2)

Følgende indsættes som del D: »D. Magnetrørermetode til samlet fordøjelsesprøveundersøgelse ved filtreringsteknik og larvepåvisning ved en latexagglutinationstest Denne metode anses kun for ligestillet i forbindelse med undersøgelse af kød fra tamsvin. 1. Apparatur og reagenser a) Kniv eller saks og pincet til udskæring af prøvemateriale. b) Bakker med 50 afmærkede felter, der hvert kan rumme ca. 2 g kød, eller andre redskaber, der giver tilsvarende sikkerhed med hensyn til prøvernes sporbarhed. c) En blender med skarp blenderkniv. Hvis prøvernes vægt er over 3 g, skal der anvendes en kødhakker med huller på 2-4 mm eller en saks. Hvis det drejer sig om frosset kød eller tunge (hinden skal være fjernet, idet den ikke kan nedbrydes), er det nødvendigt med en kødhakker, og prøven skal være betydeligt større. d) Magnetomrørere med termostatstyret varmeplade og teflonbeklædte magnetstave, ca. 5 cm lange. e) Bægerglas (rumindhold på 3 liter). f) Sier med en maskevidde på 180 mikron og en udvendig diameter på 11 cm og med trådnet af rustfrit stål. g) Stålfiltreringsapparatur til filtre med 20 μm-masker med ståltragt. h) Vakuumpumpe. i) Metal- eller plastbeholdere (rumindhold på 10-15 liter) til opsamling af fordøjelsesvæske. j) Et 3-D gyratorisk rysteapparatur. k) Aluminiumsfolie. l) Saltsyre, 25 %. m) Pepsin, styrke: 1: 10 000 NF (U.S. National Formulary) svarende til 1: 12 500 BP (British Pharmacopoeia) og til 2 000 FIP (International Pharmaceutical Federation) eller stabiliseret flydende pepsin med mindst 660 enheder/ml (den europæiske farmakopé). n) Ledningsvand opvarmet til 46-48 °C. o) En vægt, der kan veje med en nøjagtighed på 0,1 g. p) Pipetter i forskellige størrelser (1, 10, 25 ml), mikropipetter i henhold til anvisninger fra latexagglutination-producenten samt pipetteholdere. q) Nylonfiltre med 20 mikron-masker og med en diameter, der passer til filtreringssystemet. r) Plast- eller ståltang, 10-15 cm. s) Koniske prøveglas, 15 ml. t) En morter med konisk spids af teflon eller stål, som passer til de koniske prøveglas. u) Et termometer, der inden for området 1-100 °C kan måle med en nøjagtighed på 0,5 °C. v) Latexagglutinationskort fra det Trichin-L antigen-prøvesæt, der er valideret under kode nr. EURLP_D_001/2011. w) Bufferopløsning med konserveringsmiddel (prøve-diluent) fra det Trichin-L antigen-prøvesæt, der er valideret under kode nr. EURLP_D_001/2011. x) Bufferopløsning suppleret med konserveringsmiddel (negativ kontrol) fra det Trichin-L antigen-prøvesæt, der er valideret under kode nr. EURLP_D_001/2011. y) Bufferopløsning suppleret med Trichinella spiralis-antigener og konserveringsmiddel (positiv kontrol) fra det Trichin-L antigen-prøvesæt, der er valideret under kode nr. EURLP_D_001/2011. z) Bufferopløsning med polystyrenpartikler coated med antistoffer suppleret med konserveringsmiddel (latexperler) fra det Trichin-L antigen-prøvesæt, der er valideret under kode nr. EURLP_D_001/2011. aa) Engangspinde. 2. Udtagning af prøvemateriale Se kapitel I, punkt 2. 3. Procedure I. For komplette samleprøver (100 g prøvemateriale ad gangen) finder proceduren i punkt a)-i) i kapitel I, punkt 3, I, anvendelse. Derudover skal følgende procedure følges: a) Nylonfilteret med en maskestørrelse på 20 mikron placeres på filterstanden. Den koniske stålfiltreringstragt fastgøres på standen ved hjælp af fastlåsningssystemet, og stålsien med en maskevidde på 180 mikron placeres på tragten. Vakuumpumpen tilsluttes til filterstanden og til metal- eller plastbeholderen for at opsamle fordøjelsesvæsken. b) Omrøringen standses, og fordøjelsesvæsken hældes i filtreringstragten gennem sien. Bægerglasset skylles med 250 ml varmt vand. Skyllevæsken hældes i filtreringsrampen efter vellykket filtrering af fordøjelsesvæsken. c) Med tangen udtages filtreringsmembranen, idet den fastholdes i en af kanterne. Filtreringsmembranen foldes, så den mindst bliver firedobbelt, og lægges i det koniske 15 ml-rør. d) Filtreringsmembranen skubbes ned i bunden af det koniske 15 ml-rør ved hjælp af morteren og presses kraftigt ved at føre morteren, der skal være placeret inden i filtreringsmembranens foldning i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger, frem og tilbage flere gange. e) Prøve-diluenten kommes i det koniske 15 ml-rør ved hjælp af en pipette, og filtreringsmembranen homogeniseres med morteren ved at foretage flere små bagudrettede og fremadrettede bevægelser, idet bratte bevægelser undgås for at undgå væskesprøjtning i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. f) Hver prøve, den negative kontrol og den positive kontrol placeres i forskellige felter på agglutineringskortet ved hjælp af en pipette i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. g) Latex-perlerne tilføjes hvert enkelt felt på agglutineringskortet ved hjælp af en pipette i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger, uden at de kommer i berøring med prøven/prøverne og kontrollerne. I hvert felt blandes latex-perlerne derefter forsigtigt med en engangspind, indtil den homogene væske dækker hele feltet. h) Agglutineringskortet anbringes på 3-D rysteapparaturet og rystes i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. i) Efter det tidsrum, der er angivet i fabrikantens anvisninger, afsluttes rystningen, agglutineringskortet anbringes på en plan flade, og reaktionsresultaterne aflæses. Hvis der er tale om en positiv prøve, skal der forekomme perle-aggregater. Hvis der er tale om en negativ prøve, forbliver suspensionen homogen uden perle-aggregater. j) Alt udstyr, der kommer i berøring med kød, skal dekontamineres omhyggeligt mellem hver kørsel ved at neddyppe det i varmt vand (60 °C til 90 °C) nogle sekunder. Overflader, hvor der er rester af kød eller inaktiverede larver, kan rengøres med en ren svamp og ledningsvand. Når proceduren er afsluttet kan nogle få dråber rengøringsmiddel tilføjes for at fjerne fedt fra udstyret. Derefter skylles hver enkelt del grundigt flere gange for at fjerne alle spor af rengøringsmiddel. k) Morteren dekontamineres omhyggeligt mellem hver kørsel ved neddypning nogle sekunder i mindst 250 ml varmt vand (60 °C til 90 °C). Eventuelle rester af kød og inaktiverede larver på morteren fjernes med en ren svamp og ledningsvand. Når proceduren er afsluttet kan nogle få dråber rengøringsmiddel tilføjes for at fjerne fedt fra morteren. Derefter skylles morteren grundigt flere gange for at fjerne alle spor af rengøringsmiddel. II. Samleprøver på under 100 g som fastlagt i kapitel I, punkt 3, II For samleprøver på under 100 g følges proceduren i kapitel I, punkt 3, II. III. Positive eller usikre resultater Hvis resultatet af latex-agglutineringsundersøgelsen af en samleprøve er positivt eller usikkert, udtages der i overensstemmelse med kapitel I, punkt 2, litra a), en ny prøve på 20 g fra hvert svin. Prøverne på 20 g fra 5 svin undersøges samlet efter metoden beskrevet i punkt I. På denne måde skal der undersøges prøver fra 20 grupper a 5 svin. Når der opnås en positiv latex-agglutinering fra en gruppe på 5 svin, tages der yderligere prøver på 20 g fra de enkelte svin i gruppen, og hver prøve undersøges separat efter en af metoderne beskrevet i kapitel I. Parasitprøver opbevares i 90 % ethylalkohol med henblik på konservering og artsidentificering på EU-referencelaboratoriet eller det nationale referencelaboratorium. Efter udtagning af parasitter dekontamineres positive væsker ved opvarmning til mindst 60 °C.«