»B.47. OKSECORNEA-UKLARHEDS- OG -PERMEABILITETSTESTMETODEN (BCOP-TESTMETODEN) TIL IDENTIFIKATION AF ØJENÆTSENDE STOFFER OG STÆRKT ØJENIRRITERENDE STOFFER

INDLEDNING

Oksecornea-uklarheds- og -permeabilitetstestmetoden (BCOP [Bovine Corneal Opacity and Permeability]-testmetoden) er en in vitro-testmetode, som under visse omstændigheder og med særlige begrænsninger kan anvendes til at klassificere stoffer og blandinger som »øjenætsende stoffer og stærkt øjenirriterende stoffer« (1) (2) (3). For denne testmetode er stærkt øjenirriterende stoffer defineret som dem, der inducerer øjenlæsioner, der persisterer hos kaninen i mindst 21 dage efter administration. Selv om den ikke betragtes som gyldig som fuldstændig erstatning for in vivo-kaninøjentesten, anbefales BCOP anvendt som del af en trindelt testningsstrategi for forskriftsmæssig klassificering og mærkning inden for et specifikt anvendelsesområde (domæne) (4) (5). Teststoffer og -blandinger (6) kan klassificeres som øjenætsende stoffer eller stærkt øjenirriterende stoffer uden yderligere testning hos kaniner. Et stof, der er testet negativt, vil skulle testes hos kaniner ved anvendelse af en sekventiel testningsstrategi som anført i OECD Test Guideline 405 (7) (kapitel B. 5 i dette bilag).

Formålet med denne testmetode er at beskrive de procedurer, som anvendes til at vurdere et teststofs potentielle øjenætsning eller stærke øjenirritation som målt ved dets evne til at inducere uklarhed og øget permeabilitet i en isoleret oksecornea. Toksiske virkninger på cornea måles ved: (i) nedsat lystransmission (uklarhed) og (ii) øget passage af farvestoffet natriumfluorescein (permeabilitet). Uklarheds- og permeabilitetsvurderingerne af cornea efter eksponering for et teststof kombineres til udledning af en in vitro-irritationsscore (IVIS, In Vitro Irritancy Score), som anvendes til at klassificere teststoffets irritationsniveau.

INDLEDENDE BETRAGTNINGER OG BEGRÆNSNINGER

Denne testmetode er baseret på Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) BCOP Test Method Protocol (8), som blev udviklet efter en international valideringsundersøgelse (4) (5) (9) med bidrag fra European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) og Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM). Protokollen er baseret på oplysninger fra Institute for In Vitro Sciences (IIVS) og INVITTOX Protocol 124 (10), som er den protokol, der blev anvendt til den af De Europæiske Fællesskaber sponsorerede prævalideringsundersøgelse af BCOP-assayet, som blev gennemført i 1997-1998. Begge disse protokoller er baseret på BCOP-assaymetodikken, som først blev rapporteret af Gautheron et al. (11).

De identificerede begrænsninger for denne testmetode er baseret på de høje falsk positiv-rater for alkoholer og ketoner og den høje falsk negativ-rate for faste stoffer i valideringsdatabasen (se punkt 44) (5). Når stoffer i disse kemiske og fysiske stofgrupper udelukkes fra databasen, forbedres BCOP's nøjagtighed på tværs af EU-, EPA- og GHS-klassificeringssystemerne væsentligt (5). Som følge af formålet med dette assay (dvs. alene identifikation af øjenætsende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer) er falsk negativ-rater ikke kritiske, eftersom sådanne stoffer efterfølgende vil blive testet hos kaniner eller med andre tilstrækkeligt validerede in vitro-test, alt efter de forskriftsmæssige krav, ved anvendelse af en sekventiel testningsstrategi med en »weight of evidence«-tilgang. Den nuværende valideringsdatabase har desuden ikke muliggjort en tilstrækkelig vurdering af visse kemiske stofgrupper eller produktgrupper (f.eks. blandinger). Undersøgerne vil imidlertid kunne overveje at anvende denne testmetode til alle typer af testmateriale (herunder blandinger), hvor et positivt resultat vil kunne accepteres som indikativt for en øjenætsningsrespons eller svær øjenirritationsrespons. Positive resultater for alkoholer eller ketoner bør dog fortolkes med forsigtighed som følge af risikoen for overfortolkning.

Alle procedurer med okseøjne og oksecorneae skal følge testfacilitetens gældende forskrifter og procedurer for håndtering af animalske materialer, hvilket omfatter, men ikke er begrænset til, væv og vævsvæsker. Det anbefales at benytte universale laboratorieforsigtighedsregler (12).

Testmetoden har den begrænsning, at selv om den tager højde for nogle af de øjenvirkninger, som vurderes i kaninøjenirritationstestmetoden, og til en vis grad deres sværhedsgrad, tager den ikke højde for conjunctiva- og irisskader. Desuden kan reversibiliteten af cornealæsioner ikke vurderes i sig selv med BCOP-assayet, men det er på grundlag af kaninøjenundersøgelser foreslået, at en vurdering af den indledende cornealæsionsdybde kan anvendes til at skelne mellem irreversible og reversible virkninger (13). Endelig muliggør BCOP-testmetoden ikke vurdering af den potentielle systemiske toksicitet i forbindelse med øjeneksponering.

Der er bestræbelser i gang for yderligere at karakterisere anvendeligheden af og begrænsningerne for BCOP-assayet til identifikation af ikke-stærkt irriterende stoffer og ikke-irriterende stoffer (se også punkt 45). Brugerne opfordres også til at forsyne valideringsorganisationer med prøver og/eller data med henblik på formel vurdering af mulige fremtidige anvendelser af BCOP-testmetoden, herunder anvendelse til identifikation af ikke-stærkt irriterende stoffer og ikke-irriterende stoffer.

Ethvert laboratorium bør, når det påbegynder brug af dette assay, benytte kompetencekemikalierne i tillæg 2. Et laboratorium kan benytte disse kemikalier til at godtgøre sin tekniske kompetence vedrørende brug af BCOP-testmetoden, inden det påbegynder fremsendelse af BCOP-assaydata med henblik på forskriftsmæssig fareklassificering.

PRINCIP FOR TESTMETODEN

BCOP-testmetoden er en organotypisk model, som kortvarigt opretholder normal fysiologisk og biokemisk funktion af oksecornea in vitro. Ved denne testmetode vurderes teststoffets beskadigende virkning ved kvantitative målinger af ændringer i cornea-uklarhed og -permeabilitet med henholdsvis et opacitometer og et spektrofotometer til synligt lys. Begge målinger anvendes til at beregne en IVIS, som anvendes til at tildele en in vitro-irritationsfareklassificeringskategori med henblik på forudsigelse af et teststofs in vivo-øjenirritationspotentiale (se Beslutningskriterier).

I BCOP-testmetoden anvendes isolerede corneae fra øjnene fra friskslagtet kvæg. Cornea-uklarhed måles kvantitativt som omfanget af lystransmission gennem cornea. Permeabilitet måles kvantitativt som mængden af farvestoffet natriumfluorescein, der passerer gennem den fulde tykkelse af cornea som detekteret i mediet i det bageste kammer. Teststofferne tilføres til cornea-epiteloverfladen ved tilsætning til corneaholderens forreste kammer. I tillæg 3 findes en beskrivelse af og et diagram over en corneaholder, som anvendes i BCOP-testmetoden. Corneaholdere kan købes i handelen fra forskellige kilder eller konstrueres.

Kilde til okseøjne og deres alder samt udvælgelse af dyrearter

Kvæg, som sendes til slagterier, aflives typisk enten med henblik på anvendelse til konsum eller anden kommerciel udnyttelse. Kun raske dyr, som anses for egnede til at indgå i menneskets fødekæde, anvendes som kilde til corneae til brug i BCOP-testen. Eftersom vægtintervallet for kvæg er bredt og afhænger af race, alder og køn, er der ingen anbefalet vægt for dyrene på slagtetidspunktet.

Der kan forekomme variationer i corneadimensioner ved anvendelse af øjne fra dyr med forskellig alder. Corneae med en vandret diameter > 30,5 mm og værdier for den centrale corneatykkelse (CCT) på ≥ 1 100 μm stammer i almindelighed fra kvæg, som er mere end otte år gamle, mens corneae med en vandret diameter < 28,5 mm og CCT < 900 μm i almindelighed stammer fra kvæg, som er mindre end fem år gamle (14). Derfor anvendes der typisk ikke øjne fra kvæg, som er mere end 60 måneder gamle. Øjne fra kvæg, som er mindre end 12 måneder gamle, har traditionelt ikke været anvendt, eftersom disse øjne stadig er i udviklingsfasen, og corneatykkelsen og -diameteren er betydeligt mindre end det rapporterede for øjne fra voksent kvæg. Anvendelse af corneae fra yngre (dvs. 6-12 måneder gamle) dyr er imidlertid tilladelig, eftersom det giver visse fordele, såsom øget tilgængelighed, et snævert aldersinterval og nedsat risiko for potentiel arbejdstagereksponering for bovin spongiform encefalopati (BSE) (15). Da yderligere vurdering af betydningen af corneastørrelse eller -tykkelse for responsen på ætsende og irriterende stoffer ville være nyttig, opfordres brugerne til at rapportere den estimerede alder og/eller vægt for de dyr, hvorfra de corneae, der undersøges, stammer.

Indsamling og transport af øjne til laboratoriet

Øjnene indsamles af slagteriarbejdere. For at minimere mekanisk og anden beskadigelse af øjnene skal de enukleeres hurtigst muligt efter dyrenes aflivning. For at hindre, at øjnene eksponeres for potentielt irriterende stoffer, må slagteriarbejderne ikke anvende rensemiddel, når de skyller dyrenes hoveder.

Øjnene skal nedsænkes helt i Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) i en beholder med en passende størrelse og transporteres til laboratoriet på en sådan måde, at ødelæggelse og/eller bakteriekontaminering minimeres. Eftersom øjnene indsamles under slagteprocessen, vil de kunne blive eksponeret for blod og andre biologiske substanser, herunder bakterier og andre mikroorganismer. Det er derfor vigtigt at sikre, at risikoen for kontaminering minimeres (f.eks. ved at opbevare beholderen med øjnene på våd is, ved at tilsætte antibiotika til den HBSS, som øjnene opbevares i under transport [f.eks. penicillin i en koncentration på 100 IE/ml og streptomycin i en koncentration på 100 mg/ml]).

Tidsintervallet mellem indsamling af øjnene og anvendelsen af corneae i BCOP-testen skal minimeres (typisk indsamling og anvendelse samme dag), og det skal påvises, at intervallets varighed ikke påvirker assayresultaterne negativt. Disse resultater er baseret på udvælgelseskriterierne for øjnene, såvel som de positive og negative kontrolresponser. Alle de øjne, som anvendes i assayet, skal stamme fra samme gruppe øjne, som er indsamlet på en bestemt dag.

Udvælgelseskriterier for øjne, der anvendes i BCOP-testen

Når øjnene er ankommet til laboratoriet, undersøges de omhyggeligt for defekter, herunder øget uklarhed, ridser og neovaskularisering. Der anvendes kun corneae fra øjne, som er fri for sådanne defekter.

Hver behandlingsgruppe (teststof, samtidige negative og positive kontroller) består af minimum tre øjne. Der skal anvendes tre corneae som negative kontrolcorneae i BCOP-assayet. Eftersom alle corneae ekscideres fra det hele øjeæble og anbringes i corneakamrene, er der mulighed for håndteringsforårsagede artefakter i de individuelle cornea-uklarheds- og -permeabilitetsværdier (inklusive negativ kontrol). Uklarheds- og permeabilitetsværdierne for de corneae, der fungerer som negativ kontrol, anvendes desuden til at korrigere uklarheds- og -permeabilitetsværdierne for testartikel- og positiv kontrol-behandlede corneae i IVIS-beregningerne.

TESTPROCEDURE

Klargøring af øjnene

Corneae, som er fri for defekter, fridissekeres således, at der stadig er en 2-3 mm sclerakant tilbage til hjælp ved efterfølgende håndtering, idet det tilstræbes at undgå at beskadige cornea-epitelet og -endotelet. Isolerede corneae anbringes i specialdesignede corneaholdere, der består af forreste og bageste rum, som grænser op til henholdsvis epitel- og endotelsiden af cornea. Begge kamre fyldes rigeligt op med forvarmet Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (bageste kammer først), idet det sikres, at der ikke dannes bobler. Derpå bringes anordningen i ligevægt ved 32 ± 1 °C i mindst en time for at gøre det muligt for corneae at komme i ligevægt med mediet og opnå normal metabolisk aktivitet i den grad, det er muligt (den tilnærmelsesvise temperatur af cornea-overfladen in vivo er 32 °C).

Efter ligevægtsindstillingsperioden tilsættes frisk forvarmet EMEM til begge kamre, og der aflæses basislinje-uklarhed for hver cornea. Alle corneae, som har makroskopisk vævsbeskadigelse (f.eks. ridser, pigmentering, neovaskularisering) eller en uklarhed > 7 uklarhedsenheder, kasseres. Den gennemsnitlige uklarhed for alle corneae, som er bragt i ligevægt, beregnes. Minimum tre corneae med uklarhedsværdier tæt på medianværdien for alle corneae udvælges som negative (eller opløsningsmiddel-) kontrolcorneae. De resterende corneae fordeles derpå i en behandlingsgruppe og en positiv kontrolgruppe.

Eftersom varmekapaciteten for vand er højere end for luft, giver vand mere stabile temperaturbetingelser til inkubering. Derfor anbefales det at benytte et vandbad til at holde corneaholderen og dens indhold ved 32 ± 1 °C. Der kan dog også anvendes luftinkubatorer under forudsætning af omhyggelig opretholdelse af temperaturstabilitet (f.eks. ved forvarmning af holdere og medier).

Applikation af teststoffet

Der anvendes to forskellige behandlingsprotokoller - en for væsker og overfladeaktive stoffer (faste stoffer eller væsker) og en for ikke-overfladeaktive stoffer.

Væsker testes ufortyndede, mens overfladeaktive stoffer testes ved en koncentration på 10 % vægt/volumen i en 0,9 % natriumchloridopløsning, destilleret vand eller et andet opløsningsmiddel, som er påvist ikke at påvirke testsystemet negativt. Halvfaste stoffer, cremer og vokser testes typisk som væsker. Der skal gives passende begrundelse for alternative fortyndingskoncentrationer. Corneae eksponeres for væsker og overfladeaktive stoffer i 10 minutter. Anvendelse af andre eksponeringstider skal ledsages af tilstrækkeligt videnskabeligt rationale.

Ikke-overfladeaktive faste stoffer testes typisk som opløsninger eller opslæmninger ved en koncentration på 20 % i en 0,9 % natriumchloridopløsning, destilleret vand eller et andet opløsningsmiddel, som er påvist ikke at påvirke testsystemet negativt. Under visse omstændigheder og med behørig videnskabelig begrundelse kan faste stoffer også testes i ren form ved direkte applikation på cornea-overfladen ved anvendelse af metoden med åbent kammer (se punkt 29). Corneae eksponeres for faste stoffer i fire timer, men som for væsker og overfladeaktive stoffer kan der anvendes alternative eksponeringstider med tilstrækkeligt videnskabeligt rationale.

Der kan anvendes forskellige behandlingsmetoder alt efter teststoffets fysiske natur og kemiske egenskaber (f.eks. faste stoffer, væsker, viskøse kontra ikke-viskøse væsker). I den forbindelse er det absolut påkrævet at sikre, at teststoffet dækker epiteloverfladen tilstrækkeligt, og at det fjernes tilstrækkeligt under skylletrinene. Der anvendes typisk en metode med lukket kammer for ikke-viskøse til let viskøse flydende teststoffer, mens der typisk anvendes en metode med åbent kammer for halvviskøse og viskøse flydende teststoffer og for rene faste stoffer.

Ved metoden med lukket kammer indføres der tilstrækkeligt teststof (750 μl) til at dække cornea-epitelsiden i det forreste kammer gennem doseringshullerne på kammerets overside, og hullerne lukkes efterfølgende med kammerpropperne under eksponeringen. Det er vigtigt at sikre, at hver cornea eksponeres for et teststof i det rette tidsinterval.

Ved metoden med åbent kammer fjernes vindueslåseringen og glasvinduet fra det forreste kammer inden behandling. Kontrol- eller teststoffet (750 μl - nok teststof til at dække cornea helt) påføres direkte på cornea-epiteloverfladen ved anvendelse af en mikropipette. Hvis et teststof er vanskeligt at pipettere, kan teststoffet fyldes i en pipette med positiv fortrængning under tryk som hjælp til dosering. Pipettespidsen på pipetten med positiv fortrængning indsættes i sprøjtens doseringsspids, således at materialet kan fyldes over i fortrængningsspidsen under tryk. Samtidig trykkes sprøjtestemplet ned, efterhånden som pipettestemplet trækkes opad. Hvis der dukker luftbobler op i pipettespidsen, fjernes testartiklen (den presses ud), og processen gentages, indtil spidsen er fyldt uden luftbobler. Om nødvendigt kan der anvendes en normal sprøjte (uden kanyle), eftersom en sådan sprøjte dels muliggør afmåling af et nøjagtigt volumen teststof og dels letter applikation på cornea-epiteloverfladen. Efter doseringen sættes glasvinduet på plads på det forreste kammer for at genskabe et lukket system.

Inkubering efter eksponering

Efter eksponeringsperioden fjernes teststoffet, den negative kontrol eller det positive kontrolstof fra det forreste kammer, og epitelet vaskes mindst tre gange (eller indtil der ikke længere er synlige tegn på teststof) med EMEM (som indeholder phenolrødt). Der anvendes phenolrødt-holdigt medium til skylning, eftersom et farveskift for phenolrødt kan anvendes som indikator for effektiviteten af bortskylning af sure eller basiske materialer. Corneae vaskes mere end tre gange, hvis indikatoren phenolrødt stadig er misfarvet (gul eller violet), eller hvis teststoffet stadig er synligt. Når teststoffet er fjernet fra mediet, foretages en afsluttende skylning af corneae med EMEM (uden phenolrødt). EMEM (uden phenolrødt) anvendes til afsluttende skylning for at sikre fjernelse af phenolrødt fra det forreste kammer inden uklarhedsmålingen. Derefter fyldes det forreste kammer igen med frisk EMEM uden phenolrødt.

For væsker eller overfladeaktive stoffer inkuberes corneae efter skylning i yderligere to timer ved 32 ± 1 °C. Længere tid efter eksponering kan være nyttig under visse omstændigheder og kan overvejes i hvert enkelt tilfælde. Corneae, som er behandlet med faste stoffer, skylles grundigt ved afslutningen af den fire timer lange eksponeringsperiode, men kræver ikke yderligere inkubering.

Ved afslutningen af inkuberingsperioden efter eksponeringen for væsker og overfladeaktive stoffer og ved afslutningen af den fire timer lange eksponeringsperiode for ikke-overfladeaktive faste stoffer registreres uklarheden og permeabiliteten for hver cornea. Desuden observeres hver cornea visuelt, og væsentlige observationer registreres (f.eks. vævsafskalning, resterende teststof, uensartede uklarhedsmønstre). Disse observationer kan være vigtige, da de kan give sig udslag i variationer i opacitometeraflæsningerne.

Kontrolstoffer

Ved test af et flydende stof i en koncentration på 100 % medtages der ved BCOP-testmetoden en samtidig negativ kontrol (f.eks. 0,9 % natriumchloridopløsning eller destilleret vand), således at der kan detekteres ikke-specifikke ændringer i testsystemet og opnås en basislinje for assayets endepunkter. Det sikrer også, at assaybetingelserne ikke fejlagtigt resulterer i en irritationsrespons.

Ved test af fortyndet væske, overfladeaktivt stof eller fast stof medtages der ved BCOP-testmetoden en samtidig opløsningsmiddel/vehikel-kontrolgruppe, således at der kan detekteres ikke-specifikke ændringer i testsystemet og opnås en basislinje for assayets endepunkter. Kun et opløsningsmiddel/vehikel, som er påvist ikke at påvirke testsystemet negativt, kan anvendes.

Der medtages et kendt øjenirriterende stof som samtidig positiv kontrol i hvert forsøg for at verificere, at der induceres en passende respons. Eftersom BCOP-assayet anvendes i denne testmetode til identifikation af ætsende eller stærkt irriterende stoffer, skal den positive kontrol ideelt set være et referencestof, som inducerer en svær respons ved denne testmetode. For at sikre, at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør størrelsesordenen af irritationsresponsen imidlertid ikke være overdrevent stor.

Eksempler på positive kontroller for flydende teststoffer er dimethylformamid eller 1 % natriumhydroxid. Et eksempel på en positiv kontrol for faste teststoffer er 20 % (vægt/volumen) imidazol i 0,9 % natriumchloridopløsning.

Referencestoffer er nyttige i forbindelse med vurdering af øjenirritationspotentialet for ukendte kemikalier fra en særlig kemisk stofgruppe eller produktgruppe eller vurdering af det relative irritationspotentiale for et øjenirriterende stof inden for et specifikt område af irritationsresponser.

Målte endepunkter

Der kan alternativt anvendes en 96-brønds mikrotiterpladeaflæser, forudsat at (i) pladeaflæserens lineære interval for bestemmelse af fluorescein-OD490-værdier kan fastlægges; og at (ii) volumenet af fluoresceinprøverne i 96-brønds pladen er korrekt, således at der opnås OD490-værdier svarende til 1 cm standardvejlængden (dette kan kræve en helt fuld brønd [sædvanligvis 360 ml]).

DATA OG RAPPORTERING

Datavurdering

Sina et al. (16) rapporterede, at denne formel blev udledt under interne og sammenlignende laboratorieundersøgelser. Data genereret for i alt 36 forbindelser i en undersøgelse med deltagelse af flere laboratorier blev underkastet flerdimensional analyse for at bestemme ligningen for den bedste tilpasning mellem in vivo- og in vitro-data. Denne analyse blev udført af forskere i to forskellige virksomheder, som udledte næsten identiske ligninger.

Efter at uklarhedsværdier og gennemsnitlige permeabilitets-(OD490-)værdier er korrigeret for baggrundsuklarheds- og negativ kontrol-permeabilitets-OD490-værdier, skal den gennemsnitlige uklarhedsværdi og den gennemsnitlige permeabilitets-OD490-værdi for hver behandlingsgruppe kombineres i en empirisk udledt formel for at beregne en in vitro-irritationsscore (IVIS) for hver behandlingsgruppe som følger:

Uklarheds- og permeabilitetsværdierne bør også vurderes uafhængigt for at fastslå, om et teststof kun inducerede ætsning eller stærk irritation ud fra ét af de to endepunkter (se Beslutningskriterier).

Beslutningskriterier

Et stof, som inducerer en IVIS ≥ 55,1, defineres som et ætsende stof eller stærkt irriterende stof. Som anført i punkt 1 skal der, hvis teststoffet ikke identificeres som øjenætsende stof eller stærkt øjenirriterende stof, gennemføres yderligere testning med henblik på klassificering og mærkning. BCOP-testmetoden har en generel nøjagtighed på 79 % (113/143) til 81 % (119/147), en falsk positiv-rate på 19 % (20/103) til 21 % (22/103) og en falsk negativ-rate på 16 % (7/43) til 25 % (10/40) i sammenligning med in vivo-kaninøjentestmetodedata klassificeret i henhold til EPA- (1), EU- (2) eller GHS- (3) klassificeringssystemerne. Når stoffer i visse kemiske (dvs. alkoholer, ketoner) eller fysiske (dvs. faste stoffer) stofgrupper udelukkes fra databasen, ligger nøjagtigheden af BCOP på tværs af EU-, EPA- og GHS-klassificeringssystemerne fra 87 % (72/83) til 92 % (78/85), falsk positiv-raterne ligger fra 12 % (7/58) til 16 % (9/56), og falsk negativ-raterne ligger fra 0 % (0/27) til 12 % (3/26).

Selv hvis der ikke opnås en klassificering som øjenætsende stof eller stærkt øjenirriterende stof for et teststof, kan BCOP-dataene være nyttige sammen med testdata fra in vivo-kaninøjentesten eller fra en tilstrækkeligt valideret in vitro-test til yderligere vurdering af anvendeligheden af og begrænsningerne for BCOP-testmetoden til identifikation af ikke-stærkt irriterende stoffer og ikke-irriterende stoffer (et Guidance Document om anvendelse af in vitro-øjentoksicitetstestmetoder er under udarbejdelse).

Undersøgelsesacceptkriterier

En test betragtes som acceptabel, hvis den positive kontrol giver en IVIS, der er inden for to standardafvigelser fra det aktuelle historiske gennemsnit, som skal ajourføres mindst hver tredje måned eller hver gang, der gennemføres en acceptabel test på laboratorier, hvor der sjældent gennemføres test (dvs. sjældnere end en gang om måneden). Negative eller opløsningsmiddel/vehikel-kontrolresponser skal resultere i uklarheds- og permeabilitetsværdier, der er mindre end de fastsatte øvre grænser for baggrundsuklarheds- og -permeabilitetsværdier for oksecorneae behandlet med den respektive negative kontrol eller opløsningsmiddel/vehikel-kontrol.

Testrapport

Angivelse i tabelform af data fra hver enkelt testprøve (f.eks. uklarheds- og OD490-værdier og beregnet IVIS for teststoffet og de positive kontroller, negative kontroller og referencekontrollerne [hvis de er medtaget] rapporteret i tabelform, herunder data fra flergangsbestemmelser/gentagne bestemmelser, hvis det er relevant, og gennemsnit ± standardafvigelsen for hvert forsøg);

Den procedure, som anvendes til at sikre integriteten (dvs. nøjagtighed og pålidelighed) af testmetoden over tid (f.eks. periodisk testning af kompetencestoffer, anvendelse af historiske negative og positive kontroldata).

opbevarings- og transportbetingelser for øjnene (f.eks. dato og klokkeslæt for øjenindsamling, tidsinterval inden påbegyndelse af testning, transportmedier og temperaturbetingelser, eventuelle anvendte antibiotika);

LITTERATUR

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Se følgende websted:

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants (Erklæring om konklusionen på den retrospektive ICCVAM-undersøgelse af organotypiske in vitro-assays som screeningstest til identifikation af potentielle øjenætsende stoffer og stærkt øjenirriterende stoffer). Se følgende websted:

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Se følgende websted:

Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommissionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF. EUT L 396 af 30.12.2006, s. 1 .

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Se følgende websted:

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. I: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Se følgende websted:

ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Se følgende websted:

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italien: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Se følgende websted:

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

ICCVAM (2006). Background Review Document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Se følgende websted:

ICCVAM (2006). Background Review Document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Se følgende websted:

Tillæg 1

DEFINITIONER

Cornea: Den transparente del af øjeæblets forside, som dækker øjets iris og pupil, og hvorigennem lys kommer ind i øjets indre.

Corneapermeabilitet: Kvantitativ måling af beskadigelsen af cornea-epitelet ud fra bestemmelse af mængden af farvestoffet natriumfluorescein, der trænger gennem alle corneacellelag.

Cornea-uklarhed: Måling af graden af cornea-uigennemsigtighed efter eksponering for et teststof. Øget cornea-uklarhed er indikativt for beskadigelse af cornea. Uklarhed kan vurderes subjektivt som i Draize-kaninøjentesten eller objektivt med et instrument, såsom et »opacitometer«.

EPA-kategori I: Ætsende virkning (irreversibel ødelæggelse af øjenvæv) eller corneabeskadigelse eller -irritation, som persisterer mere end 21 dage (1).

EU-kategori R41: Frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller alvorlig fysisk synsnedsættelse, som opstår efter applikation af et teststof på øjets anteriore overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter applikation (2).

Falsk negativ-rate: Den andel af alle positive stoffer, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som negative. Dette er én indikator for testmetodens ydeevne.

Falsk positiv-rate: Den andel af alle negative stoffer, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som positive. Dette er én indikator for testmetodens ydeevne.

GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals [det globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier]): Et system til klassificering af kemikalier (stoffer og blandinger) efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare med tilhørende kommunikationselementer, såsom piktogrammer, signalord, risikosætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om stoffernes og blandingernes skadelige virkninger kan videreformidles med henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportører, forbrugere og redningspersonel) og miljø (3).

GHS-kategori 1: Frembringelse af vævsbeskadigelse i øjet eller alvorlig fysisk synsnedsættelse, som opstår efter applikation af et teststof på øjets anteriore overflade, og som ikke er fuldt reversibel inden for 21 dage efter applikation (3).

Ikke-irriterende stof: Stoffer, der ikke er klassificeret som øjenirriterende stoffer i EPA-kategori I, II eller III, EU-kategori R41 eller R36 eller GHS-kategori 1, 2A eller 2B.

In vitro-irritationsscore (IVIS): En empirisk udledt formel, som anvendes i BCOP-assayet, og hvorved den gennemsnitlige uklarhedsværdi og den gennemsnitlige permeabilitetsværdi for hver behandlingsgruppe kombineres i en enkelt in vitro-score for hver behandlingsgruppe. IVIS = gennemsnitlig uklarhedsværdi + (15 x gennemsnitlig permeabilitetsværdi).

Negativ kontrol: Et ubehandlet replikat, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem. Denne prøve behandles sammen med de teststofbehandlede prøver og andre kontrolprøver for at fastslå, om opløsningsmidlet interagerer med testsystemet.

Nøjagtighed: Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af »relevans«. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans« forstået som den andel korrekte udfald, testmetoden fører til.

Opacitometer: Et instrument, som anvendes til at måle »cornea-uklarhed« ved kvantitativ vurdering af lystransmission gennem cornea. Det typiske instrument har to rum, som hver har sin egen lyskilde og fotocelle. Det ene rum anvendes til den behandlede cornea, mens det andet anvendes til at kalibrere og nulstille instrumentet. Lys fra en halogenlampe sendes gennem et kontrolrum (et væsketomt kammer uden vinduer) til en fotocelle og sammenlignes med det lys, som er sendt gennem forsøgsrummet, som rummer kammeret med cornea, til en fotocelle. Forskellen i lystransmission fra fotocellerne sammenlignes, og der vises en numerisk uklarhedsværdi på et digitalt display.

Opløsningsmiddel/vehikel-kontrol: En ubehandlet prøve, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem, herunder opløsningsmidlet eller vehiklet, og som behandles sammen med de teststofbehandlede prøver og andre kontrolprøver for at fastlægge basislinjeresponsen for de prøver, som er behandlet med teststoffet opløst i det samme opløsningsmiddel eller vehikel. Ved test sammen med en samtidig negativ kontrol påviser denne prøve også, hvorvidt opløsningsmidlet eller vehiklet interagerer med testsystemet.

Positiv kontrol: Et replikat, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem og er behandlet med et stof, som vides at inducere en positiv respons. For at sikre, at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør størrelsesordenen af den svære respons ikke være overdrevent stor.

Potentiel fare: Den iboende egenskab ved et middel eller en situation, som kan forårsage skade, når en organisme, et system eller en (sub)population eksponeres for det pågældende middel.

Pålidelighed: Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarheden inden for og mellem laboratorier og repeterbarheden inden for laboratorier.

Referencestof: Et stof, som anvendes som standard til sammenligning med et teststof. Et referencestof skal have følgende egenskaber: (i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; (ii) strukturel og funktionel lighed med den stofgruppe, der testes; (iii) kendte fysiske/kemiske egenskaber; (iv) støttedata om kendte virkninger og (v) kendt styrke i det ønskede responsområde.

Stærkt øjenirriterende stof: (a) Et stof, som forårsager vævsbeskadigelse i øjet efter applikation på øjets anteriore overflade, som ikke er forsvundet inden for 21 dage efter applikation, eller som forårsager alvorlig fysisk synsnedsættelse; (b) stoffer, der er klassificeret som øjenirriterende stoffer i GHS-kategori 1, EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).

Trindelt testning: Ved anvendelse af den trindelte testningsstrategi gennemgås alle eksisterende oplysninger om et teststof i en bestemt rækkefølge ved anvendelse af en »weight of evidence«-proces på hvert trin for at fastslå, om der foreligger tilstrækkelige oplysninger til at træffe en fareklassificeringsafgørelse, inden der fortsættes til næste trin. Hvis et teststofs irritationspotentiale kan fastsættes på grundlag af de eksisterende oplysninger, er der ikke behov for yderligere testning. Hvis et teststofs irritationspotentiale ikke kan fastsættes på grundlag af de eksisterende oplysninger, udføres en trinvis sekventiel dyreforsøgsprocedure, indtil der kan foretages en utvetydig klassificering.

Valideret testmetode: En testmetode, for hvilken der er gennemført valideringsundersøgelser for at fastslå relevansen (herunder nøjagtigheden) og pålideligheden til et bestemt formål. Det er vigtigt at være opmærksom på, at en valideret testmetode måske ikke har tilstrækkelig ydeevne med hensyn til nøjagtighed og pålidelighed til at være acceptabel til det planlagte formål.

»Weight of evidence«: En proces, hvor styrkerne og svaghederne ved forskellige oplysninger afvejes for at nå frem til og underbygge en konklusion om et stofs farepotentiale.

Øjenirriterende stof: (a) Et stof, der frembringer en reversibel ændring i øjet efter applikation på øjets anteriore overflade; (b) stoffer, der er klassificeret som øjenirriterende stoffer i EPA-kategori II eller III, EU-kategori R36 eller GHS-kategori 2A eller 2B (1) (2) (3).

Øjenætsende stof: (a) Et stof, som forårsager irreversibel vævsbeskadigelse i øjet; (b) stoffer, der er klassificeret som øjenirriterende stoffer i GHS-kategori 1, EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).