KOMMISSIONENS BESLUTNING af 14. april 1993 om metoderne til paavisning af restkoncentrationer af stoffer med hormonal virkning og stoffer med tyreostatisk virkning

(93/256/EOEF)KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 85/358/EOEF af 16. juli 1985 om supplering af direktiv 81/602/EOEF om forbud mod visse stoffer med hormonal virkning og med stoffer med tyreostatisk virkning (1), senest aendret ved direktiv 88/146/EOEF (2), saerlig artikel 5, stk. 2, og

ud fra foelgende betragtninger:

I henhold til artikel 8, stk. 1, i Raadets direktiv 64/433/EOEF af 26. juni 1964 om sundhedsmaessige betingelser for produktion og afsaetning af fersk koed (3), senest aendret ved direktiv 92/5/EOEF (4), og artikel 11, stk. 4, andet afsnit, i Raadets direktiv 85/397/EOEF af 5. august 1985 om sundhedsmaessige og veterinaerpolitimaessige problemer i forbindelse med handelen inden for Faellesskabet med varmebehandlet maelk (5), senest aendret ved direktiv 89/662/EOEF (6), skal undersoegelserne for restkoncentrationer foretages efter videnskabeligt anerkendte og i praksis gennemproevede metoder, saerlig saadanne som er fastsat i EF-direktiver eller i andre internationale forskrifter;

fastsaettelsen af analysemetoder indbefatter definition af analyseprocedurer, regler for proeveudtagning og kriterier for gennemfoerelse af analyser;

analysemetoderne skal vaere tilstraekkeligt foelsomme til at paavise restkoncentrationer af stoffer med hormonal virkning og stoffer med tyreostatisk virkning;

proeveudtagningen er et vaesentligt led i analysen; der boer derfor fastsaettes regler for proeveudtagning;

i forbindelse med denne beslutning boer der tages hensyn til kriterierne i nr. 1 i bilaget til Raadets direktiv 85/591/EOEF af 20. december 1985 om indfoerelse af faelles proeveudtagnings- og analysemetoder til kontrol af levnedsmidler (7);

som foelge af udviklingen i den videnskabelige og tekniske viden og af klarhedshensyn boer Kommissionens beslutning 87/410/EOEF (8) ophaeves;

de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Veterinaerkomité -

VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

Foelgende rutineanalysemetoder er tilladt til paavisning af restkoncentrationer af stoffer med hormonal virkning og stoffer med tyreostatisk virkning:

- immunoassay

- tyndtlagskromatografi

- vaeskekromatografi

- gaskromatografi

- massespektrometri

- spektrometri

eller enhver anden metode, der opfylder kriterier svarende til dem, som er fastsat for beslaegtede metoder i bilaget.

Artikel 2

Analyseproever udtages efter foelgende regler:

1. proeven skal vaere repraesentativ og stor nok til, at der kan foretages en korrekt analyse, at analysen kan gentages, og at der kan foretages verifikationsanalyse

2. proeverne skal maerkes saaledes, at de til enhver tid kan identificeres

3. proeveudtagning, pakning, konservering, transport og opbevaring af proeverne maa ikke beskadige dem eller paavirke undersoegelsesresultatet. Uvedkommende maa ikke have adgang til proeverne.

Artikel 3

Kriterierne for anvendelse af rutineanalysemetoder til paavisning af restkoncentrationer af stoffer med hormonal virkning og stoffer med tyreostatisk virkning er fastlagt i bilaget.

Artikel 4

Denne beslutning tages op til fornyet overvejelse inden den 1. januar 1996 for at tage hensyn til den nyeste videnskabelige og tekniske viden.

Artikel 5

Beslutning 87/410/EOEF ophaeves.

Artikel 6

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 14. april 1993.

Paa Kommissionens vegne

René STEICHEN

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 191 af 23. 7. 1985, s. 46.

(2) EFT nr. L 70 af 16. 3. 1988, s. 16.

(3) EFT nr. 121 af 29. 7. 1964, s. 2012/64.

(4) EFT nr. L 57 af 2. 3. 1992, s. 1.

(5) EFT nr. L 226 af 24. 8. 1985, s. 13.

(6) EFT nr. L 395 af 30. 12. 1989, s. 13.

(7) EFT nr. L 372 af 31. 12. 1985, s. 50.

(8) EFT nr. L 223 af 11. 8. 1987, s. 18.

BILAG

1. DEFINITIONER OG ALMINDELIGE KRAV

1.1. Definitioner

1.1.1. Rutineanalysemetoder

Medlemsstaterne anvender disse metoder til at gennemfoere nationale planer for undersoegelse for restkoncentrationer i husdyr og produkter deraf i overensstemmelse med Raadets direktiv 86/469/EOEF (1). Rutinemetoderne skal vaere valideret af operationelle laboratorier og skal opfylde de relevante kriterier i dette bilag. Det drejer sig om foelgende metoder, der kan anvendes til screening og/eller verifikation:

- Metoder, der anvendes til screening (screening-metoder), er metoder, der anvendes til at paavise tilstedevaerelsen af en analysand eller en klasse af analysander paa det givne niveau. Disse metoder har en hoej produktivitet og anvendes til at undersoege store maengder proever for eventuelle positive resultater. De skal forhindre falske negative resultater.

- Metoder, der anvendes til verifikation er metoder, der giver fuldstaendig eller supplerende information, saa analysanden kan identificeres entydigt paa det givne niveau.

Disse metoder skal forebygge falske positive resultater samt indebaere en acceptabel lav sandsynlighed for falske negative resultater.

1.1.2. Analysand

Analysanden er en bestanddel af en proeveoploesning, hvis tilstedevaerelse skal paavises, identificeres og/eller bestemmes kvantitativt. Udtrykket »analysand« omfatter i givet fald derivater af analysanden, der dannes under analysen.

Kvantitativt angives analysanden som:

- maengden udtrykt som en masse (f.eks. mg, ng) eller

- indholdet udtrykt som en massebroek (f.eks. mg kg 1, ng kg 1), en massekoncentration (f.eks. mg l 1) eller en koncentration (f.eks. mol l 1).

1.1.3. Proever

1.1.3.1. Laboratorieproeve

Dette er en proeve, der er tilberedt med henblik paa at blive sendt til laboratoriet for at blive kontrolleret eller undersoegt.

1.1.3.2. Proeveoploesning

Dette er en proeve, der tilberedes paa grundlag af laboratorieproeven, og hvoraf der udtages analyseproever.

1.1.3.3. Analyseproeve

Dette er den maengde stof, der udtages af proeveoploesningen (eller, hvis proeveoploesningen og analyseproeven er identiske, af laboratorieproeven), og som rent faktisk analyseres eller observeres.

1.1.4. Standardanalysand

Denne er et veldefineret stof med et specificeret indhold af analysand af den stoerst mulige renhed, der anvendes som referencestof i analysen.

1.1.5. Referencestof

Dette er et stof, hvoraf en eller flere egenskaber er blevet bekraeftet ved hjaelp af en valideret metode, saaledes at det kan anvendes til kalibrering af et apparat eller efterproevning af en maalemetode.

1.1.6. Blindforsoeg

1.1.6.1. Blindforsoeg paa analyseproeve

Her foretages en komplet analyse af en analyseproeve, der er undtaget af en proeveoploesning, som ikke indeholder analysand.

1.1.6.2. Blindforsoeg paa reagenser

Her foretages en komplet analyse med udeladelse af analyseproeven eller med anvendelse af en tilsvarende maengde egnet oploesningsmiddel i stedet for analyseproeven.

1.1.7. Specificitet

Specificitet er en metodes evne til at skelne mellem analysanden og andre stoffer. Denne egenskab afhaenger foerst og fremmest af det anvendte maaleprincip, men kan variere alt efter forbindelse eller matrix.

Oplysninger om specificitet skal i hvert fald vedroere alle de stoffer, som maa forventes at give udslag, naar det beskrevne maaleprincip anvendes, f.eks. det paagaeldende reststofs homologe og analoge stoffer samt metabolitter. Paa grundlag af oplysningerne om metodens specificitet skal det kvantitativt kunne beregnes, i hvilken grad metoden kan skelne mellem analysanden og de andre stoffer under de givne forsoegsbetingelser.

1.1.8. Rigtighed

I denne beslutning benyttes rigtighed om gennemsnitsvaerdiens rigtighed. Den definition, der skal anvende, er fastlagt i ISO 3534-1977 under 2.83 (gennemsnitsvaerdiens rigtighed: graden af overensstemmelse mellem den sande vaerdi og den gennemsnitlige vaerdi, som ville blive opnaaet ved anvendelse af forsoegsmetoden et meget stort antal gange).

De vigtigste begraensninger for rigtighed er:

a) tilfaeldige fejl

b) systematiske fejl.

Ved et meget stort antal forsoeg naermer gennemsnitsvaerdiens rigtighed sig den systematiske fejl. Med henblik paa gennemgang af en metode paa grundlag af skriftlig dokumentation skal antallet af forsoeg anfoeres.

Maalet for rigtighed er forskellen mellem referencestoffets maalte gennemsnitsvaerdi og dets sande vaerdi udtrykt i procent af den sande vaerdi. Hvis der ikke er noget referencestof, kan de relevante parametre evalueres ved analysering af proeveoploesningen tilsat en kendt maengde analysand.

Hvis der hverken findes absolutte definerende metoder eller certificerede referencestoffer, kan en proeveoploesnings indhold af analysand defineres ved de resultater, der opnaas ved hjaelp af en metode, der udviser en hoej grad af specificitet, rigtighed og praecision for analysandens vedkommende.

1.1.9. Praecision

Dette er graden af overensstemmelse mellem resultater, der er opnaaet ved at anvende forsoegmetoden flere gange under naermere fastsatte betingelser (ISO 3534-1977 (2), nr. 2.84) og omfatter repeterbarhed og reproducerbarhed.

Repeterbarhed:

Graden af overensstemmelse mellem indbyrdes uafhaengige proeveresultater, der er opnaaet under repeterbarhedsbetingelser, dvs. med den samme metode paa identisk proevemateriale, paa det samme laboratorium, udfoert af den samme person med det samme appartur og med korte tidsintervaller.

Reproducerbarhed:

Graden af overensstemmelse mellem indbyrdes uafhaengige proeveresultater, der er opnaaet under reproducerbarhedsbetingelser, dvs. med samme metode paa identisk proevemateriale, paa forskellige laboratorier, udfoert af forskellige personer, der anvender forskelligt apparatur. I henhold til bilaget til Raadets direktiv 85/591/EOEF (3) skal praecisionsvaerdierne for analysemetoder, der skal anvendes i henhold til direktivets bestemmelser, fastlaegges paa grundlag af en faellesafproevning, der saa vidt muligt er udfoert i henhold til ISO 5725-1986 (4). Repeterbarhed og reproducerbarhed er defineret i ISO 5725-1986. Ved udfoerelsen af saadanne afproevninger anvendes der proevematerialer med et kendt analysandindhold svarende til den fastlagte oevre graensevaerdi.

Indtil en metodes reproducerbarhed er blevet dokumenteret ved en faellesafproevning, er det til foreloebig udvaelgelse af mulige metoder paa grundlag af skriftlig dokumentation tilstraekkeligt, at der foreligger oplysninger om repeterbarhed.

Maalet for repeterbarhed og reproducerbarhed er variationskoefficienten som defineret i ISO 3534-1977, nr. 2.35 (variationskoefficient: forholdet mellem standardafvigelsenog det aritmetiske gennemsnits absolutte vaerdi).

1.1.10. Paavisningsgraense

Det mindste maalte indhold, paa grundlag af hvilket det med rimelig statistisk sikkerhed er muligt at paavise analysandens tilstedevaerelse. (Mindst 95 % for stoffer, der ikke er tilladt - se 1.2.6.1). Paavisningsgraensen kan beregnes paa flere maader:

a) Der kan udfoeres blindforsoeg paa mindst 20 blindproeveoploesninger. Paavisningsgraensen beregnes som det maalte indhold svarende til gennemsnittet plus tre gange standarafvigelsen for blindforsoegene.

NB 1: Det angives, hvor stor en analyseproeve der typisk anvendes i analysen.

NB 2: Hvis det maa forventes, at faktorer som f.eks. art, koen, alder, fodring eller andre miljoeforhold kan indvirke paa metodens karakteristika, kraeves der et saet af mindst 20 blindproever for hver enkelt homogen population, som metoden skal anvendes paa.

b) Naar det drejer sig om spektrometiske forsoeg, hvori repraesentative blindforsoeg kun giver hvid stoej, beregnes paavisningsgraensen som det maalte indhold svarende til tre gange stoejen mellem toppene.

1.1.11. Bestemmelsesgraense

Det laveste indhold af analysand, som metoden er blevet valideret for naermere fastlagt rigtighed og praecision.

1.1.12. Foelsomhed

Dette er et maal for metodens evne til at skelne mellem forskelle i indholdet af analysand. I denne beslutning beregnes foelsomhed som kalibreringskurvens haeldning paa det givne niveau.

1.1.13. Praktisk anvendelighed

Dette er en egenskab ved en analysemetode, der afhaenger af formaalet med metoden og bestemmes af krav som f.eks. produktivitet og omkostninger.

1.1.14. Anvendelsesomraade

Dette er en liste over de proevematerialer og/eller analysander, som metoden kan anvendes paa i den foreliggende form eller med specificerede mindre aendringer.

1.1.15. Fortolkning af resultater

1.1.15.1. Positivt resultat

Analysandens tilstedevaerelse i proeveoploesningen er bevist efter analysemetoden, naar de generelle kriterier og kriterierne for den individuelle paavisningsmetode er opfyldt.

a) For stoffer med en tolerance paa nul er resultatet af analysen »positivt«, hvis analysandens identitet i proeveoploesningen er entydigt bevist.

b) For stoffer med en oevre graensevaerdi er resultatet af analysen »positivt«, hvis det ved forsoeget bestemte indhold af analysand i proeveoploesningen (efter en eventuel korrektion for genfinding) ligger over den oevre graensevaerdi, hvori der er taget hoejde for den acceptable sandsynlighed for at opnaa falske positive eller falske negative resultater.

1.1.15.2. Negativt resultat

Resultatet af analysen anses for »negativt« efter analysemetoden, hvis de generelle kriterier og kriterierne for den individuelle paavisningsmetode er opfyldt for saa vidt angaar relevante referencestoffer og blindforsoeg og:

a) analysandens identitet ikke er entydigt bevist for saa vidt angaar stoffer med en tolerance paa nul

b) det maalte indhold af analysand i proeveoploesningen ligger under det i 1.1.15.1, litra b), fastlagte niveau for saa vidt angaar stoffer med en oevre graensevaerdi. Bemaerk: Et negativt resultat beviser ikke for saa vidt angaar a) at proeveoploesningen ikke indeholder analysand, eller for saa vidt angaar b), at det sande indhold af analysand ligger under den oevre graensevaerdi.

1.1.16. Co-kromatografi

Efter denne metode deles den oprensede proeveoploesning inden kromatografi i to dele, og:

a) den ene del kromatograferes uden videre

b) den standardanalysand, der skal paavises, tilsaettes til den anden del, og denne blandede oploesning af proeveoploesning og standardanalysand kromatograferes. Maengden af tilsat standaranalysand skal svare til den skoennede maengde analysand i proeveoploesningen.

1.1.17. Immunogram

I denne beslutning defineres et immunogram som en grafisk afbildning af immunokemisk respons mod retentionstid eller elueringsvolumen som opnaaet ved kromatografisk separation med (normalt off-line) immunokemisk paavisning af bestanddelene i proeveekstraktet.

1.2. Almindelige krav

1.2.1. Kriterier

I henhold til bilaget til Raadets direktiv 85/591/EOEF anvendes foelgende kriterier ved undersoegelse af analysemetoder.

1.2.2. Screening-metoder

Der kan ikke opstilles faste krav til screening-metoder. Det vigtigste aspekt er, at forekomsten af falske negative resultater skal vaere minimal paa det givne niveau.

1.2.2.1. Specificitet skal defineres.

1.2.2.2. Rigtighed og praecision:

Kvantitativ bestemmelse er ikke noedvendigvis paakraevet. En screening-metode kan vaere kvalitativ eller kvantitativ afhaengigt af, om det er forbudt eller tilladt at anvende et stof. Falske positive resultater er acceptable, men forekomsten af falske negative resultater skal vaere minimal paa det givne niveau.

1.2.2.3. Paavisningsgraense:

Denne boer vaere egnet til formaalet. For stoffer med en oevre graensevaerdi skal den vaere tilstraekkeligt lav til at paavise restkoncentrationer paa dette niveau. For stoffer, som ikke maa anvendes til husdyr, skal paavisningsgraensen vaere saa lav som muligt.

1.2.2.4. Praktisk anvendelighed:

Produktiviteten boer vaere hoej og omkostningerne lave.

1.2.3. Verifikationsmetoder

1.2.3.1. Specificitet:

Verifikationsmetoder skal saa vidt muligt give entydig information om analysandens kemiske struktur. Hvis mere end en forbindelse giver samme reaktion, kan metoden ikke skelne mellem disse forbindelser.

Metoder, der udelukkende er baseret paa kromatografisk analyse uden anvendelse af molekylspektrometrisk paavisning er ikke egnede som verifikationsmetode.

Hvis en enkelt teknik mangler tilstraekkelig specificitet, kan den oenskede specificitet opnaas ved hjaelp af analysemetoder, der bestaar af passende kombinationer af oprensning, kromatografisk separation og spektrometrisk eller immunokemisk paavisning, f.eks. GC-MS, LC-MS, IAC/GC-MS, GC-IR, LC-IR, LC/IMG.

1.2.3.2. Rigtighed

Ved gentage analyser af et referencestof er de vejledende intervaller for det ved forsoeg bestemte gennemsnitlige indholds afvigelse (efter eventuel korrektion for genfinding) fra den sande vaerdi, som foelger:

Ved gentagne analyser af et referencestof under reproducerbarhedsbetingelser er de typiske vaerdier for variationskoefficienten (C.V.) mellem laboratorier beregnet efter Horwitz-ligningen [(C.V.(%) = 2(5) 0,5 logC)], hvor C er indholdet udtrykt som en potens af 10), som foelger:

typisk mellem halvdelen og to tredjedele af ovennaevnte vaerdier. 1.2.3.4. Paavisningsgraense:

Egnet til formaalet (se 1.2.6.1).

1.2.3.5. Bestemmelsesgraense:

Egnet til formaalet (se 1.2.6.2).

1.2.3.6. Foelsomhed:

Egnet til formaalet.

1.2.3.7. Praktisk anvendelighed:

Hurtighed og omkostninger er af mindre betydning sammenholdt med screening-metoder.

Hvad angaar verifikationsmetoder er de fleste anvendelighedsaspekter af mindre betydning sammenholdt med de oevrige kriterier, som er opstillet i denne beslutning. Det er normalt tilstraekkeligt, at der er de fornoedne reagenser og det fornoedne apparatur til raadighed.

1.2.4. Kalibreringskurver

Hvis metoden afhaenger af en kalibreringskurve, skal der gives foelgende oplysninger:

- den matematiske formel, som beskriver kalibreringskurven

- acceptable intervaller, inden for hvilke kalibreringskurvens parametre kan variere fra dag til dag

- kalibreringskurvens arbejdsomraade.

Saa vidt muligt boer der anvendes passende interne standarder og referencestoffer til kvalitetskontrol af verifikationsmetoden, kalibreringskurver, og der boer gives naermere oplysninger om variablernes varians, som i hvert fald gaelder for kalibreringskurvens arbejdsomraade.

1.2.5. Foelsomhed over for interferens

1.2.5.1. For alle forsoegsbetingelser, som kan variere i praksis (f.eks. reagensernes stabilitet, proevestoffets sammensaetning, pH, temperatur), boer alle aendringer, som kan paavirke analyseresultaterne, angives. I metodebeskrivelsen skal det forklares, hvorledes eventuel interferens kan undgaas. Om noedvendigt skal der beskrives alternative paavisningsprincipper for verifikation.

1.2.5.2. Ved co-kromatografi maa der kun fremkomme en top, og foroegelsen af tophoejden (eller arealet) er lig med maengden af tilsat analysand. I forbindelse med GC eller LC skal bredden i halv hoejde vaere inden for omraadet af 90 til 110 % af den oprindelige bredde, og retentionstiderne skal vaere identiske inden for en margen af 5 %. I forbindelse med TLC-metoder maa kun den plet, der antages at tilhoere analysanden blive kraftigere; der maa ikke fremkomme en ny plet, og udseendet maa ikke aendres.

1.2.5.3. Det er af stoerste betydning, at interferens fra den paagaeldende matrix' bestanddele undersoeges.

1.2.6. Forholdet mellem tilladte restkoncentrationer og analysegraenser

1.2.6.1. For stoffer, der ikke maa anvendes til husdyr, skal analysemetodens paavisningsgraense vaere tilstraekkeligt lav til, at restkoncentrationer, der kan forventes efter ulovlig brug, vil blive paavist med mindst 95 % sandsynlighed.

1.2.6.2. For stoffer med en oevre graensevaerdi maa metodens bestemmelsesgraense plus tre gange metodens standardafgivelse for en proeve med et indhold svarende til den oevre graensevaerdi ikke overskride denne vaerdi.

1.2.6.3. For stoffer med en oevre graensevaerdi skal metoden valideres ved den vaerdi og ved halvdelen og det dobbelte af den vaerdi.

2. KRITERIER FOR IDENTIFICERING OG KVANTITATIV BESTEMMELSE AF RESTKONCENTRATIONER

2.1. Generelt

Laboratorier, der udfoerer analyser med henblik paa endelig bekraeftelse af tilstedevaerelsen af restkoncentrationer af organiske stoffer med lav molekylvaegt, soerger for, at kriterierne for fortolkning af resultaterne opfyldes i overensstemmelse med kravene i dette afsnit. Kriterierne er udformet til identifikation af analysanden og skal forhindre falske positive resultater. For at blive betragtet som positive skal analyseresultaterne opfylde kriterierne for den relevante analysemetode.

2.2. Almindelige betragtninger vedroerende analysemetoden som helhed

2.2.1. Tilberedning af proeveoploesningen

Proeven udtages, behandles og tilberedes saaledes, at der er stoerst mulig chance for at paavise analysanden, saafremt denne er til stede.

2.2.2. Foelsomhed over for interferens

Der forelaegges oplysninger som anfoert under 1.2.5 (foelsomhed over for interferens).

2.2.3. Almindelige kriterier for metoden som helhed

2.2.3.1. Metodens specificitet (1.1.7), paavisningsgraense (1.1.10) og bestemmelsesgraense (1.1.11) for analysanden i det relevante proevemateriale skal vaere kendt.

NB: Disse oplysninger kan faas fra forsoegsdata og/eller teoretiske betragtninger.

2.2.3.2. Ved et positivt resultat maa analysandens fysiske og kemiske adfaerd under analysen ikke kunne skelnes fra den tilsvarende standaranalysands adfaerd i det givne proevemateriale.

2.2.3.3. Analysens positive eller negative resultat er kun gyldigt inden for metodens specificitet, paavisningsgraense og bestemmelsesgraense for den paagaeldende analysand og det paagaeldende proevemateriale.

2.2.3.4. Referencemateriale eller materialer, der er tilsat en kendt maengde analysand, boer saa vidt muligt gennemgaa hele proceduren samtidigt med hver enkelt serie proeveoploesninger, der analyseres. Subsidiaert kan der tilsaettes en intern standard til proeveoploesningerne.

2.2.4. Kriterier for off-line fysisk og/eller kemisk forudgaaende opkoncentrering, oprensning og separation

2.2.4.1. Analysanden skal vaere til stede i den fraktion, der er typisk for den tilsvarende standardanalysand i det givne proevemateriale under de samme forsoegsbetingelser.

2.2.4.2. Der forelaegges retentionsdata for standarder, kontrolproeveoploesninger og analyseproever sammen med det endelige resultat: positivt eller negativt.

2.2.5. Kriterier for kvantitative maalinger

2.2.5.1. Genfindingen skal maales og specificeres for alle kvantitative maalinger.

2.2.5.2. Variationen ved genfinding i samme laboratorium boer vaere saa lav som muligt.

2.2.5.3. Det skal tydeligt angives, hvorvidt de endelige resultater er blevet korrigeret for genfinding. I givet fald skal korrektionsmetoden beskrives.

2.3. Kriterier for analysemetoder, som kun maa anvendes til verifikation kombineret med andre metoder

2.3.1. Kvalitetskrav til bestemmelse af en analysand ved hjaelp af IA

2.3.1.1. Kalibreringskurvens arbejdsomraade skal specificeres og skal normalt daekke et koncentrationsomraade paa mindst en dekade.

2.3.1.2. Der kraeves mindst seks kalibreringspunkter, der er passende fordelt paa kalibreringskurven.

2.3.1.3. Passende kvalitetskontrolparametre skal vaere paa linje med parametrene for foregaaende assays, f.eks. NSB og kalibreringskurvens parametre.

2.3.1.4. Der skal medtages kontrolproeveoploesninger i hvert assay. Koncentrationsniveauer: nul og i den nedre, mellemliggende og oevre del af arbejdsomraadet. Resultaterne herfor skal vaere paa linje med tidligere assays.

Alle raadata for kontrolproeveoploesningerne og analyseproeven forelaegges sammen med det endelige resultat: positivt eller negativt.

2.3.2. Kriterier for bestemmelse af en analysand ved hjaelp af GC eller LC med ikke-specifik detektion

2.3.2.1. Analysanden skal elueres ved den retentionstid, der er typisk for den tilsvarende standardanalysand under de samme forsoegsbetingelser.

2.3.2.2. Den naermeste top i kromatogrammet skal vaere adskilt fra den top, der tilskrives analysanden, med mindst en hel bredde ved 10 % af hoejden.

2.3.2.3. For at faa yderligere oplysninger kan der anvendes co-kromatografi og kromatografi med mindst to kolonner med forskellig polaritet.

2.3.3. Kriterier for bestemmelse af en analysand ved hjaelp af TLC

2.3.3.1. Analysandens Rf-vaerdi(er) skal stemme overens med den (de) Rf-vaerdi(er), der er typisk(e) for standardanalysanden. Dette krav er opfyldt, naar analysandens Rf-vaerdi(er) ligger inden for ± 3 % af standardanalysandens Rf-vaerdi(er) under de samme forsoegsbetingelser.

2.3.3.2. Analysandens udseende maa ikke kunne skelnes fra standardanalysandens.

2.3.3.3. Centrum af den stofplet, der er naermest den plet, der tilhoerer analysanden, skal vaere adskilt herfra med mindst halvdelen af summen af pletternes diameter.

2.3.3.4. For at faa yderligere oplysninger kan der anvendes co-kromatografi og/eller todimensional TLC.

2.4. Kriterier for analysemetoder, som maa anvendes til verifikation

2.4.1. Kriterier for bestemmelse af en analysand ved hjaelp CL/IA eller CL/IMG

2.4.1.1. Ved LC/IMG skal analysandtoppen i IMG bestaa af mindst 5 LC-fraktioner.

2.4.1.2. Kriterierne i 2.2.4.1 og 2.2.4.2 skal opfyldes.

2.4.1.3. Reagenser

Det skal specificeres, hvor antistoffet og andre reagenser stammer fra, og hvilke egenskaber de har.

2.4.1.4. Kalibreringskurve

Da metoden afhaenger af kalibreringskurver, skal der gives de oplysninger, som er anfoert under 1.2.4 (kalibreringskurver).

Kvalitetskravene gaeldende for IA (2.3.1.1 til 2.3.1.4) skal opfyldes.

2.4.1.5. Hvis metoden ikke anvendes kombineret med andre metoder, skal der til bekraeftelse udfoeres to forskellige LC-separationer eller to immunogrammer med forskellige antistoffer.

2.4.2. Kriterier for bestemmelse af en analysand ved hjaelp af LC-SP

2.4.2.1. Kriterierne i 2.3.2.1 og 2.3.2.2 skal opfyldes.

2.4.2.2. Absorptionsmaksimaene i analysandens spektrum skal vaere paa de samme boelgelaengder som standardanalysandens med en afvigelsesmargen, der afhaenger af detektionssystemets oploesning. Ved diodearray-detektion ligger denne typisk inden for ± 2 nm.

2.4.2.3. Analysandens spektrum over 220 nm maa ikke vaere synligt forskelligt fra standardanalysandens spektrum for de dele af de to spektre, der har en relativ absorbans & le; 10 %. Dette kriterium er opfyldt, naar de samme maksima er til stede, og forskellen mellem de to spektre ikke paa noget punkt er stoerre end 10 % af standardanalysandens absorbans.

2.4.2.4. Hvis metoden ikke anvendes kombineret med andre metoder, er det til verifikation obligatorisk at udfoere co-kromatografi i LC-fasen. Se 1.2.5.2 med hensyn til kravene til co-kromatografi.

2.4.3. Kriterier for bestemmelse af en analysand ved hjaelp af TLC-SP

2.4.3.1. Metoden skal opfylde kriterierne for TLC (2.3.3.1 til 2.3.3.3).

2.4.3.2 Absorptionsmaksima i analysandens spektrum skal vaere paa de samme boelgelaengder som standardanalysandens med en afvigelsesmargen, der afhaenger af detektionssystemets oploesning.

2.4.3.3. Analysandens spektrum maa ikke vaere synligt forskelligt fra standardanalysandens.

2.4.3.4. Hvis metoden ikke anvendes kombineret med andre metoder, er det til bekraeftelse obligatorisk at udfoere co-kromatografi i TLC-fasen. Se 1.2.5.2 med hensyn til kravene til co-kromatografi.

2.4.4. Kriterier for bestemmelse af en analysand ved hjaelp af CG-SM

2.4.4.1. GC-kriterier

2.4.4.1.1. Kriterierne i 2.3.2.1 og 2.3.2.2 skal opfyldes.

2.4.4.1.2. Der anvendes en intern standard, hvis der findes et egnet stof til dette formaal. Det skal helst vaere en stabil isotopmaerket form af analysanden eller, hvis en saadan ikke findes, en beslaegtet standard med en retentionstid, der ligger taet paa analysandens.

2.4.4.1.3. Forholdet mellem analysandens retentionstid og den interne standards, dvs. analysandens relative retentionstid, skal vaere den samme som standardanalysandens med en margen paa ± 0,5 % i den givne matrix.

2.4.4.1.4. Naar metoden skal anvendes til verifikation og der ikke anvendes nogen intern standard, skal analysanden ogsaa identificeres ved co-kromatografi.

2.4.4.2. Kriterier for LRMS

2.4.4.2.1. Naar metoden skal anvendes til screening, er det et minimumskrav, at den hyppigst forekommende diagnostiske ions intensitet maales.

2.4.4.2.2. Naar metoden skal anvendes til verifikation, skal saa vidt muligt mindst fire diagnostiske ioners intensitet maales. Hvis forbindelsen ikke giver fire diagnostiske ioner med den anvendte metode, skal identifikationen af analysanden baseres paa resultaterne af mindst to uafhaengige GC-LRMS-metoder med forskellige derivater og/eller ioniseringsmetoder, som hver frembringer to eller tre diagnostiske ioner.

Molekylarionen skal saa vidt muligt vaere en af de udvalgte diagnostiske ioner.

2.4.4.2.3. Alle de diagnostiske ioners relative hyppighed i analysanden skal stemme overens med standaranalysandens, saa vidt muligt med en margen paa ± 10 % (EI mode) eller ± 20 % (CI mode).

Kriterier for identifikation af en analysand ved hjaep af IR

2.4.5.1. Definition af egnede toppe

Egnede toppe er absorptionsmaksima i standardanalysandens IR-spektrum, der opfylder foelgende krav.

2.4.5.1.1. Absorptionsmaksimummet ligger i boelgetalsomraadet 1 800 til 500 cm 1.

2.4.5.1.2. Absorptionens intensitet er ikke mindre end:

a) en specifik molaer absorbans paa 40 i forhold til nullinjen og 20 forhold til grundlinjen eller

b) en relativ absorbans paa 12,5 % af absorbansen af den mest intense top i omraadet 1 800 til 500 cm 1, naar begge maales i forhold til nullinjen, og 5 % af absorbansen af den mest intense top i omraadet 1 800 til 500 cm 1, naar begge maales i forhold til deres grundlinje.

NB: Skoent egnede i henhold til litra a) kan foretraekkes af teoretiske grunde, er toppene i henhold til litra b) lettere at bestemme i praksis.

2.4.5.2. Antallet af toppe i analysandens IR-spektrum, hvis frekvenser svarer til en egnet top i standardanalysandens spektrum, bestemmes inden for en margen paa ± 1 cm 1.

2.4.5.3. IR-kriterier.

2.4.5.3.1. Der skal vaere absorption i alle omraader af analysandens spektrum, som svarer til en egnet top i standardanalysandens referencespektrum.

2.4.5.3.2. Der kraeves mindst seks egnede toppe i standardanalysandens IR-spektrum. Hvis der er mindre end seks egnede toppe, kan det paagaeldende spektrum ikke anvendes som referencespektrum.

2.4.5.3.3. »Overensstemmelsen«, dvs. procentdelen af egnede toppe i analysandens IR-spektrum, skal vaere mindst 50.

2.4.5.3.4. Hvis en egnet top ikke har en noejagtig modsvarende top i analysandens spektrum, skal det paagaeldende omraade i dette spektrum vaere foreneligt med, at der kunne vaere en modsvarende top.

2.4.5.3.5. Proceduren kan kun anvendes paa absorptionstoppe i proeveoploesningens spektrum med en intensitet paa mindst 3 gange mellem toppene.

2.5. Andre analysemetoder

Til screening eller verifikation kan der anvendes andre analysemetoder eller kombinationer af metoder end dem, der er beskrevet i afsnit 2.3 og 2.4 (f.eks. CL - SM, MS - MS, CG - IR), saafremt de opfylder tilsvarende kriterier, saa analysanden kan identificeres entydigt paa det givne niveau.

TILLAEG

Liste over forkortelser og symboler CI = kemisk ionisering

EI = electron impact ionisering

g = gram

GC = gaskromatografi

IA = immunoassay

IAC = immunoaffinitetskromatografi

IMG = immunogram

IR = infraroed spektrometri

kg = kilogram (103 g)

l = liter

LC = vaeskekromatografi

LRMS = massespektrometri med lav oploesningsevne

mg = milligram (10 3 g)

MS = massespektrometri

ng = nanogram (10 9 g)

NSB = ikke-specifik binding

Rf = tilbagelagt afstand i forhold til oploesningsmiddelfronten

SP = spektrometri, f.eks. med diodearray-detektion

TLC = tyndtlagskromatografi

mg = mikrogram (10 6 g)

/ = off-line koblede teknikker

- = on-line koblede teknikker

f.eks. LC/GC - MS = LC off-line efterfulgt af GC med on-line MS

(1) EFT nr. L 275 af 26. 9. 1986, s. 36.

(2) Den Internationale Standardiseringsorganisation: Statistikker - termer og symboler.

(3) EFT nr. L 372 af 31. 12. 1985, s. 50.

(4) Den Internationale Standardiseringsorganisation: Analysemetoders praecision - bestemmelse af en standardanalysemetodes repeterbarhed og reproducerbarhed ved afproevninger i mange laboratorier.