4)

Følgende indsættes som kapitel X: »X. BESTEMMELSE AF FØLGENDE FORBINDELSER FRA TRÆ I SPIRITUS VED HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI (HPLC): FURFURAL, 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL, 5-METHYLFURFURAL, VANILLIN, SYRINGALDEHYD, CONIFERALDEHYD, SINAPALDEHYD, GALLUSSYRE, ELLAGINSYRE, VANILLINSYRE, SYRINGASYRE OG SCOPOLETIN 1. Anvendelsesområde Metoden vedrører bestemmelse af furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanillin, syringaldehyd, coniferaldehyd, sinapaldehyd, gallussyre, ellaginsyre, vanillinsyre, syringasyre og scopoletin ved højtryksvæskekromatografi. 2. Normativ reference Analysemetode, der er godkendt af Den Internationale Vinorganisations (OIV) generalforsamling og offentliggjort af OIV under reference OIV-MA-BS-16: R2009. 3. Princip Bestemmelse ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) med detektering ved ultraviolet spektrofotometri ved flere bølgelængder og ved spektrofluorimetri. 4. Reagenser Reagenserne skal være af analysekvalitet. Der anvendes destilleret vand eller vand af mindst tilsvarende renhed. Det er bedst at anvende mikrofiltreret vand med en resistivitet på 18,2 M Ω.cm. 4.1. Alkoholindhold på 96 %. 4.2. Methanol af HPLC-kvalitet (væske B). 4.3. 0,5 % eddikesyre (væske A). 4.4. Mobile faser: (er kun givet som eksempel). Væske A (0,5 % eddikesyre) og væske B (ren methanol). Filtreres gennem et membranfilter (porestørrelse 0,45 μm). Der afgasses om nødvendigt i ultralydsbad. 4.5. Referencestandarder for en renhed på mindst 99 %: furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanillin, syringaldehyd, coniferaldehyd, sinapaldehyd, gallussyre, ellaginsyre, vanillinsyre, syringasyre og scopoletin. 4.6. Referenceopløsning: Standardstofferne opløses i en vandig-alkoholholdig opløsning på 50 % vol. De endelige koncentrationer i referenceopløsningen bør være i størrelsesordenen: furfural: 5 mg/l; 5-hydroxymethyl furfural: 10 mg/l; 5-methylfurfural 2 mg/l; vanillin: 5 mg/l; syringaldehyd: 10 mg/l; coniferaldehyd: 5 mg/l; sinapaldehyd: 5 mg/l; gallussyre: 10 mg/l; ellaginsyre: 10 mg/l; vanillinsyre: 5 mg/l; syringasyre: 5 mg/l; scopoletin: 0,5 mg/l. 5. Apparatur Sædvanligt laboratorieudstyr 5.1. Højtryksvæskekromatograf, der kan fungere i binær gradient mode, udstyret med: 5.1.1. Spektrofotometrisk detektor til måling af bølgelængder i intervallet 260-340 nm. Det er imidlertid bedst at arbejde med en detektor med variabel bølgelængde med en diode eller lignende med henblik på at bekræfte toppenes renhed. 5.1.2. Spektrofotometrisk detektor — excitationsbølgelængde: 354 nm, emissionsbølgelængde: 446 nm (til detektering af scopoletin, der ligeledes kan detekteres ved 313 nm ved spektrofotometri). 5.1.3. Injektionsanordning til injektion af 10 eller 20 μl (f.eks.) af prøven. 5.1.4. Kolonne til højtryksvæskekromatografi af typen RP C18, partikelstørrelse maks. 5 μm. 5.2. Sprøjter til HPLC. 5.3. Anordning til membranfiltrering af små mængder. 5.4. Computer/integrator eller optager/integrator, der er kompatibel med hele apparaturet. Den skal navnlig have flere indsamlingskanaler. 6. Fremgangsmåde 6.1. Fremstilling af injektionsopløsningen. Referenceopløsningen og spiritussen filtreres om nødvendigt gennem et membranfilter med porestørrelse på ikke over 0,45 μm. 6.2. Kromatografiske driftsbetingelser: Analysen foretages ved stuetemperatur ved hjælp af det udstyr, der er beskrevet i punkt 5.1, og ved brug af de mobile faser (punkt 4.4) og en gennemstrømningshastighed på ca. 0,6 ml pr. minut i overensstemmelse med nedenstående gradient (er kun givet som et eksempel) Tidspunkt: 0 min, 50 min, 70 min, 90 min Væske A (vand-syre): 100 %, 60 %, 100 %, 100 % Væske B (methanol): 0 %, 40 %, 0 %, 0 % Bemærk, at denne gradient bør ændres i nogle tilfælde for at undgå co-eluering. 6.3. Bestemmelse 6.3.1. Referencestandarderne sprøjtes ind særskilt og blandes. Tilpas driftsbetingelserne, således at opløsningsfaktorerne for alle forbindelsernes toppe mindst svarer til 1. 6.3.2. Prøven fremstillet i overensstemmelse med punkt 6.1 indsprøjtes. 6.3.3. Arealet af toppene i referenceopløsningen og spiritussen måles, og koncentrationerne beregnes. 7. Angivelse af resultater Koncentrationen af hver bestanddel udtrykkes i mg/l. 8. Metodens kvalitetsparametre (præcision) Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse af forskellige spirituskategorier foretaget i 2009 efter internationalt anerkendte procedurer [1], [2]. 8.1. Furfural Analysand Furfural Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 15 15 15 15 15 15 Antal accepterede resultater (laboratorier) 14 12 13 14 13 13 Gennemsnit [mg/l] 2,9 1,2 1,7 10,6 15,3 13,9 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,04 0,05 0,04 0,18 0,23 0,20 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 1,4 4,5 2,3 1,7 1,5 1,5 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,1 0,2 0,1 0,5 0,6 0,6 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,24 0,18 0,09 1,4 0,49 0,69 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 8 15 5 13 3 5 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,7 0,5 0,3 3,8 1,4 1,9 8.2. 5-hydroxymethylfurfural Analysand 5-hydroxymethylfurfural Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 16 16 16 16 16 16 Antal accepterede resultater (laboratorier) 14 14 14 14 14 14 Gennemsnit [mg/l] 5,0 11,1 9,4 33,7 5,8 17,5 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,09 0,09 0,09 0,42 0,07 0,13 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 1,7 0,8 1,0 1,3 1,2 0,8 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,2 0,3 0,3 1,2 0,2 0,4 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,39 1,01 0,50 4,5 0,4 1,6 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 8 9 5 13 7 9 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 1,1 2,8 1,4 12,5 1,1 4,6 8.3. 5-methylfurfural Analysand 5-methylfurfural Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 11 11 11 11 11 11 Antal accepterede resultater (laboratorier) 11 11 8 11 10 11 Gennemsnit [mg/l] 0,1 0,2 0,1 0,5 1,7 0,8 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,01 0,01 0,02 0,02 0,03 0,07 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 10,7 6,1 13,6 4,7 2,0 10,0 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,0 0,0 0,1 0,1 0,1 0,2 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,03 0,04 0,03 0,18 0,20 0,26 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 35 18 22 39 12 35 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,1 0,1 0,1 0,5 0,6 0,7 8.4. Vanillin Analysand Vanillin Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 16 15 16 16 16 16 Antal accepterede resultater (laboratorier) 16 15 16 16 16 16 Gennemsnit [mg/l] 0,5 0,2 1,2 1,2 3,2 3,9 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,03 0,02 0,06 0,11 0,11 0,09 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 6,8 9,6 4,6 8,9 3,5 2,3 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,1 0,1 0,2 0,3 0,3 0,3 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,09 0,06 0,18 0,27 0,41 0,62 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 19 25 15 22 13 16 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,3 0,2 0,5 0,8 1,2 1,7 8.5. Syringaldehyd Analysand Syringaldehyd Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 16 15 16 16 16 16 Antal accepterede resultater (laboratorier) 13 13 13 12 14 13 Gennemsnit [mg/l] 1,0 0,2 4,8 3,2 10,5 9,7 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,03 0,02 0,04 0,08 0,10 0,09 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 2,6 8,1 0,8 2,6 0,9 0,9 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,1 0,1 0,1 0,2 0,3 0,3 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,08 0,07 0,23 0,19 0,39 0,43 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 8 33 5 6 4 4 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,2 0,2 0,7 0,5 1,1 1,2 8.6. Coniferaldehyd Analysand Coniferaldehyd Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 13 12 13 12 13 13 Antal accepterede resultater (laboratorier) 12 12 13 12 13 13 Gennemsnit [mg/l] 0,2 0,2 0,6 0,8 4,6 1,3 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,02 0,02 0,03 0,03 0,09 0,06 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 9,2 9,8 4,6 4,3 1,9 4,5 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,04 0,04 0,07 0,09 0,24 0,16 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,04 0,04 0,11 0,18 0,38 0,25 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 23 27 21 23 8 19 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,1 0,1 0,3 0,5 1,1 0,7 8.7. Sinapaldehyd Analysand Sinapaldehyd Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 14 14 14 14 15 14 Antal accepterede resultater (laboratorier) 14 13 12 13 13 12 Gennemsnit [mg/l] 0,3 0,2 0,2 1,6 8,3 0,3 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,02 0,01 0,02 0,06 0,14 0,03 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 7,5 4,6 11,2 3,7 1,6 11,4 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,06 0,03 0,06 0,17 0,38 0,08 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,09 0,05 0,08 0,20 0,81 0,18 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 31 27 46 13 10 73 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,2 0,2 0,2 0,6 2,3 0,5 8.8. Gallussyre Analysand Gallussyre Prøve Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 16 15 16 16 16 16 Antal accepterede resultater (laboratorier) 15 14 16 16 16 16 Gennemsnit [mg/l] 1,2 0,4 2,0 6,1 7,3 21,8 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,07 0,04 0,06 0,18 0,18 0,60 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 6,1 8,1 2,9 3,0 2,4 2,8 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,2 0,1 0,2 0,5 0,5 1,7 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,43 0,20 0,62 3,3 2,2 7,7 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 36 47 31 53 30 35 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 1,2 0,6 1,7 9,1 6,2 21,7 8.9. Ellaginsyre Analysand Ellaginsyre Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 7 7 7 7 7 7 Antal accepterede resultater (laboratorier) 7 7 7 7 7 6 Gennemsnit [mg/l] 3,2 1,0 9,5 13 13 36 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,20 0,16 0,30 0,41 0,95 0,34 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 6,3 16 3,2 3,2 7,4 1,0 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,6 0,4 0,9 1,1 2,7 1,0 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 1,41 0,42 4,0 5,0 4,9 14 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 44 43 42 39 39 40 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 4,0 1,2 11 14 14 40 8.10. Vanillinsyre Analysand Vanillinsyre Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 15 15 15 15 15 15 Antal accepterede resultater (laboratorier) 12 11 14 14 15 14 Gennemsnit [mg/l] 0,2 0,2 1,5 0,8 2,4 2,7 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,03 0,04 0,03 0,10 0,13 0,21 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 14,2 16,5 2,3 12,6 5,3 7,7 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,1 0,1 0,1 0,3 0,4 0,6 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,06 0,05 0,51 0,2 1,22 0,70 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 28 20 35 31 51 26 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,2 0,1 1,4 0,7 3,4 2,0 8.11. Syringasyre Analysand Syringasyre Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 16 15 16 16 16 16 Antal accepterede resultater (laboratorier) 16 15 15 15 16 15 Gennemsnit [mg/l] 0,4 0,2 2,5 1,4 3,4 4,8 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,03 0,02 0,06 0,13 0,08 0,11 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 6,7 12,6 2,3 9,0 2,3 2,3 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,1 0,1 0,2 0,4 0,2 0,3 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,08 0,05 0,29 0,26 0,43 0,67 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 19 29 11 18 13 14 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,2 0,1 0,8 0,7 1,2 1,9 8.12. Scopoletin Analysand Scopoletin Prøver Whisky Brandy Rom Cognac 1 Bourbon Cognac 2 Antal deltagende laboratorier 10 10 10 10 10 10 Antal accepterede resultater (laboratorier) 9 8 9 8 8 8 Gennemsnit [mg/l] 0,09 0,04 0,11 0,04 0,65 0,15 Standardafvigelse for repeterbarhed sr [mg/l] 0,0024 0,0008 0,0018 0,0014 0,0054 0,0040 Relativ standardafvigelse for repeterbarhed RSDr [%] 2,6 2,2 1,6 3,3 0,8 2,7 Repeterbarhedsgrænse r [mg/l] (r = 2,8 × sr) 0,007 0,002 0,005 0,004 0,015 0,011 Standardafvigelse for reproducerbarhed sR [mg/l] 0,01 0,01 0,03 0,01 0,09 0,02 Relativ standardafvigelse for reproducerbarhed RSDR [%] 15 16 23 17 15 15 Reproducerbarhedsgrænse R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,04 0,02 0,07 0,02 0,26 0,06 [1] Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies, Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332-343. [2] Horwitz, W. (1982) Analytical Chemistry 54, 67A-76A.«