DA Den Europæiske Unions Tidende L 54/1

KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR152/2009

af 27. januar 2009

om prøveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder

(EØS-relevant tekst)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 882/2004 af 29. april 2004 om offentlig kontrol med henblik på verifikation af, at foderstof- og fødevarelovgivningen samt dyresundheds- og dyrevelfærdsbestemmelserne overholdes (1), særlig artikel 11, stk. 4, litra a), b) og c), og

ud fra følgende betragtninger:

(1) Følgende retsakter blev vedtaget til gennemførelse af direktiv 70/373/EØF og gælder fortsat i henhold til artikel 61, stk. 2, i forordning (EF) nr. 882/2004: — Kommissionens første direktiv 71/250/EØF af 15. juni 1971 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol af foderstoffer (2) — Kommissionens andet direktiv 71/393/EØF af 18. november 1971 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer (3) — Kommissionens tredje direktiv 72/199/EØF af 27. april 1972 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer (4) — Kommissionens fjerde direktiv 73/46/EØF af 5. december 1972 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer (5) — Kommissionens første direktiv 76/371/EØF af 1. marts 1976 om fastsættelse af fællesskabsmåder for udtagning af prøver til den officielle kontrol med foderstoffer (6) — Kommissionens syvende direktiv 76/372/EØF af 1. marts 1976 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (7) — Kommissionens ottende direktiv 78/633/EØF af 15. juni 1978 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (8) — Kommissionens niende direktiv 81/715/EØF af 31. juli 1981 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (9) — Kommissionens tiende direktiv 84/425/EØF af 25. juli 1984 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (10) — Kommissionens direktiv 86/174/EØF af 9. april 1986 om fastsættelse af metoden til beregning af næringsværdien i foderblanding til fjerkræ (11) — Kommissionens ellevte direktiv 93/70/EØF af 28. juli 1993 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (12) — Kommissionens tolvte direktiv 93/117/EF af 17. december 1993 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (13) — Kommissionens direktiv 98/64/EF af 3. september 1998 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til bestemmelse af aminosyrer, råfedt og olaquindox i foderstoffer og om ændring af direktiv 71/393/EØF (14) — Kommissionens direktiv 1999/27/EF af 20. april 1999 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til bestemmelse af amprolium, diclazuril og carbadox i foderstoffer og om ændring af direktiv 71/250/EØF og 73/46/EØF og ophævelse af direktiv 74/203/EØF (15) — Kommissionens direktiv 1999/76/EF af 23. juli 1999 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til bestemmelse af lasalocid natrium i foderstoffer (16) — Kommissionens direktiv 2000/45/EF af 6. juli 2000 om fællesskabsmetoder til bestemmelse af vitamin A, vitamin E og tryptophan i foderstoffer (17) — Kommissionens direktiv 2002/70/EF af 26. juli 2002 om krav til bestemmelse af indholdet af dioxin og dioxinlignende PCB i foderstoffer (18) — Kommissionens direktiv 2003/126/EF af 23. december 2003 om analysemetoder til bestemmelse af animalske bestanddele med henblik på officiel kontrol af foderstoffer (19).

(2) Idet direktiv 70/373/EØF blev afløst af forordning (EF) nr. 882/2004/2004, bør gennemførelsesretsakterne til samme direktiv afløses af én enkelt forordning. Samtidig bør metoderne tilpasses den udvikling, der er sket på det videnskabelige og teknologiske område. Metoder, der ikke længere udfylder deres formål på tilfredsstillende vis, bør udgå. Det er hensigten, at prøveudtagningsbestemmelserne på et tidspunkt skal opdateres for at tage hensyn til den seneste udvikling inden for metoderne til produktion, opbevaring, transport og markedsføring af foder, men det vil for nuværende være mest hensigtsmæssigt at fastholde de eksisterende prøveudtagningsbestemmelser.

(3) Direktiv 71/250/EØF, 71/393/EØF, 72/199/EØF, 73/46/EØF, 76/371/EØF, 76/372/EØF, 78/633/EØF, 81/715/EØF, 84/425/EØF, 86/174/EØF, 93/70/EØF, 93/117/EF, 98/64/EF, 1999/27/EF, 1999/76/EF, 2000/45/EF, 2002/70/EF og 2003/126/EF bør derfor ophæves.

(4) Foranstaltningerne i denne forordning er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Stående Komité for Fødevarekæden og Dyresundhed —

UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:

Artikel 1

Udtagning af prøver som led i den offentlige kontrol af foder, for så vidt angår bestemmelse af bestanddele, tilsætningsstoffer og uønskede stoffer, bortset fra rester af pesticider og mikroorganismer, foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag I.

Artikel 2

Klargøring af prøver til analyse og angivelse af resultater foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag II.

Artikel 3

Analyser som led i den offentlige kontrol af foder foretages efter de metoder, der er beskrevet i bilag III (Analysemetoder til kontrol af sammensætningen af fodermidler og foderblandinger), bilag IV (Analysemetoder til kontrol af indholdet af godkendte tilsætningsstoffer i foder), bilag V (Analysemetoder til kontrol for uønskede stoffer i foder) og bilag VI (Analysemetoder til bestemmelse af animalske bestanddele som led i den offentlige kontrol af foder).

Artikel 4

Næringsværdien af foderblandinger til fjerkræ beregnes som angivet i bilag VII.

Artikel 5

De i bilag VIII beskrevne analysemetoder til kontrol for ulovlig forekomst af fodertilsætningsstoffer, der ikke længere er tilladt, anvendes til verifikationsformål.

Artikel 6

Direktiv 71/250/EØF, 71/393/EØF, 72/199/EØF, 73/46/EØF, 76/371/EØF, 76/372/EØF, 78/633/EØF, 81/715/EØF, 84/425/EØF, 86/174/EØF, 93/70/EØF, 93/117/EF, 98/64/EF, 1999/27/EF, 1999/76/EF, 2000/45/EF, 2002/70/EF og 2003/126/EF ophæves.

Henvisninger til de ophævede direktiver gælder som henvisninger til nærværende forordning og læses efter sammenligningstabellerne i bilag IX.

Artikel 7

Denne forordning træder i kraft på tyvendedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.

Den anvendes fra den 26. august 2009

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat. Udfærdiget i Bruxelles, den 27. januar 2009. På Kommissionens vegne Androulla VASSILIOU Medlem af Kommissionen

(1) EUT L 165 af 30.4.2004, s. 1. Berigtiget i EUT L 191 af 28.5.2004, s. 1.

(2) EFT L 155 af 12.7.1971, s. 13.

(3) EFT L 279 af 20.12.1971, s. 7.

(4) EFT L 123 af 29.5.1972, s. 6.

(5) EFT L 83 af 30.3.1973, s. 21.

(6) EFT L 102 af 15.4.1976, s. 1.

(7) EFT L 102 af 15.4.1976, s. 8.

(8) EFT L 206 af 29.7.1978, s. 43.

(9) EFT L 257 af 10.9.1981, s. 38.

(10) EFT L 238 af 6.9.1984, s. 34.

(11) EFT L 130 af 16.5.1986, s. 53.

(12) EFT L 234 af 17.9.1993, s. 17.

(13) EFT L 329 af 30.12.1993, s. 54.

(14) EFT L 257 af 19.9.1998, s. 14.

(15) EFT L 118 af 6.5.1999, s. 36.

(16) EFT L 207 af 6.8.1999, s. 13.

(17) EFT L 174 af 13.7.2000, s. 32.

(18) EFT L 209 af 6.8.2002, s. 15.

(19) EUT L 339 af 24.12.2003, s. 78.

BILAG I PRØVEUDTAGNINGSMETODER 1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE Prøver, der er bestemt til offentlig kontrol af foder, udtages i overensstemmelse med de nedenfor anførte metoder. De således fremkomne prøver betragtes som repræsentative for de partier, hvoraf prøverne er udtaget. 2. PRØVEUDTAGNINGSPERSONALE Prøverne skal udtages af personer, som er autoriseret hertil af medlemsstaterne. 3. DEFINITIONER Parti: En mængde af et produkt, som udgør en enhed, og som efter sine egenskaber må antages at være ensartet. Enkeltprøve: En mængde, som er udtaget på et enkelt sted i partiet. Samleprøve: Et samlet antal enkeltprøver, udtaget fra et og samme parti. Reduceret prøve: En repræsentativ del af en samleprøve, fremkommet ved reduktion af denne. Slutprøve: En del af den reducerede prøve eller af den homogeniserede samleprøve. 4. APPARATUR 4.1. Det apparatur, der anvendes til prøveudtagning, skal være udført i materialer, der ikke kan forurene de produkter, der skal udtages prøver af. Medlemsstaterne kan officielt godkende sådant apparatur. 4.2. Anbefalet apparatur til udtagning af prøver af foder i fast form 4.2.1. Manuel prøveudtagning 4.2.1.1. Skovl med flad bund og lodrette sider 4.2.1.2. Prøveudtagningsspyd med lang spalte eller inddelt i kamre. Prøveudtagningsspyddets dimensioner skal være afpasset efter de forhold, hvorunder partiet befinder sig (beholderens dybde, sækkenes dimensioner osv.), og efter størrelsen af de partikler, foderet består af. 4.2.2. Mekanisk prøveudtagning Godkendt mekanisk apparatur kan anvendes til udtagning af prøver af foder i bevægelse. 4.2.3. Prøvedeler Til udtagning af enkeltprøver og til klargøring af reducerede prøver og slutprøver kan anvendes apparatur, der deler prøverne i tilnærmelsesvis lige store dele. 5. KVANTITATIVE KRAV 5.A. Stoffer eller produkter, der er homogent fordelt i foderet 5.A.1. Parti Størrelsen af partiet skal være således, at der kan udtages prøver af alle de dele, som partiet består af 5.A.2. Enkeltprøver 5.A.2.1. Uemballeret foder: Mindste antal enkeltprøver: 5.A.2.1.1. partier med en vægt på højst 2,5 tons 7 5.A.2.1.2. partier med en vægt på over 2,5 tons kvadratroden af 20 gange det antal tons, partiet vejer (1), dog højst 40 enkeltprøver 5.A.2.2. Emballeret foder: Mindste antal pakninger, der skal udtages prøver af (2): 5.A.2.2.1. Pakninger på over 1 kg: 5.A.2.2.1.1. partier på 1-4 pakninger samtlige pakninger 5.A.2.2.1.2. partier på 5-16 pakninger 4 5.A.2.2.1.3. partier på over 16 pakninger kvadratroden af antallet af pakninger, som partiet udgøres af (1), dog højst 20 pakninger 5.A.2.2.2. Pakninger på 1 kg og derunder: 4 5.A.2.3. Flydende eller halvflydende foder: Mindste antal beholdere, der skal udtages prøver af (2): 5.A.2.3.1. Beholdere på over 1 liter: 5.A.2.3.1.1. partier på 1-4 beholdere samtlige beholdere 5.A.2.3.1.2. partier på 5-16 beholdere 4 5.A.2.3.1.3. partier på over 16 beholdere kvadratroden af antallet af beholdere, som partiet udgøres af (1), dog højst 20 beholdere 5.A.2.3.2. Beholdere på 1 liter og derunder 4 5.A.2.4. Foderblokke og mineralske sliksten Mindste antal blokke eller sliksten, der skal udtages prøver af (2): én blok eller sliksten pr. parti på 25 enheder, dog højst 4 blokke eller sliksten 5.A.3. Samleprøve For hvert parti, der udtages prøver af, skal der foreligge en samleprøve. Den samlede mængde af de enkeltprøver, der udgør samleprøven, må ikke være mindre end følgende mængder: 5.A.3.1. Uemballeret foder 4 kg 5.A.3.2. Emballeret foder: 5.A.3.2.1. pakninger på over 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. pakninger på 1 kg og derunder vægten af indholdet af 4 originale pakninger 5.A.3.3. Flydende eller halvflydende foder: 5.A.3.3.1. beholdere på over 1 liter 4 liter 5.A.3.3.2. beholdere på 1 liter og derunder volumenindholdet af 4 originale beholdere 5.A.3.4. Foderblokke eller mineralske sliksten: 5.A.3.4.1. med en stykvægt på over 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. med en stykvægt på højst 1 kg vægten af 4 originale blokke eller sliksten 5.A.4. Slutprøver Slutprøver udtages af samleprøven, om nødvendigt ved reduktion af denne. Der kræves analyse af mindst én slutprøve. Mængden af slutprøven, der skal analyseres, må ikke være mindre end: Foder i fast form 500 g Flydende eller halvflydende foder 500 ml 5.B. Uønskede stoffer eller produkter, der sædvanligvis er inhomogent fordelt i foderet, som f.eks. aflatoxin, meldrøje, ricinus og crotalaria i fodermidler (3) 5.B.1. Parti jf. 5.A.1 5.B.2. Enkeltprøver 5.B.2.1. Uemballeret foder: jf. 5.A.2.1 5.B.2.2. Emballeret foder: Mindste antal enkeltprøver: 5.B.2.2.1. partier bestående af 1-4 pakninger samtlige pakninger 5.B.2.2.2. partier bestående af 5-16 pakninger 4 5.B.2.2.3. partier bestående af over 16 pakninger kvadratroden af antallet af pakninger, som partiet udgøres af (1), dog højst 40 pakninger 5.B.3. Samleprøver Antallet af samleprøver vil variere afhængigt af partiets størrelse. Minimumsantallet af samleprøver pr. parti er angivet nedenfor. Den samlede vægt af de enkeltprøver, der udgør den enkelte samleprøve, må ikke være mindre end 4 kg 5.B.3.1. Uemballeret foder Partiets vægt i tons: Mindste antal samleprøver pr. parti: indtil 1 1 over 1 og indtil 10 2 over 10 og indtil 40 3 over 40 4 5.B.3.2. Emballeret foder Partiets størrelse i antal pakninger: Mindste antal samleprøver pr. parti: 1-16 1 17-200 2 201-800 3 over 800 4 5.B.4. Slutprøver Slutprøver udtages af den enkelte samleprøve ved reduktion af denne. Der kræves analyse af mindst én slutprøve pr. samleprøve. Vægten af slutprøven, der skal analyseres, må ikke være mindre end 500 g. 6. FREMGANGSMÅDE VED UDTAGNING, KLARGØRING OG EMBALLERING AF PRØVERNE 6.1. Generelt Prøverne skal udtages og klargøres så hurtigt som muligt under hensyntagen til de forholdsregler, som er nødvendige for at undgå, at produktet forandres eller forurenes. Instrumenter og også overflader og beholdere, som er beregnet til at rumme prøverne, skal være rene og tørre. 6.2. Enkeltprøver 6.2.A. Stoffer eller produkter, der er homogent fordelt i foderet Enkeltprøver skal udtages tilfældigt fra hele partiet og have omtrent samme vægt. 6.2.A.1. Uemballeret foder Der foretages en imaginær opdeling af partiet i et antal omtrent lige store dele. Der vælges ved tilfældig udvælgelse et antal dele svarende til det påkrævede antal enkeltprøver, jf. 5.A.2, og der udtages mindst én prøve fra hver af disse dele. Prøveudtagningen kan om nødvendigt foretages, mens partiet er i bevægelse (pålæsning eller aflæsning). 6.2.A.2. Emballeret foder Efter at det i 5.A.2 fastsatte antal pakninger til prøveudtagning er udvalgt, udtages en del af indholdet af hver pakning ved hjælp af spyd eller skovl. Om nødvendigt kan prøverne udtages, efter at pakningerne er tømt hver for sig. Eventuelle klumper findeles, om nødvendigt ved at udskille dem og derpå føre dem tilbage til prøven; dette gøres separat for hver enkelt samleprøve. 6.2.A.3. Flydende eller halvflydende foder, som er homogent eller kan gøres homogent Efter at det i 5.A.2 fastsatte antal beholdere til prøveudtagning er udvalgt, homogeniseres indholdet om nødvendigt, og der udtages en prøve fra hver beholder. Enkeltprøverne kan eventuelt udtages under aftapning af partiet. 6.2.A.4. Flydende eller halvflydende foder, som ikke kan gøres homogent Efter at det i 5.A.2 fastsatte antal beholdere til prøveudtagning er udvalgt, udtages prøver fra forskellige niveauer. Enkeltprøver kan ligeledes udtages, når partiet aftappes, men de første fraktioner kasseres. Under alle omstændigheder må den samlede udtagne mængde ikke være mindre end 10 liter. 6.2.A.5. Foderblokke og mineralske sliksten Efter at det i 5.A.2 fastsatte antal blokke eller sliksten til prøveudtagning er udvalgt, udtages en del af hver blok eller sliksten som prøve. 6.2.B. Uønskede stoffer eller produkter, der sædvanligvis er inhomogent fordelt i foderet, som f.eks. aflatoxin, meldrøje, ricinus og crotalaria i fodermidler Der foretages en imaginær opdeling af partiet i et antal omtrent lige store dele, svarende til det i 5.B.3 fastsatte antal samleprøver. Hvis dette antal overstiger én, fordeles det samlede antal af de i 5.B.2 fastsatte enkeltprøver nogenlunde ligeligt mellem de forskellige imaginære dele. Derpå udtages prøver af tilnærmelsesvis samme størrelse (4) på en sådan måde, at den samlede udtagne prøvemængde fra hver imaginær del ikke er mindre end de 4 kg, der er minimumskravet for hver samleprøve. Enkeltprøver udtaget fra forskellige symbolske opdelinger må ikke sammenblandes. 6.3. Klargøring af samleprøver 6.3.A. Stoffer eller produkter, der er homogent fordelt i foderet Enkeltprøverne sammenblandes, så de udgør en enkelt samleprøve. 6.3.B. Uønskede stoffer eller produkter, der sædvanligvis er inhomogent fordelt i foderet, som f.eks. aflatoxin, meldrøje, ricinus og crotalaria i fodermidler Enkeltprøverne fra hver del af partiet sammenblandes i det antal samleprøver, der er angivet i 5.B.3, idet hver samleprøves oprindelse omhyggeligt noteres. 6.4. Klargøring af slutprøver Hver samleprøve opblandes omhyggeligt for at opnå en homogen prøve (5). Om nødvendigt reduceres samleprøven til mindst 2 kg eller 2 liter enten ved anvendelse af en mekanisk eller automatisk prøvedeler eller ved firdeling (kvartning) (reduceret prøve). Der klargøres mindst tre slutprøver af tilnærmelsesvis samme vægt, som opfylder de kvantitative krav i 5.A.4/5.B.4. Hver prøve anbringes i en egnet beholder. Alle nødvendige forholdsregler tages for at undgå, at prøven forurenes eller forfalskes, eller at sammensætningen ændres under transport eller opbevaring. 6.5. Emballering af slutprøver Beholdere/pakninger plomberes og forsynes med etiketter (hele etiketten skal anbringes inden for plomben) på en sådan måde, at beholderne eller pakningerne ikke kan åbnes, uden at plomben beskadiges. 7. REGISTRERING AF PRØVEUDTAGNINGEN Der skal foretages en registrering af hver prøveudtagning, således at hvert parti utvetydigt kan identificeres. 8. PRØVERNES BESTEMMELSESSTED For hver samleprøve sendes mindst én slutprøve så hurtigt som muligt til det autoriserede analyselaboratorium sammen med de for analysen nødvendige oplysninger. (1) Er den fremkomne størrelse ikke et helt tal, afrundes til nærmeste højere hele tal. (2) For pakninger eller beholdere, hvis indhold ikke overstiger 1 kg eller 1 liter, og for blokke eller sliksten, der ikke vejer over 1 kg stykket, skal en enkeltprøve udgøres af indholdet af en original pakning eller beholder, en blok eller en sliksten. (3) Det i punkt 5.A angivne gælder for kontrol med forekomst af aflatoxin, meldrøje, ricinus og crotalaria i fuldfoder og tilskudsfoder. (4) For så vidt angår emballeret foder udtages en del af pakningernes indhold ved hjælp af spyd eller skovl, om nødvendigt efter at pakningerne er tømt hver for sig. (5) Eventuelle klumper findeles, om nødvendigt ved at udskille dem og derpå føre dem tilbage til prøven; dette gøres separat for hver enkelt samleprøve.

BILAG II ALMINDELIGE BESTEMMELSER VEDRØRENDE ANALYSEMETODER FOR FODER A. KLARGØRING AF PRØVER TIL ANALYSE 1. Formål De nedenfor beskrevne fremgangsmåder omhandler klargøring til analyse af slutprøver, der efter udtagning sendes til kontrollaboratorierne i overensstemmelse med bilag I. Prøverne klargøres således, at de i overensstemmelse med analysemetoderne afvejede mængder er homogene og repræsentative for slutprøverne. 2. Forholdsregler Prøverne klargøres i overensstemmelse med de anvendte analysemetoder. Det er derfor uhyre vigtigt at sikre, at den prøveklargøringsprocedure, der følges, er optimal i forhold til den anvendte analysemetode. Alle nødvendige arbejdsgange udføres, så det så vidt muligt undgås at forurene prøven og ændre dens sammensætning. Formaling, blanding og sigtning gennemføres så hurtigt som muligt, og således at prøven udsættes mindst muligt for luft og lys. Der anvendes ikke kværne og andre formalingsapparater med væsentlig tilbøjelighed til at frembringe varme i prøven. Særligt varmefølsomt foder bør formales manuelt. Det sikres tillige, at apparaturet i sig selv ikke forurener med mikromineraler. Kan klargøringen ikke foretages uden væsentlige ændringer af prøvens vandindhold, bestemmes vandindholdet før og efter klargøringen efter den metode, der er fastsat i del A i bilag III. 3. Fremgangsmåde Prøven neddeles i passende delprøver til analyse og til referenceformål, idet der anvendes egnede neddelingsteknikker såsom brug af skovl, stationær neddeling eller rotationsneddeler. Neddeling efter keglemetoden og firdeling (kvartning) kan ikke anbefales, da disse metoder giver risiko for uhomogene delprøver. Prøven til referenceformål opbevares i en egnet, ren og tør beholder med lufttæt lukning, mens delprøverne til analyse på mindst 100 g klargøres som angivet nedenfor. 3.1. Foder, der kan formales direkte Medmindre andet er angivet, passeres hele prøven — om nødvendigt efter formaling — gennem en sigte med en kvadratisk maskevidde med 1 mm sider (som anbefalet i ISO R565). Undgå overdreven formaling. Den sigtede prøve blandes og opsamles i en egnet, ren og tør beholder med lufttæt lukning. Prøven blandes igen umiddelbart før afvejning til analyse. 3.2. Foder, der kan formales efter tørring Medmindre andet er angivet for analysemetoden, tørres prøven, så den får et vandindhold på 8–12 %, i overensstemmelse med den under punkt 4.3 i metoden til bestemmelse af vandindhold anførte fortørring (jf. del A i bilag III). Der fortsættes som beskrevet i punkt 3.1. 3.3. Flydende eller halvflydende foder Prøven opsamles i en ren, tør og egnet beholder med lufttæt lukning. Umiddelbart før afvejning af den mængde, der skal anvendes til analysen, blandes prøven omhyggeligt. 3.4. Andet foder Prøver, der ikke kan klargøres i overensstemmelse med en af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder, behandles på anden måde, så der skabes sikkerhed for, at de mængder, der afvejes til analyse, er homogene og repræsentative for slutprøverne. 4. Opbevaring af prøverne Prøverne skal opbevares ved en temperatur, der ikke ændrer deres sammensætning. Prøver, der skal benyttes til analyser af vitaminer eller særligt lysfølsomme stoffer, opbevares i beholdere af brunt glas. B. KRAV TIL REAGENSER OG APPARATUR, DER ANVENDES I FORBINDELSE MED ANALYSEMETODERNE 1. Medmindre andet er angivet for analysemetoderne, skal alle reagenser være af analysekvalitet (p.a.). Ved udførelse af en sporstofanalyse kontrolleres reagensernes renhed ved en blindprøve. Resultatet af blindprøven er afgørende for, om der kræves yderligere oprensning af reagenserne. 2. Til alle former for fremstilling af opløsninger, fortynding, skylning eller vaskning, der er angivet i forbindelse med analysemetoderne, uden at opløsnings- eller fortyndingsmidlets art er omtalt, anvendes vand. Som generel regel gælder, at der anvendes demineraliseret eller destilleret vand. I særlige tilfælde, som angivet i de beskrevne analysemetoder, er det nødvendigt at underkaste vandet særlige oprensningsprocesser. 3. Standardapparatur, der normalt findes på kontrollaboratorier, er ikke omtalt i forbindelse med analysemetoderne; derimod omtales specialinstrumenter og –udstyr samt instrumenter og udstyr, hvis brug der stilles særlige krav til. Instrumenter og apparatur skal være rene, især ved bestemmelse af meget små stofmængder. C. ANVENDELSE AF ANALYSEMETODERNE OG ANGIVELSE AF RESULTATER 1. Ekstraktionsprocedure Der er flere metoder, der omfatter en specifik ekstraktionsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre ekstraktionsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte ekstraktionsprocedure bevisligt frembyder en ekstraktionseffektivitet for den analyserede matrix, der svarer til effektiviteten af den i metoden omtalte fremgangsmåde. 2. Oprensningsprocedure Der er flere metoder, der omfatter en specifik oprensningsprocedure. Som hovedregel kan der anvendes andre oprensningsprocedurer end den i metoden angivne, under forudsætning af at den anvendte oprensningsprocedure bevisligt giver analyseresultater for den analyserede matrix, der svarer til de resultater, som opnås med den i metoden omtalte fremgangsmåde. 3. Indberetning af anvendt analysemetode Der er generelt fastsat én analysemetode til bestemmelse af hvert enkelt stof i foder. Såfremt der findes flere metoder, skal den af kontrollaboratoriet anvendte metode anføres i analyserapporten. 4. Antal bestemmelser Det i analyserapporten angivne resultat skal være gennemsnitsværdien af mindst to bestemmelser af tilfredsstillende repeterbarhed, som er udført på to særskilte portioner af prøven. I forbindelse med analyse af uønskede stoffer gælder det dog, at hvis resultatet af den første bestemmelse er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. Ved kontrol af det angivne indhold af et stof eller en ingrediens gælder det, at hvis resultatet af den første bestemmelse bekræfter det angivne indhold, dvs. hvis analyseresultatet ligger inden for det acceptable variationsområde for det angivne indhold, er yderligere bestemmelser ikke påkrævet, såfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer. I visse tilfælde er det acceptable variationsområde fastsat i lovgivningen, som f.eks. i Rådets direktiv 79/373/EØF (1). 5. Indberetning af analyseresultater Analyseresultatet angives som anført i analysemetoden med et tilstrækkeligt antal betydende cifre og korrigeres om nødvendigt til samme vandindhold, som slutprøven havde før prøveklargøringen. 6. Måleusikkerhed og genfindingsprocent i forbindelse med analyse af uønskede stoffer For så vidt angår uønskede stoffer som omhandlet i Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2002/32/EF, herunder dioxiner og dioxinlignende PCB'er, anses et produkt til foderbrug for ikke at overholde det fastsatte maksimumsindhold, hvis analyseresultatet vurderes at overstige maksimumsindholdet under hensyntagen til den ekspanderede måleusikkerhed og korrektion for genfinding. Det vurderes, om maksimumsindholdet er overholdt, ved hjælp af den analyserede koncentration efter korrektion for genfinding og ekspanderet måleusikkerhed. Dette gælder kun i tilfælde, hvor analysemetoden tillader vurdering af måleusikkerheden og korrektion for genfinding (hvilket f.eks. ikke er tilfældet ved mikroskopering). Analyseresultatet skal indberettes som følger (hvis den anvendte analysemetode tillader vurdering af måleusikkerhed og genfindingsprocent): a) ved korrektion for genfinding den angivne genfindingsprocent. Ved en genfindingsprocent på 90–110 % er korrektion for genfinding ikke påkrævet b) som »x +/- U«, hvor x er analyseresultatet og U er den ekspanderede måleusikkerhed, idet der anvendes en dækningsfaktor på 2, hvilket giver et konfidensniveau på ca. 95 %. Analyseresultatet kan dog, hvis resultatet af analysen er væsentligt (> 50 %) lavere end den specifikation, der skal kontrolleres, hvis der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer, og hvis analysen udelukkende har til formål at kontrollere, at gældende lovgivning er overholdt, indberettes uden korrektion for genfinding, ligesom det i sådanne tilfælde kan undlades at indberette genfindingsprocent og måleusikkerhed. (1) EFT L 86 af 6.4.1979, s. 30.

BILAG III ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF SAMMENSÆTNINGEN AF FODERMIDLER OG FODERBLANDINGER A. BESTEMMELSE AF VANDINDHOLD 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme vandindholdet i foder. For så vidt angår foder indeholdende flygtige stoffer, såsom organiske syrer, skal det bemærkes, at der sammen med vandindholdet også bestemmes betydelige mængder flygtige stoffer. Metoden er ikke beregnet på analyse af mejeriprodukter, der anvendes som fodermidler, analyse af mineralske stoffer og blandinger, der overvejende består af mineralske stoffer, analyse af animalsk og vegetabilsk fedt eller analyse af olieholdige frø og frugter. 2. Princip Prøven tørres under nærmere angivne betingelser, som er afhængige af foderets art. Vægttabet bestemmes ved vejning. For fast foder med højt vandindhold er yderligere fortørring nødvendig. 3. Apparatur 3.1. Formalingsapparat udført i et materiale, der ikke er fugtabsorberende, og som er let at gøre rent, muliggør en hurtig og ensartet formaling uden mærkbar varmeudvikling, så vidt muligt forhindrer kontakt med den omgivende luft og opfylder kravene i punkt 4.1.1 og 4.1.2 (f. eks. mikrohammermøller, mikroformalingsapparater med vandkøling, demontable keglemøller, langsomtløbende keglemøller og tandskivemøller) 3.2. Analysevægt med 1 mg aflæsningsnøjagtighed 3.3. Tørre vejekar af korrosionsbestandigt metal eller glas med lufttæt lukning; nyttearealet skal være stort nok til, at prøven kan fordeles med ca. 0,3 g/cm2 3.4. Elektrisk opvarmet, temperaturreguleret tørreskab (± 2 oC), som sikrer hurtig regulering af temperaturen og med god ventilation (1). 3.5. Elektrisk opvarmet justerbart vakuumtørreskab med oliepumpe, som enten er forsynet med en anordning til tilførsel af tørret varmluft eller med et tørremiddel (f.eks. calciumoxid) 3.6. Ekssikkator med tyk, perforeret plade af metal eller porcelæn indeholdende et virksomt tørringsmiddel. 4. Fremgangsmåde NB De under dette punkt beskrevne arbejdsgange skal udføres straks efter åbningen af de pakninger, som indeholder prøverne. Analyserne skal foretages mindst to gange. 4.1. Klargøring 4.1.1. Foder, bortset fra det under punkt 4.1.2 og 4.1.3 nævnte Der udtages mindst 50 g af prøven, som — om nødvendigt — formales eller neddeles på fornøden vis for at undgå varierende fugtighedsgrader (se punkt 6). 4.1.2. Korn og gryn Der udtages mindst 50 g af prøven. Den formales, så kornstørrelsen ved sigtning med masker på 0,5 mm tillader passage af mindst 50 %, og at der ved sigtning med runde masker på 1 mm bliver højst 10 % tilbage. 4.1.3. Flydende eller grødagtigt foder; foder overvejende bestående af fedt Der udtages ca. 25 g af prøven, afvejet med 10 mg nøjagtighed, som blandes med en tilsvarende mængde vandfrit sand, afvejet med 10 mg nøjagtighed, indtil der fremkommer en homogen vare. 4.2. Tørring 4.2.1. Foder, bortset fra det under punkt 4.2.2 og 4.2.3 nævnte Et vejekar med låg (3.3) vejes med 1 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 103 oC opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i 4 timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 103 oC. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30-45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed. For prøver af foder overvejende bestående af fedt foretages yderligere en tørring på 30 minutter i tørreskabet ved 130 oC. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold. 4.2.2. Korn, mel, gryn og grutning Et vejekar med låg (3.3) vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af den formalede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 130 oC opvarmet tørreskab. For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Der tørres i 2 timer, idet tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 130 oC. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30–45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed. 4.2.3. Foderblandinger indeholdende mere end 4 % saccharose eller lactose: fodermidler såsom johannesbrødskrå, hydrolyserede kornprodukter, maltspirer, sukkerroesnitter, fiskepressevand og sukker, samt foderblandinger med mere end 25 % mineralske salte inkl. krystalvand Et vejekar med låg (3.3) vejes med 0,5 mg nøjagtighed. Ca. 5 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed i det tarerede kar og fordeles jævnt. Karret stilles efter aftagning af låget ind i et til 80-85 oC opvarmet vakuumtørreskab (3.5). For at temperaturen i tørreskabet ikke skal falde for stærkt, skal karret stilles hurtigt ind i skabet. Trykket indstilles til 100 torr, og prøven tørres i 4 timer ved dette tryk enten under tilførsel af varm, tør luft eller ved hjælp af et tørringsmiddel (ca. 300 g til 20 prøver). I sidstnævnte tilfælde afbrydes forbindelsen til vakuumpumpen, så snart det foreskrevne tryk er nået. Tørringstiden regnes fra det tidspunkt, hvor temperaturen i tørreskabet atter er kommet op på 80–85 oC. Efter tørringstidens udløb bringes tørreskabet forsigtigt op på atmosfærisk tryk. Efter åbning af tørreskabet lukkes karret straks med låget, tages ud af skabet, henstilles til afkøling i 30–45 minutter i ekssikkatoren (3.6) og vejes derefter med 1 mg nøjagtighed. Der tørres i yderligere 30 minutter under vakuum i tørreskabet ved 80–85 oC, og derefter vejes på ny. Forskellen mellem de to vejeresultater må ikke overstige 0,1 % vandindhold. 4.3. Fortørring 4.3.1. Foder, bortset fra det under punkt 4.3.2 nævnte Fast foder med højt vandindhold, og hvis formaling er vanskelig, skal fortørres som følger: 50 g af den ikke-formalede prøve (om nødvendigt foretages en grov neddeling af presset eller klumpet foder) afvejes med 10 mg nøjagtighed i en egnet beholder (f. eks. en aluminiumskål på 20 × 12 cm med en kant på 0,5 cm). Der tørres i tørreskab ved 60-70 oC, indtil vandindholdet er reduceret til mellem 8 og 12 %. Beholderen tages ud af tørreskabet og henstilles utildækket til afkøling i laboratoriet i 1 time, hvorefter der vejes med 10 mg nøjagtighed. Alt efter foderets art foretages, som beskrevet i punkt 4.1.1, derefter straks en formaling, og der tørres som beskrevet i punkt 4.2.1 eller 4.2.3. 4.3.2. Korn Korn med et vandindhold på over 17 % skal fortørres som følger: 50 g af de ikke-formalede korn afvejes med 10 mg nøjagtighed i en egnet beholder (f. eks. en aluminiumskål på 20 × 12 cm med en kant på 0,5 cm) og tørres i tørreskab i 5-7 minutter ved 130 oC, hvorefter prøven tages ud af tørreskabet. Prøven henstilles utildækket til afkøling i laboratoriet i 2 timer, hvorefter der vejes med 10 mg nøjagtighed. Straks efter formales som beskrevet i punkt 4.1.2 og tørres som beskrevet i punkt 4.2.2. 5. Beregning af resultater Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formler: 5.1. Tørring uden fortørring hvor: m = prøvens begyndelsesvægt i gram m0 = den tørre prøves vægt i gram. 5.2. Tørring med fortørring hvor: m = prøvens begyndelsesvægt i gram m1 = prøvens vægt i gram efter fortørring m2 = prøvens vægt i gram efter formaling m0 = den tørre prøves vægt i gram. 5.3. Repeterbarhed Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,2 % vandindhold i absolut værdi. 6. Bemærkning Hvis det viser sig at være nødvendigt med formaling og der i den forbindelse må påregnes en ændring af materialets vandindhold, skal analyseresultaterne for foderets bestanddele korrigeres i overensstemmelse med originalprøvens vandindhold. B. BESTEMMELSE AF VANDINDHOLDET I ANIMALSK OG VEGETABILSK FEDT 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme animalske og vegetabilske fedtstoffers og oliers vandindhold (vand og flygtige stoffer). 2. Princip Prøven tørres ved 103 °C, indtil vægten ikke mere formindskes (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg). Vægttabet bestemmes ved vejning. 3. Apparatur 3.1. Fladbundet beholder af korrosionsbestandigt materiale, diameter: 8-9 cm, højde: ca. 3 cm 3.2. Termometer med forstærket kugle og udvidelsesrum i den øverste ende, inddelt i grader fra ca. 80 °C til mindst 110 °C, længde: ca. 10 cm 3.3. Sandbad eller elektrisk varmeplade 3.4. Ekssikkator indeholdende et effektivt tørremiddel 3.5. Analysevægt. 4. Fremgangsmåde Ca. 20 g af den homogeniserede prøve afvejes med 1 mg nøjagtighed i den tørre, tarerede beholder (3.1), hvori termometret (3.2) er anbragt. Prøven opvarmes på sandbadet eller varmepladen (3.3) under stadig omrøring med termometret, så den når en temperatur på 90 °C i løbet af ca. 7 minutter. Varmen dæmpes efter den hyppighed, med hvilken boblerne stiger op fra beholderens bund. Temperaturen må ikke overstige 105 °C. Bliv ved med at røre og skrabe bunden, indtil der ikke dannes flere bobler. For at sikre, at fugtigheden helt er fjernet, gentages opvarmningen til 103 °C ± 2 ° flere gange, med afkøling til 93 °C mellem de på hinanden følgende opvarmninger. Derefter henstilles til afkøling til rumtemperatur i ekssikkatoren (3.4) og vejes. Denne proces gentages, indtil vægttabet mellem to afvejninger ikke overstiger 2 mg. NB Hvis prøvens vægt øges efter gentagne opvarmninger, er dette tegn på oxidering af fedtstoffet. I så fald beregnes resultatet af den afvejning, der er blevet foretaget, umiddelbart inden vægtforøgelsen begyndte. 5. Beregning af resultater Prøvens vandindhold (X) i procent beregnes efter følgende formel: hvor: m = prøvens vægt i gram m1 = beholderens og indholdets vægt i gram inden opvarmning m2 = beholderens og indholdets vægt i gram efter opvarmning. Resultater på under 0,05 % opføres som »mindre end 0,05 %«. Repeterbarhed Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 0,05 % vandindhold i absolut værdi. C. BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF RÅPROTEIN 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af råprotein i foder på basis af nitrogenindholdet (Kjeldahls metode). 2. Princip Prøven destrueres med svovlsyre under tilstedeværelse af en katalysator. Syreopløsningen gøres alkalisk med en natriumhydroxidopløsning. Ammoniakken destilleres og opsamles i en nøjagtigt afmålt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre titreres med en standardnatriumhydroxidopløsning. Alternativt destilleres den frigjorte ammoniak i et overskud af borsyreopløsning, hvorefter der titreres med en saltsyre- eller svovlsyreopløsning. 3. Reagenser 3.1. Kaliumsulfat. 3.2. Katalysator: kobber(II)oxid (CuO) eller kobber(II)sulfatpentahydrat (CuSO4 · 5H2O). 3.3. Granuleret zink. 3.4. Svovlsyre, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5. Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,25 mol/liter. 3.6. Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,10 mol/liter. 3.7. Svovlsyre, standardopløsning, c(H2SO4) = 0,05 mol/liter. 3.8. Indikator af methylrødt; 300 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol, σ = 95-96 % (v/v). 3.9. Natriumhydroxidopløsning (teknisk kvalitet kan bruges), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Natriumhydroxid, standardopløsning, c(NaOH) = 0,25 mol/liter. 3.11. Natriumhydroxid, standardopløsning, c(NaOH) = 0,10 mol/liter. 3.12. Granuleret pimpsten, vasket i saltsyre og udglødet. 3.13. Acetanilid (smeltepunkt = 114 oC, N-indhold = 10,36 %). 3.14. Saccharose (nitrogenfri). 3.15. Borsyre (H3BO3). 3.16. Indikatoropløsning af methylrødt: 100 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol eller methanol. 3.17. Opløsning af bromcresolgrønt: 100 mg bromcresolgrønt opløses i 100 ml ethanol eller methanol. 3.18. Borsyreopløsning (10–40 g/liter, afhængigt af det anvendte apparatur) Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, skal borsyreopløsningerne tilføres methylrødt- og bromcresolgrøntindikatorer. Fremstilles 1 liter borsyreopløsning, tilsættes der, inden tilpasning af volumen, 7 ml indikatoropløsning af methylrødt (3.16) og 10 ml opløsning af bromcresolgrønt (3.17). Borsyreopløsningens pH-værdi vil kunne variere fra batch til batch afhængigt af vandet, der bruges. Det vil ofte være nødvendigt at justere med en lille mængde alkali for at opnå en positiv blindprøve. NB En god justering opnås normalt ved at tilsætte ca. 3–4 ml NaOH (3.11) til 1 liter borsyreopløsning på 10 g/liter. Opløsningen opbevares ved rumtemperatur og beskyttes under opbevaringen mod lys og ammoniakdampe. 3.19. Standardsaltsyreopløsning, c(HCl) = 0,10 mol/liter. NB Der kan anvendes opløsninger i andre koncentrationer (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 og 3.19), forudsat at der korrigeres herfor i beregningerne. Koncentrationen skal altid angives med fire decimaler. 4. Apparatur Apparat egnet til destruktion, destillation og titrering efter Kjeldahls metode. 5. Fremgangsmåde 5.1. Destruktion 1 g af prøven afvejes med 0,001 g nøjagtighed og overføres til destruktionskolben. Der tilsættes 15 g kaliumsulfat (3.1), en passende mængde katalysator (3.2) (0,3–0,4 g kobber(II)oxid eller 0,9–1,2 g kobber(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svovlsyre (3.4) og eventuelt nogle få korn pimpsten (3.12) og blandes. Kolben opvarmes, forsigtigt i begyndelsen, og omrystes om nødvendigt af og til forsigtigt, indtil prøven er forkullet og skummet forsvundet. Derefter opvarmes kraftigere, indtil væsken koger jævnt. Opvarmningen er tilstrækkelig, hvis den kogende syre fortætter sig på kolbens væg. Det må forhindres, at siderne bliver overophedet, og at organiske partikler klæber til dem. Når opløsningen bliver klar og lysegrøn, fortsættes kogningen i yderligere to timer. Derefter henstilles kolben til afkøling. 5.2. Destillation Der tilsættes forsigtigt tilstrækkeligt vand til, at sulfaterne opløses fuldstændigt. Kolben henstår til afkøling, hvorefter der om nødvendigt tilsættes nogle få zinkkorn (3.3). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2.1 eller 5.2.2. 5.2.1. Destillation i svovlsyre I destillationsapparatets opsamlingskolbe anbringes en nøjagtigt afmålt mængde på 25 ml svovlsyre (3.5 eller 3.7) afhængigt af det formodede nitrogenindhold. Der tilsættes nogle få dråber indikator af methylrødt (3.8). Destruktionskolben forbindes med destillationsapparatets svaler, og svalerens nederste del nedsænkes i væsken i opsamlingskolben til en dybde af mindst 1 cm (se bemærkning 8.3). 100 ml natriumhydroxidopløsning (3.9) overføres forsigtigt til destruktionskolben, uden at der mistes ammoniak (se bemærkning 8.1). Kolben opvarmes, indtil ammoniakken er destilleret over. 5.2.2. Destillation i borsyre Foretages titreringen af destillatets ammoniakindhold manuelt, følges den nedenfor beskrevne fremgangsmåde. Er destillationsenheden fuldt automatiseret, så også titreringen af destillatets ammoniakindhold sker automatisk, følges brugsanvisningen til destillationsenheden. En opsamlingskolbe med 25-30 ml af borsyreopløsningen (3.18) anbringes under svalerens afløbsåbning, således at tilførselsrøret befinder sig under overfladen i den overskydende borsyreopløsning. Destillationsenheden indstilles til at give 50 ml natriumhydroxidopløsning (3.9). Destillationsenheden betjenes i overensstemmelse med brugsanvisningen, og den ammoniak, der er frigivet ved tilførslen af natriumhydroxidopløsningen, afdampes. Destillatet opsamles i forlaget med borsyre. Destillatmængden (dampdestillationstiden) afhænger af mængden af nitrogen i prøven. Brugsanvisningen følges. NB I en halvautomatisk destillationsenhed sker tilførslen af overskydende natriumhydroxid samt dampdestillationen automatisk. 5.3. Titrering Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.1 eller 5.3.2. 5.3.1. Svovlsyre Den overskydende svovlsyre i opsamlingskolben titreres med natriumhydroxidopløsning (3.10 eller 3.11) afhængigt af koncentrationen af den anvendte svovlsyre, indtil ækvivalenspunktet er nået. 5.3.2. Borsyre Med en burette titreres opsamlingskolbens indhold med standardsaltsyreopløsningen (3.19) eller med standardsvovlsyreopløsningen (3.6), og den anvendte titrantmængde aflæses. Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse, er ækvivalenspunktet nået ved det første tegn på pinkfarvning af indholdet. Buretteaflæsningen anslås med 0,05 ml nøjagtighed. En oplyst magnetisk omrørerplade eller en fotometrisk detektor vil kunne lette visualiseringen af ækvivalenspunktet. Processen kan gøres automatisk ved anvendelse af en dampdestillationsenhed med automatisk titrering. Brugsanvisningen til den enkelte destillationsenhed eller destillationsenhed/titrator følges. NB Anvendes et automatisk titreringssystem, begynder titreringen umiddelbart efter, at destillationen er begyndt, og borsyreopløsningen på 1 % (3.18) anvendes. Gøres der brug af en fuldautomatisk destillationsenhed, kan den automatiske titrering af ammoniakken også foretages med endpointbestemmelse, idet der så anvendes et potentiometrisk pH-system. I dette tilfælde anvendes en automatisk titrator med pH-meter. pH-metret skal være korrekt kalibreret i området pH 4-pH 7 i overensstemmelse med almindelige laboratorie-pH-kalibreringsprocedurer. pH-titreringsækvivalenspunktet nås ved en pH-værdi på 4,6, som er det sted på titreringskurven, hvor hældningen er stejlest. 5.4. Blindprøve For at sikre, at reagenserne er nitrogenfrie, foretages der en blindprøve (destruktion, destillation og titrering) ved brug af 1 g saccharose (3.14) i stedet for prøven. 6. Beregning af resultater Beregningerne foretages som beskrevet i punkt 6.1 eller 6.2. 6.1. Titreringsberegning, jf. 5.3.1 Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel: hvor: Vo = mængde (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) forbrugt i blindprøven V1 = mængde (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) forbrugt ved titreringen af prøven c = koncentration (mol/liter) af natriumhydroxid (3.10 eller 3.11) m = prøvens vægt i gram. 6.2. Titreringsberegning, jf. 5.3.2 6.2.1. Titrering med saltsyre Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel: hvor: m = testportionens vægt i gram c = koncentration (mol/liter) af standardsaltsyreopløsningen (3.19) V0 = mængde (ml) saltsyre anvendt i blindprøven V1 = mængde (ml) saltsyre anvendt i testportionen. 6.2.2. Titrering med svovlsyre Indholdet af råprotein, udtrykt i vægtprocent, beregnes efter følgende formel: hvor: m = testportionens vægt i gram c = koncentration (mol/liter) af standardsvovlsyreopløsningen (3.6) V0 = mængde (ml) svovlsyre (3.6) anvendt i blindprøven V1 = mængde (ml) svovlsyre (3.6) anvendt i testportionen. 7. Kontrol af metoden 7.1. Repeterbarhed Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige: — 0,2 % i absolut værdi for råproteinindhold på under 20 % — 1,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for råproteinindhold på 20–40 % — 0,4 % i absolut værdi for råproteinindhold på over 40 %. 7.2. Nøjagtighed Analysen (destruktion, destillation og titrering) foretages på 1,5–2,0 g acetanilid (3.13) under tilstedeværelse af 1 g saccharose (3.14). 1 g acetanilid kræver 14,80 ml svovlsyre (3.5). Genfindingsprocenten skal være mindst 99 %. 8. Bemærkninger 8.1. Apparaturet kan være manuelt, halvautomatisk eller automatisk. Hvis apparaturet kræver overførsel mellem destruktions- og destillationstrinet, skal sådan overførsel kunne ske uden tab. Hvis destillationsapparatets kolbe ikke har skilletragt, tilsættes natriumhydroxiden, lige inden kolben forbindes med svaleren, idet væsken hældes langsomt ned langs siden. 8.2. Hvis destruktionsproduktet størkner, gentages bestemmelsen med brug af en større mængde svovlsyre (3.4) end angivet ovenfor. 8.3. For produkter med lavt nitrogenindhold kan mængden af svovlsyre (3.7), der skal bruges i opsamlingskolben, om nødvendigt mindskes til 10 eller 15 ml og fyldes op med vand til 25 ml. 8.4. Til rutineanalyser kan der anvendes alternative analysemetoder til bestemmelse af råprotein, men Kjeldahls metode som beskrevet her i del C er referencemetoden. Det skal for hver enkelt matrix godtgøres, at de resultater, der opnås med den alternative metode (f.eks. DUMAS), svarer til dem, der opnås med referencemetoden. Eftersom resultaterne, der opnås med en alternativ metode, kan afvige en smule fra de resultater, der opnås med referencemetoden, selv efter ækvivalenskontrol, er det nødvendigt i analyserapporten at angive, hvilken analysemetode der er anvendt til bestemmelse af råprotein. D. BESTEMMELSE AF URINSTOF 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af urinstof i foder. 2. Princip Prøven opslæmmes i vand under tilsætning af et klaringsmiddel. Suspensionen filtreres. Filtratets indhold af urinstof bestemmes, efter tilsætning af 4-dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB), ved måling af ekstinktionen ved en bølgelængde på 420 nm. 3. Reagenser 3.1. 4-Dimethylaminobenzaldehydopløsning: 1,6 g 4-DMAB opløses i 100 ml 96 % ethanol, og der tilsættes 10 ml saltsyre (ρ20 = 1,19 g/ml). Dette reagens kan højst holde sig i to uger. 3.2. Carrez-reagens I: 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 · 2H2O, og 3 g iseddike opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml. 3.3. Carrez-reagens II: 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 · 3H2O, opløses i vand. Der fyldes op med vand til 100 ml. 3.4. Aktivt kul, der ikke absorberer urinstoffet (skal kontrolleres). 3.5. Urinstof, 0,1 % opløsning (w/v). 4. Apparatur 4.1. Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet 4.2. Reagensglas: 160 × 16 mm, med slibprop 4.3. Spektrofotometer. 5. Fremgangsmåde 5.1. Analyse af prøven 2 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 1 g aktivt kul (3.4) i en 500 ml målekolbe. Der tilsættes 400 ml vand og 5 ml Carrez-reagens I (3.2) og blandes i ca. 30 sekunder, hvorefter der tilsættes 5 ml Carrez-reagens II (3.3). Væsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet. Der fyldes op med vand til mærket, omrystes og filtreres. 5 ml af de klare og farveløse filtrater udtages med pipette og hældes i reagensglassene med slibprop, hvorefter der tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (3.1) og blandes. Glassene anbringes i vandbad ved 20 oC (+/- 4 oC). Efter 15 minutter måles ekstinktionen i prøveopløsningen i spektrofotometret ved 420 nm ved sammenligning med reagensernes blindprøveopløsning. 5.2. Kalibreringskurve Der udtages volumener på 1, 2, 4, 5 og 10 ml af urinstofopløsningen (3.5), disse hældes i 100 ml målekolber, og der fyldes op med vand til mærket. Der udtages 5 ml af hver opløsning, hver af dem tilsættes 5 ml 4-DMAB-opløsning (3.1), der homogeniseres, og ekstinktionen måles, som angivet ovenfor, ved sammenligning med en kontrolopløsning, som indeholder 5 ml 4-DMAB og 5 ml vand uden urinstof. Kalibreringskurven tegnes. 6. Beregning af resultater Bestem mængden af urinstof i prøven ved benyttelse af kalibreringskurven. Resultatet angives i procent af prøven. 7. Bemærkninger 7.1. Hvis indholdet af urinstof er større end 3 %, reduceres analyseprøven til 1 gram, eller den oprindelige opløsning fortyndes så meget, at der ikke er mere end 50 mg urinstof i 500 ml. 7.2. Hvis indholdet af urinstof er ringe, forøges prøvens volumen i det omfang, filtratet vedbliver at være klart og farveløst. 7.3. Hvis prøven indeholder simple kvælstofforbindelser, som for eksempel aminosyrer, foretages målingen af ekstinktionen ved 435 nm. E. BESTEMMELSE AF FLYGTIGE KVÆLSTOFHOLDIGE BASER I. BESTEMMELSE VED MIKRODIFFUSION 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvælstofholdige baser, udtrykt som ammoniak, i foder. 2. Princip Prøven ekstraheres med vand, og opløsningen klares og filtreres. De flygtige kvælstofholdige baser udskilles efter tilsætning af kaliumcarbonatopløsning ved mikrodiffusion, opfanges i en borsyreopløsning og titreres med svovlsyre. 3. Reagenser 3.1. Trichloreddikesyre, 20 % opløsning (w/v). 3.2. Indikator: 33 mg bromcresolgrønt og 65 mg methylrødt opløses i 100 ml ethanol 95–96 % (v/v). 3.3. Borsyreopløsning: 10 g borsyre opløses i en 1 liter målekolbe indeholdende 200 ml ethanol 95–96 % (v/v) og 700 ml vand. 10 ml af indikatoren (3.2) tilsættes. Opløsningen blandes og bringes om nødvendigt under tilsætning af natriumhydroxidopløsning til at antage en lyserød farve. 1 ml af denne opløsning kan binde op til 300 μg NH3. 3.4. Mættet kaliumcarbonatopløsning: 100 g kaliumcarbonat opløses i 100 ml kogende vand. Efter afkøling filtreres opløsningen. 3.5. Svovlsyre, 0,01 mol/liter. 4. Apparatur 4.1. Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet 4.2. Conwayskåle (se skitse) af glas eller plastic 4.3. Mikroburetter inddelt i 1/100 ml. 5. Fremgangsmåde 10 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed, kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml målekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet. Der tilsættes 50 ml trichloreddikesyreopløsning (3.1), fyldes op med vand til mærket, omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter. 1 ml borsyreopløsning (3.3) afpipetteres i Conwayskålens midte, hvorefter 1 ml af prøvefiltratet overføres til skålens ring. Skålen tildækkes delvist med det let indfedtede låg. 1 ml af den mættede kaliumcarbonatopløsning (3.4) kommes hurtigt ned i ringen, og skålen lukkes, så den er lufttæt. Skålen drejes forsigtigt i vandret stilling, så de to reagenser blandes. Der inkuberes i mindst 4 timer ved rumtemperatur eller i 1 time ved 40 oC. De i borsyreopløsningen indeholdte flygtige baser titreres derefter med svovlsyre (3.5) ved anvendelse af en mikroburette (4.3). På samme måde udføres en blindprøve under udeladelse af analyseprøven. 6. Beregning af resultater 1 ml 0,01 mol/liter svovlsyre svarer til 0,34 mg ammoniak. Resultatet angives i procent af prøven. Repeterbarhed Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige: — 10 % i relativ værdi ved indhold på mindre end 1,0 % ammoniak — 0,1 % i absolut værdi ved indhold på 1,0 % ammoniak og derover. 7. Bemærkning Har prøven et indhold på mere end 0,6 % ammoniak, fortyndes det oprindelige filtrat. II. BESTEMMELSE VED DESTILLATION 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvælstofholdige baser, udtrykt som ammoniak, i fiskemel, som praktisk talt ikke indeholder urinstof. Metoden anvendes kun ved indhold på mindre end 0,25 % ammoniak. 2. Princip Prøven ekstraheres med vand, og opløsningen klares og filtreres. De flygtige kvælstofholdige baser udskilles efter tilsætning af magnesiumoxid ved kogetemperatur og opfanges i en bestemt mængde svovlsyre, idet den overskydende mængde svovlsyre tilbagetitreres med en natriumhydroxidopløsning. 3. Reagenser 3.1. Trichloreddikesyre, 20 % opløsning (w/v) 3.2. Magnesiumoxid 3.3. Skumdæmpende emulsion (f.eks. silikone) 3.4. Svovlsyre, 0,05 mol/liter 3.5. Natriumhydroxidopløsning, 0,1 mol/liter 3.6. Methylrødtopløsning, 0,3 % i 95–96 % (v/v) ethanol. 4. Apparatur 4.1. Mekanisk rysteapparat: ca. 35–40 omdrejninger i minuttet 4.2. Destillationsapparatur af Kjeldahl-typen. 5. Fremgangsmåde 10 g af prøven afvejes med 1 mg nøjagtighed og kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml målekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet. Der tilsættes 50 ml trichloreddikesyreopløsning (3.1), fyldes op med vand til mærket, omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter. Afhængigt af det formodede indhold af flygtige kvælstofholdige baser udtages en mængde af det klare filtrat (normalt 100 ml). Det fortyndes til 200 ml, og der tilsættes 2 g magnesiumoxid (3.2) samt nogle få dråber skumdæmpende emulsion (3.3). Opløsningen skal reagere alkalisk over for lakmuspapir; i modsat fald tilsættes yderligere magnesiumoxid (3.2). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.2 og 5.3 for analysemetoden til bestemmelse af indholdet af råprotein (del C i dette bilag). På samme måde udføres en blindprøve under udeladelse af analyseprøven. 6. Beregning af resultater 1 ml 0,05 mol/liter svovlsyre svarer til 1,7 mg ammoniak. Resultatet angives i procent af prøven. Repeterbarhed Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % ammoniak i relativ værdi. F. BESTEMMELSE AF AMINOSYRER (BORTSET FRA TRYPTOPHAN) 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af frie (syntetiske og naturlige) og totale (peptidbundne og frie) aminosyrer i foder ved brug af en aminosyreanalysator. Metoden kan anvendes til følgende aminosyrer: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, histidin, isoleucin, leucin, phenylalanin, prolin, serin, tyrosin og valin. Metoden skelner ikke mellem salte af aminosyrer og kan ikke differentiere mellem D- og L-former af aminosyrer. Den er ikke anvendelig til bestemmelse af tryptophan- eller hydroxyanaloger af aminosyrer. 2. Princip 2.1. Frie aminosyrer Frie aminosyrer ekstraheres med fortyndet saltsyre. Kvælstofholdige makromolekyler, der ekstraheres samtidig, udfældes med sulfosalicylsyre og fjernes ved filtrering. Den filtrerede opløsnings pH-værdi justeres til 2,20. Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm. 2.2. Totale aminosyrer Den valgte metode afhænger af de aminosyrer, der skal undersøges. Cyst(e)in og methionin skal oxideres til henholdsvis cysteinsyre og methioninsulfon inden hydrolyse. Tyrosin skal bestemmes i hydrolysater af uoxiderede prøver. Alle de øvrige aminosyrer, der er nævnt i punkt 1, kan bestemmes i enten den oxiderede eller den uoxiderede prøve. Oxidering sker ved 0 oC med en phenolholdig permyresyre. Overskydende oxideringsreagens destrueres med natriumdisulfit. Den oxiderede eller uoxiderede prøve hydrolyseres med saltsyre (3.20) i 23 timer. Hydrolysatets pH-værdi justeres til 2,20. Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk påvisning ved 570 nm (440 nm for prolin). 3. Reagenser Der skal anvendes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS). 3.1. Hydrogenperoxid, w (w/v) = 30 %. 3.2. Myresyre, w (w/v) = 98–100 %. 3.3. Phenol. 3.4. Natriumdisulfit. 3.5. Natriumhydroxid. 3.6. 5-Sulfosalicylsyre-dihydrat. 3.7. Saltsyre, massefylde: ca. 1,18 g/ml. 3.8. Tri-natriumcitrat-dihydrat. 3.9. 2,2'-Thiodiethanol (thiodiglycol). 3.10. Natriumchlorid. 3.11. Ninhydrin. 3.12. Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC. 3.13. Norleucin eller anden forbindelse, der er egnet til brug som intern standard. 3.14. Nitrogengas (< 10 ppm oxygen). 3.15. 1-Octanol. 3.16. Aminosyrer 3.16.1. Standardstoffer som anført i punkt 1. Rene forbindelser, der ikke indeholder krystalvand. Tørres under vakuum over P205 eller H2SO4 i 1 uge inden brug. 3.16.2. Cysteinsyre. 3.16.3. Methioninsulfon. 3.17. Natriumhydroxidopløsning, c = 7,5 mol/liter: 300 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op til 1 liter. 3.18. Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/liter: 40 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op til 1 liter. 3.19. Phenolholdig myresyreopløsning: 889 g myresyre (3.2) blandes med 111 g vand, og der tilsættes 4,73 g phenol (3.3). 3.20. Hydrolyseblanding, c = 6 mol HCl/liter indeholdende 1 g phenol/liter: Der tilsættes 1 g phenol (3.3) til 492 ml HCl (3.7) og fyldes op med vand til 1 liter. 3.21. Ekstraktionsopløsning, c = 0,1 mol HCl/liter indeholdende 2 % thiodiglycol: 8,2 ml HCl (3.7) opløses i ca. 900 ml vand, hvorefter der tilsættes 20 ml thiodiglycol (3.9) og fyldes op med vand til 1 liter (3.7 og 3.9 må ikke blandes direkte). 3.22. 5-Sulfosalicylsyreopløsning, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicylsyre (3.6) opløses i vand, og der fyldes op med vand til 1 liter. 3.23. Oxideringsreagens (permyresyre-phenol): 0,5 ml hydrogenperoxid (3.1) blandes med 4,5 ml phenolholdig myresyreopløsning (3.19) i et lille bægerglas. Inkuberes ved 20–30 oC i 1 time for at danne permyresyre. Herefter afkøles opløsningen i isbad (15 minutter), inden den tilsættes prøven. Advarsel: Undgå kontakt med huden, og bær beskyttelsesbeklædning. 3.24. Citratbuffer, c = 0,2 mol Na+/liter, pH 2,20: 19,61 g natriumcitrat (3.8), 5 ml thiodiglycol (3.9), 1 g phenol (3.3) og 16,50 ml HCl (3.7) opløses i ca. 800 ml vand. pH justeres til 2,20. Der fyldes op med vand til 1 liter. 3.25. Elueringsbuffere fremstillet ifølge betingelserne for den benyttede analysator (4.9). 3.26. Ninhydrinreagens fremstillet ifølge betingelserne for den benyttede analysator (4.9). 3.27. Standardopløsninger af aminosyrer. Opløsningerne opbevares ved < 5 oC. 3.27.1. Standardstamopløsning af aminosyrer (3.16.1) c = 2,5 μmol/ml af hver i saltsyre. Kan fås i handelen. 3.27.2. Standardstamopløsning af cysteinsyre og methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml 0,2115 g cysteinsyre (3.16.2) og 0,2265 g methioninsulfon (3.16.3) opløses i citratbuffer (3.24) i en 1 liter målekolbe, og der fyldes op til mærket med citratbuffer. Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 12 måneder. Denne opløsning benyttes ikke, hvis standardstamopløsningen (3.27.1) indeholder cysteinsyre og methioninsulfon. 3.27.3. Standardstamopløsning af den interne standard, f.eks. norleucin, c = 20 μmol/ml 0,6560 g norleucin (3.13) opløses i citratbuffer (3.24) i en målekolbe, og der fyldes op med citratbuffer til 250 ml. Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 6 måneder. 3.27.4. Kalibreringsopløsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater, c = 5 nmol/50 μl cysteinsyre og methioninsulfon og c = 10 nmol/50 μl af de øvrige aminosyrer. 2,2 g natriumchlorid (3.10) opløses i et 100 ml bægerglas med 30 ml citratbuffer (3.24). Der tilsættes 4,00 ml standardstamopløsning af aminosyrer (3.27.1), 4,00 ml standardstamopløsning af cysteinsyre og methioninsulfon (3.27.2) og, hvis benyttet, 0,50 ml standardstamopløsning af intern standard (3.27.3). pH justeres til 2,20 med natriumhydroxid (3.18). Opløsningen overføres kvantitativt til en 50 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med citratbuffer (3.24) og blandes. Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 3 måneder. Se også bemærkning 9.1. 3.27.5. Kalibreringsopløsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater fremstillet under punkt 5.3.3.1 og til brug med ekstrakter (5.2). Kalibreringsopløsningen fremstilles efter punkt 3.27.4, men der tilsættes ikke natriumchlorid. Opløsningen opbevares ved < 5 oC i højst 3 måneder. 4. Apparatur 4.1. 100 eller 250 ml rundbundet kolbe med tilbagesvaler. 4.2. 100 ml borsilikatglasflaske med skruelåg forsynet med gummi/teflonpakning (f.eks. Duran, Schott) til brug i tørreskab. 4.3. Tørreskab med motordreven ventilation og temperaturindstilling med en nøjagtighed på ± 2 oC. 4.4. pH-meter (aflæsning med tre decimaler). 4.5. Membranfilter (0,22 μm). 4.6. Centrifuge. 4.7. Rotationsvakuumfordamper. 4.8. Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører. 4.9. Aminosyreanalysator eller HPLC-udstyr med ionbyttekolonne, anordning til ninhydrin-postkolonne-derivatisering og fotometrisk detektor. Kolonnen pakkes med sulfoneret polystyrenresin, der kan adskille aminosyrerne fra hinanden og fra andre ninhydrinpositive stoffer. Pumperne til buffer- og ninhydrinopløsningen skal i den tid, der omfatter såvel standardkalibreringskørslen som prøveanalysen, have en flowstabilitet på ±0,5 %. Nogle aminosyreanalysatorer kan benyttes, hvor hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/liter og indeholder den resterende myresyre fra oxideringstrinnet. Andre analysatorer giver ikke tilfredsstillende adskillelse af visse aminosyrer, hvis hydrolysatet indeholder overskydende myresyre og/eller høje natriumionkoncentrationer. I så fald reduceres syrevolumen ved inddampning til ca. 5 ml efter hydrolysen og inden pH-justeringen. Inddampningen foretages under vakuum ved højst 40 oC. 5. Fremgangsmåde 5.1. Klargøring af prøven Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 oC eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.12) inden formaling. 5.2. Bestemmelse af frie aminosyrer i foder og forblandinger En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en konisk kolbe, og der tilsættes 100,0 ml ekstraktionsopløsning (3.21). Blandingen rystes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.8). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et 100 ml bægerglas. Der tilsættes 5,0 ml sulfosalicylsyreopløsning (3.22) under omrøring, og der omrøres fortsat med magnetomrører i 5 minutter. Supernatanten filtreres eller centrifugeres for at fjerne eventuelt bundfald. 10,0 ml af den klarede opløsning kommes i et 100 ml bægerglas, og pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.18). Opløsningen overføres med citratbuffer (3.24) til en målekolbe af passende størrelse, og der fyldes op til mærket med citratbufferopløsningen (3.24). Hvis der bruges en intern standard, tilsættes 1,00 ml intern standard (3.27.3) for hver 100 ml slutopløsning, og der fyldes op til mærket med bufferopløsningen (3.24). Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4. Hvis ekstraktet ikke kromatograferes samme dag, skal det opbevares ved < 5 oC. 5.3. Bestemmelse af totale aminosyrer 5.3.1. Oxidering 0,1–1 g af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i: — en 100 ml rundbundet kolbe (4.1) til åben hydrolyse (5.3.2.3), eller — en 250 ml rundbundet kolbe (4.1), hvis der kræves en lav natriumkoncentration (5.3.3.1), eller — en 100 ml flaske med skruelåg (4.2) til lukket hydrolyse (5.3.2.4). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg og et vandindhold på højst 100 mg. Kolben/flasken anbringes i isbad og nedkøles til 0 oC, hvorefter der tilsættes 5 ml oxideringsblanding (3.23) og omrøres ved hjælp af en glasspatel med bøjet spids. Kolben/flasken, der indeholder spatelen, lukkes med lufttæt film. Isbadet med den lukkede beholder anbringes i et køleskab ved 0 oC og henstår i 16 timer. Efter 16 timer tages det ud af køleskabet, og det overskydende oxideringsreagens destrueres ved tilsætning af 0,84 g natriumdisulfit (3.4). Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.1. 5.3.2. Hydrolyse 5.3.2.1. Hydrolyse af oxiderede prøver Den oxiderede prøve (5.3.1) tilsættes 25 ml hydrolyseblanding (3.20). Alle prøverester, der måtte sidde fast på beholderen og spatelen, skal omhyggeligt vaskes ned. Alt efter den benyttede hydrolysemetode fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4. 5.3.2.2. Hydrolyse af uoxiderede prøver 0,1–1 g af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 0,2 mg i en 100 ml eller 250 ml rundbundet kolbe (4.1) eller en 100 ml flaske med skruelåg (4.2). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes forsigtigt 25 ml hydrolyseblanding (3.20), som blandes med prøven. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4. 5.3.2.3. Åben hydrolyse Der tilsættes tre glasperler til blandingen i kolben (klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2). Den opvarmes til kogning og holdes under konstant kogning med tilbagesvaler i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen skylles tilbagesvaleren med 5 ml citratbuffer (3.24). Kolben aftages og afkøles i isbad. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3. 5.3.2.4. Lukket hydrolyse Flasken med blandingen klargjort som beskrevet i punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2 anbringes i et tørreskab (4.3) ved 110 oC. For at forhindre trykopbygning (på grund af udvikling af gasser) og undgå eksplosion lægges skruelåget i den første time løst på flasken. Flasken må ikke lukkes med skruelåget. Efter en times forløb lukkes flasken med skruelåget og henstår i tørreskabet (4.3) i 23 timer. Efter afslutning af hydrolysen tages flasken ud af tørreskabet, skruelåget åbnes forsigtigt, og kolben anbringes i isbad, hvor den henstår til afkøling. Alt efter metoden for justering af pH-værdien (5.3.3) overføres kolbens indhold kvantitativt med citratbuffer (3.24) til et 250 ml bægerglas eller til en 250 ml rundbundet kolbe. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.3. 5.3.3. Justering af pH-værdien Alt efter aminosyreanalysatorens (4.9) natriumtolerance foretages justeringen af pH-værdien som beskrevet i punkt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2. 5.3.3.1. For kromatografisystemer (4.9), der kræver en lav natrium-koncentration: Det er tilrådeligt at bruge en intern standardstamopløsning (3.27.3), hvis der benyttes aminosyreanalysatorer, der kræver en lav natriumkoncentration (hvor syreindholdet skal reduceres). I så fald tilsættes 2,00 ml af den interne standardstamopløsning (3.27.3) til hydrolysatet før inddampningen. Der tilsættes 2 dråber 1-octanol (3.15) til det efter punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat. Volumen reduceres ved hjælp af rotationsfordamperen (4.7) til 5–10 ml under vakuum ved 40 oC. Hvis volumen ved et uheld reduceres til under 5 ml, kasseres hydrolysatet, og analysen gentages. pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.18), og der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4. 5.3.3.2. For andre aminosyreanalysatorer (4.9) : Det efter 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 frembragte hydrolysat neutraliseres delvis ved under omrøring at tilsætte 17 ml natriumhydroxidopløsning (3.17), samtidig med at temperaturen holdes under 40 oC. pH justeres til 2,20 med natriumhydroxidopløsning (3.17 og 3.18) ved rumtemperatur. Der fortsættes som beskrevet i punkt 5.3.4. 5.3.4. Prøveopløsning til kromatografi Hydrolysatet (5.3.3.1 eller 5.3.3.2) justeret til en pH-værdi på 2,20 overføres med citratbuffer (3.24) kvantitativt til en 200 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med buffer (3.24). Hvis en intern standard anvendes, og denne ikke allerede er tilsat, tilsættes der 2,00 ml intern standard (3.27.3) og fyldes op til mærket med citratbuffer (3.24). Der blandes omhyggeligt. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4. Hvis prøveopløsningen ikke kromatograferes samme dag, skal den opbevares ved < 5 oC. 5.4. Kromatografi Inden kromatografi opvarmes ekstraktet (5.2) eller hydrolysatet (5.3.4) til rumtemperatur. Blandingen rystes, og en passende mængde filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter (4.5). Der foretages ionbytningskromatografi af den fremstillede klarede opløsning ved brug af en aminosyreanalysator (4.9). Indsprøjtningen kan foretages manuelt eller automatisk. Hovedsagen er, at der altid tilsættes samme mængde opløsning ±0,5 % til kolonnen til analyse af standardopløsninger og prøveopløsninger, undtagen i tilfælde, hvor der bruges en intern standard. Forholdet mellem natrium og aminosyre i standard- og prøveopløsningerne skal være så ens som muligt. Kalibreringshyppigheden afhænger normalt af stabiliteten af ninhydrinreagenset og det anvendte analysatorsystem. Standard- eller prøveopløsningen fortyndes med citratbuffer (3.24), således at der for standarden fremkommer et topareal på 30–200 % af arealet af toppene for aminosyrerne i prøveopløsningen. Kromatografien af aminosyrerne vil variere lidt afhængigt af den anvendte type analysator og kolonnematerialet. Systemet skal kunne adskille aminosyrerne fuldstændigt fra hinanden og fra øvrige ninhydrinpositive stoffer. Kromatografisystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons på ændringer i mængderne af aminosyrer, der tilsættes kolonnen. Hvis der analyseres en ækvimolær opløsning (af de aminosyrer, der skal bestemmes), skal der ved kromatografien opnås nedenstående forhold mellem dal og tophøjde. Den ækvimolære opløsning skal indeholde mindst 30 % af den største mængde af hver aminosyre, der kan måles præcist med aminosyreanalysatoren (4.9). Ved adskillelsen af threonin og serin må forholdet mellem dal og tophøjde for den laveste af de to sammenhængende aminosyretoppe ikke være større end 2:10. (Hvis der kun bestemmes cyst(e)in, methionin, threonin og lysin, vil utilstrækkelig adskillelse fra nabotoppe indvirke uheldigt på bestemmelsen.) For alle øvrige aminosyrer skal adskillelsen være bedre end 1:10. Systemet skal sikre, at lysin adskilles fra artefakter fra andre lysinlignende stoffer og ornithin. 6. Beregning af resultater Arealet af toppene i prøve- og standardopløsningerne måles for hver enkelt aminosyre, og mængden (X) beregnes i gram aminosyre pr. kg prøve: Ved anvendelse af en intern standard multipliceres med: A = topareal for hydrolysat eller ekstrakt B = topareal for standardkalibreringsopløsning C = topareal for intern standard i hydrolysat eller ekstrakt D = topareal for intern standard, standardkalibreringsopløsning M = molarvægt af den aminosyre, der skal bestemmes c = standardopløsningens koncentration i μmol/ml m = prøvens vægt i gram (korrigeret til oprindelig vægt hvis tørret eller affedtet) V = ml totalhydrolysat (5.3.4) eller ml beregnet total fortyndingsvolumen af ekstraktet (6.1). Såvel cystin som cystein bestemmes som cysteinsyre i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som cystin (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) ved anvendelse af M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Methionin bestemmes som methioninsulfon i hydrolysater af den oxiderede prøve, men beregnes som methionin ved anvendelse af M af methionin (149,21 g/mol). Tilsat fri methionin bestemmes efter ekstraktion som methionin, hvorved der benyttes samme M til beregningen. 6.1. Totale fortyndingsvolumen af ekstrakter (F) til bestemmelse af frie aminosyrer (5.2) beregnes som følger: V = slutekstraktets volumen. 7. Evaluering af metoden Metoden er blevet afprøvet ved en international ringanalyse i 1990 med anvendelse af fire forskellige typer foder (svinefoderblanding, slagtefjerkræblanding, proteinkoncentrat og en forblanding). Resultaterne af middel- og standardafvigelse efter fjernelse af outliers er vist i tabellerne under dette punkt: Middelværdi i g/kg Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Slagtefjerkræblanding 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Proteinkoncentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Forblanding 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = antal deltagende laboratorier. 7.1. Repeterbarhed Repeterbarheden for de undersøgte aminosyrer udtrykt som »standardafvigelse inden for laboratorier« for de ovennævnte prøver er gengivet i nedenstående tabel. Standardafvigelse inden for laboratorier (Sr) i g/kg Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Slagtefjerkræblanding 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Proteinkoncentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Forblanding 1,30 n= 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = antal deltagende laboratorier.

Variationskoefficient ( %) for standardafvigelsen inden for laboratorier (Sr) Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Slagtefjerkræblanding 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Proteinkoncentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Forblanding 2,2 n= 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = antal deltagende laboratorier. 7.2 Reproducerbarhed Resultaterne af standardafvigelse mellem laboratorier for ovennævnte undersøgelser er vist i nedenstående skema. Standardafvigelse mellem laboratorier (SR) i g/kg Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Slagtefjerkræblanding 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Proteinkoncentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Forblanding 2,49 n= 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = antal deltagende laboratorier.

Variationskoefficient ( %) for standardafvigelsen mellem laboratorier (SR) Referencemateriale Aminosyre Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Svinefoderblanding 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Slagtefjerkræblanding 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Proteinkoncentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Forblanding 4,3 n= 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = antal deltagende laboratorier. 8. Anvendelse af referencematerialer Det undersøges, om metoden er brugt korrekt, ved at foretage gentagne målinger af certificerede referencematerialer, når sådanne forefindes. Det anbefales at kalibrere med certificeret aminosyrekalibreringsopløsning. 9. Bemærkninger 9.1. På grund af forskelle mellem aminosyreanalysatorer skal slutkoncentrationerne af kalibreringsopløsningerne af standardaminosyrerne (se punkt 3.27.4 og 3.27.5) og hydrolysatet (se punkt 5.3.4) betragtes som en retningslinje. Apparatets lineære responsskala skal kontrolleres for alle aminosyrer. Standardopløsningen fortyndes med citratbuffer for at opnå toparealer midt på skalaen. 9.2. Hvis der anvendes HPLC-udstyr til at analysere hydrolysaterne, skal kørselsbetingelserne optimeres i henhold til fabrikantens anbefaling. 9.3. Hvis metoden anvendes på foder, der indeholder mere end 1 % chlorid (koncentrat, mineralfoder, fodertilskud), vil der kunne ske en undervurdering af methionin, og der skal foretages en særlig behandling. G. BESTEMMELSE AF TRYPTOPHAN 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme det samlede indhold af tryptophan (totaltryptophan) og frit tryptophan i foder. Der differentieres ikke mellem D- og L-former. 2. Princip Til bestemmelse af totaltryptophan hydrolyseres prøven i basisk miljø i en mættet bariumhydroxidopløsning og holdes opvarmet til 110 oC i 20 timer. Efter hydrolysen tilsættes der intern standard. Til bestemmelse af frit tryptophan ekstraheres prøven i svagt sur væske under tilstedeværelse af intern standard. Tryptophanet og den interne standard i hydrolysatet eller i ekstraktet bestemmes ved HPLC med fluorescensdetektor. 3. Reagenser 3.1. Der benyttes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne: < 10 μS/cm). 3.2. Standardstof: tryptophan (renhedsgrad/indhold ≥ 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentoxid. 3.3. Internt standardstof: α-methyltryptophan (renhedsgrad/indhold ≥ 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentoxid. 3.4. Bariumhydroxidoctahydrat (man skal passe på ikke at udsætte Ba(OH)2.8H2O for meget for luft, da der ellers dannes BaCO3, som kan interferere med bestemmelsen) (se bemærkning 9.3). 3.5. Natriumhydroxid. 3.6. Orthophosphorsyre, w (w/w) = 85 %. 3.7. Saltsyre, ρ20 = 1,19 g/ml. 3.8. Methanol, svarende til HPLC-kvalitet. 3.9. Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC. 3.10. Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/liter: 40,0 g NaOH (3.5) opløses i vand, og der fyldes op med vand (3.1) til 1 liter. 3.11. Saltsyre, c = 6 mol/liter: 492 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand. 3.12. Saltsyre, c = 1 mol/liter: 82 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand. 3.13. Saltsyre, c = 0,1 mol/liter: 8,2 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 liter med vand. 3.14. Orthophosphorsyre, c = 0,5 mol/liter: 34 ml orthophosphorsyre (3.6) fortyndes til 1 liter med vand (3.1). 3.15. Koncentreret opløsning af tryptophan (3.2), c = 2,50 μmol/ml: I en 500 ml målekolbe opløses 0,2553 g tryptophan (3.2) i saltsyre (3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (3.13). Opløsningen opbevares ved - 18 oC i højst 4 uger. 3.16. Koncentreret opløsning af intern standard, c = 2,5 μmol/ml: I en 500 ml målekolbe opløses 0,2728 g α-methyltryptophan (3.3) i saltsyre (3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (3.13). Opløsningen opbevares ved - 18 oC i højst 4 uger. 3.17. Standardkalibreringsopløsning af tryptophan og intern standard: 2,00 ml koncentreret opløsning af tryptophan (3.15) og 2,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (α-methyltryptophan) (3.16) fortyndes med vand (3.1) og methanol (3.8) til omtrent samme volumen og omtrent samme methanolkoncentration (10–30 %) som det færdige hydrolysat. Opløsningen skal fremstilles umiddelbart før brugen. Der sørges for beskyttelse mod direkte sollys under fremstillingen. 3.18. Eddikesyre. 3.19. 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol. 3.20. Ethanolamin, w (w/w) > 98 %. 3.21. Opløsning af 1 g 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) i 100 ml methanol (3.8). 3.22. Mobil fase til HPLC: 3,00 g eddikesyre (3.18) + 900 ml vand (3.1) +50,0 ml af opløsningen (3.21) af 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) i methanol (3.8) (1 g pr. 100 ml). pH justeres til 5,00 med ethanolamin (3.20). Der fyldes op med vand (3.1) til 1 000 ml. 4. Apparatur 4.1. HPLC-udstyr med spektrofluorometrisk detektor 4.2. HPLC-kolonne, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm pakkemateriale, eller tilsvarende 4.3. pH-meter 4.4. Polypropylenflaske, 125 ml, med vid hals og skruelåg 4.5. Membranfilter, 0,45 μm 4.6. Autoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar 4.7. Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører 4.8. Vortex-blander. 5. Fremgangsmåde 5.1. Klargøring af prøver Prøven formales, så den kan passere gennem en 0,5 mm sigte. Meget fugtige prøver skal inden formalingen enten lufttørres ved højst 50 oC eller frysetørres. Prøver med et højt fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.9) inden formaling. 5.2. Bestemmelse af frit tryptophan (ekstrakt) En passende mængde (1–5 g) af den klargjorte prøve (5.1) afvejes med en nøjagtighed på 1 mg i en konisk kolbe. Der tilsættes 100,0 ml saltsyre (3.13) og 5,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (3.16). Der omrystes eller blandes i 60 minutter på mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.7). Efter henstand og bundfældning afpipetteres 10,0 ml af supernatanten i et bægerglas. Der tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (3.14). pH justeres til 3 med natriumhydroxid (3.10). Der tilsættes så meget methanol (3.8), at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (ca. samme volumen som standardkalibreringsopløsningen (3.17)). Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4. Standardopløsninger og ekstrakter beskyttes mod direkte sollys. Hvis ekstrakterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 oC i højst 3 dage. 5.3. Bestemmelse af totaltryptophan (hydrolysat) Med en nøjagtighed på 0,2 mg afvejes 0,1–1 g af den klargjorte prøve (5.1) i polypropylenflasken (4.4). Den afvejede prøveportion skal have et kvælstofindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes 8,4 g bariumhydroxidoctahydrat (3.4) og 10 ml vand. Der blandes på vortex-blander (4.8) eller magnetomrører (4.7). Den teflonbelagte magnetpind efterlades i blandingen. Flaskens vægge skylles med 4 ml vand. Skruelåget skrues løst på flasken, der sættes ind i autoklaven (4.6) med kogende vand i 30–60 minutter. Autoklaven lukkes, og der autoklaveres ved 110 (± 2) oC i 20 timer. Temperaturen i autoklaven sænkes til lige under 100 oC, inden den åbnes. For at undgå udkrystallisering af Ba(OH)2 · 8H2O tilsættes der til den varme blanding 30 ml stuevarmt vand. Der omrystes eller omrøres forsigtigt og tilsættes 2,00 ml koncentreret intern standardopløsning (α-methyltryptophan) (3.16). Flasken afkøles i vand/isbad i 15 minutter. Derefter tilsættes 5 ml orthophosphorsyre (3.14). Medens flasken stadig står i kølebadet, neutraliseres der med saltsyre (3.11) under omrøring, og pH justeres til 3,0 med saltsyre (3.12). Der tilsættes så meget methanol, at slutkoncentrationen af methanol bliver 10–30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatografien (f.eks. 100 ml). Der må ikke ske udfældning under methanoltilsætningen. Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 5.4. Standardopløsninger og hydrolysater beskyttes mod direkte sollys. Hvis hydrolysaterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 oC i højst 3 dage. 5.4. HPLC-bestemmelse Nedenstående betingelser for isokratisk eluering er vejledende; andre betingelser kan benyttes, forudsat at de giver tilsvarende resultater (se også bemærkning 9.1 og 9.2). HPLC-kolonne (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, 3 pakkemateriale, μm eller tilsvarende Kolonnetemperatur: Rumtemperatur Mobil fase (3.22): 3,00 g eddikesyre (3.18) + 900 ml vand (3.1) +50,0 ml af opløsningen (3.21) af 1,1,1-trichlor- 2-methyl-2-propanol (3.19) i methanol (3.8) (1 g pr. 100 ml). pH justeres til 5,00 med ethanolamin (3.20). Der fyldes op med vand (3.1) til 1 000 ml Flow: 1 ml/minuttet Total gennemløbstid: ca. 34 minutter Detektionsbølgelængde: excitation: 280 nm, emission: 356 nm Injektionsvolumen: 20 μl. 6. Beregning af resultater Mængden af tryptophan (X) beregnes i gram pr. 100 g prøve: A = topareal for intern standard, standardkalibreringsopløsning (3.17) B = topareal for tryptophan, ekstrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3) V1 = volumen i ml (2 ml) af den mængde koncentreret tryptophanopløsning (3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17) c = koncentration i μmol/ml (= 2,50) af den koncentrerede tryptophanopløsning (3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17) V2 = volumen i ml af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (3.16), der er tilsat til ekstraktet (5.2) (= 5,00 ml) eller til hydrolysatet (5.3) (= 2,00 ml) C = topareal for intern standard, ekstrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3) D = topareal for tryptophan, standardkalibreringsopløsning (3.17) V3 = volumen i ml (= 2,00 ml) af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (3.16), der er tilsat til standardkalibreringsopløsningen (3.17) m = prøvens vægt i gram (korrigeret til oprindelig vægt, hvis den er tørret og/eller affedtet) M = tryptophans molarvægt (= 204,23 g/mol). 7. Repeterbarhed Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført på samme prøve må ikke overstige 10 % i relativ værdi (af det højeste resultat). 8. Resultater af ringanalyse Der er gennemført en EF-ringanalyse (4. ringanalyse), hvor 3 prøver blev analyseret i op til 12 laboratorier med henblik på certificering af hydrolysemetoden. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel: Prøve 1 Svinefoder Prøve 2 Svinefoder suppleret med L-tryptophan Prøve 3 Foderkoncentrat til svin L 12 12 12 n 50 55 50 Middelværdi [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2 L = antal laboratorier, der har indleveret resultater n = antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test) sr = standardafvigelse for repeterbarhed SR = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CVr = variationskoefficient for repeterbarhed, % CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed, %. Der er også gennemført en EF-ringanalyse (3. ringanalyse), hvor 2 prøver blev analyseret i op til 13 laboratorier med henblik på certificering af metoden til ekstraktion af frit tryptophan. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel: Prøve 4 Blanding af soja og hvede Prøve 5 Blanding af soja og hvede (= prøve 4) med tilsætning af tryptophan (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Middelværdi [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [%] 4,71 5,11 L = antal laboratorier, der har indleveret resultater n = antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test) sr = standardafvigelse for repeterbarhed SR = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CVr = variationskoefficient for repeterbarhed, % CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed, %. Der er gennemført endnu en EF-ringanalyse, hvor 4 prøver blev analyseret i op til 7 laboratorier med henblik på certificering af tryptophan med hensyn til hydrolyse. Resultaterne er vist herunder. Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Prøve 1 Svinefoderblanding (CRM 117) Prøve 2 Fiskemel med lavt fedtindhold (CRM 118) Prøve 3 Sojamel (CRM 119) Prøve 4 Skummetmælkspulver (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Middelværdi [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 Sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [%] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [%] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = antal laboratorier, der har indleveret resultater n = antal enkeltværdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon outlier-test) sr = standardafvigelse for repeterbarhed SR = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CVr = variationskoefficient for repeterbarhed, % CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed, %. 9. Bemærkninger 9.1. Nedenstående særlige kromatograferingsbetingelser kan give bedre adskillelse af tryptophan og α-methyltryptophan. Isokratisk eluering efterfulgt af gradientrensning af kolonnen som følger: HPLC-kolonne: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm pakkemateriale, eller tilsvarende Kolonnetemperatur: 32 oC Mobil fase: A: 0,01 mol/liter KH2PO4/methanol, 95 + 5 (v + v) B: methanol Gradientprogram: 0 minutter 100 % A 0 % B 15 minutter 100 % A 0 % B 17 minutter 60 % A 40 % B 19 minutter 60 % A 40 % B 21 minutter 100 % A 0 % B 33 minutter 100 % A 0 % B Flow: 1,2 ml/minuttet Total gennemløbstid: ca. 33 minutter. 9.2. Kromatograferingen varierer, alt efter hvilken type HPLC og kolonnemateriale der benyttes. Der skal vælges et system, der giver adskillelse til basislinjen mellem tryptophan og den interne standard. Det er desuden vigtigt, at nedbrydningsprodukter adskilles helt fra tryptophan og den interne standard. Der køres hydrolysater uden intern standard for at kontrollere, at der ikke ligger urenheder på basislinjen under den interne standard. Det er vigtigt, at gennemløbstiden er lang nok til, at alle nedbrydningsprodukter elueres, da toppe med lang elueringstid ellers kan interferere i efterfølgende kromatograferinger. Kromatografisystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons. Det lineære respons kontrolleres med konstant (dvs. den normale) koncentration af intern standard og varierende koncentrationer af tryptophan. Det er vigtigt, at både toppen for tryptophan og toppen for intern standard ligger inden for HPLC/fluorescenssystemets lineære område. Hvis blot en af toppene er enten for lille eller for stor, gentages analysen med en anden prøvestørrelse og/eller et andet slutvolumen. 9.3. Bariumhydroxid Bariumhydroxid bliver med tiden vanskeligere at opløse. Det medfører, at opløsningen til HPLC-bestemmelse bliver uklar, hvilket kan betyde, at resultaterne for tryptophan bliver for lave. H. BESTEMMELSE AF RÅFEDT 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode anvendes til bestemmelse af råfedtindholdet i foder. Den er ikke beregnet til analyse af olieholdige frø og frugter. Anvendelsen af de to fremgangsmåder, der er beskrevet nedenfor, afhænger af arten og sammensætningen af foderet og af grunden til, at analysen gennemføres. 1.1. Metode A — Råfedt, som kan ekstraheres direkte Denne metode anvendes til vegetabilske fodermidler med undtagelse af dem, der er medtaget under metode B. 1.2. Metode B — Råfedt i alt Denne metode anvendes til animalske fodermidler samt til alle foderblandinger. Den skal anvendes til alle materialer, hvorfra råfedt ikke kan ekstraheres fuldstændigt uden forudgående hydrolyse, såsom gluten, gær, kartoffelproteiner og produkter, der underkastes processer som ekstrudering, omdannelse til flager og opvarmning. 1.3. Fortolkning af resultater I samtlige tilfælde, hvor der opnås et højere resultat ved anvendelse af metode B end ved metode A, skal de resultater, der er opnået ved metode B, accepteres som den sande værdi. 2. Princip 2.1. Metode A Prøven ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet afdampes, og remanensen tørres og vejes. 2.2. Metode B Prøven behandles med saltsyre under opvarmning. Blandingen afkøles og filtreres. Den vaskede og tørrede remanens behandles herefter som beskrevet under metode A. 3. Reagenser 3.1. Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC. Bromtallet skal være under 1, og inddampningsresten under 2 mg/100 ml 3.2. Natriumsulfat, vandfrit 3.3. Saltsyre, c = 3 mol/liter 3.4. Filtreringsmiddel, f.eks. kiselgur, Hyflo-supercel. 4. Apparatur 4.1. Ekstraktionsapparat. Dersom apparatet er udstyret med et hævertrør (Soxhlet-apparat), indstilles varmekilden, så der sker ca. 10 tømninger i timen; dersom apparatet ikke er udstyret med hævertrør, skal tilbageløbet være på ca. 10 ml i minuttet. 4.2. Ekstraktionshætter skal være fri for stof, der er opløseligt i petroleumsether, og skal have en porøsitet i overensstemmelse med kravene under 4.1. 4.3. Tørreskab, enten et vakuumtørreskab indstillet til 75 oC ± 3 oC eller et tørreskab med luftcirkulation indstillet til 100 oC ± 3 oC. 5. Fremgangsmåde 5.1. Metode A (se punkt 8.1) 5 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg, overføres til en ekstraktionshætte (4.2) og tildækkes med en affedtet vatprop. Hætten anbringes i et ekstraktionsapparat (4.1), og der ekstraheres i 6 timer med petroleumsether (3.1). Petroleumsetherekstraktet opsamles i en tør, tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten (2). Opløsningsmidlet afdampes. Remanensen tørres derpå i kolben i 1 1/2 time i tørreskab (4.3). Efter afkøling i ekssikkator vejes remanensen. Der tørres i yderligere 30 minutter for at sikre, at fedtets vægt forbliver konstant (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 1 mg). 5.2. Metode B 2,5 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg (se punkt 8.2) og overføres til et 400 ml bægerglas eller en 300 ml konisk kolbe, hvorefter der tilsættes 100 ml saltsyre (3.3) og stykker af pimpsten. Bægerglasset tildækkes med et urglas, eller hvis der anvendes en konisk kolbe, forsynes denne med en tilbagesvaler. Blandingen bringes til let kogning over en svag flamme eller på varmeplade i ca. 1 time. Materialet skal forhindres i at sætte sig fast på beholderens sider. Beholderen afkøles, og der tilsættes så meget filtreringsmiddel (3.4), at der ikke opstår noget fedttab ved filtreringen. Der filtreres gennem et fugtigt, fedtfrit dobbelt filtrerpapir. Remanensen vaskes med koldt vand, indtil filtratet er neutralt. Det kontrolleres, at filtratet ikke indeholder fedt. Tilstedeværelse af fedt viser, at der inden hydrolysen skal foretages en ekstraktion af prøven med petroleumsether ved anvendelse af metode A. Det dobbelte filtrerpapir med remanensen lægges på et urglas og tørres i tørreskab (4.3) ved 100 oC ± 3 oC i 1 ½ time. Det dobbelte filtrerpapir med den tørre remanens anbringes i ekstraktionshætte (4.2) og tildækkes med en affedtet vatprop. Hætten anbringes i et ekstraktionsapparat (4.1), hvorefter der fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, andet og tredje afsnit. 6. Angivelse af resultater Remanensens vægt angives i procent af prøven. 7. Repeterbarhed Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udført af den samme person på den samme prøve må ikke overstige: — 0,2 % i absolut værdi for råfedtindhold på under 5 % — 4,0 % i relativ værdi (af det højeste resultat) for indhold på 5–10 % — 0,4 % i absolut værdi for indhold på over 10 %. 8. Bemærkninger 8.1. For produkter med højt fedtindhold, som er vanskelige at formale, eller som ikke egner sig til udtagning af en reduceret homogen prøve, anvendes følgende fremgangsmåde: 20 g af prøven afvejes med en nøjagtighed på 1 mg og blandes med mindst 10 g vandfrit natriumsulfat (3.2). Derpå ekstraheres med petroleumsether (3.1) som angivet under punkt 5.1. Det herved opsamlede ekstrakt tilsættes petroleumsether (3.1) ad 500 ml, og blandingen rystes. Af opløsningen udtages 50 ml, som hældes i en lille, tør, tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten. Opløsningsmidlet afdampes; derpå tørres og fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, sidste afsnit. Ekstraktionsresten i hætten befries for opløsningsmidlet og formales til en kornstørrelse på 1 mm, hvorefter den hældes tilbage i ekstraktionshætten (der tilsættes ikke natriumsulfat); derpå fortsættes som beskrevet i punkt 5.1, andet og tredje afsnit. Fedtindholdet beregnes som en procentdel af prøven ved anvendelse af nedenstående formel: (10m1 + m2) × 5 hvor: m1 = vægt i gram af remanensen efter den første ekstraktion (den alikvote del af ekstraktet) m2 = vægt i gram af remanensen efter den anden ekstraktion. 8.2. For produkter med lavt fedtindhold kan der anvendes en afvejning på 5 g. 8.3. Foder med højt vandindhold til selskabsdyr vil det kunne være nødvendigt at blande med vandfrit natriumsulfat forud for hydrolyse og ekstraktion som ved metode B. 8.4. I punkt 5.2 vil det kunne være mere effektivt at anvende varmt vand i stedet for koldt vand til vaskning af remanensen efter filtrering. 8.5. Det kan for visse typer foder være nødvendigt at forlænge tørringstiden på 1 ½ time. Overdreven tørring undgås, da en sådan kan føre til lave resultater. En mikrobølgeovn kan også anvendes. 8.6. Præekstraktion ved metode A forud for hydrolyse og reekstraktion ved metode B anbefales, hvis råfedtindholdet er højere end 15 %. Dette afhænger til en vis grad af arten af foderet og af arten af fedtet i foderet. I. BESTEMMELSE AF TRÆSTOF 1. Formål og anvendelsesområde Denne metode gør det muligt at bestemme indholdet af fedtfri organiske stoffer i foder, som er uopløselige i fortyndede syre- og baseopløsninger, og som normalt betegnes som træstof. 2. Princip Prøven, der om nødvendigt er affedtet, behandles i kogende opløsninger af først svovlsyre og derefter kaliumhydroxid i bestemte koncentrationer. Remanensen adskilles ved filtrering i en glasfilterdigel, hvorefter det vaskes, tørres, vejes og foraskes ved 475–500 oC. Vægttabet ved foraskningen svarer til træstofindholdet i prøven. 3. Reagenser 3.1. Svovlsyre, c = 0,13 mol/liter 3.2. Skumdæmpende middel (f.eks. n-octanol) 3.3. Filtreringshjælpemiddel (Celite 545 el. lign.) opvarmet til 500 oC i 4 timer (8.6) 3.4. Acetone 3.5. Petroleumsether, kogepunktsinterval: 40–60 oC 3.6. Saltsyre, c = 0,5 mol/liter 3.7. Kaliumhydroxidopløsning, c = 0,23 mol/liter. 4. Apparatur 4.1. Varmeenhed til kogning med svovlsyre og kaliumhydroxid med holder til filterdiglen (4.2) og afgangsrør med hane til væskeafløb samt vakuumpumpe, eventuelt med trykluft. Enheden forvarmes før daglig brug med kogende vand i 5 minutter. 4.2. Glasfilterdigel med filterplade af sintret glas, porestørrelse: 40–90 μm. Inden den første gang tages i anvendelse, opvarmes den i nogle få minutter til 500 oC og afkøles (8.6). 4.3. Kogecylinder på mindst 270 ml med tilbagesvaler. 4.4. Tørreskab med termostat. 4.5. Muffelovn med termostat. 4.6. Ekstraktionsapparat med holder til filterdiglen (4.2) og afgangsrør med hane til væskeafløb samt vakuumpumpe. 4.7. Forbindelsesringe til samling af varmeenhed (4.1), filterdigel (4.2) og kogecylinder (4.3) og til samling af koldekstraktionsapparat (4.6) og filterdigel. 5. Fremgangsmåde I glasfilterdiglen (4.2) afvejes med 1 mg nøjagtighed 1 g af den klargjorte prøve (se bemærkning 8.1, 8.2 og 8.3), og der tilsættes 1 g filtreringshjælpemiddel (3.3). Varmeenheden (4.1) og filterdiglen (4.2) samles. Kogecylinderen (4.3) forbindes til diglen. 150 ml svovlsyre (3.1), der er opvarmet til kogepunktet, overføres til kogecylinderen, og om nødvendigt tilsættes nogle få dråber skumdæmpende middel (3.2). Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af 5 ± 2 minutter og koges livligt i nøjagtig 30 minutter. Afgangshanen (4.1) åbnes, og svovlsyren filtreres under vakuum gennem filterdiglen. Remanensen på filterdiglen vaskes under vakuum tre gange med 30 ml kogende vand hver gang. Filtret med remanensen suges tørt efter hver vask. Afgangshanen lukkes, og 150 ml kogende kaliumhydroxidopløsning (3.7) overføres til kogecylinderen. Der tilsættes nogle få dråber skumdæmpende middel (3.2). Væsken opvarmes til kogepunktet i løbet af 5 ± 2 minutter og koges livligt i nøjagtig 30 minutter. Remanensen filtreres og vaskes på samme måde som efter behandling med svovlsyre. Efter den sidste vask suges bundfaldet tørt, og diglen med indhold forbindes til koldekstraktionsapparatet (4.6). Remanensen i diglen vaskes under vakuum tre gange med 25 ml acetone (3.4) hver gang og suges tørt efter hver vask. Filterdiglen med indhold tørres i tørreskabet ved 130 oC indtil konstant vægt. Efter hver tørring afkøles diglen i en ekssikkator og vejes straks. Herefter anbringes den i muffelovnen, og indholdet foraskes ved 475–500 oC i mindst 30 minutter. Dette gentages indtil konstant vægt (vægttabet mellem to på hinanden følgende vejninger må højst være på 2 mg). Efter hver foraskning afkøles diglen først i ovnen og derefter i ekssikkatoren, inden den vejes. Der foretages en blindprøve uden prøve. Vægttabet ved foraskningen må ikke overstige 4 mg. 6. Beregning af resultater Træstofindholdet som procent af prøven beregnes efter følgende formel: hvor: m = prøvens vægt i gram m0 = vægttabet i gram efter foraskning under bestemmelsen m1 = vægttabet i gram ved foraskning af remanensen af blindprøven. 7. Repeterbarhed Forskellen mellem resultaterne af to p