++++

KOMMISSIONENS DIREKTIV

af 25 . juli 1980

om faellesskabsanalysemetoden til bestemmelse af indholdet af erucasyre i olier og fedtstoffer , der uden yderligere forarbejdning er bestemt til konsum , samt i foedevarer , der tilsaettes olier eller fedtstoffer

( 80/891/EOEF )

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,

under henvisning til Raadets direktiv 76/621/EOEF af 20 . juli 1976 om fastsaettelse af det maksimale indhold af erucasyre i olier og fedtstoffer , der uden yderligere forarbejdning er bestemt til konsum , samt i foedevarer , der tilsaettes olier eller fedtstoffer ( 1 ) , saerlig artikel 3 , og

ud fra foelgende betragtninger :

I artikel 2 i direktiv 76/621/EOEF fastsaettes det , at fra den 1 . juli 1979 maa indholdet af erucasyre i de i artikel 1 i naevnte direktiv omhandlede produkter , beregnet paa grundlag af det samlede fedtsyreindhold i de fedtstoffer , de indeholder , ikke overstige 5 % ;

i artikel 3 i direktiv 76/621/EOEF fastsaettes det , at indholdet af erucasyre skal kontrolleres efter en faellesskabsanalysemetode ;

I Kommissionens forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 af 23 . september 1968 om udtagelse og reduktion af proever samt om bestemmelse af indholdet af olie , urenheder og fugtighed i olieholdige froe ( 2 ) , fastsaettes i bilag VI , indsat ved forordning ( EOEF ) nr . 72/77 ( 3 ) , en analysemetode til bestemmelse af indholdet af erucasyre i raps - og rypsfroe ; denne metode boer anvendes ved forudvaelgelse ;

under normale betingelser for analyse af olie - og fedtstoffer ved gasvaeskechromatografi af bestanddelen af fede syrer er det ikke muligt at skelne mellem erucasyre og andre isomere af docosensyre som f.eks . cetoleinsyre ;

det er noedvendigt at bestemme erucasyreniveauet i olier og fedtstoffer samt i levnedsmidler tilsat olier eller fedtstoffer , som kan indeholde cetoleinsyre og andre isomere af docosensyre ;

det er ikke noedvendigt at bestemme erucasyreniveauet i olier og fedtstoffer samt i levnedsmidler tilsat olier og fedtstoffer , som ved en foreloebig analyse viser sig at indeholde maksimalt 5 % docosensyre eller 5 % cisdocosensyre ;

denne analysemetode anses for den mest hensigtsmaessige i oejeblikket , indtil der fastlaegges en analysemetode , der tillader en mere noejagtig bestemmelse af erucasyre ;

de i denne direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelsen fra Den staaende Levnedsmiddelkomité -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV :

Artikel 1

Medlemsstaterne foreskriver , at de noedvendige analyser til bestemmelse af erucasyreindholdet i de i artikel 1 i direktiv 76/621/EOEF naevnte produkter udfoeres i overensstemmelse med artikel 2 .

Artikel 2

1 . Som forudvaelgelse bestemmes

a ) enten totalindholdet af fede docosensyrer i de i artikel 1 naevnte produkter bestemt ved den i bilag VI til forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 beskrevne metode ,

b ) eller totalindholdet af fede cis-docosensyrer i de i artikel 1 naevnte produkter bestemt ved den i bilag VI til forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 beskrevne metode under anvendelse af gasvaeskechromatografi under saadanne betingelser at cis - og trans-isomerer af docosensyrer adskilles ; de velegnede stationaere faser for denne analyse er f.eks . af typen " cyanopropylpolysiloxan " eller flydende krystaller .

2 . Hvis totalindholdet

a ) af fede docosensyrer bestemt i overensstemmelse med stk . 1 , litra a ) , eller

b ) af fede cis-docosensyrer bestemt i overensstemmelse med stk . 1 , litra b ) ,

i de i artikel 1 naevnte produkter , beregnet paa totalindholdet af fede syrer i den fede fase , ikke overstiger 5 % behoeves ingen anden bestemmelse . I modsat fald bestemmes indholdet af erucasyre efter den metode , der er angivet i bilaget .

Artikel 3

Medlemsstaterne saetter de noedvendige love og administrative bestemmelser i kraft for senest den 1 . februar 1982 at efterkomme dette direktiv . De underretter straks Kommissionen herom .

Artikel 4

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .

Udfaerdiget i Bruxelles , den 25 . juli 1980 .

Paa Kommissionens vegne

Etienne DAVIGNON

Medlem af Kommissionen

( 1 ) EFT nr . L 202 af 28 . 7 . 1976 , s . 35 .

( 2 ) EFT nr . L 239 af 28 . 9 . 1968 , s . 2 .

( 3 ) EFT nr . L 12 af 15 . 1 . 1977 , s . 11 .

BILAG

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF ERUCASYRE I OLIER OG FEDTSTOFFER , DER UDENYDERLIGERE FORARBEJDNING ER BESTEMT TIL KONSUM , SAMT I FOEDEVARER , DER TILSAETTES OLIER ELLER FEDSTOFFER

I . INDLEDNING

1 . PROEVEFORBEREDELSE

1.1 . Generelt

Analyseproevens masse skal normalt vaere paa 50 g , medmindre en stoerre maengde er noedvendig til en specifik bestemmelse .

1.2 . Proeveforberedelse

Proeven boer homogeniseres forud for analysen .

1.3 . Opbevaring

Den saaledes forberedte proeve boer altid opbevares i en lufttaet beholder .

2 . REAGENSER

2.1 . Vand

2.1.1 . Naar der er tale om vand til oploesning , fortyndinger og vaskning , drejer det sig altid om destilleret vand eller demineraliseret vand af mindst tilsvarende renhed .

2.1.2 . Naar der er tale om en " oploesning " eller en " fortyndning " , er der , hvor intet andet er angivet , tale om en vandig oploesning .

2.2 . Kemikalier

Alle kemikalier skal , hvor intet andet er oplyst , vaere af analyseren kvalitet .

3 . APPARATUR

3.1 . Apparaturfortegnelse

Apparaturfortegnelsen omfatter specialapparatur med saerlige specifikationer .

3.2 . Analysevaegt

Analysevaegtens foelsomhed skal vaere paa 0,1 mg eller bedre .

4 . ANGIVELSE AF RESULTATER

4.1 . Resultater

Det paa analyseattesten naevnte resultat er et gennemsnit paa grundlag af mindst to bestemmelser , hvis gentagelighed er tilfredsstillende .

4.2 . Procentberegning

Medmindre andet er fastsat , udtrykkes resultaterne i procent ( m/m ) af den samlede maengde af f * tsyrer i proeven , saaledes som laboratoriet har modtaget den .

4.3 . Antal betydende cifre

Resultatet maa kun angives med saa mange betydende cifre , som metodens praecision giver mulighed for .

II . BESTEMMELSE AF ERUCASYRE

1 . FORMAAL OG ANVENDELSESOMRAADE

Med samme metode er det muligt at bestemme indholdet af erucasyre i :

a ) Olier og fedtstoffer indeholdende cetoleinsyre ( en cis-isomer af C22-syre , som forekommer i fiskeolier ) , og

b ) Haerdede olier og fedtstoffer indeholdende trans - og cis-isomer af C22-syre .

2 . DEFINITION

Indhold af erucasyre : erucasyre bestemt efter den her angivne metode .

3 . PRINCIP

Adskillelse af methylesterne af fede syrer ved tyndtlags chromatografi ved lav temperatur og soelvnitratimpraegnering samt kvantitativ bestemmelse af de adskilte estere ved gas-vaeskechromatografi .

4 . REAGENSER

4.1 . Diethylether , friskdestilleret peroxidfri .

4.2 . n-Hexan

4.3 . Kieselgel G til tyndtlagschromatografi

4.4 . Kieselgel til soejlechromatografi

4.5 . Soelvnitratoploesning , 200 g/l . Oploes 24 g soelvnitrat i vand og fyldt op til 120 ml med vand .

4.6 . Methylerucatoploesning ( 5 mg/ml ) . 50 mg methylerucat oploeses i nogle ml n-Hexan og fortyndes til 10 ml med n-Hexan .

4.7 . Methyltetracosanoat , intern standardoploesning , 0,25 mg/ml . 25 mg methyltetracosanoat oploeses i nogle ml n-Hexan ( som i pkt . 4.6 ) og fortyndes til 100 ml med n-Hexan .

4.8 . Udviklingsvaedske : Toluen og n-Hexan 90 : 10 ( v/v ) .

4.9 . 2,7 dichlorofluoresceinoploesning , 0,5 g/l . 50 mg 2,7 dichlorofluorescein oploeses under opvarmning og omroering i 100 ml af en 50 % vandig methanoloploesning .

5 . APPARATUR

5.1 . Apparatur til tyndtlags chromatografi , bestaaende af :

5.1.1 . En dybfryser , som er i stand til at holde udviklingstanken og dennes indhold paa en temperatur paa minus 20 * C til minus 25 * C .

5.1.2 . Glasplader , 200 mm gange 200 mm .

5.1.3 . Ultraviolet lampe .

5.1.4 . En glassoejle , 200 mm lang og med en indvendig diameter paa 10 mm , forsynet med filtre af glasuld eller sintret glas , eller smaa tragte med filtre af sintret glas .

5.1.5 . Applikator til anbringelse af oploesninger i form af et snaevert baand eller en streng paa en tyndlagsplade .

5.2 . Apparatur til gas-vaeskechromatografi sammen med en elektronisk integrator som beskrevet i afsnit III i bilag VI til forordning ( EOEF ) nr . 72/77 .

6 . FREMGANGSMAADE

6.1 . Fremstilling af fedtsyremethylestere

Der udtages en repraesentativ proeve paa ca . 400 mg olie eller fedt og fremstilles en oploesning indeholdende ca . 25-50 mg/ml fedtsyremethylestere i hexan efter den metode , der er beskrevet i afsnit II 3 i bilag VI til forordning ( EOEF ) nr . 72/77 .

6.2 . Tyndlagschromatografi

6.2.1 . Tilberedelse af plader

60 g silicagel ( 4.3 ) anbringes i en 500 ml rundbundet kolbe sammen med 120 ml soelvnitratoploesning ( 4.5 ) og rystes i et minut for at opnaa en fuldstaendigt homogen opslemning . Opslemningen udbredes paa normal maade paa pladerne , idet lagtykkelsen afpasses til 0,5 mm . Denne maengde opslemning er tilstraekkelig til forberedelse af fem 200 gange 200 mm plader .

Man lader pladerne toerre delvis i luften ( helst i moerke i ca . 30 minutter ) , hvorefter de toerres helt og aktiveres i en ovn ved 100 C to timer og 30 minutter . Pladerne boer benyttes snarest muligt efter aktivering , i det de ellers maa opbevares omhyggeligt i et moerkt skab og aktiveres inden brugen . NB : aktivering ved 110 C i en time kan vise sig at vaere tilstraekkeligt , forudsat at pladerne ikke er blevet moerke ) . Der traekkes linjer gennem belaegningen 10 mm fra siderne og fra toppen af hver plade inden brugen for at reducere kanteffekter under fremkaldelsen .

6.2.2 . Applikering af methylestere

Ved hjaelp af applikatoren ( 5.1.5 . ) anbringes 50 ml af den forberedte proeve af methylesteroploesning ( 6.1 . ) i en smal streg ca . 50 mm lang , mindst 40 mm fra siden af pladen og 10 mm fra bunden . Paa lignende maade applikeres 100ml af en oploesning indeholdende lige rumfang af den forberedte methylesteroploesning ( 6.1 . ) og methylerucatoploesning ( 4.6 . ) Paa grund af belaegningens skroebelige natur er det noedvendigt at udvise saerlig omhu under applikeringen af oploesningerne ( NB : om oensket kan der applikeres 50ml methylerucatoploesning ( 4.6 . ) paa pladen som ovenfor for at bidrage til identifikation af methylerucatbaandet efter fremkaldelsen ) . Efter applikeringen af methylestere kan man lade den nederste kant af pladen staa i diethylether , indtil etheren naar ca . 5 mm op over det omraade , hvor proeven er applikeret . Dette vil koncentrere methylesterne i et snaevert baand . NB : om oensket kan der applikeres 50ml af methylerucatoploesningen ( 4.6 . ) paa pladen for at lette identifikationen af methylerucatbaandet efter fremkaldelsen ( se fig . 1 ) .

6.2.3 . Udvikling af plader

Der haeldes tilstraekkeligt med udviklingsvaedske ( 4.8 . ) i tanken til at give en dybde paa ca . 5 mm , hvorefter tanken med laag anbringes i en dybfryser ( 5.1.1 . ) ved minus 25 * C eller saa naer ved denne temperatur som muligt . Efter to timer anbringes pladen omhyggeligt i tanken , idet man lader oploesningen stige til mellem ca . halvdelen og to tredjedele af pladens hoejde . Derefter fjernes pladen , og oploesningen fordampes forsigtigt fra pladen med en stroem af nitrogen . Pladen anbringes paa ny i tanken hvor man lader oploesningsmidlet stige op til pladens top . Herefter fjernes pladen igen og toerres med en stroem af nitrogen ligesom foer , hvorefter den sproejtes med 2,7 dichlorofluoresceinoploesning ( 4.9 . ) .

Set under ultraviolet lys kan methylerucat i proeven lokaliseres ved reference til det forstaerkede baand i proeven , hvortil methylerucat er blevet tilsat ( se figur ... )

6.2.4 . Adskillelse af methylesterfraktionerne

Det methylerucatbaand , der har udviklet sig fra proeven , skrabes af kvantitativt i et 50 ml baegerglas . Den silicagel over og under methylerucatbaandet , som indeholder alle de oevrige fraktioner af fedtsyremethylestere , afskrabes kvantitivt i et andet 50 ml baegerglas . Til hvert baegerglas tilsaettes 1,0 ml methyltetracosanoat standardoploesning ( 4.7 . ) og 10 ml diethylether ( 4.1 . ) . Der omroeres , og baegrenes indhold overfoeres hver for sig til soejlerne eller filtrene ( 5.1.4 . ) , som indeholder ca . 1 g silicagel ( 4.4 . ) , og esterne udtraekkes ved hjaelp af tre eller fire 10 ml portioner diethylether . Filtraterne opsamles i smaa kolber og inddampes til smaa rumfang under en svag nitrogenstroem og overfoeres til smaa glasroer med tilspidset bund . Alt oploesningsmiddel fjernes ved fordampning under nitrogen paa en saadan maade , at methylesterne koncentreres paa bunden af roerene , hvorefter methylesterne oploeses i ca . 25-50ml hexan ( 4.2 . )

6.3 . Gas-vaeskechromatografi

6.3.1 . Man benytter den fremgangsmaade der er beskrevet i afsnit III i bilag VI til Kommissionens forordning ( EOEF ) nr . 72/77 , og indsproejter 1-2 ml af de oploesninger af methylestere , der er fremkommet fra ( i ) den fraktion , der indeholder methylerucat , og ( ii ) de fraktioner , der indeholder resten af fedtsyremethylesterne .

6.3.2 . Fra den elektroniske integrator faas foelgende top-arealer :

i ) fra chromatogrammet for den fraktion , som indeholder methylerucat :

a ) methylerucat , ( E ) ;

b ) intern standard , ( L1 ) ;

c ) det totale areal af toppe for methylester med undtagelse af den interne standard ( EF ) .

ii ) fra chromatogrammet med fraktioner indeholdende resten af fedtsyremethylesterne :

a ) det totale top-omraade med undtagelse af den interne standard , ( RF ) ;

b ) interne standard . ( L2 ) .

7 . ANGIVELSE AF RESULTATER

7.1 . Beregningsmetode og formel

7.1.1 . Proevens indhold af erucasyre udtrykt som methylester i procent af den totale maengde af methylestere af fede syrer i proeven faas af udtrykket :

E/L1 ( EF/L1 + RF/L2 ) gange 100

hvor

E , EF , RF , L1 og L2 er de under 6.3.2 . omtalte top-omraader , om noedvendigt korrigeret ved anvendelse af kalibreringsfaktorer .

Indholdet af methylerucat opnaaet ved ovenstaaende formel svarer til indholdet af erucasyre udtrykt i procent af det totale indhold fedtsyrer .

7.1.2 . Hvis topomraadernes areal er udtrykt i procent beregnes vaerdierne EF og RF paa foelgende maade :

EF = 100 - L1

RF = 100 - L2 .

7.1.3 . Beregningsmetoden ( 7.1.1 . ) forudsaetter , at maengden af tetraconsansyre i proeven er ubetydelig . Naar en vis maengde af denne syre er til stede , kan maengden af tetraconsansyre ( L2 ) paa kromatogrammet over fraktioner indeholdende de oevrige fedtsyremethylestere reduceres til :

L2 - T2

hvor

T2 = T0P2/P0

T2 = Arealet af topomraadet for tetraconsansyre methylesterne stammende fra proeven , som udgoer en del af det topomraade , der er tilskrevet den interne standard paa kromatogrammet over den resterende fraktion af fedtsyremethylester .

P2 = Arealet af topomraadet for palmitinsyre methylester paa kromatogrammet over den resterende fraktion .

T0 = Arealet af topomraadet for tetraconsansyre methylester paa kromatogrammet over det samlede antal fedtsyremethylester bestemt ved den analyse , der er gengivet i artikel 2 i direktivet .

P0 = Arealet af topomraadet for palmitinsyre methylester paa kromatogrammet over det samlede antal fedtsyrer bestemt ved den analyse , der er gengivet i artikel 2 i direktivet .

7.1.4 . Udledning af formel

Fedtsyreindholdet af den fraktion , der indeholder methylerucat , udtrykt som procentdel af proevens samlede indhold af fede syrer , er givet ved udtrykket :

EF/L1 / ( EF/L1 + RF/L2 ) gange 100 eller EF/L1 ( EF/L1 + RF/L2 ) gange 100 .

Indholdet af erucasyre i den fraktion , der indeholder methylerucat , udtrykt som procentdel af de fede syrer i metylerucatfraktionen , faas af udtrykket :

E/EF

Herefter er proevens indhold af erucasyre , udtrykt i procent af totalindholdet af fede syrer , givet ved :

EF/L1 ( EF/L1 + RF/L2 ) gange E/EF gange 100 eller E/L1 ( EF/L1 + RF/L2 ) gange 100 .

7.1.5 . Gentagelighed

Forskellen mellem resultaterne af to parallele bestemmelser udfoert paa samme proeve under samme betingelser og af samme person maa ikke overstige 10 % i relativ vaerdi eller 0,5 g pr . 100 g proeve i absolut vaerdi af den hoejeste af de bestemte vaerdier .

FIGUR : JFR . EFT