KOMMISSIONENS TOLVTE DIREKTIV 93/117/EF af 17. december 1993 om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europaeiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 70/373/EOEF af 20. juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder for saa vidt angaar den officielle kontrol med foderstoffer (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 3768/85 (2), saerlig artikel 2, og

ud fra foelgende betragtninger:

Ved direktiv 90/373/EOEF er det fastsat, at den officielle kontrol med foderstoffer til konstatering af, om de betingelser, der er fastsat paa grundlag af administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser om foderstoffernes beskaffenhed og sammensaetning er opfyldt, foretages efter faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder;

for at det kan kontrolleres, om betingelserne for at anvende robenidin og methylbenzoquat i foderstoffer overholdes, boer der fastsaettes en faellesskabsanalysemtode for dette tilsaetningsstof;

de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Foderstofkomité -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV:

Artikel 1

Medlemsstaterne foreskriver, at analyserne i forbindelse med den officielle kontrol af foderstoffer, for saa vidt angaar deres indhold af robenidin og methylbenzoquat, skal foretages efter den metode, der er beskrevet i bilaget.

Artikel 2

Medlemsstaterne saetter senest den 30. november 1994 de noedvendige ved lov aller administrativt fastsatte bestemmelser i kraft for at efterkomme bestemmelserne i dette direktiv. De underretter straks Kommissionen herom.

Naar medlemsstaterne vedtager disse bestemmelser, henvises der deri til dette direktiv, eller de ledsages ved offentliggoerelsen af en saadan henvisning. De naermere regler for denne henvisning fastsaettes af medlemsstaterne.

Artikel 3

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.

Dette direktiv traeder i kraft paa tredjedagen for dets offentliggoerelse i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 17. december 1993.

Paa Kommissionens vegne

René STEICHEN

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 170 af 3. 8. 1970, s. 2.

(2) EFT nr. L 362 af 31. 12. 1985, s. 8.

BILAG

1. BESTEMMELSE AF ROBENIDIN 1,3-Bis((4-chlorobenzyliden)amino) guanidinhydrochlorid

1. Formaal og anvendelsesomraade

Dette er en metode til bestemmelse af robenidin i foderstoffer. Den nedre bestemmelsesgraense er 5 mg/kg.

2. Princip

Proeven ekstraheres med sur methanol. Ekstraktet toerres, og en alikvot maengde renses i en soejle indeholdende aluminiumoxid. Robenidinet elueres fra soejlen med koncentreret methanol, og rumfanget oeges i passende grad ved tilsaetning af mobil fase. Indholdet af robenidin bestemmes ved omvendt-fase HPLC ved anvendelse af en UV-detektor.

3. Reagenser

3.1. Methanol

3.2. Sur methanol

4,0 ml saltsyre (P20 ca. 1,18 g/ml) overfoeres til en 500 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes op til maerket med methanol (3.1) og blandes. Denne oploesning tilberedes umiddelbart foer brug.

3.3. Acetonitril, HPLC-kvalitet

3.4. Molekularsieve

Type 3A, 8-12 mesh (1,6-2,5 mm kugler, krystallinsk aluminiumsilikat, porediameter 0,3 nm).

3.5. Aluminiumoxid: sur, aktivitetsgrad I foer soejlekromatografi

100 g aluminiumoxid overfoeres til en egnet beholder, og der tilsaettes 2,0 ml vand. Beholderen tilproppes og omrystes i ca. 20 minutter. Vaesken opbevares i en godt tilproppet beholder.

3.6. Kaliumhydrogenphosphatoploesning, c = 0,025 mol/l

3,40 g kaliumdihydrogenphosphat oploeses i vand (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes op til maerket og blandes.

3.7. Dinatriumhydrogenphosphatoploesning, c = 0,025 mol/l

3,55 g vandfri (eller 4,45 dihydrat eller 8,95 g dodecahydrat) dinatriumhydrogenphosphat oploeses i vand (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes op til maerket og blandes.

3.8. HPLC mobil fase

Foelgende reagenser blandes:

650 ml acetonitril (3.3)

250 ml vand (HPLC-kvalitet)

50 ml kaliumdihydrogenphosphatoploesning (3.6)

50 ml dinatriumhydrogenphosphatoploesning (3.7)

Der filtreres gennem et 0,22 mm filter (4.6), og oploesningen udluftes (f.eks. ved ultralydsbehandling i ti minutter).

3.9. Standard

Ren robenidin: 1.3-Bis((4-chlorobenzyliden)amino)guanidinhydrochlorid E 758

3.9.1. Robenidinstamoploesning: 300 mg/ml

Med en noejagtighed paa 0,1 mg afvejes 30 mg robenidinstandard (3.9) og oploeses i syrnet methanol (3.2) i en 100 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes op til maerket med samme oploesning og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i moerke.

3.9.2. Robenidinstandardoploesning: 12 mg/ml

10,0 ml af stamoploesningen (3.9.1) overfoeres til en 250 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes til maerket med mobil fase (3.8) og blandes. Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i moerke.

3.9.3. Kalibreringsoploesninger

Til en raekke 50 ml maalekolber overfoeres henholdsvis 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 og 25,0 ml af standardoploesningen (3.9.2). Der fyldes op til maerket med mobil fase (3.8) og blandes. Disse oploesninger svarer til henholdsvis 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 og 6,0 mg/ml robenidin pr. ml. Disse oploesninger tilberedes umiddelbart foer brug.

4. Apparatur

4.1. Glassoejle

Fremstillet af brunt glas og forsynet med stophane og med et rumfang paa ca. 150 ml, indvendig diameter 10-15 mm, laengde 250 mm.

4.2. Laboratorie »wrist-action« ryster

4.3. Rotationsinddamper

4.4. HPLC-udstyr med UV-detektor med variabel boelgelaengde eller diodearraydetektor, som arbejder inden for omraadet 250-400 nm

4.4.1. Vaeskekromatografisoejle: 300 mm × 4 mm, C18, 10 mm pakning eller tilsvarende

4.5. Glasfiberfiltrerpapir (Whatman GF/A eller tilsvarende)

4.6. Membranfiltre, 0,22 mm

4.7. Membranfiltre, 0,45 mm

5. Fremgangsmaade

NB: Robenidin er lysfoelsomt. Der boer anvendes brunt glasmateriel ved alle operationer.

5.1. Generelt

5.1.1. En blindproeve analyseres for at kontrollere, at der hverken er robenidin eller andre interfererende stoffer til stede.

5.1.2. Genfindelsen kontrolleres ved at analysere blindproeven (5.1.1), der tilsaettes robenidin i en maengde svarende til analyseproevens indhold. For at tilsaette 60 mg/kg, tilsaettes 3,0 ml af stamoploesningen (3.9.1) til en 250 ml konisk kolbe. Oploesningen inddampes til ca. 0,5 ml i en stroem af nitrogen. Tilsaet 15 g af blindproeven, bland og vent ti minutter foer der fortsaettes med ekstraktion (5.2).

Fodnote: Til denne metode anvendes en blindproeve, af samme type som analyseproeven, og som ved analyse viser sig ikke at indeholde robenidin.

5.2. Ekstraktion

Med en noejagtighed paa 0,01 g afvejes ca. 15 g af den tilberedte proeve, overfoeres til en 250 ml konisk kolbe og tilsaettes 100,0 ml sur methanol (3.2), hvorefter kolben tilproppes og rystes i en time paa shakeren (4.2). Oploesningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (4.5), og hele filtratet opsamles i en 150 ml konisk kolbe. Der tilsaettes 7,5 mg molecularsieve (3.4), tilproppes og omrystes i fem minutter. Derefter filtreres omgaaende gennem et glasfiberfiltrerpapir. Denne oploesning anvendes til oprensningsprocessen (5.3).

5.3. Oprensning

5.3.1. Forberedelse af aluminiumoxid-soejlen

En lille prop af glasuld anbringes i den nederste ende af en glassoejle (4.1) og skubbes helt ned med en glasstang. 11,0 g af den forberedte aluminiumoxid (3.5) afvejes og overfoeres til soejlen. Man maa omhyggeligt passe paa at mindske luftens adgang under dette stadium. Der bankes let paa soejlens nederste ende for at faa aluminiumoxidet til at saette sig.

5.3.2. Oprensning af proeven

Med pipette overfoeres 5,0 ml af det under (5.2) forberedte proeveekstrakt til soejlen. Man holder spidsen af pipetten naer soejlevaeggen og lader oploesningen absorberes af aluminiumoxidet. Robenidin elueres fra soejlen under anvendelse af 100 ml methanol (3.1) med en gennemstroemningshastighed paa 2-3 ml/min., og eluatet opsamles i en 250 ml rundbundet kolbe. Methanoloploesningen inddampes til toerhed under nedsat tryk ved 40 °C ved hjaelp af en rotationsinddamper (4.3). Remanensen oploeses i 3-4 ml mobil fase (3.8) og overfoeres kvantitativt til en 10 ml maalekolbe. Kolben skylles med flere portioner paa 1-2 ml mobil fase, som overfoeres til maalekolben. Der fyldes op til maerket med samme oploesningsmiddel og blandes. En alikvot maengde filtreres gennem et 0,45 mm filter (4.7). Denne oploesning gemmes til HPLC-bestemmelsen (5.4).

5.4. HPLC-bestemmelse

5.4.1. Parametre

Foelgende betingelser er vejledende. Andre betingelser kan bruges, saafremt de giver de samme resultater:

HPLC-kolonne (4.4.1)

HPLC mobil fase (3.8)

Flowhastighed: 1,5-2 ml/min.

Detektorboelgelaengde: 317 nm

Injektionsvolumen: 20-50 ml.

Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres ved, at der flere gange injiceres kalibreringsoploesning (3.9.3) med 3,6 mg/ml, indtil der er opnaaet konstante tophoejder og retentionstider.

5.4.2. Kalibreringskurve

Hver kalibreringsoploesning (3.9.3) injiceres flere gange, og hoejden af toppene (arealerne) for hver koncentration maales. Der plottes en kalibreringskurve ved brug af kalibreringsoploesningernes middeltophoejder eller -arealer som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i mg/ml som abscisse.

5.4.3. Proeveoploesning

Proeveekstraktet (5.3.2) injiceres flere gange, idet der benyttes samme maengde som til kalibreringsoploesningerne, og middeltophoejden (arealet) af robenidintoppene bestemmes.

6. Beregning af resultaterne

Ud fra middeltophoejden (arealet) af proeveoploesningens robenidintoppe bestemmes proeveoploesningens koncentration i mg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.4.2).

Proevens indhold af robenidin w (mg/kg) beregnes efter ved foelgende formel:

hvor:

c = proeveoploesningens robenindinkoncentration i mg/ml

m = proeveportionens masse i gram.

7. Evaluering af resultaterne

7.1. Identitet

Stoffets identitet kan bekraeftes ved co-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvorved proevekstraktets og kalibreringsoploesningens (3.9.3) spektre indeholdende 6 mg/ml sammenlignes.

7.1.1. Co-kromatografi

Et proeveekstrakt adderes ved tilsaetning af en passende maengde kalibreringsoploesning (3.9.3). Den tilsatte maengde robenidin skal vaere af samme stoerrelse som den skoennede maengde robenidin, der er fundet i proeveekstraktet.

Kun hoejden af robenidintoppen maa oeges, efter at der er taget hensyn til baade den tilsatte maengde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal, ved den halve hoejde, ligge inden for ± 10 % af den oprindelige bredde.

7.1.2. Diodearraydetektion

Resultaterne evalueres efter nedenstaaende kriterier:

a) Den maksimale apsorbtionsboelgelaengde af proevens og standardens spektre, maalt ved toppens spids paa kromatogrammet, skal vaere den samme inden for en margen, der afhaenger af detektorsystemets oploesningsevne. Ved dioderarraydetektion er den typisk ± 2 nm.

b) Mellem 250 og 400 nm maa proevens og standardtoppens spektre maalt i toppens spids paa kromatogrammet ikke vaere forskellige for de dele af spektret, der ligger inden for 10-100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, hvis de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem de to spektre paa intet observeret punkt overstiger 15 % af standardstoffets absorbans.

c) Mellem 250 og 400 nm maa spektrene intet sted paa proeveekstraktets top vaere forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10-100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, hvis de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem spektrene paa intet observeret punkt overstiger 15 % af spektrets absorbans i spidsen.

Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er stoffets tilstedevaerelse ikke bekraeftet.

7.2. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelbestemmelser foretaget paa samme proeve maa ikke overstige 10 % af det hoejeste resultat for robenidinindhold paa over 15 mg/kg.

7.3. Genfindelse

Genfindelsen for den tilsatte blindproeve boer vaere mindst 85 %.

8. Resultaterne af en ringanalyse

Der blev af EF arrangeret en ringanalyse, hvorved fire proever af fjerkrae- og kaninfoder i form af mel eller piller blev analyseret af tolv laboratorier. Der blev foretaget en dobbeltanalyse af hver proeve. Resultaterne fremgaar af foelgende skema:

"" ID="1">Middel mg/kg> ID="2">27,0 > ID="3">27,99> ID="4">43,6 > ID="5">40,1 "> ID="1">Sr (mg/kg)> ID="2">1,46> ID="3">1,26> ID="4">1,44> ID="5">1,66"> ID="1">CVr (%)> ID="2">5,4> ID="3">4,5> ID="4">3,3> ID="5">4,1"> ID="1">Sr (mg/kg)> ID="2">4,36> ID="3">3,36> ID="4">4,61> ID="5">3,91"> ID="1">CVR (%)> ID="2">16,1 > ID="3">12,0 > ID="4">10,6 > ID="5">9,7"> ID="1">genf. (%)> ID="2">90,0 > ID="3">93,3 > ID="4">87,2 > ID="5">80,2 ""

Sr = standardafvigelse for repeterbarhed

CVr = variationskoefficient for repeterbarhed

SR = standardafvigelse for reproducerbarhed

CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed.

>

2. BESTEMMELSE AF METHYLBENZOQUAT 7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolon 1. Formaal og anvendelsesomraade

Dette er en metode til bestemmelse af methylbenzoquat i foderstoffer. Den nedre bestemmelsesgraense er 1 mg/kg.

2. Princip

Methylbenzoquat ekstraheres fra proeven med en oploesning af methansulfonsyre i methanol. Ekstraktet renses med dichlormethan, ved ionbytningskromatografi og derefter igen med dichlormethan. Methylbenzoquatindholdet bestemmes ved omvendt-fase HPLC med en UV-detektor.

3. Reagenser

3.1. Dichlormethan

3.2. Methanol, HPLC-kvalitet

3.3. HPLC mobil fase

Blanding af methanol (3.2) og vand (HPLC-kvalitet) 75 + 25 (V + V).

Der filtreres gennem et 0,22 mm filter (4.5), og oploesningen udluftes (f.eks. ved ultralydsbehandling i ti minutter).

3.4. Methansulfonsyreoploesning, s = 2 %

20,0 ml methansulfonsyre oploeses i methanol (3.2) til 1 000 ml.

3.5. Saltsyreoploesning, s = 10 %

100 ml saltsyre (p20 ca. 1,18 g/ml) oploeses i vand til 1 000 ml.

3.6. Kationbytterresin Amberlite CG-120 (Na), 100-200 mesh

Resinen forbehandles inden brug: 100 g resin opslemmes med 500 ml saltsyreoploesning (3.5) og opvarmes paa en varmeplade til kogning under fortsat omroering. Man lader opslemningen afkoele og dekanterer syren. Derefter filtreres gennem et filtrerpapir under vakuum. Resinen vaskes to gange med vand i portioner paa 500 ml og derefter med 250 ml methanol (3.2). Resinen skylles med yderligere 250 ml methanol og toerres ved at sende luft gennem filterkagen. Den toerrede resin opbevares i en tilproppet flaske.

3.7. Standard: ren methylbenzoquat (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolon)

3.7.1. Methylbenzoquatstamoploesning, 500 mg/ml

Med en noejagtighed paa 0,1 mg afvejes 50 mg standard (3.7), som oploeses i methansulfonsyreoploesning (3.4) i en 100 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes op til maerket og blandes.

3.7.2. Methylbenzoquatstandardoploesning, 50 mg/ml

5,0 ml af methylbenzoquatstamoploesningen (3.7.1) overfoeres til en 50 ml maalekolbe, hvorefter der fyldes op til maerket med methanol (3.2) og blandes.

3.7.3. Kalibreringsoploesninger

Til en raekke 25 ml maalekolber overfoeres henholdsvis 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 5,0 ml methylbenzoquatstandardoploesning (3.7.2). Der fyldes op til maerket med mobil fase (3.3) og blandes. Disse oploesninger har koncentrationer paa henholdsvis 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 og 10,0 mg methylbenzoquat pr. ml. Disse oploesninger skal tilberedes umiddelbart foer brug.

4. Apparatur

4.1. Rysteapparat

4.2. Rotationsinddamper

4.3. Glassoejle (250 mm × 15 mm), forsynet med stophane og med en kapacitet paa ca. 200 ml

4.4. HPLC-udstyr med en UV-detektor med variabel boelgelaengde eller en diodearraydetektor

4.4.1. Vaeskekromatografikolonne: 300 mm × 4 mm, C18, 10 mm pakning eller tilsvarende

4.5. Membranfiltre, 0,22 mm

4.6. Membranfiltre, 0,45 mm

5. Fremgangsmaade

5.1. Generelt

5.1.1. En blindproeve analyseres for at kontrollere, at der hverken er methylbenzoquat eller andre interfererende stoffer til stede.

5.1.2. Genfindelsen kontrolleres ved at analysere blindproeven, der tilsaettes methylbenzoquat i en maengde svarende til analyseproevens indhold. For at tilsaette 15 mg/kg, tilsaettes 600 ml af stamoploesningen (3.7.1) til en 20 g blindproeve. Bland og vent ti minutter foer der fortsaettes med ekstraktion (5.2).

Fodnote: Til denne metode anvendes en blindproeve, af samme type som analyseproeven, og som ved analyse viser sig ikke at indeholde methylbenzoquat.

5.2. Ekstraktion

Med en noejagtighed paa 0,01 g afvejes ca. 20 g af den forberedte proeve og overfoeres til en 250 ml konisk kolbe. Der tilsaettes 100,0 ml methanolsulfonsyreoploesning (3.4) og omrystes mekanisk (4.1) i 30 minutter. Oploesningen filtreres gennem filtrerpapir, og filtratet gemmes til vaeske-vaeskefordelingen (5.3).

5.3. Vaeske-vaeskefordelingen

25,0 ml af det under (5.2) opnaaede filtrat overfoeres til en 500 ml skilletragt indeholdende 100 ml saltsyreoploesning (3.5). Der tilsaettes 100 ml dichlormethan (3.1) til tragten og omrystes i et minut. Man lader de to lag faa tid til at skilles og aftapper det nederste (dichlormethan) lag i en 500 ml rundbundet kolbe. Ekstraktionen af vandfasen gentages med yderligere to portioner dichlormethan paa hver 40 ml, og disse kombineres med det foerste ekstrakt i den rundbundede kolbe. Dichlormethanekstraktet inddampes til toerhed paa rotationsinddamperen (4.2) ved 40 °C under reduceret tryk. Remanensen oploeses i 20-25 ml methanol (3.2), hvorefter kolben tilproppes, og hele ekstraktet gemmes til ionbytningskromatografi (5.4).

5.4. Ionbytningskromatografi

5.4.1. Forberedelse af kationsbyttersoejlen

En prop af glasuld anbringes i den nederste ende af en glassoejle (4.3). Der tilberedes en opslemning paa 5,0 g af den behandlede kationbytterresin (3.6) med 50 ml saltsyre (3.5), som haeldes i glassoejlen, hvorefter man lader den faa tid til at saette sig. Man lader den overskydende syre loebe ud, indtil den staar lige over resinoverfladen, og soejlen vaskes med vand, indtil vaskevandet er neutralt over for lakmuspapir. Der overfoeres 50 ml methanol (3.2) til soejlen, som man lader sive ned til resinoverfladen.

5.4.2. Soejlekromatografi

Det under (5.3) opnaaede ekstrakt overfoeres med en pipette forsigtigt til soejlen. Den rundbundede kolbe skylles med to portioner paa 5-10 ml methanol (3.2), og dette overfoeres til soejlen. Man lader ekstraktet loebe ned til resinoverfladen, og soejlen vaskes med 50 ml methanol, idet man sikrer sig at gennemstroemningshastigheden ikke overstiger 5 ml pr. minut. Den eluerede methanol bortkastes. Methylbenzoquat elueres fra soejlen under anvendelse af 150 ml methansulfonsyreoploesning (3.4), og eluatet fra soejlen opsamles i en 250 ml konisk kolbe.

5.5. Vaeske-vaeskefordeling

Det under (5.4.2) opnaaede eluat overfoeres til en 1 liter skilletragt. Den koniske kolbe skylles med 5-10 ml methanol (3.2), og skyllevaeskerne kombineres med indholdet i skilletragten. Der tilsaettes 300 ml saltsyreoploesning (3.5) og 130 ml dichlormethan (3.1) og omrystes i et minut. Man lader de to faser faa tid til at skilles og aftapper det nederste (dichlormethan) lag i en 500 ml rundbundet kolbe. Ekstraktionen af vandfasen gentages med yderligere to portioner dichlormethan paa hver 70 ml, og disse kombineres med det foerste ekstrakt i den rundbundede kolbe.

Dichlormethanekstraktet inddampes til toerhed paa rotationsinddamperen (4.2) ved 40 °C under reduceret tryk. Remanensen oploeses i kolben med ca. 5 ml methanol (3.2), og denne oploesning overfoeres kvantitativt til en 10 ml maalekolbe. Den rundbundede kolbe skylles med yderligere to portioner 1-2 ml methanol, som overfoeres til maalekolben. Der fyldes op til maerket med methanol og blandes. En alikvot maengde filtreres gennem et membranfilter (4.6). Denne oploesning gemmes til HPLC-bestemmelsen (5.6).

5.6. HPLC-bestemmelse

5.6.1. Parametre

Foelgende betingelser er vejledende. Andre betingelser kan bruges, saafremt de giver de samme resultater.

HPLC-kolonne (4.4.1)

HPCL mobil fase: Blanding af methanol og vand (3.3)

Flowhastighed: 1-1,5 ml/min.

Detektorboelgelaengde: 265 nm

Injektionsvolumen 20-50 ml.

Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres ved, at der flere gange injiceres kalibreringsoploesning (3.7.3) med 4 mg/ml, indtil der er opnaaet konstante tophoejder eller arealer og retentionstider.

5.6.2. Kalibreringskurve

Hver kalibreringsoploesning (3.7.3) injiceres flere gange, og hoejden af toppene (arealerne) for hver koncentration maales. Der plottes en kalibreringskurve ved brug af kalibreringsoploesningernes middeltophoejder eller -arealer som ordinater og de tilsvarende koncentrationer i mg/ml som abscisser.

5.6.3. Proeveoploesning

Proeveekstraktet (5.5) injiceres flere gange, idet der benyttes samme maengde som til kalibreringsoploesningerne, og middeltophoejden (arealet) af methylbenzoquattoppene bestemmes.

6. Beregning af resultaterne

Ud fra middeltophoejden (arealet) af proeveoploesningens methylbenzoquattoppe bestemmes proeveoploesningens koncentration i mg/ml ved benyttelse af kalibreringskurven (5.6.2).

Proevens indhold af methylbenzoquat w (mg/kg) beregnes efter foelgende formel:

hvor:

c = proeveoploesningens methylbenzoquatkoncentration i mg/ml

m = proeveportionens masse i gram.

7. Evaluering af resultaterne

7.1. Identitet

Stoffets identitet kan bekraeftes ved co-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor, hvorved spektrene af proevekstraktet og kalibreringsoploesningen (3.7.3) indeholdende 10 mg/ml sammenlignes.

7.1.1. Co-kromatografi

Et proeveekstrakt adderes ved tilsaetning af en passende maengde mellemstandardoploesning (3.7.2). Den tilsatte maengde methylbenzoquat skal vaere af samme stoerrelse som den skoennede maengde methylbenzoquat i proeveekstraktet.

Kun hoejden af methylbenzoquattoppen maa oeges, efter at der er taget hensyn til baade den tilsatte maengde og fortyndingen af ekstraktet. Toppens bredde skal, ved den halve hoejde, ligge inden for ± 10 % af den oprindelige bredde.

7.1.2. Diodearraydetektion

Resultaterne evalueres efter nedenstaaende kriterier:

a) Den maksimale absorptionsboelgelaengde af proevens og standardens spektre, maalt ved toppens spids paa kromatogrammet, skal vaere den samme inden for en margen, der afhaenger af detektorsystemets oploesningsevne. Ved dioderarraydetektion er den typisk ± 2 nm.

b) Mellem 220 og 350 nm maa proevens og standardtoppens spektre maalt i toppens spids paa kromatogrammet ikke vaere forskellige for de dele af spektret, der ligger inden for 10-100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, hvis de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem to spektre paa intet observeret punkt overstiger 15 % af standardstoffets absorbans.

c) Mellem 220 og 350 nm maa spektrene intet sted paa proeveekstraktets top vaere forskellige fra hinanden i de dele af spektret, der ligger inden for 10-100 % relativ absorbans. Dette kriterium er opfyldt, hvis de samme maksima er til stede, og afvigelsen mellem spektrene paa intet observeret punkt overstiger 15 % af spektrets absorbans i spidsen.

Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, er stoffets tilstedevaerelse ikke bekraeftet.

7.2. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelbestemmelser foretaget paa samme proeve maa ikke overstige 10 % af det hoejeste resultat for methylbenzoquatindhold paa mellem 4 og 20 mg/kg.

7.3. Genfindelse

Genfindelsen for den tilsatte maengde i blindproeven boer vaere mindst 90 %.

8. Resultaterne af en ringanalyse

Fem proever blev analyseret af ti laboratorier. Der blev foretaget en dobbeltanalyse af hver proeve.

Resultater

"" ID="1">Middel (mg/kg) Fundet niveau> ID="2">n.d.> ID="3">4,50> ID="4">4,50> ID="5">8,90> ID="6">8,70"> ID="1">Sr (mg/kg)> ID="2">-> ID="3">0,30> ID="4">0,20> ID="5">0,60> ID="6">0,50"> ID="1">CVr (%)> ID="2">-> ID="3">6,70> ID="4">4,40> ID="5">6,70> ID="6">5,70"> ID="1">SR (mg/kg)> ID="2">-> ID="3">0,40> ID="4">0,50> ID="5">0,90> ID="6">1,00"> ID="1">CVR (%)> ID="2">-> ID="3">8,90> ID="4">11,10> ID="5">10,10> ID="6">11,50"> ID="1">genf. (%)> ID="2">-> ID="3">92,00> ID="4">93,00> ID="5">92,00> ID="6">89,00""

Sr = standardafvigelse for repeterbarhed

CVr = variationskoefficient for repeterbarhed

SR = standardafvigelse for reproducerbarhed

CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed.

>