DA Den Europæiske Unions Tidende L 220/1

KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) Nr. 761/2009

af 23. juli 2009

om tilpasning til den tekniske udvikling af forordning (EF) nr. 440/2008 om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH)

(EØS-relevant tekst)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR —

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommissionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF (1), særlig artikel 13, stk. 3, og

ud fra følgende betragtninger:

(1) Kommissionens forordning (EF) nr. 440/2008 (2) indeholder de testmetoder, der skal anvendes til at bestemme stoffers fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og økotoksicitet i forbindelse med forordning (EF) nr. 1907/2006.

(2) Der er behov for ajourføring af forordning (EF) nr. 440/2008 derved, at nogle testmetoder ændres, og der indsættes flere nye testmetoder, som OECD har vedtaget. De interesserede parter er blevet hørt om dette forslag. Ændringerne udgør en tilpasning af de pågældende metoder til den videnskabelige og tekniske udvikling.

(3) Bestemmelserne om damptryk, som indfører den nye effusionsmetode, bør revideres.

(4) Det er påkrævet at tilføje en ny metode til måling af fibres længdevægtede geometriske middeldiameter.

(5) Det er hensigtsmæssigt at ajourføre forordning (EF) nr. 440/2008 ved, at der med høj prioritet indsættes en ny in vitro-testmetode for hudirritation, således at antallet af dyr, der anvendes til dyreforsøg, begrænses til et minimum i overensstemmelse med Rådets direktiv 86/609/EØF af 24. november 1986 om indbyrdes tilnærmelse af medlemsstaternes love og administrative bestemmelser om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (3). Selvom OECD stadig drøfter et udkast til in vitro-testmetode for hudirritation, bør metode B 46 i dette særlige tilfælde indføjes i denne forordning. Metode B 46 bør ajourføres hurtigst muligt, efter at der er opnået enighed i OECD, eller hvis der fremkommer yderligere oplysninger, der berettiger en sådan ændring.

(6) Væksthæmningstesten for alger bør revideres, idet der indsættes yderligere arter, og således at den opfylder behovene for vurdering af kemikaliers farlighed og klassificering.

(7) Der er behov for at tilføje en ny metode til måling af aerob mineralisering i overfladevand, som består i en test med simuleret bionedbrydning, og en ny metode til vurdering af toksiciteten over for slægten Lemna, som er en væksthæmningstest.

(8) Forordning (EF) nr. 440/2008 bør derfor ændres i overensstemmelse hermed.

(9) Foranstaltningerne i denne forordning er i overensstemmelse med udtalelse fra det udvalg, der er nedsat ved artikel 133 i forordning (EF) nr. 1907/2006 —

UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:

Artikel 1

Bilaget til forordning (EF) nr. 440/2008 ændres således:

1) Del A ændres således: a) Kapitel A.4 erstattes af teksten i bilag I til denne forordning. b) Teksten i bilag II til denne forordning indsættes som kapitel A.22.

2) Del B ændres således: Teksten i bilag III til denne forordning indsættes som kapitel B.46.

3) Del C ændres således: a) Kapitel C.3 erstattes af teksten i bilag IV til denne forordning. b) Teksten i bilag V og VI til denne forordning indsættes som kapitel C.25 og C.26.

Artikel 2

Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat. Udfærdiget i Bruxelles, den 23. juli 2009. På Kommissionens vegne Stavros DIMAS Medlem af Kommissionen

(1) EUT L 396 af 30.12.2006, s. 1.

(2) EUT L 142 af 31.5.2008, s. 1.

(3) EFT L 358 af 18.12.1986, s. 1.

BILAG I A.4. DAMPTRYK 1. METODE Metoden er ækvivalent med OECD TG 104 (2004). 1.1. INDLEDNING Denne reviderede version af metode A.4 (1) omfatter én supplerende metode, effusionsmetoden: isoterm termogravimetri, som er udviklet til stoffer med meget lavt tryk (ned til 10–10 Pa). Da der er et særligt behov for metoder til måling af damptrykket af stoffer med lavt damptryk, er de øvrige procedurer i denne metode revurderet med hensyn til andre anvendelsesområder. Ved termodynamisk ligevægt er damptrykket af et rent stof alene en funktion af temperaturen. Grundprincipperne findes beskrevet andetsteds (2)(3). Ingen enkelt måleteknik kan anvendes på hele trykområdet fra mindre end 10–10 til 105 Pa. I denne metode til damptrykmåling indgår otte metoder, som kan anvendes i forskellige damptrykintervaller. I tabel 1 sammenlignes de forskellige metoders anvendelighed og måleområde. Metoderne kan kun bruges på forbindelser, der ikke dekomponeres under de pågældende testbetingelser. I tilfælde, hvor de eksperimentelle metoder af tekniske grunde ikke kan anvendes, kan et tilnærmet damptryk beregnes, og i tillægget beskrives en anbefalet beregningsmetode. 1.2. DEFINITIONER OG ENHEDER Ved damptrykket af et stof forstås mætningstrykket over stoffet i fast eller flydende tilstand. Som trykenhed bør anvendes SI-enheden, der er pascal (Pa). Nedenfor er angivet andre, tidligere anvendte enheder og de tilhørende omregningsfaktorer: 1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfære = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa SI-enheden for temperatur er kelvin (K). Omregning af grader celsius til kelvin sker med formlen: T = t + 273,15 hvor T er kelvin-temperaturen eller den termodynamiske temperatur, og t er temperaturen i grader celsius. Tabel 1 Målemetode Stof Anslået repeterbarhed Anslået Reproducerbarhed Anbefalet område Faststof Væske Den dynamiske metode Letsmelteligt Ja indtil 25 % 1 til 5 % indtil 25 % 1 til 5 % 103 Pa til 2 × 103 Pa 2 × 103 Pa til 105 Pa Den statiske metode Ja Ja 5 til 10 % 5 til 10 % 10 Pa til 105 Pa 10–2 Pa til 105 Pa (1) Isoteniskop-metoden Ja Ja 5 til 10 % 5 til 10 % 102 Pa til 105 Pa Effusionsmetoden: damptrykbalance Ja Ja 5 til 20 % indtil 50 % 10–3 til 1 Pa Effusionsmetoden: Knudsen-celle Ja Ja 10 til 30 % — 10–10 til 1 P Effusionsmetoden: isotermisk termogravimetri Ja Ja 5 til 30 % indtil 50 % 10–10 til 1 Pa Gasmætningsmetoden Ja Ja 10 til 30 % indtil 50 % 10–10 til 103 Pa Metoden med roterende kugle Ja Ja 10 til 20 % — 10–4 til 0,5 Pa 1.3. TESTENS PRINCIP Sædvanligvis bestemmes damptrykket ved forskellige temperaturer. Inden for et begrænset temperaturområde er logaritmen til damptrykket af et rent stof en lineær funktion af den reciprokke termodynamiske temperatur ifølge den forenklede Clausius-Clapeyron-ligning: hvor: p = damptrykket i pascal ΔHv = fordampningsvarmen i J mol–1 R = den universelle gaskonstant, 8,314 J mol–1 K–1 T = temperaturen i K 1.4. REFERENCESTOFFER Referencestoffer behøver ikke anvendes. De bruges hovedsagelig til lejlighedsvis kontrol af en metodes præstationer og til at sammenligne resultaterne fra forskellige metoder. 1.5. BESKRIVELSE AF METODEN 1.5.1. Den dynamiske metode (Cottrells metode) 1.5.1.1. Princip Damptrykket bestemmes ved måling af stoffets kogepunktstemperatur ved forskellige givne tryk mellem ca. 103 og 105 Pa. Metoden anbefales også til kogepunktsbestemmelse. Til det formål er metoden brugbar op til 600 K. Væskers kogepunktstemperatur er ca. 0,1 °C højere i en dybde af 3-4 cm end ved overfladen på grund af det hydrostatiske tryk fra væskesøjlen. I Cottrells metode (4) er termometeret placeret i dampen over væskeoverfladen, og den kogende væske bringes til konstant at pumpe sig selv ud over termometerets kugle. Kuglen er dækket af et tyndt lag væske, der er i ligevægt med dampen ved atmosfæretryk. Termometeret viser derfor det sande kogepunkt uden fejl pga. overhedning eller hydrostatisk tryk. Den oprindelige pumpe, som Cottrell anvendte, ses i figur 1. Rør A indeholder den kogende væske. En indlejret platintråd B i bunden gør kogningen mere ensartet. Siderøret C fører til en kondensator, og kappen D forhindrer det kolde kondensat i at nå termometeret E. Når væsken i A koger, bliver bobler og væske opfanget af tragten og via de to arme af pumpen F ledt ud over termometerets kugle. Figur 1 Figur 2 Cottrell-pumpe (4) A: Termoelement B: Vakuum-stødpudevolumen C: Trykmåler D: Vakuum E: Målepunkt F: Varmeelement, ca. 150 W 1.5.1.2. Apparatur I figur 2 er vist et meget nøjagtigt apparat, der arbejder efter Cottrells princip. Det består af et rør med en kogesektion i underdelen, en svaler i midten og en afgang med flange i overdelen. Cottrell-pumpen er anbragt i kogesektionen, der opvarmes af en elektrisk varmepatron. Temperaturen måles af et termoelement med kappe eller af et modstandstermometer, der er ført gennem flangen foroven. Afgangen er tilsluttet trykreguleringssystemet. Dette består af en vakuumpumpe, et stødpudevolumen, en trykregulator for tilførsel af nitrogen til trykregulering og et manometer. 1.5.1.3. Fremgangsmåde Stoffet anbringes i kogesektionen. Faste stoffer, der ikke er pulverformige, kan volde problemer, som dog undertiden kan løses ved opvarmning af kølekappen. Apparatet forsegles ved flangen, og stoffet afgasses. Skumdannende stoffer kan ikke måles med denne metode. Derefter sættes det laveste ønskede tryk, og der tændes for opvarmningen. Samtidig tilsluttes temperaturføleren til en skriver. Ligevægt er nået, når der registreres konstant kogetemperatur ved konstant tryk. Særlig omhu må udvises for at undgå stødkogning. Desuden skal kondensationen i svaleren være fuldstændig. Ved damptryksbestemmelse for letsmeltelige faste stoffer skal man passe på, at svaleren ikke bliver tilstoppet. Efter at dette ligevægtspunkt er nået, sættes et højere tryk. Processen fortsættes på denne måde, indtil 105 Pa er nået (i alt 5 til 10 målepunkter). Som kontrol gentages ligevægtspunkterne ved faldende værdier af trykket. 1.5.2. Den statiske metode 1.5.2.1. Princip Ved den statiske metode (5) bestemmes damptrykket i termodynamisk ligevægt ved en fastlagt temperatur. Metoden er velegnet til enkeltstoffer samt væsker og faste stoffer bestående af flere komponenter i området fra 10–1 til 105 Pa samt, med tilstrækkelig omhu, i området 1 til 10 Pa. 1.5.2.2. Apparatur Apparatet består af et termostatbad (præcision ±0,2 K), en prøvebeholder tilsluttet en vakuumledning, et manometer og et system til trykregulering. Prøvekammeret (figur 3a) er tilsluttet vakuumledningen gennem en ventil og et differensmanometer (et U-rør indeholdende en egnet manometervæske), der fungerer som nulindikator. I differensmanometeret kan anvendes kviksølv, siliconeolie og phthalater, afhængigt af trykområdet og teststoffets kemiske egenskaber. Kviksølv bør dog om muligt undgås af hensyn til miljøet. Teststoffet må ikke være nævneværdigt opløseligt i væsken i U-røret eller kunne reagere med denne. I stedet for U-røret kan anvendes en trykmåler (figur 3b). I manometeret kan kviksølv anvendes i området fra normalt tryk ned til 102 Pa, mens siliconeolier og phthalater er egnede ved tryk under 102 Pa ned til 10 Pa. Der findes andre trykmålere, som kan anvendes ved tryk under 102 Pa, og opvarmede membrankapacitetsmanometre kan endda bruges ved tryk under 10–1 Pa. Temperaturen måles enten på ydervæggen af den beholder, som indeholder prøven, eller i selve beholderen. 1.5.2.3. Fremgangsmåde I det i figur 3a beskrevne apparatur fyldes U-røret med den valgte væske, som skal afgasses ved forhøjet temperatur, før der aflæses. Teststoffet anbringes i apparatet og afgasses ved reduceret temperatur. For prøver med flere komponenter skal temperaturen være tilstrækkelig lav til at sikre, at materialets sammensætning ikke ændres. Ligevægt kan nås hurtigere ved omrøring. Prøven kan køles med flydende nitrogen eller tøris, men der må udvises forsigtighed, så kondensation af luft eller pumpevæske undgås. Mens ventilen over prøvebeholderen er åben, tilsluttes sugningen i nogle minutter for at fjerne luften. Om nødvendigt gentages afgasningen nogle gange. Figur 3a Figur 3b Når prøven opvarmes med lukket ventil, stiger damptrykket. Derved ændres væskeligevægten i U-røret. For at kompensere herfor lukkes der nitrogen eller luft ind i apparatet, indtil differenstrykindikatoren igen viser nul. Det nødvendige tryk hertil kan aflæses på manometeret eller på et instrument med større præcision. Dette tryk svarer til stoffets damptryk ved måletemperaturen. På det i figur 3b viste apparatet aflæses damptrykket direkte. Damptrykket bestemmes med passende små temperaturintervaller (ca. 5 til 10 målepunkter i alt) op til den ønskede maksimumtemperatur. Lavtemperaturaflæsningerne skal gentages som kontrol. Hvis værdierne fra gentagelserne ikke falder sammen med den kurve, der er opnået ved stigende temperatur, kan dette have følgende årsager: i) prøven indeholder stadig luft (f.eks. ved højviskøse materialer) eller flygtige stoffer, der frigives ved opvarmning ii) stoffet undergår en kemisk reaktion i det undersøgte temperaturområde (f.eks. dekomposition eller polymerisering). 1.5.3. Isoteniskop-metoden 1.5.3.1. Princip Isoteniskopet (6) bygger på den statiske metodes princip. I metoden anbringes en prøve i en kugle, der holdes ved konstant temperatur og er tilsluttet til et manometer og en vakuumpumpe. Urenheder, der er flygtigere end stoffet, fjernes ved afgasning ved reduceret tryk. Prøvens damptryk ved de valgte temperaturer afbalanceres ved et kendt tryk af inert gas. Isoteniskopet er oprindeligt udviklet til måling af damptrykket af visse flydende kulbrinter, men egner sig også til undersøgelse af faste stoffer. Metoden egner sig normalt ikke til systemer med flere komponenter. Resultaterne er kun behæftet med små fejl for prøver indeholdende ikke-flygtige urenheder. Det anbefalede område er 102 til 105 Pa. 1.5.3.2. Apparatur Et eksempel på en måleanordning er vist i figur 4. En komplet beskrivelse kan findes i ASTM D 2879-86 (6). 1.5.3.3. Fremgangsmåde Når teststoffet er en væske, fungerer den selv som manometervæske i differensmanometeret. Isoteniskopet påfyldes så meget af væsken, at manometerets kugle og korte gren er fyldt. Isoteniskopet tilslutte et vakuumsystem og udpumpes, hvorefter det fyldes med nitrogen. Udpumpningen og gennemskylningen af systemet gentages to gange for at fjerne tilbageværende oxygen. Det påfyldte isoteniskop anbringes vandret, så prøven fordeler sig i et tyndt lag i prøvekuglen og manometeret. Trykket i systemet nedsættes til 133 Pa, og prøven opvarmes forsigtigt, til den netop koger (fjernelse af opløste gasser). Isoteniskopet anbringes derefter, så prøven løber tilbage i kuglen og fylder manometerets korte gren. Trykket holdes på 133 Pa. Prøvekuglens udtrukne spids opvarmes med en svag flamme, indtil den afgivne damp fra teststoffet har udvidet sig så meget, at en del af prøven fra den øverste del af kuglen og manometergrenen fortrænges ind i manometeret og derved danner et dampfyldt, nitrogenfrit rum. Isoteniskopet anbringes derefter i et termostatbad, og nitrogentrykket indstilles, til det er lig prøvens. I ligevægt er nitrogentrykket lig med teststoffets damptryk. Figur 4 Til faste stoffer anvendes som manometervæske siliconeolie eller phthalater, afhængigt af tryk- og temperaturområdet. Den afgassede manometervæske fyldes i en udposning på isoteniskopets lange gren. Det faste stof, der skal undersøges, anbringes i prøvekuglen og afgasses ved en forhøjet temperatur. Derefter holdes isoteniskopet skråt, så manometervæsken kan løbe ind i U-røret. 1.5.4. Effusionsmetoden: damptrykvægt (7) 1.5.4.1. Princip Teststoffet opvarmes i en lille ovn og anbringes i en udpumpet glasklokke. Ovnen er dækket af et låg med små huller med kendt diameter. Den damp, som fra stoffet afgives gennem et af hullerne, ledes op mod vægtskålen på en meget fintmærkende vægt, der ligeledes er placeret i den udpumpede glasklokke. I nogle udformninger er vægtskålen omgivet af en køleboks, der leder varmen bort til omgivelserne ved varmeledning, og den køles ved stråling, så den udslippende damp kondenserer på den. Dampstrålens impuls påfører en kraft på vægten. Damptrykket kan beregnes på to måder: direkte af kraften på vægtskålen og af fordampningshastigheden ved hjælp af Hertz-Knudsen-ligningen (2): hvor: G = fordampningshastighed (kg s–1 m–2) M = molær masse (g mol–1) T = temperatur (K) R = den universelle gaskonstant (J mol–1 K–1) P = damptryk (Pa) Det anbefalede område er 10–3 til 1 Pa. 1.5.4.2. Apparatur Det generelle princip i apparatet er vist i figur 5. Figur 5 A: Bundplade F: Køleboks og kølestang B: Drejespoleinstrument G: Muffelovn C: Glasklokke H: Dewarkar med flydende nitrogen D: Vægt med vægtskål I: Måling af prøvens temperatur E: Anordning til måling af vakuum J: Teststof 1.5.5. Effusionsmetoden: Knudsen-celle 1.5.5.1. Princip Metoden bygger på bestemmelse af den masse af dampformigt teststof, der pr. tidsenhed strømmer ud af en Knudsen-celle (8) gennem en mikroskopisk åbning under ekstremt vakuum. Massen af udstrømmede damp kan enten bestemmes af cellens massetab eller ved at lade dampen kondensere ved lav temperatur og bestemme den fordampede stofmængde ved kromatografi. Damptrykket beregnes ved at anvende Hertz-Knudsen-relationen (se punkt 1.5.4.1) med korrektionsfaktorer, der afhænger af apparaturets parametre (9). Det anbefalede område er 10–10 til 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2. Apparatur Apparatets generelle princip er illustreret i figur 6. Figur 6 1: Vakuumtilslutning 7: Skruelåg 2: Huller fra platinmodstandstermometer eller temperaturmåling og -kontrol 8: Vingemøtrikker 3: Låg til vakuumbeholder 9: Bolte 4: O-ring 10: Effusionsceller af rustfrit stål 5: Vakuumbeholder af aluminium 11: Varmepatron 6: Anordning til isætning og udtagning af effusionsceller 1.5.6. Effusionsmetoden: isotermisk termogravimetri 1.5.6.1. Princip Metoden bygger på bestemmelse af stigningen i teststoffets fordampningshastighed ved forhøjet temperatur og atmosfæretryk ved hjælp af termogravimetri (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Fordampningshastighederne vT bestemmes ved, at den valgte forbindelse eksponeres for en atmosfære af langsomt strømmende inert gas, mens vægttabet overvåges ved fastlagte isotermiske temperaturer T i kelvin i passende tidsrum. Damptrykkene pT beregnes af vT-værdierne ved udnyttelse af den lineære sammenhæng mellem logaritmen til damptrykket og logaritmen til fordampningshastigheden. Om nødvendigt kan der ekstrapoleres til temperaturerne 20 og 25 °C ved regressionsanalyse af log pT som funktion af 1/T. Metoden er egnet til stoffer med damptryk helt ned til 10–10 Pa (10–12 mbar) og med en renhed så tæt som muligt på to 100 % for at undgå fejlfortolkning af målte vægttab. 1.5.6.2. Apparatur Det generelle princip i testopstillingen er vist i figur 7. Figur 7 Prøveholderpladen er ophængt i en mikrovægt i et kammer med kontrolleret temperatur, hvor der strømmer tør nitrogengas forbi den, som fjerner de fordampede molekyler af teststof. Efter at have forladt kammeret bliver gasstrømmen renset i en sorptionsenhed. 1.5.6.3. Fremgangsmåde Teststoffet påføres som et homogent lag på en matteret glasplade. For faste stoffer vædes pladen ensartet med en opløsning af stoffet i et egnet opløsningsmiddel og tørres i inert atmosfære. Målingen sker ved, at den overtrukne plade hænges op i den termogravimetriske analysator, hvorefter dens vægttab registreres kontinuerligt som funktion af tiden. Fordampningshastigheden vT ved en nærmere angivet temperatur beregnes af prøvepladens vægttab Dm ved hjælp af udtrykket hvor F er teststoflagets overfladeareal, sædvanligvis prøvepladens overfladeareal, og t er tiden svarende til vægttabet Δm. Damptrykket pT beregnes af funktionen for fordampningshastigheden vT: log pT = C + D log vT hvor C og D er konstanter, der er specifikke for den anvendte testopstilling og afhænger af målekammerets diameter og af gassens strømningshastighed. Disse konstanter bestemmes én gang for alle ved måling på et sæt forbindelser med kendt damptryk og regression af log pT mod log vT (11)(21)(22). Sammenhængen mellem damptrykket pT og temperaturen T i kelvin er givet ved log pT = A + B 1/T hvor A og B er konstanter, der fås ved regression af log pT mod 1/T. Heraf kan damptrykket ved en vilkårlig temperatur beregnes ved ekstrapolation. 1.5.7. Gasmætningsmetoden (23) 1.5.7.1. Princip En inert gas ledes ved rumtemperatur og med kendt flowhastighed gennem eller hen over en prøve af teststoffet, tilstrækkelig langsomt til at sikre mætning. Det er afgørende, at gassen når til mætning. Det transporterede stof opfanges, sædvanligvis med hjælp af et sorptionsmiddel, og dets mængde bestemmes. I stedet for opsamling af dampen og efterfølgende analyse kan man benytte in-line analyse, f.eks. ved gaskromatrografi, til kvantitativ bestemmelse af den transporterede mængde materiale. Damptrykket beregnes, idet det forudsættes, at idealgasloven gælder, og at det totale tryk af en gasblanding er lig summen af gassernes partialtryk. Teststoffets partialtryk, dvs. damptrykket, beregnes af det kendte totale gasvolumen og vægten af det transporterede materiale. Gasmætningsmetoden er anvendelig på faste og flydende stoffer. Den kan anvendes på damptryk ned til 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). Metoden er mest pålidelig ved damptryk under 103 Pa. Over 103 Pa bliver damptrykket sædvanligvis overvurderet, antagelig som følge af aerosoldannelse. Da damptrykket måles ved stuetemperatur, undgår man at skulle ekstrapolere fra høje temperaturer, hvilket ofte kan medføre alvorlige fejl. 1.5.7.2. Apparatur Metoden kræver brug af et termostateret hus. Skitsen i figur 8 viser et hus, der med tre holdere til faste og tre til flydende prøver giver mulighed for tredobbelte analyser af enten et fast eller et flydende teststof. Temperaturen styres med en nøjagtighed på ±0,5 °C eller bedre. Figur 8 Som bæregas anvendes sædvanligvis nitrogen, men brug af en anden gas kan undertiden være nødvendig (24). Bæregassen skal være tør. Gasstrømmen opdeles i 6 strømme, der styres ved hjælp af nåleventiler (med en åbning på ca. 0,79 mm) og ledes ind i huset gennem et kobberrør med en lysning på 3,8 mm. Efter temperaturudligning ledes gassen gennem prøven og sorptionsfælden og forlader huset. Faste prøver anbringes med glasuldspropper på hver side i et glasrør med 5 mm lysning (se figur 9). Figur 10 viser en prøveholder til væskeformige prøver og sorptionssystemet. Den mest reproducerbare metode til måling af væskers damptryk er at påføre væsken på glaspellets eller på et inert sorptionsmiddel såsom silica og pakke holderen med disse pellets. Bæregassen kan i stedet ledes gennem en grov glasfritte og gennemboble en kolonne med flydende teststof. Figur 9 Figur 10 Sorptionssystemet indeholder en forreste sorptionssektion og en backup-sorptionssektion. Ved meget lave damptryk et det kun små mængder, der indfanges af sorptionsmidlet, og adsorption til glasulden og glasrøret mellem prøven og sorptionsmidlet kan være et alvorligt problem. En anden effektiv metode til opsamling af det fordampede materiale er dampfælder kølet med tøris. De giver ikke modtryk i mætningskolonnen, og det opfangede materiale kan let fjernes fuldstændigt. 1.5.7.3. Fremgangsmåde Flowhastigheden af den udstrømmende bæregas måles ved rumtemperatur. Flowhastigheden kontrolleres ofte under testen for at sikre nøjagtig bestemmelse af det totale volumen bæregas. Hertil bør fortrinsvis anvendes kontinuerlig overvågning med et masseflowmeter. For at gasfasen skal blive mættet, kan det være nødvendigt med en ret lang kontakttid og dermed en lav flowhastighed af gassen (25). Ved testens slutning skal den forreste sorptionssektion og backup-sorptionssektionen analyseres hver for sig. Stoffet på hver sektion desorberes ved tilsætning af et opløsningsmiddel. De resulterende opløsninger analyseres kvantitativt til bestemmelse af den desorberede vægt fra hver sektion. Valg af analysemetode (herunder valg af sorptionsmiddel og opløsningsmiddel til desorption) træffes ud fra teststoffets beskaffenhed. Effektiviteten af desorptionen bestemmes ved, at en kendt mængde teststof injiceres på sorptionsmidlet, hvorefter det desorberes, og den genfundne mængde bestemmes. Det er vigtigt at bestemme effektiviteten af desorptionen ved en koncentration svarende til prøvens og under samme betingelser som i testen. For at sikre, at bæregassen er mættet med teststof, anvendes tre forskellige flowhastigheder af gassen. Hvis det beregnede damptryk viser sig at være uafhængigt af flowhastigheden, kan gassen antages at være mættet. Damptrykket beregnes af udtrykket: hvor: P = damptryk (Pa) W = masse af det fordampede teststof (g) V = volumen af den mættede gas (m3) R = den universelle gaskonstant 8,314 (J mol–1 K–1) T = temperatur (K) M = teststoffets molmasse (g mol–1) De målte volumener skal korrigeres for tryk- og temperaturforskelle mellem flowmeteret og mætningskolonnen. 1.5.8. Roterende kugle 1.5.8.1. Princip I metoden anvendes et viskosimeter, hvis måleelement er en lille stålkugle, som holdes svævende i et magnetisk felt og sættes i rotation af roterende felter (26)(27)(28). Kuglens rotationshastighed måles med detektorspoler. Når kuglen har nået en given rotationshastighed, sædvanligvis ca. 400 o./min., standses energitilførslen til kuglen, som derefter bremses af gasfriktionen. Faldet i rotationshastigheden registreres som funktion af tiden. Damptrykket afledes af den trykafhængige nedbremsning af stålkuglen. Det anbefalede område er 10–4 til 0,5 Pa. 1.5.8.2. Apparatur Testopstillingen er vist skematisk i figur 11. Målehovedet er placeret i et termostateret hus, der er reguleret inden for 0,1 °C. Prøveholderen er placeret i et separat hus, der ligeledes er reguleret inden for 0,1 °C. Alle de øvrige dele af testopstillingen holdes ved højere temperatur for at undgå kondensation. Hele apparatet er tilsluttet et højvakuum-system. Figur 11 2. DATA OG RAPPORTERING 2.1. DATA Damptrykket skal bestemmes ved mindst to temperaturer med en af ovenstående metoder. I området 0 til 50 °C bør fortrinsvis anvendes tre eller flere temperaturer for at eftervise damptrykkurvens linearitet. Ved effusionsmetoden (Knudsen-celle og isotermisk termogravimetri) og ved gasmætningsmetoden anbefales 120 til 150 °C som temperaturområde for målingen i stedet for 0 til 50 °C. 2.2. TESTRAPPORT Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger: — den anvendte metode — nøjagtig specifikation af stoffet (identitet og urenheder) og eventuelle indledende rensningstrin — mindst to værdier af damptryk og temperatur (helst tre eller flere) — i området fra 0 til 50 °C (eller 120 til 150 °C) — mindst en af temperaturerne bør være 25 °C eller derunder, hvis dette er teknisk muligt med den valgte metode — alle originale data — en kurve over log p som funktion af 1/T — et beregnet damptryk ved 20 eller 25 °C. Hvis der iagttages en omdannelse (tilstandsændring, dekomposition), skal følgende oplysninger noteres: — ændringens art — den temperatur, ved hvilken ændringen finder sted ved atmosfæretryk — damptryk ved 10 og 20 °C under omdannelsestemperaturen og 10 og 20 °C over denne temperatur (bortset fra omdannelse fra fast stof til gas). Alle oplysninger og bemærkninger, der er relevante for fortolkningen af resultaterne, skal rapporteres, specielt hvad angår urenheder og stoffets fysiske tilstand. 3. LITTERATUR (1) De Europæiske Fællesskabers Tidende L 383 A, 26-47 (1992). (2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London. (3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. (4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. (5) NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa — Static method. (6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. (7) NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. (8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. (9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. (10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532. (11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000). (12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22-28. (13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269-278. (14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122. (15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147. (16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393-400. (17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161-168. (18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31. (19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310. (20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512-20. (21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. (22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). (23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Register, Washington DC. (24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. (25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. (26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. (27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. (28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Ved brug af kapacitansmanometer. Tillæg Metode til tilnærmet beregning INDLEDNING Tilnærmede værdier af damptrykket kan anvendes: — til at afgøre, hvilken testmetode der er velegnet — til at give et skøn eller en grænseværdi i tilfælde, hvor den eksperimentelle metode af tekniske grunde ikke kan anvendes. METODE TIL TILNÆRMET BEREGNING Damptrykket af faste stoffer og væsker kan beregnes tilnærmet med den modificerede Watson-korrelation (a). De eneste eksperimentelle data, der kræves, er det normale kogepunkt. Metoden kan anvendes i hele trykområdet fra 105 Pa til 10–5 Pa. Detaljerede oplysninger om metoden findes i »Handbook of Chemical Property Estimation Methods« (b). Se også OECD Environmental Monograph No.67 (c). BEREGNINGSMETODE Damptrykket beregnes af følgende udtryk: hvor: T = den betragtede temperatur Tb = normalkogepunktet Pvp = damptrykket ved temperaturen T ΔHvb = fordampningsvarmen ΔZb = kompressibilitetsfaktoren (anslået værdi 0,97) m = en empirisk faktor, der afhænger af den fysiske tilstand ved den betragtede temperatur Endvidere gælder: hvor KF er en empirisk faktor, der tager hensyn til stoffets polaritet. Faktoren KF er for en række forbindelser af forskellig art angivet i reference (b). I mange tilfælde indeholder de foreliggende data en angivelse af kogepunktet ved reduceret tryk. I så fald beregnes damptrykket af følgende udtryk: hvor T1 er kogepunktet ved det reducerede tryk P1. RAPPORT Hvis den tilnærmede beregningsmetode anvendes, skal beregningen være fuldstændig dokumenteret i rapporten. REFERENCER (a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. (b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. (c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

BILAG II A.22. FIBRES LÆNGDEVÆGTEDE GEOMETRISKE MIDDELDIAMETER 1. METODE 1.1. INDLEDNING Denne metode beskriver en procedure til måling af den længdevægtede geometriske middeldiameter (Length Weighted Geometric Mean Diameter — LWGMD) af syntetiske mineralfibre i løs vægt (Man Made Mineral Fibres — MMMF). Idet LWGMD af populationen med 95 % sandsynlighed vil ligge mellem 95 % konfidensgrænserne (LWGMD ± to standardfejl) af prøven, vil den fremkomne værdi (testværdien) være den laveste 95 % konfidensgrænse af prøven (dvs. LWGMD — 2 standardfejl). Metoden er baseret på et opdateret udkast (juni 1994) til HSE's industriprocedure, som blev fastlagt på et møde mellem ECFIA og HSE i Chester den 26. september 1993, og som er udviklet for og med udgangspunkt i et yderligere forsøg blandt forskellige laboratorier (1, 2). Denne målemetode kan anvendes til at bestemme fiberdiameteren af bulk-materialer eller produkter, der indeholder MMMF'er, herunder ildfaste keramiske fibre (RCF), Man-Made Vitreous Fibres (MMVF — fællesbetegnelse for syntetiske fibre indeholdende siliciumdioxid og en række andre metaloxider) og endelig krystallinske og polykrystallinske fibre. Længdevægtning er en metode, der skal kompensere for den virkning af diameterfordelingen, der skyldes brud på lange fibre, når materialer udsættes for prøveudtagning eller håndtering. Der anvendes geometrisk statistik (geometrisk middelværdi) til at måle størrelsesfordelingen af MMMF-diametre, idet disse diametre almindeligvis har størrelsesfordelinger, der tilnærmer sig log-normal. Måling af både længde og diameter er ensformigt og tidskrævende, men hvis man kun måler de fibre, der rører en uendelig tynd linje på et SEM-synsfelt, vil sandsynligheden for at vælge en given fiber være proportional med dens længde. Da der her tages hensyn til længden i beregninger om længdevægtning, er der kun behov for diameteren, hvorefter LWGMD-2SE kan beregnes som beskrevet. 1.2. DEFINITIONER Partikel: et objekt med et længde-breddeforhold på mindre end 3:1. Fiber: et objekt med et længde-breddeforhold (formatforhold) på mindst 3:1. 1.3. ANVENDELSESOMRÅDE OG BEGRÆNSNINGER Metoden er udviklet med fokus på diameterfordelinger med mediandiametre fra 0,5 μm til 6 μm. Større diametre kan måles ved hjælp af mindre SEM-forstørrelser, men metoden bliver gradvist mere begrænset med finere fiberfordelinger, og derfor anbefales en TEM-måling (transmission electron microscope), hvis mediandiameteren er under 0,5 μm. 1.4. Principper for testmetoden Der udtages en række repræsentative kerneprøver fra fibertæppet eller fra de løse bulkfibre. Bulkfibrene afkortes i en knusningsproces, hvorefter der spredes en repræsentativ delprøve i vand. Der udtages måleprøver, der filtreres gennem et polykarbonatfilter med en porestørrelse på 0,2 μm, hvorefter de forberedes til undersøgelse i scanning-elektronmikroskop (SEM-teknologi). Fiberdiametrene måles ved en skærmforstørrelse på x 10 000 eller højere (1) ved hjælp af en linjeskæringspunktmetode for at give et objektivt estimat af mediandiameteren. Det laveste 95 % konfidensinterval (baseret på en en-sidet test) beregnes for at give et estimat af den laveste værdi af materialets geometriske middelfiberdiameter. 1.5. Beskrivelse af testmetoden 1.5.1. Sikkerhedsforanstaltninger Medarbejdernes eksponering for luftbårne fibre bør minimeres, og der bør anvendes aftræksskab eller handskekasse ved håndtering af tørre fibre. Der bør gennemføres periodisk overvågning af medarbejdernes eksponering med henblik på at vurdere effektiviteten af de anvendte kontrolmetoder. Ved arbejde med MMMF'er skal der bæres engangshandsker for at reducere hudirritation og for at forebygge krydskontaminering. 1.5.2. Apparatur og udstyr — presse og matricer (der kan producere 10 MPa) — polykarbonat-kapillærfilter med en porestørrelse på 0,2 μm (25 mm diameter) — membranfilter i ester-cellulose med en porestørrelse på 5 μm til brug som backing-filter — apparatur til glasfiltrering (eller engangsfiltreringssystemer), der passer til filtre med en diameter på 25 mm (f.eks. Millipore glas-mikroanalysesæt, type nr. XX10 025 00) — frisk destilleret vand, der er filtreret gennem et filter med en porestørrelse på 0,2 μm for at fjerne mikroorganismer — sputter-coater med guld eller guld/palladium target — scanning elektronmikroskop med en opløsning ned til 10 nm og med forstørrelse x 10 000 — diverse: spatler, skalpelblade type 24, pincetter, SEM-rør, carbon-lim eller carbon-klæbebånd, silver-dag — ultralydsonde eller bordmonteret ultralydsbad — kerneprøvebor eller propbor til udtagelse af kerneprøver af MMMF-tæppe. 1.5.3. Testprocedure 1.5.3.1. Prøveudtagning Til tæpper og måtter anvendes der et 25 mm kerneprøvebor eller propbor til udtagning af stikprøver af tværsnittet. De bør være jævnt fordelt over hele bredden af et kort stykke tæppe eller udtages fra tilfældige områder, hvis der er lange tæppelængder til rådighed. Man kan anvende det samme udstyr til udtagning af tilfældige stikprøver fra løse fibre. Hvis det er muligt, skal der udtages seks stikprøver for at afspejle lokale variationer i bulkmaterialet. De seks kerneprøver knuses med et pressestempel på 50 mm diameter ved 10 MPa. Materialet blandes med spatel og presses igen ved 10 MPa. Endelig fjernes materialet fra pressen og opbevares i en lukket glasflaske. 1.5.3.2. Behandling af stikprøver Hvis det er nødvendigt, kan det organiske bindemiddel fjernes ved at anbringe fibrene i en ovn ved 450 °C i ca. en time. Ved hjælp af Cone-and-Quarter-teknikken opdeles stikprøven (dette skal udføres i et støvskab). Med en spatel tilsættes en lille mængde (< 0,5 g) af stikprøven til 100 ml frisk destilleret vand, der er filtreret gennem et 0,2 μm membranfilter (alternative former for ultra-rent vand kan også bruges, hvis de har vist sig tilfredsstillende). Prøven dispergeres omhyggeligt ved hjælp af en ultralyd-sonde med en effekt på 100 W, der er indstillet, så der opstår kavitation. (Hvis der ikke kan tilvejebringes en sonde, kan følgende metode anvendes: Ryst og vend i 30 sekunder; derefter ultralydsbehandling i bordmonteret ultralydsbad i fem minutter, og endelig skal der igen rystes og vendes i 30 sekunder). Umiddelbart efter dispersion af fibrene udtages der et antal måleprøver (f.eks. tre måleprøver på 3, 6 og 10 ml) med en pipette med stor åbning (kapacitet: 2-5 ml). Hver delprøve vacuumfiltreres gennem et 0,2 μm polykarbonatfilter med et MEC backing-filter med en porestørrelse på 5 µm og med en 25 mm glasfiltertragt med cylindrisk beholder. Der hældes ca. 5 ml filtreret destilleret vand i tragten, og delprøven tilføres derefter langsomt vandet med pipette, idet pipettespidsen holdes under væskeoverfladen. Pipette og beholder skal gennemskylles omhyggeligt efter afpipetteringen, idet tynde fibre har en tendens til at samles på overfladen. Filtret fjernes forsigtigt og tages af fra backing-filtret, inden det sættes til tørre i en beholder. Med en vippende bevægelse udskæres et kvart eller et halvt filterudsnit af det filtrerede bundfald ved hjælp af et skalpelblad type 24. Udskæringen anbringes forsigtigt på en SEM-stub ved hjælp af en klæbende carbon-tab eller carbon-lim. Der skal påsættes Silver-dag mindst tre steder for at optimere den elektriske kontakt på filterkanterne og på stubben. Når den påførte lim/silver-dag er tør, sputtercoates ca. 50 nm guld eller guld/palladium på overfladen af bundfaldet. 1.5.3.3. Kalibrering og betjening af SEM 1.5.3.3.1. Kalibrering SEM-kalibrering bør kontrolleres mindst en gang om ugen (og helst hver dag) ved hjælp af et Certified Calibration Grid. Kalibreringen bør kontrolleres i forhold til en certificeret standard. Hvis den målte værdi (SEM) ikke ligger inden for ±2 % af den certificerede værdi, skal SEM-kalibreringen gentages eller justeres. SEM skal kunne arbejde med mindst en synlig minimumdiameter på 0,2 µm ved hjælp af en reel stikprøvematrix ved en forstørrelse på x 2 000. 1.5.3.3.2. Betjening SEM skal arbejde ved 10 000 forstørrelse (2) og indstilles til at give en god opløsning med et acceptabelt billede ved langsomme scan-rates, f.eks. 5 sekunder pr. frame. Selv om betjeningen af forskellige SEM'er kan variere noget, så gælder det generelt, at man for at opnå den bedste synlighed og opløsning ved materialer med relativt lav atomvægt bør anvende stigende spændinger på 5-10 keV og indstille apparaturet til lille punktstørrelse og kort arbejdsafstand. Da man arbejder lineært gennem materialet, skal man vælge en 0o hældning for at minimere genfokusering eller, hvis SEM'en er udstyret med et eucentrisk trin, skal denne arbejdsafstand anvendes. Der kan vælges en lavere forstørrelse, hvis materialet ikke indeholder små (diameter) fibre, og fiberdiameteren er stor (> 5 µm). 1.5.3.4. Størrelsesvurdering 1.5.3.4.1. Undersøgelse ved lille forstørrelse til vurdering af stikprøven Først skal stikprøven undersøges ved lille forstørrelse for at afdække eventuel sammenklumpning af store fibre og for at vurdere fibertætheden. Hvis der konstateres for stor sammenklumpning, anbefales det, at der forberedes en ny prøve. Af hensyn til den statistiske nøjagtighed er det nødvendigt at måle et minimumsantal fibre. Ligeledes er høj fibertæthed at foretrække, da undersøgelse af tomme felter er tidskrævende og uden værdi for analysen. Hvis filtret derimod er overbelastet, er det svært at måle alle målbare fibre, og desuden risikerer man ikke at få målt de små fibre, da de let ligger skjult af de større fibre. En systematisk fejl i retning af en for høj værdi af LWGMD kan optræde som følge af fibertætheder på over 150 fibre pr. millimeter lineært snit. På den anden side vil lave fiberkoncentrationer forøge analysetiden, og derfor kan det ofte bedre betale sig at forberede en prøve med en tæthed, der ligger nær optimal tæthed, end at blive ved med at tælle på filtre med lave koncentrationer. Den optimale fibertæthed vil give et gennemsnit på ca. et eller to tælbare fibre pr. felt ved 5 000 forstørrelse. Den optimale tæthed vil imidlertid afhænge af størrelsen (diameteren) af fibrene. Derfor skal analysemedarbejderen støtte sig til en ekspertvurdering for at kunne afgøre, om fibertætheden er nær ved det optimale eller ej. 1.5.3.4.2. Længdevægtning af fiberdiametre Det er kun de fibre, der rører (eller ligger på tværs af) en (uendelig) tynd linje afsat på SEM'ens skærm, der tælles. Derfor er der afsat en horisontal (eller vertikal) linje tværs gennem skærmens centrum. Alternativt er der afsat et enkelt punkt i skærmens centrum, hvorefter der foretages en kontinuerlig scanning i en retning på tværs af filtret. Enhver fiber, der har et formatforhold større end 3:1, og som berører eller går gennem dette punkt, bliver underkastet måling af diameter, hvorefter resultatet registreres. 1.5.3.4.3. Størrelsesvurdering af fibre Det anbefales, at der måles mindst 300 fibre. Hver fiber måles kun én gang ved skæringspunktet med den linje eller det punkt, der er afsat på billedet (eller tæt ved skæringspunktet, hvis fiberkanterne er skjult). Hvis man støder på fibre med uensartede tværsnit, skal man foretage en måling, der repræsenterer fiberens gennemsnitsdiameter. Man skal være meget omhyggelig med at udpege kanten og måle den korteste afstand mellem fiberens kanter. Størrelsesvurderingen kan ske online eller offline på lagrede billeder eller fotos. Det anbefales at bruge systemer til halvautomatisk billedmåling, der henter data direkte ind i et regneark, da de sparer tid og udelukker afskriftsfejl. Endelig automatiserer de beregningerne. Enderne af lange fibre skal undersøges ved lille forstørrelse for at sikre, at de ikke krummer tilbage i målefeltet og derved måles flere gange. 2. DATA 2.1. BEHANDLING AF RESULTATERNE Fiberdiametre følger almindeligvis ikke en normalfordeling. Hvis man gennemfører en log-transformation, er det dog muligt at opnå en fordeling, der ligger nær ved normalfordelingen. Den aritmetiske middelværdi (mean lnD) og standardafvigelsen (SDlnD) af den naturlige logaritme (lnD) til n fiberdiametre (D) beregnes. (1) (2) Standardafvigelsen divideres med kvadratroden af antallet af målinger (n) for at nå frem til standardfejlen (SElnD). (3) To gange standardfejlen trækkes fra middelværdien, og eksponentialfunktionen af denne værdi (middelværdi minus to standardfejl) beregnes for at få den geometriske middelværdi minus to geometriske standardfejl. (4) 3. RAPPORTERING TESTRAPPORT Testrapporten skal mindst indeholde følgende oplysninger: — værdien af LWGMD-2SE — enhver afvigelse og især de afvigelser, der vil kunne påvirke præcisionen eller nøjagtigheden af resultaterne med tilhørende behørigt begrundede tilfælde. 4. REFERENCER 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. Februar 1999. 2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) Denne forstørrelsesværdi gælder for 3 µm fibre. For 6 µm fibre vil en forstørrelse på × 5 000 være mere passende. (2) For 3 μm fibres vedkommende, se forrige note.

BILAG III B.46. IN VITRO-HUDIRRITATION: TEST MED REKONSTRUERET HUMAN EPIDERMIS-MODEL 1. METODE 1.1. INDLEDNING Hudirritation defineres som fremkomsten af reversible hudskader efter påføring af teststof i op til 4 timer (som defineret i FN's globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS)) (1). Denne testmetode omfatter en in vitro-procedure, som afhængigt af informationsbehovet kan give mulighed for at bestemme stoffers hudirritation og udgøre en selvstændig erstatningstest i en teststrategi med en »weight of evidence«-tilgang (2). Vurderingen af hudirritation har typisk omfattet brug af forsøgsdyr (se metode B.4) (3). Af hensyn til dyrevelfærden giver metode B.4 mulighed for at bestemme hudætsning/hudirritation ved hjælp af en sekventiel teststrategi, der består af validerede in vitro- og ex vivo-metoder, hvorved det undgås, at dyr udsættes for smerter og lidelser. Der er tre validerede in vitro-testmetoder og -testretningslinjer, B.40, B.40a og TG 435 (4, 5, 6), som er relevante for ætsningsdelen af den sekventielle teststrategi i B.4. Denne testmetode bygger på modeller af rekonstrueret human epidermis, som på grund af deres overordnede udformning (brug af humant afledte epidermiskeratinocytter som cellekilde, repræsentativt væv og cellearkitektur) ret nøje efterligner de biokemiske og fysiologiske egenskaber i de øvre dele af menneskers hud, dvs. epidermis. Ved den procedure, der er beskrevet i denne testmetode, kan det afgøres, om lokalirriterende stoffer tilhører kategori 2 ifølge FN's GHS fareidentifikation. Testmetoden rummer også et sæt ydeevnestandarder til brug for vurdering af lignende og modificerede testmetoder, der er baseret på rekonstrueret human epidermis (7). To in vitro-testmetoder, hvor der benyttes rekonstrueret human epidermis-modeller, som forhandles under betegnelserne EpiSkin™ og EpiDerm™, har været underkastet prævaliderings-, optimerings- og valideringundersøgelser (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17). Disse referencer byggede på R 38. Visse aspekter af omberegningen med henblik på GHS behandles i reference 25. Metoder med samme ydeevne som EpiSkin™ (valideret referencemetode 1) anbefales som selvstændige erstatningsmetoder for in vivo-test med kaniner til klassificering af lokalirriterende stoffer i GHS kategori 2. I forbindelse med klassificering af lokalirriterende stoffer i GHS kategori 2 anbefales metoder med samme ydeevne som EpiDerm™ (valideret referencemetode 2) kun som screeningmetode eller som en del af en sekventiel teststrategi med en »weight of evidence«-tilgang. Inden en foreslået metode til in vitro-undersøgelse af hudirritation med en rekonstrueret human epidermis-model kan benyttes i forbindelse med lovgivningen, skal dens pålidelighed og relevans (nøjagtighed) og grænserne for dens påtænkte anvendelse bestemmes, så det er sikkert, at den på de punkter er sammenlignelig med den validerede referencemetode 1, og det skal ske i overensstemmelse med ydeevnestandarderne i testmetoden (tillægget). To andre in vitro-testmetoder med rekonstrueret human epidermis er valideret ifølge kravene i denne testmetode med omtrent samme resultat som den validerede referencemetode 1 (18). Det er den modificerede EpiDerm™-testmetode (modificeret referencemetode 2) og SkinEthic RHE™-testmetoden (analog til metode 1). 1.2. DEFINITIONER I denne testmetode anvendes følgende definitioner: Nøjagtighed: Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som den andel korrekte udfald, testmetoden fører til. Batchkontrolstof: Referencestof, som med det pågældende væv giver et udfald for cellernes levedygtighed midt i måleområdet. Cellelevedygtighed: En parameter, der måler den samlede aktivitet i en cellepopulation, f.eks. udtrykt ved de cellulære mitokondriedehydrogenasers evne til at reducere vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt], og som, afhængigt af det valgte endpoint og testens udformning, korrelerer med det totale antal levende celler og/eller deres levedygtighed. ET50 : Den eksponeringstid, der nedsætter cellernes levedygtighed med 50 % ved påføring af et markørstof i en nærmere angivet fast koncentration; se også IC50. Falsk negativ-rate: Andelen af alle positive stoffer, som metoden ukorrekt har udpeget som negative. Den er en indikator for testmetodens ydeevne. Falsk positiv-rate: Andelen af alle negative (ikke-aktive) stoffer, der ukorrekt er udpeget som positive. Den er en indikator for testmetodens ydeevne. Uendelig dosis: Den mængde teststof, som er påført på huden ud over den mængde, der er nødvendig for helt at dække hudoverfladen på ensartet måde. GHS (det globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier): Et system til klassificering af stoffer og blandinger efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare med tilhørende kommunikationselementer såsom piktogrammer, signalord, risikosætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om stoffernes og blandingernes skadelige virkninger kan videreformidles med henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportører, forbrugere og redningspersonel) og miljø (1) og gennemført i EU ved forordning (EF) nr. 1272/2008. IC50 : Den koncentration, ved hvilken et markørstof nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC50) efter en fast eksponeringstid; se også ET50. Ydeevnestandarder: Standarder, som med udgangspunkt i en valideret referencemetode giver mulighed for at vurdere, om en foreslået testmetode, som er mekanistisk og funktionelt tilsvarende, er sammenlignelig. De indeholder bl.a. I) de centrale dele af testmetoden, II) en minimumsliste med referencestoffer, som er udvalgt blandt de stoffer, der er benyttet til at påvise, at den validerede referencemetodes ydeevne er acceptabel, III) de sammenlignelige niveauer af nøjagtighed og pålidelighed, som er fastsat efter, hvad der er opnået med den validerede referencemetode, og som det skal påvises, at den foreslåede testmetode kan yde, ved vurdering ud fra minimumslisten med referencestoffer. Pålidelighed: Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier. Følsomhed: Andelen af alle positive/aktive stoffer, der klassificeres korrekt ved testen. Den er et mål for nøjagtigheden af en testmetode, der fører til kategoriske resultater, og har stor betydning for vurdering af en testmetodes relevans. Specificitet: Andelen af alle negative/ikke-aktive stoffer, der klassificeres korrekt ved testen. Den er et mål for nøjagtigheden af en testmetode, der fører til kategoriske resultater, og har stor betydning for vurdering af en testmetodes relevans. Hudirritation: Fremkaldelse af reversibel skade på huden ved påføring af teststoffet i indtil 4 timer. Hudirritation er en lokalt fremkaldt ikke-immunogen reaktion, som indtræder kort tid efter stimuleringen (24). Den karakteriseres især ved, at den reversible proces indebærer inflammatoriske reaktioner og de fleste af de karakteristiske kliniske tegn på irritation (rødme, ødem, kløe og smerte), der er knyttet til en inflammatorisk proces. 1.3. ANVENDELSESOMRÅDE OG BEGRÆNSNINGER Det er en begrænsning for de test med rekonstrueret human epidermis, som henhører under denne testmetode, at de kun muliggør klassificering af stoffer som hudirriterende i kategori 2 ifølge FN's GHS. Da de ikke giver mulighed for klassificering af stoffer i den valgfrie kategori 3 ifølge FN's GHS, vil alle andre stoffer ikke blive klassificeret (ingen kategori). Afhængigt af behovet for lovgivning og om der i fremtiden bliver indføjet nye endpoints, foretaget forbedringer eller udviklet nye analoge metoder, kan der blive behov for revision af denne testmetode. Denne testmetode muliggør fareidentifikation af lokalirriterende stoffer med én komponent (19), men den giver ikke fyldestgørende oplysninger om hudætsning. Gasser og aerosoler kan ikke testes; blandinger er endnu ikke vurderet ved en valideringsundersøgelse. 1.4. TESTMETODENS PRINCIP Teststoffet påføres på en tredimensional rekonstrueret human epidermis-model, som består af normale humant afledte epidermiskeratinocytter, som ved dyrkning har dannet en stærkt differentieret flerlagsmodel af den humane epidermis. Den består af velordnede basallag, stratum spinosum og stratum granulosum og et flerlaget stratum corneum, hvori intercellulære lamellære lipidlag er til stede i samme mønstre, som man finder in vivo. Princippet bag testen med rekonstrueret human epidermis-model bygger på den forudsætning, at lokalirriterende stoffer kan trænge gennem stratum corneum ved diffusion og er cytotoksiske for cellerne i de underliggende lag. Cellernes levedygtighed måles ved, at dehydrogenase omdanner vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt; Einecs-nr. 206-069-5, CAS-nr. 298-93-1)] til et blåt formazansalt, der måles kvantitativt efter ekstraktion fra vævene (20). Lokalirriterende stoffer identificeres ved deres evne til at nedsætte cellernes levedygtighed til en bestemt tærskelværdi eller derunder (f.eks. ≤ 50 % for lokalirriterende stoffer i kategori 2 ifølge FN's GHS). Stoffer, der fører til en levedygtighed for cellerne, der ligger over den fastlagte tærskel, klassificeres ikke (f.eks. > 50 % ingen kategori). Modelsystemer med rekonstrueret human epidermis kan benyttes til test af faste stoffer, væsker, halvfaste stoffer og vokser. Væsker kan være vandige eller ikke-vandige, og faste stoffer kan være opløselige eller uopløselige i vand. Faste stoffer bør testes som fint pulver, når det overhovedet er muligt. Da der ved valideringen af testsystemerne med rekonstrueret human epidermis-model er undersøgt 58 omhyggeligt udvalgte stoffer, der repræsenterer et bredt spektrum af kemiske stofgrupper, forventes metoderne at kunne anvendes generelt til alle kemiske stofgrupper (16). Valideringen omfatter 13 lokalirriterende stoffer i GHS-kategori 2. Bemærk, at ikkeætsende syrer, baser, salte og andre uorganiske stoffer ikke var omfattet af valideringen, og at visse grupper af organiske stoffer, der vides at være lokalirriterende, såsom hydroperoxider, phenoler og overfladeaktive stoffer heller ikke eller kun i begrænset omfang var med i valideringen. 1.5. GODTGØRELSE AF KOMPETENCE Inden et laboratorium påbegynder rutinemæssig brug af en valideret metode, der følger denne testmetode, bør de godtgøre deres tekniske kompetence ved hjælp af de ti anbefalede stoffer i tabel 1. I denne testmetode betragtes kemikalier i den valgfrie kategori 3 i FN's GHS som ikke-klassificerede. Inden nye lignende (analoge) testmetoder, der udvikles under denne testmetode, og som strukturelt og funktionelt ligner de validerede referencemetoder, og modificeringer af validerede metoder tages i brug af de kontrollerende myndigheder til testning, bør det ved hjælp af ydeevnestandarderne i tillægget til denne testmetode godtgøres, at den nye testmetode har tilsvarende pålidelighed og nøjagtighed. Tabel 1 Kompetencestoffer, der udgør en delmængde af referencestofferne i tillægget Stof CAS-nummer In vivo-vurdering Fysisk form GHS-kategori naphthaleneddikesyre 86-87-3 0 S Ingen kat. isopropanol 67-63-0 0,3 L Ingen kat. methylstearat 112-61-8 1 S Ingen kat. heptylbutyrat 5870-93-9 1,7 L Valgfri kat. 3 hexylsalicylat 6259-76-3 2 L Valgfri kat. 3 cyclamenaldehyd 103-95-7 2,3 L Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 2,7 L Kat. 2 butylmethacrylat 97-88-1 3 L Kat. 2 1-methyl-3-phenyl-1-piperazin 5271-27-2 3,3 S Kat. 2 heptanal 111-71-7 4 L Kat. 2 1.6. BESKRIVELSE AF METODEN Nedenfor følger en beskrivelse af komponenter og procedurer i en test til vurdering af hudirritation med rekonstrueret human epidermis-model. En rekonstrueret human epidermis-model kan konstrueres, fremstilles eller købes i handelen (f.eks. EpiSkin™, EpiDerm™ og SkinEthic RHE™). Der er standardiserede testprotokoller for EpiSkin™, EpiDerm™ og SkinEthic RHE™ til rådighed på http://ecvam.jrc.ec.europa.eu (21, 22, 23). Test bør udføres på følgende måde: 1.6.1. Komponenterne i rekonstrueret human epidermis-modellen 1.6.1.1. Almindelige modelbetingelser Der skal anvendes normale humane keratinocytter til at konstruere epithelet. Der skal være flere lag af levedygtige epithelceller (basallag, stratum spinosum, stratum granulosum) til stede under et fungerende stratum corneum. Stratum corneum skal være flerlaget og indeholde den fedtprofil, der gør den til en effektiv barriere, der kan modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. natriumdodecylsulfat (SDS) eller Triton X-100. Barrierefunktionen kan bedømmes enten ved at bestemme den koncentration, hvor et markørstof nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC50) efter en fast eksponeringstid, eller ved at bestemme den eksponeringstid, der er nødvendig for at nedsætte levedygtigheden med 50 % (ET50), når markørstoffet påføres i en nærmere fastsat konstant koncentration. Modellens fysiske udformning skal forhindre, at stof passerer uden om stratum corneum til det levedygtige væv, hvilket ville forringe modelleringen af hudens eksponering. Hudmodellen skal være fri for kontamination med bakterier, virus, mykoplasma og svampe. 1.6.1.2. Funktionsmæssige modelbetingelser 1.6.1.2.1. Levedygtighed MTT foretrækkes til kvantificering af levedygtigheden (20). Absorbansen (optical density — OD) af den farvestofmængde, der kan ekstraheres (ved opløsning) fra vævet fra behandlingen med negativ kontrol (NC), skal være mindst 20 gange absorbansen af det rene ekstraktionsmiddel. Det skal godtgøres, at vævet fra behandling med negativ kontrol er en stabil kultur (leverer enslydende levedygtighedsmålinger) i hele testeksponeringsperioden. 1.6.1.2.2. Barrierefunktion Stratum corneum og dets lipidsammensætning skal være tilstrækkelig til at modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS eller Triton X-100, bestemt ved IC50 eller ET50. 1.6.1.2.3. Morfologi Rekonstrueret hud/epidermis skal af behørigt kvalificeret personale undersøges histologisk for human hud/epidermis-lignende struktur (herunder flerlaget stratum corneum). 1.6.1.2.4. Reproducerbarhed De resultater, metoden giver med en bestemt model, skal udvise tidsmæssig reproducerbarhed, helst godtgjort ved hjælp af et egnet batchkontrolstof (se tillægget). 1.6.1.2.5. Kvalitetskontroller (QC) i modellen Hver batch af den anvendte epidermismodel skal overholde veldefinerede produktionsgodkendelseskriterier, hvoraf levedygtighed (punkt 1.6.1.2.1) og barrierefunktion (punkt 1.6.1.2.2) er de vigtigste. Der skal af leverandøren af hudmodellen (eller forsøgslederen, hvis modellen er internt fremstillet) fastsættes en interval for acceptable værdier af IC50 eller ET50 (øvre og nedre grænse). Vævenes barriereegenskaber kontrolleres af laboratoriet efter modtagelsen. Kun resultater, der er fremkommet med kvalificerede væv, kan accepteres til at give en pålidelig vurdering af lokalirriterende virkninger. Nedenfor er acceptintervallerne for de validerede referencemetoder angivet som eksempler. Tabel 2 Eksempler på batchgodkendelseskriterier til kvalitetskontrol Nedre acceptgrænse Middelværdi i acceptinterval Øvre acceptgrænse Valideret referencemetode 1 (behandling i 18 h med SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Valideret referencemetode 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 hr ET50 = 6,7 hr ET50 = 8,7 hr 1.6.1.3. Påføring af test- og kontrolstoffer Der anvendes et passende antal vævsgentagelser til hver behandling og til kontroller (mindst tredobbeltbestemmelse pr. analyseserie). For både flydende og faste stoffer gælder det, at der skal påføres tilstrækkelig meget teststof til, at hudoverfladen dækkes med et jævnt lag, samtidig med at uendelig dosis undgås (se 1.2 Definitioner), dvs. mindst 25 μL/cm2 eller 25 mg/cm2. I tilfælde af faste stoffer fugtes epidermisoverfladen med deioniseret eller destilleret vand inden påføringen, så der sikres god hudkontakt. Faste stoffer bør testes som fint pulver, når det overhovedet er muligt. Efter eksponeringsperioden vaskes teststoffet omhyggeligt af hudoverfladen med vandig buffer eller 0,9 % NaCl. Afhængigt af, hvilken rekonstrueret human epidermis-model der anvendes, kan eksponeringsperioden variere mellem 15 og 60 minutter og inkubationstemperaturen mellem 20 og 37 °C. Der er nærmere oplysninger i de tre metoders standardprocedurer (21, 22, 23). Der skal i hver undersøgelse anvendes samtidig negativ kontrol og positive kontroller (PC), så det godtgøres, at levedygtigheden (NC), barrierefunktionen og vævets deraf følgende følsomhed (PC) ligger inden for et forud fastsat acceptinterval. Som positivt kontrolstof foreslås 5 % vandig SDS. Som negativt kontrolstof foreslås vand eller phosphatbufferet saltopløsning (PBS). 1.6.1.4. Måling af cellelevedygtighed Det vigtigste i testproceduren er, at levedygtigheden ikke måles umiddelbart efter eksponeringen med teststofferne, men først efter en tilstrækkelig lang inkubationsperiode efter behandlingen i frisk substrat af de renskyllede væv fra behandlingen. En sådan periode betyder, dels at huden kan komme sig over svagt irriterende virkninger, dels at eventuelle cytotoksiske virkninger træder tydeligt frem. En inkubationsperiode efter behandlingen på 42 timer viste sig i testoptimeringfasen (9, 10, 11, 12, 13) at være optimal, og der blev derfor benyttet en sådan ved valideringen af referencetestmetoderne. Måling af omdannelse af MTT er en valideret kvantitativ metode, som skal benyttes til måling af cellelevedygtigheden. Den er forenelig med brug i et tredimensionalt væv. Hudlappen anbringes i en MTT-opløsning af passende koncentration (f.eks. 0,3-1 mg/mL) i tre timer. Det udfældede blå formazan ekstraheres fra vævet med et opløsningsmiddel (f.eks. isopropanol eller sur isopropanol), og formazankoncentrationen beregnes ud fra måling af absorbansen i et højst ±30 nm bredt bånd ved 570 nm. Teststoffets optiske egenskaber eller dets kemiske reaktion med MTT kan interferere med målingen og føre til et forkert skøn over levedygtigheden (da teststoffet kan standse, mindske eller forårsage farvedannelsen). Det kan forekomme, hvis et specifikt teststof ikke bliver fjernet fuldstændigt fra huden ved skylning, eller hvis det er trængt ned i epidermis. Hvis teststoffet reagerer direkte med MTT, hvis det selv er farvet, eller hvis det bliver farvet under behandlingen af vævet, skal der anvendes yderligere kontroller til at spore og korrigere for teststoffernes interferens med levedygtighedsmålingen. En direkte test for MTT-reduktion er nærmere beskrevet i testmetodeprotokollen for de validerede referencemetoder (21, 22, 23). Ikke-specifik farvning (NSC) som følge af interferens må ikke være større end 30 % af den negative kontrol (med henblik på korrektion). Er NSC > 30 %, anses teststoffet for uforeneligt med testen. 1.6.1.5. Acceptkriterier for målingen For hver måling med gyldige batcher (se punkt 1.6.1.2.5) skal væv, der er behandlet med negativ kontrol, give absorbansresultater, der afspejler kvaliteten af de væv, der har været underkastet alle forsendelses- og modtagelsestrin og alle processer i irritationsprotokollen. Absorbansværdierne af kontrollerne må ikke ligge lavere end forud fastsatte nedre grænser. På tilsvarende måde skal væv, der er behandlet med positiv kontrol, dvs. 5 % vandig SDS, afspejle vævenes følsomhed og deres evne til at reagere på et lokalirriterende stof under de aktuelle forsøgsvilkår (f.eks. levedygtighed ≤ 40 % for valideret referencemetode 1 og ≤ 20 % for valideret referencemetode 2). Der skal defineres passende mål for den tilknyttede variation mellem multiple bestemmelser på samme væv (f.eks. skal en eventuel standardafvigelse være ≤ 18 %). 2. DATA 2.1. DATA For hver behandling skal data fra de enkelte multipelbestemmelser (f.eks. absorbansværdier og beregnet cellelevedygtighedsprocent for hvert teststof samt klassificeringen) fremlægges i tabelform, herunder data fra eventuelle gentagelser af forsøget. Desuden skal gennemsnit og standardafvigelse angives for hvert forsøg. For hvert testet stof oplyses der om eventuelt iagttagne vekselvirkninger med MTT-reagenset og farvede teststoffer. 2.2. FORTOLKNING AF RESULTATER De absorbansværdier, som måles ved hver undersøgelse, anvendes til beregning af den procentuelle levedygtighed i forhold til den negative kontrol, som vilkårligt sættes til 100 %. Den tærskelværdi for cellelevedygtighedsprocent, som adskiller lokalirriterende stoffer fra ikke-klassificerede stoffer, og de statistiske metoder, der benyttes til at vurdere resultaterne og udpege lokalirriterende stoffer, skal klart defineres, dokumenteres og bevises at være hensigtsmæssige. Tærskelværdierne for vurdering som lokalirriterende ifølge de validerede referencemetoder er som følger: Teststoffet betragtes som værende hudirriterende i kategori 2 ifølge FN's GHS: i) hvis vævslevedygtigheden efter eksponering og inkubation efter behandling er mindre end eller lig med (≤) 50 %. Teststoffet anses for ikke at tilhøre nogen kategori: ii) hvis vævslevedygtigheden efter eksponering og inkubation efter behandling er større end (>) 50 %. 3. RAPPORTERING 3.1. TESTRAPPORT Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger: Test- og kontrolstoffer: — kemiske navne, f.eks. IUPAC-navn eller CAS-navn og -nummer, hvis de kendes — stoffets renhed og sammensætning (i vægtprocent) — fysiske-kemiske egenskaber, som er relevante for undersøgelsen (f.eks. fysisk tilstand, stabilitet og flygtighed, pH og opløselighed i vand, hvis kendt) — eventuel behandling af test/kontrolstoffer inden testen (f.eks. opvarmning, formaling) — opbevaringsforhold. Begrundelse for valg af hudmodel og forsøgsprotokol. Testbetingelser: — anvendt cellesystem — kalibreringsinformationer for udstyr og båndpas, som er anvendt til måling af cellelevedygtighed (f.eks. spektrofotometer) — komplet dokumentation for den anvendte hudmodel, herunder om dens ydeevne. Der skal bl.a. gives oplysning om i) levedygtighed ii) barrierefunktion iii) morfologi iv) reproducerbarhed og prædiktionsevne v) kvalitetskontroller (QC) i modellen — detaljer om den anvendte testprocedure — anvendte testdoser, eksponeringens varighed og længden af inkubationsperioden efter behandlingen — beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren — reference til historiske data for modellen. Der skal bl.a. gives oplysning om i) om QC-dataene kan accepteres, sammenlignet med data om tidligere batcher ii) om positive og negative kontrolværdier kan accepteres, sammenlignet med gennemsnit og intervaller for positive og negative kontroller — beskrivelse af de anvendte evalueringskriterier, herunder begrundelse for valg af prædiktionsmodellens afskæringspunkt(er). Resultater: — angivelse i tabelform af data fra hver enkelt testprøve — beskrivelse af andre observerede virkninger. Diskussion af resultater. Konklusioner. 4. LITTERATUR (1) United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Se følgende websted: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. (2) REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Se følgende websted: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. (3) Testmetode B4. AKUT TOKSICITET: HUDIRRITATION/ÆTSNING. (4) Testmetode B.40. IN VITRO-HUDÆTSNING: MÅLING AF TRANSKUTAN ELEKTRISK MODSTAND (TER). (5) Testmetode B.40.A. IN VITRO-HUDÆTSNING: TEST MED HUMAN HUDMODEL. (6) OECD (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Adopted July 19, 2006. Se følgende websted: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. (7) ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Se under »Download Study Documents« på følgende websted: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (8) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57-93. (9) Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765-770. (10) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107-114. (11) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351-367. (12) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329-249. (13) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30,109-129. (14) Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601. (15) Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Se under »Download Study Documents« på følgende websted: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (16) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603-619. (17) J. Cotovio, M.-H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, 351-358. (18) Erklæring fra ESAC om ajourførte EpiDerm-forsøg og tilsvarende SkinEthic-forsøg. 5. november 2008. (19) EC (2006). Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommissionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF. Den Europæiske Unions Tidende L 396 af 30.12.2006, s. 1. OPOCE, Luxembourg. (20) Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63. (21) EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (January 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Se under »Download Study Documents« på følgende websted: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (22) EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (October 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Se under »Download Study Documents« på følgende websted: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (23) SkinEthic RHE™ SOP. Se senere under »Download Study Documents« på følgende websted: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (24) Harvell, J.D., Lammintausta, K. Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, pp 7-18. (25) Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, 13. november 2008. Tillæg Vurdering af ydeevnen ved de foreslåede metoder til in vitro-undersøgelse af hudirritation med en rekonstrueret human epidermis-model INDLEDNING De procedurer, der foreslås anvendt i forbindelse med denne testmetode, skal vurderes med hensyn til pålidelighed og nøjagtighed ved hjælp af stoffer, der repræsenterer hele Draize-pointskalaen for irritation. Når den foreslåede procedure bedømmes ved hjælp af de 20 anbefalede referencestoffer (tabel 2), skal den have samme niveau af pålidelighed og nøjagtighed som den validerede referencemetode 1 (tabel 3) (1). Der redegøres nærmere for nøjagtigheds- og pålidelighedskrav i punkt II og III nedenfor. Der indgår ikke-klassificerede og klassificerede (i kategori 2 ifølge FN's GHS) stoffer, som repræsenterer relevante kemiske stofgrupper, således at den foreslåede testmetode kan sammenlignes med den validerede referencemetode 1 med hensyn til pålidelighed og ydeevne (følsomhed, specificitet, falsk negativ-rate, falsk postiv-rate og nøjagtighed). Inden testmetoden tages i brug til test af nye stoffer, skal det fastslås, om den er pålidelig, og om den kan identificere irriterende stoffer i kategori 2 ifølge FN's GHS korrekt. YDEEVNESTANDARDER Ydeevnestandarderne omfatter følgende tre elementer: I) de centrale dele af testmetoden, II) referencestoffer, III) fastlagte værdier for nøjagtighed og pålidelighed (2). De foreliggende ydeevnestandarder bygger på de ydeevnestandarder, der er fastlagt efter afslutning af ECVAM-valideringsundersøgelsen af hudirritation (3). I) De centrale dele af testmetoden Almindelige modelbetingelser Der skal anvendes normale humane keratinocytter til at konstruere epithelet. Der skal være flere lag af levedygtige epithelceller (basallag, stratum spinosum, stratum granulosum) til stede under et fungerende stratum corneum. Stratum corneum skal være flerlaget og indeholde den fedtprofil, der gør den til en effektiv barriere, der kan modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS eller Triton X-100. Barrierefunktionen kan bedømmes enten ved at bestemme den koncentration, hvor et markørstof nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC50) efter en fast eksponeringstid, eller ved at bestemme den eksponeringstid, der er nødvendig for at nedsætte levedygtigheden med 50 % (ET50), når markørstoffet påføres i en nærmere fastsat konstant koncentration. Modellens fysiske udformning skal forhindre, at stof passerer uden om stratum corneum til det levedygtige væv, hvilket ville forringe modelleringen af hudens eksponering. Hudmodellen skal være fri for kontamination med bakterier, virus, mykoplasma og svampe. Funktionsmæssige modelbetingelser Levedygtighed MTT foretrækkes til kvantificering af levedygtigheden (4). Absorbansen (optical density — OD) af den farvestofmængde, der kan ekstraheres (ved opløsning) fra vævet fra behandlingen med negativ kontrol (NC), skal være mindst 20 gange absorbansen af det rene ekstraktionsmiddel. Det skal godtgøres, at vævet fra behandling med negativ kontrol er en stabil kultur (leverer enslydende levedygtighedsmålinger) i hele testeksponeringsperioden. Barrierefunktion Stratum corneum og dets lipidsammensætning skal være tilstrækkelig til at modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS eller Triton X-100, bestemt ved IC50 eller ET50. Morfologi Rekonstrueret hud/epidermis skal af behørigt kvalificeret personale undersøges histologisk for human hud/epidermis-lignende struktur (herunder flerlaget stratum corneum). Reproducerbarhed De resultater, metoden giver med en bestemt model, skal udvise tidsmæssig reproducerbarhed, helst godtgjort ved hjælp af et egnet batchkontrolstof (se definitionerne i punkt 1.2). Kvalitetskontroller (QC) i modellen Hver batch af den anvendte epidermismodel skal overholde veldefinerede produktionsgodkendelseskriterier, hvoraf levedygtighed og barrierefunktion er de vigtigste. Der skal af leverandøren af hudmodellen (eller forsøgslederen, hvis modellen er internt fremstillet) fastsættes en interval for acceptable værdier af IC50 eller ET50 (øvre og nedre grænse). Vævenes barriereegenskaber kontrolleres af laboratoriet efter modtagelsen. Kun resultater, der er fremkommet med kvalificerede væv, kan accepteres til at give en pålidelig vurdering af lokalirriterende virkninger. Nedenfor er acceptintervallerne for de validerede referencemetoder angivet som eksempler. Tabel 1 Eksempler på batchgodkendelseskriterier til kvalitetskontrol Nedre acceptgrænse Middelværdi i acceptinterval Øvre acceptgrænse Valideret referencemetode 1 (behandling i 18 h med SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Valideret referencemetode 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 hr ET50 = 6,7 hr ET50 = 8,7 hr II) Referencestoffer Referencestoffer benyttes til at fastslå, om en foreslået ny in vitro-testmetode med rekonstrueret human epidermis, som er bevist at have tilstrækkelig strukturel og funktionel lighed med de validerede referencemetoder, eller som består i en mindre modfikation af en valideret referencemetode, har samme ydeevne som den validerede referencemetode 1 (1). Blandt de 20 referencestoffer på listen i tabel 2 er der stoffer i forskellige interessante kemiske stofgrupper og stoffer i kategori 2 ifølge FN's GHS. På listen er der ti stoffer i kategori 2 ifølge FN's GHS, tre stoffer i den valgfrie kategori 3 ifølge FN's GHS og syv ikke-klassificerede stoffer. I denne testmetode betragtes stoffer i den valgfrie kategori 3 som ikke-klassificerede. Disse referencestoffer er det mindste antal stoffer, der skal indgå i vurderingen af nøjagtighed og pålidelighed af en foreslået testmetode for hudirritation med rekonstrueret human epidermis. Hvis et stof på listen ikke kan fås, kan der benyttes andre stoffer, som der foreligger tilstrækkelige in vivo-referencedata om. Hvis det ønskes for at udbygge vurderingen af den foreslåede testmetodes nøjagtighed, kan der tilføjes flere stoffer, som repræsenterer andre kemiske stofgrupper, og som der foreligger tilstrækkelige in vivo-referencedata om, til minimumslisten over referencestoffer. Tabel 2 Referencestoffer til bestemmelse af nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier for hudirritationsmodeller med rekonstrueret human epidermis Stof (1) CAS-nummer Einecs-nummer Fysisk form In vivo-vurdering GHS in vitro-kategori GHS in vivo-kategori 1-brom-4-chlorbutan 6940-78-9 230-089-3 L 0 Kat. 2 Ingen kat. diethylphthalat 84-66-2 201-550-6 L 0 Ingen kat. Ingen kat. naphthaleneddikesyre 86-87-3 201-705-8 S 0 Ingen kat. Ingen kat. allylphenoxyacetat 7493-74-5 231-335-2 L 0,3 Ingen kat. Ingen kat. isopropanol 67-63-0 200-661-7 L 0,3 Ingen kat. Ingen kat. 4-(methylthio)-benzaldehyd 3446-89-7 222-365-7 L 1 Kat. 2 Ingen kat. methylstearat 112-61-8 203-990-4 S 1 Ingen kat. Ingen kat. heptylbutyrat 5870-93-9 227-526-5 L 1,7 Ingen kat. Valgfri kat. 3 hexylsalicylat 6259-76-3 228-408-6 L 2 Ingen kat. Valgfri kat. 3 tri-isobutylphosphat 126-71-6 204-798-3 L 2 Kat. 2 Valgfri kat. 3 1-decanol 112-30-1 203-956-9 L 2,3 Kat. 2 Kat. 2 cyclamenaldehyd 103-95-7 203-161-7 L 2,3 Kat. 2 Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 203-850-2 L 2,7 Kat. 2 Kat. 2 2-chlormethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridinhydrochlorid 86604-75-3 434-680-9 S 2,7 Kat. 2 Kat. 2 a-terpineol 98-55-5 202-680-6 L 2,7 Kat. 2 Kat. 2 di-n-propyldisulfid 629-19-6 211-079-8 L 3 Ingen kat. Kat. 2 butylmethacrylat 97-88-1 202-615-1 L 3 Kat. 2 Kat. 2 benzenthiol, 5-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl 7340-90-1 438-520-9 L 3,3 Kat. 2 Kat. 2 1-methyl-3-phenyl-1-piperazin 5271-27-2 431-180-2 S 3,3 Kat. 2 Kat. 2 heptanal 111-71-7 203-898-4 L 4 Kat. 2 Kat. 2 Stofferne i tabel 2 er et repræsentativt udsnit af de 58 stoffer, der indgik i den internationale ECVAM-valideringsundersøgelse af hudirritation (1). De er udvalgt ud fra følgende kriterier: — de fås i handelen — de repræsenterer hele Draize-pointskalaen (fra ikke-irriterende til stærkt irriterende) — de har en veldefineret kemisk struktur — de er repræsentative for den validerede metodes reproducerbarhed og prædiktionsevne som fastslået ved ECVAM-valideringsundersøgelsen — de er repræsentative for de typer kemisk funktion, der indgår i valideringsprocessen — de har ikke nogen ekstremt toksisk profil (f.eks. kræftfremkaldende eller reproduktionstoksiske) og indebærer heller ikke urimeligt høje bortskaffelsesomkostninger. III) Definerede nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier De foreslåede metoder skal være sammenlignelige med den validerede referencemetode 1 (tabel 3) med hensyn til ydeevne (følsomhed, specificitet, falsk negativ-rate, falsk postiv-rate og nøjagtighed), dvs. at følsomheden skal være 80 % eller derover, specificiteten skal være 70 % eller derover, og nøjagtigheden skal være 75 % eller derover. Ydeevnen skal beregnes for alle de klassificeringer, som de forskellige deltagende laboratorier når frem til med de 20 stoffer. Hvert laboratorium skal fastsætte klassificeringen af de enkelte stoffer ud fra gennemsnittet af levedygtigheden over de forskellige udførte analyseserier (mindst tre gyldige serier). Tabel 3 Ydeevne for den validerede referencemetode 1 (2) Testmetode Antal stoffer Følsomhed Specificitet Falsk negativ-rate Falsk positiv-rate Nøjagtighed Valideret referencemetode 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Valideret referencemetode 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % Den foreslåede testmetodes pålidelighed skal være sammenlignelig med de validerede referencemetoders. Reproducerbarhed inden for laboratoriet En vurdering af variationen inden for laboratoriet skal vise, at klassificeringerne (kategori 2/ingen kategori) ved forskellige uafhængige analyseserier med de 20 referencestoffer i ét enkelt laboratorium er overensstemmende i 90 % af tilfældene eller derover. Reproducerbarhed mellem laboratorier En vurdering af reproducerbarheden mellem laboratorier er ikke afgørende, hvis de foreslåede testmetoder kun skal benyttes i ét laboratorium. For metoder, der ønskes overført mellem laboratorier, skal klassificeringerne (kategori 2/ingen kategori) ved forskellige uafhængige analyseserier med de 20 referencestoffer, der foretages i helst mindst tre laboratorier, være overensstemmende i 80 % af tilfældene eller derover. REFERENCER 1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601. 2. OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paris. 3. ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Se under »Download Study Documents« på følgende websted: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Konsulteret den 27.10.2008. 4. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63. 5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603-619. (1) Disse 20 referencestoffer er et repræsentativt udsnit af de 58 stoffer, som oprindelig blev brugt til at validere referencemetode 1 (EpiSkin™). Der foreligger en fuldstændig liste over teststofferne og kriterierne for udvælgelsen (5). (2) Tabel 3 viser ydeevnen for den validerede referencemetode 1, for så vidt angår dens evne til korrekt at identificere lokalirriterende stoffer (kategori 2 ifølge FN's GHS) og ikke-klassificerede stoffer (såvel ingen kategori som valgfri kategori 3) for henholdsvis 58 og 20 referencestoffer (tabel 2). (3) EpiSkin™. (4) Baseret på 13 lokalirriterende stoffer i GHS-kategori 2. (5) Baseret på 45 lokalirriterende stoffer i GHS-kategori 3 eller ikke kategoriseret i GHS.

BILAG IV C.3. FERSKVANDSALGER OG CYANOBAKTERIER, VÆKSTHÆMNINGSTEST 1. METODE Metoden er ækvivalent med OECD TG 201 (2006) (1). 1.1. INDLEDNING Testmetoderne bliver med mellemrum gennemgået og ajourført på baggrund af den videnskabelige udvikling. Der er nødvendigt at revidere testmetode C.3, således at den omfatter flere arter og opfylder kravene til risikovurdering og klassificering af kemiske stoffer. Revisionen er foretaget på grundlag af de omfattende praktiske erfaringer med testen, den videnskabelige udvikling inden for algetoksicitetsundersøgelser samt de kontrollerende myndigheders udstrakte anvendelse af testen, siden denne oprindeligt blev indført. 1.2. DEFINITIONER I denne testmetode anvendes følgende definitioner og forkortelser: Biomasse, den tørre vægt af levende materiale, som er til stede i en population, i et givet volumen, f.eks. mg alger/liter testopløsning. »Biomasse« defineres sædvanligvis som masse, men skal i denne test forstås som masse pr. volumenenhed. I denne test anvendes typisk målinger af surrogater for biomasse som f.eks. celletal, fluorescens mv., hvorfor betegnelsen »biomasse« ligeledes dækker disse surrogatmåleværdier. Variationskoefficient, et dimensionsløst mål for variabiliteten af en parameter, defineret som forholdet mellem standardafvigelsen og middelværdien. Den kan også angives i procent. Middelværdien af variationskoefficienten for den gennemsnitlige specifikke væksthastighed i replikate kontrolkulturer beregnes som følger: 1. Variationskoefficienten beregnes som % af den gennemsnitlige specifikke væksthastighed ved hjælp af de trinvist beregnede daglige vækstrater for den pågældende replikat. 2. Der beregnes et gennemsnit af alle værdier beregnet i punkt 1. Deraf fås den gennemsnitlige variationskoefficient for den beregnede trinvise daglige specifikke vækstrate i replikate kontrolkulturer. ECx, den koncentration af teststof opløst i testsubstratet, der medfører en væksthæmning på x % (f.eks. 50 %) af testorganismen inden for en angiven eksponeringsperiode (som angives udtrykkeligt, hvis den er forskellig fra den fulde eller normale testperiode). For entydigt at skelne mellem EC-værdier afledt af vækstrate (»rate«) eller af udbytte (»yield«) benyttes de respektive symboler »ErC« og »EyC«. Næringssubstrat, det komplette, syntetiske næringssubstrat, hvori algerne vokser, når de eksponeres for teststoffet. Teststoffet vil normalt være opløst i testsubstratet. Væksthastighed (gennemsnitlig specifik væksthastighed), den logaritmiske stigning i biomasse i eksponeringsperioden. Laveste koncentration med observeret effekt (Lowest Observed Effect Concentration, LOEC), den laveste testede koncentration, ved hvilken stoffet har vist statistisk signifikant (p < 0,05) vækstnedsættende virkning i forhold til kontrolprøverne inden for en given eksponeringsperiode. Alle testkoncentrationer over LOEC skal dog have en skadelig virkning mindst svarende til den, der iagttages ved LOEC. Er disse to betingelser ikke opfyldt, skal der fyldestgørende redegøres for, hvordan den pågældende LOEC (og dermed NOEC) er valgt. Nuleffekt-koncentration (No Observed Effect Concentration (NOEC)), testkoncentrationen umiddelbart under LOEC. Responsvariabel, en variabel, som anvendes til vurdering af den toksiske virkning og er afledt af vilkårlige målte parametre, der beskriver biomassen ved andre beregningsmetoder. I nærværende metode er vækstrater og udbytte responsvariabler, der er afledt ved måling af biomasse direkte eller af et af de nævnte surrogater. Specifik væksthastighed, en responsvariabel, der er defineret som forholdet mellem ændringen i den naturlige logaritme til en observationsparameter (i nærværende testmetode, biomasse) og det tilsvarende tidsrum. Udbytte, værdien af en målevariabel ved eksponeringsperiodens slutning minus værdien af variablen ved eksponeringsperiodens start, dvs. stigningen i biomasse under testen. 1.3. TESTMETODENS ANVENDELIGHED Metoden er bedst anvendelig på vandopløselige stoffer, som under forsøgsbetingelserne forventes at forblive i vandet. Til testning af stoffer, der er flygtige, stærkt adsorberende, farvede eller tungtopløselige i vand, eller som kan ændre tilgængeligheden af næringsstoffer eller mineraler i testsubstratet, kan visse ændringer af den beskrevne fremgangsmåde være nødvendige (f.eks. lukket system eller konditionering af testbeholderne). Anvisninger for nogle sådanne ændringer er givet i (2) (3) (4). 1.4. TESTENS PRINCIP Testens formål er at bestemme teststoffets påvirkning af væksten af ferskvandsmikroalger og/eller cyanobakterier. Testorganismer i eksponentiel vækst eksponeres for teststoffet i batchkulturer i et tidsrum af normalt 72 timer. Til trods for testens forholdsvis korte varighed giver den mulighed for at vurdere virkningerne på flere generationer. Systemets respons er væksthæmningen i en række algekulturer (testenheder), der eksponeres for forskellige koncentrationer af et teststof. Responsen udtrykkes som funktion af eksponeringskoncentrationen og sammenholdes med gennemsnitsvæksten i replikate, ikke eksponerede kulturer. For at systemets respons på toksiske virkninger kan komme fuldt til udtryk (optimal følsomhed), lader man kulturerne vokse uhæmmet eksponentielt med tilstrækkelige næringsstoffer og kontinuerlig belysning tilstrækkelig længe til, at hæmningen af den specifikke væksthastighed kan måles. Vækst og væksthæmning bestemmes kvantitativt ved måling af algebiomassen som funktion af tiden. Algebiomasse defineres som tør vægt pr. volumenenhed, f.eks. mg alger/liter testopløsning. Tør vægt er imidlertid vanskelig at måle, hvorfor der anvendes surrogatparametre. Af sådanne surrogater er celletal det mest anvendte. Andre surrogatparametre er cellevolumen, fluorescens, optisk tæthed mv. Omregningsfaktoren mellem den målte surrogatparameter og biomassen skal være kendt. Endepunktet for testen er væksthæmning, udtrykt som logaritmisk stigning i biomasse (gennemsnitlig specifik væksthastighed) i eksponeringsperioden. Ud fra de gennemsnitlige specifikke væksthastigheder, der er registreret i en række testopløsninger, bestemmes den koncentration, der frembringer en bestemt hæmning x % (f.eks. 50 %) af væksthastigheden, og denne udtrykkes som ErCx (f.eks. ErC50). Når denne metode anvendes i forbindelse med EU-lovgivningen, skal resultaterne beregnes på grundlag af den gennemsnitlige specifikke væksthastighed af de grunde, der er anført i punkt 2.2. I metoden anvendes udbytte som en supplerende responsvariabel, der kan være nødvendig for at efterkomme myndighedsbestemmelser i visse stater. Udbyttet defineres som biomassen ved eksponeringsperiodens slutning minus biomassen ved eksponeringsperiodens start. Ud fra det udbytte, der er registreret i en række testopløsninger, bestemmes den koncentration, der frembringer en bestemt hæmning x % (f.eks. 50 %) i udbyttet, og denne angives som EyCx (f.eks. EyC50). Derudover kan den laveste koncentration med observeret effekt (LOEC) og nuleffekt-koncentrationen (NOEC) bestemmes statistisk. 1.5. OPLYSNINGER OM TESTSTOFFET Med henblik på fastsættelse af testbetingelser vil det være nyttigt at kende teststoffets strukturformel, renhed, lysstabilitet, stabilitet under testbetingelserne, lysabsorptionsegenskaber, pKa og resultaterne af omdannelsesundersøgelser, herunder bionedbrydeligheden i vand. Teststoffets vandopløselighed, octanol/vand-fordelingskoefficient (Pow) og damptryk skal være kendt, og til kvantitativ bestemmelse af stoffet i testopløsningerne skal der foreligge en pålidelig analysemetode, hvis genfindingsevne og detektionsgrænse rapporteres. 1.6. REFERENCESTOF Til kontrol af testmetoden kan testes et eller flere referencestoffer, f.eks. 3,5-dichlorphenol, som er anvendt i den internationale ringtest (4). Kaliumdichromat kan ligeledes anvendes som referencestof for grønalger. Det er ønskeligt, at der testes et referencestof mindst to gange årligt. 1.7. TESTENS VALIDITET Til afgørelse af, om en test er valid, anvendes følgende præstationskriterier: — Biomassen i kontrolkulturerne skal være steget eksponentielt med mindst en faktor 16 i løbet af testperioden på 72 timer. Dette svarer til en specifik væksthastighed på 0,92 dag–1. For de oftest anvendte arter er væksthastigheden sædvanligvis betydeligt højere (se tillæg 1). Dette kriterium er ikke nødvendigvis opfyldt for arter, der er mere langsomtvoksende end de i tillæg 1 anførte. I så fald må testperioden forlænges, så der opnås en vækst til mindst det 16-dobbelte i kontrolkulturerne, og så væksten er eksponentiel i hele testperioden. For at opretholde uhæmmet eksponentiel vækst under testen kan testperioden afkortes til ikke under 48 h, når blot den minimale multiplikationsfaktor på 16 nås. — Den gennemsnitlige variationskoefficient af den trinvise specifikke væksthastighed (ved 72-timers test, dag 0-1, 1-2 og 2-3) i kontrolkulturerne (se punkt 1.2 under »variationskoefficient«) må ikke være over 35 %. Vedrørende beregning af trinvis specifik væksthastighed: se andet afsnit i punkt 2.2.1. Kriteriet gælder for gennemsnitsværdien af variationskoefficienterne for replikate kontrolkulturer. — Variationskoefficienten for de gennemsnitlige specifikke væksthastigheder i hele testperioden i replikate kontrolkulturer må ikke være over 7 % i test med Pseudokirchneriella subcapitata og Desmodesmus subspicatus. For andre, mindre hyppigt benyttede testede arter må værdien ikke være over 10 %. 1.8. BESKRIVELSE AF METODEN 1.8.1. Apparatur Testbeholdere og andet apparatur, der kommer i berøring med testopløsningerne, skal være udført helt i glas eller andet kemisk inaktivt materiale. Det pågældende udstyr skal være omhyggelig vasket for at sikre, at ingen organiske eller uorganiske kontaminanter kan forstyrre algevæksten eller testopløsningernes sammensætning. Som testbeholdere anvendes sædvanligvis glaskolber af en størrelse, der giver tilstrækkeligt kulturvolumen til målingerne under testen og tilstrækkelig masseoverførsel af CO2 fra atmosfæren (se andet afsnit i punkt 1.8.9). Bemærk, at der skal være tilstrækkeligt væskevolumen til de analytiske bestemmelser (se femte afsnit i punkt 1.8.11). Derudover er der brug for følgende udstyr eller en del deraf: — dyrkningsapparatur: Det anbefales at benytte et kabinet eller kammer med mulighed for fastholdelse af den valgte inkubationstemperatur inden for ±2 °C. — instrumenter til lysmåling: Man må være opmærksom på, at den anvendte metode til lysintensitetsmåling, specielt den anvendte type detektor (kollektor), vil påvirke måleværdien. Til målingerne skal fortrinsvis benyttes en sfærisk detektor (4 π-detektor) (som reagerer på direkte og reflekteret lys fra alle vinkler over og under måleplanet) eller en 2 π-detektor (som reagerer på lys fra alle vinkler over måleplanet). — apparatur til bestemmelse af algebiomasse: Celletal, der er den oftest anvendte surrogatparameter for algebiomasse, kan bestemmes med en elektronisk partikeltæller, et mikroskop med tællekammer eller et flowcytometer. Andre biomassesurrogater kan måles med flowcytometer, fluorimeter, spektrofotometer eller kolorimeter. Det er hensigtsmæssigt at beregne en omregningsfaktor fra celletal til tør vægt. Ved spektrofotometrisk bestemmelse af lave biomassekoncentrationer kan det være nødvendigt at bruge kuvetter med en lysvej på mindst 4 cm for at få brugbare målinger. 1.8.2. Testorganismer Der kan anvendes forskellige arter af ikke-fastsiddende mikroalger og cyanobakterier. De i tillæg 1 opførte stammer har vist sig velegnede ved brug af fremgangsmåden i denne testmetode. Benyttes andre arter, skal stamme og/eller oprindelse angives. Det skal være godtgjort, at der kan opretholdes eksponentiel vækst af de valgte testalger i hele testperioden under de givne betingelser. 1.8.3. Næringssubstrat To alternative næringssubstrater, OECD-substratet og AAP-substratet, anbefales. Substraternes sammensætning er angivet i tillæg 2. Bemærk, at de to mediers initiale pH-værdi og bufferkapacitet (som regulerer pH-stigningen) er forskellige. Testningen kan derfor give forskelligt resultat afhængigt af substratet, specielt ved test af