Kommissionens forordning (EF) nr. 440/2003

af 10. marts 2003

om ændring af forordning (EØF) nr. 2676/90 om fastsættelse af fælles analysemetoder for vin

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets forordning (EF) nr. 1493/1999 af 17. maj 1999 om den fælles markedsordning for vin(1), senest ændret ved forordning (EF) nr. 2585/2001(2), særlig artikel 46, stk. 3, første afsnit, og

ud fra følgende betragtninger:

(1) I Kommissionens forordning (EØF) nr. 2676/90(3), senest ændret ved forordning (EF) nr. 1622/2000(4), er disse analysemetoder beskrevet i bilaget.

(2) Der er udviklet en metode til analyse for D-æblesyre specielt til bestemmelse af små mængder D-æblesyre i vin, og den er valideret efter internationalt anerkendte kriterier. Beskrivelsen af denne nye metode er vedtaget af Det Internationale Vinkontor (OIV) på generalforsamlingen i juni 2002.

(3) Der er udviklet en ny metode til analyse af forholdet mellem kulstofisotoperne i ethanol i vin og ethanol fremstillet ved gæring af druemost, koncentreret druemost og rektificeret koncentreret druemost, og den er valideret efter internationalt anerkendte kriterier. Beskrivelsen af denne nye metode er vedtaget af Det Internationale Vinkontor (OIV) på generalforsamlingen i 2001.

(4) Ved at benytte disse analysemetoder kan der opnås en bedre kontrol af vinens kvalitet og ægthed og undgås tvister som følge af, at der benyttes mindre præcise kontrolmetoder, især hvad angår tilsætning af blandinger af sukker af forskellig oprindelse til vin og kontrol af syring af vin med æblesyre.

(5) Den eksisterende metode til bestemmelse af D-æblesyre, som er beskrevet i bilaget til forordning (EØF) nr. 2676/90, bør suppleres med en beskrivelse af den procedure, der skal følges ved bestemmelse af små mængder, og der bør indsættes en beskrivelse af den nye metode til isotopbestemmelse af kulstof i ethanol.

(6) De i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomitéen for Vin -

UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:

Artikel 1

I bilaget til forordning (EØF) nr. 2676/90 foretages følgende ændringer:

1) I kapitel 20 "D-æblesyre" affattes punkt 8 som vist i bilag I.

2) Der indsættes et nyt kapitel 45, affattet som vist i bilag II.

Artikel 2

Denne forordning træder i kraft på syvendedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfærdiget i Bruxelles, den 10. marts 2003.

På Kommissionens vegne

Franz Fischler

Medlem af Kommissionen

(1) EFT L 179 af 14.7.1999, s. 1.

(2) EFT L 345 af 29.12.2001, s. 10.

(3) EFT L 272 af 3.10.1990, s. 1.

(4) EFT L 194 af 31.7.2000, s. 1.

BILAG I

"8. BESTEMMELSE AF SMÅ MÆNGDER AF D-ÆBLESYRE (D(+)-ÆBLESYRE) I VIN

8.1. Anvendelsesområde

Metoden anvendes til enzymatisk bestemmelse af D-æblesyre i vin ved et indhold på mindre end 50 mg/l.

8.2. Princip

Metodens princip er beskrevet i punkt 1. Den dannede mængde NADH er proportional med indholdet af D-malat og måles ved forøgelse af absorbansen ved bølgelængden 340 nm, efter at der er tilsat en mængde D-æblesyre svarende til 50 mg/l i kuvetten.

8.3. Reagenser

Opløsning af D-æblesyre, 0,199 g/l, ud over reagenserne i punkt 2.

8.4. Apparatur

Samme apparatur som i punkt 3.

8.5. Prøveforberedelse

Prøveforberedelse som i punkt 4.

8.6. Fremgangsmåde

Fremgangsmåden er som i punkt 5, men der tilsættes i kuvetten en mængde D-æblesyre svarende til 50 mg/l (tilsætning af 0,025 ml af en 0,199 g/l opløsning af D-æblesyre i stedet for den samme mængde vand); der trækkes 50 mg/l fra de målte værdier.

8.7. Intern validering

Nedenstående tabel indeholder en sammenfatning af den interne validering af den metode til bestemmelse af D-æblesyre, hvor der forud tilsættes 50 mg/l af denne isomer.

>TABELPOSITION>"

BILAG II

"45. BESTEMMELSE VED ISOTOPMASSESPEKTROMETRI AF ISOTOPFORHOLDET 13C/12C I ETHANOL I VIN OG I ETHANOL FREMSTILLET VED GÆRING AF DRUEMOST, KONCENTRERET DRUEMOST OG REKTIFICERET KONCENTRERET DRUEMOST

1. ANVENDELSESOMRÅDE

Formålet med metoden er at bestemme isotopforholdet 13C/12C for ethanol i vin og ethanol fremstillet ved gæring af drueprodukter (druemost, koncentreret druemost og rektificeret koncentreret druemost).

2. HENVISNINGER TIL STANDARDER

ISO: 5725:1994 'Analyse- og prøvningsmetoders præcision. Bestemmelse af repeterbarhed og reproducerbarhed'

V-PDB: Vienna Pee Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372).

Metode 8 i bilaget til nærværende forordning: 'Påvisning af sukkertilsætning til most, koncentreret most, rektificeret koncentreret most og vin ved anvendelse af kernemagnetisk resonans af deuterium (SNIF-NMR)'.

3. UDTRYK OG DEFINITIONER

13C/12C: Forholdet mellem isotoperne kulstof-13 (13C) og kulstof-12 (12C) i en given prøve.

δ13C: Indhold af kulstof 13 (13C) udtrykt i promille ([permil ]).

SNIF-NMR: Site-Specific Natural Isotope Fractionation studied by Nuclear Magnetic Resonance (lokalitetsspecifik naturlig isotopfraktionering undersøgt ved kernemagnetisk resonans).

V-PDB: Vienna Pee Dee Belemnite. PDB, der er primær standard for måling af naturlige variationer i indholdet af kulstof-13, var calciumcarbonat fra en kridttids-belemnitpig fra Pee Dee-formationen i South Carolina (USA). Dens 13C/12C-isotopforhold, RPDB, er 0,0112372. PDB er forlængst udtømt, men er stadig den primære standard for angivelse af naturlige variationer i indholdet af kulstof-13 og benyttes til kalibrering af referencematerialer, som kan fås ved henvendelse til Den Internationale Atomenergiorganisation (IAEA) i Wien. Målinger af naturligt forekommende kulstof-13 angives således pr. konvention i forhold til V-PDB.

m/z: Forholdet mellem masse og ladning

4. PRINCIP

Ved fotosyntesen sker planternes optagelse af gasformig CO2 hovedsagelig ved to mekanismer, nemlig C3-metabolismen (Calvins cyklus) og C4-metabolismen (Hatch og Slacks cyklus). De to fotosyntesemekanismer resulterer i forskellige isotopfraktioneringer. Således er indholdet af kulstof-13 højere i produkter fra C4-planter, f.eks. sukker og alkohol fra gæring heraf, end i tilsvarende produkter fra C3-planter. De fleste planter, såsom druer og roer, hører til C3-gruppen. Sukkerrør og majs hører til C4-gruppen. Ved at måle indholdet af kulstof-13 kan man således påvise og evaluere sukker af C4-oprindelse (rørsukker og majsisoglucose) i drueprodukter (druemost, vin, mv.). Ved at sammenholde oplysninger om indholdet af kulstof-13 med SNIF-NMR-data kan man også bestemme tilsætning af blandinger af sukker eller alkohol fra C3- og C4-planter kvantitativt.

Indholdet af kulstof-13 bestemmes i den CO2, der dannes ved fuldstændig forbrænding af prøven. Forekomsten af de vigtigste isotopomere med massetal 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 og 12C17O16O) og 46 (12C16O18O), som kan dannes ved kombination af isotoperne 18O, 17O, 16O, 13C og 12C, bestemmes ud fra de ionstrømme, der måles ved tre forskellige kollektorer i et isotopmassespektrometer. Man kan se bort fra bidragene fra isotopomere 13C17O16O og 12C17O2, da de næsten ikke forekommer. Ionstrømmen ved m/z = 45 korrigeres for bidraget fra 12C17O16O, som beregnes ud fra den ionstrøm, der måles ved m/z = 46, via den relative forekomst af 18O og 17O (Craigs korrektion). Ved sammenligning med en reference, der er kalibreret mod den internationale reference V-PDB, beregnes indholdet af kulstof-13 på den relative δ13C-skala.

5. REAGENSER

Materialer og forbrugsmaterialer afhænger af, hvilket apparatur (6) laboratoriet benytter. De mest anvendte systemer er baseret på en grundstofanalysator. Den kan være udstyret enten til indføring af prøven i en forseglet metalkapsel eller til indsprøjtning af en væskeprøve gennem en membran med en injektionssprøjte.

Alt efter, hvilken instrumenttype der benyttes, kan der anvendes følgende referencematerialer, reagenser og forbrugsmaterialer:

- Referencematerialer

- til rådighed hos IAEA:

>TABELPOSITION>

- til rådighed hos IRMM i Geel (B) (Institut for Referencematerialer og -målinger):

>TABELPOSITION>

- Prøver af arbejdsstandarder med et kendt 13C/12C-forhold og kalibreret mod internationale referencematerialer.

- For gennemstrømningssystemer kan følgende vejledende liste over forbrugsmaterialer angives:

- helium, analyseren (CAS 07440-59-7)

- oxygen, analyseren (CAS 07782-44-7)

- carbondioxid, analyseren, anvendt som sekundær standard for indholdet af kulstof-13 (CAS 00124-38-9)

- oxidationsreagens til ovnen i forbrændingssystemet, f.eks. kobber(II)oxid, til grundstofanalyse (CAS 1317-38-0)

- tørremiddel til at fjerne vand fra forbrændingen, f.eks. anhydron til grundstofanalyse (magnesiumperchlorat) (CAS 10034-81-8) (Ikke nødvendigt til apparatur med et system til fjernelse af vand, som består af en frysefælde eller et kapillarrør med selektiv permeabilitet.)

6. APPARATUR OG UDSTYR

6.1. Isotopforholdsmassespektrometer (IRMS)

Isotopforholdsmassespektrometer (IRMS), som kan bestemme det relative indhold af naturligt forekommende 13C i CO2-gas med en indre præcision på mindst 0,05 [permil ] relativt. Den indre præcision defineres her som forskellen mellem to målinger på samme CO2-prøve. Et massespektrometer til bestemmelse af isotopforhold er normalt forsynet med tredobbelt kollektor til samtidig intensitetsmåling ved m/z 44, 45 og 46. Isotopforholdsmassespektrometeret skal enten have et system med to kanaler, så der måles skiftevis på den ukendte prøve og en referenceprøve, eller et integreret system, hvor prøverne forbrændes kvantitativt og carbondioxiden fra de øvrige forbrændingsprodukter fjernes inden målingen i massespektrometeret.

6.2. Forbrændingsapparatur

Forbrændingsapparatur, der kvantitativt kan omdanne ethanol til carbondioxid og fjerne de øvrige forbrændingsprodukter, inklusive vand, uden nogen isotopfraktionering. Apparatet kan enten være et gennemstrømningssystem, der er integreret i massespektrometeret (6.2.1) eller et selvstændigt forbrændingssystem (6.2.2). Apparatet skal tillade, at der mindst opnås samme nøjagtighed som anført i punkt 11.

6.2.1. Gennemstrømningssystem

Et sådant system består enten i en grundstofanalysator eller en gaschromatograf direkte tilsluttet til et forbrændingssystem.

Til systemer til indføring af prøver i metalkapsler er følgende laboratorieudstyr påkrævet:

- mikrosprøjte eller målemikropipette med tilhørende spidser

- laboratorievægt med en aflæsningsnøjagtighed på 1 μg eller bedre

- tang til lukning af kapsler

- tinkapsler til flydende prøvemateriale

- tinkapsler til fast prøvemateriale

Bemærk:

For at mindske risikoen for fordampning af ethanol fra prøven kan man i kapslen anbringe et absorberende materiale (f.eks. Chromosorb W 45-60 mesh), som i forvejen har været underkastet en blindprøve til kontrol af, at det ikke indeholder betydende mængder kulstof, der kan indvirke på målingerne.

Når der benyttes en grundstofanalysator med indsprøjtningsenhed for væsker eller et system med gaschromatograf/forbrændingsenhed, er følgende laboratorieudstyr påkrævet:

- injektionssprøjte til væsker

- hætteglas med tæt lukning og inert membran.

Laboratorieudstyret på ovenstående lister er kun eksempler og kan erstattes med andet tilsvarende udstyr alt efter, hvilken type forbrændingsapparatur og massespektrometer laboratoriet benytter.

6.2.2. Selvstændigt system til prøveforberedelse

I dette tilfælde opsamles carbondioxiden fra forbrændingen af analyseprøven og referencen i ampuller, som dernæst anbringes i spetrometerets to kanaler til isotopanalyse. Der kan benyttes flere typer forbrændingsapparatur, som er beskrevet i litteraturen, f.eks.:

- lukket forbrændingssystem med cirkulerende oxygengas

- grundstofanalysator med helium- og oxygengennemstrømning

- forseglet glasampul med kobber(II)oxid som oxidationsmiddel.

7. FORBEREDELSE AF ANALYSEPRØVER

Ethanolen isoleres fra vinen inden isotopbestemmelsen. Isoleringen foretages ved destillation som beskrevet i punkt 3.1 i metode 8 (SNIF-NMR).

For most, koncentreret most og rektificeret koncentreret most skal sukkeret først forgæres til ethanol som beskrevet i punkt 3.2 i metode 8.

8. FREMGANGSMÅDE

Alle faser i forberedelsen skal udføres uden så betydende tab af ethanol ved fordampning, at prøvens isotopsammensætning ændres.

Nedenstående beskrivelse bygger på procedurer, der er almindeligt benyttet ved forbrænding af ethanolprøver i kommercielt tilgængelige automatiske forbrændingssystemer. Alle andre metoder, der sikrer kvantitativ omdannelse af ethanolprøven til carbondioxid uden tab af ethanol ved fordampning, kan benyttes til fremstilling af carbondioxid til isotopanalyse.

Forsøgsprocedure ved brug af grundstofanalysator:

a) Indkapsling af prøverne

- Kapsler, tang og arbejdsbord skal være rene.

- Med tangen tages der en kapsel af passende størrelse.

- Med mikropipetten anbringes den fornødne mængde væske i kapslen.

- Bemærk:

For at få 2 mg kulstof kræves der 3,84 mg absolut ethanol eller 4,17 mg destillat med et alkoholindhold på 92 vægtprocent. Den fornødne mængde destillat beregnes ud fra den mængde kulstof, som massespektrometerets følsomhed kræver.

- Kapslen lukkes med tangen.

- Hver enkelt kapsel skal være helt tæt tillukket. Er det ikke tilfældet, må den kasseres og erstattes af en ny.

- Der fremstilles to kapsler med hver prøve.

- Kapslerne anbringes på bordet på den automatiske prøveskifter til grundstofanalysatoren. Alle kapsler skal være omhyggeligt mærket med fortløbende numre.

- Der anbringes altid kapsler med arbejdsstandarder først og sidst i en prøveserie.

- Der fordeles kontrolprøver jævnt gennem en prøveserie.

b) Kontrol og justering af instrumenter til grundstofanalyse og massespektrometri

- Temperaturen i grundstofanalysatorens ovn og helium- og oxygenstrømmen indstilles således, at forbrændingen af prøven bliver optimal.

- Det kontrolleres, at der i grundstofanalysatorens og massespektrometerets system ikke er lækager (f.eks. ved kontrol af ionstrømmen for m/z = 28 svarende til N2).

- Massespektrometeret indstilles til måling af ionstrømsintensiteten ved m/z = 44, 45 og 46.

- Systemet kontrolleres med kontrolprøver, inden måling af analyseprøverne påbegyndes.

c) Gennemførelse af en måleserie

Prøverne på den automatiske prøveskifter på grundstofanalysatoren (eller chromatografen) føres ind én ad gangen. Carbondioxiden fra forbrændingen af den enkelte prøve ledes videre til massespektrometeret, som måler ionstrømmene. Computeren, der er koblet til instrumentet, registrerer ionstrømmenes intensitet og beregner δ-værdierne for hver enkelt prøve (9).

9. BEREGNING

Formålet med metoden er at måle isotopforholdet 13C/12C i ethanol, der isoleres fra vin eller produkter, der er fremstillet af druer efter gæring. Isotopforholdet 13C/12C kan udtrykkes ved sin afvigelse fra en arbejdsstandard. Afvigelsen for isotopen kulstof-13 (δ 13C) anføres således på en delta promille-skala (δ/1000) ved sammenligning af resultaterne for analyseprøven med resultaterne for den arbejdsstandard, der først er kalibreret i forhold til den primære internationale standard (V-PDB). δ 13C-værdierne beregnes i forhold til arbejdsstandarden efter følgende formel:

δ13Cprøve/std [permil ] = 1000 × (Rprøve- Rstd)/Rstd

hvor Rprøve og Rstd er isotopforholdene 13C/12C for henholdsvis prøven og den carbondioxid, der benyttes som standard.

δ 13C-værdierne beregnes dernæst i forhold til V-PDB efter følgende formel:

δ13Cprøve/V-PDB [permil ] = δ13Cprøve/std + δ13Cstd/V-PDB + (δ13Cprøve/std × δ13Cstd/V-PDB)/1000,

hvor δ13Cstd/V-PDB er den isotopafvigelse, der tidligere er bestemt for arbejdsstandarden i forhold til V-PDB.

I løbet af måleserien kan der forekomme en svag drift, som skyldes ændringer i instrumentbetingelserne. I så fald må δ 13C-værdierne for prøverne korrigeres efter forskellen mellem den målte δ 13C-værdi for arbejdsstandarden og dens sande værdi, som er fundet ved forudgående kalibrering mod V-PDB ved sammenligning med et internationalt referencemateriale. Mellem to målinger på arbejdsstandarden kan man antage, at driften og dermed korrektionen af prøveresultaterne er lineær. Prøven med arbejdsstandard skal måles både først og sidst i hver måleserie. Derudfra kan korrektionen for den enkelte prøve beregnes ved lineær interpolation.

10. KVALITETSSIKRING OG KONTROL

Det kontrolleres, at δ 13C- værdien for arbejdsstandarden ikke afviger mere end 0,5 [permil ] fra den sande værdi. Er den det, må spektrometerets indstilling kontrolleres og eventuelt justeres.

For den enkelte prøve kontrolleres det, at forskellen mellem resultaterne for de to kapsler, der er målt efter hinanden, ikke er større end 0,3 [permil ]. Det endelige resultat for en given prøve er gennemsnittet af de to kapsler. Er afvigelsen større end 0,3 [permil ], må målingen gentages.

At målingen fungerer korrekt kan kontrolleres ud fra intensiteten af ionstrømmen ved m/z = 44, som er proportional med den kulstofmængde, der er indsprøjtet i grundstofanalysatoren. Typisk vil intensiteten af denne ionstrøm være praktisk taget konstant for de analyserede prøver. En betydelig afvigelse kan give mistanke om fordampning af ethanol (f.eks. fra en ikke helt tæt kapsel) eller ustabilitet i grundstofanalysator eller massespektrometer.

11. METODENS KVALITETSPARAMETRE (nøjagtighed)

Der er foretaget en ringundersøgelse (11.1) med destillater indeholdende alkohol fra vin, sukkerrør og sukkerroer samt forskellige blandinger heraf. Der er i denne undersøgelse ikke taget højde for selve destillationen, så supplerende oplysninger fra andre ringanalyser vedrørende vin (11.2), herunder serier af egnethedsprøver (11.3), skal også tages i betragtning. Resultaterne viser, at forskellige destillationssystemer, herunder dem, der anvendes til SNIF-NMR-målinger, ikke bidrager væsentligt til variationer i bestemmelsen af δ13C for ethanol i vin, når de anvendes på hensigtsmæssig måde. De nøjagtighedsparametre, der er fundet for vin, er næsten de samme som dem, der er fundet ved ringanalysen (11.1) af destillater.

11.1. Ringanalyse af destillater

År for interkalibrering: 1996

Antal laboratorier: 20

Antal prøver: 6 dobbelte blindprøver

Analysand: δ 13C for ethanol

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

11.2. Interkalibrering med to vine og en alkohol

År for interkalibrering: 1996

Antal laboratorier: 14 til destillation af vin, hvoraf 7 også til måling af δ 13C for ethanol i vin

8 til måling af δ 13C for alkoholprøven

Antal prøver: 3 (hvidvin med 9,3 % vol. alkohol, hvidvin med 9,6 % vol. alkohol og alkohol med et alkoholindhold på 93 % m/m).

Analysand: δ 13C for ethanol

>TABELPOSITION>

De deltagende laboratorier benytter forskellige destillationsanlæg. De isotopbestemmelser δ 13C, som ét laboratorium har udført på alle de destillater, deltagerne sendte tilbage, viser hverken afvigende værdier eller værdier, der adskiller sig væsentligt fra gennemsnittet. Resultaternes varians (S2 = 0,0059) er af samme størrelsesorden som variansen for repeterbarhed Sr2 ved interkalibreringen på destillater (11.1).

11.3. Resultaterne af prøverserierne for egnethed til isotopanalyser

Siden december 1994 har der regelmæssigt været afholdt internationale egnethedsprøver vedrørende isotopbestemmelser af vin og alkohol (destillater med 96 % vol. alkohol). På denne måde kan de deltagende laboratorier kontrollere kvaliteten af deres analyser. Ved en statistisk behandling af resultaterne kan man danne et skøn over målingernes variation under reproducerbarhedsbetingelser og dermed estimere parametrene varians og reproducerbarhedsgrænse. Nedenstående tabel indeholder en sammenfatning af resultaterne af bestemmelse af δ13C for ethanol i vine og destillater:

>TABELPOSITION>

N Antal deltagende laboratorier.

11.4. Repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænser

På grundlag af de forskellige interkalibreringer, der er vist i ovenstående tabel, kan man for den foreliggende metode, inklusive destillationsfasen, fastsætte følgende repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænser:

Repeterbarhedsgrænse r: 0,24

Reproducerbarhedsgrænse R: 0,6"