++++

KOMMISSIONENS FORORDNING ( EOEF ) Nr . 2188/81

af 28 . juli 1981

om aendring af forordning ( EOEF ) nr . 625/78 om gennemfoerelsesbestemmelser for offentlig oplagring af skummetmaelkspulver

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,

under henvisning til Raadets forordning ( EOEF ) nr . 804/68 af 27 . juni 1968 om den faelles markedsordning for maelk og mejeriprodukter ( 1 ) , senest aendret ved akten vedroerende Graekenlands tiltraedelse , saerlig artikel 7 , stk . 5 , og

ud fra foelgende betragtninger :

I bilag I til Kommissionens forordning ( EOEF ) nr . 625/78 ( 2 ) , senest aendret ved forordning ( EOEF ) nr . 2937/80 ( 3 ) , der fastlaegger de kvalitetskrav , som skummetmaelkspulveret skal opfylde for at kunne tilbydes til intervention , indgaar bl . a . nogle forskrifter vedroerende analysemetoder med henblik paa paavisning af valle ved bestemmelse af indholdet af visse komponenter i skummetmaelkspulveret ; ifoelge fodnote ( 2 ) i naevnte bilag skal der fastsaettes EF-graensevaerdier for de naevnte komponenter efter en vis forsoegsperiode i medlemsstaterne ;

det er nu muligt at indfoere en EF-analysemetode , hvorved loebevalle i skummetmaelkspulver kan bestemmes ved indholdet af fri sialinsyre ; denne metode boer dog ikke goeres obligatorisk foer efter en vis periode , for at saavel kontrolorganerne som producenterne kan goere sig fortrolige med denne analysemetode ;

de i denne forordning fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Forvaltningskomiteen for Maelk og Mejeriprodukter -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING :

Artikel 1

1 . I bilag I til forordning ( EOEF ) nr . 625/78 foretages foelgende aendringer :

a ) I punkt 2 , litra b ) , affattes andet led saaledes :

" - valle :

bestemmelse af frit sialinsyreindhold ( 2 ) og/eller af cystein/cystin-komplekset , saafremt mindst én af de tre obligatoriske undersoegelser , d.v.s . undersoegelsen vedr . glycomacropeptiderne i valle ( bestemt ved en forenklet metode ) , undersoegelsen vedr . laktat og undersoegelsen vedr . aske viser hoejere vaerdier end henholdsvis 3 % , 150 mg/100 g og 8 % . "

b ) Fodnote ( 2 ) affattes saaledes :

" ( 2 ) Med hensyn til paavisning af loebevalle ved indholdet af fri sialinsyre anvendes fra den 1 . januar 1982 , den i bilag IV fastsatte analysemetode . "

2 . Bilaget til naervaerende forordning indsaettes i forordning ( EOEF ) nr . 625/78 som bilag IV .

Artikel 2

Denne forordning traeder i kraft paa tredjedagen efter offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende .

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat .

Udfaerdiget i Bruxelles , den 28 . juli 1981 .

Paa Kommissionens vegne

Gaston THORN

Formand

( 1 ) EFT nr . L 148 af 28 . 6 . 1968 , s . 13 .

( 2 ) EFT nr . L 84 af 31 . 3 . 1978 , s . 19 .

( 3 ) EFT nr . L 305 af 14 . 11 . 1980 , s . 13 .

BILAG

" BILAG IV

PAAVISNING AF LOEBEVALLE I SKUMMETMAELKSPULVER TIL OFFENTLIG OPLAGRING VED MAALING AF SIALINSYRE VED EN FORBEDRET OG FORENKLET METODE

1 . Formaal og anvendelsesomraade

Ved denne metode kan man paavise maelkeserum i skummetmaelkspulver til offentlig oplagring .

2 . Metodens princip

Ved maelkens koagulering under paavirkning af loebe frigoeres kaseinens glycomacropeptider , der har et hoejt indhold af sialinsyre . Ved maaling af sialinsyre eller N-acetylneuraminsyre kan man fastslaa eventuel tilstedevaerelse af loebevalle i skummetmaelkspulveret . Efter at maelken er rekonstitueret , udfaeldes de sialinsyreholdige glycomacropeptider med phosphowolframsyre af et filtrat , som er 12 % med hensyn til trichloreddikesyre . Den ved sur hydrolyse frigjorte sialinsyre danner med resorcinol et farvet kompleks , som maales ved spektrofotometri ved 580 nm .

3 . Reagenser

Alle reagenser skal vaere analyserene . Vandet skal vaere destilleret eller deioniseret .

3.1 . Oploesning af trichloreddikesyre ( TCA ) .

240 g trichloreddikesyre oploeses i vand og fortyndes til 1 000 ml .

3.2 . Oploesning af phosphowolframsyre .

20 g phosphowolframsyre oploeses i vand og fortyndes til 100 ml .

3.3 . 95 % ethanol ( v/v ) .

3.4 . Fortyndet svovlsyre , ca . 0,1 N .

Der fremstilles en 1 N svovlsyreoploesning ved at fortynde 28,1 ml koncentreret svovlsyre ( 95 % H2SO4 ) med vand til 1 000 ml . En 0,1 N svovlsyreoploesning fremstilles ved at fortynde 100 ml 1 N svovlsyre med vand til 1 000 ml .

3.5 . Acetatbuffer , pH 4,8 .

19,7 g vandfrit natriumacetat oploeses i vand ; der tilsaettes 9 ml iseddike og fortyndes til 1 000 ml med vand .

Kontroller og juster eventuelt pH .

3.6 . Kobbersulfatoploesning , 0,1 M .

2,497 g kobbersulfat ( CuSO4 * 5 H2O ) oploeses i vand og fortyndes til 100 ml med vand .

3.7 . Resorcinoploesning , 2 % .

2 g resorcin oploeses i vand og fortyndes til 100 ml med vand . Denne oploesning er holdbar i fire maaneder ved 5-8 * C .

3.8 . Resorcinolreagens

10 ml resorcinoploesning ( 3.7 . ) , 80 ml koncentreret saltsyre ( d20 * C = 1,19 g/l ) og 0,25 ml kobbersulfatoploesning ( 3.6 ) blandes og fortyndes til 100 ml med vand . Denne oploesning fremstilles samme dag , den skal bruges .

3.9 . Isoamylalkohol .

3.10 . Oploesning af N-acetylneuraminsyre ( sialinsyre ) .

20 mg N-acetylneuraminsyre oploeses i vand og fortyndes til 100 ml med vand . Denne oploesning er holdbar i over en uge ved + 4 * C .

4 . Instrumenter og apparatur

4.1 . Analysevaegt .

4.2 . Magnetomroerer og magnetpinde , 2 cm lange , med teflonbelaegning .

4.3 . pH-meter .

4.4 . Centrifuge , som kan give en centrifugalkraft paa 3 000 g .

4.5 . Centrifugeglas paa ca . 75 ml .

4.6 . Vandbad med termostat , som kan indstilles til 80 * C .

4.7 . Kogende vandbad .

4.8 . Rundfilter diam . 125 mm ( Schleicher og Schuell nr . 589 2 , " Weissband " -type eller af tilsvarende kvalitet ) .

4.9 . Glastragte , diameter ca . 7 cm .

4.10 . Baegerglas paa 100 og 150 ml .

4.11 . Maalekolber paa 50 , 100 og 1 000 ml .

4.12 . Reagensglas med skrueprop , ca . 10 ml .

4.13 . Spektrofotometer .

4.14 . Glascuvetter til spektrofotometer , optisk vejlaengde 10 mm .

4.15 . Maalepipetter paa 1 , 2 , 5 , 10 , 20 , 25 og 50 ml .

4.16 . Glasspatler .

4.17 . Toerreovn med termostat ved 35 * C .

5 . Tilberedelse af proeven

Efter at proeven er homogeniseret , undersoeges den ifoelge de i 6 og foelgende punkter givne instrukser .

6 . Fremgangsmaade

6.1 . Isolering af fri sialinsyre .

6.1.1 . 5 mere aller mindre 0,005 g skummetmaelkspulver afvejes i et 150 ml baegerglas .

Der tilsaettes 50 ml vand , og blandes omhyggeligt med magnetomroereren ( 4.2 ) til fuldstaendig oploesning .

Under stadig omroering tilsaettes langsomt 50 ml af oploesningen af trichloreddikesyre ( 3.1 . ) .

Henstand i 30 min . ( ved stuetemperatur ) .

6.1.2 . Der omroeres foer filtrering ( 4.8 . ) .

6.1.3 . Der overfoeres til et centrifugeglas ( 4.5 . ) 50 ml filtrat , som er udtaget 60 min . efter filtreringens begyndelse .

Der tilsaettes 1 ml phosphowolframsyre ( 3.2 . ) . Efter omroering henstaar blandingen i 10 min . ved stuetemperatur .

Der centrifugeres ved 3 000 g i 10 min .

6.1.4 . Den klare vaeske fjernes . Bundfaldet vaskes to gange med 5 ml ethanol ( 3.3 . ) , idet det roeres op ved hjaelp af magnetomroereren eller en glasspatel ( 4.16 . ) , idet der saettes 2 ml ethanol til centrifugeglasset , og omroereren skylles med de resterende 3 ml ethanol . Hver gang centrifugeres ved 3 000 g i 10 min .

Det saaledes fremkomne bundfald toerres natten over ved stuetemperatur eller 90 min . ved 35 * C .

6.1.5 . Til det toerre bundfald saettes 4 ml 0,1 N svovlsyre ( 3.4 . ) , og det roeres grundigt op .

Centrifugeglasset lukkes ( f.eks . med parafilm ) og anbringes 40 min . i vandbad ved 80 * C under lejlighedsvis omroering for at sikre en god dispersion .

Der afkoeles til stuetemperatur og tilsaettes 4 ml acetatbuffer ( 3.5 . ) . Der blandes omhyggeligt .

6.1.6 . Der centrifugeres 10 min . ved 3 000 g . Maaling af sialinsyre eller N-acetylneuraminsyren foretages paa den klare vaeske .

Om noedvendigt , dvs . hvis ekstinktionen er for hoej , fortyndes med en blanding af 0,1 N svovlsyre ( 3.4 . ) og acetatbuffer ( 3.5 . ) ( 1 + 1 , v/v ) .

6.2 . Spektrofotometrisk maaling af den frie sialinsyre .

6.2.1 . 2 ml af den klare vaeske afpipetteres i et reagensglas ( 4.12 . ) , og der tilsaettes 2 ml resorcinolreagens ( 3.8 . ) .

6.2.2 . Glasset tilproppes , indholdet blandes omhyggeligt , og det anbringes noejagtig 15 min . i vandbad ved 100 * C ( 4.7 . ) . Der afkoeles til stuetemperatur under rindende vand .

6.2.3 . Der saettes 5 ml isoamylalkohol ( 3.9 . ) til reagensglasset . Det tilproppes , og indholdet blandes omhyggeligt ved kraftig rystning . Glasset anbringes derefter 15 min . i isbad .

6.2.4 . Der centrifugeres ved 1 000 g i 2 min . , saa der opnaas god adskillelse af de to faser .

6.2.5 . Ca . 3 ml af det oeverste lag ( isoamylalkoholfasen ) afpipetteres i en glascuvette , og ekstinktionen maales ved 580 nm i forhold til blindproeven senest 30 min . efter at glasset er taget op af isbadet .

6.3 . Blindproeve .

Der fremstilles en blindproeve som under 6.2.1 . til 6.2.5 . , idet der anvendes 1 ml 0,1 N svovlsyre ( 3.4 . ) og 1 ml acetatbuffer ( 3.5 . ) i stedet for de 2 ml filtrat , som er anfoert i 6.2.1 .

6.4 . Kalibreringskurve .

6.4.1 . Noejagtig 0-2-5-10-20 og 30 ml af oploesningen ( 3.10 . ) , svarende til 0-0 , 4-1-2-4 og 6 mg sialinsyre , afpipetteres i maalekolber paa 50 ml . Der fyldes op med 0,1 N svovlsyre ( 3.4 . ) og blandes omhyggeligt .

6.4.2 . Fra hver maalekolbe afpipetteres 1 ml i et reagensglas ( 4.12 . ) , og der tilsaettes 1 ml acetatbuffer ( 3.5 . ) . Efter omhyggelig blanding fortsaettes maalingen som under 6.2.2 . til 6.2.5 .

6.4.3 . Ekstinktionerne i 6.4.2 . afbildes grafisk mod de tilsvarende maengder af sialinsyre i mikrogram , som er anfoert i 6.4.2 . ( se vedlagte figur 1 ) .

7 . Beregning og angivelse af resultaterne

7.1 . Beregningsmaade .

Indholdet af sialinsyre , udtrykt i mg/g , beregnes efter foelgende formel :

C * 8/E

hvor C er den maengde af sialinsyre i mg , som aflaeses paa kalibreringskurven svarende til den ekstinkion , der er maalt i 6.2.5 . , og E er vaegten af proeven i ( 6.1.1 . ) .

Resultatet anfoeres i hele mikrogram .

7.2 . Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to maalinger ( som er udfoert samtidig eller umiddelbart efter hinanden af den samme person ) maa ikke vaere stoerre end 5 % af resultaternes aritmetiske gennemsnit .

8 . Fortolkning af resultaterne

Ved denne metode kan man kvantificere den eventuelle tilstedevaerelse af valle i skummetmaelkspulver .

8.1 . Beregning af middelvaerdien af fri sialinsyre i mikrogram pr . g proeve i forbindelse med dets indhold af protein udtrykt i procent ( m/m )

Y = 40 + 3 ( X - 34)2

naar

40 = middelindholdet af sialinsyre i mikrogram pr . g med hensyn til skummetmaelkspulver , der indeholder mindst 34 % protein .

X = det totale proteinindhold bestemt efter Kjeldahl-metoden FIL IDF 20 : 1962 .

8.2 . Beregning af procentdel vallepulver , der maatte vaere til stede

% valle = ( Z - Y ) /10

naar

Z = er indholdet af sialinsyre i den i henhold til 7.1 bestemte proeve i mikrogram pr . g .

Y = er gennemsnitsindholdet af fri sialinsyre i den i henhold til 8.1 beregnede proeve .

10 = konventionelt indholdet af fri sialinsyre udtrykt i mikrogram af et g loebevallepulver .

8.3 . Med forbehold af fejl i metoden og naturlige forskelle i proevens sammensaetning , kan man endeligt afgoere , at der ikke er valle til stede , naar den i 8.2 opnaaede vaerdi er 2,0 eller derunder . I tilfaelde af en hoejere vaerdi bekraeftes tilstedevaerelsen af valle , og den kvantificeres i henhold til formlen 8.2 . "