Kommissionens forordning (EF) nr. 2091/2002

af 26. november 2002

om ændring af forordning (EF) nr. 2870/2000 om EF-referenceanalysemetoder for spiritus

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets forordning (EØF) nr. 1576/89 af 29. maj 1989 om fastlæggelse af almindelige regler for definition, betegnelse og præsentation af spiritus(1), ændret ved akten vedrørende Østrigs, Finlands og Sveriges tiltrædelse, særlig artikel 4, stk. 8, og

ud fra følgende betragtninger:

(1) I et bilag til Kommissionens forordning (EF) nr. 2870/2000 af 19. december 2000 om EF-referenceanalysemetoder for spiritus(2) er disse metoder beskrevet.

(2) Fire analysemetoder, som anvendes til bestemmelse af trans-anethol i spiritus med anissmag, bestemmelse af glycyrrhizinsyre og chalconer i pastis og bestemmelse af æggeblomme i æggelikør og i likør med æg, er blevet valideret efter internationalt anerkendte kriterier i et forskningsprojekt, der støttes af Kommissionen.

(3) Disse fire metoder kan anerkendes som EF-referenceanalysemetoder og skal tilføjes i bilaget til forordning (EF) nr. 2870/2000.

(4) De i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Gennemførelseskomitéen for Spiritus -

UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:

Artikel 1

I bilaget til forordning (EF) nr. 2870/2000 foretages følgende ændringer:

1) I indholdsoversigten til bilaget udgår udtrykket "(p.m.)" i punkt V, VI, VII og IX.

2) Kapitel V, VI, VII og IX, som er anført i bilaget til nærværende forordning, indsættes efter kapitel III.

Artikel 2

Denne forordning træder i kraft på syvendedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfærdiget i Bruxelles, den 26. november 2002.

På Kommissionens vegne

Franz Fischler

Medlem af Kommissionen

(1) EFT L 160 af 12.6.1989, s. 1.

(2) EFT L 333 af 29.12.2000, s. 20.

BILAG

V. ANETHOL. GASKROMATOGRAFISK BESTEMMELSE AF TRANS-ANETHOL I SPIRITUS

1. Anvendelsesområde

Metoden er egnet til bestemmelse af trans-anethol i spiritus med anissmag ved kapillargaskromatografi.

2. Normative referencer

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use - Specifications and test methods.

3. Princip

Spiritussens koncentration af trans-anethol bestemmes ved gaskromatografi (GC). Der tilsættes ens mængde intern standard, f.eks. 4-allylanisol (estragol), når estragol ikke er naturligt til stede i prøven, til prøven og til en trans-anethol-referenceopløsning med kendt koncentration, hvorefter begge opløsninger fortyndes med en 45 % ethanolopløsning og injiceres direkte i gaskromatografisystemet. Ekstrahering er nødvendig, før prøver af likører, der indeholder store mængder sukker, fremstilles og analyseres.

4. Reagenser og materialer

Under analysen må der kun anvendes reagenser med en renhed på mindst 98 %. Vand af mindst klasse 3 if. ISO 3696 anvendes.

Referencekemikalier skal opbevares koldt (ca. 4 °C), beskyttet mod lys i aluminiumbeholdere eller i reagensflasker af farvet (ravgult) glas. Propperne skal helst være forsynet med aluminiumpakning. Trans-anethol skal før brug "optøs" fra sin krystallinske tilstand, men herunder må dets temperatur ikke komme over 35 °C.

4.1. Ethanol 96 % v/v (CAS 64-17-5).

4.2. 1-methoxy-4-(1-propenyl)benzen (trans-anethol) (CAS 4180-23-8).

4.3. 4-allylanisol (estragol) (CAS 140-67-0), foreslået intern standard (IS).

4.4. Ethanol 45 % v/v.

Til 560 g destilleret vand tilsættes 378 g ethanol 96 % v/v.

4.5. Fremstilling af standardopløsninger

Alle standardopløsninger skal opbevares ved rumtemperatur (15-35 °C), beskyttet mod lys i aluminiumbeholdere eller i reagensflasker af farvet (ravgult) glas. Propperne skal helst have aluminiumtætning.

Trans-anethol og 4-allylanisol er praktisk talt uopløselige i vand og må derfor opløses i noget 96 % ethanol (4.1), før der tilsættes 45 % ethanol (4.4).

Nye stamopløsninger skal fremstilles hver uge.

4.5.1. Standardopløsning A

Stamopløsning af trans-anethol (koncentration: 2 g/l).

40 mg trans-anethol (4.2) afvejes i en 20 ml målekolbe (eller 400 mg i 200 ml osv.). Der tilsættes noget 96 % ethanol (4.1) og fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

4.5.2. Intern standardopløsning B

Stamopløsning af intern standard, f.eks. estragol (koncentration: 2 g/l).

40 mg estragol (4.3) afvejes i en 20 ml målekolbe (eller 400 mg i 200 ml osv.). Der tilsættes noget 96 % ethanol (4.1) og fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

4.5.3. Opløsninger til kontrol af lineariteten af flammeiondetektorens respons

Lineariteten af flammeiondetektorens respons skal kontrolleres med henblik på analyse under hensyntagen til en række koncentrationer af trans-anethol i spiritus fra 0 til 2,5 g/l. Under analysen fortyndes de ukendte spiritusprøver, der skal analyseres, ti gange (8.3). Med henblik på de i metoden beskrevne analysebetingelser fremstilles der stamopløsninger svarende til koncentrationer på 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 og 0,25 g/l trans-anethol i den prøve, der skal analyseres, som følger: 0,5, 1, 1,5, 2 og 2,5 ml stamopløsning A (4.5.1) afpipetteres i hver sin 20 ml målekolbe. I hver målekolbe afpipetteres 2 ml intern standardopløsning B (4.5.2), hvorefter der fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4) og blandes grundigt.

Blankopløsninger (8.4) anvendes som 0 g/l-opløsning.

4.5.4. Standardopløsning C

I en 20 ml målekolbe afpipetteres 2 ml stamopløsning A (4.5.1); der tilsættes 2 ml intern standardopløsning B (4.5.2) og fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

5. Apparatur og udstyr

5.1. Kapillargaskromatograf med flammeiondetektor og integrator eller andet databehandlingssystem, som kan måle toparealer eller tophøjder, og med automatisk prøveudtager eller med det nødvendige udstyr til manuel injektion af prøve.

5.2. Injektor med/uden split.

5.3. Kapillarsøjle, f.eks.:

længde: 50 m

indvendig diameter: 0,32 mm

filmtykkelse: 0,2 μm

stationær fase: FFAP - modificeret tværbunden porøs TPA-polyethylenglycol-polymer.

5.4. Sædvanligt laboratorieudstyr: volumetrisk glasudstyr af klasse A, analysevægt (nøjagtighed: ± 0,1 mg).

6. Betingelser for kromatografi

Kolonnens type og dimensioner samt betingelserne for gaskromatografi skal vælges således, at anethol og intern standard er adskilt fra hinanden og fra alle forstyrrende stoffer. Typiske betingelser for den i punkt 5.3 som eksempel angivne kolonne er:

6.1. Bæregas: helium af analysekvalitet.

6.2. Flowhastighed: 2 ml/min.

6.3. Injektortemperatur: 250 °C.

6.4. Detektortemperatur: 250 °C.

6.5. Ovntemperatur: isotermisk, 180 °C, køretid 10 min.

6.6. Injektionsvolumen: 1 μl, opdeling 1:40.

7. Prøver

Prøver skal opbevares ved rumtemperatur, beskyttet mod lys- og kuldepåvirkning.

8. Fremgangsmåde

8.1. Screening af prøverne for estragol

For at sikre, at prøven ikke i forvejen indeholder estragol, analyseres en blankprøve uden tilsætning af intern standard. Hvis estragol forekommer naturligt, må der vælges en anden intern standard (f.eks. menthol).

2 ml stamopløsning A afpipetteres i en 20 ml målekolbe, der fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4) og blandes grundigt.

8.2. Tilberedning af ukendte prøver

I en 20 ml målekolbe afpipetteres 2 ml prøve; der tilsættes 2 ml intern standardopløsning B (4.5.2) og fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

8.3. Blankprøve

I en 20 ml målekolbe afpipetteres 2 ml intern standardopløsning B (4.5.2), og der fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

8.4. Linearitetsprøve

Før analysen påbegyndes, kontrolleres lineariteten af flammeiondetektorens respons ved tre på hinanden følgende bestemmelser af hver linearitetsstandardopløsning (4.5.3).

Af integratorens topareal eller tophøjde afsættes for hver injektion koncentrationen af den tilsvarende stamopløsning i g/l mod forholdet R.

R= trans-anethol tophøjde eller -areal, divideret med estragol tophøjde eller -areal.

Derved skal fremkomme en retlinjet kurve.

8.5. Bestemmelse

Injicer blankopløsningen (8.3) efterfulgt af standardopløsning C (4.5.4), efterfulgt af en af linearitetsstandarderne (4.5.3), der fungerer som kvalitetskontrolprøve (denne kan vælges på grundlag af den formodede koncentration af trans-anethol i den ukendte prøve), efterfulgt af fem ukendte (8.2). Efter hver fem ukendte prøver indskydes en linearitetsprøve (kvalitetskontrolprøve) for at sikre den analytiske stabilitet.

9. Beregning af responsfaktor

Der måles enten topareal (med integrator eller andet datasystem) eller tophøjde (ved manuel integration) for trans-anethol og intern standard.

9.1. Beregning af responsfaktor (RFi)

Responsfaktoren beregnes således:

RFi = (Ci/topareal eller -højdei ) * (topareal eller -højdeis/Cis)

hvor:

Ci er koncentrationen af trans-anethol i standardopløsning A (4.5.1)

Cis er koncentrationen af intern standard i standardopløsning B (4.5.2)

areali er areal (eller højde) af trans-anethol-toppen

arealis er areal (eller højde) af intern standard-toppen.

RFi beregnes af de fem prøver af opløsning C (4.5.4).

9.2. Analyse af opløsningerne til linearitetskontrol

Injicer opløsningerne til linearitetskontrol (4.5.3).

9.3. Analyse af prøver

Injicer opløsningen af den ukendte prøve (8.2).

10. Beregning af resultaterne

Koncentrationen af trans-anethol beregnes ved følgende formel:

ci = Cis * (topareal eller -højdei/topareal eller -højdeis) * RFi

hvor:

ci er den ukendte koncentration af trans-anethol

Cis er koncentrationen af intern standard i den ukendte prøve (4.5.2)

topareal eller -højdei er trans-anethol toppens areal (eller højde)

topareal eller -højdeis er areal (eller højde) af toppen for intern standard

RFi er responskoefficienten (beregnet som angivet i punkt 9.1).

Koncentrationen af trans-anethol angives i gram pr. liter med én decimal.

11. Kvalitetssikring og -kontrol

Kromatogrammerne skal være sådan, at anethol og intern standard er adskilt fra hinanden og fra ethvert forstyrrende stof. RFi-værdien beregnes af resultaterne af de fem injektioner af opløsning C (4.5.4). Hvis variationskoefficienten (CV % = (standardafvigelse/gennemsnit) * 100)) er inden for plus eller minus 1 %, er RFi-gennemsnitsværdien acceptabel.

Ovenstående beregning skal anvendes til beregning af koncentrationen af trans-anethol i den prøve, der er udvalgt til kvalitetskontrol fra linearitetskontrolopløsningerne (4.5.3).

Hvis de beregnede gennemsnitsresultater af analysen af den linearitetsopløsning, der er valgt som intern kvalitetskontrolprøve (IQC), er inden for plus eller minus 2,5 % fra den teoretiske værdi, kan resultaterne for de ukendte prøver godtages.

12. Behandling af prøve af spiritus med stort indhold af sukker og likør før GC-analyse

Ekstraktion af alkohol i spiritus med stort sukkerindhold med henblik på bestemmelse af koncentrationen af trans-anethol med kapillargaskromatografi.

12.1. PRINCIP

Af prøven af likør udtages en alikvot del, hvortil der tilsættes intern standard i en koncentration svarende til analysandens (trans-anethol) i likøren. Dette tilsættes natriumphosphat (dodecahydrat) og vandfrit ammoniumsulphat. Den resulterende blanding rystes godt og afkøles, hvorved den deler sig i to lag. Den øverste, alkoholiske fase dekanteres. En alikvot del af denne alkoholfase udtages og fortyndes med 45 % ethanolopløsning (4.4). (Bemærkning: Der tilsættes ikke intern standard på dette trin, da den er tilsat i forvejen). Den resulterende opløsning analyseres ved gaskromatografi.

12.2. REAGENSER OG MATERIALER

Til ekstraktionen må kun anvendes reagenser med renhed på over 99 %.

12.2.1. Ammoniumsulphat, vandfrit (CAS 7783-20-2).

12.2.2. Natriumphosphat, dibasisk, dodecahydrat (CAS 10039-32-4).

12.3. APPARATUR OG UDSTYR

Koniske kolber, skilletragte, køleskab.

12.4. FREMGANGSMÅDE

12.4.1. Screening af prøverne for estragol

For at sikre, at der ikke i forvejen findes estragol i prøven, undersøges en blank ekstraktion (12.6.2), og analysen finder sted uden tilsætning af intern standard. Hvis estragol forekommer naturligt, må der vælges en anden intern standard.

12.4.2. Ekstraktion

I en konisk kolbe afpipetteres 5 ml 96 % ethanol (4.1), og i samme kolbe afvejes 50 mg intern standard (4.3), og der tilsættes 50 ml af prøven. Der tilsættes 12 g ammonium sulfat, vandfrit (12.2.1), samt 8,6 g dibasisk natriumphosphat, dodecahydrat (12.2.2). Den koniske kolbe tilproppes.

Kolben omrystes i mindst 30 minutter. Der skal anvendes mekanisk rystebord, ikke en teflonbelagt omrører, da teflon vil absorbere noget af analysanden. Bemærk, at de tilsatte salte ikke vil blive fuldstændig opløst.

Den tilproppede kolbe stilles i køleskab (T < 5 oC) i mindst to timer.

Når denne tid er gået, skal der have dannet sig to tydeligt adskilte væskelag og et bundfald. Det alkoholiske lag skal være klart. Hvis ikke, sættes kolben tilbage i køleskabet, indtil der er opnået et klart adskilt lag.

Når det alkoholiske lag er klart, udtager man uden at forstyrre den vandige fase forsigtigt en alikvot mængde (f.eks. 10 ml), som overføres til et ravgult hætteglas, der lukkes forsvarligt.

12.4.3. Fremstilling af den ekstraherede prøve til analyse

Lad ekstrakten (12.4.2) nå rumtemperatur.

I en 20 ml målekolbe afpipetteres 2 ml af alkoholfasen af den afkølede ekstraherede prøve, og der fyldes op til stregen med 45 % v/v ethanol (4.4), hvorefter der blandes grundigt.

12.5. Bestemmelse

Følg proceduren i punkt 8.5.

12.6. Beregning af resultaterne

Til beregning af resultaterne anvendes følgende formel:

Ci = (mis/V) * (areali/arealis) *RFi

hvor:

mis er massen af den udtagne (12.4.2) interne standard (4.3) (mg)

V er rumfanget af ukendt prøve (50 ml)

RFi er responsfaktoren (9.1)

areali er arealet af trans-anethol-toppen

arealis er toparealet af den interne standard.

Resultaterne angives i gram pr. liter med én decimal.

12.7. KVALITETSKONTROL OG KVALITETSSIKRING

Følg proceduren i punkt 11.

13. Metodens funktionsdata (præcision)

Statistiske resultater af interkalibrering:

I følgende tabeller er angivet værdier for anethol.

Følgende data er opnået i en international metodekvalitetsundersøgelse, der er udført efter internationalt anerkendte procedurer.

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

Prøvetyper:

A pastis, blind dobbeltprøve

B pastis, blind dobbeltprøve

C pastis, blind dobbeltprøve

D pastis, blind dobbeltprøve

E pastis, enkeltprøve

F pastis, enkeltprøve.

>TABELPOSITION>

Prøvetyper:

G ouzo, opdelt niveau (*)

H anis, blind dobbeltprøve

I likør med anissmag, dobbeltprøve

J likør med anissmag, dobbeltprøve

VI. GLYCYRRHIZINSYRE. BESTEMMELSE AF GLYCYRRHIZINSYRE MED HØJPERFORMANS-VÆSKEKROMATOGRAFI

1. Anvendelsesområde

Metoden er egnet til bestemmelse af glycyrrhizinsyre i spiritus med anissmag, ved hjælp af højperformans-æskekromatografi (HPLC). I forordning (EØF) nr. 1576/89 er det fastsat, at enhver spiritus, som har anissmag og benævnes "pastis", skal indeholde mellem 0,05 og 0,5 g glycyrrhizinsyre pr. liter.

2. Normative referencer

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use - Specifications and test methods.

3. Princip

Koncentrationen af glycyrrhizinsyre bestemmes ved højperformans væskekromatografi (HPLC) med UV-detektion. En standardopløsning og prøven filtreres og injiceres hver for sig direkte i HPLC-systemet.

4. Reagenser og materialer

Til analysen må kun benyttes reagenser af HPLC-kvalitet, absolut ethanol og vand af klasse 3 som defineret i ISO 3696.

4.1. Ethanol 96 % v/v (CAS 64-17-5).

4.2. Ammoniumglycyrrhizinat, C42H62O16.NH3 (ammoniumsalt af glycyrrhizinsyre)

(molekylvægt 839,98)(CAS 53956-04-0): renhed mindst 90 %

(molekylvægt af glycyrrhizinsyre 822,94).

4.3. Iseddikesyre, CH3COOH (CAS 64-19-7).

4.4. Methanol, CH3OH (CAS 67-56-1).

4.5. Ethanol 50 % v/v.

Til 1000 ml ved 20 °C:

- 96 % v/v ethanol (4.1): 521 ml

- vand (2.0): 511 ml.

4.6. Fremstilling af HPLC-elueringsvæsker

4.6.1. Elueringsvæske A (eksempel)

80 dele (v/v) vand (2.0)

20 dele (v/v) eddikesyre (4.3).

Elueringsvæsken afgasses i fem minutter.

Bemærkning:

Er det anvendte vand ikke mikrofiltreret, tilrådes det at filtrere den fremstillede elueringsvæske gennem et filter til organiske opløsningsmidler med porestørrelse på ikke over 0,45 μm.

4.6.2. Elueringsvæske B

Methanol (4.4).

4.7. Fremstilling af standardopløsninger

Alle standardopløsninger skal friskfremstilles efter to måneder.

4.7.1. Referenceopløsning C

25 mg ammoniumglycyrrhizinat (4.2) afvejes til nærmeste 0,1 mg i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes noget 50 % v/v ethanol (4.5), og ammoniumglycyrrhizinatet bringes i opløsning. Når det er bragt i opløsning, fyldes op til stregen med 50 % v/v ethanol (4.5).

Opløsningen filtreres gennem et filter til organiske opløsningsmidler.

4.7.2. Standardopløsninger (til kontrol af lineariteten af instrumenternes respons)

Der tilberedes en 1,0 g/l stamopløsning ved afvejning af 100 mg ammoniumglycyrrhizinat til nærmeste 0,1 mg i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes noget 50 % v/v ethanol (4.5), og ammoniumglycyrrhizinatet bringes i opløsning. Når det er bragt i opløsning, fyldes op til stregen med 50 % v/v ethanol (4.5).

Der tilberedes mindst fire andre opløsninger med 0,05, 0,1, 0,25 og 0,5 g ammoniumglycyrrhizinat pr. liter ved at afpipettere henholdsvis 5, 10, 25 og 50 ml af 1,0 g/l-og stamopløsningen i hver sin 100 ml målekolbe. Der fyldes så op til stregen med 50 % v/v ethanol (4.5), og indholdet blandes grundigt.

Alle opløsninger filtreres gennem et filter til organiske opløsningsmidler.

5. Apparatur og udstyr

5.1. Adskillelsessystem

5.1.1. Højperformans-væskekromatograf.

5.1.2. Pumpesystem, som giver mulighed for at opnå og opretholde en konstant eller programmeret gennemstrømningshastighed med stor nøjagtighed.

5.1.3. UV-spektrofotometrisk detektionssystem: skal være stillet på 254 nm.

5.1.4. System til afgasning af opløsningsmiddel.

5.2. Dataintegrator eller -registrator med en ydeevne, som er forenelig med det øvrige system.

5.3. Kolonne (eksempel)

Materiale: rustfrit stål eller glas.

Indre diameter: 4-5 mm.

Længde: 100-250 mm.

Stationær fase: tværbundet silica med en (fortrinsvis sfærisk) octadecyl (C18) funktionel gruppe, partikelstørrelse maks. 5 μm.

5.4. Laboratorieudstyr

5.4.1. Analysevægt med en nøjagtighed på 0,1 mg.

5.4.2. Glasmåleudstyr af klasse A.

5.4.3. Mikromembran-filtreringsopstilling til små mængder.

6. Betingelser for kromatografi

6.1. Elueringskarakteristika (eksempel)

- gennemstrømningshastighed: 1 ml/minut

- opløsningsvæske A = 30 %

- opløsningsvæske B = 70 %.

6.2. Detektion

- UV = 254 nm.

7. Fremgangsmåde

7.1. Fremstilling af spiritusprøven

Om nødvendigt filtreres gennem et filter til organiske opløsningsmidler (porediameter: 0,45 μm).

7.2. Bestemmelse

Når de kromatografiske betingelser har stabiliseret sig:

- Injicer 20 μl af referenceopløsning C (4.7.1).

- Injicer 20 μl af prøveopløsningen.

- De to kromatogrammer sammenholdes. Glycyrrhizinsyre-toppene identificeres ud fra retentionstiden. Mål toppens areal (eller højde) og beregn koncentrationen i g/l med to decimaler ved hjælp af følgende ligning:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor:

c er koncentrationen af glycyrrhizinsyre i den analyserede spiritus (g/l)

C er koncentrationen af ammoniumglycyrrhizinat i referenceopløsningen (g/l)

h er areal (eller højde) af glycyrrhizinsyretoppen for den analyserede spiritus

H er areal (eller højde) af glycyrrhizinsyretoppen for referenceopløsningen

P er renheden af den ammoniumglycyrrhizinat, der anvendes som reference (%)

823 er massen af mol glycyrrhizinsyre

840 er massen af mol ammoniumglycyrrhizinat.

8. Metodens funktionsdata (præcision)

Statistiske resultater af interkalibrering:

I følgende tabel er angivet værdier for glycyrrhizinsyre.

Følgende data er opnået i en international metodekvalitetsundersøgelse, der er udført efter internationalt anerkendte procedurer.

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

Prøvetyper:

A pastis, blind dobbeltprøve

B pastis, opdelt niveau (*)

C pastis, blind dobbeltprøve

D pastis, blind dobbeltprøve

E pastis, blind dobbeltprøve.

VII. CHALCONER. METODE TIL PÅVISNING AF CHALCONER I PASTIS VED HØJPERFORMANS VÆSKEKROMATOGRAFI

1. Anvendelsesområde

Metoden er velegnet til bestemmelse af, hvorvidt der er chalconer til stede i drikkevarer med anissmag eller ikke. Chalconer hører til flavonoiderne og er naturlige farvestoffer, som findes i lakridstræ (Glycyrrhiza glabra).

For at spiritus med anissmag kan kaldes "pastis", skal den indeholde chalconer (forordning (EØF) nr. 1576/89).

2. Normative referencer

ISO 3696 1987 Water for analytical laboratory use - Specifications and test methods.

3. Princip

Der fremstilles en referenceopløsning af lakridsekstrakt. Tilstedeværelse eller fravær af chalconer bestemmes ved højperformans væskekromatografi (HPLC) med UV-detektion.

4. Reagenser og materialer

Til analysen må kun benyttes reagenser af HPLC-kvalitet. Den anvendte ethanol skal være 96 % v/v. Der må kun anvendes vand af kvalitet 3 som fastlagt i ISO 3696.

4.1. Ethanol 96 % v/v (CAS 64-17-5).

4.2. Acetonitril, CH3CN (CAS 75-05-8).

4.3. Referencestof: Glycyrrhiza glabra (lakridstræ).

Groftrevet lakridstræ (Glycyrrhiza glabra). Gennemsnitsstrørrelse af stavformede partikler: længde: 10-15 mm, tykkelse: 1-3 mm.

4.4. Natriumacetat, CH3COONa (CAS 127-09-3).

4.5. Iseddikesyre, CH3COOH (CAS 64-19-7).

4.6. Fremstilling af opløsninger

4.6.1. Ethanol 50 % v/v.

Til 1000 ml ved 20 °C:

- 96 % v/v ethanol (4.1): 521 ml

- vand (2.0): 511 ml.

4.6.2. Opløsningsmiddel A: acetonitril.

Acetonitril (4.2) af en kvalitet svarende til HPLC-analyse.

Der afgasses.

4.6.3. Opløsningsmiddel B: 0,1 M natriumacetatbuffer, pH 4,66.

8,203 g natriumacetat (4.4) afvejes og tilsættes 6,005 g iseddikesyre (4.5), hvorefter der i en 1000 ml målekolbe fyldes op til stregen med vand (2).

5. Fremstilling af referenceekstrakt af Glycyrrhiza glabra (4.3)

5.1. 10 g revet lakridstræ (Glycyrrhiza glabra) (4.3) afvejes og anbringes i en rundbundet destillationskolbe.

- Der tilsættes 100 ml 50 % v/v ethanol (4.6.1).

- Der koges med tilbagesvaling i en time.

- Opløsningen filtreres.

- Filtratet stilles til side til senere brug.

5.2. Lakridstræsekstrakten uddrages fra filteret.

- Den anbringes i en rundbundet destillationskolbe.

- Der tilsættes 100 ml 50 % v/v ethanol (4.6.1).

- Der koges med tilbagesvaling i en time.

- Opløsningen filtreres. Filtratet stilles til side til senere brug.

5.3. Ekstraheringen af lakridstræet skal udføres tre på hinanden følgende gange.

5.4. De tre filtrater sammenhældes.

5.5. Opløsningsmiddelfasen (fra 5.4) inddampes i en rotationsinddamper.

5.6. Resten af ekstrakten (fra 5.5) opsamles med 100 ml 50 % v/v ethanol (4.6.1).

6. Apparatur og udstyr

6.1. Adskillelsessystem

6.1.1. Højperformans-væskekromatograf.

6.1.2. Et pumpesystem, som kan opnå og opretholde en konstant eller programmeret gennemstrømningshastighed ved højt tryk.

6.1.3. Et detektionssystem for UV/synligt lys, som kan stilles på 254 og 370 nm.

6.1.4. System til afgasning af opløsningsmiddel

6.1.5. En kolonneovn, som kan indstilles på en temperatur af 40 ± 0,1 °C.

6.2. En dataintegrator eller -registrator med en ydeevne, som er forenelig med resten af adskillelsessystemet.

6.3. Kolonne

Materiale: rustfrit stål eller glas.

Indre diameter: 4-5 mm.

Stationær fase: tværbundet silica med en octadecyl (C18) funktionel gruppe, partikelstørrelse maks. 5 μm (tværbundet fase).

6.4. Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:

6.4.1. Analysevægt (nøjagtighed: ± 0,1 mg).

6.4.2. Destillationsapparat med tilbagesvaler, bestående af f.eks.:

- 250 ml rundkolbe med standardslib

- en 30 cm lang tilbagesvaler, og

- en varmekilde (eventuelle pyrogene reaktioner, som inddrager det ekstraherede stof, skal undgås ved passende foranstaltninger).

6.4.3. Rotationsfordamper.

6.4.4. Filtreringsopstilling (dvs. Büchner-tragt).

6.5. Betingelser for kromatografi (eksempel)

6.5.1. Elueringskarakteristika for opløsningsmiddel A (4.6.2) og B (4.6.3):

- gradientændring fra 20/80 (v/v) til 50/50 (v/v) på 15 minutter

- gradientændring fra 50/50 (v/v) til 75/25 (v/v) på 5 minutter

- ensartet styrke på 75/25 (v/v) i 5 minutter

- stabilisering af kolonnen mellem injektionerne

- ensartet styrke 20/80 (v/v) i 5 minutter.

6.5.2. Gennemstrømningshastighed: 1 ml/minut.

6.5.3. Indstilling af UV-detektor

Detektoren indstilles på 370 nm for at påvise chalconer og derefter på 254 nm for at påvise glycyrrhizinsyre.

Bemærkning:

Ændringen i bølgelængde (fra 370 til 254 nm) skal finde sted 30 sekunder før starten af elueringstoppen for glycyrrhizinsyre.

7. Fremgangsmåde

7.1. Fremstilling af spiritusprøven

Der filtreres gennem et filter til organiske opløsningsmidler (porediameter: 0,45 μm).

7.2. Fremstilling af restekstrakt (5.6) af lakridstræ

Før analyse fremstilles en fortynding i forholdet 1:10 med 50 % v/v ethanol (4.6.1).

7.3. Bestemmelse

7.3.1. Der injiceres 20 μl af den fremstillede lakridstræsekstrakt (7.2). Analysen udføres ved de ovenfor (6.5) beskrevne betingelser for kromatografi.

7.3.2. Injicer 20 μl af prøveopløsningen (7.1) (spiritusprøve med anissmag). Analysen udføres ved de ovenfor (6.5) beskrevne betingelser for kromatografi.

7.3.3. De to kromatogrammer sammenholdes. Der skal være udtalt lighed mellem de to kromatogrammer i udgangsområdet for chalconer (ved detektion ved 370 nm under de ovenfor beskrevne analysebetingelser) (se figur 1).

8. Karakteristisk kromatogram for en pastis

Figur 1

Kromatogram, som er optegnet ved ovenstående metode og viser tilstedeværelse af chalconer i en "pastis". Top 1-8 er chalconer, top 9 er glycyrrhizinsyre

>PIC FILE= "L_2002322DA.002301.TIF">

9. Metodens funktionsdata (præcision)

Resultater af interkalibrering:

Følgende tabel viser præstationer ved bestemmelse af tilstedeværelse eller manglende tilstedeværelse af chalconer i pastis og spiritus med anissmag.

Følgende data er opnået i en international metodekvalitetsundersøgelse, der er udført efter internationalt anerkendte procedurer.

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

Prøvetyper:

A pastis, blind dobbeltprøve

B pastis, enkeltprøve

C pastis, enkeltprøve

D "pastis" (indeholder ikke chalconer), blind dobbeltprøve

E "pastis" (indeholder ikke chalconer), blind dobbeltprøve

F likør med anissmag (indeholder ikke chalconer), blind dobbeltprøve

G likør med anissmag (indeholder ikke chalconer), blind dobbeltprøve

H ouzo (indeholder ikke chalconer), enkeltprøve

I ouzo (indeholder ikke chalconer), enkeltprøve

J anis (indeholder ikke chalconer), blind dobbeltprøve

K "pastis" (indeholder ikke chalconer), blind dobbeltprøve.

IX. ÆGGEBLOMME. BESTEMMELSE AF ÆGGEBLOMMEKONCENTRATIONEN I SPIRITUS - FOTOMETRISK METODE

1. Anvendelsesområde

Metoden er egnet til bestemmelse af koncentrationen af æggeblomme i området 40-250 g/l i æggelikør og likør med æg.

2. Normative referencer

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use - Specifications and test methods.

3. Princip

Æggeblommens alkoholopløselige fosforforbindelser ekstraheres og bestemmes fotometrisk som fosformolybdatkompleks.

4. Reagenser og materialer

4.1. Dobbeltdestilleret vand.

4.2. Kiselgur.

4.3. Ethanol 96 % vol. (CAS 64-17-5).

4.4. 15 % opløsning af magnesiumacetat (CAS 16674-78-5).

4.5. 10 % svovlsyre (CAS 7664-93-9).

4.6. 1 N svovlsyre.

4.7. En 0,16 g/l opløsning af kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 (CAS 778-77-0).

4.8. Reagens for bestemmelse af phosphat

20 g ammoniummolybdat, (NH4)6Mo7O24.4H2O (CAS 12054-85-2), opløses i 400 ml vand ved 50 °C.

I et andet kar opløses 1 g ammoniumvanadat NH4VO3, (CAS 7803-55-6), i 300 ml varmt vand, opløsningen henstilles til den er afkølet, hvorefter der tilsættes 140 ml koncentreret salpetersyre (CAS 7697-37-2). De afkølede opløsninger overføres til samme 1000 ml målekolbe, og der fyldes op til 1000 ml-stregen.

5. Apparatur og udstyr

5.1. 100 ml konisk kolbe.

5.2. Ultralydsbad (eller magnetomrører).

5.3. 100 ml målekolbe.

5.4. 20 °C vandbad.

5.5. Filter (Whatman nr. 4 eller tilsvarende).

5.6. Digel af porcelæn (eller platin).

5.7. Kogende vandbad.

5.8. Varmeplade.

5.9. Muffelovn.

5.10. 50 ml-målekolbe.

5.11. 20 ml-målekolbe.

5.12. Spektrofotometer indstillet på 420 nm.

5.13. 1 cm-kuvette.

6. Prøver

Prøver opbevares ved rumtemperatur inden analysen.

7. Fremgangsmåde

7.1. Tilberedning af prøver

7.1.1. I en 100 ml-konisk kolbe (5.1) afvejes 10 g prøve.

7.1.2. Der tilsættes gradvis 70 ml ethanol (4.3) i små portioner, idet der omrystes for hver portion, hvorefter blandingen stilles i ultralydsbad (5.2) i 15 minutter (eller omrøres med magnetomrører (5.2) i 10 minutter ved rumtemperatur).

7.1.3. Kolbens indhold overføres til en 100 ml-målekolbe (5.3) ved skylning med ethanol (4.3). Der fyldes op til stregen med ethanol (4.3), og kolberne anbringes i et 20 °C vandbad (5.4). Ved 20 °C justeres til stregen.

7.1.4. Der tilsættes lidt kiselgur (4.2) og filtreres (5.5), idet de første 20 ml kasseres.

7.1.5. 25 ml af filtratet overføres til en digel (5.6.) af porcelæn (eller platin). Filtratet skal derefter koncentreres ved forsigtig inddampning i kogende vandbad (5.7) efter tilsætning af 5 ml af en 15 % magnesiumacetatopløsning (4.4).

7.1.6. Diglerne anbringes på varmeplade (5.8) og opvarmes, til de netop er tørre.

7.1.7. Inddampningsresten glødes ved 600 °C i en muffelovn (5.9), indtil asken er hvid, i mindst halvanden time, men kan glødes natten over.

7.1.8. Asken opløses i 10 ml 10 % svovlsyre (4.5) og overføres ved skylning med destilleret vand (4.1) til en 50 ml-målekolbe (5.10), som ved rumtemperatur fyldes op til stregen med destilleret vand (4.1). En 5 ml alikvot mængde af denne askeopløsning benyttes til fremstilling af prøveopløsning til fotometrisk phosphatbestemmelse.

7.2. Fotometrisk phosphatbestemmelse

7.2.1. Sammenligningsopløsning

7.2.1.1. 10 ml 10 % svovlsyre (4.5) hældes i en 50 ml-målekolbe (5.10), som fyldes op til stregen med destilleret vand (4.1).

7.2.1.2. En 5 ml alikvot mængde af denne opløsning (7.2.1.1) overføres til en 20 ml målekolbe (5.11), hvorefter der tilsættes 1 ml 1 N svovlsyre (4.6) og 2 ml phosphatreagens (4.8) og fyldes op til 20 ml med destilleret vand (4.1).

7.2.1.3. Der lukkes med løstsiddende prop, omrystes og varmes i kogende vandbad (5.7) i 10 minutter, hvorefter der afkøles i 20 °C vandbad (5.4) i 20 minutter.

7.2.1.4. En 1 cm kuvette (5.13) fyldes med denne sammenligningsopløsning.

7.2.2. Prøveopløsning

7.2.2.1. En 5 ml alikvot mængde af askeopløsningen (7.1.8) overføres til en 20 ml målekolbe (5.11) og tilsættes 1 ml 1 N svovlsyre (4.6) og 2 ml phosphatreagens (4.8), hvorefter der fyldes op til 20 ml med destilleret vand (4.1).

7.2.2.2. Der lukkes med løstsiddende prop, omrystes og varmes i kogende vandbad (5.7) i 10 minutter, hvorefter der afkøles i 20 °C vandbad (5.4) i 20 minutter.

7.2.2.3. Den resulterende gule opløsning analyseres straks spektrofotometrisk (5.12) i en 1 cm kuvette (5.13) ved 420 nm over for sammenligningsopløsningen (7.2.1.4).

7.2.3. Kalibreringskurve

7.2.3.1. Til optegning af kalibreringskurven overføres 2 ml alikvote mængder af phosphatreagenset (4.8) i 20 ml målekolber (5.11), som hver indeholder 1 ml 1 N svovlsyre (4.6) og henholdsvis 0, 2, 4, 6, 8 og 10 ml af kaliumdihydrogenphosphat-opløsningen (4.7), hvorefter der fyldes op til 20 ml-stregen med destilleret vand (4.1).

7.2.3.2. Der lukkes med en løstsiddende prop, omrystes og varmes i kogende vandbad (5.7) i 10 minutter, hvorefter der afkøles i 20 °C vandbad (5.4) i 20 minutter og analyseres spektrofotometrisk (5.12) i en 1 cm kuvette (5.13) ved 420 nm over for sammenligningsopløsningen (7.2.1.4).

7.2.3.3. Optegning af kalibreringskurve

>TABELPOSITION>

8. Angivelse af resultater

Koncentrationen af æggeblomme i g/l beregnes af følgende formel:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor:

110 er omregningsfaktor for total mængde P2O5 i g i 100 g æggeblomme

mg P2O5 er værdi fastlagt ud fra kalibreringskurven

massefylde er masse pr. rumfangsenhed (g/ml) af den æggebaserede likør ved 20 °C

E er vægtmængde æggebaseret likør i g

40 er fortyndingsfaktor for en 5 ml alikvot af askeopløsningen.

9. Metodens funktionsdata (præcision)

Statistiske resultater af interkalibrering:

Følgende tabel indeholder værdier for æggeblomme.

Følgende data er opnået i en international metodekvalitetsundersøgelse, der er udført efter internationalt anerkendte procedurer.

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

Prøvetyper:

A Advocaat, blind dobbeltprøve

B Advocaat, blind dobbeltprøve

C Advocaat, blind dobbeltprøve

D Advocaat (fortyndet), opdelte niveauer (*)

E Advocaat, blind dobbeltprøve.