KOMMISSIONENS FORORDNING (EOEF) Nr. 2568/91 af 11. juli 1991 om kendetegnene for olivenolie og olie af olivenpresserester og de i den forbindelse anvendte metoder

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets forordning nr. 136/66/EOEF af 22. september 1966 om oprettelse af en faelles markedsordning for fedtstoffer (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 3577/90 (2), saerlig artikel 35a, og

ud fra foelgende betragtninger:

I bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF er der fastsat betegnelser for og definitioner paa olivenolie og olie af olivenpresserester, der afsaettes i de enkelte medlemsstater, i samhandelen mellem medlemsstaterne og i samhandelen mellem medlemsstaterne og tredjelande;

for at kunne skelne mellem de forskellige typer olie er det noedvendigt at definere de fysisk-kemiske kendetegn for hver type samt de organoleptiske kendetegn for jomfruolie, saaledes at produkternes renhed og kvalitet sikres uden at dette beroerer andre eksisterende bestemmelser paa omraadet;

kendetegnene for de forskellige typer olie boer fastlaegges ensartet for hele Faellesskabet; med henblik herpaa boer der fastlaegges EF-metoder for kemisk analyse og orgenoleptisk vurdering; i en overgangsperiode boer medlemsstaterne dog kunne anvende andre metoder, idet det dog skal fastsaettes, at det er resultatet af den faelles metode, der gaelder i tilfaelde af uoverensstemmelse;

definitionen af de fysisk-kemiske kendetegn for olivenolie og analysemetoder indebaerer, at de supplerende bestemmelser til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur skal tilpasses;

som led i metoden til bedoemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn skal der oprettes paneler af udvalgte og oevede smagsdommere; der boer afsaettes den fornoedne tid til etablering af en saadan struktur; i betragtning af de vanskeligheder, som visse medlemsstater vil faa med at oprette panelerne, boer det tillades disse medlemsstater at benytte de i andre medlemsstater eksisterende paneler;

for at ordningen med importafgift paa olivenpresserester kan fungere efter hensigten boer der fastlaegges en faelles metode til bestemmelse af olieindholdet i disse produkter;

for ikke at paafoere handelen skade, boer det fastsaettes, at det i en begraenset periode er tilladt at afsaette olie aftappet foer denne forordnings ikrafttraeden;

Kommissionens forordning (EOEF) nr. 1058/77 (3), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 1858/88 (4), boer ophaeves;

Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer har ikke afgivet udtalelse inden for den af formanden fastsatte frist -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING:

Artikel 1

1. Som jomfruolie (KN-kode 1509 10 90) efter punkt 1, litra a), b) og c), i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis respektive kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 1, 2 og 3 i bilag I til naervaerende forordning.

2. Som bomolie (KN-kode 1509 10 10) efter punkt 1, litra d), i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 4 i bilag I til naervaerende forordning.

3. Som raffineret olivenolie (KN-kode 1509 90 00) efter punkt 2 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 5 i bilag I til naevaerende forordning.

4. Som olivenolie (KN-kode 1509 90 00) efter punkt 3 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 6 i bilag I til naevaerende forordning.

5. Som raa olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 10) efter punkt 4 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 7 i bilag I til naervaerende forordning.

6. Som raffineret olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 90) efter punkt 5 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 8 i bilag I til naervaerende forordning.

7. Som olie af olivenpresserester (KN-kode 1510 00 90) efter punkt 6 i bilaget til forordning nr. 136/66/EOEF betragtes olie, hvis kendetegn er i overensstemmelse med kendetegnene i punkt 9 i bilag I til naervaerende forordning.

Artikel 2

1. Bestemmelsen af kendetegnene for de i bilag I fastsatte olier sker ved hjaelp af foelgende analysemetoder:

- til bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer, beregnet som oliesyre, metoden i bilag II

- til bestemmelse af peroxidtallet, metoden i bilag III

- til bestemmlese af indholdet af alfatiske alkoholer, metoden i bilag IV

- til bestemmelse af indholdet af steroler, metoden i bilag V

- til bestemmelse af indholdet af erytrodiol og uvaol, metoden i bilag VI

- til bestemmelse af indholdet af maettede fedtsyrer i 2-stillingen i triglycerider, metoden i bilag VII

- til bestemmelse af indholdet af trilinolcin, metoden i bilag VIII

- til den spektrofotometriske undersoegelse, metoden i bilag IX

- til bestemmelse af fedtsyrernes sammensaetning, metoden i bilag X A og X B

- til bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede oploesningsmidler, metoden i bilag XI

- til bestemmelse af jomfruolies organoleptiske kendetegn, metoden i bilag XII, anvendt som omhandlet i stk. 2

- til bevis for raffinering, metoden i bilag XIII.

2. Analytikeren - eventuelt bistaaet af eksperter - bedoemmer de organoleptiske kendetegn efter proceduren beskrevet i det i bilag XII omhandlede smageskema. Hvis de gennem analysen fremkomne kendetegn afviger fra dem, der fremgaar af produktets betegnelse, undersoeges proeven af et smagspanel som omhandlet i bilag XII.

Den nye analyse foretages af panelet i overensstemmelse med naevnte bestemmelser.

Naar det gaelder bedoemmelsen af de organoleptiske kendetegn i forbindelse med foranstaltningerne under interventionsordningen, foretages den af smagspanelet i henhold til bilag XII.

Artikel 3

Indfoerelsen af de i artikel 2 fastsatte analysemetoder udelukker ikke, at medlemsstaterne indtil den 31. oktober 1992 kan anvende andre afproevede og videnskabeligt anerkendte metoder, hvis den frie bevaegelse af produkter, som ifoelge EF-metoderne opfylder de gaeldende bestemmelser, ikke hindres herved. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen disse andre metoder, inden de anvender dem.

Hvis en af de andre metoder giver et andet resultat end det, der foelger af EF-metoden, fastholdes resultatet fra EF-metoden.

Artikel 4

1. Med henblik paa vurderingen af de organoleptiske egenskaber opretter medlemsstaterne paneler af smagsdommere, der udvaelges og traenes efter reglerne i den i bilag XII beskrevne metode.

2. Hvis en medlemsstat har vanskeligheder med at oprette et panel paa sit omraade, kan den goere brug af et panel i en anden medlemsstat.

Artikel 5

Supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur erstattes af supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 i bilag XIV til denne forordning.

Artikel 6

1. Olieindholdet i presserester og andre restprodukter

fra udvinding af olivenolie (KN-kode 2306 90 11 og 2306 90 19) bestemmes efter metoden i bilag XV.

2. Det i stk. 1 omhandlede olieindhold udtrykkes i vaegtprocent af toerstoffet.

Artikel 7

EF-bestemmelserne vedroerende forekomsten af andre uoenskede stoffer end dem, der er omhandlet i bilag XI, finder anvendelse.

Artikel 8

1. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen, hvilke foranstaltninger de traeffer til anvendelse af denne forordning.

2. Medlemsstaterne meddeler Kommissionen i begyndelsen af hvert halvaar en oversigt over analyseresultaterne i forbindelse med de bestemmelser, der er foretaget i loebet af det foregaaende halvaar.

Resultaterne gennemgaas af Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer efter proceduren i artikel 39 i forordning nr. 136/66/EOEF.

Artikel 9

Forordning (EOEF) nr. 1058/77 ophaeves.

Artikel 10

1. Denne forordning traeder i kraft paa tredjedagen efter offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Metoden i bilag XII anvendes dog fra den 1. januar 1992, undtagen i forbindelse med interventionsforanstaltninger.

2. Denne forordning anvendes ikke for olivenolie og olie af olivenpresserester, der aftappes inden datoen for denne forordnings ikrafttraeden, og som bringes i handelen inden den 31. oktober 1992.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 11. juli 1991.

Paa Kommissionens vegne

Ray MAC SHARRY

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. 172 af 30. 9. 1966, s. 3025/66.(2) EFT nr. L 353 af 17. 12. 1990, s. 23.(3) EFT nr. L 128 af 24. 5. 1977, s. 6.(4) EFT nr. L 166 af 1. 7. 1988, s. 10.

BILAG

Resumé Side

Bilag I:

Karakteristika ved olivenolie .

4

Bilag II:

Bestemmelse af indholdet af frie fedtsyrer .

6

Bilag III:

Bestemmelse af peroxidtallet .

8

Bilag IV:

Bestemmelse af indholdet af alifatiske alkoholer ved gaskromatografi paa kapillarsoejle .

10

Bilag V:

Bestemmelse af sammensaetningen og indholdet af steroler ved gaskromatografi paa kapillarsoejle .

15

Bilag VI:

Bestemmelse af erythrodiol og uvaol .

23

Bilag VII:

Bestemmelse af fedtsyrer i 2-positionen i triglycerider fra olier og fedtstoffer .

25

Bilag VIII:

Bestemmelse af indholdet af trilinolein .

29

Bilag IX:

Spektrofotometrisk undersoegelse ved ultraviolet lys .

33

Bilag XA:

Gaskromatografering af fedtsyremethylestere .

36

Bilag XB:

Fremstilling af fedtsyremethylestere .

44

Bilag XI:

Bestemmelse af indholdet af flygtige halogenerede oploesningsmidler i olivenolie .

48

Bilag XII:

Organoleptisk vurdering af jomfruolie .

49

Bilag XIII:

Raffineringsbevis .

75

Bilag XIV:

Supplerende bestemmelse nr. 2, 3 og 4 til kapitel 15 i Den Kombinerede Nomenklatur

77

Bilag XV:

Olieindhold i presserester af oliven .

80

Bilag XVI:

Bestemmelse af iodtal .

82

BILAG I

KARAKTERISTIKA VED OLIVENOLIE (¹)

Type

Surhedsgrad

%

Peroxidtal

meq O2/kg

Halogenerede

oploesningsmidler (²)

mg/kg

Alifatiske

alkoholer

mg/kg

Maettede

syrer

i 2-stillingen

i triglycerid

%

Erytrodiol

+ uvaol

%

Trilinolein

%

Kolesterol

%

Brassicasterol

%

Campesterol

%

Stigmasterol

%

â-sitosterol

% (³)

D-7stigmastenol

%

Steroler

i alt

mg/kg

1. Jomfruolie

ekstra

M 1,0

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

2. Jomfruolie

M 2,0

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

3. Jomfruolie

almindelig

M 3,3

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

4. Bomolie

> 3,3

> 20

> 0,20

M 400

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

-

m 93,0

M 0,5

m 1 000

5. Olivenolie raffineret

M 0,5

M 10

M 0,20

M 350

M 1,5

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

<Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

6. Olivenolie

M 1,5

M 15

M 0,20

M 350

M 1,5

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

7. Raa olivenolie

af presserester

m 2,0

-

-

-

M 1,8

m 12

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

-

m 93,0

M 0,5

m 2 500

8. Raffineret olivenolie af presserester

M 0,5

M 10

M 0,20

-

M 2,0

m 12

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 800

9. Olivenolie

af presserester

M 1,5

M 15

M 0,20

-

M 2,0

> 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 800

M = maximum, m = minimum.

(¹) En olie deklasseres, hvis blot en enkelt egenskab ligger uden for de fastsatte graenser.

(²) Total maksimalgraensevaerdi for detektorforbindelser pr. detektor ved elektronfangst. For de enkelte paaviste bestanddele er den maksimale graesevaerdi 0,10 mg/kg.

(³) D-5,23-stigmastadienol + Clerosterol + Sitosterol + Sitostanol + D-5-avenasterol + D-5,24-stigmastadienol.

Type

Fedtsyresammensaetning

Myristin

%

Linolen

%

Arachin

%

Eicosan

%

Behen

%

Lignocerin

%

K232

K270

K270 med

aluminiumoxyd

(¹)

DK

Panelbedoemmelse

1. Jomfruolie

ekstra

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,40

M 0,20

M 0,10

M 0,01

86,5

2. Jomfruolie

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,50

M 0,25

M 0,10

M 0,01

85,5

3. Jomfruolie

almindelig

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,50

M 0,25

M 0,10

M 0,01

83,5

4. Bomolie

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,70

> 0,25

M 0,11

-

< 3,5

5. Olivenolie raffineret

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,40

M 1,20

-

M 0,16

-

6. Olivenolie

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,30

M 1,00

-

M 0,13

-

7. Raa olivenolie

af presserester

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

-

-

-

-

-

8. Raffineret olivenolie af presserester

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 5,50

M 2,50

-

M 0,25

-

9. Olivenolie

af presserester

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 5,30

M 2,00

-

M 0,20

-

(¹) Hvis olier med surhedsgrad paa over 3,3 % efter passage af aluminiumoxyd viser K270 paa over 0,11, foretages den i bilag XIII onhandlede raffineringsproeve. Med henblik paa at fastslaa renheden bestemmes K270 paa ny efter behandling med aluminiumoxyd, naar K270 overstiger graensen for den paagaeldende kategori.

BILAG II

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FRIE FEDTSYRER 1.

FORMAAL

Bestemmelse af frie fedtsyrer i olivenolie. Indholdet af frie fedtsyrer udtrykkes ved det vedtaegtsmaessigt beregnede syreindhold.

1.1.

Princip

En analyseproeve oploeses i en blanding af oploesningsmidler, hvorefter de tilstedevaerende frie fedtsyrer bestemmes ved hjaelp af en oploesning af kaliumhydroxid i ethanol.

1.2.

Reagenser

Samtlige reagenser skal vaere af anerkendt analysekvalitet, og der anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.

1.2.1.

Dietyhlether/ethanol, 95 % (v/v), blandet i forholdet 1:1 efter rumfang.

Note: Dietylether er meget let antaendelig og kan danne eksplosive peroxider. Under anvendelsen skal der traeffes saerlige forholdsregler.

Noejagtigt paa anvendelsestidspunktet neutraliseres med en oploesning af kaliumhydroxid (1.2.2) ved tilstedevaerelse af 0,3 ml phenolphtalein-oploesning (1.2.3) pr. 100 ml blanding.

Note: Hvis det ikke er muligt at anvende diethylether, kan en blanding af oploesningsmidler bestaaende af ethanol og toluen anvendes. Om noedvendigt kan ethanolen erstattes af 2-propanol.

1.2.2.

Indstillet oploesning af kaliumhydroxid i ethanol, c(KOH) ca. 0,1 mol/l eller om noedvendigt c(KOH) ca. 0,5 mol/l.

Den noejagtige koncentration af kaliumhydroxid-oploesningen i ethanol skal vaere kendt og verificeres umiddelbart foer brug. Der anvendes en oploesning, der er fremstillet mindst fem dage foer brugen, og dekanteret over i en flaske af brunt glas, lukket med en gummiprop. Oploesningen skal vaere farveloes eller straagul.

Note: En ufarvet stabil oploesning af kaliumhydroxid kan fremstilles paa foelgende maade: 1 000 ml ethanol med 8 g kaliumhydroxid og 0,5 g aluminiumspaaner bringes i kog og holdes kogende i 1 time med tilbageloeb. Derefter destilleres omgaaende, og den kraevede maengde kaliumhydroxid oploeses i destillatet. Man lader oploesningen henstaa i flere dage og dekanterer derefter den oeverste klare vaeske fra bundfaldet af kaliumcarbonat.

Oploesingen kan ogsaa fremstilles uden destillation paa foelgende maade: til 1 000 ml ethanol tilsaettes 4 ml aluminiumbutylat, hvorefter man lader blandingen henstaa i nogle dage. Derefter dekanteres den klare vaeske fra, og heri oploeses den kraevede maengde kaliumhydroxid. Denne oploesning er klar til brug.

1.2.3.

Phenolphtalein, oploesning med 10 g/l i 95-96 % (v/v) ethanol, eller alkaliblaat (i tilfaelde af staerkt farvede fedtstoffer), oploesning med 20 g/l i 95-96 % (v/v) ethanol.

1.3.

Apparatur

Saedvanligt laboratorieudstyr, herunder:

1.3.1.

Analysevaegt.

1.3.2.

250 ml Erlenmeyer-kolbe.

1.3.3.

10 ml burette med 0,05 ml inddelinger.

1.4.

Fremgangsmaade

1.4.1.

Forberedelse af analyseproeve

Analyseproeven forberedes i overensstemmelse med NF T 60-200. (Paa proeven som den er, hvis det samlede indhold af vand og urenheder ikke overstiger 1 %, ellers paa en filtreret proeve). Bestemmelsen foretages paa den filtrerede proeve. Hvis det samlede indhold af vand og urenheder er under 1 %, foretages bestemmelsen paa den ubehandlede proeve.

1.4.2.

Proeveudtagning

Ud fra det antagne syreindhold udtages en proeve efter angivelserne i foelgendetabel:

Antaget syreindhold

vaegtprocent

Proevens masse

i g

Proeven afvejes med en noejagtighed

i g paa

< 1

1- 4

4-15

15-75

> 75

20,

10,

2,5

0,5

0,1

0,05

0,02

0,01

0,001

0,0002

Proeven afvejes i Erlenmeyer-kolben (1.3.2).

1.4.3.

Bestemmelse

Proeven (1.4.2) oploeses i 50 - 150 ml af den paa forhaand neutraliserede blanding af diethylether/ethanol (1.2.1).

Under omroering titreres med kaliumhydroxidoploesning, 0,1 mol/l (1.2.2) (se note 2), indtil indikatoren slaar om (den rosa farve af phenolphtalein skal holde sig i mindst 10 sek.).

Note 1: Den indstillede oploesning af kaliumhydroxid i ethanol (1.2.2) kan erstattes af en vandig oploesning af kaliumhydroxid eller natriumhydroxid, naar den tilfoerte vandmaengde ikke medfoerer faseadskillelse.

Note 2: Hvis den noedvendige maengde 0,1 mol/l kaliumhydroxidoploesning overstiger 10 ml, anvendes i stedet en oploesning paa 0,5 mol/l.

Note 3: Bliver oploesningen uklar under titreringen, tilsaettes saa meget oploesningsmiddelblanding (1.2.1), at oploesningen bliver klar.

1.5.

Angivelse af syreindholdet i % oliesyre

Syreindholdet, udtrykt som vaegtprocent = V × c × 1 000 × 100 = V × c × M

Syreindholdet, udtrykt som vaegtprocent = V × c ×

M

1 000

×

100

m

=

V × c × M

10 × m

hvor:

V = rumfanget i ml af den forbrugte kaliumhydroxidoploesning

c

=

den noejagtige koncentration i mol/l af den anvendte kaliumhydroxidoploesning

M

=

den molvaegt i g/mol af syren, der er valgt til angivelse af resultatet (Moliesyre = 282 g/mol)

m

=

analyseproevens vaegt i gram.

Som resultat anvendes det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser.

BILAG III

BESTEMMELSE AF PEROXIDTALLET 1.

OMRAADE

Denne standard beskriver en metode til bestemmelse af peroxidtallet for olier og fedtstoffer.

2.

ANVENDELSESOMRAADE

Denne standard finder anvendelse for animalske og vegetabilske olier og fedtstoffer.

3.

DEFINITION

Peroxidtallet angiver den maengde stoffer i proeven, udtrykt som milliaekvivalenter aktivt oxygen pr. kg, som oxiderer kaliumiodid under de beskrevne forsoegsbetingelser.

4.

PRINCIP

Analyseproeven, oploest i en blanding af eddikesyre og chloroform, behandles med en oploesning af kaliumiodid. Det frigjorte iod titreres med en indstillet natriumthiosulfatoploesning.

5.

APPARATUR

Alt udstyr skal vaere fri for reducerende og oxiderende stoffer.

Note: Sliboverflader maa ikke indfedtes.

5.1.

3 ml glasske.

5.2.

Kolber med slib og prop, paa ca. 250 ml, som paa forhaand toerres og fyldes med ren, toer inert gas (nitrogen eller - helst - carbondioxid).

5.3.

25 eller 50 ml burette med 0,1 ml inddeling.

6.

REAGENSER

6.1.

Analyseren chloroform, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, toer inert gas.

6.2.

Analyseren iseddike, befriet for oxygen ved gennembobling med ren, toer inert gas.

6.3.

Maettet vandig oploesning af kaliumiodid, fremstillet umiddelbart foer brug og fri for iod og iodater.

6.4.

Natriumthiosulfat, 0,01 eller 0,002 N noejagtigt indstillet vandig oploesning, indstillet umiddelbart foer brug.

6.5.

Stivelsesoploesning, 10 g/l vandig opslaemning, fremstillet umiddelbart foer brug ud fra naturlig oploeselig stivelse.

7.

PROEVE

Proeven udtages og opbevares beskyttet mod lys, holdes nedkoelet og opbevares i fuldstaendigt fyldte glasbeholdere, der er hermetisk tillukket med slibpropper af glas eller korkpropper.

8.

FREMGANGSMAADE

Analysen udfoeres i diffust dagslys eller i kunstigt lys. I en glasske (5.1) eller i mangel heraf en kolbe (5.2) afvejes med en noejagtighed paa 0,001 g en proevemaengde i overensstemmelse med foelgende tabel, svarende til det forventede peroxidtal:

Forventet perioxidtal

(meq O2/kg)

Analyseproevens vaegt

(i g)

0 - 12

12 - 20

20 - 30

30 - 50

50 - 90

5,0 - 2,0

2,0 - 1,2

1,2 - 0,8

0,8 - 0,5

0,5 - 0,3

Proppen tages af en kolbe (5.2), og analyseproeven i glasskeen overfoeres til kolben. Der tilsaettes 10 ml chloroform (6.1), og analyseproeven oploeses hurtigt ved omrystning. Derefter tilsaettes 15 ml eddikesyre (6.2), efterfulgt af 1 ml kaliumiodidoploesning (6.3). Saa saettes proppen hurtigt i, og der omrystes i 1 min., hvorefter man lader kolben henstaa i noejagtigt 5 min. i moerke ved en temperatur paa 15 - 25o C.

Der tilsaettes ca. 75 ml destilleret vand, og det frigjorte iod titreres med natriumthiosulfatoploesning (6.4) (0,002 N oploesning for forventede vaerdier under 12, og 0,01 N oploesning for forventede vaerdier over 12) under kraftig omrystning og med anvendelse af stivelsesoploesning (6.4) som indikator.

Der udfoeres to bestemmelser paa samme analyseproeve.

Samtidig udfoeres en blindproeve. Hvis resultatet af blindproeven overstiger 0,05 ml 0,01 N natriumthiosulfatoploesning (6.4), udskiftes de urene reagenser.

9.

ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Perioxidtallet (P.V.), udtrykt i milliaekvivalenter aktivt oxygen pr. kg, er givet ved formlen:

P.V. = V × T × 1 000

P.V. =

V × T × 1 000

m

hvor:

V = antal ml forbrugt indstillet natriumthiosulfatoploesning (6.4) ved analysen, korrigeret for resultatet af blindproeven

T

=

den noejagtige normalitet af den anvendte natriumthiosulfatoploesning (6.4),

m

=

analyseproevens vaegt i g.

Som resultat angives det aritmetiske gennemsnit af de to udfoerte bestemmelser.

BILAG IV

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ALIFATISKE ALKOHOLER VED GASKROMATOGRAFI PAA KAPILLARSOEJLE 1.

OMRAADE

Metoden beskriver en fremgangsmaade til at bestemme indholdet af de enkelte alifatiske alkoholer og det samlede indhold af alifatiske alkoholer i fedtstoffer.

2.

METODENS PRINCIP

Fedtstoffer, tilsat 1-eicosanol som intern standard, forsaebes med kaliumhydroxid i ethanoloploesning, hvorefter de ikke-forsaebelige stoffer ekstraheres med diethylether.

Alkoholfraktionen separeres fra ekstrakten af ikke-forsaebelige stoffer ved kromatografi paa basiske kiselgelplader. De alkoholer, der er indvundet fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved gaskromatografi paa kapillarsoejle.

3.

APPARATUR

3.1.

250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib.

3.2.

500 ml skilletragte.

3.3.

250 ml kolber.

3.4.

Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm glasplader.

3.5.

Ultraviolet lampe med en boelgelaengde paa 366 eller 254 nm.

3.6.

100 ml og 500 ml mikrosproejter.

3.7.

En cylindrisk filtertragt med et G3 poroest septum (poroesitet 15-40 mm), med en diameter paa ca. 2 cm og en dybde paa ca. 5 cm, med en befaestelsesdel, der er egnet til filtrering under vakuum, og en samlingsdel med et 12/21 udvendig konisk glasslib.

3.8.

En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 invendig konisk glasslib, som filtertragten (3.7) kan monteres paa.

3.9.

Et 10 ml proeveroer med konisk bund og taetsluttende prop.

3.10.

En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsoejle, forsynet med et spaltningssystem, der bestaar af:

3.10.1.

Et termostatkammer til soejler, som kan opretholde den oenskede temperatur med en noejagtighed paa

p1o C.

3.10.2.

En inddampningsenhed med temperaturindstilling, med et fordampningselement af silanglas.

3.10.3.

En flammeioniserings-detektor og en omformer-forstaerker.

3.10.4.

En integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-forstraekeren (3.10.3), og som har en svartid paa ikke over ét sekund og variabel papirhastighed.

3.11.

En kapillarsoejle af glas eller kvartsglas, med en laengde paa 20-30 m, en indre diameter paa 0,25-0,32 mm, indvendig overtrukket med SE-52 eller SE-54 vaeskefase eller tilsvarende i en ensartet tykkelse paa mellem 0,10 og 0,30 mm.

3.12.

En 10 ml gaskromatografi-mikrosproejte med haerdet kanyle.

4.

REAGENSER

4.1.

Kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanoloploesning. 130 g kaliumhydroxid (minimum titer 85 %) oploeses i 200 ml destilleret vand under afkoeling, og der fyldes op med ethanol til 1 liter. Oploesningen opbevares i veltilproppede, moerke glasflasker.

4.2.

Diethylether, analyseren.

4.3.

Vandfrit natriumsulfat, analyserent.

4.4.

Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescens-indikator, tykkelse 0,25 mm (kan faas brugsfaerdige i handelen).

4.5.

Kaliumhydroxid, ca. 0,2 N, i ethanoloploesning. 13 g kaliumhydroxid oploeses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter.

4.6.

Benzen, til kromatografi (5.2.2).

4.7.

Acetone, til kromatografi (5.2.2).

4.8.

Hexan, til kromatografi (5.2.2).

4.9.

Diethylether, til kromatografi (5.2.2).

4.10.

Chloroform, analyseren.

4.11.

Referenceoploesning til tyndtlagskromatografi: En 5 % oploesning af en blanding af alkoholer fra C20 til C28 i chloroform.

4.12.

2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % oploesning i ethanol. Goeres svagt basisk ved tilsaetning af nogle faa draaber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidoploesning.

4.13.

Vandfri pyridin til kromatografi.

4.14.

Hexamethyldisilazan.

4.15.

Trimethylchlorsilan.

4.16.

Testoploesninger af trimethylsilylethere (TMSE) af de alifatiske alkoholer fra C20 til C28, friskfremstillede ud fra blandinger af rene alkoholer.

4.17.

1-eicosanol, 0,1 % (m/v) oploesning i chloroform (intern standard).

4.18.

Baeregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren.

4.19.

Hjaelpegasser:

- Hydrogen, gaskromatografiren

- Luft, gaskromatografiren.

5.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Forberedelse af de ikke-forsaebelige stoffer

5.1.1.

Et rumfang 0,1 % 1-eicosanoloploesning i chloroform (4.17), der indeholder en maengde 1-eicosanol (man kan ligeledes anvende 1-eneicosanol) svarende til ca. 10 % af indholdet af alifatiske alkoholer i den del af proeven, der er taget ud til bestemmelsen, overfoeres til 250 ml kolben ved hjaelp af 500 ml mikrosproejten. F.eks. saettes til 5 g af proeven 250 ml 0,1 % 1-eicosanoloploesning, hvis undersoegelsen gaelder olivenolier eller froeolier, og 1 500 ml, hvis det gaelder olie fra olivenpresserester.

Proeven inddampes til toerhed i en nitrogenstroem, hvorefter 5 g af den toerrede, filtrerede proeve afvejes noejagtigt og overfoeres til den samme kolbe.

5.1.2.

50 ml 2 N oploesning af kaliumhydroxid i ethanol tilsaettes, refluxsvaleren paasaettes, og vaesken opvarmes til svag kogning paa vandbad under vedvarende, kraftig omroering, indtil forsaebningen sker (oploesningen bliver klar). Opvarmningen fortsaettes i endnu 20 minutter, derefter tilsaettes 50 ml destilleret vand fra den oeverste del af svaleren, svaleren tages af, og kolben afkoeles til ca. 30o C.

5.1.3.

Kolbens indhold overfoeres kvantitativt til en 500 ml skilletragt, idet der skylles flere gange med destilleret vand, ialt ca. 50 ml. Ca. 80 ml diethylether tilsaettes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og faar lov til at henstaa (note 1).

Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt. Yderligere to ekstraktioner foretages paa den vandige fase paa samme maade, idet der bruges 60-70 ml diethylether hver gang.

Note 1: Eventuel emulsion kan oedelaegges ved tilsaetning af smaa maengder ethyl- eller methylalkohol ved hjaelp af en spray.

5.1.4.

Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destilleret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral reaktion.

Naar vaskevandet er fjernet, toerres ekstrakterne med vandfrit natriumsulfat og filtreres over vandfrit natriumsulfat ned i en paa forhaand vejet 250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med smaa maengder diethylether.

5.1.5.

Etheren destilleres ned til nogle faa ml og bringes derefter til toerhed under et let undertryk eller i en nitrogenstroem, toerres fuldstaendigt i en ovn ved 100o C i ca. 15 minutter, og vejes saa efter afkoeling i en ekssikkator.

5.2.

Separation af alkoholfraktionen

5.2.1.

Forberedelse af de basiske plader. Kiselgelpladerne (4.4) nedsaenkes fuldstaendig i 0,2 N oploesningen af kaliumhydroxid i ethanol (4.5) i 10 sekunder. Derefter faar de lov at toerre i et stinkskab i 2 timer og saettes tilsidst i en ovn ved 100o C i 1 time.

Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssikkator, til de skal bruges (plader, der er behandlet paa denne maade, skal anvendes inden 15 dage).

Note 2: Naar basiske kiselgelplader benyttes til at separere alkoholfraktionen, er det ikke noedvendigt at behandle de ikke-forsaebelige stoffer med aluminiuoxid. Paa denne maade holdes alle sure forbindelser (fede syrer og andre) tilbage paa basislinien, og de alifatiske og terpene alkoholers baand er klart adskilt fra sterolbaandet.

5.2.2.

En 95:5 (v/v) benzen/acetoneblanding anbringes i kromatografikammeret til en hoejde paa ca. 1 cm. Som et alternativ kan en 65:35 (v/v) hexan/diethyletherblanding bruges. Kammeret lukkes med det dertil passende daeksel og efterlades saaledes i ca. en halv time, saa at der opnaas ligevaegt mellem vaeske og damp. Strimler af filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringes paa kammerets indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet og regelmaessig eluering af komponenterne.

Note 3: Kromatografiblandingen boer udskiftes for hver test for at opnaa fuldstaendig reproducerbare elueringsbetingelser.

5.2.3.

Der tilberedes en ca. 5 % oploesning af de ikke-forsaebelige stoffer (5.1.5) i chloroform. Med 100 ml mikrosproejten afsaettes med 0,3 ml af denne oploesning paa en kromatografiplade (5.2.1), ca. 2 cm fra den ene ende, en streg, som er saa tynd og ensartet som muligt. Paa linie med strengen placeres 2-3 ml af alkoholreferenceoploesningen (4.11) i den ene ende af pladen, saa de alifatiske alkoholers baand kan identificeres efter eluering.

5.2.4.

Pladen anbringes i kromatografikammeret, der er forberedt som angivet i 5.2.2. Temperaturen boer holdes mellem 15 og 20o C. Kammeret lukkes straks med daekslet, og det faar lov til at eluere, indtil oploesningsmidlets forkant naar ca. 1 cm fra pladens oeverste kant. Derpaa fjernes pladen fra kromatografi-kammeret, og man lader oploesningsmidlet fordampe i en stroem af varm luft eller ved at lade pladen staa en kort tid i stinkskab.

5.2.5.

Pladen sproejtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluoresceinoploesningen. Naar pladen undersoeges under ultraviolet lys, identificeres de alifatiske alkoholers baand ved at bringes paa linie med den plet, der er opnaaet med referenceoploesningen, og alle de alifatiske alkoholers baand, tillige med det baand, der ligger umiddelbart ovenfor, og som svarer til de triterpene alkoholer, markeres med en sort blyant.

Note 4: Instruktionen om at samle alle de alifatiske alkoholers baand og de triterpene alkoholers baand skyldes, at under denne metodes betingelser er betydelige maengder af alifatiske alkoholer inkluderet i de triterpene alkoholers baand.

5.2.6.

Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede omraade. Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten (3.7). 10 ml varm chloroform tilsaettes, man blander omhyggeligt med metalspatelen og filtrerer under vakuum, filtratet opsamles i den koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten.

Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme koniske kolbe, der er forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af ca. 4-5 ml. Den tilbagevaerende oploesning overfoeres til det paa forhaand vejede 10 ml proeveroer (3.9), det inddampes til toerhed med let opvarmning i en bloed stroem af nitrogen, der fyldes atter op med nogle faa draaber acetone, det inddampes igen til toerhed, roeret placeres i en ovn ved 105o C i ca. 10 minutter, derefter lader man det svale af i en ekssikkator og vejer det.

Den rest, der findes i proeveroeret, bestaar af alkoholfraktionen.

5.3.

Forberedelse af trimethylsilyletherne

5.3.1.

Til proeveroeret, der indeholder alkoholfraktionen, saettes silyleringsreagenset, der bestaar af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 5), i forholdet 50 ml for hvert milligram alkohol, idet enhver optagelse af fugt undgaas (note 6).

Note 5: Brugsfaerdige oploesninger kan faas i handelen. Man kan ogsaa faa andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med et lige saa stort rumfang vandfrit pyridin.

5.3.2.

Proeveroeret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i vejret paa det), indtil alkoholerne er fuldstaendig oploest. Man lader det staa i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det saa i nogle faa minutter. Den klare oploesning er parat til gaskromatografisk analyse.

Note 6: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller fremkommer en lyseroed farve, er det tegn paa tilstedevaerelsen af fugt eller svaekkelse af reagensen. Hvis det forekommer, maa proeven gentages.

5.4.

Gaskromatografisk analyse

5.4.1.

Forberedende operationer, pakning af soejlen

5.4.1.1.

Soejlen monteres i gaskromatografen, idet indloebsenden forbindes med fordamperen, der staar i forbindelse med spaltningssystemet, og udloebsenden forbindes med detektoren.

Man foretager en generel kontrol af gaskromatografienheden (laekager fra gaskredsloebene, detektorens effektivitet, spaltningssystemets og registreringssystemets effektivitet osv.)

5.4.1.2.

Hvis soejlen skal bruges for foerste gang, anbefales det, at den underkastes en konditionering. Man lader en svag gasstroem passere gennem soejlen og taender saa for gaskromatografienheden, derefter begynder man gradvis at varme op til en temperatur 20o C over driftstemperaturen (note 7). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer, derefter saettes hele systemet i driftstilstand (justering af gasstroemme og spaltning, antaendelse af flammen, forbindelse til den elektroniske skriver, justering af soejlekammeret, detektorens og injektorens temperatur osv.), og derefter optegnes signalet med en foelsomhed, der er mindst to gange stoerre end den, man agter at anvende til analysen. Basisliniens forloeb skal vaere lige, uden toppe af nogen art, og den maa ikke glide.

Negativ glidning af en lige linie tyder paa laekage fra soejlens forbindelser, positiv glidning tyder paa utilstraekkelig konditionering af soejlen.

Note 7: Konditioneringstemperaturen skal altid vaere mindst 20o C lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den anvendte stationaere fase.

5.4.2.

Valg af driftsbetingelser

5.4.2.1.

De anbefalede driftsbetingelser er som foelger:

- soejletemperatur: indledende isoterm i 8 minutter ved 180o C, derefter programmeret til 5o /minut op til 260o C, og saa 15 minutter ved 260o C

- fordampertemperatur: 280o C

- detektortemperatur: 290o C

- baeregassens lineaere hastighed: helium 20-35 cm/s, hydrogen 30-50 cm/s

- spaltingsforhold: fra 1:50 til 1:100

- instrumentets foelsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale daempning

- registreringsfoelsomhed: 1-2 mV fuld skala

- papirhastighed: 30-60 cm/time

- maengde stof injiceret: 0,5-1 ml TMSE-oploesning.

Disse betingelser kan varieres i lyset af soejlens og gaskromatografens egenskaber, saa man opnaar kromatogrammer, der opfylder foelgende krav:

- retentionstiden for C26 alkohol boer vaere 18 p5 minutter

- toppen for C22 alkohol boer vaere 80 p20 % af fuld skala for olivenolie og 40 p20 % af fuld skala for froeolier.

5.4.2.2.

For at kontrollere ovenstaaende krav foretages gentagne injektioner af proeveblandinger af alkoholTMSE, og driftsbetingelserne justeres, saa de bedste resultater opnaas.

5.4.2.3.

Integrationsparametrene for toppe maa fastsaettes saadan, at de giver en korrekt vurdering af de undersoegte toparealer.

5.4.3.

Analytisk fremgangsmaade

5.4.3.1.

Med 10 ml mikrosproejten optages 1 ml hexan, derefter suges foerst 0,5 ml luft og derefter 0,5-1 ml af proeveoploesningen op. Stemplet traekkes hoejere op, saa kanylen toemmes. Kanylen trykkes gennem injektionsenhedens membran, og efter 1-2 sekunder injiceres hurtigt, derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder.

5.4.3.2.

Optegnelsen fortsaettes, indtil de tilstedevaerende alkoholers TMSE er fuldstaendig elueret.

Basislinien skal til stadighed opfylde kravene. (5.4.1.2).

5.4.4.

Identifikation af toppene

De enkelte toppe identificeres paa basis af retentionstiderne og ved sammenligning med blandinger af alkohol-TMSE, der er analyseret under de samme betingelser.

Figur 1 viser et kromatogram for alkoholfraktionen af en jomfruolie.

5.4.5.

Kvantitativ vurdering

5.4.5.1.

Toparealerne for 1-eicosanol og de alifatiske alkoholer fra C22 til C28 beregnes ved hjaelp af den integrerende taeller.

5.4.5.2.

Koncentrationen af hver enkelt alkohol beregnes i mg/100 g fedtstof som foelger:

alkohol x = Ax × ms × 100

alkohol x =

Ax × ms × 100

As × m

hvor:

Ax = toparealet for alkohol x i kvadratmillimeter

As

=

arealet af 1-eicosanoltoppen i kvadratmillimeter

ms

=

massen af tilsat 1-eicosanol i milligram

m

=

massen af den proeve, der bruges til bestemmelsen, i gram.

6.

RAPPORTERING AF RESULTATERNE

Koncentrationerne af de enkelte alifatiske alkoholer angives som mg/100 g fedtstof og deres sum som »total maengde alifatisk alkohol«.

APPENDIX Bestemmelse af gassens lineaere hastighed

Med gaskromatografen indstillet paa normale driftsbetingelser injiceres 1 - 3 ìl methan (eller propan), og man maaler den tid, det tager for gassen at passere gennem soejlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen fremkommer (tM). Den lineaere hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er soejlens laengde i cm, og tM er den maalte tid i sekunder.

1

2

3

4

5

6

7

8

BILAG V

BESTEMMELSE AF SAMMENSAETNINGEN OG INDHOLDET AF STEROLER VED GASKROMATOGRAFI PAA KAPILLARSOEJLE 1.

OMRAADE

Metoden beskriver en fremgangsmaade til bestemmelse af indholdet af de enkelte steroler og det samlede sterolindhold i fedtstoffer.

2.

METODENS PRINCIP

Fedtstoffer, med a-cholestanol tilsat som en intern standard, forsaebes med kaliumhydroxid i ethanoloploesning, og de bestanddele, der ikke kan forsaebes, ekstraheres derefter med diethylether.

Sterolfraktionen adskilles fra ekstrakten af stoffer, som ikke kan forsaebes, ved kromatografi paa en basisk kiselgelplade. De steroler, som genvindes fra kiselgelen, omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved hjaelp af gaskromatografi paa kapillarsoejle.

3.

APPARATUR

3.1.

250 ml kolbe monteret med en refluxsvaler med samlinger med glasslib.

3.2.

500 ml skilletragte.

3.3.

250 ml kolber.

3.4.

Komplet apparatur til analyse ved tyndtlagskromatografi med 20 × 20 cm glasplader.

3.5.

Ultraviolet lampe med en boelgelaengde paa 366 eller 254 nm.

3.6.

100 ml og 500 ml mikrosproejter.

3.7.

En cylindrisk filtertragt med et G3 poroest septum (poroesitet 15-40 mm), med en diameter paa ca. 2 cm og en dybde paa ca. 5 cm, med en befaestelsesdel, der er egnet til filtrering under vakuum, og en samlingsdel med et 12/21 udvendig konisk glasslib.

3.8.

En 50 ml konisk vakuumkolbe med et 12/21 indvendig konisk glasslib, som filtertragten (3.7) kan monteres paa.

3.9.

Et 10 ml proeveroer med konisk bund og taetsluttende prop.

3.10.

En gaskromatograf, der er egnet til brug med kapillarsoejle, forsynet med et spaltningssystem, der bestaar af:

3.10.1.

Et termostatkammer til soejler, som kan opretholde den oenskede temperatur med en noejagtighed paa

p1o C.

3.10.2.

En inddampningsenhed med temperaturindstilling, med et fordampningselement af silanglas.

3.10.3.

En flammeioniserings-detektor og en omformer-forstaerker.

3.10.4.

En integrerende skriver, der er egnet til brug med omformer-forstaerkeren (3.10.3), og som har en svartid paa ikke over ét sekund og variabel papirhastighed.

3.11.

En kapillarsoejle af glas eller kvartsglas, med en laengde paa 20-30 m, en indre diameter paa 0,25-0,32 mm, helt overtrukket med SE-52 eller SE-54 vaeske eller tilsvarende i en ensartet tykkelse paa mellem 0,10 og 0,30 mm.

3.12.

En 10 ml gaskromatografi-mikrosproejte med haerdet kanyle.

4.

REAGENSER

4.1.

Kaliumhydroxid, ca. 2 N, i ethanoloploesning. 130 g kaliumhydroxid (minimum titer 85 %) oploeses i 200 ml destilleret vand under afkoeling, og der fyldes op med ethanol til 1 liter. Oploesningen opbevares i veltilproppede, moerke glasflasker.

4.2.

Diethylether, analyseren.

4.3.

Vandfrit natriumsulfat, analyserent.

4.4.

Glasplader overtrukket med kiselgel, uden fluorescensindikator, tykkelse 0,25 mm (kan faas brugsfaerdige i handelen).

4.5.

Kaliumhydroxid, 0,2 N, i ethanoloploesning. 13 g kaliumhydroxid oploeses i 20 ml destilleret vand, og der fyldes op med ethanol til 1 liter.

4.6.

Benzen, til kromatografi (5.2.2).

4.7.

Acetone, til kromatografi (5.2.2).

4.8.

Hexan, til kromatografi (5.2.2).

4.9.

Diethylether, til kromatografi (5.2.2).

4.10.

Chloroform, analyseren.

4.11.

Referenceoploesning til tyndtlagskromatografi: cholesterol eller phytosteroler, 5 % oploesning i chloroform.

4.12.

2,7-dichlorfluorescein, 0,2 % oploesning i ethanol. Goeres svagt basisk ved tilsaetning af nogle faa draaber 2 N alkoholisk kaliumhydroxidoploesning.

4.13.

Vandfri pyridin til kromatografi.

4.14.

Hexamethyldisilazan.

4.15.

Trimethylchlorsilan.

4.16.

Referenceoploesninger af sterol-trimethylsilylethere (TMSE). Friskfremstillet ud fra rene steroler eller blandinger af steroler udvundet af sterolholdige olier.

4.17.

a-cholestanol, 0,2 % oploesning (m/v) i chloroform (intern standard).

4.18.

Baeregas: Hydrogen eller helium, gaskromatografiren.

4.19.

Hjaelpegasser:

- Hydrogen, gaskromatografiren

- Luft, gaskromatografiren.

5.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Forberedelse af de ikke-forsaebelige stoffer

5.1.1.

Et rumfang 0,2 % a-cholestanoloploesning i chloroform (4.17), der indeholder en maengde a-cholestanol svarende til ca. 10 % af sterolindholdet i den del af proeven, der er taget ud til bestemmelsen, indfoeres i 250 ml kolben ved hjaelp af 500 ml mikrosproejten. F.eks. saettes til 5 g af proeven 500 ml 0,2 % a-cholestanoloploesning, hvis undersoegelsen gaelder olivenolie, og 1 500 ml, hvis det gaelder froeolier eller olie fra olivenpresserester.

Proeven inddampes til toerhed i en nitrogenstroem, hvorefter 5 g af den toerrede, filtrerede proeve afvejes noejagtigt og overfoeres til den samme kolbe.

Animalske eller vegetabilske olier og fedtstoffer, der indeholder betydelige maengder cholesterol, kan vise en top, der har den samme retentionstid som a-cholestanol. Hvis det forekommer, maa sterolfraktionen analyseres to gange med og uden intern standard.

5.1.2.

50 ml 2 N kaliumhydroxid i ethanoloploesning tilsaettes, refluxsvaleren paasaettes, og vaesken opvarmes til svag kogning paa vandbad under vedvarende, kraftig omroering, indtil forsaebningen sker (oploesningen bliver klar). Opvarmningen fortsaettes i endnu 20 minutter, derefter tilsaettes 50 ml destilleret vand fra den oeverste del af svaleren, svaleren tages af, og kolben afkoeles til ca. 30o C.

5.1.3.

Kolbens indhold overfoeres kvantitativt til en 500 ml skilletragt, idet der skylles flere gange med destilleret vand, ialt ca. 50 ml. Ca. 80 ml diethylether tilsaettes, tragten rystes kraftigt i ca. 30 sekunder og faar lov til at henstaa (note 1).

Den nederste, vandige fase tappes af og opsamles i en anden skilletragt. Yderligere to ekstraktioner foretages paa den vandige fase paa samme maade, idet der bruges 60-70 ml diethylether hver gang.

Note 1: Eventuel emulsion kan oedelaegges ved tilsaetning af smaa maengder ethyl- eller methylalkohol ved hjaelp af en spray.

5.1.4.

Etherekstrakterne samles i en enkelt skilletragt og vaskes med destilleret vand (50 ml ad gangen), indtil vaskevandet giver en neutral reaktion.

Naar vaskevandet er fjernet, toerres ekstrakterne med vandfrit natriumsulfat og filtreres paa vandfrit natriumsulfat ned i en paa forhaand vejet 250 ml kolbe, idet tragt og filter vaskes med smaa maengder diethylether.

5.1.5.

Etheren destilleres ned til nogle faa ml og bringes derefter til toerhed under et let undertryk eller i en nitrogenstroem, toerres fuldstaendigt i en ovn ved 100o C i ca. 15 minutter, og vejes saa efter afkoeling i en ekssikkator.

5.2.

Separation af sterolfraktionen

5.2.1.

Forberedelse af de basiske plader. Kiselgelpladerne (4.4) nedsaenkes fuldstaendig i 0,2 N oploesningen af kaliumhydroxid i ethanol (4.5) i 10 sekunder. Derefter faar de lov at toerre i et stinkskab i 2 timer og saettes til sidst i en ovn ved 100o C i 1 time.

Pladerne tages ud af ovnen og opbevares i en calciumchlorid-ekssikkator, til de skal bruges (plader, der er behandlet paa denne maade, skal anvendes inden 15 dage).

Note 2: Naar basiske kiselgelplader benyttes til at separere sterolfraktionen, er det ikke noedvendigt at behandle de ikke-forsaebelige stoffer med aluminiumoxid. Paa denne maade holdes alle sure forbindelser (fede syrer og andre) tilbage paa basislinien, og sterolbaandet er klar adskilt fra de alifatiske og triterpene alkoholers baand.

5.2.2.

En 95:5 (v/v) benzen/acetoneblanding anbringes i kromatografikammeret til en hoejde paa ca. 1 cm. Som et alternativ kan en 65:35 (v/v) hexan/diethyletherblanding bruges. Kammeret lukkes med det dertil passende daeksel og efterlades saaledes i ca. en halv time, saa at der opnaas ligevaegt mellem vaeske og damp. Strimler af filtrerpapir, der dypper ned i eluenten, kan anbringes paa kammerets indre overflader. Dette reducerer elueringstiden med ca. 1/3 og giver en mere ensartet og regelmaessig eluering af komponenterne.

Note 3: Kromatografiblandingen boer udskiftes for hver test for at opnaa fuldstaendig reproducerbare elueringsbetingelser.

5.2.3.

Man tilbereder en ca. 5 % oploesning af de ikke-forsaebelige stoffer (5.1.5) i chloroform. Med 100 ml mikrosproejten afsaetter man paa en kromatografiplade (5.2.1) med 0,3 ml, ca. 2 cm fra den ene ende, en streg, som er saa tynd og ensartet som muligt. Paa linie med stregen placeres 2-3 ml af sterol-referenceoploesningen (4.11) i den ene ende af pladen, saa sterolbaandet kan identificeres efter eluering.

5.2.4.

Pladen anbringes i kromatografikammeret, som er forberedt som angivet i 5.2.2. Den omgivende temperatur boer holdes mellem 15 og 20o C. Kammeret lukkes straks med daekslet, og det faar lov til at eluere, indtil oploesningsmidlets forkant naar ca. 1 cm fra pladens oeverste kant. Derpaa fjernes pladen fra kromatografikammeret, og man lader oploesningsmidlet fordampe i en stroem af varm luft eller ved at lade pladen staa en kort tid i et stinkskab.

5.2.5.

Pladen sproejtes let og ensartet med 2,7-dichlorfluorosceinoploesningen. Naar pladen observeres under ultraviolet lys, kan sterolbaandet identificeres ved, at det bringes paa linie med den plet, der er opnaaet fra referenceoploesningen. Baandets graenser langs fluoroscenses kanter markeres med en sort blyant.

5.2.6.

Med en metalspatel skraber man kiselgelen af i det markerede omraade. Det fint pulveriserede materiale, der er fjernet, placeres i filtertragten (3.7). 10 ml varm chloroform tilsaettes, man blander omhyggeligt med metalspatelen og filtrerer under vakuum; filtratet opsamles i den koniske kolbe (3.8), der er forbundet med filtertragten.

Det tilbageholdte materiale i tragten vaskes tre gange med diethylether (ca. 10 ml hver gang), idet filtratet samles i den samme kolbe, der er forbundet med filtertragten. Filtratet inddampes til et rumfang af 4-5 ml, den tilbagevaerende oploesning overfoeres til det paa forhaand vejede 10 ml proeveroer (3.9), det inddampes til toerhed med let opvarmning i en bloed stroem af nitrogen, der fyldes atter op med nogle faa draaber acetone, der inddampes igen til toerhed, roeret placeres i en ovn ved 105o C i ca. 10 minutter, derefter lader man det svale af i en ekssikkator og vejer det.

Den rest, der findes i proeveroeret, bestaar af sterolfraktionen.

5.3.

Forberedelse af trimethylsilyletherne

5.3.1.

Til proeveroeret, der indeholder sterolfraktionen, saettes silyleringsreagenset, der bestaar af en 9:3:1 (v/v/v) blanding af pyridin/hexamethyl-disilazan/trimethyl-chlorsilan (note 4), i forholdet 50 ml for hvert milligram sterol, idet enhver optagelse af fugt undgaas (note 5).

Note 4: Brugsfaerdige oploesninger kan faas i handelen. Man kan ogsaa faa andre silyleringsreagenser som f.eks. bis-trimethylsilyltrifluor-acetamid + 1 % trimethyl-chlorsilan, som skal fortyndes med et lige saa stort rumfang vandfrit pyridin.

5.3.2.

Proeveroeret tilproppes, rystes omhyggeligt (uden at vende bunden i vejret paa det), indtil sterolerne er fuldstaendig oploest. Man lader det staa i mindst 15 minutter ved stuetemperatur og centrifugerer det saa i nogle faa minutter. Den klare oploesning er parat til gaskromatografisk analyse.

Note 5: Den lette opalisering, som kan fremkomme, er normal og giver ikke anledning til interferens. Hvis der dannes hvide fnug eller fremkommer en lyseroed farve, er det et tegn paa tilstedevaerelsen af fugt eller svaekkelse af reagensen. Hvis det forekommer, maa proeven gentages.

5.4.

Gaskromatografisk analyse

5.4.1.

Forberedende operationer, pakning af soejlen

5.4.1.1.

Soejlen monteres i gaskromatografen, idet indloebsenden forbindes med fordamperen, der staar i forbindelse med spaltningssystemet, og udloebsenden forbindes med detektoren.

Man foretager en generel kontrol af gaskromatografen (laekager fra gaskredsloebene, detektorens effektivitet, spaltningssystemetsog registreringssystemets effektivitet osv.)

5.4.1.2.

Hvis soejlen skal bruges for foerste gang, anbefales det, at den underkastes en konditionering. Man lader en svag gasstroem passere gennem soejlen og taender saa for gaskromatografienheden, derefter begynder man gradvis at varme op til en temperatur mindst 20o C over driftstemperaturen (note 6). Denne temperatur opretholdes i mindst 2 timer, derefter saettes hele enheden i driftstilstand (justering af gasstroemme og spaltning, antaendelse af flammen, forbindelse til den elektroniske skriver, justering af soejlekammeret, detektorens og injektorens temperatur osv.), og derefter optegens signalet med en foelsomhed, der er mindst to gange stoerre end den, man agter at anvende til analysen. Basisliniens forloeb skal vaere lige, uden toppe af nogen art, og den maa ikke glide.

Negativ glidning af en lige linie tyder paa laekage fra soejlens forbindelser, positiv glidning tyder paa utilstraekkelig konditionering af soejlen.

Note 6: Konditioneringstemperaturen skal altid vaere mindst 20o C lavere end den maksimumtemperatur, der er angivet for den anvendte stationaere fase.

5.4.2.

Valg af driftsbetingelser

5.4.2.1.

De anbefalede driftsbetingelser er som foelger:

- soejletemperatur: 260o C p5o C

- fordampertemperatur: 280o C

- detektortemperatur: 290o C

- baeregassens lineaere hastighed: helium 20-35 cm/s, hydrogen 30-50 cm/s

- spaltningsforhold: fra 1:50 til 1:100

- instrumentets foelsomhed: fra 4 til 16 gange den minimale daempning

- registreringsfoelsomhed: 1-2 mV fuld skala

- papirhastighed: 30-60 cm/time

- maengde stof injiceret: 0,5-1ml TMSE-oploesning.

Disse betingelser kan varieres i lyset af soejlens og gaskromatografens egenskaber, saa man opnaar kromatogrammer, der opfylder foelgende krav:

- retentionstiden for b-sitosterol boer vaere 20 p5 minutter

- campesteroltoppen boer vaere: for olivenolie (gennemsnitsindhold 3 %) 15 p5 % af hel skala; for soyaolie (gennemsnitsindhold 20 %) 80 p10 % af hel skala

- alle tilstedevaerende steroler skal adskilles. Desuden skal toppene ogsaa vaere fuldstaendig oploest, dvs. hver tops spor skal gaa tilbage til basislinien, foer sporet gaar op til den naeste top. Ufuldstaendig oploesning kan dog tolereres, saafremt toppen ved TRR (relativ retentionstid) 1,02 kan bestemmes kvantitativt ved brug af den vinkelrette linie.

5.4.3.

Analytisk fremgangsmaade

5.4.3.1.

Med 10 ml mikrosproejten optages 1 ml hexan, derefter traekkes foerst 0,5 ml luft og derefter 0,5-1 ml af proeveoploesningen op. Stemplet traekkes hoejere op, saa kanylen toemmes. Kanylen trykkes gennem injektionsenhedens membran, og efter 1-2 sekunder injiceres hurtigt, derefter fjernes kanylen langsomt efter ca. 5 sekunder.

5.4.3.2.

Optegnelsen fortsaettes, indtil de tilstedevaerende sterolers TMSE er fuldstaendig elueret.

Basislinien skal til stadighed opfylde kravene (5.4.1.2).

5.4.4.

Identifikation af toppene

De enkelte toppe identificeres paa basis af retentionstiderne og ved sammenligning med blandinger af sterol-TMSE, der er analyseret under de samme betingelser.

Sterolerne elueres i foelgende raekkefoelge: cholesterol, brassicasterol, 24-methylencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, D-7-campesterol, D-5,23-stigmastadienol, clerosterol, b-sitosterol, sitostanol, D-5-avenasterol, D-5,24-stigmastadienol, D-7-stigmastenol, D-7-avenasterol.

Retentionstiderne for b-sitosterol for SE 52 og SE 54 soejler er vist i tabel 1.

Figur 1 og 2 illustrerer typiske kromatogrammer for nogle olier.

5.4.5.

Kvantitativ vurdering

5.4.5.1.

Arealerne for a-cholestanol- og steroltoppene beregnes ved hjaelp af den integrerende taeller. Der ses bort fra toppene for eventuelle forbindelser, der ikke er blandt dem, der er opregnet i tabel 1.

5.4.5.2.

Koncentrationen af hver enkelt sterol beregnes i mg/100 g fedtstof som foelger:

sterol x = Ax × ms × 100

sterol x =

Ax · ms · 100

As · m

hvor:

Ax = toparealet for sterol x i kvadratmillimeter

As

=

arealet af á-cholestanoltoppen i kvadratmillimeter

ms

=

massen af tilsat á-cholestanol i milligram

m

=

massen af den proeve, der bruges til bestemmelsen, i gram.

6.

RAPPORTERING AF RESULTATERNE

6.1.

De individuelle sterolkoncentrationer angives som mg/100 g fedtstof og deres sum som »total sterolmaengde«.

6.2.

Den procentvise andel af de individuelle steroler beregnes paa grundlag af forholdet mellem arealet af den tilsvarende top og summen af arealerne af sterolernes toppe.

sterol % x = Ax × 100

% sterol x =

Ax × 100

ÓA

hvor:

Ax = arealet af top x

ÓA

=

summen af arealerne af alle toppe.

APPENDIX Bestemmelse af gassens lineaere hastighed

Med gaskromatografen indstillet paa normale driftsbetingelser injiceres 1-3 ml methan (eller propan), og man maaler den tid, det tager for gassen at passere gennem soejlen fra tidspunktet for injektionen til det tidspunkt, hvor toppen fremkommer (tM).

Den lineaere hastighed i cm/s er givet ved L/tM, hvor L er soejlens laengde i cm, og tMer den maalte tid i sekunder.

Tabel 1

Relative retentionstider for steroler

AE-5,23-stigmastadienol

Top

Identifikation

Relativ retentionstid

SE 54

soejle

SE 52

soejle

1

cholesterol

D-5-cholesten-39B>b-ol

0,67

0,63

2

cholestanol

59A>a-cholestan-39B>b-ol

0,68

0,64

3

brassicasterol

[24S]-24-methyl9D>D-5,22-cholestadien-39B>b-ol

0,73

0,71

4

24-methylen-cholesterol

24-methylen9D>D-5,24-cholestadien-39B>b-ol

0,82

0,80

5

campesterol

[24R]-24-methyl9D>D-5-cholesten-39B>b-ol

0,83

0,81

6

campestanol

[24R]-24-methyl-cholestan-39B>b-ol

0,85

0,82

7

stigmasterol

[24S]-24-ethyl9D>D-5,22-cholestadien-39B>b-ol

0,88

0,87

8

D-7-campesterol

[24R]-24-methyl9D>D-7-cholesten-39B>b-ol

0,93

0,92

9

D-5,23-stigmastadienol

[24R,S]-24-ethyl9D>D-5,23-cholestadien-39B>b-ol

0,95

0,95

10

chlerosterol

[24S]-24-ethyl9D>D-5,25-cholastadien-39B>b-ol

0,96

0,96

11

b-sitosterol

[24R]-24-ethyl9D>D-5-cholestan-39B>b-ol

1,00

1,00

12

sitostanol

24-ethyl-cholestan-39B>b-ol

1,02

1,02

13

D-5-avenasterol

[24Z]-24-ethyliden9D>D-5-cholesten-39B>b-ol

1,03

1,03

14

D-5,24-stigmastadienol

[24R,S]-24-ethyl9D>D-5,24-cholestadien-39B>b-ol

1,08

1,08

15

D-7-stigmastenol

[24R,S]-24-ethyl9D>D-7,24-cholestadien-39B>b-ol

1,12

1,12

16

D-7-avenasterol

[24Z]-24-ethyliden9D>D-7-cholesten-39B>b-ol

1,16

1,16

BILAG VI

BESTEMMELSE AF ERYTHRODIOL OG UVAOL INDLEDNING

Erythrodiol (almindeligvis forstaaet som totalindholdet af diolerne erythrodiol og uvaol) er en uforsaebelig bestanddel, som er karakteristisk for visse arter af fedtstoffer. Den findes i betydeligt hoejere koncentration i ekstraheret olivenolie end i de andre olier, som den findes i (presset olivenolie, vindruekerneolie), hvorfor bestemmelsen heraf kan anvendes til at konstatere tilstedevaerelsen af ekstraheret olivenolie.

1.

FORMAAL

At beskrive fremgangsmaaden til bestemmelse af erythrodiol i fedtstoffer.

2.

PRINCIP

Fedtstoffer forsaebes med kaliumhydroxid i ethanoloploesning, og de uforsaebelige bestanddele ekstraheres derefter med diethylether og renses paa en kolonne af aluminiumoxid.

De uforsaebelige bestanddele fraktioneres ved tyndtlagskromatografi paa kiselgel, hvorved baandet med sterolfraktionen adskilles fra baandet med erythrodiolfraktionen.

Sterolfraktionen og erythrodiolfraktionen fra pladen omdannes til trimethylsilylethere, hvorefter blandingen analyseres ved gaskromatografi.

Resultatet angives i procent erythrodiol i forhold til det samlede indhold af erythrodiol plus steroler.

3.

APPARATUR

3.1.

Det apparatur, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolindholdet).

4.

REAGENSER

4.1.

De reagenser, som er foreskrevet i bilag V (bestemmelse af sterolindholdet).

4.2.

Referenceoploesning af erythrodiol, 0,5 % oploesning i chloroform.

5.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Femstilling af de uforsaebelige stoffer

Der gaas frem som beskrevet i afsnit 5.1.2 i bilag V.

5.2.

Separation af erythrodiol og steroler

5.2.1.

Se afsnit 5.2.1 i bilag V.

5.2.2.

Se afsnit 5.2.2 i bilag V.

5.2.3.

Der fremstilles en 5 % oploesning i chloroform af de uforsaebelige stoffer.

Med en mikrosproejte paa 100 ml anbringes paa en kromatografiplade ca. 1,5 cm fra den nederste kant 0,3 ml af denne oploesning i en streg, der er saa tynd og ensartet som muligt. Paa den ene ende af pladen anbringes som reference nogle mikroliter af oploesningen af cholesterol og erythrodiol.

5.2.4.

Pladen anbringes i kromatografikarret, der er klargjort som angivet i 5.2.2 i bilag V. Den omgivende temperatur holdes paa ca. 20o C. Karret lukkes straks, og der elueres, indtil oploesningsmiddelfronten er ca. 1 cm fra pladens oeverste kant. Derpaa fjernes pladen fra kromatografikarret, og man lader oploesningsmidlet fordampe i en stroem af varm luft.

5.2.5.

Pladen sproejtes ensartet med en alkoholoploesning af 2,7-dichlorfluorescein. Naar pladen observeres under ultraviolet lys, fremstaar sterol- og erythrodiolbaandene ud for pletterne fra referenceoploesningen, og de afmaerkes med et punkt lidt uden for det fluorescerende baands kanter.

5.2.6.

Med en metalspatel skrabes kiselgelen i det markerede omraade af. Det afskrabede materiale fra pladen overfoeres til en kolbe paa 50 ml. Der tilsaettes 15 ml varm chloroform, omrystes omhyggeligt og filtreres paa glasfilter, idet siliagelen overfoeres til selve filteret. Der vaskes tre gange med 10 ml portioner varm chloroform, idet filtratet opsamles i en rundbundet kolbe paa 100 ml. Filtratet inddampes til et rumfang paa 4-5 ml og overfoeres til et tareret spidsbundet centrifugeglas paa 10 ml, og der inddampes til toerhed under let opvarmning i en svag stroem af nitrogen, hvorefter der vejes.

5.3.

Forberedelse af trimethylsilyletherne (TMSE)

Der gaas frem som beskrevet i afsnit 5.3 i bilag V.

5.4.

Gaskromatografi

Der gaas frem som beskrevet i afsnit 5.4 i bilag V.

Arbejdsbetingelserne for gaskromatograferingen skal vaelges saaledes, at de udover at opfylde kravene for analyse af sterolerne ogsaa foerer til separation af TMSE af erythrodiol og uvaol.

Efter injektion af proeven lader man skriveren koere indtil alle tilstedevaerende steroler, erythrodiol og uvaol er elueret. Derefter identificeres toppene (erythrodiol og uvaol har i forhold til b-sitosterol en relativ retentionstid paa henholdsvis ca. 1,45 og 1,55), og arealerne beregnes som angivet for sterolerne.

6.

ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Erythrodiol % = A1 + A2 + ÓAsteroler × 100

Erythrodiol % =

A1 + A2

A1 + A2 + ÓAsteroler

× 100

hvor:

A1 = toparealet for erythrodiol i mm²

A2

= toparealet for uvaol i mm²

ÓAsteroler = summen af arealerne for de tilstedevaerende steroler i mm²

Resultatet angives med én decimal.

BILAG VII

BESTEMMELSE AF FEDTSYRER I 2-POSITIONEN I TRIGLYCERIDER FRA OLIER OG FEDTSTOFFER 1.

OMFANG

I denne standard beskrives en metode til bestemmelse af sammensaetningen af den del af fedtsyrerne i en olie eller et fedtstof, som er forestret til glycerolens 2-position.

2.

ANVENDELSESOMRAADE

Denne standard finder som foelge af pankreas-lipases saerlige virkning anvendelse paa olie og fedtstoffer med et smeltepunkt paa under 45o C. Den kan ikke uden videre anvendes paa olier og fedtstoffer, der indeholder betydelige maengder fedtsyrer med 12 eller faerre kulstofatomer (kokos- og palmekerneolie, smoerfedt), staerkt umaettede fedtsyrer (med mere end fire dobbeltbindinger), med 20 eller flere kulstofatomer (fiskeolie og marine olier) eller fedtsyrer indeholdende andre oxygenerede grupper end syregruppen.

3.

PRINCIP

Eventuel neutralisering af sure olier og fedtstoffer i oploesning. Rensning paa kolonne af aluminiumoxid. Delvis hydrolyse af triglycerider ved hjaelp af pankreas-lipase inden for et bestemt tidsrum. Separation af de dannede monoglycerider ved tyndtlagskromatografi og methanolyse af disse monoglycerider. Analyse af methylesterne ved gas/vaeskekromatografi.

4.

APPARATUR

4.1.

100 ml rundbundet kolbe.

4.2.

25 ml rundbundet kolbe med slib.

4.3.

1 m lang svaler, som passer til kolben 4.2.

4.4.

250 ml Erlenmeyer-kolbe.

4.5.

50 ml baegerglas.

4.6.

500 ml skilletragt.

4.7.

Kromatografisoejle af glas, 13 mm indvendig diameter og 400 mm lang, forsynet med glasfilter og hane.

4.8.

10 ml centrifugeglas med slibprop.

4.9.

5 ml burette med 0,05 ml inddelinger.

4.10.

1 ml injektionssproejte med tynd kanyle.

4.11.

Mikrosproejte, som kan levere draaber paa 3-4 ml.

4.12.

Udstrygningsapparat til tyndtlagskromatografi.

4.13.

Glasplader til tyndtlagskromatografi, 20 × 20 cm.

4.14.

Elueringskar til tyndtlagskromatografi med slebet glaslaag egnet til 20 × 20 cm plader.

4.15.

Spray til tyndtlagskromatografi.

4.16.

Ovn indstillet til 103 p2o C.

4.17.

Termostat, som mellem 30 og 45o C kan reguleres med en noejagtighed paa 0,5o C.

4.18.

Rotationsfordamper.

4.19.

Elektrisk rysteapparat, som muliggoer en kraftig omrystning af centrifugeglasset.

4.20.

UV-lampe til undersoegelse af tyndtlagsplader.

Til kontrol af lipaseaktiviteten:

4.21.

pH-meter.

4.22.

Spiralomroerer.

4.23.

5 ml burette.

4.24.

Stopur.

For eventuel fremstilling af lipase:

4.25.

Laboratorieomroerer, egnet til dispergering og blanding af heterogene materialer.

5.

REAGENSER

5.1.

n-hexan, eller i mangel heraf petroleumsether (kogepunkt 30-50o C), kromatografikvalitet.

5.2.

2-propanol eller ethanol 95 % (v/v), analyseren kvalitet.

5.3.

2-propanol eller ethanol, 1:1 vandig oploesning.

5.4.

Diethylether, peroxidfri.

5.5.

Acetone.

5.6.

Myresyre, mindst 98 % (m/m).

5.7.

Elueringsoploesning: blanding af n-hexan (5.1), diethylether (5.4) og myresyre (5.6) i forholdet 70/30/1 (v/v/v).

5.8.

Aktiveret aluminiumoxid til kromatografi, neutral, Brockmann I.

5.9.

Silicapulver med bindemiddel, af egnet kvalitet til tyndtlagskromatografi.

5.10.

Pankreas-lipase af egnet kvalitet (note 1, note 2).

5.11.

Natriumhydroxid, vandig oploesning med 120 g/l.

5.12.

Saltsyre, 6 N vandig oploesning.

5.13.

Calciumchlorid (CaCl2), vandig oploesning med 220 g/l.

5.14.

Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig oploesning med 1 g/l.

5.15.

Bufferoploesning: pH af en 1 M vandig oploesning af trishydroxymethylaminomethan bringes op paa 8 ved tilsaetning af saltsyre (5.12) (kontrolleres med potentiometer).

5.16.

Phenolphthalein, oploesning med 10 g/l i 95 % (v/v) ethanol.

5.17.

2,7-dichlorfluorescein, oploesning med 2 g/l i 95 % (v/v) ethanol, gjort svagt alkalisk ved tilsaetning af 1 draabe 1 N natriumhydroxidoploesning pr. 100 ml.

Til kontrol af lipase-aktiviteten:

5.18.

Neutraliseret olie.

5.19.

Natriumhydroxid, 0,1 N vandig oploesning.

5.20.

Natriumcholat (enzymkvalitet), vandig oploesning med 200 g/l.

5.21.

Gummi arabicum, vandig oploesning med 100 g/l.

6.

PROEVEFORBEREDELSE

Hvis proevens syreindhold er under 3 %, bestemt efter bilag II, renses den direkte paa aluminiumoxid som beskrevet under 6.2.

Er syreindholdet i proeven over 3 %, bestemt efter bilag II, neutraliseres der med alkali ved tilstedevaerelse af et oploesningsmiddel som beskrevet under 6.1, efterfulgt af passage over aluminiumoxid som beskrevet under 6.2.

6.1.

Neutralisering med alkali ved tilstedevaerelse af oploesningsmiddel.

Der anbringes ca. 10 g af den raa olie i en skilletragt (4.6), hvorefter der tilsaettes 100 ml hexan (5.1), 50 ml 2-propanol (5.2), nogle faa draaber phenolphthaleinoploesning (5.16) og en maengde natriumhydroxidoploesning (5.11) svarende til den frie syremaengde i olien, plus 0,3 % i overskud. Der omrystes kraftigt i 1 min., tilsaettes 50 ml destilleret vand og omrystes igen, hvorefter man lader oploesningen staa og bundfaelde.

Efter separation fjernes saebelaget paa bunden, ligesom eventuelle mellemlag (slim, uoploeseligt stof) fjernes. Hexanoploesningen af den neutraliserede olie vaskes i flere omgange med 2-propanoloploesning (5.3) i portioner paa 25-30 ml, indtil phenolphthaleinets lyseroede farve forsvinder.

Det meste af hexanen fjernes ved destillation under vakuum i rotationsfordamperen (4.18), hvorefter olien toerres ved 30-40o C under vakuum ved hjaelp af en stroem af ren nitrogen, indtil hexanen er fjernet fuldstaendigt.

6.2.

Rensning paa aluminiumoxid

15 g aktiveret aluminiumoxid (5.8) opslaemmes i 50 ml hexan (5.1), og suspensionen haeldes i kromatografisoejlen (4.7) under omroering. Man lader aluminumoxidet bundfaelde sig og lader oploesningsmidlets niveau falde til 1-2 mm over adsorbenten. Derefter haeldes forsigt en oploesning af 5 g olie i 25 ml hexan (5.1) paa soejlen, og hele eluatet opsamles i en rundbundet kolbe (4.1).

7.

FREMSTILLING AF KROMATOGRAFIPLADER

Glaspladerne (4.13) renses grundigt med ethanol, petroleumsether og acetone, saa alle spor af fedtstof fjernes.

I en Erlenmeyer-kolbe (4.4) anbringes 30 g silicapulver (5.9), og der tilsaettes 60 ml destilleret vand. Derefter tilproppes kolben og rystes kraftigt i 1 min., hvorefter opslaemningen omgaaende overfoeres til udstrygningsapparatet (4.12), og de rene plader belaegges med et 0,25 mm tykt lag.

Pladerne lufttoerres i 15 min. og derefter i 1 time i ovnen (4.16) ved 103 p2o C. Pladerne afkoeles til stuetemperatur i ekssikkator foer brug. Faerdigfremstillede plader faas i handelen.

8.

FREMGANGSMAADE

8.1.

Hydrolyse med pankreas-lipase

I centrifugeglasset (4.8) afvejes ca. 0,1 g af den forberedte proeve. Hvis proeven bestaar af flydende olie, gaas direkte frem som beskrevet nedenfor. Bestaar den af fast fedt, oploeses den i 0,2 ml hexan, om noedvendigt under forsigtig opvarmning.

Der tilsaettes 20 mg lipase (5.10) og 2 ml bufferoploesning (5.15). Der omrystes forsigtigt men omhyggeligt og tilsaettes 0,5 ml natriumcholatoploesning (5.14) og 0,2 ml calciumchloridoploesning (5.13). Glasset lukkes med slibprop, rystes forsigtigt (undgaa at fugte proppen) og anbringes derefter omgaaende i termostaten (4.17), som holdes paa en temperatur paa 40 p0,5o C, og rystes i haanden i noejagtigt 1 min.

Glasset fjernes fra termostaten og omrystes kraftigt ved hjaelp af rysteapparatet (4.19) i noejagtigt 2 min.

Derefter koeles omgaaende i rindende vand. Saa tilsaettes 1 ml saltsyre (5.12) og 1 ml diethylether (5.4). Glasset tilproppes, og der blandes grundigt ved hjaelp af det elektriske rysteapparat. Derefter lader man glasset henstaa og fjerner det organiske lag ved hjaelp af sproejten (4.10), om noedvendigt efter centrifugering.

8.2.

Separation af monoglyceriderne ved tyndtlagskromatografi

Ekstraktet anbringes paa kromotografipladen med mikrosproejten (4.11) ca. 1,5 cm fra den nederste kant i en tynd ensartet linje saa smal som mulig. Pladen anbringes i det godt maettede elueringskar (4.14), og der elueres med elueringsvaesken (5.7) ved ca. 20o C op til ca. 1 cm fra pladens oeverste kant.

Pladen lufttoerres ved karrets temperatur og sproejtes med 2,7-dichlorfluoresceinoploesning (5.17). Monoglyceridbaandet identificeres (Rf ca. 0,035) under ultraviolet lys (4.20).

8.3.

Analyse af monoglyceriderne ved gas/vaeskekromatografi

Det under 8.2 fremkomne baand fjernes ved hjaelp af en spatel (undgaa at fjerne restbestanddele paa basislinjen) og overfoeres til methyleringskolben (4.2).

Det afskrabede silica behandles noejagtigt som beskrevet i bilag X B, saa monoglyceriderne omdannes til methylestere, hvorefter esterne undersoeges ved gaskromatografi som beskrevet i bilag X A.

9.

ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Sammensaetningen af fedtsyrer i 2-positionen beregnes med én decimals noejagtighed (note 3).

10.

NOTER

Note 1: Test for lipaseaktivitet

I en passende mixer tilberedes en olieemulsion ved omroering af en blanding af 165 ml gummi arabicum-oploesning (5.21), 15 g knust is og 20 ml neutraliseret olie (5.18).

10 ml af denne emulsion haeldes i et baergerglas (4.5), efterfulgt af 0,3 ml natriumcholatoploesning (5.20) og 20 ml destilleret vand.

Baegerglasset saettes i en termostat, der er indstillet til 37 p0,5o C (note 4), og elektroderne til et pH-meter (4.21) og en omroerer (4.22) nedsaenkes i baegerglasset.

Med en burette (4.23) tilsaettes draabevis natriumhydroxidoploesning (5.19), indtil der er opnaaet et pH

paa 8,5.

Der tilsaettes en tilstraekkelig maengde vandig suspension af lipase (se nedenfor). Saa snart pH-meteret viser en pH-vaerdi paa 8,3, startes stopuret (4.24), og der tilsaettes draabevis natriumhydroxidoploesning (5.19) med en saadan hastighed, at pH holdes fast paa 8,3. Den forbrugte maengde natriumhydroxidoploesning aflaeses hvert minut.

De aflaeste vaerdier afsaettes i et diagram med tiden som abscisse og den maengde alkalioploesning, der kraeves til fastholdelse af en konstant pH-vaerdi, som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje.

Den ovenfor omtalte lipasesuspension er en 1 (m/m) suspension i vand. Til hver test boer der anvendes tilstraekkeligt af denne suspension til, at der forbruges ca. 1 ml natriumhydroxidoploesning paa 4 - 5 min. Almindeligvis er der brug for 1 - 5 mg pulver.

Lipaseenheden er defineret som den maengde enzym, der frigoer 10 ì-aekvivalenter syre pr. minut. Aktiviteten A af det anvendte pulver, maalt i lipaseenheder pr. mg, beregnes efter formlen:

Note 1: A = V × 10

A =

V × 10

m

hvor:

V = antal ml natriumhydroxidoploesning (5.19) forbrugt pr. minut, beregnet ud fra diagrammet

m

= lipasetestportionens masse i mg.

Note 2: Fremstilling af lipase

Lipaser med tilfredstillende lipaseaktivitet kan faas i handelen, men de kan ogsaa fremstilles i laboratoriet paa foelgende maade: 5 kg frisk svinepankreas afkoeles til 0o C. Alt omgivende fedt og bindevaev fjernes, og pankreasvaevet finddeles i en blender, indtil der opnaas en flydende pasta. Denne omroeres med omroereren (4.25) i 4 - 6 timer med 2,5 l vandfri acetone og centrifugeres derefter. Bundfaldet ekstraheres yderligere tre gange med den samme maengde acetone, derefter to gange med en blanding af lige dele acetone og diethylether (v/v) og til sidst to gange med diethylether.

Efter toerring af bundfaldet i vakuum i 48 timer opnaas et stabilt pulver, som boer opbevares i koeleskab.

Note 3: I alle tilfaelde tilraades det at bestemme sammensaetningen af proevens samlede indhold af fedtsyrer, eftersom sammenligningen med sammensaetningen af syrer i 2-positionen vil hjaelpe med ved fortolkningen af de fundne data.

Note 4: Hydrolysetemperaturen er fastsat til 37o C, eftersom der anvendes en flydende olie. Den er dog fastsat til 40o C for analyseproeven, saa der bliver mulighed for at undersoege fedtstoffer med smeltepunkter paa op til 45o C.

BILAG VIII

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF TRILINOLEIN 1.

OMFANG

Bestemmelse af sammensaetningen af triglycerider i flydende vegetabilske olier, udtrykt ved deres aevivalente kulstoftal, ved hoejtryks vaeskekromatografi.

I denne standard beskrives en metode til separation og kvantitativ bestemmelse af triglyceridsammensaetningen af vegetabilske olier, udtrykt ved deres molekylvaegt og grad af umaettethed som funktion af deres aekvivalente kulstoftal (note 1).

2.

ANVENDELSESOMRAADE

Denne standard finder anvendelse paa alle vegetabilske olier indeholdende triglycerider af langkaedede fedtsyrer. Metoden er specielt anvendelig til paavisning af smaa maengder ikke-toerrende (linolsyreholdige) olier i de vegetabilske olier, hvor oliesyre er den fremherskende umaettede festsyrer, saasom olivenolie.

3.

PRINCIP

Separation af triglycerider efter deres aekvivalente kulstoftal ved hoejt ydende vaeskekromatografi (med omvendt fase) og tolkning af kromatogrammerne.

4.

APPARATUR

4.1.

Hoejtydende vaeskekromatograf med mulighed for termostatisk kontrol af kolonnetemperaturen.

4.2.

Injektionsenhed for portioner paa 10 ml.

4.3.

Detektor: differentialrefraktometer. Foelsomheden boer vaere mindst 10-4af fuldt udslag.

4.4.

Kolonne: roer af rustfrit staal, laengde 250 mm og indvendig diameter 4,5 mm, fyldt med silicapartikler med en diameter paa 5 mm og med 22-23 % kulstof i form af octadecylsilan (note 2).

4.5.

Skriver og/eller integrator.

5.

REAGENSER

Reagenserne skal vaere af analysekvalitet. Elueringsvaeskerne skal vaere afluftede og kan recirkuleres adskillige gange uden indflydelse paa separationerne.

5.1.

Chloroform.

5.2.

Acetone.

5.3.

Acetonitril.

5.4.

Elueringsvaeske: acetonitril + acetone (i et indbyrdes forhold, som foerer til den oenskede separation; der begyndes med en blanding i forholdet 50:50).

5.5.

Oploesningsmiddel for analyseproeven: acetone eller en blanding af acetone/chloroform i forholdet 1:1.

5.6.

Referencetriglycerider: enten anvendes glycerider, som faas i handelen (tripalmitin, triolein osv.), hvis retentionstider afsaettes mod det aekvivalente kulstoftal, eller der anvendes et referencekromatogram af soyaolie (se note 3 og 4 og figur 1 og 2).

6.

PROEVEFORBEREDELSE

Der fremstilles en 5 % oploesning af de proever, der skal analyseres, ved, at der afvejes 0,5 p0,001 g af proeven i en 10 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes op til 10 ml med oploesningsmiddel for analyseproeven (5.5).

7.

FREMGANGSMAADE

7.1.

Kromatografisystemet goeres klar, og der pumpes elueringsvaeske (5.4) igennem med en hastighed af 1,5 ml/min. til rensning af hele systemet. Der ventes, indtil basislinjen er blevet stabil.

Derefter indsproejtes 10 ml af proeven forberedt som under (6).

8.

BEREGNING OG ANGIVELSE AF RESULTATERNE

Der anvendes intern standard, dvs. at summen af toparealerne svarende til de forskellige triglycerider saettes lig med 100 %. Den procentvise andel af hvert triglycerid beregnes efter formlen:

% triglycerid = summen af alle toparealer × 100

% triglycerid =

topareal

summen af alle toparealer

× 100

idet resultatet angives med én decimal.

Note 1: Elueringsraekkefoelgen kan bestemmes ved beregning af de aekvivalente kulstoftal, ofte defineret ved udtrykket ECN = CN - 2n, hvor CN er kulstoftallet, og n er antallet af dobbeltbindinger. Det kan beregnes mere noejagtigt, hvis der tages hensyn til dobbelbindingens oprindelse. Hvis no, nl og nl n er antallet af dobbeltbindinger i henholdsvis olie-, linol- og linolensyre, kan det aekvivalente kulstoftal beregnes efter formlen:

ECN = CN - do no - dl nl - dl n nl n

hvor koefficienterne do, dl og dln kan beregnes ved hjaelp af referencetriglyceriderne. Under de betingelser, der er specificeret ved denne metode, vil resultatet ligge taet ved

ECN = CN - [2,60 no] - [2,35 nl] - [2,17 nln]

Note 2: Eksempler: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333

Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 eller lignende.

Note 3: Med adskillige referencetriglycerider er det ogsaa muligt at beregne oploesningsevnen med hensyn til triolein,

Note 3: a = RTmolein

á =

RTm

RTmolein

ved hjaelp af den reducerede retentionstid RTm = RT-RToploesningsmiddel

Ud fra en afbildning af log á mod f (antal dobbeltbindinger) kan retentionsvaerdierne for alle de triglycerider af fedtsyrer, som findes i referenctriglyceriderne, bestemmes - se figur 2.

Note 4: Kolonnen skal vaere saa effektiv, at toppene af LLL (trilinolein) adskilles helt fra toppene af triglyceriderne med naesten samme retentionstid.

Monoglycerider

og diglycerider

POO

PPO

+ 0,5

+ 0,25

- 0,25

- 0,5

BILAG IX

SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSOEGELSE VED ULTRAVIOLET LYS INDLEDNING

Spektrofotometrisk undersoegelse ved ultraviolet lys kan give oplysninger om et fedtstofs kvalitet, dets konserveringstilstand og om forandringer i det, frembragt ved teknologiske processer.

Absorptionen ved de boelgelaengder, der er specificeret i metoden, skyldes tilstedevaerelsen af konjugerede dien- og triensystemer. Disse absorptioner er udtrykt som specifikke ekstinktioner E 1 % 1 cm (ekstinktionen for en 1 % oploesning af fedtstoffet i det angivne oploesningsmiddel i et 1 cm tykt vaeskelag), saedvanligvis betegnet ved K, (ogsaa kaldet ekstinktionskoefficienten).

1.

OMRAADE

Metoden beskriver fremgangsmaaden til udfoerelse af en spektrofotometrisk undersoegelse af fedtstoffer ved ultraviolet lys.

2.

METODENS PRINCIP

Fedtstoffet oploeses i det specificerede oploesningsmiddel, og oploesningens ekstinktion bestemmes saa ved de fastsatte boelgelaengder i forhold til rent oploesningsmiddel. De specifikke ekstinktioner beregnes ud fra aflaesningerne paa spektrofotometeret.

3.

APPARATUR

3.1.

Et spektrofotometer til maaling af ekstinktion i ultraviolet lys mellem 220 og 360 nm, med mulighed for aflaesning ved hver hele nanometer.

3.2.

Firkantede kvartskuvetter med laag, med en optisk vejlaengde paa 1 cm. Naar kuvetterne er fyldt med vand eller et andet passende oploesningsmiddel, boer der ikke vaere forskelle paa mere end 0,01 ekstinktionsenheder mellem dem.

3.3.

25 ml maalekolber.

3.4.

En kromatografisoejle med en laengde paa 540 mm og en diameter paa 35 mm, med et udloebsroer med en diameter paa ca. 10 mm.

4.

REAGENSER

4.1.

Isooctan (2,2,4-trimethylpentan) af spektrofotometrikvalitet med en transmittans paa ikke mindre end 60 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller

- cyclohexan af spektrofotometrikvalitet med en transmittans paa ikke mindre end 40 % ved 220 nm og ikke mindre end 95 % ved 250 nm i forhold til destilleret vand, eller

- et andet egnet oploesningsmiddel, som kan oploese fedtstoffet fuldstaendigt (f.eks. ethanol til ricinusolie).

4.2.

Basisk aluminiumoxid til soejlekromatografi, tilberedt og kontrolleret som beskrevet i appendix 1.

4.3.

n-hexan til kromatografi.

5.

FREMGANGSMAADE

5.1.

Proeven skal vaere fuldstaendig homogen og fri for urenheder i suspension. Olier, som er flydende ved stuetemperatur, filtreres paa papir ved en temperatur paa ca. 30o C; faste fedtstoffer homogeniseres og filtreres ved en temperatur paa hoejst 10o C over smeltepunktet.

5.2.

Ca. 0,25 g af den saaledes forberedte proeve afvejes noejagtigt i en 25 ml maalekolbe, der fyldes op til maerket med det angivne oploesningsmiddel, og oploesningen homogeniseres. Den fremkomne oploesning skal vaere fuldstaendig klar. I modsat fald filtreres hurtigt paa papir.

5.3.

En kuvette fyldes med oploesningen, og ekstinktionerne maales ved en passende boelgelaengde mellem 232 og 276 nm med oploesningsmiddel som reference.

De aflaeste ekstinktionsvaerdier skal ligge inden for omraadet 0,1-0,8. Goer de ikke det, gentages maalingerne, idet der benyttes mere koncentrerede eller mere fortyndede oploesninger.

5.4.

Naar bestemmelse af en specifik ekstinktion skal ske efter passage over aluminiumoxid, gaar man frem paa foelgende maade: 30 g basisk aluminiumoxid opslaemmet i hexan haeldes paa kromatografisoejlen. Efter at adsorbenten har bundfaeldet sig, tappes den overskydende hexan af, indtil overfladen er ca. 1 cm over aluminiumoxidet.

10 g af fedtstoffet, homogeniseret og filtreret som beskrevet (5.1), oploeses i 100 ml hexan, og oploesningen haeldes paa soejlen. Eluatet opsamles, og alt oploesningsmiddel dampes af under vakuum ved en temperatur under 25o C.

Man gaar straks videre som beskrevet i (5.2) med dette fedtstof.

6.

ANGIVELSE AF RESULTATERNE

6.1.

Man opgiver den specifikke ekstinktion (ekstinktionskoefficient) ved de forskellige boelgelaengder, som beregnes efter:

Kl = c × s

Kl =

Eë

c × s

hvor:

Kë = den specifikke ekstinktion ved boelgelaengden ë

Eë

=

den ekstinktion, der er maalt ved boelgelaengden ë

c

=

oploesningens koncentration i g/100 ml

s

=

kuvettens tykkelse i cm.

Resultaterne angives med to decimaler.

6.2.

Spektrofotometrisk analyse af olivenolie i henhold til den officielle metode, der er angivet i EF-forordningerne, kraever bestemmelse af den specifikke ekstinktion i isooctanoploesning ved boelgelaengderne 232 og 270 nm samt bestemmelse af DK, som er givet ved:

DK = Km - Km - 4 + Km + 4

DK = Km -

Km - 4 + Km + 4

2

hvor Km er den specifikke ekstinktion ved boelgelaengden m, den boelgelaengde paa ca. 270 nm der giver maksimal absorption.

APPENDIX I Tilberedning af aluminiumoxidet og kontrol af dets aktivitet A 1.1.

Tilberedning af aluminiumoxidet

Aluminiumoxid, som paa forhaand er toerret i en ovn ved 380-400o C i 3 timer, anbringes i en beholder, der kan lukkes hermetisk, hvorefter der tilsaettes 5 ml destilleret vand pr. 100 g aluminiumoxid, og beholderen lukkes oejeblikkeligt. Den rystes flere gange og faar saa lov til at staa i mindst 12 timer foer brugen.

A 1.2.

Kontrol af aluminiumoxidets aktivitet

En kromatografisoejle med 30 g aluminiumoxid klargoeres. Efter fremgangsmaaden i afsnit (5.4) lader man en blanding, der bestaar af:

- 95 % jomfruolie med en specifik ekstinktion paa under 0,18 ved 268 nm

- 5 % jordnoedolie, der er behandlet med blegejord ved raffineringen, og som har en specifik ekstinktion paa ikke under 4 ved 268 nm,

passere gennem soejlen.

Hvis blandingen efter passage gennem soejlen har en specifik ekstinktion paa over 0,11 ved 268 nm, er aluminiumoxidet acceptabelt; hvis ikke maa hydratiseringsgraden oeges.

APPENDIX II Kalibrering af spektrofotometeret A 2.

Udstyret skal kontrolleres med regelmaessige mellemrum (mindst hver sjette maaned), baade for korrekt boelgelaengde og for udslagets noejagtighed.

A 2.1.

Boelgelaengden kan kontrolleres ved hjaelp af en kviksoelvlampe eller med egnede filtre.

A 2.2.

Ved kontrol af fotocellens og fotomultiplikatorroerets respons gaar man frem paa foelgende maade: 0,2 g ren kaliumchromat til spektrofotometri afvejes og oploeses i 0,05 N kaliumhydroxidoploesning i en 1 000 ml maalekolbe, og der fyldes op til maerket. Man overfoerer praecis 25 ml af denne oploesning til en 500 ml maalekolbe og fortynder op til maerket med den samme kaliumhydroxidoploesning.

Derefter maaler man denne oploesnings ekstinktion ved 275 nm med kaliumhydroxidoploesningen som reference. Den maalte ekstinktion med en 1 cm kuvette skal vaere 0,200 p0,005.

BILAG X A

GASKROMATOGRAFERING AF FEDTSYREMETHYLESTERE 1.

FORMAAL

Denne standard giver generelle retninglinjer for gaskromatografisk bestemmelse med pakket kolonne eller kapillarkolonne af den kvalitative og kvantitative sammensaetning af en blanding af fedtsyremethylestere fremstillet i henhold til bilag X B.

Metoden gaelder ikke for polymeriserede fedtsyrer.

2.

REAGENSER

2.1.

Baeregas

Inaktiv gas (nitrogen, helium, argon, hydrogen etc.) vel toerret og indeholdende mindre end 10 mg oxygen/kg.

Note 1: Hydrogen, der kun benyttes som baeregas, naar det gaelder kapillarkolonner, goer det muligt at foretage analysen dobbelt saa hurtigt, men indebaerer en risiko. Der forefindes sikkerhedsanordninger.

2.2.

Hjaelpegasser

2.2.1.

Hydrogen (renhedsgrad ·99,9 %), fri for organiske urenheder.

2.2.2.

Luft eller oxygen, fri for organiske urenheder.

2.3.

Referencestandard

En methylesterblanding af rene fedtsyrer eller methylesterne af et fedtstof, der saa vidt muligt har samme sammensaetning som det fedtstof, der skal analyseres.

Iltning af polyumaettende fedtsyrer maa undgaas.

3.

APPARATUR

Instruktionerne angaar det saedvanlige udstyr til gaskromatografering med pakket kolonne og/eller kapillarkolonne og flammeionisationsdetektor. Alt udstyr, som kan give den i 4.1.2. definerede ydeevne og oploesning, kan anvendes.

3.1.

Gaskromatograf

Gaskromatografen skal omfatte foelgende elementer:

3.1.1.

Injektionssystem

Der benyttes enten et injektionssystem

a) med pakkede kolonner med det mindst mulige doedvolumen (i dette tilfaelde skal injektionssystemet kunne opvarmes til en temperatur, som er 20-50o C hoejere end kolonnens) eller

b)

med kapillarkolonner, hvor injektionssystemet skal vaere specielt udformet til anvendelse med saadanne kolonner. Injektoren kan vaere med eller uden split.

Note 2: Er der ikke tale om fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer, kan der benyttes injektor med faldende naal (moving needle injector).

3.1.2.

Ovn

Ovnen skal vaere i stand til at opvarme kolonnen til en temperatur paa mindst 260o C og holde den valgte temperatur inden for 1o C, naar der er tale om en kapillarkolonne. Det sidste krav er saerlig vigtigt, da der benyttes et roer af sintret kvarts.

Det anbefales i alle tilfaelde at anvende temperaturprogrammeret opvarmning, navnlig til fedtsyrer med mindre end 16 kulstofatomer.

3.1.3.

Pakket kolonne

3.1.3.1.

Kolonnen skal vaere kontrueret af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (dsv. glas eller rustfrit staal), af foelgende dimensioner:

a) Laengde: 1-3 m. En relativt kort kolonne anvendes ved tilstedevaerelse af langkaedede fedtsyrer (over C20). Ved analyse af syrer med 4 eller 6 kulstofatomer anbefales det at anvende en kolonne paa 2 m.

b)

Indre diameter: 2-4 mm.

Note 3: Ved tilstedevaerelse af polyumaetterde forbindelser med mere end tre dobbeltbindinger er der risiko for, at de nedbrydes i en kolonne af rustfrit staal.

Note 4: Der kan anvendes et system med to pakkede kolonner.

3.1.3.2.

Fyldmateriale bestaaende af foelgende elementer:

a)

Baerer: kiselgur, syrevasket og silanbehandlet, eller andet egnet inaktivt baeremateriale med et snaevert kornstoerrelsesinterval (25 mm i omraadet 125 mm-200 mm), idet middelvaerdien vaelges efter kolonnens indre diameter og laengde.

b)

Stationaer fase: polaer vaeske af polyestertype (f.eks. diethylenglycolpolysuccinat, butandiolpolysuccinat, ethylenglycolpolyadipat mv.), cyanosiliconer eller enhver anden vaeske, der giver den kraevede kromatografiske adskillelse (4). Den stationaer fase boer udgoere 5 % (m/m)-20 % (m/m) af fyldmaterialet. En ikke-polaer fase kan anvendes til visse adskillelser.

3.1.3.3.

Konditionering af kolonnen

Efter at kolonnen om muligt er adskilt fra detektoren, opvarmes ovnen gradvis til 185o C, og en stroem af inaktiv gas ledes gennem den netop fremstillede kolonne med en hastighed paa 20-60 ml/min. i mindst 16 timer ved denne temperatur og derpaa i 2 timer ved 195o C.

3.1.4.

Kapillarkolonne

3.1.4.1.

Roeret skal vaere af et materiale, som er inaktivt i forhold til de stoffer, der skal analyseres (normalt glas eller sintret kvarts). Den indre diameter skal vaere paa mellem 0,2 mm og 0,8 mm. Den indvendige overflade skal undergaa en passende behandling (f.eks. forbehandling, deaktivering), inden den stationaere fasebelaegning paafoeres. En laengde paa 25 m er tilstraekkelig i de fleste tilfaelde.

3.1.4.2.

Stationaer fase: normalt af typen polyglycol [poly(ethylenglycol) 20 000], polyester (butandiolpolysuccinat) eller polaer polysiloxan (cyanosiliconer). Bundne (tvaerbundne) kolonner er velegnede.

Note 5: Der er risiko for, at polaere polysiloxaner goer det vanskeligt at identificere og adskille linolensyre og C20 syrer.

Belaegningerne skal vaere tynde, dvs. 0,1 mm-0,2 mm.

3.1.4.3.

Samling og konditionering af kolonnen

Der traeffes de normale forholdsregler ved samlingen af kapillarkolonner, dvs. placering af kolonnen i ovnen (baerer), valg og montering af samlinger (taethed), anbringelse af kolonnens ender i injektoren og detektoren (reduktion af doedvolumener). Kolonnen anbringes under en stroem af baeregas (f.eks. 0,3 bar (30 kPa) for en kolonne med en laengde paa 25 m og en indre diameter paa 0,3 mm).

Kolonnen konditioneres ved temperaturprogrammering af ovnen ved 3o C/min. fra den omgivende temperatur til en temperatur paa 10o C under den stationaere fases dekomponeringsgraense. Ovnen holdes paa denne temperatur i 1 time, indtil basislinjen har stabiliseret sig. Den genindstilles paa 180o C, saa der opnaas isotermiske betingelser.

Note 6: Korrekt praekonditionerede kolonner faas i handelen.

3.1.5.

Detektoren skal helst kunne opvarmes til en temperatur, som er hoejere end ovnens.

3.2.

Injektionssproejte

Injektionssproejten skal have en maksimumskapacitet paa 10 ml med 0,1 ml inddelinger.

3.3.

Skriver

Hvis den optegnede kurve skal anvendes til at beregne sammensaetningen af den analyserede blanding, skal skriveren vaere et meget praecist elektronisk instrument, som er foreneligt med det anvendte apparatur. Skriveren skal have foelgende specifikationer:

a) responstid mindre end 1,5 sek. og helst 1 sek. (responstiden er den tid, der forloeber, fra skriveren modtager et pludseligt signal paa 100 %, og indtil den giver et udslag paa 90 %)

b)

papirbredde: minimum 20 cm

c)

papirhastighed: regulerbar fra 0,4-2,5 cm/min.

3.4.

Integrator

Anvendelse af elektronisk integrator giver en hurtig og praecis beregning. Den skal give et lineaert udslag med tilstraekkelig foelsomhed, og korrektionen for forstyrrelser paa basislinjen skal vaere tilfredsstillende.

4.

FREMGANGSMAADE

4.1 til 4.3 angaar anvendelse af en flammeionisationsdetektor.

Alternativt kan anvendes en gaskromatograf med katarometerdetektor (registrerer aendringer af varmeledningsevne). I saa fald aendres arbejdsbetingelserne som angivet i 6.

4.1.

Proevebetingelser

4.1.1.

Bestemmelse af de optimale arbejdsbetingelser

4.1.1.1.

Pakket kolonne

Foelgende variabler indgaar i valget af arbejdsbetingelser:

a)

kolonnes laengde og diameter

b)

den stationaere fases art og maengde

c)

kolonnens temperatur

d)

baeregassens hastighed

e)

den oenskede oploesning

f)

proevens stoerrelse valgt paa en saadan maade, at detektoren og elektrometret i forening giver et lineaert udslag

g)

analysetiden.

Almindeligvis vil vaerdierne i tabel 1 og tabel 2 give de oenskede resultater, dvs. for methylstearat mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m kolonnelaengde og en elueringstid paa ca. 15 min.

Hvis apparaturet goer det muligt, skal injektoren have en temperatur paa omkring 200o C og detektoren en temperatur, som er lig med eller hoejere end kolonnes.

Forholdet mellem hydrogenstroemmen til flammeionisationsdetektoren og baeregassens hastighed ligger normalt paa 1:2 til 1:1 alt efter kolonnens diameter. Oxygenstroemmen er ca. 5-10 gange stoerre end hydrogenstroemmen.

Tabel 1

Kolonnes indre diameter

mm

Baeregassens hastighed

ml/min.

2

15-25

3

20-40

4

40-60

Tabel 2

Den stationaere fases koncentration

% (m/m)

Kolonnens temperatur

o C

5

175

10

180

15

185

20

185

4.1.1.2.

Kapillarkolone

Kapillarkolonnens ydeevne og permabilitet er ensbetydende med, at adskillelsen mellem bestanddelene og analysetiden stort set afhaenger af baeregassens hastighed i kolonnen. Det vil derfor vaere noedvendigt at skabe de bedst mulige driftsbetingelser ved ad foelge dette parameter (eller blot rette sig efter kolonnens tryktab) alt efter, om man oensker at opnaa bedre adskillelser eller foretage en hurtig analyse.

4.1.2.

Bestemmelse af antallet af teoretiske bunde (ydeevne) og oploesning

(Se figur 1).

Analysen gennemfoeres med en blanding af methylstearat og methyloleat i nogenlunde lige store maengder (f.eks. methylestere af kakaosmoer).

Kolonnens temperatur og baeregassens hastighed vaelges saaledes, at methylstearattoppens maksimum resistreres ca. 15 min. efter oploesningsmiddeltoppen. Der anvendes en tilstraekkelig maengde af methylesterblandingen til, at methylstearattoppen svarer til ca. ³/4 af fuldt udslag.

Antallet af teoretiske bunde, n (ydeevne), beregnes ud fra formelen:

n = [ 16 × dù ]²

n = [ 16 ×

dù

ù1

]²

og oploesningen, R, ud fra formelen:

R = ù1 + ù2

R =

2 × D

ù1 + ù2

hvor

dù = retentionsafstanden i mm maalt fra kromatogrammets start til det relative maksimum for methylstearattoppen

ù1 og ù2 = methylstearat- og methylolealtoppenes bredde i mm maalt mellem basislinjens skaeringspunkter med kurvens vendetangenter

D

=

afstanden i mm mellem methylstearat- og methyloleattoppenes maksima.

Betingelserne vaelges saaledes, at de for methylstearat giver mindst 2 000 teoretiske bunde pr. m kolonnelaengde og en oploesning paa mindst 1,25.

4.2.

Proeve

Med injektionssproejten (3.2) udtages 0,1-2 ml af methylesteroploesningen, der er fremstillet i henhold til bilag X B, og indsproejtes i kolonnen.

Naar det gaelder ikke oploeste estere, fremstilles i heptan til kromatografi en oploesning paa 100 mg/ml, og 0,1-1 ml af denne oploesning indsproejtes.

Ved analyse af bestanddele, der kun er til stede som spor, kan proeveudtagningen foroeges (op til ti gange).

4.3.

Analyse

Normalt vil driftsbetingelserne vaere de samme som dem, der er fastlagt i (4.1.1).

Det er dog muligt at arbejde med en lavere kolonnetemperatur, naar fedtsyrer med mindre end 12 kulstofatomer skal bestemmes, eller en hoejere temperatur, naar fedtsyrer med mere end 20 kulstofatomer skal bestemmes. Det et muligt at anvende temperaturprogrammering i begge tilfaelde. Hvis proeven f.eks. indeholder fedtsyremethylestere med mindre end 12 kulstofatomer, indsproejtes proeven ved 100o C (eller 50-60o C, hvis der er smoersyre til stede), hvorefter temperaturen straks oeges med 4-8o C/min, indtil den optimale temperatur naas. I visse tilfaelde kan de to fremgangsmaader kombineres.

Efter den programmerede opvarmning fortsaettes elueringen ved konstant temperatur, indtil alle bestanddelene er elueret. Hvis apparatet ikke arbejder med programmeret opvarmning, arbejdes der med to faste temperaturer mellem 100o C og 195o C.

Om noedvendigt anbefales det at foretage en analyse paa to stationaere faser med forskellig polaritet for at sikre sig, at der ikke forekommer maskerede toppe, hvilket kan vaere tilfaeldet ved samtidig tilstedevaerelse af C18:3 og C20:0 eller af C18:3 og C18:2 konjugeret.

4.4.

Udarbejdelse af referencekromatogrammet og referencediagrammer

Referencestandardblandingen (2.3) analyseres under de samme driftsbetingelser som for proevens vedkommende, og retentionstiderne eller retentionsafstandene for de tilstedevaerende fedtsyrer maales. Paa semilogaritmisk papir afbildes logaritmen til retentionstiden eller -afstanden mod antallet af kulstofatomer for alle grader af umaettethed; under isotermiske betingelser skal de punkter, der repraesenterer ligekaedede syrer med samme umaettethedsgrad, ligge paa rette linjer, der er nogenlunde parallelle.

Det er noedvendigt at undgaa betingelser, hvor der fremkommer »maskerede toppe«, dvs. hvor oploesningen er utilstraekkelig til at adskille to bestanddele.

5.

ANGIVELSE AF RESULTATER

5.1.

Kvalitativ analyse

Proevens methylestertoppe identificeres ud fra diagrammerne, der er udarbejdet i 4.4, om noedvendigt ved interpolation.

5.2.

Kvantitativ analyse

5.2.1.

Bestemmelse af sammensaetningen

Bortset fra undtagelsestilfaelde anvendes den interne normaliseringsmetode, dvs. det forudsaettes, at samtlige bestanddele i proeven er repraesenteret paa kromatogrammet, saaledes at toppenes samlede areal udgoer 100 % af bestanddelene (total eluering).

Hvis apparaturet omfatter en integrator, anvendes resultaterne fra denne. Hvis ikke, bestemmer man arealet af hver enkelt top ved at multiplicere toppens hoeje med dens bredde i halv hoejde og tager i givet fald hensyn til de forsekllige daempningsindstillinger under registreringen.

5.2.2.

Beregningsmetode

5.2.2.1.

Generelt

Indholdet af en given bestanddel i, udtrykt i vaegtprocent methylestere, beregnes ved, at man bestemmer den procentdel, som den tilsvarende top udgoer i forhold til summen af arealerne af samtlige toppe, ud fra foelgende formel:

Ó A × 100

Ai

n

Ó

i

A

× 100

hvor

Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i

niÓA

= summen af arealerne af samtlige toppe.

Resultatet anfoeres med en decimal.

Note 7: I dette generelle tilfaelde betragtes resultatet af beregningen, som er baseret paa relative arealer, som en vaegtprocent. I de tilfaelde, hvor man ikke kan arbejde med denne antagelse, henvises til 5.2.2.2.

5.2.2.2.

Anvendelse af korrektionsfaktorer

I visse tilfaelde, f.eks. ved tilstedevaerelse af fedtsyrer med mindre end otte kulstofatomer eller syrer med andre funktionelle grupper, boer der, naar man anvender varmeledningsevnedetektorer, eller naar den stoerst mulige praecision er specielt paakraevet, anvendes korrektionsfaktorer for at omsaette bestanddelenes procentvise toparealer til vaegtprocent.

Korrektionsfaktorerne bestemmes ved hjaelp af et kromatogram af en referenceblanding af methylestere med kendt sammensaetning under samme betingelser som for proevens vedkommende.

For denne referenceblanding udtrykkes vaegtprocent bestanddel i ud fra formlen

Ó m × 100

mi

n

Ó

i

m

× 100

hvor

mi = massen af bestanddel i i referenceblandingen

niÓm

= summen af masserne af referenceblandingens forskellige bestanddele.

Ud fra referenceblandingens (4.4) kromatogram beregnes procentdelen (areal/areal) af bestanddel i som foelger:

Ó A × 100

Ai

n

Ó

i

A

× 100

hvor

Ai

= arealet af den top, der svarer til bestanddel i

niÓA

= summen af arealerne af samtlige toppe.

Korrektionsfaktoren beregnes derpaa som:

Ki = mi × ÓA

Ki =

mi×

n

ÓA

i

Ai ×

n

Óm

i

Almindeligvis saettes korrektionsfaktorerne i relation til KC 1 6, saa de relative faktorer bliver:

Kmi = KC 1 6

Kmi=

Ki

KC 1 6

For proeven er maengden af hver bestanddel i, udtrykt i vaegtprocent methylestere,

S (Kmi × Ai) × 100

Kmi× Ai

n

Ó

i

(Kmi × Ai)

× 100

Resultatet anfoeres med en decimal.

5.2.2.3.

Anvendelse af en intern standard

I forbindelse med visse analyser (f.eks. naar det ikke er alle fedtsyrerne der er elueret, som det er tilfaeldet, naar syrer med 4 og 6 kulstofatomer er til stede sammen med syrer med 16 og 18 kulstofatomer, eller naar det er noedvendigt at bestemme den absolutte maengde af en fedtsyre i en proeve), er det noedvendigt at anvende en intern standard. Der benyttes ofte fedtsyrer med 5, 15 eller 17 kulstofatomer. Den eventuelle korrektionsfaktor for den interne standard bestemmes.

Vaegtprocent bestanddele i, udtrykt som methylestere, betemmes ud fra formlen

ms × Kmi × Ai × 100

ms× Kmi× Ai

m × Kms× As

× 100

hvor

Ai = arealet af den top, der svarer til bestanddel i

As

= arealet af den top, der svarer til den interne standard

Kmi

= korrektionsfaktoren for bestanddel i (i forhold til KC16)

Kms

= korrektionsfaktoren for den interne standard (i forhold til KC16)

m

= massen i mg af proeven

ms

= massen i mg af den interne standard.

Resultaterne anfoeres med en decimal.

6.

SAERLIGE TILFAELDE - ANVENDELSE AF KATAROMETERDETEKTORER (REGISTRERER AENDRINGER AF VARMELEDNINGSEVNE)

En gaskromatograf med detektor, der registrerer aendringer af varmeledningsevne (et katarometer) kan ogsaa anvendes til bestemmelse af den kvalitative og kvantitative sammensaetning af en blanding af fedtsyremethylestere. I saa fald aendres betingelserne i (3) og (4) som vist i tabel 3.

Til kvantitativ analyse anvendes korrektionsfaktorerne i (5.2.2.2).

Tabel 3

Variabel

Vaerdi/beting