Kommissionens forordning (EF) nr. 213/2001

af 9. januar 2001

om gennemførelsesbestemmelser til forordning (EF) nr. 1255/1999 for så vidt angår metoder til analyse og vurdering af mælks og mejeriprodukters kvalitet og om ændring af forordning (EF) nr. 2771/1999 og (EF) nr. 2799/1999

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets forordning (EF) nr. 1255/1999 af 17. maj 1999 om den fælles markedsordning for mælk og mejeriprodukter(1), særlig artikel 10 og 15, artikel 26, stk. 3, artikel 29, stk. 1, og artikel 31, stk. 14, og

ud fra følgende betragtninger:

(1) Reference- og rutinemetoderne til analyse og vurdering af mælks og mejeriprodukters kvalitet samt området og reglerne for anvendelsen af nævnte metoder er fastsat i Kommissionens forordning (EØF) nr. 1216/68, (EØF) nr. 3942/92, (EF) nr. 86/94, (EF) nr. 2721/95, (EF) nr. 1080/96, (EF) nr. 1081/96, (EF) nr. 1082/96, (EF) nr. 1854/96, (EF) nr. 880/98 og (EF) nr. 1459/98, som der findes fuldstændige referencer for i bilag XXVI til nærværende forordning. For klarhedens skyld og for at udstyre de erhvervsdrivende i sektoren med en enkelt retsakt om nævnte metoder og reglerne for anvendelsen af dem bør ovennævnte forordninger omarbejdes og samles i én enkelt tekst. Med samme mål for øje bør der foretages en ændring af Kommissionens forordning (EF) nr. 2771/1999 af 16. december 1999 om gennemførelsesbestemmelser til Rådets forordning (EF) nr. 1255/1999 for så vidt angår interventionsforanstaltninger på markedet for smør og fløde(2) og forordning (EF) nr. 2799/1999 af 17. december 1999 om gennemførelsesbestemmelser til forordning (EF) nr. 1255/1999 for så vidt angår ydelse af støtte til skummetmælk og skummetmælkspulver bestemt til foderbrug og salg af sådant skummetmælkspulver(3) for at indlemme deres bilag om analysemetoder i nærværende forordning.

(2) De kendetegn for mælks og mejeriprodukters sammensætning og kvalitet, som er fastsat i forbindelse med ordningerne i forordning (EF) nr. 1255/1999, bør verificeres for at sikre, at disse krav opfyldes nøje.

(3) Det kræves ofte, at referencemetoderne for sådanne verifikationer skal være metoder, der er offentliggjort af internationale organisationer såsom CEN, IDF, ISO og AOAC International, og som regelmæssigt ajourføres af disse organisationer. I nogle tilfælde er der fastsat en EF-referencemetode. I andre tilfælde er ingen referencemetode specificeret i EF-reglerne. For at sikre en ensartet anvendelse af referencemetoder bør der hvert år opstilles en liste over referencemetoder, og det bør anføres, at den metode, der skal anvendes, skal figurere på en sådan liste.

(4) Brugen af rutinemetoder bør ikke udelukkes. Betingelserne for anvendelse af dem bør derfor angives.

(5) For at sikre en ensartet praksis for evaluering af analyseresultaterne bør der endvidere fastsættes fælles metoder. Det forholder sig på samme måde med smagsprøvning af de pågældende produkter og omprøvning af resultater, der bestrides.

(6) For visse analyser findes der for tiden ikke internationalt accepterede referencemetoder, der er valideret. Der foreligger derfor ingen oplysninger om variationen af analyseresultater fra laboratorium til laboratorium. Der bør derfor fastsættes metoder på EF-plan, der er valideret efter internationalt fastsatte regler, og som anvendes som referencemetoder.

(7) I Kommissionens forordning (EF) nr. 2571/97 af 15. december 1997 om salg af smør til nedsat pris og ydelse af støtte for fløde, smør og koncentreret smør til fremstilling af konditorvarer, konsumis og andre levnedsmidler(4), senest ændret ved forordning (EF) nr. 635/2000(5), kræves der under visse omstændigheder tilsætning af røbestof til fløde, smør og koncentreret smør for at sikre, at disse produkters endelige anvendelse er korrekt. I betragtning af betydningen af røbestoffer af hensyn til ordningens korrekte anvendelse og for at sikre lige behandling af de erhvervsdrivende, der deltager i ordningen, bør der så vidt muligt fastsættes fælles metoder for bestemmelse af nogle af disse røbestoffer.

(8) Koncentreret smør bør tilsættes røbestof under kontrol efter Kommissionens forordning (EØF) nr. 3143/85 af 11. november 1985 om afsætning til nedsat pris af interventionssmør bestemt til direkte forbrug i form af koncentreret smør(6), senest ændret ved forordning (EF) nr. 101/1999(7), og Kommissionens forordning (EF) nr. 429/90 af 20. februar 1990 om støtte ved licitation til koncentreret smør bestemt til direkte forbrug i Fællesskabet(8), senest ændret ved forordning (EF) nr. 124/1999(9), og forordning (EF) nr. 2571/97. For at undgå omgåelse af reglerne er det nødvendigt strengt at overholde betingelser for mærkning af koncentreret smør. Der bør defor fastsættes en fælles metode for påvisning af disse røbestoffer.

(9) Der kan ydes en støtte til privat oplagring af ost af fåremælk efter artikel 9 i forordning (EF) nr. 1255/1999. Der kan ydes en særlig restitution for de samme produkter efter artikel 31 i samme forordning. Der kan indføres ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk til EF fra bestemte tredjelande ifølge præferenceordninger. På grund af ovennævnte bestemmelser er det nødvendigt ved passende kontrol at efterprøve, at der ikke er iblandet komælk i de pågældende produkter. Der bør derfor fastsættes en EF-referencemetode til påvisning af komælk, uden at dette berører anvendelsen af rutinemetoder, hvis disse opfylder bestemte kriterier.

(10) Efter Kommissionens forordning (EØF) nr. 2921/90 af 10. oktober 1990 om ydelse af støtte til skummetmælk med henblik på fremstilling af kasein og kaseinater(10), senest ændret ved forordning (EF) nr. 2654/1999(11), skal det påvises, at der ikke findes coliforme bakterier i de pågældende produkter. Den referencemetode, der er accepteret på internationalt plan for påvisning af coliforme bakterier i mælk og mejeriprodukter, er den internationale standard IDF 73A:1985. Den kan dog kun anvendes i modificeret form til påvisning af coliforme bakterier i en vis mængde produkt. En EF-referencemetode til påvisning af coliforme bakterier bør derfor baseres på ovennævnte standard.

(11) I Rådets forordning (EØF) nr. 2658/87 af 23. juli 1987 om told- og statistiknomenklaturen og den fælles toldtarif(12), senest ændret ved forordning (EF) nr. 254/2000(13), differentieres toldsatserne for foderblandinger henhørende under toldposition 2309 ud fra indholdet af mælkeprodukter. For at sikre en ensartet anvendelse af de pågældende bestemmelser bør der fastlægges en metode til bestemmelse af lactoseindholdet, der er obligatorisk for alle medlemsstater, og i denne forbindelse bør der vælges en generelt anerkendt metode.

(12) I forordning (EF) nr. 125/1999 er det fastsat, at visse krav til kvalitet skal opfyldes, for så vidt angår smør og skummetmælkspulver til intervention eller skummetmælkspulver til dyrefoder. Der bør derfor fastsættes referencemetoder til efterprøvning af, om disse krav er opfyldt.

(13) Iværksættelsen af nogle af de metoder, der for første gang indføres ved nærværende forordning, behøver en indkøringsperiode. Anvendelsen af dem bør derfor udskydes.

(14) Forvaltningskomitéen for Mælk og Mejeriprodukter har ikke afgivet udtalelse inden for den af formanden fastsatte frist -

UDSTEDT FØLGENDE FORORDNING:

KAPITEL I

ALMINDELIGE BESTEMMELSER

Artikel 1

Formål og anvendelsesområde

I denne forordning fastsættes der regler for anvendelsen af metoderne til kemisk, fysisk og mikrobiologisk analyse og for organoleptisk vurdering af mælk og mejeriprodukter i forbindelse med ordningerne i den fælles markedsordning for mælk og mejeriprodukter, der er fastsat i forordning (EF) nr. 1255/1999, samt nogle af disse metoder.

Artikel 2

Liste over metoder

1. Listen over referencemetoder for de i artikel 1 omhandlede analyser er anført i bilag I.

2. Kommissionen ajourfører mindst en gang om året nævnte liste efter proceduren i artikel 42 i forordning (EF) nr. 1255/1999.

Artikel 3

Rutinemetoder

Der kan anvendes rutinemetoder til de analyser, der er fastsat i EF-reglerne, hvis de er korrekt kalibreret og regelmæssigt kontrolleres i forhold til referencemetoden.

Den i bilag II anførte procedure kan anvendes til efterprøvning af resultater, der opnås med rutinemetoder, som ligger tæt på de grænseværdier, der er specificeret i de pågældende forordninger.

I tilfælde af tvistemål er de resultater, der opnås med referencemetoden, afgørende.

Artikel 4

Validering af referencemetoder

1. En referencemetode er valideret, hvis den opfylder forhåndsopstillede krav til præcision vedrørende repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænsen.

2. Er en referencemetode, der er fastsat i de pågældende forordninger, ikke valideret, fastsætter medlemsstaterne en foreløbig reproducerbarhedsgrænse.

Denne grænse beregnes efter proceduren i bilag III, litra b). I atten måneder efter nærværende forordnings ikrafttrædelse kan medlemsstaterne anvende en ligestillet procedure.

Det kontrolleres mindst én gang om året, om grænsen overholdes.

3. Viser resultaterne af anvendelsen af validerede referencemetoder eller metoder med midlertidige præcisionstal, at en grænse er overskredet, anvendes den i bilag IV beskrevne metode til evaluering af analyseresultater til at fastslå den "kritiske afstand" til en sådan grænse.

Artikel 5

Accept af analyseresultater

1. Analyserne foretages på laboratorier, der anvender en intern metode for kvalitetskontrol i overensstemmelse med den metode, der beskrevet i bilag V, punkt a), eller en metode på lignende niveau.

Der skal foreligge en detaljeret beskrivelse af den anvendte metode i laboratoriet.

2. Laboratorierne udarbejder deres interne præcisionsnormer i en serie for alle metoder efter:

a) den metode, der er defineret i bilag V, litra b), eller

b) en offentliggjort valideret metode, der giver en fastslået repeterbarhed.

Det kontrolleres mindst én gang om året efter proceduren i bilag III, litra a), om reproducerbarhedsgrænsen er overholdt.

Andet afsnit anvendes ikke, hvis laboratoriet har deltaget i en præstationsprøvningsordning i årets løb.

3. Laboratorierapporten om resultaterne af analysen skal indeholde tilstrækkelige oplysninger til at muliggøre en evaluering af resultaterne efter bilag IV og VIII.

4. Resultaterne af en analyse anses for acceptable, hvis de er opnået efter acceptkriterier, der er beskrevet i den interne metode for kvalitetskontrol som omhandlet i stk. 1, og interne præcisionsnormer som omhandlet i stk. 2.

Artikel 6

Sensorisk analyse

1. Med hensyn til smør anvendes metoderne i bilag VI til at efterprøve smagsdommernes arbejde og resultaternes pålidelighed. Den metode, der er beskrevet i bilag VII, anvendes som referencemetode for sensorisk analyse.

2. Med hensyn til mælk og mejeriprodukter undtagen smør benytter medlemsstaterne som referencemetode for sensorisk analyse enten IDF-standard 99C/1997 eller andre lignende metoder, som de meddeler til Kommissionen.

Metoderne i bilag VI kan anvendes til at efterprøve smagsdommernes arbejde og resultaternes pålidelighed.

Artikel 7

Prøveudtagning og bestridelse af analyseresultater

1. Med henblik på de analyser, der er fastsat i EF-reglerne, skal der udtages dobbelte prøver.

2. Den i bilag VIII beskrevne procedure anvendes i tilfælde, hvor resultaterne af en analyse ikke accepteres af den erhvervsdrivende.

KAPITEL II

ANALYSEMETODER

Artikel 8

Indhold af vand/tørstof/fedt i smør

1. Den i bilag IX beskrevne analysemetode benyttes som referencemetode ved bestemmelse af vandindholdet i smør.

2. Den i bilag X beskrevne analysemetode i bilag II benyttes som referencemetode ved bestemmelse af indholdet af fedtfrit tørstof i smør.

3. Den i bilag XI beskrevne analysemetode benyttes som referencemetode ved bestemmelse af fedtstofindholdet i smør.

Artikel 9

Røbestoffer

1. Den i bilag XII beskrevne analysemetode benyttes som referencemetode til bestemmelse af vanillin i koncentreret smør, smør og fløde.

2. Den i bilag XIII beskrevne analysemetode benyttes som referencemetode til bestemmelse af mængden af ethylester af β-apo-8' karotinsyre i koncentreret smør og smør.

3. Den i bilag XIV beskrevne analysemetode benyttes som referencemetode til bestemmelse af indholdet af stigmasterol eller β-sitosterol i smør og koncentreret smør.

4. Koncentreret smør, smør eller fløde tilsættes røbestof efter de relevante EF-regler, hvis de opnåede resultater svarer til specifikationerne i punkt 8 i de bilag, der er omhandlet i stk. 1, 2 og 3.

Artikel 10

Påvisning af kasein i komælk

1. Den i bilag XV anførte referenceanalysemetode benyttes for at sikre, at ost, som udelukkende skal være fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk, ikke indeholder kasein af komælk.

Kasein af komælk anses for at være til stede, hvis det konstaterede indhold af kasein af komælk i analyseprøven er lig med eller overstiger indholdet i den referenceprøve med 1 % komælk, som er fastsat i bilag XV.

2. Der kan benyttes rutinemetoder til påvisning af kasein af komælk i de i stk. 1 omhandlede oste på følgende betingelser:

a) påvisningsgrænsen må højst være 0,5 %

b) der må ikke forekomme falskpositive resultater

c) kasein af komælk skal være påviseligt med den fornødne følsomhed selv efter lange modningsperioder, som det kan være tilfældet under almindelige handelsforhold.

Er betingelsen i litra b) ikke opfyldt, skal alle prøver, der giver positivt resultat, analyseres ved hjælp af referencemetoden.

Er kravet i litra c) ikke opfyldt for én af de typer oste, der er omhandlet i stk. 1, skal den pågældende ost analyseres ved hjælp af referencemetoden.

Artikel 11

Påvisning af coliforme bakterier

1. Den i bilag XVI beskrevne referenceanalysemetode skal anvendes til påvisning af tilstedeværelse af coliforme bakterier i smør, skummetmælkspulver, kasein og kaseinater.

2. Der kan benyttes rutinemetoder til påvisning af coliforme bakterier, hvis de fremkomne resultater er sammenlignelige med resultaterne af den referencemetode, der er beskrevet i nævnte bilag. Rutinemetoder skal især have en tilstrækkelig påvisningsgrænse. Falsknegative resultater må ikke forekomme. Hvis det ikke kan udelukkes, at der forekommer falskpositive resultater, skal alle positive resultater bekræftes ved hjælp af referencemetoden.

Artikel 12

Lactoseindhold

Metoden til bestemmelse af indholdet af lactose i produkter henhørende under position 2309 i den kombinerede nomenklatur er beskrevet i bilag XVII.

Artikel 13

Påvisning af løbevalle

1. Metoden til påvisning af løbevalle i skummetmælkspulver til offentlig oplagring er beskrevet i bilag XVIII.

2. Metoden til påvisning af løbevalle i skummetmælkspulver og blandinger til dyrefoder er beskrevet i bilag XIX.

Artikel 14

Påvisning af kærnemælk

Metoden til påvisning af kærnemælk i skummetmælkspulver er beskrevet i bilag XX.

Artikel 15

Restkoncentrationer af antimikrobielle stoffer

Metoden til påvisning af restkoncentrationer af antibiotika og sulfonamid/dapson i skummetmælkspulver er beskrevet i bilag XXI.

Artikel 16

Indholdet af skummetmælkspulver

Metoden til bestemmelse af indholdet af skummetmælkspulver i foderblandinger er beskrevet i bilag XXII.

Artikel 17

Påvisning af stivelse

Metoden til påvisning af stivelse i skummetmælkspulver, denatureret mælkepulver og foderblandinger er beskrevet i bilag XXIII.

Artikel 18

Vandindholdet i syrnet kærnemælkspulver

Metoden til bestemmelse af vandindholdet i syrnet kærnemælkspulver til anvendelse i foderblandinger er beskrevet i bilag XXIV.

Artikel 19

Påvisning af fremmede fedtstoffer

Metoden til påvisning af fremmede fedtstoffer i mælkefedt er beskrevet i bilag XXV.

KAPITEL III

AFSLUTTENDE BESTEMMELSER

Artikel 20

Ændringer af forordning (EF) nr. 2771/1999

I forordning (EF) nr. 2771/1999 foretages følgende ændringer:

1) Artikel 4, stk. 1, første punktum, affattes således: "Myndighederne kontrollerer smørrets kvalitet ved hjælp af de metoder, der er omhandlet i bilag I, og på basis af prøver, der er udtaget efter reglerne i bilag IV".

2) I bilag I affattes teksten i fodnote nr. 2 således: "Jf. bilag I til forordning (EF) nr. 213/2001".

3) Bilag II og III udgår.

4) I bilag IV, punkt 2, næstsidste linje, ændres ordene "med bilag III" til "med bilag VII til forordning (EF) nr. 213/2001".

Artikel 21

Ændring af forordning (EF) nr. 2799/1999

I forordning (EF) nr. 2799/1999 foretages følgende ændringer:

1) Artikel 20, stk. 1, 2, 3 og 4, affattes således: "1. Blandingers og foderblandingers indhold af skummetmælkspulver kontrolleres ved hjælp af en analyse, der mindst foretages to gange i overensstemmelse med den i bilag XXII til forordning (EF) nr. 213/2001 beskrevne metode, og som suppleres med de kontrolforanstaltninger, der er nævnt i artikel 17, stk. 3, i nærværende forordning. Hvis resultaterne af sådanne kontroller ikke stemmer overens, er resultatet af kontrollen på stedet afgørende.

2. Kontrol af, om der forekommer løbevalle, foretages efter den metode, der er beskrevet i bilag XIX til forordning (EF) nr. 213/2001.

3. Foderblandingernes indhold af stivelse konstateres ved de kontrolforanstaltninger, der er nævnt i artikel 17, stk. 3, i nærværende forordning, og som skal suppleres med den analysemetode, der er beskrevet i bilag XXIII til forordning (EF) nr. 213/2001.

4. Vandinholdet i syrnet kærnemælkspulver bestemmes ved hjælp af den analysemetode, der er beskrevet i bilag XXIV til forordning (EF) nr. 213/2001."

2) Bilag III, IV, V og VI udgår.

Artikel 22

Ophævelser

Forordning (EØF) nr. 1216/68, (EØF) nr. 3942/92, (EF) nr. 86/94, (EF) nr. 2721/95, (EF) nr. 1854/96, (EF) nr. 1080/96, (EF) nr. 1081/96, (EF) nr. 1082/96, (EF) nr. 880/98 og (EF) nr. 1459/98 ophæves.

Henvisninger til de ophævede forordninger læses som henvisninger til nærværende forordning.

Artikel 23

Ikrafttrædelse

Denne forordning træder i kraft på syvendedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.

De metoder, der er fastsat i bilag III, bilag IV, punkt 4, og bilag V, VI og VIII, tages i anvendelse atten måneder efter nærværende forordnings ikrafttrædelse.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfærdiget i Bruxelles, den 9. januar 2001.

På Kommissionens vegne

Franz Fischler

Medlem af Kommissionen

(1) EFT L 160 af 26.6.1999, s. 48.

(2) EFT L 333 af 24.12.1999, s. 11.

(3) EFT L 340 af 31.12.1999, s. 3.

(4) EFT L 350 af 20.12.1997, s. 3.

(5) EFT L 76 af 25.3.2000, s. 9.

(6) EFT L 298 af 12.11.1985, s. 9.

(7) EFT L 11 af 16.1.1999, s. 14.

(8) EFT L 45 af 21.2.1990, s. 8.

(9) EFT L 16 af 21.1.1999, s. 19.

(10) EFT L 279 af 11.10.1990, s. 22.

(11) EFT L 325 af 17.12.1999, s. 10.

(12) EFT L 256 af 7.9.1987, s. 1.

(13) EFT L 28 af 3.2.2000, s. 16.

BILAG I

(Artikel 2)

LISTE OVER REFERENCEMETODERBemærkninger til listen over EU-referencemetoder.

Bemærkning 1: Isolering af mælkefedt som beskrevet i IDF-standard 6B:1989 (beskyttelse mod lys).

Bemærkning 2: Der er ikke fastsat nogen referencemetode.

Bemærkning 3: Prøven skal tilberedes efter IDF-standard 122C:1996 eller IDF-standard 73A:1985.

Bemærkning 4: Inkubering i 48 timer ved 55 °C. Der skal træffes forholdsregler mod udtørring af dyrkningsmediet.

Bemærkning 5: % FT = % tørstof - % fedtstof.

Bemærkning 6: Smørret skal svare til den producerende stats nationale kvalitetsklasse som omhandlet i bilag V til Kommissionens forordning (EF) nr. 2771/1999.

Bemærkning 7: Kommissionens direktiv 4/84/EØF.

Bemærkning 8: Kommissionens forordning (EF) nr. 1758/94 (EFT L 183 af 19.7.1994, s. 14).

Bemærkning 9: Kommissionens direktiv 78/633/EØF.

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

BILAG II

(Artikel 3)

EFTERPRØVNING AF RESULTATER, DER ER OPNÅET VED RUTINEMETODER, SOM LIGGER TÆT PÅ DE GRÆNSER FOR KENDETEGNENE FOR SAMMENSÆTNING OG KVALITET, DER ER SPECIFICERET I FORORDNINGERNE

Hvis mo er en grænse for kendetegnene for sammensætning og kvalitet, der er specificeret i en forordning, er beslutningsgrænsen (L)

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvis RRout/RRef <= 1RRout: Reproducerbarhedsgrænse for rutinemetoden

RRef: Reproducerbarhedsgrænse for referencemetoden

Hvis mo er en øvre grænse og RRout/Rref > 1, beregnes beslutningsgrænsen ved anvendelse af formlen:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Hvis mo under de samme betingelser er en nedre grænse, beregnes beslutningsgrænsen ved anvendelse af formlen:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

CrD95: er kritisk differens ved anvendelse af referencemetoden, (se bilag IV).

Hvis mo er en øvre grænse, skal et endeligt resultat, der er opnået med en rutinemetode, og som ligger over beslutningsgrænsen, erstattes af et endeligt resultat, der er opnået med referencemetoden. Dette endelige resultat skal være baseret på mindst samme antal analyser/prøver som det endelige resultat af rutinemetoden.

Hvor mo er en nedre grænse, skal samme procedure følges for et endeligt resultat, der er opnået ved en rutinemetode, og som ligger under beslutningsgrænsen.

Bemærkning

Den ovenfor beskrevne procedure kan anvendes, hvis der ikke er påviselige matrixeffekter.

Matrixeffekter kan påvises således: For hver prøve anvendt til kalibrering bestemmes forskellen (wi) mellem de resultater, der er opnået ved henholdsvis reference- og rutinemetoden.

Standardafvigelsen beregnet efter formlen:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

m: antal prøver anvendt til kalibrering

sammenlignes med det aritmetiske gennemsnit af repeterbarheds-standardafvigelsen for reference- og rutinemetoden

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

En matrixeffekt kan ikke udelukkes, hvis

>PIC FILE= "L_2001037DA.001502.EPS">

hvor

f= m (f: antal frihedsgrader)

α= fejlsandsynlighed; α = 0,05.

I dette tilfælde er yderligere undersøgelser nødvendige, før en beslutningsgrænse kan fastsættes.

BILAG III

(Artikel 4 og 5)

a) Procedure for bestemmelse af overholdelsen af en opstillet reproducerbarhedsgrænse (kemisk analyse)

Overholdelse af reproducerbarhedsgrænsen kontrolleres ved at sammenligne laboratorieresultaterne med resultaterne i et erfarent laboratorium(1), der er opnået med en identisk prøve. En dobbeltbestemmelse foretages i begge laboratorier, og resultaterne evalueres under anvendelse af formlen:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

CrD95: kritisk forskel (P = 0,95)

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>: aritmetisk gennemsnit af to resultater, der er opnået i laboratorium 1

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>: aritmetisk gennemsnit af to resultater, der er opnået i laboratorium 2

R: reproducerbarhedsgrænse: bestemmes ved interpolation

r: repeterbarhedsgrænse; hvis præcisionen varierer med koncentrationen.

Hvis den kritiske forskel overskrides, skal der foretages et andet forsøg inden for to måneder. I tilfælde af, at reproducerbarhedsgrænsen ikke er overholdt ved dette andet forsøg, skal myndighederne tage de nødvendige skridt.

b) Procedure for opnåelse af en foreløbig reproducerbarhedsgrænse (kemisk analyse)

En foreløbig reproducerbarhedsgrænse (Rprov) opnås ved hjælp af følgende ligning:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>: gennemsnit af to resultater, der er opnået i laboratorium 1

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>: gennemsnit af to resultater, der er opnået i laboratorium 2 (se del a, i bilag III)

r: repeterbarhedsgrænse eller foreløbig repeterbarhedsgrænse.

Bemærkninger:

1. Rprov kan anvendes til beregning af kritiske forskelle (se bilag VI).

2. Rprov fastsættes til 2r, hvis den beregnede værdi for Rprov er mindre end 2r.

3. Hvis den beregnede værdi er større end 3r eller større end to gange den R-værdi, der fremgår af Horwitz-ligningen(2), er Rprov uacceptabelt høj og kan ikke anvendes til beregning af den kritiske forskel.

4. Rprov skal bestemmes mindst én gang om året på grundlag af resultater, der er opnået i to laboratorier (se bilag IV).

5. Gennemsnitsværdien af Rprov skal anvendes til beregningen af kritiske forskelle. De i punkt 2 og 3 anførte regler gælder for gennemsnitsværdien af Rprov.

Reproducerbarhedsgrænsen (R-værdi) opnås fra RSDR-værdien, der beregnes som følger

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

(>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

= aritmetisk gennemsnit af de opnåede resultater)

Eksempler på beregnede RSDR-værdier

>TABELPOSITION>

For en koncentration af analytten på 1 g/100 g opnås:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>.

(1) Normalt skal et erfarent laboratorium være et laboratorium, der med succes har deltaget i valideringen af prøvemetoden eller i en præstationsprøvning.

(2) Horwitz-ligningen:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor:

RSDR: relativ standardafvigelse af reproducerbarhed

c: koncentration udtrykt som decimalbrøk (eksempel: 10 g/100 g = 0,1).

Reference:

Peeler, J.T., Horwitz, W. og Albert, R.

J. Ass. Off. Anal. Chem.

72 (5), 784-806 (1989).

BILAG IV

(Artikel 4)

EVALUERING AF ANALYSERESULTATER, DER ER OPNÅET VED ANVENDELSE AF VALIDEREDE METODER

Hvis analyseresultaterne viser, at en grænse er overskredet, beregnes det aritmetiske gennemsnit af to eller flere resultater. Følgende procedure anvendes:

1. Hvis analyseresultatet repræsenterer et enkelt resultat, skal der foretages en ny analyse på repeterbarhedsbetingelser. Hvis de to analyser ikke kan foretages på repeterbarhedsbetingelser, foretages der en ny analyse dobbelt på repeterbarhedsbetingelser, og de opnåede resultater anvendes til at vurdere, om den kritiske forskel er overholdt.

2. Den absolutte værdi af forskellen mellem det aritmetiske gennemsnit af resultater, der er opnået på repeterbarhedsbetingelser, og grænsen bestemmes. En absolut værdi for forskellen, som er større end den kritiske forskel, betyder, at den prøve, der er analyseret, ikke opfylder kravene.

Den kritiske forskel bestemmes ved hjælp af følgende formel:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>: aritmetisk gennemsnit af de opnåede resultater

mo: grænse

n: antal analyser pr. prøve

Hvis præcisionen varierer med koncentrationen, kan det være nødvendigt at bestemme r og R ved interpolation.

Normalt skal et endeligt resultat, som registreres for en prøve, vise at en grænse er overholdt.

Endelige resultater, som ligger:

- inden for intervallet

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

og

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>, hvis grænsen er et maksimum,

- inden for intervallet

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

og

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>, hvis grænsen er et minimum,

bør derfor kun forekomme undtagelsesvis.

Endelige resultater inden for de nævnte intervaller er kun acceptable, hvis de højst forekommer én gang blandt 5 prøver, der er analyseret pr. vareparti. Hvis der analyseres mindre end 5 prøver pr. vareparti, er ét resultat inden for det nævnte interval acceptabelt. Reglen om, at der kun opnås ét resultat inden for de nævnte intervaller pr. 5 analyserede prøver, skal dog overholdes, hvis varepartierne udbydes gentagne gange af en producent.

3. Hvis det endelige resultat x beregnes ved hjælp af en formel af formen x = y1 +/- y2 (eksempel: vand + fedtfrit tørstofindhold i smør for at beregne fedtindholdet), hvor y1 og y2 er de endelige resultater af en enkelt type analyse, beregnes de overordnede repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænser rx og Rx af de endelige resultater X således:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor r1 og r2 er repeterbarhedsgrænserne, og R1 og R2 er reproducerbarhedsgrænserne for henholdsvis y1 og y2.

x sammenlignes med grænsen mo efter reglerne i punkt 1 og 2. Den kritiske forskel bestemmes efter formlen

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor x er det aritmetiske gennemsnit af de opnåede x1-resultater.

4. Hvis det endelige resultat beregnes efter en formel af formen

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

(eksempel: indhold af fedtstoffer i tørstoffet i ost)

hvor y1 og y2 er de endelige resultater af en enkelt type analyse, kan de overordnede repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænser rx og Rx beregnes således:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

μ1: grænse eller målværdi y1 (eksempel: fedtstof)

μ2: grænse eller målværdi y1 (eksempel: tørstof)

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>;

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor:

r1: repeterbarhedsgrænse y1

r2: repeterbarhedsgrænse y2

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>;

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

R1: reproducerbarhedsgrænse y1

R2: reproducerbarhedsgrænse y2

Procedurerne for beregning af rx og Rx kan kun anvendes, hvis repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænserne (r*1; r*2; R*1; R*2) er mindre end eller lig med 0,15.

x sammenlignes med grænsen μx efter reglerne i punkt 1 og 2. Den kritiske forskel bestemmes efter formlen

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

er det aritmetiske gennemsnit af x-resultaterne, der er opnået i kronologisk rækkefølge(1).

(1) NB:

Hvis f.eks. resultaterne y11, y12, y21 og y22 er opnået, skal det aritmetiske gennemsnit af y11/y21 og y12/y22 beregnes.

BILAG V

INTERN KONTROL

(Artikel 5)

a) Metode for intern kvalitetskontrol (IQC) (kemisk analyse)

Definition af kontrolmateriale

Et materiale, der anvendes til IQC, underkastes den samme eller del af den samme procedure som analyserede materialer.

Et kontrolmateriale kan f.eks. være:

- et certificeret referencemateriale

- et internt referencemateriale

- et materiale, der er godkendt ved et forsøg laboratorier imellem

- et tilsat materiale.

Procedure for opbygning af IQC

Laboratoriet skal opbygge en intern kvalitetskontrol efter den procedure, der er beskrevet i IUPAC-dokumentet "Harmonized guidelines for internal quality control in analytical laboratories"(1).

Den interne kvalitetskontrol foretages ved, at der medtages kontrolmaterialer i analysesekvensen, eller ved gentagen analyse af den prøve, der skal undersøges. Kontrolmaterialerne skal ved deres kemiske sammensætning ligne de prøver, der skal undersøges, og have en passende stabilitet i den pågældende periode. Det skal godtgøres, at kontrolmaterialerne let kan opdeles i identiske portioner til analyse, og at deres analytkoncentration ligger inden for et passende interval.

Der skal medtages et kontrolmateriale mindst én gang i hver analyseserie, og den opnåede værdi afsættes på et kontrolkort for at observere fejl over længere tid. Herudover skal laboratoriet med mellemrum godtgøre, at det opfylder repeterbarhedsbetingelserne under analyseserien. Dette sker ved en dobbeltanalyse af kontrol- og/eller analysematerialerne. Resultaterne af disse analyser skal sammenlignes med alle offentliggjorte repeterbarhedsgrænser og eksisterende data om intern præcision.

Hvis der anvendes kontrolmaterialer, skal de værdier, der er opnået ved sammenligning mellem analyseserier indbyrdes af kontrolmaterialet, afsættes på et Shewhart-kort (ISO 8258 (1991)) med passende kontrolgrænser. Aktionsgrænserne sættes til

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor st er den totale standardafvigelse

og advarselsgrænserne sættes til

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Standardafvigelse i alt:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor:

sb: standardafvigelse mellem serier

sw: standardafvigelse inden for en serie

n: antal bestemmelser.

Benyttes der ikke kontrolmaterialer (f.eks. som følge af manglende stabilitet), skal mindst et af analysematerialerne analyseres dobbelt i hver analyseserie.

De absolutte forskelle, der er opnået ved dobbeltbestemmelser inden for en analyseserie (se bilag III) afbildes grafisk. Centerlinjen er 1,128 sw, den nedre grænse er 0, den øvre grænse (aktionsgrænse) er 3,686 sw, hvor sw er standardafvigelsen inden for en analyseserie.

Kontrolproceduren skal omfatte materialer med lave og høje niveauer, når koncentrationsintervallet er stort.

Hvis prøvematerialerne dækker et bredt interval af analytkoncentrationer, skal laboratoriet fastslå forholdet mellem præcision og koncentration. Hvis præcisionen er proportional med koncentrationen, skal den efterfølgende kontrol ske på grundlag af relativ præcision (dvs. absolut forskel som procent af middelværdien).

Analysesystemet er ikke pålideligt, når en af følgende situationer opstår:

A. den grafisk afbildede værdi falder uden for aktionsgrænserne.

B. den grafisk afbildede værdi og den foregående værdi falder uden for advarselsgrænserne, men inden for aktionsgrænserne

C. ni successive værdier falder på samme side af gennemsnitslinjen i det tilfælde, hvor der anvendes kontrolmaterialer.

Laboratoriet skal i denne situation reagere ved at:

A. ophøre med analysen i afventning af resultatet af diagnoseforsøgene og foranstaltningerne til afhjælpning af situationen, og

B. kassere resultaterne af analyseserien og foretage en ny analyse af prøvematerialerne.

b) Procedure for udvælgelse af internt kontrolmateriale og for fastsættelse af interne præcisionsgrænser (kemisk analyse)

Data om præcision ved laboratorieforsøg opnås ved gentagen analyse af kontrolmaterialer og/eller gentagen analyse af analyseprøver.

Ved opstilling af præcisionsparametre for variationer inden for en analyseserie og mellem analyseserier med henblik på efterfølgende anvendelse til udarbejdelse af kontrolkort følger laboratorierne følgende procedure. Laboratorierne kan benytte andre procedurer, hvis de på tilfredsstillende måde kan godtgøre, at der er opnået pålidelige præcisionsdata.

1. Udvælgelse af kontrolmaterialer

Hvis det er hensigtsmæssigt for laboratoriet at anvende et kontrolmateriale, skal der først indsamles data for at opstille grænser. Der skal så vidt muligt anvendes certificerede referencematerialer (CRM). Foreslåede kontrolmaterialer skal analyseres på repeterbarhedsbetingelser i en analyseserie med passende certificerede referencematerialer med gentagen analyse og randomisering. Hvis en sådan fremgangsmåde ikke er mulig, søger laboratorierne at deltage i præstationsprøvning og fastslå alment accepterede middelværdier (tilskrevne værdier), der kan opfattes som et virkeligt aftalt gennemsnit, som tilskrives en usikkerhed, som giver mening. Andre procedurer omfatter bl.a. tilskrivning af en reel værdi ud fra kendskab til opskriften eller brug af podede (spikede) kontrolmaterialer.

Hertil kommer, at hvis laboratoriet regelmæssigt foretager denne type analyse og allerede har udarbejdet en statistisk kontrol, skal alle nye kontrolmaterialer (f.eks. materialer, der er anmodet om, fordi lageret er ved at være brugt op) opnås ved en reference til analyser, som for tiden efterprøves med de eksisterende materialer.

2. Fastsættelse af grænser

Når laboratoriet har udvalgt et kontrolmateriale, fastsætter det ved hjælp af dette materiale præcisionstal i en analyseserie og mellem analyseserier indbyrdes.

Som et mindstekrav for fastsættelse af præcisionstallene i en analyseserie skal kontrolmaterialet analyseres ved en dobbeltbestemmelse 12 gange. Dobbeltbestemmelsen skal foretages på repeterbarhedsbetingelser, dvs. samme operatør, samme reagenser osv. Dobbeltbestemmelse af kontrolmaterialet skal randomiseres i en analyseserie. Hver dobbeltbestemmelse skal foretages på forskellige dage over en vis periode for at afspejle en rimelig variation mellem serierne under hensyntagen til normale variationer som f.eks. reagenser, rekalibrering af instrumenter og i givet fald udskiftning af laboranter.

NB:

Det skal bemærkes, at brugen af data, som ikke er fuldt repræsentative for variation mellem analyseserier, kan resultere i en unødvendig ny analyse som følge af for snævert satte grænser. Omvendt kan et laboratorium med for upræcise præcisionstal være ude af stand til at overholde grænserne i referencemetoderne. Det kan forventes, at dets ydeevne er ringe i forhold til andre laboratorier, det kan sammenlignes med, og det frembringer måske ikke data, som egner sig for det tilsigtede mål.

2.1. Bestemmelse af præcision i en analyseserie

2.1.1. Præcision i en analyseserie, hvor et kontrolmateriale foreligger

Resultater fra mindst 12 dobbeltbestemmelser skal allerførst underkastes Cochrans maksimumsvarianstest. Dette indebaerer sammenligning af kvadratet på den maksimale forskel mellem dobbeltbestemmelser

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

di= forskellen mellem dobbeltbestemmelser.

Værdien af Cochrans kriterium, C, sammenlignes med tabelværdier (ISO 5725 (1994)). Hvis en værdi kan klassificeres som suspekt eller meget afvigende, skal resultatet undersøges, for at der kan gives en forklaring, f.eks. en teknisk fejl, en edb-fejl, en fejl under gennemførelsen af analysen, en analyse af en uhensigtsmæssig prøve. Hvis forklaringen på den tekniske fejl er af en sådan art, at det viser sig umuligt at erstatte det mistænkelige resultat med et andet, skal det kasseres som virkelig afvigende. Er der suspekte eller afvigende resultater, som ikke kan forklares, beholdes de suspekte værdier som korrekte, og de statistisk afvigende værdier kasseres. Laboratoriet skal bestræbe sig på at erstatte de kasserede værdier med nye analyseresultater.

Når laboratoriet er overbevist om, at dataene ikke længere omfatter afvigende værdier, beregnes standardafvigelsen i serien sw således:

For hvert par xi1, xi2 af p-dobbeltbestemmelserne beregnes dels summen af dobbeltbestemmelser

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

og dels forskellen mellem dobbeltbestemmelser

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Følgende summationsværdier beregnes:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Et skøn over standardafvigelsen i en analyseserie er:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Den interne præcisionsgrænse er 2,8 sw.

Hvis der anvendes en referencemetode, sammenlignes den interne præcisionsgrænse med den offentliggjorte repeterbarhedsgrænse. Laboratoriet skal opfylde kravet i referencemetoden. Hvis dette krav ikke opfyldes, skal der foretages en undersøgelse.

De fastsatte grænser skal anses for foreløbige og kan tages op til fornyet gennemgang.

2.1.2. Præcision i en analyseserie, hvor der ikke findes et kontrolmateriale

Laboratoriet kan vælge at fastslå præcisionen i en analyseserie ved dobbeltanalyse af repræsentative prøver (mindst 12 dobbeltanalyser). Hvis det ikke er muligt at anvende kontrolmaterialer (f.eks. på grund af deres ustabilitet), skal der opnås data om dobbeltanalyser efter denne fremgangsmåde.

NB:

Det forudsættes, at analyserne omfatter et relativt snævert værdiinterval, og at en enkelt værdi derfor kan anvendes for samtlige prøver. Hvis resultatudsvinget er bredere, f.eks. over en 10-potens, og præcisionen afhænger af koncentrationen, skal laboratorierne bestræbe sig på at bruge relative standardafvigelser.

Dataene bør underkastes Cochrans test som i punkt 2.1.1. Når laboratoriet er overbevist om, at dataene ikke omfatter afvigende værdier, kan standardafvigelsen i en analyseserie og den interne præcisionsgrænse beregnes som i punkt 2.1.1.

Standardafvigelsen i analyseserien, sw, kan anvendes til at udarbejde kontrolkort (se bilag II). De opstillede grænser skal anses for foreløbige og kan tages op til fornyet gennemgang.

2.2. Bestemmelse af præcision mellem analyseserier indbyrdes

Gennemsnitsværdien (s1/2) for hvert datapar beregnes, og de opnåede værdier underkastes Grubbs test (ISO 5725 (1994)). Afvisnings-/godkendelseskriterierne for afvigende eller suspekte værdier er beskrevet i punkt 2.1.1. Laboratoriet skal foretage en ny analyse efter et afvist resultat. Når laboratoriet er overbevist om, at dataene er fri for afvigende værdier, beregnes standardafvigelsen sb mellem analyseserier indbyrdes.

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

eller 0, hvis udtrykket under kvadratrodstegnet er negativt.

Den totale standardafvigelse st anvendes til at udarbejde kontrolkort for gennemsnittet af n bestemmelser (se bilag II). De opstillede grænser skal anses for foreløbige og kan tages op til fornyet gennemgang.

3. Revision af oprindelige grænser

Kontrolgrænser fastsat som beskrevet ovenfor skal anses for indledende skøn.

For at ajourføre grænser, som er fastsat på grundlag af en acceptabel præcision i en analyseserie (punkt 2.1.2), skal der indsamles yderligere dobbeltanalysedata om analyseprøverne. Tidsintervallet før en revision vil afhænge af analysefrekvensen. Som en vejledning skal data tages op til fornyet gennemgang, når der er opnået yderligere 10 værdier af dobbeltanalyser. Alle data skal derefter underkastes Cochrans test, og grænserne skal fastsættes på ny på grundlag af den nye værdi for standardafvigelse. Senere beslutninger om gyldigheden af kontrolgrænserne skal træffes under hensyntagen til supplerende data.

En gennemgang af de oprindelige data for præcision i en analyseserie afhænger også af analysefrekvensen. Det tilrådes, at de oprindelige antagelser om standardafvigelse og gennemsnit tages op til fornyet gennemgang, når yderligere 10 data er opnået ved analyse af kontrolmaterialet med en hyppighed på 1 analyse pr. vareparti.

Alle data skal underkastes en Grubbs test for at afsløre ekstremt afvigende værdier. Der skal foretages en ny beregning af gennemsnitsafvigelsen og standardafvigelsen på grundlag af de nye data.

Desuden skal laboratoriet på dette stadium anvende en Cusum-graf (BS S700: (1984) og ændring 5480 (1987)) for at undersøge eventuelle problemer i forbindelse med f.eks. for gamle reagenser. Hvert enkelt resultat, der falder uden for Cusum "V-figuren", skal undersøges.

De nye grænser (gennemsnitsafvigelse og standardafvigelse) skal regelmæssigt undersøges ved hjælp af Cusum-teknikken. Ethvert tegn på, at der kan være tvivl om gyldigheden af kontrolmaterialet, skal grundigt undersøges.

4. Meddelelse af præcisionsdata

Laboratoriet sender følgende oplysninger til de nationale myndigheder:

- den anvendte metode

- standardafvigelsen i analyseserier, sw og den interne præcisionsgrænse

- standardafvigelsen mellem analyseserier indbyrdes sb

- den totale standardafvigelse s1

- antallet af nødvendige analyser for at opnå præcisionsdata.

(1) M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

BILAG VI

(Artikel 6)

EVALUERING AF SMAGSDOMMERE OG PÅLIDELIGHEDEN AF RESULTATER I SENSORISKE ANALYSER

Følgende procedurer benyttes, hvis der gøres brug af karaktergivningsmetoder (IDF - standard 99C/1997).

a) Bestemmelse af "repeterbarhedsindeks"

Der analyseres mindst ti prøver som blinde dobbeltanalyser af en smagsdommer inden for en periode på 12 måneder. Dette vil sædvanligvis finde sted i flere omgange. Resultaterne af de forskellige produkters karakteristika evalueres ved anvendelse af følgende formel:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

w1: repeterbarhedsindeks

xi1: point for første evaluering af prøve xi

xi2: point for anden evaluering af prøve xi

n: antal prøver

De prøver, der skal evalueres, skal afspejle et bredt kvalitetsudsnit. wI må ikke overstige 1,5 (fempunktsskalaer).

b) Bestemmelser af "afvigelsesindekset"

Dette indeks skal anvendes til at checke, om en smagsdommer anvender samme skala for kvalitetsvurdering som en gruppe erfarne smagsdommere. De point, som smagsdommeren har givet, sammenlignes med gennemsnittet af de point, som smagsdommerpanelet har givet.

Følgende formel anvendes for evalueringen af resultaterne:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor:

xi1; xi2: se litra a)

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>;

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>: smagsdommerpanelets gennemsnitspoint for henholdsvis første og anden evaluering af prøven xi

n: antal prøver (mindst 10 pr. tolvmånedersperiode).

De prøver, der skal evalueres, skal afspejle et bredt kvalitetsudsnit. D1 må ikke overstige 1,5 (fempunktsskalaer).

Medlemsstaterne giver meddelelse om alle vanskeligheder, der er opstået under anvendelsen af denne metode.

c) Sammenligning af de opnåede resultater i forskellige regioner af en medlemsstat og i forskellige medlemsstater

Der foretages i givet fald mindst én gang om året en test, som giver mulighed for at sammenligne resultaterne af de vurderinger, som smagsdommere fra forskellige regioner har foretaget. Konstateres der væsentlige forskelle, skal der træffes de nødvendige foranstaltninger for at finde årsagerne hertil og nå frem til sammenlignelige resultater.

Medlemsstaterne kan tilrettelægge tests, som giver mulighed for at sammenligne de resultater, der er opnået af deres egne smagsdommere og af smagsdommere fra nabomedlemsstater. I tilfælde af væsentlige forskelle skal der foretages en tilbundsgående undersøgelse for at nå frem til sammenlignelige resultater.

Medlemsstaterne underretter Kommissionen om resultaterne af disse sammenligninger.

BILAG VII

(Artikel 6)

ORGANOLEPTISK BEDØMMELSE AF SMØR

1. Formål

Formålet med denne metode til organoleptisk bedømmelse af smør er at give en ensartet metode, der kan benyttes i samtlige medlemsstater.

2. Definitioner

Ved organoleptisk bedømmelse (vurdering) forstås undersøgelse af et produkts egenskaber ved hjælp af sanseorganerne.

Ved panel forstås en gruppe udvalgte smørdommere, der under vurderingen arbejder uden indbyrdes kontakt og uden at påvirke hinanden.

Ved karaktergivning forstås et panels organoleptiske vurdering efter en talskala. Der skal benyttes en nomenklatur for fejl.

Ved klassificering forstås en kvalitetssortering, der sker på grundlag af karaktergivningen.

Ved kontroldokumenter forstås papirer, hvorpå der noteres de enkelte point for hver egenskab samt produktets endelige klasse (samme papir kan også anvendes til angivelse af kemisk sammensætning).

3. Prøvelokale

3.1. Der skal træffes forholdsregler, så smørdommerne i prøvelokalet ikke bliver påvirket af udefra kommende faktorer.

3.2. Prøvelokalet skal være frit for fremmede lugte og let at rengøre. Væggene skal have en lys farve.

3.3. Prøvelokalet og dets belysning skal være således, at de produktegenskaber, der skal bedømmes, ikke påvirkes. Lokalet skal være forsynet med passende temperaturkontrol.

4. Udvælgelse af smørbedømmere

En smørbedømmer skal være velkendt med smørprodukter og kunne foretage organoleptisk vurdering. Vedkommendes egnethed bør vurderes regelmæssigt (mindst en gang om året) af den kompetente myndighed.

5. Krav til panelet

Antallet af smørbedømmere i panelet bør være ulige og mindst tre personer. Flertallet af dem skal være medarbejdere ved den kompetente myndighed eller autoriserede personer, der ikke er ansat i mejeribruget.

Flere faktorer skal tages i betragtning inden vurderingen, for at smagsdommerne kan opnå en optimal dømmekraft:

- Smagsdommerne må ikke lide af sygdomme, der kan påvirke deres dømmekraft. Hvis sådanne sygdomme opstår, skal en anden person indlemmes i panelet.

- Smagsdommerne skal overholde tiden for deltagelse i vurderingen og afsætte tilstrækkelig tid til vurderingen.

- Smagsdommerne skal undgå at bruge stærkt duftende produkter såsom parfumer, aftershave lotioner, deodoranter og undlade at spise stærkt aromatiserede (krydrede) levnedsmidler osv.

- Smagsdommerne må hverken ryge, spise eller drikke andet end vand i den sidste halve time inden vurderingen.

6. Vurdering af værdien af de enkelte egenskaber

6.1. Den organoleptiske vurdering skal omfatte følgende egenskaber: udseende, konsistens, lugt og smag.

Udseende omfatter farve, synlig renhed, mugvækst og vandets fordeling. Vandfordelingen afprøves efter IDF-standard 112A/1989.

Konsistens omfatter hårdhed og smørbarhed.

Der kan benyttes fysiske metoder til vurdering af smørrets konsistens. Kommissionen forudser fremtidig harmonisering af sådanne metoder.

Lugt og smag

En signifikant afvigelse fra den anbefalede temperatur forhindrer pålidelig vurdering af konsistens, lugt og smag. Temperaturen er af altafgørende betydning.

6.2. Egenskaberne skal vurderes organoleptisk hver for sig. Der gives karakterer efter tabel 1.

6.3. Det kan være ønskværdigt, at smørbedømmerne, inden de begynder vurderingen, sammen giver karakterer for en eller flere referenceprøver med hensyn til udseende, konsistens samt lugt og smag, så der bliver vurderet ensartet.

6.4. Karaktererne for, at produktet kan godkendes, er som følger:

>TABELPOSITION>

Hvis den krævede karakter ikke opnås, skal fejlen beskrives. De karakterer, den enkelte smørbedømmer giver for hver egenskab, skal optegnes i kontroldokumentet. Produktet godkendes eller afvises på grundlag af en flertalsbeslutning. Der bør ikke ofte forekomme tilfælde (ikke mere end ét pr. 20 prøver), hvor de enkelte smørbedømmeres karakter for hver egenskab giver en forskel på over et point. Hvis det sker, må panellederen kontrollere, om panelet er kompetent.

7. Tilsyn

Lederen af et panel, som skal være en medarbejder ved den kompetente myndighed og kan være medlem af panelet, skal være generelt ansvarlig for hele vurderingen. Vedkommende skal optegne de enkelte smørbedømmeres karakter for hver egenskab i kontroldokumentet og attestere, om produktet er godkendt eller afvist.

8. Udtagning og forberedelse af prøver

8.1. - Det er ønskværdigt, at prøvernes identitet er skjult under vurderingen, så enhver form for eventuel partiskhed undgås.

- Panellederen bør arrangere dette inden vurderingen i de øvrige panelmedlemmers fravær.

8.2. Når den organoleptiske vurdering foretages på frysehus, udtages prøven med en smørstikker. Hvis den organoleptiske vurdering finder sted på et andet sted end i frysehuset, skal der udtages en prøve på mindst 500 g.

8.3. Under vurderingen bør smørret have en temperatur på 10-12 °C. Større afvigelser bør for enhver pris undgås.

9. Nomenklatur

Jf. vedlagte tabel 2.

Tabel 1: Bedømmelsesskema for smør

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

Tabel 2: Nomenklatur over mangler ved smør

I. Udseende

1. synlige vanddråber

2. ikke ensartet farve, tofarvet

3. stribet

4. skjoldet, marmoreret

5. plettet

6. olieudskillelse

7. for stærk farve

8. poret, åben tekstur

9. kornet

10. fremmede bestanddele

11. muggen

12. uopløst salt

II. Konsistens

14. skør, smuldrende

15. dejagtig, fedtet

16. klæbrig

17. hård

18. blød

III. Smag og aroma

20. uden smag

21. uren(1)

22. fremmed smag

23. gammel smag

24. osteagtig, syrlig ostesmag

25. syrlig

26. gærsmag

27. a) kogt smag

b) sveden smag

28. muggen smag

29. harsk

30. olieagtig, trannet

31. talgagtig

32. a) oxideret smag

b) metallisk smag

33. fodersmag

34. grov, bitter

35. oversaltet

36. muggen, fad, rådden

37. maltagtig

38. kemikaliesmag

(1) Denne benævnelse bør bruges så sjældent som muligt og kun, når manglen ikke kan beskrives mere præcist.

BILAG VIII

(Artikel 7)

PROCEDURE, SOM SKAL FØLGES, NÅR RESULTATERNE AF EN ANALYSE BESTRIDES (KEMISK ANALYSE)

1. Der foretages en yderligere analyse efter anmodning fra den erhvervsdrivende inden syv arbejdsdage efter meddelelsen af resultaterne af den første analyse, hvis forseglede dobbelte prøver af produktet er disponible og opbevares på passende måde hos de ansvarlige organer.

2. Det ansvarlige organ sender på anmodning fra den erhvervsdrivende og dennes omkostninger disse prøver til et andet laboratorium. Dette laboratorium skal være autoriseret til at udføre officielle analyser og skal have en dokumenteret kompetence for de pågældende analyser. Denne kompetence skal være dokumenteret ved en tilfredsstillende deltagelse i ringtest, præstationsprøvninger eller sammenligninger laboratorier imellem. Det andet laboratorium skal anvende referencemetoden. De opnåede resultater i de to laboratorier evalueres således:

a) Begge laboratorier opfylder repeterbarhedskravet og reproducerbarhedskravet

Det aritmetiske gennemsnit af prøveresultaterne fra begge laboratorier meddeles som det endelige resultat. Det endelige resultat evalueres ud fra den kritiske forskel og under anvendelse af følgende formel:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>: aritmetisk gennemsnit af alle resultater, som begge laboratorier har opnået

mo: grænse

R: reproducerbarhed

r: reperterbarhed

n1: antal resultater, som laboratorium 1 har opnået

n2: antal resultater, som laboratorium 2 har opnået.

NB:

Hvis det endelige resultat beregnes efter formlen

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

eller

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

(se henholdsvis bilag IV, nr. 3 og 4), erstattes R2 og r2 med R2x og r2x i formlen.

b) Begge laboratorier opfylder repeterbarhedskravet, men ikke reproducerbarhedskravet

Hvis den anden analyse bekræfter den første analyse, afvises den analyserede mængde som ikke værende i overensstemmelse med kravene. I modsat fald accepteres mængden.

c) Kun et enkelt laboratorium opfylder repeterbarhedskravet

Det endelige resultat fra det laboratorium, som opfylder repeterbarhedskravet, anvendes til at træffe beslutning om, hvorvidt den analyserede mængde kan accepteres.

d) Ingen af laboratorierne opfylder repeterbarhedskravet, men opfylder reproducerbarhedskravet

Litra a) anvendes.

e) Ingen af laboratorierne opfylder hverken repeterbarhedskravet eller reproducerbarhedskravet

Den analyserede mængde accepteres, hvis et laboratoriums resultater fører til denne konklusion.

f) Resultaterne er opnået ved ikke-validerede metoder

Den analyserede mængde accepteres, hvis et laboratoriums resultater fører til denne konklusion.

3. Myndighederne meddeler den erhvervsdrivende resultaterne af den anden analyse hurtigst muligt. Omkostningerne ved den anden analyse påhviler den erhvervsdrivende, hvis den analyserede mængde afvises.

4. Inden fem arbejdsdage efter prøveudtagningen skal prøveudtagningen om muligt gentages, hvis den erhvervsdrivende godtgør, at prøveudtagningsproceduren ikke var korrekt. Er en ny prøveudtagning ikke mulig, accepteres den analyserede mængde.

BILAG IX

(Artikel 8)

BESTEMMELSE AF VANDINDHOLDET I SMØR

1. Formål og anvendelsesområde

Denne referencemetode anvendes til bestemmelse af vandindholdet i smør.

2. Reference

IDF-standard 50 C: 1995. Mælk og mejeriprodukter - prøveudtagningsmetoder.

3. Definition

Vandindholdet i smør: Massetabet efter afslutning af den i denne standard specificerede opvarmning. Det angives i g pr. 100 g.

4. Princip

Fordampning af vandet i en prøveportion med tilsat pimpsten ved 102 °C i en tørreovn.

5. Apparatur og materialer

Sædvanligt laboratorieapparatur, især følgende:

5.1. Analysevægt, nøjagtighed 1 mg

5.2. Ekssikkator med effektivt tørremiddel (f.eks. frisktørret silicagel med indikator for vandindhold)

5.3. Tørreovn, ventileret, termostatstyret, hvor der er en temperatur på 102 +- 2 °C i hele ovnrummet

5.4. Skåle af glas, porcelæn eller korrosionsbestandigt metal, højde ca. 20 mm, diameter 60-80 mm

5.5. Pimpsten, granuleret, vasket, med diameter 0,8-10 mm.

6. Prøveudtagning

Se IDF 50 C: 1995.

7. Fremgangsmåde

7.1. Forberedelse af analyseprøven

Laboratorieprøven opvarmes i den lukkede beholder af glas eller egnet plast, som skal være mellem halvt og to tredjedele fuld, så meget, at prøven er blød nok til let at kunne blandes til en homogen masse (mekanisk eller manuel rystning). Temperaturen bør normalt ikke overstige 35 °C. Prøven afkøles til rumtemperatur. Snarest muligt efter afkøling åbnes beholderen, og indholdet omrøres hurtigt (i højst 10 s) med en egnet indretning, f.eks. en ske eller en spatel, inden vejning.

7.2. Bestemmelse af vandindholdet

7.2.1. Der anbringes ca. 10 g pimpsten i skålen (5.4).

7.2.2. Skålen med pimpstenene tørres i ovnen (5.3) ved 102 +- 2 °C i mindst 1 time.

Bemærk:

Tørretiderne i punkt 7.2.2, 7.2.5 og 7.2.7 regnes fra det tidspunkt, hvor ovntemperaturen er 102 +- 2 °C.

7.2.3. Skålen henstilles i ekssikkator (5.2) til afkøling til temperaturen i vejerummet, hvorefter den vejes med en nøjagtighed på 1 mg.

7.2.4. Med en nøjagtighed på 1 mg afvejes en analyseprøve på ca. 5 g i skålen.

7.2.5. Skålen anbringes i ovnen ved 102 +- 2 °C, hvor den henstår i 3 timer.

7.2.6. Skålen henstilles i ekssikkator til afkøling til temperaturen i vejerummet, hvorefter den vejes med en nøjagtighed på 1 mg.

7.2.7. Tørreprocessen gentages med yderligere 1 time i ovnen, afkøling og vejning som anført i punkt 7.2.6, indtil massen er konstant (masseændring højst 1 mg).

Skulle der forekomme en masseforøgelse, benyttes den laveste masse til beregningerne.

8. Angivelse af resultaterne

8.1. Beregningsmåde og formel

Vandindholdet W beregnes i masseprocent efter følgende formel:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

>TABELPOSITION>

Resultatet angives med en decimal.

8.2. Repeterbarhed

Den absolutte forskel mellem resultaterne af to enkeltbestemmelser, udført samtidig eller lige efter hinanden af samme person under samme forhold på identisk prøvemateriale, må ikke være større end 0,2 %.

8.3. Reproducerbarhed

Den absolutte forskel mellem resultaterne af to uafhængige enkeltbestemmelser, udført af to forskellige personer i forskellige laboratorier på identisk prøvemateriale, må ikke være større end 0,3 %.

9. Prøverapport

I prøverapporten skal være angivet den anvendte metode og de fundne resultater. Der skal ligeledes være anført alle forsøgsbetingelser, der ikke er specificeret i denne internationale standard, eller som anses for valgfrie, samt en detaljeret beskrivelse af alle forhold, der kan have indvirket på resultatet. Prøverapporten skal indeholde alle de oplysninger, der er nødvendige for fuldstændig identifikation af prøven.

BILAG X

(Artikel 8)

SMØR: BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF FEDTFRIT TØRSTOF

1. Formål og anvendelsesområde

Denne referencemetode anvendes til bestemmelse af indholdet af fedtfrit tørstof i smør.

2. Reference

IDF-standard 50 C: 1995. Mælk og mejeriprodukter - prøveudtagningsmetoder.

3. Definitioner

Indhold af fedtfrit tørstof i smør: Masseprocenten af stoffer, som bestemmes efter den specificerede metode. Det angives i g pr. 100 g.

4. Princip

Fordampning af vandet fra en kendt smørmasse, ekstraktion af fedtstofferne med petroleumsether og vejning af remanensen.

5. Reagens

Petroleumsether med kogepunkt mellem 30 °C og 60 °C. Efter fordampning af 100 ml af reagenset må der højst efterlades en remanens på 1 mg.

6. Apparatur og materialer

6.1. Analysevægt, nøjagtighed 1 mg

6.2. Ekssikkator med effektivt tørremiddel (f.eks. frisktørret silicagel med indikator for vandindhold)

6.3. Tørreovn, ventileret, termostatstyret, hvor der er en temperatur på 102 +- 2 °C i hele ovnrummet

6.4. Skåle af glas, porcelæn eller korrosionsbestandigt metal, med tud i en højde af ca. 20 mm, diameter 60-80 mm, med glasstav

6.5. Filterdigel af sintret glas, porediameter 16-40 μm, med sugekolbe.

7. Prøveudtagning

Se IDF-standard 50 C: 1995.

8. Fremgangsmåde

8.1. Forberedelse af analyseprøven

Laboratorieprøven opvarmes i den lukkede beholder af glas eller egnet plast, som skal være mellem halvt og to tredjedele fuld, så meget, at prøven er blød nok til let at kunne blandes til en homogen masse (mekanisk eller manuel rystning). Temperaturen bør normalt ikke overstige 35 °C. Prøven afkøles til rumtemperatur. Snarest muligt efter afkøling åbnes beholderen, og indholdet omrøres hurtigt (i højst 10 s.) med en egnet indretning, f.eks. en ske eller en spatel, inden vejning.

8.2. Bestemmelse

8.2.1. Skålen med glasstaven (6.4) og diglen (6.5) tørres i ovnen (6.3) i 1 time. Genstandene henstilles til afkøling i ekssikkator til afkøling, hvorefter de vejes sammen (dvs. skål, glasstav og digel) med en nøjagtighed på 1 mg (m0).

Bemærk:

- En afkølingstid på 45 min. er i reglen tilstrækkeligt.

- Det er vigtigt, at der benyttes samme kombination af skål, glasstav og digel for hver prøveportion, hvis der analyseres mere end én prøveportion ad gangen.

8.2.2. Digelen fjernes, og den samlede vægt af skål og glasstav registreres med en nøjagtighed på 1 mg (m1).

8.2.3. Med en nøjagtighed på 1 mg afvejes en prøveportion på ca. 5 g af analyseprøven i skålen (8.1) (m2).

8.2.4. Skålen (med glasstav og smør) anbringes i ovnen ved 102 +- 2 °C, hvor den henstår natten over.

8.2.5. Skålen (8.2.3) henstilles til afkøling til rumtemperatur.

8.2.6. Der hældes 15 ml varm (ca. 25 °C) petroleumsether i skålen, og så meget som muligt af det fastsiddende stof i skålen løsnes med glasstaven. Opløsningsmidlet overføres til digelen, og der filtreres ned i sugekolben.

8.2.7. Proceduren i punkt 8.2.6 gentages endnu 4 gange. Hvis der ikke er spor af fedtstof på skålens inderside, overføres ved sidste vask så meget som muligt af det faste stof til digelen. I modsat fald gentages proceduren i punkt 8.2.6, indtil alle spor af fedtstof er væk.

8.2.8. Det faste stof vaskes i digelen med 25 ml petroleumsether.

8.2.9. Skålen, glasstaven og digelen tørres sammen i ovnen ved 102 +- 2 °C i 30 minutter.

8.2.10. De henstilles til afkøling i ekssikkator til rumtemperatur, hvorefter de vejes med en nøjagtighed på 1 mg.

8.2.11. Proceduren i punkt 8.2.9 og 8.2.10 gentages til konstant masse (masseændring højst 1 mg) for skål, stav og digel tilsammen (m3).

9. Angivelse af resultaterne

9.1. Beregning af indhold af fedtfrit tørstof

Indholdet af fedtfrit tørstof (SNF) beregnes i masseprocent efter følgende formel:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

m0 er massen i g af den tomme skål med glasstav og digel (8.2.1)

m1 er massen i g af den tomme skål med glasstav (8.2.2)

m2 er massen i g af skål med glasstav og prøveportion (8.2.3)

m3 er slutmassen i g af skål med glasstav og digel med fast remanens (8.2.11)

Resultatet angives med én decimal.

9.2. Repeterbarhed

Den absolutte forskel mellem resultaterne af to enkeltbestemmelser, udført samtidig eller lige efter hinanden af samme person under samme forhold på identisk prøvemateriale, må ikke være større end 0,1 %.

9.3. Reproducerbarhed

Den absolutte forskel mellem resultaterne af to uafhængige enkeltbestemmelser, udført af to forskellige personer i forskellige laboratorier på identisk prøvemateriale, må ikke være større end 0,2 %.

10. Prøverapport

I prøverapporten skal være angivet den anvendte metode og de fundne resultater. Der skal ligeledes være anført alle forsøgsbetingelser, der ikke er specificeret i denne internationale standard, eller som anses for valgfrie, samt en detaljeret beskrivelse af alle forhold, der kan have indvirket på resultatet. Prøverapporten skal indeholde alle de oplysninger, der er nødvendige for fuldstændig identifikation af prøven.

Bemærk:

>TABELPOSITION>

Det kan konkluderes, at den opnåede nøjagtighed ved bestemmelse af fedtfrit tørstof også er tilstrækkelig for bestemmelse af fedtfrit mælketørstof.

BILAG XI

(Artikel 8)

BESTEMMELSE AF FEDTINDHOLDET I SMØR

Fedtindholdet bestemmes indirekte ud fra bestemmelse af vandindhold og indhold af fedtfrit tørstof efter henholdsvis bilag IX og X. Fedtindholdet i masseprocent er:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor

>TABELPOSITION>

>TABELPOSITION>

BILAG XII

(Artikel 9)

BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF VANILLIN I KONCENTRERET SMØR, SMØR OG FLØDE VED HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI (HPLC)

1. Formål og anvendelsesområde

Kvantitativ bestemmelse af vanillin i smør, koncentreret smør og fløde.

2. Princip

Ekstraktion af en kendt prøvemængde ved hjælp af en blanding af isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2). Udskillelse af størsteparten af fedtstoffet ved afkøling (temperatur mellem - 15 og - 20 °C) efterfulgt af centrifugering.

Efter fortynding med vand bestemmes vanillinindholdet ved HPLC.

3. Apparatur

Sædvanligt laboratorieapparatur, herunder især følgende:

3.1. fryser med en arbejdstemperatur mellem - 15 og - 20 °C

3.2. injektionssprøjter (engangssprøjter) 2 ml

3.3. membranfiltre (porestørrelse: 0,45 μm), modstandsdygtige over for en opløsning med 5 % ekstraktionsmiddel (4.4)

3.4. væskekromatografisk system bestående af pumpe (flow 1,0 ml/min.), injektionsenhed (20 μl injektion, automatisk eller manuel), UV-detektor (306 nm, fuldt udslag 0,01 absorptionsenhed), skriver eller integrator samt kolonnetermostat indstillet til 25 °C

3.5. analysekolonne (250 mm x 4,6 mm indvendig diameter) pakket med LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) eller tilsvarende

3.6. beskyttelseskolonne (ca. 20 mm x 3 mm indvendig diameter) pakket tørt med Perisorb RP 18 (30-40 μm) eller tilsvarende.

4. Reagenser

Alle reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet

4.1. Isopropanol

4.2. Ethanol, 96 % (v/v)

4.3. Acetonitril

4.4. Ekstraktionsopløsning

Isopropanol (4.1), ethanol (4.2) og acetonitril (4.3) blandes i forholdet 1:1:2 (v/v)

4.5. Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd)

4.5.1. Vanillin-stamopløsning (= 500 μg/ml)

Ca. 50 mg ("CM" mg) vanillin (4.5) afvejes med en nøjagtighed på 0,1 mg i en 100 ml målekolbe; der tilsættes 25 ml ekstraktionsmiddel (4.4) og fyldes op med vand.

4.5.2. Vanillinstandardopløsning (= 10 μg/ml)

Der afpipetteres 5 ml vanillinstamopløsning (4.5.1) i en 250 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op med vand.

4.6. Methanol, HPLC-kvalitet

4.7. Iseddike

4.8. Vand, HPLC-kvalitet

4.9. Mobil fase til HPLC

300 ml methanol (4.6), ca. 500 ml vand (4.8) og 20,0 ml iseddike (4.7) blandes i en 1000 ml målekolbe, og der fyldes op med vand (4.8). Blandingen filtreres gennem et filter (0,45 μm) (3.3).

5. Fremgangsmåde

5.1. Forberedelse af prøven

5.1.1. Smør

Prøven opvarmes, indtil den begynder at smelte. Lokal opvarmning til over 40 °C skal undgås. Når prøven er blevet tilstrækkeligt blød, homogeniseres den ved rystning. Der omrøres i 15 s, inden der udtages en analyseprøve. Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg ca. 5 g ("SM" g) smør i en 100 ml målekolbe.

5.1.2. Koncentreret smør

Umiddelbart inden prøveudtagningen anbringes beholderen med koncentreret smør i en ovn ved 40-50 °C, indtil smørret er fuldstændig smeltet. Prøven blandes ved forsigtig omdrejning eller omrøring. For voldsom bevægelse med dannelse af luftbobler skal undgås. Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg ca. 4 g ("SM" g) koncentreret smør i en 100 ml målekolbe.

5.1.3. Fløde

Prøven opvarmes i vandbad eller i inkubator ved en temperatur på 35-40 °C. Fedtstoffet fordeles ensartet ved forsigtig omdrejning og om nødvendigt ved omrøring. Prøven afkøles hurtigt (20 +- 2 °C). Prøven skal fremtræde ensartet, ellers gentages proceduren. Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg ca. 10 g ("SM" g) fløde i en 100 ml målekolbe.

5.2. Fremstilling af prøveopløsning

Der tilsættes ca. 75 ml ekstraktionsmiddel (4.4) til prøveportionen (5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3), omrøres eller omrystes kraftigt i ca. 15 min. og fyldes op med ekstraktionsmiddel (4.4). Ca. 10 ml af dette ekstrakt overføres til et reagensglas med prop. Glasset stilles i fryseren (3.1) i ca. 30 min. Det afkølede ekstrakt centrifugeres i 5 minutter ved ca. 2000 omdrejninger pr. minut, og der dekanteres straks. Den dekanterede opløsning henstår, til den har nået stuetemperatur. Der afpipetteres 5 ml heraf i en 100 ml målekolbe, og der fyldes op med vand. En delprøve heraf filtreres på membranfilter (3.3). Filtratet er klart til HPLC-analyse.

5.3. Størrelsessortering

Der afpipetteres 5 ml vanillinstandardopløsning (4.5.2) i en 100 ml målekolbe. Der tilsættes 5 ml ekstraktionsmiddel (4.4) og fyldes op med vand til mærket. Denne opløsning indeholder 0,5 μg vanillin pr. ml.

5.4. Bestemmelse ved HPLC

Kromatografisystemet stabiliseres i ca. 30 min. Standardopløsningen (5.3) indsprøjtes. Dette gentages, indtil forskellen i topareal eller tophøjde mellem to på hinanden følgende indsprøjtninger er mindre end 2 %. Under de beskrevne forhold har vanillin en retentionstid på ca. 9 min. Der foretages en dobbeltanalyse af standardopløsningen (5.3) med indsprøjtning af 20 μl. Der indsprøjtes 20 μl prøveopløsning (5.2). Arealet eller højden af den fremkomne vanillintop bestemmes. Efter 10 indsprøjtninger af prøveopløsninger (5.2) gentages dobbeltanalysen af standardopløsningen (5.3).

6. Beregning af resultater

Det gennemsnitlige topareal (eller tophøjde) ("AC") for de vanillintoppe, der er fremkommet ved de to dobbeltanalyser før og efter hver batch af prøveopløsninger (4 toparealer eller tophøjder), beregnes.

Responsfaktoren (R) beregnes således:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor CM er massen af vanillin i mg (4.5.1).

Indholdet (i mg/kg) af vanillin (C) i analyseprøven beregnes ved følgende formel:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

hvor:

AS= arealet af vanillintoppen fra analyseprøven

SM= massen af analyseprøven i g (5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3).

Når fløden analyseres for vanillin, skal koncentrationen af røbestoffet udtrykkes som mg røbestof/kg mælkefedt. Dette gøres ved, at man multiplicerer C med 100/f, hvor f er flødens fedtindhold i procent (m/m).

20= en faktor, hvor der tages hensyn til fortyndingerne af standard- og analyseprøven

0,96= korrektionsfaktoren for fedtindholdet ved første fortynding af analyseprøven.

Bemærkning:

I stedet for toparealer kan der benyttes tophøjder (se punkt 8.3).

7. Metodens nøjagtighed

7.1. Repeterbarhed (r)

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, der er udført hurtigst muligt efter hinanden af samme person med samme apparatur på samme prøvemateriale, må ikke overstige 16 mg/kg.

7.2. Reproducerbarhed (R)

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser, der er udført af forskellige personer i forskellige laboratorier med forskelligt apparatur på samme prøvemateriale, må ikke overstige 27 mg/kg.

8. Grænseværdier

8.1. Der skal tages tre prøver fra produktet med røbestof for at kontrollere homogeniteten.

8.2. Røbestof af vanille eller syntetisk vanillin.

8.2.1. Iblandingen af 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd er 250 g pr. t koncentreret smør eller smør. For fløde med røbestof er iblandingen 250 g pr. t smørfedt.

8.2.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier [under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95)]:

- 221,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding)

- 159,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding).

Koncentrationen af røbestof i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 221,0 mg/kg og 159,0 mg/kg.

8.3. Røbestof alene fra vanilleplantens frugt eller komplette ekstrakter heraf

8.3.1. Iblandingen af 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd er 100 g pr. t koncentreret smør eller smør. For fløde med røbestof er iblandingen 100 g pr. t smørfedt.

8.3.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier [under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95)]:

- 79,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding)

- 54,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding).

Koncentrationen af røbestof i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 79,0 mg/kg og 54,0 mg/kg.

9. Bemærkninger

9.1. Repeterbarheden er den værdi, som den absolutte forskel mellem to enkeltbestemmelser udført med samme metode på samme prøvemateriale under samme forhold (samme apparatur, samme laboratorium og inden for et kort tidsinterval) kan ventes at ligge under med en bestemt sandsynlighed. Når intet andet er anført, er denne sandsynlighed 95 %.

9.2. Reproducerbarheden R er den værdi, som den absolutte forskel mellem to resultater af enkeltanalyser udført med samme metode på samme prøvemateriale, men under forskellige forhold (forskellige laboranter, forskelligt apparatur, forskellige laboratorier og/eller på forskellige tidspunkter) kan ventes at ligge under med en bestemt sandsynlighed. Når intet andet er anført, er denne sandsynlighed 95 %.

9.3. Genfindingen af vanillin, der er tilsat i en mængde på 250 mg pr. kg butteroil, varierer fra 97,0 % til 103,8 %. I gennemsnit er der fundet 99,9 % med en standardafvigelse på 2,7 %.

9.4. Standardopløsningen indeholder 5 % ekstraktionsmiddel for at kompensere for topforbredning som følge af, at prøveopløsningerne indeholder 5 % ekstraktionsmiddel. Derved kan der foretages en kvantificering pr. tophøjde.

9.5. Analysen bygger på en lineær kalibreringskurve, der går gennem nulpunktet.

Med passende fortyndinger af standardopløsningen (4.5.2) bør lineariteten kontrolleres, første gang analysen udføres, og derefter regelmæssigt og efter udskiftninger eller reparationer på HPLC-udstyret.

BILAG XIII

(Artikel 9)

BESTEMMELSE AF ETHYLESTER AF β-APO-8'-CAROTENSYRE I KONCENTRERET SMØR OG SMØR VED SPEKTROMETRI

1. Anvendelsesområde

Det er en metode til kvantitativ bestemmelse af ethylester af β-apo-8'-carotensyre (apocarotenester) i koncentreret smør og smør. Apocarotenester er summen af alle stoffer, der er til stede i et ekstrakt af prøver fremstillet på de i metoden beskrevne betingelser, og som absorberer lys ved 440 nm.

2. Princip

Smørfedt opløses i petroleumsether (light petroleum), og absorbansen måles ved 440 nm. Indholdet af apocarotenester bestemmes ved reference til en ekstern standard.

3. Apparatur

3.1. Fuld- eller automatpipetter på 0,25, 0,50, 0,75 og 1,0 ml.

3.2. Spektrofotometer, der er egnet til brug ved 440 nm (og 447-449 nm), og som er udstyret med kuvetter med en lysvej på 1 cm.

3.3. Målekolber, 20 ml og 100 ml.

3.4. Analysevægt med en nøjagtighed på 0,1 mg.

4. Reagenser

Alle reagenser skal være af anerkendt analysekvalitet.

4.1. Opslæmning af apocarotenester (ca. 20 %)

4.1.1. Opslæmningens indhold bestemmes som følger:

Ca. 400 mg afvejes nøjagtigt ned i en 100 ml målekolbe, opløses i 20 ml chloroform (4.4) og målekolben fyldes op til mærket med cyclohexan (4.5). 5 ml af denne opløsning fortyndes til 100 ml med cyclohexan (opløsning A). 5 ml af opløsning A fortyndes til 100 ml med cyclohexan. Absorbansen måles ved 447-449 nm (maksimum måles med cyclohexan som reference i kuvetter med 1 cm lysvej).

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Amax= måleopløsningens absorbans ved maksimum

A= prøvens vægt (g)

2550= referenceværdi A (1 %, 1 cm)

P udtrykker opslæmningens renhed (%).

Bemærkning:

En opslæmning af apocarotenester er følsom for luft, varme og lys. Den kan opbevares i ca. tolv måneder i uåbnet originalbeholder (forseglet under nitrogen) på et køligt sted. Efter åbning skal indholdet anvendes inden for kort tid.

4.1.2. Standardopløsning af apocarotenester, ca. 0,2 mg/ml

0,1 g +- 0,1 mg opslæmning af apocarotenester (4.1.1) afvejes (Wg), opløses i petroleumsether (4.2) og overføres kvantitativt til en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med petroleumsether.

Denne opløsning indeholder W*P 10 mg/ml apocarotenester.

Bemærkning:

Opløsningen skal opbevares på et køligt sted i mørke. Ubrugt opløsning kasseres efter en måneds forløb.

4.2. Petroleumsether (kogepunktsinterval 40-60 °C).

4.3. Vandfrit natriumsulfat, granuleret, der forud er tørret i to timer ved 102 °C.

4.4. Chloroform

4.5. Cyclohexan

5. Procedure

5.1. Forberedelse af prøven

5.1.1. Koncentreret smør

Prøven smeltes i ovn ved ca. 45 °C.

5.1.2. Smør

Prøven smeltes i ovn ved ca. 45 °C. En repræsentativ portion filtreres gennem et filter, der indeholder ca. 10 g vandfrit natriumsulfat (4.3), afskærmet fra stærk naturlig eller kunstig belysning, bibeholdt ved en temperatur på 45 °C. En passende mængde smørfedt opsamles.

5.2. Bestemmelse

1 g +- 1 mg koncentreret smør (eller ekstraheret smørfedt (5.1.2)) (m (g)) afvejes. Det overføres kvantitativt til en 20 ml målekolbe (Vml), der fyldes op til mærket med petroleumsether (4.2), og blandes grundigt.

En delmængde overføres til en 1 cm kuvette, og absorbansen måles ved 440 nm med petroleumsether som reference. Koncentrationen af apocarotenester i opløsningen fås ud fra kalibreringskurven (C μg/ml).

5.3. Standardkurve

0, 0,25, 0,5, 0,75 og 1,0 ml standardopløsning af apocarotenester (4.1.2) pipetteres i fem 100 ml målekolber. Der fyldes op til mærket med petroleumsether (4.2) og blandes.

Opløsningernes koncentrationer går fra 0 til 2 g/ml og angives nøjagtigt ved reference til koncentrationen af standardopløsningen (4.1.2) W*P 10 mg/ml. Absorbansen måles ved 440 nm med petroleumsether (4.2) som reference.

Absorbanserne afbildes på y-aksen mod koncentrationen af apocarotenester ad x-aksen.

6. Beregning af resultater

6.1. Indholdet af apocarotenester udtrykt i mg/kg produkt angives ved:

koncentreret smør: C*V/m

smør: 0,82*C*V/m

hvor:

C= indhold af apocarotenester i μg/ml aflæst på kalibreringskurven (5.3)

V= volumen (ml) af prøveopløsningen (5.2)

m= massen (g) af testportionen (5.2)

0,82= korrektionsfaktor for indholdet af smørfedt i smør.

7. Metodens nøjagtighed

7.1. Repeterbarhed

7.1.1. Analyse af smør

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser foretaget med det kortest mulige interval af samme laborant, som benytter samme apparatur på identisk testmateriale, må ikke overstige 1,4 mg/kg.

7.1.2. Analyse af koncentreret smør

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser foretaget med det kortest mulige interval af samme laborant, som benytter samme apparatur på identisk testmateriale, må ikke overstige 1,6 mg/kg.

7.2. Reproducerbarhed

7.2.1. Analyse af smør

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser foretaget af laboranter på forskellige laboratorier, som benytter forskelligt apparatur på identisk testmateriale, må ikke overstige 4,7 mg/kg.

7.2.2. Analyse af koncentreret smør

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser foretaget af laboranter på forskellige laboratorier, som benytter forskelligt apparatur på identisk testmateriale, må ikke overstige 5,3 mg/kg.

7.3. Kilde til præcisionsdata

Præcisionsdataene blev fastlagt på grundlag af et forsøg i 1995, der omfattede elleve laboratorier og tolv prøver af smør med røbestof (seks blinde dubletter) og tolv prøver af koncentreret smør med røbestof (seks blinde dubletter).

8. Grænseværdier

8.1. Der udtages tre prøver af produktet med røbestof for at kontrollere, om iblandingen af røbestof i produktet er korrekt.

8.2. Smør

8.2.1. Under hensyntagen til baggrundsabsorbansen er iblandingen for smør 22 mg/kg.

8.2.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier (under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95)):

- 18,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding)

- 13,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 18,0 mg/kg og 13,0 mg/kg.

8.3. Koncentreret smør

8.3.1. Under hensyntagen til baggrundsabsorbansen er iblandingen for koncentreret smør 24 mg/kg.

8.3.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier (under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95)):

- 20,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding)

- 14,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 20,0 mg/kg og 14,0 mg/kg.

BILAG XIV

(Artikel 9)

BESTEMMELSE AF SITOSTEROL OG STIGMASTEROL I KONCENTRERET SMØR OG SMØR VED GASKROMATOGRAFI I KAPILLARKOLONNE

1. Formål og anvendelsesområde

Metoden består i en procedure til kvantitativ bestemmelse af sitosterol og stigmasterol i koncentreret smør og smør. Ved sitosterol forstås summen af β-sitosterol og 22-dihydro-β-sitosterol, da de andre sitosteroler anses for at være uden større betydning.

2. Princip

Det koncentrerede smør og smørret forsæbes med kaliumhydroxid i en ethanolopløsning og uforsæbelige bestanddele ekstraheres med diethylether.

Sterolerne omdannes til trimethylsilylethere og analyseres ved gaskromatografi i en kapillarkolonne med betulin som intern standard.

3. Apparatur

3.1. En 150 ml kolbe til forsæbning med tilbagesvaler med glasslib.

3.2. 500 ml skilletragte.

3.3. 250 ml kolber.

3.4. Trykudligningstragte, 250 ml eller tilsvarende, til opsamling af fordampet diethylether.

3.5. Glaskolonne, 350 mm x 20 mm, med sintret glasskive.

3.6. Vandbad eller varmekappe.

3.7. Prøveglas, 2 ml.

3.8. Gaskromatograf (med splitningssystem), som egner sig til brug med kapillarkolonne, og som består af:

3.8.1. en termostatstyret kolonneovn, som kan opretholde den ønskede temperatur inden for +- 1 °C

3.8.2. injektionsblok med temperaturindstilling

3.8.3. flammeioniseringsdetektor og konverter/forstærker

3.8.4. skriver med integrator, som kan anvendes sammen med konverteren/forstærkeren (3.8.3).

3.9. Kapillarkolonne i kvartsglas, coated med BP1 eller tilsvarende i en ensartet lagtykkelse på 0,25 μm. Kolonnen skal kunne adskille trimethylsilylderivater af lanosterol og sitosterol. En BP1-kolonne på 12 m med 0,2 mm indre diameter er velegnet.

3.10. Mikrosprøjte på 1 μl med hærdet nål til gaskromatografi.

4. Reagenser

Alle reagenser skal være analyserene. Vand skal være destilleret eller af mindst tilsvarende renhedsgrad.

4.1. Ethanol, mindst 95 %.

4.2. Kaliumhydroxid, 60 %: 600 g kaliumhydroxid (minimum 85 %) opløses i vand og fortyndes til 1 liter med vand.

4.3. Betulin, mindst 99 % renhed.

4.3.1. Betulinopløsninger i diethylether (4.4).

4.3.1.1. Betulinopløsningen til bestemmelse af sitosterol skal være af en koncentration på 1,0 mg/ml.

4.3.1.2. Betulinopløsningen til bestemmelse af stigmasterol skal være af en koncentration på 0,4 mg/ml.

4.4. Analytisk ren diethylether (fri for peroxider og rester).

4.5. Natriumsulfat, vandfrit, granuleret og forinden tørret ved 102 °C i to timer.

4.6. Silyleringsreagens, f.eks. TRI-SIL (kan fås fra Pierce Chemical Co., katalognummer 49001) eller tilsvarende (NB: le TRI-SIL er brændfarligt og giftigt, ætsende og kan være kræftfremkaldende. Laboratoriepersonalet skal have kendskab til sikkerhedsbestemmelserne for TRI-SIL og handle derefter).

4.7. Lanosterol.

4.8. Sitosterol af en kendt renhedsgrad på ikke under 90 % (P).

Bemærkning 1:

Renhedsgraden af standardmaterialer, som anvendes til kalibrering, fastsættes efter standardiseringsmetoden. Det forudsættes, at samtlige steroler, som findes i prøven, kommer til udtryk på kromatogrammet, at toppenes samlede areal repræsenterer 100 % af sterolindholdet og at sterolerne fremkalder samme detektorrespons. Systemets linearitet skal kontrolleres for de aktuelle koncentrationsniveauer.

4.8.1. Sitosterolstandardopløsning: Der fremstilles en opløsning af sitosterol (4.8) i diethylether (4.4), der indeholder ca. 0,5 mg/ml, (med en nøjagtighed på 0,001 mg/ml) (W1).

4.9. Stigmasterol af en kendt renhedsgrad på ikke under 90 % (P).

4.9.1. Stigmasterolstandardopløsning: Der fremstilles en opløsning af stigmasterol (4.9) i diethylether (4.4), der indeholder ca. 0,2 mg/ml, (med en nøjagtighed på 0,001 mg/ml (W1).

4.10. Opløsning til kontrol af adskillelsesevne. Der fremstilles en opløsning af 0,05 mg lanosterol (4.7) og 0,5 mg sitosterol (4.8) pr. ml diethylether (4.4).

5. Fremgangsmåde

5.1. Tilberedelse af standardopløsninger til kromatografi: den interne standardopløsning (4.3.1) tilsættes til den pågældende sterolstandardopløsning samtidig med tilsætning til den forsæbede prøve (se 5.2.2).

5.1.1. Standardkromatografiopløsning for sitosterol: Der overføres 1 ml sitosterolstandardopløsning (4.8.1) til hvert af to prøveglas (3.7), og diethyletheren afdampes med nitrogen. Der tilsættes 1 ml intern standardopløsning (4.3.1.1), og diethyletheren afdampes med nitrogen.

5.1.2. Standardkromatografiopløsning for sitosterol: Der overføres 1 ml sitosterolstandardopløsning (4.9.1) til hvert af to prøveglas (3.7), og diethyletheren afdampes med nitrogen. Der tilsættes 1 ml intern standardopløsning (4.3.1.2), og diethyletheren afdampes med nitrogen.

5.2. Tilberedning af uforsæbelige bestanddele

5.2.1. Smørprøven smeltes ved opvarmning til højst 35 °C. Den blandes omhyggeligt ved omrøring.

Der afvejes 1 g smør (W2) eller koncentreret smør (W2), med 1 mg nøjagtighed, i en 150 ml kolbe (3.1). Der tilsættes 50 ml ethanol (4.1) og 10 ml kaliumhydroxidopløsning (4.2). Tilbagesvaleren påsættes, og kolben opvarmes til ca. 75 °C i 30 minutter. Svaleren tages af, og kolben afkøles til rumtemperatur.

5.2.2. Der tilsættes 1,0 ml intern standardopløsning til kolben (4.3.1.1, hvis indholdet af sitosterol skal bestemmes, eller 4.3.1.2, hvis indholdet af stigmasterol skal bestemmes). Opløsningen blandes omhyggeligt. Kolbens indhold overføres kvantitativt til en 500 ml skilletragt (3.2). Kolben skylles med 50 ml vand og dernæst med 250 ml diethylether (4.4). Skilletragten rystes kraftigt i to minutter, hvorefter man lader faserne adskilles. Det nedre vandige lag tappes af, og etherlaget vaskes ved at ryste kolben med fire hold vand á 100 ml.

Bemærkning 2:

For at undgå emulsionsdannelse skal de første to skylninger med vand foretages forsigtigt (kolben vendes ti gange). Ved tredje skylning kan der rystes kraftigt i 30 sekunder. En eventuel emulsion kan brydes ved at tilsætte 5 til 10 ml ethanol. Hvis der tilsættes ethanol, skal der foretages yderligere to grundige skylninger med vand.

5.2.3. Det klare, sæbefrie etherlag ledes igennem en glaskolonne (3.5), som indeholder 30 g vandfri natriumsulfat (4.5). Etheren opsamles i en 250 ml kolbe (3.3). Der tilsættes en kogesten, og etheren afdampes til næsten tørhed i vandbad eller varmekappe, mens overskydende opløsningsmiddel omhyggeligt opsamles.

Bemærkning 3:

Hvis prøveekstrakter inddampes til fuldstændig tørhed ved for høj temperatur, kan der ske tab af sterol.

5.3. Forberedelse af trimethylsilylethere

5.3.1. Den resterende etheropløsning i kolben hældes i et 2 ml prøveglas (3.7) med 2 ml diethylether, og etheren afdampes med nitrogen. Kolben skylles med yderligere to hold diethylether á 2 ml og indholdet hældes hver gang over i prøveglasset, og etheren afdampes med nitrogen hver gang.

5.3.2. Prøven silyleres ved tilsætning af 1 ml TRI-SIL (4.6). Prøveglasset lukkes og rystes kraftigt for at opløse prøven. Hvis prøven stadig ikke er fuldstændigt opløst, opvarmes den til 65-70 °C. Prøven henstår i mindst fem minutter, inden den indsprøjtes i gaskromatografen. Standardopløsningerne silyleres på samme måde som prøverne. Opløsningen til kontrol af adskillelsesevnen (4.10) silyleres på samme måde.

Bemærkning 4:

Silylering skal foretages i vandfrit miljø. Ved ufuldstændig silylering ses en top tæt ved betulintoppen.

Ethanol kan give interferens ved silylering. Dette kan skyldes utilstrækkelig vaskning ved ekstraktionen. Hvis dette problem forekommer, kan der foretages en femte skylning med kraftig rystning i 30 sekunder ved ekstraktionen.

5.4. Gaskromatografisk analyse

5.4.1. Valg af kromatografibetingelser.

Gaskromatografen indstilles som angivet i betjeningsvejledningen.

De vejledende kromatografibetingelser er som følger:

- søjletemperatur: 265 °C

- injektorblokkens temperatur: 280 °C

- detektorens temperatur: 300 °C

- bæregassens gennemstrømningshastighed: 0,6 ml/minut

- hydrogentryk: 84 kPa

- lufttryk: 155 kPa

- splitningssystemet indstilles til mellem 10:1 og 50:1 og optimeres i henhold til betjeningsvejledningen, hvorefter detektorresponsens linearitet kontrolleres inden for det aktuelle koncentrationsområde.

Bemærkning 5:

Det er særlig vigtigt, at injektionsblokkens belægning rengøres regelmæssigt.

- indsprøjtet mængde: 1 μl trimethylsilyletheropløsning.

Systemet skal være i ligevægt og grundlinjen stabil, inden analysen påbegyndes.

Disse betingelser kan fraviges, hvis særlige forhold ved kolonnen og gaskromatografen gør det nødvendigt for at opnå kromatogrammer, som opfylder følgende krav:

- sitosteroltoppen skal være tydeligt adskilt fra lanosteroltoppen. I figur 1 ses, hvordan et kromatogram af en silyleret opløsning til kontrol af adskillelsesevnen (4.10) typisk skal se ud

- den relative retentionstid for følgende steroler skal være ca.:

kolesterol: 1,0

stigmasterol: 1,3

sitosterol: 1,5

betulin: 2,5

- retentionstiden for betulin skal være ca. 24 minutter.

5.4.2. Analyseprocedure

Der indsprøjtes 1 μl silyleret standardopløsning (stigmasterol eller sitosterol), og integratorens kalibreringsparametre indstilles.

Herefter indsprøjtes yderligere 1 μl silyleret standardopløsning for at bestemme responsfaktorerne for betulin.

Der indsprøjtes 1 μl silyleret prøveopløsning, og toppene aflæses. Hver kromatografisk serie skal begyndes med og efterfølges af indsprøjtning af standardopløsninger.

Som hovedregel kan der indsprøjtes seks prøver i hver serie.

Bemærkning 6:

Integration af stigmasteroltoppen skal også omfatte en evt. hale som afgrænset af punkt 1, 2 og 3 i figur 2b.

Integration af sitosteroltoppen skal også omfatte toppen for 22-dihydro-β-sitosterol (stigmastanol), som eluerer umiddelbart efter sitosterol (figur 3b), når den samlede mængde sitosterol bestemmes.

6. Beregning af resultater

6.1. Arealet af steroltoppe og betulintoppe i begge referencekromatogrammer omkring en serie bestemmes, og R1 beregnes således:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

Arealet af steroltoppen (stigmasterol og sitosterol) og betulintoppen i prøven bestemmes, og R2 beregnes således:

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

W1= sterolindhold (i mg) i 1 ml standardopløsning (4.8.1 eller 4.9.1)

W2= prøvens vægt i g (5.2.1)

P= sterolstandardens renhedsgrad (4.8 eller 4.9)

>REFERENCE TIL EN GRAFIK>

7. Metodens præcision

7.1. Smør

7.1.1. Repeterbarhed

7.1.1.1. Stigmasterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 19,3 mg/kg.

7.1.1.2. Sitosterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 23,0 mg/kg.

7.1.2. Reproducerbarhed

7.1.2.1. Stigmasterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke overstige 31,9 mg/kg.

7.1.2.2. Sitosterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke være større end 8,7 % af gennemsnittet af resultaterne.

7.1.3. Kilde for præcisionsdata

Præcisionsdataene er fastlagt på grundlag af et eksperiment, som i 1992 blev foretaget med otte laboratorier og seks prøver (blindbestemmelse med tre dobbeltprøver) for stigmasterol samt seks prøver (blindbestemmelse med tre dobbeltprøver) for sitosterol.

7.2. Koncentreret smør

7.2.1. Repeterbarhed

7.2.1.1. Stigmasterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke overstige 10,2 mg/kg.

7.2.1.2. Sitosterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages umiddelbart efter hinanden af den samme person med det samme udstyr, må ikke være større end 3,6 % af gennemsnittet af resultaterne.

7.2.2. Reproducerbarhed

7.2.2.1. Stigmasterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke overstige 25,3 mg/kg.

7.2.2.2. Sitosterol

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser af det samme prøvemateriale, der foretages i forskellige laboratorier med forskelligt udstyr, må ikke være større end 8,9 % af gennemsnittet af resultaterne.

7.2.3. Kilde for præcisionsdata

Præcisionsdataene er fastlagt på grundlag af et eksperiment, som i 1991 blev foretaget med ni laboratorier og seks prøver (blindbestemmelse med tre dobbeltprøver) for stigmasterol samt seks prøver (blindbestemmelse med tre dobbeltprøver) for sitosterol.

8. Grænseværdier

8.1. Der udtages tre prøver af produktet med røbestof for at kontrollere, om produktet er tilsat røbestof på korrekt måde.

8.2. Smør

8.2.1. Stigmasterol

8.2.1.1. Der iblandes 150 g mindst 95 % ren stigmasterol pr. t smør, dvs. 142,5 mg/kg, eller 170 g mindst 85 % ren stigmasterol pr. t smør, dvs. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier (under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95)):

- 116,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigmasterol)

- 118,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigmasterol)

- 81,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigmasterol)

- 82,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigmasterol).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 116,0 mg/kg og 81,0 mg/kg eller mellem 118,0 mg/kg og 82,0 mg/kg.

8.2.2. Sitosterol

8.2.2.1. Der iblandes 600 g mindst 90 % ren sitosterol pr. t smør, dvs. 540 mg/kg.

8.2.2.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier (under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95)):

- 486,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol)

- 358,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 486,0 mg/kg og 358,0 mg/kg.

8.3. Koncentreret smør

8.3.1. Stigmasterol

8.3.1.1. Der iblandes 150 g mindst 95 % ren stigmasterol pr. t koncentreret smør, dvs. 142,5 mg/kg eller 170 g mindst 85 % ren stigmasterol pr. t koncentreret smør, dvs. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier (under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95)):

- 120,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigmasterol)

- 122,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigmasterol)

- 84,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 95 % ren stigmasterol)

- 86,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 85 % ren stigmasterol).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 120,0 mg/kg og 84,0 mg/kg eller mellem 122,0 mg/kg og 86,0 mg/kg.

8.3.2. Sitosterol

8.3.2.1. Der iblandes 600 g mindst 90 % ren sitosterol pr. t koncentreret smør, dvs. 540 mg/kg.

8.3.2.2. Resultaterne af analysen af de tre prøver af produktet anvendes til at kontrollere mængden og homogeniteten af det iblandede røbestof, og det laveste af disse resultater sammenholdes med følgende grænseværdier (under hensyntagen til den kritiske forskel for en 95 % sandsynlighedsgrænse (CrD95)):

- 486,0 mg/kg (95 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol)

- 358,0 mg/kg (70 % af den mindste iblanding for 90 % ren sitosterol).

Koncentrationen af røbestoffet i den prøve, der giver det laveste resultat, benyttes sammen med interpolering mellem 486,0 mg/kg og 358,0 mg/kg.

>PIC FILE= "L_2001037DA.004801.EPS">

>PIC FILE= "L_2001037DA.004901.EPS">

>PIC FILE= "L_2001037DA.005001.EPS">

BILAG XV

(Artikel 10)

REFERENCEMETODE TIL PÅVISNING AF KOMÆLK OG KASEINAT I OST FREMSTILLET AF FÅRE-, GEDE- ELLER BØFFELMÆLK ELLER AF BLANDINGER AF FÅRE-, GEDE- OG BØFFELMÆLK

1. Omfang

Påvisning af komælk og kaseinat i ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk ved isoelektrisk fokusering af γ-kaseiner efter plasminolyse.

2. Område

Metoden er egnet til følsom og specifik påvisning af rå og varmebehandlet komælk og kaseinat i frisk og modnet ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk. Den er ikke egnet til påvisning af, om mælk og ost er forfalsket med varmebehandlede kovalleproteinkoncentrater.

3. Princip

3.1. Isolering af kaseiner fra ost og referenceopløsninger

3.2. Opløsning af isolerede kaseiner, som derefter underkastes plasminspaltning (E.C.3.4.21.7).

3.3. Isoelektrisk fokusering af de plasminbehandlede kaseiner i tilstedeværelse af urea og farvning af proteinerne.

3.4. Vurdering af de farvede γ3- og γ2-kaseinmønstre (tegn på komælk) ved sammenligning af mønstret fra prøven med dem, der fremkom i samme gel fra referenceopløsninger med 0 % og 1 % komælk.

4. Reagenser

Medmindre andet er angivet, skal der anvendes kemikalier af analysekvalitet. Vandet skal være dobbeltdestilleret eller af tilsvarende renhed.

NB:

Nedenstående detaljer gælder for laboratoriefremstillede polyacrylamidgeler, der indeholder urea, af, størrelsen 265 x 125 x 0,25 mm. Hvis der bruges gel af en anden størrelse eller type, skal separationsbetingelserne måske justeres.

Isoelektrisk fokusering

4.1. Reagenser til fremstilling af polyacrylamider, der indeholder urea

4.1.1. Stamopløsning

4,85 g acrylamid

0,15 g N,N'-metylen-bis-acrylamid (BIS)

48,05 g urea

15,00 g glycerol (87 % w/w)

opløses i vand, og der fyldes op til 100 ml. Opbevares i brun flaske i køleskab.

NB:

En forblandet acrylamid/BIS-opløsning, der fås i handelen, kan anvendes frem for de angivne vægte af neurotoksiske acrylamider. Hvis en sådan opløsning indeholder 30 % w/v acrylamid og 0,8 % w/v BIS, skal der bruges et volumen på 16,2 ml i formuleringen i stedet for de angivne vægte. Stamopløsningens holdbarhed er højst 10 døgn. Hvis dens ledningsevne er over 5 μS, afioniseres den ved omrøring med 2 g Amberlite MB-3 i 30 minutter og filtreres derefter gennem en 0,45 μm membran.

4.1.2. Gelopløsning

Der laves en gelopløsning ved blanding af additiver og amfolytter med stamopløsningen (4.1.1).

9,0 ml stamopløsning

24 mg β-alanin

500 μl amfolyt pH 3,5-9,5(1)

250 μl amfolyt pH 5-7(2)

250 μl amfolyt pH 6-8(3).

Gelopløsningen blandes og afgasses i 2-3 minutter i et ultralydbad eller i vakuum.

NB:

Gelopløsningen laves straks før ophældningen (6.2).

4.1.3. Katalysatoropløsninger

4.1.3.1. N,N,N'N'-tetrametylendiamin (TEMED)

4.1.3.2. 40 % w/v ammoniumpersulfat (PER)

800 mg PER opløses i vand, og der fyldes op til 2 ml.

NB:

Der skal altid bruges frisklavet PER-opløsning.

4.2. Kontaktvæske

Petroleum eller flydende paraffin.

4.3. Anodeopløsning

5.77 g fosforsyre (85 % w/w) opløses i vand og fortyndes til 100 ml med vand.

4.4. Katodeopløsning

2,00 natriumhydroxid opløses i vand og fortyndes til 100 ml med vand.

Tilberedelse af prøven

4.5. Reagenser til proteinisolering

4.5.1. Fortyndet eddikesyre (25,0 ml iseddike fortyndet til 100 ml ved vand).

4.5.2. Diklormetan

4.5.3. Acetone

4.6. Proteinopløsende buffer

Stamopløsning

5,75 g glycerol (87 % w/w)

24,03 g urea

250 mg ditiotreitol

opløses i vand, og der fyldes op til 50 ml.

NB:

Opbevares i køleskab - holdbarhed 1 uge.

4.7. Reagenser til plasminspaltning af kaseiner

4.7.1. Ammoniumkarbonatbuffer

En 0,2 mol/l ammoniumhydrogenkarbonatopløsning (1,58 g/100 ml vand) med 0,05 mol/l etylenediamintetra-eddikesyre (EDTA, 1,46 g/100 ml) titreres med en 0,2 mol ammoniumkarbonatopløsning (1,92 g/100 ml vand) med 0,05 mol/l EDTA til pH 8.

4.7.2. Bovin plasmin (E.C. 3.4.21.7), aktivitet mindst 5 U/ml

4.7.3. ε-aminokapronsyre til enzymhæmning

2,624 g ε-aminokapronsyre (6-amino-n-heksanonsyre) opløses i 100 ml 40 % (v/v) etanol.

4.8. Standardopløsninger

4.8.1. Godkendte referenceopløsninger af en blanding af løbebehandlet skummet fåre- og gedemælk indeholdende 0 % og 1 % komælk kan fås hos Kommissionen, Instituttet for Referencemålinger og -Materialer, B-2440 Geel, Belgien.

4.8.2. Fremstilling af midlertidige laboratoriestandardopløsninger af løbebehandlet bøffelmæk indeholdende 0 % og 1 % komælk.

Skummetmælken fremstilles ved centrifugering af bøffelmælk eller rå tankkomælk ved 37 °C ved 2500 g i 20 minutter. Efter hurtig afkøling af glas og indhold til 6-8 °C fjernes det øverste fedtlag fuldstændigt. Til fremstilling af 1 %-standardopløsningen tilsættes 5,00 ml skummet komæl