*****

KOMMISSIONENS FORORDNING (EOEF) Nr. 718/85

af 20. marts 1985

om aendring af forordning (EOEF) nr. 625/78 om gennemfoerelsesbestemmelser for offentlig oplagring af skummetmaelkspulver

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE

FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets forordning nr. 804/69 af 27. juni 1968 om den faelles markedsordning for maelk og mejeriprodukter (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 1557/84 (2), saerlig artikel 7, stk. 5, og

ud fra foelgende betragtninger:

For saa vidt angaar skummetmaelkspulvers kvalitet er det fastsat i punkt 2, litra b), i bilag I til Kommissionens forordning (EOEF) nr. 625/78 (3), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 1128/84 (4), hvilke kontrolmetoder der skal anvendes til paavisning af visse stoffer;

der er nu, blandt andet ved hjaelp af den ringanalyse, der er gennemfoert af visse forskningslaboratorier og flere kontrollaboratorier i medlemsstaterne, faerdigudviklet en ny metode til paavisning af loebevalle, hvorved glucomakropeptidindholdet bestemmes ved hjaelp af hoejtryksvaeskekromatografi; metoden indebaerer klare fordele, bl.a. med hensyn til den hurtighed, hvormed der kan foretages rutinemaessig analyse af flere proever om dagen; der boer derfor gennem en aendring af forordning (EOEF) nr. 625/78 aabnes mulighed for at anvende denne metode;

det vil imidlertid vaere hensigtsmaessigt at fastsaette en overgangs- og tilpasningsperiode paa tolv maaneder, hvor medlemsstaterne stadig kan anvende metoden med bestemmelse af indholdet af fri sialinsyre, og hvor de erhvervsdrivende stadig kan kraeve sidstnaevnte metode anvendt i tilfaelde af indsigelser mod resultaterne af den nye analysemetode;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomiteen for Maelk og Mejeriprodukter -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING:

Artikel 1

I forordning (EOEF) nr. 625/78 foretages foelgende aendringer:

1. Punkt 2, litra b), andet led, i bilag I affattes saaledes:

»- Loebevalle: bestemmelse af glucomakropeptidindholdet ved hjaelp af hoejtryksvaeskekromatografi (2). Indtil den 31. marts 1986 kan medlemsstaterne dog ogsaa anvende bestemmelse af indholdet af fri sialinsyre (3). Indtil denne dato foretages der, saafremt den beroerte part fremsaetter indsigelse, paa dennes anmodning og for dennes regning bestemmelse af indholdet af fri sialinsyre. De derved opnaaede resultater er afgoerende.«.

2. I bilag I bliver den tidligere fodnote (2) herefter fodnote (3), og som ny fodnote (2) indsaettes:

»(2) Herved forstaas metoden i bilag V.«.

3. Bilaget til denne forordning indsaettes som bilag V.

Artikel 2

Denne forordning traeder i kraft paa tredjedagen efter offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 20. marts 1985.

Paa Kommissionens vegne

Frans ANDRIESSEN

Naestformand

(1) EFT nr. L 148 af 28. 6. 1968, s. 13.

(2) EFT nr. L 150 af 6. 6. 1984, s. 6.

(3) EFT nr. L 84 af 31. 3. 1978, s. 19.

(4) EFT nr. L 109 af 26. 4. 1984, s. 9.

BILAG

»BILAG V

PAA PAAVISNING AF LOEBEVALLE I SKUMMETMAELKSPULVER TIL OFFENTLIG OPLAGRING VED HJAELP AF HOEJTRYKSVAESKEKROMATOGRAFISK BESTEMMELSE AF GLYCOMAKROPEOTIDINDHOLDET (HPLC-metode)

1.2 // 1. // Formaal og anvendelsesomraade // // Med denne metode kan det ved bestemmelse af glucomakropeptider paavises, om der er loebevalle til stede i skummetmaelkspulver. // 2. // Reference // // IDF-norm 50 A: 1980 - Maelk og mejeriprodukter - vejledning i stikproeveudtagning. // 3. // Definition // // Skummetmaelkspulvers indhold af glucomakropeptider: indholdet af saadanne stoffer bestemt ved den nedenfor beskrevne metode og udtrykt i vaegtprocent. // 4. // Princip // // - Oploesning af skummetmaelkspulveret, fjernelse af fedtstoffer og proteiner ved hjaelp af trichloreddikesyre og centrifugering. // // - Bestemmelse af maengden af glucomakropeptider (GMP) i centrifugatet ved HPLC. // // - Vurdering af resultatet i forhold til standardproever af skummetmaelkspulver, som ikke indeholder eller er tilsat en kendt maengde vallepulver. // 5. // Reagenser // // Alle reagenser skal vaere af analysekvalitet. Der anvendes destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed. // 5.1. // Oploesning af trichloreddikesyre // // 240 g trichloreddikesyre (C13CCOOH) oploeses i vand og fortyndes til 1 000 ml. // 5.2. // Elueringsvaeske med pH 6,0 // // 1,74 g kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4), 12,37 g kaliumdihydrogenphosphat (HK2PO4) og 21,41 g natriumsulfat (NA2SO4) oploeses i ca. 700 ml vand. // // Om noedvendigt indstilles pH til 6,0 ved hjaelp af fortyndet phosphorsyre eller en kaliumhydroxidoploesning. // // Der fyldes op til 1 000 ml med vand og blandes. Foer brugen filtreres elueringsvaesken gennem et membranfilter med porestoerrelse 0,45 mm. // 5.3. // Oploesning til skylning og opbevaring af kolonnerne // // En volumendel acetonitril (CH3CN) blandes med ni volumendele vand. Foer brugen filtreres oploesningen gennem et membranfilter med porestoerrelse 0,45 mm. // // Bemaerk: Der kan til skylning anvendes andre oploesninger, der har baktericid virkning, og som ikke aendrer kolonnernes adskillelsesevne. // 5.4. // Standardproever // 5.4.1. // Skummetmaelkspulver, der opfylder kravene i forordning (EOEF) nr. 625/78, benaevnt [0]. // 5.4.2. // Samme pulver tilsat 5 % (m/m) loebevallepulver med normal sammensaetning, benaevnt [5]. // 6. // Apparatur // 6.1. // Analysevaegt. // 6.2. // Centrifuge, der kan praestere en centrifugalkraft paa 2 200 g, med tilhoerende lukkede centrifugeglas paa ca. 25 ml. // 6.3. // Mekanisk omroerer. // 6.4. // Magnetomroerer. // 6.5. // Glastragte med diameter ca. 7 cm. // 6.6. // Filtrerpapir, mellemfint, med diameter ca. 12,5 cm. // 6.7. // Filtreringsudstyr af glas med tilhoerende membranfiltre med porestoerrelse 0,45 mm. // 6.8. // Maalepipette paa 10 ml, som opfylder kravene i ISO 648, klasse A, eller ISO/R 835. // 6.9. // Termostatstyret vandbad paa 25 ± 0,5° C. // 6.10. // HPLC-udstyr bestaaende af: // 6.10.1. // Pumpe; // 6.10.2. // Manuel eller automatisk injektionsenhed paa 15-30 ml; // 6.10.3. // To serieforbundne kolonner, TSK 2000 SW (laengde 30 cm, indvendig diameter 0,75 cm) eller kolonner af tilsvarende effektivitet, og en forkolonne (3 cm × 0,3 cm) pakket med I 125 eller et lige saa effektivt materiale; // 6.10.4. // Termostatstyret kolonneovn indstillet paa 35 ± 1° C; // 6.10.5. // UV-detektor med variabel boelgelaengde, hvormed der ved 205 nm kan maales med en foelsomhed paa 0,008 A; // 6.10.6. // Integrator, der kan integrere over de enkelte toppe. // // Bemaerk: Der kan arbejdes med kolonner ved stuetemperatur, men adskillelsesevnen bliver i saa fald fald lidt mindre. Temperatursvingningerne gennem en analyseraekke maa her ikke overstige ± 5° C. // 7. // Stikproeveudtagning // 7.1. // Jf. norm 50 A: 1980 // 7.2. // Stikproeven opbevares under saadanne forhold, at der hverken kan ske oedelaeggelse eller aendring af sammensaetningen. // 8. // Fremgangsmaade // 8.1. // Forberedelse af analyseproeven // // Maelkepulveret overfoeres til en beholder, der er ca. dobbelt saa stor som pulverets volumen, og som har et lufttaet laag. // // Beholderen lukkes straks. // // Maelkepulveret blandes omhyggeligt ved flere gange at vende rundt paa beholderen. // 8.2. // Udtagning af analyseproeve // // I et centrifugeglas (6.2) afvejes 2,000 ± 0,001 g. // 8.3. // Fjernelse af fedtstoffer og proteiner // 8.3.1. // Der saettes 20 ml 50° C varmt vand til analyseproeven. Pulveret oploeses ved omroering i 5 min med omroereren (6.3). Glasset afkoeles til 25° C. // 8.3.2. // I loebet af 2 min tilsaettes 10,0 ml trichloreddikesyreoploesning (5.1) under omroering med magnetomroereren (6.4). Glasset anbringes i vandbadet (6.9), hvori det henstaar i 60 min. // 8.3.3 // Der centrifugeres (6.2) ved 2 200 g i 10 min eller filtreres gennem papirfilter (6.6), idet de foerste 5 ml filtrat bortkastes. // 8.4. // Chromatografisk bestemmelse // 8.4.1. // Af centrifugatet eller filtratet (8.3.3) indsproejtes en noejagtigt afmaalt maengde paa mellem 15 og 30 ml i HPLC-apparatet (6.10) under en elueringshastighed paa 1,0 ml pr. minut. // // Bemaerk: // // 1. Elueringsvaesken (5.2) holdes paa 85° C under hele chromatograferingen for at holde den luftfri og fri for bakterievaekst. Andre foranstaltninger med tilsvarende virkning er acceptable. // // 2. Hver gang chromatograferingen afbrydes, skylles kolonnen med vand. Den maa aldrig efterlades med elueringsvaeske (5.2) i. // // Skal kolonnerne staa ubenyttede hen i mere end 24 timer, skylles de foerst med vand og dernaest med oploesning (5.3) i mindst 3 timer med en gennemloebshastighed paa 0,2 ml pr. minut. // 8.4.2. // Resultaterne af chromatograferingen af analyseproeven foreligger i form af et chromatogram, hvor hver top identificeres ved sin retentionstid, RT, nemlig: 1.2.3 // // Top II: // chromatogrammets anden top, hvis retentionstid er ca. 12,5 min, // // Top III: // chromatogrammets tredje top, der svarer til GMP, og hvis retentionstid er 15,5 ± 1,0 min, // // Top IV: // chromatogrammets fjerde top, hvis retentionstid er ca. 17,5 min. 1.2 // // Kolonnernes kvalitet kan paavirke de forskellige toppes retentionstid. // // Integratoren (6.10.6) maaler automatisk arealet A af hver top, nemlig: 1.2.3 // // AII: // arealet af top II, // // AIII: // arealet af top III, // // AIV: // arealet af top IV. 1.2 // // For at afsloere eventuelle afvigelser enten som foelge af, at apparaturet eller kolonnerne ikke har fungeret tilfredsstillende, eller paa grund af den analyserede proeves oprindelse eller art maa alle chromatogrammer bedoemmes visuelt, foer en kvalitativ tolkning paabegyndes. // // I tvivlstilfaelde gentages analysen. // 8.5. // Kalibrering // 8.5.1. // Med standardproeverne (5.4) foelges den i punkt 8.2 - 8.4.2 beskrevne fremgangsmaade noeje. // // Der benyttes frisk fremstillede oploesninger, da GMP nedbrydes i 8 % trichloreddikesyreoploesning; indholdet heraf falder med ca. 0,2 % pr. time ved 30° C. // 8.5.2. // Foer chromatografering af proeverne konditioneres kolonnerne ved gentagen indsproejtning af oploesningen (8.5.1) af standardproeven (5.4.2), indtil den top, der svarer til GMP, har konstant areal og retentionstid. // 8.5.3. // Kalibreringsfaktorerne R bestemmes ved at indsproejte filtrat (8.5.1) i samme maengde som proeverne. // 9. // Angivelse af resultaterne // 9.1. // Formler og beregning // 9.1.1. // Beregning af kalibreringsfaktoren R // // // 1.2.3.4.5 // // Top II: // RII // = // 100 AII [0] // // Top IV: // RIV // = // 100 AIV [0] // // hvor // // 1.2.3.4 // // RII et RIV // = // kalibreringsfaktorerne for henholdsvis top II og IV og // // AII [0] et AIV [0] // = // de arealer af henholdsvis top II og IV for standardproeven [0], som er bestemt under 8.5.3. // 1.2.3.4.5 // // Top III: // RIII // = // W AIII [5] - AIII [0] 1.2.3.4 // // hvor // // // // RIII // = // kalibreringsfaktoren for top III, // // AIII [0] et AIII [5] // = // de arealer af top III for henholdsvis standardproeve [0] og [5], som er bestemt under 8.5.3, // // W // = // indholdet af valle i standardproeven [5], nemlig 5 (%). 1.2 // 9.1.2. // Beregning af de relative toparealer for proeven [E] // // // // 1.2.3.4.5.6 // // SII [E] // = // RII // × // AII [E] // // SIII [E] // = // RIII // × // AIII [E] // // SIV [E] // = // RIV // × // AIV [E] 1.2.3.4 // // hvor // // // // SII [E], SIII [E], SIV [E] // = // de relative arealer af henholdsvis top II, III og IV for proeven [E], // // AII [E], AIII [E], AIV [E] // = // de arealer af henholdsvis top II, III og IV for proeven [E], som er bestemt under 8.4.2, // // RII, RIII, RIV // = // de under 9.1.1 beregnede kalibreringsfaktorer. 1.2 // 9.1.3. // Beregningen af de relative retentionstider for top II, III og IV for proeven [E] // // 1.2.3.4 // // RRTIII [E] // = // RTIII [E] RTIII [5] 1.2.3 // // hvor // // // RRTIII [E] // = den relative retentionstid for top III for proeven [E] // // RTIII [E] // = retentionstiden for top III for proeven [E], som er bestemt under 8.4.2. // // RTIII [5] // = retentionstiden for top III for standardproeven [5], som er bestemt under 8.5.3. 1.2 // 9.1.4. // Det er vist eksperimentelt, at den relative retentionstid for top III, RRTIII [E], er ligefrem proportional med vallepulverindholdet op til 10 %. // // - ved et indhold paa < 5 % er RRTIII [E] > 1,000; // // - ved indhold paa 5 % er RRTIII [E] µ 1,000. // // Den tilladte usikkerhed paa RRTIII er ± 0,002. // // Normalt afviger RRTIII [0]-vaerdien kun lidt fra 1,034. Alt efter kolonnernes tilstand kan denne vaerdi naerme sig, men skal altid vaere stoerre end 1,000. // 9.2. // Beregning af det procentvise indhold af loebevallepulver i proeven nemlig: // // W = SIII [E] - [1,3 + (SIII [0] - 0,9)] 1.2.3 // // hvor: // // // W // = indholdet af loebevalle i proeven [E], i vaegtprocent; // // SIII [E] // = det relative areal af top III for proeven [E], som er fremkommet under 9.1.2; // // 1,3 // = det relative middelareal af top III udtrykt i g pr. 100 g loebevalle og bestemt i uforfalsket skummetmaelkspulver af forskellig oprindelse. Denne vaerdi er bestemt eksperimentelt; // // SIII [0] // = det relative areal af top III og er lig med RIII × AIII [0]; sidstnaevnte stoerrelser er bestemt under henholdsvis 9.1.1 og 8.5.3; // // (SIII [0] - 0,9) // = korrektionen af det relative middelareal 1,3, naar SIII [0]-vaerdien afviger 0,9. Det relative middelareal af top III for standardproeven [0] er bestemt eksperimentelt til 0,9. 1.2 // 9.3. // Metodens noejagtighed // 9.3.1. // Repeterbarhed // // Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, der er udfoert samtidig eller med kort tids mellemrum af samme person, med samme apparatur og paa samme stikproeve, maa ikke overstige 0,2 vaegtprocent. // 9.3.2. // Reproducerbarhed // // Forskellen mellem to resultater, som to forskellige laboratorier er naaet frem til med samme stikproeve, maa ikke overstige 0,4 vaegtprocent. // 9.4. // Fortolkning // 9.4.1. // Der er ikke valle til stede, hvis der relative areal af top III, SIII [E], udtrykt i g loebevalle pr. 100 g er µ 2,0 + [SIII [0] - 0,9]: 1.2.3 // // hvor: // // // 2,0 // = den hoejest tilladte vaerdi for det relative areal af top III; der er her taget hensyn til det relative areal af top III, nemlig 1,3, usikkerheden som foelge af variationer i skummetmaelkspulvers sammensaetning og metodens reproducerbarhed (9.3.2). // // (SIII [0] - 0,9) // = korrektionen, naar SIII [0]-vaerdien afviger fra 0,9 (jf. 9.2). 1.2 // 9.4.2. // Hvis det relative areal af top III, SIII [E], er 2,0 og samtidig det relative areal af top II, SII [E], er 160 og/eller det relative areal af top IV, SIV [E], er 135, skal proteinindholdet bestemmes. // 9.4.2.1. // Hvis proteinindholdet er < 37 g pr. 100 g, stammer den analyserede proeve sandsynligvis fra maelk af ringe bakteriologisk kvalitet. Der kan intet sluttes om et eventuelt indhold af valle. Oploesningen af top II, III og IV skal dog vaere lige saa god som for standardproeverne, og den relative retentionstid for top III skal ligge i naerheden af retentionstiden for top III, SIII [0]. // 9.4.2.2. // Hvis proteinindholdet er 37 g pr. 100 g // // - og de i relative arealer af top II, III og IV for proeven [E] ligger inden for de tilladte graenser (stiplet ligne; dei figur 1 til 6 i bilaget anfoerte vaerdier er bestemt ved statistisk analyse af forsoegsdata), kan et indhold af loebevalle ikke paavises; // // - dersom kun det relative areal af top III ligger uden for de oevre graenser paa figur 2, 3 og 6, kan det sluttes, at der er loebevalle til stede. // // Loebevalleindholdet beregnes ved fra SIII [E] (beregnet i 9.1.2) at traekke middelvaerdien for top III aflaest paa figur 2 (fuldt optrukket linje) ud for proteinindholdet i proeven [E]. RRTIII [E]-vaerdien skal stemme overens med det bestemte loebevalleindhold; // // - i alle andre tilfaelde kan der intet sluttes om et eventuelt indhold af loebevalle.