KOMMISSIONENS BESLUTNING af 29. juli 1991 om dyresundhedsmaessige bestemmelser og udstedelse af sundhedscertifikat for indfoersel af tyresaed fra USA (91/479/EOEF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR - under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 88/407/EOEF af 14. juni 1988 om fastsaettelse af de veterinaerpolitimaessige krav i forbindelse med handelen inden for Faellesskabet med frosset tyresaed og indfoersel heraf (1), senest aendret ved direktiv 90/425/EOEF (2), saerlig artikel 10 og 11, og ud fra foelgende betragtninger:

USA er opfoert paa den ved Kommissionens beslutning 90/14/EOEF af 20. december 1989 om opstilling af en liste over tredjelande, hvorfra medlemsstaterne tillader indfoersel af frosset tyresaed (3);

den dyresundhedsmaessige situation i USA synes at vaere god og kontrolleret af velstrukturerede og organiserede veterinaermyndigheder, isaer hvad angaar sygdomme der kan overfoeres gennem saed;

de ansvarlige veterinaermyndigheder i USA har bekraeftet, at USA i de sidste tolv maaneder har vaeret fri for kvaegpest, mund- og klovesyge og oksens ondartede lungesyge, og at der i denne periode ikke er vaccineret mod disse sygdomme;

de ansvarlige veterinaermyndigheder i USA har forpligtet sig til inden for 24 timer via telex eller telefax over for Kommissionen for De Europaeiske Faellesskaber og medlemsstaterne at bekraefte enhver forekomst af en af de ovennaevnte sygdomme eller af bluetongue eller epizootisk haemoragisk sygdom og at give meddelelse om enhver aendring i vaccinationspolitikken i forbindelse med disse sygdomme og - inden for en rimelig frist - om ethvert forslag til aendring af USA's regler for indfoersel af husdyr eller saed eller embryoner fra saadanne dyr;

de ansvarlige veterinaermyndigheder i USA har med hensyn til kvaegtuberkulose og -brucellose givet dyresundhedsmaessige garantier, som svarer til de i Faellesskabet gaeldende;

de ansvarlige veterinaermyndigheder i USA har forpligtet sig til at foere officielt tilsyn med udstedelsen af certifikater i forbindelse med denne beslutning og at sikre, at alle relevante certifikater, afvigelser og resultater af laboratorieundersoegelser, som udstedelsen af certifikater kan vaere baseret paa, er officielt registreret i mindst tolv maaneder efter afsendelsen af den saed, de vedroerer;

de ansvarlige veterinaermyndigheder i USA har forpligtet sig til officielt at godkende tyrestationer til udfoersel af saed til Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab som fastsat i artikel 9 i direktiv 88/407/EOEF;

de ansvarlige veterinaermyndigheder i USA har forpligtet sig til for hver enkelt officielt godkendt tyrestation at fastslaa og omgaaende meddele Kommissionen for De Europaeiske Faellesskaber den dato, hvor al aktivitet hos de Culicoides-arter, der kan overfoere bluetongue eller epizootisk haemoragisk sygdom, ophoerer, og den dato, hvor saadanne Culocoides-arter atter bliver aktive;

de dyresundhedsmaessige bestemmelser og udstedelsen af sundhedscertifikat maa tilpasses den dyresundhedsmaessige situation i det paagaeldende tredjeland;

de i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Veterinaerkomité - VEDTAGET FOELGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

1. Indtil den 31. december 1992 kan medlemsstaterne give tilladelse til indfoersel fra USA af saed fra tyre, som ikke har reageret negativt paa proever for bluetongue eller proeven for epizootisk haemoragisk sygdom som foreskrevet i bilag I A, men tilladelsen skal gives i henhold til bilag II A og II B, og det skal sikres, at saeden ikke kommer til at indgaa i handelen mellem medlemsstaterne. Kommissionen tager inden ovennaevnte dato dette stykke op til revision.

2. Medlemsstaterne tillader indfoersel fra USA af tyresaed, som opfylder betingelserne i certifikatet i bilag I A og eventuelt certifikatet i bilag I B.

Artikel 2

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 29. juli 1991.

Paa Kommissionens vegne Ray MAC SHARRY Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 194 af 22. 7. 1988, s. 10.

(2) EFT nr. L 224 af 18. 8. 1990, s. 29.

(3) EFT nr. L 8 af 11. 1. 1990, s. 71.

BILAG I A

SUNDHEDSCERTIFIKAT for indfoersel af tyresaed fra USA

Certifikat nr.: .

Afsendelsesland: USA Ansvarlig myndighed: United States Department of Agriculture - APHIS

I. Identifikation af saeden:

>TABELPOSITION>

II. Saedens oprindelse:

> TABELPOSITION>

III. Saedens destination:

>TABELPOSITION>

IV. Sundhedserklaering:

Undertegnede embedsdyrlaege attesterer,

1) at USA i en periode begyndende mindst tolv maaneder inden foerste opsamling af den ovenfor beskrevne saed og sluttende 30 dage efter sidste opsamling af denne saed har vaeret fri for kvaegpest,

2) at den godkendte tyrestation, hvor den ovenfor beskrevne saed er opsamlet:

a) er blevet godkendt af USA's statsveterinaermyndighed til udfoersel af saed til Det Europaeiske Faellesskab, fordi den opfylder alle betingelserne i dette punkt b) er beliggende i centrum af et omraade med en radius paa 50 km, hvor der i en periode begyndende mindst tre maaneder inden foerste opsamling af den ovenfor beskrevne saed og sluttende tredive dage efter sidste opsamling af denne saed, ikke er forekommet tilfaelde af mund- og klovesyge, oksens ondartede lungesyge eller vesikulaer stomatitis c) i en periode begyndende mindst tre maaneder inden foerste opsamling af den ovenfor beskrevne saed og sluttende 30 dage efter sidste opsamling af denne saed har vaeret fri for mund- og klovesyge og brucellose d) i en periode begyndende mindst 30 dage inden foerste opsamling af den ovenfor beskrevne saed og sluttende 30 dage efter sidste opsamling af denne saed har vaeret fri for rabies, miltbrand, tuberkulose, enzootisk kvaegleukose og symptomer paa smitte med Trichomonas foetus, Campylobacter foetus, Leptospira canicola, Leptospira pomona, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo og Leptospira icterohaemorrhagica e) kontrolleres af en statsdyrlaege mindst to gange om aaret, hvor alle forhold, der vedroerer betingelserne i dette certifikat, tages under overvejelse og verificeres f) er under permanent tilsyn af en stationsdyrlaege, og at tilsynet foregaar saaledes,

i) at dyr kun maa indsaettes med udtrykkelig tilladelse fra tyrestationens dyrlaege og enhver indsaettelse og fjernelse af dyr registreres ii) at der foeres et register over race, foedselsdato, identifikation og sygdomshistorie for alle kreaturer paa tyrestationen og over alle diagnostiske undersoegelser og resultaterne deraf, alle behandlinger og alle vaccinationer af dyrene paa stedet iii) at uautoriserede personer formenes adgang og autoriserede besoegende skal opfylde de betingelser, som tyrestationens dyrlaege har fastsat iv) at der kun beskaeftiges personale med teknisk kompetence og den fornoedne oplaering i desinfektions- og hygiejnemetoder til bekaempelse af sygdomsspredning g) kun holder kvaeg, idet dog andre husdyr, der er strengt noedvendige for tyrestationens normale drift, kan indsaettes, hvis de ikke udgoer nogen smittefare for dyr af kvaegrace og opfylder de betingelser, der er fastsat af tyrestationens dyrlaege h) er opfoert saaledes,

i) at den har staldfaciliteter, som er fysisk adskilt fra lokalerne til behandling og opbevaring af saeden, og at disse er fysisk adskilt fra hinanden ii) at den har isolationsfaciliteter til syge dyr iii) at den har saedopsamlingsfaciliteter med et saerskilt lokale til rengoering og desinfektion eller sterilisering af udstyr iv) at den har et saedbehandlingsrum og et saedopbevarinsgrum (som ikke noedvendigvis behoever at befinde sig paa samme sted) v) at kontakt med husdyr udenfor forhindres vi) at hele tyrestationen nemt kan rengoeres og desinficeres i hvilket tilfaelde en godkendt tyrestation kan vaere beliggende samme sted som et eller flere andre tyrestationer 3) at tyrene paa den godkendte tyrestation i den periode, hvor den ovenfor beskrevne saed opsamles og opbevares:

a) har befundet sig paa den godkendte tyrestation den 1. januar 1990 og uafbrudt siden da og efter deres ankomst har vaeret underkastet alle de nedenfor i litra d) omhandlede proever med de foreskrevne resultater, eller b) er overfoert fra en godkendt tyrestation uden at komme i kontakt med dyr med en lavere sundhedsstatus og i givet fald i et transportmiddel, som er blevet rengjort og desinficeret inden brug, eller c) er indsat med tilladelse fra tyrestationens dyrlaege og ikke viser kliniske tegn paa sygdom, og at i) de stammer fra en besaetning, der er erklaeret fri for tuberkulose af statsveterinaermyndigheden, eller har befundet sig i tuberkulosefri omraader som defineret af statsveterinaermyndigheden og ikke paa noget tidspunkt har vaeret holdt i besaetninger med lavere status ii) de stammer fra en besaetning, som er erklaeret fri for brucellose af statsveterinaermyndigheden, eller har befundet sig i brucellosefri omraader eller omraader i klasse A som defineret af statsveterinaermyndigheden og ikke paa noget tidspunkt har vaeret holdt i besaetninger med lavere status iii) - de stammer fra besaetninger, hvor der i de sidste tre aar ikke har vaeret symptomer paa enzootisk kvaegleukose, eller - er foedt af koeer, som inden for 30 dage forud for deres soenners indsaettelse i isolationsfaciliteterne har vaeret underkastet en serologisk proeve for enzootisk kvaegleukose efter metoden i bilag G til Raadets direktiv 64/432/EOEF med negativt resultat, eller - inden for 30 dage forud for indsaettelsen i de officielt godkendte isolationsfaciliteter eller efter at vaere blevet to aar, alt efter hvilken begivenhed der indtraeffer sidst, har vaeret underkastet en serologisk proeve for enzootisk kvaegleukose efter metoden i bilag G til Raadets direktiv 64/432/EOEF med negativt resultat iv) de inden for 30 dage forud for indsaettelsen i de officielt godkendte isolationsfaciliteter har vaeret underkastet foelgende proever med negativt resultat i hvert enkelt tilfaelde:

- en United States Department of Agriculture (USDA) tuberkulinproeve i kaudalfolden - en USDA serologisk standardreagensglasproeve for brucellose, der er negativ med under 30 internationale agglutinationsenheder pr. ml, og en komplementbindingsproeve med en brucellatiter paa under 20 EOEF-enheder pr. ml (20 ICFT-enheder) - en serologisk proeve for enzootisk kvaegleukose efter metoden i bilag G til Raadets direktiv 64/432/EOEF - en serumneutralisationsproeve eller ELISA-proeve for rhinotracheitis infectiosa bovis/vulvovaginitis infectiosa pustulosa bovis virus - en virusisolationsproeve for bovin virusdiarré af blodproever i modtagelige cellekulturer med efterfoelgende fluorescens-antistofproeve eller immunoperoxidaseproeve; hvis tyrene paa indsaettelsèstidspunktet endnu ikke er seks maaneder gamle, udsaettes proeven, indtil de har naaet denne alder og foelgende proever med negativt resultat i hvert enkelt tilfaelde, undtagen hvor dette certifikat gaelder for saed, der er opsamlet og afskibet foer den 1. januar 1993, og hvor den importerende medlemsstat skriftligt har erklaeret, at den anvender betingelserne i artikel 1, stk. 1, i Kommissionens beslutning 91/479/EOEF:

- en blokerende ELISA-proeve for bluetongue ved hjaelp af et gruppespecifikt monoklonalt antistof efter metoden i bilag IV A til Kommissionens beslutning 91/479/EOEF - en agar-gel-immunodiffusionsproeve for alle serotyper af epizootisk haemoragisk sygdom, der forekommer i USA, efter metoden i bilag IV B til Kommissionens beslutning 91/479/EOEF idet alle eller nogle af de ovennaevnte proever kan vaere foretaget, mens dyrene var i de officielt godkendte isolationsfaciliteter, under forudsaetning af, at isolationsperioden paa tredive dage for de andre tyre i isolationsfaciliteterne, hvis resultatet af en proeve, der i henhold til dette certifikat skal give et negativt resultat, har vaeret andet end negativt, foerst betragtes som paabegyndt, naar det paagaeldende dyr er blevet fjernet fra faciliteterne og faciliteternes tuberkulose- eller brucellosestatus eventuelt er blevet genetableret,

v) de, efter at de i nr. iv) beskrevne prae-isolationsproever er afsluttet, i en periode paa mindst 30 dage har vaeret anbragt i officielt godkendte isolationsfaciliteter, som paa tidspunktet for deres indsaettelse har vaeret beliggende i centrum af et omraade med en radius paa 10 km, hvor der ikke er forekommet noget tilfaelde af mund- og klovesyge, kvaegpest, oksens ondartede lungesyge eller vesikulaer stomatitis, og som i mindst tre maaneder har vaeret fri for mund- og klovesyge og brucellose og i mindst 30 dage for rabies, miltbrand, tuberkulose og enzootisk kvaegleukose, og hvor de har vaeret underkastet foelgende proever med negativt resultat i hvert enkelt tilfaelde:

- en USDA serologisk standardreagensglasproeve for brucellose, der er negativ med under 30 internationale agglutinationsenheder pr. ml, og en komplementbindingsproeve med en brucellatiter paa under 20 EOEF-enheder pr. ml (20 ICFT-enheder) - enten en immuno-fluorescensantistofproeve eller en dyrkningsproeve for Campylobacter foetus-infektion paa en proeve af forhudsmaterialet eller en skylning af den kunstige skede - en mikroskopisk undersoegelse og en dyrkningsproeve for Trichomonas foetus-infektion paa en proeve af forhudsmaterialet eller en skylning af den kunstige skede - en serumneutralisationsproeve eller ELISA-proeve til paavisning af rhinotracheitis infectiosa bovis/vulvovaginitis infectiosa pustulosa bovis virus forudsat at isolationsperioden paa 30 dage, hvis resultatet af en proeve har vaeret andet end negativt, for de oevrige dyr foerst er blevet betragtet som paabegyndt, naar det paagaeldende dyr er blevet fjernet fra faciliteterne og faciliteternes brucellosestatus eventuelt er blevet genetableret og hvor de er blevet behandlet mod leptospirose ved indsproejtning af streptomycin eller dihydrostreptomycin eller en blanding heraf (25 mg pr. kg levende vaegt) to gange med et interval paa 14 dage d) de mindst en gang om aaret har vaeret underkastet foelgende proever med negativt resultat i hvert enkelt tilfaelde:

i) en USDA tuberkulinproeve i kaudalfolden ii) en USDA serologisk standardreagensglasproeve for brucellose, der er negativ med under 30 internationale agglutinationsenheder pr. ml, og en komplementbindingsproeve med en brucellatiter paa under 20 EOEF-enheder pr. ml (20 ICFT-enheder) iii) en serologisk proeve for enzootisk kvaegleukose efter metoden i bilag G til direktiv 64/432/EOEF iv) en serumneutralisationsproeve eller ELISA-proeve for rhinotracheitis infectiosa bovis/vulvovaginits infectiosa pustulosa bovis, idet der, naar det gaelder saed opsamlet inden den 31. december 1992, og hvis den ansvarlige myndighed i indfoerselsmedlemsstaten har afgivet skriftlig erklaering herom, kan godkendes saed fra tyre, der har reageret positivt paa en af disse proever, under forudsaetning af at en virusisolering og/eller podningsproeve for ovennaevnte sygdomskompleks er foretage paa denne saed med negativt resultat; i sidstnaevnte tilfaelde er proeven foretaget paa ........ (laboratorium) den ........ (dato) v) enten en immuno-fluorescensantistofproeve eller en dyrkningsproeve for Campylobacter foetus-infektion paa en proeve af forhudsmateriale eller en skylning af den kunstige skede, idet der dog ikke kraeves en saadan proeve for dyr, som ikke anvendes til saedproduktion, forudsat at proeven foretages, foer saedproduktionen genoptages vi) en serologisk proeve for canicola, pomona, grippotyphosa, hardjo og icterohaemorrhagica serotyper af Leptospira,

og mindst to gange om aaret foelgende proever med negativt resultat i hver enkelt tilfaelde, undtagen hvor dette certifikat gaelder for saed, der er opsamlet og afskibet foer den 1. januar 1993, og hvor den importerende medlemsstats veterinaermyndighed skriftligt har erklaeret, at den anvender betingelserne i artikel 1, stk. 1, i Kommissionens beslutning 91/479/EOEF - en blokerende ELISA-proeve for bluetongue ved hjaelp af et gruppespecifikt monoklonalt antistof efter metoden i bilag IV A til Kommissionens beslutning 91/479/EOEF - en agar-gel-immunodiffusionsproeve for alle serotyper af epizootisk haemoragisk sygdom, der forekommer i USA, efter metoden i bilag IV B til Kommissionens beslutning 91/479/EOEF idet alle de ovennaevnte proever (bortset fra tuberkulinproeven) er foretaget paa et laboratorium, der er godkendt til formaalet af statsveterinaermyndigheden i USA,

4) at den ovenfor beskrevne saed - er klassificeret som vaerende fri for bluetongue i henhold til definitionen i bilag II A til Kommissionens beslutning 91/479/EOEF, saerlig punkt 5 (*), eller - er klassificeret som proevet for bluetongue i henhold til definitionen i bilag II B til Kommissionens beslutning 91/479/EOEF, saerlig punkt 2, og hvor den importerende medlemsstats veterinaermyndighed skriftligt har erklaeret, at den anvender betingelserne i artikel 1, stk. 1, i Kommissionens beslutning 91/479/EOEF (*) (*) Det ikke gaeldende overstreges og a) er opsamlet uden brug af elektroejakulations- eller elektrostimuleringsmetoder paa en godkendt tyrestation fra tyre i) som til stadighed har befundet sig paa USA's omraade i en periode begyndende seks maaneder inden foerste opsamling af den ovenfor beskrevne saed og sluttende paa dagen for dens afsendelse ii) som, medmindre andet fremgaar af en skriftlig fravigelse i henhold til punkt 3, d), iv) ovenfor eller artikel 1, stk. 1, i Kommissionens beslutning 91/479/EOEF, ikke har reageret positivt paa nogen af proeverne, som omhandles i dette certifikat iii) som ikke har vaeret anvendt til naturlig bedaekning under opholdet paa den godkendte tyrestation iv) som har vaeret holdt paa den godkendte tyrestation i en sammenhaengende periode paa mindst 30 dage umiddelbart forud for saedopsamlingen v) som ikke har udvist kliniske tegn paa sygdom paa det paagaeldende tidspunkt b) er behandlet paa en godkendt tyrestation i) hvor der under opsamlingen af den ovenfor beskrevne saed ikke er foretaget behandling af anden saed end saed fra tyre paa godkendte tyrestationer eller saed fra tyre med samme sundhedsstatus som tyre paa godkendte tyrestationer under forudsaetning af at behandlingen i sidstnaevnte tilfaelde har fundet sted med saerskilt udstyr og paa andre tidspunkter end behandlingen af saed fra godkendte tyrestationer og at behandlingsfaciliteterne er blevet grundigt rengjort og desinficeret inden genanvendelse til behandling af saed fra tyre paa godkendte tyrestationer ii) der iagttager der strengeste hygiejnekrav, idet alle redskaber og alt udstyr, der kommer i kontakt med donortyrene eller med saeden, desinficeres eller steriliseres grundigt inden brug iii) der benytter tilsaetningsstoffer, fortyndingsmidler eller fyldstoffer, hvori eventuelle animalske produkter stammer fra kilder, som ikke frembyder nogen dyresundhedsmaessig fare, eller som er blevet behandlet, foer de er anvendt, saaledes at faren undgaas c) er beskyttet ved tilsaetning af foelgende antibiotika i de maengder, der har vaeret paakraevet for at frembringe de anfoerte koncentrationer i den endelige fortyndede saed:

mindst:

- 500 IE streptomycin pr. ml - 500 IE penicillin pr. ml - 150 ìg lincomycin pr. ml - 300 ìg spectinomycin pr. ml og straks derefter holdt ved en temperatur paa mindst 5° C (41° F) i mindst 45 minutter eller mindst:

- 50 ìg tylosin pr. ml - 250 ìg gentamycin pr. ml - 150 ìg lincomycin pr. ml - 300 ìg spectinomycin pr. ml idet kontakten mellem antibiotikumet og den ufortyndede saed er holdt i mindst tre minutter ved samme temperatur som blandingstemperaturen, og den ikke-glycerolholdige fraktion af fortyndingsmidlet er holdt paa en temperatur paa mindst 5° C (41° F) i mindst to timer d) er anbragt i individuelle containere (straa), der alle er maerket med opsamlingsdato, donortyrens race og identitet og oplysninger om den godkendte tyrestation, idet disse angivelser eller en del af dem kan vaere maerket i kode, hvis den ansvarlige myndighed i indfoerselsmedlemsstaten har faaet overladt en komplet noegle til denne kode, og under forudsaetning af at der er fuld overensstemmelse mellem maerkningen af hvert enkelt straa og identifikationen i dette certifikat e) er opbevaret i containere, som er blevet grundigt rengjort og desinficeret eller steriliseret inden brug, med anvendelse af koelemedier, som ikke tidligere er blevet anvendt til andre produkter af animalsk oprindelse, paa den godkendte tyrestation under tilsyn af tyrestationens dyrlaege i en periode paa mindst 30 dage inden afsendelsen f) ikke er udfoert efter datoen for en positiv proeve paa tyre paa tyrestationen, bortset fra en proeve for bluetongue, eller epizootisk haemoragisk sygdom som omhandlet i artikel 1, stk. 1, i Kommissionens beslutning 91/479/EOEF, og en proeve for rhinotracheitis infectiosa bovis/vulvovaginits infectiosa pustulosa bovis som omhandlet i en skriftlig fravigelse i henhold til punkt 3, d), iv), ovenfor, og inden tyrestationens sundhedsstatus er blevet genetableret g) afsendt i containere, som er blevet grundigt rengjort og desinficeret eller steriliseret inden brug, med anvendelse af koelemedier, som ikke tidligere er blevet anvendt til andre produkter af animalsk oprindelse, og som er blevet forseglet under statsdyrlaegens tilsyn forud for afsendelsen fra den godkendte tyrestation >TABELPOSITION>

BILAG I B

SUPPLERENDE CERTIFIKAT for overfoersel af saed fra en container til en anden med henblik paa afskibning fra USA til Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab

Undertegnede embedsdyrlaege attesterer at den saed, som nedenstaaende certifikater og segl henviser til, paa en godkendt tyrestation og under direkte tilsyn af undertegnede er blevet overfoert fra de containere, som den blev modtaget i med ubrudt forsegling til den container, som den skal sendes i til Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab.

>TABELPOSITION>

BILAG II A

Procedure for klassificering som bluetongue-fri af tyresaed bestemt til udfoersel fra USA til Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab

1. Alt kvaeg paa den godkendte tyrestation skal inden indsaettelsen og derefter med seks maaneders mellemrum underkastes en blokerende ELISA-proeve for antistoffer med bluetongue-virus og en AGID-proeve for antistoffer med alle stammer af epizootisk haemoragisk sygdomsvirus, som vides at forekomme i USA, i henhold til protokollerne i bilag IV A og B.

2. En tyr, der har reageret negativt paa de seneste proever som omtalt punkt 1, betegnes ved anvendelsen af denne beslutning som bluetongue seronegativ, medmindre eller indtil tyrens blod eller saed giver et positivt resultat af en af de proever, der omtales i dette bilag eller i bilag III.

3. Den vektorfri periode i sammenhaeng med en godkendt tyrestation defineres ved anvendelsen af denne beslutning som en periode begyndende 21 dage efter den dato, der fastlaegges af United States Department of Agriculture og straks meddeles ledelsen af den godkendt tyrestation og Kommissionen for De Europaeiske Faellesskaber, og hvor al aktivitet hos de Culicoides-arter, der kan overfoere bluetongue- eller epizootisk haemoragisk sygdomsvirus, ophoerer i det omraade, hvor tyrestationen er beliggende, og sluttende 21 dage efter den dato, der fastlaegges og meddeles paa samme maade, og hvor saadanne Culicoides-arter bliver aktive.

4. En saedopsamlingsperiode i forbindelse med opsamlingen af saed til udfoersel til Faellesskabet defineres ved anvendelsen af denne beslutning som en periode paa hoejst tre uger, hvori denne saed opsamles. Hvis den faktiske periode, hvori denne saed opsamles, er laengere end tre uger, opdeles denne i to eller flere opsamlingsperioder, som hver er paa hoejst tre uger og som hver behandles som en saerskilt opsamlingsperiode hvad angaar anvendelsen af de proever og procedurer, der vedroerer bluetongue og epizootisk haemoragisk sygdom som omtalt i denne beslutning.

5. Saed, der kan henfoeres til en af de nedenstaaende kategorier, klassificeres som fri for bluetongue ved udfoersel af saeden til Det Europaeiske Faellesskab:

a) saed, der er opsamlet i den vektorfri periode fra en bluetongue seronegativ tyr, naar en blodproeve paa den paagaeldende tyr, der er taget 21 dage efter saedopsamlingsperiodens afslutning, med negativt resultat er blevet underkastet en ELISA-proeve for antistoffer mod bluetongue-virus og en AGID-proeve for antistoffer mod alle serotyper af epizootisk haemoragisk sygdomsvirus, der vides at forekomme i USA, i henhold til protokollerne i bilag IV A og B b) saed, der opsamles uden for den vektorfri saeson, fra en bluetongue seronegativ tyr, naar en blodproeve paa den paagaeldende tyr, der er taget 21 dage efter saedopsamlingsperiodens afslutning, med negativt resultat er blevet underkastet en ELISA-proeve for antistoffer mod bluetongue-virus og en AGID-proeve for antistoffer mod alle serotyper af epizootisk haemoragisk sygdom, der vides at forekomme i USA, i henhold til protokollerne i bilag IV A og B, og naar blodproever, der er taget paa tyren paa de datoer, hvor den til udfoersel bestemte saed er blevet underkastet virusisolationsproceduren i bilag III med negativt resultat.

BILAG II B

Procedure for klassificering som bluetongue-testet af tyresaed bestemt til udfoersel fra USA til Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab

1. Definitionerne i bilag II A finder anvendelse.

2. Saed, der falder ind under en af de kategorier, som beskrives nedenfor, klassificeres som bluetongue-tested med henblik paa udfoersel af den til Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab:

a) saed, der er opsamlet i den vektorfri periode fra en tyr, som ikke er bluetongue seronegativ, naar en sammenligning af en blodproeve, der er taget i begyndelsen af den vektorfri periode, og en blodproeve, der er taget 21 dage efter saedopsamlingsperiodens afslutning, ikke viser tegn paa serokonversion eller paa en firedobbelt eller stoerre stigning i maengden af serumneutraliserende antistoffer mod nogen af de serotyper bluetongue-virus eller enzootiske haemoragisk sygdomsvirus, der vides at forekomme i USA, og naar blodproever, der er taget paa tyren paa datoerne for opsamlingen af den saed, der er bestemt til udfoersel til Faellesskabet, er blevet underkastet virusisolationsproceduren i bilag III med negativt resultat b) saed, der er opsamlet paa en hvilken som helst tid paa aaret fra en tyr, som ikke er seronegativ, naar en sammenligning af en blodproeve, der er taget i begyndelsen af den vektorfri periode, og en blodproeve, der er taget 21 dage efter afslutningen af samme periode, ikke viser tegn paa serokonversion eller paa en firedobbelt eller stoerre stigning i maengden af serumneutraliserende antistoffer mod nogen af de serotyper bluetongue-virus eller enzootisk haemoragisk sygdomsvirus, der vides at forekomme i USA, og naar blodproever, der er taget paa tyren paa datoerne for opsamlingen af den saed, der er bestemt til udfoersel, er blevet underkastet virusisolationsproceduren i bilag III med negativt resultat.

3. Der skal udstedes separate certifikater for bluetongue-testet saed og saed defineret som bluetongue-fri i henhold til bilag II A.

BILAG III

Procedure for virusisolation til paavisning af bluetongue-virus i blod i forbindelse med udfoersel af tyresaed fra USA til Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab

1. Der tages en blodproeve paa tyren de dage, hvor opsamlingen af saed til udfoersel finder sted (normalt to gange om ugen), og den indsproejtes subkutant og intradermalt i et faar, som ved en blokerende ELISA-proeve inden den foerste indsproejtning er fundet seronegativ senest 48 timer efter opsamlingen.

2. Der tages blodproever paa faaret til virusisolation to gange om ugen i tre uger begyndende paa datoen for den foerste indsproejtning som omtalt i punkt 1.

3. Blodproever fra tyren og faaret indsproejtes senest 48 timer efter opsamlingen i mindst seks hoenseaeg, der indeholder elleve dage gamle embryoner.

4. Hvis ingen embryoner doer, eller hvis embryoner doer inden for to dage efter indsproejtningen uden specifikke laesioner, betragtes proeven som negativ efter syv dage.

5. Materiale fra embryoner, der doer inden for to til syv dage, indsproejtes i hoenseaeg, der indeholder elleve dage gamle embryoner, og der anvendes mindst seks aeg for hvert doedt embryon.

6. Hvis indsproejtningen af materiale fra et doedt embryon foraarsager en embryondoedelighed paa 50 % eller mere, betragtes proeven som positiv. Viruset eller viraene serotypebestemmes, efter at de er overfoert til cellekultur, til bekraeftelse af tilstedevaerelsen af bluetongue-virus.

7. Der tages serum fra tyren to gange om ugen og fra faaret en gang om ugen i tre uger, og det underkastes den blokerende ELISA, der er beskrevet i bilag IV A, en serumneutralisationsproeve for antistoffer med bluetongue-virus, AGID-proeven, der er beskrevet i bilag IV B, og en serumneutralisationsproeve for antistoffer mod epizootisk haemoragisk sygdomsvirus.

8. Faaret underkastes atter en blokerende ELISA 21 dage efter den sidste indsproejtning af blod fra tyren.

9. Serokonversion eller en firedobbelt eller stoerre stigning i maengden af antistoftiter hos enten tyr eller faar er tegn paa igangvaerende eller nylig stedfunden infektion, og proeven betragtes som postiv.

10. Den serologiske proeve foretages paa alle proever under ét ved opsamlingsperiodens afslutning.

11. Saed frigives foerst til udfoersel, naar alle proever er afsluttet med negativt resultat.

BILAG IV A

Protokol for en blokerende eller kompetitiv enzym-kaede-immunitet-maaling med anvendelse af et gruppespecifikt monoklonalt antistof til paavisning af antistoffer mod bluetongue-virus

DEN KOMPETITIVE ELISA TIL PAAVISNING AF BLUETONGUE MED ANVENDELSE AF MONOKLONALT ANTISTOF 3-17-A3 Den kompetitive ELISA med anvendelse af monoklonalt antistof 3-17-A3 kan paavise antistoffer mod alle kendte serotyper af bluetongue-virus (BTV).

Proeveprincippet er, at reaktionen mellem BTV-antigen og et gruppespecifikt monoklonalt antistof (3-17-A3) afbrydes ved tilsaetning af fortyndinger af proeveserum. Tilstedevaerende antistoffer mod BTV i proeveserumet blokerer reaktionsevnen hos det monoklonale antistof (Mas) og resulterer i en formindskelse af den forventede farveudvikling ved tilsaetning af enzymsubstrat.

Materialer og reagenser:

1. Fladbundede mikrotiterplader.

2. Antigen: tilberedes som beskrevet nedenfor.

3. Blokerende buffer: 5 % (w/v) »Marvel« toerret maelkepulver, 0,1 % (v/v) Tween-20 (leveres som polyoxyethylensorbitanmonolauratsirup) i phosphatbufferet saltoploesning (PBS).

4. Monoklonalt antistof: 3-17-A3 (leveres som hybridom cellekultur supernatant), opbevaret ved 20° C eller frysetoerret, fortyndet i forholdet 1:50 med blokerende buffer inden brug, rettet mod det gruppespecifikke polypeptid p7.

5. Konjugat: kanin-antimuseglobulin (adsorberet og elueret), konjugeret med peberrodsperoxidase og opbevaret i moerke ved 4° C.

6. Substrat og kromogen: 0,2 g ortophenylendiamin (OPD) oploest i en buffer bestaaende af 2,553 g citronsyre og 4,574 g dinatriumhydrogenortophosphat tilsat destilleret vand op til 500 ml, opdelt i 25 ml alikvoter og opbevaret i moerke ved 20° C med tilsaetning af 12ìl/ml hydrogenperoxid (3 % w/v) umiddelbart inden brug.

OPD omgaas med forsigtighed - Brug gummihandsker - Mistanke om mutagen.

7. 1 Molar svovlsyre: 26,6 ml syre blandet i 473,4 ml destilleret vand.

Husk - bland altid syre i vand, aldrig vand i syre.

8. Orbitalryster (sonikator).

9. ELISA-pladelaeser (proeven kan aflaeses visuelt).

Proeveformat >TABELPOSITION>

Proevekontrol Blindproevekontrol Raekke 1 (A - H) er en blindproevekontrol bestaaende af BTV-antigen og konjugat. Den kan anvendes som blindproeve for ELISA-laeseren.

Mas-kontrol Raekke 2 (A - H) er den monoklonale antistofkontrol og bestaar af BTV-antigen, monoklonalt antistof og konjugat. Den udgoer en negativ kontrol. Middelvaerdien af absorbansaflaesningerne af denne kontrolraekke repraesenterer 0 % haemning.

Positiv kontrol Raekke 3 (A - H) er den positive kontrol. Den bestaar af BTV-antigen, BTV-positive antiserumfortyndinger, Mas og konjugat. Den tjener som indikator for, at proeven fungerer ordentligt, og der boer opnaas samstemmende haemningsniveauer fra proeve til proeve.

Proevesera I ovenstaaende proeveformat kan der afproeves 18 sera fortyndet i forholdet 1:2, 1:4, 1:8 og 1:16. Dette vil vise noget om antistoftiteret i proeveserumet. Fortyndingsraekken kan gaa laengere, saaledes at titrene for serumfortynding naar slutpunktet. Som et alternativ kan sera, naar det gaelder serologiske undersoegelser i stor skala, proeves i en enkelt fortynding (1:4) eller to fortyndinger (1:2 og 1:4) som en hurtig screeningtest.

Procedure 1. BTV-antigen fortyndes til praetitreret fortynding i PBS, der sonikeres et oejeblik for at sprede akkumuleret virus (hvis der ikke findes nogen sonikator, pippeteres der kraftigt), og der tilfoeres 50 ìl til alle huller i ELISA-pladen. Der bankes paa pladens sider for at sprede antigenet.

2. Der inkuberes ved 37° C i 60 minutter i en orbitalryster. Pladerne vaskes tre gange ved overskylning og toemning af hullerne med usterilt PBS, og de trykkes af med klatpapir.

3. Der tilsaettes 50 ìl blokerende buffer pr. hul. Proevesera og positivt serum haeldes i de relevante huller, og der fortyndes hen over pladen ved hjaelp af en multikanalpipette. Sera maa ikke tilsaettes blankproevekontrollen eller Mas-kontrollen.

4. Straks efter tilsaetningen af proeveseraene fortyndes Mas i blokerende buffer (for at praetitrere fortyndingen), og der haeldes 50 ìl i alle pladens huller, undtagen naar det gaelder blindproevekontrollen.

5. Der inkuberes ved 37° C i 60 minutter i en sonikator. Der vaskes tre gange med PBS og trykkes af med klatpapir.

6. Kanin-antimusekoncentrat fortyndes til 1:5 000 i blokerende buffer, og der haeldes 50 ìl i alle pladens huller.

7. Der inkuberes ved 37° C i 60 minutter i en sonikator. Der vaskes tre gange med PBS og trykkes af med klatpapir.

8. OPD optoes, og umiddelbart inden brug tilsaettes hver 25 ml OPD 12 ìl 30 % hydrogenperoxid. 50 ìl haeldes i alle pladens huller. Man lader farven udvikle sig i ca. 10 minutter og standser reaktionen med 1 M svovlsyre (50 ìl pr. hul.). Farven skal udvikle sig i Mas-kontrolhullerne og i de huller, der ikke indeholder sera med antistof mod BTV.

9. Hullerne undersoeges og registreres enten visuelt eller ved hjaelp af en spektrofotometrisk laeser.

Analyse af resultater Middel-OD-aflaesningen beregnes ud fra Mas-kontrollerne. Dette repraesenterer haemningsvaerdien paa 0 %. Absorbansaflaesninger af proeveseraene udtrykkes i procent haemningsvaerdier ved hjaelp af foelgende formel:

Procent haemningsvaerdi = 100 OD ved tilstedevaerelse af proeveserumOD ved fravaer af proeveserum × 100.

Haemningsvaerdier paa over 40 % ved en serumfortynding paa 1:4 betragtes som positive. Visuel aflaesning er mulig, da 40 % haemning er den laveste vaerdi, der let kan ses med det blotte oeje.

Tilberedning af BTV ELISA-antigen 1. 10 roux sammenflydende BHK-21 celler vaskes tre gange med serumfrit Eagle's medium, og der inficeres med bluetongue-virus serotype 1 i serumfrit Eagle's medium.

2. Der inkuberes ved 37° C og undersoeges daglig for cytopatisk effekt (cpe).

3. Naar der kan konstateres cpe i 80-90 % af cellelaget i hver roux, indsamles viruset ved, at eventuelle celler, der stadig sidder paa glasset, rystes af.

4. Der centrifugeres ved 2 000-3 000 rpm for at sammenpresse cellerne.

5. Supernatanten fjernes, og cellerne genopslaemmes i ca. 30 ml PBS, som indeholder 1 % »Sarkosyl« og 2 ml phenolmetylsulfonylfluorid (lysisbuffer). Dette kan bevirke, at cellerne danner en gel, og der kan tilsaettes mere lysisbuffer for at reducere denne effekt.

Anmaerkning: Phenylmetylsulfonylfluorid er skadeligt - behandles med stoerste forsigtighed.

6. Cellerne spraenges i 60 sekunder ved hjaelp af en ultralydsonde med en amplitude paa 30 micron.

7. Der centrifugeres ved 10 000 rpm i ti minutter.

8. Supernatanten opbevares ved +4° C, og den resterende cellemasse genopslaemmes i 10-20 ml lysisbuffer.

9. Der sonikeres og foretages en klaring, idet supernatanten opbevares paa hvert stadium, i alt tre gange.

10. Supernatanterne samles og centrifugeres ved 24 000 rpm i 120 minutter ved +4° C paa en 5 ml pude bestaaende af 40 % sacharose (w/v i PBS) ved hjaelp af 30 ml Beckman centrifugeglas og en SW 28 rotor.

11. Supernatanten fjernes, glassene toemmes helt, og massen genopslaemmes i PBS ved hjaelp af sonikering. Antigenet opbevares i alikvoter ved 70° C.

Titrering af BTV ELISA-antigen Bluetongue ELISA-antigen titreres ved hjaelp af den indirekte ELISA. Tofoldfortyndinger af antigen titreres over for en konstant fortynding (1:50) af monoklonalt antistof 3-17-A3. Protokollen er som foelger:

Procedure:

1. BTV antigen fortyndes i PBS over mikrotiterpladen i en todobbelt fortyndingsraekke (50 ìl/hul) ved hjaelp af en multikanalpipette.

2. Der inkuberes en time ved 37° C i en orbitalryster.

3. Pladerne vaskes tre gange med PBS.

4. Der tilsaettes hvert hul i mikrotiterpladen 50 ìl monoklonalt antistof 3-17-A3 (fortyndet 1:50).

5. Der inkuberes en time ved 37° C i en orbitalryster.

6. Pladerne vaskes tre gange med PBS.

7. Der tilsaettes hvert hul i mikrotiterpladen 50 ìl kanin-antimuseglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase fortyndet til en praetitreret optimal koncentration.

8. Der inkuberes en time ved 37° C i en sonikator.

9. Der tilsaettes substrat og chromogen som tidligere beskrevet. Reaktionen standses efter ti minutter ved tilsaetning af 1 Molar svovlsyre (50 ìl/hul).

I den kompetitive proeve skal det monoklonale antistof vaere i overskud, og der vaelges derfor en fortynding af antigen, som ligger paa titreringskurven (ikke paa den flade del), hvilket giver ca. 0,8 OD efter ti minutter.

BILAG IV B

Protokol for en agar-gel-immunodiffusionsproeve til paavisning af antistoffer mod epizootisk haemoragisk sygdom

Agar-gel-immunodiffusionsproeven foretages efter foelgende protokol:

Materialer og reagenser Antigen:

Antigen, der bundfaeldes, tilberedes i et cellekultursystem, der taaler den hurtige formering af den/de paagaeldende serotype/r epizootisk haemoragisk sygdomsvirus. BHK eller Vero-celler anbefales. Antigen forekommer i supernatantvaesken, naar virusets vaekst er ophoert, men kraever en koncentration paa 50 til 100 gange for at vaere effektivt. Dette kan opnaas ved hjaelp af enhver standardprocedure for proteinkoncentrering. Virus i antigenet kan inaktiveres ved tilsaetning af 0,3 % (v/v) betapropiolakton.

Kendt positivt kontrolserum:

Ved hjaelp af det internationale referenceserum og antigen fremstilles et nationalt standardserum, der standardiseres i det optimale forhold som for det internationale referenceserum, frysetoerres og anvendes som det kendte kontrolserum i hver enkelt proeve.

Proeveserum Procedure:

1 % agarose tilberedt i borat eller natriumbarbitolbuffer, pH 8,5 til 9,0 haeldes i en petriskaal op til mindst 3,0 mm.

Der skaeres et proevemoenster paa syv fugtfri huller paa hver 5,0 mm diameter i agaren. Moenstret bestaar af et centerhul og seks huller, der er anbragt rundt om det i en cirkel med en radius paa 3 mm.

>START GRAFIK>

1 6 2 × 5 3 4>SLUT GRAFIK>

Centerhullet fyldes med standardantigenet. De ydre huller 2, 4 og 6 fyldes med kendt positivt serum og hul 1, 3 og 5 fyldes med proevesera.

Systemet inkuberes i indtil 72 timer ved stuetemperatur i et lukket fugtigt kammer.

Fortolkning:

Et proeveserum er positivt, hvis det danner en specifik bundfaeldninglinje med antigenet og danner en ubrudt identitetslinje med kontrolserumet. Et proeveserum er negativt, hvis det ikke danner en specifik linje med antigenet og det ikke krummer kontrolserumets linje. Petriskaale boer undersoeges mod en moerk baggrund ved indirekte belysning.