 25 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af natriumhydroxid eller saltsyre.

5.2.

Fordeling, sterilisation og opbevaring af naeringssubstrat

Substratet (5.1) fordeles i portioner af 100-150 ml i flasker eller 12-15 ml i glas (4.2.2). Kolberne og glassene tilproppes.

Der steriliseres i autoklave (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter.

Substratets pH kontrolleres.

Hvis substratet ikke skal bruges med det samme, opbevares det moerkt ved en temperatur paa 1-5 oC i hoejst en maaned efter fremstillingen.

5.3.

Dehydreret naeringssubstrat - kommercielt tilgaengeligt

Naeringssubstratet (5.1) kan fremstilles af dehydreret substrat. Brugsanvisningen foelges, men skummetmaelkspulveret tilsaettes inden oploesning, hvis det ikke er en bestanddel.

pH-vaerdien justeres til 6,9 p 0,1 ved 25 oC som beskrevet i 5.1, og substratet fordeles, steriliseres og opbevares som beskrevet i 5.2.

6.

Fortyndingsvaeske

6.1

Pepton-/saltoploesning:

Sammensaetning:

Pepton

1,0 g

Natriumklorid (NaCl)

8,5 g

Vand

1 000 ml.

Fremstilling

Bestanddelene oploeses i vand, og hvis noedvendigt foretages opvarmning.

pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter sterilisation er 7,0 p 0,1 ved 25 p 0,1 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af natriumhydroxid eller saltsyre.

6.2.

Fordeling, sterilisation og opbevaring at fortyndingsvaeske

Fortyndingsvaesken (6.1) fordeles i reagensglas (4.2.1) i portioner, saaledes at hvert glas efter sterilisation indeholder 9,0 p 0,2 ml foryndingsvaeske. Glassene tilproppes.

Der steriliseres i autoklaven (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter. Fortyndingsvaeskens pH-vaerdi kontrolleres.

Hvis fortyndingsvaesken ikke skal bruges med det samme, opbevares den moerkt ved en temperatur paa 1-5 oC i hoejst en maaned efter fremstillingen.

6.3.

Dehydreret fortyndingsvaeske - kommercielt tilgaengelig

Fortyndingsvaesken (6.1) kan fremstilles af tabletter eller pulvere, som faas i dehydreret form. Brugsanvisningen foelges. pH-vaerdien justeres som beskrevet i 6.1 og fortyndingsvaeskerne fordeles, steriliseres og opbevares som beskrevet i 6.2.

7.

Metodik

7.1.

Smeltning af substratet

Inden den mikrobiologiske undersoegelse smeltes den noedvendige maengde substrat hurtigt i vandbad (4.1.5) og substratet tempereres til 45 p 1 oC i vandbad (4.1.5).

7.2.

Forbehandling af maelkeproeven

Maelkeproeven blandes grundigt, saaledes at mirkoorganismerne er fordelt saa jaevnt som muligt, ved at bunden paa maelkeproevebeholderen hurtigt vendes i vejret 25 gange. Undgaa skumdannelse eller lad skummet laegge sig. Intervallet mellem blanding og udtagning af analyseproever maa ikke vaere over 3 minutter.

7.3.

Fremstilling af primaerfortyndingen (10 ;) (raa og pasteuriseret maelk)

Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven (7.2) med raa maelk eller pasteuriseret maelk til 9 ml fortyndingsvaeske (6.1). Man maa undgaa kontakt mellem pipetten og fortyndingsvaesken. Fortyndingsvaeskens temperatur skal vaere omtrent den samme som maelkeproevens. Denne primaerfortynding blandes omhyggeligt i mixeren (4.1.9) i 5-10 sekunder.

Der opnaas saaledes en primaerfortynding paa 10 ;.

7.4.

Fremstilling af yderligere tifoldsfortyndinger (raa og pasteuriseret maelk)

Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af primaerfortyndingen (7.3) til 9 ml fortyndingsvaeske (6.1) efter angivelserne i punkt 7.3.

Der opnaas saaledes en fortynding paa 10 $.

Dette gentages for at opnaa yderligere tifoldsfortyndinger, indtil det rette antal mikroorganismer forventes opnaaet (8.1.1).

7.5.

Podning i petriskaalene

7.5.1.

Raa maelk: Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven og/eller en passende tifoldsfortynding til en skaal (4.2.4). Der skal undersoeges mindst to fortyndinger. Der tilberedes en skaal med hver valgt fortynding (8.1.1).

7.5.2.

Pasteuriseret maelk: Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven og/eller en passende tifoldsfortynding til en skaal (4.2.4). Der skal undersoeges mindst to fortyndinger. Der tilberedes to skaale af hver valgt fortynding (8.1.1).

7.5.3.

UHT-behandlet og steriliseret maelk (undersoegt efter inkubation i 15 dage ved 30 oC - Direktiv 85/397/EOEF, bilag A, kapitel VII, punkt 5):

Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 0,1 ml af maelkeproeven (7.2) til en skaal (4.2.4). Der tilberedes to skaale.

7.6.

Ophaeldning

Ca. 15-18 ml af substratet (7.1) ophaeldes i hver podet skaal.

Straks efter ophaeldningen blandes der ved drejning af petriskaalen tilstraekkeligt til at opnaa jaevnt dispergerende kolonier efter inkubation.

Der maa hoejst gaa 15 minutter mellem afslutningen af fremstillingen af maelkeproeven og, alt efter maelketype, blandingen af analyseproeven eller fortyndingen med substratet.

Man lader substratet stoerkne paa en ren, koelig, vandret flade.

7.7.

Inkubation af petriskaale

Skaalene stilles i varmeskabet (4.1.3). De inkuberes med laagene nedad. Der maa ikke stilles mere end seks oven paa hinanden. Stakkene af skaale maa ikke roere hinanden eller varmeskabets sider.

Der inkuberes ved 30 p 1 oC i 72 p 2 timer.

7.8.

Taelling af kolonier

Kolonierne i de petriskaale, der indeholder hoejst 300 kolonier, taelles.

Skaalene undersoeges i daempet belysning. Der kan for at lette taellingen benyttes en egnet lup (4.1.6) og/eller et taelleinstrument (4.1.8). Bundfaldspartikler i skaalene maa ikke forveksles med enkeltkolonier. Tvivlsobjekter undersoeges omhyggeligt med en kraftigere lup (4.1.7), naar det er noedvendigt for at skelne kolonier fra fremmede stoffer.

Spredningskolonier betragtes som enkeltkolonier. Hvis mindre end en fjerdedel af skaalen er overgroet med spredningskolonier, taelles kolonierne paa den del af skaalen, som ikke er beroert, og det tilsvarende tal beregnes for hele skaalen. Hvis mere end en fjerdedel af skaalen er overgroet med spredningskolonier, kasseres skaalen.

8.

Beregning og angivelse af resultater

8.1.

Raa og pasteuriseret maelk

8.1.1.

Der bruges tal fra alle skaale, som indeholder 10-300 kolonier (se 8.1.3 og 8.1.4).

8.1.2.

Antallet af mikroorganismer pr. 1 ml raa eller pasteuriseret maelk angives ved formlen:

(n1 + 0,1 n2) d

Ó C

(n1 + 0,1 n2) d

hvor

Ó C

er summen af kolonier talt som i 8.1.1

(n1 + 0,1 n2) d

svarer til volumen af den talte proeve, hvor:

n1

er antallet af skaale, der er talt i foerste fortynding

n2

er antallet af skaale, der er talt i anden fortynding

d

er fortyndingsfaktoren, som laa til grund for de foerste taellinger.

Tallet afrundes til to betydende cifre. Naar cifret, der skal afrundes, er 5, afrundes det, saaledes at tallet umiddelbart til venstre er lige.

Eksempel (pasteuriseret maelk):

Fortynding 10 2: 278 og 290 kolonier

Fortynding 10 3: 33 og 28 kolonier

Antal/ml = 278 + 290 + 33 + 28

Antal/ml

=

278 + 290 +33 + 28

(2 + 0,1 × 2) 10 2

Antal/ml = 0,022

=

629

0,022

=

28 590

=

29 000

=

2,9 × 10%.

8.1.3.

Hvis der kun er tal paa under 10, registreres antallet af mikroorganismer pr. ml som »mindre end 10 × d pr. ml«, hvor »d« er det reciprokke tal til den laveste fortyndingsfaktor.

8.1.4.

Hvis der kun er tal paa over 300, men taelling er mulig, beregnes et skoennet tal paa grundlag af skaale med de tal, der kommer naermest paa 300 kolonier, og dette ganges med det reciprokke tal til fortyndingsfaktoren. Resultatet registreres som »skoennet antal mikroorganismer pr. ml«.

8.2.

UHT-behandlet og steriliseret maelk

Kimtal paa over 10 kolonier pr. 0,1 ml anses for ikke laengere at opfylde kravene i direktiv 85/397/EOEF.

9.

Noejagtighed

Der foreligger endnu ikke resultater af internationalt godkendte sammenlignende undersoegelser.

V. TAELLING AF MIKROORGANISMER - KIMTAL VED 21 oC

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til optaelling af mikroorganismer ved en kolonitaellingsteknik ved 21 oC paa pasteuriseret maelk efter inkubation af maelken ved 6 oC i fem dage for at bestemme graden af kontaminering af den pasteuriserede maelk med psykrotrofe mikroorganismer, der kan formere sig i maelk ved 6 oC.

2.

Definition

Ved »mikroorganismer« forstaas organismer, der danner taellelige kolonier, naar de inkuberes aerobt under de beskrevne betingelser.

3.

Princip

Den pasteuriserede maelk inkuberes ved 6 oC i fem doegn. En defineret maengde af maelkeproeven blandes med naeringssubstratet i petriskaale og inkuberes ved 21 oC i 25 timer. Kolonierne optaelles, og antallet af mikroorganismer pr. 1 ml pasteuriseret maelk beregnes.

4.

Apparatur og glasvarer

Saedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed:

4.1.

Apparatur

4.1.1.

Varmluftsovn, der kan fungere ved 170-175 oC.

4.1.2.

Autoklave, der kan fungere ved 121 p 1 oC.

4.1.3.

Varmeskab, der overalt kan holde en temperatur paa

a) 6 p 0,2 oC

b) 21 p 1 oC.

4.1.4.

pH-meter med en noejagtighed paa p 0,1 pH-enhed, med temperaturkompensation.

4.1.5.

Vandbad, der kan holde en temperatur paa 45 p 1 oC.

4.1.6.

Lup, 2-4 gange forstoerrelse.

4.1.7.

Lup, 8-10 gange forstoerrelse.

4.1.8.

Taelleinstrument.

4.1.9.

Mixer, der kan blande 1 ml af maelkeproeven eller tifoldsfortyndingen med 9 ml fortyndingsvaeske og fungere efter princippet for ekscentrisk rotation af indholdet i reagensglasset.

4.2.

Glasvarer

4.2.1.

Reagensglas med passende lukkeanordninger og tilstraekkelig kapacitet til at indeholde 10 ml af primaerfortyndingen eller yderligere tifoldsfortyndinger, idet der samtidig skal vaere plads nok til blanding.

4.2.2.

Flasker med en kapacitet paa 150-200 ml eller glas med en kapacitet paa ca. 20 ml til naeringssubstratet.

4.2.3.

Pipetter (med vatprop) af glas eller sterilt, syntetisk materiale med ubeskadiget spids og en nominel kapacitet paa 1 ml samt en aabning med en diameter paa 1,75-3 mm.

4.2.4.

Petriskaale af klart, ufarvet glas eller sterilt, syntetisk materiale, hvor den nederste skaal har en indvendig diameter paa ca. 90-100 mm. Den indvendige dybde skal vaere mindst 10 mm. Bunden skal vaere fri for ujaevnheder, som forstyrrer taellingen af kolonier.

4.2.5.

Sterilisation af glasvarer

Glasvarer steriliseres ved en af foelgende metoder:

a) henstand ved 170-175 oC i mindst en time i varmluftsovn (4.1.1)

b) henstand ved 121 p 1 oC i mindst 20 minutter i autoklave (4.1.2).

Det skal sikres, at der sker tilstraekkelig gennemtraengning af damp i autoklaven; hvis udstyret f.eks. steriliseres i beholdere, skal disse ikke lukkes taet, og kolber skal have loestsiddende laag.

Glasvarer, der er steriliseret i autoklaven, toerres ved dampventilation.

Pipetter steriliseres i varmluftsovn (4.1.1).

5.

Dyrkningssubstrat - Milk plate count agar

5.1.

Sammensaetning

Gaerekstrakt

2,5 g

Trypton

5,0 g

Glukose D(+) eller dextrose

1,0 g

Skummetmaelkspulver

1,0 g

Agar

10-15 g, afhaengigt af den anvendte agars gelateringsevne

Vand

1 000 ml.

Skummetmaelkspulveret skal vaere frit for haemmende stoffer. Dette skal verificeres ved sammenlignende undersoegelser, hvor der anvendes skummetmaelkspulver, som ikke indeholder haemmende stoffer.

Fremstilling

Bestanddele opslaemmes og oploeses i vandet i foelgende raekkefoelge: gaerekstrakt, trypton, glukose og endelig skummetmaelkspulver i vandet. Opvarmning af opslaemningen fremmer denne proces. Agaren tilsaettes, og der opvarmes til kogepunktet under stadig omroering, eller i stroemmende vanddamp i ca. 30 minutter indtil agaren er fuldstaendig oploest.

Eventuelt filtreres gennem filtrerpapir.

pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter sterilisation er 6,9 p 0,1 ved 25 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af natriumhydroxid eller saltsyre.

5.2.

Fordeling, sterilisation og opbevaring af naeringssubstrat

Substratet (5.1) fordeles i portioner paa 100-150 ml i flasker eller 12-15 ml i glas (4.2.2). Kolberne og glassene tilproppes.

Der steriliseres i autoklaven (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter.

Substratets pH kontrolleres.

Hvis substratet ikke skal bruges med det samme, opbevares det moerkt ved en temperatur paa 1-5 oC i hoejst en maaned efter fremstillingen.

5.3.

Dehydreret naeringssubstrat - kommercielt tilgaengeligt

Naeringssubstratet (5.1) kan fremstilles af dehydreret substrat. Brugsanvisningen foelges, men skummetmaelkspulveret tilsaettes inden oploesning, hvis det ikke er en bestanddel.

pH-vaerdien justeres til 6,9 p 0,1 ved 25 oC som beskrevet i 5.1 og naeringssubstratet fordeles, steriliseres og opbevares som beskrevet i 5.2.

6.

Fortyndingsvaeske

6.1.

Pepton-/saltoploesning

Sammensaetning

Pepton

1,0 g

Natriumklorid (NaCl)

8,5 g

Vand

1 000 ml

Fremstilling

Bestanddele oploeses i vand, og hvis noedvendigt foretages opvarmning.

pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter sterilisation er 7,0 p 0,1 ved 25 p 1 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af natriumhydroxid eller saltsyre.

6.2.

Ophaeldning, sterilisation og opbevaring af fortyndingsvaesker

Fortyndingsvaesken (6.1) fordeles i reagensglas (4.2.1) i en saadan maengde, at hvert glas efter sterilisation indeholder 9,0 p 0,2 ml fortyndingsvaeske. Glassene tilproppes.

Der steriliseres i autoklaven (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter.

Fortyndingsvaeskens pH-vaerdi kontrolleres.

Hvis fortyndingsvaesken ikke skal bruges med det samme, opbevares den moerkt ved en temperatur paa 1-5 oC i hoejst en maaned efter fremstillingen.

6.3.

Dehydreret fortyndingsvaeske - kommercielt tilgaengelig

Fortyndingsvaesken (6.1) kan fremstilles af tabletter eller pulvere, som faas i dehydreret form. Brugsanvisningen foelges. pH-vaerdien justeres som beskrevet i 6.1, og fortyndingsvaeskerne fordeles, steriliseres og opbevares som beskrevet i 6.2.

7.

Metodik

7.1.

Smeltning af substratet

Inden den mikrobiologiske undersoegelse smeltes den noedvendige maengde substrat hurtigt. Substratet tempereres til 45 p 1 oC i vandbad (4.1.5).

7.2.

Forbehandling af maelkeproeven

7.2.1.

Pasteuriseret maelk inkuberes i uaabnet emballage eller, hvis dette ikke kan lade sig goere, inkuberes en repraesentativ proeve paa mindst 100 ml i 120 p 2 timer ved 6 p 0,5 oC i varmeskab (4.1.3.a)).

7.2.2.

Efter inkubationen blandes maelkeproeven grundigt, saaledes at mirkoorganismerne er fordelt saa jaevnt som muligt, ved at bunden paa maelkeproevebeholderen vendes hurtigt i vejret 25 gange. Undgaa skumdannelse, eller lad skummet laegge sig. Intervallet mellem blanding og udtagning af analyseproeven maa ikke vaere paa over tre minutter.

7.3.

Fremstilling af primaerfortyndingen (10 ;)

Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven (7.2.2) til 9 ml fortyndingsvaeske (6.1). Kontakt mellem pipetten og fortyndingsvaesken undgaas. Fortyndingsvaeskens temperatur skal vaere omtrent den samme som maelkeproevens. Denne primaerfortynding blandes omhyggeligt i mixeren (4.1.9) i 5-10 sekunder.

Der opnaas saaledes en primaerfortynding paa 10 ;.

7.4.

Fremstilling af yderligere tifoldsfortyndinger

Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af primaerfortyndingen (7.3) til 9 ml fortyndingsvaeske (6.1) efter angivelse i punkt 7.3.

Der opnaas saaledes en fortynding paa 10 $.

Dette gentages for at opnaa yderligere tifoldsfortyndinger, indtil det rette antal mikroorganismer kan forventes opnaaet (8.1).

7.5.

Podning i petriskaalene

Med en steril pipette (4.2.3) overfoeres 1 ml af proeven og/eller en passende tifoldsfortynding til en skaal (4.2.4). Der skal undersoeges mindst to fortyndinger. Der laves en skaal med hver valgt fortynding (8.1).

7.6.

Ophaeldning

Ca. 15-18 ml af substratet (7.1) ophaeldes i hver podet skaal.

Straks efter ophaeldningen blandes ved drejning af petriskaalen tilstraekkeligt til at opnaa jaevnt dispergerede kolonier efter inkubation.

Der maa hoejst gaa 15 minutter mellem afslutningen af fremstillingen af maelkeproeven og blandingen af fortyndingen med substratet.

Man lader det stoerkne paa en ren, koelig, vandret flade.

7.7.

Inkubation af petriskaale

Skaalene stilles i varmeskabet (4.1.3.b)). Skaalene inkuberes med laagene nedad. Der maa ikke stilles mere end seks skaale oven paa hinanden. Stakkene af skaale maa ikke roere hinanden eller varmeskabets sider.

Der inkuberes ved 21 p 1 oC i 25 timer.

7.8.

Taelling af kolonier

Kolonierne i de petriskaale, der indeholder hoejst 300 kolonier, taelles.

Skaalene undersoeges i daempet belysning. Der kan for at lette taellingen benyttes en egnet lup (4.1.6) og/eller et taelleinstrument (4.1.8). Bundfaldspartikler i skaalene maa ikke forveksles med enkeltkolonier. Tvivlsobjekter undersoeges omhyggeligt med en staerkere lup (4.1.7), naar det er noedvendigt for at skelne kolonier fra fremmede stoffer.

Spredningskolonier betragtes som enkeltkolonier. Hvis mindre end en fjerdedel af skaalen er overgroet med spredningskolonier, taelles kolonierne paa den del af skaalen, som ikke er beroert, og det tilsvarende tal beregnes for hele skaalen. Hvis mere end en fjerdedel af skaalen er overgroet med spredningskolonier, kasseres skaalen.

8.

Beregning og angivelse af resultater

8.1.

Der bruges tal fra alle skaale, som indeholder 10-300 kolonier (se 8.3 og 8.4).

8.2.

Antallet af mikroorganismer pr. 1 ml pasteuriseret maelk angives ved formlen:

(n1 + 0,1 n2) d

Ó C

(n1 + 0,1 n2) d

hvor

Ó C

er summen af kolonier optalt som i 8.1.1

(n1 + 0,1 n2) d

svarer til volumen af den talte proeve, hvor:

n1

er antallet af skaale, der er talt i foerste fortynding

n2

er antallet af skaale, der er talt i anden fortynding,

d

er fortyndingsfaktoren, som laa til grund for de foerste taellinger.

Tallet afrundes til to signifikante cifre. Naar cifret, der skal afrundes, er 5, afrundes det, saaledes at tallet umiddelbart til venstre er lige.

Eksempel

Fortynding 10 2: 278 og 290 kolonier

Fortynding 10 3: 33 og 28 kolonier

Antal/ml = 278 + 290 + 33 + 28

Antal/ml

=

278 + 290 +33 + 28

(2 + 0,1 × 2) 10 2

Antal/ml = 0,022

=

629

0,022

=

28 590

=

29 000

=

2,9 × 10%.

8.3.

Hvis der kun er tal paa under 10, registreres antallet af mikroorganismer pr. ml som »mindre end

10 × d pr. ml«, hvor »d« er det reciprokke tal til den laveste fortyndingsfaktor.

8.4.

Hvis der kun er tal paa over 300, men taelling er mulig, beregnes et skoennet tal paa grundlag af skaale med de tal, der kommer naermest paa 300 kolonier, og dette ganges med det reciprokke tal til fortyndingsfaktoren. Resultatet registreres som »skoennet antal mikroorganismer pr. ml«.

9.

Noejagtighed

Der foreligger ingen resultater af internationalt godkendte sammenlignende undersoegelser.

VI. TAELLING AF COLIFORME BAKTERIER VED 30 oC

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til taelling af coliforme bakterier i pasteuriseret maelk ved en kolonitaellingsteknik ved 30 oC.

2.

Definition

Ved »coliforme bakterier« forstaas bakterier, som ved 30 oC danner karakteristiske kolonier eller ukarakteristiske kolonier, der kan forgaere laktose under luftudvikling under de beskrevne betingelser.

3.

Princip

En defineret maengde af maelkeproeven blandes med naeringssubstratet i petriskaale og inkuberes ved 30 oC i 24 timer. Karakteristiske kolonier optaelles, og eventuelt ukarakteristiske koloniers identitet bekraeftes ved kontrol af evnen til at forgaere laktose. Antallet af coliforme bakterier pr. 1 ml pasteuriseret maelk beregnes derefter.

4.

Apparatur og glasvarer

Saedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed:

4.1.

Apparatur

4.1.1.

Varmluftsovn, som kan fugere ved 170-175 oC.

4.1.2.

Autoklave, der kan fungere ved 121 p 1 oC.

4.1.3.

Varmeskab, der overalt kan holde en temperatur paa 30 p 1 oC.

4.1.4.

pH-meter med en noejagtighed paa p 0,1 pH-enhed, med temperaturkompensation.

4.1.5.

Vandbad, der kan holde en temperatur paa 45 p 1 oC.

4.1.6.

Podenaal af platiniridium eller nikkelkrom.

4.2.

Glasvarer

4.2.1.

Reagensglas med passende lukkeanordninger og en kapacitet paa 20 ml til verifikationssubstratet (5.2) og durhamroer i passende dimensioner til brug sammen med reagensglassene

4.2.2.

Flasker med en kapacitet paa 150-200 ml til det faste, selektive substrat (5.1)

4.2.3.

Pipetter (med vatprop) af glas eller sterilt, syntetisk materiale med ubeskadiget spids og en nominel kapacitet paa 1-10 ml samt en aabning paa 1,75-3 mm

4.2.4.

Petriskaale af klart, ufarvet glas eller sterilt, syntetisk materiale, hvor den nederste skaal har en indvendig diameter paa ca. 90-100 mm. Den indvendige dybde skal vaere mindst 10 mm. Bunden skal vaere fri for ujaevnheder, som kan forstyrre taellingen af kolonier.

4.2.5.

Sterilisation af glasvarer

Glasvarer steriliseres ved en af foelgende metoder:

a) henstand ved 170-175 oC i mindst en time i varmluftsovn (4.1.1)

b) henstand ved 121 p 1 oC i mindst 20 minutter i autoklave (4.1.2).

Det skal sikres, at der sker tilstraekkelig gennemtraengning af damp i autoklaven; hvis udstyret f.eks. steriliseres i beholdere, skal disse ikke lukkes taet, og kolber skal have loestsiddende laag.

Glasvarer, der er steriliseret i autoklaven, toerres ved dampventilation.

Pipetter steriliseres i varmluftsovn (4.1.1).

5.

Naeringssubstrater

5.1.

Roed-violet galdelaktose agar (RVG agar). Fast, selektivt substrat.

Sammensaetning

Pepton

7 g

Gaerekstrakt

3 g

Laktose (C12H22O11 7H2O)

10 g

Natriumklorid (NaCl)

5 g

Galdesalte

1,5 g

Neutralroedt

0,03 g

Krystalviolet

10-15 g (afhaengigt af den anvendte gelatineringsevne)

Vand

1 000 ml.

Fremstilling

Bestanddele opslaemmes og oploeses i vandet, og man lader det henstaa i flere minutter. Derefter blandes kraftigt.

pH-vaerdien kontrolleres med en pH-maaler (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter kogning er 7,4 p 0,1 ved 25 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af natriumhydroxid eller saltsyre.

Substratet opvarmes til kogepunktet, skvulpes af og til og fordeles straks i portioner paa 100-150 ml i sterile flasker (4.2.2). Substratet tempereres i vandbad (4.1.5) ved 45 p 1 oC.

Substratets sterilitet skal kontrolleres paa anvendelsestidspunktet (se 6.4).

Substratet skal bruges inden tre timer efter fremstillingen.

5.2.

Brillantgroent laktosegalde bouillon. Verifikationssubstrat.

Sammensaetning

Pepton

10 g

Laktose (C12H22O11 7H2O)

10 g

Dehydreret oksegalde

20 g

Brillantgroent

0,0133 g

Vand

1 000 ml.

Fremstilling

Bestanddelene oploeses i vandet ved kogning.

pH-vaerdien kontrolleres med et pH-meter (4.1.4) og justeres eventuelt, saaledes at den efter sterilisation er 7,2 p 0,1 ved 25 oC, idet der benyttes en oploesning (mindst 0,1 mol/l) af natriumhydroxid eller saltsyre.

Substratet doseres i portioner paa 10 ml i reagensglas, hvori der er anbragt durhamroer med bunden opad (4.2.1). Glassene tilproppes.

Reagensglassene steriliseres i autoklaven (4.1.2) ved 121 p 1 oC i 15 minutter.

Durhamroerene maa ikke indeholde luftbobler efter sterilisationen.

Substratets pH kontrolleres.

Hvis substratet ikke skal bruges straks, skal det opbevares moerkt ved en temperatur paa 1-5 oC i hoejst en maaned efter fremstillingen.

5.3.

Dehydreret naeringssubstrat - kommercielt tilgaengeligt

Naeringssubstratet (5.1, 5.2) kan fremstilles af substrater, som faas i dehydreret form. Brugsanvisningen foelges. pH-vaerdien justeres og doseres, koges eller steriliseres og opbevares som beskrevet i 5.1 og 5.2.

6.

Metodik

6.1.

Substrat

Substratet (RVG agar) som beskrevet i 5.1 benyttes.

6.2.

Forbehandling af maelkeproeven

Maelkeproeven blandes grundigt, saaledes at mikroorganismerne fordeles saa jaevnt som muligt ved at bunden paa maelkeproevebeholderen hurtigt vendes i vejret 25 gange. Undgaa skumdannelse eller lad skummet laegge sig. Intervallet mellem blanding og udtagning af analyseproeven maa ikke overskride tre minutter.

6.3.

Podning i petriskaalene

3 ml af maelkeproeven (6.2) udsaas ved overfoersel med en steril pipette (4.2.3) af 1 ml af maelkeproeven til hver af de tre skaale (4.2.4).

6.4.

Ophaeldning

RVG agar (6.1) ophaeldes i hver podet skaal i portioner paa ca. 12 ml.

Straks efter ophaeldningen blandes der ved drejning af petriskaalen tilstraekkeligt til, at kolonierne fordeles jaevnt efter inkubation.

Der maa hoejst gaa 15 minutter mellem afslutningen af forbehandlingen af maelkeproeven og blandingen af analyseproeven med substratet.

Til kontrol af steriliteten overfoeres 12 ml af den RVG agar, der blev brugt til de podede skaale, til en upodet skaal.

Substratet skal stoerkne paa en ren, koelig, vandret flade, indtil det er stivnet.

Efter fuldstaendig stoerkning haeldes der mindst 4 ml RGV agar (6.1) ud paa det podede substrats overflade.

Man lader det stoerkne.

6.5.

Inkubation af petriskaale

Skaalene stille i varmeskabet (4.1.3). Skaalene inkuberes med laagene nedad. Der maa ikke saettes mere end seks oven paa hinanden. Stakke af skaale maa ikke roere hinanden eller varmeskabets sider.

Der inkuberes ved 30 p 1 oC i 24 p 2 timer.

6.6.

Taelling af kolonier

6.6.1.

Kolonierne i de petriskaale, der indeholder hoejst 150 kolonier, taelles. De moerkeroede kolonier med en diameter paa mindst 0,5 mm med eller uden omgivende praecipitation, som er karakteristisk for coliforme bakterier, taelles.

6.6.2.

Hvis alle kolonierne eller nogle af dem har et ukarakteristisk udseende (f.eks. adskiller sig fra typiske kolonier i farve, stoerrelse eller dannelse af praecipitat), udfoeres en verifikationsproeve (6.7).

6.7.

Verifikationsproeve

Efter anvisningerne i 6.6.2 foretages en verifikationsproeve paa et passende antal (f.eks. 3 til 5) ukarakteristiske kolonier ved podning i glas med brillantgroent laktosegalde bouillon (5.2) med en podenaal (4.1.6). Glassene inkuberes ved 30 p 1 oC i 24 p 2 timer.

Kolonier, som producerer luft i durhamroerene, betragtes som verificerede bakteriekolonier.

7.

Beregning og angivelse af resultater

7.1.

Til taellingen benyttes (se 7.4) skaale, som indeholder hoejst 150 kolonier.

7.2.

Hvis der benyttes en verifikationsproeve, beregnes antallet af kolonier af coliforme bakterier paa grundlag af procentdelen af verificerede coliforme bakterier.

7.3.

Antallet af coliforme bakterier pr. 1 ml pasteuriseret maelk angives ved formlen:

Ó C ,

S C

n

hvor

S C = er det samlede antal kolonier af coliforme bakterier (7.1 i forbindelse med 7.2), som er fundet ved undersoegelse af maelkeproeven (3 ml).

n

=

er antallet af ml i den undersoegte proeve (6.3.1) (3 ml).

Tallet afrundes til to signifikante cifre, hvis der er over 100 kolonier. Naar cifret, der skal afrundes, er 5, afrundes det, saaledes at tallet umiddelbart til venstre er lige.

Hvis der kun er tal paa over 150 kolonier, registreres resultatet som »Skoennet antal coliforme bakterier pr. 1 ml«.

8.

Noejagtighed

Der foreligger ingen resultater af internationale sammenlignende proever.

VII. TAELLING AF SOMATISKE CELLER

Dette er en beskrivelse af to metoder som referencemetoder til taelling af somatiske celler:

A. Mikroskopmetoden

B. Den fluoro-opto-elektroniske metode

A. Mikroskopmetode

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til taelling af somatiske celler i raa maelk.

Dette er en beskrivelse af metoden til taelling af antallet af celler i maelkeproever med henblik paa kalibrering og kontrol af noejagtigheden af den fluoro-opto-elektroniske metode (se B.1).

2.

Definition

Ved somatiske celler forstaas her de celler, f.eks. leukocytter og epitelceller, hvis kerner kan farves tydeligt med metylenblaat.

3.

Princip

0,01 ml maelk spredes over 1 cm$ af et objektglas. Filmen toerres og farves. Taelling foretages

under mikroskop. Antallet af somatiske celler, som er talt i et defineret omraade, ganges med arbejdsfaktoren for at opnaa antallet af celler/ml.

4.

Reagenser

Der skal anvendes kemikalier af analysekvalitet.

Farveoploesning

Sammensaetning

Metylenblaat

0,6 g

Ethanol - 99 %

54,0 ml

1,1,1-trikloretan eller tetrakloretan

40,0 ml

Iseddikesyre

6,0 ml

Advarsel

Tetrakloretan er giftigt. Hvis det benyttes, skal fremstillingen og paafoeringen ske i et stinkskab.

Fremstilling

Ethanol og 1,1,1-trikloretan eller tetrakloretan blandes i en flaske og opvarmes i vandbad til 60 til 70 oC. Metylenblaat tilsaettes. Der blandes omhyggeligt, afkoeles i koeleskab til 4 oC i 12 til 24 timer og tilsaettes iseddikesyre. Der filtreres gennem et filter med en porestoerrelse paa 10 til 12 mikrometer eller derunder, og farveoploesningsvaesken opbevares i en lufttaet flaske. Hvis der dannes partikler eller sediment, filtreres den igen inden brug.

5.

Apparatur og glasvarer

5.1.

Mikroskop med en forstoerrelse paa 500 til 1 000 gange.

5.2.

Mikrosproejte, 0,01 ml med en noejagtighed paa p 2 % eller bedre.

5.3.

Objektglas med et areal paa 20 mm × 5 mm afmaerket til filmen eller et standardobjektglas og en skabelon paa 20 mm × 5 mm til filmen.

5.4.

Plan varmeplade (30 til 50 oC) til toerring af objektglassene.

5.5.

Blaeser (haartoerrer) til toerring af filmen.

5.6.

Vandbad, som kan fungere ved 30 til 40 oC til opvarmning af maelkeproeven.

5.7.

Mikrometerobjektglas opdelt i 0,01 mm.

6.

Metodik

6.1.

Maelkeproever

Maelkeproeven skal undersoeges inden seks timer efter proeveudtagningen. Under opbevaringen maa proevens temperatur ikke overstige 6 oC. Frysning skal undgaas.

6.2.

Fremstilling af proeven i laboratoriet

Proeven opvarmes i vandbad (5.6) til 30 til 40 oC; den blandes omhyggeligt. Der afkoeles til den temperatur, hvortil mikrosproejten (5.2) er kalibreret, f.eks. 20 oC.

6.3.

Forbehandling af objektglassene

Objektglassene (5.3) rengoeres, f.eks. med ethanol, toerres med stoevfrit papir, flamberes og afkoeles. Opbevares i kasse, saa stoev undgaas.

6.4.

Fremstilling af film

0,01 ml maelk fra proeven, der er behandlet som ovenfor, udtages med en mikrosproejte (5.2). Ydersiden af sproejten, der er i kontakt med maelken, rengoeres omhyggeligt. Sproejten anbringes paa objektglasset (5.3), efter at konturen af feltet (20 mm × 5 mm) er tegnet. Derefter udfyldes feltet saa jaevnt som muligt. Filmen toerres paa en plan varmeplade (5.4), indtil den er helt toer.

Mindst to film skal behandles og undersoeges for hver maelkeproeve.

6.5.

Farvning af film

Filmen dyppes i farveoploesning (4) i 10 minutter. Filment toerres og eventuelt afsluttes med blaeseren (5.5). Filmen dyppes i postevand, indtil al overskudsfarve er skyllet vaek. Derefter toerres igen, og filmen opbevares, saa den ikke udsaettes for stoev.

6.6.

Kalibrering af mikroskopets synsfelt

Mikroskopfeltets diameter bestemmes med mikrometerobjektglasset som funktion af den valgte forstoerrelse (500 til 1 000 gange).

7.

Taelling og beregning

7.1.

Taelling af celler

Der benyttes et mikroskop (5.1). I stedet for at taelle celler taelles kun cellekerner. Disse er tydeligt genkendelige, og med henblik paa taellingen skal mindst halvdelen af kernen vaere synlig i mikroskopifeltet. Der taelles striber eller felter hen over den midterste tredjedel af filmen. Det undgaas at taelle striber eller felter, som udelukkende er valgt fra perifere omraader af filmene. Den omhyggelige behandling af filmene og resultaternes deraf foelgende paalidelighed skal kontrolleres mindst en gang om maaneden ved taelling af forskellige dele af filmen. Taellingen kan ogsaa foretages ved taelling af mirkoskopifelter, der er spredt paa en saadan maade, at alle dele af filmen er ligeligt repraesenteret.

7.2.

Det minimale antal celler, der skal taelles

Da mikroskopisk taelling af somatiske celler ogsaa kan benyttes til standardisering af automatiske og mekaniserede taellingsmetoder, maa variationskoefficienten for taellinger af identiske proever ikke vaere stoerre end for elektroniske instrumenter. Variationskoefficienten for en maelkeproeve, der indeholder 400 000 til 600 000 celler/ml, maa ikke overstige 5 %.

Antallet af somatiske celler, der skal taelles i hver proeve, skal ifoelge Poisson-fordelingens karakteristika vaere mindst 400, for at denne repeterbarhed opnaas.

Poisson-fordelingen forudsaetter, at

M = V = s$

hvor

M er middelvaerdien

V

er varianten

og

s

er standardafvigelsen.

Variationskoefficienten (VK) er

VK = s × 100 % eller VK = 100 % eller VK = 100 %

VK =

s × 100 %

M

eller VK =

100 %

s

eller VK =

100 %

wM-

M (middel) angiver antallet af partikler (celler), som er optalt (dvs. 400 for VK = 5 %).

7.3.

Beregning af arbejdsfaktoren

Arbejdsfaktoren beregnes ifoelge 7.3.1 eller 7.3.2 ved brug af 0,01 ml maelk.

7.3.1

Taelling af baelter paa tvaers af filmen

Baelterne, der skal taelles, er hver isaer 5 mm lange. Baelternes bredde svarer til mikroskopifeltets diameter som bestemt af mikrometerobjektglasset (5.7).

Arbejdsfaktor = 20× 100

Arbejdsfaktor =

20 × 100

d × b

hvor

d = er mikroskopifeltets diameter i millimeter

b

= er antallet af baelter, der er fuldstaendig optalt.

7.3.2.

Taelling af mikroskopifelter i den midterste tredjedel af filmen eller med et gitter

Arbejdsfaktor = 20 × 5 × 100 = 12 732

Arbejdsfaktor =

20 × 5 × 100

Ð × d² × s

4

=

12 732

d² × s

hvor

d = er mikroskopifeltets diameter i mm som bestemt af mikrometerobjektglasset (5.7)

s

= er antallet af optalte felter.

7.4.

Beregning af celletal

Antallet af optalte somatiske celler (7.1 og 7.2) ganges med arbejdsfaktoren (7.3) for at give antallet af celler pr. ml maelk.

7.5.

Noejagtighed

Variationskoefficienten (se 7.2) maa ikke overstige 5 %.

Der foreligger ikke nogen resultater af internationale sammenlignende proever.

B. Fluoro-opto-elektronisk metode

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af referencemetoden, som efter korrekt kalibrering (se A.1) kan benyttes til taelling af somatiske celler i raa maelk - med eller uden kemisk konservering.

2.

Definition

Ved somatiske celler forstaas her partikler med en minimumsfluorescensstyrke som foelge af farvningen af de somatiske cellekerners DNA.

3.

Princip

En del af proeven (f.eks. 0,2 ml) blandes grundigt med bufferoploesning og fluorescensoploesning. En del af denne blanding overfoeres derefter i form af en tynd film til en roterende disk, der fungerer som objektplan for mikroskopet.

Hver celle producerer en elektrisk impuls, som forstaerkes og registreres. Antallet af somatiske celler udskrives i tusinde pr. ml.

4.

Reagenser

Der skal benyttes kemikalier af analysekvalitet, medmindre andet er angivet. Vandet skal enten vaere destilleret eller ionbyttet eller af tilsvarende renhed.

4.1.

Bufferoploesning

Sammensaetning

Kaliumhydrogenftalat

51,0 g

Kaliumhydroxid

13,75 g

Polyethylenglykol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)-fenyl-aeter

(f.eks. Triton X-100), 1 % (V/W)

10 ml

pH 5,7 - 5,9. Destilleret vand tilsaettes til 10 000 ml.

Fremstilling

De enkelte bestanddele blandes. Opbevares lufttaet i hoejst syv dage.

4.2.

Fluorescensoploesning (stamoploesning)

Sammensaetning

Etidiumbromid

1,0 g

Vand til 1 000 ml.

Fremstilling

Etidiumbromid oploeses i vand. Opbevares i lys- og lufttaet flaske i hoejst to maaneder.

4.3.

Fluorescensoploesning (arbejdsoploesning)

20 ml af stamoploesningen (4.2) blandes med bufferoploesningen (4.1) til 1 000 ml. Arbejdsoploesningen maa ikke benyttes i mere end syv doegn.

4.4.

Rengoeringsoploesning

Sammensaetning

Bufferoploesning (4,1)

10 ml

Polyetylenglykol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametylbutyl)-fenyl-aeter

(f.eks. Triton X-100), 1 volumenprocent

10 ml

Ammoniak, 25 volumenprocent

25 ml

Destilleret vand tilsaettes til 10 000 ml.

Fremstilling

De enkelte bestanddele blandes. Opbevares i hoejst 30 dage.

5.

Apparatur og glasvarer

5.1.

Taellingsinstrument, der arbejder efter det fluorescensoptiske princip.

NB:

Instrumentet skal kalibreres inden brug. Forholdet mellem volumen af de partikler, der skal

taelles, og graensevaerdien, over hvilken taellingerne foretages, bestemmes. Kalibrering af apparatet sker ifoelge brugsanvisningen ved brug af proever, hvis celleindhold er bestemt ved mikroskopimetoden.

5.2.

Vandbad med circulation, der kan fungere ved 40 p 1 oC.

5.3.

Reagensglas med passende lukkeanordning, ca. 15 ml.

6.

Maelkeproever

6.1.

Proeven skal opbevares ved lav temperatur i et proeveglas (5.3). Hvis proeven ikke er konserveret kemisk, boer den ikke taelles inden for de foerste 24 timer efter udmalkning, da tallene saa vil vaere for lave. Opbevaringstemperaturen maa ikke overstige 6 oC.

6.2.

Konservering

Kemisk konservering skal foretages inden 24 timer. Konservering skal ske snarest muligt efter proeveudtagningen.

6.2.1.

Kemisk konservering af proeven kan ske ved tilsaetning af et af foelgende konserveringsmidler:

- ortoborsyre

Den endelige koncentration af ortoborsyre i proeven maa ikke overstige 0,6 g/100 ml. Sadanne konserverede proever kan opbevares i yderligere 24 timer ved 6 til 12 oC

- kaliumdikromat

Den endelige koncentration af kaliumdikromat maa ikke overstige 0,2 g/100 ml. Saadanne konserverede proever kan opbevares i yderligere 72 timer ved 6 til 12 oC

- natriumazid

Proeven kan konserveres med natriumazid til en endelig koncentration paa 0,024 g/100 ml, forudsat at proeverne afkoeles til 6 til 12 oC straks efter proeveudtagning og taelles inden for 48 timer efter proeveudtagningen

- bronopol

Proeverne kan konserveres med bronopol til en endelig koncentration paa 0,05 g/100 ml, forudsat at proeverne afkoeles til 6 til 12 oC umiddelbart efter proeveudtagning og taelles inden for 72 timer efter proeveudtagningen.

6.2.2.

Proever, der allerede er konserveret med ortoborsyre, kan konserveres i yderligere 48 timer med kaliumdikromat.

NB:

Der skal tages hensyn til lokale bestemmelser vedroerende udledning af spildevand i forbindelse med proever, der konserveres med kaliumdikromat.

7.

Metodik

7.1.

Forbehandling af proeverne

Maelkeproever, der skal undersoeges, skal opbevares i mindst 24 timer ved ca. 2 til 6 oC efter udlagringen. Det anbefales ikke at foretage celletaelling uden forbehandling paa malkedagen, da resultaterne kan vaere for lave. Hvis det er noedvendigt at foretage taelling af saadanne proever, skal de forbehandles i mindst tre timer med kaliumdikromat (se 6.2.1).

7.2.

Forbehandling

Den forbehandlede proeve (se 7.1) eller den ubehandlede proeve, som er mindst et doegn gammel, opvarmes i vandbad (5.2) til ca. 40 oC. Proeven opbevares derefter ved stuetemperatur, indtil taellingen foretages.

7.3.

Taelling af celler

Taelling skal udfoeres ved hjaelp af taellingsinstrument (5.1) inden 15 minutter efter afslutningen af opvarmningen (se 7.2). Umiddelbart inden taelling skal proeverne blandes grundigt, saa der opnaas en saa ensartet fordeling af de somatiske celler som muligt.

Yderligere fortynding og behandling af proeverne sker automatisk i instrumentet.

8.

Noejagtighed

Der foreligger ingen tal for repeterbarhed (r) og reproducerbarhed (R) fra internationale sammenlignende proever. I fremtiden vil der blive givet noejagtighedsdata.

Der kan paa grundlag af de data, der foreligger paa nationalt plan, foretages foelgende skoen:

Celletaellingsniveau mellem 400 000 og 500 000/ml

- standardafvigelse for repeterbarhed:

sr = 20 000 celler/ml

(svarende til en variationskoefficient paa 5 % - 4 %)

- standardafvigelse for reproducerbarhed:

sR = 40 000 celler/ml

(svarende til en variationskoefficient paa 10 % - 8 %.

9.

Noejagtighedskontrol

Noejagtidhedskontrol udfoeres ved brug af proever med et kendt celletal (P) bestemt ved mikroskopitaellinger af celler paa et nationalt referencelaboratorium.

VIII. PAAVISNING AF ANTIBIOTIKA OG SULFONAMIDER

OMFANG OG ANVENDELSESOMRAADE

Dette er en beskrivelse af referencemetoden til paavisning af antibiotika og sulfonamider i raa maelk og varmebehandlet maelk.

Referencemetoden omfatter:

A. Kvalitativ metode

Denne metode er den indledende undersoegelse, hvormed maelkeproever, der indeholder antibiotika, herunder sulfonamider, udvaelges. Den beskrevne metoden er en af en raekke lignende metoder, som i princippet alle benytter Bacillus stearothermophilus var. calidolactis ATCC 10149 som testorganisme. Metoden er valgt som vaerende repraesentiv for disse proever.

B. Metode til bekraeftelse og identifikation af penicillin

Denne metode skal benyttes til bekraeftelse af den kvalitative metode, identificering af penicillin og bestemmelse af penicillinkoncentrationen.

A. Kvalitativ metode

1.

Omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af den kvalitative paavisning af antibiotika og sulfonamider i raa og varmebehandlet maelk, naar indholdet overskrider de graenser, som er angivet i tabellen:>TABELPOSITION>

2.

Definition

Maelken indeholder antibiotika eller sulfonamider, naar substratets farve ikke aendres (se 7.1).

3.

Princip

Til en agargel, der indeholder pH-indikator og sporer af Bacillus stearothermophilus var. colidolactis ATCC 10149 (se 5.4.1), som har en god alsidig foelsomhed, og som er saerligt foelsom over for haemning med penicillin, tilsaettes en maelkeproeve sammen med naeringsstoffer. Ved inkubation, der resulterer i organismens normale vaekst og syreproduktion, aendres pH-indikatorfarven fra violet til gul. Tilstedevaerelsen af stoffer i maelken, som virker haemmende paa organismens vaekst, faar pH-indikatorfarven til at forblive violet.

4.

Apparatur og glasvarer

Saedvanligt laboratorieudstyr og i saerdeleshed:

4.1.

Apparatur

4.1.1.

Varmeskab, der kan holde en temperatur paa 64 oC p 1 oC.

4.1.2.

Vandbad, der kan holde en temperatur paa 64 oC p 1 oC.

4.1.3.

Stativ til glas eller ampuller.

4.1.4.

Pipette med engangsspidser til proeveudtagning og dosering af 0,1 ml.

4.1.5.

Tang eller pincet

4.1.6.

Varmluftsovn, der kan holde en temperatur paa 170 til 175 oC.

4.1.7.

Autoklave, der kan holde en temperatur paa 121 p 1 oC.

4.1.8.

pH-meter

4.2.

Glasvarer

4.2.1.

Proeveflasker med passende lukkeanordninger.

NB:

Visse gummipropper kan afsaette haemmende stoffer paa flaskehalsen.

4.2.2.

Petriskaale af klart, ufarvet glas eller sterilt, syntetisk materiale med flad bund af ensartet tykkelse, mindste indvendige diameter ca. 140 mm.

4.2.3.

Flasker med en kapacitet paa 250 ml.

4.2.4.

Pipetter (med vatprop) af glas eller sterilt, syntetisk materiale med en nominel kapacitet paa 1 ml og 10 ml.

4.2.5.

Glasspatler

4.2.6.

Glas eller ampuller, indvendig diameter ca. 8 mm, med kapsel eller prop.

4.2.7.

Sterilisation af glasvarer

Glasvarer steriliseres ved en af foelgende metoder:

a) henstand ved 170 til 175 oC i mindst en time i varmluftsovn (4.1.6)

b) henstand ved 121 p 1 oC i mindst 20 minutter i autoklave (4.1.7).

Det skal sikres, at der sker tilstraekkelig gennemtraengning af damp i autoklaven; hvis udstyret f.eks. steriliseres i beholdere, skal disse ikke lukkes taet, og kolber og flasker skal have loestsiddende laag.

Glasvarer, der er steriliseret i autoklaven, toerres ved dampventilation.

Pipetter steriliseres i en varmluftsovn.

5.

Substrater, oploesninger, testorganisme

Substraternes bestanddele skal vaere egnede til bakteriologiske formaal. Det anvendte vand skal vaere glasdestilleret eller demineraliseret med mindst tilsvarende renhed. Det maa ikke indeholde stoffer, som virker haemmende paa testorganismen.

5.1.

Substrater

5.1.1.

Naeringsagar

Sammensaetning

Gaerekstrakt

2 g

Pepton

5 g

Koedekstrakt

1 g

Natriumklorid

5 g

Agar

10 til 15 g

Vand

1 000 ml

Fremstilling

Bestanddelene oploeses i vand. Der opvarmes til kogning med lejlighedsvis skvulpning. pH indstilles, saa der opnaas en vaerdi paa 7,4 p 0,1 ved 25 oC efter sterilisation.

Til fremstilling af skraasubstrat tilsaettes henholdvis 10 ml i proeveglas eller 100 ml i flasker.

Substratet steriliseres ved 121 p 1 oC i 15 minuter.

5.1.2.

Agarsubstrat

Sammensaetning

Natriumklorid

2 g

Agar

15 g

Vand

1 000 ml

Trimethoprimoploesning eller tetroxoprimoploesning (se 5.1.3) (1)

10 ml

Fremstilling

Alle bestanddele bortset fra trimethoprim- eller tetroxoprimoploesningen oploeses i vand. Der opvarmes til kogning med lejlighedsvis skvulpning. Trimethoprim- eller tetroxoprimoploesningen tilsaettes, og der steriliseres ved 121 p 1 oC i 15 minutter; pH indstilles, saa der opnaas en vaerdi paa 7,0 p 0,1 ved 25 oC efter sterilisation.

5.1.3.

Trimethoprim- eller tetroxoprimoploesning

Sammensaetning

Trimethoprim

5 mg

eller tetroxoprim

30 mg

Ethanol, 96 %

5 ml/30 ml

Vand

ad 1 000 ml

Fremstilling

Trimethoprim eller tetroxoprim oploeses i ethanol (5 eller 30 ml) og fortyndes med vand.

5.1.4.

Naeringsstof

Sammensaetning

Gaerekstrakt

0,75 mg

Glukose

5,0 mg

Oploeselig stivelse

8,0 mg

Bromkresolpurpur

0,025 g

Vand

ad 50 ml

Fremstilling

Bestanddelene oploeses i vand, evt. under opvarmning, og der sterilfiltreres. Naeringsstoffet faas i handelen som tabletter.

5.2.

Standardpenicillinoploesninger5.2.1.

Der fremstilles en penicillinoploesning paa 60 ìg/ml (= 100 IE/ml) ved oploesning af krystallinsk natrium- eller kaliumbenzylpenicillin i sterilt destilleret vand i en steril flaske med hensigtsmaessigt lukke.

5.2.2.

Der fremstilles en arbejdsoploesning af penicillin ved tilsaetning af 1,25 ml af penicillinoploesningen (5.2.1) til sterilt, destilleret vand til 1 000 ml. Denne arbejdsoploesning indeholder 0,075 ìg/ml (= 0,125 IE/ml).

5.2.3.

Der fremstilles 75 ml standardpenicillinoploesning indeholdende 0,004 ìg/ml (= 0,0067 IE/ml) penicillin ved tilsaetning af 71 ml inhibitorfri maelk (5.3) til 4 ml af arbejdspenicillinoploesningen (5.2.2), der blandes.

13. 4. 91

De Europaeiske Faellesskabers Tidende

5.2.4.

De i 5.2.1 til 5.2.3 naevnte penicillinoploesninger skal fremstilles den dag, proeven udfoeres.

5.3.

Inhibitorfri maelk

Til kontrol fremstilles inhibitorfri maelk ved genfortynding (10 % m/v) af skummetmaelkspulver, som tidligere er proevet og fundet frit for haemmende stoffer, i sterilt, destilleret vand. Alternativt kan en tilstraekkelig stor maengde frisk maelk, som er proevet og fundet fri for haemmende stoffer, doseres i flasker, opvarmes en time ved 100 oC og derefter opbevares i koeleskab ved 0 til 6 oC i hoejst en uge.

5.4.

Testorganisme

5.4.1.

Som testorganisme benyttes Bacillus stearothermophilus var. calidolactis stamme ATCC 10149. Stammen er identisk med C 953.

5.4.2.

Der fremstilles en stamkultur til vedligeholdelse af testkulturen. Testkulturen opbevares paa et skraasubstrat af naeringsagar (5.1.1). Skraaagarsubstratet stregpodes paa overfladen ved brug af en podeskaal med testkulturen og inkuberes earobt i 48 timer ved 63 p 1 oC. Efter inkubationen forsegles glasset med en steril gummiprop. Denne stamkultur kan opbevares i flere maaneder i koeleskab ved 0 til 5 oC.

5.5.

Testkultur (sporeopslaemning)

5.5.1.

20 ml af den smeltede naeringsagar (5.1.1) overfoeres aseptisk til en steril petriskaal (4.2.2) og afkoeles til stuetemperatur.

5.5.2.

Med en steril pipette (4.2.4) overfoeres 5 ml sterilt, destilleret vand til et glas med stamkultur (5.4.2), og sporerne skylles af skraaagarsubstratet med en steril podenaal. Denne sporeopslaemning skal opbevares ved 0 til 5 oC og benyttes inden for 36 timer.

5.5.3.

Med en steril pipette (4.2.4) overfoeres 0,5 ml af sporeopslaemningen (5.5.2) til en agarplade (5.5.1), og podestoffet spredes grundigt over hele overfladen med en boejet glasstang. Der inkuberes ved 63 p 1 oC (4.1.1) i 16 til 18 timer.

Naar der benyttes en stamkultur (5.4.2) eller en kultur, som er over 36 timer gammel, skal podning foretages mindst to gange med et interval paa hoejst 36 timer.

5.5.4

Med en steril pipette (4.2.4) overfoeres 10 ml destilleret vand til agarpladen (5.5.3), og med en glasstav bringes sporer, der flyder paa overfladen, ned i vaesken.

Sporeopslaemningen overfoeres til en flaske (4.2.3), der indeholder 250 ml sterilt, destilleret vand. Flasken lukkes og rystes grundigt. Kulturer, som ikke skal podes umiddelbart, opbevares i koeleskab ved 0 til 6 oC.

5.5.5.

Sporeopslaemningen (5.5.4) skal praestere et levedygtigt kimtal paa 5 til 10 millioner pr. ml paa PCA inkuberet ved 63 p 1 oC i 16 til 18 timer. Sporeopslaemningen skal vaere ensartet uklar, og hvis der er fnugdannelse eller bundfald, skal den kasseres, og der fremstilles en ny opslaemning fra stamkulturen (5.4.2).

5.6.

Fremstilling af reagensglas/ampuller

5.6.1.

Agarsubstratet (5.1.2) smeltes og afkoeles til 55 oC.

5.6.2.

1 del frisk sporeopslaemning (5.5.4) tilsaettes til 5 dele agarsubstrat (5.6.1) i et glas eller en flaske, og der blandes grundigt.

5.6.3.

0,3 ml af det podede substrat (5.6.2) beregnet til at danne et 5 mm tykt lag overfoeres til et sterilt glas eller ampul (4.2.6), og der lukkes med en prop, kapsel eller ved smeltning af spidsen. Disse reagensglas/ampuller afkoeles i lodret stilling, saa naeringssubstratet stoerkner, og det henstaar derpaa i mindst 12 timer.

5.6.4.

Reagensglassene/ampullerne kan bruges samme dag, men de kan opbevares i flere maaneder, forudsat at de afkoeles umiddelbart efter fremstillingen og opbevares ved 0 til 6 oC.

6.

Metodik

6.1.

Proeverne kontrolleres saa hurtigt som muligt og helst inden 24 timer efter proeveudtagningen, idet de i mellemtiden holdes ved en temperatur paa 0 til 5 oC. Hvis det ikke er muligt at kontrollere proeverne inden 24 timer, skal de opbevares i dybfryser ( 30 til 15 oC) for at reducere inaktiveringen af penicillinet til et minimum.

6.2.

Hvert glas/ampul (5.6) identificeres tydeligt og paa en maade, saa det ikke kan slettes. Kapslen eller proppen fjernes. Det antal, der er noedvendigt til undersoegelse af proeverne og kontrollerne (5.2 og 5.3), anbringes i et egnet stativ (4.1.3).

6.3.

50 ìl af naeringsstoffet som beskrevet i 5.1.4 tilsaettes til hvert glas/ampul.

6.4.

Maelkeproeven blandes grundigt, og med sproejten (4.1.4) overfoeres 0,1 ml til det tilsvarende maerkede glas/ampul. Der bruges en ren engangsspids til hver proeve, der skal overfoeres.

6.5.

Metoden i 6.4 gentages, idet der benyttes standardpenicillinoploesning indeholdende 0,004 ìg/ml (= 0,0067 IE/ml) penicillin i stedet for maelkeproeven (5.2.3).

6.6.

Metoden i 6.4 gentages, idet den inhibitorfri kontrolmaelk (5.3) benyttes i stedet for maelkeproeven.

6.7.

Glassene/ampullerne lukkes, og stativet med glassene/ampullerne anbringes i vandbad ved 63 p 1 oC (4.1.2) i mindst 2 1/2 til 2 3/4 timer.

6.8.

Stativet med glassene/ampullerne fjernes fra vandbadet.

6.9.

Testsubstratets farve (se 7) iagttages.

7.

Fortolkning af resultater

7.1.

Purpurfarvning af testsubstratet i en maelkeproeve eller kontrolglassene/-ampullerne viser, at proeven indeholder antibiotika eller sulfonamider paa eller omkring det »helt positive niveau«, der er anfoert i tabellen paa side 39. Farven paa glassene/ampullerne med standardpenicillinoploesning (6.5) skal forblive purpur for at vise, at proevesubstratet er tilstraekkeligt foelsomt.

7.2.

Purpurfarvning af en del af det faste proevesubstrat eller uregelmaessig farvning i et af maelkeproeveglassene/-ampullerne viser, at der forekommer haemmende stoffer mellem de niveauer, der er anfoert i tabellen paa side 39.

7.3.

Gulfarvning af det faste proevesubstrat i en af maelkeproeverne eller kontrolglassene/-ampullerne angiver, at der ikke er stoffer, der virker haemmende paa testorganismen.

7.4.

Hvis der sker purpurfarvning i alle de afproevede glas/ampuller, herunder negativkontrollen, indeholder glassene/ampullerne ikke levedygtige sporer, og proeverne skal kontrolleres igen med nyfremstillet proevemateriale.

8.

Verifikation af resultater

8.1.

Alle proever verificeres som beskrevet i 7.1 og 7.2 ifoelge »Metode B«.

Hvis det er noedvendigt at opbevare maelkeproever inden verifikationen, skal de dybfryses for at undgaa nedbrydning af antibiotika.

B. Metode til verifikation af penicillin og bestemmelse af koncentration

1.

Verifikationsundersoegelsens omfang og anvendelsesomraade

Dette er en beskrivelse af verifikationsundersoegelsen for penicillin og andre antibiotika end penicillin samt metoden til bestemmelse af p