RAADETS DIREKTIV 93/85/EOEF af 4. oktober 1993 om bekaempelse af kartoflens ringbakteriose

RAADET FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab, saerlig artikel 43,

under henvisning til forslag fra Kommissionen(1) ,

under henvisning til udtalelse fra Europa-Parlamentet(2) ,

under henvisning til udtalelse fra Det OEkonomiske og Sociale Udvalg(3) , og

ud fra foelgende betragtninger:

Kartoffelproduktionen har stor betydning for Faellesskabets landbrug; udbyttet trues bestandig af skadegoerere;

beskyttelse af kartoffelafgroederne mod disse skadegoerere skal ikke blot medvirke til at opretholde produktionskapaciteten, men tillige vaere et middel til at foroege landbrugets produktivitet;

beskyttelsesforanstaltninger mod indslaebning af skadegoerere paa en medlemsstats omraade faar kun begraenset virkning, hvis ikke skadegoererne samtidig bekaempes metodisk i hele Faellesskabet, og spredning af dem forhindres;

en af kartoflens skadegoerere er Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., som er det patogen, der foraarsager kartoflens ringbakteriose; denne sygdom er forekommet nogle steder i Faellesskabet, og der findes stadig nogle begraensede smittekilder;

der vil vaere betydelig fare for kartoffelafgroederne i hele Faellesskabet, hvis ikke der traeffes effektive foranstaltninger til at lokalisere denne sygdom og bestemme dens udbredelse, til at forhindre dens forekomst og spredning og, hvis den konstateres, til at forhindre dens spredning og til at bekaempe den, saaledes at den kan udryddes;

for at dette kan opnaas, maa der traeffes en raekke foranstaltninger i Faellesskabet; medlemsstaterne maa desuden om noedvendigt kunnen traeffe supplerende eller strengere foranstaltninger under forudsaetning af, at dette ikke skaber andre hindringer for handelen med kartofler inden for Faellesskabet end dem, der er fastsat i Raadets direktiv 77/93/EOEF af 21. december 1976 om foranstaltninger mod indslaebning i medlemsstaterne af skadegoerere paa planter eller planteprodukter(4) ; disse foranstaltninger skal meddeles de oevrige medlemsstater og Kommissionen;

ved Raadets direktiv 80/665/EOEF af 24. juni 1980 om bekaempelse af kartoflens ringbakteriose(5) er der fastsat minimumsforanstaltninger, som skal gennemfoeres af medlemsstaterne mod denne sygdom;

siden da er der sket en betydelig udvikling hvad angaar forstaaelsen af kartoflens ringbakteriose og paavisningen af det patogen, der foraarsager kartoflens ringbakteriose;

anvendelsen af Faellesskabets plantesundhedsordning i et faellesskab uden indre graenser har gjort en fornyet gennemgang og revision af nogle af bestemmelserne i direktiv 80/665/EOEF noedvendig;

en saadan gennemgang har vist, at bestemmelserne i direktiv 80/665/EOEF er utilstraekkelige, og der maa fastsaettes mere detaljerede foranstaltninger;

under disse omstaendigheder boer direktiv 80/665/EOEF ophaeves og de noedvendige foranstaltninger vedtages;

i foranstaltningerne maa der for det foerste tages hensyn til, at sygdommen kan vaere latent uden synlige symptomer baade hos kartofler i vaekst og hos kartofler under lagring, og at den saaledes kun kan bekaempes effektivt ved produktion og anvendelse af sygdomsfrie laeggekartofler, og for det andet til, at det er noedvendigt at foretage systematiske officielle undersoegelser for at lokalisere sygdommen; spredningen af patogenet mellem kartofler under vaeksten er ikke den vigtigste faktor, men patogenet kan overvintre i jorden i spildkartofler (gengroninger), og spildkartofler udgoer den vaesentligste smittekilde, da de overfoerer sygdommen fra én vaekstsaeson til den naeste; patogenet spredes hovedsagelig ved, at sunde kartofler smittes ved kontakt med angrebne kartofler og ved kontakt med laegge-, optagnings- og behandlingsmaskiner og -redskaber eller opbevaringsenheder, der anvendes under transport og oplagring, og som er blevet inficeret ved tidligere kontakt med angrebne kartofler; saadanne inficerede genstande kan overfoere smitte i nogen tid efter infektionen; patogenets spredning kan mindskes eller forhindres ved desinfektion af disse genstande; disse former for infektion af laeggekartofler kan i hoej grad medvirke til, at patogenet spredes;

fastlaeggelsen af de naermere enkeltheder i saadanne generelle foranstaltninger og i de strengere eller supplerende foranstaltninger, der traeffes af medlemsstaterne for at forhindre indslaebning af patogenet paa deres omraade, boer foregaa i snaevert samarbejde mellem medlemsstaterne og Kommissionen i Den Staaende Komité for Plantesundhed (i det foelgende benaevnt komitéen) -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV:

Artikel 1

Dette direktiv omhandler de foranstaltninger, der skal traeffes i medlemsstaterne mod Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., som foraarsager kartoflens ringbakteriose (i det foelgende benaevnt »skadegoereren«), for at:

a) lokalisere den og bestemme dens udbredelse

b) forhindre, at den forekommer og spredes, og

c) hvis den konstateres: forhindre, at den breder sig, og bekaempe den, saaledes at den udryddes.

Artikel 2

1. Medlemsstaterne gennemfoerer systematiske officielle undersoegelser for skadegoereren paa kartoffelknolde og, om noedvendigt, paa kartoffelplanter (Solanum tuberosum L.) med oprindelse paa deres omraade for at bekraefte, at skadegoereren ikke findes.

Til brug ved disse undersoegelser udtages der, naar det drejer sig om kartoffelknolde, proever af baade laeggekartofler og andre kartofler, om muligt fra lagerpartier, og de underkastes officiel laboratorietest eller laboratorietest under officielt tilsyn efter den metode, som er fastsat i bilag I til paavisning og diagnosticering af skadegoereren. Derudover kan der, hvor det er hensigtsmaessigt, foretages officiel visuel inspektion eller visuel inspektion under officielt tilsyn af gennemskaarne knolde paa andre proever.

Naar det drejer sig om planter, foretages disse undersoegelser efter relevante metoder, og proeverne underkastes en officiel test eller en test under officielt tilsyn.

De officielle ansvarlige organer som omhandlet i direktiv 77/93/EOEF traeffer afgoerelse om antallet af proever, oprindelse, stratificering og udtagningstidspunkt efter gode videnskabelige og statistiske principper, ud fra skadegoererens biologi og under hensyn til de saerlige kartoffelproduktionssystemer i de paagaeldende medlemsstater. De naermere enkeltheder herom meddeles aarligt de oevrige medlemsstater og Kommissionen for at sikre, at bekraeftelsen af, at skadegoereren ikke findes, gives med samme sikkerhed i alle medlemsstater.

2. Resultaterne af de officielle undersoegelser, der er omhandlet i stk. 1, meddeles de oevrige medlemsstater og Kommissionen mindst én gang om aaret. Oplysningerne i denne meddelelse er fortrolige. De kan forelaegges komitéen efter proceduren i artikel 16a i direktiv 77/93/EOEF.

3. Foelgende bestemmelser kan vedtages efter fremgangsmaaden i artikel 16a i direktiv 77/93/EOEF:

- indholdet af de i stk. 1 i naervaerende artikel omhandlede undersoegelser, der skal foretages efter gode videnskabelige og statistiske principper

- indholdet af den meddelelse, der er omhandlet i stk. 2 i naervaerende artikel.

4. Foelgende bestemmelse skal vedtages efter fremgangsmaaden i artikel 16a i direktiv 77/93/EOEF:

- de metoder, der er relevante for de undersoegelser og test, der er omhandlet i stk. 1, tredje afsnit, i naervaerende artikel.

Artikel 3

Medlemsstaterne drager omsorg for, at en formodet eller bekraeftet forekomst paa deres omraade af skadegoereren hos kartoffelplanter og -knolde eller hoestede, oplagrede eller omsatte knolde indberettes til deres egne officielle ansvarlige organer.

Artikel 4

1. I tilfaelde, hvor der foreligger formodning om forekomst, skal de officielle ansvarlige organer i den medlemsstat, hvor disse tilfaelde er blevet indberettet, soerge for, at der gennemfoeres officiel laboratorietest eller laboratorietest under officielt tilsyn efter den i bilag I omhandlede metode og i henhold til betingelserne i bilag II, nr. 1, for at bekraefte eller afkraefte den formodede forekomst. I foerstnaevnte tilfaelde finder betingelserne i bilag II, nr. 2, anvendelse.

2. Indtil den formodede forekomst som omhandlet i stk. 1 er blevet bekraeftet eller afkraeftet, skal medlemsstaternes officielle ansvarlige organer i de tilfaelde af formodet forekomst, hvor:

i) der enten er konstateret diagnostiske visuelle symptomer, som giver anledning til at formode sygdommen

ii) eller er foretaget en positiv immunofluorescenstest som omhandlet i bilag I eller en anden relevant positiv test:

a) forbyde flytning af alle partier eller sendinger, hvoraf der er taget proever, medmindre det sker under deres tilsyn og paa betingelse af, at det er fastslaaet, at der ikke er nogen aabenbar risiko for, at skadegoereren breder sig

b) tage skridt til at finde frem til den formodede forekomsts oprindelse

c) paa grundlag af omfanget af den anslaaede risiko traeffe yderligere forholdsregler for at forhindre, at skadegoereren breder sig. Disse forholdsregler kan omfatte officielt tilsyn med flytning af alle andre knolde eller planter inden for eller fra ethvert sted, der saettes i forbindelse med den formodede forekomst.

3. Foelgende bestemmelse kan vedtages efter fremgangsmaaden i artikel 16a i direktiv 77/93/EOEF:

- de foranstaltninger, hvortil der henvises i stk. 2, litra c), i naervaerende artikel.

4. Foelgende bestemmelse skal vedtages efter fremgangsmaaden i artikel 16a i direktiv 77/93/EOEF:

- den anden relevante test, som er omhandlet i stk. 2, nr. ii), i naervaerende artikel.

Artikel 5

1. Hvis en officiel laboratorietest eller en laboratorietest under officielt tilsyn efter den i bilag I fastsatte metode bekraefter skadegoererens tilstedevaerelse i en proeve af knolde, planter eller plantedele, skal medlemsstatens officielle ansvarlige organer under hensyn til gode videnskabelige principper, skadegoererens biologi og det saerlige produktions-, omsaetnings- og forarbejdningssystem i den paagaeldende medlemsstat:

a) erklaere foelgende for inficeret: knoldene eller planterne, sendingen og/eller partiet samt maskinerne, koeretoejet, fartoejet og lageret eller enheder heraf og alle andre genstande, herunder emballage, hvorfra proeven er taget, og eventuelt produktionsstedet og marken, hvor knoldene eller planterne er hoestet

b) under hensyntagen til bestemmelserne i bilag III, nr. 1, bestemme omfanget af den sandsynlige infektion ved kontakt foer eller efter hoest eller gennem produktionsmaessig tilknytning til den erklaerede infektion

c) afgraense et omraade paa grundlag af erklaeringen om infektion i henhold til litra a), bestemmelsen af omfanget af den sandsynlige infektion i henhold til litra b) og skadegoererens mulige udbredelse under hensyntagen til bestemmelserne i bilag III, nr. 2.

2. I henhold til bestemmelserne i bilag III, nr. 3, giver medlemsstaterne omgaaende de oevrige medlemsstater og Kommissionen meddelelse om en erklaeret infektion, jf. stk. 1, litra a), og om omraadeafgraensningen, jf. stk. 1, litra c).

Oplysningerne i denne meddelelse er fortrolige. De kan forelaegges for komitéen efter proceduren i artikel 16a i direktiv 77/93/EOEF.

3. Som foelge af meddelelsen efter stk. 2 og de elementer, som indgaar heri, skal eventuelle andre medlemsstater, der er anfoert i meddelelsen, efter omstaendighederne afgive erklaering om infektion, bestemme omfanget af den sandsynlige infektion og afgraense et omraade ifoelge henholdsvis litra a), b) og c) i stk. 1.

Artikel 6

Hvis knolde eller planter er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), foreskriver medlemsstaterne, at der i overensstemmelse med artikel 4, stk. 1, skal udfoeres test af alle knolde og planter, der er klonalt beslaegtede med dem, der er omfattet af infektionen. Testene udfoeres paa det antal knolde eller planter, der er noedvendige for at bestemme den sandsynlige primaere smittekilde og omfanget af den sandsynlige infektion, om muligt efter faldende infektionsrisiko.

Som resultat af testene foretages efter omstaendighederne paa ny foelgende: erklaering om infektion, bestemmelse af omfanget af den sandsynlige infektion og afgraensning af et omraade ifoelge henholdsvis litra a), b) og c) i artikel 5, stk. 1.

Artikel 7

1. Medlemsstaterne foreskriver, at knolde eller planter, der er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), ikke maa udplantes, og at de under tilsyn af medlemsstaternes officielle ansvarlige organer skal:

- destrueres, eller

- bortskaffes paa anden maade i henhold til en eller flere foranstaltninger under officielt tilsyn efter bestemmelserne i bilag IV, nr. 1, naar det er fastlaaet, at der ikke er nogen aabenbar risiko for, at skadegoereren breder sig.

2. Medlemsstaterne foreskriver, at knolde eller planter, som er erklaeret for sandsynligvis inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra b), ikke maa udplantes, og at de, uden at det beroerer resultatet af den i artikel 6 omhandlede test af klonalt beslaegtede kartofler, under tilsyn af deres officielle ansvarlige organer skal anvendes eller bortskaffes paa passende maade som anfoert i bilag IV, nr. 2, og saaledes, at det fastslaas, at der ikke er nogen aabenbar risiko for, at skadegoereren breder sig.

3. Medlemsstaterne foreskriver, at maskiner, koeretoejer, fartoejer, lagre eller enheder deraf og alle andre genstande, herunder emballage, som er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), eller sandsynligvis inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra b), skal destrueres eller rengoeres og desinficeres efter passende metoder som anfoert i bilag IV, nr. 3. Efter desinfektion anses saadanne genstande ikke laengere for at vaere inficeret.

4. Uden at det beroerer foranstaltningerne i henhold til stk. 1, 2 og 3, foreskriver medlemsstaterne, at der skal traeffes en raekke foranstaltninger som anfoert i bilag IV, nr. 4, i det afgraensede omraade, jf. artikel 5, stk. 1, litra c).

Artikel 8

1. Medlemsstaterne foreskriver, at laeggekartofler skal opfylde kravene i direktiv 77/93/EOEF, og at de i direkte linje skal hidroere fra laeggemateriale, som er frembragt under et officielt godkendt program, og som er fundet fri for skadegoereren ved officielle test eller test udfoert under officielt tilsyn efter den i bilag I naevnte metode.

De ovennaevnte test udfoeres:

- paa planter af det oprindelige klonudvalg, saafremt infektionen beroerer produktionen af laeggekartofler

- paa planter af det oprindelige klonudvalg eller paa repraesentative proever af basislaeggekartofler eller tidligere generationer i andre tilfaelde.

2. Foelgende bestemmelser kan vedtages efter proceduren i artikel 16a i direktiv 77/93/EOEF:

- gennemfoerelsesbestemmelserne til stk. 1, andet afsnit, foerste led, i naervaerende artikel

- bestemmelserne om de repraesentative proever som omhandlet i stk. 1, andet afsnit, andet led, i naervaerende artikel.

Artikel 9

Medlemsstaterne forbyder besiddelse og haandtering af skadegoereren.

Artikel 10

Medmindre andet er fastsat i direktiv 77/93/EOEF kan medlemsstaterne tillade undtagelser fra de i naervaerende direktivs artikel 6, 7 og 9 omhandlede foranstaltninger, naar formaalet er forsoeg, forskning eller planteforaedling, idet disse undtagelser dog ikke maa vaere til hinder for bekaempelsen af skadegoereren eller skabe risiko for, at skadegoereren breder sig.

Artikel 11

Medlemsstaterne kan i fornoedent omfang traeffe supplerende eller strengere foranstaltninger til bekaempelse af skadegoereren eller til at forhindre, at den breder sig, for saa vidt de er i overensstemmelse med bestemmelserne i direktiv 77/93/EOEF.

De i foerste stykke omhandlede supplerende foranstaltninger kan omfatte en bestemmelse om, at der kun maa anvendes laeggekartofler, som enten er officielt certificerede, eller som ifoelge officiel inspektion opfylder de kraevede plantesundhedsnormer. Sidstnaevnte gaelder isaer, naar landbrugere har tilladelse til paa deres egen bedrift at anvende laeggekartofler, som stammer fra deres egen avl, og i andre tilfaelde, hvor der anvendes selvproducerede laeggekartofler.

De naermere enkeltheder i disse foranstaltninger meddeles de oevrige medlemsstater og Kommissionen.

Artikel 12

AEndringer af bilagene til dette direktiv som foelge af udviklingen i den videnskabelige og tekniske viden vedtages efter proceduren i artikel 16a i direktiv 77/93/EOEF.

Artikel 13

1. Medlemsstaterne vedtager og offentliggoer inden den 15. november 1993 de bestemmelser, der er noedvendige for at efterkomme dette direktiv. De underretter straks Kommissionen herom.

Naar medlemsstaterne vedtager disse bestemmelser, skal de indeholde en henvisning til dette direktiv, eller de skal ved offentliggoerelsen ledsages af en saaden henvisning. De naermere regler for denne henvisning fastsaettes af medlemsstaterne.

De anvender disse bestemmelser fra den 16. november 1993.

2. Medlemsstaterne meddeler straks Kommissionen teksten til de nationale retsforskrifter, som de udsteder paa det omraade, der er omfattet af dette direktiv. Kommissionen underretter de oevrige medlemsstater herom.

Artikel 14

Direktiv 89/665/EOEF ophaeves med virkning fra den 16. november 1993.

Artikel 15

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.

Udfaerdiget i Luxembourg, den 4. oktober 1993.

Paa Raadets vegne W. CLAES Formand

(1) EFT nr. C 93 af 2. 4. 1993, s. 12.

(2) EFT nr. C 176 af 28. 6. 1993, s. 210.

(3) EFT nr. C 161 af 14. 6. 1993, s. 18.

(4) EFT nr. L 26 af 31. 1. 1977, s. 20. Direktivet er senest aendret ved Kommissionens direktiv 92/103/EOEF (EFT nr. L 363 af 11. 12. 1992, s. 1).

(5) EFT nr. L 180 af 14. 7. 1980, s. 30.

BILAG I

METODE TIL SPORING OG DIAGNOSTICERING AF RINGBAKTERIOSE, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. SSP. SEPEDONICUS (SPIECKERMANN ET KOTTHOFF) DAVIS ET AL., I PARTIER AF KARTOFFELKNOLDE) 1. Fjernelse af kartoflens indre ved endeskorper

1.1. Vask 200 knolde i rindende postevand og fjern epidermis rundt om endeskorpen paa hver knold, idet der anvendes en normalt desinficeret skalpel eller kartoffelskraeller; desinficering kan foretages ved dypning af skraelleren i 70 % ethanol og ved flambering.

1.2. Fjern forsigtigt de inderste koniske vaev fra endeskorperne med en kniv eller kartoffelskraeller. Soerg for, at der er mindst muligt overskydende ikke-vaskulaert vaev. Naar endeskorperne er fjernet, boer de behandles inden 24 timer (nr. 3) eller konserveres ved -20°C i hoejst to uger.

2. Visuel undersoegelse med henblik paa ringbakteriosesymptomer

Efter af endeskorperne er fjernet, skaeres hver knold igennem paa tvaers og iagttages med henblik paa ringbakteriosesymptomer.

Pres knoldene og se efter udtraedning af opbloedt vaev fra karvaevet.

De tidligste symptomer er en svag glasagtighed eller gennemsigtighed i vaevet uden opbloedning rundt om karsystemet, isaer taet ved endeskorpen. Karvaevsringen ved endeskorpen kan vaere lidt moerkere i farven end normalt. Det foerste letgenkendelige symptom viser sig ved, at karvaevsringen har en gullig farve, og at der, naar knolden presses svagt, kommer strenge af ostelignende materiale ud fra karrene. Denne udsondring indeholder millioner af bakterier. Der kan i denne fase udvikle sig brunfarvning af karvaevet. I begyndelsen kan disse symptomer vaere begraenset til en del af ringen, der ikke noedvendigvis er taet ved endeskorpen, og kan gradvis brede sig til hele ringen. Efterhaanden som infektionen skrider frem, oedelaegges karvaevet; den ydre cortex kan blive adskilt fra den indre cortex. Paa fremskredne stadier af infektionen opstaar revner paa knoldens overflade, som ofte er roedligt-brune ved randene. Sekundaere svampe- eller bakterieangreb kan sloere symptomerne, og det kan vaere vanskeligt, ja umuligt, at skelne fremskredne ringbakteriosesymptomer fra andre bakterioser i knoldene.

3. Forberedelse af proever med henblik paa Gram-farvning, immunofluorescens-farvning (IF) og aegplantetesten

3.1. Homogeniser endeskorperne, indtil der lige netop opnaas fuldstaendig opbloedning i en fortynder, der vides at vaere ugiftig for Corynebacterium sepedonicum (f.eks, 0,05 M fosfat-buffer saltoploesning (PBS) pH 7,0), med en temperatur paa under 30°C; det maa tilraades at tilsaette et ugiftigt deflokkuleringsmiddel, og ugiftigt antiskummiddel kan vaere noedvendigt (tillaeg 1 og 2). Overdreven opbloedning boer undgaas.

3.2 Udtraek bakterier fra homogenatet ved en af de foelgende metoder(1) :

A. a) Centrifuger med hoejst 180 g i ti minutter.

b) Centrifuger flydelaget med mindst 4 000 g i ti minutter. Haeld om og frasorter flydelaget.

B. a) Lad det opbloedte materiale staa i 30 minutter, saaledes at det nedbrudte vaevsmateriale kan bundfaelde sig. Haeld flydelaget fra uden at forstyrre bundfaldet.

b) Filtrer flydelaget gennem papirfilter (Whatman nr. 1) anbragt i et sintret glasfilter (nr. 2 = 40-100 mm), idet der anvendes en vandvakuumpumpe. Saml filtratet i et centrifugeroer. Vask filtret med steril PBS til en filtratvolumen paa 35 ml.

c) Centrifuger filtratet med mindst 4 000 g i 20 minutter.

3.3 Opslaem toerstof i steril 0,01 M fosfat-buffer pH 7,2 (tillaeg 2) for at opnaa et samlet volumen paa ca. 1 ml. Del i to lige store dele og opbevar én del til referenceformaal ved nedfrysning ved -20°C(2) eller ved lyofilisering. Del den anden del i to halvdele, idet én halvdel anvendes til IF-testen og Gram-farvningen, medens den anden anvendes til aegplantetesten.

3.4. Det er bydende noedvendigt, at alle positive C. sepedonicum kontrolforsoeg og proever behandles for sig for at undgaa kontaminering. Dette gaelder IF-glas og aegplantetest.

4. Gram-farvning

4.1. Forbered Gram-farvning for alle toerstoffortyndinger (5.2.1) og for alle overskaarne knolde (2), der opviser glasagtighed, forraadnelse eller andre mistaenkelige symptomer. Proeverne boer udtages fra kanten af det syge vaev.

4.2. Forbered Gram-farvning for kendte C. sepedonicum kulturer og, om muligt, for naturligt inficeret vaev (5.1).

4.3. Fastslaa, hvilke proever der indeholder typiske Gram-positive coryneforme celler. Generelt er C. sepedonicum celler 0,8-1,2 mm lange og 0,4-0,6 mm brede.

En passende farvningsprocedure er angivet i tillaeg 3.

Praeparater fra naturlige infektioner eller fra nyligt isolerede kulturer har ofte overvaegt af coccoide stavbakterier, der normalt er lidt mindre end celler fra andre agarkulturer. Paa de fleste naeringssubstrater er C. sepedonicum celler polymorfe coryneforme stave og kan give en variabel Gram-reaktion. Cellerne optraeder enkeltvis, i par med karakteristiske »albuer« typisk for boejedeling, og undertiden i uregelmaessige grupper, der ofte omtales som palisader og kinesiske bogstaver.

5. Metode til IF-test

5.1. Anvend antiserum paa en kendt stamme af C. sepedonicum ATCC 33113 (NCPPB 2137), eller NCPPB 2140. Dette boer have en IF-titer paa mere end 1:600. Medtag en PBS-kontrol paa proeveglasset for at fastslaa, om fluorescein isothiocyanat anti-kanin immunoglobulin konjugatet (FITC) forbinder sig ikke-specifikt med bakterieceller. Corynebacterium sepedonicum (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) boer anvendes som homolog antigenkontrol paa et glas for sig. Naturligt inficeret vaev (bevaret ved lyofilisering eller nedfrysning ved -20°C) boer anvendes, naar det er muligt, som en lignende kontrol paa samme glas (figur 2).

5.2. Fremgangsmaade

5.2.1. Forbered tre fortyndinger, hvor forholdet er en eksponentiel raekke af 10 (101, 102, 103), af det endelige toerstof i destilleret vand (figur 1).

5.2.2. Anbring med pipette en afmaalt standardmasse, der er tilstraekkelig til at daekke vinduet (ca. 25 ml), af hver toerstoffortynding eller C. sepedonicum-opslaemning (ca. 106 celler/ml) i vinduerne paa et multispot-glas som vist i figur 1.

5.2.3. Lad lufttoerre ved ca. 37°C og bind med 95 % ethanol eller ved flambering.

5.2.4. Daek de relevante vinduer med C. sepedonicum-antiserum i de anbefalede fortyndinger, 0,01 M PBS pH 7,2 (tillaeg 2) som vist i figur 1. (Anvend PBS til FITC-kontrol). Arbejdsfortyndingen af antiserummet boer vaere ca. det halve af IF-titeret. Hvis der skal medtages andre antiserum-fortyndinger, boer der forberedes saerskilte glas for hver fortynding, der skal anvendes.

5.2.5. Inkuber i et fugtkammer ved omgivende lufttemperatur i 30 minutter.

5.2.6. Skyl omhyggeligt med 0,01 M PBS pH 7,2. Vask i fem minutter i tre hold af 0,01 M PBS pH 7,2.

5.2.7. Fjern omhyggeligt overskydende fugt.

5.2.8. Daek hvert vindue med FITC-konjugat med den samme fortynding, der blev anvendt til at bestemme titer, og inkuber i et moerkt fugtkammer ved omgivende lufttemperatur i 30 minutter.

5.2.9. Skyl og vask som foer.

5.2.10. Anbring ca. 5-10 ml af 0,1 M fosfat-buffer glycerin pH 7,6 (eller et lignende praeparat med en pH paa ikke under 7,6) i hvert vindue og luk med et daekglas (tillaeg 2).

5.2.11. Undersoeg med et mikroskop udstyret med en epifluorescerende lyskilde og filtre, der er egnede til arbejdet med FITC. En forstoerrelse paa 400-1 000 er passende. Gennemsoeg de fordoblede vinduer langs to diametre vinkelret og rundt om vinduesperimetrene.

Se efter fluorescerende celler i de positive kontrolproever og bestem titeret. Se efter fluorescerende celler i FITC/PBS kontrolvinduet og, hvis der intet foreligger, gaa videre til proeve-vinduerne. Bestem i mindst ti mikroskopfelter det gennemsnitlige antal af morfologisk typiske fluorescerende celler pr. felt og beregn antallet pr. ml af ufortyndet toerstof (bilag 4).

Der er flere problemer forbundet med immunofluorescens-testen.

- Baggrundsbestande af fluorescerende celler med atypisk morfologi og krydsreagerende raadbakterier med en stoerrelse og morfologi, der ligner Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, vil sandsynligvis forekomme i kartoffeltoerstof. Kun fluorescerende celler med typisk stoerrelse og morfologi tages i betragtning.

Da der er mulighed for krydsreaktioner, boer proever med en positiv immunofluorescenstest proeves paa ny med forskelligt antiserum.

- Den tekniske graense for paavisning ved denne metode ligger mellem 103 og 104 celler pr. ml ufortyndet toerstof. Proever med IF-typiske celler i et antal naer paavisningsgraensen er saedvanligvis negative for C. m. ssp. sepedonicus, men kan underkastes aegplantetest.

En immunofluorescenstest fastslaas som negativ i forbindelse med enhver proeve, hvor der ikke findes morfologisk typiske fluorescerende celler. Proeverne betragtes som »ikke-kontamineret« med Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

AEgplantetesten er ikke paakraevet.

En immunofluorescenstest fastslaas som positiv i forbindelse med enhver proeve, hvor der findes morfologisk typiske fluorescerende celler. Proever, i forbindelse med hvilke en immunofluorescenstest er blevet fastslaaet som positiv med begge antisera, betragtes som »eventuelt kontamineret« med Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. AEgplantetest er paakraevet for alle proever, der betragtes som eventuelt kontaminerede.

6. AEgplantetest

For detaljer vedroerende dyrkning, se tillaeg 5.

6.1. Fordel toerstoffet fra 3.3 mellem mindst 25 aegplanter paa loevstadium 3 (tillaeg 5) efter en af nedenstaaende metoder (6.2, 6.3 eller 6.4).

6.2. Spalteindpodning I

6.2.1. Stoet hver potte horisontalt (en blok af ekspanderet polystyren, hvor man fra en overflade har fjernet et stykke 5 cm dybt × 10 cm bredt × 15 cm langt (figur 3), er tilstraekkelig for en 10 cm-potte). En strimmel af steril aluminiumfolie boer anbringes mellem stilken og blokken for hver proeve, der undersoeges. Planten kan holdes paa plads med et gummibaand rundt om blokken.

6.2.2. Med en skalpel udfoeres et snit paa langs eller et svagt diagonalt snit, der er 0,5-1,0 cm langt og ca. saa dybt som 3/4 af stilkens diameter, mellem kimbladene og det foerste blad.

6.2.3. Hold spalten aaben med skalpelbladets spids og pensl podestoffet ind i den, idet der anvendes en eyeliner eller en fin kunstnerpensel, der er paasmurt toerstoffet. Fordel resten af toerstoffet mellem aegplanterne.

6.2.4. Luk snittet med steril vaseline fra en sproejte med 2 ml-cylinder.

6.3. Spaltepodning II

6.3.1. Hold planten mellem to fingre, anbring med pipette en draabe (ca. 5-10 ml) af det opslaemmede toerstof paa stilken mellem kimbladene og det foerste blad.

6.3.2. Skaer med en steril skalpel en diagonal spalte (med en vinkel paa ca. 5°), der er 1,0 cm lang og saa dyb som ca. 2/3 af stilkens tykkelse, idet snittet begyndes fra toerstofdraaben.

6.3.3. Luk snittet med steril vaseline fra en sproejtecylinder.

6.4. Sproejteindpodning

6.4.1. Undgaa at vande aegplanterne én dag forud for indpodningen for saaledes at mindske saftspaendingen.

6.4.2. Pod paa aegplantestilkene lige over kimbladene med en sproejte, der er forsynet med en subkutan naal (ikke mindre end 23G). Fordel toerstoffet mellem aegplanterne.

6.5. Pod paa 25 planter med en kendt C. sepedonicum-kultur og, hvor det er muligt, med naturligt inficeret vaev fra knoldene (5.1) efter samme indpodningsmetode (6.2, 6.3 eller 6.4).

6.6. Pod paa 25 planter med steril 0,05 M PBS efter samme indpodningsmetode (6.2, 6.3 eller 6.4).

6.7. Inkuber planterne under passende forhold (tillaeg 5) i 40 dage. Undersoeg regelmaessigt med henblik paa symptomer efter otte dage. Tael antallet af planter, der opviser symptomer. C. sepedonicum foraarsager visnen af blade paa aegplanter, der kan begynde som en slaphed i randene eller mellem bladstrengene. Vissent vaev kan i begyndelsen forekomme moerkegroent eller spaettet, men bliver blegere, foer det nekrotiserer. Visnede steder mellem bladstrengene har ofte et fedtet, gennembloedt udseende. Nekrotisk vaev har ofte en lysegul rand. Planterne doer ikke noedvendigvis; jo laengere perioden foer symptomernes udvikling er, desto stoerre er chancerne for overlevelse. Planterne kan vokse fra infektionen. Modtagelige unge aegplanter er langt mere foelsomme for ringe bestande af C. sepedonicum end aeldre planter, derfor er det noedvendigt at anvende planter paa eller lige foer bladstadium 3.

Visnen kan ogsaa skyldes bestande af andre bakterier eller svampe, der findes i toerstoffet fra knoldenes vaev. De omfatter Erwinia carotovora subsp. carotovora og E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exiqua var. foveata, samt store bestande af raadbakterier. En saadan visnen kan skelnes fra den visning, der skyldes C. sepedonicum, eftersom hele blade eller hele planter hurtigt visner.

6.8. Forbered en Gram-farvning (4) for alle partier af aegplanter, der opviser symptomer, idet der anvendes udsnit af visnet bladvaev og stilkvaev fra planter, og isoler proeverne paa egnede naeringssubstrater (7). Desinficer overfladen af aegplanternes blade og stilke ved aftoerring med 70 % ethanol.

6.9. Under visse omstaendigheder, isaer hvor vaekstbetingelserne ikke er optimale, kan C. sepedonicum eventuelt eksistere som en latent infektion i aegplanter selv efter en inkubationstid paa 40 dage. Saadanne infektioner kan muligvis bevirke forkroebling og kraftesloeshed hos de podede planter. Hvis IF-testen anses for positiv, kan det vaere noedvendigt at foretage yderligere test. Det er derfor afgoerende vigtigt at sammenligne vaekstraterne for alle de aegplanter, der indgaar i testen, med de sterile 0,05 M PBS podede kontrolproever, og at kontrollere miljoeforholdene i drivhuset.

Der kan gives foelgende anbefalinger med henblik paa yderligere test:

6.9.1. Udskaer stilkene over podningsstedet og fjern bladene.

6.9.2. Opbloed stilkene i 0,05 M PBS pH 7,0 som i 3.1 og 3.2.

6.9.3. Brug halvdelen af toerstoffet til at foretage en Gram-farvning (4) og en IF-test (5).

6.9.4. Brug den anden halvdel til at foretage endnu en aegplantetest (6), hvis Gram-farvningen og/eller IF-testene er positive. Anvend en kendt C. sepedonicum-kultur og sterile 0,05 M PBS kontrolproever. Hvis symptomerne ikke observeres i den paafoelgende test, skal testen anses for negativ.

7. Isolering af C. sepedonicum

Diagnosen kan kun bekraeftes, hvis C. sepedonicum isoleres og identificeres som saadan (8). Skoent C. sepedonicum er en organisme, det er vanskeligt at have med at goere, kan den isoleres fra vaev, der opviser symptomer. Den kan imidlertid blive overskygget af hurtigtvoksende raadbakterier, og isolering direkte fra toerstoffet fra knoldvaevet (3.3) kan ikke anbefales. AEgplanter udgoer et udmaerket selektivt berigelsessubstrat for vaekst af C. sepedonicum og giver ogsaa en udmaerket bekraeftende vaertstest.

Isolering boer foretages fra alle kartoffelknolde og aegplanter, der opviser symptomer (4 og 6). Opbloedning af aegplantestilke boer, hvis den er paakraevet, udfoeres som i 3 og 6.9.

7.1. Oploesningen udstryges paa et af foelgende substrater (tillaeg 6 angiver formler):

- naeringsagar med dextrose (kun for subkulturer)

- gaeragar med peptonglukose

- gaernaeringsagar med dextrose

- gaerekstraktagar med mineralsalte.

Der inkuberes ved 21°C i op til 20 dage.

C. sepedonicum er langsomtvoksende og giver saedvanligvis punktformede, cremefarvede og kuppelformede kolonidannelser i loebet af hoejst ti dage.

Der udstryges paa ny for at sikre renheden.

Vaeksthastigheden kan oeges ved hjaelp af subkulturer. Kolonidannelser er typisk cremehvide eller elfenbensfarvede, afrundede, glatte, ophoejede, kuppelkonvekse, slimagtige til flydende, har ubrudte kanter og er saedvanligvis 1 til 3 mm i diameter.

Identifikation

Mange Gram-positive coryneform-bakterier, som danner kolonier, der ligner C. sepedonicum-kolonier, kan isoleres fra sunde eller syge kartofler eller aegplanter. Over for saadanne maa C. sepedonicum identificeres ved hjaelp af foelgende test:

IF-test (punkt 5.1)

AEgplantetest

Naeringstest og fysiologisk test (tillaeg 7)

- Oxidations/fermenteringstest (O/F)

- Oxidasetest

- Vaekst ved 37°C

- Produktion af urease

- Hydrolyse af aesculin

- Hydrolyse af stivelse

- Tolerance over for 7 % natriumchloridoploesning

- Indoltest

- Katalasetest

- Produktion af H2S

- Udnyttelse af citrat

- Hydrolyse af gelatine

- Syre og glycerol, lactose, rhamnose og salicin

- Gram-farvning

Alle test boer omfatte en kendt C. sepedonicum-kontrol. Naeringstest og fysiologiske test boer udfoeres ved podning med naeringsagarsubkulturer. Der boer foretages morfologiske sammenligninger af naeringsagarkulturer med dextrose.

Til IF-testen boer cellepopulationerne bringes paa 106 celler pr. ml. IF-titeren boer svare til titeren for den kendte C. sepedonicum-kultur.

Til aegplantetesten boer cellepopulationerne bringes paa ca. 107 celler pr. ml. AEgplantetesten boer udfoeres paa ti planter for hver af testorganismerne, idet der ogsaa hér bruges den kendte C. sepedonicum-kultur og kontrol med sterilt vand; i rene kulturer boer der indtraede karakteristisk visnen efter hoejst 20 dages forloeb, men planter uden symptomer efter dette tidsrum boer inkuberes i et samlet tidssrum af 30 dage ved temperaturer, der fremmer aegplanters vaekst, men ikke overstiger 30°C (jf. tillaeg 5). Er der ingen symptomer efter 30 dage, kan det ikke fastslaas, at kulturen er en patogen form for Corynebacterium sepedonicum.

Test C. sepedonicum

O/F Inert eller svagt oxiderende

Oxidase -

Katalase +

Nitratreduktion -

Ureaseaktivitet -

H2S-produktion -

Indolproduktion -

Citratudnyttelse -

Hydrolyse af stivelse - eller svag

Vaekst ved 37°C -

Vaekst i 7 % NaCl -

Hydrolyse af gelatine -

Hydrolyse af aesculin +

Syre af:

- glycerol -

- lactose - eller svag

- rhamnose -

- salicin -

Tillaeg 1 FORMEL FOR UDBLOEDNINGSVAESKE ANBEFALET AF LELLIOTT OG SELLAR 1976

D C silicone Antifoam MS A compund (Hopkins & Williams Ltd, Cat. No. 9964-25, Chadwell Heath, Essex, England) 10 ml

Lubrol W i flager (ICI Ltd) 0,5 g

Tetrasodium pyrophosphat 1 g

0,05 M phophatbufferet saltoploesning, pH 7,0 (tillaeg 2) 1 liter

Tillaeg 2 BUFFERE

0,05 M phosphatbufferet saltoploesning med pH 7,0

Denne buffer kan anvendes til udbloedning af vaev af rodknolde (2.1)

Na2HPO4 4,26 g

KH2PO4 2,72 g

NaCl 8,0 g

Destilleret vand op til 1 liter

0,01 M phosphatbufferet saltoploesning med pH 7,2

Denne buffer anvendes til fortynding af antisera og til afvaskning af IF-objektglas

Na2HPO4. 12H2O 2,7 g

NaH2PO4. 2H2O 0,4 g

NaCl 8,0 g

Destilleret vand op til 1 liter

0,1 M phosphatbufferet glycerin pH 7,6

Denne buffer kan anvendes med katalytisk effekt til foroegelse af fluorescensen i IF-proeven

Na2HPO4. 12H2O 3,2 g

Na2PO4. 2H2O 0,15 g

Glycerol 50 ml

Destilleret vand 100 ml

Tillaeg 3 GRAMS AFSMITNINGSPROCEDURE (HUCKERS MODIFIKATION) (DOETSCH 1981)

Krystalviolet-oploesning

2 g krystalviolet oploeses i 20 ml 95 % ethanol.

0,8 g ammoniumoxalat oploeses i 80 ml destilleret vand.

De to oploesninger blandes.

Lugols jodoploesning

Jod 1 g

Kaliumiodid 2 g

Destilleret vand 300 ml

De to masser roeres sammen i en morter. Vandet haeldes i, og der omroeres i en lukket beholder, indtil oploesning har fundet sted.

Safranin-oploesning til fjernelse af afsmitningen

Stamoploesning:

Safranin O 2,5 g, og

95 % ethanol 100 ml

Der blandes og henstilles.

Der oploeses i forholdet 1:10 for at faa en praktisk anvendelig oploesning.

Afsmitningsprocedure

1. Udstrygningspraeparater, lufttoerring og varmegrad forberedes.

2. Objektglas overhaeldes med krystalviolet-oploesningen i et minut.

3. Der skylles kort med hanevand.

4. Der overhaeldes med Lugols jodoploesning i et minut.

5. Der skylles med hanevand og duppes toert.

6. Farve fjernes med 95 % ethanol, tilfoert draabevis, indtil farve ikke laengere forsvinder, eller der foretages nedsaenkning og let omrysten i 30 sekunder.

7. Der skylles med hanevand og duppes efter.

8. Der overhaeldes med safranin-oploesning i ti sekunder.

9. Der skylles med hanevand og duppes efter.

Gram-positive bakterier giver blaa/violet afsmitning; Gram-negative bakterier giver lyseroed/roed afsmitning.

Tillaeg 4 BESTEMMELSE AF POPULATIONEN AF IF-POSITIVE CELLER

Overflademaal (S) af vindue eller multispot-objektglas

p(1)

hvor D = vinduets diameter.

Synsfeltets overflademaal

p (2)

hvor d = synsfeltets diameter.

d bestemmes enten ved direkte maaling eller paa grundlag af foelgende formel:

p(3)

hvor i = synsfeltkoefficienten (afhaenger af okulartype og varierer fra 8 til 24)

K = roerkoefficienten (1 eller 1,25)

G = objektivets forstoerrelse (100 ×, 40 ×, etc.)

Af (2) d =

p

faas (3) pp

Optaelling: antal typisk fluorescerende celler pr. synsfelt (c)

Beregning: antal typisk fluorescerende celler pr. vindue (C)

Beregning: antal typisk fluorescerende celler pr. ml toerstofenhed (N)

hvor y = toerstofenhedens volumen paa vinduet, og

F = toerstofenhedens oploesningsfaktor.

Tillaeg 5 AEGPLANTEKULTUR

Froe af aegplante (Solanum melongena cv. Black Beauty) saas i pasteuriseret dyrkningskompost. Stiklingerne udplantes, naar kimbladene er helt udfoldet (10 til 14 dage), i pasteuriseret vaekstkompost.

Der skal anvendes aegplanter i bladstadium 3, hvor to og hoejst tre blade er foldet helt ud.

AEgplanterne skal dyrkes i drivhus under foelgende vaekstbetingelser:

daglaengde: 14 timer eller den naturlige daglaengde, hvis denne er paa mere end 14 timer

temperatur: 21-24°C om dagen

15°C om natten.

NB: C. sepedonicum kan ikke dyrkes ved en temperatur paa mere end 30°C. Falder nattemperaturen ikke til 15°C, kan der forekomme kromoforbeskadigelse (soelvnekrose).

Beskadigelse af roedder ved angreb af sciarid-larver kan afboedes ved anvendelse af et passende insektmiddel.

AEgplanter cv. Black Beauty saelges af:

1. AB Hammenhoegs Froe

270 50 Hammenhoeg

Sverige

2. Hurst Seeds Ltd

Avenue Road

Witham

Essex CM8 2DX

England

3. ASGRO Italia SpA

Corso Lodi, 23

Milano

4. Kuepper

Mitteldeutsche Samen GmbH

Hessenring 22,

D-37269 Eschwege

Tillaeg 6 VAEKST- OG ISOLATIONSSUBSTRATER FOR C. SEPEDONICUM

Naeringsagar (NA)

Difco Bacto Nutrient Agar i destilleret vand i det af fabrikanten anfoerte forhold. Der steriliseres i autoklave ved 121°C i 15 minutter.

Naeringsagar med dextrose (NDA)

Difco Bacto Nutrient Agar indeholdende 1 % D(+)-glucose (monohydrat). Der steriliseres i autoklave ved 115°C i 20 minutter.

Gaeragar med peptonglukose (YPGA)

Difco Bacto Yeast Extract (nr. 0127) 5 g

Difco Bacto Peptone (nr. 0118) 5 g

D(+)-glucose (monohydrate) 10 g

Difco Bacto Purified Agar (nr. 0560) 15 g

Destilleret vand 1 liter

Der steriliseres 1/2 l af substratet i autoklave ved 115°C i 20 minutter.

Gaerekstraktagar med mineralsalte (YGM)

Difco Bacto Yeast Extract 2,0 g

D(+)-glukose (monohydrate) 2,5 g

K2HPO4 0,25 g

KH2PO4 0,25 g

MgSO4 · 7H2O 0,1 g

MnSO4 · H2O 0,015 g

NaCl 0,05 g

FeSO4 · 7H2O 0,005 g

Difco Bacto Purified Agar 18 g

Destilleret vand 1 liter

Der steriliseres 1/2 l af substratet i autoklave ved 115°C i 20 minutter.

Tillaeg 7 NAERINGSTEST OG FYSIOLOGISKE TEST TIL IDENTIFIKATION AF C. SEPEDONICUM

Alle substrater skal inkuberes ved 21°C og undersoeges efter seks dages forloeb. Konstateres ingen vaekst at have fundet sted, inkuberes der i op til 20 dage.

- Oxideringstest og fermentationstest (Hugh & Leifson, 1953) - O/F-test

Basissubstrat:

KCl 0,2 g

MgSO4 · 7H2O 0,2 g

NH4H2PO4 1,0 g

Difco Bacto Peptone 1,0 g

Difco Bacto Purified Agar 3,0 g

D(+)-glucose (monohydrate) 10,0 g

Bromothymolblaat 0,03 g

Destilleret vand 1 liter

Der blandes og justeres til pH 7,0-7,2 med 1 N KOH.

Blandingen paafyldes Pyrex-kulturglas paa 16 × 100 mm (indhold 12 ml) i maengder paa 5 og 10 ml.

Der steriliseres i autoklave ved 115°C i ti minutter.

5 ml- og 10 ml-glassene stavpodes med hver enkelt kultur. Der tilfoeres aseptisk 1-2 ml sterilt flydende paraffin til 10 ml-glassene. Der inkuberes.

/* Tabel: Se EFT */

1956)

Kovacs oxidasereagens:

1 % vandig oploesning af tetramethylparaphenylendiamiddihydrochlorid (BDH nr. 30386) i destilleret vand.

Reagensen boer vaere frisklavet i maengder paa 1 ml; den kan dog opbevares i en til fire uger i en brun glasflaske ved 5 °C.

En draabe reagens dryppes paa filterpapir i en ren petriskaal. Med et platinoeje paafoeres straks lidt testkultur fra naeringsagaren.

Positiv reaktion: der udvikles purpurfarvning i loebet af ti sekunder. Varer det 10 til 30 sekunder, foer farvevirkningen kan konstateres, er kulturen svagt positiv.

NB: Det er vigtigt, at der anvendes et platinoeje og NA-kulturer, da spor af jern eller af et hoejt sukkerindhold i vaekstsubstrat kan give falske positive resultater.

- Syreproduktion fra lactose, rhamnose, salicin og glycerol

Hugh & Leifson's O/F-substrat uden glukose tilberedes. Der fordeles med 5 ml i glas. Der steriliseres i autoklave ved 115°C i ti minutter. Til den smeltede masse tilsaettes aseptisk ved 45°C 0,5 ml af en filtersteriliseret 10 % vandig oploesning af enten glycerol, lactose, rhamnose eller salicin. Der blandes omhyggeligt.

Positiv reaktion: aendringg af farven fra blaagroen til gul indikerer, at syredannelse finder sted.

- Katalasetest

En draabe hydrogenperoxid (volumen 30) dryppes paa et rent objektglas, og der emulgeres ved hjaelp af et platinoeje med en oejefuld kultur.

Positiv reaktion: produceres der iltbobler i draaben, kan katalase konstateres at forekomme.

- Nitratreductaseaktivitet og denitrifikation (Bradbury, 1970)

Kultursubstrat:

KNO3 (nitratfri) 1 g

Difco Bacto Yeast Extract 1 g

K2HPO4 5 g

Destilleret vand 1 liter

Maengder paa 10 ml haeldes i 20 ml-flasker. De steriliseres i autoklave ved 121°C i 15 minutter.

Reagens A:

H2SO4 8g

5N eddikesyre 1 liter

Reagens B:

naphtylamin 5 g

5N eddikesyre 1 liter

Nitratsubstratet podes paa to gange. Der testes efter 10 og 20 dage ved tilsaetning af 1 draabe Lugols jodoploesning, 0,5 ml reagens A og 0,5 ml reagens B. Bliver substratet ikke roedt, tilfoejes 50 mg zinkpulver. Farvereaktionen observeres.

Positiv reaktion: Farvereaktion

Fase 1 Fase 2

Ingen nitratreduktion farveloes roed

Nitratreduktion excl. nitrit

(kun nitratreductase) roed -

Nitratreduktion incl. nitrit

(denitrifikation - nitrat- og nitritreductase) farveloes farveloes

- Ureaseproduktion (Lelliott, 1966)

Basissubstrat:

Oxoid Urea Agar Base (CM53) 2,4 g

Destilleret vand 95 ml

Der steriliseres i autoklave ved 155°C i 20 minutter. Den smeltede masse nedkoeles til 50°C, og der tilsaettes aseptisk 5 ml filtersteriliseret 40 % vandig ureaoploesning (Oxoid SR20). Der blandes grundigt.

Maengder paa 6 ml fordeles i sterile roer (16 × 100 mm), som anbringes skraat og fast.

Positiv reaktion: det gul-orange substrat antager en kirsebaerroed eller moerkroedlig farvning, hvis ureaseaktivitet er forekommet.

- Citratudnyttelse (Christensen) (Skerman, 1967)

Citratagarbasis (Merck 2503) 23 g

Destilleret vand 1 liter

Der blandes og oploeses ved opvarmning. Maengder paa 6 ml fordeles som for ureasubstratet. Der steriliseres i autoklave ved 121°C i 15 minutter; glassene skraatstilles.

Positiv reaktion: citratudnyttelse indikeres ved aendring af substrates farve fra orange til roed.

- Hydrogensulphidproduktion (Ramamurthi, 1959)

Substrat:

Difco Bacto Trypton (nr. 0123) 10 g

K2HPO4 1 g

NaCl 5 g

Destilleret vand 1 liter

Der destilleres og fordeles med maengder paa 6 ml i roer paa 16 × 100 mm. Der steriliseres i autoklave ved 115°C i ti minutter.

Et blyacetatpapir (Merck 9511) podes og holdes aseptisk op for roerets munding. Det fastgoeres med laaget. Der inkuberes i op til 20 dage.

Positiv reaktion: produktion af H2S fra trypton indikeres ved, at testpapiret udvikler en sort-brun farvning.

- Indolproduktion (Ramamurthi, 1959)

Substrat:

som for H2S-testen.

Blyacetatpapiret fjernes, og der tilsaettes 1-2 ml diethylaeter, hvorefter der rystes varsomt. Lagene skal have tid til at skille sig (fem minutter). Der tilsaettes 0,5 ml Kovacs reagens (Merck 9293) forsigtigt ned langs roerets indvendige side.

Positiv reaktion: forekomst af indol indikeres ved, at der udvikles en roed farvning i det gule lag mellem aeterelementet og det vandige element.

- Vaekst ved 37°C (Ramamurthi, 1959)

Substrat:

Difco Bacto Nutrient Broth (nr. 0003) 8 g

Destilleret vand 1 liter

Der blandes, oploeses, og maengder paa 6 ml fordeles i roer.

Der steriliseres i autoklave ved 121°C i 15 minutter.

Der podes og inkuberes ved 37°C.

Positiv reaktion: se efter vaekst.

- Vaekst i 7 % natriumchloridoploesning (Ramamurthi, 1959)

Substrat:

Difco Bacto Nutrient Broth 8g

NaCl 70 g

Destilleret vand 1 liter

Der blandes, oploeses, og maengder paa 6 ml fordeles i roer.

Der steriliseres i autoklave ved 121°C i 15 minutter.

Positiv reaktion: se efter vaekst.

- Hydrolyse af gelatine (Lelliott, Billing & Hayward, 1966)

Substrat:

Difco Bacto Gelatin (nr. 0143) 120 g

Destilleret vand 1 liter

Der blandes, oploeses ved opvarmning, og maengder paa 6 ml fordeles i roer.

Der steriliseres i autoklave ved 121°C i 15 minutter.

Positiv reaktion: smeltning af gelatine, selv naar den opbevares ved 5°C i 30 minutter.

- Hydrolyse af stivelse

Substrat:

Difco Bacto Nutrient Agar (smeltet) 1 liter

Difco Bacto Soluble Starch (nr. 0178) 2 g

Der blandes og steriliseres i autoklave ved 115°C i ti minutter.

Pladerne bestryges. Der podes punktuelt paa pladerne.

Efter at der kan konstateres en god vaekst (10 til 20 dage), fjernes en del af vaeksten, og der skylles med Lugol-jod.

Positiv reaktion: hydrolyse af stivelse markeres ved klare omraader under eller rundt om bakterievaeksten; resten af substratet farves purpur.

- Aesculinhydrolase-aktivitet (Sneath & Collins, 1974)

Substrat:

Difco Bacto Peptone 10 g

Aesculin 1 g

Jerncitrat (Merck 3862) 0,05 g

Natriumcitrat 1 g

Destilleret vand 1 liter

Der blandes for at oploese, og maengder paa 6 ml fordeles i roer. Der steriliseres i autoklave ved 115°C i ti minutter.

Substratet er klart, men har en blaalig fluorescens.

Positiv reaktion: hydrolyse af aesculin markeres ved udvikling af brun farve sammen med bortfald af flourescens. Dette kan konrtolleres ved anvendelse af en ultravioletlampe.

LITTERATURHENVISNINGER

Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218.

Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147-152.

Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, 21-23.

Hugh, R. and Leifson, F., 1953. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-26.

Janse, J. D. and Van Vaerenbergh, J. The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., No 17, 1987, pp. 1-10.

Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703.

Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-118.

Lelliott, R. A., E. Billing and A. C. Hayward, 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.

Lelliott, R. A. and P. W. Sellar 1976. The detection of latent ring rot (Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101-106.

Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp.

Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. 2nd ed., Williams and Wilkins Company, Baltimore.

Sneath, P. H. A. and V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of a Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527.

(1) En alternativ ekstraktionsmetode anfoeres af Dinesen, 1984.

(2) Der er tegn paa (Janse og Van Vaerenberg, 1987), at nedfrysning kan nedsaette levedygtigheden hos Corynebacterium sepedonicum. Opslaemning af toerstoffet i 10 % glycerol kan loese problemet.

BILAG II

1. Ved formodet forekomst, som er konstateret ved en immunofluorescens test efter metoden i bilag I, og som vil blive bekraeftet eller afkraeftet, naar alle test efter den naevnte metode er afsluttet, foretages der tilbageholdelse og opbevaring af:

- saa vidt muligt alle udtagne knolde eller planter

- eventuelt resterende ekstrakt og yderligere tilberedte immunofluorescensglas

indtil alle test efter den naevnte metode er afsluttet.

2. Hvis skadegoererens tilstedevaerelse bekraeftes, foretages der tilbageholdelse og opbevaring af:

- det i nr. 1 naevnte materiale, og

- en konserveret proeve af det inficerede aegplantemateriale, der er podet med knolden eller planteekstrakten, og

- den isolerede kultur af skadegoereren

i mindst en maaned efter meddelelsesproceduren som omhandlet i artikel 5, stk.2.

BILAG III

1. Foelgende elementer tages i betragtning ved bestemmelsen af omfanget af en sandsynlig infektion som omhandlet i artikel 5, stk. 1, litra b):

- knolde eller planter, der er dyrket paa et produktionssted, som er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a)

- et eller flere produktionssteder eller steder med en vis produktionsmaessig tilknytning til de knolde eller planter, der er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), herunder dem, der deler produktionsudstyr og -faciliteter direkte eller ved en maskinstation

- knolde eller planter, der er produceret paa produktionssteder som omhandlet i foregaaende led, eller som befandt sig paa saadanne produktionssteder i den periode, hvor de knolde eller planter, der er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), befandt sig paa saadanne steder eller produktionssteder, som omhandlet i foerste led

- kartoffeloplagringssteder, der haandterer kartofler fra ovennaevnte produktionssteder

- maskiner, koeretoejer, fartoejer, lagre eller enheder deraf og alle andre genstande, herunder emballage, der kan have vaeret i kontakt med knolde eller planter, som er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), i loebet af de forudgaaende tolv maaneder, eller naar det er hensigtsmaessigt

- knolde eller planter, der har vaeret opbevaret i eller vaeret i kontakt med nogen af de anlaeg eller genstande, som er anfoert i foregaaende led, inden disse anlaeg og genstande blev rengjort og desinficeret; og

- som resultat af undersoegelserne i henhold til artikel 6, knolde eller planter med samme klonale oprindelse som knolde eller planter, der er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), og med hensyn til hvilke undersoegelser viser, at de sandsynligvis er inficeret.

2. Foelgende elementer tages i betragtning ved bestemmelsen af den mulige udbredelse som omhandlet i artikel 5, stk. 1, litra c):

- naerheden af andre produktionssteder, hvor der dyrkes kartofler eller andre vaertsplanter

- de faelles traek ved de paagaeldende laeggekartofler.

3. Oplysningerne i den meddelelse, der er omhandlet i artikel 5, stk. 2, foerste afsnit, omfatter:

- for kartoffelsendinger eller -partier, der er erklaeret for inficeret: de certifikater, som er omhandlet i artikel 7 eller 8 i direktiv 77/93/EOEF, og henholdsvis pas- eller registreringsnummer

- sortsnavn for laeggekartoflers vedkommende og saa vidt muligt i alle andre tilfaelde

- en detaljeret beskrivelse af den erklaerede infektion og det afgraensede omraade

- forhaandenvaerende ekstrakt, tilberedte immunofluorescensglas, inficeret aegplantemateriale og isoleret kultur af skadegoereren fra den test, hvorved skadegoererens tilstedevaerelse blev bekraeftet.

BILAG IV

1. Foranstaltningerne under officielt tilsyn som omhandlet i artikel 7, stk. 1, til bortskaffelse af knolde eller planter, der er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), omfatter:

- anvendelse til industriel forarbejdning ved direkte og oejeblikkelig levering til en forarbejdningsvirksomhed med hensigtsmaessige faciliteter til bortskaffelse af affald, for hvilke det er fastslaaet, at der ikke er nogen aabenbar risiko for, at skadegoereren breder sig, og mindst med faciliteter til desinfektion af lageromraader og afgaaende koeretoejer, eller

- andre foranstaltninger under forudsaetning af, at det er fastslaaet, at der ikke er nogen aabenbar risiko for, at skadegoereren breder sig; disse foranstaltninger skal meddeles Kommissionen og de oevrige medlemsstater.

2. Passende anvendelse eller bortskaffelse under tilsyn af medlemsstaternes officielle ansvarlige organer af knolde eller planter, som er erklaeret for sandsynligvis inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra b), og som omhandlet i artikel 7, stk. 2, er:

- anvendelse som spisekartofler, faerdigpakket til direkte levering og anvendelse uden ompakning, og bestemt til direkte levering og anvendelse, eller

- anvendelse som industrikartofler og bestemt til direkte og oejeblikkelig levering til en forarbejdningsvirksomhed med hensigtsmaessige faciliteter til bortskaffelse af affald og desinfektion, eller

- anden anvendelse eller bortskaffelse under forudsaetning af, at det fastslaas, at der ikke er nogen aabenbar risiko for, at skadegoereren breder sig.

3. De passende metoder til rengoering og desinfektion af de genstande, der omhandles i artikel 7, stk. 3, er dem, for hvilke det er fastslaaet, at der ikke er nogen aabenbar risiko for, at skadegoereren breder sig, og at de anvendes under tilsyn af medlemsstaternes myndigheder.

4. Den raekke foranstaltninger, der skal traeffes af medlemsstaterne i det afgraensede omraade, jf. artikel 5, stk. 1, litra c), og artikel 7, stk. 4, omfatter foelgende:

4.1. For produktionssteder, der er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), gaelder foelgende:

a) paa marker, der er erklaeret for inficeret, jf. artikel 5, stk. 1, litra a):

i) - i mindst de foerste tre vaekstaar efter det vaekstaar, hvori der blev afgivet erklaering om angreb

- traeffes der foranstaltninger til at udrydde gengroninger og andre naturligt forekommende vaertsplanter for skadegoereren

- maa der ikke plantes/anvendes kartoffelknolde, -planter eller egentlige laeggekartofler eller andre naturligt forekommende vaertsplanter for skadegoereren eller planter, for hvilke det er fastslaaet, at der er en aabenbar risiko for, at skadegoereren overlever eller breder sig, foer marken er fundet fri for gengroninger i mindst to paa hinanden foelgende vaekstaar

- i den foerste vaekstsaeson efter den periode, der er omhandlet i det foregaaende led, maa der kun anvendes officielt certificerede laeggekartofler, som er bestemt til produktion af spise-, foder- eller industrikartofler, og der skal foretages en officiel undersoegelse som omhandlet i artikel 2, stk. 1

- i vaekstsaesonen efter den i det foregaaende led omhandlede saeson skal der efter en passende rotationscyklus anvendes officielt certificerede laeggekartofler til produtkion af laeggekartofler eller andre kartofler, og der skal foretages en officiel undersoegelse som omhandlet i artikel 2, stk. 1, eller

ii) - i de foerste fire vaekstaar efter det vaekstaar, hvori der blev afgivet erklaering om infektion

- traeffes der foranstaltninger til at udrydde gengroninger og andre naturligt forekommende vaertsplanter for skadegoereren, og

- braklaegges marken og bevares som brakmark eller omdannes til og bevares som permanent graesareal med hyppig taet klipning eller intensiv graesning

- i den foerste vaekstsaeson efter den periode, der er omhandlet i det foregaaende led, skal der anvendes officielt certificerede laeggekartofler til produktion af spise-, foder- eller industrikartofler, og der skal foretages en officiel undersoegelse som omhandlet i artikel 2, stk. 1

b) andre marker:

- i det foerste vaekstaar efter det vaekstaar, hvori der blev afgivet erklaering om infektion

- maa der enten ikke plantes/anvendes kartoffelknolde, -planter eller egentlige laeggekartofler eller andre naturligt forekommende vaertsplanter for skadegoereren, og der skal traeffes foranstaltninger til at udrydde gengroninger, eller

- maa der kun anvendes officielt certificerede laeggekartofler, der er bestemt til produktion af spise-, foder- eller industrikartofler, hvis de officielle ansvarlige organer har forvisset sig om, at risikoen for gengroninger og andre naturligt forekommende vaertsplanter for skadegoereren er fjernet

- i mindst de foerste to vaekstaar efter det vaekstaar, der er omhandlet i det foregaaende led, maa der kun anvendes officielt certificerede laeggekartofler, der er bestemt til produktion af enten laeggekartofler eller andre kartofler

- i hvert af de vaekstaar, der er omhandlet i de foregaaende led, skal der traeffes foranstaltninger til at udrydde gengroninger og naturligt forekommende vaertsplanter for skadegoereren, og der skal foretages en officiel undersoegelse som omhandlet i artikel 2, stk. 1

- hvis der anvendes officielt certificerede laeggekartofler, der er bestemt til produktion af spise-, foder- eller industrikartofler, i det foerste vaekstaar efter det vaekstaar, hvori der blev afgivet erklaering om infektion, skal kartofler i vaekst kontrolleres paa passende tidspunkter, og gengroninger skal undersoeges for skadegoereren

c) umiddelbart efter erklaeringen om infektion, jf. artikel 5, stk. 1, litra a), og i hver af de foelgende vaekstaar til og med den foerste tilladte vaekstsaeson paa den eller de marker, der er erklaeret for inficeret, som omhandlet i litra a), skal alle maskiner og lagerfaciliteter paa produktionsstedet, der benyttes i kartoffelproduktionen, efter omstaendighederne rengoeres eller desinficeres ved hjaelp af passende metoder, jf. nr. 3

d) i de produktionssystemer, hvor det er muligt helt at udskifte vaekstmediet:

- maa der ikke plantes/anvendes knolde, planter eller egentlige laeggekartofler, medmindre produktionsenheden er underkastet foranstaltninger under officielt tilsyn til at udrydde skadegoereren og fjerne alt kartoffelmateriale eller andet Solanacea-materiale, herunder mindst en fuldstaendig udskiftning af vaekstmedium og rengoering og desinfektion af produktionsenheden og alt udstyr, og de officielle ansvarlige organer derefter har godkendt, at der produceres kartofler, og

- skal kartoffelproduktionen foregaa med officielt certificerede laeggekartofler eller miniknolde eller mikroplanter, der hidroerer fra testet materiale.

4.2. Inden for det afgraensede omraade skal medlemsstaterne, uden at det beroerer foranstaltningerne i nr. 4.1:

a) omgaaende efter den erklaerede infektion og i mindst tre vaekstsaesoner herefter:

- soerge for, at deres officielle ansvarlige organer foerer tilsyn med steder, hvor der dyrkes, opbevares og haandteres kartofler, samt med steder, hvor der i oevrigt anvendes kartoffelmaskineri

- om fornoedent kraeve rengoering og desinfektion af maskiner og lagre paa saadanne steder ved hjaelp af passende metoder som anfoert i nr. 3

- kraeve, at der kun anvendes certificerede laeggekartofler inden for omraadet

- kraeve, at alle hoestede laeggekartofler haandteres saerskilt fra spise-, foder- eller industrikartofler overalt i omraadet

- foretage en officiel undersoegelse som omhandlet i artikel 2, stk. 1

b) om fornoedent opstille et program for udskiftning af alle laeggekartofler i loebet af en passende periode.

De foranstaltninger, der ivaerksaettes i henhold til nr. 4.2, og registreringsnumrene paa producenter, faelleslagre og ekspeditionscentre i det afgraensede omraade meddeles hvert aar de oevrige medlemsstater og Kommissionen.