6)

Følgende kapitler C.31 til C.46 indsættes: » C.31. LANDPLANTETEST: FRØPLANTESPIRINGS- OG FRØPLANTEVÆKSTTEST INDLEDNING 1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 208 (2006). Testmetoderne bliver med mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling og deres anvendelse til lovgivningsformål. Denne opdaterede testmetode har til formål at vurdere kemikaliers potentielle virkninger på frøplantespiring og -vækst. Den omfatter således ikke kroniske virkninger eller virkninger på reproduktionen (dvs. frøsætning, blomsterdannelse, frugtmodning). Der skal tages højde for eksponeringsbetingelser og egenskaber for det kemikalie, der skal testes, for at sikre at der anvendes passende testmetoder (f.eks. bør der tages højde for virkningerne af pH-værdien og associerede modioner i forbindelse med testning af metaller/metalforbindelser) (1). Denne testmetode omhandler ikke planter, der eksponeres for dampe fra kemikalier. Denne testmetode anvendes til testning af almindelige kemikalier, biocider og plantebeskyttelsesmidler (også kendt som pesticider). Den er udviklet på grundlag af eksisterende metoder (2)(3)(4)(5)(6)(7). Andre henvisninger med relevans for plantetestning blev også taget i betragtning (8)(9)(10). De anvendte definitioner er anført i tillæg 1. PRINCIP FOR TESTEN 2. Testen vurderer virkningerne på højerestående planters frøplantespiring og tidlige vækst efter eksponering for testkemikaliet i jord (eller en anden passende jordmatrix). Frø bringes i kontakt med jord, der er behandlet med testkemikaliet, og vurderes med hensyn til virkninger efter normalt 14-21 dage efter fremspiring af 50 % af frøplanterne i kontrolgruppen. De målte endepunkter er visuel bedømmelse af frøplantespiring, tørvægt for skud (alternativt vådvægt for skud) og i visse tilfælde skudhøjde samt en vurdering af synlige skadelige virkninger på forskellige dele af planten. Disse målinger og observationer sammenlignes med målinger og observationer for ubehandlede kontrolplanter. 3. Afhængigt af den forventede eksponeringsvej indarbejdes testkemikaliet enten i jorden (eller eventuelt i en syntetisk jordmatrix) eller påføres på jordoverfladen, hvilket svarer til kemikaliets potentielle eksponeringsvej. Indarbejdelse i jorden sker ved at behandle bulkjord. Efter tilsætning fyldes jorden i potter, og frø af den angivne planteart plantes i jorden. Påføring af kemikaliet på jordoverfladen sker på pottejord, hvori frøene allerede er plantet. Testenhederne (kontroller og behandlet jord plus frø) placeres derefter under betingelser, der er egnede til at fremme planternes spiring/vækst. 4. Testen kan udføres for at bestemme dosis/respons-kurven eller ved en enkelt koncentration/mængde som en grænsetest i henhold til formålet med undersøgelsen. Hvis resultater fra den enkle test af koncentrationen/mængden overstiger et vist toksicitetsniveau (f.eks. hvis der observeres virkninger, som overstiger x %), udføres der en test til bestemmelse af dosisinterval med henblik på at bestemme en øvre og nedre grænse for toksicitet efterfulgt af flere test af koncentration/mængde med henblik på en dosis/respons-kurve. Der bruges en passende statistisk analyse til at opnå en effektiv koncentration ECx eller effektiv tilsat mængde ERx (f.eks. EC25, ER25, EC50, ER50) for det eller de mest følsomme betragtede parametre. Nuleffektkoncentrationen (NOEC) og den laveste koncentration med observeret effekt (LOEC) kan også beregnes i testen. OPLYSNINGER OM TESTKEMIKALIET 5. Følgende oplysninger er nyttige til identifikation af den forventede vej til eksponering for kemikaliet og til design af testen: strukturformel, renhed, vandopløselighed, opløselighed i organiske opløsningsmidler, 1-octanol/vand-fordelingskoefficient, sorptionsadfærd i jord, damptryk, kemisk stabilitet i vand og lys og bionedbrydelighed. TESTENS VALIDITET 6. Hvis en test skal betragtes som valid, skal følgende resultatkrav opfyldes af kontrollerne: — frøplantespiringen er mindst 70 % — frøplanterne udviser ikke synlige fytotoksiske virkninger (f.eks. chlorose, nekrose, visnen, deformation af blade og stilke), og planterne udviser kun variation i vækst og morfologi, som er normal for den specifikke art — den gennemsnitlige overlevelse for de fremspirede kontrolfrøplanter er mindst 90 % i hele undersøgelsens varighed — miljøforholdene for en specifik art er identiske, og vækstsubstrater indeholder samme mængde jordmatrix, bæremedie eller substrat fra samme kilde. REFERENCEKEMIKALIE 7. Et referencekemikalie kan testes med regelmæssige intervaller, for at kontrollere at udførelsen af testen og de specifikke testplanters respons og testbetingelserne ikke har ændret sig signifikant over tid. Alternativt kan historisk måling af biomasse eller vækst for kontroller bruges til at vurdere testsystemet i specifikke laboratorier og bruges som en foranstaltning til intern kvalitetskontrol i laboratorier. BESKRIVELSE AF METODEN Naturlig jord — syntetisk substrat 8. Planter kan dyrkes i potter med sandet jord (sandy loam), silt- og lerholdigt sandjord (loamy sand) eller sandet lerjord (sandy clay loam), der indeholder op til 1,5 % organisk kulstof (ca. 3 % organisk stof). Kommerciel pottejord eller syntetisk jordblanding, der indeholder op til 1,5 % organisk kulstof, kan også bruges. Lerjord bør ikke bruges, hvis testkemikaliet vides at have høj affinitet for ler. Markjord sigtes til en partikelstørrelse på 2 mm for at gøre jorden ensartet og fjerne grove partikler. Den endelige fremstillede jords type og tekstur, % organisk kulstof, pH og saltindhold samt elektrisk konduktivitet anføres i rapporten. Jorden skal være klassificeret i henhold til et standardklassifikationsskema (11). Jorden kan pasteuriseres eller varmebehandles for at mindske jordpatogeners virkning. 9. Naturlig jord kan vanskeliggøre fortolkningen af resultaterne og øge variabiliteten på grund af forskellige fysisk-kemiske egenskaber og mikrobielle populationer. Disse variable ændrer vandkapaciteten, evnen til kemisk binding, iltningen og indholdet af næringsstoffer og sporstoffer. Ud over variationerne i disse fysiske faktorer vil der også være variationer i de kemiske egenskaber, såsom pH and redoxpotentiale, som kan påvirke testkemikaliets biotilgængelighed (12)(13)(14). 10. Syntetiske substrater bruges typisk ikke til testning af plantebeskyttelsesmidler, men de kan bruges til testning af almindelige kemikalier, i tilfælde hvor det ønskes at minimere den naturlige jords variabilitet og gøre testresultaterne mere sammenlignelige. Anvendte substrater bør bestå af inerte materialer, der minimerer interaktionen med testkemikaliet, opløsningsmidlet eller begge. Surt vasket kvartssand, mineraluld og glaspellets (f.eks. 0,35 til 0,85 mm i diameter) har vist sig at være egnede inerte materialer, der adsorberer testkemikaliet minimalt (15), hvilket sikrer, at kemikaliet er maksimalt tilgængeligt for frøplanten ved optagelse gennem rødderne. Uegnede substrater er f.eks. vermiculit, perlit eller andre stærkt absorberende materialer. Der tilføres næringsmidler, for at sikre at planterne ikke stresses som følge af mangel på næringsstoffer, hvilket om muligt vurderes ved kemisk analyse eller visuel vurdering af kontrolplanterne. Kriterier for udvælgelse af testarter 11. Der bør sikres en tilstrækkelig bred udvælgelse af arter, f.eks. ud fra deres taksonomiske mangfoldighed i planteriget, fordeling, abundans, artsspecifikke livscykluskarakteristika og område for deres naturlige forekomst, således at der udvikles et responsområde (8)(10)(16)(17)(18)(19)(20). Følgende karakteristika for de eventuelle testarter bør tages i betragtning i forbindelse med udvælgelsen: — arterne har ensartede frø, som er umiddelbart tilgængelige fra pålidelige standardfrøkilder, og som producerer konstant, pålidelig og ensartet spiring samt ensartet frøplantevækst — planten er egnet til testning i laboratorium og kan give pålidelige og reproducerbare resultater i og på tværs af testfaciliteter — testarternes følsomhed skal stemme overens med responser hos planter i miljøet, der eksponeres for kemikaliet — de har i en vis udstrækning være brugt i tidligere toksicitetstest, og deres brug i f.eks. herbicidbioassays, screening for tungmetaller, salt- eller mineralbelastningstest eller allelopatiundersøgelser indikerer følsomhed over for en lang række stressfaktorer — de er forenelige med testmetodens dyrkningsbetingelser — de opfylder testens validitetskriterier. Nogle af de testarter, der historisk har været brugt mest, er opført på listen i tillæg 2, og potentielle vilde arter er opført på listen i tillæg 3. 12. Det antal arter, der skal testes, afhænger af de relevante lovgivningskrav og er derfor ikke angivet i testmetoden. Applikation af testkemikaliet 13. Kemikaliet skal tilsættes i et passende substrat (f.eks. vand, acetone, ethanol, polyethylenglycol, gummi arabicum, sand). Blandinger (formulerede produkter eller formuleringer), som indeholder aktive bestanddele og forskellige adjuvanser, kan også testes. Indarbejdelse i jord/syntetisk substrat 14. Kemikalier, der er vandopløselige eller opslæmmede i vand, kan tilsættes til vand, hvorefter opløsningen blandes med jord ved hjælp af en passende blander. Denne type test kan være velegnet, hvis eksponeringen for kemikaliet foregår gennem jord eller jordporevand, og kemikaliet mistænkes for at blive optaget gennem rødderne. Jordens vandholdende evne bør ikke overstiges med tilsætningen af testkemikaliet. Det tilsatte volumen vand skal være det samme for hver testkoncentration, men skal udelukkende forhindre, at jorden klumper sammen som et agglomerat. 15. Kemikalier med lav vandopløselighed opløses i et egnet flygtigt opløsningsmiddel (f.eks. acetone, ethanol) og blandes med sand. Opløsningsmidlet kan derefter fjernes fra sandet ved hjælp af en luftstrøm under konstant blanding af sandet. Det behandlede sand blandes med forsøgsjorden. Der klargøres en anden kontrol, som kun tilsættes sand og opløsningsmiddel. Der tilsættes lige dele sand, iblandet opløsningsmiddel, som fjernes, til alle behandlingsniveauer og den anden kontrol. Når der er tale om faste, uopløselige testkemikalier, blandes tør jord og kemikaliet i en passende blander. Herefter tilsættes jorden til potterne, og frøene sås straks. 16. Når der anvendes et syntetisk substrat i stedet for jord, kan kemikalier, der er opløselige i vand, opløses i næringsopløsningen umiddelbart inden testens begyndelse. Kemikalier, der ikke er opløselige i vand, men som kan opslæmmes i vand med et opløsningsmiddel som bærestof, tilsættes med bærestoffet til næringsopløsningen. Vanduopløselige kemikalier, for hvilke der ikke forefindes noget ikke-toksisk vandopløseligt bærestof, opløses i et passende flygtigt opløsningsmiddel. Opløsningen blandes med sand eller glaspellets, anbringes i et roterende vakuumapparat og inddampes, hvilket giver en ensartet belægning af kemikalie på sand eller pellets. En afvejet mængde pellets ekstraheres med det samme organiske opløsningsmiddel, og kemikaliet analyseres, inden potterne fyldes. Overfladepåføring 17. Når der er tale om plantebeskyttelsesmidler, påføres testkemikaliet ofte ved sprøjtning på jordoverfladen. Alt udstyr, der anvendes til testene, herunder udstyr til klargøring og tilførsel af testkemikaliet, skal være udformet således, at test med udstyret kan udføres nøjagtigt og giver en reproducerbar dækning. Dækningen skal være ensartet på alle jordoverflader. Det skal sikres, at kemikalier ikke adsorberer til eller reagerer med udstyr (f.eks. plastslanger og lipofile kemikalier eller ståldele og -elementer). Testkemikaliet sprøjtes på jordoverfladen, idet påføring med en almindelig marksprøjte efterlignes. Generelt bør sprøjtemængden ligge inden for det interval, der er normal praksis inden for landbruget, og volumenerne (mængden af vand osv.) anføres i rapporten. Der vælges en dysetype, som giver ensartet dækning af jordoverfladen. Hvis der påføres opløsningsmidler og bærestoffer, klargøres en anden gruppe af kontrolplanter, som kun modtager opløsningsmidlet/bærestoffet. Det er ikke nødvendigt i forbindelse med plantebeskyttelsesmidler, der testes som formuleringer. Kontrol af koncentrationen/mængden af testkemikalie 18. Påføringskoncentrationerne/-mængderne skal kontrolleres under anvendelse af passende analytisk kontrol. Når der er tale om opløselige kemikalier, kan kontrollen af alle testkoncentrationer/-mængder bekræftes ved analyse af den testopløsning, der har den højeste koncentration, med dokumentation af efterfølgende fortynding og brug af kalibreret udstyr (f.eks. kalibreret analyseudstyr i glas, kalibreret sprøjteudstyr til påføring). Når der er tale om uopløselige kemikalier, skal kontrol af forbindelser foregå ved vejning af det testkemikalie, der tilsættes til jorden. Hvis der stilles krav om påvisning af homogenitet, kan analyse af jorden være nødvendig. FREMGANGSMÅDE Testdesign 19. Frø af samme art plantes i potter. Antallet af frø, der plantes pr. potte, afhænger af art, pottestørrelse og testens varighed. Antallet af planter pr. potte bør være således, at der sikres hensigtsmæssige vækstbetingelser, og planterne ikke kommer til at stå for tæt i testperioden. Den maksimale plantetæthed er på ca. 3-10 frø pr. 100 cm2 afhængigt af frøenes størrelse. Det anbefales f.eks. at anvende en til to majs-, sojabønne-, tomat-, agurke- eller sukkerroeplanter pr. beholder på 15 cm; tre raps- eller ærteplanter pr. beholder på 15 cm og 5-10 løgfrø, hvedefrø eller andre små frø pr. beholder på 15 cm. Antallet af frø og replikatpotter (replikaten defineres som en potte, og planter i samme potte udgør derfor ikke en replikat) bør være tilstrækkeligt til optimal statistisk analyse (21). Det skal bemærkes, at variabiliteten vil være større for testarter, hvor der bruges færre store frø pr. potte (replikat), end for testarter, hvor det er muligt at bruge et større antal små frø pr. potte. Denne variabilitet kan minimeres ved at plante samme antal frø i hver potte. 20. Der bruges kontrolgrupper, for at sikre at de observerede virkninger kun er knyttet til eller kan tilskrives eksponeringen for testkemikaliet. En hensigtsmæssig kontrolgruppe skal på alle måder være identisk med testgruppen, bortset fra eksponeringen for testkemikaliet. Inden for en given test skal alle testplanter, herunder kontrollerne, være fra samme kilde. For at forhindre bias stilles der krav om vilkårlig tildeling af test- og kontrolpotter. 21. Frø belagt med et insekticid eller et fungicid (dvs. »behandlede« frø) bør undgås. Visse tilsynsmyndigheder tillader dog brug af visse ikke-systemiske kontaktfungicider (f.eks. captan, thiram) (22). Hvis frøbårne patogener er et problem, kan frøene dyppes kortvarigt i en svag 5 %-hypochloritopløsning og efterfølgende skylles grundigt i rindende vand og tørres. Afhjælpende behandling med andre plantebeskyttelsesmidler er ikke tilladt. Testbetingelser 22. Testbetingelserne skal ligne de betingelser, der er nødvendige for testarternes og -varieteternes normale vækst (tillæg 4 indeholder eksempler på testbetingelser). De spirende planter skal opbevares i henhold til god praksis for havebrug i kamre med kontrolleret miljø, klimakamre eller drivhuse. Når der bruges sådanne vækstrum, omfatter en sådan praksis normalt kontrol og registrering med passende hyppighed (f.eks. dagligt) af temperatur, luftfugtighed, kuldioxidkoncentration, lys (intensitet, bølgelængde, fotosyntetisk aktiv stråling) og lysperiode, vanding osv. for at sikre fornuftig plantevækst som bedømt ved kontrolplanterne af de udvalgte arter. Temperaturen i drivhuse skal kontrolleres ved hjælp af ventilations-, varme- og/eller kølesystemer. Følgende betingelser anbefales generelt ved testning i drivhus: — temperatur: 22 °C ± 10 °C — fugtighed: 70 % ± 25 % — lysperiode: mindst 16 timers lys — lysintensitet: 350 ± 50 μE/m2/s. Det kan være nødvendigt med supplerende belysning, hvis intensiteten falder til under 200 μE/m2/s, bølgelængde 400-700 nm, bortset fra visse arter, der har mindre behov for lys. Miljøforholdene skal overvåges og registreres under undersøgelsen. Planterne dyrkes i ikke-porøse plastpotter eller glaserede potter med en bakke eller underskål under potten. Potterne kan flyttes med jævne mellemrum for at minimere variabiliteten i planternes vækst (som følge af forskelle i testbetingelserne i vækstrummet). Potterne skal være store nok til at tillade normal vækst. 23. Jorden kan tilsættes næringsstoffer efter behov for at bevare en fornuftig vækstkraft. Behovet og tidspunkterne for tilsætning af næringsstoffer kan vurderes ved iagttagelse af kontrolplanterne. Bundvanding af testbeholdere (f.eks. ved at bruge glasfibervæger) anbefales. Topvanding kan dog bruges indledende for at fremme frøspiring og letter desuden kemikaliets bevægelse ned i jorden, når det påføres på jordoverfladen. 24. De specifikke vækstbetingelser skal være egnede til testarterne og det undersøgte testkemikalie. Kontrolplanter og behandlede planter skal opbevares under samme miljøforhold, men der skal træffes passende forholdsregler for at forhindre krydseksponering (f.eks. for flygtige kemikalier) mellem forskellige behandlinger og kontrolplanters eksponering for testkemikaliet. Testning ved en enkelt koncentration/mængde 25. Med henblik på at bestemme den passende koncentration/mængde af et kemikalie til udførelse af en test ved en enkelt koncentration eller mængde (provokations-/grænsetest) skal der tages højde for en række faktorer. I forbindelse med almindelige kemikalier er der bl.a. tale om kemikaliets fysisk-kemiske egenskaber. I forbindelse med plantebeskyttelsesmidler skal der tages højde for testkemikaliets fysisk-kemiske egenskaber og anvendelsesmønster, dets maksimale koncentration eller spredemængde, antal påføringer pr. sæson og/eller persistens. For at bestemme om et almindeligt kemikalie har fytotoksiske egenskaber, kan det være hensigtsmæssigt at teste ved et maksimalt niveau på 1 000 mg/kg tør jord. Test til bestemmelse af dosisinterval 26. Om nødvendigt kan en indledende test til bestemmelse af dosisinterval udføres, for at finde ud af hvilke koncentrationer/mængder, der skal testes i dosis/respons-hovedundersøgelsen. I forbindelse med den indledende test skal der være stor afstand mellem testkoncentrationerne/-mængderne (f.eks. 0,1, 1,0, 10, 100 og 1 000 mg/kg tør jord). I forbindelse med plantebeskyttelsesmidler kan koncentrationerne/mængderne være baseret på den anbefalede eller maksimale koncentration eller spredemængde, f.eks. 1/100, 1/10, 1/1 af den anbefalede/maskimale koncentration eller spredemængde. Testning ved flere koncentrationer/mængder 27. Formålet med testen ved flere koncentrationer/mængder er at fastlægge et dosis/respons-forhold og bestemme en ECx- eller ERx-værdi for spiring, biomasse og/eller visuelle virkninger sammenlignet med ikke-eksponerede kontroller i henhold til tilsynsmyndighedernes krav. 28. Antallet af og afstanden mellem koncentrationerne eller mængderne skal være tilstrækkelig til at fastlægge et pålideligt dosis/respons-forhold og en regressionsligning og beregne ECx eller ERx. De udvalgte koncentrationer/mængder skal omfatte de ECx- eller ERx-værdier, som skal bestemmes. Hvis der f.eks. skal bestemmes en EC50-værdi, vil det være ønskeligt at teste ved mængder, som har en virkning på 20-80 %. For at opnå dette er det anbefalede antal testkoncentrationer/-mængder mindst fem i en geometrisk serie plus ikke-behandlet kontrol med en afstandsfaktor, som ikke overstiger tre. Der skal være mindst fire replikater og i alt 20 frø pr. behandlings- og kontrolgruppe. Det kan være nødvendigt med flere replikater af visse planter med lav spireevne eller varierende vækstformer for at øge testens statistiske styrke. Hvis der bruges et større antal testkoncentrationer/-mængder, kan antallet af replikater reduceres. Hvis NOEC skal beregnes, kan det være nødvendigt med flere replikater for at opnå den ønskede statistiske styrke (23). Observationer 29. Under observationsperioden, dvs. 14-21 dage efter at 50 % af kontrolplanterne (også eventuelle kontrolplanter med opløsningsmiddel) har spiret, iagttages planterne hyppigt (mindst ugentligt og om muligt dagligt), for at konstatere om der forekommer spiring og visuel fytotoksicitet og dødelighed. Ved testens afslutning registreres målingen af den procentvise spiring og de overlevende planters biomasse samt synlige skadelige virkninger på forskellige dele af planten. Sidstnævnte omfatter abnormiteter i de spirede frøplanters udseende, hæmmet vækst, chlorose, misfarvning, dødelighed og påvirkning af planternes udvikling. Slutbiomassen kan måles ved hjælp af de overlevende planters endelige gennemsnitlige tørvægt for skud ved at høste skuddet ved jordoverfladen og tørre det til konstant vægt ved 60 °C. Alternativt kan slutbiomassen måles ved hjælp af vådvægt for skud. Skuddets højde kan være et andet endepunkt, hvis tilsynsmyndighederne kræver det. Der kan anvendes et ensartet scoringssystem for visuelle skader til evaluering af de observerbare toksiske responser. Eksempler på kvalitative og kvantitative visuelle bedømmelser findes i henvisning (23) (24). DATA OG RAPPORTERING Statistisk analyse Test ved en enkelt koncentration/mængde 30. Data for hver planteart analyseres ved hjælp af en passende statistisk metode (21). Effektniveauet ved testkoncentrationen/-mængden anføres i rapporten, eller det anføres, at der ikke er opnået en given effekt ved testkoncentrationen/-mængden (eksempel: < x % effekt observeret ved koncentration eller mængde y) Test ved flere koncentrationer/mængder 31. Et dosis/respons-forhold beregnes ved hjælp af en regressionsligning. Der kan bruges forskellige modeller: Logit-, probit-, Weibull-, Spearman-Karber- og Trimmed Spearman-Karber-metoderne kan f.eks. være hensigtsmæssige metoder til beregning af ECx eller ERx (f.eks. EC25, ER25, EC50, ER50) og værdiens konfidensgrænser som kvantale data. I forbindelse med frøplanternes vækst (vægt og højde) som kontinuerte endepunkter kan ECx eller ERx og værdiens konfidensgrænser beregnes ved hjælp af en passende regressionsanalyse (f.eks. Bruce-Versteegs ikke-lineære regressionsanalyse (25)). R2 skal om muligt være 0,7 eller højere for de mest følsomme arter, og de anvendte testkoncentrationer/-mængder skal omfatte effekter på 20-80 %. Hvis NOEC skal beregnes, foretrækkes anvendelse af stærke statistiske test, som udvælges på grundlag af datafordeling (21)(26). Testrapport 32. Testrapporten skal indeholde en præsentation af resultaterne af undersøgelsen og en detaljeret beskrivelse af testbetingelserne, en grundig diskussion af resultaterne samt analyser af dataene og de konklusioner, der er draget af analyserne. Rapporten skal indeholde et resume i tabelform og et sammendrag af resultaterne. Rapporten skal indeholde følgende: Testkemikalie: — kemisk identifikation, relevante egenskaber for det testede kemikalie (f.eks. log Pow, vandopløselighed, damptryk og oplysninger om skæbne og adfærd i miljøet, hvis de foreligger) — oplysninger om klargøring af testopløsningen og kontrol af testkoncentrationer, jf. punkt 18. Testede arter: — oplysninger om testorganismer: arter/sorter, plantefamilier, videnskabelige og generiske navne, kilder og frøets historie beskrevet så udførligt som muligt (dvs. leverandørens navn, spiringsprocent, frøstørrelse, klasse, parti- eller batchnummer, frøår eller vækstsæson, hvor det er indsamlet, dato for spiringsbedømmelse), levedygtighed osv. — antal testede mono- og di-cotyledon-arter — begrundelse for valg af art — beskrivelse af opbevaring, behandling og vedligeholdelse af frø. Testbetingelser: — testfacilitet (f.eks. vækstkammer, klimakammer eller drivhus) — beskrivelse af testsystem (f.eks. pottedimensioner, pottemateriale og jordmængde) — jordegenskaber (tekstur eller jordtype: jordpartikelfordeling og -klassifikation, fysisk- kemiske egenskaber, herunder % organisk stof, % organisk kulstof og pH) — klargøring af jord/substrat (f.eks. jord, syntetisk jord, sand mv.) inden testen — beskrivelse af eventuelt næringssubstrat — anvendelse af testkemikaliet: beskrivelse af anvendelsesmetode, beskrivelse af udstyr, eksponeringshastighed og -mængde, herunder kontrol af kemikaliet, beskrivelse af kalibreringsmetode og beskrivelse af miljøforhold under anvendelsen — vækstbetingelser: lysintensitet (f.eks. fotosynteseaktiv solindstråling), lysperiode, maks./min. temperaturer, vandingstidspunkter og -metode, gødning — antal frø pr. potte, antal planter pr. dosis, antal replikater (potter) pr. eksponeringsmængde — type og antal kontroller (negative og/eller positive kontroller, eventuel opløsningsmiddelkontrol) — testens varighed. Resultater: — tabel over alle endepunkter for hver replikat, testkoncentration/-mængde og art — spiringer, antal og procent, sammenlignet med kontroller — biomassebestemmelse (tørvægt eller vådvægt for skud) af planterne som procentdel af kontrollerne — skudhøjde for planterne som procentdel af kontrollerne, hvis målt — procent visuelle skader og kvalitativ og kvantitativ beskrivelse af visuelle skader (chlorose, nekrose, visnen, deformation af blade og stilke samt ingen virkninger) forårsaget af testkemikaliet sammenlignet med kontrolplanterne — beskrivelse af den bedømmelsesskala, der bruges til at vurdere visuelle skader, hvis der foretages en visuel bedømmelse — ved undersøgelser med en enkelt mængde skal skaderne anføres i rapporten i procent — ECx- eller ERx-værdier (f.eks. EC50, ER50, EC25, ER25) og tilhørende konfidensgrænser. Når der foretages regressionsanalyser anføres standardfejl for regressionsligningen og standardfejl for individuelle vurderinger af parametre (f.eks. hældning, skæring) — NOEC-værdier (og LOEC-værdier), hvis de er beregnet — beskrivelse af de anvendte statistiske metoder og forudsætninger — grafisk visning af data og dosis/respons-forhold for testarterne. Afvigelser fra de procedurer, der er beskrevet i denne testmetode, og eventuelle usædvanlige hændelser under testen. LITTERATUR (1) G. Schrader, K. Metge og M. Bahadir (1998), Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods, Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) Den Internationale Standardiseringsorganisation (1993), ISO 11269-1, Soil Quality — Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) Den Internationale Standardiseringsorganisation (1995), ISO 11269-2, Soil Quality — Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM) (2002), E 1963-98, Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA (1982), FIFRA, 40CFR, Part 158.540, Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA (1996), OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850, Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background — Non-target Plant Testing — 850.4025: Target Area Phytotoxicity — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence) — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201 (1982), Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1 (1993), Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) C. Boutin, K. E. Freemark og C. J. Keddy (1993), Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation, Technical Report Series No. 145, Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) R. Forster, U. Heimbach, C. Kula og P. Zwerger (1997), Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms — A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna), Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) B. Hale, J. C. Hall, K. Solomon og G. Stephenson (1994), A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) L. J. Audus (1964), Herbicide behaviour in the soil, in: L. J. Audus ed., The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, kapitel 5, s. 163-206. (13) M. L. Beall Jr. og R. G. Nash (1969), Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) G. D. Beetsman, D. R. Kenney og G. Chesters (1969), Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA) (1987), Environmental Assessment Technical Handbook, Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, s. 14 ff., FDA, Washington, DC. (16) R. A. McKelvey, J. P. Wright, J. L. Honegger og L. W. Warren (2002), A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing, Pest Management Science vol. 58:1161-1174. (17) C. Boutin, N. Elmegaard og C. Kjær (2004), Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment, Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) C. Boutin og C. A. Rogers (2000), Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases, Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) C. Boutin og J. L. Harper (1991), A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats, J. Ecol. 9:155-271. (20) C. Boutin, H.-B. Lee, T. E. Peart, S. P. Batchelor og R. J. Maguire (2000), Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species, Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OECD (2006), Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Series on Testing and Assessment No 54, Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling, Paris. (22) K. K. Hatzios og D. Penner (1985), Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants, Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) P. B. Hamill, P. B. Marriage og G. Friesen. (1977), A method for assessing herbicide performance in small plot experiments, Weed Science 25:386-389. (24) R. E. Frans og R. E. Talbert (1992), Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response, in: B. Truelove (Ed.), Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) R. D. Bruce og D. J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Kapitel C.33 i dette bilag: Formeringstest — regnorme (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Tillæg 1 Definitioner Aktiv bestanddel (eller aktivstof) er et materiale, der er beregnet til at sikre en specifik biologisk effekt (f.eks. insektbekæmpelse, plantesygdomsbekæmpelse eller ukrudtsbekæmpelse i behandlingsområdet), kaldes også aktiv bestanddel/aktivstof af teknisk kvalitet. Kemikalie betyder et stof eller en blanding. Plantebeskyttelsesmidler eller pesticider er materialer med en specifik biologisk aktivitet, som bruges bevidst til at beskytte planter mod skadegørere (f.eks. svampesygdomme, insekter og konkurrerende planter). ECx-koncentration med x % effekt eller ERx-mængde med x % effekt er den koncentration eller mængde, der forårsager en uønsket ændring på x % i det endepunkt for en test, der måles i forhold til kontrollen (eksempelvis ville en reduktion på 25 % eller 50 % i frøplantespiring, skudvægt eller endeligt antal planter eller en stigning på 25 % eller 50 % i visuelle skader give en værdi på henholdsvis EC25/ER25 eller EC50/ER50). Spiring er, når skuddet eller kimbladet viser sig over jordoverfladen. Formulering er det kommercielt formulerede produkt, der indeholder den aktive bestanddel — kaldes også det endelige præparat (8) eller »typical end-use product« (TEP). LOEC (laveste koncentration med observeret effekt, Lowest Observed Effect Concentration) er den laveste koncentration af testkemikaliet, hvor der observeres en virkning. I denne test har LOEC ingen statistisk signifikant virkning (p < 0,05) inden for en angiven eksponeringsperiode sammenlignet med kontrollen og er højere end NOEC-værdien. Planter, der ikke er målarter: De planter, der ikke tilhører målgruppen. Ved plantebeskyttelsesmidler er der sædvanligvis tale om planter uden for behandlingsområdet. NOEC (nuleffektkoncentration, No Observed Effect Concentration) er den testkemikaliekoncentration, hvor der ikke observeres nogen virkning. I denne test har NOEC ingen statistisk signifikant virkning (p < 0,05) inden for en given eksponeringsperiode sammenlignet med kontrollen. Fytotoksicitet: Skadelige afvigelser (ved måling og visuelle bedømmelse) fra planternes normale mønster for udseende og vækst som reaktion på et givet kemikalie. Replikat er den forsøgsenhed, der repræsenterer kontrolgruppen og/eller behandlingsgruppen. I disse undersøgelser defineres potten som replikaten. Visuel bedømmelse: Bedømmelse af visuelle skader baseret på iagttagelse af plantetæthed, vækstkraft, misdannelse, chlorose, nekrose og generelt udseende sammenlignet med en kontrol. Testkemikalie: Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne testmetode. Tillæg 2 Liste over arter, der historisk har været anvendt til plantetestning Familie Art Generisk navn DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Gulerod Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Solsikke Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Salat Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Gul sennep Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Kinakål Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Raps Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Kål Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Majroe Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Havekarse Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Radise Chenopodiaceae Beta vulgaris Sukkerroe Cucurbitaceae Cucumis sativus Almindelig agurk Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Sojabønne Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Mungbønne Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Havebønne Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Almindelig ært Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Bukkehornsfrø Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Kællingetand Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Rødkløver Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Fodervikke Linaceae Linum usitatissimum Hør Polygonaceae Fagopyrum esculentum Boghvede Solanaceae Solanum lycopersicon Tomat MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Løg Poaceae (Gramineae) Avena sativa Havre Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Byg Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Almindelig rajgræs Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Ris Poaceae (Gramineae) Secale cereale Rug Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Sorghum, durra Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Hvede Poaceae (Gramineae) Zea mays Majs Tillæg 3 Liste over potentielle vilde arter OECD — vilde arter, der kan anvendes til testning af toksicitet for planter. Bemærk: Nedenstående tabel indeholder oplysninger om 52 vilde arter (henvisninger er anført i parentes for hver art). De angivne spiringshastigheder stammer fra offentliggjort litteratur og er blot angivet som generel vejledning. Individuelle erfaringer kan variere afhængigt af frøkilden og andre faktorer. FAMILIE Artens botaniske navn (dansk generisk navn) Levetid (9) og levested Vægt af frø (mg) Lysperiode til spiring eller vækst (10) Plantedybde (mm) (11) Tid til spiring (dage) (12) Særlige behandlinger (13) Toksicitetstest (14) Leverandør af frø (15) Andre henvisninger (16) APIACEAE Torilis japónica (hvas randfrø) А, В forstyrrede områder, hække, græsarealer (16, 19) 1,7-1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) kold stratificering (7, 14, 18, 19) modning kan være nødvendig (19) spiring hæmmes af mørke (1, 19) ingen særlig behandling (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (almindelig tusindfryd) Ρ græsarealer, agerjord, græsplæner (16, 19) 0,09-0,17 (4, 19) L = D (14) 0 4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (18, 19) ingen særlig behandling (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (kornblomst) A marker, vejkanter, åbne områder (16) 4,1-4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) ingen særlig behandling (2, 4) POST (2, 4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (sort knopurt) Ρ marker, vejkanter, åbne områder (16, 19) 2,4-2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) modning kan være nødvendig (18, 19) spiring hæmmes af mørke (19) ingen særlig behandling (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium (lægealant) Ρ fugtige, forstyrrede områder (16) 1-1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) ingen særlig behandling (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (stivhåret borst) Ρ marker, vejkanter, forstyrrede områder (16, 19) 0,85-1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) spiring hæmmes af mørke (17, 18, 19) ingen særlig behandling (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (håret solhat) Β, Ρ forstyrrede områder (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) ingen særlig behandling (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (canadisk gyldenris) Ρ græsarealer, åbne områder (16) 0,06-0,08 (4, 14) L = D (11) 0 4) 14-21 (11) blandes med lige dele sand, og gennemblød i 500 ppm Ga i 24 timer (11) ingen særlig behandling (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum (almindelig brodfrø) A marker, åbne områder (16) 25-61 (14, 29) 0 (1) 5 (29) spiring kan hæmmes af mørke (1 ) gennemblødes i varmt vand i 12 timer (29) PRÆ & POST (31) A Xanthium spinosum (tornet brodfrø) A åbne områder (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 6) ardannelse (14) ingen særlig behandling (6) PRÆ & POST (6) A Xanthium strumarium (skræppe-brodfrø) A marker, åbne områder (16) 67,4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) ingen særlig behandling (6, 14, 21) PRÆ & POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (engkarse) Ρ marker, vejkanter, græsplæner (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) spiring hæmmes af mørke (18, 19) ingen særlig behandling (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (trævlekrone) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) modning kan være nødvendig (18) ingen særlig behandling (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (hvidmelet gåsefod) A markkanter, forstyrrede områder (16, 19) 0,7-1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) behandling varierer afhængigt af frøfarve (19) dvaletilstand ved tør opbevaring (19) spiring hæmmes af mørke (1, 18, 19) kold stratificering (18) ingen særlig behandling (14, 34) PRÆ & POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (prikbladet perikon) Ρ marker, agerjord, åbne områder (16, 19) 0,1-0,23 (14, 19) L= D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) spiring hæmmes af mørke (1, 18, 19) ingen særlig behandling (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (vedbendpragtsnerle) A vejkanter, åbne områder, kornmarker (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (1) ingen særlig behandling (6, 21) PRÆ & POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (rund fladaks) Ρ agerjord, græsarealer, vejkanter (16, 30) 0,2 (14) L= D (14) 0 (1) 10-20 (6, 10) 12 (91 %) (10) spiring hæmmes af mørke (1) ingen særlig behandling (6, 10, 14) PRÆ & POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (almindelig kællingetand) Ρ græsarealer, vejkanter, åbne områder (16, 19) 1-1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) ardannelse (14, 19) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (18, 19) ingen særlig behandling (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (kassia, sicklepod) A fugtige skove (16) 23-28 9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6, 9) frø gennemblødes i vand i 24 timer (9) ardannelse (14) frøenes levedygtighed varierer afhængigt af farve (1) ingen særlig behandling (6) POST (6, 9) A Sesbania exaltata (hamp) A alluvial jord (16) 11-13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) frø gennemblødes i vand i 24 timer (9) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (1) ingen særlig behandling (21) PRÆ & POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (rødkløver) Ρ marker, vejkanter, agerjord (16, 19) 1,4-1,7 (14, 19) L= D (14) 1 (50 %) (19) ardannelse (14, 18) modning kan være nødvendig (19) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (1, 19) ingen særlig behandling (5) POST 5) A, E, F LAM IAC E AE Leonurus cardiaca (almindelig hjertespand) Ρ åbne områder (16) 0,75-1,0 (4, 14) L= D (14) 0 4) ingen særlig behandling (4, 14) POST 4) F Mentha spicata (grøn mynte) Ρ fugtige områder (16) 2,21 4) 0 4) ingen særlig behandling 4) POST 4) F Nepeta cataria (almindelig katteurt) Ρ forstyrrede områder (16) 0,54 (4, 14) L= D (14) 0 4) ingen særlig behandling (2, 4, 14) POST (2, 4) F Prunella vulgaris (almindelig brunelle) Ρ agerjord, græsarealer, forstyrrede områder (16, 19) 0,58-1,2 (4, 14, 19) L= D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) spiring hæmmes af mørke (18, 19) bedre spiring med større frø (1 ) ingen særlig behandling (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (lægegaltetand) Ρ græsarealer, markkanter (19) 14-18 (14, 19) L= D (14) 7 (50 %) (19) ingen særlig behandling (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (kinajute) A marker, åbne områder (16) 8,8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) ardannelse (14) ingen særlig behandling (5, 10, 21) PRÆ & POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (tornet sida) A marker, vejkanter (16) 3.8 (14) L= D (14) 10-20 (6, 21) ardannelse (14) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (1) ingen særlig behandling (6, 21) PRÆ & POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (kornvalmue) A marker, agerjord, forstyrrede områder (16, 19) 0,1-0,3 (4, 14, 19, 29) L= D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) kold stratificering og ardannelse (1, 19, 32) ingen særlig behandling (4, 14, 29) POST 4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (almindelig hvene) græsplæner, græsarealer (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) spiring hæmmes af mørke (1, 17-19) ingen særlig behandling (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (agerrævehale) A marker, åbne områder (16) 0,9-1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) ardannelse (14) behandles med 101 mg/l KNO3 (14) varm stratificering (1) spiring hæmmes af mørke (1) ingen særlig behandling (34) PRÆ & POST (28, 34) A 32 Avena fatua (flyvehavre) A dyrkede områder, åbne områder (16) 7-37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10-20 (6, 10) 3 (70 %) (18) ardannelse (7, 32) mørke hæmmer spiring (1) kold stratificering (1, 18) ingen særlig behandling (6, 10, 14) PRÆ & POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (taghejre) A marker, vejkanter, agerjord (16) 0,45-2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) modningsperiode (1, 7, 32) spring hæmmes af lys (1 ) ingen særlig behandling (14) PRÆ & POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (almindelig kamgræs) P marker, vejkanter, åbne områder (16, 19) 0,5-0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (19) ingen særlig behandling (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (blodhirse) A marker, græsplæner, åbne områder (16) 0,52-0,6 (14, 30) L = D (14) 10-20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) ardannelse, kold stratificering og modning (1, 7, 14, 32) behandles med 101 mg/l KNO3 (14) spiring hæmmes af mørke (1) ingen særlig behandling (21) PRÆ & POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (almindelig hanespore) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10-20 (7, 21) ardannelse (7, 32) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (1) ingen særlig behandling (3, 14, 21) PRÆ & POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (canadisk hundekvik) P bredområder, forstyrrede områder (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14-28 (11) ingen særlig behandling (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (engsvingel) P marker, fugtige områder (16, 19) 1,53-2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) ingen særlig behandling (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum (liden byg) A græsarealer, vejkanter, åbne områder (16) 3,28 (14) varm stratificering (1) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (1) PRÆ (31) 7 Phleum pratense (engrottehale) P græsarealer, agerjord, forstyrrede områder (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) spiring hæmmes af mørke (19) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (17) ingen særlig behandling (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (snerlepileurt) A åbne områder, vejkanter (16) 5-8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) kold stratificering i 4-8 uger (1, 2, 4, 20, 29) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (1) PRÆ & POST (1, 2, 20, 28, 31) A 32 Polygonum lapathifolium (knudet pileurt) A fugtig jord (16) 1,8-2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (1) spiring hæmmes af mørke (18) kold stratificering (1) ingen særlig behandling (5) PRÆ & POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (pennsylvansk pileurt) A marker, åbne områder (16) 3,6-7 (14, 29) 2 (29) kold stratificering i 4 uger ved 0-5 °C (1, 29) spiring hæmmes af mørke (1) PRÆ (31) A, E Polygonum periscaria (ferskenpileurt) A forstyrrede områder, agerjord (16, 19) 2,1 -2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) ardannelse, kold stratificering, Ga-behandling (14) kold stratificering, modning (17-19) spiring hæmmes af mørke (19) ingen særlig behandling (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (kruset skræppe) P agerjord, vejkanter, åbne områder (16, 19) 1,3-1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) spiring hæmmes af mørke (18, 19) modning kan være nødvendig (18) ingen særlig behandling (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (rød arve) A agerjord, åbne områder, forstyrrede områder (16, 19) 0,4-0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) kold stratificering, Ga-behandling (1, 14, 18, 19, 32) spiring kræver lys (1) ingen særlig behandling (2, 4) POST (2, 4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (bidende ranunkel) Ρ agerjord, vejkanter, åbne områder (16, 19) 1,5-2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41-56 (19, 29) ingen særlig behandling (5, 14, 22, 24-26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (febernellikerod) Ρ hække, fugtige områder (16, 19) 0,8-1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) spiring hæmmes af mørke (18, 19) varm stratificering (1) ingen særlig behandling (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (burresnerre) A agerjord, fugtige områder, forstyrrede områder (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) kold stratificering (1, 18, 19) spiring ikke påvirket af strålingsintensitet (18, 19) spiring hæmmes af mørke (1) ingen særlig behandling (6, 14) PRÆ & POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (hvid snerre) Ρ levende hegn, åbne områder (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) ingen særlig behandling (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (almindelig fingerbøl) Β, Ρ hække, åbne områder (16, 19) 0,1 -0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) spiring hæmmes af mørke (1, 17-19) ingen særlig behandling (4, 22-26) POST (4, 22-26) D, G, F Veronica persica (storkronet ærenpris) A agerjord, åbne områder, forstyrrede områder (16, 19) 0,5-0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) spiring hæmmes af mørke (18, 19) kold stratificering (18) ingen særlig behandling (14) PRÆ & POST (28) A 32 Angivne leverandører af frø Leverandør-ID Leverandørinformation A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344-4050 www.tropilab.com C Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586-3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431-7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873-3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 (0)1256 6022668 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274-7333 www.thompson-morgan.com ANGIVNE KILDER: (1) C. C. Baskin og J. M. Baskin (1998), Seeds, Academic Press, Toronto. (2) L. G. Blackburn og C. Boutin (2003), Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®), Ecotoxicology, 12:271-285. (3) C. Boutin, H.-B. Lee, T. Peart, P. S. Batchelor og R. J. Maguire (2000), Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species, Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) C. Boutin, N. Elmegaard og C. Kjær (2004), Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment, Ecotoxicology, 13:349-369. (5) V. Breeze, G. Thomas og R. Butler (1992), Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides, Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) R. A. Brown og D. Farmer (1991), Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides, in: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J. W. Gorsuch, W. R. Lower, W. Wang og M. A. Lewis, eds., American Society for Testing & Materials, Philadelphia, s. 197-208. (7) D. D. Buhler og M. L. Hoffman (1999), Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants, Weed Science Society of America, K. Lawrence. (8) A. R. Clapham, T. G. Tutin og E. F. Warburg (1981), Excursion flora of the British Isles, 3rd ed., Cambridge University Press, Cambridge. (9) P. A. Clay og J. L. Griffin (2000), Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications, Weed Science, 48:481-486. (10) J. F. H. Cole og L. Canning (1993), Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants, BCPC — Weeds, s. 151-156. (11) M. Fiely (Ernst Conservation Seeds) (2004), personlig samtale (www.ernstseed.com). (12) J. S. Fletcher, F. L. Johnson og J. C. McFarlane (1990), Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment, Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) J. S. Fletcher, T. G. Pfleeger, H. C. Ratsch og R. Hayes (1996), Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants, Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) S. Flynn, R. M. Turner og J. B. Dickie (2004), Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004), Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid). (15) J. Franzaring, C. Kempenaar og L. J. M. van der Eerden (2001), Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species, Environmental Pollution, 114:21-28. (16) H. A. Gleason og A. Cronquist (1991), Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed., New York Botanical Garden, Bronx, NY, USA. (17) J. P. Grime (1981), The role of seed dormancy in vegetation dynamics, Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) J. P. Grime, G. Mason, A. V. Curtis, J. Rodman, S. R. Band, M. A. G. Mowforth, A. M. Neal og S. Shaw (1981), A comparative study of germination characteristics in a local flora, Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) J. P. Grime, J. G. Hodgson og R. Hunt (1988), Comparative plant ecology: a functional approach to common British species, Unwin Hyman Ltd., London. (20) C. Kjær (1994), Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.), Weed Research, 34:453-459. (21) T. E. Klingaman, C. A. King og L. R. Oliver (1992), Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity, Weed Science, 40:227-232. (22) R. H. Marrs, C. T. Williams, A. J. Frost og R. A. Plant 1989, Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest, Environmental Pollution, 59:71-86. (23) R. H. Marrs, A. J. Frost og R. A. Plant (1991), Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure, Environmental Pollution, 69:223-235. (24) R. H. Marrs, A. J. Frost og R. A. Plant (1991), Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms, Environmental Pollution, 73:25-42. (25) R. H. Marrs, A. J. Frost, R. A. Plant og P. Lunnis (1993), Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift, Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) R. H. Marrs og A. J. Frost (1997), A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities, Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) E. J. P. Marshall og J. E. Bernie (1985), Herbicide effects on field margin flora, BCPC — Weeds, s. 1021-1028. (28) R. A. McKelvey, J. P. Wright og J. L. Honegger (2002), A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing, Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) S. Morton (Herbiseed) (2004), personlig samtale (http://www.herbiseed.com). (30) USDA, NRCS (2004), The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov), National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA. (31) USEPA (1999), One-Liner Database, [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) R. H. Webster (1979), Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes, Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford, England. (33) A. L. White og C. Boutin (National Wildlife Research Centre, Environment Canada) (2004), personlig samtale. (34) P. Zwerger og W. Pestemer (2000), Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test, Z. PflKrankh, PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Tillæg 4 Eksempler på passende vækstbetingelser for visse plantearter Følgende betingelser har vist sig egnet til ti plantearter og kan bruges som retningslinjer for test i vækstkamre — også med visse andre arter: Kuldioxidkoncentration: 350 ± 50 ppm Relativ fugtighed: 70 ± 5 % i lyse perioder og 90 ± 5 % i mørke perioder Temperatur: 25 °C ± 3 °C om dagen, 20 °C ± 3 °C om natten Lysperiode: 16 timers lys/8 timers mørke, idet der forudsættes en gennemsnitlig bølgelængde på 400-700 nm Lys: lysstyrke på 350 ± 50 μE/m2/s, målt øverst i kammeret. Plantearterne er følgende: — tomat (Solanum lycopersicon) — agurk (Cucumis sativus) — havesalat (Lactuca sativa) — sojabønne (Glycine max) — hvidkål (Brassica oleracea var. capitata) — gulerod (Daucus carota) — almindelig havre (Avena sativa) — almindeligt rajgræs (Lolium perenne L.) — majs (Zea mays) — løg (Allium cepa). C.32. FORMERINGSTEST — ENCHYTRAEIDER INDLEDNING 1. Denne testmetode svarer til OECD Test Guideline (TG) 220 (2004). Den er beregnet til vurdering af kemikaliers virkninger på reproduktionen hos enchytraeider, Enchytraeus albidus Henle 1873, i jord. Den er hovedsagelig baseret på en metode, der er udviklet af Umweltbundesamt, Tyskland (1), og som er blevet ringtestet (2). Andre metoder til testning af kemikaliers toksicitet for enchytraeider og regnorme er også taget i betragtning (3)(4)(5)(6)(7)(8). INDLEDENDE OVERVEJELSER 2. Jordboende annelider af slægten Enchytraeus er økologisk relevante arter til økotoksikologisk testning. Enchytraeider forekommer ganske vist ofte i jord med regnorme, men de er også ofte hyppigt forekommende i jord uden regnorme. Enchytraeider kan både bruges i laboratorietest og i tilnærmede feltforsøg og rene feltforsøg. Fra et praktisk synspunkt er mange Enchytraeus-arter lette at håndtere og avle, og deres generationstid er betydeligt kortere end regnormens. Varigheden af en formeringstest med enchytraeider er derfor kun 4-6 uger, mens den for regnorme (Eisenia fetida) er otte uger. 3. Grundlæggende oplysninger om enchytraeiders økologi og økotoksikologi i jordmiljøet kan findes i (9)(10)(11)(12). PRINCIP FOR TESTEN 4. Voksne enchytraeider udsættes for en række koncentrationer af testkemikaliet blandet i syntetisk jord. Testen kan inddeles i to trin: a) en test til bestemmelse af dosisinterval, såfremt der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger, hvori dødeligheden er det primære endepunkt, der vurderes efter to ugers eksponering, og b) en endelig formeringstest, hvor forældredyrets samlede antal unger og forældredyrets overlevelse vurderes. Den endelige tests varighed er seks uger. Efter de første tre uger fjernes de voksne orme, og morfologiske ændringer registreres. Efter yderligere tre uger tælles ungerne, der klækkes af de kokoner, de voksne orme har frembragt. Reproduktionen for de dyr, der blev eksponeret for testkemikaliet, sammenlignes med reproduktionen for kontrollen/kontrollerne for at fastlægge i) koncentrationen uden observeret effekt (NOEC) og/eller ii) ECx (f.eks. EC10, EC50) ved at bruge en regressionsmodel til at anslå, hvilken koncentration der ville forårsage x % reduktion i reproduktionen. ECx skal ligge i det område, testkoncentrationerne dækker (f.eks. EC10, EC50), således at ECx opnås ved interpolation og ikke ved ekstrapolation. OPLYSNINGER OM TESTKEMIKALIET 5. Testkemikaliets vandopløselighed, log Kow, fordelingskoefficient mellem jord og vand (f.eks. kapitel C.18 eller C.19 i dette bilag) og damptryk skal helst være kendt. Yderligere oplysninger om testkemikaliets skæbne i jord, såsom fotolyse- og hydrolysehastighed, er ønskelige. 6. Denne testmetode kan benyttes til vandopløselige eller -uopløselige kemikalier. Dog vil tilførselsmåden for testkemikaliet variere som følge heraf. Testmetoden kan ikke anvendes på flygtige kemikalier, dvs. kemikalier, for hvilke Henrys konstant eller luft-/vandfordelingskoefficienten er større end en, eller kemikalier, for hvilke damptrykket overstiger 0,0133 Pa ved 25 °C. TESTENS VALIDITET 7. Hvis en test skal være valid, skal følgende resultatkrav opfyldes af kontrollerne: — Dødeligheden blandt voksne orme må ikke overstige 20 % ved afslutningen af testen til bestemmelse af dosisinterval og efter de første tre uger af formeringstesten. — Under forudsætning af at der blev brugt ti voksne orme pr. beholder ved opstilling af testen, skal der gennemsnitligt mindst være frembragt 25 unger pr. beholder ved testens afslutning. — Variationskoefficienten for det gennemsnitlige antal unger må ikke overstige 50 % ved formeringstestens afslutning. Hvis en test ikke opfylder ovenstående validitetskriterier, skal den afsluttes, medmindre der kan fremlægges en begrundelse for at fortsætte testen. Begrundelsen skal fremgå af testrapporten. REFERENCEKEMIKALIE 8. Et referencekemikalie bør enten testes med jævne mellemrum eller eventuelt indgå i hver test, for at kontrollere at testorganismernes respons ikke har ændret sig signifikant over tid. Et egnet referencekemikalie er carbendazim, som har vist sig at påvirke enchytraeiders overlevelse og formeringsevne (13)(14), men der kan også anvendes andre kemikalier, hvis toksicitetsdata er velkendte. En formulering af carbendazim, som er kendt under handelsnavnet Derosal™, og som leveres af AgrEvo Company (Frankfurt, Tyskland) og indeholder 360 g/l (32,18 %) aktiv bestanddel, blev brugt i en ringtest (2). Den EC50-værdi for formering, der blev bestemt i ringtesten, lå i området 1,2 ± 0,8 mg aktiv bestanddel/kg tørmasse (2). Hvis en positiv toksisk standard er inkluderet i testserien, anvendes der en koncentration, og antallet af replikater skal være det samme som i kontrollerne. Hvis der anvendes carbendazim, anbefales test af 1,2 mg aktivt stof/kg tørvægt (testet som en flydende formulering). BESKRIVELSE AF TESTEN Udstyr 9. Testbeholderne skal være udført helt i glas eller et andet kemisk inert materiale. Glas (f.eks. volumen: 0,20-0,25 liter; diameter: ≈ 6 cm) er egnede. Beholderne bør have gennemsigtige låg (f.eks. glas eller polyethylen), der er designet til at reducere vandfordampning, samtidig med at der kan ske en gasudveksling mellem jord og atmosfære. Lågene bør være gennemsigtige for at sikre lysgennemtrængelighed. 10. Der kræves normalt laboratorieudstyr, specielt følgende: — tørreskab — stereomikroskop — pH-meter og fotometer — egnede nøjagtige vægte — passende udstyr til temperaturkontrol — passende udstyr til luftfugtighedskontrol (ikke væsentligt, hvis eksponeringsbeholderne har låg) — inkubator eller lille rum med klimaanlæg — pincetter, kroge eller spiraler — fremkalderkar. Klargøring af den syntetiske jord 11. Den syntetiske jord, der bruges i testen (5)(7), har følgende sammensætning (baseret på tørvægt, tørret til en konstant vægt ved 105 °C): — 10 % sphagnum, lufttørret og findelt (en partikelstørrelse på 2 ± 1 mm er acceptabel ); det anbefales at kontrollere, at jord klargjort med et frisk parti sphagnum er egnet til dyrkning af ormene, inden den bruges i en test — 20 % kaolinholdigt ler, helst med over 30 % kaolinit — ca. 0,3-1,0 % calciumcarbonat (CaCO3, pulveriset, analysekvalitet) for at få en pH på 6,0 ± 0,5. Hvor meget calciumcarbonat der skal tilsættes, afhænger primært af sphagnummens kvalitet/art — ca. 70 % lufttørret kvartssand (afhængigt af den nødvendige mængde CaCO3), overvejende fint sand med over 50 % af en partikelstørrelse på 50-200 μm. Det anbefales at påvise egnetheden af syntetisk jord til at dyrke ormene og til at opfylde testvaliditetskriterierne, før jorden anvendes i en endelig test. Det anbefales især at foretage en sådan kontrol, for at sikre at udførelsen af testen ikke kompromitteres, hvis den syntetiske jords organiske kulstofindhold reduceres, f.eks. ved at sænke sphagnumindholdet til 4-5 % og øge sandindholdet tilsvarende. Ved en sådan reduktion af det organiske kulstofindhold kan mulighederne for, at testkemikaliet adsorberes til jorden (organisk kulstof), reduceres, og testkemikaliets tilgængelighed for ormene forøges. Det er blevet påvist, at Enchytraeus albidus kan opfylde validitetskriterierne for reproduktion ved test i feltjord med lavere organisk kulstofindhold end det nævnte (f.eks. 2,7 %) (15), og erfaringer — omend begrænsede — viser, at dette også kan opnås i syntetisk jord med 5 % tørv. Bemærk: Når der bruges naturlig jord i supplerende test (f.eks. på efterfølgende trin), skal det også dokumenteres, at jorden er egnet, og at validitetskriterierne er opfyldt. 12. De tørre bestanddele i jorden blandes grundigt (f.eks. i stor laboratorieblander). Dette gøres, mindst en uge inden testen påbegyndes. Den blandede jord opbevares i to dage for at ækvilibrere den/stabilisere surhedsgraden. Til bestemmelse af pH anvendes en blanding af jord og en opløsning på 1 M kaliumchlorid (KCl) eller 0,01 M calciumchlorid (CaCl2) i forholdet 1:5 (se (16) og tillæg 3). Hvis jorden er mere syreholdig end det krævede område (se punkt 11), kan den justeres ved tilsætning af en passende mængde CaCO3. Hvis jorden er for basisk, kan den justeres ved tilsætning af mere af blandingen i henhold til punkt 11, men uden CaCO3. 13. Den syntetiske jords maksimale vandholdende evne (WHC) bestemmes i overensstemmelse med procedurerne beskrevet i tillæg 2. En eller to dage før testens start fugtes den tørre syntetiske jord på forhånd ved at tilsætte deioniseret vand nok til at opnå omkring halvdelen af det endelige vandindhold, dvs. 40-60 % af den maksimale vandholdende evne. Ved testens start opdeles den fugtede jord i portioner svarende til antallet af testkoncentrationer (og eventuelt referencekemikalie) og kontroller, der benyttes til testen. Vandindholdet justeres til 40-60 % af den maksimale vandholdende evne ved tilsætning af testkemikalieopløsningen og/eller ved tilsætning af destilleret eller deioniseret vand (se punkt 19-21). Vandindholdet bestemmes ved testens begyndelse og slutning (ved tørring til konstant vægt ved 105 °C) og skal ligge inden for det optimale område for ormenes overlevelse. Jordens vandindhold kan bestemmes omtrentlig ved forsigtigt at presse jorden i hånden. Hvis vandindholdet er korrekt, viser små vanddråber sig mellem fingrene. Udvælgelse og klargøring af forsøgsdyr 14. Den anbefalede testart er Enchytraeus albidus Henle 1837 (hvid kompostorm), som tilhører familien Enchytraeidae (orden: Oligochaeta, række: Annelida). E. albidus er en af de største arter af enchytraeider, og der er registreret individer på op til 35 mm i længden (17)(18). E. albidus findes i hele verden på marine, limniske og terrestriske levesteder, primært i organiske materialer under nedbrydning (tang og kompost) og sjældent i engområder (9). Dens brede økologiske tolerance og visse morfologiske variationer kan tyde på, at arten omfatter forskellige racer. 15. Enchytraeus albidus sælges som fiskefoder. Det bør undersøges, om bestanden er kontamineret af andre, normalt mindre arter (1)(19). Hvis kontaminering forekommer, bør alle orme skylles med vand i en petriskål. Store voksne individer af Enchytraeus albidus udvælges derefter (ved hjælp af et stereomikroskop) for at starte en ny bestand. Alle andre orme kasseres. E. albidus kan let dyrkes i en lang række organiske materialer (se tillæg 4). Ormens livscyklus er kort, da den når sin modenhed mellem 33 dage (ved 18 °C) og 74 dage (ved 12 °C) (1). Kun bestande, der har været i laboratoriet i mindst fem uger (en generation) uden problemer, bør anvendes i en test. 16. Andre arter af Enchytraeus-slægten kan også anvendes, f.eks. E. buchholzi Vejdovsky 1879 eller E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (se tillæg 5). Hvis andre arter af Enchytraeus anvendes, skal de identificeres klart, og begrundelsen for valget af art skal anføres i rapporten. 17. De dyr, der bruges til test, er voksne orme. De skal have æg (hvide pletter) i bælteområdet, og de skal have omtrent samme størrelse (ca. 1 cm i længden). Synkronisering af dyrkningskulturen er ikke nødvendig. 18. Hvis enchytraeiderne ikke dyrkes i den samme jordtype og under samme betingelser (herunder fodring) som for den endelige test, skal de akklimatiseres i mindst 24 timer og op til tre dage. Et større antal voksne individer end det, der er nødvendigt for udførelsen af testen, akklimatiseres for at give mulighed for afvisning af skadede individer eller individer, der er uegnede af andre årsager. Ved afslutningen af akklimatiseringsperioden udvælges kun orme med æg, som ikke udviser unormal adfærd (f.eks. forsøger at slippe væk fra jorden), til testen. Ormene udtages omhyggeligt med pincet, krog eller spiral og anbringes i en petriskål, der indeholder en lille mængde ferskvand. Kunstigt fremstillet ferskvand, jf. kapitel C.20 i dette bilag (Daphnia magna formeringstest), foretrækkes til dette formål, eftersom deioniseret eller demineraliseret vand eller ledningsvand kan være skadeligt for ormene. Ormene undersøges i et stereomikroskop, og eventuelle orme uden æg frasorteres. Eventuelle mider eller springhaler, der måtte have inficeret kulturerne, frasorteres omhyggeligt. Sunde orme, der ikke bruges til testen, returneres til stamkulturen. Klargøring af testkoncentrationer Vandopløseligt testkemikalie 19. En opløsning af testkemikaliet klargøres i deioniseret vand i en mængde, der er tilstrækkelig til alle replikater af en testkoncentration. Det anbefales at bruge en passende mængde vand for at opnå det nødvendige vandindhold, dvs. 40-60 % af den maksimale vandholdende evne (se punkt 13). Hver opløsning af testkemikaliet blandes grundigt med et parti forhåndsfugtet jord, før det tilsættes til testbeholderen. Vanduopløseligt testkemikalie 20. For kemikalier, der er uopløselige i vand, men opløselige i organiske opløsningsmidler, kan testkemikaliet opløses i det mindst mulige volumen af et egnet bærestof (f.eks. acetone). Der bør kun anvendes flygtige opløsningsmidler. Bærestoffet sprøjtes på eller blandes med en lille mængde, f.eks. 2,5 g, fint kvartssand. Bærestoffet fjernes ved afdampning i et stinkskab i mindst en time. Denne blanding af kvartssand og testkemikalie tilsættes den fugtede jord og blandes grundigt, efter at der er tilsat en passende mængde deioniseret vand for at opnå det krævede fugtindhold. Den færdige blanding overføres til testbeholderne. 21. I forbindelse med kemikalier, der er tungtopløselige i vand og organiske opløsningsmidler, blandes 2,5 g fintformalet kvartssand pr. testbeholder med testkemikaliet for at opnå den ønskede testkoncentration. Denne blanding af kvartssand og testkemikalie tilsættes den fugtede jord og blandes grundigt, efter at der er tilsat en passende mængde deioniseret vand for at opnå det krævede fugtindhold. Den færdige blanding fordeles mellem testbeholderne. Proceduren gentages for hver testkoncentration, og der klargøres også en passende kontrolgruppe. 22. Kemikalier bør normalt ikke testes ved koncentrationer på over 1 000 mg/kg tørmasse jord. Det kan dog i overensstemmelse med en specifik tests mål være nødvendigt at teste ved højere koncentrationer. UDFØRELSE AF TESTEN Testgrupper og kontrolgrupper 23. For hver testkoncentration anbringes en mængde testjord svarende til 20 g tørvægt i testbeholderen (se punkt 19-20). Kontroller uden testkemikaliet klargøres også. Hver beholder tilsættes foder i overensstemmelse med fremgangsmåden i punkt 29. Ormene fordeles vilkårligt, således at der er ti i hver testbeholder. Ormene overføres forsigtigt til hver testbeholder og placeres på jordoverfladen ved hjælp af f.eks. en pincet, en krog eller en spiral. Antallet af replikater for testkoncentrationer og for kontroller afhænger af det anvendte testdesign (se punkt 34). Testbeholderne placeres vilkårligt i testinkubatoren, og disse placeringer randomiseres på ny en gang om ugen. 24. Hvis der bruges et bærestof til tilførsel af testkemikaliet, testes en kontrolserie indeholdende kvartssand påsprøjtet eller iblandet opløsningsmidlet ud over testserierne. Koncentrationen med opløsnings- eller dispergeringsmiddel skal være den samme som den, der bruges i testbeholderne med testkemikaliet. En kontrolserie indeholdende kvartssand (2,5 g pr. beholder) bør testes for kemikalier, der kræver administration i overensstemmelse med fremgangsmåden i punkt 21. Testbetingelser 25. Testtemperaturen er 20 °C ± 2 °C. For at sikre at ormene ikke forlader jorden, udføres testen under kontrollerede lys-/mørkecyklusser (helst 16 timers lys og 8 timers mørke) med belysning på 400-800 lux i testbeholdernes område. 26. For at kontrollere jordfugtigheden vejes beholderne i begyndelsen af testen og efterfølgende en gang om ugen. Vægttab erstattes ved tilsætning af en passende mængde deioniseret vand. Det skal bemærkes, at vandtabet kan reduceres ved at opretholde en høj luftfugtighed (> 80 %) i testinkubatoren. 27. Fugtindholdet og pH måles i begyndelsen og slutningen af både den indledende test og den endelige test. Målinger foretages i kontrollen og behandlede (alle koncentrationer) jordprøver, der er klargjort og opbevaret på samme måde som testkulturerne, men uden orme. Foder tilsættes kun til disse jordprøver i begyndelsen af testen for at fremme mikrobiel aktivitet. Den tilsatte mængde foder skal være den samme som den, der tilsættes til testkulturerne. Det er ikke nødvendigt at tilsætte yderligere foder til beholderne under testen. Fodring 28. Der kan bruges foder, som er i stand til at opretholde populationen af enchytraeider. Valsede havregryn, om muligt autoklaveret inden brug for at forebygge mikrobiel kontaminering (opvarmning er også hensigtsmæssig), har vist sig at være egnet foder. 29. Foder gives først ved at blande 50 mg formalede valsede havregryn i jorden i hver beholder, inden ormene tilsættes. Derefter tilsættes der foder ugentligt frem til dag 21. Der tilsættes ikke foder på dag 28, da de voksne individer er blevet fjernet på dette trin, og deres afkom har brug for forholdsvis lidt supplerende foder efter dette tidspunkt. Fodring under testen omfatter 25 mg formalede valsede havregryn pr. beholder, som forsigtigt anbringes på jordoverfladen for at undgå at skade ormene. For at undgå svampevækst skal havreflagerne begraves i jorden ved at dække dem med små mængder jord. Hvis foder ikke bliver spist, skal rationen reduceres. Design af testen til bestemmelse af dosisinterval 30. Når det er nødvendigt, udføres der en indledende test til bestemmelse af dosisinterval med f.eks. fem testkemikaliekoncentrationer på 0,1, 1,0, 10, 100 og 1 000 mg/kg (tørvægt af jord). En replikat pr. behandling og kontrol er tilstrækkelig. 31. Varigheden af den indledende test er to uger. Ved afslutningen af testen vurderes dødeligheden for ormene. En orm registreres som død, hvis den ikke reagerer på en mekanisk påvirkning af bagenden. Andre oplysninger end dødelighed kan også være afgørende for fastlæggelsen af koncentrationsområdet i den endelige test. Ændringer i de voksne individers adfærd (f.eks. manglende evne til at grave sig ned i jorden; orme, der ligger ubevægelige op ad testbeholderens glasvæg) og morfologi (f.eks. åbne sår) registreres derfor også sammen med tilstedeværelsen af eventuelt afkom. Sidstnævnte kan bestemmes ved anvendelse af farvningsfremgangsmåden i tillæg 6. 32. LC50 kan bestemmes omtrentligt ved at beregne det geometriske gennemsnit af dødelighedsdataene. Ved fastlæggelsen af koncentrationsområdet for den endelige test antages virkningerne på reproduktionen at være lavere end LC50 med højst en faktor 10. Der er dog tale om en empirisk sammenhæng, som ikke nødvendigvis er den samme i alle specifikke tilfælde. Yderligere observationer foretaget i den indledende test, såsom forekomsten af afkom, kan bidrage til at præcisere det koncentrationsområde for testkemikaliet, der skal bruges til den endelige test. 33. Med henblik på nøjagtig bestemmelse af LC50 anbefales det at udføre testen med mindst fire replikater af hver af testkemikaliekoncentrationerne og et tilstrækkeligt antal koncentrationer til at give mindst fire statistisk signifikante forskellige gennemsnitsresponser ved disse koncentrationer. Der bruges et tilsvarende antal koncentrationer og replikater til eventuelle kontroller. Design af den endelige formeringstest 34. Der foreslås tre design på grundlag af anbefalingerne som følge af en ringtest (2): — For at fastlægge NOEC skal der testes mindst fem koncentrationer i en geometrisk serie. Der anbefales fire replikater for hver testkoncentration plus otte kontroller. Koncentrationerne bør vælges med en afstandsfaktor, som ikke overstiger 1,8. — For at bestemme ECx (f.eks. EC10, EC50) skal der testes mindst fem koncentrationer, og ECx skal ligge i det område, testkoncentrationerne dækker, således at ECx opnås ved interpolation og ikke ved ekstrapolation. Der anbefales mindst fire replikater for hver testkoncentration og fire kontrolreplikater. Afstandsfaktoren kan variere, f.eks. under eller lig med 1,8 i det forventede effektområde og over 1,8 ved højere og lavere koncentrationer. — En kombineret metode giver mulighed for at bestemme både NOEC og ECx. Der anvendes otte behandlingskoncentrationer i en geometrisk serie. Der anbefales fire replikater for hver behandling plus otte kontroller. Koncentrationerne bør vælges med en afstandsfaktor, som ikke overstiger 1,8. 35. Der bruges ti voksne orme pr. testbeholder (se punkt 23). Foder tilsættes ved begyndelsen af testen og herefter en gang om ugen (se punkt 29) frem til og med dag 21. På dag 21 undersøges jordprøverne omhyggeligt med hænderne, levende voksne orme observeres og tælles, og ændringer i adfærd (f.eks. manglende evne til at grave sig ned i jorden; orme, der ligger ubevægelige op ad testbeholderens glasvæg) og morfologi (f.eks. åbne sår) registreres. Alle voksne orme fjernes derefter fra testbeholderne og testjorden. Testjord, der indeholder eventuelle kokoner, der måtte være frembragt, inkuberes i yderligere tre uger under samme testbetingelser, bortset fra at fodring kun finder sted på dag 35 (25 mg formalede valsede havregryn pr. beholder). 36. Efter seks uger tælles de nyudklækkede orme. Denne metode, som er baseret på Rose Bengal-farvning (se tillæg 6), anbefales, men andre vådekstrations- og vådflotationsteknikker (uden varme) (se tillæg 6) har også vist sig at være egnede (4)(10)(11)(20). Bengal Rose-farvning anbefales, fordi vådekstraktion fra et jordsubstrat kan hæmmes af turbiditet forårsaget af opslæmmede lerpartikler. Grænsetest 37. Hvis der ikke observeres virkninger ved den højeste koncentration i testen til bestemmelse af dosisinterval (dvs. 1 000 mg/kg), kan formeringstesten udføres som en grænsetest med 1 000 mg/kg, for at påvise at NOEC for formering er større end denne værdi. Resume og tidsplan for testen 38. De enkelte trin i testen kan opsummeres som følger: Tidspunkt Test til bestemmelse af dosisinterval Endelig test Dag – 7 eller tidligere — Klargør syntetisk jord (blanding af tørre bestanddele) — Klargør syntetisk jord (blanding af tørre bestanddele) Dag – 5 — Kontroller den syntetiske jords pH — Mål jordens maksimale vandholdende evne — Kontroller den syntetiske jords pH — Mål jordens maksimale vandholdende evne Dag – 5 til – 3 — Sorter orme med henblik på akklimatisering — Sorter orme med henblik på akklimatisering Dag – 3 til 0 — Akklimatiser orme i mindst 24 timer — Akklimatiser orme i mindst 24 timer Dag – 1 — Fugt den syntetiske jord, og fordel den i partier — Fugt den syntetiske jord, og fordel den i partier Dag 0 — Klargør stamopløsninger — Tilsæt testkemikalie — Afvej testsubstrat i testbeholdere — Ibland foder — Tilsæt orme — Mål jordens pH og fugtindhold — Klargør stamopløsninger — Tilsæt testkemikalie — Afvej testsubstrat i testbeholdere — Ibland foder — Tilsæt orme — Mål jordens pH og fugtindhold Dag 7 — Kontroller jordens fugtindhold — Kontroller jordens fugtindhold — Fodr ormene Dag 14 — Bestem dødelighed for voksne individer — Bestem antal unger — Mål jordens pH og fugtindhold — Kontroller jordens fugtindhold — Fodr ormene Dag 21 — Observer de voksne individers adfærd — Fjern voksne individer — Bestem dødelighed for voksne individer — Kontroller jordens fugtindhold — Fodr ormene Dag 28 — Kontroller jordens fugtindhold — Ingen fodring Dag 35 — Kontroller jordens fugtindhold — Fodr ormene Dag 42 — Tæl unger — Mål jordens pH og fugtindhold DATA OG RAPPORTERING Behandling af resultater 39. Tillæg 7 indeholder en oversigt, men testmetoden giver ingen endelig statistisk vejledning i analyse af testresultaterne. 40. I testen til bestemmelse af dosisinterval er det primære endepunkt dødelighed. Ændringer i de voksne individers adfærd (f.eks. manglende evne til at grave sig ned i jorden; orme, der ligger ubevægelige op ad testbeholderens glasvæg) og morfologi (f.eks. åbne sår) registreres dog også sammen med tilstedeværelsen af eventuelle unger. Der bruges normalt probabilistisk analyse (21) eller logistisk regression til at bestemme LC50. I tilfælde hvor denne analysemetode er uegnet (f.eks. hvis der er færre end tre koncentrationer med delvis dødelighed) kan der bruges alternative metoder. Disse metoder kan omfatte glidende gennemsnit (22), Trimmed Spearman-Karber-metoden (23) eller simpel interpolation (f.eks. geometrisk gennemsnit af LC0 og LC100 som beregnet ved kvadratroden af LC0 ganget med LC100). 41. I den endelige test er endepunktet for testen frugtbarhed (dvs. antal unger). Som i testen til bestemmelse af dosisinterval skal alle andre tegn på skade dog anføres i den endelige rapport. I forbindelse med den statistiske analyse er der brug for det aritmetiske gennemsnit og standardafvigelsen pr. behandling og pr. kontrol for at beregne reproduktionen. 42. Hvis der er foretaget en variansanalyse, kan standardafvigelsen, s, og frihedsgraderne, df, erstattes af henholdsvis det samlede variansestimat fra variansanalysen og frihedsgraderne herfra — forudsat at variansen ikke afhænger af koncentrationen. I dette tilfælde bruges kontrollernes og behandlingernes individuelle varianser. Disse værdier beregnes normalt med kommerciel statistisk software, der bruger resultater pr. beholder som replikater. Hvis det skønnes mere hensigtsmæssigt at samle data for de negative kontroller og opløsningsmiddelkontrollerne end at teste dem hver for sig, skal de testes, for at konstatere at de ikke er signifikant forskellige (punkt 45 og tillæg 7 indeholder beskrivelser af egnede test). 43. Yderligere statistisk testning og følgeslutning afhænger af, hvorvidt replikatværdierne er normalt fordelt og er homogene med hensyn til varians. Beregning af NOEC 44. Anvendelse af stærke statistiske test foretrækkes. Der bør bruges oplysninger fra f.eks. tidligere erfaring med ringtest eller andre historiske oplysninger om, hvorvidt data er nogenlunde normalt fordelt. Varianshomogenitet (homoskedasitet) er mere afgørende. Erfaringer viser, at variansen ofte stiger med stigende gennemsnit. I disse tilfælde kan transformation af data medføre homoskedasitet. En sådan transformation bør dog være baseret på erfaring med historiske data snarere end på data, der undersøges. Med homogene data udføres flere t-test, såsom Williams' test (α = 0,05, ensidet) (24)(25) eller i visse tilfælde Dunnetts test (26)(27). Det skal bemærkes, at t-værdierne i tabellen — i tilfælde af ulige replikation — skal korrigeres i henhold til Dunnett og Williams. Nogle gange stiger/falder responserne ikke regelmæssigt på grund af stor variation. I dette tilfælde, hvor der er tale om en kraftig afvigelse fra monotoni, er Dunnetts test mere velegnet. Hvis der er afvigelser fra homoskedasitet, kan det være fornuftigt at undersøge mulige virkninger på varians nærmere, for at beslutte om der kan bruges t-test uden at miste betydelig styrke (28). Alternativt kan der bruges flere U-test, f.eks. Bonferroni-U-test ifølge Holm (29), eller når dataene udviser heteroskedasticitet, men ellers svarer til et underliggende monotont dosis/respons-forhold, en anden ikke-parametrisk test [f.eks. Jonckheere-Terpstra (30)(31) eller Shirley (32)(33)], som generelt ville være at foretrække frem for t-test justeret for forskel i varians (se også figuren i tillæg 7). 45. Er der udført en grænsetest, og forudsætningerne for parametriske testprocedurer (normalitet, homogenitet) er opfyldt, kan den parvise Student-t-test bruges eller alternativt Mann-Whitney-U-testen (29). Beregning af ECx 46. For at beregne enhver ECx-værdi bruges middelværdierne pr. behandling til regressionsanalyse (lineær eller ikke-lineær), når der er opnået et passende dosis/respons-forhold. For ormenes vækst som en kontinuerlig respons kan ECx-værdier estimeres ved hjælp af passende regressionsanalyse (35). Blandt egnede forhold for kvantale data (dødelighed/overlevelse) og afkom er normale sigmoidforhold, logistiske forhold eller Weibull-forhold, som omfatter to til fire parametre, hvoraf nogle også kan modellere hormetiske responser. Hvis et dosis/respons-forhold blev bestemt ved lineær regressionsanalyse, bør en signifikant r2 (determinationskoefficient) og/eller hældning findes ved regressionsanalyse, inden ECx bestemmes ved at indsætte en værdi, der svarer til x % af kontrolgennemsnittet, i den ligning, der er fundet ved regressionsanalyse. 95 % konfidensgrænser beregnes ifølge Fieller (nævnt i Finney (21)) eller andre moderne passende metoder. 47. Alternativt modelleres responsen som en procentdel eller andel af modelparametre, hvilket fortolkes som kontrollernes gennemsnitsrespons. I disse tilfælde kan den normale (logistiske, Weibull-) sigmoidkurve ofte let tilpasses til resultaterne ved hjælp af den probabilistiske regressionsmetode (21). I disse tilfælde skal vægtningsfunktionen justeres for metrisk respons, jf. Christensen (36). Hvis der er konstateret hormese, bør den probabilistiske analyse erstattes af en logistisk funktion med fire parametre eller Weibull-funktion tilpasset med den ikke-lineære regressionsmetode (36). Hvis et passende dosis/respons-forhold ikke kan tilpasses til dataene, kan der bruges andre metoder til at bestemme ECx, og værdiens konfidensgrænser, f.eks. glidende gennemsnit i henhold til Thompson (22) og Trimmed Spearman-Karber-metoden (23). TESTRAPPORT 48. Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger: Testkemikalie: — fysiske egenskaber og, når det er relevant, relevante fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. opløselighed i vand, damptryk) — kemisk identifikation af testkemikaliet ifølge IUPAC-nomenklaturen, CAS-nummer, parti, batch, strukturformel og renhed — prøvens udløbsdato. Testede arter: — anvendte testdyr: art, videnskabeligt navn, herkomst af organismer og dyrkningsbetingelser. Testbetingelser: — bestanddele og klargøring af den syntetiske jord — tilsætningsmetode for testkemikaliet — beskrivelse af testbetingelserne, herunder temperatur, fugtindhold, pH osv. — fuldstændig beskrivelse af forsøgsdesign og fremgangsmåder. Testresultater: — dødelighed for voksne orme efter to uger og antal unger ved afslutningen af testen til bestemmelse af dosisinterval — dødelighed for voksne orme efter tre ugers eksponering og fuld fortegnelse over afkom ved afslutningen af den endelige test — eventuelle observerede fysiske eller patologiske symptomer og adfærdsændringer hos testorganismerne — LC50, NOEC og/eller ECx (f.eks. EC50, EC10) for formering, hvis nogle af værdierne er udtrykt med konfidensintervaller, og en graf for den tilpassede model, der blev benyttet til beregning heraf, samt alle oplysninger og bemærkninger, som kan være til hjælp ved fortolkning af resultaterne. Afvigelser fra de procedurer, der er beskrevet i denne testmetode, og eventuelle usædvanlige hændelser under testen. LITTERATUR (1) J. Römbke (1989), Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen, Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) J. Römbke og T. Moser (1999), Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test, UBA-Texte 4/99, s. 150 + s. 223 ff. (3) W. Westheide og D. Bethge-Beilfuss (1991), The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, in: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects, Ed.: G. Esser og D. Overdieck, s. 497-508. Amsterdam Elsevier, (4) E. Dirven-Van Breemen, R. Baerselmann og J. Notenboom (1994), Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek, RIVM Rapport Nr. 719102025. s. 46 ff. (5) Kapitel C.8 i dette bilag, Toksicitet for regnorme. (6) ISO (Den Internationale Standardiseringsorganisation) (1993), Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida), Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1, ISO, Genève. (7) ISO (Den Internationale Standardiseringsorganisation) (1996), Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida), Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2, ISO, Genève. (8) S. Rundgren og A. K. Augustsson (1998), Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877), in: H. Løkke og C. A. M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests, John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. (9) K. Kasprzak (1982), Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems, Pedobiologia 23, 217-232. (10) J. Römbke (1995), Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF — Z. Umweltchem, Ökotox. 7, 246-249. (11) W. Dunger og H. J. Fiedler (1997), Methoden der Bodenbiologie, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) W. A. M. Didden (1993), Ecology of Terrestrial Enchytraeidae, Pedobiologia 37, 2-29. (13) H. Becker (1991), Bodenorganismen — Prüfungskategorien der Forschung, UWSF — Z. Umweltchem, Ökotox. 3, 19-24. (14) J. Römbke og A. Federschmidt (1995), Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. (15) J. Römbke, F. Riepert og R. Achazi (2000), Enchytraeen als Testorganismen, in: Toxikologische Beurteilung von Böden. S. Heiden, R. Erb, W. Dott og A. Eisentraeger (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. (16) ISO (Den Internationale Standardiseringsorganisation) (1994), Soil Quality — Determination of pH, No. 10390, ISO, Genève. (17) A. W. Bell (1958), The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus, Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. (18) C. O. Nielsen og B. Christensen (1959), The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species, Natura Jutlandica 8-9, 1-160. (19) V. Bouguenec og N. Giani (1987), Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus, Ann. Limnol. 23, 9-22. (20) J. Korinkova og J. Sigmund (1968), The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. (21) D. J. Finney (1971), Probit Analysis (3rd ed.), s. 19-76, Cambridge Univ. Press. (22) D. J. Finney (1978), Statistical Method in Biological Assay, Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) M. A. Hamilton, R. C. Russo og R. V. Thurston (1977), Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays, Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. (24) D. A. Williams (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. (25) D. A. Williams (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. (26) C. W. Dunnett (1955), A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. (27) C. W. Dunnett (1964), New Tables for Multiple Comparisons with a Control, Biometrics 20, 482-491. (28) N. van der Hoeven (1998), Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols?, Ecotoxicology 7: 355-361. (29) S. Holm (1979), A simple sequentially rejective multiple test procedure, Scand. J. Statist. 6, 65-70. (30) A. R. Jonckheere (1954), A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. (31) T. J. Terpstra (1952), The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327-333. (32) E. A. Shirley (1979), The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144-151. (33) D. A. Williams (1986), A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183-186. (34) R. R. Sokal og F. J. Rohlf (1981), Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research, 2nd edition. W. H. Freeman and Company, New York. (35) E. R. Christensen (1984), Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model, Water Research 18, 213-221. (36) P. H. Van Ewijk og J. A. Hoekstra (1993), Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present, Ecotox, Environ. Safety 25, 25-32. Tillæg 1 Definitioner I forbindelse med denne testmetode anvendes følgende definitioner: Kemikalie betyder et stof eller en blanding. ECx (effektkoncentration for x % virkning) er den koncentration, der har en virkning på x % på testorganismer inden for en angiven eksponeringsperiode sammenlignet med en kontrol. I denne test udtrykkes effektkoncentrationerne som en masse af testkemikalie pr. tørmasse testjord. LC0 (ikke-dødelig koncentration) er den koncentration af et testkemikalie, der ikke dræber nogen af de eksponerede testorganismer inden for et givet tidsrum. I denne test udtrykkes LC0 som en masse af testkemikalie pr. tørmasse testjord. LC50 (dødelig koncentration 50 %) er den koncentration af et testkemikalie, der dræber 50 % af de eksponerede testorganismer inden for et givet tidsrum. I denne test udtrykkes LC50 som en masse af testkemikalie pr. tørmasse testjord. LC100 (dødelig koncentration 100 %) er den koncentration af et testkemikalie, der dræber 100 % af de eksponerede testorganismer inden for et givet tidsrum. I denne test udtrykkes LC100 som en masse af testkemikalie pr. tørmasse testjord. LOEC (laveste koncentration med observeret effekt, Lowest Observed Effect Concentration) er den laveste testkemikaliekoncentration, som ved sammenligning med kontrollen har en statistisk signifikant effekt (p < 0,05). I denne test udtrykkes LOEC som en masse testkemikalie pr. tørmasse testjord. Alle testkoncentrationer over LOEC bør normalt udvise en effekt, der er statistisk forskellig fra kontrollen. Eventuelle afvigelser fra ovenstående i forbindelse med identifikation af LOEC skal begrundes i testrapporten. NOEC (nuleffektkoncentration, No Observed Effect Concentration) er den højeste testkemikaliekoncentration umiddelbart under LOEC, hvor der ikke observeres nogen virkning. I denne test har NOEC ingen statistisk signifikant virkning (p < 0,05) inden for en given eksponeringsperiode sammenlignet med kontrollen. Reproduktionsrate er det gennemsnitlige antal unger, der er produceret pr. antal voksne individer i løbet af testperioden. Testkemikalie er stoffer eller blandinger, der testes med denne testmetode. Tillæg 2 Bestemmelse af den maksimale vandholdende evne Bestemmelse af den syntetiske jords vandholdende evne Følgende metode har vist sig at være hensigtsmæssig. Den er beskrevet i bilag C til ISO DIS 11268-2. Der opsamles en bestemt mængde (f.eks. 5 g) testjordsubstrat ved hjælp af en egnet anordning (sneglebor el.lign.). Bunden af røret dækkes med et stykke filterpapir, og røret placeres herefter — efter påfyldning af vand — på et stativ i et vandbad. Røret sænkes gradvist, indtil vandstanden står over jordhøjde. Det står herefter i vandet i omkring tre timer. Da ikke alt vand, som absorberes af jordens kapillærer, kan bindes, drænes jordprøven i to timer ved at anbringe røret på et leje af meget vådt fintformalet kvartssand i en lukket beholder (for at forhindre udtørring). Prøven vejes herefter tørret til en konstant masse ved 105 °C. Den vandholdende evne (WHC) kan derefter beregnes som følger: Hvor: S = vandmættet substrat + rørmasse + filterpapirmasse T = tara (rørmasse + filterpapirmasse) D = tørmasse af substrat KILDER: ISO (Den Internationale Standardiseringsorganisation) (1996), Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida), Del 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2, ISO, Genève. Tillæg 3 Bestemmelse af jordens pH Følgende metode til bestemmelse af en jordprøves pH er baseret på beskrivelsen i ISO 10390 (Soil Quality — Determination of pH). En bestemt mængde jord tørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer. En suspension af jorden (indeholdende mindst 5 gram jord) fremstilles herefter i fem gange sin mængde af enten 1 M kaliumchlorid (KCl) i analysekvalitet eller en 0,01 M opløsning af calciumchlorid (CaCl2) i analysekvalitet. Suspensionen omrystes derefter grundigt i fem minutter. Efter omrystning henstår suspensionen i mindst to timer, men ikke over 24 timer. Væskefasens pH måles herefter ved hjælp af et pH-meter, der er kalibreret før hver måling i en passende serie bufferopløsninger (f.eks. pH 4,0 og 7,0). KILDER: ISO (Den Internationale Standardiseringsorganisation) (1994), Soil Quality — Determination of pH, No. 10390, ISO, Genève. Tillæg 4 Dyrkningsbetingelser for Enchytraeus Sp. Enchytraeider af arten Enchytraeus albidus (og andre Enchytraeus-arter) kan dyrkes i store plastkasser (f.eks. 30 × 60 × 10 cm) fyldt med en 1:1 blanding af syntetisk jord og naturlig, uforurenet havejord. Kompostmateriale skal undgås, da det kan indeholde toksiske kemikalier, f.eks. tungmetaller. Fauna fjernes fra jorden inden brug (f.eks. ved dybfrysning). Et substrat, som udelukkende består af syntetisk jord, kan også bruges, men reproduktionen kan være lavere end den, der opnås med blandet jordsubstrat. Det substrat, der bruges til dyrkning, skal have en pH på 6,0 ± 0,5. Kulturen opbevares i mørke ved en temperatur på 15-20 °C ± 2 °C. Temperaturer på over 23 °C skal undgås. Jorden bør være fugtig, men ikke våd. Det korrekte fugtindhold i jorden er opnået, når små vanddråber viser sig mellem fingrene, når jorden presses forsigtigt sammen. Iltfattige betingelser skal undgås, ved at sikre at låg på dyrkningsbeholdere tillader passende gasudveksling med atmosfæren. Jorden skal brydes omhyggeligt hver uge for at fremme beluftning. Ormene kan fodres med valsede havregryn. Havregrynene opbevares i lukkede beholdere og autoklaveres eller opvarmes inden brug for at undgå infektion med melmider (f.eks. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) eller rovmider (f.eks. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Efter varmebehandling formales foderet, så det nemt kan strøs ud på jordoverfladen. Fra tid til anden kan de valsede havregryn suppleres med vitaminer, mælk og torskelevertran. Andre egnede foderkilder er bagegær og fiskefoderet »TetraMin«. Fodring finder sted ca. to gange om ugen. En passende mængde valsede havregryn strøs ud på jordoverfladen eller iblandes omhyggeligt i substratet, når jorden brydes for at fremme beluftning. Den absolutte mængde uddelt foder afhænger af antallet af orme i substratet. Som hovedregel øges mængden af foder, hvis alt foderet er spist inden for en dag efter fodring. Omvendt reduceres mængden af foder, hvis der stadig er foder på overfladen på tidspunktet for den anden fodring (en uge senere). Foder med svampevækst fjernes og erstattes. Efter tre måneder flyttes ormene til et frisk fremstillet substrat. Dyrkningsbetingelserne anses for tilfredsstillende, hvis ormene: a) ikke forsøger at forlade jordsubstratet, b) bevæger sig hurtigt gennem jorden, c) har en blank overflade uden fastsiddende jordpartikler, d) er mere eller mindre hvide, e) forekommer i forskellige aldre i kulturerne og f) formerer sig løbende. Tillæg 5 Gennemførelse af test med andre Enchytraeus-arter Valg af art Der kan bruges andre arter end E. albidus, men testmetoden og validitetskriterierne skal tilpasses i overensstemmelse hermed. Eftersom mange Enchytraeus-arter er umiddelbart tilgængelige og let kan holdes i laboratoriet, er det vigtigste kriterium for at vælge andre arter end E. albidus økologisk relevans og desuden sammenlignelig følsomhed. Der kan også være formelle årsager til at skifte art. I lande hvor E. albidus ikke forekommer og ikke kan importeres (f.eks. på grund af karantænemæssige begrænsninger), vil det f.eks. være nødvendigt at bruge en anden Enchytraeus-art. Eksempler på egnede alternative arter — Enchytraeus crypticus (Westheide og Graefe 1992): I de senere år er denne art ofte blevet anvendt i økotoksikologiske undersøgelser på grund af ukompliceret formering og testning. Den er dog lille, og det gør den vanskeligere at håndtere end E. albidus (især på trin forud for brug af farvningsfremgangsmåden). Det er ikke med sikkerhed dokumenteret, at E. crypticus findes i det fri, og den er kun blevet beskrevet fra dyrkede regnormebestande. Dens økologiske behov kendes derfor ikke. — Enchytraeus buchholzi