KOMMISSIONENS DIREKTIV 92/95/EOEF af 9. november 1992 om aendring af bilaget til syvende direktiv 76/372/EOEF om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til Raadets direktiv 70/373/EOEF af 20. juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder for saa vidt angaar den officielle kontrol med foderstoffer (1), senest aendret ved akten vedroerende Spaniens og Portugals tiltraedelse, saerlig artikel 2, og

ud fra foelgende betragtninger:

Kommissionens syvende direktiv 76/372/EOEF af 1. marts 1976 om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer (2), aendret ved direktiv 81/680/EOEF (3), foreskriver de metoder, der skal benyttes for indholdet af aflatoksin B1;

metoderne boer tilpasses til udviklingen i den videnskabelige og tekniske viden; der boer navnlig findes en metode, hvorved der kan kontrolleres meget lave indhold af aflatoksin som fastsat i Raadets direktiv 74/63/EOEF af 17. december 1973 om fastsaettelse af stoersteindhold for uoenskede stoffer og produkter i foderstoffer (4), senest aendret ved direktiv 91/132/EOEF (5);

der boer desuden findes en metode, hvorved aflatoksin B1 kan kontrolleres, naar der er stoffer til stede, som generer bestemmelser, f.eks. citruskvas;

de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Staaende Foderstofkomité -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV:

Artikel 1

Bilaget til direktiv 76/372/EOEF aendres som angivet i bilaget til naervaerende direktiv.

Artikel 2

Medlemsstaterne saetter de noedvendige love og administrative bestemmelser i kraft for at efterkomme dette direktiv senest den 1. oktober 1993. De underretter straks Kommissionen herom.

Naar medlemsstaterne vedtager disse bestemmelser, henvises der deri til dette direktiv, eller de ledsages ved offentliggoerelsen af en saadan henvisning. De naermere regler for denne henvisning fastsaettes af medlemsstaterne.

Artikel 3

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne. Udfaerdiget i Bruxelles, den 9. november 1992. Paa Kommissionens vegne

Ray MAC SHARRY

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 170 af 3. 8. 1970, s. 2. (2) EFT nr. L 102 af 15. 4. 1976, s. 8. (3) EFT nr. L 246 af 29. 8. 1981, s. 32. (4) EFT nr. L 38 af 11. 2. 1974, s. 31. (5) EFT nr. L 66 af 13. 3. 1991, s. 16.

BILAG

I. I afsnit A »Fremgangsmaade ved endimensional tyndtlagskromatografi« affattes punkt 1 »Formaal og anvendelsesomraade« saaledes:

»1. Formaal og anvendelsesomraade

Metoden goer det muligt at bestemme indholdet af aflatoksin B1 i raavarer og ublandede foderstoffer. Denne metode kan ikke anvendes ved tilstedevaerelse af citruskvas. Den mindste maengde, der kan bestemmes, er 0,01 mg/kg (10 ppb).

Ved tilstedevaerelse af interfererende stoffer, som generer bestemmelserne, maa analysen gentages efter metode B (hoejtryksvaeskekromatografi).«

II. I afsnit B »Todimensional tyndtlagskromatografi« erstattes teksten af foelgende:

»B. BESTEMMELSE AF AFLATOKSIN B1. HPLC-METODE

1. Formaal og anvendelsesomraade I dette forslag beskrives en metode til bestemmelse af aflatoksin B1 i foderstoffer (ogsaa med indhold af citruskvas). Den mindste maengde, der kan bestemmes er 0,001 mg/kg (1 ppb). 2. Princip Metoden er baseret paa separation ved hoejtryksvaeskekromatografi (HPLC) med fluoressenspaavisning. Proeven ekstraheres med kloroform. Ekstraktet filtreres, og en aliquot del renses over en Florisilkolonne og derefter over en C18-kolonne. Den endelige separation og bestemmelse foretages paa en omvendt-fase-C18 HPLC-soejle efterfulgt af post column derivatisering med jod i vand samt fluoressensmaaling. Bemaerk: Mykotoksiner er meget giftige stoffer. Arbejdet skal udfoeres i stinkskab. Speciel forsigtighed skal udvises naar toksinerne er i toer form paa grund af deres tendens til at spredes elektrostatisk paa arbejdspladsen. 3. Reagenser 3.1. Kloroform, stabiliseret med 0,5-1.0 % (w/w) ethanol. Se bemaerkning 10.2. 3.2. Methanol, HPLC-kvalitet til fremstilling af 3.6. 3.3. Acetone. 3.4. Acetonitril, HPLC-kvalitet. 3.5. Elueringsmidler: tilbered et doegn foer brug eller fjern luften i oploesningen ved hjaelp af ultralyd. 3.5.1. Blanding af acetone (3.3) og vand (98+2) (v+v). 3.5.2. Blanding af vand og methanol (3.2) (80+20) (v+v). 3.5.3. Blanding af vand og acetone (3.3) (85+15) (v+v). 3.6. Mobile fase til HPLC. Blanding af vand, methanol (3.2) og acetonitril (3.4) (130+70+40) (v+v+v). NB: Det kan vaere noedvendigt at aendre blandingsforholdet for vaeskerne til den mobile fase afhaengig af den benyttede HPLC-soejle. 3.7. Maettet jodoploesning i vand. Tilsaet 2 g jod til 400 ml vand. Bland i mindst 90 minutter og filtrer gennem et membranfilter (4.15). Den maettede oploesning beskyttes mod lys for at undgaa fotokemisk nedbrydning. 3.8. Syrevasket celite 545 eller tilsvarende materiale. 3.9. Florisil-kolonne (Waters SEP-PAK) eller tilsvarende materiale. 3.10. C18-kolonne (Waters SEP-PAK) eller tilsvarende materiale. 3.11. Inaktiv luft, f.eks. kvaelstof, kloroform. 3.12. Aflatoksin B1-standardoploesning, koncentration 10 mg/ml. Koncentrationen kontrolleres som foelger: ovennaevnte oploesnings absorptionsspektrum bestemmes mellem 330 og 370 nm ved hjaelp af spektrofotometret (4.23). Absorbansen (A) maales ved 363 nm. Koncentrationen af aflatoksin B1 beregnes 1 mg pr. ml oploesning efter formlen: Koncentration (mg/ml) = 312 × A × 1000

22 300 = 13,991 × A 3.12.1. Aflatoksin B1 stamoploesning i kloroform. Overfoer 2,5 ml af aflatoksin B1 standardoploesningen (3.12) kvantitativt til en 50 ml maalekolbe og fyld op til maerket med kloroform. Denne stamoploesning (0,5 mg/ml) opbevares koeligt 40 °C) i moerke, taet tillukket og omviklet med aluminiumsfolie. 3.13. Aflatoksin B1-kalibreringsoploesninger til HPLC. NB: Der benyttes syrevaskede glasvarer til fremstillingen af disse oploesninger (jf. 4 - apparatur). 3.13.1. Kalibreringsoploesning 4 ng/ml. Maalekolben i alufolien med stamoploesningen (3.12.1) henstaar til opvarmning til stuetemperatur (nogle faa timer). Overfoer 400 ml stamoploesning til en 50 ml maalekolbe og inddamp til toerhed i en stroem af inaktiv luft (3.11). Oploes resten i ca. 20 ml vand/acetoneblanding (3.5.3); fyld op til maerket med vand/acetoneblanding (3.5.3) og bland godt. 3.13.2. Kalibreringsoploesning 3 ng/ml. Fortynd 7,5 ml af kalibreringsoploesningen 4 ng/ml (3.13.1) til 10 ml med vand/acetoneblanding (3.5.3) og bland godt. 3.13.3. Kalibreringsoploesning 2 ng/ml. Fortynd 25 ml af kalibreringsoploesningen 4 ng/ml (3.13.1) til 50 ml med vand/acetoneblanding (3.5.3) og bland godt. Denne oploesning benyttes ogsaa til gentagen injektion ved HPLC-bestemmelsen og er i det foelgende benaevnt referenceoploesninger. 3.13.4. Kalibreringsoploesning 1 ng/ml. Fortynd 2,5 ml af kalibreringsoploesningen 4 ng/ml (3.12.1) til 10 ml med vand/acetoneblanding (3.4.3) og blandt godt. 3.14. Ampul med en blanding af aflatoksin B1, B2, G1 i G2 koncentrationer paa henholdsvis ca. 1, 0,5, 1 en 0,5 mg/ml i 1 ml kloroform. 3.14.1. Testoploesning til HPLC. Overfoer ampullens indhold (3.14) til et reagensglas med slib og glasprop eller et glas med skruelaag. Overfoer 40 ml af denne oploesning til et reagensglas med slib og glasprop (syrevasket) (4.22). Inddamp kloroformen med inaktiv luft og oploes i 10 ml vand/acetoneblanding (3.5.3). 3.15. Reagenser til verificering (6). 3.15.1. Maettet NaCl-oploesning i vand. 3.15.2. Natriumsulfat, vandfri, granuleret. 4. Apparatur Advarsel: Anvendelse af glasvarer, der ikke er vasket med syre, til vandige aflatoksinoploesninger kan foraarsage tab af aflatoksin. Der maa udvises saerlig omhu med nye glasvarer og engangsglasvarer saasom glas til autosampler og Pasteur-pipetter. Laboratorieglasvarer, der kommer i kontakt med vandige oploesninger af aflatoksin, boer derfor henstaa i fortyndet syre (f.eks. svovlsyre, c = 2 mol/l) i flere timer og derefter grundigt skylles med destilleret vand, saa alle spor af syre fjernes (f. eks. tre gange; det kontrolleres med pH-papir). Denne behandling er i praksis noedvendig for rundbundede kolber (4.4), maalekolber, maalecylindre, flasker eller reagensglas, der bruges til kalibreringsoploesninger og slutekstrakter (isaer glas til autosampler) og Pasteur-pipetter, hvis de bruges til overfoersel af kalibreringsoploesninger eller ekstrakter. 4.1. Kvaern. 4.2. Sigte med maskevidde 1,0 mm (ISO R 565). 4.3. Mekanisk rysteapparat. 4.4. Vakuumrotationsfordamper med en 150 ml rundbundet kolbe (150-250 ml). 4.5. Hoejtryksvaeskekromatograf, injektor med loop til injektion af 250 ml. Se fabrikantes instruktion for delvis eller fuldstaendig loopfyldning. 4.6. HPLC-analysesoejle: 3 mm eller 5 mm C18-soejlemateriale. 4.7. Pulseringsfri pumpe til eftersoejle-jodreagens, f.eks. HPLC-pumpe eller en pumpe, der er specielt konstrueret til dette formaal. 4.8. Doedvolumenfrit T-stykke (Valco), af rustfrit staal (1/16" × 0,75 mm). 4.9. Spiralreaktionskolonne af teflon eller rustfrit staal. Dimensioner paa 3 000 × 0,5 mm til 5 000 × 0,5 mm er erfaringsvis velegnede i forbindelse med 5 mm eller 3 mm HPLC-soejler. 4.10. Termostatstyret vandbad indstillet paa 60 °C. Temperaturen skal kunne reguleres med under 0,1 °C noejagtighed. 4.11. Fluoressensdetektor med ca. 365 nm excitations boelgelaengde og ca. 435 nm emissionsboelgelaengde (for filterinstrument: emissionsboelgelaengde: > 400 nm). Paavisning af mindst 0,05 ng aflatoksin B1 skal vaere mulig. Undertiden kan et vist modtryk vaere oenskeligt (f.eks. restriktor eller spole af teflon eller rustfri staalkolonne forbundet med detektorens udgang) for at forhindre luftbobler i gennemloebskuvetten. 4.12. Skriver. 4.13. Integrator (eventuelt). 4.14. Foldefilter. Macherey-Nagel 617 1/4, diameter 24 cm eller tilsvarende filter. 4.15. Membranfilter med porestoerrelse paa 0,45 mm, Millipore HAWP 04700 eller lignende. 4.16. 500 ml konisk kolbe med slib og glasprop. 4.17. Glassoejle (indvendig diameter ca. 1,0 cm, laengde ca. 30 cm) med Luer-endestykke. 4.18. Kloroformresistent Luer-hane af nylon (f.eks. Bio-Rad 7328017, Analytichem A1 6078 eller J.T. Baker 4514 eller lignende). 4.19. Kemisk resistent sproejte, 10 ml Luer-forbindelse. 4.20. Sproejte til paasaetning af 250 ml (se 4.5). 4.21. 100 ml mikrosproejte (det kontrolleres ved vejning, af noejagtigheden er inden for 2 %). 4.22. 10 ml maalereagensglas med slib og glasprop. 4.23. Spektrofotometer til maaling i spektrets UV-omraade. 4.24. Udstyr til verificering (6). 4.24.1. Syrevasket 100 ml skilletragt med teflonhane. 4.24.2. Varmeblok 40-50 °C. 5. Fremgangsmaade 5.1. Fremstilling af proeven Proeven formales, saa den passerer fuldstaendigt gennem sigten (4.2). 5.2. Analyseproeven 50,0 g af den fremstillede proeve afvejes i kolben (4.16). 5.3. Ekstraktion Tilsaet 25 g Celite (3.8), 250 ml kloroform (3.1) og 25 ml vand til analyseproeven (5.2). Tilluk og ryst i 30 minutter paa et mekanisk rysteapparat (4.3). Filtrer gennem et foldefilter (4.14) og opsaml 50 ml af filtratet. Med hensyn til proever, der kraever fortynding, udtages en aliquot del af filtratet, der fortyndes til 50 ml med kloroform, saa koncentrationen af aflatoksin B1 ikke er stoerre end 4 ng/ml. 5.4. Oprensning Processen boer foretages uden naevnevaerdige afbrydelser. Bemaerk: - det laboratorium, hvor analysen foretages, skal vaere beskyttet mod dagslys; det kan ske ved:

(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29.

(2) ISO 3534-1977

(3) EFT nr. L L 351 af 2. 12. 1989, s. 39.

1) UV-absorberende folie paa vinduerne kombineret med daempet belysning (ikke direkte sollys!) 2) gardiner eller persienner i forbindelse med kunstigt belysning (lysstofroer kan benyttes) - aflatoksinholdige oploesninger skal i videst muligt omfang beskyttes mod lys (opbevaring i moerke og brug af alufolie). 5.4.1. Florisil SEP-PAK oprensning 5.4.1.1. Forberedelse af kombinationen soejle og kolonne Der anbringes en hane (4.18) paa den korte ende af Florisil-kolonnen (3.9) (se fig. 1). Vask kolonnen og fjern luften saaledes: 8 ml ud af 10 ml kloroform presses via hanen gennem kolonnen med en sproejte (4.19). Den lange ende af kolonnen forbindes med en glassoejle (4.17), og de resterende 2 ml kloroform presses gennem kolonnen op i soejlen. Hanen lukkes og sproejten fjernes. 5.4.1.2. Oprensning Det i 5.3 opsamlede filtrat paasaettes soejle/kolonnekombinationen ved hjaelp af tyngdekraften. Der skylles med 5 ml kloroform (3.1) og derefter med 20 ml methanol (3.2). Eluaterne kasseres. Det maa under dette arbejde sikres, at soejle/kolonnekombinationen ikke loeber toer. Eluer aflatoksin B1 med 40 ml af acetone/vandblandingen (3.5.1) og opsaml hele eluatet i den rundbundede (150 ml) kolbe til rotationsfordamperen (4.4). Eluatet koncentreres paa rotationsfordamperen ved 40-50 °C, indtil der ikke laengere destilleres acetone (NB: ca. 0,5 ml af vaesken er paa dette punkt tilbage i kolben. Forsoeg har vist, at videre fordampning ikke er skadelig, og at naar der er 0,5 ml vaeske tilbage, er der ingen signifikant acetonemaengde tilbage. Acetonerester kan medfoere tab af aflatoksin B1 paa C18-kolonne.) Der tilsaettes 1 ml methanol (3.2), og kolben skylles, saa aflatoksin B1 bliver oploest paa siderne, hvorefter der tilsaettes 4 ml H2O. Kolonnen aftages og kasseres. Glassoejlen skylles med vand og gemmes til C18-oprensningsprocessen. 5.4.2. C18-SEP-PAK oprensning 5.4.2.1. Forberedelse af kombinationen soejle og SEP-PAK kolonne Der anbringes en stophane (4.18) paa den korte end af C18-kolonnen (3.10) (se fig. 1). Skyl kolonnen og fjern luft saaledes: 10 ml methanol (3.2) presses hurtigt via hanen gennem kolonnen med en sproejte (4.19) (luftbobler i patronen er synlige som lyse pletter paa en ellers graalig baggrund). Fra sproejten med 10 ml vand presses 8 ml heraf via hanen op gennem kolonnen (luftindtraengning i kolonnen skal undgaas ved overgangen fra methanol til vand). Den lange ende af kolonnen forbindes med en glassoejle, og de resterende 2 ml vand presses op i soejlen gennem kolonnen. Hanen lukkes og sproejten fjernes. 5.4.2.2. Oprensning Det i 5.4.1.2 opsamlede ekstrakt overfoeres kvantitativt til soejlen (4.17) idet kolben skylles to gange med 5 ml vand/methanolblanding (3.5.2) og vaesken elueres ved hjaelp af tyngdekraften. Det maa under dette arbejde sikres, at soejle/kolonnekombinationen ikke loeber toer. (Hvis der opstaar luftbobler i forsnaevringen ved kolonnen, afbrydes elueringen, og der bankes let paa toppen af glassoejlen for at fjerne luftboblerne, hvorefter oprensningen fortsaettes.) Der elueres med 25 ml vand/methanolblanding. Eluaterne kasseres. Aflatoksin B1 elueres med 50 ml vand/acetoneblanding (3.5.3), og hele eluatet opsamles i en 50 ml maalekolbe. Der fyldes op med vand til 50 ml og blandes. Den herved opnaaede oploesning benyttes til kromatografi (5.5). Bemaerk: Det er normalt ikke noedvendigt at filtrere det endelige ekstrakt inden HPLC. Hvis det findes noevendigt, maa der ikke benyttes cellulosefiltre, da de kan medfoere tab af aflatoksin B1. Teflonfiltre kan bruges. 5.5. Hoejtryksvaeskekromatografi (HPLC) (Med hensyn til opstilling af udstyret henvises til fig. 2.) Der skal beregnes tilstraekkelig tid til, at instrumenterne bliver opvarmet og stabiliseret. Bem. 1: Flow-hastighederne for HPLC-vaeskerne og post column reagenser er kun vejledende. Det kan vaere noedvendigt at justere dem alt efter HPLC-soejlens type og stoerrelse. Bem. 2: Aflatoksins topareal er temperaturafhaengig, og der maa derfor korrigeres for afvigelser (se fig. 3). Ved injektion af en bestemt maengde aflatoksin B1-referenceoploesning (3.12.3) med regelmaessige intervaller (f.eks. ved hver tredje injektion) kan topvaerdierne for aflatoksin B1 mellem disse referenceoploesninger korrigeres ved hjaelp af middelvaerdien, forudsat at forskellen mellem reaktionerne mellem to paa hinanden foelgende injektioner er meget lille (< 10 %). Injektionerne skal derfor foretages kontinuerligt. Hvis en afbrydelse er noedvendig, er det den sidste injektion foer stoppet og den foerste injektion efter stoppet, der er referenceoploesning (3.13.3). Da kalibreringskurven er lineaer og passerer gennem nulpunktet, bestemmes aflatoksin B1-maengden i proeveekstrakterne direkte ved reference til de naermestliggende standardoploesninger. 5.5.1. Indstilling af HPLC-pumpe HPLC-pumpen (4.5) indstilles, saa den giver et flow paa 0,5 eller 0,3 ml/min. til henholdsvis en 5 mm eller en 3 mm HPLC-soejle (4.6); idet den mobile fase (3.6) benyttes. 5.5.2. Indstilling af post column pumpen Pumpen (4.7) indstilles til at give et flow paa 0,2-0,4 ml/min. af den jodmaettede vandoploesning (3.7). Som en grov retningslinje kan der tilraades flow paa ca. 0,4 eller 0,2 ml/min. i kombinationer med flow paa henholdsvis 0,5 og 0,3 ml/min. af den mobile fase (3.6). 5.5.3. Fluoressensdetektor Fluoressensdetektoren (4.11) indstilles til excitationsboelgelaengden 365 nm og emissionsboelgelaengden 435 nm (filterinstrument: > 400 nm). Attenueringen indstilles saaledes, at 1 ng aflatoksin B1 giver ca. 80 % af fuldt udslag paa skriveren. 5.5.4. Proevepaasaetter Der paasaettes maengder paa 250 ml af alle oploesninger. Foelg brugsanvisningen til injektoren. 5.5.5. Kontrol af den kromatografiske separation Der paasaettes en kromatografisk testoploesning (3.14.1). Dalene skal vaere mindre end 5 % af summen af tophoejderne i de naermestliggende topomraader. 5.5.6. Kontrol af apparaturets stabilitet Inden hver analyseraekke paasaettes referenceoploesningen (3.13.3) gentagne gange, indtil der er opnaaet stabile toparealer. (NB: arealerne af aflatoksin B1 toppene i paa hinanden foelgende injektioner boer ikke afvige indbyrdes med mere end 6 %.) Derefter fortsaettes straks med kontrol af lineariteten. 5.5.7. Kontrol af lineariteten

Der paasaettes aflatoksin B1-kalibreringsoploesninger (3.13.1 til 3.13.4). For hver tredje injektion anvendes referenceoploesningen (3.13.3) til korrektion af aendringer i reaktion (NB: Arealerne af toppene af referenceoploesning maa hoejst afvige med 10 % i loebet af 90 minutter). Der korrigeres for afvigelser efter formlen i punkt 7. Kalibreringskurven boer vaere lineaer og passere gennem nulpunktet med en afvigelse paa hoejst to gange standardafvigelse paa Y-vaerdien. De fundne vaerdier skal afvige med under 3 % fra de nominelle vaerdier. Hvis disse krav er opfyldt, fortsaettes der umiddelbart. I modsat fald identificeres og korrigeres fejlkilderne foerst. 5.5.8. Injektion af proeveekstrakter De oprensede proeveekstrakter (5.4.2.2) paasaettes. Hver gang der paasaettes to proeveekstrakter, paasaettes der referenceoploesning (3.12.3), dvs.: referenceoploesning, ekstrakt, ekstrakt, referenceoploesning, ekstrakt, ekstrakt, referenceoploesning osv. 6. Verificering og identitet 6.1. Behandling af ekstraktet (5.4.2.2) Der tilsaettes 5 ml NaCl-oploesning (3.15.1) til slutekstraktet fra 5.4.2.2. Der ekstraheres tre gange i 1 minut med 2 ml kloroform (3.1) med brug af skilletragten (4.24.1). Det opsamlede kloroformekstrakt haeldes igennem ca. 1 g natriumsulfat (3.15.2) over i et 10 ml reagensglas. Der kan bruges en lille tragt (diameter 4 cm) med lidt bomuld i forsnaevringen, der daekkes med ca. 1 g natriumsulfat (3.14.2). Natriumsulfatlaget vaskes med nogle faa ml kloroform og opsamles i reagensglasset. Kloroformekstraktet inddampes til toerhed i reagensglasset ved brug af varmeblokken (4.24.2) og oploeses derefter igen i 1 ml kloroform. 6.2. Fremstilling af derivater og tyndtlagskromatografi Jf. Raadets direktiv 76/372/EOEF, bilaget, metode A, punkt 5.6.2. 7. Beregning af resultater Proevens indhold af aflatoksin B1 mg/kg beregnes efter nedenstaaende formel: Indhold af B1 i mg/kg = m × Ve x t

Vm × M × Vf Vc hvor: m = maengden af aflatoksin B1 i ng som B1-top i proeven beregnet som foelger: m = P (proeve)

P (st1) + P (st2) × 2 r (st) P (proeve) = toparealet for aflatoksin B1 i proeven P (st1) = toparealet for aflatoksin B1 i den forudgaaende paasaetning af referenceoploesning (3.13.3) P (st2) = toparealet for aflatoksin B1 i den efterfoelgende paasaetning af referenceoploesning (3.13.3) r (st) = den paasatte maengde referenceoploesning B1 (3.13.3) i ng Vm = maengden af den paasatte proeveekstrakt i ml; der tages hoeje for eventuel fortynding under 5.3 Ve x t = den endelige maengde proeveekstrakt i ml M = proevens vaegt i g Vf = maengden af filtrat i ml overfoert til Florisil-kolonnen (5.4.1.2) Vc = maengden af kloroform i ml, der er anvendt til ekstrahering af proeven. Hvis proceduren i denne forskrift foelges, kan formlen forkortes til: Indhold af aflatoksin B1 i mg/kg = 20 × m 7.1. Resultaterne kan ogsaa beregnes ved maaling af tophoejderne. 8. Reperterbarhed Jf. punkt 10.1 (bemaerkninger). 9. Reproducerbarhed Jf. punkt 10.1. 10. Bemaerkninger 10.1. Praecision En sammenlignende undersoegelse (1) af foderblandinger gennemfoert paa internationalt plan gav de i tabel 1 anfoerte resultater for repeterbarhed og reproducerbarhed. Begrebet reperterbarhed (r), som det er anvendt her, defineres som det stoerste forhold mellem to aflaesninger af samme proeve udfoert paa samme laboratorium under samme betingelser, som ikke er signifikant paa 95 % sandsynlighedsniveau. Begrebet reproducerbarhed (R) defineres paa tilsvarende maade, naar der er to forskellige laboratorier der sammenlignes, ifoelge ISO 3534 - 1977, 2.35 (2) og Kommissionens beslutning 89/610/EOEF (3). I tabel 1 er r og R ogsaa angivet som variationskoefficienter. Tabel 1 Reperterbarhed (r) og reproducerbarhed (R) udtrykt som forholdstal og de tilsvarende variationskoefficienter (15 laboratorier). Niveau r R CVr (*) CVR (mg/kg) (%) (%) 8 & 14 1,4 1,7 11 18 (*) CV = variationskoefficient. 10.2. Stabilisering af kloroform Absorptionsevnen af florisilkolonnen kan aendres, hvis der bruges anden stabilisator end ethanol til kloroform. Dette skal kontrolleres i henhold til 10.3, hvis den foreskrevne kloroform ikke kan skaffes. 10.3. Noejagtighed Det efterproeves, om metoden udfoeres rigtigt, ved gentagne maalinger paa certificeret referencemateriale. Hvis saadant materiale ikke forefindes, boer metodens effektivitet afproeves ved genfindingsforsoeg paa blindproever. Middelvaerdien maa ikke afvige fra den sande vaerdi med fra under 20 % til over 10 %.

Figur 1: Kombination af soejle og kolonne 1. Mobil fase

2. Pumpe

3. Proevepaasaetter

4. Forkolonne

5. HPLC-kolonne

6. Maettet jodoploesning

7. Pumpe til jodreagens 8. T-stykke

9. Termostatstyret bad

10. Spiralkolonne

11. Fluoressensdetektor

12. Restriktor

13. Spild

14. Skriver henholdsvis integrator Figur 2: Flowdiagram for HPLC-systemet til post column derivatisering med jod Udslag Gennemsnit af sammenhoerende

referencestandarder Tid reference- standard ekstrakt (eller kalibreringsop- loesning) ekstrakt (eller kalibreringsop- loesning) reference- standard ekstrakt (eller kalibrerings- oploesning) Figur 3: Kompensation for aendring for afvigelse i aflatoksin B1-udslag ved paasaetning af referenceoploesning med regelmaessige intervaller (3.13.3).«