KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) Nr. 1081/96 af 14. juni 1996 om en referencemetode til påvisning af komælk og -kaseinat i ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk og om ophævelse af forordning (EØF) nr. 690/92

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets forordning (EØF) nr. 804/68 af 27. juni 1968 om den fælles markedsordning for mælk og mejeriprodukter (1), senest ændret ved Kommissionens forordning (EF) nr. 2931/95 (2), særlig artikel 9, stk. 3, artikel 16, stk. 1 og 4, og artikel 17, stk. 14, og

ud fra følgende betragtninger:

Der kan ydes støtte til privat oplagring af ost fremstillet af fåremælk i henhold til Rådets forordning (EØF) nr. 508/71 af 8. marts 1971 om fastsættelse af almindelige regler om ydelse af støtte til privat oplagring af ostesorter, der er egnede til lagring (3); der kan træffes beslutning om en særlig restitution for de samme produkter efter artikel 17 i forordning (EØF) nr. 804/68; indførsel af ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk til EF fra bestemte tredjelande efter præferenceordninger er forudset;

da ovennævnte bestemmelser er fastsat vedrørende ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk, må det ved passende kontrol kunne efterprøves, at det pågældende produkt ikke er blevet iblandet komælk; der bør fastsættes en EF-referencemetode til påvisning af komælk, uden at dette berører benyttelsen af rutinemetoder, hvis disse opfylder bestemte kriterier;

en referencemetode, der anvendes på ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk, afløser den referencemetode, der er beskrevet i Kommissionens forordning (EØF) nr. 690/92 (4), som derfor kan ophæves;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomitéen for Mælk og Mejeriprodukter -

UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:

Artikel 1

Den i bilaget anførte referencemetode skal anvendes for at sikre, at ost, som udelukkende skal være fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk, ikke indeholder komælkskasein.

Komælkskasein anses for at være til stede, hvis det konstaterede indhold af komælkskasein i analyseprøven er lig med eller overstiger indholdet i den referenceprøve indeholdende 1 % komælk, som er beskrevet i bilaget.

Artikel 2

Der kan benyttes rutinemetoder til påvisning af komælkskasein i de i artikel 1 omhandlede oste på følgende betingelser:

- Påvisningsgrænsen skal være 0,5 % eller derunder.

- Der må ikke forekomme falskpositive resultater. Hvis dette ikke kan udelukkes, skal alle prøver, der giver positivt resultat, analyseres ved benyttelse af referencemetoden.

- Komælkskasein skal være påviseligt med den fornødne følsomhed selv efter lange modningsperioder, som det kan være tilfældet under almindelige handelsforhold. Hvis dette krav ikke er opfyldt for en bestemt type af de i artikel 1 omhandlede oste, skal den pågældende ost analyseres ved benyttelse af referencemetoden.

Artikel 3

Forordning (EØF) nr. 690/92 ophæves. Henvisninger til forordning (EØF) nr. 690/92 skal forstås som henvisninger til nærværende forordning.

Artikel 4

Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.

Den anvendes fra den 1. oktober 1996.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfærdiget i Bruxelles, den 14. juni 1996.

På Kommissionens vegne

Franz FISCHLER

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 148 af 28. 6. 1968, s. 13.

(2) EFT nr. L 307 af 20. 12. 1995, s. 10.

(3) EFT nr. L 58 af 11. 3. 1971, s. 1.

(4) EFT nr. L 74 af 20. 3. 1992, s. 23.

BILAG

REFERENCEMETODE TIL PÅVISNING AF KOMÆLK OG KASEINAT I OST FREMSTILLET AF FÅRE-, GEDE- ELLER BØFFELMÆLK ELLER AF BLANDINGER AF FÅRE-, GEDE- OG BØFFELMÆLK

1. Omfang

Påvisning af komælk og kaseinat i ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk ved isoelektrisk fokusering af ã-kaseiner efter plasminolyse.

2. Område

Metoden er egnet til følsom og specifik påvisning af rå og varmebehandlet komælk og kaseinat i frisk og modnet ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk. Den er ikke egnet til påvisning af, om mælk og ost er forfalsket med varmebehandlede kovalleproteinkoncentrater.

3. Princip

3.1. Isolering af kaseiner fra ost og referenceopløsninger

3.2. Opløsning af isolerede kaseiner, som derefter underkastes plasminspaltning (E.C.3.4.21.7).

3.3. Isoelektrisk fokusering af de plasminbehandlede kaseiner i tilstedeværelse af urea og farvning af proteinerne.

3.4. Vurdering af de farvede ã3- og ã2-kaseinmønstre (tegn på komælk) ved sammenligning af mønstret fra prøven med dem, der fremkom i samme gel fra referenceopløsninger med 0 % og 1 % komælk.

4. Reagenser

Medmindre andet er angivet, skal der anvendes kemikalier af analysekvalitet. Vandet skal være dobbeltdestilleret eller af tilsvarende renhed.

NB: Nedenstående detaljer gælder for laboratoriefremstillede polyacrylamidgeler, der indeholder urea, af størrelsen 265 × 125 × 0,25 mm. Hvis der bruges gel af en anden størrelse eller type, skal separationsbetingelserne måske justeres.

Isoelektrisk fokusering

4.1. Reagenser til fremstilling af polyacrylamider, der indeholder urea

4.1.1. Stamopløsning

4,85 g acrylamid

0,15g N,N'-metylen-bis-acrylamid (BIS)

48,05 g urea

15,00 g glycerol (87 % w/w)

opløses i vand, og der fyldes op til 100 ml. Opbevares i brun flaske i køleskab.

NB: En forblandet acrylamid/BIS-opløsning, der fås i handelen, kan anvendes frem for de angivne vægte af neurotoksiske acrylamider. Hvis en sådan opløsning indeholder 30 % w/v acrylamid og 0,8 % w/v BIS, skal der bruges et volumen på 16,2 ml i formuleringen i stedet for de angivne vægte. Stamopløsningens holdbarhed er højst 10 døgn. Hvis dens ledningsevne er over 5 ìS, afioniseres den ved omrøring med 2 g Amberlite MB-3 i 30 minutter og filtreres derefter gennem en 0,45 ìm membran.

4.1.2. Gelopløsning

Der laves en gelopløsning ved blanding af additiver og amfolytter med stamopløsningen (4.1.1).

9,0 ml stamopløsning

24 mg â-alanin

500 ìl amfolyt pH 3,5-9,5 (1)

250 ìl amfolyt pH 5-7 (2)

250 ìl amfolyt pH 6-8 (3).

Gelopløsningen blandes og afgasses i 2-3 minutter i et ultralydbad eller i vakuum.

NB: Gelopløsningen laves straks før ophældningen (6.2).

4.1.3. Katalysatoropløsninger

4.1.3.1. N,N,N'N'-tetrametylendiamin (TEMED)

4.1.3.2. 40 % w/v ammoniumpersulfat (PER)

800 mg PER opløses i vand, og der fyldes op til 2 ml.

NB: Der skal altid bruges frisklavet PER-opløsning.

4.2. Kontaktvæske

Petroleum eller flydende paraffin

4.3. Anodeopløsning

5,77 g fosforsyre (85 % w/w) opløses i vand og fortyndes til 100 ml med vand.

4.4. Katodeopløsning

2,00 natriumhydroxid opløses i vand og fortyndes til 100 ml med vand.

Tilberedelse af prøven

4.5. Reagenser til proteinisolering

4.5.1. Fortyndet eddikesyre (25,0 ml iseddike fortyndet til 100 ml ved vand).

4.5.2. Diklormetan

4.5.3. Acetone

4.6. Proteinopløsende buffer

Stamopløsning

5,75 g glycerol (87 % w/w)

24,03 g urea

250 mg ditiotreitol

opløses i vand, og der fyldes op til 50 ml.

NB: Opbevares i køleskab - holdbarhed 1 uge.

4.7. Reagenser til plasminspaltning af kaseiner

4.7.1. Ammoniumkarbonatbuffer

En 0,2 mol/l ammoniumhydrogenkarbonatopløsning (1,58 g/100 ml vand) med 0,05 mol/l etylenediamintetra-eddikesyre (EDTA, 1,46 g/100 ml) titreres med en 0,2 mol ammoniumkarbonatopløsning (1,92 g/100 ml vand) med 0,05 mol/l EDTA til pH 8.

4.7.2. Bovin plasmin (E.C. 3.4.21.7), aktivitet mindst 5 U/ml

4.7.3. å-aminokapronsyre til enzymhæmning

2,624 g å-aminokapronsyre (6-amino-n-heksanonsyre) opløses i 100 ml 40 % (v/v) etanol.

4.8. Standardopløsninger

4.8.1. Godkendte referenceopløsninger af en blanding af løbebehandlet skummet fåre- og gedemælk indeholdende 0 % og 1 % komælk kan fås hos Kommissionen, Instituttet for Referencemålinger og -Materialer, B-2440 Geel, Belgien.

4.8.2. Fremstilling af midlertidige laboratoriestandardopløsninger af løbebehandlet bøffelmælk indeholdende 0 % og 1 % komælk.

Skummetmælken fremstilles ved centrifugering af bøffelmælk eller rå tankkomælk ved 37 °C ved 2 500 g i 20 minutter. Efter hurtig afkøling af glas og indhold til 6-8 °C fjernes det øverste fedtlag fuldstændigt. Til fremstilling af 1 %-standardopløsningen tilsættes 5,00 ml skummet komælk til 495 ml skummet bøffelmælk i et 1 l bæger. pH-værdien justeres til 6,4 ved tilsætning af fortyndet mælkesyre (10 % w/v). Temperaturen justeres til 35 °C, og 100 ìl kalveløbe tilsættes (løbeaktivitet: 1: 10 000, ca. 3 000 U/ml). Der omrøres i et minut, hvorefter opløsningen henstår tildækket med alufolie ved 35 °C i en time, så ostemassen kan dannes. Når ostemassen er dannet, frysetørres al den løbebehandlede sødmælk uden forudgående homogenisering eller afdræning af vallen. Efter frysetørringen formales produktet, så der fremkommer et homogent pulver. Til fremstilling af 0 %-standardopløsningen følges samme metode med brug af skummet bøffelmælk. Standardopløsningerne skal opbevares ved - 20 °C.

NB: Det kan tilrådes at kontrollere bøffelmælkens renhed ved isoelektrisk fokusering af de plasminbehandlede kaseinater, inden standardopløsningerne fremstilles.

Reagenser til proteinfarvning

4.9. Fikservæske

150 g trikloreddikesyre opløses i vand, og der fyldes op til 1 000 ml.

4.10. Affarvningsopløsning

500 ml metanol og 200 ml iseddike fortyndes til 2 000 ml med destilleret vand.

NB: Affarvningsopløsningen frisklaves hver dag. Den kan fremstilles ved at blande lige store mængder stamopløsninger af 50 % (v/v) metanol og 20 % iseddike.

4.11. Farvningsopløsninger

4.11.1. Farvningsopløsning (stamopløsning 1)

3,0 g Coomassie Brilliant Blue G 250 (C.I. 42655) opløses i 1 000 ml 90 % (v/v) metanol ved hjælp af en magnetisk omrører (ca. 45 minutter) og filtreres gennem to middelhastigheds-foldefiltre.

4.11.2. Farvningsopløsning (stamopløsning 2)

5,0 g kobbersulfatpenhydrat opløses i 1 000 ml 20 % (v/v) eddikesyre.

4.11.3. Farvningsopløsning (arbejdsopløsning)

125 ml af hver af stamopløsningerne (4.11.1, 4.11.2) sammenblandes umiddelbart før farvningen.

NB: Farvningsopløsningen bør laves samme dag, den skal bruges.

5. Apparatur

5.1. Glasplader (265 × 125 × 4 mm), gummirulle (bredde 15 cm) og vandret flade

5.2. Gelbærefolie (265 × 125 mm)

5.3. Dækfolie (280 × 125 mm). Der anbringes en strimmel klæbebånd (280 × 6 × 0,25 mm) på hver langside (jf. figur 1)

5.4. Elektrofokuseringskammer med køleplade (f.eks. 265 × 125 mm) og egnet spændingskilde (≥ 2,5 kV) eller automatisk elektroforeseapparat

5.5. Cirkulationskryostat, termostatstyret ved 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrifuge, justerbar til 3 000 g

5.7. Elektrodestrimler (længde ≥ 265 mm)

5.8. Plastdråbetæller til anode- og katodeopløsninger

5.9. Analyseprøveapplikatorer (10 × 5 mm, viskose- eller lavproteinabsorberingsfilterpapir)

5.10. Saks, skalpel og pincetter af rustfrit stål

5.11. Farvnings- og affarvningsskåle (f.eks. 280 × 150 mm instrumentbakker) af rustfrit stål eller glas

5.12. Justerbar homogenisator med stang (10 mm diameter), skala 8 000-20 000 rpm

5.13. Magnetisk omrører

5.14. Ultralydbad

5.15. Filmsvejser

5.16. 5-25 ìl mikropipetter

5.17. Vakuumkoncentrator eller frysetørrer

5.18. Termostatstyret vandbad, der kan indstilles til 35 og 40 ± 1 °C, med rysteaggregat

5.19. Densitometerudstyr med aflæsning ved ë = 634 nm

6. Metodik

6.1. Tilberedelse af prøven

6.1.1. Isolering af kaseiner

En mængde svarende til 5 g tør ostemasse eller standardopløsninger afvejes i et 100 ml centrifugeglas. Der tilsættes 60 ml destilleret vand og homogeniseres med en stanghomogenisator (8 000-10 000 rpm). pH-værdien justeres til 4,6 med fortyndet eddikesyre (4.5.1), og der centrifugeres (5 minutter - 3 000 g). Fedtet og vallen afhældes, restindholdet homogeniseres i 40 ml destilleret vand (pH-værdien justeret til 4-5 med fortyndet eddikesyre (4.5.1)) ved 20 000 rpm. Der tilsættes 20 ml diklormetan (4.5.2), homogeniseres igen og centrifugeres (5 minutter - 3 000 g). Kaseinlaget, der flyder mellem den vandige og den organiske fase (jf. figur 2), fjernes med en spatel, og begge faser afhældes. Kaseinet homogeniseres igen i 40 ml destilleret vand (som ovenfor) og 20 ml diklormetan, og der centrifugeres. Dette gentages, indtil begge ekstraktionsfaser er farveløse (2-3 gange). Proteinresterne homogeniseres med 50 ml acetone (4.5.3) og filtreres gennem et middelhastigheds-foldefilterpapir. Resterne vaskes på filtret med to særskilte portioner acetone på hver 25 ml og henstår til tørring i luft eller en kvælstofstrøm, hvorefter de finknuses i en morter.

NB: Tørre kaseinisolater bør opbevares ved -20 °C.

6.1.2. Plasminspaltning af â-kaseiner for at intensivere ã-kaseiner

25 mg isoleret kasein (6.1.1) opslæmmes i 0,5 ml ammoniumkarbonatbuffer (4.7.1) og homogeniseres i 20 minutter, f.eks. ved ultralydbehandling. Der opvarmes til 40 °C og tilsættes 10 ìl plasmin (4.7.2), blandes og inkuberes i en time ved 40 °C under stadig omrystning. Til hæmning af enzymer tilsættes 20 ìl å-aminokapronsyre (4.7.3) og derefter yderligere 200 mg fast urea og 2 mg ditiotreitol.

NB: For at få større symmetri i de fokuserede kaseinbånd kan det tilrådes at frysetørre opløsningen efter tilsætningen af å-aminokapronsyre og derefter opløse resterne i 0,5 ml ureabuffer (4.6).

6.2. Tilberedelse af polyacrylamidgeler, der indeholder urea

Gelbærefolien (5.2) rulles med et par dråber vand ud på en glasplade (5.1), og eventuelt overskydende vand fjernes med papirhåndklæde- eller serviet. Dækfolien (5.3) udrulles med afstandsstykker (0,25 mm) på en anden glasplade på samme måde. Pladen anbringes plant på en vandret flade.

10 ìl TEMED (4.1.3.1) tilsættes til den tilberedte, afgassede gelopløsning (4.1.2), og efter omrystning 10 ìl PER-opløsning (4.1.3.2). Opløsningen blandes grundigt og hældes straks derefter jævnt ud på midten af dækfolien. Den ene side af gelbærefolien (med bæresiden nedad) anbringes på dækfoliepladen og sænkes langsomt, således at der danner sig en gelfilm mellem folierne, som spreder sig regelmæssigt uden bobledannelse (jf. figur 3). Gelbærepladen sænkes forsigtigt helt ned ved hjælp af en tynd spatel, og der lægges endnu tre plader oven på den, der skal tjene som vægte. Når polymiseringen er fuldstændig (ca. 60 minutter), overføres den polymeriserede gel på gelbærefolien sammen med dækfolien, ved at glaspladerne vippes. Bærefoliens bagside rengøres omhyggeligt for at fjerne gelrester og urea. Gelsandwichen svejses til et filmglas og opbevares i køleskab (højst 6 uger).

NB: Dækfolien med afstandsstykkerne kan genbruges. Polyacrylamiden kan skæres i mindre størrelser, hvad der kan anbefales, når der kun er få prøver, eller hvis der anvendes et automatisk elektroforeseapparat (2 geler - størrelse 4,5 × 5 cm).

6.3. Isoelektrisk fokusering

Køletermostaten indstilles til 12 °C. Gelbærefoliens bagside aftørres med petroleum, hvorefter et par dråber petroleum (4.2) dryppes på midten af køleblokken. Derpå rulles gelsandwichen (med bæresiden nedad) ud på den, men det skal undgås, at der danner sig bobler. Eventuel overskydende petroleum tørres af, og dækfolien fjernes. Elektrodestrimlerne gennemvædes med elektrodeopløsningerne (4.3 og 4.4), tilskæres i gelens længde og anbringes de givne steder (elektrodeafstand 9,5 cm).

Fokuseringen foretages på nedenstående betingelser:

6.3.1. Gelstørrelse 265 × 125 × 0,25 mm

>TABELPOSITION>

NB: Hvis gelens tykkelse eller bredde ændres, skal strøm og kraft justeres herefter (f.eks. fordobles elstrøm og kraft, hvis der benyttes en 265 × 125 × 0,5 mm gel).

6.3.2. Eksempel på et spændingsprogram for et automatisk elektroforeseapparat (2 geler på 5,0 × 4,5 cm); elektroder anbringes uden strimler direkte på gelen:

>TABELPOSITION>

Prøveapplikatoren anbringes på andet trin ved 0000 Vh.

Prøveapplikatoren fjernes på andet trin ved 0030 Vh.

6.4. Proteinfarvning

6.4.1. Proteinfiksering

Elektrodestrimlerne aftages, så snart der er slukket for strømmen, og gelen kommes straks i en farvnings- eller affarvningsskål fyldt med 200 ml fikservæske (4.9). Den henstår i 15 minutter, men omrystes af og til.

6.4.2. Vask og farvning af gelpladen

Fikservæsken drænes grundigt, og gelpladen vaskes i 30 sekunder to gange med 100 ml affarvningsopløsning (4.10). Affarvningsopløsningen afhældes, og skålen fyldes med 250 ml farvningsopløsning (4.11.3). Man lader farven udvikle sig i 45 minutter under forsigtig omrystning.

6.4.3. Affarvning af gelpladen

Farvningsopløsningen afhældes, og gelpladen vaskes med 100 ml affarvningsopløsning (4.10) to gange, hvorefter der omrystes med 200 ml affarvningsopløsning i 15 minutter. Affarvningstrinnet gentages mindst 2-3 gange, indtil baggrunden er klar og ufarvet. Derefter skylles gelpladen med destilleret vand (to gange 2 minutter) og tørres i luft (2-3 timer) eller med en hårtørrer (10-15 minutter).

NB 1: Fiksering, vask, farvning og affarvning foretages ved 20 °C. Der må ikke benyttes højere temperaturer.

NB 2: Hvis man foretrækker mere følsom sølvfarvning (f.eks. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17-1150-01), skal plasminbehandlede kaseinprøver fortyndes til 5 mg/ml.

7. Vurdering

Vurderingen foretages ved sammenligning af proteinmønstrene i den ukendte prøve med referenceprøver på samme gel. Påvisning af komælk i ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk sker via de ã3- og ã2-kaseiner, hvis isoelektriske punkter ligger mellem pH 6,5 og pH 7,5 (jf. figur 4a, 4b og 5). Påvisningsgrænsen er under 0,5.

7.1. Visuel vurdering

Med henblik på visuel vurdering af indholdet af komælk kan det tilrådes at justere koncentrationerne af prøve- og standardkoncentrationerne, så der fremkommer samme intensitet af ovine, caprine og/eller bøffel-ã2- og ã3-kaseiner (jf. »ã2 E, G B« og »ã3 E, G, B« i figur 4a, 4b og 5). Derefter kan indholdet af komælk (mindre end, lig med eller højere end 1 %) i den ukendte prøve bedømmes direkte ved at sammenligne med intensiteten af de bovine ã3- og ã2-kaseiner (jf. »ã3 C« og »ã2 C« i figur 4a, 4b og 5) med 0 %- og 1 %-standardopløsningen (får, ged) eller midlertidige laboratoriestandardopløsninger (bøffel) analyseret på samme gel.

7.2. Densitometrisk vurdering

Om muligt benyttes densitometri (5.19) til bestemmelse af forholdet mellem toparealerne for bovine, ovine, caprine og/eller bøffel-ã2- og ã3-kaseiner (jf. figur 5). Denne værdi sammenlignes med forholdet mellem toparealerne for ã2- og ã3-kaseiner i 1 %-standardopløsningen (får, ged) eller midlertidige laboratoriestandardopløsninger (bøffel) analyseret på samme gel.

NB: Metoden fungerer tilfredsstillende, hvis der er et klart, positivt tegn på bovine ã2- og ã3-kaseiner i 1 %-standardopløsningen, men ikke i 0 %-standardopløsningen. Hvis det ikke er tilfældet, forbedres metoden ved, at den følges ganske nøje i alle detaljer.

En prøve betragtes som positiv, hvis de bovine ã2- og ã3-kaseiner eller de tilsvarende toparealforhold er lig med eller højere end niveauet for 1 %-standardopløsningen.

8. Litteraturhenvisninger

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of ã2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilised pH gradient - isoelectric focusing of ã-caseins using plasmin as signal amplifier. I: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.), pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 ìm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

>REFERENCE TIL EN FILM>

Figur 1: Skematisk tegning af dækfolie

>REFERENCE TIL EN FILM>

Figur 2: Kaseinlaget, der flyder mellem den vandige og den organiske fase efter centrifugering

H2O-fase; Kasein; CH2Cl2-fase

>REFERENCE TIL EN FILM>

Figur 3: Viftemetode til støbning af ultratynde polyakrylamidgeler.

a = afstandsbånd (0,25 mm); b = dækfolie (5.3); c og e = glasplader (5.1); d = gelopløsning (4.1.2); f = gelbærefolie (5.2)

>REFERENCE TIL EN FILM>

Figur 4a: Isoelektrisk fokusering af plasminbehandlede kaseinater fra ost fremstillet af fåre- eller gedemælk med forskellige mængder komælk.

% CM = procent komælk; C = ko; E = får; G = ged.

Den øverste halvdel af IEF-gelen ses.

>REFERENCE TIL EN FILM>

Figur 4b: Isoelektrisk fokusering af plasminbehandlede kaseinater fra ost fremstillet af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk med forskellige mængder komælk.

% CM = procent komælk; 1+ = prøve indeholdende 1 % komælk og tilsat rent bovint kasein midt på sporet. C = ko; E = får; G = ged; B = bøffel.

IEF-gelens totale separationsafstand ses.

>REFERENCE TIL EN FILM>

Figur 5: Overlejring af densitogrammer af standardopløsninger (STD) og osteprøver fra en blanding af fåre- og gedemælk efter isoelektrisk fokusering.

a og b = standardopløsninger med 0 % og 1 % komælk; c til g = osteprøver med 0, 1, 2, 3 og 7 % komælk; C = ko; E = får; G = ged.

Den øverste halvdel af IEF-gelen er scannet ved ë = 634 nm.

(1) Produkterne Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) og Resolyte® pH 5-7 og pH 6-8 (BDH, Merck) har vist sig særligt velegnede til at opnå den ønskede separation af ã-kaseiner.