»BILAG VI

ANALYSEMETODER TIL BESTEMMELSE AF ANIMALSKE BESTANDDELE SOM LED I DEN OFFENTLIGE KONTROL AF FODER

1. FORMÅL OG ANVENDELSESOMRÅDE

Bestemmelse af animalske bestanddele i foder skal udføres ved lysmikroskopi eller PCR (polymerasekædereaktion) i overensstemmelse med de bestemmelser, der er fastsat i dette bilag.

Disse to metoder gør det muligt at påvise tilstedeværelsen af animalske bestanddele i fodermidler og foderblandinger. De gør det imidlertid ikke muligt at beregne mængden af sådanne bestanddele i fodermidler og foderblandinger. Begge metoder har en påvisningsgrænse under 0,1 % (w/w).

PCR-metoden gør det muligt at identificere, hvilken taksonomisk gruppe animalske bestanddele, der er til stede i fodermidler og foderblandinger, tilhører.

Disse metoder skal finde anvendelse i forbindelse med kontrollen med anvendelsen af forbuddene i artikel 7, stk. 1, i og bilag IV til forordning (EF) nr. 999/2001 og i artikel 11, stk. 1, i forordning (EF) nr. 1069/2009.

Afhængigt af hvilken type foder der afprøves, kan disse metoder anvendes inden for en enkelt operationel protokol, enten alene eller tilsammen i overensstemmelse med de standardprocedurer (SOP), som er fastsat af EU-referencelaboratoriet for animalske proteiner i foderstoffer (EURL-AP) og offentliggjort på dets websted (1).

2. METODER

2.1. Lysmikroskopi

2.1.1. Princip

Animalske bestanddele, der kan være til stede i fodermidler og foderblandinger, som er sendt til analyse, identificeres ud fra typiske kendetegn, der kan identificeres ved mikroskopi (bl.a. muskelfibre og andre kødpartikler, brusk, knogler, horn, hår, børster, blod, fjer, æggeskaller, fiskeben og skæl).

2.1.2. Reagenser og udstyr

2.1.2.1. Reagenser

2.1.2.1.1. Koncentreringsmiddel

2.1.2.1.1.1. Tetrachlorethylen (massefylde 1,62)

2.1.2.1.2. Farvningsreagens

2.1.2.1.2.1. Alizarinrødtopløsning (2,5 ml 1M saltsyre fortyndes i 100 ml vand, og der tilsættes 200 mg alizarinrødt til opløsningen)

2.1.2.1.3. Monteringsmedier

2.1.2.1.3.1. Lud (NaOH 2,5 % w/v eller KOH 2,5 % w/v)

2.1.2.1.3.2. Glycerol (ufortyndet, viskositet: 1 490 cP)

2.1.2.1.3.3. Norland ® Optical Adhesive 65 (viskositet: 1 200 cP) eller en harpiks med tilsvarende egenskaber med henblik på præparering af permanente objektglas

2.1.2.1.4. Monteringsmedier med farvende egenskaber

2.1.2.1.4.1. Lugolopløsning (2 g kaliumiodid opløses i 100 ml vand, og der tilsættes 1 g jod under hyppig omrystning)

2.1.2.1.4.2. Cystinreagens (2 g blyacetat og 10 g NaOH i 100 ml vand)

2.1.2.1.4.3. Fehlings væske (klargjort før brug af lige dele (1/1) af to stamopløsninger A og B. Opløsning A: 6,9 g kobber(II)sulfatpentahydrat opløses i 100 ml vand. Opløsning B: 34,6 g kaliumnatriumtartrattetrahydrat og 12 g NaOH opløses i 100 ml vand)

2.1.2.1.4.4. Tetramethylbenzidin/hydrogenperoxid (1 g 3,3«,5,5’tetramethylbenzidin (TMB) opløses i 100 ml iseddike og 150 ml vand. Før brug blandes 4 dele af denne TMB-opløsning med 1 del 3 %-hydrogenperoxid)

2.1.2.1.5. Skyllevæsker

2.1.2.1.5.1. Ethanol ≥ 96 % (teknisk kvalitet)

2.1.2.1.5.2. Acetone (teknisk kvalitet)

2.1.2.1.6. Blegemiddel

2.1.2.1.6.1. Natriumhypochloritopløsning, som fås i handelen (9-14 % aktivt chlor).

2.1.2.2. Udstyr

2.1.2.2.1. Analysevægt med 0,001 g aflæsningsnøjagtighed

2.1.2.2.2. Formalingsudstyr (mølle eller morter)

2.1.2.2.3. Sigter med kvadratiske masker med en maskevidde på 0,25 mm og 1 mm

2.1.2.2.4. Konisk glasskilletragt med et rumindhold på 250 ml med teflon eller slebet stophane ved keglens bund. Stophanens åbning skal have en diameter på ≥ 4 mm. Alternativt kan et glasbæger med konisk bund anvendes, forudsat at laboratoriet har dokumenteret, at påvisningsniveauet svarer til det, der opnås ved at benytte den koniske glasskilletragt.

Skilletragt

2.1.2.2.5. Stereomikroskop med et endeligt forstørrelsesinterval på mindst 6,5 × til 40 ×

2.1.2.2.6. Sammensat mikroskop med et endeligt forstørrelsesinterval på mindst 100 × til 400 × med transmitteret lys/lysfelt. Alternativt kan polariseret lys og differentiel interferenskontrast anvendes

2.1.2.2.7. Standardlaboratorieglasudstyr

2.1.2.2.8. Udstyr til klargøring af objektglas: klassiske objektglas, konkave objektglas, dækglas (20 × 20 mm), pincetter, tynd spatel

2.1.3. Udtagning og forberedelse af prøver

2.1.3.1. Prøveudtagning

Der skal anvendes en repræsentativ prøve, som er udtaget i overensstemmelse med bestemmelserne i bilag I.

2.1.3.2. Forholdsregler

For at undgå krydskontaminering på laboratoriet skal alt genanvendeligt udstyr rengøres omhyggeligt før brugen. Skilletragtens dele adskilles inden rengøring. Skilletragtens dele og glasudstyr forvaskes manuelt og vaskes derefter i en vaskemaskine. Sigter rengøres ved brug af en børste med stive syntetiske børster. Det anbefales at foretage en afsluttende rengøring af sigter med acetone og komprimeret luft efter sigtning af fedtholdigt materiale, som f.eks. fiskemel.

2.1.3.3. Forberedelse af andre prøver end fedt eller olie

2.1.3.3.1. Tørring af prøver: Prøver med et vandindhold på over 14 % skal tørres inden håndteringen.

2.1.3.3.2. Sigtning af prøver på forhånd: Det anbefales at sigte (1 mm-sigte) foder i pilleform og kerner på forhånd og derefter forberede og analysere begge fraktionerne som separate prøver.

2.1.3.3.3. Delprøveudtagning og formaling: Der udtages en delprøve på mindst 50 g af prøven, og den formales efterfølgende.

2.1.3.3.4. Ekstraktion og forberedelse af sedimentet: En portion på 10 g (med en nøjagtighed på 0,01 g) af den formalede delprøve overføres til skilletragten eller glasbægeret med konisk bund, og der tilsættes 50 ml tetrachlorethylen. Den portion, der overføres til tragten, udgør højst 3 g, når det drejer sig om fiskemel eller andre rene animalske produkter, mineralske ingredienser eller forblandinger, som genererer mere end 10 % sediment. Blandingen omrystes kraftigt i mindst 30 sekunder, og der tilsættes forsigtigt yderligere mindst 50 ml tetrachlorethylen, idet den indvendige side af tragten vaskes for at fjerne eventuelle partikler, der har sat sig fast. Den resulterende blanding henstår i mindst 5 minutter, før sedimentet skilles fra ved åbning af hanen.

Hvis der anvendes et glasbæger med konisk bund, omrøres blandingen kraftigt i mindst 15 sekunder, og eventuelle partikler, der har sat sig fast på siden af glasbægeret, vaskes omhyggeligt ned langs indersiden med mindst 10 ml ren tetrachlorethylen. Blandingen henstår i 3 minutter og omrøres igen i 15 sekunder, og eventuelle partikler, der har sat sig fast på siden af glasbægeret, vaskes omhyggeligt ned langs indersiden med mindst 10 ml ren tetrachlorethylen. Den resulterende blanding henstår i mindst 5 minutter, hvorefter den flydende fraktion fjernes og kasseres ved omhyggelig dekantering, idet der udvises omhu for ikke at miste noget af sedimentet.

Sedimentet tørres og vejes med en nøjagtighed på 0,001 g. Hvis mere end 5 % af sedimentet består af partikler på over 0,50 mm, sigtes det (0,25 mm-sigte), og begge fraktionerne undersøges.

2.1.3.3.5. Ekstraktion og forberedelse af flotatet: Efter at sedimentet er skilt fra med den ovenfor beskrevne metode, bør der være to faser tilbage i skilletragten: en flydende, der består af tetrachlorethylen, og en fast, der er dannet af floteringsmateriale (flydelaget). Denne faste fase er flotatet, og det skal skilles fra ved at hælde tetrachlorethylenet helt fra tragten ved at åbne hanen. Ved at skilletragten vendes, overføres flotatet til en stor petriskål, og det lufttørres i et stinkskab. Hvis mere end 5 % af flotatet består af partikler på over 0,50 mm, sigtes det (0,25 mm-sigte), og begge fraktionerne undersøges.

2.1.3.3.6. Forberedelse af råmateriale: En portion på mindst 5 g af den formalede delprøve forberedes. Hvis mere end 5 % af råmaterialet består af partikler på over 0,50 mm, sigtes det (0,25 mm-sigte), og begge fraktionerne undersøges.

2.1.3.4. Forberedelse af prøver, der består af fedt eller olie

Følgende protokol følges for forberedelse af prøver, der består af fedt eller olie:

— Fedt i fast form opvarmes i en ovn, indtil det er blevet flydende.

— Med pipette overføres 40 ml fedt eller olie fra bunden af prøven til et centrifugerør.

— Der centrifugeres i 10 minutter ved 4 000 omdrejninger i minuttet.

— Hvis fedtet efter centrifugering er fast, opvarmes det i en ovn, indtil det er blevet flydende.

— Der centrifugeres endnu en gang ved 4 000 omdrejninger i 5 minutter.

— Med en lille ske eller en spatel overføres halvdelen af de dekanterede urenheder til objektglas til undersøgelse. Det anbefales at bruge glycerol som monteringsmedium.

— De resterende urenheder anvendes til at forberede sedimentet som beskrevet i punkt 2.1.3.3.

2.1.3.5. Brug af farvningsreagenser

For at lette korrekt identifikation af de animalske bestanddele kan laboranten anvende farvningsreagenser under prøveforberedelsen i overensstemmelse med retningslinjerne, der er udstedt af EURL-AP og offentliggjort på dets websted.

Hvis der anvendes alizarinrødtopløsning til at farve sedimentet, anvendes følgende protokol:

— Det tørrede sediment hældes i et reagensglas og skylles to gange med ca. 5 ml ethanol (der anvendes vortex-apparat i 30 sekunder, opløsningsmidlet skal henstå i ca. 1 minut 30 sekunder, så det bundfælder sig, før det hældes fra).

— Sedimentet bleges ved tilsætning af mindst 1 ml natriumhypochloritopløsning. Lad reaktionen fortsætte i 10 minutter. Røret fyldes med vand, sedimentet henstår i 2-3 minutter, og vandet og de opslæmmede partikler hældes forsigtigt fra.

— Sedimentet renses yderligere to gange med ca. 10 ml vand (der anvendes vortex-apparat i 30 sekunder, lad bundfælde, og hæld hver gang vandet fra).

— Der tilsættes 2-10 dråber alizarinrødtopløsning, og blandingen vortexes. Reaktionen skal have lov at finde sted i 30 sekunder, og det farvede sediment renses to gange med ca. 5 ml ethanol efterfulgt af én skylning med acetone (der anvendes hver gang vortex-apparat i 30 sekunder, opløsningsmidlet skal henstå ca. 1 minut, før det hældes fra).

— Det farvede sediment tørres.

2.1.4. Mikroskopisk undersøgelse

2.1.4.1. Præparering af objektglas

Der forberedes præparater af sedimentet og, afhængigt af laborantens valg, af enten flotatet eller råmaterialet. Hvis der har været anvendt sigtning ved prøveforberedelsen, forberedes begge fraktionerne (både den fine og den grove fraktion). De testportioner af fraktioner, der udstryges på objektglas, skal være repræsentative for hele fraktionen.

Der præpareres et tilstrækkeligt antal objektglas for at sikre, at en fuldstændig undersøgelsesprotokol, jf. punkt 2.1.4.2, kan gennemføres.

Objektglas monteres med passende monteringsmedium i overensstemmelse med de standardprocedurer, der er fastsat af EURL-AP og offentliggjort på dets websted. Objektglassene skal være dækket med dækglas.

2.1.4.2. Observationsprotokoller vedrørende påvisning af animalske partikler i foderblandinger og fodermidler

De præparerede objektglas skal observeres i overensstemmelse med de observationsprotokoller, der er fastsat i diagram 1 for foderblandinger og fodermidler, dog ikke rent fiskemel, eller i diagram 2 for rent fiskemel.

Mikroskopiobservationerne udføres med sammensat mikroskop på sedimentet og, afhængigt af laborantens valg, på enten flotatet eller råmaterialet. Stereomikroskop kan benyttes som supplement til sammensat mikroskop for de grove fraktioner. Hvert objektglas skal screenes i sin helhed ved forskellige forstørrelser.

Minimumsantallet af objektglas, der skal observeres på hvert enkelt trin af observationsprotokollen, skal overholdes strengt, medmindre det ikke med hele fraktionsmaterialet er muligt at nå op på det fastsatte antal objektglas. Højst 6 objektglas pr. bestemmelse skal observeres.

For at lette identifikationen af partiklernes type og oprindelse kan laboranten bruge støtteværktøjer såsom beslutningsstøttesystemer, billedbiblioteker og referenceprøver.

Diagram 1

Observationsprotokol vedrørende påvisning af animalske partikler i foderblandinger og fodermidler, bortset fra fiskemel

Diagram 2

Observationsprotokol vedrørende påvisning af animalske partikler i fiskemel

2.1.4.3. Antal bestemmelser

Hvis der efter en første bestemmelse, der er gennemført i overensstemmelse med den relevante observationsprotokol, jf. diagram 1 eller diagram 2, ikke er påvist nogen animalske partikler af en given type (dvs. landdyr eller fisk), er det ikke nødvendigt med en yderligere bestemmelse, og resultatet af analysen indberettes med anvendelse af den terminologi, der er fastsat i punkt 2.1.5.1.

Hvis der efter en første bestemmelse, der er gennemført i overensstemmelse med den relevante observationsprotokol, jf. diagram 1 eller diagram 2, er påvist 1-5 animalske partikler af en given type (dvs. landdyr eller fisk), foretages der en yderligere bestemmelse på en ny delprøve på 50 g. Hvis der efter denne anden bestemmelse er påvist 0-5 animalske partikler af den samme type, skal resultatet af analysen indberettes med anvendelse af den terminologi, der er fastsat i punkt 2.1.5.2, ellers foretages der en tredje bestemmelse på en ny delprøve på 50 g. Hvis summen af partikler af en given type, der er påvist ved de to bestemmelser, efter den første og anden bestemmelse imidlertid er større end 15, er det ikke nødvendigt med en yderligere bestemmelse, og resultatet af analysen indberettes direkte med anvendelse af den terminologi, der er fastsat i punkt 2.1.5.3. Hvis summen af animalske partikler af en given type, der er påvist ved de tre bestemmelser, efter den tredje bestemmelse er større end 15, indberettes resultatet af analysen med anvendelse af den terminologi, der er fastsat i punkt 2.1.5.3. Ellers indberettes resultatet af analysen med anvendelse af den terminologi, der er fastsat i punkt 2.1.5.2.

Hvis der efter en første bestemmelse, der er gennemført i overensstemmelse med den relevante observationsprotokol, jf. diagram 1 eller diagram 2, er påvist mere end 5 animalske partikler af en given type (dvs. landdyr eller fisk), indberettes resultatet af analysen med anvendelse af den terminologi, der er fastsat i punkt 2.1.5.3.

2.1.5. Angivelse af resultaterne

Ved indberetningen af resultaterne skal laboratoriet angive, hvilken type materiale analysen er blevet udført på (sediment, flotat eller råmateriale), og hvor mange bestemmelser der er blevet foretaget.

Laboratorierapporten skal mindst indeholde oplysninger om tilstedeværelsen af bestanddele fra landdyr og fra fisk.

De forskellige tilfælde afrapporteres på følgende måde.

2.1.5.1. Hvis der ikke er blevet påvist nogen animalske partikler af en given type:

— Der har ved lysmikroskopi ikke kunnet påvises partikler fra landdyr i den forelagte prøve.

— Der har ved lysmikroskopi ikke kunnet påvises partikler fra fisk i den forelagte prøve.

2.1.5.2. Hvis der er blevet påvist i gennemsnit 1-5 animalske partikler af en given type:

— Der har ved lysmikroskopi i gennemsnit pr. bestemmelse kunnet påvises højst 5 partikler fra landdyr i den forelagte prøve. Partiklerne blev identificeret som … [knogler, brusk, muskelvæv, hår, horn …]. Da dette lave indhold ligger under påvisningsgrænsen for mikroskopimetoden, kan risiko for et falsk positivt resultat ikke udelukkes

eller, hvis det er relevant:

— Der har ved lysmikroskopi i gennemsnit pr. bestemmelse kunnet påvises højst 5 partikler fra fisk i den forelagte prøve. Partiklerne blev identificeret som … [fiskeben, fiskeskæl, brusk, muskelvæv, øresten, gælle …]. Da dette lave indhold ligger under påvisningsgrænsen for mikroskopimetoden, kan risiko for et falsk positivt resultat ikke udelukkes.

Hvis der er foretaget sigtning på forhånd, skal det oplyses i laboratorierapporten, hvilken fraktion (sigtet fraktion, pelleteret fraktion eller kerner) de animalske partikler er blevet påvist i, for så vidt som påvisning af animalske partikler udelukkende i den sigtede fraktion kan være tegn på en forurening fra omgivelserne.

2.1.5.3. Hvis der er blevet påvist i gennemsnit mere end 5 animalske partikler af en given type:

— Der har ved lysmikroskopi i gennemsnit pr. bestemmelse kunnet påvises mere end 5 partikler fra landdyr i den forelagte prøve. Partiklerne blev identificeret som … [knogler, brusk, muskelvæv, hår, horn …]

eller, hvis det er relevant:

— Der har ved lysmikroskopi i gennemsnit pr. bestemmelse kunnet påvises mere end 5 partikler fra fisk i den forelagte prøve. Partiklerne blev identificeret som … [fiskeben, fiskeskæl, brusk, muskelvæv, øresten, gælle …].

Hvis der er foretage sigtning på forhånd, skal det oplyses i laboratorierapporten, hvilken fraktion (sigtet fraktion, pelleteret fraktion eller kerner) de animalske partikler er blevet påvist i, for så vidt som påvisning af animalske partikler udelukkende i den sigtede fraktion kan være tegn på en forurening fra omgivelserne.

2.2. PCR

2.2.1. Princip

Deoxyribonukleinsyre (dna)-fragmenter af animalsk oprindelse, som kan forekomme i fodermidler og foderblandinger påvises med en genetisk amplifikationsmetode ved PCR, der er målrettet mod artsspecifikke dna-sekvenser.

PCR-metoden kræver, at der først foretages en dna-ekstraktion. Derefter amplificeres det fremkomne dna-ekstrakt for at påvise de dyrearter, assayet er målrettet mod.

2.2.2. Reagenser og udstyr

2.2.2.1. Reagenser

2.2.2.1.1. Reagenser til dna-ekstraktion

Der må kun anvendes reagenser, der er godkendt af EURL-AP og offentliggjort på dets websted.

2.2.2.1.2. Reagenser til genetisk amplifikation

2.2.2.1.2.1. Primere og sonder

Der må kun anvendes primere og sonder med oligonukleotidsekvenser, der er valideret af EURL-AP (2).

2.2.2.1.2.2. Mastermix

Der må kun anvendes mastermix-opløsninger, som ikke indeholder reagenser, der kan føre til falske resultater på grund af tilstedeværelsen af animalsk dna (3).

2.2.2.1.2.3. Dekontamineringsreagenser

2.2.2.1.2.3.1. Saltsyreopløsning (0,1N)

2.2.2.1.2.3.2. Blegemiddel (natriumhypochloritopløsning (0,15 % aktivt chlor))

2.2.2.1.2.3.3. Ikke-ætsende reagenser til dekontaminering af bekosteligt udstyr såsom analysevægte (f.eks. DNA EraseTM fra MP Biomedicals).

2.2.2.2. Udstyr

2.2.2.2.1. Analysevægt med 0,001 g aflæsningsnøjagtighed

2.2.2.2.2. Formalingsudstyr

2.2.2.2.3. Thermocycler, der muliggør tidstro PCR

2.2.2.2.4. Mikrocentrifuge til mikrocentrifugerør

2.2.2.2.5. Mikropipettesæt, som gør det muligt, at der afpipetteres fra 1-1 000 μl

2.2.2.2.6. Molekylærbiologisk standardudstyr af plast: mikrocentrifugerør, plastspidser med filter til mikropipetter, plader til thermocycler

2.2.2.2.7. Frysere til at opbevare prøver og reagenser.

2.2.3. Udtagning og forberedelse af prøver

2.2.3.1. Prøveudtagning

Der skal anvendes en repræsentativ prøve, som er udtaget i overensstemmelse med bestemmelserne i bilag I.

2.2.3.2. Forberedelse af prøver

Forberedelsen af laboratorieprøver indtil dna-ekstraktion skal opfylde kravene i bilag II. Der udtages en delprøve på mindst 50 g af prøven, og den formales efterfølgende.

Prøveforberedelsen skal foregå i et andet lokale end dem, der er beregnet til dna-ekstraktion og til genetisk amplifikation-reaktioner som beskrevet i ISO 24276.

Der forberedes to testportioner på mindst 100 mg hver.

2.2.4. Dna-ekstraktion

Dna-ekstraktionen udføres på hver testportion, der er forberedt ved hjælp af den standardprocedure, der er fastsat af EURL-AP og offentliggjort på dets websted.

Der forberedes to ekstraktionskontroller for hver ekstraktionsserie som beskrevet i ISO 24276:

— en ekstraktionsblindkontrol

— en positiv dna-ekstraktionskontrol.

2.2.5. Genetisk amplifikation

Den genetiske amplifikation foretages ved anvendelse af de metoder, som er valideret for de enkelte arter, der kræver identificering. Disse metoder er fastsat i de standardprocedurer, der er fastsat af EURL-AP og offentliggjort på dets websted. Hvert dna-ekstrakt analyseres i mindst to forskellige fortyndinger for at evaluere hæmning.

Der forberedes to amplifikationskontroller pr. målart som beskrevet i ISO 24276:

— Der anvendes en positiv dna-målkontrol for alle plader eller serier af PCR-assays.

— Der anvendes en amplifikationsreagenskontrol (også kaldet no template control (NTC)) for alle plader eller serier af PCR-assays.

2.2.6. Fortolkning og angivelse af resultater

Ved indberetningen af resultaterne skal laboratoriet som minimum angive vægten af de anvendte testportioner, den anvendte ekstraktionsmetode, antallet af foretagne bestemmelser og metodens påvisningsgrænse.

Resultaterne fortolkes og indberettes ikke, hvis den positive dna-ekstraktionskontrol og de positive dna-målkontroller ikke giver positive resultater for det mål, assayet vedrører, og amplifikationensreagenskontrollen samtidig er negativ.

Hvis resultaterne af de to testportioner ikke er overensstemmende, gentages som minimum den genetiske amplifikation. Hvis laboratoriet har mistanke om, at dna-ekstrakterne kan være årsag til uoverensstemmelsen, foretages der en ny dna-ekstraktion og efterfølgende genetisk amplifikation, inden resultaterne fortolkes.

Den endelige angivelse af resultater skal være baseret på integration og fortolkning af resultaterne af de to testportioner i overensstemmelse med de standardprocedurer, der er fastsat af EURL-AP og offentliggjort på dets websted.

2.2.6.1. Negativt resultat

Et negativt resultat afrapporteres på følgende måde:

Der blev ikke påvist noget dna fra X i den forelagte prøve (X står for den dyreart eller gruppe af dyrearter, assayet er målrettet mod).

2.2.6.2. Positivt resultat

Et positivt resultat afrapporteres på følgende måde:

Der blev påvist dna fra X i den forelagte prøve (X står for den dyreart eller gruppe af dyrearter, assayet er målrettet mod).«