*****

KOMMISSIONENS FORORDNING (EOEF) Nr. 1864/90

af 29. juni 1990

om aendring af forordning (EOEF) nr. 1470/68 om udtagelse og reduktion af proever samt om analysemetoder for saa vidt angaar olieholdige froe

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets forordning nr. 136/66/EOEF af 22. september 1966 om oprettelse af en faelles markedsordning for fedtstoffer (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 2902/89 (2), saerlig artikel 24a, og

ud fra foelgende betragtninger:

Betegnelsen »dobbeltlav« for raps- og rybsfroe afhaenger af deres indhold af glucosinolater; den bedst egnede metode boer anvendes ved bestemmelsen af dette indhold;

den faelles EF-metode for bestemmelse af indholdet af glucosinolater i rapsfroe blev fastlagt i Kommissionens forordning (EOEF) nr. 1470/68 (3), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 2435/86 (4); siden da er der udviklet og afproevet en bedre analysemetode; den faelles EF-metode for bestemmelse af indholdet af glucosinolater boer derfor aendres;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomitéen for Fedtstoffer -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING:

Artikel 1

Bilag VIII til forordning (EOEF) nr. 1470/68 erstattes af bilaget til denne forordning.

Artikel 2

Denne forordning traeder i kraft paa dagen for offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Den anvendes fra den 1. juli 1990.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 29. juni 1990.

Paa Kommissionens vegne

Ray MAC SHARRY

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. 172 af 30. 9. 1966, s. 3025/66.

(2) EFT nr. L 280 af 29. 9. 1989, s. 2.

(3) EFT nr. L 239 af 28. 9. 1968, s. 2.

(4) EFT nr. L 210 af 1. 8. 1986, s. 55.

BILAG

»BILAG VIII

BESTEMMELSE AF GLUCOSINOLATER I OLIEFROE VED

vaeskekromatografi (HPLC, high performance liquid chromatography)

1.2 // // // 1. // ANVENDELSESOMRAADE // // Dette bilag beskriver en metode til bestemmelse af forskellige glucosinolater i oliefroe fra arten brassica, specielt raps, ved hjaelp af HPLC. Der er tale om HPLC af afsvovlede glucosinolater. Metoden medtager ikke glucosinolater, der er substitueret i glucosemolekylet; men disse forbindelser forekommer kun i ubetydelig maengde i de rapsfroe, som faas i handelen for nuvaerende. // 2. // HENVISNINGER // // Forberedelse af proever til analyse skal udfoeres i overensstemmelse med de relevante bilag til denne forordning. Foelgende bilag er saerlig vigtige: // // Bilag II - Reduktion af kontraktproever til analyseproever. // // Bilag III - Bestemmelse af fugtindhold og indhold af flygtige stoffer. // 3. // PRINCIP // // Ekstraktion af glucosinolater med methanol-vand, efterfulgt af soejlekromatografisk oprensning og enzymatisk omdannelse paa kolonnen af glucosinolater til afsvovlede glucosinolater. Bestemmelse af de dannede afsvovlede glucosinolater ved hjaelp af omvendt fase HPLC med gradientevaluering og UV-detektion. // 4. // REAGENSER OG MATERIALER // // Alle reagenser skal vaere af analysekvalitet, og det vand, der benyttes, skal vaere glasdestilleret vand uden organiske urenheder eller vand af mindst tilsvarende renhed. // 4.1. // Methanoloploesning, 70 % (v/v) i vand. // 4.2. // Natriumacetat, 0,02 mol/l oploesning ved pH 4,0. // 4.3. // Natriumacetat, 0,2 mol/l oploesning. // 4.4. // Imidazolformiat, 6 mol/l oploesning. // // Oploes 204 g imidazol i 113 ml myresyre i en 500 ml maalekolbe. Fortyndes med vand til 500 ml. // 4.5. // Intern standardoploesning. // // Der anvendes sinigrin (kalium-allylglucosinolat-monohydrat, MV = 415,49), hvis renhed boer kontrolleres som angivet i 4.5.3. // 4.5.1. // 5 mmol/l sinigrinoploesning. // // 207,7 mg kalium-allylglucosinolat-monohydrat oploeses i vand i en 100 ml maalekolbe, og der fyldes op til maerket. // 4.5.2. // 20 mmol/l sinigrinoploesning. // // 831,0 mg kalium-allylglucosinolat-monohydrat oploeses i vand i en 100 ml maalekolbe, og der fyldes op til maerket. // // Disse oploesninger opbevares i koeleskab ved 4 °C, hvis de kun skal opbevares i kort tid (f.eks. en uge), eller i dybfryser ved - 18 °C i laengere perioder. // 4.5.3. // Renhedskontrol for sinigrin. // // Der benyttes en eller flere af foelgende tre tests: // // - kun én stor top, naar analyseret med HPLC som beskrevet heri // // - kun én stor top, naar analyseret som intakt sinigrin med HPLC (ionpar-teknikken) // // - kun én stor top ved gaskromatografianalyse af afsvovlet og silyleret sinigrin. // // // I ovennaevnte tests boer den store top repraesentere mindst 98 % af de samlede toparealer. // // Bekraeft ved bestemmelse af den maengde glucose, der er frigjort efter hydrolyse med myrosinase (thioglucosid glucohydrolase EC 3.2.3.1). Glucosen boer maales af enzymatisk vej ved hjaelp af et kommercielt proevesaet. Der maa tages hensyn til eventuel fri glucose, som boer bestemmes uden tilsaetning af myrosinase. Den molaere koncentration af glucose, der maales, boer vaere mindst 98 % af den molaere koncentration af den testede sinigrinoploesning. // 4.5.4. // Alternativ intern standard: Glucotropaeolin. // // I visse froe af arten Brassica eller i froe af lignende arter (dyrkede eller vildtvoksende) kan sinigrin forekomme naturligt. Naar naturligt sinigrin optraeder, er det noedvendigt at bruge den alternative interne kontrol: Glucotropaeolin (benzylglucosinolat, kaliumsalt, MV = 447,52); men undertiden er det vanskeligt at adskille glucotropaeolin fra andre naturligt forekommende glucosinolater. Glucotropaeolin bruge paa samme maade (5 og 20 mmol/l oploesninger) som sinigrin, efter at dens renhed er kontrolleret efter den fremgangsmaade, der er beskrevet i 4.5.3, og efter at man har verificeret, at dens respinsfaktor i sammenligning med sinigrin svarer til den, der er angivet i 7.2. // 4.6. // Mobile faser. // 4.6.1. // Eluent A: Vand (HPLC-kvalitet). // 4.6.2. // Eluent B: Acetonitril (HPLC-kvalitet) 20 % (v/v) oploesning i vand (HPLC-kvalitet). Koncentrationen kan modificeres i forhold til de soejler, som benyttes. // 4.7. // Ionbytningsresin: // 4.7.1. // DEAE Sepharose C1-6B, solgt i brugsfaerdig opslaemning, // 4.7.2 // DEAE sephadex A 25 opslaemning, fremstillet som foelge. // // 10 g resin blandes med overskud af eddikesyre ved 2 mol/l. Man lader det staa og saette bundfald. Der tilsaettes 2 mol/l eddikesyre, indtil opslaemningens rumfang er lig med det dobbelte af bundfaldets rumfang. // 4.8. // Sulphatase, Helix pomatia type H1 (EC 3.1.6.1), paa forhaand renset og kontrolleret som angivet nedenfor, derefter fortyndet. // 4.8.1. // Forberedelse af ionbytningssoejler // // Fem Pasteur-pipetter (5.9) skaeres over 7 cm over halsen, og en glasuldsprop anbringes i halsen (5.8). Pipetterne placeres lodret paa et stativ, og i hver pipette anbringes en opslaemning af ionbytningsresinen DEAE Sepharose (4.7.1) paa en saadan maade, at der opnaas et rumfang paa 500 ml draenet resin. // // 1 ml imidazolformiatoploesning 6 mol/l (4.4) haeldes i hver pipette, og der skylles to gange med 1 ml vand. // 4.8.2. // Oprensning af sulphatase // // 25 mg Helix pomatia type H1 afvejes til naermeste 0,1 mg og oploeses i 2,5 ml vand. 500 ml af denne oploesning overfoeres til hver af de regenererede soejler (4.8.1). Hver soejle vaskes med 1,5 ml vand, idet den udstroemmende vaeske fjernes. Derefter tilsaettes 1,5 ml af en 0,2 mol/l natriumacetatoploesning (4.3), og eluaterne fra de fem soejler optages og samles i et reagensglas. // // Eluaterne koncentreres ved filtrering paa et Millipore PTGC 11K25 filter, indtil der er opnaaet en rest paa ca. 100 ml (sulphatase med en molaer masse over 5 000 fjernes ikke). Der tilsaettes 2,5 ml vand og koncentreres igen ved filtrering, indtil der er opnaaet en rest paa ca. 100 ml. Den fortyndes med vand til 2,5 ml, og den rensede sulphatase opbevares i dybfryser ved - 18 °C (i smaa maengder for at muliggoere hurtig optoening af den maengde, der er noedvendig til oejeblikkelig brug). // 4.8.3. // Test for sulphataseaktiviteten. // 4.8.3.1. // Forberedelse af en 0,15 mmol/l sinigrinoploesning, bufet til pH 5,8. // // Foelgende oploesninger forberedes efter hinanden: // // a) 1 ml eddikesyre overfoeres til en 500 ml kolbe, og der fyldes op til maerket // // b) 1 ml ethylendiamin overfoeres til en 500 ml kolbe, og der fyldes op til maerket // // // c) 73 ml af oploesning a) blandes med 40 ml af oploesning b) // // d) Der justeres til pH 5,8 med enten oploesning a) eller oploesning b). // // 3 ml af den 5 mmol/l sinigrinoploesning (4.5.1) haeldes i en 100 ml kolbe, og der fyldes op til maerket med oploesning c). // 4.8.3.2. // Aktivitetstest. // // En aktivitetsenhed udtrykkes som dannelsen af 1 micromol afsvovlet sinigrin pr. minut ved 30 °C og pH 5,8. // // For at udfoere testen overfoeres 2 ml af den bufrede sinigrinoploesning (4.8.3.1) til spektrometerets referencecelle og maalecelle (5.3). Spektrometeret indstillet til en boelgelaengde paa 228 nm ved en celletemperatur paa 30 °C. Til tiden t = O placeres 50 ml renset sulphatase (4.8.2) i maalecellen, og skriveren tilsluttes. Skriveren standses, naar absorbansen ikke laengere varierer (Ae), tangenten plottes 1.2.3.4 // // til punktet T = O, og dens gradient // D A D t // maales 1.2 // // Sulphataseaktiviteten, udtrykt i aktivitetsenheder pr. milliliter sulphataseoploesning, er lig med: 1.2.3.4.5.6.7 // // D A D t // × // V D E // × // 1 000 50 // × 106 1.2 // // hvor: 1.2.3 // // D A D t // er tangentes gradient i punktet t = 0, i absorbansenheder pr. minut // // V // er det reagerende mediums rumfang i liter (dvs, 2,05 × 10-31). // // D E // er differencen mellem de molaere ekstinktionskoefficienter for sinigrin og afsvovlet sinigrin ved 228 nm: 1.2.3.4 // // // D E = // D Ae e × c 1.2.3 // // // hvor: 1.2.3.4 // // // D Ae // er differencen mellem absorbansen ved ligevaegt for det afsvovlede sinigrin og absorbansen ved tiden t = 0 // // // e // er cellens laengde i cm (dvs. 1 cm) // // // c // er koncentrationen af afsvovlet sinigrin ved ligevaegt, i mol pr. liter, dvs.: 1.2.3.4.5.6 // // // // c = // 0,15 × 10-3 × 0,95 × 2 2,05 // = 1,39 × 10-4 mol/l 1.2 // // Udbyttet ved ligevaegt for afsvovling af sinigrin er 0,95. // // Derefter beregnes DE, som skal vaere i stoerrelsesordenen 1 500 l × mol-1 × cm-1. // // Sulphataseaktiviteten kan ogsaa beregnes ved hjaelp af foelgende forenklede formel: 1.2.3 // // Aktivitet = // D A × 5,7 D t × D Ae 1.2 // // Den fundne aktivitet boer vaere stoerre end 0,5 mmol/min x ml renset sulphataseoploesning (4.8.2). // 4.8.4. // Fortynding. // // Ved hjaelp af en pipette overfoeres 1 ml renset sulphatase (4.8.2) til en 10 ml maalekolbe, man fylder op til maerket vand og blander. // // Oploesningen deles op i smaa kvanta og opbevares ved - 18 °C. // 5. // APPARATUR // // Normalt laboratorieudstyr, og specielt: // // // 5.1. // HPLC-udstyr med mulighed for anvendelse af gradienteluering og kontrolleret soejletemperatur (30 °C, forbundet med en UV-detektor, der tillader maalinger ved 229 nm. // 5.2. // Kromatografisk soejle til HPLC, type C18 eller C8, med partikelstoerrelse 5 mm, eller for eksempel: 1.2.3 // // - Lichrosorb RP 18 soejle 5 mm // (150 mm × 4,6 mm) // // - Spherisorb ODS2 soejle 5 mm // (250 × 4-5 mm) // // - Novapak C18 soejle 4 mm // (150 mm × 4 mm) // // - Lichrospher RP8 soejle 5 mm // (125 mm × 4 mm) // // - Nucleosil C18 soejle 5 mm // (200 mm × 4 mm). 1.2 // 1.2 // // Den valgte soejles ydelse boer jaevnligt kontrolleres, fortrinsvis ved brug af en afsvovlet glucosinolatblanding, fremstillet fra en referenceproeve af rapsfroe skaffet fra Faellesskabets referencebureau. Isaer maa soejlen ikke nedbryde 4-hydroxyglucobrassicin, et vigtigt, men forholdsvis ustabilt glucosinolat. // // Nye soejler skal underkastes en proevekoersel, saa reproducerbare resultater kan opnaas. // 5.3. // Dobbeltstraalespektrometer, som kan virke i det ultraviolette omraade og, saa vidt muligt, ved kontrolleret temperatur paa 30 °C, monteret med kvartsceller og, saa vidt muligt, med en skriver. // 5.4. // Mikromoelle, for eksempel en kaffemoelle. // 5.5. // Centrifuge til 6 ml roer, som kan opnaa en centrifugalacceleration paa 5 000 g. // 5.6. // Vandbad eller opvarmningsenhed, som kan indstilles til 75 °C. // 5.7. // Polypropylenroer med kapaciteten 6 ml. // 5.8. // Glasuld. // 5.9. // Pasteur-pipetter, 150 mm lange. // 6. // FREMGANGSMAADE // 6.1. // Forberedelse af analysemetoden. // // Laboratorieproeven reduceres i overensstemmelse med bilag II og males i mikromoellen (5.4) i 20 sekunder. Melet blandes og males i yderligere 5 sekunder. // // Hvis froeene har et fugtindhold paa over 10 % (w/w), skal de foerst toerres ved hjaelp af en luftstroem ved ca. 45 °C. // // Bemaerk: Naar behandlede (bejdsede) froe analyseres, skal de vaskes med dichlormethan, foer de males. // 6.2. // Bestemmelse af indholdet af fugt og flygtige stoffer. // // Indholdet af fugt og flygtige stoffer bestemmes i overensstemmelse med bilag III. // 6.3. // Analyseproeve. // // To roer forberedes (5.7), og 200 mg af analyseproeven af oliefroe, afvejet til naermeste 0,1 mg, overfoeres til hvert af dem. // 6.4. // Ekstraktion af glucosinolater. // // Roerene placeres i et vandbad eller en opvarmningsenhed (5.6), indstillet til 75 °C, og staar der i 1 minut. 2 ml kogende 70 % methanoloploesning (4.1) tilsaettes, og umiddelbart efter tilsaettes: // // - til det foerste roer A 200 ml 5 mmol/l sinigrinoploesning (4.5.1) // // - til det andet roer B 200 ml 20 mmol/l sinigrinoploesning (4.5.2). // // Opvarmningen fortsaettes i vandbadet ved 75 °C i 10 minutter under jaevnlig omrystning. Indholdet af hvert roer blandes og centrifugeres med en acceleration af 5 000 g i 3 minutter. Supernatenten fra hvert roer overfoeres til et andet roer (5.7). // // Til bundfaldet i hvert roer saettes 2 ml 70 % kogende methanoloploesning (4.1), og det opvarmes atter i vandbadet ved 75 °C i 10 minutter under jaevnlig omrystning. Det centrifugeres i 3 minutter, og supernatenten med tilsvarende supernatent fra foerste ekstraktion. Rumfanget justeres med vand til ca. 5 ml, og der blandes. // // Denne ekstrakt kan opbevares i to uger i moerke i en fryser ved - 18 °C. // 6.5. // Forberedelse af ionbytningssoejler. // // Det noedvendige antal Pasteur-pipetter, dvs. 1 pipette pr. proeve, skaeres, saa der er et rumfang paa 1,2 ml over halsen, og en glasuldsprop (5.8) saettes i halsen. Pipetterne placeres vertikalt paa et stativ. // // 0,5 ml af den grundigt blandede opslaemning af DEAE Sephadex A 25 (4.7.2) anbringes i hver soejle og faar tid til at saette bundfald. // // Soejlerne skylles med 2 ml 6 mol/l imidazolformiat (4.4) og derefter to gange i 1 ml vand.

1.2 // // // 6.6. // Rensning og afsvovling // // 1 ml ekstrakt (6.4) anbringes i den forberedte soejle (6.5), uden at resinoverfladen forstyrres, og man lader den dryppe af. Der tilsaettes to gange 1 ml natriumacetatbuffer, 0,02 mol/l ved pH 4,0 (4.2), og man lader den dryppe af hver gang. // // 75 m l fortyndet, renset sulphataseoploesning (4.8.4) tilsaettes. Man lader det staa og virke natten over ved stuetemperatur. Det opnaaede afsvovlede glucosinolat elueres med to gange 1 ml vand (HPLC-kvalitet), som faar lov til at loebe af efter hver tilsaetning. Eluatet opsamles i et roer. Eluatet blandes godt og opbevares i moerke i en fryser ved -18 °C, hvis det ikke straks skal underkastes kromatografi. // 6.7. // Referencetest // // Hvis det er paakraevet (se 7.3), udfoeres en referencetest under de samme betingelser paa en identisk testportion, men med udeladelse af den interne standardoploesning af sinigrin, for at paavise og bestemme maengden af et eventuelt indhold af sinigrin i analyseproeven. // 6.8. // Kromatografi // 6.8.1. // Indstilling af apparatet. // // Den mobile fases stroemningshastighed: afhaenger af soejlens beskaffenhed (se 6.8.2). // // Soejlens temperatur: 30 °C. // // Detektionsboelgelaengde: 229 nm. // 6.8.2. // Test og elueringsgradient // // I henhold til betjeningsvejledningen for apparatet injiceres ikke over 50 ml af den afsvovlede glucosinolatoploesning, som blev opnaaet under 6.6. // // I overensstemmelse med den anvendte soejle kan flere gradienter vaere passende. // // - Spherisorb RP 18 5 mm soejle (150 mm × 4,6 mm) // // - 100 % af eluent A (4.6.1) og 0 % af eluent B (4.6.2) i 1 minut // // - en linaer elueringsgradient i 20 minutter indtil 0 % af eluent A og 100 % af eluent B opnaas // // - en linaer elueringsgradient i 5 minutter indtil 100 % af eluent A og 0 % af eluent B opnaas // // - 100 % af eluent A og 0 % af eluent B i 5 minutter for at bringe systemet i ligevaegt. // // - Lichrospher RP8 5 mm soejle (125 mm × 4,0 mm) // // - 100 % eluent A i 2 minutter 30 sekunder // // - en linaer elueringsgradient i 18 minutter indtil 0 % af eluent A og 100 % af eluent B opnaas // // - 100 % af eluent B i 5 minutter // // - en lineaer elueringsgradient i 2 minutter fra 0 % af eluent A og 100 % af eluent B indtil 100 % af eluent A og 0 % af eluent B opnaas // // - 100 % af eluent A og 0 % af eluent B i 5 minutter for at bringe systemet i ligevaegt. // // Bemaerk: Gradientprofilerne kan modificeres for at give optimal separation alt efter de soejler, der anvendes. // 6.8.3. // Undersoegelse af kromatogrammer, // // Kun de toppe, hvis areal er stoerre end 1 % af summen af toparealerne, tages i betragtning. // // Elueringsraekkefoelgen for toppene med en type C18 soeje og en elueringsgradient som i 6.8.2 er almindeligvis som foelger: // // 1. Afsvovlet glucoiberin // // 2. Afsvovlet progoitrin // // 3. Afsvovlet epi-progoitrin // // 4. Afsvovlet sinigrin // // 5. Afsvovlet glucoraphanin // // 6. Afsvovlet gluconapoleiferin // // 7. Afsvovlet glucoalyssin // // 8. Afsvovlet gluconapin // // 9. Afsvovlet 4-hydrozyglucobrassicin // // 10. Afsvovlet glucobrassicanapin // // 11. Afsvovlet glucotropaeolin // // 12. Afsvovlet glucobrassicin // // 13. Afsvovlet gluconasturtiin // // 14. Afsvovlet 4-methozyglucobrassicin // // 15. Afsvovlet neoglucobrassicin // // 7. // ANGIVELSE AF RESULTATER // 7.1. // Beregning af indholdet af hvert glucosinolat // // Indholdet af hvert glucosinolat, udtrykt i mikromol pr. gram hele, toerrede froe, er lig med: 1.2.3.4 // // toparealet for afsvovlet glucosinolat toparealet for afsvolvet sinigrin // × // maengden af sinigrin tisat roeret i 6.4 (i mmol) vaegt af den ekstraherede froeproeve 1.2.3.4 // // × afsvovlet glucosinolats responsfaktor (7.2) // × // 100 100 - H 1.2 // // hvor: // // H er indholdet af fugt og flygtige stoffer i testproeven, udtrykt i masseprocent (6.2). // // I visse tilfaelde kraeves resultaterne udtrykt ved et bestemt fugtindhold (f.eks. 9 %). I saadanne tilfaelde multipliceres det opnaaede resultat for toerstof med: // // (100 - fugtindhold) 100 // 7.2. // Responsfaktorer // // Vaerdierne for responsfaktorer er bestemt eksperimentelt; de er fastlagt ved overensstemmelse mellem de forskellige laboratorier, der deltog, og det kan blive noedvendigt at revidere dem til sin tid. // // Afsvovlet glucoiberin 1,07 // // Afsvovlet glucobrassicanapin 1,15 // // Afsvovlet glucoraphanin 1,07 // // Afsvovlet 4-hydrozyglucobrassicin 0,28 // // Afsvovlet glucoalyssin 1,07 // // Afsvovlet glucobrassicin 0,29 // // Afsvovlet neoglucobrassicin 0,20 // // Afsvovlet progoitrin 1,09 // // Afsvovlet epi-progoitrin 1,09 // // Afsvovlet glucotropaeolin 0,95 // // Afsvovlet sinigrin 1,00 // // Afsvovlet gluconasturtiin 0,95 // // Afsvovlet gluconapin 1,11 // // Afsvovlet gluconapoleiferin 1,00 // // Afsvovlet 4-methozyglucobrassicin 0,25 // // Afsvovlet afsvovlede glucosinolater 1,00. // 7.3. // Totalt indhold af glucosinolater // // Det samlede indhold af glucosinolater, udtrykt i mikromol pr. gram toerstof i proeven, er lig med summen af alle glucosinolater, hvis tilsvarende topareal er stoerre end 1 % af summen af alle glucosinolater toparealer. // // Brugen af interne referencestandarder med to koncentrationer (4.5.1 og 4.5.2) goer det muligt at tage hoejde for sinigrin, der eventuelt er indeholdt i proeven, eller for tilstedevaerelsen af en ukendt forbindelse, som elueres sammen med sinigrin : // // - hvis forskellen mellem resultaterne for totalt glucosinolatindhold ved de to gentagne analyser overholder betingelserne for repeterbarhed (8.2), er der ingen forurening af den interne reference. Resultatet er det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser // // - hvis forskellen mellem resultaterne ligger uden for betingelserne for repeterbarhed (8.2), gentages bestemmelsen paa to andre testproever, og der udfoeres en referencetest (6.7), idet man udelader den interne standardoploesning. Arealet for det forurenende stof traekkes fra arealet for intern standard for at give det sande areal for den interne reference, der er brugt i formlen i 7.1. Resultatet er det aritmetiske gennemsnit af resultaterne af de to bestemmelser. // 8. // PRAECISION OG NOEJAGTIGHED // 8.1. // Praecision (repeterbarhed og reproducerbarhed) // // Et faelles internationalt studie organiseret i 1988 mellem tolv laboratorier, hvor hvert laboratorium udfoerte to bestemmelser paa fire rapsproever, gav de repeterbare og reproducerbare vaerdier, der er angivet i tabel 1. // // Resultaterne blev evalueret i henhold til ISO 5725 (Statistical Application - Accuracy of trial methods - Determination of a trial method normalised by inter-laboratory trial). // // // Tabel 1: Repeter- og reproducerbarhedsvaerdier opnaaet ved det faelles studie (1988) 1.2.3.4.5 // // // // // // Proever // Rapsfroe A // Rapsfroe B // Rapsfroe C // Rapsfroe D // // // // // // Antal laboratorier efter udelukkelse af de afvigende resultater // 11 // 11 // 11 // 11 // // // // // // Gennemsnit // 20,6 // 14,1 // 4,9 // 25,6 // // // // // // Standardafvigelse ved repeterbarhed // 1,7 // 0,6 // 0,3 // 0,8 // Variationskoefficient for repeterbarhed // 8,5 % // 4,4 % // 6,7 % // 3,3 % // Repeterbarhed // 4,9 // 1,7 // 0,9 // 2,4 // // // // // // Standardafvigelse ved reproducerbarhed // 3,4 // 2,5 // 1,5 // 2,4 // Variationskoefficient for reproducerbarhed // 17 % // 18 % // 31 % // 9,4 % // Reproducerbarhed // 9,6 // 7,1 // 1,4 // 6,8 // // // // // 1.2 // 8.1.1. // Repeterbarhed. // // Ved anvendelse af ovenstaaende resultater (8.1) boer forskellen mellem vaerdien af de to bestemmelser, udfoert hurtigt efter hinanden af den samme analytiker med brug af det samme apparatur og paa den samme proeve, ikke overstige 2 mmol/g for indhold mindre end 20 mmol/g og 4 mmol/g for indhold mellem 20 og 35 mmol/g. // 8.1.2. // Reproducerbarhed. // // Ved anvendelse af ovenstaaende resultater (8.1) boer forskellen mellem vaerdierne for det endelige resultat opnaaet af to laboratorier, som brugte naervaerende metode til at analysere den samme laboratorieproeve, ikke overstige 4 mmol/g for indhold mindre end 20 mmol/g og 8 mmol/g for indhold mellem 20 og 35 m mol/g. // 8.2. // Noejagtighed // // Korrekt anvendelse af metoden skal bekraeftes ved udfoerelse af kontrolbestemmelse paa en reference-rapsfroeproeve, der har et attesteret total glucosinolatindhold i det omraade, analysen oenskes anvendt til. // // Reference-rapsfroeproever med saadanne attesterede glucosinolatindhold kan fremskaffes fra EF's Community Bureau of Reference (BCR) program. // // Fremgangsmaaden for sammenligning af laboratorieresultaterne opnaaet med referenceproeven med det attesterede glucosinolatinhold er beskrevet et afsnit »instruction for use« af den rapport, som fremsendes med referencematerialet. // 9. // TESTRAPPORT // // Testrapporten skal angive den anvendte metode og det opnaaede resultat. Den skal ogsaa angive alle detaljer i forbindelse med udfoerelsen, der ikke er specificeret i den internationale standard, eller som er anset for valgfrie, tillige med eventuelle begivenheder, som kan have haft indflydelse paa resultatet. // // Testrapporten skal indeholde alle oplysninger, som er noedvendige for den fuldstaendige identifikation af proeven.«

Bemaerk : Gradientprofilerne kan modificeres for at give optimal separation alt efter de soejler, der anvendes .

6.8.3 .

Undersoegelse af kromatogrammer, //

Kun de toppe, hvis areal er stoerre end 1 % af summen af toparealerne, tages i betragtning . //

Elueringsraekkefoelgen for toppene med en type C18 soeje og en elueringsgradient som i 6.8.2 er almindeligvis som foelger : //

1 . Afsvovlet glucoiberin //

2 . Afsvovlet progoitrin //

3 . Afsvovlet epi-progoitrin //

4 . Afsvovlet sinigrin //

5 . Afsvovlet glucoraphanin //

6 . Afsvovlet gluconapoleiferin //

7 . Afsvovlet glucoalyssin //

8 . Afsvovlet gluconapin //

9 . Afsvovlet 4-hydrozyglucobrassicin //

10 . Afsvovlet glucobrassicanapin //

11 . Afsvovlet glucotropaeolin //

12 . Afsvovlet glucobrassicin //

13 . Afsvovlet gluconasturtiin //

14 . Afsvovlet 4-methozyglucobrassicin //

15 . Afsvovlet neoglucobrassicin

7 .

ANGIVELSE AF RESULTATER

7.1 .

Beregning af indholdet af hvert glucosinolat //

Indholdet af hvert glucosinolat, udtrykt i mikromol pr . gram hele, toerrede froe, er lig med :

1.2.3.4 //

toparealet for afsvovlet glucosinolat toparealet for afsvolvet sinigrin

x

maengden af sinigrin tisat roeret i 6.4 ( i *mol ) vaegt af den ekstraherede froeproeve

1.2.3.4x afsvovlet glucosinolats responsfaktor ( 7.2 )

x

100 100 _ H

1.2 //

hvor : //

H er indholdet af fugt og flygtige stoffer i testproeven, udtrykt i masseprocent ( 6.2 ). //

I visse tilfaelde kraeves resultaterne udtrykt ved et bestemt fugtindhold ( f.eks . 9 %). I saadanne tilfaelde multipliceres det opnaaede resultat for toerstof med : //

( 100 _ fugtindhold ) 100

7.2 .

Responsfaktorer //

Vaerdierne for responsfaktorer er bestemt eksperimentelt; de er fastlagt ved overensstemmelse mellem de forskellige laboratorier, der deltog, og det kan blive noedvendigt at revidere dem til sin tid . //

Afsvovlet glucoiberin 1,07 //

Afsvovlet glucobrassicanapin 1,15 //

Afsvovlet glucoraphanin 1,07 //

Afsvovlet 4-hydrozyglucobrassicin 0,28 //

Afsvovlet glucoalyssin 1,07 //

Afsvovlet glucobrassicin 0,29 //

Afsvovlet neoglucobrassicin 0,20 //

Afsvovlet progoitrin 1,09 //

Afsvovlet epi-progoitrin 1,09 //

Afsvovlet glucotropaeolin 0,95 //

Afsvovlet sinigrin 1,00 //

Afsvovlet gluconasturtiin 0,95 //

Afsvovlet gluconapin 1,11 //

Afsvovlet gluconapoleiferin 1,00 //

Afsvovlet 4-methozyglucobrassicin 0,25 //

Afsvovlet afsvovlede glucosinolater 1,00 .

7.3 .

Totalt indhold af glucosinolater //

Det samlede indhold af glucosinolater, udtrykt i mikromol pr . gram toerstof i proeven, er lig med summen af alle glucosinolater, hvis tilsvarende topareal er stoerre end 1 % af summen af alle glucosinolater toparealer . //

Brugen af interne referencestandarder med to koncentrationer ( 4.5.1 og 4.5.2 ) goer det muligt at tage hoejde for sinigrin, der eventuelt er indeholdt i proeven, eller for tilstedevaerelsen af en ukendt forbindelse, som elueres sammen med sinigrin : //

_ hvis forskellen mellem resultaterne for totalt glucosinolatindhold ved de to gentagne analyser overholder betingelserne for repeterbarhed ( 8.2 ), er der ingen forurening af den interne reference . Resultatet er det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser //

_ hvis forskellen mellem resultaterne ligger uden for betingelserne for repeterbarhed ( 8.2 ), gentages bestemmelsen paa to andre testproever, og der udfoeres en referencetest ( 6.7 ), idet man udelader den interne standardoploesning . Arealet for det forurenende stof traekkes fra arealet for intern standard for at give det sande areal for den interne reference, der er brugt i formlen i 7.1 . Resultatet er det aritmetiske gennemsnit af resultaterne af de to bestemmelser .

8 .

PRAECISION OG NOEJAGTIGHED

8.1 .

Praecision ( repeterbarhed og reproducerbarhed ) //

Et faelles internationalt studie organiseret i 1988 mellem tolv laboratorier, hvor hvert laboratorium udfoerte to bestemmelser paa fire rapsproever, gav de repeterbare og reproducerbare vaerdier, der er angivet i tabel 1 . //

Resultaterne blev evalueret i henhold til ISO 5725 ( Statistical Application _ Accuracy of trial methods _ Determination of a trial method normalised by inter-laboratory trial ).

Tabel 1 : Repeter - og reproducerbarhedsvaerdier opnaaet ved det faelles studie ( 1988 )

1.2.3.4.5Proever

Rapsfroe A

Rapsfroe B

Rapsfroe C

Rapsfroe D // // // // //

Antal laboratorier efter udelukkelse af de afvigende resultater

11

11

11

11 // // // // //

Gennemsnit

20,6

14,1

4,9

25,6 // // // // //

Standardafvigelse ved repeterbarhed

1,7

0,6

0,3

0,8

Variationskoefficient for repeterbarhed

8,5 %

4,4 %

6,7 %

3,3 %

Repeterbarhed

4,9

1,7

0,9

2,4 // // // // //

Standardafvigelse ved reproducerbarhed

3,4

2,5

1,5

2,4

Variationskoefficient for reproducerbarhed

17 %

18 %

31 %

9,4 %

Reproducerbarhed

9,6

7,1

1,4

6,8 // // // // //

1.28.1.1 .

Repeterbarhed . //

Ved anvendelse af ovenstaaende resultater ( 8.1 ) boer forskellen mellem vaerdien af de to bestemmelser, udfoert hurtigt efter hinanden af den samme analytiker med brug af det samme apparatur og paa den samme proeve, ikke overstige 2 *mol/g for indhold mindre end 20 *mol/g og 4 *mol/g for indhold mellem 20 og 35 *mol/g .

8.1.2 .

Reproducerbarhed . //

Ved anvendelse af ovenstaaende resultater ( 8.1 ) boer forskellen mellem vaerdierne for det endelige resultat opnaaet af to laboratorier, som brugte naervaerende metode til at analysere den samme laboratorieproeve, ikke overstige 4 *mol/g for indhold mindre end 20 *mol/g og 8 *mol/g for indhold mellem 20 og 35 *mol/g .

8.2 .

Noejagtighed //

Korrekt anvendelse af metoden skal bekraeftes ved udfoerelse af kontrolbestemmelse paa en reference-rapsfroeproeve, der har et attesteret total glucosinolatindhold i det omraade, analysen oenskes anvendt til . //

Reference-rapsfroeproever med saadanne attesterede glucosinolatindhold kan fremskaffes fra EF's Community Bureau of Reference ( BCR ) program . //

Fremgangsmaaden for sammenligning af laboratorieresultaterne opnaaet med referenceproeven med det attesterede glucosinolatinhold er beskrevet et afsnit "instruction for use" af den rapport, som fremsendes med referencematerialet .

9 .

TESTRAPPORT //

Testrapporten skal angive den anvendte metode og det opnaaede resultat . Den skal ogsaa angive alle detaljer i forbindelse med udfoerelsen, der ikke er specificeret i den internationale standard, eller som er anset for valgfrie, tillige med eventuelle begivenheder, som kan have haft indflydelse paa resultatet . //

Testrapporten skal indeholde alle oplysninger, som er noedvendige for den fuldstaendige identifikation af proeven ."