6)

Bilag VII affattes således: »BILAG VII BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF 2-GLYCERYLMONOPALMITAT I PROCENT 1. GENSTAND OG ANVENDELSESOMRÅDE Metoden er en analyseprocedure for bestemmelse af det procentvise indhold af palmitinsyre i 2-stillingen i triglycerider ved måling af 2-glycerylmonopalmitat. Metoden kan anvendes på vegetabilske olier, der er flydende ved stuetemperatur (20 °C). 2. PRINCIP Olieprøven behandles efter forberedelsen med pankreaslipase, som specifikt hydrolyserer triglyceridets 1- og 3-stilling og efterlader 2-monoglycerider. Det procentvise indhold af 2-glycerylmonopalmitat i monoglyceridfraktionen bestemmes efter silylering ved gaskromatografi med kapillarkolonne. 3. APPARATUR OG SÆDVANLIGT UDSTYR 3.1. 25 ml erlenmeyerkolbe 3.2. 100, 250 og 300 ml bægerglas 3.3. kromatografikolonne af glas, indvendig diameter 21-23 mm og længde 400 mm, med sintret glasfilter og hane 3.4. 10, 50, 100 og 200 ml måleglas 3.5. 100 og 250 ml rundbundede kolber 3.6. rotationsfordamper 3.7. 10 ml centrifugeglas med konisk bund og slibprop 3.8. centrifuge til 10 og 100 ml glas 3.9. termostat, der kan holde en temperatur på 40 ± 0,5 °C 3.10. 1 og 2 ml målepipetter 3.11. 1 ml injektionssprøjte 3.12. 100 μl mikroinjektionssprøjte 3.13. 1 000 ml skilletragt 3.14. gaskromatograf til kapillarkolonner med kold »on column«-injektor til direkte indsprøjtning af prøven i kolonnen og med en ovn, der kan fastholde den ønskede temperatur inden for ca. 1 °C. 3.15. kold »on column«-injektor til direkte indsprøjtning af prøven i kolonnen 3.16. flammeioniseringsdetektor og elektrometer 3.17. skriver-integrator, der passer til elektrometeret, med responstid højst 1 sekund og variabel papirhastighed 3.18. kapillarkolonne af glas eller sintret kvarts, længde 8-12 m og indvendig diameter 0,25-0,32 mm, coatet med 5 % methylpolysiloxan eller phenylmethylpolysiloxan i en lagtykkelse på 0,10-0,30 μm, og brugbar op til 370 °C 3.19. 10 μl mikroinjektionssprøjte med hærdet kanyle, længde mindst 7,5 cm, til indsprøjtning direkte i kolonnen. 4. REAGENSER 4.1. silicagel med kornstørrelse 63-200 μm (70/280 mesh), tilberedt således: Silicagelen anbringes i en porcelænsskål, tørres i ovn ved 160 °C i fire timer og afkøles til stuetemperatur i ekssikkator. Der tilsættes 5 % vand til silicagelen på følgende måde: I en erlenmeyerkolbe afvejes 152 g silicagel, og der tilsættes 8 g destilleret vand; kolben tilproppes og rystes forsigtigt, indtil vandet er jævnt fordelt. Henstår i mindst 12 timer inden brugen. 4.2. n-hexan (til kromatografi) 4.3. isopropanol 4.4. isopropanol, vandig opløsning 1:1 (v/v) 4.5. pankreaslipase. Den anvendte lipase skal have en aktivitet på 2,0-10 lipaseenheder pr. mg. (Der er pankreaslipaser i handelen med en aktivitet på 2-10 enheder pr. mg enzym.) 4.6. bufferopløsning af trishydroxymethylaminomethan: 1 M vandig opløsning indstillet til pH 8 (potentiometrisk måling) med koncentreret HCl (1:1, v/v) 4.7. natriumcholat, enzymkvalitet, 0,1 % vandig opløsning (opløsningen skal bruges inden for to uger) 4.8. calciumchlorid, 22 % vandig opløsning 4.9. diethylether til kromatografi 4.10. elueringsvæske: blanding af n-hexan og diethylether, 87:13 (v/v) 4.11. natriumhydroxid, 12 % opløsning (w/w) 4.12. phenolphthalein, 1 % opløsning i ethanol 4.13. bæregas: hydrogen eller helium, til gaskromatografi 4.14. hjælpegasser: hydrogen, mindst 99 % ren, fri for vand og organisk materiale, og luft af samme renhed, til kromatografi 4.15. silyleringsreagens: blanding af pyridin, hexamethyldisilazan og trimethylchlorsilan 9:3:1 (v/v/v). (Der fås brugsklare opløsninger i handelen. Der kan også benyttes andre silyleringsreagenser, f.eks. bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethylchlorsilan, fortyndet med samme volumen vandfri pyridin.) 4.16. Referenceopløsninger: rene monoglycerider eller blandinger af monoglycerider med kendt procentvis sammensætning af omtrent samme størrelse som prøven. 5. FREMGANGSMÅDE 5.1. Prøveforberedelse 5.1.1. Olier med under 3 % frie syrer behøver ikke at neutraliseres inden kromatograferingen på silicagelkolonne. Olier med mere end 3 % frie syrer neutraliseres som beskrevet i punkt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Der anbringes 50 g olie og 200 ml n-hexan i skilletragten på 1 000 ml (3.13). Der tilsættes 100 ml isopropanol og en mængde 12 % natriumhydroxidopløsning (4.11), der svarer til oliens indhold af frie syrer forhøjet med 5 %. Der rystes kraftigt i 1 minut. Derefter tilsættes der 100 ml destilleret vand, og efter fornyet omrystning sættes skilletragten til side. Efter separation tappes det nedre lag med sæberne af. Eventuelle mellemlag (slim og uopløselige stoffer) fjernes. Hexanopløsningen af neutraliseret olie vaskes flere gange med portioner af isopropanol/vand-opløsningen (4.4) a 50-60 ml, indtil phenolphthaleinets lyserøde farve er forsvundet. Det meste af hexanen fjernes ved vakuumdestillation (f.eks. rotationsfordamper), og olien overføres til en 100 ml rundbundet kolbe (3.5). Olien inddampes til fuldstændig tørhed under vakuum. Herefter skal oliens syreindhold være mindre end 0,5 %. 5.1.2. I en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1) anbringes 1,0 g olie, som er behandlet som beskrevet ovenfor, og den opløses i 10 ml elueringsvæske (4.10). Opløsningen henstår mindst 15 minutter inden kromatografering på silicagelkolonne. Hvis opløsningen er uklar, centrifugeres den, så kromatografibetingelserne bliver optimale. (Der kan anvendes brugsklare patroner med 500 mg SPE-silicagel.) 5.1.3. Fremstilling af kromatografikolonnen Der hældes ca. 30 ml elueringsvæske (4.10) i kolonnen (3.3), og i bunden af kolonnen placeres der ved hjælp af en glasstav et stykke vat, som luften trykkes ud af. I et bægerglas fremstilles en opslæmning af 25 g silicagel (4.1) i ca. 80 ml elueringsvæske, og opslæmningen hældes på kolonnen gennem en tragt. Når det er kontrolleret, at al silicagelen er kommet ned i kolonnen, skylles der med elueringsvæske (4.10), hanen åbnes, og der tappes væske af, indtil overfladen er ca. 2 mm over silicagelens overkant. 5.1.4. Kolonnekromatografi I en 25 ml erlenmeyerkolbe (3.1) anbringes 1,0 g prøve, som er behandlet som beskrevet i punkt 5.1. Prøven opløses i 10 ml elueringsvæske (4.10). Opløsningen overføres til kromatografikolonnen, der er fremstillet som beskrevet i punkt 5.1.3. Kolonnepakningens overflade må ikke forstyrres. Der åbnes for hanen og aftappes elueringsmiddel, indtil prøveopløsningens overflade er på niveau med silicagelen. Der elueres med 150 ml elueringsvæske. Hastigheden sættes til 2 ml/min (dvs. at de 150 ml løber gennem kolonnen på ca. 60-70 minutter). Eluatet opsamles i en tareret 250 ml rundbundet kolbe. Opløsningsmidlet afdampes under vakuum, og de sidste rester fjernes med en nitrogenstrøm. Kolben vejes, og ekstraktmængden udregnes. (Hvis der benyttes brugsklare SPE-silicagelpatroner, følges denne fremgangsmåde: 1 ml af opløsningen (5.1.2) sættes på patroner, der er forberedt med 3 ml n-hexan. Når opløsningen er løbet igennem, elueres der med 4 ml n-hexan/diethylether 9:1 (v/v). Eluatet opsamles i et 10 ml glas og inddampes med en nitrogenstrøm til fuldstændig tørhed. Remanensen behandles med pankreaslipase (5.2). Det er meget vigtigt, at fedtsyresammensætningen før og efter behandlingen på SPE-patronen kontrolleres.) 5.2. Hydrolyse med pankreaslipase 5.2.1. I centrifugeglasset afvejes 0,1 g olie, som er behandlet som beskrevet i punkt 5.1. Der tilsættes 2 ml bufferopløsning (4.6), 0,5 ml natriumcholatopløsning (4.7) og 0,2 ml calciumchloridopløsning, idet der omrøres omhyggeligt mellem hver tilsætning. Glasset lukkes med slibproppen og anbringes i termostaten ved 40 ± 0,5 °C. 5.2.2. Der tilsættes 20 mg lipase og omrystes omhyggeligt (uden at proppen fugtes), og glasset anbringes i termostaten i nøjagtig 2 minutter, hvorefter det tages op, rystes energisk i nøjagtig 1 minut og hensættes til afkøling. 5.2.3. Der tilsættes 1 ml diethylether, tilproppes og rystes energisk, og centrifugeres, hvorefter etheropløsningen overføres til et rent og tørt glas med en mikroinjektionssprøjte. 5.3. Fremstilling af silanderivater og gaskromatografi 5.3.1. Med en mikroinjektionssprøjte overføres 100 μl af opløsningen (5.2.3) til et 10 ml glas med konisk bund. 5.3.2. Opløsningsmidlet afdampes med en svag nitrogenstrøm, der tilsættes 200 μl silyleringsreagens (4.15), glasset tilproppes, og man lader det stå i 20 minutter. 5.3.3. Efter 20 minutter tilsættes der 1-5 ml n-hexan (alt efter kromatograferingsbetingelserne): Den fremkomne opløsning er klar til gaskromatografering. 5.4. Gaskromatografi Der anvendes følgende arbejdsbetingelser: — injektortemperatur (»on column«-injektor) under opløsningsmidlets kogepunkt (68 °C) — detektortemperatur: 350 °C — kolonnetemperatur: temperaturprogrammering af ovnen: 60 °C i 1 minut, derefter stigning først med 15 °C pr. minut indtil 180 °C og dernæst med 5 °C pr. minut indtil 340 °C, og endelig 340 °C i 13 minutter — bæregas: hydrogen eller helium indstillet til en sådan lineær hastighed, at der opnås den i figur 1 viste opløsning. C54-triglyceridet skal have en retentionstid på 40 ± 5 minutter (se figur 2). (Ovenstående arbejdsbetingelser er vejledende. Den enkelte analyseansvarlige må optimere dem for at opnå det ønskede resultat. Højden af toppen for 2-glycerylmonopalmitat skal være mindst 10 % af fuldt udslag på skriveren.) — indsprøjtet mængde: 0,5-1 μl af opløsningen i (5 ml) n-hexan (5.3.3). 5.4.1. Identifikation af toppene De enkelte monoglycerider identificeres efter deres retentionstider i prøveanalysen sammenlignet med tiderne fra analyse af standardmonoglyceridblandinger under samme betingelser. 5.4.2. Kvantitativ vurdering Arealerne af toppene beregnes ved hjælp af integratoren. 6. ANGIVELSE AF RESULTATER Det procentvise indhold af glycerylmonopalmitat beregnes ud fra forholdet mellem arealet af den pågældende top og summen af arealerne af samtlige monoglyceridtoppe (se figur 2) efter følgende formel: glycerylmonopalmitat (%): hvor: Ax = arealet af den top, der svarer til glycerylmonopalmitat ΣA = summen af arealerne af samtlige monoglyceridtoppe Resultatet angives med én decimal. 7. ANALYSERAPPORT Analyserapporten skal indeholde følgende: — henvisning til denne metode — alle oplysninger til fuldstændig identifikation af prøven — resultatet af analysen — alle afvigelser fra metoden, uanset om det er besluttet af de berørte parter eller har andre årsager — nøje identifikation af laboratoriet, dato for udførelse af analysen og de ansvarliges underskrift. Figur 1 Kromatogram af reaktionsprodukter fra silylering efter lipasebehandling af en raffineret olivenolie med tilsætning af 20 % forestret olie (100 %) Figur 2 Kromatogram af: A) ægte olivenolie, efter lipasebehandling og silylering; under de pågældende betingelser (kapillarkolonne 8-12 m) elueres voksfraktionen samtidig med eller kort tid efter diglyceridfraktionen. Efter lipasebehandlingen bør triglyceridindholdet ikke være højere end 15 % Kromatogram af: B) forestret olie efter lipasebehandling og silylering; under de pågældende betingelser (kapillarkolonne 8-12 m) elueres voksfraktionen samtidig med eller kort tid efter diglyceridfraktionen. Efter lipasebehandlingen bør triglyceridindholdet ikke være højere end 15 % 8. NOTER Note 1. FREMSTILLING AF LIPASE Lipaser med tilfredsstillende aktivitet kan fås i handelen. De kan også fremstilles i laboratoriet på følgende måde: 5 kg frisk svinepankreas afkøles til 0 °C. Alt omgivende fedt og bindevæv fjernes, og vævet findeles i blender til en flydende pasta. Den omrøres i 4-6 timer med 2,5 l vandfri acetone, hvorefter den centrifugeres. Bundfaldet ekstraheres endnu tre gange med samme mængde vandfri acetone og derefter to gange med en blanding af acetone og diethylether (1:1) (v/v) og to gange med diethylether. Bundfaldet tørres i 48 timer under vakuum til et stabilt pulver, som har lang holdbarhed ved opbevaring tørt i køleskab. Note 2. TEST FOR LIPASEAKTIVITET Der fremstilles en olivenolieemulsion på følgende måde: I en mixer omrøres i 10 minutter en blanding af 165 ml af en gummi arabicum-opløsning med 100 g/l, 15 g knust is og 20 ml neutraliseret olivenolie. I et 50 ml bægerglas hældes først 10 ml af denne emulsion og derefter 0,3 ml natriumcholatopløsning (0,2 g/ml) og 20 ml destilleret vand. Bægerglasset anbringes i termostat ved 37 °C, og der nedsænkes en pH-meterelektrode og en propelomrører i bægerglasset. Fra en burette tilsættes der dråbevis en 0,1 N natriumhydroxidopløsning, indtil pH er 8,3. Der tilsættes en portion af opslæmningen af lipasepulver i vand (0,1 g lipase pr. ml). Når pH-meteret viser et pH på 8,3, startes stopuret, og der tilsættes dråbevis så meget natriumhydroxidopløsning, at pH holdes på 8,3. Hvert minut noteres den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning. Målingerne afsættes i et koordinatsystem med tiden som abscisse og det forbrugte antal ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning som ordinat. Der skal fremkomme en ret linje. Lipaseaktiviteten, målt i lipaseenheder pr. mg, beregnes efter følgende formel: hvor: A er aktiviteten i lipaseenheder pr. mg V er antallet af ml 0,1 N natriumhydroxidopløsning pr. minut (beregnet ud fra grafen) N er natriumhydroxidopløsningens normalitet m er mængden af tilsat lipase i mg. Lipaseenheden er defineret som den mængde enzym, der frigør 10 mikroækvivalenter syre pr. minut.«