BILAG II

PROTOKOL TIL DIAGNOSTICERING, PÅVISNING OG IDENTIFIKATION AF RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

OMRÅDE

Denne protokol beskriver de forskellige procedurer, der indgår i:

i) diagnosticering af brunbakteriose i kartoffelknolde og af bakterievisnesyge hos kartoffel- og tomatplanter samt visse andre værtsplanter

ii) påvisning af Ralstonia solanacearum i prøver af kartoffelknolde og –planter, tomatplanter og andre værtsplanter samt vand og jord

iii) identifikation af Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

INDHOLD

Side Generelle principper 40 AFSNIT I: Anvendelse af protokollen 40 1. Protokol til påvisning og diagnosticering af brunbakteriose og bakterievisnesyge (R. solanacearum) i kartoffelknolde og -planter, tomatplanter eller andre værtsplanter med symptomer på brunbakteriose eller bakterievisnesyge 40 2. Protokol til påvisning og identifikation af R. solanacearum i prøver af symptomfrie kartoffelknolde 43 3. Protokol til påvisning og identifikation af R. solanacearum i prøver af symptomfrie kartoffel- eller tomatplanter eller andre værtsplanter 46 AFSNIT II: Detaljerede metoder til påvisning af R. solanacearum i kartoffelknolde og -planter, tomatplanter eller andre værtsplanter med symptomer på brunbakteriose eller bakterievisnesyge 48 1. Symptomer 48 2. Hurtigscreeningtest 48 3. Isolering 49 4. Test til identifikation af R. solanacearum 49 AFSNIT III: 1. Detaljerede metoder til påvisning og identifikation af R. solanacearum i prøver af symptomfrie kartoffelknolde 49 1.1. Forberedelse af prøver 49 1.2. Analyse 51 2. Detaljerede metoder til påvisning og identifikation af R. solanacearum i prøver af symptomfrie kartoffel- eller tomatplanter eller andre planter 51 2.1. Forberedelse af prøver 51 2.2. Analyse 52 AFSNIT IV: 1. Protokol til påvisning og identifikation af R. solanacearum i vand 53 2. Metoder til påvisning og identifikation af R. solanacearum i vand 55 2.1. Forberedelse af prøver 55 2.2. Analyse 55 AFSNIT V: 1. Protokol til påvisning og identifikation af R. solanacearum i jord 56 2. Metoder til påvisning og identifikation af R. solanacearum i jord 58 2.1. Forberedelse af prøver 58 2.2. Analyse 58 AFSNIT VI: Optimerede protokoller til påvisning og identifikation af R. solanacearum 58 A. Diagnosticerings- og påvisningstest 58 1. Karstrømningstest 58 2. Påvisning af poly-β-hydroxybutyratkorn 58 3. Serologiske agglutinationstest 59 4. Selektiv isolering 60 4.1. Dyrkning på selektivt medie 60 4.2. Berigelsesprocedure 60 5. Immunofluorescens-test (IF-test) 61 6. Polymerase-kædereaktion (PCR-test) 64 6.1. Dna-oprensningsmetoder 65 a) Metode efter Pastrik (2000) 65 b) Andre metoder 65 6.2. PCR 66 6.3. Analyse af PCR-produktet 66 7. Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH-test) 67 8. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA-test) 69 a) Indirekte ELISA 69 b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA 70 9. Biotest 71 B. Identifikationstest 72 1. Biokemiske undersøgelser og enzymundersøgelser 72 2. IF-test 72 3. ELISA-test 73 4. PCR-test 73 5. FISH-test 73 6. Fedtsyreprofilering (FAP) 73 7. Metoder til bestemmelse af stammer 73 7.1. Biovarbestemmelse 73 7.2. »Fingeraftryk« af genomet 74 7.3. PCR-metoder 74 C. Konfirmativ test 74 Tillæg 1 Laboratorier, der har deltaget i optimering og validering af protokoller 76 Tillæg 2 Medier til isolering og dyrkning af R. solanacearum 77 Tillæg 3 A. Standardiseret kontrolmateriale, som fås i handelen 79 B. Forberedelse af kontroller 80 Tillæg 4 Buffere til testprocedurer 82 Tillæg 5 Bestemmelse af cellekoncentration i IF- og FISH-testene 85 Tillæg 6 Validerede PCR-protokoller og -reagenser 86 Tillæg 7 Validerede reagenser til FISH-test 91 Tillæg 8 Dyrkning af tomat- og ægplanter 93 Litteraturhenvisninger 94

GENERELLE PRINCIPPER

I tillæggene findes optimerede protokoller for de forskellige metoder, validerede reagenser og nærmere oplysninger om forberedelse af prøve- og kontrolmateriale. I tillæg 1 findes en liste over de laboratorier, der har deltaget i optimering og validering af protokoller.

Eftersom protokollerne omfatter påvisning af en skadegører, der er omfattet af reglerne om karantæne, og indebærer anvendelse af levedygtige kulturer af R. solanacearum som kontrolmateriale, er det nødvendigt at gennemføre procedurerne under karantæne på passende betingelser med hensigtsmæssige faciliteter til bortskaffelse af affald og i henhold til betingelserne i relevante tilladelser, der er udstedt af de officielle plantekarantænemyndigheder.

Testparametrene skal sikre konsekvent og reproducerbar påvisning af mængden af R. solanacearum på de tærskelværdier, der er fastsat for de valgte metoder.

Det er af afgørende betydning, at positive kontroller forberedes præcist.

Test i henhold til de fastsatte tærskelværdier forudsætter endvidere, at udstyr er korrekt indstillet, vedligeholdt og kalibreret, at reagenser håndteres og opbevares omhyggeligt, og at alle foranstaltninger træffes for at undgå, at prøver kontaminerer hinanden, f.eks. ved at positive kontroller holdes adskilt fra forberedte prøver. Der skal anvendes kvalitetskontrolstandarder for at undgå administrative eller andre fejl, navnlig med hensyn til mærkning og dokumentation.

Formodet forekomst, jf. artikel 4, stk. 2, i direktiv 98/57/EF, forudsætter et positivt resultat ved diagnose- eller screeningtest af en prøve som nærmere angivet i flowdiagrammer. Hvis en første screeningtest (IF-test, PCR/FISH eller selektiv isolering) giver et positivt resultat, skal der gennemføres endnu en screeningtest baseret på et andet biologisk princip.

Hvis den første screeningtest er positiv, er der mistanke om kontaminering med R. solanacearum, og der skal gennemføres endnu en screeningtest. Hvis den anden screeningtest er positiv, er mistanken bekræftet (formodet forekomst), og testen i henhold til protokollen skal fortsættes. Hvis den anden screeningtest er negativ, anses prøven for ikke at være kontamineret med R. solanacearum.

Bekræftet forekomst, jf. artikel 5, stk. 1, i direktiv 98/57/EF, forudsætter isolering og identifikation af en renkultur af R. solanacearum med bekræftelse af patogenitet.

AFSNIT I

ANVENDELSE AF PROTOKOLLEN

1. Protokol til påvisning og diagnosticering af brunbakteriose og bakterievisnesyge (Ralstonia solanacearum) i kartoffelknolde og -planter, tomatplanter eller andre værtsplanter med symptomer på brunbakteriose eller bakterievisnesyge

Testproceduren er beregnet til kartoffelknolde og -planter med symptomer, der er typiske for eller giver mistanke om brunbakteriose eller bakterievisnesyge. Den omfatter en hurtigscreeningtest, isolering af patogenet fra inficeret karvæv på et (selektivt) medie og i tilfælde af positivt resultat identifikation af kulturen som Ralstonia solanacearum.

2. Protokol til påvisning og identifikation af Ralstonia solanacearum i prøver af symptomfrie kartoffelknolde

Princip

Testproceduren er beregnet til påvisning af latente infektioner i kartoffelknolde. Et positivt resultat fra mindst to screeningtest (3) baseret på forskellige biologiske principper skal suppleres med isolering af patogenet med efterfølgende bekræftelse af en renkultur som R. solanacearum, hvis der er tale om isolering af typiske kolonier. Et positivt resultat fra kun én af screeningtestene er ikke tilstrækkeligt til, at prøven kan anses for at være under mistanke.

Screeningtest og isolationstest skal muliggøre påvisning af 103-104 celler/ml resuspenderet pellet, der er medtaget som positive kontroller i hver testserie.

3. Protokol til påvisning og identifikation af Ralstonia solanacearum i prøver af symptomfrie kartoffel- eller tomatplanter eller andre værtsplanter

AFSNIT II

DETALJEREDE METODER TIL PÅVISNING AF RALSTONIA SOLANACEARUM I KARTOFFELKNOLDE OG -PLANTER, TOMATPLANTER ELLER ANDRE VÆRTSPLANTER MED SYMPTOMER PÅ BRUNBAKTERIOSE ELLER BAKTERIEVISNESYGE

1. Symptomer (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Symptomer hos kartofler

Kartoffelplanten. De tidlige infektionssymptomer i marken er, når bladene visner i plantens top ved høje temperaturer om dagen for derefter at komme sig om natten. I de tidlige visningsstadier forbliver bladene grønne, men senere indtræder gulnen og brun nekrose. Epinasti forekommer også. Visnen af enkelte skud eller hele planter bliver hurtigt irreversibel og medfører, at planten falder sammen og dør. Ledningsvævet i stængler fra visne planter, der er skåret tværs over, er normalt brunt, og et mælkeagtigt bakteriesekret siver ud fra sårfladen eller kan trykkes ud, ved at man klemmer stænglen. Hvis en overskåret stængel anbringes vertikalt i vand, vil slimtråde strømme fra ledningsvævet.

Kartoffelknolden. Kartoffelknolde skal enten skæres tværs over nær ved navleenden (stolon) eller på langs over navleenden. Det tidlige infektionsstadium genkendes ved en glasagtig, gullig til lysebrun misfarvning af karringen, hvorfra der spontant kommer et blegt bakteriesekret efter et par minutter. Senere bliver misfarvningen af ledningsvævet mere tydeligt brun, og vævsdøden kan brede sig til parenkymvævet. På mere fremskredne stadier bryder infektionen ud fra navleenden og øjnene, hvorfra bakterieslim kan sive ud og få jordpartikler til at hænge ved. Der kan fremkomme rødbrune, let indsunkne læsioner på huden som følge af sammenfald af karvæv inden i knolden. I fremskredne stadier af sygdommen er sekundær udvikling af svampe- og bakteriefremkaldt forrådnelse et almindeligt fænomen.

1.2. Symptomer hos tomater

Tomatplanten. Det første synlige symptom er de yngste blades slatne udseende. Under gunstige forhold for patogenet (jordtemperaturer på ca. 25 °C; mættet fugtighed) følger epinasti og visnen af den ene side eller af hele planten inden for nogle få dage, hvorefter hele planten falder sammen. Under mindre gunstige forhold (jordtemperatur på under 21 °C) er visnen mindre udtalt, men der kan udvikle sig talrige birødder på stænglen. Der kan ses våde streger, der starter nederst på stænglen, hvilket er tegn på ledningsvævets død. Når stænglen skæres over på tværs, siver der hvidt eller gulligt bakteriesekret ud fra misfarvede brune ledningsvæv.

1.3. Symptomer hos andre værtsplanter

Planter af Solanum dulcamara og S. nigrum. Under naturlige betingelser udviser disse ukrudtsværtsplanter sjældent visnesymptomer, undtagen ved jordtemperaturer på over 25 °C eller ekstremt høje inokulumniveauer (som f.eks. for S. nigrum, der vokser op ad sygdomsramte kartoffel- eller tomatplanter). I de tilfælde, hvor visnen forekommer, er symptomerne som de for tomater beskrevne. Hos ikke-visnende planter af S. dulcamara, som vokser med stængel og rødder i vand, vil der i nogle tilfælde ved tværsnit kunne observeres lysebrun misfarvning af ledningsvæv i stænglens fod eller de dele af stænglen, som er under vand. Bakterier kan sive fra overskåret ledningsvæv eller danne slimtråde, hvis den overskårne stængel anbringes vertikalt i vand, selv når der ikke er visnesymptomer.

2. Hurtigscreeningtest

Hurtigscreeningtest kan lette en foreløbig diagnose, men er ikke af afgørende betydning. Brug en eller flere af følgende validerede test:

2.1. Karstrømningstest

(Jf. afsnit VI, del A, punkt 1)

2.2. Påvisning af poly-β-hydroxybutyrat (PHB)

Karakteristiske PHB-korn i R. solanacearum-cellerne gøres synlige ved at farve varmefikserede udstrygningspræparater af bakteriesekret fra inficeret væv på et objektglas med Nile Blue A eller Sudan Black (jf. afsnit VI, del A, punkt 2).

2.3. Serologiske agglutinationstest

(Jf. afsnit VI, del A, punkt 3)

2.4. Andre test

Andre anbefalelsesværdige hurtigscreeningstest er IF-testen (jf. afsnit VI, del A, punkt 5), FISH-testen (jf. afsnit VI, del A, punkt 7), ELISA-testen (jf. afsnit VI, del A, punkt 8) og PCR-testen (jf. afsnit VI, del A, punkt 6).

3. Isolering

a) Bakteriesekret eller partier af misfarvet væv fra karringen i kartoffelknolden eller fra karstrengene i stænglen fra kartoffel- eller tomatplanter eller andre visnende værtsplanter opslæmmes i en lille mængde sterilt, destilleret vand eller 50 mM fosfatbuffer (tillæg 4), og prøven henstår i 5-10 minutter.

b) Der laves en række tifoldsfortyndinger af suspensionen.

c) 50-100 µl af suspensionen overføres til et standardnæringsmedie (NA, YPGA eller SPA; jf. tillæg 2) og/eller til Kelmans selektive tetrazolium-medie (tillæg 2) og/eller et valideret selektivt medie (f.eks. SMSA; jf. tillæg 2). Spred eller udstryg med en formålstjenlig fortyndingsteknik. Hvis der er behov for det, tilberedes et sæt særskilte plader med en fortyndet cellesuspension af R. solanacearum, biovar 2, som positiv kontrol.

d) Pladerne inkuberes i 2-6 dage ved 28 °C. — På standardnæringsmediet udvikler virulente isolater af R. solanacearum perlemorsagtige, flødefarvede, flade, uregelmæssige og udflydende kolonier, der ofte har karakteristiske hvirvler i centrum. Avirulente former af R. solanacearum udvikler små, runde, udflydende og smørlignende kolonier, som er fuldstændig flødefarvede. — På Kelmans tetrazolium-medie og på SMSA-medier er hvirvlerne blodrøde. Avirulente former af Ralstonia solanacearum udvikler små, runde, udflydende og smørlignende kolonier, som er fuldstændig dybrøde.

4. Test til identifikation af R. solanacearum

Test til bekræftelse af identiteten af formodede isolater af R. solanacearum er vist i afsnit VI, del B.

AFSNIT III

1. Detaljerede metoder til påvisning og identifikation af Ralstonia solanacearum i prøver af symptomfrie kartoffelknolde

1.1. Forberedelse af prøver

NB:

— Standardprøvestørrelsen er 200 knolde pr. test. Mere intensiv prøveudtagning kræver flere test af prøver på denne størrelse. Et større antal knolde i prøven vil medføre, at resultater ikke eller kun vanskeligt kan fortolkes. Proceduren kan dog også anvendes med prøver på under 200 knolde, hvis der kun er færre knolde til rådighed.

— Validering af alle nedenfor beskrevne metoder er baseret på test af prøver bestående af 200 knolde.

— Det nedenfor beskrevne kartoffelekstrakt kan desuden anvendes til påvisning af Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus., der forårsager kartoffelringbakteriose.

Valgfri forbehandling forud for prøveforberedelse:

a) Prøverne inkuberes ved 25-30 °C i op til to uger før testen for at fremme formeringen af eventuelle populationer af R. solanacearum.

b) Knoldene vaskes. Der anvendes passende desinfektionsmidler (chlorforbindelser, når der skal udføres PCR-test, for at fjerne dna fra patogenet) og rengøringsmidler mellem hver prøve. Knoldene lufttørres. Denne vaskning er især nyttig (men ikke obligatorisk) for prøver med for meget jord, og hvis der skal gennemføres en PCR-test eller direkte isolering.

1.1.1. Med en ren, desinficeret skalpel eller grøntsagskniv fjernes huden fra de enkelte knoldes navleende (stolon), således at ledningsvævet bliver synligt. Et lille stykke ledningsvæv (kartoffelprop) fra navleenden udskæres omhyggeligt, idet mængden af andet plantevæv begrænses til et minimum (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NB: Eventuelle knolde (med råd) med mistænkelige symptomer på brunbakteriose anbringes og undersøges for sig.

Hvis der under fjernelsen af kartoffelproppen observeres mistænkelige symptomer på brunbakteriose, undersøges knolden visuelt, og den overskæres tæt ved navleenden. Overskårne knolde med mistænkelige symptomer bør opbevares i mindst 2 dage ved stuetemperatur, så der kan ske en forkorkning, og opbevares på køl (ved 4-10 °C) under korrekte karantænebetingelser. Alle knolde, herunder knolde med mistænkelige symptomer, bør opbevares i overensstemmelse med bilag III.

1.1.2. Navleenderne samles i ubrugte engangsbeholdere, som kan lukkes og/eller forsegles (hvis beholderne genbruges, bør de rengøres og desinficeres grundigt ved hjælp af chlorforbindelser). Kernerne fra navleenderne skal helst tages i arbejde med det samme. Hvis dette ikke er muligt, opbevares de i beholderen uden tilsætning af buffer i højst 72 timer på køl eller højst 24 timer ved stuetemperatur.

Navleenderne behandles på en af nedenstående måder:

a) Navleenderne dækkes med en tilstrækkelig mængde (ca. 40 ml) ekstraktionsbuffer (tillæg 4) og rystes horisontalt (50-100 rpm) i 4 timer ved under 24 °C eller 16-24 timer nedkølet.

b) Navleenderne homogeniseres med en tilstrækkelig mængde (ca. 40 ml) ekstraktionsbuffer (tillæg 4) enten i en blender (f.eks. Waring eller Ultra Thurax) eller ved knusning i en forseglet engangspose til udblødning (f.eks. Stomacher- eller Bioreba-pose af polyethylen med stor trækstyrke, 150 mm × 250 mm; steriliseret ved bestråling) ved hjælp af en gummihammer eller egnet formalingsudstyr (f.eks. Homex).

NB: Der er stor risiko for krydskontaminering af prøver, når prøverne homogeniseres ved hjælp af en blender. Der skal tages forholdsregler for at undgå aerosoldannelse eller udflydning under ekstraktionsprocessen. Det skal sikres, at der for hver enkelt prøve anvendes nysteriliserede blenderknive og -glas. Hvis PCR-testen skal anvendes, skal man undgå dna-rester på beholdere og formalingsudstyr. Når der anvendes PCR, anbefales det, at knusning foregår i engangsposer, og at der anvendes engangsrør.

1.1.3. Supernatanten dekanteres fra. Hvis den er for uklar, klares den enten ved langsom centrifugering (højst 180 g i 10 min. ved en temperatur på 4-10 °C) eller ved vakuumfiltrering (40-100 µm), idet filteret vaskes med ekstra (ca. 10 ml) ekstraktionsbuffer.

1.1.4. Bakteriefraktionen opkoncentreres ved centrifugering ved 7 000 g i 15 min. (eller 10 000 g i 10 min.) ved en temperatur på 4-10 °C, og supernatanten fjernes, idet det undgås at forstyrre pelleten.

1.1.5. Pelleten resuspenderes i 1,5 ml pelletbuffer (tillæg 4). Der anvendes 500 µl til test for R. solanacearum, 500 µl til Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus og 500 µl til referenceformål. Der tilsættes steril glycerol, til der opnås en slutkoncentration på 10-25 % (v/v), til 500 µl af referencedelprøven og til den resterende testdelprøve, der vortexes, og prøverne opbevares ved –16 til –24 °C (uger) eller ved –68 til –86 °C (måneder). Testdelprøverne opbevares ved 4-10 °C under testen.

Gentagen nedfrysning og optøning frarådes.

Hvis det er nødvendigt at transportere ekstraktet, skal levering foregå i en køleboks inden for 24-48 timer.

1.1.6. Det er nødvendigt, at alle positive R. solanacearum-kontroller og prøver behandles for sig for at undgå kontaminering. Dette gælder IF-glas og alle test.

1.2. Analyse

Testene og de optimerede protokoller er beskrevet og illustreret med flowdiagrammer i de relevante tillæg:

Selektiv isolering (jf. afsnit VI, del A, punkt 4)

IF-test (jf. afsnit VI, del A, punkt 5)

PCR-test (jf. afsnit VI, del A, punkt 6)

FISH-test (jf. afsnit VI, del A, punkt 7)

ELISA-test (jf. afsnit VI, del A, punkt 8)

Biotest (jf. afsnit VI, del A, punkt 9)

2. Detaljerede metoder til påvisning og identifikation af Ralstonia solanacearum i prøver af symptomfrie kartoffel- eller tomatplanter eller andre værtsplanter

2.1. Forberedelse af prøver

NB: Med henblik på påvisning af latente populationer af R. solanacearum anbefales det at teste sammensatte prøver. Proceduren kan anvendes til sammensatte prøver af op til 200 stængeldele. Undersøgelser af en given plantepopulation bør baseres på en statistisk repræsentativ prøve af plantepopulationen.

2.1.1. Stængelstykker med en længde på 1-2 cm samles i en lukket steril beholder i overensstemmelse med følgende procedurer:

Tomatstiklinger fra planteskole: Med en ren, desinficeret kniv fjernes et stykke på 1 cm forneden på hver stængel lige over jorden.

Tomatplanter dyrket på mark eller i drivhus: Med en ren, desinficeret kniv fjernes på hver plante det nederste sideskud; dette skæres af lige over det sted, hvor skuddet er forbundet med hovedstænglen. Der fjernes et stykke på 1 cm nederst på hvert sideskud.

Andre værtsplanter: Med en ren, desinficeret kniv eller beskæresaks fjernes et stykke på 1 cm forneden på hver stængel lige over jorden. Når der er tale om S. dulcamara eller andre værtsplanter, som vokser i vand, fjernes stykker på 1-2 cm fra stængler, der er under vand, eller udløbere med rødder under vandet.

Ved udtagning af prøver i et givet område anbefales det, at der testes en statistisk repræsentativ prøve på mindst 10 planter pr. prøvetagningssted af hver enkelt potentiel ukrudtsværtsplante. De mest pålidelige resultater i forbindelse med påvisning af patogener opnås i slutningen af foråret samt om sommeren og om efteråret, om end der kan påvises naturlig infektion hele året hos den flerårige Solanum dulcamara, som vokser i vandløb. Kendte værtsplanter er blandt andre gengroninger af kartofler, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium og andre arter af Solanaceae-familien. Andre værtsplanter er Pelargonium spp. og Portulaca oleracea. Europæiske ukrudtsplanter, som er potentielle værter for populationer af biovar 2/race 3-stammen af R. solanacearum i rødder og/eller rhizosfærer under visse miljøforhold, omfatter Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra og Urtica dioica.

NB: På dette stadium kan der foretages visuel undersøgelse for indre symptomer (misfarvning af væv eller bakteriesekret). Stængelstykker med symptomer anbringes for sig og underkastes særskilt test (jf. afsnit II).

2.1.2. Stængelstykkerne desinficeres kortvarigt med 70 % ethanol og tørres straks på filtrerpapir. Stængelstykkerne behandles derefter på en af nedenstående måder:

a) Stykkerne dækkes med en tilstrækkelig mængde (ca. 40 ml) ekstraktionsbuffer (tillæg 4) og rystes horisontalt (50-100 rpm) i 4 timer ved under 24 °C eller 16-24 timer nedkølet.

b) Stykkerne behandles straks ved knusning i en kraftig pose til macerering (f.eks. Stomacher- eller Bioreba-pose) med en passende mængde ekstraktionsbuffer (tillæg 4) ved hjælp af en gummihammer eller egnet formalingsudstyr (f.eks. Homex). Hvis dette ikke er muligt, opbevares stængelstykkerne i højst 72 timer på køl eller højst 24 timer ved stuetemperatur.

2.1.3. Supernatanten dekanteres fra, efter at prøven har fået lov at bundfælde i 15 min.

2.1.4. Yderligere klaring af ekstraktet eller opkoncentrering af bakteriefraktionen er normalt ikke nødvendig, men kan foretages ved filtrering og/eller centrifugering som beskrevet i afsnit III, punkt 1.1.3-1.1.5.

2.1.5. Det rene eller koncentrerede prøveekstrakt deles i 2 lige store dele. Den ene halvdel opbevares ved 4-10 °C under testen, mens den anden halvdel opbevares i 10-25 % (v/v) steril glycerol ved –16 til –24 °C (uger) eller ved –68 til –86 °C (måneder) med henblik på et evt. behov for yderligere testning.

2.2. Analyse

Testene og de optimerede protokoller er beskrevet og illustreret med flowdiagrammer i de relevante tillæg.

Selektiv isolering (jf. afsnit VI, del A, punkt 4)

IF-test (jf. afsnit VI, del A, punkt 5)

PCR-test (jf. afsnit VI, del A, punkt 6)

FISH-test (jf. afsnit VI, del A, punkt 7)

ELISA-test (jf. afsnit VI, del A, punkt 8)

Biotest (jf. afsnit VI, del A, punkt 9)

AFSNIT IV

1. Protokol til påvisning og identifikation af R. solanacearum i vand

2. Metoder til påvisning og identifikation af R. solanacearum i vand

Princip

Den validerede påvisningsprotokol, som er beskrevet under dette punkt, kan anvendes til påvisning af patogener i prøver af overfladevand samt til analyse af prøver af spildevand fra kartoffelforarbejdning eller kloakker. Det er dog vigtigt at holde sig for øje, at den forventede påvisningsfølsomhed varierer, alt efter hvilket medie der anvendes. Isolationstestens følsomhed påvirkes af populationer af konkurrerende blødrådsakterier, som der normalt er langt flere af i spildevand fra kartoffelforarbejdning og kloakvand end i overfladevand. Med nedenfor beskrevne protokol skulle det være muligt at påvise helt ned til 103 celler pr. liter i overfladevand, mens følsomheden af påvisning i spildevand fra kartoffelforarbejdning eller kloakker kan forventes at ville være betydeligt lavere. Af samme grund anbefales det, at spildevand analyseres efter en eventuel rensningsproces (såsom bundfældning eller filtrering), der medfører en reduktion af populationerne af blødrådsakterier. Begrænsningerne for så vidt angår protokollens følsomhed bør indgå i vurderingen af, hvor pålidelige eventuelle negative resultater skal anses for at være. Denne protokol har vist sig at være et nyttigt redskab i undersøgelser for forekomst af patogenet i overfladevand, men der bør tages hensyn til protokollens begrænsninger, når det anvendes til lignende undersøgelser af spildevand fra kartoffelforarbejdning eller kloakker.

2.1. Forberedelse af prøver

NB:

— De mest pålidelige resultater i forbindelse med påvisning af R. solanacearum i overfladevand opnås i slutningen af foråret samt om sommeren og om efteråret, når vandets temperatur kommer op på over 15 °C.

— Pålideligheden af protokollen øges med gentagne prøveudtagninger på forskellige tidspunkter i ovennævnte periode på udvalgte prøvetagningssteder, idet virkningerne af klimatiske ændringer derved begrænses.

— Der skal tages hensyn til betydningen af eventuel kraftig nedbør samt de pågældende vandløbs forløb for at undgå, at en omfattende udvandingseffekt tilslører patogenets eventuelle forekomst.

— Der udtages prøver af overfladevand nær værtsplanterne, hvor sådanne er til stede.

2.1.1. Der udtages vandprøver på udvalgte prøvetagningssteder ved at fylde sterile engangsglas eller -flasker, om muligt i en dybde af over 30 cm og højst 2 m fra bredden. Prøver af spildevand fra forarbejdning og kloakker udtages på det sted, hvor spildevandet udledes. Der anbefales en prøvestørrelse på 500 ml pr. prøvetagningssted. Foretrækkes mindre prøver, anbefales det at udtage prøver mindst tre gange pr. prøvetagningssted, idet hver prøve skal bestå af to kontraprøver på mindst 30 ml. Til intensive undersøgelser udvælges mindst 3 prøvetagningssteder for hver 3 km vandløb, idet det skal sikres, at der også udtages prøver af alle tilløb til vandløbet.

2.1.2. Prøverne transporteres køligt (4-10 °C) og mørkt og analyseres inden for 24 timer.

2.1.3. Om nødvendigt opkoncentreres bakteriefraktionen ved hjælp af en af følgende metoder:

a) Delprøver på 30-50 ml centrifugeres ved 10 000 g i 10 min. (eller 7 000 g i 15 min.), helst ved en temperatur på 4-10 °C, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 1 ml pelletbuffer (tillæg 4).

b) Der foretages membranfiltrering (mindste porestørrelse: 0,45 µm), hvorefter filteret skylles i 5-10 ml pelletbuffer, og skyllevandet retineres. Denne metode egner sig til større mængder vand med et lavt indhold af blødrådsakterier.

Opkoncentrering kan normalt ikke anbefales til prøver af spildevand fra kartoffelforarbejdning eller kloakker, idet øgede populationer af konkurrerende blødrådsakterier vil hæmme påvisningen af Ralstonia solanacearum.

2.2. Analyse

Testene er beskrevet og illustreret med flowdiagrammer i de relevante tillæg.

AFSNIT V

1. Protokol til påvisning og identifikation af R. solanacearum i jord

2. Metoder til påvisning og identifikation af R. Solanacearum i jord

Principper

Den validerede påvisningsprotokol, som er beskrevet under dette punkt, kan anvendes til påvisning af patogener i jordprøver, men også til analyse af prøver af fast affald fra kartoffelforarbejdning eller kloakslam. Det skal dog bemærkes, at disse metoder ikke er tilstrækkeligt følsomme til at garantere påvisning af små og/eller spredte populationer af Ralstonia solanacearum, der kan forekomme i naturligt inficerede prøver af disse substrater.

Begrænsningerne for så vidt angår protokollens følsomhed bør indgå i vurderingen af, hvor pålidelige eventuelle negative resultater skal anses for at være, og bør ligeledes tages i betragtning, når protokollen anvendes i undersøgelser, der har til formål at påvise patogenets eventuelle forekomst i jord eller slam. Den mest pålidelige metode til undersøgelse for forekomst af patogenet i markjord er at plante en modtagelig vært og kontrollere, om denne inficeres, men selv med denne metode vil lave infektionsniveauer ikke blive opdaget.

2.1. Forberedelse af prøver

2.1.1. Prøver af markjord bør udtages efter standardprincipperne for nematodeprøveudtagning. Der indsamles 0,5-1 kg jord pr. prøve på 60 steder pr. 0,3 ha i en dybde af 10-20 cm (eller i et kvadratnet på 7 × 7 m). Hvis der er mistanke om, at patogenet er til stede, øges antallet af indsamlingssteder til 120 pr. 0,3 ha. Prøverne opbevares ved 12-15 °C, indtil de skal analyseres. Til prøver af affald fra kartoffelforarbejdning og kloakslam indsamles i alt 1 kg materiale fra forskellige steder, som repræsenterer den samlede mængde slam, der skal analyseres. Hver prøve blandes grundigt inden testen.

2.1.2. Delprøver på 10-25 g jord eller slam dispergeres med orbitalryster (250 rpm) i 60-150 ml ekstraktionsbuffer (tillæg 4) i op til 2 timer. Om nødvendigt kan der tilsættes 0,02 % sterilt Tween 20 og 10-20 g sterilt grus for at fremme dispersionen.

2.1.3. Suspensionen holdes på 4 °C under testen.

2.2. Analyse

Testene er beskrevet og illustreret med flowdiagrammer i de relevante tillæg.

AFSNIT VI

OPTIMEREDE PROTOKOLLER TIL PÅVISNING OG IDENTIFIKATION AF R. SOLANACEARUM

A. DIAGNOSTICERINGS- OG PÅVISNINGSTEST

1. Karstrømningstest

Tilstedeværelsen af R. solanacearum i stængler af visnende kartoffel- eller tomatplanter eller andre værtsplanter kan påvises ved følgende enkle test: Stænglen overskæres lige over jorden. Den overskårne stængel anbringes i et glas med rent vand. Det observeres, om de karakteristiske tråde af bakterieslim spontant strømmer ud af de overskårne karstrenge efter et par minutter.

2. Påvisning af poly-β-hydroxybutyratkorn

1. Der tilberedes et udstrygningspræparat af bakteriesekret fra inficeret væv eller af en 48-timers kultur på YPGA- eller SPA-medie (tillæg 2) på et objektglas.

2. Som kontrol tilberedes positive udstrygningspræparater af en biovar 2-stamme af R. solanacearum og om nødvendigt et negativt udstrygningspræparat af en kendt PHB-negativ stamme.

3. Prøven lufttørres, og undersiden af hvert objektglas føres hurtigt hen over en flamme, indtil præparaterne er fikseret.

4. Prøven farves med enten Nile Blue eller Sudan Black og undersøges i mikroskop som beskrevet nedenfor.

Nile Blue-test

a) Hvert objektglas overhældes med en vandig 1 % Nile Blue A-opløsning og inkuberes i 10 min. ved 55 °C.

b) Farvningsopløsningen afdrænes. Prøven vaskes kort i langsomt rindende ledningsvand. Overskydende vand fjernes med filtrerpapir.

c) Udstrygningspræparatet overhældes med en vandig 8 % eddikesyreopløsning og inkuberes i 1 min. ved stuetemperatur.

d) Prøven vaskes kort i langsomt rindende ledningsvand. Overskydende vand fjernes med filtrerpapir.

e) Prøven genfugtes med en dråbe vand, og der sættes dækglas på.

f) Det farvede udstrygningspræparat undersøges under et epifluorescensmikroskop ved 450 nm i immersionsolie ved 600-1 000 ganges forstørrelse (der anvendes et olie- eller vandimmersionsobjektiv).

g) Der observeres for klart orange fluorescens fra PHB-korn. Desuden foretages observation i gennemfaldende normalt lys for at sikre, at kornene er intracellulære, og at cellemorfologien er typisk for R. solanacearum.

Sudan Black-test

a) Hvert objektglas overhældes med 0,3 % Sudan Black B-opløsning i 70 % ethanol og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.

b) Farvningsopløsningen afdrænes og vaskes hurtigt i ledningsvand, idet overskydende vand fjernes med filtrerpapir.

c) Glassene neddyppes kort i xylen og tørres på filtrerpapir. NB: Xylen er et sundhedsskadeligt produkt. Træf alle nødvendige sikkerhedsforanstaltninger og arbejd i stinkskab!

d) Objektglassene overhældes med 0,5 % (w/v) vandig safranin og henstår 10 sek. ved stuetemperatur. NB: Safranin er et sundhedsskadeligt produkt. Træf alle nødvendige sikkerhedsforanstaltninger og arbejd i stinkskab!

e) Prøven vaskes i langsomt rindende vand og tørres på filtrerpapir, og der sættes dækglas på.

f) De farvede udstrygningspræparater undersøges under et lysmikroskop med gennemfaldende lys i immersionsolie ved 1 000 ganges forstørrelse (der anvendes et olieimmersionsobjektiv).

g) Der observeres for blåsort farvning af PHB-korn i celler af R. solanacearum med lyserøde cellevægge.

3. Serologiske agglutinationstest

Agglutination af R. solanacearum-celler i bakteriesekret eller ekstrakter fra væv, der udviser symptomer, observeres bedst, hvis der anvendes validerede antistoffer (jf. tillæg 3) mærket med de rigtige farvede markører, såsom røde Staphylococcus aureus-celler eller farvede latex-partikler. Hvis der anvendes udstyr, som fås i handelen (jf. tillæg 3), følges fabrikantens anvisninger. Ellers anvendes følgende procedure:

a) Dråber af en suspension af mærkede antistoffer og bakteriesekret (ca. 5 µl af hver) blandes i vinduerne på objektglas med flere brønde.

b) Positive og negative kontroller tilberedes med suspensioner af biovar 2-stamme af R. solanacearum og en heterolog stamme.

c) Der observeres for agglutination i positive prøver efter forsigtig blanding heraf i 15 sekunder.

4. Selektiv isolering

4.1. Dyrkning på selektivt medie

NB: Inden denne metode anvendes første gang, gennemføres indledende test for at sikre reproducerbar påvisning af 103-104 kolonidannende celler af R. solanacearum pr. ml tilsat til prøveekstrakter, som tidligere er testet negative.

Der anvendes korrekt valideret selektivt medie såsom SMSA (som ændret ved Elphinstone et al., 1996; jf. tillæg 2).

Der kræves omhu for at differentiere R. solanacearum fra andre bakterier, som er i stand til at danne kolonier på mediet. Kolonier af R. solanacearum kan desuden udvise atypisk morfologi, hvis pladerne er overfyldte, eller hvis også antagonistiske bakterier er til stede. Hvis der er formodning om konkurrence eller antagonisme, bør prøven analyseres igen med en anden test.

Der kan forventes den højeste påvisningsfølsomhed med denne metode, når der anvendes frisklavede prøveekstrakter. Metoden kan dog også anvendes til ekstrakter, der er blevet opbevaret i glycerol ved –68 til –86 °C.

Til anvendelse som positive kontroller forberedes tifoldsfortyndinger af en suspension af 106 cfu pr. ml af en virulent biovar 2-stamme af R. solanacearum (f.eks. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). For at være sikker på at undgå kontaminering forberedes positive kontroller helt adskilt fra de prøver, der skal testes.

For hver frisklavet batch af selektivt medie bør dets egnethed med hensyn til dyrkning af patogenet testes, inden det anvendes til at teste rutineprøver.

Test af kontrolmateriale foretages som for prøvernes vedkommende.

4.1.1. Der anvendes en passende fortyndings- og udstrygningsmetode for at sikre, at eventuelle kolonidannende baggrundspopulationer af blødrådsakterier fortyndes væk. Spred 50-100 µl pr. plade med prøveekstrakt og hver fortynding.

4.1.2. Pladerne inkuberes ved 28 °C. Pladerne aflæses efter 48 timer og derefter dagligt i op til 6 dage. Kolonier af R. solanacearum på SMSA-medie er typisk mælkehvide, flade, uregelmæssige og udflydende og udvikler efter 3 dages inkubation lyserøde til blodrøde centre med indre striber eller hvirvler (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NB: Det kan ske, at der dannes kolonier af R. solanacearum på dette medie. Disse kan være små, runde, dybrøde og ikke eller kun delvist udflydende og er derfor vanskelige at skelne fra kolonidannende blødrådsakterier.

4.1.3. Formodede kolonier af R. solanacearum oprenses efter udstrygning eller fortynding på et generelt næringsmedie for at opnå isolerede kolonier (jf. tillæg 2).

4.1.4. Kulturer opbevares i sterilt vand (pH 6-8, uden chlorin) ved stuetemperatur og mørkt, når der er tale om kortere opbevaringstid, og i en passende kuldebeskyttende beholder ved –68 til –86 °C eller lyofiliseret ved længere opbevaringstid.

4.1.5. Formodede kulturer identificeres (jf. afsnit VI, del B), og der gennemføres en patogenitetstest (jf. afsnit VI, del C).

Fortolkning af resultaterne af selektiv udstrygning

Selektiv udstrygning er negativ, hvis der ikke er observeret nogen kolonier efter 6 døgn, eller hvis der ikke er fundet nogen formodede kolonier af R. solanacearum, forudsat at der ikke foreligger mistanke om hæmning som følge af konkurrence eller antagonisme fra andre bakterier, og at karakteristiske kolonier af R. solanacearum er fundet i den positive kontrol.

Selektiv udstrygning er positiv, hvis der isoleres formodede kolonier af R. solanacearum.

4.2. Berigelsesprocedure

Der anvendes et valideret berigelsesmedie såsom modificeret Wilbrink-bouillon (jf. tillæg 2).

Denne procedure kan anvendes til selektiv forøgelse af populationer af R. solanacearum i prøveekstrakter og til at øge påvisningsfølsomheden. Proceduren er desuden et effektivt middel til at fortynde inhibitorer for PCR-reaktionen (1:100). Det skal dog bemærkes, at berigelsen af R. solanacearum kan mislykkes som følge af konkurrence eller antagonisme fra saprofytiske organismer, som ofte beriges i den samme proces. Af samme grund kan isolering af R. solanacearum fra berigede bouillonkulturer være en vanskelig proces. Dertil kommer, at det på grund af sandsynligheden for en forøgelse af populationer af serologisk beslægtede blødrådsakterier anbefales at anvende specifikke monoklonale antistoffer frem for polyklonale antistoffer, når ELISA-testen benyttes.

4.2.1. Til berigelses-PCR overføres 100 µl prøveekstrakt til 10 ml berigelsesbouillon (tillæg 2), som forinden er blevet inddelt i delprøver i dna-frie glas eller beholdere. Til berigelses-ELISA kan der anvendes større mængder prøveekstrakt i forhold til bouillonen (f.eks. 100 µl i 1,0 ml berigelsesbouillon).

4.2.2. Der inkuberes i 72 timer ved 27-30 °C i kultur under rystning eller i stillestående kultur med glassets prop sat løst på af hensyn til beluftning.

4.2.3. Blandes grundigt inden brug i ELISA- eller PCR-test.

4.2.4. Beriget bouillon behandles som beskrevet for prøvernes vedkommende i ovenfor omhandlede test.

NB: Hvis det forventes, at berigelsen af R. solanacearum vil blive hæmmet på grund af store populationer af bestemte konkurrerende blødrådsakterier, vil berigelse af prøveekstrakterne inden centrifugering eller anden form for opkoncentrering kunne give bedre resultater.

5. IF-test

Princip

Det anbefales, at IF-testen anvendes som den primære screeningtest på grund af dens dokumenterede robusthed i forbindelse med de fastsatte tærskelværdier.

Når IF-testen anvendes som den primære screeningtest, og IF-resultatet er positivt, skal isoleringen, PCR-testen eller FISH-testen gennemføres som anden screeningtest. Når IF-testen anvendes som anden screeningtest, og IF-resultatet er positivt, skal der gennemføres yderligere test i henhold til flowdiagrammet for at fuldende analysen.

NB: Der skal anvendes en valideret kilde til antistoffer mod R. solanacearum (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Det anbefales, at titeren bestemmes for enhver ny antistofbatch. Titeren defineres som den største fortynding, ved hvilken der opstår optimal reaktion ved test af en suspension af 105-106 celler/ml fra den homologe stamme af R. solanacearum, idet der benyttes et passende fluoresceinisothiocyanatkonjugat (FITC-konjugat) i overensstemmelse med producentens anbefalinger. De validerede polyklonale antisera havde alle en IF-titer på mindst 1:2 000. Under testen bør antistofferne anvendes som en arbejdsfortynding (WD), der er den samme som eller tæt på titeren.

Testen bør gennemføres på frisklavede prøveekstrakter. Om nødvendigt kan testen udmærket gennemføres på ekstrakter, der er opbevaret ved –68 til –86 °C i glycerol. Glycerol kan fjernes fra prøven ved tilsætning af 1 ml pelletbuffer (tillæg 4), ny centrifugering i 15 min. ved 7 000 g og resuspension i en tilsvarende mængde pelletbuffer. Dette er ofte unødvendigt, særlig hvis prøverne er fikseret til objektglassene ved flambering.

Der forberedes særskilte, positive kontrolglas fra den homologe stamme eller en anden referencestamme af R. solanacearum suspenderet i kartoffelekstrakt, som angivet i tillæg 3, del B, og evt. i buffer.

Naturligt inficeret væv (opbevaret evt. ved frysetørring eller ved frysning ved –16 til –24 °C) bør anvendes, når det er muligt, som en lignende kontrol på samme glas.

Som negative kontroller kan anvendes delprøver af prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt for R. solanacearum.

Standardiseret positivt og negativt kontrolmateriale, som kan anvendes til denne test, er angivet i tillæg 3.

Der benyttes objektglas med flere brønde og helst med ti vinduer med en diameter på mindst 6 mm.

Test af kontrolmateriale foretages som for prøvernes vedkommende.

5.1. Testglassene tilberedes på en af nedenstående måder:

i) For pellets med forholdsvis lidt bundfældet stivelse: En afmålt standardmængde (15 µl er passende for 6 mm vinduesdiameter — mængden øges forholdsmæssigt for større vinduer) af en fortynding på 1:100 af den resuspenderede kartoffelpellet afpipetteres på det første vindue. Derefter afpipetteres en lignende mængde ufortyndet pellet (1:1) på de øvrige vinduer i rækken. Den anden række kan anvendes som duplikat eller til en anden prøve som beskrevet i figur 1.

ii) For andre pellets: Der laves tifoldsfortyndinger (1:10, 1:100) af den resuspenderede pellet i pelletbuffer. En afmålt standardmængde (15 µl er passende for 6 mm vinduesdiameter — mængden øges forholdsmæssigt for større vinduer) af den resuspenderede pellet og hver fortynding afpipetteres på en række vinduer. Den anden række kan anvendes som duplikat eller til en anden prøve som beskrevet i figur 2.

5.2. Dråberne tørres ved stuetemperatur eller ved opvarmning til 40-45 °C. Bakteriecellerne fikseres på glasset ved opvarmning (15 min. ved 60 °C), ved flambering, med 95 % ethanol eller ifølge særlige anvisninger fra antistofleverandørerne.

Glas med fikseret materiale kan om nødvendigt derefter opbevares frosset i en udtørret beholder så kort tid som nødvendigt (højst 3 måneder) inden yderligere test.

5.3. IF-procedure

i) Forberedelse af testglas som beskrevet ovenfor i punkt 5.1, nr. i): Der laves en række tofoldsfortyndinger. Den første brønd bør have 1/2 af titeren (T/2), de øvrige 1/4 af titeren (T/4), 1/2 af titeren (T/2), titeren (T) og det dobbelte af titeren (2T).

ii) Forberedelse af testglas som beskrevet ovenfor i punkt 5.1, nr. ii): Der laves en arbejdsfortynding (WD) af antistoffet i IF-buffer. Arbejdsfortyndingen påvirker specificiteten.

Figur 1. Forberedelse af testglas som beskrevet i punkt 5.1, nr. i), og punkt 5.3, nr. i)

Fortyndinger af resuspenderet pellet 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Fortynding af resuspenderet pellet (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Tofoldsfortyndinger af antiserum/antistof Prøve 1 1 2 3 4 5 Duplikat af prøve 1 eller prøve 2 6 7 8 9 10





Figur 2. Forberedelse af testglas som beskrevet i punkt 5.1, nr. ii), og punkt 5.3, nr. ii)

Arbejdsfortynding af antiserum/antistof 1/1 1/10 1/100 tom tom  Tifoldsfortynding af resuspenderet pellet Prøve 1 1 2 3 4 5 Duplikat af prøve 1 eller prøve 2 6 7 8 9 10

5.3.1. Objektglassene placeres på fugtigt filtrerpapir. Testvinduerne dækkes hver især helt med antistoffortyndingen(-erne). Den mængde antistof, der anbringes på de enkelte vinduer, skal mindst svare til den tilsatte mængde ekstrakt.

Følgende procedure følges, hvis der ikke foreligger særlige anvisninger fra antistofleverandørerne.

5.3.2. Glassene inkuberes tildækket på fugtigt papir i 30 min. ved stuetemperatur (18-25 °C).

5.3.3. Dråberne rystes af de enkelte glas, og glassene skylles forsigtigt med IF-buffer. De vaskes ved nedsænkning i 5 min. i IF-buffer-Tween (tillæg 4) og efterfølgende i IF-buffer. Aerosoldannelse eller overførsel af dråber, der kan medføre krydskontaminering, skal undgås. Overskydende fugt fjernes omhyggeligt ved at duppe dem forsigtigt.

5.3.4. Objektglassene placeres på fugtigt filtrerpapir. Testvinduerne dækkes med den fortynding af FITC-konjugatet, der er brugt til at bestemme titeren. Den mængde konjugat, der anbringes på vinduerne, skal svare til den tilsatte mængde antistof.

5.3.5. Glassene inkuberes tildækket på fugtigt papir i 30 min. ved stuetemperatur (18-25 °C).

5.3.6. Konjugatdråberne rystes af glasset. Glassene skylles og vaskes som ovenfor (5.3.3).

Overskydende fugt fjernes forsigtigt.

5.3.7. 5-10 µl af 0,1 M fosfatbufferet glycerol (tillæg 4) eller et tilsvarende indlejringsmiddel, der modvirker falmning, og som kan fås i handelen, afpipetteres på hvert vindue, og der sættes dækglas på.

5.4. Aflæsning af IF-testen

5.4.1 Testglassene undersøges i et epifluorescensmikroskop og et filter, som er egnet til arbejdet med FITC, i immersionsolie eller -vand ved 500-1 000 ganges forstørrelse. Vinduerne gennemsøges langs to diametre vinkelret på hinanden og langs omkredsen. Ved prøver, hvor der ikke konstateres nogen eller kun få celler, undersøges mindst 40 mikroskopfelter.

Glasset med den positive kontrol undersøges først. Cellerne skal være stærkt fluorescerende og fuldstændigt farvede ved den antistoftiter eller arbejdsfortynding, der er bestemt. IF-testen (afsnit VI, del A, punkt 5) gentages, hvis farvningen er unormal.

5.4.2. Dernæst observeres, om der er stærkt fluorescerende celler med den for R. solanacearum karakteristiske morfologi i testvinduerne på glassene (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescensens intensitet skal svare til den positive kontrolstammes ved samme antistoffortynding. Celler med ufuldstændig farvning eller med svag fluorescens ses der bort fra.

Hvis der er mistanke om kontaminering, gentages testen. Dette kan være tilfældet, hvis alle objektglas i en batch har positive celler som følge af kontaminering af buffer, eller hvis der konstateres positive celler (uden for vinduerne på objektglasset) på glassets belægning.

5.4.3. Der er flere problemer forbundet med immunofluorescens-testens specificitet. Baggrundsflora af fluorescerende celler med atypisk morfologi og krydsreagerende blødrådsbakterier, som i størrelse og morfologi ligner R. solanacearum, vil sandsynligvis forekomme i pellets af navleende og stængelstykker fra kartofler.

5.4.4. Kun fluorescerende celler med typisk størrelse og morfologi ved den antistoftiter eller arbejdsfortynding, der er beskrevet i punkt 5.3, tages i betragtning.

5.4.5. Fortolkning af IF-resultatet

i) Hvis der findes stærkt fluorescerende celler med karakteristisk morfologi, anslås det gennemsnitlige antal typiske celler pr. mikroskopfelt, og antal typiske celler pr. ml resuspenderet pellet beregnes (tillæg 5). IF-resultatet er positivt for prøver med mindst 5 × 103 typiske celler pr. ml resuspenderet pellet. Prøven betragtes som potentielt kontamineret, og der skal gennemføres supplerende test.

ii) IF-resultatet er negativt for prøver med under 5 × 103 celler pr. ml resuspenderet pellet, og prøven anses for negativ. Det er ikke nødvendigt med yderligere test.

6. PCR-test

Principper

Når PCR-testen anvendes som den primære screeningtest, og resultatet er positivt, skal isolering eller IF-testen gennemføres som anden obligatoriske screeningtest. Når PCR anvendes som anden screeningtest, og resultatet er positivt, skal der gennemføres yderligere test i henhold til flowdiagrammet for at fuldende diagnosen.

Fuld udnyttelse af denne metode som primær screeningtest kan kun anbefales, når der er opnået særlig ekspertise.

NB: Indledende test med denne metode skulle muliggøre reproducerbar påvisning af 103-104 celler af R. solanacearum pr. ml tilsat til prøveekstrakter, som tidligere er testet negative. Der kan evt. være behov for optimeringsforsøg for at opnå maksimal følsomhed og specificitet i alle laboratorier.

Der skal anvendes validerede PCR-reagenser og protokoller (jf. tillæg 6). Der skal helst vælges en metode med en intern kontrol.

Der skal træffes relevante forholdsregler for at undgå, at prøven kontamineres med target-dna. PCR-testen bør gennemføres af erfarne teknikere på særlige molekylærbiologiske laboratorier for at minimere muligheden for kontaminering med target-dna.

Negative kontroller (ved dna-ekstraktion og i PCR-testprocedurer) bør altid håndteres som den sidste prøve i proceduren, så det tydeligt ses, hvis der er sket overførsel af dna fra andre prøver.

PCR-testen bør indeholde følgende negative kontroller:

— prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt for R. solanacearum

— bufferkontroller, der anvendes til ekstrahering af bakterien og dna'et fra prøven

— PCR-mastermix.

Den bør indeholde følgende positive kontroller:

— Delprøver af resuspenderede pellets, til hvilke der er tilsat R. solanacearum (forberedelse: se tillæg 3, del B).

— En suspension i vand af 106 celler pr. ml af R. solanacearum fra et virulent isolat (f.eks. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; jf. tillæg 3, del B).

— Om muligt anvendes desuden dna ekstraheret fra positive kontrolprøver ved PCR-testen.

For at undgå potentiel kontaminering forberedes positive kontroller under betingelser, der er adskilt fra de prøver, der skal testes.

Prøveekstrakter bør i videst muligt omfang være fri for jord. Det kan derfor i visse tilfælde anbefales at forberede ekstrakter fra vaskede kartofler, hvis der skal anvendes PCR-protokoller.

Standardiseret positivt og negativt kontrolmateriale, som kan anvendes til denne test, er angivet i tillæg 3.

6.1. Dna-oprensningsmetoder

Der anvendes positive og negative kontrolprøver som beskrevet ovenfor (jf. tillæg 3).

Test af kontrolmateriale foretages som for prøvernes vedkommende.

Den findes en lang række metoder til oprensning af target-dna fra komplekse prøvesubstrater, hvorved PCR-inhibitorer og andre enzymatiske reaktioner fjernes og target-dna'et opkoncentreres i prøveekstraktet. Følgende metode er blevet optimeret med henblik på anvendelse med de validerede PCR-metoder, der er beskrevet i tillæg 6.

a) Metode efter Pastrik (2000)

1) Der afpipetteres 220 µl lysisbuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)) i et 1,5 ml eppendorfrør.

2) Der tilsættes 100 µl prøveekstrakt, og det placeres i en varmeblok eller et vandbad ved 95 °C i 10 min.

3) Røret anbringes i isbad i 5 min.

4) Der tilsættes 80 µl lysozymstamopløsning (50 mg lysozym pr. ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0), og der inkuberes ved 37 °C i 30 min.

5) Der tilsættes 220 µl Easy DNA®-opløsning A (Invitrogen), der vortexes grundigt, og der inkuberes ved 65 °C i 30 min.

6) Der tilsættes 100 µl Easy DNA®-opløsning B (Invitrogen), og der vortexes kraftigt, indtil præcipitatet løber frit i røret, og prøven er jævnt tyktflydende.

7) Der tilsættes 500 µl chloroform, og der vortexes, indtil prøven bliver mindre tyktflydende og blandingen er homogen.

8) Der centrifugeres ved 15 000 g i 20 min. ved 4 °C for at adskille faser og danne interfasen.

9) Den øverste fase overføres til et rent eppendorfrør.

10) Der tilsættes 1 ml 100 % ethanol (–20 °C), der vortexes kort, og der inkuberes i isbad i 10 min.

11) Der centrifugeres ved 15 000 g i 20 min. ved 4 °C, og ethanolen fjernes fra pellet.

12) Der tilsættes 500 µl 80 % ethanol (–20 °C), og der blandes ved at vende røret på hovedet.

13) Der centrifugeres ved 15 000 g i 10 min. ved 4 °C, pellet beholdes, og ethanolen fjernes.

14) Pellet lufttørres eller tørres i en DNA Speed Vac.

15) Pellet resuspenderes i 100 µl sterilt ultrarent vand og henstår ved stuetemperatur i mindst 20 min.

16) Opbevares ved –20 °C, indtil den skal anvendes til PCR.

17) Evt. hvidt præcipitat spinnes ned ved centrifugering, og 5 µl af den supernatant, der indeholder dna, anvendes til PCR.

b) Andre metoder

Der kan anvendes andre dna-ekstraktionsmetoder, f.eks. Qiagen DNeasy Plant Kit, forudsat at det er dokumenteret, at de er lige så effektive til at oprense dna fra kontrolprøver med 103-104 patogene celler pr. ml.

6.2. PCR

6.2.1. Test- og kontrolskabeloner til PCR forberedes i overensstemmelse med de validerede protokoller (afsnit VI, del A, punkt 6). Der forberedes en tifoldsfortynding af prøve-dna-ekstrakt (1:10 i ultrarent vand).

6.2.2. Det relevante PCR-mastermix forberedes i et kontamineringsfrit miljø i overensstemmelse med de publicerede protokoller (tillæg 6). Hvor det er muligt, anbefales det at anvende en multiplex-PCR-protokol, som også omfatter en intern PCR-kontrol.

6.2.3. Der tilsættes 2-5 µl dna-ekstrakt pr. 25 µl PCR-reaktion i sterile PCR-rør i overensstemmelse med PCR-protokollerne (jf. tillæg 6).

6.2.4. Der medtages en negativ kontrolprøve, der udelukkende indeholder PCR-mastermix, og der tilsættes ultrarent vand fra samme kilde som den, der anvendes til PCR-blandingen i prøvens sted.

6.2.5. Rørene anbringes i det samme PCR-apparat som det, der blev anvendt til den indledende test, og det korrekt optimerede PCR-protokol gennemføres (tillæg 6).

6.3. Analyse af PCR-produktet

6.3.1. PCR-amplikoner kan adskilles ved agarosegelelektroforese. Ved testen anvendes mindst 12 µl amplificeret dna-mastermix fra hver prøve blandet med 3 µl loadingbuffer (tillæg 6) i 2,0 % (w/v) agarosegel i tris-acetat-EDTA-buffer (TAE-buffer) (tillæg 6) ved 5-8 V pr. cm. Der anvendes en relevant dna-markør, f.eks. 100 bp ladder.

6.3.2. Dna-båndene visualiseres ved farvning i ethidiumbromid (0,5 mg pr. l) i 30-60 min., idet der træffes de fornødne forholdsregler ved håndteringen af dette mutagen.

6.3.3. Den farvede gel undersøges ved UV-gennemlysning (λ = 302 nm) for amplificerede PCR-produkter af den forventede størrelse (tillæg 6); resultatet skal dokumenteres.

6.3.4. Ved alle nye fund/tilfælde verificeres PCR-amplikonens ægthed ved restriktionsenzymanalyse af en prøve af det resterende amplificerede dna ved at inkubere ved optimal temperatur i et optimalt tidsrum med passende enzym og buffer (se tillæg 6). De nedbrudte fragmenter adskilles som før ved agarosegelelektroforese, og det karakteristiske restriktionsfragment-mønster undersøges ved UV-gennemlysning efter farvning med ethidiumbromid og sammenlignes med den nedbrudte og den ikke-nedbrudte positive kontrol.

Fortolkning af PCR-testresultatet

PCR-testen er negativ, hvis det R. solanacearum-specifikke PCR-amplikon af den forventede størrelse ikke påvises i den pågældende prøve, men påvises i alle positive kontrolprøver (ved multiplex-PCR med plantespecifikke interne kontrolprimere skal endnu et PCR-produkt af den forventede størrelse amplificeres med den pågældende prøve).

PCR-testen er positiv, hvis det R. solanacearum-specifikke PCR-amplikon af den forventede størrelse og med (evt.) det forventede restriktionsmønster påvises, forudsat at det ikke er blevet amplificeret fra nogen af de negative kontrolprøver. Pålidelig bekræftelse af et positivt resultat kan endvidere fås ved at gentage testen med et nyt sæt PCR-primere (tillæg 6).

NB: Der er mistanke om PCR-inhibition, hvis det forventede amplikon fremkommer fra den positive kontrolprøve, der indeholder R. solanacearum i vand, men der fås negative resultater fra positive kontrolprøver med R. solanacearum i kartoffelekstrakt. I multiplex-PCR-protokoller med interne PCR-kontroller er det tegn på inhibition af reaktionen, hvis ingen af de to amplikoner fremkommer.

Der er mistanke om kontaminering, hvis det forventede amplikon fremkommer fra en eller flere af de negative kontroller.

7. FISH-test

Princip

Når FISH-testen anvendes som den første screeningtest, og resultatet er positivt, skal isolering eller IF-testen gennemføres som anden obligatoriske screeningtest. Når FISH-testen anvendes som anden screeningtest, og resultatet er positivt, skal der gennemføres yderligere test i henhold til flowdiagrammet for at komplettere diagnosen.

NB: Der skal anvendes validerede R. solanacearum-specifikke oligo-prober (jf. tillæg 7). Indledende test med denne metode skulle muliggøre reproducerbar påvisning af mindst 103-104 celler af R. solanacearum pr. ml tilsat til prøveekstrakter, som tidligere er testet negative.

Følgende procedure bør gennemføres på frisklavet prøveekstrakt, men kan også udmærket gennemføres på prøveekstrakt, der er opbevaret i glycerol ved –16 til –24 °C eller –68 til –86 °C.

Som negative kontroller anvendes delprøver af prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt for R. solanacearum.

Til anvendelse som positive kontroller forberedes suspensioner med 105-106 celler pr. ml af R. solanacearum, biovar 2 (f.eks. stamme NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; jf. tillæg 3), i 0,01 M fosfatbuffer fra en 3-5 dage gammel dyrkning. Der forberedes særskilte glas med positive kontroller fra den homologe stamme eller en anden referencestamme af R. solanacearum suspenderet i kartoffelekstrakt, som angivet i tillæg 3, del B.

Ved at anvende den FITC-mærkede eubakterielle oligo-probe kan hybridiseringsprocessen kontrolleres, da den farver alle eubakterier, der forekommer i prøven.

Standardiseret positivt og negativt kontrolmateriale, som kan anvendes til denne test, er angivet i tillæg 3, punkt A.

Test af kontrolmateriale foretages som for prøvernes vedkommende.

7.1. Fiksering af kartoffelekstrakt

Følgende protokol er baseret på Wullings et al. (1998):

7.1.1. En fikseringsopløsning forberedes (se tillæg 7).

7.1.2. Der afpipetteres 100 µl af hvert prøveekstrakt i et eppendorfrør, og der centrifugeres i 7 min. ved 7 000 g.

7.1.3. Supernatanten fjernes, og pellet opløses i 200 µl fikseringsopløsning, der er forberedt mindre end 24 timer før. Der vortexes og inkuberes i 1 time i køleskab.

7.1.4. Der centrifugeres i 7 min. ved 7 000 g, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 75 µl 0,01 M fosfatbuffer (se tillæg 7).

7.1.5. Der uddryppes 16 µl af de fikserede suspensioner på et rent multitest-glas, jf. figur 7.1. Der uddryppes 2 forskellige ufortyndede prøver pr. glas, og der anvendes 10 µl til at lave en fortynding i forholdet 1:100 (i 0,01 M fosfatbuffer). Den resterende prøveopløsning (49 µl) kan opbevares ved –20 °C efter tilsætning af 1 del 96 % ethanol. Hvis der er behov for at gentage FISH-assayet, fjernes ethanolen ved centrifugering, og der tilsættes samme mængde 0,01 M fosfatbuffer (der vortexes).

Figur 7.1: Placering på FISH-glas

Prøve 1 Blindprøve Blindprøve Blindprøve Prøve 2 vindue 1 vindue 2 vindue 3 vindue 4 vindue 5 Prøve 1 Blindprøve Blindprøve Blindprøve Prøve 2 vindue 6 vindue 7 vindue 8 vindue 9 vindue 10 Dækglas 1 Dækglas 2

7.1.6. Glassene lufttørres (eller tørres i et tørreapparat ved 37 °C) og fikseres ved flambering.

På dette trin kan proceduren afbrydes, og hybridiseringen fortsættes næste dag. Glassene bør opbevares støvfrit og tørt ved stuetemperatur.

7.2. Hybridisering

7.2.1. Cellerne dehydreres i en række med stigende ethanolkoncentration (50 %, 80 % og 96 %) i 1 min. for hver. Glassene lufttørres i en glasholder.

7.2.2. Et fugtkammer til inkubation forberedes ved at dække bunden i en lufttæt kasse med filtrerpapir, der er gennemvædet med 1x hybmix (tillæg 7). Kassen præinkuberes i hybridiseringsovnen ved 45 °C i mindst 10 min.

7.2.3. Der tilsættes 10 μl hybridiseringsopløsning (tillæg 7) til 8 vinduer (vindue 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 og 10; jf. fig. 7.1) på hvert glas, idet de to vinduer i midten (3 og 8) skal være tomme.

7.2.4. Der sættes dækglas (24 × 24 mm) på det første og de sidste fire vinduer uden luftlommer. Objektglassene anbringes i det foropvarmede fugtkammer og hybridiseres i 5 timer i ovnen ved 45 °C i mørke.

7.2.5. Der forberedes 3 bægerglas med 1 l Milli Q-vand (af molekylærbiologisk kvalitet), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix og 666 ml Milli Q-vand) og 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix og 958 ml Milli Q-vand). De præinkuberes alle i vandbad ved 45 °C.

7.2.6. Dækglassene fjernes fra objektglassene, og objektglassene anbringes i en glasholder.

7.2.7. Overskydende probe bortvaskes ved inkubation i 15 min. i bægerglasset med 1x hybmix ved 45 °C.

7.2.8. Glasholderen overføres til 1/8 hybmix vaskeopløsning, og der inkuberes i yderligere 15 min.

7.2.9. Glassene neddyppes kort i Milli Q-vand og placeres på filtrerpapir. Overskydende fugt fjernes ved at dække overfladen forsigtigt med filtrerpapir. 5-10 μl indlejringsopløsning, der modvirker falmning (f.eks. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, eller tilsvarende) afpipetteres på hvert vindue, og der anbringes et stort dækglas (24 × 60 mm) over hele objektglasset.

7.3. Aflæsning af FISH-testen

7.3.1. Objektglassene undersøges straks under et epifluorescensmikroskop i immersionsolie ved 630 eller 1 000 ganges forstørrelse. Med et filter, der er egnet til fluoresceinisothiocyanat (FITC), farves eubakterielle celler (herunder de fleste gram-negative celler) i prøven fluorescerende grønne. Ved anvendelse af et filter for tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat fremtræder Cy3-farvede celler af R. solanacearum fluorescerende røde. Cellemorfologien sammenlignes med de positive kontroller. Cellerne skal være stærkt fluorescerende og fuldstændig farvede. FISH-testen (afsnit VI, del A, punkt 7) gentages, hvis farvningen er unormal. Vinduerne gennemsøges langs to diametre vinkelret på hinanden og langs omkredsen. Ved prøver, hvor der ikke konstateres nogen eller kun få celler, undersøges mindst 40 mikroskopfelter.

7.3.2. Dernæst observeres, om der er stærkt fluorescerende celler med den karakteristiske morfologi for R. solanacearum i testvinduerne på glassene (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescensens intensitet skal mindst svare til den positive kontrolstammes. Celler med ufuldstændig farvning eller med svag fluorescens ses der bort fra.

7.3.3. Hvis der er mistanke om kontaminering, gentages testen. Dette kan være tilfældet, hvis alle objektglas i en batch har positive celler som følge af kontaminering af buffer, eller hvis der konstateres positive celler (uden for vinduerne på objektglasset) på glassets belægning.

7.3.4. Der er flere problemer forbundet med FISH-testens specificitet. Baggrundsflora af fluorescerende celler med atypisk morfologi og krydsreagerende blødrådsakterier, som i størrelse og morfologi ligner R. solanacearum, kan forekomme — om end mindre hyppigt end i IF-testen — i pellets af navleende og stængelstykker fra kartofler.

7.3.5. Kun fluorescerende celler med typisk størrelse og morfologi tages i betragtning.

7.3.6. Fortolkning af FISH-testresultatet

i) FISH-testresultaterne er gyldige, hvis der i alle positive kontroller og i ingen af de negative kontroller ses stærkt grønt-fluorescerende celler med størrelse og morfologi, der er typisk for R. solanacearum, ved anvendelse af FITC-filteret, og stærkt rødt-fluorescerende celler ved anvendelse af rhodaminfilteret. Hvis der findes stærkt fluorescerende celler med karakteristisk morfologi, anslås det gennemsnitlige antal typiske celler pr. mikroskopfelt, og antal typiske celler pr. ml resuspenderet pellet beregnes (tillæg 4). Prøver med mindst 5 × 103 typiske celler pr. ml resuspenderet pellet betragtes som potentielt kontaminerede. Der skal gennemføres yderligere test. Prøver med mindre end 5 × 103 typiske celler pr. ml resuspenderet pellet betragtes som negative.

ii) FISH-testen er negativ, hvis der ikke ses stærkt rødt-fluorescerende celler med størrelse og morfologi, der er typisk for R. solanacearum, ved anvendelse af rhodaminfilteret, forudsat at der ses typiske stærkt rødt-fluorescerende celler i de positive kontrolpræparater ved anvendelse af rhodaminfilteret.

8. ELISA-test

Princip

På grund af sin relativt lave følsomhed er ELISA-testen udelukkende en valgfri test, der kan anvendes som supplement til IF, PCR eller FISH. Når der anvendes DAS ELISA, er berigelse og brug af monoklonale antistoffer obligatorisk (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Berigelse af prøverne, inden ELISA-testen gennemføres, kan være et velegnet middel til at øge testens følsomhed, men der er en risiko for, at den mislykkes som følge af konkurrence fra andre organismer, der er til stede i prøven.

NB: Der skal anvendes en valideret kilde til antistoffer mod R. solanacearum (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Det anbefales, at titeren bestemmes for enhver ny antistofbatch. Titeren defineres som den største fortynding, ved hvilken der opstår optimal reaktion ved test af en suspension af 105-106 celler/ml fra den homologe stamme af R. solanacearum, idet der benyttes passende sekundære antistofkonjugater i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Under testen bør antistofferne anvendes som en arbejdsfortynding, der er den samme som eller tæt på titeren for den markedsførte formulering.

Antistoffernes titer bestemmes på en suspension af 105-106 celler/ml fra den homologe stamme af R. solanacearum.

Medtag et prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt for R. solanacearum, og en suspension af en ikke-krydsreagerende bakterie i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) som negative kontroller.

Som positiv kontrol anvendes delprøver af prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt, blandet med 103-104 celler pr. ml af R. solanacearum, biovar 2 (f.eks. stamme NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; jf. tillæg 2, del A og B). Til sammenligning af resultaterne på de enkelte plader anvendes en standardsuspension af 105-106 celler pr. ml. i PBS fra R. solanacearum. Det skal sikres, at positive kontroller på mikrotiterpladen holdes fuldstændig adskilt fra prøver, der er ved at blive analyseret.

Standardiseret positivt og negativt kontrolmateriale, som kan anvendes til denne test, er angivet i tillæg 3, punkt A.

Test af kontrolmateriale foretages som for prøvernes vedkommende.

Der er valideret to ELISA-protokoller.

a) Indirekte ELISA (Robinson-Smith et al., 1995)

1) Prøveekstraktet anvendes i portioner à 100-200 µl. (Opvarmning ved 100 °C i 4 minutter i vandbad eller varmeblok kan i visse tilfælde begrænse de ikke-specifikke resultater.)

2) Der tilsættes en lige så stor mængde coatingbuffer af dobbelt styrke (tillæg 4) og vortexes.

3) 100 µl portioner af prøven anbringes på hver af mindst to brønde i mikrotiterpladen (f.eks. Nunc-Polysorp eller lignende), og der inkuberes i 1 time ved 37 °C eller natten over ved 4 °C.

4) Ekstrakterne hældes ud af brøndene. Brøndene vaskes tre gange med PBS-Tween (tillæg 4). Det sidste hold vaskeopløsning skal henstå i brøndene mindst 5 min.

5) Der laves en passende fortynding af antistoffer mod R. solanacearum i blokeringsbuffer (tillæg 4). Til validerede antistoffer, som fås i handelen, anvendes de anbefalede fortyndinger (normalt dobbelt så koncentreret som titeren).

6) Der overføres 100 µl til hver brønd og inkuberes i 1 time ved 37 °C.

7) Opløsningen af antistoffer hældes ud af brøndene, og der vaskes som beskrevet i punkt 4.

8) Der laves en passende fortynding af sekundært alkalisk antistof-fosfatasekonjugat i blokeringsbuffer. Der overføres 100 µl til hver brønd og inkuberes i 1 time ved 37 °C.

9) Opløsningen af konjugerede antistoffer hældes ud af brøndene, og der vaskes som beskrevet i punkt 4.

10) Der overføres 100 µl alkalisk fosfatasesubstratopløsning (tillæg 4) til hver brønd. Der inkuberes i mørke ved stuetemperatur, og absorbansen aflæses ved 405 nm med regelmæssige mellemrum over 90 min.

b) DASI ELISA

1) Der laves en passende fortynding af polyklonale anti-R. solanacearum-immunglobuliner i coatingbuffer, pH 9,6 (tillæg 4). Der overføres 200 µl til hver brønd. Der inkuberes ved 37 °C i 4-5 timer eller ved 4 °C i 16 timer.

2) Brøndene vaskes tre gange med PBS-Tween (tillæg 4). Der overføres 190 µl prøveekstrakt til mindst 2 brønde. Desuden anbringes positive og negative kontroller i to brønde på hver plade. Der inkuberes i 16 timer ved 4 °C.

3) Brøndene vaskes tre gange med PBS-Tween (tillæg 4).

4) Der laves en passende fortynding af specifikke monoklonale antistoffer mod R. solanacearum i PBS (tillæg 4) indeholdende 0,5 % bovint serumalbumin (BSA), og 190 µl overføres til hver brønd. Der inkuberes ved 37 °C i 2 timer.

5) Brøndene vaskes tre gange med PBS-Tween (tillæg 4).

6) Der laves en passende fortynding af antimuse-immunglobuliner konjugeret med alkalisk fosfatase i PBS. Der overføres 190 µl til hver brønd. Der inkuberes ved 37 °C i 2 timer.

7) Brøndene vaskes tre gange med PBS-Tween (tillæg 4).

8) Der laves en alkalisk fosfatasesubstratopløsning indeholdende 1 mg p-nitrophenylfosfat pr. ml. substratbuffer (tillæg 4). Der overføres 200 µl til hver brønd. Der inkuberes i mørke ved stuetemperatur, og absorbansen aflæses ved 405 nm med regelmæssige mellemrum over 90 min.

Fortolkning af ELISA-testresultaterne

ELISA-testen er negativ, hvis den gennemsnitlige OD-værdi af aflæsningerne af duplikatprøvebrøndene er < 2 x OD af værdien af kontrolbrønden med negativt prøveekstrakt, forudsat at OD for alle de positive kontroller er på over 1,0 (efter 90 minutters inkubation med substratet) og er større end to gange den for de negative prøveekstrakter opnåede OD.

ELISA-testen er positiv, hvis den gennemsnitlige OD-værdi af aflæsningerne af duplikatprøvebrøndene er > 2 x OD af værdien af kontrolbrønde med negativt prøveekstrakt, forudsat at OD-aflæsningerne for alle de negative kontrolbrønde er mindre end to gange aflæsningerne af de positive kontrolbrønde.

Negative ELISA-aflæsninger af positive kontrolbrønde er tegn på, at testen ikke er blevet gennemført korrekt, eller at den er blevet hæmmet. Positive ELISA-aflæsninger af negative kontrolbrønde er tegn på, at krydskontaminering eller binding af ikke-specifikke antistoffer har fundet sted.

9. Biotest

NB: Indledende test med denne metode skal muliggøre reproducerbar påvisning af 103-104 kolonidannende celler af R. solanacearum pr. ml tilsat til prøveekstrakter, som tidligere er testet negative (forberedelse: se tillæg 3).

Testen er mest følsom, når der anvendes frisklavet prøveekstrakt, og der er optimale vækstbetingelser. Metoden kan dog udmærket anvendes på ekstrakter, der er blevet opbevaret i glycerol ved –68 til –86 °C.

Følgende protokol er baseret på Janse (1988):

9.1. Der benyttes ti testplanter af en modtagelig tomatkultivar (f.eks. Moneymaker eller en anden kultivar med tilsvarende modtagelighed, som prøvningslaboratoriet måtte vælge) i bladstadium 3 til hver prøve. Nærmere oplysninger vedrørende dyrkning findes i tillæg 8. Som alternativ kan der anvendes ægplanter (f.eks. kultivaren Black Beauty eller en anden kultivar med tilsvarende modtagelighed). Der anvendes udelukkende planter i bladstadium 2-3, hvor højst tre blade er foldet helt ud. Det har vist sig, at symptomer er mindre udtalte og udvikler sig langsommere i ægplanter. Det anbefales derfor at anvende tomatstiklinger.

100 µl prøveekstrakt fordeles mellem testplanterne.

9.2.1. Sprøjteinokulering

På plantestænglerne podes lige over kimbladene med en sprøjte, der er forsynet med en subkutan nål (ikke mindre end 23 G). Prøven fordeles mellem testplanterne.

9.2.2. Snitinokulering

Idet planten holdes mellem to fingre, anbringes med pipette en dråbe (ca. 5-10 µl) af den suspenderede pellet på stænglen mellem kimbladene og det første blad.

Med en steril skalpel skæres et diagonalt snit, der er 1,0 cm langt og så dybt som ca. 2/3 af stænglens tykkelse, idet snittet begyndes fra pelletdråben.

Snittet lukkes med steril vaseline fra en sprøjte.

9.3. Efter samme metode indpodes 5 stiklinger med en vandig suspension af 105-106 celler/ml af en 48-timers kultur af en virulent biovar 2-stamme af R. solanacearum som positiv kontrol og med pelletbuffer (tillæg 4) som negativ kontrol. Positive og negative kontrolplanter holdes adskilt fra de øvrige planter for at undgå krydskontaminering.

9.4. Testplanterne dyrkes under karantæneforhold i op til 4 uger ved 25-30 °C og høj relativ fugtighed, og de vandes i passende omfang, således at såvel overvanding som vandmangel med deraf følgende visnen undgås. For at undgå kontaminering inkuberes planter til positiv kontrol og negativ kontrol på tydeligt adskilte bænke i et drivhus eller vækstkammer, eller, hvis pladsen er begrænset, der sikres absolut adskillelse mellem behandlingerne. Hvis det er nødvendigt at inkubere planter, der anvendes til forskellige prøver, tæt sammen, adskilles de med passende afskærmning. Ved gødskning, vanding, inspektion eller anden håndtering udvises der stor omhu for at undgå krydskontaminering. Det er af afgørende betydning, at drivhuse og vækstkamre holdes fri for alle skadegørende insekter, idet sådanne kan overføre bakterien fra den ene prøve til den anden.

Der observeres for symptomer på visnen, epinasti, klorose og/eller nedsat vækst.

9.5. Der isoleres fra inficerede planter (afsnit II, punkt 3) og foretages identifikation af formodede renkulturer af R. solanacearum (afsnit VI, del B).

9.6. Hvis der ikke er observeret symptomer efter 3 uger, gennemføres en IF-/PCR-test/isolering af en sammensat prøve af stængelstykker på 1 cm fra hver testplante, idet stykkerne skal være taget over podningsstedet. Hvis testen er positiv, foretages fortyndingsudstrygning (afsnit IV, punkt 1).

9.7. Der foretages identifikation af eventuelle formodede renkulturer af R. solanacearum (afsnit VI, del B).

Fortolkning af resultaterne af biotesten

Biotestresultaterne er gyldige, hvis planterne til positiv kontrol udviser typiske symptomer, hvis bakterierne kan reisoleres fra disse planter, og hvis der ikke observeres symptomer på de negative kontroller.

Biotesten er negativ, hvis testplanterne ikke er inficeret med R. solanacearum, og forudsat at R. solanacearum er påvist i de positive kontrolplanter.

Biotesten er positiv, hvis testplanterne er inficeret med R. solanacearum.

B. IDENTIFIKATIONSTEST

Formodede renkulturer af R. solanacearum-isolater identificeres ved at anvende mindst to af følgende test, der bygger på forskellige biologiske principper.

Hvor det er relevant, inddrages kendte referencestammer i hver af de test, der gennemføres (jf. tillæg 3).

1. Biokemiske undersøgelser og enzymundersøgelser

Følgende fænotypiske egenskaber, som R. solanacearum enten har eller slet ikke har, bestemmes efter metoderne Lelliott and Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

Test Forventet resultat Fluorescerende pigmentproduktion – Poly-β-hydroxybutyrat-inklusioner + Oxidations/fermenteringstest (O/F) O+/F- Katalaseaktivitet + Kovacs oxidasetest + Nitratreduktion + Udnyttelse af citrat + Vækst ved 40 °C – Vækst i 1 % NaCl + Vækst i 2 % NaCl – Arginindihydrolase-aktivitet – Smeltning af gelatine – Hydrolyse af stivelse – Hydrolyse af aesculin – Levanproduktion –

2. IF-test

2.1. Der forberedes en suspension af ca. 106 celler pr. ml i IF-buffer (tillæg 4).

2.2. Der forberedes en tofoldsfortyndingsrække af et passende antiserum (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. IF-metoden benyttes (afsnit VI, del A, punkt 5).

2.4. IF-testen er positiv, hvis isolatets IF-titer svarer til den positive kontrols titer.

3. ELISA-test

NB: Hvis der kun gennemføres to identifikationstest, skal der ikke anvendes andre serologiske test ud over denne metode.

3.1. Der forberedes en suspension af ca. 108 celler pr. ml i 1 x PBS (tillæg 4).

3.2. Der gennemføres en passende ELISA-procedure med et specifikt monoklonalt antistof mod R. solanacearum.

3.3. ELISA-testen er positiv, hvis ELISA-aflæsningen af isolatet svarer til mindst halvdelen af aflæsningsværdien for den positive kontrol.

4. PCR-test

4.1. Der forberedes en suspension af ca. 106 celler pr. ml i steriliseret vand af molekylærbiologisk kvalitet.

4.2. 100 µl af cellesuspensionen opvarmes i lukkede rør i en varmeblok eller i kogende vandbad ved 100 °C i 4 min. Prøverne kan da opbevares ved –16 til –24 °C, indtil der er brug for dem.

4.3. Der anvendes relevante PCR-procedurer for at amplificere R. solanacearum-specifikke amplikoner (f.eks. Seal et al. (1993); Pastrik og Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4. Der opnås en positiv identifikation af R. solanacearum, hvis PCR-amplikonerne har samme størrelse og samme restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (RFLP) som den positive kontrolstamme.

5. FISH-test

5.1. Der forberedes en suspension af ca. 106 celler pr. ml i ultrarent vand.

5.2. FISH-metoden benyttes (afsnit VI, del A, punkt 7), idet der anvendes mindst to R. solanacearum-specifikke oligo-prober (tillæg 7).

5.3. FISH-testen er positiv, hvis isolatet og den positive kontrol giver samme reaktioner.

6. Fedtsyreprofilering (FAP)

6.1. Kulturen dyrkes i 48 timer ved 28 °C på trypticasesojaagar (Oxoid).

6.2. Der benyttes en passende FAP-procedure (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. FAP-testen er positiv, hvis den formodede kulturs profil er identisk med den positive kontrols. Forekomst af karakteristiske fedtsyrer som 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH og 18:1 2OH og ingen forekomst af 16:0 3OH tyder med stor sandsynlighed på forekomst af en Ralstonia-stamme.

7. Metoder til bestemmelse af stammer

Det anbefales at anvende en af følgende metoder til bestemmelse af stammer ved hver ny isolering af R. solanacearum.

Hvor det er relevant, inddrages kendte referencestammer i hver af de test, der gennemføres (jf. tillæg 3).

7.1. Biovarbestemmelse

R. solanacearum opdeles i biovarer ud fra deres evne til at udnytte og/eller oxidere tre disaccharider og tre hexosealkoholer (Hayward, 1964, og Hayward et al., 1990). Vækstmedier til biovartesten er beskrevet i tillæg 2. Testen kan gennemføres på vellykket vis ved at sprøjteinokulere renkulturer af R. solanacearum-isolater i medierne og inkubere ved 28 °C. Hvis medierne fordeles på sterile celledyrkningsplader med 96 brønde (200 µl pr. brønd), kan der observeres et farveskift fra olivengrøn til gul inden for 72 timer, hvilket viser et positivt testresultat.

Biovar 1 2 3 4 5 Udnyttelse af: Maltose – + + – + Laktose – + + – + D(+)-cellobiose – + + – + Mannitol – – + + + Sorbitol – – + + – Dulcitol – – + + –

Supplerende test differentierer biovar 2-underfænotyper

Biovar 2A (Findes i hele verden) Biovar 2A (Fundet i Chile og Colombia) Biovar 2T (Fundet i tropiske egne) Udnyttelse af trehalose – + + Udnyttelse af meso-inositol + – + Udnyttelse af D-ribose – – + Pektolytisk aktivitet (1) Lav Lav Høj

7.2. »Fingeraftryk« af genomet

Molekylær differentiering af stammer i R. solanacearum-komplekset kan foretages med forskellige teknikker, herunder:

7.2.1. Restriktions-fragment-længde-polymorfisme-analyse (RFLP-analyse) (Cook et al., 1989)

7.2.2. Gentagen sekvens-PCR med REP-, BOX- og ERIC-primere (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3. Amplifikations-fragment-længde-polymorfisme-analyse (AFLP-analyse) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. PCR-metoder

Specifikke PCR-primere (Pastrik et al., 2002; jf. tillæg 6) kan anvendes til at differentiere stammer tilhørende gruppe 1 (biovar 3, 4 og 5) og gruppe 2 (biovar 1, 2A og 2T) af R. solanacearum, som oprindelig defineret ved RFLP-analyse (Cook et al., 1989) og 16S rDNA-sekventering (Taghavi et al., 1996).

C. KONFIRMATIV TEST

Patogenitetstesten skal gennemføres som endelig bekræftelse af en R. solanacearum-diagnose og til vurdering af, i hvilket omfang kulturer, der er identificeret som R. solanacearum, er virulente.

1) Der forberedes et inokulum på ca. 106 celler pr. ml fra en 24-48 dage gammel kultur af det isolat, der skal testes, og en passende positiv kontrolstamme af R. solanacearum (f.eks. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; jf. tillæg 3).

2) Der podes på 5-10 modtagelige tomat- eller ægplantestiklinger på bladstadium 3 (afsnit VI, del A, punkt 9).

3) Planterne inkuberes i op til 2 uger ved 25-28 °C og høj relativ fugtighed, og de vandes i passende omfang, således at såvel overvanding som vandmangel undgås. For rene isolater bør der indtræde karakteristisk visnen efter højst 15 dages forløb. Er der ingen symptomer efter denne periode, kan det ikke bekræftes, at kulturen er en patogen form af R. solanacearum.

4) Der observeres for symptomer på visnen og/eller epinasti, klorose og nedsat vækst.