++++

KOMMISSIONENS NIENDE DIREKTIV

af 31 . juli 1981

om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til den officielle kontrol med foderstoffer

( 81/715/EOEF )

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,

under henvisning til Raadets direktiv 70/373/EOEF af 20 . juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder for saa vidt angaar den officielle kontrol med foderstoffer ( 1 ) , senest aendret ved akten vedroerende Graekenlands tiltraedelse , saerlig artikel 2 , og

ud fra foelgende betragtninger :

ved naevnte direktiv er det fastsat , at den officielle kontrol med foderstoffer til konstatering af , om de betingelser , der er fastsat paa grundlag af love og administrative bestemmelser om foderstoffernes beskaffenhed og sammensaetning er opfyldt , foretages efter faellesskabsproeveudtagningsmaader og -analysemetoder ;

der er allerede ved Kommissionens direktiv 71/250/EOEF ( 2 ) , 71/393/EOEF ( 3 ) , 72/199/EOEF ( 4 ) , 73/46/EOEF ( 5 ) , 74/203/EOEF ( 6 ) , 75/84/EOEF ( 7 ) , 76/372/EOEF ( 8 ) og 78/633/EOEF ( 9 ) , senest aendret ved direktiv af 30 . juli 1981 , fastsat en raekke faellesskabsanalysemetoder ; i betragtning af de resultater , der er naaet siden da , boer der fastsaettes en niende serie af metoder ;

de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overenstemmelse med udtalelse fra Den staaende Foderstofkomité -

UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV :

Artikel 1

Medlemsstaterne foreskriver , at analyserne i forbindelse med den officielle kontrol af foderstoffer for saa vidt angaar deres indhold af avoparein og monensin natrium skal foretages efter de metoder , der er beskrevet i bilaget .

Artikel 2

Medlemsstaterne saetter de noedvendige love og administrative bestemmelser i kraft for at efterkomme dette direktiv den 1 . december 1981 .

De underretter straks Kommissionen herom .

Udfaerdiget i Bruxelles , den 31 . juli 1981 .

Artikel 3

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .

Paa Kommissionens vegne

Gaston THORN

Formand

( 1 ) EFT nr . L 170 af 3 . 8 . 1970 , s . 2 .

( 2 ) EFT nr . L 155 af 12 . 7 . 1971 , s . 13 .

( 3 ) EFT nr . L 279 af 20 . 12 . 1971 , s . 7 .

( 4 ) EFT nr . L 123 af 29 . 5 . 1972 , s . 6 .

( 5 ) EFT nr . L 83 af 30 . 3 . 1973 , s . 21 .

( 6 ) EFT nr . L 108 af 22 . 4 . 1974 , s . 7 .

( 7 ) EFT nr . L 32 af 5 . 2 . 1975 , s . 26 .

( 8 ) EFT nr . L 102 af 15 . 4 . 1976 , s . 8 .

( 9 ) EFT nr . L 206 af 29 . 7 . 1978 , s . 43 .

BILAG

1 . BESTEMMELSE AF AVOPARCIN VED DIFFUSION PAA AGARPLADER

1 . FORMAAL OG ANVENDELSESOMRAADE

Metoden anvendes til bestemmelse af avoparcin i foderstoffer og forblandinger . Undergraensen for bestemmelsen er 2 mg/kg ( 2 ppm ) . Tilstedevaerelsen af polyether-antibiotika natrium kan paavirke bestemmelsen .

2 . PRINCIP

Proeven ekstraheres med en blanding af acetone/vand/saltsyre . Ekstraktets antibiotiske styrke bestemmes ved at maale diffusionen af avoparcin i et agarsubstrat podet med Bacillus subtilis . Diffusionen viser sig ved dannelsen af zoner , hvori mikroorganismens vaekst er haemmet . Diameteren af disse zoner anses for at vaere direkte proportional med logaritmen til den antibiotiske styrke inden for de anvendte koncentrationer af antibiotikum .

3 . TESTORGANISME : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 ( NCIB 8054 )

3.1 . Opbevaring af stamkulturen

Bacillus subtilis podes paa skraaagar med naeringssubstrat ( 4.1 ) og inkuberes natten over ved 30 * C . Kulturen opbevares i koeleskab ved ca . 4 * C . Den ompodes en gang om maaneden .

3.2 . Fremstilling af sporesuspension ( 1 )

Vaeksten fra et skraaagarglas ( 3.1 ) opslaemmes med 2 til 3 ml sterilt vand . Denne opslaemning anvendes til podning af 300 ml naeringssubstrat ( 4.1 ) i en Roux-kolbe , og der inkuberes i tre til fem dage ved 30 * C . Naar sporedannelsen er blevet bekraeftet ved mikroskopi , opslaemmes vaeksten i 15 ml ethanol ( 4.2 ) , og der omrystes . Opslaemningen kan opbevares ved ca . 4 * C i mindst fem maaneder .

4 . NAERINGSSUBSTRATER OG REAGENSER

4.1 Naeringssubstrat ( 2 )

Pepton 6,0 g

Trypton 4,0 g

Gaerekstrakt 3,0 g

Koedekstrakt 1,5 g

Glucose 1,0 g

Agar 15,0 g

Vand 1 000 ml

pH 6,5 ( efter sterilisering ) .

4.2 . Ethanol 20 pct . ( u/v ) : 200 ml ethanol fortyndes med 800 ml vand .

4.3 . Analyseren saltsyre , d : 1,18-1,19 .

4.4 . Analyseren natriumhydroxidoploesning , 2M .

4.5 . Phosphatbufferoploesning , 0,1 M :

Kaliumdihydrogenphosphat , KH2PO4 13,6 g

Vand til 1 000 ml

pH justeres til 4,5 .

4.6 . Blanding af acetone/vand/saltsyre ( 4.3 ) : 65/32,5/2,5 ( v/v/v ) .

4.7 . Standardpraeparat : avoparcinsulfat af kendt styrke .

5 . STANDARDOPLOESNINGER

En noejagtigt afvejet maengde paa ca . 10 mg standardpraeparat ( 4.7 ) oploeses i en phosphatbufferoploesning ( 4.5 ) og fortyndes med denne paa en saadan maade , at der fremkommer en stamoploesning indeholdende 100 mg avoparcin pr . ml . Opbevaret i en tilproppet flaske ved 4 * C vil denne oploesning vaere holdbar i indtil syv dage .

5.1 . Til forblandinger

Ved successiv fortynding med bufferoploesningen ( 4.5 ) fremstilles foelgende oploesninger af stamoploesningen :

S8 4,0 mg/ml

S4 2,0 mg/ml

S2 1,0 mg/ml

S1 0,5 mg/ml

5.2 . Til foderstoffer

Ved successiv fortynding med bufferoploesningen ( 4.5 ) fremstilles foelgende oploesninger af stamoploesningen :

S8 2,0 mg/ml

S4 1,0 mg/ml

S2 0,5 mg/ml

S1 0,25 mg/ml

6 . FREMSTILLING AF EKSTRAKT OG TESTOPLOESNINGER

6.1 . Forblandinger

Med en noejagtighed paa 10 mg afvejes tilstraekkelig meget af proeven til , at den indeholder mellem 10 og 100 mg avoparcin . Maengden overfoeres til en 100 ml maalekolbe med 60 ml af blandingen ( 4.6 ) og rystes i 15 minutter paa en mekanisk ryster . pH kontrolleres og justeres om noedvendigt med saltsyre ( 4.3 ) til pH 2 . Kolben fyldes op til maerket med blandingen ( 4.6 ) , og indholdet blandes godt . En portion filtreres gennem et passende filtrerpapir ( f . eks . Whatman nr . 1 ) , idet de foerste 5 ml af filtratet bortkastes . Udtag en delmaengde af filtratet og indstil pH paa 4,5 med natriumhydroxid oploesning ( 4.4 ) . Denne delmaengde fortyndes med bufferoploesning ( 4.5 ) til en forventet avoparcinkoncentration paa 4 mg/ml ( = U8 ) .

Af denne oploesning fremstilles oploesning U4 ( forventet indhold : 2 mg/ml ) . U2 ( forventet indhold : 1 mg/ml ) og U1 ( forventet indhold : 0,5 mg/ml ) ved successiv fortynding ( 1 + 1 ) med bufferoploesning ( 4.5 ) .

6.2 . Foderstoffer

50,0 g af proeven afvejes og blandes med 100 ml af blandingen ( 4.6 ) i 30 minutter paa en mekanisk ryster . Ekstraktet klares ved centrifugering ( der anvendes tilproppede centrifugeroer ) , og en delmaengde af det klarede ekstrakt ( se tabel nedenfor ) justeres til pH 4,5 med natriumhydroxidoploesning ( 4.4 ) . Denne delmaengde fortyndes med bufferoploesning ( 4.5 ) til U8 ( se tabel nedenfor ) .

Af denne oploesning fremstilles oploesning U4 ( forventet indhold : 1,0 mg/ml ) , U2 ( forventet indhold : 0,5 mg/ml ) og U1 ( forventet indhold : 0,25 mg/ml ) ved successiv fortynding ( 1 + 1 ) med bufferoploesning ( 4.5 ) .

Forventet indhold af avoparcin i mg/kg * 5 * 7,5 * 10 * 15 * 20 * 40 *

Proevens vaegt i g ( mere aller mindre 0,1 g ) * 50 * 50 * 50 * 50 * 50 * 50 *

Blandingens volumen ( 4.6 ) ( ml ) * 100 * 100 * 100 * 100 * 100 * 100 *

Det klarede ekstrakts volumen ( ml ) * 20 * 15 * 20 * 15 * 20 * 10 *

Det endelige volumen ( ml ) : U8 * 25 * 25 * 50 * 50 * 100 * 100 *

Forventet U8-koncentration i mg/ml * 2 * ca . 2 * 2 * ca . 2 * 2 * 2 *

7 . TESTMETODE

7.1 . Podning af testsubstratet

Testsubstratet ( 4.1 ) podes med sporesuspensionen ( 3.2 ) ved 50-60 * C . Paa plader med testsubstrat ( 4.1 ) bestemmes forud den maengde sporesuspension , der giver de stoerste og tydeligste haemningszoner med de forskellige koncentrationer af avoparcin .

7.2 . Forberedelse af pladerne

Diffusionen i agar udfoeres paa plader med de fire koncentrationer af standardoploesningen ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og de fire koncentrationer af testoploesningen ( U8 , U4 , U2 og U1 ) . Disse fire koncentrationer af ekstrakt og standard skal noedvendigvis alle findes paa hver plade . Der boer derfor vaelges plader , der er store nok til at rumme mindst otte huller i agarsubstratet med en diameter paa 10-13 mm og mindst 30 mm mellem hullernes centrum . Testen kan udfoeres paa plader , der bestaar af en glasplade med en aluminium - eller plastring ovenpaa , 200 mm i diameter og 20 mm hoej .

Pladerne paahaeldes substrat ( 4.1 ) , der er podet som angivet i 7.1 , saa der opnaas et ca . 2 mm tykt lag ( 60 ml til en plade paa 200 mm i diameter ) . Pladerne anbringes vandret til stoerkning , hullerne udstanses , og noejagtigt afmaalte maengder af test - og standardoploesning anbringes i hullerne ( mellem 0,10 og 0,15 ml pr . hul , afhaengig af diameteren ) . Hver koncentration skal anbringes mindst fire gange , saaledes at hver bestemmelse er baseret paa en aflaesning af 32 haemningszoner .

7.3 . Inkubation

Pladerne inkuberes i 16-18 timer ved 30 * C .

8 . BEDOEMMELSE

Haemningszonernes diameter maales med 0,1 mm noejagtighed . Middeldiameteren for hver koncentration afsaettes paa semilogaritmisk papir , saaledes at de viser logaritmen til koncentrationen i forhold til haemningszonernes diameter . Der indtegnes den " bedst tilpassede " rette linje for henholdsvis standardoploesningen og ekstraktet , som vist nedenfor .

Det " bedst tilpassede punkt " for den laveste vaerdi for standardoploesningen ( SL ) bestemmes ved hjaelp af formlen :

( a ) SL = ( 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8 ) /10

Det " bedst tilpassede punkt " for den hoejeste vaerdi for standardoploesningen ( SH ) bestemmes ved hjaelp af formlen :

( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10

Paa tilsvarende maade beregnes det " bedst tilpassede punkt " for den laveste vaerdi for ekstraktet ( UL ) og den hoejeste vaerdi for ekstraktet ( UH ) ved at erstatte S1 , S2 , S4 og S8 med U1 , U2 , U4 og U8 i ovennaevnte formler .

De beregnede SL - og SH-vaerdier indtegnes paa samme millimeterpapir og forbindes til den " bedst tilpassede linje " for standardoploesningen . UL - og UH-vaerdierne indtegnes paa tilsvarende maade og forbindes til den " bedst tilpassede linje " for ekstraktet .

Hvis der ikke er stoffer til stede , som forstyrrer analysen , vil linjerne vaere parallelle . Til praktiske formaal kan linjerne betragtes som vaerende parallelle , hvis vaerdierne ( SH-SL ) og ( UH-UL ) ikke afviger mere end 10 % fra middelvaerdien .

Saafremt linjerne viser sig ikke at vaere parallelle , kan enten U1 og S1 eller U8 og S8 udelades , og SL , SH , UL og UH beregnes ved hjaelp af de alternative formler , for at opnaa de alternative " bedst tilpassede linjer " :

( a' ) SL = ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 eller ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6

( b' ) SH = ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 eller ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6

og tilsvarende for UL og UH . Det kontrolleres som ovenfor , om de alternative " bedst tilpassede linjer " er parallelle . Det noteres i den endelige rapport , at resultatet er beregnet ud fra tre koncentrationer .

Hvis linjerne kan betragtes som vaerende parallelle , beregnes logaritmen til den relative styrke ( log . A ) ved hjaelp af en af foelgende formler :

For fire koncentrationer

log A = ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) gange 0,602 / ( U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 )

For tre koncentrationer

log A = ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) gange 0,401 / ( U4 + S4 - U1 - S1 ) eller

of

( d' ) log A = ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) gange 0,401 / ( U8 + S8 - U2 - S2 )

Faktisk styrke = formodet styrke gange relativ styrke .

Hvis den relative styrke ligger uden for omraadet 0,5-2,0 , gentages analysen med den fornoedne tilpasning af avoparcinindholdet i ekstrakterne eller , hvor dette ikke er muligt , i standardoploesningerne . Hvis den relative styrke ikke kan bringes inden for det kraevede interval , maa de resultater , der opnaas , betragtes som tilnaermede og dette boer anfoeres i den endelige rapport .

Hvis linjerne ikke kan betragtes som vaerende parallelle , gentages bestemmelsen . Hvis der stadig ikke opnaas parallellitet , maa bestemmelsen betragtes som utilfredsstillende .

9 . REPETERBARHED

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser , udfoert paa samme proeve af samme analytiker , boer ikke overstige :

- 2 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold af avoparcin paa fra 2 og indtil 10 mg/kg ;

- 20 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa mere end 10 og indtil 25 mg/kg ;

- 5 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold paa mere end 25 og indtil 50 mg/kg ;

- 10 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa over 50 mg/kg .

2 . BESTEMMELSE AF MONENSIN NATRIUM VED DIFFUSION PAA AGARPLADER

1 . FORMAAL OG ANVENDELSESOMRAADE

Metoden anvendes til bestemmelse af monensin natrium i foderstoffer og forblandinger . Undergraensen for bestemmelsen er 10 mg/kg ( 10 ppm ) ( 3 ) .

2 . PRINCIP

Proeven ekstraheres med 90 pct . methanol . Ekstraktets behandling afhaenger af proevens indhold af monensin natrium . Dets antibiotiske styrke bestemmes ved at maale diffusionen af monensin natrium i et agarsubstrat podet med Bacillus subtilis . Diffusionen viser sig ved dannelsen af zoner , hvori mikroorganismens vaekst er haemmet . Diameteren af disse zoner anses for at vaere direkte proportional med logaritmen til den antibiotiske styrke inden for de anvendte koncentrationer af antibiotikum . Metoden er mindre foelsom ved tilstedevaerelsen af natriumioner .

3 . TESTORGANISME : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 ( NCIB 8054 )

3.1 . Opbevaring af stamkulturen

Bacillus subtilis podes paa skraaagar med naeringssubstrat ( 4.1 ) og inkuberes natten over ved 30 * C . Kulturen opbevares i koeleskab ved ca . 4 * C . Den ompodes én gang om maaneden .

3.2 . Fremstilling af sporesuspension ( 4 )

Vaeksten fra et skraaagarglas ( 3.1 ) opslaemmes med 2-3 ml sterilt vand . Denne opslaemning anvendes til podning af 300 ml naeringssubstrat ( 4.1 ) i en Roux-kolbe , og der inkuberes i tre til fem dage ved 30 * C . Naar sporedannelsen er blevet bekraeftet ved mikroskopi , opslaemmes vaeksten i 15 ml ethanol ( 4.3 ) , og der omrystes . Opslaemningen kan opbevares ved ca . 4 * C i mindst fem maaneder .

4 . NAERINGSSUBSTRATER OG REAGENSER

4.1 . Naeringssubstrat ( 5 )

Tryptone 10,0 g

Gaerekstrakt 3,0 g

Koedekstrakt 1,5 g

Glukose 1,0 g

Agar ( efter kvalitet ) 10,0 til 20,0 g

Vand 1 000 ml

pH 6,5 ( efter sterilisering )

4.2 . Testsubstrat

Glukose 10,0 g

Gaerekstrakt 2,5 g

Kaliumhydrogenphosphat , K2HPO4 0,69 g

Kaliumdihydrogenphosphat , KH2PO4 0,45 g

Agar ( efter kvalitet ) 10,0 til 20,0 g

Vand 1 000 ml

pH 6,0 ( efter sterilisering )

4.3 . Ethanol 20 pct . ( v/v ) : 200 ml ethanol fortyndes med 800 ml vand .

4.4 . Methanol , vandfri .

4.5 . Methanol 90 pct . ( v/v ) : 900 ml methanol ( 4.4 ) fortyndes med 100 ml vand .

4.6 . Methanol 50 pct . ( v/v ) : 500 ml methanol ( 4.4 ) fortyndes med 500 ml vand .

4.7 . Aluminiumoxid , granuleret ( Alcoa F , 20 mesh : Activated Alumina UG1 : F Lancaster and Co . , eller tilsvarende ) .

4.8 . Standardpraeparat : monensin natrium af kendt styrke ( f . eks . fra International Laboratory for Biological Standards , Central Veterinary Laboratory , Weybridge , Surrey KT15 3NB , England ) .

5 . APPARATUR

5.1 . Vakuumrotationsfordamper med 250 ml rundbundet kolbe .

5.2 . Glasroer til kromatografi , indvendig diameter : 25 mm , laengde : 400 mm , med en aabning paa 2 mm i diameter i den ene ende .

5.3 . Glasroer til kromatografi , indvendig diameter : 11 mm , laengde : ca . 300 mm , med en aabning paa 2 mm i diameter i den ene ende .

6 . STANDARDOPLOESNINGER

En noejagtigt afvejet maengde standardpraeparat ( 4.8 ) oploeses i methanol ( 4.4 ) og fortyndes saaledes , at der fremkommer en stamoploesning indeholdende 800 mg monensin natrium pr . ml . Opbevaret i tilproppede flasker ved 4 * C vil denne oploesning vaere holdbar i indtil to uger .

Af denne stamoploesning fremstilles ved successiv fortynding med 50 % methanol ( 4.6 ) foelgende oploesninger :

S8 8,0 mg/ml

S4 4,0 mg/ml

S2 2,0 mg/ml

S1 1,0 mg/ml

7 . FREMSTILLING AF EKSTRAKTET

7.1 . Ekstraktion

7.1.1 . Forblandinger

2,0 g af proeven afvejes , der tilsaettes 100 ml 90 pct . methanol ( 4.5 ) , hvorefter der homogeniseres og centrifugeres i faa minutter . Supernatanten fortyndes med 50 pct . methanol ( 4.6 ) indtil et forventet monensin natrium indhold paa 8 mg/ml ( = U8 ) .

7.1.2 . Foderstoffer med et monensin natrium indhold paa ikke under 50 ppm

10,0 til 20,0 g af proeven afvejes , og der tilsaettes 100 ml 90 % methanol ( 4.5 ) , hvorefter der homogeniseres i 15 minutter og stilles til bundfaeldning .

En vatprop anbringes i den snaevre ende af et glasroer ( 5.2 ) , og der tilsaettes aluminiumoxid ( 4.7 ) , samtidig med at der bankes let paa roeret , indtil soejlen er 75 til 80 mm hoej .

Ekstraktet dekanteres gennem aluminiumoxidsoejlen , og filtratet opsamles . 30 ml af filtratet fortyndes til 50 ml med vand . Derefter fortyndes med 50 % methanol ( 4.6 ) for at opnaa et forventet monensin natrium indhold paa 8 mg/ml ( = U8 ) .

7.1.3 . Foderstoffer med et monensin natrium indhold paa under 50 ppm ( indtil 10 ppm )

10,0 til 20,0 g af proeven afvejes , og der tilsaettes 100 ml 90 pct . methanol ( 4.5 ) , hvorefter der homogeniseres i 15 minutter . Derefter centrifugeres , til vaesken er klar .

Hvis proeven indeholder 20 ppm af monensin natrium tages 40 ml af supernatanten ; hvis proeven indeholder 10 ppm tages 80 ml som inddampes til toerhed under vakuum paa en rotationsfordamper ( 5.1 ) ved hoejst 40 * C . Remanensen oploeses i 10 ml 90 pct . methanol ( 4.5 ) .

En vatprop anbringes i den snaevre ende af et glasroer ( 5.3 ) , og der tilsaettes aluminiumoxid ( 4.7 ) , samtidig med at der bankes let paa roeret , indtil soejlen er 75 til 80 mm hoej .

Methanoloploesningen af remanensen dekanteres gennem aluminiumoxidsoejlen , og filtratet opsamles . Soejlen udvaskes med 10 ml 90 pct . methanol ( 4.5 ) , som tilsaettes filtratet .

Oploesningen inddampes til toerhed under vakuum i en rotationsfordamper ( 5.1 ) ved under 40 * C . Remanensen oploeses i 10 ml vandfri methanol ( 4.4 ) , og der fyldes op til 20 ml med vand . Oploesningen centrifugeres ved mindst 4 000 omdr./min . i mindst fem minutter . Derefter fortyndes med 50 % methanol ( 4.6 ) for at opnaa et forventet monensin natrium indhold paa 8 mg/ml ( = U8 ) .

7.2 . Testoploesninger

Oploesningerne U4 ( forventet indhold : 4 mg/ml ) , U2 ( forventet indhold : 2 mg/ml ) og U1 ( forventet indhold : 1 mg/ml ) fremstilles af oploesning U8 ved successiv fortynding ( 1 + 1 ) med 50 % methanol ( 4.6 ) .

8 . TESTMETODE

8.1 . Podning af testsubstratet

Testsubstratet ( 4.2 ) podes med sporesuspensionen ( 3.2 ) ved 50 til 60 * C . Paa plader med testsubstrat ( 4.2 ) bestemmes forud den maengde sporesuspension , der giver de stoerste og tydeligste haemningszoner med de forskellige koncentrationer af monensin natrium .

8.2 . Forberedelse af pladerne

Diffusionen i agar udfoeres paa plader med de fire koncentrationer af standardoploesningen ( S8 , S4 , S2 og S1 ) og de fire koncentrationer af testoploesningen ( U8 , U4 , U2 og U1 ) . Disse fire koncentrationer af ekstrakt og standard skal noedvendigvis alle findes paa hver plade . Der boer derfor vaelges plader , der er store nok til at rumme mindst otte huller i agarsubstratet med en diameter paa 10 til 13 mm og mindst 30 mm mellem hullernes centrum . Testen kan udfoeres paa plader , der bestaar af en glasplade med en aluminium - eller plastring ovenpaa , 200 mm i diameter og 20 mm hoej .

Pladerne paahaeldes substrat ( 4.2 ) , der er podet som angivet i 8.1 , saa der opnaas et ca . 2 mm tykt lag ( 60 ml til en plade paa 200 mm i diameter ) . Pladerne anbringes vandret til stoerkning , hullerne udstanses , og noejagtigt afmaalte maengder af test - og standardoploesning anbringes i hullerne ( mellem 0,10 og 0,15 ml pr . hul , afhaengig af diameteren ) . Hver koncentration skal anbringes mindst 4 gange , saaledes at hver bestemmelse er baseret paa en aflaesning af 32 haemningszoner .

8.3 . Inkubering

Pladerne inkuberes i ca . 18 timer ved 35 til 37 * C .

9 . BEDOEMMELSE

Haemningszonernes diameter maales med 0,1 mm noejagtighed . Middeldiameteren for hver koncentration afsaettes paa semilogaritmisk papir , saaledes at de viser logaritmen til koncentrationen i forhold til haemningszonernes diameter . Der indtegnes den " bedst tilpassede " rette linie for henholdsvis standardoploesningen og ekstraktet , f.eks . som vist nedenfor .

Det " bedst tilpassede punkt " for den laveste vaerdi for standardoploesningen ( SL ) bestemmes ved hjaelp af formlen :

( a ) SL = ( 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8 ) /10

Det " bedst tilpassede punkt " for den hoejeste vaerdi for standardoploesningen ( SH ) bestemmes ved hjaelp af formlen :

( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10

Paa tilsvarende maade beregnes det " bedst tilpassede punkt " for den laveste vaerdi for ekstraktet ( UL ) og den hoejeste vaerdi for ekstraktet ( UH ) ved at erstatte S1 , S2 , S4 og S8 med U1 , U2 , U4 og U8 i ovennaevnte formler .

De beregnede SL - og SH-vaerdier indtegnes paa samme millimeterpapir og forbindes til den " bedst tilpassede linie " for standardoploesningen . UL - og UH-vaerdierne indtegnes paa tilsvarende maade og forbindes til den " bedst tilpassede linie " for ekstraktet .

Hvis der ikke er stoffer til stede , som forstyrrer analysen , vil linierne vaere parallelle . Til praktiske formaal kan linierne betragtes som vaerende parallelle , hvis vaerdierne ( SH-SL ) og ( UH-UL ) ikke afviger mere end 10 % fra middelvaerdien .

Saafremt linierne viser sig ikke at vaere parallelle , kan enten U1 og S1 eller U8 og S8 udelades , og SL , SH , UL og UH beregnes ved hjaelp af de alternative formler , for at opnaa de alternative " bedst tilpassede linier " :

( a' ) SL = ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 eller ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6

( b' ) SH = ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 eller ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6

og tilsvarende for UL og UH . Det kontrolleres som ovenfor , om de alternative " bedst tilpassede linier " er parallelle . Det noteres i den endelige rapport , at resultatet er beregnet ud fra tre koncentrationer .

Hvis linierne kan betragtes som vaerende parallelle , beregnes logaritmen til den relative styrke ( log A ) ved hjaelp af én af foelgende formler :

For fire koncentrationer

( c ) log A = ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) gange 0,602 / ( U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 )

For tre koncentrationer

( d ) log A = ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 ) gange 0,401 / ( U4 + S4 - U1 - S1 ) eller

( d' ) log A = ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 ) gange 0,401 / ( U8 + S8 - U2 - S2 )

Faktisk styrke = formodet styrke x relativ styrke .

Hvis den relative styrke ligger uden for omraadet 0,5 til 2,0 , gentages analysen med den fornoedne tilpasning af monensin natrium koncentrationen i ekstrakterne eller , hvis dette ikke er muligt , i standardoploesningerne . Hvis den relative styrke ikke kan bringes inden for det kraevede interval , maa de resultater , der opnaas , betragtes som tilnaermede , og dette boer anfoeres i den endelige rapport .

Hvis linierne ikke kan betragtes som vaerende parallelle , gentages bestemmelsen . Hvis der stadig ikke opnaas parallellitet , maa bestemmelsen betragtes som utilfredsstillende .

10 . REPETERBARHED

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser , udfoert paa samme proeve af samme analytiker , boer ikke overstige :

- 20 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa mere end 10 g indtil 25 mg/kg ;

- 5 mg/kg i absolut vaerdi for et indhold paa mere end 25 g indtil 50 mg/kg ;

- 10 % i forhold til den hoejeste vaerdi for et indhold paa over 50 mg/kg .