++++

KOMMISSIONENS FORORDNING ( EOEF ) Nr . 1058/77

af 18 . maj 1977

om saerlige kendetegn for olivenolier og visse varer , der indeholder olivenolie , og om aendring af nomenklaturen i den faelles toldtarif for saa vidt angaar olivenolie

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,

under henvisning til Raadets forordning nr . 136/66/EOEF af 22 . september 1966 om oprettelse af en faelles markedsordning for fedtstoffer ( 1 ) , senest aendret ved forordning ( EOEF ) nr . 1707/73 ( 2 ) , saerlig artikel 13 , stk . 4 og artikel 18 , stk . 3 ,

under henvisning til Raadets forordning nr . 162/66/EOEF af 27 . oktober 1966 om samhandelen med fedtstoffer mellem Faellesskabet og Graekenland ( 3 ) , saerlig artikel 3 , stk . 4 og 9 ,

under henvisning til Raadets forordning ( EOEF ) nr . 443/72 af 29 . februar 1972 om de importafgifter , der finder anvendelse paa raffineret olivenolie og visse olivenholdige varer ( 4 ) , saerlig artikel 8 , og

ud fra foelgende betragtninger :

For oejeblikket henhoerer alle jomfruolier under underposition 15.07 A II a ) i den faelles toldtarif ; som foelge heraf er der fastsat en enkelt importafgift for disse varer ; for at importafgiften skal kunne virke efter hensigten , boer den fastsaettes efter de forskellige typer jomfreeolier , og der boer derfor sondres mellem olivenolierne alt efter deres saerlige fysisk-kemiske kendetegn nomenklaturen i den faelles toldtarif boer derfor tilpasses :

den toldnomenklatur , som foelger af anvendelsen af forordning nr . 136/66/EOEF , er anfoert i den faelles toldtarif , der er bilag til forordning ( EOEF ) nr . 950/68 ( 5 ) , senest aendret ved forordning ( EOEF ) nr . 874/77 ( 6 ) ;

for at sikre , at systemet med importafgifter ved indfoersel af presserester af oliven virker korrekt , boer der fastsaettes en faelles metode til kontrol af disse varers olieindhold ;

Kommissionens forordning ( EOEF ) nr . 618/72 af 29 . marts 1972 om saerlige kendetegn for olivenolier og visse varer , der indeholder olivenolie ( 7 ) , er aendret flere gange , saerlig ved forordning ( EOEF ) nr . 3366/75 ( 8 ) ; i betragtning af de nye aendringer er det fundet belejligt at ophaeve den paagaeldende forordning og optage samtlige bestemmelser i en ny forordning ;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomiteen for Fedtstoffer -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING :

Artikel 1

1 . Som olivenolie betragtes i henhold til underposition 15.07 A i den faelles toldtarif kun olie , som udelukkende er fremstillet af oliven , dog ikke reesterificeret olivenolie , og blandinger af olivenolie med anden olie .

Konstatering af tilstedevaerelsen af reesterificeret olie eller anden olie foretages i overensstemmelse med de i bilag VII henholdsvis VIII anfoerte metoder .

2 . Til underposition 15.07 A I a ) , 15.07 A I b ) og 15.07 A I c ) i den faelles toldtarif henfoeres olier , som har de i bilag I , pkt . 1 , 2 og 3 anfoerte karakteristika . Til bestemmelse af ovennaevnte karakteristika anvendes de i bilag IV , V og VI beskrevne metoder .

3 . Til underposition 15.07 A II a ) i den faelles toldtarif henfoeres olier , som har de i bilag I , pkt . 4 , anfoerte karakteristika .

4 . Underposition 15.17 A i den faelles toldtarif omfatter ikke varer fra position 15.17 , som har de i bilag II naevnte karakteristika .

Artikel 2

1 . Indholdet af olivenolie i oliekager og andre restprodukter fra udvinding af olivenolie , som henfoeres til underposition 23.04 A , bestemmes i overensstemmelse med den metode , som er anfoert i bilag IX .

2 . Det i stk . 1 omhandlede indhold af olivenolie udtrykkes i et procenttal , der angiver oliens vaegt i forhold til vaegten af toerstoffet .

Artikel 3

Den faelles toldtarif , der er bilag til forordning ( EOEF ) nr . 950/68 , aendres saaledes :

1 . I supplerende bestemmelse 1 til kapitel 15 erstattes " 15.07 " med " 15.07 D " .

2 . De supplerende bestemmelser 2 , 3 og 4 til kapitel 15 erstattes af de supplerende bestemmelser 2 , 3 og 4 i bilag III til naervaerende forordning .

3 . Pos . 15.07 A affattes saaledes :

Position i den faelles toldtarif * * Zollsatz *

* * Autonom % eller importafgift ( I ) * Bundet % *

1 * 2 * 3 * 4 *

15.07 * A . Olivenolie * * *

* I . Ikke behandlet * * *

* a ) Jomfruolie * 20 ( I ) * - *

* b ) Bomolie * 20 ( I ) * - *

* c ) Andre varer * 20 ( I ) * - *

* II . I andre tilfaelde * * *

* a ) Fremkommet ved behandling af olier henhoerende under pos . 15.07 A I a ) eller 15.07 A I b ) , ogsaa blandet med jomfruolie . * 20 ( I ) * - *

* b ) Andre varer * 20 ( I ) * - *

Artikel 4

I samtlige faellesskabsakter , hvor der er henvist til underposition 15.07 A II og 15.07 A I a ) og b ) i den faelles toldtarif , skal disse henvisninger , ifoelge den paagaeldende vares karakteristika , betragtes som omhandlende henholdsvis underposition 15.07 A I a ) , b ) og c ) samt 15.07 A II a ) og b ) i den faelles toldtarif .

Artikel 5

Kommissionens forordning ( EOEF ) nr . 618/72 af 29 . marts 1972 ophaeves .

Artikel 6

Denne forordning traeder i kraft paa treogfyrretyvendedagen efter offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende .

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat .

Udfaerdiget i Bruxelles , den 18 . maj 1977 .

Paa Kommissionens vegne

Finn GUNDELACH

Naestformand

( 1 ) EFT nr . 172 af 30 . 9 . 1966 , s . 3025/66 .

( 2 ) EFT nr . L 175 af 29 . 6 . 1973 , s . 5 .

( 3 ) EFT nr . 197 af 29 . 10 . 1966 , s . 3393/66 .

( 4 ) EFT nr . L 54 af 3 . 3 . 1972 , s . 3 .

( 5 ) EFT nr . L 172 af 22 . 7 . 1968 , s . 1 .

( 6 ) EFT nr . L 106 af 29 . 4 . 1977 , s . 20 .

( 7 ) EFT nr . L 78 af 31 . 3 . 1972 , s . 5 .

( 8 ) EFT nr . L 333 af 30 . 12 . 1975 , s . 13 .

BILAG

Indholdsfortegnelse

* * Side *

BILAG I : * Karakteristika for olivenolier * 9 *

BILAG II : * Varer henhoerende under pos . 15.17 A * 10 *

BILAG III : * Supplerende bestemmelser nr . 2 , 3 og 4 til kapitel 15 i den faelles toldtarif * 10 *

BILAG IV : * I . Behandling af proeven med aktiveret aluminiumoxid * 12 *

* II . Neutralisation og blegning af olivenolie i laboratoriet * 12 *

BILAG V : * Bestemmelse af olie af presserester i olivenolier * 14 *

* A . Den saakalde Bellier-Metode * 14 *

* B . Den saakaldte Vizern-metode , modificeret * 14 *

BILAG VI : * Bestemmelse af saebe til paavirkning af alkaliindhold * 16 *

BILAG VII : * Bestemmelse af re-esterificerede olier * 16 *

BILAG VIII : * Bestemmelse af tilstedevaerelsen af andre olier i olivenolie ved analyse af fedtstoffernes sterolfration * 20 *

BILAG IX : * Metode til bestemmelse af olieindhold i presserester af oliven * 24 *

BILAG I

KARAKTERISTIKA FOR OLIVENOLIER

1 . Som jomfruolie i henhold til pos . 15.07 A I a ) i den faelles toldtarif betragtes naturlig olivenolie , som udelukkende er udvundet ved mekaniske processer , herunder presning , men ikke blandinger med olivenolie , udvundet paa anden maade , og som har foelgende karakteristika :

a ) Et indhold af frie fedtsyrer , beregnet som oliesyre , paa hoejst 3 vaegtprocent

b ) Extinktionskoefficient K270 ( absorption ved en lagtykkelse paa 1 cm af en oploesning af 1 g olie pr . 100 ml isooctan ( 2,2,4-trimethylpentan ) ved en boelgelaengde paa 270 nm ) , der ikke er over 0,25 og som efter behandling af olieproeven med aktiveret aluminiumoxid ikke er over 0,11 .

c ) Variation i extinktionskoefficienten i boelgelaengdeomraader omkring 270 nm paa ikke over 0,01 .

Denne variation defineres ved :

D K = K m - 0,5 ( K m-4 + K m+4 ) .

K m er extinktionskoefficienten for de i omraadet omkring 270 nm liggende boelgelaengder , som ligger i maksimum af absorptionskurven .

K m-4 og K m+4 er extinktionskoefficienterne for boelgelaengder , der ligger henholdsvis 4 nm hoejere eller lavere end ved K m .

d ) Negative reaktioner efter Bellier-methoden og Vizern-methoden , modificeret , ved fremgangsmaaderne i bilag V , pkt . A og B .

e ) Negativ reaktion for saebe efter fremgangsmaaden i bilag VI .

2 . Som bomolie i henhold til pos . 15.07 A I b ) i den faelles toldtarif betragtes , uanset indholdet af frie fedtsyrer , olivenolie med foelgende karakteristika :

a ) En extinktionskoefficient K270 , der er over 0,25 , og som efter behandling med aktiveret aluminiumoxid ikke er over 0,11 . Visse olier med et indhold af frie fedtsyrer udtrykt som oliesyre paa over 3 % kan efter behandling med aktiveret aluminiumoxid have en extinktionskoefficient paa mere end 0,11 . I saa fald skal de efter neutralisation og blegning i laboratoriet i overensstemmelse med metoder i bilag IV have foelgende karakteristika :

- En extinktionskoefficient K270 paa ikke over 1,10 ;

- En variation i extinktionskoefficienten i boelgelaengeomraadet omkring 270 nm paa over 0,01 , men ikke over 0,16 .

b ) Negative reaktioner efter Bellier-metoden og Vizern-metoden , modificeret , ved fremgangsmaaderne i bilag V , pkt . A og B .

c ) Negativ reaktion for saebe efter fremgangsmaaden i bilag VI .

3 . Til pos . 15.07 A I c ) i den faelles toldtarif henfoeres olier , bl.a . " olie af presserester " , der har foelgende karakteristika :

a ) Indhold af fri fedtsyrer , udtrykt som oliesyre , paa over 3 vaegtprocent .

b ) Positiv reaktion efter Bellier-metoden og/eller Vizern-metoden , modificeret , ved fremgangsmaaden i bilag V , pkt . A og B .

c ) Negativ reaktion for saebe efter fremgangsmaaden i bilag VI .

4 . Til pos . 15.07 A II a ) i den faelles toldtarif henfoeres olivenolie , der er fremkommet ved behandling af olivenolier udvundet af olier henhoerende under pos . 15.07 A I a ) eller 15.07 A I b ) , ogsaa blandet med jomfruolie , og som har foelgende karakteristika :

a ) Indhold af frie fedtsyrer , beregnet som oliesyre , paa hoejst 3 vaegtprocent .

b ) Positiv reaktion for saebe efter fremgangsmaaden i bilag VI , eller

- Extinktionskoefficient K270 paa over 0,25 men ikke over 1,10 , og som efter behandling af olieproeven med aktiveret aluminiumoxyd er over 0,11 .

- Variation i extinktionskoefficienten i boelgelaengdeomraadet omkring 270 nm paa over 0,01 men ikke over 0,16 .

Denne variation defineres ved :

D K = K m - 0,5 ( K m-4 + K m+4 ) .

K m er extinktionskoefficienten for de i omraadet omkring 270 nm liggende boelgelaengder , som ligger i maksimum af absorptionskurven .

K m-4 og K m+4 er ekstinktionskoefficienterne for boelgelaengder , der ligger henholdsvis 4 nm hoejere eller lavere end ved K m .

c ) Negativ reaktion efter Bellier-metoden og Vizern-metoden , modificeret , ved fremgangsmaaden i bilag V , pkt . A og B .

BILAG II

VARER HENHOERENDE UNDER POS . 15.17 A

Pos . 15.17 A omfatter ikke :

a ) Restprodukter fra behandlingen af fedtstoffer og fede olier , som indeholder olie , hvis jodtal efter Wijs' metode uden katalysator er under 70 eller over 100 .

b ) Restprodukter fra behandlingen af fedtstoffer og fede olier , som indeholder olie , hvis jodtal er mellem 70 og 100 , men hvor arealet under den peak , der svarer til retentionsvolumenet ( retentionstiden ) for beta-sitosterol og som er bestemt i overensstemmelse med bilag VIII , udgoer mindre end 93 % af summen af arealerne under samtlige sterolpeaks .

BILAG III

SUPPLERENDE BESTEMMELSER NR . 2 , 3 OG 4 TIL KAPITEL 15 I DEN FAELLES TOLDTARIF

2 . A . Som olivenolie ( pos . 15.07 A ) betragtes kun olie , som udelukkende er fremstillet af oliven , bortset fra re-esterificeret olivenolie og blandinger af olivenolie med anden olie .

B . Som ikke-behandlet olivenolie betragtes olier med de karakteristika , der er anfoert under pkt . I - III .

I . Som jomfruolie ( pos . 15.07 A I a ) ) betragtes naturlig olivenolie , som udelukkende er udvundet ved mekaniske processer , herunder presning , bortset fra blandinger med olivenolie , udvundet paa anden maade , og som har foelgende karakteristika :

a ) Et indhold af frie fedtsyrer , beregnet som oliesyre , paa hoejst 3 vaegtprocent .

b ) Extinktionskoefficient K270 ( absorption ved en lagtykkelse paa 1 cm af en oploesning af 1 g olie pr . 100 ml isooctan ( 2,2,4-trimethylpentan ) ved en boelgelaengde paa 270 nm ) der ikke er over 0,25 og som efter behandling af olieproeven med aktiveret aluminiumoxid ikke er over 0,11 .

c ) Variation i extinktionskoefficienten i boelgelaengdeomraadet omkring 270 nm paa ikke over 0,01 .

Denne variation defineres ved :

D K = K m - 0,5 ( K m-4 + K m+4 ) .

K m er extinktionskoefficienten for de i omraadet omkring 270 nm liggende boelgelaengder , som ligger i maksimum af absorptionskurven .

K m-4 og K m+4 er extinktionskoefficienterne for boelgelaengder , der ligger henholdsvis 4 nm hoejere eller lavere end ved K m .

d ) Negative reaktioner efter Bellier-metoden og Vizern-metoden , modificeret .

e ) Negativ reaktion for saebe .

II . Som bomolie ( pos . 15.07 A I b ) ) uanset indholdet af frie fedtsyrer , olivenolie med foelgende karakteristika :

a ) En extinktionskoefficient K270 , der er over 0,25 og som efter behandling med aktiveret aluminiumoxid ikke er over 0,11 . Visse olier med et indhold af frie fedtsyrer udtrykt som oliesyre paa over 3 % kan efter behandling med aktiveret aluminiumoxid have en extinktionskoefficient K270 paa over 0,11 . I saa fald skal de efter neutralisation og blegning i laboratoriet have foelgende karakteristika :

- En extinktionskoefficient K270 paa ikke over 1,10 .

- En variation i extinktionskoefficienten i boelgelaengdeomraadet omkring 270 nm paa over 0,01 , men ikke over 0,16 .

b ) Negative reaktioner efter Bellier-metoden og Vizern-metoden , modificeret .

c ) Negativ reaktion for saebe .

III . Til pos . 15.07 A I c ) henfoeres olier , bl.a . " olie af presserester " , der har foelgende karakteristika :

a ) Indhold af frie fedtsyrer , udtrykt som oliesyre , paa over 3 vaegtprocent .

b ) Positiv reaktion efter Bellier-metoden og/eller Vizern-metoden , modificeret .

c ) Negativ reaktion for saebe .

C . Til pos . 15.07 A II a ) henfoeres olivenolie , der er fremkommet ved behandling af olivenolier udvundet af olier henhoerende under pos . 15.07 A I a ) eller 15.07 A I b ) , ogsaa blandet med jomfruolie , og som har foelgende karakteristika :

a ) Indhold af frie fedtsyrer , beregnet som oliesyre , paa hoejst 3 vaegtprocent .

b ) Positiv reaktion for saebe , eller :

- Extinktionskoefficient K270 , paa over 0,25 men ikke over 1,10 og som efter behandling af olieproeven med aktiveret aluminiumoxyd er over 0,11 , og

- Variation i extinktionskoefficienten i boelgelaengdeomraadet omkring 270 nm paa over 0,01 , men ikke over 0,16 .

Denne variation defineres ved :

D K = K m - 0,5 ( K m-4 + K m+4 ) .

K m er extinktionskoefficienten for de i omraadet omkring 270 nm liggende boelgelaengder , som ligger i maksimum af absorptionskurven .

K m-4 og K m+4 er extinktionskoefficienterne for boelgelaengder , der ligger henholdsvis 4 nm hoejere eller lavere end ved K m .

c ) Negative reaktioner efter Bellier-metoden og Vizern-metoden , modificeret .

3 . Pos . 15.17 A omfatter ikke :

a ) Restprodukter fra behandlingen af fedtstoffer og fede olier , som indeholder olie , hvis jodtal efter Wijs' metode uden katalysator er under 70 eller over 100 .

b ) Restprodukter fra behandlingen af fedtstoffer og fede olier , som indeholder olie , hvis jodtal er mellem 70 og 100 , men hvor arealet under den peak , der svarer til retentionsvolumenet ( retentionstiden ) for beta-sitosterol og som er bestemt efter bilag VIII til den i punkt 6 nedenfor naevnt forordning , udgoer mindre end 93 % af summen af arealerne under samtlige sterolpeaks .

4 . Til bestemmelse af ovennaevnte karakteristika anvendes de i bilagene til forordning ( EOEF ) nr . 1058/77 beskrevne analysemetoder .

BILAG IV

I . BEHANDLING AF PROEVEN MED AKTIVERET ALUMINIUMOXID

1 . Man kommer 30 g basisk aluminiumoxid , der er fremstillet efter den i stykke 2 beskrevne metode , i en kolonne til kromatografi med en diameter paa ca . 35 mm og en laengde paa 450 mm , og som er forsynet med et udloebsroer med diameter ca . 10 mm .

Aluminiumoxidet stampes mekanisk , ved at man forsigtigt lader kolonnen , der holdes vertikalt , falde gentagne gange ned paa en traeflade . I den saaledes klargjorte kolonne paafyldes der 100 ml af en oploesning paa 10 % olie i hexan .

Eluatet opsamles og oploesningsmidlet fordampes i vakuum ved en temperatur under 25 * C .

Af den saaledes udvundne olie skal bestemmelsen af extinktionskoefficienten ved 270 nm straks foretages .

2 . Man opnaar basisk aluminiumoxid med Brockmann's aktivitet I ( 0 % vand ) ved igennem tre timer ved 380-400 * C at opvarme basisk aluminiumoxid ( til kromatografi ) med en kornstoerrelse mellem 30 mm og 130 mm ( middelvaerdi 80 mm ) . man haelder 5 ml destilleret vand i 100 g af dette produkt for at faa basisk aluminiumoxid med en Brockmann's aktivitet mellem II og III . Man omroerer hyppigt og lader det staa en nat i en hermetisk tillukket beholder .

Kontrol af aluminiumoxidets aktivitet :

30 g basisk aluminiumoxid ( der faas paa den ovenfor angivne maade ) haeldes i en kolonne ( til kromatografi ) med en diameter paa ca . 35 mm og en laengde paa 450 mm . Gennem denne kolonne haeldes som angivet i metoden en blanding af 95 % jomfruolie , der har en extinktionskoefficient K270 under 0,18 , og af 5 % jordnoeddeolie , der ved raffineringen er blevet behandlet med blegejord , og som har en extinktionskoefficient paa ikke under 4 . Hvis blandingen har en extinktionskoefficient paa mere end 0,11 , er aluminiumoxidet anvendeligt . Hvis der ikke forekommer aluering af de konjugerede triener paa denne aluminiumoxid , skal der anvendes et mere toert aluminiumoxid , efter at der er blevet kontrolleret , om det opfylder kravene i den foregaaende test .

II . NEUTRALISATION OG BLEGNING AF OLIVENOLIE I LABORATORIET

A . NEUTRALISATION AF OLIE

1 . Apparatur

- hoejst 300 ml-baegerglas ;

- laboratoriecentrifuge med 100 ml-reagensglas ;

- 250 ml-baegerglas ;

- 100 ml-kolber ;

- dekantertragt til 1 liter .

2 . Reagenser

- vandig natriumhydroxydoploesning paa 12 % ;

- aetanoloploesning paa 1 % af fenolftalin ;

- analyseret heksan ;

- analyseret isopropylalkohol .

3 . Fremgangsmaade

a ) olier af en surhedsgrad , udtrykt i oliesyre , paa under 30 %

50 g raaolie haeldes i et hoejt 300 ml-baegerglas og opvarmes til 65 * C i vandbad . Under langsom bevaegelse tilsaettes en maengde sodiumhydroxid paa 12 % svarende til oliens indhold af frie fedtsyrer , med et overskud paa 5 % . Omroeringen fortsaettes i fem minutter , idet der opretholdes en temperatur paa 65 * C .

Det hele omhaeldes i 100 ml-reagensglas til centrifugering og saebemassen udskilles ved centrifugering . Den dekanterede olie haeldes i et 250 ml-baegerglas og vaskes med 50-60 ml destilleret kogende vand , idet det vandholdige lag fjernes ved hjaelp af en haevert . Vaskningerne gentages , indtil sporene af saeberester er fuldstaendig forsvundet ( indtil fenolftaleinets rosa farve er forsvundet ) .

Olie centrifugeres for at fjerne de smaa restmaengder af vand .

b ) Olier af en surhedsgrad , udtrykt i oliesyre , paa over 30 %

I en demantertragt til en liter haeldes 50 g raaolie , 200 ml heksan , 100 ml isopropylalkohol , og en saa stor maengde natriumhydroxydoploesning paa 12 % , som svarer til oliens indhold af frie fedtsyrer , med et overskud paa 0,3 % . Der omroeres kraftigt i 1 minut . Derefter tilsaettes 100 ml destilleret vand ; der omroeres paa ny , og man lader vaesken staa .

Efter lagdelingen lader man det nederste lag , der indeholder saeberne , loebe af . Mellem de to lag ( olieholdigt foroven og vandholdigt forneden ) dannes der ofte et mellemlag , som bestaar af planteslim og uoploeselige stoffer , og som ligeledes skal fjernes .

Derefter vaskes heksanoploesningen af syrefri olie med portioner , bestaaende af 50-60 ml af en oploesning af isopropylalkohol og destilleret vand i forholdet 1 : 1 ( v/d ) , indtil fenolftaleinets rosa farve forsvinder . Derpaa fjernes heksanet fuldstaendigt ved afdestillering i vakuum ( for eksempel ved hjaelp af en rotationsfordamper ) .

B . BLEGNING AF DEN NEUTRALISEREDE OLIE

1 . Apparatur

- 250 ml kolbe med tre slebne halse , der goer det muligt at indsaette :

a ) et gradinddelt termometer , der kan aflaeses op til 90 * C ;

b ) et mekanisk roereapparat med 250-300 omdrejninger i minuttet og udstyret til at fungere i vakuum ;

c ) et forbindelsesstykke til vakuumpumpen .

- vakuumpumpe udstyret med manometer og i stand til at give residualtryk paa 15-30 milibar .

2 . Fremgangsmaade

I trehalsekolben vejes ca . 100 g af den neutraliserede olie . Termometret og roereapparatet indsaettes ; vakuumpumpen tilsluttes og olien opvarmes under omroering indtil 90 * C . Denne temperatur holdes under stadig omroering , indtil den olie , der skal analyseres , er fuldstaendig befriet for sit vandindhold ( ca . 30 minutter ) .

Vakuum brydes og der tilsaettes 2 a 3 g aktiveret jord . Vakuum genoprettes , indtil der opnaas et residual-tryk paa 15-30 milibar , og der omroeres stadig ved en temperatur af 90 * C i 30 minutter med ca . 250 omdrejninger i minuttet .

Dernaest filtreres ved varme i et termostatisk reguleret toerreskab ( 50-60 * C ) .

BILAG V

BESTEMMELSE AF OLIE AF PRESSERESTER I OLIVENOLIER

A . DEN SAAKALDTE BELLIER-METHODE

1 . Apparatur

- 100 ml-kolbe med tilbagestroemningssvaler ,

- 5 ml pipette gradueret i tiendedele ,

- varmekilde , der goer det muligt at naa op paa en temperatur paa omkring 80 * C ,

- termometer , der maaler fra 15 til 60 * C .

2 . Reagenser

- hydro-alkoholisk oploesning af kali ( 42,5 og KOH oploest i 72 ml destilleret vand , idet dette volumen fyldes op til 500 ml med 95 * ethylalkohol ,

- ethylalkohol-oploesning , der maaler 70 * ,

- vandig oploesning af eddikesyre 1 + 2 ( i volumen ) , der afpasses saaledes , at 1,5 ml neutraliserer noejagtig 5 ml af den hydro-alkoholiske oploesning af kaliumhydroxid ved tilstedevaerelse af phenolphthalein .

3 . Tilberedning af proeven

Olien befries for vand ved dekantering og filtrering gennem filtrerpapir ved en temperatur , der er lidt hoejere end smeltepunktet for visse faste bestanddele , som kunne vaere udskilt fra det flydende fedtstof .

4 . Fremgangsmaade

I kolben haeldes ca . 1 ml olie tilberedt som angivet i stykke 3 . Der tilsaettes 5 ml hydroalkoholisk kalioploesning . Tilbagestroemningssvaleren tilsluttes og vaesken koges i 10 minutter under omroering fra tid til anden . Man lader den afkoele til den omgivende temperatur . Der tilsaettes 1,5 ml vandig eddikesyreoploesning og 50 ml ethylalkoholoploesning , der forinden er opvarmet til 50 * C . Den blandes under omroering , termometret anbringes heri og afkoeles , idet oploesningens udseende iagttages , saa snart den har naaet en temperatur paa 45 * C . Saafremt der dannes et fnugget bundfald ved en temperatur paa over 40 * C , er reaktionen positiv . Hvis der ikke dannes fnugget bundfald , lader man vaesken staa i den omgivende temperatur , som skal vaere mellem 20 og 22 * C i mindst 24 timer og , om fornoedent , i 48 timer . Oploesningen iagttages paa ny ; dannelsen af et fnugget bundfald som suspension i midten af vaesken viser ligeledes , at reaktionen er positiv .

Udformning af resultaterne

Positiv eller negativ bestemmelse af olie af presserester ( Bellier-metoden ) .

B . DEN SAAKALDTE VIZERN-METODE , MODIFICERET

Den uforsaebelige del af den olie , der skal analyseres , isoleres , og dens reaktion i alkohol 85 * iagttages under visse betingelser .

1 . Apparatur

1 - 300 ml glaskolber , der er modstandsdygtige over for alkali , og som er forsynet med en tilbageloebssvaler ,

2 - 500 ml eller 1 000 ml skilletragt ,

3 - 100 ml baegerglas ,

4 - Reagensglas .

2 . Reagenser

- Alkoholoploesning af kaliumhydroxid 2N

- Petroleumether

- Ethylalkohol 50 %

- Ethylalkohol 96 , maalt med alkoholometer

- Iltet vand , 10 rumfang

- Ethylalkohol 85 , maalt med alkoholometer .

3 . Fremgangsmaade

Ca 5 g af analyseproeven afvejes i en 300 ml kolbe . Der tilsaettes 50 ml alkoholoploesning af kaliumhydroxid 2N . Tilbageloebssvaleren tilsluttes og vaesken bringes til svag kogning . Efter en times opvarmning omroeres vaesken , den afkoeles til 30-35 C og haeldes i en skilletragt , idet der anvendes 50 ml destilleret vand .

Kolben vaskes omhyggeligt med 50 ml petroleumether gentagne gange . Petroleumetheren haeldes i en skilletragt Indholdet omroeres kraftigt lidt over et minut . Efter dekantering elimineres den vandige fase , idet den haeldes i en anden skilletragt . Der tilsaettes yderligere 50 ml petroleumether , der omroeres kraftigt , hvorefter blandingen stilles til hvile . Den vandige fase haeldes i en tredje skilletragt og der tilsaettes yderligere 50 ml petroleumether . Der omroeres og blandingen stilles til hvile .

I en skilletragt opsamles de etherekstrakter , der stammer fra de forskellige udtraekninger af den uforsaebelige del , og der vaskes mindst tre gange med alkohol 50 % ( 50 ml hver gang ) , indtil denne rensevaeske ikke mere giver alkalireaktion ved phenolphthalein .

Oploesningen med den uforsaebelige del filtreres i en 300 ml kolbe , filtret vaskes med petroleumether , hvorefter oploesningen fjernes ved destillering . Der tilsaettes 10 ml alkohol 96 , og efter delvis opvarmning ( ca . 40 C ) filtreres der i et 100 ml baegerglas . 300 ml kolben vaskes med 10 ml alkohol 96 , og der filtreres derefter i baegerglasset .

I 100 ml baegerglasset , der indeholder alkoholekstrakterne med den uforsaebelige del , tilsaettes 5 ml altet vand . 10 rumfang ; der opvarmes i vandbad indtil fuldstaendig fordampning . Endvidere tilsaettes 20 ml alkohol 96 og 5 ml altet vand ; der foretages paa ny en fuldstaendig fordampning .

Baegerglasset fjernes fra vandbadet , og der tilsaettes 20 ml alkohol 85 . Der opvarmes forsigtigt i vandbad , idet der navnlig soerges for , at ingen alkohol gaar tabt , saaledes at koncentrationen ikke formindskes . Det drejer sig om en saerdeles vigtig faktor , som ikke maa overses .

Filtrering paa papir , afkoeling og iagttagelse af reaktionen i oploesningen efter en time , derefter 4 timer . Saafremt oploesningen efter en time er fuldstaendig gennemsigtig , er analysen negativ , dvs . at der ikke er olie af presserester .

Saafremt oploesningen efter en time er uklar , iagttages der paa ny 4 timer senere .

Saafremt oploesningen efter 4 timer fortsat er uklar , men der ikke forekommer fnug , er analysen fortsat negativ . Hvis der derimod iagttages fnugdannelser , er analysen positiv , og der er tilstedevaerelse af olie af presserester .

Udformning af resultaterne

Bestemmelse af olie af presserester ( Vizern-metode , modificeret ) : positiv eller negativ .

Bemaerkninger :

Olivenolie giver en gennemsigtig eller hoejst en smule maelkefarvet oploesning ved ethvert forsoeg . Olie af presserester , ren eller blandet , viser karakteristiske fnug , der holder sig svaevende som smaa skyer , men som aflejrer sig , naar vaesken har vaeret i ro i flere timer .

BILAG VI

BESTEMMELSE AF SAEBE TIL PAAVISNING AF ALKALIINDHOLD

Princip

Paavisning af alkalisaebe ved hjaelp af bromphenolblaat .

Reagenser

- 0,1 % bromphenoloploesning i ethanol 96 % v/v

- Frisk destilleret acetone tilsat 2 % vand v/v .

Acetone med 2 % vand skal give en gullig eller groengullig farve ved tilstedevaerelse af et par draaber af bromphenolblaatoploesningen .

Apparatur

Et 150 mm gange 15 mm reagensglas .

Fremgangsmaade

10 ml acetone og 1 draabe af bromphenoloploesningen haeldes i reagensglasset . Oploesningen boer blive gullig . Sker dette ikke , skylles glasset og proppen med acetone indtil den blaa farve forsvinder . Der haeldes 10 g olie i glasset , der lukkes med den rene prop , hvorefter vaesken omroeres og stilles til hvile . Saafremt det oeverste acetonelag bliver blaat , er det tegn paa , at der er saebe til stede .

Udformning af resultatet

Resultatet udtrykkes som positivt eller negativt .

BILAG VII

BESTEMMELSE AF REESTERIFICEREDE OLIER

Metoden har til formaal i olier og fedtstoffer at bestemme sammensaetningen af den fedtsyrefraktion , som forestres i glycerols 2-stilling ( ss-stilling eller intern stilling ) idet reesterificerede olier indeholder mere palmitinsyre end ikke-reesterificerede olier .

Princip :

Denne metode hviler paa en specifik og partiel hydrolyse af triglyceriderne af pankreaslipasen med en foretrukken dannelse af mono-2 glycerider . Denne hydrolyse foerer til en blanding , som ved siden af de ikke hydrolyserede triglycerider indeholder diglycerider , mono-2 glycerider og frie fedtsyrer . Denne blanding fraktioneres gennem tyndtlagskromatografi og monoglyceriderne isoleres . Disse monoglycerider methanoliseres , og de fremkomne methylestere analyseres ved hjaelp af gaskromatografi .

Det analyserede produkt anses som vaerende tilsat reesterificeret olie , naar palmitinsyreandelen i 2-stillingen for triglycerider er stoerre end 2 % .

1 . Udstyr

- 500 ml skilletragt ,

- kolonne af glas til kromatografi , indre diameter 13 mm , laengde 400 mm , udstyret med en plade af sintret glas og en hane ,

- 250 ml bredhalset kolbe ,

- 100 ml kolbe ,

- 10 ml centrifugeglas , med slebet prop ,

- 1 ml injektionssproejte , forsynet med en tynd naal ,

- 25 ml kolbe med en ca . 1 m lang svaler med slebet ansats ,

- 50 ml baegerglas ,

- 5 ml burette , gradueret i 1/20 ml ,

- spreder til tyndlagskromatografi , med glasplader paa 20 gange 20 cm ,

- mikrosproejte som kan give draaber paa 3-4 ml ,

- udviklingskar til tyndlagskromatografi ,

- rotationsfordamper ,

- ovn som kan indstilles til 103 * C mere eller mindre 2 * C ,

- termostat som er indstillelig mellem 30 * C og 45 * C med en noejagtighed paa mere eller mindre 0,5 * C ,

- elektrisk vibrationsomroerer som muliggoer en kraftig omroering af centrifugeglasset ,

- pulverisator til tyndlagskromatografi ,

- UV-lampe til undersoegelse af de kromatografiske plader ,

- laboratorieomroerer , som er egnet til knusning og fordeling af heterogene materialer ,

- pH-meter ,

- aksialomroerer ,

- ur .

2 . Reagenser

- Vandig 12 % ( m/v ) natriumhydroxidoploesning ,

- oploesning af 1 % ( m/v ) af phenolphtalein i 95 % ( v/v ) ethanol ,

- diethyloxid , fri for peroxider ,

- isopropylalkohol eller 95 % ( v/v ) ethylalkohol , p.a . ,

- aktiveret aluminiumoxid til kromatografi , neutralt , med Brockmann aktivitet I nyligt aktiveret gennem 2 timer ved 260 * C og opbevaret i en ekssikkator ,

- hexan eller eventuelt petroleumether ( kp . = 30 - 50 * C ) , til kromatografi ,

- myresyre 98 % ( m/m ) minimum ,

- pankreaslipase af passende aktivitet ( note 1 , note 2 ) ,

- bufferoploesning : 1 M vandig oploesning af tri-hydroxymethylaminomethan , som er givet pH 8 ved hjaelp af 6 N saltsyre ( potentiometrisk kontrol ) ,

- 0,1 % ( m/v ) vandig oploesning af natriumklorat ( enzymatisk kvalitet ) ,

- 6 N saltsyreoploesning ,

- udviklingsoploesning : hexan eller eventuelt petroleumether/diethyloxid/myresyre 70/30/1 ( v/v/v ) ,

- 10 % ( m/v ) vandig gummi arabicum oploesning ,

- 22 % ( m/v ) vandig calciumchlorid ( CaCl2 ) oploesning ,

- 0,2 % ( m/v ) alkoholoploesning af dichlor-2'-7' fluorescein , let alkaliseret ved tilsaetning af en draabe 1 N natriumhydroxid pr . 100 ml ,

- silicium i pulverform , med bindemiddel , kvalitet til tyndlagskromatografi ,

- 20 % ( m/v ) vandig natriumkloratoploesning ,

- 0,1 N vandig natriumhydroxid oploesning ,

- neutraliseret olie .

3 . Tilberedning af proeven

Proeve med aciditet mindre end 3 % : direkte neutralisering paa aluminiumoxid som beskrevet i 3-2 .

Proeve med aciditet stoerre end 3 % : neutralisering ved hjaelp af alkali med tilstedevaerelse af oploesningsmiddel som beskrevet i 3-1 , derefter passage paa aluminiumoxid som beskrevet i 3.2 .

3.1 . Neutralisering ved hjaelp af alkali med tilstedevaerelse af oploesningsmiddel

I en 500 ml skilletragt haeldes ca . 10 g raa olie , 100 ml hexan eller eventuelt petroleumether , 50 ml isopropylalkohol eller 95 % ethylalkohol , nogle draaber phenolphtalein-oploesning og en maengde af den 12 % natriumhydroxidoploesning svarende til oliens frie aciditet plus en overskydende maengde paa 0,3 % . Der omroeres kraftigt i 1 minut , derefter tilsaettes 50 ml destilleret vand , der omroeres igen , og blandingen stilles til hvile .

Efter dekantering elimineres det nederste lag , som indeholder saeberne . Eventuelle mellemliggende lag elimineres ( planteslim og uoploeselige stoffer ) , hexanoploesningen af neutraliseret olie vasket med gentagne portioner paa 25 eller 30 ml af en isopropylalkohol-oploesning eller ethylalkoholoploesning og destilleret vand 1 : 1 ( v/v ) , indtil phenolphaleinens rosafarvning forsvinder .

Stoerstedelen af hexanen elimineres ved vakuumdestillation , og olien toerres ved 30 til 40 * C i vakuum ved hjaelp af en ren nitrogenstroem , indtil oploesningsmidlet er fuldstendig elimineret .

3.2 . Behandling med aluminiumoxid

Der fremstilles en suspension af 15 g aktiveret aluminiumoxid i 50 ml hexan eller eventuelt petroleumether , og denne haeldes under omroering i en glaskolonne til kromatografi . Aluminiumoxidet fordeles ligeligt og oploesningsmidlet paafyldes indtil 1-2 mm over absorbantens oeverste niveau . I kolonnen haeldes omhyggelig en oploesning , som er klargjort ca . 15 minutter i forvejen ved oploesning af 5 g olie i 25 ml hexan eller eventuelt petroleumether , og den samlede maengde vaeske , som forlader kolonnen , opsamles i en 100 ml kolbe .

Den stoerste del af oploesningsmidlet elimineres ved vakuumdestillation , derefter toerres olien ved 30 til 40 * C i vakuum ved hjaelp af en ren nitrogenstroem indtil total elimination af oploesningsmidlet .

4 . Tilberedning af pladerne til kromatografi

I en bredhalset 250 ml kolbe anbringes 30 g silicium i pulverform med bindemiddel og 60 ml destilleret vand , og der omroeres , indtil der fremkommer en godt homogen groedet masse . Der afgasses i vakuum ved hjaelp af vandpumpe i 1 minut .

Den groedede masse udspredes som normalt paa pladerne ved hjaelp af sprederen og tykkelsen reguleres til 0,25 mm .

Den ovennaevnte maengde groed er tilstraekkelig til klargoering af fem 20 gange 20 cm plader .

Pladerne lufttoerres i ca . 15 minutter og toerres derefter i varmeskab ved 103 * C mere eller mindre * C i 2 timer .

De saaledes fremstillede plader opbevares i en ekssikkator .

5 . Fremgangsmaade

5.1 . Hydrolyse ved hjaelp af pankreaslipase

I det 10 ml centrifugeglas afvejes ca . 0,1 g af den tilberedte proeve .

Der tilsaettes 20 mg lipase og 2 ml bufferoploesning . Der omroeres omhyggeligt og med forsigtighed , derefter tilsaettes 0,5 ml af den 0,1 % natriumkloratoploesning og 0,2 ml af calciumchloridoploesningen . Glasset lukkes med den slebne prop , der fastgoeres med forsigtighed ( idet man undgaar at fugte proppen ) , og glasset saettes straks i en termostat , som er indstillet paa 40 * C mere eller mindre 0,5 * C , og der omroeres i noejagtig 1 minut .

Glasset tages ud af termostaten , og der omroeres kraftigt i noejagtig 2 minutter .

Der afkoeles straks under rindende vand , derefter tilsaettes 1 ml 6 N saltsyre og 1 ml diethyloxid . Glasset tillukkes , og der omroeres kraftigt . Blandingen stilles til ro , og den oevre organiske fase udtages ved hjaelp af sproejten .

5.2 . Udskillelse af monoglycerider ved hjaelp af tyndlagskromatografi

Ekstratet anbringes paa den kromatografiske plade ca . 1,5 cm fra den nederste rand i en fortsat og ensartet stribe , saaledes at der opnaas en startlinje , der er saa tynd som muligt .

Pladen stilles ind i udviklingskammeret , og der udvikles , indtil oploesningsmidlets front er naaet til ca . 1 cm fra pladens oeverste kant . Den omgivende temperatur skal vaere 20 * C .

Pladen lufttoerres ved varmeskabets temperatur og dichlor-2'-7' fluoresceinoploesningen pulveriseres . Monoglyceridernes baand ( Rf = ca . 0,035 ) afgraenses i UV-lys , og de afkrasses ved hjaelp af en metalspatel ( undgaa et tage de bestanddele som er forblevet paa startlinjen med ) ; sicilium opsamles i 25 ml methyleringskolbe .

Monoglyceriderne omdannes til methylestere ved direkte at behandle det tidligere opsamlede silicium , som beskrevet i den generelle metode til tilberedning af methylestere fra fedtsyrer angivet i punkt 7.3 ; derefter foretages gaskromatografi af estere , som beskrevet i metoden i punkt 7.4 .

Paa samme proeve bestemmes sammensaetningen af de samlede fedtsyrer , idet det er nyttigt at sammenligne med sammensaetningen af fedtsyrerne i 2-stilling med henblik paa fortolkning af resultaterne .

6 . Udforming af resultater

Sammensaetningen af fedtsyrerne i 2-stilling beregnes i procent med 1 decimal ( note 3 ) .

7 . Noter

7.1 . Kontrol af lipaseaktiviteten

Der fremstilles en olieemulsion ved i et passende blandeapparat i ca . 10 minutter at omryste en blanding bestaaende af 165 ml 10 % gummi arabicumoploesning , 15 g knust is og 20 ml af en i forvejen neutraliseret olie .

I et 50 ml baegerglas anbringes 10 ml af den ovennaevnte emulsion , derefter 0,3 ml 20 % natriumchloratoploesning og 20 ml destilleret vand .

Baegerglasset anbringes i en termostat , som er indstillet til 37 * C mere eller mindre 0,5 * C , i baegerglasset neddyppes derefter elektroderne fra et pH-meter og en aksialomroerer .

Ved hjaelp af en 5 ml burette tilsaettes draabe efter draabe en 0,1 N natriumhydroxidoploesning indtil pH = 8,5 .

Der tilsaettes et passende volumen af en suspension af lipasepulver i vand ( se nedenfor ) . Saa snart pH-meteret viser 8,3 startes uret , og der tilsaettes en 0,1 N natriumhydroxidoploesning i et saadant tempo , at pH netop forbliver 8,3 . Hvert minut noteres det forbrugte omfang alkalioploesning .

De fremkomne resultater optegnes i et koordinatsystem med abscissen som tidsakse og ud af ordinaten de maengder af alkalioploesning i ml , der er forbrugt for at holde pH konstant . Der skal fremkomme en ret linje .

Den foernaevnte lipasesuspension er en 1 procent suspension i vand udtrykt i masse . Ved hvert forsoeg tages netop en saadan maengde af denne suspension , at i loebet af 4 til 5 minutter netop 1 ml alkalioploesning forbruges . Normalt kan dette opnaas med 1 til 5 mg pulver .

Lipaseenheden defineres som den maengde enzym , der frigoer 10 syremikroaekvivalenter pr . minut .

Det anvendte pulvers aktivitet A maalt i lipaseenheder pr . mg er :

A = V gange 10/m

V = antal ml 0,1 N natriumhydroxidoploesning pr . minut beregnet ud fra grafen

m = massen af pulverproeven i mg .

Det anvendte lipase skal have en aktivitet mellem 0,8 og 2 lipaseenheder pr . mg .

7.2 . Tilberedning af lipasen

Der eksisterer i handelen lipase , som har en lipaseaktivitet , der er tilfredsstillende . Det er ligeledes muligt at fremstille den i laboratoriet paa foelgende maade :

5 kg frisk grisepankreas afkoeles til 0 * C , omliggende fast fedt og bindevaev fjernes , og pankreasen formales i en knivmoelle , indtil der fremkommer en flydende pasta . Denne pasta omroeres ved lav temperatur i 4 til 6 timer med 2,5 l vandfrit acetone ; derefter centrifugeres . Remanensen ekstraheres 3 gange med samme rumfang acetone , 2 gange med en acetone-diethyloxidblanding 1/1 ( v/v ) og 2 gange med diethyloxid .

Remanensen vakuumtoerres 48 timer , saaledes at der fremkommer et stabilt pulver , som skal opbevares i koeleskab .

7.3 . Fremstilling af fedtsyremethylestere

I henhold til den i bilag VI , afsnit II , i Kommissionens forordning ( EOEF ) nr . 72/77 af 13 . januar 1977 ( 1 ) om aendring af forordning ( EOEF ) nr . 1470/68 om udtagelse og reduktion af proever samt om bestemmelse af indholdet af olie , urenheder og fugtighed i olieholdige froe anfoerte metode .

7.4 . Gasfasekromatografi af fedtsyremethylestere

I henhold til den i bilag VI , afsnit III , i Kommissionens forordning ( EOEF ) nr . 72/77 anfoerte metode .

( 1 ) EFT nr . L 12 af 15 . 1 . 1977 , s . 11 .

BILAG VIII

BESTEMMELSE AF TILSTEDEVAERELSEN AF ANDRE OLIER I OLIVENOLIE ANALYSE AF FEDTSTOFFERS STEROLFRAKTION

Princip

Gaskromatografisk analyse af steroler , fremstillet ved tyndtlagskromatografi af den uforsaebelige del , toerret med forsigtighed .

Apparatur

1 . Apparatur til tyndtlagskromatografi , omfattende saerlig 4 glasplader 20 gange 20 gange 0,4 cm 2 paa 20 gange 5 gange 0,4 cm og 1 mikrosproejte til 0,1 ml ;

2 . 50 ml baegerglas ;

3 . poroese filtre , poroesitet 3 , diameter 15 mm ;

4 . 100 ml-kolbe ;

5 . 10 ml-centrifugeglas med konisk bund og med slebet prop ;

6 . graduerede 1 ml - og 5 ml-pipetter ;

7 . gaskromatograf udstyret med en flammeioniseringsdetektor og med en soelv - eller glasinjektor eller et system til direkte indsproejtning paa kolonnen og forbundet med en skriver ;

8 . kolonne til gaskromatografi af glas eller af rustfrit staal , U - eller spiralformet af 1 à 2 meters laengde og med en indre diameter paa 3 à 4 mm - stationaer fase af silikongummi ( af typen methyl ( 1 ) ) , som er stabil indtil mindst 300 * C , hvormed der i forholdet 2 til 4 % impraegneres en kalcineret , med syre vasket og silaniseret diatomejord med kornstoerrelse 80/100 eller 100/120 mesh ;

Bemaerkning : Da visse typer rustfrit staal kan fremkalde fejlagtige resultater paa grund af oedelaeggelse af sterolerne , anbefales det at bruge glas .

9 . mikrosprojte , der kan dosere maengder paa 1,5 eller 10 ml .

Reagenser

1 . Chloroform til kromatografi ;

2 . benzen til kromatografi ;

3 . heptan ;

4 . silikagel ( for eksempel Kieselgel G ) ;

5 . referenceoploesning til kromatografi paa plade , bestaaende af 5 % cholesterol i chloroform ;

6 . acetone til kromatografi ;

7 . oploesning paa 0,1 % i absolut aetylalkohol af natriumsalt af 2',7'-dichlorfluorescein .

8 . pyridin ;

9 . hexamethyldicilazon ;

10 . trimethylchlorsilan ;

11 . oploesning bestemt til foelsomhedstesten : 1 mg cholesterol i 1 ml n-pentain ;

12 . oploesning til undersoegelse af peakoploesningen : 0,9 mg rapsoliephytosteroler og 0,1 mg cholesterol i 1 ml n-pentan . Sterolerne skal vaere friskt tilberedt efter den metode , der beskrives under punkt A i afsnittet " fremgangsmaaden " ,

13 . oploesning til referencetesten : 1 mg solsikkeoliephytosteroler i 1 ml n-pentan , friskt tilberedt som beskrevet under punkt A i afsnittet " fremgangsmaaden " .

Fremstilling af plader til kromatografi

Paa udsprederen anbringes i raekkefoelge en plade 20 gange 5 gange 0,4 cm , fire plader 20 gange 20 gange 0,4 cm og en plade 20 gange 5 gange 0,4 cm . Der haeldes 40 g silikagel og ca . 80 ml vand i en bredhalset 500 ml-kolbe . Der omroeres med en glasstang , eventuelt med et mekanisk roereapparat af glas , indtil der faas en homogen suspension . Eventuelle gasser fjernes ved at evakuere ved hjaelp af en vandstraalepumpe i mindst et minut . Derefter laegges suspensionen paa sprederen , idet tykkelsen reguleres til 0,5 mm , og pladerne belaegges med et ensartet lag . Pladerne lufttoerres i ca . 15 minutter og toerres derpaa i et varmeskab ved 105 C i to timer . De saaledes fremstillede plader opbevares i en ekssikkator i vakuum .

FREMGANGSMAADE

A . Tilberedning af den uforsaebelige del

Indledning

Ved den uforsaebelige del forstaas de stoffer , der er oploeselige i fedtstof , og som efter forsaebning er uoploeselige i vand men oploeselige i den vaeske , der anvendes til bestemmelse . Den omfatter fedtstoffernes naturlige bestanddele ( sterol , alkohol , kulbrinte ) , samt organiske stoffer , der ikke fordamper ved 100 * C ( mineralsk olie ) , som ikke er en del af fedtstofferne , og som disse eventuelt kan indeholde . Som oploesningsvaeske anvendes petroleumether eller ethyloxid . Der maa tages hensyn til , at resultaterne med de to oploesninger i de fleste tilfaelde er forskellige , og at man finder et stoerre procentindhold med ethyloxid . For olivenolie er petroleumether kendt som den oploesning , der skal anvendes , paa grund af det klima , de fleste analyselaboratorier ligger i .

Metoden med petroleumether

Apparatur

- Ca . 150 ml kolbe , der kan tilsluttes en tilbageloebssvaler ,

- ca . 500 ml skilletragte ,

- ovn som kan indstilles til 103 C ( mere eller mindre 2 C ) .

Reagenser

- Ca . 2 N KOH-ethanoloploesning i ethanol 95 % v/v . Reagensen maa ikke vaere moerkere end den straagule farve ( se bemaerkning II.D.1.1.2 ) .

- Petroleumether , der uddestilleres fra 40 til 60 * C , med et bromindeks , der er mindre end 1 , og fri for urenheder .

Fremgangsmaade

Med en noejagtighed paa 0,01 g afvejes ca . 5 g af fedtstoffet i kolben . Der tilsaettes 50 ml af ca . 2 N KOH-ethanoloploesningen . Tilbageloebssvaleren tilsluttes . Vaesken koger svagt i en time . Varmekilden slukkes . Gennem den oeverste del af svaleren tilsaettes ca . 50 ml destilleret vand og vaesken omroeres .

Efter afkoeling haeldes vaesken over i skilletragten og kolben skylles flere gange med i alt ca . 50 ml . petroleumether .

Der omroeres kraftigt i et minut .

Vaesken stilles til hvile indtil de to faser er fuldstaendig adskilt , og den saebeholdige oploesning opsamles i en anden skilletragt . Saafremt der undtagelsesvis forekommer emulsionsdannelse , skal denne tilintetgoeres ved tilsaetning af smaa maengder ethanol eller koncentreret kaliumhydroxid-oploesning .

Den saebeholdige oploesning uddrages endnu 2 gange , hver gang med ca . 50 ml petroleumether .

De tre petroleumholdige dele samles i samme tragt , og de vaskes 3 gange med ca . 50 ml ethanol 50 % v/v .

Fra tragtens oeverste del haeldes - om noedvendigt ad flere gange - den maengde , der svarer til petroleumetheren , i en tareret 250 ml kolbe ( idet der foretages smaa skyldninger af tragten med petroleumether ) .

Oploesningen fjernes ved forsigtig opvarmning i vakuum og affaldet toerres ved en temperatur under 50 * C i vakuum for at undgaa uoensket iltning .

B . Udskillelse af sterolfraktionen ved tyndtlagskromatografi

I udviklingskammeret anbringes normalblandingen af heptan/acetone - 85/15 eller benzol/acetone 95/5 ( v/v ) op til en hoejde af ca . 1 cm ; kammeret lukkes ved hjaelp af daekslet og man lader blandingen staa i mindst tre timer , saaledes at vaeske/damp-ligevaegt kan opstaa . Det tilraades ligeledes paa de indre sider af kammeret at fastgoere strimler af filtrerpapier , nedsaenket i vaesken . Denne forsigtighedsforanstaltning har den fordel at forkorte vaeskens vandring med ca . en tredjedel og at faa komponenterne til at eluere paa en mere ensartet maade .

I mellemtiden fremstilles en oploesning paa 5 % af den med petroleumether chloroform udtrukne uforsaebelige del . Ca . 0,3 ml af denne oploesning udtages og anbringes ved hjaelp af 0,1 ml-mikrosproejten paa den kromatografiske plade ca . 1,5 cm fra den nederste rand i en fortsat og ensartet stribe , saaledes at der opnaas en startlinje , der er saa tynd som muligt . Efter den saedvanlige fremgangsmaade anbringes i randen af pladen nogle ml af referenceoploesningen , som indeholder cholesterol , for at kunne bestemme Rf-vaerdien af sterolfraktionen .

Pladen stilles ind i udviklingskammeret , der er klargjort som ovenfor angivet . Den omgivende temperatur skal vaere ca . 20 * C . Der lukkes med daekslet og udvikles , indtil oploesningstnidlets front er naaet til ca . 1 cm fra pladens oeverste rand . Pladen tages ud af udviklingskammeret , og man lader oploesningsmidlet fordampe i en varm nitrogenstroem .

Ved at stroejte jaevnt og forsigtigt fremkaldes den alkoholiske oploesning af natriumsalt 2',7'-dichlorfluorescein paa pladen . Ved at undersoege pladen i ultraviolet lys bestemmes sterolernes stilling ved hjaelp at deres beliggenhed i linje med den cholesterolplet , der fremkommer ved referenceoploesningen . Sterolzonen afkradses ved hjaelp af en metalspatel . Den udskilte silikagel haeldes i et 50 ml-baegerglas med 15 ml varm chloroform , der omroeres , og den samlede maengde silikagel anbringes paa det poroese filter og filtreres .

Filtret vaskes tre gange , hver gang med 15 ml varm chloroform , og filtratet opsamles i en 100 ml-kolbe .

Chloroformoploesningen inddampes til 4 a 5 ml , og haeldes i et centrifugeglas , forsynet med en slebet prop , der i forvejen er tareret . Oploesningsmidlet inddampes til toerhed ved en let opvarmning i en nitrogenstroem , derefter vejes den saaledes frembragte sterolfraktion .

C . Gaskromatografisk analyse af steroler

1 . Tilberedning af trimethylsilietbere ( TMS )

For hver * g sterol tilsaettes i centrifugeglasset 0,02 ml reagens til silanisering , sammensat af en blanding af pyridin-hexamethyldisilazan-trimethylchlorosilan 9.3.1 ( v/v/v ) , idet ethvert spor af fugtighed omhyggeligt undgaas . Centrifugeglasset anbringes i en ekssikkator i ca . 30 minutter , derpaa lukkes , og der centrifugeres i nogle minutter . Til den analyse , som derefter skal foretages , udtages den resterende oploesning .

2 . Betingelser for den gaskromatografiske analyse

Kolonnetemperatur 220 à 250 * C .

Temperatur i indsproejtningssystemet , hvis det opvarmes saerskilt : 20 à 40 * C over kolonnens temperatur . Nitrogenmaengde 30 à 60 ml/min . Detektortilslutningen afbrydes og under disse omstaendigheder bringes de nye kolonner i ligevaegt i 16 à 24 timer . Detektoren tilsluttes , flammen taendes og hydrogen - , oxygen - eller luftstroemmen reguleres saaledes , at der faas en passende flammehoejde og foelsomhed . Skriveren saettes i gang og papiret fremfoeres med en passende hastighed ; nulpunktet og maaleomraadet justeres . Hvis grundlinjen er stabil , er apparatet klar til brug .

3 . Foelsomhedstest

Der udtages 5 ml af oploesningen til foelsomhedstesten , oploesningsmidlet inddampes , foelg fremgangsmaaden i 1 ; indsproejt 0,1 til 0,2 ml oploesning . Kun cholesterol-peaken maa vise sig paa kromatogrammet .

Maaleomraadet indstilles saaledes , at naesten hele skriverens udslagsomraade udnyttes .

4 . Test af top-oploesning

Der udtages 5 ml af oploesningen til oploesningstesten . Oploesningen inddampes , foelg fremgangsmaaden i 1 .

Der indsproejtes 3 à 5 ml af den saaledes tilberedte oploesning ( IMS ) . Peaks af cholesterol , af brassicasterol , af campesterol og af b-sitosterol skal vise sig paa kromatogrammet . Derefter maales retentionsafstandene ( afstanden fra indsproejtningspunktet til det hoejeste punkt paa en peak ) , o CH for cholesterol , o H for brassicasterol , o C for campesterol og d S for b-sitosterol , saavel som bredden ved basis af peak ( rententionslaengden mellem vendetangenternes skaeringspunkter paa for - og bagside af peaks med basislinjen ) , o CH for cholesterol og o H for brassicasterol . Topoploesningen udtrykt i formlen :

PR = 2 ( d B - d CH ) / ( o H + o CH )

skal vaere lig med mindst 1 .

De relative retentionstider ( cholesterol = 1,00 ) for brassicasterol , campesterol og b-sitosterol , beregnes .

5 . Referencetest

Der udtages 5 ml af oploesningen til referencetest , oploesningsmidlet inddampes , foelg fremgangsmaaden i 1 , indsproejt 0,1 til 0,2 ml af den saaledes tilberedte oploesning ( TMS ) . Peaks af campesterol af sti masterol af b-sitosterol og D 7 stigmasterol skal vise sig paa kromatogrammet .

Rententionsafstandene for peaks , d C for campesterol , d S * for stigmasterol , d S for b-sitosterol og d S * 7 for D 7 stigmasterol , maales .

Derefter beregnes de relative retentionstider , som tilnaermelsesvis er :

Cholesterol 1,0 ( ca . 15 minutter )

Brassicasterol 1,1

Campesterol 1,3

Stigmasterol 1,4

b-sitosterol 1,6 ( 2 )

D 7 stigmasterol 1,8 ( 3 )

6 . Analyse

Der indsproejtes 0,1 til 0,2 ml af den TMSE-oploesning af de steroler , der skal analyseres , og kromatogrammet registreres .

D . Udformning af resultaterne

Ved fortolkningen af sammensaetningen af den analyserede sterolfraktion maa der ikke tages hensyn til de toppe , der har andre retentionstider end dem , der ikke tages hensyn til de toppe , der har andre retentionstider end dem , der eksperimentielt er bestemt for de ovennaevnte seks steroler .

Procentindholdet af b-sitosterol foelger af formlen :

b-sitosterol toppens areal/Summen af de seks sterolpeaks arealer gange 100

Indholdet af b-sitosterol maa ikke vaere mindre end 93 % i forhold til sammensaetningen i % af de samlede steroler .

( 1 ) F * eks . SE 30 .

( 2 ) Saafremt andre steroler under disse betingelser har samme refentionssvolumen som b-sttosterol , faelles de som b-sttosterol .

( 3 ) Saafremt andre steroler under disse betingelser har samme retentionsvolumen som D 7 stigmasterol , faelles de som D 7 stigmasterol .

BILAG IX

OLIEINDHOLD I PRESSERESTER AF OLIVEN

Apparatur

- Egnet ekstraktionsapparat , forsynet med en 200-250 ml kolbe

- Elektrisk opvarmet bad ( sandbad , vandbad , osv . ) eller varmeplade

- Analysevaegt

- ovn , der er indstillet til hoejst 80 * C

- Elektrisk ovn med temperaturregulering , der kan indstilles til 103 * C mere eller mindre 2 * C , og som muliggoer luftindblaesning eller vakuum

- Mekanisk moelle , der er let at rengoere , egnet til olivenoliekager , og som er i stand til at male uden opvarmning eller maerkbar reduktion af indholdet af vand , af flygtige stoffer og af stoffer , der kan uddrages ved hjaelp af hexan

- Ekstraktionshylster og vat eller filterpapir , fri for substanser , der kan uddrages ved hjaelp af hexan

- Ekssikkator

- Sigte med huller paa 1 mm i diameter

- Pimpsten i smaa korn , toerret .

Reagens

Teknisk n-hexan , hvis fordampningsrest ved fuldstaendig fordampning er mindre end 0,002 g/100 ml .

FREMGANGSMAADE

Tilberedning af proeven

Om noedvendigt males analyseproeven i den mekaniske moelle , der skal vaere omhyggeligt rengjort paa forhaand , saaledes at proeven kan reduceres til smaa partikler , der kan passere sien fuldstaendigt .

Ca . en tyvendedel af proeven anvendes til en fuldstaendig rengoering af moellen ; denne formalede del bortkastes , og resten males , opsamles og blandes med omhu , hvorefter analysen straks foretages .

Proevemaengde

Der afvejes med 0,01 g noejagtighed ca . 10 g af analyseproeven til proevemaengde , naar formalingen er afsluttet .

Tilberedning af ekstraktionshylstret

Proevemaengden anbringes i hylstret , og dette lukkes med vandsugende vat . Saafremt der anvendes filterpapir , indpakkes proeven i dette papir .

Fortoerring

Hvis presseresterne er meget fugtige ( indhold af vand og flygtige stoffer paa over 10 % ) , foretages der en fortoerring , idet det fyldte hylster ( eller filterpapir ) anbringes en passende tid i ovnen , der hoejst kan opvarmes til 80 * C , saaledes at indholdet af vand og flygtige stoffer bringes ned under 10 % .

Tilberedning af kolben

Kolben , der indeholder 1 à 2 pimpstenskorn , og som paa forhaand er toerret i ovnen ved en temperatur paa 103 * C mere eller mindre 2 * C og derefter afkoelet mindst 1 time i ekssikkatoren , vejes med 1 mg noejagtighed .

Foerste ekstraktion

Hylstret ( eller filterpapiret ) , der indeholder proevemaengden , anbringes i ekstraktionsapparatet . Den noedvendige maengde hexan haeldes i kolben . Kolben tilsluttes ekstraktionsapparatet , og det hele anbringes i det elektrisk opvarmede bad . Opvarmningen reguleres saaledes , at tilbageloebsmaengden udgoer mindst 3 draaber i sekundet ( moderat , ikke staerk kogning ) .

Efter 4 timers ekstraktion foretages afkoeling . Hylstret udtages af ekstraktionsapparatet og anbringes i en luftstroem for at fjerne stoerstedelen af det indeholdte oploesningsmiddel .

Anden ekstraktion

Hylstret toemmes i mikromoellen , og der males saa fint som muligt .

Anbring maengdemaessigt blandingen paa ny i hylstret og dette i ekstraktionsapparatet .

Ekstraktionen begyndes paa ny , og den fortsaettes endnu to timer , idet kolben med forrige ekstraktion anvendes .

Den oploesning , der opnaas i ekstraktionskolben , skal vaere gennemsigtig . Saafremt dette ikke er tilfaeldet , filtreres der paa et stykke filterpapir , idet den foerste kolbe og filterpapiret gentagne gange vaskes me * hexan . Filtratet og afvaskningsoploesningen opsamles i en saerskilt kolbe , der paa forhaand er toerret og vejet med 1 mg noejagtighed .

Eliminering af oploesning og vejning af ekstraktet

Stoerstedelen af oploesningsmidlet fjernes ved destillation i elektrisk opvarmet vandbad . De sidste rester af oploesningsmidlet fjernes ved at opvanne kolben i ovnen ved 103 * C mere eller mindre 2 * C i 20 minutter . Fordampningen fremskyndes enten ved indblaesning af luft eller , bedre , inaktiv gas fra tid til anden eller ved anvendelse af vakuum .

Kolben afkoeles i ekssikkatoren i mindst 1 time , og den vejes med 1 mg noejagtighed .

Der opvarmes paa ny i 10 min . under samme forhold , hvorefter kolberne afkoeles i ekssikkator og vejes .

Forskellen mellem to vejninger maa ikke overstige 10 mg . 1 modsat fald opvarmes der paa ny i perioder paa ti minutter med efterfoelgende afkoeling og vejning , indtil forskellen i masse er hoejst 10 mg . Den sidste vejning af kolben noteres .

Der foretages to bestemmelser af den samme proevemaengde .

UDFORMNING AF RESULTATER

Beregning og formler

Ekstraktet udtrykt i masseprocent af produktet som leveret er

a ) lig med :

S = m1 gange 100/m0

idet S = masseprocent af produktet som leveret

m0 = massen i gram af den udtagne proevemaengde

m1 = massen i gram af ekstraktet efter toerring

Som resultat tages det aritmetiske gennemsnit af de to bestemmelser , saafremt ingen gentagelse af bestemmelsen er noedvendig

Resultatet udtrykkes med en decimal .

b ) Ekstraktet kan udtrykkes i relation til toerstoffet ved anvendelse af foelgende formel :

S gange 100/100 - U = ekstrakt i % fedtstof/toerstof

idet S = masseprocent for ekstraktet af produktet som leveret ( jf . a ) )

U = indhold af vand og flygtige stoffer .

Reproducerbarhed

Forskellen mellem resultaterne af de to samtidigt eller umiddelbart efter hinanden af samme analytiker foretagne bestemmelser , maa ikke overstige 0,2 g ekstrakt ved hexan for 100 g proeve .

I modsat fald gentages analysen paa to andre proevemaengder . Hvis forskellen ogsaa denne gang overstiger 0,2 g , tages som resultat det aritmetiske gennemsnit af de fire bestemmelser .