KOMMISSIONENS FORORDNING (EOEF) Nr. 690/92 af 19. marts 1992 om en referencemetode til paavisning af komaelkskasein i faaremaelksost

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til Traktaten om Oprettelse af Det Europaeiske OEkonomiske Faellesskab,

under henvisning til traktaten vedroerende Spaniens og Portugals tiltraedelse, saerlig artikel 67, stk. 1 og 2, artikel 98, artikel 234, stk. 2, og artikel 310,

under henvisning til Raadets forordning (EOEF) nr. 1677/85 af 11. juni 1985 om monetaere udligningsbeloeb i landbrugssektoren (1), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 2205/90 (2), saerlig artikel 1, stk. 1,

under henvisning til Raadets forordning (EOEF) nr. 804/68 af 27. juni 1968 om den faelles markedsordning for maelk og mejeriprodukter (3), senest aendret ved Kommissionens forordning (EOEF) nr. 374/92 (4), saerlig artikel 9, stk. 3, artikel 14, stk. 7, og artikel 17, stk. 4,

under henvisning til Raadets forordning (EOEF) nr. 876/68 af 28. juni 1968 om fastsaettelse af de almindelige regler for ydelse af eksportrestitutioner for maelk og mejeriprodukter og om kriterierne for fastsaettelse af restitutionsbeloebet (5), senest aendret ved forordning (EOEF) nr. 1344/86 (6), saerlig artikel 6, stk. 3, og

ud fra foelgende betragtninger:

Ost, der udelukkende er fremstillet af faaremaelk, er underkastet nogle saerlige regler i henhold til EF-forordning for landbrugssektoren; inden saadanne regler anvendes, boer der tages skridt til at sikre, at det paagaeldende produkt ikke indeholder komaelk;

der kan ydes stoette til privat oplagring af faaremaelkost i henhold til Raadets forordning (EOEF) nr. 508/71 af 8. marts 1971 om fastsaettelse af almindelige regler om ydelse af stoette til privat oplagring af ostesorter, der er egnede til lagring (7); der kan traeffes beslutning om en saerlig restitution for de samme produkter i henhold til forordning (EOEF) nr. 876/68; der kraeves ikke monetaere udligningsbeloeb for handel med produkter fremstillet af faaremaelk i henhold til forordning (EOEF) nr. 1677/85; tiltraedelsesudligningsbeloeb er udelukket i handelen med faaremaelksost til og fra Spanien i henhold til Raadets forordning (EOEF) nr. 466/86 af 25. februar 1986 om fastsaettelse af almindelige regler for ordningen med tiltraedelsesudligningsbeloeb for maelk og mejeriprodukter som foelge af Spaniens tiltraedelse (8) og Raadets forordning (EOEF) nr. 3640/90 af 11. december 1990 om fastsaettelse af almindelige regler for ordningen med tiltraedelsesudligningsbeloeb for maelk og mejeriprodukter i anden etape af Portugals tiltraedelse (9);

da Kommissionen har fastsat naevnte bestemmelser vedroerende ost fremstillet af faaremaelk, er det noedvendigt ved passende kontrol at sikre sig, at det paagaeldende produkt ikke er blevet iblandet komaelk; der maa fastsaettes en EF-referencemetode til paavisning af komaelk, uden at dette beroerer benyttelsen af rutinemetoder, hvis disse opfylder bestemte kriterier;

Forvaltningskomiteen for Maelk og Mejeriprodukter har ikke afgivet udtalelse inden for den af formanden fastsatte frist -

UDSTEDT FOELGENDE FORORDNING:

Artikel 1

Den i bilaget anfoerte referencemetode for analyse anvendes for at sikre, at ost, som udelukkende skal vaere fremstillet af faaremaelk, ikke indeholder komaelkskasein.

Komaelkskasein anses for at vaere til stede, hvis det konstaterede indhold af komaelkskasein i analyseproeven er lig med eller overstiger indholdet i den referenceproeve, som er beskrevet i bilaget

Artikel 2

Der kan paa nedenstaaende betingelser benyttes rutinemetoder til paavisning af komaelkskasein i faaremaelksost:

- paavisningsgraensen skal vaere 0,5 % eller derunder

- der maa ikke forekomme falske positive resultater. Hvis dette ikke kan udelukkes, skal alle proever, som giver positivt resultat, analyseres ved benyttelse af referencemetoden

- komaelkskasein skal vaere paaviselig med den fornoedne foelsomhed selv efter lange modningsperioder, som det kan vaere tilfaeldet under almindelige handelsforhold. Hvis dette krav ikke er opfyldt for en bestemt type faaremaelksost, skal den paagaeldende ost analyseres ved benyttelse af referencemetoden.

Artikel 3

Denne forordning traeder i kraft paa tredjedagen efter offentliggoerelsen i De Europaeiske Faellesskabers Tidende.

Den anvendes fra den 16. september 1992. Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaelder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfaerdiget i Bruxelles, den 19. marts 1992. Paa Kommissionens vegne

Ray MAC SHARRY

Medlem af Kommissionen

(1) EFT nr. L 164 af 24. 6. 1985, s. 6. (2) EFT nr. L 201 af 31. 7. 1990, s. 9. (3) EFT nr. L 148 af 28. 6. 1968, s. 13. (4) EFT nr. L 41 af 18. 2. 1992, s. 9. (5) EFT nr. L 155 af 3. 7. 1968, s. 1. (6) EFT nr. L 119 af 8. 5. 1986, s. 36. (7) EFT nr. L 58 af 11. 3. 1971, s. 1. (8) EFT nr. L 53 af 1. 3. 1986, s. 23. (9) EFT nr. L 362 af 27. 12. 1990, s. 3.

BILAG

REFERENCEMETODE TIL PAAVISNING AF KOMAELKSKASEIN I OST FREMSTILLET AF FAAREMAELK

1. Omfang Paavisning af komaelkskasein i ost fremstillet af faaremaelk ved isoelektrisk fokusering af g-kaseiner efter plasminolyse. 2. Anvendelsesomraade Metoden er egnet til foelsom, specifik paavisning af komaelkskasein i frisk og modnet ost fremstillet af faaremaelk. 3. Princip 3.1. Isolering af kasein fra ost. 3.2. Oploesning af de isolerede kaseiner, som derefter underkastes plasminspaltning (E.C.3.4.21.7). 3.3. Isoelektrisk isolering af de plasminbehandlede kaseiner i tilstedevaerelse af urea og farvning af proteinerne med Coomassie Brilliant Blue G-250. 3.4. Bedoemmelse af de farvede g2-kaseinmoenstre (tegn paa komaelk) ved sammenligning af det moenster, der er fremkommet fra proeven, med dem, der er fremkommet i samme gel fra standardoploesninger indeholdende 0 % og 1 % komaelk. 4. Reagenser Medmindre andet er angivet, skal der anvendes kemikalier af analysekvalitet. Vandet skal vaere dobbeltdestilleret eller af tilsvarende renhed. NB: Foelgende detaljer gaelder for laboratorietilvirkede polyakrylamidgeler, der indeholder urea, af dimensionerne 265 mm × 125 mm × 0,25 mm. Hvis der bruges gel af anden stoerrelse eller type, skal separationsbetingelserne maaske justeres. Isoelektrisk fokusering 4.1. Reagenser til fremstilling af polyakrylamidgelder, der indeholder urea. 4.1.1. Stamoploesning Man oploeser 4,85 g akrylamid 0,15 g NN-metylen-bis-akrylamid (BIS) 48,05 g urea 12,22 g glycerol (87 % w/w) i vand og fylder op til 100 ml. Opbevares i brun flaske i koeleskab. NB: En forblandet akrylamid/BIS-oploesning, der faas i handelen, kan anvendes frem for de angivne vaegte af neurotoksiske akrylamider. Hvis en saadan oploesning indeholder 30 % w/v akrylamid og 0,8 % w/v BIS, skal der bruges et volumen paa 16,2 ml i formuleringen i stedet for de angivne vaegte. Stamoploesningens holdbarhed er hoejst 10 doegn. Hvis dens ledningsevne er over mS, afioniseres den ved omroering med 2 g Amberlite MB-3 i 30 minutter og filtreres derefter gennem en 0,45 mm membran. 4.1.2. Geloploesning Der fremstilles en geloploesning ved blanding af additiver og amfolytter med stamoploesningen (4.1.1). 9,0 ml stamoploesning 24 mg ss-alanin 500 ml amfolyt pH 3,5-9,5 (1) 500 ml amfolyt pH 6-7 (1) Geloploesningen blandes og afgasses i 2-3 minutter i et ultralydsbad eller i vakuum. NB: Geloploesningen fremstilles umiddelbart foer ophaeldningen (6.2). 4.1.3. Katalysatoroploesninger 40 % w/v ammoniumpersulfat (PER): 800 mg PER oploeses i vand, og der fyldes og med vand til 2 ml. N, N, NN-tetrametyletylen-diamin (TEMED). NB: Der skal altid bruges frisklavet PER-oploesning. 4.2. Kontaktvaeske Petroleum eller flydende paraffin. 4.3. Anodeoploesning 5,77 g forsforsyre (85 % w/w); der flydes op med vand til 100 ml. 4.4. Katodeoploesning 2,00 g natriumhydroxid oploeses i vand, og der fyldes op med vand til 100 ml. Forbehandling af proeven 4.5. Proteinisoleringsreagenser Diklormetan. Fortyndet eddikesyre (25,0 ml iseddikesyre fortyndet med vand til 100 ml). Acetone. 4.6. Proteinoploesende buffer Man oploeser 5,75 g glycerol (87 % w/w) 24,03 g urea 250 mg ditiotreitol i destilleret vand og fylder op til 50 ml. NB: Opbevares i koeleskab - holdbarhed 1 uge. 4.7. Reagenser til plasminspaltning af kaseiner 4.7.1. Ammoniumkarbonatbuffer En 0,2 mol/l ammoniumhydrogenkarbonatoploesning (1,58 g/100 ml vand) titreres med en 0,2 mol/l ammoniumkarbonatoploesning (1,92 g/100 ml vand) til pH 8. 4.7.2. Bovin plasmin (E.C.3.4.21.7), aktivitet mindst 5 U/ml 4.7.3. Enzymhaemningsoploesning 2,624 g e-aminokapronsyre (6 amino-n heksanonsyre) oploeses i 100 ml 40 % (v/v) etanol. 4.8. Fremstilling af standardoploesninger af loebebehandlet skummet faaremaelk med indhold af 0 % og 1 % komaelk Skummetmaelken fremstilles ved centrifugering af ovin eller bovin raa bulkmaelk ved 37 °C ved 2 500 g i 20 minutter. Efter hurtig afkoeling af glas og indhold til 6 til 8 °C fjernes det oeverste fedtlag fuldstaendigt. Til fremstilling af 1 % standardoploesningen tilsaettes 5,00 ml bovin skummetmaelk til 495 ml ovin skummetmaelk i et 1 l baeger, pH-vaerdien justeres til 6,4 ved tilsaetning af fortyndet maelkesyre (10 % w/v). Temperaturen indstilles til 35 °C, og der tilsaettes 100 ml kalveloebe (loebeaktivitet: 1: 10 000, ca. 3 000 U/ml) og omroeres i 1 minut, hvorefter oploesningen henstaar tildaekket med alufolie ved 35 °C i en time, saa ostemassen kan dannes. Naar ostemassen er dannet, frysetoerres al den loebebehandlede maelk uden forudgaaende homogenisering eller afdraening af vallen. Efter frystetoerringen formales produktet, saa der fremkommer et homogent pulver. Ved fremstilling af 0 %-standardoploesningen foelges samme metode med 500 ml ren ovin skummetmaelk. NB: Det kan tilraades at kontrollere faaremaelkens renhed ved isoelektrisk fokusering af de plasminbehandlede kaseiner inden fremstilling af standardoploesningerne. Reagenser til proteinfarvning 4.9. Fikservaeske 150 g trikloreddikesyre oploeses i vand, og der fyldes op til 1 000 ml. 4.10. Affarvningsoploesning 500 ml metanol og 200 ml isedikesyre; der fyldes op til 2 000 ml med destilleret vand. NB: Affavningsoploesningen frisklaves hver dag. Den kan med fordel fremstilles af stamoploesninger af 50 % (v/v) metanol og 20 % (v/v) iseddikesyre ved blanding af lige store maengder. 4.11. Farvningsoploesninger 4.11.1. Farvningsoploesning (stamoploesning 1) 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G 250 (C.I. 42655) oploeses i 1 000 ml 90 % (v/v) metanol ved hjaelp af en magnetisk omroerer (ca. 45 min.) og filtreres gennem to middelhastigheds-foldefiltre. 4.11.2. Farvningsoploesning (stamoploesning 2) 5,0 g kobbersulfatpentahydrat oploeses i 1 000 ml 20 % (v/v) eddikesyre. 4.11.3. Farvningsoploesning (arbejdsoploesning) 125 ml af hver af stamoploesningerne (4.11.1 og 4.11.2) sammenblandes umiddelbart foer farvningen. NB: Farvningsoploesningen boer kun bruges samme dag, den er fremstillet. 5. Apparatur 5.1. Glasplader (265 × 125 × 4 mm), gummirulle (15 cm bredde) og vandret flade 5.2. Gelbaerefolie (265 × 125 mm) 5.3. Daekfolie (280 × 125 mm). Der anbringes en strimmel klaebebaand (280 × 6× 0,25 mm) paa hver langside (jf. fig. 1) 5.4. Elektrofokuseringskammer med koeleplade (f. eks. 265 × 125 mm) med egnet spaendingskilde (' 2,5 kV) eller automatisk elektroforesapparat 5.5. Cirkulationskryostat, termostatstyret ved 12 ± 0,5 °C 5.6. Centrifuge, justerbar til 3 000 g 5.7. Elektrodestrimler (' 265 mm laengde) 5.8. Plastdraabetaellerflaske til anode- og katodeoploesninger 5.9. Analyseproeveapplikatorer (10 mm × 5 mm, viskose- eller lavproteinabsorberingsfilterpapir) 5.10. Saks, skalpel og pincetter af rustfrit staal 5.11. Farvnings- og affarvningsskaale af rustfrit staal eller glas (f. eks. 265 mm × 150 mm instrumentbakker) 5.12. Justerbar homogenisator med stang (10 mm diameter), rpm-skala 8 000-20 000 rpm 5.13. Magnetisk omroerer 5.14. Ultralydsbad 5.15. Filmsvejser 5.16. 5-25 ml mikropipetter 5.17. Vakuumkoncentrat eller frysetoerrer 5.18. Termostatstyret vandbad indstilleligt til 35 og 40 ± 1 °C med rysteaggregat 5.19. Densitometerudstyr med aflaesning ved l= 634 nm 6. Metodik 6.1. Forbehandling af proeven 6.1.1. Isolering af kaseiner En maengde svarende til 5 g toer ostemasse eller standardoploesninger - for hvidskimmelosts vedkommende benyttes om muligt den umodnede del i midten - afvejes i et 100 ml centrifugeglas, der tilsaettes 60 ml destilleret vand og homogeniseres med en stanghomogenisator (8 000-10 000 rpm). Der justeres til pH 4,6 med fortyndet eddikesyre (4.5) og centrifugeres (5 min.-3 000 g). Fedtet og vallen afhaeldes, restindholdet homogeniseres i 40 ml destilleret vand (justeret til pH 4-5 med fortyndet eddikesyre (4.5)) ved 20 000 rpm, hvorefter der tilsaettes 20 ml diklormetan (4.5), homogeniseres og centrifugeres (5 min.-3 000 g). kaseinlaget, der flyder mellem den vandige og den organiske fase (jf. fig. 2) loeftes med en spatel, og begge faser afhaeldes. Kaseinet homgeniseres igen i 40 ml destilleret vand (se ovenfor) og 20 ml diklormetan, og der centrifugeres. Dette gentages, indtil begge ekstraktionsfaser er farveloese (2 til 3 gange). Proteinresterne homogeniseres med 50 ml toer acetone (4.5) og filtreres gennem et midelhastigheds-foldefilterpapir. Resterne vaskes paa filtret med to saerskilte portioner acetone paa hver 25 ml og henstaar til toerring i luft eller en kvaelstofstroem, hvorefter de finknuses i en morter.

NB: Toerre proteinisolater kan opbevares i ubegraenset tid ved stuetemperatur. Til hurtigisolering af proteiner homogeniseres en maengde, der svarer til 5 g toer ostemasse, to gange med 100 ml acetone (4.5), hver gang ved 20 000 rpm, henstaar i 5 min. og filtreres derefter gennem et foldefilter. Proteinresterene toerres med acetone som ovenfor beskrevet, saa der til sidst fremkommer det acetonetoerrede pulver. Hurtigmetoden kan ikke benyttes til ost af Roquefort-typen. 6.1.2. Plasminspaltning af v-kaseiner med henblik paa intensivering af g-kaseiner 25 mg isoleret kasein eller 50 mg af de frysetoerrede (4.8) standardoploesninger eller det acetonetoerrede pulver fra hurtigisolering af proteiner opslaemmes i 0,5 ml ammoniumkarbonatbuffer (4.7.1) og homogeniseres i 20 min., f.eks. ved ultralydsbehandling. Der opvarmes til 40 °C og tilsaettes 10 ml plasmin (4.7.2), blandes og inkuberes i en time ved 40 °C under stadig omrystning. Til haemning af enzymer tilsaettes 20 ml- e-aminokapronsyreoploesning (4.7.3) og derefter yderligere 200 mg fast urea og 2 mg ditiotreitol. NB: /For at faa mere symmetri i de fokuserede kaseinbaand kan det tilraades at frysetoerre oploesningen efter tilsaetningen af e-aminokapronsyre og derefter oploese resterne i 0,5 ml ureabuffer (4.6). 6.2. Forbehandling af akrylamidgeler, der indeholder urea Gelbaerefolien (5.2) rulles ved hjaelp af et paar draaber vand ud paa en glasplade (5.1), og eventuelt overskydende vand fjernes med papirhaandklaede eller -serviet. Daekfolien (5.3) udrulles med afstandsstykker (0,25 mm) paa en anden glasplade paa samme maade. Pladen anbringes plant paa en vandret flade. 10 ml af hver af katalysatoroploesningerne TEMED og PER (4.1.3) tilsaettes til den forbehandlede, afgassede geloploesning (4.1.2), som blandes kort og haeldes jaevnt ud paa midten af daekfolien. Den ene side af gelbaerefolien (med baeresiden nedad) anbringes paa daekfoliepladen og saenkes langsomt, saa der danner sig en gelfilm mellem folierne, der breder sig regelmaessigt uden bobledannelse (fig 3), Man lader forsigtigt gelbaerepladen synke helt ned ved hjaelp af en tynd spatel og laegger endnu tre glasplader oven paa den, der skal tjene som vaegte. Naar polymeriseringen er fuldstaendig (ca. 60 min.) overfoeres den polymeriserede gel paa gelbaerefolien sammen med daekfolien ved at glaspladerne vippes. Bagsiden af baerefolien rengoeres omhyggeligt, saa gelrester og urea bliver fjernet »Gelsandwichen« svejses til et filmglas og opbevares i koeleskab (hoejst 6 uger). NB: Daekfolien med afstandsstykkerne kan genbruges. Polyakrylamidgelen kan tilskaeres i mindre stoerrelser, hvad der kan anbefales, naar der kun er faa proever, eller hvis der anvendes et automatisk elektroforeseapparat (2 geler - stoerrelse 4,5 cm × 5 cm). 6.3. Isoelektrisk fokusering Koeletermostaten indstilles til 12 °C. Bagsiden af gelbaerefolien aftoerres med petroleum, hvorefter et par draaber petroleum (4.2) dryppes paa midten af koeleblokken. Derpaa rulles gelsandwichen (med baeresiden nedad) ud paa den, men man skal passe paa, at der ikke danner sig bobler. Eventuel overskydende petroleum toerres af, og daekfolien fjernes. Elektrodestrimlerne gennemvaedes med elektrodeoploesningerne (4.3 og 4.4), tilskaeres i gelens laengde og anbringes de givne steder (elektrodeafstand 9,5 cm). Fokuseringen foretages paa nedenstaaende betingelser: 6.3.1. Gelstoerrelse 265 mm × 125 mm × 0,25 mm Trin Tid (min.) Spaending (V) Stroem (mA) Kraft (W) Volttimer (Vh) 1. Praefokusering 30 max. 2 500 max. 15 konst. 4 ca. 300 2. Proevefokusering (*) 60 max. 2 500 max. 15 konst. 4 ca. 1 000 3. Slutfokusering 60 max. 2 500 max. 5 max. 20 ca. 3 000 40 max. 2 500 max. 6 max. 20 ca. 3 000 30 max. 2 500 max. 7 max. 25 ca. 2 500 (*) Proeveapplikation: Efter praefokusering (1. trin) pipetteres 18 ml af hver af proeveoploesningerne over paa proeveapplikatorerne (10 mm × 15 mm), der anbringes paa gelen med en indbyrdes afstand paa 1 mm og 5 mm fra anoden og trykkes let ned. Fokuseringen foretages paa ovenstaaende betingelser, og proeveapplikatorerne borttages med forsigtighed efter de 60 min. proevefokusering. NB: Hvis gelernes tykkelse eller bredde aendres, skal stroem og kraft justeres herefter (f. eks. fordobles el-stroem og kraft, hvis der benyttes en 265 mm × 125 mm × 0,5 mm gel). 6.3.2. Eksempel paa et spaendingsprogram for et automatisk elektroforeseapparat (2 geler paa 5,0 cm × 4,5 cm); elektroder anbringes uden strimler direkte paa gelen. Trin Spaending Stroem Kraft Temp. Volttimer 1. Praefokusering 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Proevefokusering 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusering 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusering 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh Proeveapplikatoren anbringes paa 2. trin ved 0000 Vh. Proeveapplikatoren fjernes paa 2. trin ved 0030 Vh. 6.4. Proteinfarvning 6.4.1. Proteinbinding Elektrodestrimlerne aftages straks efter, at der er slukket for stroemmen, og gelen kommes straks i en farvnings- eller affarvningsskaal fyldt med 200 ml fikservaeske (4.9); den henstaar i 15 min., men omrystes af og til. 6.4.2. Vask og farvning af gelpladen Fikservaesken afdraenes grundigt, og gelpladen vaskes 30 sekunder to gange med 100 ml affarvningsoploesning (4.10). Affarvningsoploesningen afhaeldes, og skaalen fyldes med 250 ml farvningsoploesning (4.11.3). Man lader farven udvikle sig i 45 min. med forsigtig omrystning. 6.4.3. Affarvning af gelpladen Farvningsoploesningen afhaeldes, og gelpladen vaskes med 100 ml affarvningsoploesning to gange, hvorefter der rystes i mindst to gange 15 min. med 200 ml affarvningsoploesning, indtil baggrunden er klar og ufarvet. Derefter skylles gelpladen med destilleret vand (to gange 2 min.) og toerres i luft (2 til 3 timer) eller med en haartoerrer (10 til 15 min.). NB: Binding, vask, farvning og affarvning foretages ved 20 °C. Hoejere temperaturer maa ikke benyttes. 7. Vurdering Vurderingen foretages ved sammenligning af proteinmoenstrene i proeven med referenceproever paa samme gel. Paavisningen af komaelk i faaremaelk eller produkter deraf via de g2- og g3-kaseiner, der er intensiveret ved plasminbehandling (6.1.2), og hvis isoelektriske punkter ligger mellem pH 6,5 og pH 7,5 (fig. 4 og 5). Paavisningsgraensen er under 0,5 %. Med henblik paa visuel vurdering af indholdet af komaelk kan det tilraades at justere koncentrationerne af proeve- og standardoploesningerne, saa der fremkommer samme intensitet af ovine g2-kaseiner (jf. »g2S« i fig. 4 og 5). Derefter kan indholdet af komaelk (mindre, lig med eller hoejere end 1 %) i den ukendte proeve bedoemmes direkte ved sammenligning med intensiteten af de bovine g2-kaseiner (jf. »g2C« i fig. 4 og 5). Om muligt benyttes densitometri (5.19) til bestemmelse af forholdet mellem toparealerne for bovin g2-kasein og ovin g2-kasein (jf. fig. 5). Denne vaerdi sammenlignes med forholdet mellem g2-kaseiner i den 1 %-stamoploesning, der er analyseret paa samme gel. NB: Metoden fungerer tilfredsstillende, hvis der er et klart, positivt tegn paa bovin g2-kasein i 1 %-standardoploesningen, men ikke i 0 %-stamoploesningen. Hvis det ikke er tilfaeldet, forbedres metoden ved, at den foelges ganske noeje i alle detaljer. 8. Litteraturhenvisninger Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine cheese by gel isoelectric focusing of g2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of g2-caseins using plasmin as signal amplifier. I: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, Muenchen (1989). Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -kaese durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. (under udarbejdelse). Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 mm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Fig. 1. Skematisk tegning af daekfolie

Afstandsbaand

Polyesterfolie

Fig. 2. Kaseinlaget, der flyder mellem den vandige og den organiske fase efter centrifugering

H2O-fase

Kasein

CH2Cl2-fase

Fig. 3. Viftemetode til stoebning af ultratynde polyakrylamidgeler.

a = afstandsbaand (0,25 mm); b = daekfolie (5.3); c, e = glasplader (5.1); d = geloploesning (4.1.2); f = gelbaerefolie (5.2)

Fig. 4. Isoelektrisk fokusering af plasminbehandlede kaseiner fra ost af Pecorino-typen med forskellige maengder komaelk. % CM = procent komaelk, C = ko, S = faar

Ost af Pecorino-typen indeholdende

Fig. 5. Overlejring af densitogrammer af osteproever af Pecorino-typen, der indeholder 0, 1, 2, 3 og 7 % komaelk, efter isoelektrisk fokusering. Den oeverste halvdel af IEF-gelen blev dannet ved l = 634 nm. STD = standardoploesninger med 0 % og 1 % komaelk

(1) Produkterne Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia-LKB) og Servalyt pH 6-7 (Serva) har vist sig saerligt velegnede til opnaaelse af den oenskede separation af -kaseiner.