Kommissionens beslutning

af 22. februar 2001

om fastlæggelse af prøveudtagningsplaner for og diagnosticeringsmetoder til påvisning og bekræftelse af visse fiskesygdomme og om ophævelse af beslutning 92/532/EØF

(meddelt under nummer K(2001) 426)

(EØS-relevant tekst)

(2001/183/EF)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets direktiv 91/67/EØF af 28. januar 1991 om dyresundhedsmæssige betingelser for afsætning af akvakulturdyr og -produkter(1), senest ændret ved direktiv 98/45/EF(2), særlig artikel 15, og

ud fra følgende betragtninger:

(1) Prøveudtagningsplanerne for og metoderne til diagnosticering og bekræftelse af visse fiskesygdomme er fastlagt i Kommissionens beslutning 92/532/EØF(3), senest ændret ved beslutning 96/240/EF(4).

(2) Siden beslutning 92/532/EØF blev vedtaget, har der været en vis praktisk og videnskabelig udvikling, og direktiv 91/67/EØF er blevet ændret. Derfor må prøveudtagningsplanerne og diagnosticeringsmetoderne ajourføres.

(3) Ajourføringen vedrører undersøgelse og identificering af vira, der fremkalder hæmorrhagisk virusseptikæmi (VHS) (egtvedsyge) og infektiøs hæmatopoietisk nekrose (IHN), og ændringer i overensstemmelse med de seneste ændringer af direktiv 91/67/EØF.

(4) EF-referencelaboratoriet for fiskesygdomme, der blev oprettet ved Rådets direktiv 93/53/EØF(5), er blevet hørt.

(5) De prøveudtagningsplaner for og metoder til diagnosticering og bekræftelse af visse fiskesygdomme, der blev fastsat ved beslutning 92/532/EØF, bør af hensyn til klarheden ophæves.

(6) De i denne beslutning fastsatte foranstaltninger i overensstemmelse med udtalelse fra Den Stående Veterinærkomité -

VEDTAGET FØLGENDE BESLUTNING:

Artikel 1

Prøveudtagningsplanerne for og metoderne til diagnosticering og bekræftelse af hæmorrhagisk virusseptikæmi (VHS) (egtvedsyge) og infektiøs hæmatopoietisk nekrose (IHN) er fastsat i bilaget.

Artikel 2

Denne beslutning ophæver beslutning 92/532/EØF.

Artikel 3

Denne beslutning er rettet til medlemsstaterne.

Udfærdiget i Bruxelles, den 22. februar 2001.

På Kommissionens vegne

David Byrne

Medlem af Kommissionen

(1) EFT L 46 af 19.2.1991, s. 1.

(2) EFT L 189 af 3.7.1998, s. 12.

(3) EFT L 337 af 21.11.1992, s. 18.

(4) EFT L 79 af 29.3.1996, s. 19.

(5) EFT L 175 af 19.7.1993, s. 23.

BILAG

PRØVEUDTAGNINGSPLANER FOR OG METODER TIL DIAGNOSTICERING OG BEKRÆFTELSE AF HÆMORRHAGISK VIRUSSEPTIKÆMI (VHS) (EGTVEDSYGE) OG INFEKTIØS HÆMATOPOIETISK NEKROSE (IHN)

INDLEDNING

Dette bilag:

a) fastsætter retningslinjer for og minimumskrav til prøveudtagningsplaner for og metoder til diagnosticering og bekræftelse af hæmorrhagisk virusseptikæmi (VHS) (egtvedsyge) og infektiøs hæmatopoietisk nekrose (IHN)

b) integrerer bestemmelserne i bilag B og C til direktiv 91/67/EØF for godkendelse og opretholdelse af den status, som zoner og akvakulturbrug i ikke-godkendte zoner har opnået

c) fastsætter bestemmelser med henblik på korrekt diagnosticering af VHS og IHN og officiel godkendelse af status for zoner og akvakulturbrug i ikke-godkendte zoner, jf. artikel 5 og 6 i direktiv 91/67/EØF

d) er rettet både til de myndigheder, der er ansvarlige for bekæmpelse af VHS og IHN og det laboratoriepersonale, der udfører undersøgelser vedrørende disse sygdomme. Derfor vedrører bilaget navnlig prøveudtagningsprocedurer, principper for og anvendelse af laboratorieundersøgelser, evaluering af laboratorieundersøgelsesresultater og detaljerede laboratorieteknikker. Laboratorierne kan dog eventuelt ændre de undersøgelser, som er beskrevet i bilaget, eller anvende andre undersøgelser, forudsat at det kan godtgøres, at følsomheden og specificiteten er den samme.

Del I vedrører prøveudtagningsplaner og diagnosticeringsmetoder i forbindelse med overvågning af VHS og IHN med henblik på opnåelse eller opretholdelse af status som godkendt zone eller godkendt akvakulturbrug i en ikke-godkendt zone.

I del II beskrives diagnosticeringsmetoderne til bekræftelse af VHS og IHN ved mistanke om disse sygdomme.

I del III fastsættes der kriterier og retningslinjer for et officielt sundhedskontrolprogram, der dokumenterer, at der ikke tidligere er forekommet VHS og/eller IHN.

Del IV indeholder henstillinger med hensyn til proceduren for titrering af VHS- og IHN-virus for at kontrollere, om cellekulturerne er modtagelige for infektion.

Del V indeholder en liste over akronymer og forkortelser.

DEL I

Prøveudtagningsplaner og diagnosticeringsmetoder i forbindelse med overvågning af VHS og IHN med henblik på opnåelse og opretholdelse af status som godkendt zone eller som godkendt akvakulturbrug i en ikke-godkendt zone

I. Kontrol og prøveudtagning

1. Generelle bestemmelser for klinisk sundhedskontrol, udtagning og udvælgelse af prøver i forbindelse med overvågning af zoner eller akvakulturbrug i ikke-godkendte zoner med henblik på opnåelse eller opretholdelse af godkendt VHS- og/eller IHN-status

Den kliniske sundhedskontrol og udtagningen af prøver af fiskevæv og/eller ovarievæske i zoner eller på akvakulturbrug i ikke-godkendte zoner med henblik på opnåelse eller opretholdelse af godkendt VHS- og/eller IHN-status, jf. bilag B og C til direktiv 91/67/EØF, er sammenfattet i tabel 1A, 1B og 1C. Der er anført nærmere enkeltheder i punkt I.I.2-I.I.4. Tabel 1A og 1B anvendes ikke for nye akvakulturbrug og akvakulturbrug, der genoptager deres virksomhed med fisk, rogn eller mælke fra en godkendt zone eller et godkendt brug i en ikke-godkendt zone, forudsat at de opfylder kravene i direktiv 91/67/EØF, bilag C, punkt I.A.6.a eller I.A.6.b eller punkt II.A.3.a eller II.A.3.b.

Den kliniske sundhedskontrol skal foretages i perioden oktober-juni, eller når som helst, blot vandtemperaturen er under 14 °C. Når der på akvakulturbrug skal foretages klinisk sundhedskontrol to gange om året, skal der være mindst fire måneder mellem sådan sundhedskontrol. Alle produktionsenheder (damme, tanke, netbure mv.) kontrolleres for døde fisk, svage fisk eller fisk med unormal adfærd. Kontrollen skal især koncentreres om vandudledningsområdet, hvor de svage fisk har tendens til at søge hen på grund af vandstrømmen.

Fisk til prøveudtagelse udtages således:

- Hvis der produceres regnbueørred, udtages der en prøve bestående udelukkende af fisk af denne art. Hvis der ikke produceres regnbueørred, skal prøven bestå af fisk af alle andre producerede arter, hvis sådanne arter er modtagelige for VHS- og/eller IHN-virus (arterne er opført i bilag A til Rådets direktiv 91/67/EØF). Arterne skal være forholdsmæssigt repræsenteret i prøven.

- Hvis der anvendes mere end én vandkilde til fiskeproduktion, skal der indgå fisk fra alle vandkilder i prøven.

- Hvis der er svage fisk, fisk med unormal adfærd eller nyligt døde fisk (som ikke er gået i opløsning), skal prøven først og fremmest bestå af sådanne fisk. Hvis der ikke er sådanne fisk, skal prøven bestå af normalt udseende, sunde fisk, der indsamles på en sådan måde, at alle dele af bruget og alle årgange er forholdsmæssigt repræsenteret i prøven.

2. Specifikke bestemmelser, herunder indsamling af prøver, i forbindelse med overvågning af zoner eller akvakulturbrug i ikke-godkendte zoner med henblik på opnåelse eller opretholdelse af godkendt VHS- og/eller IHN-status

1. En zone eller et akvakulturbrug i en ikke-godkendt zone, der overvåges af den officielle tjeneste, kan opnå godkendt VHS- og/eller IHN-status efter:

a) Model A - toårigt overvågningsprogram:

Alle brug i zonen eller hvert enkelt brug i en ikke-godkendt zone, der skal godkendes, skal have været fri for kliniske eller andre tegn på VHS og/eller IHN i mindst to år, og der skal derefter foretages sundhedskontrol to gange om året i to år. I denne toårige kontrolperiode forud for opnåelse af godkendt status må der fortsat ikke være kliniske eller andre tegn på VHS og/eller IHN, og der skal udtages prøver til undersøgelse i overensstemmelse med tabel 1A. Endvidere skal prøverne udvælges, forberedes og undersøges som beskrevet i punkt I.I-I.IV, og laboratorieundersøgelserne skal have været VHS- og/eller IHN-negative eller

b) Model B - toårigt overvågningsprogram med reduceret prøvestørrelse

På alle brug i den zone eller ethvert brug i en ikke-godkendt zone, der skal godkendes, skal der efter gennemførelsen af et officielt sundhedskontrolprogram, der dokumenterer, at der i mindst fire år ikke er forekommet VHS og/eller IHN, foretages sundhedskontrol to gange om året i to år. I den toårige kontrolperiode forud for opnåelse af godkendt status må der fortsat ikke være kliniske eller andre tegn på VHS og/eller IHN, og der skal udtages prøver til undersøgelse i overensstemmelse med tabel 1B. Endvidere skal prøverne udvælges, forberedes og undersøges som beskrevet i I.I-I.IV, og laboratorieundersøgelserne skal have været VHS- og/eller IHN-negative. For at de officielle tjenester kan godkende et sundhedskontrolprogram som dokumentation for VHS- og/eller IHN-frihed, skal det være i overensstemmelse med kriterierne og retningslinjerne i del III.

2. Særlige bestemmelser for godkendelse af nye akvakulturbrug og akvakulturbrug, der genoptager deres virksomhed med fisk, rogn eller mælke fra en godkendt zone eller et godkendt brug i en ikke-godkendt zone.

Nye akvakulturbrug og akvakulturbrug, der genoptager deres virksomhed med fisk, rogn eller mælke fra en godkendt zone eller et godkendt brug i en ikke-godkendt zone, kan opnå status som godkendt, jf. kravene i direktiv 91/67/EØF, bilag C, punkt I.A.6.a/b eller II.A.3.a/b. Derfor anvendes prøveudtagningsbestemmelserne i model A og B ovenfor (punkt I.I.2.1.a og I.I.2.1.b), ikke for sådanne brug.

3. Overvågningsprogrammer for opretholdelse af godkendt VHS- og/eller IHN-status.

For at en zone eller et brug i en ikke-godkendt zone kan opretholde godkendt VHS- og/eller IHN-status, skal der foretages kontrol og udtages prøver til undersøgelse efter tabel 1C. Prøverne skal udvælges, forberedes og undersøges som beskrevet i I.I-I.IV, og laboratorieundersøgelserne skal have været VHS- og/eller IHN-negative.

3. Forberedelse og forsendelse af fiskeprøver

Inden prøverne sendes eller transporteres til laboratoriet, fjernes stykker af de organer, som skal undersøges, fra fisken med sterile dissektionsredskaber og overføres til sterile plastrør indeholdende transportvæske, dvs. cellekulturvæske med 10 % kalveserum og antibiotika. En kombination af 200 i.e. penicillin, 200 μg streptomycin, 200 μg kanamycin pr. ml kan anbefales, men andre dokumenteret effektive antibiotika kan også anvendes. Det vævsmateriale, som skal undersøges, er milt og forreste nyre tillige med enten hjerte eller hjerne. I visse tilfælde skal ovarievæsken undersøges (tabel 1A-C).

Ovarievæske eller organstykker fra højst 10 fisk (Tabel 1A-C) kan indsamles i et sterilt plastrør med mindst 4 ml transportvæske og udgøre en samleprøve. Vævet i hver prøve bør veje mindst 0,5 g.

Rørene bør anbringes i isolerede beholdere (f.eks. tykvæggede polystyrenæsker) sammen med tilstrækkeligt med is eller "fryseblokke" til at sikre, at prøverne holdes nedkølet under transport til laboratoriet. Frysning skal undgås. En prøves temperatur under forsendelsen bør aldrig overstige 10 °C, og der bør stadig være is tilbage i transportkassen eller en eller flere af fryseblokkene skal fortsat være delvis eller helt frosset ved kassens ankomst.

Den virologiske undersøgelse skal påbegyndes snarest muligt og senest 48 timer efter prøveudtagningen. I undtagelsestilfælde(1) kan den virologiske undersøgelse påbegyndes senest 72 timer efter prøveudtagningen, når materialet er beskyttet af transportvæske, og temperaturkravene under transport kan overholdes (punkt I.I.3, tredje afsnit).

Der kan sendes hele fisk til laboratoriet, hvis temperaturkravene under transport kan overholdes. Hele fisk kan indpakkes i vandsugende papir og skal forsendes i en plasticpose, der er kølet som nævnt ovenfor. Der kan også sendes levende fisk.

Al emballering og mærkning skal alt efter tilfældet ske efter gældende nationale eller internationale transportbestemmelser.

4. Indsamling af supplerende diagnostisk materiale

Efter aftale med det pågældende diagnostiske laboratorium kan også andet fiskevæv indsamles og forberedes til supplerende undersøgelser.

II. Forberedelse af prøver til virologisk undersøgelse

1. Frysning i undtagelsestilfælde

Hvis der er praktiske vanskeligheder (f.eks. dårlige vejrforhold, lukkedage, laboratorieproblemer osv.), som gør det umuligt at pode celler senest 48 timer efter indsamlingen af vævsprøverne, kan vævsprøverne nedfryses ved - 20 °C eller lavere temperatur i en celledyrkningsvæske og den virologiske undersøgelse foretages inden for 14 dage. Vævet må dog kun fryses og optøs én gang, inden det undersøges. Der skal føres et register med nærmere oplysninger om grunden til hver enkelt nedfrysning af vævsprøver (uvejr, cellelinjer, døde osv.).

2. Homogenisering af organer

På laboratoriet skal vævet i rørene homogeniseres fuldstændigt (med stomacher, blender eller morter og pistil med sterilt sand) og derefter opslæmmes i den oprindelige transportvæske.

Hvis prøven består af hele fisk på under 4 cm, findeles de ved hjælp af en steril saks eller skalpel efter fjernelse af kroppen bag gatåbningen. Hvis prøven består af hele fisk på 4-6 cm, indsamles indvoldene, herunder nyre. Hvis prøven består af hele fisk på over 6 cm, indsamles vævsprøver som beskrevet i punkt I.I.3. Vævsprøverne findeles ved hjælp af en steril saks eller skalpel, homogeniseres som beskrevet ovenfor og opslæmmes i transportvæske.

Det endelige forhold mellem vævsmateriale og transportvæske skal på laboratoriet justeres til 1:10.

3. Centrifugering af homogenatet

Homogenatet centrifugeres i en kølecentrifuge ved 2-5 °C og 2000-4000 x g i 15 minutter, hvorefter supernatanten opsamles og behandles i 4 timer ved 15 °C eller natten over ved 4 °C med antibiotika, idet det her kan anbefales f.eks. at anvende gentamicin 1 mg/ml.

Hvis prøven er blevet sendt i en transportvæske (dvs. i væske indeholdende antibiotika), kan behandling af supernatanten med antibiotika udelades.

Formålet med antibiotikabehandlingen er at undgå bakterieforurening af prøverne og overflødiggøre filtrering gennem membranfiltre.

Hvis den opsamlede supernatant opbevares ved en temperatur på - 80 °C senest 48 timer efter prøveudtagningen, kan den optøs og genanvendes til virologisk undersøgelse, dog kun én gang.

Hvis der opstår praktiske vanskeligheder (f.eks. at varmeskabet går i stykker, eller at der opstår problemer med cellekulturer), som gør det umuligt at pode celler senest 48 timer efter indsamlingen af vævsprøverne, kan supernatanten fryses ved - 80 °C og den virologiske undersøgelse udskydes i højst 14 dage.

Inden supernatanten podes på cellerne, blandes den med en tilsvarende mængde passende fortyndet pool af antiserum mod de hjemlige serotyper af IPN-virus og inkuberes hermed i mindst 1 time ved 15 °C eller i højst 18 timer ved 4 °C. Antiserumtiteren skal være mindst 1/2000 i en 50 %-pladeneutraliseringsprøve.

Formålet med at behandle alle podestoffer med antiserum mod IPN-virus (et virus, som i nogle dele af Europa forekommer i 50 % af alle fiskeprøver) er at hindre, at der udvikles CPE som følge af IPN-virus i podede cellekulturer. Det vil nedsætte de virologiske undersøgelsers varighed og antallet af tilfælde, hvor forekomst af CPE ellers måtte opfattes som en potentiel indikation af VHS- eller IHN-virus.

Når prøverne kommer fra produktionsenheder, der anses for at være fri for IPN, kan behandling af podestoffer med antiserum mod IPN-virus undlades.

III. Virologisk undersøgelse

1. Cellekulturer og -væsker

BF-2 eller RTG-2 og enten EPC- eller FHM-celler dyrkes ved 20-30 °C i en passende væske, f.eks. Eagle's MEM (eller modifikationer heraf), tilsat 10 % føtalt bovint serum og antibiotika i standardkoncentrationer.

Når cellerne dyrkes i lukkede glas, anbefales det at benytte bicarbonat som buffer til væsken. Til den væske, der anvendes til dyrkning af celler i åbne enheder, kan Tris-HCl (23 mM) og Na-bicarbonat (6 mM) benyttes som buffer. PH-værdien skal ligge på 7,6 +- 0,2.

Cellekulturer, der skal anvendes til podning med vævsmateriale, bør være unge (4-48 timer) og være i aktiv vækst (ikke sammenflydende) på podningstidspunktet.

2. Podning af cellekulturer

En antibiotikabehandlet organopslæmning podes på cellekulturer i to fortyndinger, dvs. primærfortyndingen og derudover en tifoldsfortynding heraf, så der fremkommer slutopløsninger af vævsmateriale i celledyrkningsvæske på henholdsvis 1:100 og 1:1000 (for at hindre homolog interferens). Mindst to cellelinjer skal podes (jf. punkt I.III.1). Forholdet mellem podestoffets og cellekulturvæskens rumfang bør være ca. 1:10.

For hver fortynding og hver cellelinje anvendes et celleområde på mindst ca. 2 cm2 svarende til ét hul på en cellekulturplade med 24 huller. Det anbefales at benytte celledyrkningsplader, men andre enheder med tilsvarende eller større vækstareal kan også anvendes.

3. Inkubering af cellekulturer

Podede cellekulturer inkuberes ved 15 °C i 7-10 døgn. Hvis cellekulturvæsken ændrer farve fra rød til gul, som er tegn på forurening af væsken, skal pH-værdien justeres med steril bicarbonatopløsning eller tilsvarende stoffer for at sikre, at cellematerialet er modtageligt for virusinfektion.

Der foretages mindst hver sjette måned, eller når der er mistanke om, at cellerne er mindre modtagelige, titrering af frosne lagre af VHS- og IHN-virus for at fastslå, om cellekulturerne er modtagelige for infektion. I afsnit IV er der anført en anbefalet metode.

4. Mikroskopi

Podede cellekulturer skal undersøges jævnligt (mindst tre gange om ugen) for forekomst af CPE ved ca. 40-150 x forstørrelse. Hvis der konstateres tydelig CPE, skal der omgående anvendes virusidentificeringsmetoder som beskrevet i punkt I.IV.

5. Dyrkning af subkulturer

Er der ingen udvikling af CPE efter primærinkuberingen i 7-10 døgn, gennemføres der dyrkning af subkulturer med friske cellekulturer på et celleareal af samme størrelse som primærkulturens.

Mængder af væsken (supernatanten) fra alle kulturer/huller, som udgør primærkulturen, samles pr. cellelinje 7-10 døgn efter podningen og podes på homologe cellekulturer, der er ufortyndet eller i tifoldsfortyndinger (som giver slutfortyndinger af supernatanten på henholdsvis 1:10 og 1:100) som beskrevet i punkt I.III.2. Alternativt podes mængder på 10 % af den væske, som udgør primærkulturen, direkte i et hul med friske cellekulturer (hul til hul-dyrkning af subkulturer). Inden podningen kan der foretages en inkubation af fortyndingerne med antiserum mod IPN-virus i passende fortynding som beskrevet i punkt I.II.3.

De podede kulturer inkuberes derefter i 7-10 døgn ved 15 °C og observeres som beskrevet i punkt I.III.4.

Hvis den forekommer toksisk CPE i løbet af de første tre inkubationsdøgn, kan der dyrkes subkulturer på det stadium, men cellerne skal i så fald inkuberes i syv døgn og dyrkes i subkultur igen med yderligere syv døgns inkubation. Hvis den udvikler sig toksisk CPE efter tre døgns forløb, kan cellerne passeres én gang og inkuberes, så man kommer op på de i alt 14 døgn fra primærpodningen. Der bør ikke være tegn på toksicitet i de sidste syv inkubationsdøgn.

Hvis der trods antibiotikabehandling optræder bakterieforurening, skal supernatanten inden dyrkning af subkulturer centrifugeres ved 2-5 °C og 2000-4000 x g i 15-30 minutter og/eller filtreres gennem et 0,45 μm filter (svagt proteinbindende membranfilter). Derudover er metoderne til dyrkning af subkulturer de samme som for toksisk CPE.

IV. Virusidentificering

1. Virusidentificeringstest

Hvis der er konstateret tegn på CPE i en cellekultur, indsamles væsken (supernatanten) og undersøges efter én eller flere af følgende metoder: neutralisering, IF eller ELISA. Hvis prøverne ikke har gjort det muligt at identificere virus med sikkerhed i løbet af en uge, skal virus overføres til et nationalt referencelaboratorium for fiskesygdomme eller til EF-referencelaboratoriet for fiskesygdomme til øjeblikkelig identificering.

2. Neutralisering

Cellerne fjernes fra den opsamlede væske ved centrifugering (2000-4000 x g) eller membranfiltrering (0,45 μg) gennem et svagt proteinbindende membranfilter, og væsken fortyndes 1:100 og 1:10000 i celledyrkningsvæske.

Mængder af fortyndingerne blandes og inkuberes i 60 minutter ved 15 °C med lige dele af følgende reagenser hver for sig:

- serum indeholdende gruppespecifikt antistof mod VHS-virus fortyndet i forholdet 1:50 v/v(2)

- serum indeholdende gruppespecifikt antistof mod IHN-virus fortyndet i forholdet 1:50 v/v(3)

- pulje af antisera mod indigene serotyper af IPN-virus fortyndet i forholdet 1:50 v/v(4)

- væske alene (positiv kontrol).

Der skal fra hver virus-serum-blanding podes mindst to cellekulturer med 50 μl hver, som derefter inkuberes ved 15 °C. CPE-udviklingen kontrolleres som beskrevet i punkt I.III.4.

Visse VHS-virusstammer reagerer ikke i neutraliseringsprøver. Sådanne isolater må identificeres ved hjælp af IF eller ELISA.

Andre neutralisationsprøver, hvis effektivitet er godtgjort, kan også anvendes.

3. IF

For hvert virusisolat, der skal identificeres, udstryges der celler på mindst otte dækglas eller lignende med en tæthed, der giver ca. 60-90 % sammenflydning efter 24 timers dyrkning. Det anbefales at anvende EPC-celler, fordi de klæber stærkt til glasoverflader, men der kan også anvendes andre cellelinjer såsom BF-2, RTG-2 eller FHM.

Når cellerne har sat sig på glasoverfladen (ca. 1 time efter udstrygningen), eller når kulturerne er inkuberet i indtil 24 timer, podes det virus, der skal identificeres. Fire kulturer podes i forholdet 1:10 og fire kulturer i forholdet 1:1000. De inkuberes så ved 15 °C i 20-30 timer.

Efter inkubationen skylles kulturerne to gange i Eagle's MEM uden serum, fikseres i 80 % iskold acetone og farves ved brug af et tolags-IFAT. Det første reagenslag består af poly- eller monoklonale antistoffer af referencekvalitet. Det andet reagenslag er et fluorochromkonjugeret antiserum mod immunglobulinet i det første lag. For hver af de testede antisera skal der farves mindst en højdosis- og en lavdosispodet kultur. Prøven skal omfatte en passende negativ og positiv kontrol. Der kan anvendes fluorochromer såsom FITC eller TRITC.

De farvede kulturer præpareres med glycerolsaltopløsning. De undersøges under indfaldende UV-lys. Der anvendes okularer, der forstørrer 10 x eller 12 x, og x 25- eller x 40-objektiver med en blænde på henholdsvis > 0,7 og > 1,3.

Ovenstående IF-metode er givet som eksempel. Der kan anvendes andre IF-metoder (mht. cellekulturer, fiksering og antistoffer af referencekvalitet), hvis effektivitet er godtgjort.

4. ELISA

Hullerne i mikrotiterplader dækkes natten over med anbefalede fortyndinger af rensede immunglobulinfraktioner af antistoffer af referencekvalitet.

Efter skylning af hullerne med PBS-Tween-20-buffer tilsættes det virus, der skal identificeres, til hullerne i to- eller firefoldsfortyndinger og henstår til reaktion med antistofbelægningen i 60 minutter ved 37 °C. Efter skylning med PBS-Tween-20-buffer tilsættes biotinylerede antistoffer af en specificitet svarende til specificiteten af antistofbelægningen og henstår til reaktion i 60 minutter ved 20 °C. Efter endnu en skylning som ovenfor tilsættes HRP-konjungeret streptavidin, som henstår til reaktion i 60 minutter ved 20 °C. Efter en sidste skylning gøres bundet enzym synligt ved anvendelse af passende ELISA-substrater (OPD eller andre).

Ovenstående biotin-/avidinbaserede ELISA-version er givet som eksempel. Der kan anvendes andre ELISA-versioner, hvis effektivitet er godtgjort.

TABEL 1A

Kontrol- og prøveudtagningsordning for zoner og for akvakulturbrug i ikke-godkendte zoner for den toårige kontrolperiode forud for opnåelse af godkendt VHS- og/eller IHN-status

(jf. direktiv 91/67/EØF, bilag B og C, og bestemmelserne i del I i dette bilag)

>TABELPOSITION>

Maksimalt antal fisk pr. samleprøve: 10.

TABEL 1B

Kontrol- og prøveudtagningsordning for den toårige kontrolperiode forud for opnåelse af godkendt VHS- og/eller IHN-status i zoner og på akvakulturbrug i ikke-godkendte zoner med officielt dokumenteret historik for frihed for disse sygdomme

(jf. direktiv 91/67/EØF, bilag B og C, og bestemmelserne i del I og III i dette bilag)

>TABELPOSITION>

Maksimalt antal fisk pr. samleprøve: 10.

TABEL 1C

Kontrol- og prøveudtagningsordning for zoner og for akvakulturbrug i ikke-godkendte zoner med henblik på opretholdelse af godkendt VHS- og/eller IHN-status

(jf. direktiv 91/67/EØF, bilag B og C, og bestemmelserne i del I i dette bilag)

>TABELPOSITION>

Maksimal antal fisk pr. samleprøve 10.

DEL II

Diagnosticeringsmetoder til bekræftelse af VHS og IHN ved mistanke om udbrud

IHN og VHS kan diagnosticeres efter en af følgende metoder:

- A. Konventionel virusisolering med efterfølgende serologisk virusidentificering

- B. Virusisolering med samtidig serologisk virusidentificering

- C. Andre diagnosticeringsmetoder (IFAT, ELISA)

Bekræftelse af det første tilfælde af VHS og/eller IHN på brug i godkendte zoner må ikke baseres på metode C alene. Metode A eller B skal også anvendes.

Det vævsmateriale, der skal underkastes virologisk undersøgelse, kan i nogle tilfælde skulle ledsages af supplerende materiale til bakteriologisk, parasitologisk, histologisk eller anden undersøgelse, for at der kan stilles en differentialdiagnose.

A. Konventionel virusisolering med efterfølgende serologisk virusidentificering

I.1. Udvælgelse af prøver

Der udvælges mindst 10 fisk med typiske tegn på IHN eller VHS til undersøgelse

I.2. Forberedelse og forsendelse af fiskeprøver

Som fastsat i punkt I.I.3

I.3. Indsamling af supplerende diagnostisk materiale

Som fastsat i punkt I.I.4

II. Forberedelse af prøver til virologisk undersøgelse

Som fastsat i punkt I.II

III. Virologisk undersøgelse

Som fastsat i punkt I.III

IV. Virusidentificering

Som fastsat i punkt I.IV.

B. Virusisolering med samtidig serologisk virusidentificering

I.1. Udvælgelse af prøver

Som fastsat i punkt II.A.I

I.2. Forberedelse og forsendelse af fiskeprøver

Som fastsat i punkt I.I.3.

I.3. Indsamling af supplerende diagnostisk materiale

Som fastsat i punkt I.I.4.

II.1. Homogenisering af organer

Som fastsat i punkt I.II.2.

II.2. Centrifugering af homogenatet

Homogenatet centrifugeres i en kølecentrifuge ved 2-5 °C og 2000-4000 x g i 15 minutter, hvorefter supernatanten opsamles og behandles i 4 timer ved 15 °C ved med antibiotika, f.eks. gentamicin 1 mg/ml, eller membranfiltreres (0,45 μm) gennem et svagt proteinbindende membranfilter.

II.3. Behandling af supernatanten med diagnostiske antisera

Organopslæmningen, der er behandlet med antibiotika eller membranfiltreret, fortyndes i forholdet 1:10 og 1:1000 i cellekulturvæske, og mængder blandes og inkuberes i 60 minutter ved 15 °C med lige dele af de i punkt I.IV.2 anførte reagenser.

III.1. Cellekulturer og væsker

Som fastsat i punkt I.III.1.

III.2. Podning af cellekulturer

Fra hver virus-/serumblanding (tilberedt efter punkt II.B.II.3) podes mindst to cellekulturer pr. cellelinje med 50 μl hver.

III.3. Inkubering af cellekulturer

Som fastsat i punkt I.III.3.

III.4. Mikroskopi

Podede cellekulturer undersøges dagligt for forekomst af CPE ved ca. 40-150 x forstørrelse. Hvis et af de benyttede antisera forhindrer udvikling af CPE, kan viruset anses for at være identificeret.

Hvis ingen af antiseraene forhindrer udvikling af CPE, skal der anvendes en af identificeringsmetoderne i punkt I.IV.

III.5. Dyrkning af subkulturer

Hvis der ikke er nogen udvikling af CPE efter 7-10 døgn, skal der dyrkes subkulturer ud fra kulturer podet med supernatanten plus væske (punkt II.B.II.3), jf. punkt I.III.5.

C. Andre diagnosticeringsmetoder

Supernatant, som beskrevet i punkt I.II.2, kan analyseres ved IFAT eller ELISA efter henholdsvis I.IV.3 eller I.IV.4. Disse hurtigmetoder skal suppleres med en virologisk undersøgelse, jf. A eller B, senest 48 timer efter prøveudtagningen, hvis:

a) reaktionen er negativ eller

b) reaktionen er positiv med materiale fra første tilfælde af IHN eller VHS i en godkendt zone.

Vævsmateriale kan analyseres efter andre diagnosticeringsmetoder såsom RT-PCR, IF på frosne stykker eller immunhistokemi på formalinfikseret vævsmateriale. Disse metoder skal altid ledsages af podning af ufikseret vævsmateriale på cellekulturer.

DEL III

Dokumenteret historik for frihed fra VHS og/eller IHN i zoner eller på bedrifter i ikke-godkendte zoner

Retningslinjer og kriterier for et officielt sundhedskontrolprogram

1. Et sundhedskontrolprogram kan kun iværksættes:

- efter at der er gennemført et officielt godkendt udryddelsesprogram for VHS- og/eller IHN-virus, der også omfatter udskiftning af alle fisk på akvakulturbruget, rengøring, desinficering og braklægning, inden der genudsættes fisk fra godkendte brug eller

- på akvakulturbrug, der aldrig har haft VHS- eller IHN-virus.

2. Sundhedskontrolprogrammet skal baseres både på kliniske undersøgelser og laboratorieundersøgelser.

3. I programmet skal der indgå to årlige kliniske sundhedsundersøgelser efter retningslinjerne i del I.

4. Ved mindst den ene af de sundhedsundersøgelser, der skal foretages hvert år, skal der udtages 30 fiskevævs- og/eller ovarievæskeprøver på hvert brug. Prøverne skal udvælges og forberedes til laboratorieundersøgelse, jf. del I, II og IV.

5. Sundhedskontrolprogrammet skal løbe i mindst 4 år på alle brug i den zone eller på det brug (i en ikke-godkendt zone), der skal godkendes.

6. For at programmet kan godkendes officielt, må der ikke forekomme eller påvises tilfælde af VHS eller IHN (ingen klinisk infektion eller virusisolering).

DEL IV

Titreringsmetode til kontrol af cellekulturers modtagelighed for infektion

Nedenfor er anført anbefalede titreringsmetoder, jf. punkt I.III.3.

Der bør anvendes mindst to VHS-virusisolater og ét IHN-virusisolat. Isolaterne bør repræsentere den vigtigste virusgruppe i EF, dvs. for VHS-virus ét patogent isolat fra regnbueørred i fersk vand og ét marint isolat, der er patogent for pighvarre, og for IHN-virus en europæisk stamme, som er patogen for regnbueørred. Der bør anvendes veldefinerede isolater fra medlemsstaterne. EF-referencelaboratorierne for fiskesygdomme kan levere referenceisolater.

Virusportioner i cellekulturer med lavt passagetal dyrkes i celledyrkningsglas på BF-2- eller RTG-2-celler for VHS-virus og på EPC- eller FHM-celler for IHN-virus. Der bør anvendes celledyrkningsvæske med mindst 10 % serum. Der anvendes en lav MOI ved podning (< 1).

Ved fuld CPE høstes der virus ved centrifugering af cellekultursupernatanten ved 2000 x g i 15 minutter. Derefter filtreres den gennem et 0,45 ìm membranfilter og fordeles i mærkede fryserør. Viruset opbevares ved - 80 °C.

En uge efter frysning optøs tre glas med hvert virus i koldt vand og titreres på deres respektive cellelinjer. Mindst hver sjette måned, eller når der er mistanke om, at cellelinjernes modtagelighed for infektion er nedsat, optøs og titreres hvert virusisolat.

Titreringsmetoderne skal nøje beskrives, og der anvendes samme metode hver gang.

Titrering indtil fortyndingsslutpunktet gentages seks gange på hvert fortyndingstrin. Titerne sammenlignes med tidligere titere. Hvis titeren af et de tre virusisolater falder to logaritmer i forhold til den oprindelige titer, bør cellelinjen ikke længere anvendes til kontrolformål.

Hvis der anvendes flere cellelinjer i laboratoriet, bør hver cellelinje undersøges for sig.

Data og optegnelser bør opbevares i mindst 10 år.

DEL V

Akronymer og forkortelser

BF-2 bluegill fry-2 (cellelinje)

CPE cytopatisk effekt

CRL EF-referencelaboratorium for fiskesygdomme

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

EPC epithelioma papulosum cyprini (cellelinje)

FHM fathead minnow (cellelinje)

FITC fluoresceinisothiocyanat

Hepes N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre

HRP peberrodsperoxidase

IF immunofluorescens

IFAT indirekte fluorescent antistoftest

IHN infektiøs hæmatopoietisk nekrose

IPN infektiøs pankreasnekrose

MEM minimum essential medium

MOI infektionsfaktor (forholdet mellem antallet af tilsatte inficerende viruspartikler og et kendt antal celler i en kultur)

OPD ortophenyldiamin

PBS fosfatbufferet saltopløsning

RTG-2 regnbueørredgonade (cellelinje)

RT-PCR omvendt transcriptase-polymerasekædereaktion

Tris-HCl tris(hydroxymethyl)aminomethan - HCl

TRITC tetramethylrhodaminisothiocyanat

VHS hæmorrhagisk virusseptikæmi (egtvedsyge)

(1) I undtagelsestilfælde, f.eks. når der indsamles fisk i meget afsides områder uden daglig postforbindelse.

(2) Eller som specificeret af referencelaboratoriet med hensyn til antiseraenes eventuelle cytotoksicitet.

(3) Eller som specificeret af referencelaboratoriet med hensyn til antiseraenes eventuelle cytotoksicitet.

(4) Eller som specificeret af referencelaboratoriet med hensyn til antiseraenes eventuelle cytotoksicitet.