15)

I del B indsættes følgende kapitler: »B.59 In chemico-hudsensibilisering: direkte peptidreaktivitetsassay (DPRA) INDLEDNING Denne forsøgsmetode svarer til OECD's testvejledning (Test Guideline (TG)) 442C (2015). Et hudsensibiliserende stof er et stof, der fremkalder en allergisk reaktion ved hudkontakt som defineret ved De Forenede Nationers globalt harmoniserede system til klassificering og mærkning af kemikalier (UN GHS) (1) og forordning (EF) nr. 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (CLP-forordningen) (18). Denne forsøgsmetode indeholder en kemisk procedure (direkte peptidreaktivitetsassay — DPRA), der anvendes til at underbygge sondringen mellem hudsensibiliserende og ikke-hudsensibiliserende stoffer i henhold til UN GHS og CLP. Der hersker almindelig enighed om de centrale biologiske begivenheder, som ligger til grund for hudsensibilisering. Den nuværende viden om kemiske og biologiske mekanismer i forbindelse med hudsensibilisering er sammenfattet i form af en Adverse Outcome Pathway (AOP) (2) fra den molekylære udløsende begivenhed gennem de mellemliggende begivenheder til den skadelige virkning, nemlig allergisk kontaktdermatitis hos mennesker eller kontaktoverfølsomhed hos gnavere. I hudsensibilisering-AOP'en er den molekylære udløsende begivenhed den kovalente binding af elektrofile stoffer til nuklofile centre i hudproteiner. Vurderingen af hudsensibilisering har typisk omfattet brug af laboratoriedyr. Med de klassiske metoder baseret på marsvin, Guinea Pig Maximisation Test (GPMT) og Buehler-testen (TM B.6 (3)), undersøger man både induktions- og udløsningsfasen ved hudsensibilisering. En musetest, assay på lokale lymfeknuder (Local Lymph Node Assay (LLNA), TM B.42 (4)) og dens to ikke-radioaktive ændringer, LLNA: DA (TM B.50 (5)) og LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51 (6)), som alle udelukkende vurderer induktionsresponsen, er også blevet accepteret, eftersom de indebærer en fordel i forhold til marsvinetest, hvad angår dyrevelfærd og en objektiv måling af induktionsfasen for hudsensibilisering. På det seneste har man anset mekanistisk baserede in chemico- og in vitro-forsøgsmetoder for videnskabeligt gyldige til evaluering af kemikaliers hudsensibiliseringsfare. Men der vil være behov for kombinationer af metoder uden brug af dyr (in silico, in chemico, in vitro) inden for integrerede tilgange til prøvning og vurdering (IATA) for fuldt ud at kunne erstatte de dyreforsøg, der anvendes i øjeblikket, i lyset af den begrænsede AOP-mekanistiske dækning af hver af de aktuelt tilgængelige forsøgsmetoder uden brug af dyr (2) (7). Det foreslås, at DPRA bruges til at håndtere den molekylære udløsende begivenhed for hudsensibiliserings-AOP'en, nemlig proteinreaktivitet, ved at kvantificere testkemikaliernes reaktivitet over for modellens syntetiske peptider, som enten indeholder lysin eller cystein (8). De procentvise nedbrydningsværdier for cystein og lysin bruges herefter til at klassificere et stof i en af fire reaktivitetsklasser, der bruges som grundlag for sondringen mellem hudsensibiliserende og ikke-sensibiliserende stoffer (9). DPRA er blevet vurderet i en valideringsundersøgelse ledet af et EU-referencelaboratorium for alternativer til dyreforsøg (EURL ECVAM) og en efterfølgende uafhængig peer review udført af EURL ECVAM's videnskabelige rådgivende udvalg (ESAC) og betragtes som videnskabeligt underbygget (10) til brug som en del af en IATA til at underbygge sondringen mellem hudsensibiliserende og ikke-hudsensibiliserende stoffer med henblik på fareklassificering og mærkning. Litteraturen indeholder eksempler på anvendelse af DPRA-data i kombination med andre oplysninger (11) (12) (13) (14). Definitioner findes i tillæg 1. INDLEDENDE OVERVEJELSER, ANVENDELSE OG BEGRÆNSNINGER Sammenhængen mellem proteinreaktivitet og hudsensibiliseringspotentiale er veldokumenteret (15) (16) (17). Men da proteinbinding kun udgør en vigtig begivenhed, selv om der er tale om den molekylære udløsende begivenhed for hudsensibiliserings-AOP'en, er oplysninger om proteinreaktivitet, der genereres med forsøgs- og ikke-forsøgsmetoder, muligvis ikke i sig selv tilstrækkelige til at konkludere, at kemikalier ikke kan forårsage hudsensibilisering. Derfor bør data genereret med denne forsøgsmetode ses i sammenhæng med integrerede tilgange, såsom IATA, idet de kombineres med andre supplerende oplysninger, f.eks. hidrørende fra in vitro-assays vedrørende andre vigtige begivenheder for hudsensibiliserings-AOP samt ikke-forsøgsmetoder, herunder analogislutninger fra analoge kemikalier. Denne forsøgsmetode kan anvendes i kombination med andre supplerende oplysninger som begrundelse for forskelsbehandling mellem hudsensibiliserende (dvs. UN GHS-/CLP-kategori 1) og ikke-hudsensibiliserende stoffer i forbindelse med IATA. Denne metode kan ikke anvendes alene, hverken til at kategorisere hudsensibiliserende stoffer i underkategorierne 1A og 1B som defineret i UN GHS/CLP, eller til at forudsige styrken i forbindelse med beslutninger om sikkerhedsvurdering. Afhængigt af den juridiske ramme kan et positivt udfald af DPRA imidlertid anvendes alene til at klassificere et kemikalie i UN GHS-/CLP-kategori 1. DPRA-forsøgsmetoden har vist sig at kunne overføres til laboratorier, der har erfaring med højtrykvæskekromatografi (HPLC). Graden af reproducerbarhed for de forudsigelser, der kan forventes fra forsøgsmetoden, ligger i størrelsesordenen 85 % inden for laboratorier og 80 % mellem laboratorier (10). Resultater, der er fremkommet i valideringsundersøgelsen (18) og offentliggjorte undersøgelser (19), viser generelt, at nøjagtigheden af DPRA til sondring mellem sensibiliserende stoffer (dvs. UN GHS-/CLP-kategori 1) og ikke-sensibiliserende stoffer er 80 % (N= 157) med en følsomhed på 80 % (88/109) og en specificitet på 77 % (37/48) sammenlignet med LLNA-resultater. Det er mere sandsynligt, at DPRA vil føre til for lave forudsigelser for kemiske stoffer med lav til moderat hudsensibiliserende styrke (dvs. UN GHS-/CLP-underkategori 1B) i forhold til kemikalier med høj hudsensibiliserende styrke (dvs. UN GHS-/CLP-underkategori 1A) (18) (19). De nøjagtige værdier, der her angives for DPRA som en selvstændig forsøgsmetode, er imidlertid kun vejledende, da forsøgsmetoden bør betragtes i kombination med andre informationskilder i forbindelse med en IATA og i overensstemmelse med bestemmelserne i punkt 9 ovenfor. I forbindelse med vurderingen af metoder til test af hudsensibilisering uden brug af dyr bør man desuden holde sig for øje, at LLNA-test samt andre dyreforsøg ikke fuldt ud afspejler situationen hos arten af interesse, dvs. mennesker. På grundlag af de samlede tilgængelige data har DPRA vist sig at være relevant for testkemikalier, der dækker en række forskellige organiske funktionelle grupper, reaktionsmekanismer, hudsensibiliseringsstyrke (som fastlagt ved in vivo-undersøgelser) og fysisk-kemiske egenskaber (8) (9) (10) (19). Samlet set viser disse oplysninger nytteværdien af DPRA som bidrag til identifikation af hudsensibiliseringsfare. Betegnelsen “testkemikalie” anvendes i denne forsøgsmetode om det, der testes, og vedrører ikke anvendeligheden af DPRA til test af stoffer og/eller blandinger. Denne forsøgsmetode er ikke anvendelig til test af metalforbindelser, da de er kendt for at reagere med proteiner gennem andre mekanismer end kovalent binding. Et testkemikalie bør være opløseligt i et passende opløsningsmiddel i en slutkoncentration på 100 mM (se punkt 18). Testkemikalier, der ikke er opløselige i denne koncentration, kan imidlertid stadig testes ved lavere opløselige koncentrationer. I så fald vil et positivt resultat stadig kunne anvendes til at understøtte bestemmelsen af testkemikaliet som hudsensibiliserende, men et negativt resultat bør ikke føre til nogen endelig konklusion om manglende reaktivitet. I øjeblikket er der begrænsede oplysninger tilgængelige om anvendeligheden af DPRA til blandinger med kendt sammensætning (18) (19). DPRA betragtes alligevel som teknisk anvendelig til test af stoffer med flere bestanddele og blandinger med kendt sammensætning (se punkt 18). Før brug af denne forsøgsmetode til lovmæssig test af en blanding til generering af data bør det overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor. Sådanne overvejelser er ikke nødvendige, når der foreligger et myndighedskrav om test af blandingen. Den nuværende forudsigelsesmodel kan ikke anvendes til komplekse blandinger af ukendt sammensætning eller til stoffer med ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter eller biologiske materialer (dvs. UVCB-stoffer) på grund af de definerede molforhold for testkemikalie og peptid. Der vil derfor skulle udvikles en ny forudsigelsesmodel til dette baseret på en gravimetrisk metode. I de tilfælde, hvor det kan påvises, at forsøgsmetoden ikke er anvendelig til andre specifikke kategorier af kemikalier, bør forsøgsmetoden ikke anvendes til de pågældende kategorier. Denne forsøgsmetode er en in chemico-metode, der ikke omfatter et metabolisk system. Kemikalier, der kræver enzymatisk bioaktivering for at udøve deres hudsensibiliseringspotentiale (dvs. pro-haptener), kan ikke spores med denne forsøgsmetode. Der findes rapporter om, at kemikalier, der bliver til sensibiliserende stoffer efter abiotisk omdannelse (dvs. præ-haptener), i nogle tilfælde kan spores korrekt med denne forsøgsmetode (18). I lyset af ovenstående bør negative resultater, der er opnået med forsøgsmetoden, fortolkes i lyset af de anførte begrænsninger og i kombination med andre informationskilder inden for rammerne af en IATA. Testkemikalier, der ikke bindes kovalent til peptidet, men fremmer dets oxidering (dvs. cysteindimerisering), kan medføre en overvurdering af peptidnedbrydningen, hvilket kan resultere i mulige falsk positive forudsigelser og/eller placering i en højere reaktivitetsklasse (jf. punkt 29 og 30). Som beskrevet understøtter DPRA sondring mellem hudsensibiliserende og ikke-hudsensibiliserende stoffer. Det kan imidlertid også bidrage til vurderingen af sensibiliseringsstyrken (11), når det bruges i integrerede tilgange såsom IATA. Der er dog behov for yderligere arbejde, fortrinsvis baseret på data for mennesker, for at fastslå, hvordan DPRA-resultaterne kan anvendes til styrkevurderingen. PRINCIP FOR TESTEN DPRA er en in chemico-metode, der kvantificerer restkoncentrationen af cystein- eller lysin-holdigt peptid efter 24 timers inkubering med testkemikaliet ved 25 ± 2,5 °C. Den syntetiske peptid indeholder phenylalanin for at hjælpe med påvisningen. Den relative peptidkoncentration måles ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) med gradienteluering og UV-detektion ved 220 nm. Herefter beregnes nedbrydningsværdierne for det cystein- og lysinholdige peptid i procent og anvendes i en forudsigelsesmodel (se punkt 29), som gør det muligt at placere testkemikaliet i en af fire reaktivitetsklasser, der anvendes som grundlag for sondringen mellem sensibiliserende stoffer og ikke-sensibiliserende stoffer. Før rutinemæssig brug af den metode, der beskrives i denne forsøgsmetode, bør laboratorierne godtgøre deres tekniske kompetence ved hjælp af de 10 kompetencestoffer, der findes opført i tillæg 2. FREMGANGSMÅDE Denne forsøgsmetode er baseret på DPRA DB-ALM protokol nr. 154 (20), der repræsenterer den protokol, der blev anvendt i valideringsundersøgelsen koordineret af EURL ECVAM. Det anbefales, at denne protokol anvendes, når metoden indføres og anvendes i laboratoriet. Følgende er en beskrivelse af de vigtigste DPRA-komponenter og procedurer. Hvis der anvendes en alternativ HPLC-opstilling, bør dens ækvivalens med den validerede opstilling, som beskrives i DB-ALM-protokollen, dokumenteres (f.eks. ved at teste kompetencestofferne i tillæg 2). Præparering af de cystein- eller lysinholdige peptider Stamopløsninger af cystein (Ac-RFAACAA-COOH) og lysin (Ac-RFAAKAA-COOH), der indeholder syntetiske peptider med en renhed på over 85 % og helst i intervallet 90-95 %, fremstilles lige før deres inkubering med testkemikaliet. Slutkoncentrationen af cysteinpeptidet bør være 0,667 mM i pH 7,5-fosfatbuffer, mens slutkoncentrationen af lysinpeptid bør være 0,667 mM i pH 10,2-ammoniumacetatbuffer. HPLC-analysesekvensen bør fastlægges med henblik på at holde varigheden af HPLC-analysen under 30 timer. Til den HPLC-opstilling, som blev anvendt i valideringsundersøgelsen og beskrives i denne forsøgsmetode, kan op til 26 analyseprøver (der omfatter testkemikaliet, den positive kontrol og et hensigtsmæssigt antal opløsningsmiddelkontroller på grundlag af antallet af individuelle opløsningsmidler, der anvendes i testen, som hvert afprøves i tre eksemplarer), medtages i en enkelt HPLC-kørsel. Til alle replikater, som analyseres i samme kørsel, bør der anvendes identiske stamopløsninger af cystein- og lysinpeptid. Det anbefales at kontrollere, at de enkelte peptidbatches har korrekt opløselighed, inden de bruges. Præparering af testkemikaliet Teststoffets opløselighed i et passende opløsningsmiddel bør vurderes, inden assayet gennemføres, i henhold til opløselighedsproceduren, der beskrives i DPRA DB-ALM-protokollen (20). Et passende opløsningsmiddel vil opløse testkemikaliet helt. Eftersom en stor overskydende mængde af DPRA-testkemikaliet inkuberes i enten cystein- eller lysinpeptiderne, betragtes visuel kontrol af dannelsen af en klar opløsning for at være tilstrækkelig til at fastslå, at testkemikaliet (og alle dets komponenter i forbindelse med afprøvning af et stof med flere bestanddele eller en blanding) er opløst. Egnede opløsningsmidler er acetonitril, vand, en 1:1-blanding af vand og acetonitril, isopropanol, acetone eller en 1:1-blanding af acetone og acetonitril. Andre opløsningsmidler kan anvendes, så længe de ikke påvirker stabiliteten af peptidet, som overvåges med referencekontrol C (dvs. prøver bestående af peptid alene opløst i et passende opløsningsmiddel, jf. tillæg 3). Som en sidste mulighed, hvis testkemikaliet ikke er opløseligt i nogen af disse opløsningsmidler, må det forsøges at opløse det i 300 μl DMSO og fortynde den fremkomne opløsning med 2 700 μl acetonitril. Hvis testkemikaliet ikke er opløseligt i denne blanding, må det forsøges at opløse den samme mængde af testkemikaliet i 1 500 μl DMSO og fortynde den fremkomne opløsning med 1 500 μl acetonitril. Testkemikaliet bør afvejes på forhånd i hætteglas og opløses lige inden testen i et egnet opløsningsmiddel, så der fremstilles en 100 mM-opløsning. For blandinger og stoffer med flere bestanddele med kendt sammensætning bør en enkelt renhed bestemmes af summen af andelen af bestanddelene (undtagen vand), og en enkelt tilsyneladende molekylvægt bør bestemmes på grundlag af de enkelte molekylvægte af de enkelte bestanddele i blandingen (undtagen vand) og deres individuelle andele. Den resulterende renhed og tilsyneladende molekylvægt bør derefter bruges til at beregne den mængde testkemikalie, som skal bruges for fremstille en 100 mM-opløsning. For polymerer, for hvilke det ikke er muligt at fastslå en primær molekylvægt, kan molekylvægten af monomeren (eller den tilsyneladende molekylvægt af de forskellige monomerer, der udgør polymeren) anvendes til at fremstille en 100 mM-opløsning. Men ved test af blandinger, stoffer med flere bestanddele eller polymerer med kendt sammensætning bør det overvejes også at teste det rene kemikalie. For væsker bør det rene kemikalie testes uden forudgående fortynding ved at inkubere det med cystein- og lysinpeptiderne i et molforhold på henholdsvis 1:10 og 1:50. For faste stoffer bør teststoffet opløses til sin maksimale opløselige koncentration i samme opløsningsmiddel, som bruges til at fremstille den tilsyneladende 100 mM-opløsning. For væsker bør det rene kemikalie testes uden forudgående fortynding ved at inkubere det med cystein- og lysinpeptiderne i et molforhold på henholdsvis 1:10 og 1:50. Enslydende resultater (reaktive eller ikkereaktive) mellem den tilsyneladende 100 mM-opløsning og det rene kemikalie bør give mulighed for at udlede en entydig konklusion om resultatet. Forberedelse af den positive kontrol, referencekontroller og co-elueringskontroller Kanelaldehyd (CAS 104-55-2, ≥ 95 % fødevaregodkendt renhed) bør anvendes som positiv kontrol i en koncentration på 100 mM i acetonitril. Andre egnede positive kontroller, helst med nedbrydningsværdier i mellemområdet, kan anvendes, hvis der foreligger historiske data, som kan anvendes til at udlede sammenlignelige acceptkriterier for kørslen. Desuden bør man også medtage referencekontroller (dvs. prøver, der kun indeholder peptidet opløst i et passende opløsningsmiddel) i HPLC-analysesekvensen, og disse benyttes til at kontrollere HPLC-systemets egnethed forud for analysen (referencekontrol A), stabiliteten af referencekontrollerne over tid (referencekontrol B) og til at kontrollere, at det opløsningsmiddel, der anvendes til at opløse testkemikaliet, ikke påvirker den procentvise peptidnedbrydning (referencekontrol C) (jf. tillæg 3). Den relevante referencekontrol for hvert kemikalie bruges til at beregne den procentvise peptidnedbrydning for det pågældende kemikalie (se punkt 26). Desuden bør man medtage en co-elueringskontrol, som udelukkende består af testkemikaliet, i analyseserien med henblik på at konstatere mulig co-eluering af testkemikaliet med enten lysin- eller cysteinpeptidet. Inkubering af testkemikaliet med cystein- og lysinpeptidopløsningerne Cystein- og lysinpeptidopløsninger bør inkuberes i autosampler-hætteglas med testkemikaliet i et forhold på henholdsvis 1:10 og 1:50. Hvis der observeres bundfald umiddelbart efter tilsætning af testkemikalieopløsningen til peptidopløsningen på grund af testkemikaliets lave vandopløselighed, kan man ikke være sikker på, hvor meget af testkemikaliet, der forblev i opløsningen til at reagere med peptidet. Derfor kan man i sådanne tilfælde stadig bruge et positivt resultat, men et negativt resultat er usikkert og bør fortolkes med behørig forsigtighed (se også bestemmelserne i punkt 11 vedrørende test af kemikalier, der ikke er opløselige op til en koncentration på 100 mM). Reaktionsopløsningen bør stå i mørke ved 25 ± 2,5 °C i 24 ± 2 timer, før HPLC-analysen foretages. Hvert testkemikalie bør analyseres i tre eksemplarer for begge peptider. Prøverne skal undersøges visuelt forud for HPLC-analysen. Hvis der observeres bundfald eller faseadskillelse, kan prøverne centrifugeres ved lav hastighed (100-400 × g) for at tvinge bundfald til bunden af hætteglasset som en sikkerhedsforanstaltning, da store mængder bundfald kan tilstoppe HPLC-rør og -kolonner. Hvis der observeres bundfald eller faseadskillelse efter inkubationsperioden, kan peptidnedbrydningen være undervurderet, og man kan ikke udlede en konklusion om den manglende reaktivitet med tilstrækkelig sikkerhed i tilfælde af et negativt resultat. Udarbejdelse af standardkalibreringskurven for HPLC Der bør genereres en kalibreringskurve for både cystein- og lysinpeptiderne. Peptidstandarder præpareres i en opløsning med 20 % eller 25 % acetonitrilbuffer i forhold til buffer, idet der anvendes fosfatbuffer (pH 7,5) til cysteinpeptidet og ammoniumacetatbuffer (pH 10,2) til lysinpeptidet. Under anvendelse af serielle fortyndingsstandarder for peptidstamopløsningen (0,667 mM) fremstilles der seks kalibreringsopløsninger, der dækker området fra 0,534 til 0,0167 mM. En blindprøve af fortyndingsbufferen bør også medtages i standardkalibreringskurven. Passende kalibreringskurver skal have en r2 > 0,99. Forberedelse af HPLC og analyse HPLC-systemets egnethed skal kontrolleres forud for analysen. Peptidnedbrydningen overvåges af HPLC kombineret med en UV-detektor (fotodiodearraydetektor eller absorbansdetektor med fast bølgelængde med 220 nm-signal). Den relevante kolonne installeres i HPLC-systemet. Den HPLC-opstilling, der er beskrevet i den validerede protokol, består af en Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 mμ som foretrukken kolonne. Med denne HPLC-kolonne med omvendt fase bør hele systemet bringes i ligevægt ved 30 °C med 50 % fase A (0,1 % (v/v) trifluoreddikesyre i vand) og 50 % fase B (0,085 % (v/v) trifluoreddikesyre i acetonitril) i mindst 2 timer før kørsel. HPLC-analysen bør udføres ved en flowhastighed på 0,35 ml/min. og en lineær gradient fra 10 % til 25 % acetonitril i 10 minutter efterfulgt af en hurtig stigning til 90 % acetonitril for at fjerne andre materialer. Der bør indsprøjtes lige store mængder af hver enkelt standard, prøve og kontrol. Kolonnen bør bringes i ligevægt igen under de oprindelige forhold i 7 minutter mellem injektionerne. Hvis der anvendes en anden HPLC-kolonne med omvendt fase, kan det være nødvendigt at justere de indstillingsparametre, der er beskrevet ovenfor, for at sikre en passende eluering og integration af cystein- og lysinpeptiderne, herunder injektionsvolumen, der kan variere alt efter det anvendte system (typisk i størrelsesordenen 3-10 μl). Hvis der anvendes en alternativ HPLC-opstilling, er det vigtigt at dokumentere dens ækvivalens med den validerede opsætning, som er beskrevet ovenfor (f.eks. ved at teste kompetencestofferne i tillæg 2). Absorbans måles ved 220 nm. Hvis en fotodiodearraydetektor anvendes, registreres absorbansen ved 258 nm ligeledes. Det skal bemærkes, at nogle leverancer af acetonitril kan have en negativ indvirkning på peptidstabiliteten, og dette skal vurderes, når der anvendes et nyt batch acetonitril. Forholdet mellem toparealet ved 220 nm og toparealet ved 258 nm kan bruges som indikator for co-elueringen. For hver prøve vil et forhold i området 90 % < gennemsnitligt (19) områdeforhold for kontrolprøver < 100 % være en god indikation af, at co-elueringen ikke har fundet sted. Der kan være testkemikalier, som kan fremme oxideringen af cysteinpeptidet. Topniveauet for det dimeriserede cysteinpeptid kan kontrolleres visuelt. Hvis dimeriseringen tilsyneladende er indtruffet, bør dette noteres, eftersom den procentvise peptidnedbrydning kan overvurderes, hvilket kan føre til falsk positive forudsigelser og/eller placering i en højere reaktivitetsklasse (jf. punkt 29 og 30). HPLC-analyse af cystein- og lysinpeptider kan udføres samtidig (hvis der er to HPLC-systemer til rådighed) eller på forskellige dage. Hvis analysen udføres på forskellige dage, bør alle kemiske opløsninger fremstilles for begge assays på hver af disse dage. Tidspunktet for analysen vælges således, at injektionen af den første prøve indledes 22-26 timer efter, at testkemikaliet blev blandet med peptidopløsningen. HPLC-analysesekvensen bør fastlægges med henblik på at holde varigheden af HPLC-analysen under 30 timer. Til den HPLC-opstilling, der blev brugt i valideringsundersøgelsen, og som beskrives i denne forsøgsmetode, kan der medtages op til 26 analyseprøver i en enkelt HPLC-kørsel (se også punkt 17). Tillæg 3 indeholder et eksempel på HPLC-analysesekvensen. DATA OG RAPPORTERING Dataevaluering Koncentrationen af cystein-eller lysinpeptidet bestemmes fotometrisk ved 220 nm i hver prøve ved at måle toparealet (areal under kurven, AUC) for de relevante toppe og ved at beregne peptidkoncentrationen ved hjælp af den lineære kalibreringskurve, som er afledt af disse standarder. Den procentvise peptidnedbrydning bestemmes i hver prøve ved at måle toparealet og dividere det med det gennemsnitlige topareal for de relevante referencekontroller C (se tillæg 3) i henhold til nedenstående formel. Acceptkriterier Følgende kriterier bør være opfyldt, for at en kørsel kan anses for gyldig: a) Standardkalibreringskurven bør have en r2 > 0,99. b) Den gennemsnitlige peptidnedbrydningsværdi i procent for de tre replikater for kanelaldehyden til den positive kontrol bør være mellem 60,8 % og 100 % for cysteinpeptidet og mellem 40,2 % og 69,0 % for lysinpeptidet, og den maksimale standardafvigelse for de positive kontrolreplikater bør være < 14,9 % for den procentvise cysteinnedbrydning og < 11,6 % for den procentvise lysinnedbrydning. c) Den gennemsnitlige peptidkoncentration for referencekontrol A bør være 0,5 ± 0,05 mM og variationskoefficienten for peptidernes toparealer for de ni referencekontroller B og C i acetonitril bør være < 15,0 %. Hvis et eller flere af disse kriterier ikke er opfyldt, bør kørslen gentages. Følgende kriterier bør være opfyldt, hvis testresultatet for kemikaliet skal anses for gyldigt: a) Den maksimale standardafvigelse for replikaterne af testkemikaliet bør være < 14,9 % for den procentvise cysteinnedbrydning og < 11,6 % for den procentvise lysinnedbrydning, b) Den gennemsnitlige peptidkoncentration af de tre referencekontroller C i det relevante opløsningsmiddel bør være 0,50 ± 0,05 mM. Hvis disse kriterier ikke er opfyldt, bør dataene afvises og kørslen gentages for det pågældende testkemikalie. Forudsigelsesmodel Den gennemsnitlige procentvise cystein- og lysinnedbrydningsværdi i procent beregnes for hvert enkelt testkemikalie. Negativ nedbrydning betragtes som “0” ved beregning af middelværdien. Ved brug af cystein 1:10-/lysin 1:50-forudsigelsesmodellen i tabel 1 bør grænsen på 6,38 % for den gennemsnitlige peptidnedbrydning anvendes til at underbygge sondringen mellem hudsensibiliserende og ikke-hudsensibiliserende stoffer inden for rammerne af en IATA. Det kan måske være nyttigt at anvende forudsigelsesmodellen til at placere et testkemikalie i en reaktivitetsklasse (dvs. lav, moderat og høj reaktivitet) som grundlag for styrkevurderingen inden for rammerne af en IATA. Tabel 1 Cystein 1:10/lysin 1:50-forudsigelsesmodel (20) Middelværdi for procentvis cystein- og lysinnedbrydning Reaktivitetsklasse DPRA-forudsigelse (21) 0 % < middelværdi for procentvis nedbrydning ≤ 6,38 % Ingen eller minimal reaktivitet Negativ 6,38 % < middelværdi for procentvis nedbrydning ≤ 22,62 % Lav reaktivitet Positiv 22,62 % < middelværdi for procentvis nedbrydning ≤ 42,47 % Moderat reaktivitet 42,47 % < middelværdi for procentvis nedbrydning ≤ 100 % Høj reaktivitet Der kan være tilfælde, hvor testkemikaliet (stoffet eller en eller flere bestanddele af et stof eller en blanding) absorberer betydeligt ved 220 nm og har samme retentionstid for peptidet (co-eluering). Co-eluering kan afhjælpes ved at justere HPLC-opstillingen smule med henblik på at adskille elueringstiden for testkemikaliet og peptidet yderligere. Hvis der anvendes en alternativ HPLC-opstilling for at forsøge at afhjælpe co-elueringen, bør man dokumentere dens ækvivalens med den validerede opstilling (f.eks. ved at teste kompetencestofferne i tillæg 2). Når co-eluering forekommer, kan topområdet for peptidet ikke kan integreres, og det er ikke muligt at beregne den procentvise nedbrydning af peptidet. Hvis co-eluering af sådanne testkemikalier forekommer i forbindelse med både cystein- og lysinpeptider, bør analysen rapporteres som “usikker”. I tilfælde, hvor co-eluering kun forekommer med lysinpeptidet, kan cystein 1:10-modellen, som er beskrevet i tabel 2, anvendes. Tabel 2 Cystein 1:10-forudsigelsesmodel (22) Procentvis cystein- (Cys) nedbrydning Reaktivitetsklasse DPRA-forudsigelse (23) 0 % ≤ procentvis Cys-nedbrydning ≤ 13,89 % Ingen eller minimal reaktivitet Negativ 13,89 % < procentvis Cys-nedbrydning ≤ 23,09 % Lav reaktivitet Positiv 23,09 % < procentvis Cys-nedbrydning ≤ 98,24 % Moderat reaktivitet 98,24 % < procentvis Cys-nedbrydning ≤ 100 % Høj reaktivitet Der kan være andre tilfælde, hvor overlappet i retentionstid mellem testkemikaliet og de to peptider er ufuldstændig. I sådanne tilfælde kan man vurdere de procentvise peptidnedbrydningsværdier og anvende dem i cystein 1:10-/lysin 1:50-modellen, men det er imidlertid ikke muligt at foretage en præcis placering af testkemikaliet i en reaktivitetsklasse. En enkelt HPLC-analyse for både cystein- og lysinpeptidet bør være tilstrækkelig for et testkemikalie, når resultatet er entydigt. Men i tilfælde af resultater, der ligger tæt på den tærskelværdi, der bruges til at skelne mellem positive og negative resultater (dvs. usikre resultater), kan der være behov for yderligere undersøgelser. Hvis situationer, hvor den gennemsnitlige procentvise nedbrydning ligger i området 3 % til 10 % for cystein 1:10-/lysin 1:50-forudsigelsesmodellen, eller den procentvise cysteinnedbrydning ligger i området 9 %-17 % for cystein 1:10-forudsigelsesmodellen, bør man overveje endnu en kørsel og en tredje kørsel, hvis de to første kørsler giver modstridende resultater. Testrapport Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger Testkemikalie — Stof med kun en bestanddel — kemisk identifikation, f.eks. IUPAC- eller CAS-navn(e), CAS-nummer/numre, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel og/eller andre identifikatorer — fysisk udseende, vandopløselighed, molekylvægt og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber i den udstrækning, det er muligt — renhed, kemisk identitet af urenheder i det omfang, det er relevant og praktisk muligt osv. — eventuel behandling inden testen (f.eks. opvarmning, formaling) — testede koncentrationer — opbevaring og stabilitet i det omfang, det er muligt. — Stof med flere bestanddele, UVCB-stoffer og blandinger: — kendetegnet så vidt muligt ved f.eks. kemisk identitet (jf. ovenfor), renhed, kvantitativ forekomst og bestanddelenes relevante fysisk-kemiske egenskaber (jf. ovenfor) i det omfang, det er muligt — fysisk udseende, vandopløselighed og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber i den udstrækning, det er muligt — molekylvægt eller tilsyneladende molekylvægt i tilfælde af blandinger/polymerer med kendt sammensætning eller andre oplysninger, der er relevante for undersøgelsens gennemførelse — eventuel behandling inden testen (f.eks. opvarmning, formaling) — testede koncentrationer — opbevaring og stabilitet i det omfang, det er muligt. Kontroller — positiv kontrol — kemisk identifikation, f.eks. IUPAC- eller CAS-navn(e), CAS-nummer/numre, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel og/eller andre identifikatorer — fysisk udseende, vandopløselighed, molekylvægt og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber i den udstrækning, det er muligt — renhed, kemisk identitet af urenheder i det omfang, det er relevant og praktisk muligt osv. — eventuel behandling inden testen (f.eks. opvarmning, formaling) — testede koncentrationer — opbevaring og stabilitet i det omfang, det er muligt — reference til historiske positive kontrolresultater, der udviser passende acceptkriterier for kørsel, hvis det er relevant. — Opløsningsmiddel/bærestof — anvendt opløsningsmiddel/bærestof og forholdet mellem dets bestanddele, hvis det er relevant — kemisk identifikation, f.eks. IUPAC- eller CAS-navn(e), CAS-nummer/numre og/eller andre identifikatorer — renhed, kemisk identitet af urenheder i det omfang, det er relevant og praktisk muligt osv. — fysisk udseende, molekylvægt og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber ved brug af andre opløsningsmidler/bærestoffer end dem, der er nævnt i forsøgsmetoden, i det omfang, det er muligt — opbevaring og stabilitet i det omfang, det er muligt — begrundelse for valg af opløsningsmiddel for de enkelte testkemikalier — for acetonitril testresultater for indvirkningen på peptidstabilitet. Præparering af peptider, positiv kontrol og testkemikalie — karakterisering af peptidopløsninger (leverandør, parti, nøjagtig vægt af peptidet, tilsat mængde til stamopløsning) — karakterisering af den positive kontrolopløsning (nøjagtig vægt af det positive kontrolstof, tilsat mængde til testopløsningen) — karakterisering af opløsninger af testkemikaliet (nøjagtig vægt af testkemikaliet, tilsat mængde til testopløsningen). Indstilling af HPLC-instrument og analyse — type af HPLC-instrument, HPLC- og forkolonner, detektor, autosampler — relevante parametre for HPLC-analysen såsom kolonnetemperatur, injektionsmængder, flow og gradient. Systemets egnethed — topareal for peptid ved 220 nm for hver standard- og referencekontrol A-replikat — grafisk gengivelse af lineær kalibreringskurve og den indbettede r2 — peptidkoncentrationen for hvert referencekontrol A-replikat — gennemsnitlig peptidkoncentration (mM) i de tre referencekontroller A, SD og CV — peptidkoncentrationen for referencekontrollerne A og C. Analysesekvens — For referencekontroller: — topareal for peptid ved 220 nm for hvert B- og C-replikat — gennemsnitligt topareal for peptid ved 220 nm for de ni referencekontroller B og C i acetonitril, standardafvigelse og variationskoefficient (af hensyn til stabiliteten af referencekontrollerne i analyseperioden) — for hvert anvendt opløsningsmiddel toparealet for peptidet ved 220 nm for de tre relevante referencekontroller C (til beregning af den procentvise peptidnedbrydning) — for hvert anvendt opløsningsmiddel peptidkoncentrationen (mM) for de tre relevante referencekontroller C — for hvert anvendt opløsningsmiddel den gennemsnitlige peptidkoncentration (mM) for de tre relevante referencekontroller C, standardafvigelse og variationskoefficient. — For positiv kontrol: — topareal for peptid ved 220 nm for hvert replikat — procentvis peptidnedbrydning for hvert replikat — gennemsnitlig peptidnedbrydning for de tre replikater, standardafvigelse og variationskoefficient. — For hvert testkemikalie: — eventuel forekomst af bundfald i reaktionsblandingen ved afslutningen af inkubationstiden; om bundfaldet blev genopløst eller centrifugeret — forekomst af co-eluering — beskrivelse af eventuelle andre relevante observationer, hvis det er relevant — topareal for peptid ved 220 nm for hvert replikat — procentvis peptidnedbrydning for hvert replikat — gennemsnitlig peptidnedbrydning for de tre replikater, standardafvigelse og variationskoefficient — gennemsnitlige procentvise nedbrydningsværdier for cystein og lysin — anvendt forudsigelsesmodel og DPRA-forudsigelser. Kompetencetest — hvis det er relevant, den procedure, der anvendes til at påvise laboratoriets kompetence til at anvende forsøgsmetoden (f.eks. ved test af kompetencestoffer) eller til at påvise reproducerbare resultater af forsøgsmetoden over tid. Diskussion af resultaterne — diskussion af de resultater, der er opnået med DPRA-forsøgsmetoden — diskussion af forsøgsmetodens resultater i forbindelse med en IATA, hvis der foreligger andre relevante oplysninger. Konklusion LITTERATUR (1) United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Tilgængelig på: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html (2) OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment, No.168, OECD, Paris. (3) Kapitel B.6 i dette bilag: Hudsensibilisering. (4) Kapitel B.42 i dette bilag: Assay på lokale lymfeknuder: (5) Kapitel B.50 i dette bilag: Hudsensibilisering: Assay på lokale lymfeknuder: DA. (6) Kapitel B.51 i dette bilag: Hudsensibilisering: Assay på lokale lymfekunder BrdU-ELISA (7) Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85:367-485. (8) Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81:332-343. (9) Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97:417-427. (10) EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing. Tilgængelig på: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra (11) Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. Journal of Applied Toxicology, published online, 14 May 2013, DOI: 10.1002/jat.2869. (12) Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489-504. (13) Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618. (14) Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389-400. (15) Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625-639. (16) Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc. (17) Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin. (18) EC EURL ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Tilgængelig på: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra (19) Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI:10.1002/jat.2868. (20) DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Tilgængelig på: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/ (21) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France. (22) FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Tilgængelig på: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf — 138 (23) ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87). Tillæg 1 DEFINITIONER Nøjagtighed : Overensstemmelsen mellem forsøgsmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for forsøgsmetodens ydeevne og et af aspekterne af »relevans«. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som den andel af korrekte udfald, forsøgsmetoden fører til (21). AOP (Adverse Outcome Pathway) : Sekvens af begivenheder fra den kemiske struktur af et målkemikalie eller en gruppe af ensartede kemikalier gennem den molekylære udløsende begivenhed til et in vivo-resultat af interesse (2). Kalibreringskurve : Forholdet mellem den eksperimentelle responsværdi og den analytiske koncentration (også kaldet standardkurve) for et kendt stof. Kemikalie : Et stof eller en blanding. Variationskoefficient : Et mål for variation, der beregnes for en gruppe af replikationsdata ved at dividere standardafvigelsen med middelværdien. Den kan ganges med 100 for at opnå en procentsats. Fare : Den iboende egenskab ved et middel eller en situation, som kan forårsage skade, når en organisme, et system eller en (sub)population eksponeres for det pågældende middel. IATA (integreret tilgang til afprøvning og vurdering) : En struktureret tilgang, der bruges til identifikation af farer (potentiale), farebeskrivelse (styrke) og/eller sikkerhedsvurdering (potentiale/styrke og eksponering) af et kemikalie eller en gruppe af kemikalier, som på strategisk vis integrerer og vægter alle relevante data som grundlag for lovgivningsmæssige beslutninger om mulige farer og/eller risici og/eller behovet for yderligere målrettede og derfor færrest mulige test. Molekylær udløsende begivenhed : Kemikalieinduceret forstyrrelse af et biologisk system på molekylært niveau, der identificeres som startbegivenheden i AOP. Blanding : En blanding eller opløsning, der er sammensat af to eller flere stoffer, hvori de ikke reagerer (1). Stof med kun en bestanddel : Et stof, der defineres af dets mængdemæssige sammensætning, hvori en hovedbestanddel udgør mindst 80 % (vægt/vægt). Stof med flere bestanddele : Et stof, der defineres af dets mængdemæssige sammensætning, hvori flere end en hovedbestanddel er til stede i en koncentration på ≥ 10 % (vægt/vægt) og < 80 % (vægt/vægt). Et stof, der består af flere forskellige bestanddele, er resultatet af en fremstillingsproces. Forskellen mellem en blanding og et stof med forskellige bestanddele er, at blandingen er fremstillet ved blanding af to eller flere stoffer uden kemisk reaktion. Et stof, der består af flere forskellige bestanddele, er resultatet af en kemisk reaktion. Positiv kontrol : Et replikat, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem og er behandlet med et stof, som vides at inducere en positiv respons. For at sikre at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør den positive respons ikke være overdrevent stor. Referencekontrol : En ubehandlet prøve, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem, herunder opløsningsmidlet eller bærestoffet, og som behandles sammen med de testkemikaliebehandlede prøver og andre kontrolprøver for at fastlægge basisresponsen for de prøver, som er behandlet med testkemikaliet opløst i det samme opløsningsmiddel eller bærestof. Når denne prøve testes med en samtidig negativ kontrol, viser den også, hvorvidt opløsningsmidlet eller bærestoffet interagerer med testsystemet. Relevans : Beskrivelse af sammenhængen mellem testen og den pågældende virkning og dens meningsfuldhed og brugbarhed til et bestemt formål. Det angives, i hvilket omfang testen måler eller forudsiger den pågældende biologiske virkning korrekt. Forsøgsmetodens nøjagtighed (konkordans) indgår i vurderingen af dens relevans (21). Pålidelighed : Mål for, i hvilken grad en forsøgsmetode kan udføres reproducerbart i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier og repeterbarhed inden for laboratorier (21). Reproducerbarhed : Overensstemmelse mellem resultater af test af samme kemikalie med samme testprotokol (21). Følsomhed : Andelen af alle positive/aktive kemikalier, der klassificeres korrekt ved forsøgsmetoden. Det er et mål for nøjagtigheden af en forsøgsmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en forsøgsmetodes relevans (21). Specificitet : Andelen af alle negative/inaktive kemikalier, der klassificeres korrekt ved forsøgsmetoden. Det er et mål for nøjagtigheden af en forsøgsmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en forsøgsmetodes relevans (21). Stof : Grundstoffer og forbindelser heraf, naturlige eller industrielt fremstillede, indeholdende sådanne tilsætningsstoffer, som er nødvendige til bevarelse af stoffets stabilitet, og sådanne urenheder, som følger af fremstillingsprocessen, bortset fra opløsningsmidler, som kan udskilles, uden at det påvirker stoffets stabilitet eller ændrer dets sammensætning (1). Systemets egnethed : Bestemmelse af instrumentets funktionsdygtighed (f.eks. følsomhed) ved analyse af en referencestandard, før analyse-batchen køres (22). Testkemikalie : Betegnelsen »testkemikalie« henviser til det, der bliver testet. De Forenede Nationers globalt harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals — UN GHS) : Et system til klassificering af kemikalier (stoffer og blandinger) efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare med tilhørende kommunikationselementer såsom piktogrammer, signalord, risikosætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om kemikaliernes skadelige virkninger kan videreformidles med henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportører, forbrugere og redningspersonel) og miljø (1). UVCB : Stoffer med ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter eller biologiske materialer. Gyldig forsøgsmetode : En forsøgsmetode, der anses for at være tilstrækkeligt relevant og pålidelig til et bestemt formål, og som er baseret på videnskabeligt forsvarlige principper. En forsøgsmetode har aldrig absolut gyldighed, men kun i forbindelse med et bestemt formål (21). Tillæg 2 KOMPETENCESTOFFER In chemico-hudsensibilisering: Direkte peptidreaktivitetsassay (DPRA) Før rutinemæssig brug af denne forsøgsmetode, bør laboratorierne godtgøre deres tekniske kompetence ved at opnå den forventede DPRA-forudsigelse på korrekt vis for de 10 kompetencestoffer, der anbefales i tabel 1, og ved at opnå cystein- og lysin-nedbrydningsværdier, der falder ind under de respektive referenceområder for 8 ud af de 10 kompetencestoffer for hvert peptid. Disse kompetencestoffer er udvalgt således, at de repræsenterer responsområdet for hudsensibiliseringsfare. Andre udvælgelseskriterier er, at stofferne er kommercielt tilgængelige, at der foreligger in vivo-referencedata af høj kvalitet og in vitro-data af høj kvalitet, der er genereret med DPRA, og at de blev anvendt i den EURL ECVAM-koordinerede valideringsundersøgelse til at påvise en vellykket gennemførelse af forsøgsmetoden i de laboratorier, der deltog i undersøgelsen. Tabel 1 Anbefalede kompetencestoffer til dokumentation af teknisk kompetence i det direkte peptidreaktivitetsassay Kompetencestoffer CASRN Fysisk form In vivo-forudsigelse (24) DPRA-forudsigelse (25) Interval (26) af procentvis cysteinpeptidnedbrydning Interval (26) af procentvis lysinpeptid nedbrydning 2,4-dinitrochlorbenzen 97-00-7 Fast Sensibiliserende stof (ekstrem) Positiv 90-100 15-45 Oxazolon 15646-46-5 Fast Sensibiliserende stof (ekstrem) Positiv 60-80 10-55 Formaldehyd 50-00-0 Flydende Sensibiliserende stof (stærk) Positiv 30-60 0-24 Benzylidenacetone 122-57-6 Fast Sensibiliserende stof (moderat) Positiv 80-100 0-7 Farnesal 19317-11-4 Flydende Sensibiliserende stof (svag) Positiv 15-55 0-25 2,3-butanedion 431-03-8 Flydende Sensibiliserende stof (svag) Positiv 60-100 10-45 1-butanol 71-36-3 Flydende Ikke-sensibiliserende stof Negativ 0-7 0-5,5 6-methylcoumarin 92-48-8 Fast Ikke-sensibiliserende stof Negativ 0-7 0-5,5 Mælkesyre 50-21-5 Flydende Ikke-sensibiliserende stof Negativ 0-7 0-5,5 4-methoxyacetophenon 100-06-1 Fast Ikke-sensibiliserende stof Negativ 0-7 0-5,5 Tillæg 3 EKSEMPLER PÅ ANALYSESEKVENSER Kalibreringsstandarder og referencekontroller STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 Fortyndingsbuffer Referencekontrol A, rep 1 Referencekontrol A, rep 2 Referencekontrol A, rep 3 Co-elueringskontroller Co-elueringskontrol 1 for testkemikalie 1 Co-elueringskontrol 2 for testkemikalie 2 Referencekontroller Referencekontrol B, rep 1 Referencekontrol B, rep 2 Referencekontrol B, rep 3 Første sæt replikater Referencekontrol C, rep 1 Kanelaldehyd, rep 1 Prøve 1, rep 1 Prøve 2, rep 1 Andet sæt replikater Referencekontrol C, rep 2 Kanelaldehyd, rep 2 Prøve 1, rep 2 Prøve 2, rep 2 Tredje sæt replikater Referencekontrol C, rep 3 Kanelaldehyd, rep 3 Prøve 1, rep 3 Prøve 2, rep 3 Referencekontroller Referencekontrol B, rep 4 Referencekontrol B, rep 5 Referencekontrol B, rep 6 Tre sæt referencekontroller (dvs. prøver, som udelukkende består af peptidet opløst i et passende opløsningsmiddel) bør indgå i analysesekvensen: Referencekontrol A: anvendes til at kontrollere HPLC-systemets egnethed. Referencekontrol B: indgår i begyndelsen og slutningen af analysesekvensen for at kontrollere stabiliteten af referencekontrollerne i løbet af analysen. Referencekontrol C: indgår i analysesekvensen for at kontrollere, at det opløsningsmiddel, der anvendes til at opløse testkemikaliet, ikke påvirker den procentvise peptidnedbrydning. B.60 In vitro-hudsensibilisering: ARE-Nrf2-luciferase-forsøgsmetoden INDLEDNING Denne forsøgsmetode svarer til OECD's testvejledning (Test Guideline (TG)) 442D (2015). Et hudsensibiliserende stof er et stof, der fremkalder en allergisk reaktion ved hudkontakt som defineret ved De Forenede Nationers globalt harmoniserede system til klassificering og mærkning af kemikalier (UN GHS) (1) og forordning (EF) nr. 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (CLP-forordningen) (27). Denne forsøgsmetode indeholder en in vitro-procedure (ARE-Nrf2-luciferase-assayet), der anvendes til at underbygge sondringen mellem hudsensibiliserende og ikke-hudsensibiliserende stoffer i henhold til FN's GHS (1) og CLP. Der hersker almindelig enighed om de centrale biologiske begivenheder, som ligger til grund for hudsensibilisering. Den nuværende viden om kemiske og biologiske mekanismer i forbindelse med hudsensibilisering er sammenfattet i form af en Adverse Outcome Pathway (AOP) (2), fra den molekylære udløsende begivenhed gennem de mellemliggende begivenheder til den skadelige sundhedsvirkning, dvs. allergisk kontaktdermatitis hos mennesker eller kontaktoverfølsomhed hos gnavere (2) (3). Den molekylære udløsende begivenhed er den kovalente binding af elektrofile stoffer til nukleofile centre i hudproteiner. Den anden centrale begivenhed i denne AOP finder sted i keratinocytter og omfatter inflammatoriske reaktioner samt genekspression forbundet med specifikke cellesignalveje, f.eks. antioxidant-/elektrofilresponselement- (ARE) afhængige veje. Den tredje centrale begivenhed er aktivering af dendritiske celler, som typisk vurderes ved ekspression af bestemte celleoverflademarkører, kemokiner og cytokiner. Den fjerde centrale begivenhed er T-celleproliferation, som vurderes indirekte ved assayet på lokale lymfeknuder i mus (4). Vurderingen af hudsensibilisering har typisk omfattet brug af laboratoriedyr. Med de klassiske metoder baseret på marsvin, Guinea Pig Maximisation Test (GPMT) og Buehler-testen (TM B.6 (5)) undersøger man både induktions- og udløsningsfasen ved hudsensibilisering. En musetest, assayet på lokale lymfeknuder (LLNA, TM B.42 (4)), og dens to ikke-radioaktive ændringer, LLNA: DA (TM B.50 (6)) og LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51 (7)), som alle udelukkende vurderer induktionsresponsen, er også blevet accepteret, eftersom de indebærer en fordel i forhold til marsvinetest både, hvad angår dyrevelfærd og objektiv måling af induktionsfasen for hudsensibilisering. På det seneste har man anset mekanistisk baserede in chemico- og in vitro-forsøgsmetoder for videnskabeligt valide til evaluering af kemikaliers hudsensibiliseringsfare. Men der vil være behov for kombinationer af metoder uden brug af dyr (in silico, in chemico, in vitro) inden for integrerede tilgange til afprøvning og vurdering (IATA) for fuldt ud at kunne erstatte de dyreforsøg, der anvendes i øjeblikket, i lyset af den begrænsede AOP-mekanistiske dækning af hver af de aktuelt tilgængelige forsøgsmetoder uden brug af dyr (2) (3). Denne forsøgsmetode (ARE-Nrf2-luciferase-assay) foreslås i forbindelse med den anden centrale begivenhed som forklaret i punkt 2. Der foreligger rapporter om, at hudsensibiliserende stoffer har medført gener, der reguleres af antioxidantresponselementet (ARE) (8) (9). Små elektrofile stoffer såsom hudsensibiliserende stoffer kan påvirke sensorproteinet Keap1 (Kelch-lignende SSG-associeret protein 1), f.eks. ved kovalent modifikation af cysteinrestkoncentrationen, hvilket fører til dissociering fra transskriptionsfaktoren Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2). Den dissocierede Nrf2 kan herefter aktivere ARE-afhængige gener såsom dem, der koder for fase II-detoxificerende enzymer (8) (10) (11). I øjeblikket er det eneste in vitro-Nrf2-luciferase-assay, der er omfattet af denne forsøgsmetode, KeratinoSensTM-assayet, for hvilket man har gennemført valideringsundersøgelser (9) (12) (13) efterfulgt af en uafhængig peer review foretaget af Den Europæiske Unions referencelaboratorium for alternativer til dyreforsøg (EURL ECVAM) (14). KeratinoSensTM-assayet blev betragtet som videnskabeligt validt til at kunne bruges som en del af en IATA til at underbygge sondringen mellem hudsensibiliserende og ikke-hudsensibiliserende stoffer med henblik på fareklassificering og -mærkning (14). Laboratorier, som er villige til at anvende forsøgsmetoden, kan erhverve den rekombinante cellelinje, der anvendes i KeratinoSensTM-assayet, ved at indgå en licensaftale med udvikleren af forsøgsmetoden (15). Definitioner findes i tillæg 1. INDLEDENDE OVERVEJELSER, ANVENDELSE OG BEGRÆNSNINGER Eftersom aktivering af Keap1-Nrf2-ARE-vejen udelukkende vedrører den anden centrale begivenhed i hudsensibiliserings-AOP'en, er det usandsynligt, at oplysninger om forsøgsmetoder baseret på aktiveringen af denne vej alene er tilstrækkelige til at kunne konkludere noget om kemikaliers hudsensibiliseringspotentiale. Derfor bør data genereret med denne forsøgsmetode ses i sammenhæng med integrerede tilgange, såsom IATA, idet de kombineres med andre supplerende oplysninger, f.eks. hidrørende fra in vitro-assays vedrørende andre vigtige begivenheder for hudsensibiliserings-AOP'en samt ikke-forsøgsmetoder, herunder analogislutning fra analoge kemikalier. I litteraturen findes der eksempler på, hvordan man kan bruge ARE-Nrf2-luciferase-forsøgsmetoden sammen med andre oplysninger (13) (16) (17) (18) (19). Denne forsøgsmetode kan bruges til at understøtte sondringen mellem hudsensibiliserende (dvs. UN GHS/CLP-kategori 1) og ikke-hudsensibiliserende stoffer i forbindelse med IATA. Denne forsøgsmetode kan ikke anvendes alene, hverken til at kategorisere hudsensibiliserende stoffer i underkategori 1A og 1B som defineret i UN GHS/CLP eller til at forudsige styrken i forbindelse med beslutninger om sikkerhedsvurdering. Afhængigt af lovrammen kan et positivt resultat imidlertid anvendes alene til at klassificere et kemikalie i UN GHS/CLP-kategori 1. På baggrund af datasættet fra valideringsundersøgelsen og interne test i forbindelse med den uafhængige peer review af forsøgsmetoden viste KeratinoSensTM-assayet sig at kunne overføres til laboratorier med erfaring i cellekulturer. Graden af reproducerbarhed i de forudsigelser, der kan forventes fra forsøgsmetoden, ligger i størrelsesordenen 85 % inden for og mellem laboratorier (14). Nøjagtigheden (77 % — 155/201), følsomheden (78 % — 71/91) og specificiteten (76 % — 84/110) af KeratinoSensTM-assayet til sondring mellem hudsensibiliserende (dvs. UN GHS/CLP-kategori 1) og ikke-hudsensibiliserende stoffer sammenlignet med LLNA-resultaterne blev beregnet ved at benytte alle de data, der blev rapporteret til EURL ECVAM med henblik på evaluering og peer review af forsøgsmetoden (14). Disse tal svarer til de nyligt offentliggjorte tal baseret på interne test af ca. 145 stoffer (77 % nøjagtighed, 79 % følsomhed, 72 % specificitet) (13). Det er mere sandsynligt, at KeratinoSensTM-assayet vil føre til for lave forudsigelser for kemiske stoffer med lav til moderat hudsensibiliserende styrke (dvs. UN GHS/CLP-underkategori 1B) i forhold til kemikalier med høj hudsensibiliserende styrke (dvs. UN GHS/CLP-underkategori 1A) (13) (14). Samlet set viser disse oplysninger nytteværdien af KeratinoSensTM-assayet som bidrag til identifikation af hudsensibiliseringsfare. De nøjagtige værdier, der her angives for KeratinoSensTM-assayet som en selvstændig forsøgsmetode, er imidlertid kun vejledende, da forsøgsmetoden bør overvejes i kombination med andre informationskilder i forbindelse med en IATA og i overensstemmelse med bestemmelserne i punkt 9 ovenfor. I forbindelse med vurderingen af metoder til hudsensibilisering uden brug af dyr bør man desuden holde sig for øje, at LLNA samt andre dyreforsøg ikke fuldt ud afspejler situationen hos arten af interesse, dvs. mennesker. Betegnelsen “testkemikalie” anvendes i denne forsøgsmetode om det, der testes, og vedrører ikke anvendeligheden af ARE-Nrf2-luciferase-forsøgsmetoden til test af stoffer og/eller blandinger. På grundlag af de nuværende tilgængelige data viste KeratinoSensTM-assayet sig at være relevant for testkemikalier, der dækker en række forskellige organiske funktionelle grupper, reaktionsmekanismer, hudsensibiliseringsstyrke (som fastlagt ved in vivo-undersøgelser) og fysisk-kemiske egenskaber (9) (12) (13) (14). Man testede hovedsagelig stoffer med en enkelt bestanddel, men der findes også en begrænset mængde data om test af blandinger (20). Forsøgsmetoden kan ikke desto mindre teknisk set benyttes til stoffer med forskellige bestanddele og blandinger. Før brug af denne forsøgsmetode til lovmæssig test af en blanding til generering af data bør det imidlertid overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor. Sådanne overvejelser er ikke nødvendige, når der foreligger et myndighedskrav om test af blandingen. Ved test af stoffer med flere bestanddele eller blandinger bør der desuden tages hensyn til cytotoksiske bestanddeles eventuelle interferens med de observerede responser. Forsøgsmetoden gælder opløselige testkemikalier eller testkemikalier, der danner en stabil dispersion (dvs. en kolloid eller en suspension, hvor testkemikaliet ikke bundfældes eller separeres fra opløsningsmidlet i forskellige faser), enten i vand eller DMSO (herunder alle bestanddele af testkemikaliet ved test af et stof med forskellige bestanddele eller en blanding). Testkemikalier, der ikke opfylder disse betingelser ved den højeste krævede slutkoncentration på 2 000 μM (jf. punkt 22), kan stadig testes ved lavere koncentrationer. I så fald kan resultater, der opfylder kriterierne for positivitet som beskrevet i punkt 39, stadig anvendes til at hjælpe med bestemmelsen af testkemikaliet som hudsensibiliserende, mens et negativt resultat, der er opnået med koncentrationer < 1 000 μM, bør betragtes som usikkert (se forudsigelsesmodellen i afsnit 39). Generelt vil stoffer med en LogP på op til 5 være testet med succes, mens ekstremt hydrofobe stoffer med en LogP over 7 ligger uden for forsøgsmetodens kendte anvendelsesområde (14). For stoffer med en LogP på mellem 5 og 7 foreligger der kun begrænsede oplysninger. Negative resultater bør fortolkes med forsigtighed, da stoffer med en eksklusiv reaktivitet over for lysinrester kan identificeres som negative med forsøgsmetoden. På grund af den anvendte cellelinjes begrænsede metaboliske kapacitet (21) og på grund af forsøgsbetingelserne kan pro-haptener (dvs. kemikalier, der kræver enzymatisk aktivering f.eks. via P450-enzymer) og haptener (dvs. kemikalier, der aktiveres ved selvoxidering), især med en langsom oxideringsgrad, også give negative resultater. Testkemikalier, der ikke virker sensibiliserende, men som ikke desto mindre er kemiske stressstoffer, kan på den anden side give falsk positive resultater (14). Desuden er det ikke altid muligt at foretage en pålidelig vurdering af stærkt cytotoksiske testkemikalier. Endelig kan testkemikalier, der reagerer med luciferaseenzymet, forstyrre luciferasens aktivitet i cellebaserede assays og forårsage enten synlig hæmning eller øget luminescens (22). Eksempelvis findes der rapporter om, at fytoøstrogenkoncentrationer på over 1 μM forstyrrede luminescenssignalerne i andre luciferasebaserede reportergenassays på grund af overaktivering af luciferasereportergenet (23). Som følge heraf skal den luciferaseekspression, som er opnået ved høje koncentrationer af fytoøstrogener eller lignende kemiske stoffer, der mistænkes for at forårsage fytoøstrogenlignende overaktivering af luciferasereportergenet, undersøges nøje (23). I de tilfælde, hvor det kan påvises, at forsøgsmetoden ikke er anvendelig til andre specifikke kategorier af testkemikalier, bør forsøgsmetoden ikke anvendes til disse kategorier. Ud over at bidrage til sondringen mellem hudsensibiliserende og ikke-hudsensibiliserende stoffer leverer KeratinoSensTM-assayet også oplysninger om koncentrationsrespons, der muligvis kan bidrage til vurderingen af sensibiliseringsstyrken ved anvendelse i integrerede metoder såsom IATA (19). Der er dog behov for yderligere arbejde, som fortrinsvis bør baseres på pålidelige data om mennesker, for at fastslå, hvordan resultaterne af KeratinoSensTM-assayet kan bidrage til styrkevurderingen (24) og til placering af sensibiliserende stoffer i underkategorier i henhold til UN GHS/CLP. PRINCIP FOR TESTEN Til ARE-Nrf2-luciferase-forsøgsmetoden anvendes en udødeliggjort vedhæftende cellelinje, der er afledt af humane HaCaT-keratinocytter, som er stabilt transfekteret med et valgbart plasmid. Cellelinjen indeholder luciferasegenet under transskriptionskontrollen for en konstitutiv promotor, der er sammensmeltet med et ARE-element, som vides at blive opreguleret af kontaktsensibiliserende stoffer (25) (26). Luciferasesignalet afspejler de sensibiliserende stoffers aktivering af endogene Nrf2-afhængige gener, og afhængigheden af luciferasesignalet i den rekombinante cellelinje på Nrf2 er blevet dokumenteret (27). Dette giver mulighed for kvantitativ måling (ved luminescensdetektion) af luciferasegeninduktion ved hjælp af veldokumenterede lysproducerende luciferasesubstrater som en indikator for Nrf2-transskriptionsfaktorens aktivitet i celler efter eksponering for elektrofile stoffer. Testkemikalierne anses for positive i KeratinoSensTM-assayet, hvis de forårsager en statistisk signifikant induktion af luciferaseaktiviteten over en bestemt tærskel (dvs. > 1,5 gange eller 50 % stigning) under en bestemt koncentration, som ikke i væsentlig grad påvirker cellernes levedygtighed (dvs. under 1 000 μM og i en koncentration, hvor cellernes levedygtighed er på over 70 % (9) (12)). Med henblik herpå bestemmes den maksimale foldinduktion af luciferaseaktiviteten over opløsningsmiddelkontrollen (den negative kontrol) (Imax). Da cellerne udsættes for serier af koncentrationer af testkemikalierne, skal den nødvendige koncentration for en statistisk signifikant induktion af luciferaseaktivitet over tærsklen (dvs. EF1,5-værdi) interpoleres fra dosis/respons-kurven (se punkt 32 for beregninger). Endelig bør der foretages parallelle målinger af cytotoksicitet for at vurdere, om niveauerne for induktion af luciferaseaktivitet forekommer ved subcytotoksiske koncentrationer. Før rutinemæssig brug af ARE-Nrf2-luciferase-assayet, der hører til denne forsøgsmetode, bør laboratorierne godtgøre deres tekniske kompetence ved hjælp af de 10 kompetencestoffer, der findes opført i tillæg 2. Der stilles ydeevnestandarder (28) til rådighed for at lette valideringen af nye eller ændrede in vitro-Nrf2-luciferase-forsøgsmetoder svarende til KeratinoSensTM-assayet, og de gør det muligt at ændre denne forsøgsmetode i tide, så de kan medtages. Gensidig anerkendelse af data i henhold til OECD-aftalen vil kun være garanteret for forsøgsmetoder, der er valideret i henhold til ydeevnestandarderne, hvis disse forsøgsmetoder er gennemgået og medtaget i OECD's tilhørende testvejledning. FREMGANGSMÅDE I øjeblikket er den eneste metode, der er omfattet af denne forsøgsmetode, det videnskabeligt validerede KeratinoSensTM-assay (9) (12) (13) (14). Standardprocedurer for KeratinoSensTM-assayet er tilgængelige og bør anvendes ved gennemførelse og brug af metoden i laboratoriet (15). Laboratorier, som er villige til at anvende forsøgsmetoden, kan erhverve den rekombinante cellelinje, der anvendes i KeratinoSensTM-assayet, ved at indgå en licensaftale med udvikleren af forsøgsmetoden. Følgende afsnit indeholder en beskrivelse af de vigtigste komponenter og procedurer i Nrf2-luciferase-forsøgsmetoden. Fremstilling af keratinocytkulturerne Der bør anvendes en transgen cellelinje med stabil indsættelse af luciferase-reportergenet, der kontrolleres af ARE-elementet (f.eks. KeratinoSensTM-cellelinjen). Ved modtagelsen opformeres cellerne (f.eks. 2-4 generationer) og opbevares frosne som en homogen stamme. Celler fra den oprindelige stamme kan opformeres til det maksimale antal generationer (dvs. 25 for KeratinoSensTM) og anvendes til rutinetest under anvendelse af det relevante opbevaringsmedium (for KeratinoSensTM er der tale om DMEM indeholdende serum og Geneticin). Ved testen bør cellerne være 80-90 % sammenflydende, og det bør sikres, at cellerne aldrig er fuldkommen sammenflydende. En dag inden testen høstes cellerne og fordeles i plader med 96 brønde (10 000 celler/brønd for KeratinoSensTM). Man bør være opmærksom på at undgå sedimentering af cellerne under udsåningen, så der sikres en ensartet fordeling af cellerne i brøndene. I modsat fald kan dette trin medføre stor variation fra brønd til brønd. For hver gentagelse anvendes tre replikater til måling af luciferaseaktivitet, mens et parallelt replikat bruges til cellelevedygtighedsassayet. Præparering af testkemikalie og kontrolstoffer Testkemikaliet og kontrolstofferne præpares på dagen for testen. For KeratinoSensTM-assayet opløses testkemikalierne i dimethylsulfoxid (DMSO) til den ønskede slutkoncentration (f.eks. 200 mM). DMSO-opløsninger kan betragtes som selvsteriliserende, og der er således ikke behov for steril filtrering. Testkemikalier, der ikke er opløselige i DMSO, opløses i sterilt vand eller dyrkningsmedium, og opløsningerne steriliseres ved f.eks. filtrering. For et testkemikalie, som ikke har nogen defineret molekylvægt, fremstilles der en stamopløsning i en standardkoncentration (40 mg/ml eller 4 % (vægt/volumen)) i KeratinoSensTM-assayet. Hvis der benyttes andre opløsningsmidler end DMSO, vand eller dyrkningsmedium, bør der fremlægges en tilstrækkelig videnskabelig begrundelse for dette. Baseret på DMSO-stamopløsninger af testkemikaliet foretages der seriefortyndinger med DMSO for at opnå 12 master-koncentrationer af det kemikalie, der skal testes (fra 0,098 til 200 mM i KeratinoSensTM-assayet). For et testkemikalie, der ikke er opløseligt i DMSO, foretages fortyndingerne for at opnå master-koncentrationerne med sterilt vand eller sterilt dyrkningsmedium. Uafhængigt af det anvendte opløsningsmiddel fortyndes skal master-koncentrationerne herefter fortyndes yderligere 25 gange i dyrkningsmedium indeholdende serum og endelig bruges til behandling med en yderligere fortyndingsfaktor på 4 gange, så slutkoncentrationen af testkemikaliet varierer fra 0,98 til 2 000 μM i KeratinoSensTM-assayet. Alternative koncentrationer kan bruges, hvis det er begrundet (f.eks. i tilfælde af cytotoksicitet eller dårlig opløselighed). Den negative kontrol (opløsningsmiddelkontrollen), der anvendes i KeratinoSensTM-assayet, er DMSO (CAS-nr. 67-68-5, ≥ 99 % renhed), hvortil der præpareres seks brønde pr. plade. Der foretages samme fortynding som beskrevet for master-koncentrationerne i punkt 22, således at slutkoncentrationen i den negative kontrol (opløsningsmiddelkontrollen) er 1 %, der vides ikke at påvirke cellernes levedygtighed, og som svarer til samme DMSO-koncentration som i testkemikaliet og i den positive kontrol. For et testkemikalie, der ikke er opløseligt i DMSO, og hvor fortyndingerne er foretaget i vand, skal DMSO-niveauet for den endelige testopløsning i alle brønde justeres til 1 % som for de øvrige testkemikalier og kontrolstoffer. Den positive kontrol, der bruges i KeratinoSensTMassayet, er kanelaldehyd (CAS-nr. 14371-10-9, ≥ 98 % renhed), hvor der fremstilles en serie på fem master-koncentrationer fra 0,4 til 6,4 mM i DMSO (fra en 6,4 mM stamopløsning), der fortyndes som beskrevet for master-koncentrationer i punkt 22, således at slutkoncentrationen af den positive kontrol går fra 4 til 64 μM. Andre egnede positive kontroller, helst med EC1,5-værdier i mellemområdet, anvendes, hvis der foreligger historiske data, som kan anvendes til at udlede sammenlignelige acceptkriterier for kørsel. Påføring af testkemikalier og kontrolstoffer For hvert testkemikalie og positive kontrolstof kræves der et forsøg for at udlede en forudsigelse (positiv eller negativ), der består af mindst to uafhængige gentagelser med hver tre replikater (dvs. n=6). I tilfælde af modstridende resultater for de to uafhængige gentagelser bør der udføres en tredje gentagelse med tre replikater (dvs. n=9). Hver selvstændig gentagelse udføres på en anden dag med en frisk stamopløsning af testkemikalier og uafhængigt høstede celler. Cellerne kan imidlertid komme fra den samme generation. Efter podning som beskrevet i punkt 20 dyrkes cellerne i 24 timer i mikrotiterplader med 96 brønde. Herefter fjernes mediet og erstattes af frisk dyrkningsmedium (150 μl dyrkningsmedium med serum, men uden Geneticin for KeratinoSensTM), hvortil der tilsættes 50 μl af det 25 gange fortyndede testkemikalie og kontrolstofferne. Mindst en brønd pr. plade bør være tom (ingen celler og ingen behandling) for at gøre det muligt at vurdere baggrundsværdierne. De behandlede plader inkuberes derefter i ca. 48 timer ved 37 ± 1 °C under tilstedeværelse af 5 % CO2 i KeratinoSensTM-assayet. Der bør træffes forholdsregler for at undgå, at flygtige testkemikalier fordamper, og for at undgå krydskontaminering med testkemikalier mellem brøndene, f.eks. ved at dække pladerne med en folie inden inkubering med testkemikalierne. Målinger af luciferaseaktivitet Tre faktorer er afgørende for at sikre relevante luminescensaflæsninger: — valg af et følsomt luminometer — brug af et pladeformat med tilstrækkelig højde til at undgå krydskontaminering med lys og — brug af et luciferasesubstrat med tilstrækkelig lysvirkning til at sikre tilstrækkelig følsomhed og lav variabilitet. Inden testen udføres der et kontrolforsøg med opsætningen som beskrevet i tillæg 3 for at sikre, at disse tre punkter er opfyldt. Efter 48 timers eksponering med testkemikaliet og kontrolstofferne i KeratinoSensTM-assayet vaskes cellerne med fosfatbufferet saltopløsning, og den relevante lysisbuffer for luminescensaflæsninger tilsættes hver brønd i 20 min. ved stuetemperatur. Plader med cellelysat placeres derefter i luminometeret til aflæsning, som i KeratinoSensTM-assayet er programmeret til at: i) tilsætte luciferasesubstrat til hver brønd (dvs. 50 μl), ii) vente 1 sekund og iii) integrere luciferaseaktiviteten i 2 sekunder. Hvis man anvender alternative indstillinger, f.eks. som følge af den anvendte luminometermodel, bør dette begrundes. Desuden kan man benytte et lyssubstrat, forudsat at kvalitetskontrolforsøget i tillæg 3 er lykkedes. Vurdering af cytotoksicitet For KeratinoSensTM-assayet for cellelevedygtighed udskiftes mediet efter 48 timers eksponering med frisk medium med MTT [ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt tetrazolium-bromid, CAS-nr. 298-93-1), og cellerne inkuberes i 4 timer ved 37 °C under tilstedeværelse af 5 % CO2. Herefter fjernes MTT-mediet, og cellerne lyseres (f.eks. ved tilsætning af 10 % SDS-opløsning til hver brønd) natten over. Efter omrystning måles absorptionen ved f.eks. 600 nm med et fotometer. DATA OG RAPPORTERING Dataevaluering Følgende parametre beregnes i KeratinoSensTM-assayet: — den maksimale gennemsnitlige foldinduktion af luciferaseaktivitet (Imax), der er observeret ved en hvilken som helst koncentration af testkemikaliet og den positive kontrol — EC1,5-værdien, der repræsenterer den koncentration, hvor en induktion af luciferaseaktiviteten på over tærsklen på 1,5 fold (dvs. 50 % større luciferaseaktivitet) blev opnået — IC50- og IC30-koncentrationsværdierne for 50 % og 30 % reduktion af cellelevedygtigheden. — Foldinduktionen af luciferaseaktiviteten beregnes ved hjælp af ligning 1, og den samlede maksimale foldinduktion (Imax) beregnes som et gennemsnit af de enkelte gentagelser. Ligning 1: hvor Lsample er luminescensaflæsningen i brønden med testkemikaliet Lblank er luminescensaflæsningen i brønden med blindprøven, der ikke indeholder celler og ikke er blevet behandlet Lsolvent er den gennemsnitlige luminescensaflæsning i brønde, der indeholder celler og opløsningsmiddelkontrol (negativ kontrol) EC1,5 beregnes ved lineær interpolation i henhold til ligning 2, og den samlede EC1,5 beregnes som det geometriske gennemsnit af de enkelte gentagelser. Ligning 2: hvor Ca er den laveste koncentration i μM med > 1,5 fold induktion Cb er den højeste koncentration i μM med < 1,5 fold induktion Ia er foldinduktionen målt ved den laveste koncentration med > 1,5 fold induktion (gennemsnit af tre replikatbrønde) Ib er foldinduktionen målt ved den højeste koncentration med < 1,5 fold induktion (gennemsnit af tre replikatbrønde) Levedygtigheden beregnes med ligning 3: Ligning 3: hvor Vsample er MTT-absorbansen i brønden med testkemikaliet Vblank er MTT-absorbansaflæsningen i brønden med blindprøven, der ikke indeholder celler og ikke er blevet behandlet Vsolvent er den gennemsnitlige MTT-absorbansaflæsning i brønde, der indeholder celler og opløsningsmiddelkontrol (negativ kontrol) IC50 og IC30 beregnes ved lineær interpolation i henhold til ligning 4, og den samlede IC50 og IC30 beregnes som det geometriske gennemsnit af de enkelte gentagelser. Ligning 4: hvor X er den procentvise reduktion i den koncentration, der skal beregnes (50 og 30 for IC50 og IC30) Ca er den laveste koncentration i μM med > x % reduktion af levedygtigheden Cb er den højeste koncentration i μM med < x % reduktion af levedygtigheden Va er den procentvise levedygtighed ved den laveste koncentration med > x % reduktion af levedygtigheden Vb er den procentvise levedygtighed ved den højeste koncentration med < x % reduktion af levedygtigheden For hver koncentration, der udviser > 1,5 foldinduktion af luciferaseaktivitet, beregnes den statistiske signifikans (f.eks. ved hjælp af den tohalede Student's t-test), hvor man sammenligner luminescensværdierne for de tre replikate prøver med luminescensværdierne i brøndene med opløsningsmiddelkontrollen (den negative kontrol) for at afgøre, hvorvidt induktionen af luciferaseaktivitet er statistisk signifikant (p < 0,05). Den laveste koncentration med > 1,5 fold induktion af luciferaseaktivitet er den værdi, der bestemmer EC1,5-værdien. Det undersøges i hvert enkelt tilfælde, om denne værdi er lavere end IC30-værdien, hvilket indikerer, at der er mindre end 30 % reduktion i cellelevedygtigheden ved den EC1,5-værdi, der fastlægger koncentrationen. Det anbefales, at data kontrolleres visuelt ved hjælp af grafer. Hvis der ikke kan konstateres nogen tydelig dosis/respons-kurve, eller dosis/respons-kurven er bifasisk (dvs. grænsen på 1,5 passeres to gange), bør forsøget gentages for at kontrollere, om dette er specifikt for testkemikaliet eller skyldes en eksperimentel artefakt. Hvis den bifasiske respons kan reproduceres ved et uafhængigt forsøg, bør den laveste EC1,5-værdi (koncentrationen, hvor grænsen på 1,5 krydses første gang) rapporteres. I de sjældne tilfælde, hvor en statistisk ikke-signifikant induktion over 1,5 fold observeres efterfulgt af en højere koncentration med en statistisk signifikant induktion, betragtes resultaterne af denne gentagelse kun som gyldige og positive, hvis den statistisk signifikante induktion over grænsen på 1,5 blev opnået for en ikke-cytotoksisk koncentration. Endelig gælder det for testkemikalier, der genererer en 1,5 fold induktion eller mere allerede ved den laveste testkoncentration på 0,98 μM, at EC1,5-værdien på < 0,98 fastsættes baseret på en visuel kontrol af dosis/respons-kurven. Acceptkriterier Følgende acceptkriterier bør være opfyldt ved brug af KeratinoSensTM-assayet. For det første bør den induktion af luciferaseaktivitet, der er opnået med den positive kontrol, kanelaldehyd, være statistisk signifikant over en tærskel på 1,5 (f.eks. ved hjælp af en t-test) i mindst en af de testede koncentrationer (fra 4 til 64 μM). For det andet bør EC1,5-værdien ligge inden for to standardafvigelser af det historiske gennemsnit for testfaciliteten (f.eks. mellem 7 μM og 30 μM baseret på valideringsdatasættet), der bør ajourføres regelmæssigt. Desuden bør den gennemsnitlige induktion i de tre replikater for kanelaldehyd på 64 μM være mellem 2 og 8. Hvis sidstnævnte kriterium ikke er opfyldt, bør dosisresponsen for kanelaldehyden kontrolleres nøje, og disse test må kun accepteres, hvis der er en tydelig dosisrespons med stigende induktion af luciferaseaktivitet ved stigende koncentrationer af den positive kontrol. Endelig bør den gennemsnitlige variationskoefficient for luminescensaflæsningen af DMSO for den negative kontrol (opløsningsmiddelkontrollen) være under 20 % i hver gentagelse bestående af seks brønde testet i tre eksemplarer. Hvis variationen er højere, bør resultaterne kasseres. Fortolkning af resultater og forudsigelsesmodel En KeratinoSensTM-forudsigelse anses for positiv, hvis følgende fire betingelser alle er opfyldt i to ud af to eller i de samme to ud af tre gentagelser; ellers betragtes KeratinoSensTM-forudsigelsen som negativ (figur 1): 1. Imax er større end (>) 1,5 fold og med statistisk signifikant forskellighed sammenlignet med opløsningsmiddelkontrollen (den negative kontrol) (som blev bestemt med den tohalede uparrede Student's t-test). 2. Cellernes levedygtighed er større end (>) 70 % ved den laveste koncentration med induktion af luciferaseaktivitet over 1,5 fold (dvs. ved den EC1,5-fastsættende koncentration). 3. EC1,5-værdien er mindre end (<) 1 000 μM (eller < 200 μg/ml for testkemikalier uden defineret molekylvægt). 4. Der findes en tilsyneladende generel dosisrespons for luciferaseinduktion (eller en bifasisk respons som nævnt i punkt 33). Hvis alle de tre første betingelser er opfyldt i en given gentagelse, men der ikke kan observeres en klar dosisrespons for luciferaseinduktionen, bør resultatet af den pågældende gentagelse betragtes som usikkert, og der kan være behov for yderligere undersøgelser (figur 1). Desuden bør et negativt resultat opnået med koncentrationer < 1 000 μM (eller < 200 μg/ml for testkemikalier uden defineret molekylvægt) også betragtes som usikkert (jf. punkt 11). Figur 1 Forudsigelsesmodel, der anvendes i KeratinoSensTM-assayet. En KeratinoSensTM-forudsigelse bør overvejes inden for rammerne af en IATA og i overensstemmelse med bestemmelserne i punkt 9 og 11. I sjældne tilfælde kan testkemikalier, der inducerer luciferaseaktivitet meget tæt på de cytotoksiske niveauer, være positive i nogle gentagelser ved ikke-cytotoksiske niveauer (dvs. ved EC1,5-bestemmende koncentrationer under (<) IC30), og i andre gentagelser kun ved cytotoksiske niveauer (dvs. ved EC1,5-bestemmende koncentrationer over (>) IC30). Sådanne testkemikalier testes på ny med en smallere dosisresponsanalyse under anvendelse af en lavere fortyndingsfaktor (f.eks. en 1,33 eller √2 (= 1,41) fold fortynding mellem brøndene) for at fastslå, om induktionen har fundet sted ved cytotoksiske niveauer eller ej (9). Testrapport Testrapporten bør indeholde følgende oplysninger: Testkemikalie — Stof med kun en bestanddel — kemisk identifikation, f.eks. IUPAC- eller CAS-navn(e), CAS-nummer/numre, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel og/eller andre identifikatorer — fysisk udseende, vandopløselighed, DMSO-opløselighed, molekylvægt og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber i den udstrækning, det er muligt — renhed, kemisk identitet af urenheder i det omfang, det er relevant og praktisk muligt osv. — eventuel behandling inden testen (f.eks. opvarmning, formaling) — testede koncentrationer — opbevaring og stabilitet i det omfang, det er muligt. — Stof med flere bestanddele, UVCB-stoffer og blandinger: — kendetegnet så vidt muligt ved f.eks. kemisk identitet (jf. ovenfor), renhed, kvantitativ forekomst og bestanddelenes relevante fysisk-kemiske egenskaber (jf. ovenfor) i det omfang, det er muligt — fysisk udseende, vandopløselighed, DMSO-opløselighed og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber i den udstrækning, det er muligt — molekylvægt eller tilsyneladende molekylvægt i tilfælde af blandinger/polymerer med kendt sammensætning eller andre oplysninger, der er relevante for undersøgelsens gennemførelse — eventuel behandling inden testen (f.eks. opvarmning, formaling) — testede koncentrationer — opbevaring og stabilitet i det omfang, det er muligt. Kontroller — Positiv kontrol — kemisk identifikation, f.eks. IUPAC- eller CAS-navn(e), CAS-nummer/numre, SMILES- eller InChI-kode, strukturformel og/eller andre identifikatorer — fysisk udseende, vandopløselighed, DMSO-opløselighed, molekylvægt og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber i den udstrækning, det er muligt og relevant — renhed, kemisk identitet af urenheder i det omfang, det er relevant og praktisk muligt osv. — eventuel behandling inden testen (f.eks. opvarmning, formaling) — testede koncentrationer — opbevaring og stabilitet i det omfang, det er muligt — reference til historiske positive kontrolresultater, der udviser passende acceptkriterier for kørsel, hvis det er relevant. — Negativ kontrol (bærestofkontrol) — kemisk identifikation, f.eks. IUPAC- eller CAS-navn(e), CAS-nummer/numre og/eller andre identifikatorer — renhed, kemisk identitet af urenheder i det omfang, det er relevant og praktisk muligt osv. — fysisk udseende, molekylvægt og yderligere relevante fysisk-kemiske egenskaber ved brug af andre negative kontroller/bærestoffer end dem, der er nævnt i forsøgsmetoden, i det omfang det er muligt — opbevaring og stabilitet i det omfang, det er muligt — begrundelse for valg af opløsningsmiddel for de enkelte testkemikalier betingelser for forsøgsmetoden — navn og adresse på sponsoren, testfaciliteten og undersøgelseslederen — beskrivelse af forsøgsmetoden — anvendt cellelinje, opbevaringsforhold og kilde (f.eks. det anlæg, som den er hentet fra) — antal generationer og graden af konfluens for de celler, der anvendes til test — anvendt celletællingsmetode til udsåning inden testen, og de foranstaltninger, der er truffet for at sikre en ensartet fordeling af celleantal (jf. punkt 20) — anvendt luminometer (f.eks. model), herunder instrumentindstillinger, det anvendte luciferasesubstrat og dokumentation for hensigtsmæssige luminescensmålinger baseret på kontrolprøven, der er beskrevet i tillæg 3 — den procedure, der anvendes til at påvise laboratoriets kompetence til at anvende forsøgsmetoden (f.eks. ved test af kompetencestoffer) eller til at påvise reproducerbare resultater af forsøgsmetoden over tid. Testprocedure — antal anvendte gentagelser og replikater — koncentrationer af testkemikaliet, tilsætningsprocedure og eksponeringstid (hvis anderledes end anbefalet) — beskrivelse af de anvendte vurderings- og beslutningskriterier — beskrivelse af de benyttede undersøgelsesacceptkriterier — beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren. Resultater — opstilling i tabelform af Imax, EC1,5 og levedygtighedsværdier (dvs. IC50, IC30), som er opnået for testkemikaliet og for den positive kontrol for hver gentagelse samt middelværdierne (Imax: gennemsnit, EC1,5 og levedygtighedsværdier: geometrisk middelværdi) og standardafvigelse beregnet ved hjælp af data fra de enkelte gentagelser samt en angivelse af vurderingen af testkemikaliet i henhold til forudsigelsesmodellen — opnået variationskoefficient ved luminescensaflæsningerne for den negative kontrol for hvert forsøg — graf, der viser dosis/respons-kurver for induktion af luciferaseaktivitet og levedygtighed — beskrivelse af eventuelle andre relevante observationer, hvis det er relevant. Diskussion af resultaterne — diskussion af de resultater, der er opnået med KeratinoSensTM-assayet — vurdering af forsøgsmetodens resultater inden for rammerne af en IATA, hvis der foreligger andre relevante oplysninger. Konklusion LITTERATUR (1) United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Tilgængelig på: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html. (2) OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paris. (3) Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85, 367-485. (4) Kapitel B.42 i dette bilag: Hudsensibilisering: Assay på lokale lymfeknuder. (5) Kapitel B.6 i dette bilag: Hudsensibilisering. (6) Kapitel B.50 i dette bilag: Hudsensibilisering: Assay på lokale lymfeknuder: DA. (7) Kapitel B.51 i dette bilag: Hudsensibilisering: Assay på lokale lymfeknuder: BrdU-ELISA. (8) Natsch A. (2010). The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers. Toxicological Sciences 113, 284-292. (9) Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281-290. (10) Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005). The role of Keap1 in cellular protective responses. Chem. Res. Toxicol. 18, 1779-1791. (11) Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013). The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol. 1(1), 45-49. (12) Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 25, 733-744. (13) Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, 33, 1337-1352. (14) EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing, 42 pp. Tilgængelig på: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation. (15) DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSensTM., 17 pp. Tilgængelig på: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index (16) Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009). Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing. Toxicol. Sci. 107, 106-121. (17) Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389-400. (18) Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potentials. Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489-504. (19) Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. J Appl Toxicol. 33, 1353-1364: (20) Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013). The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study. Toxicology In Vitro 27, 1220-1225. (21) Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1683-1969. (22) Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17, 646-657. (23) OECD (2012). BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457. OECD, Paris. (24) ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87). (25) Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006). Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing. J. Invest. Dermatol., 126, 1813-1822. (26) Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004). Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen. Toxicol. Lett. 150, 301-316. (27) Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013). Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSensTM cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events. Toxicol. in vitro 27, 2225-2232. (28) OECD (2015). Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 213. (29) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Paris, France. (30) NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides — (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf Tillæg 1 DEFINITIONER Nøjagtighed : Overensstemmelsen mellem forsøgsmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for forsøgsmetodens ydeevne og et af aspekterne af »relevans«. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som den andel af korrekte udfald, forsøgsmetoden fører til (29). AOP (Adverse Outcome Pathway) : Sekvens af begivenheder fra den kemiske struktur af et målkemikalie eller en gruppe af ensartede kemikalier gennem den molekylære udløsende begivenhed til et in vivo-resultat af interesse (2). ARE : Antioxidantresponselement (også kaldet EpRE, electrofilresponselement) — et responselement, der findes i upstream-promotorområdet for mange cytobeskyttende gener og fase II-gener. Når det aktiveres af Nfr2, igangsætter det transskriptionsinduktionen for disse gener. Kemikalie : Et stof eller en blanding. Variationskoefficient : Et mål for variation, der beregnes for en gruppe af replikationsdata ved at dividere standardafvigelsen med middelværdien. Den kan ganges med 100 for at opnå en procentsats. EC1,5 : Interpoleret koncentration for en 1,5 fold luciferaseinduktion. IC30 : Koncentration, der medfører nedsættelse af cellelevedygtigheden med 30 %. IC50 : Koncentration, der medfører nedsættelse af cellelevedygtigheden med 50 %. Fare : Den iboende egenskab ved et middel eller en situation, som kan forårsage skade, når en organisme, et system eller en (sub)population eksponeres for det pågældende middel. IATA (integreret tilgang til afprøvning og vurdering) : En struktureret tilgang, der bruges til identifikation af farer (potentiale), farebeskrivelse (styrke) og/eller sikkerhedsvurdering (potentiale/styrke og eksponering) af et kemikalie eller en gruppe af kemikalier, som på strategisk vis integrerer og vægter alle relevante data som grundlag for lovgivningsmæssige beslutninger om mulige farer og/eller risici og/eller behovet for yderligere målrettede og derfor færrest mulige test. Imax : Maksimal induktionsfaktor for luciferaseaktivitet sammenlignet med opløsningsmiddelkontrollen (den negative kontrol) målt for en hvilken som helst koncentration af testkemikaliet. Keap1 : Kelch-lignende ECH-associeret protein 1 — et sensorprotein, der kan regulere Nrf2-aktiviteten. Under ikke-inducerede betingelser er Keap1-sensorproteinet rettet mod Nrf2-transskriptionsfaktoren ubitquitinylering og proteolytisk nedbrydning i proteasomet. Kovalent modifikation af de reaktive cysteinrester af Keap 1 med små molekyler kan føre til, at Nrf2 adskilles fra Keap1 (8) (10) (11). Blanding : En blanding eller opløsning, der er sammensat af to eller flere stoffer, hvori de ikke reagerer (1). Stof med kun en bestanddel : Et stof, der defineres af dets mængdemæssige sammensætning, hvori en hovedbestanddel udgør mindst 80 % (vægt/vægt). Stof med flere bestanddele : Et stof, der defineres af dets mængdemæssige sammensætning, hvori flere end en hovedbestanddel er til stede i en koncentration på ≥ 10 % (vægt/vægt) og < 80 % (vægt/vægt). Et stof, der består af flere forskellige bestanddele, er resultatet af en fremstillingsproces. Forskellen mellem en blanding og et stof med forskellige bestanddele er, at blandingen er fremstillet ved blanding af to eller flere stoffer uden kemisk reaktion. Et stof, der består af flere forskellige bestanddele, er resultatet af en kemisk reaktion. Nrf2 : Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 — en transskriptionsfaktor i antioxidantresponsvejen. Når Nrf2 ikke er ubiquitinyleret, opbygger det cytoplasmaet og forflytter sig ind i kernen, hvor det kombineres med ARE i upstream-promotorområdet hos mange cytobeskyttende gener og igangsætter deres transskription (8) (10) (11). Positiv kontrol : Et replikat, som indeholder alle komponenterne fra et testsystem og er behandlet med et stof, som vides at inducere en positiv respons. For at sikre at det er muligt at vurdere variabiliteten i den positive kontrolrespons over tid, bør den positive respons ikke være overdrevent stor. Relevans : Beskrivelse af sammenhængen mellem testen og den pågældende virkning og dens meningsfuldhed og brugbarhed til et bestemt formål. Det angives, i hvilket omfang testen måler eller forudsiger den pågældende biologiske virkning korrekt. Forsøgsmetodens nøjagtighed (konkordans) indgår i vurderingen af dens relevans (29). Pålidelighed : Mål for, i hvilken grad en forsøgsmetode kan udføres reproducerbart i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier og repeterbarhed inden for laboratorier (29). Reproducerbarhed : Overensstemmelse mellem resultater af test af samme kemikalie med samme testprotokol (29). Følsomhed : Andel af alle positive/aktive kemikalier, der klassificeres korrekt ved forsøgsmetoden. Det er et mål for nøjagtigheden af en forsøgsmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en forsøgsmetodes relevans (29). Opløsningsmiddel-/bærestofkontrol : Replikat, der indeholder alle bestanddele af et testsystem, undtagen testkemikaliet, men inklusive det anvendte opløsningsmiddel. Det anvendes til at bestemme basisresponsen for prøver behandlet med testkemikaliet, der er opløst i det samme opløsningsmiddel. Specificitet : Andel af alle negative/inaktive kemikalier, der klassificeres korrekt ved forsøgsmetoden. Det er et mål for nøjagtigheden af en forsøgsmetode, som giver kategoriske resultater, og er et vigtigt kriterium ved vurderingen af en forsøgsmetodes relevans (29). Stof : Grundstoffer og forbindelser heraf, naturlige eller industrielt fremstillede, indeholdende sådanne tilsætningsstoffer, som er nødvendige til bevarelse af stoffets stabilitet, og sådanne urenheder, som følger af fremstillingsprocessen, bortset fra opløsningsmidler, som kan udskilles, uden at det påvirker stoffets stabilitet eller ændrer dets sammensætning (1). Testkemikalie : Betegnelsen »testkemikalie« henviser til det, der bliver testet. De Forenede Nationers globalt harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals — UN GHS) : Et system til klassificering af kemikalier (stoffer og blandinger) efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare med tilhørende kommunikationselementer såsom piktogrammer, signalord, risikosætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om kemikaliernes skadelige virkninger kan videreformidles med henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportører, forbrugere og redningspersonel) og miljø (1). UVCB : Stoffer med ukendt eller variabel sammensætning, komplekse reaktionsprodukter eller biologiske materialer. Gyldig forsøgsmetode : En forsøgsmetode, der anses for at være tilstrækkeligt relevant og pålidelig til et bestemt formål, og som er baseret på videnskabeligt forsvarlige principper. En forsøgsmetode har aldrig absolut gyldighed, men kun i forbindelse med et bestemt formål (29). Tillæg 2 KOMPETENCESTOFFER In vitro-hudsensibilisering: ARE-Nrf2-luciferase-forsøgsmetoden Før rutinemæssig brug af denne forsøgsmetode bør laboratorierne godtgøre deres tekniske kompetence ved at opnå den forventede KeratinoSensTM-forudsigelse på korrekt vis for de 10 kompetencestoffer, der anbefales i tabel 1, og ved at opnå de EC1,5- og IC50-værdier, der falder ind under de respektive referenceområder for 1,5 ud af de 10 kompetencestoffer. Disse kompetencestoffer er udvalgt således, at de repræsenterer responsområdet for hudsensibiliseringsfare. Andre udvælgelseskriterier er kommerciel tilgængelighed, tilgængelighed af in vivo-referencer af høj kvalitet og tilgængelighed af in vitro-data af høj kvalitet for KeratinoSensTM-assayet. Tabel 1 Anbefalede stoffer til godtgørelse af teknisk kompetence i anvendelse af KeratinoSens™-assayet Kompetencestoffer CASRN Fysisk form In vivo-forudsigelse (28) KeratinoSens™ Forudsigelse (29) EC1,5 (μM)-referenceinterval (30) IC50 (μM)-referenceinterval (30) Isopropanol 67-63-0 Flydende Ikke-sensibiliserende Negativ > 1 000 > 1 000 Salicylsyre 69-72-7 Fast Ikke-sensibiliserende Negativ > 1 000 > 1 000 Mælkesyre 50-21-5 Flydende Ikke-sensibiliserende Negativ > 1 000 > 1 000 Glycerol 56-81-5 Flydende Ikke-sensibiliserende Negativ > 1 000 > 1 000 Kanelalkohol 104-54-1 Fast Sensibiliserende (svagt) Positiv 25-175 > 1 000 Ethylenglycoldimethacrylat 97-90-5 Flydende Sensibiliserende (svagt) Positiv 5-125 > 500 2-mercaptobenzothiazol 149-30-4 Fast Sensibiliserende (moderat) Positiv 25-250 > 500 Methyldibromglutaronitril 35691-65-7 Fast Sensibiliserende (stærkt) Positiv < 20 20-100 4-methylaminophenolsulfat 55-55-0 Fast Sensibiliserende (stærkt) Positiv < 12,5 20-200 2,4-dinitro-chlorbenzen 97-00-7 Fast Sensibiliserende (ekstremt) Positiv < 12,5 5-20 Tillæg 3 KVALITETSKONTROL AF LUMINESCENSMÅLINGER Grundlæggende forsøg til sikring af optimale luminescensmålinger i KeratinoSens™-assayet Følgende tre parametre er afgørende for at sikre opnåelsen af pålidelige resultater med luminometeret: — tilstrækkelig følsomhed, der giver en stabil baggrund i kontrolbrøndene — ingen gradient over pladen som følge af lange aflæsningstider — ingen lysforurening af hosliggende brønde fra stærkt aktive brønde. Inden tes