Kommissionens beslutning

af 21. februar 2002

om ændring af bilag D til Rådets direktiv 90/426/EØF for så vidt angår test til diagnosticering af afrikansk hestepest

(meddelt under nummer K(2002) 556)

(EØS-relevant tekst)

(2002/160/EF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets direktiv 90/426/EØF af 26. juni 1990 om dyresundhedsmæssige betingelser for enhovede dyrs bevægelser og indførsel af enhovede dyr fra tredjelande(1), senest ændret ved beslutning 2001/298/EF(2), særlig artikel 23, og

ud fra følgende betragtninger:

(1) Bilag D til direktiv 90/426/EØF beskriver den komplementbindingstest, der skal udføres til diagnosticering af afrikansk hestepest.

(2) I november 2000 var EF-referencelaboratoriet i Algete, Spanien, vært ved det årlige møde mellem de nationale referencelaboratorier for afrikansk hestepest i EU-medlemsstaterne. Under dette møde blev der fremlagt videnskabeligt bevis for, at den komplementbindingstest, der på nuværende tidspunkt er beskrevet i bilag D til direktiv 90/426/EØF, har alvorlige mangler, navnlig fordi den kun egner sig til påvisning af antistoffer efter nylig infektion eller vaccination. Desuden har moderne ELISA'er i praksis afløst denne test på næsten alle laboratorier i EF og tillige i de større eksportlande.

(3) De internationalt anerkendte laboratorietest til påvisning af antistoffer mod afrikansk hestepestvirus er beskrevet i Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines(3) fra Det Internationale Kontor for Epizootier (OIE). Den nuværende udgave nævner dog kun en af de foreliggende ELISA'er.

(4) Bilag D til direktiv 90/426/EØF bør derfor ændres for at tage hensyn til den tekniske udvikling og internationalt godkendte normer.

(5) De i denne beslutning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Stående Veterinærkomité -

VEDTAGET FØLGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

Bilag D til direktiv 90/426/EØF affattes som angivet i bilaget til nærværende beslutning.

Artikel 2

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.

Udfærdiget i Bruxelles, den 21. februar 2002.

På Kommissionens vegne

David Byrne

Medlem af Kommissionen

(1) EFT L 224 af 18.8.1990, s. 42.

(2) EFT L 102 af 12.4.2001, s. 63.

(3) Kapitel 2.1.11, 4. udgave 2000.

BILAG

"BILAG D

AFRIKANSK HESTEPEST

DIAGNOSE

Reagenser til de ELISA'er, der er beskrevet nedenfor, fås hos EF-referencelaboratoriet eller OIE-referencelaboratorierne for afrikansk hestepest.

1. KOMPETITIV ELISA TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD AFRIKANSK HESTEPESTVIRUS (AHSV) (FORESKREVET TEST)

Kompetitiv ELISA anvendes til påvisning af specifikt AHSV-antistof i sera fra alle arter enhovede dyr. Det bredspektrede, polyklonale immunanti-AHSV-marsvineserum (i det følgende betegnet "marsvineantiserum") er serumgruppespecifikt og kan påvise alle kendte serotyper af AHS-virus.

Testprincippet er at afbryde reaktionen mellem AHSV-antigen og et marsvineantiserum ved hjælp af en testserumprøve. AHSV-antistofferne i testserumprøven vil konkurrere med antistofferne i marsvineantiserummet, hvilket medfører, at farven bliver mindre kraftig end forventet (efter tilsætning af enzymmærket antimarsvineantistof og substrat). Der kan testes sera i en enkelt fortynding på 1:5 (spottestmetode), eller der kan titreres (serumtitreringsmetode) til fortyndingsendepunkterne. Hæmningsværdier på over 50 % kan betragtes som positive.

Den testprotokol, der er beskrevet i det efterfølgende, anvendes på Regional Reference Laboratory for African horse sickness i Pirbright, Det Forenede Kongerige.

1.1. Testprocedure

1.1.1. Fremstilling af plader

1.1.1.1. ELISA-plader påføres AHSV-antigen, der er udvundet af inficerede cellekulturer og fortyndet med carbonat-bicarbonatbuffer, pH-værdi 9,6. ELISA-pladerne inkuberes natten over ved 4 °C.

1.1.1.2. Pladerne skylles 3 gange ved, at hullerne overhældes med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH-værdi 7,2-7,4, tømmes og tørres med absorberende papir.

1.1.2. Kontrolhuller

1.1.2.1. De positive kontrolsera titreres i en tofolds fortyndingsrække mellem 1:5 og 1:640 tværs over kolonne 1 i blokerende buffer (PBS indeholdende 0,05 % (v/v) Tween-20, 5,0 % (w/v) skummetmælkspulver (Cadbury's MarvelTM) og 1 % (v/v) serum fra voksent kvæg) til en slutmængde på 50 μl/hul.

1.1.2.2. Der tilsættes 50 μl negativt kontrolserum i en fortynding på 1:5 (10 μl serum + 40 μl blokerende buffer) til hul A og B i kolonne 2.

1.1.2.3. Der tilsættes 100 μl/hul blokerende buffer til hul C og D i kolonne 2 (BLANK).

1.1.2.4. Der tilsættes 50 μl blokerende buffer til hul E, F, G og H i kolonne 2 (marsvinekontrol).

1.1.3. Spottestmetode

1.1.3.1. Der tilsættes en 1:5-fortynding af hvert testserum i blokerende buffer til huller til dobbeltbestemmelse i kolonne 3 til 12 (10 μl sera + 40 μl blokerende buffer).

eller

1.1.4. Serumtitreringsmetode

1.1.4.1. Der tilberedes en tofolds fortyndingsrække af hver prøve (mellem 1:5 og 1:640) i blokerende buffer over otte huller i hver kolonne (3 til 12).

derefter

1.1.5. Der tilsættes 50 μl marsvineantisera, som forinden er fortyndet med blokerende buffer, til alle huller bortset fra BLANK-hullerne i ELISA-pladen (alle huller indeholder nu en slutmængde på 100 μl).

1.1.5.1. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C på en orbitalryster.

1.1.5.2. Pladerne skylles tre gange og tørres som før.

1.1.5.3. Der tilsættes 50 μl kanin-antimarsvin peberrodsperoxidase-konjugat (HRP), som forinden er fortyndet med blokerende buffer, til hvert hul.

1.1.5.4. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C på en orbitalryster.

1.1.5.5. Pladerne skylles tre gange og tørres som før.

1.1.6. Kromogen

Kromogen-OPD-opløsningen (OPD = ortho-phenyldiamin) tilberedes efter fabrikantens anvisninger (0,4 mg/ml i steriliseret destilleret vand) lige inden brug. Der tilsættes substrat (hydrogenperoxid = H2O2) til en slutkoncentration på 0,05 % (v/v) (1: 2000 af en 30 % opløsning af H2O2). Der tilsættes 50 μl af OPD-opløsningen til hvert hul, og pladerne henstår på bordet i 10 minutter ved omgivelsestemperatur. Reaktionen standses ved, at der tilsættes 50 μl/hul 1 M svovlsyre (H2SO4).

1.1.7. Aflæsning

Aflæses spektrofotometrisk ved 492 nm.

1.2. Angivelse af resultater

1.2.1. Ved hjælp af en programpakke udprintes værdierne for absorbans (OD) og den procentvise hæmning (PI) for test- og kontrolsera baseret på gennemsnitsværdien for de fire marsvinekontrolhuller. Dataene udtrykt som OD- og PI-værdier anvendes til bestemmelse af, om testen er udført pålideligt nok. De øvre kontrolgrænser (UCL) og nedre kontrolgrænser (LCL) for marsvinekontrollen ligger henholdsvis mellem OD-værdierne 1,4 og 0,4. Endepunktstiteren for den positive kontrol baseret på 50 % PI bør være 1:240 (mellem 1:120 og 1:480). Plader, der ikke opfylder de ovennævnte kriterier, må kasseres. Hvis titeren for det positive kontrolserum er større end 1:480 og prøverne stadig er negative, kan de negative prøver dog accepteres.

Hullerne med negativt kontrolserum til dobbeltbestemmelse og blankhullerne til dobbeltbestemmelse bør henholdsvis give PI-værdier mellem + 25 % og - 25 % og mellem + 95 % og + 105 %. Resultater uden for disse grænser er ikke ensbetydende med, at pladen må kasseres, men tyder på, at der er ved at udvikle sig baggrundsfarve.

1.2.2. Den diagnostiske tærskel (cut-off-værdi) for testsera er 50 % (PI 50 %). Prøver, der giver PI-værdier over 50 %, registreres som positive. Prøver, der giver PI-værdier under 50 %, registreres som negative.

Prøver, der giver PI-værdier over og under tærsklen for hullerne til dobbeltbestemmelse, betragtes som tvivlsomme. Sådanne prøver kan gentestes i spottesten og ved titrering. Positive prøver kan også titreres, så der fås en indikation af, hvor positive de er.

Spottestskema

>TABELPOSITION>

-ve. Cont.= negativ kontrol.

+ve. Cont.= positiv kontrol.

GP Cont.= marsvinekontrol.

Serumtitreringsskema

>TABELPOSITION>

-ve. Cont.= negativ kontrol.

+ve. Cont.= positiv kontrol.

GP Cont.= marsvinekontrol.

2. INDIREKTE ELISA TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD AFRIKANSK HESTEPESTVIRUS (AHSV) (FORESKREVET TEST)

Den nedenfor beskrevne test er i overensstemmelse med testbeskrivelsen i kapitel 2.1.11 i OIE's Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 4. udgave, 2000.

Det rekombinante VP7-protein er blevet anvendt som antigen til bestemmelse af AHS-virusantistof på grund af dets store følsomhed og specificitet. Andre fordele er, at det er stabilt og ikke infektiøst.

2.1. Testprocedure

2.1.1. Fast fase

2.1.1.1. ELISA-plader påføres rekombinant AHSV-4 VP7 fortyndet med carbonat-bicarbonatbuffer, pH-værdi 9,6. Pladerne inkuberes natten over ved 4 °C.

2.1.1.2. Pladerne skylles fem gange med destilleret vand indeholdende 0,01 % (v/v) Tween 20 (skylleopløsning). Pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale, så eventuel resterende skylleopløsning fjernes.

2.1.1.3. Pladerne blokeres med fosfatbufferet saltopløsning(PBS) + 5 % (w/v) skummetmælk (skummetmælkspulver fra NestléTM), 200 μl/hul, i 1 time ved 37 °C.

2.1.1.4. Den blokerende opløsning fjernes, og pladerne bankes forsigtigt mod absorberende materiale.

2.1.2. Prøver

2.1.2.1. De serumprøver, der skal testes, og positive og negative kontrolsera fortyndes 1:25 med PBS + 5 % (w/v) skummetmælk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl pr. hul. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C.

Ved titrering tilberedes tofolds fortyndingsrækker fra 1:25 (100 μl/hul), ét serum pr. pladekolonne, og det samme gøres med de positive og negative kontroller. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C.

2.1.2.2. Pladerne skylles som beskrevet på trin 2.1.1.2.

2.1.3. Konjugat

2.1.3.1. Der overføres 100 μl/hul peberrodsperoxidasekonjugeret (HRP) antihestegammaglobulin fortyndet med PBS + 5 % mælk + 0,05 % Tween 20, pH-værdi 7,2. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C.

2.1.3.2. Pladerne skylles som beskrevet på trin 2.1.1.2.

2.1.4. Kromogen/substrat

2.1.4.1. Der tilsættes 200 μl/hul kromogen-/substratopløsning [10 ml 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyd) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolin-hydrazonhydro-chlorid) + 5 μl H2O2].

Farveudviklingen standses ved tilsætning af 50 μl 3 N H2SO4 efter ca. 5-10 minutter (inden den negative kontrol begynder at antage farve).

Andre kromogener såsom ABTS (2,2'-azino-bis-[3-ethylbenzo-thiazolin-6-sulfonsyre]), TMB (tetramethylbenzidin) eller OPD (ortho-phenyldiamin) kan også benyttes.

2.1.4.2. Pladerne aflæses ved 600 nm (eller 620 nm).

2.2. Fortolkning af resultater

2.2.1. Cut-off-værdien beregnes ved, at der lægges 0,6 til værdien af den negative kontrol (0,6 er den afledte standardafvigelse for en gruppe på 30 negative sera).

2.2.2. Prøver, der giver absorbansværdier, som ligger under cut-off, betragtes som negative.

2.2.3. Prøver, der giver absorbansværdier, som ligger over cut-off + 0,15, betragtes som positive.

2.2.4. Prøver, der giver mellemliggende absorbansværdier, er tvivlsomme, og resultatet skal bekræftes ved en anden metode.

3. BLOKERENDE ELISA TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD AFRIKANSK HESTEPESTVIRUS (AHSV) (FORESKREVET TEST)

Den blokerende ELISA kan påvise specifikke AHSV-antistoffer i sera fra alle modtagelige arter. VP7 er det vigtigste AHSV-antigenprotein og findes inden for de ni serotyper. Da det monoklonale antistof (Mab) også er rettet mod VP7, vil testen udvise stor følsomhed og specificitet. Desuden er det rekombinante VP7-antigen helt uskadeligt og garanterer derfor en høj grad af sikkerhed.

Testprincippet er at afbryde reaktionen mellem det rekombinante VP7, det antigen, der er bundet til ELISA-pladen, og det VP7-specifikke konjugerede Mab. Antistoffet i testseraene vil blokere reaktionen mellem antigenet og Mab, hvilket medfører, at farven bliver mindre kraftig.

Den nedenfor beskrevne test udføres på EF-referencelaboratoriet for afrikansk hestepest i Algete, Spanien.

3.1. Testprocedure

3.1.1. ELISA-plader

3.1.1.1. Pladerne påføres rekombinant AHSV-4 VP7, som er fortyndet med carbonat-bicarbonatbuffer, pH-værdi 9,6. Der inkuberes natten over ved 4 °C.

3.1.1.2. Pladerne skylles 5 gange med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) indeholdende 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).

3.1.1.3. Pladerne stabiliseres ved behandling med en stabiliserende opløsning (så de kan opbevares i lang tid ved 4 °C uden tab af aktivitet) og tørres med absorberende materiale.

3.1.2. Prøver og kontroller

3.1.2.1.

>TABELPOSITION>

3.1.2.2.

>TABELPOSITION>

3.1.3. Konjugat

Der tilsættes 50 μl/hul forfortyndet peberrodsperoxidasekonjugeret (HRP) Mab (monoklonale antistoffer, der er specifikke for VP7) til hvert hul og blandes forsigtigt, så der opnås homogenitet. Der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.

3.1.4. Pladerne skylles fem gange med PBST og tørres som før.

3.1.5. Kromogen/substrat

Der tilsættes 100 μl/hul kromogen-/substratopløsning [1 ml ABTS (2,2'-azino-bis-[3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre] 5 mg/ml ± 9 ml substratbuffer (0,1 M fosfat-citratbuffer med en pH-værdi på 4 indeholdende 0,03 % H2O2) og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Farveudviklingen standses ved tilsætning af 100 μl/hul 2 % (w/v) SDS (natriumdodecylsulfat).

3.1.6. Aflæsning

Der aflæses ved 405 nm i en ELISA-læser.

3.2. Fortolkning af resultater

3.2.1. Validering af prøven

Testen er pålidelig, når absorbansen (OD) af den negative kontrol (NC) er højere end 1,0, og OD af den positive kontrol (PC) er lavere end 0,2.

3.2.2. Beregning af cut-off

Positiv cut-off=

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Negativ cut-off=

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor NC er OD af den negative kontrol, og PC er OD af den positive kontrol.

3.2.3. Fortolkning af resultater

Prøver med lavere OD end den positive cut-off bør betragtes som positive for AHSV-antistoffer.

Prøver med højere OD end den negative cut-off bør betragtes som negative for AHSV-antistoffer.

Prøver med OD mellem disse to værdier bør betragtes som tvivlsomme, og der bør tages endnu en prøve fra dyrene efter 2-3 uger."